CZ304451B6 - Molekula mutantu CTLA4 či nukleové kyseliny, vektor a hostitelský vektorový systém, hostitelská buňka, způsob přípravy proteinu mutantu CTLA4 a jeho použití, farmaceutická kompozice a způsob regulace - Google Patents

Abstract

Je popsána molekula mutantu CTLA4 obsahující aminokyselinovou sekvenci, molekula nukleové kyseliny, která zahrnuje nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci korespondující s molekulou mutantu CTLA4, vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny, hostitelský vektorový systém obsahující vektor, hostitelská buňka mající uvedený vektor, způsob přípravy proteinu mutantu CTLA4, protein mutantu CTLA4 připravený způsobem objasněným v popisu, farmaceutická kompozice, která obsahuje molekulu mutantu CTLA4, způsob regulace in vitro interakce T buňky s CD80 a/nebo CD86 pozitivní buňkou, stejně jako použití molekuly mutantu CTLA4 pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčbu nemoci imunitního systému.

Description

Molekula mutantu CTLA4 či nukleové kyseliny, vektor a hostitelský vektorový systém, hostitelská buňka, způsob přípravy proteinu mutantu CTLA4 a jeho použití, farmaceutická kompozice a způsob regulace

Oblast techniky

Tento vynález se týká molekuly mutantu CTLA4 obsahující aminokyselinovou sekvenci, molekuly nukleové kyseliny, která zahrnuje nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci korespondující s molekulou mutantu CTLA4, vektoru obsahujícího sekvenci nukleové kyseliny, hostitelského vektorového systému obsahujícího vektor, hostitelské buňky mající uvedený vektor, způsobu přípravy proteinu mutantu CTLA4, proteinu mutantu CTLA4 připraveného způsobem uvedeným výše, farmaceutické kompozice, která obsahuje molekulu mutantu CTLA4, způsobu regulace in vitro interakce T buňky s CD80 a/nebo CD86 pozitivní buňkou, jakož i použití molekuly mutantu CTLA4 pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčbu nemoci imunitního systému.

Dosavadní stav techniky

Antigen-nespecifické intercelulámí interakce mezi T-lymfocyty a buňkami představujícími antigen („antigen presenting cells - APC“) vytváří kostimulační (spolustimulační) signály T-buněk, které dále vytváří odezvy T buněk na antigen (Jenkins and Johnson (1993), Curr. Opin. Immunol., 5: 361 - 367). Kostimulační signály určují velikost odezvy T buněk na antigen, a dále to, zda tato odezva aktivuje nebo inaktivuje následující odezvy na antigen (Mueller a kol., 1989, Annu. Rev. Immunol. 7: 445- 480.

Aktivace T buněk bez kostimulace má za následek nezdařilou nebo anergickou odezvu T-buněk (Schwartz, R. H., 1992, Cell 71:1065-1068). Jeden klíčový kostimulační signál vzniká interakcí povrchového receptoru CD28 T-buněk s B7 příbuznými molekulami na buňkách představujících antigen (například také známé jako B7-1 a B7-2 nebo CD80 a CD86) (P. Linsley and Ledbetter, 1993, Annu. Rev. Immunol., 191-212).

Tato molekula nyní známá jako CD80 (B7—1) byla původně popsána jako lidský aktivační antigen B buněk (Yokochi, T. a kol., 1981, J. Immunol., 128: 823-827; Freeman, G. J. a kol., 1989, J. Immunol., 143: 2714-2722) a později identifikována jako protireceptor pro příbuzné molekuly T buněk CD28 a CTLA4 (Linsley, P. a kol., 1990, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 87: 5031-5035; Linsley, P. S. a kol., 1991a, J. Exp. Med., 173: 721-730; Linsley, P. S. a kol., 1991b, J. Exp. Med., 174: 561-570).

Nedávno byl identifikován další protireceptor pro CTLA4 na buňkách představujících antigen (Azuma, N. a kol., 1993, Nátuře, 366:76-79; Freemann, 1993a, Science 262: 909-911; Freeman, G. J. a kol., 1993b, J. Exp. Med. 178: 2185-2192; Hathcock, K. L. S. a kol., 1994, J. Exp. Med., 180: 631-640; Lenschow, D. J. a kol., 1993, Proč. Nati. Sci. USA, 90:11054-11058; Ravi-Wolf, Z. a kol., 1993, Proč. Nati. Sci. USA, 90:11182-11186; Wu, Y. a kol., J. Exp. Med. 178:17891793). Tato molekula nyní známá jako CD86 (Caux, C. a kol., 1994, J. Exp. Med., 180:1841— 1848), ale také nazývaná B7-0 (Azuma a kol., 1993, viz výše) nebo B7-2 (Freeman a kol., 1993a, viz výše) má společnou sekvenční identitu asi z 25 % s CD80 v její extracelulámí oblasti (Azuma a kol., 1993, viz výše; Freeman a kol., 1993a, viz výše; 1993b, viz výše). CD86-transfekované buňky vyvolávají odezvy T buněk zprostředkované CD28 (Azuma a kol., 1993, viz výše; Freeman a kol., 1993a, 1993b, viz výše).

Srovnání exprese CD80 a CD86 bylo předmětem několika studií (Azuma a kol., 1993, viz výše; Hathcock a kol., 1994, viz výše; Larsen, C. P. a kol., 1994), J. Immunol., 152: 5208-5219; Stack, R. M., a kol., 1994, J. Immunol., 152: 5723-5733). Současné údaje ukazují, že exprese CD80

-1 CZ 304451 B6 a CD 86 jsou regulovány různě a naznačují, že exprese CD86 má tendenci předcházet expresi CD80 během imunitní odezvy.

Rozpustné formy CD28 a CTLA4 byly vytvořeny spojením variabilně příbuzných extracelulárních domén CD28 a CTLA4 s konstantními doménami imunoglobulinů (Ig) za vzniku CD28Ig aCTLA4Ig. CTLA4Ig váže jak CD80 pozitivní, tak i CD86 pozitivní buňky silněji než CD28Ig (Linsley, P. a kol., 1994, Immunity, 1:793-80). Mnoho imunitních odezev závislých na T buňkách je blokováno CTLA4 jak in vitro, tak i in vivo. (Linsley a kol., 1991b, viz výše; Linsley, P. S. a kol., 1992a, Science, 257:792-795; Linsley, P. S. a kol., 1992b, J. Exp. Med., 176:1595— 1604; Lenschow, D. J. a kol., 1992, Science, 257:789-792; Tan, P. a kol., 1992, J. Exp. Med., 177:165-173; Turka L. A., 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:11102-11105).

Peach a kol. (J. Exp. Med., 1994, 180:2049-2058) identifikovali oblasti v extracelulámí doméně CTLA4, které jsou důležité pro silnou vazbu na CD80. Konkrétně hexapeptidový vzor (MYPPPY, SEQ ID NO: 9) v oblasti podobající se oblasti 3 určující komplementární (CDR3like region) byl identifikován jako plně zachovaný u všech členů skupiny CD28 a CTLA4. Alaninová skenovací mutageneze prostřednictvím MYPPPY (SEQ ID NO: 9) vzoru v CTLA4 a vybraných zbytcích CD28Ig snížila nebo zrušila vazbu na CD80.

Byly také vytvořeny chimémí molekuly vzájemně si vyměňující homologní oblasti CTLA4 a CD28. Molekuly HS4, HS4-A a HS4-B byly vytvořeny vložením oblastí CTLA4 podobajících se CDR-3, které také obsahovaly část karboxylového konce prodlouženého tak, aby obsahoval určité nezachované aminokyselinové zbytky na CD28Ig. Tyto homology mutantů vykazovaly vyšší vazebnou aviditu k CD80 než k CD28Ig.

V další skupině chimemích homologů mutantů, oblast CTLA4 podobající se CDR1, která není zachovaná v CD28 a předpokládá se, že prostorově sousedí s oblastí podobající se CDR3, byla vložena do HS4 a HS4-A. Tyto chimémí homology molekul mutantů (označené jako E1S7 a HS8) vykazovaly dokonce větší vazebnou aviditu pro CD80 než CD28Ig.

Chimémí homology molekul mutantů byly také připraveny vložením oblasti CTLA4 podobající se CDR-2 do HS7 a HS8, ale tato kombinace dále nezlepšila vazebnou aviditu pro CD80. Bylo určeno, že MYPPPY vzor u CTLA4 a CD28 je rozhodující pro vazbu na CD80, ale určité nezachované aminokyselinové zbytky v oblastech CTLA4 podobajících se CDR-1 a CDR-3 byly také zodpovědné za zvýšenou vazebnou aviditu CTA4 k CD80.

Bylo ukázáno, že CTLA4Ig účinně blokuje kostimulaci T buněk spojenou s CD80, ale nebyl tak účinný při blokování odezev spojených s CD86. Rozpustné molekuly mutantu CTLA4, zvláště ty mající vyšší aviditu pro CD86 než pro standardní typ CTLA4 byly vytvořeny, aby mohly co možná nejlépe blokovat aktivaci antigenem specificky aktivovaných buněk oproti CTLA4Ig.

Z výše uvedeného vyplývá, že existuje potřeba zlepšit molekuly CTLA4 tak, aby poskytovaly lepší farmaceutické prostředky pro imunitní supresi a léčbu rakoviny než dříve známé rozpustné formy CTLA4.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je molekula mutantu CTLA4 obsahující aminokyselinovou sekvenci, která začíná methioninem v poloze +1 a končí kyselinou asparagovou v poloze +124, jak je zobrazeno na obrázku 7, nebo začíná alaninem v poloze -1 a končí kyselinou asparagovou v poloze +124, jak je zobrazeno na obrázku 7.

-2CZ 304451 B6

Předmětem tohoto vynálezu je také molekula nukleové kyseliny, která zahrnuje nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci korespondující s molekulou mutantu CTLA4 vymezenou výše nebo jejím výhodným provedením.

Předmětem tohoto vynálezu je také vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny vymezenou výše nebo její výhodné provedení.

Předmětem tohoto vynálezu je také hostitelský vektorový systém obsahující vektor vymezený výše nebo jeho výhodné provedení ve vhodné hostitelské buňce.

Předmětem tohoto vynálezu je také hostitelská buňka mající vektor vymezený výše nebo jeho výhodné provedení.

Předmětem tohoto vynálezu, je také způsob přípravy proteinu mutantu CTLA4, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje pěstování hostitelského vektorového systému vymezeného výše nebo jeho výhodného provedení pro vytvoření proteinu mutantu CTLA4 v hostitelské buňce a takto vytvořený protein se odebírá.

Předmětem tohoto vynálezu je také protein mutantu CTLA4 připravený způsobem uvedeným výše.

Předmětem tohoto vynálezu je také farmaceutická kompozice, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a molekulu mutantu CTLA4 vymezenou svrchu nebo její výhodné provedení nebo molekulu mutantu CTLA4 vymezenou bezprostředně výše.

Předmětem tohoto vynálezu je také způsob regulace in vitro interakce T buňky s CD80 a/nebo CD86 pozitivní buňkou, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje kontaktování CD80 a/nebo CD86 pozitivní buňky s rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 vymezenou svrchu nebo její výhodné provedení nebo molekulou mutantu CTLA4 vymezenou v odstavci zařazeném před předchozím odstavcem za vytvoření komplexu molekuly mutantu CTLA4/CD80 nebo molekuly mutantu CTLA4/CD86, přičemž tento komplex ruší interakci mezi T buňkou a CD80 a/nebo CD86 pozitivní buňkou.

Předmětem tohoto vynálezu je také použití molekuly mutantu CTLA4 vymezené výše nebo jejího výhodného provedení nebo molekuly mutantu CTLA4 vymezené výše pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčbu nemoci imunitního systému.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 zobrazuje rovnovážnou vazebnou analýzu L104EA29YIg, L104EIg a standardního CTLA4Ig na CD86Ig.

Obrázky 2A a 2B objasňují údaje z FACS zkoušek ukazujících vazbu L104EA29YIg, L104EIg a CTLA4Ig na lidské buňky CHO transfekované CD80 nebo CD86, jak je popsáno dále v příkladu 2.

Obrázky 3A a 3B znázorňují inhibici proliferace CD80-pozitivních a CD86-pozitivních CHO buněk, jak je popsáno dále v příkladu 2.

Obrázky 4A a 4B ukazují, že L104EA29YIg je účinnější než CTLA4Ig při inhibici proliferace primárních a sekundárních alostimulovaných T buněk, jak je popsáno dále v příkladu 2.

-3 CZ 304451 B6

Obrázky 5A až 5C ukazují, že L104EA29YIg je účinnější než CTLA4Ig při inhibici tvorby cytokinů IL-2 (obr. 5A), IL-4 (obr. 5B) a γ-interferonu (obr. 5C) v alostimulovaných lidských T buňkách, jakje popsáno dále v příkladu 2.

Obrázek 6 ukazuje, že L104EA29YIg je účinnější než CTLA4Ig při inhibici proliferace fytohemaglutininu -(PHA) stimulovaného opičími T buňkami, jak je popsáno dále v příkladu 2.

Obrázek 7 znázorňuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 3 a 4) molekuly mutantu CTLA4 (L104EA29YIg) obsahující signální peptid; mutovanou extracelulámí doménu CTLA4 začínající methioninem v poloze +1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124 nebo začínající alaninem v poloze -1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124; a Ig oblast, jakje popsáno dále v příkladu 1.

Obrázek 8 znázorňuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 5 a 6) molekuly mutantu CTLA4 (L104EIg) obsahující signální peptid; mutovanou extracelulámí doménu CTLA4 začínající methioninem v poloze +1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124 nebo začínající alaninem v poloze -1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124; a Ig oblast, jakje popsáno dále v příkladu 1.

Obrázek 9 znázorňuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 7 a 8) CTLA4Ig mající signální peptid; standardní (divoký typ) aminokyselinovou sekvenci extracelulámí domény CTLA4 začínající methioninem v poloze +1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124 nebo začínající alaninem v poloze -1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124; a Ig oblast.

Obrázky 10A až 10C:

Obrázek 10A je SDS gel: CTLA4Ig (pruh 1), L104EIg (pruh 2) a L104EA29YIg (pruh 3);

Obrázek 10B a 10C - vylučovací chromatografie - chromatogramy: CTLA4Ig - obr. 10B aL104EA29YIg-obr. 10C.

Obrázek 11 zobrazuje stužkový diagram (levá strana) CTLA4 extracelulámího Ig jako V-násobně vytvořeného ze struktury roztoku stanovené NMR spektroskopií. Pravá strana obr. 11 zobrazuje zvětšený pohled na oblast S25-R33 a oblast MYPPPY (SEQ ID NO: 9) označující umístění a orientaci postranního řetězce mutace, která zvyšuje aviditu LI04 a A29.

Obrázek 12 popisuje schématický diagram vektoru, piLN-LEA29Y, ve kterém je obsažen inzert L104EA29YIg.

Shrnutí vynálezu

Tento vynález poskytuje rozpustné molekuly mutantu CTLA4, které se váží na CD80 a/nebo CD86. Mezi molekuly mutantu patří ty, které mohou rozpoznat a navázat se buď na CD80 nebo na CD86, nebo na oba. V některých provedeních molekuly mutantu se váží na CD80 a/nebo CD86 s větší aviditou než CTLA4.

Jedním příkladem molekuly mutantu CTLA4 je L104EA29YIg (obrázek 7), jak je popsáno v tomto vynálezu. Dalším příkladem molekuly mutantu CTLA4 je L104EIg (obrázek 8), jakje popsáno v tomto vynálezu. L104EA29YIg a L104EIg se váží na CD80 a CD86 intenzivněji než CTLA4Ig.

-4CZ 304451 B6

Podrobný popis vynálezu

Definice

Dále bude specifikován význam slov nebo frází používaných v tomto popisu vynálezu.

„Standardní typ CTLA4“ má aminokyselinovou sekvenci přirozeně se vyskytujícího, nezkráceného CTLA4 patentové spisy US 5 434 131, US 5 844 095, US 5 851 795), nebo jeho extracelulámí domény, který váže CD80 a/nebo CD86 a/nebo ruší vazbu CD80 a/nebo CD86 na jejich ligandy.

V určitých provedeních extracelulámích doména standardního typu CTLA4 začíná methioninem v poloze +1 a končí kyselinou asparagovou v poloze +124 nebo extracelulámí doména standardního CTLA4 začíná alaninem v poloze -1 a končí kyselinou asparagovou v poloze +124. Standardní CTLA4 je buněčný povrchový protein, která má N-koncovou extracelulámí doménu, transmembránovou doménu a C-koncovou cytoplazmatickou doménu. Extracelulámí doména se váže na cílové antigeny, jako je CD80 a CD86. V buňce přirozeně se vyskytující je standardní CTLA4 protein překládán translací jako nezralý polypeptid, který obsahuje signální peptid na Nkonci. Nezralý polypeptid podléhá posttranslačnímu zpracování, které zahrnuje štěpení a odstranění signálního peptidu za vzniku štěpného produktu CTLA4, který má nově vytvořený N-konec, který se liší od N-konce v nezralé formě. Odborníkovi v oboru je zřejmé, že k dalšímu posttranslačnímu zpracování může docházet po odstranění jedné nebo více aminokyselin z nově vytvořeného N-konce štěpného produktu CTLA4. Zralá forma molekuly CTLA4 obsahuje extracelulámí doménu nebo jakoukoliv její část, která se váže na CD80 a/nebo CD86.

„CTLA4Ig“ je rozpustný fuzní protein obsahující extracelulámí doménu standardního typu CTLA4 nebo její část, která se váže na CD80 a/nebo CD86, přičemž je napojen na konec Ig. Určité provedení obsahuje extracelulámí doménu standardního typu CTLA4, která začíná methioninem v poloze +1 a končí kyselinou asparagovou v poloze +124; nebo začíná alaninem v poloze -1 a končí kyselinou asparagovou v poloze +124; napojení glutaminového kyselinového zbytku v poloze +125; a imunoglobulinovou část obsahující kyselinu glutamovou v poloze +126 a končící lysinem v poloze +357 (obrázek 9; SEQ ID NO: 8).

„Fúzní protein“ je definován jako jedna nebo více aminokyselinových sekvencí spojených za použití způsobů dobře známých v oboru a jak je popsáno v patentovém spise US 5 434 131 nebo US 5 637 481. Spojené aminokyselinové sekvence tímto vytváří jeden fúzní protein.

„Molekula mutantu CTLA4“ je molekula, kterou může být celá molekula CTFA4 nebo jejich části (deriváty nebo fragmenty), která mají mutaci nebo více mutací v CTFA4 (výhodně v extracelulámí doméně CTFA4), takže je podobná, ale není identická se standardní molekulou CTFA4. Molekuly mutantu se váží buď na CD80 nebo na CD86, nebo na oba antigeny. Molekuly mutantu CTFA4 mohou obsahovat biologicky nebo chemicky aktivní cizí molekulu odlišnou od CTFA4, která je zabudována uvnitř neboje připojena. Molekuly mutantu mohou být rozpustné (tj. cirkulující) nebo navázané na povrch. Molekuly mutantu CTFA4 mohou obsahovat celou extracelulámí doménu CTLA4 nebo její části, jako jsou například fragmenty nebo deriváty. Molekuly mutantu CTFA4 mohou být připraveny synteticky nebo rekombinantně.

„Mutace“ je změna nukleotidové nebo aminokyselinové sekvence standardního polypeptidů.

V tomto případě to je změna standardní extracelulámí domény CTFA4. Tato změna může být aminokyselinová změna, jako jsou substituce, delece, adice nebo trunkace (zkomolení). Molekula mutantu může mít jednu nebo více mutací. Mutace v nukleotidové sekvenci mohou, ale nemusí mít za následek mutaci v aminokyselinové sekvenci, jak je dobře známo odborníkům v oboru. Z tohoto hlediska určité nukleotidové kodony kódují stejnou aminokyselinu. Například nukleotidové kodony CGU, CGG, CGC a CGA kódují aminokyselinu árginin (R); nebo kodony GAU a GAC kódují aminokyselinu kyselinu asparagovou (D). Tak protein může být kódován jednou nebo více molekulami nukleové kyseliny, které se liší vjejich specifické nukleotidové sekvenci,

-5CZ 304451 B6 ale přesto kódované molekuly proteinu mají identické sekvence. Sekvence kódující aminokyseliny jsou následující:

Aminokyselina	Symbol	Jednopí směnný	Kodony
Alanin	Ala	A	GCU, GCC, GCA, GCG
Cystein	Cys	C	UGU, UGC
Asparagová	Asp	D	GAU, GAC
Glutamová	Glu	E	GAA, GAG
Fenylalanin	Phe	F	UUU,UUC
Glycin	Gly	G	GGU, GGC, GGA, GGG
Histidin	His	H	CAU, CAC
Isoleucin	Ile	I	AUU, AUC, AUA
Lysin	Lys	K	AAA, AAG
Leucin	Leu	L	UUA, UUG, CUU, CUC,
Methionin	Met	M	AUG
Asparagin	Asn	N	AAU, AAC
Prolin	Pro	P	CCU, CCC, CCA, CCG
Glutamin	Gin	Q	CAA, CAG
Arginín	Arg	R	CGU, CGC, CGA, CGG,
Serin	Ser	S	UCU, UCC, UCA, UCG,
Threonin	Thr	T	ACU, ACC, ACA, ACG
Vaiin	Val	V	GUU, GUC, GUA, GUG
Tryptofan	Trp	w	UGG
Tyrosin	Tyr	Y	UAU, UAC

„Extracelulámí doména CTLA4“, ve zde používaném smyslu, je částí CTLA4, která rozpoznává a váže CD80 a/nebo CD86. Například extracelulámí doména CTLA4 začíná methioninem v poloze +1 a končí kyselinou asparagovou v poloze +124 (obrázek 9; SEQ ID NO: 8). Alternativně extracelulámí doména začíná aíaninem v poloze -1 a končí kyselinou asparagovou v poloze +124 (obrázek 9; SEQ ID NO: 8). Extracelulámí doména obsahuje fragmenty nebo deriváty CTLA4, které váží CD80 a/nebo CD86.

„Proteinová sekvence ne-CTLA4“ nebo „molekula ne-CTLA4“ je definována jako jakákoliv molekula, která neváže CD80 a/nebo CD86 a neinterferuje s vazbou CTLA4 na její cíl. Takovým neomezujícím příkladem je například konstantní oblast imunoglobulinu (Ig) nebo její část. Výhodně je konstantní oblastí Ig lidské nebo opičí konstantní oblast Ig, jako je například lidská C(gama)l, včetně oblastí pantové, CH2 a CH3. Tato konstantní oblast Ig může být mutována pro snížení jejich efektorových funkcí (patentové spisy US 5 637 481 a US 6 132 992).

-6CZ 304451 B6 „Fragment molekuly mutantu CTLA4“ je část molekuly mutantu CTLA4, výhodně extracelulámí doména CTLA4 nebo její část, která rozpoznává a váže se na její cíl, jako je například CD80 a/nebo CD86.

„Derivát molekuly mutantu CTLA4“ je molekula, která má alespoň 70% sekvenční podobnost a funkce jako extracelulámí doména CTLA4, tj. že rozpoznává a váže CD80 a/nebo CD86.

„Část molekuly CTLA4“ obsahuje fragmenty nebo deriváty molekuly CTLA4, která váže CD80 a/nebo CD86.

Z důvodu lepšího pochopení tohoto vynálezu je dále uveden následující popis.

Kompozice podle vynálezu

Tento vynález poskytuje rozpustné molekuly mutantu CTLA4, které rozpoznávají a váží CD80 a/nebo CD86. V některých provedeních mají rozpustné mutanty CTLA4 vyšší aviditu k CD80 a/nebo CD86 než CTLA4Ig.

Mezi příklady molekul mutantu CTLA4 patří L104EA29YIg (obrázek 7; SEQ ID NO: 3 a 4). Aminokyselinová sekvence L104EA29YIg může začínat alaninem v aminokyselinové poloze -1 a končit lysinem v aminokyselinové poloze +357. Alternativně aminokyselinová sekvence L104EA29YIg může začínat methioninem v aminokyselinové poloze +1 a končit lysinem v aminokyselinové poloze +367. CTLA4 část L104EA29YIg začíná methioninem v aminokyselinové poloze +1 a končí kyselinou asparagovou v aminokyselinové poloze +124. L104EA29YIg obsahuje spojení aminokyselinového zbytku glutaminu v poloze +125 a imunoglobulinové části začínající kyselinou glutamovou v poloze +126 a končící lysinem v poloze +357 (obrázek 7; SEQ ID NO: 4). L104EA29YIg se váže přibližně 2 krát intenzivněji než standardní typ CTLA4Ig (dále označovaný jako CTLA4Ig) na CD80 a přibližně 4 krát intenzivněji na CD86. Tato silnější vazba L104EA29YIg způsobuje, že je účinnější než CTLA4Ig při blokování imunitních reakcí.

Molekuly mutantu CTLA4 obsahují alespoň extracelulámí doménu CTLA4 nebo její část, které váží CD80 a/nebo CD86. Extracelulámí část molekuly mutantu CTLA4 obsahuje aminokyselinovou sekvenci začínající methioninem v poloze +1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124 (obrázek 7; SEQ ID NO: 4 nebo obrázek 8; SEQ ID NO: 6). Alternativně extracelulámí část CTLA4 může obsahovat aminokyselinovou sekvenci začínající alaninem v poloze -1 končící kyselinou asparagovou v poloze +124 (obrázek 7; SEQ ID NO: 4 nebo obrázek 8; SEQ ID NO: 6).

V jednom provedení rozpustná molekula mutantu CTLA4 je fuzním proteinem obsahujícím extracelulámí doménu CTLA4, která má jednu nebo více mutací v oblasti aminokyselinové sekvence začínající serinem v poloze +25 a končící argininem v poloze +33 (S25-R33). Například alanin v poloze +29 standardního CTLA4 může být substituován (nahrazen) tyrosinem (kodony UAU, UAC). Alternativně alanin může být substituován leucinem (kodony: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG), fenylalaninem (kodony: UUU, UUC), tryptofanem (kodon: UGG) nebo threoninem (kodony: ACU, ACC, ACA, ACG). Odborníkovi v oboru je zřejmé, že uracilový nukleotid (U) sekvence RNA odpovídá thyminovému nukleotidu (T) sekvence DNA.

V dalším provedení rozpustná molekula mutantu CTLA4 je fuzním proteinem obsahujícím extracelulámí doménu CTLA4, která má jednu nebo více mutací uvnitř nebo blízko oblasti aminokyselinové sekvence začínající methioninem v poloze +97 a končící glycinem v poloze +107 (M97-G107). Například leucin v poloze +104 standardního CTLA4 může být substituován kyselinou glutamovou (kodony: GAA, GAG). Molekula mutantu CTLA4 s touto substitucí je označována v tomto textu jako L104EIg (obrázek 8; SEQ ID NO: 5 a 6).

-7CZ 304451 B6

V ještě dalším provedení rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 je fúzní protein obsahující extracelulámí doménu CTLA4, která má jednu nebo více mutací v oblastech S25-R33 a M97G107. Například v jednom provedení molekula mutantu CTLA4 obsahuje tyrosin v poloze +29 místo alaninu a kyselinu glutamovou v poloze +104 místo leucinu. Molekula mutantu CTLA4 s těmito substitucemi je označována v tomto textu jako L104EA29YIg (obrázek 7; SEQ ID NO: 3 a 4). Molekula nukleové kyseliny, která kóduje L104EA29YIg je obsažena v pD16L104EA29YIg a byla uložena 19. června 2000 do Americké sbírky typů kultur (American Type Culture Collection - ATCC), 10801 University Blvd., Mananas, VA 20110-2209 (ATCC č. PTA-2104). Vektor pD16L104EA29YIg je odvozen z vektoru pcDNA3 (INVITROGEN).

Tento vynález dále poskytuje rozpustnou molekulu mutantu CTLA4 obsahující extracelulámí doménu mutantu CTLA4, jak je znázorněna na obrázku 7 (SEQ ID NO: 3 a 4) nebo na obrázku 8 (SEQ ID NO: 5 a 6), nebo její část(i) a část, která(é) mění rozpustnost, afinitu a/nebo mocenství molekuly mutantu CTLA4.

V souladu s aplikací tohoto vynálezu touto částí může být konstantní oblast imunoglobulinu nebo její část. Pro použití in vivo je výhodné, aby konstantní oblast imunoglobulinu nevyvolávala nežádoucí imunitní reakci v subjektu. Například v klinických zkouškách může být výhodné, aby molekuly mutantu obsahovaly konstantní oblasti lidského a opičího imunoglobulinu. Jedním příkladem vhodné oblasti imunoglobulinu je lidská C(gama)l, která obsahuje oblasti pantovou, CH2 a CH3. Další izotypy jsou možné. Dále jsou možné další konstantní oblasti imunoglobulinu (výhodně slabě nebo neimunogenní konstantní oblasti imunoglobulinu).

Další části obsahují polypeptidové značky („tags“). Mezi vhodné značky například patří molekuly p97, molekula env gpl20, molekula E7 a molekula ova (Dash, B., a kol., 1994, J. Gen. Virol. 75: 1389-97; Ikeda, T., a kol., 1994, Gene, 138: 193-6; Falk, K., a kol., 1993, Cell. Immunol., 150: 447-52; Fujisaka, K. a kol., 1994, Virology, 204: 789—93). Další molekuly pro použití jako značky jsou možné (Gerard, C. a kol., 1994, Neuroscience, 62: 721-739; Bym R. a kol., J. Virol., 1989, 63:4370-4375; Smith D. a kol., 1987, Science, 238: 1704-1707; Lásky, L., 1996, Science, 233:209-212).

Tento vynález dále poskytuje rozpustné fúzní proteiny mutantu CTLA4, které jsou výhodně reaktivnější s antigenem CD80 a/nebo 86 ve srovnání se standardním CTLA4. Jedním příkladem je L104EA29YIg, jak je znázorněno na obrázku 7 (SEQ ID NO: 3 a 4).

V dalším provedení rozpustná molekula mutantu CTLA4 obsahuje spojovací aminokyselinový zbytek, který je umístěn mezi částí CTLA4 a imunoglobulinovou částí. Spojovací aminokyselinou může být jakákoliv aminokyselina včetně glutaminu. Tato spojovací aminokyselina může být zavedena způsoby molekulární nebo chemické syntézy, které jsou známy v oboru.

V dalším provedení rozpustná molekula mutantu CTLA4 obsahuje imunoglobulinovou část (například pantovou, CH2 a CH3 doménu), kde kterýkoliv nebo všechny cysteinové zbytky v pantové doméně imunoglobulinové části jsou substituovány serinem, například cysteiny v polohách +130, +136 nebo +139 (obrázek 7; SEQ ID NO: 4 nebo obrázek 8; SEQ ID NO: 6). Tato molekula mutantu může také obsahovat prolin v poloze +148, který je substituován serinem, jak je znázorněno na obrázku 7 (SEQ ID NO: 4) nebo na obrázku 8 (SEQ ID NO: 6).

Rozpustná molekula mutantu CTLA4 může obsahovat signální peptidovou sekvenci spojenou s N-koncem extracelulámí domény CTLA4 části molekuly mutantu. Signálním peptidem může být jakákoliv sekvence, která umožní vylučování molekuly peptidů, jako je signální peptid z onkostatinu M (Malík, a kol., 1989, Molec. Cell Biol., 9: 2847-2853) nebo CD5 (Jones, N. H. a kol., 1986, Nátuře, 323: 346-349), nebo signální peptid z jakéhokoliv extracelulámího proteinu.

Molekula mutantu může obsahovat signální peptid onkostatin M spojený s N-koncem extracelulámí domény CTLA4 a molekulu lidského imunoglobulinu (například panovou, CH2 a CH3)

-8CZ 304451 B6 spojenou s C-koncem extracelulámí domény CTLA4. Tato molekula obsahuje signální peptid onkostatin M s aminokyselinovou sekvencí začínající methioninem v poloze -26 a končící alaninem v poloze -1, CTLA4 část obsahuje aminokyselinou sekvenci začínající methioninem v poloze +1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124, spojovací aminokyselinový zbytek glutaminu v poloze +125 a imunoglobulinovou část obsahující aminokyselinovou sekvenci začínající kyselinu glutamovou v poloze +126 a končící lysinem v poloze +357.

Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu mohou být připraveny molekulárními a chemickými způsoby syntézy. Molekulární způsoby mohou zahrnovat následující kroky: zavedení molekuly nukleové kyseliny do vhodné hostitelské buňky, kde se exprimuje a kóduje rozpustnou molekulou mutantu CTLA4; kultivaci hostitelské buňky za podmínek, které umožňují expresi molekul mutantu v hostitelské buňce; a izolaci exprimovaných molekul mutantu. Část signálního peptidu molekuly mutantu umožňuje, aby molekuly proteinu byly exprimovány na buněčném povrchu a byly vylučovány hostitelskou buňkou. Translací vytvořené molekuly mutantu mohou být posttranslačně modifikovány, jako odštěpením signálního peptidu za vzniku zralého proteinu majícího CTLA4 a imunoglobulinovou část. Ke štěpení může docházet za alaninem v poloze -1, čímž vzniká zralá molekula mutantu mající methionin v poloze +1 jako první aminokyselinu (obrázek 7; SEQ ID NO: 4 nebo obrázek 8; SEQ ID NO: 6). Alternativně ke štěpení může docházet za methioninem v poloze -2, čímž vzniká zralá molekula mutantu mající alanin v poloze -1 jako první aminokyselinu.

Ve výhodném provedení je rozpustná molekula mutantu CTLA4 mající extracelulámí doménu lidského CTLA4 spojena s celou molekulou nebo částí molekuly lidského imunoglobulinu (například pantovou, CH2 a CH3). Tato výhodná molekula obsahuje CTLA4 část rozpustné molekuly složené z aminokyselinové sekvence začínající methioninem v poloze +1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124, spojovací aminokyselinový zbytek glutaminu v poloze +125 a imunoglobulinovou část začínající kyselinou glutamovou v poloze +126 a končící lysinem v poloze +357. Část obsahující extracelulámí doménu CTLA4 je mutovaná tak, že alanin v poloze +29 je substituován tyrosinem a leucin v poloze +104 je substituován kyselinou glutamovou. Imunoglobulinová část molekuly mutantu může být mutována tak, že cysteiny v polohách +130, +136 a +139 jsou substituovány serinem a prolin v poloze +148 je substituován serinem. Tato molekula mutantu je v tomto textu označena jako L104EA29YIg (obrázek 7; SEQ ID NO: 3 a 4).

V dalším provedení má molekula mutantu L104EA29YIg aminokyselinovou sekvenci začínající alaninem v poloze -1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124, spojovací aminokyselinový zbytek glutaminu v poloze +125 a imunoglobulinovou část obsahující kyselinou glutamovou v poloze +126 (například začínající v poloze +126 a končící lysinem v poloze +357). Část obsahující extracelulámí doménu CTLA4 je mutována tak, že alanin v poloze +29 je nahrazen tyrosinem a leucin v poloze +104 je nahrazen kyselinou glutamovou. Imunoglobulinová část molekuly mutantu je mutována tak, že cysteiny v polohách +130, +136 a +139 jsou nahrazeny serinem a prolin v poloze +148 je nahrazen serinem. Tato molekula mutantu je v tomto textu označena jako L104EA29YIg (obrázek 7; SEQ ID NO: 3 a 4). Po odštěpení signální sekvence L104EA29YIg buď může začínat methioninem v poloze +1 nebo může začínat alaninem v poloze -1.

Další molekulou mutantu podle tohoto vynálezu je rozpustná molekula mutantu CTLA4 mající extracelulámí doménu lidského CTLA4 spojenou s molekulou lidského imunoglobulinu (například pant, CH2 a CH3). Tato molekula obsahuje část aminokyselinové sekvence kódující CTLA4 začínající methioninem v poloze +1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124, spojovací aminokyselinový zbytek glutaminu v poloze +125 a imunoglobulinovou část obsahující aminokyselinovou sekvenci začínající kyselinou glutamovou v poloze +126 a končící lysinem v poloze +357. Část obsahující extracelulámí doménu CTLA4 je mutována tak, že leucin v poloze +104 je substituován kyselinou glutamovou. Pantová část molekuly mutantu je mutována tak, že cysteiny v polohách +130, +136, +139 jsou substituovány serinem a prolin v poloze +148 je substituován

-9CZ 304451 B6 serinem. Tato molekula mutantu je v tomto textu označena jako L104EIg (obrázek 8; SEQ ID NO: 5 a 6).

V alternativním provedení L104EIg je rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 mající extracelulámí doménu lidského CTLA4 spojenou s molekulou lidského proteinu (např. pant, CH2 a CH3). Tato výhodná molekula obsahuje CTLA4 část skládající se z aminokyselinové sekvence začínající alaninem v poloze -1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124, spojovací aminokyselinový zbytek glutaminu v poloze +125 a imunoglobulinovou část začínající kyselinou glutamovou v poloze +126 a končící lysinem v poloze +357. Část obsahující extracelulámí doménu CTLA4 je mutována tak, že leucin v poloze +104 je substituován kyselinou glutamovou. Pantová část molekuly mutantu je mutována tak, že cysteiny v polohách +130, +136 a +139 jsou substituovány serinem a prolin v poloze +148 je substituován serinem. Tato molekula mutantu je v tomto textu označena jako L104EIg (obrázek 8; SEQ ID NO: 5 a 6).

Dále tento vynález poskytuje rozpustnou molekulu mutantu CTLA4 mající: a) první aminokyselinovou sekvenci membránového glykoproteinu, například CD28, CD86, CD80, CD40 a gp39, který blokuje proliferaci T buněk, fúzovanou s druhou aminokyselinovou sekvencí; b) druhou aminokyselinovou sekvencí, která je fragmentem extracelulámí domény mutantu CTLA4, který blokuje proliferaci T buněk, jako je například molekula aminokyseliny začínající methioninem v poloze +1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124 (obrázek 7; SEQ ID NO: 4 nebo obrázek 8; SEQ ID NO: 6); a c) třetí aminokyselinovou sekvenci, která působí jako identifikační značka nebo zvyšuje rozpustnost molekuly. Například třetí aminokyselinová sekvence se může v podstatě skládat z aminokyselinových oblastí pantové, CH2 a CH3 neimunogenní molekuly imunoglobulinu. Mezi příklady vhodných molekul imunoglobulinu například patří lidský nebo opičí imunoglobulin, jako je C(gama)l, přičemž tento výčet není vyčerpávající. Další izotypy jsou také možné.

Tento vynález dále poskytuje molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidové sekvence kódující aminokyselinové sekvence odpovídající rozpustným molekulám mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu. V jednom provedení je molekula nukleové kyseliny DNA (například cDNA) nebo její hybrid. Alternativně jsou molekulami nukleové kyseliny RNA nebo její hybridy.

Dále tento vynález poskytuje vektor, který obsahuje nukleotidové sekvence podle tohoto vynálezu. Také je poskytnut hostitelský vektorový systém. Hostitelský vektorový systém zahrnuje vektor podle tohoto vynálezu ve vhodné hostitelské buňce. Mezi příklady vhodných hostitelských buněk například patří prokaryotické a eukaryotické buňky.

Tento vynález poskytuje farmaceutické prostředky (kompozice) pro použití pro léčení nemocí imunitního systému, přičemž tyto prostředky obsahují farmaceuticky účinné množství rozpustných molekul mutantu CTLA4. V určitých provedeních jsou nemoci imunitního systému zprostředkovány interakcemi CD28- a/nebo CTLA4-pozitivních buněk s pozitivními buňkami CD80 a/nebo CD86. Rozpustnými molekulami mutantu CTLA4 jsou výhodně molekuly CTLA4 mající jednu nebo více mutací v extracelulámí oblasti CTLA4. Farmaceutický prostředek může obsahovat rozpustné proteinové molekuly mutantu CTLA4 a/nebo molekuly nukleové kyseliny a/nebo vektory kódující tyto molekuly. Ve výhodných provedeních rozpustné molekuly mutantu CTLA4 mají aminokyselinovou sekvenci extracelulámí domény CTLA4, jak je znázorněna na obrázku 7 (SEQ ID NO: 4) a na obrázku 8 (SEQ ID NO: 6) (L104EA29Y nebo L104E). Je rovněž výhodnější, když rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 je L104EA29YIg, jak je popsáno v tomto textu. Tyto prostředky mohou dále obsahovat jiná terapeutická činidla, jako jsou například léčivé toxiny, enzymy, protilátky nebo konjugáty (bez omezení na tyto příklady).

Farmaceutické kompozice také výhodně obsahují nosiče a pomocné látky, což jsou jakékoliv látky, které po sloučení s molekulou podle tohoto vynálezu (například rozpustnou molekulou mutantu CTLA4, jako je L104EA29Y nebo L104E) zachovají molekulovou aktivitu a nereagují s imunitním systémem subjektu (pacienta). Mezi neomezující příklady vhodných nosičů a po-10CZ 304451 B6 mocných látek například patří lidský sérový albumin, iontoměniče, oxid hlinitý (alumina), lecithin, pufrovací látky, jako jsou fosfáty, glycin, kyselina sorbová, sorbát draselný a soli nebo elektrolyty, jako je protaminsulfát. Mezi další příklady patří jakékoliv standardní farmaceutické nosiče, jako je fyziologický roztok pufrovaný fosfátem, voda, emulze, jako je emulze olej/voda; a různé typy smáčedel. Dalšími nosiči mohou také být sterilní roztoky, tablety včetně potažených tablet a kapslí. Obvykle takové nosiče obsahují vehikula, jako je škrob, mléko, cukr, určité druhy jílu, želatina, kyseliny stearová nebo její soli, stearat hořečnatý nebo vápenatý, mastek, rostlinné tuky nebo oleje, gumy, glykoly nebo další známá vehikula. Takové nosiče mohou také zahrnovat aromatizační a barevná aditiva nebo jiné složky.

Prostředky obsahující takové nosiče jsou připraveny dobře známými konvenčními způsoby. Takové prostředky mohou také být zabudovány do různých tukových kompozic, jako jsou například liposomy a rovněž i různých polymemích kompozic, jako jsou polymemí mikrokuličky.

Farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu mohou být podávány běžnými subjektu způsobby podávání, jako je například intravenózní aplikace, intraperitoneální aplikace, intramuskulámí aplikace, subkutánní aplikace, orální aplikace, podávání pomocí čípků, místní podávání nebo podávání implantačním zařízením pro pomalé uvolňování, jako je miniosmotická pumpa.

Farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu mohou být v různých dávkovačích formách, jako jsou například kapalné roztoky nebo suspenze, tablety, pilulky, prášky, čípky, polymemí mikrokapsle nebo mikrovezikuly, liposomy a injektovatelné nebo infuzní roztoky. Výhodná forma závisí na způsobu podávání a terapeutické aplikaci.

Nejúčinnější způsob podávání a dávkovači schéma prostředků podle tohoto vynálezu závisí na intenzitě a průběhu nemoci, pacientově zdravotním stavu, reakci na léčbu a posouzení ošetřujícím lékařem. Z tohoto důvodu by dávkování prostředků mělo být upravováno podle individuálního subjektu.

Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 mohou být podávány subjektu v množství a čase (například časový interval a četnost) dostatečném pro blokování endogenních molekul B7 (jako je například CD80 a/nebo CD86) od vazby na jejich ligandy. Blokováním vazby endogenní B7/ligand dochází k inhibici interakcí mezi B7-pozitivními buňkami (jako jsou například CD80- a/nebo CD86pozitivní buňky) a pozitivními buňkami CD28 a/nebo CTLA4. Dávkování terapeutického činidla je závislé na mnoho faktorech, jako je například typ postižené tkáně, typ léčené autoimunitní nemoci, intenzitě nemoci, pacientově zdravotním stavu a pacientově reakci na léčbu těmito činidly. Proto se dávkování těchto činidel může lišit v závislosti na subjektu a způsobu podávání. Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 mohou být podávány v množství od 0,1 do 20,0 mg/kg hmotnosti pacienta za den, výhodně od 0,5 do 10,0 mg/kg za den. Podávání farmaceutických prostředků podle tohoto vynálezu může být prováděno v různých časových intervalech. V jednom provedení může být farmaceutická kompozice podle tohoto vynálezu podávána jednu či více hodin. Dále podávání může být opakováno v závislosti na intenzitě nemoci a rovněž i na dalších faktorech, které jsou známy odborníkovi v oboru.

Tento vynález dále poskytuje způsoby přípravy proteinu, které zahrnují růst hostitelského vektorového systému podle tohoto vynálezu za produkce proteinu v hostiteli a odebírání takto připraveného proteinu.

Dále tento vynález poskytuje způsoby regulace funkčních interakcí CTLA4- a CD28-pozitivních T buněk s CD80- a/nebo CD86-pozitivními buňkami. Tento způsob zahrnuje kontakt CD80a/nebo CD86-pozitivních buněk s rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu tak, aby byly vytvořeny komplex mutantu CTLA4/CD80 a/nebo komplex mutantu CTLA4/CD86, přičemž tyto komplexy interferují s reakcí endogenního antigenů CTLA4 s CD80 a/nebo CD86, a/nebo interferují s reakcí endogenního antigenů CD28 s CD80 a/nebo CD86. V jednom provedení tohoto vynálezu je rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 fuzní protein,

- 11 CZ 304451 B6 který obsahuje alespoň část extracelulámí domény mutantu CTLA4. V dalším provedení rozpustná molekula mutantu CTLA4 obsahuje: první aminokyselinovou sekvenci zahrnující extracelulámí doménu CTLA4 z aminokyselinové sekvence začínající methioninem v poloze +1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124, zahrnující alespoň jednu mutaci; a druhou aminokyselinovou sekvenci zahrnující oblasti pantové, CH2 a CH3 molekuly lidského imunoglobulinu gama 1 (obrázek 7; SEQ ID NO: 4 nebo obrázek 8; SEQ ID NO: 6).

Při aplikaci tohoto vynálezu jsou CD80- nebo CD86- pozitivní buňky kontaktovány s fragmenty nebo deriváty rozpustných molekul mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu. Alternativně je rozpustná molekula mutantu CTLA4 fúzním proteinem CD28Ig/CTLA4Ig majícím první aminokyselinovou sekvenci odpovídající části extracelulámí domény receptoru CD28 spojenou s druhou aminokyselinovou sekvencí odpovídající části extracelulámí domény receptoru mutantu CTLA4 a třetí aminokyselinovou sekvenci odpovídající oblastem pantové, CH2 a CH3 lidského imunoglobulinu C-gama-1.

Očekává se, že rozpustné molekuly mutantu CTLA4 budou vykazovat inhibiční vlastnosti in vivo. Za podmínek, kde dochází k interakcím T buňka/APC buňka, například interakcím T buňka/B buňka, jako výsledku kontaktu mezi T buňkami a APC buňkami, vazba zavedených molekul mutantu k reagování s CD80- a/nebo CD86- pozitivními buňkami, například B buňkami, může interferovat, tj. inhibovat interakce T buňka/APC buňka, což má za následek regulaci imunitních odezev.

Tento vynález poskytuje způsoby snižování rozsahu imunitních odezev. Regulace směřující ke snižování imunitní odezvy rozpustnými molekulami CTLA4 může probíhat prostřednictvím inhibice nebo blokování imunitní odezvy již probíhající nebo může zahrnovat zabránění indukce imunitní odezvy. Rozpustné molekuly CTLA4 podle tohoto vynálezu mohou inhibovat funkce aktivovaných T buněk, jako je proliferace T lymfocytů a vylučování cytokinu, potlačením odezev T buněk nebo vyvoláním specifické tolerance u T buněk, či oběma způsoby.

Tento vynález dále poskytuje způsoby léčby nemocí imunitního systému a vyvolání tolerance. V určitých případech jsou nemoci imunitního systému zprostředkovány interakcemi CD28a/nebo CTLA4-pozitivních buněk s CD80/CD86-pozitivními buňkami. V dalším provedení jsou inhibovány interakce T buněk. Mezi nemoci imunitního systému například patří autoimunitní choroby, imunoproliferační nemoci, poruchy spojené s transplantací štěpu. Tyto způsoby zahrnují podávání rozpustných molekul mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu subjektu za účelem regulace interakcí T buněk s CD80- a/nebo CD86-pozitivními buňkami. Alternativně může být podáván hybrid mutantu CTLA4 mající membránový glykoprotein spojený s molekulou mutantu CTLA4. Mezi příklady nemocí spojených s transplantací štěpu patří transplantační reakce příjemce vůči štěpu (graft versus host disease GVHD) (například může být způsobena transplantací kostní dřeně nebo při vyvolání tolerance), imunitní poruchy spojené s odhojením transplantovaného štěpu, chronická odmítnutí a tkáňové nebo buněčné alo- nebo xenoimplantáty zahrnující pevné orgány, kůži, ostrůvky, svaly, hepatocyty, neurony. Mezi příklady imunoproliferačních nemocí například patří lupenka; T buněčný lymfom; T buněčná akutní lymfoblastická leukémie; testikulámí angiocentrický T buněčný lymfom; benigní lymfocytická angiitída; a autoimunní choroby jako je lupus (například lupus erythematosus, lupus nefritis), Hashimotova thyroiditida, primární myxedém, Gravesova choroba, zhoubná anémie, autoimunitní atrofická gastritida, Addisonova choroba, cukrovka (například insulin dependentní diabetes mellitus, diabetes mellitus typu I), syndrom dobiých pastvin, myastenie gravis, pemfigus, Crohnova choroba, sympatická oftalmie, autoimunitní uveitida, roztroušená skleróza, autoimunitní hemolytická anémie, idiopatická thrombocytopenie, primární biliámí cirhóza, chronická hepatitida, ulcerativní kolitida, Sjogrenův syndrom, revmatické onemocnění (jako například revmatická artritida), polymyozitida, sklerodermie a smíšené onemocnění pojivové tkáně.

Tento vynález také poskytuje způsob inhibice transplantačního odmítnutí pevných orgánů a/nebo tkání subjektem, tímto subjektem je příjemce transplantované tkáně. Obvykle je odmítnutí štěpu

- 12CZ 304451 B6 u tkáňových transplantátů iniciováno prostřednictvím jeho rozpoznáním jako cizí T buňkami, potom následuje imunitní reakce, která zničí tento štěp. Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu mohou inhibováním proliferace T lymfocytů a/nebo sekrece cytokinu snížit destrukci tkáně a vyvolat útlum antigen-specifických T buněk, což může mít za následek dlouhodobé přijetí štěpu bez nutnosti celkové imunosuprese. Dále mohou být podávány rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu s dalšími léčivými přípravky, jako jsou například kortikoidy, cyklosporin, rapamycin, mykofenolát, mofetil, azathioprin, takrolismus, baziliximab a/nebo další biologické látky.

Tento vynález také poskytuje způsoby inhibice transplantační reakce příjemce vůči štěpu u subjektu. Tento způsob zahrnuje podávání rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu subjektu, a to buď samostatně, nebo společně s dalšími přídavnými ligandy reagujícími s IL-2, IL-4 nebo γ-interferonem. Například rozpustná molekula mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu může být podávána příjemci transplantátu kostní dřeně z důvodu inhibice aloreaktivity donorových T buněk. Alternativně může být způsobeno, aby dárcovské T buňky v kostní dřeni byly tolerovány aloantigeny příjemce ex vivo před transplantací.

Inhibice odezev T buněk rozpustnými molekulami mutantu CTLA4 může také být užitečná při léčbě autoimunitních poruch. Mnoho autoimunitních poruch vzniká nevhodnou aktivací T buněk, které jsou reaktivní vůči autoantigenům, a které podporují produkci cytokinů a protilátek, které jsou zapojeny v patologii této nemoci. Podávání rozpustné molekuly mutantu CTLA4 subjektu trpícímu nebo vnímavému na autoimunitní poruchu může zabránit aktivaci autoreaktivních T buněk a může snížit nebo eliminovat symptomy nemoci. Tento způsob také zahrnuje podávání rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu subjektu, a to buď samotné, nebo společně s dalšími přídavnými ligandy reagujícími s IL-2, IL-^4 nebo γ-interferonem.

Tento vynález dále poskytuje použití rozpustných molekul mutantu CTLA4 společně s dalšími imunosupresivními látkami, jako je například cyklosporin (viz Mathiesen: „Prolonged Survival and Vascularization of Xenografted Human Glioblastoma Cells in the Central Nervous System of Cyclosporin A-Treated Rats“ (1989), Cancer Lett., 44: 151-156), prednison, azathioprin amethotrexat (R. Handschumacher „Chapter 53: Drugs Ušed for Immunosuppresion“, s. 1264— 1276). Další imunosupresivní látky jsou možné. Například při léčbě revmatické artritidy mohou být rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podávány společně s farmaceuticky látkami, jako jsou například kortikosteroidy, nesteroidní protizánětlivá léčiva/Cox-2 inhibitory, methotrexat, hydroxychlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept, infliximab, anakinra, azathioprin a/nebo další biologické látky jako je anti-TNF. Při léčbě systematického lupus erythematodes mohou být podávány rozpustné molekuly mutantu CTLA4 společně s farmaceutickými přípravky jako jsou například kortikosteroidy, cytoxan, azanthioprin, hydroxychlorochin, mykofenolát mofetil a/nebo další biologické látky. Dále při léčbě systematické roztroušené sklerózy mohou být podávány rozpustné molekuly mutantu CTLA4 společně s farmaceutickými přípravky, jako jsou například kortikosteroidy, interferon beta-la, interferon beta-lb, glatirameracetat, mitoxantronhydrochlorid a/nebo další biologické látky.

Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 (výhodně L104EA29YIg) mohou být také použity společně s jedním nebo více z následujících činidel pro regulaci imunitní odezvy: rozpustný gp39 (také známý jako CD40 ligand (CD40L), CD 154, T-BAM, TRAP), rozpustný CD29, rozpustný CD40, rozpustný CD80, rozpustný CD86, rozpustný CD28, rozpustný CD56, rozpustný Thy-1, rozpustný CD3, rozpustný TCR, rozpustný VLA-4, rozpustný VCAM-1, rozpustný LECAM-1, rozpustný ELAM-1, rozpustný CD44, protilátky reagující s gp39, protilátky reagující sCD40, protilátky reagující sB7, protilátky reagující s CD28, protilátky reagující sLFA-1, protilátky reagující s LFA-2, protilátky reagující sIL-2, protilátky reagující s IL-12, protilátky reagující s IFN-gama, protilátky reagující s CD2, protilátky reagující s CD48, protilátky reagující s ICAM (například ICAM-2), protilátky reagující s CTLA4, protilátky reagující s Thy-1, protilátky reagující s CD56, protilátky reagující s CD3, protilátky reagující s CD29, protilátky reagující s TCR, protilátky reagující s VLA-4, protilátky reagující s VCAM-1, protilátky reagující s LECAM-1,

-13 CZ 304451 B6 protilátky reagující s ELAM-1, protilátky reagující s CD44. V určitých provedeních jsou výhodné monoklonální protilátky. V jiných provedeních jsou výhodné fragmenty protilátek. Odborníkovi v oboru je zřejmé, že tato kombinace může zahrnovat rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu a jedno další imunosupresivní činidlo, rozpustné molekuly mutantu CTLA4 se dvěma dalšími imunosupresivními činidly, rozpustné molekuly mutantu CTLA4 se třemi dalšími imunosupresivními činidly, atd. Stanovení optimální kombinace a dávkování může být prováděno a optimalizováno s použitím způsobů dobře známých v oboru.

Mezi příklady specifických kombinací patří: L104EA29YIg a CD80 mAbs; L104EA29YIg aCD86 mAbs; L104EA29YIg a CD80 mAbs CD86 mAbs; L104EA29YIg a gp39 mAbs; L104EA29YIg a CD40 mAbs; L104EA29YIg a CD28 mAbs; L104EA29YIg, CD80 a CD86 mAbs a gp39 mAbs; L104EA29YIg, CD80 a CD86 mAbs a CD40 mAbs; a L104EA29YIg, antiLFA1 mAb, a anti-gp39 mAb. Specifickým příkladem gp39 mAb je MR1. Další kombinace jsou zřejmé a snadno zjistitelné odborníkem v oboru.

Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu, například L104EA29YIg, mohou být podávány jako samostatná aktivní složka nebo společně s dalšími léčivy v imunomodulačních schématech nebo s dalšími protizánětlivými činidly, jako například při léčbě nebo prevenci akutního nebo chronického odmítnutí alo- nebo xenoimplantátů nebo při zánětlivých nebo autoimunitních poruchách, nebo pro vyvolání tolerance. Například mohou být použity v kombinaci s inhibitorem kalcineurinu, jako je například cyklosporin A nebo FK506; imunosupresivním makrolidem, jako je například rapamycin nebo jeho derivát, například 40-O-(2-hydroxy)ethylrapamycin, lymfocytickým činidlem (homing), například FTY720 nebo jeho analogem; kortikoidy; cyklofosfamidem; azathioprenem; methotrexatem; leflunomidem nebo jeho analogem; mizoribinem; kyselinou mykofenolovou; mykofenolátem mofetilu; 15-deoxyspergualinem nebo jeho analogem; imunosupresivními monoklonálními protilátkami, jako jsou například monoklonální protilátky kreceptorům leukocytů, například MHC, CD2, CD3, CD4, CD lla/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150(SLAM), 0X40, 4-1BB nebo jejich ligandy; nebo s jinými imunomodulačními sloučeninami, například CTLA4/CD28-Ig nebo jinými molekulami inhibitorů adheze, například mAbs nebo nízkomolekulámí inhibitory včetně LFA-1 antagonistů, antagonistů Selektinu a antagonistů VLA-4. Tato sloučenina je zejména vhodná v kombinaci se sloučeninou, která interferuje s CD40 a jeho ligandy, například protilátkami CD40 a protilátkami k CD40-L, například při výše popsaných indikacích, jako je například vyvolání tolerance.

V případech, kdy rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu jsou podávány společně s dalšími imunosupresivními, imunomodulačními nebo protizánětlivými sloučeninami, jak je například uvedeno výše, dávkování těchto sloučenin se bude samozřejmě lišit v závislosti na typu současně podávaného léčiva, například zda to je steroid nebo cyklosporin, na specificky použitém léčivu, na léčeném zdravotním stavu atd.

V souladu s výše uvedeným tento vynález dále poskytuje způsoby, jak jsou definovány výše, které zahrnují společné podávání, například současně nebo po sobě, terapeuticky účinného množství rozpustných molekul mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu, L104EA29YIg, ve volné formě nebo ve formě farmaceuticky přijatelné soli, a druhého léčiva, přičemž tímto druhým léčivem je imunosupresivní, imunomodulační nebo protizánětlivé léčivo, například jak je uvedeno výše. Dále jsou poskytnuty terapeutické kombinace, například soupravy, pro použití v jakémkoliv způsobu definovaném výše, zahrnující L104EA29YIg ve volné formě nebo ve formě farmaceuticky přijatelné soli, pro současné nebo následné použití s alespoň jedním farmaceutickou kompozicí obsahující imunosupresivní, imunomodulační nebo protizánětlivé léčivo. Tato souprava může obsahovat instrukce pro použití.

- 14CZ 304451 B6

Způsoby produkce molekul podle vynálezu

Exprese molekul mutantu CTLA4 může být prováděna v prokaryotických buňkách. Prokaryotické buňky jsou nejčastěji reprezentovány různými kmeny bakterií. Bakterie mohou být grampozitivní nebo gramnegativní. Obvykle jsou výhodné gramnegativní bakterie jako je E. coli. Další mikrobiální kmeny však mohou být také použity.

Sekvence kódující molekuly mutantu CTLA4 mohou být vloženy do vektoru určeného pro expresi cizí sekvence v prokaiyotických buňkách, jako je E. coli. Tyto vektory mohou obsahovat běžně používané prokaryotické kontrolní sekvence, které jsou definovány v tomto textu, a obsahují promotory pro iniciaci transkripce, případně s operátorem, společně se sekvencemi ribozomálního vazebného místa, včetně běžně používaných promotorů, jako je beta-laktamasa (penicillinasa), laktózový (lac) promotorový systém (Chang a kol., 1977, Nátuře 198:1056), tryptofanový (trp) promotorový systém (Goeddel a kol., 1980, Nucleic Acids Res. 8: 4057) a lambda derivovaný P_L promotor a ribozomální vazebné místo N-genu (Shimatake, a kol., 1981, Nátuře, 292:128).

Takové expresní vektory budou také obsahovat počátky replikace a volitelné markéry, jako je beta-laktamasa nebo neomycinfosfotransferasový gen zodpovědný za rezistenci k antibiotikům tak, aby se takové vektory mohly replikovat a selektovat v bakteriích nebo buňkách nesoucích tyto plazmidy při růstu v přítomnosti antibiotik, jako je ampicillin nebo kanamycin.

Tento expresní plazmid může být zaváděn do prokaryotických buněk řadou standardních způsobbů, jako je například CaCl₂-šok (Cohen, 1972, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 69: 2110, a Sambrook a kol., (eds.) „Molecular Cloníng: A Laboratory Manual“, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989) a elektroporace.

Při provádění tohoto vynálezu jsou eukaryotické buňky také vhodné hostitelské buňky. Mezi příklady eukaryotických buněk patří jakékoliv zvířecí buňky, ať primární nebo imortalizované, kvasinky (například Saccharomyces cerevisae, Schizosacharomyces pombe a Pichia pastoris) a rostlinné buňky. Myelomové, COS a CHO buňky jsou příklady živočišných buněk, které mohou být použity jako hostitelé. Neomezující příklady vhodných CHO buněk zahrnují DG 44 (Chasin, a kol., 1986, Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555-556; Kolkekar, 1997, Biochemistry 36: 10901— 10909), CHO-K1 (ATCC No. CCL-61), CHO-K1 Tet-On buněčná linie (Clontech), CHO označené jako ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO klon 13 (GEIMG, Genová, IT), CHO klon B (GEIMG, Genová, IT), CHO-K1/SF označené jako ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) a RR-CHOK1 označené jako ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Mezi příklady rostlinných buněk patří buňky tabáku (z celých rostlin, tkáňová kultura, kalus), kukuřice, sójových bobů a rýže. Buňky ze semen kukuřice, sóji a rýže jsou také přijatelné.

Sekvence nukleové kyseliny kódující molekuly mutantu CTLA4 mohou být také vloženy do vektoru určeného pro expresi cizí sekvence v eukaryotickém hostiteli. Regulační prvky tohoto vektoru se mohou lišit v závislosti na konkrétním eukaryotickém hostiteli.

Běžně používané eukaryotické řídicí sekvence používané v expresivních vektorech obsahují promotory a řídicí sekvence kompatibilní se savčími buňkami, jako je například CMV promotor (CDM8 vektor) a ptačí sarkomový virus (ASV) (nLN vektor). Mezi další běžně používané promotory patří časné a pozdní promotory ze Simian viru 40 (SV40) (Fiers, a kol., 1973, Nátuře 273:113), nebo další virové promotory, jako jsou ty odvozené od polyomu, Adenoviru 2, a hovězího papilomového viru. Také může být použit indukovatelný promotor, jako je hMTII (Karin a kol., (1982), Nátuře, 299: 797-802.

- 15CZ 304451 B6

Vektory pro expresi molekul mutantu CTLA4 v eukaryotických buňkách mohou také nést sekvence nazývané zesilovače transkripce. Ty jsou důležité při optimalizaci genové exprese a jsou umístěny v promotorové oblasti buď v protisměru transkripce, nebo ve směru transkripce.

Mezi neomezujícími příklady expresních vektorů pro eukaryotické hostitelské buňky například patří vektory pro savčí hostitelské buňky (například BPV-1, pHYg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech);; pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFVl (Life Technologies); pVPakc vektory, pCMV vektory, pSG5 vektory (Stratagene)), retrovirové vektory (například pFB vektory (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) nebo jejich modifikované formy, adenovirové vektory; vektory příbuzné Adenoviru, baculovirové vektory, kvasinkové vektory (například pESC vektory (Stratagene)).

Sekvence nukleové kyseliny kódující molekuly mutantu CTLA4 se mohou integrovat do genomu hostitelské eukaryotické buňky a replikují se jako hostitelské genomové replikáty. Alternativně vektor nesoucí molekuly mutantu CTLA4 může obsahovat počátky replikace umožňující extrachromozomální replikaci.

Při expresi sekvencí nukleové kyseliny v Saccharomyces cerevisia může být použit počátek replikace z endogenního kvasinkového plazmidu, 2μ kruhu. (Boach, 1983, Meth. Enz., 101:307). Alternativně mohou být použity sekvence z kvasinkového genomu, které jsou schopny podporovat autonomní replikaci (viz například Stinchcomb a kol., 1979, Nátuře, 282:39); Tschemper a kol., 1980, Gene 10: 157; a Clarke a kol., 1983, Meth. Enz., 101: 300).

Transkripční řídicí sekvence kvasinkových vektorů obsahují promotory pro syntézu glykolytických enzymů (Hess a kol., 1968, J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149; Holland a kol., 1978, Biochemistry, 17: 4900). Mezi další promotory známé v oboru patří CMV promotor umístěný ve vektoru CDM8 (Toyama a Okayama, 1990, FEBS, 268: 217 - 221); promotor pro 3-fosfoglyceratkinasu (Hitzeman a kol., 1980, J. Biol. Chem., 255: 2073), a pro další glykolytické enzymy.

Další promotory jsou indukovatelné, neboť mohou být regulovány vnějšími podněty nebo růstovým prostředím buněk. Tyto indukovatelné promotory zahrnují promotory z genů pro proteiny tepelného šoku, alkoholdehydrogenasu 2, isocytochrom C, kyselou fosfatasu, enzymy spojené s katabolismem dusíku a enzymy zodpovědné za využití maltózy a galaktózy.

Regulační sekvence mohou také být umístěny na 3' konci kódující sekvence. Tyto sekvence mohou stabilizovat mediátorovou RNA. Takové terminátory se nachází v nepřeložené 3' oblasti, která je umístěna za kódujícími sekvencemi v několika savčích genech a odvozených genech odvozených od kvasinek.

Mezi neomezující příklady vektorů rostlin a rostlinných buněk patří například Agrobacterium T, plazmidy, květákový mozaikový virus (CaMV) a rajčatový zlatý mozaikový virus (TGMV).

Obecné aspekty transformací hostitelského systému savčích buněk jsou popsány Axelem (v patentovém spise US 4 399 216, vydaném 16. srpna 1983). Savčí buňky mohou být transformovány způsoby, jako je například transfekce za přítomnosti fosforečnanu vápenatého, mikroinjekce, elektroporace nebo transdukce s virovými vektory.

Mezi způsoby zavádění cizích sekvencí DNA do rostlinných a kvasinkových genomů patří: 1) mechanické způsoby, jako je mikroinjekce DNA do jednotlivých buněk nebo protoplastů, míchání buněk se skleněnými kuličkami za přítomnosti DNA nebo nastřelování wolframových nebo zlatých kuliček potažených DNA do buněk nebo protoplastů; 2) zavádění DNA po úpravě membránové permeability buňky vůči makromolekulám prostřednictvím polyethylenglykolu, nebo vystavení buňky vysokonapěťovým elektrickým pulzům (elektroporace); nebo 3) použití liposomů (obsahujících cDNA), které prostupují buněčnými membránami.

- 16CZ 304451 B6

Exprese molekul mutantu CTLA4 může být detekována způsoby známými v oboru. Například molekuly mutantu mohou být detekovány Coomassie barvením SDS-PAGE gelů nebo imunovybarvováním (imunoblotováním) za použití protilátek, které váží CTLA4. Regenerace proteinu může být prováděna za použití standardních prostředků pro přečištění proteinů, jako je například afinitní chromatografie nebo iontoměničová chromatografie, za vzniku v podstatě čistého produktu (R. Scopes: Protein Purification, Principles and Practice“, Third Edition, Springer-Verlag (1994).

Tento vynález dále poskytuje rozpustné molekuly mutantu CTLA4 připravené zde popsaným způsobem.

Mutageneze na kodonu CTLA4Ig

V jednom provedení byla použita bodová mutageneze a nová screeningová procedura pro zjištění několika mutací v extracelulámí doméně CTLA4, které zlepšují vazebnou aviditu CD86. V tomto provedení byly prováděny mutace na zbytcích v oblastech extracelulámí domény CTLA4 začínající serinem v poloze 25 a končící argininem v poloze 33, na C' řetězci (alanin 49 a threonin 51), na F řetězci (lysin 93, kyselina glutamová 95, leucin 96), a v oblasti od methioninu 97 přes tyrosin 102, tyrosin 103 přes glycin 107, a vG řetězci v polohách glutamin 111, tyrosin 113 a isoleucin 115. Tyto místa byla vybrána na základě studií chimemích CD28/CTLA4 fuzních proteinů (Peach a kol., J. Exp. Med., 1994, 180: 2049-2058) a na modelu předpovídajícím, které boční řetězce aminokyselinového zbytku by byly vystaveny rozpouštědlu a na nedostatku identity nebo homologie aminokyselinových zbytků v určitých polohách mezi CD28 a CTLA4. Také jakýkoliv zbytek, který je prostorově v blízkém sousedství (5 až 20 Angstromových jednotek) k identifikovaným zbytkům je považován za součást tohoto vynálezu.

Pro syntézu a screening rozpustných molekul mutantu CTLA4 se změněnými afinitami pro CD80 a/nebo CD86 byla použita dvoustupňová strategie. První experimenty byly vedeny k vytvoření knihovny mutací na specifickém kodonu extracelulámí části CTLA4, potom byl prováděn screening prostřednictvím Biacore testovacího systému z důvodu určení mutantů se změněnou reaktivitou k CD80 nebo CD86. Biacore testovací systém (Pharmacia, Piscataway, NJ) používá povrchový plazmonový rezonanční detekční systém, který zahrnuje zejména kovalentní vazbu buď CD80Ig, nebo CD86Ig na senzorový čip potažený dextranem, který je umístěn v detektoru. Testovaná molekula může potom být injektována do komůrky obsahující senzorový čip a množství navázaného komplementárního proteinu může být stanoveno na základě změny molekulové hmotnosti, která je fyzikálně spojena s dextranem potaženou stranou senzorového čipu; změna molekulové hmotnosti může být měřena detekčním systémem.

Výhody vynálezu

Protože vazba CTLA4 na CD80 a CD86 se vyznačuje velkými rychlostmi směrem ke vzniku (rychlost „on“) a velkými disociačními rychlostmi (rychlost „off“) a protože komplexy CTLA4Ig-CD86 disociují přibližně 5 až 8 krát rychleji než komplexy CTLA4Ig-CD80, bylo usouzeno, že zpomalení rychlosti disociace CTLA4Ig od CD80 a/nebo CD86 by mohlo mít za následek molekuly se silnějšími imunosupresivními vlastnostmi. Proto je očekáváno, že rozpustné molekuly mutantu CTLA4 mající vyšší aviditu k CD80- nebo CD86-pozitivním buňkám ve srovnání se standardním typem CTLA4 nebo nemutovanými formami CTLA4Ig budou blokovat iniciaci antigen specifických aktivovaných buněk s vyšší účinností než standardní typ CTLA4 nebo nemutované formy CTLA4Ig.

Produkční náklady na CTLA4Ig jsou velmi vysoké. Molekuly mutantu CTLA4Ig s vysokou aviditou mající potenciálně vyšší imunosupresivní vlastnosti mohou být použity v klinické praxi ve značně nižších dávkách než nemutovaný CTLA4Ig k dosažení podobných hladin imunosuprese. Proto rozpustné molekuly mutanty CTLA4, například L104EA29YIg, mohou být nákladově velmi příznivé.

- 17CZ 304451 B6

Následující příklady jsou uvedeny k objasnění tohoto vynálezu a napomáhají odborníkům v jeho aplikaci. Příklady nejsou zamýšleny, aby jakýmkoliv způsobem omezovaly rozsah tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Tento příklad poskytuje popis použitých způsobů k vytvoření nukleotidových sekvencí kódujících rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu. Byl vytvořen jednomístný mutant L104EIg, u kterého byla testována vazebná kinetika vůči CD80 a/nebo CD86. Nukleotidová sekvence L104EIg byla použita jako matrice pro vytvoření byla rovněž testována vazebná kinetika vůči CD80 a/nebo CD86.

Mutageneze na kodonu CTLA4

Byla vyvinuta mutageneze a screeningová strategie k identifikování molekul mutantu CTLA4Ig, které měly nižší rychlosti disociace („off ‘ rychlosti) z molekul CD80 a/nebo CD86. Jednomístné mutantní nukleotidové sekvence byly vytvořeny za použití CTLA4Ig jako matrice (patentové spisy US 5 844 095; US 5 851 795; a US 5885 796; ATCC číslo 68629). Mutagenní oligonukleotidové PCR primery byly určeny pro náhodnou mutagenezi specifického cDNA kodonu umožněním umístění jakékoliv báze v polohách 1 a 2 na kodonu, v poloze 3 mohl být umístěn pouze guanin nebo thymin (XXG/T; také označováno jako NNG/T). Tímto způsobem specifický kodon kódující aminokyselinu mohl být náhodně mutován, aby kódoval každou z 20 aminokyselin. Z tohoto pohledu XXG/T mutageneze poskytuje 32 potenciálních kodonů kódujících každou z 20 aminokyselin. PCR produkty kódující mutace v blízkém sousedství oblasti -M97-G107 na CTLA4Ig (viz obrázek 7; SEQ ID NO: 3 a 4 nebo obrázek 8; SEQ ID NO: 5 a 6) byly štěpeny pomocí Sacl/Xbal a subklonovány do podobně upraveného expresního vektoru CTLA4IgnLN (také označovaného jako piLN). Tento způsob byl použit k vytvoření molekuly L104EIg, jednomístné molekuly mutantu CTLA4 (obr. 8 (SEQ ID NO: 5 a 6).

Při mutagenezi v blízkosti S25-R33 na CTLA4Ig bylo tiché Nhel restrikční místo nejdříve zavedeno 5' do smyčky prostřednictvím PCR primerem vedené mutageneze. PCR produkty byly štěpeny Nhel/Xbal a subklonovány do podobně upravených CTLA4Ig nebo L104EIg expresních vektorů. Tento způsob byl použit k vytvoření dvoumístné CTLA4 mutantní molekuly L104EA29Ig (obrázek 7; SEQ ID NO: 3 a 4). Zejména molekula nukleové kyseliny kódující jednomístnou CTLA4 mutantní molekulu, L104EIg, byla použita jako matrice k vytvoření dvoumístné CTLA4 mutantní molekuly, L104EA29YIg. Vektor piLN mající L104EA29YIg je znázorněn na obrázku 12.

Příklad 2

Tento příklad poskytuje popis použitých screeningových metod k identifikaci jedno- a dvoumístných mutantních CTLA4 polypeptidů, exprimovaných z konstruktů popsaných v příkladu 1, které vykazovaly vyšší vazebnou aviditu k CD80 a CD86 antigenům ve srovnání s nemutovanými molekulami CTLA4Ig.

Současné in vitro a in vivo studie ukazují, že samotný CTLA4Ig není schopen úplně blokovat iniciaci antigen specifických aktivovaných T buněk. In vitro studie s CTLA4Ig a monoklonální protilátkou specifickou buď pro CD80, nebo pro CD86 měřící inhibici proliferaci T buněk ukazují, že monoklonální protilátka vůči CD80 nezvyšovala inhibici CTLA4Ig. Avšak monoklonální

-18CZ 304451 B6 protilátka vůči CD86 přesto zvyšovala inhibici, což ukazuje, že CTLA4Ig nebyl tak účinný při blokování CD86 interakcí. Tyto údaje podporují dřívější zjištění (Linsley a kol., Immunity, 1994, 1: 793-801), že inhibice buněčných odezev zprostředkovaných CD80 vyžadují přibližně lOOkrát nižší koncentrace CTLA4Ig oproti odezvám zprostředkovaných CD-86. Na základě těchto zjištění bylo předpokládáno, že rozpustné molekuly mutantu CTLA4 mající vyšší aviditu k CD86 než standardní CTLA4 by měly být schopny lépe blokovat iniciaci antigen specifických aktivovaných buněk než CTLA4Ig.

Z tohoto úhlu pohledu byly rozpustné molekuly mutantu CTLA4 popsané v příkladu 1 kontrolovány za použití nového screeningového postupu k identifikaci několika mutací v extracelulámí doméně CTLA4, která zlepšuje vazebnou aviditu k CD80 a CD86. Tato screeningová strategie poskytla účinný způsob pro přímou identifikaci mutantů se zřejmě nižšími „off“ rychlostmi bez potřeby přečištění a kvantifikace proteinu, neboť „off“ rychlostní stanovení není závislé na koncentraci (O'Shannessy a kol., 1993, Anal. Biochem., 212: 457-468).

COS buňky byly transfekovány jednotlivými minipreparativně přečištěnými plazmidy DNA a množeny po dobu několika dní. Tři dni kondicionované kultivační médium bylo aplikováno do přístroje BIAcore biosenzor chips (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) na biosenzorové čipy potažené CD80Ig nebo CD86Ig. Specifická vazba a disociace mutantů proteinů byla měřena povrchovou plazmonovou rezonancí (O'Shannessy a kol., 1993, Anal. Biochem., 212:457-468). Všechny experimenty byly měřeny na přístrojích BIAcore a BIAcore 2000 za použití biosenzorů při teplotě 25 °C. Ligandy byly imobilizovány na senzorových čipech NCM5 pro vědecké účely (Pharmacia) za použití standardní kondenzace s N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)karbodiimid-N-hydroxysukcinimidu (Johnsson, B. a kol., 1991, Anal. Biochem., 198:268-277; Khilko, S. N., a kol., 1993, J. Biol. Chem. 268: 5425-15434).

Screeningová metoda

COS buňky kultivované na 24-jamkové destičce pro tkáňové kultury byly dočasně transfekovány s DNA kódující mutantní CTLA4Ig. Kultivační médium obsahující vyloučený rozpustný mutant CTLA4Ig bylo odebíráno po 3 dnech.

Kondicionované kultivační médium s COS buňkami bylo ponecháno protékat přes BIAcore biosenzorové čipy derivatizované CD86Ig nebo CD80Ig (jak je popsáno v Greene a kol., 1996, J. Biol. Chem., 271: 26762-26771, a molekuly mutantu byly identifikovány siychlostmi „off“ nižšími než které byly pozorovány u standardního CTLA4Ig. Nukleové kyseliny cDNA odpovídající vybraným vzorkům média byly sekvencovány a DNA byla připravena k provádění hromadné transfekce COS buněk, ze které byl připraven mutantní protein CTLA4Ig po přečištění proteinu A z kultivačního média.

Podmínky analýzy na přístroji BOAcore a analýza dat rovnovážné vazby byla prováděna způsobbem popsaným v J. Greene a kol., 1996, J. Biol. Chem., 271: 26762-26771 a jak je uvedeno v tomto textu.

Analýza údajů z přístroje BIAcore

Senosorgramové základní linie byly normalizovány na nulovou odezvu (response unit - RU) před analýzou. Vzorky byly vedeny přes srovnávací průtokové komůrky k stanovení odezvy pozadí z důvodu rozdílu indexu lomu v objemu mezi vzorky. Rovnovážné disociační konstanty byly vypočteny ze znázorněné grafické závislosti R_eq na C, kde Re_q je odezva v ustáleném stavu mínus odezva na srovnávacím čipu, a C je molámí koncentrace analytu. Vazebné křivky byly analyzovány za použití komerčního software pro nelineární prokládání bodů regresní křivkou (Prism, GraphPAD Software).

-19CZ 304451 B6

Experimentální údaje byly nejdříve vloženy do modelu jednoduché vazby ligandu na jednotlivý receptor (1-místný model, tj. jednoduchý Langmuirův systém, Α+ΒθΑΒ), a rovnovážné asociační konstanty (Kd=[A]*[B]\[AB] byly vypočteny z rovnice R=R_max*C/(K_d+C). Následně byly údaje vloženy do nejjednoduššího dvoumístného modelu vazby ligandu (tj. na receptor mající 2 nezávislá vazebná místa bez interakcí, jak je popsáno rovnicí R=R_maxi»C/(K_di+C) + Rmax2 •C/(Kd2+C)).

Dobrá shoda těchto dvou modelů byla analyzována vizuelně srovnáním experimentálních údajů a statisticky F testem pomocí součtu čtverců. Jednodušší jednomístný model byl vybrán jako lepší, pokud dvoumístné proložení modelu nebylo významně lepší (p<0,1).

Asociační a disociační analýzy byly prováděny za použití softwaru BIA evaluation 2.1 Software (Pharmacia). Asociační rychlostní konstanty k<,_n byly vypočteny dvěma způsoby, zahrnutím jak homogenních jednomístných interakcí, tak i paralelních dvoumístných interakcí. Pro jednomístné interakce byly hodnoty ko_n vypočteny podle rovnice R_t=Req(l-exp“^{ks(t t}o), kde Rt je odezva v daném čase t; Req je odezva v ustáleném stavu; to je čas na počátku nástřiku; a ks=dR/dt=kon*Ckoff, kde C je koncentrace analytu vypočtená za předpokladu monomemích vazebných míst. Dvoumístné interakční hodnoty kon byly vypočteny podle rovnice Rt=Reqi(l-exp“^ksl(t“^to)+R£q2(lexp^ks2(t %)· Pro každý model byly hodnoty k_on stanoveny z vypočtené směrnice (k asi 70% maximální asociaci) grafického znázornění k_s vůči C.

Disociační data byla analyzována podle jednomístného (AB=A+B) nebo dvoumístného (AiBj=Ai+Bj) modelu a rychlostní konstanty (ko_ff) byly vypočteny z nejlépe proložených křivek. Tento model vazebného místa byl použit s výjimkou případů, kdy odezva zbytků byla větší než pozadí přístroje (2-10Ru, podle přístroje, v těchto případech byl použit dvoumístný model. Poločasy obsazení receptoru byly vypočteny za použití vztahu ti/2=0,693/koff.

Průtoková cytometrie

Myší mAb L307.4 (anti-CD80) byl zakoupen od firmy Becton Dickinson (San Jose, Califomia) a IT2.2 (anti-B7-0[také známý jako CD86] byl zakoupen od firmy Pharmingen (San Diego, Califomia). Pro imunobarvení byly CD80-pozitivní a/nebo CD86-pozitivní CHO buňky byl odebrány z jejich kultivačních nádob a byly inkubovány ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS) obsahujícím 10 mM EDTA. CHO buňky (1-10 x 10⁵) byly nejdříve inkubovány smABs nebo s imunoglobulinovými fúzními proteiny v DMEM obsahujícím 10 % fetálního hovězího séra (FBS), potom byly promyty a inkubovány s fluoresceinisothiokyanatanem konjugovaným s kozím anti-myším nebo anti-lidským imunoglobulinem (činidly 2. fáze) (Tágo, Burlingame, Kalifornie). Buňky byly naposledy promyty a byly analyzovány na přístroji FACScan (Becton Dickinson).

SDS-PAGE a vylučovací chromatografie

SDS-PAGE byla prováděna na Tris/glycin 4 až 20% akrylamidových gelech (Novex, San Diego, Kalifornie). Analytické gely byly barveny barvivém Coomassie Blue a zobrazení vlhkých gelů bylo získáno digitálním skenováním. CTLA4Ig (25 pg) a L104EA29YIg (25 pg) byly analyzovány vylučovací chromatografií za použití TSK-GEL G300 SWxl kolony (7,8 x 300 mm), Tosohaas, Montgomeryville, PA) vyvážené fyziologickým roztokem tlumeným fosfátem obsahujícím 0,02 % NaN₃ při průtoku 1,0 ml/min.

CTLA4Xci2os a LlO4EA29YXci2os

Jednořetězcová CTLA4_Ci2os byla připravena dříve popsaným způsobem (Linsley a kol., 1995, Biol. Chem., 270: 15417-15424). Stručně uvedeno, onkostatin M CTLA4 (OMCTLA4) expresivní vektor byl použit jako matrice, původní primer,

-20CZ 304451 B6

GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG (SEQ ID NO: 1) byl vybrán pro spojení sekvencí ve vektoru; a reverzní primer,

GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC (SEQ ID NO: 2), odpovídal posledním sedmi aminokyselinám (tj. aminokyselinám 118 až 124) v extracelulámí doméně CTLA4 a obsahoval restrikční enzymové místo a terminační kodon (TGA) (stop kodon). Reverzní primer specifikoval C120S mutaci (cystein - serin v poloze 120). Zejména nukleotidová sekvence GCA (nukleotidy 34 až 36) reverzního primerů uvedená výše je nahrazena jednou z následujících nukleotidových sekvencí: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT nebo GCT. Odborníkovi v oboru je zřejmé, že nukleotidová sekvence GCA je zpětná komplementární sekvence kodonu TCG pro cystein. Podobně nukleoidové sekvence AGA, GGA, TGA, CGA, ACT nebo GCT jsou zpětné komplementární sekvence kodonů pro serin. Polymerasové řetězové reakční produkty byly štěpeny HindlII/Xbal a přímo subklonovány do expresivního vektoru kLN (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ). LlO4EA29YX_Ci2os byl připraven stejným způsobem. Každý konstrukt byl ověřován sekvencováním DNA.

Identifikace a biochemická charakterizace mutantů s vysokou aviditou

Dvacet čtyři aminokyselin bylo vybráno pro mutagenezi a asi 2300 získaných mutantních proteinů bylo zkoušeno na vazbu s CD86Ig pomocí povrchové plazmonové rezonance (SPR; jak je popsáno výše). Převládající účinky mutageneze na každém místě jsou shrnuty v tabulce II. Náhodná mutageneze některých aminokyselin v oblasti S25-R33 zřejmě neměnila vazbu ligandů. Mutageneze E31 a R33 a zbytků M97-Y102 zřejmě způsobily snížení vazby ligandů. Mutagenezí zbytků, S25, A29 a T30, K93, L96, Y103, L104 a G105 vznikly proteiny s malými „on“ a/nebo malými „off“ rychlostmi. Tyto výsledky potvrdily dřívější zjištění, že zbytky v oblasti S25-R33 a zbytky v nebo blízko M97-Y102 ovlivňuji vazbu ligandů (Peach a kol., 1994, J. Exp. Med., 180: 2049-2058).

Mutageneze v místech S25, T30, K93, L96, Y103 a G105 pomohla identifikovat některé mutantní proteiny, které měly menší „off“ rychlosti od CD86Ig. Avšak v těchto případech malá rychlost „off ‘ byla kompenzována malou rychlostí „on“, čímž vznikly mutantní proteiny s výslednou aviditou pro CD86Ig, která byla zřejmě podobná aviditě pozorované u standardního typu CTLA4Ig. Dále mutageneze K9 měla za následek významnou agregaci, která byla možná odpovědná za pozorované kinetické změny.

Náhodnou mutagenezí LI04 po transfekci COS buněk a screeningem SPR vzorků kultivačního média přes imobilizovaný CD86Ig bylo získáno 6 vzorků média obsahujících mutantní proteiny s přibližně 2 krát menšími rychlostmi „off ‘ než u standardního CTLA4Ig. Když byly sekvencovány odpovídající cDNA těchto mutantů, bylo zjištěno, že každá kóduje mutaci leucinu na kyselinu glutamovou (L104E). Zřejmě substituce (náhrada) leucinu 104 za kyselinu asparagovou (L104D) neovlivnila vazbu CD86Ig.

Mutageneze byla potom opakována na každém místě uvedeném v tabulce II, tentokrát s použitím L104 jako matrice PCR místo standardního CTLA4Ig, jak je popsáno výše. SPR analýza, opět požívající imobilizovaný CD86Ig, identifikovala 6 vzorků kultivačního média z mutageneze alaninu 29 s proteiny majícími přibližně 4 krát menší „off‘ rychlosti než standardní CTLA4Ig. Dvě nejpomalejší představovaly substituce tyrosinu (L104EA29Y), 2 byly leucin (L104EA29L), jedna byla tryptofan (L104EA29W) a jedna byla threonin (L104EA29T). Zřejmě nebyly identifikovány žádné mutanty s malou rychlostí „off‘, kdy byl náhodně mutován v standardním CTLA4Ig samotný alanin.

-21 CZ 304451 B6

Relativní molekulová hmotnost a agregátní stav přečištěného L104E a L104EA29YIg byly testovány pomocí SDS-PAGE a vylučovací chromatografií. L104EA29YIg (asi 1 pg, pruh 3) aL104EIg (asi 1 pg, pruh 2) zřejmě měly stejnou elektroforetickou pohyblivost jako CTLAIg (asi 1 pg, pruh 1) za redukčních podmínek (asi 50 kDa; +βΜΕ; plus 2-merkaptoethanol) a neredukěních podmínek (asi 100 kDa; -βΜΕ) (obr. 10A). Vylučovací chromatografie ukázala, že L104EA29YIg (obr. 10C) zřejmě měl stejnou mobilitu jako dimemí CTLAIg (obr. 10B). Hlavní píky představují proteinový dimer, zatímco nejiychleji vyplavovaný menší pík na obrázku 10B představuje agregáty s vyšší molekulovou hmotností. Asi 5,0 % CTLA4Ig bylo přítomno jako agregáty s vyšší molekulovou hmotností, ale nebyla pozorována žádná agregace L104EA29YIg nebo L104EIg. Proto silnější vazba na CD86Ig pozorovaná u L104EIg a L104EA29YIg nemohla přispívat k agregaci vyvolané mutagenezí.

Rovnovážná a kinetická vazebná analýza

Rovnovážná a kinetická vazebná analýza byla prováděna na proteinu A purifikovaném CTLA4Ig, L104EIg a L104EA29YIg za použití povrchové plazmonové rezonance (SPR). Výsledky jsou shrnuty v tabulce I. Pozorované rovnovážné disociační konstanty (K_d;tabulka I) byly vypočteny z vazebných křivek vytvořených v rozsahu koncentrací (5,0 až 200 nM). L104EA29YIg se váže silněji na CD86Ig než L104EIg nebo CTLA4Ig. Nižší hodnota K_d pro L104EA29YIg (3,21 nM) než pro L104EIg (6,06 nM) nebo pro CTLA4Ig (13,9 nM) ukazuje vyšší vazebnou aviditu L104EA29YIg kCD86Ig. Nižší hodnota K_d pro L104EA29YIg (3,66 nM) než pro L104EIg (4,47 nM) nebo pro CTLA4Ig (6,51 nM) ukazuje vyšší vazebnou aviditu L104EA29YIg k CD80Ig.

Kinetická vazebná analýza zjistila, že srovnatelné „on“ rychlosti pro CTLA4Ig, L104EIg aL104EA29YIg vazby kCD80 byly podobné, stejně takové byly rychlosti „on“ pro CD86Ig (tabulka I). Avšak rychlosti „off¹ pro tyto molekuly nebyly stejné (tabulka I). Ve srovnání s CTLA4Ig měl L104EA29YIg přibližně 2 krát menší „off“ rychlost od CD80Ig a přibližně 4 krát menší „off¹ rychlost od CD86Ig. L104E měl „off“ rychlosti uprostřed mezi L104EA29YIg aCTLA4Ig. Protože zavedení těchto mutací významně neovlivnilo rychlosti „on“, zvyšování avidity pro CD80Ig a CD86Ig pozorované s L104EA29YIg bylo pravděpodobně primárně způsobeno poklesem rychlosti „off“.

K určení, zda zvýšení avidity L104EA29YIg pro CD86Ig a CD80Ig bylo způsobeno mutacemi ovlivňující způsob každého monomeru asociovat se jako dimer nebo zda byly zavedeny do každého monomeru strukturální změny zvyšující aviditu byly připraveny jednořetězcové konstrukty extracelulámích domén CTLA4 a L104EA29Y a poté byla provedena mutageneze cysteinu 120 na serin, jakje popsáno výše a v Linsley a kol., 1995. J. Biol. Chem., 270: 15417-15424. Gelová permeační chromatografie prokázala, že přečištěné proteiny CTLA4_cl20s a L1O4EA29YX_Ci₂os byly monomemí (Linsley a kol., 1995, viz výše), před tím než byly analyzovány SPR na jejich vazebné vlastnosti k ligandům. Výsledky ukázaly, že vazebná afinita obou monomemích proteinů pro CD86Ig byla přibližně 35 až 80 krát menší než avidita pozorovaná u jejich dimerů (tabulka I). Toto podporuje dříve publikované údaje konstatující, že dimerizace CTLA4 byla potřebná pro vysokou vazebnou aviditu k ligandům (Greene a kol., 1996, J. Biol. Chem. 271:26762-26771).

L1O4EA29YXci₂os se vázal s afinitou přibližně 2 krát vyšší než CTLA4_Ci₂os jak na CD80Ig, tak i na CD86Ig. Zvýšená afinita byla způsobena přibližně 3krát menší rychlostí disociace z obou ligandů. Proto silnější vazba ligandů u L104EA29Y byla nej pravděpodobněji způsobena strukturálními změnami zvyšujícími aviditu, které byly zavedeny do každého monomemího řetězce, spíše než změnami, při kterých molekula dimerizovala.

-22CZ 304451 B6

Polohová a strukturální analýza mutací zvyšujících aviditu

Struktura roztoku extracelulámí Ig V-podobné doméně CTLA4 byla nedávno stanovena NMR spektroskopií (Metzler a kol., 1997, Nátuře Struct. Biol., 4: 527-531). To umožnila přesná poloha leucinu 104 a alaninu 29 v 3-rozměmé struktuře (obr. 11). Leucin je umístěn blízko vysoce zachované aminokyselinové sekvence MYPPPY (SEQ ID NO: 9). Alanin 29 je umístěn blízko Ckonce oblasti S25-R33, která prostorově přiléhá k oblasti MYPPPY (SEQ ID NO: 9). Zatímco je významná interakce mezi zbytky na začátku těchto dvou oblastí, neexistuje zřejmě žádná přímá interakce mezi LI04 a A29, ačkoliv oba zahrnují část přiléhajícího hydrofóbního jádra v proteinu. Strukturální důsledky těchto dvou mutantů zvyšujících aviditu byly stanoveny modelováním. Mutace A29Y může být snadno umístěna ve štěrbině mezi oblastí S25-R33 a oblastí MYPPPY (SEQ ID NO: 9) a může sloužit ke stabilizaci konformace oblasti MPPPY (SEQ ID NO: 9). U standardní CTLA4 LI 04 vytváří extenzivní hydrofóbní interakce sL96 a V94 v blízkosti oblasti MYPPPY (SEQ ID NO: 9). Je vysoce nepravděpodobné, že mutace kyseliny glutamové zaujme konformaci podobající se LI04 ze dvou důvodů. Za prvé, není dostatek prostoru pro umístění dalšího postranního řetězce kyseliny glutamové ve struktuře bez významného narušení oblasti S25-R33. Za druhé, energetické nároky na pokrytí negativního náboje na postranním řetězci kyseliny glutamové v této hydrofóbní oblasti by byly značné. Místo toho modelové studie předpovídají, že postranní řetězec kyseliny glutamové se posune k povrchu, kde jeho náboj může být stabilizován solvatací. Taková konformační změna může být snadno provedena prostřednictvím G105 s minimální deformací dalších zbytků v těchto oblastech.

Vazba mutantů s vysokou aviditou na CHO buňky exprimující CD80 nebo CD86

FACS analýza CTLA4Ig (obrázek 2) a molekuly mutantu vázající se na trvale transfekované CD80+ a CD86+ CHO buňky byla prováděna způsobem popsaným v tomto popisu. CD80-pozitivní a CD86-pozitivní CHO buňky byly inkubovány se vzrůstající koncentrací CTLA4Ig, L104EA29YIg nebo L104EIg a potom byly promyty. Navázaná imunoglobulinový tužní protein byl detekován za použití fluoresceinisothiokyanatanu konjugováného s kozím anti-lidským (goat anti-human) imunoglobulinem.

Jak je znázorněno na obrázku 2, CD80-pozitivní nebo CD86-pozitivní CHO buňky (1,5 x 10⁵) byly inkubovány se známými koncentracemi CTLA4Ig (čtverec), L104EA29YIg (kruh) nebo L104EIg (trojúhelník) po dobu 2 hodin při teplotě 23 °C, potom byly promyty a inkubovány s fluoresceinisothiokyanatanem konjugovaným s kozí anti-lidskou imunoglobulinovou protilátkou. Vazba na celkově 5000 živých buněk byla analyzována (jedním stanovením) na přístroji FACScan a střední fluorescenční intenzita (MFI) byla stanovena z histogramu dat za použití PCLYSYS. Data byla korigována na pozadí fluorescence naměřené na buňkách inkubovaných pouze s činidlem druhého kroku (MFI=7). Kontrola L6 mAb (80 pg/ml) vykazovala MFI<30. Tyto výsledky reprezentují 4 nezávislá měření.

Vazba L104EA29YIg, L104EIg a CTLA4Ig na lidské CD80-transfekované CHO buňky je přibližně ekvivalentní (obr. 2A). L104EA29YIg a L104EIg se váží silněji na CHO buňky trvale transfekované lidským CD86 než CTLA4Ig (obr. 2B).

Funkční zkoušky

Lidské CD4-pozitivní T buňky byly izolovány imunomagnetickou negativní selekcí (Linsley a kol., 1992, J. Exp. Med., 176: 1595-1604). Izolované CD4-pozitivní T buňky byly stimulovány phorbalmyristatacetatem (PMA) a dále CD80-pozitivními nebo CD86-pozitivními CHO buňkami za přítomnosti titračních koncentrací inhibitoru. CD4-pozitivní T buňky (8-10 x 10⁴/jamku) byly kultivovány v přítomnosti 1 nM PMA s nebo bez ozářených stimulátorů CHO buněk. Proliferační odezvy byly měřeny po přidání 1 pCi/jamku [3H]thymidinu během posledních 7 hodin 72 hodinové kultivace. Inhibice PMA plus CD80-pozitivních CHO nebo CD86-pozitivních

-23CZ 304451 B6

CHO stimulovaných T buněk byla prováděna prostřednictvím L104EA29YIg a CTLA4Ig. Výsledky jsou shrnuty v obr. 3. L104EA29YIg inhibuje více proliferaci CD80-pozitivních PMA stimulovaných CHO buněk než CTLA4Ig (obr. 3A). L10EA29YIg je také účinnější, než CTLA4Ig při inhibování proliferaci CD86-pozitivních PMA stimulovaných CHO buněk (obr. 3B). Proto L104EA29YIg je silnější inhibitor než CD80-, tak i CD86-zprostředkovaných kostimulací T buněk.

Obrázek 4 ukazuje inhibici prostřednictvím L104EA29YIg a CTLA4Ig alostimulovaných lidských T buněk připravených výše a dále stimulovaných lidskou B lymfoblastoidní buněčnou linií (LCL nazývanou PM, která exprimuje CD80 a CD86 (T buňky při koncentraci 3,0 x 10⁴/jamka aPM při koncentraci 8,0 x 10³/jamku). Primární alostimulace trvala 6 dní, potom byly buňky pulzovány s ³H-thymidinem po dobu 7 hodin a následně byla stanovena inkorporace radioaktivního izotopu.

Druhá alostimulace byla prováděna následovně. Sedm dní primárně alostimulované T buňky byly sklizeny pomocí lymfocytického separačního média (LSM) (ICN, Aurora, OH), kde byly ponechány 24 hodin. Potom byly T buňky restimulovány (sekundárně) za přítomnosti titraěního množství CTLA4Ig nebo L104EA29YIg přídavkem PM(A) ve stejném poměru jako výše. Stimulace probíhala 3 dny, potom byly buňky pulzně označeny radioaktivním izotopem a sklizeny, jak je uvedeno výše. Účinek L104EA29YIg na primárně alostimulované T buňky je zobrazen na obr. 4A. Účinek L104EA29YIg na sekundárně alostimulované T buňky je zobrazen na obr. 4B. L104EA29YIg inhibuje proliferační odezvy jak primárně, tak i sekundárně stimulovaných T buněk lépe než CTLA4Ig.

Pro měření produkce cytokinů (obr. 5) byl připraven duplikát sekundárně alostimulovaných desek. Po 3 dnech bylo kultivační médium testováno pomocí ELISA souprav (Biosource, Camarilo, CA) za podmínek doporučených výrobcem. Bylo zjištěno, že L104EA29YIg je silnější než CTLA4Ig při blokování produkce T buněčného IL-2, IL-4 a γ-IFN cytokinů po sekundárním alostimulu. (obr. 5A-C)

Účinky L104EA29YIg a CTLA4Ig na smíšenou lymfocytickou odezvu u opic (MLR) jsou zobrazeny na obr. 6. Periferní krevní mononukleámí buňky (PBMC; 3,5 x 10⁴ buněk/jamku od každé opice) od 2 opic byly přečištěny prostřednictvím lymfocytického separačního média (LSM) a smíchány s 2 pg/ml fytohemaglutininu (PHA). Buňky byly stimulovány 3 dny, potom byly pulzně označeny radioaktivním izotopem po dobu 16 hodin. Po této době byly buňky sklizeny. L104EA29YIg inhiboval proliferaci T buněk u opic lépe než CTLA4Ig.

-24CZ 304451 B6

Tabulka I

Rovnovážné a zdánlivé kinetické konstanty jsou uvedeny v následující tabulce (hodnoty jsou ve 5 tvaru: průměr ± směrodatná odchylka ze 3 rozdílných experimentů

Zmobilizovaný protein	Analyt	kon (X ΙΟΊ M”1 S1	koff (x í<?) m-1 s1	Ka nM
CD80Ig	CTLA4Ig	3,44+0,29	2,21+0,18	6,51+1,08
CD80Ig	L104EIg	3,02+0,05	1,35+0,08	4,47+0,36
CD80lg	L104EA29YIg	2,96+0,20	1,08+0,05	3,66+0,41
CD80Ig	CTLA4Xci2os	12,0+1,0	230+10	195+25
CD80lg	L1O4EA29YXCi2os	8,3+0,26	71+5	85,0+2,5
CD86Ig	CTLA4Ig	5,95+0,57	8,16+0,52	13,9+2,27
CD86Ig	I104EIg	7,03+0,22	4,26+0,11	6,06+0,05
CD86Ig	L104EA29YIg	6, 42+0,40	2,06+0,03	3,21+0,23
CD86Ig	CTLA4Xci2os	16,5+0,5	840+55	511+17
CD86Ig	LlO4EA29YXci2os	11,4+1,6	300+10	267+29

-25CZ 304451 B6

Tabulka II

Účinek na vazbu CD861g prostřednictvím mutageneze CTLA41g v uvedených místech - stanove5 ní SPR, jak bylo popsáno výše. Převládající účinek je označen značkou „+“

Místo mutageneze

Účinky mutageneze

Malá rychlost zjevný „on/malá

S25

P26

G27

K28

A29

T30

E31

R33

K93

L96

M97

Y98

P99

P100

P101

Y102

Y103

Y104

G105

1106

Žádný, účinek rychlost „off +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+

Menší vazba ligandů +

+ +

+ +

+

G107 +

Qlll +

Y113 +

1115 +

Jak bude zřejmé odborníkovi v oboru, tento vynález může být prováděn i v jiných formách než ío které jsou výslovně popsány výše. Popsaná provedení vynálezu pouze vysvětlují, ale neomezují.

Rozsah tohoto vynálezu je uveden v připojených patentových nárocích a není omezen na příklady v předcházejícím popisu.

Claims (42)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Molekula mutantu CTLA4 obsahující aminokyselinovou sekvenci, která začíná methioninem v poloze +1 a končí kyselinou asparagovou v poloze +124, jak je zobrazeno na obrázku 7, nebo začíná alaninem v poloze -1 a končí kyselinou asparagovou v poloze +124, jak je zobrazeno na obrázku 7.
2. 2. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 1 dále obsahující aminokyselinovou sekvenci, která mění rozpustnost, afinitu nebo mocenství rozpustné molekuly mutantu CTLA4.
3. 3. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 2, která dále obsahuje imunoglobulinovou část.
4. 4. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 3, ve které imunoglobulinová část je konstantní oblastí imunoglobulinu nebo její částí.
5. 5. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 4, kde konstantní oblast imunoglobulinu zahrnuje pantovou, CH2 a CH3 oblast molekuly imunoglobulinu.
6. 6. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 4 nebo 5, kde konstantní oblastí imunoglobulinu nebo její částí je lidská nebo opičí konstantní oblast imunoglobulinu nebo její část.
7. 7. Molekula mutantu CTLA4 podle kteréhokoli z nároků 3 až 6, kde imunoglobulinová část obsahuje jednu nebo více mutací pro snížení efektorové funkce.
8. 8. Molekula mutantu CTLA4 podle kteréhokoli z nároků 3 až 7, kde imunoglobulinová část obsahuje pant a jakýkoli nebo všechny cysteinové zbytky v pantové části jsou substituovány serinem.
9. 9. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 8, kde cystein v poloze +130 je substituován serinem, cystein v poloze +136 je substituován serinem a cystein v poloze +139 je substituován serinem, jak je zobrazeno na obrázku 7.
10. 10. Molekula mutantu CTLA4 podle kteréhokoli z nároků 4 až 9, kde konstantní oblast lidského imunoglobulinu je mutována tak, že zahrnuje cystein v poloze +130 substituovaný serinem, cystein v poloze +136 substituovaný serinem, cystein v poloze +139 substituovaný serinem a prolin v poloze +148 substituovaný serinem, jak je zobrazeno na obrázku 7.
11. 11. Molekula mutantu CTLA4 podle kteréhokoli z nároků 3 až 10, kde imunoglobulinovou část zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která začíná kyselinou glutamovou v poloze +126 a končí lysinem v poloze +357, jak je zobrazeno na obrázku 7.
12. 12. Molekula mutantu CTLA4 podle kteréhokoli z nároků 3 až 11, která dále obsahuje spojení aminokyselinového zbytku, který je umístěn mezi aminokyselinovou sekvenci, která končí asparagovou kyselinou v poloze +124 a imunoglobulinovou částí.
13. 13. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 12, kde spojem aminokyselinového zbytku je glutamin.
14. 14. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 1 obsahující aminokyselinovou sekvenci, která začíná methioninem v poloze +1 a končí lysinem v poloze +357, jak je zobrazeno na obrázku 7 nebo která začíná alaninem v poloze -1 a končí lysinem v poloze +357, jak je zobrazeno na obrázku 7.

    -27CZ 304451 B6
15. 15. Molekula mutantu CTLA4 podle kteréhokoli z nároků 1 až 14, která dále obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která umožňuje sekreci rozpustné molekuly mutantu CTLA4.
16. 16. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 15, kde aminokyselinová sekvence obsahuje signální peptid onkostatinu M.
17. 17. Molekula mutantu CTLA4 podle kteréhokoli z nároků 1 až 16, která má pomalejší rychlosti disociace od vazby CD80 než přirozeně se vyskytující typ CTLA4.
18. 18. Molekula mutantu CTLA4 podle kteréhokoli z nároků 1 až 17, která je rozpustná.
19. 19. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 1, která je kódovaná molekulou nukleové kyseliny uloženou jako ATCC č. PTA-2104.
20. 20. Molekula nukleové kyseliny, která zahrnuje nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci korespondující s molekulou mutantu CTLA4 podle kteréhokoli z nároků 1 až 19.
21. 21. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 20 mající nukleotidovou sekvenci, která začíná guanidinem v nukleotidové poloze -3 a končí adeninem v nukleotidové poloze +1071, jak je zobrazeno na obrázku 7, nebo mající nukleotidovou sekvenci, která začíná adeninem v nukleotidové poloze +1 a končí adeninem v nukleotidové poloze +1071, jak je zobrazeno na obrázku 7.
22. 22. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 20, která je uložena jako ATCC č. PTA-2104.
23. 23. Molekula nukleové kyseliny, která obsahuje část molekuly nukleové kyseliny podle nároku 22, kde tato část obsahuje celou extracelulámí doménu mutantu molekuly CTLA4.
24. 24. Vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 20 až 23.
25. 25. Vektor podle nároku 24, který je uložen jako ATCC č. PTA-2104.
26. 26. Hostitelský vektorový systém obsahující vektor podle nároku 24 nebo 25 ve vhodné hostitelské buňce.
27. 27. Hostitelský vektorový systém podle nároku 26, kde vhodnou hostitelskou buňkou je bakteriální buňka nebo eukaryotická buňka.
28. 28. Hostitelská buňka mající vektor podle nároku 24 nebo 25.
29. 29. Hostitelská buňka podle nároku 28, kterou je eukaryotická buňka.
30. 30. Hostitelská buňka podle nároku 29, kde eukaryotickou buňkou je COS buňka.
31. 31. Hostitelská buňka podle nároku 29, kde eukaryotickou buňkou je vaječníková buňka čínského křečka (CHO).
32. 32. Hostitelská buňka podle nároku 31, kde vaječníková buňka čínského křečka (CHO) je vybrána ze skupiny sestávající zDG44, CHO-K1, CHO-K1 Tet-On buněčné linie, CHO označené jako ECACC 85050302, CHO klonu 13, CHO klonu B, CHO-K1/SF a RR-CHOK1.
33. 33. Způsob přípravy proteinu mutantu CTLA4, vyznačující se tím, že zahrnuje pěstování hostitelského vektorového systému podle nároku 26 nebo 27 pro vytvoření proteinu mutantu CTLA4 v hostitelské buňce a takto vytvořený protein se odebírá.
34. 34. Protein mutantu CTLA4 připravený způsobem podle nároku 33.

    -28CZ 304451 B6
35. 35. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a molekulu mutantu CTLA4 podle kteréhokoli z nároků 1 až 19 nebo molekulu mutantu CTLA4 podle nároku 34.
36. 36. Způsob regulace in vitro interakce T buňky s CD80 a/nebo CD86 pozitivní buňkou, vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování CD80 a/nebo CD86 pozitivní buňky s rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 podle kteréhokoli z nároků 1 až 19 nebo molekulou mutantu CTLA4 podle nároku 34 za vytvoření komplexu molekuly mutantu CTLA4/CD80 nebo molekuly mutantu CTLA4/CD86, přičemž tento komplex ruší interakci mezi T buňkou a CD80 a/nebo CD86 pozitivní buňkou.
37. 37. Způsob podle nároku 36, vyznačující se tím, že CD80 a/nebo CD86 pozitivní buňkou je buňka představující antigen.
38. 38. Způsob podle nároku 36 nebo 37, vyznačující se tím, že interakce T buněk s CD80 a/nebo CD86 pozitivními buňkami je inhibována.
39. 39. Použití molekuly mutantu CTLA4 podle kteréhokoli z nároků 1 až 19 nebo molekuly mutantu CTLA4 podle nároku 34 pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčbu nemoci imunitního systému.
40. 40. Použití podle nároku 39, kde nemoc imunitního systému je zprostředkována interakcemi T buněk s CD80 a/nebo CD86 pozitivními buňkami.
41. 41. Použití nároku 40, kde tyto interakce T buněk jsou inhibovány.
42. 42. Použití molekuly mutantu CTLA4 podle kteréhokoli z nároků 1 až 19 nebo molekuly mutantu CTLA4 podle nároku 34 a ligandu reagujícího s IL—4 pro výrobu farmaceutické kompozice pro inhibici transplantační reakce příjemce vůči štěpu (GVHD).