CN115803009A

CN115803009A - 用于治疗眼病和癌症的vegf阱和微阱及方法

Info

Publication number: CN115803009A
Application number: CN202180048482.6A
Authority: CN
Inventors: W·奥尔森; J·马丁; N·斯塔尔; J·基姆
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2020-05-08
Filing date: 2021-05-07
Publication date: 2023-03-14
Also published as: KR20230008830A; MX2022013812A; CA3182893A1; WO2021226444A3; JP2023525034A; WO2021226444A2; US20240124554A1; EP4146686A2; AU2021268026A1; US20210347852A1

Abstract

本发明涉及VEGF阱和VEGF微阱，其包括VEGF受体Ig样结构域，与多聚化组分融合，其结合VEGF并阻断其与VEGF受体的相互作用。这样的分子对于治疗血管生成性眼病(例如，年龄相关的黄斑变性)、癌症和其他不希望的血管生成是有用的。

Description

用于治疗眼病和癌症的VEGF阱和微阱及方法

相关申请的交叉参考

本专利申请要求2020年5月8日提交的美国临时申请No.63/022,178的优先权，将每篇的全部公开内容按引用并入。

序列表

本申请的序列列表以ASCII格式的序列表通过电子方式提交，文件名为“250298_000215_SL.txt”，创建日期为2021年5月6日，且大小为171,982字节。提交的这个序列表是说明书的一部分，并且通过引用将其全部内容并入本文。

发明领域

本发明的领域涉及可用于治疗癌症和血管生成性眼病的VEGF阱(trap)和微阱(mini-trap)分子以及这些治疗方法本身。

发明背景

几种眼病与病理性血管生成有关。例如，年龄相关性黄斑变性(AMD)的发展与脉络膜新生血管形成(CNV)相关。从CNV的泄漏导致黄斑水肿和黄斑下方的液体聚集，导致视力丧失。糖尿病黄斑水肿(DME)是另一种具有血管生成成分的眼病。DME是糖尿病患者中中度视力丧失的最常见原因，也是糖尿病性视网膜病变(一种影响视网膜血管的疾病)的常见并发症。液体泄漏到黄斑中心时，就会发生临床意义上的DME，黄斑是视网膜的感光部分，负责清晰、直接的视觉。黄斑中的液体会导致严重的视力丧失或失明。另一种与异常血管生成相关的眼病是视网膜中央静脉阻塞(CRVO)。CRVO是由视网膜中央静脉阻塞引起的，导致视网膜中血液和液体的回流。视网膜也会缺血，导致新的、不合适的血管生长，这可能导致视力进一步丧失和更严重的并发症。血管内皮生长因子(VEGF)的释放有助于增加眼睛的血管通透性和不适当的新血管生长。因此，抑制VEGF的促血管生成特性是治疗血管生成性眼病的有效策略。

各种VEGF抑制剂，如VEGF阱，Eylea(aflibercept)，已被批准用于治疗此类眼病。VEGF阱的片段，微阱，也是治疗此类血管生成性眼病的有用工具。然而，VEGF微阱可能存在与患者体内的抗铰链抗体(AHA)反应性的缺陷。这种AHA识别被截短的免疫球蛋白Fc的C末端残基暴露时形成的新表位。尽管AHA已在患有自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎)的个体中被鉴定，但这种抗体的功能尚不清楚。Falkenburg等，J.Immunol.198:82-93(2017)。

发明概述

本发明提供了一种VEGF微阱，其特征在于以下的结构域结构：

[(VEGFR1 Ig2)-(VEGFR2 Ig3)]a-多聚化组分(MC)，

或

[(VEGFR1 Ig2)-(VEGFR2 Ig3)-(VEGFR2 Ig4)]a-多聚化组分(MC)，

其中a＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；和

其中MC是铰链区，其是

-包含隐形(stealth)突变的IgG1铰链区(例如，其中残基ELLG(SEQ ID NO：90)突变为PVA)；

-IgG1铰链区-IgG2铰链区嵌合体(例如，其中IgG1残基ELLG(SEQ ID NO：90)

突变为PVA)；

-包含uber突变的IgG1铰链区(例如，其中残基ELLG(SEQ ID NO：90)突变为GGG)；

-残基APEL(SEQ ID NO：91)突变(例如，突变为GGGF(SEQ ID NO：92)、GGGG(SEQ IDNO：93)或GGGL(SEQ ID NO：94)的IgG1铰链区；

-APE残基缺失的IgG1铰链；

-IgG2铰链区(例如，具有两个或四个可以形成二硫键的半胱氨酸)；

-IgG3铰链区；

-IgG4铰链区；

-包含隐形突变的IgG4铰链区(例如，其中IgG4铰链残基EFLG(SEQ ID NO：95)突变为PVA)；或

-包含uber突变的IgG4铰链区(例如，其中残基EFLG(SEQ ID NO：95)突变为GGG)

例如，其中铰链区包含以下的氨基酸序列、由以下的氨基酸序列组成或基本上由以下的氨基酸序列组成：

DKTHTCPPCPAPPVA(SEQ ID NO：2)(参见VEGF微阱hIgG1隐形Fc)；

DKTHTCPPCPAPGGG(SEQ ID NO：3)(参见VEGF微阱hIgG1 uber Fc)；

ERKCCVECPPCPAPPVA(SEQ ID NO：4)(参见VEGF微阱hIgG2 Fc w/4Cys)；

VECPPCPAPPVA(SEQ ID NO：5)(参见VEGF微阱hIgG2 Fc w/2Cys)；

EPKSCDTPPPCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：6或其氨基酸6-21)(参见VEGF微阱hIgG3Fc)；

ESKYGPPCPPCPAPEFLG(SEQ ID NO：7或其氨基酸4-18)(参见VEGF微阱hIgG4Fc)；

ESKYGPPCPPCPAPPVA(SEQ ID NO：8或其氨基酸4-17)(参见VEGF微阱hIgG4隐形Fc)；

ESKYGPPCPPCPAPGGG(SEQ ID NO：9或其氨基酸4-17)(参见VEGF微阱hIgG4uberFc)；

DKTHTCPPCPAPPVA(SEQ ID NO：10)(参见VEGF微阱hIgG1-2嵌合Fc)；

DKTHTCPPCPGGGFLG(SEQ ID NO：11)(参见VEGF微阱hIgG1 Mut GGGF(SEQ ID NO：92)Fc)；

DKTHTCPPCPGGGGLG(SEQ ID NO：12)(参见VEGF微阱hIgG1 Mut GGGG(SEQ ID NO：93)Fc)；

DKTHTCPPCPGGGLLG(SEQ ID NO：13)(参见VEGF微阱hIgG1 Mut GGGL(SEQ ID NO：94)Fc)；

DKTHTCPPCPLLG(SEQ ID NO：14)(参见VEGF微阱hIgG1 Del(APE)Fc)；或

DKTHTCPLCPAPELLG(SEQ ID NO：68)；或

SEQ ID NO：15-22或74-77的任一个直至但不包括GPSV(SEQ ID NO：96)IdeS切割位点，如图2所示。

本发明还提供了一种VEGF阱，其特征在于以下的结构域结构

[(VEGFR1 Ig2)-(VEGFR2 Ig3)]a-多聚化组分(MC)，

或

[(VEGFR1 Ig2)-(VEGFR2 Ig3)-(VEGFR2 Ig4)]a-多聚化组分(MC)，

其中a＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；和

其中MC包括铰链区和蛋白酶切割位点，其是

-包含隐形突变的IgG1铰链区

-IgG1铰链区-IgG2铰链区嵌合体

-APE残基缺失的IgG1铰链区；

-IgG2铰链区(例如，包括两个或四个可以形成二硫键的半胱氨酸)；

-IgG3铰链区；

-IgG4铰链区；

-包含隐形突变的IgG4铰链区；

例如，其中MC包括氨基酸序列：

EPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：16，或其变体)或其氨基酸6-24(参见VEGF阱hIgG1隐形Fc)；

EPKSCDKTHTCPPCPAPGGGGPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：17，或其变体)或其氨基酸6-24(参见VEGF阱hIgG1 uber Fc)；

ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：18，或其变体)或其氨基酸1-21或6-21(VECPPCPAPPVAGPSV(SEQ ID NO：97))(参见VEGF阱hIgG2 Fc w/2Cys或w/4Cys)；

EPKSCDTPPPCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：19，或其变体)或其氨基酸6-25(参见VEGF阱hIgG3 Fc)；

ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：20，或其变体)或其氨基酸1-22(参见VEGF阱hIgG4 Fc)；

ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：21，或其变体)或其氨基酸1-21(参见VEGF阱hIgG4隐形Fc)；

ESKYGPPCPPCPAPGGGGPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：22，或其变体)或其氨基酸1-21(参见VEGF阱hIgG4 uber Fc)；

DKTHTCPPCPAPPVAGPSV(SEQ ID NO：70)(参见VEGF阱hIgG1隐形Fc或hIgG1-2嵌合Fc)；

DKTHTCPPCPGGGFLGGPSV(SEQ ID NO：74的氨基酸6-25)(VEGF阱hIgG1mut GGGF(SEQ ID NO：92)Fc)；

DKTHTCPPCPGGGGLGGPSV(SEQ ID NO：75的氨基酸6-25)(参见VEGF阱hIgG1 mutGGGG(SEQ ID NO：93)Fc)；

DKTHTCPPCPGGGLLGGPSV(SEQ ID NO：76的氨基酸6-25)(参见VEGF阱hIgG1 mutGGGL(SEQ ID NO：94)Fc)；或

DKTHTCPPCPLLGGPSV(SEQ ID NO：77的氨基酸6-22)(参见VEGF阱hIgG1Del(APE)Fc)。

在本发明的一个实施方案中，本文列出的任一种VEGF阱或微阱的特征在于以下的任何一个或多个：

·在25℃以约1-2pM的K_D或更高的亲和力结合人VEGF₁₆₅，其中所述亲和力通过表面等离子体共振来测量；

·具有小于97kDa的同型二聚体分子量(例如，约50kDa、49kDa、48kDa、47kDa或46kDa；或小于上述任一个重量)；

·对于阻断VEGFR1和/或VEGFR2的VEGF₁₂₁和/或VEGF₁₆₅激活，具有约1-2×10^-11M的IC₅₀，如在HEK293细胞中测量的，所述细胞表达与IL18α或IL18Rβ的胞内结构域融合的VEGF受体胞外结构域并具有NFκB-荧光素酶-IRES-eGFP报告基因；

·在猴初始

血清样品和/或人AMD/DME基线血清样品中呈现出低于REGN7483

(SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：67))的免疫原性，如通过抗药物抗体(ADA)测定测量的；

·与VEGF₁₆₅同型二聚体形成1:1复合物；

·与VEGF₁₆₅同型二聚体和抗VEGF Fab片段形成1:1:2复合物(VEGF微阱:VEGF₁₆₅同型二聚体:Fab片段)；

·在氧诱导性视网膜病(OIR)小鼠模型中玻璃体内给药时减少视网膜新生血管形成；

·玻璃体内注射时，在兔眼中呈现出比阿柏西普更短的玻璃体内半衰期；

·在非人灵长类动物中，玻璃体内注射5.5mg/眼时，呈现出低于玻璃体内注射4mg/眼的阿柏西普的游离分子血浆水平；

·玻璃体内注射约5.5mg/眼后约336小时，非人灵长类动物血浆中呈现出约0.1或0.2或0.1-0.2微克/ml(或更低)的游离分子浓度；

·在4次约每隔28天玻璃体内注射约5.5mg/眼后，在非人灵长类动物的眼中没有明显积聚；

·在包含VEGF阱和/或VEGF微阱的组合物中，这些分子被一个或多个岩藻糖残基(例如，约43-45％)、半乳糖残基(如，约64-72％)、唾液酸残基(如，约20-27％)、高甘露糖残基(例如，Man5)(例如，约19-25％)和/或二等分聚糖(例如，大约1.6-1.9％；即，在两个规则分支之间具有N-乙酰氨基葡萄糖的N-聚糖，参见例如，图26(A))糖基化。

·一个或多个组氨酸被氧化成2-氧-组氨酸。

·一个或多个色氨酸被脱氧。

·其一个或多个天冬酰胺被糖基化。

·一个或多个丝氨酸或苏氨酸被O-糖基化；

·一个或多个天冬酰胺被脱酰胺。

·一个或多个天冬氨酸-甘氨酸基序转化为异天冬氨酸-甘氨酸和/或Asn-Gly。

·一个或多个甲硫氨酸被氧化。

·一个或多个色氨酸被转化为N-甲酰犬尿氨酸。

·一个或多个精氨酸被转化为Arg 3-脱氧葡糖醛酮。

·不存在C-末端残基。

·存在一个或多个非糖基化糖苷。

·木糖基化。

·在赖氨酸被糖基化。

·包含具有游离硫醇基团的胱氨酸。

·包含链内二硫键。

·包含平行或交叉方向的二硫键；和/或

·包含羧甲基化的赖氨酸或精氨酸。

在本发明的实施方案中，任一个VEGF阱的MC包含以下的氨基酸序列：

GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：23)；

GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：24)；

GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：25)；

GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO：26)；

GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：27)；

GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：28)；

GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：29)；

GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：30)；

GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：31)；

VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：78)；

DKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：79)；

ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：80)；

ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：81)；

DKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：82)；

DKTHTCPPCPGGGFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：83)；

DKTHTCPPCPGGGGLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：84)；

DKTHTCPPCPGGGLLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：85)；或

DKTHTCPPCPLLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：86)。

在本发明的一个实施方案中，VEGF微阱包含以下的氨基酸序列：

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKERKCCVECPPCPAPPVA(SEQ ID NO：32)；

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKVECPPCPAPPVA(SEQID NO：33)；

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPPVA(SEQ ID NO：34)；

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKESKYGPPCPPCPAPPVA(SEQ ID NO：35)；

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPPVA(SEQ ID NO：36)；

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPGGGFLG(SEQ ID NO：37)；

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPGGGGLG(SEQ ID NO：38)；

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPGGGLLG(SEQ ID NO：39)；

或

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPLLG(SEQ ID NO：40)。

在本发明的一个实施方案中，VEGF阱包含以下的氨基酸序列：

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：41)；

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：42)；

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：43)；

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SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPGGGLLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：48)；或

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPLLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：49)。

在本发明的一个实施方案中，VEGF阱或VEGF微阱是糖基化的，例如，其中所述VEGF阱或VEGF微阱包含N-连接的聚糖；所述VEGF阱或VEGF微阱包含O-连接的聚糖；所述VEGF阱或VEGF微阱在一个或多个残基是唾液酸化的、半乳糖基化的和/或岩藻糖基化的；所述VEGF阱或VEGF微阱在一个或多个残基包含N-连接的甘露糖-5聚糖(Man5)；和/或所述VEGF阱或VEGF微阱包含CHO细胞糖基化。本发明的范围包括包含本文所示的VEGF阱或VEGF微阱的糖基化变体的异质混合物。例如，在本发明的一个实施方案中，约47％的VEGF阱或VEGF微阱是唾液酸化的，约70％的VEGF阱或VEGF微阱是半乳糖基化的，约36％的VEGF阱或VEGF微阱是岩藻糖基化的和/或约11％的VEGF阱或VEGF微阱是Man-5糖基化的。

本发明还包括包含VEGF阱或微阱同型二聚体(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；和/或mREGN10515)和VEGF的复合物；例如，其中VEGF是人VEGF，如人VEGF₁₆₅或VEGF₁₂₁；和/或复合物包括抗VEGF抗体或其Fab片段，例如，其包括人VEGF和抗VEGF Fab片段，其中化学计量比为1:1:2(VEGF微阱:人VAGF:Fab)；和/或其中复合物位于VEGF微阱和VEGF之间并且VEGF微阱与VEGF的化学计量比为1:1。

本发明提供了包含本发明的VEGF阱或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；和/或mREGN10515)和药学上有效的载剂(carrier)的药物制剂。

本发明还提供了编码本发明的VEGF阱或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；和/或mREGN10515)的分离的多核苷酸，例如，SEQ ID NO：71、72或73；以及包括多核苷酸的载体。

本发明还提供了包含本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞)。

本发明还提供了分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：32-49的氨基酸序列，或由选自SEQ ID NO：32-49的氨基酸序列组成或基本上由选自SEQ ID NO：32-49的氨基酸序列组成。

本发明还提供了容器或注射装置(例如，注射器、一次性注射器或预填充注射器)，例如，其是无菌的，包含本发明的VEGF阱或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；和/或mREGN10515)，或其药物制剂。

本发明还提供了制备VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；和/或mREGN10515)或其药物制剂的方法，包括将本发明的VEGF阱接触切割所述VEGF阱的MC的蛋白酶(例如，IdeS，例如，包含SEQ ID NO：50-65任一个的氨基酸序列)并在促进切割的条件下孵育VEGF阱和蛋白酶，将切割的VEGF微阱产物与药学上有效的载剂组合。

本发明还提供了制备VEGF阱或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；和/或mREGN10515)或其药物制剂的方法，包括在促进阱或微阱表达的条件下在培养基中孵育含有编码VEGF阱或VEGF微阱的多核苷酸或其载体的宿主细胞，和任选从宿主细胞和/或培养基分离阱或微阱，任选将切割的VEGF阱或VEGF微阱产物与药学上有效的载剂组合。任选，该方法包括将VEGF阱接触切割所述VEGF阱的MC的蛋白酶并在促进切割的条件下孵育VEGF阱和蛋白酶的步骤。是该方法产物的VEGF阱或VEGF微阱也形成本发明的部分。

本发明还提供了用于治疗或预防受试者(例如，人)的血管生成性眼病(例如，年龄相关性黄斑变性、湿性年龄相关性黄斑变性、干性年龄相关性视网膜变性、黄斑水肿、视网膜静脉阻塞后黄斑水肿、黄斑静脉阻塞(RVO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、早产儿视网膜病变(ROP)、糖尿病黄斑水肿(DME)、脉络膜新生血管形成(CNV)、虹膜新生血管形成、新生血管性青光眼、青光眼术后纤维化、增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)、视盘新生血管形成、角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、玻璃体新生血管形成、血管翳、翼状胬肉、血管性视网膜病变、糖尿病黄斑水肿受试者的糖尿病性视网膜病变；糖尿病性视网膜病变、非增殖性糖尿病性视网膜病变和/或增殖性糖尿病性视网膜病变)的方法，其包括将治疗有效量的本发明的VEGF阱或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；和/或mREGN10515)施用于(例如，眼内或玻璃体内)受试者。在本发明的一个实施方案中，受试者眼中视网膜的新生血管形成减少和/或受试者眼中视网膜的血管通透性减少。

本发明还提供了用于治疗或预防受试者(例如，人)的癌症(例如，肺癌、乳癌、结直肠癌、转移性结直肠癌、前列腺癌、皮肤癌或胃癌)的方法，包括将治疗有效量的本发明的VEGF阱或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；和/或mREGN10515)施用于(例如，静脉内)受试者。

本发明还提供了将本发明的VEGF阱或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；和/或mREGN10515)或其药物制剂施用于受试者(例如，人)的方法，包括将VEGF阱或VEGF微阱或药物制剂引入到(例如，通过注射，例如玻璃体内注射)受试者的身体中。

本发明还包括用于减少受试者的视网膜的新生血管形成和/或受试者的视网膜血管通透性的方法，包括将治疗有效量的本文所示的VEGF阱或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；和/或mREGN10515)或其药物制剂施用于受试者。

本发明除了进一步例如在N-末端或C-末端包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个(例如，至多10个)额外的氨基酸外，包括由本文所示的氨基酸序列组成的任一个VEGF阱或微阱，；及其使用任一种的相关方法。

附图简述

图1.具有IgG铰链氨基酸的VEGF阱和微阱的概况[//＝IdeS切割位点]。IdeS切割产生的VEGF微阱是指所示的VEGF阱的IdeS切割产生的微阱。IgG包括关于阱或微阱的多聚化组分中的IgG形式的信息。

图2.具有所示IdeS切割位点的VEGF阱铰链区序列。IgG1(PEL和T)的Fc铰链区中可能与患者血清中预先存在的抗铰链抗体反应的残基的位置用箭头表示。下铰链区、核心铰链区和上铰链区残基用方框表示。(分别为，SEQ ID NO：15-22、16、74-77)

图3.具有所示的常见描述性名称和分子量的VEGF阱和微阱的概括。

图4.由IdeS切割VEGF阱形成的典型VEGF微阱的示意图。

图5.阿柏西普(REGN3)、源自REGN3的VEGF微阱(REGN7483^F)、VEGF阱hIgG1隐形Fc、具有4个cys的VEGF阱hIgG2 Fc、具有4个cys的VEGF微阱hIgG2、具有2个cys的VEGF阱hIgG2Fc和具有2个cys的VEGF微阱hIgG2之间的序列比较。

图6.阿柏西普(REGN3)、源自REGN3的VEGF微阱(REGN7483^F)、REGN10513、REGN10514、REGN10512、REGN10515、REGN10104、REGN10511、REGN10102、REGN10117和REGN10187之间的序列比较。图公开了分别如SEQ ID NO：92-94的“GGGF”、“GGGG”和“GGGL”。

图7(A-J).VEGF阱和VEGF微阱的氨基酸序列(A)REGN3、REGN7483、(B)REGN10104、mREGN10104、(C)REGN10102、REGN10105、(D)REGN1017、REGN10103、(E)REGN10187、mREGN10187、(F)REGN10511、mREGN10511、(G)REGN10512、mREGN10512、(H)REGN10513、mREGN10513、(I)REGN10514、REGN11095、和(J)REGN10515、mREGN10515。通过箭头指示VEGF阱中的IdeS蛋白酶切割位点。N-末端VEGFR1结构域2是深色阴影的和VEGFR结构域3是浅色阴影和框住的。VEGF阱中的C-末端Fc结构域是深色阴影的。VEGF阱和VEGF微阱的铰链区是无阴影的。图公开了分别如SEQ ID NO：92-94的“GGGF”、“GGGG”和“GGGL”。

图8(A-E).VEGF阱和VEGF微阱(REGN10117(A)、REGN10104和mREGN10104(B)、REGN10102(C)、REGN10187和mREGN10187(D)；以及REGN10103和REGN10105(E)；每个中与对照REGN7483、REGN3(VEGFT)和VEGF121一起)阻断VEGFR1表达细胞(293/D9/VEGFR1)的VEGF₁₂₁激活(40pM的VEGF₁₂₁)的生物测定活性。

图9(A-E).VEGF阱和VEGF微阱(REGN10102(A)、REGN10104和mREGN10104(B)、REGN10117(C)、REGN10187(D)REGN10187和mREGN10187(D)；以及REGN10103和REGN101005(E)；每个中与对照REGN7483、REGN3(VEGFT)和VEGF₁₂₁一起)阻断VEGFR2表达细胞(293/D9/VEGFR2)的VEGF₁₂₁激活(40pM的VEGF₁₂₁)的生物测定活性。

图10(A-F).各种VEGF阱(REGN3(A)、REGN10102(B)、REGN10511(C)、REGN10512(D)、REGN10514(E)和REGN10515(F))随时间(孵育0、1、2或4小时或过夜(O/N)后)的Ides蛋白酶介导的切割的非还原性SDS-PAGE分析。图公开了分别如SEQ ID NO：92-94的“GGGF”和“GGGL”。

图11(A-B).抗药物抗体电化学发光免疫测定(ECL)-桥接格式。(A)测定格式图。(B)针对初始猴血清样品中预先存在的抗铰链抗体(AHA)的REGN7483^F、REGN10105(来自IdeS切割的具有有2个Cys的IgG2 Fc的VEGF阱)、mREGN10104(来自REGN10104的IdeS切割的)、REGN10105(在CHO细胞中重组表达的)、REGN10103(来自IdeS切割的具有有4个Cys的IgG2 Fc的VEGF阱)和mREGN10187的测定。

图12.抗药物抗体电化学发光免疫测定(ECL)-桥接格式。针对人AMD/DME血清样品中预先存在的抗铰链抗体(AHA)的REGN7483^F、REGN10105(来自IdeS切割的具有有2个Cys的IgG2 Fc的VEGF阱)、mREGN10104(来自REGN10104的IdeS切割的)、REGN10105(在CHO细胞中重组表达的)、REGN10103(来自IdeS切割的具有有4个Cys的IgG2 Fc的VEGF阱)和mREGN10187的测定。

图13.用于降低效应子功能的人IgG4隐形和人IgG1隐形的示意图。图公开了分别如SEQ ID NO 100和95的“CPPC”和“EFLG”。

图14.具有隐形突变的IgG4抗体的示意图(以出现的顺序分别为SEQ ID NO：111和109)。

图15.具有IgG2下铰链区序列的IgG4序列。构建体的序列是加框的。如图中所示的具有具有IgG2加框的铰链序列MC(或在IgG4 ESKY(SEQ ID NO：98)基序开始)的IgG4/2杂合VEGF阱及其(在GPSV(SEQ ID NO：96)前切割的)微阱是本发明的部分。以出现的顺序，图分别公开了SEQ ID NO：112-114。

图16.具有隐形突变的IgG1抗体的示意图(以出现的顺序，分别为SEQ ID NO：102和109)。

图17.具有无效应子(effectorless)CH2序列的IgG1序列。如图中所示的具有MC(具有IgG2加框的铰链序列)或在IgG1 DKTHT(SEQ ID NO：99)基序开始)的IgG1/2杂合VEGF阱及其(在GPSV(SEQ ID NO：96)前切割的)微阱是本发明的部分。以出现的顺序，图分别公开了SEQ ID NO 112-114。

图18(A-B).通过与多角度激光散射偶联的大小排阻色谱(SEC-MALS)的(A)REGN10105:hVEGF165和(B)REGN11095:hVEGF₁₆₅复合物(实线)的分析。来自REGN10105或REGN11095(灰色虚线)和hVEGF₁₆₅(黑色虚线)的单独样品的色谱也是重叠的。针对每个样品显示了作为保留体积函数的相对折射指数，并显示了测量的分辨峰的摩尔质量。

图19(A-D).与VEGF和REGN18 Fab复合的VEGF微阱REGN10105的结构的Cryo-EM分析。分析了单独的hVEGF、单独的REGN10105、REGN10105与hVEGF或REGN10105、hVEGF和REGN18 Fab的样品。(A)REGN10105/VEGF/REGN18 Fab混合物的SEC-MALS色谱。(B)原始Cryo-EM图像，圆圈中是复合物/颗粒。(C)2D类平均值的选择；箭头表示VEGFR2结构域3。(D)单独的2D类；箭头表示VEGF或VEGFR2结构域3。

图20(A-B).对用人Fc、阿柏西普、REGN11095或REGN10105玻璃体内处理的氧诱导性视网膜病小鼠模型的视网膜中观察到的(A)无血管和(B)异常区域的概括。分析了用GSLectin I(无血管区域研究)或NG2(异常区域研究)染色的视网膜平片(flat mount)。

图21.未注射或用人Fc、阿氟西普(0.05、0.5或5微克)或REGN10105(0.025、0.25或2.5微克)玻璃体内处理的氧诱导性视网膜病小鼠模型的视网膜中观察到的(相对hFc处理的)标准化异常区域概括。分析用或NG2染色的视网膜平片。将数据相对Fc治疗组进行标准化。

图22(A-B).从全身施用人Fc、阿柏西普、REGN11095或REGN10105的氧诱导性视网膜病小鼠模型中观察到(相对hFc处理标准化)的(A)无血管和(B)异常区域的概括。分析了用GS Lectin I(无血管区域研究)或NG2(异常区域研究)染色的视网膜平片。

图23(A-F).新西兰白兔玻璃体中VEGF阱的衰减分析。(A)REGN3(动物428、429和430)、(B)REGN7483(动物434、435和436)、(C)REGN3(动物570、571和572)、(D)REGN10105(动物573、574和575)和(E)REGN11095(动物576、577和578)。OS＝左眼，OD＝右眼。(F)在IVT注射REGN3、REGN10105或REGN11095之前和之后的眼内压(IOP)(mmHg)。

图24(A-D).用REGN10105或REGN11095多次给药(第1、29、57和85天)的雄性和雌性非人灵长类动物眼睛中随时间的游离和结合的VEGF微阱的分析。(A)游离REGN10105、(B)游离REGN11095、(C)结合的REGN10105、(D)结合的REGN11095。

图25.在玻璃体内施用REGN7483(5.5mg/眼)、REGN10105(5.5mg/眼)或阿柏西普(4mg/眼)的非人灵长类动物中随时间的全身性(血浆)VEGF阱和微阱浓度。

图26(A-B).来自REGN10103和REGN10105的N-连接的甘氨酸的HILIC-FLR色谱图(A)重叠的和(B)分离的。具有任何一种或多种所示N-聚糖或具有图中所示聚糖分布的组合物的REGN10103或REGN10105是本发明的部分。

发明详述

本发明提供了VEGF阱和VEGF微阱，相对于其他微阱，表现出优异的稳定性和低粘度，尤其是在高浓度。这些特征使得VEGF阱和微阱非常适合于高浓度的制剂，这反过来促进了低体积中的高剂量，从而减少了频繁的给药。眼睛的解剖学和生理学使得不希望在玻璃体内注射大量的液体；因此，玻璃体内注射应以不超过约100微升的体积进行。这些因素的组合使得基于蛋白质的药物的开发在技术上具有挑战性，所述药物可用于在合适的体积内进行足够量的玻璃体内注射。最大化递送的药物量，以便最小化在给定的时间段内所需的剂量的次数，是一个更大的挑战。本文提供的阱和微阱克服了这些技术障碍。

包括本文所述的VEGF微阱(如REGN10105)的水性组合物的粘度甚至相对于其他VEGF微阱也是低的。低粘度允许使用更高规格的针头进行玻璃体内施用，从而最大限度地减少患者的不适感并提高患者的依从性。

此外，在加速条件，本文中所述的VEGF微阱，例如REGN10105和REGN11095，比阿柏西普表现出更高的稳定性(高分子量物质(molecular weight species)的形成更低)。REGN10105相对于其他VEGF微阱(如REGN7483)还特别具有光稳定性。

本文所述的VEGF微阱(例如REGN10105)玻璃体内给药后的潜在全身暴露水平也低于阿柏西普。具体而言，REGN10105在兔玻璃体中的半衰期更短，导致从眼睛清除到身体其他部位的可能性更小。

本文所述的VEGF微阱，其特征在于，在体外，因为与预先存在的抗铰链抗体的反应性较低，施用时，免疫原性反应的可能性较小。例如，具有基于IgG2的Fc铰链区的VEGF微阱在基于IgG1的Fc铰区(如在REGN7483中)中缺少PEL和T残基，这些残基可能与预先存在的抗铰链抗体反应。

VEGF阱是基于VEGF受体的嵌合分子，其包括两个或更多个VEGF受体的免疫球蛋白(Ig)-样结构域，如VEGFR1(也称为Flt1)(例如，VEGFR1的Ig2结构域(VEGFR1d2))和/或VEGFR2(也称为Flk1或KDR)(例如，VEGFR2的Ig3结构域(VEGFR2d3))，优选在VEGF阱的每条多肽链上排列为[(VEGFR1d2)-(VEGFR2d3)]_n(例如，其中n＝1)，并且还含有促进两个或多个嵌合多肽的多聚化(例如，二聚化)的Fc结构域)。

VEGF微阱包括VEGF结合域(例如，VEGFR1-Ig结构域2和VEGFR2-Ig结构域3，以与VEGF阱(如阿柏西普)类似的方式排列)，其连接到Fc结构域的片段，优选Fc结构域的铰链区(例如，包括上铰链区(有时以E-(P、S或R)-K基序开始)、核心铰链区和下铰链区)，延伸至但不包括IdeS蛋白酶的GPSV(SEQ ID NO：96)切割位点(参见例如图2)。铰链区优选包括一个或多个(例如2或4个)半胱氨酸，其可以与另一个VEGF微阱多肽链形成半胱氨酸桥(cysteine bridge)。优选，VEGF阱和微阱是此类多肽的同型二聚复合物。VEGF阱和微阱也可以在包括此类单体多肽和同型二聚体的异质群的组合物中。这种单体、多聚体和组合物形成本发明的部分。多肽同型二聚体可以例如通过二硫键(disulfide bridges)结合在一起。VEGF阱和VEGF微阱的示意图如图4所示。

VEGFR的“Ig”结构域是指所示的VEGF受体所示的免疫球蛋白样结构域。

分子生物学中的标准方法描述于Sambrook，Fritsch和Maniatis(1982&1989 2^ndEdition,2001 3^rd Edition)Molecular Cloning,A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor,N.Y.；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.；Wu(1993)Recombinant DNA，Vol.217，Academic Press，San Diego,Calif.。标准方法还出现在Ausbel等，(2001)Current Protocols in Molecular Biology，Vols.1-4，John Wiley and Sons,Inc.New York，N.Y.中，其描述了在细菌细胞中克隆和DNA诱变(Vol.1)，在哺乳动物细胞和酵母中克隆(Vol.2)，糖缀合物和蛋白质表达(Vol.3)和生物信息学(Vol.4)。

描述了用于蛋白质纯化的一般方法，包括免疫沉淀、色谱、电泳、离心和结晶(Coligan等(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.1,John Wiley andSons,Inc.,New York)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的生产、蛋白质的糖基化(参见，例如，Coligan等(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.2,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel等(2001)Current Protocols inMolecular Biology,Vol.3,John Wiley and Sons,Inc.,NY,N.Y.,pp.16.0.5-16.22.17；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research，St.Louis,Mo.；pp.45-89；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory，Piscataway,N.J.,pp.384-391)。描述了多克隆和单克隆抗体的生产、纯化和片段化(Coligan等(2001)Current Protcolsin Immunology,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow和Lane(1999)UsingAntibodies，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor,N.Y.；Harlow和Lane，上文)。用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可利用的(参见，例如，Coligan等(2001)Current Protocols in Immunology，Vol.4，John Wiley,Inc.，New York)。

用于流式细胞术的方法，包括荧光激活的细胞分选(FACS)，是可利用的(参见，例如，Owens等(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice，John Wiley and Sons，Hoboken,N.J.；Givan(2001)Flow Cytometry，第2版；Wiley-Liss,Hoboken,N.J.；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry，John Wiley and Sons，Hoboken,N.J.)。适用于修饰核酸(包括核酸引物和探针、多肽和抗体，用于例如用作诊断试剂)的荧光试剂是可利用的(Molecular Probes(2003)Catalogue，Molecular Probes,Inc.，Eugene，Oreg.；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,Mo.)。

描述了免疫系统的标准组织学方法(参见，例如，Muller-Harmelink(编辑)(1986)Human Thymus:Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,N.Y.；Hiatt等(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,Pa.；Louis等(2002)Basic Histology:Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,N.Y.)。

VEGF微阱和VEGF阱

本发明的VEGF微阱呈现出优异的VEGF中和活性，以及低免疫原性和粘度以及高稳定性。此外，本发明的VEGF阱非常适合于产生这样的VEGF微阱，只要它们可以用蛋白酶(如IdeS蛋白酶(例如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)IdeS)切割。

本发明提供了包含以下结构域结构的VEGF微阱：

[(VEGFR1 Ig2)-(VEGFR2 Ig3)]a-多聚化组分(MC)，

或

[(VEGFR1 Ig2)-(VEGFR2 Ig3)-(VEGFR2 Ig4)]a-多聚化组分(MC)，

其中a＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；和

其中MC是铰链区，其是

-包含隐形突变的IgG1铰链区(例如，其中残基ELLG(SEQ ID NO：90)突变为PVA)；

-包含uber突变的IgG1铰链区(例如，其中残基ELLG(SEQ ID NO：90)突变为GGG)

-IgG1铰链区-IgG2铰链区嵌合体(例如，其中IgG1残基ELLG(SEQ ID NO：90)突变为PVA)；

-APE残基缺失的IgG1铰链；

-IgG3铰链区；

-IgG4铰链区；

-包含隐形突变的IgG4铰链区(例如，其中IgG4铰链残基EFLG(SEQ ID NO：95)突变为PVA)；

-包含uber突变的IgG4铰链区(例如，其中残基EFLG(SEQ ID NO：95)突变为GGG)；或

-含有人Fc的IdeS蛋白水解切割产物的铰链区；

及其多聚体(例如，同型二聚体)。

在本发明的一个实施方案中，VEGF微阱铰链区包含以下氨基酸序列，或基本上由以下氨基酸序列组成，或由以下氨基酸序列组成：

DKTHTCPPCPAPPVA(SEQ ID NO：2)(参见VEGF微阱hIgG1隐形Fc)；

DKTHTCPPCPAPGGG(SEQ ID NO：3)(参见VEGF微阱hIgG1 uber Fc)；

ERKCCVECPPCPAPPVA(SEQ ID NO：4)(参见VEGF微阱hIgG2 Fc w/4Cys)；

VECPPCPAPPVA(SEQ ID NO：5)(参见VEGF微阱hIgG2 Fc w/2Cys)；

EPKSCDTPPPCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：6或其氨基酸6-21(下划线的))(参见VEGF微阱hIgG3 Fc)；

ESKYGPPCPPCPAPEFLG(SEQ ID NO：7或其氨基酸4-18(下划线的))(参见VEGF微阱hIgG4 Fc)；

ESKYGPPCPPCPAPPVA(SEQ ID NO：8或其氨基酸4-17(下划线的))(参见VEGF微阱hIgG4隐形Fc)；

ESKYGPPCPPCPAPGGG(SEQ ID NO：9或其氨基酸4-17(下划线的))(参见VEGF微阱hIgG4 uber Fc)；

DKTHTCPPCPAPPVA(SEQ ID NO：10)(参见VEGF微阱hIgG1-2嵌合Fc)；

DKTHTCPPCPLLG(SEQ ID NO：14)(参见VEGF微阱hIgG1 Del(APE)Fc)；或

DKTHTCPLCPAPELLG(SEQ ID NO：68)。

或

本文所示的任一个MC的铰链区(例如，SEQ ID NO：78-86的任一个)或图1、2、3、5、6、7或13-17任一个中所示的那些。

阿柏西普(REGN3)和REGN7483的IgG铰链区包含氨基酸序列：DKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：1)。在本发明的一个实施方案中，本文定义的VEGF微阱和VEGF阱的附带条件是排除阿柏西普的MC的铰链区和/或REGN7483的铰链区。

本发明还包括包含以下结构域结构的VEGF阱：

[(VEGFR1 Ig2)-(VEGFR2 Ig3)]a-多聚化组分(MC)，

或

[(VEGFR1 Ig2)-(VEGFR2 Ig3)-(VEGFR2 Ig4)]a-多聚化组分(MC)，

其中a＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；和

其中MC是包括铰链区和蛋白酶(如IdeS)切割位点的免疫球蛋白Fc多肽(但是，在本发明的一个实施方案中，Fc不是野生型人IgG1)。在本发明的一个实施方案中，VEGF阱MC是人Fc，其包括：

-包含隐形或uber突变的IgG1铰链区；

-IgG1铰链区-IgG2铰链区嵌合体；

-IgG1 APE残基缺失；

-IgG3铰链区；

-IgG4铰链区；

-包含隐形或uber突变的IgG4铰链区；

或

-本文所示的任一个MC。

在本发明的一个实施方案中，VEGF阱MC包括氨基酸序列(其中^v是IdeS蛋白酶切割位点)：

EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA ^∨ GPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：16，或其变体)或其氨基酸6-24(参见VEGF阱hIgG1隐形Fc)；

EPKSCDKTHTCPPCPAPGGG ^v GPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：17，或其变体)或其氨基酸6-24(参见VEGF阱hIgG1 uber Fc)；

ERKCCVECPPCPAPPVA ^∨ GPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：18，或其变体)或其氨基酸1-21或6-21(VECPPCPAPPVA^vGPSV(SEQ ID NO：97))(参见VEGF阱hIgG2Fc w/2Cys或w/4Cys)；

EPKSCDTPPPCPPCPAPELLG ^v GPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：19，或其变体)或其氨基酸6-25(参见VEGF阱hIgG3 Fc)；

ESKYGPPCPPCPAPEFLG ^v GPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：20，或其变体)或其氨基酸1-22(参见VEGF阱hIgG4 Fc)；

ESKYGPPCPPCPAPPVA ^∨ GPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：21，或其变体)或其氨基酸1-21(参见VEGF阱hIgG4隐形Fc)；

ESKYGPPCPPCPAPGGG ^∨ GPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：22，或其变体)或其氨基酸1-21(参见VEGF阱hIgG4 uber Fc)；

DKTHTCPPCPAPPVA^∨GPSV(SEQ ID NO：70)(参见VEGF阱hIgG1隐形Fc或hIgG1-2嵌合Fc)；

DKTHTCPPCPGGGFLG^∨GPSV(SEQ ID NO：74的氨基酸6-25)(参见VEGF阱hIgG1 mutGGGF(SEQ ID NO：92)Fc)；

DKTHTCPPCPGGGGLG^vGPSV(SEQ ID NO：75的氨基酸6-25)(参见VEGF阱hIgG1 mutGGGG(SEQ ID NO：93)Fc)；

DKTHTCPPCPGGGLLG^∨GPSV(SEQ ID NO：76的氨基酸6-25)(参见VEGF阱hIgG1 mutGGGL(SEQ ID NO：94)Fc)；或

DKTHTCPPCPLLG^∨GPSV(SEQ ID NO：77的氨基酸6-25)(参见VEGF阱hIgG1Del(APE)Fc)。

参见例如图2。

在本发明的一个实施方案中，VEGF阱MC包含氨基酸序列：

GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

(SEQ ID NO：23)；

GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

(SEQ ID NO：24)；

(SEQ ID NO：25)；

GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(SEQ ID NO：26)；

(SEQ ID NO：27)；

GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

(SEQ ID NO：28)；

(SEQ ID NO：29)；

(SEQ ID NO：30)；或

(SEQ ID NO：31)。

在本发明的一个实施方案中，本文所示的任一个VEGF微阱不包括这样的MC。

在本发明的一个实施方案中，包括Fc结构域铰链区或其变体或片段(例如，来自IgG4)的多聚化组分包括S108P突变，例如，以促进二聚体稳定。

在本发明的实施方案中，本发明的VEGF阱或VEGF微阱包含具有效应子功能降低的修饰的Fc结构域或其片段(例如，其中片段包括铰链区)。如本文所述的“具有效应子功能降低的修饰的Fc结构域”表示相对于野生型天然存在的Fc结构域已经修饰、突变、截短等的免疫球蛋白的任何Fc部分，使得包含修饰的Fc的分子相对于包含野生型天然存在形式的Fc部分的比较分子呈现出至少一种效应的严重性或程度的降低，所述至少一种效应选自细胞杀灭(例如，ADCC和/或CDC)、补体激活、吞噬和调理作用。在某些实施方案中，“具有效应子功能降低的修饰的Fc结构域”是与Fc受体(例如，FcγR)的结合降低或减弱的Fc结构域。

在本发明的某些实施方案中，修饰的Fc结构域是铰链区中包含置换的变体IgG1Fc或变体IgG4 Fc。例如，用于本发明内容中修饰的Fc可以包含变体IgG1 Fc，其中IgG1 Fc铰链区的至少一个氨基酸被来自IgG2 Fc铰链区的相应氨基酸替代。或者，用于本发明内容中的修饰的Fc可以包含变体IgG4 Fc，其中IgG4 Fc铰链区的至少一个氨基酸被来自IgG2Fc铰链区的相应氨基酸替代。可以用于本发明内容中的非限制性、示例性的修饰的Fc区示于美国专利申请公开No.2014/0243504中，将其公开内容全部按引用并入，以及本文所示的修饰Fc区的任何功能等效变体。

可以用于本发明内容中的其他修饰的Fc结构域和Fc修饰包括US 2014/0171623；US8,697,396；US 2014/0134162；WO 2014/043361中所示的任一种修饰，将其公开内容全部按引用并入。

具有隐形突变的工程化IgG1是基于IgG1框架，但铰链CPPCPAPELLG(SEQ ID NO：1的氨基酸6-16)替换为CPPCPAPPVA(SEQ ID NO：2的氨基酸6-15)以及IgG1CH2结构域替换为IgG4的。参见，例如，图13、图14、图15、图16和图17。

具有隐形突变的工程化IgG4具有三个氨基酸置换(EFLG(SEQ ID NO：95)至PVA)，以类似于IgG2的铰链区-其缺乏结合FcγR1的能力-在铰链稳定的IgG4的框架中(CPPC(SEQID NO：100)或CPSC(SEQ ID NO：101))，其缺乏结合C1 q的能力。参见，例如，图13、图14、图15、图16和图17。

在本发明的一个实施方案中，VEGF阱或微阱在铰链区中具有IgG1 uber或uber隐形突变，使得CPPCPAPELLG(SEQ ID NO：102)成CPPCPAPGGG(SEQ ID NO：103)；或VEGF阱或微阱在铰链区中具有IgG4 uber或uber隐形突变，使得CPPCPAPEFLG(SEQ ID NO：104)成CPPCPAPGGG(SEQ ID NO：103)。

具有人IgG1隐形Fc或人IgG4隐形Fc的VEGF阱或微阱替代VEGF阱IgG1中的铰链中的倾向于预先存在的抗铰链抗体应答的氨基酸残基(PEL)。由于这些嵌合Fc区的IgG铰链与人IgG2的之间的序列保守性，它们对预先存在的抗铰链抗体(AHA)的应答低。

嵌合IgG2/IgG4 Fc VEGF阱和微阱是本发明的部分。这些分子组合了IgG2和IgG4同种型的有利特异性并具有最小的效应子功能的能力。已知不同的IgG同种型发挥不同类型和水平的效应子功能。这些差异大部分是由于每个同种型与不同的FcγR相互作用的能力，以及与补体成分C1q相互作用的能力。IgG2和IgG4同种型均证明了与IgG1同种型相比降低的产生Fc依赖性效应子功能的能力。

本发明还包括VEGF微阱，其是本发明的VEGF阱蛋白水解切割的结合VEGF的产物，其中切割除去了部分MC。例如，在本发明的一个实施方案中，用IdeS蛋白酶(或其变体)或在GPSV(SEQ ID NO：41的氨基酸218-221)前切割的另一种蛋白酶进行蛋白水解切割。

在本发明的一个实施方案中，本发明的VEGF微阱包含如下所示的氨基酸序列：

REGN10103-VEGF微阱hIgG2 Fcw/4Cys CPPAPPAPPVA(SEQ ID NO：105)

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISN ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKERKCCVECPPCPAPPVA(SEQ ID NO：32)；

REGN10105-VEGF微阱hIgG2 Fcw/2Cys CPPAPAPPVA(SEQ ID NO：106)

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISN ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKVECPPCPAPPVA(SEQID NO：33)

微-REGN10104(mREGN10104)-VEGF微阱hIgG1隐形Fc

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISN ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPPVA(SEQ ID NO：34)；REGN10104，其中Fc结构域(或其片段)已经除去。

微-REGN10187(mREGN10187)-VEGF微阱hIgG4隐形Fc

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISN ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKESKYGPPCPPCPAPPVA(SEQ ID NO：35)；REGN10187，其中Fc结构域(或其片段)已经除去。

微-REGN10511(mREGN10511)-VEGF微阱hIgG1-2嵌合Fc

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISN ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPPVA(SEQ ID NO：36)；REGN10511，其中Fc结构域(或其片段)已经除去。

微-REGN10512(mREGN10512)-VEGF微阱hIgG1 Mut GGGF(SEQ ID NO：92)Fc

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISN ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPGGGFLG(SEQ ID NO：37)；REGN10512，其中Fc结构域(或其片段)已经除去。

微-REGN10513(mREGN10513)-VEGF微阱hIgG1MutGGGG(SEQ ID NO：93)Fc

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISN ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPGGGGLG(SEQ ID NO：38)；REGN10513，其中Fc结构域(或其片段)已经除去。

微-REGN10514(mREGN10514或REGN11095)-VEGF微阱hIgG1 Mut GGGL(SEQ ID NO： 94)Fc

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISN ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPGGGLLG(SEQ ID NO：39)；REGN10514，其中Fc结构域(或其片段)已经除去。

微-REGN10515(mREGN10515)-VEGF微阱hIgG1 Del(APE)Fc

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISN ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPLLG(SEQ ID NO：40)；REGN10515，其中Fc结构域(或其片段)已经除去。

参见图7。

在本发明的一个实施方案中，本发明的VEGF阱包含如下所示的氨基酸序列：

REGN10102-VEGF阱hIgG2 Fc w/2Cys

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISN ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：41)

REGN10104-VEGF阱hIgG1隐形Fc

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISN ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：42)

REGN10117-VEGF阱hIgG2 Fc w/4Cys

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNA TYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

(SEQ ID NO：43)

REGN10187-VEGF阱hIgG4隐形Fc

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISN ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：44)

REGN10511-VEGF阱hIgG1-2嵌合Fc

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISN ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：45)

REGN10512-VEGF阱hIgG1 Mut GGGF(SEQ ID NO：92)Fc

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISN ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPGGGFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：46)

REGN10513-VEGF阱hIgG1 Mut GGGG(SEQ ID NO：93)Fc

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISN ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPGGGGLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：47)

REGN10514-VEGF阱hIgG1 Mut GGGL(SEQ ID NO：94)Fc

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISN ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPGGGLLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：48)

REGN10515-VEGF阱hIgG1 Del(APE)Fc

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISN ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPLLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：49)

这样的VEGF阱可通过IdeS蛋白酶切割。是这样切割的产物的VEGF微阱是本发明的部分。参见图7。

各种VEGF阱和VEGF微阱之间的序列对比列于图5和6。

多肽“变体”(例如，包括SEQ ID NO：32-49任一个的氨基酸序列的多肽的变体)是指包含与本文所示的参考氨基酸序列为至少约70-99.9％(例如，70、72、74、75、76、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9％)相同或相似的氨基酸序列的多肽；通过BLAST算法进行比较时，其中选择算法的参数以获得在相应参考序列的整个长度上相应序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字大小：3；询问范围中的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；缺口代价：存在11、延伸1；条件组成分数矩阵调整)。在本发明的一个实施方案中，多肽的变体是的相对于本文所示的参考氨基酸序列包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个点突变(例如，氨基酸置换、缺失和/或插入)的多肽。具有是本文所示那些中任一个的变体的氨基酸序列的VEGF阱和微阱是本发明的部分。

以下参考文献涉及常常用于序列分析的BLAST算法：BLAST ALGORITHMS:Altschul等(2005)FEBS J.272(20):5101-5109；Altschul,S.F.等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.等(1993)Nature Genet.3:266-272；Madden,T.L.等(1996)Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.等(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Zhang,J.等(1997)Genome Res.7:649-656；Wootton,J.C.等(1993)Comput.Chem.17:149-163；Hancock,J.M.et al.,(1994)Comput.Appl.Biosci.10:67-70；ALIGNMENT SCORING SYSTEMS:Dayhoff,M.O.等，"A model of evolutionary change in proteins."，见Atlas ofProtein Sequence and Structure,(1978)vol.5,suppl.3.M.O.Dayhoff(编辑)，pp.345-352,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.；Schwartz,R.M.等，"Matrices fordetecting distant relationships."，见Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)vol.5,suppl.3."M.O.Dayhoff(编辑)，pp.353-358,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.；Altschul,S.F.,(1991)J.Mol.Biol.219:555-565；States,D.J.等(1991)Methods 3:66-70；Henikoff,S.等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919；Altschul,S.F.等(1993)J.Mol.Evol.36:290-300；ALIGNMENT STATISTICS:Karlin,S.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268；Karlin,S.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877；Dembo,A.等(1994)Ann.Prob.22:2022-2039；和Altschul,S.F."Evaluating the statistical significance of multiple distinctlocal alignments."，见Theoretical and Computational Methods in Genome Research(S.Suhai编辑)，(1997)pp.1-14,Plenum,New York。

如本文所示，术语“REGN10104”；“mREGN10104”；“REGN10102”；“REGN10105”；“REGN10117”；“REGN10103”；“REGN10187”；“mREGN10187”；“REGN10511”；“mREGN10511”；“REGN10512”；“mREGN10512”；“REGN10513”；“mREGN10513”；“REGN10514”；“REGN11095”；“REGN10515”；“mREGN10515”是指分别包括多肽的VEGF阱和VEGF微阱，所述多肽包括这些名称下的本文所述的氨基酸序列及其变体；和/或包括两个或更多个这样的多肽的多聚体(例如，同型二聚体)。

在本发明的一个实施方案中，根据以下的任一个或多个表征如本文所示的VEGF微阱：

·例如在25℃，以约1或2或1-2pM(例如约0.74pM、0.8、0.86、0.865pM、1pM、1.1pM、1.08pM、1.78pM、2.6pM、1.89pM、1.37pM、1.08pM、1.82pM或1.37pM)的K_D或更高的亲和力结合人VEGF₁₆₅或VEGF₁₂₁，例如，VEGF₁₆₅，例如，其中所述亲和力通过表面等离子体共振来测量，例如，在约2.5nM至约0.078pM人VEGF₁₆₅的存在下。

·对于阻断VEGFR1和/或VEGFR2的VEGF₁₂₁和/或VEGF₁₆₅激活，具有约1-2×10^-11M的IC₅₀，例如，如在表达VEGF受体，例如还具有NFκB-荧光素酶-IRES-eGFP报告基因的HEK293细胞中测量的(例如，其中胞外结构域与IL18Rα或IL18β的胞质结构域融合)。例如，对于阻断(i)VEGFR1的VEGF₁₆₅(40pM)激活(例如，约1.06×10^-11M或约2.19×10^-11M)；(ii)VEGFR2的VEGF₁₆₅(20pM)激活(例如，约2.46×10^-11M或约2.39×10^-11M)；(iii)VEGFR1的VEGF₁₂₁(40pM)激活(例如，约1.74×10^-11M或约2.16×10^-11M)；(iv)VEGFR2的VEGF₁₂₁(60pM)激活(例如，约1.80×10^-11M或约2.30×10^-11M)。

·猴初始血清样品和/或人AMD/DME基线血清样品展示出免疫原性低于REGN7483的，例如，如通过抗药物抗体(ADA)测定测量的，例如电化学发光免疫测定桥接测定，例如，其中所述VEGF微阱用生物素和钌标记，例如，其中ADA结合生物素和钌标记的VEGF微阱，形成桥，其中生物素标记的VEGF微阱结合链霉亲和素涂覆的板表面，例如，其中电流激活钌标记的药物以产生指示复合物存在的电化学发光信号。参见图11(A)中的测定格式概括。

·与VEGF₁₆₅同型二聚体形成1:1复合物(REGN10105:VEGF₁₆₅同型二聚体或REGN10105:VEGF₁₆₅同型二聚体)(例如，以6μm:2μm；2μm:2μm或2μm:6μm比例的VEGF微阱:VEGF₁₆₅同型二聚体)。

·与VEGF₁₆₅同型二聚体和REGN18抗VEGF Fab形成1:1:2复合物(REGN10105:VEGF₁₆₅同型二聚体:REGN18)。

·在OIR小鼠模型中玻璃体内给药时(例如，以约0.125、0.025、0.25或2.5微克/眼)降低视网膜新生血管形成(例如，相对于给药人Fc的小鼠)，例如，如在视网膜平片下测量。

·在玻璃体内注射时(例如，约.115、.146或.147微克/眼)，在兔(例如新西兰白兔)眼中，与阿柏西普相比，显示出更快的玻璃体内半衰期(例如，约3.4或3.9天)，例如，其中VEGF微阱用10mM组氨酸配制，例如，其中VEGF微阱与AF488染料缀合。

·在玻璃体内注射时(例如，5.5mg/眼)，与阿柏西普(例如，4mg/眼)相比(例如，在非人灵长类动物(NHP)中)，展现全身暴露(如游离分子血浆水平)较少。例如，在注射(例如，单次注射)约5.5mg/眼约336小时后，血浆中游离分子(例如NHP)的浓度约为0.1或0.2或0.1-0.2微克/ml(或更低)。

·在多次玻璃体内注射(例如，4次，例如，约每28天一次)例如约5.5mg/眼后，不会例如在非人灵长类动物的血浆中累积(例如，作为游离或结合VEGF的分子)。

·在如升高的温度(例如37℃，例如4周)的应激条件下，在大约等摩尔条件下，比阿柏西普表现出更高的稳定性。例如，在90mg/ml时，每周产生约3-4％(例如，3.5、3.6、3.7、3.74、4.0或4.1)的高分子量物质(HMW)(例如，在37℃4周)；和/或在120mg/ml时，每周产生约5-6％(例如，5.0、5.1、5.2、5.3、5.5、5.7或5.9)的高分子量物质(HMW)(例如，在37℃4周)；例如，而140mg/ml的阿柏西普每周产生约5.6％的高分子量物质(HMW)(例如，在37℃持续4周)；或，例如，而REGN7483^F在90mg/ml时每周产生约5-6％(例如，5.4、5.45、5.5、5.6)的HMW物质(例如，在37℃4周)。REGN7483^F微阱是通过FabRICATOR切割阿柏西普产生的。

·在约1000rpm和/或两个冻融循环(例如，在约90mg/ml或120mg/ml)下搅拌约15分钟后，聚集水平没有显著变化。

·相比于REGN7483，展现较低的粘度，例如90mg/ml时约5.8，120mg/ml时(例如在20℃)约12.1cP；例如，而REGN7483在90mg/ml时具有约6.9cP的粘度；或在120mg/ml时12.1cP，或例如，而REGN7483在120mg/ml时(例如，在20℃在组氨酸存在下)具有约14.5cP的粘度，例如，其中VEGF微阱是REGN10105。

·相比于REGN7483，展现出更高的光稳定性，例如，HMW增加约8.7％(相对于暗对照样品)/M lux*hr(例如，其中VEGF微阱为REGN10105)；而，例如，REGN7483呈现出约9.5％的HMW增加(相对于黑暗对照样品)/M lux*hr，例如，在约10mg/ml浓度，例如，其中光是冷白光和/或紫外光。

·在包含VEGF阱和/或VEGF微阱(例如，具有IgG2铰链区)的组合物中，这些分子用N-聚糖糖基化(例如岩藻糖基化、唾液酸化、半乳糖基化和甘露糖基化或用二等分N-聚糖修饰)，使得总N-聚糖的约43-45％具有核心岩藻糖残基，总N-聚糖的约64-72％具有至少一个半乳糖残基，总N-聚糖的约20-27％具有至少一个唾液酸残基，约19-25％鉴定为具有高甘露糖(例如Man5)和/或总N-聚糖的约1.6-1.9％是二等分聚糖；例如，其中此类分子用N-聚糖糖基化，使得总N-聚糖的约43.3％具有核心岩藻糖残基，总N-聚糖的约64.4％具有至少一个半乳糖残基，总N-聚糖的约20％具有至少一个唾液酸残基，约25.2％鉴定为具有高甘露糖(例如Man5)和/或约1.6％的总N-聚糖是二等分聚糖(例如，其中VEGF微阱是REGN10103)；或此类分子用N-聚糖糖基化，使得总N-聚糖的约44.8％具有核心岩藻糖残基，总N-聚糖的约71.6％具有至少一个半乳糖残基，总N-聚糖的约26.5％具有至少一个唾液酸残基，约18.6％鉴定为具有高甘露糖(例如Man5)和/或总N-聚糖的约1.9％为二等分聚糖(例如，其中VEGF微阱是REGN10105)。

·VEGF阱或微阱的一个或多个丝氨酸或苏氨酸是O-糖基化的；

·VEGF阱或微阱的一个或多个天冬酰胺是脱酰胺的；

·VEGF阱或微阱的一个或多个天冬氨酸-甘氨酸基序转化成异-天冬氨酸-甘氨酸和/或Asn-Gly；

·VEGF阱或微阱的一个或多个甲硫氨酸是氧化的；

·VEGF阱或微阱的一个或多个色氨酸转变成N-甲酰犬尿氨酸

·VEGF阱或微阱的一个或多个精氨酸转变成Arg 3-脱氧葡糖醛酮；

·VEGF阱或微阱的C-末端残基(例如，甘氨酸或丙氨酸)不存在；

·VEGF阱或微阱中存在一个或多个未糖基化的糖基化位点；

·VEGF阱或微阱是木糖基化的；

·VEGF阱或微阱在赖氨酸处被糖基化；

·VEGF阱或微阱包含具有游离硫醇基团的胱氨酸；

·VEGF阱或微阱包含链内二硫键；

·VEGF阱或微阱包含平行或交叉方向的二硫键；和/或

·VEGF阱或微阱包含羧甲基化的赖氨酸或精氨酸。

参见，例如，Guidance for Industry Q1B Photostability Testing of NewDrug Substances and Products,U.S.Department of Health and Human Services,Foodand Drug Administration,Center for Drug Evaluation and Research(CDER),Centerfor Biologics Evaluation and Research(CBER)，1996年11月。

本文所示的VEGF阱和VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；或mREGN10515)也可以是糖基化的(例如，用N-连接的和/或O-连接的聚糖)。例如，在本发明的一个实施方案中，VEGF阱或微阱在一个或多个位点是唾液酸化的、半乳糖基化的和/或岩藻糖基化的。在本发明的一个实施方案中，VEGF阱或微阱具有一个或多个N-连接的甘露糖-5聚糖(Man5)。在本发明的一个实施方案中，VEGF阱或VEGF微阱包括通常添加至在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达的分子上的糖基化(CHO细胞糖基化)。参见，例如，Carillo等，Glycosylation Analysis of Therapeutic Glycoproteins Produced in CHO Cells,Methods Mol Biol.2017；1603:227-241；或Hossler等，Optimal and consistent proteinglycosylation in mammalian cell culture,Glycobiology 19(9):936-949(2009)。在本发明的一个实施方案中，VEGF阱或微阱是包括阱或微阱的糖基化变体的异质混合物的组合物。单独的VEGF阱或VEGF微阱分子关于其特定的糖基化模式可以不同于组合物中的其他分子。例如，约47％的分子可以是唾液酸化的，约70％的分子可以半乳糖基化的，约36％的分子可以是岩藻糖基化的和/或约11％的分子可以是Man-5糖基化的。在本发明的一个实施方案中，包含VEGF阱和/或VEGF微阱的组合物具有约43.3％岩藻糖基化的，约64.4％半乳糖基化的，约20％唾液酸化的，约25.2％高甘露糖聚糖和约1.6％二等分N-聚糖的聚糖谱(例如，其中VEGF微阱是REGN10103)；或具有约44.8％岩藻糖基化的，约71.6％半乳糖基化的，约26.5％唾液酸化的，约18.6％高甘露糖聚糖和约1.9％二等分N-聚糖的聚糖谱(其中VEGF微阱是REGN10105)。

参见，例如，Yu等，Production,characterization,and pharmacokineticproperties of antibodies with N-linked mannose-5 glycans,MAbs.2012年7-8月；4(4):475-87。

在本发明的一个实施方案中，REGN10105在以下所示的一个或多个下划线的N残基处是N-糖基化的(例如，如本文所述)SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKVECPPCPAPPVA(SEQ ID NO：33)。本文所示的其他VEGF阱和微阱中的相应N残基可以相似地是N-糖基化的。

在本发明的一个实施方案中，本文所示的VEGF阱或微阱中的一个或多个组氨酸是2-氧-组氨酸。

可以产生2-氧-组氨酸(2-氧-his)的两种化学版本，

其相对于组氨酸，分子量增加13.98Da(13.98Da版本)；或

其相对于组氨酸，分子量增加15.99Da(15.99Da版本)；其中2-氧-组氨酸的13.98Da版本是CDM中表达的微阱中观察到的主要部分。可以通过分光光度法评估肽中2-氧-组氨酸的13.98Da版本的含量，因为这部分在350nM波长具有增强的光吸收，而15.99Da版本不具有这样的增强吸收。可以通过光来催化微阱中的2-氧-组氨酸的13.98Da版本的形成，而15.99Da版本的形成可以通过金属(如铜(Cu²⁺))来催化。

色氨酸的氧化可以获得复杂的产物混合物。主要的产物可以是N-甲酰犬尿氨酸和犬尿氨酸，以及单氧化、二氧化和/或三氧化产物。带有氧化Trp修饰的肽通常呈现出4、16、32和48Da的质量增加，对应于犬尿氨酸(KYN)、羟基色氨酸(W_ox1)和N-甲酰犬尿氨酸/二羟基色氨酸(NFK/W_ox2，也称为“双氧化Trp”)、三羟基色氨酸(W_ox3，也称为“三氧化Trp”)及其组合，如羟基犬尿氨酸(KYN_ox1，+20Da)的形成。氧化成羟基色氨酸(W_ox1)(Mass spectrometricidentification of oxidative modifications of tryptophan residues in proteins:chemical artifact or post-translational modification？J Am Soc MassSpectrom.2010Jul；21(7):1114–1117)。与色氨酸相似，酪氨酸的氧化主要产生3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)和二酪氨酸(Li,S,C Schoneich和RT.Borchardt.1995.ChemicalInstability of Protein Pharmaceuticals:Mechanisms of Oxidation and Strategiesfor Stabilization.Biotechnol.Bioeng.48:490-500)。

本发明的范围包括组合物，其中所述组合物中的VEGF微阱或阱中约0.1-2％(或更低，例如，0.1％或更低，或0.05％或0.01％)的组氨酸是2-氧-组氨酸。

IDES及其变体

本发明包括通过用酿脓链球菌IdeS(FabRICATOR)及其变体蛋白水解消化阿柏西普产生的VEGF微阱及其组合物。FabRICATOR可从Genovis,Inc,；Cambridge，MA；Lund，瑞典，商购获得。

在一个实施方案中，IdeS多肽包含在SEQ ID NO：50-65所示的全长分离氨基酸序列上具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。在一个方面中，分离的氨基酸序列在全长的分离氨基酸序列上具有至少约80％的序列同一性。在另一个方面中，分离的氨基酸序列在全长的分离氨基酸序列上具有至少约90％的序列同一性。在另一个方面中，分离的氨基酸序列在全长的分离氨基酸序列上具有至少约100％的序列同一性。在一个方面中，多肽能够将靶蛋白切割成片段。在特定方面中，靶蛋白是IgG。在另一个特定方面中，靶蛋白是融合蛋白。在再另一个特定方面中，片段可以包含Fab片段和/或Fc片段。

在一个实施方案中，IdeS氨基酸序列包含由

MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN(SEQ ID NO：66)限定的亲本氨基酸序列，但位置87、130、182和/或274的天冬酰胺突变为除了天冬酰胺以外的氨基酸。在一个实施方案中，与亲本氨基酸序列相比，突变可以在碱性pH值给予增加的化学稳定性。在另一个方面中，与亲本氨基酸序列相比，突变可以在碱性pH值给予化学稳定性增加50％。在一个方面中，氨基酸可以选自天冬氨酸、亮氨酸和精氨酸。在特定方面中，位置87的天冬酰胺残基突变为天冬氨酸残基。在另一个特定方面中，位置130的天冬酰胺残基突变为精氨酸残基。在再另一个特定方面中，位置182的天冬酰胺残基突变为亮氨酸残基。在再另一个特定方面中，位置274的天冬酰胺残基突变为天冬氨酸残基。在再另一个特定方面中，位置87和130的天冬酰胺残基被突变了。在再另一个特定方面中，位置87和182的天冬酰胺残基被突变了。在再另一个特定方面中，位置87和274的天冬酰胺残基被突变了。在再另一个特定方面中，位置130和182的天冬酰胺残基被突变了。在再另一个特定方面中，位置130和274的天冬酰胺残基被突变了。在再另一个特定方面中，位置182和274的天冬酰胺残基被突变了。在再另一个特定方面中，位置87、130和182的天冬酰胺残基被突变了。在再另一个特定方面中，位置87、182和274的天冬酰胺残基被突变了。在再另一个特定方面中，位置130、182和274的天冬酰胺残基被突变了。在再另一个特定方面中，位置87、130、182和274的天冬酰胺残基被突变了。

可以通过已经固定于固体支持物(例如，色谱珠)的IdeS来切割阿柏西普或另一种VEGF阱。例如，可以将在缓冲水溶液中(在切割缓冲剂中)包括VEGF阱的样品施加于例如色谱柱中固定的IdeS。可以将柱例如在约18℃孵育例如30分钟。然后可以用切割缓冲剂洗涤柱。切割后，可以将消化和洗涤溶液施加于蛋白A柱以捕获切割的Fc副产物，其中微阱产物保留在流过级分中。在本发明的一个实施方案中，切割缓冲剂和/或蛋白A柱平衡和洗涤溶液为pH7，例如，40mM Tris，54mM醋酸盐pH7.0±0.1。这样用于制备VEGF微阱的方法是本发明的部分。

在本发明的一个实施方案中，IdeS变体包括以下所示氨基酸序列：

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(SEQ ID NO：50)；

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(SEQ ID NO：51)；

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(SEQ ID NO：52)；

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(SEQ ID NO：53)；

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(SEQ ID NO：54)；

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(SEQ ID NO：55)；

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(SEQ ID NO：56)；

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(SEQ ID NO：57)；

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(SEQ ID NO：58)；

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(SEQ ID NO：59)；

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(SEQ ID NO：60)；

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(SEQ ID NO：61)；

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(SEQ ID NO：62)；

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(SEQ ID NO：63)；

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(SEQ ID NO：64)；或

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(SEQ ID NO：65)。

与亲本氨基酸序列(SEQ ID NO：66)相比，这样的IdeS变体在碱性pH值具有增加的化学稳定性。

本发明包括组合物，所述组合物包括本文所示的VEGF微阱和用于通过IdeS切割产生VEGF微阱产物的相应VEGF阱。混合物中的VEGF阱是对于IdeS来蛋白水解的未消化的或有待消化的反应物。例如，组合物可以包括：

·VEGF阱REGN10102和VEGF微阱REGN10105；

·VEGF阱REGN10104和VEGF微阱mREGN10104；

·VEGF阱REGN10117和VEGF微阱REGN10103；

·VEGF阱REGN10187和VEGF微阱mREGN10187；

·VEGF阱REGN10511和VEGF微阱mREGN10511；

·VEGF阱REGN10512和VEGF微阱mREGN10512；

·VEGF阱REGN10513和VEGF微阱mREGN10513；

·VEGF阱REGN10514和VEGF微阱REGN11095；和/或

·VEGF阱REGN10515和VEGF微阱mREGN10515。

在本发明的一个实施方案中，VEGF微阱比VEGF阱多(例如，摩尔或克)，例如，多2、5、10或15倍。这样的组合物可以进一步包括IdeS或其变体，例如，如本文所示的。IdeS可以不存在或仅微量存在，例如，0.04ppm(或更低)或低于0.3ppm。组合物还可以包括有利于进行蛋白酶切割的缓冲剂和/或其他组分。

多核苷酸、载体、宿主细胞和制备方法

编码本文所示的任何VEGF阱或VEGF微阱多肽的分离多核苷酸形成本发明的部分，如本文所示的包含多核苷酸的载体和/或包含多核苷酸、载体、VEGF阱或VEGF微阱和/或多肽的宿主细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)那样。这样的宿主细胞形成本发明的部分。

多核苷酸包括DNA和RNA。本发明包括本发明的任何多核苷酸，例如，编码本文所示的VEGF阱或VEGF微阱多肽(例如，SEQ ID NO：32-49的任一个)。任选，多肽可操作地连接启动子或其他表达控制序列。在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸与分泌信号序列融合。由这样的多核苷酸编码的多肽也在本发明的范围内。

在本发明的一个实施方案中，编码REGN10103的多核苷酸包含核苷酸序列：

AGTGATACCGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCAATACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATGGAATTGAACTATCTGTTGGAGAAAAGCTTGTCTTAAATTGTACAGCAAGAACTGAACTAAATGTGGGGATTGACTTCAACTGGGAATACCCTTCTTCGAAGCATCAGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACCTAAAAACCCAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGTGTAACCCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACCAAGAAGAACAGCACATTTGTCAGGGTCCATGAAAAGGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCATGA(SEQ IDNO：71)

在本发明的一个实施方案中，编码REGN10105的多核苷酸包含核苷酸序列：

AGTGATACCGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCAATACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATGGAATTGAACTATCTGTTGGAGAAAAGCTTGTCTTAAATTGTACAGCAAGAACTGAACTAAATGTGGGGATTGACTTCAACTGGGAATACCCTTCTTCGAAGCATCAGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACCTAAAAACCCAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGTGTAACCCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACCAAGAAGAACAGCACATTTGTCAGGGTCCATGAAAAGGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCATGA(SEQ ID NO：72)

在本发明的一个实施方案中，编码REGN11095的多核苷酸包含核苷酸序列：

AGTGATACCGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCAATACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATGGAATTGAACTATCTGTTGGAGAAAAGCTTGTCTTAAATTGTACAGCAAGAACTGAACTAAATGTGGGGATTGACTTCAACTGGGAATACCCTTCTTCGAAGCATCAGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACCTAAAAACCCAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGTGTAACCCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACCAAGAAGAACAGCACATTTGTCAGGGTCCATGAAAAGGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGGCGGTGGACTTCTAGGGTGA(SEQ ID NO：73)

通常，“启动子”或“启动子序列”是能够(例如，直接地或通过其他结合启动子的蛋白质或物质)结合细胞中的RNA聚合酶并启动编码序列转录的DNA调控区。启动子可以可操作地连接至包括增强子和遏制子序列的其他表达控制序列，和/或连接本发明的多核苷酸。可以用于控制基因表达的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子(美国专利No.5,385,839和5,168,062)、SV40早期启动子区(Benoist等，(1981)Nature 290:304-310)、劳斯肉瘤病毒的3’长末端重复中含有的启动子(Yamamoto等，(1980)Cell 22:787-797)、疱疹胸甘激酶启动子(Wagner等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1441-1445)、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等，(1982)Nature 296:39-42)；原核生物表达载体，如β-内酰胺酶启动子(VIIIa-Komaroff等，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3727-3731)，或tac启动子(DeBoer等，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25；还参见Scientific American(1980)242:74-94中的“Useful proteins from recombinant bacteria”；和来自酵母或其他真菌的启动子元件，如Gal4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子或碱性磷酸酶启动子。

当在细胞或其他表达系统中，其他表达控制序列引导RNA聚合酶介导的编码序列转录成RNA，优选mRNA，其随后可以进行RNA剪接(如果其含有内含子)和任选地翻译成由编码序列编码的蛋白质时，编码多肽的多核苷酸“可操作地连接”至启动子或其他表达控制序列。

本发明包括编码VEGF阱或VEGF微阱多肽链的多核苷酸，所述多肽链是在本文具体列出的那些氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：32-49)的变体。

真核和原核细胞宿主细胞，包括哺乳动物细胞，可以用作VEGF阱或VEGF微阱多肽(例如，SEQ ID NO：32-49的任一个)表达的宿主。这样的宿主细胞是本领域公知的并且许多可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。这些宿主细胞包括，尤其是，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO K1、EESYR、NICE、NS0、Sp2/0、胚肾细胞和BHK细胞。宿主细胞包括真菌细胞，如毕赤酵母(Pichia)例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，或细菌细胞，例如，大肠杆菌(E.coli)。本发明包括分离的宿主细胞(例如，CHO细胞或上述任何类型的宿主细胞)，其包含一个或多个VEGF阱或VEGF微阱多肽(或其变体)和/或编码这样的多肽的多核苷酸(例如，如本文讨论的)。编码VEGF阱或VEGF微阱的多核苷酸，或其载体，可以是异位的或通过染色体整合至染色体DNA或宿主细胞中。

转化可以是用于将多核苷酸引入宿主细胞中的任何已知方法。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法是本领域公知的并且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体中多核苷酸的包装、基因枪注射以及将DNA直接微注射至核中。此外，可以通过病毒载体将核酸分子引入哺乳动物细胞中。转化细胞的方法是本领域公知的。参见，例如，美国专利No.4399216、4912040、4740461和4959455。因此，本发明包括用于制备VEGF阱或VEGF微阱的重组方法，包括步骤：

(i)在有利于编码VEGF阱或VEGF微阱的多肽表达的条件下(例如，在生物反应器中，例如，在化学限定培养基(CDM)或非CDM中)培养宿主细胞(例如，CHO或毕赤酵母或巴斯德毕赤酵母)，和，

(ii)任选，从宿主细胞和/或其中宿主细胞生长的培养基分离VEGF阱或VEGF微阱或其链。

在本发明的一个实施方案中，该方法包括将一个或多个编码VEGF阱或VEGF微阱多肽(例如，包括SEQ ID NO：32-49任一个中所示的氨基酸序列)的多核苷酸引入宿主细胞中的步骤，例如，其中多核苷酸在载体中；和/或整合至宿主细胞染色体中和/或可操作地连接启动子。制备包括两条或更多条多肽链的VEGF阱或VEGF微阱时，链在单个宿主细胞中的共同表达导致链的缔合，例如，在细胞中或在细胞表面上或在细胞外(如果这样的链被分泌)，以形成同型二聚VEGF微阱。本发明还包括其是本文所示生产方法和任选本文所示纯化方法的产物的VEGF阱或VEGF微阱。

重组VEGF阱和VEGF微阱(例如，SEQ ID NO：32-49的任一个)是本发明的部分，例如，其是此类方法的产物。

参见，例如，Ling等，Development and manufacturability assessment ofchemically-defined medium for the production of protein therapeutics in CHOcells,Biotechnol Prog Sep-Oct 2015；31(5):1163-71。

本发明还提供了制备本文所示的VEGF阱或从VEGF阱制备VEGF微阱(例如，同型二聚VEGF微阱)的方法，包括以下步骤、由以下步骤组成或基本上由以下步骤组成：用切割Fc铰链结构域下(至C-末端侧)的免疫球蛋白Fc多聚组分中的VEGF阱的蛋白酶蛋白水解VEGF阱，使得下铰链或其一部分是VEGF微阱产物的部分。例如，蛋白水解可以用酿脓链球菌IdeS(例如，FabRICATOR蛋白酶；Genovis,Inc.；Cambridge，MA；Lund，瑞典)或兽疫链球菌Streptococcus equi subspecies zooepidemicus)IdeZ(New England Biolabs；Ipswich，MA)进行。在本发明的一个实施方案中，这样的方法缺乏包括这些VEGF微阱多肽的氨基酸残基(例如，定向化学修饰，如PEG化或碘乙酰胺化)的明显修饰和/或二硫键还原的任何步骤。此类制备方法的VEGF微阱产物也是本发明的部分。

此类制备VEGF微阱的方法后是用于例如从杂质(如Fc片段、蛋白水解酶或其他材料)纯化VEGF微阱的方法。在本发明的一个实施方案中，用于纯化的方法在促进同型二聚VEGF微阱形成的条件下进行(例如，在非还原条件下，例如，在不存在还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇的情况下)。此类制备方法和/或纯化方法的VEGF微阱产物也是本发明的部分。在本发明的一个实施方案中，通过包括色谱纯化的方法来进行纯化。

本发明还提供了分离的多肽，其包括选自SEQ ID NO：32-49的氨基酸序列，或由选自SEQ ID NO：32-49的氨基酸序列组成或基本上由选自SEQ ID NO：32-49的氨基酸序列组成。包含此类多肽的组合物是本发明的部分，例如，其中所有或一部分这样的多肽缔合成例如可以与VEGF结合的同型二聚VEGF阱或VEGF微阱复合物。此类组合物可以包括例如一个或多个宿主细胞、蛋白酶(例如，IdeS)和培养基。

生物反应器，如罐生物反应器或一次性生物反应器，可以用于培养表达VEGF阱或VEGF微阱的宿主细胞。这样的生物反应器可以包括用于培养物混合的叶轮(如涡轮、船用或螺旋式设计)和用于控制培养基的温度、pH、氧和/或氮含量的装置。生物反应器体积可以是研究规模的(例如，250mL或2升)或制造规模的(例如，2000升或10000升)。本发明包括罐生物反应器，其包含本发明的VEGF阱和/或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；或mREGN10515)和任选的宿主细胞(例如，如本文讨论的)和/或培养基(例如，CDM)。参见，例如，Innovations in Cell Culture,BioProcess Vol.12(suppl 5)(Sept.2014)。

组合和药物制剂

本发明提供了包括VEGF阱或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；或mREGN10515)结合一种或多种成分的组合物；及其使用方法和制备这些组合物的方法。包含VEGF微阱和药学上可接受的载剂或赋形剂的药物制剂是本发明的部分。在本发明的一个实施方案中，本发明的药物制剂具有大约5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1或6.2的pH。

为了制备VEGF阱或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；或mREGN10515)的药物制剂，将微阱与药学上可接受的载剂或赋形剂混合。参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia:National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1984)；Hardman等(2001)Goodman and Gilman'sThe Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,andWilkins,New York,N.Y.；Avis等(编辑)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等(编辑)(1990)PharmaceuticalDosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等(编辑)(1990)PharmaceuticalDosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,N.Y.；Weiner and Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.。在本发明的一个实施方案中，药物制剂是无菌的。这样的组合物是本发明的部分。

本发明的药物制剂包括VEGF阱或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；或mREGN10515)和药学上可接受的载剂，包括，例如，水、缓冲剂、防腐剂和/或去污剂。

本发明的范围包括干燥的(例如，冻干的)组合物，其包含VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；或mREGN10515)或其药物制剂，其包括药学上可接受的载剂，但基本上不含水。

在再一个实施方案中，根据Physicians'Desk Reference 2003(ThomsonHealthcare；第57版(2002年11月1日))，将结合本文公开的VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；或mREGN10515)施用于受试者的其他治疗剂施用于受试者。

本发明提供了包含任一种VEGF阱或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；或mREGN10515)或其包含药学上可接受的载剂的药物制剂的容器(例如，塑料或玻璃瓶，例如，带有盖子，或色谱柱、空心针或注射器筒)。本发明还提供了包含本文所示的VEGF阱或VEGF微阱或制剂的注射装置，例如，注射器、预填充注射器或自动注射器。在本发明的一个实施方案中，容器被着色(例如棕色或绿色)以阻挡光线。

本发明包括含有结合一种或多种其他治疗剂的VEGF阱或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；或mREGN10515)的组合。VEGF阱或VEGF微阱和其他治疗剂可以在单个组合物中或在分开的组合物中。例如，在本发明的实施方案中，其他治疗剂是寡核苷酸(例如，降低VEGF表达的寡核苷酸，例如，反义寡核苷酸)、Ang-2抑制剂(例如，nesvacumab)、Tie-2受体激活子、抗PDEF抗体或其抗原结合片段、抗PDGF受体或PDGF受体β抗体或其抗原结合片段和/或其他VEGF拮抗剂，如阿柏西普、康柏西普、贝伐珠单抗、雷珠单抗、抗VEGF适体，如哌加他尼(pegaptanib)(例如，哌加他尼钠)、单链(例如，VL-VH)抗VEGF抗体(如brolucizumab)、抗VEGF DARPin(如Abicipar Pegol DARPin)、双特异性抗VEGF抗体，例如，其还结合ANG2，如RG7716，或人血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)的可溶性形式，其包含胞外结构域1-3，表达为Fc-融合蛋白。

施用和治疗

本发明提供了用于治疗或预防受试者的癌症(例如，至少部分由VEGF介导了其生长和/或转移，例如，VEGF介导的血管生成)或血管生成性眼病的方法，包括将治疗有效量的VEGF阱或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；或mREGN10515)施用于受试者。

本发明还提供了用于治疗需要的受试者的癌症(例如，至少部分由VEGF介导了其生长和/或转移，例如，VEGF介导的血管生成)或血管生成性眼病的方法，该方法包括将治疗有效量的本文所示的VEGF阱或VEGF微阱和任选的其他治疗剂施用于受试者的身体，例如，施用于受试者的眼中。如本文使用的，表述“血管生成性眼病”表示由血管生长或增殖引起的或与血管生长或增殖相关的或由血管渗漏引起的任何眼病。在本发明的一个实施方案中，通过玻璃体内注射来进行给药。使用本文的方法可治疗或可预防的血管生成性眼病的非限制性实例包括：

·年龄相关性黄斑变性(AMD)(例如湿性或干性，优选湿性)

·黄斑水肿，

·视网膜静脉阻塞后黄斑水肿，

·视网膜静脉阻塞(RVO)，

·视网膜中央静脉阻塞(CRVO)，

·视网膜分支静脉阻塞(BRVO)，

·糖尿病黄斑水肿(DME)，

·脉络膜新生血管形成(CNV)，

·虹膜新生血管形成，

·新生血管性青光眼，

·青光眼术后纤维化，

·增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)，

·视盘新生血管形成，

·角膜新生血管形成，

·视网膜新生血管形成，

·玻璃体新生血管形成，

·血管翳，

·翼状胬肉，

·血管性视网膜病变，

·糖尿病黄斑水肿受试者的糖尿病性视网膜病变；和

·糖尿病性视网膜病变(例如，非增殖性糖尿病性视网膜病变(例如，通过约47或53的糖尿病性视网膜病变严重性等级(DRSS)水平表征的)或增殖性糖尿病性视网膜病变；例如，在不患有DME或中心相关DME的受试者中)。

术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指逆转、稳定或消除不期望的疾病或病症(例如血管生成性眼病或癌症)的治疗措施，例如，通过使此类疾病或病症的一个或多个症状或体征以任何临床可测量的程度消退、稳定或消失，例如，关于血管生成性眼病，通过引起糖尿病性视网膜病变严重性评分(DRSS)的降低或维持，通过改善或维持视力(例如，最佳矫正视力，例如，如通过增加ETDRS字母测量的)，增加或维持视野和/或减少或维持中心视网膜厚度，而关于癌症，阻止或逆转受试者中癌细胞的生长、存活和/或转移。通常，治疗措施是向患有疾病或病症的受试者施用一个或多个剂量的治疗有效量的VEGF阱或VEGF微阱。

用于治疗或预防癌症(例如，其至少部分是由血管生成介导的)或血管生成性眼病的VEGF阱或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；或mREGN10515)的有效或治疗量是指足以引起癌症或血管生成性眼病的逆转、稳定或消除的VEGF阱或VEGF微阱的量，例如，通过使癌症或血管生成性眼病的一个或多个症状或体征以任何临床可测量的程度消退、稳定或消失，例如，关于血管生成性眼病，通过引起糖尿病性视网膜病变严重性评分(DRSS)的降低或维持，通过改善或维持视力(例如，最佳矫正视力，例如，如通过增加ETDRS字母测量的)，增加或维持视野和/或减少或维持中心视网膜厚度，而关于癌症，阻止或逆转受试者中癌细胞的生长、存活和/或转移。在本发明的一个实施方案中，用于治疗或预防血管生成性眼病的VEGF阱或VEGF微阱的有效或治疗有效量为约0.5-25mg，例如，在不超过约100μl中。该量可以根据待给药的受试者的年龄和大小、目标疾病、状况、施用途径等而改变。在某些实施方案中，初始剂量后可以使用第二或多个随后剂量的VEGF阱或VEGF微阱，其量可以与初始剂量大致相同或更低或更高，其中随后剂量可以间隔约1至约8周。

VEGF阱或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；或mREGN10515)或其组合物的施用方式可以改变。给药途径包括胃肠外、非胃肠外、口服、直肠、经黏膜、肠、肌内、皮下、皮内、髓内、鞘内、直接脑室内、静脉内、腹腔内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、眼内、玻璃体内、透皮或动脉内。

本发明提供了将VEGF阱或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；或mREGN10515)施用于受试者的方法，包括将VEGF阱或VEGF微阱或其药物制剂引入受试者体内。例如，在本发明的实施方案中，该方法包括用注射器的针刺入受试者的身体，并将VEGF阱或VEGF微阱或其药物制剂注射至受试者的体内，例如，注射至受试者的眼睛、静脉、动脉、肌肉组织或皮下组织中。

在本发明的一个实施方案中，本发明的药物制剂的玻璃体内注射(其包括本发明的VEGF阱或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；或mREGN10515)包括用含有制剂的注射器和针(例如，30-规格的注射针)刺入眼睛的步骤并将制剂(例如，少于或等于约100微升)注入眼睛的玻璃体中(例如，使用足够的体积以递送本文所示的治疗有效量，例如，约0.5-20mg VEGF微阱)。任选，该方法包括将局部麻醉剂(例如，丙美卡因、利多卡因或丁卡因)、抗生素(例如，氟喹诺酮类)、防腐剂(例如聚维酮碘)和/或瞳孔扩张剂施用于待注射的眼睛。在本发明的一个实施方案中，在注射前建立待注射的眼睛周围的无菌区域。在本发明的一个实施方案中，玻璃体内注射后，监测受试者的眼内压升高、发炎和/或血压。

术语“与……结合”表示本发明的组分VEGF阱或VEGF微阱(例如，REGN10104；mREGN10104；REGN10102；REGN10105；REGN10117；REGN10103；REGN10187；mREGN10187；REGN10511；mREGN10511；REGN10512；mREGN10512；REGN10513；mREGN10513；REGN10514；REGN11095；REGN10515；或mREGN10515)，连同另一种药剂，如抗ANG2，可以配制成单个组合物，例如，用于同时递送，或分开配制成两个或更多个组合物(例如，包括每种组分的药盒)。彼此结合给药的组分可以在不同于另一种成分给药的时间施用于受试者；例如，可以在给定时间段内以间隔非同时(例如单独地或顺序地)给予每次施用。在同一的给药过程中，也可以基本上同时(例如，精确地在同一时间或以非临床显著的时间间隔)施用彼此结合施用的单独组分。此外，可以通过相同或不同的途径将彼此结合给药的单独成分施用于受试者。

如本文使用的，术语“受试者”是指例如，需要预防和/或治疗癌症或血管生成性眼病的哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、猫、狗、奶牛、绵羊、马、山羊、兔)，优选人。受试者可以患有癌症或血管生成性眼病或易罹患产生癌症或血管生成性眼病。

在本发明的一个实施方案中，包括玻璃体内注射本发明的VEGF阱或VEGF微阱步骤的任何方法，例如，用于治疗或预防癌症或血管生成性眼病，不会导致眼内压和/或血压的显著升高。

实施例

这些实施例旨在举例说明本发明，而不是其限制。实施例中所示的组合物和方法形成本发明的部分。

实施例1：VEGF阱和VEGF微阱以及VEGF在受体捕获的表面上的结合动力学分析。

评估了各种VEGF阱和VEGF微阱的结合特征。

REGN#	VEGF阱或微阱
		REGN110	人VEGF<sub>165</sub>
REGN3	VEGF阱hIgG1 Fc(阿柏西普)
		REGN7483	VEGF微阱hIgG1 Fc
REGN10104	VEGF阱hIgG1隐形Fc
		mREGN10104	VEGF微阱hIgG1隐形Fc
REGN10102	VEGF阱hIgG2 Fc w_2Cys
		REGN10105	VEGF微阱hIgG2 Fc w_2Cys
REGN10117	VEGF阱hIgG2 Fc w_4Cys
		REGN10103	VEGF微阱hIgG2 Fc w_4Cys
REGN10187	VEGF阱hIgG4隐形Fc
		mREGN10187	VEGF微阱hIgG4隐形Fc
REGN10514	VEGF阱hIgG1 Mut GGGL(SEQ ID NO：94)Fc
		REGN11095	VEGF微阱hIgG1 Mut GGGL(SEQ ID NO：94)Fc

REGN3＝SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPC240PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK403TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：69)

实验程序(包括相关细胞系、蛋白质、试剂以及工具类型和模型)。

使用Biacore 3000仪器使用实时表面等离子体共振生物传感器测定人VEGF₁₆₅与各种纯化的VEGF微阱构建体结合的平衡解离常数(K_D值)。所有结合研究均在25℃在10mMHEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％v/v表面活性剂吐温-20，pH7.4(HBS-ET)运行缓冲剂(buffer)中进行。Biacore传感器表面首先通过与单克隆小鼠抗VEGFR1抗体(REGN18)的胺偶联来衍生，以捕获VEGF微阱构建体。对以下人VEGF试剂:人VEGF₁₆₅进行结合研究。在HBS-ET运行缓冲剂中制备不同浓度的VEGF₁₆₅试剂(2.5 nM-0.078pM；人VEGF₁₆₅的2倍系列稀释液)，然后以90_μL/分钟的流速在抗VEGFR1捕获的VEGF微阱构建体表面注射108秒。在HBS-ET运行缓冲剂中监测结合的VEGF₁₆₅试剂与VEGF微阱构建体的分离60分钟。动力学结合(ka)和解离(kd)速率常数通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件将实时传感图拟合到1:1结合模型来确定。如下从动力学速率常数计算结合解离平衡常数(K_D)和解离半衰期(t1/2)：

和

在25℃人VEGF₁₆₅结合不同VEGF微阱构建体的结合动力学参数显示于表1-2和表1-3中。所有VEGF微阱显示出与阿柏西普REGN3相当的结合动力学。

表1-2. 25℃人VEGF₁₆₅结合不同VEGF微阱构建体的结合动力学参数

表1-3. 25℃人VEGF₁₆₅与不同VEGF微阱构建体结合的结合动力学参数(额外测量)(“GGGL”公开为SEQ ID NO：94，“CPPAPAPPVA”公开为SEQ ID NO:106)

实施例2：在荧光素酶生物测定中评估VEGF微阱阻断VEGF₁₆₅或VEGF₁₂₁激活VEGFR1和VEGFR2的能力

评估了各种VEGF阱或VEGF微阱阻断VEGFR激活的能力。

表2-1.VEGF阱和VEGF微阱

REGN#	描述
			人VEGF<sub>121</sub>
REGN110	人VEGF<sub>165</sub>
		REGN3	VEGF阱hIgG1 Fc(阿柏西普)
REGN7483	VEGF微阱hIgG1 Fc
		REGN10104	VEGF阱hIgG1 Fc隐形
mREGN10104	VEGF微阱hIgG1 Fc隐形
		REGN10102	VEGF阱hIgG2 Fc w_2Cys
REGN10105	VEGF微阱hIgG2 Fc w_2Cys
		REGN10117	VEGF阱hIgG2 Fc w_4Cys
REGN10103	VEGF微阱hIgG2 Fc w_4Cys
		REGN10187	VEGF阱hIgG4隐形Fc
mREGN10187	VEGF微阱hIgG4隐形Fc
		REGN10514	VEGF阱hIgG1 Mut GGGL(SEQ ID NO：94)Fc
REGN11095	VEGF微阱hIgG1 Mut GGGL(SEQ ID NO：94)Fc

实验程序(包括相关细胞系、蛋白质、试剂以及工具类型和模型的描述)。

细胞系

生成了两种细胞系来分别测量通过VEGFR1和VEGFR2的配体信号传导途径。对于VEGFR1，通过两种嵌合受体构建了HEK293/D9/Flt(1-7)-IL18Rα/Flt-IL18Rβ克隆V3H9，所述嵌合受体结合了与IL18Rα亦或IL18Rβ的胞质结构域融合的VEGFR1胞外结构域Flt1(1-7)。将嵌合受体转染至具有整合的NFκB-荧光素酶-IRES-eGFP报告基因的细胞系中。在结合VEGF时，胞外VEGFR1二聚化，导致IL18Rα和IL18Rβ胞内结构域的相互作用、NFκB信号传导和随后的荧光素酶产生。相似地，对于VEGFR2，通过两种嵌合受体构建了HEK293/D9/Flk(1-7)-IL18Rα/Flt-IL18Rβ，所述嵌合受体结合了与IL18Rα或IL18Rβ的胞质结构域融合的VEGFR2胞外结构域Flk1(1-7)。

测定程序

将HEK293/D9/Flt-IL18Rα/Flt-IL18Rβ(VEGFR1)或HEK293/D9/Flk(1-7)-IL18Rα/Flt-IL18Rβ(VEGFR2)细胞以0.5％FBS(Seradigm，Cat#1500-500)的OptiMEM(INVITROGEN，Cat#31985)中10,000细胞/孔涂布于96-孔白色不透明平板(Nunc，Cat#136101)中，并在37℃，5％CO₂孵育过夜。第二天，用浓度范围从5000pM至0.085pM的VEGF阱或微阱蛋白的1:3连续稀释液不同地处理细胞，接着添加固定浓度的40pM的VEGF₁₂₁(R&D SYSTEMS Cat#4644-VS)或VEGF₁₆₅(REGN110)配体蛋白，并在37℃，5％ CO₂孵育6小时。然后将One-Glo荧光素酶底物(PROMEGA，Cat#6130)加入细胞中并使用VICTOR^TM X5 Multilabel读板器(PerkinElmer,Model 2030-0050)测量了发光。使用GraphPad Prism软件使用4-参数逻辑方程针对11点响应曲线分析了数据，以确定EC₅₀和IC₅₀值。

结果概述和结论

VEGF₁₂₁以～30pM的EC₅₀值激活HEK293/D9/Flt-IL18Rα/Flt-IL18Rβ(VEGFR1)或HEK293/D9/Flk(1-7)-IL18Rα/Flt-IL18Rβ(VEGFR2)(图8和图9以及表2-2)。

所有VEGF微阱以与使用全长VEGF阱REGN3观察到的相似IC₅₀值抑制了20pM VEGF₁₂₁介导的VEGFR1或VEGFR2的激活(图8和图9以及表2-2和表2-3)。

表2-2.VEGF微阱阻断VEGFR1和VEGFR2细胞中的VEGF₁₂₁或VEGF₁₆₅的生物测定活性

表2-3.VEGF微阱阻断VEGFR1和VEGFR2细胞中的VEGF₁₂₁或VEGF₁₆₅的生物测定活性(附加的测量)

实施例3：使用SDS-PAGE分析确定由Ides蛋白酶介导的VEGF-阱变体的相对切割效率

测定了IdeS蛋白酶切割各种VEGF阱的能力。

表3-1.VEGF阱和VEGF微阱

实验程序(包括相关细胞系、蛋白质、试剂以及工具类型和模型的描述)

使用SDS-PAGE分析确定了由Ides蛋白酶介导的各种VEGF阱构建体的相对切割效率。所有切割研究在室温下在10mM磷酸钠、40mM氯化钠、0.03％聚山梨酸酯20和5％蔗糖，pH6.2缓冲剂中进行。首先将各种VEGF阱构建体以0.1mg的规格标准化至0.1mg/mL。对于每种VEGF阱构建体，从标准化的储液制备100uL样品等份试样，一式五份。然后将储液Ides蛋白酶(0.1mg/mL)以5ng蛋白酶/ug VEGF阱的比例加入所有样品中。使样品孵育0、1、2、4和24hr的时间段。通过添加0.1mL基于胺的储液的pH2.8缓冲剂在每个时间点停止切割。通过VEGF阱变体类型将收集的样品时间点分组，并且随后在非还原条件下使用4-20％ Tris-甘氨酸凝胶通过SDS-PAGE分析了2ug每种消化样品。将每个凝胶在恒定300mA运行1hr的时间段。将Simply-Blue Safe-Stain用于随后的每个凝胶的染色。通过视觉分析了脱色的凝胶，以确定每种VEGF阱变体随着孵育时间由IdeS蛋白酶介导的相对切割效率。通过比较未切割的VEGF阱二聚体、部分切割的VEGF阱二聚体、完全切割的VEGF阱二聚体(VEGF微阱)和Fc单体片段的相对水平来确定切割效率的程度。然后基于观察到的Ides介导的切割确定VEGF阱变体中相对切割效率的分级。

测试的每种VEGF阱变体的IdeS蛋白酶介导的切割的SDS-PAGE分析显示于图10(A-F)中。

实施例4：测定VEGF微阱与预先存在的抗铰链抗体(AHA)的反应性。

测定了各种VEGF微阱与预先存在的人和猴抗铰链抗体的反应性。

表3-1.VEGF微阱

微阱	人IgG	详细信息
			REGN7483	IgG1	从阿柏西普酶切割的
mREGN10104	IgG1隐形	从VEGF阱-IgG1酶切割的
			REGN10105	IgG2(2Cys)	在CHO中重组表达的
REGN10105	IgG2(2Cys)	从VEGF阱-IgG2酶切割的
			REGN10103	IgG2(4Cys)	从VEGF阱-IgG2酶切割的
mREGN10187	IgG4隐形	从VEGF阱-IgG4酶切割的

实验程序(包括相关细胞系、蛋白质、试剂以及工具类型和模型)

在抗药物抗体(ADA)测定中评估了VEGF微阱针对预先存在的抗铰链抗体(AHA)的潜在免疫原性。参见图11(A)中的测定形式的说明。这种ADA测定是使用生物素-和钌-标记的药物(微阱)来形成桥的电化学发光免疫测定(ECL)桥接测定。抗药物抗体结合生物素-和钌-标记的药物(VEGF微阱)，形成桥接的复合物，其随后被链霉亲和素涂层板表面捕获。电流激活钌标记的药物以产生电化学发光信号。

使用48个人AMD/DME基线血清样品和24个猴初始血清样品，在这个测定中测试了六种VEGF微阱。将抗VEGFR1单克隆抗体(REGN18)用作阳性对照。结果概括于图11(B)和图12。

结果概述和结论

数据表明了初始猴血清样品和人AMD/DME基线血清样品中预先存在的抗铰链抗体(AHA)没有识别VEGF微阱构建体，除了REGN7483(hIgG1)(其显示出可变的计数范围)。阳性对照抗VEGFR1 mAb显示了6858-15055范围中的平均计数。

实施例5：通过与多角度激光散射(SEC-MALS)偶联的尺寸排阻色谱对VEGF微阱(REGN10105和REGN11095)和重组人VEGF₁₆₅(REGN110)之间形成的体外复合物的尺寸分析。

测定了两种VEGF微阱(REGN10105和REGN11095)结合人VEGF₁₆₅(hVEGF₁₆₅；REGN110)的化学计量。

材料和设备

表5-1.工具列表

表5-2.试剂和材料

试剂	来源
		10X Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水	Gibco
HPLC级水	J.T.Baker
		磷酸二钠七水合物	J.T.Baker
磷酸二氢钠，一水合物	J.T.Baker
		高氯酸钠	Sigma Aldrich

方法

SEC-MALS移动相缓冲剂.

通过组合1.4g磷酸二氢钠一水合物、10.7g磷酸二钠七水合物和500mL 5M氯化钠制备了移动相缓冲剂(10mM磷酸钠、500mM氯化钠，pH7.0±0.1)；然后用HPLC级水使溶液的体积为5.0L。最终测量的缓冲剂pH为7.0。使用前将移动相缓冲剂进行过滤(0.2μm)。

SEC-MALS.

SEC-MALS系统由连接紫外(UV)、光散射(LS)和折射率(RI)检测器的UPLC组成。探测器按以下顺序串联：UV-LS-RI。LS和RI探测器根据Wyatt Technology提供的说明进行校准。将

SEC柱尺寸排除柱连接SEC-MALS系统，并在注入样品之前以0.3mL/min的流速在pH7.0的10mM磷酸钠、500mM氯化钠(SEC流动相缓冲剂)中预平衡。将确定量的微阱分别与hVEGF₁₆₅(REGN110)组合，并在1X DPBS，pH 7.4中稀释，以产生不同的比率。所有样品在注射前在环境温度孵育2小时并在4℃保持未过滤。牛血清白蛋白(BSA；2mg/mL；10μg样品量)被分开注射并包括作为系统适应性对照。

MALS数据分析.

使用ASTRA V软件(版本7.3.1.9，Wyatt Technology)分析数据。数据拟合至将过量散射光与溶质浓度和重均摩尔质量Mw关联的方程(Kendrick等，Online Size-ExclusionHigh-Performance Liquid Chromatography Light Scattering and DifferentialRefractometry Methods to Determine Degree of Polymer Conjugation to Proteinsand Protein-Protein or Protein-Ligand Association States”.(2001).AnalBiochem.299(2),136-46；Wyatt(1993)Anal.Chim.Acta 272(1),1-40,Light Scatteringand the Absolute Characterization of Macromolecules)：

方程1：

其中c是溶质浓度，R(θ,c)是溶质的过量Raleigh比，作为散射角和浓度的函数，Mw是摩尔质量，P(θ)描述了散射光的角度依赖性(对于回转半径<50nm的粒子，为～1)，A₂是渗透压膨胀的第二维里系数(其可以忽略，因为测量是在稀溶液上进行的)，和方程2：

其中n₀表示溶剂折射率，N_A是阿伏伽德罗数，λ₀是真空中入射光的波长，以及dn/dc表示溶质的比折射率增量。

BSA单体的摩尔质量用于评估数据收集期间光散射和差分折射率检测仪的校准常数(系统适应性检查)。由UV和RI检测仪测定的BSA平均摩尔质量的相对标准偏差(％RSD)≤5.0％。

光散射检测仪的归一化系数、检测仪间延迟体积和频带展宽项是根据所采用的SEC-MALS条件下收集的BSA色谱图计算的。这些值应用于为所有其他样本收集的数据文件，以更正这些项目。

使用Astra软件中提供的蛋白质缀合物分析，通过实验确定了280nm处的dn/dc值和消光系数(糖基化校正)。校正的消光系数和dn/dc值用于分析所有蛋白质-蛋白质复合物样品。

结果

从存在和不存在不同浓度配体的微阱的SEC-MALS分析确定结合人VEGF165(hVEGF₁₆₅；REGN110)的两个单独的微阱(REGN10105和REGN11095)的化学计量。在等同的结合条件下，与hVEGF₁₆₅结合的化学计量对于每个测试的微阱是等价的。图18(A)和图18(B)呈现了从所有分析样品所得络合物的化学计量，并汇总在表5-3和表5-4中。

图18(A)和图18(B)显示了对应于3:1、1:1和1:3摩尔比的每种微阱与hVEGF₁₆₅的代表性重叠色谱图。还重叠了游离hVEGF₁₆₅和游离微阱的色谱图进行比较。注释的峰数对应于游离hVEGF₁₆₅(峰1)、游离微阱(峰2)和微阱-hVEGF₁₆₅复合物(峰3)。每个观察到的峰的摩尔质量叠加在每个色谱图的各个峰上。

测量的峰1和峰2的摩尔质量分别约为46kDa和63kDa，分别对应于游离hVEGF₁₆₅和游离微阱。基于计算的游离hVEGF₁₆₅和游离微阱的摩尔质量，微阱:hVEGF₁₆₅的1:1复合物的理论摩尔质量预计为109kDa。因此，基于计算的大约106kDa的平均摩尔质量，色谱峰3很可能对应于1:1的微阱:hVEGF₁₆₅复合物(表5-3和5-4)。此外，在任何测试的条件下，几乎没有或没有在任何样品中可靠地检测到更高分子量复合物，这表明每个微阱与hVEGF₁₆₅结合，而没有更高阶的多聚化。总之，结果证明了每个微阱呈现出结合hVEGF₁₆₅的等价化学计量，其中每个微阱分子能够结合一个分子的hVEGF₁₆₅配体。

表5-3.hVEGF₁₆₅(REGN110)与REGN10105的复合物的摩尔质量和保留时间的概括

R_t：保留时间；M_w：重均摩尔质量；NA：不适用；min：分钟；kDa：千道尔顿；

表5-4.hVEGF₁₆₅(REGN110)与REGN11095的复合物的摩尔质量和保留时间的概括

实施例6：与VEGF和抗VEGF Fab(REGN18)的形成复合物的VEGF微阱REGN10105的低温电子显微镜(Cryo-EM)结构分析。

低温电子显微镜用于分析REGN10105与VEGF以及Fab分子的结合。REGN18是抗人VEGFR1-d2 mAb，它是VEGF结合的非阻断剂，添加其是为了增加复合物的大小，使样品更适合Cryo-EM研究。

Fab片段制备。按照制造商的标准方案，使用Fabricator酶(Genovis)，将抗hVEGFR1结构域2抗体REGN18切割成F(ab’)₂和Fc片段。使用2-巯基乙胺(2-MEA，ThermoFisher)将F(ab’)₂还原成Fab，然后使用CaptureSelect IgG Fc(ms)亲和树脂(ThermoFisher)去除Fc片段。通过将Fab片段注射到连接AKTA Avant 25色谱系统(GEhealthcare)的尺寸排阻色谱(SEC)柱(Superdex 200Increase 15/300GL，GE healthcare公司)中，来进一步纯化Fab片段。运行缓冲剂含有50mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl。将峰级分合并并在10kDa截止离心过滤器(Millipore Sigma)中浓缩，以便随后用于复合物制备。

复合物制备。将100μg纯化的微阱(REGN10105-L3)与200μg REGN18 Fab和160μghVEGF(REGN110-L9)混合，并在4℃孵育过夜。将混合物注入SEC柱(Superdex 200Increase15/300GL，GE)中，该柱连接AKTA色谱系统(GE healthcare)和多角度光散射(MALS)检测仪(Wyatt Technology)。SEC运行缓冲剂含有50mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl。将来自与估算分子量为210kDa的REGN10105-REGN110-REGN18 Fab复合物对应的峰的级分合并，并在30kDa截止离心过滤器(Millipore Sigma)中浓缩至使用Nanodrop仪器(ThermoFisher)测量的3.2mg/mL浓度。参见图19(A)。REGN18是一种VEGF结合的非阻断剂，并添加以增加REGN10105-REGN110复合物的大小，从而使样品更适合后续的低温EM研究。

低温EM样品制备和数据收集。将新鲜纯化的REGN10105-REGN110-REGN18 Fab复合物与0.15％ PMAL-C8 Amphitol去污剂混合，然后将3.5μL混合物移液到UltrAufoil R1.2/1.3，300目网格(Quantifoil)上。使用滤纸吸走多余的液体，并将网格浸入液氮冷却的液体乙烷中，使用在4℃和100％湿度下运行的Vitrobot Mark IV(ThermoFisher)。然后将网格加载到配备K3相机(Gatan)的Titan Krios G3i显微镜(ThermoFisher)中。在计数模式下以105,000x(

像素大小)的标称放大率收集了13,248个影像。每个影像在2秒的曝光时间内包含46个剂量分数，每

获得的总剂量为～40个电子。

低温EM数据处理和图谱生成。低温EM数据使用Cryosparc v2.14.2进行处理。影像通过Patch运动校正进行运动校正，并且CTF参数通过Patch CTF估计进行估计。最初使用水滴选择器(Blob picker)拾取粒子，以生成用于模板拾取的2D类平均值。在进行多轮2D分类以去除垃圾粒子后，留下633,335个粒子。在从头开始重建和异质细化后，识别了125,447个与REGN10105-REGN110-REGN18 Fab复合物对应的粒子，并使用非均匀细化将其进一步细化至

分辨率重建。

结果。测定了REGN10105、hVEGF和REGN18之间的复合物形成。REGN10105与hVEGF二聚体形成1:1复合物(58kDa+46kDa＝104kDa)。REGN10105、VEGF二聚体和REGN18 Fab形成1:1:2的复合物(104kDa+48kDa*2＝210kDa)。样品中存在一些REGN18 F(ab’)₂污染。参见图19(A)。

通过低温电子显微镜下的可视化来表征REGN10105/VEGF/REGN18复合物的二维结构。2D类显示出二级结构特征，其中一些显示出明显的2倍对称性。VEGFR2结构域3密度在许多视图中都可见，但与复合物的其他部分相比，它非常模糊(箭头指向)，这表明该结构域是灵活的。VEGFR2结构域3密度在远端甚至更模糊。

REGN10105-VEGF-REGN18复合物的

低温EM图谱显示了VEGFR2结构域3C末端的密度低。VEGFR1结构域2、VEGF和REGN18 Fab可变结构域的密度非常清晰；并且由于这个区域的柔性，REGN18Fab恒定域的密度低。VEGFR2结构域3在主链和一些侧链可以追踪的地方被解析，但在R2-d3的C末端，低温EM密度非常弱，这可能是由于该区域的高度灵活性。参见图19(B-D)。

REGN10105是本发明的部分，其与人VEGF₁₆₅和抗VEGF Fab复合时，形成基本如图19(C-D)所示的复合物。

实施例7：微阱REGN10105和REGN11095在氧诱导性视网膜病(OIR)小鼠模型中的作用。

测定了OIR小鼠模型中全身和玻璃体内REGN11095和REGN10015对视网膜血管系统的影响。

在小鼠氧诱导性视网膜病(OIR)模型中，Taconic C57Bl/6小鼠幼崽在出生后(P)第6天置于高氧环境(75％O₂)中，并于P11返回到室内空气中。研究1(玻璃体内(IVT)注射等摩尔筛选研究)：OIR幼崽在P13分别IVT注射0.125μg人(h)Fc(hFc)、0.25μg阿柏西普、0.125μg REGN10105、0.125μg REGN11095，并在P16收集。研究2(IVT剂量反应研究)：OIR小鼠在P13 IVT注射0.25μg hFc，0.025μg、0.25μg和2.5μg的REGN10105或0.05μg，0.5μg和5μg的阿柏西普，并在P16收集。研究3(等摩尔全身(IP)研究)：OIR小鼠在P12 IP分别注射5mg/kghFc、10mg/kg阿柏西普、5mg/kg REGN10105或5mg/ml REGN11095，并在P16收集。将视网膜固定、解剖，并用FITC标记的加纳(Grifornia simplicifolia)凝集素I(GS凝集素I)染色，以标记视网膜血管(Vector Laboratories)，以及用具有二级Alexa Fluor594(ThermoScientific)的NG2(Millipore)的进行染色，以标记新生血管簇(neovascular tufts)。

在出生后(P)6至P11，将小鼠幼崽置于75％O₂的室内。在氧气室内放置5天后，将其放回室内空气(21％O₂)中。对于玻璃体内(IVT)研究，小鼠在P13注射试剂，并在P16采集眼睛。对于系统(IP)研究，小鼠在P12注射试剂并在P16收集眼睛。

研究1：玻璃体内(IVT)阿柏西普和VEGF微阱等摩尔剂量研究

·阿柏西普(REGN3)：0.25μg/眼

·REGN11095：0.125μg/眼

·REGN10105：0.125μg/眼

·运载体(Vehicle)(hFc)：0.125μg/眼

每组3只小鼠；注射左眼和右眼

在小鼠氧诱导性视网膜病(OIR)模型中，Taconic C57Bl/6小鼠幼崽在出生后(P)第6天被置于高氧环境(75％O₂)中，并在P11回到室内空气中。

研究1(IVT等摩尔筛选研究)：OIR幼崽在P13分别IVT注射0.125μg人Fc(hFc)、0.25μg阿柏西普、0.125μg REGN10105、0.125μg REGN11095，并在P16收集。

将视网膜固定、解剖，并用FITC标记的加纳凝集素I(GS凝集素I)染色，以标记视网膜脉管系统(Vector Laboratories)，以及用具有二级Alexa Fluor594(ThermoScientific)的NG2(Millipore)的进行染色，以标记新生血管簇。图20(A)总结了小鼠视网膜的无血管区域。图20(B)总结了小鼠视网膜的异常区域。

研究2：玻璃体内(IVT)等摩尔阿柏西普和VEGF微阱剂量反应研究

·阿柏西普(REGN3)：0.05μg/眼、0.5μg/眼和5μg/眼

·REGN10105：0.025μg/眼、0.25μg/眼和2.5μg/眼

·运载体(hFc)：0.25μg/眼

每组3-4只小鼠；只注射左眼

研究2(IVT剂量反应研究)：OIR小鼠在P13 IVT分别注射0.25μg人Fc(hFc)，0.025μg、0.25μg和2.5μg REGN10105，或0.05μg、0.5μg和5μg阿柏西普，并在P16收集。

将视网膜固定、解剖，并用FITC标记的加纳凝集素I(GS凝集素I)染色，以标记视网膜脉管系统(Vector Laboratories)，以及用具有二级Alexa Fluor594(ThermoScientific)的NG2(Millipore)的进行染色，以标记新生血管簇。

标准化至仅给药hFc小鼠的异常视网膜区域的区域显示于图21中。

研究3：全身阿柏西普和VEGF微阱等摩尔研究

·阿柏西普(REGN3)：10mg/kg

·REGN10105 5mg/kg

·REGN11095 5mg/kg

·运载体(hFc)：5mg/kg

*实验进行了2次

每组3只小鼠；分析了左眼和右眼

研究3(等摩尔全身(IP)研究)：OIR小鼠在P12 IP分别注射5mg/kg hFc、10mg/kg阿柏西普、5mg/kg REGN10105或5mg/ml REGN11095，并在P16收集。

标准化至仅给药hFc小鼠的视网膜无血管区域概括于图22(A)中。标准化至仅给药hFc小鼠的视网膜异常区域概括于图22(B)中。

实施例8：兔中VEGF阱和微阱(REGN10105、REGN11095和REGN3)体内药物药代动力学(PK)。

研究了兔中REGN10105和REGN11095的药代动力学。

这种PK研究显示了在NZW兔玻璃体中VEGF微阱(REGN10105和REGN11095)的半衰期比VEGF阱(REGN3)的更短，VEGF微阱的持续性分别短约22％和32％(5.0天vs 3.9天和3.4天)。

表8-1.测试的VEGF阱和VEGF微阱

实验程序.VEGF阱(REGN3)和两个新的VEGF微阱(REGN10105和REGN11095)是通过胺偶联用被Alexa Fluor 488(AF488)标记的分子。表8-2提供了蛋白质浓度、内毒素水平和标记度(DOL)。对6只雄性新西兰白(NZW)兔进行了双侧玻璃体内(IVT)注射(6只眼睛/3只兔/分子)。所有眼睛在注射前用OcuMetrics Fluorotron荧光光度计(Mountain View，CA)检查玻璃体基线荧光，并在注射后第3、7、14和21天随访玻璃体荧光强度。一般眼部检查包括IVT注射前和注射后30分钟以及每个随访时间点的眼内压(IOP)、炎症体征、角膜和结膜水肿、出血、前房漂浮物、瞳孔大小和形状、白内障和视网膜脱离。荧光强度和位置信息被提取并导入GraphPad Prism，用于图形显示和分析。数据被拟合到一阶单室模型。

表8-2.兔玻璃体内荧光法PK中VEGF阱和VEGF微阱的半衰期(t_1/2)

结果.NZW兔玻璃体中VEGF阱(REGN3)和VEGF微阱(REGN10105和REGN11095)的PK研究显示了半衰期分别为5.0(±0.4)、3.9(±0.3)和3.4(±0.5)天。参见图23(A-C)。任一种分子IVT注射前后，IOP均无明显变化。参见图23(D)。在一般眼科检查中未观察到临床显著体征。

实施例9：食蟹猴中VEGF微阱的药代动力学研究。

研究了REGN10105和REGN11095在猴子中的药代动力学。

玻璃体内给药后，测量了食蟹猴(6/性别/组)血浆中游离和结合的REGN10105和REGN11095的浓度。在本研究中，麻醉动物每4周接受一次双侧玻璃体内注射REGN10105或REGN11095，共4剂，5.5mg/眼/剂。使用A1-cc注射器和30号针头每剂给药50微升/眼。在4剂给药的每一次后采集血样，用于全身药物暴露评估。用于测量游离和结合的REGN10105和REGN11095血浆浓度的测定是基于酶联免疫吸附测定的方法，每种化合物的游离和结合物质的定量下限为0.078μg/mL。参见图24(A-D)。

游离REGN10105的血浆浓度峰值在第一次采样时间(6小时)时达到，而结合REGN10104的血浆浓度延迟，并且通常在给药后5至7天之间。雄性和雌性猴子在第一次给药后以及在随后的每一次(总共4剂)给药后，游离或结合的REGN10105的血浆浓度相似，表明在多次给药后，没有性别差异，也没有全身药物累积。给药REGN11095的动物，尽管它们具有与REGN10105相似的血浆药代动力学特征(例如，达到峰值浓度的时间、缺乏性别差异以及多次给药后无累积)，但其血浆浓度和暴露量均低于给药REGN1 105的动物。

单次剂量(多剂量研究的第一次剂量)后游离REGN10105血浆浓度与REGN7483和REGN3的血浆浓度曲线的比较表明，以相似的剂量(5.5mg/眼的REGN10105或REGN7483或4mg/眼的REGN3)进行玻璃体内注射时，REGN7483比REGN3的血浆浓度(全身暴露)更低，然后是REGN10105。这表明，与REGN3相比，玻璃体内注射每只眼睛后，REGN7483和REGN10105的全身暴露更低。参见图25。

实施例10：VEGF微阱的N-连接聚糖分析。

本实施例中测定了REGN10103和REGN10105的聚糖分布，特别是岩藻糖基化、半乳糖基化和唾液酸化、高甘露糖和二等分糖基化的水平。

在含有0.1％Waters RapiGest和4.2mM TCEP的50mM HEPES缓冲剂(pH 7.9)中，PNGase-F在45℃释放蛋白质中的N-连接聚糖25分钟。在45℃用RapiFluor MS荧光染料标记释放的聚糖30分钟。通过加入25％DMF和53％[v/v]乙腈沉淀蛋白质，并通过16000×g离心5分钟将其沉淀至管底部。收集含有标记聚糖的上清液，并在UPLC上使用亲水相互作用液相色谱(Waters BEH Amide柱)和柱后荧光检测进行分析。与柱结合后，使用由50mM甲酸铵水溶液(pH 4.4)作为流动相A和乙腈作为流动相B组成的二元流动相梯度分离标记的聚糖。使用激发波长为265nm和发射波长为425nm的荧光检测仪检测分离的聚糖。使用所得色谱图中N-聚糖峰的相对面积百分比，N-聚糖分布被报告为(1)含有核心岩藻糖残基、(2)含有至少一个唾液酸残基、(3)鉴定为甘露聚糖-5、(4)含有至少1个半乳糖残基和(5)二等分N-聚糖的N-聚糖的总百分比。

来自REGN10103和REGN10105的N-连接聚糖的重叠HILIC-FLR(亲水性相互作用色谱荧光)色谱图如图26(A)中所示，以及分开的色谱图如表26(B)中所示并概括于本文的表10-1中。

表10-1.聚糖定量总结

相对于REGN10105，REGN10103中的高甘露糖物质(例如Man5)水平升高。REGN10103中的半乳糖基化和唾液酸化的相对丰度低于REGN10105中的，这可能是由于REGN10103中升高的甘露糖所致。

实施例11：REGN10105粘度和稳定性研究

在本实施例中进行了REGN10105的稳定性(应力稳定性和光稳定性)和粘度研究。

开发了REGN10105(IgG2，2个Cys，FabRICATOR切割的VEGF微阱)，且发现其消除了与Fc切割的IgG1分子REGN7483相关的抗铰链抗体的风险。在包括组氨酸的组合物中评估了REGN101005的粘度、热稳定性和光稳定性。

在38-132mg/mL的浓度范围内对REGN10105进行粘度评估。绘制了浓度与粘度的关系图，并将结果与REGN7483进行比较：在等摩尔浓度，REGN10105的粘度特征与REGN7583相比较低(REGN10104(90mg/ml)的粘度为5.8cP，而REGN1483(90mg/ml)的粘度为6.9cP)。在REGN10105浓度为120mg/mL时观察到约12cP的粘度。在浓度高于120mg/mL时粘度呈指数增加。

在填充体积为0.4mL的I型硼硅酸盐玻璃瓶中，在90mg/mL和120mg/mL的条件下评估REGN10105的热稳定性。在37℃测试4周的热应力稳定性，并在5℃评估3个月的贮存稳定性。将生成的数据与90mg/mL REGN7483^F的稳定性测试结果进行比较。与90mg/mL的REGN7483(5.45％ HMW/周)相比，REGN10105在热应力下显示出较低的聚集率(3.74％ HMW/周)。REGN10105在类似浓度的储存稳定性与REGN7483相当。此外，REGN10105制剂在搅拌(1000rpm至15分钟)和冻融(2×)时没有显示出任何明显的聚集水平变化。

在暴露于环境(10W/m²，0.6h，以及冷白光(CWL)，8Klux，18h(6W*h/m²和144klux*h))和0.5×ICH(10W/m²，10h，以及8Klux，75h(100W*h/cm²和600Klux*h))后，在光室(Bahnson ES2000 CL-LT光稳定性室)中评估10mg/mL REGN10105的光稳定性。REGN10105显示出比REGN7483稍好的光稳定性。总体而言，REGN10105显示出比REG N7483更高的热稳定性和更低的粘度。

*****

本文引用的所有参考文献通过引用并入，其程度与每个单独的出版物、数据库条目(例如，Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利被具体地和单独地指示通过引用并入的程度相同。本通过引用并入的声明旨在由申请人将每一个单独的出版物、数据库条目(例如，Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利进行关联，即使该引用与通过引用并入的专用声明不直接相邻，其中的每一个都被明确指定。在说明书中包含通过引用并入的专用声明(如果有的话)不会以任何方式削弱该通过引用并入的通用声明。本文参考文献的引用并不意味着承认该参考文献是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。

序列表

<110> 瑞泽恩制药公司（REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.）

<120> 用于治疗眼病和癌症的VEGF阱和微阱及方法

<130> 250298.000215

<140>

<141>

<150> 63/022,178

<151> 2020-05-08

<160> 115

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 1

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成肽

<400> 2

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala

1 5 10 15

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成肽

<400> 3

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Gly

1 5 10 15

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 4

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

1 5 10 15

Ala

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 5

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala

1 5 10

<210> 6

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 6

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly

20

<210> 7

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 7

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 8

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

1 5 10 15

Ala

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 9

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly

1 5 10 15

Gly

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 10

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala

1 5 10 15

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 11

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Phe Leu Gly

1 5 10 15

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 12

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Gly Leu Gly

1 5 10 15

<210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 13

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Leu Leu Gly

1 5 10 15

<210> 14

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 14

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Leu Leu Gly

1 5 10

<210> 15

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 15

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr

35

<210> 16

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 16

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Asp Thr

<210> 17

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 17

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Gly Gly Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Asp Thr

<210> 18

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 18

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

1 5 10 15

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

<210> 19

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 19

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr

35

<210> 20

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 20

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

<210> 21

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 21

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

1 5 10 15

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

<210> 22

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 22

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

<210> 23

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 23

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

1 5 10 15

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

20 25 30

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

35 40 45

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe

50 55 60

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

65 70 75 80

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile

85 90 95

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

100 105 110

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

115 120 125

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

130 135 140

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

145 150 155 160

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

165 170 175

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

180 185 190

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

195 200 205

Pro Gly Lys

210

<210> 24

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 24

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

1 5 10 15

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

20 25 30

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

35 40 45

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr

50 55 60

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

65 70 75 80

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile

85 90 95

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

100 105 110

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

115 120 125

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

130 135 140

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

145 150 155 160

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

165 170 175

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

180 185 190

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

195 200 205

Pro Gly Lys

210

<210> 25

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 25

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

1 5 10 15

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

20 25 30

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

35 40 45

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe

50 55 60

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

65 70 75 80

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile

85 90 95

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

100 105 110

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

115 120 125

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

130 135 140

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

145 150 155 160

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

165 170 175

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

180 185 190

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

195 200 205

Pro Gly Lys

210

<210> 26

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 26

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

1 5 10 15

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

20 25 30

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

35 40 45

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr

50 55 60

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

65 70 75 80

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile

85 90 95

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

100 105 110

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

115 120 125

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

130 135 140

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

145 150 155 160

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val

165 170 175

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

180 185 190

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

195 200 205

Leu Gly Lys

210

<210> 27

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 27

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

1 5 10 15

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

20 25 30

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

35 40 45

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe

50 55 60

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

65 70 75 80

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile

85 90 95

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

100 105 110

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

115 120 125

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

130 135 140

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

145 150 155 160

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

165 170 175

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

180 185 190

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

195 200 205

Pro Gly Lys

210

<210> 28

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 28

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

1 5 10 15

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

20 25 30

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

35 40 45

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

50 55 60

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

65 70 75 80

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

85 90 95

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

100 105 110

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

115 120 125

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

130 135 140

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

145 150 155 160

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

165 170 175

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

180 185 190

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

195 200 205

Pro Gly Lys

210

<210> 29

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 29

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

1 5 10 15

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

20 25 30

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

35 40 45

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

50 55 60

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

65 70 75 80

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

85 90 95

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

100 105 110

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

115 120 125

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

130 135 140

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

145 150 155 160

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

165 170 175

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

180 185 190

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

195 200 205

Pro Gly Lys

210

<210> 30

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 30

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

1 5 10 15

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

20 25 30

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

35 40 45

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

50 55 60

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

65 70 75 80

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

85 90 95

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

100 105 110

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

115 120 125

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

130 135 140

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

145 150 155 160

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

165 170 175

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

180 185 190

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

195 200 205

Pro Gly Lys

210

<210> 31

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 31

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

1 5 10 15

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

20 25 30

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

35 40 45

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

50 55 60

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

65 70 75 80

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

85 90 95

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

100 105 110

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

115 120 125

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

130 135 140

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

145 150 155 160

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

165 170 175

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

180 185 190

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

195 200 205

Pro Gly Lys

210

<210> 32

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 32

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

1 5 10 15

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

20 25 30

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

35 40 45

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

50 55 60

Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

65 70 75 80

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

85 90 95

Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile

100 105 110

Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr

115 120 125

Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys

130 135 140

His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly

145 150 155 160

Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr

165 170 175

Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met

180 185 190

Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Glu Arg Lys

195 200 205

Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala

210 215 220

<210> 33

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 33

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

1 5 10 15

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

20 25 30

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

35 40 45

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

50 55 60

Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

65 70 75 80

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

85 90 95

Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile

100 105 110

Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr

115 120 125

Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys

130 135 140

His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly

145 150 155 160

Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr

165 170 175

Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met

180 185 190

Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Val Glu Cys

195 200 205

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala

210 215

<210> 34

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 34

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

1 5 10 15

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

20 25 30

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

35 40 45

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

50 55 60

Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

65 70 75 80

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

85 90 95

Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile

100 105 110

Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr

115 120 125

Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys

130 135 140

His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly

145 150 155 160

Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr

165 170 175

Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met

180 185 190

Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr

195 200 205

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala

210 215 220

<210> 35

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 35

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

1 5 10 15

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

20 25 30

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

35 40 45

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

50 55 60

Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

65 70 75 80

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

85 90 95

Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile

100 105 110

Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr

115 120 125

Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys

130 135 140

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Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met

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<210> 36

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 36

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 37

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 38

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 39

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 41

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 42

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<210> 43

<211> 433

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 43

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Lys

<210> 44

<211> 433

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 44

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Lys

<210> 45

<211> 431

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 45

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<210> 46

<211> 432

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 46

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<210> 47

<211> 432

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 47

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420 425 430

<210> 48

<211> 432

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 48

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 49

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420 425

<210> 50

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 50

Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val

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<210> 51

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 51

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Gln Thr Asn

<210> 52

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 52

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<210> 53

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 53

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<210> 54

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 54

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Gln Thr Asn

<210> 55

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 55

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Gln Thr Asn

<210> 56

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 56

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245 250 255

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Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly

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<210> 57

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 57

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<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 58

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<211> 339

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 59

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325 330 335

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<210> 60

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 60

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305 310 315 320

Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn

325 330 335

Gln Thr Asn

<210> 61

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 61

Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val

1 5 10 15

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325 330 335

Gln Thr Asn

<210> 62

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 62

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1 5 10 15

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Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn

325 330 335

Gln Thr Asn

<210> 63

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 63

Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val

1 5 10 15

Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe

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Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn

325 330 335

Gln Thr Asn

<210> 64

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 64

Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val

1 5 10 15

Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe

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Gln Thr Asn

<210> 65

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 65

Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val

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Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe

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Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val

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Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val

165 170 175

Ile Asp Met Phe Ile Leu Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly

180 185 190

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195 200 205

Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg

210 215 220

His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys

225 230 235 240

Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala

245 250 255

Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp

260 265 270

Ser Asp Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn

275 280 285

Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly

290 295 300

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305 310 315 320

Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn

325 330 335

Gln Thr Asn

<210> 66

<211> 339

<212> PRT

<213> 化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）

<400> 66

Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val

1 5 10 15

Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe

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Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr

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Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala

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Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys

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Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg

210 215 220

His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys

225 230 235 240

Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala

245 250 255

Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp

260 265 270

Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn

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Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn

325 330 335

Gln Thr Asn

<210> 67

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 67

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Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

65 70 75 80

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85 90 95

Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile

100 105 110

Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr

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165 170 175

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180 185 190

Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr

195 200 205

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

210 215 220

<210> 68

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 68

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

<210> 69

<211> 432

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 69

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

1 5 10 15

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

20 25 30

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

35 40 45

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

50 55 60

Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

65 70 75 80

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

85 90 95

Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile

100 105 110

Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr

115 120 125

Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys

130 135 140

His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly

145 150 155 160

Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr

165 170 175

Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met

180 185 190

Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr

195 200 205

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

210 215 220

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

225 230 235 240

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

245 250 255

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

260 265 270

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

275 280 285

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

290 295 300

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

305 310 315 320

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

325 330 335

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

340 345 350

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

355 360 365

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

370 375 380

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

385 390 395 400

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

405 410 415

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

420 425 430

<210> 70

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 70

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly

1 5 10 15

Pro Ser Val

<210> 71

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 71

agtgataccg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 60

actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 120

ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 180

agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 240

gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccaataca 300

atcatagatg tggttctgag tccgtctcat ggaattgaac tatctgttgg agaaaagctt 360

gtcttaaatt gtacagcaag aactgaacta aatgtgggga ttgacttcaa ctgggaatac 420

ccttcttcga agcatcagca taagaaactt gtaaaccgag acctaaaaac ccagtctggg 480

agtgagatga agaaattttt gagcacctta actatagatg gtgtaacccg gagtgaccaa 540

ggattgtaca cctgtgcagc atccagtggg ctgatgacca agaagaacag cacatttgtc 600

agggtccatg aaaaggagcg caaatgttgt gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct 660

gtggcatga 669

<210> 72

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 72

agtgataccg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 60

actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 120

ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 180

agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 240

gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccaataca 300

atcatagatg tggttctgag tccgtctcat ggaattgaac tatctgttgg agaaaagctt 360

gtcttaaatt gtacagcaag aactgaacta aatgtgggga ttgacttcaa ctgggaatac 420

ccttcttcga agcatcagca taagaaactt gtaaaccgag acctaaaaac ccagtctggg 480

agtgagatga agaaattttt gagcacctta actatagatg gtgtaacccg gagtgaccaa 540

ggattgtaca cctgtgcagc atccagtggg ctgatgacca agaagaacag cacatttgtc 600

agggtccatg aaaaggtcga gtgcccaccg tgcccagcac cacctgtggc atga 654

<210> 73

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 73

agtgataccg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 60

actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 120

ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 180

agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 240

gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccaataca 300

atcatagatg tggttctgag tccgtctcat ggaattgaac tatctgttgg agaaaagctt 360

gtcttaaatt gtacagcaag aactgaacta aatgtgggga ttgacttcaa ctgggaatac 420

ccttcttcga agcatcagca taagaaactt gtaaaccgag acctaaaaac ccagtctggg 480

agtgagatga agaaattttt gagcacctta actatagatg gtgtaacccg gagtgaccaa 540

ggattgtaca cctgtgcagc atccagtggg ctgatgacca agaagaacag cacatttgtc 600

agggtccatg aaaaggacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggcgg tggacttcta 660

gggtga 666

<210> 74

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

polypeptide

<400> 74

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Gly

1 5 10 15

Gly Gly Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr

35

<210> 75

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 75

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr

35

<210> 76

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 76

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Gly

1 5 10 15

Gly Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr

35

<210> 77

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 77

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Leu

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

<210> 78

<211> 223

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 78

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 79

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 79

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly

1 5 10 15

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

20 25 30

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu

35 40 45

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

50 55 60

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

65 70 75 80

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

85 90 95

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu

100 105 110

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

115 120 125

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

130 135 140

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

145 150 155 160

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

165 170 175

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

180 185 190

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

195 200 205

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

210 215 220

Gly Lys

225

<210> 80

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 80

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

1 5 10 15

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

20 25 30

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

35 40 45

His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

50 55 60

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

65 70 75 80

Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn

85 90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

180 185 190

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

195 200 205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

210 215 220

Ser Pro Gly Lys

225

<210> 81

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 81

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

1 5 10 15

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

20 25 30

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

35 40 45

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

50 55 60

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

65 70 75 80

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

85 90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

180 185 190

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

195 200 205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Gly Lys

225

<210> 82

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 82

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly

1 5 10 15

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

20 25 30

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

35 40 45

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

50 55 60

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg

65 70 75 80

Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

85 90 95

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu

100 105 110

Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

115 120 125

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

130 135 140

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

145 150 155 160

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met

165 170 175

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

180 185 190

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

195 200 205

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

210 215 220

Gly Lys

225

<210> 83

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 83

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Phe Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 84

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 84

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Gly Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 85

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 85

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 86

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 86

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Leu Leu Gly Gly Pro Ser

1 5 10 15

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

20 25 30

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

35 40 45

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

50 55 60

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

65 70 75 80

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

85 90 95

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

100 105 110

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

115 120 125

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

145 150 155 160

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

165 170 175

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

180 185 190

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

195 200 205

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 87

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 87

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys

1 5 10

<210> 88

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 88

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys

1 5 10 15

<210> 89

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 89

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

<210> 90

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 90

Glu Leu Leu Gly

1

<210> 91

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 91

Ala Pro Glu Leu

1

<210> 92

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 92

Gly Gly Gly Phe

1

<210> 93

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 93

Gly Gly Gly Gly

1

<210> 94

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 94

Gly Gly Gly Leu

1

<210> 95

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 95

Glu Phe Leu Gly

1

<210> 96

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 96

Gly Pro Ser Val

1

<210> 97

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 97

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val

1 5 10 15

<210> 98

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 98

Glu Ser Lys Tyr

1

<210> 99

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 99

Asp Lys Thr His Thr

1 5

<210> 100

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 100

Cys Pro Pro Cys

1

<210> 101

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 101

Cys Pro Ser Cys

1

<210> 102

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 102

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10

<210> 103

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 103

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 104

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 104

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly

1 5 10

<210> 105

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 105

Cys Pro Pro Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val Ala

1 5 10

<210> 106

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 106

Cys Pro Pro Ala Pro Ala Pro Pro Val Ala

1 5 10

<210> 107

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 107

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val

20

<210> 108

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 108

Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5

<210> 109

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 109

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala

1 5 10

<210> 110

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 110

Gly Gly Gly Leu Leu Gly

1 5

<210> 111

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 111

Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly

1 5 10

<210> 112

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

polypeptide

<400> 112

Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

1 5 10 15

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

20 25 30

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

35 40 45

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

50 55 60

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

65 70 75 80

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

85 90 95

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

100 105 110

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

115 120 125

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

130 135 140

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

145 150 155 160

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

165 170 175

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

180 185 190

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

195 200 205

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

210 215 220

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230 235

<210> 113

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 113

Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Met Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 114

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 114

Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10 15

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

20 25 30

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

35 40 45

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

50 55 60

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

65 70 75 80

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

85 90 95

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

100 105 110

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

115 120 125

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

130 135 140

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

165 170 175

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

180 185 190

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

195 200 205

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

210 215 220

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

225 230

<210> 115

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 115

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala

1 5 10

Claims

1.一种包含多肽的VEGF微阱，所述多肽的特征在于以下的结构域结构：

[(VEGFR1 Ig2)-(VEGFR2 Ig3)]a-多聚化组分(MC)，

或

[(VEGFR1 Ig2)-(VEGFR2 Ig3)-(VEGFR2 Ig4)]a-多聚化组分(MC)，

其中a＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；和

其中所述MC包含铰链区、由铰链区组成或基本上由铰链区组成，所述铰链区是

-包含上铰链区、核心铰链区和下铰链区的IgG Fc结构域，或其具有附带条件的变体，所述下铰链区延伸至但不包括IdeS蛋白酶的GPSV(SEQ ID NO：96)切割位点，所述附带条件是所述铰链区不由氨基酸序列DKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：15的氨基酸6-21)、DKTHTCPPCPPC(SEQ ID NO：87)、DKTHTCPPCPPCPPC(SEQ ID NO：88)或DKTHTCPLCPAPELLG(SEQ IDNO：89)组成；

-IgG1铰链区，其中残基ELLG(SEQ ID NO：90)突变为PVA；

-IgG1铰链区-IgG2铰链区嵌合体，其中IgG1残基ELLG(SEQ ID NO：90)突变为PVA；

-IgG1铰链区，其中残基ELLG(SEQ ID NO：90)突变为GGG；

-IgG1铰链区，其中残基APEL(SEQ ID NO：91)突变为GGGF(SEQ ID NO：92)、GGGG(SEQID NO：93)或GGGL(SEQ ID NO：94)；

-IgG1铰链，其中APE残基缺失；

-IgG2铰链区；

-IgG3铰链区；

-IgG4铰链区；

-IgG4铰链区，其中IgG4铰链残基EFLG(SEQ ID NO：95)突变为PVA；或

-IgG4铰链区，其中残基EFLG(SEQ ID NO：95)突变为GGG。

2.权利要求1的VEGF微阱，其中所述铰链区包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：

DKTHTCPPCPAPPVA(SEQ ID NO：2，或其变体)；

DKTHTCPPCPAPGGG(SEQ ID NO：3，或其变体)；

ERKCCVECPPCPAPPVA(SEQ ID NO：4，或其变体)；

VECPPCPAPPVA(SEQ ID NO：5，或其变体)；

DTPPPCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：6的氨基酸6-21，或其变体)；

YGPPCPPCPAPEFLG(SEQ ID NO：7的氨基酸4-18，或其变体)；

YGPPCPPCPAPPVA(SEQ ID NO：8的氨基酸4-17，或其变体)；

YGPPCPPCPAPGGG(SEQ ID NO：9的氨基酸4-17，或其变体)；

DKTHTCPPCPAPPVA(SEQ ID NO：10，或其变体)；

DKTHTCPPCPGGGFLG(SEQ ID NO：11，或其变体)；

DKTHTCPPCPGGGGLG(SEQ ID NO：12，或其变体)；

DKTHTCPPCPGGGLLG(SEQ ID NO：13，或其变体)；或

DKTHTCPPCPLLG(SEQ ID NO：14，或其变体)。

3.一种包含多肽的VEGF阱，所述多肽的特征在于以下的结构域结构：

[(VEGFR1 Ig2)-(VEGFR2 Ig3)]a-多聚化组分(MC)，

或

[(VEGFR1 Ig2)-(VEGFR2 Ig3)-(VEGFR2 Ig4)]a-多聚化组分(MC)，

其中a＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；和

其中所述MC包含人Fc铰链区，其是

-包含隐形突变的IgG1铰链区；

-IgG1铰链区-IgG2铰链区嵌合体；

-一个或多个残基APELLG(SEQ ID NO：108)或PEL突变的IgG1铰链区；

-APE残基缺失的IgG1

-IgG2铰链区；

-IgG3铰链区；

-IgG4铰链区；或

-包含隐形突变的IgG4铰链区；

其中所述MC包含蛋白酶切割位点。

4.权利要求3的VEGF阱，其中所述MC包含以下的氨基酸序列、由以下的氨基酸序列组成或基本上由以下的氨基酸序列组成：

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：15，或其变体)或其氨基酸6-25；

EPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：16，或其变体)或其氨基酸6-24；

EPKSCDKTHTCPPCPAPGGGGPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：17，或其变体)或其氨基酸6-24；

ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：18，或其变体)或其氨基酸1-21或6-21；

EPKSCDTPPPCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：19，或其变体)或其氨基酸6-25；

ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：20，或其变体)或其氨基酸1-22；

ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：21，或其变体)或其氨基酸1-21；

ESKYGPPCPPCPAPGGGGPSVFLFPPKPKDT(SEQ ID NO：22，或其变体)或其氨基酸1-21；

DKTHTCPPCPAPPVAGPSV(SEQ ID NO：70)；

DKTHTCPPCPGGGFLGGPSV(SEQ ID NO：74的氨基酸6-25)；

DKTHTCPPCPGGGGLGGPSV(SEQ ID NO：75的氨基酸6-25)；

DKTHTCPPCPGGGLLGGPSV(SEQ ID NO：76的氨基酸6-25)；或

DKTHTCPPCPLLGGPSV(SEQ ID NO：77的氨基酸6-22)。

5.权利要求3-4任一项的VEGF阱，其中所述MC包含以下的氨基酸序列、由以下的氨基酸序列组成或基本上由以下的氨基酸序列组成：

6.一种VEGF微阱，其包含以下的氨基酸序列、由以下的氨基酸序列组成或基本上由以下的氨基酸序列组成：

7.一种VEGF阱，其包含以下的氨基酸序列、由以下的氨基酸序列组成或基本上由以下的氨基酸序列组成：

8.权利要求1-7任一项的VEGF阱或VEGF微阱，其是糖基化的。

9.权利要求1-8的VEGF阱或微阱，其中

·所述VEGF阱或VEGF微阱包含N-连接的聚糖；

·所述VEGF阱或VEGF微阱包含O-连接的聚糖；

·所述VEGF阱或VEGF微阱在一个或多个残基是唾液酸化的、半乳糖基化的和/或岩藻糖基化的；

·所述VEGF阱或VEGF微阱在一个或多个残基包含N-连接的甘露糖-5聚糖(Man5)和/或二等分N-聚糖；和/或

·所述VEGF阱或VEGF微阱包含CHO细胞糖基化。

10.权利要求1-9任一项的VEGF阱或微阱，其特征在于以下的任何一个或多个：

·具有小于97kDa的分子量；

·对于阻断VEGFR1和/或VEGFR2的VEGF₁₂₁和/或VEGF₁₆₅激活，具有约1-2×10^-11M的IC₅₀，如在HEK293细胞中测量的，所述HEK293细胞表达与IL18α或IL18Rβ的胞内结构域融合的VEGF受体胞外结构域并具有NFκB-荧光素酶-IRES-eGFP报告基因；

·在猴初始血清样品和/或人AMD/DME基线血清样品中呈现出比REGN7483更低的免疫原性，如通过抗药物抗体(ADA)测定测量的；

·与VEGF₁₆₅同型二聚体形成1:1复合物；

·与VEGF₁₆₅同型二聚体和抗VEGF Fab片段形成1:1:2复合物(VEGF微阱:VEGF₁₆₅同型二聚体:抗VEGF Fab片段)；

·在氧诱导性视网膜病小鼠模型中玻璃体内给药时，减少视网膜新生血管形成；

·注射约0.146mg VEGF微阱时，在兔的玻璃体中半衰期为约3.4天或3.9天；

·在非人灵长类动物中，与玻璃体内注射4mg/眼的阿柏西普相比，玻璃体内注射约5.5mg/眼时呈现出更低的游离分子血浆水平；

·玻璃体内注射约5.5mg/眼后约336小时，在非人灵长类动物血浆中呈现出约0.1或0.2或0.1-0.2微克/ml(或更低)的游离分子浓度；

·在4次约每隔28天的玻璃体内注射约5.5mg/眼后，在非人灵长类动物的眼中没有明显积聚；

·在37℃储存4周时，与阿柏西普和/或REGN7483相比，呈现出较少的高分子量物质的形成；

·在20℃，在90mg/ml浓度，具有约5.8cP的粘度，和/或在约120mg/ml浓度，具有约12.1cP的粘度；

·以HMW/M lux*hr以约8.8％的增加速率暴露于光时，形成HMW物质(相对于暗对照)；

·一个或多个组氨酸被氧化成2-氧-组氨酸，

·一个或多个色氨酸被脱氧；

·其一个或多个天冬酰胺被糖基化；

·一个或多个丝氨酸或苏氨酸被O-糖基化；

·一个或多个天冬酰胺被脱酰胺；

·一个或多个天冬氨酸-甘氨酸基序转化为异天冬氨酸-甘氨酸和/或Asn-Gly；

·一个或多个甲硫氨酸被氧化；

·一个或多个色氨酸转化为N-甲酰犬尿氨酸；

·一个或多个精氨酸转化为Arg 3-脱氧葡糖醛酮；

·不存在C-末端残基；

·存在一个或多个非糖基化糖苷；

·被木糖基化；

·在赖氨酸被糖基化；

·包含具有游离硫醇基团的胱氨酸；

·包含链内二硫键；

·包含平行或交叉方向的二硫键；和/或

·包含羧甲基化的赖氨酸或精氨酸。

11.权利要求1-10任一项的VEGF阱或VEGF微阱，其是同型二聚体。

12.一种组合物，其包含权利要求1-11任一项的VEGF阱或VEGF微阱的糖基化变体的异质混合物。

13.权利要求12的组合物，其中约20-27％的所述VEGF阱或VEGF微阱是唾液酸化的，约64-72％的所述VEGF阱或VEGF微阱是半乳糖基化的，约43-45％的所述VEGF阱或VEGF微阱是岩藻糖基化的，约19-25％的VEGF阱或VEGF微阱是Man-5糖基化的，和/或约1-2％用二等分N-聚糖修饰的。

14.一种组合物，其包含权利要求1-11任一项的VEGF微阱和VEGF阱；任选地，还包含IdeS蛋白酶或其变体。

15.一种复合物，其包含与VEGF或其同型二聚体结合的权利要求1-11任一项的VEGF阱或VEGF微阱同型二聚体。

16.权利要求15的复合物：

·其中所述VEGF是人VEGF；

·其中所述VEGF是人VEGF₁₆₅；

·其中所述VEGF是人VEGF₁₂₁；

·其包括抗VEGF抗体或其Fab片段；

·其包括人VEGF同型二聚体和抗VEGF Fab片段，其中VEGF微阱同型二聚体:人VEGF:Fab的化学计量比率为1:1.2；

和/或

·其中VEGF微阱同型二聚体:VEGF同型二聚体的化学计量比率为1:1。

17.一种药物制剂，其包含权利要求1-11任一项的VEGF阱或VEGF微阱和药学上有效的载剂。

18.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-9任一项的VEGF阱或VEGF微阱，任选包含SEQ ID NO：71、72或73所示的核苷酸序列。

19.一种载体，其包含权利要求18的多核苷酸。

20.一种宿主细胞，其包含权利要求18-19任一项的多核苷酸或载体。

21.权利要求20的宿主细胞，其是中国仓鼠卵巢细胞。

22.一种分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：32-49的氨基酸序列、由选自SEQ ID NO：32-49的氨基酸序列组成或基本上由选自SEQ ID NO：32-49的氨基酸序列组成。

23.一种用于制备VEGF微阱或其药物制剂的方法，其包含将权利要求3、4、5、7、8、9、10或11任一项的VEGF阱与切割所述VEGF阱的MC的蛋白酶接触，并在促进切割的条件下孵育所述VEGF阱和蛋白酶，并且任选分离所述切割的VEGF微阱产物。

24.权利要求23的方法，其中所述蛋白酶是IdeS。

25.权利要求24的方法，其中所述IdeS蛋白酶包含选自SEQ ID NO：50-65的氨基酸序列。

26.一种用于制备VEGF阱或VEGF微阱的方法，其包含在促进阱或微阱表达的条件下在培养基中孵育权利要求20-21任一项的宿主细胞，并任选从所述宿主细胞和/或培养基分离所述阱或微阱。

27.权利要求26的方法，其中所述VEGF阱或VEGF微阱是VEGF阱，所述方法进一步包含将所述VEGF阱接触切割所述VEGF阱的MC的蛋白酶，并在促进所述蛋白酶切割的条件下孵育所述VEGF阱和蛋白酶。

28.一种VEGF阱或VEGF微阱，其是权利要求23-27任一项的方法的产物。

29.权利要求28的VEGF阱或VEGF微阱，其是同型二聚体。

30.一种组合物，其是权利要求23-25或27任一项的方法的产物，其包含VEGF阱、IdeS蛋白酶和VEGF微阱，所述VEGF微阱是由所述蛋白酶切割所述VEGF阱的产物。

31.一种容器、生物反应器或注射装置，其包含权利要求1-11或17或28或29任一项的VEGF阱或VEGF微阱或其药物制剂。

32.权利要求31的容器、生物反应器或注射装置，其是选自注射器、一次性注射器和预填充注射器的注射装置。

33.权利要求31-32任一项的注射装置，其是无菌的和/或玻璃和/或塑料的。

34.一种用于治疗或预防需要的受试者中的血管生成性眼病的方法，其包含将治疗有效量的权利要求1-11或17或28或29的VEGF阱或VEGF微阱或其药物制剂施用于所述受试者。

35.权利要求34的方法，其中所述血管生成性眼病是年龄相关性黄斑变性、湿性年龄相关性黄斑变性、黄斑水肿、视网膜静脉阻塞后黄斑水肿、黄斑静脉阻塞(RVO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、糖尿病黄斑水肿(DME)、脉络膜新生血管形成(CNV)、虹膜新生血管形成、新生血管性青光眼、早产儿视网膜病变(ROP)、青光眼术后纤维化、增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)、视盘新生血管形成、角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、玻璃体新生血管形成、血管翳、翼状胬肉、血管性视网膜病变、糖尿病黄斑水肿受试者的糖尿病性视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、非增殖性糖尿病性视网膜病变和/或增殖性糖尿病性视网膜病变。

36.权利要求34-35任一项的方法，其中将所述VEGF阱或VEGF微阱眼内施用于受试者。

37.权利要求34-35任一项的方法，其中将所述VEGF阱或VEGF微阱玻璃体内施用于受试者。

38.一种用于在需要的受试者中减少视网膜的新生血管形成和/或减少视网膜的血管通透性和/或增加视网膜的无血管化面积和/或减小视网膜血管化面积的方法，其包含将治疗有效量的权利要求1-11或17或28或29的VEGF阱或VEGF微阱或其药物制剂施用于所述受试者。

39.一种用于治疗或预防需要的受试者中的癌症的方法，其包含将治疗有效量的权利要求1-11或17或28或29的VEGF阱或VEGF微阱或其药物制剂施用于所述受试者。

40.权利要求39的方法，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、结直肠癌、转移性结直肠癌、前列腺癌、皮肤癌或胃癌。

41.一种用于将权利要求1-11或17或28或29的VEGF阱或VEGF微阱或其药物制剂施用于受试者的方法，其包含将所述VEGF阱或VEGF微阱或药物制剂引入所述受试者的体内。

42.权利要求41的方法，其中通过注射将所述VEGF阱或VEGF微阱或药物制剂引入所述受试者的体内。

43.权利要求41-42任一项的方法，其中通过玻璃体内注射将所述VEGF阱或VEGF微阱或药物制剂引入所述受试者的眼中。

44.权利要求34-38或41-43任一项的方法，其中所述施用后所述受试者未经历眼内压的升高和/或血压的升高。