MX2010004883A

MX2010004883A - Polipeptidos y acidos nucleicos inmunosupresores.

Info

Publication number: MX2010004883A
Application number: MX2010004883A
Authority: MX
Inventors: Juha Punnonen; Madan M Paidhungat; Erik E Karrer; Steven H Bass; Margaret Neighbors; Steven J Chapin; Sridhar Viswanathan; Brent R Larsen
Original assignee: Perseid Therapeutics Llc
Priority date: 2007-11-01
Filing date: 2008-10-15
Publication date: 2010-11-10
Also published as: CN103172750B; CY1113713T1; WO2009058564A3; US8496935B2; TWI448473B; WO2009058564A2; PH12013501101B1; IL205036A0; PL2222697T3; EP2222697B1; PL2612868T3; IL205036A; US8268587B2; US20100260759A1; US8445230B2; US20110182898A1; US20110130546A1; DK2222697T3; US20110177071A1; EP2385065A1

Abstract

La invención provee polipéptidos inmunosupresores y ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos; en un aspecto la invención provee polipéptidos CTLA-4 mutantes y ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos CTLA-4 mutantes; se proveen también composiciones y métodos para utilizar tales polipéptidos y ácidos nucleicos.

Description

POLIPEPTIDOS Y ÁCIDOS NUCLEICOS INMUNOSUPRESORES REFERENCIAS CRUZADAS A SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica la prioridad y el beneficio de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos N.° 60/984.631 , presentada el 1o de noviembre de 2007, y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos N.° 61/051.215, presentada el 7 de mayo de 2008, la divulgación de cada una de las cuales se incorpora aquí a modo de referencia en su totalidad a todos los efectos.

NOTIFICACION DE LOS DERECHOS DE AUTOR De conformidad con el artículo 1.71 (e) del título 37 del Código de Normas Federales (C.F.R.), los solicitantes señalan que una parte de la presente divulgación contiene material que está protegido por derechos de autor. El titular de los derechos de autor no objeta la reproducción facsímil del documento de patente o su divulgación, según consta en el archivo o los registros de la Oficina de Patentes y Marcas, pero se reserva los derechos para cualquier otro fin.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere en general a polipéptidos novedosos que se unen a CD80 y/o CD86, al ácido nucleico que codifica dichos polipéptidos y los procedimientos para producir y utilizar tales polipéptidos y ácidos nucleicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las células T desempeñan un papel muy importante en el inicio y la regulación de las respuestas inmunitarias. Para que se produzca la activación completa de las células T, se requieren al menos dos eventos de señalización diferenciados. Se produce una primera señal con la interacción de los receptores de la célula T (RCT) expresados en las células T con antígenos (Ag) específicos que se presentan en el contexto de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) expresadas en células presentadoras de antígenos (CPA). Una segunda señal (coestimulación) resulta de la interacción entre ligandos coestimuladores expresados en CPA y sus receptores correspondientes expresados en células T. Una vía de coestimulación dominante implica la interacción entre los ligandos de CD80 (B7-1 o B7.1) y CD86 (B7-2 o B7.2) expresados en CPA con CD28 y CTLA-4 (también conocido como CD152) principalmente expresado en las células T. CTLA-4 (antígeno 4 asociado al linfocito T citotóxico) y CD28 actúan como receptores de los ligandos CD80 y CD86. La señalización positiva está mediada por el receptor CD28. La unión de los ligandos CD80 y CD86 al CD28 disminuye el umbral de activación de la célula T al promover la formación de sinapsis inmunológicas (Viola A. et al, Science 238:680-682 (1999)). Adicionalmente, la coestimulación del CD28 activa o mejora la producción de factores centrales para la proliferación y supervivencia de células T, así como la interleucina-2 (IL-2), el NF-Kb, y la Bcl-XL (Norton S.D. et al, J. Inmunol. 149:1556-1561 (1992); Vella A. T. et al, J. Inmunol. 158: 4714-4720 (1997)). In vivo, los ratones con deficiencia de CD28 están gravemente inmunocomprometidos y muestran bajas respuestas de células T específicas de antígeno (Green, J.M. et al, Immunity 1 :501-508 (1994)). Puede producirse la anergia o la tolerancia de las células T cuando éstas se activan en ausencia de la señal coestimuladora. La señalización negativa es mediada por el receptor CTLA-4.

Los ligandos CD80 y CD86 se enlazan con gran avidez al CTLA-4 y equilibra las respuestas inmunoproliferativas que derivan de la señalización de CD28. Los mecanismos potenciales de la señalización de CTLA-4 incluyen uniones competitivas de moléculas coestimuladoras CD80/CD86 (Masteller, E.M. et al, J. Inmunol. 164:5319 (2000)), la inhibición de la señalización de RCT mediante la inducción de fosfatasas a inmunosinapsis (Lee K. M. et al, Science 282:2263 (1998)), y la interrupción de la sinapsis inmunológica (Pentcheva-Hoang T. et al, Immunity 21 :401 (2004): Chikuma S. et al, J. Exp.

Med 197:129 (2003): Schneider H. et al, Science 313:1972 (2006)). In vivo, los ratones con deficiencia de CTLA-4 muestran fenotipos autoinmunes profundos caracterizados por una infiltración de tejidos y una destrucción de órganos masivas (Waterhouse P. et al, Science 270:985 (1995)). Los agentes terapéuticos diseñados para antagonizar la vía de coestimulación CD80/CD86, como la CTLA-4-lg humana soluble, tienen potencial para el tratamiento de enfermedades y trastornos autoinmunes. La presente invención proporciona moléculas ventajosas con capacidades mejoradas para modular o suprimir señalizaciones a través de la vía de coestimulación CD80/CD86 y los procedimientos para utilizar dichas moléculas para la manipulación selectiva y diferencial de las respuestas de la célula T. Las moléculas son de uso beneficioso en una variedad de aplicaciones, según se establece detalladamente a continuación.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un primer aspecto, la invención proporciona un polipéptido de CTLA-4 aislado o recombinante que comprende una secuencia de polipéptidos que difiere de la secuencia de polipéptidos del dominio extracelular de CTLA-4 humano que se muestra en SEQ ID NO:159 en hasta 15 residuos de aminoácidos, donde el polipéptido aislado o recombinante tiene la capacidad de unir CD80 o CD86 o un dominio extracelular de cualquiera de ellos y/o tiene la capacidad de suprimir o impedir una respuesta inmunitaria. Un polipéptido, de conformidad con el primer aspecto de la invención, puede tener al menos una identidad de secuencia del 90%, o una identidad de secuencia de al menos 95%, de al menos 96%, de al menos 97%, de al menos 98% o de al menos 99% con la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO:36. Un polipéptido, de conformidad con el primer aspecto dé la invención, puede contener la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO:36: Un polipéptido, de conformidad con el primer aspecto de la invención, puede tener una identidad de secuencia de al menos 90% o una identidad de secuencia de al menos 95%, de al menos 96%, de al menos 97%, de al menos 98% o de al menos 99% con la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO:50. Un polipéptido, de conformidad con el primer aspecto de la invención, puede contener la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO:50. Un polipéptido, de conformidad con el primer aspecto de la invención, puede tener la capacidad de unirse al CD80 humano o el CD86 humano o un dominio extracelular de cualquiera de estos. Un polipéptido, de conformidad con el primer aspecto de la invención, puede contener una secuencia de polipéptidos que es de 124 residuos de aminoácidos de longitud. Un polipéptido, de conformidad con el primer aspecto de la invención, puede contener una sustitución de un aminoácido en una posición de aminoácido seleccionada del grupo compuesto por las posiciones de aminoácidos correspondientes a la posición 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 u 85 con relación a la SEQ ID NO: 159. Un polipéptido, de conformidad con el primer aspecto de la invención, puede contener dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos en posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo compuesto por las posiciones de aminoácidos correspondientes a la posición 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 u 85 con relación a la SEQ ID NO: 159. Un polipéptido, de conformidad con el primer aspecto de la invención, puede contener una sustitución de aminoácidos en la posición 70 con relación a la SEQ ID NO: 159, como la sustitución S70F. Un polipéptido del primer aspecto de la invención puede contener una sustitución de aminoácidos en la posición 104 con relación a la SEQ ID NO:159, como la sustitución L104E. Un polipéptido del primer aspecto de la invención puede contener una sustitución de aminoácidos en la posición 30 con relación a la SEQ ID NO:159, como la sustitución T30N/D/A o la sustitución T30N. Un polipéptido del primer aspecto de la invención puede contener una sustitución de aminoácidos en la posición 64 con relación a la SEQ ID NO:159, como la sustitución S64P. Un polipéptido del primer aspecto de la invención puede contener una sustitución de aminoácidos en la posición 50 con relación a la SEQ ID NO:159, como la sustitución A50M. Un polipéptido del primer aspecto de la invención puede contener una sustitución de aminoácidos en la posición 54 con relación a la SEQ ID NO: 159, como la sustitución M54K/V o la sustitución M54K. Un polipéptido del primer aspecto de la invención puede contener una sustitución de aminoácidos en la posición 65 con relación a la SEQ ID NO: 159, como la sustitución I65S. Un polipéptido del primer aspecto de la invención puede contener una sustitución de aminoácidos en la posición 56 con relación a la SEQ ID NO: 159, como la sustitución N56D. Un polipéptido del primer aspecto de la invención puede contener una sustitución de aminoácidos en la posición 55 con relación a la SEQ ID NO:159, como la sustitución G55E. Un polipéptido del primer aspecto de la invención puede contener una sustitución de aminoácidos en la posición 85 con relación a la SEQ ID NO: 159, como la sustitución M85A. Un polipéptido del primer aspecto de la invención puede contener una sustitución de aminoácidos en la posición 24 con relación a la SEQ ID NO:159, como la sustitución A24E/S o la sustitución A24E. Un polipéptido del primer aspecto de la invención puede tener una afinidad de unión al CD86 o un dominio extracelular de este que es aproximadamente igual o mayor a la afinidad de unión de un dominio extracelular de CTLA-4 humano monomérico al CD86 o al dominio extracelular de CD86. Un polipéptido del primer aspecto de la invención puede tener una afinidad de unión al CD80 o un dominio extracelular de este mayor a la afinidad de unión de un dominio extracelular de CTLA-4 humano monomérico al CD80 o al dominio extracelular de CD80. Un polipéptido del primer aspecto de la invención puede tener la capacidad de suprimir una respuesta inmunitaria. Un polipéptido del primer aspecto de la invención puede tener la capacidad de inhibir la activación de las células T o la proliferación de las células T. En un segundo aspecto, la invención proporciona un multimero de polipéptidos aislado o recombinante que comprende al menos dos polipéptidos del primer aspecto de la invención. En un tercer aspecto, la invención proporciona una proteína de fusión aislada o recombinante compuesta por (a) un polipéptido de conformidad con el primer aspecto de la invención, y (b) un segundo polipéptido, en la que el segundo polipéptido es un polipéptido de Fe de Ig, y donde la proteína de fusión tiene la capacidad de unirse a CD80 y/o CD86 o un dominio extracelular de cualquiera de ellos o ambos, y/o la capacidad de modular o regular una respuesta inmunitaria. En un cuarto aspecto, la invención proporciona una proteína dimérica de fusión aislada o recombinante que se compone de dos proteínas monoméricas de fusión de conformidad con el tercer aspecto de la invención. En un quinto aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante compuesto por una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido del primer aspecto de la invención, un multimero del segundo aspecto de la invención, una proteína de fusión del tercer aspecto de la invención o una proteína dimérica de fusión del cuarto aspecto de la invención. En un sexto aspecto, la invención proporciona un vector compuesto por un ácido nucleico del quinto aspecto de la invención. En un séptimo aspecto, la invención proporciona una célula huésped aislada o recombinante compuesta por un polipéptido del primer aspecto de la invención, un multímero del segundo aspecto de la invención, una proteína de fusión del tercer aspecto de la invención, una proteína dimérica de fusión del cuarto aspecto de la invención, un ácido nucleico del quinto aspecto de la invención y/o un vector del sexto aspecto de la invención. En un octavo aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica compuesta por un excipiente farmacéuticamente aceptable, un portador farmacéuticamente aceptable, o un diluyente farmacéuticamente aceptable y uno o más de los siguientes: un polipéptido del primer aspecto de la invención, un multímero del segundo aspecto de la invención, una proteína de fusión del tercer aspecto de la invención, una proteína dimérica de fusión del cuarto aspecto de la invención, un ácido nucleico del quinto aspecto de la invención, un vector del sexto aspecto de la invención y/o una célula huésped del séptimo aspecto de la invención. En un noveno aspecto, la invención proporciona un procedimiento para suprimir una respuesta inmunitaria, procedimiento que comprende poner en contacto una célula B7 positiva con una cantidad efectiva de al menos uno de los siguientes: un polipéptido del primer aspecto de la invención, un multímero del segundo aspecto de la invención, una proteína de fusión del tercer aspecto de la invención, una proteína dimérica de fusión del cuarto aspecto de la invención, un ácido nucleico del quinto aspecto de la invención, un vector del sexto aspecto de la invención y/o una célula huésped del séptimo aspecto de la invención para suprimir una respuesta inmunitaria y se suprime asi una respuesta inmunitaria. En un décimo aspecto, la invención proporciona un polipéptido del primer aspecto de la invención, un multímero del segundo aspecto de la invención, una proteína de fusión del tercer aspecto de la invención, una proteina dimérica de fusión del cuarto aspecto de la invención, un ácido nucleico del quinto aspecto de la invención, un vector del sexto aspecto de la invención y/o una célula huésped del séptimo aspecto de la invención para su uso en la supresión de una respuesta inmunitaria. En un undécimo aspecto, la invención proporciona el uso de un polipéptido del primer aspecto de la invención, un multímero del segundo aspecto de la invención, una proteína de fusión del tercer aspecto de la invención, una proteína dimérica de fusión del cuarto aspecto de la invención, un ácido nucleico del quinto aspecto de la invención, un vector del sexto aspecto de la invención y/o una célula huésped del séptimo aspecto de la invención en la fabricación de un medicamento para suprimir una respuesta inmunitaria. En un duodécimo aspecto, la invención proporciona un conjugado compuesto por un polipéptido del primer aspecto de la invención, un multímero del segundo aspecto de la invención, una proteína de fusión del tercer aspecto de la invención o una proteína dimérica de fusión del cuarto aspecto de la invención, y una porción no polipeptídica covalentemente enlazada a dicho polipéptido, dicho multímero, dicha proteína de fusión o dicha proteína dimérica de fusión, donde dicho conjugado tiene la capacidad de suprimir una respuesta inmunitaria. Se describen a continuación otros aspectos de la invención. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante compuesto por una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% para al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO:1 a 73, donde el polipéptido se une a CD80 o CD86 o un dominio extracelular (DEC) de cualquiera de ellos, y/o tiene la capacidad de suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante compuesto por una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% para al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO:1 a 73, donde el polipéptido tiene afinidad de unión para un dominio extracelular de CD86 humano o a un dominio extracelular de CD80 humano que es aproximadamente igual o mayor que la afinidad de unión de un dominio extracelular de CTLA-4 humano al dominio extracelular de CD86 humano o al dominio extracelular de CD80 humano, respectivamente, y donde el polipéptido tiene, opcionalmente, la capacidad de suprimir una respuesta inmunitaria. Algunos de dichos polipéptidos tienen una afinidad de unión al dominio extracelular de CD86 humano que es mayor que la afinidad de unión del dominio extracelular de CTLA-4 humano al dominio extracelular de CD86 humano. Algunos de dichos polipéptidos tienen una afinidad de unión al dominio extracelular de CD80 humano que es mayor que la afinidad de unión del dominio extracelular de CTLA-4 humano al dominio extracelular de CD80 humano. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido muíante de CTLA-4 aislado o recombinante que está compuesto por una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de la secuencia de polipéptidos del dominio extracelular de CTLA-4 humano que se muestra en la SEQ ID NO: 159 en no más de 10, 9 , 8, 7 ó 6 residuos de aminoácidos (por ejemplo: no más de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 residuos de aminoácidos), y (b) comprende al menos una sustitución de aminoácidos en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 u 85 con relación a la SEQ ID NO: 159, donde el polipéptido muíante de CTLA-4 tiene la capacidad de unirse a CD80 ó CD86 o un dominio extracelular de cualquiera de ellos y/o tiene la capacidad de suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene (i) una identidad de secuencia de al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO:1 a 73 y (ii) un residuo de fenilalanina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 70 de dicha secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO:1 a 73, donde el polipéptido tiene la capacidad de unirse a CD80 y/o CD86 ó un dominio extracelular de cualquiera de los dos, y/o tiene la capacidad de suprimir o inhibir una respuesta inmune. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido mutante de CTLA-4 aislado o recombinante que se une a CD80 y/o CD86 y/o un dominio extracelular de cualquiera de ellos o ambos y/o es capaz de suprimir una respuesta inmunitaria, donde dicho polipéptido comprende una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de la secuencia de polipéptidos del polipéptido de dominio extracelular de CTLA-4 humano que se muestra en SEQ ID NO: 159 en no más de 10, 9, 8, 7 ó 6 residuos de aminoácidos (por ejemplo, no más de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 residuos de aminoácidos) y (b) comprende al menos una sustitución de aminoácidos, donde dicha sustitución comprende al menos S70F, donde las posiciones de residuos de aminoácidos se numeran de conformidad con la SEQ ID NO: 159. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido mutante de CTLA-4 aislado o recombinante que comprende una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de la secuencia de polipéptidos del dominio extracelular de CTLA-4 humano que se muestra en la SEQ ID NO: 159 en no más de 11 , 10, 9, 8, 7 ó 6 residuos de aminoácidos (por ejemplo, no más de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 residuos de aminoácidos), y (b) comprende al menos una sustitución de aminoácidos en una posición de residuo de aminoácido correspondiente a la posición 24, 30, 32, 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 u 85 con relación a la SEQ ID NO: 159, donde el polipéptido muíante de CTLA-4 tiene la capacidad de unirse a CD80 o CD86 o un dominio extracelular de cualquiera de ellos y/o tiene la capacidad de suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante que comprende una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEQ ID NO:31 en no más de 10, 9, 8, 7 ó 6 residuos de aminoácidos (por ejemplo, no más de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 residuos de aminoácidos), y (b) que comprende al menos uno de los siguientes: un residuo de metionina en una posición correspondiente a la posición 50 de la SEQ ID NO:31 , un residuo de lisina en una posición correspondiente a la posición 54 de la SEQ ID NO:31 , un residuo de ácido glutámico en una posición correspondiente a la posición 55 de la SEQ ID NO:31 , un residuo de prolina en una posición correspondiente a la posición 64 de la SEQ ID NO:31 , un residuo de serina en una posición correspondiente a la posición 65 de la SEQ ID NO:31 , un residuo de fenilalanina en una posición correspondiente a la posición 70 de la SEQ ID NO:31 , donde las posiciones del residuo de aminoácido están numeradas de conformidad con la SEQ ID NO:31 ,y el polipéptido se une a CD80 y/ó CD86 y/o un dominio extracelular de cualquiera de ellos, y/o inhibe una respuesta inmunitaria. En otro aspecto, la invención proporciona un dímero de proteína de fusión aislada o recombinante que comprende dos proteínas de fusión monoméricas unidas por al menos un enlace de disulfuro formado entre dos residuos de cisteína presentes en cada proteína de fusión monomérica muíante, donde cada proteína de fusión monomérica comprende (a) un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO: 1 a 73 y (b) un polipéptido de Fe de Ig, donde el dímero de proteína de fusión tiene la capacidad de unirse a CD80 y/o CD86, y/o CD80-lg y/o CD86-lg, y/o tiene la capacidad de impedir o inhibir una respuesta inmunitaria. En otro aspecto, la invención proporciona un dímero de proteína de fusión aislada o recombinante que comprende dos proteínas de fusión monoméricas, cada proteína de fusión monomérica comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222, donde el polipéptido se une a CD80 y/o CD86 y/o un dominio extracelular de estos y/o suprime una respuesta inmunitaria, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de estos. En otro aspecto, la invención proporciona un dímero de proteína ?6 de fusión aislada o recombinante que comprende dos proteínas de fusión monoméricas, donde cada proteína de fusión monomérica comprende: (1) un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que difiere de una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO: 1 a 73 en no más de 10, 9, 8, 7 ó 6 residuos de aminoácidos (por ejemplo, no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 residuos de aminoácidos), y donde el residuo de aminoácido en la secuencia de polipéptidos en la posición 41 , 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 u 85 es idéntico al residuo de aminoácido en la posición correspondiente de dicha secuencia de polipéptidos seleccionada, y (2) un polipéptido de Fe de Ig, donde el dímero de la proteína de fusión se une a CD80 y/o CD86 y/o inhibe una respuesta inmunitaria. En otro aspecto, la invención proporciona un dímero de proteína de fusión aislada o recombinante que comprende dos proteínas de fusión monomérica, donde cada proteína de fusión monomérica comprende: (1) un polipéptido del dominio extracelular de CTLA-4 mutante que comprende una secuencia de polipéptidos que (i) difiere de una secuencia de polipéptidos del dominio extracelular de CTLA-4 humano que se muestra en la SEQ ID NO: 159 en no más de 10, 9, 8, 7 ó 6 residuos de aminoácidos (por ejemplo, no más de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 residuos de aminoácidos), y (ii) comprende al menos una sustitución de aminoácido en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 u 85 en relación con la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 159; y (2) un polipéptido de Fe de Ig, donde el dímero de la proteína de fusión se une a CD80 y/o CD86, y/o suprime o inhibe una respuesta inmunitaria. Algunos de los dimeros de proteínas de fusión comprenden una o más sustituciones en las posiciones de aminoácido en relación con la SEQ ID NO: 159 seleccionadas del grupo que comprende A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S y S70F, y (2) un polipéptido de Fe de Ig, polipéptido de Fe de Ig que es opcionalmente un polipéptido de Fe de lgG2, donde el dímero mutante de CTLA-4-lg se une a hCD80 y/o hCD86, y/o suprime o inhibe una respuesta inmunitaria. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de identidad de secuencia con una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO: 50 y la SEQ ID NO: 56, donde el polipéptido (i) se une a CD80 y/o CD86 o un dominio extracelular de cualquiera de ellos o ambos, y/o (ii) suprime una respuesta inmunitaria. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222, donde el polipéptido (i) se une a CD80 y/o CD86 o un dominio extracelular de cualquiera de ellos, (ii) se une a una proteína de fusión de CD80-lg y/o una protema de fusión de CD86-lg, y/o (iíi) suprime una respuesta inmunitaria.

También, se proporciona un dímero de proteína de fusión aislada o recombinante que comprende dos proteínas de fusión monoméricas unidas por al menos un enlace de disulfuro formado entre dos residuos de cisteina presentes en cada proteína de fusión monomérica muíante, donde cada proteína de fusión monomérica comprende (a) un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 95% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende la SEQ ID NO: 79, la SEQ ID NO: 197, la SEQ ID NO: 198, la SEQ ID NO: 199 y la SEQ ID NO: 200 y (b) un polipéptido de Fe de Ig, donde el dímero de la proteína de fusión tiene (i) la capacidad de unirse a CD80 y/o CD86 y/o un dominio extracelular de CD80 y/o CD86, (ii) la capacidad de unirse a CD80-lg y/o CD86-lg, y/o (iii) tiene la capacidad de inhibir o suprimir una respuesta inmunitaria. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO: 1 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222, donde el polipéptido se une a CD80 y/o CD86 y/o un dominio extracelular de cualquiera de ellos o ambos, y/o tiene la capacidad de suprimir una respuesta inmunitaria, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico, aislado o recombinante que comprende una secuencia de polipéptidos que codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222, donde el polipéptido se une a CD80 y/o CD86 y/o un dominio extracelular de estos y/o suprime una respuesta inmunitaria o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende: (a) una secuencia de polinucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con al menos una secuencia de polinucleótidos seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO: 80 a 158, 201 a 204, 223 y 224; (b) una secuencia de polinucleótidos complementaria de (a); o (c) un fragmento de cualquier secuencia de polinucleótidos de (a) o (b), donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que se une a CD80 y/o CD86 y/o un dominio extracelular de cualquiera de ellos o ambos, y/o tiene la capacidad de suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO: 1 a 73 en no más de 10, 9, 8, 7, ó 6 residuos de aminoácidos (por ejemplo, no más de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 residuos de aminoácido), y (b) donde el residuo de aminoácido en la secuencia de polipéptidos en la posición 41 , 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70, u 85 es idéntico al residuo aminoácido en la posición correspondiente de dicha secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO:1 a 73, donde el polipéptido se une a CD80 y/o CD86 y/o un dominio extracelular de cualquiera de ellos o ambos, y/o inhibe una respuesta inmunitaria o una secuencia de polinucleótidos complementaria de estos. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de la secuencia de polipéptidos de dominio extracelular de CTLA-4 humano que se muestra en SEQ ID NO: 159 en no más de 10, 9, 8, 7 ó 6 residuos de aminoácidos (por ejemplo, no más de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 residuos de aminoácidos), y (b) comprende al menos una sustitución de aminoácidos en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 u 85 en relación con la SEQ ID NO: 159, donde dicho polipéptido tiene la capacidad de unirse a CD80 y/o CD86 y/o un dominio extracelular de cualquiera de ellos, y/o tiene la capacidad de suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de estos. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene (i) una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO: 1 a 73 y (ii) un residuo de fenilalanina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 70 de dicha secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO: 1 a 73, donde el polipéptido se une a hCD80 y/o hCD86 o un dominio extracelular de estos y/o inhibe una respuesta inmunitaria, donde dicha sustitución de aminoácido comprende, opcionalmente, S70F o una secuencia de polinucleótidos complementaria del este. En otro aspecto, la invención proporciona ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido dimérico recombinante que comprende dos polipéptidos donde cada polipéptido comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO: 1 a 73, donde el dimero se une a hCD80 y/o hCD86 y/o inhibe una respuesta inmunitaria, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende (a) un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO: 1 a 73, y (b) un polipéptido de Ig, donde la proteina de fusión se une a CD80 y/o CD86, y/o tiene la capacidad de suprimir una respuesta inmunitaria o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEQ ID NO: 31 en no más de 10, 9, 8, 7 ó 6 residuos de aminoácidos (por ejemplo, no más de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 residuos de aminoácidos), y (b) comprende al menos uno de los siguientes: un residuo de metionina en una posición correspondiente a la posición 50 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de lisina en una posición correspondiente a la posición 54 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de ácido glutámico en una posición correspondiente a la posición 55 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de prolina en una posición correspondiente a la posición 64 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de serina en una posición correspondiente a la posición 65 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de fenilalanina en una posición correspondiente a la posición 70 de la SEQ ID NO: 31 , donde las posiciones del residuo de aminoácido están numeradas de conformidad con la SEQ ID NO: 31 , y donde el polipéptido se une a CD80 y/o CD86, y/o inhibe una respuesta inmunitaria, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de estos. En otro aspecto, la invención proporciona un vector de expresión que comprende: (i) una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un primer polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO: 1 a 73, donde dicho primer polipéptido se une al CD80 humano y/o CD86 humano y/o un dominio extracelular de cualquiera de ellos o ambos, y/o suprime una respuesta inmunitaria, y (ii) una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica un segundo polipéptido que comprende una región bisagra, un dominio CH2, y un dominio CH3 de un polipéptido de inmunoglobulina (Ig), cuyo polipéptido de Ig es, opcionalmente, un polipéptido de Fe de lgG2 humana. En otro aspecto, la invención proporciona una célula huésped aislada o recombinante transfectada con un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión, ácido nucleico que comprende: (i) una primera secuencia de nucleótidos que codifica el primer polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO: 1 a 73, donde dicho primer polipéptido tiene la capacidad de unirse al CD86 humano y/o CD80 humano y/o un dominio extracelular de cualquiera de ellos o ambos, y/o tiene la capacidad de suprimir una respuesta inmunitaria; y (ii) una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un segundo polipéptido que comprende una región bisagra, un dominio CH2, y un dominio CH3 de un polipéptido de inmunoglobulina (lg), cuyo polipéptido de lg es, opcionalmente, un polipéptido de Fe de lgG2 humana, donde la célula huésped es capaz de expresar la proteína de fusión. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para suprimir una respuesta ¡nmunitaria, procedimiento que comprende poner en contacto una célula B7 positiva con una cantidad efectiva de al menos un polipéptido, conjugado, ácido nucleico, vector o célula de la invención para suprimir una respuesta ¡nmunitaria, donde se suprime por tanto una respuesta inmunitaria. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para modular la interacción de las células T que expresan CD28 y/o CTLA-4 con las células B7 positivas, procedimiento que comprende poner en contacto células B7 positivas con una cantidad efectiva de al menos un polipéptido, conjugado, ácido nucleico, vector o célula de la invención para modular la interacción de las células B7 positivas con células T CD28-positivas y/o células T CTLA-4-positivas, donde se modula la interacción de células B7-positivas con células T CD28-positivas y/o células T CTLA-4-positivas. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para inhibir la interacción de células T CD28 positivas y/o células T CTLA-4 positivas con células B7 positivas, procedimiénto que comprende poner en contacto células B7 positivas con una cantidad efectiva de al menos un polipéptido, conjugado, ácido nucleico, vector o célula de la invención, donde se inhibe la interacción de las células T CD28 positivas y/o las células T CTLA-4 positivas con las células B7 positivas. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para inhibir la interacción de las células T CD28 positivas con las células Expositivas en un individuo, dicho procedimiento consiste en administrarle a un individuo una cantidad efectiva de al menos un polipéptido, conjugado, ácido nucleico, vector o célula de la invención, donde se inhibe la interacción de las células endógenas T CD28 positivas con las células endógenas B7-positivas en el individuo. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para tratar al individuo que padece una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario modulados por la interacción de las células T endógenas con células endógenas que expresan CD28 y/o CD86, procedimiento que consiste en administrarle al individuo que necesita dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un polipéptido, un conjugado, un ácido nucleico, un vector o una célula de la invención, donde se inhibe(n) la(s) interacción(es) entre células T endógenas y células endógenas que expresan dicho CD80 y/o dicho CD86, tratándose así la enfermedad o el trastorno del sistema inmunitario en el individuo. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para inhibir el rechazo del trasplante de tejidos u órganos de un donante por el individuo receptor, procedimiento que consiste en administrarle al individuo receptor que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un polipéptido, un conjugado, un ácido nucleico, un vector o una célula de la invención, inhibiendo así el rechazo del trasplante de tejidos u órganos por parte del individuo receptor. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para producir una proteína de fusión, procedimiento que consiste en: (1) cultivar una célula huésped transformada con un ácido nucleico en un medio de cultivo, donde el ácido nucleico comprende (i) una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia de polipéptidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 73, polipéptido que se une a CD86 y/o CD80 y/o un dominio extracelular de cualquiera de CD86 o CD80, y (¡i) una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de Ig que comprende una región bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3, a través de los cuales se expresa el ácido nucleico y se produce una proteína de fusión; y (2) recuperar la proteína de fusión. También se proporciona un procedimiento para producir un polipéptido que consiste en introducir el ácido nucleico de la invención en una población de células, donde el ácido nucleico está operativamente ligado a una secuencia reguladora efectiva para producir el polipéptido que codifica el ácido nucleico; cultivar las células en un medio de cultivo para producir el polipéptido; y aislar el polipéptido de las células o medio de cultivo. También se proporcionan composiciones que comprenden una molécula de la invención (por ejemplo, una molécula de CTLA-4 muíante) y un excipiente, portador o diluyente. También se incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de la invención y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptables. Se describen a continuación aspectos adicionales de la invención.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 es un diagrama esquemático del vector plasmídico de expresión de ADNpC de CTLA-4-lg mutante, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante. En la figura 1 , cada proteína de fusión CTLA-4-lg mutante comprende un polipéptido del dominio extracelular de CTLA-4 mutante de la invención fusionado en su terminal carboxilo al terminal amino de un polipéptido de Fe de lgG2 humana (hlgG2). Las figuras 2A-2D son diagramas esquemáticos de proteínas de fusión de hCD80-lg, hCD86-lg, LEA29Y-lg e hCTLA-4-lgG2 ejemplares, respectivamente. Se muestran esquemáticamente el péptido señal, el dominio extracelular (DEC), el conector (si corresponde), y el dominio Fe de Ig de cada proteína de fusión. También se muestran los residuos de aminoácido presentes en las uniones entre el péptido señal, el dominio extracelular, el conector (si corresponde) y la Fe de la Ig. El péptido señal de cada proteína de fusión se escinde típicamente durante el tratamiento y de este modo la proteína de fusión segregada (madura) típicamente no contiene la secuencia del péptido señal. La Figura 2D presenta un diagrama esquemático de la proteina de fusión CTLA-4-lgG2 humana ("hCTLA-4-lgG2") que comprende un dominio extracelular de CTLA-4 humano ("hCTLA-4-DEC") covalentemente fusionado en su terminal carboxilo a la terminal amino de un polipéptido de lgG2 humana. La secuencia de polipéptidos previsible de esta proteína de fusión hCTLA-4-lgG2 se muestra en la SEQ ID NO: 161 y comprende los siguientes segmentos: el péptido señal de hCTLA-4 (residuos de aminoácido 1 a 37), el polipéptido del DEC de hCTLA-4 (residuos de aminoácido 38 a 161) y el polipéptido de Fe de lgG2 humana (residuos de aminoácido 162 a 389). No se incluye ningún conector (por ejemplo, ningún(os) residuo(s) de aminoácido) entre la terminal carboxilo del polipéptido del DEC de hCTLA-4 y la terminal amino de Fe de lgG2 humana. El polipéptido de Fe de lgG2 humana comprende una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 de lgG2 humana. En la figura 2D, se muestran los residuos de aminoácido en las uniones entre estos varios segmentos. Específicamente, se muestran los últimos cuatro residuos de aminoácido del péptido señal, los primeros cinco y los últimos cinco residuos de aminoácido del polipéptido del DEC de hCTLA-4, y los primeros cinco y los últimos cinco residuos de aminoácidos del polipéptido de Fe de lgG2 humana. El péptido señal se escinde típicamente durante el tratamiento y de ese modo la proteína de fusión segregada (proteína de fusión madura) de hCTLA-4-lgG2 típicamente no contiene la secuencia del péptido señal. La secuencia de polipéptidos de la forma madura o segregada de esta proteína de fusión de hCTLA-4-lgG2 se muestra en la SEQ ID NO: 162. La secuencia de polipéptidos del DEC de hCTLA-4 comprende los residuos de aminoácidos 1 a 124 de la SEQ ID NO: 162 y la secuencia de polipéptidos de Fe de lgG2 humana comprende los residuos de aminoácidos 125 a 352 de la SEQ ID NO: 162. En otro aspecto, esta proteína de fusión de Ig de hCTLA-4 madura no incluye el residuo de lisina (K) de la terminal carboxilo y de este modo comprende los residuos de aminoácidos 1 a 351 de la SEQ ID NO: 162. La proteína de fusión de hCTLA-4-lgG2 madura, que tiene un total de 352 aminoácidos, comprende los residuos de aminoácidos 38 a 389 de la secuencia de polipéptidos de la proteína de hCTLA-4 natural de longitud completa que se muestra en la SEQ ID NO: 160 y comienza con la secuencia de aminoácidos: metionina-histidina-valina-alanína. Si así se lo desea, los aminoácidos de la forma madura pueden numerarse comenzando por la secuencia Met de Met-His-Val-Ala que designa a Met como el primer residuo (por ejemplo, el dominio extracelular comprende los residuos de aminoácidos numerados de 1 a 124), como en la SEQ ID NO: 162. Un dímero de hCTLA-4 lgG2 maduro es la forma de la proteína de fusión que típicamente se usa en los ensayos de los Ejemplos que se describen más adelante, a menos que se indique lo contrario. En la SEQ ID NO: 163, se muestra una secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión de hCTLA-4-lgG2 que comprende el DEC de hCTLA-4 fusionado con el polipéptido de Fe de hlgG2. La figura 3 representa los análisis de SDS/PAGE de las siguientes proteínas: los indicadores del peso molecular de varias masas (kilodalton (kDa) (pista 1); una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante ejemplar de la invención basada en el clon de D3 (es decir, D3-lgG2) (pista 2); una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante ejemplar basada en el clon de D4 (es decir, D4-lgG2) (pista 3); y la proteína de fusión Orencia® (Abatacept) (pista 4) (Bristol-Myers Squibb Co., Princeton, NJ). La figura 4 presenta un perfil de elución de una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante de la invención (es decir, D3-lgG2) de los análisis de SEC. que demuestra que las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutante de la invención son de tamaño homogéneo cuando se purifican con células de COS transitoriamente transfectadas. La figura 5 muestra un típico análisis Biacore™ de la unión de las siguientes proteínas de fusión a hCD86-lg: la proteína de fusión Orencia®, LEA29Y-lg y D3-lgG2. La fase de disociación del análisis comienza en el momento que indica la flecha. La proteína de fusión Orencia®, que está compuesta por el polipéptido del DEC de CTLA-4 humano natural fusionado a un polipéptido del dominio Fe de lgG1 mutante efectivamente funciona como un control de CTLA-4-lg humano natural. Una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante de la invención, como D3-lgG2, tiene una mayor avidez unida a CD86-lg que la proteína de fusión Orencia® que tiene un índice de disociación de CD86-lg más bajo que la proteína Orencia®. La figura 6 es una representación gráfica de los resultados de los ensayos de inhibición de la proliferación de PBMC (con estimulación del anticuerpo anti-CD3) que implica a las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutante ejemplares de la invención (D3-04-lgG2, D3-11-lgG2, D3-12-lgG2, D3-14-lgG2). Estos ensayos muestran que las proteínas de fusión CTLA-4lg mutante de la invención son significativamente más potentes que Orencia® y LEA29Y-Ig para inhibir la proliferación de las células T in vitro. La figura 7 es una representación gráfica de los ensayos de inhibición de la proliferación de la célula CD4+T (con estimulación anti-CD3 y coestimulación dependiente hB7.2) que implica una serie de proteínas de fusión CTLA-4-lg mutante ejemplar de la invención. Las proteínas de fusión Orencia® y LEA29Y-lg se incluyeron como controles con fines comparativos. La figura 8 es una representación gráfica de los ensayos de inhibición de la proliferación de la PBMC (con estimulación del antígeno PPD) que implican una serie de proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes ejemplares de la invención. Se incluyeron Orencia® y LEA29Y-lg como controles con fines comparativos. La figura 9 es una representación gráfica de los ensayos de inhibición de la proliferación de una reacción de linfocitos mezclados por una única vía (MLR) que implican una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante ejemplar de la invención - D-3-lgG2. Las proteínas de fusión Orencia® y LEA29Y-lg se incluyeron como controles con fines comparativos. La figura 10 es un diagrama esquemático que muestra la estructura de una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante ejemplar de la invención. Se muestran esquemáticamente dos proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes monoméricas idénticas, cada una comprende DEC de CTLA-4 muíante maduro fusionado en su terminal C a la terminal N del polipéptido de la Fe de la lgG2 humana. Cada polipéptido de la lgG2 humana incluye una bisagra lgG2, un dominio CH2 y un dominio CH3. También se muestran los residuos de aminoácido ejemplares presentes en las uniones entre los polipéptidos del DEC y Fe de Ig. Los residuos de aminoácidos en las uniones entre estos componentes pueden diferir en función de la secuencia de polipéptidos del DEC de CTLA-4 muíante y/o de la secuencia de polipéptidos de Ig. La proíeína de fusión dimérica resulla de la formación de al menos un enlace disulfuro entre los residuos de cisteína en posiciones análogas en los dos monómeros. Se indican con asteriscos los residuos de cisteína (C) potencialmente implicados en la formación de los enlaces disulfuro eníre los dos monómeros. El pépíido señal de cada proíeína de fusión monomérica se escinde lípicamenle durante el tratamiento y por eso la proteína de fusión segregada (madura) típicameníe no incluye la secuencia del péptido señal. La figura 11 es una representación gráfica de los ensayos de proliferación de la célula CD4+T (con estimulación aníi-CD3 y coesíimulación dependiente de hB7.2) que implican proteínas de fusión de hCTLA-4-lgG2, Orencia® y LEA29Y-lg. Las figuras 12A-12F presentan un alineamiento de la secuencia de polipéptidos del dominio extracelular de CTLA-4 humano silvestre (denominado en la figura "DEChCTLA4"), la secuencia de polipéptidos del polipéptido LEA29Y (denominado en la figura "DECLEA29Y") y las secuencias de polipéptido de los polipéptidos del DEC de CTLA-4 muíaníe ejemplares de la invención. Se indican a la izquierda los nombres de los clones de estos polipéptidos de DEC de CTLA-4 mutantes de la invención. Se señalan con un punto los residuos de aminoácidos que son idénticos a los que están en el DEC de CTLA-4 humano silvestre (.). La figura 13 presenta una matriz BLOSUM62. Las figuras 14A-14D muestran alineamientos ejemplares y puntajes de alineamiento determinados por un cálculo manual para dos secuencias de aminoácidos. Las figuras 15A-15B muestran perfiles de farmacocinética (PK) para la proteína de fusión Orencia®, CTLA-4-lgG2 humana y proteínas de fusión CTLA-4-lgG2 representativas de la invención administradas a razón de 1mg/kg en un único (A) bolo intravenosa (IV) o (B) en una inyección subcutánea (SC) en ratas.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones Se entenderá también que la terminología utilizada aquí tiene el propósito de describir únicamente las formas de realización específicas y no pretende ser excluyente. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en el presente tienen el mismo significado que normalmente les asignan los entendidos en la técnica relacionada con la invención.

Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se utilizan indistintamente para referirse a un polímero de residuos de ácido nucleico (por ejemplo, desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos) en forma de cadena simple o doble. A menos que se los excluya específicamente, los términos abarcan los ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos naturales conocidos que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y se metabolizan de un modo similar al de los nucleótidos naturales. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácidos nucleicos específica también abarca implícitamente variantes modificadas de forma conservadora (por ejemplo, sustituciones del código degenerado) y secuencias de nucleótidos complementarias así como también la secuencia explícitamente indicada. En particular, las sustituciones del código degenerado pueden lograrse al generar secuencias en las que la tercera posición de uno o más códigos se sustituye con una base mezclada y/o residuos de deoxinosina (Batzer et al, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al, J. Biol. Chem. 260:2605 2608 (1985); y Cassol et al. (1992); Rossolini et al, Mol Cell. Probes 8:91 98 (1994)). El término ácido nucleico o polinucleótido se utiliza indistintamente con ADNc o ARNm codificados por un gen. El término "gen" se refiere ampliamente a cualquier segmento de ácido nucleico asociado con una función biológica. Un gen puede incluir una secuencia de codificación y/o una secuencia reguladora requerida para su expresión. Un gen también puede incluir segmento(s) de ácido nucleico del ADN no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otra(s) proteína(s) (por ejemplo, una región promotora, estimulante, u otra región reguladora). Un gen puede obtenerse a partir de una variedad de fuentes, incluida la clonación de una fuente de interés o la síntesis de una secuencia de información conocida o previsible, y puede incluir una o más secuencias diseñadas para obtener los parámetros deseados. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de forma alternativa para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un químico mimético artificial de su correspondiente aminoácido natural, así como también polímeros de aminoácidos naturales y polímeros de aminoácidos no naturales. Según se los emplea aquí, los términos abarcan cadenas de aminoácidos de cualquier extensión, incluyendo las proteínas de longitud completa (es decir, los antígenos), donde los residuos de aminoácidos se unen a partir de enlaces covalentes de péptidos. La numeración de un polímero de aminoácidos o de un polímero de ácido nucleico dado "corresponde a" o "guarda relación con" la numeración de un polímero de aminoácidos o un polímero de ácido nucleico seleccionado cuando la posición de cualquier componente del polímero dado (por ejemplo, aminoácidos, nucleótido, al que también se hace referencia genéricamente como un "residuo"), se designa por referencia a la misma o a una posición equivalente en el polímero de aminoácidos o ácido nucleico y no por la posición numérica verdadera del componente en el polímero dado. Por consiguiente, por ejemplo, la numeración de una posición de aminoácidos en una secuencia de polipéptidos dada guarda relación con ésta o con una posición de aminoácidos equivalente en una secuencia de polipéptidos utilizada como secuencia de referencia. Una "posición equivalente" (por ejemplo, una "posición de aminoácidos equivalente" o una "posición de ácido nucleico equivalente") se define aquí como una posición (así como una posición de aminoácidos o una posición de ácido nucleico o una posición del residuo) de una secuencia de polipéptidos de prueba (o un polinucleótido de prueba) que se alinea con una posición correspondiente de una secuencia de polipéptidos de referencia (o polinucleótido de referencia), cuando se alinea (preferentemente alineado de manera óptima) utilizando un algoritmo de alineación como se describe aquí. No es necesario que la posición de aminoácidos equivalente de la secuencia de polipéptidos tenga el mismo número de posición numérica que la posición correspondiente del polipéptido de prueba. Asimismo, no es necesario que la posición del ácido nucleico equivalente de la secuencia del polinucleótido de prueba tenga el mismo número de posición numérica que la posición numérica correspondiente del polinucleótido de prueba. Un polipéptido "muíante" comprende una secuencia de polipéptidos que difiere en uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de polipéptidos de un polipéptido original o de referencia (como, por ejemplo, una secuencia de polipéptidos naturales (WT)). En otro aspecto, un polipéptido mutante comprende una secuencia de polipéptidos que difiere de una secuencia de polipéptidos de un polipéptido original o de referencia en aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 30% 40%, 50% o más del número total de residuos de la secuencia de polipéptidos original o de referencia. En otro aspecto, un polipéptido mutante comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% con la secuencia de polipéptidos del polipéptido original o de referencia. En otro aspecto, un polipéptido mutante comprende una secuencia de polipéptidos que difiere de la secuencia de polipéptidos del polipéptido natural o de referencia en de 1 a 100 o más residuos de aminoácidos (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más residuos de aminoácidos). Un polipéptido mutante puede comprender una secuencia de polipéptidos que difiera de la secuencia de polipéptidos del polipéptido original o de referencia, por ejemplo, a través de la eliminación, adición o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más residuos de aminoácidos) del polipéptido original o de referencia, o cualquier combinación de la(s) eliminación(es), adición(es), y/o sustitución(es). El polipéptido original o de referencia puede ser en sí mismo un polipéptido mutante. Un ácido nucleico "mutante" comprende una secuencia de nucleótidos que difiere en uno o más residuos de ácido nucleico de la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico original o de referencia (como un ácido nucleico natural). En un aspecto, el ácido nucleico muíante comprende una secuencia de nucleótidos que difiere de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico original o de referencia en aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 30% 40%, 50% o más del número total de residuos de la secuencia de nucleótidos original o de referencia. En otro aspecto, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico original o de referencia. En otro aspecto, el ácido nucleico mutante comprende una secuencia de nucleótidos que difiere de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico original o de referencia en de 1 a 100 o más residuos de nucléotidos (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más residuos de nucleótidos). El ácido nucleico mutante puede comprender una secuencia de nucleótidos que difiere de la del ácido nucleico original o de referencia, por ejemplo, por la eliminación, adición o sustitución de uno o más residuos de nucleótidos (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más residuos de nucleótidos) del ácido nucleico original o de referencia, o cualquier combinación de dicha(s) eliminación(es), adición(es), y/o sustitución(es). Una mutación en el ácido nucleico también puede resultar del corte y empalme o el truncamiento de los nucleótidos o de los errores en el tratamiento o la escisión de nucleótidos. El ácido nucleico de referencia u original puede ser en si mismo un ácido nucleico mutante. "Natural" aplicado a un objeto significa que el objeto se encuentra en la naturaleza y que no es producido artificialmente por el hombre. "No natural" aplicado a un objeto significa que el objeto no es natural (es decir, que el objeto no se encuentra en la naturaleza). Por ejemplo, un polipéptido no natural se refiere a un polipéptido preparado por el hombre, como, por ejemplo, mediante síntesis in vitro o elaboración artificial. Una "subsecuencia" o un "fragmento" de una secuencia de interés es cualquier porción de la totalidad de la secuencia hasta, pero no inclusive, la totalidad de la secuencia de interés. Un ácido nucleico, una proteína u otro componente están "aislados" cuando están parcial o completamente separados de los componentes con los que normalmente están asociados (otras proteínas, ácidos nucleicos, células, reactivos sintéticos, etc.). En términos molares, una especie aislada es más abundante que otras especies en una composición. Por ejemplo, una especie aislada puede comprender al menos aproximadamente 50%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% (en términos molares) de todas las especies macromoleculares presentes. Preferentemente, la especie de interés se purifica a homogeneidad esencial (es decir, las especies contaminantes no se detectan en la composición con procedimientos de detección convencionales). La pureza y la homogeneidad pueden determinarse a través de una variedad de técnicas conocidas en la técnica, como electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida de una muestra de proteína o ácido nucleico, seguido de visualización por tinción. Si así se lo desea, se puede utilizar una técnica de alta resolución, como la cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) o un medio similar para la purificación del material. El término "purificado" aplicado a ácidos nucleicos o polipéptidos denota generalmente un ácido nucleico o polipéptido que es esencialmente libre de otros componentes según lo determinado mediante técnicas analíticas conocidas en la técnica (por ejemplo, un polipéptido o un polinucleótido purificado forma una banda discreta en la electroforesis en gel, el eluato cromatográfico, y/o un medio sometido a centrifugación en gradiente de densidad). Por ejemplo, se considera "purificado" un ácido nucleico o polipéptido que esencialmente produce una banda en la electroferesis en gel. Un ácido nucleico o un polipéptido purificado es puro al menos en aproximadamente el 50%, usualmente al menos en aproximadamente el 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% o más (por ejemplo, un porcentaje en peso en términos molares). En un sentido afín, la invención proporciona procedimientos para enriquecer las composiciones de una o más moléculas de la invención, como uno o más polipéptidos o polínucleótidos de la invención. Se enriquece una composición para una molécula cuando se produce un incremento sustancial en la concentración de la molécula después de la aplicación de una técnica de purificación o enriquecimiento. Un polipéptido o polinucleótido sustancialmente puro típicamente comprende al menos aproximadamente el 55%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, 99.5% o más en peso (en términos molares) de todas las especies macromoleculares en una composición específica. Un ácido nucleico o un polipéptido es "recombinante" cuando es artificial o transgénico o deriva de una proteína o un ácido nucleico artificial o transgénico. El término "recombinante" cuando se usa en relación con una célula típicamente indica que la célula replica un ácido nucleico heterólogo o expresa un polipéptido codificado por un ácido nucleico heterólogo. Las células recombinantes pueden comprender genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula. Las células recombinantes también incluyen aquéllas compuestas por genes que se encuentran en la forma nativa de la célula, pero se modifican y reintroducen en la célula por medios artificiales. El término también abarca las células compuestas por ácido nucleico endógeno que se modifican sin la eliminación del ácido nucleico; se incluyen las modificaciones obtenidas por el reemplazo de genes, la mutación en ubicaciones específicas y las técnicas relacionadas conocidas por los entendidos en la técnica. La tecnología de ADN recombinante incluye técnicas para la producción de ADN recombinante in vitro y la transferencia del ADN recombinante en células donde puede expresarse o propagarse, produciendo así un polipéptido recombinante.

Un "cassette de expresión recombinante" o simplemente un "cassette de expresión" es un constructo de ácidos nucleicos, generado recombinante o sintéticamente, con elementos del ácido nucleico que son capaces de efectuar la expresión de un gen estructural en huéspedes compatibles con dichas secuencias. Las expresiones de cassette incluyen al menos promotores y opcionalmente señales de finalización de la transcripción. Típicamente, el cassette de expresión recombinante incluye un ácido nucleico que será transcripto (por ejemplo, el ácido nucleico que codifica un polipéptido deseado) y un promotor. Los factores adicionales necesarios o auxiliares para efectuar la expresión también pueden utilizarse como se describe aquí. Por ejemplo, un cassette de expresión también puede incluir secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia señal que dirige la secreción de una proteína expresada de la célula huésped. También pueden incluirse en un cassette de expresión, las señales de finalización de la transcripción, los estimulantes y otras secuencias de ácidos nucleicos que influencian la expresión génica. Un ácido nucleico "exógeno", un "segmento de ADN exógeno", una "secuencia heteróloga" o un "ácido nucleico heterólogo", según se emplean en el presente, son los que se originan en una fuente extraña para la célula huésped específica, o, si se origina en la misma fuente, se modifica su forma original. Por tanto, un gen heterólogo en una célula huésped incluye un gen que es endógeno para la célula huésped específica, pero que ha sido modificado. La modificación de una secuencia heteróloga en las aplicaciones que se describen en la presente típicamente se producen con el uso de procedimientos de evolución molecular dirigida. Por tanto, los términos se refieren a un segmento de ADN que es extraño o heterólogo a la célula, u homólogo a la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula huésped en la que no suele encontrarse el elemento. Los ácidos nucleicos exógenos o el ADN exógeno se expresan para obtener los polipéptidos exógenos. Un "vector" puede ser cualquier agente capaz de introducir o mantener un ácido nucleico en la célula huésped e incluye de forma no excluyente, por ejemplo, los plásmidos (por ejemplo, plásmidos de ADN), ácidos nucleicos desnudos, vectores virales, virus, complejos de ácidos nucleicos con uno o más polipéptidos u otras moléculas, así como también ácidos nucleicos inmovilizados en partículas en fase sólida. A continuación, se describen detalladamente los vectores. Puede usarse un vector como agente para introducir o mantener un gen exógeno y/o una proteína en la célula huésped. Un vector puede ser capaz de transducir, transfectar o transformar la célula y por lo tanto provocar que la célula se replique o exprese ácidos nucleicos y/o proteínas distintas de las nativas de la célula o de forma no nativa para la célula. Un vector puede incluir materiales auxiliares para el ingreso del ácido nucleico en la célula, como una partícula viral, un liposoma, una cubierta proteica, o similares. Puede utilizarse cualquier procedimiento para transferir un ácido nucleico a la célula; a menos que se indique lo contrario, el término vector no implica ningún procedimiento en particular para introducir un ácido nucleico en la célula, ni implica la transducción de ningún tipo de célula en particular. La presente invención no excluye ningún vector específico para introducir o mantener cualquier ácido nucleico de la invención, incluido, por ejemplo, el ácido nucleico que codifica un polipéptido de CTLA-4 mutante de la invención o un fragmento de este (por ejemplo, el DEC de CTLA-4 mutante) que se une al CD80 y/o CD86 o un fragmento de estos (por ejemplo, el DEC de CD80 o el DEC de CD86). El término "vector de expresión" típicamente se refiere a una construcción de un ácido nucleico o una secuencia, generada recombinante o sintéticamente, con una serie de elementos del ácido nucleico específicos que permiten la transcripción de un ácido nucleico específico en una célula huésped. El vector de expresión típicamente incluye un ácido nucleico que será transcripto conectado operativamente a un promotor. El término "expresión" incluye cualquier paso de la producción del polipéptido, incluida, sin limitación, la transcripción, la modificación postranscripcional, la translación, la modificación postranslacional y/o la secreción. Un "péptido señal" es una secuencia de péptidos (o aminoácidos) que típicamente precede un polipéptido de interés y se traslada en conjunción con el polipéptido y dirige o facilita el ingreso del polipéptido al sistema de secreción. Un péptido señal típicamente se adhiere o fusiona covalentemente al extremo amino terminal del polipéptido de interés y facilita la secreción del polipéptido de interés desde la célula huésped. El péptido señal típicamente se escinde del polipéptido de interés después de la translación. El término "codificar" se refiere a la capacidad de una secuencia de nucleótidos de codificar uno o más aminoácidos. El término no requiere un codón de inicio o terminación. Una secuencia de aminoácidos puede codificarse en cualquiera de las seis fases de lectura diferentes proporcionadas por una secuencia de polinucleótidos y su complemento. El término "secuencia de control" se define aquí para incluir todos los componentes necesarios o ventajosos para la expresión de un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña para la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Las secuencias de control incluyen, sin limitación, un líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia propeptídica, un promotor, una secuencia del péptido señal y un finalizador de la transcripción. Como mínimo, una secuencia de control incluye un promotor, y señales de parada transcripcionales y translacionales. Las secuencias de control pueden ser proporcionadas con conectores con el fin de introducir sitios de restricción específicas facilitando la unión de las secuencias de control con la región codificante de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. El término "secuencia codificante" se refiere a una secuencia de nucleótidos que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto proteico. Los límites de la secuencia codificante son generalmente determinados por una fase abierta de lectura (ORF), que puede empezar con el codón de inicio ATG.

Un ácido nucleico está "conectado operativamente" con otra secuencia de ácidos nucleicos cuando se ubica en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor o estimulante se une operativamente a una secuencia codificante si dirige la transcripción de la secuencia codificante. Conectado operativamente significa que las secuencias de ADN que se unen son típicamente contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en un marco de lectura. Sin embargo, ya que los estimulantes generalmente funcionan cuando se separan del promotor por varias kilobases y las secuencias intrónicas pueden tener distintas longitudes, algunos elementos polinucleótidos pueden estar conectados operativamente pero no ser contiguos. Una "célula huésped" es cualquier célula susceptible de transformarse con ácido nucleico. "Sustancialmente la longitud completa de una secuencia de polinucleótidos" o "sustancialmente la longitud completa de una secuencia de polipéptidos" se refiere a al menos aproximadamente el 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más de la longitud de una secuencia de polinucleótidos o una secuencia de polipéptidos, respectivamente. Un "antígeno" se refiere a una sustancia que reacciona con el(los) producto(s) de una respuesta inmunitaria estimulada por ün inmunógeno específico. Véase, por ejemplo, JULIUS CRUSE ET AL, ATLAS OF IMMUNOLOGY 60 (1999); RICHARD COICO ET AL, IMMUNOLOGY: A SHORT COURSE 27-30 (5.a ed. 2003). Una respuesta inmunitaria puede comprender una respuesta humoral y/o una respuesta inmunitaria mediada por una célula (por ejemplo, linfocitos T citotóxicos (LTC)). Los productos de una respuesta inmunitaria pueden incluir anticuerpos y/o LTC. Los antígenos son típicamente macromoléculas (por ejemplo, polipéptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos complejos, fosfolípidos, polisacáridos) que son extrañas al huésped; esa porción del antígeno conocida como determinante antigénico reacciona con (por ejemplo, se une a) el(los) producto(s) de la respuesta inmunitaria, como un anticuerpo o un receptor específico de células T en un linfocito T. Un antígeno puede, pero no necesariamente, inducir una respuesta inmunitaria así como también reaccionar con el(los) producto(s) de la respuesta inmunitaria. La "antigenicidad" se refiere al estado o la propiedad de ser antigénico es decir, de tener las propiedades de un antígeno. La especificidad de un antígeno puede mostrarse en la relación del antígeno con su anticuerpo o viceversa; un antígeno típicamente reacciona de una manera muy específica con su correspondiente anticuerpo y no con el mismo grado de especificidad con otros anticuerpos evocados por el inmunógeno. Una "cantidad antigénica" es una cantidad de antígeno que se detecta y reacciona con el/los producto(s) de una respuesta inmunitaria estimulada por un inmunógeno específico. Un "inmunógeno" es una sustancia capaz de inducir respuestas inmunitarias más que tolerancia inmunológica. Véase, por ejemplo, JULIUS CRUSE ET AL, supra en 60-61 ; RICHARD COICO, supra en 27-30. Los ¡nmunógenos también reaccionan con (por ejemplo, se unen a) el/los producto(s) de la respuesta inmunitaria inducida que ha(n) sido específicamente inducidos contra ellos. Por eso mismo, todos los ¡nmunógenos son antígenos. La "¡nmunogenicidad" se refiere al estado o propiedad de ser inmunogénico, es decir, a tener las propiedades de un inmunógeno. Una "cantidad inmunogénica" es una cantidad de inmunógeno que es efectiva para inducir una respuesta inmunitaria detectable. Un inmunógeno puede producir una respuesta inmunitaria fuerte en el individuo, como al menos inmunidad protectora parcial o total con relación a un patógeno al menos. Una molécula "inmunonoduladora" o "inmunomodulatoria", como el polipéptido o ácido nucleico inmunomodulatorio, modula una respuesta inmunitaria. Por "modulación" o "modular" una respuesta inmunitaria se pretende alterar la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, la "modulación de" o cuando se "modula" una respuesta inmunitaria en un individuo en general significa que la respuesta inmunitaria es estimulada, inducida, inhibida, disminuida, suprimida, incrementada, mejorada o de otro modo alterada en este individuo. La modulación de una respuesta inmunitaria puede calcularse por medios conocidos por los entendidos en la técnica, incluidos los descritos a continuación. Un "inmunosupresor" es una molécula, como un polipéptido o un ácido nucleico, que suprime una respuesta inmunitaria. Según se lo emplea aquí, un "anticuerpo" (abreviado "Ab") se refiere a una proteína de inmunoglobulina (abreviada "Ig"), producida de forma natural o total o parcialmente sintética. El término incluye todos los derivativos del este que mantienen una capacidad de unión específica a un antígeno. El término también cubre toda proteína que tiene un dominio de unión homólogo o en gran parte homólogo a un dominio de unión de la inmunoglobulina. Las proteínas pueden derivarse de fuentes naturales, o producirse total o parcialmente de forma sintética. Un anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Un anticuerpo puede ser miembro de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo cualquiera de las cinco clases humanas: IgA (que incluye a las subclases lgA1 e lgA2), IgD, IgE, IgG (que incluye a las subclases lgG1 , lgG2, lgG3, e lgG4) e IgM. Los anticuerpos se componen de cadenas de polipéptidos pesadas y livianas apareadas, y cada una de las cadenas se compone de dominios individuales de inmunoglobulina. Cada cadena incluye una región constante (C) y una región variable (V). Una unidad de anticuerpo estructural típica comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, cada par tiene una cadena "liviana" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). Las cadenas pesadas existen en cinco grandes tipos (?, µ, d, a, y e) en función de la clase de anticuerpo y contienen aproximadamente de 450 a 600 residuos de aminoácidos. Las cadenas livianas son de dos grandes tipos (? y ) y contienen aproximadamente 230 residuos de aminoácidos. Por ejemplo, un anticuerpo de IgG es una proteíha tetramérica compuesta por dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas. Cada cadena pesada de IgG contiene cuatro dominios de inmunoglobulina unidos en el siguiente orden desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxilo terminal: VH-Ch1-Ch2-CH3 (a veces también abreviado como VH-CH1-CH2-CH3). Las abreviaturas se refieren al dominio variable de la cadena pesada, al dominio constante 1 de la cadena pesada, al dominio constante 2 de la cadena pesada y al dominio constante 3 de la cadena pesada, respectivamente. También, puede hacerse referencia a una cadena pesada por clase de anticuerpo, como, por ejemplo, Cy1 , que representa el primer dominio constante de la cadena pesada gamma (?) del anticuerpo de IgG. Cada cadena liviana de IgG comprende dos dominios de inmunoglobulina unidos en el siguiente orden desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxilo terminal: VH-CL, donde VH y CL se refieren a la cadena liviana del dominio variable y a la cadena liviana del dominio constante, respectivamente. La región variable de un anticuerpo, que típicamente comprende aproximadamente de 100 a 1 10 aminoácidos o más en el extremo amino terminal de cada cadena de polipéptido, incluye los determinantes de la unión del antígeno y por eso es responsable en gran medida por el reconocimiento y especificidad del antígeno. El mayor grado de variabilidad de la secuencia de aminoácidos entre anticuerpos se encuentra en la región variable. Gran parte de la variabilidad de la secuencia se produce en las regiones determinantes de complementariedad (RDC) ubicadas en la región variable. Hay un total de seis RDC, tres RDC en cada cadena pesada y tres RDC en cada cadena liviana, las cuales en su conjunto forman un sitio de unión a antígeno. Las RDC de cadena pesada se designan VH RDC1 , VH RDC2¡ y VH RDC3 mientras que las RDC de cadena liviana se designan VL RDC1 , VL RDC2 y VL RDC3. La región ubicada fuera de las RDC se llama región marco (FR). Las regiones marco de anticuerpos distintos pueden variar en los residuos de aminoácidos, pero el grado de variabilidad de los aminoácidos no es tan grande como el que existe entre las regiones variables de anticuerpos distintos. En muchos casos, las regiones marco proporcionan una matriz estable o constante para la diversidad de aminoácidos que presentan las RDC. El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a cualquier derivado de un anticuerpo que es menor que su longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen sin limitación, por ejemplo, el fragmento de unión a antígeno (Fab) que contiene VH-CH1 y VH-C|_, el fragmento variable (Fv) que contiene VH y VL, el fragmento de la cadena variable única (scFv) que contiene VH y VL unidos en una cadena, así como también otros fragmentos de la región V, como Fab', F(ab)2, F(ab')2, diacuerpo de dsFv, Fe y fragmentos de polipéptido Fd. Véase Scott, T A. y Mercer, E l., Concise Encyclopedia: Biochemistry and Molecular Biology (de Gruyter, 3.a ed. 1997), y Watson, J.D. et al, Recombinant DNA (2.a ed. 1992) (en adelante denominado "Watson"). Puede producirse un fragmento de anticuerpo a través de cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, el . fragmento de anticuerpo puede producirse enzimática o químicamente por fragmentación de un anticuerpo intacto o puede producirse en forma recombinante mediante un gen que codifique la secuencia parcial de anticuerpos. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden producirse por digestión con peptidasa. Por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo en los enlaces disulfuro en la región bisagra para producir F(ab')2, un dímero del fragmento Fab que es en sí mismo una cadena liviana unida a VH-CH1 por un enlace disulfuro. El F(ab') 2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región bisagra que por tanto convierte el dímero F(ab') 2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente un fragmento Fab con parte de la región bisagra. Véase FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993) para una descripción más detallada de los anticuerpos y de los fragmentos de anticuerpos. Mientras varios fragmentos de anticuerpos se definen en términos de digestión de un anticuerpo intacto, un entendido apreciará que los fragmentos Fab' pueden sintetizarse nuevamente químicamente o haciendo uso de una metodología de ADN recombinante. De esta forma, el término también incluye fragmentos de anticuerpos producidos mediante la modificación de anticuerpos enteros o sintetizados de nuevo haciendo uso de metodologías de ADN recombinante. Alternativamente, puede producirse el fragmento de anticuerpo total o parcialmente de forma sintética. El fragmento de anticuerpo puede ser opcionalmente un fragmento de anticuerpo de cadena única. Indistintamente, el fragmento puede comprender múltiples cadenas unidas entre sí, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro. El fragmento también puede ser opcionalmente un complejo multimolecular. Un fragmento de anticuerpo funcional estará típicamente compuesto por al menos 50 aminoácidos aproximadamente y más típicamente por al menos 200 aminoácidos aproximadamente. Una región o dominio Fe de una molécula de la ¡nmunoglobulina o del anticuerpo (también llamado polipéptido de Fe de Ig o polipéptído de Fe) corresponde en gran medida a la región constante de cadena pesada de la ¡nmunoglobulina, y es responsable por varias funciones, inclusive la(s) función(es) efectoras de anticuerpos. Por ejemplo, la región Fe de Ig de la molécula comprende dominios de ¡nmunoglobulina CH2 y CH3 y la región bisagra del extremo amino terminal que conduce a CH2. La región bisagra es una porción de la cadena pesada entre Fe y CH1 que contiene enlaces disulfuro de la cadena inter-pesada y le da flexibilidad a la molécula del anticuerpo. Los dominios constantes de la región Fe interactúan con las células del sistema inmunitario. Los receptores de Fe son proteínas que unen la región Fe de los anticuerpos. Una familia significante de receptores de Fe para la clase de anticuerpos de IgG incluye los receptores gamma de Fe (FcyR). La unión de anticuerpos a los receptores de Fe en las células media en varias funciones del anticuerpo. Las diferentes subclases de IgG exhiben diferentes afinidades por los receptores gamma de Fe. En general, lgG1 e lgG3 se unen a los receptores con una mayor afinidad que lgG2 e lgG4. Los receptores Fe se expresan en una variedad de células, incluidas, por ejemplo, las células B, monocitos, células dendríticas, neutrófilos y ciertos linfocitos. La unión de una Fe de Ig a su receptor conduce a estas células efectoras a los sitios del antígeno ligado provocando en última instancia respuestas inmunitarias y de señalización, incluida la activación de las células B, respuestas inflamatorias, citotóxicas y fagocíticas. Una fusión de Fe de Ig es una molécula compuesta por uno o más polipéptidos (o una o más moléculas pequeñas) unida operativamente a una región Fe de una inmunoglobulina o un anticuerpo. Véase, pór ejemplo, Chamow et al, 1996, Trends Biotechnol. 14:52-60. En consecuencia, una proteína de fusión de Fe de Ig es una molécula que comprende uno o más polipéptidos unidos operativamente a una región Fe de Ig. Una proteína de fusión puede comprender, por ejemplo, la región Fe de un anticuerpo (que facilita las funciones efectora y farmacocinética) y la región de unión o dominio de unión de una proteína receptora o proteína de ligando u otra proteína o fragmento de ésta. La región de unión o el dominio de unión media en el reconocimiento del receptor o ligando diana (comparable con la región variable del anticuerpo de un anticuerpo para un antígeno). Una región Fe de Ig puede unirse de forma directa o indirecta con uno o más polipéptidos o moléculas pequeñas (socios de fusión). Varios conectores conocidos en la técnica, y según se describe a continuación, pueden utilizarse para unir una Fe de Ig con un socio de fusión para generar una fusión de Fe de Ig. Una proteína de fusión típicamente comprende una región Fe de Ig unida de forma covalente, directa o indirectamente, a por lo menos un polipéptido, polipéptido que une típicamente el ligando o receptor diana.

Los anticuerpos monoclonales o policlonales pueden prepararse a través de cualquier técnica conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Kohler & Milstein, Nature 256:495 497 (1975); Kozbor et al, Immunology Today 4: 72 (1983); Colé et al, pp. 77 96 en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy (1985)). Se pueden adaptar las técnicas de producción de anticuerpos de cadena única (Patente de Estados Unidos N.° 4.946.778) para producir anticuerpos para los polipéptidos de la invención. Además, pueden usarse ratones transgénicos u otros organismos, incluidos los mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados. La tecnología Phage Display puede utilizarse para identificar los anticuerpos y fragmentos Fab heteroméricos que se unen específicamente a los antígenos seleccionados (véase, por ejemplo, McCafferty et al, Nature 348:552 554 (1990); Marks et al, Biotechnology 10:779 783 (1992)). El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico capaz de unión específica con una parte del anticuerpo. Los epítopos usualmente están compuestos por agrupamientos de moléculas con una superficie químicamente activa como los aminoácidos o las cadenas laterales del azúcar y usualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como también características específicas de carga. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se diferencian en que la unión al primero pero no al último se pierde en la presencia de disolventes desnaturalizantes. Una "afinidad de unión específica" entre dos moléculas, por ejemplo, un ligando y un receptor, significa una unión preferencial de una molécula por otra. La unión de las moléculas se considera típicamente especifica si la constante de asociación en equilibrio de la unión (por ejemplo, KA) es aproximadamente 1 x 102 M" hasta aproximadamente 1 x 1013 M"1 o mayor, inclusive aproximadamente 104 a 1013 M"\ aproximadamente 106 a 1012 M"1, aproximadamente 108 M"1 hasta 1011 M" o aproximadamente 108 a 1010 M*1. Los valores de KA para la interacción entre un antígeno y una anticuerpo generalmente oscila entre aproximadamente 105 M"1 y aproximadamente 1012 M"1, usualmente entre aproximadamente 107 M"1 y aproximadamente 1011 M"1, y con frecuencia entre aproximadamente 108 M"1 y aproximadamente 1010 M'1. Se determina KA (M"1) al calcular ka/kd, donde ka es la tasa constante de asociación y kd es la tasa constante de disociación. Las unidades de ka y kd son M"1 s"1 y s"1, respectivamente. La constante de disociación de equilibrio, KD, es la recíproca a KA. KD = kd/ka. Para la reacción A+B <=> AB (que representa una única unión de ligando con una única proteina de interés (por ejemplo, receptora)), KD es igual a ([A] [B])/[AB]. Los ejemplos no excluyentes de técnicas conocidas para medir las afinidades de unión y/o avidez de las moléculas incluyen, por ejemplo, la tecnología Biacore™ (GE Healthcare) según se establece en otra parte aquí, la calorimetría isotérmica de titulación (MicroCal LLC, Northampton, MA USA), ELISA, y procedimientos de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS). Por ejemplo, puede utilizarse FACS u otros procedimientos de clasificación para seleccionar poblaciones de moléculas (como, por ejemplo, ligandos visibles en la superficie celular) que se unen específicamente a su miembro del par de unión asociado (como un receptor, por ejemplo, un receptor soluble). Los complejos ligando-receptores pueden detectarse y elegirse, por ejemplo, por fluorescencia (por ejemplo, al reaccionar el complejo con un anticuerpo fluorescente que reconoce el complejo). Las moléculas de interés que se unen a un miembro del par de unión asociado (por ejemplo, el receptor) se agrupan y se clasifican nuevamente en presencia de bajas concentraciones del receptor. Al realizar múltiples clasificaciones por rondas en presencia de concentraciones decrecientes de receptor (el intervalo de concentración ejemplar oscila en el orden de 10~6 M y 10"13 M, es decir, entre 1 micromolar (µ?) y 1 nanomolar (nM), o menos (por ejemplo, 10"11 M ó 10"12 M), en función de la naturaleza de la interacción del ligando-receptor), pueden aislarse las poblaciones de moléculas de interés que exhiben una afinidad de unión especifica hacia el receptor. La frase "se une específicamente (o selectivamente)" a un anticuerpo o "específicamente (o selectivamente) inmunorreactivo con", cuando hace referencia a una proteína, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Por tanto, en las condiciones designadas del inmunoensayo, los anticuerpos especificados se unen a una proteina específica al menos dos veces al fondo y no se unen sustancialmente en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo en esas condiciones puede requerir que un anticuerpo sea seleccionado por su especificidad para una proteíha específica. Puede emplearse una variedad de formatos de inmunoensayos para seleccionar los anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína específica. Por ejemplo, es de rutina usar inmunoensayos ELISA en fase sólida para seleccionar los anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína (véase, por ejemplo, Harlow & Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual (1988), para una descripción de los formatos y condiciones de los inmunoensayos que pueden usarse para determinar una inmunoreactividad específica). Usualmente, una reacción específica o selectiva será al menos el doble de la señal o el ruido de fondo y más típicamente más de 10 a 100 veces el fondo. El término "citocina" incluye, sin limitación, por ejemplo, interleucinas, interferones (IFN), quimioquinas, factores de crecimiento hematopoyéticos, factores de necrosis tumoral (FNT) y factores transformadores del crecimiento. En general, estas son proteínas de bajo peso molecular que regulan la maduración, la activación, la proliferación y la diferenciación de las células del sistema inmunitario. El término "detección" describe, en general, un proceso que identifica moléculas óptimas de la presente invención, como por ejemplo, los polipéptidos de la invención y las proteínas de fusión relacionadas que las comprenden, y los ácidos nucleicos que codifican las moléculas. Muchas propiedades de las respectivas moléculas pueden usarse al seleccionar y revisar, por ejemplo, la capacidad de una molécula respectiva para inducir o alterar una respuesta inmunitaria deseada en un sistema de prueba o en una aplicación in vitro, ex vivo, o in vivo. La "selección" es una forma de búsqueda en que se logran simultáneamente la identificación y la separación física mediante la expresión de un marcador de selección, que, en algunas circunstancias genéticas, permite que las células que expresan el marcador sobrevivan y otras mueran (o viceversa). Los marcadores de detección incluyen, por ejemplo, la luciferasa, la beta-galactosidasa y la proteína verde fluorescente, los sustratos de reacción y similares. Los indicadores de selección incluyen genes resistentes a drogas y toxinas y similares. Otro modo de detección implica una separación física basada en un evento detectable, como la unión de un ligando a un receptor, la reacción de un sustrato con una enzima, o cualquier otro proceso físico que pueda generar una señal detectable ya sea directamente (por ejemplo, mediante la utilización de un sustrato o ligando cromogénico) o indirectamente (por ejemplo, mediante la reacción con un anticuerpo cromogénico secundario). La selección mediante una separación física puede llevarse a cabo a través de varios procedimientos, incluido sin limitación, por ejemplo, FACS de la célula entera o en microgotas. Debido a las limitaciones en el estudio de las respuestas inmunitarias primarias, los estudios in vitro, in vivo son procedimientos de detección particularmente útiles. En algunos de estos estudios un polinucleótido o polipéptido de la invención se introduce primero en el individuo sometido a prueba (por ejemplo, un mamífero, como un animal) y subsiguientemente se estudia una respuesta inmunitaria inducida mediante el análisis del tipo de respuesta inmunitaria en el animal inmunizado (por ejemplo, la producción de anticuerpos en el suero del animal inmunizado, la proliferación de células T), o mediante el estudio de la calidad o la fuerza de la respuesta inmunitaria inducida en el animal inmunizado (por ejemplo, el nivel de titulación en el anticuerpo inducido). Según se lo emplea aquí, el término "individuo" incluye, sin limitación, un organismo o animal, incluidos los mamíferos y los no mamíferos. Un mamífero incluye, sin limitación, humanos, primates no humanos (por ejemplo, babuinos, orangutanes, monos, gorilas), ratones, perros, cerdos, vacas, cabras, gatos, conejos, ratas, conejillos de india, hámsters, caballos, ovejas u otros mamíferos no humanos. Un no mamífero incluye, sin limitación por ejemplo, un invertebrado no mamífero o un vertebrado no mamífero, como los pájaros (por ejemplo, una gallina o un pato) o los peces. El término "composición farmacéutica" se refiere a una composición apropiada para el uso farmacéutico en un individuo, incluido un animal o un humano. Una composición farmacéutica típicamente comprende una cantidad efectiva de un agente activo o portador, excipiente, o diluyente. El portador, excipiente, o diluyente es típicamente un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable, respectivamente. El término "cantidad efectiva" se refiere a una dosificación (o dosis) o a la cantidad de una sustancia suficiente como para producir el resultado deseado. El resultado deseado puede comprender una mejoría objetiva o subjetiva en la persona que recibe la dosificación o la cantidad. Por ejemplo, el resultado deseado puede comprender la inducción, la promoción, la estimulación o la modulación medible, detectable o probable de una respuesta inmunitaria en un individuo a quien se le administra una dosificación o cantidad de un antígeno o inmunógeno (o una composición de este) especifica. Una dosificación (o dosis) o cantidad de un inmunógeno suficiente como para producir ese resultado puede describirse como una dosificación (o dosis) o una cantidad "inmunogénica". El "tratamiento profiláctico" es un tratamiento administrado a un individuo que no presenta signos o síntomas, o presenta sólo signos o síntomas iniciales de una enfermedad, patología o trastorno, tratamiento que se administra con el propósito de prevenir o disminuir el riesgo de desarrollar la enfermedad, la patología o el trastorno. Un tratamiento profiláctico funciona como tratamiento preventivo contra una enfermedad, patología o trastorno, o como un tratamiento que inhibe o reduce el desarrollo progresivo de una enfermedad, una patología o un trastorno. Una "actividad profiláctica" es una actividad de un agente que, cuando se administra a un individuo que no presenta signos o síntomas, o que sólo presenta signos o síntomas iniciales de una patología, enfermedad o trastorno, previene o disminuye el riesgo de que el individuo desarrolle la patología, la enfermedad o el trastorno. Un agente "profiláctico útil" (por ejemplo, un ácido nucleico o un polipéptido) se refiere a un agente que es útil en la prevención del desarrollo de la enfermedad, la patología o el trastorno, o útil en la inhibición o reducción del desarrollo progresivo o la estimulación de la enfermedad, la patología o el trastorno. Un "tratamiento terapéutico" es un tratamiento administrado a un individuo que presenta síntomas o signos de una patología, una enfermedad o un trastorno, tratamiento que se administra al individuo con el propósito de disminuir o eliminar esos signos o síntomas. Una "actividad terapéutica" es una actividad de un agente que elimina o disminuye los signos o síntomas de patología, la enfermedad o el trastorno cuando se administra a un individuo que padece esos signos o síntomas. Un agente "terapéuticamente útil" significa que el agente es útil en disminuir, tratar o eliminar los signos o síntomas de una enfermedad, una patología o un trastorno. Generalmente, la nomenclatura usada en el presente y muchos de los procedimientos de laboratorio en el cultivo de células, la genética molecular, la biología molecular, la estructura química del ácido nucleico y la estructura química de la proteína que se describen a continuación son conocidos y comúnmente empleados por los entendidos en la técnica. Se utilizan las técnicas estándar descritas en Sambrook et al, Molecular Cloning -A Laboratory Manual (2.a Ed.), Vol. 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (en adelante "Sambrook") y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F. M. Ausubel et al, eds., Current Protocols, un emprendimiento conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc. (1994, con suplementos hasta 1999) (en adelante "Ausubel") para los procedimientos del ácido nucleico recombinante, la síntesis del ácido nucleico, los procedimientos de cultivo celular y la incorporación transgénica, por ejemplo, la electroporación, la inyección, la pistola de genes, la presión a través de la piel y la lipofección. Generalmente, la síntesis de oligonucleótidos y las etapas de purificación se llevan a cabo de conformidad con las especificaciones. Generalmente, las técnicas y procedimientos se realizan según los métodos convencionales en la técnica y varias referencias generales que se proporcionan a lo largo de este documento. Se cree que los procedimientos aquí contenidos son conocidos por los entendidos en la técnica y se proporcionan para la comodidad del lector. En el presente documento, se definen varios términos adicionales o se caracterizan de otro modo.

Moléculas y procedimientos de la invención La presente invención proporciona moléculas y procedimientos para tratar enfermedades, trastornos y afecciones del sistema inmunitario, incluidos, por ejemplo, aquéllos en que se desea la modulación del sistema inmunitario (por ejemplo, las respuestas inmunitarias dependientes de células T). Las moléculas de la invención (por ejemplo, los polipéptidos de la invención, los conjugados de la invención, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos o las proteínas de fusión) son útiles para el tratamiento de las enfermedades, trastornos y afecciones del sistema inmunitario en los que se desea la inmunosupresión incluidos, sin limitación, por ejemplo, el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones autoinmunes, enfermedades inmunoproliferativas, trastornos relacionados con injertos y procedimientos de tratamiento que incluyen el trasplante de tejidos, células, órganos o injertos de un donante a un receptor donde se desea la supresión de una respuesta inmunitaria en este contra el tejido, la célula, el órgano o el injerto del donante. En un aspecto, la invención proporciona moléculas CTLA-4 mutantes novedosas que tienen propiedades mejoradas en comparación cón una molécula de CTLA-4, como el polipéptido de CTLA-4 humano natural ("hCTLA-4") o un fragmento de este que se une a CD80 y/o CD86, como el dominio extracelular de CTLA-4 ("DEC de hCTLA-4"). Según se establece a continuación más detalladamente, se utilizaron varias estrategias de mutagénesis y detección para producir e identificar moléculas CTLA-4 mutantes novedosas que se unen a CD80 y/o CD86. En particular, se utilizaron dichas estrategias para producir e identificar moléculas CTLA-4 mutantes que mejoraron la avidez de las uniones de CD80 (B7-1) y/o CD86 (B7-2), en comparación con el CTLA-4 humano ("hCTLA-4"), y/o que mejoraron las afinidades de unión de CD80 y/o CD86, en comparación con el DEC de hCTLA-4. Las moléculas CTLA-4 mutantes de la invención que unen el ligando endógeno de CD80 y/o CD86 expresados en las células que presentan antígenos efectivamente inhiben o bloquean la interacción de estos ligandos con el receptor endógeno de CD28, que se expresa en la superficie de las células T. Como resultado, se inhibe o bloquea la señal coestimulante crítica para la activación de la célula T proporcionada mediante la interacción del receptor de CD28 de la superficie de la célula T con las moléculas B7 (es decir, CD80 y CD86). La activación de estas células T no es óptima y tienen una baja capacidad de proliferación. En las instancias en las que se bloquea la señalización entre los ligandos de CD80 y CD86 y un receptor de CD28, las células T no se estimulan de forma óptima para activarse y, por tanto, no son inducidas a proliferar de manera óptima. De manera similar, en instancias donde se inhibe la señalización entre el ligando CD80 y CD86 y el receptor de CD28, se inhibe la activación y la proliferación de las células T. En un aspecto, la invención proporciona moléculas CTLA-4 mutantes que funcionan como antagonistas de la señalización de CTLA-4. En otro aspecto, la invención proporciona moléculas CTLA-4 mutantes que funcionan como antagonistas de la señalización de CD28, por eso suprime o bloquea las respuestas inmunitarias dependientes de células T; estas moléculas funcionan como agentes inmunosupresores. Aun en otro aspecto, la invención proporciona moléculas CTLA-4 mutantes que se unen a ambos CD80 y CD86, pero que tienen mayor avidez de unión a CD86 que a CD80, y entonces inhiben la coestimulación dependiente de CD86 más allá de la coestimulación dependiente de CD80. Se espera que todas estas moléculas CTLA-4 de la invención sean útiles para el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones en los que la inmunosupresión sea deseable o beneficiosa. Se ha demostrado que una proteína de fusión CTLA-4-lg humana y una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante específica - ambas elaboradas por Bristol-Myers Squibb Co. (Princeton, NJ) - son efectivas para tratar ciertas enfermedades o afecciones relacionadas con la inmunidad. La proteína de fusión Orencia® (también conocida como Abatacept ("ABA")) (Bristol-Myers Squibb Co. (Princeton, NJ)) es una proteína de fusión dimérica recombinante soluble que se compone de dos proteínas de fusión de inmunoglobulina (Ig) monomérica idénticas unidas entre sí covalentemente mediante un enlace disulfuro formado entre un residuo de cisteína presente en cada proteína de fusión monomérica. Orencia es una marca registrada de Bristol-Myers Squibb Company. Cada proteína de fusión de Ig monomérica del dímero de Orencia® está compuesta por el dominio extracelular de CTLAr4 humano (SEQ ID NO: 159) fusionado en su el extremo carboxilo terminal al amino terminal del polipéptido de Fe de lgG1 mutante específico (SEQ ID NO: 186). La secuencia completa del polipéptido de cada proteína de fusión monomérica se muestra en SEC ID N.° 164. El dímero de Orencia® se produce en un sistema de expresión mamífero y tiene un peso molecular aparente de 92 kDa. Se cree que las dos proteínas de fusión de Ig monoméricas del dímero de Orencia® se unen entre sí covalentemente mediante un único enlace disulfuro formado entre el residuo de cisteína en la posición 120 de cada monómero lgG1 de hCTLA-4 mutante y que ningún enlace de disulfuro se forma entre los dos polipéptidos mutantes de Fe de lgG1. El dímero de Orencia® es un modulador de coestimulación selectivo que inhibe la activación de la célula T al unirse a CD80 y CD86 y por tanto bloquea la interacción con el CD28. El dimero de Orencia® actualmente está aprobado para el tratamiento de humanos adultos que padecen artritis reumatoidea (AR) de leve a grave. Se proporciona información adicional sobre el dimero Orencia® y sus indicaciones y efectividad clínicas en el sitio wéb orencia.com y bms.com. Según se indica más atrás, cada monómero de la proteína de fusión del dimero de Orencia® contiene un dominio extracelular de CTLA-4 humano. El CTLA-4 humano es una proteína de la membrana transitoriamente expresada en las células T. La secuencia de la proteína hCTLA-4 natural de longitud completa se muestra en la SEQ ID NO: 160, y se muestra una secuencia de ácidos nucleicos que codifican el hCTLA-4 natural de longitud completa en la SEC ID N.° 194. El CTLA-4 humano incluye un péptido señal (PS), un dominio extracelular (DEC), un dominio transmembrana (DT) y un dominio citoplásmico (DC), unidos entre sí covalentemente en ese orden (pór ejemplo, el extremo carboxilo terminal del DEC está covalentemente unido al extremo amino terminal del DT, y el extremo carboxilo terminal del TD está covalentemente unido I extremo amino terminal del DC). El polipéptido del DEC de hCTLA-4 WT típicamente comprende de 38 a 161 residuos de la secuencia de proteínas hCTLA-4 de longitud completa (SEQ ID NO: 160) y típicamente es una longitud de 124 residuos de aminoácidos. Esta secuencia de polipéptidos de DEC de hCTLA-4 se muestra en la SEQ ID NO: 159. Durante el proceso, se escinde el péptido señal (PS) en la proteína de hCTLA-4 de longitud completa, que típicamente comprende de 1 a 35 o de 1 a 37 residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 160. Véase, por ejemplo, Harper et al, J. Immunol. 147(3): 1037-1044 (1991). En la SEC ID N.° 182 o la SEC ID N.° 216, respectivamente, se muestra la secuencia del péptido señal de CTLA-4 humano que comprende de 1 a 35 o de 1 a 37 residuos de aminoácidos de la proteína de hCTLA-4. Ya sea que la secuencia del péptido señal se muestre en la SEQ ID NO: 182 o en la SEQ ID NO: 216, cuando el péptido señal se escinde, la proteína de hCTLA-4 madura típicamente comienza con el residuo de metionina en la posición del aminoácido 38 de la secuencia de proteínas de hCTLA-4 de longitud completa que se muestra en la SEQ ID NO: 160. Por tanto, incluso si la secuencia del péptido señal de hCTLA-4 es la de SEC. ID, N.° 182, que comprende de 1 a 35 residuos de aminoácidos de la proteína de hCTLA-4, la proteína de hCTLA-4 madura resultante secretada comienza con la metionina que está en la posición 38 de la proteína de hCTLA-4 de longitud completa. Los residuos de lisina (L) y alanina (A) en las posiciones 36 y 37, respectivamente, de la proteína de hCTLA-4 de longitud completa no están presentes en la proteína de hCTLA-4 madura y se cree que se escinden de la proteína de hCTLA-4 madura durante el proceso. Por eso, los residuos de aminoácidos de la secuencia de proteínas de hCTLA-4 madura son típicamente numerados comenzando por el residuo de metionina presente en la posición 38 de la proteína de hCTLA-4 de longitud completa como el primer aminoácido (es decir, que ocupa la primera posición); en consecuencia, el residuo de histidina ocupa la posición 2 de aminoácido en la proteína de hCTLA-4 madura, etc. Cada monómero del dímero de Orencia® incluye la secuencia del polipéptido del DEC de hCTLA-4 que se muestra en la SEQ ID NO: 159. En la proteína de hCTLA-4 WT de longitud completa, el péptido señal comprende de 1 a 37 residuos de aminoácidos, el dominio extracelular (DEC) comprende de 38 a 161 residuos de aminoácidos, el dominio transmembrana (DT) comprende de 162 a 182 residuos de aminoácidos, y el dominio citoplasmático (DC) comprende de 183 a 223 residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 160. El dominio maduro (DM) de la proteína de hCTLA-4 típicamente comprende de 36 a 223 residuos de aminoácidos, o en algunas instancias, de 37 a 223 o de 38 a 223 residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 160. El ácido nucleico de la SEQ ID NO: 194 comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia del péptido señal (de 1 a 11 1 residuos de nucleótidos), una secuencia de ácidos nucleicos que codifica hCTLA-4 (de 1 12 a 483 residuos de nucleótidos), una secuencia de nucleótidos que codifica la transmembrana de hCTLA-4 y los dominios citoplasmáticos (de 484 a 669 residuos de nucleótidos); los últimos tres nucleótidos en el extremo carboxilo terminal son el codón de terminación TGA. Belatacept (también conocida como "LEA29Y-lg", "LEA-lg" o "A29YL104E-lg") (Bristol-Myers Squibb Co. (Princeton, NJ)) es una proteína dimérica recombinante soluble compuesta por dos proteínas de fusión de Ig idénticas unidas entre sí covalentemente mediante un enlace disulfuro formado entre un residuo de cisteína en cada proteína de fusión monomérica. Cada proteína de fusión monomérica está compuesta por un dominio extracelular del polipéptido de CTLA- mutante fusionado en su al extremo carboxilo terminal al amino terminal del polipéptido de lgG1 mutante específico. La secuencia de polipéptidos del DEC de CTLA-4 difiere de la secuencia de polipéptidos del DEC de CTLA-4 humano natural por dos mutaciones, específicamente una sustitución de tirosina por alanina en la posición 29 (abreviada como la sustitución A29Y) y la sustitución de glutamina por leucina en la posición 104 (abreviada como la sustitución L104E), y en ésta se numeran los residuos de aminoácidos en el DEC de CTLA-4 humano con la metionina en el extremo amino terminal representando el aminoácido en la posición 1. Cada monómero de Belatacept incluye la secuencia de los polipéptidos de Fe de lgG1 mutantes que se muestran en la SEQ ID NO: 186; este polipéptido de Fe de lgG1 mutante es idéntico al polipéptido de Fe de lgG1 mutante incluido en la proteína de fusión de Orencia®. Por eso, la proteína de fusión monomérica de Belatacept difiere de cada proteína de fusión monomérica de Orencia® en dos aminoácidos. En la SEQ ID NO: 166, se muestra la secuencia de polipéptidos de cada proteína de fusión en Belatacept. Por tanto, el nombre "LEA29Y-lg" refleja el hecho de que cada proteína de fusión monomérica del dímero de Belatacept se compone de un DEC de CTLA-4 mutante que difiere de la secuencia de polipéptidos del DEC de CTLA-4 humano por dos mutaciones L104E y A29Y. Se ha mostrado que Belatacept se une al CD86 con una avidez aproximadamente 4 veces mayor y se une al CD80 con una avidez aproximadamente 2 veces mayor que el dímero de Orencia® (Larson et al, Amer. J. Transplant. 5:443-453, 444 (2005).

Se ha mostrado que Belatacept es hasta aproximadamente 10 veces más potente que el dímero de Orencia® para inhibir la activación in vitro de las células T y para mejorar la potencia inmunosupresora in vivo en comparación con la proteína de Orencia®, como lo demuestra su capacidad incrementada para inhibir las respuestas del anticuerpo dependiente de células T y su prolongación mejorada de la supervivencia del aloinjerto renal en pruebas clínicas que involucran a primates no humanos. Se proporciona información adicional sobre Belatacept y sus indicaciones y efectividad clínicas en el sitio web bms.com. En un aspecto, la invención proporciona moléculas CTLA-4 mutantes, incluidas las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes recombinantes que se establecen aquí, que tienen una avidez de unión con relación a CD86 mayor que la avidez de unión del dímero de Orencia® (hCTLA-4-lg dimérica) a CD86. La invención también proporciona moléculas CTLA-4 mutantes, incluidas las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes diméricas recombinantes solubles novedosas, que tienen una avidez de unión con relación a CD80 aproximadamente igual o mayor que la avidez de unión del dímero de Orencia® a CD80. En otro aspecto aún, la invención proporciona moléculas CTLA-4 mutantes, incluidas las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes recombinantes solubles novedosas, que tienen una mayor capacidad para suprimir una o más respuestas inmunitarias (por ejemplo, las respuestas inmunitarias de las células T dependientes) que Orencia® (Abatacept). Se espera que las moléculas CLTA-4 mutantes de la invención que tienen una o más propiedades mejoradas comparadas con el dímero de Orencia® sean más potentes y por tanto más efectivas, útiles, y ventajosas que el dímero de Orencia® en el tratamiento de enfermedades, trastornos los o estados en que es deseable la inmunosupresión, incluidas aquellas enfermedades, trastornos o estados para los que el dímero de Orencia® se aprueba y/o se ha mostrado que brinda beneficios clínicos, como las enfermedades autoinmunes, incluidas, por ejemplo, la artritis reumatoide y la soriasis. En otro aspecto, la invención proporciona moléculas CTLA-4 mutantes, incluidas las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantés recombinantes solubles novedosas que se establecen en el presente, que tienen una avidez de unión a CD86 que es mayor que la avidez de unión de Belatacept (LEA29Y-lg) a CD86. La invención también proporciona moléculas CTLA-4 mutantes, incluyendo las proteínas de fusión CTLA-4-lg recombinantes solubles novedosas que se establecen en el presente, que tienen una avidez de unión a CD86 que es mayor que la avidez de unión del Belatacept a CD86. En otro aspecto, la invención proporciona moléculas CTLA-4 mutantes, incluidas las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes recombinantes solubles novedosas que se establecen aquí, que tienen una mayor capacidad para suprimir una o más respuestas inmunitarias (por ejemplo, las respuestas inmunitarias dependientes de células T) que Belatacept. Se espera que las moléculas CTLA-4 mutantes de la invención que tienen una o más propiedades mejoradas en comparación con Belatacept sean más potentes que Belatacept y por tanto más efectivas, útiles, y ventajosas que Belatacept en el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones en los que es deseable la inmunosupresión, incluidas las enfermedades, los trastornos o las afecciones en las que se ha mostrado que la proteína de fusión de Belatacept proporciona beneficios clínicos, como la supervivencia del aloinjerto renal en primates no humanos. Puede determinarse la seguridad, la tolerancia, la farmacocinética, la inmunogenicidad y la eficiencia clínica de una molécula de la invención, como la molécula CTLA-4 muíante de la invención (por ejemplo, un polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante o una proteína de fusión CTLA-4-Ig mutante soluble como se establece detalladamente a continuación) en un individuo que tiene una enfermedad o trastorno inmune (por ejemplo, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, soriasis, etc.), a quien se administra una dosis específica de la molécula de una manera particular (por ejemplo, mediante administración parenteral, intravenosa o subcutánea) a través de metodologías comparables con las empleadas en las pruebas clínicas para Orencia® que involucraban a individuos similares. Véanse, por ejemplo, los sitios web bms.com y orencia.com. Por ejemplo, puede evaluarse hasta qué punto una molécula CTLA-4 mutante de la invención (por ejemplo, CTLA-4-lg mutante soluble) es efectiva para reducir el avance del daño en las articulaciones en los individuos que tienen artritis reumatoide (AR), aliviar los signos y síntomas de la AR, incluida la reducción del dolor, utilizando metodologías similares a las empleadas en las pruebas clínicas de Orencia® que involucraban pacientes con AR. Puede determinarse la seguridad, la tolerancia, la farmacocinética, la inmunogenicidad y la eficacia clínica de una molécula de la invención (por ejemplo, un polipéptido del DEC de CTLA-4 o una proteína de fusión CTLA-4-lg muíante soluble según se establece detalladamente a continuación) en un individuo en que es deseable la inmunosupresion (por ejemplo, un individuo que se somete a un trasplante de tejido, células, órganos o injertos de un donante) y a quien se le administra una dosis específica de la molécula de una manera particular (por ejemplo, mediante administración parenteral, intravenosa, o subcutánea) a través de metodologías comparables con las empleadas en las pruebas clínicas para Belatacept que involucraban a individuos similares. Véase, por ejemplo, la página web bms.com. Por ejemplo, puede evaluarse hasta qué punto una molécula de CTLA-4 mutante de la invención (por ejemplo, CTLA-4-lg mutante soluble) es efectiva para reducir el rechazo del trasplante renal o de riñon en el paciente receptor que se somete a un trasplante renal o de riñon a través de metodologías similares a las empleadas en la prueba clínica de Belatacept que involucraban a pacientes sometidos a un trasplante renal o de riñon. A continuación, se establecen más detalladamente las moléculas y los procedimientos de la invención así como otros aspectos de ésta.

Polipéptidos de la invención La presente invención proporciona polipéptidos novedosos, a los que se hace referencia colectivamente como "polipéptidos de la invención". El término "polipéptidos de la invención" pretende incluir variantes y/o derivados de las secuencias de polipéptidos que se divulgan aquí. Los polipéptidos de la invención incluyen polipéptidos de CTLA-4 recombinantes no naturales o mutantes que se unen a CD80 y/0 CD86 y/o suprimen o inhiben las respuestas inmunitarias. Los polipéptidos de la invención incluyen proteínas de fusión recombinantes que comprenden un polipéptido de CTLA-4 mutante de la invención, e incluyen formas monoméricas y diméricas de estas proteínas de fusión. Los polipéptidos de la invención incluyen multímeros que comprenden uno o más polipéptidos de CTLA-4 de la invención. La invención también incluye conjugados que comprenden uno o más polipéptidos de CTLA-4 mutantes de la invención. Algunos polipéptidos de la invención son polipéptidos solubles. Por ejemplo, según se establece más detalladamente a continuación, la invención incluye proteínas de fusión solubles que comprenden un polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante unido a un polipéptido diferente (como, por ejemplo, un polipéptido de inmunoglobulina, como, por ejemplo, un polipéptido de Fe de Ig) que estimula la solubilidad del DEC del polipéptido de CTLA-4 mutante. Según se establece más detalladamente a continuación, en un aspecto de la invención, se utilizaron varias estrategias de mutagénesis y detección para producir e identificar polipéptidos novedosos capaces de unirse a CD80 y/o CD86. En particular, se utilizaron estas estrategias para producir e identificar polipéptidos novedosos con capacidades mejoradas para unirse a CD80 y/o CD86, incluidos los polipéptidos de CTLA-4 mutantes novedosos que tienen afinidades o avideces de unión mejoradas a CD80 y/o CD86. Los polipéptidos de la invención que se unen a los ligandos CD80 y/o CD86 expresados en las células que presentan antígenos bloquean o interfieren en la interacción de estos ligandos y los receptores de CD28 expresados en las células T. Como resultado, se inhibe o bloquea la señal de coestimulación de las células T proporcionada por la interacción del receptor CD28 de superficie de células T con las moléculas B7 (es decir, CD80 y CD86). Se cree que estos polipéptidos son útiles en el tratamiento profiláctico y terapéutico de enfermedades, trastornos y afecciones en las que es beneficiosa la modulación del sistema inmunitario (por ejemplo, las respuestas de las células T).

Polipéptidos de CTLA-4 mutantes En un aspecto, la invención proporciona polipéptidos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73 (por ejemplo, SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 , SEQ ID NO:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID N0:21 , SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31 , SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID N0:41 , SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID N0:51 , SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61 , SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71 , SEQ ID NO:72, y SEQ ID NO:73), donde el polipéptido se une a CD80 y/o CD86 o un fragmento del polipéptido de CD80 y/o CD86 (o un DEC de cualquiera de ellos o ambos), y/o modulan o regulan una respuesta inmunitaria. Algunos de estos polipéptidos, como cada uno de los que figuran en las SEQ ID NO: 1 a 73, se establecen como polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes segregados o maduros. Los polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes que figuran en cada una de las SEQ ID NO: 1a 73 no incluyen un péptido señal; este se escinde durante el proceso, produciendo así el polipéptido maduro o segregado. Un fragmento de polipéptido de CD80 puede comprender, por ejemplo, un dominio extracelular del polipéptido CD80, como, por ejemplo, el DEC del polipéptido CD80 humano ("DEC de hCD80"). Un fragmento del polipéptido CD86 puede comprender, por ejemplo, un dominio extracelular del polipéptido CD86, como, por ejemplo, el DEC del polipéptido CD86 humano ("DEC de hCD86"). Algunos de estos polipéptidos se unen a CD80 y/o CD86 mamífero o un fragmento de polipéptido de estos, como, por ejemplo, el DEC de CD80 y CD86 mamífero. Algunos de estos polipéptidos se unen al CD80 humano natural ("hCD80") y/o CD86 humano natural ("hCD86") o un fragmento de polipéptido de estos, como, por ejemplo, DEC de hCD80 o DEC de hCD86. En algunos procedimientos, se suprime o inhibe al menos una respuesta inmunitaria. Algunos de estos polipéptidos presentan una afinidad o avidez de unión con relación a hCD80 o un fragmento de este (por ejemplo, DEC de hCD80) que es al menos aproximadamente igual o mayor que la afinidad o avidez de unión al DEC de hCTLA-4 del polipéptido para hCD80 o un fragmento de este, respectivamente. La secuencia del polipéptido de hCD80 de longitud completa prevista, que incluye un péptido señal, un DEC, un dominio de transmembrana y un dominio citoplasmático unidos entre sí covalentemente en ese orden, aparece en la SEQ ID NO: 195. El péptido señal comprende los residuos de aminoácidos 1 a 34, el DEC comprende residuos de aminoácidos 35 a 242, el dominio transmembrana comprende los residuos de aminoácidos 243 a 263 y el dominio citoplasmático comprende residuos de aminoácidos 264 a 288 de la SEQ ID NO: 195. La secuencia de polipéptidos del DEC de hCD80 se muestra en la SEQ ID NO: 174. La secuencia de ácidos nucleicos que se muestra en la SEQ ID NO: 173 codifica el péptido señal CD80 humano natural (en el extremo amino terminal) y el DEC de CD80 humano. Algunos de estos polipéptidos tienen una afinidad o avidez de unión a hCD86 o un fragmento de este (por ejemplo, DEC de hCD86) que es al menos aproximadamente igual o mayor que la afinidad o avidez de unión del polipéptido del DEC de hCTLA-4 a hCD86 o un fragmento de este (por ejemplo, DEC), respectivamente. La secuencia del polipéptido de hCD86 de longitud completa prevista, que incluye un péptido señal, un DEC, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático unidos entre sí covalentemente en ese orden, aparece en la SEQ ID NO: 175, y en la SEQ ID NO: 176 se muestra un ácido nucleico ejemplar que codifica la secuencia de polipéptidos hCD86 de longitud completa prevista. La secuencia de polipéptidos del DEC de hCD86 se muestra en la SEQ ID NO: 180. Algunos de estos polipéptidos tienen una afinidad o avidez de unión con relación a hCD86 que es al menos aproximadamente igual o mayor que la afinidad o avidez de unión del polipéptido de DEC de LEA29Y con relación a hCD86 que aparece en la secuencia de la SEQ ID NO: 168. Los polipéptidos ejemplares de la invención que tienen afinidades o avideces de unión con relación al DEC de hCD86 o hCD86 que son al menos aproximadamente iguales o mayores que las del DEC de hCTLA-4 y DEC de LEA29Y (también denominado DEC de "A29YL104E" o "L104EA29Y") a hCD86 o DEC de hCD86, respectivamente, incluyen, por ejemplo, sin limitación, los comprendidos en una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 10 a 12, 15, 17, 24, 26, 28, 35 y 61. Véase, por ejemplo, el cuadro 5 en el Ejemplo 4. La información presentada en el cuadro 5 refleja una interacción monomérica entre el CTLA-4-lg representativo y el DEC de CD86 monomérico. El término LEA29Y (o A29YL104E o L104EA29Y), si no se indica lo contrario, se refiere al DEC de LEA29Y (o DEC de A29YL104E o L104EA29Y). Algunos de estos polipéptidos comprenden una secuencia de polipéptidos que tiene una longitud de aminoácidos aproximadamente igual a la longitud de aminoácidos de un dominio extracelular del CTLA-4 humano. Estos polipéptidos pueden describirse como polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes. Algunos de estos polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes comprenden una secuencia de polipéptidos que es aproximadamente de 1 10 a 138 residuos de aminoácidos, aproximadamente de 1 12 a 136 residuos de aminoácidos, aproximadamente de 1 14 a 134 residuos de aminoácidos, aproximadamente de 1 16 a 132 residuos de aminoácidos, aproximadamente de 118 a 130 de aminoácidos, aproximadamente de 119 a 129 residuos de aminoácidos, aproximadamente de 120 a 128 residuos de aminoácidos, aproximadamente de 121 a 127 residuos de aminoácidos, aproximadamente de 122 a 126 residuos de aminoácidos, aproximadamente de 123 a 125 residuos de aminoácidos de longitud. Algunos de estos polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes comprenden una secuencia de 124 residuos de aminoácidos de longitud. Los polipéptidos ejemplares incluyen, por ejemplo, sin limitación, un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73, donde este polipéptido se une a CD80 y/o CD86 (o a un DEC de cualquiera o ambos). Algunos de estos polipéptidos que se establecieron anteriormente, incluidos, por ejemplo, los polipéptidos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo de las SEQ ID NO: 1 al 73 y que se une a CD80 y/o CD86 y/o un DEC de ellos, tienen la capacidad de modular o regular una respuesta inmunitaria. Una o más de las variadas respuestas inmunitarias puede ser modulada o regulada por estos polipéptidos de la invención, inclusive, sin limitación, por ejemplo, la activación o la proliferación de las células T, la síntesis o la producción de citocina (por ejemplo, la producción de TNF-a, IFN-?, IL-2, etc.), la inducción de varios marcadores de activación (por ejemplo, CD25, receptor IL-2, etc.), la síntesis o la producción de moléculas inflamatorias, la inflamación, la hinchazón de las articulaciones, la sensibilidad en las articulaciones, el dolor, la rigidez, los niveles séricos de la proteína C reactiva, la producción del anticuerpo anticolágeno, y/o la(s) respuesta(s) del anticuerpo dependiente de células T. En algunos casos, este polipéptido tiene una capacidad mayor que hCTLA-4 o el DEC de hCTLA-4 para inhibir o suprimir al menos una de estas respuestas inmunitarias. Por ejemplo, algunos de estos polipéptidos son capaces de inhibir la activación de las células T o la proliferación de las célula T en los ensayos in vitro. Los ejemplos 4 al 9 que se exponen a continuación, por ejemplo, demuestran la capacidad de las proteínas de fusión representativas de la invención que comprenden una secuencia representativa de polipéptidos del DEC de CTLA-4 muíante, como las que se establecen aquí, para inhibir la proliferación de las células T in vitro. Algunos de estos polipéptidos son capaces de inhibir o suprimir in vivo una respuesta inmunitaria en un individuo, como mediante la administración a un sujeto que necesita terapia inmunosupresora de una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de al menos uno de estos polipéptidos. Se espera que algunos de estos polipéptidos sean útiles en varias aplicaciones, incluidos, por ejemplo, sin limitación, los procedimientos profilácticos y/o terapéuticos para tratar enfermedades, trastornos y trastornos del sistema inmunitario en los que se desea la inmunomodulación, como se establece en más detalle más adelante. Se espera que estos polipéptidos sean útiles en los procedimientos profilácticos y/o terapéuticos para suprimir o inhibir la respuesta inmunitaria en un sujeto (por ejemplo, en el tratamiento in vivo de las enfermedades o los trastornos del sistema inmunitario de los mamíferos, como por ejemplo, los humanos, en el que se desea la inmunoinhibición o la ¡nmunosupresión), los procedimientos para inhibir el rechazo del trasplante de tejido u órgano del donante por parte del receptor (por ejemplo, por un mamífero, como por ejemplo, un humano), y otros procedimientos que se establecen en otra parte aquí. Adicional o indistintamente, algunos de estos polipéptidos tienen la capacidad de suprimir o inhibir una respuesta inmunítaria que es al menos aproximadamente igual o mayor que la capacidad del DEC de hCTLA-4 o hCTLA-4 para suprimir o inhibir uno o más tipos de respuestas inmunitarias. Por ejemplo, algunos de estos polipéptidos tienen la capacidad de inhibir la activación o la proliferación de células T en ensayos in vivo y/o in vitro y/o en aplicaciones, como los que se establecen anteriormente o más detalladamente a continuación, que es al menos aproximadamente igual o mayor que la capacidad del DEC de hCTLA-4 o hCTLA-4 para inhibir la activación o la proliferación de las células T en estas aplicaciones. Además, algunos de estos polipéptidos tienen la capacidad de inhibir o suprimir una respuesta inmunitaria (por ejemplo, la activación de las células T, la producción de citocina, la respuesta del anticuerpo dependiente de las células T) que es mayor que la capacidad de un polipéptido de LEA29Y - un DEC de CTLA-4 mutante específico que comprende la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEQ ID NO: 168 - para suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria. Los ejemplos 4 al 9 que se exponen a continuación, por ejemplo, comparan la capacidad de las proteínas de fusión representativas de la invención que comprenden una secuencia de polipéptidos del DEC de CTLA-4 muíante de la invención para inhibir la proliferación de las células T in vitro con relación a la capacidad de la proteína de fusión que comprende el polipéptido del DEC de hCTLA-4 o LEA29Y para inhibir la proliferación de las células T in vitro. Se espera que estas moléculas sean beneficiosas en una variedad de aplicaciones terapéuticas, incluido el tratamiento de enfermedades o trastornos autoinmunes, y los procedimientos profilácticos y terapéuticos para inhibir el rechazo del trasplante de órganos, células o de injertos de tejido. Algunos de estos polipéptidos pueden diferir entre sí, por ejemplo, por la eliminación, la adición y/o la sustitución de un aminoácido. Una sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución conservadora o no conservadora. Véase, por ejemplo, la sección titulada "Variación de la secuencia". En otro aspecto, la invención también proporciona polipéptidos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73, en las que el polipéptido se une a hCD80 monomérico o hCD86 monomérico o un DEC de cualquiera o de ambos. Algunos de estos polipéptidos tienen (1 ) una afinidad de unión a hCD86 que es aproximadamente igual o mayor que la afinidad de unión de un polipéptido hCTLA-4 monomérico o LEA29Y a hCD86 o un DEC de este, y (2) una afinidad de unión por hCD80 monomérico que es aproximadamente igual o mayor que la afinidad de unión de hCTLA-4 monomérico a hCD80 monomérico. El polipéptido LEA29Y comprende la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 168. Además, algunos de estos polipéptidos tienen una capacidad mayor para suprimir una o más respuestas inmunitarias que se establecen en el presente (por ejemplo, la activación/proliferación de células T, la síntesis/producción de citocina, la inducción de los marcadores de activación, la producción de moléculas inflamatorias, la inflamación, la producción del Ab anticolágeno, la respuesta del Ab dependiente de células T) que el hCTLA-4 monomérico, el DEC de h-CTLA-4 monomérico o el polipéptido LEA29Y. La invención también proporciona polipéptidos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73, en las que el polipéptido tiene una afinidad de unión a un DEC de hCD86 o un DEC de hCD80 que es aproximadamente igual o mayor que la afinidad de unión de un DEC de hCTLA-4 al DEC de hCD86 o el DEC de hCD80, respectivamente. Algunos de estos polipéptidos tienen una afinidad de unión al DEC de hCD86 que es mayor que la afinidad de unión del DEC de hCTLA-4 (SEQ ID NO: 159) o el polipéptido LEA29Y (SEQ ID NO: 168) al DEC de hCD86. Algunos de estos polipéptidos tienen una afinidad de unión al DEC de hCD80 que es mayor que la afinidad de unión del DEC de hCTLA-4 al DEC de hCD80. Algunos de estos polipéptidos tienen la capacidad de suprimir una respuesta inmunitaria, en algunos casos, una mayor capacidad para suprimir una o más respuestas inmunitarias, incluidas las que se establecen anteriormente y a lo largo del presente documento, que el DEC de hCTLA-4 o el polipéptido LEA29Y. En otro aspecto, la invención proporciona una variante del polipéptido CTLA-4 aislado o recombinante que comprende una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de una secuencia de polipéptidos del DEC de CTLA-4 humano que se muestra en la SEQ ID NO: 159 en no más de 15 residuos de aminoácidos, no más de 14 residuos de aminoácidos, no más de 13 residuos de aminoácidos, no más de 12 residuos de aminoácidos, no más de 11 residuos de aminoácidos, no más de 10 residuos de aminoácidos, no más de 9 residuos de aminoácidos, no más de 8 residuos de aminoácidos, no más de 7 residuos de aminoácidos, no más de 6 residuos de aminoácidos, no más de 5 residuos de aminoácidos, (por ejemplo, no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, ó 14 residuos de aminoácidos), y (b) donde el residuo de aminoácido en la posición 24, 30, 32, 39, 41 , 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70, 85, 104 ó 106 de la secuencia de polipéptidos del DEC de hCTLA-4 (SEQ ID NO: 159) se sustituye con un residuo de aminoácido distinto en la variante de la secuencia del polipéptido de CTLA-4, donde las posiciones de los residuos de aminoácidos en la variante del polipéptido de CTLA-4 se numeran de conformidad con la SEQ ID NO: 159, y donde la variante del polipéptido de CTLA-4 tiene la capacidad de unirse a CD80 o CD86 o un dominio extracelular o un fragmento de cualquiera de estos y/o tiene la capacidad de suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria. Algunas de estas variantes comprenden una o más (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince) sustituciones de aminoácidos seleccionados de un grupo compuesto por A24E, A24S, S25A, G27H, K28N, T30N, T30D, T30A, V32I, Q39K, Q39E, D41G, D41 N, D41S, A50M, A50G, M54K, M54E, M54V, G55E, G55K, N56D, D63K, S64P, I65S, I65F, I65T, S70F, M85A, M85V, M85A, L104E, L104D e I106M, I106F e I106L En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido de CTLA-4 muíante aislado o recombinante que comprende una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de la secuencia de polipéptidos del dominio extracelular de CTLA-4 humano que se muestra en la SEQ ID NO: 159 en no más de 12 residuos de aminoácidos (por ejemplo, no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 residuos de aminoácidos), y (b) comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once ó 12 sustituciones de aminoácidos seleccionados de un grupo compuesto por las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones de aminoácidos 24, 30, 32, 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 y 104 de la SEQ ID NO: 159, donde las posiciones de aminoácidos del polipéptido de CTLA-4 mutante se numeran de conformidad con la SEQ ID NO: 159 y donde el polipéptido de CTLA-4 mutante tiene la capacidad de unirse a CD80 o CD86 o un dominio extracelular o un fragmento de cualquiera de estos, y/o tiene la capacidad de suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria. Las sustituciones ejemplares de aminoácidos en estas posiciones incluyen, sin limitación, sustituciones conservadoras de aminoácidos de los residuos de aminoácidos presentes en el DEC de hCTLA-4 WT y/o A24S/E (es decir, A24S o A24E), T30N/D/A (es decir, T30N o T30D o T30A), V32I/L/M/V, A50M/G, M54EA /K, G55E/K/R, N56D/A, S64P/M/C, I65S 17F/V, S70F/Y/W, L104E/M, o cualquier combinación de las sustituciones de estos. En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos aislados o recombinantes (por ejemplo, polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante) que comprenden una secuencia de polipéptidos (a) que difiere de la secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73 en no más de 14, 13, 12, 11 , 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 residuo(s) de aminoácido(s), y (b) donde el residuo de aminoácido en la secuencia de polipéptidos de la posición del residuo de aminoácido 41 , 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70, u 85 es idéntico al residuo de aminoácido en la posición correspondiente de dicha secuencia de polipéptidos seleccionada (por ejemplo, un polipéptido seleccionado de las SEQ ID NO: 1 al 73), donde el polipéptido se une a CD80 y/o CD86 y/o un dominio extracelular de cualquiera o de ambos, y/o inhibe una(s) respuesta(s) inmunitaria(s). En algunos casos, el polipéptido difiere del polipéptido seleccionado (por ejemplo, el seleccionado de la SEQ ID NO: 1 al 73) en no más de 10, 9, 8, 7 ó 6 residuos de aminoácidos (por ejemplo, no más de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9o 10 residuos de aminoácidos), pero el aminoácido que ocupa una o más de las posiciones de los residuos de aminoácidos 41 , 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 y 85 es idéntico al residuo de aminoácido que se incluye en la posición de la secuencia de polipéptidos seleccionada (por ejemplo, uno seleccionado de las SEQ ID NO: 1 al 73) y no es eliminado o sustituido por otro aminoácido. Algunos de estos polipéptidos comprenden una secuencia de polipéptidos que difiere de la secuencia de polipéptidos seleccionada en no más de 10, 9, 8, 7, ó 6 residuos de aminoácidos (por ejemplo, no más de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 residuos de aminoácidos) y que incluye residuos de aminoácidos en una o más de las posiciones de residuos de los aminoácidos 24, 30, 32, 41 , 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70, 85, 104 y 106 que son idénticos a los residuos de los aminoácidos en las correspondientes posiciones en la secuencia de polipéptidos seleccionada. Estos polipéptidos pueden diferir de la secuencia de polipéptidos seleccionada por la(s) eliminación(es), adición(es) y/o sustitución(es) de aminoácidos en una(s) posición(es) en que no se especifica la existencia de un aminoácido idéntico al de la secuencia seleccionada. Se incluyen estos polipéptidos que tienen una afinidad o avidez de unión a hCD86 o un fragmento de este (por ejemplo, el DEC de hCD86) que es al menos aproximadamente igual o mayor que la afinidad o avidez de unión del polipéptido del DEC de hCTLA-4 o LEA29Y a hCD86 o un fragmento de estos (por ejemplo, el DEC), respectivamente. Algunos de estos polipéptidos tienen una afinidad o avidez de unión a hCD80 o un fragmento de este (por ejemplo, el DEC de hCD80) que es al menos aproximadamente igual o mayor que la afinidad o la avidez de unión del polipéptido del DEC de hCTLA-4 a hCD80 o un fragmento de estos, respectivamente. Algunos de estos polipéptidos comprenden una secuencia de polipéptidos que tienen una longitud aproximadamente igual a la longitud de aminoácidos del DEC de hCTLA-4, por ejemplo, 118 a 130, 1 19 a 129, 120 a 128, 121 a 127, 122 a 126, 123 a 125, ó 124 residuos de aminoácidos de longitud. Algunos de estos polipéptidos son capaces de suprimir uná o más de las variadas respuestas inmunitarias, incluida, por ejemplo, la activación de células T, la proliferación de células T, la síntesis o producción de citocina (por ejemplo, la producción de TNF-a, IFN-?, IL-2), la inducción de los marcadores de activación (por ejemplo, CD25, receptor IL-2), la inflamación, la producción de moléculas inflamatorias, la producción del Ab anticolágeno y/o la(s) respuesta(s) de los Ab dependientes de células T. Algunos de estos polipéptidos tienen una mayor capacidad para inhibir uná o más de estas respuestas inmunitarias que hCTLA-4, el polipéptido del DEC de hCTLA-4 o el polipéptido LEA29Y. Por ejemplo, algunos de estos polipéptidos son capaces de inhibir la activación de la célula T o la proliferación de la célula T en ensayos in vitro. Por ejemplo, los ejemplos 4 al 9 comparan la capacidad de las proteínas de fusión representativas de la invención que comprenden una secuencia de polipéptidos del DEC de CTLA-4 muíante de la invención para inhibir la proliferación de las células T in vitro con respecto a la capacidad de una proteína de fusión que comprende el DEC de hCTLA-4 o el polipéptido LEA29Y. Algunos de estos polipéptidos son capaces de inhibir o suprimir in vivo una respuesta inmunitaria en un individuo, como mediante la administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de al menos un polipéptido a un sujeto que necesita terapia inmunopresora. Se espera que algunos de estos polipéptidos sean útiles en una variedad de aplicaciones, incluidos, por ejemplo, sin limitación, los procedimientos profilácticos y/o terapéuticos para tratar enfermedades, trastornos y afecciones del sistema inmunitario en las que se desea la supresión de una respuesta inmunitaria, incluidos, por ejemplo, procedimientos profilácticos y/o terapéuticos para tratar enfermedades o trastornos autoinmunes, procedimientos para inhibir el rechazo de un trasplante de tejidos u órganos de un donante por parte del receptor (por ejemplo, por un mamífero, como, por ejemplo, un humano), y otros procedimientos que se establecen en otra parte del presente documento. En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos aislados o recombinantes (por ejemplo, polipéptidos del DEC de CTLA-4) que comprenden una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de la secuencia de polipéptidos del dominio extracelular de CTLA-4 humano que se muestra en la SEC. ID N° 159 en no más de 10 residuos de aminoácidos, no más de 9 residuos de aminoácidos, no más de 8 residuos de aminoácidos, no más dé 7 residuos de aminoácidos, no más de 6 residuos de aminoácidos, no más de 5 residuos de aminoácidos, no más de 4 residuos de aminoácidos, no más de 3 residuos de aminoácidos, no más de 2 residuos de aminoácidos, no más de 1 residuo de aminoácido (por ejemplo, no más de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 residuos de aminoácidos), y (b) comprende al menos una sustitución de aminoácidos en una posición del residuo de aminoácido correspondiente a la posición 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 u 85 con relación a la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 159, en la que el polipéptido se une a hCD80 y/o hCD86 y/o un DEC de cualquiera o de ambos, y/o inhibe una respuesta inmunitaria (por ejemplo, la activación o proliferación de células T, la síntesis o la producción de citocina (por ejemplo, la producción de TNF-a, IFN-?, IL-2), la inducción de los marcadores de activación (por ejemplo, CD25, receptor IL-2), la inflamación, la producción de moléculas inflamatorias, la producción del Ab anticolágeno, y/o la respuesta de los Ab dependientes de células T), como los procedimientos y/o ensayos in vitro y/o in vivo que se establecen más detalladamente a continuación. Algunos de estos polipéptidos comprenden una secuencia de polipéptidos que tiene una longitud de 124 residuos de aminoácidos. Algunos de estos polipéptidos comprenden 2, 3, 4, 5 ó 6 sustituciones de aminoácidos en posiciones con relación a la secuencia de polipéptidos que se establece en la SEQ ID NO: 159 seleccionada de un grupo compuesto por la posición del residuo de aminoácido 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 y 85. Algunos de estos polipéptidos comprenden además una sustitución de aminoácido en una posición del residuo de aminoácido que corresponde a la posición 104 y/ó 30 con relación a la SEQ ID NO: 59. Algunos de estos polipéptidos comprenden al menos una sustitución de aminoácido con relación a la SEQ ID NO: 159 en la posición 70 (opcionalmente S70F), la posición 64 (opcionalmente S64P), la posición 50 (opcionalmente A50M/G, por ejemplo, A50M, A50G), la posición 54 (opcionalmente ?54??/, por ejemplo, M54K), la posición 65 (opcionalmente I65S), la posición 56 (opcionalmente N56D), la posición 55 (opcionalmente G55E/K, por ejemplo, G55E, G55K), la posición 85 (opcionalmente M85A), y/o la posición 24 (opcionalmente A24E/S, por ejemplo, A24E). Cualquiera de estos polipéptidos además puede comprender una sustitución de aminoácido con relación a la SEQ ID NO: 159 en la posición 104 (opcionalmente, L104E/D, por ejemplo, L104E), la posición 30 (opcionalmente, T30N/D/A, por ejemplo, T30N, T30D, o T30A), y/o la posición 32 (opcionalmente, V32I). En algunos casos, el polipéptidó comprende una o más sustituciones en las posiciones de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 159 seleccionados del grupo que consiste en A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S, y S70F. Algunos de estos polipéptidos exhiben una afinidad de unión a CD86 (por ejemplo, hCD86) o el DEC de CD86 (por ejemplo, el DEC de hCD86) que es aproximadamente igual o mayor que la afinidad de unión de un DEC de hCTLA-4 monomérico a CD86 o al DEC de CD86, respectivamente. Algunos de estos polipéptidos exhiben una afinidad de unión a CD80 (por ejemplo, hCD80) o el DEC de CD80 (por ejemplo, el DEC de hCD80) que es mayor que la afinidad de unión de un DEC de hCTLA-4 a CD80 o el DEC de CD80, respectivamente. Algunos de estos polipéptidos tienen la capacidad de suprimir o inhibir una o más respuestas inmunitarias (por ejemplo, la activación o proliferación de células T, la producción de citocina, etc.), ya sea in vitro y/o in vivo. Algunos de estos polipéptidos inhiben una o más de estas respuestas inmunitarias en mayor medida que hCTLA-4, el DEC de hCTLA-4 o el polipéptidó LEA29Y. Se espera que estos polipéptidos sean beneficiosos en una variedad de aplicaciones terapéuticas, incluidos los procedimientos profilácticos y/o terapéuticos para tratar enfermedades y trastornos autoinmunes, o los procedimientos profilácticos y/o terapéuticos para inhibir el rechazo del trasplante de órganos, células o injertos de tejido. En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos aislados o recombinantes (por ejemplo, polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante) que comprenden una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de la secuencia de polipéptidos del dominio extracelular de CTLA-4 humano que se muestra en la SEQ ID NO: 159 en no más de 6 residuos de aminoácidos (por ejemplo, no más de 1 , 2, 3, 4, 5, ó 6 residuos de aminoácidos), y (b) comprende una o más sustituciones en las posiciones de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 159 seleccionadas del grupo compuesto por A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S, y S70F donde el polipéptido se une a hCD80 y/o hCD86 o un dominio extracelular de cualquiera o de ambos, y/o inhibe una respuesta inmunitaria (por ejemplo, la activación o proliferación de células T, la síntesis o la producción de citocinas, la inducción de los marcadores de activación, la producción de moléculas inflamatorias, la inflamación, la hinchazón o la sensibilidad en las articulaciones, el dolor, la rigidez, los niveles séricos de la proteína C reactiva, la producción del Ab anticolágeno, y/o la respuesta del Ab dependiente de células T, etc.) en ensayos in vitro o en procedimientos in vivo. Se espera que estos polipéptidos sean útiles en el tratamiento de un individuo que padece una enfermedad, trastorno, o afección en los que la terapia inmunosupresora podría resultar beneficiosa, incluidos, por ejemplo, los procedimientos terapéuticos y profilácticos para inhibir el trasplante de órganos, células o injertos de tejido. La invención también incluye un polipéptido aislado o recombinante que comprende una secuencia de polipéptidos que a su vez comprende (i) una identidad de secuencia de al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con cualquier secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 al 73 y (ii) un residuo de fenilalanina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 70 de dicha secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73, donde el polipéptido se une h-CD80 y/o h-CD86 o un dominio extracelular de estos y/o inhibe una respuesta inmunitaria (por ejemplo, la activación o la proliferación de células T, la síntesis o la producción de citocina, la inducción de los marcadores de activación, la producción de moléculas inflamatorias, la inflamación, la hinchazón o la sensibilidad en las articulaciones, el dolor, la rigidez, los niveles séricos de la proteína C reactiva, la producción del Ab anticolágeno y/o la respuesta del Ab dependiente de células T, etc.) en ensayos in vitro y/o procedimientos in vivo. Algunos de estos polipéptidos comprenden uno o más de los siguientes con relación a la secuencia seleccionada: un residuo de ácido glutámico en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 24; un residuo de asparagina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 30; un residuo de isoleucina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 32; un residuo de metionina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 50; un residuo de lisina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 54; un residuo de ácido glutámico en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 55; un residuo de ácido aspártico en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 56; un residuo de prolina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 64; un residuo de serina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 65 y un residuo de ácido glutámico en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 104. Se espera que estos polipéptidos sean beneficiosos en una variedad de aplicaciones, incluidos los procedimientos para el tratamiento de enfermedades y trastornos autoinmunes, y los procedimientos para inhibir el trasplante de órganos, células o injertos de tejido. Por ejemplo, en un aspecto no excluyente, la invención incluye un polipéptido aislado o recombinante (por ejemplo, un DEC de CTLA-4 mutante) que comprende una secuencia de polipéptidos que comprende (i) una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 24 y (ii) un residuo de fenilalanina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 70 de la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 24, donde el polipéptido se úne hCD80 y/o hCD86 y/o un DEC de cualquiera o de ambos, y/o inhibe una respuesta inmunitaria in vitro y/o in vivo. El polipéptido puede comprender al menos uno de los siguientes con relación a la SEQ ID NO: 24: un residuo de ácido glutámico en la posición 24; un residuo de asparagina en la posición 30, un residuo de isoleucina en la posición 32; un residuo de metionina en la posición 50; un residuo de lisina en la posición 54; un residuo de ácido glutámico en la posición 55; un residuo de ácido aspártico en la posición 56; un residuo de prolina en la posición 64; un residuo de serina en la posición 65; y un residuo de ácido glutámico en la posición 104. La invención también incluye un polipéptido aislado o recombinante (por ejemplo, un polipéptido del DEC de CTLA-4 muíante) que se une a hCD80 y/o hCD86 (y/o un DEC de cualquiera o de ambos) y/o inhibe una respuesta inmunitaria (como se establece anteriormente), por ejemplo, in vitro y/o in vivo, donde el polipéptido comprende una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de la secuencia de polipéptidos del polipéptido del DEC de CTLA-4 humano que se muestra en la SEC. ID N° 159 en no más de 6 residuos de aminoácidos, y (b) comprende al menos una sustitución de aminoácido, donde al menos esta sustitución de aminoácido comprende S70F, donde las posiciones del residuo de aminoácido están numeradas de conformidad con la SEQ ID NO: 159. El polipéptido puede además comprender al menos una sustitución seleccionada del grupo compuesto por A24E, T30N, V32I, D41 G, A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S, M85A, L104E e I106F. Se cree que estos polipéptidos son útiles en una variedad de aplicaciones, incluidos los procedimientos para tratar las enfermedades y los trastornos autoinmunes y los procedimientos para inhibir el rechazo al trasplante de órganos, células, tejidos o injertos. La invención también incluye un polipéptido aislado o recombinante que comprende una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEQ ID NO: 31 en no más de 6 residuos de aminoácidos, y (b) comprende al menos uno de los siguientes: un residuo de metionina en una posición correspondiente a la posición 50 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de lisina en una posición correspondiente a la posición 54 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de ácido glutámico en una posición correspondiente a la posición 55 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de prolina en una posición correspondiente a la posición 64 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de serina en una posición correspondiente a la posición 65 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de fenilalanina en una posición correspondiente a la posición 70 de la SEQ ID NO: 31 , donde las posiciones de los aminoácidos están numeradas de conformidad con la SEQ ID NO: 31 y el polipéptido se une a CD80 y/o CD86 y/o un DEC de cualquiera o de ambos, y/o inhibe una respuesta inmunitaria como se establece anteriormente in vitro y/o in vivo. El polipéptido puede comprender un residuo de ácido glutámico en una posición correspondiente a la posición 104, un residuo de ácido asparagina en una posición correspondiente a la posición 30 y/o un residuo de isoleucina en una posición correspondiente a la posición 32 de la SEQ ID NO: 31. Se cree que estos polipéptidos son beneficiosos en una variedad de aplicaciones, incluidos los procedimientos para tratar enfermedades y trastornos reumáticos y procedimientos para inhibir el trasplante de órganos, células o injertos de tejido. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante que comprende una secuencia de polipéptidos que comprende (i) una identidad de secuencia de al menos el 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo compuesto por las SEQ ID NO: 36 a 46 y 55 y (ii) un residuo de ácido glutámico en una posición de aminoácido 55 de dicha secuencia de polipéptidos seleccionada, en la que el polipéptido se une a CD80 y/o CD86 o un dominio extracelular de cualquiera o de ambos y/o suprime una respuesta inmunitaria. Las respuestas inmunitarias que pueden suprimirse incluyen, por ejemplo, la activación o la proliferación de células T, la síntesis o la producción de citocina (por ejemplo, la producción de TNF-a, IFN-?, IL-2), la inducción de los marcadores de activación (por ejemplo, CD25, receptor IL-2), la inflamación, la producción de moléculas inflamatorias, la producción del Ab anticolágeno y/o las respuestas del Ab dependiente de células T). Esta secuencia de polipéptidos además puede comprender un residuo de fenilalanina en una posición de aminoácido 70. Esta secuencia de polipéptidos puede además comprender un residuo de prolina en la posición 64 y/o un residuo de asparagina en la posición 30. Esta secuencia de polipéptidos puede además comprender un residuo de metionina en la posición 50 y/o un residuo de lisina en la posición 54. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante que comprende una secuencia de polipéptidos que comprende (i) una identidad de secuencia de al menos el 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo compuesto por las SEQ ID NO: 28, 30, 36 al 46, 55 al 57 y 65 al 73, y (ii) ün residuo de ácido glutámico en una posición de aminoácido 55 de dicha secuencia de polipéptidos, donde el polipéptido se une a CD80 y/o CD86 o un dominio extracelular de cualquiera o de ambos y/o suprime una respuesta inmunitaria, como la activación o la proliferación de células T, la síntesis o la producción de citocina (por ejemplo, la producción de TNF-a, IFN-?, IL-2), la inducción de los marcadores de activación (por ejemplo, CD25, receptor IL-2), la inflamación, la producción de moléculas inflamatorias, la producción del Ab anticolágeno y/o las respuestas del Ab dependiente de células T. Esta secuencia de polipéptidos puede comprender además un residuo de fenilalanina en la posición de aminoácido 70. Esta secuencia de polipéptidos puede además comprender un residuo de prolina en la posición 64 y/o un residuo de asparagina en la posición 30. Esta secuencia de polipéptidos puede además comprender un residuo de metionina en la posición 50 y/o, un residuo de lisina en la posición 54. Cualquier polipéptido de la invención establecido anteriormente puede además incluir un péptido que facilite la secreción de dicho polipéptido. Por tanto, en un aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante que comprende (a) cualquier polipéptido según se establece anteriormente (por ejemplo, un DEC de CTLA-4 mutante que se establece anteriormente) y (b) un péptido que facilita la secreción del polipéptido expresado de una célula huésped. El péptido es opcionalmente un péptido señal. El extremo carboxilo terminal del péptido señal está típicamente i conectado en forma covalente con el extremo amino terminal del polipéptido.

El péptido señal puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 182 o SEQ ID NO: 216. El péptido señal puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con la secuencia de residuos de aminoácidos 1 al 35, 1 al 36, ó 1 al 37 de la SEQ ID NO: 160. Cualquier polipéptido de la invención que se establece anteriormente puede comprender además un dominio transmembrana y/o un dominio citoplásmico. Por tanto, en un aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante que comprende (a) cualquier polipéptido de la invención que se establece anteriormente (por ejemplo, un DEC de CTLA-4 mutante que se establece anteriormente), y (b) un dominio transmembrana. Esta proteína puede además, opcionalmente, comprender un péptido señal como se establece anteriormente, donde el extremo carboxilo terminal del péptido señal está conectado covalentemente con el extremo amino terminal del polipéptido de la invención. El extremo carboxilo terminal del péptido señal está típicamente conectado de forma covalente con el extremo amino terminal del dominio transmembrana. El extremo carboxilo terminal del dominio transmembrana está típicamente conectado de forma covalente con el extremo amino terminal del dominio citoplásmico. En algunos casos, el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con la secuencia de aminoácidos que comprende de 162 a 182 residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 160. En algunos casos, el dominio citoplásmico comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia de aminoácidos que comprende de 183 a 223 residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 160. Cualquiera de los polipéptidos que se establecen anteriormente puede comprender uno o más de los residuos de aminoácido glicosilados o pegilados. La invención también incluye multímeros de polipéptido aislado o recombinante que comprende dos o más polipéptidos, donde al menos uno de los polipéptidos del multímero es un polipéptido de CTLA-4 muíante de la invención como se establece aquí (por ejemplo, un DEC de CTLA-4 muíante o Ig de CTLA-4 muíante). Este multímero comprende al menos un polipéptido de la invención y puede además comprender al menos un polipépíido adicional que no iiene por qué ser un polipépíido de la invención. Por ejemplo, un mulíímero puede comprender al menos un polipépíido de la invención y al menos oíro polipépíido que puede ser, por ejemplo, un polipépíido naíural (por ejemplo, un DEC de hCTLA-4 o hCTLA-4-lg) y/o al menos oíro polipépíido muíaníe (como un polipépíido muíanle que no es un polipépíido de la invención). Algunos o lodos los polipépíidos en el mulíímero (o polipéplidos mulliméricos) pueden ser idénticos enlres sí o, en algunos casos, lodos los polipéplidos en el multímero pueden ser diferentes entre sí. En algunos casos, el polipéptido multímero es un dímero que comprende dos polipéptidos de la invención, que opcionalmente pueden ser polipéptidos idénticos (es decir, homodímeros) o polipéptidos diferentes (es decir, heterodímeros). En algunos casos, el polipéptido multimero es un tetrámero que comprende cuatro polipéptidos de la invención. El tetrámero puede comprender cuatro polipéptidos idénticos (es decir, homotetrámeros) o cualquier combinación de cuatro polipéptidos de la invención con tal de que al menos un polipéptido no sea idéntico a los otros tres polipéptidos (es decir, heterotétramos). La invención también incluye un tetrámero que comprende cuatro DEC de polipéptidos de CTLA-4 naturales (por ejemplo, DEC de hCTLA-4) o cuatro CTLA-4-lg naturales idénticos (por ejemplo, hCTLA-4-lg). En algunos casos, el multimero es capaz de unirse a CD80 y/o CD86 (o un DEC de cualquiera o de ambos) y/o suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria en los procedimientos in vivo y/o in vitro (por ejemplo, la proliferación o activación de células T, la producción de citocina, etc.). Algunos de estos multímeros tienen una mayor capacidad que hCTLA-4 o hCTLA-4-lg (por ejemplo, hCTLA-4-lgG2 o la proteína Orencia®) para suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria in vitro y/o in vivo. Los polipéptidos de los multímeros pueden conectarse entre sí, ya sea mediante conectores covalentes o enlaces disulfuro entre uno o más residuos de cisteína en uno o más polipéptidos. Algunos de estos tetrámeros de la invención comprenden una estructura esquemáticamente similar a la de un anticuerpo, pero los dominios variables del anticuerpo se reemplazan con cualquier polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante de la invención que se establecen aquí. La cadena pesada de un anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH) fusionado con un dominio CH1 de inmunoglobulina (Ig) (por ejemplo, CH1 de lgG2), que está fusionado a una bisagra. La bisagra está fusionada a un dominio CH2 de Ig (por ejemplo, CH2 de lgG2), que está fusionado a un dominio CH3 de Ig (por ejemplo, CH3 de lgG2). La cadena liviana de un anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena liviana (VL) fusionado a un dominio de Ig C kappa (CK) o C lambda (CA). Dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas están covalentemente conectadas entre sí mediante uno o más enlaces disulfuro formados por residuos de cisteína en las cadenas pesadas y livianas. La invención incluye un tetrámero CTLA-4 muíante en el que cada dominio de las cadenas pesadas y livianas se reemplaza con un polipéptido del DEC de CTLA-4 muíante de la invención. Por tanlo, este tetrámero comprende dos cadenas livianas y dos cadenas pesadas. Cada cadena liviana comprende un polipéptido del DEC de CTLA-4 muíante fusionado a un dominio de Ig CK o CA. Cada cadena pesada comprende un DEC de CTLA-4 muíante fusionado a un dominio CH1 de Ig (por ejemplo, CH1 de lgG2), que está fusionado a una bisagra. La bisagra está fusionada a un dominio CH2 de Ig (por ejemplo, CH2 de lgG2), que está fusionado a un dominio CH3 de Ig (por ejemplo, CH3 de lgG2). Las dos cadenas pesadas y las dos cadena livianas están covalentemente conecíadas eníre sí por uno o más enlaces disulfuro formados por residuos de cisíeina en las cadenas pesadas y livianas. Esle íeírámero puede describirse como un íeírámero CTLA-4-lg. Los entendidos en la técnica conocen y comprenden los procedimientos para construir este tetrámero de CTLA-4-lg. Un constructo de CD4-lg tetramérico, que comprende un polipéptido CD4 y que neutraliza los aislados primarios de VIH tipo 1 , se establece en Allaway, G.P. et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 1 1 (5):533-9 (1995). El tetrámero puede comprender cuatro polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes idénticos o cualquier combinación de los cuatro polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes de la invención, siempre que al menos un DEC de CTLA-4 muíante no sea idéntico a los oíros íres polipépíidos del DEC de CTLA-4 muíaníes. Algunos de estos tetrámeros son capaces de unirse a CD80 y/o CD86 con una avidez de unión más alta que la de hCTLA-4 (o hCTLA-4-lg). Algunos de esíos íetrámeros son capaces de suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria; en algunos casos, esíe íeírámero íiene una mayor capacidad que hCTLA-4 o hCTLA-4-lg (por ejemplo, hCTLA-4-lgG2 u Orencia®) para suprimir o inhibir una respuesta inmuniíaria en los ensayos in vitro o en los procedimientos in vivo (por ejemplo, la proliferación o acíivación de células T, la producción de citociha, etc.). Se espera que los multímeros de la invención sean beneficiosos en una variedad de aplicaciones, incluidos métodos para traíar enfermedades o trastornos autoinmunes, y métodos de inhibición para trasplantes de injertos de órganos, células o tejido. La invención también incluye multímeros aislados, conjugados o recombinantes que comprenden dos o más conjugados, donde al menos uno de los conjugados es un conjugado de la invención que comprende un polipéplido de CTLA-4 muíaníe de la invención (por ejemplo, un DEC de CTLA-4 mutante o CTLA-4-lg mutante). Algunos de todos los conjugados en el multímero pueden ser idénticos entre si, o todos los conjugados en el multímero pueden ser diferentes entre si. En algunos casos, el multímero conjugado es un dímero que comprende dos conjugados o un tetrámero que comprende cuatro conjugados de la invención. Algunos de estos multímeros conjugados son capaces de unirse a CD80 y/o CD86 (o un DEC de cualquiera o de ambos) y lo suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria in vitro y/o in vivo. Las moléculas conjugadas en multímeros pueden estar conectadas entre sí, mediante conectores covalentes o enlaces disulfuro entre uno o más residuos de cisteína en uno o más conjugados. La invención incluye un dímero de polipéptido aislado o recombinante que comprende cualesquiera dos polipéptidos de la invención que se establecen anteriormente (por ejemplo, un DEC de CTLA-4 mutante que se establece anteriormente), donde el dímero presenta una avidez de unión a CD86 humano o un dominio extracelular de este que es aproximadamente igual o mayor que la avidez de unión de un dímero que comprende dos dominios extracelulares de CTLA-4 humano a CD86 humano o un dominio extracelular de este, respectivamente. La invención incluye dímeros de polipéptido aislados o recombinantes que comprenden dos polipéptidos de la invención que se establecen anteriormente (por ejemplo, un DEC de CTLA-4 mutante que se establece anteriormente), donde el dímero presenta una avidez de unión a hCD80 o un DEC de este que es aproximadamente igual o mayor que la avidez de unión de un dimero que comprende dos polipéptidos del DEC de hCTLA-4 (SEQ ID NO: 159) por hCD80 o un DEC de estos, respectivamente. Por ejemplo, en un aspecto no excluyente, el dimero puede comprender dos polipéptidos, donde cada polipéptido comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ó 100% con una secuencia seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73, y cada polipéptido se une a hCD80 y/o hCD86 y/o inhibe una respuesta inmunitaria. En otro aspecto no excluyente, el dimero puede comprender dos polipéptidos, donde cada polipéptido difiere de la secuencia de polipéptidos del DEC de hCTLA-4 (SEQ ID NO: 159) en no más de 6 residuos de aminoácidos y comprende al menos una sustitución en una posición de aminoácido con relación a la SEQ ID NO: 159 seleccionada del grupo compuesto por A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S, y S70F; y el polipéptido comprende opcionalmente además la sustitución de L104E, y cada polipéptido se une a hCD80 y/o hCD86 y/o inhibe una respuesta inmunitaria. En algunos casos, el dimero presenta una avidez de unión a hCD80 o un DEC de este que es aproximadamente igual o mayor que la avidez de unión de un dimero que comprende dos polipéptidos del DEC de hCTLA-4 a hCD80 y un DEC de este, respectivamente. En algunos casos, el dimero presenta una avidez de unión a hCD86 o un DEC de este que es mayor que la avidez de unión de un dimero que comprende dos polipéptidos LEA29Y a hCD86 o un DEC de este, respectivamente, donde cada polipéptido LEA29Y comprende la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEQ ID NO: 168. En algunos casos, el dímero se disocia al unirse a hCD86 o un DEC de este a una velocidad que es menor a la velocidad a la que un dímero que comprende dos polipéptidos del DEC de hCTLA-4 se disocia al unirse a hCD86 o un DEC de este, respectivamente. En algunos casos, el dímero se disocia al unirse a hCD86 o un DEC de este a una velocidad que es menor que la velocidad a la que un dímero que comprende dos polipéptidos LEA29Y se disocia al unirse a hCD86 o un DEC de este, respectivamente, donde cada polipéptido LEA29Y comprende la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEQ ID NO: 168. En algunos casos, el dímero se asocia con hCD86 o un DEC de este a una velocidad que es mayor que la velocidad a la que un dímero que comprende dos polipéptidos del DEC de hCTLA-4 se asocia con hCD86 o un DEC de este, respectivamente. En algunos casos, el dímero se asocia con hCD86 o un DEC de este a una velocidad que es mayor que la velocidad a la que un dímero que comprende dos polipéptidos LEA29Y se asocia con hCD86 o un DEC de este, respectivamente, donde cada polipéptido LEA29Y comprende la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEQ ID NO: 168. En algunos casos, este dímero que comprende un DEC de CTLA-4 muíante tiene una mayor capacidad para suprimir una respuesta inmunitaria (por ejemplo, la activación o la proliferación de células T, la producción de citocina, etc.) que un dímero que comprende dos dominios extracelulares de CTLA-4 humano o dos polipéptidos LEA29Y.

Algunos de estos dímeros tienen una constante de disociación del equilibrio (KD) de CD86 que es menor que la constante de disociación de equilibrio (KD) de CD86 de un dimero que comprende dos polipéptidos del DEC de hCTLA-4 o dos polipéptidos LEA29Y. Algunos de estos dimeros tienen una constante de disociación de equilibrio (KD) de CD86 que es menor que la constante de disociación de equilibrio (KD) de CD86 de un dimero que comprende dos polipéptidos LEA29Y; cada polipéptido LEA29Y comprende la secuencia de polipéptidos que se expone en la SEQ ID NO: 168. Algunos de estos multímeros que comprenden al menos dos polipéptidos de la invención (por ejemplo, un dimero que comprende dos polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes de la invención) tienen una capacidad mejorada para suprimir una respuesta inmunitaria en comparación con un multimero de hCTLA-4 de longitud completa de la misma valencia (es decir, un multimero que comprende el mismo número de polipéptidos de CTLA-4 de longitud completa). Algunos de estos multímeros que comprenden al menos dos polipéptidos de la invención tienen una capacidad mejorada para suprimir una respuesta inmunitaria en comparación con un multimero del DEC de hCTLA-4 de la misma valencia (es decir, un multimero que comprende el mismo número de polipéptidos del DEC de hCTLA-4). Cualquier polipéptido de la invención que se establece anteriormente puede comprender además una secuencia de polipéptidos adicional que mejora la solubilidad, como una secuencia de polipéptidos de inmunoglobulina (Ig), que de ese modo forma, por ejemplo, una proteína de fusión soluble, como se establece más detalladamente más adelante. Cada polipéptido de un multímero de polipéptido puede comprender además una secuencia de polipéptidos adicional que mejora la solubilidad, como una secuencia de polipéptidos de Ig, que de ese modo forma, por ejemplo, una proteína de fusión soluble. Por lo tanto, por ejemplo, cada polipéptido de un dimero que comprende dos o más polipéptidos de la invención, como se establece anteriormente, puede comprender además una secuencia de polipéptidos adicional que mejora la solubilidad, como una secuencia de I polipéptidos de Ig, que de ese modo forma, por ejemplo, una proteína de fusión soluble.

Se espera que estos polipéptidos y dímeros de la invención sean beneficiosos en una variedad de aplicaciones, inclusive los procedimientos para tratar enfermedades y trastornos autoinmunes y los procedimientos para inhibir el trasplante de órganos, células, o injertos de tejido.

Como se establece previamente, la secuencia de proteínas de hCTLA-4 madura típicamente comienza con el residuo de metionina en la posición de aminoácido 38 de la secuencia de proteínas de hCTLA-4 de longitud completa que se muestra en la SEQ ID NO: 160, y los residuos de aminoácidos de la secuencia de proteína hCTLA-4 madura están típicamente numerados comenzando con este residuo de metionina como primer aminoácido (es decir, que ocupa la posición 1 de aminoácidos).

Algunos polipéptidos CTLA-4 mutantes de la invención (incluidas las proteínas de fusión monoméricas y diméricas y los polipéptidos multiméricos) incluyen al menos una sustitución de aminoácido en una posición de aminoácido correspondiente a una posición de aminoácido en la secuencia de proteína hCTLA-4 madura que está por fuera de la interfaz de unión clásica de hCTLA-4/hB7-2 (véase, por ejemplo, Schwartz et al, Nature 410:604-608 (2001 )), que incluye, pero sin limitación, por ejemplo, cualesquiera de las posiciones de aminoácido 24, 41 , 54, 55, 56, 64, 65, 70, y 85. En general, los entendidos en la técnica no habrían podido prever que una sustitución de aminoácido en cualquiera de las posiciones ya enunciadas (24, 41 , 54, 55, 56, 64, 65, 70, y/u 85) o cualquier combinación de una o más sustituciones seleccionadas del grupo de posiciones 24, 41 , 54, 55, 56, 64, 65, 70 y 85 tendría la capacidad de mejorar la afinidad o la avidez de unión de hCTLA-4 a hB7-2, una capacidad mejorada para inhibir la interacción de las células CD28 positivas con B7-2 positivas o que proporcionaría una capacidad mayor para suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria que, por ejemplo, el DEC de hCTLA-4 o hCTLA-4-lg (por ejemplo, la activación o la proliferación de células T, la síntesis o la producción de citocina, la inducción de los marcadores de activación, la síntesis o la producción de moléculas inflamatorias, la inflamación, la hinchazón o la sensibilidad en las articulaciones, la producción del anticuerpo anticolágeno, la respuesta del anticuerpo dependiente de células T y similares). Además, un entendido en la técnica no habría podido prever que una(s) sustitución(es) de aminoácido específica(s) o una combinación de sustituciones de aminoácidos específicas establecidas aquí en cualquiera de las posiciones ya enunciadas (24, 41 , 54, 55, 56, 64, 65, 70 y/u 85) o cualquier combinación de estas posiciones tendría(n) la capacidad de mejorar la afinidad o avidez de unión de hCTLA-4 a hB7-2, una capacidad mejorada para inhibir la interacción de las células CD28 con las B7-2 positivas, o que proporcionaría una capacidad mayor para suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria que, por ejemplo, el DEC de hCTLA-4 o hCTLA-4-lg.

Proteínas de fusión CTLA-4 mutantes La invención también proporciona proteínas de fusión aisladas o recombinantes novedosas que comprenden un primer polipéptido que es al menos uno de los polipéptidos de la invención que se establecen anteriormente y a lo largo del presente documento (como el polipéptido de CTLA-4 muíante de la invención, como, por ejemplo, un polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante) conectados o fusionados a un segundo polipéptido, que de ese modo forman una proteína de fusión. El segundo polipéptido típicamente facilita la secreción o la expresión del primer polipéptido. Los polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante ejemplares incluyen los que comprenden secuencias identificadas como las SEQ ID NO: 1 a 73. La invención incluye proteínas de fusión que comprenden dominios de inmunoglobulina (Ig), como los dominios de Fe de Ig, fusionadas o adheridas a las porciones biológicas activas de la invención, como los polipéptidos de CTLA-4 mutantes de la invención. Se cree que las proteínas de fusión de la invención son útiles como agentes profilácticos o terapéuticos para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una variedad de enfermedades y trastornos y afecciones del sistema inmunitario en los que resulta beneficiosa la inmunomodulación y/o la inmunosupresión, en ensayos de diagnóstico, y para la preparación de medicamentos o agentes que tienen actividades o propiedades de inmunomodulación y/o inmunosupresoras como se establece más detalladamente en otra parte del presente documento. Las proteínas de fusión de la invención que comprenden un polipéptido de CTLA-4 muíante y un polipéptido de Ig (por ejemplo, Fe de Ig) típicamente se denominan proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes. Cualquiera de las proteínas de fusión de la invención, incluidas las proteínas de fusión monoméricas y diméricas de la invención que se establecen más detalladamente a continuación y en los Ejemplos, puede comprender un polipéptido de Ig, como, por ejemplo, un polipéptido de Fe de Ig, como se establece aquí y se establece anteriormente y a continuación. El segundo polipéptido puede conectarse directamente con el primer polipéptido. Por ejemplo, el extremo amino terminal del segundo polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de Ig, como un polipéptido de Fe de Ig) puede fusionarse de forma covalente directamente al extremo carboxilo terminal del primer polipéptido de la invención (por ejemplo, el polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante). Alternativamente, el segundo polipéptido puede estar conectado indirectamente con el primer polipéptido, como donde se incluye una secuencia conectora de aminoácido que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 residuos de aminoácidos entre el primer y el segundo polipéptido. En los casos en los que se incluye un conector, el extremo amino terminal de la secuencia conectora de aminoácido está típicamente fusionado de forma cpvalente al extremo carboxilo terminal del primer polipéptido (por ejemplo, el DEC de CTLA-4 mutante), y el extremo amino terminal del segundo polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de Ig, como Fe de Ig) está típicamente fusionado de forma covalente al extremo carboxilo terminal de la secuencia conectora de aminoácidos. En algunos casos, el segundo polipéptido comprende al menos una porción de un polipéptido de Ig, como, por ejemplo, uno o más dominios de una región constante de las cadenas pesadas de Ig. El segundo polipéptido puede comprender una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 de un polipéptido de Ig. En algunos casos, el segundo polipéptido comprende un dominio de Fe de un polipéptido de Ig natural (es decir, un polipéptido de Fe de Ig silvestre), como, por ejemplo, un dominio de Fe de un polipéptido de Ig humana natural (es decir, un polipéptido de Fe de Ig humana silvestre). Como se establece en otra parte, el polipéptido de Ig puede ser de varias especies, incluidos, por ejemplo, el mamífero, por ejemplo, el humano, el ratón, los primates no humanos (por ejemplo, el mono, el gorila), el gato, el perro, el caballo, etc., y puede ser de varias clases (por ejemplo, IgG, IgM, IgE, etc.) y subclases (por ejemplo, para IgG incluyen lgG1 , lgG2, lgG4, etc.), y puede comprender un dominio Fe o una porción de cualquiera de estos polipéptidos de Ig. En la técnica se conocen las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de los polipéptidos de Ig de varias de estas especies. En un aspecto, la invención proporciona proteínas de fusión aisladas o recombinantes novedosas que comprenden un polipéptido de CTLA-4 muíante aislado o recombinante de la invención que se establece anteriormente (por ejemplo, un DEC de CTLA-4 mutante) se conecta o fusiona covalentemente, ya sea directa o indirectamente (mediante una secuencia conectora de aminoácidos), en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal del polipéptido de Fe de Ig, es decir, el dominio Fe de un polipéptido de Ig. Cualquiera de las proteínas de fusión de la invención, incluidas las proteínas de fusión CTLA-4-lg monoméheas y diméricas de la invención que se establecen más detalladamente a continuación y en los Ejemplos, pueden comprender un polipéptido de Fe de Ig como se establece aquí y en otras partes anteriormente y a continuación. Un polipéptido de Fe de Ig típicamente comprende la región bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3 del polipéptido de Ig. El polipéptido de Fe de Ig puede derivar de varías especies, incluidos, por ejemplo, el humano, el ratón, el primate, etc., y puede comprender un polipéptido de Fe de Ig natural (por ejemplo, lgG1 , lgG2, o lgG4 silvestres). Los polipéptidos de Fe de IgG humana ejemplares incluyen, por ejemplo, pero sin limitación, lgG1 humana, lgG2 humana, lgG4 humana, etc. La secuencia de polipéptidos de Fe de lgG1 humana ejemplar se expone en la SEQ ID NO: 185. Las secuencias de polipéptido de los polipéptidos de Fe de lgG2 humana ejemplar se exponen en las SEQ ID NO: 184 y 218, respectivamente. Alternativamente, el polipéptido de Fe de Ig puede comprender un polipéptido de Ig muíante. Por ejemplo, puede incluirse en una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante un Fe de lgG1 muíante en el que uno o más residuos de cisteína se susíituyen con oíro aminoácido (por ejemplo, un residuo de serina) y se eliminan por íanto uno o más enlaces disulfuro formados entre dos cadenas de Ig, o en el que uno o más residuos de prolina se susíiluyen con oíro aminoácido (por ejemplo, prolina) para reducir la función de efector (unión del receptor de Fe reducida). Se muesíra en la SÉQ ID NO: 186 la secuencia de polipéptidos de un polipéptido de Fe de lgG1 mutaníe ejemplar. La invención incluye una proíeína de fusión aislada o recombinaníe, como un dímero de CTLA-4-lg muíante o un monómero de CTLA-4-lg mutante, que comprende al menos uno de los polipéptidos de CTLA-4 mutaníe recombinaníe que se eslablecen aníeriormente unidos en su extremo carboxilo terminal al exíremo amino íerminal de un polipépíido de Fe de Ig recombinaníe que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ó 100% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 184 (polipéptido de Fe de lgG2 humana), 185 (polipéptido de Fe de lgG1 humana), 186 (polipéptido de Fe de lgG1 humana), y 218 (polipéptido de Fe de lgG2 sin residuo de lisina (K) en el extremo carboxilo terminal). En un aspecío, la secuencia de polipépíidos de una proíeína de fusión CTLA-4-lg muíanle prevista de la invención comprende los siguientes segmentos: una secuencia de péptido señal que facilita la secreción de la proteína de fusión (por ejemplo, péptido señal de hCTLA-4 (SEQ ID NO: 182 ó 216)); un polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante, el polipéptido del DEC de CTLA-4 típicamente, pero no necesariamente, comprende entre aproximadamente 118 y 130 residuos de aminoácidos, y usualmente, aproximadamente 124 residuos de aminoácidos de longitud; y un polipéptido de Fe de Ig. Los polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes ejemplares incluyen los establecidos anteriormente y los que se establecen a continuación. En algunos casos, no se incluye ninguna secuencia conectora de aminoácidos entre el extremo carboxilo terminal del polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante y el extremo amino terminal del polipéptido de Fe de Ig humana; es decir, el extremo carboxilo terminal de un polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante está covalentemente fusionado en forma directa al extremo amino terminal del polipéptido de Fe de Ig en la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante. Si así se lo desea, sin embargo, un CTLA-4-lg mutante puede incluir un conector (por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos) entre el extremo carboxilo terminal del DEC del polipéptido de CTLA-4 mutante y el extremo amino terminal del polipéptido de Fe de Ig humana. El péptido señal de una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante monomérica de la invención se escinde típicamente del extremo amino terminal de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante durante el proceso y por eso la forma madura o segregada de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante de la invención no suele incluir una secuencia del péptido señal. El dímero de una proteína de fusión que comprende dos de estas proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes típicamente se forma durante el proceso celular mediante la creación de enlaces disulfuro covalentes entre (1 ) residuos de cisteína en un DEC de CTLA-4 mutante y el Fe de lgG2 de una de estas proteínas de fusión monoméricas y (2) los residuos de cisteína en el DEC de CTLA-4 mutante y el Fe de lgG2 de la segunda (típicamente, pero no necesariamente idéntica) proteína de fusión monomérica. La invención incluye proteínas de fusión diméricas (también denominadas proteínas de fusión dímeras) que comprenden dos proteínas de fusión monoméricas de la invención. El dímero puede comprender dos proteínas de fusión monoméricas idénticas o diferentes. La proteina de fusión dimérica está formada por un enlace(s) entre las dos proteínas de fusión monoméricas. Una proteína de fusión dimérica que comprende dos de estas proteínas de fusión monoméricas se forma típicamente durante el proceso celular mediante la generación de enlaces disulfuro covalentes entre los residuos de cisteína en una proteína de fusión monomérica y los residuos de cisteína en la segunda proteína de fusión monomérica. Por eso, en algunos casos, una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante de la invención se expresa como un dímero que comprende dos proteínas de fusión monoméricas de la invención. En un aspecto, la invención proporciona una proteina de fusión CTLA-4-lg mutante dimérica aislada o recombinante que comprende dos proteínas de fusión monoméricas, donde cada proteína de fusión monomérica comprende un polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante de la invención, como se establece en detalle anteriormente y más adelante, que se fusiona en su extremo carboxilo terminal a un polipéptido de Fe de Ig. El dímero se forma durante el proceso celular mediante la generación de enlaces disulfuro covalentes entre los residuos de cisteína en el DEC de CTLA-4 mutante y el Fe de Ig de una proteína de fusión monomérica y los residuos de cisteína en el DEC de CTLA-4 mutante y el Fe de Ig de la segunda proteína de fusión monomérica. Las dos proteínas de fusión monoméricas comprenden, típicamente, pero no necesariamente, secuencias idénticas. La forma segregada o madura de una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante no incluye un péptido señal, ya que el péptido señal se escinde típicamente en el extremo amino terminal de la proteína durante el proceso. La proteína de fusión CTLA-4-lg mutante prevista incluye un péptido señal, cuyo extremo carboxilo terminal se conecta típicamente en forma covalente con el extremo amino terminal de la proteína CTLA-4-lg mutante. El extremo amino terminal de cada monómero de una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante madura comprende típicamente una metionina (M). Como ejemplo no excluyente, la invención proporciona proteínas de fusión diméricas que comprenden dos proteínas de fusión CTLA-4-lg monoméricas, donde cada proteína de fusión CTLA-4-lg mutante monomérica comprende un polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante conectado en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal de un polipéptido de Fe de Ig, donde el polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante comprende una secuencia de polipéptidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 73. En algunas de estas proteínas de fusión diméricas, las dos proteínas de fusión monoméricas están covalentemente conectadas entre sí mediante un enlace disulfuro covalente formado durante el proceso celular entre un residuo de cisteina en la posición 120 en cada secuencia de polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante. Alternativamente, o además, las dos proteínas de fusión monoméricas están covalentemente conectadas entre sí mediante un enlace disulfuro covalente formado entre uno o más residuos de cisteina en el polipéptido de Fe de Ig de la primera proteína de fusión monomérica y uno o más residuos de cisteina en el polipéptido de Fe de Ig de la segunda proteína de fusión monomérica. Las proteínas de fusión monoméricas pueden estar conectadas entre sí mediante múltiples enlaces disulfuro (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, o más enlaces disulfuro) formados durante el proceso celular entre los residuos de cisteina presentes en sus respectivos polipéptidos de Fe de Ig. En algunos casos, cada proteína de fusión monomérica comprende el mismo polipéptido de Fe de Ig (por ejemplo, Fe de lgG2 humana, como se muestra en, por ejemplo, las SEQ ID NO: 184 ó 218), y el/los enlace(s) disulfuro covalentes pueden generarse durante el proceso celular entre los residuos de cisteina en posiciones equivalentes en cada polipéptido de Fe de ig- Un polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante ejemplar es el polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante D3-12 que comprende la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 1 1. Una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante ejemplar de la invención es el polipéptido del DEC de CTLAr4 mutante D3-12 que se conecta o fusiona covalentemente en forma directa (sin conectar) en su extremo carboxilo terminal con el extremo amino terminal del polipéptido de Fe de lgG2 humana que se muestra en la SEQ ID NO: 218, formando así la proteína de fusión D3-12-lgG2 que se muestra en la SEQ ID NO: 205, o se conecta o fusiona covalentemente de forma directa (sin conectar) desde su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal del polipéptido de Fe de lgG2 humana que se muestra en la SEQ ID NO: 184, formando así la proteína de fusión D3-12-lgG2 que se muestra en la SEQ ID NO: 74. La secuencia de la SEQ ID NO: 74 difiere de la de SEQ ID NO: 205 en un residuo - es decir, un residuo de lisina adicional que está presente en el extremo carboxilo terminal de la SEQ ID NO: 74. Experimentalmente, hemos descubierto con el análisis por cromatografía líquida y espectrometría de masas (LCMS), o similares, que una proteína de fusión CTLA-4-lg madura producida en células de CHO mediante la transfección de un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un DEC de CTLA-4 muíante, como, por ejemplo, la secuencia de polipéptidos del DEC de D3-12 que se muestra en la SEQ ID NO: 11 , y el polipéptido de Fe de hlgG2 que se muestra en la SEQ ID NO: 184, típicamente no incluye el residuo de lisina (K) en el extremo carboxilo terminal previsto, como se esperaría a partir de la secuencia de Fe de hlgG2 que se muestra en la SEQ ID NO: 184. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 153 codifica el péptido señal de hCTLA-4 y la proteína de fusión D3-12-lgG2 e incluye el codón de terminación TAA en su extremo carboxilo terminal. El codón AAA, que es el código para un residuo de lisina, precede inmediatamente el codón de terminación TAA en la secuencia de la SEQ ID NO: 153. En la SEQ ID NO: 74 se muestra la secuencia de polipéptidos prevista de una proteína de fusión de D3-12-lgG2 madura producida mediante la transfección de un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 153 en células CHO. El péptido señal está ausente en la forma madura de la proteína de fusión D3-12-lgG2, ya que se escinde durante el proceso de formación de la proteína de fusión madura. Sin embargo, hemos descubierto, basados en los análisis LCMS, que en este caso la D3-12-lgG2 típicamente no incluye el residuo de lisina en el extremo carboxilo terminal previsto, como se esperaría a partir de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 153. En realidad, la secuencia de polipéptidos de la D3-12-lgG2 madura resultante producida con estos procedimientos es la que se muestra en la SEQ ID NO: 205. Se cree que la lisina del extremo carboxilo terminal del polipéptido de Fe de lgG2 se escinde durante el proceso o antes de la secreción. Se cree que la producción de la proteína D3-12-lgG2 usando otra línea de células de mamífero mediante la transfección de este vector que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 153 en estas células de mamífero (por ejemplo, las células COS y similares) produciría u a proteina de fusión D3-12-lgG2 similar que no tiene el residuo de lisina del extremo carboxilo terminal previsto en virtud del proceso análogo o de la maquinaria de secreción.

La proteína de fusión D3-12-lgG2 dimérica comprende estos dos monómeros D3-12-lgG2 conectados entre sí por uno o más enlaces disulfuro formados durante el proceso celular mediante la generación de enlaces disulfuro covalentes entre residuos de cisteína. La D3-12-lgG2 y otras proteínas de fusión de la invención pueden elaborarse, por ejemplo, a través de los procedimientos que se exponen en el Ejemplo 3. Por ejemplo, puede clonarse una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido D3-12 (por ejemplo, la SEQ ID NO: 90) en el vector de fusión de Fe de lgG2, las células de mamífero pueden transfectarse con el vector, y la protema de fusión resultante puede expresarse (típicamente en forma dimérica), purificarse y evaluarse como se describe en el Ejemplo 3. Otro polipéptido del DEC de CTLA-4 muíante ejemplar es el polipéptido del DEC de CTLA-4 muíante D3-54 que comprende la secuencia de polipépíidos de la SEQ ID NO: 36 y una proíeína de fusión CTLA-4-lg muíanle ejemplar que comprende el polipéptido del DEC de CTLA-4 muta íe D3-54 que se conecta o fusiona covalentemenle en forma directa (sin conector) desde su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal del polipéptido de Fe de hlgG2, según se muestra en la SEQ ID NO: 218 (sin la lisina en el extremo carboxilo íerminal), formando así la proíeína de fusión D3-54-lgG2 que se muesíra en la SEQ ID NO: 211 , o que se conecla o fusiona covalenlemeníe en forma direcla (sin conecíor) desde su exíremo carboxilo terminal al extremo amino íerminal del polipépíido de Fe de hlgG2 que se muesíra en la SEQ ID NO: 184 (con la lisina en el extremo carboxilo terminal), formando así la proteína de fusión D3-54-lgG2 que se muestra en la SEQ ID NO: 197. Como se establece anteriormente, el análisis experimental indica que la proteína de fusión D3-54-lgG2 madura producida en las células CHO no incluye típicamente el residuo de lisina en el extremo carboxilo terminal previsto. Se cree que la lisina del extremo carboxilo terminal de Fe de hlgG2 se escinde durante el proceso o antes de la secreción, produciendo la secuencia de la proteína de fusión D3-54-lgG2 que se muestra en la SEQ ID NO: 211. Además, como se menciona anteriormente, se puede elaborar D3-29-lgG2 a través de los procedimientos del Ejemplo 3. La proteína de fusión D3-54-lgG2 dimérica comprende dos monómeros D3-54-lgG2 conectados entre sí por uno o más enlaces disulfuro formados durante el proceso celular mediante la generación de enlaces disulfuro covalentes entre residuos de cisteína. La secuencia del ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 201 codifica las proteínas de fusión que se muestran en las SEQ ID NO: 197 y 211. Otras proteínas de fusión de la invención pueden comprender de manera similar un polipéptido del DEC de CTLA-4 muíante conectado o fusionado a hlgG2 (SEQ ID NO: 218 ó 184). Las proteínas de fusión CTLA-4-lgG2 mutantes ejemplares de la invención incluyen, por ejemplo, las secuencias de polipéptido de cada una de las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222. Cada una de las secuencias de polipéptido de las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 220 y 222 incluyen un residuo de lisina en el extremo carboxilo terminal; este residuo de lisina en el extremo carboxilo terminal típicamente se escinde durante el proceso o antes de la secreción, produciendo las secuencias de polipéptidos sin la lisina en el extremo carboxilo terminal que se muestran en las SEQ ID NO: 205 a 210, 2 1 a 214, 219 y 221 , respectivamente. j La Figura 10 es un diagrama esquemático que muestra una configuración o estructura ejemplar de una proteina de fusión CTLA-4-lgG2 mutante ejemplar de la invención. Esquemáticamente, se muestran dos proteínas de fusión CTLA-4-lgG2 mutantes monoméricas idénticas que comprenden un polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante madura covalentemente conectada en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal de un polipéptido de Fe de lgG2 humana. Cada polipéptido de lgG2 humana incluye una bisagra lgG2 humana, un dominio CH2 y un dominio CH3. También, se muestran los residuos de aminoácidos presentes en las intersecciones entre el polipéptido del DEC y de Fe de Ig. Los residuos ;dé aminoácidos en las intersecciones entre estos componentes pueden diferir ¡en función de la secuencia de polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante y/o de1 la I secuencia del polipéptido de Ig. Esta proteína de fusión CTLA-4-lgG2 mutante dimérica produce una formación de al menos un enlace disulfuro entre los residuos de cisteína en posiciones análogas en los dos monómeros de las i proteínas de fusión CTLA-4-lgG2 mutantes. Se marcan con asteriscos los residuos de cisteína (C) potencialmente implicados en la formación de los enlaces disulfuro entre los dos monómeros. El péptido señal de cada proteina de fusión monomérica se escinde típicamente durante el proceso y, por tanto, la proteína de fusión (madura) segregada no incluye típicamente la secuencia del péptido señal. La secuencia de polipéptidos del polipéptido de lgG2 humana, que comprende la bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3 de la lgG2 humana, se muestra en la SEQ ID NO: 184. En un aspecto alternativo, la secuencia de polipéptidos del polipéptido de lgG2 humana, que comprende la bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3 de la lgG2 humana se muestra en la SEQ ID NO: 128; en este caso, el polipéptido de lgG2 no incluye el residuo de lisina (K) en el extremo carboxilo terminal, según se compara con la secuencia de la SEQ ID NO: 184. Las propiedades de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutaiite de la invención se establecen detalladamente en otra parte en el presente documento y pueden compararse con las propiedades de una o más proteínas de fusión de Ig de referencia, como, por ejemplo, hCTLA-4-lgG1 , hCTLA-4-lgG2, proteína de fusión Orencia® y LEA29Y-lg. Las propiedades que pueden compararse incluyen, por ejemplo, la capacidad para unirse a CD80 y/o CD86 (y/o CD80-lg y/o CD86-lg), y/o la capacidad para inhibir o suprimir una respuesta inmunitaria (por ejemplo, la activación o proliferación de células T, la producción de citocina, etc.). La proteína de fusión hCTLA-4-lgG1 madüra existe típicamente en una solución como un dímero de la proteína de fusión hCTLA-4-lgG1 que comprende dos proteínas hCTLA-4-lgG1 monoméricas idénticas; cada proteína de fusión hCTI_A-4-lgG1 monomérica comprende un polipéptido del DEC de hCTLA-4 (SEQ ID NO: 159) conectado a un polipéptido de Fe de lgG1. La proteína de fusión hCTLA-4-lgG2 madura existe típicamente en una solución como un dímero de la proteína de fusión hCTLA-4-lgG2 que comprende dos proteínas de hCTLA-4-lgG2 monoméricas idénticas; cada proteína de fusión hCTLA-4-lgG2 monomérica (SEQ ID NO: 162) comprende un polipéptido del DEC de hCTLA-4 (SEQ ID NO: 159) que se conecta a un polipéptido de Fe de lgG2. La proteína de fusión Orencia® madura es un dímero de la proteína de fusión que comprende dos proteínas de fusión Orencia® monoméricas; cada proteína de fusión monomérica (SEQ ID NO: 164) comprende un polipéptido del DEC de hCTLA-4 (SEQ ID NO: 159) conectado a un polipéptido de lgG1 mutante específico (SEQ ID NO: 186). La proteína de fusión LEA29Y-lg madura existe típicamente en una solución como un dímero de la proteína de fusión LEA29Y-lg que comprende dos proteínas de fusión LEA29Y-lg monoméricas idénticas, cada proteína de fusión LEA29Y-lg monomérica (SEQ ID NO: 166) comprende un polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante específico (SEQ ID NO: 168) conectado a un polipéptido de lgG1 mutante específico (SEQ ID NO: 186). Se cree que las dos proteínas de fusión monómeras del dímero Orencia® están covalentemente conectadas entre sí mediante un enlace disulfuro único formado entre el residuo de cisteína en la posición 120 de cada monómero de lgG1 de hCTLA-4 mutante y no se forma ningún enlace disulfuro entre los dos polipéptidos de Fe de lgG1 mutante. Algunas proteínas de fusión CTLA-4 mutantes unen a CD80 (por ejemplo, hCD80) y/o CD86 (por ejemplo, hCD86). Algunas de estas proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes se unen a una proteína de fusión CD80-lg y/o una proteína de fusión CD86-lg. Las proteínas de fusión CD80-lg ejemplares incluyen la protema de fusión hCD80-mlg (SEQ ID NO: 225) que comprende un DEC de CD80 humano conectado a un polipéptido de Fe de Ig murina y la proteína de fusión hCD80-hlgG1 (SEQ ID NO: 171) que comprende la secuencia del DEC de hCD80 conectada al polipéptido de Fe de lgG1 humana. Las proteínas de fusión CD86-lg ejemplares incluyen la proteína de fusión hCD86-mlg (SEQ ID NO: 226) que comprende un DEC de hCD86 (SEQ ID NO: 180) conectado a un polipéptido de Fe de Ig murina, y una proteína de fusión hCD86-hlgG1 madura (SEQ ID NO: 178) que comprende la secuencia del DEC de hCD86 (SEQ ID NO: 180) conectada al polipéptido de Fe de lgG1 humana (SEQ ID NO: 185). En las SEQ ID NO: 227 y 228, respectivamente, se muestran las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión hCD86-mlg y hCD80-mlg. En un aspecto, la invención proporciona una proteína de fusión aislada o recombinante que comprende (a) un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 al 73 y (b) un polipéptido de Fe de Ig (por ejemplo, Fe de hlgG2), donde la proteína de fusión se une a CD80 y/o CD86 y/o una proteína de fusión CD80-lg y/o CD86-lg, y/o exhibe una capacidad para inhibir o suprimir una respuesta inmunitaria. El polipéptido de Fe de Ig puede comprender una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo de las SEQ ID NO: 184, 185, 186 y 218. En algunos casos, el extremo carboxilo terminal del polipéptido de (a) está covalentemente conectado al extremo amino terminal del polipéptido de Fe de Ig de (b). Algunas de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutante se unen al CD80 y/o C86 de un mamífero (por ejemplo, hCD80 y/o hCD86) y/o una proteína de fusión CD80-lg y/o CD86-lg. CD80-lg puede comprender, por ejemplo, un DEC de CD80 humano conectado a Fe de Ig (por ejemplo, hCD80-lg). En una realización, una hCD80-lg es un DEC de CD80 humano conectado a Fe de Ig humana (hCD80-hlg); en otra realización, un hCD80-lg es un DEC de CD80 humano conectado a Fe de Ig murina (hCD80-mlg). En otra realización, un hCD86-lg es un DEC de CD86 humano conectado a Fe de Ig humana (hCD86-hlg); en otra realización, un hCD86-lg es un DEC de CD86 humano conectado a Fe de Ig murina (hCD86-mlg). Algunas de estas proteínas de fusión tienen la capacidad de inhibir o suprimir una o más de una variedad de respuestas inmunitarias, como, por ejemplo, la activación de células T, la proliferación de células T, la síntesis o producción de citocina (por ejemplo, la producción de TNF-a, IFN-?, IL-2), la inducción de los marcadores de activación (por ejemplo, CD25, receptor IL-2) o las moléculas inflamatorias, la inflamación, la producción del Ab anticolágeno y/o la(s) respuesta(s) del Ab dependiente de células T en ensayos y/o procedimientos in vitro y/o in vivo. Se espera que estas proteínas de fusión sean beneficiosas en una variedad de aplicaciones, incluidos los procedimientos para el tratamiento de enfermedades y trastornos del sistema inmunitario (por ejemplo, enfermedades autoinmunes), y procedimientos para inhibir el trasplante de órganos, células o injertos de tejido, como se establece a continuación. En otro aspecto, la invención proporciona un dímero de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante aislada o recombinante que comprende dos proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes monomérieas conectadas i mediante al menos un enlace disulfuro formado entre dos residuos de eisteína presentes en cada proteína de fusión CTLA-4-lg mutante monomérica. Cada monómero de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante comprende: (a) un DEC del polipéptido de CTLA-4 mutante que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por la SEQ ID NO: 1 a 73, y (b) un polipéptido de Fe de Ig (por ejemplo, un Fe de hlgG2), donde el dímero de la proteína de fusión se une a CD80 y/o CD86, y/o CD80- Ig y/o CD86-lg, y/o exhibe una capacidad para inhibir o suprimir una respuesta inmunitaria. En algunos casos, el extremo carboxilo terminal del polipéptido de (a) se conecta o fusiona covalentemente al extremo amino terminal del polipéptido de Fe de Ig de (b). El polipéptido de Fe de Ig puede comprender una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 184 al 86 y 218. En algunos casos, el dímero de la proteína de fusión está formado por un enlace disulfuro covalente entre un residuo de cisteína en la posición de aminoácido 120 de cada secuencia del polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante o en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 120 en cada secuencia de polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante con relación a la secuencia de polipéptidos del DEC de hCTLA-4 que se muestra en la SEQ ID NO: 159. Algunos de estos dimeros de las proteínas de fusión tienen la capacidad de inhibir o suprimir una o más de las variadas respuestas inmunitarias, como, por ejemplo, la activación de las células T, la proliferación de las células T, la síntesis o la producción de citocinas (por ejemplo, la producción de TNF-a, IFN-?, IL-2), la inducción de los marcadores de activación (por ejemplo, CD25, receptor IL-2) o moléculas inflamatorias, la inflamación, la producción del Ab anticolágeno, y/o la(s) respuesta(s) del Ab dependiente de células T en ensayos y/o procedimientos in vitro y/o in vivo. Se espera que estos dimeros de las proteínas de fusión sean beneficiosos en una variedad de aplicaciones, incluidos los procedimientos para tratar enfermedades y trastornos del sistema inmunitario (por ejemplo, enfermedades autoinmunes), y los procedimientos para inhibir el trasplante de órganos, células o injertos de tejidos, como se establece a continuación. Algunos de estos monómeros de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutante tienen afinidades de unión a hCD86 o el DEC de hCD86 que son al menos iguales o mayores que las del DEC de hCTLA-4 y LEA29 a hCD86 o DEC de hCD86, respectivamente. Véase, por ejemplo, el cuadro 5 en el Ejemplo 4. El polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante presente en algunas proteínas de fusión diméricas y monoméricas que comprenden una secuencia de polipéptidos que tiene una longitud de aminoácidos aproximadamente igual a la longitud de aminoácidos del DEC de hCTLA-4. Por ejemplo, algunos de los polipéptidos del DEC de CTLA-4 muíante comprenden una secuencia de polipéptidos que es aproximadamente de 110 a 138, 112 a 136, 114 a 134, 116 a 132, 118 a 130, 119 a 129, 120 a 128, 121 a 127, 122 a 126, ó 123 a 125 residuos de aminoácidos de longitud. Algunos de los DEC de los polipéptidos de CTLA-4 mutante comprenden una secuencia de 124 residuos de aminoácidos. Los polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes ejemplares incluyen, por ejemplo, pero sin limitación, los que comprenden una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73, donde este DEC del polipéptido de CTLA-4 mutante se une a CD80 y/o CD86 (o un DEC de cualquiera o ambos), y/o tienen una capacidad para inhibir una respuesta inmunitaria. Algunos de estos dímeros de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes tienen una avidez de unión a hCD86 y/o hCD86-lg que es al menos igual o mayor que la avidez de unión del dímero de la proteína de fusión hCTLA-4-lg (por ejemplo, el dímero de hCTLA-4-lgG2 o hCTLA-4-lgG1), el dímero de Orencia®, y/o el dímero de LEA29Y-lg a hCD86 y/o hCD86-lg, respectivamente. Algunos de estos dímeros de las proteínas de fusión tienen una avidez de unión a hCD86 y/o hCD86-mlg que es de 2 a 10 veces (2x- 10x), de 5 a 10 veces (5x-10x), de 10 a 20 veces (10x-20x), de 20 a 40 veces (20x-40x), o más de 40 veces (>40x) mayor que la avidez de unión del dimero de Orencia® a hCD86 y/o hCD86-mlg. Véase, por ejemplo, las proteínas de fusión diméricas ejemplares de la invención en el cuadro 3 a continuación. Alternativa o adicionalmente, algunos de estos dimeros de las proteínas de fusión tienen una avidez de unión a hCD80 y/o hCD80-lg que es al menos aproximadamente igual o mayor que la avidez de unión del dimero hCTLA-4-Ig (por ejemplo, el dimero hCTLA-4-lgG2 o hCTLA-4-lgG1), el dimero Orencia®, y/o el dimero LEA29Y-lg a hCD80 y CD80-lg, respectivamente. Algunos de estos dimeros de las proteínas de fusión tienen una avidez de unión a hCD80 y/o hCD80-mlg que es de 0.5 a 2 veces (0.5x-2x), de 2 a 4 veces (2x-4x), o más de 2 veces (>2x) mayor que la avidez de unión del dimero de Orencia® por hCD86 y/o hCD86-mlg. Véanse, por ejemplo, las proteínas de fusión diméricas de la invención en el cuadro 4 a continuación. Algunos de estos dimeros de las proteínas de fusión CTL_A-4-lg mutantes se disocian de la unión a hCD86 y/o hCD86-lg a una velocidad inferior a la velocidad de disociación del dimero de hCTLA-4-lg (por ejemplo, un dimero de hCTLA-4-lgG2 o hCTLA-4-lgG1), el dimero de Orencia®, y/o el dimero de LEA29Y-lg de la unión a hCD86 y/o hCD86-lg, respectivamente. Algunas de las proteínas de fusión se asocian o se unen a hCD86 y/o hCD86-Ig a una velocidad que es al menos igual o mayor que la velocidad de asociación de un dimero de hCTLA-4-lg (por ejemplo, un dimero de hCTLA-4-lgG2 o hCTLA-4-lgG1), un dimero de Orencia®, y/o un dimero de LEA29Y-lg a hCD86 y/o hCD86-lg, respectivamente. Para algunos de estos dimeros de las proteínas de fusión, la constante de disociación de equilibrio (KD) para la reacción de unión entre CD86 (o CD86-lg) y el dímero de la proteína de fusión de la invención es menor al equilibrio de la constante de disociación (KD) para la reacción de unión entre CD86 (o CD86-lg) y un dímero de hCTLA-4-lg (por ejemplo, un dímero de hCTLA-4-lgG2 o hCTLA-4-lgG1 ), un dímero de Orencia®, y/o un dímero de LEA29Y-lg. Véanse, por ejemplo, los dimeros de las proteínas de fusión ejemplares de la invención en el cuadro 3. Para algunos de estos dimeros de las proteínas de fusión, la constante de disociación de equilibrio (KD) para la reacción de unión entre CD80 (o CD80-Ig) y el dímero de la proteína de fusión de la invención es aproximadamente igual o menor al equilibrio de la constante de disociación (KQ) para la reacción de unión entre CD80 (o CD80-lg) y un dímero de hCTLA-4-lg (por ejemplo, el dímero de hCTLA-4-lgG2 o hCTI_A-4-lgG1), un dímero de Orencia® o un dímero de LEA29Y-lg. Véanse, por ejemplo, los dimeros de las proteínas de fusión de la invención en el cuadro 4. Algunos de estos dimeros de las proteínas de fusión CTLA-4-lg tienen la capacidad de inhibir o suprimir una respuesta inmunitaria (por ejemplo, inhibir la activación o proliferación de células T, inhibir la producción de citocina, etc.) que es al menos aproximadamente igual o mayor que la capacidad de un dímero de hCTLA-4-lg (por ejemplo, un dímero de hCTLA-4-lgG2 o hCTLA-4-lgG1 ), un dímero de Orencia®, y/o un dímero de LEA29Y-lg para inhibir o suprimir las mencionadas respuestas inmunitarias, respectivamente. Por ejemplo, algunos de estos dimeros de las proteínas dé fusión son capaces de inhibir la activación de las células T o la proliferación de las células T en ensayos in vitro. Los ejemplos 4 al 9 que se exponen a i continuación, por ejemplo, demuestran la capacidad de los dimeros de ías proteínas de fusión representativas de la invención que comprenden una secuencia del polipéptido del DEC de CTLA-4 muíante representativa para inhibir la proliferación de las células T in vitro. Algunos de estos dimeros son capaces de inhibir o suprimir una respuesta inmunitaria en un individuo in vivo, mediante la administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de al menos uno de estos dimeros a un individuo que necesita una terapia inmunosupresora. Se espera que algunos de estos dimeros de las proteínas de fusión sean útiles en una variedad de aplicaciones, incluidos, por ejemplo, pero sin limitación, los procedimientos profilácticos y/o terapéuticps para inhibir o suprimir una respuesta inmunitaria en un individuo que padece una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario en los que se desea ' la inmunosupresión (por ejemplo, las enfermedades autoinmunes) y los procedimientos para inhibir el rechazo por parte de un receptor del trasplante de tejidos, células u órganos de un donante. ¡ Algunos de estos dimeros tienen capacidades variables para modular o suprimir la señalización con CD28, ya que tienen diferentes avideces de unión comparativas a CD80 y CD86. Estos dimeros son útiles en las aplicaciones en las que se desea manipular diferencialmente las respuestas de las células T, incluidos los procedimientos terapéuticos1 y profilácticos para tratar las enfermedades y trastornos del sistema inmunitario, como, por ejemplo, las enfermedades y trastornos de inmunodeficiencia (por ejemplo, AR, EM, soriasis, etc.). En el Ejemplo 4 se muestran las proteínas de fusión diméricas ejemplares que comprenden polipéptidos de la invención que tienen algunas de las avideces de unión de CD80/CD86 diferenciales y las propiedades inmunoinhibidoras que se establecieron anteriormente. Algunos de los dímeros de CTLA-4-lg mutantes tienen la capacidad de suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria que es al menos aproximadamente igual o mayor que la capacidad de la proteína hCTLA-4 o un dímero de hCTLA-4-lg para suprimir o inhibir uno o más clases de respuestas inmunitarías. Por ejemplo, algunos de estos dímeros tienen la capacidad de inhibir la activación o proliferación de las células T en ensayos y/o procedimientos in vitro y/o in vivo, como aquéllos que se establecen anteriormente y a continuación, que es al menos aproximadamente igual o mayor que la capacidad de la proteína hCTLA-4 o un dímero de hCTLA-4-lg (por ejemplo, un dímero de Orencia®, hCTLA-4-lgG2, o un dímero de hCTLA-4-lgG1 ) para inhibir la activación o la proliferación de células T en estos procedimientos. Además, algunos de estos dímeros tienen la capacidad de inhibir o suprimir una respuesta inmunitaria (por ejemplo, la activación o proliferación de células T, la producción de citocinas, la respuesta del anticuerpo dependiente de células T) en mayor medida que la capacidad de un dímero de LEA29Y-lg para inhibir o suprimir una respuesta inmunitaria. Los ejemplos 4 al 9, por ejemplo, comparan la capacidad de las proteínas de fusión diméricas representativas de la invención que comprenden una secuencia de polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante de la invención que inhibe la proliferación de las células T in vitro con relación a la capacidad de las hCTLA-4-lgG2, Orencia® y LEA29Y-lg diméricas para inhibir la proliferación de las células T in vitro. Véanse, por ejemplo, los cuadros 6 a 9 a continuación. Algunos de estos dimeros tienen tanto la capacidad de unirse a hCD80 y/o hCD86 (o hCD80-lg y/o hCD86-lg) como la capacidad para inhibir o suprimir una respuesta inmunitaria en los ensayos y/o procedimientos in vitro y/o in vivo, como los que se establecen anteriormente y los que se establecen más detalladamente a continuación (por ejemplo, un procedimiento in vivo en el que se administra una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de al menos uno de estos dimeros). Algunos de estos dimeros tienen una avidez de unión a hCD80 y/o hCD86 (o hCD80-lg y/o hCD86-lg) que es al menos aproximadamente igual o mayor que la avidez de unión de la proteina hCTLA-4, una hCTLA-4-lg dimérica (por ejemplo, hCTLA-4-lgG2, Orencia®) o una LEA29Y-lg dimérica a hCD80 y/o hCD86 (o hCD80-lg y/o hCD86-lg), respectivamente, y una capacidad para inhibir una respuesta inmunitaria que al menos es igual o mayor que la capacidad de la proteína hCTLA-4, hCTLA-4-lg dimérica (por ejemplo, hCTLA-4-lgG2, Orencia®) o LEA29Y-lg dimérica para inhibir una respuesta inmunitaria. Se espera que estos dimeros de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes sean útiles en una variedad de aplicaciones, incluidos, por ejemplo, los procedimientos profilácticos y/o terapéuticos para tratar enfermedades, trastornos, y afecciones del sistema inmunitario, como se establece más detalladamente más adelante. En otro aspecto, la invención proporciona un dímero de la proteína de fusión aislado o recombinante (por ejemplo, un dímero de la proteína de fusión CTLA-4-lg muíante) que comprende dos proteínas dé fusión monoméricas idénticas (por ejemplo, dos proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes monoméricas), donde cada proteína de fusión monomérica comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5% ó 100% con una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 74 al 79, 197 al 200, 205 al 214 y 219 al 222, donde el dímero se une a CD80 y/o CD86 (y/o un CD80-lg y/o CD86-lg, como hCD80-mlg y/o hCD86-mlg, respectivamente), y/o tiene la capacidad para inhibir una respuesta inmunitaria, incluidas las que se establecen anteriormente y a continuación. Cada una de las secuencias de polipéptido que se exponen en las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222 es un DEC de CTLA-4 mutante maduro fusionado en su extremo carboxilo terminal al extremo aminó terminal de un polipéptido de Fe de lgG2, y cada secuencia puede denominarse proteína de fusión CTLA-4-lg. La secuencia de polipéptidos de cada una de las SEQ ID NO: 74 al 79, 197 al 200, 220 y 222 es idéntica a las SEQ ID NO: 205 al 214, 219, y 221, excepto que cada una de las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 220 y 222 incluye una lisina en el extremo carboxilo terminal.

En otro aspecto, la invención proporciona un monómero de la proteina de fusión aislado o recombinante que comprende una secuencia de polipéptidos que comprende una identidad de al menos 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99% 99.5% ó 100% con una secuencia de polipéptidos que comprende los residuos de aminoácidos 1 al 351 de cualquiera de las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222, donde la proteína de fusión se une a CD80 y/o CD86 (y/o un CD80-lg y/o CD86-lg, como hCD80-mlg y/o hCD86-mlg, respectivamente), y/o tiene la capacidad de inhibir una respuesta inmunitaria, incluidas las que se establecen anteriormente y a continuación. En otro aspecto, la invención proporciona un dímero de la proteína de fusión aislado o recombinante que comprende dos proteínas de fusión monoméricas idénticas, donde cada proteína de fusión monomérica comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia de polipéptidos que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 351 de cualquiera de las SEQ ID NO: 74 al 79, 197 al 200, 205 al 214, y 219 al 222, donde el mencionado dímero de la proteína de fusión se une a CD80 y/o CD86 (y/o un CD80-lg y/o CD86-lg, como hCD80-mlg y/o hCD86-m|g, respectivamente) y tiene la capacidad de inhibir una respuesta inmunitaria, incluidas las que se establecen anteriormente y a continuación. También, se proporciona una proteína de fusión CTLA-4-lg muíante monomérica que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con la secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 205 a 214, y 219 a 222, donde la mencionada proteina de fusión monomérica se une a CD80 y/o CD86 (y/o un CD80-lg y/o CD86-lg, como hCD80-mlg y/o hCD86-mlg, respectivamente), y/o tiene la capacidad de inhibir una respuesta inmunitaria.

Algunos de estos dímeros y monómeros de las proteínas de fusión tieneni la capacidad de inhibir o suprimir una o más respuesta inmunitarias, incluidas, j por ejemplo, la activación o proliferación de células T, la síntesis o producción de citocinas (por ejemplo, la producción de TNF-a, IFN-?, IL-2), la inducción de los marcadores de activación (por ejemplo, CD25, receptor IL-2), la inflamación, la producción del Ab anticolágeno, y/o la(s) respuesta(s) del Áb dependiente de células T) en ensayos y/o procedimientos in vitro y/o in vivo (por ejemplo, in vivo en un individuo que padece una enfermedad, trastorno, o afección en los que la terapia inmunosupresora sería beneficiosa y a quien se le administra una cantidad terapéuticamente efectiva de esta proteína de fusión dimérica como se establece más detalladamente a continuación). Se espera que estos monómeros y dímeros de la proteína de fusión sean útilés en una variedad de aplicaciones, incluidos los procedimientos terapéuticos y profilácticos para tratar enfermedades del sistema inmunitario, incluidos los establecidos a continuación.

En otro aspecto, la invención proporciona un dímero de la proteína de fusión aislado o recombinante (por ejemplo, un dímero de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante) que comprende dos proteínas de fusión monoméricas (por ejemplo, una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante monomérica) donde la proteina de fusión monomérica comprende: (1 ) un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido del dominio extracelular de CTLA-4 mutante) que comprende una secuencia de polipéptidos que difiere de la secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73 en no más de 6 residuos de aminoácidos (por ejemplo, no más de 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 residuos de aminoácidos), y donde el residuo de aminoácido en la secuencia de polipéptidos en la posición 41 , 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 u 85 es idéntico al residuo de aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia de polipéptidos seleccionada (por ejemplo, un polipéptido seleccionado de las SEQ ID NO: 1 al 73), y (2) un polipéptido de Fe de Ig (por ejemplo, un Fe de lgG2), donde el dímero de la proteína de fusión se une a CD80 y/o CD86 (y/o CD80-lg y/o CD86-lg), y/o inhibe una respuesta inmunitaria (por ejemplo, la activación o proliferación de células T, la producción de citocinas, la inducción de los marcadores de activación o moléculas inflamatorias, la producción del Ab anticolágeno y/o las respuestas del Ab dependiente de células T) en ensayos y/o procedimientos in vitro y/o in vivo como se establece detalladamente a continuación. La invención también incluye una proteina de fusión monomérica aislada o recombinante según se establece anteriormente que se une a CD80 y/o CD86 (y/o CD80-lg y/o CD86-Ig) y/o induce una respuesta inmunitaria in vitro o in vivo. En el dímero de la proteína de fusión, las dos proteínas de fusión monoméricas (por ejemplo, un monómero de CTLA-4-lg mutante) están opcionalmente conectadas entre sí de forma covalente mediante uno o más enlaces disulfuro por medio de los residuos de cisteína en cada monómero y los dos monómeros son típicamente idénticos entre sí. En algunos casos, el polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante en este dímero o monómero de la proteína de fusión difiere del polipéptido seleccionado (por ejemplo, el seleccionado de las SEQ ID NO: 1 al 73) en no más de 6 residuos de aminoácidos, pero el aminoácido que ocupa la posición 41 , 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 u 85 es idéntico al residuo de aminoácido que se incluye en esa posición en la secuencia de polipéptidos seleccionada; es decir, un residuo de aminoácido en esa posición no puede eliminarse ni sustituirse. Algunos de estos polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante en esta proteína de fusión comprenden una secuencia de polipéptidos que difiere de la secuencia de polipéptidos seleccionada en no más de 6 residuos de aminoácidos y que incluye residuos de aminoácidos en las posiciones 24, 30, 32, 41 , 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70, 85, 104 y 106 que son idénticos a los residuos de aminoácidos en las posiciones correspondientes en la secuencia de polipéptidos seleccionada. Este polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante puede diferir de la secuencia de polipéptidos seleccionada por la(s) eliminación(es), adición(es), y/o sustitución(es) de aminoácidos. Una sustitución de aminoácido puede ser una sustitución conservadora o no conservadora. Véase, por ejemplo, la sección "Variación de secuencias". Algunas de estas proteínas de fusión diméricas tienen una avidez de unión a hCD86 o hCD86-lg que es al menos aproximadamente igual o mayor que la avidez de unión de hCTLA-4, hCTLA-4-lg dimérica, LEA29Y-lg dimérica, o la proteína Orencia® a hCD86 o hCD86-lg, respectivamente. Algunas de estas proteínas de fusión monoméricas presentan una afinidad o avidez de unión a hCD86, hCD86-lg, o el DEC de hCD86 que es al menos aproximadamente igual o mayor que la afinidad o avidez de unión del hCTLA-4 monomérico, hCTLA-4-lg monomérica, LEA29Y monomérico a hCD86, hCD86-lg, o el DEC de hCD86, respectivamente. Indistinta o adicionalmente, algunas de estas proteínas de fusión diméricas tienen una avidez de unión a hCD80 o hCD80-lg que es al menos aproximadamente igual o mayor que la avidez de hCTLA-4 o hCTLA-4-lg a hCD80, respectivamente. Alternativa o adicionalmente, algunas de estas proteínas de fusión monoméricas presentan una afinidad o avidez de unión a hCD80, hCD80-lg, o el DEC de hCD80 que es al menos aproximadamente igual o mayor que la afinidad o avidez de unión del hCTLA-4 monomérico o hCTLA-4-lg monomérica a hCD80, hCD80-lg, o el DEC de hCD80, respectivamente. En algunos casos, el polipéptido del DEC de CTLA-4 muíante en este dimero o monómero de la proleína de fusión comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una longitud aproximadamente igual a la longitud del aminoácido del DEC de hCTLA-4, por ejemplo, desde aproximadamente 118 a 130, 119 a 129, 120 a 128, 121 a 127, 122 a 126, 123 a 125 ó 124 residuos de aminoácidos de longitud. El extremo amino terminal del polipéptido de Fe de Ig (por ejemplo, el Fe de lgG2, el Fe de lgG1 , el Fe de lgG4, o el Fe de IgG muíaníe que reduce la función efectora o la unión del receptor Fe) puede conectarse o fusionarse covalentemente de forma directa o indirecta (mediante un conector que comprenda, por ejemplo, de 1 a 10 residuos de aminoácidos) al extremo carboxilo terminal del polipéptido del DEC de CTLA-4 muíante. El polipéptido de Fe de Ig puede comprender una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con la secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 184 a 186 y 218, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: 184, 185, 186, y 218. Algunos de estos dímeros y monómeros de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes son capaces de suprimir una o más de una variedad de respuestas inmunitarias, incluidas, por ejemplo, la activación de las células T, la proliferación de las células T, la síntesis o la producción de citocinas (por ejemplo, la producción de TNF-a, IFN-?, IL-2), la inducción de los marcadores de activación (por ejemplo, CD25, receptor IL-2) o las moléculas inflamatorias, la inflamación, la producción del Ab anticolágeno, y/o la(s) respuesta(s) del Ab dependiente de células T. Algunos de estos dímeros CTLA-4-lg mutantes tienen una capacidad mayor para inhibir una o más de estas respuestas inmunitarias que hCTl_A-4, hCTLA-4-lg dimérica, o LEA29Y-Ig dimérica. Los ejemplos 4 al 9, por ejemplo, proporcionan datos que comparan la capacidad de las proteínas de fusión diméricas representativas de la invención que comprenden un polipéptido del DEC de CTLA-4 muíante de la invención para inhibir la proliferación de las célula T in vitro con relación a la capacidad a estos efectos de una hCTLA-4-lg dimérica o una LEA29Y-lg dimérica. Algunos de estos monómeros de CTLA-4-lg muíante tienen una capacidad mayor para inhibir una o más de estas respuestas inmunitarias que el hCTLA-4 monomérico, hCTLA-4-lg monomérica, o LEA29Y-lg monomérica. Algunos de estos monómeros y dimeros son capaces de inhibir o suprimir una respuesta inmunitaria en un individuo in vivo, mediante la administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de al menos uno de estos polipéptidos a un individuo que necesita terapia inmunosupresora. Se espera que estas proteínas de fusión sean beneficiosas en una variedad de aplicaciones, incluidos los procedimientos para tratar una enfermedad, trastorno, o afección en los que la terapia inmunosupresora resultaría beneficiosa, como los procedimientos profilácticos y/o terapéuticos para tratar enfermedades y trastornos autoinmunes, y procedimientos para inhibir el trasplante de órganos, células o injertos de tejidos. En otro aspecto, la invención proporciona un dímero de la proteína aislada o recombinante (por ejemplo, un dímero de la proteína de fusión CTLA-4-lg muíante) que comprende dos proteínas de fusión monoméricas (por ejemplo, dos proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes monoméricas), donde la proteína de fusión monomérica comprende: (1) un polipéptido del dominio exíracelular (DEC) de CTLA-4 mutante que comprende una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 al 73 en no más de 6 residuos de aminoácidos (por ejemplo, no más de 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 residuos de aminoácidos), y (b) comprende al menos una sustitución del aminoácido en una posición del aminoácido correspondiente a la posición 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 u 85 con relación a la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 159; y (2) un polipéptido de Fe de Ig, donde el dímero de la proteína de fusión se une a CD80 y/o CD86 (y/o CD80-lg y/o CD86-lg), y/o inhibe una respuesta inmunitaria (por ejemplo, la activación de células T, la proliferación de células T, la síntesis o la producción de citocinas, la inducción de los marcadores de activación, la producción del Ab anticolágeno, y/o la respuesta del Ab dependiente de células T, etc.) en ensayos y/o procedimientos in vivo y/o in vitro, como se establece más detalladamente a continuación. La invención también incluye una proteína de fusión monomérica aislada o recombinante, como se establece anteriormente, que se une a CD80 y/o CD86 (y/o CD80-lg y/o CD86-lg) y/o induce una respuesta inmunitaria in vitro o in vivo. En algunos casos, CD80 es hCD80 y CD86 es hCD86. En el dímero de la proteína de fusión, las dos proteínas de fusión monoméricas (por ejemplo, el monómero de CTLA-4-lg mutante) están conectadas entre sí covalentemente mediante uno o más enlaces disulfuro por medio de residuos de cisteína en cada monómero y los dos monómeros son típicamente idénticos entre si. El extremo amino terminal del polipéptido de Fe de Ig (por ejemplo, Fe de lgG2, el Fe de lgG1 , el Fe de lgG4, o el Fe de IgG mutante que reduce la función efectora o la unión del receptor Fe) puede conectarse o fusionarse covalentemente de forma directa o indirecta (mediante un conector que comprende, por ejemplo, de 1 a 10 residuos de aminoácidos) al extremo carboxilo terminal del polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante. El polipéptido de Fe de Ig puede comprender una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 184 a 186 y 218. Algunos de estos dímeros o monómeros de las proteínas de fusión comprenden un polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una longitud aproximadamente igual a la longitud de los aminoácidos del DEC de hCTLA-4, por ejemplo, de 118 a 130, 119 a 129, 120 a 128, 121 a 127, 122 a 126 ó 123 a 125 residuos de aminoácidos de longitud. Algunos de estos polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante en este dímero o monómero de la proteína de fusión comprende una secuencia de polipéptidos que es de 124 residuos de aminoácidos de longitud. Algunos de estos polipéptidos del DEC de CTLA-4 comprenden 2, 3, 4, 5 ó 6 sustituciones de aminoácidos en las posiciones relacionadas con la secuencia que se expone en la SEQ ID NO: 159 seleccionadas del grupo compuesto por las posiciones 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 y 85. Algunos de estos polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante comprenden además una sustitución de aminoácido en una posición correspondiente a la posición 104 y/o 30 con relación a la SEQ ID NO: 159. Algunos de estos polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante comprenden al menos una sustitución de aminoácido con relación a la SEQ ID NO: 159 en la posición 70 (opcionalmente S70F), la posición 64 (opcionalmente S64P), la posición 50 (opcionalmente A50M), la posición 54 (opcionalmente M54K/V, por ejemplo, M54K), la posición 65 (opcionalmente I65S), la posición 56 (opcionalmente N56D), la posición 55 (opcionalmente G55E), la posición 85 (opcionalmente M85A), y/o la posición 24 (opcionalmente A24E/S, por ejemplo, A24E). Cualquiera de estos polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante puede comprender además una sustitución de aminoácido con relación a la SEQ ID NO: 159 en la posición 104 (opcionalmente L104E/D, por ejemplo, L104E), la posición 30 (opcionalmente T30N/D/A, por ejemplo, T30N, T30D, o T30A), y/o la posición 32 (opcionalmente V32I). Algunos de estos polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante comprenden al menos una sustitución en la posición de aminoácido con relación a la SEQ ID NO: 159 seleccionada del grupo compuesto por A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S, y S70F. Algunos de estos polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante comprenden 2, 3, 4, 5 ó 6 sustituciones en las posiciones de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 159 seleccionadas del grupo compuesto por A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S y S70F. Algunos de los dímeros de CTLA-4-lg mutante exhiben una avidez de unión a CD86 (por ejemplo, hCD86) o CD86-lg dimérica (por ejemplo, hCD86-lg) que es aproximadamente igual o mayor que la avidez de unión de la proteína hCTLA-4, de la hCTLA-4-lg dimérica (por ejemplo, CTLA-4-lgG1 o CTLA-4-lgG2), la proteína Orencia®, o LEA29Y-lg dimérica a CD86 o CD86-lg dimérica, respectivamente. Algunos de estos dímeros tienen una avidez de unión a CD80 (por ejemplo, hCD80) o CD80-lg dimérica (por ejemplo, hCD80-lg) que es mayor que la avidez de unión de hCTLA-4, un hCTLA-4-lg dimérico, la proteína Orencia®, y/o LEA29Y-lg dimérica a CD80 o CD80-lg dimérica, respectivamente. Algunos de estos monómeros de CTLA-4-lg muíante exhiben una afinidad o avidez de unión a CD86 (por ejemplo, hCD86) o CD86-lg (por ejemplo, hCD86-lg) que es aproximadamente igual o mayor que la afinidad o avidez de unión de hCTLA-4 monomérico, hCTLA-4-lg monomérica, o LEA29Y-lg monomérica a CD86 o CD86-lg, respectivamente. Algunos de estos monómeros presentan una afinidad o avidez de unión a CD80 (por ejemplo, hCD80) o CD80-lg (por ejemplo, hCD80-lg) que es mayor que la afinidad o avidez de unión de hCTLA-4 monomérico o hCTLA-4-lg monomérica (por ejemplo, CTLA-4-lgG1 o CTLA-4-lgG2) a CD80 o CD80-lg dimérica, respectivamente. Algunos de estos dímeros y monómeros de CTLA-4-lg tienen la capacidad de suprimir o inhibir una o más respuestas inmunitarias, incluidas las que se establecen anteriormente y a lo largo de este documento (por ejemplo, la activación o la proliferación de células T, la producción de citocina, la inducción de los marcadores de activación, la inflamación, la producción del anticuerpo anticolágeno, y/o las respuestas de anticuerpos dependientes de células T), en ensayos y/o procedimientos in vivo y/o in vitro (por ejemplo, in vivo en un individuo que padece una enfermedad, trastorno o afección en los que la terapia inmunosupresora resultaría beneficiosa y a quien se le administra una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un dímero de CTLA-4-lg mutante). Algunos de estos dímeros de CTLA-4-lg mutante inhiben una o más respuestas inmunitarias en mayor medida que hCTLA-4, hCTLA-4- I Ig (por ejemplo, CTI_A-4-lgG1 dimérica o CTLA-4-lgG2 dimérica), la proteína Orencia®, y/o la LEA29Y-lg dimérica. Algunos de estos monómeros de CTLA- 4-lg mutante inhiben una o más de estas respuestas inmunitarias en mayor medida que hCTLA-4 monomérico, hCTLA-4-lg monomérica y/o LEA29Yflg monomérica. Se espera que estos dímeros y monómeros de CTLA-4 lg i mutante sean beneficiosos en una variedad de aplicaciones, incluidos los procedimientos para tratar enfermedades y trastornos autoinmunes, y los procedimientos para inhibir el rechazo al trasplante de órganos, células o injertos de tejido.

En otro aspecto, la invención proporciona un dímero de j la I proteína de fusión aislada o recombinante (por ejemplo, un dímero de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante) que comprende dos proteínas de fusión monoméricas (por ejemplo, la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante i monomérica), donde cada proteína de fusión monomérica comprende: (1) un polipéptido (por ejemplo, un dominio extracelular de CTLA-4 mutante) que i comprende una secuencia de polipéptidos que (i) tiene una identidad de I secuencia de al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con uha secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ¡ID NO: 1 al 73 y (ii) incluye un residuo de fenílalanina en una posición ele i aminoácido correspondiente a la posición 70 de dicha secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 al 73; y (2) un polipéptido de Fe de Ig (por ejemplo, el Fe de lgG2, el Fe de lgG1 , el Fe de lgG4, o el Fe de IgG mutante que reduce la función efectora o la unión del receptor Fe), donde el dímero de la proteína de fusión se une a CD80 (por ejemplo, hCD80) y/o CD86 (por ejemplo, hCD86) (y/o CD80-lg por ejemplo, hCD80-lg, y/o CD86-lg, por ejemplo, hCD86-lg), y/o tiene la capacidad de inhibir una respuesta inmunitaria in vitro o in vivo. La invención también incluye una proteína de fusión monomérica aislada o recombinante, según se establece anteriormente, que se une a CD80 (por ejemplo, hCD80) y/o CD86 (por ejemplo, hCD86) (y/o CD80-lg, por ejemplo, hCD80-lg, y/o CD86-lg, por ejemplo, hCD86-lg) y/o induce una respuesta inmunitaria in vitro o in vivo. En algunos casos, el polipéptido de Fe de Ig comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ó 100% con una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 184 a 186 y 218. El extremo amino terminal del polipéptido de Fe de Ig puede conectarse o fusionarse covalentemente en forma directa o indirecta (mediante un conector que comprenda, por ejemplo, de 1 a 10 aminoácidos) al extremo carboxilo terminal del polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante. En algunos de estos dímeros o monómeros de CTLA-4-lg mutante, el polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante comprende uno o más de los siguientes, con relación a dicha secuencia de polipéptidos seleccionada: un residuo de ácido glutámico en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 24; un residuo de asparagina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 30; un residuo de isoleucina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 32; un residuo de metionina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 50; un residuo de lisina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 54; un residuo de ácido glutámico en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 55; un residuo de ácido aspártico en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 56; un residuo de prolina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 64; un residuo de serina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 65; y un residuo de ácido glutámico en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 104. Por ejemplo, algunos de estos polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante en estos dimeros o monómeros de CTLA-4-lg mutantes comprenden una secuencia de polipéptidos que comprende (i) una identidad de secuencia de al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 24 y (ii) un residuo de fenilalanina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 70 de la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 24, donde el dimero de la proteína de fusión se une a hCD80 y/o hCD86 (y/o hCD80-lg y/o hCD86-lg), y/o inhibe una respuesta inmunitaria en ensayos y/o procedimientos in vitro y/o in vivo. Algunos de estos polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante en estos dimeros o monómeros de CTLA-4-lg mutantes comprenden uno o más de los siguientes con relación a la SEQ ID NO: 24: un residuo de ácido glutámico en la posición 24; un residuo de asparagina en la posición 30; un residuo de isoleucina en la posición 32; un residuo de metionina en la posición 50; un residuo de lisina en la posición 54; un residuo de ácido glutámico en la posición 55; un residuo de ácido aspártico en la posición 56; un residuo de prolina en la posición 64; un residuo de serina en la posición 65 y un residuo de ácido glutámico en la posición 104. Algunos de estos dímeros de CTLA-4-lg mutantes exhiben una avidez de unión a CD86 (por ejemplo, hCD86) o a CD86-lg dimérica (por ejemplo, hCD86-lg) que es aproximadamente igual o mayor que la avidez de unión de hCTLA-4, hCTLA-4-lg dimérica, la proteína Orencia®, o LEA29Y-lg a CD86 o CD86-lg dimérica, respectivamente. Algunos de estos dímeros presentan una avidez de unión a CD80 (por ejemplo, hCD80) o CD80-lg dimérica (por ejemplo, hCD80-lg) que es mayor que la avidez de unión de hCTLA-4, un hCTLA-lg dimérica, o la proteina Orencia® a CD80 o CD80-lg, respectivamente. Algunos de estos monómeros de CTLA-4-lg mutante presentan una afinidad o avidez de unión a CD86 (por ejemplo, hCD86) o CD86-lg (por ejemplo, hCD86-lg) que es aproximadamente igual o superior a la afinidad o avidez de una hCTLA-4 monomérica, hCTLA-4-lg monomérica, y/o LEA29Y-lg monomérica a CD86 o CD86-lg, respectivamente. Algunos de estos monómeros presentan una afinidad o avidez de unión a CD80 (por ejemplo, hCD80) o CD80-lg (por ejemplo, hCD80-lg) que es mayor que la afinidad de unión o avidez de una hCTLA-4 monomérica o hCTLA-4-lg monomérica a un CD80 o CD80-lg dimérica, respectivamente.

Algunos de estos dímeros y monómeros de CTLA-4 mutante tienen una capacidad para suprimir o inhibir una o más respuestas inmunitarias (por ejemplo, la activación o la proliferación de células T, la producción de citocina, la inducción de los marcadores de activación, la inflamación, la producción de Ab anticolágeno, las respuestas del Ab dependiente de las células T), en ensayos y/o procedimientos in vitro y/o in vivo (por ejemplo, in vivo en un individuo que padece una enfermedad, trastorno o afección del sistema inmunitario en que la terapia inmunosupresora seria beneficiosa y a quien se le administra una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos uno de estos dímeros de CTLA-4-lg). Algunos de estos dímeros de CTLA-4-lg mutante tienen una capacidad para suprimir o inhibir una o más respuestas inmunitarias en mayor medida que hCTLA-4, una hCTLA-4-lg dimérica (por ejemplo, CTLA-4-lgG1 o CTLA-4-lgG2 diméricas), la proteína Orencia® y/o LEA29Y-lg dimérica. Algunos de estos monómeros de CTLA-4-lg mutantes tienen una capacidad para suprimir o inhibir una o más de estas respuestas inmunitarias en mayor medida qüe hCTLA-4 monomérica, hCTLA-4-lg monomérica y/o LEA29Y-lg monomérica. Se espera que estos dímeros y monómeros de CTLA-4-lg mutantes sean beneficiosos en una variedad de procedimientos terapéuticos y/o profilácticos para tratar enfermedades o trastornos en los que el tratamiento inmunosupresor resultaría beneficioso, inclusive, por ejemplo, los procedimientos para tratar enfermedades autoinmunes y los procedimientos para inhibir el rechazo del trasplante de órganos, células, o injertos de tejido.

En otro aspecto aún, la invención proporciona un dímero de la proteína de fusión aislado o recombinante (por ejemplo, un dímero de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante) que comprende dos proteínas de fusión monoméricas (por ejemplo, las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes monoméricas, donde cada proteína de fusión comprende: (1) un polipéptido (por ejemplo, el dominio extracelular de CTLA-4 mutante) que comprende una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de la secuencia de polipéptidos del polipéptido del dominio extracelular de CTLA-4 humano que se muestra en la SEQ ID NO: 159 en no más de 6 residuos de aminoácidos, y (b) comprende al menos una sustitución del aminoácidos, donde dicha sustitución de aminoácido única comprende S70F, donde las posiciones del residuo de aminoácido están numeradas de conformidad con la SEQ ID NO: 159; y (2) uh polipéptido de Fe de IgG (por ejemplo, el Fe de lgG2, el Fe de lgG1 , el Fe de lgG4, o un Fe de Ig mutante que reduce la función efectora o la unión del receptor de Fe), donde dicho dímero se une a hCD80 y/o hCD86 (y/o hCD80-Ig y/o hCD86-lg), y/o inhibe una respuesta inmunitaria (por ejemplo, la activación o la proliferación de células T, la producción de citocina, la inducción de los marcadores de activación, la inflamación, la producción del anticuerpo anticolágeno, la respuesta del anticuerpo dependiente de células T, etc.) en los ensayos y/o procedimientos in vitro y/o in vivo como se establece j detalladamente más adelante. La invención también incluye una proteína de fusión monómerica aislada o recombinante como se establece más arriba que se une a CD80 (por ejemplo, hCD80) y/o CD86 (por ejemplo, hCD86) (y/o CD80-lg, por ejemplo, hCD80-lg, y/o CD86-lg, por ejemplo, hCD86-lg) y/o induce una respuesta inmunitaria ¡n vitro o in vivo. El polipéptido de Fe de Ig puede comprender una secuencia que tiene una identidad de al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con la secuencia de polipéptido seleccionada de un grupo compuesto por las SEQ ID NO: 184 a 186 y 218. El extremo amino terminal del polipéptido de Fe de Ig puede conectarse o fusionarse covalentemente de forma directa o indirecta (mediante un conector que comprende por ejemplo, de 1 a 10 aminoácidos) al extremo carboxilo terminal del polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante. En algunos de estos dimeros o monómeros de CTLA-4-lg mutante, el polipéptido del DEC de CTLA-4 comprende además al menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo compuesto por A24E, T30N, V32I, D41 G, A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S, M85A, L104E e I106F. En algunos de estos dimeros o monómeros de CTLA-4-lg, el polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante comprende además la sustitución de L104E y/o dos, tres o cuatro sustituciones adicionales seleccionadas del grupo de las sustituciones: T30N, V32I, A50M, M54K, G55E, N56D, S64P e I65S. Algunos de estos dimeros presentan una avidez de unión a CD86 (por ejemplo, hCD86) o CD86-lg (por ejemplo, hCD86-lg) que es aproximadamente igual o mayor que la avidez de unión de hCTLA-4, hCTLA-4-lg dimérica, y/o la proteína Orencia® a CD86 o CD86-lg dimérica, respectivamente. Algunos de estos dimeros presentan una avidez de unión a CD80 (por ejemplo, hCD80) o CD80-lg dimérica (por ejemplo, hCD80-lg) que es mayor que la avidez de unión de hCTLA-4, una hCTLA-4-lg dimérica y/u Orencia® a CD80 o CD80-lg dimérica, respectivamente. Algunos de estos monómeros exhiben una afinidad o avidez de unión a CD86 (por ejemplo, hCD86) o CD86-lg (por ejemplo, hCD86-lg) que es aproximadamente igual o mayor que la afinidad o avidez de unión de la hCTLA-4 monomérico, hCTLA-Ig monomérica, o LEA29Y-lg monomérica a CD86 o CD86-lg, respectivamente. Algunos de estos monómeros presentan una afinidad o avidez de unión a CD80 (por ejemplo, hCD80) o CD80-lg (por ejemplo, hCD80-lg) que es mayor que la afinidad o avidez de unión de hCTLA-4 monomérico o hCTLA-4-lg monomérico a CD80 o CD80-lg dimérica, respectivamente. Algunos de estos dímeros y monómeros de CTLA-4-lg mutante tienen una capacidad para suprimir o inhibir una o más respuestas inmunitarias (por ejemplo, la activación o la proliferación de células T, la producción de citocina, la inducción de los marcadores de activación, la inflamación, la producción del anticuerpo anticolágeno, la respuesta del anticuerpo dependiente de células T, etc.) en los ensayos y/o procedimientos in vitro y/o in vivo (por ejemplo, in vivo en un individuo que padece una enfermedad, trastorno o afección en los que la terapia inmunosupresora sería beneficiosa y a quien se le administra una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos uno de estos dímeros de CTLA-4-lg). Algunos de estos dímeros tienen la capacidad de suprimir o inhibir una o más de estas respuestas inmunitarias en mayor medida que hCTLA-4, una hCTLA-4-lg dimérica (por ejemplo, CTLA-4-lgG1 o CTLA-4-lgG2), la proteína Orencia®, y/o LEA29Y-lg dímérica. Algunos de estos monómeros tienen la capacidad de suprimir o inhibir una o más de estas respuestas inmunitarias en mayor medida que hCTLA-4 monomérica, hCTLA-4-lg monomérica y/o LEA29Y-lg monomérica. Se espera que estos dímeros y monómeros de CTLA-4-lg mutantes sean beneficiosos en una variedad de procedimientos terapéuticos y/o profilácticos para tratar enfermedades o trastornos en los que el tratamiento inmunosupresor resultaría beneficioso, inclusive, por ejemplo, los procedimientos para tratar enfermedades y trastornos autoinmunes y los procedimientos para inhibir el trasplante de órganos o injertos de tejido. En otro, aspecto, la invención proporciona un dímero de la proteína de fusión aislada o recombinante (por ejemplo, un dímero de la proteína de fusión CTLA-4-lg muíante) que comprende dos proteínas de fusión monoméricas (por ejemplo, proteína de fusión CTLA-4-lg muíante), donde cada una de estas proteínas de fusión monoméricas comprenden: (í) un polipéptido (por ejemplo, un dominio extracelular de CTLA-4 muíante) que comprende una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 31 en no más de 6 residuos de aminoácidos y (b) comprende al menos uno de los siguieníes: un residuo de melionina en una posición correspondienle a la posición 50 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de lísina en una posición correspondiente a la posición 54 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de ácido glutámico en una posición correspondiente a la posición 55 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de prolina en una posición correspondiente a la posición 64 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de serina en una posición correspondiente a la posición 65 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de fenilalanina en una posición correspondiente a la posición 70 de la SEQ ID NO: 31 , donde las posiciones del residuo de aminoácido están numeradas de conformidad con la SEQ ID NO: 31 ; y (2) un polipéptido de Fe de Ig, donde dicho dímero se une a hCD80 y/o hCD86 (y/o hCD86-lg y/o hCD86-lg) y/o inhibe una respuesta inmunitaria. La invención incluye también una proteina de fusión monomérica aislada o recombinante como se establece más arriba que se une a CD80 (por ejemplo, hCD80) y/o CD86 (por ejemplo, hCD86) (y/o CD80-lg, por ejemplo, hCD80-lg, y/o CD86-lg, por ejemplo, hCD86-lg) y/o induce una respuesta inmunitaria in vitro o in vivo. El polipéptido de Fe de Ig puede comprender un Fe de lgG2, Fe de lgG1 , Fe de lgG4 o un Fe de IgG muíante que reduce la función efectora o la unión del receptor de Fe. El polipéptido de Fe de Ig puede comprender una secuencia que tiene una identidad de al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 184 a 186 y 218. El extremo amino terminal del polipéptido de Fe de Ig puede conectarse o fusionarse covalentemente en forma directa o indirecta (mediante un conector que comprende, por ejemplo, de 1 a 10 aminoácidos) al extremo carboxilo terminal del polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante. En algunos de estos dímeros o monómeros, el polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante comprende un residuo de ácido glutámico en una posición correspondiente a la posición 104, un residuo de ácido de asparagina en una posición correspondiente a la posición 30 y/o un residuo de isoleucina en una posición correspondiente a la posición 32 de la SEQ ID NO: 31. Algunos de estos dimeros presentan una avidez de unión a CD86 (por ejemplo, hCD86) o CD86-lg dimérica (por ejemplo, hCD86-lg) que es aproximadamente igual o mayor que la avidez de unión de la proteína hCTLA-4, hCTLA-4-lg dimérica, la proteina Orencia®, y/o LEA29Y-lg dimérica a CD86 o CD86-lg dimérica, respectivamente. Algunos de estos dimeros presentan una avidez de unión a CD80 (por ejemplo, hCD80) o CD80-lg dimérica (por ejemplo, hCD80-lg) que es mayor que la avidez de unión de hCTLA-4, hCTLA-4-lg dimérica, y/o la proteína Orencia® a CD80 o CD80-lg dimérica, respectivamente. Algunos de estos monómeros exhiben una afinidad o avidez de unión a CD86 (por ejemplo, hCD86) o CD86-lg (por ejemplo, hCD86-lg) que es aproximadamente igual o mayor que la afinidad o avidez de una hCTLA-4 monomérica, hCTLA-4-lg monomérica, o LEA29Y-lg monomérica a CD86 o CD86-lg, respectivamente. Algunos de estos monómeros presentan una afinidad o avidez de unión a CD80 (por ejemplo, hCD80) o CD80-lg (por ejemplo, hCD80-lg) que es mayor que la afinidad o I avidez de unión de hCTLA-4 monomérica o hCTLA-4-lg monomérica a CD80 o CD80-lg dimérica, respectivamente. Algunos de estos dimeros y monómeros de CTLA-4-lg mutantes tienen la capacidad de suprimir o inhibir una o más respuestas inmunitarias (por ejemplo, la activación o la proliferación de células T, la producción de citocina, la inducción de los marcadores de activación, la inflamación, la producción del anticuerpo anticolágeno, las respuestas del anticuerpo dependiente de células T) in vitro y/o in vivo como se establece detalladamente a continuación. Algunos de estos monómeros tienen la capacidad de suprimir una o más de estas respuestas inmunitarias en mayor medida que hCTLA-4 monomérica o hCTLA-4-lg monomérica. Algunos de estos dímeros tienen la capacidad de suprimir una o más de estas respuestas immunes en mayor medida que hCTLA-4, una hCTLA-4 dimérica, proteína Orencia® y/o LEAY29-lg. Se espera que estos dímeros y monómeros de CTLA-4-lg sean beneficiosos en una variedad de procedimientos terapéuticos y/o profilácticos para tratar enfermedades o trastornos del sistema inmunitario en los que el tratamiento inmunosupresor resultaría beneficioso (por ejemplo, enfermedades y trastornos autoinmunes y procedimientos para inhibir el rechazo al trasplante de órganos o injertos de tejido). Cualquiera de estos dímeros o monómeros de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante dimérica o monomérica que se establecen anteriormente pueden incluir además un péptido que facilita la secreción de la proteína de fusión desde una célula huésped. El péptido es opcionalmente un péptido señal. El extremo carboxilo terminal del péptido señal está típicamente conectado de forma covalente con el extremo amino terminal de la proteína de fusión. El péptido señal puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 182 o de la SEQ ID NO: 216. El péptido señal puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con la secuencia de aminoácidos que comprende los residuos de aminoácidos 1 al 35, 1 al 36, ó 1 al 37 de la SEQ ID NO: 160. Además, como se establece a continuación, cualquiera de estas proteínas de fusión CTLA-4-lg monoméricas o diméricas que se establecen anteriormente puede comprender uno o más de los residuos de aminoácidos que son glicosilados o pegilados. La invención proporciona también una proteína de fusión CTLA-4-lgG2 muíante madura/secretada que tiene 352 aminoácidos de longitud y comprende un polipéptido del DEC de CTLA-4 muíante que comprende 124 residuos de aminoácidos y un polipéptido de Fe de lgG2 humana que comprende 228 residuos de aminoácidos. Los polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante ejemplares incluyen los polipéptidos que comprenden las secuencias identificadas con cualquier SEQ ID NO: 1 al 73. Las proteínas de fusión CTLA-4-lgG2 mutantes ejemplares incluyen las que comprenden una secuencia de polipéptidos identificada con cualquiera de las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 205 a 214, y 219 a 222. Si así se lo desea, los aminoácidos de una proteína de fusión CTLA-4-lgG2 mutante madura pueden numerarse empezando por el primer residuo de aminoácido de CTLA-4-lgG2 mutante (es decir, el primer residuo del DEC del polipéptido de CTLA-4 mutante). En algunos aspectos, el primer residuo de la proteína de fusión CTLA-4-lgG2 mutante (o el DEC de CTLA-4 mutante) es de metionina y por eso la numeración de los aminoácidos de la proteína de fusión CTLA-4-lgG2 mutante (o el DEC de CTLA-4 mutante) empezaría por la metionina (designado como el residuo de aminoácido 1 ). La invención también incluye proteínas de fusión multiméricas aisladas o recombinantes que comprenden dos o más proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes que se establecen anteriormente. En algunos casos, el multímero es un dímero de la proteína de fusión que comprende dos proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes, que pueden ser proteínas de fusión idénticas (es decir, un homodímero) o proteínas de fusión distintas (es decir, un heterodímero). En algunos casos, el multímero es una proteína de fusión tetramérica, que comprende cuatro polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes de la invención. El tetrámero puede comprender cuatro polipéptidos del DEC de CTLA-4 idénticos (es decir, un homotetrámero) o cualquier combinación de los cuatro polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes de la invención con tal de que los cuatro polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes no sean idénticos (es decir, un heterotetrámero). Algunos de estos multímeros se unen a CD80 y/o CD86 (y/o hCD80-lg y/o hCD86-lg) y/o suprimen o inhiben una respuesta inmunitaria. La invención incluye formas solubles de cualquiera de los polipéptidos, de las proteínas de fusión y de los multímeros que se establecen anteriormente. También hay formas solubles incluidas en el conjugado de la invención que se establecen a continuación. Las moléculas solubles de la invención, por ejemplo, los polipéptidos solubles, las proteínas de fusión diméricas, las proteínas de fusión monoméricas, los multímeros y los conjugados de la invención, no están conectadas o unidas o adheridas a la célula. Algunas de estas moléculas solubles pueden estar en una solución o son capaces de circular, por ejemplo, en un fluido (por ejemplo, en el cuerpo de un individuo). Un péptido señal puede usarse típicamente para facilitar la secreción de esta molécula, pero el péptido señal se escinde durante la secreción de la molécula desde una célula huésped. Por tanto, en algunos casos, una molécula soluble, como un polipéptido soluble, una proteína de fusión dimérica, una proteína de fusión monomérica o un multimero, no incluye un péptido señal. Como se establece anteriormente, un polipéptido del dominio extracelular de CTLA-4 muíante de la invención puede conectarse a una molécula de Ig, incluso, por ejemplo, una porción de un polipéptido de Ig, por ejemplo, un polipéptido de Fe de Ig, que resulta en una proteína de fusión soluble. Por tanto, en un aspecto, la invención incluye proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes solubles que comprenden cualquier polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante de la invención, según se establece aquí, fusionado o conectado con al menos una porción de un polipéptido de Ig, por ejemplo, un Fe de Ig natural (por ejemplo, Fe de lgG2 humana) o un polipéptido de Fe de Ig mutante. Estas proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes solubles pueden ser proteínas de fusión monoméricas o diméricas e incluyen los monómeros y los dímeros de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes que se establecen detalladamente arriba y en otra parte del presente, inclusive en los ejemplos a continuación. Como se establece detalladamente arriba y en otra parte del presente documento, algunas de estas proteínas de fusión monoméricas y diméricas solubles pueden tener la capacidad de unirse a CD80 y/o CD86 y/o la capacidad de suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria (por ejemplo,, la activación o la proliferación de células T) en aplicaciones in vitro y/o in vivo. Se espera que estas moléculas solubles de la invención sean particularmente beneficiosas en una variedad de aplicaciones, incluso, por ejemplo, en los procedimientos terapéuticos o profilácticos para tratar enfermedades y trastornos del sistema inmunitario (por ejemplo, enfermedades autoinmunes) y en los procedimientos profilácticos y terapéuticos para inhibir el trasplante de células, órganos o injertos de tejido. Las moléculas solubles de la invención, por ejemplo, los polipéptidos del DÉC de CTLA-4 mutante recombinante soluble, las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes monoméricas y diméricas, los conjugados del DEC de CTLA-4 mutante, los conjugados de CTLA-4-lg mutante, los multimeros que comprenden polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante o de CTI_A-4 lg mutante, los multimeros que comprenden los conjugados de CTLA-4 mutante o los conjugados de CTLA-4-lg mutantes de la invención, que se unen a CD80 y/o CD86, al ser administrados a un individuo en una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva, inhiben la interacción entre el CD80 endógeno y/o el CD86 endógeno y/o el CD28 endógeno, y por tanto suprimen en el individuo una respuesta del sistema inmunitario o un ataque del sistema inmunitario a los tejidos, los órganos, y/o las células sanas del individuo. En los casos en que un individuo es el receptor de tejidos, órganos y/o células sanas del cuerpo de un donante (por ejemplo, como cuando el individuo receptor recibe un injerto de tejido o trasplante de célula u órgano de un donante), estas moléculas solubles inhiben la interacción entre CD80 y/o CD86 endógenos y CD28 endógeno, y por tanto inhiben una respuesta dañina o un ataque del sistema inmunitario del individuo a los tejidos, órganos o células sanas del cuerpo donados al individuo por el donante. Al suprimir una respuesta del sistema inmunitario o un ataque a los tejidos sanos del cuerpo, se pueden disminuir los efectos secundarios (por ejemplo, el dolor, la inflamación de las articulaciones, etc.) asociados a esta respuesta del sistema inmunitario o al ataque a los tejidos, órganos o células sanas en el individuo y puede retrasarse o prevenirse el daño resultante de esta respuesta o de este ataque. Los procedimientos para medir las afinidades y las avideces de unión de los polipéptidos de la invención que se establecen anteriormente, incluyen, por ejemplo, los polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante, las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes diméricas y monoméricas y los multímeros de la invención conocidos por los entendidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, la tecnología Biacore™ (GE Healthcare), la microcalorimetría isotérmica de titulación (MicroCal LLC, Northampton, MA), ELISA, los procedimientos de expresión en fago de la afinidad de unión y los procedimientos de FACS. Los procedimientos de Biacore se establecen detalladamente en el Ejemplo 4 a continuación. Los procedimientos de FACS u otros procedimientos de clasificación se establecen más detalladamente arriba y en otra parte del presente documento. A continuación, en el Ejemplo 2, se establecen los procedimientos para medir las afinidades de unión de los polipéptidos de la invención a hCD80 y/o hCD86 con el fago ELISA. Los entendidos en la técnica conocen los procedimientos para detectar y medir las respuestas de las células T inducidas por las moléculas de la invención (inclusive, por ejemplo, los polipéptidos del DEC de CTLA-4 muíante, las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutante diméricas y monoméricas y los multimeros de la invención). La activación de las células T se caracteriza comúnmente por hechos psicológicos incluso, por ejemplo, la síntesis de citocina asociada a las células T (por ejemplo, la producción de IFN-?) y la inducción de los marcadores de activación (por ejemplo, CD25, el receptor IL-2). Las células CD4+ T reconocen sus péptidos inmunogénicos en el contexto de las moléculas CMH clase II, mientras que las células CD8+ T reconocen sus péptidos inmunogénicos en el contexto de las moléculas CMH clase I. En los Ejemplos 5 al 8 y en otra parte del presente documento, se establecen los procedimientos ejemplares para evaluar y medir la capacidad de las moléculas de la invención que se establecen anteriormente para inhibir o suprimir la activación de las células T y/o la proliferación de las células T o para bloquear la señalización medíante CD86 y/o CD80. Los polipéptidos, las proteínas de fusión monoméricas y diméricas, y los multimeros de la invención, incluso los que se establecen anteriormente, comprenden además opcionalmente un aminoácido adicional, como una metionina, agregada al extremo amino terminal y/o una marcación del péptido para la purificación o la identificación. Los polipéptidos de la invención, incluso los que se establecen anteriormente, comprenden además opcionalmente la purificación subsiguiente del polipéptido, por ejemplo, una subsecuencia seleccionada de una marca del epítopo, una marca FLAG, una secuencia de polihistidina y una fusión de GST. Además, como se establece más detalladamente a continuación, la invención incluye los ácidos nucleicos aislados, recombinantes o sintéticos que codifican todos los polipéptidos, las proteínas de fusión y los multimeros de la invención que se establecen anteriormente y detalladamente a continuación.

Identidad de secuencia Como se establece anteriormente, en un aspecto, la invención incluye un polipéptido aislado o recombinante que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ó 100% con una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73, donde el polipéptido se une a CD80 o CD86 o un dominio extracelular de cualquiera y/o tiene la capacidad de suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria. En otro aspecto, como se establece detalladamente a continuación, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucléotidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ó 100% con al menos una secuencia de poiipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73, donde el polipéptido tiene la capacidad de unirse a CD80 y/o CD86 y/o un DEC de estos, y/o tiene la capacidad de suprimir una respuesta inmunitaria, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de estos. La medida en que una secuencia (de poiipéptidos o de ácido nucleico) es similar a otra indica propiedades estructurales y funcionales similares para las dos secuencias. Consecuentemente, en el contexto de la presente invención, las secuencias que presentan una secuencia similar a cualquier secuencia ejemplar son una característica de la presente invención. Las secuencias que presentan un porcentaje de las identidades de la secuencia como se define a continuación son una característica de la invención. Puede usarse una cantidad de procedimientos para determinar las relaciones de las secuencias, inclusive la alineación manual y la alineación y el análisis de la secuencia asistido por computadora. Hay una cantidad de programas informáticos disponibles para realizar la alineación de las secuencias o puede hacerlo un entendido en la técnica. Como se menciona anteriormente, no es necesario que las secuencias de los ácidos nucleicos y de los poiipéptidos utilizados en el objeto de la invención sean idénticas, sino que pueden ser sustancialmente idénticas a la secuencia correspondiente a un ácido nucleico de la invención o a un polipéptido de la invención, respectivamente. Por ejemplo, los poiipéptidos de la invención pueden estar sujetos a varios cambios, como una o más inserciones, eliminaciones y/o sustituciones de aminoácidos, conservadoras o no conservadoras y estos cambios pueden incluso, por ejemplo, proporcionar ciertas ventajas por su uso, como en el uso terapéutico o profiláctico o! la administración o la aplicación diagnóstica. Los ácidos nucleicos de la invención también pueden someterse a varios cambios, como una o más sustituciones de uno o más ácidos nucleicos en uno o más codones, de forma que un codón específico codifique un mismo aminoácido o aminoácidos diferentes, lo que provoca una variación silenciosa (por ejemplo, la mutación a una secuencia de nucleótidos genera una mutación silenciosa en la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, cuando el aminoácido codificado no se altera por la mutación del ácido nucleico) o una variación no silenciosa, una o más eliminaciones de uno o más ácidos nucleicos (o codones) en la secuencia, una o más adiciones o inserciones de uno o más ácidos nucleicos (o codones) en la secuencia, la escisión o uno o más truncamientos de uno o más ácidos nucleicos (o codones) en la secuencia. Los ácidos nucleicos también pueden modificarse para incluir uno o más codones que proporcionan una expresión óptima en un sistema de expresión (por ejemplo, bacteriano o de mamífero), mientras que, si se lo desea, dichos uno o más codones pueden codificar aun el mismo aminoácido(s). Estos cambios de ácidos nucleicos pueden proporcionar ciertas ventajas en su uso o administración terapéutica o profiláctica o aplicación diagnóstica. Los ácidos nucleicos o polipéptidos pueden modificarse de varias formas, siempre y cuando comprendan una secuencia sustancialmente idéntica (como se define a continuación) a una secuencia en un ácido nucleico o polipéptido respectivo de la invención. El término "idéntico" o "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias que son iguales o que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se los compara o alinea para determinar la similitud máxima a través del algoritmo para la comparación de secuencias que se establece a continuación o a través de una inspección visual. El "porcentaje de identidad de la secuencia" ("% de identidad") de una secuencia de la base de datos con una secuencia de referencia (es decir, de estudio) significa que la secuencia de la base de datos es idéntica (es decir, aminoácido por aminoácido para una secuencia de polipéptidos, o nucleótido por nucleótido para una secuencia de polinucleótidos) en un porcentaje específico a la secuencia de estudio en una longitud comparable. El porcentaje de identidad de la secuencia ("% de identidad de la secuencia" o "% de identidad") de una secuencia de la base de datos con una secuencia de estudio se puede calcular como sigue. Primero, se determina la alineación óptima de las dos secuencias utilizando un algoritmo para la comparación de la secuencia con parámetros de alineación específicos. Se puede realizar esta determinación de la alineación a través de upa computadora o manualmente, como se establece a continuación. Después, las dos secuencias óptimamente alineadas se comparan con la longitud objeto de comparación y se determina la cantidad de posiciones en la alineación óptima en que existen residuos idénticos en ambas secuencias, lo cual proporciona la cantidad de posiciones que se corresponden. Entonces, la cantidad de posiciones que se corresponden se divide entre la cantidad total de posiciones de la longitud de comparación (que, a menos que se especifique lo contrario, es la longitud de la secuencia de estudio) y el resultado se multiplica entonces por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia de la secuencia de la base de datos con la secuencia objeto de estudio. Con respecto a las secuencias de polipéptidos, típicamente una secuencia se considera "secuencia de estudio" (por ejemplo, una secuencia de polipéptidos de la invención) con la que se comparan una o más secuencias distintas, es decir, "secuencia(s) de la base de datos" (por ejemplo, las secuencias presentes en una secuencia en una base de datos). El algoritmo de comparación de la secuencia utiliza los parámetros de alineación designados para determinar la alineación óptima entre la secuencia de estudio y la(s) secuencia(s) de la base de datos. Cuando se compara una secuencia de estudio con una secuencia de la base de datos, por ejemplo, la base de datos del GENBANK® (Genetic Sequence Data Bank; U.S. Department of Health and Human Services) o la base de datos de GENESEQ® (Thomson Derwent; disponible también como la base de datos de DGENE® en STN), usualmente sólo se ingresa en la computadora la secuencia de estudio y los parámetros de alineación; se obtienen las alineaciones óptimas entre la secuencia de estudio y cada secuencia de la base de datos hasta una cantidad específica de secuencias en la base de datos. 1. Determinación de la alineación óptima Dos secuencias de polipéptidos están "óptimamente alineadas" cuando están alineadas usando parámetros definidos, es decir, una matriz de sustitución de aminoácidos definida, una penalización por la existencia de una brecha (también denominada penalización por apertura de brecha), y una penalización por la ampliación de una brecha, de modo alcanzar el puntaje de similitud más alto posible para ese par de secuencias. Se utiliza frecuentemente la matriz BLOSUM62 (Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89(22): 10915-10919) como una matriz de sustitución del puntaje por omisión en algoritmos de la alineación de la secuencia de polipéptidos (como BLASTP, que se establece a continuación). La penalización por la existencia de una brecha se impone a través de la introducción de una única brecha de aminoácidos de las secuencias alineadas y la penalización por la ampliación de la brecha se impone por cada posición de residuo en la brecha. A menos que se establezca lo contrario, los parámetros de alineación que se utilizan aquí son: la matriz de puntuación de BLOSUM62, la penalización por la existencia de una brecha = 11 y la penalización por la ampliación de la brecha = 1. La puntuación de la alineación se define por las posiciones de aminoácidos de cada secuencia en las que la alineación comienza y termina (por ejemplo, la ventana de la alineación) y, opcionalmente por la inserción de una o múltiples brechas en una o ambas secuencias, de modo de llegar al puntaje de similitud más alto posible. En tanto que la alineación óptima entre dos o más secuencias puede determinarse manualmente (como se establece a continuación), el proceso se facilita mediante el uso de un algoritmo implementado por computadora como el BLAST® (Biblioteca Nacional de Medicina), por ejemplo, el BLASTP para las secuencias de polipéptidos y el BLASTN para las secuencias de ácido nucleico que se establecen en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, y a disposición del público por medio de varias fuentes, como la página web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Si se utiliza una interfaz BLAST computarizada, si existe la opción de usar un "filtro de complejidad baja", debería desactivarse esta opción (es decir, no filtrar). La alineación óptima entre dos secuencias de polipéptidos también puede determinarse mediante un cálculo manual del algoritmo BLASTP (es decir, sin la asistencia de una computadora) usando los mismos parámetros de alineación que se especifican anteriormente (la matriz = BLOSUM62, penalización por apertura de brecha = 11 y penalización por ampliación de brecha = 1). Al comienzo, las dos secuencias están inicialmente alineadas por inspección visual. Después se calcula una puntuación de alineación inicial como sigue: para cada posición individual de alineación (es decir, por cada par de residuos alineados), se asigna un valor numérico de conformidad con la matriz de BLOSUM62 (Figura 13). La sumatoria de los valores asignados a cada par de residuos en la alineación es el puntaje de alineación. Si las dos secuencias que se alinean son muy similares, esta alineación inicial frecuentemente proporciona el puntaje de alineación más alto posible. La alineación con el puntaje de alineación más alto posible es la alineación óptima basado en los parámetros de alineación empleados. En las Figuras 14A a 14D se proporcionan ejemplos del cálculo manual de las puntuaciones de alineación para dos secuencias. La figura 14A muestra el cálculo de una puntuación de alineación para una alineación arbitraria (alineación 14A) de una secuencia de estudio, identificada aquí como los residuos 39 al 53 de la secuencia del DEC de CTLA-4 humana (SEQ ID NO: 159), y una secuencia "de base de datos", identificada aquí como los residuos 40 al 54 de D3 (SEQ ID NO: 61). Debajo de cada posición en la alineación, se muestra el valor numérico asignado por la matriz de BLOSUM62 para cada par de aminoácidos alineados. La Figura 14B muestra el puntaje de alineación para ! la alineación óptima de las mismas dos secuencias. Para ayudar a la visualización, se muestra cada par idéntico de aminoácidos en la alineación en negrita. La alineación en la Figura 14B (alineación 14B) a continuación produce el puntaje de alineación más alto posible (la sumatoria de los valores que se muestran debajo de cada posición de alineación) de estas dos i secuencias; cualquier otra alineación de estas dos secuencias, con o sin brechas, produciría una puntuación de alineación más baja. En algunos casos, se puede obtener una puntuación de alineación más alta al introducir una o más brechas en la alineación. Siempre que se introduce una brecha en la alineación, se asigna una penalización por apertura de brecha, y además se evalúa una penalización por ampliación de brecha por cada posición de residuo dentro de la brecha. Por lo tanto, al usar los parámetros de alineación que se establecen anteriormente (incluso la penalización por brecha abierta = 11 y la penalización por ampliación de brecha = 1), una brecha de un residuo en la alineación tendría un valor de -(11 +(1x1)) = -12 asignado a la brecha; una brecha de dos residuos tendría el valor de - (11+(2x1)) = 13 asignado a la brecha, y así en adelante. Este cálculo se repite para cada nueva brecha que se introduce en la alineación. El siguiente ejemplo muestra cómo la introducción de una brecha en una alineación puede producir una puntuación de alineación más alta, a pesar de la penalización por brecha. La Figura 14C muestra una alineación (alineación 14C) de una secuencia de estudio, identificada aquí como los residuos 39 al 53 de la secuencia del DEC de CTLA-4 humano (SEQ ID NO: 159) y una secuencia "de la base de datos", identificada aquí como los residuos 41 al 55 de D3 (SEQ ID NO: 61), pero en este caso se eliminan los aminoácidos 49 y 50. La alineación 14C, que es la mejor alineación posible sin la introducción de ninguna brecha, produce una puntuación de alineación de 34. La alineación de la Figura 14D (alineación 14D) muestra el efecto de la introducción de una brecha de dos residuos en la secuencia más baja en el puntaje de alineación. A pesar de una penalización total por brecha de 13 (penalización por apertura de brecha de 1 1 y doble penalización por ampliación de brecha de 1 ), el puntaje final de la alineación de las dos secuencias aumenta a 43. La alineación D produce el puntaje de alineación más alto posible y, a eso se debe la alineación óptima de estas dos secuencias; cualquier otra alineación de estas dos secuencias (con o sin brechas) produciría una puntuación de la alineación más baja. Se entenderá que los ejemplos de los cálculos de alineación de secuencias que se establecen anteriormente, que usan secuencias relativamente cortas, se proporcionan sólo con fines ilustrativos. En la práctica, los parámetros de alineación que se emplean (la matriz de BLOSUM62, la penalización por apertura de brecha = 1 1 y la penalización por ampliación de brecha = 1 ) están generalmente previstos para las secuencias de polipéptidos de 85 aminoácidos de longitud o más. El sitio web del NCBI proporciona los siguientes parámetros de alineación para las secuencias con otras longitudes, que son adecuados tanto para el cálculo asistido por computadora como para alineación manual, a través del mismo procedimiento que se establece anteriormente. Para las secuencias de 50 a 85 aminoácidos de longitud, los parámetros óptimos son los de la matriz BLOSUM80 (Henikoff y Henikoff, más arriba), la penalización por apertura de brecha = 10 y la penalización por extensión de brecha = 1. Para las secuencias de 35 a 50 aminoácidos de longitud, los parámetros óptimos son los de la matriz PAM70 (Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M. & Orcutt, B.C. (1978) "A model of evolutionary change in proteins" en Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supl. 3, M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Nati. Biomed. Res. Found., Washington, DC), la penalización por apertura de brecha = 10, la penalización por ampliación de brecha = 1. Para las secuencias de menos de 35 aminoácidos de longitud, los parámetros óptimos son los de la matriz PAM30 (Dayhoff, M.O., más arriba), la penalización por brecha abierta = 9 y la penalización por la extensión de brecha = 1. 2. Cálculo del porcentaje de identidad Una vez que las secuencias están óptimamente alineadas, se calcula el porcentaje de identidad de la secuencia de la base de datos con relación a la secuencia de estudio contando la cantidad de posiciones en la alineación óptima conformadas por pares de residuos idénticos, lo que se divide entre la cantidad de residuos en la longitud de comparación (también denominada ventana de comparación), que, a menos que se especifique lo contrario, es la cantidad de residuos en la secuencia de estudio y se multiplica el número del resultado por 100. Nuevamente, con referencia a las alineaciones anteriores, en cada ejemplo la secuencia designada como la secuencia de estudio (superior) es de 15 aminoácidos de longitud. En la alineación B, hay 12 pares de residuos de aminoácidos alineados (se muestran en negrita) que son idénticos en la alineación óptima de la secuencia de estudio (superior) con la secuencia de la base de datos (inferior). Por tanto, esta secuencia específica de la base de datos tiene una identidad del (12/15) x 100 = 80% con toda la longitud de la secuencia de estudio de 15 residuos; en otras palabras, la secuencia de la base de datos en la alineación B tiene al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 80% con la secuencia de estudio. En la alineación D, 11 pares de residuos de aminoácidos (que se muestran en negrita) son idénticos en la alineación óptima; de este modo esta secuencia específica de la base de datos tiene una identidad del (11/15) x 100 = 73.3% con toda la longitud de la secuencia de estudio de 15 residuos; en otras palabras, la secuencia de la base de datos en la alineación D tiene al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 73% con la secuencia de estudio. El término "identidad sustancial" (o "sustancialmente idénticos"), según se aplica a los polipéptidos, típicamente significa que cuando dos secuencias de aminoácidos (es decir, una secuencia de estudio y una secuencia de la base de datos) están óptimamente alineadas según el algoritmo BLASTP (manualmente o por medio de una computadora), usando los parámetros adecuados que se establecen anteriormente, la secuencia de la base de datos tiene una identidad de la secuencia de aminoácidos de al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ó 100% con la secuencia de estudio. En algunos casos, la identidad sustancial existe debido a una longitud de comparación de al menos 100 residuos de aminoácidos, por ejemplo, 110, 115, 118, 119, 120, 121 , 122, 123, 124, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 200, 250, 300, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351 , 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 375, 400, 450 ó 500 residuos de aminoácidos.

De forma similar, el término identidad sustancial (o sustancialmente idénticos), empleado en el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos, significa que cuando dos secuencias de ácidos nucleicos (es decir, una secuencia de estudio y una de la base de datos) están óptimamente alineadas según el algoritmo BLASTN (manualmente o por medio de una computadora), usando los parámetros adecuados que se establecen a continuación, la secuencia de la base de datos tiene al menos una identidad de secuencia de ácidos nucleicos del 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ó 100% con la secuencia de estudio. Los parámetros usados por las alineaciones de las secuencias de ácidos nucleicos son: recompensa por coincidencia 1 , penalización por no coincidencia -3, penalización por existencia de brecha 5, penalización por ampliación de brecha 2 (no se utiliza la sustitución de matrices en el algoritmo BLASTN). En algunos casos, la identidad sustancial existe debido a una longitud de comparación de al menos 300 residuos de aminoácidos, por ejemplo, al menos 330, 345, 354, 357, 360, 363, 366, 369, 362, 365, 375, 390, 405, 420, 435, 450, 600, 750, 900, 1.035, 1.038, 1.041 , 1.044, 1.047, 1.050, 1.053, 1.056, 1.059, 1.062, 1.065, 1.068, 1.071 , 1.074, 1.077, 1.080, 1.200, 1.350 ó 1.500 residuos de nucleótidos. Se pueden utilizar otros programas de alineación de secuencias conocidos en la técnica. El programa ALIGN produce una alineación global (en general) óptima de dos secuencias de proteínas o ácidos nucleicos seleccionadas a través de una modificación de la dinámica de programación del algoritmo establecido por Myers y Miller CABIOS 4:11-17 (1988). El programa ALIGN típicamente, aunque no necesariamente, se usa con los extremos ponderados. Si establecen penalizaciones por la apertura de brechas o la ampliación de brechas, con frecuencia se fijan entre aproximadamente -5 a -15 y 0 a -3, respectivamente, más preferentemente entre aproximadamente -12 y -0.5 a -2, respectivamente, para las alineaciones de las secuencias de aminoácidos, y -10 a -20 y -3 a -5, respectivamente, más comúnmente entre aproximadamente -16 y -4, respectivamente, para las alineaciones de las secuencias de ácido nucleico. Asimismo, se establece el programa ALIGN en Pearson et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444-48 (1988) y, Pearson et al, Meth. Enzymol. 18:63-98 (1990). Indistintamente, y particularmente por los múltiples análisis de secuencias, (es decir, la comparación de más de tres secuencias), es posible utilizar el programa CLUSTAL W (establecido en, por ejemplo, Thompson et al, Nucí. Acids Res. 22:4673-4680 (1994)). El programa CLUSTAL W es un algoritmo adecuado para las alineaciones de múltiples secuencias de ADN y aminoácidos (Thompson et al, Nucí. Acids Res. 22:4673-4680 (1994)). CLUSTAL W realiza múltiples comparaciones por pares entre grupos de secuencias y las reúne en una alineación múltiple basada en homología. En un aspecto, las penalizaciones por apertura de brecha o ampliación de brecha se fijan en 10 y 0.05, respectivamente. Alternativa o adicionalmente, el programa CLUSTAL W se ejecuta utilizando la configuración "dinámica" (contra la "rápida"). Típicamente, el análisis de la secuencia de nucleótidos con CLUSTAL W se realiza usando la matriz BESTFIT, mientras que las secuencias de aminoácidos se evalúan usando una serie de variables de las matrices BLOSUM en función del nivel de identidad entre las secuencias (por ejemplo, según la versión 1.6 del programa comercializada por San Diego Supercomputer Center (SDSC) o la versión W 1.8 comercializada por European Bioinformatics Institute, Cambridge, UK). Preferentemente, la configuración del CLUSTAL W se fija igual que la configuración por defecto del CLUSTAL W del SDSC (por ejemplo, en lo referente a las penalizaciones especiales por las brechas hidrofílicas en el análisis de la secuencia de aminoácidos). El programa CLUSTAL W se establece además en, por ejemplo, Higgins et al, CABIOS 8(2): 189-91 (1992), Thompson et al, Nucleic Acids Res. 22:4673-80 (1994) y Jeanmougin et al, Trends Biochem. Sci. 2:403-07 (1998). En un formato alternativo, la identidad o porcentaje de identidad entre un par específico de secuencias de aminoácidos alineadas se refiere a un porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos que se obtiene a partir del análisis de CLUSTAL W (por ejemplo, la versión W 1.8), contando la cantidad de parejas idénticas en la alineación y dividiendo esa cantidad de parejas idénticas entre la mayor de (i) la longitud de las secuencias alineadas y (ii) 96, y usando los siguientes parámetros predeterminados de Clustal W para obtener alineaciones pareadas lentas/exactas - Penalización por apertura de brecha: 10; penalización por ampliación de brecha: 0,10; la matriz del peso proteico: serie de Gonnet; la matriz del peso del ADN: IUB; las alineaciones por pares lentos/rápidos de Toggle = Alineamiento LENTO o COMPLETO. El algoritmo FASTA es otro algoritmo útil para determinar el porcentaje de identidad o el porcentaje de similitud que se establece en Pearson et al, Proc Nati. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) y Pearson, Methóds Enzymol. 266:227-258 (1996). Se optimizan los parámetros típicos utilizados en una alineación FASTA de las secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad, matriz 15 BL50: -5, k-tuple = 2; penalización por unirse = 40, optimización = 28; penalización por brecha = -12, penalización por longitud = -2; y por ancho = 16. Otros algoritmos adecuados incluyen los algoritmos BLAST y BLAST 2.0 que facilitan el análisis de al menos dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos, mediante la alineación de una secuencia seleccionada frente a múltiples secuencias de una base de datos (por ejemplo, GenSeq) o al ser modificadas mediante un algoritmo adicional como BL2SEQ, entre dos secuencias seleccionadas. El software para realizar el análisis BLAST se comercializa en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) (dirección de la página web ncbi.nlm.nih.gov). El algoritmo BLAST implica primero identificar los pares de secuencias de puntuación más alta (HSP) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia de estudio, que son coincidentes o satisfacen alguna puntuación umbral T valuada positivamente al alinearse con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. Se hace referencia a T como una puntuación umbral de palabras vecinas (Altschul et al, supra). Estos resultados de palabras iniciales vecinas actúan como semillas que inician búsquedas para encontrar los HSP más largos que las conforman. Los resultados de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia mientras sea posible aumentar el puntaje de alineación acumulativo. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (el puntaje de premiación para un par de residuos que se igualan; siempre > 0) y N (el puntaje de penalización para residuos que no se igualan; siempre < 0). En las secuencias de aminoácidos se usa una matriz de puntuación para calcular el puntaje acumulativo. La ampliación de los aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: el puntaje de alineación acumulativo cae desde el valor máximo alcanzado en la cantidad X; el puntaje acumulativo desciende a cero o por debajo de este debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se llega al final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para la secuencia de nucleótidos) puede usarse con una palabra de longitud (W) de 1 1 , una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, puede utilizarse el programa BLASTP (por ejemplo, BLASTP 2.0.14; Jun-29-2000) con una palabra de longitud de 3 y una expectativa (E) de 10. La matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915) utiliza alineaciones (?) de 50, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. Nuevamente, como con otros algoritmos adecuados, puede incrementarse la rigidez comparativa hasta que el programa identifique únicamente secuencias que están más íntimamente relacionadas con las que se encuentran en el listado de secuencias del presente documento (por ejemplo, un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos el 85, 90, 91 , 92, 93, 49, 95, 96, 97, 98, 99%, ó 100% con una secuencia de polipéptidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1 a 79, 197 a 200, 205 a 214, y 219 a 222; o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 85, 90, 91 , 92, 93, 49, 95, 96, 97, 98, 99% ó 1Q0% con una secuencia de nucleótidos seleccionada de cualquier SEQ ID NO: 80 a 158, 201 a 204, 223 y 224 o una secuencia de nucleótidos complementaria de estos. El algoritmo BLAST realiza también un análisis estático de la similitud o la identidad entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Una medida dé similitud o identidad proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que indica la probabilidad de que se produzca una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos al azar. Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a la secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor a aproximadamente 0.2, como menor a aproximadamente 0, 01 o menor a aproximadamente 0.001. El programa de análisis BLAST puede modificarse, también o alternativamente, con programas de filtración de complejidad baja como los programas DUST o SEG, que preferentemente están integrados a las operaciones del programa BLAST (véase, por ejemplo, Wootton et al, Comput. Chem. 17:149-63 (1993), AltschuI et al, Nat. Genet. 6:119-29 (1991), Hancock et al, Comput. Appl. Biosci. 10:67-70 (1991) y, Wootton et al, Meth. Enzymol. 266:554-71 (1996)). En estos aspectos, si se utiliza una proporción lamba, las configuraciones útiles para la proporción oscilan entre 0.75 y 0.95, inclusive entre 0.8 y 0.9. Si en estos aspectos se utilizan los costos de existencia de una brecha (o puntuaciones de brecha), la existencia de la brecha se ubica típicamente entre aproximadamente -5 y -15, más típicamente aproximadamente -10, y el costo de brecha por residuo se ubica típicamente entre aproximadamente 0 a -5, como entre 0 y -3 (por ejemplo, -0.5). Los parámetros de brecha similares pueden utilizarse con otros programas según corresponda. Asimismo, se establecen los programas BLAST y los principios que les subyacen en, por ejemplo, AltschuI et al, J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990), Karlin y AltschuI, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2264-68 (199) (según modificaciones por Karlin y AltschuI, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-77 (1993)) y, AltschuI et al, Nucí. Acids Res. 25:3389-3402 (1997). Se incorpora en el software PILEUP otro ejemplo de un algoritmo útil. El programa PILEUP crea una alineación de secuencias múltiples de un grupo de secuencias relacionadas a través de alineaciones progresivas pareadas para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de la secuencia o el porcentaje de similitud de la secuencia. El PILEUP usa una simplificación del procedimiento de alineación progresiva de Feng y Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360, que es similar al procedimiento que se establece en Higgins y Sharp (1989) CABIOS 5:151-153. El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una con un máximo de longitud de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de la alineación múltiple comienza con la alineación pareada de dos de las secuencias de mayor similitud, produciendo una agrupación de dos secuencias alineadas. Después, esta agrupación se alinea con la siguiente secuencia más relacionada o una agrupación de secuencias alineadas. Se alinean dos agrupaciones de secuencias a través de una simple extensión de la alineación por pares de dos secuencias individuales. La alineación final se realiza a través de una serie de alineaciones progresivas pareadas. El programa se ejecuta mediante la designación de secuencias especificas y sus aminoácidos o nucleótidos coordinan regiones de comparación de secuencias y la designación de los parámetros del programa. Una secuencia de referencia se compara, usando el PILEUP, con otras secuencias de prueba para determinar la relación del porcentaje de identidad de la secuencia (o porcentaje de similitud de la secuencia) a través de parámetros específicos. Los parámetros ejemplares para el programa PILEUP son: ponderación de brecha predeterminada (3.00), ponderación de longitud de brecha predeterminada (0.10), brechas finales ponderadas. El PILEUP es un componente del paquete del software para el análisis de la secuencia GCG, por ejemplo, la versión 7.0 (Devereaux et al. (1984) Nucí. Acids Res. 12:387-395). Otros algoritmos útiles para realizar el análisis de identidad incluyen el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, el algoritmo de la alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443 y, el procedimiento de búsqueda de la similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444. Las implementaciones computarizadas de estos algoritmos (por ejemplo, GAP, BESTFIT, FASTA y T FASTA) se proporcionan en el Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl.

Variación de la secuencia Como se establece anteriormente, en un aspecto, la invención proporciona un polipéptido del dominio extracelular de CTLA-4 mutante aislado y recombinante que comprende una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73 en no más de 6 residuos de aminoácidos (por ejemplo, no más de 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 residuos de aminoácidos), donde el polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante se une a CD80 y/o CD86 y/o un dominio extracelular de cualquiera o de ambos, y/o inhibe una respuesta inmunitaria. Esta(s) sustitución(es) de aminoácidos incluye(n) la(s) sustitución(es) conservadora(s) de aminoácidos. Como un ejemplo no excluyente, un polipéptido de la invención puede tener una secuencia de polipéptidos que difiere de la SEQ ID NO: 1 en un total de hasta 6 aminoácidos (que puede ser una combinación de sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos, incluso las que se establecen anteriormente). En algunos casos, ninguna, alguna o todas las sustituciones son sustituciones de conformidad con un grupo de sustitución que se define a continuación. Las sustituciones de aminoácidos de conformidad con la invención pueden incluir, sin limitación, una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos. Una sustitución conservadora de residuos de aminoácidos típicamente implica intercambiar un miembro dentro de una clase funcional de residuos por un residuo que pertenece a la misma clase funcional (los residuos de aminoácidos idénticos se consideran funcionalmente homólogos o conservados en el cálculo del porcentaje funcional de la homología). En la técnica se conocen los cuadros de sustitución conservadora que proporciona aminoácidos funcionalmente similares. En el cuadro 1 se proporciona un ejemplo que expone seis grupos ejemplares que comprenden aminoácidos que pueden considerarse "sustituciones conservadoras" entre sí.

CUADRO 1 Grupos de sustitución conservadora de residuos de aminoácidos Es posible prever otros grupos de sustitución de aminoácidos.

Por ejemplo, los aminoácidos pueden agruparse por funciones o estructura química o composición similares (por ejemplo, su contenido de azufre, ácido, básico, alifático y aromático). Por ejemplo, una agrupación alifática puede comprender: Glicina (G), Alanina (A), Valina (V), Leucina (L), Isoleucina (I). Otros grupos que contienen aminoácidos, que se consideran sustituciones conservadoras entre sí, incluyen: Aromático: Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W)¡ con contenido de azufre: Metionina (M), Cisteína (C)¡ Básico: Arginina (R), Lisina (K), Histidina (H); Ácido: Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E)¡ residuos no polares sin carga, Cisteína (C), Metionina (M) y Prolina (P)¡ Residuos hidrofílicos sin carga: Serina (S), Treonina (t); Asparagina (N) y Glutamina (Q). Véase también Creighton (1984) Proteihs, W.H. Freeman y Compañía, por agrupaciones adicionales de aminoácidos. El listado de una secuencia de polipéptidos aquí, en conjunción con los mencionados grupos de sustitución, proporciona un listado expreso de todas las secuencias de polipéptidos sustituidas de forma conservadora. Existen más sustituciones conservadoras dentro de las clases de residuos de aminoácidos que se establecen anteriormente, que pueden también o alternativamente ser adecuadas. Los grupos de conservación para las sustituciones que son más conservadoras incluyen: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina. De este modo, por ejemplo, en un aspecto particular, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos el 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99% con la SEQ ID NO: 1 (o cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222) y que difiere de la secuencia de SEQ ID NO: 1 principalmente en (por ejemplo, al menos el 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%), si no totalmente, en cuanto a las sustituciones de aminoácidos mucho más conservadoras. Pueden determinarse grupos adicionales de sustituciones de aminoácidos que también pueden ser adecuados según los principios establecidos en, por ejemplo, Creighton (1984) PROTEINS: STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES (2.a Ed. 1993), W.H. Freeman and Company. En algunos aspectos, al menos el 33%, 50%, 60%, 70% o más (por ejemplo, al menos el 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97% o más) de las sustituciones en una variante de la secuencia de aminoácidos comprende sustituciones de uno o más residuos de aminoácidos en una secuencia de polipéptidos de la invención por residuos que se encuentran dentro de la misma clase funcional de homología (como lo determina cualquier sistema de clasificación adecuado, como los que se establecen anteriormente) como los residuos de aminoácidos de la secuencia de polipéptidos que reemplazan. Las variaciones sustituidas en forma conservadora de una secuencia de polipéptidos de la presente invención incluyen sustituciones en un porcentaje menor, típicamente menor al 10%, 9%, 8%, 7% ó 6% de los aminoácidos de la secuencia de polipéptidos, o más típicamente menor al 5%, 4%, 3%, 2% ó 1% de los aminoácidos de la secuencia de polipéptidos, con un aminoácido seleccionado en forma conservadora del mismo grupo de sustitución conservadora. La invención incluye polipéptidos que comprenden variaciones de aminoácidos de una secuencia de polipéptidos de la invención que se establece aquí. Como se establece anteriormente, en un aspecto, la invención proporciona polipéptidos aislados y recombinantes (por ejemplo, polipéptidos de CTLA-4 muíante, por ejemplo, polipéptidos del DEC de CTLA-4 mulante) los que comprenden una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73, donde el polipéptido se une a CD80 y/o CD86 o un fragmento del polipéptido de CD80 y/o CD86 (o un DEC de cualquiera o de ambos) y/o suprime una respuesta inmunitaria. Estos polipéptidos pueden variar en una o más eliminaciones, adiciones o sustituciones de aminoácidos, inclusive en una o más sustituciones conservadoras o no conservadoras, siempre y cuando, sin embargo, los polipéptidos posean las propiedades funcionales establecidas. En un aspecto en particular, la invención proporciona variantes del polipéptido que comprenden variaciones modificadas en forma conservadora de cualquiera de estos polipéptidos que aquí se establecen, por ejemplo, una que comprende una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo de las SEQ ID NO: 1 a 73. Según se establece anteriormente, en otro aspecto, la invención proporciona proteínas de fusión aisladas o recombinantes (por ejemplo, proteínas de fusión CTLA-4 mutantes) que comprenden una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo compuesto por las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222, donde las proteínas de fusión unen a CD80 y/o CD86 (y/o CD80-lg y/o CD86-lg), y/o suprime una respuesta inmunitaria. Estas proteínas de fusión pueden variar en una o más eliminaciones, adiciones o sustituciones de aminoácidos, incluso una o más sustituciones conservadoras o no conservadoras, siempre y cuando, sin embargo, las proteínas de fusión posean las propiedades funcionales establecidas. En un aspecto en particular, la invención proporciona variantes de polipéptidos que comprenden variaciones modificadas en forma conservadora de cualquier proteína de fusión que se establece aquí, por ejemplo, una que comprende una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo de las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222. También se proporcionan variantes de polipéptidos de cualquier polipéptido aislado o recombinante de la invención que se establece anteriormente en el presente documento, donde la secuencia de aminoácidos de la variante del polipéptido difiere de la secuencia de polipéptidos respectiva del polipéptido de referencia en una o más sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos, aunque a veces las sustituciones no conservadoras son permisibles o incluso preferidas (los ejemplos de estas sustituciones no conservadoras se establecen aquí más adelante). Por ejemplo, las secuencias de la variante del polipéptido puede variar de una secuencia de polipéptidos de CTLA-4 mutante en una o más sustituciones de residuos de aminoácidos en la secuencia del polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante con uno o más residuos de aminoácidos que presentan un peso similar (es decir, un residuo que presenta una homología de peso similar al residuo que reemplaza en la respectiva secuencia de polipéptidos). El peso (y consecuentemente el tamaño) de los residuos de aminoácidos de un polipéptido puede afectar significativamente en la estructura del polipéptido. La conservación basada en el peso o la homología se basa en la posibilidad de que un aminoácido correspondiente no idéntico se asocie a una puntuación positiva en las matrices basadas en el peso que se establecen aquí (por ejemplo, la matriz BLOSUM50; la matriz PAM250).

De forma similar a las clases funcionales de aminoácidos que se mencionan anteriormente, los residuos de aminoácidos que ocurren naturalmente pueden dividirse en grupos conservadores basados en peso (que se dividen en grupos conservadores "fuertes" y "débiles"). Comúnmente, se usan los ocho grupos conservadores fuertes basados en peso que son Ser Thr Ala, Asn Glu Gln Lys, Asn His Gln Lys, Asn Asp Glu Gln, Gln His Arg Lys, Met lie Leu Val, Met lie Leu Phe, His Tyr, y Phe Tyr Trp. Los grupos conservadores débiles basados en peso incluyen Cys Ser Ala, Ala Thr Va|, Ser Ala Gly, Ser Thr Asn Lys, Ser Thr Pro Ala, Ser Gly Asn Asp, Ser Asn Asp Glu Gln Lys, Asn Asp Glu Gln His Lys, Asn Glu Gln His Arg Lys, Phe Val Leu He Met y His Phe Tyr. Algunas versiones del programa de análisis de secuencias CLUSTAL W proporcionan un análisis de los grupos conservadores fuertes y los grupos conservadores débiles basados en pesó a la salida de la alineación, ofreciéndose así una técnica conveniente para determinar la conservación basada en peso (por ejemplo, el CLUSTAL W proporcionado por el SDSC que típicamente se utiliza con la configuración predeterminada del SDSC). En algunos aspectos, al menos el 33%, 50%, 60%, 70%, 80% ó 90% de las sustituciones en esta variante del polipéptido comprenden sustituciones donde un residuo dentro de un grupo |de conservación basado en peso reemplaza un residuo de aminoácido de la secuencia de polipéptidos que está en el mismo grupo de conservación basado en peso. En otras palabras, ese porcentaje de sustituciones se conservan en términos de las características del peso del residuo de aminoácido. La secuencia de una variante del polipéptido puede diferir de un polipéptido de CTLA-4 muíante de la invención en una o más sustituciones de aminoácidos con uno o más residuos de aminoácidos que tienen un perfil hidropático similar (es decir, que exhiben una hidrofilicidad similar) a los residuos sustituidos (original) del polipéptido de CTLA-4 mutante. Puede determinarse un perfil hidropático a través del índice de Kyte y Doolittle y las puntuaciones para cada aminoácido natural en el índice son las siguientes: I (+4.5), V (+4.2), L (+3.8), F (+2.8), C (+2.5), M (+1.9); A (+1.8), G (-0.4), T (-0.7), S (-0.8), W (-0.9), Y (-1.3), P (-1.6), H (-3.2); E (-3.5), Q (-3.5), D (-3.5), N (-3.5), K (-3.9), y R (-4.5) (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 4.554.101 y, Kyte y Doolittle, J. Molec. Biol. 157:105-32 (1982) para obtener más información). Al menos el 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98%, 99% ó 100% de los residuos de aminoácidos en la secuencia de la vanante del polipéptido que no son idénticos a los residuos correspondientes en la secuencia de polipéptidos de CTLA-4 mutante idénticos o funcionalmente homólogos que aquí se divulgan ("homólogo más relacionado"), homólogo este que puede seleccionarse de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 73, exhiben un cambio menor a +/- 2 en la hidrofilicidad, incluso menor a +/- 1 en la hidrofilicidad y menor a +/- 0.5 en la hidrofilicidad con respecto a los residuos de aminoácidos no idénticos en la posición correspondiente en el homólogo más relacionado. La variante de polipéptido puede exhibir un cambio total en la hidrofilicidad con respecto a su homólogo más relacionado seleccionado de un grupo de las SEQ ID NO: 1 a 73, menor a aproximadamente 150, menor a aproximadamente 100 y/o menor a aproximadamente 50 (por ejemplo, menor a aproximadamente 30, 20 ó 10). Los ejemplos de sustituciones típicas de aminoácidos que retienen una hidrofilicidad similar o idéntica incluyen las sustituciones de arginina-lisina, las sustituciones de glutamato-aspartato, las sustituciones de serina-treonina, las sustituciones de glutamina-asparagina y las sustituciones de valina-leucina-isoleucina. Los algoritmos y el software, como el programa GREASE disponible a través del SDSC, proporcionan una manera conveniente para evaluar rápidamente el perfil hidropático de una secuencia de aminoácidos. Puesto que una proporción sustancial (por ejemplo, al menos aproximadamente el 33%), si no más (al menos el 50%) o casi todas (por ejemplo, el 65, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99%) de las sustituciones de aminoácidos en la secuencia de una variante del polipéptido frecuentemente tendrán una puntuación hidropática similar al residuo de aminoácido que reemplazan en la secuencia de polipéptidos (de referencia), se espera que la secuencia de la variante del polipéptido exhiba una salida del programa GREASE similar a la secuencia de polipéptidos. Por ejemplo, en un aspecto en particular, puede esperarse que una variante del polipéptido de la SEQ ID NO: 61 tenga una salida del programa GREASE (o un programa similar) más parecida a la salida de GREASE que se obtiene al ingresar la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 61 que la obtenida utilizando un polipéptido de CTLA-4 natural (por ejemplo, hCTLA-4), que puede determinarse mediante la inspección visual o la comparación de gráficos asistida por computadora (por ejemplo, superposición gráfica/alineación) y/o la salida numérica proporcionada sometiendo la secuencia variante de prueba y la SEQ ID NO: 1 al programa. La conservación de los residuos de aminoácidos en términos de la homología funcional, la homología de peso y las características hidropáticas, también se refiere a otras variantes de la secuencia de polipéptidos proporcionadas por la invención, incluso, pero sin limitación, por ejemplo, las variantes de la secuencia de polipéptidos de una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222. En un aspecto particular, la invención incluye al menos una de estas variantes del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de polipéptidos recombinantes seleccionada de un grupo de las SEQ ID NO: 1 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222, donde la secuencia de aminoácidos de la variante tiene al menos una de estas sustituciones de residuos de aminoácidos seleccionada de conformidad con la conservación basada en el peso u homología o un perfil hidropático similar, según se establece anteriormente. Estas variantes del polipéptido que se establecen anteriormente tienen típicamente una capacidad para unirse a CD80 y/o CD86 y/o una capacidad para suprimir al menos un tipo de respuesta inmunitaria, según se establece anteriormente y más detalladamente a continuación en los Ejemplos.

Secuencias del péptido señal Los polipéptidos de la invención también pueden comprender cualquier cantidad y tipo adecuado de secuencias de aminoácidos adicionales, como uno o más fragmentos de péptidos. En una realización, este polipéptido de la invención comprende además un péptido señal. Generalmente, el péptido señal dirige al polipéptido recombinante hacia el retículo endoplasmático cuando el polipéptido recombinante se expresa en una célula animal. Puede incluirse una secuencia señal que dirige el tráfico del orgánulo y/o la secreción de al menos una porción del polipéptido ante la expresión en una célula. Estas secuencias están típicamente presentes en la forma inmadura (es decir, no totalmente procesada) del polipéptido, y subsiguientemente son eliminadas o degradadas por las peptidasas celulares que llegan a la forma madura de la proteína. Por ejemplo, un polipéptido de CTLA-4 mutante o una proteína de fusión de la invención puede incluir cualquier secuencia señal adecuada o combinaciones de secuencias señales que dirigen el polipéptido hacia los compartimentos intracelulares, como una secuencia que dirige el polipéptido para transportarlo (translocado) hasta (por ejemplo, para que la proteína pueda ser procesada y liberada de) el retículo endoplasmático o la vía de secreción (por ejemplo, el RE, golgi, y otros orgánulos y compartimentos celulares), los núcleos, y/o dirige al polipéptido para secretarlo desde la célula, translocarlo hacia una membrana celular o dirigirlo hacia una segunda célula además de la célula desde la que se secreta la proteina. En este aspecto, el polipéptido puede incluir una secuencia ¡ntracelular esperada ("señal de clasificación") que dirige el polipéptido hasta un compartimento(s) endosomal y/o lisosomal u otro compartimento rico en CMH II para promover la presentación y la respuesta del CD4+ y/o CD8+ de las células T, como la señal de clasificación lisosomal/endosomal esperada derivada de la proteína 1 lisosomal de la membrana asociada (por ejemplo, LAMP-1- véase, por ejemplo, Wu et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:1161-75 (1995) y Ravipraskash et al, Virology 290:74-82 (2001)), una porción u homólogo de ésta (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.633.234) u otra secuencia lisosomal o endosomal adecuada y/o del RE esperada (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.248.565). En algunos aspectos, puede desearse que la secuencia intracelular esperada se localice en las cercanías o adyacencia(s) de la(s) secuencia(s) del epítopo probadas/identificadas dentro del polipéptido, que pueden identificarse mediante técnicas conocidas en la técnica y por eso aumenta la probabilidad de presentación de células T de fragmentos de polipéptidos que comprenden este(os) epitopo(s). Estos polipéptidos pueden expresarse desde un ADN o ARN aislado, recombinante o sintético introducido en una célula huésped por uno o más vectores para la transferencia de nucleótidos, incluidos, por ejemplo, uno o más vectores para la transferencia de genes, que se establecen aquí más adelante. El polipéptido puede comprender una secuencia señal que dirige el polipéptido hacia el retículo endoplasmático (RE) (por ejemplo, facilita la translocación del RE del polipéptido) cuando el polipéptido se expresa en la célula de un mamífero. El polipéptido puede comprender cualquier secuencia adecuada esperada del RE. En la técnica se conocen muchas secuencias esperadas del RE. Los ejemplos de estas secuencias señales se establecen en la Patente de Estados Unidos N° 5.846.540. Las secuencias señales del RE/la secreción incluyen la secuencia señal del factor alfa de la levadura, y las secuencias señales virales del mamífero como la secuencia señal del virus del herpes gD. Los péptidos señal ejemplares para la producción de E. coli incluyen las secuencias señal STII o Ipp de E. coli. Se establecen más ejemplos de secuencias señal en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 4.690.898, 5.284.768, 5.580.758, 5.652.139 y 5.932.445. Las secuencias señal adecuadas pueden identificarse usando las técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, el programa SignalP (que se establece en, por ejemplo, Nielsen et al. (1997) Protein Engineeríng 10:1-6), es comercializado por el Center for Biological Sequence Analysis en la dirección del sitio web denominado cbs.dtu.dk/services/SignalP, o se puede utilizar un software para analizar secuencias similares que es capaz de identificar dominios parecidos a la secuencia señal. En Nielsen et al, Protein Eng. 10(1):1-6 (1997), se proporcionan técnicas relacionadas para identificar péptidos señal adecuados. Las secuencias pueden analizarse manualmente en busca de características comúnmente asociadas a las secuencias señal, como se establece en, por ejemplo, la solicitud de patente europea N.°: 0 621 337, Zheng y Nicchitta (1999) J. Biol. Chem. 274(51 ): 36623-30, y Ng et al, (1996) J. Cell Biol. 134(2):269-78.

Aspectos adicionales Cualquier polipéptido de la invención (inclusive cualquier proteína de fusión de la invención) puede estar presente como parte de una secuencia de polipéptidos mayor, como ocurre ante la adición de uno o más dominios o subsecuencias para la estabilización, la detección o la purificación de polipéptidos. Estos dominios o subsecuencias pueden fusionarse covalentemente al polipéptido de la invención, lo que será fácilmente comprendido por un entendido en la técnica quien será capaz de reproducirlo. Una subsecuencia de purificación de los polipéptidos puede incluir, por ejemplo, una marca de epítopo, una marca FLAG, una secuencia de polihistidina, una fusión GST o cualquier otra subsecuencia de detección/purificación o "marca" conocida en la materia. Estos dominios o subsecuencias adicionales tienen escaso o ningún efecto en la actividad del polipéptido de la invención o pueden eliminarse mediante la aplicación de los pasos de procesamiento postsintesis asi como mediante tratamiento con una peptidasa, la inclusión de una inteína o similares. Cualquier polipéptido de la invención (inclusive cualquier proteina de fusión de la invención) también puede comprender uno o más aminoácidos modificados. El aminoácido modificado puede ser, por ejemplo, un aminoácido glicosilado, un aminoácido PEGilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido conjugado con una porción lipídica, y/o un aminoácido conjugado con un agente orgánico derivatizante. La presencia de aminoácidos modificados puede ser ventajosa para, por ejemplo, (a) aumentar la semivida del polipéptido sérico y/o la semivida in vivo funcional, (b) reducir la antigenicidad o la inmunogenicidad del polipéptido, (c) aumentar la estabilidad de almacenamiento del polipéptido, (d) aumentar la biodisponibilidad, (e) disminuir la función efectora, y/o (f) disminuir o inhibir la libre asociación no deseada (por ejemplo, la formación de agregados) entre dos o más moléculas de la invención (como entre dos o más dímeros de la proteina de fusión dé la invención). El(los) aminoácido(s) se modifica(n), por ejemplo, de forma cotraslacional o postraslacional durante la producción recombinante (por ejemplo, la glicosilación ligada a N en los motivos N-X-S/T durante la expresión en las células de un mamífero) o se modifica(n) por medios sintéticos. Los polipéptidos de la invención (inclusive las proteínas de fusión de la invención) que aquí se establecen pueden además modificarse de distintos modos, por ejemplo, mediante la modificación postraslacional y/o la modificación sintética o la variación. Por ejemplo, los polipéptidos o las proteínas de fusión de la invención pueden glicosilarse de forma adecuada, típicamente por medio de la expresión en la célula de un mamífero. Por ejemplo, en un aspecto, la invención proporciona polipéptidos glicosilados que son capaces de unirse a CD86 y/o CD80, y/o tienen la capacidad de suprimir una respuesta inmunitaría (por ejemplo, la proliferación o la activación de células T) como se establece en otra parte del presente documento, donde cada polipéptido glicosilado mencionado comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222. Los polipéptidos de la invención pueden estar sujetos a cualquier cantidad de formas adicionales adecuadas de modificación o variación postraslacional y/o sintética. Por ejemplo, la invención proporciona proteínas miméticas de los polipéptidos de la invención. Los péptidos miméticos se establecen en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.668.1 10 y las referencias allí contenidas. En otro aspecto, un polipéptido o una proteína de fusión de la invención pueden modificarse con la adición de grupos protectores de las cadenas laterales de uno o más de los aminoácidos del polipéptido o de la proteína de fusión. Estos grupos protectores pueden facilitar el transporte del polipéptido o de las proteínas de fusión a través de la(s) membrana(s), si se lo desea, o a través de algún(os) tejido(s), por ejemplo, reduciendo la hidrofilicidad y aumentando la lipofilicidad del polipéptido o la proteína de fusión. Los ejemplos de grupos protectores incluyen grupos protectores de ester, grupos protectores de amino, grupos protectores de acilo y grupos protectores de ácido carboxílico, que son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.121.236). Las proteínas de fusión sintéticas de la invención pueden tomar cualquier forma adecuada. Por ejemplo, la proteína de fusión puede modificar estructu raímente su configuración, lo que ocurre de forma natural para formar un péptido cíclico u otro péptido modificado estructuralmente. Los polipéptidos de la invención también pueden conectarse a uno o más polímeros no priónicos, típicamente un polímero hidrofílico sintético, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol | o polioxialquileno, usando técnicas bien conocidas en la materia, como se establece en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 4.179.337, 4.301.144, 4.496.689, 4.640.835, 4.670.417 y 4.791.192 o un polímero similar como polivinilalcohol o polivinilpirrolidona (PVP). í La invención incluye conjugados que comprenden al menos ¡un polipéptido de la invención (por ejemplo, el polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante, CTLA-4-lg muíante dimérica o monomérica, el polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante multimérico, CTLA-4-lg mutante multimérica) y una porción sin polipéptidos. El término "conjugado" (o indistintamente "polipéptido conjugado") pretende señalar una molécula heterogénea (compuesta; o quimérica) formada por la unión covalente de uno o más polipéptido(s) con una o más porciones sin polipéptidos. El término "unión covalente" significa que el polipéptido y la porción sin polipéptidos están covalentemente unidos Í entre sí de forma directa o covalentemente unidos entre sí de forma indirecta i mediante una porción o porciones intervinientes, como una porción o porciones puente, espaciadoras o conectoras usando un grupo de unión i presente en el polipéptido. Preferentemente, el conjugado es soluble en concentraciones y condiciones pertinentes, es decir, es soluble en fluidos fisiológicos, como la sangre. Los ejemplos de polipéptidos conjugados de la invención incluyen polipéptidos glicosilados y/o PEGilados. El término "polipéptido no conjugado" puede usarse para hacer referencia a la parte polipeptidica del conjugado. Este conjugado típicamente se une a CD80 (por ejemplo, hCD80) y/o CD86 (por ejemplo, hCD86) y/o un dominio extracelular de cualquiera o de ambos (inclusive hCD80-lg y/o hCD86-lg), y/o tiene la capacidad de inhibir una respuesta inmunitaria. Esta respuesta inmunitaria puede comprender, pero sin limitación, por ejemplo, la activación o la proliferación de las células T, la producción/síntesis de citocina, la inducción de los marcadores de activación, la producción de moléculas inflamatorias, la inflamación, la producción de Ab anticolágeno, y/o la respuesta del Ab dependiente de células T. Los polipéptidos ejemplares incluyen los que tienen una identidad de al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia seleccionada del grupo de las SEQ ID NO: 1 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222. El término "porción sin polipéptidos" pretende señalar la molécula que es capaz de conjugarse con un grupo de unión de un polipéptido de la invención. Los ejemplos preferidos de esta molécula incluyen moléculas de polímeros, porciones de azúcar, compuestos lipofílicos, o agentes orgánicos derivatizantes. Cuando se la utiliza en el contexto de un conjugado como se establece aquí, se entenderá que la porción sin polipéptidos está conectada a la parte polipeptidica del conjugado mediante un grupo de unión del polipéptido. El término "molécula de polímero" se define como una molécula formada por una unión covalente de dos o más monómeros, donde ninguno de los monómeros es un residuo de aminoácido, excepto por el polímero que es una albúmina humana u otra proteína abundante en el plasma. El término "polímero" puede usarse indistintamente con el término "molécula de polímero". Un sitio de N-glicosilación tiene la secuencia N-X-Sfl7C, donde X es cualquier residuo de aminoácido excepto prolina, N es asparagina y S T/C es serina, treonina o cisteína, preferentemente serina o treonina, y más preferentemente treonina. Un "sitio de O-glicosilación" comprende el grupo OH de un residuo de serina o treonina. El término "grupo de unión" pretende señalar a un grupo de residuos de aminoácidos del polipéptído capaz de acoplarse con la porción sin polipéptidos pertinente, como una molécula del polímero o una porción de azúcar. En el cuadro 2 a continuación se proporcionan los ejemplos no excluyentes de los grupos de unión útiles y algunas porciones sin polipéptidos correspondientes.

CUADRO 2 Grupos de unión útiles y ejemplos de las porciones sin polipéptidos correspondientes. Grupo de Aminoácido Ejemplos de Ejemplos del Referencia unión porciones sin procedimiento de polipéptidos conjugación / PEG activado -NH2 Extremo amino Polímero, por mPEG-SPA Nektar Inc. 2003 Catalog; véase terminal ejemplo, PEG mPEG2-NHS también Nektar Therapeutics, Lys mPEG2- 2005-06 Catalog butyrALD -COOH Extremo Polímero, por mPEG-Hz Nektar, Inc. 2003 Catalog; véase carboxilo ejemplo, PEG Acoplamiento in también Nektar Therapeutics terminal Porción de azúcar vitro 2005-06 Catalog Asp, Glu -SH Cys Polímero, por mPEG-VS Nektar Inc. 2003 Catalog; Nektar ejemplo, PEG mPEG2- AL Therapeutics 2005-2006 Catalog; (mPEG- Delgado et al, Critical Reviews in Porción de azúcar maleimida) Therapeutic Drug Carrier Systems Acoplamiento in 9(3.4):249-304 (1992) vitro -OH Ser, Thr, OH- Porción de azúcar Glicosilación conectada con 0- in vivo -CONH2 Asn como parte Porción de azúcar N glicosilación in de un sitio de vivo N- glicosilación Residuo Phe, Tyr, Trp Porción de azúcar Acoplamiento in aromático vitro -CONH2 Gln Porción de azúcar Acoplamiento in Yan y Wold, Biochemistry, 1984, vitro Jul 31 ; 23(16): 3759-65 Aldehido Carbohidrato Polímero, por PEGilación Andresz et al, 1978, Makromol. Cetona oxidado ejemplo, PEG Chem. 179:301 ; WO 92/16555, PEG-hidrazida WO 00/23114 Guanidina Arg Porción de azúcar Acoplamiento in Lundblad y Noyes, Chemical vitro Reagents for Protein Modification, CRC Press Inc. Boca Ratón, Fl Anillo His Porción de azúcar Acoplamiento in Véase la guanidina imidazó-lico vitro Para la N-glicosilación in vivo, el término "grupo de unión" se utiliza de manera poco convencional para indicar los residuos de aminoácidos que conforman un sitio de N- glicosilación (con la secuencia N-X-S/T/C, donde X es cualquier residuo de aminoácido excepto prolina, N es asparagina y S/T/C es serina, treonina o cisteína, preferentemente serina o treonina y más preferentemente treonina). Aunque el residuo de asparagina del sitio de N-glicosilación es al que se une la porción de azúcar durante la glicosilación, esta unión no puede efectuarse a menos que los otros residuos de aminoácidos del sitio de la N-glicosilación estén presentes. Concordantemente, cuando una porción sin polipéptidos es una porción de azúcar y la conjugación se alcanza por N-glicosilación, el término "residuo de aminoácido que comprende un grupo de unión para la porción sin polipéptidos", según se lo emplea en conexión con las alteraciones de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la invención, se entenderá como la alteración de uno, dos o todos los residuos de aminoácidos que conforman el sitio de la N-glicosilación de manera tal de introducir un sitio de N-glicosilación funcional en la secuencia de aminoácidos, eliminar dicha secuencia o retener un sitio de N- glicosilación funcional en la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, a través de la sustitución de un residuo de serina que ya conforma el sitio de N- glicosilación con un residuo de treonina y viceversa). El término "introducir" (es decir, un residuo de aminoácido "introducido" o la "introducción" de un residuo de aminoácido) pretende ante todo significar la sustitución de un residuo de aminoácido ya existente con otro residuo de aminoácido, pero también puede significar la inserción de un residuo de aminoácido adicional. \ El término "eliminar" (es decir, un residuo de aminoácido "eliminado" o la "eliminación" de un residuo de aminoácido) pretende ante todo significar la sustitución del aminoácido que se eliminará con otro residuo de aminoácido, pero también puede significar la eliminación (sin sustitución) del i residuo de aminoácido que será eliminado. El término "residuo de aminoácido que comprende un grupo de unión para la porción sin polipéptidos" pretende indicar que el residuo de aminoácido es uno al que se une (en el caso de un residuo de aminoácido introducido) o se hubiera unido (en el caso de un residuo de aminoácido eliminado) la porción sin polipéptidos. i Al eliminar y/o introducir residuos de aminoácidos que comprenden un grupo de enlace para la porción no polipeptídica, es posible adaptar específicamente el polipéptido de la invención de modo que ; la molécula se vuelva más susceptible a la conjugación de la porción no polipeptídica de elección, para optimizar el patrón de conjugación (por ejemplo, para asegurar una distribución óptima de las porciones no polipeptídicas en la superficie del polipéptido y de ese modo, por ejemplo, proteger eficazmente los epítopos y otras partes superficiales del polipéptido sin afectar significativamente su función). Por ejemplo, mediante Ja introducción de grupos de enlace, el polipéptido se ve alterado en el contenido de los residuos de aminoácidos específicos a los que se une la porción no polipeptídica relevante, a través de lo cual se logra una conjugación más eficaz, específica y/o exhaustiva. Mediante la remoción de uno o más grupos de enlace, es posible evitar la conjugación con la porción no polipeptídica en partes del polipéptido donde dicha conjugación no es ventajosa, por ejemplo, a un residuo de aminoácido ubicado en un sitio funcional del polipéptido o próximo a este (puesto que la conjugación en dicho sitio puede provocar la desactivación o la reducción de la unión a CD80 o CD86 o la reducción de la actividad inmunosupresora del conjugado resultante). Además, puede resultar ventajoso eliminar un grupo de enlace ubicado cerca de otro grupo de enlace. El residuo de aminoácido que comprende un grupo de enlace para una porción no polipeptídica, sea ésta un residuo existente o un residuo eliminado o introducido, se selecciona según la naturaleza de la porción no polipeptídica y, en algunos casos, según el procedimiento de conjugación que se utilizará. Por ejemplo, cuando la porción no polipeptídica es una molécula de polímero, como una molécula derivada de polietilenglicol (PEG) u óxido de polialquileno (POA), los residuos de aminoácidos capaces de funcionar como un grupo de enlace pueden seleccionarse del grupo compuesto por cisteína, lisina (y/o el grupo amino N-terminal del polipéptido), ácido aspártico, ácido glutámico, histidina y arginina. Cuando la porción no polipeptídica es una porción de azúcar, el grupo de enlace es un sitio de glicosilación N u O /n vivo o in vitro, preferentemente un sitio de N-glicosilación. En algunos casos, en la parte del polipéptido de CTLA-4 mutante de un conjugado de la invención, se eliminan los grupos de enlaces ubicados en los sitios de unión al receptor, como mediante sustitución del residuo de aminoácido que comprende dicho grupo. En algunos casos, los residuos de aminoácidos que comprenden un grupo de enlace para una porción no polipeptídica, como una cisteína o lisina, frecuentemente no se introducen en el sitio de unión al receptor del polipéptido de CTLA-4 mutante o cerca de este. Puede modificarse un polipéptido de CTLA-4 mutante de la invención para proteger y de ese modo modificar o destruir o desactivar de otro modo un epitopo presente en el polipéptido de CTLA-4 mutante, mediante la conjugación con una porción no polipeptídica. Pueden identificarse los epítopos del polipéptido de CTLA-4 mutante mediante el uso de procedimientos conocidos en la técnica, también conocidos como mapeo de epítopos, véase por ejemplo, Romagnoli et al, J. Biol. Chem. 380(5):553-9 (1999), DeLisser HM, Methods Mol Biol, 1999, 96:1 1-20, Van de Water et al, Clin. Immunol. Immunopathol. 85(3):229-35 (1997), Saint-Remy JM, Toxicology 1 19(1 ):77-81 (1997). La cantidad exacta de grupos de enlace disponible para conjugación y presente en el polipéptido de CTLA-4 mutante depende del efecto que se deba alcanzar mediante la conjugación. El efecto que se obtendrá dependerá, por ejemplo, de la naturaleza y el grado de conjugación (por ejemplo, la identidad de la porción no polipeptídica, la cantidad de porciones no polipeptídicas deseable o posible para conjugación con el polipéptido, donde deberían conjugarse o donde debería evitarse la conjugación, etc.). Por ejemplo, si se desea una inmunogenicidad reducida, la cantidad (y ubicación) del grupo de enlaces debería bastar para proteger la mayoría o todos los epítopos. Esto se obtiene normalmente cuando se protege una proporción mayor del polipéptido de CTLA-4 muíante. La protección eficaz de epítopos se alcanza normalmente cuando la cantidad total de grupos de enlace disponible para conjugación se encuentra en el intervalo de 1 a 6 grupos de enlace, por ejemplo, de 1 a 5, como en el intervalo de 1 a 3, como 1 , 2 ó 3 grupos de enlace. La vida media funcional in vivo puede depender del peso molecular del conjugado, y la cantidad de grupos de enlace necesarios para proporcionar una vida media mejorada y depende por tanto del peso molecular de la porción no polipeptídica en cuestión. Algunos de dichos conjugados comprenden de 1 a 6, por ejemplo, de 1 a 5, como de 1 a 3, por ejemplo, 1 , 2, ó 3 porciones no polipeptídicas, cada una con un peso molecular de alrededor de 100 a 2000 daltons (Da), como de alrededor de 200 Da, alrededor de 300 Da, alrededor de 400 Da, alrededor de 600 Da, alrededor de 900 Da, alrededor de 1000 Da, o alrededor de 2 a 40 kDa, como de alrededor de 2 kDa, alrededor de 5 kDa, alrededor de 12 kDa, alrededor de 15 kDa, alrededor de 20 kDa, alrededor de 30 kDa, alrededor de 40 kDa o alrededor de 60 kDa. En el conjugado de la invención, algunos, la mayor parte o sustancialmente todos los grupos de enlace conjugables están ocupados por la porción no polipeptídica pertinente. El conjugado de la invención puede exhibir una o más de las siguientes propiedades mejoradas: (a) vida media en suero y/o vida media funcional in vivo aumentadas, (b) antigenicidad o inmunogenicidad reducidas, (c) estabilidad de almacenamiento aumentada, (d) biodisponibilidad aumentada, (e) función efectora disminuida, o (f) autoasociación disminuida o inhibida (por ejemplo, formación de agregados disminuida) entre dos o más moléculas de la invención. Por ejemplo, el conjugado puede exhibir una inmunogenicidad reducida en comparación con hCTLA-4 o en comparación con el polipéptido no conjugado correspondiente, por ejemplo, una reducción de al menos 10%, como una reducción de al menos 25%, como una reducción de al menos 50%, por ejemplo, una reducción de al menos 75% en comparación con el polipéptido no conjugado o en comparación con un hCTLA-4. El conjugado puede exhibir una vida media funcional in vivo aumentada y/o vida media en suero aumentada en comparación con una molécula de referencia, como hCTLA-4 o en comparación con el polipéptido no conjugado correspondiente. Los conjugados particulares preferidos son los conjugados en los que la relación entre la vida media funcional in vivo (o vida media en suero) de dicho conjugado y la vida media funcional in vivo (o vida media en suero) de dicha molécula de referencia es al menos de 1.25, como de al menos 1.50, como de al menos 1.75, como de al menos 2, como de al menos 3, como de al menos 4, como de al menos 5, como de al menos 6, como de al menos 7, como de al menos 8. La vida media se determina convenientemente en un animal experimental, como una rata o un mono, y puede basarse en la administración intravenosa o subcutánea. En un aspecto adicional, el conjugado puede exhibir una biodisponibilidad aumentada en comparación con una molécula de referencia como un hCTLA-4 o un polipéptido no conjugado correspondiente. La molécula de polímero que se acoplará al polipéptido puede ser cualquier molécula de polímero adecuada, como un homopolímero o heteropolímero natural o sintético, típicamente con un peso molecular en; el intervalo de 300 a 100.000 Da, como de 300 a 20.000 Da, más preferentemente en el intervalo de 500 a 0.000 Da, aún más preferentemente en el intervalo de 500 a 5000 Da. Los ejemplos de homopolímeros incluyen un poliol (por ejemplo, poli-OH), una poliamina (por ejemplo poli-NH2) y un ácido policarboxílico (por ejemplo poli-COOH). Un heteropolímero es un polímero que comprende uno o más grupos de acoplamiento diferentes, como, por ejemplo, un grupo hidroxilo y un grupo amina. Ejemplos de moléculas de polímero adecuadas incluyen moléculas de polímero seleccionadas del grupo compuesto por óxido de polialquileno (PAO), incluido el polialquilenglicol (PAG), como el polietilenglicol (PEG) y el polipropilenglicol (PPG), PEG ramificados, alcohol polivinílico (PVA), policarboxilato, poli-(vinilpirolidona), anhídrido del ácido polietilen-co-maleico, anhídrido del ácido poliestireno-co-málico, dextrano incluido el carboximetil-dextrano, o cualquier otro biopolímero adecuado para reducir la inmunogenicidad y/o aumentar la vida media funcional in vivo y/o vida media en suero. Otro ejemplo de una molécula de polímero es la albúmina humana u otra proteína plasmática abundante. En general, los polímeros derivados de polialquilenglicol son biocompatibles, no tóxicos, no antigénicos, no inmunogénicos, tienen varias propiedades de solubilidad en agua y son fácilmente excretados de los organismos vivos. PEG es la molécula de polímero que se utiliza preferentemente, puesto que sólo tiene unos pocos grupos capaces de reticulación en comparación, por ejemplo, con polisacáridos como dextrano y similares. En particular, el PEG monofuncional, por ejemplo, monometoxipolietilenglicol (mPEG), es de interés puesto que su química de acoplamiento es relativamente simple (sólo un grupo reactivo está disponible para conjugarse con un grupo de enlace en el polipéptido). Por consiguiente, se elimina el riesgo de reticulación, los conjugados de polipéptidos resultantes son más homogéneos y es más fácil de controlar la reacción de las moléculas de polímero con el polipéptido. Cuando la molécula es PEGilada, comprende habitualmente 1 , 2, 3, 4 ó 5 moléculas de polietilenglicol (PEG). Cada molécula de PEG puede tener un peso molecular de alrededor de 5 kDa (kilodaltones) a 100 kDa, incluido, por ejemplo, alrededor de 10 kDa, alrededor de 12 kDa, alrededor de 20 kDa, alrededor de 40 kDa. Las moléculas de PEG adecuadas son comercializadas por Shearwater Polimers, Inc. y Enzon, Inc. y pueden seleccionarse entre SS-PEG, NPC-PEG, aldehído-PEG, mPEG-SPA, mPEG-SCM, mPEG-BTC, SC-PEG, mPEG tresilado (US 5.880.255) u oxicarbonil-oxi-N-dicarboxiimida-PEG (US 5.122.614).

En un aspecto, la invención proporciona un conjugado aislado o sintético que comprende: (a) un polipéptido de la invención (por ejemplo, un polipéptido del DEC de la CTLA-4 mutante, una CTLA-4-lg dimérica o monomérica mutante, un polipéptido del DEC de la CTLA-4 multimérica mutante, CTLA-4-lg multimérica mutante); y (b) al menos una porción no polipeptídica, como, por ejemplo, de 1 a 10, de 1 a 9, de 1 a 8, de 1 a 7, de 1 a 7, de 1 a 6, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3, 1 , 2 ó 3 porciones no polipeptídicas enlazadas al polipéptido, donde el conjugado se une a CD80 (por ejemplo, hCD80) y/o CD86 (por ejemplo, hCD86) y/o un dominio extracelular o alguno de ellos o ambos (incluidos hCD80-lg y/o hCD86-lg), y/o es capaz de inducir una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta inmunitaria dependiente de células T). Entre los polipéptidos ejemplares se incluyen los que tienen al menos una identidad del 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 1 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222. En algunos casos, el conjugado comprende una porción no polipeptídica. En algunos casos, el conjugado comprende dos, tres, cuatro o más porciones no polipeptídicas. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos del polipéptido del conjugado además comprende una o más sustituciones que introducen cada una un grupo de enlace para la porción no polipeptídica (por ejemplo, mediante la sustitución de un residuo de aminoácido de la secuencia de polipéptidos con un residuo diferente que comprende un grupo de enlace para la porción no polipeptídica, o mediante inserción en la secuencia de polipéptidos de un residuo de aminoácido adicional que comprende un grupo de enlace para la porción no polipeptidica). Un conjugado puede comprender dos o más polipéptidos de la invención. En algunos casos, una porción no polipeptidica está covalentemente enlazada a cualquiera o ambos de los referidos polipéptidos. Si el conjugado comprende dos o más polipéptidos idénticos de la invención, el mismo tipo y la misma cantidad de porciones no polipeptídicas están típicamente enlazadas a cada uno de dichos polipéptidos, normalmente de la misma manera al (a los) grupo(s) de enlace en cada polipéptido. Como se observa anteriormente, la porción no polipeptidica puede comprender, por ejemplo, una molécula de azúcar, que opcionalmente puede enlazarse a un sitio de N-glicosilación, o un polímero, como, por ejemplo, una porción de polietilenglicol. La porción de polietilenglicol NM puede estar covalentemente enlazada a un residuo de cisteína o un residuo de lisina del polipéptido de la invención. En algunos casos, la porción de polietilenglicol está covalentemente enlazada al grupo amino en el extremo N-terminal del polipéptido. Puede describirse un conjugado que comprende un CTLA-4-lg mutante de la invención como un conjugado de CTLA-4-lg muíante de la invención. Se incluyen también multímeros de conjugados. Los conjugados multiméricos incluyen dos o más conjugados, donde al menos un conjugado es un conjugado de la invención que comprende al menos un polipéptido de la invención. Los conjugados en un conjugado multimérico pueden ser, pero no necesariamente, idénticos entre sí.

Como se plantea anteriormente, los polipéptidos de la invención, incluidas las proteínas de fusión de la invención, pueden someterse comúnmente a glicosilación. Los polipéptidos y las proteínas de fusión de la invención pueden someterse además (o modificarse de modo que puedan someterse) a otras formas de modificación postraduccional incluida, por ejemplo, la hidroxilación, la unión de lípidos o derivados de lipidos, la metilación, la miristilación, la pegilación, la fosforilación y la sulfatación. Otras modificaciones postraduccionales a las que pueden someterse un polipéptido o proteína de fusión de la invención incluyen la acetilación, la acilación, la ribosilación de ADP, la amidación, la unión covalente de flavina, la unión covalente de una porción de heme, la unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, la unión covalente de fosfotidilinositol, la reticulación, la ciclización, la formación de enlaces disulfuro, la demetilación, la formilación, la formación de anclaje GPI, la yodinación, la oxidación, el procesamiento proteolítico, la prenilación, la racemización, selenilación, arginilación, y ubiquitinación. Se describen otras modificaciones de proteínas comunes en, por ejemplo, Creighton, anteriormente, Seifter et al, Meth. Enzymol. 18:626-646 (1990), y Rattan et al, Ann. NY Acad. Sci. 663:48-62 (1992). Las modificaciones postraduccionales para polipéptidos o proteínas de fusión exprésadas a partir de ácidos nucleicos en las células huésped varían en función del tipo de huésped o tipo de célula huésped en que se expresa el péptido. Por ejemplo, la glicosilación no ocurre frecuentemente en los huéspedes bacterianos como E. coli y varía considerablemente en los sistemas de baculovirus en comparación con sistemas celulares dé mamíferos. De forma acorde, cuando se desea la glicosilación (lo que es usual para la mayoría de los polipéptidos de la presente invención), un polipéptido o proteína de fusión debería expresarse (producirse) en un huésped glicosilante, en general una célula eucariota (por ejemplo, una célula de mamífero o una célula de insecto). Pueden verificarse las modificaciones al polipéptido o la proteína de fusión en términos de la modificación postraduccional mediante cualquier técnica adecuada, inclusive, por ejemplo, la difracción de rayos X, imágenes de RMN, espectrometría de masas y/o cromatografía (por ejemplo, cromatografía de fase inversa, cromatografía por afinidad o cromatografía gas-líquido). El polipéptido o la proteína de fusión también o alternativamente pueden comprender cualquier cantidad adecuada de aminoácidos no naturales (por ejemplo, aminoácidos ß) y/o aminoácidos alternativos (por ejemplo, selenocisteína), o análogos de aminoácidos, como los enumerados en el manual of Patent Examining Procedure § 2422 (7.a Revisión - 2000), que puede incorporarse mediante síntesis de proteínas, como a través de síntesis de proteínas en fase sólida (según se describe en, por ejemplo, Merrifield, Adv. Enzymol. 32:221-296 (1969) y otras referencias citadas aquí). Puede modificarse adicionalmente un polipéptido o una proteína de fusión de la invención a través de la inclusión de al menos un aminoácido modificado. La inclusión de uno o más aminoácidos modificados puede resultar ventajosa para, por ejemplo, (a) aumentar la vida media en suero de los polipéptidos o la proteína de fusión, (b) reducir la antigenicidad de los polipéptidos o la proteína de fusión o (c) aumentar la estabilidad de almacenamiento de los polipéptidos o la proteína de fusión. El(los) aminoácido(s) se modifican, por ejemplo, cotraduccionalmente o postraduccionalmente durante la producción recombinante (por ejemplo, el sitio de glicosilación ligado a N en los motivos N-X-S/T durante la expresión en células de mamífero) o se modifican por medios sintéticos. Los ejemplos no limitantes de un aminoácido modificado incluyen un aminoácido glucosilado, un aminoácido sulfatado, un aminoácido prenilado (por ejemplo, farnesilado, geranilgeranilada), un aminoácido acetilado, un aminoácido acilado, un aminoácido PEGilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido carbosilado, un aminoácido fosforilado y similares. Hay un sinnúmero de referencias adecuadas para guiar al entendido en la modificación de aminoácidos. Pueden encontrarse protocolos ejemplares en Walker (1998) Protein Protocols en CD-ROM, Human Press, Towata, NJ. El aminoácido modificado puede seleccionarse de un aminoácido glucosilado, un aminoácido PEGilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido conjugado con una porción lipídica, y un aminoácido conjugado con un agente orgánico derivatizante. La invención proporciona además polipéptidos (incluidas las proteínas de fusión) que tienen las características descritas anteriormente que además comprenden secuencias adicionales de aminoácidos que afectan la función biológica (por ejemplo, la inmunogenicidad, la diana y/o la vida media) del polipéptido (o la proteina de fusión).

Un polipéptido o una proteína de fusión de la invención pueden incluir además una secuencia diana distinta o complementaria a una secuencia señal. Por ejemplo, el polipéptido o la proteína de fusión puede comprender una secuencia dirigida a un receptor en un tipo celular particular (por ejemplo, un monocito, una célula dendrítica o una célula asociada) para proporcionar la liberación dirigida del polipéptido en dichas células y/o tejidos relacionados. Se describen anteriormente secuencias señales e incluyen secuencias de localización/anclaje de membrana (por ejemplo, secuencias de paro de transferencias, secuencias de anclaje de GPI) y similares. Un socio de fusión particularmente útil para un polipéptido de la invención (incluida una proteína de fusión de la invención) es una a secuencia peptídica que facilita la purificación del polipéptido, por ejemplo, una subsecuencía de purificación de polipéptidos. Un polinucleótido de la invención puede comprender una secuencia codificante fusionada en marco con secuencia de aminoácidos marcadora que, por ejemplo, facilita la purificación de los polipéptidos codificados. Dichos dominios peptídicos que facilitan la purificación o las subsecuencias de purificación de polipéptidos incluyen, sin limitación, péptidos quelantes de metales, como módulos de histídina-triptofano que permiten la purificación en metales inmovilizados, como un péptido de hexa-histidina u otra secuencia de polihistidina, una secuencia que codifica dicha marca se incorpora en el vector pQE comercializado por QIAGEN, Inc. (Chatsworth, California), una secuencia que se une a una glutationa (por ejemplo, glutationa-S-transferasa (GST)), un marcador de hemaglutinina (HA) (correspondiente a un epitopo derivado de la proteína de hemaglutinina influenza; Wilson et al, Cell 37:767 (1984)), secuencias de proteínas de unión a maltosa, el epitopo FLAG utilizado en el sistema de purificación de extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp, Seattle, WA) (los epítopos FLAG son comercializados por Kodak (New Haven, Connecticut)), un marcador de epitopo E (marca E), tioredoxina (TRX), avidina y similares. Se han descrito en la técnica las marcas de epítopos facilitadores de purificación (véase, por ejemplo, Whitehorn et al, Biotechnology 13:1215-19 (1995)). Un polipéptido puede incluir un marcador e-his que puede comprender una secuencia de polihistidina y una secuencia de anti-e-epítopo (Pharmacy Biotech Catalog); los marcadores e-his pueden fabricarse mediante técnicas estándar. La inclusión de una secuencia de conectores de polipéptidos escindibles con proteasa entre el dominio de purificación y el polipéptido es útil para facilitar la purificación. Los residuos de histidina facilitan la purificación en IMIAC (cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC), según se describe en Porath et al, Protein Expression and Purification 3:263-281 (1992)), mientras que el sitio de escisión de enterocinasa proporciona un procedimiento para separar el polipéptido de la proteína de fusión. Pueden utilizarse también vectores pGEX (Promega, Madison, Wl) para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutationa S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción mediante esferas de ligando-agarosa (por ejemplo, glutationa-agarosa en el caso de fusión de GST) seguido de elución en presencia de ligando libre. Se describen ejemplos adicionales de la purificación de polipéptidos que facilita las subsecuencias y su uso para la purificación proteica en, por ejemplo, la publicación de patente internacional N.°: WO 00/15823. Después de la expresión del polipéptido de interés y su aislamiento a través de dichos socios de fusión o de otra forma según se describe anteriormente, pueden utilizarse pasos de replegamiento de proteínas, según se desee, para completar la configuración de los polipéptidos maduros. Una proteína de fusión de la invención también puede incluir uno o más fragmentos de péptidos o porciones de péptidos adicionales que promueven la detección de la proteína de fusión. Por ejemplo, puede incorporarse un fragmento o porción de péptido indicador (por ejemplo, una proteína de verde fluorescente (GFP), ß-galactosidasa o un dominio detectable de este) en la proteína de fusión. Las moléculas marcadoras adicionales que pueden conjugarse con el polipéptido de la invención incluyen radionucleidos, enzimas, fluoróforos, ligandos de molécula pequeña, y similares. Dichos socios de fusión promotores de detección son particularmente útiles en las proteínas de fusión utilizadas en técnicas de diagnóstico, según se trata en otras partes aquí. En otro aspecto, un polipéptido de la invención puede comprender un socio de fusión que promueve la estabilidad del polipéptido, la secreción del polipéptido (que no sea mediante focalización de señales) o ambas. Por ejemplo, el polipéptido puede comprender un dominio de inmunoglobulina (Ig), como un polipéptido de IgG que comprende una región bisagra de Fe, un dominio CH2 y un dominio CH3, que promueve la estabilidad y/o la secreción del polipéptido.

Los fragmentos de la proteina de fusión de péptidos o las porciones de péptidos pueden asociarse de cualquier manera conveniente. Los distintos fragmentos o porciones de polipéptidos de la proteína de fusión pueden asociarse covalentemente (por ejemplo, por medio de un péptido o enlace disulfuro). Los fragmentos o las porciones de polipéptidos pueden fusionarse directamente (por ejemplo, el extremo carboxílico de una secuencia antigénica o inmunogénica de la invención puede fusionarse con el extremo amino-terminal de una secuencia de purificación o secuencia heteróloga inmunogénica). La proteína de fusión puede incluir cualquier cantidad adecuada de enlaces modificados, por ejemplo, isósteros, dentro o entre las porciones de péptidos. Alternativa o adicionalmente, la proteína de fusión puede incluir un conector de péptidos entre uno o más fragmentos o porciones ¦ I de polipéptidos que incluyen una o más secuencias de aminoácidos que no forman parte de las porciones de péptidos biológicamente activas. Puede utilizarse un conector de péptidos adecuado. Dicho conector puede tener cualquier tamaño adecuado. Típicamente, el conector es menor a alrededor de 30 residuos de aminoácidos, menor a alrededor de 20 residuos de aminoácidos y/o menor a 10 residuos de aminoácidos. El conector predominantemente puede comprender o componerse de residuos neutros de aminoácidos. Se describen en general los conectores adecuados en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.°: 5.990.275, 6.010.883, 6.197.946, y la solicitud de patente europea 0 035 384. Si se desea separar fragmentos de péptidos o porciones de péptidos, puede utilizarse un conector que facilite la separación. Se describe un ejemplo de dicho conector en la patente de EE. UU. N.°: 4.719.326. Los conectores "flexibles", típicamente compuestos por combinaciones de residuos de glicina y/o serina, pueden resultar ventajosos. Se describen ejemplos de dichos conectores, por ejemplo, en McCafferty et al, Nature 348:552-554 (1990), Huston et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988), Glockshuber et al, Biochemistry 29:1362-1367 (1990), y Cheadle et al, Molecular Immunol. 29:21-30 (1992), Bird et al, Science 242:423-26 (1988) y las patentes de EE. UU. N.°: 5.672.683, 6.165.476, y 6.132.992. El uso de un conector también puede reducir la respuesta inmunitaria indeseada a la proteína de fusión creada por la fusión de los dos fragmentos de péptidos o porciones de péptidos, que pueden originar la presencia de un epítopo de CMH I y/o CMH II en la proteína de fusión. Además del uso de un conector, pueden PEGilarse secuencias identificadas de epítopos indeseables o secuencias adyacentes (por ejemplo, mediante la inserción de un residuo de lisinas para promover la adhesión de PEG) para proteger los epítopos identificados de la exposición. Pueden utilizarse otras técnicas para reducir la inmunogenicidad de la proteína de fusión de la invención en asociación con la administración de la proteína de fusión, incluidas las técnicas proporcionadas en la patente de EE. UU. 6.093.699.

Fabricación de polipéptidos Se describen a continuación procedimientos recombinantes para producir y aislar los polipéptidos de la invención (incluidas las proteínas de fusión de la invención). Además de la producción recombinante, los polipéptidos pueden producirse mediante la síntesis directa de péptidos utilizando técnicas de fase sólida (véase, por ejemplo, Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co, San Francisco; Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc 85:2149-2154). Puede realizarse la síntesis de péptidos utilizando técnicas manuales o mediante automatización. Puede lograrse la síntesis automática, por ejemplo, utilizando un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer, Foster City, Calif.) de conformidad con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Por ejemplo, las subsecuencias pueden sintetizarse químicamente por separado y combinarse utilizando procedimientos químicos para proporcionar polipéptidos de CTLA-4 mutantes o fragmentos funcionales de estos. Alternativamente, dichas secuencias pueden ordenarse a partir de muchas compañías que se especializan en la producción de polipéptidos. Más comúnmente, los polipéptidos de la invención se producen mediante la expresión de ácidos nucleicos codificantes y la recuperación de polipéptidos, por ejemplo, según se describe a continuación. La invención proporciona procedimientos para producir polipéptidos (incluidas las proteínas de fusión) de la invención. Uno de dichos métodos comprende introducir en una población de células cualquiera de los ácidos nucleicos descritos aquí, que está ligado operativamente a una secuencia reguladora eficaz para producir los polipéptidos codificados, cultivar las células en un medio de cultivo para producir el polipéptido, y aislar el polipéptido de las células o del medio de cultivo. Se utiliza una cantidad de ácido nucleico suficiente para facilitar la captación por las células (transfección) y/o expresión del polipéptido. El medio de cultivo puede ser cualquiera de los descritos aquí y en los Ejemplos. Los entendidos en la técnica conocen medios adicionales. El ácido nucleico se introduce en dichas células mediante cualquier procedimiento de administración descrito aquí, incluidas, por ejemplo, las inyecciones, los dispositivos de inyección sin aguja, la pistola de genes, la electroporación (por ejemplo, el dispositivo de electroporación de ADN, Inovio Biomedical Corp. (San Diego)), administración transdérmica, la captación pasiva, etc. El ácido nucleico de la invención puede formar parte de un vector, como un vector de expresión recombinante, incluido un vector plasmídico de ADN, un vector viral o cualquier vector descrito aquí. Puede prepararse y formularse el ácido nucleico o el vector que comprende un ácido nucleico de la invención como se describe aquí, anteriormente, y en los Ejemplos que siguen. Puede introducirse dicho ácido nucleico o dicho vector de expresión en una población de células de un mamífero in vivo, o pueden eliminarse células seleccionadas del mamífero (por ejemplo, células tumorales) del mamífero y puede eliminarse el vector de expresión del ácido nucleico ex vivo en la población de dichas células en una cantidad suficiente de modo que la captación y la expresión de los polipéptidos codifique los resultados. O, se produce un ácido nucleico o vector que comprende un ácido nucleico de la invención utilizando células cultivadas in vitro. En un aspecto, el procedimiento para producir un polipéptido de la invención comprende introducir un vector de expresión recombinante en una población de células que comprende cualquier ácido nucleico descrito aquí en una cantidad y fórmula tal que se produzca la captación del vector y la expresión del polipéptido; administrar el vector de expresión a un mamífero a través de cualquier formato de introducción/administración descrito aquí; y aislar el polipéptido del mamífero o de un subproducto del mamífero. Se describen a continuación detalladamente las células huésped, los vectores de expresión, los procedimientos adecuados para transfectar las células huésped con un vector de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la invención, cultivos celulares y procedimientos para producir y recuperar dichos . polipéptidos de un cultivo celular en la sección titulada "Ácidos nucleicos de la invención." Se plantean más adelante los procedimientos adicionales de producción en los Ejemplos. Como se observa anteriormente, los polipéptidos de la invención (que incluyen las proteínas de fusión de la invención) pueden someterse a varios cambios, como una o más inserciones de aminoácidos o ácidos nucleicos, supresiones y sustituciones, tanto conservadoras como no conservadoras, incluidos los casos en los que, por ejemplo, dichos cambios pueden proporcionar ciertas ventajas en su uso, por ejemplo, en su uso o administración terapéuticos o profilácticos o su aplicación diagnóstica. Los procedimientos para fabricar variantes de polipéptidos empleando sustituciones de aminoácidos, supresiones, inserciones y adiciones son comunes en la técnica. Los polipéptidos y sus variantes que tienen [ la capacidad deseada de unirse a CD80 y/o CD86, o un fragmento de estos (por ejemplo, DEC) o la capacidad para suprimir una respuesta inmunitaria in vitro o in vivo, según se describe detalladamente en otras partes aqui, pueden ser fácilmente identificados a través de los ensayos conocidos por los entendidos en la técnica y a través de los ensayos descritos aquí. Véanse, por ejemplo, los ensayos presentados en los ejemplos que siguen. Los ácidos nucleicos de la invención, sobre los que se profundiza más adelante, pueden someterse también a varios cambios, como una o más sustituciones de uno o más ácidos nucleicos en uno o mas codones de modo tal que un codón particular codifique el mismo o distintos aminoácidos, provocando una sustitución conservadora o no conservadora^ o una o más supresiones de uno o más ácidos nucleicos en la secuencia. Los ácidos nucleicos pueden modificarse también para incluir uno o más codones que proporcionan una expresión óptima en un sistema de expresión (por ejemplo, una célula de mamífero o un sistema de expresión de mamífero), mientras que, si así se lo desea, dichos uno o más codones aún codifican el(los) mismo(s) aminoácido(s). Los procedimientos para producir variantes ele ácidos nucleicos empleando sustituciones de ácidos nucleicos, supresiones, inserciones y adiciones, y codones degenerados, son comunes en la técnica, y se identifican fácilmente las variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen las propiedades deseadas descritas aquí (por ejemplo, la capacidad de unirse a CD80 y/o CD86, y/o suprimir una respuesta inmunitaria in vitro o in vivo) utilizando los ensayos descritos aquí. Dichos cambios en los ácidos nucleicos pueden proporcionar ciertas ventajas en su uso o en la administración terapéutica o profiláctica, o aplicación diagnóstica. En un aspecto, los ácidos nucleicos y polipéptidos pueden modificarse de una cantidad de maneras siempre que comprendan una secuencia de ácidos nucleicos o polipéptidos sustancialmente idéntica a la secuencia de ácidos nucleicos de un ácido nucleico codificador del polipéptido de CTLA-4 muíante respectivo o polipéptido de CTLA-4 mutante de la invención, respectivamente.

Acidos nucleicos de la invención La invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes (a los que se hace referencia también aquí como polinucleótidos), a los que se hace referencia colectivamente como "ácidos nucleicos de la invención" (o "polinucleótidos de la invención"), que codifican polipéptidos de la invención. Los ácidos nucleicos de la invención, incluidos todos los descritos a continuación, son útiles para la producción recombinante (por ejemplo, expresión) de polipéptidos de la invención, típicamente a través de la expresión de un vector plasmídico de expresión que comprende una secuencia que codifica el polipéptido o un fragmento de este, como terapéutica, como profiláctica, como herramientas de diagnóstico, como sondas de diagnóstico para determinar la presencia de ácidos nucleicos complementarios o parcialmente complementarios (incluida la detección de un ácido nucleico de CTLA-4 natural). Por ejemplo, los ácidos nucleicos de la invención, incluidos todos los descritos a continuación, son útiles porque codifican polipéptidos que son útiles para suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria (por ejemplo, la activación de las células T, la proliferación de las células T, la síntesis de citocina o su producción (por ejemplo, la producción de TNF-a, IFN-?, IL-2), la inducción de marcadores de activación (por ejemplo, CD25, receptor de IL-2), la inflamación, la producción de anticuerpos anticolágeno, y/o la respuesta de anticuerpos dependientes de células T), las aplicaciones in vitro y/o in vivo, inclusive, por ejemplo, los procedimientos profilácticos y/o terapéuticos para tratar enfermedades del sistema inmunitario, trastornos, y afecciones donde se desea suprimir una respuesta inmunitaria (por ejemplo, procedimientos para tratar enfermedades autoinmunes y trastornos y procedimientos para inhibir el rechazo de un tejido, una célula, o un trasplante de órganos de un donante por un receptor). También, pueden incorporarse ácidos nucleicos de la invención en vectores de expresión útiles para terapia génica, vacunación de ADN, y terapia inmunosupresora. Se describen en otras partes aquí los usos adicionales de los ácidos nucleicos y los vectores de la invención que comprenden dichos ácidos nucleicos. En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los polipéptidos (incluida cualquier proteína de fusión, etc.) de la invención descritos anteriormente en la sección titulada "Polipéptidos de la invención" y en otras partes aquí. La invención también proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una combinación de dos o más de cualquiera de los polipéptidos (incluida cualquier proteína de fusión) de la invención descritos anteriormente y en otras partes aquí. Se incluye también un ácido nucleico que codifica cualesquiera polipéptidos de la invención, como, por ejemplo, polipéptidos de DEC de CTLA-4 muíante o la proteína de fusión CTLA-4-lg muíaníe, que comprende una secuencia de codones susíancialmente optimizada para la expresión en un huésped mamífero, como un humano. Por ejemplo, en un aspeclo, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene al menos una identidad de secuencia de 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este, donde el polipéptido se une a CD80 y/o CD86 o un fragmento de polipéptido de CD80 y/o CD86 (por ejemplo, un dominio extracelular de CD80 y/o CD86) y/o suprime una respuesta ¡nmunitaria in vitro y/o in vivo, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. Se incluye información adicional sobre las propiedades funcionales y las características de dichos polipéptidos atrás en "Polipéptidos de la invención." Algunos de dichos ácidos nucleicos codifican un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una longitud de aminoácidos de alrededor o igual a la longitud de aminoácidos del DEC de hCTLA-4 como, por ejemplo, de 110 a 138, de 112 a 132, de 118 a 130, de 119 a 129, de 120 a 128, de 121 a 127, de 122 a 126, de 123 a 125 ó 124 residuos de aminoácidos. Los ácidos nucleicos ejemplares que codifican los polipéptidos del DEC de CTLA-4 muíante que comprenden las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 1 a 73, sin limitación, por ejemplo, ácidos nucleicos que tienen secuencias de nucleótidos establecidas en la SEQ ID NO: 80 a 152, respectivamente. Por ejemplo, un ácido nucleico ejemplar que codifica el polipéptido mostrado en la SEQ ID NO: 1 (clon D3-1) es el ácido nucleico mostrado en la SEQ ID NO: 80. Se incluyen también fragmentos de cualquiera de dichos ácidos nucleicos, donde dicho fragmento codifica un polipéptido que se une a CD80 y/o CD86 y/o un DEC de cualquiera de ellos o ambos, y/o que tiene la capacidad para suprimir una respuesta ¡nmunitaria. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido (por ejemplo, polipéptidos del DEC de CTLA-4 muíante) que comprende una secuencia de polipéptidos (a) que difiere de una secuencia de polipéplidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73 en no más de 6 residuos de aminoácidos (por ejemplo, no más de 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 residuos de aminoácidos), y (b) donde el residuo de aminoácido en la secuencia de polipéptidos en la posición 41 , 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 ó 85 es idéntica al residuo de aminoácido en la posición correspondiente de dicha secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73, donde el polipéptido se une a CD80 y/o CD86 y/o un dominio extracelular de cualquiera de ellos o ambos, y/o inhibe una respuesta inmunitaria in vitro y/o in vivo, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. Esto es, no se elimina ni sustituye el residuo de aminoácido en dicha posición 41 , 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 ó 85 en dicha secuencia de polipéptidos seleccionada. Algunos de dichos ácidos nucleicos codifican polipéptidos que comprenden una secuencia que difiere de la secuencia de polipéptidos seleccionada en no más de 6 residuos de aminoácidos y que incluye residuos de aminoácidos en las posiciones 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13 y/ó 14 seleccionados de las posiciones de aminoácidos 24, 30, 32, 41 , 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70, 85, 104 y 106 que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la posición correspondiente en la secuencia de polipéptidos seleccionada. Dichos polipéptidos pueden diferir de la secuencia de polipéptidos seleccionada mediante supresión(es), adición(es) y/o sustitución(es) de aminoácido(s). Una sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución conservadora o no conservadora. Se analizan las sustituciones conservadoras ejemplares en la sección titulada "Variación de secuencias". Algunos de dichos polipéptidos comprenden una secuencia que tienen una longitud de alrededor de 118 a 130, 1 19 a 129, 120 a 128, 121 a 127, 122 a 126, 123 a 125 ó 124 residuos de aminoácidos. El texto anterior contiene información adicional sobre las propiedades funcionales y características de dichos polipéptidos. Los ácidos nucleicos ejemplares incluyen, sin limitación, por ejemplo, los que comprenden las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 80 a 152. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido (por ejemplo, DEC de CTLA-4 mutante) que comprende una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de la secuencia de polipéptidos del dominio extracelular de CTLA-4 humano mostrado en la SEQ ID NO: 159 en no más de 6 residuos de aminoácidos, y (b) comprende al menos una sustitución de aminoácidos en una posición de aminoácido correspondiente a una posición 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 u 85 relativa a la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 159, donde el polipéptido se une a hCD80 y/o hCD86 y/o un DEC de cualquiera de ellos o ambos, y/o inhibe una respuesta inmunitaria in vitro y/o ¡n vivo, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. Algunos de dichos ácidos nucleicos codifican polipéptidos que comprenden 2, 3, 4, 5 ó 6 sustituciones de aminoácidos en las posiciones relativas a las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 159 seleccionadas del grupo compuesto por la posición 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 y 85. Algunos de dichos ácidos nucleicos que codifican polipéptidos además comprenden una sustitución de aminoácidos en una posición correspondiente a una posición 104 y/o 30 relativa a la SEQ ID NO: 159. Algunos de dichos ácidos nucleicos codifican polipéptidos que comprenden al menos una sustitución de aminoácidos relativa a la SEQ ID NO: 159 en la posición 70 (por ejemplo, S70F), la posición 64 (por ejemplo, S64P), la posición 50 (por ejemplo, A50M), la posición 54 (por ejemplo, ?54??/), la posición 65 (por ejemplo, I65S), la posición 56 (por ejemplo, N56D), la posición 55 (por ejemplo, G55E), la posición 85 (por ejemplo, M85A), y/o la posición 24 (por ejemplo, A24E). Cualquiera de dichos polipéptidos puede comprender además una sustitución de aminoácidos relativa a la SEQ ID NO: 159 en la posición 104 (opcionalmente L104E/D, por ejemplo, L104E), la posición 30 (por ejemplo, T30N/D/A), y/o la posición 32 (por ejemplo, V32I). Algunos de dichos ácidos nucleicos codifican polipéptidos que comprenden una o más sustituciones en las posiciones de aminoácidos relativas a la SEQ ID NO: 159 seleccionadas del grupo compuesto por A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S y S70F. Algunos de dichos polipéptidos codificados comprenden una secuencia que tiene una longitud de aminoácidos de alrededor de 118 a 130, 119 a 129, 120 a 128, 121 a 127, 122 a 126, 123 a 125 ó 124 residuos de aminoácidos. El texto anterior contiene información adicional sobre las propiedades funcionales y características de dichos polipéptidos. La invención también proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido (por ejemplo, DEC de CTLA-4 mutante) que comprende una secuencia de polipéptidos que comprende (i) una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con cualquier secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73 y (ii) un residuo de fenilalanina en una posición de aminoácido correspondiente a una posición 70 de dicha secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73, donde el polipéptido se une a hCD80 y/o hCD86 o un DEC de este y/o inhibe una respuesta inmunitaria, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. Algunos de dichos ácidos nucleicos codifican polipéptidos que comprenden uno o más de los siguientes con relación a la secuencia seleccionada: un residuo de ácido glutámico en una posición de aminoácido correspondiente a una posición 24; un residuo de asparagina en una posición de aminoácido correspondiente a una posición 30; un residuo de isoleucina en una posición de aminoácido correspondiente a una posición 32; un residuo de metionina en una posición de aminoácido correspondiente a una posición 50; un residuo de lisina en una posición de aminoácido correspondiente a una posición 54; un residuo de ácido glutámico en una posición de aminoácido correspondiente a una posición 55; un residuo de ácido aspártico en una posición de aminoácido correspondiente a una posición 56; un residuo de prolina en una posición de aminoácido correspondiente a una posición 64; un residuo de serina en una posición de aminoácido correspondiente a una posición 65; y un residuo de ácido glutámico en una posición de aminoácido correspondiente a una posición 104. Algunos de dichos ácidos nucleicos codifican polipéptidos que comprenden una secuencia de polipéptidos que tienen una longitud de alrededor de 118 a 130, 119 a 129, 120 a 128, 121 a 127, 122 a 126, 123 a 125 ó 124 residuos de aminoácidos. El texto anterior contiene información adicional de las propiedades funcionales y las características de dichos polipéptidos. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido (por ejemplo, DEC de CTLA-4 mutante) que comprende una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de la secuencia de polipéptidos de los polipéptidos del DEC de CTLA-4 humano mostrados en la SEQ ID NO: 159 en no más de 6 residuos de aminoácidos, y (b) comprende al menos una sustitución de aminoácidos, donde dicha sustitución de aminoácidos es al menos S70F, donde los residuos de las posiciones de aminoácidos se numeran de conformidad con la SEQ ID NO: 159, donde el polipéptido se une a hCD80 y/o hCD86 (y/o un DEC de cualquiera de ellos o ambos) y/o inhibe una respuesta inmunitaria o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. Algunos de dichos ácidos nucleicos codifican un polipéptido que además comprende al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por A24E, T30N, V32I, D41G, A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S, M85A, L104E y I106F. Algunos de dichos ácidos nucleicos codifican polipéptidos que comprenden una secuencia de polipéptidos que tiene una longitud de alrededor de 118 a 130, 119 a 129, 120 a 128, 121 a 127, 122 a 126, 123 a 125 ó 124 residuos de aminoácidos. El texto anterior contiene información adicional de las propiedades funcionales y las características de dichos polipéptidos. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido (por ejemplo, DEC de CTLA-4 mutante) que comprende una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de la secuencia de polipéptidos mostrada en la SEQ ID NO: 31 en no más de 6 residuos de aminoácidos, y (b) comprende al menos uno de los siguientes: un residuo de metionina en una posición correspondiente a una posición 50 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de lisina en una posición correspondiente a una posición 54 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de ácido glutámico en una posición correspondiente a una posición 55 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de prolina en una posición correspondiente a una posición 64 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de serina en una posición correspondiente a una posición 65 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de fenilalanina en una posición correspondiente a una posición 70 de la SEQ ID NO: 31 , donde el residuo de las posiciones ele aminoácidos se numeran de conformidad con la SEQ ID NO: 31 , y donde el polipéptido se une a CD80 y/o CD86 y/o un DEC de cualquiera de ellos o ambos, y/o inhibe una respuesta inmunitaria o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. Algunos de dichos polipéptidos codificados comprenden un residuo de ácido glutámico en una posición correspondiente a una posición 104, un residuo de ácido de asparagina en una posición correspondiente a una posición 30, y/o un residuo de isoleucina en una posición correspondiente a una posición 32 de la SEQ ID NO: 31.

Algunos de dichos ácidos nucleicos codifican polipéptidos que comprenden una secuencia de polipéptidos que tienen una longitud de alrededor de 118 a 130, 119 a 129, 120 a 128, 121 a 127, 122 a 126, 123 a 125 ó 124 residuos de aminoácidos. El texto anterior contiene información adicional de las propiedades funcionales y las características de dichos polipéptidos. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene una identidad de al menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ó 100% con una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 80 a 158, 201 a 204, 223 y 224, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este, donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que se une a hCD80 y/o hCD86 y/o un DEC de cualquiera de ellos o ambos, y/o suprime una respuesta inmunitaria o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. Los ácidos nucleicos ejemplares que comprenden las secuencias de polinucleótidos identificadas por las SEQ ID NO: 80 a 158 codifican polipéptidos ejemplares que comprenden las secuencias de polipéptidos identificadas por las SEQ ID NO: 1 a 79, respectivamente. Los ácidos nucleicos ejemplares que comprenden las secuencias de polinucleótidos identificadas por las SEQ ID NO: 201 a 204 codifican polipéptidos ejemplares que comprenden las secuencias de polipéptidos identificadas por las SEQ ID NO: 197 a 200, respectivamente. En otro aspecto, la invención incluye un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende: (a) una secuencia de polinucleótidos que tiene una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia de ARN:polinucleótido, donde la secuencia de ARN:polinucleótido comprende una secuencia seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 80 a 158, 201 a 204, 223 y 224 donde se reemplazan todos los residuos de nucleótidos de timina en la secuencia con residuos de nucleótidos de uracilo; (b) una secuencia de polinucleótidos complementaria de (a); o (c) un fragmento de cualquier secuencia de polinucleótidos de (a) o (b), donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que (i) se une a CD80 y/o CD86 y/o un DEC de cualquiera de ellos o ambos, y/o (ii) tiene la capacidad para suprimir una respuesta inmunitaria in vitro o in vivo (por ejemplo, la activación de las células T o su proliferación, la síntesis de citocinas o su producción (por ejemplo, la producción de TNF-a, IFN-?, IL-2), la inducción de marcadores de activación (por ejemplo, CD25, receptor de IL-2), la inflamación, la producción de anticuerpos anticolágeno y/o la respuesta de anticuerpos dependientes de células T), o una secuencia de polinucleótidos de este. La invención incluye un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica cualquier multímero de cualquier polipéptido de la invención descrito anteriormente (por ejemplo, dimero, tetrámero, etc.). Como se analiza más profundamente en otras partes, se forma típicamente un dimero que comprende dos polipéptidos de la invención (incluidas dos proteínas de fusión) durante el procesamiento celular mediante la generación de uno o más enlaces disulfuro covalentes entre residuo(s) de cisteína en un polipéptido y residuo(s) de cisteína en el segundo polipéptido. Pueden formarse otros multimeros de forma similar. Por ejemplo, en un aspecto no limitante, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido dímero recombinante que comprende dos polipéptidos, donde cada uno de dichos polipéptidos comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73, donde el dímero se une a hCD80 y/o hCD86 y/o inhibe una respuesta inmunitaria, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. Se incluye también un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido dímero que comprende dos polipéptidos, donde cada uno de dichos polipéptidos difiere de la secuencia de polipéptidos del DEC de hCTLA-4 (SEQ ID NO: 159) en no más de 6 residuos de aminoácidos y comprende al menos una sustitución en una posición de aminoácido relativa a la SEQ ID NO: 159 seleccionada del grupo compuesto por A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S y S70F; y los polipéptidos opcionalmente además comprende la sustitución L104E, donde dicho dímero se une a hCD80 y/o hCD86 y/o inhibe una respuesta inmunitaria, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. El texto anterior contiene información adicional sobre las propiedades funcionales de dichos dímeros. La invención también proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica cualquier proteína de fusión de la invención, incluida cualquier proteína de fusión multimérica de la invención (por ejemplo, dímeros, tetrámeros, etc.). En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende (a) un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73, y (b) un polipéptido de Ig, donde la proteína de fusión se une a CD80 y/o CD86 (y/o CD80-lg y/o CD86-lg), y/o tiene la capacidad para suprimir una respuesta inmunitaria, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. Los polipéptidos de Ig pueden comprender un polipéptido en Fe de Ig, incluido, por ejemplo, un polipéptido en Fe de Ig que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 184 a 186 y 218. Se forma típicamente una proteína de fusión dimérica que comprende dos de dichas proteínas monoméricas de fusión durante el procesamiento celular mediante la generación de enlaces disulfuro covalentes entre residuos de cisteina en una proteína de fusión monomérica y residuos de cisteina en la segunda proteína de fusión monomérica. Pueden formarse de forma similar otros multimeros. El texto anterior contiene información adicional de las propiedades funcionales y las características de dichas proteínas de fusión. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleotidos que codifica un dímero proteico (por ejemplo, dímero de CTLA-4-lg muíante) que comprende dos proteínas de fusión monoméricas (por ejemplo, CTLA-4-lg muíante monomérico), comprendiendo cada una de las proteínas de fusión monomérica: (a) un polipépíido (por ejemplo, DEC de CTLA-4 muíaníe) que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73, y (b) un polipépíido de Ig, donde el dímero de la proleína de fusión se une a CD80 y/o CD86 (y/o CD80-lg y/o CD86-lg), y/o íiene la capacidad para inhibir o suprimir una respuesfa inmunitaria, o una secuencia de polinucleóíidos complemeníaria de esíe. Las dos proíeínas de fusión monoméricas, al expresarse, se enlazan a fravés dé al menos un enlace disulfuro formado entre dos residuos de cisteína presentes en cada proteína de fusión monomérica de CTLA-4 muíanle. Los polipéptidos de Ig pueden comprender un polipépíido en Fe de Ig, incluido, por ejemplo, un polipépíido en Fe de Ig que comprende una secuencia que íiene una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ó 100% con una secuencia seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 184 a 186 y 218. En algunos casos; el exlremo carboxílico del polipépíido de (a) está covalentemente enlazado o fusionado al exíremo amino-lerminal de los polipéptidos de Fe de Ig de (b). El texto anterior contiene información adicional sobre las propiedades funcionales y características de dichos dímeros. Se incluye típicamente un codón de terminación (por ejemplo, TGA) en el extremo carboxílico de cada secuencia de ácidos nucleicos cuando se incluye la secuencia en un vector de expresión para la expresión de una proteína de interés. Por ejemplo, cada una de las secuencias de nucleótidos de la invención que codifica un polipéptido de CTLA-4 muíante o proteína de fusión CTLA-4 mutante puede además incluir opcionalmente un codón de terminación en el extremo carboxílico, como TAA. El TAA puede ser sustituido por un codón de terminación diferente, como un codón de terminación TGA. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de fusión natural (por ejemplo, hCTLA-4-lg, hCD86-lg, etc.) puede incluir también un codón de terminación en su extremo carboxílico. Cada una de las secuencias de nucleótidos puede además incluir opcionalmente en el extremo amino una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal para facilitar la secreción de un polipéptido de CTLA-4 mutante o proteína de fusión. Los dímeros de proteína de fusión CTLA-4 mutante ejemplares incluyen aquéllos que comprenden la secuencia de polipéptidos mostrada en las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222. Los ácidos nucleicos ejemplares que codifican las proteínas de fusión CTLA-4 de Ig de las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 220 y 222 se establecen en las SEQ ID NO: 153 a 158, 201 a 204 y 223 a 224, respectivamente. Las secuencias de la proteína de fusión de las SEQ ID NO: 205 a 210, 211 a 214, 219 y 221 son idénticas a las secuencias de proteínas de la SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 220, y 222, respectivamente, excepto que las secuencias de proteínas de las SEQ ID NO: 205 a 210 no incluyen el residuo de lisina (K) en el extremo C-terminal; según se explica anteriormente, se cree que el residuo de lisina en el extremo C-terminal predecido, que es codificado por el codón AAA inmediatamente precedente al codón de terminación TAA de cada una de dichas secuencias de polinucleótidos se escinde de la proteína de fusión resultante durante el procesamiento o la secreción. La secuencia de ácidos nucleicos de las SEQ ID NO: 153 a 158, 201 a 204 y 223 a 224 codifican las secuencias de la proteína de fusión de las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 220 y 222, respectivamente, cada una de las cuales, después de la escisión/pérdida del residuo de K en el extremo C-terminal produce las secuencias de la proteína de fusión mostradas en las SEQ ID NO: 205 a 210, 211 a 214, 219 y 221 , respectivamente. Cada una de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 153 a 158, 201 a 204, y 223 a 224 también incluyen en su extremo amino-terminal una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señal mostrado en la SEQ ID NO: 181 ó 215, péptido señal que se escinde en última instancia para formar la proteína de fusión madura. Los residuos de nucleótidos 1 a 111 de cada una de las secuencias de polinucleótidos de las SEQ ID NO: 153 a 158, 201 a 204 y 223 a 224, según recuento desde el extremo amino-terminal de cada una de dichas secuencias de polinucleótidos (se establecen los residuos de nucleótidos 1 a 111 en la SEQ ID NO: 215), codifican el péptido señal de WT hCTLA-4 con 37 residuos de aminoácidos mostrado en la SEQ ID NO: 216, péptido señal que se escinde en última instancia al expresarse a partir del monómero o dímero de la proteína de fusión madura de CTLA-4 mutante; por consiguiente, para cada una de las secuencias de ácidos nucleicos de las SEQ ID NO: 153 a 158, 201 a 204 y 223 a 224, el primer codón que codifica el primer residuo de aminoácido (metionina) de la proteína de fusión de lgG2 madura se compone de los residuos de nucleótidos 112 a 114 de dicha secuencia de nucleótidos. Como se observa anteriormente, en algunos casos, la secuencia peptidica señal puede comprender únicamente residuos de aminoácidos 1 a 35 según se muestra en la SEQ ID NO: 182 y la secuencia de nucleótidos que codifica este péptido señal de 35 residuos de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 181. Sin embargo, los residuos de lisina (K) y alanina (A) codificados en las posiciones 36 y 37, respectivamente (codificados por los dos codones AAA-GCC), no se encuentran presentes en la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante madura resultante y se cree que se escinden de la proteína de fusión madura de CTLA-4-lg mutante durante el procesamiento. La secuencia de proteínas de CTLA-4 mutante maduras típicamente comienza con el residuo de metionina presente en el residuo en la posición de aminoácido 38 de la proteína de fusión CTLA-4 mutante codificada. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un dímero de una proteína de fusión (por ejemplo, un dímero de CTLA-4-lg mutante) que comprende dos proteínas de fusión monoméricas idénticas (por ejemplo, CTLA-4-lg mutante monomérico), donde cada una de dichas proteínas de fusión monoméricas comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por la SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222, donde el dimero de la proteína de fusión se une a CD80 y/o CD86 (y/o a CD80-lg y/o CD86-lg), y/o tiene la capacidad para inhibir una respuesta inmunítaría, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. Se proporciona también un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica dicha proteína de fusión monomérica que se une a CD80 y/o CD86 (y/o a CD80-lg y/o CD86-lg, y/o tiene la capacidad para inhibir una respuesta inmunitaria. Los dímeros de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante ejemplares incluyen aquéllos que comprenden una secuencia de polipéptidos mostrada en las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 220 y 222; los ácidos nucleicos ejemplares que codifican dichas proteínas de fusión de Ig de CTLA-4 mutante, que se expresan como dímeros de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante, incluyen aquéllos que comprenden las secuencias de polinucleótidos mostradas en la SEQ ID NO: 153 a 158, 201 a 204 y 223 a 224, respectivamente. Los dímeros de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante ejemplares adicionales comprenden la secuencia de polipéptidos de las SEQ ID NO: 205 a 210, 21 1 a 214, 219 y 222, que se expresan como dímeros de proteínas de fusión; estas proteínas de fusión carecen de un residuo de lisina en el extremo C-terminal porque típicamente se escinde durante el procesamiento o antes de la secreción. Los ácidos nucleicos ejemplares que codifican estas secuencias de proteínas de fusión con la lisina C-terminal (la lisina se escinde subsiguientemente) incluyen las secuencias de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 153 a 158, 201 a 204 y 223 a 224, respectivamente. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína de fusión, donde dicha proteína de fusión comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de, al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222, donde la proteína de fusión se une a CD80 y/o CD86 (y/o a CD80-lg y/o CD86-lg), y/o tiene la capacidad para inhibir una respuesta inmunitaria, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. En otro aspecto, la invención incluye un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una I identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% cjon una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 153 a 158, 201 a 204 y 223 a 224, donde dicho ácido nucleico que codifica un dímero de proteína de CTLA-4-lg muíante se une a CD80 y/o CD86 (y/o a CD80-lg y/o CD86-lg), y/o tiene la capacidad para inhibir una respuesta inmuniíaria, o una secuencia de polinucleólidos complementaria de este. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un dimero de una proteína de fusión (por ejemplo, un dlmero de CTLA-4-lg muíante) que comprende dos proteínas de fusión monoméricas (por ejemplo, CTLA-4-lg mutante monomérico), donde cada una de dichas proteínas de fusión monoméricas comprende: (1) un polipéptido (por ejemplo, DEC de CTLA-4 mutante) que comprende una secuencia de polipéptidos que difiere de una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73 en no más de 6 residuos de aminoácidos, y donde el residuo de aminoácido en la secuencia de polipéptidos en la posición 41 , 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 ó 85 es idéntica al residuo de aminoácido en la posición correspondiente de dicha secuencia de polipéptidos seleccionada (por ejemplo, un polipéptido seleccionado de las SEQ ID NO: 1 a 73), y (2) un polipéptido en Fe de Ig, donde el dimero se une a CD80 y/o CD86 (y/o CD80-Ig y/o CD86-lg), y/o inhibe una respuesta inmunitaria, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. El texto anterior contiene información adicional sobre las propiedades funcionales y características de dichos dimeros. Se proporciona también un ácido nucleico recombinante o aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína de fusión monoménca que se une a CD80 y/o CD86 (y/o CD80-lg y/o CD86-lg) y/o tiene la capacidad para inhibir una respuesta inmunitaria. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un dímero de una proteína de fusión (por ejemplo, un dímero de CTLA-4-lg muíante) que comprende dos proteínas de fusión monoméricas (por ejemplo, dos CTLA-4-lg mutantes monoméricos), donde cada una de dichas proteínas de fusión monoméricas comprende: (1) un polipéptido del dominio extracelular de CTLA-4 muíante que comprende una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73 en no más de 6 residuos de aminoácidos, y (b) comprende al menos una sustitución de aminoácidos en una posición de aminoácido correspondiente a una posición 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 u 85 relativa a la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 159; y (2) un polipéptido de Ig, donde el dímero de la proteína de fusión se une a CD80 y/o CD86 (y/o CD80-lg y/o CD86-lg), y/o inhibe una respuesta inmunitaria, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. El texto anterior contiene información adicional de las propiedades funcionales y las características de dichos dímeros. Los polipéptidos de Ig pueden comprender un polipéptido en Fe de Ig, incluido, por ejemplo, un polipéptido en Fe de Ig que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 184 a 186 y 218. Algunos de dichos polipéptidos de (a) comprenden al menos una sustitución en una posición de aminoácido relativa a la SEQ ID NO: 159 seleccionada del grupo compuesto por A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S y S70F. Algunos de dichos polipéptidos de (a) además comprenden una sustitución de aminoácidos relativa a la SEQ ID NO: 159 en la posición 104 (por ejemplo, L104E/D), la posición 30 (por ejemplo, T30N/D/A), y/o la posición 32 (por ejemplo, V32I). Se proporciona también un ácido nucleico recombinante o aislado que codifica dicha proteína de fusión monomérica que se une a CD80 y/o CD86 (y/o CD80-lg y/o CD86-lg) y/o tiene la capacidad para inhibir una respuesta inmunitaria. En otro aspecto, la invención incluye un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica un dímero de una proteína de fusión (por ejemplo, un dímero de CTLA-4-lg mutante) que comprende dos proteínas de fusión monoméricas (por ejemplo, CTLA-4-lg mutante monomérico), donde cada una de dichas proteínas de fusión monoméricas comprende: (1) un polipéptido (por ejemplo, DEC de CTLA-4 mutante) que comprende una secuencia de polipéptidos que (i) tiene una identidad de secuencia de al menos 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73 y (ii) incluye un residuo de fenílalanina en una posición de aminoácido correspondiente a una posición 70 de dicha secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 1 a 73; y (2) un polipéptido de Ig, donde el dímero de la proteína de fusión se une a CD80 y/o CD86 (y/o CD80-lg y/o CD86-lg), y/o tiene la capacidad para inhibir una respuesta inmunitaria, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. Los polipéptidos de Ig codificados pueden comprender un polipéptido en Fe de Ig que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 184 a 186 y 218. Algunos de dichos dimeros codificados comprenden uno o más de los siguientes relacionados con dicha secuencia de polipéptidos seleccionada de (1)(i): un residuo de Glu en una posición correspondiente a una posición 24; un Asn en una posición correspondiente a una posición 30; un residuo de He en una posición correspondiente a una posición 32; un residuo de Met en una posición correspondiente a una posición 50; un residuo de Lys en una posición correspondiente a una posición 54; un residuo de Glu en una posición correspondiente a una posición 55; un residuo de Asp en una posición correspondiente a una posición 56; un residuo de Pro en una posición correspondiente a una posición 64; un residuo de Ser en una posición de aminoácido correspondiente a una posición 65; y un residuo de Glu en una posición correspondiente a una posición 104. El texto anterior comprende información adicional de las propiedades funcionales y las características de dichos dimeros. Se proporciona también un ácido nucleico recombinante o aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína de fusión monomérica que se une a CD80 y/o CD86 (y/o CD80-lg y/o CD86-lg) y/o tiene la capacidad para inhibir una respuesta inmunitaria. En otro aspecto, la invención incluye un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica un dímero de una proteína de fusión (por ejemplo, un dímero de CTLA-4-lg mutante) que comprende dos proteínas de fusión monoméricas (por ejemplo, CTLA-4-lg mutante monomérico), donde cada una de dichas proteínas de fusión monoméricas comprende: (1) un polipéptido (por ejemplo, DEC de CTLA-4 mutante) que comprende una secuencia de polipéptidos que (a) difiere de la secuencia de polipéptidos de los polipéptidos del DEC de CTLA-4 humanos mostrados en la SEQ ID NO: 159 en no más de 6 residuos de aminoácidos, y (b) comprende al menos una sustitución de aminoácidos, donde dicha sustitución de aminoácidos al menos comprende S70F, donde dichos residuos en las posiciones de aminoácidos se numeran de conformidad con la SEQ ID NO: 159; y (2) un polipéptido de Fe de IgG, donde dicho dímero se une a hCD80 y/o hCD86 (y/o hCD86-lg y/o hCD86-lg), y/o inhibe una respuesta inmunitaria, o una secuencia de polinucleótidbs complementaria de este. Los polipéptidos de Fe de Ig pueden comprender una secuencia que tiene una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 184 a 186 y 218. Los polipéptidos codificados de (1) pueden comprender además al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por A24E, T30N, V32I, D41G, A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S, M85A, L104E y I106F. El texto anterior contiene información adicional sobre las propiedades funcionales y las características de dichos dimeros. Se proporciona también un ácido nucleico recombinante o aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína de fusión monomérica que se une a CD80 y/o CD86 (y/o CD80-lg y/o CD86-lg) y/o tiene la capacidad para inhibir una respuesta inmunitaria. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica un dímero de una proteína de fusión (por ejemplo, un dímero de CTLA-4-lg mutante) que comprende dos proteínas de fusión monoméricas (por ejemplo, CTLA-4-lg mutante monomérico), donde cada una de dichas proteínas de fusión monoméricas comprende: (1 ) un polipéptido (por ejemplo, DEC de CTLA-4 mutante) que comprende una secuencia de polipéptídos que (a) difiere de la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 31 en no más de 6 residuos de aminoácidos, y (b) comprende al menos uno de los siguientes: un residuo de metionina en una posición correspondiente a una posición 50 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de lisina en una posición correspondiente a una posición 54 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de ácido glutámico en una posición correspondiente a una posición 55 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de prolina en una posición correspondiente a una posición 64 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de serina en una posición correspondiente a una posición 65 de la SEQ ID NO: 31 , un residuo de fenilalanina en una posición correspondiente a una posición 70 de la SEQ ID NO: 31 , donde el residuo en las posiciones de aminoácidos se numeran de conformidad con la SEQ ID NO: 31 ; y (2) un polipéptido de Ig, donde dicho dímero se une a hCD80 y/o hCD86 (y/o hCD86-lg y/o hCD86-lg), y/o inhibe una respuesta inmunitaria, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este. Los polipéptidos de Ig pueden comprender un polipéptido en Fe de Ig, incluido, por ejemplo, un polipéptido en Fe de Ig que comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 184 a 186 y 218. En algunos de dichos dímeros o monómeros, el polipéptido de (1) comprende un residuo de ácido glutámico en una posición correspondiente a una posición 104, un residuo de ácido de asparagina en una posición correspondiente a una posición 30 y/o un residuo de isoleucina en una posición correspondiente a una posición 32 de la SEQ ID NO: 31. El texto anterior contiene información adicional de las propiedades funcionales y las características de dichos dímeros. Se proporciona también un ácido nucleico recombinante o aislado que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica dicha proteína de fusión monomérica que se une a CD80 y/o CD86 (y/o CD80-lg y/o CD86-lg) y/o tiene la capacidad para inhibir una respuesta inmunitaria. Se incluyen también en la invención fragmentos de cualquiera de dichos ácidos nucleicos de la invención descritos anteriormente, donde dicho fragmentos codifican un polipéptido que se une a hCD80 y/o hCD86 y/o un DEC de cualquiera de ellos o ambos, y/o tiene la capacidad para suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria. Muchos fragmentos de estos ácidos nucleicos expresarán polipéptidos que se unen a hCD80 y/o hCD86 o un DEC de estos o suprimen una respuesta inmunitaria, propiedades que pueden identificarse fácilmente con una experimentación razonable. Los fragmentos de nucleotidos típicamente comprenden al menos 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 950, 1000 o más bases de nucleótidos. La invención incluye un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica una proteina que comprende un péptido señal y un polipéptido de la invención (que incluye una proteina de fusión monomérica o dimérica de la invención), como polipéptidos de DEC de CTLA-4 muíante o una proteína de fusión CTLA-4-lg muíante de la invención, que se une a CD80 y/o CD86 y/o suprime una respuesta inmunitaria in vitro o in vivo en ensayos y/o procedimientos según se describe en detalle en otras partes aquí. La secuencia pepíídica señal codificada, que dirige la secreción de los polipéptidos maduros a través de una membrana celular procariota o eucariota, está típicamente covalentemente ligada al exíremo amino terminal de dichos polipéptidos. Puede utilizarse una caníidad de péplidos señal, incluida, por ejemplo, la secuencia peplídica señal establecida en la SEQ ID NO: 182, que está codificada, por ejemplo, por la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 181 , o la secuencia pepíídica señal esíablecida en la SEQ ID NO: 216, que está codificada, por ejemplo, por la secuencia de nucleótidos mosírada en la SEQ ID NO: 215. La invención lambién incluye un ácido nucleico aislado o recombinaníe que codifica una proíeína que comprende un péplido señal, polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes, un dominio íransmembrana y/o un dominio ciíoplásmico como se plantea en detalle anteriormeníe. Puede uíilizarse la secuencia pepíídica señal de longitud completa de la proteína CTLA-4 humana para dirigir la expresión o la secreción de polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes recombinantes o la proteína de fusión CTLA-4 muíante de la invención. En un aspecto, el péptido señal (SP) de la hCTLA-4 comprende los residuos de aminoácidos 1 a 37 de la proteína hCTLA-4; esta secuencia peptídica señal se muestra en la SEQ ID NO: 216. En este caso, la proteína madura hCTLA-4 típicamente comienza con el residuo de metionina en la posición 38, y los residuos de aminoácidos de la proteína madura hCTLA-4 se enumeran de forma acorde comenzando con este residuo de metionina designado como el primer aminoácido (por ejemplo, que ocupa posición 1). Por consiguiente, un péptido señal que comprende la secuencia peptídica mostrada en la SEQ ID NO: 216 puede fusionarse o conectarse al extremo amino (N) terminal de los polipéptidos de DEC de CTLA-4 mutantes o la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante de la invención, como mediante un enlace covalente, para facilitar la expresión o la secreción de los polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes o la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante, respectivamente. Se establece un ácido nucleico ejemplar que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia peptídica señal de hCTLA-4 de la SEQ ID NO: 216 en la SEQ ID NO: 215. Cuando la secuencia peptídica señal de la SEQ ID NO: 216 se fusiona para enlazarse al extremo amino-terminal de los polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes o la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante, al expresarse o secretarse de dichos polipéptidos o proteína de fusión, se escinde el péptido señal; los polipéptidos del DEC de CTLA-4 maduros mutantes resultantes o la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante madura típicamente comienza con el residuo de metionina en la posición 38, y los residuos de aminoácidos de los polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes maduros o la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante madura se enumeran de forma acorde comenzando f? este residuo de metionina designado como el primer aminoácido (por ejemp¡lo, que ocupa la posición 1). La invención incluye polipéptidos aislados o recombinantes que comprenden un péptido señal (por ejemplo, la SEQ ID NO: 216) y polipéptidos de DEC de CTLA-4 mutantes (por ejemplo, una secuencia seleccionada del grupo de las SEQ ID NO: 1 a 73), en los que el péptido señal está covalentemente enlazado al extremo amino-terminal de los polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante. Se incluyen también polipéptidos aislados o recombinantes que comprenden un péptido señal (por ejemplo, la SEQ ID NO: 216) y una CTLA-4-lg mutante (por ejemplo, una secuencia seleccionada del grupo de las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222), donde el péptido señal está covalentemente enlazado al extremo amino-terminal de la CTLA-4-lg mutante. Se proporciona también un ácido nucleico aisladó o recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos (por ejemplo,, la SEQ ID NO: 215) que codifica un péptido señal (por ejemplo, la SEC. N.°: 216) y una secuencia de nucleótidos que codifica polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante (por ejemplo, una secuencia seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 1 a 73) o una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante (por ejemplo, una secuencia seleccionada del grupo de las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 2Q5 a 214 y 219 a 222). En un aspecto alternativo, el péptido señal de la proteina hCTLA-4 de longitud completa comprende los residuos 1 a 35 de la proteina hCTLA-4 de longitud completa; este péptido señal comprende la secuencia peptídica mostrada en la SEQ ID NO: 182. En este caso, los dos residuos de aminoácidos lisina (K) y alanina (A) en las posiciones 36 y 37, respectivamente, de la proteína hCTLA-4 se encuentran sin embargo típicamente ausentes de la proteina hCTLA-4 madura segregada según se determina mediante secuenciación proteica. Por consiguiente, la proteína hCTLA-4 madura resultante comienza de forma similar con el residuo de metionina en la posición 38, y los residuos de aminoácidos de la proteína madura hCTLA-4 se enumeran de forma acorde comenzando con este residuo de metionina en la posición 38 de la proteina hCTLA-4 designado como el primer aminoácido de la proteína madura hCTLA-4. Puesto que los residuos de aminoácidos lisina (K) y alanina (A) en las posiciones 36 y 37, respectivamente, de la proteína hCTLA-4 de longitud completa no se encuentran presentes en la proteína hCTLA-4 madura resultante, se cree que se han escindido de la proteína madura hCTLA-4 durante el procesamiento. Se muestra un ácido nucleico ejemplar que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia peptídica señal de hCTLA-4 (SEQ ID NO: 182) en la SEQ ID NO: 181. Un péptido señal que comprende la secuencia peptídica mostrada en la SEQ ID NO: 182 puede fusionarse o conectarse al extremo amino-terminal de los polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes o la proteína de fusión CTLA-4-lg muíante de la invención, como mediante un enlace covalente, para facilitar la expresión o la secreción de los polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes o la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante, respectivamente. Cuando la secuencia peptídica señal de la SEQ ID NO: 182 se fusiona o conecta al extremo amino-terminal de los polipéptidos de DEC de CTLA-4 mutante o la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante, al expresarse o secretarse el polipéptido o la proteína de fusión, se escinde el péptido señal; los polipéptidos del DEC de CTLA-4 resultantes maduros mutantes o la proteina de fusión CTLA-4-lg mutante madura sin embargo típicamente comienza con el residuo de metionina en la posición 38, y los residuos de aminoácidos de los polipéptidos del DEC de CTLA-4 maduros mutantes o la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante madura se enumeran de forma acorde comenzando con este residuo de metionina designado como el primer aminoácido (por ejemplo, que ocupa posición 1). Puesto que los residuos de aminoácidos lisina (K) y alanina (A) en las posiciones 36 y 37, respectivamente, de la proteína hCTLA-4 de longitud completa no se encuentran presentes en los polipéptidos del DEC de CTLA-4 resultantes maduros mutantes o la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante madura, se cree que se han escindido de dichos polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes o la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante durante el procesamiento. La invención incluye polipéptidos aislados o recombinantes que comprenden un péptido señal (por ejemplo, la SEQ ID NO: 182) y los polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes (por ejemplo, una secuencia seleccionada del grupo de las SEQ ID NO: 1 a 73), donde el péptido señal está covalentemente enlazado al extremo amino-terminal de los polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante. Se incluyen también polipéptidos aislados o recombinantes que comprenden un péptido señal (por ejemplo, la SEQ ID NO: 182) y una CTLA-4-lg mutante (por ejemplo, una secuencia seleccionada del grupo de las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222), donde el péptido señal está covalentemente enlazado al extremo amino-terminal de la CTLA-4-lg mutante. Se proporciona también un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, la SEQ ID NO: 181) que codifica un péptido señal (por ejemplo, la SEQ ID NO: 182) y una secuencia de nucleótidos que codifica polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante (por ejemplo, una secuencia seleccionada del grupo de las SEQ ID NO: 1 a 73) o una proteina de fusión CTLA-4-lg mutante (por ejemplo, una secuencia seleccionada del grupo de las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222). Un ácido nucleico de la invención puede comprender además una o más secuencias de nucleótidos adecuadas adicionales. Por ejemplo, dado que un polipéptido de la invención (que incluye una proteina de fusión de la invención) puede comprender una o más secuencias de polipéptidos adicionales, como, por ejemplo, una subsecuencia de purificación de polipéptidos (como, por ejemplo, se selecciona una subsecuencia de un epítopo marcador, un marcador FLAG, una secuencia de polihistidina, y una fusión de GST), una secuencia peptídica señal, etc., la invención incluye ácidos nucleicos que codifican todos dichos polipéptidos que comprenden dichas secuencias adicionales. Se tratan anteriormente los péptidos señal ejemplares, que al expresarse están típicamente covalentemente ligados al extremo amino terminal de un polipéptido de la invención. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222 puede comprender además un ácido nucleico que codifica un péptido 'señal, como la secuencia peptídica señal de la SEQ ID NO: 182, como, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 181 , o la secuencia peptídica señal establecida en la SEQ ID NO: 216, que son codificadas por, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 215. Dichas secuencias de nucleótidos directamente pueden fusionarse conjuntamente, en un marco de lectura apropiado, de modo que el ácido nucleico resultante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal de la invención y una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención. Puede aislarse un ácido nucleico de la invención a través de cualquier técnica adecuada, muchas de las cuales son conocidas en la técnica. Puede reintroducirse un ácido nucleico aislado de la invención (por ejemplo, un ácido nucleico que se prepara en una célula huésped y subsiguientemente se purifica sustancialmente a través de cualquier técnica de purificación de ácido nucleico adecuada) en una célula huésped o reintroducirse en un ambiente celular u otro ambiente biológico o composición donde ya no es la especie de ácido nucleico dominante y ya no se separa de otros ácidos nucleicos. Prácticamente cualquier ácido nucleico aislado o recombinante de la invención puede insertarse o fusionarse en una molécula de ácido nucleico adecuadamente mayor (incluido por ejemplo, pero sin limitación, un cromosoma, un plásmido, un vector de expresión o cassette, un genoma viral, una secuencia génica, un elemento de expresión lineal, un genoma bacteriano, un genoma de planta, o un cromosoma artificial, como un cromosoma artificial de mamífero (MAC), o las contrapartes de levadura y bacteriana de este (por ejemplo, YAC o BAC) para formar un ácido nucleico recombinante utilizando técnicas estándar. Como ejemplo adicional, puede fusionarse un ácido nucleico aislado de la invención en secuencias de nucleótidos menores, como secuencias promotoras, secuencias inmunoestimuladoras, y/o secuencias que codifican otros aminoácidos, como otros epítopos de antígeno y/o secuencias conectoras para formar un ácido nucleico recombinante. En algunos casos, puede generarse un ácido nucleico sintético o recombinante mediante técnicas de sintesis química aplicadas fuera del contexto de una célula huésped (por ejemplo, un ácido nucleico producido a través de reacción en cadena polimerasa (RCP) o técnicas de síntesis química, ejemplos de lo cual se describen más detalladamente aquí). Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos (incluidas proteínas de fusión) de la invención pueden tener cualquier composición química adecuada que permita la expresión de un polipéptido de la invención u otra actividad biológica deseada (por ejemplo, hibridación con otros ácidos nucleicos). Los polinucleótidos de la invención pueden presentarse en forma de ARN o en forma de ADN, e incluyen ARNm, ARNc, ARN y ADN recombinante o sintético y ADNc. Los ácidos nucleicos de la invención son típicamente moléculas de ADN, y normalmente moléculas de ADN bicatenario. Sin embargo, también se proporciona el ADN monocatenario, el ARN monocatenario, el ARN bicatenario, y los ácidos nucleicos de ADN/ARN híbrido o combinaciones de estos que comprenden cualquiera de las secuencias de nucleótidos de la invención. Un ácido nucleico de la invención puede incluir cualquier base de nucleótido, análogo de base y/o cadena principal adecuados (por ejemplo, una cadena principal formada, o que incluye, un enlace fosfotioato en lugar de fosfodiester, por ejemplo, ADN que comprende una cadena principal de fosfotioato o fosforotioato). Un ácido nucleico de la invención, si monocatenario, puede ser la cadena codificante o la cadena no codificante (por ejemplo, antisentido o complementaria). Además de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutantes codificantes o la CTLA-4-lg mutante), los polinucleótidos de la invención pueden comprender una o más secuencias de nucleótidos codificantes adicionales, de modo de codificar, por ejemplo, una proteína de fusión, una secuencia diana (aparte de una secuencia señal), o similares (ejemplos más particulares de lo cual se plantean más detalladamente aquí), y/o puede comprender secuencias no codificantes de nucleótidos, como intrones, secuencias Analizadoras, ó 5' y/o regiones no traducidas 3', regiones que pueden ser efectivas para expresar la secuencia codificante en un huésped adecuado, y/o elementos de control, como un promotor (por ejemplo, un promotor natural o recombinante o aleatorizado). Las modificaciones a un ácido nucleico son particularmente tolerables en la 3.a posición de una secuencia de codones de ARNm que codifica dicho polipéptido. En aspectos particulares, al menos una porción del ácido nucleico comprende una cadena principal de fosforotioato, que incorpora al menos un análogo de nucleótido sintético en lugar o además de los nucleótidos naturales en la secuencia de ácidos nucleicos. También o alternativamente, el ácido nucleico puede comprender la adición de bases aparte de guanina, adenina, uracilo, timina y citocina. Dichas modificaciones pueden asociarse con una vida media superior, y por consiguiente pueden ser deseables en vectores de ácidos nucleicos de la invención. Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos recombinantes y vectores de ácidos nucleicos (según se establece más detalladamente a continuación), ácidos nucleicos o vectores que comprenden al menos una de las modificaciones antemencionadas, o cualquier combinación de éstas, donde el ácido nucleico persiste por más tiempo en un huésped mamífero que un ácido nucleico sustancialmente idéntico sin dicha modificación o modificaciones. Se proporcionan ejemplos de nucleótidos modificados y/o no citocina, no adenina, no guanina, no timina que pueden incorporarse en una secuencia de nucleótidos de la invención en, por ejemplo, el Manual of Patént Examining Procedure § 2422 (7.a Revisión - 2000). Se entenderá que un ácido nucleico que codifica al menos uno de los polipéptidos de la invención (que incluye una proteína de fusión de la invención), incluidas las descritas anteriormente y en otras partes aquí, no se limita a una secuencia que codifica directamente la expresión o producción de un polipéptido de la invención. Por ejemplo, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que produce un polipéptido de la invención a través de una expresión similar a inteína (según se describe en, por ejemplo, Colson y Davis (1994) Mol. Microbiol. 12(3):959-63, Duan et al. (1997) Cell 89(4):555-64, Perler (1998) Cell 92(1): 1-4, Evans et al. (1999) Biopolymers 51(5):333-42, y de Grey, Trends Biotechnol. 18(9):394-99 (2000)), o una secuencia de nucleótidos que comprende intrones autoempalmantes (u otros transcritos de ARN autoempalmantes), que forman polipéptidos recombinantes intermedios - que codifican secuencias (según se describe en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.°: 6.010.884). El ácido nucleico también o alternativamente puede comprender secuencias que provocan otras modificaciones de empalme a nivel del ARN para producir un transcrito de ARNm que codifica el polipéptido y/o el nivel de ADN a modo de mecanismos transempalme previo a la transcripción (se describen los principios relacionados con dichos mecanismos, por ejemplo, en Chabot, Trends Genet. (1996) 12(11):472-78, Cooper (1997) Am. J. Hum. Genet. 61(2):259-66, y Hertel et al. (1997) Curr. Opin. Cell. Biol. 9(3):350-57). Debido a la degeneración inherente del código genético, varios ácidos nucleicos pueden codificar cualquier polipéptido particular de la invención. Por consiguiente, por ejemplo, cualquiera de los ácidos nucleicos particulares descritos aquí pueden modificarse mediante el remplazo de uno o más codones con un codón equivalente (con respecto al aminoácido exigido por el codón) a partir de la degeneración del código genético. Pueden utilizarse también otras secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que tiene una secuencia idéntica o funcionalmente equivalente a una secuencia de polipéptidos de la invención para sintetizar, clonar y expresar dichos polipéptidos. En general, cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención pueden modificarse para aumentar la expresión en un huésped particular, utilizando las técnicas ejemplificadas aquí con respecto a los ácidos nucleicos descritos anteriormente que codifican un polipéptido de la invención (por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican el DEC de CTLA-4 mutante o CTLA-4-lg mutante). Cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención según se describe aquí pueden estar codón-optimizados para la expresión en un mamífero particular (normalmente humanos). Se conocen en la técnica una cantidad de técnicas para la optimización de codones. Los codones que se utilizan más frecuentemente en un huésped particular se denominan codones óptimos y se clasifican los que no se utilizan muy frecuentemente como codones raros o de uso escaso (véase, por ejemplo, Zhang, S. P. et al. (1991) Gene 105:61-72). Los codones pueden sustituirse para reflejar el uso de codones preferidos del huésped, proceso que se denomina "optimización de ! i ! codones" o "control del sesgo de codones". Pueden utilizarse secuencias codificantes optimizadas que comprenden codones preferidos por un huésped procariota o eucariota particular para aumentar la tasa de traslación o para producir transcritos de ARN recombinantes que tienen propiedades deseables, como una vida media mayor, en comparación con los transcritos producidos a partir de una secuencia no optimizada. Se conocen técnicas para producir secuencias optimizadas por codones (véase, por ejemplo, E. et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17:477-508). Los codones de terminación de translación pueden modificarse también para reflejar la preferencia del huésped. Por ejemplo, los codones de terminación preferidos para S. cerevisiae y mamíferos son UAA y UGA, respectivamente. Los codones de terminación preferidos para las plantas monocotiledóneas es UGA, mientras que los insectos y E. coli prefieren utilizar UAA como codón de terminación (véase, por ejemplo, Dalphin, M.E. et al. (1996) Nuc. Acids Res. 24:216-218).

La disposición de codones en contexto con otros codones también puede influir en las propiedades biológicas de una secuencia de ácidos nucleicos, y .los inventores también contemplan las modificaciones de ácidos nucleicos para proporcionar una disposición contextual de codones común para un huésped particular. Por consiguiente, una secuencia de ácidos nucleicos de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos con codones optimizados, por ejemplo, con una frecuencia optimizada de codones y/o pares de codones optimizados (por ejemplo, el contexto de los codones) para una especie particular (por ejemplo, el polipéptido puede expresarse a partir de una secuencia de polinucleótidos optimizada para la expresión en humanos mediante el reemplazo de codones humanos "raros" basado en la frecuencia de codones o el contexto de los codones, como mediante técnicas como las que se describen en Buckingham et al. (1994) Biochimie 76(5):351-54 y las patentes de Estados Unidos N.°: 5.082.767, 5.786.464, y 6.114.148). Los ácidos nucleicos de la invención pueden modificarse mediante truncamiento o uno o más residuos en la porción del extremo carboxílico de la secuencia. Además, puede incluirse una variedad de codones stop o de terminación al final de la secuencia de nucleótidos, como se plantea más detalladamente a continuación. Pueden incluirse uno o más ácidos nucleicos de la invención en un vector, una célula o entorno del huésped donde una secuencia codificante de nucleótidos de la invención es un gen heterólogo. Los polinucleótidos de la invención incluyen secuencias de polinucleótidos que codifican cualquier polipéptido de la invención (o fragmentos de polipéptidos de este) que se une a CD80 y/o CD86 y/o suprime una respuesta inmunitaria, polinucleótidos que se hibridan al menos en condiciones astringentes a una o más de dichas secuencias de polinucleótidos descritas aquí, secuencias de polinucleótidos complementarias a cualquiera de dichas secuencias de polinucleótidos y variantes, análogos y derivados homólogos de todos los anteriores. Una secuencia codificante hace referencia a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido particular o un dominio, subsecuencia, región o fragmento de dichos polipéptidos. Una secuencia codificante puede codificar un polipéptido de CTLA-4 muíante o fragmento de este que tiene una propiedad funcional, como la capacidad de unirse a CD80 y/o CD86 y/o inhibir o suprimir una respuesta inmunitaria. Un ácido nucleico de la invención puede comprender una secuencia codificante respectiva de un polipéptido de CTLA-4 mutante de la invención y variantes, análogos y sus derivados homólogos. Asimismo, se pueden encontrar ácidos nucleicos de la invención combinados con formulaciones composicionales típicas de ácidos nucleicos, inclusive en presencia de vehículos, tampones, adyuvaníes, excipientes, diluyentes, y similares, como los conocen los entendidos en la técnica. A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de ácidos nucleicos descritos aquí también abarca implícitamente variantes de este modificadas conservadoramente (por ejemplo, sustiíuciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como también la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, pueden realizarse las sustituciones de codones degenerados a través de la generación de secuencias donde la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se susliluye con una base mixta y/o residuos de deoxiinosina (Batzer et al. (1991) Nucí. Acid Res. 19:5081 ; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; Cassol et al. (1992); Rossolini et al. (1994) Mol. Cell. Sondas 8:91-98).

Hibridación de ácidos nucleicos Como se observa anteriormente, la invención incluye ácidos nucleicos que se hibridan a un ácido nucleico diana de la invención, como, por ejemplo, un polinucleótido seleccionado del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 80 a 158, 201 a 204, 223 y 224 o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este, donde la hibridación se realiza sustancialmente sobre la longitud completa del ácido nucleico diana. El ácido nucleico hibridizante puede hibridarse a una secuencia de nucleótidos de la invención, como, por ejemplo, la de la SEQ ID NO: 80, en condiciones astringentes al menos o en condiciones altamente astringentes al menos. Se conocen condiciones de hibridación moderadamente astringentes, astringentes y altamente astringentes para los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos. Se plantean brevemente aquí algunos ejemplos de los factores que pueden combinarse para alcanzar esos niveles de astringencia. Los ácidos nucleicos "se hibridan" cuando se asocian típicamente en solución. Los ácidos nucleicos se hibridan debido a una variedad de fuerzas fisicoquímicas bien caracterizadas, como enlace de hidrógeno, exclusión de disolvente, apilamiento de bases y similares. Para obtener orientación acerca de la hibridación de ácidos nucleicos, se refiere al lector a P. Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry And Molecular Biology — Hybridization with nucleic acid probes , vol. 24, parte I, capítulo 2, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé assays" (Elsevier, NY) (de aquí en adelante "Tijssen"), así como también a Ausubel, supra, Hames y Higgins (1995) Gene PROBES 1 , IRL Press en Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (Hames y Higgins 1) y Hames y Higgins (1995) Gene Probes 2, irl Press en Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (Hames y Higgins 2), en los que se proporciona información acerca de la síntesis, la clasificación, la detección y la cuantificación de ADN y ARN, incluidos los oligonucleótidos. Una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridan entre si en condiciones astringentes al menos. La frase "se híbrida específicamente a" hace referencia a la unión, la duplicación o la hibridación de una molécula únicamente a una secuencia particular de nucleótidos en condiciones astringentes cuando esa secuencia se encuentra presente en una mezcla compleja (por ejemplo, de la célula total) de ADN o ARN. "Se une(n) sustancialmente" hace referencia a una hibridación complementaria entre una sonda de ácido nucleico y un ácido nucleico diana y comprende desajustes menores que pueden acomodarse reduciendo la astringencia del medio de hibridación para alcanzar la detección deseada de la secuencia de polinucleótidos diana. Las "condiciones de lavado de hibridación astringentes" y "condiciones de hibridación astringentes" en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, como hibridaciones Southern y Northern, son dependientes de secuencia y difieren en función de los parámetros ambientales diferentes. Se proporciona una orientación exhaustiva sobre la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993), supra, y en Hames y Higgins 1 y Hames y Higgins 2, supra. En general, se seleccionan condiciones altamente astringentes de modo que la hibridación se produzca a alrededor de 5° C o una temperatura inferior al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. El Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50% de la secuencia de prueba se híbrida a una sonda perfectamente ajustada. En otras palabras, el Tm indica la temperatura a la que el dúplex de ácido nucleico es desnaturalizada en un 50% en condiciones dadas y representa una medida directa de la estabilidad del ácido nucleico híbrido. Por consiguiente, el Tm corresponde a la temperatura correspondiente al punto medio en la transición de la hélice a la espiral al azar; depende de la longitud, la composición de los nucleótidos y la fuerza iónica para largas extensiones de nucleótidps. Típicamente, en "condiciones astringentes," se hibridará una sonda a 'su subsecuencia diana, pero a ninguna otra secuencia. Se seleccionan las "condiciones muy astringentes" de modo que sean iguales al Tm de una sonda particular. Puede estimarse el Tm de un dúplex ADN-ADN a través de la ecuación (1): Tm (°C) = 81.5°C + 16.6 (log10M) + 0.41 (%G + C) - 0.72 (%f) -500/n, donde M es la molaridad de los cationes monovalentes (normalmente Na+), (%G + C) es el porcentaje de nucleótidos de guanosina (G) y citocina (C ), (%f) es el porcentaje de formamida y n es la cantidad de bases de nucleótidos (por ejemplo, longitud) del híbrido. Véase Rapley, R. y Walker, J.M. eds., Molecular Biomethods Handbook (1998), Human Press, Inc., (de aquí en adelante Rapley y Walker), Tijssen (1993), supra. Puede estimarse el Tm de un dúplex de ARN-ADN utilizando la ecuación (2): Tm (°C) = 79.8°C + 18.5 (log10M) + 0.58 (%G + C) - 1 1.8(%G + C)2 - 0.56 (%f) - 820/n, donde M es la molaridad de los cationes monovalentes (normalmente Na+), (%G + C) es el porcentaje de guanosina (G ) y citocina (C ) nucleótidos, (%f) es el porcentaje de formamida y n es la cantidad de bases de nucleótidos (por ejemplo, longitud) del híbrido. Id. Las ecuaciones 1 y 2 anteriores son típicamente precisas únicamente para los dúplex de híbridos más extensos que alrededor de 100 a 200 nucleótidos. Id. El Tm de la secuencia de ácidos nucleicos inferior a 50 nucleótidos puede calcularse de la siguiente manera: Tm (°C) = 4(G + C) + 2(A + T), donde A (adenina), C, T (timina) y G son las cantidades de los nucleótidos correspondientes. En general, se elimina el material de ácido nucleico hibridado mediante una serie de lavados, la astringencia de los cuales puede ajustarse en función de los resultados deseados para realizar el análisis de hibridación. Las condiciones de lavado de baja astringencia (por ejemplo, utilizando más sal y una temperatura más baja) aumentan la sensibilidad, pero pueden producir señales de hibridación no específicas y señales de fondo altas. Las condiciones de mayor astringencia (por ejemplo, utilizando menos sal y una temperatura mayor más cercana a la temperatura de hibridación) reducen la señal de fondo, típicamente la señal específica restante. Se proporciona orientación adicional útil con relación a dichas técnicas de hibridación en, por ejemplo, Rapley y Walker, supra (en particular, con respecto a dichos experimentos de hibridación, parte I, capítulo 2, "Overview of hybridization principies and the strategy of nucleic acid probé assays"), Elsevier, New York, asi como también en Ausubel, supra, Sambrook, supra, Watson, supra, Hames y Higgins (1995) Gene probes 1 , IRL Press en Oxford Univ. Press, Oxford, England, y Hames y Higgins (1995) Gene Probes 2, IRL Press, Oxford Univ. Press, Oxford, Inglaterra. Las condiciones astringentes ejemplares (o astringencia normal) para el análisis de al menos dos ácidos nucleicos que comprenden al menos 100 nucleótidos incluyen la incubación en una solución o en una prueba de Southern o Northern blot que comprende formalina al 50% (o formamida) con 1 miligramo (mg) de heparina a 42°C y la hibridación se lleva a cabo durante la noche. Un lavado astringente normal puede llevarse a cabo utilizando, por ejemplo, una solución que comprende un lavado 0.2x SSC a alrededor de 65°C durante alrededor de 15 minutos (véase Sambrook, supra, para una descripción del tampón SSC). Normalmente, el lavado astringente normal es precedido por un lavado de baja astringencia para eliminar la señal de sonda de fondo. Puede llevarse a cabo un lavado de baja astringencia, por ejemplo, en una solución que comprende 2x SSC a alrededor de 40°C durante alrededor de 15 minutos. Puede llevarse a cabo un lavado altamente astringente utilizando una solución que comprende NaCI 0.15 M a alrededor de 72°C durante alrededor de 15 minutos. Puede llevase a cabo un ejemplo de lavado de astringencia media (normal), menos astringente que el lavado astringente normal descrito anteriormente, para un dúplex, por ejemplo, de más de 100 nucleótidos, en una solución que comprende 1x SSC a 45°C durante 15 minutos. Se lleva a cabo un ejemplo de lavado de baja astringencia para un dúplex, por ejemplo, de más de 100 nucleótidos, en una solución de 4-6x SSC a 40°C durante 15 minutos. Para sondas cortas (por ejemplo, alrededor de 10 a 50 nucleótidos), las condiciones astringentes típicamente involucran concentraciones salinas inferiores a alrededor de ión de Na+ 1.0 M, típicamente una concentración de alrededor de 0.01 a ión de Na+ 1.0 M (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3, y la temperatura es típicamente al menos de alrededor de 30°C. Las condiciones astringentes pueden alcanzarse también con la adición de agentes desestabilizadores, como formamida. Las condiciones de astringencia moderadas ejemplares incluyen la incubación durante la noche a 37°C en una solución que comprende formalina al 20% (o formamida), 0.5x SSC, fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), 5x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido de lavado de filtros en 1x SSC a alrededor de 37 a 50°C, o condiciones sustancialmente similares, por ejemplo, las condiciones moderadamente astringentes descritas en Sambrook, supra, y/o Ausubel, supra. Las condiciones altamente astringentes son condiciones que utilizan, por ejemplo, (1 ) una baja fuerza iónica y una temperatura de lavado alta, como cloruro de sodio 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/dodecil sulfato de sodio al 0.1 % (SDS) a 50°C, (2) emplean un agente desnaturalizante durante la hibridación, como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con 0.1% albúmina de suero bovino (BSA)/Ficoll al 0. %/polivinilpirrolidona (PVP) al 0.1 %/tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C, o (3) emplean formamida al 50% , 5x SSC (NaCI 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1 % , 5x solución de Denhardt, de esperma de salmón sonicado ADN (50 µg/m ), SDS al 0.1 % y sulfato de dextrano al 10% a 42°C, con lavados a (i) 42°C en 0.2x SSC, (ii) a 55°C en formamida al 50%y (iii) a 55°C en 0.1 x SSC (preferentemente en combinación con EDTA). En general, una relación señal a ruido de 2x ó 2.5x-5x (o superior) que la observada para una sonda no relacionada en los ensayos de hibridación particulares indican la detección de una hibridación específica. La detección de al menos hibridación astringente entre dos secuencias en el contexto de la presente invención indica una similitud estructural relativamente fuerte u homología a, por ejemplo, los ácidos nucleicos de la presente invención. Como se observa, las condiciones "altamente astringentes" se seleccionan a alrededor de 5° C o menos con respecto al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos.

Las secuencias diana estrechamente relacionadas o idénticas a la secuencia de nucleótidos de interés (por ejemplo, "sonda") pueden identificarse en condiciones altamente astringentes. Las condiciones de baja astringencia son adecuadas para las secuencias que son menos complementarias. Véase, por ejemplo, Rapley y Walker; Sambrook, supra. Puede utilizarse hibridación comparativa para identificar los ácidos nucleicos de la invención, y este procedimiento de hibridación comparativa es un procedimiento preferido para distinguir los ácidos nucleicos de la invención. La detección de hibridación altamente astringente entre dos secuencias de nucleótidos en el contexto de la presente invención indica una similitud/homología estructural relativamente fuerte a, por ejemplo, los ácidos nucleicos proporcionadas en los listados de secuencias contenidos aquí. Una hibridación altamente astringente entre dos secuencias de nucleótidos demuestra un grado de similitud u homología de estructura, una composición, disposición u orden basada en nucleótidos superior que la detectada en condiciones de hibridación astringentes. En particular, la detección de una hibridación altamente astringente en el contexto de la presente invención indica una fuerte similitud estructural u homología estructural (por ejemplo, una estructura de nucleótidos, composición, disposición u orden de bases) con, por ejemplo, los ácidos nucleicos proporcionadas en la enumeración de secuencias contenida aquí. Por ejemplo, resulta deseable identificar ácidós nucleicos de prueba que se hibridan a los ácidos nucleicos ejemplares contenidos aquí en condiciones astringentes.

Por consiguiente, una medida de hibridación astringente es la capacidad para hibridarse a un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 80 a 158, 201 a 204, 223 y 224, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de este) en condiciones altamente astringentes (o condiciones muy astringentes o condiciones de hibridación astringente ultra alta o condiciones de hibridación astringente ultra-ultra alta). Pueden determinarse fácilmente por vía empírica las condiciones de hibridación astringente (inclusive, por ejemplo, las condiciones de hibridación astringente alta, astringente ultra alta, astringente ultra-ultra alta) y condiciones de lavado para cualquier ácido nucleico de prueba. Por ejemplo, para determinar las condiciones de hibridación altamente astringentes y las condiciones de lavado, se aumentan gradualmente las condiciones de lavado e hibridación (por ejemplo, incrementando la temperatura, disminuyendo la concentración de sal, aumentando la concentración de detergentes y/o aumentando la concentración de disolventes orgánicos, como formalina, en la hibridación o el lavado), hasta alcanzar un conjunto de criterios seleccionados. Por ejemplo, se incrementan gradualmente la hibridación y las condiciones de lavado hasta que una sonda que comprende una o más secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 80 a 158, 201 a 204, 223, y 224 y las secuencias complementarias de polinucleótidos de éstas, se une a una diana complementaria perfectamente coincidente (una vez más, un ácido nucleico que comprende al menos una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo compuesto por las SEQ ID NO: 80 a 158, 201 a 204, 223 y 224 o las secuencias complementarias de polinucleótidos de este), con una relación señal a ruido que es al menos 2.5x, y opcionalmente 5x o más alta que la observada para la hibridación de la sonda a una diana no coincidente. La diana no coincidente puede comprender un ácido nucleico correspondiente a, por ejemplo, un polipéptido de CTLA-4-que codifica una secuencia de ácidos nucleicos. Normalmente, el análisis de hibridación se lleva a cabo en condiciones de hibridación seleccionadas de modo tal que un ácido nucleico que comprende una secuencia que es perfectamente complementaria con una secuencia de nucléotidos de referencia divulgada (o conocida) (por ejemplo, la SEQ ID NO: 80), se híbrida con la secuencia que codifica antígenos recombinantes (por ejemplo, una variante de secuencia de nucleótidos de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 80) con una relación señal a ruido al menos alrededor de 5, 7 ó 10 veces superior que la observada en la hibridación de un ácido nucleico a un ácido nucleico perfectamente complementarios que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos alrededor de 80 ó 90% idéntica al ácido nucleico de referencia. Dichas condiciones pueden considerarse indicativas de la hibridación específica. Pueden ajustarse las condiciones de hibridación anteriormente descritas o seleccionarse condiciones de hibridación alternativas para alcanzar cualquier nivel de astringencia deseado en la selección de la secuencia hibridizante de ácidos nucleicos. Por ejemplo, las condiciones de hibridación altamente astringente y de lavado anteriormente descritas pueden aumentar gradualmente (por ejemplo, aumentando la temperatura, disminuyendo la concentración de sal, aumentando la concentración de detergente y/o aumentando la concentración de disolventes orgánicos, como formalina, en la hibridación o el lavado), hasta dar cumplimiento a una serie de criterios seleccionados. Por ejemplo, pueden aumentarse gradualmente las condiciones de hibridación y lavado hasta la unión de la sonda deseada con una diana complementaria coincidente con una relación señal a ruido que es al menos alrededor de 2.5x, y opcionalmente al menos alrededor de 5x (por ejemplo, alrededor de 10x, alrededor de 20x, alrededor de 50x, alrededor de 100x, o aun alrededor de 500x), que es tan alta como la relación señal a ruido observada a partir de la hibridación de la sonda a un ácido nucleico por fuera de la invención, como un ácido nucleico que codifica polipéptidos WT del DEC de CTLA-4.

Fabricación y modificación de ácidos nucleicos Pueden obtenerse los ácidos nucleicos de la invención y/o generarse a través de la aplicación de cualquier técnica de síntesis, manipulación y/o aislamiento adecuada, o combinaciones de éstas. Se describen los procedimientos ejemplares infra. Por ejemplo, los polinucleótidos de la invención típicamente se producen a través de técnicas de síntesis de ácido nucleico estándar, como técnicas de síntesis en fase sólida conocidas en la técnica. En dichas técnicas, se sintetizan individualmente fragmentos de hasta alrededor de 100 bases normalmente, luego se unen (por ejemplo, mediante procedimientos de ligadura enzimática o química, o procedimientos de recombinacion mediados por polimerasa o procedimientos de recombinación mediados por polimerasa) para formar esencialmente cualquier secuencia de ácidos nucleicos continua deseada. La síntesis de los ácidos nucleicos de la invención también puede verse facilitada (o alternativamente alcanzada), mediante síntesis química utilizando, por ejemplo, el procedimiento clásico de fosforamidita, que se describe, por ejemplo, en Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22: 1859-69, o el procedimiento descrito en Matthes et al. (1984) EMBO J. 3:801-05, por ejemplo, según se practica típicamente en procedimientos sintéticos automáticos. El ácido nucleico de la invención también puede producirse a través del uso de un sintetizador de ADN automático. Se describen otras técnicas para sintetizar ácidos nucleicos y principios relacionados en, por ejemplo, Itakura et al, Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984), Itakura et al, Science 198:1056 (1984) e Ike et al, Nucí. Acid Res. 11 :477 (1983). Convenientemente, pueden ordenarse ácidos nucleicos diseñados a diversas fuentes comerciales, como The Midland Certífied Reagent Company (mcrc@oligos.com), la Great American Gene Company (dirección de sitio web genco.com), ExpressGen Inc. (dirección de sitio web expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA). De forma similar, pueden ordenarse los péptídos y anticuerpos diseñados a medida a una diversidad de fuentes, por ejemplo, PeptidoGenic (pkim@ccnet.com), HTI Bio-products, Inc. (dirección de sitio web htibio.com) y BMA Biomedicals Ltd. (U.K.), Bio.Syntesis, Inc. Pueden obtenerse también ciertos nucleótidos de la invención a través del tamizaje de genotecas de ADNc utilizando sondas de oligonucleótidos que pueden hibridarse a polinucleótidos amplificados por PCR que codifican los polipéptidos de la invención. Los entendidos en la técnica conocen los procedimientos para cribar y aislar clones de ADNc y procedimientos para la amplificación de PCR; se describen más adelante procedimientos ejemplares (véanse, por ejemplo, los procedimientos descritos en los ejemplos que siguen). Dichas técnicas se describen en, por ejemplo, Berger y Kimmel, "Guide to Molecular Cloning Techniques," en Methods in Enzymol. Vol. 152, Acad. Press, Inc., San Diego, CA ("Berger"); Sambrook, supra; y Ausubel, supra. Pueden obtenerse algunos ácidos nucleicos de la invención alterando una cadena principal natural, por ejemplo, mediante mutagénesis, la recombinación ¡n vitro (por ejemplo, transposiciones) o la recombinación de oligonucleótidos. En otros casos, dichos polinucleótidos pueden fabricarse en silicio o a través de procedimientos de recombinación de oligonucleótidos según se describe en las referencias citadas aquí. Se conocen en la técnica las técnicas de ADN recombinante útiles en la modificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, restricción de la digestión de endonucleasa, ligadura, transcripción inversa y producción de ADNc y PCR). Se proporcionan técnicas de ADN recombinantes útiles y principios relacionados con éstas en, por ejemplo, Mulligan (1993) Science 260:926-932, Friedman (1991) Therapy For Genetic Diseases, Oxford University Press, Ibanez et al. (1991) EMBO J. 10:2105-10, Ibanez et al. (1992) Cell 69:329-41 (1992), y las patentes de Estados Unidos N° 4.440.859, 4.530.901 , 4.582.800, 4.677.063, 4.678.751 , 4.704.362, 4.710.463, 4.757.006, 4.766.075, y 4.810.648, y se describen más en particular en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, y la tercera edición de este (2001), Ausubel et al. (1994-1999), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (con Greene Publishing Associates para algunas ediciones), Berger, supra, y Watson, supra.

Secuencia codificante modificada Los ácidos nucleicos de la invención pueden modificarse cuando corresponda para aumentar o mejorar la expresión en un huésped específico mediante la modificación de la secuencia con respecto al uso del codón y/o al contexto del codón, según el(los) huésped(es) específico(s) en que se desea la expresión del ácido nucleico. Los codones que se utilizan más frecuentemente en un huésped específico se llaman codones óptimos y los que no se utilizan muy frecuentemente se califican como codones raros o de escaso uso (véase por ejemplo, Zhang, S. P. et al. (1991) Gene 105:61-72). Los codones pueden sustituirse para reflejar el uso preferido del codón del huésped, un proceso llamado "optimización de codones" o "preferencia codónica para el control de las especies". La secuencia codificante optimizada, que comprende codones preferidos por una célula procariota o eucariota huésped específica, puede usarse para aumentar la tasa de traslación o para producir transcritos de ARN recombinante con propiedades deseables, como una vida media mayor, en comparación con los transcritos producidos a partir de una secuencia no optimizada. Se conocen las técnicas para producir secuencias optimizadas por codones (véase, por ejemplo, Murray, E. et al. (1989) Nucí. Acids Res. 17:477-508). También puede modificarse la traslación del codón de terminación para reflejar al huésped de preferencia. Por ejemplo, el codón de terminación preferido para la levadura de cerveza y los mamíferos es UAA y UGA, respectivamente. El codón de terminación preferido por las plantas monocotiledóneas es el UGA, mientras que los insectos y el E. coli prefieren usar el UAA como codón de terminación (véase por ejemplo, Dalphin, M.E. et al. (1996) Nucí. Acids Res. 24:216-218, para debatirlo). La disposición de lós codones en contexto con otros codones también puede influir en las propiedades biológicas de una secuencia de ácidos nucleicos, y los inventores también contemplan las modificaciones de los ácidos nucleicos para proporcionar una disposición contextual común a los codones para un huésped específico. Por consiguiente, una secuencia de ácidos nucleicos de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos optimizada por codones, por ejemplo, optimizada por la frecuencia de codones y/o par de codones (por ejemplo, el contexto del codón) para una especie específica (por ejemplo, el polipéptido puede expresarse desde una secuencia de polinucleótidos optimizada para la expresión en humanos mediante el reemplazo de codones humanos "raros" a partir de la frecuencia de los codones o el contexto de los codones, empleando técnicas como las establecidas en Buckingham et al. (1994) Biochimie 76(5):351-54 y las patentes de Estados Unidos N° 5.082.767, 5.786.464 y 6.114.148). Por ejemplo, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una variante de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 80, donde la secuencia de nucleótidos variante difiere de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 80 en la sustitución de los codones "raros" por un huésped específico con codones comúnmente expresados en el huésped, codones estos que codifican el mismo residuo de aminoácido que los codones "raros" sustituidos en la SEQ ID NO: 80.

Vectores, componentes de vectores y sistemas de expresión La presente invención también incluye los constructos recombinantes que comprenden uno o más de los ácidos nucleicos de la invención que se establecen anteriormente. Estos constructos pueden comprender un vector, como un plásmido, un cósmido, un fago, un virus, una partícula viral, una partícula semejante a virus, un cromosoma artificial bacteriano (CAB), un cromosoma artificial de levadura (CAL) o similares o un vector no replicador, como un liposoma, un ADN desnudo o conjugado, una microparticula del ADN donde se inserta al menos una secuencia de ácidos nucleicos de la invención, en una orientación directa e inversa. En un aspecto particular de esta realización, el constructo comprende además una o más secuencias reguladoras, incluso, por ejemplo, un promotor, conectado de forma operativa a una secuencia de ácidos nucleicos de la invención (por ejemplo, el ácido nucleico que codifica un polipéptido del DEC de CTLA-4 muíante dimérico o CTLA-4-lg mutante monomérica aislado o recombinante). Los entendidos en la técnica conocen grandes cantidades de vectores y promotores adecuados y que están disponibles comercialmente. En algunos casos, un vector, por ejemplo, un virus o una partícula semejante a virus, también o alternativamente puede incluir uno o más polipéptidos de la invención, por ejemplo, incorporados en la cápsula del virus o de la partícula semejante a virus. Los vectores pueden ser útiles como agentes de introducción para la inserción o la administración de genes o proteínas exógenas a un individuo. Los vectores de la presente invención, incluidos los establecidos aquí, son útiles como agentes de introducción para la inserción o administración de ácidos nucleicos y/o polipéptidos de la invención. Entre los textos generales que establecen aquí técnicas biológicas moleculares útiles, incluso el uso de vectores, promotores y muchos otros temas pertinentes, se incluye a Berger, supra, Sambrook (1989), supra y Ausubel, supra. Los ejemplos de técnicas suficientes para guiar a los entendidos a través de la amplificación de los procedimientos in vitro, inclusive la reacción en cadena de la polimerasa (RCP), la reacción en cadena de la ligasa (RCL), la amplificación de la Q-replicasa y otras técnicas mediadas por los polímeros del ARN (por ejemplo, NASBA), por ejemplo, para la producción de ácidos nucleicos homólogos de la invención se encuentran en Berger, Sambrook, y Ausubel, todos supra, como también en Mullís et al. (1987), la patente de Estados Unidos N° 4.683.202; PCR Protocols: A Guide to Procedures and Applications (Innis et al, eds.) Academíc Press Inc. San Diego, CA (1990) ("Innis"); Arnheim & Levinson (1 de octubre de 1990) C&EN 36-47; The Journal de NIH Research (1991) 3:81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc.

Nati. Acad. Sci. USA 86:1 173-1177; Guatelli et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci.

USA 87:1874-1878; Lomeli et al. (1989) J. Clin. Chem. 35:1826-1831 ; Landegren et al. (1988) Science 241 :1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291-294; Wu y Wallace (1989) Gene 4:560-569; Barringer et al. (1990) Gene 89:117-122, y Sooknanan y Malek (1995) Biotechnology 13:563-564.

En general, la RCP hace referencia a un procedimiento donde cantidades mínimas de una parte específica del ácido nucleico (por ejemplo, el ARN o el ADN) se amplifican mediante procedimientos bien conocidos en la I técnica (véase por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 4.683.195 y otras referencias citadas anteriormente). En general, se utiliza la secuencia de información de los extremos de la región de interés o fuera de estos para estructurar los oligonuleótidos iniciadores. Estos iniciadores serán idénticos o similares en la secuencia a los filamentos opuestos de la plantilla que se amplificará. Los 5' nucleótidos terminales de los filamentos opuestos pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La RCP también puede utilizarse para amplificar las secuencias de ARN específico o de ADN específico, las secuencias de ADN o de ARN recombínantes, las secuencias de ADN y de ARN del ADN genómico total, y el ADNc transcrito del ARN celular total, las secuencias de bacteriófagos o plásmidos, etc. La RCP es un ejemplo, pero no el único ejemplo, de un procedimiento de reacción de la polimerasa de ácido nucleico para amplificar una muestra de prueba del ácido nucleico que comprende el uso de otro ácido nucleico como iniciador (por ejemplo, uno conocido). Los procedimientos mejorados de clonación in vitro de los ácidos nucleicos amplificados se establecen en Wallace et al, patente de Estados Unidos N.° 5.426.039. Los procedimientos mejorados para la amplificación de grandes ácidos nucleicos mediante RCP se resumen en Cheng et al. (1994) Nature 369:684 685 y en las referencias allí citadas, donde se generan los amplicones de la RCP de hasta 40 kilobases (kb). Los entendidos apreciarán que esencialmente cualquier ARN puede convertirse en un ADN bicatenario adecuado para la restricción por digestión, la expansión de la RCP y la secuenciación utilizando transcriptasa inversa y polimerasa. Véase Ausubel, Sambrook, y Berger, todo supra. Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden incorporarse en cualesquiera de una variedad de vectores, por ejemplo, los vectores de expresión, para expresar un polipéptido, incluso, por ejemplo, un polipéptido de la invención. Puede usarse el vector de expresión compatible con las células procariotas huéspedes; estos vectores de expresión en procariotas son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente.

Estos vectores incluyen, sin limitación, por ejemplo, el vector BLUESCRIPT (Stratagene), el vector de expresión T7 (Invitrogen), el vector pET (Novagen) y los vectores procarióticos similares. Alternativamente, pueden utilizarse vectores de expresión compatibles con las células éucariotas huéspedes; estos vectores de expresión en éucariotas son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. Estos vectores incluyen, sin limitación, por ejemplo, los vectores pCMV (por ejemplo, Invitrogen), el vector pIRES (Clontech), el vector pSG5 (Stratagene), pCADN3.1 (Invitrogen Life Technologies), pCADN3 (Invitrogen Life Technologies), el vector de expresión Ubiquitous Chromatin Opening Element (UCOE™) (Millipore), y los vectores de expresión eucarióticos similares. El vector UCOE™ típicamente se utiliza para producir proteínas en células de mamífero (por ejemplo, células CHO). De conformidad con Millipore, la tecnología de expresión de UCOE™ impide la silenciación transgénica y proporciona una expresión estable del gen a alto nivel sin respetar el lugar de integración cromosómica. Véase la página web en la dirección de página web millipore.com. Un vector de expresión UCOE ejemplar en el que, por ejemplo, puede incorporarse un ácido nucleico de la invención es el vector de expresión UCOE denominado CET1019AS-puro-Scel, licenciado por Millipore. La información sobre el vector de expresión CET10 9AS-puro-Scel puede encontrarse en, por ejemplo, John Wynne, "UCOE™ Technology Maximizes Protein Expression," BioProceso International 4(7): 104-105 (julio/agosto de 2006) (RP1725EN00) (disponible *> en la dirección de la página web millipore.com/bibliography/tech1/rp1725en00); se puede obtener información adicional sobre este vector y la licencia de Millipore en la página web de Millipore, inclusive en, por ejemplo, las direcciones de páginas web millipore.com/company/cp3/ucoe_licensing y millipore.com/techpublications/tech1/ps1013en00. Por consiguiente, por ejemplo, una secuencia de ADN que codifica el DEC de CTLA-4 mutante (por ejemplo, la SEQ ID NO: 36 o la SEQ ID NO: 50) fusionada a una secuencia de ADN que codifica un polipéptido del Fe de lgG2 (por ejemplo, la SEQ ID NO: 184), que produce la secuencia de ADN de la SEQ ID NO: 201 , se inserta en un vector UCOE CET1019AS (Millipore) y puede utilizarse el plásmido de ADN resultante para transfectar células huésped. Los vectores de expresión incluyen las secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico o sintético, por ejemplo, los derivados de SV40, los vectores bacterianos (por ejemplo, S. typhimurium, S. typhi, S. flexneri, Listeria monocytogenes, B. anthracis); los plásmidos, los plásmidos bacterianos; el ADN del fago; los baculovirus; los plásmidos de levadura; los vectores derivados de combinaciones del ADN de plásmidos y del fago; ADN viral o vectores de ARN, incluso, por ejemplo, los virus de vacuna o adeno-asociados (VAA), los adenovirus, el virus Semliki-Forest (por ejemplo, Notka et al, Biol. Chem. 380:341-52 (1999), los poxvirus (por ejemplo, el MVA), los alfavirus (por ejemplo, el virus de encefalitis equina venezolana (EEV), el virus de encefalitis equina occidental (EEO), el virus de encefalitis equina oriental (EEE)), el virus de estomatitis vesicular (VEV), el virus de la viruela aviar, la seudorrabia, los virus del herpes simple, los retrovirus y muchos otros. Puede usarse cualquier vector para transducir material genético a la célula y, si se desea la replicación, se puede reproducir y es viable en el huésped pertinente. Pueden atenuarse los vectores virales y bacterianos que actúan como vehículos de inserción; la atenuación debería ser suficiente para disminuir, si no eliminar, la inducción de síntomas de enfermedades no deseados. La Figura 1 es un diagrama esquemático de un vector plásmido de expresión ejemplar pCADN de CTLA-4 muíante que codifica un CTLA-4-lg mutante de la invención. A continuación se proporciona información adicional con respecto a los vectores de expresión adecuados, inclusive en los Ejemplos. Puede emplearse también un vector de la invención que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la invención según se establece aquí, así como también un promotor o una secuencia de control adecuados, para transformar un huésped adecuado para permitir que el huésped exprese la proteína. Los ejemplos de expresión de huéspedes adecuados incluyen: las células bacterianas, como E. coli, Streptomyces, y Salmonella typhimurium las células de los hongos, como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, y Neurospora crassa; las células de los insectos, como Drosophila y Spodoptera frugiperda; las células de los mamíferos, como las del ovario de hámster chino (CHO) (por ejemplo, CHO-K1), COS (por ejemplo, COS-1 , COS-7), las de riñon de hámster bebé (BHK) y las de riñon embrionario humano (HEK) (por ejemplo, HEK 293), las células del melanoma de Bowes y las células vegetales. Se entiende que no todas las células o lineas celulares deben ser capaces de producir los polipéptidos completamente funcionales de la invención o los fragmentos de estos. La invención no está limitada por las células huésped empleadas. A continuación, se proporciona información adicional con respecto a las células huéspéd adecuadas. En los sistemas bacterianos, se puede seleccionar una cantidad de vectores de expresión según el uso que se pretenda dar a los polipéptidos deseados o los fragmentos de estos. Por ejemplo, cuando se necesitan grandes cantidades de un polipéptido específico o fragmentos de este para, la inducción de anticuerpos, es posible que se deseen vectores que dirigen la expresión a alto nivel de las proteínas de fusión fácilmente purificables. Estos vectores incluyen, sin limitación, la clonación multifuncional de E. coli y los vectores de expresión como BLUESCRIPT (Stratagene), donde la secuencia codificante de los nucleótidos de interés (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica un CTLA-4-lg mutante recombinante) puede ligarse! al vector en la misma fase con secuencias para el extremo amino terminal de Met y los 7 residuos subsiguientes de beta-galactosidasa de modo producir una proteína híbrida, los vectores pIN (Van Heeke y Schuster (1989) J. Bibll Chem. 264:5503-5509), los vectores pET (Novagen, Madison Wl) y similares. De forma similar, en la levadura Saccharomyces cerevisiae, pueden utilizarse muchos vectores que comprenden promotores constitutivos o inducibles como el factor alfa, alcohol oxidasa y PGH para la producción de los polipéptidos de la invención. Por reseñas, véase Ausubel, supra, Berger, supra, y Grant et al. (1987) Meth. Enzymol. 153:516-544. En una célula huésped de mamífero, pueden utilizarse varios sistemas de expresión, como los sistemas virales. En los casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, la secuencia codificante se liga opcionalmente a ün complejo de transcripción/traslación del adenovirus compuesto por el promotor tardío y el líder tripartito de la secuencia. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral produce un virus viable capaz de expresar un polipéptido de interés en las células huéspedes infectadas (Logan y Shenk (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :3655-3659). Además, se utilizan los potenciadores de la transcripción, como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (VSR) para aumentar la expresión en las células huéspedes de mamífero. Un vector, por ejemplo, un vector de expresión o un polinucleótido de la invención, puede comprender una o más secuencias de control de la expresión. Una secuencia de control de la expresión está típicamente asociada y/o operativamente conectada a una secuencia de ácidos nucleicos de la invención, como un ácido nucleico que codifica un polipéptido del DEC de CTLA-4 mutante recombinante o una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante recombinante. Una secuencia de control de la expresión es típicamente una secuencia de nucleótidos que promueve, potencia o controla la expresión (típicamente la transcripción) de otra secuencia de nucleótidos. Las secuencias de control de la expresión adecuadas que pueden emplearse incluyen un promotor, que incluye un promotor constitutivo, un promotor inducible, y/o un promotor represible, un potenciador para amplificar la expresión, una secuencia de iniciación, una secuencia de terminación de la traslación, una secuencia de control de empalme y similares. Cuando se incluye un ácido nucleico de la invención en un vector, el ácido nucleico típicamente se conecta de forma operativa con una secuencia de control de la transcripción (promotor) adecuada para dirigir la síntesis del ARNm. Los promotores ejercen un impacto particularmente importante a nivel de los polipéptidos de expresión recombinante. Puede utilizarse cualquier promotor adecuado. Los ejemplos de promotores adecuados incluyen el promotor del citomegalovirus (CMV) con o sin el intrón inicial (intrón A), el promotor del VIH de repetición de terminal larga, el promotor de la fosfoglicerato cinasa (PGK), los promotores del virus del sarcoma de Rous (VSR), como los promotores de VSR de repetición terminal larga (RTL), los promotores SV40, los promotores del virus del tumor mamario de ratón (VTMR), los promotores HSV, como el promotor Lap2 o el promotor de la timidina cinasa del herpes (según se establece en, por ejemplo, Wagner et al. (1981) Proc. Nati. Acad. Sci. 78:144-145), los promotores derivados del virus SV40 o Epstein Barr, los promotores virales adeno-asociados (VAA), como el promotor p5, los promotores de la metalotioneína (por ejemplo, el promotor de la metalotioneína en la oveja o el promotor de la metalotioneína en el ratón (véase, por ejemplo, Palmiter et al. (1983) Science 222:809-814), el promotor de la ubiquitina C humana, los promotores de E. coli, como los promotores de los lac y trp, el promotor PL del fago lambda, y otros promotores que es sabido que controlan la expresión de los genes en las células procariotas o eucariotas (ya sea directamente en la célula o en los virus que afectan las células). Pueden emplearse los promotores que exhiben una fuerte expresión constitutiva en su estado inicial en los mamíferos, especialmente los humanos, como promotores CMV, como el promotor CMV de expresión rápida (que se establece en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.168.062, 5.385.839, 5.688.688 y 5.658.759) y los promotores que tienen una identidad de secuencia sustancial con estos promotores CMV. También, pueden emplearse promotores recombinantes que tienen propiedades potenciadas, como en publicación de la patente internacional N.°: WO 02/00897. Un promotor que está operativamente conectado a un ácido nucleico de la invención para la expresión del ácido nucleico puede contar con cualquier mecanismo adecuado de acción. Por consiguiente, el promotor puede ser, por ejemplo, un promotor "inducible", (por ejemplo, un promotor de hormonas de crecimiento, un promotor de metalotioneína, un promotor de la proteína de choque térmico, un promotor de E1 B, un promotor de hipoxia inducida, un promotor de radiación inducible o un promotor del adenovirus MLP y del líder tripartito), un promotor inducible-represible, un promotor relacionado con la etapa de desarrollo (por ejemplo, un promotor del gen de globina) o un promotor de tejido específico (por ejemplo, un promotor de la célula a-actina del músculo liso, un promotor de la miosina de una cadena liviana 1 o un promotor de la caderina endotelial vascular). Los promotores inducibles adecuados incluyen la ecdisona y los análogos de la ecdisona. Los promotores inducibles análogos de la ecdisona son comercializados, por ejemplo, por Stratagene (La Jolla, CA). Si así se lo desea, puede inducirse un ácido nucleico de la invención empleando un sistema de encendido y apagado, de expresión de genes inducibles. Los ejemplos de estos sistemas de encendido y apagado de expresión de genes incluyen el Sistema de Expresión del Gen Tet-On ™ y el Sistema de Expresión del Gen Tet-Off ™, respectivamente (Clontech, Palo Alto, CA; para una descripción detallada de cada uno de estos sistemas véase, por ejemplo, Clontech Catalog 2000, pp. 110-111). El promotor inducible puede ser cualquier promotor que se encuentre sobre y/o subregulado al responder a una señal apropiada. Los promotores inducibles adicionales incluyen los promotores inducibles por arabinosa, los promotores inducibles por esteroides (por ejemplo, los promotores inducibles por glucocorticoide), así como también los promotores del pH, el estrés y los promotores térmicos. El promotor puede ser, y con frecuencia es, un promotor huésped nativo o un promotor derivado de un virus que infecta un huésped específico (por ejemplo, un promotor de beta-actina, un promotor EF1 humano o un promotor derivado de un AW humano operativamente conectado al ácido nucleico de interés), donde es particularmente importante evitar el silenciamiento de la expresión génica debido a las reacciones ¡nmunológicas del huésped ante las secuencias que no están regularmente presentes en el huésped. También puede utilizarse un sistema de promotores bidireccionales (según se establece en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.017.478) conectado a secuencias de nucleótidos múltiples de interés. Se proporcionan otros promotores y principios adecuados relacionados con la selección, el uso y la construcción de promotores adecuados en, por ejemplo, Werner (1999) Mamm Genome 0(2): 168-75, Walther et al. (1996) J. Mol. Med. 74(7):379-92, Novina (1996) Trends Genet. 12(9):351-55, Hart (1996) Semin. Oncol. 23(1 ):154-58, Gralla (1996) Curr. Opin. Genet. Dev. 6(5):526-30, Fassler et al. (1996) Methods Enzymol 273:3-29, Ayoubi et al. (1996), 10(4) FASEB J 10(4):453-60, Goldsteine et al. (1995) Biotechnol. Annu. Rev. 1 :105-28, Azizkhan et al. (1993) Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 3(4):229-54. Dynan (1989) Cell 58(1): 1-4, Levine (1989) Cell 59(3):405-8, y Berk et al. (1986) Annu. Rev. Genet. 20:45-79, así como también en la patente de Estados Unidos N.° 6.194.191. Pueden identificarse otros promotores adecuados para el uso de la base de datos de promotores eucariotas (divulgación 68) (disponible en la dirección de página web epd.isb-sib.ch/) y otras bases de datos similares, como la base de datos de las regiones reguladoras de la transcripción (TRRD) (versión 4.1 ) (disponible en la dirección de página web bionet.nsc.ru/trrd/) y la base de datos de los factóres de transcripción (TRANSFAC) (disponible en la dirección de página web transfac.gbf.de/TRANSFAC/index.html).

Como alternativa de un promotor, particularmente en los vectores y constructos de ARN, un vector o ácido nucleico de la invención puede comprender uno o más sitios internos de entrada al ribosoma (IRES), IRES estos que codifican secuencias o potenciadores de la secuencia de ARN (secuencia de consenso Kozak análoga) como la secuencia inicial del virus del mosaico del tabaco. Un vector o polinucleótido de la invención puede incluir una secuencia activadora anterior (UAS), como una secuencia activadora Gal4 (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.°: 6.133.028) u otra secuencia reguladora anterior (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 6.204.060). Un vector o polinucleótido de la invención puede incluir una secuencia de consenso de Kozak que es funcional en una célula de mamífero. La secuencia de Kozak puede ser una secuencia natural o modificada, como las secuencias Kozak de consenso modificadas que se establecen en la patente de Estados Unidos N.° 6.107.477. Las señales de iniciación específicas pueden asistir a la traslación efectiva de una secuencia codificante de la invención, como los polipéptidos del DEC de CTLA-4 muíante que codifica una secuencia de nucleótidos. Estas señales pueden incluirse en un vector de la invención. Estas señales pueden incluir, por ejemplo, el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En los casos donde una secuencia codificante, su codón de iniciación y las secuencias anteriores se insertan en un vector de expresión apropiado, no se necesitan señales de control traslacional adicionales. Sin embargo, en los casos donde se inserta sólo una secuencia codificante (por ejemplo, una secuencia codificante de la proteína madura) o una porción de ésta, deben proporcionarse las señales de control transcripcional del ácido nucleico exógeno, incluso el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación debe estar en la fase de lectura correcta para asegurar la transcripción del inserto completo. Los elementos transcripcionales exógenos y los codones de iniciación pueden tener varios orígenes - tanto naturales como sintéticos- . La eficiencia de la expresión puede potenciarse con la inclusión de potenciadores apropiados en el sistema celular en uso (véase, por ejemplo, Scharf et al, Results Probl. Cell. Differ. 20:125-62 (1994); y Bittner et al, Meth. Enzymol. 153:516-544 (1987)). Los potenciadores adecuados incluyen el potenciador del virus del sarcoma de Rous (VSR) y los potenciadores de RTE que se establecen en la patente de Estados Unidos N.°: 6.225.082. Los entendidos en la técnica reconocerán que la introducción de un codón de inicio (ATG) en el extremo 5' de una secuencia de nucleótidos específica de interés normalmente produce la adición de la metionina del extremo amino terminal a la secuencia de aminoácidos codificada cuando la secuencia se expresa en una célula de mamífero (pueden producirse otras modificaciones en las bacterias y/u otras células eucariotas, como la introducción de un residuo de formil-metionina en un codón de inicio). Para la expresión de un ácido nucleico de la invención en las células eucariotas, típicamente se incluyen un codón de inicio y una secuencia de nucleotidos que codifica un péptido señal en el extremo 5' de la secuencia de ácidos nucleicos de la invención (por ejemplo, la SEQ ID NO: 80) y típicamente se incluye un codón de terminación en el extremo carboxilo terminal del ácido nucleico (por ejemplo, la SEQ ID NO: 80). Una secuencia de péptidos señal ejemplar es la secuencia de péptidos señal de hCTLA-4 (SEQ ID NO: 182); la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el activador de tejido plasmínógeno del péptido señal se muestra en la SEQ ID NO: 181. Otra secuencia de péptidos señal ejemplar es la secuencia de péptidos señal de hCTLA-4 (SEQ ID NO: 216) que es codificada por la secuencia de ácidos nucleicos que se muestra en la SEQ ID NO: 215. A continuación se tratan detalladamente las secuencias de terminación. Estos elementos pueden incluirse en el constructo del vector de elección. Al expresarse, las variantes de los polipéptidos codificados por el ácido nucleico (por ejemplo, la SEQ ID NO:80) inicialmente incluirán un residuo de metionina en el extremo amino terminal y la secuencia de péptidos señal. Sin embargo, la metionina en el extremo amino terminal y la secuencia de péptidos señal se escinden ante la secreción y de ese modo generan los polipéptidos codificados (por ejemplo, la SEQ ID NO:1). El nivel de expresión de un ácido nucleico de la invención (o los polipéptidos correspondientes de la invención) puede evaluarse mediante cualquier técnica adecuada. Los ejemplos incluyen el análisis de Northern Blot (que se trata, por ejemplo, en McMaster et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74(11):4835-38 (1977) y Sambrook, infra), la reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa reversa (RT-PCR) (según se establece, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.° 5.601.820 y Zaheer et al, Neurochem. Res. 20:1457-63 (1995)), y las técnicas de hibridación in situ (según se establece en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 5.750.340 y 5.506.098). La cuantificación de proteínas también puede alcanzarse mediante el ensayo de Lowry y otros ensayos de cuantificación de proteínas (véase, por ejemplo, Bradford, Anal. Biochem. 72:248-254 (1976); Lowry et al, J. Biol. Chem. 193:265 (1951)). El análisis Western blot de los polipéptidos recombinantes de la invención obtenidos del lisado de células transfectadas con los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos recombinantes es otra técnica adecuada para evaluar los niveles de expresión de los polipéptidos recombinantes. Un vector, por ejemplo, un vector de expresión o un polinucleótido de la invención, puede comprender un sitio de unión al ribosoma para la iniciación de la traslación y una región para la terminación de la transcripción. Una región adecuada para la terminación de la transcripción es, por ejemplo, una secuencia de poliadenilación que facilita la escisión y la poliadenilación de un transcrito de ARN producido a partir de una secuencia de ADN. Puede utilizarse cualquier secuencia de poliadenilación adecuada, inclusive una secuencia sintética optimizada, como también la secuencia de poliadenilación de HBC (hormona bovina del crecimiento), el gen de la hormona humana del crecimiento, el virus polioma, la TK (timidina cinasa), el VEB (virus de Epstein Barr), la beta globina de conejo y los papilomavirus, inclusive los papilomavirus humanos y el VBP (el virus del papiloma bovino). Las secuencias de poliadenilación (poli-A) adecuadas también incluyen la secuencia de poliadenilación SV40 (virus del sarcoma humano 40) y la secuencia de BGH poli-A. Dichas secuencias poli-A se establecen en, por ejemplo, Goodwin et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26(12):2891-8, Schek et al. (1992) Mol. Ce». Biol. 12(12):5386-93, y van den Hoff et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21(21):4987-8. Los principios adicionales relacionados con la selección de secuencias de poliadenilación adecuadas se establecen en, por ejemplo, Levitt et al. (1989) Genes Dev. 1989 3(7): 1019-1025, Jacob et al. (1990) Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1(1):49-59, Chen et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23(14):2614-2620, Moreira et al. (1995) EMBO J. 14(15):3809-3819, Carswell et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9(10):4248-4258. Un vector o polinucleótido de la invención puede comprender además sitios de combinación sitio-específica que pueden utilizarse para modular la transcripción de una secuencia de nucleótidos de interés, según se establece en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 4.959.317, 5.801.030 y 6.063.627, la solicitud de patente europea N.° 0 987 326 y la publicación internacional de la solicitud de patente N.° WO 97/09439. Un vector o polinucleótido de la invención también puede comprender un ácido nucleico que codifica la secuencia de secreción/localización para fijar la expresión de polipéptidos a un compartimento, membrana u orgánulo celular o para dirigir la secreción de los polipéptidos al espacio periplásmico o al medio de cultivo celular. Estas secuencias son conocidas en la técnica e incluyen péptidos o péptidos señal líderes de secreción, las secuencias dianas de orgánulos (por ejemplo, las secuencias de localización nuclear, las señales de retención en RE, las secuencias de tránsito mitocondrial, las secuencias de tránsito de cloroplastos), las secuencias de localización/anclaje de la membrana (por ejemplo las secuencias de paro de transferencias, las secuencias de anclaje del GPI) y similares. Los polinucleótidos de la invención pueden fusionarse dentro de la fase, por ejemplo, a este ácido nucleico que codifica una secuencia de secreción y/o localización. Los polipéptidos que se expresan mediante dichos polinucleótidos de la invención pueden incluir la secuencia de aminoácidos correspondiente a la(s) secuencia(s) de secreción y/o localización. Además, un vector o polinucleótido de la invención puede comprender una o más secuencias de nucleótidos o genes marcadores seleccionabas para proporcionar una característica fenotipica para la selección de células huéspedes transformadas, como la resistencia a la dihidrofolato reductasa, la resistencia a la neomícina, la resistencia a G418, la resistencia a la puromicina y/o la resistencia a la blasticidina para el cultivo eh células eucariotas, o como la resistencia a la tetraciclina o la ampicílina en la E. coli. Un vector o polinucleótido de la invención también puede comprender un origen de replicación útil para la propagación en un microorganismo. El origen de replicación bacteriano (Ori) que se utiliza es preferentemente uno que no afecta adversamente el gen de expresión en las células de mamífero. Los ejemplos de las secuencias de origen de la replicación útiles incluyen fago f1 ori, RK2 oriV, pUC ori y pSC101 ori. La secuencia de origen de la replicación incluye ColEI ori y p15 (disponible en el plásmido pACYC177, New England Biolab, Inc.); alternativamente, en algunos contextos, puede desearse otra copia de la secuencia baja ori (similar a p15). El ácido nucleico actúa deseablemente en este respecto como un vector versátil, capaz de replicar y/o expresarse tanto en las eucariotas como en las procariotas huésped (por ejemplo, un vector que comprende una secuencia de origen de la replicación reconocida tanto en las eucariotas como en las procariotas). La invención incluye un vector de ADN o ARN desnudo, inclusive, por ejemplo, un elemento de expresión lineal (según se establece en, por ejemplo, Sykes y Johnston (1997) Nat Biotech 17:355-59), un vector de ácido nucleico compactado (según se establece en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 6.077.835 y/o la publicación internacional de la solicitud de patente N.° WO 00/70087), un vector de plásmido como pCADN3.1 , pBR322, pUC 19/18 o pUC 118/119, un "tipo" de vector de ácido nucleico de tamaño mínimo (según se establece en, por ejemplo, Schakowski et al. (2001) Mol. Ther. 3:793-800) o como un constructo del vector del ácido nucleico precipitado, como un constructo precipitado del CaP04 (según se establece en, por ejemplo, la solicitud de patente internacional N.° WO 00/46147, Benvenisty y Reshef (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:9551-55, Wigler et al. (1978), Cell 14:725, y Coraro y Pearson (1981 ) Somatic Cell Genetics 7:603), que comprende un ácido nucleico de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona un plásmido de ADN desnudo que comprende la SEQ ID NO: 80 operativamente conectado al promotor de CMV o a la variante del promotor de CMV y a una secuencia de poliadenilación adecuada. En la técnica, se conocen los vectores de nucleótidos desnudos y los usos de estos (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 5.589.466 y 5.973.972). Un vector de la invención es típicamente un vector de expresión adecuado para expresarse en un sistema bacteriano, en un sistema eucariótico, en un sistema de mamíferos u otro sistema (en oposición al vector preparado para replicar la secuencia de ácidos nucleicos sin expresión, el que puede denominarse vector de clonación). Por ejemplo, en un aspecto, la invención proporciona un vector de expresión bacteriano que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la invención (por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica CTLA-4-lg muíante recombinante). Los vectores adecuados incluyen, por ejemplo, los vectores que dirigen la expresión a alto nivel de las proteínas de fusión fácilmente purificables (por ejemplo, la clonación de la E. coli multifuncional y los vectores de expresión como el BLUESCRIPT (Stratagene), los vectores pIN (Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509 (1989); los vectores pET (Novagen, Madison Wl); y similares). Mientras que estos vectores de expresión pueden ser útiles en la expresión de polipéptidos específicos de la invención, las glicoproteínas de la invención se expresan preferentemente en células eucariotas y, en consecuencia, la invención también proporciona vectores de expresión eucariotas. El vector de expresión puede ser un vector adecuado para la expresión del ácido nucleico de la invención en una célula de levadura. Puede emplearse cualquier vector adecuado para la expresión en un sistema de levadura. Los vectores adecuados para usarse en, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae incluyen, por ejemplo, los vectores que comprenden promotores constitutivos o inducibles como el factor alfa, el alcohol oxidasa y PGH (reseñado en Ausubel, supra, Berger, supra, y Grant et al, Meth. Enzymol. 153:516-544 (1987)). Generalmente, el vector de expresión será un vector adecuado para la expresión de un ácido nucleico de la invención en una célula animal, como una célula de insecto (por ejemplo, la célula SF-9) o una célula de mamífero (por ejemplo, la célula CHO, la célula 293, la célula HeLa, la célula de fibroblastos humanos o una célula similar bien caracterizada). Se conocen en la técnica los vectores de expresión de mamíferos adecuados (véase, por ejemplo, Kaufman, Mol. Biotechnol. 16(2):151-160 (2000), Van Craenenbroeck, Eur. J. Biochem. 267(18):5665-5678 (2000), Makrides, Protein Expr. Purif. 17(2):183-202 (1999), y Yarranton, Curr. Opin. Biotechnol. 3(5):506-511 (1992)). También se conocen los vectores plásmidos de expresión de células de insecto adecuados (Braun, Biocrafts 26(6): 1038-1040: 1042 (1999)). Típicamente, un vector de expresión puede propagarse en una célula huésped, que puede ser una célula eucariota (como una célula de mamífero, una célula de levadura o una célula vegetal) o una célula procariota, como una célula bacteriana. La introducción de un vector de ácido nucleico o un vector de expresión en la célula huésped (por ejemplo, la transfección) puede efectuarse mediante la transfección de fosfato de calcio (véase, por ejemplo, el procedimiento de co-precipitación con fosfato de calcio de Graham et al, Virology 52:456-457 (1973)), la transfección mediada con DEAE-Dextrano, la electroporación, un gen o una pistola de inyección, una inyección, la lipofección y la biolística u otras técnicas comunes (véase, por ejemplo, Kriegler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION: A LABORATORY MANUAL, Stockton Press (1990); véase Davis, L, Dibner, M., y Battey, I., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986) para una descripción de los procedimientos in vivo, ex vivo e in vitro). Las células que comprenden estos y otros vectores de la invención forman una parte importante de: la invención. En un aspecto, la invención proporciona un vector de expresión que contiene: (i) una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un primer polipéptido que contiene una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 96% 97%, 98%, 99% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NO: de 1 a 73, donde el primer polipéptido se une a CD86 humano y/o CD80 humano, y/o a un dominio extracelular de alguno de estos o de ambos, y/o suprime una respuesta inmunitaria, y (ii) una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica un segundo polipéptido que comprende una región bisagra, un dominio CH2, y un dominio CH3 de un polipéptido de inmunoglobulina (Ig). El polipéptido de Ig es, opcionalmente, un polipéptido de Fe de Ig humano (por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG4, etc.) o un polipéptido de Fe de Ig mutante. (por ejemplo, un polipéptido de Fe de Ig en el que se han sustituido uno o más residuos de cisterna por otro aminoácido (por ejemplo, un residuo de serina), eliminando así uno o más enlaces disulfuro formados entre dos cadenas de Ig, o en el que se sustituyen uno o más residuos de prolina por otro aminoácido (por ejemplo, prolina) para reducir la función efectora (reducción de unión al receptor de Fe). En otro aspecto, la invención proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NO: de 74 a 79, de 197 a 200, de 205 a 214 y de 219 a 222. Los cósmidos son otro tipo de ácidos nucleicos que proporciona la invención. Se puede utilizar cualquier vector cósmido adecuado para reproducir exactamente, transferir y expresar la secuencia de ácidos nucleicos de la invención. Normalmente, un cósmido comprende un oriV bacteriano, un marcador de selección antibiótica, un sitio de clonación y uno o dos sitios eos derivados del bacteriófago lambda. El cósmido puede ser un cósmido lanzadera o un cósmido mamífero, que comprende un oriV SV40 e, idealmente, un marcádor o marcadores de selección mamíferos adecuados. Se puede obtener una explicación más detallada sobre los vectores cósmidos, por ejemplo, en Hohn et al. (1988) Biotechnology 10:1 13-27. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden incluir y/o administrar a un huésped o a una célula huésped en forma de un vehículo de administración adecuado (es decir, un vector). El vector puede ser cualquier vector adecuado, que comprende vectores cromosómicos, no cromosómicos, de ácidos nucleicos sintéticos u otros vectores descritos anteriormente, y puede incluir cualquier combinación de los elementos de expresión descritos y/u otros elementos de la secuencia que faciliten la transfección y/o que promuevan la expresión. Como ejemplos de estos vectores se pueden mencionar los virus, los plásmidos bacterianos, los fagos, los cósmidos, los fagémidos, los derivados de SV40, los baculovirus, los plásmidos de levadura, los vectores derivados de combinaciones de plásmidos y el ADN de fago, y los vectores de ácido nucleico virales (ARN o ADN), la polilisina y las células bacterianas. Se puede llevar a cabo la administración de una secuencia de ADN recombinante de la invención con un plásmido de ADN desnudo o un plásmido asociado a uno o más agentes de mejora de la transfección, como se plantea en detalle en el presente documento. El vector de ADN plasmídico puede tener cualquier combinación de características adecuada. Los vectores de ADN plasmídico pueden contener una región promotora/potenciadora fuerte (por ejemplo, promotor de CMV humano, RSV, SV40, SL3-3, MMTV o HIV LTR), una secuencia de terminación poli(A) eficaz, un origen de replicación para el producto plasmídico en E. coli, un gen resistente a antibióticos como marcador de selección y un sitio de clonación apropiado (por ejemplo, un policonector). En la figura 1 se muestra un vector plasmídico específico para la administración del ácido nucleico de la invención; en los ejemplos que aparecen a continuación se explican la construcción y las características de este vector. En otro aspecto, la invención proporciona un vector no ácido nucleico que comprende al menos un ácido nucleico o polipéptido de la invención. Estos vectores no ácido nucleico comprenden, por ejemplo, entre otros, virus recombinantes, conjugados de ácidos nucleicos y proteínas virales (que, con partículas virales recombinantes, se denominan a veces "vectores virales") o células, como por ejemplo células bacterianas recombinantes (y, generalmente, atenuadas) Salmonella, Shigella, Listeria y Bacillus Calmette-Guérin (BCG). Por lo tanto, la invención proporciona, por ejemplo, un vector viral, un vector insecto, un vector bacteriano o vector de plantas que comprende un ácido nucleico de la secuencia de la invención. Se puede utilizar cualquier vector viral, vector de insecto, vector de plantas o vector bacteriano adecuado y muchos de estos son conocidos en la técnica. Un vector viral puede contener la cantidad que sea de polinucleótidos virales, solos (un vector de ácido nucleico viral) o, generalmente, combinados con una o más proteínas virales (normalmente dos, tres o más), que facilitan la administración, la replicación y/o la expresión del ácido nucleico de la invención en una célula huésped deseada. En un aspecto, se pueden utilizar bacterias intracelulares (por ejemplo, Listeria monocytogenes) para administrar un ácido nucleico de la invención. Un ejemplo de vector bacteriano para la administración de ADN plasmídico de uno o más ácidos nucleicos de la invención es la Listeria monocytogenes (Lieberman et al, Vaccine 20:2007-2010 (2002)). La invención comprende vectores virales recombinantes o aislados que se han modificado para contener uno o más ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención. Un vector viral puede incluir un polinucleótido que contenga la totalidad o parte de un genoma viral, un conjugado de proteína viral/ácido nucleico, una partícula semejante a virus (PSV), un vector semejante a los descritos en la patente de Estados Unidos N.°: 5.849.586 y en la publicación de solicitud de patente internacional N.°: WO 97/04748, o una partícula de virus intacta que contenga uno o más ácidos nucleicos virales, y, normalmente, se modifica genéticamente el vector viral para que contenga al menos un ácido nucleico y/o polipéptido de la invención. Un vector viral (es decir, un virus recombinante) puede contener una partícula viral natural o una partícula viral modificada; a continuación, se plantean ejemplos específicos. Normalmente, se utilizan diversos virus como vectores para la administración de ácidos nucleicos exógenos, incluido, al menos un ácido nucleico de la invención, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un DEC de CTLA-4 mutante o CTLA-4-lg mutante mencionado en el presente documento. Estos vectores comprenden los virus de ADN y ARN encapsulados o no encapsulados modificados por recombinación, que pertenecen típicamente al grupo constituido por baculoviridiae, parvoviridiae, picomoviridiae, herpesveridiae, poxviridae, adenoviridiae o picornnaviridiae. Los vectores virales pueden ser naturales o modificados por técnicas de recombinación de ácidos nucleicos de manera que sean deficientes en la replicación, competentes en la replicación o de replicación condicional. El vector viral puede ser un vector que requiera la presencia de otro vector o virus natural para su replicación y/o expresión (es decir, un virus dependiente de auxiliar), como por ejemplo un amplicón de un vector de adenovirus. Normalmente, estos vectores virales contienen una partícula viral natural o una partícula viral modificada en su contenido proteico y/o de ácidos nucleicos para aumentar la capacidad transgénica o colaborar en la transfección y/o la expresión del ácido nucleico (ejemplos de estos vectores son los amplicones del virus herpes/AAV). Es posible que se modifique el genoma viral para que incluya promotores inducibles que sólo logren la replicación o la expresión en determinadas condiciones. El vector viral puede ser derivado de o contener un virus que habitualmente infecte animales, preferentemente vertebrados, como por ejemplo mamíferos, incluidos, por ejemplo, los seres humanos. Como partículas de vectores virales adecuadas se pueden mencionar, por ejemplo, las partículas de un vector de adenovirus (incluido cualquier virus de adenoviridae o derivado de virus de adenoviridae), partículas de vectores virales adeno-asociados (partículas de un vector de VAA) u otros parvovirus y partículas de vectores de parvovirus, partículas del virus del papiloma, vector del virus Semliki-Forest, vectores del flavivirus, vectores del picornavirus, vectores de alfavirus, vectores virales de herpes, vectores de poxvirus, vectores de retrovirus, incluidos los vectores del lentivirus. Ejemplos de estos virus y vectores virales se proporcionan, por ejemplo, en Fields Virology, mencionado anteriormente, Fields et al, eds., Virology, Raven Press, Ltd., Nueva York (3.a ed., 1996 y 4.a ed., 2001), Encyclopedia oí Virology, R.G. Webster et al, eds., Academic Press (2.a ed., 1999), Fundamental Virology, Fields et al, eds., Lippincott-Raven (3.a ed., 1995), Levine, "Viruses," Scientific American Library N.°: 37 (1992), Medical Virology, D.O. White et al, eds., Academic Press (2.a ed. 1994), Introduction to Modern Virology, Dimock, N.J. et al, eds., Blackwell Scientific Publications, Ltd. (1994). Los vectores virales que se pueden utilizar con los ácidos nucleicos de la invención y los procedimientos que se explican en el presente documento comprenden vectores de virus adeno-asociados; estos se analizan, por ejemplo, en Cárter (1992) Curr. Opinión Biotech. 3:533-539 (1992) y Muzcyzka (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:97-129 (1992). Otros tipos y aspectos de los vectores de VAA se describen, por ejemplo, en Buschacher et al, Blood 5(8):2499-504, Cárter, Contrib. Microbiol. 4:85-86 (2000), Smith-Arica, Curr. Cardiol. Rep. 3(1):41-49 (2001 ), Taj, J. Biomed. Sci. 7(4):279-91 (2000), Vigna et al, J. Gene Med. 2(5):308-16 (2000), Klimatcheva et al, Front. Biosci. 4 481-96 (1999), Lever et al, Biochem. Soc. Trans. 27(6):841-47 (1999), Snyder, J. Gene Med. 1 (3): 166-75 (1999), Gerich et al, Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. 5(2): 1 18-23 (1998) y During, Adv. Drug Deliv. Review 27(1 ):83-94 (1997), y en las patentes de Estados Unidos N.°: 4.797.368; 5.139.941 ; 5.173.414; 5.614.404; 5.658.785; 5.858.775, y 5.994.136, asi como otras referencias mencionadas en otras partes del presente documento. Los vectores virales adeno-asociados se pueden construir y/o purificar utilizando procedimientos presentados, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.°: 4.797.368 y en Laughlin et al, Gene 23:65-73 (1983). Los vectores de alfavirus pueden ser vectores de administración genética en otros contextos. Los vectores de alfavirus son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Cárter (1992) Curr Opinión Biotech 3:533-539, Schlesinger Expert Opin. Biol. Ther. (2001) 1 (2): 177-91 , Polo et al, Dev. Biol. (Basel). 2000;104:181-5, Wahlfors et al, Gene Ther. (2000) 7(6):472-80, en las publicaciones de las solicitudes de patente internacional N.°: WO 01/81609, WO 00/39318, WO 01/81553, WO 95/07994, WO 92/10578. Otro grupo de vectores virales propicio es el de los vectores virales de herpes. Se mencionan ejemplos, por ejemplo, en Lachmann et al, Curr. Opin. Mol. Ther. (1999) 1 (5):622-32, Fraefel et al, Adv. Virus Res. (2000) 55:425-51 , Huard et al, Neuromuscul. Disord. (1997) 7(5):299-313, Frenkel et al, Gene Ther. (1994) Suppl 1 :S40-6, y en las patentes de Estados Unidos N.°: 6.261.552 y 5.599.691.

Los vectores de retrovirus, incluidos vectores de lentivirus, también pueden ser vehículos de administración genética propicios en determinados contextos. Se conocen muchos vectores de retrovirus en la técnica. Se mencionan ejemplos de vectores de retrovirus, por ejemplo, en Miller, Curr Top Microbiol. Immunol. (1992) 158:1-24, Weber et al, Curr. Opin. Mol. Ther. (2001) 3(5):439-53, Hu et al, Pharmacol. Res/. (2000) 52(4):493-51 1 , Kim et al, Adv. Virus Res. (2000) 55:545-63, Palu et al, Rev. Med. Virol. (2000) 10(3): 185-202, Takeuchi et al, Adv. Exp. Med. Biol. (2000) 465:23-35 y en las patentes de Estados Unidos N.°: 6.326.195; 5.888.502; 5.580.766 y 5.672.510. Los vectores de baculovirus son otro grupo de vectores virales propicios, especialmente para la producción de polipéptidos de la invención. La producción y uso de vectores de baculovirus son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Kost, Curr. Opin. Biotechnol. 10(5):428-433 (1999); Jones, Curr. Opin. Biotechnol. 7(5):512-516 (1996)). Cuando el vector se va a emplear en usos terapéuticos, se selecciona un vector que sea capaz de infectar adecuadamente (o en el caso de vectores de ácido nucleico, transfectar o transformar) las células diana en las que se desea obtener el efecto terapéutico. Los vectores de adenovirus también pueden ser vectores virales apropiados para la transferencia genética. Los vectores de adenovirus son muy conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Graham et al. (1995) Mol. Biotechnol. 33(3):207-220, Stephenson (1998) Clin. Diagn. Virol. 10(2-3): 187-94, Jacobs (1993) Clin Sci (Lond). 85(2): 117-22, en las patentes de Estados Unidos 5.922.576; 5.965.358 y 6.168.941 y en las solicitudes de patente internacional WO 98/22588, WO 98/56937, WO 99/15686, WO 99/54441 y WO 00/32754. Los vectores de adenovirus, vectores virales de herpes y vectores virales de Sindbis, que son útiles para el trabajo práctico de la invención y adecuados para la transducción y expresión de ácidos nucleicos de la invención en organismos in vivo, se describen en general, por ejemplo, en Jolly (1994) Cáncer Gene Therapy 1 :51-64, Latchman (1994) Molec. Biotechnol. 2:179-195, y Johanning et al. (1995) Nucí. Acids Res. 23:1495-1501. El vector de virus puede ser deficiente en replicación en una célula huésped. Se incluyen vectores de virus adeno-asociados (AAV), que naturalmente son deficientes en replicación si carecen de adenovirus complementarios o al menos productos genéticos de adenovirus (proporcionados, por ejemplo, por un virus auxiliar, un plásmido o una célula de complementación). La frase "deficiente en replicación" significa que el vector viral comprende un genoma que carece de al menos una función genética esencial para la replicación. Una deficiencia en un gen, función genética o región genética o genómica, tal como se emplea en el presente documento, se define como la supresión de una cantidad suficiente de material genético del genoma viral como para afectar o anular la función del gen cuya secuencia de ácidos nucleicos se elimina total o parcialmente. Las funciones genéticas esenciales para la replicación son las funciones genéticas necesarias para la replicación (es decir, propagación) de un vector viral deficiente en replicación. Las funciones genéticas esenciales de la partícula del vector viral varían según el tipo de partícula del vector viral de que se trate, Se mencionan ejemplos de partículas de vectores virales deficientes en replicación, por ejemplo, en Marconi et al, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 93(21 ) 1 1319-20 (1996), Johnson y Friedmann, Methods Cell Biol. 43 (pt. A):21 1-30 (1994), Timiryasova et al, J. Gene Med. 3(5):468-77 (2001), Burton et al, Stem Cells 19(5):358-77 (2001 ), Kim et al, Virology 282(1 ): 154-67 (2001 ), Jones et al, Virology 278(1): 137-50 (2000), Gilí et al, J. Med. Virol. 62(2): 127-39 (2000). Otros vectores deficientes en replicación tienen como base vectores de virus de la leucemia murina (MLV) (Miller et al. (1990) Mol. Cell Biol. 10:4239; Kolberg (1992) J. NIH Res. 4:43, y Cornetta et al. (1991 ) Hum. Gene. Ther. 2:215). Los vectores del virus de la viruela del canario son propicios para la infección de células humanas, pero naturalmente (es decir, sin modificación genética) son incapaces de replicación en estas células. 1 La construcción básica de vectores virales recombinantes es conocida por los entendidos en la técnica e implica la utilización de técnicas de biología molecular convencionales tales como las que se explican, por ejemplo, en Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press 1989) y en su tercera edición (2001), Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience Publishers 1995) y Watson, mencionado anteriormente, y en varias de las referencias mencionadas en el presente documento. Por ejemplo, los vectores de adenovirus se pueden construir y/o purificar utilizando los procedimientos presentados, por ejemplo, en Graham et al, Mol. Biotechnol. 33(3):207-220 (1995), en la patente de Estados Unidos N.°: 5.965.358, en Donthine et al, Gene Ther. 7(20): 1707-14 (2000) y en otras referencias mencionadas en el presente documento. Los vectores virales adeno-asociados se pueden construir y/o purificar utilizando los procedimientos presentados, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.°: 4.797.368 y en Laughiin et al, Gene 23:65-73 (1983). En la técnica, se conocen procedimientos similares con respecto a otros vectores virales, especialmente con respecto a vectores virales de herpes (véase, por ejemplo, Lachman et al, Curr. Opin. Mol. Ther. 1 (5):622-32 (1999)), vectores de lentivirus y otros vectores de retrovirus. En general, el vector viral contiene una inserción del ácido nucleico (por ejemplo, un vector de adenovirus natural puede contener una inserción de hasta 3 KB sin supresiones), o, más comúnmente, comprende una o más supresiones del genoma del virus para alojar la inserción del ácido nucleico y de ácidos nucleicos adicionales, según se desee, y para evitar la replicación en células huésped. Los vectores no virales, como por ejemplo, los plásmidos de ADN, los ácidos nucleicos desnudos y los ácidos nucleicos que forman un complejo con un vehículo de administración como por ejemplo un liposoma, también se pueden asociar con moléculas que dirigen al vector hacia una región específica del huésped (por ejemplo, un órgano, tejido y/o tipo de célula específico). Por ejemplo, se puede conjugar un nucleótido con una proteína diana, como por ejemplo una proteína viral que se une a un receptor o una proteína que se une a un receptor de una diana específica (por ejemplo, mediante una modificación de las técnicas presentadas en Wu et al, J. Biol. Chem. 263(29):14621-24 (1988)). Se conocen composiciones lipídicas catiónicas específicas (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 6.120.799). Se proporcionan otras técnicas para reconocer construcciones genéticas en la publicación de solicitud de patente internacional N.°: WO 99/41402.

Huéspedes de expresión La presente invención también proporciona células huésped modificadas genéticamente transducidas, transfectadas o transformadas con un vector de la invención (por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión) o un ácido nucleico de la invención. Las células huésped modificadas genéticamente se pueden cultivar en medios nutritivos convencionales modificados según sea adecuado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar el ácido nucleico de interés. Las condiciones de cultivo, como por ejemplo temperatura, pH y otras similares son las que se utilizaron anteriormente con la célula huésped seleccionada para la expresión y serán evidentes para los entendidos en la técnica y se pueden obtener en las referencias que se citan en el presente documento, incluido, por ejemplo, Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3.a ed., Wiley - Liss, Nueva York y las referencias citadas allí. Los polipéptidos de la invención codificados por los vectores o ácidos nucleicos de la invención se expresan en estas células huésped y se pueden separar a través de procedimientos convencionales. Por ejemplo, los polipéptidos que se hayan liberado dentro del cultivo de células se pueden separar del cultivo mediante ultracentrifugación u otras técnicas similares. Los polipéptidos de la invención se pueden producir en diversos huéspedes de expresión, lo que comprende, entre otros, células animales, como por ejemplo células mamíferas (por ejemplo, células CHO), incluidas células humanas y de primates no humanos, y en células no animales, como por ejemplo en plantas, levaduras, hongos, bacterias y otras similares. Como ejemplos de huéspedes de expresión adecuados se pueden mencionar células bacterianas, como por ejemplo E. coli, Streptomyces, y Salmonella typhimurium; células fúngicas, como por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Neurospora crassa; células de insectos como por ejemplo Drosophila y Spodoptera frugiperda; células mamíferas, como por ejemplo células CHO (por ejemplo, CHO-K1 ), COS (por ejemplo, COS-1 , COS-7), BHK y HEK (por ejemplo, HEK 293), células de melanoma de Bowes y células de plantas. Como se indicó anteriormente, la invención no se verá limitada por las células huésped empleadas. Además de Sambrook, Berger y Ausubel, mencionados anteriormente, se puede obtener información sobre cultivos celulares, por ejemplo, en Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, NY; Gamborg y Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Sprínger Lab Manual, Springer-Verlag (Berlín Heidelberg NY)¡ Atlas y Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Ratón, FL. Estas células huésped se pueden adaptar a cultivo en medio sin suero y no proteico, medio sin componentes de origen animal, como por ejemplo, un medio químicamente definido (CD) (como por ejemplo, CD PptiCHO™ (Invitrogen, #12681 )) utilizando procedimientos conocidos en la técnica. La invención proporciona una célula que contiene uno o más de los ácidos nucleicos, vectores u otras construcciones de la invención (por ejemplo, una construcción que expresa un DEC de CTLA-4 mutante o CTLA-4-lg mutante) descritas en el presente documento o una combinación de los anteriores. La invención también comprende una célula que contiene uno o más polipéptidos, anticuerpos o proteínas de fusión u otras construcciones de la invención descritas en el presente documento, o una combinación de uno o más de los anteriores. Una célula de la invención es típicamente una célula aislada o recombinante y es posible que contenga una célula huésped. Esta célula, por ejemplo, un célula recombinante, puede modificarse por transformación, transfección y/o infección con al menos un ácido nucleico, un vector u otra construcción de la invención. Esta célula puede ser una célula eucariota (por ejemplo, una célula mamifera, de levadura o de una planta) o una célula procariota (por ejemplo, una célula bacteriana) y se puede transformar con cualquier construcción de la invención utilizando diversos métodos conocidos, incluida, por ejemplo, la transfección con fosfato de calcio (véase, por ejemplo, el procedimiento de coprecipitación con fosfato de calcio), la transfección mediada por DEAE-dextrano, la electroporación (Irvíng et al, Cell 64:891-901 (1991)), la pistola de genes o pistola de inyección, la inyección, la lipofección y los procedimientos biolísticos u otros procedimientos mencionados anteriormente. Véanse también (os procedimientos y la tecnología de electroporación de Inovio Biomedical Corp. en el sitio Web inovio.com. Una cepa de células huésped se elige, opcionalmente, por su capacidad para modular la expresión de las secuencias introducidas o para procesar la proteína expresada según se desee. Estas modificaciones de proteínas comprenden, entre otras, la acetilación, la carboxilación, la glicosilación, la fosforilación, la lipidación y la acilación. Diversas células huésped, como por ejemplo, E. coli, Bacillus sp., levadura o células mamíferas, tales como CHO, HeLa, BHK, MDCK, HEK 293, WI38, etc. presentan una mecánica celular específica y mecanismos característicos para estas actividades posteriores a la traducción y es posible que se elijan para garantizar la modificación y los procedimientos adecuados de la proteína extraña introducida. Se puede introducir un ácido nucleico de la invención en una célula huésped adecuada (en cultivo o en un organismo huésped) para permitir que el huésped exprese una proteína de interés (por ejemplo, un DEC de CTLA-4 muíante o una CTLA-4-lg mutante). Cualquier célula huésped adecuada puede ser transformada/transducida por los ácidos nucleicos de la invención. Como ejemplos de huéspedes de expresión adecuados se pueden mencionar: células bacterianas, por ejemplo, E. coli, Streptomyces, Bacillus sp. y Salmonella typhimurium; células fúngicas, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Neurospora crassa; células de insectos, por ejemplo, Drosophila y Spodoptera frugiperda; células mamiferas, por ejemplo, células Vero, células HeLa, células CHO (por ejemplo, CHO-K1), células COS, células WI38, células NIH-3T3 (y otras células de fibroblastos, por ejemplo, células MRC-5), células MDCK, células KB, células SW-13, células MCF7, células BHK, células HEK-293, células de melanoma de Bowes y células de plantas, etc. La presente invención también proporciona células huésped transducidas, transformadas o transfectadas con al menos un ácido nucleico de la invención o un vector de la invención. Como se comentó anteriormente, un vector de la invención normalmente contiene un ácido nucleico de la invención. Las células huésped se modifican genéticamente (por ejemplo, se transducen, transforman, infectan o transfectan) con los vectores de la invención, que pueden ser, por ejemplo, vectores de clonación o vectores de expresión. El vector se puede presentar en forma de plásmido, partícula viral, fago, bacteria atenuada o cualquier otro tipo de vector adecuado. Las células huésped adecuadas para la transducción y/o infección con vectores virales de la invención para producir los polipéptidos recombinantes de la invención y/o reproducir exactamente el vector viral de la invención incluyen las células mencionadas anteriormente. Se mencionan ejemplos de células que se ha demostrado que resultan adecuadas para contener partículas de vectores virales por ejemplo, en Polo et al, Proc. Nati. Acad. Sci. 96(8):4598-603 (1999), Farson et al, J. Gene Med. 1 (3):195-209 (1999), Sheridan et al, Mol. Ther. 2(3):262-75 (2000), Chen et al, Gene Ther. 8(9):697-703 (2001 ), y Pizzaro et al, Gene Ther. 8(10):737-745 (2001). Para vectores virales deficientes en replicación, como por ejemplo vectores de VAA, para lograr la replicación del vector viral son necesarias líneas celulares complementarias, líneas celulares transformadas con virus auxiliares o líneas celulares transformadas con plásmidos que codifican genes esenciales. Las células huésped modificadas genéticamente se pueden cultivar en medios nutritivos convencionales modificados según sea adecuado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar el gen de interés. Se pueden cultivar células huésped en medio con suero o medio sin suero. Las células huésped se pueden cultivar en medio sin suero, no proteico, sin componentes de origen animal, incluido, por ejemplo, un medio químicamente definido (por ejemplo, CD OptiCHO™ (Invitrogen, #12681 )). Si se desea, se puede complementar el medio de cultivo celular con complementos conocidos por los entendidos en la técnica, como por ejemplo, uno o más aminoácidos, por ejemplo L-glutamina (por ejemplo, 2% v/v de L-glutamina 200 mM (Invitrogen, #25031)). Las condiciones de cultivo, como por ejemplo la temperatura, el pH y otras similares, son las mismas que se utilizaron anteriormente con la célula huésped seleccionada para la expresión y serán evidentes para los entendidos en la técnica. Estas pueden obtener en las referencias que se citan en el presente documento, por ejemplo, en Animal Cell Technology, Rhiel et al, eds., (Kluwer Academic Publishers 1999), Chaubard et al, Genetic Eng. News 20(18) (2000), Hu et al, ASM News 59:65-68 (1993), Hu et al, Biotechnol. Prog. 1 :209-215 (1985), Martin et al, Biotechnol. (1987), Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4a ed., (Wiley, 2000), Mather, Introduction to Cell and Tissue Culture: Theory and Technique, (Plenum Press, 1998), Freshney, Culture of Immortalized Cells, 3.a ed., (John Wiley & Sons, 1996), Cell Culture: Essential Techniques, Doyle et al, eds. (John Wiley & Sons 1998), y General Techniques of Cell Culture, Harrison et al, eds., (Cambridge Univ. Press 1997). El ácido nucleico también puede formar parte, reproducirse exactamente y/o expresarse en células de plantas. Las técnicas relacionadas con el cultivo de células de plantas se explican, por ejemplo, en Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems, John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, NY; Gamborg y Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlín Heidelberg Nueva York) y Plant Molecular Biology (1993) R.R.D. Croy (ed.) Bios Scientific Publishers, Oxford, Reino Unido. ISBN 0 12 198370 6. Los medios de cultivo de células, en general, se presentan en Atlas y Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Ratón, FL. Para obtener una producción de proteínas recombinantes a largo plazo y en una proporción elevada, se pueden utilizar sistemas de expresión estables. Por ejemplo, se pueden transducír líneas celulares que expresan de manera estable un polipéptido de la invención con vectores de expresión que contengan orígenes de replicación virales y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador de selección. Después de la introducción del vector, se pueden cultivar las células de la línea celular durante 1 ó 2 días en un medio enriquecido antes de pasarlas a un medio selectivo. El objetivo del marcador de selección es dotar de resistencia a la selección y su presencia permite el cultivo y la recuperación de las células que expresan satisfactoriamente las secuencias introducidas. Por ejemplo, se pueden hacer proliferar grupos resistentes de células transformadas de forma estable utilizando técnicas de cultivo de tejidos adecuadas para ese tipo de células. Se pueden obtener fácilmente medios sin suero a nivel comercial (por ejemplo, suministrados por JRH Biosciences, SAFC Biosciences, Sigma-Aldrich Corporation, en Internet en sigmaaldrich.com). Es posible que en algunos casos se prefieran medios sin suero o medios condicionados (por ejemplo, medios de cultivo cosechados previamente de cultivos de células no transfectadas o vírgenes) para la producción de proteínas o para la creación de bancos de células. La invención comprende células o líneas celulares inmortalizadas que contienen uno o más polipéptidos (incluidas, por ejemplo, proteínas de fusión dimérícas o monoméricas y polipéptidos multiméricos), conjugados, ácidos nucleicos o vectores de la invención. Opcionalmente, se cultivan células huésped transformadas con un vector de expresión y/o polinucleótido en condiciones adecuadas para la expresión y la recuperación de la proteína codificada del cultivo celular. Es posible que el polipéptido o el fragmento de este que produce esta célula recombinante sea segregado, se encuentre unido a la membrana o se encuentre a nivel intracelular, según la secuencia y/o el vector que se utilice. Se pueden diseñar vectores de expresión que contienen polinucleótidos que codifican polipéptidos maduros de la invención con secuencias señal que dirigen la secreción de los polipéptidos maduros a través de membranas de células procariotas o eucariotas. Normalmente, se incorporan estas secuencias señal al vector de manera que la secuencia señal se exprese en el extremo amino terminal del polipéptido de la invención. Los principios relacionados con estas secuencias señal se explican en otras partes del presente documento.

Producción y recuperación de polipéptidos Después de la transducción de una cepa de huésped adecuada y cultivo de la cepa de huésped hasta una densidad de células adecuada, se induce el promotor seleccionado por un medio adecuado (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y se cultivan las células durante un período adicional. Normalmente, se cultivan las células por centrifugación, se rompen a través de medios físicos o químicos y se retiene el extracto bruto resultante para una nueva purificación. Se puede realizar la rotura de las células microbianas que se van a emplear para expresar proteínas a través de cualquier procedimiento apropiado, lo que comprende ciclos de congelamiento y descongelamiento, sonicación, rotura mecánica, el uso de agentes de lisado celular u otros procedimientos conocidos por los entendidos en la técnica. Como se indicó, hay una gran cantidad de referencias disponibles para el cultivo y la producción de diversas células, incluidas las células de origen bacteriano, vegetal, animal (especialmente de mamíferos) y de archaebacterias. Véase, por ejemplo, Sambrook, Ausubel y Berger (mencionado anteriormente), y Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, Tercera edición, Wiley-Liss, Nueva York y las referencias qué se citan allí; Doyle y Griffiths (1997) Mammalian Cell Culture: Essential Techniques, John Wiley and Sons, NY; Humason (1979) Animal Tissue Techniques, cuarta edición W.H. Freeman and Company; y Ricciardelli et al, (1989) In vitro Cell Dev. Biol. 25:1016 1024. Se puede obtener información sobre el cultivo y la regeneración de células de origen vegetal en Payne et al, (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems, John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, N.Y.; Gamborg y Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlín Heidelberg Nueva York) y Plant Molecular Biológy (1993) R. R. D. Croy, Ed. Bíos Scientífic Publishers, Oxford, Reino Unido, ISBN 0 12 198370 6. Los medios de cultivo de células, en general, se presentan en Atlas y Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Ratón, FL. Se puede encontrar información adicional sobre el cultivo de células en publicaciones comerciales disponibles, como por ejemplo Life Science Research Cell Culture Catalogue (1998) de Sigma- Aldrich, Inc. (St. Louis, Mo.) ("Sigma-LSRCCC") y, por ejemplo, Plant Culture Catalogue and supplement (1997) también de Sigma-Aldrich, Inc (St. Louis, Mo.) ("Sigma-PCCS"). Se pueden recuperar y purificar polipéptidos de la invención a partir de cultivos de células recombinantes a través de diversos procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad (por ejemplo, utilizando cualquiera de los sistemas de marcación mencionados en el presente documento), cromatografía con hidroxilapatita y cromatografía con lectina. Se pueden emplear etapas de replegamiento, si se desea, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, se puede utilizar cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en las etapas finales de purificación. Además de las referencias mencionadas anteriormente, existen diversos procedimientos de purificación muy conocidos en la técnica, por ejemplo, los que aparecen en Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; y Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2.a Edición Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Human Press, NJ, Harris y Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practica! Approach IRL Press en Oxford, Oxford, Inglaterra; Harris y Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press en Oxford, Oxford, Inglaterra; Scopes (1993) Protein Purification: Principies and Practice 3a Edición Springer Verlag, NY; Janson y Ryden (1998) Protein Purification: Principies, High Resolution Methods and Applications, segunda edición Wiley-VCH, NY; y Walker (1998) Protein Protocols en CD-ROM Humana Press, NJ Los entendidos comprenderán que las proteínas de fusión de la invención (por ejemplo, proteína de fusión CTLA-4-lg mutante) se pueden producir a través de diversos procedimientos que se explican en el presente documento, incluidos, por ejemplo, los que aparecen en el ejemplo 1 para producir la LEA29Y-lg. Por ejemplo, en lugar del ácido nucleico que codifica LEA29Y, se puede clonar una secuencia de ácidos nucleicos que codifique un polipéptido de DEC de CTLA-4 mutante de la invención (por ejemplo, el polipéptido D3-54) en el vector de fusión de Fe de lgG2 para producir un vector que codifique la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante (por ejemplo, D3-54-lgG2), se pueden crear células CHO-K1 estables que expresen dicha proteína de fusión CTLA-4-lg mutante mediante la transfección de estas células con el vector que codifique la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante, y se puede expresar y purificar la proteina de fusión CTLA-4-lg mutante resultante (por ejemplo, D3-54-lgG2) (normalmente en forma dimérica) y como se explica en el ejemplo 1.

Sistemas de expresión in vitro También, se pueden emplear sistemas de transcripción/traducción in vitro para producir polipéptidos recombinantes de la invención o fragmentos de estos utilizando ADN y/o ARN de la presente invención o fragmentos de los mismos. Muchos de estos sistemas se encuentran disponibles a nivel comercial. Se puede consultar una guía general sobre protocolos de transcripción y traducción in vitro en Tymms (1995) In vitro Transcríption and Translation Protocois: Methods in Molecular Biology, Vol. 37, Garland Publishing, Nueva York.

Procedimientos de la invención Los polipéptidos (incluidos, por ejemplo, las proteínas de fusión diméricas y monoméricas y los polipéptidos multiméricos), los conjugados, las composiciones, los ácidos nucleicos, los vectores y las células de la invención presentan diversas propiedades y características, y se cree que son útiles en diversas aplicaciones, incluidos, entre otros, por ejemplo, los procedimientos profilácticos o terapéuticos para tratar diversas enfermedades, trastornos y afecciones del sistema inmunitario en los que la modulación o la regulación del sistema inmunitario y de las respuestas del sistema inmunitario puede resultar beneficiosa. Se cree que, por ejemplo, los polipéptidos, los conjugados, las composiciones, ácidos nucleicos, vectores y células de la invención que tienen la capacidad de unirse a CD80 y/o CD86 o a un DEC de cualquiera de los anteriores y/o la capacidad de inhibir una respuesta inmunitaria, resultan útiles en procedimientos profilácticos y/o terapéuticos para inhibir o suprimir una respuesta inmunitaria en un individuo, procedimientos para inhibir el rechazo del trasplante de tejidos, células u órganos de un donante por parte del receptor, y otros procedimientos que se describen en otra parte del presente documento. Se espera que algunos de estos polipéptidos, el conjugados, composiciones, ácidos nucleicos, vectores y células de la invención resulten útiles en procedimientos para modular o inhibir la interacción de las células T que expresan CD28 y/o CTLA-4 con células B7 positivas. En un aspecto, los procedimientos terapéuticos o profilácticos de la invención implican la administración a un individuo de una cantidad eficaz de al menos uno de estos polipéptidos (incluidos, por ejemplo, una proteína de fusión, un multímero, etc.), conjugados, composiciones, ácidos nucleicos, vectores y células para suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria. En un contexto terapéutico, el individuo es típicamente un individuo que padece una enfermedad, trastorno o afección del sistema inmunitario y la administración está dirigida a prevenir el avance de la enfermedad, trastorno o afección. Por ejemplo, la administración de una molécula de la invención a un individuo que sufre una enfermedad del sistema inmunitario (por ejemplo, una enfermedad autoinmune) puede dar como resultado la supresión o inhibición de dicho ataque al sistema inmunitario o respuesta biológica relacionada con el mismo. Al suprimir el ataque al sistema inmunitario en tejidos sanos del cuerpo, se pueden disminuir o aliviar los síntomas físicos que se producen en estos tejidos como resultado de dicho ataque o relacionados con el mismo (por ejemplo, dolor, inflamación o sensibilidad en las articulaciones), y se puede retrasar, disminuir o detener el daño biológico y físico producto de dicho ataque o relacionado con este.

En un contexto profiláctico, el individuo puede padecer, ser propenso o puede creerse que padece una enfermedad, trastorno o afección del sistema inmunitario y, generalmente, la administración está dirigida a prevenir el avance de la enfermedad, el trastorno o la afección, inhibir o aliviar los síntomas, los signos o las respuestas biológicas relacionadas con el mismo, prevenir el daño corporal que püeda provocar y/o mantener o mejorar las funciones físicas del individuo. En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para modular la interacción de las células T que expresan CD28 y/o CTLA-4 con células B7 positivas, procedimiento que comprende poner en contacto células B7 positivas con al menos uno de los siguientes, en una cantidad eficaz para modular la interacción de células B7 positivas con células T CD28 positivas y/o células T CTLA-4 positivas: (1) un polipéptido de la invención (por ejemplo, un polipéptido de DEC de CTLA-4 o una proteína de fusión CTLA-4-lg muíante dimérica o monomérica); (2) un multímero que contiene uno o más polipéptidos de la invención (por ejemplo, un dimero que comprende dos de estos polipéptidos o un tetrámero que comprende cuatro de estos polipéptidos); (3) un conjugado que contiene al menos un polipéptido de la invención; (4) un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención); (5) un vector que contiene un ácido nucleico de la invención o que codifica un polipéptido de la invención; (6) una célula o una población de células que contiene un polipéptido, un ácido nucleico, un conjugado y/o un vector de la invención; y/o (7) una composición de la invención, donde se modula la interacción de células B7 positivas con células T CD28 positivas y/o células T CTLA-4 positivas. Normalmente, el efecto modulador es un efecto inhibidor de manera que se inhibe la interacción de las células B7 positivas con las células T CD28 positivas y/o células T CTLA-4 positivas. En algunos casos, las células B7 positivas son células presentadoras de antígenos (CPA). En algunos de estos procedimientos, se inhibe la interacción de las células B7-2 positivas (por ejemplo, CPA que expresan B7-2 (CD86)) con células T CD28 positivas. En algunos de estos procedimientos, se inhibe la interacción de las células B7-1 positivas (por ejemplo, CPA que expresan B7-1 (CD80)) con células T CD28 positivas. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para inhibir la interacción de células T CD28 positivas y/o células T CTLA-4 positivas con células B7 positivas, procedimiento que comprende poner en contacto células B7 positivas (por ejemplo, células B7-1 positivas y/o células B7-2 positivas) con una cantidad eficaz de al menos una de las siguientes moléculas o componentes de la invención para inhibir la interacción de células T CD28 positivas y/o células T CTLA-4 positivas con células B7 positivas: (1) un polipéptido de la invención (por ejemplo, un polipéptido de DEC de CTLA-4 o una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante dimérica o monomérica); (2) un multímero que contiene uno o más polipéptidos de la invención (por ejemplo, un dímero que comprende dos de estos polipéptidos o un tetrámero que comprende cuatro de estos polipéptidos); (3) un conjugado que contiene al menos un polipéptido de la invención; (4) un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención); (5) un vector que contiene un ácido nucleico de la invención o que codifica un polipéptido de la invención; (6) una célula o una población de células que contiene un polipéptido, un ácido nucleico, un conjugado y/o un vector de la invención; y/o (7) una composición de la invención, donde se inhibe la interacción de las células T CD28 positivas y/o las células T CTLA-4 positivas con células B7 positivas. En algunos casos, las células B7 positivas son CPA. En algunos casos, se inhibe la interacción de células T CD28 positivas con células hB7-1 positivas y/o células hB7-2 positivas. En algunos de estos procedimientos, la inhibición de la interacción de las células T CD28 positivas con las células hB7-1 positivas y/o las células hB7-2 positivas provoca la supresión o la inhibición de uno o más de los que aparecen a continuación: la activación o la proliferación de células T, la síntesis o la producción de citocinas (por ejemplo, la producción de TNF-a, IFN-?, IL-2), la inducción de diversos marcadores de activación (por ejemplo, CD25, receptor IL-2), la inflamación, la inflamación o sensibilidad en las articulaciones, el nivel de proteína C reactiva en suero, la producción de anticuerpos anti-colágeno y/o las respuestas de anticuerpos dependientes de células T. En algunos de estos procedimientos, se administra al menos una de estas moléculas o componentes de la invención a un individuo en una cantidad eficaz para inhibir la interacción de células T CD28 positivas endógenas con células B7-1 positivas y/o células B7-2 positivas endógenas en el individuo. En algunos de estos procedimientos, se inhibe la interacción de células T CD28 positivas endógenas con células B7 positivas endógenas que expresan B7-2 (CD86) o B7-1 (CD80). En algunos casos, las células B7 positivas son CPA que expresan B7-2 o B7-1 y se inhibe la interacción de B7-2 o B7-1 con células T CD28 positivas. En algunos casos, se inhibe la interacción de B7-2 y B7-1 expresados en las CPA con células T CD28 positivas. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para suprimir una respuesta inmunitaria in vitro o in vivo. El procedimiento comprende poner en contacto las células B7 positivas con al menos una de las siguientes moléculas o componentes de la invención en una cantidad eficaz para suprimir una respuesta inmunitaria: (1) un polipéptido de la invención (por ejemplo, un polipéptido de DEC de CTLA-4 o una proteina de fusión CTLA-4-lg mutante dimérica o monomérica); (2) un multímero que contiene uno o más polipéptidos de la invención (por ejemplo, un dímero que comprende dos de estos polipéptidos o un tetrámero que comprende cuatro de estos polipéptidos); (3) un conjugado que contiene al menos un polipéptido de la invención; (4) un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención); (5) un vector que contiene un ácido nucleico de la invención o que codifica un polipéptido de la invención; (6) una célula o una población de células que contiene un polipéptido, un ácido nucleico, un conjugado y/o un vector de la invención; y/o (7) una composición de la invención, donde se suprime una respuesta inmunitaria de ese modo. Es posible que se supriman una o más respuestas inmunitarias, incluidas, por ejemplo, la respuesta de células T, la proliferación o la activación de células T, la síntesis o la producción de citocinas, la inflamación, la inflamación o sensibilidad en las articulaciones, el nivel de proteína C reactiva en suero, la producción de anticuerpos anti-colágeno y/o las respuestas de anticuerpos dependientes de células T. En los procedimientos que comprenden poner en contacto una célula B7 positiva con un polipéptido de la invención, el polipéptido se une a B7-1 (por ejemplo, B7-1 humana) expresada en células B7 positivas y/o se une a B7-2 (por ejemplo, B7-2 humana) expresada en células B7 positivas. En algunos casos, las células B7 positivas son CPA. En algunos casos, se suprime una respuesta inmunitaria in vitro, como por ejemplo, en un ensayo in vitro, incluidos los que se describen detalladamente en otra parte del presente documento (véanse, por ejemplo, los ejemplos que figuran más adelante). En algunos casos, se suprime una respuesta inmunitaria in vivo en un individuo al que se le administra una cantidad eficaz para suprimir una respuesta inmunitaria, como por ejemplo, en los procedimientos de tratamiento terapéutico o profiláctico (por ejemplo, procedimientos para tratar una enfermedad reumática, como por ejemplo la artritis reumatoide, u otras enfermedades autoinmunes) que se explican detalladamente en otra parte del presente documento. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para suprimir una respuesta inmunitaria en un individuo (por ejemplo, un mamífero, como por ejemplo los seres humanos). El procedimiento comprende la administración a un individuo que lo necesita de al menos una de las siguientes moléculas o componentes de la invención en una cantidad eficaz desde el punto de vista terapéutico o profiláctico (por ejemplo, una dosis eficaz desde el punto de vista terapéutico o profiláctico) que suprima una respuesta inmunitaria en el individuo: (1) un poíipéptido de la invención (por ejemplo, un poíipéptido de DEC de CTLA-4 o una proteína de fusión CTLA-4-Ig muíante dimérica o monomérica); (2) un multímero que contiene uno o más polipéptidos de la invención (por ejemplo, un dímero que comprende dos de estos polipéptidos o un tetrámero que comprende cuatro de estos polipéptidos); (3) un conjugado que contiene al menos un poíipéptido de la invención; (4) un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un poíipéptido de la invención); (5) un vector que contiene un ácido nucleico de la invención o que codifica un poíipéptido de la invención; (6) una célula o una población de células que contiene un poíipéptido, un ácido nucleico, un conjugado y/o un vector de la invención; y/o (7) una composición de la invención, donde se suprime así una respuesta inmunitaria en el individuo. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para tratar a un individuo que padece una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario modulado por la interacción de células T endógenas con células endógenas que expresan CD80 y/o CD86. El procedimiento comprende administrar a un individuo que necesita el tratamiento una cantidad eficaz desde el punto de vista terapéutico de: (1) un poíipéptido de la invención (por ejemplo, un polipéptido de DEC de CTLA-4 o una proteína de fusión CTLA-4-Ig mutante dimérica o monomérica); (2) un multímero que contiene uno o más polipéptidos de la invención (por ejemplo, un dímero que comprende dos de estos polipéptidos o un tetrámero que comprende cuatro de estos polipéptidos); (3) un conjugado que contiene al menos un polipéptido de la invención; (4) un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención); (5) un vector que contiene un ácido nucleico de la invención o que codifica un polipéptido de la invención; (6) una célula o una población de células que contiene un polipéptido, un ácido nucleico, un conjugado y/o un vector de la invención; y/o (7) una composición de la invención, para tratar así una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario en el individuo. Si el individuo es un ser humano, CD80 es CD80 humano, CD86 es CD86 humano y CD28 es CD28 humano. En algunos de estos procedimientos, se inhibe la interacción de células T endógenas que expresan CD28 con células endógenas que expresan CD86 y/o células endógenas que expresan CD80. Se cree que es posible tratar de forma eficaz diversas enfermedades o trastornos del sistema inmunitario, incluidas las enfermedades o trastornos reumáticos o autoinmunes, utilizando una o más de las moléculas de la invención descritas en el presente documento, como por ejemplo, un polipéptido de DEC de CTLA-4 mutante (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: de 1 a 73, como por ejemplo, D3-54 (SEQ ID NO:36), D3-69 (SEQ ID NO.50) o D3-27 (SEQ ID NO:24) de DEC de CTLA-4 mutante) o una proteína de fusión del este (por ejemplo, D3-54-lgG2 (SEQ ID NO:197 ó 211), D3-69-lgG2 (SEQ ID NO:199 ó 213) y D3-29-lgG2 (SEQ ID NO:79 ó 210)). Es posible que la enfermedad o el trastorno del sistema inmunitario estén relacionados o sea, por ejemplo, entre otros, la enfermedad de Addison, la alergia, la alopecia areata, el mal de Alzheimer, la vasculitis asociada a anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA), la espondilitis anquilosante, el síndrome antifosfolípido (síndrome de Hughes), la artritis, el asma, la aterosclerosis, las placas ateroscleróticas, las enfermedades autoinmunes (por ejemplo, el lupus, la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Graves, etc.), la anemia hemolítica autoinmune, la hepatitis autoinmune, la enfermedad del oído interno autoinmune, el síndrome linfoproliferativo autoinmune, la miocarditis autoinmune, la ooforitis autoinmune, la orquitis autoinmune, la azoospermia, la enfermedad de Behcet, la enfermedad de Berger, el penfigoide ampolloso, la cardiomiopatía, la enfermedad cardiovascular, la celiaquía/enfermedad celíaca, el síndrome de fatiga crónica y la disfunción inmunitaria (SFCDI), la polineuritis idiopática crónica, la polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC), la polineuropatía crónica recidivante (síndrome de Guillain-Barré), el síndrome de Churg-Strauss (SCS), el penfigoide cicatricíal, la enfermedad por crioaglutininas (CAD), EPOC, el síndrome de CREST, la enfermedad de Crohn, la dermatitis herpetiformis, la dermatomiositis, la diabetes, el lupus discoide, el eccema, la epidermolisis ampollosa adquirida, la crioglobulinemia mixta esencial, el síndrome de Evans, el exoftalmos, la fibromialgia, el síndrome de Goodpasture, la enfermedad o el trastorno relacionado con un injerto, la enfermedad de Graves, la enfermedad de injerto contra huésped (EICH), la tiroiditis de Hashimoto, la fibrosis pulmonar idiopática, la púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), la nefropatia por IgA, la enfermedad o trastorno inmunoproliferativo (por ejemplo, la soriasis), las enfermedades inflamatorias intestinales (El I), la diabetes mellitus insulinodependiente (DMID), la enfermedad pulmonar intersticial, la diabetes juvenil, la artritis juvenil, la artritis idiopática juvenil (AIJ), la enfermedad de Kawasaki, el síndrome miasténico de Lambert-Eaton, el liquen plano, el lupus, la nefritis lúpica, la hipofisitis linfocitica, la enfermedad de Méniére, el síndrome de Miller Fisher/la encefalomieloradiculopatía aguda diseminada, la enfermedad mixta del tejido conectivo, la esclerosis múltiple (EM), el reumatismo muscular, la encefalomielitis miálgica (EM), la miastenia gravis, la inflamación ocular, el pénfigo foliáceo, el pénfigo vulgar, la anemia perniciosa, la poliarteritis nodosa, la policondritis, el síndrome poliglandular (síndrome de Whitaker), la polimialgia reumática, la polimiositis, la agammaglobulinemia primaria, la cirrosis biliar primaria /colangiopatía autoinmune, la soriasis, la artritis psoriásica, la enfermedad de Raynaud, el síndrome de Reiter/artritis reactiva, la restenosis, la fiebre reumática, la enfermedad reumática, la artritis reumatoide, la sarcoidosis, el síndrome de Schmidt, la esclerodermia, el síndrome de Sjórgen, el rechazo de trasplantes de órganos sólidos (riñon, corazón, hígado, pulmón, etc.), el síndrome de Stiff-Man, el lupus eritematoso sístémico (LES), la esclerodermia sistémica, la arteritis de Takayasu, la arteritis temporal /arteritis de células gigantes, la tiroiditis, la diabetes tipo 1 , la diabetes tipo 2, la colitis ulcerosa, la uveitis, la vasculitis, el vitíligo, la granulomatosis de Wegener y la prevención o supresión de una respuesta inmunitaría asociada con el rechazo del trasplante de tejidos, células, injertos u órganos de un donante por parte del receptor. Las enfermedades o trastornos relacionados con un injerto comprenden la enfermedad de injerto contra huésped (EICH), tales como las relacionadas con los trasplantes de médula ósea y trastornos inmunes causados por el rechazo de un trasplante de órganos o asociado con esto, tejidos o injertos de células (por ejemplo, aloinjertos o xenoinjertos de tejidos o células), incluidos, por ejemplo, los injertos de piel, músculos, neuronas, islotes, órganos, células parenquimales del hígado, etc. Con respecto a un trasplante de tejidos, células, injertos u órganos sólidos de un donante a un receptor, se cree es posible que las moléculas de la invención descritas en el presente documento (por ejemplo, un polipéptido de DEC de CTLA-4 mutante o una proteína de fusión CTLA-4-Ig mutante) resulten eficaces para prevenir un rechazo agudo de dicho trasplante por parte del receptor y/o para emplearse en tratamientos de mantenimiento a largo plazo para prevenir el rechazo de dicho trasplante por parte del receptor (por ejemplo, para inhibir el rechazo de un trasplante de células de islotes productoras de insulina de un donante por parte de un receptor que padece diabetes). La invención comprende cualquier polipéptido de DEC de CTLA-4 mutante o proteína de fusión CTLA-4-lg mutante de la invención para su üso en la supresión de una respuesta inmunitaria relacionada con al menos una de las enfermedades o trastornos del sistema inmunitario mencionados anteriormente. También comprende el uso de cualquier polipéptido de DEC de CTLA-4 mutante o proteína de fusión CTLA-4-lg mutante de la invención en la fabricación de un medicamento para suprimir una respuesta inmunitaria relacionada con al menos una de las enfermedades o trastornos del sistema inmunitario mencionados anteriormente. Una cantidad eficaz de una molécula de la invención, como por ejemplo, un polipéptido de DEC de CTLA-4 mutante (por ejemplo, D3-54, D3-69, D3-29, D3-56, D3-75) o una proteína de fusión de Ig que contenga un polipéptido de DEC de CTLA-4 mutante de la invención (por ejemplo, D3-54-lgG2, D3-69-lgG2, D3-29-lgG2, D3-56-lgG2, D3-75-lgG2, respectivamente), para suprimir una respuesta inmunitaria en un individuo, o tratar una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario modulado por la interacción de células T endógenas con células endógenas que expresan CD80 y/o CD86 en un individuo en los procedimientos descritos en el presente documento, puede contener entre 0.0001 miligramos por kilogramo (mg/kg) en peso corporal del individuo y 200 miligramos por kilogramo (mg/kg) en peso corporal del individuo aproximadamente, por ejemplo; entre 0.001 miligramos por kilogramo (mg/kg) en peso corporal del individuo y 100 miligramos por kilogramo (mg/kg) de peso del individuo aproximadamente, o, por ejemplo; entre 0.001 mg/kg de peso del individuo y al menos 0.005. 0.01 ; 0.025, 0.05; 0.1 ; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 0.9; 1 ; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 25; 50 ó 75 mg/kg en peso corporal del individuo aproximadamente. Es posible que se supriman en el individuo una o más respuestas inmunitarias, incluidas, por ejemplo, la respuesta de las células T, la activación o proliferación de células T, la síntesis o producción de citocinas (por ejemplo, la producción de TNF-a, IFN-?, IL-2, etc.), la inducción de diversos marcadores de activación (por ejemplo, CD25, receptor IL-2, etc.), la síntesis o producción de moléculas inflamatorias, la inflamación, la inflamación o sensibilidad en las articulaciones, el dolor, la rigidez, el nivel de proteína C reactiva en suero, la producción de anticuerpos anti-colágeno y/o las respuestas de anticuerpos dependientes de células T)). Una cantidad eficaz de una molécula o componente de la invención para suprimir una respuesta inmunitaria puede ser una cantidad que suprima una respuesta inmunitaria, un síntoma o un signo de la misma en una cantidad perceptible o medible. La respuesta inmunitaria se puede suprimir parcialmente o en su totalidad. Una cantidad eficaz para tratar una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario puede ser una cantidad que alivie o disminuya al menos un síntoma, una respuesta biológica o el efecto relacionado con la enfermedad o el trastorno, prevenga el avance de la enfermedad o el trastorno o mejore las funciones físicas del individuo. Una cantidad eficaz de una molécula o un componente de la invención para modular o inhibir la interacción de células T que expresan CD28 y/o CTLA-4 con células B7 positivas puede ser una cantidad que module o inhiba la unión entre las células B7 positivas y CD28 positivas y/o las células T CTLA-4 positivas, respectivamente. Estas interacciones de unión pueden modularse o inhibirse total o parcialmente. En algunos de estos procedimientos, se administra al individuo un dímero de una proteína de fusión CTLA-4-lg muíante de la invención en una cantidad eficaz desde el punto de vista terapéutico o profiláctico (o dosis), suficiente para suprimir una respuesta inmunitaria, tratar una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario modulado por la interacción de las células T con las células que expresan B7, o modular o inhibir la interacción de las células T que expresan CD28 y/o CTLA-4 con células B7 positivas. El dímero de la proteína de fusión que se administra es típicamente un dímero de una proteína de fusión de Ig soluble. En algunos de estos procedimientos, la cantidad o dosis eficaz del dímero de la proteína de fusión de la invención comprende entre 0.001 miligramos por kilogramo (mg/kg) en peso corporal del individuo y 200 miligramos por kilogramo (mg/kg) en peso corporal del individuo aproximadamente (por ejemplo, un ser humano) o entre 0.001 mg/kg y 300 mg/kg en peso corporal del individuo aproximadamente. Por ejemplo, es posible que la cantidad o la dosis eficaz del dímero de la proteína de fusión comprenda entre 0.001 mg/kg en peso corporal del individuo y al menos 0.005; 0.01; 0.05; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 0.9; 1 ; 2; 3; 4; 5; 10; 25; 30; 40; 50; 60; 75; 80; 90; 100; 125; 150; 175; 200; 225; 250 ó 300 mg/kg en peso corporal del individuo aproximadamente (por ejemplo, un ser humano, incluido un ser humano adulto). En algunos casos, la cantidad o dosis eficaz que se administra al individuo oscila entre 0.001 miligramos (mg) y 50 miligramos por kilogramo (kg) en peso corporal del individuo aproximadamente, incluido, entre otros, por ejemplo, entre 0.01 mg/kg y 100 mg/kg en peso corporal del individuo aproximadamente (por ejemplo; seres humanos); entre 0.01 mg/kg y 50 mg/kg en peso corporal del individuo aproximadamente; o entre 0.01 mg/kg y 25 mg/kg en peso corporal del individuo aproximadamente; por ejemplo; 0.05 mg/kg ; 0.075 mg/kg; 0.1 mg/kg; 0.15 mg/kg; 0.2 mg/kg; 0.25 mg/kg; 0.3 mg/kg; 0.5 mg/kg; 0.75 mg/kg; 1 mg/kg; 1.5 mg/kg; 2 mg/kg; 2.5 mg/kg; 3 mg/kg; 5 mg/kg; 10 mg/kg; 20 mg/kg; 25 mg/kg; 50 mg/kg; 75 mg/kg ó 100 mg/kg en peso corporal del individuo aproximadamente (por ejemplo; un paciente humano adulto). En algunos casos, la cantidad o dosis eficaz del dímero de la proteína de fusión es entre 2 y 10 mg/kg aproximadamente; entre 3 y 10 mg/kg aproximadamente; entre 3 y 5 mg/kg aproximadamente; entre 5 y 10 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 y 5 mg/kg; entre 0.05 y 1.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.05 y 3 mg/kg aproximadamente; entre 0.05 y 2.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.05 y 1.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 y 2.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 y 3.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 y 0.5 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 y 0.8 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 y 0.6 mg/kg aproximadamente; entre 0.01 mg/kg y 0.05 mg/kg aproximadamente; entre 0.01 mg/kg y 0.1 mg/kg aproximadamente; entre 0.01 mg/kg y 0.05 mg/kg aproximadamente; entre 0.01 mg/kg y 1 mg/kg aproximadamente; entre 0.01 y 5 mg/kg aproximadamente; entre 0.01 mg/kg y 3 mg/kg aproximadamente; entre 0.05 mg/kg y 2.5 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 mg/kg y 1 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 mg/kg y 5 mg/kg aproximadamente; entre 0.2 y 1 mg/kg aproximadamente; entre 0.2 y 0.6 mg/kg aproximadamente; entre 0.2 y 0.5 mg/kg aproximadamente; entre 0.3 y 1 mg/kg, entre 0.3 y 0.6 mg/kg; y entre 0.3 y 0.5 mg/kg en peso del individuo. En algunos casos, la cantidad o dosis eficaz es de menos de 500 mg aproximadamente para un individuo que pesa menos de 60 kg (por ejemplo, menos de 100 mg; 75 mg; 50 mg; 25 mg; 12.5 mg ó 10 mg aproximadamente), menos de 750 mg aproximadamente para un individuo que pesa entre 60 y 100 kg (por ejemplo, menos de 150 mg; 100 mg; 75 mg; 37.5 mg ó 20 mg aproximadamente) o menos de 1000 mg aproximadamente para un individuo que pesa más de 100 kg (por ejemplo, menos de 500 mg, 100 mg, 50 mg, 25 mg ó 10 mg aproximadamente). En otro aspecto, en algunos de los procedimientos de la invención, se administra al individuo una proteína de fusión CTLA-4-lg muíante de la invención en una cantidad o dosis eficaz desde el punto de vista terapéutico o profiláctico, suficiente, por ejemplo, para suprimir una respuesta inmunitaria, tratar una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario modulado por la interacción de células T con células que expresan B7, o modular o inhibir la interacción de células T que expresan CD28 y/o CTLA-4 con células B7 positivas. La cantidad o dosis eficaz de la proteína de fusión, que suele ser una proteína de fusión soluble, puede contener entre 0.001 mg/kg y 300 mg/kg aproximadamente; entre 0.001 mg/kg y 200 mg/kg aproximadamente; o entre 0.001 mg/kg y 300 mg/kg en peso corporal del individuo aproximadamente (por ejemplo, un ser humano). En un aspecto, la cantidad o dosis eficaz de la proteína de fusión contiene entre 0.001 mg/kg y al menos 0.005; 0.01 ; 0.05; 0.1 ; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 0.9; 1 ; 2; 3; 4; 5; 10; 25; 30; 40; 50; 60; 75; 80; 90; 100; 125; 150; 175; 200; 225, 250 ó 300 mg/kg en peso corporal del individuo aproximadamente. En otro aspecto, la cantidad o dosis eficaz comprende entre 0.01 mg/kg y 100 mg/kg aproximadamente; entre 0.01 mg/kg y 50 mg/kg aproximadamente; o entre 0.01 mg/kg y 25 mg/kg de peso del individuo aproximadamente. Como dosis o cantidades ejemplares se pueden mencionar 0.05 mg/kg; 0.075 mg/kg; 0.1 mg/kg; 0.15 mg/kg; 0.2 mg/kg; 0.25 mg/kg; 0.3 mg/kg; 0.5 mg/kg; 0.75 mg/kg; 1 mg/kg; 1.5 mg/kg; 2 mg/kg; 2.5 mg/kg; 3 mg/kg; 5 mg/kg; 10 mg/kg; 20 mg/kg; 25 mg/kg; 50 mg/kg; 75 mg/kg y 100 mg/kg en peso corporal del individuo aproximadamente (por ejemplo, un ser humano adulto). En otro aspecto, la cantidad o dosis eficaz de la proteína de fusión es entre 2 y 10 mg/kg aproximadamente; entre 3 y 10 mg/kg aproximadamente; entre 3 y 5 mg/kg aproximadamente; entre 5 y 10 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 y 5 mg/kg; entre 0.05 y 1.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.05 y 3 mg/kg aproximadamente; entre 0.05 y 2.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.05 y 1.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 y 2.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 y 3.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 y 0.5 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 y 0.8 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 y 0.6 mg/kg aproximadamente; entre 0.01 mg/kg y 0.05 mg/kg aproximadamente; entre 0.01 mg/kg y 0.1 mg/kg aproximadamente; entre 0.01 mg/kg y 0.05 mg/kg aproximadamente; entre 0.01 mg/kg y 1 mg/kg aproximadamente; entre 0.01 y 5 mg/kg aproximadamente; entre 0.01 mg/kg y 3 mg/kg aproximadamente; entre 0.05 mg/kg y 2.5 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 mg/kg y 1 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 mg/kg y 5 mg/kg aproximadamente; entre 0.2 y 1 mg/kg aproximadamente; entre 0.2 y 0.6 mg/kg aproximadamente; entre 0.2 y 0.5 mg/kg aproximadamente; entre 0.3 y 1 mg/kg aproximadamente; entre 0.3 y 0.6 mg/kg aproximadamente; y entre 0.3 y 0.5 mg/kg en peso del individuo aproximadamente. En algunos aspectos, la cantidad o la dosis eficaz es de menos de 500 mg aproximadamente para un individuo que pese menos de 60 kg (por ejemplo, menos de 100 mg; 75 mg; 50 mg; 25 mg; 12.5 mg ó 10 mg aproximadamente), menos de 750 mg aproximadamente para un individuo que pese entre 60 y 100 kg (por ejemplo, menos de 150 mg; 100 mg; 75 mg; 37.5 mg ó 20 mg aproximadamente) o menos de 1000 mg aproximadamente para un individuo que pese más de 100 kg (por ejemplo, menos de 500 mg, 100 mg, 50 mg, 25 mg ó 10 mg aproximadamente). Se puede determinar la cantidad o la dosis eficaz de un ácido nucleico, un vector, una composición y/o una célula de la invención suficiente para suprimir o modular de igual modo una respuesta inmunitaria, tratar una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario modulado por la interacción de células T con células que expresan B7, o modular o inhibir la interacción de células T que expresen CD28 y/o CTLA-4 con células B7 positivas. Por ejemplo, si se va a administrar al individuo un vector que codifica un dímero de una proteína de fusión de la invención, los entendidos en la técnica podrán determinar fácilmente qué cantidad del vector se debe administrar para que se produzca en el individuo una cantidad del dimero de la proteína de fusión que resulte eficaz desde el punto de vista terapéutico o profiláctico. Como dímeros de proteínas de fusión de la invención ejemplares se pueden mencionar cualesquiera de los descritos de forma detallada anteriormente y en otras partes del presente documento, incluido, por ejemplo, un dimero de una proteína de fusión que contiene dos monómeros de una proteína de fusión idénticos, donde cada monómero de la proteína de fusión contiene un polipéptido de DEC de CTLA-4 mutante de la invención fusionado en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal de un polipéptido de Fe de Ig (por ejemplo, Fe de lgG2, lgG1 , lgG4 o un polipéptido de Fe de Ig mutante que reduzca la función efectora). Un polipéptido de DEC de CTLA-4 mutante ejemplar puede ser uno que contenga una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO: de 1 a 73. Un dimero de una proteína de fusión ejemplar puede ser uno que contenga dos monómeros de una proteína de fusión, donde cada monómero de la proteína de fusión comprenda una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO: de 74 a 79; de 197 a 200; de 205 a 214 y de 219 a 222. Típicamente, en una proteína de fusión diméríca, las dos proteínas de fusión monoméricas se encuentran unidas por un enlace covalente con al menos un enlace disulfuro formado entre los residuos de cisteína presentes en cada monómero. En cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, es posible administrar al individuo, en forma de una composición, la molécula o el componente de la invención, por ejemplo, el polipéptido (por ejemplo, la proteina de fusión dimérica o monomérica o el multímero de polipéptido), el conjugado, el ácido nucleico, el vector, la composición y/o la célula de la invención). La composición típicamente contiene al menos una de estas moléculas o componentes y un excipiente, vehículo o diluyente. La composición puede comprender una composición farmacéutica que contiene al menos una de estas moléculas o componentes y un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, PBS). El pH de las composiciones de la invención se ubica típicamente en el intervalo entre pH 6.0 y pH 9.0 aproximadamente, incluido, por ejemplo, entre pH 6.5 y pH 8.5 aproximadamente, y, generalmente, entre pH 7.0 y pH 8.0 aproximadamente. En un aspecto, el pH de las composiciones de la invención se ubica típicamente en el intervalo entre pH 3 y pH 10 aproximadamente, entre pH 4 y pH 10 aproximadamente, entre pH 5 y pH 9 aproximadamente, entre pH 6 y pH 9 aproximadamente, entre pH 5.5 y pH 8.5 aproximadamente, entre pH 6.0 y pH 6.7 aproximadamente, entre pH 6.0 y pH 6.5 aproximadamente, entre pH 6.2 y pH 8.7 aproximadamente, entre pH 6.5 y pH 7.5 aproximadamente, entre pH 6.2 y pH 7.0 aproximadamente, entre pH 6.3 y pH 6.8 aproximadamente, entre pH 6.4 y pH 6.8 aproximadamente, y entre pH 7.0 y pH 7.4 aproximadamente. En un aspecto, una composición que contenga al menos una de las moléculas o componentes de la invención, como por ejemplo, una proteína de fusión CTLA-4-lg muíante, tiene un pH de pH 5.5, pH 6.0, pH 6.1 , ?? 6.2, ?? 6.3, ?? 6.4, ?? 6.5, ?? 6.6, ?? 6.7, ?? 6.8, ?? 6.9, ?? 7.0, ?? 7.1 , ?? 7.2, ?? 7.3, ?? 7.4, ?? 7.5, ?? 7.6, ?? 7.7, ?? 7.8, ?? 7.9, ?? 8.0, ?? 8.1 , ?? 8.2, ?? 8.3, ?? 8.4, ?? 8.5, ?? 8.6, ?? 8.7, ?? 8.8, ?? 8.9, ?? 9.0, ?? 9.1 , ?? 9.2, ?? 9.3, ?? 9.4, ?? 9.5, ?? 9.6, ?? 9.7, ?? 9.8, ??, 9.9 ó ?? 10.0. Algunas composiciones de la invención contienen una o más sales (por ejemplo, cloruro de sodio, fosfato de sodio, cloruro de calcio y otras similares), uno o más tampones (por ejemplo, HEPES, citrato de sodio, fosfato de sodio (por ejemplo, Na2HP04/Na3P04), succinato, tartrato, fumarato, gluconato, oxalato, lactato, acetato, tr¡s(hidroximetil)aminometano (Tris), y otros similares), uno, dos, tres, cuatro, cinco o más sacáridos o azúcares (por ejemplo, sacarosa, mañosa, maltosa, trehalosa, dextrosa y otros similares), y/o uno, dos, tres, cuatro, o más polialcoholes o alcoholes de azúcares (por ejemplo, manitol, sorbitol, glicol, glicerina, arabitol, eritritol, xilitol, ribitol, lactitol y otros similares). Se pueden incluir en la composición uno, dos, tres, cuatro, cinco o más monosacáridos, disacáridos y/o polisacáridos. La composición de la invención puede contener una molécula o componente a cualquier concentración que resulte eficaz para suprimir una respuesta inmunitaria cuando se administra al individuo. Por ejemplo, en algunos de estos procedimientos (incluidos, por ejemplo, los procedimientos en los que es conveniente la inmunosupresión, como por ejemplo, entre otros, el tratamiento de la artritis reumatoide o trastornos inmunes similares, o procedimientos para inhibir el rechazo del trasplante de tejidos, células, injertos u órganos de un donante por parte del receptor), se administra al individuo (por ejemplo, por vía parental, subcutánea, intravenosa, intramuscular, etc.) una composición farmacéutica compuesta por un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable y un dímero de una proteína de fusión de la invención, donde la composición farmacéutica contiene un dímero de una proteína de fusión de la invención a una concentración de entre 0.001 mg/ml y 200 mg/ml aproximadamente; entre 0.001 mg/ml y 300 mg/ml aproximadamente; entre 0.01 mg/ml y 200 mg/ml aproximadamente; entre 0.01 mg/ml y 250 mg/ml aproximadamente; entre 0.1 mg/ml y 200 mg/ml aproximadamente; entre 0.001 mg/ml y 100 mg/ml aproximadamente; entre 0.001 mg/ml y 90 mg/ml aproximadamente; entre 0.01 mg/ml y 90 mg/ml aproximadamente; entre 0.01 mg/ml y 75 mg/ml aproximadamente; entre 0.1 y 80 mg/ml aproximadamente; entre 0.1 mg/ml y 75 mg/ml aproximadamente; entre 0.1 y 60 mg/ml aproximadamente; entre 0.1 mg/ml y 50 mg/ml; entre 0.1 mg/ml y 40 mg/ml aproximadamente; entre 0.1 y 30 mg/ml aproximadamente; entre 1 mg/ml y 90 mg/ml aproximadamente; entre 1 mg/ml y 80 mg/ml aproximadamente; entre 1 mg/ml y 75 mg/ml aproximadamente; entre 1 mg/ml y 60 mg/ml aproximadamente; entre 1 mg/ml y 50 mg/ml aproximadamente; entre 1 mg/ml y 40 mg/ml aproximadamente; entre 1 mg/ml y 30 mg/ml aproximadamente; entre 1 mg/ml y 20 mg/ml aproximadamente; entre 1 mg/ml y 10 mg/ml aproximadamente; entre 1 mg/ml y 5 mg/ml aproximadamente; entre 5 mg/ml y 90 mg/ml aproximadamente; entre 5 mg/ml y 80 mg/ml aproximadamente; entre 5 mg/ml y 75 mg/ml aproximadamente; entre 5 mg/ml y 60 mg/ml aproximadamente; entre 5 mg/ml y 50 mg/ml aproximadamente; entre 5 mg/ml y 40 mg/ml aproximadamente; entre 5 mg/ml y 30 mg/ml aproximadamente; entre 5 mg/ml y 20 mg/ml aproximadamente; entre 5 mg/ml y 10 mg/ml aproximadamente; entre 1 mg/ml y 5 mg/ml aproximadamente; entre 10 mg/ml y 75 mg/ml aproximadamente; entre 25 mg/ml y 75 mg/ml aproximadamente; entre 30 mg/ml y 60 mg/ml aproximadamente; entre 25 mg/ml y 50 mg/ml aproximadamente; entre 50 mg/ml y 100 mg/ml aproximadamente; incluido, por ejemplo, 1 mg/ml aproximadamente; 5 mg/ml; 10 mg/ml; 15 mg/ml aproximadamente; 25 mg/ml aproximadamente; 30 mg/ml aproximadamente; 40 mg/ml aproximadamente; 50 mg/ml aproximadamente; 60 mg/ml aproximadamente; 70 mg/ml aproximadamente; 80 mg/ml aproximadamente; 90 mg/ml aproximadamente; ó 100 mg/ml. También se consideran otras concentraciones. En algunos procedimientos de la invención descritos en el presente documento, incluidos algunos procedimientos terapéuticos o profilácticos, se administra al individuo un volumen de cualquiera de estas composiciones (por ejemplo, una composición farmacéutica) que contenga una proteína de fusión de la invención en una cantidad que oscile entre 0.01 mililitro (mi) y 10 mi aproximadamente; entre 0.01 mi y 5 mi aproximadamente; entre 0.1 mi y 5 mi aproximadamente; entre 0.5 mi y 2ml aproximadamente; entre 1 mi y 2 mi aproximadamente; incluido, por ejemplo, un volumen de 0.01 mi; 0.025 mi; 0.05 mi; 0.1ml; 0.2 mi; 0.3 mi; 0.4 mi; 0.5 mi; 0.75 mi; 1 mi; 2ml; 3ml; 4 mi; 5 mi; 10 mi; 20ml; 25 mi; 50 mi; 75 mi; 100 mi; 200 mi; 250 mi; 300 mi; 500 mi; 1000 mi, etc. a través de una única inyección intravenosa, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal. En otra parte del presente documento se explican más detalladamente composiciones ejemplares de la invención. Es posible que varíe la cantidad o la dosis eficaz de una molécula de la invención que se administra a un individuo específico según, por ejemplo, la enfermedad, trastorno o afección que se esté tratando, la potencia de la molécula de CTLA-4 mutante específica de la invención (es decir, su eficacia) que se administrará (por ejemplo, un dímero de una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante de la invención), la forma de administración de la molécula y la capacidad individual del individuo para tolerar una cantidad específica de la molécula que se utilice. Por ejemplo, en un procedimiento para suprimir una respuesta inmunitaria en un individuo que sufre artritis reumatoide (AR) o en un procedimiento para tratar la artritis reumatoide, se puede determinar la cantidad o dosis eficaz de un dímero de CTLA-4-lg mutante de la invención (por ejemplo, D3-29-IGg2, D3-54-lgG2, D3-56-lgG2, D3-69-lgG2, D3-75-lgG2, etc.) que se administrará al individuo sobre la base de diversos factores, como por ejemplo la potencia del dímero de CTLA-4-lg mutante, la forma de administración del dímero y/o la gravedad de los síntomas o signos de artritis reumatoide en el individuo. En un aspecto, se puede determinar una cantidad o dosis eficaz de un dímero de CTLA-4-lg mutante específico de la invención comparando la potencia de dicho dímero de CTLA-4-lg mutante con la de un dímero de Orencia®. Se conoce en la técnica la dosis de un dímero de Orencia® que resulta eficaz para tratar la artritis reumatoide y otros trastornos relacionados. Por ejemplo, el dímero de Orencia® se administra típicamente por vía intravenosa a un ser humano que sufre artritis reumatoide en una dosis de 10 mg de Orencia® por kilogramo (kg) en peso corporal del individuo aproximadamente. Se puede administrar un dímero de CTLA-4-lg mutante de la invención que es aproximadamente "X" veces más potente que la Orencia® (por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea o por otra vía descrita en el presente documento) a un humano que sufre artritis reumatoide a una dosis "X" veces menor que la dosis del dímero de Orencia® para lograr un efecto terapéutico (por ejemplo, suprimir una respuesta inmunitaria) que sea equivalente aproximadamente al efecto del dímero de Orencia®. Si se desea un efecto terapéutico mayor, se puede determinar fácilmente y administrar al individuo una mayor cantidad o dosis del dímero de CTLA-4-lg mutante, aumentada de forma proporcional. En todos los procedimientos descritos en el presente documento, se puede administrar la molécula o el componente de la invención, por ejemplo, el polipéptido (por ejemplo, la proteína de fusión dimérica o monomérica o el multímero de polipéptido), el conjugado, ácido nucleico, vector, composición y/o célula de la invención) por vía parenteral, subcutánea o intravenosa o por otra vía que se explique en otra parte del presente documento. Es posible administrar la molécula o componente de la invención en una cantidad eficaz desde el punto de vista terapéutico, una, dos, tres o cuatro veces por mes, dos veces por semana, bisemanalmente (cada dos semanas) o bimensualmente (cada dos meses). La administración puede prologarse por un período de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 ó 12 meses o mayor (por ejemplo, por uno, dos, tres, cuatro años o más, incluso durante toda la vida del individuo). Los procedimientos descritos en el presente documento pueden comprender además la administración al individuo de una cantidad eficaz de al menos un agente o compuesto terapéutico o inmunosupresor adicional. Por lo tanto, por ejemplo, la invención proporciona un procedimiento para suprimir una respuesta inmunitaria que comprende la administración a un individuo que lo necesite de (1) una cantidad eficaz de al menos un primer agente inmunosupresor, donde cada uno de estos agentes inmunosupresores es un polipéptido, un ácido nucleico, un vector, una composición y/o una célula de la invención, y (2) una cantidad eficaz de al menos un segundo agente inmunosupresor de manera que se suprima una respuesta inmunitaria en el individuo. Es posible utilizar o administrar diversos agentes terapéuticos o inmunosupresores adicionales (que no sean moléculas de la invención) junto con una molécula de la invención (por ejemplo, un polipéptido, un ácido nucleico, un vector, una composición y/o una célula de la invención). Estos agentes comprenden, por ejemplo, un fármaco modificador de la enfermedad reumática (FAME) (como por ejemplo, el metotrexato (MTX), un antagonista de citocinas (por ejemplo, un antagonista de IL-2 o IL-6), un compuesto esteroideo (por ejemplo, corticosteroides, glucocosteroides, por ejemplo, prednisona o metilprednisona), un compuesto no esteroideo, el salicilato de sodio o magnesio, el ibuprofeno, el ácido acetilsalicílico, el acetaminofeho, anticuerpos, agentes biológicos que bloquean la síntesis de una producción de citocina antiinflamatoria, Raptiva® efalizumab, un agente o compuesto antiinflamatorio y un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (NSAID). Este agente terapéutico o inmunosupresor adicional se puede administrar al individuo en una composición farmacéutica que contenga el agente adicional y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. La cantidad o dosis eficaz de agente a administrar dependerá del agente específico. Algunos de estos agentes se utilizan actualmente en terapias inmunosupresoras y se pueden determinar las dosis adecuadas sobre la base de la enfermedad, el trastorno o la afección que se esté tratando, la capacidad del individuo para tolerar cantidades o dosis especificas y la eficacia inmunosupresora del agente. Se conocen dosis ejemplares de los agentes inmunosupresores mencionados anteriormente que no son moléculas de la invención. Se puede administrar el agente inmunosupresor adicional que no es una molécula de la invención antes, simultáneamente o después de la administración de la molécula de la invención (por ejemplo, una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante). Un régimen de tratamiento, que comprende, por ejemplo, distintas dosis, un plan de administración, un modo de administración (por ejemplo, inyección intravenosa, inyección subcutánea, etc.) y una composición farmacéutica que contiene al menos una molécula o componente de la invención puede variar según la enfermedad, trastorno o condición objeto de tratamiento. Se pueden administrar una o más de estas moléculas o componentes de la invención a un individuo, pero no es necesario que se administren en la misma formulación farmacéutica, a través de los mismos modos de administración, en la misma cantidad ni con la misma frecuencia de administración. En algunos de estos procedimientos, por ejemplo, se administra por vía subcutánea 1 mi aproximadamente de una composición farmacéutica que contiene un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y una concentración de un dímero de una proteína de fusión de la invención de 50 mg/ml aproximadamente a un individuo (por ejemplo, un ser humano adulto) que necesite la inmunosupresión (por ejemplo, un individuo que sufra artritis reumatoide). La dosis inicial es de 50 mg del dímero de la proteína de fusión. Para un individuo con un peso corporal de 100 kg, esta dosis inicial corresponde a 0.5 mg del dímero de la proteína de fusión por kg en peso corporal del individuo. Se administra por vía subcutánea una segunda dosis de la misma cantidad una o dos semanas después de la primera dosis. Se administran dosis adicionales por vía subcutánea todas las semanas, bisemanalmente o una vez al mes, o con mayor o menor frecuencia según sea necesario. Se cree que este formato de composición y modo de administración resultan útiles, por ejemplo, para el tratamiento de un ser humano que sufre artritis reumatoide u otro trastorno inmune en el que se recomienda la inmunosupresión o para inhibir el rechazo del trasplante de tejidos, células, injertos u órganos de un donante por parte del receptor.

Procedimientos para tratar la artritis reumatoide La artritis reumatoide es una de las enfermedades autoinmunes inflamatorias sistémicas más comunes y se calcula que afecta al 1-2% de la población adulta. Véase, por ejemplo, Dipiro, J.T., Rheumatoid arthritis, in Pharmacotherapy: A Pathophysiologic Approach, 1671-1682 (Talbert, R.T. et al, eds., McGraw-Hill, Nueva York, 6.a ed. 2005). La enfermedad se caracteriza por la hiperplasia de la membrana sinovial y la infiltración de las células inflamatorias, incluidas las células T activadas. Las células T activadas cumplen una función fundamental en el avance de la artritis reumatoide a través de la estimulación de diversos tipos de células para producir citocinas proinflamatorias, como por ejemplo IL-1 , IL-6 y TNF-alfa, autoanticuerpos y metaloproteinasas de matrices (Hoffman, R.W., Front. Biosci. 6:1369-1378 (2001); Choy, E.K. et al, N. Engl. J. Med 344:907-916 (2001)). La gran contribución de las células T al avance de la artritis reumatoide hace que la activación de las células T sea un objetivo racional para la intervención terapéutica. Se cree que estas moléculas inflamatorias provocan la respuesta inflamatoria, el daño a los tejidos (por ejemplo, el daño a las articulaciones) y el dolor asociado con la artritis reumatoide. La coestimulación de las células T mediada por las interacciones entre el receptor CD28 y CD80 y/o los ligandos de CD86 es fundamental para la activación de la mayoría de las células T (Riley, J.L. et al, Blood 105:13-21 (2005)). Se ha demostrado que los agentes terapéuticos o profilácticos que antagonizan la vía de coestimulación de CD80/CD86 - CD28, tales como la proteina de fusión Orencia® (Abatacept), que es una proteína de fusión hCTLA-4-lg dimérica soluble, resultan eficaces desde el punto de vista clínico en el tratamiento de la artritis reumatoide (Kremer, J.M. et al, Ann. Intern. Meó. 144:865-876 (2006); Genovese, M.C. et al, N. Engl. J. Med. 353:11 14-1123 (2005)). Se cree que el Abatacept ejerce una función inmunosupresora mediante la unión a los ligandos CD80 y/o CD86 en células presentadoras de antígenos cuando se administran a un individuo (por ejemplo, un ser humano adulto) in vivo en una cantidad eficaz desde el punto de vista terapéutico o profiláctico, y de este modo previene la interacción de uno o ambos ligandos con el receptor CD28 en células T. Actualmente, el Abatacept está aprobado para tratar pacientes humanos adultos con artritis reumatoide activa moderada a grave que presentan una respuesta inadecuada a uno o más FAME, tales como el metotrexato o antagonistas TNF. El Abatacept se administra a un paciente adulto con artritis reumatoide en una dosis de 10 mg/kg en peso corporal del individuo por infusión intravenosa. Después de la primera dosis, se administran al individuo una segunda y tercera dosis de 10 mg/kg de la proteína de fusión a las dos y a las cuatro semanas, respectivamente, de la administración de la primera dosis. Las dosis posteriores se administran cada cuatro semanas (es decir, una vez al mes). Se cree que es necesaria la infusión intravenosa de Abatacept para proporcionar el alto nivel de dosis necesario para obtener la eficacia deseada en el tratamiento de la artritis reumatoide.

Entre otros tratamientos que se utilizan actualmente para la artritis reumatoide, se pueden mencionar la administración de agentes inmunosupresores no específicos, tales como el metotrexato y fármacos antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos. Además, hay agentes biológicos aprobados que están dirigidos a citocinas proinflamatorias específicas, tales como TNF-a (por ejemplo, Remicade® infliximab, Enbrel® entaercept, Humira® adalimumab) y IL-1 (por ejemplo, Kineret® anakinra). Sin embargo, muchos de estos tratamientos presentan efectos secundarios importantes -algunos incluso son tóxicos- especialmente cuando se administran por un período prolongado. A pesar de que existen diversos tratamientos disponibles, hay una necesidad insatisfecha importante para el tratamiento de la artritis reumatoide. Por ejemplo, el 60% de los pacientes humanos con artritis reumatoide que se han sometido anteriormente a un tratamiento con FAME y no han tenido éxito, y el 80% de los pacientes humanos con artritis reumatoide que se han sometido anteriormente a un tratamiento con anti-TNF y no han tenido éxito, no lograron un puntaje de ACR 50 luego del tratamiento con Orencia durante 6 meses (Kremer J.M. et al, Ann. Intern. Med. 144:865-876 (2006); Genovese, M.C. et al, N. Engl. J. Med. 353:1 1 14-11 (2005)). Estudios de respuesta a la dosis utilizando Abatacept y la proteína de fusión Belatacept (LEA29Y-lg) en el tratamiento de la artritis reumatoide en adultos indicaron que la eficacia depende de la dosis y que no se satura en los niveles de dosis más altos evaluados (Kremer, J.M. et al, N. Engl. J. Med. 349:1907- 1915(2003); Moreland, L.W. et al, Arthrit. Rheum. 46:1470-1479 (2002)). Se espera que una CTLA-4-lg muíante soluble dimérica de la invención que tiene mayor avidez de unión a hCD80 y/o a hCD86 que el Abatacept ejerza efectos inmunosupresores más potentes que el Abatacept cuando se administra a un individuo con artritis reumatoide. Esta CTLA-4-lg muíante se une a una cantidad semejante de ligandos CD80 y/o CD86 a una concentración más baja que el Abatacepí. Una CTLA-4-lg mulaníe con una mayor avidez de unión a CD80 o CD86 y una velocidad de disociación de CD80 o CD86 más baja, respecíivameníe, íiene un mayor íiempo de permanencia en dicho ligando. Se espera que esíe mayor íiempo de permanencia esté asociado a una mayor eficacia in vivo. Se cree que dicha CTLA-4-lg mutaníe puede resullar eficaz en el íralamienlo terapéuíico o profilácíico de un individuo con artritis reumatoide en una dosis más baja que el Abatacept. O sea, que se cree que esta CTLA-4-lg muíante puede lograr un grado de eficacia equivalente al del Abaíacepí cuando se adminisíra a un individuo con artritis reumatoide en una dosis menor a la dosis de Abatacept de 10 mg/kg en peso corporal del individuo. La invención proporciona proteínas de fusión CTLA-4-lg mutaníes diméricas solubles con diversas avideces de unión a hCD80 y/o a hCD86. Las proleínas de fgsión CTLA-4-lg mulaníes diméricas solubles con avideces de unión considerablemeníe mayores a hCD86 que el Abaíacepí pueden íener un grado de eficacia equivalente al del Abaíacepí cuando se administran a un individuo con artritis reumaíoide en una dosis bástanle menor a la del Abatacept. Es posible que la administración de una dosis más baja de la CTLA-4-lg mutante permita un modo de administración más cómodo (por ejemplo, inyección subcutánea) que el que se utiliza actualmente para la administración del Abatacept (inyección intravenosa). Además, se cree que una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante soluble de la invención con una mayor potencia inmunosupresora que la proteína de fusión Abatacept o Belatacept permitiría obtener un mayor nivel de eficacia en el tratamiento de pacientes con artritis reumatoide. Se espera que una CTLA-4-lg mutante con mayor potencia inmunosupresora sea capaz de aliviar los síntomas asociados a la artritis reumatoide e inhibir el avance de los efectos perjudiciales a nivel físico de la artritis reumatoide de manera más eficaz que el Abatacept. Esta CTLA-4-lg mutante se puede formular en un diluyente, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, PBS) a una concentración ubicada en el intervalo de 0.1 y 200 mg/ml. El tratamiento de un individuo con artritis reumatoide se puede llevar a cabo mediante la administración al individuo de una cantidad (dosis) eficaz desde el punto de vista terapéutico o profiláctico de la CTLA-4-lg mutante por inyección subcutánea o infusión intravenosa, con una frecuencia de administración determinada adecuadamente (por ejemplo, una dosis inicial seguida de una dosis entre 2 y hasta 4 veces al mes, una dosis por mes o una dosis cada dos meses). La dosis dependerá de la gravedad de la enfermedad o de los síntomas del individuo. Por ejemplo, es posible administrar una cantidad o dosis de una CTLA-4-lg mutante de no más de 10 mg/kg (incluido, por ejemplo, 1 mg/kg; 0.5 mg/kg; 0.25 mg/kg; 1 mg/kg; 2 mg/kg; 3 mg/kg; 4 mg/kg; 5 mg/kg; 6 mg/kg; 7 mg/kg; 8 mg/kg ó 9 mg/kg) en peso corporal del individuo aproximadamente. Es posible que una CTLA-4-lg mutante con mayor potencia inmunosupresora permita emplear un plan de administración de menor frecuencia (por ejemplo, una vez cada dos meses) que el que se utiliza típicamente con el Abatacept. Como alternativa, es posible administrar al individuo con artritis reumatoide una cantidad o dosis de una CTLA-4-lg mutante mayor que 10 mg/kg de peso del individuo aproximadamente (por ejemplo, entre 10 mg/kg y 100 mg/kg aproximadamente, entre 10 mg/kg y 25 mg/kg aproximadamente, entre 10 mg/kg y 50 mg/kg aproximadamente, entre 10 mg/kg y 75 mg/kg aproximadamente, etc., incluido, por ejemplo, aproximadamente 15 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 g/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg) si la enfermedad y/o los síntomas del individuo ameritan dicha cantidad o dosis. Se puede determinar la cantidad o dosis eficaz de un dimero de CTLA-4-lg mutante de la invención para tratar la artritis reumatoide en un ser humano que la padece, sobre la base de diversos factores, como por ejemplo la potencia del dimero de CTLA-4-lg mutante, el modo de administración del dimero y/o la gravedad de los síntomas o signos de la artritis reumatoide en el individuo. Por ejemplo, se puede establecer una cantidad o dosis eficaz de un dimero de CTLA-4-lg mutante de la invención mediante la comparación de la potencia de dicho dimero con la del dimero de Orencia® y la determinación de la cantidad o dosis del dimero de CTLA-4-lg mutante que produciría el efecto ¡nmunosupresor deseado en comparación con la Orencia® (por ejemplo, un efecto mejorado o aproximadamente equivalente) sobre la base de la cantidad o la dosis de Orencia® que se administraría típicamente a un individuo humano que presenta síntomas o signos semejantes a los de la artritis reumatoide. En una realización, por ejemplo, la invención proporciona un procedimiento para tratar la artritis reumatoide en un individuo que necesita tratamiento, procedimiento que consiste en la administración al individuo de una cantidad eficaz de una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante dimérica soluble de la invención mediante, por ejemplo, inyección intravenosa o subcutánea. La cantidad o dosis eficaz que se administra al individuo puede comprender entre 0.001 miligramos (mg) y 10 miligramos por kilogramo (kg) en peso corporal del individuo aproximadamente, incluidas, entre otras, por ejemplo; entre 0.01 mg/kg y 10 mg/kg de peso del individuo aproximadamente, 0.05 mg/kg; 0.1 mg/kg; 0.2 mg/kg; 0.25 mg/kg; 0.3 mg/kg; 0.5 mg/kg; 1 mg/kg; 2 mg/kg; 5 mg/kg; 6 mg/kg; 7 mg/kg; 8 mg/kg; 9 mg/kg; ó 10 mg/kg en peso corporal del paciente humano adulto aproximadamente. En algunos casos, la cantidad o dosis eficaz se ubica entre 2 y 10 mg/kg aproximadamente; entre 3 y 10 mg/kg aproximadamente; entre 3 y 5 mg/kg aproximadamente; entre 5 y 10 mg/kg aproximadamente; 0.1 y 5 mg/kg de peso; entre 0.05 y 1.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.05 y 3 mg/kg de peso aproximadamente; entre 0.05 y 2.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.05 y 1.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.05 y 2.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 y 2.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 y 3.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 y 0.5 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 y 0.8 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 y 0.6 mg/kg aproximadamente; entre 0.2 y 1 mg/kg aproximadamente; entre 0.2 y 0.6 mg/kg aproximadamente; entre 0.2 y 0.5 mg/kg aproximadamente; entre 0.3 y 1 mg/kg aproximadamente; entre 0.3 y 0.6 mg/kg aproximadamente; entre 0.3 y 0.5 mg/kg de peso de un individuo aproximadamente. En algunos casos, la cantidad o dosis eficaz es de menos de 500 mg aproximadamente para un individuo que pesa menos de 60 kg (por ejemplo, menos de 100 mg; 75 mg; 50 mg; 25 mg ó 12.5 mg aproximadamente), menos de 750 mg aproximadamente para un individuo que pesa entre 60 y 100 kg (por ejemplo, menos de 150 mg; 100 mg; 75 mg; 37.5 mg ó 20 mg aproximadamente) o menos de 1000 mg aproximadamente para un individuo que pesa más de 100 kg (por ejemplo, menos de 500 mg, 100 mg, 50 mg, 25 mg ó 10 mg aproximadamente). Después de la primera dosis, se administran dosis equivalentes a intervalos de 1 , 2, 4, 8, 10, 12, 14 ó 16 semanas. Se puede determinar la frecuencia de las dosis posteriores según lo que sea necesario. Se puede formular esta proteína de fusión CTLA-4-lg mutante con un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable para producir una composición farmacéutica adecuada para su administración a un individuo (por ejemplo, un mamífero, incluido un ser humano). La concentración de la proteína de fusión en la composición se puede ubicar en el intervalo entre 0.01 mg/ml y 300 mg/ml aproximadamente o entre 0.01 mg/ml y 200 mg/ml, incluido, entre otros, por ejemplo; entre 0.1 mg/ml y 300 mg/ml aproximadamente; entre 0.1 mg/ml y 200 mg/ml aproximadamente; entre 0.1 mg/ml y 100 mg/ml aproximadamente; entre 0.5 mg/ml y 100 mg/ml aproximadamente; entre 0.5 mg/ml y 50 mg/ml aproximadamente; entre 1 mg/ml y 100 mg/ml aproximadamente; entre 1 mg/ml y 75 mg/ml aproximadamente; entre 5 mg/ml y 75 mg/ml aproximadamente; entre 10 mg/ml y 75 mg/ml aproximadamente; entre 10 mg/ml y 60 mg/ml aproximadamente; entre 25 mg/ml y 60 mg/ml aproximadamente; entre 30 mg/ml y 60 mg/ml aproximadamente; entre 25 mg/ml y 50 mg/ml aproximadamente; entre 40 mg/ml y 50 mg/ml aproximadamente; 25 mg/ml aproximadamente ó 50 mg/ml aproximadamente. También se consideran otras composiciones, incluidas las explicadas anteriormente y las que se explicarán a continuación. Se espera que este tratamiento reduzca uno o más signos y/o síntomas asociados a la artritis reumatoide, como por ejemplo, la inflamación, la sensibilidad en las articulaciones, la inflamación en las articulaciones, el dolor y la rigidez en el individuo. Es posible que dicho tratamiento disminuya el avance de la enfermedad en el paciente. Por ejemplo, el tratamiento puede reducir el avance del daño estructural en el individuo. Es posible que dicho tratamiento también mejore las funciones físicas del individuo.

Procedimientos para inhibir el rechazo de un trasplante de tejidos, células, injertos u órganos En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para inhibir el rechazo, o suprimir una respuesta inmunitaria asociada, de un trasplante de tejidos, células, injertos cutáneos u órganos de un donante por parte del, receptor, procedimiento que consiste en administrar al individuo receptor una cantidad eficaz desde el punto de vista terapéutico de uno o más de los siguientes: (1) un polipéptido de la invención (por ejemplo, un polipéptido de DEC de CTLA-4 o una proteína de fusión CTLA-4-lg muíante dimérica o monomérica); (2) un multímero que contiene uno o más polipéptidos de la invención (por ejemplo, un dímero que comprende dos de estos polipéptidos o un tetrámero que comprende cuatro de estos polipéptidos); (3) un conjugado que contiene al menos un polipéptido de la invención; (4) un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención); (5) un vector que contiene un ácido nucleico de la invención o que codifica un polipéptido de la invención; (6) una célula o una población de células que contiene un polipéptido, un ácido nucleico, el conjugado y/o vector de la invención; y/o (7) una composición de la invención, para inhibir así el rechazo de un trasplante de tejidos, células, injertos cutáneos u órganos por el individuo receptor. El donante y el receptor pueden ser de la misma especie o de diferente especie. El donante o el receptor pueden ser un mamífero, por ejemplo un ser humano, un primate no humano (por ejemplo, un mono, un gorila), una oveja, un gato, un perro, un cerdo, una vaca, un caballo, etc. En algunos de estos procedimientos, se administra el polipéptido, el conjugado, vector y/o célula de la invención al individuo receptor antes, simultáneamente o después del trasplante del tejido, células, el injerto cutáneo u órgano. La cantidad eficaz comprende típicamente entre 0.001 mg/kg en peso corporal del individuo y 200 mg/kg en peso corporal del individuo aproximadamente. En algunos de estos procedimientos, por ejemplo, la cantidad eficaz de la proteína de fusión comprende entre 0.001 miligramos por kilogramo (mg/kg) de peso del individuo y al menos 0.005; 0.01 ; 0.05; 0.1 ; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 0.9; 1 ; 2; 3; 4; 5; 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250 ó 300 miligramos por kilogramo (mg/kg) en peso corporal del individuo aproximadamente. En algunos de estos procedimientos, por ejemplo, la cantidad eficaz de la proteína de fusión comprende entre 0.001 miligramos por kilogramo (mg/kg) en peso del individuo y al menos 0.005; 0.01 ; 0.05; 0.1 ; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 0.9; 1 ; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 20; 25; 50 ó 75 miligramos por kilogramo (mg/kg) en peso corporal del individuo aproximadamente. Se puede administrar el polipéptido, el conjugado, el ácido nucleico, el vector y/o la célula de la invención al individuo receptor antes, durante o inmediatamente después del trasplante. Como alternativa o adicionalmente, es posible administrar la molécula de la invención una o más horas después del trasplante, el día posterior al trasplante y/o diariamente a partir del día del trasplante, o al menos una vez por semana, al menos una vez cada dos semanas, al menos una vez por mes después del trasplante, según resulte necesario, durante hasta 12, 24 ó 36 meses o más, o por un período más prolongado, según sea necesario. El trasplante de un órgano puede referirse al trasplante de cualquier órgano, por ejemplo, un riñon, el hígado, el corazón o un pulmón. La cantidad o dosis eficaz de una molécula de CTLA-4 muíante de la invención (por ejemplo, un dímero de una proteína de fusión CTLA-4-lg muíante) que se administrará a un individuo receptor de un trasplaníe de un órgano, íejido o célula que inhiba el rechazo del trasplaníe (o suprima una respuesta inmunitaria asociada a dicho trasplante) se determina típicameníe sobre la base de la poíencia de dicha molécula, el modo de adminisíración, el lipo de trasplante (por ejemplo, de células, tejidos, órganos), los antecedentes del individuo y/o la gravedad de los síntomas o signos de una respuesía ¡nmuniíaria del individuo receplor del írasplaníe que sugiera un rechazo del írasplanle. Por ejemplo, se puede establecer una caníidad o dosis eficaz de un dímero de CTLA-4-lg muíaníe de la invención (por ejemplo, los dímeros D3-29-IGg2, D3-54-lgG2, D3-56-lgG2, D3-69-lgG2, D3-75-lgG2, etc.) mediante la comparación de la potencia de dicho dímero con la del dímero de Belatacept. Se conocen las dosis eficaces de Belaíacepí que resulían úíiles para prevenir o suprimir una respuesta inmunitaria asociada a un írasplaníe de riñon. Por ejemplo, se administra Belatacepl medianíe infusión iníravenosa a un ser humano después de un írasplaníe de riñon de un donaníe en una caníidad o dosis de 5 mg ó 10 mg por kilogramo en peso corporal del ser humano por mes. Se puede adminisírar un dímero de CTLA-4-lg muíaníe de la invención que es aproximadamente "X" veces más potente que el Belatacept (por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea o por otra vía descrita en el presente documento) a un ser humano que se sometió a un trasplante de riñon en una cantidad o dosis "X" veces menor a la dosis de Belatacept para lograr un efecto terapéutico (por ejemplo, suprimir una respuesta inmunitaria) aproximadamente equivalente al efecto de Belatacept. Si se desea un efecto terapéutico mayor, se puede determinar y administrar una mayor cantidad o dosis del dímero de la proteína de fusión CTLA-4-lg de la invención, aumentada de forma proporcional. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para tratar el rechazo de un trasplante de tejidos, células u órganos (por ejemplo, el rechazo de un trasplante de un órgano sólido (por ejemplo, riñon, hígado, pulmón, corazón, etc.)) en un individuo que recibe dichos tejidos, células u órganos de un donante, procedimiento que consiste en administrarle al receptor una cantidad eficaz desde el punto de vista terapéutico de al menos un polipéptido, un conjugado, un ácido nucleico, un vector y/o una célula de la invención para inhibir así el rechazo de un trasplante de tejidos, células u órganos de un donante por parte del individuo receptor. Se puede administrar el polipéptido, el conjugado, el ácido nucleico, el vector y/o la célula de la invención al individuo receptor antes, simultáneamente o después del trasplante de células, tejidos u órganos. En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para inhibir el rechazo de un trasplante de células de islotes de un donante en un individuo receptor que lo necesite, procedimiento que consiste en administrar al individuo una cantidad o dosis eficaz de una molécula de CTLA-4 mutante de la invención (por ejemplo, una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante) antes, simultáneamente o después del trasplante de células de islotes del páncreas de un donante al individuo. El individuo (por ejemplo, un ser humano) típicamente sufre diabetes (por ejemplo, DMDI) y este procedimiento resulta útil en el tratamiento de individuos con diagnóstico de diabetes o que sufren de diabetes. Los procedimientos de trasplantes de islotes se conocen en la técnica. Normalmente, se extraen los islotes del páncreas de un donante de órganos fallecido, se purifican y se procesan, y se implantan en un individuo receptor que sufre diabetes. Luego del trasplante, las células beta de los islotes comienzan a producir y liberar insulina, y de esta manera reducen la necesidad de insulina del individuo receptor. En los procedimientos para inhibir el rechazo de un trasplante, se puede formular la molécula de CTLA-4 mutante de la invención (por ejemplo, CTLA-4-lg mutante) con un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable para producir una composición farmacéutica adecuada para administrarse en un individuo (por ejemplo, un mamífero, incluido el ser humano). Algunos de estos procedimientos comprenden la administración de una composición farmacéutica que contiene un excipiente, un vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptable y un dímero de CTLA-4-lg mutante de la invención a una concentración de entre 0.01 mg/ml y 300 mg/ml aproximadamente ó 0.01 mg/ml y 200 mg/ml aproximadamente; incluido; entre otros; por ejemplo; entre 0.1 mg/ml y 300 mg/ml aproximadamente; entre 0.1 mg/ml y 200 mg/ml aproximadamente; entre 0.1 mg/ml y 100 mg/ml aproximadamente; entre 0.5 mg/ml y 100 mg/ml aproximadamente; entre 0.5 mg/ml y 50 mg/ml aproximadamente; entre 1 mg/ml y 100 mg/ml aproximadamente; entre 1 mg/ml y 75 mg/ml aproximadamente; entre 5 mg/ml y 75 mg/ml aproximadamente; entre 10 mg/ml y 75 mg/ml aproximadamente; entre 10 mg/ml y 60 mg/ml aproximadamente; entre 25 mg/ml y 60 mg/ml aproximadamente; entre 30 mg/ml y 60 mg/ml aproximadamente; entre 25 mg/ml y 50 mg/ml aproximadamente; entre 40 mg/ml y 50 mg/ml aproximadamente; 25 mg/ml aproximadamente ó 50 mg/ml aproximadamente. También se consideran otras composiciones, incluidas las explicadas anteriormente y las que se explicarán a continuación.

Procedimientos para inhibir una respuesta inmunitaria En otro aspecto, la invención comprende el uso de un polipéptido (por ejemplo, una proteína de fusión dimérica o monomérica, o un polipéptido multimérico), un conjugado, un ácido nucleico, un vector o una célula de la invención para la fabricación de un medicamento para inhibir o suprimir una respuesta inmunitaria en mamíferos (por ejemplo, seres humanos o primates no humanos). Las respuestas inmunitarias que pueden suprimirse comprenden, por ejemplo, la activación o proliferación de células T, la síntesis o producción de citocinas, la inducción de los marcadores de activación, la síntesis o la producción de moléculas inflamatorias, la inflamación, la producción de anticuerpos anti-colágeno, la respuesta de anticuerpos dependientes de células T. La invención también comprende el uso de un polipéptido (por ejemplo, una proteína de fusión dimérica o monomérica, o un polipéptido multimérico), un conjugado, un ácido nucleico, un vector o una célula de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario. La enfermedad o trastorno del sistema inmunitario puede ser mediada por la interacción de las células T con células CD80 positivas y/o células CD86 positivas en un mamífero. La enfermedad o el trastorno del sistema inmunitario puede ser una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario, como por ejemplo una enfermedad o trastorno reumático o una enfermedad o trastorno autoinmune. Esta enfermedad o trastorno del sistema inmunitario puede ser o estar relacionada, por ejemplo, entre otras, la enfermedad de Addison, la alergia, la alopecia areata, el mal de Alzheimer, la vasculitis asociada a anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA), la espondilitis anquilosante, el síndrome antifosfolípido (síndrome de Hughes), la artritis, el asma, la aterosclerosis, las placas ateroscleróticas, las enfermedades autoinmunes (por ejemplo, el lupus, la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Graves, etc.), la anemia hemolítica autoinmune, la hepatitis autoinmune, la enfermedad del oído interno autoinmune, el síndrome linfoproliferativo autoinmune, la miocarditis autoinmune, la ooforitis autoinmune, la orquitis autoinmune, la azoospermia, la enfermedad de Behcet, el síndrome de Behcet, la enfermedad de Berger, el penfigoide ampolloso, la cardiomiopatía, la enfermedad cardiovascular, la celiaquía/enfermedad celíaca, el síndrome de fatiga crónica y la dísfunción inmunitaria (SFCDI), la polineuritis ¡diopática crónica, la polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC), la polineuropatía crónica recidivante (síndrome de Guillain-Barré), el síndrome de Churg-Strauss (SCC), penfigoide cicatricial, la enfermedad por crioaglutininas (CAD), EPOC, el síndrome de CREST, la enfermedad de Crohn, la dermatitis herpetiformis, la dermatomiositis, la diabetes, el lupus discoide, el eccema, la epidermolisis ampollosa adquirida, la crioglobulinemia mixta esencial, el síndrome de Evans, el exoftalmos, la fibromialgia, el síndrome de Goodpasture, la enfermedad o el trastorno relacionado con un injerto, la enfermedad de Graves, la enfermedad de injerto contra huésped (EICH), la tiroiditis de Hashimoto, la fibrosis pulmonar ¡diopática, el púrpura trombocitopénica ¡diopática (PTI), la nefropatia por IgA, la enfermedad o el trastorno inmunoproliferativo (por ejemplo, soriasis), las enfermedades inflamatorias intestinales (Ell), la diabetes mellitus insulinodependiente (DMDI), la enfermedad pulmonar intersticial, la diabetes juvenil, la artritis juvenil, la artritis ¡diopática juvenil (AIJ), la enfermedad de Kawasaki, el síndrome miasténico de Lambert-Eaton, el liquen plano, el lupus, la nefritis lúpica, la hipofisitis linfocitica, la enfermedad de Méniére, el síndrome de Miller Fisher/la encefalomielorradiculopatía aguda diseminada, la enfermedad mixta del tejido conectivo, la esclerosis múltiple (EM), el reumatismo muscular, la encefalomielitis miálgica (EM), la miastenia grave, la inflamación ocular, el pénfigo foliáceo, el pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndrome poliglandular (síndrome de Whitaker), la polimialgia reumática, la polimiositis, la agamaglobulinemia primaria, la cirrosis biliar primaría /la colangiopatía autoinmune, la soriasis, la artritis psoriásica, la enfermedad de Raynaud, el síndrome de Reiter/la artritis reactiva, la restenosis, la fiebre reumática, la enfermedad reumática, la artritis reumatoide, la sarcoidosis, el síndrome de Schmidt, la esclerodermia, el síndrome de Sjórgen, el rechazo de trasplantes de órganos sólidos (riñon, corazón, hígado, pulmón, etc.), el síndrome de Stiff-Man, el lupus sistémico eritematoso (LSE), el escleroderma sistémico, la arteritis de Takayasu, la arteritis temporal /arteritis de células gigantes, la tiroiditis, la diabetes tipo 1 , la diabetes tipo 2, la colitis ulcerosa, la uveítis, la vasculitis, el vitíligo, la granulomatosis de Wegener y la prevención o supresión de una respuesta inmunitaria asociada al rechazo del trasplante de tejidos, células, injertos u órganos de un donante por parte del receptor. La invención también comprende el uso de un polipéptido, un conjugado, un ácido nucleico, un vector o una célula de la invención para la fabricación de un medicamento para inhibir la interacción de las células CD80 positivas y/o las células CD86 positivas con las células T CD28 positivas y/o CTLA-4 positivas. En otro aspecto, la invención comprende el uso de un polipéptido, un conjugado, un ácido nucleico, un vector o una célula de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del rechazo de un trasplante tejido u órgano (por ejemplo, el rechazo de un trasplante de un órgano sólido (por ejemplo, riñon, pulmón, hígado, corazón, etc.) en un mamífero.

Evaluación de las respuestas inmunitarias Se puede medir la supresión de respuestas inmunitarias de un polipéptido, un ácido nucleico, un vector, un virus, un seudovirus, las partículas semejantes a virus o la composición de la invención mediante cualquier técnica adecuada. Como ejemplos de técnicas útiles para evaluar las respuestas inmunitarias humorales se pueden mencionar la citometría de flujo, los ensayos de inmunotransferencia, los ensayos de inmunohistoquímica, los ensayos de inmunoprecipitación, los radioinmunoensayos (RIE) y los inmunoensayos enzimáticos. Los inmunoensayos enzimáticos comprenden ensayos por inmunoflujo ligado a enzimas (ELIFA) y ensayos por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), incluidos los ensayos ELISA sándwich y ELISA de competición. En los inmunoensayos, también se puede emplear HPLC y electroforesis capilar (CE) para detectar los complejos de anticuerpos y las sustancias diana. Los siguientes textos proporcionan una orientación general para llevar a cabo dichos procedimientos y principios relacionados: por ejemplo, Harlow y Lañe (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, Hampton R et al. (1990) Serological Methods a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul Minn., Stevens (1995) Clinical Immunology and Serology: A Laboratory Perspective, CRC press, Bjerrum (1988) Handbook of Immunoblotting of Proteins, Vol. 2, Zoa (1995) Diagnostic Immunopathology: Laboratory Practice and Clinical Application, Cambridge University Press, Folds (1998) Clinical Diagnostic Immunology: Protocols in Quality Assurance and Standardizaron, Blackwell Science Inc., Bryant (1992) Laboratory Immunology & Serology 3a edición, W B Saunders Co. y Maddox D E et al. (1983) J. Exp. Med. 158:121 . Los siguientes textos proporcionan una orientación con respecto a los procedimientos ELISA y los principios relacionados: por ejemplo, Reen (1994) Methods Mol. Biol. 32:461-6, Goldberg et al. (1993) Curr. Opin. Immunol. 5(2):278-81 , Voller et al. (1982) Lab. Res. Methods Biol. Med. 5:59-81 , Yolken et al. (1983) Ann. NY Acad. Sci. 420:381-90, Vaughn et al. (1999) Am. J. Trop. Med. Hyg. 60(4):693-8 y Kuno et al. (1991 ) J. Virol. Methods 33(1-2):101-13. Los siguientes textos proporcionan una orientación con respecto a los procedimientos de citometría de flujo: por ejemplo, Diamond (2000) In Living Color : Protocols in Flow Cytometry and Cell Sorting, Springer Verlag, Jaroszeki (1998) Flow Cytometry Protocols, 1.a Ed., Shapiro (1995) Practical Flow Cytometry, 3.a edición, Rieseberg et al. (2001 ) Appl. Microbiol. Biotechnol. 56(3-4):350-60, Scheffold y Kern (2000) J. Clin. Immunol. 20(6):400-7 y McSharry (1994) Clin. Microbiol. Rev. (4): 576-604. Se pueden medir las respuestas citotóxicas y otras respuestas inmunitarias de las células T mediante cualquier técnica adecuada. Como ejemplos de estas técnicas se pueden mencionar el ensayo ELISpot (en particular, ELISpot IFN-gamma), la tinción intracelular de citocinas (TIC) (especialmente combinado con análisis FACS), la tinción del tetrámero de las células T de CD8+/FACS, los ensayos de proliferación de células T estándar y modificados, el ensayo de CTL de liberación de cromo, el análisis por dilución límite (LDA) y los ensayos de destrucción de CTL. Los siguientes textos proporcionan orientación y los principios relacionados con los ensayos de proliferación de células T, por ejemplo, Plebanski y Buriles (1994) J. Immunol. Meth. 170:15, Sprent et al. (2000) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 355(1395):317-22 y Messele et al. (2000) Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7(4):687-92. El LDA se explica, por ejemplo, en Sharrock et al. (1990) Immunol. Today 11 :281-286. Los ensayos ELISpot y los principios relacionados se describen, por ejemplo, en Czerinsky et al. (1988) J. Immunol. Meth. 110:29-36, Olsson et al. (1990) J. Clin. Invest. 86:981-985, Schmittel et al. (2001 ) J. Immunol. Meth. 247(1 -2): 17-24, Ogg y McMichael (1999) Immunol. Lett. 66(1-3):77-80, Schmittel et al. (2001) J. Immunol. Meth. 247(1 -2): 17-24, Kurane et al. (1989) J. Exp. Med. 170(3)763-75, Chain et al. (1987) J. Immunol. Meth. 99(2):221-8, Czerkinsky et al. (1988) J. Immunol. Meth. 1 10:29-36 y en la patente de Estados Unidos N.°: 5.750.356 y 6.218.132. Los ensayos de tetrámeros se explican, por ejemplo, en Skinner et al. (2000) J. Immunol. 165(2):613-7. Otras técnicas analíticas de células T se explican en Hartel et al. (1999) Scand. J. Immunol. 49(6):649-54 y Parish et al. (1983) J. Immunol. Meth. 58(1-2):225-37. La activación de células T también se puede analizar midiendo la actividad de CTL o la expresión de antígenos de activación, tales como el receptor IL-2, CD69 ó las moléculas HLA-DR. La proliferación de células T purificadas se puede medir en un ensayo de reacción de linfocitos mezclados (RLM), ensayos estos que son bien conocidos en la técnica. Los ensayos ELISpot miden la cantidad de células T que segregan una citocina específica, como por ejemplo IFN-? o TNF-a, que sirve como marcador de efectores de células T. En el mercado se encuentran disponibles kits de ELISA para citocinas específicas (por ejemplo, ELISPot IFN-? específico comercializado por R&D Systems, Minneapolis, MN). En la sección de ejemplos que aparece a continuación, en los ejemplos de 5 a 8, se proporcionan procedimientos adicionales para evaluar y medir la capacidad de las moléculas de la invención (por ejemplo, los polipéptidos de la invención, incluidas, por ejemplo, las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes solubles de la invención) para suprimir o inhibir la activación de las células T y/o la proliferación de las células T.

Procedimientos de la administración En los procedimientos descritos en el presente documento, se puede administrar una composición farmacéutica inyectable que contiene un excipiente o un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado (por ejemplo, PBS) y una cantidad eficaz de una molécula de la invención, como por ejemplo, un polipéptido (por ejemplo, DEC de CTLA-4 muíante o CTLA-4-lg monomérica, dimérica o mulíimérica muíante) o un conjugado de la invención, por vía parenteral, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subdérmica, transdérmica, subcutánea o intradérmica a un huésped. Como alternativa, se pueden utilizar técnicas de introducción de proteínas biolísticas (administración por pistola de inyección) (se explican ejemplos de este tipo de administración en otras partes del presente documento). Además, se puede utilizar cualquier otra técnica adecuada. Se puede facilitar la administración de polipéptidos por medio de la utilización de liposomas. Se pueden utilizar las técnicas de administración mencionadas para la administración de un polipéptido o un conjugado de la invención junto con cualquier procedimiento terapéutico o profiláctico descrito en el presente documento. Aunque el siguiente planteamiento se concentre principalmente en los ácidos nucleicos, se entenderá que se aplica del mismo modo a los vectores de ácidos nucleicos de la invención. Se puede administrar un ácido nucleico de la invención o una composición del mismo a un huésped a través de cualquier vía de administración adecuada. En algunos aspectos de la invención, la administración del ácido nucleico se realiza por vía parenteral (por ejemplo, subcutánea (s.c), intramuscular (i.m.) o intradérmica (i.d.)), tópica o transdérmica. El ácido nucleico se puede introducir directamente en un tejido, como por ejemplo un músculo, a través de una inyección utilizando una aguja u otro dispositivo similar. Véanse, por ejemplo, Nabel et al. (1990), mencionado anteriormente; Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468), Robbins (1996) Gene Therapy Protocols, Humana Press, NJ y Joyner (1993) Gene Targeting: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, Inglaterra, y las patentes de Estados Unidos N °: 5.580.859 y 5.589.466. Otros procedimientos, como por ejemplo los 'biolísticos" o la transformación mediada por partículas, véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.°: 4.945.050 y 5.036.006, Sanford et al, J. Particulate Sci. Tech. 5:27-37 (1987), Yang et al, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 87:9568-72 (1990) y Williams et al, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 88:2726-30 (1991). Estos procedimientos son útiles, no sólo para la introducción de ADN in vivo en un individuo, como por ejemplo un mamífero, sino también para la modificación de las células ex vivo para introducir nuevamente en un mamífero (que se explica mejor en otras partes del presente documento). Para la administración por pistola de genes convencional, se precipita el vector o el ácido nucleico de interés sobre la superficie de esferas de metal microscópicas. Se aceleran los microproyectiles con una onda expansiva o gas helio expansible, y penetran en los tejidos hasta una profundidad de varias capas de células. Por ejemplo, el Accel™ Gene Delivery Device fabricado por Agacetus, Inc. Middleton Wl resulta adecuado para utilización en esta realización. El ácido nucleico o vector se puede administrar utilizando estos procedimientos, por ejemplo, por vía intramuscular, intradérmica, subdérmica, subcutánea y/o intraperitoneal. Se pueden consultar otros procedimientos y dispositivos relacionados con la administración biolística en las publicaciones de solicitudes de patente internacional N. 0 WO 99/2796, WO 99/08689, WO 99/04009 y WO 98/10750; y en las patentes de Estados Unidos N.°: 5.525.510; 5.630.796; 5.865.796 y 6.010.478.

El ácido nucleico se puede administrar combinado con un agente facilitador de la transfección; se presentan ejemplos de esto anteriormente. El ácido nucleico se puede administrar por vía tópica y/o por administración en partículas líquidas (en contraste con la administración biolística en partículas sólidas). Se proporcionan ejemplos de estos procedimientos de administración de ácidos nucleicos, composiciones y otras construcciones que pueden resultar adecuados como vehículos de administración para los ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N.°: 5.591.601 ; 5.593.972; 5.679.647; 5.697.901 ; 5.698.436; 5.739.1 18; 5.770.580; 5.792.751 ; 5.804.566; 5.81 1.406; 5.817.637; 5.830.876; 5.830.877; 5.846.949; 5.849.719; 5.880.103; 5.922.687; 5.981.505; 6.087.341 ; 6.107.095; 6.1 10.898; y en las publicaciones de solicitudes de patente internacional N.°: WO 98/06863, WO 98/55495 y WO 99/57275. Como alternativa, el ácido nucleico se puede administrar al huésped mediante la introducción de genes basada en liposomas. Se proporcionan procedimientos ejemplares y principios relacionados con la introducción de genes basada en liposomas, por ejemplo, en Debs y Zhu (1993) WO 93/24640; Mannino y Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7):682-691 ; Rose, patente de Estados Unidos N.°: 5.279:833; Brigham (1991 ) WO 91/06309; Brigham et al. (1989) Am. J. Med. Sci. 298:278-281 ; Nabel et al. (1990) Science 249:1285-1288; Hazinski et al. (1991 ) Am. J. Resp. Cell Molec. Biol. 4:206-209; y Wang y Huang (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 84:7851-7855) y Felgner et al. (1987) Proc. Nati Acad.

Sci. Estados Unidos 84:7413-7414). En otras partes del presente documento se describen más exhaustivamente las composiciones de liposomas farmacéuticamente aceptables adecuadas que se pueden utilizar para administrar el ácido nucleico. En los procedimientos de la invención, se puede emplear cualquier cantidad de ácido nucleico de la invención. Por ejemplo, se puede formular una cantidad suficiente de ácido nucleico en un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable y administrarse a un individuo de manera de que el polipéptido o conjugado codificado se produzca en el individuo en una cantidad eficaz, por ejemplo, para suprimir una respuesta inmunitaha en el individuo, inhibir la interacción entre células B7 positivas endógenas y células CD28 positivas en el individuo, o inhibir el rechazo de un trasplante de tejidos, células, órganos o injertos. En un formato, donde el ácido nucleico se administra por inyección, se administran entre 50 microgramos (pg) y 100 mg de ácido nucleico. En una aplicación ejemplar, para suprimir una respuesta inmunitaria, se administra una composición farmacéutica que contiene PBS y una cantidad de ADN vector que codifica una cantidad eficaz de un polipéptido CTLA-4 mutante, por inyección o electroporación u otro procedimiento de administración adecuado (por ejemplo, pistola de genes, impresión a través de la piel y lipofección) a un individuo que necesite dicho tratamiento (por ejemplo, un individuo que sufra una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario en la que se recomiende un tratamiento inmunosupresor). En la figura 1 se muestra un vector ejemplar.

La cantidad de plásmido de ADN para utilizar en los procedimientos de la invención en los que la administración se realiza a través de una pistola de genes es, por ejemplo, entre 100 y 1000 veces menor aproximadamente que la cantidad que se utiliza para la inyección directa (por ejemplo, a través de una inyección con aguja convencional). A pesar de esta sensibilidad, se puede utilizar al menos 1 pg aproximadamente de ácido nucleico en estas técnicas de administración biolística. Los sistemas de vectores virales de ARN o ADN pueden resultar útiles para la administración de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención. Se pueden administrar vectores virales directamente a un individuo in vivo o se pueden utilizar para tratar células in vitro y se administran las células modificadas al individuo en un formato ex vivo. Los vectores virales útiles incluyen los mencionados anteriormente, como por ejemplo los vectores virales adeno asociados, de adenovirus, de retrovirus, de lentivirus y de herpes simplex. Con estos vectores virales, se puede transferir fácilmente un ácido nucleico de la invención a las células y los tejidos diana del individuo. Además, con los procedimientos de transferencia genética del retrovirus, el lentivirus y los virus adeno-asociado, se puede integrar un ácido nucleico de la invención al genoma del huésped, provocando así una expresión continua del ácido nucleico introducido. Se cree que la administración de un vector viral de la invención que contiene al menos un ácido nucleico de la invención a un individuo es capaz de suprimir una respuesta inmunitaria en el individuo al que se le administra el vector. Opcionalmente, algunos procedimientos profilácticos y/o terapéuticos de la invención se realizan con una dosis de un vector viral adecuado suficiente como para inhibir una respuesta inmunitaria detectable. Se puede utilizar cualquier vector viral adecuado que contenga un ácido nucleico de la invención a cualquier concentración adecuada para suprimir una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, se le puede administrar al individuo huésped una población de vectores de retrovirus (ejemplos de estos se mencionan, por ejemplo, en Buchscher et al. (1992) J. Virol. 66(5) 2731-2739, Johann et al. (1992) J. Virol. 66 (5):1635-1640 (1992), Sommerfelt et al, (1990) Virol. 176:58-59, Wilson et al. (1989) J. Virol. 63:2374-2378, Miller et al, J. Virol. 65:2220-2224 (1991), Wong-Staal et al, PCT/US94/05700, Rosenburg y Fauci (1993) en Fundamental Immunology, Third Edition Paul (ed.) Raven Press, Ltd., Nueva York y en las referencias que aparecen allí) y vector de AAV (que se describe, por ejemplo, en West et al. (1987) Virology 160:38-47, Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801 , Muzyczka (1994) J. Clin. Invest. 94:1351 , Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5(1 1):3251-3260, patentes de Estados Unidos N.°: 4.797.368 y 5.173.414 y las publicaciones de solicitudes de patente internacional N.°: WO 93/24641), o un vector de adenovirus (que se menciona, por ejemplo, en Berns et al. (1995) Ann. NY Acad. Sci. 772:95-104; Ali et al. (1994) Gene Ther. 1 :367-384; y Haddada et al. (1995) Curr. Top. Microbio!. Immunol. 199 ( Pt 3):297-306), de manera que se produzcan niveles de inmunosupresión de la expresión del ácido nucleico incluido en el vector, causando así la respuesta inmunosupresora deseada.

En otras partes del presente documento, se describen otros tipos adecuados de vectores virales (incluidos los ejemplos alternativos de los vectores adecuados de retrovirus, AAV y adenovirus). Las condiciones de infección adecuadas para estos y otros tipos de partículas de vectores virales se describen, por ejemplo, en Bachrach et al, J. Virol., 74(18), 8480-6 (2000), Mackay et al, J. Virol., 19(2), 620-36 (1976) y Fields Virology, mencionado anteriormente. Se proporcionan otras técnicas que resultan útiles para la producción y la aplicación de los vectores virales, por ejemplo, en "Practical Molecular Virology: Viral Vectors for Gene Expression" en Methods in Molecular Biology, vol. 8, Collins, M. Ed., (Humana Press 1991), Viral Vectors: Basic Science and Gene Therapy, 1a Ed. (Cid-Arregui et al, Eds.) (Eaton Publishing 2000), "Viral Expression Vectors," en Current Topics in Microbiology and Immunology, Oldstone et al, Eds. (Springer-Verlag, NY, 1992), y "Viral Vectors" en Current Communications in Biotechnology, Gluzman y Hughes, eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Se determinan la toxicidad y la eficacia terapéutica de los vectores o virus que incluyen una o más moléculas de la invención utilizando procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos de células o animales experimentales. Se puede determinar la DML5o (la dosis mínima letal para el 50% de la población) y/o la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz para el 50% de la población) utilizando los procedimientos citados en el presente documento y otros conocidos en la técnica. Véase también S. Plotkin y W.

Orenstein, Vaccines (W. B. Saunders Co. 1999 3a ed.) para consultar las dosis sugeridas para vacunas virales conocidas. Se pueden administrar ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión, células transducidas y otras formulaciones de la presente invención en una cantidad determinada, por ejemplo, por la DML5o de la formulación y los efectos secundarios de estos a diferentes concentraciones, cuando se aplican a la masa y la salud general del paciente. Por lo tanto, por ejemplo, la invención proporciona un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria mediante la administración de una dosis igual o mayor que la DE50 de una composición farmacéuticamente aceptable que contiene una población de partículas similares a virus o virus (por ejemplo, virus atenuados o virus deficientes en replicación) que contiene un polipéptido o un ácido nucleico de la invención. La administración se puede realizar a través de una dosis única o de dosis divididas (o bien por coadministración, administración en serie o combinaciones de las anteriores). Las técnicas de administración y los protocolos se describen, por ejemplo, en Plotkin (Vaccines) mencionado anteriormente, y en otras referencias que se citan en el presente documento. Con relación a esto, las técnicas para evaluar la dosis del ácido nucleico, el polipéptido, el vector y las composiciones celulares eficaces para inducir la inmunidad se explican, por ejemplo, en la solicitud de patente europea N.°: 1 156 333 y en las referencias citadas allí. El vector viral se puede dirigir a tejidos, células y/u órganos específicos en un individuo, por ejemplo, un mamífero. Se citaron anteriormente ejemplos de estos vectores. Por ejemplo, se puede utilizar el vector viral o el ácido nucleico para administrar selectivamente la secuencia del ácidos nucleicos de la invención a los monocitos, las células dendríticas, las células asociadas a las células dendríticas (por ejemplo, los queratinocitos asociados a las células de Langerhans), las células T y/o las células B. El vector viral puede ser un vector viral deficiente en replicación. Se puede modificar también la partícula del vector viral para disminuir la respuesta inmunitaria del huésped al vector viral, obteniendo asi una expresión de genes constante. Estos vectores "sigilosos" se mencionan, por ejemplo, en Martin, Exp. Mol. Pathol. 66(1):3-7 (1999), Croyle et al, J. Virol. 75(10):4792-801 (2001), Rollins et al, Hum.Gene Ther. 7(5):619-26 (1996), Ikeda et al, J. Virol. 74(10):4765-75 (2000), Halbert et al, J. Virol. 74(3): 1524-32 (2000) y la publicación de solicitud de patente internacional N.°: WO 98/40509. Como alternativa o adicionalmente, se pueden administrar las partículas del vector viral mediante una estrategia seleccionada para reducir la respuesta inmunitaria del huésped a las partículas del vector. Se proporcionan estrategias para reducir la respuesta inmunitaria a la partícula del vector viral al administrarse a un huésped, por ejemplo, en Maione et al, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 98(1 1):5986-91 (2001), Morral et al, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 96(22):2816-21 (1999), Pastore et al, Hum. Gene Ther. 10(11 ):1773-81 (1999), Morsy et al, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 95(14):7866-71 (1998), Jóos et al, Hum. Gene Ther. 7(13):1555-66 (1996), Kass-Eisler et al, Gene Ther. 3(2): 154-62 (1996), en las patentes de Estados Unidos N.°: 6.093.699; 6.211.160; 6.225.113; la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos N.°: 2001-0066947A1. La piel y el músculo son, por lo general, los objetivos preferidos para la administración de los polipéptidos, los conjugados, los ácidos nucleicos y los vectores de la invención a través de cualquier técnica adecuada. Por lo tanto, una característica de la invención es la administración de un polipéptido, un conjugado, un ácido nucleico o un vector de la invención sobre la piel o a través de la piel de un individuo (por ejemplo, un mamífero). Las moléculas de la invención se pueden administrar en una solución inyectable farmacéuticamente aceptable sobre la piel o a través de la piel de un individuo, por ejemplo, por vía intramuscular o intraperitoneal. La administración también se puede llevar a cabo mediante dispositivos transdérmicos, o, más comúnmente, por administración biolística del polipéptido, el conjugado, el ácido nucleico y/o el vector en la piel o a través de la piel del individuo o en los músculos expuestos del individuo. Los dispositivos transdérmicos proporcionados por la invención, descritos en otras partes del presente documento, por ejemplo, se pueden aplicar sobre la piel de un huésped durante un período adecuado de manera que se produzca una transferencia suficiente de un polinucleótido y/o un vector al individuo, provocando así la supresión de una respuesta inmunitaria en el sujeto o la inhibición del rechazo de un trasplante de injertos, células o tejidos. Se facilita típicamente la administración muscular mediante la inyección de una solución líquida que contiene un polipéptido, un polinucleótido o un vector de la invención. Como ejemplos de células diana específicas se pueden mencionar las células dendríticas, otras CPA, las células B, los monocitos, las células T (incluidas las células T auxiliares) y las células asociadas a estas células del sistema inmunitario (por ejemplo, quiratinocitos y otras células de la piel asociadas a las células de Langerhans). La dirección de los vectores y ácidos nucleicos de la invención se explica en otras partes del presente documento. Esta administración dirigida se puede llevar a cabo con ácidos nucleicos o vectores que contengan ácidos nucleicos unidos funcionalmente a promotores específicos de las células y/o de los tejidos, de los que se conocen ejemplos en la técnica. Se puede administrar el polinucleótido de la invención mediante cualquier sistema de administración adecuado de manera que se produzca la expresión de un polipéptido recombinante en el huésped que provoque la supresión de una respuesta inmunitaria, la inhibición de la interacción entre células B7 positivas y CD28 positivas o la inhibición del rechazo de un trasplante de tejidos, células, órganos o injertos. Por ejemplo, se puede administrar a un individuo una cantidad eficaz de una población de células bacterianas que contenga un ácido nucleico de la invención, que provoque la expresión de un polipéptido de CTLA-4 mutante recombinante de la invención y la supresión de una respuesta inmunitaria en el individuo. Se conocen en la técnica las células bacterianas fabricadas para la administración genética en mamíferos. Se facilita la administración de un polinucleótido o un vector de la invención a un individuo mediante la aplicación de electroporación a una cantidad de células eficaz o a un tejido diana eficaz, de manera que las células capturen al ácido nucleico y/o el vector, y que el vector se exprese en ellas, provocando la producción de un polipéptido recombinante de la invención allí y la posterior supresión de una respuesta inmunitaria en el individuo.

Procedimientos de producción y purificación La invención también proporciona procedimientos para producir y purificar los polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores y células de la invención. En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para fabricar un polipéptido recombinante de la invención mediante la introducción de un ácido nucleico de la invención en una población de células en un medio de cultivo, cultivar las células en el medio y (durante determinado tiempo y en las condiciones adecuadas para obtener el nivel de expresión de genes deseado) para producir el polipéptido, y separar el polipéptido de las células, del medio de cultivo o de ambos. El ácido nucleico típicamente se encuentra ligado funcionalmente a una secuencia reguladora eficaz para expresar el polipéptido codificado por el ácido nucleico. El polipéptido se puede separar de los lisados celulares, los sobrenadantes de las células y/o el medio de cultivo de las células a través de diversos mecanismos adecuados conocidos en la técnica, incluidas, por ejemplo, las diversas cromatografías de los lisados celulares y/o los sobrenadantes celulares. Por ejemplo, se puede separar el polipéptido de los lisados celulares y/o el medio de cultivo celular mediante la concentración del medio de cultivo utilizando filtros centrífugos (Amicon), o como alternativa, la precipitación de los polipéptidos con sulfato de amonio o polietilenglicol y una nueva suspensión de los polipéptidos en PBS u otros tampones adecuados. Se puede purificar el polipéptido utilizando cromatografía de exclusión por tamaño en columna Sephacryl S-400 (Amersham Biosciences) como se explica, por ejemplo, en Hjorth, R. y J. Moreno-Lopez, J. Virol. Methods 5:151-158 (1982) u otra cromatografía de afinidad, o mediante centrifugación a través de gradientes de sacarosa al 20-60% como se explica, por ejemplo, en Konish et al, Virology 188:714-720 (1992). Se pueden identificar las fracciones que contienen los polipéptidos deseados por ELISA o SDS-PAGE seguido de tinción de plata para proteínas e inmunotransferencia. Las fracciones deseadas se agrupan y se concentran nuevamente. Las fracciones de centrifugación de sucrosa en gradiente se pueden extraer utilizando filtración a través de gel en columna PD-10 (Amersham Biosciences). Otras técnicas de purificación incluyen las que se explican en los ejemplos que aparecen a continuación y la cromatografía de interacción hidrofóbica (Diogo, M. M, et al, J. Gene Med. 3:577-584 (2001)) y cualquier otra técnica adecuada conocida por los entendidos. Se puede utilizar cualquier mecanismo de purificación adecuado conocido en la técnica. Entre los procedimientos de purificación de polipéptidos conocidos en la técnica se pueden mencionar los que aparecen, por ejemplo en, Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc., Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2.a edición Wiley-Liss, NY, Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris y Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, Inglaterra, Scopes (1993) Protein Purification: Principies and Practice 3.a edición Springer Verlag, NY, Janson y Ryden (1998) Protein Purification: Principies, High Resolution Methods and Applications, segunda edición Wiley-VCH, NY; y Walker (1998; Protein Protocols en CD-ROM Humana Press, NJ. Las células adecuadas para la producción de polipéptidos son conocidas en la técnica y se mencionan en otras partes del presente documento (por ejemplo, pueden resultar adecuadas las células Vero, las células 293, BHK, CHO (por ejemplo, CHO-K1) y las células COS). Se pueden lisar células mediante cualquier técnica adecuada, como por ejemplo, la sonicación, la microfluidización, el corte físico, la lisis por prensa French o la lisis basada en detergentes. En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento de purificación de un polipéptido de la invención, que comprende la transformación de una célula huésped adecuada con un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido recombinante que contiene la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO:1) en la célula huésped (por ejemplo, una célula CHO o una célula 293), el lisado de la célula mediante una técnica de lisado adecuada (por ejemplo, la sonicación, la lisis basada en detergentes u otra técnica adecuada), y la purificación del lisado por afinidad en una columna de cromatografía que contiene una resina que incluye al menos un anticuerpo nuevo de la invención (generalmente, un anticuerpo monoclonal de la invención) o un fragmento de unión al antígeno de este, de manera que se enriquece el lisado para el polipéptido deseado (por ejemplo, un polipéptido que contiene la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO:1). En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de purificación de los polipéptidos diana, procedimientos estos que difieren del mencionado anteriormente en que un ácido nucleico contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que contiene un polipéptido de la invención (por ejemplo, la SEQ ID NO:1) y una marca adecuada (por ejemplo, un epítopo e/su marca) y el polipéptido se purifica mediante técnicas de enriquecimiento por inmunoafinidad, cromatografía en columna de afinidad lentejas-lectina, cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (CAMI) o cromatografía de afinidad quelante de metales (CAQM). En otras partes del presente documento se presentan otros procedimientos de purificación. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para producir un polipéptido de la invención, procedimiento que comprende la introducción en una población de células de un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico de la invención, el cultivo de las células en el medio de cultivo en condiciones adecuadas que permitan la expresión del ácido nucleico del vector, la producción del polipéptido codificado por el ácido nucleico, y la separación del polipéptido de las células, del medio de cultivo o de ambos. La elección de las células se realiza sobre la base del procedimiento del polipéptido deseado y del vector adecuado (por ejemplo, se prefieren las células de E. coli para los plásmidos bacterianos, mientras que se prefieren las células 293 para los plásmidos lanzadera de mamíferos y/o adenovirus, especialmente los adenovirus deficientes en E1 ). En otro aspecto, la invención incluye un procedimiento para producir un polipéptido, procedimiento que consiste en: (a) la introducción de un vector de expresión recombinante en una población de células que comprende al menos un ácido nucleico de la invención que codifica un polipéptido de la invención; (b) la administración del vector de expresión a un mamífero y (c) la extracción del polipéptido del mamífero o de un subproducto del mamífero. Se puede producir un polipéptido de la invención mediante el cultivo de una célula o de una población de células de la invención (que, por ejemplo, se ha transformado con un ácido nucleico de la invención que codifica dicho polipéptido) en condiciones que permitan la expresión del polipéptido y la recuperación del polipéptido expresado en la célula o por la célula utilizando procedimientos convencionales conocidos en la técnica. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para producir un polipéptido de la invención, que comprende (a) la introducción de un ácido nucleico de la invención en una población de células, donde el ácido nucleico se encuentra unido funcionalmente a una secuencia reguladora eficaz para producir el polipéptido codificado por el ácido nucleico; (b) el cultivo de las células en un medio de cultivo para producir el polipéptido; y (c) la separación del polipéptido de las células o del medio de cultivo. También se incluye una célula cultivada a la que se le ha introducido un vector de la invención (por ejemplo, un vector de expresión de la invención). También se incluye un procedimiento para producir un polipéptido de la invención que comprende la introducción de un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido en una población de células en el medio, células éstas que permiten la expresión del ácido nucleico, la conservación de las células en las condiciones en las que el ácido nucleico se expresa y posteriormente extrae del polipéptido del medio. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para producir una proteína de fusión. El procedimiento comprende: (1) el cultivo de una célula huésped transformada con un ácido nucleico en un medio de cultivo, donde el ácido nucleico comprende: (i) una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con una identidad de al menos 95% con una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NO: de 1 a 73, cuyo polipéptido se une a CD86 y/o CD80, y/o a un dominio extracelular de CD86 o de CD80, y (ii) una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de Fe de Ig que contiene una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3, por el cual se expresa el ácido nucleico y se produce la proteína de fusión; y (2) la recuperación de la proteina de fusión. Se puede emplear cualquier polipéptido de Fe de Ig, incluido por ejemplo, un polipéptido de Fe de lgG1 , un polipéptido de Fe de lgG2, un polipéptido de Fe de lgG4 o un polipéptido de Fe de Ig muíante. En cualquiera de estos procedimientos, el ácido nucleico también contiene una tercera secuencia de nucleótidos que codifica un péptido secretor o señal unido funcionalmente a la proteína de fusión, y la proteina de fusión es segregada de la célula huésped como un dímero de la proteína de fusión con enlaces disulfuro que contiene una primera y una segunda proteína de fusión idénticas, y se recupera el dímero de la proteína de fusión con enlaces disulfuro del medio de cultivo. En algunos de estos procedimientos, se forma el dímero de la proteína de fusión con enlaces disulfuro a través de un enlace disulfuro entre un residuo de cisteína de la primera proteína de fusión y un residuo de cisteína de la segunda proteína de fusión. En algunos de estos procedimientos, la proteína de fusión se recupera del medio de cultivo, de la célula huésped o del periplasma de la célula huésped. En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada o recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica (i) un primer polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos con una identidad de secuencia de al menos 95% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NO: de 1 a 73, donde el primer polipéptido se une a CD80 y/o CD86 y/o a un dominio extracelular de alguno de estos o de ambos y (ii) un segundo polipéptido que comprende una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 de un polipéptido de IgG. El segundo polipéptido puede contener cualquier polipéptido de Ig adecuado de los descritos en otras partes del presente documento, incluido, por ejemplo, el que comprende la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO:184 o la SEQ ID NO:218. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para producir un dímero de una proteína de fusión soluble. Este procedimiento comprende el cultivo de una célula huésped transformada con un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un dímero de una proteína de fusión soluble de la invención. Como proteínas de fusión ejemplares se pueden mencionar las que comprenden las secuencias de polipéptidos de cualquiera de las SEQ ID NO: de 74 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222. El vector comprende una secuencia de nucleótidos que facilita la expresión de la proteína de fusión (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal). La proteína de fusión es segregada por la célula huésped en forma de un dímero de proteína de fusión con enlaces disulfuro que contiene dos proteínas de fusión idénticas, y se recupera el dímero de proteína de fusión con enlaces disulfuro del medio de cultivo. En algunos de estos procedimientos, se forma el dímero de proteína de fusión con enlaces disulfuro a través de un enlace disulfuro entre un residuo de cisteína de cada proteína de fusión. El dímero de la proteína de fusión típicamente se recupera del medio de cultivo, de la célula huésped o del periplasma de la célula huésped. El ejemplo 12 proporciona un procedimiento ejemplar para crear una línea celular transfectada estable para expresar una proteína de fusión CTLA4-lg mutante de la invención, producir la proteína de fusión CTLA4-lg mutante y luego purificar la proteína de fusión muíante a partir del cultivo. Además de la producción recombinante, se puede producir el polipéptido de la invención mediante síntesis directa de péptidos utilizando técnicas en fase sólida (véase, por ejemplo, Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co, San Francisco y Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154). Es posible realizar la síntesis de péptidos utilizando técnicas manuales o mecanizadas. Es posible realizar la síntesis mecanizada, por ejemplo, utilizando un Peptide Synthesizer (sintetizador de péptidos) modelo 431A de Applied Biosystems (Perkin Elmer, Foster City, Calif.) según las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Por ejemplo, se pueden sintetizar químicamente las subsecuencias por separado y combinar utilizando procedimientos químicos para producir un polipéptido de la invención o fragmentos del mismo. Como alternativa, se pueden adquirir polipéptidos sintetizados de cualquiera de las compañías que se especializan en la producción de polipéptidos. Por lo general, los polipéptidos de la invención se producen mediante la expresión de ácidos nucleicos codificantes y la recuperación de los polipéptidos, por ejemplo, como se explicó anteriormente. La invención incluye un procedimiento para producir un polipéptido de la invención que comprende la introducción de una ácido nucleico de la invención, un vector de la invención, o una combinación de estos, en un animal, como por ejemplo un mamífero (incluido, por ejemplo, una rata, primate no humano, un murciélago, un tití, un cerdo o un pollo), de manera que el polipéptido de la invención se exprese en el animal y luego el polipéptido se extrae del animal o de un subproducto del animal. Se puede llevar a cabo la extracción del polipéptido del animal o del subproducto del animal mediante cualquier técnica adecuada que dependerá del animal y de la estrategia de recuperación deseada. Por ejemplo, se puede recuperar el polipéptido del suero de ratones, monos o cerdos con expresión del polipéptido de la invención. La invención proporciona animales transgénicos (incluidos los mamíferos mencionados anteriormente) que contienen al menos un ácido nucleico de la invención. El animal transgénico puede tener el ácido nucleico integrado a su genoma huésped (por ejemplo, mediante un vector de AAV, un vector de lentivirus, las técnicas biolisticas realizadas con secuencias promotoras de la integración, etc.) o pueden tener el ácido nucleico conservado epicromosómicamente (por ejemplo, en un vector plasmídico no integrador o por inserción en un vector viral no integrador). Los vectores epicromosómicos se pueden modificar genéticamente para producir uha expresión de genes más transitoria que los vectores de integración. Los vectores basados en ARN ofrecen ventajas específicas en este aspecto.

Composiciones La invención también proporciona composiciones nuevas y útiles que contienen al menos un componente de la invención, como por ejemplo, al menos un polipéptido (incluido, por ejemplo, proteínas de fusión y polipéptidos multiméricos), el conjugado, ácido nucleico, vector, virus, partícula semejante a virus (VLP) y/o célula de la invención, o cualquier combinación de los anteriores con un vehículo, excipiente o diluyente. El vehículo, excipiente o diluyente puede ser un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede contener la cantidad que resulte adecuada de polipéptidos, conjugado, ácidos nucleicos, vectores, virus, partículas semejantes a virus y/o células de la invención. Además, se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen al menos un polipéptido, conjugado, ácido nucleico, vector, virus, partícula semejante a virus y/o célula, o cualquier combinación de las anteriores, con un vehículo, un excipiente o un diluyente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones resultan beneficiosas en los procedimientos de la invención que se explican en el presente documento, incluidos, por ejemplo, los procedimientos para suprimir las respuestas inmunitarias. Por ejemplo, en una realización no excluyente, la invención proporciona una composición que contiene un excipiente, diluyente o vehículo y al menos un polipéptido de la invención (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más polipéptidos), como por ejemplo un polipéptido de DEC de CTLA-4 muíante (por ejemplo, cualesquiera de las SEQ ID NO: de 1 a 73) o una proteína de fusión CTLA-4-lg muíante (por ejemplo, cualesquiera de las SEQ ID NO: de 74 a 79, de 197 a 200, de 205 a 214 y de 219 a 222), donde el o los polipépíidos se encuentran presentes en la composición en una caníidad eficaz como para suprimir una respuesta inmunitaria, incluida, por ejemplo, una respuesta inmuniíaria que participa en el rechazo de trasplaníes y/o la autoinmunidad, inhibir el rechazo de una trasplante de tejidos, células u órganos de un donante o inhibir la interacción de las células B7 positivas endógenas con las células T CD28 positivas en un individuo al que se le administra la composición. También se incluye una composición farmacéutica que contiene un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de uno o más de los componentes de la invención. La cantidad eficaz puede ser una cantidad o dosis eficaz desde el punto de vista terapéutico o profiláctico para su uso en un procedimiento terapéutico o profiláctico descrito en otra parte del presente documento, como por ejemplo un procedimiento para tratar una enfermedad autoinmune o un procedimiento para inhibir el rechazo de un trasplante de tejidos, células, injertos u órganos de un donante por parte del individuo receptor. La composición (o la composición farmacéutica) puede ser cualquier composición no tóxica que no interfiera con las propiedades inmunosupresoras de un polipéptido, un conjugado, un ácido nucleico, un vector, un virus, una partícula semejante a virus y/o una célula de la invención que se incluya en dicha composición. La composición puede contener uno o más excipientes, diluyentes o vehículos y la composición farmacéutica contiene uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Se conoce en la técnica una gran variedad de vehículos, diluyentes y excipientes aceptables, y estos pueden incluirse en las composiciones y las composiciones farmacéuticas de la invención. Por ejemplo, se pueden utilizar diversos vehículos acuosos, por ejemplo, agua destilada o purificada, una solución salina esterilizada, una solución salina tamponada, como por ejemplo un tampón fosfato salino (PBS) y otros similares que resultan beneficiosos en las formulaciones inyectables del polipéptido, la proteína de fusión, el conjugado, el ácido nucleico, el vector, el virus, la partícula semejante a virus y/o la célula de la invención. Se conocen en la técnica, diversos excipientes, vehículos y diluyentes adecuados para la administración de proteínas terapéuticas. Estas soluciones son estériles preferentemente y, generalmente, no contienen sustancias nocivas. Las composiciones se pueden estabilizar mediante procedimientos convencionales muy conocidos. Las composiciones de la invención pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, según sea necesario, para aproximarse a las condiciones fisiológicas. Estas sustancias comprenden, por ejemplo, agentes de ajuste de pH, agentes amortiguadores y agentes de ajuste de tonicidad, incluidos, por ejemplo, acetato de sodio, el ascorbato de sodio, el cloruro de sodio, el cloruro de potasio, el cloruro de calcio, el lactato de sodio y otros similares. Las composiciones de la invención, incluidas las composiciones farmacéuticas, también pueden contener uno o más componentes, como diluyentes, agentes de relleno, sales, tampones, agentes tensoactivos, emulsionantes, detergentes (por ejemplo, un detergente o emulsionante no iónico, como por ejemplo Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80, F-68 plurónico y otros similares), estabilizantes (por ejemplo, azúcares o aminoácidos no proteicos), conservantes, fijadores de tejidos, solubilizantes y/u otros materiales adecuados para formar parte de una composición farmacéutica. Se presentan ejemplos de componentes adecuados para su uso en la composición farmacéutica, por ejemplo, en Berge et al, J. Pharm. Sci. 66(1 ): 1-19 (1977), Wang y Hanson, J. Parenteral. Sci. Tech. 42:S4-S6 (1988), en las patentes de Estados Unidos N.°: 6.165.779 y 6.225.289 y en otras partes del presente documento. Las composiciones farmacéuticas también incluyen conservantes (por ejemplo, alcohol bencílico, azida de sodio, m-cresol, etc.), antioxidantes, quelantes de metales (por ejemplo, metionina, EDTA, etc.) y/u otros aditivos conocidos por los entendidos en la técnica. Se presentan ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para su uso en composiciones farmacéuticas, por ejemplo, en Urquhart et al, Lancet 16:367 (1980), Lieberman et al, Pharmaceutical Dosage Forms -Disperse Systems (2.a ed., Vol. 3, 1998), Ansel et al, Pharmaceutical Dosage Forms & Drug Delivery Systems (7.a ed. 2000), Martindale, The Extra Pharmacopeia (31.a edición), Remington's Pharmaceutical Sciences (16.a-20a ediciones), The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman y Gílman, Eds. (9.a ed. - 1996), Wilson and Gisvolds Textbook of Organic Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, Delgado y Remers, Eds. (10.a ed. - 1998) y en las patentes de Estados Unidos N °: 5.708.025 y 5.994.106. Los principios de formulación de las composiciones farmacéuticamente aceptables se explican, por ejemplo, en Platt, Clin. Lab Med. 7:289-99 (1987), Aulton, Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design, Churchill Livingstone (NuevaYork) (1988), Extemporaneous Oral Liquid Dosage Preparations, CSHP (1998) y "Drug Dosage", J. Kans. Med. Soc. 70(1 ):30-32 (1969). Se describen otros vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados especialmente para la administración de vectores, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente internacional N.°: WO 98/32859. Las composiciones de la invención, incluidas las composiciones farmacéuticas, pueden contener uno o más vehículos o excipientes acuosos (incluidos, por ejemplo, los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables) y uno o más componentes, como por ejemplo uno o más tampones, una o más sales, uno o más detergentes o emulsionantes y/o uno o más azúcares. El tampón es típicamente un tampón adecuado para mantener el pH de la composición en un intervalo que conduzca a la estabilidad de la molécula de la invención presente en la composición (por ejemplo, CTLA-4-lg mutante). Como tampones ejemplares para utilizar en la composición se pueden mencionar, entre otros, por ejemplo, el tampón ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-aminoetano sulfónico (HEPES), tampón citrato (por ejemplo, una mezcla de citrato disód ico-citrato trisódico, una mezcla de citrato de sodio-ácido cítrico, una mezcla de ácido cítrico-citrato de sodio, una mezcla de citrato monosódico-citrato disódico, una mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico), tampón fosfato de sodio (por ejemplo, una mezcla de fosfato disód ico-fosfato trisódico (Na2HP04 Na3P04), una mezcla de fosfato dibásico de sodio-fosfato monobásico de sodio), tampón acetato (por ejemplo, una mezcla de ácido acético-acetato de sodio, una mezcla de ácido acético- hidróxido de sodio), tampón histidina, tampón Tris, tampón Tris-maleato, tampón succinato (por ejemplo, una mezcla de ácido succínico-hidróxido de sodio, una mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, una mezcla de ácido succínico-succinato disódico, una mezcla de succinato monosódico-succinato disódico), un tampón maleato, un tampón imidazol, un tampón tartrato, un tampón fumarato, un tampón gluconato, un tampón oxalato, un tampón lactato, un tampón acetato y otros similares, o una combinación de cualesquiera de los anteriores (por ejemplo, un combinado de tampones citrato y acetato, etc.). La concentración del tampón en la composición puede ser cualquiera que sea adecuada para las moléculas de la invención (por ejemplo, CTLA-4-lg mutante) incluidas en la solución de la composición, como por ejemplo, entre otras, en el intervalo de 1 mM a 100 mM aproximadamente, de 1 mM a 50 mM aproximadamente, de 5 mM a 50 mM aproximadamente, o de 5 mM a 25 mM aproximadamente, incluidas, por ejemplo, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM (como por ejemplo, tampón HEPES 20 mM, tampón citrato disódico-citrato trisódico 20 mM, tampón succinato 20 mM, etc.). Como sales ejemplares para utilizar en la composición se pueden mencionar, entre otras, por ejemplo, las sales solubles en agua, incluidas las sales orgánicas e inorgánicas (por ejemplo, la sal inorgánica soluble en agua), como por ejemplo el cloruro de sodio, el cloruro de magnesio, el bicarbonato de sodio, el cloruro de potasio, el cloruro de calcio y el cloruro de amonio, y otras similares, o cualquier sal farmacéuticamente aceptable o compatible desde el punto de vista fisiológico. Como concentraciones ejemplares de la sal en la solución de la composición se pueden mencionar, por ejemplo, ente otras, las concentraciones en el intervalo de 1 mM a 150 mM aproximadamente, de 10 mM a 125 mM aproximadamente, o de 75 mM a 125 mM aproximadamente, incluidas, por ejemplo, 10 mM, 50 mM, 75mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM (como por ejemplo NaCI 100 mM). Como azúcares o carbohidratos ejemplares para usar en la composición se pueden mencionar, entre otros, por ejemplo, la sacarosa, la maltosa, la trehalosa, la dextrosa, la mañosa, la rafinosa, la lactosa, la maltodextrina, el dextrano, la sacarosa, etc., a una concentración, por ejemplo, en los intervalos, entre otros, de 0.1 % a 10% en peso de azúcar aproximadamente, de 1 % a 5% en peso de azúcar aproximadamente, o de 1% a 3% en peso de azúcar aproximadamente, incluido, por ejemplo; 0.1 %; 0.5%; 1 %; 1.5%; 2%; 2.5%; 3%; 4%; 5%; 6%; 7%; 8%; 9% ó 10% en peso de azúcar (por ejemplo, 2% en peso de sacarosa, 2% en peso de trehalosa ó 2% en peso de mañosa) según la composición. Como alcoholes de azúcar ejemplares para utilizar en la composición se pueden mencionar, entre otros, por ejemplo, manitol, sorbitol, glicol, glicerina, arabitol, eritritol, xilitol, ribitol, lactitol y otros similares en intervalos de concentraciones, entre otros, por ejemplo, de 0.1 % aproximadamente a 10% en peso de alcohol de azúcar aproximadamente, de 1 a 5% aproximadamente, de 1 a 3% aproximadamente; incluido; por ejemplo, 0.1%; 0.5%; 1 %; 1.5%; 2%; 2.5%; 3%; 4%; 5%; 6%; 7%; 8%; 9% ó 10% en peso de alcohol de azúcar aproximadamente según la composición. La osmolaridad de las composiciones de la invención, incluidas las composiciones farmacéuticas, normalmente es similar a la osmolaridad en suero de la sangre, que se ubica en el intervalo de 250 a 350 miliosmoles por kilogramo (mOSm/kg) de agua aproximadamente. La concentración de sal en la composición es típicamente menor que 125 mM. Es posible ajustar o variar las concentraciones de sal y azúcar para que la osmolaridad de la composición se ubique en el intervalo 250-350 mOSm/kg de agua. Como detergentes o emulsionantes ejemplares para utilizar en la composición se pueden mencionar, entre otros, por ejemplo, polisorbatos, como por ejemplo Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80 o F-68 plurónico en un intervalo; por ejemplo; de 0.001% aproximadamente a 0.2% en peso de detergente o emulsionante según la composición; incluido; por ejemplo; 0.001%; 0.002%; 0.003%; 0.004%; 0.005%; 0.006%; 0.007%; 0.008%; 0.009%; 0.01%; 0.02%; 0.03%; 0.04%; 0.05%; 0.075% y 0.1% en peso de detergente o emulsionante (por ejemplo, Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80 o F-68 plurónico) según la composición. Las composiciones de la invención, incluidas las composiciones farmacéuticas, pueden contener un polímero, como por ejemplo una molécula de PEG, a una concentración suficiente como para disminuir o inhibir asociaciones no deseadas entre dos o más moléculas de la invención, como por ejemplo, dos o más dímeros de la proteína de fusión CTLA-4-lg muíante de la invención. La composición puede contener dos o más polímeros (por ejemplo, PEG). El polímero (por ejemplo, molécula de PEG) típicamente tiene un peso molecular de entre 200 Da y 8000 Da aproximadamente (por ejemplo 200, 300, 400, 600, 900, 1000, 1450, 3350, 4500 ó 8000 Da aproximadamente, comercializado por Dow Chemical). Se cree que el añadido de un polímero (por ejemplo, molécula de PEG) a la composición disminuye la formación de agregados no deseados, agregados particularmente no deseados de dos o más dímeros de una proteína de fusión de la invención. Las composiciones de la invención, incluidas las composiciones farmacéuticas, pueden incluir un oligosacárido cíclico, como por ejemplo la ciclodextrina (por ejemplo, Captisol® (Cydex)). En un aspecto, la composición contiene dos o más oligosacáridos cíclicos diferentes. El añadido de oligosacáridos cíclicos a la composición mejora la solubilidad, la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la dosis de ingredientes farmacéuticamente activos (por ejemplo, la molécula de CTLA-4 mutante). El pH de una composición de la invención, incluidas las composiciones farmacéuticas, se puede ubicar en el intervalo de pH 3 y pH 10 aproximadamente; entre pH 4 y pH 10 aproximadamente; entre pH 5 y pH 9 aproximadamente; entre pH 6 y pH 9 aproximadamente; entre pH 5.5 y pH 8.5 aproximadamente; entre pH 6.0 y pH 6.7 aproximadamente; entre pH 6.0 y pH 6.5 aproximadamente; entre pH 6.2 y pH 8.7 aproximadamente; entre pH 6.5 y pH 8.5 aproximadamente; entre pH 6.5 y pH 7.5 aproximadamente; entre pH 6.2 y pH 7.0 aproximadamente; entre pH 6.3 y pH 6.8 aproximadamente; entre pH 6.4 y pH 6.8 aproximadamente; entre pH 7.0 y pH 8.0 y entre pH 7.0 y pH 7.4 aproximadamente. En un aspecto, las composiciones de la invención, como por ejemplo una CTLA-4-lgG2 mutante, tienen un pH de pH 5.0; pH 5.1 ; pH 5.2; pH 5.3; pH 5.4; pH 5.5; pH 5.6; pH 5.7; pH 5.8; pH 5.9; pH 6.0; pH 6.1 ; pH 6.2; pH 6.3; pH 6.4; pH 6.5; pH 6.6; pH 6.7; pH 6.8; pH 6.9; pH 7.0; pH 7.1 ; pH 7.2; pH 7.3; pH 7.4; pH 7.5; pH 7.6; pH 7.7; pH 7.8; pH 7.9; pH 8.0; pH 8.1 ; pH 8.2; pH 8.3; pH 8.4; pH 8.5; pH 8.6; pH 8.7; pH 8.8; pH 8.9; pH 9.0; pH 9.1 ; pH 9.2; pH 9.3; pH 9.4; pH 9.5; pH 9.6; pH 9.7; pH 9.8; pH; 9.9 ó pH 10.0. En un aspecto, la composición proporciona una composición de la invención que contiene un excipiente o vehículo (incluido, por ejemplo, una composición farmacéutica que contiene un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable) y una cantidad eficaz de cualquier polipéptido, multímero, dímero, conjugado, dímero de la proteína de fusión CTLA-4 de la invención descrito en otras partes y en el presente documento, y que también contiene un tampón capaz de mantener el pH de la composición dentro del intervalo de pH 3 aproximadamente y pH 10 aproximadamente, agua, opcionalmente un detergente no iónico, opcionalmente una sal y opcionalmente un alcohol de azúcar, monosacárido, disacárido o polisacárido. Algunas de estas composiciones tienen pH fisiológico. Algunas de estas composiciones tienen un pH de entre 4 y 7.5 aproximadamente; entre 5.0 y 7.5 aproximadamente o entre 6.4 y 6.6 aproximadamente; incluido, por ejemplo, pH 6.5 aproximadamente, pH 7.4 aproximadamente o pH 7.5. Algunas de estas composiciones contienen un tampón a una concentración de entre 1 mM y 100 mM aproximadamente, entre 1 mM y 50 mM aproximadamente, entre 5 mM y 35 mM aproximadamente, entre 10 mM y 25 mM aproximadamente, incluido, por ejemplo, 20 mM, 25mM ó 30 mM aproximadamente. Algunas de estas composiciones contienen uno de los siguientes tampones: tampón HEPES, tampón citrato, tampón succinato, tampón acetato, tampón citrato, tampón maleato, tampón fosfato y tampón Tris. Algunas de estas composiciones contienen uno de los siguientes tampones: tampón HEPES, tampón citrato de sodio y tampón succinato de sodio. Para algunas de las composiciones, el pH se ubica entre 6.0 aproximadamente y 6.7 y el tampón es succinato de sodio o citrato de sodio. Para algunas de las composiciones, el pH es de entre 7.0 aproximadamente y 7.7 y el tampón es HEPES. Algunas de estas composiciones también contienen un alcohol de azúcar o sacárido, donde el sacárido es un monosacárido, disacárido (por ejemplo, sacarosa o trehalosa) o un polisacárido. Algunas de estas composiciones contienen una sal presente a una concentración de entre 1 mM y 50 mM aproximadamente, incluido, por ejemplo, 20 mM, 25 mM ó 30 mM aproximadamente. Algunas de estas composiciones contienen un detergente no iónico, como por ejemplo, uno de los siguientes detergentes no iónicos: Tween®-80, Tween®-60, Tween®-40, Tween®-20 o F-68 plurónico. En algunas de las composiciones (incluidas las composiciones farmacéuticas) mencionadas en el párrafo anterior, el polipéptido, el multímero, el dímero, el conjugado, la proteína de fusión o el dímero de la proteína de fusión se encuentra presente a una concentración que se ubica en el intervalo de 1 mg/ml (peso/volumen o p/v) y 200 mg/ml (p/v) aproximadamente, de 25 mg/ml (p/v) y 100 mg/ml (p/v) aproximadamente, de 50 mg/ml y 300 mg/ml aproximadamente, opcionalmente en el intervalo de 50 mg/ml (p/v) y 100 mg/ml (p/v) aproximadamente. Algunas de estas composiciones contienen una cantidad eficaz de un polipéptido, un multímero, un dímero, un conjugado, una proteína de fusión o un dímero de una proteína de fusión de entre 0.1 mg/kg y 15 mg/kg aproximadamente, y se administra la composición a un mamífero (por ejemplo, un ser humano). Algunas de estas composiciones contienen una cantidad eficaz de un polipéptido, un multímero, un dímero, un conjugado, una proteína de fusión o un dímero de una proteína de fusión de entre 0.5 mg/kg y 10 mg/kg aproximadamente, y la composición se administra por vía parenteral. Algunas de estas composiciones contienen una cantidad eficaz de un polipéptido, multímero, dímero, el conjugado, proteína de fusión o dímero de proteína de fusión de entre 0.1 mg/kg y 5 mg/kg aproximadamente, y opcionalmente 0.5 mg/kg aproximadamente, y la composición se administra por vía subcutánea. Algunas de estas composiciones contienen una cantidad eficaz de un polipéptido, un multímero, un dímero, un conjugado, una proteína de fusión o un dímero de la proteína de fusión de entre 5 mg/kg y 15 mg/kg aproximadamente (opcionalmente 10 mg/kg aproximadamente), y la composición se administra por vía intravenosa. Para algunas de las composiciones, el polipéptido, multímero, dímero, el conjugado, proteína de fusión o dímero de proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36. Para algunas de las composiciones, el polipéptido, el multímero, el dímero, el conjugado, la proteína de fusión o el dímero de la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 50. Algunas de estas composiciones son estériles y/o son isotónicas para la sangre. Algunas de estas composiciones son composiciones líquidas. Algunas de estas composiciones se encuentran en forma líquida o deshidratada, donde la forma deshidratada puede ser una forma liofilizada, secada al aire y secada por aspersión. En un aspecto ejemplar, la invención proporciona una composición farmacéutica que contiene: (i) una proteína de fusión CTLA-4-lg de la invención a una concentración de entre 1 mg/ml y 300 mg/ml (por ejemplo, entre 1 mg/ml y 100 mg/ml, entre 50 mg/ml ó 100 mg/ml aproximadamente, etc.) (opcíonalmente una proteína de fusión dimérica); (ii) un tampón con una capacidad de amortiguación de entre pH 5.0 y pH 9.0 aproximadamente y una concentración de entre 5 mM y 50 mM aproximadamente; (iii) un diluyente farmacéuticamente aceptable para llevar la composición al volumen deseado; (iv) un azúcar a una concentración de entre 0.5% y 10% en peso de azúcar de la composición; (v) un azúcar a una concentración de entre 1 mM y 200 mM aproximadamente; (vi) opcíonalmente un detergente no iónico (por ejemplo, Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80 o F-68 plurónico) a una concentración de entre 0.01 mg/ml y 0.5 mg/ml, por ejemplo, entre 0.01 mg/ml y 0.1 mg/ml y (vii), opcionalmente, un oligosacárido cíclico (por ejemplo, ciclodextrina (Captisol®), donde el pH de la composición se ubica en el intervalo de entre pH 5.0 y pH 8.0 aproximadamente. Una proteína de fusión CTLA-4-lg ejemplar de la invención comprende las que incluyen una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222 (opcionalmente, por ejemplo, seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NO: 197, 199, 211 y 213), donde la proteína de fusión se une a CD80 y/o CD86 y/o a un dominio extracelular de los mismos y/o suprime una respuesta inmunitaria. Estas proteínas de fusión pueden ser monoméricas o diméricas. En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que contiene: (i) un conjugado que comprende una proteína de fusión CTLA-4-lg de la invención (opcionalmente, una proteína de fusión dimérica) y una porción no polipeptídica covalentemente enlazada a la proteína de fusión, este conjugado se encuentra a una concentración de entre 1 mg/ml y 300 mg/ml aproximadamente (por ejemplo, entre 1 mg/ml y 100 mg/ml aproximadamente, 50 mg/ml aproximadamente ó 100 mg/ml aproximadamente, etc.); (ii) un tampón con una capacidad de amortiguación de entre pH 5.0 y pH 8.0 aproximadamente a una concentración de entre 5 mM y 50 mM aproximadamente; (iii) un diluyente farmacéuticamente aceptable para llevar la composición al volumen deseado; (iv) un azúcar a una concentración de entre 0.5% y 10% aproximadamente en peso del azúcar de la composición; (v) una sal a una concentración de entre 1 mM y 200 mM aproximadamente; y (vi) opcionalmente, un detergente no iónico (por ejemplo, Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80 o F-68 plurónico) a una concentración de entre 0.01 mg/ml y 0.5 mg/ml aproximadamente, por ejemplo; entre 0.01 mg/ml y 0.1 mg/ml aproximadamente, donde el pH de la composición se ubica en el intervalo de pH 5.0 aproximadamente a pH 8.0 aproximadamente. El conjugado puede contener una, dos, tres, cuatro o más porciones no polipeptídicas. Cada porción no polipeptídica puede contener un polímero (por ejemplo PEG o PAO) o una porción de azúcar. En algunos casos, la porción no polipeptídica es una molécula de un polímero, como por ejemplo una molécula de PEG. La molécula del polímero puede tener cualquier peso molecular deseado según el efecto funcional deseado (por ejemplo, mayor semivida, menor asociación entre las moléculas de la proteína de fusión, etc.). En algunos casos, por ejemplo, el polímero es un PEG que tiene un peso molecular de entre 1 kDa aproximadamente y 100 kDa aproximadamente (por ejemplo 1 ; 2; 2.5; 3; 5; 8; 10; 12; 20; 25; 30; 40; 60 kDa, etc.). La porción no polipeptídica (por ejemplo, una porción de azúcar o una molécula de un polímero) se enlaza covalentemente a un grupo de enlace de un residuo de aminoácidos de la proteína de fusión a través de los procedimientos convencionales descritos anteriormente. Las proteínas > de fusión CTLA-4-lg ejemplares comprenden las que incluyen una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada de un grupo que comprende las SEQ ID NO: de 74 a 79, de 197 a 200, de 205 a 214 y de 219 a 222 (opcionalmente, por ejemplo, seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NO: 197, 199, 211 y 213), donde la proteína de fusión se une a CD80 y/o CD86 y/o a un dominio extracelular de los mismos y/o suprime una respuesta inmunitaria. Estas proteínas de fusión pueden ser monoméricas o diméricas. En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que contiene: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% con una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo de las SEQ ID NO: de 1 a 73, como por ejemplo, las SEQ ID NO: 36 y 50, donde dicho polipéptido está presente a una concentración de un intervalo entre 1 mg/ml y 200 mg/ml aproximadamente (p/v); (b) un tampón con una capacidad de amortiguación de entre pH 5.0 y pH 8.0 aproximadamente a una concentración de entre 5 mM y 50 mM aproximadamente; (c) un diluyente farmacéuticamente aceptable para llevar la composición al volumen deseado; (d) un azúcar a una concentración de entre 0.5% y 10% en peso; (e) una sal a una concentración de entre 1 mM y 200 mM aproximadamente; y (f) opcionalmente, un detergente, donde el pH se ubica en un intervalo entre pH 5.0 y pH 8.0 aproximadamente. En algunas de estas composiciones farmacéuticas, (a) el polipéptido comprende la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 36 presente en un intervalo de concentración de entre 50 mg/ml y 100 mg/ml aproximadamente; (b) el tampón es tampón HEPES presente a una concentración de 20 mM aproximadamente; (c) el diluyente farmacéuticamente aceptable es agua; (d) el azúcar es sacarosa o trehalosa a una concentración de 2% en peso; (e) la sal es cloruro de sodio a una concentración de 100 mM aproximadamente; y (f) opcionalmente, se selecciona un detergente del grupo que comprende Tween®-80, Tween®-60, Tween®-40, Tween®-20 o F-68 plurónico a una concentración menor o igual a 0.1 mg/ml aproximadamente, donde el pH de la composición es pH 7.4 aproximadamente. En otras de estas composiciones farmacéuticas, (a) el polipéptido comprende la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO:50 presente en un intervalo de concentración de entre 50 mg/ml y 100 mg/ml aproximadamente; (b) el tampón es tampón citrato de sodio presente a una concentración de 20 mM aproximadamente; (c) el diluyente farmacéuticamente aceptable es agua; (d) el azúcar es sacarosa o trehalosa a una concentración de 2% en peso; (e) la sal es cloruro de sodio a una concentración de 100 mM aproximadamente; y (f) opcionalmente, se selecciona un detergente del grupo que comprende Tween®-80, Tween®-60, Tween®-40, Tween®-20 o F-68 plurónico a una concentración menor o igual a 0.1 mg/ml aproximadamente, donde el pH es pH 6.5 aproximadamente. En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que contiene: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:36; y (b) tampón HEPES o citrato de sodio (por ejemplo, una mezcla de citrato disódico-citrato trisódico, una mezcla de citrato de sodio-ácido cítrico, una mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, una mezcla de citrato monosódico-citrato disódico o una mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico). También se proporciona una composición farmacéutica que comprende: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:36; y (b) un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable, donde la composición tiene un pH de entre 7 y 8 aproximadamente. Algunas de estas composiciones farmacéuticas tienen un pH de 7.4 ó 7.5 aproximadamente. Algunas de estas composiciones farmacéuticas contienen tampón HEPES o citrato de sodio. También se proporciona una composición farmacéutica que comprende: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:50; y (b) tampón citrato de sodio (por ejemplo, una mezcla de citrato disódico-citrato trisódico, una mezcla de citrato de sodio-ácido cítrico, una mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, una mezcla de citrato monosódico- citrato disódico o una mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico). También se proporciona una composición farmacéutica que comprende: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:50; y (b) un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable, donde la composición tiene un pH de entre 6 aproximadamente y 7 aproximadamente. Algunas de estas composiciones farmacéuticas tienen un pH de 6.5 aproximadamente. Algunas de estas composiciones farmacéuticas contienen tampón citrato de sodio. En un aspecto ejemplar, la invención proporciona una composición farmacéutica que contiene entre 1 mg/ml y 300 mg/ml de una proteína de fusión CTLA-4-lg de la invención (por ejemplo, D3-54-lgG2) (por ejemplo, entre 1 mg/ml y 100 mg/ml aproximadamente, por ejemplo, 50 mg/ml aproximadamente ó 100 mg/ml aproximadamente) que se expresa típicamente como una proteína de fusión dimérica, en tampón HEPES 20 mM en agua, NaCI 100 mM, 2% en peso de sucrosa según la composición, pH 7.4, que incluye, opcionalmente, un detergente no iónico (por ejemplo, Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80 o F-68 plurónico) a una concentración de entre 0.01 mg/ml y 0.5 mg/ml aproximadamente, por ejemplo; entre 0.01 mg/ml y 0.1 mg/ml aproximadamente, y que incluye, opcionalmente, un polietilenglicol (PEG), como por ejemplo una molécula de PEG con un peso molecular de entre 200 Daltones (Da) y 8000 Da aproximadamente (por ejemplo, 200, 300, 400, 600, 900, 1000, 1450, 3350, 4500 ó 8000 Da aproximadamente, comercializado por Dow Chemical). En otro aspecto ejemplar, la invención proporciona una composición farmacéutica que contiene entre 1 mg/ml y 300 mg/ml de una proteína de fusión CTLA-4-lg de la invención (por ejemplo, D3-69-lgG2) que se expresa típicamente como una proteína de fusión dimérica, en tampón citrato de sodio 20 mM en agua, NaCI 100 mM, 2% en peso de sacarosa según la composición, pH 6.5, que incluye, opcionalmente, un detergente no iónico (por ejemplo, Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80 o F-68 plurónico) a una concentración de entre 0.01 mg/ml y 0.5 mg/ml aproximadamente, por ejemplo; entre 0.01 mg/ml y 0.1 mg/ml aproximadamente, y que incluye, opcionalmente, una molécula de PEG, como por ejemplo una molécula de PEG con un peso molecular de entre 200 Daltones (Da) y 8000 Da aproximadamente (por ejemplo, 200, 300, 400, 600, 900, 1000, 1450, 3350, 4500 u 8000 Da aproximadamente, comercializado por Dow Chemical). La invención incluye recipientes para contener una composición de la invención que contiene una molécula de la invención (por ejemplo, una molécula de CTLA-4 mutante, como por ejemplo CTLA-4-lg muíante) y un excipiente, diluyente o vehículo. La composición puede ser una composición farmacéutica que contiene una molécula de la invención y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Los recipientes incluyen, entre otros, por ejemplo, frascos (por ejemplo, frascos de vidrio, como por ejemplo un frasco de vidrio tipo I), autoinyectores, inyectores tipo bolígrafo (de dosis fija o variable) y jeringas previamente rellenas u otros recipientes adecuados. Si se desea, un recipiente puede contener una o más dosis predeterminadas de la molécula de la invención eficaces para suprimir una respuesta inmunitaria para tratar una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario como se explicó en otras partes del presente documento. Algunos de esos recipientes resultan útiles para la administración de la composición a un individuo que sufre una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario (por ejemplo, autoinyectores, inyectores tipo bolígrafo¡ jeringas previamente rellenas, etc.). Algunos de estos recipientes permiten la autoadministración de la composición por parte del individuo (por ejemplo, los inyectores tipo bolígrafo, los autoinyectores, las jeringas previamente rellenas, etc.). También se proporcionan composiciones o formulaciones estables de una molécula (por ejemplo, DEC de CTLA-4 muíante o CTLA-4-lg mutante) de la invención, incluidas las composiciones farmacéuticamente aceptables de una molécula de la invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la invención incluye composiciones o formulaciones liofilizadas. El término "Nofilizado", generalmente, se refiere al estado de una sustancia que se ha sometido a un procedimiento de secado como por ejemplo la liofilización, donde se elimina al menos un 50% de la humedad. Los procedimientos de preliofilización y liofilización son muy conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Lyophilization of Biopharmaceuticals, Vol. 2 de Biotechnology: Pharmaceutical Aspects (Henry R. Costantino et al. eds., 2004), la patente de Estados Unidos 6.436.897 y WO 06/104852), y pueden ser comprendidos fácilmente por los entendidos en la técnica. Los entendidos en la técnica pueden emplear cualquier procedimiento de liofilización adecuado o se lo puede modificar según corresponda para preparar una composición liofilizada de la invención. Se prepara, generalmente, una composición secada al aire, secada por aspersión o liofilizada se prepara, a partir de un líquido, como por ejemplo una solución, una suspensión, una emulsión, etc. El líquido que se secará al aire, se secará por aspersión o se liofilizará típicamente incluye todos los componentes que (menos el líquido, por ejemplo, el agua) deben aparecer en la composición liquida final reconstituida. De este modo, la composición secada al aire, por aspersión o liofilizada tendrá la composición líquida deseada (por ejemplo, la composición farmacéutica) cuando se reconstituya. Se pueden secar al aire, secar por aspersión o liofilizar las composiciones ejemplares de la invención, incluidas las composiciones farmacéuticas que contienen una molécula de la invención (por ejemplo, una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante de la invención, como por ejemplo, las SEQ ID NO: 197, 199, 211 ó 213), que se mencionan en esta solicitud, para producir una composición secada al aire, por aspersión o liofilizada estable, respectivamente, utilizando procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, los procedimientos ejemplares descritos en Lyophilization of Biopharmaceuticals, mencionado anteriormente. Por ejemplo, un recipiente (por ejemplo un frasco, como por ejemplo un frasco de vidrio) que contiene una composición líquida de una molécula de la invención (por ejemplo, CTLA-4-lg muíante, una proteína de fusión de la invención, como por ejemplo, las SEQ ID NO:197, 199, 211 , ó 213) que se liofilizará puede liofilizarse a través de procedimientos convencionales conocidos por los entendidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Lyophilization of Biopharmaceuticals, mencionado anteriormente. Posteriormente, se puede reconstituir la molécula liofilizada de la invención (por ejemplo, CTLA-4-lg mutante de la invención) con un líquido para generar una composición liquida reconstituida. Las formulaciones liofilizadas se reconstituyen típicamente mediante el añadido de una solución acuosa para disolver la formulación liofilizada. Se puede utilizar cualquier líquido o solución acuosa adecuada para reconstituir una formulación liofilizada. Las formulaciones liofilizadas suelen reconstituirse utilizando agua estéril o destilada, pero se pueden utilizar soluciones que contengan vehículos, excipientes, diluyentes, tampones y/u otros componentes, incluidos los que se describen en el presente documento para la reconstitución. En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica en forma liofilizada, donde la composición contiene entre 1 mg/ml y 300 mg/ml de una proteína de fusión CTLA-4-lg de la invención, que se expresa típicamente como una proteína de fusión dimérica, en un tampón adecuado (por ejemplo, HEPES, mezcla de citrato disódico-citrato trisódico, etc.) en agua a una concentración a la que se mantenga el pH deseado (por ejemplo, entre pH 6.0 y pH 7.5 aproximadamente), una sal (por ejemplo, NaCI 50 mM), un azúcar (por ejemplo, 4-6% en peso de sucrosa según la composición), y que incluye, opcionalmente, un detergente no iónico (Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80 o F-68 plurónico) a una concentración de 0.01 mg/ml y 0.5 mg/ml aproximadamente, por ejemplo, 0.01 mg/ml y 0.1 mg/ml aproximadamente (por ejemplo, Tween®-20, Tween®-60, Tween®-80 o F-68 plurónico). Una forma liofilizada de una composición farmacéutica contiene, normalmente, una concentración de sal más baja y una mayor concentración de azúcar en comparación con una composición líquida no liofilizada. En un aspecto específico, la invención proporciona una composición liofilizada estable para su administración terapéutica después de la reconstitución con agua estéril que contiene una cantidad eficaz desde el punto de vista terapéutico de una molécula de la invención y, opcionalmente, uno o más de los siguientes componentes farmacéuticamente aceptables: (a) un azúcar o sacárido, como por ejemplo sacarosa, mañosa, dextrosa o trehalosa en una cantidad de entre 1% en peso y 10% en peso aproximadamente; (b) un detergente o emulsionante, como por ejemplo Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80 o F-68 plurónico; (c) un agente isotónico o una sal, como por ejemplo una sal inorgánica (por ejemplo, cloruro de sodio) a una concentración de entre 0 mM y 50 mM aproximadamente (incluidas, por ejemplo, las concentraciones mencionadas anteriormente); (d) un tampón adecuado para mantener el pH de la composición dentro del intervalo que conduce a la estabilidad de la molécula; (e) un agente dispersante (por ejemplo, en una cantidad suficiente para dispersión a largo plazo de la molécula de la invención, como por ejemplo, entre 0.001 p/v% y 1.0 p/v%) (por ejemplo, polisorbato, como por ejemplo Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80 o F-68 plurónico); y (f) un estabilizante (por ejemplo, un sacárido, dextranos, un grupo de PEG de peso molecular bajo (MW), como por ejemplo un PEG con un peso molecular de entre 200 Da y 8000 Da aproximadamente (por ejemplo, 200, 300, 400, 600, 900, 1000, 1450, 3350, 4500 u 8000 Da) o un conservante. En algunas de estas composiciones liofilizadas, la molécula de la invención es una proteína de fusión recombinante o aislada de la invención, como por ejemplo una proteína de fusión que contiene una secuencia de polipéptidos con una identidad de secuencia de al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% ó 100% con al menos una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NO: de 74 a 79, de 197 a 200, de 205 a 214 y de 219 a 222 (opcionalmente, por ejemplo, seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NO: 197, 199, 21 1 y 213), donde la proteína de fusión se une a CD80 y/o a CD86 y/o a un dominio extracelular de los mismos y/o suprime una respuesta inmunitaria. Estas proteínas de fusión pueden ser monomérícas o diméricas. Como cantidades ejemplares de cada uno de los componentes de las composiciones liofilizadas se pueden mencionar las citadas anteriormente y en el resto del presente documento. En un aspecto, se selecciona un tampón para mantener el pH de la composición dentro del intervalo de pH 3 y pH 8 aproximadamente, de pH 4 y pH 7.5 aproximadamente. Una composición liofilizada de la invención que contiene una proteina de fusión CTLA-4-lg muíante recombinante de la invención se encuentra estable típicamente a entre -80° y +40°C y/o mantiene bastante bien su actividad biológica durante al menos una semana, un mes o más (por ejemplo, seis meses), un año, dos años, tres años, cuatro años o más cuando se almacena a temperaturas ambiente (por ejemplo, entre 22°C y 30°C aproximadamente). Después de la reconstitución con un líquido (por ejemplo, agua estéril para inyección (WFI)), la composición liofilizada resulta adecuada para su administración (por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea, parenteral, intramuscular, intradérmica., intraperitoneal, etc.) a un individuo (por ejemplo, un ser humano). La invención también proporciona un kit que contiene una composición liofilizada que contiene una molécula liofilizada de la invención (por ejemplo, una proteína de fusión CTLA-4-lg muíante, como por ejemplo, las SEQ ID NO:197, 199, 211 ó 213) en un primer recipiente (por ejemplo, un frasco, como por ejemplo un frasco de vidrio) e instrucciones para reconstituir la composición liofilizada utilizando un líquido (por ejemplo, agua estéril, WFI o tampón). Opcionalmente, el kit también puede contener un segundo recipiente (por ejemplo, un frasco, como por ejemplo un frasco de vidrio) que contenga una cantidad suficiente de líquido (por ejemplo, agua estéril, WFI o tampón) para la reconstitución de la composición liofilizada a una composición líquida. En este caso, la reconstitución se logra utilizando una jeringa para extraer el volumen deseado de agua del segundo recipiente e introduciendo el agua en el primer recipiente. Se agita suavemente el primer recipiente para formar una solución con la molécula de la invención (por ejemplo, la proteína de fusión). El kit puede incluir un dispositivo para reconstituir la composición liofilizada y/o administrar la composición líquida reconstituida. Como dispositivos ejemplares se incluyen, entre otros, por ejemplo, una jeringa para mezclar los dos componentes, la jeringa de cámara doble y el inyector de cámara doble. Un componente o cámara contiene la composición liofilizada y el segundo componente o cámara contiene el líquido para la reconstitución. Con estos dispositivos, la reconstitución se lleva a cabo justo antes de la administración y, generalmente, se administra la composición reconstituida por vía parenteral (por ejemplo, por inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular o intradérmica). La composición o composición farmacéutica de la invención puede contener o puede encontrarse en la forma de un liposoma. Entre los lípídos adecuados para una formulación liposomal se encuentran, entre otros, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos, lisolecitina, fosfolipidos, saponina, ácidos biliares y otros similares. La preparación de estas formulaciones liposomales se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N.°: 4.837.028 y 4.737.323. La forma de las composiciones o de la composición farmacéutica dependerá, al menos en parte, de la vía de administración del polipéptido, el conjugado, el ácido nucleico, el vector, el virus, la partícula semejante a virus y/o la célula de interés. Como hay muchas vías de administración posibles, la forma de la composición farmacéutica y sus componentes varían. Por ejemplo, para la administración transmucosal o transdérmica, se pueden incluir en la composición penetrantes adecuados para la barrera que se debe penetrar. Estos penetrantes, generalmente, son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosal, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusidico. En contraste, se puede facilitar la administración transmucosal a través del uso de inhaladores nasales o supositorios. La inyección es un modo de administración común para las composiciones de la invención, incluidas las composiciones farmacéuticas. Las composiciones inyectables farmacéuticamente aceptables contienen típicamente uno o más vehículos líquidos adecuados, como por ejemplo agua, petróleo, suero salino fisiológico, agua bacteríostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ), PBS o aceites. Las composiciones farmacéuticas líquidas también pueden incluir suero salino fisiológico, dextrosa (u otra solución sacárida), alcoholes (por ejemplo, etanol), polioles (polialcoholes, como por ejemplo manitol, sorbitol, etc.) o glicoles, como por ejemplo etilenglicol, propilenglicol, moléculas de PEG, agentes de recubrimiento que promueven una fluidez adecuada, como por ejemplo lecitina, agentes isotónicos, como por ejemplo manitol o sorbitol, esteres orgánicos como por ejemplo etioleato y agentes de retraso de la absorción, como por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatinas. La composición inyectable puede presentarse en forma de una solución acuosa, estable y libre de pirógenos.

Una solución acuosa inyectable puede contener un vehículo isotónico como por ejemplo cloruro de sodio, una solución inyectable de Ringer, dextrosa, una solución inyectable de Ringer con lactato o un vehículo de administración equivalente (por ejemplo, solución inyectable de cloruro de sodio/dextrosa). Las formulaciones adecuadas para inyección por vía intraarticular, intravenosa, intramuscular, intradérmica, subdérmica, intraperitoneal y subcutánea comprenden soluciones inyectables acuosas y no acuosas, estériles isotónicas, que pueden incluir solventes, cosolventes, antioxidantes, agentes reductores, agentes quelantes, tampones, bacteriostatos, conservantes antimicrobianos y solutos que producen una formulación isotónica con la sangre del receptor que se esté tratando (por ejemplo, PBS y/o soluciones salinas, como por ejemplo NaCI 0.1 M), y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, agentes emulsionantes, estabilizantes y conservantes. Se puede facilitar la administración de un polipéptido, un conjugado, un ácido nucleico, un vector, un virus, un seudovirus, una partícula semejante a virus y/o una célula de la invención (o de alguna composición que contenga alguno de estos componentes) con un dispositivo de administración de un material adecuado. Como ejemplos de materiales de matriz adecuados para producir dispositivos de administración no biodegradables se pueden mencionar la hidroxiapatita, el bioglass, los aluminatos u otras cerámicas. En algunas aplicaciones, se pueden utilizar un agente secuestrante, como por ejemplo la carboximetilcelulosa (CMC), la metilcelulosa o la hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) para unir el componente particular al dispositivo para administración localizada. Se puede formular un ácido nucleico o vector de la invención con uno o más poloxámeros, copolímeros de bloque de polioxietileno y polioxipropileno u otros surfactantes o sustancias lipófilas similares al jabón para la administración del ácido nucleico o el vector a una población de células o a un tejido o a la piel a un individuo. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.°: 6.149.922; 6.086.899 y 5.990.241. Los ácidos nucleicos y vectores de la invención se pueden asociar con uno o más agentes de aumento de la transfección. En algunas realizaciones, un ácido nucleico' y/o un vector del ácido nucleico de la invención se asocian típicamente con una o más sales, vehículos (por ejemplo, PEG) y/o formulaciones promotoras de estabilidad que ayudan en la transfección (por ejemplo, sales de fosfato de sodio, vehículos de dextraño, vehículos de óxido de hierro o vehículos de administración biolística ("pistola de genes"), como por ejemplo, vehículos de esferas o polvo de oro). Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.°: 4.945.050. Entre otros agentes para aumentar la transfección, se encuentran las partículas virales con las que se puede conjugar el ácido nucleico o el vector de ácido nucleico, un agente de precipitación de fosfato de calcio, una proteasa, una lipasa, una solución de bupivacaína, una saponina, un lípido (por ejemplo, un lípido cargado), un liposoma (por ejemplo, un liposoma catiónico), un péptido o un complejo proteico facilitador de la transfección (por ejemplo, una poli(etilenimina), polilisina o complejo de proteína y ácido nucleico viral), un virosoma o una célula modificada o una estructura similar a una célula (por ejemplo, una célula de fusión). También, se pueden administrar los ácidos nucleicos y vectores de la invención mediante procedimientos de electroporación in vivo o ex vivo, incluidos, por ejemplo, los descritos en las patentes de Estados Unidos N.°: 6.110.161 y 6.261.281 y en Widera et al, J. of Immunol. 164:4635-4640 (2000). Se puede facilitar la administración transdérmica de un componente de la invención (por ejemplo, un polipéptido, un conjugado, un ácido nucleico, un vector, un virus, una partícula semejante a virus y/o una célula de la invención) a través de un parche transdérmico que contiene dicho componente en una composición adecuada en cualquier forma adecuada. La invención proporciona estos dispositivos de parche transdérmico. Por ejemplo, este componente se puede encontrar en un depósito líquido en un dispositivo de parche con depósito de fármacos, o como alternativa, el componente se puede dispersar a través de un material adecuado para incorporarse a un dispositivo de parche transdérmico simple. Típicamente, el parche contiene una cantidad inmunosupresora de al menos uno de estos componentes, como por ejemplo una cantidad eficaz para suprimir una respuesta inmunitaria en un individuo en contacto con el parche. En la técnica se conocen ejemplos de estos dispositivos de parche. El dispositivo de parche puede ser un dispositivo pasivo o un dispositivo capaz de administración por iontoforesis de al menos uno de los componentes a la piel o al tejido del individuo. Es posible que una composición, especialmente una composición farmacéutica, contenga una dosis adecuada de al menos uno de los componentes de la invención (por ejemplo, el polipéptido, el conjugado, el ácido nucleico, el vector, el virus, la partícula semejante a virus y/o la célula) suficiente como para obtener la respuesta inmunosupresora deseada en un individuo después de su administración. Se puede determinar la dosis adecuada a través de cualquier técnica adecuada y en la técnica se conocen factores a tener en cuenta para determinar la dosis adecuada. En un régimen de prueba de dosificación sencillo, se administran dosis bajas de la composición a un individuo o sistema de prueba (por ejemplo, un modelo en animales, un sistema libre de células o un sistema de ensayo de células enteras). Comúnmente, la dosis se determina según la eficacia del componente específico que se administrará, la afección del individuo, el peso corporal del individuo y/o el área del individuo a tratar. El tamaño de la dosis también se determina según la aparición, la naturaleza y la importancia de cualquier efecto secundario que acompañe la administración de cualquier componente específico en un individuo específico. Se proporcionan principios relacionados con las dosis de los agentes terapéuticos y profilácticos, por ejemplo, en Platt, Clin. Lab Med. 7:289-99 (1987), "Drug Dosage" J. Kans. Med. Soc. 70(1):30-32 (1969) y en otras referencias que aparecen en el presente documento (por ejemplo, Remington's, mencionado anteriormente).

A modo de ejemplo, una cantidad eficaz desde el punto de vista terapéutico de un polipéptido de la invención para una dosis inicial para tratar una enfermedad autoinmune puede contener entre 0.001 mg/kg en peso corporal del individuo y 100 mg/kg en peso corporal del individuo aproximadamente, como por ejemplo entre 0.001 miligramos por kilogramo (mg/kg) en peso corporal del individuo y 100 miligramos por kilogramo (mg/kg) de peso del individuo aproximadamente, o, por ejemplo, entre 0.001 mg/kg de peso del individuo y al menos 0.005; 0.01 ; 0.025; 0.05; 0.1; 0.2; 0.25; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 0.9; 1 ; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 20; 25; 30; 40; 50; 60; 70; 75; 80; 90 ó 100 mg/kg en peso corporal del individuo aproximadamente. Se puede administrar esta dosis de conformidad con cualquier protocolo adecuado, por ejemplo, se puede administrar diariamente, semanalmente o bisemanalmente, o en combinación de cualquiera de las anteriores (por ejemplo, los días 0, 1, 2, 4, 5, 6 y 7, y semanalmente a partir de ese momento, o en las semanas 0, 1 , 2, 4 y 6), seguido por intervalos de 1 , 2 ó 3 meses, y a través de cualquier modo de administración adecuado, por ejemplo, mediante electroporación o inyección subcutánea (s.c), intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.) o intraperitoneal (i.p.), subdérmica, transdérmica, parenteral o intradérmica (i d.). En algunos casos, se administra típicamente un polipéptido de la invención en forma de polipéptido soluble, como por ejemplo, una proteína de fusión que contiene un polipéptido de DEC de CTLA-4 mutante de la invención unido por enlace covalente a un polipéptido de Fe de Ig. Por ejemplo, se puede administrar una composición farmacéutica que contiene una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante de la invención en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable a través de cualquier vía adecuada (por ejemplo, la vía intradérmica, la intravenosa o la subcutánea) en una cantidad eficaz que dependerá de la enfermedad (por ejemplo, la artritis reumatoide) o la afección autoinmune que se tratará (por ejemplo, para inhibir el rechazo a un trasplante de tejidos, células, injertos u órganos sólidos de un donante por parte de un individuo receptor). En un aspecto ejemplar, la invención proporciona un procedimiento para suprimir una respuesta inmunitaria en un individuo que lo necesite, procedimiento que comprende la administración al individuo de una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, entre 1 mg/ml aproximadamente y 300 mg/ml aproximadamente, incluido entre 25 mg/ml aproximadamente y 150 mg/ml aproximadamente (por ejemplo, 50 ó 100 mg/ml) de la proteína de fusión D3-54-lgG2 en tampón HEPES 20 mM en agua, NaCI 100 mM, 2% en peso de sucrosa, pH 7.4, donde el individuo padece un trastorno autoinmune (por ejemplo, artritis reumatoide). En otro aspecto ejemplar, la invención proporciona un procedimiento para inhibir el rechazo de un trasplante de tejidos, células, injertos u órganos sólidos de un donante a un individuo receptor, procedimiento que comprende administrar al individuo receptor una composición farmacéutica que contenga entre 25 mg/ml y 100 mg/ml aproximadamente (por ejemplo, 50 ó 100 mg/ml) de la proteína de fusión D3-69-lgG2 en tampón citrato de sodio 20 mM en agua, NaCI 100 mM, 2% en peso de sucrosa, pH 6.5.

Además, se proporciona una composición de un vector viral, que comprende un vehículo o excipiente y un vector viral de la invención. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable y un vector viral. La cantidad o la dosis de partículas del vector viral o del ácido nucleico que codifica las partículas del vector viral depende de: (1 ) el tipo de partículas del vector viral con respecto al origen del vector, incluido, entre otros, por ejemplo, si el vector es un vector del virus alfavirus, un vector del virus Semliki-Forest, un vector del virus adenovirus, un vector viral adeno-asociado (AAV), un vector del virus flavivirus, un vector del virus del papiloma y/o un vector viral del virus herpes simple (VHS), (2) si el vector es un vector de expresión transgénica o un vector de expresión de péptidos recombinantes, (3) el huésped y (4) otros puntos para tener en cuenta que se mencionaron anteriormente. Generalmente, cuando se trata de vectores de transferencia genética, la composición farmacéuticamente aceptable comprende al menos 1 x 102 partículas del vector viral aproximadamente en un volumen de 1 mi aproximadamente (por ejemplo, al menos entre 1 x 102 aproximadamente y 1 x 08 partículas aproximadamente en 1 mi aproximadamente). También pueden resultar adecuadas dosis más altas (por ejemplo, al menos 1 x 106 aproximadamente, 1 x 108 aproximadamente, 1 x 109 aproximadamente, ,1 x 1010 partículas/ml aproximadamente). La invención también proporciona una composición (incluida una composición farmacéutica) que contiene un conjunto de dos o más polipéptidos o conjugados de la invención. Además, la invención proporciona una composición (incluida una composición farmacéutica) que contiene una población de uno o más polipéptidos multiméricos o conjugados multiméricos de la invención. Como se indicó anteriormente, las composiciones farmacéuticas incluyen un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Kits La presente invención también proporciona los kit incluidos uno, dos, tres o más de los polipéptidos (por ejemplo, los polipéptidos de DEC de CTLA-4 mutantes, las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes, incluidas las proteínas de fusión diméricas), los conjugados, los ácidos nucleicos, los vectores, las células y/o las composiciones de la invención. Los kit de la invención contienen opcionalmente: (1) al menos un polipéptido (por ejemplo, una proteína de fusión CTLA-4-lg muíante), el conjugado, el ácido nucleico, el vector, la partícula semejante a virus, la célula y/o la composición de la invención; (2) de forma opcional, al menos un segundo agente inmunosupresor (por ejemplo, un agente antiinflamatorio no esteroideo, un metotrexato, un esteroide, un antagonista de TNFa, etc.); (3) las instrucciones para la realización de cualesquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, incluido un procedimiento terapéutico o profiláctico e instrucciones para el uso de cualesquiera de los componentes identificados en (1) o (2); (4) un recipiente que puede contener al menos uno de los componentes identificados en (1 ) o (2); y/o (5) materiales de embalaje. Se pueden envasar uno o más de los polipéptidos (por ejemplo, una proteína de fusión CTLA-4-lg muíante), los conjugados, los ácidos nucleicos, los vectores, las partículas semejantes a virus, las células y/o las composiciones de la invención, de forma opcional, con uno o más de los segundos agentes inmunosupresores, en paquetes, dispositivos de administración y kits para administración al individuo, por ejemplo un mamífero, incluido el ser humano. Se indican y se proporcionan una o más dosis de una cantidad eficaz de cada polipéptido (por ejemplo, la proteina de fusión CTLA-4-lg mutante), el conjugado, el ácido nucleico, el vector, la partícula semejante a virus, la célula y/o la composición de la invención o el segundo agente inmunosupresor opcional (por ejemplo, la dosis) para el procedimiento terapéutico o profiláctico indicado. Puede proporcionarse el o los polipéptidos (por ejemplo, la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante), los conjugados, los ácidos nucleicos, los vectores y/o las composiciones de células, y, si se desea, un segundo agente inmunosupresor opcional, en forma líquida o en polvo (por ejemplo, liofilizado) y pueden formularse con un excipiente o vehículo (incluido, por ejemplo, un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable), de manera de que formen una composición (incluida, por ejemplo, una composición farmacéutica). Se proporcionan los paquetes o los dispositivos de administración que contienen una o más fórmulas de dosificación por unidad. Normalmente, las instrucciones de administración de estos componentes se proporcionan con el envase, junto con una indicación adecuada en la etiqueta de que el compuesto es adecuado para el tratamiento de la afección indicada.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos ilustran mejor la invención, pero no se deben interpretar como limitadores su alcance en forma alguna.

EJEMPLO 1 El presente ejemplo proporciona una descripción de los métodos para crear una proteína de fusión LEA29Y-lg, que se utilizó como control y con fines comparativos en ensayos de unión y de actividad basados en células Biacore™.

Creación de un vector plasmidico de ADN que codifica una proteina de fusión LEA29Y-lg. El presente ejemplo describe la creación de un vector plasmidico de ADN que codifica una proteína de fusión LEA29Y-lg. LEA29Y-lg comprende un polipéptido de DEC de CTLA-4 muíante conocido específico, denominado "LEA29Y" (o "LEA" o "L104EA29Y" o "A29YL104E"), que está unido por un enlace covalente en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal de un polipéptido de Fe de lgG1 humana muíante específico. El polipépíido LEA29Y es un polipéplido del DEC de CTLA-4 mutaníe que comprende una secuencia de polipéptidos que difiere de la secuencia de polipéptidos del dominio extracélular de CTLA-4 humano en dos mutaciones -una sustitución A29Y y una sustitución L104E- en las que las posiciones 29 y 104 numeradas según la secuencia de polipéptidos del polipéptido del DEC de CTLA-4 humano, si se denomina el primer residuo de aminoácidos de CTLA-4 humano, residuo de aminoácidos posición 1. Véase la patente de Estados Unidos N.°: 7.094.874 . Se creó el vector plasmídico pCDNA3.1-LEA que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica LEA29Y-lg para producir esta proteína de fusión. El ADN que codifica LEA29Y-lg se crea mediante ensamblaje de PCR utilizando oligonucleótidos superpuestos diseñados sobre la base de la homología de secuencias con la secuencia de nucleótidos que codifica LEA29Y-lg que se muestra en la SEQ ID NO:167. Los oligonucleótidos se diseñan, crean y ensamblan utilizando procedimientos convencionales muy conocidos por los entendidos en la técnica y pueden incluir los códigos de iniciación, los códigos de parada y los sitios de restricción que sean necesarios. Los procedimientos de amplificación por PCR también utilizados son muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Berger, Ausubel y Sambrook, todos mencionados anteriormente. Los oligonucleótidos se ensamblan en una reacción de PCR de 100 µ? con oligonucleótidos 1 µ?, 1 x de tampón de Taq (Qiagen; #201225) y dNTP 200 µ? para 30 ciclos de amplificación (94°C, 30 seg.; 60°C, 30 seg.¡ 72°C, 60 seg.). El ADN amplificado se purifica utilizando columnas de centrifugado de PCR QiaQuick (Qiagen, Cat. #28104) y es digerido por enzimas de restricción Nhel y Sacll. Los fragmentos se separan mediante electroforesis en gel de agarosa, se purifican utilizando el kit de extracción en gel de Qiaquick "Qiaquick Gel Extraction Kit" (Qiagen, #28704) según las recomendaciones del fabricante y se ligan en pCDNA 3.1 (+) plasmídico (Invitrogen, Cat. #V790-20) digerido de forma similar. Las ligaduras se transforman en células de E. coli TOP10 (Qiagen, Cat. #C4040-10) según las recomendaciones del fabricante. Las células obtenidas se incuban durante la noche a 37°C en medio LB que contiene carbenicilina 50 pg/ml con agitación a 250 rpm y luego se utilizan para preparar una reserva de maxiprep (Qiagen; #12362) de ADN plasmídico (denominado de aquí en adelante vector plasmídico pCDNA3.1-LEA). El vector plasmídico pCDNA3.1-LEA es idéntico al vector CTLA-4-lgG2 mutante del vector plasmídico pCDNA que se muestra en la figura 1 con excepción de la secuencia del ácido nucleico que codifica el polipéptido CTLA-4-lgG2 mutante que es reemplazado por la secuencia del ácido nucleico que codifica la proteína de fusión LEA29Y-lg. Se incluyó un ácido nucleico que codifica el péptido señal de CTLA-4 humano como secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señal. En la SEQ ID NO:167 se muestra una secuencia del ácido nucleico que codifica la proteína de fusión LEA29Y-lg teórico. La SEQ ID NO: 167 comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señal (por ejemplo, los residuos de aminoácidos de 1 a 37 de la SEQ ID NO: 165).

En la SEQ ID NO:165 y 166, respectivamente, se muestran las secuencias de polipéptido de la proteína de fusión LEA29Y-lg teórico y LEA29Y-lg madura (sin el péptido señal). Como se indica en la figura 2C, la secuencia de aminoácidos teórico de LEA29Y-lg incluye los siguientes segmentos: el péptido señal teórico (residuos de aminoácidos de 1 a 37), el polipéptido del DEC de LEA29Y (residuos de aminoácidos de 38 a 161), un conector (residuo de aminoácidos 162) y un dominio Fe muíante (modificado) de un polipéptido de lgG1 humana (residuos de aminoácidos de 163 a 394). En la figura 2C, también se muestran los residuos de aminoácidos de las uniones entre estos varios segmentos. Específicamente, se muestran los últimos cuatro residuos de aminoácidos del péptido señal, los primeros cinco y los últimos cinco residuos de aminoácidos del DEC de LEA29Y, el residuo de aminoácido del conector único (Q), y los primeros cinco y los últimos cinco residuos de aminoácidos del polipéptido de Fe de lgG1 mutante. El péptido señal se escinde típicamente durante el tratamiento y de ese modo la proteína de fusión segregada (o sea la proteína de fusión madura) LEA29Y-lg, generalmente, no contiene la secuencia del péptido señal. La forma madura o segregada de LEA29Y-lg, que tiene un total de 357 aminoácidos, comprende los residuos de aminoácidos de 38 a 394 (la secuencia de longitud completa sin el péptido señal) de la secuencia teórico que se muestra en la SEQ ID NO:165 y comienza con la secuencia de aminoácidos: metionina-histidina-valina-alanina. La SEQ ID NO:165 incluye el péptido señal (por ejemplo, los residuos de 1 a 37) en la extremo amino terminal; el péptido señal se escinde típicamente para formar la proteína madura que se muestra en la SEQ ID NO:166. Si así se lo desea, los aminoácidos de la forma madura pueden numerarse comenzando por la secuencia Met de Met-His-Val-Ala que designa a Met como el primer residuo (por ejemplo, el dominio extracelular comprende los residuos de aminoácidos numerados de 1 a 124) como en la proteína de fusión LEA29Y-lg madura que tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 166. En un aspecto, la secuencia de la SEQ ID NO:165 ó 166 no incluye el residuo de lisina del extremo carboxilo terminal; este residuo puede escindirse durante el tratamiento o antes de la secreción. La secuencia proteica de la proteína de fusión LEA29Y-lg está descrita en la patente de Estados Unidos N.°: 7.094.874. Específicamente, la SEQ ID NO:4 de la patente de Estados Unidos 7.094.874 muestra una secuencia proteica que codifica la forma no madura de la LEA29Y-lg monomérica. En la patente de Estados Unidos N.°: 7.094.874 , se hace referencia a la proteína de fusión LEA29Y-lg como "L104EA29Ylg". La proteína de fusión LEA29Y-lg madura que contiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 166 que se menciona aquí difiere de la secuencia de la proteína de fusión que se muestra en la SEQ ID NO:4 en la patente de Estados Unidos N.°: 7.094.874 porque la SEC. ID. N°:4 de la patente de Estados Unidos N.°: 7.094.874 incluye un péptido señal (o sea los residuos 1 a 26 de la SEQ ID NO:4). El péptido señal se escinde típicamente durante el tratamiento y de ese modo la forma madura (segregada) de la proteína de fusión LEA29Y-lg, generalmente, no incluye la secuencia del péptido señal. La SEQ ID NO:3 de la patente de Estados Unidos N.°: 7.094.874 presenta una secuencia del ácido nucleico que codifica la proteína de fusión L104EA29Ylg (o sea LEA29Y-lg). LEA29Y-lg existe típicamente en solución como una proteína de fusión dimérica que comprende dos proteínas dé fusión monoméricas idénticas. En este caso, cada proteína de fusión LEA29Y-lg monomérica madura comprende un polipéptido del DEC de LEA29Y (SEQ ID NO: 168) fusionado en su extremo carboxilo terminal a la extremo amino terminal del Fe de lgG1 mutante (SEQ ID NO: 186). Los dos monómeros de LEA29Y-lg se encuentran unidos por un enlace covalente por enlaces disulfuro formados entre residuos de cisteína en cada moribmero, formando de ese modo el dímero de la proteína de fusión LEA29Y-lg. El dímero de LEA29Y-lg es la forma de la molécula de proteína de fusión que se utiliza en los ensayos descritos en estos ejemplos, salvo que se establezca específicamente lo contrario Creación de la línea celular CHO-K1 estable que expresa la proteina de fusión LEA29Y-lq. Se creó una línea celular estable para generar múltiples cantidades de miligramos de la proteína de fusión LEA29Y-lg que se mencionó anteriormente.

Transfección de células CH0-K1. Se sembraron células CHO-K1 con una densidad de 1 x 106 en matraces T-175 (BD Falcon, #3531 12) que contenían 40 mi de medio de cultivo (medio DMEM/F12 (Invitrogen, #10565-018) complementado con suero fetal bovino al 10% (SFB) (Hyclone, #SV30014.03) y 1x de PS (penicilina + estreptomicina) (Invitrogen, #15140-122)). Las células se incubaron durante 24 horas (h) a 37 °C y luego se transfectaron con 10 pg de Maxiprep de ADN plasmídico (por ejemplo, vector plasmídico que codifica LEA29Y-lg que se describió anteriormente) mezclado con 60 µ? de Fugene 6 (Roche, #1 1814443001) según las condiciones recomendadas por el fabricante. Las células se incubaron durante 2 días a 37°C en medio de cultivo y luego durante 10 días en medio de selección (medio de cultivo que contiene Genetícin 300 pg/ml (Invitrogen, #10131-027)), con cambio de medio cada 2 días. Se extrajo el medio y se dispersaron las células mediante el agregado de 3 mi de tripsina 0.05% (Invitrogen, Cat. #25300-054) e incubación a 37°C durante 3 minutos. Se diluyeron las células dispersas en 10 mi de medio de cultivo y se cosecharon a través de centrifugación a 1000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente en un rotor GH-3.8 (Beckman Coulter, #360581). Después de desechar el sobrenadante, se suspendieron las células en 1 mi de medio de cultivo, se filtraron a través de membranas de 40 pm (BD Falcon, #352340) y se llevaron a una densidad de 1 x 106 células/ml.

Separación de clones únicos Utilizando un separador de células (Dako, MoFlo), las células vivas se dispersaron en forma individual en placas de cultivo de 96 pocilios (Sigma-Aldrich, #CLS-3596) que contenían 200 µ?/pocillo de medio de cultivo con medio condicionado al 25% (medio de cultivo cosechado previamente de cultivos de células no transfectadas (o vírgenes)). Después de incubación a 37 °C durante 10 a 14 días, las células se dispersaron mediante hidrólisis de tripsina y se traspasaron a placas de cultivo nuevas que contenían 200 µ?/pocillo de medio de cultivo. Se cultivaron las células a 37°C en medio de cultivo hasta que la densidad celular alcanzó el 70% de confluencia (14 días aproximadamente, con recambio de medio cada 7 días).

Identificación de los clones deseados Se identificaron los clones con expresión de niveles altos de proteína de fusión LEA29Y-lg recombinante medíante análisis de transferencia en mancha y western. Para el análisis de transferencia en mancha, se cosecharon 100 µ? de medio de cada pocilio de las placas de cultivo de 96 pocilios y se traspasaron a membranas de nitrocelulosa (Whatman, #10439388) según las recomendaciones del fabricante. Se lavaron las membranas dos veces con 200 mi de PBST (PBST es tampón fosfato salino (PBS) + Tween®-20 al 0.05%) durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego se incubaron con PBST que contenía 5% de leche descremada en polvo (EMD, #1.15363.0500) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron las membranas como se describió anteriormente y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en 20 mi de PBST que contenía anticuerpos de cabra anti Ig humana conjugados con peroxidasa de rábano (HRP) (Vector Labs, #BA-3000) diluidos 1 :4000. Se lavaron las membranas como se describió anteriormente y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con PBST que contenia reactivo estreptavidina-HRP (BD Biosciences, #554066) diluido 1 :2000. Se lavaron las membranas como se describió anteriormente y se detectaron señales utilizando reactivo de detección para Western Blot ECL (Amersham, Cat. #RPN2132) según las condiciones recomendadas por el fabricante. Se dispersaron los clones identificados como positivos por intensidad de señal alta (es decir, que expresaban niveles altos de proteína de fusión) mediante hidrólisis de tripsina y se traspasaron a placas de cultivo de 6 pocilios (BD Falcon, Cat. #353046) que contenían 2 ml/pocillo de medio de cultivo. Después de incubación a 37°C durante 3 ó 4 días, las células se dispersaron mediante hidrólisis de tripsina y se traspasaron a matraces T-75 (BD Falcon, Cat. #353136) que contenían 20 mi de medio de cultivo. Después de incubación a 37 °C durante 2 días, se cosecharon 100 µ? de medio y se analizó utilizando análisis western para evaluar los niveles de expresión de proteína. Para el análisis western, se corrieron cantidades iguales (15 µ?) de medio de cada cultivo celular a través de geles NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Invitrogen, #NP0322BOX) en tampón de corrida MES (MES es 2-(N-morfolino)ácído etanosulfónico, pH 7.3) (Invitrogen, #NP0002) en las condiciones recomendadas por el fabricante. Se traspasaron las proteínas de los geles a las membranas de nitrocelulosa (Invitrogen, Cat. #LC2001) mediante electrotransferencia según las condiciones recomendadas por el fabricante. Se trataron las membranas como se describió anteriormente para el análisis de transferencia en mancha y se identificaron los clones positivos (que expresan la proteína de fusión de interés) por intensidad de señal y peso molecular aparente. Se dispersaron los clones positivos mediante hidrólisis de tripsina como se describió anteriormente y se propagaron en matraces T-175 que contenían 40 mi de medio de cultivo.

Producción y purificación de proteina de fusión LEA29Y-lg. Propagación de cultivos en botellas de cultivo rotatorias. Se cultivó una línea celular CHO-K1 estable que se había transfectado, como se describió anteriormente, con ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de interés hasta alcanzar la confluencia en matraces T-175 que contenían 40 mi de medio de cultivo (medio DMEM/F-12 (Invitrogen, #10565-018) complementado con SFB al 10% (Hyclone #SV30014.03) y 1x de PS (Invitrogen, #15140-122)). Se cosecharon las células mediante incubación en 3 mi de tripsina al 0.05% (Invitrogen, Cat. #25300-054) durante 3 minutos a 37°C, se diluyeron en 12 mi de medio de cultivo y luego se traspasaron a botellas de cultivo rotatorias (Corning, Cat. #431191) que contenían 250 mi de medio de cultivo. Después de incubación de los cultivos en botellas de cultivo rotatorias a 37°C en una incubadora rotatoria humidificada durante 2 días, se extrajo el medio y se reemplazó por 250 mi de medio de cultivo nuevo. Los cultivos se incubaron durante 2 días a 37°C y el medio se reemplazó por 250 mi de medio UltraCHO (medio UltraCHO (BioWhittaker, Cat. #12-724) complementado con EX-CYTE 1/1000 (Serologicals Proteins, Cat. #81129N) y 1x de PS). Después de incubación durante 2 días a 37°C, se reemplazó el medio por 250 mi de medio UltraCHO nuevo. Se incubaron los cultivos durante 2 días a 37°C y se reemplazó el medio por 250 mi de medio de producción (medio DMEM/F-12 complementado con ITSA 1/1 OOx (Life Technologies #51300-044), EX-CYTE 1/1000X y 1x de PS). Durante la producción, se cosechó el medio y se reemplazó por medio de producción nuevo día por medio.

Purificación de proteínas. Se aclaró el medio de producción de los cultivos en botellas de cultivo mediante centrifugación a 2500 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se filtró a través de membranas 0.2 µ? (VWR, Cat. #73520-986). Se concentró el medio 10 veces mediante filtración de flujo tangencial utilizando membranas MWCO 10 kDa (Millipore, Cat. #P3C010C00) y luego se utilizó en cromatografía de afinidad de proteína A empleando un sistema de HPCL BioCad visión. Se unió la proteína de fusión de Ig a la resina de proteína A Poros 20 (Applied Biosystems, Cat. #1-5029-01) en tampón PBS, se lavó con el mismo tampón, se eluyó con tampón de ácido cítrico 80 mM (pH 4.0) que contenía cloruro de sodio 160 mM y luego se neutralizó mediante agregado de base Tris 2M. Por último, la solución de proteínas se dializó con 6 litros (1) de PBS utilizando membranas MWCO 10 kDa (Pierce, Cat. #PI66810).

EJEMPLO 2 El presente ejemplo describe métodos ejemplares que se utilizan para crear y evaluar genotecas de mutantes de CTLA-4 para la actividad de unión de CD80 humano y/o CD86 humano modificado mediante expresión en fago.

Proteina de fusión CD80 humano-lg. Se utilizaron proteínas de fusión de CD80 humano-lg ("hCD80-Ig") y CD86 humano-lg ("hCD86-lg") como ligandos en los experimentos de adsorción de fagos y ELISA de fagos para identificar moléculas CTLA-4 mutantes que se unan a CD80 humano ("hCD80") y/o CD86 humano ("hCD86") y/o a un dominio extracelular de alguno de los anteriores o de ambos. Las proteínas de fusión de CD80 humano-lg (también llamadas "hB7.1-lg" o "hB7-1-lg") y CD86 humano-lg (también llamadas "hB2.1-lg" o "hB2-1-lg") son proporcionadas por R&D Systems (Minneapolis, MN). En la SEQ ID NO: 172 se muestra una secuencia del ácido nucleico representativa que codifica la proteína de fusión CD80-lgG1 humana natural teórica, que contiene el péptido señal CD80 humano, DEC de CD80 humano y Fe de lgG1 humana. En la SEQ ID NO:170 y la SEQ ID NO:171 , respectivamente, se muestran las secuencias de polipéptido teórico y maduro de la proteína de fusión hCD80-lgG1. La proteína de fusión teórica que se muestra en la SEC. ID. N°-:170 contiene DEC de CD80 humano natural covalentemente fusionado en su extremo carboxilo terminal a la extremo amino terminal de un polipéptido de Fe de lgG1 humana e incluye un péptido señal en su extremo amino terminal. El péptido señal se escinde típicamente para formar la proteína de fusión CD80-lg madura que se muestra en la SEQ ID NO: 171. En el presente documento, la CD80-lgG1 humana por lo general se abrevia hCD80-lg. Como se muestra en la figura 2A, la secuencia del aminoácido teórico de la proteína de fusión hCD80-lg (también llamada "CD80-lgG1 ") incluye los siguientes segmentos: el péptido señal teórico (residuos de aminoácidos de 1 a 34), el DEC de CD80 humano (residuos de aminoácidos de 35 a 242), un conector (residuos de aminoácidos de 243 a 245) y un polipéptido de Fe de lgG1 humana (residuos de aminoácidos de 246 a 476). En la figura 2A, se muestran los residuos de aminoácidos de las uniones entre estos varios segmentos. Específicamente, se muestran los últimos cuatro residuos de aminoácidos del péptido señal, los primeros cinco y los últimos cinco residuos de aminoácidos del DEC de CD80 humano, los residuos de aminoácidos del conector (GVT) y los primeros cinco y los últimos cinco residuos de aminoácidos del polipéptido de Fe de lgG1 humana. En la proteína de fusión CD80-lg, hay tres residuos GVT presentes como artefacto de clonación (o conector) entre el extremo carboxilo terminal del DEC de CD80 (que termina con los residuos de aminoácidos FPDN) y el extremo amino terminal del polipéptido de Fe de lgG1 (que comienza con los residuos de aminoácidos PKSC). Este artefacto de clonación o conector GVT se muestra en las secuencias de polipéptidos de CD80-lg teóricos y maduros que se muestran en las SEQ ID NO: 170 y 171 , respectivamente. El péptido señal se escinde típicamente durante el tratamiento y de ese modo la proteína de fusión segregada (o sea la proteína de fusión madura) de hCD80-lg, generalmente, no contiene el péptido señal. La forma madura o segregada de hCD80-lg, que tiene un total de 442 aminoácidos, comprende los residuos de aminoácidos de 35 a 476 (la secuencia de longitud completa sin el péptido señal) de la SEQ ID NO: 170 y comienza con la secuencia de residuos de aminoácidos: valina-isoleucina-histidina-valina. Si así se lo desea, los aminoácidos de la forma madura pueden numerarse comenzando por la valina (Val) de la secuencia Val-lle-Hís-Val que designa a Val como el primer residuo (por ejemplo, el DEC comprende los residuos de aminoácidos numerados de 1 a 208) como en la forma madura de hCD80-lg que contiene la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEQ ID NO:171. La proteína de fusión hCD80-lg existe típicamente en solución como una proteína de fusión dimérica que comprende dos proteínas de fusión hCD80-lg maduras monoméricas idénticas. En este caso, cada proteína de fusión hCD80-lg madura monomérica (SEQ ID NO: 171) comprende un DEC de CD80 humano (SEQ ID NO:174) fusionado en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal de un Fe de lgG1 humana (SEQ ID t NO: 185). Los dos monómeros de hCD80-lg se encuentran unidos por un enlace covalente con enlaces disulfuro formados entre residuos de cisteína en cada monómero, formando de ese modo el dímero de la proteína de fusión hCD80-lg. El dímero de la proteína de fusión hCD80-lg es la forma de la molécula de proteína de fusión que se utiliza en los ensayos descritos en estos ejemplos, salvo que se establezca específicamente lo contrario. En la SEQ ID NO: 196 se muestra un ácido nucleico representativo que codifica el polipéptido de CD80 humano de longitud completa teórico. La secuencia del ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 196 codifica el péptido señal del CD80 humano, el DEC, el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático e incluye el código de parada TAA en el extremo carboxilo terminal.

Proteina de fusión CD86 -Ig humana. En la SEC. ID. N°:179 se muestra una secuencia de ácidos nucleicos representativa que codifica la secuencia de/ aminoácidos teórica de la proteína de fusión CD86-lgG1 humana (por lo general, en la presente se abrevia "hCD86-lg"). Esta secuencia de aminoácidos incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal de la proteína de fusión CD86-lgG1 humana madura. En la SEC. ID. N°:177 se muestra la secuencia de aminoácidos teórica de la proteína de fusión hCD86-lg y en la SEQ ID NO:179 se muestra un ácido nucleico ejemplar que codifica la proteína de fusión hCD86-lg teórica. Como se muestra en la figura 2B, la secuencia de aminoácidos teórica de la proteína de fusión hCD86-lg incluye los siguientes segmentos: el péptido señal teórico (residuos de aminoácidos de 1 a 23), el dominio extracelular de CD86 humano (residuos de aminoácidos de 24 a 243), la secuencia del conector (residuos de aminoácidos de 244 a 246) y un polipéptido de Fe de lgG1 humana (residuos de aminoácidos de 247 a 477). En la figura 2B, también se muestran los residuos de aminoácidos de las uniones entre estos varios segmentos. Específicamente, se muestran los últimos cuatro residuos de aminoácidos del péptido señal, los primeros cinco y los últimos siete residuos de aminoácidos del DEC de CD86 humano, los residuos de aminoácidos del conector (GVT) y los primeros cinco y los últimos cinco residuos de aminoácidos del polipéptido de Fe de lgG1 humana. El péptido señal de CD86 se escinde típicamente del polipéptido hCD86-lg teórico durante el tratamiento y de ese modo la proteina de fusión CD86-lg humana segregada (es decir, la proteína de fusión madura) generalmente, no incluye el péptido señal. La forma madura o segregada de hCD86-lg, que tiene un total de 454 aminoácidos, comprende los residuos de aminoácidos de 24 a 477 (la secuencia de longitud completa sin el péptido señal) de la SEC. ID. N°:177 y comienza con la siguiente secuencia de residuos de aminoácidos: alanina-prolina-leucina. Si asi se lo desea, los aminoácidos de la proteína de fusión madura pueden numerarse comenzando por el residuo de alanina (Ala) de la secuencia Ala-Pro-Leu que designa Ala como el primer residuo (por ejemplo, el DEC comprende los residuos de aminoácidos numerados de 1 a 218) como en la forma madura de hCD86-lg que contiene la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEC. ID. N°:178. La proteína de fusión madura (SEC. ID. N°:178) comprende una proteína de DEC de hCD86 natural covalentemente fusionada en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal de un polipéptido de Fe de hlgGl La proteína de fusión hCD86-lg existe típicamente en solución como una proteína de fusión dimérica que comprende dos proteínas de fusión hCD86-lg maduras monoméricas idénticas. En este caso, cada proteína de fusión CD86-lg madura monomérica (SEQ ID NO: 178) comprende un DEC de CD86 humano (SEQ ID NO: 180) fusionado en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal de un Fe de lgG1 humana (SEQ ID NO:185). Los dos monómeros de hCD86-lg se encuentran unidos por un enlace covalente con enlaces disulfuro formados entre residuos de cisteína en cada monómero, formando de ese modo el dímero de la proteína de fusión hCD86-lg. El dímero de la proteína de fusión hCD86-lg es la forma de la molécula de proteína de fusión que se utiliza en los ensayos descritos en estos ejemplos, salvo que se establezca específicamente lo contrario. En la proteína de fusión CD86-lg (por ejemplo, formas teórica y madura), hay tres residuos GVT presentes como artefactos de clonación (o conectores) entre el extremo carboxilo terminal del DEC de CD86 y el extremo amino terminal del polipéptido de Fe de lgG1. En otro aspecto, la proteína de DEC de CD86 humana natural comprende una secuencia de polipéptidos que comprende los residuos de aminoácidos de 1 a 218 de la SEQ ID NO:180 (es decir, excluye los dos últimos residuos de aminoácidos del extremo carboxilo terminal del (PP)).

Proteína de fusión Orencia®. Como control adicional y con fines comparativos, se adquirió una proteína de fusión disponible en el mercado conocida como la proteína de fusión Orencia® (Bristol-Myers Squibb Co., Princeton, NJ). La proteína de fusión Orencia® está compuesta por el dominio extracelular de CTLA-4 humano natural covalentemente fusionado en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal de un polipéptido de Fe de lgG1 específico muíante. La proteína Orencia® es una proteína de fusión dimérica que comprende dos proteínas de fusión monoméricas idénticas que se encuentran unidas por enlace covalente con enlaces disulfuro formados entre residuos de cistéína presentes en cada proteína de fusión monomérica. En la SEC. ID. N°:164 se muestra la secuencia de polipéptidos de cada monómero de proteína ¡ de fusión Orencia® madura y está compuesta por los siguientes segmentos: un dominio extracelular de CTLA-4 humano natural (residuos de aminoácidos de 1 a 124), la secuencia del conector (residuo de aminoácidos 125) y un polipéptido de . Fe de lgG1 mutante (residuos de aminoácidos de 126 a 357). Cada monómero de proteína de fusión Orencia® tiene una estructura similar a la del monómero de proteína de fusión LEA29Y-lg que se muestra esquemáticamente en la figura 2C, excepto que el DEC de LEA29Y se reemplaza por el DEC de CTLA-4 humano natural, y no hay péptido señal presente en ningún monómetro de proteína de fusión Orencia® porque cada monómero es una proteína de fusión segregada o madura. En la SEQ ID NO:8 y la SEQ ID NO:7, respectivamente, de la patente de Estados Unidos N.°: 7.094.874 se muestran la secuencia de polipéptidos de la forma no madura de un monómero de Orencia® (que incluye un péptido señal) y una secuencia del ácido nucleico que codifica la forma no madura de un monómero de proteína de fusión Orencia®. En la patente de Estados Unidos N.°: 7.094.874 también se muestran los procedimientos para producir y utilizar la proteína de fusión Orencia®.

Creación de secuencias de ADN que codifican polipéptidos de CTLA-4 mutantes. Se utilizaron procedimientos de evolución dirigidos para generar genotecas de polinucleótidos no naturales recombinantes que codifican polipéptidos de dominio extracelular de CTLA-4 mutantes recombinantes. Se conocen las secuencias de proteínas y nucleótidos de varios homólogos de CTLA-4 mamíferos naturales. Véase, por ejemplo, National Center for Biotechnology Information. La diversidad de secuencias que se identificaron en diversos homólogos del dominio extracelular de CTLA-4 mamíferos naturales se utilizó en los procedimientos de evolución dirigidos para generar genotecas de polinucleótidos recombinantes que codifican polipéptidos de dominio de DEC de CTLA-4 muíante. Los procedimientos de evolución dirigidos incluyen, por ejemplo, los procedimientos de recombinación y mutagénesis in vitro que se describen básicamente en Stemmer, Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 91 :10747-10751 (1994); Chang et al, Nature Biotech 17:793-797 (1999); publicación de la solicitud de patente internacional N.°: WO 98/27230 y en las patentes de Estados Unidos N.°: 6.117.679 y 6.537.776.

Creación de qenotecas de secuencias de ADN que codifican polipéptidos de CTLA-4 mutantes. Se amplificaron secuencias de ADN mutante que codifican polipéptidos de DEC de CTLA-4 mutante recombinante de reacciones de ensamblaje por PCR utilizando cebadores directos e inversos diseñados sobre la base de la homología de secuencias. Los cebadores se diseñaron, crearon y ensamblaron utilizando procedimientos convencionales muy conocidos por los entendidos en la técnica e incluyen los códigos de iniciación, los códigos de parada y los sitios de restricción necesarios. Los procedimientos de amplificación por PCR que también se utilizan son muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Berger, Ausubel y Sambrook, todos mencionados anteriormente. Como cebadores directos e inversos ejemplares se pueden mencionar, entre otros, el cebador directo que aparece a continuación: cebador directo (5'-ctattgctacggccgctatggccmtkcacgtcgctcaaccagccgtcgtactcgcgtcc-3') (SEQ ID N0:191) y el cebador inverso (5'- gtgatggtgatggtgtgcggccgcatcaga-3') (SEQ ID NO:192). Se utilizaron 5 µ? de reacción de ensamblaje como plantilla en una reacción de PCR de 100 µ? con cebadores directos e inversos 1 µ?, tampón de Taq (Qiagen; #201225) y dNTP 200 µ? para 15 ciclos de amplificación (94°C, 30 seg.; 50°C, 30 seg.¡ 72°C, 40 seg.). El ADN amplificado que codifica polipéptidos de DEC de CTLA-4 mutantes fue digerido con enzimas de restricción (Sfil y Notl) y se separaron los fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa, se purificaron utilizando el kit de extracción en gel de Qiaquick (Qiagen, #28704) según las recomendaciones del fabricante y se ligaron en el vector de expresión en fago pSB0124 digerido en forma similar (procedimiento similar al que se describe en Chang et al, Nature Biotech 17:793-797 (1999)). Se transformó la ligadura de la genoteca resultante en las células de E. coli TOP10 (Invitrogen, Inc; #C4040-50) mediante electroporación, siguiendo las condiciones recomendadas por el fabricante. Se incubaron las células transformadas en LB (medio de caldo Luria) que contenía carbenicilina 50 pg/ml a 250 rpm durante la noche a 37°C y luego se utilizaron para preparar una reserva de maxiprep (Qiagen; #12362) de ADN de la genoteca en las condiciones recomendadas por el fabricante.

Tamizaje de genotecas de expresión en fago de polipéptidos de CTLA-4 mutante que presentan avideces de unión mejoradas a CD80 y/o CD86 humano Generación de qenotecas de expresión en fago de polipéptidos de CTLA-4 mutantes. Se transformó el ADN de genoteca (por ejemplo, una genoteca de secuencias de ADN que codifican mutantes de DEC de CTLA-4) en células de E. coli TG-1 (Stratagene; #200123) mediante electroporación en las condiciones recomendadas por el fabricante. El cultivo se cultivó en condiciones de selección de fagémidos (medio LB que contenía carbenicilina a 50 pg/ml) por 1-2 generaciones, se infectó con fago auxiliar M 3KO7 (a un nivel de multiplicidad de infección de 5-10) y se incubó con agitación a 250 rpm durante la noche a 37°C bajo selección doble para fagémido (carbenicilina a 50 pg/ml) y fago auxiliar (kanamicina a 70 Mg/ml). Se aclararon los cultivos mediante centrifugación (6000 rpm, 15 minutos, a 4°C en un rotor 600TC Sorvall) y se precipitaron las partículas de fagos a través de la incubación de 32 mi de sobrenadantes de los cultivos con 8 mi de solución PEG/NaCI (PEG-8000 20%; 2.5 M de NaCI) con hielo durante 30 minutos y luego se centrifugaron (9500 rpm, 40 minutos, 4°C en un rotor 600TC Sorvall). Se suspendió el sedimento de fagos en 1 mi de PBS que contenia BSA al 1% (seroalbúmina bovina, Sigma; #A7906), se traspasó a un tubo de microcentrifugación y se aclaró mediante centrifugación (velocidad máxima, 5 minutos, temperatura ambiente en una centrífuga de mesa Eppendorf).

Cribado de qenotecas en fago de mutantes de CTLA-4. Se cribaron genotecas en fago en hasta cinco series contra proteínas de fusión hCD80-lg o hCD86-lg en condiciones convencionales. Véase, por ejemplo, Lowman, et al, Biochemistry 12;30(45):10832-10838 (1991); Smith, G.P. et al, Chem. Rev. 97:391-410 (1997). Cada serie de cribado comprendió: (a) unión de poiipéptidos de DEC de CTLA-4 mutante de expresión en fago a ligandos de hCD80-lg o hCD86-lg; (b) extracción de fagos no unidos; (c) elución de fagos unidos; y (d) amplificación de fagos eluidos para la siguiente serie de cribado. Se transdujo una alícuota de fagos de cada serie a células de E. coli para obtener colonias transductoras individuales.

Identificación de mutantes de CTLA-4 que presentan una avidez de unión mejorada a CD80 humano y/o CD86 humano mediante ELISA de fagos. Se inocularon las colonias individuales que se obtuvieron en cada serie de cribado en placas de cultivo de 96 pocilios (NUNC; #243656) que contenían 150 µ?/pocillo de medio levadura triptona 2 x (YT) con 50 pg/ml de carbenicilina y se incubaron a 250 rpm durante la noche a 37°C. Se utilizaron los cultivos producidos durante la noche para inocular placas de pocilios profundos (Scienceware; #378600001) que contenían 600 µ?/pocillo del mismo medio. Se incubaron los cultivos a 250 rpm durante 2 horas a 37°C, se infectaron con fago auxiliar M13K07 (multiplicidad de infección 5-10) y luego se incubaron a 250 rpm durante la noche a 37°C bajo selección doble para marcadores fagémidos y de fago auxiliar (carbenicilina a 50 pg/ml y kanamicina a 70 pg/ml, respectivamente). Se aclararon los cultivos mediante centrifugación a 4000 rpm durante 20 minutos a 4°C en un rotor GH 3.8 Beckman. Se recubrieron las placas de ELISA (NUNC; #449824) mediante agregado de 50 µ?/pocillo de PBS que contenia hCD80-lg o hCD86-lg 10 pg/ml y se incubaron durante la noche a 4°C. Se lavaron las placas tres veces con 200 µ?/pocillo de PBST y se bloquearon mediante agregado de 200 µ?/pocillo de PBS que contenía 3% de leche descremada en polvo, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se traspasaron 25 µ?/pocillo de sobrenadantes de fagos de la placa de pocilios profundos a placas de ELISA que contenían 25 µ?/pocillo de 6 % de leche descremada en polvo y se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron tres veces las placas con 200 µ?/pocillo de PBST y se incubaron con 50 µ?/pocillo de anticuerpo monoclonal anti-M13 conjugado con HRP (GE Healthcare, #27-9421-01) diluido 1 :5000 en PBST que contenía 3% de leche descremada en polvo, durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron tres veces las placas con 200 µ?/pocillo de PBST y se detectó la señal utilizando un kit de sustrato TMB (Pierce; #34021) en las condiciones recomendadas por el fabricante. Se seleccionaron para análisis adicional los polipéptidos de DEC de CTLA-4 mutantes que mostraban una avidez de unión mejorada a CD80 humano y/o CD86 humano (que se midió por una avidez mejorada para hCD80-lg y/o hCD86-lg), en comparación con la avidez de unión de CTLA-4 humano a CD80 humano y/o CD86 humano (que se midió mediante la avidez de unión de DEC de CTLA-4 humano a hCD80-lg y/o hCD86-lg).

EJEMPLO 3 Creación de un vector de proteína de fusión de Fe de lgG2.

Se creó un vector de expresión de proteína de fusión lgG2-Fc plasmídico para producir una proteína de fusión con un polipéptido DEC de CTLA-4 de la invención y un polipéptido de Fe de lgG2 humana. Se generó el ADN que codifica el polipéptido de Fe de lgG2 humana mediante amplificación por PCR del ADNc de leucocitos humanos (BD Biosciences, Cat. #HL4050AH) utilizando el cebador directo (5'-aagctgtcaccggtggatcgatcccgaaccctgccctgattctgatgagcgcaaatgttgtgtcgagtgccca ccgt-3') (SEQ ID NO: 189) y el cebador inverso (5'-cagaattcattatttacccggagacagggagaggctcttctg-3') (SEQ ID NO: 190). Los cebadores se diseñaron, crearon y ensamblaron utilizando mecanismos convencionales muy conocidos por los entendidos en la técnica e incluyen los códigos de iniciación, los códigos de parada y los sitios de restricción necesarios. Los procedimientos de amplificación por PCR que se utilizan también son muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Berger, Ausubel y Sambrook, todos mencionados anteriormente. Se utilizaron 50-100 ng de ADNc como plantilla en una reacción de PCR de 100 pl con cebadores directos e inversos 1 µ?, tampón de Taq (Stratagene; #200435) y dNTP 200 µ? para 25 ciclos de amplificación (94°C, 30 seg.; 55°C, 30 seg.; 72°C, 60 seg.). Se purificó el producto de PCR utilizando columnas de centrifugado de PCR QiaQuick (Qiagen #28106) según las condiciones recomendadas por el fabricante y fue digerido con enzimas de restricción Agel yEcoRI. Se separó el fragmento de digestión de PCR mediante electroforesis en gei de agarosa y se purificó con el kit de extracción en gel de Qiaquick (Qiagen, #28704) según las condiciones recomendadas por el fabricante. Una versión modificada del vector pCDNA3.1-LEA (descrito anteriormente), que contiene un sitio de restricción Agel en la secuencia de señal de CTLA-4 (que se introduce como mutación silenciosa), puede ser digerida con Agel y EcoRI, y ligarse al fragmento mencionado anteriormente. Se transformó la ligadura en células de E. coli One-shot TOP10 (Invitrogen Cat. #C4040-03) en las condiciones recomendadas por el fabricante. Se incubaron las células transformadas en LB (medio de caldo Luria) que contiene carbenicilina 50 pg/ml a 250 rpm durante la noche a 37°C y luego se utilizaron para preparar una reserva de maxiprep (Qiagen; #12362) de ADN plasmídico, en las condiciones recomendadas por el fabricante. El vector plasmidicofcde expresión resultante se denomina vector de expresión de proteína de fusión de Fe de pCDNA lgG2. Este vector es idéntico al vector plasmídico de CTLA-4-lgG2 muíante de pCDNA que se muestra en la figura 1 , excepto que se extrae la secuencia del ácido nucleico que codifica el polipéptido de DEC de CTLA-4 muíante. La secuencia del ácido nucleico que codifica el péptido señal en el vector de fusión de Fe de pCDNA lgG2 (que en la figura 1 puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal adecuado) es un ácido nucleico que codifica el péptido señal de CTLA-4 humano (SEC. ID. N°:181 o SEC. ID. N°:215). Este vector de fusión de Fe de lgG2 no incluye ningún ácido nucleico que codifique un polipéptido de DEC de CTLA-4 mutante de la invención o cualquier otro polipéptido de DEC de CTLA-4.

Clonación de secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de CTLA-4 mutantes en el vector de fusión de Fe de lgG2. Para producir polipéptidos de CTLA-4 mutantes como proteínas de fusión de Fe solubles, se clonaron secuencias de ADN que codifican polipéptidos de DEC de CTLA-4 mutantes que se detectó que presentan una avidez de unión mejorada a CD80 humano y/o CD86 humano (en comparación con la avidez de unión de CTLA-4-DEC humano a CD80 y/o CD86 humano) a partir del tamizaje de genotecas en fago en el vector de proteína de fusión de Fe de lgG2 que se describió anteriormente utilizando, por ejemplo, el procedimiento que aparece a continuación. Se recuperaron primero las secuencias de ADN que codifican polipéptidos de DEC de CTLA-4 mutantes que muestran una mayor avidez de unión a hCD80-lg y/o hCD86-lg del vector de expresión en fago mediante amplificación por PC utilizando cebadores directos e inversos diseñados a partir de la homología de secuencias a varios residuos de nucleótidos (por ejemplo, de 30 a 60 nucleótidos) en los extremos amino y carboxilo terminales de los polipéptidos de DEC de CTLA-4 mutantes y procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, los procedimientos descritos en Berger, Ausubel y Sambrook, todos mencionados anteriormente. Por ejemplo, en un aspecto ejemplar, se recuperaron secuencias de ADN que codifican polipéptidos de DEC de CTLA-4 mutantes del vector de expresión en fago mediante amplificación por PCR utilizando el cebador directo (5'- ggaataccggttttttgtaaagccatgcacgtcgctcaaccagccgtcgtactc-3') (SEC. ID. N°:191) y el cebador inverso (5 -ggcactcagatctacgtcatcgatcccgaa-3') (SEC. ID. N°:192). Se utilizaron 10 nanogramos (ng) de ADN plasmídico (vector de expresión en fago que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el DEC de CTLA-4 muíante) como plantilla en una reacción de PCR de 100 pl con cebadores directos e inversos 1 µ? que se describieron anteriormente, tampón de Taq (Stratagene; #200435) y dNTP 200 µ? para 25 ciclos de amplificación (94°C, 30 seg.; 55°C, 30 seg.; 72°C, 60 seg.). Se purificó el producto de PCR utilizando columnas de centrifugado de PCR QiaQuick (Qiagen #28106) en las condiciones recomendadas por el fabricante y este fue digerido con enzimas de restricción Agel y Clal. Los fragmentos se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, se purificaron utilizando el kit de extracción en gel de Qiaquick "Qiaquick Gel Extraction Kit" (Qiagen, #28704) en las condiciones recomendadas por el fabricante y se ligaron en el vector de fusión de Fe de lgG2 plasmídico digerido en forma similar. Se transformó la ligadura en células de E. coli One-shot TOP10 (Invitrogen Cat. #C4040-03) según las condiciones recomendadas por el fabricante. Se incubaron las células transformadas en LB (medio de caldo Luria) que contenía carbenicilina 50 pg/ml a 250 rpm durante la noche a 37°C y luego se utilizaron para preparar una reserva de maxiprep (Qiagen; #12362) de ADN plasmidico en las condiciones recomendadas por el fabricante. El vector plasmidico de expresión resultante, que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión CTLA-4-lgG2 muíante de la invención, se denomina vector de expresión plasmidico de Fe de lgG2 de DEC de CTLA-4 mutante de pCDNA. En la figura 1 se muestra un diagrama esquemático de este vector. Este vector incluye un promotor Bla; gen resistente a la ampicilina; origen pUC; secuencia de señal de poliadenilación (poli A) de SV40; origen f1 ; promotor SV40; gen resistente a la neomicina; promotor de CMV para facilitar la expresión de una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante de la invención (que contiene, por ejemplo, el péptido señal de CTLA-4 humano, el polipéptido de DEC de CTLA-4 mutante y el polipéptido de Fe de lgG2 humana); una secuencia del ácido nucleico que codifica un péptido señal de CTLA-4 humano (SEC. ID. N°: 181 o SEC. ID. N°:215); una secuencia del ácido nucleico que codifica un polipéptido de DEC de CTLA-4 mutante de la invención (incluido, entre otros, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica alguno de la SEQ ID NO:80 a 152); una secuencia del ácido nucleico ejemplar que codifica un polipéptido de Fe de lgG2 se muestra en la SEC. ID. N°:183 o SEC. ID. N°:217; y una secuencia de señal de terminación poli A de la hormona de crecimiento bovino (bGH). La secuencia del ácido nucleico de la SEQ ID NO:183 codifica el polipéptido de Fe de hlgG2 con el residuo de lisina (K) de la extremo carboxilo terminal (SEC. ID. N°:184)¡ la secuencia del ácido nucleico de la SEQ ID NO:217 codifica el polipéptido de Fe de hlgG2 sin el residuo de lisina en la extremo carboxilo terminal (SEQ ID NO:218). El vector de proteína de fusión de Fe de lgG2 plasmídico también puede utilizarse para producir una proteína de fusión CTLA-4-lgG2 humana ("hCTLA-4-lg"). En este caso, se clonó en el vector plasmídico de la proteína de fusión de Fe de lgG2 una secuencia del ácido nucleico que codifica el DEC de CTLA-4 humano (por ejemplo, SEQ ID NO:193) a través de procedimientos de clonación convencionales, similares a los descritos anteriormente, en el lugar de la secuencia de nucleótidos que codifica al DEC de CTLA-4 mutante. La proteína de fusión hCTLA-4-lg existe típicamente en solución como una proteína de fusión dimérica que comprende dos proteínas de fusión hCTLA-4-lg maduras monoméricas idénticas. En este caso, cada proteína de fusión hCTLA-4-lg madura monomérica comprende un DEC de CTLA-4 humano (SEQ ID NO: 159) fusionado en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal de un Fe de lgG2 humana (SEQ ID NO:218 o SEQ ID NO: 184). Los dos monómeros de hCTLA-4-lg se encuentran unidos por un enlace covalente con enlaces disulfuro formados entre residuos de cisteína en cada monómero, formando de ese modo el dímero de la proteina de fusión hCTLA-4-lg. El dímero de la proteína de fusión hCTLA-4-lg maduro es la forma de la proteína de fusión que se utiliza en los ensayos descritos en estos ejemplos, salvo que se establezca específicamente lo contrario. A nivel experimental, se descubrió que una proteína de fusión CTLA-4-lg humana o una proteína de fusión CTLA-4-lg muíante preparada en células CHO mediante transfeccion de un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión hCTLA-4-lg o CTLA-4-lg muíante y el polipéptido de Fe de hlgG2 que se muesíra en la SEC. ID. N°:184 suele no incluir el residuo de lisina (K) del exíremo carboxilo íerminal íeórico, según lo determinado por análisis de LCMS; en consecuencia, la secuencia del polipépíido de Fe de hlgG2 de hCTLA-4-lgG2 o CTLA-4-lgG2 muíante es la que se muestra en la SEQ ID NO:218, secuencia de polipéptídos de Fe de hlgG2 que fípicamenle no incluye el residuo de lisina en el exíremo carboxilo terminal, en comparación con la secuencia de polipépíidos que se muesíra en la SEQ ID NO: 184.

Transfeccion íransiíoria de células COS. Se culíivaron células COS-7 hasla alcanzar un 80-90% de confluencia en malraces T-175 que coníenían 40 mi de medio de cultivo (medio DMEM/F12 (Invitrogen, Cat. #10565-018) complementado con SFB al 10% (Hyclone Cat. #SV30014.03) y 1x de PSG (penicilina, estrepíomicina y gluíamina) (Inviírogen, Caí. #10378-016)). Inmediatamente antes de la íransfección de las células con un vector de expresión plasmídico, se exírajo el medio y en susíiíución se colocaron 35 mi de medio de expresión (medio OptiMem (Gibco #51985) que contenía 1x de PSG). Se mezcló ADN plasmídico (10 pg) (por ejemplo, un vector de expresión de Fe de lgG2 de DEC de CTLA-4 muíante de pCDNA que codifica una proteína de fusión CTLA-4-lgG2 mutaníe de la invención) con reactivo de transfección FuGENE6 (Roche #11 815 075 001) en una proporción de volumen 1:3 y se lo añadió a 1 mi de medio de cultivo. Luego se añadió lentamente esta mezcla al malraz T-175 y se agitó suavemente a los efectos de su mezcla. Después de incubación a 37°C durante 3 días, se cosechó el medio, se añadió medio de expresión adicional y se incubaron los cultivos durante 3 días más. Se puede emplear un procedimiento similar para preparar células COS-7 transfectadas con un vector plasmídico similar que codifica la CTLA-4-lgG2 humana o un vector plasmídico pCDNA3.1-LEA que codifica LEA29Y-lg.

Purificación de proteínas. Se aclararon los sobrenadantes de los cultivos de transfección (por ejemplo, los que contenían células transfectadas con un vector de Fe de lgG2 de DEC de CTLA-4 mutante de pCDNA que codifica la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante) mediante centrifugación a 1000x g durante 10 minutos a temperatura ambiente y filtración a través de membranas de 0.2 pm (Nalgene, VWR #73520-982). Se purificaron las proteínas mediante cromatografía de afinidad de proteína A utilizando un sistema de HPLC AKTA Explorer (GE Healthcare). Se unió una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante a columnas FF de proteína A Hitrap (GE Healthcare, #17-5079-01) en tampón de PBS, se lavó con el mismo tampón, se eluyó con tampón de ácido cítrico 100 mM (pH 4.0) y luego se neutralizó mediante el agregado de base Tris 2M en un volumen de 1/10. Por último, se cambió el tampón de la solución de proteínas por PBS mediante diálisis utilizando membranas MWCO 10 «Da (Pierce, Cat. #PI66810). Se puede utilizar un procedimiento similar para purificar las proteínas de fusión CTLA-4-lgG2 humana o LEA29Y-lg.

Evaluación de la calidad de las proteínas- Análisis de SDS/PAGE. Se midió el peso molecular aparente de una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante purificada de la invención mediante análisis de SDS/PAGE en condiciones no reductoras. En condiciones no reductoras, una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante de la invención existe típicamente como proteína de fusión dimérica que contiene dos proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes monoméricas. En un aspecto, el dímero es un homodímero que contiene dos monómeros de proteina de fusión CTLA-4-lg mutante idénticos. En un aspecto, cada monómero de la proteína de fusión CTLA-4-lg contiene un DEC de CTLA-4 mutante maduro o segregado fusionado en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal de un polipéptido de Fe de lgG2 humana. Los dos monómeros de CTLA-4-lg mutantes se encuentran unidos por un enlace covalente con enlaces disulfuro formados entre residuos de cisteína en cada monómero. El homodímero es la forma de la molécula de proteína de fusión mutante de la invención descrita típicamente en estos ejemplos, salvo que se establezca específicamente lo contrario Los datos que se muestran en estos ejemplos se refieren a los homodímeros de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante, salvo que se establezca específicamente lo contrario. Los análisis de SDS/PAGE se realizaron de la siguiente manera: Se añadieron 2 pg de proteína purificada a 20 µ? de tampón de muestra LDS (Invitrogen #NP0007) y se corrieron a través de geles NuPAGE 4-12% Bís-Tris (Invitrogen #NP0321 BOX) en 1x de tampón de corrida MES dodecil sulfato de sodio (SDS)/PAGE (Invitrogen #NP0002) en las condiciones recomendadas por el fabricante. Los geles se tiñeron mediante incubación en 50 mi de SimpIyBlue SafeStain (Invitrogen #LC6060) durante 1 hora con agitación suave a temperatura ambiente. Los geles se decoloraron mediante dos incubaciones con 200 mi de agua durante 1 hora con agitación suave a temperatura ambiente y se procesaron en tampón de secado (Bio RAD 161-0752) en las condiciones recomendadas por el fabricante. En la figura 3, se presenta un gel de SDS/PAGE representativo de dos homodímeros de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante ejemplar de la invención (se denominan clones D3 y D4) y la proteína de fusión Orencia®, que funciona como un control de comparación. El dímero de la proteína de fusión D3-lg contiene dos monómeros de la proteína de fusión D3-lg idénticos que se encuentran unidos por un enlace covalente con enlaces disulfuro formados entre residuos de cisteína de cada monómero de D3-lg. Cada monómero de D3-lg contiene un polipéptido de DEC de CTLA-4 muíante (llamado "D3") que contiene la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEQ ID NO:61 fusionada directamente (es decir, sin residuo(s) de aminoácido "conector") en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal del polipéptido de Fe de hlgG2 que se muestra en la SEC. ID. N°:218. De modo similar, el dímero de la proteína de fusión D4-lg contiene dos monómeros de D4-lg idénticos que se encuentran unidos por un enlace covalente con enlaces disulfuro formados entre residuos de cisteína de cada monómero de D3-lg. Cada proteína de fusión D4-lgG2 monomérica contiene un polipéptido de DEC de CTLA-4 muíante (llamado "D4") que contiene la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEC. ID. N°:62 fusionada directamente (es decir, sin residuo(s) de aminoácido "conector") en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal de la secuencia de polipéptidos de Fe de hlgG2 que se muestra en la SEQ ID NO:218. Como se explicó anteriormente, a nivel experimental, descubrimos que una proteína de fusión CTLA-4-lg muíante preparada en células CHO uíilizando un vecíor que coníiene una secuencia de nucleólidos que codifica el polipépíido de Fe de hlgG2 íeórico que se muesíra en la SEC. ID. N°:184 lípicamenle no incluye el residuo de lisina (K) en el exíremo carboxilo íerminal íeórico, según se deíermina medianíe el análisis LCMS; en consecuencia, la secuencia del polipépíido de Fe de hlgG2 de una CTLA-4-lgG2 muíaníe que se describe en la preseníe es la que se muesíra en la SEQ ID NO:218, secuencia de polipéptidos de Fe de hlgG2 que típicamente no incluye el residuo de lisina en el extremo carboxilo terminal, en comparación con la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEC. ID. N°:184. Se realizaron análisis de SDS/PAGE en todas las preparaciones de proteínas para verificar la calidad de las proteínas en términos de su peso molecular aparente, la concentración de la proteína y la pureza. Los resultados de los análisis de SDS/PAGE fueron similares para todas las preparaciones de proteínas. Por ejemplo, los resultados del gel ejemplar que se muestra en la figura 3, los dímeros de la proteína de fusión D3-lgG2 y D4-lgG2 purificada tienen un peso molecular aparente de 80 kDa aproximadamente, que coincide con el peso molecular teórico de la estructura de la proteína de fusión CTLA-4-lgG2 muíante homodimérica ejemplar que se presenta en la figura 10 (peso molecular teórico = 78-79 kDa). (Los monómeros de la proteína CTLA-4-lgG2 muíante purificada tienen generalmente pesos moleculares aparentes de 39-40 kDa.) Las bandas de proteínas del gel que se muestra en la figura 3 se tiñeron con intensidades equivalentes; esto confirma la precisión de la medición de la concentración de proteínas para muestras diferentes. En cuanto a la pureza de las proteínas, se puede observar una banda de peso molecular menor en la figura 3 a un peso molecular aparente de 44 kDa aproximadameníe, lo que coincide con el peso molecular teórico de una proteína de fusión lgG2 monomérica. La intensidad relativa de esta banda de peso molecular menor es coherentemente baja y se estima que sea menor al 5% de la proteína total.

Se pueden utilizar análisis de SDS/PAGE análogos para evaluar la pureza de las proteínas de fusión CTI_A-4-lgG2 humanas o LEA29Y-lg producidas utilizando métodos similares a los descritos anteriormente.

Análisis de endotoxinas. Se midieron los niveles de endotoxina de las proteínas de fusión CTLA-4 mutantes utilizando un kit de ensayo QCL-1000 para pruebas de lisado de amebocitos de limulus (Cambrex #50-648U) en las condiciones recomendadas por el fabricante. El nivel máximo de endotoxinas para las proteínas que se utilizan en ensayos basados en células se fijó en 10 unidades de endotoxina (EU)/mg de proteina. Se pueden utilizar análisis análogos para medir los niveles de endotoxinas de las preparaciones de las proteínas CTLA-4-lgG2 o LEA29Y-lg humanas.

Análisis de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Se midieron los niveles de agregado de proteínas (incluidos los niveles de agregado de polipéptidos de CTLA-4 mutantes y polipéptidos de control) mediante cromatografía de exclusión por tamaño utilizando un sistema Dionex BioLC (Dionex). La proteína (5 \ig) se corrió a través de una columna Tosoh G3000Wxl (Tosoh Bioscience) en tampón de corrida PBS utilizando una corrida ¡socrática de 20 minutos y detección por absorbancia (A) a 214 nanómetros (nm). El nivel máximo de agregado para la proteína utilizada en otros ensayos se estableció en 10%. Se realizó el análisis de SEC en todas las preparaciones de proteínas para verificar la calidad de la proteína en cuanto a los niveles de agregado de proteína. Los resultados fueron similares para todas las preparaciones de proteínas y en la figura 4 se muestra un perfil de elución representativo de un análisis de SEC de un dímero de la proteína de fusión CTLA-4-lg muíante (D3-lg). En el eje y se muestran las unidades de miliabsorbancia (mAU) y en el eje x se muestra el tiempo de elución en minutos. La estructura del dímero D3-lg se explicó anteriormente en la sección "Análisis de SDS/PAGE". Este dímero de CTLA-4-lg mutante purificado es mayoritariamente homogéneo en su tamaño y no contiene niveles altos de especies agregadas. Se analizaron en forma similar otras proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención y mostraron resultados parecidos (los datos no se muestran). Se descubrió que las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes purificadas de la invención eran homogéneas en cuanto a su tamaño y no contenían niveles altos (>10%) de proteínas agregadas. Resulta importante verificar los estados de agregado de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes purificadas de la invención porque es posible que las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes con agregados altos se unan a moléculas con mayor avidez de unión al CD80 humano y/o CD86 humano y, de este modo, es posible que muestren una mayor actividad biológica.

EJEMPLO 4 Medición de avidez de unión de proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes a proteínas de fusión CD80 humano-lg murinas (hCD80-mlg) y CD86 humano-lg murinas (hCD86-mlg) utilizando resonancia de plasmón superficial (RPS) (análisis Biacore™).

El presente ejemplo describe un procedimiento para evaluar proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes en cuanto a una mejora en la avidez de unión a ligandos de hCD80-mlg y/o hCD86-mlg a través de un análisis de interacción Biacore. En la nomenclatura que se utiliza para describir este tipo de análisis, se denomina "ligando" al asociado de unión inmovilizado y "analito" al asociado de unión en la fase móvil. Las proteínas de fusión que contienen un dominio Ig típicamente forman estructuras diméricas en solución debido a la fuerte asociación que se produce entre dos dominios Ig. A menos que se indique lo contrario, se espera que estas conformaciones diméricas existan para las proteínas de fusión que se describen en el presente ejemplo (es decir, CTLA-4-lg muíante, proteína de fusión Orencia®, LEA29Y-lg, hCD80-mlg y hCD86-mlg). El término "avidez" suele relacionarse con la fuerza de unión entre los analitos diméricos (por ejemplo, proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes) y los ligandos diméricos (por ejemplo, proteínas de fusión hCD80-mlg o hCD86-mlg). Los aumentos en la avidez de unión que se describen para las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes son consecuencia de los aumentos en la afinidad de unión entre cada dominio de DEC de CTLA- 4 y su ligando correspondiente. La fuerza de la avidez de unión suele describirse en términos de la constante de equilibrio de disociación (KD), que describe la concentración molar del analito a la que el 50% del ligando disponible se encuentra unido en equilibrio. En el presente método de tamizaje, se derivaron chips del sensor Biacore con ligandos de hCD80-mlg o hCD86-mlg y se dejó que fluyeran proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes en tampón sobre los chips del sensor recubiertos con ligandos. Se evaluó la capacidad de unión de una molécula de proteína de fusión CTLA-4-lg mutante a un asociado de unión específica (es decir, hCD80-mlg o hCD86-mlg). También se dejó que fluyeran proteínas de fusión de control (es decir, proteina de fusión CTLA-4-lgG2 humana, proteína de fusión Orencia® y proteína de fusión LEA29Y-lg mutante) sobre los chips del sensor recubiertos con ligandos y, de igual modo, se evaluó la capacidad de unión de estas moléculas a hCD80-mlg o hCD86-mlg con fines comparativos. Utilizando el sistema Biacore, se puede evaluar la constante de velocidad de asociación (kon) y disociación (k0ff) de una proteina de interés unida a ligandos de hCD80-mlg o hCD86-mlg y utilizarlas para calcular la constante de equilibrio de disociación, KQ. La proteína de fusión CTLA-4-lgG2 humana, que contiene el polipéptido DEC de CTLA-4 humano natural fusionado al polipéptido lgG2 humano, puede funcionar como "control" de CTLA-4-lg humana natural. Además, o alternativamente, como la proteína de fusión Orencia® está compuesta por el polipéptido DEC de CTLA-4 humano natural fusionado a un polipéptido de Fe de lgG1 modificado, también funciona efectivamente como control de CTLA-4-lg humano natural para fines comparativos. Se identificó que las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes presentaban mayor avidez de unión a hCD80-mlg y/o hCD86-mlg, en comparación con la CTLA-4-lgG2 humana, la proteína de fusión Orencia® y/o LEA29Y-lg. Como se explica más detalladamente a continuación, la avidez de unión mejorada de una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante de la invención a hCD80-mlg y/o hCD86-mlg en comparación con la avidez de unión de la proteína de fusión Orencia® (es decir, hCTLA-4-lgG1) y/o LEA29Y-lg a hCD80-mlg y/o hCD86-mlg no se debió a diferencias entre la lgG2 presente en las moléculas CTLA-4-lg mutantes y en la lgG1 mutante presente en la moléculas Orencia® o LEA29Y-lg. Todos los análisis Biacore™ se realizaron en un sistema Bíacore™ 2000 (GE Healthcare) a temperatura ambiente (temperatura ambiente, 25°C). Para todos los experimentos, se utilizó como tampón de flujo HBS-EP (HEPES 10 mM (pH 7.4); NaCI 150 mM; EDTA 3 mM; 0.005% de agente tensoactivo P20).

Ensayo cinético estándar. El ensayo cinético estándar mide la cinética de unión de los ligandos diméricos (por ejemplo, la proteína de fusión hCD80-mlg o la proteína de fusión hCD86-mlg) que se encuentran recubriendo chips del sensor y analitos diméricos (por ejemplo, proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención) en fase móvil. Se inmovilizó anticuerpo IgG de conejo anti-ratón (GE Healthcare, #BR-1005-14) sobre chips del sensor CM5 (GE Healthcare, #BR-1000-14) de conformidad con el protocolo del fabricante. Se diluyó anticuerpo hasta 30 pg/ml en tampón de inmovilización (acetato de sodio 10 mM; pH 5.0 (BR-1003-51)). A una magnitud de flujo de 5 µ?/minuto, se activó el chip del sensor CM5 con una inyección de 35 µ? de una mezcla de hidrocloruro de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) (preparado mediante una mezcla de volúmenes iguales de EDC 11.5 mg/ml y NHS 75 mg/ml) (GE Healthcare, #BR-1000-50), seguido de una inyección de 35 µ? de anticuerpo no diluido. Los sitios sin reacción se desactivaron con 35 µ? de etanolamina-HCL 1M, pH 8.5 (GE Healthcare, #BR-1000-50). Este procedimiento por lo general produjo 15.000 unidades de respuesta (RU) de anticuerpos acoplados. Los ligandos de CTLA-4, CD80 humano-lg murino (hCD80-mlg) (Ancell, #510-820) o CD86 humano-Ig murino (hCD86-mlg) (Ancell, #509-820) se unieron a los chips del sensor recubiertos con anticuerpos mediante inyección de 10 µ? ó 16 µ?, respectivamente, de solución de ligandos (proteína 2 pg/ml en tampón HBS-EP [HEPES 10 mM; pH 7.4; NaCI 150 mM; EDTA 3 mM; 0.005% (v/v) de agente tensoactivo P-20, GE Healthcare, #BR-1001-88]) a una magnitud de flujo de 10 µ?/minuto. Los niveles de captura de ligandos fueron generalmente 135-170 RU. Se diluyeron proteínas CTLA-4-lg mutantes en tampón HBS-EP y se hicieron fluir sobre los chips del sensor recubiertos con ligandos durante 2 minutos a 30 µ?/minuto, luego se realizó incubación durante 5 minutos con tampón HBS-EP sin proteínas, a la misma magnitud de flujo. Como las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes presentan velocidades de disociación de hCD86-mlg muy bajas, también se realizaron ensayos cinéticos utilizando períodos de disociación más prolongados (por ejemplo, 20 minutos). Los niveles de señales Rmáx. para las proteínas CTLA-4-lg mutantes se ubicaron en el intervalo de 70-100 RU aproximadamente. La regeneración entre los ciclos se realizó mediante incubación con tampón de glicina 10 mM (pH 1.7) a 50 µ?/minuto durante 3 minutos. Se sometieron chips nuevos a 4-5 ciclos de captura/unión/regeneración antes de ser utilizados en los experimentos reales. Se sustrajeron datos de una célula de referencia que contenía sólo anticuerpos de captura IgG de conejo anti-ratón a partir de datos que se obtuvieron de células de flujo que contenían hCD80-mlg o hCD86-mlg capturado. Generalmente, se analizaron 8 diluciones de proteínas CTLA-4-lg mutantes de entre 500 nM y 0.2 nM con respecto a una referencia en blanco (tampón HBS-EP solo). En la figura 5 se muestran trazos del sensograma de un análisis Biacore típico. Esta figura muestra la respuesta (RU) con respecto al tiempo (en segundos) que genera la unión de las tres proteínas de fusión que figuran a continuación a la proteína de fusión hCD86-mlg: (1 ) proteína de fusión Orencia® (que funciona como control y con fines comparativos) (Bristol-Myers Squibb Co.; véase, por ejemplo, Larson CP. et al, Am. J. Trans. 5:443-453 (2005)); (2) la proteína de fusión LEA29Y-lg (con fines comparativos); y (3) una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante ejemplar de la invención que se denomina "clon de D3" (llamada también D3-lgG2). La proteína de fusión D3- lgG2 contiene dos proteínas de fusión monoméricas idénticas que se encuentran unidas por un enlace covalente con uno o más enlaces disulfuro formados entre residuos de cisteína en cada monómero. Véase el planteamiento que aparece en la sección "Análisis de SDS/PAGE". Cada proteína de fusión monomérica contiene un polipéptido de DEC de CTLA-4 mutante maduro que se muestra en la SEQ ID NO: 159 covalentemente fusionado en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal del polipéptido de lgG2 humana que se muestra en la SEQ ID NO: 184 ó 218. Otras proteínas de fusión diméricas de la invención pueden comprender estructuras similares a las de la proteína de fusión D3-lgG2 dimérica- excepto que se sustituye el polipéptido de DEC de CTLA-4 mutante D3 de cada proteína de fusión monomérica por un polipéptido de DEC de CTLA-4 mutante diferente. La fase de asociación refleja la unión entre el analito de interés y el ligando de interés. En la figura 5, la fase de asociación para cada analito se representa en la curva en momentos previos al momento que indica la flecha y se caracteriza por la unión del analito (D3-lgG2, proteína de fusión Orencia® o LEA29Y-lg) al ligando de hCD86-mlg. En la curva se refleja la velocidad en la que un analito se asocia con el ligando de hCD86-mlg- véase, por ejemplo, la alta velocidad de aumento en las unidades de respuesta a partir de los 510 segundos aproximadamente. La fase de disociación del análisis comienza en el momento que indica la flecha en la figura 5. Durante la fase de disociación, se disocian el analito y el ligando de la conformación unida. En la figura 5, se representa la velocidad a la que un analito se disocia del ligando de hCD86-mlg mediante la disminución de unidades de respuesta (velocidad de disminución de las unidades de respuesta con respecto al tiempo). A partir de estos datos, se pueden determinar las constantes de velocidad de disociación (velocidades "off ', k0ff o kd) y las constantes de velocidad de asociación (velocidades "on", kon o ka) relativas. Se puede describir la avidez total de la interacción a través de la KD, (k0ff)/ (kon). Los aumentos en la avidez de unión suelen manifestarse en velocidades de disociación más bajas. Si existe una velocidad de disociación más baja y a la vez una velocidad de asociación igual, mayor o ligeramente menor, de modo que la constante de equilibrio de disociación KD sea más baja, la avidez será mayor En este caso, una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante con avidez de unión al ligando de hCD86-mlg mayor que la avidez de unión de la proteína de fusión Orencia® al mismo ligando también tendrá una velocidad de disociación más baja del ligando que la proteína Orencia®. Una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante con mayor avidez de unión al ligando de hCD86-mlg que la avidez de unión de LEA29Y-lg al mismo ligando, también tendrá una velocidad de disociación más baja del ligando que la LEA29Y-lg. En la figura 5 se muestra que la velocidad de disociación de LEA29Y-lg del ligando de hCD86-mlg es bastante menor que la velocidad de disociación de la proteína Orencia® del mismo ligando. LEA29Y-lg también tiene una velocidad de asociación para la unión con hCD86-mlg similar a la que se observa para la proteína de fusión Orencia®. En consecuencia, LEA29Y-lg tiene mayor avidez para hCD86-mlg que la proteína Orencia®. Este hallazgo coincide con estudios anteriores que describían que LEA29Y-lg tenía mayor avidez de unión al ligando de hCD86-mlg que la proteina de fusión Orencia® (Larson CP. et al, Am. J. Trans. 5:443-453 (2005)). En la figura 5 también se muestra que la proteína de fusión D3-lgG2 mutante de la invención tiene menor velocidad de disociación del ligando de hCD86-mlg que la de la proteína de fusión Orencia® y la de la proteína de fusión LEA29Y-lg. La proteína de fusión D3-lgG2 también tiene una velocidad de asociación similar (pero algo más rápida) para la unión con el ligando de hCD86-mlg en comparación con las velocidades de asociación tanto de la proteína de fusión Orencia® como de la proteína de fusión LEA29Y-lg al ligando de hCD86-mlg. En consecuencia, la proteína de fusión D3-lgG2 presenta una mayor avidez de unión al ligando de hCD86-mlg que la proteína de fusión Orencia® y la proteína de fusión LEA29Y-lg. Por lo tanto, se espera que la proteína de fusión D3-lgG2 se una a CD86 nativos, incluido, por ejemplo, el CD86 que se expresa in vivo en CPA en mamíferos, como por ejemplo humanos, con una mayor avidez de unión. Esta opinión además está respaldada por los ensayos funcionales basados en células que se discuten en los ejemplos que figuran a continuación. Se realizaron análisis Biacore utilizando otras proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención. Además, se realizaron análisis Biacore utilizando chips del sensor recubiertos con hCD80-mlg y proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención. Se determinó la velocidad de disociación y la avidez de unión de estas moléculas mutantes y se las comparó con la velocidad de disociación y la avidez de unión de las proteínas de fusión Orencia® y LEA29Y-lg. En los cuadros 3 y 4 'se muestran los resultados representativos y se explican más detalladamente a continuación.

Análisis de datos de Biacore convencionales. Después de la eliminación de las porciones de regeneración y captura de los sensogramas, las curvas se calibraron en cero en un promedio de 5 s de todas las curvas 10 s antes de la inyección de la muestra aproximadamente. Se sustrajo una curva en blanco de cada curva de prueba. Los datos se analizaron mediante software BIAevaluation (v4.1 , comercializado por GE Healthcare) utilizando la función "Fit kinetics, Simultaneous ka/kd". Se definió el tiempo de inicio de inyección como un tiempo previo a la fase de asociación donde todas las curvas se encontraban cercanas a cero. La selección de datos para la fase de asociación comenzó aproximadamente 10 s después del momento de inicio de la inyección y finalizó aproximadamente 10 s antes del momento de interrupción de la inyección. Se definió el tiempo de interrupción de la inyección como un momento anterior a la aparición de algún pico de señal asociado a la fase de disociación. Se estableció el comienzo de la fase de disociación 10 s después del momento de interrupción de la inyección e incluyó 280-295 s de la fase de disociación de 5 minutos. El modelo de Langmuir 1 :1 describe la reacción A + B <=> AB. Este modelo representa la unión de un ligando único a una proteína de interés única (por ejemplo, un receptor). Se utilizó el modelo de Langmuir 1:1 del software BIAevaluation para determinar la constante de velocidad de asociación (ka) y la constante de velocidad de disociación (kd), y para calcular la constante de equilibrio de disociación, KD. KD = kd/ka. KD = ([A] [B])/[AB]. La constante de equilibrio de disociación, KD, es igual al inverso de la constante de equilibrio de asociación, KA. KD = 1/ KA. Las ecuaciones de velocidad para la reacción (analito A más ligando B que producen el complejo AB), en las que A = analito inyectado, B = ligando libre y t = tiempo, son: d[B]/dt = - (ka [A][B] -kd [AB]) y d[AB]/dt = ka[A][B] - kd[AB]. Si se sustituye R, unidades de respuesta (RU) de Biacore en un tiempo determinado, por [AB], Rmax-R por [B] y C (concentración de analitos) por [A], la expresión de velocidad neta en unidades Biacore es dR/dt = kaC(Rmax-R) - kdR, donde R a tO = 0, B[0] = Rmax y AB[0] = 0 RU, con la respuesta total = [AB] + Rl. La variación bruta (Rl) se fijó en cero, y Rmax, ka y kd se adaptaron globalmente para todas las curvas. Se realizaron los ensayos cinéticos estándar y los análisis de datos que se describieron anteriormente a las preparaciones de proteínas de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante de la invención, y a las proteínas de fusión LEA29Y-lg y Orencia®. En los cuadros 3 y 4 se resumen los datos de unión para las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes representativas de la invención. El cuadro 3 presenta la avidez de unión de proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes representativas a hCD86-mlg, según mediciones realizadas con el ensayo Biacore convencional descrito anteriormente. Específicamente, en el cuadro 3 se muestra el nombre de cada proteina de fusión CTLA-4lg mutante; el número de identificación de secuencia (SEC. ID. N°) que corresponde a la secuencia de polipéptidos de la proteína de fusión de DEC de CTLA-4 mutante monomérica; la constante de equilibrio de disociación (KD (Molar (M)) que se determina a partir de la avidez de unión de la proteína mutante a hCD86-mlg y la avidez de unión de cada CTLA-4-lg mutante a la hCD86-mlg con relación a la avidez de unión de la proteína de fusión Orencía® a hCD86-mlg. Esta avidez de unión relativa (que se muestra en la columna que se encuentra más a la derecha) se muestra como una avidez de unión una vez mayor de la proteína de fusión mutante a hCD86-mlg en comparación con la avidez de unión de la proteína de fusión Orencia® a hCD86-mlg. Cada una de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención que figuran en el cuadro 3 existen típicamente en solución como una proteína de fusión dimérica que comprende dos proteínas de fusión monoméricas idénticas, donde cada proteína monomérica comprende un polipéptido de DEC de CTLA-4 mutante (por ejemplo, los D1 , D1T, D2, D3, D4, etc. mencionados) fusionado directamente en extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal de un polipéptido de Fe de lgG2 que contiene la secuencia de la SEQ ID NO: 184 ó 218. Cada CTLA-4-lg mutante dimérica se puede obtener utilizando procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Como alternativa, se puede preparar cada dímero de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes diméricas utilizando los métodos presentados anteriormente en el ejemplo 3. En resumen, se puede clonar una secuencia del ácido nucleico que codifica un DEC de CTLA-4 mutante específico que se identifica en el cuadro 3 (por ejemplo, una secuencia del ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptidos de DEC de CTLA-4 mutantes que se identifican en el cuadro 3) en el vector de fusión de Fe de lgG2, se pueden transfectar células mamíferas con el vector y se puede expresar, purificar y evaluar la proteina de fusión resultante como se describió en el ejemplo 3. En la lista de secuencias que se incluye aquí, se presenta una secuencia del ácido nucleico ejemplar para cada DEC de CTLA-4 mutante. La proteína de fusión Orencia®, que contiene dos proteínas de fusión monoméricas, cada proteína de fusión monomérica comprende un DEC de CTLA-4 humano natural fusionado a un Fe de lgG1 modificado, funciona como referencia, o sea que la avidez de unión de hCD86-mlg se establece como 1. También, se muestran los valores de KD para la proteína de fusión LEA29Y-lg y para la proteína de fusión CTLA-4-lg humana. Además, también se muestra cuántas veces mayor es la avidez de unión de hCD86-mlg de LEA29Y-lg en comparación con la avidez de unión de hCD86-mlg de la proteína Orencia®. La avidez de unión de las proteínas de fusión CTLA-4-lgG2 y Orencia® a hCD86-mlg es aproximadamente equivalente, lo que confirma que las diferencias entre el polipéptido de la lgG2 humana presente en la CTLA-4-lgG2 humana y la lgG1 modificada presente en la proteína Orencia® contribuyen poco, o nada, con las respectivas afinidades de unión a hCD86- mlg de estas moléculas. Como se explica más detalladamente en el ejemplo 5 que aparece a continuación, se confirmó que las diferencias en las actividades funcionales inmunosupresoras entre polipéptidos de CTLA-4-lg mutantes de la invención y la proteína Orencia® (o LEA29Y-lg) no se pueden atribuir a las regiones de Fe de Ig respectivas que comprenden isotipos de IgG diferentes. Como se muestra en el cuadro 3, las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes representativas de la invención presentan la avidez de unión a hCD86-mlg que aparece a continuación: (1) una avidez de unión al menos similar o incluso mayor que la avidez de unión de CTLA-4-lgG2 humana ("hCTLA-4-lgG2") (que contiene dos proteínas de fusión monoméricas unidas por un enlace covalente, cada proteína monomérica comprende el polipéptido de DEC de CTLA-4 humano fusionado a un polipéptido de Fe de lgG2); (2) una avidez de unión al menos similar o incluso mayor que la avidez de unión de la proteína Orencia® al ligando hCD86-mlg; y/o (3) una avidez de unión al menos similar o incluso mayor que la avidez de unión de LEA29Y-lg al ligando hCD86-mlg. Para cada mutante de CTLA-4-lg, se indica cuántas veces mayor es la avidez de unión al ligando hCD86-mlg con relación a la avidez de unión de la proteina Orencia® a hCD86-mlg (4.a columna del cuadro 3). Se descubrió que la mayoría de las proteínas de fusión CTLA-4-Ig mutantes tienen velocidades de disociación de la proteína de fusión hCD86-mlg más bajas que la velocidad de disociación de la proteína de fusión Orencia® de hCD86-mlg (los datos no sé muestran). Se descubrió que varias de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes tienen una velocidad de asociación a hCD86-mlg más alta que la velocidad de asociación de la proteína de fusión Orencia® al mismo ligando (los datos no se muestran). Todas las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes que se muestran en el cuadro 3 presentaban constantes de equilibrio de disociación (KD) de hCD86-mlg más bajas que la constante de equilibrio de disociación de hCD86-mlg de la proteína de fusión CTLA-4-lgG2 humana o la proteína de fusión Orencia®. Además, la mayoría de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes que se muestran en el cuadro 3 tenían constantes de equilibrio de disociación de hCD86-mlg más bajas que la constante de equilibrio de hCD86-mlg de LEA29Y-lg. Todas las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes que se muestran en el cuadro 3 presentaban mayor avidez de unión a hCD86-mlg que la avidez de unión de la CTLA-4-lgG2 humana o la proteína de fusión Orencia® a hCD86-mlg (en la 4a columna del cuadro 3 se muestra la cantidad estimada de veces que la avidez de unión a hCD86-mlg supera a la proteína de fusión Orencia®). Además, muchas de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes que se muestran en el cuadro 3 tenían mayor avidez de unión a hCD86-mlg que la avidez de unión de LEA29Y-lg a hCD86-mlg (4a columna del cuadro 3). Es probable que una CTLA-4-lg muíante de la invención que tiene mayor avidez de unión al ligando de hCD86-mlg que la Orencia® o la proteína de fusión LEA29Y-lg tenga mayor potencia inmunosupresora in vivo en comparación con la hCTLA-4-lgG2, Orencia® o la proteína de fusión LEA29Y-lg, respectivamente, como por ejemplo, en procedimientos terapéuticos y/o profilácticos para suprimir una respuesta inmunitaria en un individuo (por ejemplo, en el tratamiento in vivo de enfermedades o trastornos del sistema inmunitario de mamíferos, como por ejemplo, seres humanos, en los que es conveniente la inmunoinhibición o la inmunosupresión), procedimientos para inhibir el rechazo del trasplante de tejidos u órganos de un donante por parte del receptor (por ejemplo, un mamífero, como por ejemplo, los seres humanos) y otros procedimientos que se describen en otra parte del presente documento.

CUADRO 3 *Nota: los números de identificación de secuencia (SEQ ID NO:) que se muestran en el cuadro 3 para las proteínas de fusión CTLA-4-lgG2 humana, Orencia® y LEA29Y-lg son los de las secuencias de polipéptidos de estas proteínas de fusión de Ig, respectivamente. La SEQ ID NO. que se muestra en el cuadro 3 para cada proteína de fusión CTLA-4-lg mutante identifica la secuencia de polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante identificada. Los datos se refieren a una CTLA-4-lg mutante que contiene un DEC de CTLA-4 mutante (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: de 1 a 48 y de 58 a 73) fusionado en su extremo amino terminal al extremo carboxilo terminal del polipéptido de Fe de lgG2 que se muestra en la SEQ ID NO:184 ó 218. Se conocen en la técnica los procedimientos para obtener estas proteínas de fusión y se describen en el presente documento. Sin embargo, como se indicó anteriormente, a nivel experimental, se descubrió que una CTLA-4-lg mutante, preparada en células CHO con un vector que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de Fe de hlgG2 teórico que se muestra en la SEQ ID NO: 184, típicamente no incluye el residuo de lisina (K) en el extremo carboxilo terminal teórico; en consecuencia, la secuencia del polipéptido de Fe de hlgG2 de una CTLA-4-lgG2 mutante es la que se muestra en la SEQ ID NO:218, secuencia de polipéptidos de Fe de hlgG2 que no incluye el residuo de lisina en el extremo carboxilo terminal, en comparación con la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO:184. En las SEQ ID NO: de 205 a 214, 219 y 221 se muestran secuencias de proteínas de fusión ejemplares que no incluyen el residuo de lisina en su extremo carboxilo terminal. El cuadro 4 presenta la avidez de unión de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes a hCD80-mlg, según lo medido con el ensayo Biacore convencional. Específicamente, en el cuadro 4 se muestra el nombre del clon de una p¿oteína de fusión CTLA-4-lg mutante; el número de identificación de secuencia (SEQ ID NO:) que corresponde a la secuencia de polipéptidos de la proteína de fusión de DEC de CTLA-4 mutante monomérica; la constante de equilibrio de disociación (KD (Molar (M)) para el ensayo de avidez de unión del ligando de hCD80-mlg; y la avidez de unión de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante al ligando de hCD80-mlg con relación a la avidez de unión de la proteína de fusión Orencia® al mismo ligando. Para cada proteína mutante, se muestra cuántas veces mayor es la avidez de unión al ligando de hCD80-mlg con relación a la avidez de unión de la proteína de fusión Orencia® al ligando de hCD80-mlg (4.a columna del cuadro 4). La proteína de fusión Orencia® funciona como referencia, o sea que la avidez de unión a hCD80-mlg se establece como 1. Las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes existen típicamente como proteínas de fusión diméricas en solución. Como se muestra en el cuadro 4, las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes diméricas de la invención presentan la avidez de unión al ligando de hCD80-mlg que aparece a continuación: (1) avidez de unión al menos similar o incluso mayor que la avidez de unión de CTLA-4-lgG2 humana; (2) avidez de unión al menos similar o incluso mayor que la avidez de unión de la proteína de fusión Orencia® al ligando de hCD80-mlg; y/o (3) avidez de unión al menos similar o incluso mayor que la avidez de unión de LEA29Y-lg al ligando de hCD80-mlg. Como se comentó anteriormente, se puede preparar cada dímero de CTLA-4-lg mutante dimérica utilizando los procedimientos presentados anteriormente en el ejemplo 3. Se descubrió que varias proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes tienen velocidades de disociación de la proteína de fusión hCD80-mlg similar o incluso mayor que la velocidad de disociación de la proteína de fusión Orencia® del mismo ligando (los datos no se muestran). Se descubrió que algunas proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes tienen una velocidad de asociación a hCD80-mlg similar o incluso mayor que la velocidad de asociación de la proteína de fusión Orencia® al mismo ligando (los datos no se muestran). Muchas proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes que se muestran en el cuadro 4 presentaban constantes de equilibrio de disociación (KD) de hCD80-mlg más bajas que la constante de equilibrio de disociación de hCD80-mlg de la proteína de fusión CTLA-4-lgG2 humana o la proteína de fusión Orencia®. Además, varias de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes que se muestran en el cuadro 4 tenían constantes de equilibrio de disociación de hCD80-mlg al menos similar a la constante de equilibrio de hCD80-mlg de LEA29Y-lg. Muchas de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes que se muestran en el cuadro 4 presentaban mayor avidez de unión a hCD80-mlg que la avidez de unión de la CTLA-4-lgG2 humana o la proteína de fusión Orencia® al mismo ligando (en la 4.a columna se muestra cuántas veces mayor es la avidez de unión de hCD80-mlg con relación a la proteína de fusión Orencia®). Además, varias de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes que se muestran en el cuadro 4 presentaban una avidez de unión a hCD80-mlg al menos similar a la avidez de unión de LEA29Y-lg al mismo ligando. Es probable que una CTLA-4-lg mutante de la invención que tiene mayor avidez de unión a hCD80-mlg que la hCTLA-4-lgG1 , Orencia® o la proteína de fusión LEA29Y-lg, tenga mayor potencia inmunosupresora in vivo en comparación con la hCTLA-4-lgG2, la Orencia® o la proteína de fusión LEA29Y-lg, respectivamente, como por ejemplo, en procedimientos terapéuticos y/o profilácticos para suprimir una respuesta inmunitaria en un individuo (por ejemplo, en el tratamiento in vivo de enfermedades o trastornos del sistema ¡nmunitario de mamíferos, como por ejemplo, los seres humanos, en los que es conveniente la inmunoinhibición o la inmunosupresión), procedimientos para inhibir el rechazo del trasplante de tejidos u órganos de un donante por parte del receptor (por ejemplo, por un mamífero, como por ejemplo, los seres humanos) y otros procedimientos que se describen en otra parte del presente documento.

CUADRO 4 SEC. ID. N.0:* Afinidad de unión de Proteina de (p. ej., de DEC hCD80-mlg (con relación al fusión (dimero) de CTLA-4 KDde hCD80-mlg dimero de la proteína de muíante) (M) fusión Orencia®) hCTLA-4-lgG2 162 6.55 x 10"1U 1.34x Dimero de la proteina de fusión 164 8.77 x 10"10 1 Orencia® LEA29Y-lg 166 4.39 x 10",u- 2.19 x 10" '? 2x-4x D1-lgG2 58 <4.39x 10"1U >2x D1T-lgG2 59 <4.39x10"lu >2x D2-lgG2 60 <4.39x 10"1U > 2x D3-lgG2 61 1.75 x 10'a- 4.39 x 10"IU 0.5x - 2x D4-lgG2 62 1.75 x 10 a -4.39 x 10"'u 0.5x - 2x D5-lgG2 63 1.75 x 10 a- 4.39 x 10"1U 0.5x - 2x D6-lgG2 64 1.75 x 10 a- 4.39 x 10" ,u 0.5x - 2x D20-lgG2 65 1.75 x 10 a -4.39 x 10"1U 0.5x - 2x D21-lgG2 66 1.75 x 10 a- 4.39 x 10"1U 0.5x - 2x D23-lgG2 67 <4.39 10"1U > 2x D24-lgG2 68 1.75 x 10 a -4.39 x 10" lu 0.5x - 2x D26-lgG2 69 1.75 x 10 a- 4.39 x 10'1U 0.5x - 2x D27-lgG2 70 1.75 x 10 a -4.39 x 10"1U 0.5x - 2x D28-lgG2 71 1.75 x 10 a -4.39 x 10"1U 0.5x-2x D29-lgG2 72 1.75 x 10 a -4.39 x 10"1U 0.5x - 2x D31-lgG2 73 1.75 x 10 a -4.39 x 10"u 0.5x - 2x D3-1-lgG2 1 1.75 x 10 a -4.39 x 10"1U 0.5x- 2x D3-2-lgG2 2 1.75 x 10a -4.39 x 10"'u 0.5x - 2x D3-3-lgG2 3 1.75 x 10"a-4.39x 10'1U 0.5x - 2x D3-4-lgG2 4 1.75 x 10 a -4.39 x 10'1U 0.5x - 2x D3-5-lgG2 5 1.75 x 10 a -4.39 x 10"1U 0.5x - 2x D3-6-lgG2 6 1.75 x 10a -4.39 x 10"'u 0.5x - 2x D3-7-lgG2 7 1.75 x 10 a -4.39 x 10",u 0.5x - 2x D3-8-lgG2 8 1.75 x 10 a -4.39 x 10"IU 0.5x-2x D3-9-lgG2 9 1.75 x 10a -4.39 x 10",ü 0.5x - 2x D3-11-lgG2 10 1.75 x 10"a- 4.39 x 10"'u 0.5x - 2x D3-12-lgG2 11 <4.39 10"1U > 2x D3-14-lgG2 12 1.75 x 10"a-4.39x 10"1U 0.5x-2x D3-15-lgG2 13 1.75 x 10"a-4.39x 10" ,u 0.5x - 2x D3-16-lgG2 14 1.75 x 10"a- 4.39 x 10"'u 0.5x - 2x D3-17-lgG2 15 1.75 x 10"a- 4.39 x 10"'u 0.5x-2x D3-19-lgG2 16 1.75 x 10"a-4.39x 10'1U 0.5x - 2x D3-20-lgG2 17 1.75 x 10"a-4.39x 10"'u 0.5x - 2x D3-21-lgG2 18 1.75 x 10"a-4.39 x 10"1U 0.5x-2x D3-22-lgG2 19 1.75 x 10"a-4.39x 10"1U 0.5x - 2x D3-23-lgG2 20 1.75 x 10 a -4.39 x 10" lu 0.5x - 2x D3-24-lgG2 21 1.75 x 10"M-4.39x 10",u 0.5x - 2x D3-25-lgG2 22 1.75 X 10"a- 4.39 x 10",u 0.5x - 2x D3-26-lgG2 23 1.75 x 10 a -4.39 x 10"'u 0.5x - 2x D3-27-lgG2 24 1.75 x 10"a-4.39x 10"'u 0.5x-2x D3-28-lgG2 25 1.75 x 10'a- 4.39 x 10",u 0.5x - 2x D3-29-lgG2 26 1.75 x 10 s -4.39 x 10'1U 0.5x - 2x D3-30-lgG2 27 1.75 x 10 s -4.39 x 10"1U 0.5x -2x D3-31-lgG2 28 <4.39x 10"'u > 2x D3-32-lgG2 29 1.75 x 10a-4.39x 10"1U 0.5x-2x D3-33-lgG2 30 1.75 x 10"a-4.39x 10"1U 0.5x - 2x D3-34-lgG2 31 1.75 x 10"s-4.39x 10"1U 0.5x - 2x D3-39-lgG2 32 1.75 x 10"a- 4.39 x 10"1U 0.5x - 2x D3-50-lgG2 33 1.75 x 10"a-4.39x 10"1U 0.5x - 2x D3-52-lgG2 34 1.75 x 10"a-4.39 10"1U 0.5x-2x D3-53-lgG2 35 <4.39x 10'1U > 2x D3-54-lgG2 36 1.75 x 10"a-4.39 10"1U 0.5x - 2x D3-56-lgG2 38 1.75 x 10"a-4.39x 10"?? 0.5x - 2x D3-62-lgG2 44 < 4.39 x 10"1U > 2x D3-65-lgG2 47 <4.39x 10"1U > 2x D3-66-lgG2 48 <4.39x 10"? > 2x D3-69-lgG2 50 <4.39 10"1U > 2x D3-70-lgG2 51 <4.39 10"1U > 2x D3-71-lgG2 52 <4.39x 10"1U > 2x D3-72-lgG2 53 <4.39x 10"'u > 2x D3-73-lgG2 54 <4.39 10'1U > 2x D3-74-lgG2 55 < 4.39 x 10"1U > 2x D3-75-lgG2 56 <4.39 10"'? > 2x D3-76-lgG2 57 1.75 x 10"a-4.39x 10'1U 0.5x - 2x *Nota: las SEQ ID NO: que se muestran en el cuadro 4 para las proteínas de fusión CTLA-4-lgG2 humana, Orencia® y LEA29Y-lg son las de las secuencias de polipéptidos de estas proteínas de fusión, respectivamente. La SEQ ID NO: que se muestra en el cuadro 4 para cada proteína de fusión CTLA-4-lg mutante identifica la secuencia de polipéptidos del DEC de CTLA-4 muíante de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante identificada. Los datos se refieren a una CTLA-4-lg mutante que contiene un DEC de CTLA-4 mutante (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: de 1 a 48 y de 58 a 73) fusionado en su extremo amino terminal al extremo carboxilo terminal del polipéptido de Fe de lgG2 que se muestra en la SEQ ID NO: 184 ó 218. Sin embargo, a nivel experimental, mediante análisis por LCMS, se descubrió que una CTLA-4-lg mutante preparada en células CHO con un vector que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de Fe de hlgG2 teórico que se muestra en la SEQ ID NO: 184, típicamente no incluye el residuo de lisina (K) en el extremo carboxilo terminal teórico; en consecuencia, la secuencia del polipéptido de Fe de hlgG2 de una CTLA-4-lgG2 mutante es la que se muestra en la SEQ ID NO:218, secuencia de polipéptidos de Fe de hlgG2 que no incluye típicamente el residuo de lisina en el extremo carboxilo terminal, en comparación con la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 184. En las SEQ ID NO: de 205 a 214, 219 y 221 se muestran secuencias de proteínas de fusión ejemplares que no incluyen el residuo de lisina en el extremo carboxilo terminal.

Ensayos cinéticos monoméricos. A través de ensayos de unión cinética monovalente, se obtuvo una nueva confirmación de las propiedades de unión de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes. Estos ensayos miden la cinética de unión de una proteína de prueba bivalente (por ejemplo, una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante dimérica) que se encuentra recubriendo chips del sensor y del ligando monovalente (hCD86-mlg digerida con papaína) en la fase móvil. Se realizó un enlace entre el anticuerpo cabra anti IgG humana (Jackson ImmunoResearch, #109-005-098) y los chips del sensor CM5 De conformidad con los protocolos del fabricante, que, por lo general, produjo 15.000 unidades de respuesta (RU). Se capturó el ligando mediante incubación de chips del sensor recubiertos con anticuerpo con 10 µ? de una solución de 2 pg/ml de proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes diméricas en tampón HBS-EP a una magnitud de flujo de 10 µ?/minuto. Los niveles de captura del ligando fueron generalmente entre 25 y 80 unidades de respuesta. Se diluyeron ligandos de hCD86-mlg monoméricos (creados mediante digestión con papaína y adsorción de hCD86-mlg con sefarosa de proteina A, como se describe en Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996) en tampón HBS-EP y se hicieron circular a través de chips del sensor de prueba recubiertos con proteínas durante 2 minutos a 30 µ?/minuto, luego se realizó incubación durante 2 minutos en tampón HBS-EP sin proteínas, a la misma magnitud de flujo. La regeneración entre los ciclos se realizó mediante 3 minutos de incubación en tampón de glicina 10 mM (pH 1.7) a 30 µ?/minuto. Generalmente, se analizaron 8 diluciones de proteínas de analitos monoméricos de entre 3000 nM y 0.2 nM con respecto a una referencia en blanco (tampón HBS-EP solo) por duplicado. Los niveles de señales Rmáx. para la unión a proteínas CTLA-4-lg mutantes oscilaron entre 10 y 60 unidades de respuesta. Para los ensayos cinéticos, se seleccionaron los datos de ensayos de unión monomérica descritos anteriormente, excepto que la selección de datos de asociación comenzó y finalizó a 5 s de los tiempos de inicio e interrupción de la inyección y la selección de datos de disociación comenzó 5 s después del tiempo de interrupción de la inyección, y generalmente incluyó de 1 a 60 s del período de disociación. Estos datos también se analizaron en cuanto a las afinidades de equilibrio en estado estacionario utilizando el software BIAevaluation. Para cada concentración, se promediaron los niveles de unión en estado estacionario (Valores de respuestaeq ("Req")) por encima del intervalo de 5 a 20 s cerca de la interrupción de la inyección de la muestra utilizando la función de BIAevaluation "General fit: average". Se determinó la afinidad en estado estacionario a partir de la gráfica de Req en función de la concentración utilizando software BIAevaluation de conformidad con la fórmula Req=KA x C x Rmax/(KA x C x n+1), donde "C" es la concentración de analitos y "n", el factor de interferencia estérica, es 1 y KD= 1/ KA. En algunos casos, se observó la unión no específica sustancial, representada por un trazo de valor R fijo residual después de la disociación. Estos datos se corrigieron restando de los valores de Req los valores de R residuales. Luego se calculó la KD en el software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) utilizando el modelo "one site-specific binding" ("unión específica en un sitio"). Se realizó este ensayo de unión monomérica a un subconjunto de proteínas CTLA-4-lg mutantes representativas y los resultados se resumen en el cuadro 5. En general, el grado de mejora de la unión de DEC de hCD86 a proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes relacionadas con LEA29Y-lg que se observó en los ensayos de unión monomérica, fue similar al que se observó para la unión de hCD86-mlg a proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes relacionadas con LEA29Y-lg en los ensayos cinéticos estándar. Estos resultados respaldan la conclusión de que las mejoras observadas en la cinética de unión a las proteínas mutantes se deben a mejoras reales en las afinidades de unión de las proteínas mutantes (por ejemplo, en comparación con las proteínas de fusión Orencia® y/o LEA29Y-lg) y no a posibles artefactos causados por una mayor valencia de las preparaciones de proteínas agregadas.

CUADRO 5 *Nota: la SEQ ID NO: que se muestra en el cuadro 5 para LEA29Y-lg es la de la secuencia de polipéptidos de la proteína de fusión LEA29Y-lg. La SEQ ID NO: que se muestra en el cuadro 5 para cada proteína de fusión CTLA-4-lg mutante identifica la secuencia de polipéptidos del DEC de CTLA-4 mutante presente en la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante identificada. Los datos se refieren a una CTLA-4-lg mutante que contiene un DEC de CTLA-4 mutante (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO:4, de 10 a 12, 15, 17, 24, 26, 28, 35 y 61 ) fusionado en su extremo amino terminal al extremo carboxilo terminal del polipéptido de Fe de lgG2 que se muestra en la SEQ ID NO: 184 ó 218. Sin embargo, a nivel experimental, mediante análisis por LCMS se descubrió que una CTLA-4-lg muíante preparada en células CHO utilizando un vector que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de Fe de hlgG2 teórico que se muestra en la SEQ ID NO: 184, típicamente no incluye el residuo de lisina (K) en el extremo carboxilo terminal teórico; en consecuencia, la secuencia del polipéptido de Fe de hlgG2 de una CTLA-4-lgG2 mutante es la que se muestra en la SEQ ID NO:208, cuya secuencia de polipéptidos de Fe de hlgG2 no incluye típicamente el residuo de lisina en el extremo carboxilo terminal, en comparación con la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 184. En las SEQ ID NO: de 205 a 214, 219 y 221 , se muestran las secuencias de proteínas de fusión ejemplares que no incluyen el residuo de lisina en el extremo carboxilo terminal. En las SEQ ID NO: de 74 a 79, de 197 a 200, 220 y 222 se muestran las secuencias de proteínas de fusión ejemplares que incluyen el residuo de lisina en el extremo carboxilo terminal.

EJEMPLO 5 Medición de la actividad biológica de mutantes de CTLA-4 a través de ensayos de proliferación de PBMC humana (estimulación del anticuerpo anti-CD3).

Se ha demostrado que la CTLA-4-lg y las variantes específicas de la misma son inhibidores potentes de la proliferación de células T in vitro (véase, por ejemplo, Larson et al, Am. J. Transplant. 5, 443). Para medir la mejora de la actividad de las proteínas CTI_A-4-lg mutantes en estos ensayos, se desarrolló un ensayo de proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Se diluyó sangre humana (tomada fresca de un programa de donantes) con un volumen igual de PBS y se fraccionó para aislar las PBMC utilizando un gradiente de Histopaque (Sigma, #10771 ) Ficoll en las condiciones recomendadas por el fabricante. Se diluyeron las PBMC en medio de cultivo (medio DMEM/F12 (Invitrogen, #10565-018) complementado con SFB al 10% (Hyclone #SV30014.03) y 1x de PSG (Invitrogen, #10378-016) y se traspasaron a placas de cultivo de 96 pocilios (BD Biosciences, #353077) a una densidad de 1 x 105 células/pocilio. Se diluyeron en serie los compuestos de prueba en medio de cultivo y se añadieron a los pocilios por triplicado. Se inició la proliferación de células mediante añadido de anticuerpo CD3 ratón anti-humano (BD Pharmingen: 555329) hasta una concentración final de 5 pg/ml. Después de incubación a 37°C durante 2 días, se añadió 3H timidina (GE Healthcare, #TRK758-5MCI) a una concentración de 1 pCi/pocillo y se incubaron las placas a 37°C durante 16 horas más. Se cosecharon las células con un recolector de células (FilterMate Omnifilter-96 Harvester) en las condiciones recomendadas por el fabricante y se midieron para la incorporación de 3H timidina utilizando un contador de centelleo (Wallac Trilux, #1450-421). El grado de incorporación de 3H timidina (captación de 3H timidina) indica el grado de la proliferación de células T. Se midió la incorporación de 3H-timidina utilizando técnicas convencionales. La proliferación de células T se expresa como el promedio de cuentas por minuto (cpm) de los pocilios triplicados. Los datos de proliferación de las células se analizaron con el software GraphPad Prism 5 utilizando un modelo de ajuste de curva de regresión no lineal (respuesta a la dosis sigmoidea, pendiente variable) y el procedimiento de mínimos cuadrados. Se informan los parámetros de CI50 (que también aparece como Cl50) y sus intervalos de confianza asociados de 95% de los resultados (cuadro 6). En la figura 6 se observan las curvas de proliferación de células de un ensayo de proliferación de PBMC representativo (utilizando estimulación del anticuerpo anti-CD3) que implica una serie de proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes ejemplares de la invención; o sea, las proteínas de fusión D3-04-lgG2, D3-1 1-lgG2, D3-12-lgG2 y D3-14-lgG2. Aparece una gráfica de la incorporación de 3H timidina (cuentas por minuto (cpm)) contra la concentración de proteínas (nanoMolar (nM)). La incorporación 3H timidina (captación de 3H timidina), que indica el grado de la proliferación de células, se mide a través de técnicas convencionales. Las proteínas de fusión Orencia® y LEA29Y-lg se incluyeron como controles con fines comparativos. Estos resultados demuestran que las proteínas de fusión de Ig CTLA-4-lg mutantes de la invención presentan una potencia considerablemente más alta o una mayor capacidad que las proteínas de fusión Orencia® y/o LEA29Y-lg para inhibir o suprimir la activación de células T policlonares o la proliferación de células T in vitro.

Se realizó el ensayo de proliferación de PBMC utilizando otras proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención. En el cuadro 6 se proporciona un resumen de los datos para una serie representativa de proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención. En el cuadro 6 se presentan comparaciones de valores de CI50 promedio (nanomolar (nM)) para proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes ejemplares contra las de control (las proteínas de fusión Orencia®, hCTLA-4-lgG2 y LEA29Y-lg) en el ensayo de proliferación de PBMC (con estimulación del anticuerpo anti-CD3). El valor de CI50 representa la concentración de un compuesto (por ejemplo, CTLA-4-lg muíante, hCTLA-4-lgG2, Orencia® o proteína de fusión LEA29Y-lg) que se requiere para lograr una inhibición del 50% de la proliferación de células T in vitro. A partir de experimentos específicos, se calculó el promedio de los valores de CI50 para proporcionar valores de CI50 promedio, que se utilizaron para análisis estadísticos. Se utilizó un análisis de varianza (ANOVA /por sus siglas en inglés/) de un solo factor junto con una prueba de Dunnett o Bonferroni retrospectiva para comparar las proteínas de fusión CLTA-4-lg mutantes y la hCTLA-4-lgG2 con la proteína de fusión Orencia® o LEA29Y-lg, respectivamente (C.W. Dunnett, New Tables for Múltiple Comparisons with a Control, Biometrics 20(3):482-491 (sept. 1964); Abdi, Herve, "The Bonferroni and Sidak corrections for múltiple comparisons", en la Encyclopedia of Measurement and Statistics (N.J. Salkind ed., Thousand Oaks, CA 2007); también se encuentra disponible en Internet en utdallas.edu/~herve/Abdi-Bonferroni2007-pretty.pdf.). No se realizó un análisis estadístico de la protema de fusión de Ig compuesta de uno de los siguientes polipéptidos de DEC de CTLA-4 mutantes -los clones D24, D3-07, D3-15 y D3-16- debido a que n = 1. El término "SD (log medio medioCI50)" representa la desviación estándar en los valores medios de log CI50 promedio.

CUADRO 6. Resumen de datos de ensayos de proliferación de PBMC ejemplares utilizando estimulación del anticuerpo anti-CD3 Los superíndices que se muestran en el cuadro 6 son los siguientes: 1 Diferente desde el punto de vista estadístico de Orencia con un p<0.05; según lo determinado por el análisis de varianza (ANOVA) de un solo factor con prueba de Dunnett retrospectiva. 2D¡ferente desde el punto de vista estadístico de LEA con un p<0.05¡ según lo determinado por el análisis de varianza (ANOVA) de un solo factor con prueba de Bonferroni retrospectiva. Las proteínas de fusión que contienen DEC de CTLA-4 mutante de D3-7, D3-15, D3-71 y D24 se analizaron una sola vez, por lo tanto, no se pudo realizar una comparación estadística. Nota: el término "ND" que aparece en el cuadro 6 significa "no disponible". Los análisis estadísticos revelaron que todas las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes que se analizaron en al menos dos análisis independientes y que aparecen con el superíndice (1) (véase el cuadro 6) mostraron una potencia superior desde el punto de vista estadístico que la de las proteínas de fusión Orencia® y hCTLA-4-lgG2 (p < 0.05) (es decir, presentan mayor capacidad de suprimir o inhibir la proliferación de células T en ensayos de PBMC in vitro que las proteínas de fusión Orencia® y hCTLA-4-lgG2). Las que aparecen con el superíndice (2) (véase el cuadro 6) también mostraron una potencia superior desde el punto de vista estadístico que la de la proteína de fusión LEA29Y-lg (p < 0.05) (es decir, presentan mayor capacidad para suprimir o inhibir la proliferación de células T en ensayos de PBMC in vitro que la proteína de fusión LEA29Y-lg), según se determina por análisis de varianza (ANOVA) de un solo factor con las pruebas de Dunnett y Bonferroni retrospectivas que se mencionaron anteriormente. No hubo diferencia estadística entre las proteínas de fusión CTLA-4 humanas que contenían o bien al Fe de lgG1 modificada (como por ejemplo la Orencia®) o bien al Fe de lgG2 natural (como por ejemplo la hCTLA4-lgG2). Este hallazgo implica que las diferencias en las actividades funcionales que se muestran en el cuadro 6 entre las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención (que contienen, cada una un Fe de lgG2 humana) y o bien la Orencia® o la hCTLA4-lgG2 son una consecuencia directa de los cambios de aminoácidos (es decir, las sustituciones de aminoácidos) que se realizan en la región de DEC de CTLA-4. Las diferencias en las actividades funcionales entre estas proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención y, por ejemplo, la Orencia® (que contiene un Fe de lgG1 modificada) no se debieron a diferencias en sus respectivas secuencias de polípéptidos de Fe de Ig. Se cree que dada la mayor capacidad de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención para suprimir o inhibir la proliferación de células T en ensayos in vitro en comparación con las proteínas de fusión Orencia®, LEA29Y-lg y/o hCTLA-4-lgG2, estas proteínas mutantes también deberían presentar mayores potencias inmunosupresoras en procedimientos terapéuticos y/o profilácticos in vivo en comparación con las proteínas de fusión Orencia®, LEA29Y-lg y/o hCTLA-4-lgG2. Se cree que cada una de estas proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención presentan una mayor capacidad para suprimir o inhibir la proliferación de células T en procedimientos o aplicaciones in vivo con relación a las proteínas de fusión Orencia®, LEA29Y-lg y/o hCTLA-4-lgG2, como por ejemplo en procedimientos terapéuticos y/o profilácticos para suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria en un individuo (por ejemplo, en el tratamiento in vivo de enfermedades o trastornos del sistema inmunitario de mamíferos, como por ejemplo, seres humanos), procedimientos para suprimir o inhibir el rechazo del trasplante de tejidos u órganos de un donante por parte del receptor (por ejemplo, por un mamífero, como por ejemplo, los seres humanos) y/u otros procedimientos de tratamiento o diagnóstico que se describen en otra parte del presente documento. Aplicando los mismos análisis estadísticos, se descubrió que no había diferencia estadística entre la proteína de fusión Orencia® (que contiene lgG1 de DEC de CTLA-4 humano muíante) y la CTLA-4-lgG2 humana. Por lo tanto, se cree que las diferencias en los dominios Ig de estas moléculas (es decir, la lgG1 mutante de la proteina de fusión Orencia® y de la lgG2 humána de la hCTLA-4-lgG2) no afectaron la funcionalidad de estas moléculas. Véase la figura 1 1. La inhibición de la proliferación que se observó con mayores dosis de la proteína de fusión Orencia® no fue significativamente diferente que la que se observó con la CTLA-4-lgG2, lo que indica que sus respectivas actividades inmunosupresoras no varían de conformidad con sus isotipos de IgG diferentes, sino que son más bien el resultado de sus polipéptidos de DEC de hCTLA-4. Por lo tanto, las diferentes actividades inmunosupresoras de los polipéptidos de CTLA-4-lg mutantes de la invención y la proteína de fusión Orencia® (o LEA29Y-lg, ya que contiene la misma Ig que la proteína Orencia®) no se pueden atribuir al hecho de que sus respectivas regiones de Fe contengan isotipos de IgG diferentes. La invención incluye proteínas de DEC de CTLA-4 mutantes monoméricas que tienen la capacidad y, en algunos casos, una mayor capacidad para suprimir o inhibir la activación o proliferación de células T que la que tiene una proteína de CTLA-4 humana monomérica o un dominio extracelular de la misma. También se proporcionan proteínas de fusión de DEC de CTLA-4 mutantes monoméricas que tienen la capacidad y, en algunos casos, una mayor capacidad para suprimir o inhibir la activación o proliferación de células T que la que tiene una proteína de fusión de Ig de hCTLA-4 monomérica o un dominio extracelular de la misma. También se incluyen dímeros de proteína de DEC de CTLA-4 mutantes que tienen la capacidad y, en algunos casos, una mayor capacidad para suprimir o inhibir la activación o proliferación de células T que la que tiene un dímero que contiene dos dominios extracelulares de CTLA-4 humano. Algunos dímeros de proteínas de fusión de DEC de CTLA-4 mutantes de la invención (por ejemplo, dímeros de la proteína de fusión CTLA-4-DEC-lg mutante) tienen la capacidad y, en algunos casos, una mayor capacidad para suprimir o inhibir la activación o proliferación de células T que la que tiene un dímero de la proteína de fusión hCTLA-4-lgG2, un dímero de la proteína de fusión Orencia® y/o un dímero de la proteína de fusión LEA29Ylg. .

EJEMPLO 6 Medición de actividad biológica de moléculas de CTLA-4-lg mutantes utilizando ensayos de proliferación de células T CD4* humana.

Se ha demostrado que la CTLA-4-lg humana y vahantes especificas de la misma inhiben la proliferación de células T al bloquear la señalización de CD80 y CD86 a través de CD28 (Linsley P.S., Immunity 1 :793-801 (1994); Larson C. P. et al, Am. J. Transplant. 5:443-453 (2005)). Como se han mejorado las proteínas CTLA-4-lg mutantes de la invención en cuanto a su avidez de unión al ligando de CD86-lg, se desarrolló un ensayo de proliferación de células T CD4+ para medir la actividad de las proteínas CTLA-4-lg mutantes al bloquear las señalizaciones a través de CD86.

Creación de una secuencia de ADN que codifica una proteína de CD86 humana de longitud completa. Se creó pCDNA3.1 hB7.2 plasmídica de longitud completa para codificar la proteína de CD86 humana de longitud completa para su expresión sobre la superficie de células transfectadas. Se generó el ADN que codifica CD86 humano mediante amplificación por PCR de ADNc derivado de leucocitos humanos (BD Biosciences, Cat# HL4050AH) utilizando cebadores de oligonucleótidos directos e inversos que se diseñaron a partir de la homología de secuencias con la secuencia de nucleótidos que codifica CD86 que se presenta en la SEQ ID NO: 176. Los cebadores se diseñaron, crearon y ensamblaron utilizando mecanismos convencionales muy conocidos por los entendidos en la técnica e incluyen los códigos de iniciación, códigos de parada y los sitios de restricción que son necesarios. Los procedimientos de amplificación por PCR que se utilizan son también muy conocidos en la técnica. Dichos procedimientos se describen, por ejemplo, en Berger, Ausubel y Sambrook, todos mencionados anteriormente. Se utilizaron 50 ng de ADNc como plantilla en una reacción de PCR de 100 µ? con cebadores directos e inversos 1 µ?, tampón de Herculasa Polimerasa (Stratagene; #600260) y dNTP 200 µ? para 30 ciclos de amplificación (94°C, 30 seg.; 50°C, 30 seg.; 72°C, 60 seg.). Se purificó el producto de PCR utilizando columnas de centrifugado de PCR QiaQuick (Qiagen #28106) y este fue digerido con enzimas de restricción Kpnl y Notl. Los fragmentos se separan mediante electroforesis en gel de agarosa, se purifican utilizando el kit de extracción en gel de Qiaquick "Qiaquick Gel Extraction Kit" (Qiagen, #28704) según las recomendaciones del fabricante y se ligan en pCDNA 3.1 (+) plasmídico (Invitrogen, Cat. #V790-20) digerido de forma similar. Las ligaduras se transformaron en células de E. coli TOP10 (Qiagen, Cat. #C4040-10) según las recomendaciones del fabricante. Se incubaron las células transformadas en LB (medio de caldo Luria) que contenia carbenicilina 50 pg/ml a 250 rpm durante la noche a 37°C y luego se utilizaron para preparar una reserva de maxiprep (Qiagen; #12362) de ADN plasmídico en las condiciones recomendadas por el fabricante. En la SEQ ID NO:175 se muestra la secuencia de aminoácidos teórica de la proteína de CD86 humana de longitud completa. En dicha secuencia, los residuos de aminoácidos de 1 a 23 comprenden la secuencia de señal teórica, los residuos de aminoácidos de 24 a 241 comprenden el dominio extracelular de CD86 humano, los residuos de aminoácidos de 242 a 270 comprenden el dominio transmembrana y los residuos de aminoácidos de 271 a 329 comprenden el dominio citoplasmático.

Creación de lineas celulares estables que expresan el CD86 humano en la superficie de la célula. Se cultivaron células HEK293 hasta alcanzar un 80-90% de confluencia en matraces T-75 que contenían 20 mi de medio de cultivo (medio DMEM/F12 (Invitrogen, Cat. #10565-018) complementado con SFB al 10% (Hyclone Cat.#SV30014.03) y 1x de PSG (Invitrogen, Cat. #10378-016)). Se transfectaron las células con 10 pg de ADN plasmídico (pCDNA3.1 hB7.2 de longitud completa) mezclado con 60 µ? de Fugene 6 (ROCHE, #11814443001) en las condiciones recomendadas por el fabricante. Las células se incubaron durante 2 días a 37°C en medio de cultivo y luego se incubaron durante 10 días más a 37°C en medio de selección (medio de cultivo que contiene Geneticin 300 pg/ml (Invitrogen, #10131-027)), con cambio de medio cada 2 días. Para permitir la distribución FACS (distribución celular activada por fluorescencia), se tiñeron las células transfectadas con anticuerpo anti-CD86 marcado con FITC (BD Biosciences, #555) en las condiciones recomendadas por el fabricante. Utilizando un separador de células (Dako, MoFlo) regulado para señal de FITC, las células CD86-posit¡vas se separaron en forma individual en placas de cultivo de 96 pocilios (Sigma-Aldrich, #CLS-3596) que contenían 200 µ?/pocillo de medio de cultivo con medio condicionado al 25% (medio de cultivo cosechado previamente de cultivos de células no transfectadas (o vírgenes)). Después de incubación a 37°C durante 13 a 19 días, las células se dispersaron mediante hidrólisis de tripsina y se traspasaron a placas de cultivo de 24 pocilios que contenían 0.5 ml/pocillo de medio de cultivo. Después de incubación a 37°C durante 7 días, las células se dispersaron mediante hidrólisis de tripsina y se traspasaron a matraces T-75 que contenían 20 mi de medio de cultivo. Se seleccionaron las lineas celulares finales sobre la base de niveles altos de expresión de CD86 en la superficie de la célula medidos mediante análisis FACs de las células teñidas con anticuerpo anti-CD86 marcado con FITC utilizando un FACS Caliber (BD Biosciences), en las condiciones recomendadas por el fabricante. . I Ensayos de proliferación de células T CD4* Se enriquecieron las células T CD4+ hasta >96% a partir de preparaciones de capa leucocitaria humana (Stanford University Blood Center, Stanford, CA) utilizando el kit de selección de CD4 positiva humana de EasySep "EasySep Human CD4 Positive Selection Kit' (StemCell Technologies, #18052R) con un separador celular magnético (RoboSep, StemCell Technologies, #20000) según las recomendaciones del fabricante. Las células T CD4+ enriquecidas se llevaron a una densidad de 1 x 106 células/ml en medio de Yssel (Gemini Bio-Products, #400-102) complementado con SFB al 10% (Hyclone SV30014.03) y se traspasaron a placas de cultivo de tejidos de 96 pocilios en un volumen de 50 µ?/pocillo. Se irradiaron las células HEK293 con expresión de CD86 humano unido a la membrana a 6000 rad (Stanford Research Institute, Menlo Park, CA), se llevaron a 1 x 106 células/ml en el mismo medio y se traspasaron a las placas de cultivo en un volumen de 50 µ?/pocillo. Se diluyeron en serie los compuestos de prueba en el mismo medio y se añadieron a los pocilios por triplicado. Se inició la proliferación de células mediante añadido de anticuerpo CD3 ratón anti-humano (BD Pharmingen: 555329) hasta una concentración final de 5 pg/ml. Después de incubación a 37°C durante 3 días, se añadió 3H timidina (GE Healthcare, #TRK758-5MCI) a una concentración de 1 pCi/pocillo y se incubaron las placas a 37°C durante 18 horas más. Se cosecharon las células con un recolector de células (Perkin Elmer Filter Harvester D961962) y se midió la 3H timidina utilizando un contador de centelleo para líquidos (Wallac Trilux 1450) en las condiciones recomendadas por el fabricante. Los datos de proliferación de las células se analizaron con el software GraphPad Prism 5 empleando una ecuación de pendiente variable (Y=lnferior + (Superior-lnferior)/(1+10A((LogCI50-X)(HillSlope))) para generar una CI50 para cada compuesto de prueba. El término "(LogCI50-X)(HillSlope)" es un exponente de la ecuación. En la figura 7 se observan las curvas de proliferación de los ensayos de proliferación de células T CD4+ representativos en los que participa una serie ejemplar de proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención; o sea, las D3-04-lgG2, D3-11-lgG2, D3-12-lgG2 y D3-14-lgG2. Las proteínas de fusión Orencia® y LEA29Y-lg se incluyeron como controles con fines comparativos. Aparece una gráfica de la incorporación de 3H timidina (cpm) frente a la concentración de proteína (nM). La incorporación 3H timidina indica el grado de la proliferación de células y se mide a través de técnicas convencionales. Estos resultados demuestran que las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención presentan una potencia considerablemente más alta o una mayor capacidad que las proteínas dé fusión Orencia® y/o LEA29Y-lg para inhibir o suprimir la coestimulación de CD86 in vitro. Este ensayo de proliferación de células T CD4+ se realizó en otras varias proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención. En el cuadro 7 se proporciona un resumen de los datos para una serie de proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes ejemplares de la invención. En el cuadro 7 se presentan comparaciones de valores de CI50 promedio (nanomolar (nM)) para proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes ejemplares frente a los controles de referencia (proteínas de fusión Orencia®, LEA29Y-lg y CTLA-4-lgG2 humana) obtenidos utilizando el ensayo de proliferación de células T CD4+. A partir de experimentos específicos, se calculó el promedio de los valores de CI50 para proporcionar valores de CI50 promedio, que se utilizaron para análisis estadísticos. El término "SD (log medio CI50)" representa la desviación estándar en los valores medios de log CI50.

CUADRO 7 Resumen de datos de ensayos de proliferación de células T CD4* ejemplares Los superíndices que se muestran en el cuadro 7 son los siguientes: 1diferente desde el punto de vista estadístico de Orencia con un p<0.05; según lo determinado por el análisis de varianza (ANOVA) de un solo factor con prueba de Dunnett retrospectiva. 2Diferente desde el punto de vista estadístico de LEA con un p<0.05; según lo determinado por el análisis de varianza (ANOVA) de un solo factor con prueba de Bonferroni retrospectiva. La proteína de fusión que contiene DEC de CTLA-4 mutante de D3-02 se analizó una sola vez, por lo tanto, no se pudo realizar una comparación estadística. Los análisis estadísticos revelaron que todas las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes que se analizaron en, al menos, dos análisis independientes y que aparecen con el superíndice (1) (véase el cuadro 7) mostraron una potencia superior desde el punto de vista estadístico que la de las proteínas de fusión Orencia® y hCTLA-4-lgG2 (p < 0.05) (es decir, presentan una mayor capacidad para suprimir o inhibir la proliferación de las células T en ensayos de células T CD4+ in vitro que las proteínas de fusión Orencia® y hCTLA-4-lgG2). Las que aparecen con el superíndice (2) (véase el cuadro 7) también mostraron una potencia superior desde el punto de vista estadístico que la de la proteína de fusión LEA29Y-lg (p < 0.05) (es decir, presentan una mayor capacidad para suprimir o inhibir la proliferación de células T en ensayos de células T CD4+ in vitro que la proteína de fusión LEA29Y-lg), según lo determina un análisis de varianza (ANOVA) de un solo factor con las pruebas de Dunnett y Bonferroni retrospectivas que se mencionaron anteriormente. No hubo diferencia estadística entre las proteínas de fusión CTLA-4 humanas que contenían o bien al Fe de lgG1 modificada (como por ejemplo la Orencia®) o bien al Fe de lgG2 natural (como por ejemplo la hCTLA4-lgG2). Este hallazgo implica que las diferencias en las actividades funcionales que se muestran en el cuadro 7 entre las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención (que contienen, cada una Fe de lgG2 humana) y o bien la Orencia® o la hCTLA4-lgG2 son una consecuencia directa de cambios de aminoácidos (es decir, sustituciones de aminoácidos) que se realizan en la región de DEC de CTLA-4. Las diferencias en las actividades funcionales entre estas proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención y, por ejemplo, la Orencia® (que contiene Fe de lgG1 modificada) no se debieron a diferencias en sus respectivas secuencias de polipéptidos de Fe de Ig. Se cree que dada la mayor capacidad de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención para suprimir o inhibir la coestimulación de células T mediada por CD86 (por ejemplo, las células T humanas) en ensayos in vitro en comparación con las proteínas de fusión Orencia®, LEA29Y-lg y/o hCTLA-4-lgG2, estas proteínas mutantes también deberían presentar mayores potencias inmunosupresoras en aplicaciones o procedimientos terapéuticos y/o profilácticos in vivo en comparación con las proteínas de fusión Orencia®, LEA29Y-lg y/o CTLA-4-lg humanas (por ejemplo, CTLA-4-lgG2 humana ("hCTLA-4-lgG2")), respectivamente. En un aspecto, se cree que las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención presentan una mayor capacidad para suprimir o inhibir la coestimulación de las células T mediada por CD86 (por ejemplo, las células T humanas) en un procedimiento o aplicación in vivo en comparación con las proteínas de fusión Orencia®, LEA29Y-lg y/o CTLA-4-lg humana (por ejemplo, la hCTLA-4-lgG2), respectivamente, por ejemplo, en procedimientos terapéuticos y/o profilácticos para suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria en un individuo (por ejemplo, en el tratamiento in vivo de enfermedades o trastornos del sistema inmunitario, por ejemplo, en mamíferos, como por ejemplo, los seres humanos), procedimientos para suprimir o inhibir el rechazo del trasplante de tejidos u órganos de un donante por parte del receptor (por ejemplo, por un mamífero, como por ejemplo, los seres humanos) y/u otros procedimientos de tratamiento o diagnóstico que se describen en otra parte del presente documento.

EJEMPLO 7 Medición de actividad biológica de moléculas de CTLA-4-lg mulantes utilizando ensayos de proliferación de PBMC humana (estimulación de la memoria del antígeno ).

La activación de las células T de la memoria es un aspecto importante de la autoinmunidad (Rogers N.J. et al. Eur. J. Immunol 35:2909-2919 (2005)). Para medir la actividad inmunopresora de las proteínas CTLA-4-Ig mutantes en este sentido, se desarrolló un ensayo de proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) utilizando estimulación del antigeno PPD. Se diluyó sangre humana (tomada fresca de un programa de donantes) con un volumen igual de PBS y se fraccionó para aislar las PBMC utilizando un gradiente de Histopaque (Sigma, #10771 ) Ficoll en las condiciones recomendadas por el fabricante. Se diluyeron las PBMC en medio RPMI (Sigma, #R8758) complementado con SFB al 10% (Hyclone #SV30014.03) y 1x de PSG (penicilina, estreptomicina y glutamina) (Invitrogen, #10378-016) y se traspasaron a placas de cultivo de 96 pocilios (BD Biosciences, #353077) a una densidad de 1 x 105 células/pocilio. Se diluyeron en serie los compuestos de prueba en el mismo medio y se añadieron a los pocilios por cuadriplicado. Se inició la proliferación de células mediante el añadido de antígeno PPD (derivado de proteína purificada de Mycobacterium tuberculosis, Mycos, #P-1000-001 ) hasta una concentración final de 5 pg/ml. Después de incubación a 37°C durante 5 días, se añadió 3H timidina (GE Healthcare, #TRK758-5MCI) a una concentración de 1 pCi/pocillo y se incubaron las placas a 37°C durante 18 horas más. Se cosecharon las células con un recolector de células (FilterMate Omnifilter-96 Harvester, Perkin Elmer) en las condiciones recomendadas por el fabricante y se midieron para la incorporación de 3H timidina utilizando un contador de centelleo (Wallac Trilux, #1450-421 ). Los datos de proliferación de las células se analizaron con el software GraphPad Prism 5 utilizando un modelo de ajuste de curva de regresión no lineal (respuesta a la dosis sigmoidea, pendiente variable) y el procedimiento de mínimos cuadrados. Se informan los parámetros de CI50 (o "CI50") y sus intervalos de confianza asociados de 95%. En la figura 8, se observan las curvas de proliferación de los ensayos de proliferación de PBMC representativos en los que participa una serie de proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes ejemplares de la invención; o sea, las proteínas de fusión D3-lgG2, D3-12-lgG2, D3-17-lgG2 y D3-29-lgG2. Las proteínas de fusión Orencia® y LEA29Y-lg se incluyeron como controles con fines comparativos. Aparece una gráfica de la incorporación de 3H timidina (cpm) frente a la concentración de proteínas (nM). La incorporación 3H timidina, que indica el grado de la proliferación de células, se mide a través de técnicas convencionales. Estos resultados demuestran que, en un aspecto, las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención presentan una potencia considerablemente más alta que las proteínas Orencia® y/o LEA29Y-Ig para inhibir o suprimir la proliferación de las células T de la memoria in vitro (por ejemplo, las proteínas CTLA-4-lg mutantes tienen una mayor capacidad que las proteínas Orencia® y/o LEA29Y-lg de inhibir o suprimir la proliferación de las células T de la memoria in vitro en ensayos de proliferación de PBMC humana (estimulación de la memoria del antígeno)). Este ensayo de proliferación de PBMC con estimulación del antígeno PPD se realizó en otras proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención. En el cuadro 8 se proporciona un resumen de los datos para una serie de proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes ejemplares de la invención. En el cuadro 8 se presentan comparaciones de valores medios de CI50 (nanomolar (nM)) para proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes ejemplares frente a los controles de referencia (las proteínas de fusión Orencia® y LEA29Y-lg) a través del ensayo de proliferación de PBMC con estimulación de la memoria del antígeno. A partir de experimentos específicos, se calculó el promedio de los valores de CI50 para proporcionar los valores medios de CI50 , que se utilizaron para análisis estadísticos. El término "SD (log medio CI50)" representa la desviación estándar en los valores medios de log CI50.

CUADRO 8 Resumen de datos de los ensayos de proliferación de PBMC ejemplares con estimulación del antígeno PPD Nota: el término "ND" que aparece en el cuadro 8 significa disponible".

Los análisis estadísticos revelaron que todas las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes analizadas mostraron una potencia superior desde el punto de vista estadístico que las proteínas de fusión Orencia® y LEA29Y-Ig con p < 0.05, tal como se determinó mediante un análisis de varianza (ANOVA) de un solo factor con las pruebas retrospectivas de Dunnett y Bonferroni, respectivamente, que se mencionaron anteriormente (por ejemplo, las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes tienen una mayor capacidad que las proteínas de fusión Orencia® y/o LEA29Y-lg para inhibir o suprimir la proliferación de las células T de la memoria in vitro en ensayos de proliferación dé PBMC humana (estimulación de la memoria del antígeno)). Se cree que dada la mayor capacidad de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención para suprimir o inhibir la proliferación de las células T de la memoria (por ejemplo, la memoria de las células T humanas) en ensayos in vitro en comparación con las proteínas de fusión Orencia® y/o LEA29Y-lg, estas proteínas mutantes también deberían presentar mayores potencias inmunosupresoras en procedimientos terapéuticos y/o profilácticos in vivo en comparación con las proteínas de fusión Orencia®, LEA29Y-lg y/o CTLA-4-lg humana (por ejemplo, CTLA-4-lgG2 humana). En un aspecto, se cree que las proteínas CTLA-4-lg mutantes de la invención presentan una mayor capacidad para suprimir o inhibir la proliferación de las células T de la memoria (por ejemplo, la memoria de las células T humanas) en un procedimiento o aplicación in vivo en comparación con las proteínas de fusión Orencia®, LEA29Y-lg y/o CTLA-4-lg humana (por ejemplo, la CTLA-4-lgG2 humana), por ejemplo, en procedimientos terapéuticos y/o profilácticos para suprimir, o inhibir una respuesta inmunitaria en un individuo (por ejemplo, en el tratamiento in vivo de enfermedades o trastornos del sistema inmunitario, por ejemplo, en mamíferos, como por ejemplo, los seres humanos), procedimientos para suprimir o inhibir el rechazo del trasplante de tejidos u órganos de un donante por parte del receptor (por ejemplo, por un mamífero, como por ejemplo, los seres humanos) y/u otros procedimientos de tratamiento o diagnóstico que se describen en otra parte del presente documento.

EJEMPLO 8 Medición de la actividad biológica de las moléculas de CTLA-4-lg m uta n tes a través de ensayos de MLR humana (reacción de linfocitos mezclados).

La CTLA-4-lg y sus variantes son inhibidores potentes de las respuestas alogénicas primarias in vitro (Vaughan, A. N. et al, J. Immunol. 165:3175-3181 (2000); Wallace P. M., et al, Transplantation 58:602-610 (1994)). Para medir la mejora de la actividad de las proteínas CTLA-4-lg mutantes en estos ensayos, se desarrolló un ensayo de proliferación de células con una reacción de linfocitos humanos mezclados (MLR). Se diluyó sangre humana (tomada fresca de un programa de donantes humanos) con un volumen igual de PBS y se fraccionó para aislar las PBMC utilizando un gradiente de Histopaque (Sigma, #10771) Ficoll en las condiciones recomendadas por el fabricante. Se diluyeron las PBMC del donante en medio RPMI (Sigma, #R8758) complementado con SFB al 10% (Hyclone #SV30014.03) y 1x de PSG (Invitrogen, #10378-016) y se traspasaron a placas de cultivo de 96 pocilios (BD Biosciences, #353077) a una densidad de 1 x 105 células/pocilio. Se irradiaron PBMC de otro donante a 2500 rad, se diluyeron en el mismo medio y se traspasaron a las mismas placas a una densidad de 1 x 105 células/pocilio. Se diluyeron en serie los compuestos de prueba en el mismo medio y se añadieron a los pocilios por cuadriplicado. Después de incubación a 37°C durante 5 días, se añadió 3H timidina (GE Healthcare, #TRK758-5MCI) a una concentración de 1 ?Ci/pocillo y se incubaron las placas a 37°C durante 18 horas más. Se cosecharon las células con un recolector de células (FilterMate Omnifilter-96 Harvester, Perkin Elmer) en las condiciones recomendadas por el fabricante y se midieron para la incorporación de 3H timidina utilizando un contador de centelleo (Wallac Trilux, #1450-421). Los datos de proliferación de las células se analizaron con el software GraphPad Prism 5 utilizando un modelo de ajuste de curva de regresión no lineal (respuesta a la dosis sigmoidea, pendiente variable) y el procedimiento de mínimos cuadrados. Se informan los parámetros de CI50 y sus intervalos de confianza asociados de 95%. En la figura 9 se observan las curvas de proliferación de células de los ensayos de proliferación de MLR representativos en los que participa una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante ejemplar de la invención: D3-lgG2.

Las proteínas de fusión Orencia® y LEA29Y-lg se incluyeron como controles con fines comparativos. Aparece una gráfica de la incorporación de 3H timidina (cpm) frente a la concentración de proteínas (nM). La incorporación de 3H timidina, que indica el grado de la proliferación de células, se mide a través de técnicas convencionales. Estos resultados demuestran que la D3-lgG2 presenta una potencia considerablemente más alta que las proteínas de fusión Orencia® y/o LEA29Y-lg para inhibir o suprimir la estimulación alogénica primaria de las células T in vitro (por ejemplo, D3-lgG2 presenta una mayor capacidad para suprimir o inhibir la estimulación alogénica primaria de la proliferación de células T en un ensayo de MLR in vitro que las proteínas de fusión Orencia® o LEA29Y-lg). Este ensayo de MLR se realizó en otras varias proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención. En el cuadro 9 se proporciona un resumen de los datos para una serie de proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes ejemplares de la invención. En el cuadro 9 se presentan comparaciones de valores medios de CI50 (nanomolar (nM)) para las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes ejemplares frente a los controles de referencia (las proteínas de fusión Orencia® y LEA29Y-lg) en el ensayo de MLR. Se calculó el promedio de los valores de CI50 correspondientes a dos experimentos individuales para proporcionar los valores medios de CI50. El término "SD (log medio CI50)" representa la desviación estándar en los valores medios de log CI50. Los valores medios de CI50 para las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes que se muestran en el cuadro 9 fueron más bajos que los valores medios de CI50 respectivos de las proteínas de fusión Orencia® y LEA29Y-lg. En un aspecto, la invención proporciona proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes que se cree que presentan una potencia superior que las proteínas de fusión Orencia® y/o LEA29Y-lg (por ejemplo, se cree que las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes presentan mayor capacidad para suprimir o inhibir la estimulación alogénica primaria de la proliferación de las células T en un ensayo de MLR in vitro que las proteínas de fusión Orencia® o LEA29Y-lg). Se cree que dada la capacidad mejorada que se espera de las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención para suprimir o inhibir la estimulación alogénica primaria de células T (por ejemplo, las células T humanas) en ensayos in vitro en comparación con las proteínas de fusión Orencia® y/o LEA29Y-lg, estas proteínas mutantes también deberían presentar mayores potencias inmunosupresoras en aplicaciones o procedimientos terapéuticos y/o profilácticos in vivo en comparación con las proteínas de fusión Orencia® y/o LEA29Y-lg. En un aspecto, las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes de la invención presentan una potencia considerablemente más alta que las proteínas de fusión Orencia®, LEA29Y-lg y/o CTI_A-4-lg humana (por ejemplo, CTLA-4-lgG2 humana) para inhibir o suprimir la estimulación alogénica primaria de las células T in vitro (por ejemplo, las proteínas de fusión CTI_A-4-Ig mutantes exhiben una mayor capacidad para suprimir o inhibir la estimulación alogénica primaria de la proliferación de las células T en un ensayo de MLR in vitro que las proteínas de fusión Orencia®, LEA29Y-lg y/o CTLA-4-lg humanas). En un aspecto, se cree que una proteína CTLA-4-lg mutante de la invención presenta una mayor capacidad para suprimir o inhibir la estimulación alogénica primaria de células T (por ejemplo, las células T humanas) en un procedimiento o aplicación in vivo en comparación con las proteínas de fusión Orencia®, LEA29Y-lg y/o CTLA-4-lg humana, por ejemplo, en procedimientos terapéuticos y/o profilácticos para suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria en un individuo (por ejemplo, en el tratamiento in wVo de enfermedades o trastornos del sistema inmunitario, por ejemplo, en mamíferos como, por ejemplo, seres humanos), un procedimiento para suprimir o inhibir el rechazo del trasplante de tejidos u órganos de un donante por parte del receptor (por ejemplo, por un mamífero, como por ejemplo, los seres humanos) y/u otros procedimientos de tratamiento o diagnóstico que se describen en otra parte del presente documento.

CUADRO 9 Resumen de datos de ensayos de MLR ejemplares Nota: el término "ND" que aparece en el cuadro 9 significa "no disponible".

EJEMPLO 9 Un paciente humano adulto que sufre artritis reumatoide puede ser tratado con una proteína de fusión CTLA-4-lg muíante soluble del siguiente modo. Se prepara una composición farmacéutica compuesta por una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante soluble de la invención y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo PBS). Una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante soluble ejemplar comprende dos proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes monoméricas idénticas unidas por un enlace covalente con uno o más enlaces disulfuro, donde cada proteína de fusión monomérica contiene un polipéptido de DEC de CTLA-4 muíante de la invención que contiene una secuencia de polipéptidos elegida entre las SEQ ID NO: 1 a la 73 fusionada en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal de un polipéptido de Fe de lgG2 humana. Como proteínas de fusión ejemplares, se pueden mencionar las que comprenden las secuencias de polipéptidos presentadas en cualquiera de las SEQ ID NO: 74 a la 79, de la 197 a la 200, de la 205 a la 214 y de la 219 a la 222. Estas proteínas de fusión se expresan típicamente en forma dímérica. La concentración de la proteina de fusión en la composición farmacéutica puede ubicarse en el intervalo de 0.05 mg/ml aproximadamente a 200 mg/ml aproximadamente, de 1 mg/ml aproximadamente a 150 mg/ml aproximadamente, de 25 mg/ml aproximadamente a 120 mg/ml aproximadamente, de 1 mg/ml a 100 mg/ml aproximadamente, de 25 mg/ml a 100 mg/ml aproximadamente, de 50 mg/ml aproximadamente a 100 mg/ml aproximadamente, de 50 mg/ml aproximadamente a 75 mg/ml aproximadamente, de 100 mg/ml aproximadamente a 150 mg/ml aproximadamente y otros similares. Por ejemplo, la concentración de la proteína de fusión en la composición farmacéutica puede ser aproximadamente de 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml ó 200 mg/ml. El pH de dicha composición farmacéutica se ubica en el intervalo de pH 4 aproximadamente a pH 10 aproximadamente, incluido de pH 5 aproximadamente a pH 9 aproximadamente, de pH 6.5 aproximadamente a pH 8.5 aproximadamente, preferentemente de pH 6.0 aproximadamente a pH 8.0 aproximadamente, de pH 6.5 aproximadamente a pH 7.5 o de pH 7.0 aproximadamente a pH 8.0 aproximadamente. El tratamiento de la artritis reumatoide del paciente se lleva a cabo mediante la administración de una cantidad eficaz desde el punto de vista terapéutico de la CTLA-4-lg mutante (por ejemplo, una dosis eficaz) al paciente por vía intravenosa o por inyección subcutánea. El lugar de la inyección puede ser, por ejemplo, un brazo, el torso o una pierna del paciente. La dosis eficaz de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante administrada típicamente es, entre otras, por ejemplo, entre aproximadamente 0.01 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal aproximadamente de un paciente humano adulto, como por ejemplo; entre 0.01 y 5.0 mg/kg; entre 0.01 y 3.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.05 y 2.5 mg/kg; entre 0.1 y 2.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 y 1.0 mg/kg; entre 0.01 y 0.05 mg/kg aproximadamente; entre 0.5 y 1.5 mg/kg aproximadamente; entre 1.0 y 4.0 mg/kg aproximadamente; entre 1.0 y 3.0 mg/kg aproximadamente; entre 1.0 y 2.0 mg/kg aproximadamente; incluidos, entre otros; aproximadamente 0.01 mg/kg; 0.05 mg/kg; 0.075 mg/kg; 0.1 mg/kg; 0.15 mg/kg; 0.2 mg/kg; 0.25 mg/kg; 0.3 mg/kg; 0.5 mg/kg; 0.75 mg/kg; 1 mg/kg; 1.25 mg/ml; 1.5 mg/kg; 2 mg/kg; 2.5 mg/kg; 3 mg/kg; 4 mg/kg; 5 mg/kg; 10 mg/kg; 20 mg/kg; 25 mg/kg; 50 mg/kg; 75 mg/kg ó 100 mg/kg de peso corporal del paciente se administran al paciente. Como alternativa, se puede utilizar una cantidad o dosis eficaz, o intervalo de dosis descrito en la sección anterior "Procedimientos de la invención". La dosis de proteína de fusión que se administrará se determina sobre la base de la potencia de la proteína de fusión y/o la gravedad de los síntomas o signos de la artritis reumatoide que el paciente presente. La cantidad total de proteína de fusión CTLA-4-lg muíante que se administra al paciente puede ser, por ejemplo, entre 0.01 mg aproximadamente y 100 mg aproximadamente, típicamente entre 1 mg y 100 mg aproximadamente, entre 10 mg y 100 mg, entre 10 mg aproximadamente y 75 mg aproximadamente, o entre 10 y 50 mg aproximadamente. El volumen de la composición farmacéutica que se administra al paciente se determina sobre la base de la concentración de la proteína de fusión en la composición y la dosis de proteína de fusión que se administrará. En el caso de la inyección subcutánea, se administran típicamente entre uno y dos mililitros de la composición farmacéutica que contiene la proteína de fusión por inyección. En el caso de la inyección intravenosa, se puede administrar un volumen adecuado de la composición farmacéutica que contenga la proteína de fusión. Después de inyectar la dosis inicial, se puede administrar al paciente una segunda dosis idéntica de la proteína de fusión por vía subcutánea (por ejemplo, por inyección subcutánea) o intravenosa (por ejemplo, por inyección intravenosa) por ejemplo en la semana 1 , 2, 3 ó 4 posteriores a la dosis inicial. El plan de administración puede ser una dosis cada dos semanas, una dosis por mes, una dosis cada dos meses, etc. según, por ejemplo, el estado del paciente. Las dosis posteriores se pueden administrar cada cuatro semanas o con mayor o menor frecuencia, según sea necesario. Es posible que la frecuencia de administración varíe según el estado del paciente y también es posible que dependa de la gravedad de los síntomas o signos de artritis reumatoide que el paciente presente. En un aspecto ejemplar, se administra a un paciente humano que sufre artritis reumatoide una composición farmacéutica que contiene un dimero de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante de la invención (por ejemplo, D3-29-lgG2, D3-54-lgG2, D3-56-lgG2, D3-69-lgG2, etc.) y un excipiente farmacéuticamente aceptable en cantidad suficiente como para proporcionar una dosis del dimero de la proteína de fusión de 0.5 mg/kg en peso corporal aproximadamente, por inyección subcutánea, una vez por semana o una vez por mes, según resulte necesario, en función del estado del paciente y de su respuesta al fármaco. En otro aspecto ejemplar, se administra a un paciente humano que sufre artritis reumatoide una composición farmacéutica que contiene un dimero de la proteína de fusión CTLA-4-lg de la invención (por ejemplo, D3-29-lgG2, D3-54-lgG2, D3-56-lgG2, D3-69-lgG2, etc.) y un excipiente farmacéuticamente aceptable en cantidad suficiente como para proporcionar una dosis del dimero de la proteína de fusión de 10 mg/kg aproximadamente, por vía intravenosa, una vez por semana o una vez por mes, según resulte necesario, en función del estado del paciente y de su respuesta al fármaco. Para esta administración, se pueden emplear los procedimientos convencionales de administración por vía intravenosa. Por ejemplo, la composición farmacéutica se puede infundir en el paciente humano junto con otro líquido, como por ejemplo, una solución salina esterilizada, una solución de dextrosa u otra solución isotónica, utilizando goteo intravenoso continuo convencional a través de un dispositivo de acceso por vía intravenosa convencional. Se espera que cada uno de los procedimientos de tratamiento descritos anteriormente por inyección subcutánea o intravenosa reduzca o alivie uno o más signos, síntomas o respuestas biológicas asociados con la artritis reumatoide en el paciente, por ejemplo, la inflamación, la sensibilidad en las articulaciones, la hinchazón de las articulaciones, el dolor, la atrofia de los tejidos y la rigidez. Es posible que dicho tratamiento disminuya el avance de la enfermedad en el paciente, en especial en los tejidos conectivo, muscular y óseo. Por ejemplo, el tratamiento puede reducir el avance del daño o el deterioro del tejido conectivo, la atrofia del tejido muscular, el tejido óseo, las articulaciones, el tejido cartilaginoso y/o la columna vertebral y otros similares en el paciente. También es posible que se alivien o disminuyan otros síntomas clínicos de la enfermedad, entre los que se incluyen el daño provocado a la piel, al sistema nervioso central o a los órganos. Además, es posible que dicho tratamiento también mejore las funciones físicas del paciente.

EJEMPLO 10 Se puede tratar un paciente humano adulto que se encuentra en tratamiento de mantenimiento para prevenir el rechazo de un trasplante de un órgano puede con una proteina de fusión CTLA-4-lg muíante soluble del siguiente modo. Se prepara una composición farmacéutica compuesta por una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante soluble de la invención y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo PBS o similar). Una proteína de fusión CTLA-4-lg mutante soluble ejemplar comprende dos proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes monoméricas idénticas unidas por un enlace covalente con uno o más enlaces disulfuro, donde cada proteína de fusión monomérica contiene un polipéptido de DEC de CTLA-4 mutante de la invención que contiene una secuencia de polipéptidos elegida de entre las SEQ ID NO: 1 a 73 fusionada en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal de un polipéptido de Fe de lgG2 humana. Como proteínas de fusión ejemplares se pueden mencionar las que comprenden las secuencias de polipéptidos presentadas en cualquiera de las SEQ ID NO: 74 a 79, 197 a 200, 205 a 214 y 219 a 222. La concentración de la proteína de fusión en la composición farmacéutica puede ubicarse en el intervalo de 0.05 mg/ml aproximadamente a 200 mg/ml aproximadamente, de 1 mg/ml aproximadamente a 150 mg/ml aproximadamente, de 25 mg/ml aproximadamente a 120 mg/ml aproximadamente, de 1 mg/ml a 100 mg/ml aproximadamente, de 25 mg/ml a 100 mg/ml aproximadamente, de 50 mg/ml aproximadamente a 100 mg/ml aproximadamente, de 50 mg/ml aproximadamente a 75 mg/ml aproximadamente, de 100 mg/ml aproximadamente a 150 mg/ml aproximadamente y otros similares. Por ejemplo, la concentración de la proteína de fusión en la composición farmacéutica puede ser aproximadamente de 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml ó 200 mg/ml. El pH de dicha composición farmacéutica se ubica en el intervalo de pH 4 aproximadamente a pH 10 aproximadamente, incluido de pH 5 aproximadamente a pH 9 aproximadamente, de pH 6.5 aproximadamente a pH 8.5 aproximadamente, de pH 6.0 aproximadamente a pH 8.0 aproximadamente, de pH 6.5 aproximadamente a pH 7.5 o de pH 7.0 aproximadamente a pH 8.0 aproximadamente. El tratamiento de mantenimiento para prevenir o suprimir el rechazo de un trasplante de un órgano se lleva a cabo mediante la administración de una cantidad eficaz desde el punto de vista terapéutico de la CTLA-4-lg (por ejemplo, una dosis eficaz) al paciente que ha recibido un trasplante de un órgano (por ejemplo, un trasplante de riñon) por vía intravenosa o por inyección subcutánea. El lugar de la inyección puede ser, por ejemplo, un brazo, el torso o una pierna del paciente. La dosis eficaz de la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante administrada típicamente es, entre otras, por ejemplo, entre aproximadamente 0.01 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal aproximadamente de un paciente humano adulto, como por ejemplo; entre 0.01 y 5.0 mg/kg; entre 0.01 y 3.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.05 y 2.5 mg/kg; entre 0.1 y 2.0 mg/kg aproximadamente; entre 0.1 y 1.0 mg/kg; entre 0.01 y 0.05 mg/kg aproximadamente; entre 0.5 y 1.5 mg/kg aproximadamente; entre 1.0 y 4.0 mg/kg aproximadamente; entre 1.0 y 3.0 mg/kg aproximadamente; entre 1.0 y 2.0 mg/kg aproximadamente; incluidos, entre otros; aproximadamente 0.01 mg/kg; 0.05 mg/kg; 0.075 mg/kg; 0.1 mg/kg; 0.15 mg/kg; 0.2 mg/kg; 0.25 mg/kg; 0.3 mg/kg; 0.5 mg/kg; 0.75 mg/kg; 1 mg/kg; 1.25 mg/ml; 1.5 mg/kg; 2 mg/kg; 2.5 mg/kg; 3 mg/kg; 4 mg/kg; 5 mg/kg; 10 mg/kg; 20 mg/kg; 25 mg/kg; 50 mg/kg; 75 mg/kg ó 100 mg/kg de peso corporal del paciente se administran al paciente. Como alternativa, se puede utilizar una cantidad o dosis eficaz, o intervalo de dosis descrito en la sección anterior "Procedimientos de la invención". La dosis de proteína de fusión que se administrará se determina sobre la base de la potencia de la proteína de fusión y/o la gravedad de los síntomas o signos de rechazo de un trasplante de un órgano que el paciente presente. La cantidad total de proteína de fusión CTLA-4-lg mutante que se administra al paciente puede ser, por ejemplo, entre 0.01 mg aproximadamente y 100 mg aproximadamente, típicamente entre 1 mg y 100 mg aproximadamente, entre 10 mg y 100 mg, entre 10 mg aproximadamente y 75 mg aproximadamente, o entre 10 y 50 mg aproximadamente. El volumen de la composición farmacéutica que se administra al paciente se determina sobre la base de la concentración de la proteína de fusión en la composición y la dosis de proteína de fusión que se administrará. La proteína de fusión se puede administrar cualquier día después del trasplante, por ejemplo, el día 1 , 4, 7, 14, 28, 56, 84, etc. después del trasplante. En el caso de la inyección subcutánea, se administran típicamente entre uno y dos mililitros de la composición farmacéutica. En el caso de la inyección intravenosa, se puéde administrar un volumen adecuado de la composición farmacéutica que contenga la proteína de fusión. Después de inyectar la dosis inicial, se puede administrar al paciente una segunda dosis idéntica de la proteína de fusión por vía subcutánea o intravenosa en la semana 1 , 2, 3 ó 4 posteriores a la dosis inicial. El plan de administración puede ser una dosis cada dos semanas, una dosis por mes, una dosis cada dos meses, etc. según, por ejemplo, el estado del paciente. Las dosis posteriores se pueden administrar cada cuatro semanas, o con mayor o menor frecuencia, según sea necesario, y se puede continuar, se así se desea, con dosis mensuales. Es posible que la frecuencia de administración varíe según el estado del paciente y también es posible que dependa de la gravedad de los síntomas o los signos de rechazo a un trasplante de un órgano que el paciente presente. Se espera que este tratamiento reduzca o alivie uno o más signos, síntomas o respuestas biológicas asociadas al rechazo del trasplante de un órgano, como por ejemplo, rechazo agudo del órgano trasplantado, rechazo crónico del órgano trasplantado, disminución de la función del órgano trasplantado, aumento de los niveles de creatinina en suero en el paciente y/o aumento de infiltración de células T en el órgano trasplantado. Es posible que este tratamiento reduzca la probabilidad de rechazo del órgano trasplantado por parte del sistema inmunitario del paciente.

EJEMPLO 11 Evaluación farmacocinética de las proteínas de fusión CTLA-4-lgG2 mutantes en ratas.

La concentración en suero de un agente terapéutico después de la administración externa a un organismo vivo influye en gran medida la eficacia terapéutica y se determina mediante una evaluación farmacocinética (PK). En el siguiente procedimiento, se evaluaron los perfiles farmacocinéticos en ratas para los artículos de prueba D3-29-lgG2, D3-54-lgG2, D3-56-lgG2, D3-69-lgG2 y D3-75-lgG2 de CTLA-4-lgG2 mutantes representativos en comparación con los artículos de prueba de las proteínas de fusión hCTLA-4-lgG2 y Orencia®. A continuación se describe el diseño del estudio, los datos generados y su interpretación.

Diseño del estudio en vivo. Se utilizaron ratas Hans Wistar macho de peso equivalente después de un período de aclimatación de al menos 5 días. Se calcularon los volúmenes de dosis de artículo de prueba para cada animal según el peso de manera de que todos recibieran 1mg/kg de artículo de prueba. Por lo tanto, una rata típica de 150 gramos (g) recibió un volumen de dosis de 150 µ?, ya que se preparó cada artículo de prueba a una concentración de 1 mg/ml en PBS. Se realizó una única administración de un artículo de prueba de CTLA-4-lgG2 mutante mencionado anteriormente, hCTLA-4lgG2 o proteína de fusión Orencia®, ya sea por vía intravenosa (i.v. o IV) en bolo o por vía subcutánea (se abrevia "s.c." o "SC"). El tamaño del estudio resultó suficiente para un mínimo de cuatro muestras de sangre de 300 µ? por período y, a su vez, limitó el volumen de la sangre extraída de cualquiera de las ratas a no más de 10% del volumen total de sangre. La secuencia temporal de la toma de muestras de sangre fue o bien previa a la dosis, 5 minutos (min), 30 min, 2 horas (h), 4 h, 8 h, 1 día (d), 2 d, 3 d, 4 d, 6 d, 8 d, 10 d, 12 d y 14 d posterior a la dosis, ó 5 min, 30 min, 2 h, 4 h, 8 h, 1 d, 2 d, 3 d, 4 d, 6 d, 8 d, 10 d,11 d, 12 d, 13 d, 14 d y 15 d posterior a la dosis, para las administraciones por vía intravenosa y por vía subcutánea, respectivamente. Se preparó suero a partir de las muestras de sangre individuales y se analizó mediante ELISA para cuantificar la presencia del artículo de prueba administrado.

Procedimiento ELISA de PK. La proteína de fusión CTLA-4-lgG2, hCTLA-4lgG2 u Orencia® presente en las muestras de suero estaba unida a CD80 humano-lgG murina (descrita anteriormente) que se encontraba recubriendo placas de microvaloración. La detección se logró mediante añadido de IgG de cabra anti humana conjugada con peroxidasa de rábano (HRP) (Jackson ImmunoResearch #109-035-098). Se realizó la cuantifícación utilizando un sustrato de HRP cromogénico; 3.3',5.5'-tetrametilbenzidina (TMB), más peróxido de hidrógeno (Kem-En-Tec #4390A), por el cual se detuvo la reacción mediante añadido de ácido sulfúrico 0.2N (H2SO4) y se midió la absorbancia óptica con un espectrofotómetro a 450 nm. Se diluyeron las muestras de suero 1/20 antes de añadirse a la placa de ELISA, de manera que la matriz se normalizó a suero de rata al 5% y se volvió a diluir en suero de rata al 5% hasta realizar ocho diluciones en total. Se cuantificó la concentración de cada muestra de suero diluida con respecto a una curva estándar preparada utilizando valoraciones del mismo artículo de prueba adicionado con suero de rata al 5%. La curva estándar se ubicaba en el intervalo entre 10 y 0.078 ng/ml y se determinó que el intervalo de precisión se ubicaba entre el doble de la referencia y 5 ng/ml en el suero de rata al 5%. Se evaluó la calidad de la curva estándar mediante controles de calidad del mismo artículo de prueba preparado en suero de rata al 5% a concentraciones alta, media y baja del intervalo de precisión de la curva estándar. El criterio de aceptación del control de calidad era que la concentración de control de calidad observada se ubicara dentro del 20% de la concentración de control de calidad esperada. Se obtuvo la concentración de una muestra de suero no conocida individual realizando un promedio de las concentraciones asignadas a diluciones con densidades ópticas ubicadas dentro del intervalo de precisión de la curva estándar. Se utilizaron al menos 4 muestras de suero individuales para calcular la concentración sérica promedio en cada período nominal.

Parámetros farmacocinéticos. Las figuras 15A y 15B muestran perfiles farmacocinéticos para la proteína de fusión Orencia®, hCTLA-4-lgG2 y las proteínas de fusión CTLA-4-lgG2 mutantes administradas a razón de 1 mg/kg en un único (A) bolo intravenosa (IV) o (B) en una inyección subcutánea (SC) en ratas. Las barras de error representan la desviación estándar de los (SD) promedio. La línea punteada representa el límite inferior de cuantificación para el ELISA (~3 ng/ml para el artículo de prueba en suero al 100%). La concentración sérica promedio en cada período nominal después de la administración del artículo de prueba en el tiempo 0 h comprende los datos del perfil semilogarítmico de concentración en función del tiempo en la figura 15. Las concentraciones séricas promedio se utilizaron para generar parámetros farmacocinéticos utilizando WinNonLin modelo 201 (entrada por bolo intravenoso) o modelo 200 (entrada extravascular) para las vías de administración intravenosa o subcutánea, respectivamente. En el cuadro 10 se resumen los parámetros farmacocinéticos más importantes para las vías de administración subcutánea e intravenosa, respectivamente.

CUADRO 10 Resumen de parámetros de PK para las proteínas de fusión Orencia®. hCTLA-4-lgG2 y proteínas de fusión CTLA-4-lgG2 m uta n tes administradas a las ratas a razón de 1 mg/kg en un único bolo por vía intravenosa o subcutánea Compuesto Vía Cmáx.(ug/L) T1/2 AUC Cl Vz (h) (h*ng/L) (ml/h/kg) (ml/kg) Orencia SC 3.3 70.0 391 2.6 258.13 CTLA- SC 5.9 45.0 838 1.2 77.49 4lgG2 SC D3-29 SC 4.6 11.2 650 1.5 24.90 D3-54 SC 4.5 23.6 528 1.9 64.52 D3-56 SC 7.4 23.7 1049 1.0 32.67 D3-69 SC 6.0 28.1 967 1.0 41.97 D3-75 9.0 56.4 1204 0.8 67.59 Orencia IV 22.3 42.3 728 1.37 83.9 CTLA- IV 66.2 49.8 2483 0.40 29.0 4lgG2 IV D3-29 IV 43.0 33.0 912 1.10 52.2 D3-54 IV 20.6 39.4 1034 0.97 55.0 D3-56 IV 34.2 15.3 1822 0.55 12.1 D3-69 IV 81.9 83.0 2133 0.47 56.1 D3-75 IV 30.1 65.4 2326 0.43 40.5 Cmax se refiere a la concentración máxima de artículo de prueba en suero. EL valor de la semivida de eliminación (T1/2) es el tiempo medido en horas en el que la concentración del artículo de prueba en el suero disminuye a la mitad durante la fase terminal del perfil de concentración en función del tiempo. El área bajo la curva de concentración sérica en función del tiempo (AUC) se cuantifica a partir de cero hasta el infinito utilizando la regla del trapecio. Se calculó la eliminación (clearance, Cl) utilizando la ecuación dosis/AUC, mientras que el volumen de distribución (Vz) de la fase terminal se calculó utilizando la ecuación Cl/k.

En el cuadro 11 se presenta el factor de biodisponibilidad (F) de cada compuesto, que se determinó mediante el cálculo de AUC por vía subcutánea/ AUC por vía intravenosa.

CUADR0 11 Comparación de biodisponibilidad entre las proteínas de fusión Orencia®, hCTLA-4-lq2, D3-29-lgG2, D3-54-lgG2, D3-56-lgG2, D3-69-lqG2 y D3-75-lgG2.

En las proteínas de fusión CTLA-4lgG2 humana y Orencia® se observaron perfiles farmacocinéticos similares a pesar de su diferencia en los marcos de IgG, lo que implica que las porciones de Fe de lgG2 humana y de lgG1 humana mutada de estos respectivos artículos de prueba presentan actividad farmacocinética semejante cuando el dominio funcional es constante. Por lo tanto, se deduce que cualquier cambio que se observe en el perfil farmacocinético de las proteínas de fusión CTLA-4-lgG2 mutantes en comparación con la proteína de fusión Orencia® se debe atribuir a las diferencias en el dominio funcional y no a la porción de Fe.

Para cada proteína de fusión CTLA-4-lgG2 mutante, la eliminación fue lenta tal como lo sugerían los altos valores de semívida de eliminación y el gran tamaño de las áreas bajo las curvas. Los valores de semivida de eliminación oscilaron entre 1 1.2 y 56.4 horas para la administración subcutánea y entre 15.3 y 83.0 horas para la administración intravenosa en comparación con la proteína de fusión Orencia®, que presentó una semivida de eliminación de 70.0 ó 42.3 horas cuando se administró por vía subcutánea o intravenosa, respectivamente. Los valores de AUC de las proteínas de fusión CTI_A-4-lgG2 mutantes en promedio fueron superiores a los de la proteína de fusión Orencia®. Después de la administración subcutánea, el promedio fue 879.5 +/- 281.6 h*kg*ng/L/mg en comparación con 391 h*kg*ng/L/mg para la administración subcutánea en la proteína de fusión Orencia®, mientras que en la administración intravenosa se produjo un AUC promedio de 1645.5 +/- 641.1h*kg*ng/L/mg en comparación con 728h*kg*ng/L/mg para la administración intravenosa en la proteína de fusión Orencia®. El volumen de distribución fue similar en ambas vías de administración ya que las proteínas de fusión CTLA-4-lgG2 mutantes se distribuyeron por fuera del suero, pero dentro del líquido extravascular tal como lo sugirió el valor promedio de 44.8 ml/kg; que es superior al volumen de referencia del plasma de 30 ml/kg, y dentro del límite de referencia del líquido extracelular de 300 ml/kg para una rata estándar (Davies, B. et al, Pharm. Res. 10(7):1093-95 (1993)).

La biodisponibilidad también fue similar para la mayoría de las proteínas de fusión CTLA-4-lgG2 mutantes, con un promedio de 0.6+/- 0.1 ; que supera a la biodisponibilidad de 0.53 de la proteína de fusión Orencia®. Por último, la Cmax resultó, en general, más alta para las proteínas de fusión CTLA-4-lgG2 mutantes que para la proteína de fusión Orencia®. Los valores de Cmax oscilaron entre 4.5 y 9.3ug/L para la administración subcutánea y entre 20.6 y 81.9ug/L para la administración intravenosa en comparación con la proteína de fusión Orencia®, que presentó una Cmax de 3.3 ó 22.3ug/L cuando se administró por vía subcutánea o intravenosa, respectivamente. En general, los datos farmacocinéticos mostraron que todas las proteínas de fusión CTI_A-4-lgG2 mutantes evaluadas presentaban típicamente un perfil farmacocinético no inferior al de la proteína de fusión Orencia® cuando se administran a ratas a 1mg/kg por vía subcutánea o intravenosa y que las porciones de Fe de lgG1 o de lgG2 son semejantes cuando el dominio funcional es constante.

EJEMPLO 12 El presente ejemplo describe un procedimiento para crear una línea celular transfectada estable para expresar proteínas de fusión CTLA4-lg mutantes de la invención, para utilizar la línea celular para la producción a escala laboratorio habitual de la proteína de fusión CTLA4-lg muíante y para purificar las proteínas de fusión CTLA-4-lg mutantes del medio de expresión celular. Aunque el presente ejemplo describe en particular un procedimiento para crear una línea celular CHO-K1 transfectada estable para expresar la proteina de fusión D3-54-lgG2, para utilizar dicha célula para producir a escala laboratorio y para purificar la proteína que se encuentra en el medio, se pueden utilizar los procedimientos que se describen aquí con cualquier proteína de fusión CTLA-4-lg mutante de la invención y/o con cualquiera de las líneas celulares que corresponda según se hizo referencia anteriormente.

Creación de una línea celular transfectada estable.

Materiales Células CHO-K1 vírgenes (no transfectadas): Se almacenaron células CHO-K1 adaptadas a cultivo en suspensión sin suero en medio químicamente definido (ID. de célula: M4-PeM-0436- 112-01) en nitrógeno líquido en fase de vapor (Dewar MVE1536P). Se descongeló un recipiente con M4-PeM-0436-112-01 y se cultivó en medio CD OptiCHO™ (Invitrogen, #12681) en matraces de agitación. Los cultivos proporcionaron células para la transfección y un medio condicionado para el crecimiento y la clonación. Los cultivos se realizaron a 37 °C, C02 al 5%.

Plásmido: Se introdujo ADN que codifica el DEC de CTLA-4 mutante D3-54 fusionado a una región de Fe de lgG2a humana en el vector CET1019AS UCOE (Millipore) y se utilizó la CET1019AS-D3-54-lgG2 plasmídica resultante para todas las transfecciones.

Medio de cultivo celular: Para todos los cultivos, se utilizó medio químicamente definido sin componentes de origen animal, CD Opti-CHO (Invitrogen #12681), complementado con 2% v/v de L-glutamina 200 mM (Invitrogen #25031).

Medio condicionado: Se obtuvo el medio condicionado mediante el cultivo de la línea celular CHO-K1 parental en medio CD Opti-CHO. Cuando el recuento de células fue de > 5 x 105 células/ml, se centrifugó el cultivo de células y se filtró el sobrenadante del medio condicionado mediante filtración estéril. Se preparó el medio condicionado el día mismo de su utilización o se lo guardó a 2J8°C durante 7 días como máximo.

Medio condicionado al 50%: medio condicionado (mencionado anteriormente) combinado con un mismo volumen de medio de cultivo de células fresco; se prepara el mismo día de su utilización.

Procedimientos analíticos. Se realizó el recuento de células y la determinación de viabilidad con un contador de células Cedex o Cedex HiRes (Innovatis). Se realizó la evaluación inicial de los clones que expresan la proteína de fusión CTLA-4-lg mutante (D3-54-lgG2) en cuanto a la producción mediante ELISA. Las placas de ELISA se recubrieron durante la noche con proteína de fusión hCD80-lg murino. Al día siguiente, se traspasaron las muestras que se someterían a análisis a las placas de ELISA en diluciones de 50 y 200 veces por duplicado. Después de dos horas de incubación, se añadió anticuerpo anti IgG humana-HRP y se incubó durante 30 minutos. Se ampliaron las placas con TMB y se realizó una lectura de las mismas a 450 nm. Se informaron las densidades ópticas (OD). Se realizó una determinación cuantitativa de la concentración de la proteína de fusión D3-54-lgG2 mediante el procedimiento de HPLC de proteina A utilizando una columna Poros A/20 (ABI # 1-5024-12). Se utilizaron dos tampones: tampón A: ácido fosfórico 50 mM, cloruro de potasio 150 mM, pH 7.6 ± 0.1 y Tampón B: ácido fosfórico 50 mM, cloruro de potasio 150 mM, pH 2.5 ± 0.1. Además, se añadió isopropanol al 5% a ambos tampones. Después de la inyección de la muestra, se llevó a cabo el equilibrio y el lavado de la muestra con 42% de tampón A y 58% de tampón B (pH 6.5). La elución fue de gradiente lineal para 12% de tampón A y 88% de tampón B durante 1 minuto.

Procedimiento. Se adaptaron las células CHO-K1 adherentes vírgenes utilizadas para la creación de las lineas celulares estables que se utilizaron para la producción GMP de la proteína de fusión D3-54-lgG2 a un cultivo en suspensión en medio químicamente definido CD OptiCHO™. Se descongeló un recipiente con estas células CHO-KI vírgenes y se cultivó en matraces de agitación de 125 mi con medio CD OptiCHO™ hasta una densidad de 5 x 105 células víables/ml. Se suspendieron nuevamente las células viables 2 x 106 en 400 µ? de medio condicionado al 50% y se combinaron con 20 pg de ADN plasmídico (D3-54-lgG2 en un vector CET1019AS UCEO) en una cubeta. Se realizó la electroporación con un Gene Xcell Pulser (BioRad) a 320 voltios (V) con una duración de pulsos de onda cuadrada de 15 milisegundos (ms). Se realizaron transfecciones por duplicado y se agruparon las células. Las células agrupadas se traspasaron a un matraz T-25 con 5 mi de medio condicionado al 50% y se incubaron durante dos días. Se colocaron las células transfectadas directamente en placas de 96 pocilios para la clonación o se cultivaron con selección antibiótica hasta que se obtuvo una mezcla estable y luego se colocaron en placas de 96 pocilios. Dos días después de la electroporación, se diluyó el cultivo hasta 1250 células/ml en medio condicionado con 8 pg/ml de puromicina para la presión de selección. Se colocaron las células en placas de 96 pocilios en un volumen de 200 µ? por pocilio (250 células/pocilio). Se incubaron las placas durante 10 días aproximadamente para destruir las células no transfectadas y las células transitoriamente transfectadas. Después de 10-12 días, se realizó una inspección visual de cada pocilio de cada placa para detectar pocilios con colonias únicas. Se volvió a observar estos pocilios para verificar que contuvieran colonias únicas y sanas adecuadas para expansión en placas de 24 pocilios. Dos días después de la electroporación, se centrifugó el cultivo y se suspendió nuevamente en medio condicionado al 50% con 7 pg/ml de puromicina para la presión de selección. Además, se inoculó un matraz de control con células no transfectadas en el mismo medio. Sobre la base de estudios de optimización en curso, se aumentó la concentración de puromicina a 8 pg/ml después de 3 días. La mezcla estable se generó de 10 a 12 días después de la selección, cuando se destruyeron todas las células en el matraz de control. Se verificó la expresión de producto en la mezcla estable a través de HPLC de proteína A y se verificó que la viabilidad del cultivo era > 95%. Se diluyeron las células en serie en medio condicionado sin puromicina hasta alcanzar una densidad final de 3.8 células/ml. Se sembraron las células en placas de 96 pocilios en un volumen de 200 µ? por pocilio (75 células/pocilio ó 0.8 células/pocilio). Después de un día, se realizó una inspección visual de cada pocilio de cada placa para detectar los pocilios con células o colonias únicas. Al día siguiente, se seleccionaron los pocilios con colonias únicas de 2 a 4 células. Se eliminaron todos los pocilios con más de dos colonias. Un segundo operador verificó las selecciones. Se volvieron a observar los pocilios para verificar que contuvieran colonias únicas y sanas adecuadas para dilatación en placas de 24 pocilios. Los clones de las placas de 96 pocilios se dilataron en placas de 24 pocilios con 1 mi de medio condicionado por pocilio con 8 g/ml de puromicina. Se traspasó todo el contenido de los pocilios seleccionados de las placas de 96 pocilios con colonias únicas a pocilios individuales en las placas de 24 pocilios. Se extrajeron 200 µ? de cada pocilio nuevo de la placa de 24 pocilios para lavar el pocilio correspondiente de la placa de 96 pocilios y se volvieron a traspasar. Como reserva, se añadieron 200 µ? de medio condicionado con 8 pg/ml de puromicina a cada pocilio de las placas de 96 pocilios. Después de 1 a 3 días, se tomó una muestra de cada pocilio de las placas de 24 pocilios y* se les realizó una prueba de expresión de D3-54-lgG2 mediante ELISA. Se seleccionaron clones para someterlos a una nueva dilatación sobre la base de los valores brutos de densidad óptica de ELISA y de su crecimiento adecuado. Se dilataron los mejores 35 a 40 clones de conformidad con los resultados del ELISA y del crecimiento observable en matraces T-25 que contenían 5 mi de medio condicionado con 8 pg/ml de puromicina. Se traspasó todo el contenido de los pocilios seleccionados de las placas de 24 pocilios a matraces T-25 individuales. Se lavaron las células residuales de los pocilios con el mismo medio y se añadieron al matraz T-25 correspondiente. Como reserva, se añadió 1 mi de medio condicionado con 8 g/ml de puromicina a cada pocilio de las placas de 24 pocilios. Se redujo nuevamente la cantidad de clones mediante selección de los clones con mayor productividad. Se suspendieron nuevamente las células en medio nuevo a 1-2 x 105 células viables/ml y se sembraron en matraces T25 (5 mi de cultivo) o matraces de agitación de 125 mi (12 mi de cultivo). Se incubaron los cultivos durante 22 a 24 horas y luego se determinó la densidad de las células final y la viabilidad y se tomó una muestra para determinar la concentración del producto mediante HPLC de proteína A. Se calculó la productividad mediante la división de la cantidad total de proteína producida entre la cantidad total de células viables en el matraz y la división del resultado entre la duración del cultivo. Se convirtieron las unidades a picogramos por célula por día o "pcd". Se clasificaron los clones de conformidad con sus valores de pcd, pero se omitieron los clones que no mostraron un crecimiento considerable. Se dilataron los clones mejor calificados en matraces de agitación de 125 mi para la crioconservación y la nueva evaluación del crecimiento y de la productividad. Se sembraron los clones que se iban a continuar evaluando en matraces de agitación de 250 mi a 1 x 05 células viables/ml en 50 mi de medio nuevo. Cuando la densidad de las células alcanzó 1 x 106 células viables/ml, se pasó el cultivo a un matraz de agitación nuevo, nuevamente a 1 x 105 células viables/ml en 50 mi de medio nuevo. Se repitió el pasaje una vez más. Durante este tercer pasaje, se tomaron muestras del cultivo diariamente para determinar el recuento de las células, la viabilidad y la concentración del producto mediante HPLC de proteína A. Se seleccionaron para subclonación los clones con mayor expresión de la proteína de fusión D3-54-lgG2 según los índices de crecimiento y de producción específica. Se realizó la subclonación mediante limitación de la dilución como se describió en la sección anterior para las mezclas estables, con la salvedad de que no se utilizó puromicina en ningún momento. La dilatación, la detección y la evaluación de los subclones también se realizaron como se describió anteriormente. Se realizaron varios pasajes de los subclones seleccionados en los matraces de agitación durante aproximadamente 90 días para evaluar la estabilidad de la producción. En cada pasaje, se sembraron las células en matraces de agitación de 125 mi a 1 x 105 células viables/ml en 25 mi de medio nuevo. Se realizaron pasajes de los cultivos cada 3 a 4 días. Antes de cada pasaje, se midió la densidad celular y la viabilidad, y se tomó una muestra para determinar la concentración del producto medíante HPLC de proteína A. Se crioconservaron los clones y los subclones seleccionados desde el momento de la clasificación con los valores de pcd hasta varios momentos en la evaluación de la estabilidad. Se preparó medio de congelación fresco con 90% de medio de cultivo y DMSO al 10% (Sigma). Se centrifugaron las células de los matraces de agitación y se suspendieron nuevamente en medio de congelación a densidades en el intervalo 2 - 10 x 106 células/ml. Se dividió la suspensión celular en alícuotas de 1 mi en frascos criogénicos. Se colocaron los frascos criogénicos en recipientes de congelación de isopropanol y se guardaron a -80°C durante la noche. Al día siguiente, se traspasaron los frascos congelados a almacenamiento con nitrógeno líquido en fase de vapor.

Producción de proteínas de fusión CTLA4-lgG2 mutantes. Se descongeló un criovial con un volumen de 1 mi de células CHO-K1 que expresan la proteína de fusión D3-54-lgG2 y se cultivó en matraces de agitación de 125 mi con medio CD OptiCHO™ a 37°C y con C02 al 5% hasta una densidad de 5 x 105 células viables/ml. Se combinaron varios matraces para inocular una bolsa wave a 1-2 x 105 células/ml en un volumen de 5 ó 10 I de volumen de medio CD OptiCHO™ con glutamina 4 mM. El cultivo en la bolsa wáve se mantiene en una incubadora a 37°C complementado con C02 al 5% sobre una plataforma oscilante a 18-22 rpm y con un ángulo de 8 grados para equipos comercializados por Sartorius Stedim Biotech. Se toman muestras del cultivo a diario para obtener el recuento de células, la viabilidad, el nivel de nutrientes, el perfil de los metabolitos y el nivel de expresión de la CTLA-4-lgG2 mutante (es decir, D3-54-lgG2) utilizando un ensayo de HPLC de proteína A. Se cosechó el cultivo cuando la viabilidad disminuyó a ~50%, típicamente entre 9 y 1 1 días después de la inoculación. Se aclaró el material de cultivo celular mediante filtración utilizando una combinación de filtración profunda y filtración estéril, y o se continúo utilizando inmediatamente en otros procedimientos o se guardó a 2-8 °C.

Purificación de proteínas de fusión CTLA-4-lqG2 mutantes. Se purificaron las proteínas de fusión CTLA4-lgG2 mutantes (D3-54-lgG2) mediante cromatografía de afinidad de proteína A utilizando un sistema de HPLC AKTA Explorer (GE Healthcare). Se unió una proteina de fusión CTLA-4-lg (D3-54-lgG2) mutante a columnas FF de proteína A MabSelect (GE Healthcare, #17-5079-01) en tampón de PBS (Invitrogen), se colocó a una concentración ~10mg/ml de medio de cromatografía, se lavó con el mismo tampón, se eluyó con tampón de ácido cítrico 100 mM (pH 4.0) y luego se neutralizó mediante agregado de base Tris 2M en un volumen de 1/10. Se volvió a procesar la muestra de proteína A purificada mediante diafiltración utilizando un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) con un cambio de tampón por Tris-CI 20mM, pH 7.5. Se volvió a purificar la muestra de proteína con cambio de tampón mediante cromatografía de intercambio amónico en una columna Q-Sefarosa, donde se coloca con una densidad ~10mg/ml. Se eluye la proteína unida utilizando un gradiente lineal de NaCI de 20 volúmenes de columna (CV) de NaCI 0-500mM en Tris-CI 20 mM, pH 7.5. Se agruparon las fracciones pico más importantes y se determinó la concentración mediante medición de la absorbancia a 280 nm. Se confirmó la pureza de la proteína mediante análisis SDS- PAGE y se determinó el contenido de monómero utilizando un procedimiento de HPCL de exclusión por tamaño. Se almacenaron las muestras en alícuotas a 2-8°C o a -20°C si demoran en ser utilizadas.

Aunque la invención anterior ha sido descrita lo suficiente como para resultar clara y comprensible, los entendidos en la técnica comprenderán a partir de la lectura de lo divulgado en la presente patente que se pueden aplicar diversos cambios en cuanto a la forma y los detalles, sin apartarse del verdadero alcance de la invención. Se entiende que los materiales, los ejemplos y las realizaciones descritos en el presente documento se presentan únicamente con el objetivo de ilustrar la invención y no pretenden ser excluyentes, y que, en virtud de lo anterior, se sugiere a los entendidos en la técnica aplicar diversas modificaciones o cambios, los que deberán incluirse dentro del alcance y el espíritu de la presente solicitud y del alcance de las reivindicaciones que se adjuntan. Todas las publicaciones, las solicitudes de patentes, las patentes u otros documentos mencionados se incorporan en su totalidad como referencia a todos los efectos y en la misma medida en que se incorporarían si se indicara cada publicación, patente, solicitud de patente u otro documento específico como incorporado específicamente en su totalidad con relación al presente documento a todos los efectos. Ante la eventualidad de que se produzca algún conflicto, regirá la presente memoria, incluidas las definiciones.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido aislado o recombinante que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 96% con la SEQ ID NO: 36, donde el polipéptido se une a CD80 humano o CD86 humano o a un dominio extracelular de alguno de éstos y tiene una mayor capacidad para inhibir una respuesta inmunitaria que un polipéptido de LEA29Y que comprende la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEQ ID NO: 168.

2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polipéptido comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 97%, 98% ó 99% con la SEQ ID NO: 36.

3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polipéptido comprende la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEQ ID NO: 36.

4. Un polipéptido aislado o recombinante que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95% con la SEQ ID NO: 50, donde el polipéptido se une a CD80 humano o CD86 humano o a un dominio extracelular de alguno de éstos y tiene una mayor capacidad para inhibir una respuesta inmunitaria que un polipéptido de LEA29Y que comprende la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEQ ID NO: 168.

5. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el polipéptido comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 96%, 97%, 98% ó 99% con la SEQ ID NO: 50.

6. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el polipéptido comprende la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEQ ID NO: 50.

7. Un dímero de un polipéptido aislado o recombinante que comprende dos polipéptidos de cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el dímero tiene mayor capacidad para suprimir una respuesta inmunitaria que un dímero que comprende dos dominios extracelulares de CTLA-4 humano o dos polipéptidos de LEA29Y, donde cada polipéptido de LEA29Y contiene la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEQ ID NO: 168.

8. El dímero de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el dímero tiene una constante de equilibrio de disociación (KD) de CD86 menor que la constante de equilibrio de disociación (KD) de CD86 de un dímero que comprende dos dominios extracelulares de CTLA-4 humano o dos polipéptidos de LEA29Y, donde cada polipéptido de LEA29Y contiene la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEQ ID NO: 168.

9. Una proteína de fusión aislada o recombinante que comprende (a) un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y (b) un segundo polipéptido donde el segundo polipéptido es un polipéptido de Fe de Ig, donde la proteína de fusión tiene una mayor capacidad para suprimir una respuesta inmunitaria que una proteína dé fusión LEA29Y-lg, y donde la proteína de fusión LEA29Y-lg contiene la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 166.

10. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque la proteína de fusión comprende la secuencia de polipéptidos que se muestra en las SEQ ID NO: 197 ó 2

11. 11. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque la proteína de fusión comprende la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEQ ID NO: 199 ó en la SEQ ID NO: 213.

12. Un dimero de una proteína de fusión aislada o recombinante que comprende dos proteínas de fusión monoméricas unidas por al menos un enlace disulfuro formado entre dos residuos de cisteína presentes en cada proteína de fusión monomérica mutante, donde cada proteína de fusión monomérica comprende (a) un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y (b) un polipéptido de Fe de Ig, y donde el dimero de la proteína de fusión tiene una mayor capacidad para suprimir una respuesta inmunitaria que un dimero de una proteína de fusión LEA29Y-lg, donde el dimero de la proteína de fusión LEA29Y-lg comprende dos proteínas de fusión LEA29Y-lg monoméricas y cada una de ellas contiene la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 166.

13. El dímero de la proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el dímero de la proteína de fusión tiene una constante de equilibrio de disociación (KD) de CD86 menor que la constante de equilibrio de disociación (KD) de CD86 de un dímero de la proteína de fusión LEA29Y-lg, donde el dímero de la proteína de fusión LEA29Y-lg contiene dos proteínas de fusión LEA29Y-lg monoméricas y cada una de ellas contiene la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 166.

14. El dímero de la proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 12 o de la reivindicación 13, caracterizado además porque cada proteína de fusión monomérica comprende la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEQ ID NO: 197 ó 211.

15. El dímero de la proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 12 o de la reivindicación 13, caracterizado además porque cada proteína de fusión monomérica comprende la secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEQ ID NO: 199 ó 213.

16. Un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un dímero de un polipéptido de la reivindicación 7 o de la reivindicación 8, una proteína de fusión de cualesquiera de las reivindicaciones 9 a 11 , o un dímero de una proteína de fusión de cualesquiera de las reivindicaciones 12 a 15, o una secuencia de polinucleótidos complementaria de éstos.

17. Un vector que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 16.

18. Una célula huésped aislada o recombinante que comprende: (a) un polipéptido de cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6; (b) un dímero de un polipéptido de la reivindicación 7 ó de la reivindicación 8; (c) una proteína de fusión de cualesquiera de las reivindicaciones 9 a 11 ; (d) un dímero de una proteína de fusión de cualesquiera de las reivindicaciones 12 a 15; (e) un ácido nucleico de la reivindicación 16; y/o (f) un vector de la reivindicación 17.

19. Una composición farmacéutica compuesta por un excipiente farmacéuticamente aceptable o un vehículo farmacéuticamente aceptable y uno o más de los siguientes: (a) un polipéptido de cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6; (b) un dímero de un polipéptido de la reivindicación 7 u 8; (c) una proteína de fusión de cualesquiera de las reivindicaciones 9 a 11 ; (c) un dímero de una proteína de fusión de cualesquiera de las reivindicaciones 12 a 15; (d) un ácido nucleico de la reivindicación 16; (e) un vector de la reivindicación 17; y/o (f) una célula huésped de la reivindicación 18.

20. Un polipéptido de cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un dímero de un polipéptido de la reivindicación 7 u 8, una proteína de fusión de cualesquiera de las reivindicaciones 9 a 11 , un dímero de una proteína de fusión de cualesquiera de las reivindicaciones 12 a 15, un ácido nucleico de la reivindicación 16, un vector de la reivindicación 17 ó una célula de la reivindicación 18 para su utilización en la supresión o la inhibición de una respuesta inmunitaria en un mamífero.

21. El uso de un polipéptido de cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un dímero de un polipéptido de la reivindicación 7 u 8, una proteína de fusión de cualesquiera de las reivindicaciones 9 a 11 , un dímero de una proteína de fusión de cualesquiera de las reivindicaciones 12 a 5, un ácido nucleico de la reivindicación 16, un vector de la reivindicación 17 ó una célula de la reivindicación 18 para la fabricación de un medicamento para suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria en un mamífero.

22. Un polipéptido de cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un dímero de un polipéptido de la reivindicación 7 u 8, una proteína de fusión de cualesquiera de las reivindicaciones 9 a 11 , un dímero de una proteína de fusión de cualesquiera de las reivindicaciones 12 a 15, un ácido nucleico de la reivindicación 16, un vector de la reivindicación 17 ó una célula de la reivindicación 18 para su utilización en el tratamiento de una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario.

23. El uso de un polipéptido de cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un dímero de un polipéptido de la reivindicación 7 u 8, una proteína de fusión de cualesquiera de las reivindicaciones 9 a 11 , un dímero de una proteína de fusión de cualesquiera de las reivindicaciones 12 a 5, un ácido nucleico de la reivindicación 6, un vector de la reivindicación 7 ó una célula de la reivindicación 18 para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario.

24. Un polipéptido de cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un dimero de un polipéptido de la reivindicación 7 u 8, una proteína de fusión de cualesquiera de las reivindicaciones 9 a 11 , un dimero de una proteína de fusión de cualesquiera de las reivindicaciones 12 a 15, un ácido nucleico de la reivindicación 16, un vector de la reivindicación 17 ó una célula de la reivindicación 18 para su utilización en el tratamiento del rechazo de un trasplante de tejidos u órganos en un mamífero.

25. El uso de un polipéptido de cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un dimero de un polipéptido de la reivindicación 7 u 8, una proteína de fusión de cualesquiera de las reivindicaciones 9 a 11 , un dimero de una proteína de fusión de cualesquiera de las reivindicaciones 12 a 15, un ácido nucleico de la reivindicación 16, un vector de la reivindicación 17 ó una célula de la reivindicación 18 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del rechazo de un trasplante de tejidos u órganos en un mamífero.