JP3816518B2 - 相補的なアデノウイルスベクター系と細胞系 - Google Patents
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Description
本願は、1994年6月10日に出願された同時係属中の米国特許出願第08/258,416号の一部継続出願である。
発明の技術分野
本発明は、組換え多重欠損アデノウイルスベクターおよび当該ベクターの培養に有用な相補的細胞系に関する。さらに、本発明は、該ベクターの医療的用途に関する。
発明の背景
1952〜1953年の冬から春にかけて、国立衛生研究所(NIH)のロウとその共同研究者らは、ワシントン特別区に住む幼児から外科的に切除されたアデノイド(腺様増殖組織)を取得し、組織培養を行った(Roweら,Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 84, 570-573(1953))。数週間後、該培養の多くが上皮細胞の破壊を特徴とする進行性の変性を示し始めた。この細胞変性効果は培養濾液によって、樹立されたヒト細胞系の組織培養物に連続的に伝達することができた。該細胞変性剤は「アデノイド変性」(Ad)剤と呼ばれた。「アデノウイルス」の名前は、最終的に、これらの薬剤に一般的に使われる名称になった。アデノウイルスの多くの原型株−その中の幾つかは呼吸疾患を引き起こす−の発見がこれら最初の発見に続いた[Roweら,上述;Dingleら,Am. Rev. Respir. Dis., 97, 1-65(1968);Horwitz,「アデノウイルス科とそれらの複製」(Adenoviridae and Their Replication),ウイルス学(Virology)(Fieldsら編,レイヴン出版社,ニューヨーク,第2版,1990年),1679-1721頁に総説]。
ヒトから40を越すアデノウイルスサブタイプが単離されており、さらに加えて50を越すサブタイプが他の哺乳類又は鳥類から単離されている(Ishibashiら,「動物のアデノウイルス」(Adenoviruses of animals),アデノウイルス(The Adenoviruses),Ginsberg編,プレナム出版,ニューヨーク,ニューヨーク州,497-562頁,(1984年);Strauss,「ヒトにおけるアデノウイルス感染」(Adenovirus infections in humans),アデノウイルス(The Adenoviruses),Ginsberg編,プレナム出版,ニューヨーク,ニューヨーク州,451-596頁,(1984年))。これらのサブタイプは全てアデノウイルス科に属し、現在のところ2つの属、すなわちマストアデノウイルス属とアビアデノウイルス属とに分けられている。
全てのアデノウイルスは形態的および構造的に類似している。しかしながら、ヒトにおいては、アデノウイルスは互いに異なる免疫学的特性を有するがために、血清型に分けられている。2つのヒトアデノウイルス血清型、すなわち、Ad2とAd5は徹底的に研究されてきた。これらの研究によりアデノウイルス一般についての情報の大部分が提供された。
アデノウイルスはエンベロープを有さず、正二十面体で直径が65〜80nm、外部キャプシドと内部コアから成る。キャプシドは、20の三角形の表面すなわち切子面と12の頂点から成る(Horneら,J. Mol. Biol., 1, 84-86(1959))。切子面はヘキソンで、頂点はペントンで構成されている。各頂点からファイバーが突出している。ヘキソン、ペントンおよびファイバーに加えて、8つの微量の構造ポリペプチドがあるが、それらの大多数の正確な位置は不明である。ある微量ポリペプチド成分、すなわち、ポリペプチドIXは、各切子面の9群中心(the group-of-nine center)といわれる場所において、ヘキソン−ヘキソンの接点を安定化させ得る位置で結合している(Furcinittiら,EMBO, 8, 3563-3570(1989))。微量ポリペプチドVIおよびVIIIは、隣接する切子面間のヘキソン−ヘキソンの接点を安定化させると信じられている。微量ポリペプチドIIIAは、頂点の領域に位置することが知られているが、キャプシドとコアとを繋いでいることがStewartら、(Cell, 67, 145-154(1991))によって示唆されている。
ウイルスコアは、単離物によっては長さが103塩基対〜163塩基対と変化することが観察されている逆位末端反復配列(ITRs)を有する直鎖状の二本鎖DNA分子を含有すると言われている(Garonら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2391-2394(1972);Wolfsonら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 3054-3057(1972);Arrandら,J. Mol. Biol., 128, 577-594(1973);Steenbergら,Nucleic Acids Res., 4, 4371-4389(1977);およびTooze,DNA腫瘍ウイルス(DNA Tumor Viruses),第2版,コールドスプリングハーバー,ニューヨーク:コールドスプリングハーバー研究所,943-1054頁,(1981年))。ITRはDNAの複製起点を担持する(Garonら,上述;Wolfsonら,上述;Arrandら,上述;Steenbergら,上述)。
ウイルスDNAは4つのポリペプチド、すなわち、V,VII,μおよび末端ポリペプチド(TP)と結合している。55kdのTPはdCMPを介してDNAの5’末端に共有結合している(Rekoshら,Cell, 11, 283-295(1977);Robinsonら,Virology, 56, 54-69(1973))。他の3つのポリペプチドはDNAに非共有結合的に結合してキャプシドの小さな容量に合うようにDNAを折り畳んでいる。DNAはヌクレアーゼ消化パターンからわかるように細胞のヌクレオソームに類似した構造にパッケージングされているらしい(Cordenら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 401-404(1976);Tateら,Nucleic Acids Res., 6, 2769-2785(1979);Mirzaら,Biochim. Biophys. Acta, 696, 76-86(1982))。
アデノウイルスゲノムの全体的な構造は血清型を通して保たれており、特定の機能は同様な位置に置かれている。Ad2およびAd5のゲノムは完全に配列決定されており、他の血清型由来のゲノムの選択された領域の配列も入手可能である。
アデノウイルスは、細胞膜上の特定の受容体にファイバーを付着させることにより細胞感染を始める[Londberg-Holmら,J. Virol., 4, 323-338(1969);Morganら,J. Virol., 4, 777-796(1969);Pastanら,「アデノウイルスの細胞への侵入:古い問題に関するいくつかの新しい観察」(Adenovirus entry into cells: some new observations on an old problem),ウイルス病原の概念(Concepts in Viral Pathogenesis),Notkinsら編,シュプリンガー−フェアラーク,ニューヨーク,ニューヨーク州,141-146頁,(1987年)]。次いで、ペントンベースがアデノウイルスインテグリン受容体に結合する。それから、受容体と結合したウイルスは原形質膜から、エンドサイトーシス小胞又はレセプトソームを形成する、クラスリンで被覆された窪みに移動し、そこでPhが5.5に落ちる[Pastanら,ウイルス病原の概念(Concepts in Viral Pathogenesis),Notkins and Oldstone編,シュプリンガー−フェアラーグ,ニューヨーク,141-146頁,(1987年)]。Phの降下がウイルス表面の外形を変化させ、その結果レセプトソームが破裂してウイルスが細胞の細胞質中に放出されると信じられている。ウイルスDNAは、核に輸送される間、細胞質中では部分的に被覆されていない、すなわち、部分的に結合タンパク質が外れている。
ウイルスが核孔に達すると、ウイルスDNAは、残りのタンパク質のほとんどを細胞質に残して核に入る(Philipsonら,J. Virol., 2, 1064-1075(1968))。しかしながら、ウイルスDNAは完全にタンパク質を持たないわけではなく、少なくともウイルスDNAの一部は少なくとも4つのウイルスポリペプチド、すなわち、V,VII,TPおよびμと結合しており、ウイルスDNA−細胞ヒストン複合体に転化される(Tateら,Nucleic Acids Res., 6, 2769-2785(1979))。
細胞感染からウイルス粒子産生へのサイクルは1〜2日続き、結果として細胞あたり1万に達する感染性粒子が産生される(Greenら,Virology, 13, 169-176(1961))。アデノウイルスの感染過程はウイルスDNAの複製によって分けられる、初期(E)および後期(L)の相に区分される。もっとも、初期相の間に起こる事のいくつかは後期相の間にも起こり、その逆もある。ウイルス遺伝子の一時的な発現を十分に記述するためにさらに下位区分がなされている。
初期相の間に、細胞内に存在する全RNAのうちの小さな割合を占めているウイルスmRNAが、細胞核に存在するアデノウイルスDNAの両方の鎖から合成される。少なくとも、E1、E2、E3、E4およびMLP−L1と命名された5つの領域が転写される[Lewisら,Cell, 7, 141-151(1976);Sharpら,Verology, 75, 442-456(1976);Sharp,「アデノウイルスの転写」(Adenovirus transcription),アデノウイルス(The Adenoviruses),Ginsberg編,プレナム出版,ニューヨーク,ニューヨーク州,173-204頁,1984年)]。それぞれの領域は少なくとも1つの明瞭なプロモーターを有し、プロセスされて複数のMRNA種を生じる。
初期(E)領域の産物は、(1)他のウイルス成分の発現に制御的な役割を果たし、(2)細胞のDNA複製およびタンパク質合成の一般的な停止に関与し、および(3)ウイルスDNAの複製に必要である。初期mRNAの転写を調節する複雑な一連の出来事は、E1A、L1および13.5kd遺伝子を含むある特定の、すぐの初期領域の発現で始まる[Sharp(1984),上述,に総説されている;Horwitz(1990),上述]。遅延初期領域であるE1B、E2A、E2B、E3およびE4の発現はE1A遺伝子産物に依存する。3つのプロモーター、72マップ単位(mu)にあるE2プロモーター、タンパク質IXプロモーターおよびIVaプロモーターは、DNA複製の開始によりエンハンスされるがそれに依存しない(Wilsonら、Virology, 94, 175-184(1979))。それらの発現はウイルスの遺伝子発現の移行期を特徴づける。初期遺伝子発現のカスケードの結果、ウイルスDNAの複製が開始される。
アデノウイルスDNAの複製は、ゲノムのどちらかの末端にある複製起点から、5’から3’方向への連続的合成によって親の一本鎖を置換する[Kellyら,「ウイルスのDNA複製の開始」(Initiation of Viral DNA replication),ウイルス研究の進歩(Advances in Virus Research),Maramoroschら編,アカデミック出版社,サンディエゴ、カリフォルニア州,34,1-42 1988年);Horwitz(1990),上述;van der Vliet,「生体外におけるアデノウイルスDNAの複製」(Adenovirus DNA replication in vitro),真核細胞の核(The Eukaryotic Nucleus),Straussら編,テルフォード出版,カルドウェル,ニュージャージー州,1,1-29,(1990年),に総説されている]。E2由来のコードされている3つのウイルスタンパク質:(1)一本鎖DNA結合タンパク質(DBP)、(2)アデノウイルスDNAポリメラーゼ(Ad pol)、および(3)プレ末端タンパク質(pTP)はアデノウイルスDNA合成に必須である。これら必須のタンパク質に加えて生体外の実験によって多くの宿主細胞因子がDNAの合成に必要であることが確認されている。
DNA合成はdCMP分子のpTPのセリン残基への共有結合的接着によって開始する。それからpTP−DCMP複合体はAd polが伸長するためのプライマーとして機能する。置換された親の一本鎖は逆位末端反復配列の塩基の対合によってフライパンの柄のような構造を形成することができる。この末端の2重の構造は親ゲノムの末端と同一であり、相補鎖合成の開始の起点として機能できる。
ウイルスDNAの複製の開始が後期相に入るのに必須のように思われる。ウイルス感染の後期相はウイルス構造ポリペプチドおよびキャプシドの構築に関わる非構造タンパク質の大量産生によって特徴付けられる。主要後期プロモーター(MLP)が十分に活性となり、16.5muで始まりゲノムの末端付近で終結する転写産物を産生する。この長い転写産物の転写後のプロセッシングは後期mRNAの5つの系統をもたらし、それぞれL1からL5と命名される(Shawら,Cell, 22, 905-916(1980))。初期相から後期相への変遷を制御し、又結果としてそのような転写産物の利用における劇的な変遷を生じる機構は明らかでない。一次感染ウイルスの後期の転写が活性である時は、後期転写は重感染ウイルスからは起こらないので、DNA複製の条件はDNA鋳型がシス特性であるかもしれない(Thomasら,Cell, 22, 523-533(1980))。
ウイルス粒子の構築は、個々のポリペプチド鎖から主要な構造単位を組み立てる最初のステップから複雑なプロセスである[Philipson,「アデノウイルスの構築」(Adenovirus Assembly),アデノウイルス(The Adenoviruses),Ginsberg編,プレナム出版,ニューヨーク,ニューヨーク州,309-337頁,(1984年),に総説されている;Horwitz(1990),上述]。ヘキソン、ペントンベースおよびファイバーは細胞質内での合成後、三量体のホモポリマー形態を構築する。100kdタンパク質はヘキソンの3量体化の為の骨格タンパク質として機能するようであり、得られたヘキソン三量体はヘキソンカプソマーと呼ばれる。ヘキソンカプソマーは自己構築して空のキャプシドの殻を形成することができ、ペントンベースとファイバーの三量体は、構成成分が核内に存在するときは、結合してペントンを形成することができる。正二十面体の切子面は3つのヘキソンカプソマーで構成され、そのことはキャプシドが分離することでわかるが、9群中心ヘキソン形成の途中のステップは観察されていない。幾つかの構築中間体が温度感受性変異株を用いた実験により示されている。キャプシド構築の進行は50kdおよび30kdの骨格タンパク質に依存していると考えられる。裸のDNAはおそらく、頂点の一つの開口部を通って完成状態に近いキャプシドに入り込む。該プロセスの最後の段階は、前駆ポリペプチドpVI、pVII、pVIIIおよびpTPのタンパク分解的なトリミングを含んでおり、それはキャプシド構造を安定化させ、該DNAをヌクレアーゼ処理に非感受性とし、成熟したウイルス粒子を産生する。
ある種の組換えアデノウイルスベクターが遺伝子治療に用いられている。1つあるいはそれ以上の組換え遺伝子を運搬するための組換えアデノウイルスベクターの使用は、治療を必要とする器官、組織あるいは細胞への1またはそれ以上の遺伝子の目的とする送達を可能にし、それにより体細胞の遺伝子治療のほとんどの場合に遭遇する送達に関する問題が克服される。さらに、組換えアデノウイルスベクターはアデノウイルスタンパク質の発現に宿主細胞の増殖を必要としない[Horwitzら,ウイルス学(Virology),レイヴン出版,ニューヨーク,2,1679-1721,(1990年);Berkner, BioTechniques, 6, 616(1988)]。さらにもし治療が必要な疾病器官が肺であれば、遺伝子情報の運びやとしてのアデノウイルスの使用は、アデノウイルスが通常気道上皮栄養性であるという点でさらに有利である[Straus,アデノウイルス(Adenoviruses),プレナム出版,ニューヨーク,451-496頁,(1984年)]。
ヒトの遺伝子治療に使用可能なベクターとしてのアデノウイルスの他の長所は以下の通りである:(i)組換えが稀であり;(ii)ヒトがアデノウイルスに感染することが頻繁にあるにもかかわらず、アデノウイルス感染からヒトへの悪影響に関連するものが今のところなく;(iii)現在、アデノウイルスゲノム(直鎖状で二本鎖DNA)は、長さにして7.0〜7.5kbまでの範囲の外来遺伝子を収容するように操作でき;(iv)アデノウイルスベクターはそれ自身のDNAを細胞の染色体には挿入せず、そのためその効果は一時的で細胞の正常な機能を妨害することはありそうにもなく;(v)アデノウイルスは脳や肺の細胞の様な、分裂せず、つまり最終分化を遂げた細胞に感染することができ;(vi)生アデノウイルス−必須な特徴として複製する能力を有している−がヒトワクチンとして安全に利用されている(Horwitzら,上述;Berknerら,J. Virol., 61, 1213-1220(1987);Straus,上述;Chanockら,JAMA, 195, 151(1966);Haj-Ahmadら,J. Virol., 57, 267(1986);およびBallayら,EMBO, 4, 3861(1985))。
発現ベクターとして使うために、外来遺伝子をアデノウイルスゲノムの2つの主要な領域、すなわちE1およびE3領域に挿入して、単欠損アデノウイルスおよびそれ由来のベクターを得ている。E1領域への挿入は、相補細胞内での増殖あるいは完全なヘルパーウイルスの存在を必要とする欠損のある子孫を生み出す。それらは、損傷を受けたあるいは消失したE1領域の機能を代替する(Berknerら,上述;Davidsonら,J. Virol., 61, 1226-1239(1987);およびMansourら,Mol. Cell Biol., 6, 2684-2694(1986))。ゲノムのこの領域は外来遺伝子の発現に最も頻繁に利用されている。
E1領域に挿入された遺伝子は種々のプロモーターの制御下におかれ、多くは発現カセットによっては大量に外来遺伝子産物を産生する。しかしながらこれらのアデノウイルスベクターは非相補的細胞系中では増殖しない。現在のところ、単欠損アデノウイルスに欠けている必須機能を相補する細胞系は2、3存在するのみである。それらの細胞系の例としては、HEK−293(Grahamら,Cold Spring Harbor Sym. Quant. Biol., 39, 637-650(1975))やW162(Weinbergら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5383-5386(1983))およびgMDBP(Klessigら,Mol. Cell Biol., 4, 1354-1362(1984);Broughら,Virology, 190, 624-634(1992))が含められる。
外来遺伝子の挿入に有効であるとして上述したもう1つの領域、E3領域は組織培養中でのウイルスの増殖には非必須なので、この領域を外来遺伝子発現カセットで置換すると非相補的細胞系においても生産的に増殖できるウイルスが得られる。例えば、E3領域内へのB型肝炎表面抗原の挿入および発現、それに続くハムスターへの接種および抗体の形成が報告されている(Morinら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 4624-4630(1987))。
単欠損アデノウイルスベクターの問題点は、外来遺伝子の挿入や発現に利用できるアデノウイルス内のスペース量を制限してしまうことである。現在存在している単欠損アデノウイルスベクターと相補的細胞系とに含まれているウイルス配列に類似性あるいは重複がある為に、組換え現象(上述の様に通常は極めて稀である)が起こり得、そしてベクター保存株中において、そのように繁殖した複製可能なウイルスを生み出すことがありうる。この現象が実際問題として、ベクターの保存株を遺伝子治療の目的で利用できないようにしている。
したがって、本発明の目的は外来DNAの、より大きな断片の挿入および発現に適応可能な多重欠損アデノウイルスベクターを提供することである。本発明の別の目的は該本発明の多重欠損アデノウイルスベクターを相補する細胞系を提供することである。さらに本発明の目的は又、多重欠損アデノウイルスベクターの組換え体およびそのような組換え体を用いる治療方法、特に遺伝子治療、予防接種などに関する治療方法を提供することである。本発明のこれらの、又他の目的および利点、又発明の他の特色は、以下の詳細な説明から明確になるであろう。
発明の簡単な要約
本発明は多重欠損アデノウイルスベクターおよび相補的細胞系を提供する。該多重欠損アデノウイルスベクターは、現在入手可能な単欠損アデノウイルスベクターで可能とされる以上の、より大きな外来DNAの断片の挿入および発現に適応可能である。該多重欠損アデノウイルスベクターは又、複製に欠陥を有し、相補的細胞系中で繁殖あるいは増殖させた時の組換えに耐性であり、その特性が遺伝子治療および他の治療目的に特に望ましい。従って、本発明はさらに、組換え多重欠損アデノウイルスベクターおよびそのような組換え体の利用を含む治療方法、例えば遺伝子治療、予防接種などに関する治療方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図1はAdGVCFTR.10LおよびAdGVCFTR.10Rウイルスベクターの一連の概略図である。
図2はAdGVCFTR.11ウイルスベクターの一連の概略図である。
図3はAdGVCFTR.12ウイルスベクターの概略図である。
図4はAdGVCFTR.13ウイルスベクターの概略図である。
図5はE2A発現ベクターの概略図である。
図6はあるクローン化293/E2A細胞系における誘導されたDBP発現の程度をスクリーニングする為に用いられたイムノブロット像である。
図7はあるクローン化293/E2A細胞系による、誘導の最初の24時間の間にわたるDBPの蓄積を解析する為に用いられたイムノブロット像である。
図8はAdGVCFTR.10LおよびAdGVCFTR.12Bウイルスベクターの一連の概略図である。
図9は臭化エチジウムで染色したDNAゲルの逆コントラスト写真であり、継代したトランスフェクション溶解物からのAdGVCFTR.12BウイルスベクターのPCR検出に関するデータを示す。
図10はAdGVLuc;E2GUSウイルスベクターの概略図である。
図11はE4−ORF6発現ベクターの概略図である。
図12は臭化エチジウムで染色したDNAゲルの逆コントラスト写真であり、継代したAdGVβgal.12の溶解物におけるE4欠失領域のPCR検出に関するデータを示す。
図13はトランスフェクション後のある細胞系(x軸)ごとのPFU/細胞(y軸)の程度を示す棒グラフである。
図14はAdGVβgal.12ウイルスベクターの概略図である。
発明の詳細な説明
本発明は特に、遺伝子クローニングおよび発現のための多重欠損アデノウイルスベクターを提供する。本発明の多重欠損アデノウイルスベクターは、現在、入手可能な単欠損アデノウイルスベクターとは、アデノウイルスゲノムの少なくとも2つの領域に欠損があるという点で、又外来DNAのより大きな断片を受入れ、発現できるという点で異なっている。ここで用いられる「外来DNA」という用語は、アデノウイルスゲノムにとって外来の、本発明のベクターに挿入されたいかなるDNA配列をも意味する。そのような外来DNAは遺伝子、遺伝子の部分あるいはその他のいかなるDNA配列を構成しても良く、RNA、アンチセンスRNA、および/又はポリペプチドをコードする配列が含むがそれらに限定されない。
アデノウイルスゲノムの領域は1つあるいはそれ以上の遺伝子からなる。Horwitz(1990)、上述。そのような遺伝子は接着、浸透、脱外皮、複製、コアタンパク質、ヘキソン、ファイバー、ヘキソン関連タンパク質などのアデノウイルスの種々の構成成分や活性を仲介、促進、引き起こし、あるいはそのものである遺伝子産物をコードしている。例えば、前述の構成成分や活性のいくつかに、あるいは全てに関与するかもしれない欠損領域による一つの影響はアデノウイルスの繁殖が不能であることである。ここでは前述の構成成分や活性を遺伝子の機能と呼ぶこととする。
ここで用いられる、遺伝子あるいは遺伝子機能における欠損、すなわち、欠損した遺伝子、遺伝子領域もしくは領域とは、ウイルスゲノムの遺伝的な材料の欠失として定義され、DNA配列が全体にもしくは部分的に欠失した遺伝子の機能を減ずるもしくは抹消するように、又ウイルスゲノムにとって外来のDNAを挿入するためにウイルスゲノム内に余地もしくは容量を与える。そのような欠損は、非相補的な細胞宿主の組織培養中におけるアデノウイルスベクターの繁殖に必須な遺伝子内にあっても、又、必須でない遺伝子内にあっても良いが、該発明のウイルスベクターの欠損した遺伝子の、好ましくは少なくとも1つ、より好ましくは少なくとも2つが繁殖に必須な遺伝子の欠損である。
いかなるサブタイプ、サブタイプの混合物又はキメラアデノウイルスを多重欠損アデノウイルスベクターの作製のためのDNAの原料として用いてもよい。しかしながら、Ad5ゲノムは完全に配列が決定されているので、本発明ではAd5血清型について記載する。
本発明のアデノウイルスベクターはアデノウイルスゲノムの初期領域1(E1)、初期領域2A(E2A)および/又は初期領域2B(E2B)を含む初期領域2(E2)、初期領域3(E3)および初期領域4(E4)を含む初期領域の1つあるいはそれ以上によって与えられる機能を少なくとも欠損しているのが好ましい。E1領域における欠損は領域E1A、E1BあるいはE1AとE1Bの両方に存在する。本発明のアデノウイルスベクターは領域E2(すなわちE2A、E2BあるいはE2AとE2Bの両方)、および/又はE3、および/又はE4における欠損と共に領域E1によって与えられる機能を少なくとも欠損しているのがさらに好ましい。
欠失した領域のいかなる1つもアデノウイルスにとって外来である外来遺伝子産物を生み出すためにプロモーター可変性発現カセットで置換してもよい。例えば、外来遺伝子のE2A領域への挿入は、特異な制限部位の導入によって容易になされ、外来遺伝子産物はE2Aプロモーターから発現され得る。
しかしながら本発明はゲノムの初期領域においてのみ遺伝子機能を欠損したアデノウイルスベクターに限定されない。ゲノムの後期領域に欠損のあるアデノウイルスベクター、ゲノムの初期および後期領域に欠損のあるアデノウイルスベクター、本質的に全てのゲノムが除かれているベクターも又包含される。この場合少なくともウイルスの逆位末端反復配列およびいくらかのプロモーターあるいはウイルスの逆位末端反復配列およびパッケージングシグナルのいずれかが完全に残されていることが好ましい。当業者であれば排除されるアデノウイルスゲノムの領域が大きいほど、より大きな外来性のDNAの断片がゲノムに挿入できるということが認識できるであろう。例えば、36kbのアデノウイルスゲノムであれば、ウイルスの逆位末端反復配列といくらかのプロモーターを完全な形で残すと、アデノウイルスの許容量はおよそ35kbである。あるいは、ITRとパッケージングシグナルのみを有する多重欠損アデノウイルスベクターを作製することもできる。これにより、このベクターから37−38kbの外来DNAの発現が効果的に予測されよう。
一般的に、ウイルスベクターは細胞内でのアデノウイルスDNA断片間での高レベルの組換えを期待して構築される。断片間で類似(あるいは重複)している領域を有しゲノムの完全長を構成しているアデノウイルスベクターの2つ又は3つの断片を細胞にトランスフェクションする。宿主細胞の組換え機構は前述の断片を組変えることによって完全長のウイルスベクターゲノムを構成する。種々の単一領域における改変を含む、ウイルスを構築するための他の好適な手法が以前に報告されており(Berknerら,Nucleic Acids Res., 12, 925-941(1984);Berknerら,Nucleic Acids Res., 11, 6003-6020(1983);Broughら,Virol., 190, 624-634(1992))、これらは多重欠損ウイルスの構築のために用いることができる。さらに他の好適な手法は、例えば生体外での組換えや連結も含む。
ウイルスベクター構築の最初の段階は標準的な分子生物学的な技術を用いて、プラスミドカセット内でアデノウイルスゲノムの特定の領域の欠失あるいは改変を構築することである。示量解析の後、この変化させたDNA(欠失あるいは改変を含む)はそれからアデノウイルスゲノムの1/2までを含むより大きなプラスミドに移される。次の段階は該プラスミドDNA(欠失あるいは改変を含む)およびアデノウイルスゲノムの大きな断片を受容細胞にトランスフェクトすることである。これら2つのDNA断片は合わせると、アデノウイルスゲノムと類似領域の全てを包含する。この類似領域内で組換え現象が起こり、欠失又は改変を含んでいる組換えウイルスゲノムが造られる。多重欠損ベクターの場合、受容細胞は組換え機能だけではなく、トランスフェクトされたウイルスゲノムには含まれていない失われたウイルス機能の全てを提供、すなわち組換えウイルスゲノムの全ての欠損を相補する。多重欠損ベクターは、例えばITRおよび/又はパッケージングシグナルの改造によってもさらに改変され、そのような多重欠損ベクターのみ、相補的細胞系において機能し、又増殖する。
加えて、本発明は、本発明の多重欠損アデノウイルスベクターの繁殖あるいは増殖のための相補的細胞系をも提供する。本発明の好ましい細胞系はアデノウイルスゲノムのE1、E2、E3およびE4領域を含む遺伝子機能の内の少なくとも1つの遺伝子機能を相補することで特徴付けられる。他の細胞系としては後期領域を含む遺伝子機能由来の少なくとも1つの遺伝子機能において欠損があるアデノウイルスベクターを相補するもの、初期および後期の遺伝子機能の組合わせを相補するもの、および全てのアデノウイルス機能を相補するものが含まれる。当業者であれば選択する細胞系は、関心のある組換え多重欠損アデノウイルスベクターから欠失し、それらの機能を特異的に相補するものであり、標準的な分子生物学的技術を用いて製せられるものであることがわかるであろう。該細胞系はさらに相補的遺伝子を重複しないように含んでおり、それがベクターゲノムが細胞DNAと組変えする可能性を最小限に、実質的に排除するということによってさらに特徴付けられる。従って、複製可能なアデノウイルスはベクター保存株からは排除され、従って特定の治療目的、特に遺伝子治療の目的に好適である。これは又非相補的細胞におけるアデノウイルスの複製をも排除する。
相補的細胞系は、組換えアデノウイルスベクターの高力価保存株を製する為には、2以上の欠損アデノウイルス遺伝子機能の産物を、それらの産物にとって適切なレベルで発現することが可能なものでなければならない。例えば、E2A産物であるDBPは、アデノウイルスDNAの複製のためには、化学量論的なレベル、すなわちかなり高レベルで発現する必要があるが、E2B産物であるAdpolはアデノウイルスDNAの複製のためには、触媒レベル、すなわち比較的低レベルでのみ発現する必要がある。組換えアデノウイルスベクターの高力価保存株を確実にするためには、産物のレベルを適切にしなければならないだけでなく、産物の時間的な発現を細胞の通常のウイルス感染において見られるものと矛盾がないようにしなければならない。例えば、ウイルスのDNA複製に必要な構成成分はウイルス粒子の構築に必要な構成成分よりも前に発現されなければならない。ウイルス産物の高レベルの発現にしばしば伴う細胞毒性を回避するために、又産物の時間的発現を調節するために、誘導プロモーター系が使用される。例えば、ヒツジのメタロチオネイン誘導プロモーター系が、完全なE4領域、E4領域の転写解読枠6、およびE2A領域を発現するのに使用できる。他の好適な誘導プロモーター系の例には細菌のlacオペロン、テトラサイクリンオペロン、T7ポリメラーゼ系、および真核生物と原核生物の転写因子、抑制因子やその他の構成成分を組み合わせたものやキメラ構築物があるが、これらのものに限定されない。発現されるべきウイルス産物に高い毒性があるときは、2つに分かれた誘導系を用いることが好ましく、ここでインデューサーはウイルスベクター内に保持され、誘導産物は相補的細胞系の染色質内に保持される。テトラサイクリン発現系やlac発現系の様な、抑制性/誘導性発現系も又使用してよい。
トランスフェクトされた細胞の小さな部分に入り込むDNAは、より小さな分画内でさえも安定に維持されるようになる。1つあるいはそれ以上のトランスフェクトされた遺伝子を発現している細胞系の単離は、例えば抗生物質、薬物あるいはその他の化合物に対する耐性を与える第2の遺伝子(マーカー遺伝子)を同じ細胞に導入することによって達成される。この選別は、抗生物質、薬物あるいはその他の化合物の存在下では、移入された遺伝子を有さない細胞は死に、一方で移入された遺伝子を含む細胞は生き残るという事実に基づいている。そして生き残った細胞はクローン単離され個々の細胞系として拡大される。これらの細胞系ではマーカー遺伝子と関心ある1またはそれ以上の遺伝子の両方を発現するものが含まれる。細胞の繁殖は親の細胞系およびその選別の方法に依存している。細胞のトランスフェクションも又細胞のタイプに依存している。トランスフェクションに使用される最も一般的な技術は、リン酸カルシウム沈澱、リポソーム、DEAEデキストランにより仲介されるDNA伝達である。
ここで具体的に説明されるDNA配列およびプラスミドの多くの改変や変異が可能である。例えば、遺伝暗号の縮重により、コードされたポリペプチドコーディング配列の変更なしに、ポリペプチドのコーディング全領域にわたる、又、翻訳停止シグナル中での、ヌクレオチドの置換が見込まれる。そのような置換可能な配列は、特定の遺伝子の既知のアミノ酸あるいはDNA配列から演繹することができ、常套の合成あるいは部位特異的変異導入法によって構築され得る。合成DNA法はItakuraらの方法,Science, 198, 1056(1977)およびCreaらの方法,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5765(1987)に実質的に一致して行われ得る。部位特異的変異導入法はManiatisら,モレキュラークローニング:ア ラボラトリー マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),コールドスプリングハーバー,ニューヨーク(第2版1989年)に記載されている。従って、本発明はここで特に例示されたDNA配列およびプラスミドに決して限定されない。例示されたベクターは嚢胞性繊維症の遺伝子治療の為のものであるので、嚢胞性繊維症膜貫通型制御因子(cystic fibrosis transmembrane regulator:CFTR)遺伝子を有し、発現するが、しかしながら記載されたベクターは他の疾病−気腫、喘息、成人呼吸促進症候群および慢性気管支炎のような慢性の肺疾患、癌や冠状動脈性心臓病や遺伝子治療や予防接種などによって好適に治療あるいは予防されるその他の疾患が含められるがそれらに限定されない−を治療するために容易に改造される。従って、いかなる遺伝子あるいはDNA配列も多重欠損アデノウイルスベクターに挿入され得る。遺伝子あるいはDNA配列の選択は、例えば遺伝子治療、予防接種などの状況において治療および/又は予防効果をなし遂げるものである。
当業者であれば本発明の多重欠損アデノウイルスベクターを治療や予防、すなわち遺伝子治療、予防接種など(例えばRosenfeldら,Science, 252, 431-434(1991),Jaffeら,Clin. Res., 39(2),302A(1991),Rosenfeldら、Clin. Res., 39(2),311A(1991),Berkner, BioTechniques, 6, 616-629(1988)参照)の目的で動物に投与する好適な方法があることが理解できよう。又ベクターの投与には複数の経路を用いることができるが、特別な経路が別の経路に比べてより迅速、且つより効果的な反応を可能にするということがわかるだろう。医薬上許容しうる賦形剤も又当業者に良く知られているものであり容易に入手できるものである。賦形剤の選択は組成物を投与するのに用いられる個々の方法によって幾分決定される。従って、本発明の医薬組成物の好適な製剤は広く多様である。以下の製剤および方法は単なる例示であって何らこれに限定されるものではない。しかしながら経口、注射およびエアロゾル製剤が好ましい。
経口投与に好適な製剤は(a)水、生理食塩水あるいはオレンジジュースのような希釈液に有効量の化合物を溶解させた液状溶液剤;(b)各々、特定量の活性成分を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤あるいは錠剤;(c)適当な液体での懸濁液剤および(d)好適な乳剤からなる。錠剤にはラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、微小性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド性二酸化シリコン、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸およびその他の賦形剤、着色剤、希釈液、緩衝剤、給湿剤、防腐剤、芳香剤および医薬上適合し得る賦形剤を1つあるいはそれ以上含めることができる。ロゼンジ剤は、活性成分を通常シュクロースやアカシアあるいはトラガカントといった香味料に含めることができ、又、ゼラチンやグリセリン、あるいはシュクロースやアカシアのような不活性な基剤に活性成分を含めている香錠剤や、乳剤、ゲル剤などは活性成分に加え、この分野で公知の賦形剤が含められる。
本発明のベクターは、単独であるいは他の好適な成分と組み合わせて、吸入によって投与されエアロゾル製剤に製せられる。これらのエアロゾル製剤はジクロロジフロロメタン、プロパン、窒素などのような圧縮された許容しうる抛射薬内に入れることができる。それらは又ネブライザーやアトマイザーのような非圧縮性製剤用医薬品して製剤化してもよい。
非経口的な投与に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤および予定された被投与者の血液と製剤を等張にするための溶質が含まれていても良く、又水性および非水性の無菌の懸濁液剤があり、これには懸濁剤、可溶化剤、肥厚剤、安定化剤および防腐剤が含まれていてもよい。製剤はアンプルやバイアルのように単位投与量あるいは多投与量で容器に封入され、フリーズドライ(凍結乾燥)され、注射するためには使用直前に例えば水のような注射用の無菌の液体の希釈液を添加するだけでよい状態で保存され得る。即席の注射液剤や懸濁液剤は前述の種類の無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製される。
さらに、本発明において用いられるベクターは乳化基剤や水溶性基剤のような種々の基剤と混合することにより座剤に製することができる。
膣内投与に好適な製剤にはペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、パスタ、泡あるいはスプレー形態が挙げられ、それらには活性成分に加え、当分野で適当であることが知られている担体が含められる。
本発明において、動物、とくにヒトに投与される量は重要な遺伝子又は他の配列、用いた組成、投与の方法および治療される特定の部位および生物によって変化する。投与量は好ましい応答、例えば、治療あるいは予防応答を好ましい時間枠内でもたらすに十分であるべきである。
本発明の多重欠損アデノウイルスベクターおよび相補的細胞系は又、生体外でも利用可能性がある。例えば、アデノウイルスの遺伝子機能および構築、あるいは好適な標的細胞における外来DNAの発現を研究するのに用いることができる。当業者であれば、本発明のアデノウイルスベクターでトランスフェクトされ得る、および/又はアデノウイルス粒子に感染させて、結果として挿入されたアデノウイルスDNA補充成分の発現を生じる細胞を選択することによって、好適な標的細胞を同定することができる。好ましくは、好適な標的細胞はアデノウイルスの細胞への接着および侵入のための受容体を有するものが選択される。そのような細胞は全ての哺乳類からはじめに単離されたものをも含むが、それらに限定されるものではない。一旦好適な標的細胞を選抜すれば、該標的細胞を、本発明の外来のDNAを有する組換え多重欠損アデノウイルスベクターあるいはアデノウイルス粒子に接触させて、それぞれトランスフェクションあるいは感染させる。発現、毒性および標的細胞での外来DNAの挿入および活性に関連する他のパラメーターは当分野で良く知られている通常の方法を用いて測定する。その際研究者らは、種々の生物から外殖され組織培養で研究されている種々の細胞種における該発明のベクターによって導入された外来DNAの種々の配列の発現の効能や効果と同様に、アデノウイルス感染に関する現象論について学び、解明することができる。
さらに遺伝子治療において好適に治療される疾患を有する患者からの外殖あるいは除去された細胞が、本発明において有用に生体外で操作される。例えば、生体外で培養されたそのような個体由来の細胞を本発明のアデノウイルスベクターと、トランスフェクションするのに好適な条件下で接触させるが、その条件は当業者であれば容易に決定できるものであり、該ベクターは、好適な外来DNAを含む。そのような接触は好適には培養細胞へのベクターのトランスフェクションをもたらし、トランスフェクトされた細胞は好適なマーカーおよび選択的な培養条件によって選択される。その際、標準的な方法を用いて細胞の生存性を調べ、すなわち毒性を測定し、関心のベクターの1またはそれ以上の外来遺伝子の遺伝子産物の存在を調べる、すなわち発現を測定し、個々の細胞について、関心ある外来遺伝子を有するベクターとの適合性、その発現およびその毒性について調べる。それによってそのようにして調べたベクター/外来DNA系をを用いて、個体の治療の妥当性や効能についての情報が得られる。そのような外殖およびトランスフェクトされた細胞、用いた遺伝子治療法の可能な効能/毒性を調べるのに役立つのに加えて、又その個体内の生体内の位置に戻すことが出来る。そのような個体に戻される細胞は、それについての生体外トランスフェクションあるいは個体体内の他の組織や細胞と隔てるマトリックスによって包まれあるいは埋め込まれて場合を除いては、改変せず、装飾せずに戻されるかもしれない。そのような基質としてはコラーゲンやセルロースなどの生体適合性物質であってもよい。勿論それとは別に、あるいはそれに加えて、生体外の試験で一旦陽性の反応を観察したら、上に詳細に記載した投与方法によって生体内のそのままの位置でトランスフェクションを実行することができる。
以下の実施例にさらに本発明を説明するが、勿論、どのような場合にもその範囲を限定するものと解釈すべきではない。本実施例で言及される酵素類は特に指定し示さない限りベセスダリサーチラボラトリーズ(BRL),ガイザースバーグ(Gaithersburg),メリーランド州20877,ニューイングランドバイオラブス社(NMB),ベバリー,マサチューセッツ州01915あるいはベーリンガーマンハイムバイオケミカルズ(BMB),7941 キャッスルウェイドライブ,インディアナポリス,インディアナ州 46250 より入手可能であり、製造元の推奨に実質的に従って用いる。ここで用いる技術の多くは当業者に良く知られたものである。分子生物学的な技術は、Maniatisら,モレキュラークローニング:ア ラボラトリー マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),コールドスプリングハーバー,ニューヨーク(第2版,1989年)およびカレント プロトコール イン モレキュラー バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology),(Ausubelら編,1987年)のような好適な実験マニュアルに詳細に記載されている。当業者であれば以下に示した種々に代えて別の方法をそれに代わる別の方法に置換えができることを認識するであろう。実施例および図は、嚢胞性繊維症膜貫通型制御因子遺伝子(CFTR)を有するAdGV.10、AdGV.11、AdGV.12およびAdGV.13、すなわちAdGVCFTR.10、AdGVCFTR.11、AdGVCFTR.12およびAdGVCFTR.13に関するものであるが、これらのベクターはCFTR遺伝子の発現に限定されるものではなく、他の遺伝子およびDNA配列の発現にも利用できる。従って、例えば本発明は外来遺伝子、その断片である好適なDNA配列あるいはその他のDNA配列からなるようなベクターをも包含する。そのような好適なDNA配列は遺伝子治療によって好適に治療される疾患を治療するための遺伝子治療において効果を有するであろう。あるいは好適なDNA配列は又、DNA配列が哺乳類中で発現され、結果として例えばポリペプチド−該ポリペプチドに対する免疫反応を引き起こすことができる−を生じ、予防接種に用いるような時など予防効果も有するであろう。さらに哺乳類で発現しうる好適なDNA配列のさらに別の使途は、アンチセンス分子、特にMRNAおよび合成オリゴヌクレオチドからなる群より選択されるアンチセンス分子のような、何か他の好適な治療および/又は予防剤を提供することである。
実施例1
この実施例においてE1およびE3領域に欠損のあるAdGV.10を含む1つの実施形態、すなわちAdGVCFTR.10の作製について述べる。
AdGVCFTR.10はサイトメガロウイルス(CMV)の初期プロモーターからCFTR遺伝子を発現する。このベクターの2つの作製例を構築し、図1−AdGVCFTR.10LおよびAdGVCFTR.10Rの一連の概略図である−に示されるようにベクターゲノムのE1領域にCFTR発現カセットが置かれる方向によってAdGVCFTR.10LおよびAdGVCFTR.10Rと命名した。
CFTR発現カセットは以下のようにして構築した。pRK5(ジェネンテック社,サウスサンフランシスコ,カリフォルニア州)をKpn I(ニューイングランドバイオラブズ)(NEB),ベバリー、マンハッタン州)で消化し、マングビーンヌクレアーゼ(NEB)で平滑末端化し、Xho Iリンカー(NEB)をKpn Iサイトの位置で連結させた。得られたベクターをpRK5−Xho Iと命名した。そしてpRK5−Xho IをSma I(NEB)とHin dIII(NEB)で消化し、マングビーンヌクレアーゼで平滑末端化した。CFTR遺伝子を含むプラスミド、pBQ4.7(Lap-Chee Tsui博士,Hospital for Sick Children,トロント,カナダ)を有するプラスミドはAva I(NEB)およびSac I(NEB)で消化し、マングビーンヌクレアーゼで平滑末端化した。これら2つの断片を単離し相互に連結させてCFTR発現カセットであるpRK5−CFTR1を作成した。
pRK5−CFTR1をSpe I(NEB)およびXho Iで消化し、クレノウ(NEB)で平滑末端化した。1−454/3325−5788由来のAd5配列を含むpAd60.454(L. E. Babiss博士,ロックフェラー大学,ニューヨーク,ニューヨーク州)をBgl II(NEB)で消化し、クレノウで平滑末端化した。これら2つの断片は低融点アガロース技術(Maniatisら,モレキュラークローニング:ア ラボラトリー マニュアル(Molecular Cloning:a laboratory manual),コールドスプリングハーバー研究所,コールドスプリングハーバー,ニューヨーク州(第2版1989年))によってベクター配列から精製し、相互に連結させてpGVCFTR.10LおよびpGVCFTR.10Rの左アームプラスミドを作成した。
pGVCFTR.10LあるいはpGVCFTR.10R由来の左アームプラスミドをNhe I(NEB)で消化した。ウイルスの右アームはAd5d1324(Thomas E. Shenk博士,プリンストン大学,プリンストン,ニュージャージー州)をCla I(NEB)で消化することによって作成した。2つの断片−小さい918塩基対断片および大きい、およそ32,800塩基対断片−をショ糖密度勾配遠心(マニアティスら,上述)によって分離した。大きい方の断片を左アームプラスミド断片と混合し、常套のリン酸カルシウム法(Grahamら,Virology, 52, 456(1973))によって293細胞にトランスフェクトした。得られた組換えウイルスを293細胞上でプラーク精製し、常套のウイルス技術(例えばBerknerら,(1983)および(1984),上述)を用いてウイルスの保存株を樹立した。
実施例2
この実施例においてE1、E3およびE4領域に欠損のあるAdGVCFTR.11の作製について述べる。
AdGVCFTR.11はAdGVCFTR.10の1−27082、即ち左アームとBam HI(NEB)およびSal I(NEB)で線状化されたAd5の21562−35935、即ち右アームを含むプラスミド(pGV11A,pGV11B,pGV11C)あるいはpGV11D;後で詳細に述べる)との間での単一の生体内組換えによって構築され、それに後述の種々のE3およびE4の改変体を導入した。
完全なAdGVCFTR.10をSpe I(NEB)およびSrf I(ストラタジーン社,ラ ジョラ,カリフォルニア州)で消化して1−27082塩基対の断片を得た後、AdGVCFTR.10由来の左アームを全溶液の1/4が40%である凹型10−40%ショ糖密度勾配で単離した。
右アームを改変pGEMベクター(pGBS)のBam HI−Sal I消化によって得られた。pGBSは以下のようにして作製した。pGemI(プロメガ社,マディソン,ウイスコンシン州)をEco RIで消化しクレノウで平滑末端化し、そしてSal Iリンカーを該ベクターに連結させた。そして、得られたDNAをSal Iで消化し再び連結させ、それによってEco RIサイトをSal Iサイトで置換し2つのSal Iサイト間の配列を欠如させ、Hin dIIIで消化されクレノウで平滑末端化したpGEMH/P/Sを作製し、Bam HIリンカーを該ベクターに連結させてpGEMS/Bを作製した。pGEMS/BをBam HIおよびSal Iで消化し、p50−100(Paul Freimuth博士,コロンビア大学,ニューヨーク州)と呼ばれるpBRプラスミド由来の約14kbのBam HI−Sal I断片(Ad5由来の21562−35935)と連結させ、pGBSを作製した。
抗免疫性および抗炎症性の特性を有する2つのAd E3遺伝子産物をアデノウイルスベクターに導入するために3つの異なった様式の右アームプラスミドを構築した。pGV11(0)(実施例7)と命名されたpGBS△E3ORF6での大きなE3欠失を、5’末端にAd2 E3 19kDaの抗免疫性遺伝子産物を、および3’末端にAd5 E3 14.7KDaの抗炎症性遺伝子産物を有する2シストロン性のmRNAの発現を駆動するラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列(ロングターミナルリピート)(RSV−LTR)プロモーターを有する発現カセットの3つの異った様式のものに必須的に置換した。Bst BI(NEB)断片の欠失によって19kDaのcDNA断片を欠失させることによりさらに1つのウイルスを構築した。AdGVCFTR.11(D)と命名されたこのウイルスはE3 14.7kDaの抗炎症性遺伝子産物のみを有する単シストロン性のmRNAの発現を駆動するRSV−LTRプロモーターを有する。
まず、Eco RI(27331)−Nde I(31089)断片をPUC19ポリリンカーの同一サイトにクローニングすることによりpGBS△E3(実施例5)由来のSpe I(27082)−Nde I(31089)断片をpUC19にサブクローニングした。pGBSから生成されたHin dIII(26328)−Eco RI(27331)断片をこのクローンのEco RIサイトにクローニングして、pHN△E3を作製した。適切なプライマーを用いて、RSV−LTRプロモーター、Ad2 E3 19kDaの遺伝子産物およびAd5 E3 14.7kDaの遺伝子産物を有する、フランキングXba Iサイトを持つPCR断片を作製した。増幅した断片をXba Iで消化しpUC19にサブクローニングしてpXAを作製した。Xba I断片の解析後、該断片をpHN△E3に連結させpHNRAを作製した。
適当なプライマーを用いて、それらを含むmRNAの翻訳を増強させることが知られている(Joblingら,Nature, 325, 622-625(1987);Jangら,Genes and Development, 4, 1560-1572(1990))内部リボーゾーム導入サイト(IRES)をコードしているフランキングBst BIサイトを持つ2つのPCR断片を作製した。1つの断片(様式B)にはアルファルファモザイクウイルスの外皮タンパク質mRNAの非翻訳リーダー(AMV RNA 4 リーダー)(Joblingら,上述)由来の34塩基対のIRESが含まれる。もう1つの断片(様式C)には脳心筋炎ウイルス(エンセファロマイオカルディティスウイルス)(EMCV)mRNA(Jangら,上述)の5’非翻訳領域由来の570塩基対のIRESが含まれる。様式BあるいはC由来の各々のBst BI断片をpXAにおいてBst BI断片の代わりにクローニングした。得られたプラスミド−それぞれpXB、pXCと命名される−をXba I断片の配列解析の後、それぞれpHN△E3に移し、pHNRBおよびpHNRCを作製した。
pGBS△E3ORF6由来のSpe I(27082)−Nde I(31089)断片を、pHNRA、pHNRB、pHNRCおよびpHNRD由来のSpe I−Nde I断片で置換し、それぞれpGV11A、pGV11B、、pGV11CおよびpGV11Dを作製した。
pGBVプラスミドDNAをBam HIおよびSal Iで線状化し、精製した左アームDNA断片と20μg全DNAまでで種々に濃度を変えて混合し、必要に応じてサケ精子あるいはウシ胸腺DNA(ライフテクノロジー社,ガイザースバーグ(Gaithersburg),マサチューセッツ州)でDNA量を約20μgになるように用いた。混合した断片を常法のリン酸カルシウム技術(Grahamら,上述)を用いて293細胞にトランスフェクトした。
トランスフェクトして5日後、細胞単層を3回の凍結融解により回収した。得られたハイブリッドウイルスは293細胞上で力価検定し、単離されたプラークを選び取った。最初のプラーク保存株中に単一の組換えウイルスが存在するのを確実にするためにプラーク単離の工程を2回以上繰り返した。単離プラーク保存株をBurlsesonら、ヴィロロジー:ラボラトリー マニュアル(Virology:a Laboratory Manual)、アカデミック出版社、(1992年)に記載されている常套のウイルス技術に従って大容量のウイルス保存株に増幅した。
図2は種々のAdGVCFTR.11ウイルスベクターの一連の概略図である。図は比較の為AdGVCFTR.10Lの図と一列に並べた。
実施例3
この実施例においてE1、E3およびE4領域に欠損のあるAdGVCFTR.12の作製について述べる。
AdGV.12はE4領域の完全な排除により特徴付けられる。この大きな欠失によりおよそ10kbまでの外来のDNAを挿入することができる。さらに重要なことに、ゲノムの他の領域はAdGVCFTR.12ベクターを用いた外来DNA発現カセットの導入に利用しやすい。いまやこの欠失が他の産物のためのより大きな発現カセットの取り込みを可能にするのである。例えば、膜貫通型のドメインを有さず、それゆえ膜に結合していないTNFあるいはIL−6などの可溶性の受容体、および例えばcdc2、cdkキナーゼ、サイクリンEあるいはサイクリンDといったサイクリン類のような細胞周期制御産物に対するもののようなアンチセンス分子、および炎症や免疫応答を排除するための転写因子、すなわちE2Fあるいはc−mycなどである。
pGV11(0)を改造し全E4領域が欠失している右アームプラスミドを作製する。得られたプラスミドは全E3およびE4領域を欠失し、pGV12(0)と命名される。これは32811のAfl IIIサイトおよび35640のBsq IサイトでPac I制限部位を導入することによりなされる。これら2つのサイト間でのPac I断片の欠失がE4プロモーターおよびE4ポリAサイト内にあるE4 TATA要素を含む全てのE4配列を効果的に排除する。
ウイルスの構築は293/E4細胞系あるいは293/ORF6細胞系を使用する以外は先に述べたようにして行う。AdGVCFTR.10L由来の左アーム右アームpGV12(0)プラスミド、および全ての他の一般的な技術は実施、例2で述べたものである。E4はウイルスの増殖に必要な必須遺伝子産物を有しているので、得られたE4欠失変異ウイルスは外因的に発現されたE4の非存在下では増殖できない。従って、全てのウイルス構築の操作は新しい293/E4細胞系あるいは293/ORF6細胞系で行われる(各々実施例8および実施例9に述べられている)。得られたウイルスがAdGVCFTR.12であり比較としてAdGVCFTR.10Lのみ用いて図3に図式的に示してある。
実施例4
この実施例においてE1、E2A、E3およびE4領域に欠損のあるAdGVCFTR.13の作製について述べる。
AdGV.13はE1およびE4領域の完全な排除(ADGV.12の如く)だけでなくE2Aの完全な排除によっても特徴付けられる。E2Aの完全なコード領域は、転写解読枠(Vosら,Virology, 172, 634-642(1989);Broughら,Virology, 190, 624-634(1992))の両末端でのCla I制限部位の挿入を有するH5in800およびH5in804という2つのE2A変異ウイルス由来のDNAを相互に融合させることによって欠失させる。H5in800のCla Iサイトは遺伝子のコドン2および3の間にあり、H5in804のCla IサイトはE2A遺伝子の停止コドン内にある。結果として生ずるウイルスはE2A読み枠と類似点を持たない23アミノ酸からなる転写解読枠を含む。さらに重要なことに、このカセットはウイルスゲノムの他の領域に特徴的な遺伝子を導入することができる。これは関心ある遺伝子を小ORFが存在する適切な読み枠に挿入することにより、あるいは関心ある遺伝子に加えてそれ自身のプロモーター配列、ポリアデニレーションシグナルおよび停止コドンを有する他の発現カセットを導入することによって成し得る。
アデノウイルスDNAをH5in800およびH5in804から調製した。制限酵素Hin dIII(NEB)で消化した後、両H5in800およびH5in804由来のHin dIIIA断片をpKS+(ストラタジーン社)にクローニングする。得られたプラスミドをpKS+H5in800Hin dIIIAおよびpKS+H5in804Hin dIIIAとそれぞれ命名した。そしてpKS+H5in800Hin dIIIA由来のCla I(NEB)断片を単離し、pKS+H5in804Hin dIIIA由来の同一のCla I断片の代わりにクローニングする。このキメラプラスミド、pHin dIIIA△E2Aは上に述べたように全てのE2A読み枠を効果的に排除している。この点で、E2Aの欠失をBamH I(NEB)およびSpe I(NEB)制限部位に移し、pGV12(0)中の野性型の配列を置換してpGV13(0)を構築した。
AdGVCFTR.13ウイルス(図4参照)をAdGVCFTR.10左アームDNAおよびpGV13(0)右アームプラスミドDNAを用いることによって既に述べた様にして構築する。しかしながら、このウイルス構築物の宿主細胞系は3重の相補的細胞系293/E4/E2Aである。図4はAdGVCFTR.13ウイルスベクターの概略図である。図は比較の為にAdGVCFTR.10Lの図と一列に並べてある。
実施例5
この実施例についてpGBSΔE3の作製について述べる。
このプラスミドは、E3プロモーターおよび現存するE3遺伝子を含めた、pGBS内のE3領域の大部分を除去するため、他の構築物のために場所を空けるため、そしてE3発現カセットの導入を容易にするために製せられる。このプラスミドは28331から30469までの欠失を含んでいる。
PCR断片はAd5s(27324)およびA5a(28330)Xをプライマーとして、そのpGBSを鋳型として用いて製せられる。得られた断片をEco RI(27331)およびXba I(28330)で消化し、ゲル精製した。そしてこの断片をEco RIサイト(27331)およびXba I(30470)サイトでpGBSに導入した。
実施例6
この実施例においてpGBSΔE3ΔE4の作製について述べる。
さらなる外来性の配列をアデノウイルスゲノム内に移すのを容易にするためにAd5 E4領域の大きな欠失をpGBSΔE3に導入した。32830−35566E4コーディング配列を欠失させた。
pGBSをMun Iで消化したDNA断片をクレノウで処理して該断片を平滑末端化し、これにPac Iリンカーを連結させることによって32830の位置でMun Iサイトの代わりにPac Iサイトを製した。その改変したDNAをNde Iで消化し、得られた1736塩基対断片(Nde I31089−Pac I32830)をゲル精製した。PCR断片を、A5(35564)P(IDT、コーラルビレー、アイオワ州)およびT7プライマー(IDT、コーラルビレー、アイオワ州)、並びに鋳型としてpGBSを用いて調製した。得られた断片をPac IおよびSal Iで消化しPac I35566−Sal I35935を作製した。pUC19のポリリンカー領域内のSma IサイトをPac Iリンカーに連結させることによってPac Iサイトに改変した。Pac I35566−Sal I35935断片を改変させたpUC19ベクターにポリリンカー領域内のPac IおよびSal Iサイトの位置でそれぞれ移した。改変したNde I31089−Pac I32830断片を、Pac I35566−Sal I35935断片が既に挿入されているpUC19に、Nde IおよびPac Iサイトの位置でそれぞれ移した。pUC19プラスミド由来のNde I31089−Sal I35935断片をゲル精製によって精製し、pGBSΔE3内の各Nde IおよびSal Iサイトに置き換えてクローニングしてpGBSΔE3ΔE4を得た。
実施例7
この実施例においてpGBSΔE3ORF6の作製について述べる。
Ad5の894塩基対のE4 ORF−6遺伝子をpGBSΔE3ΔE4中のE4プロモーターの3’に置いた。ORF−6は非E4相補的細胞系においてはウイルスの増殖に唯一絶対的に必要なE4産物である。それゆえに、AdGVCFTR.11ウイルスを293細胞で繁殖させ得る為に、この産物をそれ独自のプロモーター制御下で右アームプラスミド(実施例2)に再導入した。
PCR断片をA5s(33190)P(32塩基対;5'CACTTAATTAAACGCCTACATGGGGGTAGAGT3')(配列表配列番号1)およびA5a(34084)P(34塩基対;5'CACTTAATTAAGGAAATATGACTACGTCCGGCGT)(配列表配列番号2)をプライマー(IDT、コーラルビレー、アイオワ州)として、pGBSを鋳型として用いて製した。この断片をPac Iで消化しゲル精製した。その産物をpGBSΔE3ΔE4中の1つのPac Iサイトに導入し、19kDaおよび14.7kDa Ad E3産物の発現のためにE3が改変されているプラスミドpGV11(0)を製した。
実施例8
この実施例において293/E4細胞系の作製について述べる。
pSMT/E4は以下の様にして作製した。2752塩基対のMun I(Ad2のサイト32825)−Sph I(ポリリンカー)断片を、Ad2由来の領域32264−35577がサブクローニングされたpUC19プラスミドであるpE4(89−99)から単離、クレノウで平滑末端化し、ホスファターゼ(NEB)で処理した。発現カセットプラスミドpSMT/E4を作製するために、2752塩基対のMun I−Sph I断片を、Bam HIで線状化しクレノウで平滑末端化しホスファターゼで処理したpMT010/A+(McNeallら,Gene, 76, 81-89(1989))に連結させた。
細胞系293は(ATCC CRL 1573;アメリカンタイプカルチャーコレクション,ロックヴィル,メリーランド州)は10%ウシ胎児血清ダルベッコの改変イーグル培地(ライフテクノロージ社,ガイザースバーグ(Gaithersburg),メリーランド州)で培養した。ついで293細胞をEco RIで線状化したpSMT/E4にリン酸カルシウム法(Sambrookら,モレキュラークローニング:ア ラボラトリー マニュアル(Molecular Cloning:a laboratory manual),コールドスプリングハーバー研究所出版(1989年))によりトランスフェクトした。トランスフェクション後、約24−48時間で100μMメトトレキサートおよびアメソプテリン(シグマ化学社,セントルイス,ミズーリ州)を含有する培地(上記)を添加した。培地中のメトトレキサートの存在はpSMT/E4プラスミドにおける選択マーカーであるジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子の発現を選択する。
正常の細胞のDHFR遺伝子は与えるメトトレキサートの濃度によって阻害され(細胞種特異的)、細胞死を引き起こす。pSMT/E4を有するトランスフェクトされた細胞におけるさらなるDHFR遺伝子の発現はメトトレキサートに対する耐性を与える。従って、新しい遺伝子を有するトランスフェクトされた細胞のみがこれらの条件下で生育する細胞である(Sambrookら参照,上述,に総説されている)。
選択マーカーを保持している最初の1つの細胞から細胞の小コロニーが形成されると、それらをクローンごとに単離し回収した(サムブルークら参照,上述,で概観されている)。これらのクローンは細胞系を生成するまで拡大した。これらの細胞系はその産物−−この場合E4−−の発現でスクリーニングされる、また欠損のあるウイルス−−この場合E1およびE4の両方を欠損したウイルス−−を相補する機能性でスクリーニングされる。
この工程の結果、がAdGVCFTR.12のようなE1およびE4の機能の両方を欠損しているアデノウイルスベクターを相補することが可能な最初の293/E4細胞系が産生された。
実施例9
この実施例において293/OFR−6細胞系の作製について述べる。
プライマーA5s(33190)PおよびA5a(34084)Pをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)[PCRプロトコール,ア ガイド トゥ メソッド アンド アプリケーション(PCR Protocols, A guide to Methods and Applications),Innisら編,アデミックプレス社、1990年]に用いてクローニングのためのAd5 E4のORF−6遺伝子を増幅し、又、末端にPac Iサイトをつくった。増幅した断片をクレノウで平滑末端化しpCR−Script SK(+)(ストラタジーン社,ラ ジョラ,カリフォルニア州)にクローニングした。得られたプラスミド、pCR/ORF−6の配列を決定し、そのOFR−6挿入断片を、SMTプロモータを含んでいる平滑末端化されたEco RI−Hin dIII断片をpRCpuroの平滑末端化Mlu I−Hin dIIIサイトに連結させることによって作製したpSMT−puro発現ベクターに移し、pSMT/ORF−6を作製した。
トランスフェクトされた細胞がピューロマイシン耐性遺伝子[それを発現する細胞がピューロマイシンの存在下で生育し得る]の選択下に置かれているということを除けば、実施例8に記載したように293細胞系を培養しpSMT/ORF−6でトランスフェクトした。形質転換された細胞のコロニーをサブクローニングして、回収し、実施例8に記載したようにスクリーニングした。
この細胞系はAdGVCFTR.12ベクターシリーズのようなE1およびE4領域を欠損しているベクターを相補するのに好適である。
実施例10
この実施例では293/E4/E2A細胞系の作製について述べる。該293/E4/E2A細胞系によりE1、E4およびE2Aを欠損したウイルスベクターが増殖できる。
293/E4細胞に導入するためのE2A発現カセット(図5参照)は以下のように製する。最初の段階はE2Aの効率的な発現のためにE2AのATGのまわりの塩基を完全なコザックのコンセンサス(コザックら,J. Molec. Biol., 1 96, 947-950(1987))を形成するように改造することである。E2A遺伝子の5’末端を改造するために2つのプライマーを設計した。18塩基対のオリゴヌクレオチド(5'GCCGCCTCATCCGCTTTT3')(配列表配列番号3)であるAd5s(23884)をE2A遺伝子のSma Iサイトの隣にある内部領域を始点とするよに設計した。32塩基対のオリゴヌクレオチド(5'CCGGAATTCCACCATGGCGAGTCGGGAAGAGG3')(配列表配列番号4)であるDBP(ATG)R1を、クローニングを容易にするために、これを改造しているE2A遺伝子のATGのまわりの翻訳コンセンサス配列を完全なコザック拡張コンセンサス配列を導入するように、および丁度5’のEco RIサイトを導入するように設計した。上記のプライマーを用いて得られたPCR産物をEco RIおよびSma I(NEB)で消化し、pBluescript IIKS+(ストラタジーン社,ラ ジョラ,カリフォルニア州)の同一のポリリンカー部位にクローニングした。得られたプラスミドをpKS/ESDBPと命名した。
Sma I−Xba I断片をpHRカウフマン(Morinら,Mol. Cell Biol., 9, 4372-4380(1989))から単離し、E2Aの読み枠を補うためにpKS/ESDBPの対応するSma IおよびXba Iサイトにクローニングした。得られたプラスミドはpKSDBPと命名した。発現カセット内に含まれるベクター由来のすべての相同配列を排除するために、ポリリンカー内のEco RIサイトが破壊されている(ジェンベク,ロックヴィル,メリーランド州)PNEB193(NEB)の対応するKpn IおよびPme Iサイトに、pKSDBP由来のKpn I−Dra I断片を移した。得られたクローンpE2Aは実施例4のE2Aを欠失したベクターに相同するどんな余分な配列も有さずE2Aの読み枠の全てを含んでいる。
適切にmRNAが核でプロセッシングされるように、又、E2Aの発現がさらにエンハンスされるように5’スプライスカセットをpE2Aに移した。このことを行うために、実施例1に記載したpRK5をSac II(NEB)で消化し、マングビーンヌクレアーゼ(NEB)で平滑末端化し、そしてEco RI(NEB)で消化した。得られた、スプライシングシグナルを含む、およそ240塩基対の重要な断片をpE2AのCla I(クレノウにより平滑末端化された)−Eco RIサイトにクローニングし、p5’E2Aを製する。E2A配列を有するp5’E2A由来の平滑末端化された(クレノウ)Sal I−Hin dIII断片をpSMT/puroおよびpSMT/neoの平滑末端化された(クレノウ)Xba Iサイトに移す。
全てのE2A遺伝子を含んだpKSE2A由来のXba I断片をpSMT/puroおよびpSMT/neoのXba Iサイトに移す。得られたE2A発現プラスミド、pSMT/E2A/puroおよびpSMT/E2A/neoをそれぞれ293/E4および203/ORF−6細胞にトランスフェクトした。pSMT/E2A/puroでトランスフェクトされた細胞は標準培地+ピューロマイシン中の生育で選択され、pSMT/E2A/neoでトランスフェクトされた細胞は標準培地+ゲネチシン(G418;ライフテクノロジー社、ガイザースバーグ(Gaithersburg)、メリーランド州)中の生育で選択される。単離したコロニーのクローンの拡大は実施例8に記載のとおりである。得られた細胞系はそのE1、E4およびE2A欠損ウイルスベクターを相補する能力により選別される。
これらの細胞系は、ウイルスベクターのAdGVCFTR.13シリーズに記載されたものの様にウイルスのE1、E4およびE2A領域を欠損しているウイルスベクターを相補するのに好適である。
実施例11
この実施例では細胞系A549(ATCC)を親株として用いた相補的細胞系の作製について述べる。
Ad2ウイルスDNAは前述の技術によって調製される。ゲノムDNAはSsp IおよびXho Iで消化し、5438塩基対の断片を精製しpKS+(ストラタジーン)のEco RV/Xho IサイトにクローニングしpKS341−5778を作製した。クローンの特徴を測定した後、Xho I(クレノウを用いて平滑末端化された)−Eco RI断片をpRC/CMVneoのNru I(平滑)−Eco RIサイトに移しpElneoを製した。このクローンを用いてA549細胞を形質転換して相補的細胞系(293同様)を製する。該細胞では、293細胞の際に記載したのと同じ方法で、さらなる発現カセットが導入され、優れたプラーク形成能をもつ多相補的細胞系を製する。
実施例12
この実施例では293/E2A細胞系の作製の方法およびE2およびE4の両領域を欠損しているアデノウイルスベクターの構築のためのその利用について述べる。
実施例10に記載および図5に描写されるように、E2A発現カセットベクターが得られた。E2A発現カセットベクターはトランスフェクトされた細胞のマーカーとしてネオマイシン耐性を与える遺伝子を含んでいる。
又、実施例10に記載したように、293細胞はpSMT/E2A/neoでトランスフェクトされ、トランスフェクトされた細胞は標準培地+G418中での増殖で選別された。選別された細胞のクローン拡大は実施例8に記載されたようにして行われた。得られた細胞系は誘導時のそのDNA結合タンパク質(DBP;E2A遺伝子産物)を発現するそれらの能力およびE1およびE2A欠損ウイルスベクターを相補するそれらの能力でスクリーニングした。
DBP発現能力に対する、293/E2A細胞系のネオマイシン陽性(neo+;すなわち、ネオマイシン耐性)の単離クローンの能力を調べるために、細胞をG418存在下で生育させて選別を続けた。独立した単離クローンからの樹立した単層を100μMのZnCl2で24時間誘導させ、DBP遺伝子の発現を常法を用いてイムノブロッティングで検出した。調べた62株の内、42%のneo+細胞系がDPB発現に陽性(DPB+)であり、DPB+細胞系の全ては誘導性のDBP発現を示した。以下の表1にはDBP発現によるスクリーニングからのデータを表す:
続いてブラウらの方法、上述、を用いたイムノブロッティングによって誘導されたDBPの発現の程度でクローン化293/E2A細胞系をスクリーニングし、標識されたオートラジオグラフィー図で描写された結果を図6および7に示す。HeLaに基づくgmDBP2細胞のそれと同様程度にDBPを蓄積した細胞をさらに解析した。図6に示す様に、誘導された細胞の溶解物によると、誘導されたDBPの発現の程度は単離クローンによって大きく異なっている。例えば上述のように、細胞系104、112および216は誘導するとかなりの量のDBPを産生する、その一方で細胞系19および61はgmDBP2細胞によって産生されるほども産生しない。
誘導して最初の24時間にわたってDBPを蓄積する能力を、又再び、ブラウらの方法、上述、を用いてクローン化293/E2A細胞系について解析した。図7に示す様に、誘導後、0、2、16および24時間で回収した細胞の溶解物によると、いくつかの株にインキュベーション時間にわたる累進的なDBPの蓄積がウイルスの増殖と矛盾無く見られた。
得られた293/E2A細胞系による相補性を調べるために、常套の手法を用いてこれらの細胞系における増殖についてE2A欠失ウイルスを調べた。当業者にはよく知られているように、ウイルス増殖は宿主細胞の単層におけるプラーク形成の単純な観察によって半定量的に測定でき、ここでもそれを行った。同じ株についてE2A遺伝子の相対的な発現、すなわちDBPの相対的な発現をブラウら,Virology, 190, 624-634(1992)、に従ってイムノブロットにより測定した。各々の細胞系の前述のパラメーター(最も低い+/−〜最も高い+++++)に関して、発現あるいは増殖の相対的な程度を表2に述べる:
表2に反映されるように、この研究の結果は2つの293/E2A細胞系(すなわち54および112)はE2A欠失ウイルスのプラーク形成および、従って増殖を補助することを示した。
選別された細胞系はまた当分野には慣例の細胞培養法を用いてウイルスのE1およびE2A領域を欠損しているベクターを相補することも示された。そのような2重に欠損を有するベクターは実施例1および3に開示された方法を用いて製することができる。図8はE1およびE2A領域を欠損しているアデノウイルスベクターであるAdGVCFTR.12Bの構造を示している。細胞継代後の、トランスフェクトされた細胞の3つの異なる溶解物におけるAdGVCFTR.12Bベクターの存在は常套のPCRアッセイによって、ベクターに関連したDNA配列を検出することにより示された。CFTR配列(図9において“A”と標記したカラム)の存在、E2A配列の不在、すなわち欠失の根拠(“B”と標記したカラム)および野性型のE2A配列(“C”と標記したカラム)の存在について3つの異なった溶解物を別々に調べた。その実験は常套の方法を用いて成された、図9に示された臭化エチジウムで染色された、ゲル分離されたDNA断片の逆コントラスト写真から解析され得る。
結果は、3つの溶解物全てがAdGVCFTR.12Bベクターの構造に一致したCFTRおよびE2A欠失配列を含んでいることを示している。これらの溶解物には野性型のE2A配列は検出されなかった。図9において“M”は産物のサイズを確かめるためのDNAマーカーを表し、“+”は与えられたプライマーセットに正の鋳型を用いた場合のサンプルの印であり、“−”は与えられたプライマーセットに負の鋳型を用いた場合のサンプルの印であり、そして上述のA、BおよびCは試した3つのウイルス溶解物を表す。
それによって、E1およびE2領域に欠失を有するアデノウイルスベクターが作製され、2重の欠損ベクターを相補する能力を有する細胞系を確認した。
実施例13
この実施例では外来DNAの表現へのE2A欠失プラスミドの使用を説明する。
実施例4に述べたように、E2A欠失プラスミドpGV13(0)をpGV12Bベクターシリーズの構築に用いた。pGV13(0)の改変には、特有のSce I制限サイトをCla Iサイトと置換し、E2A遺伝子のATGのまわりの領域を能率的なコザックのコンセンサス配列に変更することが含められる。フランキングなSce I制限サイトを有するマーカー遺伝子(β−グルクロニダーゼ)をE2A遺伝子に挿入し、そのマーカー遺伝子は最も豊富な初期遺伝子、すなわちDBPの発現に用いられるシグナルの全てに応答して発現する。トランスフェクションおよび続いてβ−グルクロニダーゼ活性を評価することによって機能性について得られたプラスミド(pGBSE2GUS)を調べた;調べた全てのトランスフェクトした細胞系は、高いβ−グルクロニダーゼの発現レベルを示し、これはβ−グルクロニダーゼが基質X−gluとの反応を触媒するときに青色を産生することによって検出される。
図10で描写される様な他のウイルスベクター(AdGVLuc;E2GUS)は、例えば遺伝子治療目的の為の外来DNAの配置への欠失したE2領域の利用を説明するために構築される。AdGVLuc;E2GUSベクターはE1領域にCMVルシフェラーゼマーカーを含み、E2A領域にβ−グルクロニダーゼを含む。前ベクター(AdGVLuc.10)は293/E2A細胞をトランスフェクトするのに用いられ、得られたウイルスプラークのその後のX−gluを用いたβ−グルクロニダーゼについての染色では実際、青色は示されなかった、すなわちβ−グルクロニダーゼ活性は検出されなかった。AdGVLuc;E2GUSベクターでトランスフェクトされた293/E2A細胞から形成されたプラークは、X−gluの添加によって、かなりの量の青色を産生した。
従って、アデノウイルスベクターのE2A領域で置換された外来DNAは機能できる。
実施例14
この実施例では293/ORF6細胞系の作製方法およびE1およびE4領域の両方を欠損しているアデノウイルスベクターを構築するためのその利用について説明する。
図11に描写されるE4−ORF6発現カセットは上記の実施例9に開示された方法を用いて構築される。293細胞のトランスフェクションはpSMT/ORF6/puroでなされ、トランスフェクトされた細胞は標準の培地+ピューロマイシン中での生育によって選別された。クローンの拡大は実施例8に記載されたようにして行った。得られた細胞系は誘導の際のそれらのE4−ORF6の発現能力およびE1およびE4を欠損したウイルスベクターを補う能力で選別した。
293/ORF6細胞系のピューロマイシン陽性(puro+、すなわちピューロマイシン耐性)の単離クローンはそれらのORF6の発現能力で選別した。選別を維持するためにピューロマイシン存在下で細胞を生育させた。個々の単離クローンからの確立した単層を100μMのZnCl2で24時間かけて誘導した。ORF6遺伝子の発現はノザンブロッティング、それによるRNA転写を確認することによって検出した。試した各々の細胞系の発現の相対的な程度(最も低い(+)〜最も高い +++++)を表3に示す。
ORF6遺伝子の発現を調べた結果はピューロマイシン耐性細胞系の53%はORF6転写陽性であり、ORF6が陽性なような細胞系は全てORF6発現を誘発しやすいことを示した。
またPCRはアデノウイルスベクターのE4欠失領域での遺伝子の挿入を検出するために用いられ、その結果は図12に描写される。AdGVβgal.12でトランスフェクトされた継代された細胞の溶解物を野性型E4に関連したある遺伝子配列、すなわち3087塩基対および367塩基対の断片を増幅するPCRに付した。モック感染させた293/ORF6細胞(レーン1)、AdGVβgal.10で感染させた細胞(レーン2)およびAdGVβgal.12で感染させた細胞(レーン3)をゲル電気泳動および臭化エチジウム染色に付した。図12に示される得られた染色されたゲルの逆コントラスト写真は、AdGVβgal.10ベクターが367塩基対の配列を含むE4領域の部分を欠いていること、AdGVβgal.12ベクターが3087塩基対配列を含むE4領域の部分を欠いていることを示している。
293/ORF6細胞系においてE4を欠失したベクターの増殖を観察した。細胞を10感染多重度(moi)で感染させ、生育5日後でかなりの量のウイルスの増殖が相補性プラーク解析によって観察された。結果を細胞あたりのプラーク形成単位(PFU)をy軸に、および調べた細胞系をx軸に示した棒グラフである図13に描写する。陽性コントロール生育としては、E4の機能を補うことが知られている細胞系W162を用いた。陰性コントロールとしては、E1機能のみを補うことが知られている293細胞系を用いた。細胞系A2、B8、216および406はE4欠失ウイルス(d1366)の定量的に異なる相補性を示す293/ORF6細胞系の独立した単離体である。
従って細胞系がE4機能を相補する−それによってE4欠失ウイルスの増殖を可能にし、機能を有する外来DNAを担持することが可能であることが示される−と確認された。これらの細胞系はウイルスのE1およびE4領域を2重に欠損した、上記のAdGVCFTR.12シリーズに記載された様な、あるいはAdGVβ-gal.12ベクターの図説である図14に示されたようなベクターを相補するに好適である。AdGVβ-gal.12ベクターはE1領域に挿入されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と欠失のあるE4領域を有している。
実施例15
この実施例ではE1およびE4欠失を有するアデノウイルスベクターの利用を説明する。
E4欠失プラスミドであるpGBS△E4はいくつかの特徴的な制限部位を含むように改変されている。これらのサイトは、この領域に好適な外来DNAをクローン化するために用いられ、発現のためには、アデノウイルスE4プロモーターが用いられる。上述のように、この領域でのβ−グルクロニダーゼのクローニングによって、完全に機能的であり、外来DNAを発現しているウイルスベクターが得られた。従って、E1領域に配置された好適な外来DNAおよびE4領域での他の好適な外来DNA、これらはともに同一ウイルスベクター上にあり、それぞれの外来DNAをE1およびE4プロモーターあるいは必要とされる他のプロモーターの制御を利用して発現することができる。
E4領域の2番目の改変は種々の異種の制御要素由来の好適な外来DNAの発現を許す。プラスミド構築物は多数の交換が都合よくなされ得るようにして造られる。マルチプラスミドは都合よく交換され得る次のような特徴を有する:
1.相同組換えに使用されるアデノウイルス部分−ベクターのE1末端およびE4末端に外来DNAを配置するために結合している−;
2.プロモーター部分;
3.スプライスシグナル部分;
4.外来DNA部分;
5.ポリアデニレーション部位;
6.アデノウイルスパッケージング配列;
7.アデノウイルスITR;および
8.哺乳類の組織培養と同様に細菌においてもプラスミドを選択および生育するために必要な全てのプラスミドDNA配列。
ここで述べられた刊行物および特許を含めた全ての引例は、ここに言及したことで、引用により組み込まれるべく、個々に、詳細に示され、ここにその全てが明示されたと同程度に、明細書中に組み込まれるものである。
本発明は好適な具体例を強調して記載したものであるが、好適には具体例は変更させて良いことは当業者には明白である。ここで詳細に記載された以外の方法で該発明を実行してもよい。従って、本発明は添付の請求項の精神および範囲内に包含される全ての変更を含むものである。
配列表
(1)一般情報
(i)出願人:ジェンベク、インコーポレイテッド
(ii)発明の名称:相補的なアデノウイルスベクター系と細胞系
(iii)配列の数:4
(iv)コンピューターリーダブル形式:
(A)媒体の種類:フロッピーディスク
(B)コンピューター:IBM PC 互換機
(C)オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウェア:パテントイン リリース#1.0,バージョン#1.25
(v)現在の出願人に関するデータ:
(A)出願番号:WO PCT/US95/07341
(B)出願日:1995年6月7日
(C)分類:
(iv)優先出願に関するデータ:
(A)出願番号:US 258416
(B)出願日:1994年6月10日
(2)配列番号1に関する情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:32塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(合成)
(xi)配列:配列番号1:
(2)配列番号2に関する情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:34塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(合成)
(xi)配列:配列番号2:
(2)配列番号3に関する情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(合成)
(xi)配列:配列番号3:
(2)配列番号4に関する情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:32塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(合成)
(xi)配列:配列番号4:
Claims (18)
- (i)(a)アデノウイルスゲノムのE1領域及びE4領域の1以上の遺伝子機能をトランスに相補することをその複製に必要とし(他の領域の遺伝子機能の相補は必要ない)、且つ(b)アデノウイルスゲノムの全E4領域を欠失している、変異アデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクター、及び
(ii)核ゲノムに、誘導可能なプロモーターに機能的に連結しているアデノウイルスゲノムのE4領域のオープンリーディングフレーム6(ORF−6)が挿入されている(E4領域の他のORFは挿入されていない)、アデノウイルスベクターがその中で複製する293細胞(E4領域内で細胞ゲノムとアデノウイルスゲノムとの重複はない)
を含んでなるシステム。 - (i)(a)アデノウイルスゲノムのE1領域、E2A領域及びE4領域の1以上の遺伝子機能をトランスに相補することをその複製に必要とし(他の領域の遺伝子機能の相補は必要ない)、且つ(b)アデノウイルスゲノムの全E4領域を欠失している、変異アデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクター、及び
(ii)核ゲノムに、誘導可能なプロモーターに機能的に連結しているアデノウイルスゲノムのE4領域のオープンリーディングフレーム6(ORF−6)が挿入されている(E4領域の他のORFは挿入されていない)、アデノウイルスベクターがその中で複製する293細胞(E4領域内で細胞ゲノムとアデノウイルスゲノムとの重複はない)
を含んでなるシステム。 - アデノウイルスベクターがE3領域の全部又は一部の欠失を含む、請求項1又は2記載のシステム。
- アデノウイルスゲノムがヒトアデノウイルスゲノムである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のシステム。
- アデノウイルスゲノムがAd5アデノウイルスゲノムである、請求項4記載のシステム。
- 293細胞が293/OFR−6と命名されるものである、請求項1〜5のいずれか1項に記載のシステム。
- 293細胞系におけるアデノウイルスゲノムのE4領域のORF−6がヒトアデノウイルスゲノムのE4領域のORF−6である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のシステム。
- 293細胞系におけるアデノウイルスゲノムのE4領域のORF−6がAd5アデノウイルスゲノムのE4領域のORF−6である、請求項7に記載のシステム。
- 誘導可能なプロモーターがヒツジメタロチオネインプロモーターである、請求項1〜8のいずれか1項に記載のシステム。
- アデノウイルスベクターを増殖させる方法であって、以下を含む方法:
(i)(a)アデノウイルスゲノムのE1領域及びE4領域の1以上の遺伝子機能をトランスに相補することをその複製に必要とし(他の領域の遺伝子機能の相補は必要ない)、且つ(b)アデノウイルスゲノムの全E4領域を欠失している、変異アデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターを提供すること、
(ii)核ゲノムに、誘導可能なプロモーターに機能的に連結しているアデノウイルスゲノムのE4領域のオープンリーディングフレーム6(ORF−6)が挿入されている(E4領域の他のORFは挿入されていない)、アデノウイルスベクターがその中で複製する293細胞(E4領域内で細胞ゲノムとアデノウイルスゲノムとの重複はない)を提供すること、及び
(iii)293細胞中でアデノウイルスベクターを増殖させること。 - アデノウイルスベクターを増殖させる方法であって、以下を含む方法:
(i)(a)アデノウイルスゲノムのE1領域、E2A領域及びE4領域の1以上の遺伝子機能をトランスに相補することをその複製に必要とし(他の領域の遺伝子機能の相補は必要ない)、且つ(b)アデノウイルスゲノムの全E4領域を欠失している、変異アデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターを提供すること、
(ii)核ゲノムに、誘導可能なプロモーターに機能的に連結しているアデノウイルスゲノムのE4領域のオープンリーディングフレーム6(ORF−6)が挿入されている(E4領域の他のORFは挿入されていない)、アデノウイルスベクターがその中で複製する293細胞(E4領域内で細胞ゲノムとアデノウイルスゲノムとの重複はない)を提供すること、及び
(iii)293細胞中でアデノウイルスベクターを増殖させること。 - アデノウイルスベクターがE3領域の全部又は一部の欠失を含む、請求項10又は11記載の方法。
- アデノウイルスゲノムがヒトアデノウイルスゲノムである、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
- アデノウイルスゲノムがAd5アデノウイルスゲノムである、請求項13記載の方法。
- 293細胞が293/OFR−6と命名されるものである、請求項10〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 293細胞系におけるアデノウイルスゲノムのE4領域のORF−6がヒトアデノウイルスゲノムのE4領域のORF−6である、請求項10〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 293細胞系におけるアデノウイルスゲノムのE4領域のORF−6がAd5アデノウイルスゲノムのE4領域のORF−6である、請求項16に記載の方法。
- 誘導可能なプロモーターがヒツジメタロチオネインプロモーターである、請求項10〜17のいずれか1項に記載の方法。
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