ES2329607T3

ES2329607T3 - Metodos de purificacion de virus.

Info

Publication number: ES2329607T3
Application number: ES06126383T
Authority: ES
Inventors: Miranda Weggeman; Emile Joannes Josephus Maria Van Corven
Original assignee: Crucell Holand BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 2004-02-23
Filing date: 2005-02-21
Publication date: 2009-11-27
Anticipated expiration: 2025-02-21
Also published as: CA2555412C; DK1780269T3; CA2555412A1; US8124106B2; WO2005080556A3; DE602005015332D1; JP2007522814A; WO2005080556A9; EP1780269A2; US20070207461A1; KR20070001163A; NZ548495A; CN101343625A; EP1718738A2; WO2005080556A2; AU2005214090A1; KR101211329B1; US20090017523A1; AU2005214090B2; ATE435906T1

Abstract

Método para eliminar proteínas de adenovirus libres de una preparación de adenovirus recombinante, que comprende la etapa de: someter una preparación de adenovirus recombinante que comprende proteínas de adenovirus libres a un filtro cargado que contiene grupos de intercambio aniónico.

Description

Métodos de purificación de virus.

Antecedentes de la invención

Virus, o bien aquéllos que se producen en la naturaleza, o bien versiones recombinantes de los mismos, se usan para vacunación y en el campo de la terapia génica. Es posible que muchos virus o partículas similares a virus se propaguen de manera segura y eficaz en células huésped (véase por ejemplo el documento WO 01/38362, que describe la propagación de diversos virus en células huésped siendo células de retina inmortalizadas por E1). Los adenovirus recombinantes son una clase preferida de vectores virales para su uso en terapia génica y para fines de vacunación. Tales adenovirus recombinantes normalmente son deficientes en al menos la región E1, y se propagan en células complementarias que proporcionan la región E1, tales como células 293, o células de retina inmortalizadas por E1 tales como células PER.C6^{TM} (véase por ejemplo la patente estadounidense 5.994.128).

Tras la propagación de los virus en las células huésped, para prácticamente todas las aplicaciones es necesario purificar los virus a partir de las células huésped, antes de su uso adicional.

La solicitud de patente internacional WO 98/22588 describe métodos para la producción y purificación de vectores adenovirales. Los métodos comprenden hacer crecer células huésped, infectar las células huésped con adenovirus, recoger y lisar las células huésped, concentrar el lisado bruto, cambiar el tampón del lisado bruto, tratar el lisado con nucleasa y purificar adicionalmente el virus usando cromatografía.

Varias otras publicaciones describen la purificación de virus a partir de células huésped, la mayoría concentrándose en el uso de matrices cromatográficas específicas para la purificación del virus a partir de un lisado de células huésped, véanse por ejemplo las patentes estadounidenses 6.008.036, 6.586.226, 5.837.520, 6.261.823, 6.537.793 y las solicitudes de patente internacional WO 00/50573, WO 02/44348 y WO 03/078592. La mayoría de los métodos descritos aplican una etapa de tratamiento con nucleasa para degradar las impurezas de ADN. A pesar de la descripción de varios procedimientos con respecto a diferentes matrices de cromatografía, sigue habiendo una necesidad de métodos alternativos y preferiblemente mejorados para la purificación de virus a partir de cultivos de células huésped. La presente invención proporciona tales métodos.

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Descripción de las figuras

Figura 1. Esquema del método conocido de recoger las células (T/B) frente al método según la invención (B/T), véase el ejemplo 1. T: Triton, B: Benzonase. p.i.: post-infección.

Figura 2. Eliminación de proteínas de célula huésped en la clarificación tras el procedimiento T/B frente a B/T (véase la figura 1 para el esquema). Se muestra un análisis de SDS-PAGE (del 4-12% de bis-tris NuPAGE, Invitrogen) teñido con plata de muestras en proceso de 5 purificaciones separadas (véase el ejemplo 1 y la tabla 1 para las muestras). El panel 2 es de una recogida T/B, en la que la lisis precedió a la adición de nucleasa; los paneles 3-7 son de una recogida B/T, en la que se añadió nucleasa antes de la lisis. Se clarificó el material recogido (carriles 1) mediante un filtro Clarigard de 0,5 \mum (carriles 2), seguido por un filtro Sartopore 2 de 0,8/0,45 \mum (carriles 3). M: marcador, el P_{M} en kD se muestra al lado.

Figura 3. Cromatograma de material retenido Ad35 TFF (ejemplo 6) cargado en una columna Q-XL (panel A) y en un filtro cargado (panel B). El círculo en el panel B indica el pico adicional, que solamente se separa del pico de virus usando el filtro cargado.

Figura 4. Análisis de centrifugación en disco de dos fracciones del cromatograma del filtro cargado. El panel A muestra el perfil de sedimentación del pico del virus Ad35, el panel B muestra el perfil de sedimentación del pico adicional (señalado con un círculo en la figura 3).

Figura 5. Análisis SDS-PAGE de fracciones cromatográficas de Ad35 (véase el ejemplo 6). Gel de bis-tris al 4-12%, teñido con plata. El gel A muestra las fracciones de la serie con el filtro cargado: 1. marcador; 2. material de partida; 3. fracción no retenida; 4. pico 1 (señalado con un círculo en la figura 3); 5. pico de Ad35. El gel B muestra las fracciones de la serie de Q-XL: 1. material de partida; 2. fracción no retenida; 3. pico de Ad35.

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Descripción de la invención

La presente invención proporciona métodos y usos para la eliminación de proteínas de adenovirus libres de preparaciones de adenovirus recombinantes según las reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención Células huésped

Una célula huésped según la presente invención puede ser cualquier célula huésped en la que un virus deseado puede propagarse. Por ejemplo, la propagación de vectores de adenovirus recombinante se realiza en células huésped que complementan las deficiencias en el adenovirus. Tales células huésped preferiblemente tienen en su genoma al menos una secuencia E1 de adenovirus, y por eso son capaces de complementar adenovirus recombinantes con una deleción en la región E1. Además, el adenovirus puede tener una deleción en la región E3, que es una región prescindible del genoma de Ad, y por tanto una deleción de este tipo no tiene que complementarse. Puede usarse cualquier célula huésped que complemente E1, tal como células de retina humana inmortalizadas mediante E1, por ejemplo 911 (véase la patente estadounidense 5.994.128), amniocitos transformados con E1 (véase la patente europea 1230354), células A549 transformadas con E1 (véanse por ejemplo el documento WO 98/39411, la patente estadounidense 5.891.690), GH329:HeLa (Gao et al, 2000, Human Gene Therapy 11: 213-219), 293 y similares. Preferiblemente células PER.C6^{TM} (patente estadounidense 5.994.128) o células derivadas de las mismas se usan como células huésped, puesto que son adecuadas para la propagación de diversos virus diferentes (véase por ejemplo el documento WO 01/38362), incluyendo, pero sin limitarse a adenovirus recombinantes.

Líneas celulares y métodos adicionales para la propagación de vectores adenovirales recombinantes se han dado a conocer por ejemplo en la patente estadounidense 6.492.169 y en el documento WO 03/104467.

Ejemplos de otras líneas celulares de mamíferos útiles que pueden usarse directamente como células huésped para propagar virus o convertirse en células huésped complementarias para virus deficiente en replicación son células Vero y HeLa y líneas celulares de ovario de hámster chino, W138, BHK, COS-7, HepG2, 3T3, RIN y células MDCK, tal como las conoce el experto en la técnica.

Las células huésped según la invención se cultivan para aumentar los números de células y virus y/o los títulos de virus. Se realiza el cultivo de una célula para permitir que metabolice, y/o crezca y/o divida y/o produzca virus de interés según la invención. Esto puede lograrse mediante métodos como los bien conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a proporcionar nutrientes para la célula, por ejemplo en los medios de cultivo apropiados. Los métodos pueden comprender el crecimiento adherido a superficies, el crecimiento en suspensión o combinaciones de los mismos. Puede realizarse el cultivo por ejemplo en placas, frascos rotativos o en biorreactores, usando sistemas discontinuos, semicontinuos o continuos, fibra hueca y similares. Con el fin de lograr una producción a gran escala (continua) de virus a través de cultivo celular se prefiere en la técnica tener células que puedan crecer en suspensión, y se prefiere tener células que puedan cultivarse en ausencia de suero derivado de animal o ser humano o de componentes de suero derivado de animal o ser humano. Se conocen las condiciones adecuadas para cultivar células (véase por ejemplo Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Paterson, editores (1973), y R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, cuarta edición (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9).

La presente invención comprende someter a lisis células huésped cultivadas que están infectadas con virus. El cultivo de células huésped y su infección con un virus son bien conocidos por el experto en la técnica. La infección de células huésped puede lograrse por ejemplo de manera simple exponiendo el virus a la célula huésped apropiada en condiciones fisiológicas, permitiendo la captación del virus. Para ciertos virus incluso no es necesario empezar con el propio virus, puesto que pueden usarse secuencias de ácidos nucleicos para reconstituir el virus en las células cultivadas.

Varios aspectos de y sistemas adecuados para cultivar células huésped para la producción de adenovirus también pueden encontrarse en el documento WO 98/22588, páginas 11-28. Métodos para cultivar células y propagar virus en células huésped también se han dado a conocer en, por ejemplo, las patentes estadounidenses 6.168.944, 5.994.134, 6.342.384, 6.168.941, 5.948.410, 5.840.565, 5.789.390, 6.309.650, 6.146.873 y las solicitudes de patente internacional WO 01/38362, WO 01/77304 y WO 03/084479.

Adenovirus

Preferiblemente, el vector adenoviral es deficiente en al menos una función génica esencial de la región E1, por ejemplo, la región E1a y/o la región E1b, del genoma adenoviral que se requiere para la replicación viral. En ciertas realizaciones, el vector es deficiente en al menos una función génica esencial de la región E1 y al menos parte de la región E3 no esencial (por ejemplo, una deleción Xba I de la región E3). El vector adenoviral puede ser "deficiente múltiple", que significa que el vector adenoviral es deficiente en una o más funciones génicas esenciales en cada una de dos o más regiones del genoma adenoviral. Por ejemplo, los vectores adenovirales deficientes en E1 o deficientes en E1, E3 mencionados anteriormente pueden ser deficientes además en al menos un gen esencial de la región E4 y/o al menos un gen esencial de la región E2 (por ejemplo, la región E2A y/o la región E2B). Los vectores adenovirales delecionados de toda la región E4 pueden provocar respuestas inmunitarias del huésped inferiores. Los ejemplos de vectores adenovirales adecuados incluyen vectores adenovirales que carecen de (a) toda o parte de la región E1 y toda o parte de la región E2, (b) toda o parte de la región E1, toda o parte de la región E2 y toda o parte de la región E3, (c) toda o parte de la región E1, toda o parte de la región E2, toda o parte de la región E3 y toda o parte de la región E4, (d) al menos parte de la región E1a, al menos parte de la región E1b, al menos parte de la región E2a y al menos parte de la región E3, (e) al menos parte de la región E1, al menos parte de la región E3 y al menos parte de la región E4 y (f) todos los productos génicos adenovirales esenciales (por ejemplo, amplicones adenovirales que comprenden ITRs y la señal de empaquetamiento solamente). En caso de deleciones de regiones esenciales del genoma de adenovirus, las funciones codificadas por estas regiones han de proporcionarse en trans, preferiblemente por la célula huésped, es decir cuando partes o la totalidad de las regiones E1, E2 y/o E4 se delecionan del adenovirus, estas han de estar presentes en la célula huésped, por ejemplo integradas en el genoma, o en forma del denominado adenovirus auxiliar o plásmidos auxiliares. El vector adenoviral deficiente en replicación puede generarse usando cualquier especie, cepa, subtipo o mezcla de especies, cepas o subtipos de un adenovirus o un adenovirus quimérico como fuente de ADN de vector (véase por ejemplo los documentos WO 96/26281, WO 00/03029), que por ejemplo pueden proporcionar el vector adenoviral con la capacidad de infectar ciertos tipos de células deseados. El vector adenoviral puede ser cualquier vector adenoviral que puede crecer en una célula, que se deriva en alguna parte significativa (aunque no necesariamente sustancialmente) de o se basa en el genoma de un adenovirus. El vector adenoviral puede comprender un genoma adenoviral de un adenovirus de tipo salvaje del grupo C, especialmente de serotipo 5 (es decir, Ad5) o Ad2. El vector adenoviral puede comprender también un genoma adenoviral o al menos una proteína fibrosa derivada de un adenovirus de grupo B, por ejemplo Ad11, Ad35, Ad51, etc. (véase por ejemplo el documento WO 00/70071), cuyas realizaciones tienen la ventaja de que se encuentran menos anticuerpos neutralizantes contra estos serotipos en la población, y confieren la posibilidad de seleccionar como diana otros tipos de células, puesto que el tropismo de estos vectores adenovirales difiere de los derivados de Ad5. Obviamente, el experto en la técnica conocerá que puede aplicarse también cualquier otro serotipo. El experto en la técnica será consciente de las posibilidades de propagar vectores adenovirales de serotipos diferentes en células huésped específicas, usando métodos tales como por ejemplo los dados a conocer en la patente estadounidense 6.492.169 o en el documento WO 03/104467, y referencias en los mismos. Vectores adenovirales, métodos para la construcción de los mismos y métodos para propagarlos, se conocen bien en la técnica y se describen en, por ejemplo, las patentes estadounidenses números 5.559.099, 5.837.511, 5.846.782, 5.851.806, 5.994.106, 5.994.128, 5.965.541, 5.981.225, 6.040,174, 6.020.191 y 6.113.913, y Thomas Shenk, "Adenoviridae and their Replication", M. S. Horwitz, "Adenoviruses", capítulos 67 y 68, respectivamente, en Virology, B. N. Fields et al., eds., 3ª ed., Raven Press, Ltd., Nueva York (1996), y otras referencias mencionadas en el presente documento.

La construcción de vectores adenovirales se entiende bien en la técnica e implica el uso de técnicas de biología molecular habituales, tales como las descritas en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2ª ed., Scientific American Books (1992), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995), y otras referencias mencionadas en el presente documento.

Transgenes

En una realización, el virus según la invención es un virus de tipo salvaje, o un mutante o parte del mismo que todavía es infeccioso en células huésped según la invención.

En otra realización, el virus es un virus recombinante que comprende información heteróloga, que puede usarse en un ámbito terapéutico para fines de terapia génica, o como antígeno para fines de vacunación. Esta es una realización preferida usando por ejemplo vectores adenovirales. La información heteróloga se refiere a "transgén". Los métodos según la presente invención son aplicables a un virus, preferiblemente adenovirus, que comprende cualquier transgén, y por tanto la naturaleza del transgén no es en sí misma materia de la presente invención.

Varios posibles transgenes se han descrito por ejemplo en el documento WO 98/22588, páginas 42-49. Transgenes que pueden estar presentes en un virus según la invención pueden ser por ejemplo genes terapéuticos, tales como genes supresores de tumores, incluyendo pero sin limitarse a p53, p16, APC, DCC, NF-1, WT-1, p21, BRCA1, BRCA2 y similares; enzimas, tales como citosina desaminasa, HGPRT, glucocerebrosidasa, timidina quinasa de VHS o timidina quinasa humana, etc.; hormonas, tales como hormona del crecimiento, prolactina, eritropoyetina, gonadotropina coriónica, hormona estimulante de la tiroides, leptina, ACTH, angiotensina, insulina, glucagón, somatostatina, calcitonina, vasopresina y similares; interleucinas y citocinas, tales como IL-1, IL-3, IL-12, G-CSF, GM-CSF, TNF y similares; sustitución de genes que faltan o están mutados en trastornos específicos, tales como ADA, factor IX, CFTR, etc.; otros genes terapéuticos tales como inhibidores de la angiogénesis, inhibidores del ciclo celular y similares; constructos antisentido para inhibir la expresión de por ejemplo oncogenes, tales como ras, myc, jun, bcl, abl y similares; así como antígenos para vacunas tales como antígenos virales, por ejemplo derivados de un picornavirus, coronavirus, togavirus, flavivirus, rhabdovirus, paramixovirus, ortomixovirus, poxvirus, hepadnavirus, reovirus, retrovirus, herpesvirus y similares, por ejemplo más específicamente antígenos de influenza (con como antígenos potenciales por ejemplo HA y/o NA), hepatitis B (con como antígeno potencial el antígeno de superficie de hepatitis B), virus del Nilo occidental, rabia, CoV-SARS, virus del herpes simple 1 y 2, sarampión, viruela, polio, VIH (con antígenos por ejemplo gag derivado de VIH-1, env, nef, o modificaciones de los mismos incluyendo versiones optimizadas de codones, véase por ejemplo el documento WO 02/22080), virus de Ébola, de Marburg, de Lassa; o antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos de parásitos (incluyendo tripanosomas, tenias, ascárides, helmintos, malaria, etc.) y similares. Claramente, el experto en la técnica elegirá el gen de interés que es útil en la práctica terapéutica concebida, siendo en terapia génica y/o en vacunación, y no está restringido a lo enumerado anteriormente. También está claro que regiones de control para el transgén están preferiblemente presentes en vectores virales recombinantes dirigidos a la expresión del transgén, por ejemplo incluyendo un promotor y una señal de poliadenilación. Todos estos aspectos son bien conocidos por el experto en la técnica, y no necesitan elaborarse adicionalmente en el presente documento. Varias regiones control se tratan en el documento WO 98/22588, páginas 49-55.

Algunos adenovirus usados en la presente invención se tratan adicionalmente en los ejemplos.

Lisado de las células huésped

Tras la infección de un adenovirus, el virus se replica dentro de la célula y de este modo se amplifica. La infección por adenovirus da como resultado finalmente la lisis de las células que están infectándose. Las características líticas de los adenovirus permiten, por tanto, dos modos diferentes de producción de virus. El primer modo es recoger el virus antes de la lisis de las células, empleando factores externos para lisar las células. El segundo modo es recoger sobrenadante de virus tras la lisis (casi) completa de las células por el virus producido (véase por ejemplo la patente estadounidense 6.485.958, que describe la recogida de adenovirus sin lisis de las células huésped por un factor externo). Para el último modo, se requieren tiempos de incubación más largos con el fin de lograr la lisis de células completa, y por tanto altos rendimientos de virus. Además, el derrame gradual del contenido de la célula huésped en el medio puede ser perjudicial para la integridad y el rendimiento de los virus obtenidos. Por tanto, se prefiere emplear factores externos para lisar activamente las células, según la invención.

Métodos que pueden usarse para la lisis activa de células son conocidos por el experto en la técnica, y se han tratado por ejemplo en el documento WO 98/22588, páginas 28-35. Métodos útiles en este sentido son por ejemplo, congelación-descongelación, cizalla sólida, lisis hipertónica y/o hipotónica, cizalla líquida, sonicación, extrusión a alta presión, lisis por detergente, combinaciones de los anteriores y similares. En una realización de la invención, las células se lisan usando al menos un detergente. El uso de un detergente para la lisis tiene la ventaja de que es un método fácil, y que puede escalarse fácilmente. En otra realización, las células se lisan mediante cizalla usando ultrafiltración de fibras huecas, tales como las que se describen en el documento WO 03/084479.

Detergentes

Detergentes que pueden usarse según la presente invención, y el modo en el que se emplean, son generalmente conocidos por el experto en la técnica. Varios ejemplos se tratan por ejemplo en el documento WO 98/22588, páginas 29-33.

Nucleasa

La presente invención emplea nucleasa para eliminar contaminantes, es decir la mayor parte de la célula huésped, ácidos nucleicos. Nucleasas a modo de ejemplo adecuadas para su uso en la presente invención incluyen Benzonase®, Pulmozyme®, o cualquier otra DNasa y/o RNasa usadas comúnmente dentro de la técnica. En realizaciones preferidas de la invención, la nucleasa es Benzonase®, que hidroliza rápidamente ácidos nucleicos hidrolizando enlaces fosfodiéster internos entre nucleótidos específicos, reduciendo de ese modo la viscosidad del lisado de células. Benzonase® puede obtenerse comercialmente de Merck KGaA (código W214950).

Clarificación

En realizaciones preferidas de la invención, se clarifica el lisado de células huésped que comprende el virus. La clarificación puede realizarse mediante una etapa de filtración, eliminando residuos de células y otras impurezas. Los filtros adecuados pueden utilizar filtros de celulosa, fibras de celulosa regeneradas, fibras de celulosa combinadas con ayudas filtrantes inorgánicas (por ejemplo tierra de diatomeas, perlita, sílice pirogénica), filtros de celulosa combinados con ayudas filtrantes inorgánicas y resinas orgánicas, o cualquier combinación de los mismos, y filtros poliméricos (los ejemplos incluyen pero no se limitan a nailon, polipropileno, polietersulfona) para lograr la eliminación eficaz y recuperaciones aceptables. En general, un procedimiento de múltiples etapas es preferible pero no requerido. Un procedimiento de dos o tres etapas a modo de ejemplo consistiría en filtro(s) de curso para eliminar precipitados grandes y residuos de células seguido de filtro(s) de segunda fase de pulido con tamaños de poro nominales superiores a 0,2 micras pero inferiores a 1 micra. La combinación óptima puede ser una función de la distribución de tamaño del precipitado así como de otras variables. Además, también pueden usarse para la clarificación operaciones de una única etapa empleando un filtro relativamente estrecho o centrifugación. De manera más general, será aceptable usar en la etapa de clarificación de la presente invención cualquier enfoque de clarificación incluyendo filtración clásica, microfiltración, centrifugación o adición de ayudas filtrantes (por ejemplo tierra de diatomeas) en combinación con filtración clásica o en profundidad, que proporciona un filtrado de claridad adecuada para no obstruir la membrana y/o las resinas en las etapas posteriores.

En una realización, se usa filtración en profundidad y filtración por membrana. Productos comercialmente disponibles útiles a este respecto se mencionan por ejemplo en el documento WO 03/097797, páginas 20-21. Membranas que pueden usarse pueden estar compuestas por materiales diferentes, pueden diferir en el tamaño de poro y pueden usarse en combinaciones. Pueden obtenerse comercialmente de diversos vendedores.

Ultrafiltración/diafiltración

En ciertas realizaciones de la invención, se somete la suspensión de virus a ultrafiltración/diafiltración al menos una vez durante el procedimiento, por ejemplo para concentrar el virus y/o intercambiar el tampón, y/o para la concentración y diafiltración del material recogido clarificado. El procedimiento usado para concentrar el virus según el método de la presente invención puede incluir cualquier procedimiento de filtración (por ejemplo, ultrafiltración (UF)) en el que se aumenta la concentración de virus forzando al diluyente a pasar a través de un filtro de tal manera que se elimina el diluyente de la preparación de virus mientras que el virus no puede pasar a través del filtro y de este modo permanece, de forma concentrada, en la preparación de virus. Se describe la UF en detalle en, por ejemplo, Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman y A. Zydney (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, 1996). Un procedimiento de filtración preferido es la filtración de flujo tangencial ("FFT") tal como se describe en, por ejemplo, el catálogo de MILLIPORE titulado "Pharmaceutical Process Filtration Catalogue" páginas 177-202 (Bedford, Massachusetts, 1995/96). La FFT se usa ampliamente en la industria de bioprocesamiento para la recogida de células, clarificación, y concentración de productos incluyendo virus. El sistema está compuesto por tres corrientes de proceso distintas: la disolución de alimentación, el permeado y el material retenido. Dependiendo de la aplicación, pueden usarse filtros con diferentes tamaños de poro. En una realización de la presente invención, el material retenido es el producto y puede usarse para etapas de purificación adicionales si se desea. Para esta realización, la membrana de ultrafiltración particular seleccionada tendrá un tamaño de poro suficientemente pequeño para retener virus pero suficientemente grande para aclarar eficazmente las impurezas. Dependiendo del fabricante y del tipo de membrana, para límites de exclusión de peso molecular nominal de adenovirus (NMWC, nominal molecular weight cutoff) entre 100 y 1000 kDa pueden ser apropiadas, por ejemplo membranas con NMWC de 300 kDa o 500 kDa. La composición de la membrana puede ser, pero no se limita a, celulosa regenerada, polietersulfona, polisulfona, o derivados de las mismas. Las membranas pueden ser hojas planas o fibras huecas. La UF se refiere generalmente a la filtración usando filtros con un tamaño de poro más pequeño que 0,1 \mum. Los productos se retienen generalmente, mientras que se reduce el volumen a través de la permeación. Las dos geometrías más ampliamente usadas para la FFT en la industria biofarmacéutica son módulos de placa y bastidor y fibra hueca. Se desarrollaron unidades de fibra hueca para la ultrafiltración y microfiltración por Amicon y Ramicon en el inicio de los años 70 (Cheryan, M. Ultrafiltration Handbook), a pesar de que ahora existen múltiples vendedores incluyendo Spectrum y A/G Technology. Los módulos de fibra hueca consisten en una serie de fibras autosostenidas con una capa de piel densa que proporciona a las membranas su selectividad de permeación. Los diámetros de las fibras oscilan desde 0,5 mm - 3 mm. Una ventaja de los módulos de fibra hueca es la disponibilidad de filtros desde áreas de membrana pequeñas (aproximadamente 16 cm^{2}) hasta áreas de membrana muy grandes (aproximadamente 28 m^{2}) permitiendo un escalado lineal y simple. En ciertas realizaciones preferidas según la invención, se usan fibras huecas para la FFT. Se ha notificado que estas proporcionan menos cizalladura y una mejor razón de partícula viral/unidad infecciosa (PV/UI) que las membranas de selección planas. En ciertas realizaciones, se usan fibras huecas de 0,05 \mum según la
invención.

La diafiltración (DF), o intercambio de tampón, usando ultrafiltros es un modo ideal para la eliminación y el intercambio de sales, azúcares, la separación con disolvente no acuoso de especies libres de las unidas, la eliminación de material de bajo peso molecular, o el cambio rápido de entornos iónicos y/o pH. Los microsolutos se eliminan de manera más eficaz añadiendo disolvente a la disolución que está siendo ultrafiltrada a una velocidad igual a la velocidad de la UF. Esto lava las microespecies de la disolución a un volumen constante, purificando los virus retenidos. La presente invención utiliza una etapa de DF para intercambiar el tampón del lisado antes de la cromatografía adicional u otras etapas de purificación. Según una realización de la invención se realiza DF mediante FFT para el intercambio de tampón, en la que la adición de tampón es igual a la eliminación del permeado.

Antes de someterse la suspensión de virus a cromatografía de intercambio aniónico, puede someterse a intercambio de tampón con un tampón que comprende NaCl 0,4 M, u otra sal que proporciona una fuerza iónica equivalente. En una realización, esto se logra mediante diafiltración a volumen constante, usando 4 VDFs del tampón deseado.

Purificación adicional

Según las realizaciones preferidas de la presente invención, la suspensión de virus que se ha obtenido mediante el método según la presente invención, preferiblemente tras la clarificación del lisado, se purifica adicionalmente, por ejemplo mediante métodos generalmente conocidos por el experto en la técnica. Esto puede lograrse por ejemplo mediante centrifugación en gradiente de densidad, tal como se trata por ejemplo en el documento WO 98/22588, páginas 59-61.

Sin embargo, preferiblemente, la purificación adicional emplea al menos una etapa de cromatografía, tal como se trata por ejemplo en el documento WO 98/22588, páginas 61-70. Muchos procedimientos se han descrito para la purificación adicional de virus, en los que se incluyen etapas de cromatografía en el procedimiento. El experto en la técnica será consciente de estos procedimientos y puede variar el modo exacto de emplear etapas cromatográficas para optimizar el procedimiento de la invención.

Para la purificación de adenovirus, se prefiere usar al menos una etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Tras la etapa de cromatografía de intercambio aniónico, el virus puede ser suficientemente puro. En ciertas realizaciones, sin embargo, una etapa de cromatografía de exclusión molecular se realiza adicionalmente para aumentar la robustez del procedimiento. Esta etapa puede ser antes de o tras la etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Obviamente, otras etapas de purificación pueden también combinarse adecuadamente con una etapa de cromatografía de intercambio aniónico.

El uso de cromatografía de intercambio aniónico para la purificación de adenovirus se ha descrito de manera extensa, y este aspecto por tanto está dentro del alcance del experto en la técnica. Muchas matrices de cromatografía diferentes se han empleado para la purificación de adenovirus y son adecuadas, y el experto en la técnica puede encontrar fácilmente el material de intercambio aniónico óptimo para purificar el virus, por ejemplo guiado por la siguiente técnica.

La patente estadounidense 5.837.520 (véase también Huyghe et al., 1995, Human Gene Therapy 6: 1403-1416) describe un método de purificar adenovirus en el que el lisado de células huésped se trata con una nucleasa, seguido de cromatografía de intercambio aniónico y de afinidad de ión metálico.

La patente estadounidense 6.485.958 describe el uso de cromatografía de intercambio aniónico fuerte para la purificación de adenovirus recombinante.

La cromatografía de intercambio aniónico se ha empleado con columnas de lecho fluidizado para la purificación de partículas de adenovirus, véase el documento WO 00/50573.

Además, la cromatografía de intercambio aniónico de lecho expandido, y ciertas resinas cromatográficas para la cromatografía de intercambio aniónico para la purificación de partículas de adenovirus se han descrito en la patente estadounidense 6.586.226.

Además de las columnas de intercambio aniónico, son adecuados productos de cromatografía de membrana de intercambio aniónico tales como los producidos por Pall (por ejemplo serie Mustang^{TM}) y Sartorius (por ejemplo serie Sartobind). Para el uso de estos filtros y sus ventajas en la purificación de adenovirus véase por ejemplo el documento WO 03/078592. De manera clara, el empleo de tales filtros también está dentro del alcance del término "cromatografía de intercambio aniónico" tal como se usa en el presente documento.

Tal como se describió anteriormente, el procedimiento puede emplear de manera adecuada además una etapa de cromatografía de exclusión molecular.

La solicitud internacional WO 97/08298 describe la purificación de adenovirus usando ciertas matrices cromatográficas para evitar el daño a los virus, incluyendo etapas de intercambio aniónico y exclusión molecular.

La patente estadounidense 6.261.823 describe un método para purificar adenovirus en el que la preparación de adenovirus se somete a cromatografía de intercambio aniónico seguido de cromatografía de exclusión molecular. En la etapa de exclusión molecular, se logra una separación de grupo de partículas virales de las impurezas de bajo peso molecular. Según ciertas realizaciones de la presente invención, aproximadamente del 15-30%, preferiblemente aproximadamente el 20% del volumen de columna se carga en la columna de exclusión molecular (modo de separación de grupo de cromatografía de exclusión molecular). Por tanto, en una realización preferida de la invención, una suspensión de adenovirus que se ha preparado según el método de la invención se purifica adicionalmente usando una etapa de cromatografía de intercambio aniónico y una etapa de cromatografía de exclusión molecular.

El documento WO 03/078592 describe el uso de filtros de intercambio aniónico de alto rendimiento (es decir un filtro cargado que contiene grupos de intercambio aniónico) para la purificación del adenovirus (Ad5). Se describen las siguientes ventajas para tales filtros cargados en comparación con columnas de intercambio aniónico: (i) velocidades de flujo más rápidas, (ii) mayor capacidad de unión, (iii) mayor recuperación de virus, (iv) validación de limpieza y empaquetamiento no requeridas para su uso clínico, y (v) ausencia de problemas de vida útil o de problemas de almacenamiento cuando se usan cartuchos de filtros desechables. Tal como se describió anteriormente, el uso de tales filtros de intercambio aniónico es una realización de la presente invención, y es una realización que se considera que está incluida dentro del alcance de "cromatografía de intercambio aniónico" en la presente invención. Sin embargo, además de ser un equivalente para la cromatografía en columna, los presentes inventores han encontrado sorprendentemente una ventaja para purificar el adenovirus serotipo 35 (Ad35) usando un filtro de intercambio aniónico, con respecto al uso de una columna de intercambio aniónico: ciertas proteínas de adenovirus que no se incorporaron en las partículas de adenovirus se separan de las partículas de adenovirus mediante el uso de un filtro de intercambio aniónico, no mediante una columna de intercambio aniónico. Tales proteínas de adenovirus libres no se encontraron anteriormente en preparaciones de partículas de adenovirus recombinante y normalmente pasarían sin detectarse, pero ahora pueden eliminarse usando la etapa de someter una preparación de adenovirus recombinante que comprende proteínas de adenovirus libres a un filtro cargado que contiene grupos de intercambio aniónico. Este efecto del uso del filtro cargado no se indicó en el documento WO 03/078592. Además, el documento WO 03/078592 no da a conocer el empleo de filtros de intercambio aniónico para la purificación de Ad35, u otras partículas de adenovirus del subgrupo B. La invención proporciona por tanto un método para eliminar proteínas de adenovirus libres de una preparación de adenovirus recombinante, que comprende la etapa de: someter una preparación de adenovirus recombinante que comprende proteínas de adenovirus libres a un filtro cargado que contiene grupos de intercambio aniónico. Sin querer restringirse a la teoría, puede concebirse que la estabilidad posiblemente un tanto inferior de las partículas de adenovirus recombinante del subgrupo B (véase por ejemplo el documento WO 2004/001032) da lugar a las proteínas de adenovirus libres no detectadas hasta la fecha que parecen no incorporadas en partículas de adenovirus. Por tanto, este método particular según la invención puede ser particularmente beneficioso para la purificación de adenovirus recombinante del subgrupo B, tal como Ad35, Ad11, etc. Sin embargo, también es posible que el método mejore la purificación de los adenovirus basados en Ad5 o Ad2 más estables. La invención proporciona el uso de un filtro de intercambio aniónico para la eliminación de proteínas de adenovirus libres (es decir, no incorporadas en partículas virales) de una preparación de adenovirus recombinante. Preferiblemente, dicha preparación de adenovirus recombinante comprende adenovirus del subgrupo B recombinante, tal como Ad35 recombinante. La invención proporciona también un método para la purificación de partículas de adenovirus del subgrupo B recombinantes, tales como partículas de Ad35, comprendiendo el método una etapa de someter las partículas del subgrupo B recombinantes, tales como Ad35, a una etapa de purificación mediante filtro de intercambio aniónico. En la técnica se conocen filtros de intercambio aniónico adecuados para su uso en estos métodos de la invención y están comercialmente disponibles (véase el documento WO 03/078592, párrafos [40]-[41]), por ejemplo de Pall (por ejemplo la serie Mustang^{TM}) y de Sartorius (por ejemplo la serie Sartobind).

Tampones

Pueden usarse muchos tampones durante la purificación del virus según la presente invención. En varias realizaciones de la presente invención, los tampones usados para UF/DF y cromatografía de intercambio aniónico contenían en general NaCl 0,4-1,0 M/TRIS 50 mM pH 7,5, dependiendo las concentraciones de NaCl de la etapa del procedimiento. En ciertas realizaciones preferidas, los tampones usados tras la clarificación están libres de detergente, cloruro de magnesio y sacarosa. La ausencia de estos aditivos distingue a estos tampones de los usados en protocolos establecidos conocidos. No obstante, cuando se emplean los métodos según la presente invención, se obtiene un adenovirus purificado y sustancialmente no agregado. Una ventaja del uso de tampones sin estos aditivos es que son más fáciles de preparar, más baratos y que no existe la necesidad de someterlos a prueba para detectar la eliminación de los
aditivos.

En una realización según la invención, el adenovirus se cambia de tampón durante la separación de grupos, y finalmente se almacena en el tampón que se usa también para el Adenovirus World Standard (Hoganson et al, Development of a stable adenoviral vector formulation, Bioprocessing marzo de 2002, páginas 43-48): Tris 20 mM pH 8, NaCl 25 mM, glicerol al 2,5%.

Obviamente, pueden usarse muchos otros tampones, y pueden encontrarse varios ejemplos de formulaciones adecuadas para el almacenamiento y la administración farmacéutica de preparaciones de (adeno)virus purificados por ejemplo en la patente europea número 0853660, y en las solicitudes de patente internacional WO 99/41416, WO 99/12568, WO 00/29024, WO 01/66137, WO 03/049763.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar adicionalmente la invención por medio de ciertas realizaciones de la invención, y no ha de interpretarse que limitan de ningún modo el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 La adición de nucleasa al cultivo celular en lugar de al lisado de células huésped mejora el procedimiento para la purificación de virus

En este ejemplo se muestra que la adición de nucleasa al cultivo celular antes de lisar las células reduce la cantidad de ADN de célula huésped residual en la masa final purificada.

En las series 1 y 2 se lisó un cultivo celular PERC.6® de 10 litros con Triton X-100® al 1% (Sigma) en el día 2,5 tras la infección con un vector adenoviral. Treinta minutos tras la lisis se añadieron Benzonase® (Merck KgaA, 50 unidades/ml) y MgCl_{2} (2 mM). Tras otros 30 minutos se clarificó la recogida de Triton X-100®/Benzonase® (T/B) mediante filtración. Por tanto, ésta fue una serie según procedimientos conocidos en la técnica.

En las series 3-8, se añadieron Benzonase® (50 U/ml) y MgCl_{2} (2 mM) a un cultivo celular PERC.6 de 10 litros (día 2,5 tras la infección), y tras 10 minutos de incubación se lisaron las células con Triton X-100® al 1%. Tras una incubación adicional de 50 minutos se clarificó la recogida de Benzonase®/Triton X-100® (B/T) mediante filtración.

Por tanto, la diferencia con los procedimientos conocidos en la técnica se encuentra en el orden en el que se añadieron la nucleasa (Benzonase®) y el detergente (Triton X-100®): tradicionalmente en primer lugar se lisan las células, y posteriormente se añade nucleasa (denominado en el presente documento recogida de T/B), mientras que en el procedimiento según la invención, en primer lugar se añade nucleasa y posteriormente se lisan las células (denominado en el presente documento recogida de B/T). Esto se muestra esquemáticamente en la Figura 1.

Entonces se purificaron las muestras adicionalmente. Se realizó la clarificación mediante filtración en profundidad (filtro Clarigard de 0,5 \mum, Millipore) seguido de clarificación adicional sobre un filtro Sartopore 2 de 0,8/0,45 \mum (Sartorius). Se concentró el material clarificado 5 veces sobre una fibra hueca de 0,05 \mum (Spectrum), seguido de diafiltración con, posteriormente, 6 volúmenes de NaCl 1,0 M/TRIS 50 mM pH 7,5 y 4 volúmenes de NaCl 0,4 M/Tris 50 mM pH 7,5. Se cargó el material retenido diafiltrado en una columna de Sepharose Q-XL (Amersham) y se eluyó la fracción de virus con NaCl 0,55 M/TRIS 50 mM pH 7,5. Se purificó adicionalmente esta fracción y se cambió el tampón con una columna de Sepharose 4 FF (Amersham). Se concentró la masa generada purificada hasta la concentración deseada con una fibra hueca (0,05 \mum de tamaño de poro, Spectrum), se filtró con filtro de 0,22 \mum y se tomaron alícuotas. Se analizaron las muestras de masa purificadas para determinar el ADN de células huésped residual mediante Q-PCR.

El tratamiento con T/B dio como resultado una reducción del ADN que tras el procesamiento en el sentido de 3' adicional pudo cumplir justo la especificación requerida en el material cargado y acabado. Los requisitos normativos para el ADN de células huésped residual para formulaciones de virus vivos son <10 ng por dosis (suponiendo que una dosis contiene 1E11 partículas virales).

Tal como se muestra en la Tabla 1, invertir las etapas de Triton X-100® y Benzonase® reducía significativamente la cantidad de ADN de células huésped residual en la masa purificada: mediante la adición de nucleasa antes de la lisis de células activas podía reducirse la cantidad de ADN de células huésped residual de 10 a 40 veces, hasta menos de 0,1 ng/1E11 partículas virales.

Además, está claro a partir del análisis de SDS-PAGE (Figura 2) que, tras la clarificación mediante filtración en profundidad y de membrana de una recogida de B/T, se eliminaron varias proteínas de células huésped, entre ellas una cantidad significativa de proteínas histonas (P_{M} de aproximadamente 10-20 kD en geles, identidad confirmada mediante espectrometría de masas), durante la clarificación mientras que estas proteínas están aún claramente presentes en la recogida de T/B clarificada.

Por tanto, el procedimiento según la invención da como resultado ventajas significativas con respecto a los conocidos en la técnica anterior. Sin querer restringirse a la teoría, posibles explicaciones para las diferencias entre las series 1 y 2 (T/B) por un lado y las series 3-8 (B/T) por otro lado pueden incluir:

1.: Tras la adición de Benzonase® el ADN liberado de las células lisadas debido a la producción de virus puede ya digerirse. Tan pronto como se libera el ADN de las células lisadas mediante Triton, la Benzonase® está presente para digerir inmediatamente el ADN, evitando de ese modo la formación de agregados de ADN grandes. La digestión del ADN no agregado es probablemente más eficaz que la digestión de los agregados de ADN mayores.

2.: El tiempo de incubación total de Benzonase® aumenta con 30 minutos, dando como resultado una digestión más eficaz (véase el folleto de Benzonase® de Merck KGaA código W 214950).

3.: Se forman complejos de histonas posiblemente más grandes cuando se digiere el ADN inmediatamente tras la liberación y se retienen estas partículas más grandes mediante los filtros de clarificación. La retención de los complejos de histona-ADN durante la clarificación podría haber contribuido también a la reducción del ADN de células huésped residual.

Se han sometido a prueba varias resinas de intercambio aniónico por ejemplo QAE 550C y Super Q 650M (adquiridas de Tosoh), Q Sepharose HP, ANX Sepharose 4FF, DEAE Sepharose, Q Sepharose XL, Q Sepharose Big Bead y Q Sepharose FF (adquiridas de Amersham). Aunque todas estas resinas eran adecuadas para la purificación de adenovirus recombinantes, encontramos que Q Sepharose XL era la más adecuada para nuestro fin basándose en la separación de virus de proteínas de células huésped y ADN de células huésped, y en las características de flujo.

Se sometieron a prueba varias resinas de exclusión molecular por ejemplo Sephacryl S300, Sephacryl S500 Sepharose 4FF y Sepharose 6 FF (todas adquiridas de Amersham). Aunque todas estas resinas eran adecuadas para la purificación de los adenovirus recombinantes, encontramos que Sepharose 4 FF era la más adecuada para nuestro fin basándose en la capacidad para separar virus de ADN y proteínas de células huésped.

Ejemplo 6

Purificación de Ad35 usando cromatografía de intercambio aniónico frente a filtros cargados

Se hicieron crecer células PER.C6 en un tanque con agitación hasta una densidad celular de aproximadamente 1 millón células/ml. Se infectaron las células con el vector Ad35.CS (un vector de Ad35 con el gen CS de P. falciparum) con una MDI de 40. Tras 4 días de producción de virus se trató el cultivo celular infectado con Benzonase y Triton X-100 (método de B/T) tal como se describe en el ejemplo 1. Se clarificó la recogida de B/T tal como se describe en el ejemplo 1. Se concentró la recogida clarificada 5 veces mediante FFT (usando una fibra hueca de 0,05 \mum), y posteriormente se diafiltró frente a 10 volúmenes de diafiltración de NaCl 0,1 M, PS80 al 0,05%, Tris 50 mM pH 7,5. Se filtró el material retenido concentrado y diafiltrado sobre un filtro de 0,45 \mum, y se cargó en el filtro o la columna de captura. Como etapa de captura se sometieron a prueba una columna Q-XL (columna de 3 ml, 15 cm de altura de lecho) o un filtro Sartobind 75 (filtro cargado que contiene grupos aniónicos, Sartorius). Se eluyeron los componentes unidos con un gradiente de NaCl desde 0 hasta 1 M en un tampón a base de TRIS. El perfil de elución del filtro cargado muestra un pico adicional al comienzo del gradiente, que está separado del pico de Ad35. El pico del virus Ad35 se eluye del filtro cargado en un pico más agudo a una mayor concentración de sal, NaCl 0,44 M (NaCl inicial 0,41, final 0,49 M) en comparación con la resina Q-XL, NaCl 0,39 M (NaCl inicial 0,19, final 0,53 M). Se analizaron las fracciones eluidas mediante SDS-PAGE, HPLC-AEX, centrifugación de disco y DICT50.

El pico adicional no se comporta como las partículas de virus Ad35 intactas, cuando se analizan mediante cromatografía HPLC-AEX y centrifugación de disco (Figura 4). El análisis de SDS-PAGE de las fracciones cromatográficas muestra los siguientes resultados (Figura 5): en la fracción no retenida de ambas series son visibles nada o muy pocas cantidades de proteínas. El pico adicional del cromatograma del filtro cargado muestra algunas pero no todas las proteínas de Ad35. En el pico adicional parecen estar ausentes las proteínas virales IIIa, V, VI y VII, mientras que las proteínas virales II, III, IV y 52,55k están presentes.

A partir de estos datos de análisis puede concluirse que los filtros cargados pueden separar proteínas virales de partículas virales intactas, mientras que Sepharose Q-XL no puede. Si no se produce ninguna separación, lo más probable es que esto no se detectará mediante ensayos para evaluar la pureza como HPLC-RP o SDS-PAGE, puesto que todas las proteínas presentes en el pico adicional también están presentes en el virión intacto.

TABLA 1 Reducción de la cantidad de ADN de células huésped residual en muestras de masa purificadas invirtiendo el método de recogida de T/B a un método de B/T. Se purificó la recogida en una escala de 2-20 l. Para detalles véase el ejemplo 1

1

<110> CRUCELL HOLLAND B.V.

\hskip1cm

Weggeman, Miranda

\hskip1cm

van Corven, Emile

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DE VIRUS

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<130> 0100 EP 01 DIV

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<160> 4

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<170> PatentIn versión 3.2

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<210> 1

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador directo 6401

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcaccggtgc cgccatggat tctcgtcctc a

\hfill

31

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<210> 2

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador inverso 6401

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<400> 2

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gcgctagctc actgatgatg ttgcag

\hfill

26

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<210> 3

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador directo 6001

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<400> 3

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cccaagcttg ccgccatggg cgttacagg

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29

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<210> 4

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador inverso 6001

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggctctagat tactaaaaga caaatttgc

\hfill

29

Claims

1. Método para eliminar proteínas de adenovirus libres de una preparación de adenovirus recombinante, que comprende la etapa de: someter una preparación de adenovirus recombinante que comprende proteínas de adenovirus libres a un filtro cargado que contiene grupos de intercambio aniónico.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha preparación de adenovirus recombinante comprende un adenovirus recombinante del subgrupo B.

3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho adenovirus recombinante es un adenovirus recombinante Ad35.

4. Uso de un filtro cargado que contiene grupos de intercambio aniónico para la eliminación de proteínas de adenovirus libres de una preparación de adenovirus recombinante.