ES2307093T3 - Desarrollo de un vacuna preventiva para la infeccion por filovirus en primates. - Google Patents

Desarrollo de un vacuna preventiva para la infeccion por filovirus en primates. Download PDF

Info

Publication number
ES2307093T3
ES2307093T3 ES05013732T ES05013732T ES2307093T3 ES 2307093 T3 ES2307093 T3 ES 2307093T3 ES 05013732 T ES05013732 T ES 05013732T ES 05013732 T ES05013732 T ES 05013732T ES 2307093 T3 ES2307093 T3 ES 2307093T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
domain
ebola
dna
adenovirus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES05013732T
Other languages
English (en)
Inventor
Gary J. Nabel
Zhi-Yong Yang
Nancy Sullivan
Anthony Sanchez
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institutes of Health NIH
US Department of Health and Human Services
Original Assignee
National Institutes of Health NIH
US Department of Health and Human Services
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institutes of Health NIH, US Department of Health and Human Services filed Critical National Institutes of Health NIH
Application granted granted Critical
Publication of ES2307093T3 publication Critical patent/ES2307093T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
    • C12N2760/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
    • C12N2760/14134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14211—Marburgvirus, e.g. lake Victoria marburgvirus
    • C12N2760/14222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Un vector de expresión que comprende el ID SEC Nº 52 o un análogo del mismo que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95, 96, 97, 98, 99 ó 100% con el mismo que media la expresión, en el que el porcentaje de identidad se calcula a lo largo de la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia.

Description

Desarrollo de una vacuna preventiva para la infección por filovirus en primates.
Ámbito de la invención
La presente invención se refiere a un vector de expresión que comprende el ID SEC Nº: 52 o un análogo del mismo que tiene al menos una identidad de secuencia de 95, 96, 97, 98, 99 o 100% con el que media la expresión, en el que el porcentaje de identidad se calcula a lo largo de la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia.
Antecedentes de la invención
Los virus de Ébola y los virus genéticamente relacionados de Marburg, son filovirus asociados con brotes de fiebre hemorrágica muy letales en seres humanos y primates en América del Norte, Europa y África (Peters, C.J. y col. en: Fields Virology, eds. Fields, B.N. y col. 1161-1176, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1996; Peters, C.J. y col., 1994, Semin. Virol. 5:147-154). Los virus de Ébola son virus de ARN de cadena negativa compuestos de cuatro subtipos, que incluyen los descritos en los episodios de Zaire, Sudán, Reston y Costa de Marfil (Sanchez, A. y col., 1996, PNAS USA 93:3602-3607). Aunque se han definido varios subtipos, la organización genética de estos virus es similar y cada uno contiene siete genes ordenados linealmente. Entre las proteínas víricas, la glicoproteína de la envuelta existe en dos formas alternativas, una proteína segregada de 50-70 kilodalton (kDa) de función desconocida codificada por el genoma vírico y una glicoproteína de transmembrana de 130 kDa generada por preparación del ARN que media la entrada vírica (Peters, C.J. y col. en: Fields Virology, eds. Fields, B.N. y col. 1161-1176, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1996; Sanchez, A. y col., 1996, PNAS USA 93:3602-3607). Otros productos de genes estructurales incluyen la nucleoproteína (NP), proteínas de matriz VP24 y VP40, proteínas supuestamente no estructurales VP30 y VP35 y la polimerasa vírica (revisado por Peters, C.J. y col. en: Fields Virology, eds. Fields, B.N. y col. 1161-1176, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1996). Aunque la variación espontánea de su secuencia de ARN ocurre en la naturaleza, parece que hay menos polimorfismo de nucleótidos con los subtipos de Ébola que entre otros virus de ARN (Sanchez, A. y col., 1996, PNAS USA 93:3602-3607), lo que sugiere que la inmunización puede ser útil en la protección contra estas enfermedades. Sin embargo, los intentos previos de provocar respuestas inmunitarias protectoras contra el virus de Ébola usando procedimientos de inmunización activa y pasiva tradicionales no han tenido éxito en primates (Peters, C.J. y col. en: Fields Virology, eds. Fields, B.N. y col. 1161-1176, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1996; Clegg, J.C.S. y col., 1997, New Generation Vaccines, eds.: Levine, M.M. y col. 749-765, New York, NY. Marcel Dekker, Inc.; Jahrling, P.B. y col., 1996, Arch. Virol. Suppl 11:135-140). Por lo tanto, sería conveniente proporcionar una vacuna que provocara una respuesta inmunitaria contra un filovirus o enfermedad causada por la infección por el filovirus. Por lo tanto, sería conveniente proporcionar procedimientos para hacer y usar dicha vacuna.
Los brotes de fiebre hemorrágica causada por el virus de Ébola están asociados con tasas de mortalidad altas que son una característica que diferencia a este patógeno humano. La alta letalidad está asociada con el subtipo de Zaire, una de cuatro cepas identificadas hasta ahora (Feldmann, H. y col., 1994, Virology 199:469-473; Sanchez, A. y col., 1996, PNAS USA 93:3602-3607). Su rápida evolución deja pocas oportunidades para desarrollar la inmunidad natural y actualmente no hay una terapia antivírica eficaz. Por lo tanto, la vacunación ofrece una intervención prometedora para prevenir y limitar la propagación. Se describe aquí una estrategia de vacuna altamente eficaz para la infección por el virus de Ébola en primates. Una combinación de inmunización por ADN y refuerzo con vectores adenovíricos que codifican las proteínas víricas generaba inmunidad celular y humoral en macacos cynomolgus. La estimulación con una dosis letal de la cepa de tipo salvaje altamente patógena, Mayinga 1976, del virus de Ébola de Zaire dio como resultado una infección uniforme en los controles, que evolucionaron a un estado moribundo y muerte en menos de una semana. En comparación, todos los animales vacunados fueron asintomáticos durante más de seis meses, sin virus detectable después de la estimulación inicial. Estos descubrimientos demuestran que se puede desarrollar una vacuna preventiva contra la infección por el virus de Ébola en primates.
Breve descripción de los dibujos
la fig. 1 muestra el mapa de construcción de VRC6000 (pVR1012-GP(Z)) (véase, Plásmidos de Ebola/Marburg/
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 2 muestra el mapa de construcción de VRC6001 (pVR1012x/s-GP(Z)) (véase, Plásmidos Ebola/Marburg/
Lassa, Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 3 muestra el mapa de construcción de VRC6002 (pVR1012-GP(Z) delta MUC) (véase, Plásmidos de Ebola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 4 muestra el mapa de construcción de VRC6003 (pVR1012-GP(Z) delta MUC delta FUR) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 5 muestra el mapa de construcción de VRC6004 (pVR1012-GP(Z) delta GP2) (véase, Plásmidos de Ebola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
\global\parskip0.890000\baselineskip
la fig. 6 muestra el mapa de construcción de VRC6005 (pVR1012-GP(Z) delta GP2 delta C-term A) (véase, Plásmidos de Ebola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 7 muestra el mapa de construcción de VRC6006 (pVR1012-GP(Z) delta GP2 delta C-term B) (véase, Plásmidos de Ebola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 8 muestra el mapa de construcción de VRC6007 (pVR1012-GP(Z) delta GP2 delta FUS) (véase, Plásmidos de Ebola/Marburg/Lassa y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 9 muestra el mapa de construcción de VRC6008 (pVR1012-GP(Z) delta TM) (véase, Plásmidos de Ebola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 10 muestra el mapa de construcción de VRC6052 (pVR1012-GP(Z) delta SGP) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 11 muestra el mapa de construcción de VRC6101 (pVR1012x/s Ebola GP(R) (dTM)) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 12 muestra el mapa de construcción deVRC 6110 (pAdApt Ebola GP(R) (dTM)) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 13 muestra el mapa de construcción de VRC6200 (pVR1012-GP(S)) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 14 muestra el mapa de construcción de VRC6201 (pVR1012x/s Ebola GP(S)) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 15 muestra el mapa de construcción de VRC6202 (pVR1012-GP(S) delta TM) (véase, Ebola/Marburg/Lassa Plasmid, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 16 muestra el mapa de construcción de VRC6300 (pVR1012-GP(IC)) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 17 muestra el mapa de construcción de VRC6301 (pVR1012x/s-GP(IC)) (véase, Plásmidos de Ébola/
Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 18 muestra el mapa de construcción de VRC6302 (pVR1012-GP(IC) delta TM) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 19 muestra el mapa de construcción de VRC 6303 (pVR1012x/s Ebola GP (IC) (dTM)) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 20 muestra el mapa de construcción de VRC6310 (pAdApt Ebola GP (IC) (dTM)) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 21 muestra el mapa de construcción de VRC6351 (pVR1012x/s-SGP(IC)) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 22 muestra el mapa de construcción de VRC6400 (pVR1012-NP) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 23 el mapa de construcción de muestra VRC6401 (pVR1012x/s=NP) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 24 muestra el mapa de construcción de VRC6500 (pVR1012-VP35) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 25 muestra el mapa de construcción de VRC6600 (pAD/CMV-GP(dTM)(Z-CITE-S)) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 26 muestra el mapa de construcción de VRC6601 (pAdApt Ebola GP(S)) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 27 muestra el mapa de construcción de VRC 6602 (pAdApt Ebola GP(S)(dTM)) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 28 muestra el mapa de construcción de VRC6603 (pAdApt Ebola GP(Z)) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 29 muestra el mapa de construcción de VRC6604 (pAdApt Ebola GP(Z)(dTM)) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 30 muestra el mapa de construcción de VRC6701 (pVR1012-Marburg) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 31 muestra el mapa de construcción de VRC6702 (pVR1012x/s Marburg GP (dTM)) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 32 muestra el mapa de construcción de VRC 6710 (pAdApt Marburg GP (dTM)) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 33 muestra el mapa de construcción de VRC6800 (pVR1012x/s Lassa GP) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 34 muestra el mapa de construcción de VRC6801 (pVR1012x/s Lassa GP (dTM) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 35 muestra el mapa de construcción de VRC6810 (pAdApt Lassa GP) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 36 muestra el mapa de construcción de VRC6811 (pAdApt Lassa GP (dTM)) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 37 muestra el mapa de construcción de CMV/R Ebola GP (Z) delta TM/h (codón optimizado) (véase, Plásmidos de Ebola/Marburg/Lassa y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 38 muestra el mapa de construcción de pVR1012 Ebola GP (Z, P87666) delta TM/h (codón optimizado) (véase, Plásmidos de Ebola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 39 muestra el mapa de construcción de CMV/R Ebola GP (S/Gulu) delta TM/h (codón optimizado) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/ Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 40 muestra el mapa de construcción de CMV/R Ebola GP (S,Q66798) delta TM/h (codón optimizado) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 41 muestra el mapa de construcción de VRC6802, pVR1012x/s Lassa delta TM/h (codón optimizado) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 42 muestra el mapa de construcción de VRC6703, pVR1012x/s Marburg delta TM/h (codón optimizado) (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 43 muestra el mapa de construcción de CMV/R Ebola NP (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 44 es una representación en diagrama de las moléculas de glicoproteína secretada (SGP) y glicoproteína (GP) del virus Ébola (especie de Zaire aislada en 1976) que muestra importantes características estructurales. Las regiones N-terminales en blanco de SGP y GP corresponden a secuencias idénticas (compartidas), mientras que los extremos C en negro identifican secuencias únicas de las moléculas GP o SGP. Los sitios de escisión de la signalasa comunes tanto para SGP como para GP y el sitio de escisión de furina para GP0 (forma no escindida de GP) (\downarrow) se determinaron por secuenciación N-terminal. También se muestran los restos de cisteína (S), sitios de glicosilación unidos a N previstos (proyecciones con forma de Y), un péptido de fusión previsto, una secuencia repetida de héptadas y una secuencia de anclaje de transmembrana. En el virus de Ébola, las posiciones de estas estructuras son conservadas y sus secuencias son muy similares o, en el caso de los sitios de glicosilación unidos a N, están al menos concentradas en la región central de GP. El sitio de escisión de la signalasa es el ID SEC Nº: 48, el sitio de escisión de la furina es el ID SEC Nº: 49 y el péptido de fusión es el ID SEC Nº: 50.
la fig. 45 es una representación en diagrama de la GP estructural. Se muestra la orientación prevista del heterodímero GP1-GP2 unido por enlace disulfuro indeterminado (indicado por la marca de pregunta). Los enlaces de disulfuro intramoleculares que se muestran vienen de predicciones previas basadas en similitudes con estructuras de glicoproteínas de retrovirus. Véase la figura 44 para otras características de la secuencia de aminoácidos.
\global\parskip1.000000\baselineskip
la fig. 46 muestra la inducción de los efectos citopáticos por las glicoproteínas del virus de Ébola y mapa de los determinantes moleculares de citopaticidad.
la fig. 47 muestra las respuestas de anticuerpo específicas de Ébola generadas por diferentes combinaciones de cebado/refuerzo con ADN/adenovirus: los datos son las medias de la dilución de punto final recíproca para cada grupo de ratones y las barras de error representan la desviación típica.
la fig. 48 muestra la inmunización con ADN-adenovirus de macacos cynomolgus. A) Programa de inmunización para las inyecciones de ADN y/o adenovirus y estimulación con la cepa Mayinga salvaje del subtipo de Zaire del virus de Ébola. B) Titulaciones por Elisa de los anticuerpos específicos de Ébola en el suero. El suero se recogió en la semana 12 (barras blancas) y 2 días antes de la inmunización en la semana 24 (barras negras). C) Respuestas linfoproliferativas a la glicoproteína secretada (SGP) de Ébola después de inmunización. Las barras representan el número medio de veces de proliferación de las cuatro muestras de sangre de cada sujeto. La desviación típica no se muestra porque el nivel del valor inicial de inducción variaba entre experimentos. Sin embargo, las CMSP de los 8 animales se ensayaron en el mismo experimento para cada punto de tiempo y las medias presentadas en la figura son representativas de los resultados obtenidos para cualquier punto de tiempo individual. D) Respuestas linfoproliferativas a SGP de Ébola en CMSP en masa después de reducción de los subconjuntos de linfocitos. Las CMSP de la semana 24 se trataron con perlas magnéticas Dynal recubiertas con el anticuerpo indicado para reducir los subconjuntos de células CD4^{+} o CD8^{+}. Las células que quedaban después de la reducción se normalizaron respecto a la entrada del número de células y se estimularon como se describe en el Ejemplo. Los resultados se muestran para dos controles (sujetos 2 y 3) y 2 monos vacunados (sujetos 6 y 7).
la fig. 49 muestra la protección de los macacos cynomolgus contra la estimulación letal con virus de Ébola después de inmunización con ADN-virus. A, B) Niveles de enzimas hepáticas en monos después de la estimulación con virus de Ébola. Los niveles de enzimas hepáticas [alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST)] en el suero de primates no humanos se midieron por procedimientos estándar recomendados usando el disco reactivo 12 de química general para el analizador Piccolo^{TM} (Abaxis, Inc., Sunnyvale, CA). Los resultados se muestran para cuatro monos inmunizados (símbolos negros) y cuatro de control (símbolos blancos). C) Viremia del plasma en monos después de infección con el virus de Ébola. Las cruces representan tiempo de la muerte en los animales de control [días 5 (sujeto 1) y 6 (sujetos 2 y 4)]. Se practicó la eutanasia en un animal de control, sujeto 3, el día 7 cuando estaba moribundo. En un animal vacunado que era resistente a la infección, sujeto 5, se practicó la eutanasia el día 10 para el examen histológico de los tejidos. El día 17 ninguno de los animales tenía viremia detectable, y permanecieron sin viremia durante la duración del periodo de observación (6 meses). Los datos son el inverso de la dilución de punto final del suero para cada mono. Se muestran los resultados para cuatro monos inmunizados (símbolos negros) y cuatro de control (símbolos blancos).
la fig. 50 muestra la expresión potenciada del vector de expresión de CMV modificado, CMV/R.
la fig. 51 muestra la inmunogenicidad potenciada del vector de expresión de CMV modificado, CMV/R, en ratones.
TABLA 1 Números de acceso en GenBank de Ébola/Marburg/Lassa
1
TABLA 2 Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa y adenovirus recombinantes
2
3
4
5
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un vector de expresión que comprende el ID SEC Nº: 52 o un análogo del mismo que tiene al menos una identidad de secuencia de 95, 96, 97, 98, 99 o 100% con el que media la expresión, en el que el porcentaje de identidad se calcula a lo largo de la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia. Además, en el presente documento se describen vacunas de filovirus que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína estructural filovírica operativamente unida a una secuencia de control, en un excipiente farmacéuticamente aceptable. En un aspecto descrito en el presente documento, la molécula de ácido nucleico codifica la forma de transmembrana de la glicoproteína (GP) vírica. De forma alternativa, la molécula de ácido nucleico codifica la forma secretada de la glicoproteína vírica (SGP). En otra forma alternativa, la molécula de ácido nucleico codifica la nucleoproteína vírica (NP).
Además, en el presente documento se describen vacunas que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas estructurales filovíricas distintas de GP, SGP y NP, p. ej., otros productos génicos estructurales que provocan una respuesta inmunitaria contra un filovirus o enfermedad causada por la infección por el filovirus. Las moléculas de ácido nucleico de las vacunas descritas en el presente documento codifican productos génicos estructurales de cualquier cepa vírica de Ébola, que incluye las cepas de Zaire, Sudán, Costa de Marfil y Reston. También se pueden usar las moléculas de ácido nucleico que codifican los productos génicos estructurales de las cepas del virus de Marburg genéticamente relacionado. Además, las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento se pueden modificar, p. ej., las moléculas de ácido nucleico expuestas en el presente documento se pueden mutar, siempre que la proteína expresada modificada provoque una respuesta inmunitaria contra un patógeno o enfermedad. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico puede mutarse de modo que la proteína expresada sea menos tóxica para las células. También se describen en el presente documento, vacunas que comprenden una combinación de moléculas de ácido nucleico. Por ejemplo, y sin limitación, las moléculas de ácido nucleico que codifican GP, SGP y NP de las cepas de Zaire,
Sudán y Costa de Marfil se pueden combinar en cualquier combinación, en una composición de vacuna.
También se describen en el presente documento procedimientos para inmunizar a un sujeto contra la enfermedad causada por infección con filovirus, que comprende administrar al sujeto una cantidad inmunológicamente eficaz de una vacuna de filovirus. Los procedimientos para hacer y usar las vacunas de filovirus también se describen en el presente documento, incluyendo la preparación de composiciones farmacéuticas.
Análisis bioquímico de glicoproteínas secretadas y de virión del virus de Ébola
Los virus de Ébola (EBO) son miembros de Flavoviridae y producen una forma de enfermedad de fiebre hemorrágica grave, a veces mortal, en seres humanos y/o primates no humanos. El gen de la glicoproteína (GP) de los filovirus es el cuarto gen (de siete) desde el extremo 3' del genoma de ARN de cadena negativa. Todos los virus de EBO caracterizados hasta ahora tienen el mismo tipo de organización del gen GP no convencional, que da como resultado la expresión de una glicoproteína no estructural secretada (SGP) de forma preferente frente a la estructural GP. La SGP es codificada en un solo marco (marco 0), mientras que la GP es codificada en dos marcos (marcos 0 y -1). La expresión de GP ocurre cuando los dos marcos están conectados por un suceso de edición de transcripción que da como resultado la inserción de una sola adenosina extra (añadida a una serie de siete adenosinas).
Con referencia a la figura 44, para la especie de Zaire del virus EBO, los 295 restos N-terminales (incluyendo la secuencia señal) del la SGP (364 restos en total) y la GP (676 restos en total) son idénticos, pero la longitud y composición de sus secuencias C-terminales son únicas. La GP, una proteína de transmembrana de tipo 1, se encuentra en la superficie del virión infeccioso y funciona en la estructura adjunta en la unión y entrada del virus en células susceptibles. Las comparaciones de las secuencias de aminoácidos previstas de GP para todas las especies de virus EBO muestra una conservación general en las regiones N-terminal y C-terminal (cada una aproximadamente un tercio de la secuencia total) y están separadas por una sección media muy variable. Esta proteína está muy glicosilada, y contiene grandes cantidades de glicanos unidos a N y O, y en el virus de Marburg (MBG) (otro tipo de filovirus) se ha visto que forma trímeros. Justo en el extremo N de la secuencia de anclaje de transmembrana de la GP (restos 650 a 672) hay un patrón (restos 585 a 609) que está muy conservado en los filovirus. Esta secuencia también tiene un grado alto de homología con un patrón en las glicoproteínas de los retrovirus oncogénicos que se ha mostrado que es inmunosupresora in vitro. Parcialmente superpuesta con este patrón hay una secuencia repetida de héptadas (53 retos; posiciones 541 a 593) que se cree que funciona en la formación de superenrollamientos intermoleculares en el ensamble de trímeros, similar a las estructuras previstas para las glicoproteínas de superficie de otros virus. Inmediatamente después de esta secuencia hacia el lado N-terminal hay un péptido de fusión previsto seguido cerca de un sitio de escisión multibásico putativo, para la convertasa de tipo subtilisina/kexina, furina. La escisión por la furina se ha demostrado indirectamente por el uso de inhibidores específicos y se ha previsto que ocurra en la última arginina en la secuencia RRTRR\downarrow (posición 501 desde el principio del marco de lectura abierto [ORF]). Aunque la función de la SGP está menos definida, estudios recientes han mostrado que la SGP puede unirse a neutrófilos, mientras que la GP se une a células endoteliales. Los diferentes patrones de unión de la SGP y la GP sugieren que a pesar de tener idénticas secuencias de aminoácidos N-terminales (-280 resto), estas glicoproteínas son estructuralmente muy diferentes una de la otra.
Con referencia a la figura 45, se analizó la escisión, oligomerización y otras propiedades estructurales de las glicoproteínas expresadas por una especie de Zaire del virus de Ébola, para definir mejor sus funciones. Las glicoproteínas de virión/estructurales de 50 a 70 kDa secretada y 150 kDa (SGP y GP, respectivamente), que comparten los 295 restos N-terminales, son escindidas cerca del extremo N por la signalasa. Un segundo suceso de escisión, que ocurre en la GP en un sitio multibásico (RRTR\downarrow) (ID SEC Nº: 51) que probablemente es mediado por la furina, da como resultado dos glicoproteínas (GP1 y GP2) unidas por enlace disulfuro. Este sitio de escisión por furina está presente en la misma posición en las GP de todos los virus de Ébola (R[R/K]X[R/K]R\downarrow), y se predice uno para los virus de Marburg (R[R/K]KR\downarrow), aunque en una posición diferente. Basándose en los resultados de estudios de reticulación, los investigadores pudieron determinar que los peplómeros de virión de Ébola están compuestos de trímeros de heterodímeros GP1-GP2 y que aspectos de su estructura eran similares a los de los retrovirus (incluyendo lentivirus de tipo VIH-1 y VIH-2), paramixovirus y virus influenza. Los investigadores también determinaron que SGP es secretada de células infectadas casi exclusivamente en forma de un homodímero que está unido por enlace disulfuro.
En relación con la figura 46, los investigadores definieron el principal determinante vírico de la patogenicidad del virus de Ébola; la síntesis de la glicoproteína de virión (GP) del virus de Ébola de Zaire inducía efectos citotóxicos en células endoteliales humanas in vitro e in vivo. Este efecto estaba delimitado por un dominio de tipo mucina, rico en serina-treonina de esta glicoproteína de transmembrana de tipo 1, uno de los siete productos génicos del virus. La transferencia génica de GP en vasos sanguíneos porcinos o humanos explantados producía una pérdida masiva de células endoteliales en 48 horas que conducía a un aumento sustancial de la permeabilidad vascular. La eliminación de la región de tipo mucina de la GP abolía estos efectos sin afectar a la expresión o función de la proteína. La GP derivada de la cepa de virus de Reston, que produce enfermedad en primates no humanos pero no en el hombre, no alteraba la vasculatura de los vasos sanguíneos humanos. En comparación, la GP de Zaire inducía alteración de las células endoteliales y citotoxicidad en los vasos sanguíneos tanto de seres humanos como de primates no humanos y el dominio de mucina era necesario para este efecto. Estos descubrimientos indican que la GP, por su dominio de mucina, es el determinante vírico de la patogenicidad del Ébola y probablemente contribuye a la hemorragia durante la infección.
Moléculas de ácido nucleico
Como se indica en el presente documento, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser en forma de ARN o en forma de ADN obtenidas por clonación o producidas sintéticamente. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario. El ADN o ARN monocatenario puede ser la cadena codificante, conocida también como cadena homosentido, o puede ser la cadena no codificante, llamada también cadena antisentido.
Por molécula(s) de ácido nucleico "aislada(s)" se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha sacado de su entorno nativo. Por ejemplo, las moléculas de ADN recombinante contenidas en un vector se consideran aisladas para los propósitos descritos más adelante en el presente documento. Otros ejemplos de moléculas de ADN aisladas incluyen moléculas de ADN recombinante mantenidas en células huésped heterólogas o moléculas de ADN purificadas (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen trascritos de ARN in vivo o in vitro de las moléculas de ADN descritas en el presente documento. Las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente.
Las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento incluyen moléculas de ADN que comprenden un marco de lectura abierto (ORF) que codifica un producto génico estructural de filovirus salvaje; y moléculas de ADN que comprenden una secuencia sustancialmente diferente de las descritas antes pero que, debido a la degeneración del código genético, todavía codifica un ORF de un producto génico estructural de filovirus salvaje. Por supuesto, el código genético es conocido en la técnica.
También se describen en el presente documento fragmentos de moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento. Por un fragmento de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de un ORF que codifica un producto génico estructural de filovirus salvaje se entiende fragmentos de al menos aproximadamente 15 nt y, más preferiblemente, al menos aproximadamente 20 nt, todavía más preferiblemente al menos aproximadamente 30 nt, e incluso más preferiblemente, al menos aproximadamente 40 nt de longitud. Por supuesto, los fragmentos más largos de 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 nt de longitud también se entiende que están descritos en el presente documento como fragmentos correspondientes a la mayor parte, si no a toda, la secuencia de nucleótidos del ORF que codifica un producto génico estructural de filovirus salvaje. Por un fragmento de al menos 20 nt de longitud, por ejemplo, se entiende fragmentos que incluyen 20 o más bases contiguas de la secuencia de nucleótidos del ORF de un producto génico estructural de filovirus salvaje.
Los fragmentos de ácido nucleico preferidos descritos en el presente documento incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican partes que llevan epítopo de la proteína estructural de filovirus. En particular, dichos fragmentos de ácido nucleico descritos en el presente documento incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican dominios que llevan epítopo de una proteína estructural de filovirus, en los que el dominio es el dominio de identidad de GP/SGP, el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana y el dominio intracelular, y cualquier combinación de los mismos, por ejemplo, una glicoproteína de filovirus que está truncada en el extremo carboxi para suprimir el anclaje de transmembrana y el dominio intracelular, una glicoproteína de filovirus que está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana y el dominio intracelular, una glicoproteína de filovirus que está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, una glicoproteína de filovirus que está truncada en el extremo carboxi para suprimir el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, dominio de repetición de héptadas y dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, una glicoproteína de filovirus que está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, dominio de repetición de héptadas y dominio de anclaje de transmembrana e intracelular. Otro ejemplo es una glicoproteína de filovirus que tiene una deleción de amino, interna o carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana o el dominio intracelular.
En otro aspecto, en el presente documento se describe una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que hibrida en condiciones de hibridación restrictivas con una parte del polinucleótido en una molécula de ácido nucleico como se ha descrito antes. Por "condiciones de hibridación restrictivas" se entiende incubación toda la noche a 42ºC en una solución que comprende: formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 750 mM, citrato trisódico 75 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y ADN de esperma de salmón fraccionado y desnaturalizado 20 \mug/ml, seguido de lavado de los filtros en 0,1 x SSC a aproximadamente 65ºC.
Por un polinucleótido que hibrida con una "parte" de un polinucleótido se entiende un polinucleótido (ADN o ARN) que hibrida con al menos 15 nucleótidos (nt) y, más preferiblemente, al menos aproximadamente 20 nt, todavía más preferiblemente al menos aproximadamente 30 nt, e incluso más preferiblemente aproximadamente 30-70 nt del polinucleótido de referencia.
Por una parte de un polinucleótido de "al menos 20 nt de longitud", por ejemplo, se entiende 20 o más nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de referencia. Por supuesto, un polinucleótido que hibrida solo con una secuencia de poli A o un tramo complementario de restos T (o U), no estaría incluida en un polinucleótido de la invención usado para hibridar con una parte de un ácido nucleico de la invención, puesto que dicho polinucleótido hibridaría con cualquier molécula de ácido nucleico que contenga un tramo poli A o su complementario (p. ej., prácticamente cualquier clon de ADNc bicatenario).
Como se indica en el presente documento, las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento que codifican un producto génico estructural de filovirus pueden incluir, pero no se limitan a las que codifican la secuencia de aminoácidos del polipéptido de longitud completa, por si mismo, la secuencia que codifica el polipéptido de longitud completa y secuencias adicionales, tales como las que codifican una secuencia líder o secretora, tales como una secuencia de pre o pro o preproteína, la secuencia codificante del polipéptido de longitud completa, con o sin las secuencias codificantes adicionales mencionadas antes, junto con secuencias no codificantes adicionales, incluyendo, por ejemplo, pero no limitado a intrones y secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como las secuencias no traducidas transcritas que tienen una función en la transcripción, procesamiento de ARNm, incluyendo señales de religación y poliadenilación, por ejemplo, unión de ribosoma y estabilidad del ARNm; y secuencia codificante adicional que codifica aminoácidos adicionales, tales como los que proporcionan funcionalidades adicionales.
Además se describen en el presente documento variantes de las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento, que codifican partes, análogos o derivados del producto génico estructural de filovirus. Las variantes pueden ser naturales, tales como una variante alélica natural. Por una "variante alélica" se entienden una o más formas alternativas de un gen que ocupa un locus dado en un genoma de un organismo. (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, 1985 New York). Las variantes no naturales se pueden producir usando técnicas de mutagénesis conocidas en la materia.
\newpage
Dichas variantes incluyen las producidas por sustituciones, deleciones o adiciones de nucleótidos, que pueden implicar uno o más nucleótidos. Las variantes pueden estar alteradas en regiones codificantes, regiones no codificantes o ambas. Las alteraciones en las regiones codificantes pueden producir sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservativas o no conservativas. Se prefieren en especial entre estas las sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades del producto génico estructural de filovirus o partes del mismo. También se prefieren en especial en este respecto las sustituciones conservativas.
Además, se describen en el presente documento moléculas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica y, más preferiblemente, al menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un producto génico estructural de filovirus salvaje o un fragmento del mismo o una secuencia de nucleótidos complementaria a la misma.
Por un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica un producto génico estructural de filovirus, se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco puntos de mutaciones por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica el producto génico estructural del virus de Ébola. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos de la secuencia de referencia se pueden suprimir o sustituir por otro nucleótido, o se puede insertar en la secuencia de referencia un número de nucleótidos de hasta 5% del total de los nucleótidos de la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones 5' ó 3' terminales de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier sitio entre estas posiciones terminales, entremezclados sea individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia.
De forma práctica, si cualquier molécula de ácido nucleico particular es al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de nucleótidos de referencia se puede determinar de forma convencional usando programas de ordenador conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711). Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981 Advances in Applied Mathematics 2:482-489, para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se fijan, por supuesto, de modo que el porcentaje de identidad se calcula a lo largo de la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia y están permitidos huecos en la homología de hasta 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia.
En el presente documento se describen moléculas de ácido nucleico al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas con las secuencias de ácidos nucleicos mostradas en el presente documento en la lista de secuencias, que codifican un polipéptido que tiene actividad del polipéptido del virus de Ébola, Marburg o Lassa. Por "un polipéptido que tiene actividad del polipéptido del virus de Ébola, Marburg o Lassa" se entiende polipéptidos que presentan actividad del polipéptido del virus de Ébola, Marburg o Lassa en un ensayo biológico particular. Por ejemplo, se puede medir la actividad de proteína GP, SGP o NP para los cambios en el carácter inmunológico por un ensayo inmunológico adecuado.
Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, un experto en la técnica reconocerá inmediatamente que un gran número de moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica con una secuencia de ácido nucleico mostrada en el presente documento en la lista de secuencias, codificarán un polipéptido "que tiene actividad del polipéptido del virus de Ébola, Marburg o Lassa". De hecho, puesto que las variantes degeneradas de estas secuencias de nucleótidos codifican todas el mismo polipéptido, esto estará claro para los expertos en la materia sin realizar el ensayo de comparación descrito antes. Además, se reconocerá en la técnica, que para estas moléculas de ácido nucleico que no son variantes degeneradas, un número razonable también codificará un polipéptido que tiene actividad del polipéptido del virus de Ébola, Marburg o Lassa. Esto se debe a que el experto en la materia es consciente de las sustituciones de aminoácidos que no es probable o es poco probable que afectan significativamente a la función de proteína (p. ej., sustituyendo un aminoácido alifático por un segundo aminoácido alifático).
Por ejemplo, se proporciona una guía relativa a como hacer sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas en Bowie, J. U. y col., 1990, Science 247:1306-1310, en la que los autores indican que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a las sustituciones de aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Polipéptidos y fragmentos
Se describe además en el presente documento un polipéptido de filovirus que tiene una secuencia de aminoácidos que codifica un marco de lectura abierto (ORF) de un gen estructural de filovirus salvaje, o un péptido o polipéptido que comprende una parte del mismo (p. ej., SGP).
Se reconocerá en la técnica que algunas secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de filovirus se pueden variar sin un efecto significativo en la estructura o la función de la proteína. Si se contemplan dichas diferencias en la secuencia, debe recordarse que hay zonas críticas en la proteína que determinan la actividad.
Por lo tanto, se describe además en el presente documento variaciones del polipéptido de filovirus que muestran actividad de polipéptido de filovirus sustancial o que incluyen regiones de la proteína de filovirus tales como las partes de proteínas descritas a continuación. Dichos mutantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones tipo. Como se ha indicado, se puede encontrar una guía relativa a que cambios de aminoácidos es probable que sean fenotípicamente silenciosos en Bowie, J. U. y col., 1990, Science 247:1306-1310.
Por lo tanto, el fragmento, derivado o análogo del polipéptido descrito en el presente documento puede ser (i) uno en el que uno o más restos de aminoácidos se sustituyen por un resto de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un resto de aminoácido conservado) y dicho resto de aminoácido sustituido puede ser o no uno codificado por el código genético, o (ii) uno en el que uno o más de los restos de aminoácidos incluyen un grupo sustituyente, o (iii) uno en el que aminoácidos adicionales están fusionados al polipéptido maduro, tal como un péptido de la región de fusión Fc de IgG o secuencia líder o secretora o una secuencia que se usa para purificar el polipéptido maduro o una secuencia de proproteína. Dichos fragmentos, derivados y análogos se considera que están dentro del alcance de los expertos en la materia a partir de las enseñanzas del presente documento.
Como se ha indicado, los cambios son preferiblemente de naturaleza secundaria, tales como sustituciones de aminoácidos conservativas que no afectan significativamente al plegado o actividad de la proteína (véase la Tabla A).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA A Sustituciones de aminoácidos conservativas
6
Por supuesto, el número de sustituciones de aminoácidos que hará un experto en la materia dependerá de muchos factores, incluyendo los descritos antes. Hablando en general, el número de sustituciones de aminoácidos para cualquier polipéptido de filovirus dado no será mayor que 50, 40, 30, 20, 10 5 ó 3.
Los aminoácidos en los polipéptidos de filovirus descritos en el presente documento que son esenciales para la función, se pueden identificar por procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244:1081 -1085). Este último procedimiento introduce mutaciones de alanina individuales en cada resto en la molécula. Después, se ensaya la actividad biológica de las moléculas mutantes resultantes tal como los cambios en el carácter inmunológico.
Los polipéptidos descritos en el presente documento se proporcionan de forma conveniente en una forma aislada. Por "polipéptido aislado" se entiende un polipéptido sacado de su entorno natural. Por lo tanto, un polipéptido producido y/o contenido dentro de una célula huésped recombinante se considera aislado para los propósitos descritos en el presente documento. También se entiende por un "polipéptido aislado" polipéptidos que se han purificado, parcial o sustancialmente, de una célula huésped recombinante o una fuente natural. Por ejemplo, una versión del polipéptido de filovirus producida de forma recombinante se puede purificar sustancialmente por el procedimiento en una etapa descrito por Smith y Johnson, 1988, Gene 67:31-40.
Los polipéptidos descritos en el presente documento incluyen un polipéptido que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un producto génico estructural de filovirus salvaje o parte del mismo, o codificado por una secuencia de ácido nucleico mostrada en el presente documento en la lista de secuencias; así como polipéptidos que son al menos 95% idénticos y, más preferiblemente, al menos 96%, 97%, 98% o 99% idénticos a los descritos antes.
Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a la secuencia de aminoácidos de referencia de un polipéptido de filovirus se entiende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia del polipéptido puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de los aminoácidos de referencia del polipéptido de filovirus. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta el 5% de los restos de aminoácidos en la secuencia de referencia pueden estar suprimidos o sustituidos por otro aminoácido, o puede insertarse en la secuencia de referencia un número de aminoácidos de hasta 5% de los restos de aminoácidos totales en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, entremezcladas individualmente entre los restos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia.
De forma práctica, si cualquier polipéptido particular es al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a la secuencia de aminoácidos de referencia se puede determinar de forma convencional usando programas de ordenador conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711). Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia descrita en la presente invención, los parámetros se fijan, por supuesto, de modo que el porcentaje de identidad se calcula a lo largo de la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia y están permitidos huecos en la homología de hasta 5% del número total de restos de aminoácidos en la secuencia de referencia.
En otro aspecto, se describen en el presente documento partes de los polipéptidos descritos en el presente documento con al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos. Las partes preferidas descritas en el presente documento incluyen polipéptidos que comprenden una parte que lleva epítopo de una proteína estructural de filovirus. En particular, las partes preferidas descritas en el presente documento incluyen polipéptidos que comprenden un dominio que lleva epítopo de una proteína estructural de filovirus, en las que el dominio es el dominio de identidad de GP/SGP, el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana y el dominio intracelular, y cualquier combinación de los mismos, por ejemplo, una glicoproteína de filovirus que está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de anclaje de transmembrana y el intracelular, una glicoproteína de filovirus que está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana y el intracelular, una glicoproteína de filovirus que está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana y el intracelular, una glicoproteína de filovirus que está truncada en el extremo carboxi para suprimir el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, dominio de repetición de héptadas y dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, y una glicoproteína de filovirus que está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, dominio de repetición de héptadas y dominio de anclaje de transmembrana e intracelular. Otro ejemplo es una glicoproteína de filovirus que tiene una deleción de amino, interna o carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana o el dominio
intracelular.
\newpage
Los polipéptidos descritos en el presente documento se pueden producir por cualquier medio convencional (Houghten, R.A., 1985, PNAS USA 82:5131-5135). El procedimiento de "síntesis múltiple y simultánea de péptidos (SMPS)" se describe en la patente de EE.UU. nº 4.631.211 de Houghten y col. (1986).
La presente invención proporciona un vector de expresión que comprende el ID SEC Nº: 52 o un análogo del mismo que tiene al menos una identidad de secuencia de 95, 96, 97, 98, 99 o 100% con el que media la expresión, en el que el porcentaje de identidad se calcula a lo largo de toda la longitud de la secuencia de nucleótidos de referencia. Además se describen en el presente documento vectores que incluyen moléculas de ácido nucleico que se describen en el presente documento, células huésped que están genéticamente diseñadas con vectores recombinantes y la producción de polipéptidos de filovirus o fragmentos de los mismos por técnicas recombinantes.
Se describen además en el presente documento, regímenes de inmunización de "cebado y refuerzo" en los que la respuesta inmunitaria inducida por la administración de una composición de cebado se refuerza por la administración de una composición de refuerzo. La demostración experimental descrita en el presente documento muestra que se puede lograr un refuerzo eficaz usando vectores de adenovirus de replicación deficiente, después del cebado con cualquiera de una variedad de tipos diferentes de composiciones de cebado. Como se describe en el presente documento, se ha descubierto que los adenovirus de replicación deficiente, como muestran los experimentos descritos a continuación, son un medio eficaz para proporcionar un refuerzo a una respuesta inmunitaria cebada frente al antígeno usando cualquiera de una variedad de composiciones de cebado diferentes.
Los adenovirus de replicación deficiente obtenidos a partir de serotipo 5 humano han sido desarrollados como un vector vírico vivo por Graham y colaboradores (Graham y Prevec, 1995, Mol. Biotechnol. 3:207-20; Bett y col., 1994, PNAS USA 91:8802-6). Los adenovirus son virus sin envuelta que contienen un genoma de ADN bicatenario de aproximadamente 3600 pb. Los virus recombinantes se pueden construir por recombinación in vitro entre un plásmido de genoma de adenovirus y un vector lanzadera que contiene el gen de interés junto con un promotor eucariota fuerte, en una línea celular permisiva que permita la replicación vírica. Se pueden obtener titulaciones de virus altas de la línea celular permisiva, pero los virus resultantes, aunque son capaces de infectar una amplia variedad de tipos de células, no se replican en ninguna otra célula más que la línea permisiva y por lo tanto son un sistema de suministro de antígeno seguro. Se ha mostrado que los adenovirus recombinantes provocan respuestas inmunitarias protectoras contra una serie de antígenos incluyendo la proteína NS1 del virus de la encefalitis transmitido por garrapata (Jacobs y col., 1992, J. Virol. 66:2086-95) y nucleoproteína del virus del sarampión (Fooks y col., 1995, Virology 210:456-65).
De forma extraordinaria, el trabajo experimental descrito a continuación demuestra que el uso de realizaciones de la presente invención permite que el adenovirus recombinante de replicación deficiente que expresa un antígeno, refuerce una respuesta inmunitaria cebada por una vacuna de ADN. Se ha encontrado que el adenovirus de replicación deficiente induce una respuesta inmunitaria después de inmunización intramuscular. En los regímenes de vacunación de cebado/refuerzo el adenovirus de replicación deficiente también se prevé que sea capaz de cebar una respuesta que pueda ser reforzada por un virus recombinante diferente o antígeno producido de forma recombinante.
Los primates no humanos inmunizados con ADN plasmídico y reforzados con adenovirus de replicación deficiente estaban protegidos contra la estimulación. Tanto los adenovirus recombinantes de replicación deficiente como el ADN plasmídico son vacunas que son seguras para usar en seres humanos. De forma ventajosa, los autores de la invención encontraron que se puede usar un régimen de vacunación que usa inmunización intramuscular para el cebado y refuerzo, que constituye un régimen de inmunización general adecuado para inducir una respuesta inmunitaria, p. ej., en seres humanos.
En diferentes aspectos, en el presente documento se describe un vector de adenovirus de replicación deficiente que codifica un antígeno para el refuerzo de una respuesta inmunitaria al antígeno cebado por la administración previa del antígeno o el ácido nucleico que codifica el antígeno.
Un aspecto general descrito en el presente documento es el uso de un vector de adenovirus de replicación deficiente para el refuerzo de una respuesta inmunitaria a un antígeno.
Un aspecto descrito en el presente documento, es un procedimiento de refuerzo de una respuesta inmunitaria a un antígeno en un individuo, incluyendo el procedimiento proporcionar al individuo un vector de adenovirus de replicación deficiente que incluya un ácido nucleico que codifique el antígeno operativamente unido a secuencias reguladoras para producir el antígeno en el individuo por expresión del ácido nucleico, de forma que se refuerce una respuesta inmunitaria al antígeno previamente cebado en el individuo.
Una respuesta inmunitaria a un antígeno se puede cebar por inmunización genética, por infección con un agente infeccioso o por antígeno producido de forma recombinante.
Otro aspecto descrito en el presente documento, es un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria a un antígeno en un individuo, comprendiendo el procedimiento administrar al individuo una composición de cebado que comprende el antígeno o el ácido nucleico que codifica el antígeno, y después administrar una composición de refuerzo que comprende un vector de adenovirus de replicación deficiente que incluye el ácido nucleico que codifica el antígeno operativamente unido a secuencias reguladoras para producir el antígeno en el individuo por expresión del ácido nucleico.
Otro aspecto, describe el uso de un vector de adenovirus de replicación deficiente, como se ha descrito, en la fabricación de un medicamento para administrar a un mamífero para reforzar una respuesta inmunitaria a un antígeno. Dicho medicamento, en general es para administrar después de la administración previa de una composición de cebado que comprende el antígeno.
La composición de cebado puede comprender cualquier vector vírico, incluyendo adenovírico, u otros distintos de adenovirus, tales como un vector del virus vaccinia tal como una cepa de replicación deficiente tal como el virus Ankara modificado (MVA) (Mayr y col., 1978, Zentralbl. Bakteriol. 167:375-90; Sutterand Moss, 1992, PNAS USA 89:10847-51; Suttery col., 1994, Vaccine 12:1032-40) o NYVAC (Tartaglia y col., 1992 Virology 118:217-32), un vector de virus de viruela aviar tal como virus de viruela de aves de corral o de viruela de canario, p. ej., la cepa conocida como ALVAC (Kanapox, Paoletti y col., 1994, Dev. Biol. Stand 1994 82:65-9), o vector del herpesvirus.
La composición de cebado puede comprender ADN que codifica el antígeno, estando dicho ADN preferiblemente en forma de plásmido circular que no es capaz de replicarse en células de mamíferos. Cualquier marcador seleccionable no debe ser resistente a un antibiótico usado en clínica, así por ejemplo, se prefiere la resistencia a la kanamicina frente a la resistencia a la ampicilina. La expresión del antígeno debe estar dirigida por un promotor que es activo en células de mamífero, por ejemplo, el promotor inmediato temprano del citomegalovirus (CMV IE).
En realizaciones particulares de los diferentes aspectos descritos en el presente documento, a la administración de una composición de cebado le sigue el refuerzo con una primera y segunda composición de refuerzo, siendo la primera y segunda composición de refuerzo iguales o diferentes entre sí, p. ej., como se ilustra a continuación. Se pueden usar otras composiciones más de refuerzo. En una realización, un régimen de inmunización triple usa ADN, después adenovirus (Ad) como una primera composición de refuerzo y después MVA como una segunda composición de refuerzo, opcionalmente seguida de otra composición de refuerzo (tercera) o posterior administración de refuerzo de uno u otro o ambos vectores iguales o diferentes. Otra opción es ADN, después MVA, después Ad, opcionalmente seguido de la posterior administración de refuerzo de uno u otro o ambos vectores iguales o diferentes.
El antígeno que se va a incluir en las respectivas composiciones de cebado y refuerzo (no importa cuantas composiciones de refuerzo se usen) no es necesario que sean idénticos, pero deben compartir epítopos. El antígeno puede corresponder a un antígeno completo en un patógeno o célula objetivo, o a un fragmento del mismo. Se pueden usar epítopos peptídicos o cadenas artificiales de epítopos de forma más eficaz cortando la secuencia de proteína innecesaria en el antígeno y la secuencia codificante en el vector o vectores. Se pueden incluir uno o más epítopos, por ejemplo epítopos que son reconocidos por células T auxiliares, en especial epítopos reconocidos en individuos de diferentes tipos de HLA.
En el vector de adenovirus de replicación deficiente, las secuencias reguladoras para la expresión del antígeno codificado incluirán un promotor. Por "promotor" se entiende una secuencia de nucleótidos a partir de la cual se puede iniciar el transporte del ADN operativamente unido secuencia abajo (es decir, en la dirección 3' en la cadena homosentido del ADN bicatenario). "Operativamente unido" significa unido como parte de la misma molécula de ácido nucleico, situado y orientado de forma adecuada para iniciar la transcripción a partir del promotor. El ADN operativamente unido a un promotor está "regulado por el inicio de la transcripción" del promotor. Se pueden incluir otras secuencias reguladoras que incluyen fragmentos de terminación, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) y otras secuencias, según sea adecuado, de acuerdo con el conocimiento y la práctica del experto en la materia: véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook y col. 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press. Se describen con detalle muchas técnicas y protocolos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión de genes y análisis de proteínas en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col. eds., John Wiley & Sons, 1994.
Los promotores adecuados para usar en aspectos y realizaciones descritos en el presente documento incluyen el promotor inmediato temprano de citomegalovirus (CMV IE), con o sin intrón A, y cualquier otro promotor que sea activo en células de mamíferos.
Cualquiera o ambas composiciones de cebado y refuerzo pueden incluir un adyuvante o citoquina, tal como interferón alfa, interferón gamma, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor estimulador de las colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulador de las colonias de granulocitos (gCSF), factor de necrosis tumoral (TNF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-12, o ácido nucleico que codifica a los mismos.
La administración de la composición de refuerzo en general es semanas o meses después de administrar la composición de cebado, preferiblemente aproximadamente 2-3 semanas o 4 semanas, u 8 semanas o 16 semanas o 20 semanas o 24 semanas o 28 semanas o 32 semanas.
Preferiblemente, la administración de la composición de cebado, composición de refuerzo, o tanto la composición de cebado como la de refuerzo es inmunización intramuscular.
La administración intramuscular de vacunas de adenovirus o ADN plasmídico se puede lograr usando una aguja para inyectar una suspensión del virus o el ADN plasmídico. Una alternativa es el uso de un dispositivo de inyección sin aguja para administrar una suspensión de virus o de ADN plasmídico (usando, p. ej., Biojector^{TM}) o un polvo liofilizado que contiene la vacuna (p. ej., de acuerdo con las técnicas y productos de Powderject), permitiendo la fabricación de dosis preparadas individualmente que no necesitan almacenarse en frío. Esto sería una gran ventaja para una vacuna que es necesaria en zonas rurales de África.
El adenovirus es un virus con un registro de seguridad excelente en inmunizaciones humanas. La generación de virus recombinantes se puede llevar a cabo de forma sencilla, y se pueden fabricar de forma reproducible en grandes cantidades. Por lo tanto, la administración intramuscular de adenovirus recombinantes de replicación deficiente es muy adecuada para vacunaciones profilácticas y terapéuticas de seres humanos contra enfermedades que pueden controlarse mediante una respuesta inmunitaria.
El individuo puede tener una enfermedad o trastorno de modo que el suministro del antígeno y la generación de una respuesta inmunitaria al antígeno sean beneficiosos o tengan un efecto terapéutico beneficioso.
Lo más probable es que la administración tenga un objetivo profiláctico para generar una respuesta inmunitaria contra un patógeno o enfermedad antes de la infección o el desarrollo de los síntomas.
Las enfermedades y trastornos que se pueden tratar o prevenir incluyen aquellos en los que una respuesta inmunitaria puede tener una función protectora o función terapéutica.
Los componentes que se van a administrar se pueden formular en composiciones farmacéuticas. Estas composiciones pueden comprender un excipiente, vehículo, tampón, estabilizante u otros materiales farmacéuticamente aceptables conocidos para los expertos en la materia. Dichos materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza exacta del vehículo u otro material puede depender de la vía de administración, p. ej., las vías intravenosa, cutánea o subcutánea, intramucosa (p. ej., intestino), intranasal, intramuscular o intraperitoneal.
Como se ha indicado, la administración preferiblemente es intradérmica, subcutánea o intramuscular.
Las composiciones farmacéuticas líquidas en general incluyen un vehículo líquido, tal como agua, vaselina, aceites vegetales o animales, aceite mineral o aceite sintético. Se puede incluir solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.
Para la inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o inyección en el sitio aquejado, el principio activo estará en forma de una solución acuosa aceptable por vía parenteral que es apirogénica y tiene pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la materia pueden preparar soluciones adecuadas, usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro sódico, inyección de Ringer, inyección de Ringer-lactato. Se pueden incluir conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/o otros aditivos, según sean necesarios.
Se puede usar una formulación de liberación lenta.
Después de la producción de las partículas de adenovirus de replicación deficiente y formulación opcional de dichas partículas en composiciones, las partículas se pueden administrar a un individuo, en particular a un ser humano u otro primate.
La administración puede ser a otro mamífero, p. ej., roedor tal como ratón, rata o hámster, cobaya, conejo, oveja, cabra, cerdo, caballo, vaca, burro, perro o gato.
La administración preferiblemente es en una "cantidad profilácticamente eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz" (según sea el caso, aunque la profilaxis se puede considerar terapia), la cual es suficiente para mostrar beneficio al individuo. La cantidad real administrada y la velocidad y el curso de tiempo de la administración, dependerán de la naturaleza y gravedad de lo que se está tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, decisiones de la dosificación, etc., dependen de la responsabilidad de los médicos generales u otros doctores, o en un contexto veterinario de un veterinario, y normalmente se tiene en cuenta el trastorno tratado, el estado del paciente individual, el sitio de suministro, el procedimiento de administración y otros factores que conocen los facultativos. Se pueden encontrar ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados antes en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed., 1980.
En un régimen preferido, se administra ADN (preferiblemente por vía intramuscular) con una dosis de 10 microgramos a 50 miligramos/inyección, seguido de adenovirus (preferiblemente por vía intramuscular) con una dosis de 5x10^{7} -1x10^{12} partículas/inyección.
Si se desea, la composición se puede presentar en un kit, envase o dispensador, que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el principio activo. El kit puede comprender, por ejemplo, lámina de metal o plástico, tal como un envase de blíster. El kit, envase o dispensador puede ir acompañado de instrucciones para la administración.
\newpage
Una composición se puede administrar sola o combinada con otros tratamientos, sea de forma simultánea o secuencial dependiendo del estado que se va a tratar.
El suministro a un mamífero no humano no es necesario que sea para un propósito terapéutico, sino que se puede usar en un contexto experimental; por ejemplo en investigación de mecanismos de respuestas inmunitarias a un antígeno de interés, p. ej., protección frente a una enfermedad.
Otros aspectos descritos en el presente documento serán evidentes para los expertos en la materia, en vista de la descripción anterior y la siguiente ilustración experimental, incluida a modo de ilustración y no limitación, y con referencia a las figuras adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Desarrollo de una vacuna preventiva para la infección por el virus de Ébola en primates
Se ha mostrado que la inmunización genética influye en las rutas de activación inmunitaria tanto humoral como celular y en la protección contra la infección por patógenos humanos (Tang, D.C. y col., 1992, Nature 356:152-154; Ulmer, J.B. y col., 1993, Science 259:1745-1749; Wang, B. y col., 1993 PNAS USA 90:4156-4160; Sedegah, M. y col., 1994, PNAS USA 91: 9866-9870). Se cree que la eficacia de las vacunas plasmídicas es resultado de la síntesis de proteínas de la célula huésped y la presentación endógena del inmunógeno, y posiblemente de efectos inmunoestimuladores del propio ADN plasmídico (Krieg, A.M. y col., 1995, Nature 374:546-549; Sato, Y. y col., 1996, Science 273:352-354). Se ha mostrado que las vacunas de ADN provocan respuestas inmunitarias específicas a antígenos del virus de Ébola y protegen a cobayas (Xu, L. y col., 1998, Nat. Med. 4:7-42) y ratones (Vanderzanden, L. y col., 1998, Virology 246:134-144) frente a la estimulación con virus de Ébola adaptado para producir infección letal en roedores (Connolly, B.M. y col., 1999, J. Infect. Dis. 179:S203-S217; Bray, M. y col., 1998, J. Infect. Dis. 178:651-661). Aunque son provocadas respuestas inmunitarias tanto humoral como mediada por célula, la titulación de anticuerpos se correlacionaba con el grado de protección en los animales inmunizados con plásmidos que codifican proteínas del virus de Ébola del subtipo Zaire.
Una vacuna ampliamente eficaz es necesario que proporcione inmunidad frente a los múltiples subtipos de Ébola aislados en infecciones humanas (Zaire, Sudán y Costa de Marfil), pero una vacuna multivalente puede diluir la respuesta inmunitaria específica demostrada para la vacuna para un solo subtipo. Para abordar este problema, los autores de la invención analizaron la eficacia de la vacuna de ADN de Ébola de Zaire original comparado con su uso en combinación con ADN de Ébola de subtipos de Sudán y Costa de Marfil. Como en un estudio previo (Xu, L. y col., 1998, Nat. Med. 4:7-42), la inmunización con un solo plásmido que codifica la glicoproteína del virión del subtipo Zaire, GP(Z), generó una respuesta sustancial de anticuerpo específico de virus y confirió inmunidad protectora en las cobayas (Tabla I). La inclusión de un plásmido que expresaba la nucleoproteína de Ébola, NP, no afectaba a la titulación de anticuerpos contra GP(Z) de Ébola ni disminuía su eficacia protectora. Una mayor ampliación de los componentes de la vacuna para incluir NP y tres subtipos de glicoproteínas de Ébola, Zaire, Costa de Marfil y Sudán, GP(Z,IC,S)+NP, daba una respuesta inmunitaria preestimulación comparable a la vacuna de un solo plásmido. Además, se logró una protección completa frente a la infección con Ébola de Zaire en cobayas que recibieron la vacuna multivalente (Tabla I, sujetos 13-16). No se indujo anticuerpo anamnéstico por la estimulación con virus, lo que indicaba que la vacuna proporcionaba por sí misma una respuesta inmunitaria suficiente para eliminar el virus eficazmente. Estos descubrimientos muestran que la inmunización con plásmido multivalente no disminuía sustancialmente la protección de anticuerpo específica de glicoproteína (GP) ni su eficacia protectora en un modelo de roedor.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA I Inmunización genética multivalente en cobayas
7
Tabla I
Comparación de inmunización genética multivalente frente a monovalente en cobayas. Se inmunizaron cobayas por vía intramuscular tres veces en intervalos de dos semanas con 100 \mug de ADN (Plásmido, 100 \mug de p1012; GP(Z), 100 \mug de pGP(Z); GP(Z) + NP, 75 \mug de pGP(Z) y 25 \mug de pNP; GP(Z,IC,S) + NP, 25 \mug de cada uno de pGP(Z), pGP(IC), pGP(S) y pNP). Se recogió suero 6 semanas después de la primera inyección y se midieron las titulaciones antes de estimulación de los anticuerpos contra GP de Ébola (IgG ELISA) por ELISA (Ksiazek, T.G. y col., 1992, J. Clin. Microbiol. 30:947-950) y se presentan como la inversa de la dilución de punto final. Tres meses después de la inmunización final, los animales se estimularon como se ha descrito (Xu, L. y col., 1998, Nat. Med. 4:37-42).
Puesto que la protección en el modelo de roedor de la infección por el virus de Ébola se correlacionaba con las titulaciones de anticuerpos, y las respuestas humorales eficaces pueden influir en el resultado clínico en enfermedades humanas (Baize, S. y col., 1999, Nat. Med. 5:423-426; Maruyama, T. y col., 1999, J. Virol. 73:6024-6030), los autores de la invención consideraron importante provocar una respuesta humoral fuerte para las vacunas ensayadas en primates, a pesar de que la inmunidad mediada por célula es inducida de forma coordinada y probablemente contribuye a la protección (Xu, L. y col., 1998, Nat. Med. 4:37-42). Recientemente, los regímenes de cebado con ADN seguido de administración de vectores víricos han demostrado respuestas inmunitarias potenciadas comparado con vacunas que usan solo ADN (Sedegah, M. y col., 1998, PNAS USA 95:7648-7653; Hanke, T. y col., 1998, Vaccine 16:439-445; Robinson, H.L. y col., 1999, Nat. Med. 5:526-534; Schneider, J. y col., 1998, Nat. Med. 4:397-402). Los adenovirus recombinantes de replicación deficiente se pueden hacer crecer a altas titulaciones, infectar células que presentan antígeno e inducir potentes respuestas inmunitarias (Davis, A. R y col., 1985, PNAS USA 82:7560-7564; Natuk, R.J. y col., 1992, PNAS USA 89:7777-7781; Xiang, Z.Q. y col., 1996, Virology 219:220-227). Los adenovirus han mostrado un efecto de refuerzo en ratones (Xiang, Z.Q. y col., 1999, J. Immunol. 162:6716-6723), pero no se ha ensayado la eficacia de la combinación de ADN y adenovirus en un modelo de estimulación infecciosa, y todavía no se conoce el éxito de este procedimiento en primates. Por lo tanto, los autores de la invención desarrollaron un vector adenovírico recombinante que dirige niveles altos de expresión de GP ADV-GP(Z) y usaron este vector para ensayar si una estrategia de cebado-refuerzo modificada aumentaría la respuesta de anticuerpos al virus de Ébola, obtenida con el ADN desnudo solo. Se inyectó a los ratones ADN y vectores de adenovirus individualmente o en combinaciones y se evaluaron las respuestas inmunitarias humorales y mediadas por células. Se encontró un aumento de 10 a 100 veces en la titulación de anticuerpos en los ratones a los que se había inyectado ADN seguido de refuerzo con adenovirus, comparado con la inmunización sola con ADN (Fig. 47). También se observó un aumento de las respuestas de células T citotóxicas con esta combinación. La inmunización solo con ADV-GP(Z) dio titulaciones de anticuerpos que no eran significativamente diferentes de las obtenidas con la inmunización con cebado con ADN y refuerzo con adenovirus. Estos datos sugieren que la inmunogenicidad de la vacuna de ADN de GP de Ébola en ratones mejora por el refuerzo con adenovirus recombinante y que esta estrategia puede representar un procedimiento útil para potenciar respuestas inmunitarias en primates no humanos.
Aunque el modelo de roedor ha sido útil en el desarrollo de una estrategia de vacunación, el virus de Ébola aislado de seres humanos debe adaptarse primero por múltiples pasos secuenciales en roedores con el fin de producir una infección letal en ratones o cobayas (Connolly, B.M. y col., 1999, J. Infect. Dis. 179:S203-S217; Bray, M. y col., 1998, J. Infect. Dis. 178: 651-661). Se cree que los modelos de primates de infección por Ébola tienen un valor predictivo mayor para la enfermedad humana y la protección inmunitaria. Por lo tanto, los autores de la invención llevaron a cabo estudios en primates no humanos usando una vacuna bimodal ADN/ADV y la estrategia de plásmidos múltiples que se correlacionaba con la protección en cobayas. Macacos Cynomolgus (Macaca fascicularis) recibieron 3 inyecciones de vectores de ADN desnudo en intervalos de 4 semanas (Fig. 48A) y, después de varios meses de reposo en los que se ha mostrado que se refuerzan las respuestas inmunitarias (Letvin, N.L. y col., 1997, PNAS USA 94:9378-9383), se reforzaron con adenovirus recombinante que expresa sólo la glicoproteína de Zaire (Fig. 48A). Los animales de control recibieron vectores vacíos (plásmido de ADN y adenovirus recombinante ADV-AE1) y los animales vacunados recibieron la vacuna de ADN multicomponente que contenía NP y tres subtipos de GP de Ébola (pGP/NP), seguido de ADV-GP(Z). Como se esperaba, no se pudieron detectar anticuerpos anti-Ébola en el suero en animales de control, pero en los animales que recibieron la vacuna de Ébola se detectó una respuesta de anticuerpo específica de antígeno en la semana 12, un mes después de la tercera inyección de ADN (Fig. 48B). Después de refuerzo con adenovirus recombinante, las titulaciones de anticuerpo aumentaron de 10 a 20 veces sobre los niveles obtenidos con el ADN solo. Tres meses después de la inmunización final, los niveles de anticuerpos permanecían altos, excepto para un animal (sujeto 8) cuya titulación disminuyó ligeramente de 5x10^{4} a 1,3x10^{4}.
Después se examinaron las respuestas celulares de primates a antígenos de Ébola con un ensayo de proliferación de linfocitos in vitro. En los monos de control, la proliferación de linfocitos específica de antígeno, medida por la absorción de ^{3}H-timidina, era equivalente a la de las células correspondiente, no estimuladas, dando como resultado un índice de proliferación cercano a 1,0 para cada animal (Fig. 48C). En comparación, las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de animales inmunizados con la vacuna multivalente mostraron una estimulación aumentada en 9 a 20 veces, demostrando una respuesta inmunitaria fuerte al antígeno de Ébola a nivel celular. La reducción drástica de linfocitos CD4 positivos redujo la respuesta proliferativa estimulada por antígeno de las CMSP de monos vacunados a los niveles observados en los animales de control (Fig. 48D). Sin embargo, la reducción drástica de linfocitos CD8 positivos no afectaba a la proliferación de linfocitos específicos de antígeno. Por lo tanto, el subconjunto de linfocitos CD4 positivos, que proporcionan la ayuda de células T necesaria para las titulaciones de anticuerpos altas, contribuye a la respuesta inmunitaria celular inducida por la vacuna.
Para determinar la eficacia protectora de este régimen de vacunación, los monos se estimularon con una dosis letal de la cepa de Mayinga salvaje del virus de Ébola del subtipo de Zaire. En los monos de control, el análisis químico de la sangre puso de manifiesto un aumento de las enzimas hepáticas (Figura 49A, B) que es característico de la infección por el virus de Ébola (Fisher-Hoch, S.P. y col., 1985, J. Infect. Dis. 152:887-894). No se observó dicho aumento en los sujetos vacunados. La elevación de la alanina aminotransferasa (ALT) y la aspartato aminotransferasa (AST) en el suero era paralela a un aumento espectacular de la viremia en todos los animales de control (Fig. 49C). En comparación, no se observó un aumento sustancial de la carga vírica en los monos vacunados. La cinética del progreso de la enfermedad era similar entre los animales de control, y la incidencia de la enfermedad era 100% en este grupo. La muerte se produjo a los 5 y 6 días para 3 animales, y se practicó la eutanasia en el último mono, moribundo, el día 7. En comparación, 4 de 4 monos inmunizados con la vacuna de combinación de ADN-adenovirus sobrevivieron a esta estimulación letal del virus de Ébola, y se alcanzó la inmunidad esterilizante en 3 de los 4 sujetos. El animal que quedaba mostró una pequeña elevación transitoria del antígeno vírico; sin embargo, cuando se hizo el seguimiento a largo plazo, ninguno de los animales vacunados mostró signos o síntomas de infección, y no hubo viremia detectable durante más de 6 meses después de la infección, cuando se midió por detección con ELISA el antígeno vírico (Fig. 49A) y análisis de titulación de punto final del virus cultivado. El receptor de vacuna (sujeto 8) que presentó un nivel bajo transitorio de viremia el día 10, volvió a niveles indetectables el día 17.
Puesto que no se conoce la reserva natural para el virus de Ébola, el potencial para las medidas de salud públicas tradiciones para prevenir futuros brotes es ilimitado, aumentado la urgencia del desarrollo de una vacuna y productos terapéuticos en seres humanos. Los presentes descubrimientos demuestran que los primates pueden inmunizarse contra los efectos letales de la infección por el virus de Ébola, y que la inmunidad esterilizante se puede lograr usando una estrategia de cebado-refuerzo heterólogo. Una vacuna genética de multicomponentes que expresa proteínas estructurales del virus de Ébola de aislados geográficos diversos generó una respuesta inmunitaria fuerte específica de antígeno y dio como resultado la supervivencia de los primates inmunizados después de estimulación con una dosis letal de Ébola de Zaire, el subtipo de este virus asociado con el mayor número de muertes en infecciones en seres humanos. Los resultados de este estudio sugieren que la inmunidad humoral y mediada por células T contribuye a la eliminación de virus en primates no humanos, de acuerdo con los estudios previos en roedores (Xu, L. y col., 1998, Nat. Med. 4:37-42; Wilson, J. y col., 2000, Science 287:1664-1666). Dos parámetros inmunitarios, la titulación de anticuerpos (1:75,000 frente a <1:100, P= 0,001) y la respuesta proliferativa celular (\sim12 veces frente a 1,4 veces, P= 0,0014), proporcionaron correlaciones inmunitarias de protección significativamente altas. Los estudios que investigan las correlaciones de protección inmunitaria de la infección por el virus de Ébola en seres humanos se complican por la naturaleza agresiva del virus y el nivel necesariamente alto del confinamiento de bioseguridad. Con el modelo de inmunidad de primate presentado aquí, se prevé que ahora sea posible elucidar los mecanismos de protección inmunitaria para la infección por el virus de Ébola, para avanzar en las terapias antivíricas de base inmunitaria, y desarrollar una vacuna humana para este patógeno e incluso otras causas infecciosas de fiebre hemorrágica.
\vskip1.000000\baselineskip
Descripción de construcciones de Ébola, Marburg y Lassa
VRC 6000 VRC6000 (pVR1012-GP(Z)).
Cadena principal, pVR1012 (#450) que expresa la glicoproteína de Ébola del subtipo Zaire. La orientación es BamHI/EcoRI/EcoRV/BcoRIBg/II)
VRC 6001 VRC6001 (pVR1012x/s-GP(Z)) No hay más descripción.
Es la misma que 6000, con la adición de un sitio de restricción Sfi en la cadena principal de pVR1012.
VRC 6002 VRC6002 (pVR1012-GP(Z) delta MUC).
Se suprimió el dominio de tipo mucina de GP(Z). Se suprimieron 530 pb de la cadena principal de pVR1012 GP(Z), desde EarI(2844) a BfaI(3374). Este mutante se puede unir al receptor de Ébola.
VRC 6003 VRC6003 (pVR1012-GP(Z) delta MUC delta FUR).
Se suprimieron el dominio de tipo mucina y el sitio de escisión de furina de GP(Z). Se suprimieron 539 pb de la cadena principal de pVR1012 GP(Z), desde EarI(2844) a EarI(3437). La proteína tiene propiedades similares a pVR1012-GP(Z) delta MUC.
VRC 6004 VRC6004 (pVR1012-GP(Z) delta GP2).
Se suprimió la mayor parte de la región GP2 en GP(Z). Se suprimieron 430 pb de la cadena principal de pVR1012-GP(Z), desde BclI(3414) a BspEI(3844). Se retuvo la región TM (transmembrana).
VRC 6005 VRC6005 (pVR1012-GP(Z) delta GP2 delta C-term A).
Es una deleción C-terminal de GP2. Se suprimieron 267 pb de la cadena principal de pVR1012-GP (Z), desde MscI(3623) a BspMI(3890).
VRC 6006 VRC6006 (pVR1012-GP(Z) delta GP2 delta C-term B).
Es una deleción menor de GP2 C-terminal. Se suprimieron 110 pb de la cadena principal de pVR1012-GP(Z) desde BstXI(3780) a BspMI(3890).
VRC 6007 VRC6007 (pVR1012-GP(Z) delta GP2 delta FUS).
Se suprimió el péptido de fusión en GP2 de GP(Z) en este mutante, usando la PCR. Se suprimieron 47 pb de la cadena principal pVR1012-GP(Z), desde (3508-3555).
VRC 6008 VRC6008 (pVR1012-GP(Z) delta TM).
En este mutante se truncó la región TM de GP(Z). Se añadió un codón de parada (TGA) secuencia abajo del sitio BspMI (3889). Esta proteína es secretada y no forma un trímero.
VRC 6052 VRC 6052 (pVR1012-GP(Z) delta sGP).
Se suprimió la mayor parte de la región de homología SGP/GP. Se suprimieron 687 pb de la cadena principal de pVR1012-GP(Z), desde HincII(2083) a HincII(2270).
VRC6101 VRC 6101 (pVR1012x/s Ebola GP(R)(dTM)).
El vector expresa la glicoproteína de Ébola (subtipo Reston) sin sus dominios de transmembrana e intracelular. Usando la PCR, se generó un codón de parada secuencia abajo del aa 650 de GP(R), seguido de un sitio XbaI. Esta proteína puede ser secretada y se llama GP(R)(dTM).
VRC 6110 VRC 6110 (pAdApt Ebola GP(R)(dTM)).
Un vector lanzadera adenovírico que expresa la glicoproteína del virus de Ébola (subtipo Reston) sin sus dominios de transmembrana e intracelular. Usando la PCR se generó un codón de parada secuencia abajo del aa 651 de GP(Reston), seguido de un sitio XbaI. El adenovirus recombinante resultante expresa una glicoproteína secretada de 651 aa llamada GP(R)(dTM).
VRC 6200 VRC6200 (pVR1012-GP(S))
Cadena principal, pVR1012(#450), que expresa la glicoproteína de Ébola de subtipo Sudán. La orientación es EcoRI/EcoRV/BamHI\BamHI\BamHI\XbaI.
VRC 6201 VAC 6201 (pVR1012x/s Ebola GP(S)).
No hay más descripción, pero es la misma que 6200 con la adición de un sitio Sfi en la cadena principal en 1012.
VRC 6202 VRC6202 (pVR1012-GP(S) delta TM).
En este mutante se truncó la región TM de GP(S). Se añadió un codón de parada (TGA) secuencia abajo del sitio BspMI(xxx). Esta proteína es secretada y no forma un trímero.
VRC 6300 VRC6300(pVR1012-GP(IC)).
Cadena principal, pVR1012(#450), que expresa la glicoproteína de Ébola de subtipo Costa de Marfil. La orientación es EcoRI/EcoRV/BamHI/BamHI/BamHI/XbaI.
VRC 6301 VRC6301 (pVR1012x/s-GP(IC)).
No hay más descripción, pero es la misma que 6300 con la adición de un sitio Sfi en la cadena principal 1012.
VRC 6302 VRC6302 (pVR1012-GP(IC) delta TM).
En este mutante se truncó la región GP(IC). Se añadió un codón de parada (TGA) secuencia abajo del sitio BspMI. Esta proteína es secretada y no forma un trímero.
VRC 6303 VRC 6303 (pVR1012x/s Ebola GP (IC) (dTM)).
Un vector basado en pVRC2000 que expresa la glicoproteína de Ébola (subtipo de Costa de Marfil) sin dominios de transmembrana e intracelular. Usando la PCR, se generó un codón de parada secuencia abajo del aa 650, seguido de un sitio BglII. El vector expresa una glicoproteína secretada de 650 aa (aa 1 - aa 650).
VRC 6310 VRC 6310 (pAdApt Ebola GP (IC) (dTM)).
Un vector lanzadera adenovírico que expresa la glicoproteína de Ébola (subtipo de Costa de Marfil) sin sus dominios de transmembrana e intracelular. Usando la PCR se generó un codón de parada secuencia abajo del aa 651 de GP(IC). El adenovirus recombinante resultante expresa una glicoproteína secretada de 651 aa llamada GP(IC)(dTM).
VRC 6351 VRC6351 (pVR1012x/s-sGP(IC)). No hay más descripción.
VRC 6400 VRC6400 (pVR1012-NP).
Cadena principal, pVR1012(#450) que expresa la nucleoproteína de Ébola del subtipo de Costa de Marfil.
VRC 6401 VRC6401 (pVR1012x/s-NP).
No hay más descripción, pero es la misma que 6400 con la adición de un sitio Sfi en la cadena principal 1012.
VRC 6500 VRC6500 (pVR1012-VP35).
La cadena principal es pVR1012(#450). El inserto es VP35 de Ébola clonado a partir de pGEM 3Zf(+)VP35
(#1213).
VRC 6600 VRC6600 (pAD/CMV-GP(dTM)(Z-CITE-S). No hay más descripción.
VRC 6601 VRC6601 (pAdApt Ebola GP(S)). No hay más descripción.
VRC 6602 VRC 6602 (pAdApt Ebola GP(S)(dTM)).
Un vector lanzadera adenovírico que expresa la glicoproteína del virus de Ébola (subtipo de Sudán) sin sus dominios de transmembrana e intracelular. Se fusionó un codón de parada secuencia abajo del aa 650 de GP(S). El adenovirus recombinante resultante expresa una glicoproteína secretada de 654 aa llamada GP(S)(dTM).
VRC 6603 VRC6603 (pAdApt Ebola GP(Z)). No hay más descripción.
VRC 6604 VRC 6604 (pAdApt Ebola GP(Z)(dTM)).
Un vector lanzadera adenovírico que expresa la glicoproteína del virus de Ébola (subtipo de Zaire) sin sus dominios de transmembrana e intracelular. Se fusionó un codón de parada secuencia abajo del aa 651 de GP(Z). El adenovirus recombinante resultante expresa una glicoproteína secretada de 655 aa llamada GP(Z)(dTM).
VRC6701 VRC6701 (pVR1012-Marburg).
Marco de lectura abierto de la glicoproteína de Marburg (GP), cepa Musoke. Marburg se clonó en la cadena principal #450(Sam(romo)/XbaI) a partir de VRC6700 (Xba/PvuII).
VRC 6702 VRC 6702 (pVR1012x/s Marburg GP (dTM)).
Este vector expresa la glicoproteína del virus de Marburg sin sus dominios de transmembrana e intracelular. Usando la PCR se generó un codón de parada secuencia abajo del aa 650 de GP(Marburg), seguido de un sitio BglII. Esta proteína puede ser secretada y se denomina GP(Marburg)(dTM).
VRC 6710 VRC 6710 (pAdApt Marburg GP (dTM)).
Un vector lanzadera adenovírico (pVRC1290) que expresa la glicoproteína del virus de Marburg sin sus dominios de transmembrana e intracelular. Usando la PCR se generó un codón de parada secuencia abajo del aa 650, seguido de un sitio BglII. El adenovirus recombinante resultante expresa una proteína secretada de 650 aa (aa 1 - aa 650).
VRC 6800 VRC6800 (pVR1012x/s Lassa GP). No hay más descripción.
VRC 6801 VRC6801 (pVR1012x/s Lassa GP (dTM)). No hay más descripción.
VRC 6810 VRC6810 (pAdApt Lassa GP). No hay más descripción.
VRC 6811 VRC6811 (pAdApt Lassa GP (dTM)). No hay más descripción.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1
Construcción de vector. La construcción de vectores de ADN que expresan la glicoproteína (GP), GP secretada (SGP) y nucleoproteína (NP) de Ébola de Zaire, han sido descritos por Xu, L. y col., 1998 Nat. Med. 4:37-42. Los vectores de expresión de GP de Sudán y costa de Marfil se construyeron de forma similar. Brevemente, se generaron los marcos de lectura abiertos de GP a partir de la reacción en cadena de la polimerasa después de transcripción inversa de los productos de ARN (RT-PCR) de ARN de célula infectada, usando los cebadores: 5' ATC TTC AGG ATC TCG CCA TGG A 3' (gen GP de Sudán; NcoI > ATG; ID SEC Nº: 44), 5' GAT ATT CAA CAA AGC AGC TTG CAG 3' (gen GP de Sudán; parada GP extremo C; ID SEC Nº: 45), 5' CTA ATC ACA GTC ACC ATG GGA 3' (gen GP de Costa de Marfil; NcoI > ATG; ID SEC Nº: 46), 5' AAA GTA TGA TGC TAT ATT AGT TCA 3' (gen GP de Costa de Marfil; parada GP extremo C; ID SEC Nº: 47) dando los clones TA PCR2.1 Sudán y PCR2.1 Costa de Marfil. La glicoproteína de Sudán se hizo digerir del plásmido PCR2.1 con XbaI>HindIII, se trató con Klenow y se clonó en el sitio XbaI de p1012 (Xu, L. y col., 1998, Nat. Med. 4:37-42). La GP de Costa de Marfil se hizo digerir del plásmido PCR2.1 con EcoRI, se trató conKlenow, y se clonó en el sitio XbaI de p1012 (Xu, L. y col., 1998, Nat. Med. 4:37-42).
Para hacer ADV-GP, el fragmento BamHI/EcoRI de GP(Z) se hizo digerir de pGEM-3Zf(-)-GP, se trató con Klenow, y se insertó en el plásmido pRc/CMV tratado con HindIII/XbaI/Kle/CIP. El plásmido resultante (PRC/CMV-GP(Z)) se hizo digerir con NruI/DraIII y se trató con Klenow. El fragmento NruI/DraIII/Kle que contenía el potenciador de CMV, ADN de GP(Z) y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina se insertó en el sitio BglII del plásmido lanzadera adenovírico pAdBgIII (Ohno, T. y col., 1994, Science 265:781-784). El adenovirus, un vector Ad5 basado en dl 309 de primera generación, contenía una deleción en E1 para hacer el vector de replicación deficiente y una deleción/sustitución parcial en E3, que altera las secuencias codificantes para las proteínas E3 con una masa molecular relativa de 14,7 kD, 14,5 kD y 10,4 kD, respectivamente. El adenovirus recombinante que expresaba la GP de Zaire, ADV-GP(Z), se hizo de acuerdo con los procedimientos previamente publicados (Aoki, K. y col., 1999, Mol. Med. 5:224-231). La dosis de adenovirus administrada, 10^{10} unidades formadoras de placa (UFP) por animal (aproximadamente 3 x 10^{9} UFP/kg), está dentro del intervalo usado con seguridad en ensayos de terapia génica humana.
Seguridad y estudio en animales. Se usaron 8 macacos cynomolgus (Macaca fascicularis), de 3 años de edad y que pesaban 2-3 kg, obtenidos de Covance (Princeton, NJ), para el experimento de inmunización y estimulación. Para obtener muestras de sangre y administrar las vacunas, los monos se anestesiaron con ketamina. Los animales se alojaron por separado y recibieron enriquecimiento regular de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (DHEW Nº NIH 86-23). Justo antes de la estimulación con el virus de Ébola y hasta el final del experimento, los animales se mantuvieron en el Laboratorio de confinamiento máximo (BSL-4) y se alimentaron y examinaron diariamente. Se practicó la eutanasia en un animal que apareció moribundo y posteriormente se hizo la necropsia para el examen patológico. Además se practicó la eutanasia en un animal vacunado asintomático para el análisis patológico y virológico.
Inmunización de ratón. Se construyeron los vectores de ADN y adenovirus que expresaban la GP o NP de Ébola de Zaire como se ha descrito previamente (Xu, Ly col., 1998, Nat. Med. 4:37-42; Ohno, T. y col., 1994, Science 265:781-784), con la expresión génica controlada por el potenciador y promotor de citomegalovirus. Los ratones se inmunizaron por vía intramuscular con 100 \mug de ADN (pGP o un plásmido de control p1012) o 10^{8} UFP de adenovirus (ADV-GP o virus de control ADV-\DeltaE1) los días 0, 14, y 28 y se recogió sangre el día 28. El día 42, los ratones recibieron un refuerzo intramuscular con ADN o adenovirus y se midieron las titulaciones el día 56. Las titulaciones de IgG de ELISA se determinaron usando placas de 96 pocillos recubiertas con una preparación de antígeno del virus de Ébola derivado de viriones purificados y enriquecidos en las proteínas asociadas a membrana (GP, VP40 y VP24) (Ksiazek, T.G. y col., 1992, J. Clin. Microbiol. 30:947-950). La unión específica de antígeno se detectó usando un conjugado de IgG antihumana de cabra (H+L)-peroxidasa de rábano y ABTS/Peróxido (sustrato/indicador).
Inmunización de macaco. Para las inmunizaciones con ADN, los animales recibieron 1 mg de cada uno de los ADN que expresan GP(Zaire) [GP(Z)], GP(Costa de Marfil) [pGP(IC)], GP(Sudán) [pGP(S)] y NP(Zaire) administrados como una mezcla [pGP/NP], o 4 mg de plásmido de control vacío [pGP(Z)] bilateralmente (2 mg por lado) en el músculo deltoides. La inmunización las semanas 0 y 4 fueron por inyección IM, y la semana 8 por Biojector. Para el refuerzo con adenovirus, los animales recibieron 10^{10} UFP de ADV-GP (subtipo de Zaire) o ADV-\DeltaE1 (vector vacío) dividido en dos dosis administradas bilateralmente en el músculo deltoides. La semana 32, todos los animales recibieron una inyección intraperitoneal de aproximadamente 6 UFP de virus de Ébola (aislado 1976 Zaire; cepa Mayinga) (Kiley, M.P. y col., 1980, J. Gen. Virol. 49:333-341) en 1 ml de solución salina tamponada de Hanks. El virus se aisló directamente de la sangre de paciente y se usó después de un solo paso en células Vero.
Las titulaciones de IgG de ELISA se determinaron como antes para el control (Plásmido: ADV-AE1) y los monos inmunizados [pGP/NP: ADV-GP(Z)]. La dilución de punto final inversa para cada sujeto fue en la semana 12 y semana 24. Los niveles de anticuerpos en el suero se midieron por ELISA como se ha descrito (Ksiazek, T.G. y col., 1992, J. Clin. Microbiol. 30:947-950).
Se recogió sangre de los animales de control (plásmido: ADV-\DeltaE1) o inmunizados [pGP/NP: ADV-GP(Z)] 1-3 días antes de las inmunizaciones en las semanas 4, 8 y 20 y la semana 24. Se separó sangre por un gradiente Percoll para obtener la población enriquecida en linfocitos. Los linfocitos se estimularon como se ha descrito (Xu, L. y col., 1998, Nat. Med. 4:37-42) durante 5 días in vitro usando el líquido sobrenadante de células transfectadas con glicoproteína secretada (SGP) de Ébola o plásmido vacío, y se midió la proliferación por la absorción de ^{3}H-timidina. Se calculó el índice de proliferación como la proliferación en los pocillos que recibían SGP dividido entre la proliferación en los pocillos que recibían el líquido sobrenadante de control.
Detección vírica en macacos. La presencia de antígeno del virus de Ébola en la circulación se detectó como se ha descrito (Ksiazek, T.G. y col., 1992, J. Clin. Microbiol. 30:947-950) capturando la proteína VP40 de diluciones seriadas de plasma de mono. Se usaron placas de 96 pocillos recubiertas con mAb antiVP40 para capturar el antígeno, y la detección se hizo con un suero de virus anti-Ébola de conejo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2
Las secuencias de aminoácidos de GP(Zaire) y NP(Zaire) de Ébola se obtuvieron de Genbank: GP(Zaire), nº de acceso de Genbank P87666; NP(Zaire), nº de acceso de Genbank NC_002549; mientras que GP(Sudán/Gulu) se obtuvo de CDC. Después las secuencias de aminoácidos se volvieron a traducir a secuencias de ADN usando codones de referencia de mamífero. Se prepararon oligonucleótidos seriados de 75 pb con 25 pb que se superponían para cubrir el gen entero. Después los oligonucleótidos se ensamblaron en genes de mamífero intactos que contenían los codones preferidos usando la PCR. En el diseño, se introdujo un codón de parada opuesto a los dominios de transmembrana previstos de GP(Zaire) (aa 648-676) y GP (Sudán/Gulu) (aa 648-676) de modo que esta región era excluida de los genes creados sintéticamente. Las deleciones también condujeron a la pérdida de una región citoplasmática de 4 aa en ambas construcciones. La secuenciación final de la secuencia de GP(Zaire) de Ébola puso de manifiesto 10 aminoácidos divergentes respecto a la secuencia de GP de laboratorio, que se usó en los estudios de animales y estos se corrigieron por mutagénesis dirigida al lugar. Estos insertos se clonaron en p1012 x/s por XbaI/SalI.
\newpage
Construcción de CMV/R-GP(S/G)(\DeltaTM)/h
La forma de dominio de transmembrana suprimido, modificado por codón, del gen de GP de Ébola (Sudan/ Gulu) se escindió de p1012 (x/s)-GP(S/G)(\DeltaTM)/h usando SalI/KpnI y se insertó en el plásmido CMV/R/MCS digerido con SalI/KpnI.
\vskip1.000000\baselineskip
Construcción de CMV/R GP(Z)(\DeltaTM)/h
La forma de dominio de transmembrana suprimido, modificado por codón, del gen de GP de Ébola (Zaire) se escindió de p1012 x/s-GP(Z)(\DeltaTM)/h, sitios SalI/BglII, y se clonó en los sitios SalI/BglII del plásmido CMV/R.
\vskip1.000000\baselineskip
Construcción de CMV/R Ebola NP
El fragmento ArotI-KpnI de VRC6400 (pVR1012-NP) que expresaba la nucleoproteína de Ébola de subtipo Zaire se escindió y se clonó en los sitios NotI/KpnI del plásmido CMV/R.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 Vector de expresión de mamífero no vírico mejorado
Esta invención proporciona un vector de expresión de mamífero mejorado que genera un nivel más alto de expresión de proteína que los vectores usados habitualmente.
Inicialmente, se desarrollaron y ensayaron 3 nuevos vectores, conteniendo cada uno un potenciador distinto. El potenciador de RSV, el potenciador de ubiquitina de ratón (mUBB) y el potenciador de CMV (Xu y col., 1998, Nature Med. 4:37-42) se combinaron cada uno con la región HTL V-1 R (Takebe y col., 1988, Mol. Cell Biol. 8:466-472) para crear vectores separados. Cuando estos 3 vectores se compararon con la cadena principal que contenía el potenciador de CMV combinado con el potenciador de traducción y el intrón (CMVint) de CMV, que actualmente es el vector más eficaz, los datos in vitro mostraron que la expresión con el vector que contenía CMV/R había aumentado 5-10 veces comparado con CMV/int y los estudios inmunológicos mostraron una inducción significativamente mayor de respuestas de células T CD4 y CD8 comparado con CMVint. Tanto las respuestas in vivo como in vitro eran notablemente más altas con este nuevo vector. Ninguno de los otros dos vectores produjo resultados comparables.
El vector de expresión es único en cuanto que usa un potenciador de la traducción específico combinado con potenciador/promotores específicos para dar altos niveles de expresión e inmunogenicidad potenciada para las vacunas de ADN. Esto es particularmente importante porque la potencia de estas vacunas en seres humanos es marginal y las mejoras genéricas pueden servir como plataformas importantes para hacer que la tecnología sea práctica para uso humano. Los casetes de vectores de expresión se pueden usar en otras vacunas basadas en genes así como, o para la producción de proteínas recombinantes de vectores de expresión eucariotas. La invención es útil en la producción de vacunas genéticas y terapias génicas para una amplia variedad de enfermedades, incluyendo el VIH y otras enfermedades víricas y cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 50
Expresión potenciada del vector de expresión de CMV modificado, CMV/R
Se transfectaron células 3T3 de fibroblastos de ratón con el vector (A) solo (carril 1), CMVint-gp-145(dCFI) (carril 2), CMV/R-gp145(dCFI) (carril 3) o (B) mUBB-gp145(dCFI) (carril 4), mUBB/R-gp145(dCFI) (carril 5) en discos de cultivo tisular de 6 pocillos con 0,5 \mug de los plásmidos correspondientes usando fosfato cálcico. 24 horas después de la transfección, las células se recogieron y se lisaron en tampón de lisis (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, NP-40 al 1%), cóctel de inhibidor de proteasa Mini Complete (Roche)). Se separaron 10 \mug de proteína total de cada muestra en un gel de gradiente al 4-15% usando SDS-PAGE, seguido de transferencia de proteína y análisis de transferencia Western. Se usó IDV-IgG humana (1:5000) como el anticuerpo primario, e IgG antihumana de cabra conjugada con HRP (1:5000) como el anticuerpo secundario. La membrana se reveló usando el sistema de revelado de transferencia Western ECL. Las flechas indican la banda específica para la poliproteína HIV Env gp 145(\DeltaCFI).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 51
Inmunogenicidad potenciada del vector de expresión de CMV modificado, CMV/R, en ratones
Se inmunizaron cinco ratones en cada grupo con 50 \mug del ADN plasmídico indicado en las semanas 0, 2 y 6. 10 días después de la última inyección, se recogieron los esplenocitos de cada ratón y se estimularon usando una mezcla de péptidos de control (oligómeros de 15 miembros), o una mezcla de péptidos de HIV Env (oligómeros de 15 miembros) durante 6 horas. Los esplenocitos estimulados se tiñeron usando un cóctel de anticuerpos que contenían CD3 PE-antiratón, CD4 PeiCP-antiratón, CD3 APC-anti-ratón, IFN-\gamma FITC-anti-ratón y TNF-\alpha FITC-anti-ratón. Las muestras se analizaron por citometría de flujo. Se midieron los números de células positivas para CD3/CD4/IFN-\gamma/TNF-\alpha y CD3/CD8/IFN-\gamma/TNF-\alpha usando el software FloJo (Treestar).
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de potenciador/promotor de CMV, región R (HTVL-1), aceptor de religación CMV IE (ID SEC Nº: 52):
8
1-741: Potenciador/Promotor de CMV
742-972: Región R de HTLV-1
973-1095: Aceptor de religación CMV/IE
Los aspectos adicionales descritos en el presente documento se caracterizan mejor en los siguientes puntos:
1. Una composición de cebado y una composición de refuerzo bimodal para cebar y reforzar una respuesta inmunitaria a un antígeno en un individuo, que comprende (1) una composición de cebado compuesta de un plásmido de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg, Lassa, retrovirus, paramixovirus o influenza, o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un plásmido de ADN tomado de la Tabla 2 o su inserto, o un análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, y (2) una composición de refuerzo compuesta de un adenovirus de replicación deficiente que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg, Lassa, retrovirus, paramixovirus o influenza, o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un adenovirus de replicación deficiente tomado de la Tabla 2 o su inserto, o un análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, para producir dicho antígeno por expresión de dicho plásmido de ADN y adenovirus de replicación deficiente, de modo que se refuerce una respuesta inmunitaria al antígeno previamente cebado en el individuo.
2. Una composición de cebado y una composición de refuerzo bimodal para cebar y reforzar una respuesta inmunitaria a un antígeno en un individuo, que comprende (1) una composición de cebado compuesta de un plásmido de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa, o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un plásmido de ADN tomado de la Tabla 2 o su inserto, o un análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, y (2) una composición de refuerzo compuesta de un adenovirus de replicación deficiente que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa, o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un adenovirus de replicación deficiente tomado de la Tabla 2 o su inserto, o un análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, para producir dicho antígeno por expresión de dicho plásmido de ADN y adenovirus de replicación deficiente, de modo que se refuerce una respuesta inmunitaria al antígeno previamente cebado en el individuo.
3. Una composición de cebado y una composición de refuerzo bimodal para cebar y reforzar una respuesta inmunitaria a un antígeno en un individuo, que comprende (1) una composición de cebado compuesta de una primera construcción genética que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa, o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, y (2) una composición de refuerzo compuesta de una segunda construcción genética que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa, o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, o la glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa producida de forma recombinante o el dominio del mismo que lleva el epítopo o un análogo que es 95% idéntico con el mismo, en el que la primera construcción genética se coge del grupo que consiste en ADN plasmídico, adenovirus de replicación deficiente, virus vaccinia de replicación deficiente, virus de viruela aviar recombinante y herpesvirus recombinante, y en el que la segunda construcción genética se coge del grupo que consiste en adenovirus de replicación deficiente, virus vaccinia de replicación deficiente, virus de viruela aviar recombinante y herpesvirus recombinante, para producir dicho antígeno por expresión de dicha primera construcción genética y dicha segunda construcción genética, de modo que se refuerce una respuesta inmunitaria al antígeno previamente cebado en el individuo.
4. Un método para reforzar una respuesta inmunitaria a un antígeno en un individuo, que comprende proporcionar a dicho individuo una composición de refuerzo compuesta de un adenovirus de replicación deficiente que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg, Lassa, retrovirus, paramixovirus o influenza, o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un adenovirus de replicación deficiente tomado de la Tabla 2 o su inserto, o un análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, para producir dicho antígeno por expresión de dicho adenovirus de replicación deficiente, de modo que se refuerce una respuesta inmunitaria al antígeno previamente cebado en el individuo.
5. Un método para reforzar una respuesta inmunitaria a un antígeno en un individuo, que comprende proporcionar a dicho individuo una composición de refuerzo compuesta de un adenovirus de replicación deficiente que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa, o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un adenovirus de replicación deficiente tomado de la Tabla 2 o su inserto, o un análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, para producir dicho antígeno por expresión de dicho adenovirus de replicación deficiente, de modo que se refuerce una respuesta inmunitaria al antígeno previamente cebado en el individuo.
6. Un método de refuerzo de una respuesta inmunitaria a un antígeno en un individuo que comprende proporcionar a dicho individuo una composición de refuerzo compuesta de una segunda construcción genética que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa, o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, o la glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa producida de forma recombinante o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es 95% idéntico con el mismo, para producir dicho antígeno por expresión de dicho adenovirus de replicación deficiente, en el que la segunda construcción genética se toma del grupo que consiste en adenovirus de replicación deficiente, virus vaccinia de replicación deficiente, virus de viruela aviar recombinante y herpesvirus recombinante, de modo que se refuerza una respuesta inmunitaria al antígeno previamente cebado en el individuo durante la producción de dicho antígeno por expresión de una primera construcción genética, y en el que la primera construcción genética se toma del grupo que consiste en ADN plasmídico, adenovirus de replicación deficiente, virus vaccinia de replicación deficiente, virus de viruela aviar recombinante y herpesvirus recombinante.
7. Un método para inducir una respuesta inmunitaria a un antígeno en un individuo que comprende proporcionar a dicho individuo una composición de cebado que comprende un plásmido de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg, Lassa, retrovirus, paramixovirus o influenza, o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un ADN plasmídico tomado de la Tabla 2 o su inserto o un análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo y después proporcionar a dicho individuo una composición de refuerzo compuesta de un adenovirus de replicación deficiente que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg, Lassa, retrovirus, paramixovirus o influenza, o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un adenovirus de replicación deficiente tomado de la Tabla 2 o su inserto, o un análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, para producir dicho antígeno por expresión de dicho plásmido de ADN y adenovirus de replicación deficiente, de modo que se refuerce una respuesta inmunitaria al antígeno previamente cebado en el individuo.
8. Un método para inducir una respuesta inmunitaria a un antígeno en un individuo que comprende proporcionar a dicho individuo una composición de cebado que comprende un plásmido de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa, o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un ADN plasmídico tomado de la Tabla 2 o su inserto, o un análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, y después proporcionar a dicho individuo una composición de refuerzo compuesta de un adenovirus de replicación deficiente que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa, o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un adenovirus de replicación deficiente tomado de la Tabla 2 o su inserto, o un análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, para producir dicho antígeno por expresión de dicho plásmido de ADN y adenovirus de replicación
deficiente, de modo que se refuerce una respuesta inmunitaria al antígeno previamente cebado en el individuo.
9. Un método para inducir una respuesta inmunitaria a un antígeno en un individuo que comprende proporcionar a dicho individuo una composición de cebado que comprende una primera construcción genética que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa, o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, y después proporcionar a dicho individuo una composición de refuerzo compuesta de una segunda construcción genética que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa, o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, o glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa producida de forma recombinante o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, en el que la primera construcción genética se coge del grupo que consiste en ADN plasmídico, adenovirus de replicación deficiente, virus vaccinia de replicación deficiente, virus de viruela aviar recombinante y herpesvirus recombinante, y en el que la segunda construcción genética se coge del grupo que consiste en adenovirus de replicación deficiente, virus vaccinia de replicación deficiente, virus de viruela aviar recombinante y herpesvirus recombinante, para producir dicho antígeno por expresión de dicha primera construcción genética y dicha segunda construcción genética, de modo que se refuerce una respuesta inmunitaria al antígeno previamente cebado en el individuo.
10. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Zaire o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
11. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Sudán o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
12. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Costa de Marfil o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
13. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Reston o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
14. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína de Marburg o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
15. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Zaire o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
16. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Sudán o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
17. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Costa de Marfil o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
18. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Reston o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
19. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína de Marburg o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
20. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Zaire o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína tiene una deleción interna o de carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana o el dominio intracelular.
21. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Sudán o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína tiene una deleción interna o de carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana o el dominio intracelular.
22. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Costa de Marfil o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína tiene una deleción interna o de carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana o el dominio intracelular.
23. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Reston o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína tiene una deleción interna o de carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana o el dominio intracelular.
24. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína de Marburg o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína tiene una deleción interna o de carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana o el dominio intracelular.
25. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Zaire o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de anclaje de tranmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular.
26. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Sudán o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular.
27. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Costa de Marfil o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular.
28. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Reston o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular.
29. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína de Marburg o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular.
30. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Zaire o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
31. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Sudán o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
32. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Costa de Marfil o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
33. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Reston o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
34. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína de Marburg o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al
mismo.
35. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Zaire o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
36. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Sudán o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
37. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Costa de Marfil o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
38. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Reston o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
39. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína de Marburg o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al
mismo.
40. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Zaire o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína tiene una deleción interna o carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana o el dominio intracelular.
41. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Sudán o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína tiene una deleción interna o carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana o el dominio intracelular.
42. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Costa de Marfil o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína tiene una deleción interna o carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana o el dominio intracelular.
43. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Reston o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína tiene una deleción interna o carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana o el dominio intracelular.
44. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína de Marburg o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína tiene una deleción interna o carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana o el dominio intracelular.
45. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Zaire o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular.
46. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Sudán o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular.
47. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Costa de Marfil o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular.
48. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Reston o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de anclaje de transmembrana o intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular.
49. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la nucleoproteína de Marburg o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular.
50. VRC6000 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6000.
51. VRC6001 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6001.
52. VRC6002 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6002.
53. VRC6003 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6003.
54. VRC6004 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6004.
55. VRC6005 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6005.
56. VRC6006 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6006.
57. VRC6007 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6007.
58. VRC6008 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6008.
59. VRC6052 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6052.
60. VRC6101 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6101.
61. VRC6110 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6110.
62. VRC6200 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6200.
63. VRC6201 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6201.
64. VRC6202 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6202.
65. VRC6300 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6300.
66. VRC6301 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6301.
67. VRC6302 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6302.
68. VRC6303 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6303.
69. VRC6310 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6310.
70. VRC6351 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6351.
71. VRC6400 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6400.
72. VRC6401 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6401.
73. VRC6500 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6500.
74. VRC6600 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6600.
75. VRC6601 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6601.
76. VRC6602 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6602.
77. VRC6603 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6603.
78. VRC6604 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6604.
79. VRC6701 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6701.
80. VRC6702 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6702.
81. VRC6710 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6710.
82. VRC6800 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6800.
83. VRC6801 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6801.
84. VRC6810 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6810.
85. VRC6811 o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2 es VRC6811.
86. CMV/R Ebola GP(Z) deltaTM/h (codón optimizado) o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o el adenovirus de replicación deficiente tomado de la Tabla 2 es CMV/R Ebola GP(Z) deltaTM/h (codón optimizado).
\newpage
87. pVR1012 Ebola GP (Z, P87666) deltaTM/h (codón optimizado) o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o el adenovirus de replicación deficiente tomado de la Tabla 2 es pVR1012 Ebola GP (Z, P87666) delta TM/h (codón optimizado).
88. CMV/R Ebola GP(S/Gulu) delta TM/h (codón optimizado) (codón optimizado) o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o el adenovirus de replicación deficiente tomado de la Tabla 2 es CMV/R Ebola GP (S/Gulu) delta TM/h (codón optimizado).
89. CMV/R Ebola GP (S,Q66798) delta TM/h (codón optimizado) (codón optimizado) o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o el adenovirus de replicación deficiente tomado de la Tabla 2 es CMV/R Ebola GP (S,Q66798) delta TM/h (codón optimizado).
90. VRC6802, pVR1012x/s Lassa delta TM/h (codón optimizado) o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o el adenovirus de replicación deficiente tomado de la Tabla 2 es VRC6802, pVR1012x/s Lassa (codón optimizado).
91. VRC6703, pVR1012x/s Marburg delta TM/h (codón optimizado) o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o el adenovirus de replicación deficiente tomado de la Tabla 2 es VRC6703, pVR1012x/s Marburg (codón optimizado).
92. CMV/R Ebola NP o una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o el adenovirus de replicación deficiente tomado de la Tabla 2 es CMV/R Ebola NP.
93. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que la composición de cebado o refuerzo se administra por vía intramuscular.
94. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que la composición de refuerzo se administra aproximadamente 2-3 semanas, o 4 semanas, u 8 semanas, o 16 semanas, o 20 semanas, o 24 semanas, o 32 semanas después de la administración de la composición de cebado.
95. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que la composición de cebado o refuerzo se administra combinada con un adyuvante.
96. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que la composición de cebado o refuerzo se administra combinado con una citoquina o ácido nucleico que codifica a la misma.
97. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN se administra con una dosis de 10 microgramos a 50 miligramos/inyección.
98. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que el adenovirus de replicación deficiente se administra con una dosis de 5x10^{7} a 1x10^{12} partículas/inyección.
99. Una composición o procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el que la composición de cebado o refuerzo está compuesta además del mismo o diferente plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una segunda glicoproteína o nucleoproteína de Ébola o dominio del mismo que lleva epítopo o análogo del mismo, que es al menos 95% idéntico al mismo, y en el que la segunda glicoproteína o nucleoproteína de Ébola es diferente de la primera.
\vskip1.000000\baselineskip
Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el autor de la solicitud es sólo para la conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido mucho cuidado al recopilar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza cualquier responsabilidad en este aspecto.
Documentos de patente citados en la descripción
US 4631211 A, Houghten
US 1986 A
US 60326476 B
Bibliografía de no patentes citada en la descripción
PETERS, C.J. y col. Fields Virology. Lippincott-Raven, 1996, 1161-1176
PETERS, C.J. y col. Semin. Virol., 1994, vol. 5, 147-154
SÁNCHEZ, A. y col. PNAS USA, 1996, vol. 93, 3602-3607
CLEGG, J.C.S. y col. New Generation Vaccines. Marcel Dekker, Inc, 1997, 749-765
JAHRLING, P.B. y col. Arch Virol Suppl, 1996, vol. 11, 135-140
FELDMANN, H. y col. Virology, 1994, vol. 199, 469-473
Genes II. John Wiley & Sons, 1985
SMITH; WATERMAN. Advances in Applied Mathematics, 1981, vol. 2, 482-489
BOWIE, J. U. y col. Science, 1990, vol. 247, 1306-1310
BOWIE, J.U. y col. Science, 1990, vol. 247, 1306-1310
CUNNINGHAM; WELLS. Science, 1989, vol. 244, 1081-1085
SMITH; JOHNSON. Gene, 1988, vol. 67, 31-40
HOUGHTEN, R.A. PNAS USA, 1985, vol. 82, 5131-5135
GRAHAM; PREVEC. Mol. Biotechnol., 1995, vol. 3, 207-20
BETT y col. PNAS USA, 1994, vol. 91, 8802-6
JACOBS y col. J Virol, 1992, vol. 66, 2086-95
FOOKS y col. Virology, 1995, vol. 210, 456-65
MAYR y col. Zentralbl. Bakteriol., 1978, vol. 167, 375-90
SUTTER; MOSS. PNAS USA, 1992, vol. 89, 10847-51
SUTTER y col. Vaccine, 1994, vol. 12, 1032-40
TARTAGLIA y col. Virology, 1992, vol. 118, 217-32
KANAPOX; PAOLETTI y col. Dev. Biol. Stand., 1994, vol. 82, 65-9
SAMBROOK y col. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989
Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1994.
Remington's Pharmaceutical Sciences. 1980
TANG, D.C. y col. Nature, 1992, vol. 356, 152-154
ULMER, J.B. y col. Science, 1993, vol. 259, 1745-1749
WANG, B. y col. PNAS USA, 1993, vol. 90, 4156-4160
SEDEGAH, M. y col. PNAS USA, 1994, vol. 91, 9866-9870
KRIEG, A.M. y col. Nature, 1995, vol. 374, 546-549
SATO, Y. y col. Science, 1996, vol. 273, 352-354
XU, L. y col. Nat. Med., 1998, vol. 4,7-42
VANDERZANDEN, L. y col. Virology, 1998, vol. 246, 134-144
CONNOLLY, B.M. y col. J Infect Dis, vol. 179, S203-S217
BRAY, M. y col. J. Infect. Dis., 1998, vol. 178, 651-661
XU, L. y col. Nat. Med., 1998, vol. 4, 37-42
BAIZE, S. y col. Nat. Med., 1999, vol. 5, 423-426
MARUYAMA, T. y col. J. Virol, 1999, vol. 73, 6024-6030
SEDEGAH, M. y col. PNAS USA, 1998, vol. 95, 7648-7653
HANKE, T. y col. Vaccine, 1998, vol. 16, 439-445
ROBINSON, H.L. y col. Nat. Med., 1999, vol. 5, 526-534
SCHNEIDER, J. y col. Nat. Med., 1998, vol. 4,397-402
DAVIS, A.R y col. PNAS USA, 1985, vol. 82, 7560-7564
NATUK, R.J. y col. PNAS USA, 1992, vol. 89, 7777-7781
XIANG, Z.Q. y col. Virology, 1996, vol. 219,220-227
XIANG, Z.Q. y col. J. Immunol., 1999, vol. 162, 6716-6723
CONNOLLY, B.M. y col. J. Infect. Dis., 1999, vol. 179, S203-S217
LETVIN, N.L. y col. PNAS USA, 1997, vol. 94, 9378-9383
FISHER-HOCH, S.P. y col. J. Infect. Dis., 1985, vol. 152, 887-894
WILSON, J. y col. Science, 2000, vol. 287,1664-1666
OHNO, T. y col. Science, 1994, vol. 265, 781-784
AOKI, K. y col. Mol. Med., 1999, vol. 5,224-231
KSIAZEK, T.G. y col. J. Clin. Microbiol., 1992, vol. 30, 947-950
ZAIRE. isolate; Mayinga strain, 1976
KILEY, M.P. y col. J. Gen. Virol., 1980, vol. 49,333-341
XU y col. Nalure Med., 1998, vol. 4, 37-42
TAKEBE y col. Mol. Cell Biol., 1988, vol. 8, 466-472
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> El Gobierno de los Estados Unidos representado por el secretario de Salud y Servicios Humanos
\hskip1cm
NABEL, GARY 
\hskip1cm
YANG, ZHI-YONG 
\hskip1cm
SULLIVAN, NANCY 
\hskip1cm
SANCHEZ, ANTHONY 
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Desarrollo de una vacuna preventiva para la infección por filovirus en primates
\vskip0.400000\baselineskip
<130> K1565EP/1 S3
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/326476
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2001-10-01
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7154
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012-GP(Z)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
9
10
11 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7188
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012x/s Ebola GP(Z)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
12
13
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6624
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012-GP(Z) delta MUC
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
15
16 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6561
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012-GP(Z) deltaMUC delta FUR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
17
18 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6724
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012-GP(Z) delta GP2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
19
20
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6887
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012-GP(Z) delta GP2 delta C-term A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
22
23
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7044
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012-GP(Z) delta GP2 Delta C-term B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
25
26
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7106
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012-GP(Z) delta GP2 delta FUS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
28
29
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6914
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012-GP(Z) delta TM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
31
32
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6467
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012-GP(Z) delta SGP
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
34
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6913
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012x/s Ebola GP(R)(dTM)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
36
37 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8131
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pAdApt Ebola GP(R)(dTM)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
39
40
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7082
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012-GP(S)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
42
43
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7087
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012x/s Ebola GP(S)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
45
46 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6940
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012-GP(S) delta TM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
48
49
50 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7002
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012-GP(IC)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
51
52
53 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7036
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012 x/s Ebola GP(IC)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
54
55
56 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6885
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012-GP(IC) delta TM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
57
58
59 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6889
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012x/s Ebola GP(IC)(dTM)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
60
61
62 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8146
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pAdApt EbolaGP(IC)(dTM)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
63
64
65 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7023
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012x/s-SGP(IC)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
650
66
67 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7295
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012-NP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
68
69
70 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7329
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012x/s Ebola-NP
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
71
72
73 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6148
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012-VP35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
74
75
76 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10783
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pAD/CMV-GP(dTM)(Z-CITE-S)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
77
78
79
80 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8338
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pAdApt Ebola GP(S)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
81
82
83 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pAdApt Ebola GP(S)(dTM)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
84
85
86 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8439
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pAdApt Ebola GP(Z)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
87
88
89 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8199
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pAdApt Ebola GP(Z)(dTM)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
91
92
93 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7778
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012 Marburg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
94
95
96 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7005
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012x/s Marburg GP(dTM)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
97
98
99 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8256
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pAdApt Marburg GP(dTM)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
100
101
102 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6447
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012x/s Lassa GP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
103
104
105 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6258
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012x/s Lassa GP(dTM)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
106
108 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7711
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pAdApt Lassa GP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
109
110
111
112 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7522
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pAdApt Lassa GP(dTM)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
113
114
115 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6324
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CMV/R Ebola GP(Z) delta TM/h
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
116
117
118 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6868
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012x/s Ebola GP(Z) delta TM/h (P87666)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
119
120
121 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CMV/R-GP(S/G)(deltaTM)/h
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
122
123
124 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6324
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CMV/R-GP(S,Q66798)(dTM)/h
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
125
126
127 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6236
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012x/s Lassa (codón optimizado)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
128
129
130 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6902
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012x/s Marburg (codón optimizado)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
131
132
133 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6625
\vskip0.400000\baselineskip
<212>ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CMV/R Ebola NP
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
134
136 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de GP de Ébola de Sudán
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm
137 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de GP de Ébola de Sudán
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip1cm
138 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de GP de Ébola de Costa de Marfil
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\hskip1cm
139 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de GP de Ébola de Costa de Marfil
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\hskip1cm
140 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Ébola
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\hskip1cm
141 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Ébola
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\hskip1cm
142 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Ébola
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\hskip1cm
143 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Ébola
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\hskip1cm
144 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1087
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia de potenciador/promotor de CMV, región R (HTVL-1), aceptor de religación CMV IE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
145

Claims (7)

1. Un vector de expresión que comprende el ID SEC Nº 52 o un análogo del mismo que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95, 96, 97, 98, 99 ó 100% con el mismo que media la expresión, en el que el porcentaje de identidad se calcula a lo largo de la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia.
2. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que el % de identidad es 95.
3. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que el % de identidad es 96.
4. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que el % de identidad es 97.
5. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que el % de identidad es 98.
6. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que el % de identidad es 99.
7. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que el % de identidad es 100.
ES05013732T 2001-10-01 2002-09-24 Desarrollo de un vacuna preventiva para la infeccion por filovirus en primates. Expired - Lifetime ES2307093T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32647601P 2001-10-01 2001-10-01
US326476 2001-10-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2307093T3 true ES2307093T3 (es) 2008-11-16

Family

ID=23272371

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES05013732T Expired - Lifetime ES2307093T3 (es) 2001-10-01 2002-09-24 Desarrollo de un vacuna preventiva para la infeccion por filovirus en primates.

Country Status (9)

Country Link
US (5) US7635688B2 (es)
EP (1) EP1504112A4 (es)
JP (2) JP2005508916A (es)
AT (1) ATE396739T1 (es)
AU (1) AU2002327049B2 (es)
CA (4) CA2776522C (es)
DE (1) DE60226911D1 (es)
ES (1) ES2307093T3 (es)
WO (1) WO2003028632A2 (es)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1654370T3 (en) * 2003-08-01 2018-08-20 Government Of The Us Secretary Department Of Health And Human Services ACCELERATED EBOLA VACCINATION
CN1913919B (zh) * 2003-09-15 2011-10-19 美国政府健康及人类服务部 基于hiv多进化枝的env的hiv疫苗
WO2005080556A2 (en) 2004-02-23 2005-09-01 Crucell Holland B.V. Virus purification methods
US7504243B2 (en) 2004-03-19 2009-03-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods for the production of biliverdin
WO2005110492A2 (en) * 2004-04-12 2005-11-24 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method of using adenoviral vectors to induce an immune response
US20090214588A1 (en) * 2004-07-16 2009-08-27 Nabel Gary J Vaccines against aids comprising cmv/r-nucleic acid constructs
CA2581840C (en) 2004-09-27 2014-08-05 Crucell Holland B.V. Optimized vaccines to provide protection against ebola and other viruses
DE602006003420D1 (de) 2005-04-11 2008-12-11 Crucell Holland Bv Virusreinigung mit ultrafiltration
EP1877087B1 (en) 2005-04-15 2013-02-20 GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Methods and compositions for producing an enhanced immune response to a human papillomavirus immunogen
US20070185025A1 (en) * 2005-09-11 2007-08-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Filoviral immunosuppressive peptides and uses thereof
US7947286B2 (en) * 2005-10-07 2011-05-24 Panthera Biopharma Llc Drosophila cell lines producing recombinant secretable filovirus surface glycoproteins lacking the membrane spanning domain
CN101484466A (zh) * 2006-02-16 2009-07-15 美国国有健康与人类服务部(马里兰州) 针对流感病毒的抗病毒剂和疫苗
EP2152889B1 (en) 2007-05-29 2017-03-15 Nature Technology Corporation Vectors and methods for genetic immunization
WO2009092038A1 (en) * 2008-01-16 2009-07-23 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Influenza dna vaccination and methods of use thereof
BRPI0914847A2 (pt) 2008-06-20 2020-12-15 Basf Se Formulação agroquímica, processo para a preparação da composição, kit de partes, usos de uma mistura de um filtro fotoprotetor orgânico, e da formulação agroquímica, e, métodos para combater insetos prejudiciais e/ou de fungos fitopatogênicos, e para controlar vegetação indesejada
WO2010048615A2 (en) 2008-10-24 2010-04-29 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services, Center For Disease Control And Prevention Human ebola virus species and compositions and methods thereof
US9339480B2 (en) 2008-11-26 2016-05-17 Satiogen Pharmaceuticals, Inc. Bile acid recycling inhibitors for treatment of obesity and diabetes
EP2370455B1 (en) 2008-11-26 2019-07-03 Government of the United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Virus like particle compositions and methods of use
WO2010096561A1 (en) 2009-02-18 2010-08-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Synthetic hiv/siv gag proteins and uses thereof
US20120219584A1 (en) 2009-10-05 2012-08-30 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health Protection against pandemic and seasonal strains of influenza
US9125411B2 (en) 2010-04-15 2015-09-08 Basf Se UV absorbers for reducing the E/Z isomerization of pesticides
TR201902214T4 (tr) 2010-04-16 2019-03-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Şempanze adenoviral vektörü-bazlı filovirüs aşıları.
US20110294767A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Satiogen Pharmaceuticals, Inc. Bile acid recycling inhibitors and satiogens for treatment of diabetes, obesity, and inflammatory gastrointestinal conditions
DK2655604T3 (en) * 2010-12-14 2018-08-06 Us Gov Health & Human Services ADENOVIRUS SEROTYPE-26- AND SEROTYPE-35-FILOVIRUS VACCINES
US9402891B2 (en) * 2011-06-08 2016-08-02 Ohio State Innovation Foundation Norovirus immunogens and related materials and methods
AU2012321315B2 (en) * 2011-07-11 2016-04-14 Inovio Pharmaceuticals, Inc Cross-protective arenavirus vaccines and their method of use
WO2013044203A2 (en) 2011-09-23 2013-03-28 THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPTARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES Novel influenza hemagglutinin protein-based vaccines
ES2633766T3 (es) 2011-10-28 2017-09-25 Lumena Pharmaceuticals Llc Inhibidores de reciclaje de ácido biliar para el tratamiento de enfermedades de hígado colestático pediátrico
AU2012328453B2 (en) 2011-10-28 2017-05-04 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Bile acid recycling inhibitors for treatment of hypercholemia and cholestatic liver disease
CA3194125A1 (en) * 2012-04-12 2013-10-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Filovirus consensus antigens, nucleic acid constructs and vaccines made therefrom, and methods of using same
CN105792842B (zh) 2013-10-11 2020-06-02 美利坚合众国, 由健康及人类服务部部长代表 埃巴病毒疫苗
TWI516602B (zh) 2013-10-29 2016-01-11 臺北醫學大學 高通量篩選高表現細胞之方法及由其篩選之細胞
WO2015183969A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Stabilized influenza hemagglutinin stem region trimers and uses thereof
CN106999565B (zh) * 2014-09-03 2021-03-05 巴法里安诺迪克有限公司 重组修饰的痘苗病毒安卡拉(mva)丝状病毒疫苗
KR102713707B1 (ko) 2014-12-31 2024-10-04 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 신규 다가 나노입자 기반 백신
CA2974114A1 (en) * 2015-01-28 2016-08-04 Integrated Biotherapeutics, Inc. Equine immunoglobulin compositions and uses for treating filovirus-mediated diseases
JP7099956B2 (ja) 2015-12-04 2022-07-12 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド がんの治療のためのｍｉｃａ／ｂアルファ３ドメインによるワクチン接種
US11459619B2 (en) 2016-02-08 2022-10-04 The Johns Hopkins University Handheld nucleic acid-based assay for rapid identification
IL303650B2 (en) 2016-09-02 2025-02-01 Us Health Stable group 2 trimers from the stem region of influenza hemagglutinin and their uses
WO2019028266A1 (en) 2017-08-02 2019-02-07 The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services HEPATITIS B NANOPARTICLE VACCINE FOR INFLUENZA VIRUS
CA3100070A1 (en) * 2018-05-18 2019-11-21 Universite Laval Vectors for dna vaccination
WO2020163719A2 (en) 2019-02-08 2020-08-13 The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Nanoparticle-based influenza virus vaccines and uses thereof
WO2024138204A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Stabilized pfs48/45 proteins and uses thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6171596B1 (en) * 1993-12-10 2001-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligomeric HIV-1 envelope glycoproteins
US6027881A (en) 1996-05-08 2000-02-22 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Mutant Aequorea victoria fluorescent proteins having increased cellular fluorescence
US6200959B1 (en) * 1996-12-04 2001-03-13 Powerject Vaccines Inc. Genetic induction of anti-viral immune response and genetic vaccine for filovirus
WO1999032147A1 (en) * 1997-12-23 1999-07-01 The Regents Of The University Of Michigan Immunization for ebola virus infection
AU7089600A (en) 1999-08-30 2001-03-26 U.S. Army Medical Research Institute Of Infectious Diseases Monoclonal antibodies and vaccines against epitopes on the ebola virus glycoprotein

Also Published As

Publication number Publication date
US7094598B2 (en) 2006-08-22
US8124592B2 (en) 2012-02-28
CA2462455C (en) 2012-07-17
CA2776272C (en) 2016-05-17
US8106027B2 (en) 2012-01-31
CA2776522C (en) 2015-02-17
CA2776272A1 (en) 2003-04-10
US20100303857A1 (en) 2010-12-02
US20060148087A1 (en) 2006-07-06
US8106026B2 (en) 2012-01-31
CA2462455A1 (en) 2003-04-10
DE60226911D1 (de) 2008-07-10
WO2003028632A3 (en) 2004-12-02
US7635688B2 (en) 2009-12-22
CA2776391C (en) 2015-03-31
US20100298414A1 (en) 2010-11-25
US20040259825A1 (en) 2004-12-23
JP2006081549A (ja) 2006-03-30
CA2776522A1 (en) 2003-04-10
CA2776391A1 (en) 2003-04-10
EP1504112A2 (en) 2005-02-09
US20100297171A1 (en) 2010-11-25
EP1504112A4 (en) 2006-02-08
JP4198148B2 (ja) 2008-12-17
WO2003028632A2 (en) 2003-04-10
JP2005508916A (ja) 2005-04-07
AU2002327049B2 (en) 2008-04-03
ATE396739T1 (de) 2008-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2307093T3 (es) Desarrollo de un vacuna preventiva para la infeccion por filovirus en primates.
AU2002327049A1 (en) Development of a preventive vaccine for filovirus infection in primates
WO2003028632A9 (en) Development of a preventive vaccine for filovirus infection in primates
US9012618B2 (en) Nucleic acids encoding modified Ebola virus glycoproteins with diminished cytotoxicity while retaining native antigenic structures
EP2961846B1 (en) Crimean-congo haemorrhagic fever virus antigenic composition
ES2970797T3 (es) Métodos y composiciones para inducir inmunidad protectora contra infección por filovirus
WO2017102929A1 (en) Human immunodeficiency virus antigens, vectors, compositions, and methods of use thereof
US20200171141A1 (en) Compositions and Methods for Generating an Immune Response to LASV
EP1586331B1 (en) Development of a preventive vaccine for filovirus infection in primates
AU2005244541B2 (en) Development of a preventative vaccine for filovirus infection in primates
CA2519282C (en) Development of a preventive vaccine for filovirus infection in primates