ES2307093T3 - Desarrollo de un vacuna preventiva para la infeccion por filovirus en primates. - Google Patents
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Abstract
Un vector de expresión que comprende el ID SEC Nº 52 o un análogo del mismo que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95, 96, 97, 98, 99 ó 100% con el mismo que media la expresión, en el que el porcentaje de identidad se calcula a lo largo de la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia.
Description
Desarrollo de una vacuna preventiva para la
infección por filovirus en primates.
La presente invención se refiere a un vector de
expresión que comprende el ID SEC Nº: 52 o un análogo del mismo que
tiene al menos una identidad de secuencia de 95, 96, 97, 98, 99 o
100% con el que media la expresión, en el que el porcentaje de
identidad se calcula a lo largo de la longitud completa de la
secuencia de nucleótidos de referencia.
Los virus de Ébola y los virus genéticamente
relacionados de Marburg, son filovirus asociados con brotes de
fiebre hemorrágica muy letales en seres humanos y primates en
América del Norte, Europa y África (Peters, C.J. y col. en:
Fields Virology, eds. Fields, B.N. y col.
1161-1176, Philadelphia,
Lippincott-Raven, 1996; Peters, C.J. y col., 1994,
Semin. Virol. 5:147-154). Los virus de Ébola
son virus de ARN de cadena negativa compuestos de cuatro subtipos,
que incluyen los descritos en los episodios de Zaire, Sudán, Reston
y Costa de Marfil (Sanchez, A. y col., 1996, PNAS USA
93:3602-3607). Aunque se han definido varios
subtipos, la organización genética de estos virus es similar y cada
uno contiene siete genes ordenados linealmente. Entre las proteínas
víricas, la glicoproteína de la envuelta existe en dos formas
alternativas, una proteína segregada de 50-70
kilodalton (kDa) de función desconocida codificada por el genoma
vírico y una glicoproteína de transmembrana de 130 kDa generada por
preparación del ARN que media la entrada vírica (Peters, C.J. y col.
en: Fields Virology, eds. Fields, B.N. y col.
1161-1176, Philadelphia,
Lippincott-Raven, 1996; Sanchez, A. y col., 1996,
PNAS USA 93:3602-3607). Otros productos de
genes estructurales incluyen la nucleoproteína (NP), proteínas de
matriz VP24 y VP40, proteínas supuestamente no estructurales VP30 y
VP35 y la polimerasa vírica (revisado por Peters, C.J. y col. en:
Fields Virology, eds. Fields, B.N. y col.
1161-1176, Philadelphia,
Lippincott-Raven, 1996). Aunque la variación
espontánea de su secuencia de ARN ocurre en la naturaleza, parece
que hay menos polimorfismo de nucleótidos con los subtipos de Ébola
que entre otros virus de ARN (Sanchez, A. y col., 1996, PNAS
USA 93:3602-3607), lo que sugiere que la
inmunización puede ser útil en la protección contra estas
enfermedades. Sin embargo, los intentos previos de provocar
respuestas inmunitarias protectoras contra el virus de Ébola usando
procedimientos de inmunización activa y pasiva tradicionales no han
tenido éxito en primates (Peters, C.J. y col. en: Fields
Virology, eds. Fields, B.N. y col. 1161-1176,
Philadelphia, Lippincott-Raven, 1996; Clegg, J.C.S.
y col., 1997, New Generation Vaccines, eds.: Levine, M.M. y
col. 749-765, New York, NY. Marcel Dekker, Inc.;
Jahrling, P.B. y col., 1996, Arch. Virol. Suppl
11:135-140). Por lo tanto, sería conveniente
proporcionar una vacuna que provocara una respuesta inmunitaria
contra un filovirus o enfermedad causada por la infección por el
filovirus. Por lo tanto, sería conveniente proporcionar
procedimientos para hacer y usar dicha vacuna.
Los brotes de fiebre hemorrágica causada por el
virus de Ébola están asociados con tasas de mortalidad altas que
son una característica que diferencia a este patógeno humano. La
alta letalidad está asociada con el subtipo de Zaire, una de cuatro
cepas identificadas hasta ahora (Feldmann, H. y col., 1994,
Virology 199:469-473; Sanchez, A. y col.,
1996, PNAS USA 93:3602-3607). Su rápida
evolución deja pocas oportunidades para desarrollar la inmunidad
natural y actualmente no hay una terapia antivírica eficaz. Por lo
tanto, la vacunación ofrece una intervención prometedora para
prevenir y limitar la propagación. Se describe aquí una estrategia
de vacuna altamente eficaz para la infección por el virus de Ébola
en primates. Una combinación de inmunización por ADN y refuerzo con
vectores adenovíricos que codifican las proteínas víricas generaba
inmunidad celular y humoral en macacos cynomolgus. La estimulación
con una dosis letal de la cepa de tipo salvaje altamente patógena,
Mayinga 1976, del virus de Ébola de Zaire dio como resultado una
infección uniforme en los controles, que evolucionaron a un estado
moribundo y muerte en menos de una semana. En comparación, todos los
animales vacunados fueron asintomáticos durante más de seis meses,
sin virus detectable después de la estimulación inicial. Estos
descubrimientos demuestran que se puede desarrollar una vacuna
preventiva contra la infección por el virus de Ébola en
primates.
la fig. 1 muestra el mapa de construcción de
VRC6000 (pVR1012-GP(Z)) (véase, Plásmidos de
Ebola/Marburg/
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 2 muestra el mapa de construcción de
VRC6001 (pVR1012x/s-GP(Z)) (véase, Plásmidos
Ebola/Marburg/
Lassa, Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
Lassa, Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 3 muestra el mapa de construcción de
VRC6002 (pVR1012-GP(Z) delta MUC) (véase,
Plásmidos de Ebola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la
Tabla 2).
la fig. 4 muestra el mapa de construcción de
VRC6003 (pVR1012-GP(Z) delta MUC delta FUR)
(véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa y Adenovirus recombinantes
en la Tabla 2).
la fig. 5 muestra el mapa de construcción de
VRC6004 (pVR1012-GP(Z) delta GP2) (véase,
Plásmidos de Ebola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la
Tabla 2).
\global\parskip0.890000\baselineskip
la fig. 6 muestra el mapa de construcción de
VRC6005 (pVR1012-GP(Z) delta GP2 delta
C-term A) (véase, Plásmidos de Ebola/Marburg/Lassa,
y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 7 muestra el mapa de construcción de
VRC6006 (pVR1012-GP(Z) delta GP2 delta
C-term B) (véase, Plásmidos de Ebola/Marburg/Lassa,
y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 8 muestra el mapa de construcción de
VRC6007 (pVR1012-GP(Z) delta GP2 delta FUS)
(véase, Plásmidos de Ebola/Marburg/Lassa y Adenovirus recombinantes
en la Tabla 2).
la fig. 9 muestra el mapa de construcción de
VRC6008 (pVR1012-GP(Z) delta TM) (véase,
Plásmidos de Ebola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la
Tabla 2).
la fig. 10 muestra el mapa de construcción de
VRC6052 (pVR1012-GP(Z) delta SGP) (véase,
Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la
Tabla 2).
la fig. 11 muestra el mapa de construcción de
VRC6101 (pVR1012x/s Ebola GP(R) (dTM)) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 12 muestra el mapa de construcción deVRC
6110 (pAdApt Ebola GP(R) (dTM)) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 13 muestra el mapa de construcción de
VRC6200 (pVR1012-GP(S)) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 14 muestra el mapa de construcción de
VRC6201 (pVR1012x/s Ebola GP(S)) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 15 muestra el mapa de construcción de
VRC6202 (pVR1012-GP(S) delta TM) (véase,
Ebola/Marburg/Lassa Plasmid, y Adenovirus recombinantes en la Tabla
2).
la fig. 16 muestra el mapa de construcción de
VRC6300 (pVR1012-GP(IC)) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 17 muestra el mapa de construcción de
VRC6301 (pVR1012x/s-GP(IC)) (véase, Plásmidos
de Ébola/
Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 18 muestra el mapa de construcción de
VRC6302 (pVR1012-GP(IC) delta TM) (véase,
Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la
Tabla 2).
la fig. 19 muestra el mapa de construcción de
VRC 6303 (pVR1012x/s Ebola GP (IC) (dTM)) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 20 muestra el mapa de construcción de
VRC6310 (pAdApt Ebola GP (IC) (dTM)) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 21 muestra el mapa de construcción de
VRC6351 (pVR1012x/s-SGP(IC)) (véase,
Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la
Tabla 2).
la fig. 22 muestra el mapa de construcción de
VRC6400 (pVR1012-NP) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 23 el mapa de construcción de muestra
VRC6401 (pVR1012x/s=NP) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 24 muestra el mapa de construcción de
VRC6500 (pVR1012-VP35) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 25 muestra el mapa de construcción de
VRC6600
(pAD/CMV-GP(dTM)(Z-CITE-S))
(véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes
en la Tabla 2).
la fig. 26 muestra el mapa de construcción de
VRC6601 (pAdApt Ebola GP(S)) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 27 muestra el mapa de construcción de
VRC 6602 (pAdApt Ebola GP(S)(dTM)) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 28 muestra el mapa de construcción de
VRC6603 (pAdApt Ebola GP(Z)) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 29 muestra el mapa de construcción de
VRC6604 (pAdApt Ebola GP(Z)(dTM)) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 30 muestra el mapa de construcción de
VRC6701 (pVR1012-Marburg) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 31 muestra el mapa de construcción de
VRC6702 (pVR1012x/s Marburg GP (dTM)) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 32 muestra el mapa de construcción de
VRC 6710 (pAdApt Marburg GP (dTM)) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 33 muestra el mapa de construcción de
VRC6800 (pVR1012x/s Lassa GP) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 34 muestra el mapa de construcción de
VRC6801 (pVR1012x/s Lassa GP (dTM) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 35 muestra el mapa de construcción de
VRC6810 (pAdApt Lassa GP) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 36 muestra el mapa de construcción de
VRC6811 (pAdApt Lassa GP (dTM)) (véase, Plásmidos de
Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 37 muestra el mapa de construcción de
CMV/R Ebola GP (Z) delta TM/h (codón optimizado) (véase, Plásmidos
de Ebola/Marburg/Lassa y Adenovirus recombinantes en la Tabla
2).
la fig. 38 muestra el mapa de construcción de
pVR1012 Ebola GP (Z, P87666) delta TM/h (codón optimizado) (véase,
Plásmidos de Ebola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la
Tabla 2).
la fig. 39 muestra el mapa de construcción de
CMV/R Ebola GP (S/Gulu) delta TM/h (codón optimizado) (véase,
Plásmidos de Ébola/Marburg/ Lassa, y Adenovirus recombinantes en la
Tabla 2).
la fig. 40 muestra el mapa de construcción de
CMV/R Ebola GP (S,Q66798) delta TM/h (codón optimizado) (véase,
Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la
Tabla 2).
la fig. 41 muestra el mapa de construcción de
VRC6802, pVR1012x/s Lassa delta TM/h (codón optimizado) (véase,
Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la
Tabla 2).
la fig. 42 muestra el mapa de construcción de
VRC6703, pVR1012x/s Marburg delta TM/h (codón optimizado) (véase,
Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y Adenovirus recombinantes en la
Tabla 2).
la fig. 43 muestra el mapa de construcción de
CMV/R Ebola NP (véase, Plásmidos de Ébola/Marburg/Lassa, y
Adenovirus recombinantes en la Tabla 2).
la fig. 44 es una representación en diagrama de
las moléculas de glicoproteína secretada (SGP) y glicoproteína (GP)
del virus Ébola (especie de Zaire aislada en 1976) que muestra
importantes características estructurales. Las regiones
N-terminales en blanco de SGP y GP corresponden a
secuencias idénticas (compartidas), mientras que los extremos C en
negro identifican secuencias únicas de las moléculas GP o SGP. Los
sitios de escisión de la signalasa comunes tanto para SGP como para
GP y el sitio de escisión de furina para GP0 (forma no escindida de
GP) (\downarrow) se determinaron por secuenciación
N-terminal. También se muestran los restos de
cisteína (S), sitios de glicosilación unidos a N previstos
(proyecciones con forma de Y), un péptido de fusión previsto, una
secuencia repetida de héptadas y una secuencia de anclaje de
transmembrana. En el virus de Ébola, las posiciones de estas
estructuras son conservadas y sus secuencias son muy similares o, en
el caso de los sitios de glicosilación unidos a N, están al menos
concentradas en la región central de GP. El sitio de escisión de la
signalasa es el ID SEC Nº: 48, el sitio de escisión de la furina es
el ID SEC Nº: 49 y el péptido de fusión es el ID SEC Nº: 50.
la fig. 45 es una representación en diagrama de
la GP estructural. Se muestra la orientación prevista del
heterodímero GP1-GP2 unido por enlace disulfuro
indeterminado (indicado por la marca de pregunta). Los enlaces de
disulfuro intramoleculares que se muestran vienen de predicciones
previas basadas en similitudes con estructuras de glicoproteínas de
retrovirus. Véase la figura 44 para otras características de la
secuencia de aminoácidos.
\global\parskip1.000000\baselineskip
la fig. 46 muestra la inducción de los efectos
citopáticos por las glicoproteínas del virus de Ébola y mapa de los
determinantes moleculares de citopaticidad.
la fig. 47 muestra las respuestas de anticuerpo
específicas de Ébola generadas por diferentes combinaciones de
cebado/refuerzo con ADN/adenovirus: los datos son las medias de la
dilución de punto final recíproca para cada grupo de ratones y las
barras de error representan la desviación típica.
la fig. 48 muestra la inmunización con
ADN-adenovirus de macacos cynomolgus. A) Programa de
inmunización para las inyecciones de ADN y/o adenovirus y
estimulación con la cepa Mayinga salvaje del subtipo de Zaire del
virus de Ébola. B) Titulaciones por Elisa de los anticuerpos
específicos de Ébola en el suero. El suero se recogió en la semana
12 (barras blancas) y 2 días antes de la inmunización en la semana
24 (barras negras). C) Respuestas linfoproliferativas a la
glicoproteína secretada (SGP) de Ébola después de inmunización. Las
barras representan el número medio de veces de proliferación de las
cuatro muestras de sangre de cada sujeto. La desviación típica no se
muestra porque el nivel del valor inicial de inducción variaba entre
experimentos. Sin embargo, las CMSP de los 8 animales se ensayaron
en el mismo experimento para cada punto de tiempo y las medias
presentadas en la figura son representativas de los resultados
obtenidos para cualquier punto de tiempo individual. D) Respuestas
linfoproliferativas a SGP de Ébola en CMSP en masa después de
reducción de los subconjuntos de linfocitos. Las CMSP de la semana
24 se trataron con perlas magnéticas Dynal recubiertas con el
anticuerpo indicado para reducir los subconjuntos de células
CD4^{+} o CD8^{+}. Las células que quedaban después de la
reducción se normalizaron respecto a la entrada del número de
células y se estimularon como se describe en el Ejemplo. Los
resultados se muestran para dos controles (sujetos 2 y 3) y 2 monos
vacunados (sujetos 6 y 7).
la fig. 49 muestra la protección de los macacos
cynomolgus contra la estimulación letal con virus de Ébola después
de inmunización con ADN-virus. A, B) Niveles de
enzimas hepáticas en monos después de la estimulación con virus de
Ébola. Los niveles de enzimas hepáticas [alanina aminotransferasa
(ALT) y aspartato aminotransferasa (AST)] en el suero de primates no
humanos se midieron por procedimientos estándar recomendados usando
el disco reactivo 12 de química general para el analizador
Piccolo^{TM} (Abaxis, Inc., Sunnyvale, CA). Los resultados se
muestran para cuatro monos inmunizados (símbolos negros) y cuatro de
control (símbolos blancos). C) Viremia del plasma en monos después
de infección con el virus de Ébola. Las cruces representan tiempo de
la muerte en los animales de control [días 5 (sujeto 1) y 6 (sujetos
2 y 4)]. Se practicó la eutanasia en un animal de control, sujeto 3,
el día 7 cuando estaba moribundo. En un animal vacunado que era
resistente a la infección, sujeto 5, se practicó la eutanasia el día
10 para el examen histológico de los tejidos. El día 17 ninguno de
los animales tenía viremia detectable, y permanecieron sin viremia
durante la duración del periodo de observación (6 meses). Los datos
son el inverso de la dilución de punto final del suero para cada
mono. Se muestran los resultados para cuatro monos inmunizados
(símbolos negros) y cuatro de control (símbolos blancos).
la fig. 50 muestra la expresión potenciada del
vector de expresión de CMV modificado, CMV/R.
la fig. 51 muestra la inmunogenicidad potenciada
del vector de expresión de CMV modificado, CMV/R, en ratones.
La presente invención proporciona un vector de
expresión que comprende el ID SEC Nº: 52 o un análogo del mismo que
tiene al menos una identidad de secuencia de 95, 96, 97, 98, 99 o
100% con el que media la expresión, en el que el porcentaje de
identidad se calcula a lo largo de la longitud completa de la
secuencia de nucleótidos de referencia. Además, en el presente
documento se describen vacunas de filovirus que comprenden una
molécula de ácido nucleico que codifica una proteína estructural
filovírica operativamente unida a una secuencia de control, en un
excipiente farmacéuticamente aceptable. En un aspecto descrito en el
presente documento, la molécula de ácido nucleico codifica la forma
de transmembrana de la glicoproteína (GP) vírica. De forma
alternativa, la molécula de ácido nucleico codifica la forma
secretada de la glicoproteína vírica (SGP). En otra forma
alternativa, la molécula de ácido nucleico codifica la
nucleoproteína vírica (NP).
Además, en el presente documento se describen
vacunas que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican
proteínas estructurales filovíricas distintas de GP, SGP y NP, p.
ej., otros productos génicos estructurales que provocan una
respuesta inmunitaria contra un filovirus o enfermedad causada por
la infección por el filovirus. Las moléculas de ácido nucleico de
las vacunas descritas en el presente documento codifican productos
génicos estructurales de cualquier cepa vírica de Ébola, que
incluye las cepas de Zaire, Sudán, Costa de Marfil y Reston.
También se pueden usar las moléculas de ácido nucleico que codifican
los productos génicos estructurales de las cepas del virus de
Marburg genéticamente relacionado. Además, las moléculas de ácido
nucleico descritas en el presente documento se pueden modificar, p.
ej., las moléculas de ácido nucleico expuestas en el presente
documento se pueden mutar, siempre que la proteína expresada
modificada provoque una respuesta inmunitaria contra un patógeno o
enfermedad. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico puede mutarse
de modo que la proteína expresada sea menos tóxica para las
células. También se describen en el presente documento, vacunas que
comprenden una combinación de moléculas de ácido nucleico. Por
ejemplo, y sin limitación, las moléculas de ácido nucleico que
codifican GP, SGP y NP de las cepas de Zaire,
Sudán y Costa de Marfil se pueden combinar en cualquier combinación, en una composición de vacuna.
Sudán y Costa de Marfil se pueden combinar en cualquier combinación, en una composición de vacuna.
También se describen en el presente documento
procedimientos para inmunizar a un sujeto contra la enfermedad
causada por infección con filovirus, que comprende administrar al
sujeto una cantidad inmunológicamente eficaz de una vacuna de
filovirus. Los procedimientos para hacer y usar las vacunas de
filovirus también se describen en el presente documento, incluyendo
la preparación de composiciones farmacéuticas.
Los virus de Ébola (EBO) son miembros de
Flavoviridae y producen una forma de enfermedad de fiebre
hemorrágica grave, a veces mortal, en seres humanos y/o primates no
humanos. El gen de la glicoproteína (GP) de los filovirus es el
cuarto gen (de siete) desde el extremo 3' del genoma de ARN de
cadena negativa. Todos los virus de EBO caracterizados hasta ahora
tienen el mismo tipo de organización del gen GP no convencional, que
da como resultado la expresión de una glicoproteína no estructural
secretada (SGP) de forma preferente frente a la estructural GP. La
SGP es codificada en un solo marco (marco 0), mientras que la GP es
codificada en dos marcos (marcos 0 y -1). La expresión de GP ocurre
cuando los dos marcos están conectados por un suceso de edición de
transcripción que da como resultado la inserción de una sola
adenosina extra (añadida a una serie de siete adenosinas).
Con referencia a la figura 44, para la especie
de Zaire del virus EBO, los 295 restos N-terminales
(incluyendo la secuencia señal) del la SGP (364 restos en total) y
la GP (676 restos en total) son idénticos, pero la longitud y
composición de sus secuencias C-terminales son
únicas. La GP, una proteína de transmembrana de tipo 1, se
encuentra en la superficie del virión infeccioso y funciona en la
estructura adjunta en la unión y entrada del virus en células
susceptibles. Las comparaciones de las secuencias de aminoácidos
previstas de GP para todas las especies de virus EBO muestra una
conservación general en las regiones N-terminal y
C-terminal (cada una aproximadamente un tercio de
la secuencia total) y están separadas por una sección media muy
variable. Esta proteína está muy glicosilada, y contiene grandes
cantidades de glicanos unidos a N y O, y en el virus de Marburg
(MBG) (otro tipo de filovirus) se ha visto que forma trímeros. Justo
en el extremo N de la secuencia de anclaje de transmembrana de la
GP (restos 650 a 672) hay un patrón (restos 585 a 609) que está muy
conservado en los filovirus. Esta secuencia también tiene un grado
alto de homología con un patrón en las glicoproteínas de los
retrovirus oncogénicos que se ha mostrado que es inmunosupresora
in vitro. Parcialmente superpuesta con este patrón hay una
secuencia repetida de héptadas (53 retos; posiciones 541 a 593) que
se cree que funciona en la formación de superenrollamientos
intermoleculares en el ensamble de trímeros, similar a las
estructuras previstas para las glicoproteínas de superficie de
otros virus. Inmediatamente después de esta secuencia hacia el lado
N-terminal hay un péptido de fusión previsto seguido
cerca de un sitio de escisión multibásico putativo, para la
convertasa de tipo subtilisina/kexina, furina. La escisión por la
furina se ha demostrado indirectamente por el uso de inhibidores
específicos y se ha previsto que ocurra en la última arginina en la
secuencia RRTRR\downarrow (posición 501 desde el principio del
marco de lectura abierto [ORF]). Aunque la función de la SGP está
menos definida, estudios recientes han mostrado que la SGP puede
unirse a neutrófilos, mientras que la GP se une a células
endoteliales. Los diferentes patrones de unión de la SGP y la GP
sugieren que a pesar de tener idénticas secuencias de aminoácidos
N-terminales (-280 resto), estas glicoproteínas son
estructuralmente muy diferentes una de la otra.
Con referencia a la figura 45, se analizó la
escisión, oligomerización y otras propiedades estructurales de las
glicoproteínas expresadas por una especie de Zaire del virus de
Ébola, para definir mejor sus funciones. Las glicoproteínas de
virión/estructurales de 50 a 70 kDa secretada y 150 kDa (SGP y GP,
respectivamente), que comparten los 295 restos
N-terminales, son escindidas cerca del extremo N por
la signalasa. Un segundo suceso de escisión, que ocurre en la GP en
un sitio multibásico (RRTR\downarrow) (ID SEC Nº: 51) que
probablemente es mediado por la furina, da como resultado dos
glicoproteínas (GP1 y GP2) unidas por enlace disulfuro. Este sitio
de escisión por furina está presente en la misma posición en las GP
de todos los virus de Ébola
(R[R/K]X[R/K]R\downarrow), y se
predice uno para los virus de Marburg
(R[R/K]KR\downarrow), aunque en una posición
diferente. Basándose en los resultados de estudios de reticulación,
los investigadores pudieron determinar que los peplómeros de virión
de Ébola están compuestos de trímeros de heterodímeros
GP1-GP2 y que aspectos de su estructura eran
similares a los de los retrovirus (incluyendo lentivirus de tipo
VIH-1 y VIH-2), paramixovirus y
virus influenza. Los investigadores también determinaron que SGP es
secretada de células infectadas casi exclusivamente en forma de un
homodímero que está unido por enlace disulfuro.
En relación con la figura 46, los investigadores
definieron el principal determinante vírico de la patogenicidad del
virus de Ébola; la síntesis de la glicoproteína de virión (GP) del
virus de Ébola de Zaire inducía efectos citotóxicos en células
endoteliales humanas in vitro e in vivo. Este efecto
estaba delimitado por un dominio de tipo mucina, rico en
serina-treonina de esta glicoproteína de
transmembrana de tipo 1, uno de los siete productos génicos del
virus. La transferencia génica de GP en vasos sanguíneos porcinos o
humanos explantados producía una pérdida masiva de células
endoteliales en 48 horas que conducía a un aumento sustancial de la
permeabilidad vascular. La eliminación de la región de tipo mucina
de la GP abolía estos efectos sin afectar a la expresión o función
de la proteína. La GP derivada de la cepa de virus de Reston, que
produce enfermedad en primates no humanos pero no en el hombre, no
alteraba la vasculatura de los vasos sanguíneos humanos. En
comparación, la GP de Zaire inducía alteración de las células
endoteliales y citotoxicidad en los vasos sanguíneos tanto de seres
humanos como de primates no humanos y el dominio de mucina era
necesario para este efecto. Estos descubrimientos indican que la
GP, por su dominio de mucina, es el determinante vírico de la
patogenicidad del Ébola y probablemente contribuye a la hemorragia
durante la infección.
Como se indica en el presente documento, las
moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser en
forma de ARN o en forma de ADN obtenidas por clonación o producidas
sintéticamente. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario. El
ADN o ARN monocatenario puede ser la cadena codificante, conocida
también como cadena homosentido, o puede ser la cadena no
codificante, llamada también cadena antisentido.
Por molécula(s) de ácido nucleico
"aislada(s)" se entiende una molécula de ácido nucleico,
ADN o ARN, que se ha sacado de su entorno nativo. Por ejemplo, las
moléculas de ADN recombinante contenidas en un vector se consideran
aisladas para los propósitos descritos más adelante en el presente
documento. Otros ejemplos de moléculas de ADN aisladas incluyen
moléculas de ADN recombinante mantenidas en células huésped
heterólogas o moléculas de ADN purificadas (parcial o
sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen
trascritos de ARN in vivo o in vitro de las moléculas
de ADN descritas en el presente documento. Las moléculas de ácido
nucleico descritas en el presente documento incluyen además dichas
moléculas producidas sintéticamente.
Las moléculas de ácido nucleico descritas en el
presente documento incluyen moléculas de ADN que comprenden un
marco de lectura abierto (ORF) que codifica un producto génico
estructural de filovirus salvaje; y moléculas de ADN que comprenden
una secuencia sustancialmente diferente de las descritas antes pero
que, debido a la degeneración del código genético, todavía codifica
un ORF de un producto génico estructural de filovirus salvaje. Por
supuesto, el código genético es conocido en la técnica.
También se describen en el presente documento
fragmentos de moléculas de ácido nucleico descritas en el presente
documento. Por un fragmento de una molécula de ácido nucleico que
tiene la secuencia de nucleótidos de un ORF que codifica un
producto génico estructural de filovirus salvaje se entiende
fragmentos de al menos aproximadamente 15 nt y, más
preferiblemente, al menos aproximadamente 20 nt, todavía más
preferiblemente al menos aproximadamente 30 nt, e incluso más
preferiblemente, al menos aproximadamente 40 nt de longitud. Por
supuesto, los fragmentos más largos de 50, 100, 150, 200, 250, 300,
350, 400, 450 o 500 nt de longitud también se entiende que están
descritos en el presente documento como fragmentos correspondientes
a la mayor parte, si no a toda, la secuencia de nucleótidos del ORF
que codifica un producto génico estructural de filovirus salvaje.
Por un fragmento de al menos 20 nt de longitud, por ejemplo, se
entiende fragmentos que incluyen 20 o más bases contiguas de la
secuencia de nucleótidos del ORF de un producto génico estructural
de filovirus salvaje.
Los fragmentos de ácido nucleico preferidos
descritos en el presente documento incluyen moléculas de ácido
nucleico que codifican partes que llevan epítopo de la proteína
estructural de filovirus. En particular, dichos fragmentos de ácido
nucleico descritos en el presente documento incluyen moléculas de
ácido nucleico que codifican dominios que llevan epítopo de una
proteína estructural de filovirus, en los que el dominio es el
dominio de identidad de GP/SGP, el dominio de tipo mucina, el sitio
de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio
de repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana y
el dominio intracelular, y cualquier combinación de los mismos, por
ejemplo, una glicoproteína de filovirus que está truncada en el
extremo carboxi para suprimir el anclaje de transmembrana y el
dominio intracelular, una glicoproteína de filovirus que está
truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de
repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana y
el dominio intracelular, una glicoproteína de filovirus que está
truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de péptido
de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de
anclaje de transmembrana e intracelular, una glicoproteína de
filovirus que está truncada en el extremo carboxi para suprimir el
sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión,
dominio de repetición de héptadas y dominio de anclaje de
transmembrana e intracelular, una glicoproteína de filovirus que
está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de tipo
mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de
fusión, dominio de repetición de héptadas y dominio de anclaje de
transmembrana e intracelular. Otro ejemplo es una glicoproteína de
filovirus que tiene una deleción de amino, interna o carboxi para
suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina,
el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de
héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana o el dominio
intracelular.
En otro aspecto, en el presente documento se
describe una molécula de ácido nucleico que comprende un
polinucleótido que hibrida en condiciones de hibridación
restrictivas con una parte del polinucleótido en una molécula de
ácido nucleico como se ha descrito antes. Por "condiciones de
hibridación restrictivas" se entiende incubación toda la noche a
42ºC en una solución que comprende: formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl
750 mM, citrato trisódico 75 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5
x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y ADN de esperma
de salmón fraccionado y desnaturalizado 20 \mug/ml, seguido de
lavado de los filtros en 0,1 x SSC a aproximadamente 65ºC.
Por un polinucleótido que hibrida con una
"parte" de un polinucleótido se entiende un polinucleótido (ADN
o ARN) que hibrida con al menos 15 nucleótidos (nt) y, más
preferiblemente, al menos aproximadamente 20 nt, todavía más
preferiblemente al menos aproximadamente 30 nt, e incluso más
preferiblemente aproximadamente 30-70 nt del
polinucleótido de referencia.
Por una parte de un polinucleótido de "al
menos 20 nt de longitud", por ejemplo, se entiende 20 o más
nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del
polinucleótido de referencia. Por supuesto, un polinucleótido que
hibrida solo con una secuencia de poli A o un tramo complementario
de restos T (o U), no estaría incluida en un polinucleótido de la
invención usado para hibridar con una parte de un ácido nucleico de
la invención, puesto que dicho polinucleótido hibridaría con
cualquier molécula de ácido nucleico que contenga un tramo poli A o
su complementario (p. ej., prácticamente cualquier clon de ADNc
bicatenario).
Como se indica en el presente documento, las
moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento que
codifican un producto génico estructural de filovirus pueden
incluir, pero no se limitan a las que codifican la secuencia de
aminoácidos del polipéptido de longitud completa, por si mismo, la
secuencia que codifica el polipéptido de longitud completa y
secuencias adicionales, tales como las que codifican una secuencia
líder o secretora, tales como una secuencia de pre o pro o
preproteína, la secuencia codificante del polipéptido de longitud
completa, con o sin las secuencias codificantes adicionales
mencionadas antes, junto con secuencias no codificantes
adicionales, incluyendo, por ejemplo, pero no limitado a intrones y
secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como las secuencias no
traducidas transcritas que tienen una función en la transcripción,
procesamiento de ARNm, incluyendo señales de religación y
poliadenilación, por ejemplo, unión de ribosoma y estabilidad del
ARNm; y secuencia codificante adicional que codifica aminoácidos
adicionales, tales como los que proporcionan funcionalidades
adicionales.
Además se describen en el presente documento
variantes de las moléculas de ácido nucleico descritas en el
presente documento, que codifican partes, análogos o derivados del
producto génico estructural de filovirus. Las variantes pueden ser
naturales, tales como una variante alélica natural. Por una
"variante alélica" se entienden una o más formas alternativas
de un gen que ocupa un locus dado en un genoma de un organismo.
(Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, 1985 New York).
Las variantes no naturales se pueden producir usando técnicas de
mutagénesis conocidas en la materia.
\newpage
Dichas variantes incluyen las producidas por
sustituciones, deleciones o adiciones de nucleótidos, que pueden
implicar uno o más nucleótidos. Las variantes pueden estar alteradas
en regiones codificantes, regiones no codificantes o ambas. Las
alteraciones en las regiones codificantes pueden producir
sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservativas
o no conservativas. Se prefieren en especial entre estas las
sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran
las propiedades y actividades del producto génico estructural de
filovirus o partes del mismo. También se prefieren en especial en
este respecto las sustituciones conservativas.
Además, se describen en el presente documento
moléculas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que
tiene una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica y, más
preferiblemente, al menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una
secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la
secuencia de aminoácidos de un producto génico estructural de
filovirus salvaje o un fragmento del mismo o una secuencia de
nucleótidos complementaria a la misma.
Por un polinucleótido que tiene una secuencia de
nucleótidos al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una
secuencia de nucleótidos de referencia que codifica un producto
génico estructural de filovirus, se entiende que la secuencia de
nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de
referencia excepto que la secuencia de polinucleótidos puede
incluir hasta cinco puntos de mutaciones por cada 100 nucleótidos de
la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica el producto
génico estructural del virus de Ébola. En otras palabras, para
obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos al
menos 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos de referencia,
hasta el 5% de los nucleótidos de la secuencia de referencia se
pueden suprimir o sustituir por otro nucleótido, o se puede
insertar en la secuencia de referencia un número de nucleótidos de
hasta 5% del total de los nucleótidos de la secuencia de referencia.
Estas mutaciones de la secuencia de referencia se pueden producir
en las posiciones 5' ó 3' terminales de la secuencia de nucleótidos
de referencia o en cualquier sitio entre estas posiciones
terminales, entremezclados sea individualmente entre los nucleótidos
en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la
secuencia de referencia.
De forma práctica, si cualquier molécula de
ácido nucleico particular es al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99%
idéntica a la secuencia de nucleótidos de referencia se puede
determinar de forma convencional usando programas de ordenador
conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence
Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group,
University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711).
Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman,
1981 Advances in Applied Mathematics
2:482-489, para encontrar el mejor segmento de
homología entre dos secuencias. Cuando se usa Bestfit o cualquier
otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una
secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia
de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros
se fijan, por supuesto, de modo que el porcentaje de identidad se
calcula a lo largo de la longitud completa de la secuencia de
nucleótidos de referencia y están permitidos huecos en la homología
de hasta 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de
referencia.
En el presente documento se describen moléculas
de ácido nucleico al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas con
las secuencias de ácidos nucleicos mostradas en el presente
documento en la lista de secuencias, que codifican un polipéptido
que tiene actividad del polipéptido del virus de Ébola, Marburg o
Lassa. Por "un polipéptido que tiene actividad del polipéptido
del virus de Ébola, Marburg o Lassa" se entiende polipéptidos que
presentan actividad del polipéptido del virus de Ébola, Marburg o
Lassa en un ensayo biológico particular. Por ejemplo, se puede
medir la actividad de proteína GP, SGP o NP para los cambios en el
carácter inmunológico por un ensayo inmunológico adecuado.
Por supuesto, debido a la degeneración del
código genético, un experto en la técnica reconocerá inmediatamente
que un gran número de moléculas de ácido nucleico que tienen una
secuencia al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica con una
secuencia de ácido nucleico mostrada en el presente documento en la
lista de secuencias, codificarán un polipéptido "que tiene
actividad del polipéptido del virus de Ébola, Marburg o Lassa".
De hecho, puesto que las variantes degeneradas de estas secuencias
de nucleótidos codifican todas el mismo polipéptido, esto estará
claro para los expertos en la materia sin realizar el ensayo de
comparación descrito antes. Además, se reconocerá en la técnica,
que para estas moléculas de ácido nucleico que no son variantes
degeneradas, un número razonable también codificará un polipéptido
que tiene actividad del polipéptido del virus de Ébola, Marburg o
Lassa. Esto se debe a que el experto en la materia es consciente de
las sustituciones de aminoácidos que no es probable o es poco
probable que afectan significativamente a la función de proteína (p.
ej., sustituyendo un aminoácido alifático por un segundo aminoácido
alifático).
Por ejemplo, se proporciona una guía relativa a
como hacer sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas
en Bowie, J. U. y col., 1990, Science
247:1306-1310, en la que los autores indican que las
proteínas son sorprendentemente tolerantes a las sustituciones de
aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe además en el presente documento un
polipéptido de filovirus que tiene una secuencia de aminoácidos que
codifica un marco de lectura abierto (ORF) de un gen estructural de
filovirus salvaje, o un péptido o polipéptido que comprende una
parte del mismo (p. ej., SGP).
Se reconocerá en la técnica que algunas
secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de filovirus se pueden
variar sin un efecto significativo en la estructura o la función de
la proteína. Si se contemplan dichas diferencias en la secuencia,
debe recordarse que hay zonas críticas en la proteína que determinan
la actividad.
Por lo tanto, se describe además en el presente
documento variaciones del polipéptido de filovirus que muestran
actividad de polipéptido de filovirus sustancial o que incluyen
regiones de la proteína de filovirus tales como las partes de
proteínas descritas a continuación. Dichos mutantes incluyen
deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones
tipo. Como se ha indicado, se puede encontrar una guía relativa a
que cambios de aminoácidos es probable que sean fenotípicamente
silenciosos en Bowie, J. U. y col., 1990, Science
247:1306-1310.
Por lo tanto, el fragmento, derivado o análogo
del polipéptido descrito en el presente documento puede ser (i) uno
en el que uno o más restos de aminoácidos se sustituyen por un resto
de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un resto
de aminoácido conservado) y dicho resto de aminoácido sustituido
puede ser o no uno codificado por el código genético, o (ii) uno en
el que uno o más de los restos de aminoácidos incluyen un grupo
sustituyente, o (iii) uno en el que aminoácidos adicionales están
fusionados al polipéptido maduro, tal como un péptido de la región
de fusión Fc de IgG o secuencia líder o secretora o una secuencia
que se usa para purificar el polipéptido maduro o una secuencia de
proproteína. Dichos fragmentos, derivados y análogos se considera
que están dentro del alcance de los expertos en la materia a partir
de las enseñanzas del presente documento.
Como se ha indicado, los cambios son
preferiblemente de naturaleza secundaria, tales como sustituciones
de aminoácidos conservativas que no afectan significativamente al
plegado o actividad de la proteína (véase la Tabla A).
\vskip1.000000\baselineskip
Por supuesto, el número de sustituciones de
aminoácidos que hará un experto en la materia dependerá de muchos
factores, incluyendo los descritos antes. Hablando en general, el
número de sustituciones de aminoácidos para cualquier polipéptido
de filovirus dado no será mayor que 50, 40, 30, 20, 10 5 ó 3.
Los aminoácidos en los polipéptidos de filovirus
descritos en el presente documento que son esenciales para la
función, se pueden identificar por procedimientos conocidos en la
técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de
barrido de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science
244:1081 -1085). Este último procedimiento introduce mutaciones de
alanina individuales en cada resto en la molécula. Después, se
ensaya la actividad biológica de las moléculas mutantes resultantes
tal como los cambios en el carácter inmunológico.
Los polipéptidos descritos en el presente
documento se proporcionan de forma conveniente en una forma aislada.
Por "polipéptido aislado" se entiende un polipéptido sacado de
su entorno natural. Por lo tanto, un polipéptido producido y/o
contenido dentro de una célula huésped recombinante se considera
aislado para los propósitos descritos en el presente documento.
También se entiende por un "polipéptido aislado" polipéptidos
que se han purificado, parcial o sustancialmente, de una célula
huésped recombinante o una fuente natural. Por ejemplo, una versión
del polipéptido de filovirus producida de forma recombinante se
puede purificar sustancialmente por el procedimiento en una etapa
descrito por Smith y Johnson, 1988, Gene
67:31-40.
Los polipéptidos descritos en el presente
documento incluyen un polipéptido que comprende un polipéptido que
tiene la secuencia de aminoácidos de un producto génico estructural
de filovirus salvaje o parte del mismo, o codificado por una
secuencia de ácido nucleico mostrada en el presente documento en la
lista de secuencias; así como polipéptidos que son al menos 95%
idénticos y, más preferiblemente, al menos 96%, 97%, 98% o 99%
idénticos a los descritos antes.
Por un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a la
secuencia de aminoácidos de referencia de un polipéptido de
filovirus se entiende que la secuencia de aminoácidos del
polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la
secuencia del polipéptido puede incluir hasta cinco alteraciones de
aminoácidos por cada 100 aminoácidos de los aminoácidos de
referencia del polipéptido de filovirus. En otras palabras, para
obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al
menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia,
hasta el 5% de los restos de aminoácidos en la secuencia de
referencia pueden estar suprimidos o sustituidos por otro
aminoácido, o puede insertarse en la secuencia de referencia un
número de aminoácidos de hasta 5% de los restos de aminoácidos
totales en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la
secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino o
carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en
cualquier parte entre esas posiciones terminales, entremezcladas
individualmente entre los restos en la secuencia de referencia o en
uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia.
De forma práctica, si cualquier polipéptido
particular es al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a la
secuencia de aminoácidos de referencia se puede determinar de forma
convencional usando programas de ordenador conocidos tales como el
programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8
para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575
Science Drive, Madison, Wis. 53711). Cuando se usa Bestfit o
cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para
determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95%
idéntica a una secuencia de referencia descrita en la presente
invención, los parámetros se fijan, por supuesto, de modo que el
porcentaje de identidad se calcula a lo largo de la longitud
completa de la secuencia de aminoácidos de referencia y están
permitidos huecos en la homología de hasta 5% del número total de
restos de aminoácidos en la secuencia de referencia.
En otro aspecto, se describen en el presente
documento partes de los polipéptidos descritos en el presente
documento con al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos
50 aminoácidos. Las partes preferidas descritas en el presente
documento incluyen polipéptidos que comprenden una parte que lleva
epítopo de una proteína estructural de filovirus. En particular,
las partes preferidas descritas en el presente documento incluyen
polipéptidos que comprenden un dominio que lleva epítopo de una
proteína estructural de filovirus, en las que el dominio es el
dominio de identidad de GP/SGP, el dominio de tipo mucina, el sitio
de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio
de repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana y
el dominio intracelular, y cualquier combinación de los mismos, por
ejemplo, una glicoproteína de filovirus que está truncada en el
extremo carboxi para suprimir el dominio de anclaje de transmembrana
y el intracelular, una glicoproteína de filovirus que está truncada
en el extremo carboxi para suprimir el dominio de repetición de
héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana y el intracelular,
una glicoproteína de filovirus que está truncada en el extremo
carboxi para suprimir el dominio de péptido de fusión, el dominio
de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana y
el intracelular, una glicoproteína de filovirus que está truncada
en el extremo carboxi para suprimir el sitio de escisión de furina,
el dominio de péptido de fusión, dominio de repetición de héptadas
y dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, y una
glicoproteína de filovirus que está truncada en el extremo carboxi
para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de
furina, el dominio de péptido de fusión, dominio de repetición de
héptadas y dominio de anclaje de transmembrana e intracelular. Otro
ejemplo es una glicoproteína de filovirus que tiene una deleción de
amino, interna o carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el
sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el
dominio de repetición de héptadas, el dominio de anclaje de
transmembrana o el dominio
intracelular.
intracelular.
\newpage
Los polipéptidos descritos en el presente
documento se pueden producir por cualquier medio convencional
(Houghten, R.A., 1985, PNAS USA
82:5131-5135). El procedimiento de "síntesis
múltiple y simultánea de péptidos (SMPS)" se describe en la
patente de EE.UU. nº 4.631.211 de Houghten y col. (1986).
La presente invención proporciona un vector de
expresión que comprende el ID SEC Nº: 52 o un análogo del mismo que
tiene al menos una identidad de secuencia de 95, 96, 97, 98, 99 o
100% con el que media la expresión, en el que el porcentaje de
identidad se calcula a lo largo de toda la longitud de la secuencia
de nucleótidos de referencia. Además se describen en el presente
documento vectores que incluyen moléculas de ácido nucleico que se
describen en el presente documento, células huésped que están
genéticamente diseñadas con vectores recombinantes y la producción
de polipéptidos de filovirus o fragmentos de los mismos por técnicas
recombinantes.
Se describen además en el presente documento,
regímenes de inmunización de "cebado y refuerzo" en los que
la respuesta inmunitaria inducida por la administración de una
composición de cebado se refuerza por la administración de una
composición de refuerzo. La demostración experimental descrita en el
presente documento muestra que se puede lograr un refuerzo eficaz
usando vectores de adenovirus de replicación deficiente, después del
cebado con cualquiera de una variedad de tipos diferentes de
composiciones de cebado. Como se describe en el presente documento,
se ha descubierto que los adenovirus de replicación deficiente, como
muestran los experimentos descritos a continuación, son un medio
eficaz para proporcionar un refuerzo a una respuesta inmunitaria
cebada frente al antígeno usando cualquiera de una variedad de
composiciones de cebado diferentes.
Los adenovirus de replicación deficiente
obtenidos a partir de serotipo 5 humano han sido desarrollados como
un vector vírico vivo por Graham y colaboradores (Graham y Prevec,
1995, Mol. Biotechnol. 3:207-20; Bett y
col., 1994, PNAS USA 91:8802-6). Los
adenovirus son virus sin envuelta que contienen un genoma de ADN
bicatenario de aproximadamente 3600 pb. Los virus recombinantes se
pueden construir por recombinación in vitro entre un
plásmido de genoma de adenovirus y un vector lanzadera que contiene
el gen de interés junto con un promotor eucariota fuerte, en una
línea celular permisiva que permita la replicación vírica. Se pueden
obtener titulaciones de virus altas de la línea celular permisiva,
pero los virus resultantes, aunque son capaces de infectar una
amplia variedad de tipos de células, no se replican en ninguna otra
célula más que la línea permisiva y por lo tanto son un sistema de
suministro de antígeno seguro. Se ha mostrado que los adenovirus
recombinantes provocan respuestas inmunitarias protectoras contra
una serie de antígenos incluyendo la proteína NS1 del virus de la
encefalitis transmitido por garrapata (Jacobs y col., 1992, J.
Virol. 66:2086-95) y nucleoproteína del virus
del sarampión (Fooks y col., 1995, Virology
210:456-65).
De forma extraordinaria, el trabajo experimental
descrito a continuación demuestra que el uso de realizaciones de la
presente invención permite que el adenovirus recombinante de
replicación deficiente que expresa un antígeno, refuerce una
respuesta inmunitaria cebada por una vacuna de ADN. Se ha encontrado
que el adenovirus de replicación deficiente induce una respuesta
inmunitaria después de inmunización intramuscular. En los regímenes
de vacunación de cebado/refuerzo el adenovirus de replicación
deficiente también se prevé que sea capaz de cebar una respuesta que
pueda ser reforzada por un virus recombinante diferente o antígeno
producido de forma recombinante.
Los primates no humanos inmunizados con ADN
plasmídico y reforzados con adenovirus de replicación deficiente
estaban protegidos contra la estimulación. Tanto los adenovirus
recombinantes de replicación deficiente como el ADN plasmídico son
vacunas que son seguras para usar en seres humanos. De forma
ventajosa, los autores de la invención encontraron que se puede
usar un régimen de vacunación que usa inmunización intramuscular
para el cebado y refuerzo, que constituye un régimen de inmunización
general adecuado para inducir una respuesta inmunitaria, p. ej., en
seres humanos.
En diferentes aspectos, en el presente documento
se describe un vector de adenovirus de replicación deficiente que
codifica un antígeno para el refuerzo de una respuesta inmunitaria
al antígeno cebado por la administración previa del antígeno o el
ácido nucleico que codifica el antígeno.
Un aspecto general descrito en el presente
documento es el uso de un vector de adenovirus de replicación
deficiente para el refuerzo de una respuesta inmunitaria a un
antígeno.
Un aspecto descrito en el presente documento, es
un procedimiento de refuerzo de una respuesta inmunitaria a un
antígeno en un individuo, incluyendo el procedimiento proporcionar
al individuo un vector de adenovirus de replicación deficiente que
incluya un ácido nucleico que codifique el antígeno operativamente
unido a secuencias reguladoras para producir el antígeno en el
individuo por expresión del ácido nucleico, de forma que se refuerce
una respuesta inmunitaria al antígeno previamente cebado en el
individuo.
Una respuesta inmunitaria a un antígeno se puede
cebar por inmunización genética, por infección con un agente
infeccioso o por antígeno producido de forma recombinante.
Otro aspecto descrito en el presente documento,
es un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria a un
antígeno en un individuo, comprendiendo el procedimiento administrar
al individuo una composición de cebado que comprende el antígeno o
el ácido nucleico que codifica el antígeno, y después administrar
una composición de refuerzo que comprende un vector de adenovirus
de replicación deficiente que incluye el ácido nucleico que
codifica el antígeno operativamente unido a secuencias reguladoras
para producir el antígeno en el individuo por expresión del ácido
nucleico.
Otro aspecto, describe el uso de un vector de
adenovirus de replicación deficiente, como se ha descrito, en la
fabricación de un medicamento para administrar a un mamífero para
reforzar una respuesta inmunitaria a un antígeno. Dicho
medicamento, en general es para administrar después de la
administración previa de una composición de cebado que comprende el
antígeno.
La composición de cebado puede comprender
cualquier vector vírico, incluyendo adenovírico, u otros distintos
de adenovirus, tales como un vector del virus vaccinia tal como una
cepa de replicación deficiente tal como el virus Ankara modificado
(MVA) (Mayr y col., 1978, Zentralbl. Bakteriol.
167:375-90; Sutterand Moss, 1992, PNAS USA
89:10847-51; Suttery col., 1994, Vaccine
12:1032-40) o NYVAC (Tartaglia y col., 1992
Virology 118:217-32), un vector de virus de
viruela aviar tal como virus de viruela de aves de corral o de
viruela de canario, p. ej., la cepa conocida como ALVAC (Kanapox,
Paoletti y col., 1994, Dev. Biol. Stand 1994
82:65-9), o vector del herpesvirus.
La composición de cebado puede comprender ADN
que codifica el antígeno, estando dicho ADN preferiblemente en
forma de plásmido circular que no es capaz de replicarse en células
de mamíferos. Cualquier marcador seleccionable no debe ser
resistente a un antibiótico usado en clínica, así por ejemplo, se
prefiere la resistencia a la kanamicina frente a la resistencia a
la ampicilina. La expresión del antígeno debe estar dirigida por un
promotor que es activo en células de mamífero, por ejemplo, el
promotor inmediato temprano del citomegalovirus (CMV IE).
En realizaciones particulares de los diferentes
aspectos descritos en el presente documento, a la administración de
una composición de cebado le sigue el refuerzo con una primera y
segunda composición de refuerzo, siendo la primera y segunda
composición de refuerzo iguales o diferentes entre sí, p. ej., como
se ilustra a continuación. Se pueden usar otras composiciones más
de refuerzo. En una realización, un régimen de inmunización triple
usa ADN, después adenovirus (Ad) como una primera composición de
refuerzo y después MVA como una segunda composición de refuerzo,
opcionalmente seguida de otra composición de refuerzo (tercera) o
posterior administración de refuerzo de uno u otro o ambos vectores
iguales o diferentes. Otra opción es ADN, después MVA, después Ad,
opcionalmente seguido de la posterior administración de refuerzo de
uno u otro o ambos vectores iguales o diferentes.
El antígeno que se va a incluir en las
respectivas composiciones de cebado y refuerzo (no importa cuantas
composiciones de refuerzo se usen) no es necesario que sean
idénticos, pero deben compartir epítopos. El antígeno puede
corresponder a un antígeno completo en un patógeno o célula
objetivo, o a un fragmento del mismo. Se pueden usar epítopos
peptídicos o cadenas artificiales de epítopos de forma más eficaz
cortando la secuencia de proteína innecesaria en el antígeno y la
secuencia codificante en el vector o vectores. Se pueden incluir
uno o más epítopos, por ejemplo epítopos que son reconocidos por
células T auxiliares, en especial epítopos reconocidos en individuos
de diferentes tipos de HLA.
En el vector de adenovirus de replicación
deficiente, las secuencias reguladoras para la expresión del
antígeno codificado incluirán un promotor. Por "promotor" se
entiende una secuencia de nucleótidos a partir de la cual se puede
iniciar el transporte del ADN operativamente unido secuencia abajo
(es decir, en la dirección 3' en la cadena homosentido del ADN
bicatenario). "Operativamente unido" significa unido como parte
de la misma molécula de ácido nucleico, situado y orientado de
forma adecuada para iniciar la transcripción a partir del promotor.
El ADN operativamente unido a un promotor está "regulado por el
inicio de la transcripción" del promotor. Se pueden incluir
otras secuencias reguladoras que incluyen fragmentos de terminación,
secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes
marcadores, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) y otras
secuencias, según sea adecuado, de acuerdo con el conocimiento y la
práctica del experto en la materia: véase, por ejemplo,
Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook
y col. 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press. Se describen con
detalle muchas técnicas y protocolos para la manipulación de ácidos
nucleicos, por ejemplo, en la preparación de construcciones de
ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN
en células y expresión de genes y análisis de proteínas en
Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col. eds.,
John Wiley & Sons, 1994.
Los promotores adecuados para usar en aspectos y
realizaciones descritos en el presente documento incluyen el
promotor inmediato temprano de citomegalovirus (CMV IE), con o sin
intrón A, y cualquier otro promotor que sea activo en células de
mamíferos.
Cualquiera o ambas composiciones de cebado y
refuerzo pueden incluir un adyuvante o citoquina, tal como
interferón alfa, interferón gamma, factor de crecimiento derivado
de plaquetas (PDGF), factor estimulador de las colonias de
granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor
estimulador de las colonias de granulocitos (gCSF), factor de
necrosis tumoral (TNF), factor de crecimiento epidérmico (EGF),
IL-1, IL-2, IL-4,
IL-6, IL-8, IL-10 e
IL-12, o ácido nucleico que codifica a los
mismos.
La administración de la composición de refuerzo
en general es semanas o meses después de administrar la composición
de cebado, preferiblemente aproximadamente 2-3
semanas o 4 semanas, u 8 semanas o 16 semanas o 20 semanas o 24
semanas o 28 semanas o 32 semanas.
Preferiblemente, la administración de la
composición de cebado, composición de refuerzo, o tanto la
composición de cebado como la de refuerzo es inmunización
intramuscular.
La administración intramuscular de vacunas de
adenovirus o ADN plasmídico se puede lograr usando una aguja para
inyectar una suspensión del virus o el ADN plasmídico. Una
alternativa es el uso de un dispositivo de inyección sin aguja para
administrar una suspensión de virus o de ADN plasmídico (usando, p.
ej., Biojector^{TM}) o un polvo liofilizado que contiene la
vacuna (p. ej., de acuerdo con las técnicas y productos de
Powderject), permitiendo la fabricación de dosis preparadas
individualmente que no necesitan almacenarse en frío. Esto sería una
gran ventaja para una vacuna que es necesaria en zonas rurales de
África.
El adenovirus es un virus con un registro de
seguridad excelente en inmunizaciones humanas. La generación de
virus recombinantes se puede llevar a cabo de forma sencilla, y se
pueden fabricar de forma reproducible en grandes cantidades. Por lo
tanto, la administración intramuscular de adenovirus recombinantes
de replicación deficiente es muy adecuada para vacunaciones
profilácticas y terapéuticas de seres humanos contra enfermedades
que pueden controlarse mediante una respuesta inmunitaria.
El individuo puede tener una enfermedad o
trastorno de modo que el suministro del antígeno y la generación de
una respuesta inmunitaria al antígeno sean beneficiosos o tengan un
efecto terapéutico beneficioso.
Lo más probable es que la administración tenga
un objetivo profiláctico para generar una respuesta inmunitaria
contra un patógeno o enfermedad antes de la infección o el
desarrollo de los síntomas.
Las enfermedades y trastornos que se pueden
tratar o prevenir incluyen aquellos en los que una respuesta
inmunitaria puede tener una función protectora o función
terapéutica.
Los componentes que se van a administrar se
pueden formular en composiciones farmacéuticas. Estas composiciones
pueden comprender un excipiente, vehículo, tampón, estabilizante u
otros materiales farmacéuticamente aceptables conocidos para los
expertos en la materia. Dichos materiales no deben ser tóxicos y no
deben interferir con la eficacia del principio activo. La
naturaleza exacta del vehículo u otro material puede depender de la
vía de administración, p. ej., las vías intravenosa, cutánea o
subcutánea, intramucosa (p. ej., intestino), intranasal,
intramuscular o intraperitoneal.
Como se ha indicado, la administración
preferiblemente es intradérmica, subcutánea o intramuscular.
Las composiciones farmacéuticas líquidas en
general incluyen un vehículo líquido, tal como agua, vaselina,
aceites vegetales o animales, aceite mineral o aceite sintético. Se
puede incluir solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución
de sacárido o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o
polietilenglicol.
Para la inyección intravenosa, cutánea o
subcutánea, o inyección en el sitio aquejado, el principio activo
estará en forma de una solución acuosa aceptable por vía parenteral
que es apirogénica y tiene pH, isotonicidad y estabilidad
adecuados. Los expertos en la materia pueden preparar soluciones
adecuadas, usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como
inyección de cloruro sódico, inyección de Ringer, inyección de
Ringer-lactato. Se pueden incluir conservantes,
estabilizantes, tampones, antioxidantes y/o otros aditivos, según
sean necesarios.
Se puede usar una formulación de liberación
lenta.
Después de la producción de las partículas de
adenovirus de replicación deficiente y formulación opcional de
dichas partículas en composiciones, las partículas se pueden
administrar a un individuo, en particular a un ser humano u otro
primate.
La administración puede ser a otro mamífero, p.
ej., roedor tal como ratón, rata o hámster, cobaya, conejo, oveja,
cabra, cerdo, caballo, vaca, burro, perro o gato.
La administración preferiblemente es en una
"cantidad profilácticamente eficaz" o una "cantidad
terapéuticamente eficaz" (según sea el caso, aunque la
profilaxis se puede considerar terapia), la cual es suficiente para
mostrar beneficio al individuo. La cantidad real administrada y la
velocidad y el curso de tiempo de la administración, dependerán de
la naturaleza y gravedad de lo que se está tratando. La prescripción
del tratamiento, por ejemplo, decisiones de la dosificación, etc.,
dependen de la responsabilidad de los médicos generales u otros
doctores, o en un contexto veterinario de un veterinario, y
normalmente se tiene en cuenta el trastorno tratado, el estado del
paciente individual, el sitio de suministro, el procedimiento de
administración y otros factores que conocen los facultativos. Se
pueden encontrar ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados
antes en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.
ed., 1980.
En un régimen preferido, se administra ADN
(preferiblemente por vía intramuscular) con una dosis de 10
microgramos a 50 miligramos/inyección, seguido de adenovirus
(preferiblemente por vía intramuscular) con una dosis de 5x10^{7}
-1x10^{12} partículas/inyección.
Si se desea, la composición se puede presentar
en un kit, envase o dispensador, que puede contener una o más
formas de dosificación unitaria que contienen el principio activo.
El kit puede comprender, por ejemplo, lámina de metal o plástico,
tal como un envase de blíster. El kit, envase o dispensador puede ir
acompañado de instrucciones para la administración.
\newpage
Una composición se puede administrar sola o
combinada con otros tratamientos, sea de forma simultánea o
secuencial dependiendo del estado que se va a tratar.
El suministro a un mamífero no humano no es
necesario que sea para un propósito terapéutico, sino que se puede
usar en un contexto experimental; por ejemplo en investigación de
mecanismos de respuestas inmunitarias a un antígeno de interés, p.
ej., protección frente a una enfermedad.
Otros aspectos descritos en el presente
documento serán evidentes para los expertos en la materia, en vista
de la descripción anterior y la siguiente ilustración experimental,
incluida a modo de ilustración y no limitación, y con referencia a
las figuras adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha mostrado que la inmunización genética
influye en las rutas de activación inmunitaria tanto humoral como
celular y en la protección contra la infección por patógenos humanos
(Tang, D.C. y col., 1992, Nature
356:152-154; Ulmer, J.B. y col., 1993,
Science 259:1745-1749; Wang, B. y col., 1993
PNAS USA 90:4156-4160; Sedegah, M. y col.,
1994, PNAS USA 91: 9866-9870). Se cree que la
eficacia de las vacunas plasmídicas es resultado de la síntesis de
proteínas de la célula huésped y la presentación endógena del
inmunógeno, y posiblemente de efectos inmunoestimuladores del
propio ADN plasmídico (Krieg, A.M. y col., 1995, Nature
374:546-549; Sato, Y. y col., 1996, Science
273:352-354). Se ha mostrado que las vacunas de ADN
provocan respuestas inmunitarias específicas a antígenos del virus
de Ébola y protegen a cobayas (Xu, L. y col., 1998, Nat.
Med. 4:7-42) y ratones (Vanderzanden, L. y col.,
1998, Virology 246:134-144) frente a la
estimulación con virus de Ébola adaptado para producir infección
letal en roedores (Connolly, B.M. y col., 1999, J. Infect.
Dis. 179:S203-S217; Bray, M. y col., 1998, J.
Infect. Dis. 178:651-661). Aunque son provocadas
respuestas inmunitarias tanto humoral como mediada por célula, la
titulación de anticuerpos se correlacionaba con el grado de
protección en los animales inmunizados con plásmidos que codifican
proteínas del virus de Ébola del subtipo Zaire.
Una vacuna ampliamente eficaz es necesario que
proporcione inmunidad frente a los múltiples subtipos de Ébola
aislados en infecciones humanas (Zaire, Sudán y Costa de Marfil),
pero una vacuna multivalente puede diluir la respuesta inmunitaria
específica demostrada para la vacuna para un solo subtipo. Para
abordar este problema, los autores de la invención analizaron la
eficacia de la vacuna de ADN de Ébola de Zaire original comparado
con su uso en combinación con ADN de Ébola de subtipos de Sudán y
Costa de Marfil. Como en un estudio previo (Xu, L. y col., 1998,
Nat. Med. 4:7-42), la inmunización con un
solo plásmido que codifica la glicoproteína del virión del subtipo
Zaire, GP(Z), generó una respuesta sustancial de anticuerpo
específico de virus y confirió inmunidad protectora en las cobayas
(Tabla I). La inclusión de un plásmido que expresaba la
nucleoproteína de Ébola, NP, no afectaba a la titulación de
anticuerpos contra GP(Z) de Ébola ni disminuía su eficacia
protectora. Una mayor ampliación de los componentes de la vacuna
para incluir NP y tres subtipos de glicoproteínas de Ébola, Zaire,
Costa de Marfil y Sudán, GP(Z,IC,S)+NP, daba una respuesta
inmunitaria preestimulación comparable a la vacuna de un solo
plásmido. Además, se logró una protección completa frente a la
infección con Ébola de Zaire en cobayas que recibieron la vacuna
multivalente (Tabla I, sujetos 13-16). No se indujo
anticuerpo anamnéstico por la estimulación con virus, lo que
indicaba que la vacuna proporcionaba por sí misma una respuesta
inmunitaria suficiente para eliminar el virus eficazmente. Estos
descubrimientos muestran que la inmunización con plásmido
multivalente no disminuía sustancialmente la protección de
anticuerpo específica de glicoproteína (GP) ni su eficacia
protectora en un modelo de roedor.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Tabla
I
Comparación de inmunización genética
multivalente frente a monovalente en cobayas. Se inmunizaron
cobayas por vía intramuscular tres veces en intervalos de dos
semanas con 100 \mug de ADN (Plásmido, 100 \mug de p1012;
GP(Z), 100 \mug de pGP(Z); GP(Z) + NP, 75
\mug de pGP(Z) y 25 \mug de pNP; GP(Z,IC,S) + NP,
25 \mug de cada uno de pGP(Z), pGP(IC),
pGP(S) y pNP). Se recogió suero 6 semanas después de la
primera inyección y se midieron las titulaciones antes de
estimulación de los anticuerpos contra GP de Ébola (IgG ELISA) por
ELISA (Ksiazek, T.G. y col., 1992, J. Clin. Microbiol.
30:947-950) y se presentan como la inversa de la
dilución de punto final. Tres meses después de la inmunización
final, los animales se estimularon como se ha descrito (Xu, L. y
col., 1998, Nat. Med. 4:37-42).
Puesto que la protección en el modelo de roedor
de la infección por el virus de Ébola se correlacionaba con las
titulaciones de anticuerpos, y las respuestas humorales eficaces
pueden influir en el resultado clínico en enfermedades humanas
(Baize, S. y col., 1999, Nat. Med. 5:423-426;
Maruyama, T. y col., 1999, J. Virol.
73:6024-6030), los autores de la invención
consideraron importante provocar una respuesta humoral fuerte para
las vacunas ensayadas en primates, a pesar de que la inmunidad
mediada por célula es inducida de forma coordinada y probablemente
contribuye a la protección (Xu, L. y col., 1998, Nat. Med.
4:37-42). Recientemente, los regímenes de cebado
con ADN seguido de administración de vectores víricos han demostrado
respuestas inmunitarias potenciadas comparado con vacunas que usan
solo ADN (Sedegah, M. y col., 1998, PNAS USA
95:7648-7653; Hanke, T. y col., 1998, Vaccine
16:439-445; Robinson, H.L. y col., 1999, Nat.
Med. 5:526-534; Schneider, J. y col., 1998,
Nat. Med. 4:397-402). Los adenovirus
recombinantes de replicación deficiente se pueden hacer crecer a
altas titulaciones, infectar células que presentan antígeno e
inducir potentes respuestas inmunitarias (Davis, A. R y col., 1985,
PNAS USA 82:7560-7564; Natuk, R.J. y col.,
1992, PNAS USA 89:7777-7781; Xiang, Z.Q. y
col., 1996, Virology 219:220-227). Los
adenovirus han mostrado un efecto de refuerzo en ratones (Xiang,
Z.Q. y col., 1999, J. Immunol.
162:6716-6723), pero no se ha ensayado la eficacia
de la combinación de ADN y adenovirus en un modelo de estimulación
infecciosa, y todavía no se conoce el éxito de este procedimiento
en primates. Por lo tanto, los autores de la invención desarrollaron
un vector adenovírico recombinante que dirige niveles altos de
expresión de GP ADV-GP(Z) y usaron este
vector para ensayar si una estrategia de
cebado-refuerzo modificada aumentaría la respuesta
de anticuerpos al virus de Ébola, obtenida con el ADN desnudo solo.
Se inyectó a los ratones ADN y vectores de adenovirus
individualmente o en combinaciones y se evaluaron las respuestas
inmunitarias humorales y mediadas por células. Se encontró un
aumento de 10 a 100 veces en la titulación de anticuerpos en los
ratones a los que se había inyectado ADN seguido de refuerzo con
adenovirus, comparado con la inmunización sola con ADN (Fig. 47).
También se observó un aumento de las respuestas de células T
citotóxicas con esta combinación. La inmunización solo con
ADV-GP(Z) dio titulaciones de anticuerpos
que no eran significativamente diferentes de las obtenidas con la
inmunización con cebado con ADN y refuerzo con adenovirus. Estos
datos sugieren que la inmunogenicidad de la vacuna de ADN de GP de
Ébola en ratones mejora por el refuerzo con adenovirus recombinante
y que esta estrategia puede representar un procedimiento útil para
potenciar respuestas inmunitarias en primates no humanos.
Aunque el modelo de roedor ha sido útil en el
desarrollo de una estrategia de vacunación, el virus de Ébola
aislado de seres humanos debe adaptarse primero por múltiples pasos
secuenciales en roedores con el fin de producir una infección letal
en ratones o cobayas (Connolly, B.M. y col., 1999, J. Infect.
Dis. 179:S203-S217; Bray, M. y col., 1998,
J. Infect. Dis. 178: 651-661). Se cree que
los modelos de primates de infección por Ébola tienen un valor
predictivo mayor para la enfermedad humana y la protección
inmunitaria. Por lo tanto, los autores de la invención llevaron a
cabo estudios en primates no humanos usando una vacuna bimodal
ADN/ADV y la estrategia de plásmidos múltiples que se
correlacionaba con la protección en cobayas. Macacos Cynomolgus
(Macaca fascicularis) recibieron 3 inyecciones de vectores de ADN
desnudo en intervalos de 4 semanas (Fig. 48A) y, después de varios
meses de reposo en los que se ha mostrado que se refuerzan las
respuestas inmunitarias (Letvin, N.L. y col., 1997, PNAS USA
94:9378-9383), se reforzaron con adenovirus
recombinante que expresa sólo la glicoproteína de Zaire (Fig. 48A).
Los animales de control recibieron vectores vacíos (plásmido de ADN
y adenovirus recombinante ADV-AE1) y los animales
vacunados recibieron la vacuna de ADN multicomponente que contenía
NP y tres subtipos de GP de Ébola (pGP/NP), seguido de
ADV-GP(Z). Como se esperaba, no se pudieron
detectar anticuerpos anti-Ébola en el suero en animales de control,
pero en los animales que recibieron la vacuna de Ébola se detectó
una respuesta de anticuerpo específica de antígeno en la semana 12,
un mes después de la tercera inyección de ADN (Fig. 48B). Después
de refuerzo con adenovirus recombinante, las titulaciones de
anticuerpo aumentaron de 10 a 20 veces sobre los niveles obtenidos
con el ADN solo. Tres meses después de la inmunización final, los
niveles de anticuerpos permanecían altos, excepto para un animal
(sujeto 8) cuya titulación disminuyó ligeramente de 5x10^{4} a
1,3x10^{4}.
Después se examinaron las respuestas celulares
de primates a antígenos de Ébola con un ensayo de proliferación de
linfocitos in vitro. En los monos de control, la
proliferación de linfocitos específica de antígeno, medida por la
absorción de ^{3}H-timidina, era equivalente a la
de las células correspondiente, no estimuladas, dando como
resultado un índice de proliferación cercano a 1,0 para cada animal
(Fig. 48C). En comparación, las células mononucleares de sangre
periférica (CMSP) de animales inmunizados con la vacuna multivalente
mostraron una estimulación aumentada en 9 a 20 veces, demostrando
una respuesta inmunitaria fuerte al antígeno de Ébola a nivel
celular. La reducción drástica de linfocitos CD4 positivos redujo la
respuesta proliferativa estimulada por antígeno de las CMSP de
monos vacunados a los niveles observados en los animales de control
(Fig. 48D). Sin embargo, la reducción drástica de linfocitos CD8
positivos no afectaba a la proliferación de linfocitos específicos
de antígeno. Por lo tanto, el subconjunto de linfocitos CD4
positivos, que proporcionan la ayuda de células T necesaria para
las titulaciones de anticuerpos altas, contribuye a la respuesta
inmunitaria celular inducida por la vacuna.
Para determinar la eficacia protectora de este
régimen de vacunación, los monos se estimularon con una dosis letal
de la cepa de Mayinga salvaje del virus de Ébola del subtipo de
Zaire. En los monos de control, el análisis químico de la sangre
puso de manifiesto un aumento de las enzimas hepáticas (Figura 49A,
B) que es característico de la infección por el virus de Ébola
(Fisher-Hoch, S.P. y col., 1985, J. Infect.
Dis. 152:887-894). No se observó dicho aumento
en los sujetos vacunados. La elevación de la alanina
aminotransferasa (ALT) y la aspartato aminotransferasa (AST) en el
suero era paralela a un aumento espectacular de la viremia en todos
los animales de control (Fig. 49C). En comparación, no se observó un
aumento sustancial de la carga vírica en los monos vacunados. La
cinética del progreso de la enfermedad era similar entre los
animales de control, y la incidencia de la enfermedad era 100% en
este grupo. La muerte se produjo a los 5 y 6 días para 3 animales,
y se practicó la eutanasia en el último mono, moribundo, el día 7.
En comparación, 4 de 4 monos inmunizados con la vacuna de
combinación de ADN-adenovirus sobrevivieron a esta
estimulación letal del virus de Ébola, y se alcanzó la inmunidad
esterilizante en 3 de los 4 sujetos. El animal que quedaba mostró
una pequeña elevación transitoria del antígeno vírico; sin embargo,
cuando se hizo el seguimiento a largo plazo, ninguno de los
animales vacunados mostró signos o síntomas de infección, y no hubo
viremia detectable durante más de 6 meses después de la infección,
cuando se midió por detección con ELISA el antígeno vírico (Fig.
49A) y análisis de titulación de punto final del virus cultivado.
El receptor de vacuna (sujeto 8) que presentó un nivel bajo
transitorio de viremia el día 10, volvió a niveles indetectables el
día 17.
Puesto que no se conoce la reserva natural para
el virus de Ébola, el potencial para las medidas de salud públicas
tradiciones para prevenir futuros brotes es ilimitado, aumentado la
urgencia del desarrollo de una vacuna y productos terapéuticos en
seres humanos. Los presentes descubrimientos demuestran que los
primates pueden inmunizarse contra los efectos letales de la
infección por el virus de Ébola, y que la inmunidad esterilizante
se puede lograr usando una estrategia de
cebado-refuerzo heterólogo. Una vacuna genética de
multicomponentes que expresa proteínas estructurales del virus de
Ébola de aislados geográficos diversos generó una respuesta
inmunitaria fuerte específica de antígeno y dio como resultado la
supervivencia de los primates inmunizados después de estimulación
con una dosis letal de Ébola de Zaire, el subtipo de este virus
asociado con el mayor número de muertes en infecciones en seres
humanos. Los resultados de este estudio sugieren que la inmunidad
humoral y mediada por células T contribuye a la eliminación de virus
en primates no humanos, de acuerdo con los estudios previos en
roedores (Xu, L. y col., 1998, Nat. Med.
4:37-42; Wilson, J. y col., 2000, Science
287:1664-1666). Dos parámetros inmunitarios, la
titulación de anticuerpos (1:75,000 frente a <1:100, P= 0,001) y
la respuesta proliferativa celular (\sim12 veces frente a 1,4
veces, P= 0,0014), proporcionaron correlaciones inmunitarias de
protección significativamente altas. Los estudios que investigan las
correlaciones de protección inmunitaria de la infección por el
virus de Ébola en seres humanos se complican por la naturaleza
agresiva del virus y el nivel necesariamente alto del confinamiento
de bioseguridad. Con el modelo de inmunidad de primate presentado
aquí, se prevé que ahora sea posible elucidar los mecanismos de
protección inmunitaria para la infección por el virus de Ébola,
para avanzar en las terapias antivíricas de base inmunitaria, y
desarrollar una vacuna humana para este patógeno e incluso otras
causas infecciosas de fiebre hemorrágica.
\vskip1.000000\baselineskip
VRC 6000 VRC6000
(pVR1012-GP(Z)).
Cadena principal, pVR1012 (#450) que expresa la
glicoproteína de Ébola del subtipo Zaire. La orientación es
BamHI/EcoRI/EcoRV/BcoRIBg/II)
VRC 6001 VRC6001
(pVR1012x/s-GP(Z)) No hay más
descripción.
Es la misma que 6000, con la adición de un sitio
de restricción Sfi en la cadena principal de pVR1012.
VRC 6002 VRC6002
(pVR1012-GP(Z) delta MUC).
Se suprimió el dominio de tipo mucina de
GP(Z). Se suprimieron 530 pb de la cadena principal de
pVR1012 GP(Z), desde EarI(2844) a
BfaI(3374). Este mutante se puede unir al receptor de
Ébola.
VRC 6003 VRC6003
(pVR1012-GP(Z) delta MUC delta FUR).
Se suprimieron el dominio de tipo mucina y el
sitio de escisión de furina de GP(Z). Se suprimieron 539 pb
de la cadena principal de pVR1012 GP(Z), desde
EarI(2844) a EarI(3437). La proteína
tiene propiedades similares a pVR1012-GP(Z)
delta MUC.
VRC 6004 VRC6004
(pVR1012-GP(Z) delta GP2).
Se suprimió la mayor parte de la región GP2 en
GP(Z). Se suprimieron 430 pb de la cadena principal de
pVR1012-GP(Z), desde BclI(3414)
a BspEI(3844). Se retuvo la región TM
(transmembrana).
VRC 6005 VRC6005
(pVR1012-GP(Z) delta GP2 delta
C-term A).
Es una deleción C-terminal de
GP2. Se suprimieron 267 pb de la cadena principal de
pVR1012-GP (Z), desde MscI(3623) a
BspMI(3890).
VRC 6006 VRC6006
(pVR1012-GP(Z) delta GP2 delta
C-term B).
Es una deleción menor de GP2
C-terminal. Se suprimieron 110 pb de la cadena
principal de pVR1012-GP(Z) desde
BstXI(3780) a BspMI(3890).
VRC 6007 VRC6007
(pVR1012-GP(Z) delta GP2 delta FUS).
Se suprimió el péptido de fusión en GP2 de
GP(Z) en este mutante, usando la PCR. Se suprimieron 47 pb de
la cadena principal pVR1012-GP(Z), desde
(3508-3555).
VRC 6008 VRC6008
(pVR1012-GP(Z) delta TM).
En este mutante se truncó la región TM de
GP(Z). Se añadió un codón de parada (TGA) secuencia abajo del
sitio BspMI (3889). Esta proteína es secretada y no forma un
trímero.
VRC 6052 VRC 6052
(pVR1012-GP(Z) delta sGP).
Se suprimió la mayor parte de la región de
homología SGP/GP. Se suprimieron 687 pb de la cadena principal de
pVR1012-GP(Z), desde
HincII(2083) a HincII(2270).
VRC6101 VRC 6101 (pVR1012x/s Ebola
GP(R)(dTM)).
El vector expresa la glicoproteína de Ébola
(subtipo Reston) sin sus dominios de transmembrana e intracelular.
Usando la PCR, se generó un codón de parada secuencia abajo del aa
650 de GP(R), seguido de un sitio XbaI. Esta proteína
puede ser secretada y se llama GP(R)(dTM).
VRC 6110 VRC 6110 (pAdApt Ebola
GP(R)(dTM)).
Un vector lanzadera adenovírico que expresa la
glicoproteína del virus de Ébola (subtipo Reston) sin sus dominios
de transmembrana e intracelular. Usando la PCR se generó un codón de
parada secuencia abajo del aa 651 de GP(Reston), seguido de
un sitio XbaI. El adenovirus recombinante resultante expresa
una glicoproteína secretada de 651 aa llamada GP(R)(dTM).
VRC 6200 VRC6200
(pVR1012-GP(S))
Cadena principal, pVR1012(#450), que expresa la
glicoproteína de Ébola de subtipo Sudán. La orientación es
EcoRI/EcoRV/BamHI\BamHI\BamHI\XbaI.
VRC 6201 VAC 6201 (pVR1012x/s Ebola
GP(S)).
No hay más descripción, pero es la misma que
6200 con la adición de un sitio Sfi en la cadena principal en
1012.
VRC 6202 VRC6202
(pVR1012-GP(S) delta TM).
En este mutante se truncó la región TM de
GP(S). Se añadió un codón de parada (TGA) secuencia abajo del
sitio BspMI(xxx). Esta proteína es secretada y no
forma un trímero.
VRC 6300
VRC6300(pVR1012-GP(IC)).
Cadena principal, pVR1012(#450), que expresa la
glicoproteína de Ébola de subtipo Costa de Marfil. La orientación es
EcoRI/EcoRV/BamHI/BamHI/BamHI/XbaI.
VRC 6301 VRC6301
(pVR1012x/s-GP(IC)).
No hay más descripción, pero es la misma que
6300 con la adición de un sitio Sfi en la cadena principal 1012.
VRC 6302 VRC6302
(pVR1012-GP(IC) delta TM).
En este mutante se truncó la región
GP(IC). Se añadió un codón de parada (TGA) secuencia abajo
del sitio BspMI. Esta proteína es secretada y no forma un
trímero.
VRC 6303 VRC 6303 (pVR1012x/s Ebola GP
(IC) (dTM)).
Un vector basado en pVRC2000 que expresa la
glicoproteína de Ébola (subtipo de Costa de Marfil) sin dominios de
transmembrana e intracelular. Usando la PCR, se generó un codón de
parada secuencia abajo del aa 650, seguido de un sitio BglII.
El vector expresa una glicoproteína secretada de 650 aa (aa 1 - aa
650).
VRC 6310 VRC 6310 (pAdApt Ebola GP (IC)
(dTM)).
Un vector lanzadera adenovírico que expresa la
glicoproteína de Ébola (subtipo de Costa de Marfil) sin sus dominios
de transmembrana e intracelular. Usando la PCR se generó un codón de
parada secuencia abajo del aa 651 de GP(IC). El adenovirus
recombinante resultante expresa una glicoproteína secretada de 651
aa llamada GP(IC)(dTM).
VRC 6351 VRC6351
(pVR1012x/s-sGP(IC)). No hay más
descripción.
VRC 6400 VRC6400
(pVR1012-NP).
Cadena principal, pVR1012(#450) que expresa la
nucleoproteína de Ébola del subtipo de Costa de Marfil.
VRC 6401 VRC6401
(pVR1012x/s-NP).
No hay más descripción, pero es la misma que
6400 con la adición de un sitio Sfi en la cadena principal 1012.
VRC 6500 VRC6500
(pVR1012-VP35).
La cadena principal es pVR1012(#450). El inserto
es VP35 de Ébola clonado a partir de pGEM
3Zf(+)VP35
(#1213).
(#1213).
VRC 6600 VRC6600
(pAD/CMV-GP(dTM)(Z-CITE-S).
No hay más descripción.
VRC 6601 VRC6601 (pAdApt Ebola
GP(S)). No hay más descripción.
VRC 6602 VRC 6602 (pAdApt Ebola
GP(S)(dTM)).
Un vector lanzadera adenovírico que expresa la
glicoproteína del virus de Ébola (subtipo de Sudán) sin sus dominios
de transmembrana e intracelular. Se fusionó un codón de parada
secuencia abajo del aa 650 de GP(S). El adenovirus
recombinante resultante expresa una glicoproteína secretada de 654
aa llamada GP(S)(dTM).
VRC 6603 VRC6603 (pAdApt Ebola
GP(Z)). No hay más descripción.
VRC 6604 VRC 6604 (pAdApt Ebola
GP(Z)(dTM)).
Un vector lanzadera adenovírico que expresa la
glicoproteína del virus de Ébola (subtipo de Zaire) sin sus dominios
de transmembrana e intracelular. Se fusionó un codón de parada
secuencia abajo del aa 651 de GP(Z). El adenovirus
recombinante resultante expresa una glicoproteína secretada de 655
aa llamada GP(Z)(dTM).
VRC6701 VRC6701
(pVR1012-Marburg).
Marco de lectura abierto de la glicoproteína de
Marburg (GP), cepa Musoke. Marburg se clonó en la cadena principal
#450(Sam(romo)/XbaI) a partir de VRC6700
(Xba/PvuII).
VRC 6702 VRC 6702 (pVR1012x/s Marburg GP
(dTM)).
Este vector expresa la glicoproteína del virus
de Marburg sin sus dominios de transmembrana e intracelular. Usando
la PCR se generó un codón de parada secuencia abajo del aa 650 de
GP(Marburg), seguido de un sitio BglII. Esta proteína
puede ser secretada y se denomina GP(Marburg)(dTM).
VRC 6710 VRC 6710 (pAdApt Marburg GP
(dTM)).
Un vector lanzadera adenovírico (pVRC1290) que
expresa la glicoproteína del virus de Marburg sin sus dominios de
transmembrana e intracelular. Usando la PCR se generó un codón de
parada secuencia abajo del aa 650, seguido de un sitio BglII.
El adenovirus recombinante resultante expresa una proteína secretada
de 650 aa (aa 1 - aa 650).
VRC 6800 VRC6800 (pVR1012x/s Lassa GP).
No hay más descripción.
VRC 6801 VRC6801 (pVR1012x/s Lassa GP
(dTM)). No hay más descripción.
VRC 6810 VRC6810 (pAdApt Lassa GP). No
hay más descripción.
VRC 6811 VRC6811 (pAdApt Lassa GP (dTM)).
No hay más descripción.
\vskip1.000000\baselineskip
Construcción de vector. La construcción
de vectores de ADN que expresan la glicoproteína (GP), GP secretada
(SGP) y nucleoproteína (NP) de Ébola de Zaire, han sido descritos
por Xu, L. y col., 1998 Nat. Med. 4:37-42.
Los vectores de expresión de GP de Sudán y costa de Marfil se
construyeron de forma similar. Brevemente, se generaron los marcos
de lectura abiertos de GP a partir de la reacción en cadena de la
polimerasa después de transcripción inversa de los productos de ARN
(RT-PCR) de ARN de célula infectada, usando los
cebadores: 5' ATC TTC AGG ATC TCG CCA TGG A 3' (gen GP de Sudán;
NcoI > ATG; ID SEC Nº: 44), 5' GAT ATT CAA CAA AGC AGC
TTG CAG 3' (gen GP de Sudán; parada GP extremo C; ID SEC Nº: 45), 5'
CTA ATC ACA GTC ACC ATG GGA 3' (gen GP de Costa de Marfil;
NcoI > ATG; ID SEC Nº: 46), 5' AAA GTA TGA TGC TAT ATT
AGT TCA 3' (gen GP de Costa de Marfil; parada GP extremo C; ID SEC
Nº: 47) dando los clones TA PCR2.1 Sudán y PCR2.1 Costa de Marfil.
La glicoproteína de Sudán se hizo digerir del plásmido PCR2.1 con
XbaI>HindIII, se trató con Klenow y se clonó en el
sitio XbaI de p1012 (Xu, L. y col., 1998, Nat. Med.
4:37-42). La GP de Costa de Marfil se hizo digerir
del plásmido PCR2.1 con EcoRI, se trató conKlenow, y se clonó
en el sitio XbaI de p1012 (Xu, L. y col., 1998, Nat.
Med. 4:37-42).
Para hacer ADV-GP, el fragmento
BamHI/EcoRI de GP(Z) se hizo digerir de
pGEM-3Zf(-)-GP, se trató con
Klenow, y se insertó en el plásmido pRc/CMV tratado con
HindIII/XbaI/Kle/CIP. El plásmido resultante
(PRC/CMV-GP(Z)) se hizo digerir con
NruI/DraIII y se trató con Klenow. El fragmento
NruI/DraIII/Kle que contenía el potenciador de CMV,
ADN de GP(Z) y la señal de poliadenilación de la hormona de
crecimiento bovina se insertó en el sitio BglII del plásmido
lanzadera adenovírico pAdBgIII (Ohno, T. y col., 1994,
Science 265:781-784). El adenovirus, un
vector Ad5 basado en dl 309 de primera generación, contenía una
deleción en E1 para hacer el vector de replicación deficiente y una
deleción/sustitución parcial en E3, que altera las secuencias
codificantes para las proteínas E3 con una masa molecular relativa
de 14,7 kD, 14,5 kD y 10,4 kD, respectivamente. El adenovirus
recombinante que expresaba la GP de Zaire,
ADV-GP(Z), se hizo de acuerdo con los
procedimientos previamente publicados (Aoki, K. y col., 1999,
Mol. Med. 5:224-231). La dosis de adenovirus
administrada, 10^{10} unidades formadoras de placa (UFP) por
animal (aproximadamente 3 x 10^{9} UFP/kg), está dentro del
intervalo usado con seguridad en ensayos de terapia génica
humana.
Seguridad y estudio en animales. Se
usaron 8 macacos cynomolgus (Macaca fascicularis), de 3 años
de edad y que pesaban 2-3 kg, obtenidos de Covance
(Princeton, NJ), para el experimento de inmunización y estimulación.
Para obtener muestras de sangre y administrar las vacunas, los
monos se anestesiaron con ketamina. Los animales se alojaron por
separado y recibieron enriquecimiento regular de acuerdo con la Guía
para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (DHEW Nº NIH
86-23). Justo antes de la estimulación con el virus
de Ébola y hasta el final del experimento, los animales se
mantuvieron en el Laboratorio de confinamiento máximo
(BSL-4) y se alimentaron y examinaron diariamente.
Se practicó la eutanasia en un animal que apareció moribundo y
posteriormente se hizo la necropsia para el examen patológico.
Además se practicó la eutanasia en un animal vacunado asintomático
para el análisis patológico y virológico.
Inmunización de ratón. Se construyeron
los vectores de ADN y adenovirus que expresaban la GP o NP de Ébola
de Zaire como se ha descrito previamente (Xu, Ly col., 1998, Nat.
Med. 4:37-42; Ohno, T. y col., 1994,
Science 265:781-784), con la expresión génica
controlada por el potenciador y promotor de citomegalovirus. Los
ratones se inmunizaron por vía intramuscular con 100 \mug de ADN
(pGP o un plásmido de control p1012) o 10^{8} UFP de adenovirus
(ADV-GP o virus de control
ADV-\DeltaE1) los días 0, 14, y 28 y se recogió
sangre el día 28. El día 42, los ratones recibieron un refuerzo
intramuscular con ADN o adenovirus y se midieron las titulaciones
el día 56. Las titulaciones de IgG de ELISA se determinaron usando
placas de 96 pocillos recubiertas con una preparación de antígeno
del virus de Ébola derivado de viriones purificados y enriquecidos
en las proteínas asociadas a membrana (GP, VP40 y VP24) (Ksiazek,
T.G. y col., 1992, J. Clin. Microbiol.
30:947-950). La unión específica de antígeno se
detectó usando un conjugado de IgG antihumana de cabra
(H+L)-peroxidasa de rábano y ABTS/Peróxido
(sustrato/indicador).
Inmunización de macaco. Para las
inmunizaciones con ADN, los animales recibieron 1 mg de cada uno de
los ADN que expresan GP(Zaire) [GP(Z)],
GP(Costa de Marfil) [pGP(IC)], GP(Sudán)
[pGP(S)] y NP(Zaire) administrados como una mezcla
[pGP/NP], o 4 mg de plásmido de control vacío [pGP(Z)]
bilateralmente (2 mg por lado) en el músculo deltoides. La
inmunización las semanas 0 y 4 fueron por inyección IM, y la semana
8 por Biojector. Para el refuerzo con adenovirus, los animales
recibieron 10^{10} UFP de ADV-GP (subtipo de
Zaire) o ADV-\DeltaE1 (vector vacío) dividido en
dos dosis administradas bilateralmente en el músculo deltoides. La
semana 32, todos los animales recibieron una inyección
intraperitoneal de aproximadamente 6 UFP de virus de Ébola (aislado
1976 Zaire; cepa Mayinga) (Kiley, M.P. y col., 1980, J. Gen.
Virol. 49:333-341) en 1 ml de solución salina
tamponada de Hanks. El virus se aisló directamente de la sangre de
paciente y se usó después de un solo paso en células Vero.
Las titulaciones de IgG de ELISA se determinaron
como antes para el control (Plásmido: ADV-AE1) y los
monos inmunizados [pGP/NP: ADV-GP(Z)]. La
dilución de punto final inversa para cada sujeto fue en la semana 12
y semana 24. Los niveles de anticuerpos en el suero se midieron por
ELISA como se ha descrito (Ksiazek, T.G. y col., 1992, J. Clin.
Microbiol. 30:947-950).
Se recogió sangre de los animales de control
(plásmido: ADV-\DeltaE1) o inmunizados [pGP/NP:
ADV-GP(Z)] 1-3 días antes de
las inmunizaciones en las semanas 4, 8 y 20 y la semana 24. Se
separó sangre por un gradiente Percoll para obtener la población
enriquecida en linfocitos. Los linfocitos se estimularon como se ha
descrito (Xu, L. y col., 1998, Nat. Med.
4:37-42) durante 5 días in vitro usando el
líquido sobrenadante de células transfectadas con glicoproteína
secretada (SGP) de Ébola o plásmido vacío, y se midió la
proliferación por la absorción de ^{3}H-timidina.
Se calculó el índice de proliferación como la proliferación en los
pocillos que recibían SGP dividido entre la proliferación en los
pocillos que recibían el líquido sobrenadante de control.
Detección vírica en macacos. La presencia
de antígeno del virus de Ébola en la circulación se detectó como se
ha descrito (Ksiazek, T.G. y col., 1992, J. Clin. Microbiol.
30:947-950) capturando la proteína VP40 de
diluciones seriadas de plasma de mono. Se usaron placas de 96
pocillos recubiertas con mAb antiVP40 para capturar el antígeno, y
la detección se hizo con un suero de virus anti-Ébola de conejo.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de aminoácidos de
GP(Zaire) y NP(Zaire) de Ébola se obtuvieron de
Genbank: GP(Zaire), nº de acceso de Genbank P87666;
NP(Zaire), nº de acceso de Genbank NC_002549; mientras que
GP(Sudán/Gulu) se obtuvo de CDC. Después las secuencias de
aminoácidos se volvieron a traducir a secuencias de ADN usando
codones de referencia de mamífero. Se prepararon oligonucleótidos
seriados de 75 pb con 25 pb que se superponían para cubrir el gen
entero. Después los oligonucleótidos se ensamblaron en genes de
mamífero intactos que contenían los codones preferidos usando la
PCR. En el diseño, se introdujo un codón de parada opuesto a los
dominios de transmembrana previstos de GP(Zaire) (aa
648-676) y GP (Sudán/Gulu) (aa
648-676) de modo que esta región era excluida de
los genes creados sintéticamente. Las deleciones también condujeron
a la pérdida de una región citoplasmática de 4 aa en ambas
construcciones. La secuenciación final de la secuencia de
GP(Zaire) de Ébola puso de manifiesto 10 aminoácidos
divergentes respecto a la secuencia de GP de laboratorio, que se usó
en los estudios de animales y estos se corrigieron por mutagénesis
dirigida al lugar. Estos insertos se clonaron en p1012 x/s por
XbaI/SalI.
\newpage
La forma de dominio de transmembrana suprimido,
modificado por codón, del gen de GP de Ébola (Sudan/ Gulu) se
escindió de p1012 (x/s)-GP(S/G)(\DeltaTM)/h
usando SalI/KpnI y se insertó en el plásmido CMV/R/MCS
digerido con SalI/KpnI.
\vskip1.000000\baselineskip
La forma de dominio de transmembrana suprimido,
modificado por codón, del gen de GP de Ébola (Zaire) se escindió de
p1012 x/s-GP(Z)(\DeltaTM)/h, sitios
SalI/BglII, y se clonó en los sitios
SalI/BglII del plásmido CMV/R.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento ArotI-KpnI de VRC6400
(pVR1012-NP) que expresaba la nucleoproteína de
Ébola de subtipo Zaire se escindió y se clonó en los sitios
NotI/KpnI del plásmido CMV/R.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta invención proporciona un vector de
expresión de mamífero mejorado que genera un nivel más alto de
expresión de proteína que los vectores usados habitualmente.
Inicialmente, se desarrollaron y ensayaron 3
nuevos vectores, conteniendo cada uno un potenciador distinto. El
potenciador de RSV, el potenciador de ubiquitina de ratón (mUBB) y
el potenciador de CMV (Xu y col., 1998, Nature Med.
4:37-42) se combinaron cada uno con la región HTL
V-1 R (Takebe y col., 1988, Mol. Cell Biol.
8:466-472) para crear vectores separados. Cuando
estos 3 vectores se compararon con la cadena principal que contenía
el potenciador de CMV combinado con el potenciador de traducción y
el intrón (CMVint) de CMV, que actualmente es el vector más eficaz,
los datos in vitro mostraron que la expresión con el vector
que contenía CMV/R había aumentado 5-10 veces
comparado con CMV/int y los estudios inmunológicos mostraron una
inducción significativamente mayor de respuestas de células T CD4 y
CD8 comparado con CMVint. Tanto las respuestas in vivo como
in vitro eran notablemente más altas con este nuevo vector.
Ninguno de los otros dos vectores produjo resultados
comparables.
El vector de expresión es único en cuanto que
usa un potenciador de la traducción específico combinado con
potenciador/promotores específicos para dar altos niveles de
expresión e inmunogenicidad potenciada para las vacunas de ADN.
Esto es particularmente importante porque la potencia de estas
vacunas en seres humanos es marginal y las mejoras genéricas pueden
servir como plataformas importantes para hacer que la tecnología sea
práctica para uso humano. Los casetes de vectores de expresión se
pueden usar en otras vacunas basadas en genes así como, o para la
producción de proteínas recombinantes de vectores de expresión
eucariotas. La invención es útil en la producción de vacunas
genéticas y terapias génicas para una amplia variedad de
enfermedades, incluyendo el VIH y otras enfermedades víricas y
cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
50
Se transfectaron células 3T3 de fibroblastos de
ratón con el vector (A) solo (carril 1),
CMVint-gp-145(dCFI) (carril
2), CMV/R-gp145(dCFI) (carril 3) o (B)
mUBB-gp145(dCFI) (carril 4),
mUBB/R-gp145(dCFI) (carril 5) en discos de
cultivo tisular de 6 pocillos con 0,5 \mug de los plásmidos
correspondientes usando fosfato cálcico. 24 horas después de la
transfección, las células se recogieron y se lisaron en tampón de
lisis (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, NP-40 al 1%),
cóctel de inhibidor de proteasa Mini Complete (Roche)). Se separaron
10 \mug de proteína total de cada muestra en un gel de gradiente
al 4-15% usando SDS-PAGE, seguido de
transferencia de proteína y análisis de transferencia Western. Se
usó IDV-IgG humana (1:5000) como el anticuerpo
primario, e IgG antihumana de cabra conjugada con HRP (1:5000) como
el anticuerpo secundario. La membrana se reveló usando el sistema
de revelado de transferencia Western ECL. Las flechas indican la
banda específica para la poliproteína HIV Env gp
145(\DeltaCFI).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
51
Se inmunizaron cinco ratones en cada grupo con
50 \mug del ADN plasmídico indicado en las semanas 0, 2 y 6. 10
días después de la última inyección, se recogieron los esplenocitos
de cada ratón y se estimularon usando una mezcla de péptidos de
control (oligómeros de 15 miembros), o una mezcla de péptidos de HIV
Env (oligómeros de 15 miembros) durante 6 horas. Los esplenocitos
estimulados se tiñeron usando un cóctel de anticuerpos que
contenían CD3 PE-antiratón, CD4
PeiCP-antiratón, CD3
APC-anti-ratón,
IFN-\gamma
FITC-anti-ratón y
TNF-\alpha
FITC-anti-ratón. Las muestras se
analizaron por citometría de flujo. Se midieron los números de
células positivas para
CD3/CD4/IFN-\gamma/TNF-\alpha y
CD3/CD8/IFN-\gamma/TNF-\alpha
usando el software FloJo (Treestar).
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de potenciador/promotor de CMV,
región R (HTVL-1), aceptor de religación CMV IE (ID
SEC Nº: 52):
1-741: Potenciador/Promotor de
CMV
742-972: Región R de
HTLV-1
973-1095: Aceptor de religación
CMV/IE
Los aspectos adicionales descritos en el
presente documento se caracterizan mejor en los siguientes
puntos:
1. Una composición de cebado y una composición
de refuerzo bimodal para cebar y reforzar una respuesta inmunitaria
a un antígeno en un individuo, que comprende (1) una composición de
cebado compuesta de un plásmido de ADN que comprende una molécula
de ácido nucleico que codifica la glicoproteína o nucleoproteína del
virus de Ébola, Marburg, Lassa, retrovirus, paramixovirus o
influenza, o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un
plásmido de ADN tomado de la Tabla 2 o su inserto, o un análogo del
mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, y (2) una
composición de refuerzo compuesta de un adenovirus de replicación
deficiente que comprende una molécula de ácido nucleico que
codifica la glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola,
Marburg, Lassa, retrovirus, paramixovirus o influenza, o el dominio
del mismo que lleva el epítopo, o un adenovirus de replicación
deficiente tomado de la Tabla 2 o su inserto, o un análogo del
mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, para producir
dicho antígeno por expresión de dicho plásmido de ADN y adenovirus
de replicación deficiente, de modo que se refuerce una respuesta
inmunitaria al antígeno previamente cebado en el individuo.
2. Una composición de cebado y una composición
de refuerzo bimodal para cebar y reforzar una respuesta inmunitaria
a un antígeno en un individuo, que comprende (1) una composición de
cebado compuesta de un plásmido de ADN que comprende una molécula
de ácido nucleico que codifica la glicoproteína o nucleoproteína del
virus de Ébola, Marburg o Lassa, o el dominio del mismo que lleva
el epítopo, o un plásmido de ADN tomado de la Tabla 2 o su inserto,
o un análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, y
(2) una composición de refuerzo compuesta de un adenovirus de
replicación deficiente que comprende una molécula de ácido nucleico
que codifica la glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola,
Marburg o Lassa, o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un
adenovirus de replicación deficiente tomado de la Tabla 2 o su
inserto, o un análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el
mismo, para producir dicho antígeno por expresión de dicho plásmido
de ADN y adenovirus de replicación deficiente, de modo que se
refuerce una respuesta inmunitaria al antígeno previamente cebado en
el individuo.
3. Una composición de cebado y una composición
de refuerzo bimodal para cebar y reforzar una respuesta inmunitaria
a un antígeno en un individuo, que comprende (1) una composición de
cebado compuesta de una primera construcción genética que comprende
una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína o
nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa, o el dominio
del mismo que lleva el epítopo, o un análogo del mismo que es al
menos 95% idéntico con el mismo, y (2) una composición de refuerzo
compuesta de una segunda construcción genética que comprende una
molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína o
nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa, o el dominio
del mismo que lleva el epítopo, o un análogo del mismo que es al
menos 95% idéntico con el mismo, o la glicoproteína o
nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa producida de
forma recombinante o el dominio del mismo que lleva el epítopo o un
análogo que es 95% idéntico con el mismo, en el que la primera
construcción genética se coge del grupo que consiste en ADN
plasmídico, adenovirus de replicación deficiente, virus vaccinia de
replicación deficiente, virus de viruela aviar recombinante y
herpesvirus recombinante, y en el que la segunda construcción
genética se coge del grupo que consiste en adenovirus de replicación
deficiente, virus vaccinia de replicación deficiente, virus de
viruela aviar recombinante y herpesvirus recombinante, para
producir dicho antígeno por expresión de dicha primera construcción
genética y dicha segunda construcción genética, de modo que se
refuerce una respuesta inmunitaria al antígeno previamente cebado en
el individuo.
4. Un método para reforzar una respuesta
inmunitaria a un antígeno en un individuo, que comprende
proporcionar a dicho individuo una composición de refuerzo
compuesta de un adenovirus de replicación deficiente que comprende
una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína o
nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg, Lassa, retrovirus,
paramixovirus o influenza, o el dominio del mismo que lleva el
epítopo, o un adenovirus de replicación deficiente tomado de la
Tabla 2 o su inserto, o un análogo del mismo que es al menos 95%
idéntico con el mismo, para producir dicho antígeno por expresión
de dicho adenovirus de replicación deficiente, de modo que se
refuerce una respuesta inmunitaria al antígeno previamente cebado en
el individuo.
5. Un método para reforzar una respuesta
inmunitaria a un antígeno en un individuo, que comprende
proporcionar a dicho individuo una composición de refuerzo
compuesta de un adenovirus de replicación deficiente que comprende
una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína o
nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa, o el dominio
del mismo que lleva el epítopo, o un adenovirus de replicación
deficiente tomado de la Tabla 2 o su inserto, o un análogo del
mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, para producir dicho
antígeno por expresión de dicho adenovirus de replicación
deficiente, de modo que se refuerce una respuesta inmunitaria al
antígeno previamente cebado en el individuo.
6. Un método de refuerzo de una respuesta
inmunitaria a un antígeno en un individuo que comprende proporcionar
a dicho individuo una composición de refuerzo compuesta de una
segunda construcción genética que comprende una molécula de ácido
nucleico que codifica la glicoproteína o nucleoproteína del virus de
Ébola, Marburg o Lassa, o el dominio del mismo que lleva el epítopo
o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, o la
glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa
producida de forma recombinante o el dominio del mismo que lleva el
epítopo o análogo del mismo que es 95% idéntico con el mismo, para
producir dicho antígeno por expresión de dicho adenovirus de
replicación deficiente, en el que la segunda construcción genética
se toma del grupo que consiste en adenovirus de replicación
deficiente, virus vaccinia de replicación deficiente, virus de
viruela aviar recombinante y herpesvirus recombinante, de modo que
se refuerza una respuesta inmunitaria al antígeno previamente
cebado en el individuo durante la producción de dicho antígeno por
expresión de una primera construcción genética, y en el que la
primera construcción genética se toma del grupo que consiste en ADN
plasmídico, adenovirus de replicación deficiente, virus vaccinia de
replicación deficiente, virus de viruela aviar recombinante y
herpesvirus recombinante.
7. Un método para inducir una respuesta
inmunitaria a un antígeno en un individuo que comprende proporcionar
a dicho individuo una composición de cebado que comprende un
plásmido de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico que
codifica una glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola,
Marburg, Lassa, retrovirus, paramixovirus o influenza, o el dominio
del mismo que lleva el epítopo, o un ADN plasmídico tomado de la
Tabla 2 o su inserto o un análogo del mismo que es al menos 95%
idéntico con el mismo y después proporcionar a dicho individuo una
composición de refuerzo compuesta de un adenovirus de replicación
deficiente que comprende una molécula de ácido nucleico que
codifica una glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola,
Marburg, Lassa, retrovirus, paramixovirus o influenza, o el dominio
del mismo que lleva el epítopo, o un adenovirus de replicación
deficiente tomado de la Tabla 2 o su inserto, o un análogo del mismo
que es al menos 95% idéntico con el mismo, para producir dicho
antígeno por expresión de dicho plásmido de ADN y adenovirus de
replicación deficiente, de modo que se refuerce una respuesta
inmunitaria al antígeno previamente cebado en el individuo.
8. Un método para inducir una respuesta
inmunitaria a un antígeno en un individuo que comprende proporcionar
a dicho individuo una composición de cebado que comprende un
plásmido de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico que
codifica una glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola,
Marburg o Lassa, o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un
ADN plasmídico tomado de la Tabla 2 o su inserto, o un análogo del
mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, y después
proporcionar a dicho individuo una composición de refuerzo
compuesta de un adenovirus de replicación deficiente que comprende
una molécula de ácido nucleico que codifica una glicoproteína o
nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa, o el dominio del
mismo que lleva el epítopo, o un adenovirus de replicación
deficiente tomado de la Tabla 2 o su inserto, o un análogo del mismo
que es al menos 95% idéntico con el mismo, para producir dicho
antígeno por expresión de dicho plásmido de ADN y adenovirus de
replicación
deficiente, de modo que se refuerce una respuesta inmunitaria al antígeno previamente cebado en el individuo.
deficiente, de modo que se refuerce una respuesta inmunitaria al antígeno previamente cebado en el individuo.
9. Un método para inducir una respuesta
inmunitaria a un antígeno en un individuo que comprende proporcionar
a dicho individuo una composición de cebado que comprende una
primera construcción genética que comprende una molécula de ácido
nucleico que codifica una glicoproteína o nucleoproteína del virus
de Ébola, Marburg o Lassa, o el dominio del mismo que lleva el
epítopo, o un análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el
mismo, y después proporcionar a dicho individuo una composición de
refuerzo compuesta de una segunda construcción genética que
comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una
glicoproteína o nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa,
o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un análogo del mismo
que es al menos 95% idéntico con el mismo, o glicoproteína o
nucleoproteína del virus de Ébola, Marburg o Lassa producida de
forma recombinante o el dominio del mismo que lleva el epítopo, o un
análogo del mismo que es al menos 95% idéntico con el mismo, en el
que la primera construcción genética se coge del grupo que consiste
en ADN plasmídico, adenovirus de replicación deficiente, virus
vaccinia de replicación deficiente, virus de viruela aviar
recombinante y herpesvirus recombinante, y en el que la segunda
construcción genética se coge del grupo que consiste en adenovirus
de replicación deficiente, virus vaccinia de replicación deficiente,
virus de viruela aviar recombinante y herpesvirus recombinante,
para producir dicho antígeno por expresión de dicha primera
construcción genética y dicha segunda construcción genética, de modo
que se refuerce una respuesta inmunitaria al antígeno previamente
cebado en el individuo.
10. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Zaire o
el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es
al menos 95% idéntico al mismo.
11. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Sudán o
el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es
al menos 95% idéntico al mismo.
12. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Costa de
Marfil o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del
mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
13. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Reston o
el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es
al menos 95% idéntico al mismo.
14. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la glicoproteína de Marburg o el
dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al
menos 95% idéntico al mismo.
15. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Zaire o
el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es
al menos 95% idéntico al mismo.
16. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Sudán o
el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es
al menos 95% idéntico al mismo.
17. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Costa de
Marfil o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del
mismo que es al menos 95% idéntico al mismo.
18. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Reston o
el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es
al menos 95% idéntico al mismo.
19. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la nucleoproteína de Marburg o el
dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al
menos 95% idéntico al mismo.
20. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Zaire o
el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es
al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína tiene
una deleción interna o de carboxi para suprimir el dominio de tipo
mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de
fusión, el dominio de repetición de héptadas, el dominio de anclaje
de transmembrana o el dominio intracelular.
21. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Sudán o
el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es
al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína tiene
una deleción interna o de carboxi para suprimir el dominio de tipo
mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de
fusión, el dominio de repetición de héptadas, el dominio de anclaje
de transmembrana o el dominio intracelular.
22. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Costa de
Marfil o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del
mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la
glicoproteína tiene una deleción interna o de carboxi para suprimir
el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el
dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas,
el dominio de anclaje de transmembrana o el dominio
intracelular.
23. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la glicoproteína del Ébola de Reston o
el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es
al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína tiene
una deleción interna o de carboxi para suprimir el dominio de tipo
mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de
fusión, el dominio de repetición de héptadas, el dominio de anclaje
de transmembrana o el dominio intracelular.
24. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la glicoproteína de Marburg o el
dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al
menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína tiene una
deleción interna o de carboxi para suprimir el dominio de tipo
mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de
fusión, el dominio de repetición de héptadas, el dominio de anclaje
de transmembrana o el dominio intracelular.
25. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Zaire o
el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es
al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína está
truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de anclaje
de tranmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo
carboxi para suprimir el dominio de repetición de héptadas y el
dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada
en el extremo carboxi para suprimir el dominio de péptido de
fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje
de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo
carboxi para suprimir el sitio de escisión de furina, el dominio de
péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio
de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el
extremo carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de
escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de
repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e
intracelular.
26. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Sudán o
el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es
al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína está
truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de anclaje
de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo
carboxi para suprimir el dominio de repetición de héptadas y el
dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada
en el extremo carboxi para suprimir el dominio de péptido de
fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje
de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo
carboxi para suprimir el sitio de escisión de furina, el dominio de
péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio
de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el
extremo carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de
escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de
repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e
intracelular.
27. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Costa de
Marfil o el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del
mismo que es al menos 95% idéntico al mismo, en el que la
glicoproteína está truncada en el extremo carboxi para suprimir el
dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada
en el extremo carboxi para suprimir el dominio de repetición de
héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o
está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de
péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio
de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el
extremo carboxi para suprimir el sitio de escisión de furina, el
dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y
el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está
truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de tipo
mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de
fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje
de transmembrana e intracelular.
28. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la nucleoproteína del Ébola de Reston o
el dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es
al menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína está
truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de anclaje
de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo
carboxi para suprimir el dominio de repetición de héptadas y el
dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada
en el extremo carboxi para suprimir el dominio de péptido de
fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje
de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo
carboxi para suprimir el sitio de escisión de furina, el dominio de
péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio
de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el
extremo carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de
escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de
repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e
intracelular.
29. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o primera construcción genética comprende una molécula de
ácido nucleico que codifica la nucleoproteína de Marburg o el
dominio del mismo que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al
menos 95% idéntico al mismo, en el que la glicoproteína está
truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de anclaje
de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo
carboxi para suprimir el dominio de repetición de héptadas y el
dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada
en el extremo carboxi para suprimir el dominio de péptido de
fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje
de transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo
carboxi para suprimir el sitio de escisión de furina, el dominio de
péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio
de anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el
extremo carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de
escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de
repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e
intracelular.
30. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
glicoproteína del Ébola de Zaire o el dominio del mismo que lleva
el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al
mismo.
31. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
glicoproteína del Ébola de Sudán o el dominio del mismo que lleva
el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al
mismo.
32. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
glicoproteína del Ébola de Costa de Marfil o el dominio del mismo
que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95%
idéntico al mismo.
33. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
glicoproteína del Ébola de Reston o el dominio del mismo que lleva
el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al
mismo.
34. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
glicoproteína de Marburg o el dominio del mismo que lleva el
epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al
mismo.
mismo.
35. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
nucleoproteína del Ébola de Zaire o el dominio del mismo que lleva
el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al
mismo.
36. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
nucleoproteína del Ébola de Sudán o el dominio del mismo que lleva
el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al
mismo.
37. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
nucleoproteína del Ébola de Costa de Marfil o el dominio del mismo
que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95%
idéntico al mismo.
38. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
nucleoproteína del Ébola de Reston o el dominio del mismo que lleva
el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al
mismo.
39. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
nucleoproteína de Marburg o el dominio del mismo que lleva el
epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al
mismo.
mismo.
40. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
glicoproteína del Ébola de Zaire o el dominio del mismo que lleva
el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al
mismo, en el que la glicoproteína tiene una deleción interna o
carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de
escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de
repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana o el
dominio intracelular.
41. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
glicoproteína del Ébola de Sudán o el dominio del mismo que lleva
el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al
mismo, en el que la glicoproteína tiene una deleción interna o
carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de
escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de
repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana o el
dominio intracelular.
42. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
glicoproteína del Ébola de Costa de Marfil o el dominio del mismo
que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95%
idéntico al mismo, en el que la glicoproteína tiene una deleción
interna o carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio
de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio
de repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana o
el dominio intracelular.
43. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
glicoproteína del Ébola de Reston o el dominio del mismo que lleva
el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al
mismo, en el que la glicoproteína tiene una deleción interna o
carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de
escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de
repetición de héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana o el
dominio intracelular.
44. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
glicoproteína de Marburg o el dominio del mismo que lleva el
epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo,
en el que la glicoproteína tiene una deleción interna o carboxi para
suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina,
el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de
héptadas, el dominio de anclaje de transmembrana o el dominio
intracelular.
45. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
nucleoproteína del Ébola de Zaire o el dominio del mismo que lleva
el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al
mismo, en el que la glicoproteína está truncada en el extremo
carboxi para suprimir el dominio de anclaje de transmembrana e
intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el
dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de
transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi
para suprimir el dominio de péptido de fusión, el dominio de
repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e
intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el
sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el
dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de
transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi
para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de
furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de
héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e
intracelular.
46. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
nucleoproteína del Ébola de Sudán o el dominio del mismo que lleva
el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al
mismo, en el que la glicoproteína está truncada en el extremo
carboxi para suprimir el dominio de anclaje de transmembrana e
intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el
dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de
transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi
para suprimir el dominio de péptido de fusión, el dominio de
repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e
intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el
sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el
dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de
transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi
para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de
furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de
héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e
intracelular.
47. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
nucleoproteína del Ébola de Costa de Marfil o el dominio del mismo
que lleva el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95%
idéntico al mismo, en el que la glicoproteína está truncada en el
extremo carboxi para suprimir el dominio de anclaje de
transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi
para suprimir el dominio de repetición de héptadas y el dominio de
anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el
extremo carboxi para suprimir el dominio de péptido de fusión, el
dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de
transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi
para suprimir el sitio de escisión de furina, el dominio de péptido
de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el dominio de
anclaje de transmembrana e intracelular, o está truncada en el
extremo carboxi para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio
de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio
de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e
intracelular.
48. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
nucleoproteína del Ébola de Reston o el dominio del mismo que lleva
el epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al
mismo, en el que la glicoproteína está truncada en el extremo
carboxi para suprimir el dominio de anclaje de transmembrana o
intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el
dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de
transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi
para suprimir el dominio de péptido de fusión, el dominio de
repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e
intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el
sitio de escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el
dominio de repetición de héptadas y el dominio de anclaje de
transmembrana e intracelular, o está truncada en el extremo carboxi
para suprimir el dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de
furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de
héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e
intracelular.
49. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente o segunda construcción
genética, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la
nucleoproteína de Marburg o el dominio del mismo que lleva el
epítopo o análogo del mismo que es al menos 95% idéntico al mismo,
en el que la glicoproteína está truncada en el extremo carboxi para
suprimir el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o
está truncada en el extremo carboxi para suprimir el dominio de
repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e
intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir
el dominio de péptido de fusión, el dominio de repetición de
héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e intracelular, o
está truncada en el extremo carboxi para suprimir el sitio de
escisión de furina, el dominio de péptido de fusión, el dominio de
repetición de héptadas y el dominio de anclaje de transmembrana e
intracelular, o está truncada en el extremo carboxi para suprimir el
dominio de tipo mucina, el sitio de escisión de furina, el dominio
de péptido de fusión, el dominio de repetición de héptadas y el
dominio de anclaje de transmembrana e intracelular.
50. VRC6000 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6000.
51. VRC6001 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6001.
52. VRC6002 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6002.
53. VRC6003 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6003.
54. VRC6004 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6004.
55. VRC6005 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6005.
56. VRC6006 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6006.
57. VRC6007 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6007.
58. VRC6008 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6008.
59. VRC6052 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6052.
60. VRC6101 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6101.
61. VRC6110 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6110.
62. VRC6200 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6200.
63. VRC6201 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6201.
64. VRC6202 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6202.
65. VRC6300 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6300.
66. VRC6301 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6301.
67. VRC6302 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6302.
68. VRC6303 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6303.
69. VRC6310 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6310.
70. VRC6351 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6351.
71. VRC6400 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6400.
72. VRC6401 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6401.
73. VRC6500 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6500.
74. VRC6600 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6600.
75. VRC6601 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6601.
76. VRC6602 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6602.
77. VRC6603 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6603.
78. VRC6604 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6604.
79. VRC6701 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6701.
80. VRC6702 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6702.
81. VRC6710 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6710.
82. VRC6800 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6800.
83. VRC6801 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6801.
84. VRC6810 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6810.
85. VRC6811 o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o adenovirus de replicación deficiente cogido de la Tabla 2
es VRC6811.
86. CMV/R Ebola GP(Z) deltaTM/h (codón
optimizado) o una composición o procedimiento de cualquiera de los
puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o el
adenovirus de replicación deficiente tomado de la Tabla 2 es CMV/R
Ebola GP(Z) deltaTM/h (codón optimizado).
\newpage
87. pVR1012 Ebola GP (Z, P87666) deltaTM/h
(codón optimizado) o una composición o procedimiento de cualquiera
de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o el
adenovirus de replicación deficiente tomado de la Tabla 2 es pVR1012
Ebola GP (Z, P87666) delta TM/h (codón optimizado).
88. CMV/R Ebola GP(S/Gulu) delta TM/h
(codón optimizado) (codón optimizado) o una composición o
procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el
que el plásmido de ADN o el adenovirus de replicación deficiente
tomado de la Tabla 2 es CMV/R Ebola GP (S/Gulu) delta TM/h (codón
optimizado).
89. CMV/R Ebola GP (S,Q66798) delta TM/h (codón
optimizado) (codón optimizado) o una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN o el adenovirus de replicación deficiente tomado de la Tabla
2 es CMV/R Ebola GP (S,Q66798) delta TM/h (codón optimizado).
90. VRC6802, pVR1012x/s Lassa delta TM/h (codón
optimizado) o una composición o procedimiento de cualquiera de los
puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o el
adenovirus de replicación deficiente tomado de la Tabla 2 es
VRC6802, pVR1012x/s Lassa (codón optimizado).
91. VRC6703, pVR1012x/s Marburg delta TM/h
(codón optimizado) o una composición o procedimiento de cualquiera
de los puntos 1-9, en el que el plásmido de ADN o el
adenovirus de replicación deficiente tomado de la Tabla 2 es
VRC6703, pVR1012x/s Marburg (codón optimizado).
92. CMV/R Ebola NP o una composición o
procedimiento de cualquiera de los puntos 1-9, en el
que el plásmido de ADN o el adenovirus de replicación deficiente
tomado de la Tabla 2 es CMV/R Ebola NP.
93. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que la
composición de cebado o refuerzo se administra por vía
intramuscular.
94. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que la
composición de refuerzo se administra aproximadamente
2-3 semanas, o 4 semanas, u 8 semanas, o 16 semanas,
o 20 semanas, o 24 semanas, o 32 semanas después de la
administración de la composición de cebado.
95. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que la
composición de cebado o refuerzo se administra combinada con un
adyuvante.
96. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que la
composición de cebado o refuerzo se administra combinado con una
citoquina o ácido nucleico que codifica a la misma.
97. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el plásmido
de ADN se administra con una dosis de 10 microgramos a 50
miligramos/inyección.
98. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que el
adenovirus de replicación deficiente se administra con una dosis de
5x10^{7} a 1x10^{12} partículas/inyección.
99. Una composición o procedimiento de
cualquiera de los puntos 1-9, en el que la
composición de cebado o refuerzo está compuesta además del mismo o
diferente plásmido de ADN o adenovirus de replicación deficiente que
comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una segunda
glicoproteína o nucleoproteína de Ébola o dominio del mismo que
lleva epítopo o análogo del mismo, que es al menos 95% idéntico al
mismo, y en el que la segunda glicoproteína o nucleoproteína de
Ébola es diferente de la primera.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el autor
de la solicitud es sólo para la conveniencia del lector. No forma
parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido mucho
cuidado al recopilar las referencias, no se pueden excluir errores u
omisiones y la EPO rechaza cualquier responsabilidad en este
aspecto.
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012x/s Lassa GP
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6258
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012x/s Lassa GP(dTM)
\newpage
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<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7711
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pAdApt Lassa GP
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
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<211> 7522
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pAdApt Lassa GP(dTM)
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<400> 36
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6324
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CMV/R Ebola GP(Z) delta
TM/h
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<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 38
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<211> 6868
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012x/s Ebola GP(Z) delta
TM/h (P87666)
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<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
CMV/R-GP(S/G)(deltaTM)/h
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6324
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
CMV/R-GP(S,Q66798)(dTM)/h
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 40
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 41
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<211> 6236
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012x/s Lassa (codón
optimizado)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
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<211> 6902
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVR1012x/s Marburg (codón
optimizado)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6625
\vskip0.400000\baselineskip
<212>ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CMV/R Ebola NP
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
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<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de GP de Ébola de Sudán
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de GP de Ébola de Sudán
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de GP de Ébola de Costa de
Marfil
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de GP de Ébola de Costa de
Marfil
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Ébola
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Ébola
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\hskip1cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Ébola
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Ébola
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1087
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia de potenciador/promotor
de CMV, región R (HTVL-1), aceptor de religación CMV
IE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (7)
1. Un vector de expresión que comprende el ID
SEC Nº 52 o un análogo del mismo que tiene una identidad de
secuencia de al menos el 95, 96, 97, 98, 99 ó 100% con el mismo que
media la expresión, en el que el porcentaje de identidad se calcula
a lo largo de la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de
referencia.
2. El vector de expresión de la reivindicación
1, en el que el % de identidad es 95.
3. El vector de expresión de la reivindicación
1, en el que el % de identidad es 96.
4. El vector de expresión de la reivindicación
1, en el que el % de identidad es 97.
5. El vector de expresión de la reivindicación
1, en el que el % de identidad es 98.
6. El vector de expresión de la reivindicación
1, en el que el % de identidad es 99.
7. El vector de expresión de la reivindicación
1, en el que el % de identidad es 100.
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