ES2777323T3

ES2777323T3 - Procedimientos y composiciones para inducir inmunidad protectora contra infección por filovirus

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Publication number: ES2777323T3
Application number: ES15767631T
Authority: ES
Inventors: Ariane Volkmann; Robin Steigerwald; Ulrike Dirmeier; Maria Grazia Pau; Benoit Christophe Stephan Callendret; Lucy A Ward
Original assignee: Bavarian Nordic AS; Janssen Vaccines and Prevention BV; US Department of Health and Human Services
Current assignee: Bavarian Nordic AS; Janssen Vaccines and Prevention BV; US Department of Health and Human Services
Priority date: 2014-09-03
Filing date: 2015-09-03
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2035-09-03
Also published as: EP3656395B1; EP3188753A1; PL3188753T3; JP2017527568A; BR112017003891A2; PT3656395T; US20170290904A1; CN107454848B; EA035504B1; EP3188753B1; DK3188753T3; EA201790517A1; US10561721B2; PL3656395T3; EP3656395A1; CN107454848A; SG11201701741QA; US20220088170A1; US11918639B2; PT3188753T

Abstract

Una combinación de vacuna que comprende (i) una primera composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un vector de adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína antigénica de un primer subtipo de filovirus, donde dicho primer subtipo de filovirus es un subtipo de Ebolavirus, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable; y (ii) una segunda composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un vector MVA que comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína antigénica de un subtipo de Ebolavirus y que codifica adicionalmente al menos una proteína antigénica de otro subtipo de filovirus, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable; para usar en la generación de una respuesta inmune protectora contra al menos un subtipo de Ebolavirus, donde la primera composición se usa para sensibilizar una respuesta inmune contra al menos un subtipo de Ebolavirus y la segunda composición se usa para reforzar dicha respuesta inmune.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos y composiciones para inducir inmunidad protectora contra infección por filovirus

CAMPO TÉCNICO

Esta descripción se refiere a composiciones, vacunas y procedimientos para inducir inmunidad protectora contra la infección por filovirus, particularmente inmunidad protectora contra la infección de uno o más subtipos de Ebolavirus y virus de Marburg.

ANTECEDENTES

Los virus del Ébola, tales como el virus del Ébola de Zaire (EBOV) y el virus del Ébola de Sudán (SUDV), y el virus de Marburgo (MARV) estrechamente relacionado se asocian a brotes de fiebre hemorrágica del Ébola (EHF) muy letales en humanos y en primates en América del Norte, Europa y África. Estos virus son filovirus conocidos por infectar a seres humanos y primates no humanos con consecuencias de salud graves que incluyen la muerte. Las infecciones por filovirus han producido tasas de letalidad de hasta 90 % en seres humanos. Las infecciones por EBOV, SUDV y MARV causan e Hf que se desenlaza en la muerte, a menudo, en un plazo de 7 a 10 días desde la infección. La EHF se presenta como un síndrome febril grave que se manifiesta como una fiebre abrupta, náuseas, vómitos, diarrea, erupción maculopapular, malestar general, postración, señales generales de aumento de permeabilidad vascular, anomalías en la coagulación y alteración de la regulación de la respuesta inmunitaria innata. Gran parte de la enfermedad parece ser causada por la alteración de la regulación de las respuestas inmunitarias innatas a la infección y por la replicación del virus en las células endoteliales vasculares, lo que produce la muerte de las células hospedadoras y la destrucción de la barrera endotelial. Los filovirus se pueden esparcir por aerosolización de partículas pequeñas o mediante el contacto directo con sangre, órganos y fluidos corporales infectados de origen humano o de primates no humanos (NHP, por sus siglas en inglés). Se informa que la infección con único virión es suficiente para provocar la fiebre hemorrágica del ébola (EHF) en seres humanos. En la actualidad, no existe tratamiento o vacuna aprobados para el tratamiento o la prevención de la EHF. Los cuidados paliativos siguen siendo la única intervención médica aprobada en el caso de individuos infectados por filovirus.

Al ser la causa de una enfermedad humana grave, los filovirus siguen generando preocupación tanto como fuentes de infecciones naturales y como posibles agentes de bioterrorismo. Aún no se ha identificado de forma definitiva el reservorio de filovirus en la naturaleza. Se ha descrito que cuatro subtipos de virus del Ébola provocan la EHF, es decir, aquellos en episodios de Zaire, Sudán, Bundibugyo y Costa de Marfil (Sanchez, A. y col., 1996, PNAS USA, 93:3602-3607). Dichos subtipos de virus del Ébola tienen organizaciones genéticas similares, por ejemplo, virus de ARN monocatenario negativo que contiene siete genes dispuestos linealmente. Los productos génicos estructurales incluyen, por ejemplo, la glicoproteína de envoltura que existe en dos formas alternativas: una glicoproteína soluble secretada (ssGP) y una glicoproteína transmembrana (GP) generada mediante la edición de ARN que media la entrada viral (Sanchez, y col. 1996 PNAS USA 93:3602-3607).

Se ha sugerido que la inmunización puede ser útil para proteger contra la infección por Ébola porque parece haber menos polimorfismo de nucleótidos dentro de los subtipos de Ébola que entre otros virus de ARN (Sánchez y col. 1996 PNAS USA 93: 3602-3607) Hasta hace relativamente poco tiempo, el desarrollo de vacunas preventivas contra filovirus ha tenido resultados variables, en parte, debido a que no se comprenden bien los requisitos de respuestas inmunitarias protectoras contra infecciones por filovirus. De manera adicional, la gran cantidad de filovirus en circulación en los reservorios naturales dificulta los esfuerzos para diseñar una vacuna que proteja contra todas las especies de filovirus. En la actualidad, existen varias plataformas de administración de antígeno en vacuna que han demostrado diversos niveles de protección en primates no humanos (NHP) expuestos a dosis infecciosas elevadas de filovirus. Se encuentran en desarrollo candidatos de vacunas con base en una variedad de tecnologías de plataforma que incluyen vectores capaces de replicación (por ejemplo, virus de estomatitis vesicular, virus de la rabia, virus de parainfluenza), vectores no capaces de replicación (adenovirus, virus vaccinia Ankara modificado), subunidades proteicas que incluyen partículas tipo virales expresadas en células bacterianas, células de insectos, células de mamíferos, células vegetales, vacunas de ADN y/o filovirus atenuados vivos y muertos (Friedrich y col., 2012). La glicoproteína GP de EBOV es un componente esencial de una vacuna de protección contra las exposiciones a la misma especie de EBOV. Asimismo, la inclusión de GP de EBOV y SUDV, las dos especies más virulentas de virus del Ébola, puede proteger a monos contra las exposiciones intramusculares contra EBOv y SUDV, así como contra las exposiciones a especies del virus del Ébola de Bundibugyo (BDBV) y Tai Forest (TAFV, previamente conocida como Costa de Marfil). Del mismo modo, la inclusión de la GP de MARV puede proteger a monos contra las exposiciones por aire o intramusculares a MARV. El desarrollo de medidas médicas contra estos virus es una prioridad importante, en particular, el desarrollo de una vacuna de PAN-filovirus, es decir, una vacuna de protección contra todos los filovirus patogénicos.

Los vectores de adenovirus incapaces de replicación (rAd) son inductores potentes de respuestas inmunitarias celulares y, por consiguiente, son vectores útiles para vacunas con base génica particularmente para lentivirus y filovirus, así como otros patógenos no virales (Shiver, y col., (2002) Nature 415(6869): 331-5; (Hill, y col., Hum Vaccin 6(1): 78-83. ; Sullivan, y col., (2000) Nature 408(6812): 605-9; Sullivan y col., (2003) Nature 424(6949): 681-4; Sullivan, y col., (2006) PLoS Med 3(6): e177; Radosevic, y col., (2007); Santra, y col., (2009) Vaccine 27(42): 5837-45.

Las vacunas con base en adenovirus tienen muchas ventajas como vacunas para humanos debido a que se pueden producir en títulos elevados en condiciones de GMP y a que se ha demostrado con son seguras e inmunogénicas en seres humanos (Asmuth, y col., J Infect Dis 201(1): 132-41; Kibuuka, y col., J Infect Dis 201(4): 600-7; Koup, y col., PLoS One 5(2): e9015. ; Catanzaro, y col., (2006) J Infect Dis 194(12): 1638-49; Harro, y col., (2009) Clin Vaccine Immunol 16(9): 1285-92. A pesar de que la mayoría del trabajo en vacunas iniciales se llevó a cabo con rAd5 debido a su potencia significativa para generar respuestas de linfocitos T CD8+ y anticuerpos amplios, la existencia previa de inmunidad a rAd5 en humanos puede limitar su eficacia (Catanzaro, (2006); Cheng, y col., (2007) PLoS Pathog 3(2): e25.; McCoy, y col., (2007) J Virol 81(12): 6594-604.; Buchbinder, y col., (2008) Lancet 372(9653): 1881-93). Esta propiedad puede limitar el uso de rAd5 en aplicaciones clínicas para muchas vacunas que se están desarrollando en la actualidad que incluyen el virus del Ébola (EBOV) y el virus de Marburgo (MARV).

Los vectores de adenovirus defectuosos en la replicación, rAd26 y rAd35, derivados del adenovirus serotipo 26 y serotipo 35, respectivamente, tienen la capacidad de eludir la inmunidad preexistente de Ad5. rAd26 puede crecer hasta títulos altos en líneas celulares que complementan Ad5 E1 adecuadas para fabricar estos vectores a gran escala y en grado clínico (Abbink, y col., 2007), y se ha demostrado que este vector induce respuestas inmunes humorales y mediadas por células en estrategias de vacuna de sensibilización y refuerzo (Abbink, y col., 2007; Liu, y col., (2009) Nature 457 (7225): 87-91). Se cultivan los vectores de rAd35 a títulos elevados en líneas celulares adecuadas para la producción de vacunas de grado clínico (Havenga, y col., (2006) J Gen Virol 87(Pt 8): 2135-43) y se formulan para inyección, así como polvo inhalable estable (Jin, y col., Vaccine 28(27): 4369-75). Estos vectores exhiben transducción eficiente de células dendríticas humanas (de Gruijl, y col., (2006) J Immunol 177(4): 2208-15; Lore, y col., (2007) J Immunol 179(3): 1721-9) y, por lo tanto, tienen la capacidad de mediar la presentación y el suministro de antígenos a nivel elevado.

El virus de Vaccinia Ankara modificado (MVA) se relaciona al virus Vaccinia, un miembro del género Orthopoxvirus en la familia Poxviridae. Se sabe que los poxvirus son buenos inductores de respuestas de linfocitos T CD8 debido a su expresión intracitoplasmática. Sin embargo, generalmente se cree que son pobres en la generación de células T restringidas CD4 M^hC clase II (ver por ejemplo Haslett y col. Journal of Infectious Diseases 181: 1264-72 (2000), página 1268). Se ha modificado el MVA para utilizarlo como un vector viral para expresión génica recombinante o como una vacuna recombinante.

Bavarian Nordic desarrolló cepas de MVA que tienen perfiles de seguridad potenciados para el desarrollo de productos más seguros, tales como vacunas o fármacos. Bavarian Nordic aprobó el MVA, lo designó MVA-BN y depositó una muestra representativa el 30 de agosto de 2000 en European Collection of Cell Cultures (ECACC) con el número de acceso V00083008. MVA-BN se describe más detalladamente en los documentos WO 02/42480 (US 2003/0206926) y WO 03/048184 (US 2006/0159699).

El MVA-BN se puede unir a células humanas en las que los genes codificados de forma viral se expresan de forma eficiente e ingresar en ellas. El MVA-BN no tiene capacidad de replicación, lo que significa que el virus no se replica en células humanas. En células humanas, se expresan los genes virales y no se producen virus infecciosos. El MVA-BN está clasificado como organismo de Nivel de Bioseguridad 1 según los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos. Las preparaciones de MVA-BN y derivados se administraron en varios tipos de animales y a más de 2000 sujetos humanos, que incluyen individuos inmunodeficientes. Se demostró que todas las vacunaciones son generalmente seguras y se toleran bien. A pesar de su alta atenuación y su virulencia reducida, se demostró en estudios preclínicos que el MVA-BN provoca respuestas inmunitarias tanto humorales como celulares al virus vaccinia y a los productos génicos heterólogos codificados por genes clonados en el genoma de MVA [E. Harrer y col. (2005), Antivir. Ther. 10(2):285-300; A. Cosma y col. (2003), Vaccine 22(1):21-9; M. Di Nicola y col. (2003), Hum. Gene Ther. 14(14):1347-1360; M. Di Nicola y col. (2004), Clin. Cancer Res., 10(16):5381-5390].

Geisbert y col., (2011) Journal of Virology 85(9): 4222-4233 se relaciona con las vacunas vectorizadas de adenovirus y su uso para inducir inmunidad protectora contra el virus del Ébola. Específicamente, Geisbert y col. describe los vectores rAd35 y rAd26 que portan el antígeno glicoproteico del virus del Ébola y los efectos inmunoprotectores de tales vacunas administradas como una inoculación única o como una combinación de sensibilización y refuerzo.

Son necesarias vacunas mejoradas que provoquen respuestas inmunitarias contra filovirus, particularmente, inmunidad protectora contra los virus más letales del Ébola y de Marburgo.

BREVE RESUMEN

En la presente descripción, se descubre que varias combinaciones de sensibilización y refuerzo de vectores no capaces de replicación generan protección inmunitaria efectiva contra las infecciones por filovirus.

Por consiguiente, un aspecto general de la presente descripción se refiere a una vacuna combinada que comprende: (i) una primera composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un vector de adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica de un primer subtipo de filovirus o una proteína antigénica sustancialmente similar, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y

(ii) una segunda composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un vector de MVA que comprende un ácido nucleico que codifica proteínas antigénicas de al menos dos subtipos de filovirus o proteínas antigénicas sustancialmente similares, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable,

donde una de las composiciones es una composición de sensibilización y la otra composición es una composición de refuerzo.

Otro aspecto general de la presente descripción se refiere al uso de: una primera composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un vector de adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica de un primer subtipo de filovirus o una proteína antigénica sustancialmente similar, y una segunda composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un vector de MVA que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica de al menos dos subtipos de filovirus o proteínas antigénicas sustancialmente similares, para generar una respuesta inmunitaria protectora contra al menos uno de los subtipos de filovirus, donde la primera y la segunda composiciones se utilizan para sensibilizar o para reforzar dicha respuesta inmunitaria.

En ciertas realizaciones de la presente descripción, la primera composición (i) comprende además un vector de adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica de un segundo subtipo de filovirus. En otras realizaciones de la presente descripción, la primera composición (i) comprende además un vector de adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica de un tercer subtipo de filovirus. Los subtipos de filovirus según la presente descripción pueden ser cualquier subtipo de filovirus.

En una realización preferida de la presente descripción, el primer, segundo y tercer subtipos de filovirus se seleccionan de entre el grupo de Zaire, Sudán, Reston, Bundibugyo, Tai Forest y Marburg. Las proteínas antigénicas pueden ser cualquier proteína de cualquier filovirus que comprende una determinante antigénica. En una realización preferida de la presente descripción, las proteínas antigénicas son glicoproteínas o nucleoproteínas. Las proteínas antigénicas codificadas por los vectores de adenovirus o vectores de MVA comprendidas en la primera y la segunda solución según la presente descripción pueden ser cualquier proteína antigénica de cualquier filovirus. En una realización preferida de la presente descripción, las proteínas antigénicas del primer, segundo y tercer tipo de filovirus se seleccionan del grupo de SEQ ID NO:1, SeQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, s Eq ID NO:4, y SEQ ID NO:5. En una realización preferida de la presente descripción, el primer, el segundo y el tercer subtipo de filovirus no son iguales.

En otra realización de la presente descripción, el vector de adenovirus en la primera composición (i) comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica con una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5. En una realización preferida de la presente descripción, la composición (i) comprende además un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica que tiene una secuencia diferente seleccionada de entre el grupo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, y SEQ ID NO:5. Preferentemente, la composición (i) comprende además un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica con incluso una secuencia diferente seleccionada del grupo de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5.

En una realización preferida de la presente descripción, el vector de adenovirus en la primera composición (i) comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica con SEQ ID NO: 1. En una realización preferida de la presente descripción, la composición (i) comprende además un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica con SEQ ID NO:2. Preferentemente, la composición (i) comprende además un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica con SEQ ID ⁿO:3.

En otra realización preferida más de la presente descripción, el vector MVA en la composición (ii) comprende un ácido nucleico que codifica proteínas antigénicas de al menos cuatro subtipos de filovirus. Preferentemente, dicho vector de MVA comprende un ácido nucleico que codifica proteínas antigénicas de cuatro subtipos diferentes de filovirus con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, y la SEQ ID NO: 5.

Se contempla que los procedimientos, vacunas y composiciones descritos en la presente se pueden presentar en un kit. Por ejemplo, en una realización, la presente descripción puede incluir un kit que comprende:

(i) una primera composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un vector de adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica de un primer subtipo de filovirus o una proteína antigénica sustancialmente similar, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y

Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, la presente invención hace referencia a una vacuna combinada, un kit o un uso donde el vector de adenovirus en la composición (i) comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica con SEQ ID NO: 1; y donde el vector de MVA en la composición comprende un ácido nucleico que codifica proteínas antigénicas de cuatro subtipos diferentes de filovirus con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, y la SEQ ID NO: 5.

En incluso otra realización preferida de la invención, la presente descripción hace referencia a una vacuna combinada, un kit o un uso donde la primera composición comprende un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una primera proteína antigénica con SEQ ID NO: 1, un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una segunda proteína antigénica con SEQ ID NO: 2 y un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una tercera proteína antigénica con SEQ ID NO: 3; y donde el vector de MVA en la composición (ii) comprende un ácido nucleico que codifica proteínas antigénicas de cuatro subtipos diferentes de filovirus con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, y la SEQ ID NO: 5.

En una realización preferida de la presente descripción, los vectores de adenovirus comprendidos en la vacuna combinada, el kit de la presente descripción o los vectores de adenovirus utilizados para generar una respuesta inmune protectora contra al menos uno de los subtipos de filovirus son vectores rAd26 o rAd35. En una realización preferida de la invención de este uso, la composición de refuerzo se administra 1-12 semanas luego de la composición de sensibilización.

Un aspecto general adicional de la presente invención hace referencia a un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra un filovirus en un sujeto, el que comprende:

a. administrar al sujeto una primera composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un vector de adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una primera glicoproteína antigénica de un primer subtipo de filovirus o una proteína antigénica sustancialmente similar, y

b. administrar al sujeto una segunda composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un vector de MVA que comprende un ácido nucleico que codifica proteínas antigénicas de al menos dos cepas de filovirus o proteínas antigénicas sustancialmente similares,

donde las etapas (a) y (b) se ponen en práctica en cualquier orden.

En ciertas realizaciones de la presente descripción, la primera composición comprende además un vector de adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica de un tercer subtipo de filovirus. En otras realizaciones de la presente descripción, la primera composición comprende además un vector de adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica de un tercer subtipo de filovirus.

En otra realización de la presente descripción, el vector de adenovirus en la primera composición comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica con la SEQ ID NO:1. En una realización preferida de la presente descripción, la composición comprende además un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica con SEQ ID NO:2. Preferentemente, la composición comprende además un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica con SEQ ID NO:3.

En una realización más preferida de la presente descripción, el vector MVA en la segunda composición comprende un ácido nucleico que codifica proteínas antigénicas de al menos cuatro subtipos de filovirus.

Preferentemente, dicho vector de MVA comprende un ácido nucleico que codifica proteínas antigénicas de cuatro subtipos diferentes de filovirus con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, y la SEQ ID NO: 5.

Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, la presente descripción hace referencia a un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra un filovirus en un sujeto, donde el vector de adenovirus en la primera composición comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica con SEQ ID NO: 1; y donde el vector de MVA en la segunda composición comprende un ácido nucleico que codifica proteínas antigénicas de cuatro subtipos diferentes de filovirus con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, y la SEQ ID NO: 5. En incluso otra realización preferida de la invención, la presente descripción hace referencia a un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra un filovirus en un sujeto, donde la primera composición comprende un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una primera proteína antigénica con SEQ ID NO: 1, un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una segunda proteína antigénica con SEQ ID NO: 2 y un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una tercera proteína antigénica con SEQ ID NO: 3; y donde el vector de MVA en la segunda composición comprende un ácido nucleico que codifica proteínas antigénicas de cuatro subtipos diferentes de filovirus con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ iD NO: 4, y la SEQ ID NO: 5.

En una realización preferida, los vectores de adenovirus usados en el procedimiento de la presente descripción son vectores rAd26 o rAd35. En otra realización preferida de la presente descripción, la etapa (b) del procedimiento se lleva a cabo 1-12 semanas después de la etapa (a).

En otra realización preferida de la presente descripción, la vacunación de sensibilización, es decir, la etapa (a), se lleva a cabo en la semana 0, seguida de una vacuna de refuerzo, es decir, la etapa (b), en la semana 1-10, más preferentemente, en la semana 6-10 y, más preferentemente, en la semana 8. En otra realización preferida de la presente descripción, la vacunación de sensibilización, es decir, la etapa (a), se lleva a cabo en la semana 0, seguida de una vacuna de refuerzo, es decir, la etapa (b), en la semana 1-4, preferentemente, en la semana 1, 2 o 4.

En otra realización preferida de la presente descripción, la vacunación de sensibilización, es decir, la etapa (b), se lleva a cabo en la semana 0, seguida de una vacuna de refuerzo, es decir, la etapa (a), en la semana 1-10, más preferentemente, en la semana 6-10 y, más preferentemente, en la semana 8. En otra realización preferida de la presente descripción, la vacunación de sensibilización, es decir, la etapa (b), se lleva a cabo en la semana 0, seguida de una vacuna de refuerzo, es decir, la etapa (a), en la semana 1-4, preferentemente, en la semana 1, 2 o 4.

En una realización preferida de la presente descripción, el procedimiento comprende una vacunación de sensibilización con una cantidad inmunológicamente efectiva de uno o más vectores de rAd26 que expresan una o más proteínas antigénicas de filovirus, seguida por una vacunación de refuerzo con una cantidad inmunológicamente efectiva de uno o más vectores diferentes de rAd26, preferentemente, vectores de MVA que expresan la o las glicoproteínas de filovirus o glicoproteínas sustancialmente similares.

En realizaciones preferidas de la presente descripción, el o los filovirus son Ebolavirus o Marburgvirus. Los virus del Ébola pueden ser de cualquier especie, por ejemplo, subtipo de ébola de Zaire (EBOV) y de Sudán (SUDV), Reston, Bundibugyo y Tai Forest. El virus de Marburgo (MARV) puede ser de cualquier especie. Se ilustran ejemplos de secuencias de aminoácidos de proteínas antigénicas de filovirus adecuadas en la SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO; 5. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

El compendio que antecede, así como la siguiente descripción detallada de la presente invención, se comprenderán mejor cuando se lean junto con los dibujos adjuntos. Se debe entender que la presente descripción no se limita a las realizaciones precisas ilustradas en las figuras.

La patente o solicitud contiene al menos una figura en color. Si se solicitara, y luego de efectuado el pago de la tasa necesaria, la oficina entregará copias de esta publicación de patente o solicitud de patente con el o los dibujos en color.

En los dibujos:

La Figura 1 resume los grupos en un ensayo animal;

La Figura 2 ilustra el diseño experimental del ensayo.

La Figura 3 muestra el resultado de la exposición a la cepa de exposición de ébola de Zaire Kikwit 1995.

La Figura 4 muestra la respuesta inmunitaria humoral específica a la glicoproteína de subtipo de ébola de Zaire (evaluada mediante ELISA) que se observa en el ensayo animal. Se obtuvieron títulos muy elevados de anticuerpos independientemente de los regímenes de vacunación. (ND = momento no analizado.)

La Figura 5 muestra la respuesta inmunitaria humoral específica a la glicoproteína de cepa Gulu de Sudán (evaluada mediante ELISA) que se observa en el ensayo animal. Se obtuvieron títulos muy elevados de anticuerpos independientemente de los regímenes de vacunación. (ND = momento no analizado.)

La Figura 6 muestra la respuesta inmunitaria humoral específica a la glicoproteína de cepa de Angola de Marburgo (evaluada mediante ELISA) que se observa en el ensayo animal. Se obtuvieron títulos muy elevados de anticuerpos independientemente de los regímenes de vacunación. (ND = momento no analizado.)

La Figura 7 muestra la respuesta inmunitaria celular específica a GP de MARVA, ZEBOV y SEBOV analizada mediante ELISPOT de IFN-y.

La Figura 8 muestra la respuesta inmunitaria específica a GP de ZEBOV analizada mediante un ELISA de GP anti-EBOV, donde se observa una respuesta inmunitaria humoral mayor el día 50 luego de la inmunización de refuerzo en sujetos inmunizados con MVA como sensibilizante y Ad26 como refuerzo que con las vacunas en orden inverso. La Figura 9 muestra la respuesta de linfocitos T específica a GP de ZEBOV en humanos analizados mediante ensayo ELISpot.

La Figura 10 muestra la respuesta de linfocitos CD8+ específica a GP de ZEBOV en humanos analizados mediante ensayo ICS.

La Figura 11 muestra la función de las respuestas de linfocitos T CD8+ específica a GP de EBOV en humanos mediante ensayo ICS cuando se utiliza un intervalo de sensibilización y refuerzo de 28 días.

La Figura 12 muestra la función de las respuestas de linfocitos T CD8+ específica a GP de EBOV en humanos mediante ensayo ICS cuando se utiliza un intervalo de sensibilización y refuerzo de 56 días.

La Figura 13 muestra la respuesta de linfocitos CD4+ específica a GP de ZEBOV en humanos analizados mediante ensayo ICS.

La Figura 14 muestra la función de las respuestas de linfocitos T CD4+ específica a GP de EBOV en humanos mediante ensayo ICS cuando se utiliza un intervalo de sensibilización y refuerzo de 28 días.

La Figura 15 muestra la función de las respuestas de linfocitos T CD4+ específica a GP de EBOV en humanos mediante ensayo ICS cuando se utiliza un intervalo de sensibilización y refuerzo de 56 días.

La Figura 16 muestra la respuesta inmunitaria inducida por una inmunización de sensibilización con Ad26.ZEBOV seguida por un refuerzo de MVA-BN-Filo 14 días después evaluado mediante ELISA (A), ELIspot (B) e ICS (C y D). La Figura 17 muestra la respuesta inmunitaria específica a GP de ZEBOV analizada mediante ELISA de GP anti-EBOV.

La Figura 18 muestra la respuesta de linfocitos T específica a GP de ZEBOV en humanos analizados mediante ensayo ELISpot.

La Figura 19 muestra la respuesta inmunitaria celular de CD4+ (A) y CD8+ (B) específica a GP de ZEBOV en humanos analizada mediante ensayo ICS y la función de las respuestas de linfocitos T c D8+ (C) y CD4+ (D) específicas a GP de EBOV en humanos mediante ensayo ICS cuando se utilizan MVA como sensibilizante y Ad26 como refuerzo 14 días después.

La Figura 20 muestra los anticuerpos EBOV Mayinga GP-vinculante provocados por la vacunación con Ad26.ZEBOV/MVA-BN-Filo y regímenes MVA-BN-Filo/Ad26.ZEBOV determinados por ^gP ELISA. Se indican los regímenes de vacunación debajo del eje de x. IM elevado e IM estándar hacen referencia la dosis y la vía de MVA BN Filo. La línea punteada horizontal indica LOD.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realización que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención.

Se citan o describen varias publicaciones, artículos y patentes en el fondo y en toda la memoria descriptiva. Cualquier mención de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o similares que se haya incluido en la presente memoria descriptiva tiene únicamente el fin de dar contexto a la presente descripción. Dicha discusión no es una admisión de que alguno o todos estos asuntos forman parte de la técnica anterior con respecto a cualquier descripción en esta invención.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un especialista en la materia a la que está relacionada esta descripción. Por el contrario, determinados términos utilizados en la presente tienen los significados establecidos en la memoria descriptiva. Cabe destacar que, tal como se usan en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares «un», «una», «el» y «la» incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

A menos que se indique lo contrario, se entenderá que la expresión «al menos» antes de una serie de elementos hace referencia a cada elemento de la serie. Los expertos en la técnica reconocerán o serán capaces de determinar sin utilizar nada más que los experimentos de rutina muchos equivalentes de realizaciones específicas de la descripción de la presente. Se pretende que tales equivalentes sean abarcados por la presente descripción.

A lo largo de esta memoria descriptiva y de las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo exija de otro modo, la palabra «comprende», y variaciones tales como «comprenden» y «que comprende», se entenderá que implican la inclusión de un número entero o etapa o grupo de enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros o etapas. Cuando se usa en el presente documento, el término «que comprende» puede sustituirse con el término «que contiene» o «que incluye» o, a veces, cuando se usa en el presente documento con el término «que tiene». Cuando se utilizan en el contexto de un aspecto o modalidad de la presente descripción, se puede sustituir cualquiera de los términos y expresiones mencionados anteriormente (que comprende, que contiene, que incluye, que tiene) con la expresión «que consiste en».

Cuando se utiliza en la presente, «que consiste en» excluye cualquier elemento, paso o ingrediente no especificado en el elemento de la reivindicación. Cuando se usa en la presente «que consiste esencialmente de» no excluye materiales o etapas que no afecten materialmente las características básicas y novedosas de la reivindicación. Como se usa en el presente documento, se entiende que el término conjuntivo «y/o» entre múltiples elementos recitados abarca tanto opciones individuales como combinadas. Por ejemplo, en casos en los que «y/o», une dos elementos, una primera opción hace referencia a la aplicabilidad del primer elemento sin el segundo. Una segunda opción se refiere a la aplicabilidad del segundo elemento sin el primero. Una tercera opción hace referencia a la aplicabilidad del primer y el segundo elemento juntos. Se entiende que cualquiera de estas opciones está comprendida en el significado y que, por lo tanto, satisface el requerimiento del término «y/o» tal como se usa en la presente. También se entiende que el significado comprende la aplicabilidad simultánea de más de una de las opciones y, por consiguiente, satisface el requisito de «y/o».

Como se usa en el presente documento, «sujeto» significa cualquier animal, preferentemente un mamífero, lo más preferentemente un ser humano, a quien se le tratará o ha sido tratado por un procedimiento según una realización de la presente descripción. El término «mamífero», tal como se usa en esta invención, comprende cualquier mamífero. Ejemplos de mamíferos incluyen, de modo no taxativo, vacas, caballos, ovejas, cerdos, gatos, perros, ratones, ratas, conejos, cobayos, monos, seres humanos, etc., y más preferentemente, un ser humano.

Como se usa en el presente documento, el término «inmunidad protectora» o «respuesta inmunitaria protectora» significa que el sujeto vacunado puede controlar una infección con el agente patógeno contra el que se realizó la vacunación. Usualmente, el sujeto que desarrolló una «respuesta inmunitaria protectora» desarrolla síntomas clínicos únicamente leves a moderados o no desarrolla síntomas. Usualmente, un sujeto que tiene una «respuesta inmune protectora» o «inmunidad protectora» contra cierto agente no morirá como resultado de la infección con dicho agente. Una «proteína de cápside de adenovirus» se refiere a una proteína en la cápside de un adenovirus (por ejemplo, Ad 26 o Ad 35) que está implicada en la determinación del serotipo y/o tropismo de un adenovirus particular. Las proteínas de cápside adenovirales suelen incluir las fibras, pentones y/o hexones. Como se usa en esta invención, una «proteína de cápside Ad26» o una «proteína de cápside Ad35» puede ser, por ejemplo, una proteína de cápside quimérica que incluye al menos una parte de una proteína de cápside Ad26 o Ad35. En determinadas realizaciones de la presente descripción, la proteína de cápside es una proteína de cápside completa de Ad26 o Ad35. En determinadas realizaciones de la presente descripción, el hexón, el pentón y la fibra son de Ad26 o de Ad35.

En la presente, «adyuvante» y «estimulador inmunitario» se utilizan de forma intercambiable y se definen como una o más sustancias que provocan la estimulación del sistema inmunitario. En este contexto, se utiliza un adyuvante para mejorar la respuesta inmunitaria a los vectores de MVA y/o adenovirus de la presente descripción.

El término «correspondiente a», cuando se aplica a las posiciones de los residuos de aminoácidos en las secuencias, significa las posiciones correspondientes en una pluralidad de secuencias cuando las secuencias están alineadas de manera óptima.

En el contexto de dos o más secuencias polipeptídicas o de ácidos nucleicos (por ejemplo, glicoproteínas de filovirus y polinucleótidos que las codifican), los términos «idéntico» o «identidad» porcentual hacen referencia a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales cuando se comparan y se alinean con correspondencia máxima, tal como se mide mediante uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o mediante inspección visual.

En el caso de comparación de secuencia, usualmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, se ingresan las secuencias de ensayo y de referencia en una computadora, se designan las coordenadas de las subsecuencias, si fuera necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmos de secuencias. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o secuencias de ensayo en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros de programa designados.

El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda del procedimiento de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección visual (véase, en líneas generales, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel y col., eds., Current Protocols, una publicación conjunta de Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (suplemento de 1995) (Ausubel)).

Ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLa St 2.0, que se describen en Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 y Altschuel y col. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectivamente. El software para la realización del análisis con BLAST se encuentra disponible públicamente a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica. Este algoritmo implica identificar primero los pares de secuencias con valor alto (HSP, por sus siglas en inglés) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia problema que corresponde o satisface algún valor de umbral T valorado de forma positiva cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. La T hace referencia al puntaje umbral de la palabra más próxima (Altschul et ál, supra). Estos resultados iniciales de la palabra más próxima actúan como punto de partida para iniciar las búsquedas para encontrar HSP más largos que las contienen. Se extienden los resultados de palabras en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia, todo lo que se pueda aumentar el puntaje de alineamiento acumulado.

Las calificaciones acumuladas se calculan, para secuencias de nucleótidos, con el uso de parámetros M (calificación de recompensa para un par de residuos con coincidencia; siempre > 0) y N (calificación de penalización para residuos sin coincidencias; siempre < 0). En el caso de secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de valor para calcular el valor acumulado. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa cae una cantidad X desde su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa llega a cero o por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa de forma predeterminada una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de valor BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 89: 10915 (1989)).

Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor probabilidad de suma (P(N)), la que es una indicación de la probabilidad de que una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos ocurra por casualidad. Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a una secuencia de referencia si la menor probabilidad de suma al comparar el ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menor de alrededor de 0,1, más preferentemente, menor de alrededor de 0,01 y más preferentemente, menor de alrededor de 0,001.

Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico tenga reactividad inmunológica cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, tal como se describió anteriormente. Por lo tanto, un polipéptido es, por lo general, sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos polipéptidos difieren únicamente en sustituciones conservativas. Otro indicio de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones rigurosas, tal como se describió anteriormente.

En el contexto de proteínas antigénicas de filovirus de la presente descripción, la expresión «sustancialmente similar» indica que un polipéptido comprende una secuencia con al menos 90 %, preferentemente, al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de referencia en una ventana de comparación de 10-20 aminoácidos. Se determina el porcentaje de identidad de secuencia mediante la comparación de dos secuencias alineadas de forma óptima en una ventana de comparación, donde la parte de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (la que no comprende adiciones o eliminaciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. Se calcula el porcentaje mediante la determinación del número de posiciones en las que la base de ácido nucleico o residuo de aminoácido aparece en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, la división del número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y la multiplicación del resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

Se determinó en la presente descripción que las combinaciones de sensibilización y refuerzo heterólogas, en particular, de sensibilización con Ad26 seguida de refuerzo con MVA y viceversa, son sorprendentemente efectivas para generar respuestas inmunitarias protectoras contra uno o más subtipos de filovirus.

Proteínas antigénicas de filovirus

Los virus del Ébola y el virus de Marburgo genéticamente relacionado son filovirus asociados con brotes de fiebre hemorrágica muy letales en seres humanos y primates en América del Norte, Europa y África (Peters, C.J. y col. en: Fields Virology, eds. Fields, B.N. y col. 1161-1176, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1996; Peters, C.J. y col. 1994 Semin Virol 5:147-154). Aunque se han definido varios subtipos, la organización genética de dichos virus es similar, y cada uno contiene siete genes dispuestos linealmente. Entre las proteínas virales, la glicoproteína de envoltura existe en dos formas alternativas: una proteína secretada (sGP) de 50-70 kilodaltons (kDa) y una glicoproteína transmembrana (GP) de 130 kDa generada mediante la edición de ARN que media la entrada viral (Peters, C.J. y col. en: Fields Virology, eds. Fields, B.N. y col. 1161-1176, Filadelfia, Lippincott-Raven, 1996; Sanchez, A. y col. 1996 PNAS USA 93:3602-3607). Otros productos génicos estructurales incluyen la nucleoproteína (NP), las proteínas de matriz VP24 y VP40, las proteínas no estructurales asumidas VP30 y VP35, y la polimerasa viral (reseñada en Peters, C.J. y col. en: Fields Virology, eds. Fields, BN y col. 1161-1176, Filadelfia, Lippincott-Raven, 1996)

Las moléculas de ácido nucleico comprendidas en los vectores de MVA y adenovirus pueden codificar productos génicos estructurales de cualquier especie de filovirus, tal como subtipos de Zaire (a los que también se hace referencia en la presente como ZEBOV), de Sudán (a los que también se hace referencia en la presente como SEBOV), de Reston, de Bundibugyo y de Costa de Marfil. Se encuentra una única especie de virus de Marburgo (a la que también se hace referencia en la presente como MARV).

Los vectores adenovirales y los vectores MVA de la presente descripción se pueden usar para expresar proteínas antigénicas que son proteínas que comprenden un determinante antigénico de una amplia variedad de antígenos de filovirus. En una realización preferida y usual, los vectores de la invención incluyen ácido nucleico que codifica la forma transmembrana de la glicoproteína viral (GP). En otras realizaciones, los vectores de la invención pueden codificar la forma secretada de la glicoproteína viral (ssGP) o la nucleoproteína viral (NP).

Un experto reconocerá que es posible modificar las moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína antigénica de filovirus, por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico establecidas en la presente pueden mutar, siempre que la proteína expresada modificada genere una respuesta inmunitaria contra un patógeno o enfermedad. Por lo tanto, como se usa en esta invención, el término «proteína antigénica» o «proteína de filovirus» se refiere a una proteína que comprende al menos un determinante antigénico de una proteína de filovirus descrita anteriormente. Las expresiones comprenden glicoproteínas de filovirus (es decir, productos génicos de un filovirus) o una nucleoproteína de filovirus, así como proteínas recombinantes que comprenden uno o más determinantes de glicoproteínas de filovirus. Las proteínas antigénicas también comprenden proteínas antigénicas que son sustancialmente similares.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la proteína puede mutar de modo que sea menos tóxica para las células (véase, por ejemplo, Wo /2006/037038) o puede expresarse con un nivel aumentado o disminuido en las células. La presente descripción también incluye vacunas que comprenden una combinación de moléculas de ácido nucleico. Por ejemplo, y de modo no taxativo, es posible combinar moléculas de ácido nucleico que codifican GP, ssGP y NP de las cepas de ébola de Zaire, Sudán, Marburgo y Costa de Marfil/Taí Forest en cualquier combinación en una composición de vacuna.

Adenovirus

Un adenovirus según la presente descripción pertenece a la familia de los Adenoviridae y preferentemente es uno que pertenece al género Mastadenovirus. Puede ser un adenovirus humano, pero también puede ser un adenovirus que infecta otras especies, lo que incluye, de modo no taxativo, un adenovirus bovino (por ejemplo, adenovirus bovino 3, BAdV3), un adenovirus canino (por ejemplo, CAdV2), un adenovirus porcino (por ejemplo, PAdV3 o 5) o un adenovirus de simio (el que incluye un adenovirus de mono y un adenovirus de simio, tal como un adenovirus de chimpancé o un adenovirus de gorila). Preferentemente, el adenovirus es un adenovirus humano (HAdV o AdHu, en la presente descripción, se hace referencia a un adenovirus humano como Ad sin indicación de especie, por ejemplo, la notación «Ad5» significa lo mismo que HAdV5, el que es un adenovirus humano de serotipo 5) o un adenovirus de simio, como de chimpancé o de gorila (ChAd, AdCh o SAdV).

La mayoría de los estudios avanzados se han realizado con adenovirus humanos, y se prefieren los adenovirus humanos según ciertos aspectos de la presente descripción. En determinadas realizaciones preferidas, el adenovirus recombinante según la presente descripción se basa en un adenovirus humano. En realizaciones preferidas de la presente descripción, el adenovirus recombinante se basa en un adenovirus humano de serotipo 5, 11,26, 34, 35, 48, 49 o 50. Según una realización particularmente preferida de la presente descripción, un adenovirus es un adenovirus humano de uno de los serotipos 26 o 35.

Una ventaja de estos serotipos es la baja seroprevalencia y/o pocos títulos de anticuerpo neutralizante preexistente en la población humana. Se describe la preparación de vectores de rAd26, por ejemplo, en WO 2007/104792 y en Abbink y col., (2007) Virol 81(9): 4654-63. Se encuentran ejemplos de secuencias de genoma de Ad26 en el acceso a GenBank EF 153474 y en la SEQ ID NO:1 de WO 2007/104792. Se describe la preparación de vectores de rAd35, por ejemplo, en la patente estadounidense n.o 7270811, en WO 00/70071 y en Vogels y col., (2003) J Virol 77(15): 8263-71. Se encuentran ejemplos de secuencias de genoma de Ad35 en el acceso a GenBank AC_000019 y en la Figura 6 de WO 00/70071.

Los adenovirus de simio generalmente también tienen una baja seroprevalencia y/o bajos títulos de anticuerpos neutralizantes preexistentes en la población humana, y se ha informado una cantidad significativa de trabajo usando vectores de adenovirus de chimpancé (p. Ej. US6083716; WO 2005/071093; WO 2010/086189; WO 2010085984; Farina y col., 2001, J Virol 75: 11603-13; Cohen y col., 2002, J Gen Virol 83: 151-55; Kobinger y col., 2006, Virology 346: 394-401; Tatsis y col., 2007, Molecular Therapy 15: 608-17, vea también la reseña de Bangari y Mittal, 2006, Vaccine 24: 849-62, y la reseña de Lasaro y Ertl, 2009, Mol Ther 17: 1333-39). Por lo tanto, en otras realizaciones preferidas, el adenovirus recombinante según la presente descripción se basa en un adenovirus de simio, por ejemplo, un adenovirus de chimpancé. En determinadas realizaciones de la presente descripción, el adenovirus recombinante se basa en adenovirus de simio de tipo 1, 7, 8, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,1, 28,1, 29, 30, 31,1, 32, 33, 34, 35,1, 36, 37,2, 39, 40,1, 41,1, 42,1, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 50 o SA7P.

Vectores adenovirales rAd26 y rAd35

En una realización preferida según la presente descripción, los vectores adenovirales comprenden proteínas de la cápside de dos serotipos raros: Ad26 y Ad35. En la modalidad típica, el vector es un virus rAd26 o rAd35.

Por lo tanto, los vectores que se pueden usar en la presente descripción comprenden una proteína de cápside Ad26 o Ad35 (por ejemplo, una proteína de fibra, pentón o hexón). Un experto reconocerá que no es necesario utilizar una proteína de cápside de Ad26 o Ad35 entera en los vectores de la presente descripción. Por lo tanto, es posible utilizar las proteínas de cápside quiméricas que incluyen al menos una parte de una proteína de cápside de Ad26 o Ad35 en los vectores de la presente descripción. Los vectores de la presente descripción también pueden comprender proteínas de cápside en las que cada una de las fibras, pentones y hexones deriva de un serotipo diferente, siempre que al menos una proteína de cápside derive de Ad26 o Ad35. En realizaciones preferidas de la presente descripción, cada una de las fibras, pentones y hexones deriva de Ad26 o de Ad35.

Un experto reconocerá que es posible combinar los elementos derivados de múltiples serotipos en un único vector de adenovirus recombinante. Por lo tanto, se puede producir un adenovirus quimérico que combina propiedades deseables de diferentes serotipos. Por consiguiente, en algunas realizaciones, un adenovirus quimérico de la presente descripción podría combinar la ausencia de inmunidad preexistente de los serotipos Ad26 y Ad35 con características tales como estabilidad de temperatura, arreglo, anclaje, rendimiento de la producción, infección redirigida o mejorada, estabilidad del ADN en la célula diana y similares.

En ciertas realizaciones, el vector de adenovirus recombinante útil en la presente descripción se deriva principalmente o completamente de Ad35 o de Ad26 (es decir, el vector es rAd35 o rAd26). En algunas realizaciones de la presente descripción, el adenovirus no es capaz de replicación, por ejemplo, debido a que contiene una eliminación en la región E1 del genoma. En el caso de los adenovirus de la presente descripción, los que se derivan de Ad26 o Ad35, se suele intercambiar la secuencia codificante E4-orf6 del adenovirus con el E4-orf6 de un adenovirus del subgrupo C humano, tal como Ad5. Esto hace posible la propagación de dichos adenovirus en líneas celulares complementarias conocidas que expresan los genes E1 de Ad5, tal como, por ejemplo, células 293, células PER.C6 y similares (vea, por ejemplo, Havenga y col., 2006, J Gen Virol 87: 2135-43; WO 03/104467). En determinadas realizaciones de la presente descripción, el adenovirus es un adenovirus humano de serotipo 35 con una eliminación en la región E1, en la que se clonó el ácido nucleico que codifica el antígeno, y con una región E4 orf6 de Ad5. En determinadas realizaciones de la presente descripción, el adenovirus es un adenovirus humano de serotipo 26 con una eliminación en la región E1, en la que se clonó el ácido nucleico que codifica el antígeno, y con una región E4 orf6 de Ad5. En el caso del adenovirus Ad35, se suele retener el extremo 3' del marco de lectura abierto E1B 55K en el adenovirus, por ejemplo, los 166 pb directamente anteriores al marco de lectura de pIX o un fragmento que lo comprende, tal como un fragmento de 243 pb directamente anteriores al codón de inicio de pIX, marcado en el extremo 5' por un sitio de restricción Bsu36I, debido a que esto aumenta la estabilidad del adenovirus porque el promotor del gen de pIX reside parcialmente en dicha área (vea, por ejemplo, Havenga y col., 2006, supra, WO 2004/001032).

Se conoce en la técnica la preparación de vectores adenovirales recombinantes.

Se describe la preparación de vectores de rAd26, por ejemplo, en WO 2007/104792 y en Abbink y col., (2007) Virol 81(9): 4654-63. Se encuentran ejemplos de secuencias de genoma de Ad26 en el acceso a GenBank EF 153474 y en la ^sE^qID NO:1 de WO 2007/104792. Se describe la preparación de vectores de rAd35, por ejemplo, en la patente estadounidense n.o 7270811 y en Vogels y col., (2003) J Virol 77(15): 8263-71. Se encuentra un ejemplo de secuencia de genoma de Ad35 en el n.o de acceso en GenBank AC_000019.

En una realización de la presente descripción, los vectores útiles para la presente descripción incluyen los descritos en WO2012/082918.

Típicamente, un vector útil en la presente descripción se produce usando un ácido nucleico que comprende el genoma adenoviral recombinante completo (por ejemplo, un vector de plásmido, cósmido o baculovirus). Por lo tanto, la presente descripción también proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican los vectores adenovirales de la presente descripción. Las moléculas de ácido nucleico de la presente descripción se pueden encontrar en forma de ARN o en forma de ADN obtenido mediante clonación o producido de forma sintética. El ADN puede ser de cadena doble o de cadena simple.

Los vectores de adenovirus útiles en la presente descripción son típicamente de replicación defectuosa. En dichas realizaciones, la eliminación o inactivación de regiones críticas para la replicación del virus, tales como la región E1, puede hacer que el virus no sea capaz de replicarse. Las regiones se pueden eliminar o inactivar de forma sustancial, por ejemplo, mediante la inserción del gen de interés (usualmente enlazado a un promotor). En algunas realizaciones, los vectores de la presente descripción pueden contener eliminaciones de otras regiones, tales como las regiones E2, E3 o E4, o inserciones de genes heterólogos enlazados a un promotor. En el caso de adenovirus con mutaciones de E2 y/o E4, generalmente se utilizan líneas celulares complementarias E2 y/o E4 para generar adenovirus recombinantes. No es necesario que la línea celular sea complementaria a las mutaciones en la región E3 del adenovirus, dado que E3 es necesario para la replicación.

Una línea de célula empaquetadora se usa típicamente para producir una cantidad suficiente de vectores de adenovirus de la presente descripción. Una célula empaquetadora es una célula que comprende los genes eliminados o inactivados en un vector que no es capaz de replicarse, lo que hace posible que el virus se replique en la célula. Las líneas celulares adecuadas incluyen, por ejemplo, PER.C6, 911, 293 y E1 A549.

Tal como se indicó anteriormente, una amplia variedad de glicoproteínas de filovirus se puede expresar en los vectores. Si fuera necesario, se puede optimizar por codones el gen heterólogo que codifica las glicoproteínas de filovirus para garantizar la expresión adecuada en el hospedador tratado (por ejemplo, ser humano). La optimización de codones es una tecnología ampliamente aplicada en la técnica. Típicamente, el gen heterólogo se clona en la región E1 y/o E3 del genoma adenoviral.

Un promotor derivado de adenovirus (por ejemplo, el promotor MLP (promotor tardío principal)) o un promotor heterólogo pueden controlar (es decir, enlazar de forma operativa) el gen de filovirus heterólogo. Ejemplos de promotores heterólogos adecuados incluyen el promotor de CMV y el promotor de RSV. Preferentemente, el promotor se encuentra antes del gen heterólogo de interés en un casete de expresión.

Como se indicó anteriormente, los vectores de adenovirus útiles para la presente descripción pueden comprender una amplia variedad de glicoproteínas de filovirus conocidas por los expertos en la técnica.

En una realización preferida de la invención de la presente descripción, el vector de rAd comprende una o más GP seleccionadas del grupo que consiste en GP del virus del Ébola de Zaire (EBOV), GP del virus del Ébola de Sudán (SUDV), GP del virus de Marburgo (MARV) y GP sustancialmente similares a estos.

Vectores de MVA

Los vectores de MVA de la presente descripción utilizan virus atenuado derivado del virus Vaccinia Ankara modificado, el que se caracteriza por la pérdida de su capacidad para replicarse de forma reproductiva en línea celulares humanas. Los vectores de MVA expresan una amplia variedad de glicoproteínas de filovirus, así como otras proteínas de filovirus estructurales, tales como VP40 y nucleoproteína (NP).

En un aspecto, la presente descripción provee un virus Vaccinia Ankara modificado (MVA) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un determinante antigénico de una glicoproteína (GP) de filovirus, en particular, una glicoproteína de envoltura. En otro aspecto, la presente descripción provee un vector de MVA recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica un determinante antigénico de una glicoproteína de filovirus, en particular, una glicoproteína de envoltura, y una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica un determinante antigénico de otra proteína de filovirus.

Más de 570 pasajes en serie en fibroblastos de embrión de pollo de la cepa dérmica de vaccinia Ankara [virus Vaccinia Ankara corioalantoide, CVA; vea una reseña en Mayr y col. (1975), Infection 3, 6-14], la que se mantuvo en el Instituto de Vacunación, Ankara, Turquía durante muchos años y se utilizó como la base para la vacunación de humanos, han generado MVA. Sin embargo, debido a las frecuentes complicaciones graves luego de la vacunación asociada con los virus vaccinia, hubo varios intentos para generar una vacuna segura, más atenuada, contra la viruela.

Durante el período de 1960 a 1974, el Prof. Anton Mayr logró atenuar el CVA en más de 570 pasajes continuos en células CEF [Mayr y col. (1975)]. Se demostró en una variedad de modelos animales que el MVA resultante era avirulento [Mayr, A. & Danner, K. (1978), Dev. Biol. Estar. 41: 225-234]. Como parte del desarrollo previo del MVA como una vacuna previruela, se realizaron ensayos clínicos que usaron MVA-517 en conjunto con Lister Elstree [Stickl (1974), Prev. Med. 3: 97-101; Stickl y Hochstein-Mintzel (1971), Munch. Med. Wochenschr. 113: 1149-1153] en sujetos con riesgo de reacciones adversas generadas por vaccinia. En 1976, se registró el MVA derivado del lote madre de MVA-571 (que corresponde a la transferencia 571) en Alemania como la vacuna de sensibilización en un programa de vacunación de viruela parenteral de dos etapas. Posteriormente, se utilizó el MVA-572 en aproximadamente 120 000 individuos caucásicos, quienes eran en su mayoría niños de entre 1 y 3 años de edad, que no presentaron efectos secundarios graves informados, aunque muchos de los sujetos pertenecían a la población con alto riesgo de complicaciones asociadas con vaccinia (Mayr y col. (1978), Zentralbl. Bacteriol. (B) 167:375-390). MVA-572 se depositó en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales como ECACC V94012707.

Como resultado del pasaje utilizado para atenuar el MVA, existe una cantidad de cepas o aislados diferentes, según el número de pasajes en células CEF. Por ejemplo, se utilizó MVA-572 en Alemania en dosis pequeñas como una prevacuna durante el programa de erradicación de la viruela y se usó MVA-575 extensivamente como una vacuna veterinaria. Tanto el MVA como el MVA-BN carecen de aproximadamente 15% (31 kb de seis regiones) del genoma, en comparación con el virus CVA ancestral. Las eliminaciones afectan a una cantidad de genes de rango de hospedadores y de virulencia, así como también el gen para cuerpos de inclusión tipo A. El MVA-575 se depositó el 7 de diciembre de 2000 en la Colección Europea de Cultivos Celulares Animales (ECACC, por sus siglas en inglés) con el número de acceso V00120707. El MVA (virus de vaccinia Ankara modificado) del virus CVA atenuado se obtuvo mediante propagación en serie (más de 570 pasajes) del CVA en fibroblastos de embrión de pollo primarios.

A pesar de que Mayr y col. demostró durante la década de 1970 que el MVA se encuentra altamente atenuado y no es virulento en humanos y mamíferos, ciertos investigadores han informado que el MVA no se encuentra completamente atenuado en líneas celulares de mamíferos y humanos, ya que puede existir aplicación residual en estas células [Blanchard y col. (1998), J. Gen. Virol. 79:1159-1167; Carroll y Moss (1997), Virology 238:198-211; Patente Estadounidense No. 5.185.146; Ambrosini y col. (1999), J. Neurosci. Res. 55: 569]. Se asume que los resultados publicados en dichas publicaciones se obtuvieron con varias cepas conocidas de MVA, dado que los virus utilizados difieren esencialmente en sus propiedades y, particularmente, en su comportamiento de crecimiento en varias líneas celulares. Dicha replicación residual no es deseada por varias razones, las que incluyen preocupaciones de seguridad en relación con el uso en humanos.

El MVA-BN se puede unir a células humanas en las que los genes codificados de forma viral se expresan de forma eficiente e ingresar en ellas. El MVA-BN se adapta en gran medida al fibroblasto de embrión de pollo (CEF, por sus siglas en inglés) primario y no se replica en células humanas. En células humanas, se expresan los genes virales y no se producen virus infecciosos. El MVA-BN está clasificado como organismo de Nivel de Bioseguridad 1 según los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos. Las preparaciones de MVA-BN y derivados se administraron en varios tipos de animales y a más de 2000 sujetos humanos, que incluyen individuos inmunodeficientes. Se demostró que todas las vacunaciones son generalmente seguras y se toleran bien. A pesar de su alta atenuación y su virulencia reducida, se demostró en estudios preclínicos que el MVA-BN provoca respuestas inmunitarias tanto humorales como celulares al virus vaccinia y a los productos génicos heterólogos codificados por genes clonados en el genoma de MVA [E. Harrer y col. (2005), Antivir. Ther. 10(2):285-300; A. Cosma y col. (2003), Vaccine 22(1):21-9; M. Di Nicola y col. (2003), Hum. Gene Ther. 14(14):1347-1360; M. Di Nicola y col. (2004), Clin. Cáncer Res., 10(16):5381-5390].

Los «derivados» o «variantes» de MVA se refieren a virus que exhiben esencialmente las mismas características de replicación que MVA como se describe en esta invención, pero que presentan diferencias en una o más partes de sus genomas. El MVA-BN, así como también un derivado o variante de MVA-BN, no puede replicarse de forma reproductiva in vivo en humanos y ratones, incluso en ratones gravemente inmunocomprometidos. Más específicamente, el MVA-BN o un derivado o variante del MVA-BN también tiene, preferentemente, la capacidad de replicación reproductiva en fibroblastos de embrión de pollo (CEF), pero no tiene la capacidad de replicación reproductiva en la línea celular del queratinocito humano HaCat [Boukamp et ál (1988), J Cell. 106: 761-771], la línea celular de osteosarcoma de hueso humano 143B (ECACC n.o 91112502), la línea celular de riñón embrionario humano 293 (ECACC n.o 85120602) y la línea celular de adenocarcinoma del cuello del útero humano HeLa (ATCC n.o CCL-2). De manera adicional, un derivado o variante de MVA-BN tiene una relación de amplificación de virus de al menos dos veces menos y más preferentemente, de tres veces menos que el MVA-575 en células Hela y líneas celulares HaCaT. Las pruebas y el análisis de estas propiedades de las variantes de MVA se describen en WO 02/42480 (US 2003/0206926) y WO 03/048184 (US 2006/0159699).

El término «no capaz de replicación reproductiva» o «sin capacidad de replicación reproductiva» se describe, por ejemplo, en WO 02/42480, que también enseña cómo obtener MVA que tenga las propiedades deseadas como se mencionó anteriormente. El término se aplica a un virus que tiene una relación de amplificación de virus a los 4 días después de la infección de menos de 1 usando los ensayos descritos en WO 02/42480 o en la patente estadounidense No. 6.761.893.

El término «no se reproduce reproductivamente» se refiere a un virus que tiene una relación de amplificación de virus a los 4 días después de la infección de menos de 1. Ensayos descritos en WO 02/42480 o en la patente estadounidense No. 6.761.893 son aplicables para la determinación de la relación de amplificación del virus.

La amplificación o replicación de un virus normalmente se expresa como la proporción del virus producido a partir de una célula infectada (salida) a la cantidad utilizada originalmente para infectar la célula en primer lugar (entrada) denominada «relación de amplificación». Una relación de amplificación de «1» define un estado de amplificación en el que la cantidad de virus producida a partir de células infectadas es la misma que la cantidad utilizada inicialmente para infectar las células, lo que significa que las células infectadas permiten la infección y reproducción del virus. En contraste, una relación de amplificación de menos de 1, es decir, una reducción de salida en comparación con el nivel de entrada, indica una carencia de replicación reproductiva y, por consiguiente, la atenuación del virus.

Las ventajas de la vacuna basada en MVA incluyen su perfil de seguridad, así como también la disponibilidad para la producción de vacunas a gran escala. Las pruebas preclínicas revelaron que el MVA-BN demuestra una atenuación y eficacia superiores en comparación con otras cepas del MVA (WO 02/42480). Una propiedad adicional de las cepas del MVA-BN es la capacidad de inducir sustancialmente el mismo nivel de inmunidad en regímenes de sensibilización del virus vaccinia y de refuerzo del virus vaccinia en comparación con los regímenes de sensibilización con ADN y refuerzo del virus vaccinia.

Se considera que los virus MVA-BN recombinantes, la modalidad más preferida en esta invención, son seguros debido a su deficiencia de replicación distintiva en células de mamíferos y su avirulencia establecida. Además, aparte de su eficacia, su viabilidad de fabricación a escala industrial puede ser beneficiosa. Además, las vacunas basadas en MVA pueden administrar múltiples antígenos heterólogos y permitir la inducción simultánea de inmunidad humoral y celular. Los vectores de MVA útiles para la presente descripción pueden prepararse usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en WO/2002/042480 y W^o/2002/24224.

En otro aspecto de la presente descripción, las cepas virales de MVA deficientes en replicación también pueden ser adecuadas, tales como la cepa MVA-572, MVA-575 o cualquier cepa de MVA atenuada de manera similar. También puede ser adecuado un MVA mutante, tal como el virus de Vaccinia Ankara de corioalantoide (dCVA). Un dCVA comprende sitios de eliminación del I, del II, del III, del IV, del V y del VI del genoma del MVA. Los sitios son particularmente útiles para la inserción de múltiples secuencias heterólogas. El dCVA se puede replicar de forma reproductiva (con una relación de amplificación de más de 10) en una línea celular humana (tal como las líneas celulares humanas 293, 143B y MRC-5), lo que hace posible la optimización mediante mutación adicional que es útil para una estrategia de vacunación con base en virus (vea WO 2011/092029).

En una realización preferida de la presente descripción, el vector de MVA comprende un ácido nucleico que codifica una o más proteínas antigénicas seleccionadas del grupo que consiste en GP del virus del Ébola de Zaire (EBOV), GP del virus del Ébola de Sudán (SUDV), GP del virus de Marburgo (MARV), NP del virus del Ébola de Tai Forest y GP o NP sustancialmente similares a estos.

Es posible insertar la proteína de filovirus en una o más regiones intergénicas (IGR) del MVA. En determinadas realizaciones de la presente descripción, la IGR se selecciona de IGR07/08, IGR 44/45, IGR 64/65, IGR 88/89, IGR 136/137 y IGR 148/149. En determinadas realizaciones de la presente descripción, menos de 5, 4, 3 o 2 IGR del MVA recombinante comprenden secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican determinantes antigénicos de una glicoproteína de envoltura de filovirus y/o una proteína de filovirus adicional. Las secuencias de nucleótidos pueden, de manera adicional o alternativa, insertarse en uno o más de los sitios de eliminación de origen natural, en particular, en los sitios de eliminación principales I, II, III, IV, V o VI del genoma de MVA. En determinadas realizaciones de la presente descripción, menos de 5, 4, 3 o 2 de los sitios de eliminación de origen natural del MVA recombinante comprenden secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican determinantes antigénicos de una glicoproteína de envoltura de filovirus y/o una proteína de filovirus adicional.

La cantidad de sitios de eliminación de MVA que comprenden secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican determinantes antigénicos de una proteína de filovirus puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más. En determinadas realizaciones de la presente descripción, las secuencias de nucleótidos heterólogas se insertan en 4, 3, 2 o menos sitios de inserción. Preferentemente, se utilizan dos sitios de inserción. En ciertas realizaciones de la presente descripción, se usan tres sitios de inserción. Preferentemente, el MVA recombinante comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6 o 7 genes insertados en 2 o 3 sitios de inserción.

Los virus MVA recombinantes proporcionados en el presente documento pueden generarse mediante procedimientos de rutina conocidos en la técnica. Los expertos en la técnica conocen bien los procedimientos para obtener poxvirus recombinantes o para insertar secuencias de codificación exógenas en un genoma poxviral. Por ejemplo, los procedimientos para las técnicas estándar de biología molecular como la clonación de ADN, aislamiento de ADN y ARN, análisis de transferencia Western, RT-PCR y técnicas de amplificación de PCR se describen en Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed.) [J. Sambrook y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] y se describen técnicas para el manejo y la manipulación de virus en Virology Methods Manual [B.W.J. Mahy y col. (eds.), Academic Press (1996)]. De manera similar, se describen las técnicas y los conocimientos técnicos para el manejo, la manipulación y la modificación genética del MVA en Molecular Virology: A Practical Approach [A.J. Davison & R.M. Elliott (Eds.), The Practical Approach Series, IRL Press en Oxford University Press, Oxford, Reino Unido (1993) (véase, por ejemplo, el Capítulo 9: Expresión de genes por vectores del virus Vaccinia)] y Current Protocols in Molecular Biology [John Wiley & Son, Inc. (1998) (ver, por ejemplo, Capítulo 16, Sección IV: Expresión de proteínas en células de mamíferos usando el vector viral vaccinia)].

Para la generación de los diversos MVA recombinantes descritos en la presente invención, pueden aplicarse diferentes procedimientos. Es posible colocar la secuencia de ADN a insertar en el virus en una construcción de plásmido de E. coli en el que se ha insertado ADN homólogo a una sección de ADN del MVA. Por separado, la secuencia de ADN a insertar puede ligarse a un promotor. El enlace promotor-gen se puede colocar en la construcción de plásmido, de forma que quede flanqueado en ambos extremos por ADN homólogo a una secuencia de ADN que flanquea una región de ^aDⁿde MVA que contiene un locus no esencial. Es posible amplificar la construcción de plásmido resultante mediante propagación con bacteria E. coli y aislarla. Se puede transfectar el plásmido aislado que contiene la secuencia de gen de ADN que se insertará en un cultivo celular, por ejemplo, de fibroblastos de embrión de pollo (CEF), al tiempo que se infecta el cultivo con MVA. La recombinación entre el ADN de MVA homólogo en el plásmido y el genoma viral, respectivamente, puede generar un MVA modificado por la presencia de secuencias de ADN exógenas.

Según una realización preferida de la presente descripción, una célula de un cultivo celular adecuado como, por ejemplo, células CEF, puede infectarse con un poxvirus. Posteriormente, es posible transfectar la célula infectada con un primer vector plásmido que comprende un gen o genes exógenos o heterólogos, preferentemente, conforme al control transcripcional de un elemento de control de expresión de poxvirus. Como se explicó anteriormente, el vector plasmídico también comprende secuencias capaces de dirigir la inserción de la secuencia exógena en una parte seleccionada del genoma poxviral. Opcionalmente, el vector de plásmido también contiene un casete que comprende un gen de selección y/o marcador enlazado de forma operativa al promotor de poxvirus.

Los genes de selección o marcadores adecuados son, por ejemplo, los genes que codifican la proteína verde fluorescente, p-galactosidasa, neomicin-fosforribosiltransferasa u otros marcadores. El uso de casetes de selección o marcadores simplifica la identificación y el aislamiento del poxvirus recombinante generado. Sin embargo, un poxvirus recombinante también puede identificarse mediante tecnología de PCR. Posteriormente, se puede infectar una célula adicional con el poxvirus recombinante obtenido tal como se describió anteriormente y se puede transfectar con un segundo vector que comprende un segundo gen o genes exógenos o heterólogos. En este caso, se puede introducir este gen en un sitio de inserción diferente del genoma del poxvirus, el segundo vector también difiere en las secuencias homólogas al poxvirus que dirigen la integración del segundo gen o genes exógenos en el genoma del poxvirus. Luego de que ocurre la recombinación homóloga, se puede aislar el virus recombinante que comprende dos o más genes exógenos o heterólogos. Se pueden repetir las etapas de infección y transfección con el virus recombinante aislado en etapas previas para infección y mediante el uso de un vector adicional que comprende un gen o genes exógenos adicionales para la transfección con el fin de introducir genes exógenos adicionales en el virus recombinante.

De manera alternativa, las etapas de infección y transfección tal como se describen anteriormente son intercambiables, es decir, se puede transfectar primero una célula adecuada mediante el vector de plásmido que comprende el gen exógeno y, luego, se puede infectar con el poxvirus. Como alternativa adicional, es posible introducir cada gen exógeno en diferentes virus, coinfectar una célula con todos los virus recombinantes obtenidos y analizar para determinar un virus recombinante que incluya todos los genes exógenos. Una tercera alternativa es la ligadura del genoma de ADN y las secuencias exógenas in vitro y la reconstitución del genoma de ADN del virus Vaccinia recombinante con un virus auxiliar. Una cuarta alternativa es la recombinación homóloga en E. coli u otra especie bacteriana entre un genoma del virus vaccinia, tal como MVA, clonado como un cromosoma bacteriano artificial (BAC, por sus siglas en inglés) y una secuencia exógena lineal flanqueada con secuencias de ADN homólogas a secuencias que flanquean el sitio deseado de integración en el genoma del virus vaccinia.

Uno o más promotores de poxvirus pueden controlar el gen de filovirus heterólogo (es decir, pueden estar enlazados de forma operativa). En determinadas realizaciones de la presente descripción, el promotor de poxvirus es un promotor Pr7.5, un promotor híbrido temprano y tardío o un promotor PrS, un promotor PrS5E, un promotor temprano o tardío natural o sintético, o un promotor ATI de virus de viruela vacuna.

Composiciones inmunogénicas

Las composiciones inmunogénicas son composiciones que comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de vectores de adenovirus o MVA purificados o parcialmente purificados para usar en la presente descripción. Dichas composiciones pueden formularse como una vacuna (también denominada «composición inmunogénica») según procedimientos bien conocidos en la técnica. Dichas composiciones pueden incluir adyuvantes para mejorar las respuestas inmunes. Las proporciones óptimas de cada componente en la formulación se pueden determinar mediante técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica en vista de la presente descripción.

La preparación y el uso de composiciones inmunogénicas son bien conocidas por los expertos en la materia. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente incluyen un vehículo líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Se puede incluir solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

Las composiciones de la presente descripción pueden comprender otros antígenos de filovirus o las inoculaciones de sensibilización o de refuerzo pueden comprender otros antígenos. Los otros antígenos usados en combinación con los vectores de adenovirus de la presente descripción no son críticos para la presente descripción y pueden ser, por ejemplo, antígenos de filovirus y ácidos nucleicos que los expresan.

Las composiciones inmunogénicas útiles en la presente descripción pueden comprender adyuvantes.

Los adyuvantes adecuados para la administración conjunta según la presente descripción deberían ser potencialmente seguros, bien tolerados y efectivos en personas que incluyen QS-21, Detox-PC, MPL- SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL- 1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026,GSK-I, GcMAF, B-alethine, MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, Betafectin, Alum, y MF59.

Otros adyuvantes que pueden administrarse incluyen lectinas, factores de crecimiento, citocinas y linfocinas tales como alfa-interferón, interferón gamma, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (gCSF), factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (gMCSF), factor de necrosis tumoral (TNF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-I, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-IO e IL-12 o ácidos nucleicos codificadores.

Las composiciones de la presente descripción pueden comprender un excipiente, vehículo, tampón, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la materia. Dichos materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material puede depender de la ruta de administración, por ejemplo, rutas intramusculares, subcutáneas, orales, intravenosas, cutáneas, intramucosas (por ejemplo, intestino), intranasales o intraperitoneales.

Procedimiento para inducir inmunidad protectora contra infección por filovirus

La presente descripción proporciona un procedimiento para sensibilizar y reforzar una respuesta inmune a uno o más Filovirus en un individuo que usa un vector adenoviral en combinación con otro vector adenoviral y/o un vector MVA. Según un aspecto general de la presente descripción, un procedimiento para inducir una respuesta inmune contra un filovirus en un sujeto comprende:

b. administrar al sujeto una segunda composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un vector de MVA que comprende un ácido nucleico que codifica proteínas antigénicas de al menos dos cepas de filovirus

donde las etapas (a) y (b) se ponen en práctica en cualquier orden. En una realización preferida de la presente descripción, la etapa posterior se realiza 1-12 semanas después de la primera etapa.

En ciertos aspectos adicionales de la presente descripción, la primera composición comprende además uno o más vectores de adenovirus adicionales que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica de un segundo subtipo de filovirus. En otras realizaciones de la presente descripción, la primera composición comprende además uno o más vectores de adenovirus que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica de un tercer subtipo de filovirus.

En una realización de los procedimientos descritos, se usa un vector de adenovirus para cebar la respuesta inmune, y se usa otro vector de adenovirus y/o MVA para reforzar la respuesta inmune aproximadamente 1-12 semanas después de la vacunación de sensibilización. Las composiciones de refuerzo generalmente se administran semanas o meses después de la administración de la composición de sensibilización, por ejemplo, aproximadamente 1 o 2 semanas o 3 semanas, o 4 semanas, o 6 semanas, o 8 semanas, o 12 semanas, o 16 semanas, o 20 semanas., o 24 semanas, o 28 semanas, o 32 semanas o uno o dos años después de la administración de la composición de sensibilización.

En una realización preferida de la presente descripción, los vectores de adenovirus descritos en esta invención incluyen un vector rAd26 o rAd35. En una realización ejemplar de la presente descripción, se usa un vector rAd26 o rAd35 para sensibilizar la respuesta inmune, y se usa un vector MVA para reforzar la respuesta inmune, o viceversa. En una realización más preferida según el procedimiento descrito aquí, se usa un vector rAd26 para la sensibilización seguido de un refuerzo con un vector MVA. Preferentemente, la composición de refuerzo se administra 1-12 semanas después de la sensibilización, más preferentemente 1,2, 4 u 8 semanas luego de la sensibilización. En una realización preferida de la presente descripción, la composición de refuerzo se administra 8 semanas luego de la sensibilización. En otra realización preferida de la presente descripción, la composición de refuerzo se administra 1 semana luego de la sensibilización. En otra realización preferida de la presente descripción, la composición de refuerzo se administra 2 semanas luego de la sensibilización. En otra realización preferida de la presente descripción, la composición de refuerzo se administra 4 semanas luego de la sensibilización.

En una realización más preferida según el procedimiento descrito en esta invención, se usa un vector MVA para la sensibilización seguido de un refuerzo con un vector rAd26. Preferentemente, la composición de refuerzo se administra 1-12 semanas después de la sensibilización, más preferentemente 1,2, 4 u 8 semanas luego de la sensibilización. En una realización preferida de la presente descripción, la composición de refuerzo se administra 8 semanas luego de la sensibilización. En otra realización preferida de la presente descripción, la composición de refuerzo se administra 1 semana luego de la sensibilización. En otra realización preferida de la presente descripción, la composición de refuerzo se administra 2 semanas luego de la sensibilización. En otra realización preferida de la presente descripción, la composición de refuerzo se administra 4 semanas luego de la sensibilización.

La presente descripción también se relaciona con procedimientos para inducir respuestas inmunes contra más de un subtipo de filovirus mediante la sensibilización y el refuerzo de las respuestas inmunes, preferentemente con una combinación de vectores heterólogos.

Según otro aspecto de la presente descripción, un procedimiento para inducir una respuesta inmune contra una pluralidad de subtipos de filovirus en un sujeto comprende:

a. administrar al sujeto una cantidad inmunológicamente efectiva de una pluralidad de vectores rAd26 o rAd35 que comprenden una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican glicoproteínas o glicoproteínas sustancialmente similares de la pluralidad de subtipos de filovirus; y

b. administrar al sujeto una cantidad inmunológicamente efectiva de una pluralidad de vectores de MVA que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican las glicoproteínas o las glicoproteínas sustancialmente similares,

donde las etapas (a) y (b) se ponen en práctica en cualquier orden.

En una o más realizaciones del procedimiento descrito de la presente descripción, se usan una pluralidad de vectores rAd26 o rAd35 para sensibilizar la respuesta inmune, y una pluralidad de vectores MVA para estimular la respuesta inmune, o viceversa.

En una realización preferida según el procedimiento divulgado en esta invención, se usa una pluralidad de vectores rAd26 para la sensibilización seguido de un refuerzo con una pluralidad de vectores MVA. Preferentemente, la inoculación de refuerzo se administra 1-12 semanas después de la sensibilización, más preferentemente 1, 2, 4 u 8 semanas después de la sensibilización.

Los antígenos en las respectivas composiciones de sensibilización y refuerzo (sin embargo, se emplean muchas composiciones de refuerzo) no necesitan ser idénticos, sino que deben compartir determinantes antigénicos o ser sustancialmente similares entre sí.

La administración de las composiciones inmunogénicas que comprenden los vectores es típicamente intramuscular o subcutánea. Sin embargo, también se pueden contemplar otros modos de administración, tales como intravenoso, cutáneo, intradérmico o nasal. La administración intramuscular de las composiciones inmunogénicas se puede lograr usando una aguja para inyectar una suspensión del vector de adenovirus. Una alternativa es el uso de un dispositivo de inyección sin aguja para administrar la composición (usando, por ejemplo, Biojector (TM)) o un polvo liofilizado que contiene la vacuna.

Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o inyección en el sitio de aflicción, el vector estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que esté libre de pirógenos y tenga un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la materia son capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos como la inyección de cloruro de sodio, la inyección de Ringer, la inyección de Ringer lactato. Se pueden incluir conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según sea necesario. También se puede emplear una formulación de liberación lenta.

Típicamente, la administración tendrá un objetivo profiláctico para generar una respuesta inmune contra un antígeno de filovirus antes de la infección o el desarrollo de síntomas. Las enfermedades y trastornos que pueden tratarse o prevenirse según la presente descripción incluyen aquellas en las que una respuesta inmune puede desempeñar un papel protector o terapéutico. En otras realizaciones de la presente descripción, los vectores de adenovirus y MVA pueden administrarse para profilácticos posteriores a la exposición.

Las composiciones inmunogénicas que contienen los vectores de adenovirus se administran a un sujeto, dando lugar a una respuesta inmune antifilovirus en el sujeto. Una cantidad de una composición suficiente para inducir una respuesta inmune detectable se define como una «dosis inmunológicamente efectiva». Como se muestra a continuación, las composiciones inmunogénicas de la presente descripción inducen una respuesta inmune humoral así como mediada por células. En una realización típica de la presente descripción, la respuesta inmune es una respuesta inmune protectora.

La cantidad real administrada y la velocidad y período de tiempo de administración dependerán de la naturaleza y la gravedad de lo tratado. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosificación, etc., es responsabilidad de los médicos generales y otros médicos, o en el contexto veterinario un veterinario, y generalmente tiene en cuenta el trastorno a tratar, la condición del paciente individual, el sitio de entrega, el procedimiento de administración y otros factores conocidos por los profesionales. Se pueden encontrar ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. ed., 1980. Después de la producción de vectores de adenovirus y MVA y la formulación opcional de tales partículas en composiciones, los vectores se pueden administrar a un individuo, particularmente humano u otro primate. La administración puede ser a humanos u otro mamífero, por ejemplo, ratón, rata, hámster, conejillo de indias, conejo, oveja, cabra, cerdo, caballo, vaca, burro, mono, perro o gato. La entrega a un mamífero no humano no necesita ser para un propósito terapéutico, sino que puede usarse en un contexto experimental, por ejemplo, en la investigación de mecanismos de respuestas inmunes a los vectores de adenovirus o MVA.

En un régimen ejemplar, el vector de adenovirus se administra (por ejemplo, intramuscularmente) en un volumen que varía entre aproximadamente 100 |jl y aproximadamente 10 ml que contiene concentraciones de aproximadamente 10⁴a 10¹²partículas de virus/ml. Preferentemente, el vector de adenovirus se administra en un volumen que varía entre 0,25 y 1,0 ml. Más preferentemente, el vector de adenovirus se administra en un volumen de 0,5 ml.

Típicamente, el adenovirus se administra en una cantidad de aproximadamente 10⁹a aproximadamente 10¹²partículas virales (vp) a un sujeto humano durante una administración, más típicamente en una cantidad de aproximadamente 10¹⁰a aproximadamente 10¹²vp. En una realización preferida de la presente descripción, el vector de adenovirus se administra en una cantidad de aproximadamente 5x10¹⁰vp. En otra realización preferida de la presente descripción, el vector de adenovirus se administra en una cantidad de aproximadamente 0,8x10¹⁰vp. En otra realización preferida de la presente descripción, el vector de adenovirus se administra en una cantidad de aproximadamente 2x10¹⁰vp. En otra realización preferida de la presente descripción, el vector de adenovirus se administra en una cantidad de aproximadamente 4x10¹⁰vp. En ciertas realizaciones de la presente descripción, los adenovirus se formulan como una composición trivalente, donde se mezclan tres adenovirus con cada uno un inserto diferente. En una composición trivalente, cada adenovirus distinto está presente preferentemente en una cantidad de aproximadamente 4x10¹⁰vp. En dicha composición trivalente, el número total de partículas de adenovirus por dosis asciende a aproximadamente 1,2x10¹¹vp. En otra realización preferida de la presente descripción, cada adenovirus distinto en la composición trivalente está presente en una cantidad de aproximadamente 1x10¹¹vp. En dicha composición trivalente, el número total de partículas de adenovirus por dosis asciende a aproximadamente 3x10¹¹vp. La vacunación inicial es seguida por un refuerzo como se describió anteriormente.

En otro régimen ejemplar, el vector MVA se administra (por ejemplo, intramuscularmente) en un volumen que varía entre aproximadamente 100 j l y aproximadamente 10 ml de solución salina que contiene una dosis de aproximadamente 1x10⁷TCID⁵⁰a 1x10⁹TCID⁵⁰(Dosis infecciosa del cultivo de tejidos al 50%) o Inf.U. (Unidad infecciosa). Preferentemente, el vector MVA se administra en un volumen que varía entre 0,25 y 1,0 ml. Más preferentemente, el vector MVA se administra en un volumen de 0,5 ml.

Típicamente, el vector MVA se administra en una dosis de aproximadamente 1x10⁷TCID⁵⁰a 1x10⁹TCID⁵⁰(o Inf.U.) a un sujeto humano durante una administración. En una realización preferida de la presente descripción, el vector MVA se administra en una cantidad de aproximadamente 5x10⁷TCID⁵⁰a 5x10⁸TCID⁵⁰(o Inf.U.). En una realización más preferida de la presente descripción, el vector MVA se administra en una cantidad de aproximadamente 5x10⁷TCID⁵⁰(o Inf.U.). En una realización más preferida de la presente descripción, el vector MVA se administra en una cantidad de aproximadamente 1x10⁸TCID⁵⁰(o Inf.U.). En otra realización preferida de la presente descripción, el vector MVA se administra en una cantidad de aproximadamente 1,9x10⁸TCID⁵⁰(o Inf.U). En otra realización preferida más de la presente descripción, el vector MVA se administra en una cantidad de aproximadamente 4,4x10⁸TCID⁵⁰(o Inf.U.). En una realización más preferida de la presente descripción, el vector MVA se administra en una cantidad de aproximadamente 5x10⁸TCID⁵⁰(o Inf.U.)

La composición puede, si se desea, presentarse en un kit, paquete o dispensador, que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el ingrediente activo. El kit puede comprender, por ejemplo, una lámina metálica o plástica, tal como un envase de ampollas. El kit, paquete o dispensador puede estar acompañado de instrucciones para la administración.

Las composiciones de la presente descripción pueden administrarse solas o en combinación con otros tratamientos, ya sea simultánea o secuencialmente dependientes de la afección a tratar.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar, la invención.

Ejemplo 1

Se realizó un estudio en animales con el objetivo de identificar una vacuna multivalente contra el filovirus con una eficacia real > 80% contra múltiples Filovirus [p. Ej., Marburg, Ebola (también conocido como Zaire) y Sudán] para el desarrollo avanzado continuo. El estudio probó un programa de vacunación extendido usando dos o tres vacunas y el impacto del uso de combinaciones de vacunas heterólogas (en oposición a las homólogas) en las respuestas inmunes de NHP posteriores a los Filovirus diana. El NHP vacunado fue expuesto al virus del Ébola Kikwit para probar la eficacia de las vacunas aplicadas.

Manipulaciones de animales

Estos estudios cumplieron con todas las secciones aplicables de las Reglas finales de los reglamentos de la Ley de bienestar animal (9 CFR Partes 1,2 y 3) y la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio - National Academy Press, Washington D. C. Octava Edición (la Guía).

Un total de 16 macacos Cynomolgus (Macaca fascicularis) (NHP) (12 machos y 4 hembras), macacos cynomolgus de origen mauriciano, de 4 a 5 años de edad, aprox. Se compraron 4-8 kg cada uno de PrimGen (Hines, IL). Los animales fueron experimentalmente sin tratamiento previo al virus Reston (RESTV) por ELISA antes de la vacunación. Se excluyeron los animales con exposición previa a Tuberculosis micobacteriana, el virus de inmunodeficiencia de los simios (SIV), el virus linfotrópico T de los simios-1 (STLV-1), el herpesvirus de la macacina 1 (virus del herpes B) y el retrovirus de los simios (SRV1 y SRV2). Se probaron infecciones con Salmonella y Shigella y se confirmaron negativas para Tuberculosis micobacteriana.

Los filovirus son patógenos del grupo de riesgo 4 (alta contención); por lo tanto, todas las manipulaciones relacionadas con el virus del ebolavirus del Zaire, el virus del ébola del Sudán o los virus de Marburg se llevaron a cabo en la instalación de contención del Nivel de Bioseguridad (BSL)-4/Nivel de Bioseguridad Animal (ABSL-4) acreditado por CDC.

Materiales de la vacuna

Los vectores rAd fueron fabricados por Crucell Holland BV Son vectores purificados de vacuna de Adenovirus recombinante de replicación deficiente con deleción en E1/E3 de tipo 26 o 35 (Ad26 y Ad35, respectivamente) que contienen los genes de la glicoproteína de Filovirus (GP) insertados en la posición E1. Estos vectores se rescataron en células PER.C6®, se purificaron en placa, se escalaron y a continuación se purificaron mediante un procedimiento de bandas de CsCl de dos pasos y posteriormente se formularon en un tampón de formulación basado en TRIS y se almacenaron por debajo de -65 °C. La liberación para el uso in vivo de estos vectores incluye prueba de carga biológica, bajo nivel de endotoxina (<5EU/ml) y confirmación de la expresión e integridad del transgen.

En particular, los vectores rAd expresaron EBOV Mayinga GP (SEQ ID NO:1), SUDV Gulu GP (SEQ ID NO:2) y MARV Angola GP (SEQ ID NO:3). Cada vector de rAd expresó una única proteína antigénica (GP).

Los vectores MVA fueron fabricados por Bavarian Nordic. En particular, el vector múltiple MVA (MVA-BN-Filo) expresó 4 proteínas antigénicas diferentes: ^eB^oV Mayinga GP (SEQ ID NO:1); SUDV Gulu ^gP (SEQ ID NO:2); MA^rV Musoke GP (SEQ ID NO: 4); y el virus del bosque de Tai (TAFV) NP (SEQ ID NO:5).

Los materiales de la vacuna se almacenaron a -80 °C en un congelador de temperatura controlada.

Vacunación y diseño experimental.

Vea las Figuras 1 y 2 para la agrupación de estudio y el diseño experimental.

Los macacos Cynomolgus (Macaca fascicularis) (NHP) se vacunaron utilizando dos plataformas de vacuna diferentes, 2 animales por grupo, además de un grupo de control que consiste en dos controles de exposición sin tratamiento previo (vector vacío). Los animales se vacunaron primero con los vectores recombinantes en los grupos que se muestran en la Figura 1. Cada macaco fue anestesiado y recibió una inyección intramuscular (IM) de la vacuna en el muslo posterior izquierdo. Las dosis de sensibilización y refuerzo se administraron con 4 u 8 semanas de diferencia (Fig.1) Cada dosis de adenovirus consistió en una única inyección IM en el muslo posterior izquierdo. Los vectores de MVA se administraron por vía subcutánea.

EDTA o sangre completa con heparina se envió durante la noche a temperatura ambiente a Texas Biomed en D28, D56 y D63. Además, se recogió sangre completa con heparina o EDTA en D77 mientras que los animales se alojaron en Texas Biomed. En todos estos puntos de tiempo, la sangre entera de EDTA se procesará para PBMC y plasma en Texas Biomed.

Se utilizaron PBMC en un ensayo ELISPOT de IFN-g usando los grupos de péptidos Ebola Zaire 1 y 2, los grupos de péptidos Sudán Gulu 1 y 2, un grupo de péptidos consenso de Ebolavirus, el grupo de péptidos Marburg Angola 1 y 2 y un grupo de péptidos de consenso Marburgvirus, junto con un control negativo DMSO único y un control positivo de estimulación anti-CD3. Todas las estimulaciones se realizaron por duplicado, para un total de 20 pocillos por NHP. Además, se procesó sangre entera sin anticoagulante para suero en Bioqual en D0, D28, D56 y D68, y en D77 en Texas Biomed. Alícuotas del suero recolectado en Bioqual se enviarán congeladas a Texas Biomed en D68. Cada suero se analizó en un ELISA específico para ZEBOV GP. Además, el suero de D0, D56 y D77 se analizó en un SEBOV GP y un ELISA específico de MARVA GP (dos ensayos diferentes).

Tabla 1: Parámetros medidos antes de la exposición al virus Ébola

Inóculo de Filovirus para exposiciones animales

Como se muestra en la Fig. 2, aproximadamente 4 semanas después de la vacunación de refuerzo, los animales fueron expuestos a EBOV. En particular, EBOV kikwit-9510621 se usó para exposiciones animales y fue suministrado por Texas Biomed. Se obtuvo un segundo pasaje de cultivo celular (P2) de EBOv kikwit-9510621 del Dr. Tom Ksiazek (en WRCEVA del NIAID en el Laboratorio Nacional Health Galveston de UTMB) en 2012 y se propagó en Texas Biomed por tercera vez en células Vero E6 y tuvo un título de 2,1 x 105 PFU/ml. EBOV kikwit-9510621. LOT No.

2012099171.

Título en la cosecha: 2,1 x 105 PFU/ml se utilizó para el estudio.

Se confirmó que el stock de exposición era el EBOV kikwit 9510621 de tipo salvaje mediante una secuenciación profunda con solo 1 diferencia de SNP de la secuencia consenso Genbank P2. El stock de exposición se almacenó en fase de vapor de nitrógeno líquido como alícuotas de 500 ± 50 pl que contenían medios (MEM) que contenían 10% de FBS. Para un desafío de 100 PFU, el agente de exposición de filovirus se diluyó a una dosis diana de 200 PFU/ml en solución salina tamponada con fosfato. Brevemente, el virus stock se diluyó mediante tres diluciones consecutivas 1:10 en PBS para lograr una concentración de material de desafío de 200 PFU/ml. Se administró un total de 0,5 ml de material de exposición a cada animal.

Antes de la inyección del virus, los monos se sedaron mediante inyección intramuscular con Telazol (2 a 6 mg/kg; 5 a 8 mg/kg de ketamina IM prn para anestesia suplementaria). En el día de estudio 0, se recogió sangre y cada mono se expuso posteriormente a una dosis específica de 100 UFP de EBOV en un volumen de 0,5 ml mediante inyección intramuscular en el músculo deltoides derecho del brazo. El sitio de exposición fue grabado.

Después de la administración del virus, cada mono fue devuelto a su jaula y observado hasta que se recuperó de la anestesia (reclinación esternal/capacidad de mantener una postura erguida). Los criterios de valoración en este estudio fueron supervivencia/no supervivencia. La no supervivencia se define por un animal que tiene una enfermedad terminal o está moribundo. La salud de los animales se evaluó en una hoja de puntuación de observación clínica diaria. Anti-EBOV GP IgG ELISA

La respuesta humoral específica de Filovirus se determinó en los puntos temporales descritos en la tabla 1 mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas modificado (ELISA), como se describió previamente en Sulivan y col. (2006) (Protección inmune de primates no humanos contra el virus del Ébola con vectores únicos de adenovirus de dosis baja que codifican GP modificados. PLoS Medicine 3, e177). Brevemente, las placas ELISA se revistieron durante la noche con Galanthus Nivalis Lectin a 10 pg/ml. A continuación, después del bloqueo, las placas se revistieron con un sobrenadante GP específico de la cepa Ebola o Marburg. Estos sobrenadantes se produjeron por transfección transitoria de Hek293T con plásmidos de expresión que codifican la glicoproteína de filovirus eliminada del dominio transmembrana y la cola citoplasmática. Las muestras de suero de mono se analizaron en una serie de dilución de 4 veces a partir de 1:50. La IgG unida se detectó por colorimetría a 492 nm. Los títulos de suero relativos se calcularon frente a un suero de referencia específico de cepa de glicoproteína de filovirus. Los resultados del ensayo de Elisa se muestran en las Figuras 4-6.

Ensayo ELISPOT IFN-g

La respuesta inmune celular específica de Filovirus se determinó en los puntos de tiempo descritos en la tabla 1 mediante el ensayo de inmunospot unido a la enzima interferón gamma (ELISPOT) como se describió anteriormente en Ophorst y col. 2007 (Aumento de la inmunogenicidad de la vacuna recombinante contra la malaria basada en Ad35 a través de la formulación con adyuvante de fosfato de aluminio. Vaccine 25, 6501-6510). Los grupos de péptidos utilizados para la estimulación de cada glicoproteína de la cepa de Ébola y Marburg consisten en 15 mers superpuestos por 11 aminoácidos. Para minimizar los efectos no deseados de un número demasiado elevado de péptidos en un grupo, cada grupo de péptidos de glicoproteína se dividió en dos, una mitad N-terminal y una mitad C-terminal. Los péptidos que se superponen con más de nueve aminoácidos consecutivos dentro de tres Ebolavirus (Zaire, Sudán y Tai Forest) o dos virus de Marburg (virus de Marburg y Ravn) se combinaron en un grupo de consenso. Los grupos de péptidos y péptidos individuales se usaron a una concentración final de 1|jg/ml para cada péptido individual. Los resultados del ensayo ELISPOT se muestran en la Figura 7.

Como se muestra en los resultados resumidos en las Figs. 3-7, el estudio en animales de este documento demostró la utilidad de los vectores rAd y MVA en combinaciones de sensibilización y refuerzo para prevenir infecciones por filovirus en primates. En particular, la administración de uno o más vectores rAd26 que expresan GP(s) de uno o más tipos de filovirus o vectores MVA que expresan múltiples antígenos de filovirus dio como resultado una sensibilización efectiva de la respuesta humoral a uno o más tipos de filovirus. Después de aumentar la inmunización en la semana 8 con el vector heterólogo, todos los regímenes de vacunas indujeron una respuesta inmune humoral y celular similar a uno o más tipos de filovirus y proporcionaron una protección del 100% contra una exposición altamente patógena del ébola de Zaire.

Ejemplo 2

Se realizó un segundo estudio de NHP para confirmar la inmunogenicidad y la eficacia protectora de 2 regímenes de sensibilización y refuerzo a las semanas 0-4 y a intervalos de 0-8 semanas. Uno que comprende una vacuna monovalente Ad26.ZEBOV como sensibilizante y un MVA-BN-Filo como refuerzo; el otro comprende un MVA-BN-Filo como sensibilizante y un Ad26.ZEBOV como refuerzo. Todas las inmunizaciones fueron intramusculares. Ad26.ZEBOV (5x10¹⁰vp) se utilizó como sensibilizador para el régimen de 0-8 semanas, y se combinó con un refuerzo de 1x10⁸TCID⁵⁰de MVA-BN-Filo (4 NHP) y 5x10⁸TCID⁵⁰MVA-BN-Filo (4 NHP) para evaluar el impacto de un estándar y una dosis alta de MVA en este régimen. Dos grupos adicionales de 4 NHP fueron sensibilizados con 1x10⁸TCID⁵⁰de MVA-BN-Filo y 5x10⁸TCID⁵⁰MVA-BN-Filo, respectivamente; en ambos casos seguido de un refuerzo con Ad26.ZEBOV (5x10¹⁰vp) después de 4 semanas, para evaluar el impacto de la dosis de MVA-BN-Filo como sensibilizador en un régimen de 4 semanas. Además, se sensibilizaron 2 NHP con Ad26.ZEBOV (5x10¹⁰vp) seguido de 1x10⁸TCID⁵⁰de MVA-BN-Filo. Finalmente, se inmunizaron 2 NHP con el vector Ad26 vacío (sin expresar ningún antígeno de Filovirus, 5x10¹⁰vp IM) y TBS como control de inmunización negativo para el estudio. Todos los animales fueron expuestos a 4 semanas después de la última inmunización con 100 pfu de virus de exposición P3 de tipo salvaje EBOV KBOwit 1995. La agrupación de este estudio se resume en 2.

Tabla 2: Estudio experimental de agrupación de protección en primates no humanos expuestos a EBOV Grupo Inmunización 1 Inmunización 2 Programa de Exposición Relación de (Dosis 1) (Dosis 2) inmunización después de 4 supervivencia (semanas) semanas (%) 1/A Ad26.empty Control negativo de 0-8 EBOV (Kikwit) 0/2 (0%) (5x10¹⁰vp) MVA (TBS)

2/B Ad26.ZEBOV MVA-BN-Filo 0-8 EBOV (Kikwit) 4/4 (100%)

(5*10¹⁰vp) (5*10⁸TCID⁵⁰)

3/C MVA-BN-Filo Ad26.ZEBOV 4-8 EBOV (Kikwit) 2/4 (50%) (5*10⁸TCID⁵⁰) (5*10¹⁰vp)

4/D Ad26.ZEBOV MVA-BN-Filo 0-8 EBOV (Kikwit) 4/4 (100%)

(5*10¹⁰vp) (1*10⁸TCID⁵⁰)

5/E MVA-BN-Filo Ad26.ZEBOV 4-8 EBOV (Kikwit) 2/4 (50%) (1*10⁸TCID⁵⁰) (5*10¹⁰vp)

6/F Ad26.ZEBOV MVA-BN-Filo 4-8 EBOV (Kikwit) 2/2 (100%)

(5*10¹⁰vp) (5*10⁸TCID⁵⁰)

Abreviaturas: TBS: Solución salina tamponada con tris; TCID⁵⁰: Dosis infecciosa de cultivo de tejidos al 50%; vp: partículas virales. 100% de supervivencia están en negrita.

Inmunogenicidad

La respuesta inmune en NHP se caracteriza con respecto a los anticuerpos neutralizantes y de unión a Filovirus GP (ELISA), así como a las células T productoras de citocinas (ELISpot).

ELISA:

Los anticuerpos reactivos EBOV Mayinga GP se analizaron mediante ELISA específico de GP para todos los puntos de tiempo (véase la Figura 20).

El ELISA anti-EBOV GP IgG se realizó como se describe en el experimento 1. No se observaron títulos de ELISA en animales vacunados con control. Los regímenes de vacuna fueron inmunogénicos en todos los animales. Los títulos más altos se observaron en el Grupo B, recibiendo Ad26.ZEBOV y una dosis alta de MVA-BN-Filo con un intervalo de 8 semanas.

Eficacia protectora

Ambos regímenes de sensibilización y refuerzo Ad26.ZEBOV/MVA-BN-Filo de 8 semanas resultaron en una supervivencia completa después de la exposición a EBOV, independientemente de la dosis de MVA-BN-Filo (1*10⁸TCID⁵⁰o 5*10⁸TCID⁵⁰). Además, un régimen de 4 semanas de Ad26.ZEBOV/MVA-BN-Filo dio protección en 2 de los 2 NHP. Ambos regímenes de 4 semanas de MVA-BN-Filo/Ad26.ZEBOV brindaron protección en 2 de los 4 NHP. Ejemplo 3

Se realiza un estudio clínico en humanos para evaluar la seguridad, tolerabilidad e inmunogenicidad de los regímenes que utilizan MVA-BN-Filo a una dosis de 1x10⁸TCID⁵⁰y Ad26.ZEBOV a una dosis de 5x10¹⁰vp. El estudio consiste en dos partes.

El estudio principal es un estudio aleatorizado, controlado con placebo, ciego observador que se realiza en 72 sujetos adultos sanos que nunca antes recibieron una vacuna experimental contra el Ébola y que no tienen una exposición conocida al virus del Ébola o el diagnóstico de la enfermedad del Ébola. En este estudio se prueban 4 regímenes: 2 regímenes tienen MVA-BN-Filo como sensibilizador y Ad26.ZEBOV como refuerzo en un intervalo de 28 o 56 días, y 2 regímenes tienen Ad26.ZEBOV como sensibilizador y MVA-BN-Filo como refuerzo en un intervalo de 28 o 56 días. El subestudio consiste en un brazo de tratamiento abierto, no controlado, no aleatorio que evalúa la seguridad, la tolerabilidad y la inmunogenicidad de un régimen con Ad26.ZEBOV a una dosis de 5x10¹⁰vp como sensibilizador y MVA-BN-Filo en una dosis de 1x10⁸TCID⁵⁰como refuerzo 14 días después, y se realiza en l5 sujetos adultos sanos. El estudio consiste en un período de vacunación en el que los sujetos se vacunan al inicio del estudio (día 1) seguido de un refuerzo el día 15, 29 o 57, y un seguimiento posterior al refuerzo hasta que todos los sujetos hayan tenido su visita de refuerzo posterior de 21 días (día 36, 50 o 78) o interrumpido antes.

Los sujetos en el estudio principal se inscribieron en 4 grupos diferentes de 18 sujetos sanos cada uno. En general, los sujetos se asignan al azar dentro de un grupo en una proporción de 5:1 para recibir la vacuna activa o placebo (solución salina al 0.9%) a través de inyecciones IM (0,5 ml) de la siguiente manera:

• MVA-BN-Filo (1x10⁸TCID⁵⁰) en el día 1, seguido por un refuerzo de Ad26.ZEBOV (5x10¹⁰vp) en el día 29 (Grupo 1) o día 57 (Grupo 2), o

• Ad26.ZEBOV (5x10¹⁰vp) en el día 1, seguido por un refuerzo de MVA-BN-Filo (1x10⁸TCID⁵⁰) en el día 29 (Grupo 3) o día 57 (Grupo 4).

Los 15 sujetos en el subestudio reciben la vacuna activa a través de inyecciones IM (0.5 ml) de la siguiente manera:

• Ad26.ZEBOV (5x10¹⁰vp) en el día 1, seguido por un refuerzo de MVA-BN-Filo (1x10⁸TCID⁵⁰) en el día 15 (Grupo 5).

Los ejemplos de programas de vacunación del estudio se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3: Pro ramas de vacunación del estudio

N: número de sujetos que recibirán la vacuna del estudio; TCID⁵⁰: Dosis infecciosa del cultivo de tejidos al 50%; vp:

partículas virales

La seguridad se evalúa mediante la recopilación de eventos adversos locales y sistémicos solicitados, eventos adversos no solicitados y eventos adversos graves, y mediante un examen físico. Además, la química estándar, los parámetros hematológicos (incluidos los parámetros de coagulación) y el análisis de orina se evalúan en múltiples puntos de tiempo.

La inmunogenicidad se evalúa utilizando los ensayos inmunológicos resumidos en las Tablas 4 y 5. El paquete de ensayos exploratorios puede incluir, entre otros, los ensayos enumerados.

Tabla 4: Resumen de ensayos inmunológicos (Serología)____________________________________________ Ensayo Propósito

Criterios de valoración secundarios

Ensayo de neutralización de virus Análisis de anticuerpos neutralizantes para EBOV GP ELISA Análisis de anticuerpos que se unen a EBOV GP

Criterios de valoración exploratorios

Ensayo de neutralización de adenovirus/MVA Anticuerpos neutralizantes contra adenovirus/MVA Caracterización de anticuerpos moleculares. Análisis de las características de anticuerpos anti-EBOV GP, SUDV GP, MARV GP y/o TAFV NP, incluida la subtipificación de IgG

ELISA exploratorio Análisis de anticuerpos de unión a una fuente diferente de GP _________________________________________ EBOV_______________________________________________ EBOV: Virus del Ébola; ELISA: ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas; GP: glicoproteína; IgG: inmunoglobulina G; MARV: Virus de Marburg; MVA: Vaccinia Ankara modificada; NP: nucleoproteína; SUDV: Virus de Sudán; TAFV: Virus del bosque Tai

Tabla 5: Resumen de ensayos inmunológicos (celular)

Ensayo Propósito

Criterios de valoración secundarios

ELISpot Respuestas de IFN-y de células T a EBOV GP

Criterios de valoración exploratorios

ICS de PBMC congelados Análisis de las respuestas de las células T a EBOV GP, SUDV GP, MARV GP y/o TAFV NP (incluidos CD4/8, IL-2, IFN-y, TNF-a y/o marcadores de activación)

ICS y/o ELISpot de PBMC fresco Análisis de las respuestas de las células T a EBOV GP, incluidas las respuestas de células T positivas para CD4 y de __________________________________________ baja magnitud________________________________________ EBOV: Virus del Ébola; ELISpot: inmunospot ligado a enzimas; GP: glicoproteína; ICS: tinción intracelular de citocinas; IFN: interferón; IL: interleucina; MARV: Virus de Marburg; NP: nucleoproteína; PBMC: células mononucleares de sangre periférica; SUDV: Virus de Sudán; TAFV: Virus del bosque de Tai; TNF: factor de necrosis tumoral

El estudio clínico está en curso. Algunos de los resultados iniciales se describen a continuación.

Evaluación de seguridad

La seguridad se evaluó mediante la recopilación de eventos adversos locales y sistémicos solicitados, eventos adversos no solicitados y eventos adversos graves, y mediante un examen físico. Además, la química estándar, los parámetros hematológicos (incluidos los parámetros de coagulación) y el análisis de orina se evaluaron en múltiples puntos de tiempo.

Los datos de seguridad de este primero en humanos mostraron que ambas vacunas parecen ser bien toleradas en esta etapa con reacciones transitorias que normalmente se esperan de la vacunación. No se asociaron eventos adversos significativos con el régimen de vacuna. La mayoría de los eventos fueron leves, ocurrieron uno o dos días después de la vacunación y duraron uno o dos días en promedio. Se observaron muy pocos casos de fiebre.

Evaluación de la respuesta inmune.

La inmunogenicidad se evaluó hasta 21 días después de la inmunización de refuerzo utilizando un ensayo ELISA para analizar los anticuerpos que se unen a EBOV GP, un ensayo ELISpot para analizar una respuesta de células T específicas de EBOV GP y ensayos ICS para detectar respuestas de células T CD4+ y CD8+ a EBOV GP. Se recogieron muestras para el análisis de la respuesta inmune humoral y celular inducida por las vacunas del estudio los días 1, 8, 29, 36 y 50 en los grupos 1 y 3 y en los días 1, 8, 29, 57, 64 y 78 para los grupos 2 y 4.

Evaluación de la respuesta inmune humoral

Las respuestas de anticuerpos de unión inducidas por las vacunas del estudio se evaluaron mediante un ensayo ELISA de GP anti-EBOV (Fig. 8). Es importante destacar que todos los sujetos que recibieron un régimen de vacuna mostraron seroconversión a los 21 días después de la inmunización de refuerzo. Se ha observado una respuesta inmunogénica robusta en todos los sujetos inmunizados.

Mientras que la respuesta inmune específica de EBOV GP posterior a la sensibilización con MVA-BN-Filo solo se observó a niveles bajos en 7 a 40% de los sujetos, se observó una fuerte respuesta específica de antígeno después del refuerzo con Ad26.ZEBOV administrado a los 28 días o 56 días después del refuerzo. Sorpresivamente, esta respuesta es de mayor magnitud que la inducida por el régimen de vacunación inversa en el mismo intervalo de tiempo de sensibilización y refuerzo (Grupo 3 y Grupo 4, sensibilización Ad26.ZEBOV seguido de refuerzo MVA-BN-Filo 28 o 56 días después) respectivamente) a los 21 días después de la inmunización de refuerzo [Título medio geométrico con un intervalo de confianza del 95% de EU/mL 10573 (6452; 17327) y 4274 (2350; 7775) para los grupos 1 y 3 respectivamente, y 18729 (12200; 28751) y 7553 (511; 1115) para los grupos 2 y 4, respectivamente].

Cabe señalar que en los primates no humanos (NHP), reforzar una sensibilización de MVA con Ad26 había resultado en una respuesta inmune específica de GP de EBOV que era similar en magnitud a la inducida por el régimen de vacuna inversa (Ad/MVA), al mismo intervalo de tiempo de sensibilización y refuerzo (ver Fig. 4) o que fue inferior en magnitud (Fig. 20). Por lo tanto, las respuestas inmunes observadas para un régimen específico de sensibilización y refuerzo en NHP no fueron predictivas para las respuestas inmunes observadas siguiendo ese mismo régimen de sensibilización y refuerzo en humanos.

Evaluación de la respuesta inmune celular.

La respuesta inmune celular específica de GP de EBOV se midió por interferón gamma (IFN-y) ELISpot e ICS. Para evaluar la respuesta inmune celular, las PBMC almacenadas (células mononucleares de sangre periférica) se descongelaron y se estimularon con péptidos organizados en 2 grupos (Grupos 1 y 2). La suma de las respuestas de células T estimuladas por grupo se muestra en la Figura 9.

Mediante el análisis ELISpot (Fig. 9), se pudo detectar fácilmente una respuesta de IFN-^yen el 50 al 60% de los sujetos en el día 29 después de la inmunización de sensibilización con Ad26.ZEBOV (respuesta media de IFN-y 103 y 58 puntos formando unidades por millón PBMC para el Grupo 3 y 4, respectivamente) y en el 86% de los sujetos en el día 57 después de la inmunización de sensibilización con Ad26.ZEBOV (Grupo 4, respuesta media de IFN-^y283 puntos formando unidades por millón (SFU/106) PBMC). Estas respuestas aumentaron aún más mediante la inmunización el día 29 o el día 57 con MVA-BN-Filo (87% de respondedores, respuesta media de IFN-y 463 SFU/106 PBMC para el Grupo 3, 86% de respondedores, 648 SFU/106 PBMC para el Grupo 4) y se mantuvo en ese nivel hasta el día 21 después del refuerzo (79% de respondedores, respuesta media IFN-y 390 s Fu/106 PBMC para el Grupo 3 y 100% de respondedores, 464 S^fU/106 P^bM^cpara el Grupo 4).

Los resultados para los ensayos celulares que miden las respuestas específicas de células T CD4+ y CD8+ por ICS se muestran en las Figuras 10-15.

Como se esperaba, no se observó respuesta de células T CD8+ o CD4+ específicas a GP de EBOV en individuos inmunizados con placebo (Figs. 10 y 13). No se observaron respuestas de citocinas CD8+ el día 29 o el día 57 después de la inmunización de sensibilización con MVA-BN-Filo (Grupo 1 y 2). Sin embargo, se observó una respuesta de células T CD8+ inducida por la vacuna en el 53% de los sujetos 7 días después del refuerzo con Ad26.ZEBOV (mediana de respuesta total de citocinas: 0,08% y 0,07%, cuando Ad26 aumenta la inmunización administrada el día 29 o el día 57, respectivamente; Fig.10). Esta respuesta se mantuvo el día 21 después de la vacunación de refuerzo (mediana de respuesta total de citocina: 0,1% y 0,06%, cuando Ad26 aumenta la inmunización administrada el día 29 o el día 57, respectivamente; Fig.10). En comparación, el 57% de los sujetos que recibieron una inmunización primaria con Ad26.ZEBOV (Grupo 3 y Grupo 4) mostraron en el día 29 una respuesta de células T CD8+ (mediana de respuesta total de citocina: 0,12 y 0,05%, respectivamente), el 86% de los sujetos en el día 57 después de la inmunización de sensibilización Ad26.ZEBOV (Grupo 4) mostró una respuesta de células T CD8+ (respuesta media total de citocina: 0,19%). Esta respuesta se mejoró aún más después de la inmunización de refuerzo con MVA-BN-Filo en el día 29, con un 67% y un 73% de sujetos que respondieron 7 y 21 días después del refuerzo, respectivamente (respuesta media: 0,27% en ambos días).

Sorpresivamente, aunque se observó un porcentaje menor de respondedores en el Grupo 1 (programa de 0-28 días de sensibilización y refuerzo MVA-Ad26) en comparación con el Grupo 3 (programa de 0-28 días de sensibilización y refuerzo Ad26-MVA), la proporción de células T CD8+ polifuncionales (células T CD8+ que expresan más de una citocina) inducida por el régimen de sensibilización y refuerzo MVA-Ad26 en estos respondedores fue mayor después del refuerzo que la inducida por el régimen de sensibilización y refuerzo Ad26-MVA (Fig. 11) Esta diferencia no se observó cuando el sensibilizador y el refuerzo se administraron en el día 57. Usando este programa, tanto los regímenes de sensibilización MVA refuerzo Ad26 (Grupo 2) sensibilización Ad26 refuerzo MVA (Grupo 4) indujeron una proporción similar alta de células T CD8+ polifuncionales (Fig. 12).

Sorpresivamente, la inmunización de sensibilización con MVA-BN-Filo seguida de un refuerzo con Ad26.ZEBOV administrado en un intervalo de 28 días (Grupo 1) indujo una respuesta muy fuerte de células T CD4+ que alcanzó un máximo a los 7 días después de la inmunización de refuerzo (93% de respondedores, mediana de respuesta total de citocina 0,37%; Fig. 13). En el pico, esta respuesta de células T CD4+ fue de una magnitud mayor que la observada en el Grupo 3 después de la inmunización de sensibilización con Ad26.ZEBOV seguido de un refuerzo de MVA-BN-Filo en un intervalo de 28 días (67% de respondedores, mediana de respuesta total de citocinas 0,11 %) 21 días después del refuerzo, las respuestas de células T CD4+ inducidas por ambos regímenes fueron similares. Extender el intervalo del régimen MVA-BN-Filo/Ad26.ZEBOV a 56 días dio como resultado respuestas de células T CD4+ más bajas. El régimen Ad26.ZEBOV/MVA-BN-Filo indujo respuestas de células T CD4+ ligeramente más bajas en un intervalo de 28 días y respuestas similares en un intervalo de 56 días. Las células T CD4+ inducidas por ambas combinaciones de vacunas fueron predominantemente polifuncionales (Fig. 14 y 15).

A continuación, se resumen los resultados del subestudio que evalúa la inmunogenicidad de una sensibilización con Ad26.ZEBOV a 5x10¹⁰vp seguido de un refuerzo 14 días después usando 1x10⁸TCID⁵⁰de MVA-BN-Filo.

En general, se ha demostrado que este régimen relativamente corto que utiliza un intervalo de 14 días entre el sensibilizador y el refuerzo es inmunogénico. La respuesta inmune humoral a las vacunas se evaluó mediante ELISA. Como se observó durante intervalos más largos, todos los sujetos seroconvirtieron 21 días después de la inmunización de refuerzo (Figura 16A). Además, ELISpot observó una respuesta inmune celular en el 92% de los sujetos 21 días después de la inmunización de refuerzo (Figura 16B). Esta respuesta inmune celular consistió en células T CD4+ (67% de respondedores, respuesta media 0,08% en el día 21 después del refuerzo) y CD8+ (64% de respondedores, respuesta media 0,15% en el día 7 después del refuerzo). La respuesta inmune inducida usando un intervalo de 2 semanas pareció algo menor que la respuesta inducida cuando se usaron intervalos más largos entre sensibilización y refuerzo (consulte la sección anterior).

Ejemplo 4

Se realiza un estudio aleatorizado, controlado con placebo, observador ciego (precedido por una vacunación inicial abierta de un total de 6 sujetos de estudio centinela) para evaluar la seguridad, tolerabilidad e inmunogenicidad de un régimen heterólogo de (a) una dosis única de MVA-BN-Filo (1x10⁸TCID⁵⁰) o placebo (solución salina al 0,9%) como sensibilizador seguido de una dosis única de Ad26.ZEBOV (5x10¹⁰vp) o placebo como refuerzo en diferentes momentos (14, 28 o 56 días después de la sensibilización; Grupos 1 a 3) y (b) una dosis única de Ad26.ZEBOV (5x10¹⁰vp) o placebo como sensibilizador seguido de una dosis única de MVA-BN-Filo (1x10⁸TCID⁵⁰) o placebo como refuerzo a los 28 días después del sensibilizador (Grupo 4).

Con el fin de evaluar la seguridad de las 2 vacunas de forma independiente, se incluyen los grupos 5 y 6 donde los regímenes homólogos de 2 dosis únicas de MVA-BN-Filo (1x10⁸TCID⁵⁰) o placebo, o 2 dosis únicas de Ad26.ZEBOV (5x10¹⁰vp) o placebo se administran con el programa de sensibilización y refuerzo más corto de 1 y 15 días. Este estudio se lleva a cabo en un objetivo de aproximadamente 92 sujetos sanos, con edades comprendidas entre 18 y 50 años (inclusive) que nunca antes habían recibido una vacuna experimental contra el Ébola y que no tienen una exposición o diagnóstico conocidos de la enfermedad del Ébola.

El estudio consiste en un período de vacunación en el que los sujetos se vacunan en su visita inicial (Día 1) seguido de un refuerzo el día 15, 29 o 57, y un período de seguimiento posterior al refuerzo hasta que todos los sujetos hayan tenido su visita de refuerzo posterior de 21 días, o interrumpido antes. En ese momento, el estudio no será ciego.

Los sujetos se inscriben en 6 grupos diferentes, que comprenden 18 (Grupos 1 a 4) o 10 (Grupos 5 y 6) sujetos sanos cada uno. Dentro de los Grupos 1 a 4, los sujetos se asignan al azar en una proporción de 5:1 para recibir la vacuna activa o placebo durante todo el estudio. Los grupos 5 y 6 comienzan cada uno con una cohorte Sentinel de 3 sujetos que reciben la vacuna activa de forma abierta, seguidos de una cohorte ciega de 7 sujetos, que se asignan al azar en una proporción de 6:1 para recibir la vacuna activa o placebo. Los programas de vacunación del estudio en los diferentes grupos se resumen en la Tabla 6.

La inmunogenicidad se evalúa utilizando los ensayos inmunológicos resumidos en las Tablas 7 y 8. El paquete de ensayos exploratorios puede incluir, entre otros, los ensayos enumerados.

Tabla 6: Programas de vacunación del estudio

Grupo N n Día 1 Día 15 Día 29 Día 57

MVA-BN-Filo ₃MVA-BN-Filo

5 10 ^{(centinela) (centinela)}

_{6 MVA-BN-Filo MVA-BN-Filo}

1 Placebo Placebo

₃Ad26.ZEBOV Ad26.ZEBOV

6 10 ^{(centinela) (centinela)}

_{6 Ad26.ZEBOV Ad26.ZEBOV}

1 Placebo Placebo

N: número de sujetos que recibirán la vacuna del estudio

El nivel de dosis de MVA-BN-Filo es 1x10⁸TCID⁵⁰(Dosis infecciosa del cultivo de tejidos al 50%) en todos los grupos; El nivel de dosis de Ad26.ZEBOV es 5x10¹⁰vp (partículas virales) en todos los grupos; el placebo es solución salina al 0,9%

Tabla 7: Resumen de ensayos inmunológicos (serología)_____________________________________________ Ensayo__________________________________ Propósito___________________________________________ Criterios de valoración secundarios

Ensayo de neutralización de virus Análisis de anticuerpos neutralizantes para EBOV GP ELISA___________________________________ Análisis de anticuerpos que se unen a EBOV GP_____________ Criterios de valoración exploratorios

Ensayo de neutralización de adenovirus/MVA Anticuerpos neutralizantes contra adenovirus/MVA Caracterización de anticuerpos moleculares. Análisis de las características de anticuerpos anti-EBOV GP,

SUDV GP, MARV GP y/o TAFV NP, incluida la subtipificación de IgG

ELISA exploratorio Análisis de anticuerpos de unión a una fuente diferente de GP __________________________________________EBOV______________________________________________ EBOV: Virus del Ébola; ELISA: ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas; GP: glicoproteína; IgG: inmunoglobulina G; MARV: Virus de Marburg; MVA: Vaccinia Ankara modificada; NP: nucleoproteína; SUDV: Virus de Sudán; TAFV: Virus del bosque Tai

Tabla 8: Resumen de ensayos inmunológicos (celular)_______________________________________________ Ensayo__________________________________Propósito____________________________________________ Criterios de valoración secundarios

Ensayo__________________________________ Propósito____________________________________________ ELISpot Respuestas de IFN-y de células T a EBOV GP

Criterios de valoración exploratorios

ICS de PBMC congelados Análisis de las respuestas de las células T a EBOV GP, SUDV GP, MARV GP y/o TAFV NP (incluidos CD4/8, IL-2, IFN-^y, TNF-a y/o marcadores de activación)

ICS y/o ELISpot de PBMC fresco Análisis de las respuestas de las células T a EBOV GP, incluidas las respuestas de células T positivas para CD4 y de baja __________________________________________ magnitud____________________________________________ EBOV: Virus del Ébola; ELISpot: inmunospot ligado a enzimas; GP: glicoproteína; ICS: tinción intracelular de citocinas; IFN: interferón; IL: interleucina; MARV: Virus de Marburg; NP: nucleoproteína; PBMC: células mononucleares de sangre periférica; SUDV: Virus de Sudán; TAFV: Virus del bosque de Tai; TNF: factor de necrosis tumoral

Evaluación de la respuesta inmune humoral

Los resultados iniciales confirman la inmunogenicidad de la combinación de Ad26.ZEBOV a 5x10¹⁰vp y MVA-BN-Filo a 1x10⁸TCID⁵⁰cuando cualquiera de las vacunas se usa como sensibilizador y la otra como refuerzo.

Como se muestra en la Figura 17, todos los sujetos seroconvirtieron 21 días después de la inmunización de refuerzo cuando se evaluaron mediante ELISA. Similar a los experimentos anteriores, se observó una mayor respuesta inmune a los 21 días después de la inmunización de refuerzo cuando se usó MVA como sensibilizador y se administró Ad26 como refuerzo 28 días después (Grupo 2, Concentración media geométrica de EU/mL 6987) en comparación con el orden inverso de la inmunización de la vacuna (Grupo 4, Concentración media geométrica de EU/mL 2976).

La fuerza de la respuesta inmune humoral se correlacionó con el intervalo entre la sensibilización y el refuerzo, con mayores concentraciones de anticuerpos observadas cuando se usa un intervalo de 56 días entre la sensibilización MVA y el refuerzo Ad26 (grupo 3, Concentración media geométrica de EU/mL 14048) en comparación con un programa más corto (grupo 1, intervalo de 14 días, concentración media geométrica de EU/mL 4418 y grupo 2, intervalo de 28 días, concentración media geométrica de EU/mL 6987).

Sorpresivamente, se observó una respuesta inmune humoral robusta según lo evaluado por ELISA cuando se usó MVA-BN-Filo como sensibilizador y seguido de una inmunización de refuerzo con Ad26.ZEBOV 14 días después. Todos los sujetos que recibieron el régimen de vacuna seroconvirtieron 21 días después de la inmunización de refuerzo, y la concentración de anticuerpos en este punto de tiempo alcanzó niveles similares o más altos que cuando se usó la combinación de sensibilización Ad26 y refuerzo MVA a intervalos de 28 días (Título medio geométrico de EU/mL 4418 y 2976, respectivamente). Sorpresivamente, las concentraciones de anticuerpos inducidas por esta combinación de sensibilización y refuerzo MVA/Ad26 a intervalos de 14 días fueron sorprendentemente más altas que la respuesta inducida por el régimen de vacuna inversa en el mismo intervalo de tiempo de sensibilización y refuerzo (consulte el ejemplo 2, figura 16A, Concentración media geométrica de EU/mL 915). Esto confirma la inducción de una respuesta inmune robusta por parte de una combinación de una sensibilización MVA y refuerzo Ad26 y la ventaja de dicha combinación cuando se usa un intervalo de sensibilización y refuerzo corto (14 días).

Evaluación de la respuesta inmune celular.

La respuesta inmune celular específica de GP de EBOV se midió por interferón gamma (IFN-^y) ELISpot e ICS. Para evaluar la respuesta inmune celular, las PBMC almacenadas (células mononucleares de sangre periférica) se descongelaron y se estimularon con péptidos organizados en 2 grupos (Grupos 1 y 2). La suma de las respuestas de células T estimuladas por grupo se muestra en las Figuras 18-19.

El análisis ELISpot (Fig. 18) confirmó la inducción de una respuesta IFN-y utilizando tanto sensibilización Ad26.ZEBOV seguido de refuerzo MVA-BN-Filo o el régimen de vacuna inversa. Para todos los estudios de intervalo de sensibilización y refuerzo, la respuesta celular mejoró después de la inmunización de refuerzo. La respuesta de IFN-^yfue más alta cuando se usó Ad26 como sensibilizador seguido de MVA como refuerzo 28 días después (87% de respondedores, respuesta mediana de IFN-^y687 y 600 SFU/10⁶PBMC para el Grupo 4 en el día 7 y el día 21 después del refuerzo, respectivamente). Sorpresivamente, cuando se usa MVA-BN-Filo como sensibilizador seguido de Ad26.ZEBOV como refuerzo, se observó una respuesta IFN-y más fuerte cuando se usa un intervalo más corto de 14 días entre sensibilización y refuerzo (87 y 93% de respondedores, 395 y 577 SFU/10⁶PBMC para el Grupo 1 en el día 7 y 21 después del refuerzo, respectivamente) en comparación con la respuesta inducida por un intervalo de 28 días (Grupo 2, 73 y 67% de respondedores, respuesta mediana de IFN-y 427 y 375 SFU/10⁶PBMC para el día 7 y el día 21 después del refuerzo) o 56 días (Grupo 3, 47% respondedores, respuesta mediana de IFN-y 118 y 153 SFU/106 PBMC para el día 7 y el día 21 después del refuerzo).

Digno de mencionarse, la respuesta inmune celular inducida por el sensibilizador MVA-BN-Filo y refuerzo Ad26.ZEBOV en un intervalo de 14 días estuvo bien equilibrada con la respuesta de células T CD8+ y CD4+ específicas a GP EBOV (73% de respondedores para células T CD4+ y CD8+, mediana de respuesta total a citocinas ^cD4+ 0,15 y 0,19% en el día 7 y 21 después del refuerzo, respectivamente; mediana de respuesta total a citocina CD8+ 0,19 y 0,34% en el día 7 y 21 después del refuerzo, respectivamente; Fig. 19A y B). Las células T CD8+ y CD4+ inducidas por esta combinación de vacunas fueron predominantemente polifuncionales (Fig. 19C y D).

Las siguientes tablas 9-12 se presentan como resúmenes de los estudios clínicos presentados en la presente invención. Los estudios presentados en los ejemplos 3 y 4 son estudios numerados 1001 y 1002 respectivamente. La Tabla 9 es un resumen de las respuestas inmunes humorales según lo determinado en los ensayos ELISA durante los estudios como se describe en los ejemplos 3 y 4.

Tabla 9: Resumen de tít l ELI A n i líni

Día del Ad26/MVA MVAAd26 MVAAd26 MVAAd26 MVAAd26 estudio 0,14 0,14 0, 28 0, 28 0, 56

Estudio 1001 1001 1002 1001 1002 1001 1002 1001

d8 22 21(0)

dl5 164

-

d22 298 (83) - - - 293 (87) - - -

d29 - 533 (93)* 477 (100)* 582 (100) - 36 (40)* 55 (47)* 22 (7)

d36 915 (100) 4418 (100) 269 (80) 1025 (93) -

d50 - - 10573 (100) 6987 (100) -

d57 - - - 854 (100)* - - - 21 (7)*

Los datos se presentan como concentración media geométrica (GMC) en ELISA por mL. El porcentaje de respondedores en cada momento se indica entre paréntesis; Ad26: Inmunización con Ad.26.ZEBOV; MVA: Inmunización con MVA-BN-Filo; El programa de sensibilización y refuerzo se indica en los encabezados. 0,14: intervalo de 14 días entre las inmunizaciones de sensibilización y refuerzo; 0, 28: intervalo de 28 días entre las inmunizaciones de sensibilización y refuerzo; 0, 56: intervalo de 56 días entre las inmunizaciones de sensibilización y refuerzo; *: día de refuerzo; GMC: Concentración media geométrica. El estudio 1001 se describió en el ejemplo 3 y el estudio 1002 se describió en el ejemplo 4.

La Tabla 10 es un resumen de las respuestas inmunes celulares como se determina en los ensayos ELISpot durante los estudios como se describe en los ejemplos 3 y 4.

Tabla 10: Descripción general de las respuestas inmunes celulares en estudios clínicos según lo determinado por ELISpot _________________________ _____________ ________________ Día del Ad26/MVA Ad26/MVA 0, Ad26/MVA 0,

estudio 0,14 28 ₅₆MVAAd260,14 MVAAd260, 28 MVAAd260, 56

Es

d22 354(75) - - 293 (87) - -

d29 - 103 (60)* 58 (50) - 25 (7)* 25 (0)

d57 - - 243 (86)* - - 25 (0)* d64 - - 648 (86) - - 440 (100)

Los datos se representan como mediana SFU /106 PBMC. El porcentaje de respondedores en cada momento se indica entre paréntesis; Ad26: Inmunización con Ad.26.ZEBOV; MVA: Inmunización con MVA-BN-Filo; El programa de sensibilización y refuerzo se indica en los encabezados. 0, 14: intervalo de 14 días entre las inmunizaciones de sensibilización y refuerzo; 0, 28: intervalo de 28 días entre las inmunizaciones de sensibilización y refuerzo; 0, 56: intervalo de 56 días entre las inmunizaciones de sensibilización y refuerzo; *: día de refuerzo; SFU: Unidades formadoras de puntos; PBMC: Células mononucleares de sangre periférica. El estudio 1001 se describió en el ejemplo 3 y el estudio 1002 se describió en el ejemplo 4. El estudio 1001 se describió en el ejemplo 3 y el estudio 1002 se describió en el ejemplo 4.

La Tabla 11 es un resumen de las respuestas de células T CD4+ según lo determinado por la tinción intracelular de citocinas (ICS) durante los estudios como se describe en los ejemplos 3 y 4.

Tabla 11: Descripción general de la respuesta inmune de células T CD4+ medida por ICS en estudios clínicos Día del Ad26/MVA Ad26/MVA 0, Ad26/MVA 0,

estudio 0,14 28 ₅₆MVAAd260,14 MVAAd260, 28 MVAAd260, 56

Estudio 1001 1001 1001 1002 1001 1001

d8 0,02 (0) 0,02 (0) 0,02 (0) 0,02 (0) 0,02 (0) 0,02 (0) Día del Ad26/MVA Ad26/MVA 0, Ad26/MVA 0,

estudio 0,14 28 ₅₆MVAAd260,14 MVAAd260, 28 MVAAd260, 56

Estudio 1001 1001 1001 1002 1001 1001

d15 0,06 (36)* - - 0,02 (7)* - -

d22 0,06 (45) - - 0,15 (73) - -

d29 - 0,07 (43)* 0,06(31) - 0,02 (13)* 0,02 (7)

d36 0,08 (67) 0,11 (64) - 0,19 (73) 0,37 (93) -

d50

0,15 (60)

0,16 (67) -

d57 - - 0,05 (36)* - - 0,02 (0)*

d64 - - 0,16 (71) - - 0,17 (67) d78 - - 0,12 (57) - - 0,08 (53) Los datos se representan como la mediana de la respuesta total de citocinas CD4+ en %. El porcentaje de respondedores en cada momento se indica entre paréntesis; Ad26: Inmunización con Ad.26.ZEBOV; MVA: Inmunización con MVA-BN-Filo; El programa de sensibilización y refuerzo se indica en los encabezados 0, 14: intervalo de 14 días entre las inmunizaciones de sensibilización y refuerzo; 0, 28: intervalo de 28 días entre las inmunizaciones de sensibilización y refuerzo ; 0, 56: intervalo de 56 días entre las inmunizaciones de sensibilización y refuerzo; *: día de refuerzo. El estudio 1001 se describió en el ejemplo 3 y el estudio 1002 se describió en el ejemplo 4.

La Tabla 12 es un resumen de las respuestas de células T CD8+ según lo determinado por la tinción intracelular de citocinas (ICS) durante los estudios como se describe en los ejemplos 3 y 4.

Tabla 12: De ri i n n r l de la respuesta inmune de células T CD8+ medida por ICS en estudios clínicos Día del Ad26/MVA 0, Ad26/MVA 0,

estudio 28 ₅₆MVAAd260,14 MVAAd260, 28 MVAAd260, 56

Estudio 1001 1001 1002 1001 1001

d8 0,02 (0) 0,02 (0) 0,02 (0) 0,02 (0) 0,02 (0)

dl5 - - 0,02 (0)* - -

d22 - - 0,19 (73) - -

Día del Ad26/MVA 0, Ad26/MVA 0,

estudio 28 ₅₆MVAAd260,14 MVAAd260, 28 MVAAd260, 56

Estudio 1001 1001 1002 1001 1001

d29 0,12 (57)* 0,05 (57) - 0,02 (0)* 0,02 (0)

d36 0,07 (50) 0,27 (67) - 0,34 (73) 0,08 (53) -

d50 - 0,27 (73) - - 0,1 (53) -

d57 - - 0,19 (86)* - - 0,02 (0)*

d64 - 0,24 (86)

0,07 (53)

d78 - - 0,24 (79) - - 0,06 (47)

Los datos se presentan como la mediana de la respuesta total de citocinas CD8+ en %. El porcentaje de respondedores en cada momento se indica entre paréntesis. Ad26: Inmunización con Ad.26.ZEBOV; MVA: Inmunización con MVA-BN-Filo; El programa de sensibilización y refuerzo se indica en los encabezados 0, 14: intervalo de 14 días entre las inmunizaciones de sensibilización y refuerzo; 0, 28: intervalo de 28 días entre las inmunizaciones de sensibilización y refuerzo ; 0, 56: intervalo de 56 días entre las inmunizaciones de sensibilización y refuerzo; *: día de refuerzo. El estudio 1001 se describió en el ejemplo 3 y el estudio 1002 se describió en el ejemplo 4.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una combinación de vacuna que comprende

(i) una primera composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un vector de adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína antigénica de un primer subtipo de filovirus, donde dicho primer subtipo de filovirus es un subtipo de Ebolavirus, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable; y

(ii) una segunda composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un vector MVA que comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína antigénica de un subtipo de Ebolavirus y que codifica adicionalmente al menos una proteína antigénica de otro subtipo de filovirus, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable;

para usar en la generación de una respuesta inmune protectora contra al menos un subtipo de Ebolavirus, donde la primera composición se usa para sensibilizar una respuesta inmune contra al menos un subtipo de Ebolavirus y la segunda composición se usa para reforzar dicha respuesta inmune.

2. Una combinación de vacuna para usar según la reivindicación 1, donde la primera composición (i) comprende además un vector de adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica de un segundo subtipo de filovirus.

3. Una combinación de vacuna para usar según la reivindicación 2, donde la primera composición (i) comprende además un vector de adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica de un tercer subtipo de filovirus.

4. Una combinación de vacuna para usar según la reivindicación 1, donde el vector de adenovirus en la primera composición (i) comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína antigénica con la SEQ ID NO:1.

5. Una combinación de vacuna para usar según la reivindicación 4, donde la composición (i) comprende además un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína antigénica con la SEQ ID NO:2.

6. Una combinación de vacuna para usar según la reivindicación 5, donde la composición (i) comprende además un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína antigénica con la SEQ ID NO:3.

7. Una combinación de vacuna para usar según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el vector MVA en la composición (ii) comprende un ácido nucleico que codifica proteínas antigénicas de al menos cuatro subtipos de filovirus.

8. Una combinación de vacunas para usar según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el vector de MVA en la composición (ii) comprende un ácido nucleico que codifica proteínas antigénicas de cuatro subtipos de filovirus diferentes que tienen la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, y la SEQ ID NO: 5.

9. Una combinación de vacuna para usar según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el vector de adenovirus es un vector rAd26 o un vector rAd35.