JP2017527568A - フィロウイルス感染に対する防御免疫の誘導を目的とする方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、フィロウイルス感染に対する防御免疫、詳細には、１つまたは複数の亜型のエボラウイルス及びマールブルグウイルスの感染に対する防御免疫の誘導を目的とする組成物、ワクチン、及び方法を提供する。【選択図】図４

Description

本発明は、フィロウイルス感染に対する防御免疫、詳細には、１つまたは複数の亜型のエボラウイルス及びマールブルグウイルスの感染に対する防御免疫の誘導を目的とする組成物、ワクチン、及び方法に関する。

ザイールエボラウイルス（ＥＢＯＶ）及びスーダンエボラウイルス（ＳＵＤＶ）などのエボラウイルス、ならびに密接な関係にあるマールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）は、ヒト及び霊長類において高度に致死的なエボラ出血熱（ＥＨＦ）の、北米、欧州、及びアフリカにおける大流行と関連している。こうしたウイルスはフィロウイルスであり、ヒト及び非ヒト霊長類に感染し、死を含む重篤な健康被害をもたらすことが知られている。フィロウイルス感染は、ヒトにおいて最大で９０％の症例致死率をもたらしてきた。ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、及びＭＡＲＶが感染すると、ＥＨＦを引き起こし、感染後７〜１０日以内に死に至ることが多い。ＥＨＦは、急激な発熱、嘔気、嘔吐、下痢、斑状丘疹状皮疹、倦怠感、衰弱、血管透過性が増加する全身性の徴候、凝血異常、及び自然免疫応答の調節不全によって明らかとなる急性発熱性症候群として現れる。疾患の多くが、感染に対する自然免疫応答の調節不全、及び血管内皮細胞におけるウイルス複製に起因して現れ、当該ウイルス複製は、宿主細胞の死、及び内皮バリアーの破壊を誘導するものである。フィロウイルスは、小微粒子エアロゾルによってか、またはヒトもしくはＮＨＰを起源とする感染血液、感染臓器、及び感染体液との直接接触によって拡散することができる。ヒトにおいてエボラ出血熱（ＥＨＦ）を引き起こすには、単一ウイルス粒子の感染で十分であることが報告されている。現在、ＥＨＦの治療または予防を対象として承認された治療またはワクチンは存在しない。依然として、支持療法が、フィロウイルスに感染した個人を対象とする唯一の承認された医学的介入である。

重篤なヒト疾患を引き起こすとものとして、フィロウイルスは、自然感染源、及び同時にバイオテロリズムの潜在的病原体の両方として懸念される状況が続いている。自然におけるフィロウイルスの保有宿主（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を最終的に同定するには未だ至っていない。４つの亜型のエボラウイルスがＥＨＦを引き起こすと説明されており、すなわち、ザイール（Ｚａｉｒｅ）、スーダン（Ｓｕｄａｎ）、ブンディブギョ（Ｂｕｎｄｉｂｕｇｙｏ）、及びコートジボワール（Ｉｖｏｒｙ Ｃｏａｓｔ）での発症におけるものである（Ｓａｎｃｈｅｚ，Ａ．ら １９９６ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：３６０２−３６０７）。こうした亜型のエボラウイルスは、類似した遺伝的構成を有しており、例えば、マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、７つの直鎖状に配置された遺伝子を含んでいる。構造遺伝子産物には、例えば、２つの代替形態で存在する外被糖タンパク質、分泌可溶性糖タンパク質（ｓｓＧＰ）、及びＲＮＡ編集によって生成し、ウイルスの侵入を媒介する膜貫通糖タンパク質（ＧＰ）が含まれる（Ｓａｎｃｈｅｚら １９９６ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：３６０２−３６０７）。

免疫化は、エボラ感染からの保護に有効であり得ることが示唆されており、これは、他のＲＮＡウイルスと比較しても、エボラ亜型の中ではヌクレオチド多型があまり存在しないように思われるためである（Ｓａｎｃｈｅｚら １９９６ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：３６０２−３６０７）。最近まで、フィロウイルスに対する予防的なワクチンの開発から得られる結果は一定しないものであった。この理由の一端は、フィロウイルス感染に対する予防的免疫応答の要件に対する理解が不十分なことにある。さらに、天然の保有宿主内を循環しているフィロウイルスの数が多いことが、すべてのフィロウイルス種から保護するワクチンの設計試行を複雑なものとしている。

現在、ワクチン抗原送達プラットフォームがいくつか存在しており、これらは、高感染用量のフィロウイルスに曝露された非ヒト霊長類（ＮＨＰ）をさまざまなレベルで保護することが示されたものである。さまざまなプラットフォーム技術に基づいてワクチン候補が開発中であり、当該プラットフォーム技術には、複製能を有するベクター（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、パラインフルエンザウイルス）、複製能を有さないベクター（アデノウイルス、改変ワクシニアアンカラウイルス（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ Ｖｉｒｕｓ））、細菌細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、植物細胞において発現されるウイルス様粒子を含むタンパク質サブユニット、ＤＮＡワクチン、および／または弱毒化生フィロウイルス及び弱毒化死滅フィロウイルス（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈら，２０１２）が含まれる。ＥＢＯＶ糖タンパク質であるＧＰは、同種のＥＢＯＶによる曝露からの保護に必須のワクチン成分である。さらに、最も病原性が高いエボラウイルス種の２つであるＥＢＯＶ及びＳＵＤＶに由来するＧＰを含めることで、ＥＢＯＶ及びＳＵＤＶによる筋肉内曝露、ならびに遠縁ブンディブギョ種（ｄｉｓｔａｎｔｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ Ｂｕｎｄｉｂｕｇｙｏ）（ＢＤＢＶ）、タイフォレスト（Ｔａi Ｆｏｒｅｓｔ）エボラウイルス（ＴＡＦＶ、かつては、コートジボワール（Ｉｖｏｒｙ Ｃｏａｓｔ）またはコートジボワール（Ｃｏｔｅ ｄ’Ｉｖｏｉｒｅ）として知られていた）種による曝露からサルを保護することができる。同様に、ＭＡＲＶに由来するＧＰを含めることで、ＭＡＲＶによる筋肉内曝露及びエアロゾル曝露からサルを保護することができる。こうしたウイルスを対象とする医学的対策の開発は、優先度が高いものである。これは、具体的には、ＰＡＮ−フィロウイルスワクチンの開発であり、当該ワクチンは、すべての病原性フィロウイルスから保護する１つのワクチンである。

複製欠損アデノウイルス（ｒＡｄ）は、細胞性免疫応答の強力な誘導因子であり、それ故に、特にレンチウイルス及びフィロウイルス、ならびに他の非ウイルス病原体を対象とする、遺伝子に基づくワクチンに有用なベクターとして役立ってきた（Ｓｈｉｖｅｒら，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ ４１５（６８６９）：３３１−５、（Ｈｉｌｌら，Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ ６（１）：７８−８３．、Ｓｕｌｌｉｖａｎら，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０８（６８１２）：６０５−９、Ｓｕｌｌｉｖａｎら，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ ４２４（６９４９）：６８１−４、Ｓｕｌｌｉｖａｎら，（２００６）ＰＬｏＳ Ｍｅｄ ３（６）：ｅ１７７、Ｒａｄｏｓｅｖｉｃら，（２００７）、Ｓａｎｔｒａら，（２００９）Ｖａｃｃｉｎｅ ２７（４２）：５８３７−４５。

アデノウイルスに基づくワクチンは、ＧＭＰ条件下において高力価で生産することができるようになって以来、ヒトワクチンとしての優位性をいくつか有しており、ヒトにおいて安全かつ免疫原性であることが判明している（Ａｓｍｕｔｈら，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２０１（１）：１３２−４１、Ｋｉｂｕｕｋａら，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２０１（４）：６００−７、Ｋｏｕｐら，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（２）：ｅ９０１５．、Ｃａｔａｎｚａｒｏら，（２００６）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９４（１２）：１６３８−４９、Ｈａｒｒｏら，（２００９）Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６（９）：１２８５−９２。初期のワクチン研究のほとんどが、ｒＡｄ５を使用して実施され、これは、広範な抗体応答及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することにおいて、ｒＡｄ５が顕著な効力を有しているためであるが、その一方で、ヒトにおいて、ｒＡＤ５に対する免疫が既に存在していると、効力が限定され得るものである（Ｃａｔａｎｚａｒｏ，（２００６）、Ｃｈｅｎｇら（２００７）ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ３（２）：ｅ２５．、ＭｃＣｏｙら（２００７）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８１（１２）：６５９４−６０４．、Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒら（２００８）Ｌａｎｃｅｔ ３７２（９６５３）：１８８１−９３）。この特性は、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）及びマールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）を含む、現在開発中の多くのワクチンを対象とする臨床用途においてｒＡｄ５を使用することを限定する可能性がある。

複製欠損アデノウイルスベクターであるｒＡｄ２６及びｒＡｄ３５は、それぞれ、アデノウイルスの血清型２６及び血清型３５に由来し、Ａｄ５に対する既存免疫を回避する能力を有している。ｒＡｄ２６は、こうしたベクターの大スケールかつ臨床品質な製造に適した、Ａｄ５のＥ１を補完する細胞株において増殖して高力価を有することができる（Ａｂｂｉｎｋら，２００７）と共に、このベクターは、初回免疫−追加免疫（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ）ワクチン法において、液性免疫応答及び細胞媒介性免疫応答を誘導することが示された（Ａｂｂｉｎｋら，２００７、Ｌｉｕら，（２００９）Ｎａｔｕｒｅ ４５７（７２２５）：８７−９１）。ｒＡｄ３５ベクターは、臨床品質ワクチンの製造に適した細胞株で増殖して高力価を有する（Ｈａｖｅｎｇａら，（２００６）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８７（Ｐｔ ８）：２１３５−４３）と共に、注射ならびに安定な吸入可能粉末向けに製剤化されてきた（Ｊｉｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２８（２７）：４３６９−７５）。こうしたベクターは、ヒト樹状細胞へと効率的に導入されることが示され（ｄｅ Ｇｒｕｉｊｌら，（２００６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７７（４）：２２０８−１５、Ｌｏｒｅら，（２００７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７９（３）：１７２１−９）、したがって、高レベルの抗原送達及び提示を媒介する能力を有するものである。

改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスは、ワクシニアウイルスと関連するものであり、ポックスウイルス科ファミリーにおけるオルソポックスウイルス属のメンバーである。ポックスウイルスは、細胞質内で発現を行うため、ＣＤ８Ｔ細胞応答の優れた誘導因子であることが知られている。しかしながら、ポックスウイルスは、ＣＤ４ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞の生成には不向きなものであると一般に考えられている（例えば、Ｈａｓｌｅｔｔら Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １８１：１２６４−７２（２０００）の１２６８ページを参照のこと）。ＭＶＡは、組換え遺伝子発現用のウイルスベクター、または組換えワクチンとしての使用を目的としてこれまで操作されてきた。

ワクチンまたは医薬品などの、より安全な製品の開発を目的として安全性プロファイルが高められたＭＶＡ株がＢａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃによって開発された。ＭＶＡは、Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃによってさらに継代されて、ＭＶＡ−ＢＮと命名され、その代表試料が、受入番号Ｖ０００８３００８として、２０００年８月３０日に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に預託された。ＭＶＡ−ＢＮは、ＷＯ０２／４２４８０（ＵＳ２００３／０２０６９２６）及びＷＯ０３／０４８１８４（ＵＳ２００６／０１５９６９９）においてさらに説明されており、当該文献は両方共、それらの全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。

ＭＶＡ−ＢＮは、ヒト細胞に付着して侵入することができ、そこで、ウイルス性にコードされる遺伝子を非常に効率的に発現する。ＭＶＡ−ＢＮは、複製能を有しておらず、これは、このウイルスがヒト細胞において複製しないことを意味している。ヒト細胞では、ウイルス遺伝子が発現し、感染性ウイルスは生成しない。ＭＶＡ−ＢＮは、米国のＣｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎによれば、バイオセイフティーがレベル１の生物であると分類されている。ＭＶＡ−ＢＮ及び派生株の製剤は、これまで多くの種類の動物に対して、及び免疫不全である個人を含む２０００を超えるヒト対象に対して投与されている。ワクチン接種のすべてで、一般に安全であり、忍容性が良好であることが判明している。ＭＶＡ−ＢＮは、高度に減弱化され、病原性が低減されているにもかかわらず、前臨床試験において、ワクシニアに対して、及びＭＶＡゲノムへとクローン化された遺伝子によってコードされる異種遺伝子産物に対して、液性免疫応答及び細胞性免疫応答の両方を誘発することが示された［Ｅ．Ｈａｒｒｅｒら（２００５），Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．１０（２）：２８５−３００、Ａ．Ｃｏｓｍａら（２００３），Ｖａｃｃｉｎｅ ２２（１）：２１−９、Ｍ．Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａら（２００３），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（１４）：１３４７−１３６０、Ｍ．Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａら（２００４），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１０（１６）：５３８１−５３９０］。

フィロウイルスに対する免疫応答、具体的には、より致命的なエボラウイルス及びマールブルグウイルスに対する防御免疫を誘発するワクチンの改良が必要とされているものの対処されていない状況である。

複製能力を有さないベクターを使用した、初回免疫−追加免疫のさまざまな組み合わせが、フィロウイルス感染に対して有効な免疫防御を生成することが本発明において発見された。

したがって、本発明の１つの一般的態様は、
（ｉ）第１のフィロウイルス亜型の抗原タンパク質または実質的に類似した抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のアデノウイルスベクターを、医薬的に許容可能な担体と共に含む第１の組成物と、
（ｉｉ）少なくとも２つのフィロウイルス亜型の抗原タンパク質または実質的に類似した抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のＭＶＡベクターを、医薬的に許容可能な担体と共に含む第２の組成物と、
を含む組み合わせワクチンであって、
組成物の一方が、初回免疫組成物であり、もう一方の組成物が、追加免疫組成物である組み合わせワクチンに関する。

本発明の別の一般的態様は、第１のフィロウイルス亜型の抗原タンパク質または実質的に類似した抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のアデノウイルスベクターを含む第１の組成物と、少なくとも２つのフィロウイルス亜型の抗原タンパク質または実質的に類似した抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のＭＶＡベクターを含む第２の組成物と、の少なくとも１つのフィロウイルス亜型に対する防御免疫応答の生成を目的とする使用であって、第１の組成物及び第２の組成物が、当該免疫応答の初回免疫または追加免疫を目的として使用される使用に関する。

ある特定の実施形態では、第１の組成物（ｉ）は、第２のフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターをさらに含む。他の実施形態では、第１の組成物（ｉ）は、第３のフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターをさらに含む。

本発明によるフィロウイルス亜型は、任意のフィロウイルス亜型であり得る。

好ましい実施形態では、第１、第２、及び第３のフィロウイルス亜型は、ザイール、スーダン、レストン（Ｒｅｓｔｏｎ）、ブンディブギョ、タイフォレスト、及びマールブルグの群から選択される。抗原タンパク質は、抗原決定基を含む、任意のフィロウイルスに由来する任意のタンパク質であり得る。好ましい実施形態では、抗原タンパク質は、糖タンパク質または核タンパク質である。本発明による第１の溶液及び第２の溶液に含まれるアデノウイルスベクターまたはＭＶＡベクターによってコードされる抗原タンパク質は、任意のフィロウイルスに由来する任意の抗原タンパク質であり得る。好ましい実施形態では、第１、第２、及び第３のフィロウイルス型の抗原タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５の群から選択される。好ましい実施形態では、第１、第２、及び第３のフィロウイルス亜型は、同一ではない。

別の実施形態では、第１の組成物（ｉ）におけるアデノウイルスベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５の群から選択される配列を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含む。好ましい実施形態では、組成物（ｉ）は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５の群から選択される異なる配列を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスをさらに含む。好ましくは、組成物（ｉ）は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５の群から選択されるさらに異なる配列を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスをさらに含む。

好ましい実施形態では、第１の組成物（ｉ）におけるアデノウイルスベクターは、配列番号１を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含む。好ましい実施形態では、組成物（ｉ）は、配列番号２を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスをさらに含む。好ましくは、組成物（ｉ）は、配列番号３を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスをさらに含む。

さらに別の好ましい実施形態では、組成物（ｉｉ）におけるＭＶＡベクターは、少なくとも４つのフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含む。好ましくは、当該ＭＶＡベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号４、及び配列番号５を有した、４つの異なるフィロウイルス亜型に由来する抗原タンパク質をコードする核酸を含む。

本明細書に記載の方法、ワクチン、及び組成物は、キットにおいて実施され得ることを企図する。例えば、１つの実施形態では、本発明は、
（ｉ）第１のフィロウイルス亜型の抗原タンパク質または実質的に類似した抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のアデノウイルスベクターを、医薬的に許容可能な担体と共に含む第１の組成物と、
（ｉｉ）少なくとも２つのフィロウイルス亜型の抗原タンパク質または実質的に類似した抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のＭＶＡベクターを、医薬的に許容可能な担体と共に含む第２の組成物と、
を含むキットであって、
組成物の一方が、初回免疫組成物であり、もう一方の組成物が、追加免疫組成物であるキットを含み得る。

それ故に、好ましい実施形態では、本発明は、組み合わせワクチン、キット、または使用であって、組成物（ｉ）におけるアデノウイルスベクターが、配列番号１を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含み、組成物におけるＭＶＡベクターが、配列番号１、配列番号２、配列番号４、及び配列番号５を有した、４つの異なるフィロウイルス亜型に由来する抗原タンパク質をコードする核酸を含む、組み合わせワクチン、キット、または使用に関する。

さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、組み合わせワクチン、キット、または使用であって、第１の組成物が、配列番号１を有する第１の抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスと、配列番号２を有する第２の抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスと、配列番号３を有する第３の抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスと、を含み、組成物（ｉｉ）におけるＭＶＡベクターが、配列番号１、配列番号２、配列番号４、及び配列番号５を有した、４つの異なるフィロウイルス亜型に由来する抗原タンパク質をコードする核酸を含む、組み合わせワクチン、キット、または使用に関する。

好ましい実施形態では、本発明の組み合わせワクチン、キットに含まれるアデノウイルスベクター、または少なくとも１つのフィロウイルス亜型に対する防御免疫応答の生成に使用されるアデノウイルスベクターは、ｒＡｄ２６ベクターまたはｒＡｄ３５ベクターである。この使用の好ましい実施形態では、追加免疫組成物は、初回免疫組成物の１〜１２週間後に投与される。

本発明の１つの追加の一般的態様は、対象における、フィロウイルスに対する免疫応答の誘導方法に関し、当該方法は、
ａ．第１のフィロウイルス亜型の抗原糖タンパク質または実質的に類似した抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のアデノウイルスベクターを含む第１の組成物の、対象に対する投与と、
ｂ．少なくとも２つのフィロウイルス株の抗原タンパク質または実質的に類似した抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のＭＶＡベクターを含む第２の組成物の、対象に対する投与と、
を含み、
段階（ａ）及び段階（ｂ）は、いずれの順序でも実施される。

ある特定の実施形態では、第１の組成物は、第２のフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターをさらに含む。他の実施形態では、第１の組成物は、第３のフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターをさらに含む。

別の実施形態では、第１の組成物におけるアデノウイルスベクターは、配列番号１を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含む。好ましい実施形態では、組成物は、配列番号２を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスをさらに含む。好ましくは、組成物は、配列番号３を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスをさらに含む。

さらにより好ましい実施形態では、第２の組成物におけるＭＶＡベクターは、少なくとも４つのフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含む。

好ましくは、当該ＭＶＡベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号４、及び配列番号５を有した、４つの異なるフィロウイルス亜型に由来する抗原タンパク質をコードする核酸を含む。

それ故に、好ましい実施形態では、本発明は、対象における、フィロウイルスに対する免疫応答の誘導方法であって、第１の組成物におけるアデノウイルスベクターが、配列番号１を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含み、第２の組成物におけるＭＶＡベクターが、配列番号１、配列番号２、配列番号４、及び配列番号５を有した、４つの異なるフィロウイルス亜型に由来する抗原タンパク質をコードする核酸を含む誘導方法に関する。

さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、対象における、フィロウイルスに対する免疫応答の誘導方法であって、第１の組成物が、配列番号１を有する第１の抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスと、配列番号２を有する第２の抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスと、配列番号３を有する第３の抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスと、を含み、第２の組成物におけるＭＶＡベクターが、配列番号１、配列番号２、配列番号４、及び配列番号５を有した、４つの異なるフィロウイルス亜型に由来する抗原タンパク質をコードする核酸を含む誘導方法に関する。

好ましい実施形態では、本発明の方法において使用されるアデノウイルスベクターは、ｒＡｄ２６ベクターまたはｒＡｄ３５ベクターである。本発明の別の好ましい実施形態では、方法の段階（ｂ）は、段階（ａ）の１〜１２週間後に実施される。

別の好ましい実施形態では、初回免疫ワクチン接種、すなわち、段階（ａ）が、０週目に実施された後、追加免疫ワクチン接種、すなわち、段階（ｂ）が、１〜１０週目、より好ましくは、６〜１０週目、及びさらにより好ましくは、８週目に実施される。別の好ましい実施形態では、初回免疫ワクチン接種、すなわち、段階（ａ）が、０週目に実施された後、追加免疫ワクチン接種、すなわち、段階（ｂ）が、１〜４週目、好ましくは、１、２、または４週目に実施される。

別の好ましい実施形態では、初回免疫ワクチン接種、すなわち、段階（ｂ）が、０週目に実施された後、追加免疫ワクチン接種、すなわち、段階（ａ）が、１〜１０週目、より好ましくは、６〜１０週目、及びさらにより好ましくは、８週目に実施される。別の好ましい実施形態では、初回免疫ワクチン接種、すなわち、段階（ｂ）が、０週目に実施された後、追加免疫ワクチン接種、すなわち、段階（ａ）が、１〜４週目、好ましくは、１、２、または４週目に実施される。

本発明の好ましい実施形態では、方法は、１つまたは複数のフィロウイルス抗原タンパク質を発現する免疫学的に有効な量の１つまたは複数のｒＡｄ２６ベクターでの初回免疫ワクチン接種と、その後に続く、ｒＡＤ２６とは異なる免疫学的に有効な量の１つまたは複数のベクターでの追加免疫ワクチン接種と、を含み、当該ｒＡＤ２６とは異なる免疫学的に有効な量の１つまたは複数のベクターは、好ましくは、１つまたは複数のフィロウイルス糖タンパク質または実質的に類似した糖タンパク質を発現するＭＶＡベクターである。

本発明の好ましい実施形態では、１つまたは複数のフィロウイルスは、エボラウイルスまたはマールブルグウイルスである。エボラウイルスは、任意の種であってよく、例えば、ザイールエボラウイルス（ＥＢＯＶ）及びスーダンエボラウイルス（ＳＵＤＶ）、レストン、ブンディブギョ、タイフォレストである。マールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）は、任意の種であってよい。適したフィロウイルス抗原タンパク質の例示のアミノ酸配列は、配列番号１〜配列番号５に示されるものである。

前述の概要、ならびに本発明の下記の詳細な説明は、添付の図と併せて読むと、理解が深まるであろう。本発明は、図に示す詳細な実施例に限定されないと理解されるべきである。

特許または出願ファイルは、カラーで作成された図を少なくとも１つ含む。この特許または特許出願公開の、カラーの図を含むコピーは、要請及び必要料金の納付により、特許庁によって提供されることになる。

動物試験における群化の概要を示す。 試験の実験設計を示す。 エボラザイールキクウィト（Ｅｂｏｌａ Ｚａｉｒｅ Ｋｉｋｗｉｔ）１９９５株を負荷した際の負荷結果を示す。 エボラザイールの糖タンパク質に特異的な液性免疫応答（ＥＬＩＳＡによって評価）が、動物試験から観測されたことを示す。ワクチンレジメンとは無関係に、非常に高い抗体力価が得られた（ＮＤ＝未分析時点）。 スーダングル（Ｓｕｄａｎ Ｇｕｌｕ）の糖タンパク質に特異的な液性免疫応答（ＥＬＩＳＡによって評価）が、動物試験から観測されたことを示す。ワクチンレジメンとは無関係に、非常に高い抗体力価が得られた（ＮＤ＝未分析時点）。 マールブルグアンゴラ（Ａｎｇｏｌａ）の糖タンパク質に特異的な液性免疫応答（ＥＬＩＳＡによって評価）が、動物試験から観測されたことを示す。ワクチンレジメンとは無関係に、非常に高い抗体力価が得られた（ＮＤ＝未分析時点）。 ＺＥＢＯＶのＧＰ、ＳＥＢＯＶのＧＰ、及びＭＡＲＶＡのＧＰに特異的な細胞性免疫応答を示し、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって分析したものである。 抗ＥＢＯＶ ＧＰ ＥＬＩＳＡによって分析したものであり、ＺＥＢＯＶ のＧＰに特異的な免疫応答を示し、初回免疫としてＭＶＡ、及び追加免疫としてＡｄ２６で免疫化した対象において、５０日目に観測された追加免疫化後の液性免疫応答は、ワクチンの順序を逆にしたものと比較して増強されていた。 ヒトにおける、ＺＥＢＯＶのＧＰに特異的なＴ細胞応答を示し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって分析したものである。 ヒトにおける、ＺＥＢＯＶのＧＰに特異的なＣＤ８＋細胞性免疫応答を示し、ＩＣＳアッセイによって分析したものである。 初回免疫と追加免疫との間隔を２８日としたときの、ヒトにおける、ＥＢＯＶのＧＰに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答の機能性を示し、ＩＣＳアッセイによって分析したものである。 初回免疫と追加免疫との間隔を５６日としたときの、ヒトにおける、ＥＢＯＶのＧＰに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答の機能性を示し、ＩＣＳアッセイによって分析したものである。 ヒトにおける、ＺＥＢＯＶのＧＰに特異的なＣＤ４＋細胞性免疫応答を示し、ＩＣＳアッセイによって分析したものである。 初回免疫と追加免疫との間隔を２８日としたときの、ヒトにおける、ＥＢＯＶのＧＰに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞応答の機能性を示し、ＩＣＳアッセイによって分析したものである。 初回免疫と追加免疫との間隔を５６日としたときの、ヒトにおける、ＥＢＯＶのＧＰに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞応答の機能性を示し、ＩＣＳアッセイによって分析したものである。 Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶで初回免疫化し、１４日後にＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏで追加免疫することによって誘導された免疫応答を示し、ＥＬＩＳＡ（Ａ）、ＥＬＩｓｐｏｔ（Ｂ）、ならびにＩＣＳ（Ｃ及びＤ）によって評価したものである。 ＺＥＢＯＶのＧＰに特異的な免疫応答を示し、ＥＢＯＶ ＧＰ ＥＬＩＳＡによって分析したものである。 ヒトにおける、ＺＥＢＯＶのＧＰに特異的なＴ細胞応答を示し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって分析したものである。 ヒトにおける、ＺＥＢＯＶのＧＰに特異的な、強力かつバランスのとれたＣＤ４＋（Ａ）細胞性免疫応答及びＣＤ８＋（Ｂ）細胞性免疫応答を示すと共に、初回免疫としてＭＶＡ、及び１４日後に追加免疫としてＡｄ２６を使用したときの、ヒトにおける、ＥＢＯＶのＧＰに特異的なＣＤ８＋（Ｃ）Ｔ細胞応答及びＣＤ４＋（Ｄ）Ｔ細胞応答の機能性を示し、いずれもＩＣＳアッセイによって分析したものである。 ＥＢＯＶ ＭａｙｉｎｇａのＧＰに結合する抗体を示し、Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶ／ＭＶＡ ＢＮ Ｆｉｌｏレジメン及びＭＶＡ ＢＮ Ｆｉｌｏ／Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶレジメンでのワクチン接種によって誘発され、ＧＰ ＥＬＩＳＡによって決定したものである。ワクチン接種のレジメンは、ｘ軸の下に示されている。高用量筋肉内（ｈｉｇｈ ＩＭ）及び標準用量筋肉内（ｓｔａｎｄａｒｄ ＩＭ）は、ＭＶＡ ＢＮ Ｆｉｌｏの用量及び経路を指す。水平な点線は、検出限界（ＬＯＤ）を示す。

発明の詳細な説明
さまざまな出版物、論文、及び特許が、背景及び本明細書にわたって、引用または記載されており、こうした参考文献はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に含めた文書、行為、材料、装置、論文、または同様のものに対する考察は、本発明を対象とする文脈の提供を目的としている。そのような考察は、こうした事項のいずれかまたはすべてが、開示または請求する任意の発明に関して、先行技術分野の一部を形成することを認めるものではない。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、本発明と関係する分野の当業者が一般に理解するものと同一の意味を有する。そうでない場合は、本明細書で使用される、ある特定の用語は、本明細書に示される意味を有する。本明細書に引用される特許、公開特許出願、及び出版物はすべて、参照によって、あたかも本明細書で完全に示されように組み込まれる。本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形である「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈から明らかでない限り、複数形の参照を含む。

別段の記載がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連におけるあらゆる要素を指すと理解されることになる。当業者であれば、日常の実験法を使用するだけで、本明細書に記載の発明の特定実施形態に対する同等形態の多くを認識または確認することが可能であろう。そのような同等形態は、本発明に包含されることを意図する。

文脈から必要でない限り、本明細書及び特許請求の範囲を通して、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」という言葉、ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形形態は、記載の整数もしくは段階、または整数もしくは段階の群の包含を意味するが、任意の他の整数もしくは段階、または整数もしくは段階の群の排除は意味しないと理解されることになる。本明細書で使用されるとき、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」という用語は、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」もしくは「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」という用語で置き換えることができるか、または本明細書で使用されるとき、場合によっては、「ｈａｖｉｎｇ」という用語で置き換えることができる。前述の用語（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｈａｖｉｎｇ）のいずれかが、本発明の態様または実施形態の関連において本明細書で使用されるときはいつでも、やや好ましくはないが、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」という用語で置き換えてよい。

本明細書で使用されるとき、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」は、特許請求の範囲の要素において特定されていない任意の要素、段階、または成分を排除する。本明細書で使用されるとき、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ」は、特許請求の範囲の基礎特性及び新規特性に実質的に影響を与えない材料または段階を排除しない。

本明細書では、複数の記載要素の間の「ａｎｄ／ｏｒ」という接続用語は、個々の選択肢及び組み合わせた選択肢の両方を包含すると理解される。例えば、２つの要素が、「ａｎｄ／ｏｒ」によって結合されている場合、第１の選択肢は、第２要素なしでの第１要素の適用性を指す。第２の選択肢は、第１要素なしでの第２要素の適用性を指す。第３の選択肢は、第１要素及び第２要素の両方の適用性を指す。こうした選択肢のいずれか１つが、意味に含まれ、それ故に、本明細書で使用される「ａｎｄ／ｏｒ」という用語の要件を満たすと理解される。複数の選択肢の同時適用性も意味に含まれ、それ故に、「ａｎｄ／ｏｒ」という用語の要件を満たすと理解される。

本明細書では、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、本発明の実施形態による方法によって治療されることになるか、または治療されたことがある任意の動物、好ましくは、哺乳類、最も好ましくは、ヒトを意味する。本明細書では、「哺乳類」という用語は、任意の哺乳類を包含する。哺乳類の例には、限定はされないが、雌ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒト等が含まれ、より好ましくは、ヒトである。

本明細書では、「防御免疫」または「防御免疫応答」という用語は、ワクチン接種を受けた対象が、それを標的としてワクチン接種を実施した病原体による感染の制御が可能であることを意味する。通常、「防御免疫応答」が生じた対象では、軽度〜中程度の臨床症状が生じるのみであるか、または全く症状が生じない。通常、ある特定の病原体に対する「防御免疫応答」または「防御免疫」を有する対象は、当該病原体による感染の結果として死ぬことにならない。

「アデノウイルスカプシドタンパク質」は、アデノウイルス（例えば、Ａｄ２６またはＡｄ３５）のカプシド上に存在するタンパク質であり、特定のアデノウイルスの血清型及び／または指向性の決定に関与するタンパク質を指す。アデノウイルスのカプシドタンパク質は、典型的には、繊維タンパク質、ペントンタンパク質、及び／またはヘキソンタンパク質を含む。本明細書では、「Ａｄ２６カプシドタンパク質」または「Ａｄ３５カプシドタンパク質」は、例えば、Ａｄ２６またはＡｄ３５のカプシドタンパク質の少なくとも一部を含むキメラカプシドタンパク質であってよい。ある特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、Ａｄ２６またはＡｄ３５の全カプシドタンパク質である。ある特定の実施形態では、ヘキソン、ペントン、及び繊維は、Ａｄ２６またはＡｄ３５のものである。

「アジュバント」及び「免疫刺激物質」という用語は、本明細書で互換的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１つまたは複数の物質であると定義される。この関連では、アジュバントは、本発明のアデノウイルスベクター及び／またはＭＶＡベクターに対する免疫応答の増進に使用される。

「に一致する（に対応する）」という用語は、配列におけるアミノ酸残基の位置に適用されるとき、配列が最適にアライメントされると、複数の配列において一致する位置を意味する。

２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列（例えば、フィロウイルスの糖タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド）の関連において、「同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」割合という用語は、下記の配列比較アルゴリズムの１つを使用して測定されるか、または視覚的検査によって測定され、最大一致に向けて比較及びアライメントされるときに、同一である２つ以上の配列もしくは部分配列を指すか、または同一である特定割合のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列を指す。

配列比較については、典型的には、１つの配列が参照配列となり、それと試験配列とが比較される。配列比較アルゴリズムを使用するときは、試験配列及び参照配列をコンピューターへと入力すると共に、必要であれば、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。その後、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性割合を計算する。

比較を目的として、最適な配列アライメントを実施することができ、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によって、こうしたアルゴリズムをコンピューターに実装することによって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、または視覚的検査によって（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．と、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との共同事業（１９９５付録）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を一般的なものとして参照のこと）実施することができる。

配列同一性割合及び配列類似性の決定に適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０のアルゴリズムであり、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、及びＡｌｔｓｃｈｕｅｌら（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２において説明されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中に存在する同一の長さの文字列とアライメントすると、一致するか、またはある正値の限界スコアＴを満たす、検索配列中の長さがＷの短い文字列を同定することによって、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を最初に特定することを含むものである。Ｔは、近隣文字列スコア限界（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と称される（前出のＡｌｔｓｃｈｕｌら）。こうした最初の近隣文字列ヒットは、それを含む、より長いＨＳＰの検索を開始するための足掛かり（ｓｅｅｄ）となる。その後、文字列ヒットは、それぞれの配列に沿って、累積アライメントスコアが増加し得る限り、両方向に拡張される。

ヌクレオチド配列については、累積スコアは、パラメーターＭ（一致残基対に対する報酬（ｒｅｗａｒｄ）スコア、常に＞０）及びパラメーターＮ（不一致残基に対するペナルティスコア、常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアが計算される。各方向への文字列ヒットの拡張は、累積アライメントスコアが、その最大達成値から数にしてＸ低下した場合、累積スコアが１つまたは複数の負のスコアリング残基アライメントの蓄積に起因してゼロ以下に達した場合、またはいずれかの配列の末端に到達した場合、に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターであるＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定するものである。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列が対象）は、初期設定として、１１の文字列長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定として、３の文字列長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）。

配列同一性割合の計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性尺度の１つは、最小確率和（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致が偶然生じるであろう確率の指標を提供するものである。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較において、最小確率和が約０．１未満、より好ましくは、約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満であるならば、参照配列と類似していると考えられる。

２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるというさらなる指標は、以下に記載するように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと、免疫学的に交差反応性であるということである。したがって、例えば、２つのペプチドが、保存的置換のみによって異なる場合、ポリペプチドは、典型的には、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が、実質的に同一であるという別の指標は、以下に記載するように、２つの分子が、厳密な条件下で、お互いにハイブリッド形成することである。

本発明のフィロウイルス抗原タンパク質の関連において、「実質的に類似した」という用語は、ポリペプチドが、１０〜２０残基のアミノ酸の比較窓（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）にわたって、参照配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを示す。配列同一性割合は、比較窓にわたって最適にアライメントされた２つの配列を比較することによって決定され、２つの配列を最適にアライメントするには、比較窓におけるポリヌクレオチド配列部分は、参照配列（追加または欠失を含まない）と比較した際に、追加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。割合は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が、両方の配列に生じる位置の数を決定することによって計算され、これにより、一致した位置の数が得られ、一致した位置の数を、比較窓における位置の総数で割った結果に１００を掛けることで、配列同一性割合が得られる。

本発明では、驚くべきことに、初回免疫−追加免疫の異種性である組み合わせが、特に、１つまたは複数の亜型のフィロウイルスに対する防御免疫応答の生成に有効であることが発見された。当該初回免疫−追加免疫の異種性である組み合わせは、具体的には、Ａｄ２６による初回免疫、及びその後に実施する、ＭＶＡによる追加免疫、ならびにＭＶＡによる初回免疫、及びその後に実施する、Ａｄ２６による追加免疫である。

フィロウイルス抗原タンパク質
エボラウイルス、及び遺伝的に関連するマールブルグウイルスは、北米、欧州、及びアフリカにおいて、ヒト及び霊長類において高度に致死的な出血熱が大流行することと関連があるフィロウイルスである（Ｐｅｔｅｒｓ，Ｃ．Ｊ．ら ｉｎ： Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ編 Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．ら １１６１−１１７６，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，１９９６、Ｐｅｔｅｒｓ，Ｃ．Ｊ．ら １９９４ Ｓｅｍｉｎ Ｖｉｒｏｌ ５：１４７−１５４）。いくつかの亜型が定義されたものの、こうしたウイルスの遺伝的構成は類似しており、それぞれが７つの直鎖状に配置された遺伝子を含んでいる。ウイルスタンパク質間で、外被糖タンパク質は、２つの代替形態で存在しており、当該代替え形態は、５０〜７０キロダルトン（ｋＤａ）の分泌タンパク質（ｓＧＰ）と、ＲＮＡ編集によって生成し、ウイルスの侵入を媒介する１３０ｋＤａの膜貫通糖タンパク質（ＧＰ）と、である（Ｐｅｔｅｒｓ，Ｃ．Ｊ．ら ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ編 Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．ら １１６１−１１７６，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，１９９６、Ｓａｎｃｈｅｚ，Ａ．ら １９９６ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：３６０２−３６０７）。他の構造遺伝子産物には、核タンパク質（ＮＰ）、基質タンパク質であるＶＰ２４及びＶＰ４０、推定非構造タンパク質であるＶＰ３０及びＶＰ３５、ならびにウイルスポリメラーゼが含まれる（Ｐｅｔｅｒｓ，Ｃ．Ｊ．ら ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ編 Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．ら １１６１−１１７６，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，１９９６において概説されている）。

アデノウイルスベクター及びＭＶＡベクターに含まれる核酸分子は、亜型のザイール（基準種であり、本明細書でＺＥＢＯＶとも称される）、スーダン（本明細書でＳＥＢＯＶとも称される）、レストン、ブンディブギョ、及びコートジボワールなどの、任意のフィロウイルス種の構造遺伝子産物をコードしてよい。マールブルグウイルスは、単一種（本明細書でＭＡＲＶとも称される）がある。

本発明のアデノウイルスベクター及びＭＶＡベクターは、さまざまなフィロウイルス抗原の抗原決定基を含むタンパク質である抗原タンパク質を発現するために使用することができる。典型的かつ好ましい実施形態では、本発明のベクターは、膜貫通形態のウイルス糖タンパク質（ＧＰ）をコードする核酸を含む。別の実施形態では、本発明のベクターは、分泌形態のウイルス糖タンパク質（ｓｓＧＰ）、またはウイルス核タンパク質（ＮＰ）をコードしてよい。

当業者であれば、フィロウイルス抗原タンパク質をコードする核酸分子は改変してよく、例えば、本明細書に示される核酸分子には、改変して発現したタンパク質が病原体または疾患に対する免疫応答を誘発する限り、変異させてよいことを認識するであろう。したがって、本明細書では、「抗原タンパク質」または「フィロウイルスタンパク質」という用語は、上に記載したフィロウイルスタンパク質の少なくとも１つの抗原決定基を含むタンパク質を指す。用語は、フィロウイルス糖タンパク質（すなわち、フィロウイルスの遺伝子産物）またはフィロウイルス核タンパク質、ならびに１つまたは複数のフィロウイルス糖タンパク質決定基を含む組換えタンパク質を包含する。抗原タンパク質という用語は、実質的に類似した抗原タンパク質も包含する。

いくつかの実施形態では、タンパク質は、細胞に対する毒性が低下するように変異導入（例えば、ＷＯ／２００６／０３７０３８を参照のこと）され得るか、または細胞における発現レベルを増加または減少させることができる。本発明は、核酸分子の組み合わせを含むワクチンも含む。例えば、限定はされないが、ザイール株、スーダン株、マールブルグ株、及びコートジボワール／タイフォレストエボラ株のＧＰ、ｓｓＧＰ、及びＮＰをコードする核酸分子を、任意の組み合わせで、１つのワクチン組成物において組み合わせてよい。

アデノウイルス
本発明によるアデノウイルスは、アデノウイルス科のファミリーに属し、好ましくは、マストアデノウイルス属に属する。アデノウイルスは、ヒトアデノウイルスであり得るが、他の種に感染するアデノウイルスでもあり得、限定はされないが、ウシアデノウイルス（例えば、ウシアデノウイルス３型、ＢＡｄＶ３）、イヌアデノウイルス（例えば、ＣＡｄＶ２）、ブタアデノウイルス（例えば、ＰＡｄＶ３もしくはＰＡｄＶ５）、またはサル（ｓｉｍｉａｎ）アデノウイルス（サル（ｍｏｎｋｅｙ）アデノウイルス、及びチンパンジーアデノウイルスもしくはゴリラアデノウイルスなどの類人猿アデノウイルスを含む）が含まれる。好ましくは、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶもしくはＡｄＨｕであり、本発明において、種を示さずにＡｄと称したのであれば、ヒトアデノウイルスを意味し、例えば、略表記である「Ａｄ５」は、ＨＡｄＶ５と同一の意味を有し、ＨＡｄＶ５は、ヒトアデノウイルスの血清型５である）、またはチンパンジーアデノウイルスもしくはゴリラアデノウイルスなどのサルアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈ、もしくはＳＡｄＶ）である。

最も先端的な試験は、ヒトアデノウイルスを使用して実施されており、ヒトアデノウイルスが、本発明のある特定の態様によれば好ましい。ある特定の好ましい実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルスに基づくものである。好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルスの血清型５、血清型１１、血清型２６、血清型３４、血清型３５、血清型４８、血清型４９、または血清型５０に基づくものである。本発明の特に好ましい実施形態によれば、アデノウイルスは、血清型２６または血清型３５のいずれかのヒトアデノウイルスである。

こうした血清型の優位性は、ヒト集団において、血清有病率が低く、及び／または既存中和抗体の力価が低いことである。ｒＡｄ２６ベクターの調製は、例えば、ＷＯ２００７／１０４７９２、及びＡｂｂｉｎｋら，（２００７）Ｖｉｒｏｌ ８１（９）：４６５４−６３において説明されており、当該文献は両方共、参照によって、それらの全体が本明細書に組み込まれる。Ａｄ２６の例示のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）ＥＦ １５３４７４、及びＷＯ２００７／１０４７９２の配列番号１で見られる。ｒＡｄ３５ベクターの調製は、例えば、米国特許第７，２７０，８１１号、ＷＯ００／７００７１、及びＶｏｇｅｌｓら，（２００３）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７（１５）：８２６３−７１において説明されており、当該文献はすべて、参照によって、それらの全体が本明細書に組み込まれる。Ａｄ３５の例示のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＣ＿００００１９、及びＷＯ００／７００７１の図６で見られる。

サルアデノウイルスは、一般に、ヒト集団においても、血清有病率が低く、及び／または既存中和抗体の力価が低く、チンパンジーアデノウイルスベクターを使用して報告された研究は非常に多い（例えば、ＵＳ６０８３７１６、ＷＯ２００５／０７１０９３、ＷＯ２０１０／０８６１８９、ＷＯ２０１００８５９８４、Ｆａｒｉｎａら，２００１，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５：１１６０３−１３、Ｃｏｈｅｎら，２００２，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８３：１５１−５５、Ｋｏｂｉｎｇｅｒら，２００６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３４６：３９４−４０１、Ｔａｔｓｉｓら，２００７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １５：６０８−１７であり、同様に、Ｂａｎｇａｒｉ ａｎｄ Ｍｉｔｔａｌ，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：８４９−６２による概説、及びＬａｓａｒｏ ａｎｄ Ｅｒｔｌ，２００９，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７：１３３３−３９による概説も参照のこと）。したがって、他の好ましい実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスは、例えば、チンパンジーアデノウイルスといったサルアデノウイルスに基づくものである。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、サルアデノウイルスの１型、７型、８型、２１型、２２型、２３型、２４型、２５型、２６型、２７．１型、２８．１型、２９型、３０型、３１．１型、３２型、３３型、３４型、３５．１型、３６型、３７．２型、３９型、４０．１型、４１．１型、４２．１型、４３型、４４型、４５型、４６型、４８型、４９型、５０型、またはＳＡ７Ｐに基づくものである。

アデノウイルスベクターｒＡｄ２６及びアデノウイルスベクターｒＡｄ３５
本発明による好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、２つの希少血清型であるＡｄ２６及びＡｄ３５に由来するカプシドタンパク質を含む。典型的な実施形態では、ベクターは、ｒＡｄ２６ウイルスまたはｒＡｄ３５ウイルスである。

したがって、本発明で使用することができるベクターは、Ａｄ２６またはＡｄ３５のカプシドタンパク質（例えば、繊維タンパク質、ペントンタンパク質、またはヘキソンタンパク質）を含む。当業者であれば、本発明のベクターにおいて、Ａｄ２６またはＡｄ３５の全カプシドタンパク質を使用する必要はないことを認識するであろう。したがって、Ａｄ２６またはＡｄ３５のカプシドタンパク質の少なくとも一部を含むキメラカプシドタンパク質を、本発明のベクターにおいて使用することができる。本発明のベクターは、少なくとも１つのカプシドタンパク質がＡｄ２６またはＡｄ３５に由来するものである限り、繊維タンパク質、ペントンタンパク質、及びヘキソンタンパク質のそれぞれが、異なる血清型に由来するものであるカプシドタンパク質を含んでもよい。好ましい実施形態では、繊維タンパク質、ペントンタンパク質、及びヘキソンタンパク質は、それぞれがＡｄ２６に由来するものであるか、またはそれぞれがＡｄ３５に由来するものである。

当業者であれば、単一の組換えアデノウイルスベクターにおいて、複数の血清型に由来する要素を組み合わせることができることを認識するであろう。したがって、異なる血清型に由来する所望の特性を組み合わせたキメラアデノウイルスを生成することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のキメラアデノウイルスは、Ａｄ２６血清型及びＡｄ３５血清型に対する既存免疫性の欠如と、温度、安定性、会合、繋留、生成収率、感染の再指向化または改善、標的細胞におけるＤＮＡの安定性、及び同様のものなどの特性と、を組み合わせることが可能である。

ある特定の実施形態では、本発明において有用な組換えアデノウイルスベクターは、主に、または完全に、Ａｄ３５またはＡｄ２６に由来するものである（すなわち、ベクターがｒＡｄ３５またはｒＡｄ２６である）。いくつかの実施形態では、アデノウイルスは、複製を欠損しており、これは、例えば、アデノウイルスがゲノムのＥ１領域において欠失を含むためである。本発明のアデノウイルスについては、Ａｄ２６またはＡｄ３５に由来し、アデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６コード配列と、Ａｄ５などの、ヒトＣ亜群のアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６と、を交換することが通常である。このことよって、例えば、２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、及び同様のものなどの、Ａｄ５のＥ１遺伝子を発現するよく知られた補完細胞株において、そのようなアデノウイルスを増殖させることが可能となる（例えば、Ｈａｖｅｎｇａら，２００６，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８７：２１３５−４３、ＷＯ０３／１０４４６７を参照のこと）。ある特定の実施形態では、アデノウイルスは、血清型３５のヒトアデノウイルスであり、抗原をコードする核酸がクローン化されたＥ１領域に欠失を有すると共に、Ａｄ５のＥ４ ｏｒｆ６領域を有する。ある特定の実施形態では、アデノウイルスは、血清型２６のヒトアデノウイルスであり、抗原をコードする核酸がクローン化されたＥ１領域に欠失を有すると共に、Ａｄ５のＥ４ ｏｒｆ６領域を有する。Ａｄ３５アデノウイルスについては、アデノウイルス中にＥ１Ｂ ５５Ｋの翻訳領域の３’末端を保持していることが通常であり、これは、例えば、ｐＩＸの翻訳領域の直ぐ上流に位置する１６６ｂｐであるか、またはＢｓｕ３６Ｉの制限部位によって５’末端が標識された、ｐＩＸの開始コドンの直ぐ上流に位置する２４３ｂｐの断片などの、当該１６６ｂｐを含む断片である。この理由は、アデノウイルスの安定性がこれによって増加するためであり、安定性増加の理由は、ｐＩＸ遺伝子のプロモーターが、この範囲に部分的に存在しているためである（例えば、前出のＨａｖｅｎｇａら，２００６、ＷＯ２００４／００１０３２を参照のこと）。

組換えアデノウイルスベクターの調製は、当該技術分野においてよく知られている。

ｒＡｄ２６ベクターの調製は、例えば、ＷＯ２００７／１０４７９２及びＡｂｂｉｎｋら（２００７）Ｖｉｒｏｌ ８１（９）：４６５４−６３において説明されている。Ａｄ２６の例示のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ１５３４７４、及びＷＯ２００７／１０４７９２の配列番号１で見られる。ｒＡｄ３５ベクターの調製は、例えば、米国特許第７，２７０，８１１号及びＶｏｇｅｌｓら，（２００３）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７（１５）：８２６３−７１において説明されている。Ａｄ３５の例示のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＣ＿００００１９で見られる。

本発明の実施形態では、本発明に有用なベクターには、ＷＯ２０１２／０８２９１８において説明されているものが含まれ、当該文献の開示は、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。

典型的には、本発明において有用なベクターは、全組換えアデノウイルスゲノムを含む核酸（例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、またはバキュロウイルスベクター）を使用して生成される。したがって、本発明は、本発明のアデノウイルスベクターをコードする単離された核酸分子も提供する。本発明の核酸分子は、クローン化によって得られるか、または合成的に生成されるＲＮＡ形態またはＤＮＡ形態であり得る。ＤＮＡは、２本鎖または１本鎖であってよい。

本発明に有用なアデノウイルスベクターは、典型的には、複製を欠損している。こうした実施形態では、ウイルスは、Ｅ１領域などの、ウイルスの複製に決定的に重要な領域を欠失または不活性化することによって複製欠損とされる。領域は、例えば、関心遺伝子（通常、プロモーターに連結される）を挿入することによって、実質的に欠失または不活性化することができる。いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、Ｅ２領域、Ｅ３領域、またはＥ４領域などの他の領域における欠失、またはプロモーターに連結された異種遺伝子の挿入を含んでよい。Ｅ２及び／またはＥ４が変異したアデノウイルスについては、一般に、Ｅ２及び／またはＥ４を補完する細胞株を使用して組換えアデノウイルが生成される。アデノウイルスのＥ３領域における変異は、細胞株によって補完される必要はなく、これは、Ｅ３が複製には必要ないためである。

本発明のアデノウイルスベクターを十分量生成させるために、典型的には、パッケージング細胞株が使用される。パッケージング細胞は、複製欠損ベクターにおいて欠失または不活性化された遺伝子を含む細胞であり、したがって、その細胞において、ウイルスが複製することを可能にするものである。適した細胞株には、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６、９１１、２９３、及びＥ１ Ａ５４９が含まれる。

上に記載したように、ベクターにおいて、さまざまなフィロウイルス糖タンパク質を発現することができる。必要であれば、治療される宿主（例えば、ヒト）における適切な発現を確実なものとするために、フィロウイルス糖タンパク質をコードする異種遺伝子のコドンを最適化することができる。コドン最適化は、当該技術分野において、幅広く適用される技術である。典型的には、異種遺伝子は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域及び／またはＥ３領域へとクローン化される。

異種フィロウイルス遺伝子は、アデノウイルスに由来するプロモーター（例えば、主要後期プロモーター）の制御下（すなわち、当該プロモーターに動作可能な形で連結されている）にあり得るか、または異種プロモーターの制御下にあり得る。適した異種プロモーターの例には、ＣＭＶプロモーター及びＲＳＶプロモーターが含まれる。好ましくは、プロモーターは、発現カセット内における関心異種遺伝子の上流に位置する。

上に記載したように、本発明に有用なアデノウイルスベクターは、当業者に知られるさまざまなフィロウイルス糖タンパク質を含むことができる。

本発明の好ましい実施形態では、ｒＡｄベクターは、ザイールエボラウイルス（ＥＢＯＶ）のＧＰ、スーダンエボラウイルス（ＳＵＤＶ）のＧＰ、マールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）のＧＰ、及びそれらと実質的に類似したＧＰからなる群から選択される１つまたは複数のＧＰを含む。

ＭＶＡベクター
本発明に有用なＭＶＡベクターは、ヒト細胞株において、それが再生的に複製する能力を消失していることによって特徴づけられる改変ワクシニアアンカラウイルスに由来する弱毒化ウイルスを利用するものである。ＭＶＡベクターは、さまざまなフィロウイルス糖タンパク質、ならびにＶＰ４０及び核タンパク質（ＮＰ）などの、他の構造的なフィロウイルスタンパク質を発現するものである。

１つの態様では、本発明は、フィロウイルス糖タンパク質（ＧＰ）、具体的には、外被糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含む組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）を提供する。別の態様では、本発明は、フィロウイルス糖タンパク質、具体的には、外被糖タンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列と、さらなるフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列と、を含む組換えＭＶＡベクターを提供する。

ＭＶＡは、トルコのアンカラのワクチン接種研究所（Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）において長年維持され、ヒトのワクチン接種の基礎として使用されていた経皮ワクシニア株アンカラ［漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラウイルス、ＣＶＡ、概説については、Ｍａｙｒら（１９７５），Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ３，６−１４を参照のこと］をニワトリ胚線維芽細胞において５７０回を超えて連続継代することによって生成された。しかしながら、ワクチン接種後に、ワクシニアウイルスと関連する重篤な合併症が生じることが多いため、より弱毒化した、より安全な天然痘ワクチンを生成させようとする試みがいくつか存在した。

１９６０年〜１９７４年までの期間で、Ａｎｔｏｎ Ｍａｙｒ教授は、ＣＥＦ細胞において、５７０回を超えて連続継代することによって、ＣＶＡを弱毒化することに成功した［Ｍａｙｒら（１９７５）］。得られたＭＶＡが非病原性であることが、さまざまな動物モデルにおいて示された［Ｍａｙｒ，Ａ．＆ Ｄａｎｎｅｒ，Ｋ．（１９７８），Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．４１：２２５−２３４］。前天然痘ワクチンとしてＭＶＡを開発する初期段階の一環として、ワクシニアに由来する有害な反応の危険がある対象において、ＭＶＡ−５１７をリステリアエルスツリー（Ｌｉｓｔｅｒ Ｅｌｓｔｒｅｅ）と組み合わせて使用した臨床試験が存在した［Ｓｔｉｃｋｌ（１９７４），Ｐｒｅｖ．Ｍｅｄ．３：９７−１０１、Ｓｔｉｃｋｌ ａｎｄ Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ−Ｍｉｎｔｚｅｌ（１９７１），Ｍｕｎｃｈ．Ｍｅｄ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．１１３：１１４９−１１５３］。１９７６年には、ＭＶＡ−５７１のシードストック（５７１回目の継代に対応）に由来するＭＶＡが、２段階の非経口天然痘ワクチン接種プログラムにおけるプライマーワクチンとして、ドイツにおいて登録された。その後、ＭＶＡ−５７２は、１〜３歳の子供を主として、約１２０，０００のコーカサス人に使用され、対象の多くが、ワクチンと関連した合併症の危険が高い集団に属していたものの、重篤な副作用は報告されなかった（Ｍａｙｒら（１９７８），Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（Ｂ） １６７：３７５−３９０）。ＭＶＡ−５７２は、ＥＣＡＣＣ Ｖ９４０１２７０７として、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓに預託された。

ＭＶＡの弱毒化に継代を使用した結果として、ＣＥＦ細胞において実施された継代回数に応じて、多くの異なる株または単離株が存在している。例えば、天然痘根絶プログラムの間に、ドイツにおいて、ＭＶＡ−５７２は、前ワクチンとして少用量で使用され、ＭＶＡ−５７５は、動物用ワクチンとして大規模に使用された。ＭＶＡならびにＭＶＡ−ＢＮは、祖先のＣＶＡウイルスと比較すると、ゲノムの約１５％（６つの領域に由来する３１ｋｂ）を欠いている。欠失は、多くの病原性遺伝子及び宿主範囲遺伝子、ならびにＡ型封入体遺伝子に影響を及ぼしている。ＭＶＡ−５７５は、受入番号Ｖ００１２０７０７として、２０００年１２月７日に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に預託された。弱毒化ＣＶＡ−ウイルスＭＶＡ（改変ワクシニアウイルスアンカラ）は、初代ニワトリ胚線維芽細胞において、ＣＶＡの連続増殖（５７０回を超える継代）によって得られた。

Ｍａｙｒらは、１９７０年代の間に、ＭＶＡが高度に弱毒化され、ヒト及び哺乳類において非病原性であることを示したものの、ある特定の研究者は、ＭＶＡが哺乳類細胞株及びヒト細胞株において完全には弱毒化されておらず、これは、こうした細胞において、残存複製が生じる可能性が存在するためであると報告している［Ｂｌａｎｃｈａｒｄら（１９９８），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１１５９−１１６７、Ｃａｒｒｏｌｌ ＆ Ｍｏｓｓ（１９９７），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３８：１９８−２１１、米国特許第５，１８５，１４６号、Ａｍｂｒｏｓｉｎｉら（１９９９），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５５：５６９］。こうした出版物において報告された結果は、使用されたウイルスが、その特性、具体的には、さまざまな細胞株におけるその増殖挙動において本質的に異なるため、さまざまな既知のＭＶＡ株で得られたものであると想定される。そのような複製が残存していることは、ヒトにおける使用との関連において、安全性への懸念を含む、さまざまな理由から望ましくないことである。

ワクチンまたは医薬品などの、より安全な製品の開発を目的として安全性プロファイルが高められたＭＶＡ株が、Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃによって開発された。ＭＶＡは、Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃによってさらに継代され、ＭＶＡ−ＢＮと命名されて、その代表試料が、受入番号Ｖ０００８３００８として、２０００年８月３０日に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に預託された。ＭＶＡ−ＢＮは、ＷＯ０２／４２４８０（ＵＳ２００３／０２０６９２６）及びＷＯ０３／０４８１８４（ＵＳ２００６／０１５９６９９）においてさらに説明されており、当該文献は両方共、それらの全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。

ＭＶＡ−ＢＮは、ヒト細胞に付着して侵入することができ、そこで、ウイルス性にコードされた遺伝子を非常に効率的に発現する。ＭＶＡ−ＢＮは、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）に強く適応しており、ヒト細胞においては複製されない。ヒト細胞では、ウイルス遺伝子が発現し、感染性ウイルスは生成しない。ＭＶＡ−ＢＮは、米国のＣｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎによれば、バイオセイフティーがレベル１の生物であると分類されている。ＭＶＡ−ＢＮ及び派生株の製剤は、これまで多くの種類の動物に対して、及び免疫不全である個人を含む２０００を超えるヒト対象に対して投与されている。ワクチン接種のすべてで、一般に安全であり、忍容性が良好であることが判明している。ＭＶＡ−ＢＮは、高度に減弱化され、病原性が低減されているにもかかわらず、前臨床試験において、ワクシニアに対して、及びＭＶＡゲノムへとクローン化された遺伝子によってコードされる異種遺伝子産物に対して、液性免疫応答及び細胞性免疫応答の両方を誘発することが示された［Ｅ．Ｈａｒｒｅｒら（２００５），Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．１０（２）：２８５−３００、Ａ．Ｃｏｓｍａら（２００３），Ｖａｃｃｉｎｅ ２２（１）：２１−９、Ｍ．Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａら（２００３），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（１４）：１３４７−１３６０、Ｍ．Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａら（２００４），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１０（１６）：５３８１−５３９０］。

ＭＶＡの「派生株（誘導体株）（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」または「変異株（ｖａｒｉａｎｔ）」は、本明細書に記載のＭＶＡと同一の複製特性を本質的に示すが、そのゲノムの１つまたは複数部分において差異を示すウイルスを指す。ＭＶＡ−ＢＮならびにＭＶＡ−ＢＮの派生株または変異株は、ヒト及びマウスにおいて、さらに、著しく免疫が抑制されたマウスにおいてさえ、インビボでの再生的な複製に失敗するものである。より具体的には、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮの派生株または変異株は、好ましくは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）においては、再生的な複製能力も有するが、ヒト角化細胞株であるＨａＣａｔ［Ｂｏｕｋａｍｐら（１９８８），Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０６：７６１−７７１］、ヒト骨肉腫細胞株である１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ預託番号９１１１２５０２）、ヒト胚腎臓細胞株である２９３（ＥＣＡＣＣ預託番号８５１２０６０２）、及びヒト子宮頸癌細胞株であるＨｅＬａ（ＡＴＣＣ預託番号ＣＣＬ−２）においては、増殖性の複製能力は有さない。さらに、ＭＶＡ−ＢＮの派生株または変異株の、Ｈｅｌａ細胞及びＨａＣａＴ細胞株におけるウイルス増幅比は、ＭＶＡ−５７５と比較して、少なくとも２倍低く、より好ましくは３倍低い。ＭＶＡ変異株のこうした特性の試験及びアッセイは、ＷＯ０２／４２４８０（ＵＳ２００３／０２０６９２６）及びＷＯ０３／０４８１８４（ＵＳ２００６／０１５９６９９）において説明されている。

「再生的な複製能力を有さない（ｎｏｔ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」または「再生的な複製能力を有さない（ｎｏ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」という用語は、例えば、ＷＯ０２／４２４８０において説明されていると共に、上述の所望特性を有するＭＶＡを得る方法もそこで教示されている。用語は、ＷＯ０２／４２４８０または米国特許第６，７６１，８９３号において説明されているアッセイを使用し、感染の４日後に、ウイルスの増幅比が１未満であるウイルスに適用されると共に、当該文献は両方共、参照によって、それらの全体が本明細書に組み込まれる。

「再生的な複製に失敗する」という用語は、感染の４日後に、ウイルスの増幅比が１未満であるウイルスを指す。ウイルス増殖率の決定に、ＷＯ０２／４２４８０または米国特許第６，７６１，８９３号において説明されているアッセイが適用可能である。

ウイルスの増幅または複製は、最初の段階で細胞への感染に元々使用した量（インプット）に対する、感染細胞由来の生成ウイルス（アウトプット）の比として示されることが通常であり、「増幅比（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）」と称される。１の増幅比は、感染細胞から生成したウイルス量が、細胞への感染に最初に使用した量と同一である増幅状態であると定義され、このことは、感染細胞がウイルスの感染及び再生に許容的であること意味する。対照的に、１未満である増幅比は、すなわち、インプットレベルと比較してアウトプットが減少しており、このことは、再生的な複製の欠如を示すと共に、それ故に、ウイルスが弱毒化されていることを示すものである。

ＭＶＡに基づくワクチンの優位性には、その安全性プロファイル、ならびに大規模なワクチン製造が可能であることが含まれる。前臨床試験によって、ＭＶＡ−ＢＮは、他のＭＶＡ株と比較して、優れた弱毒化及び効力を示すことが明らかとなった（ＷＯ０２／４２４８０）。ＭＶＡ−ＢＮ株のさらなる特性は、ＤＮＡ−初回免疫／ワクシニアウイルス追加免疫レジメンと比較したとき、ワクシニアウイルス初回免疫／ワクシニアウイルス追加免疫レジメンにおいて、実質的に同レベルの免疫を誘導する能力である。

本明細書の最も好ましい実施形態である組換えＭＶＡ−ＢＮは、安全であると考えられ、これは、哺乳類細胞において、それが明確に複製を欠損しており、非病原性がよく確立されているためである。さらに、その効力に加えて、産業規模での製造を実現する可能性を有していることが有益であり得る。さらに、ＭＶＡに基づくワクチンは、複数の異種抗原を送達することができ、液性免疫及び細胞性免疫の同時誘導を可能にし得るものである。

本発明に有用なＭＶＡベクターは、ＷＯ／２００２／０４２４８０及びＷＯ／２００２／２４２２４において説明されているものなどの、当該技術分野において知られる方法を使用して調製することができると共に、当該文献の関連開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。

別の態様では、ＭＶＡ−５７２株、ＭＶＡ−５７５株、または同様に弱毒化された任意のＭＶＡ株などの複製欠損ＭＶＡウイルス株も適したものであり得る。また、欠失を有する漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ（ｄＣＶＡ）などのＭＶＡ変異株も適したものであり得る。ｄＣＶＡは、ＭＶＡのゲノムに、ｄｅｌＩ欠失部位、ｄｅｌＩＩ欠失部位、ｄｅｌＩＩＩ欠失部位、ｄｅｌＩＶ欠失部位、ｄｅｌＶ欠失部位、及びｄｅｌＶＩ欠失部位を含む。部位は、複数の異種配列の挿入に特に有用である。ｄＣＶＡは、ヒト細胞株（ヒト２９３細胞株、ヒト１４３Ｂ細胞株、及びヒトＭＲＣ−５細胞株など）において、再生的に複製（１０を超える増幅比で）でき、これにより、ウイルスに基づくワクチン法に有用なさらなる変異による最適化を可能にするものである（ＷＯ２０１１／０９２０２９を参照のこと）。

本発明の好ましい実施形態では、ＭＶＡベクターは、ザイールエボラウイルス（ＥＢＯＶ）のＧＰ、スーダンエボラウイルス（ＳＵＤＶ）のＧＰ、マールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）のＧＰ、タイフォレストウイルスのＮＰ、及びそれらと実質的に類似したＧＰまたはＮＰからなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸を含む。

フィロウイルスタンパク質は、ＭＶＡの１つまたは複数の遺伝子間領域（ＩＧＲ）に挿入してよい。ある特定の実施形態では、ＩＧＲは、ＩＧＲ０７／０８、ＩＧＲ４４／４５、ＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、ＩＧＲ１３６／１３７、及びＩＧＲ１４８／１４９から選択される。ある特定の実施形態では、組換えＭＶＡの５、４、３、または２未満のＩＧＲは、フィロウイルス外被糖タンパク質及び／またはさらなるフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。１つまたは複数の自然に生じる欠失部位へと、具体的には、ＭＶＡゲノムの主な欠失部位であるＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、またはＶＩへと追加的に、または代替的に、異種ヌクレオチド配列を挿入してよい。ある特定の実施形態では、組換えＭＶＡの自然に生じる５、４、３、または２未満の欠失部位は、フィロウイルス外被糖タンパク質及び／またはさらなるフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。

フィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含む、ＭＶＡの挿入部位数は、１、２、３、４、５、６、７、またはそれを超え得る。ある特定の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、４、３、２、またはそれより少ない数の挿入部位へと挿入される。好ましくは、２つの挿入部位が使用される。ある特定の実施形態では、３つの挿入部位が使用される。好ましくは、組換えＭＶＡは、２つまたは３つの挿入部位へと挿入された遺伝子を少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つ含む。

本明細書で提供される組換えＭＶＡウイルスは、当該技術分野において知られる日常的な方法によって生成させることができる。組換えポックスウイルスの取得方法、またはポックスウイルスゲノムへの異種コード配列の挿入方法は、当業者によく知られている。例えば、ＤＮＡのクローン化手法、ＤＮＡ及びＲＮＡの単離手法、ウエスタンブロット解析手法、ＲＴ−ＰＣＲ増幅手法、ならびにＰＣＲ増幅手法などの、標準的な分子生物学手法を対象とする方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］において説明されており、ウイルスの取扱い及び処理を対象とする手法は、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ［Ｂ．Ｗ．Ｊ．Ｍａｈｙら（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）］において説明されている。同様に、ＭＶＡの取り扱い、処理、及び遺伝子操作を対象とする手法及びノウハウは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ［Ａ．Ｊ．Ｄａｖｉｓｏｎ ＆ Ｒ．Ｍ．Ｅｌｌｉｏｔｔ（編），Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ（１９９３）（例えば、９章：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｂｙ Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓを参照のこと）］、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．（１９９８）（例えば、１６章、ＩＶ節：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒを参照のこと）］において説明されている。

本明細書に開示のさまざまな組換えＭＶＡの生成には、異なる方法が適用可能であり得る。ウイルスへと挿入されることになるＤＮＡ配列は、ＭＶＡのＤＮＡ区画に対して相同性であるＤＮＡが挿入されたＥ．ｃｏｌｉプラスミド構築物へと配置することができる。別として、挿入されることになるＤＮＡ配列は、プロモーターに連結することができる。プロモーターと遺伝子との連鎖は、プラスミド構築物において、非必須遺伝子座を含む、ＭＶＡのＤＮＡ領域と隣接するＤＮＡ配列に対して相同性であるＤＮＡと、プロモーターと遺伝子との連鎖と、が両末端で隣接するように配置することができる。得られたプラスミド構築物は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌内において増殖させることによって増幅してから単離することができる。挿入されることになるＤＮＡ遺伝子配列を含む単離プラスミドは、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の細胞培養物へと遺伝子導入することができ、同時に、培養物にＭＶＡを感染させる。プラスミド中に存在する、ＭＶＡに相同性であるＤＮＡと、ウイルスゲノムと、がそれぞれ組換わることで、外来ＤＮＡ配列が存在することによって改変されたＭＶＡを生成させることができる。

好ましい実施形態によれば、例えば、ＣＥＦ細胞のような、適した細胞培養物の細胞に、ポックスウイルスを感染させることができる。その後、感染細胞に対して、好ましくは、ポックスウイルスの発現を制御する要素の転写制御下に１つまたは複数の外来遺伝子または異種遺伝子を含む第１のプラスミドベクターを遺伝子導入することができる。上で説明したように、プラスミドベクターは、ポックスウイルスゲノムの選択部分への外来性配列の挿入を指向できる配列も含む。任意選択で、プラスミドベクターは、ポックスウイルスプロモーターに動作可能な形で連結されたマーカー遺伝子及び／または選択遺伝子を含むカセットも含む。

適したマーカー遺伝子または選択遺伝子は、例えば、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ、または他のマーカーをコードする遺伝子である。選択カセットまたはマーカーカセットを使用することで、生成した組換えポックスウイルスの同定及び単離が単純化される。しかしながら、組換えポックスウイルスは、ＰＣＲ技術によっても同定することができる。結果的に、上に記載したように取得した組換えポックスウイルスをさらなる細胞に感染させると共に、第２の１つまたは複数の外来遺伝子または異種遺伝子を含む第２のベクターを当該細胞に遺伝子導入することができる。念のため、この遺伝子は、ポックスウイルスゲノムの異なる挿入部位へと導入されることになり、第２ベクターは、ポックスウイルスのゲノムへの、１つまたは複数の第２の外来遺伝子の組み込みを指向するポックスウイルス相同性配列においても異なるものである。相同組換えが生じた後、２つ以上の外来遺伝子または異種遺伝子を含む組換えウイルスを単離することができる。組換えウイルスへと追加の外来遺伝子を導入するには、前の感染段階において単離した組換えウイルスを使用すると共に、遺伝子導入を目的とするさらなる１つまたは複数の外来遺伝子を含むさらなるベクターを使用することによって、感染段階及び遺伝子導入段階を繰り返すことができる。

あるいは、上に記載した感染段階及び遺伝子導入段階は、互換的であり、すなわち、外来遺伝子を含むプラスミドベクターによって、適した細胞に最初に遺伝子導入した後、ポックスウイルスを感染させることができる。さらなる代替手段として、異なるウイルスへとそれぞれの外来遺伝子を導入し、得られたすべての組換えウイルスを細胞に同時感染させてから、すべての外来遺伝子を含む組換え体を探索することも可能である。第３の代替手段は、ＤＮＡゲノムと外来配列とをインビトロで連結し、再結合されたワクシニアウイルスＤＮＡゲノムを、ヘルパーウイルスを使用して再構築することである。第４の代替え手段は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてクローン化された、ＭＶＡなどのワクシニアウイルスのゲノムと、ワクシニアウイルスゲノムにおいて所望の組み込み位置と隣接する配列に対して相同性であるＤＮＡ配列と隣接する直鎖状外来配列と、の間で、Ｅ．ｃｏｌｉまたは別の細菌種において、相同組換えを実施することである。

異種フィロウイルス遺伝子は、１つまたは複数のポックスウイルスプロモーターの制御下（すなわち、当該プロモーターに、動作可能な形で連結されている）にあってよい。ある特定の実施形態では、ポックスウイルスプロモーターは、Ｐｒ７．５プロモーター、ハイブリット早期／後期プロモーター、またはＰｒＳプロモーター、ＰｒＳ５Ｅプロモーター、合成もしくは天然の早期プロモーターもしくは後期プロモーター、または牛痘ウイルスＡＴＩプロモーターである。

免疫原性組成物
免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の精製または部分精製された、本発明における使用を目的とするアデノウイルスベクターまたはＭＶＡベクターを含む組成物である。当該組成物は、当該技術分野でよく知られる方法に従って、ワクチン（「免疫原性組成物とも称される」）として製剤化してよい。そのような組成物は、免疫応答を増進するアジュバントを含んでよい。製剤におけるそれぞれの成分の最適比は、本開示を考慮して、当業者によく知られる手法によって決定してよい。

免疫原性組成物の調製及び使用は、当業者によく知られている。液体医薬組成物は、一般に、水、石油、動物油もしくは野菜油、鉱物油、または合成油などの液体担体を含む。生理食塩水溶液、デキストロースもしくは他の糖類の溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含んでよい。

本発明の組成物は、他のフィロウイルス抗原を含んでよく、または初回免疫接種もしくは追加免疫接種が、他の抗原を含んでよい。本発明のアデノウイルスベクターと組み合わせて使用される他の抗原は、本発明に対して決定的に重要ではなく、例えば、フィロウイルス抗原及びそれを発現する核酸であってよい。

本発明において有用な免疫原性組成物は、アジュバントを含み得る。

本発明による同時投与に適したアジュバントは、ヒトにおいて、潜在的に安全であって、忍容性が良好であり、有効なものであるべきであり、当該アジュバントには、ＱＳ−２１、Ｄｅｔｏｘ−ＰＣ、ＭＰＬ−ＳＥ、ＭｏＧＭ−ＣＳＦ、ＴｉｔｅｒＭａｘ−Ｇ、ＣＲＬ−１００５、ＧＥＲＢＵ、ＴＥＲａｍｉｄｅ、ＰＳＣ９７Ｂ、Ａｄｊｕｍｅｒ、ＰＧ−０２６，ＧＳＫ−Ｉ、ＧｃＭＡＦ、Ｂ−ａｌｅｔｈｉｎｅ、ＭＰＣ−０２６、Ａｄｊｕｖａｘ、ＣｐＧ ＯＤＮ、Ｂｅｔａｆｅｃｔｉｎ、Ａｌｕｍ、及びＭＦ５９が含まれる。

投与され得る他のアジュバントには、アルファ−インターフェロン、ガンマインターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、顆粒球−コロニー刺激因子（ｇＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇＭＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−ＩＯ、及びＩＬ−１２などのレクチン、増殖因子、サイトカイン、及びリンホカインが含まれ、またはそれ故に、それらをコードする核酸が含まれる。

本発明の組成物は、医薬的に許容可能な添加剤、担体、緩衝剤、安定剤、または当業者に知られる他の材料を含むことができる。そのような材料は、非毒性であるべきであり、活性成分の効力を妨害するべきでない。担体または他の材料の正確な性質は、例えば、筋肉内経路、皮下経路、経口経路、静脈内経路、経皮（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）経路、粘膜内（例えば、腸）経路、鼻腔内経路、腹腔内経路といった投与経路に依存するものであってよい。

フィロウイルス感染に対する防御免疫の誘導方法
本発明は、アデノウイルスベクターを、別のアデノウイルスベクター及び／またはＭＶＡベクターと組み合わせて使用して、個体おける１つまたは複数のフィロウイルスに対する免疫応答を初回免疫及び追加免疫する方法を提供する。

本発明の１つの一般的な態様によれば、対象における、フィロウイルスに対する免疫応答の誘導方法は、
ａ．第１のフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のアデノウイルスベクターを含む第１の組成物の、対象に対する投与と、
ｂ．少なくとも２つのフィロウイルス株の抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のＭＶＡベクターを含む第２の組成物の、対象に対する投与と、
を含み、
段階（ａ）及び段階（ｂ）は、いずれの順序でも実施される。好ましい実施形態では、後の段階は、最初の段階の１〜１２週間後に実施される。

本発明のある特定の追加態様では、第１の組成物は、第２のフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含む１つまたは複数の追加のアデノウイルスベクターをさらに含む。他の実施形態では、第１の組成物は、第３のフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含む１つまたは複数の追加のアデノウイルスベクターをさらに含む。

開示の方法の１つの実施形態では、アデノウイルスベクターは、免疫応答の初回免疫に使用され、別のアデノウイルスベクター及び／またはＭＶＡベクターが、初回免疫ワクチン接種の約１〜１２週間後に、免疫応答の追加免疫に使用される。追加免疫組成物は、一般に、初回免疫組成物投与の数週間後または数ヶ月後に投与され、例えば、初回免疫組成物投与の約１週間後、または約２週間後、または約３週間後、または約４週間後、または約６週間後、または約８週間後、または約１２週間後、または約１６週間後、または約２０週間後、または約２４週間後、または約２８週間後、または約３２週間後、または約１〜２年後に投与される。

本発明の好ましい実施形態では、本明細書に開示のアデノウイルスベクターは、ｒＡｄ２６ベクターまたはｒＡｄ３５ベクターを含む。１つの例示の実施形態では、ｒＡｄ２６ベクターもしくはｒＡｄ３５ベクターが免疫応答の初回免疫に使用され、ＭＶＡベクターが免疫応答の追加免疫に使用されるか、その逆でも同様に使用される。

この方法による、より好ましい実施形態では、初回免疫にｒＡｄ２６ベクターが使用された後、ＭＶＡベクターで追加免疫が実施される。好ましくは、追加免疫組成物は、初回免疫の１〜１２週間後に投与され、より好ましくは、初回免疫の１、２、４、または８週間後に投与される。好ましい実施形態では、追加免疫組成物は、初回免疫の８週間後に投与される。別の好ましい実施形態では、追加免疫組成物は、初回免疫の１週間後に投与される。別の好ましい実施形態では、追加免疫組成物は、初回免疫の２週間後に投与される。別の好ましい実施形態では、追加免疫組成物は、初回免疫の４週間後に投与される。

この方法による、より好ましい実施形態では、初回免疫にＭＶＡベクターが使用された後、ｒＡｄ２６ベクターで追加免疫が実施される。好ましくは、追加免疫組成物は、初回免疫の１〜１２週間後に投与され、より好ましくは、初回免疫の１、２、４、または８週間後に投与される。好ましい実施形態では、追加免疫組成物は、初回免疫の８週間後に投与される。別の好ましい実施形態では、追加免疫組成物は、初回免疫の１週間後に投与される。別の好ましい実施形態では、追加免疫組成物は、初回免疫の２週間後に投与される。別の好ましい実施形態では、追加免疫組成物は、初回免疫の４週間後に投与される。

本発明は、好ましくは、異種ベクターを組み合わせた、免疫応答の初回免疫及び追加免疫による、複数の亜型のフィロウイルスに対する免疫応答の誘導方法にも関する。

本発明の別の態様によれば、対象における、複数の亜型のフィロウイルスに対する免疫応答の誘導方法は、
ａ．複数の亜型のフィロウイルスの糖タンパク質または実質的に類似した糖タンパク質をコードする複数の核酸を含む免疫学的に有効な量の複数のｒＡｄ２６ベクターまたはｒＡｄ３５ベクターの、対象に対する投与と、
ｂ．糖タンパク質または実質的に類似した糖タンパク質をコードする複数の核酸を含む免疫学的に有効な量の複数のＭＶＡベクターの、対象に対する投与と、
を含み、
段階（ａ）及び段階（ｂ）は、いずれの順序でも実施される。

記載の方法の１つまたは複数の実施形態では、免疫応答の初回免疫に複数のｒＡｄ２６ベクターもしくはｒＡｄ３５ベクターが使用され、免疫応答の追加免疫に複数のＭＶＡベクターが使用されるか、その逆でも同様に使用される。

本明細書に記載の方法による好ましい実施形態では、初回免疫に複数のｒＡｄ２６ベクターが使用された後、複数のＭＶＡベクターで追加免疫が実施される。好ましくは、追加免疫接種は、初回免疫の１〜１２週間後に実施され、より好ましくは、初回免疫の１、２、４、または８週間後に実施される。

それぞれの初回免疫組成物及び追加免疫組成物における抗原（どれほど多くの追加免疫組成物を用いるとしても）は同一である必要はないが、抗原決定基を共有するか、またはお互いに実質的に類似しているべきである。

ベクターを含む免疫原性組成物の投与は、典型的には、筋肉内または皮下である。しかしながら、静脈内、経皮、皮内、または経鼻などの他の投与様式も想定され得る。免疫原性組成物の筋肉内投与は、アデノウイルスベクターの懸濁液を注射する針を使用することによって達成してよい。代替手段は、組成物を投与する無針注射機器を使用（例えば、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（商標）を使用）するか、またはワクチンを含む凍結乾燥粉末を使用することである。

静脈内注射、経皮注射、もしくは皮下注射、または苦痛部位への注射向けには、ベクターは、発熱性物質を含まず、適したｐＨ、等張性、及び安定性を有する、非経口的に許容可能な水溶性溶液の形態をとることになる。当業者であれば、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張性媒体を使用して、適した溶液を調製することが容易に可能である。保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び／または他の添加剤を必要に応じて含めてよい。徐放製剤を用いてもよい。

典型的には、投与は、感染または症状発症の前に、フィロウイルス抗原に対する免疫応答を生じさせるための予防目的を有することになる。本発明に従って治療または予防され得る疾患または障害には、免疫応答が予防的役割または治療的役割を担い得るものが含まれる。他の実施形態では、アデノウイルスベクター及びＭＶＡベクターは、曝露後の予防を目的として投与され得る。

アデノウイルスベクターを含む免疫原性組成物は、対象に対して投与され、対象において抗フィロウイルス免疫応答を生じさせる。検出可能な免疫応答の誘導に十分な組成物量が、「免疫学的に有効な用量」であると定義される。後述のように、本発明の免疫原性組成物は、液性免疫応答ならびに細胞媒介性免疫応答を誘導する。典型的な実施例では、免疫応答は防御免疫応答である。

実際の投与量、ならびに投与の速度及び時間経過は、治療されているものの性質及び重症度に依存することになる。例えば、投与量等に関する決定といった、治療の処方は、一般医及び他の医師、または獣医学関連では獣医の責任の範囲内であり、典型的には、治療されることになる障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、及び医師に知られる他の因子を考慮するものである。上述の手法及びプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編 １９８０において見つけることができる。

アデノウイルスベクター及びＭＶＡベクターを生産し、任意選択で、そのような粒子を組成物へと製剤化した後、ベクターは、個体、具体的には、ヒトまたは他の霊長類に対して投与されてよい。投与は、ヒト、または他の動物に対するものであってよく、他の動物は、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、雌ウシ、ロバ、サル、イヌ、またはネコである。非ヒト哺乳類に対する送達は、治療目的には必要ないが、実験関連における使用を目的としてよく、例えば、アデノウイルスベクターまたはＭＶＡベクターに対する免疫応答機構の研究において使用してよい。

１つの例示のレジメンでは、アデノウイルスは、約１０^４〜１０^１２個ウイルス粒子／ｍｌの濃度を有する、約１００μｌ〜約１０ｍｌの容積で投与（例えば、筋肉内に）される。好ましくは、アデノウイルスベクターは、０．２５〜１．０ｍｌの容積で投与される。より好ましくは、アデノウイルスベクターは、０．５ｍｌの容積で投与される。

典型的には、アデノウイルスは、ヒト対象に対して、１回の投与の間に、約１０^９〜約１０^１２個のウイルス粒子（ｖｐ）量で投与され、より典型的には、約１０^１０〜約１０^１２個のｖｐ量で投与される。好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、約５ｘ１０^１０個のｖｐ量で投与される。別の好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、約０．８ｘ１０^１０個のｖｐ量で投与される。別の好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、約２ｘ１０^１０個のｖｐ量で投与される。別の好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、約４ｘ１０^１０個のｖｐ量で投与される。ある特定の実施形態では、アデノウイルスは、３価組成物として製剤化され、それぞれが異なる挿入断片を有する３つのアデノウイルスが共に混合される。３価組成物では、異なるアデノウイルスのそれぞれが、好ましくは、約４ｘ１０^１０個のｖｐ量で存在する。当該３価組成物では、用量当たりのアデノウイルス粒子総数は、約１．２ｘ１０^１１個のｖｐに達する。別の好ましい実施形態では、３価組成物における異なるアデノウイルスはそれぞれ、約１ｘ１０^１１個のｖｐ量で存在する。当該３価組成物では、用量当たりのアデノウイルス粒子総数となれば、約３ｘ１０^１１個のｖｐに達する。初回ワクチン接種後に上述のように追加免疫が実施される。

別の例示のレジメンでは、ＭＶＡベクターは、約１ｘ１０^７ＴＣＩＤ_５０〜１ｘ１０^９ＴＣＩＤ_５０（５０％組織培養感染用量）の用量または約１ｘ１０^７Ｉｎｆ．Ｕ．〜１ｘ１０^９Ｉｎｆ．Ｕ．（感染単位）の用量を含む、約１００μｌ〜約１０ｍｌの容積を有する生理食塩溶液で投与（例えば、筋肉内に）される。好ましくは、ＭＶＡベクターは、０．２５〜１．０ｍｌの容積で投与される。より好ましくは、ＭＶＡベクターは、０．５ｍｌの容積で投与される。

典型的には、ＭＶＡベクターは、ヒト対象に対して、１回の投与の間に、約１ｘ１０^７ＴＣＩＤ_５０〜１ｘ１０^９ＴＣＩＤ_５０（またはＩｎｆ．Ｕ．）の用量で投与される。好ましい実施形態では、ＭＶＡベクターは、約５ｘ１０^７ＴＣＩＤ_５０〜５ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０（またはＩｎｆ．Ｕ．）の用量で投与される。より好ましい実施形態では、ＭＶＡベクターは、約５ｘ１０^７ＴＣＩＤ_５０（またはＩｎｆ．Ｕ．）の量で投与される。より好ましい実施形態では、ＭＶＡベクターは、約１ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０（またはＩｎｆ．Ｕ．）の量で投与される。別の好ましい実施形態では、ＭＶＡベクターは、約１．９ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０（またはＩｎｆ．Ｕ）の量で投与される。さらに別の好ましい実施形態では、ＭＶＡベクターは、約４．４ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０（またはＩｎｆ．Ｕ．）の量で投与される。より好ましい実施形態では、ＭＶＡベクターは、約５ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０（またはＩｎｆ．Ｕ．）の量で投与される。

必要であれば、組成物は、キット、パック、またはディスペンサーにおいて存在してよく、これらは、活性成分を含む１つまたは複数の単位投与量形態を含んでよい。キットは、例えば、ブリスターパックなどの金属箔またはプラスチック箔を含んでよい。キット、パック、またはディスペンサーには、投与の指示書が付属してよい。

本発明の組成物は、治療されることになる状態に応じて、単独、または他の治療と組み合わせて、同時投与または逐次投与のいずれかで投与されてよい。

下記の実施例は、例示のために提供されるが、請求発明を限定するものではない。
実施例１
動物試験は、開発の継続進展に向けて、複数［例えば、マールブルグ、エボラ（アカ（ａｋａ）ザイール）、及びスーダン］のフィロウイルスに対して、≧８０の効力を有する複数のフィロウイルスワクチンの同定を目標として実施した。試験では、２つまたは３つのワクチン接種を実施することによる、ワクチン接種スケジュールの延長と、異種（同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）とは対照的）ワクチンの組み合わせを使用することによって、標的フィロウイルスに対してその後に生じるＮＨＰの免疫応答に与える影響と、を試験した。ワクチン接種したＮＨＰにエボラウイルスであるキクウィトを負荷することで、適用したワクチン接種の効力を試験した。

動物に対する処理
こうした試験は、動物福祉法規制の最終規則（Ｆｉｎａｌ Ｒｕｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）（９ ＣＦＲ パート１、２、及び３）の適用可能な節のすべて、ならびにＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ−Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．第８版（ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅ）に準拠した。

全部で１６匹のカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））（ＮＨＰ）（雄１２匹及び雌４匹）であり、それぞれ４〜５歳、約４〜８ｋｇのモーリシャス起源であるカニクイザルをＰｒｉｍＧｅｎ（Ｈｉｎｅｓ，ＩＬ）から購入した。ワクチン接種前に、動物がレストンウイルス（ＲＥＳＴＶ）に対して実験的にナイーブであることをＥＬＩＳＡによって確認した。結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、サルＴ細胞白血病ウイルス１型（ＳＴＬＶ−１）、マカクヘルペスウイルス１型（ヘルペスＢウイルス）、ならびにサルレトロウイルス（ＳＲＶ１及びＳＲＶ２）に対して以前に曝露されたことのある動物は除外し、サルモネラ及び赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）による活動性感染を試験すると共に、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対して陰性であることを確認した。

フィロウイルスは、危険群４（高度封じ込め）の病原体であり、それ故に、ザイールエボラウイルス、スーダンエボラウイルス、またはマールブルグウイルスが関与する処理はすべて、ＣＤＣが認可するバイオセーフティーレベル（ＢＳＬ）−４／動物バイオセーフティーレベル（ＡＢＳＬ−４）の封じ込め施設において実施した。

ワクチン材料
ｒＡｄベクターは、Ｃｒｕｃｅｌｌ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂ．Ｖによって製造されたものである。当該ｒＡｄベクターは、Ｅ１位置にフィロウイルス糖タンパク質（ＧＰ）遺伝子の挿入を含むＥ１／Ｅ３欠失複製欠損組換えアデノウイルスの２６型または３５型である精製ワクチンベクター（それぞれＡｄ２６及びＡｄ３５）である。こうしたベクターのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞における救出、プラーク精製、スケールアップを実施してから、２段階のＣｓＣｌによるバンド形成手順によって精製した後、ＴＲＩＳに基づく製剤緩衝液において製剤化した後、−６５℃未満で保管した。こうしたベクターのインビボ向けの使用を開始するには、バイオバーデン試験、エンドトキシンレベルの低さ（＜５ＥＵ／ｍｌ）、ならびに導入遺伝子の発現及び完全性の確認が伴う。

具体的には、ｒＡｄベクターは、ＥＢＯＶ ＭａｙｉｎｇａのＧＰ（配列番号１）、ＳＵＤＶグルのＧＰ（配列番号２）、及びＭＡＲＶアンゴラのＧＰ（配列番号３）を発現するものを使用した。ｒＡｄベクターは、それぞれが１つの単一抗原タンパク質（ＧＰ）を発現するものを使用した。

ＭＶＡベクターは、Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃによって製造されたものである。具体的には、４つの異なる抗原タンパク質を発現するＭＶＡ−多価ベクター（ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ）を使用した。当該４つの異なる抗原タンパク質は、ＥＢＯＶ ＭａｙｉｎｇａのＧＰ（配列番号１）、ＳＵＤＶグルのＧＰ（配列番号２）、ＭＡＲＶ ムソーク（Ｍｕｓｏｋｅ）のＧＰ（配列番号４）、及びタイフォレストウイルス（ＴＡＦＶ）のＮＰ（配列番号５）である。

ワクチン材料は、温度制御された冷凍庫において−８０℃で保管した。

ワクチン接種及び実験設計
試験の群化及び実験設計については、図１及び図２を参照のこと。

２つの異なるワクチンプラットホームを使用し、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））（ＮＨＰ）に対して、群当たり２匹の動物としてワクチンを接種し、これに、ナイーブ（空ベクター）負荷した２匹の対照からなる対照群を加えた。図１に示す群の動物には、組換えベクターを最初にワクチン接種した。カニクイザルをそれぞれ麻酔し、左後ろ大腿部へとワクチンを筋肉内（ＩＭ）注射した。４〜８週間の間隔を空けて、初回免疫用量及び追加免疫用量を与えた（図１）。それぞれのアデノウイルス用量は、左後ろ大腿部への単回筋肉内（ＩＭ）注射からなるものである。ＭＶＡベクターは、皮下に投与した。

２８日目、５６日目、及び６３日目に、ＥＤＴＡまたはヘパリンを含めた全血を室温で一晩かけてＴｅｘａｓ Ｂｉｏｍｅｄに配送した。さらに、７７日目に、動物をＴｅｘａｓ Ｂｉｏｍｅｄに収容しながら、全血を採取し、ヘパリンまたはＥＤＴＡを採取した。こうした時点のすべてで、ＥＤＴＡを含めた全血は、Ｔｅｘａｓ Ｂｉｏｍｅｄにおいて、ＰＢＭＣ及び血漿を対象として処理されることになる。

ＰＢＭＣは、エボラザイールのペプチドプール１及びペプチドプール２、スーダングルのペプチドプール１及びペプチドプール２、エボラウイルスのコンセンサスペプチドプール、マールブルグアンゴラのペプチドプール１及びペプチドプール２、ならびにマールブルグウイルスのコンセンサスペプチドプールを使用するＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて使用し、このアッセイには、ＤＭＳＯのみの負の対照及び抗ＣＤ３刺激による正の対照を共に加えた。刺激はすべて、２連で実施し、ＮＨＰ当たり、全部で２０ウェルを使用した。

さらに、抗凝血剤を含めない全血は、血清を対象として、０日目、２８日目、５６日目、及び６８日目にはＢｉｏｑｕａｌで処理し、７７日目にはＴｅｘａｓ Ｂｉｏｍｅｄで処理した。Ｂｉｏｑｕａｌで採取した一定分量の血清は、６８日目にＴｅｘａｓ Ｂｉｏｍｅｄに凍結配送されることになる。血清はそれぞれ、ＺＥＢＯＶのＧＰに特異的なＥＬＩＳＡでアッセイした。さらに、０日目、５６日目、及び７７日目の血清は、ＳＥＢＯＶのＧＰに特異的なＥＬＩＳＡ、及びＭＡＲＶＡのＧＰに特異的なＥＬＩＳＡ（２つの異なるアッセイ）でアッセイした。

動物の負荷のためのフィロウイルス接種
図２に示すように、追加免疫ワクチン接種の約４週間後に、動物にＥＢＯＶを負荷した。具体的には、Ｔｅｘａｓ Ｂｉｏｍｅｄから入手したＥＢＯＶキクウィト−９５１０６２１を動物の負荷に使用した。ＥＢＯＶキクウィト−９５１０６２１を２回継代培養した細胞（Ｐ２）は、２０１２年にＴｏｍ Ｋｓｉａｚｅｋ博士から（ＵＴＭＢのＨｅａｌｔｈ Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙにあるＮＩＡＩＤのＷＲＣＥＶＡにて）入手し、Ｔｅｘａｓ Ｂｉｏｍｅｄにて、ベロ（Ｖｅｒｏ）Ｅ６細胞において３回目の増殖を実施し、その力価は、２．１ｘ１０^５ＰＦＵ／ｍｌであった。ＥＢＯＶキクウィト−９５１０６２１のロット番号は、２０１２０９９１７１である。

収集時の力価が２．１ｘ１０^５ＰＦＵ／ｍｌであるものを試験に使用した。

負荷用ストックは、ディープシークエンシングによって、ＧｅｎｂａｎｋのＰ２コンセンサス配列とのＳＮＰ差異が１つのみである野生型のＥＢＯＶキクウィト９５１０６２１であることを確認した。負荷用ストックは、１０％ＦＢＳ含有培地（ＭＥＭ）を含む５００±５０μｌ分量として、液体窒素蒸気相中で保管した。１００ＰＦＵの負荷向けには、フィロウイルス負荷病原体を希釈することで、リン酸緩衝生理食塩水中の標的用量を２００ＰＦＵ／ｍｌとした。簡潔に記載すると、ＰＢＳ中で１：１０の希釈を連続的に３回実施してストックウイルスを希釈することで、２００ＰＦＵ／ｍｌの負荷材料濃度を達成した。それぞれの動物に対して、全部で０．５ｍｌの負荷材料を与えた。

サルは、ウイルスを注射する前に、Ｔｅｌａｚｏｌの筋肉内注射（２〜６ｍｇ／ｋｇ、必要であれば、追加麻酔に５〜８ｍｇ／ｋｇのケタミンを筋肉内（ＩＭ）へ）を介して鎮静させた。試験の０日目に、血液を採取した後、それぞれのサルの右腕三角筋に、筋肉内注射を介して、０．５ｍｌ容積で、標的用量１００ＰＦＵのＥＢＯＶを負荷した。負荷部位を記録した。

ウイルスを投与した後、それぞれのサルをそのホームケージに戻し、麻酔から回復するまで観察した（うつ伏せ／直立姿勢の維持能）。この試験の評価項目は、生存／非生存とした。非生存は、動物が末期疾病を有するか、または瀕死であることと定義する。動物の健康は、毎日の臨床観察スコアシートで評価した。

抗ＥＢＯＶ ＧＰ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
フィロウイルスに特異的な液性応答は、表１に記載の時点で、改変酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって、Ｓｕｌｉｖａｎら（２００６）（Ｉｍｍｕｎｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｂｏｌａ ｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ ｌｏｗ−ｄｏｓｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＧＰｓ．ＰＬｏＳ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３，ｅ１７７）において以前に説明されたように決定した。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。簡潔に記載すると、１０μｇ／ｍｌのスノードロップ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ Ｎｉｖａｌｉｓ）レクチンで、ＥＬＩＳＡプレートを一晩被覆した。その後、ブロッキングの後、エボラ株に特異的なＧＰの上清またはマールブルグ株に特異的なＧＰの上清のいずれかでプレートを被覆した。こうした上清は、膜貫通ドメイン及び細胞質側末端を欠失したフィロウイルス糖タンパク質をコードする発現プラスミドをＨｅｋ２９３Ｔに一過性に遺伝子導入することによって生成させたものである。サルの血清試料は、１：５０から始まる４倍希釈系列で試験した。結合したＩｇＧは、４９２ｎｍでの比色分析によって検出した。相対血清力価は、フィロウイルス株の糖タンパク質に特異的な参照血清に対して計算した。Ｅｌｉｓａアッセイの結果を図４〜６に示す。

ＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
フィロウイルスに特異的な細胞性免疫応答は、表１に記載の時点で、インターフェロンガンマの酵素結合免疫スポット（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）アッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）によって、Ｏｐｈｏｒｓｔら ２００７（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄ３５−ｂａｓｅｄ ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２５，６５０１−６５１０）において以前に説明されたように決定した。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。エボラ株またはマールブルグ株の糖タンパク質のそれぞれを対象とする刺激に使用したペプチドプールは、１１のアミノ酸が重複する１５アミノ酸長からなるものである。プール中のペプチド数が多すぎることによる望ましくない作用を最小化するために、糖タンパク質ペプチドプールをそれぞれ２つに分割し、一方はＮ末端の半分、もう一方はＣ末端の半分とした。

３つのエボラウイルス（ザイール、スーダン、及びタイフォレスト）内または２つのマールブルグウイルス（マールブルグウイルス及びラビン（Ｒａｖｎ）ウイルス）内で、アミノ酸が９を超えて連続して重複するペプチドは、コンセンサスプールに組み込んだ。ペプチドプール及び単一ペプチドは、それぞれの単一ペプチドの最終濃度を１μｇ／ｍｌとして使用した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を図７に示す。

図３〜図７に要約した結果が示すように、本明細書に記載の動物試験によって、霊長類におけるフィロウイルス感染の予防を目的とした、初回免疫−追加免疫の組み合わせにおいて、ｒＡｄベクター及びＭＶＡベクターの有用性が示された。具体的には、１つもしくは複数の型のフィロウイルスのＧＰを発現する１つもしくは複数のｒＡｄ２６ベクター、または複数のフィロウイルス抗原を発現するＭＶＡベクターを投与することで、結果的に、１つまたは複数の型のフィロウイルスに対する液性応答が効率的に初回免疫された。異種ベクターを使用して８週目に追加免疫化した後、すべてのワクチンレジメンが、１つまたは複数の型のフィロウイルスに対する、類似した液性免疫応答または細胞性免疫応答を誘導すると共に、高度に病原性であるエボラザイールの負荷から１００％保護した。

実施例２
第２のＮＨＰ試験を実施することで、間隔を０〜４週及び０〜８週とした、２つの初回免疫−追加免疫レジメンの免疫原性及び保護効力を確認した。一方は、初回免疫として１価のＡｄ２６．ＺＥＢＯＶワクチン、及び追加免疫としてＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏを含むものであり、もう一方は、初回免疫としてＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ、及び追加免疫としてＡｄ２６．ＺＥＢＯＶを含むものである。免疫化はすべて、筋肉内に実施した。０〜８週のレジメンについては、Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶ（５ｘ１０^１０個のｖｐ）を初回免疫として使用すると共に、１ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ（４匹のＮＨＰ）及び５ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ（４匹のＮＨＰ）を追加免疫として組み合わせることで、このレジメンにおける標準用量のＭＶＡ及び高用量のＭＶＡの影響を評価した。４匹のＮＨＰ群を２つ追加し、１ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ及び５ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏでそれぞれ初回免疫した後、両方の場合において、４週間後にＡｄ２６．ＺＥＢＯＶ（５ｘ１０^１０個のｖｐ）で追加免疫を実施することで、４週のレジメンにおける、初回免疫としてのＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏの用量の影響を試験した。追加で、２匹のＮＨＰをＡｄ２６．ＺＥＢＯＶ（５ｘ１０^１０個のｖｐ）で初回免疫した後、１ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏを使用した。最後に、試験の負の免疫化対照として、空のＡｄ２６ベクター（フィロウイルス抗原を全く発現しないものであり、５ｘ１０^１０個のｖｐを筋肉内（ＩＭ）へ）、及びＴＢＳで２匹のＮＨＰを免疫化した。最後の免疫化の４週間後に、すべての動物に対して、１００ｐｆｕのＥＢＯＶキクウィト１９９５野生型Ｐ３負荷ウイルスを負荷した。この試験の群化を２に要約する。

免疫原性
ＮＨＰにおける免疫応答は、フィロウイルスＧＰ結合抗体及びフィロウイルス中和抗体（ＥＬＩＳＡ）ならびにサイトカイン産生Ｔ細胞（ＥＬＩＳｐｏｔ）に関して特徴づける。

ＥＬＩＳＡ：
ＥＢＯＶ ＭａｙｉｎｇａのＧＰに反応性である抗体は、ＧＰ特異的ＥＬＩＳＡによってすべての時点を対象に分析した（図２０を参照のこと）。

抗ＥＢＯＶ ＧＰ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡは、実験１に記載したように実施した。対照のワクチン接種動物では、ＥＬＩＳＡの力価は観測されなかった。すべての動物において、ワクチンレジメンは免疫原性であった。群Ｂにおいて最も高い力価が観測され、群Ｂは、Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶ及び高用量のＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏを８週の間隔を空けて与えた群である。

保護効力
Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶ／ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏを初回免疫／追加免疫に使用した８週レジメンの両方が、ＥＢＯＶ負荷後の完全な生存をもたらし、これは、ＭＶＡ ＢＮ Ｆｉｌｏの用量（１×１０^８ＴＣＩＤ_５０または５×１０^８ＴＣＩＤ_５０）とは無関係であった。さらに、Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶ／ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏを使用した４週レジメンは、２匹のＮＨＰ中２匹を保護した。ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ／Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶを使用した４週レジメンの両方が、４匹のＮＨＰ中２匹を保護した。

実施例３
１ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０用量のＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ、及び５ｘ１０^１０個のｖｐ用量のＡｄ２６．ＺＥＢＯＶを使用して、レジメンの安全性、忍容性、及び免疫原性の評価を目的として、ヒトにおける臨床試験を実施する。実施した試験は２つパートからなるものである。

主試験は、実験的なエボラ候補ワクチンを以前に投与されたことが全くなく、エボラウイルスへの曝露歴またはエボラ疾患の診断歴を有さない７２人の健康な成人対象において実施中の無作為化プラセボ対照観察者盲検試験である。この試験では、４つのレジメンを試験する。すなわち、２８日または５６日の間隔で、初回免疫としてＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ、及び追加免疫としてＡｄ２６．ＺＥＢＯＶを使用する２つのレジメンと、２８日または５６日の間隔で、初回免疫としてＡｄ２６．ＺＥＢＯＶ、及び追加免疫としてＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏを使用する２つのレジメンと、である。

下位試験は、５ｘ１０^１０個のｖｐ用量のＡｄ２６．ＺＥＢＯＶを初回免疫として使用し、１４日後に１ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０用量のＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏを追加免疫として使用するレジメンの安全性、忍容性、及び免疫原性を評価する非盲検非対照非無作為化治療群からなり、１５人の健康な成人対象において実施するものである。

試験は、対象がベースライン（１日目）にワクチン接種された後、１５日目、２９日目、または５７日目に追加免疫を実施するワクチン接種期間と、すべての対象が追加免疫の２１日後（３６日目、５０日目、もしくは７８日目）の訪問を済ませるか、またはそれより早期に中断するまでの追加免疫後の経過観察と、からなるものである。

主試験における対象は、それぞれが１８人の健康な対象である４つの異なる群へと登録される。概して記載すると、対象は、群の中で５：１の比で無作為化され、筋肉内（ＩＭ）注射（０．５ｍｌ）を介して、下記のように、活性ワクチンまたはプラセボ（０．９％の生理食塩水）を投与される。
・１日目のＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ（１ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０）の後、２９日目（群１）もしくは５７日目（群２）にＡｄ２６．ＺＥＢＯＶ（５ｘ１０^１０個のｖｐ）を追加免疫、または
・１日目のＡｄ２６．ＺＥＢＯＶ（５ｘ１０^１０個のｖｐ）の後、２９日目（群３）もしくは５７日目（群４）にＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ（１ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０）を追加免疫。
下位試験における１５人の対象は、筋肉内（ＩＭ）注射（０．５ｍｌ）を介して、下記のように、活性ワクチンを投与される。
・１日目のＡｄ２６．ＺＥＢＯＶ（５ｘ１０^１０個のｖｐ）の後、１５日目（群５）に、ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ（１ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０）を追加免疫。
例示の試験ワクチン接種スケジュールを表３に要約する。

安全性は、自発的な局所有害事象及び全身有害事象、非自発的な有害事象及び重篤有害事象の収集、ならびに身体診察によって評価する。さらに、標準的な化学パラメーター、血液学的パラメーター（凝血パラメーターを含む）、及び尿検査パラメーターを複数時点で評価する。

免疫原性は、表４及び表５に要約した免疫アッセイを使用して評価する。探索アッセイのパッケージには、限定はされないが、記載のアッセイが含まれてよい。

臨床試験は、現在進行中である。初期の結果をいくつか以下に記載する。

安全性評価
安全性は、自発的な局所有害事象及び全身有害事象、非自発的な有害事象及び重篤有害事象の収集、ならびに身体診察によって評価した。さらに、標準的な化学パラメーター、血液学的パラメーター（凝血パラメーターを含む）、及び尿検査パラメーターを複数時点で評価した。

ヒトにおいて最初であるこの試験に由来する安全性データによって、ワクチン接種で通常予想される一過性の反応は有するが、この段階で両方のワクチンの忍容性は良好であると思われることが示された。ワクチンレジメンと関連する顕著な有害事象は生じなかった。事象の大半は緩和であり、ワクチン接種の１〜２日後に生じ、平均で１〜２日間持続するものであった。発熱症例が観測されることはほとんどなかった。

免疫応答の評価
免疫原性は、追加免疫の２１日後に至るまで評価し、この評価では、ＥＢＯＶのＧＰに対する抗体結合の分析にＥＬＩＳＡアッセイ、ＥＢＯＶのＧＰに特異的なＴ細胞応答の分析にＥＬＩＳｐｏｔアッセイ、ならびにＥＢＯＶのＧＰに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答の検出にＩＣＳアッセイを使用した。試験ワクチンによって誘導される液性免疫応答及び細胞性免疫応答の分析試料は、群１及び群３では、１日目、８日目、２９日目、３６日目、及び５０日目に採取し、群２及び群４では、１日目、８日目、２９日目、５７日目、６４日目、及び７８日目に採取した。

液性免疫応答の評価
試験ワクチンによって誘導される結合抗体応答は、抗ＥＢＯＶ ＧＰ ＥＬＩＳＡアッセイによって評価した（図８）。重要なことに、ワクチンレジメンを受けた対象のすべてが、追加免疫の２１日後に抗体陽転を示した。免疫化された対照のすべてにおいて、強固な免疫原性の応答が観測された。

ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏで初回免疫した後に観測された、ＥＢＯＶのＧＰに特異的な免疫応答のレベルは、７〜４０％の対象においては低いものにすぎなかった一方で、初回免疫の２８日後または５６日後にＡｄ２６．ＺＥＢＯＶを投与して追加免疫した後に観測された抗原特異的免疫応答は強いものであった。驚くべきことに、この応答の大きさは、初回免疫−追加免疫の間隔が同一である逆転ワクチンレジメン（群３及び群４、Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶで初回免疫した後、それぞれ２８日後または５６日後にＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏで追加免疫）によって誘導されるものと比較して、追加免疫の２１日後に増強されるものである［９５％信頼区間を有する幾何平均力価は、群１及び群３では、それぞれ１０５７３（６４５２、１７３２７）ＥＵ／ｍｌ及び４２７４（２３５０、７７７５）ＥＵ／ｍｌであり、群２及び群４では、それぞれ１８７２９（１２２００、２８７５１）ＥＵ／ｍｌ及び７５５３（５１１、１１１５）ＥＵ／ｍｌであった］。

非ヒト霊長類（ＮＨＰ）では、ＭＶＡによる初回免疫をＡｄ２６で追加免疫することで、ＥＢＯＶのＧＰに特異的な免疫応答がもたらされ、この免疫応答は、初回免疫−追加免疫の間隔が同一である逆転ワクチンレジメン（Ａｄ／ＭＶＡ）によって誘導されるものと大きさが同等（図４参照）であるか、または大きさが劣る（図２０）ものであったことに留意されなくてはならない。したがって、ＮＨＰにおいて、１つの特異的な初回免疫−追加免疫レジメンで観測される免疫応答は、ヒトにおいて、同一の初回免疫−追加免疫レジメン後に観測される免疫応答を予知するものではなかった。

細胞性免疫応答の評価
ＥＢＯＶのＧＰに特異的な細胞性免疫応答は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳｐｏｔ及びＩＣＳによって測定した。細胞性免疫応答を評価するために、保管ＰＢＭＣ（末梢血単核球）を解凍し、２つのプール（プール１及びプール２）において構成されるペプチドで刺激した。プール毎に刺激したＴ細胞応答の合計を図９に示す。

ＥＬＩＳｐｏｔ分析（図９）によって、Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶで初回免疫した後の２９日目には、５０〜６０％の対象において（群３及び群４では、ＩＦＮ−γ応答の中央値は、１００万個のＰＢＭＣ当たりそれぞれ１０３及び５８スポット形成単位（ＳＦＵ／１０^６））、Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶで初回免疫した後の５７日目には、８６％の対象において（群４では、ＩＦＮ−γ応答の中央値は、１００万個のＰＢＭＣ当たり２８３スポット形成単位（ＳＦＵ／１０^６））、ＩＦＮ−γ応答を容易に検出することが可能であった。こうした応答は、２９日目または５７日目に、ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏで免疫化することによって、さらに追加免疫され（群３では、８７％がレスポンダー、ＩＦＮ−γ応答の中央値は、４６３ＳＦＵ／１０^６個ＰＢＭＣであり、群４では、８６％がレスポンダー、６４８ＳＦＵ／１０^６個ＰＢＭＣであった）、追加免疫後の２１日目に至るまでそのレベルが維持された（群３では、７９％がレスポンダー、ＩＦＮ−γ応答の中央値は、３９０ＳＦＵ／１０^６個ＰＢＭＣであり、群４では、１００％がレスポンダー、４６４ＳＦＵ／１０^６個ＰＢＭＣであった）。

特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞応答及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答をＩＣＳによって測定した細胞アッセイの結果を図１０〜１５に示す。

予想したように、プラセボで免疫化した個人では、ＥＢＯＶのＧＰに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答は観測されなかった（図１０及び図１３）。ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏで初回免疫した後の２９日目または５７日目には、ＣＤ８＋サイトカイン応答は観測されなかった（群１及び群２）。しかしながら、Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶで追加免疫した７日後には、５３％の対象において、ワクチンが誘導したＣＤ８＋Ｔ細胞応答が観測された（総サイトカイン応答の中央値は、Ａｄ２６による追加免疫が２９日目または５７日目に実施されると、それぞれ０．０８％及び０．０７％であった。図１０）。この応答は、追加免疫後の２１日目に維持されていた（総サイトカイン応答の中央値は、Ａｄ２６による追加免疫が２９日目または５７日目に実施されると、それぞれ０．１％及び０．０６％であった。図１０）。比較として、Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶで初回免疫を受けた対象（群３及び群４）の５７％が、２９日目にＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示し（総サイトカイン応答の中央値は、それぞれ０．１２％及び０．０５％）、Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶにより初回免疫した後の５７日目に、対象（群４）の８６％が、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示した（総サイトカイン応答の中央値は、０．１９％）。この応答は、２９日目にＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏで追加免疫した後にさらに増進し、追加免疫の７日後及び２１日後に、それぞれ６７％及び７３％の対象が応答を示した（応答中央値は、両日共に０．２７％）。

驚くべきことに、観測されたレスポンダー割合は、群３（Ａｄ２６−ＭＶＡによる初回免疫−追加免疫を０−２８日で実施するスケジュール）と比較して、群１（ＭＶＡ−Ａｄ２６による初回免疫−追加免疫を０−２８日で実施するスケジュール）で低い一方で、こうしたレスポンダーにおいて、ＭＶＡ−Ａｄ２６による初回免疫−追加免疫レジメンによって誘導された多機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞（複数のサイトカインを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞）の割合は、Ａｄ２６−ＭＶＡによる初回免疫−追加免疫レジメンによって誘導されたものと比較して、追加免疫後に増強されていた（図１１）。この差異は、初回免疫及び追加免疫が５７日目に実施されると観測されなかった。このスケジュールを使用すると、ＭＶＡ初回免疫Ａｄ２６追加免疫（群２）レジメン、及びＡｄ２６初回免疫ＭＶＡ追加免疫（群４）レジメンの誘導する多機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は両方共、類似して高かった（図１２）。

驚くべきことに、ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏで追加免疫した後、間隔を２８日としてＡｄ２６．ＺＥＢＯＶで追加免疫（群１）すると、追加免疫の７日後をピークとする非常に強固なＣＤ４＋Ｔ細胞応答が誘導された（レスポンダー９３％、総サイトカイン応答の中央値０．３７％、図１３）。ピークでは、このＣＤ４＋Ｔ細胞応答の大きさは、Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶで初回免疫した後、間隔を２８日としてＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏで追加免疫した後の群３において見られたものと比較して増強されていた（レスポンダー６７％、総サイトカイン応答の中央値０．１１％）。追加免疫の２１日後に、両レジメンによって誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答は同等であった。ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ／Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶレジメンの間隔を５６日まで延長すると、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は低下した。Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶ／ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏレジメンが誘導したＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、２８日間隔でやや低く、５６日間隔で同等であった。ワクチンの組み合わせの両方が誘導したＣＤ４＋Ｔ細胞は、優位に多機能性であった（図１４及び図１５）。

５ｘ１０^１０個のｖｐのＡｄ２６．ＺＥＢＯＶで初回免疫した後、１ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏを使用して、１４日後に追加免疫することによる免疫原性を下位試験で評価した結果を以下に要約する。

概して記載すると、初回免疫と追加免疫との間隔を１４日とした、相対的に短いこのレジメンは、免疫原性であることが明らかとなった。ワクチン接種に対する液性免疫応答は、ＥＬＩＳＡによって評価した。期間の長いもので観測されたように、追加免疫の２１日後までに、すべての対象が抗体陽転した（図１６Ａ）。さらに、追加免疫の２１日後に、９２％の対象において、ＥＬＩＳｐｏｔよって細胞性免疫応答が観測された（図１６Ｂ）。この細胞性免疫応答は、ＣＤ４＋（レスポンダー６７％、追加免疫後の２１日目の応答中央値０．０８％）特異的Ｔ細胞、及びＣＤ８＋（レスポンダー６４％、追加免疫後の７日目の応答中央値０．１５％）特異的Ｔ細胞の両方からなるものであった。間隔を２週間として誘導した免疫応答は、初回免疫と追加免疫との間隔を長くして誘導した応答（前節を参照のこと）と比較すると、幾分か低下しているように思われた。

実施例４
無作為化プラセボ対照観察者盲検試験（全部で６人の前哨（ｓｅｎｔｉｎｅｌ）試験の対象へ最初に非盲検でワクチン接種することから始まる）を実施することで、（ａ）初回免疫として単回用量のＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ（１ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０）またはプラセボ（０．９％の生理食塩水）を使用した後、異なる時点（初回免疫の１４日後、２８日後、または５６日後、群１〜３）で、追加免疫として単回用量のＡｄ２６．ＺＥＢＯＶ（５ｘ１０^１０個のｖｐ）またはプラセボを使用する異種性レジメンと、（ｂ）初回免疫として単回用量のＡｄ２６．ＺＥＢＯＶ（５ｘ１０^１０個のｖｐ）またはプラセボを使用した後、初回免疫の２８日後に追加免疫として単回用量のＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ（１ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０）またはプラセボを使用する（群４）異種性レジメンと、の安全性、忍容性、及び免疫原性の評価を実施する。

２つのワクチンの安全性を独立して評価するために、単回用量のＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ（１ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０）もしくはプラセボを２回使用する相同レジメン、または単回用量のＡｄ２６．ＺＥＢＯＶ（５ｘ１０^１０個のｖｐ）もしくはプラセボを２回使用する相同レジメンを、１日及び１５日の短期化した初回免疫−追加免疫スケジュールで実施する群５及び群６を含める。この試験は、年齢が１８〜５０歳（１８歳と５０歳を含む）であり、実験的なエボラ候補ワクチンを以前に投与されたことが全くなく、エボラ疾患への曝露歴またはその診断歴を有さない約９２人の健康な対象を標的として実施する。

試験は、対象がベースラインの訪問（１日目）でワクチン接種された後、１５日目、２９日目、または５７日目に追加免疫を実施するワクチン接種期間と、すべての対象が追加免疫の２１日後の訪問を済ませるか、またはそれより早期に中断するまでの追加免疫後の経過観察と、からなるものである。その際は、試験は非盲検で実施するものとする。

対象は、１８人（群１〜４）または１０人（群５及び群６）の健康な対象をそれぞれ含む６つの異なる群へと登録される。対象は、群１〜４の中で５：１の比で無作為化されて、試験にわたって、活性ワクチンまたはプラセボを投与される。群５及び群６は、非盲検様式で活性ワクチンを投与される３人の対象の前哨コホートからそれぞれ開始した後、６：１の比で無作為化されて活性ワクチンまたはプラセボを投与される７人の対象の盲検コホートが続く。異なる群の試験ワクチン接種スケジュールを表６に要約する。

安全性は、自発的な局所有害事象及び全身有害事象、非自発的な有害事象及び重篤有害事象の収集、ならびに身体診察によって評価する。さらに、標準的な化学パラメーター、血液学的パラメーター（凝血パラメーターを含む）、及び尿検査パラメーターを複数時点で評価する。

免疫原性は、表７及び表８に要約した免疫アッセイを使用して評価する。探索アッセイパッケージには、限定はされないが、記載のアッセイが含まれてよい。

臨床試験は、現在進行中である。初期の結果をいくつか以下に記載する。

液性免疫応答の評価
初期の結果は、いずれか一方のワクチンを初回免疫として使用し、もう一方のワクチンを追加免疫として使用するとき、５ｘ１０^１０個のｖｐのＡｄ２６．ＺＥＢＯＶと、１ｘ１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏと、の組み合わせで生じる免疫原性を確認するものである。

図１７に示すように、ＥＬＩＳＡによって評価すると、追加免疫の２１日後に、すべての対象が抗体陽転した。前述の実験と類似して、ＭＶＡを初回免疫として使用し、２８日後に追加免疫としてＡｄ２６を投与すると（群２、幾何平均濃度６９８７ＥＵ／ｍＬ）、順序を逆転させたワクチン免疫化（群４、幾何平均濃度２９７６ＥＵ／ｍＬ）と比較して、追加免疫の２１日後に観測された免疫応答は増強されていた。

液性免疫応答の強度は、初回免疫と追加免疫の間隔と関連しており、ＭＶＡによる初回免疫とＡｄ２６による追加免疫との間隔を５６日とすると（群３、幾何平均濃度１４０４８ＥＵ／ｍＬ）、短期化スケジュール（群１、１４日の間隔、幾何平均濃度４４１８ＥＵ／ｍＬ、及び群２、２８日の間隔、幾何平均濃度６９８７ＥＵ／ｍＬ）と比較して、観測される抗体濃度は上昇した。

驚くべきことに、初回免疫としてＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏを使用した後、１４日後にＡｄ２６．ＺＥＢＯＶで追加免疫すると、ＥＬＩＳＡによる評価で、強固な液性免疫応答が観測された。追加免疫の２１日後までに、ワクチンレジメンを受けたすべての対象が抗体陽転し、この時点の抗体濃度は、間隔を２８日として、Ａｄ２６による初回免疫と、ＭＶＡによる追加免疫と、を組み合わせて使用したときと比較して、到達レベルが類似または上昇していた（幾何平均力価は、それぞれ４４１８ＥＵ／ｍＬ及び２９７６ＥＵ／ｍＬ）。驚くべきことに、間隔を１４日として、このＭＶＡ／Ａｄ２６の初回免疫と追加免疫との組み合わせによって誘導された抗体濃度は、初回免疫−追加免疫の時間間隔を同一にして逆転させたワクチンレジメンによって誘導された応答（実施例２、図１６Ａを参照のこと、幾何平均濃度９１５ＥＵ／ｍＬ）と比較して、著しく増強されていた。これによって、ＭＶＡによる初回免疫とＡｄ２６による追加免疫との組み合わせによって、強固な免疫応答の誘導が生じ、初回免疫と追加免疫との間隔を短期（１４日）にすると、そのような組み合わせに優位性が生じることが確認された。

細胞性免疫応答の評価
ＥＢＯＶのＧＰに特異的な細胞性免疫応答は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳｐｏｔ及びＩＣＳによって測定した。細胞性免疫応答を評価するために、保管ＰＢＭＣ（末梢血単核球）を解凍し、２つのプール（プール１及びプール２）において構成されるペプチドで刺激した。プール毎に刺激したＴ細胞応答の合計を図１８〜１９に示す。

ＥＬＩＳｐｏｔ分析（図１８）によって、Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶで初回免疫した後にＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏで追加免疫するもの、またはこれを逆転させたワクチンレジメンのどちらを使用してもＩＦＮ−γ応答が誘導されることが確認された。初回免疫と追加免疫との間隔の試験のすべてで、追加免疫後に細胞応答が増進した。Ａｄ２６を初回免疫として使用した後、２８日後にＭＶＡを追加免疫として使用すると、ＩＦＮ−γ応答は最も増強された（群４では、レスポンダーは８７％、追加免疫後の７日目及び２１日目で、ＩＦＮ−γ応答の中央値は、それぞれ６８７ＳＦＵ／１０^６個ＰＢＭＣ及び６００ＳＦＵ／１０^６個ＰＢＭＣ）。驚くべきことに、ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏを初回免疫として使用した後、Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶを追加免疫として使用すると、初回免疫と追加免疫との間隔を短期化して１４日としたとき（群１では、追加免疫後の７日目及び２１日目で、それぞれ、レスポンダーは８７％及び９３％、３９５ＳＦＵ／１０^６個ＰＢＭＣ及び５７７ＳＦＵ／１０^６個ＰＢＭＣであった）、間隔を２８日（群２では、追加免疫後の７日目及び２１日目で、レスポンダーは、それぞれ７３％及び６７％、ＩＦＮ−γ応答の中央値は、それぞれ４２７ＳＦＵ／１０^６個ＰＢＭＣ及び３７５ＳＦＵ／１０^６個ＰＢＭＣであった）または５６日（群３では、追加免疫後の７日目及び２１日目で、レスポンダーは４７％、ＩＦＮ−γ応答の中央値は、１１８ＳＦＵ／１０^６個ＰＢＭＣ及び１５３ＳＦＵ／１０^６個ＰＢＭＣであった）とすることによって誘導される応答と比較して、観測されたＩＦＮ−γ応答は増強されていた。

注目すべきことに、間隔を１４日として、ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏで初回免疫し、Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶで追加免疫することによって誘導された細胞性免疫は、ＥＢＯＶのＧＰに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答とＣＤ４＋Ｔ細胞との両方のバランスが良好であった（ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との両方で７３％がレスポンダーであり、追加免疫後の７日目及び２１日目で、ＣＤ４＋総サイトカイン応答の中央値は、それぞれ０．１５％及び０．１９％であり、追加免疫後の７日目及び２１日目で、ＣＤ８＋総サイトカイン応答の中央値は、それぞれ０．１９％及び０．３４％であった。図１９Ａ及び図１９Ｂ）。このワクチン組み合わせによって誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞は両方共、優位に多機能性であった（図１９Ｃ及び図１９Ｄ）。

以下の表９〜１２は、本明細書に示す臨床試験の要約として示されるものである。実施例３及び実施例４に示す試験は、それぞれ試験１００１及び試験１００２と番号付けされている。

表９は、実施例３及び実施例４に記載した試験の間に、ＥＬＩＳＡアッセイで決定した液性免疫応答の概要である。

データは、ＥＬＩＳＡにおけるｍＬ当たりの幾何平均濃度（ＧＭＣ）として示される。それぞれの時点のレスポンダーの割合は、括弧付きで示される。Ａｄ２６は、Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶでの免疫化を示す。ＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏでの免疫化を示す。初回免疫と追加免疫のスケジュールは、見出し行に示される。０、１４は、初回免疫と追加免疫との間隔が１４日であることを示す。０、２８は、初回免疫と追加免疫との間隔が２８日であることを示す。０、５６は、初回免疫と追加免疫との間隔が５６日であることを示す。^＊は、追加免疫の日であることを示す。ＧＭＣは、幾何平均濃度を示す。試験１００１は、実施例３に記載したものであり、試験１００２は、実施例４に記載したものである。
表１０は、実施例３及び実施例４に記載した試験の間に、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで決定した細胞性免疫応答の概要である。

データは、ＳＦＵ／１０^６個ＰＢＭＣの中央値として示される。それぞれの時点のレスポンダーの割合は、括弧付きで示される。Ａｄ２６は、Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶでの免疫化を示す。ＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏでの免疫化を示す。初回免疫と追加免疫のスケジュールは、見出し行に示される。０、１４は、初回免疫と追加免疫との間隔が１４日であることを示す。０、２８は、初回免疫と追加免疫との間隔が２８日であることを示す。０、５６は、初回免疫と追加免疫との間隔が５６日であることを示す。^＊は、追加免疫の日であることを示す。ＳＦＵは、スポット形成単位を示す。ＰＢＭＣは、末梢血単核球を示す。試験１００１は、実施例３に記載したものであり、試験１００２は、実施例４に記載したものである。試験１００１は、実施例３に記載したものであり、試験１００２は、実施例４に記載したものである。

表１１は、実施例３及び実施例４に記載した試験の間に、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって決定したＣＤ４＋Ｔ細胞応答の概要である。

データは、総ＣＤ４＋サイトカイン応答の％中央値として示される。それぞれの時点のレスポンダーの割合は、括弧付きで示される。Ａｄ２６は、Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶでの免疫化を示す。ＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏでの免疫化を示す。初回免疫と追加免疫のスケジュールは、見出し行に示される。０、１４は、初回免疫と追加免疫との間隔が１４日であることを示す。０、２８は、初回免疫と追加免疫との間隔が２８日であることを示す。０、５６は、初回免疫と追加免疫との間隔が５６日であることを示す。^＊は、追加免疫の日であることを示す。試験１００１は、実施例３に記載したものであり、試験１００２は、実施例４に記載したものである。

表１２は、実施例３及び実施例４に記載した試験の間に、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって決定したＣＤ８＋Ｔ細胞応答の概要である。

データは、総ＣＤ８＋サイトカイン応答の％中央値として示される。それぞれの時点のレスポンダーの割合は、括弧付きで示される。Ａｄ２６は、Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶでの免疫化を示す。ＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏでの免疫化を示す。初回免疫と追加免疫のスケジュールは、見出し行に示される。０、１４は、初回免疫と追加免疫との間隔が１４日であることを示す。０、２８は、初回免疫と追加免疫との間隔が２８日であることを示す。０、５６は、初回免疫と追加免疫との間隔が５６日であることを示す。^＊は、追加免疫の日であることを示す。試験１００１は、実施例３に記載したものであり、試験１００２は、実施例４に記載したものである。

本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示のみが目的であると共に、それらの観点からさまざまな変更形態または変更が当業者には示唆されるであろうし、こうした変更形態または変更は、本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲の中に含まれることになると理解される。
配列一覧
配列番号１
糖タンパク質 エボラウイルスザイール、Ｍａｙｉｎｇａ株（アミノ酸配列）：

配列番号２
糖タンパク質 エボラウイルススーダン、グル（Ｇｕｌｕ）株（アミノ酸配列）：

配列番号３
糖タンパク質 マールブルグウイルスアンゴラ（Ａｎｇｏｌａ）（アミノ酸配列）：

配列番号４
糖タンパク質 マールブルグウイルスムソーク（Ｍｕｓｏｋｅ）（アミノ酸配列）：

配列番号５
核タンパク質 エボラウイルスタイフォレスト（Ｔａi Ｆｏｒｅｓｔ）／コートジボワール（Ｉｖｏｒｙ ｃｏａｓｔ）（アミノ酸配列）：

Claims (34)

1. （ｉ）第１のフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のアデノウイルスベクターを、医薬的に許容可能な担体と共に含む第１の組成物と、
   （ｉｉ）少なくとも２つのフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のＭＶＡベクターを、医薬的に許容可能な担体と共に含む第２の組成物と、
   を含む、ワクチンの組み合わせであって、前記組成物の一方が初回免疫組成物であり、もう一方の組成物が追加免疫組成物である前記ワクチンの組み合わせ。
2. 前記第１の組成物（ｉ）が、第２のフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターをさらに含む、請求項１に記載のワクチンの組み合わせ。
3. 前記第１の組成物（ｉ）が、第３のフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターをさらに含む、請求項２に記載のワクチンの組み合わせ。
4. 前記第１の組成物（ｉ）における前記アデノウイルスベクターが、配列番号１を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項１に記載のワクチンの組み合わせ。
5. 組成物（ｉ）が、配列番号２を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスをさらに含む、請求項４に記載のワクチンの組み合わせ。
6. 組成物（ｉ）が、配列番号３を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスをさらに含む、請求項５に記載のワクチンの組み合わせ。
7. 組成物（ｉｉ）における前記ＭＶＡベクターが、少なくとも４つのフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のワクチンの組み合わせ。
8. 組成物（ｉｉ）における前記ＭＶＡベクターが、配列番号１、配列番号２、配列番号４、及び配列番号５を有した、４つの異なるフィロウイルス亜型に由来する抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチンの組み合わせ。
9. 前記アデノウイルスベクターが、ｒＡｄ２６ベクターまたはｒＡｄ３５ベクターである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のワクチンの組み合わせ。
10. 少なくとも１つのフィロウイルス亜型に対する防御免疫応答の生成における使用であって、前記第１の組成物が前記免疫応答の初回免疫に使用され、前記第２の組成物が前記免疫応答の追加免疫に使用される前記使用を目的とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のワクチンの組み合わせ。
11. 少なくとも１つのフィロウイルス亜型に対する防御免疫応答の生成における使用であって、前記第２の組成物が前記免疫応答の初回免疫に使用され、前記第１の組成物が前記免疫応答の追加免疫に使用される前記使用を目的とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のワクチンの組み合わせ。
12. 対象における、フィロウイルスに対する免疫応答の誘導方法であって、
    ａ．第１のフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のアデノウイルスベクターを含む第１の組成物の、前記対象に対する投与と、
    ｂ．少なくとも２つのフィロウイルス株の抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のＭＶＡベクターを含む第２の組成物の、前記対象に対する投与と、
    を含み、段階（ａ）及び段階（ｂ）が、いずれの順序でも実施される前記誘導方法。
13. 前記第１の組成物が、第２のフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記第１の組成物が、第３のフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記第１の組成物における前記アデノウイルスベクターが、配列番号１を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項１２に記載の方法。
16. 前記第１の組成物が、配列番号２を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記第１の組成物が、配列番号３を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記第２の組成物における前記ＭＶＡベクターが、少なくとも４つのフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記第２の組成物における前記ＭＶＡベクターが、配列番号１、配列番号２、配列番号４、及び配列番号５を有した、４つの異なるフィロウイルス亜型に由来する抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記アデノウイルスベクターが、ｒＡｄ２６ベクターまたはｒＡｄ３５ベクターである、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 段階（ｂ）が、段階（ａ）の１〜１２週間後に実施される、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. （ｉ）第１のフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のアデノウイルスベクターを、医薬的に許容可能な担体と共に含む第１の組成物と、
    （ｉｉ）少なくとも２つのフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のＭＶＡベクターを、医薬的に許容可能な担体と共に含む第２の組成物と、
    を含むキットであって、前記組成物の一方が初回免疫組成物であり、もう一方の組成物が追加免疫組成物である前記キット。
23. 前記第１の組成物（ｉ）が、第２のフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターをさらに含む、請求項２２に記載のキット。
24. 前記第１の組成物（ｉ）が、第３のフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターをさらに含む、請求項２３に記載のキット。
25. 前記第１の組成物（ｉ）における前記アデノウイルスベクターが、配列番号１を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項２２に記載のキット。
26. 組成物（ｉ）が、配列番号２を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスをさらに含む、請求項２５に記載のキット。
27. 組成物（ｉ）が、配列番号３を有する抗原タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスをさらに含む、請求項２６に記載のキット。
28. 組成物（ｉｉ）における前記ＭＶＡベクターが、少なくとも４つのフィロウイルス亜型の抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載のキット。
29. 組成物（ｉｉ）における前記ＭＶＡベクターが、配列番号１、配列番号２、配列番号４、及び配列番号５を有した、４つの異なるフィロウイルス亜型に由来する抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載のキット。
30. 前記アデノウイルスベクターが、ｒＡｄ２６ベクターまたはｒＡｄ３５ベクターである、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載のキット。
31. 少なくとも１つのフィロウイルス亜型に対する防御免疫応答の生成における使用であって、前記第１の組成物が前記免疫応答の初回免疫に使用され、前記第２の組成物が前記免疫応答の追加免疫に使用される前記使用を目的とする、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載のキット。
32. 少なくとも１つのフィロウイルス亜型に対する防御免疫応答の生成における使用であって、前記第２の組成物が前記免疫応答の初回免疫に使用され、前記第１の組成物が前記免疫応答の追加免疫に使用される前記使用を目的とする、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載のキット。
33. 医薬組成物または薬剤の調製における使用であって、前記第１の組成物が前記免疫応答の初回免疫に使用され、前記第２の組成物が前記免疫応答の追加免疫に使用される前記使用を目的とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のワクチンの組み合わせ、または請求項２２〜３２のいずれか１項に記載のキット。
34. 医薬組成物または薬剤の調製における使用であって、前記第２の組成物が前記免疫応答の初回免疫に使用され、前記第１の組成物が前記免疫応答の追加免疫に使用される前記使用を目的とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のワクチンの組み合わせ、または請求項２２〜３２のいずれか１項に記載のキット。

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