ES2310247T3 - Vectores adenovirales estables y metodos de propagacion de los mismos. - Google Patents

Abstract

Un adenovirus recombinante del subgrupo B que tiene una deleción en la región E1 y adenovirus que no codifica un producto funcional del gen E1B 55K, comprendiendo dicho adenovirus: (i) la secuencia del adenovirus localizada entre el codón de terminación de la secuencia codificante de E1B 55K y el codón de iniciación de la secuencia codificante de pIX; y (ii) una secuencia codificante de pIX funcional bajo el control de una secuencia que tiene actividad de promotor, en donde dicha secuencia que tiene actividad de promotor consiste en hasta 0,7 kb de secuencias del adenovirus que están directamente corriente arriba del codón de iniciación de pIX, comprendiendo dicha secuencia la secuencia mínima requerida para actividad de promotor que está presente en las últimas 166 bp de la secuencia codificante de E1B 55K.

Description

Vectores adenovirales estables y métodos de propagación de los mismos.

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la medicina, más en particular la invención se refiere a vectores adenovirales recombinantes y al uso de los mismos.

Antecedentes de la invención

Los adenovirus humanos son partículas icosaédricas sin envuelta de 60-90 nM de tamaño. Hasta la fecha se han identificado 51 serotipos que se subdividen en 6 subgrupos basados en las propiedades de hemaglutinación y homología de secuencia (Francki et al., 1991). El genoma tiene una longitud de 34 a 36 kb y está flanqueado en ambos extremos por secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR). El ciclo infeccioso del virus se divide en una fase temprana y una fase tardía. En la fase temprana (6-8 horas tras la infección) el virus elimina la envuelta y el genoma se transporta al núcleo tras lo cual las regiones génicas tempranas E1-E4 se vuelven transcripcionalmente activas.

La región temprana-1 (E1) contiene dos regiones de transcripción denominadas E1A y E1B. La región E1A codifica dos proteínas principales que están implicadas en la modificación del ciclo celular de la célula huésped y la activación de otras regiones de transcripción víricas (revisado por Russell, 2000). La región E1B codifica dos proteínas principales, 19K y 55K, que previenen, a través de diferentes vías, la inducción de apoptosis que resulta de la actividad de las proteínas E1A (Rao et al., 1992; Yew y Berk, 1992; revisado en Shenk, 1996). Además, la proteína E1B-55K se requiere en la fase tardía para el transporte selectivo de ARNm vírico y la inhibición de la expresión de proteínas del huésped (Pilder et al., 1986).

Una proteína intermedia, pIX, es parte de la cápside y se sabe que estabiliza las interacciones hexón-hexón (Furcinitti et al., 1989). Además, se ha descrito que pIX transactiva promotores que contienen TATA como el promotor de E1A y MLP (Lutz et al., 1997).

Debido al conocimiento extenso de la biología viral y la alta eficacia de la administración nuclear después de entrar en las células, los adenovirus se han convertido herramientas populares para la administración de genes en células humanas. Además, los vectores adenovirales son estables y se pueden producir de forma relativamente fácil a gran escala. En la mayoría de los casos los vectores tienen delecionados al menos la región E1, que los transforma en deficientes en replicación. La producción de vectores con E1 delecionada basados en los serotipos Ad5 o Ad2 del subgrupo C se alcanza en líneas celulares que complementan E1 tal como 293 (Graham et al., 1970), 911 (Fallaux et al., 1996) y PER.C6^{TM} (Fallaux et al., 1998). Como se divulga en la patente de EE.UU. 5994128 los vectores y líneas celulares necesitan estar emparejados de forma cuidadosa para evitar la generación de adenovirus competentes para replicación a través de recombinación homóloga entre secuencias de adenovirus en la línea celular y el vector. De esta manera, las células PER.C6^{TM} y los vectores adenovirales emparejados proporcionan un sistema preferido para la producción de vectores adenovirales del grupo C (Fallaux et al., 1998). La deleción de secuencias de E1 proporciona espacio para la introducción de genes exógenos en el vector vírico. Puesto que el tamaño máximo de los genomas de Ad5 que se puede incorporar en viriones está limitado a alrededor del 105% de la longitud salvaje, los virus con E1 delecionada pueden contener aproximadamente 4,8 kb de ADN exógeno (Bett et al., 1993).

La máxima capacidad de empaquetamiento en viriones que carecen de pIX se reduce a aproximadamente el 95% de la longitud normal del genoma (Ghosh-Choudhury et al., 1987). Esto está causado lo más probable por la estabilidad reducida de los viriones pIX- ("pIX-menos"). La deficiencia en mutantes Ad5 pIX-menos se puede complementar mediante expresión episomal de pIX en una línea celular empaquetadora usada para producir virus (Caravokyri et al., 1995).

Aunque los serotipos Ad5 y Ad2 son los más normalmente usados como vectores de transferencia génica, otros serotipos pueden tener características preferidas que los hacen más útiles como herramienta terapéutica o profiláctica. Los virus Ad35 y Ad11 del subgrupo B por ejemplo son mucho menos propensos a la neutralización por suero humano que los virus Ad5 y Ad2 (divulgado en WO 00/70071). La neutralización de vectores adenovirales de transferencia disminuye la eficacia de transducción in vivo. Además, se ha determinado que la eficacia de infección de células presentadoras de antígeno, como células dendríticas, por virus recombinantes que llevan la fibra de Ad35 está muy aumentada in vitro comparada con virus Ad5 (WO 00/70071, WO 02/24730). De esta manera, los vectores basados en Ad35 combinan eficacia de infección muy mejorada con baja neutralización en sueros humanos, haciendo tales vectores adecuados para fines de vacunación.

La generación y propagación de vectores basados en Ad35 con E1 completamente delecionada es posible (ver por ejemplo, la solicitud internacional de patente PCT/EP03/50125 de Crucell Holland B.V., presentada el 24 de abril de 2003, publicada como WO 03/104467 el 18 de diciembre de 2003). Sin embargo, un análisis cuidadoso de varios vectores recombinantes basados en Ad35 ha revelado que tales vectores son menos estables, es decir, pueden contener menos ADN exógeno comparados con los vectores basados en Ad5. En la presente solicitud de patente se presentan medios y métodos para superar este problema.

Descripción de las figuras

Fig. 1. Mapa de pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3

Fig. 2. Análisis en gel de los fragmentos de PCR generados en virus Ad35 con E1 delecionada con y sin la región E3. P1 = plásmido control; M = marcador: escalera 1 kb más (Invitrogen); mQ = H2O. Las longitudes genómicas indicadas están en kb.

Fig. 3A. Alineamientos de secuencia de las regiones de secuencia corriente arriba proximales de pIX de varios adenovirus generados con el software MEGalign (Dnastar) usando el método Clustal. La fuente de las secuencias se indica en el texto. El sitio Sp1 y la caja TATA en Ad5 y Ad2 (como en Babiss y Vales, 1991) están enmarcados.

Fig. 3B. Comparación esquemática de cajas Sp1 y TATA putativas en regiones proximales de pIX a partir de las secuencias dadas en 3A.

Fig. 4. Mapa de pAdApt535.Luc

Fig. 5. Mapa de pAdApt535.

Fig. 6A. Análisis en gel de los fragmentos de PCR generados del ADN aislado de los virus Ad35.AdApt.Luc y Ad35.AdApt535.Luc o generados de plásmidos control. M = Marcador (escalera de 1 kb más, Invitrogen). Cada preparación de virus o plásmido control se analiza con dos amplificaciones de PCR específicas.

Fig. 6B. Análisis en gel de los fragmentos de PCR generados de los virus Ad35.AdApt.LacZ\DeltaE3 (35LacZ) y Ad35.AdApt535.LacZ\DeltaE3 (535LacZ) o generados de plásmidos control.

Fig. 7. Mapa de pBr.Ad35.\DeltaSM.AdApt.LacZ

Fig. 8. Representación esquemática de los promotores putativos en el promotor de E1B y la región codificante de 55K.

Fig. 9. Representación esquemática de los sitios de restricción en la región de 55K que se puede usar para generar distintos fragmentos para la identificación de un promotor putativo. La numeración de los sitios se hace según a su posición en el Ad35 salvaje.

Fig. 10. Alineamiento de secuencia de la región entre las señales de poli-A de la región E1A y de la región de E1B/pIX en tres subgrupos diferentes de serotipos B.

Fig. 11. Representación esquemática de pBr.Ad35.PRn.

Fig. 12. Representación esquemática de pBr.Ad35.PRn\DeltaE3.

Fig. 13. Representación esquemática del sistema para producir partículas adenovíricas recombinantes en células tales como PER.C6 por medio de un suceso de recombinación homóloga doble.

Fig. 14. Alineamiento de las secuencias del ADNc de pIX de Ad35 y Ad11 con la secuencia salvaje de Ad35. Las secuencias obtenidas de los fragmentos de ADNc clonados según se describe en el ejemplo 18 se alinearon usando el software SeqMan de DNASTAR. Las secuencias del ADNc de Ad35 se derivaron de los ARNs aislados de cultivos infectados con wtAd35 o Ad35E1B+Luc (se muestra la secuencia de uno de siete clones), la secuencia del ADNc de Ad11 del ARN aislado de un cultivo infectado con wtAd11. La numeración de la secuencia es arbitraria. Para la secuencia de Ad35 salvaje, se muestra del nucleótido 3339 al nucleótido 3628 de la secuencia de Ad35 salvaje. La secuencia del intrón (visto como un hueco en las secuencias de ADNc) está flanqueada por los sitios donante de ayuste (SD) y aceptor de ayuste (SA) que son muy parecidos a las secuencias consenso conocidas. El software SeqMan ha colocado los primeros nucleótidos del SD (AG) en las secuencias de ADNc en el extremo 3' de la secuencia del intrón en lugar de en el extremo 5'.

Fig. 15. Localización de sitio caperuza (cap) de pIX en virus Ad35. Representación esquemática de la organización del genoma alrededor del gen E1B y la secuencia pIX en Ad35; muestra el sitio de inicio de la transcripción y los límites de intrones en el ARNm de pIX. Las secuencias de nucleótidos son según el ADN de Ad35 salvaje (WO 00/70071). M= MunI, B= Bsu36I, SD= donante de ayuste y SA= aceptor de ayuste. El sitio de inicio de la transcripción (nucl. 3339, sitio de caperuza), el codón de terminación de 55K (TAA) y el codón de iniciación de pIX (nucl. 3484, ATG) están en negrita. Una línea de puntos indica que las secuencias no se muestran.

Fig. 16. Resultados de la PCR de transgenes a partir de virus Ad35 que mantienen una secuencia de 166 bp 3' de E1B. Un ejemplo representativo de los resultados de los ensayos de PCR en transgenes en virus Ad35.AdAptBsuLuc5
Orf6 (carriles 1-9) y Ad35.AdAptBsuLuc (carriles 10-14). M = marcador 1 kb+ (Invitrogen), P= plásmido control pAdAptBsuLuc.

Compendio de la invención

En la presente invención se muestra que un adenovirus recombinante del grupo B que tiene una deleción en la región E1 hasta el codón de terminación de E1B 55K, puede contener menos secuencias exógenas que un adenovirus Ad5 recombinante similar. Parece que esto es debido a una pérdida relativa de la expresión del gen pIX en dicho virus del grupo B en una célula empaquetadora dada, cuando la región codificante de pIX sólo está precedida por secuencias entre el codón de terminación de E1B 55K y codón de iniciación de pIX. Se muestra que tales virus se pueden hacer más estables y/o capaces de contener más secuencias exógenas cuando bien el promotor de pIX se restablece al menos parcialmente incluyendo secuencias de la región codificante de E1B 55K en tal virus, o usando un promotor heterólogo para regular pIX, de modo que se alcanza un expresión normal, o incluso una sobreexpresión relativa, de pIX en una célula empaquetadora determinada.

La presente invención proporciona adenovirus recombinantes del subgrupo B, ácido nucleico que tras su introducción en una célula empaquetadora constituye el genoma de tales adenovirus, métodos para aumentar la estabilidad y/o capacidad de empaquetamiento de tales adenovirus, y células empaquetadoras que comprenden tales adenovirus, según las reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención

Es un aspecto de la invención proporcionar un método para aumentar la estabilidad y/o la capacidad de empaquetamiento de un adenovirus recombinante que tiene al menos una deleción en la región E1, que comprende el paso de expresar los elementos necesarios para la producción y ensamblaje de dicho adenovirus recombinante en partículas virales en un célula empaquetadora en presencia de un nivel elevado del producto del gen pIX en dicha célula empaquetadora, relativo al nivel del producto del gen pIX obtenido cuando la secuencia codificante de pIX está detrás de su secuencia proximal corriente arriba endógena sin secuencias E1B 55K. En ciertas formas de realización del método de la invención, dicho nivel elevado del producto del gen pIX se produce reteniendo o introduciendo parte de las secuencias de E1B 55K en dicho adenovirus. En otras formas de realización, dicho nivel elevado del producto del gen pIX se produce mediante la expresión de las secuencias codificantes de pIX bajo el control de un promotor heterólogo.

La invención proporciona además un adenovirus recombinante que comprende una secuencia codificante de pIX funcional bajo el control de una secuencia de expresión, comprendiendo dicha secuencia de expresión parte de una secuencia de E1B 55K capaz de aumentar la expresión de la secuencia codificante de pIX en una célula empaquetadora determinada, relativo a la expresión de dicha secuencia codificante de pIX detrás de su secuencia corriente arriba de pIX proximal endógena sin la parte de dicha secuencia de E1B 55K, con la condición de que dicha parte de una secuencia de E1B 55K no codifique para un producto funcional del gen E1B 55K. En la presente invención se muestra que las secuencias del promotor de pIX pueden estar presentes en dichas secuencias de E1B 55K, y la inclusión de estas secuencias en dicha secuencia de expresión puede por lo tanto aumentar la expresión de pIX. La presencia de dichas secuencias de E1B 55K aumenta la estabilidad y/o capacidad de empaquetamiento de dicho adenovirus recombinante, comparado con la situación donde dicha secuencia codificante de pIX está detrás de su secuencia corriente arriba de pIX proximal endógena sin la parte de dicha secuencia de E1B 55K.

Se ha divulgado un adenovirus de serotipo 35 con una deleción en la región E1 pero con una región codificante de E1B 55K intacta (pBr.Ad35.leftITR.\DeltaE1A\Delta21K) en WO 02/40665. Sin embargo, un producto funcional del gen 55K, tal como el presente en el vector divulgado, inhibe la apoptosis, y por lo tanto se desea para obtener adenovirus recombinantes que carecen de expresión funcional de E1B 55K, por ejemplo, mutando el gen E1B 55K o preferiblemente incluyendo sólo parte de las secuencias de E1B 55K, más preferiblemente incluyendo sólo secuencias corriente abajo del codón de iniciación de E1B 55K. Estará claro para el experto en la materia que es beneficioso minimizar la cantidad de secuencias de E1B 55K en dicho vector para generar virus con una deleción máxima en E1 para dar cabida más ácido nucleico exógeno, mientras que se retienen al mismo tiempo suficientes secuencias de E1B 55K para tener el beneficio según la presente invención de una estabilidad aumentada y/o una capacidad de empaquetamiento aumentada en el adenovirus recombinante. Con las enseñanzas de la presente invención, el experto en la materia será capaz de determinar las secuencias mínimas requeridas en E1B 55K que lleven a la estabilización y/o aumento en la capacidad de empaquetamiento del adenovirus recombinante, por ejemplo, usando técnicas estándar de clonación molecular para obtener deleciones en serie de la región E1B 55K empezando a partir del vector divulgado (pBr.Ad35.leftITR.\DeltaE1A\Delta21K) y determinando la estabilidad o capacidad de empaquetamiento. Es por lo tanto un objeto de la presente invención proporcionar un vector adenoviral recombinante según la invención en donde dichas secuencias que codifican el producto del gen E1B 55K comprenden alrededor de 0,7 kb o menos de las secuencias del adenovirus que están directamente corriente arriba del marco abierto de lectura de pIX. En otras formas de realización, dichas secuencias comprenden no más de alrededor de 680, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, ó 100 nt de las secuencias del adenovirus que están directamente corriente arriba del marco abierto de lectura de pIX. En una forma de realización, tal vector adenoviral recombinante retiene 166 bp del extremo 3' de la secuencia codificante de 55K. Como estará claro para el experto en la materia, la invención no está limitada a la presencia de una secuencia que se encuentra en un tramo contiguo directamente corriente arriba de las secuencias codificantes de pIX en el adenovirus natural. En lugar de eso, también será posible según la invención tener secuencias que están más lejos corriente arriba, es decir de la región E1B 55K (por ejemplo un fragmento de restricción o de PCR, ver por ejemplo el ejemplo 10 y la figura 9), fusionadas a las secuencias reguladoras de pIX más proximales, creando de esta manera una combinación artificial de secuencias reguladoras, siempre que esto produzca un aumento en la expresión de pIX en una célula empaquetadora determinada, cuando se compara con la ausencia de cualquier secuencia de E1B 55K. Dicho adenovirus es un adenovirus del subgrupo B, preferiblemente un adenovirus Ad35 o Ad11. Se ha mostrado que los adenovirus de serotipos 35 u 11 son particularmente útiles para la administración a seres humanos, ya que hay muchos menos individuos que tienen anticuerpos neutralizantes para estos serotipos que para el serotipo 5 hasta ahora el más usado (WO 00/70071). Es otro aspecto de la invención proporcionar el ácido nucleico que puede actuar como el genoma del adenovirus según la presente invención.

Como alternativa o además de la presencia de secuencias de E1B 55K que aumentan la expresión del gen pIX, también es posible sobreexpresar pIX misma mutando el gen pIX, preferiblemente su promotor, para aumentar la estabilidad y/o la capacidad de empaquetamiento de un adenovirus recombinante. Un gen pIX modificado es un gen pIX que tiene un promotor y/o terminador de la transcripción diferente, y/o secuencias codificantes mutadas, por ejemplo obtenidas mediante optimización de codones, introducción de intrones que estabilizan el ARN, y similares. Un gen pIX según la invención comprende información genética que codifica pIX, e incluye ácido nucleico tal como el gen pIX tal como se encuentra en adenovirus naturales, ADNc e información que codifica pIX mutante en forma de variantes alélicas o ácido nucleico que codifica pIX mutante que tiene al menos parte de la función de pIX que puede ser diferente de pIX normal en aspectos cuantitativos o cualitativos, derivado de pIX mediante mutación, deleción, adición, o translocación de aminoácidos, o combinaciones de las mismas.

Si un adenovirus recombinante tiene una deleción de al menos la región E1B 55K hasta e incluyendo el codón de terminación del producto del gen E1B 55K, el marco abierto de lectura de pIX estará precedido por secuencias entre el codón de terminación de E1B 55K y el codón de iniciación de pIX. A estas secuencias se hace referencia aquí como las "secuencias corriente arriba de pIX proximales endógenas" (por ejemplo, se hace referencia a la secuencia corriente arriba de pIX de Ad35 en vectores adenovirales recombinantes basados en Ad35, la secuencia corriente arriba pIX de Ad11 en vectores adenovirales recombinantes basados en Ad11, etc. como endógenas en este respecto; la definición incluye variantes alélicas que se pueden encontrar en la naturaleza y que no se han creado en el laboratorio; ver la Fig. 3A para algunas secuencias corriente arriba proximales de pIX).

Un "promotor heterólogo" como se usa aquí se define como cualquier secuencia diferente de las secuencias que se encuentran de forma natural corriente arriba del gen pIX, incluyendo las secuencias de la región E1B 55K y las secuencias corriente arriba proximales de pIX endógenas, y que es capaz de actuar como un promotor y por lo tanto regular la transcripción de las secuencias codificantes de pIX. En un aspecto, un promotor heterólogo puede ser una secuencia al menos en parte derivada de una secuencia corriente arriba proximal de pIX (es decir, las secuencias entre el codón de terminación de E1B 55K y el codón de iniciación de pIX) de un adenovirus de otro serotipo que el serotipo del que se deriva el vector adenoviral recombinante (por ejemplo, una secuencia corriente arriba de pIX de Ad5 en un vector adenoviral recombinante Ad35). A esto se hace referencia aquí como un "promotor de pIX proximal no endógeno". En una forma de realización de la invención, la expresión de pIX derivada de Ad35 está dirigida por un promotor de pIX proximal no endógeno de Ad5. Se puede usar cualquier promotor de pIX proximal no endógeno derivado de la secuencia corriente arriba de pIX proximal de un serotipo que confiere niveles más altos de expresión de pIX que las secuencias proximales de pIX endógenas del vector adenoviral. La identificación de tales promotores de pIX proximales no endógenos se puede basar en información de secuencia, tal como será evidente para el experto en la materia a partir del ejemplo 4. En formas de realización particulares, el vector adenoviral según la invención deriva a un adenovirus de un serotipo del subgrupo E, o preferiblemente de un serotipo del subgrupo B. En formas de realización específicas, dicho vector adenoviral deriva de un adenovirus de serotipo 35 (Ad35), Ad11, Ad7, o Ad4. En formas de realización alternativas, dicho promotor de pIX proximal no endógeno deriva al menos en parte de una secuencia corriente arriba de pIX proximal de un adenovirus clasificado en el subgrupo C, A, D, o F. En formas de realización particulares dicho promotor de pIX proximal no endógeno deriva al menos en parte de una secuencia corriente arriba de pIX proximal de un adenovirus de serotipo 12 (Ad12), Ad9, o Ad40, o más preferiblemente de Ad5 o Ad2. De forma alternativa, las secuencias que actúan como promotor de pIX proximal no endógeno se pueden determinar de forma empírica, mediante métodos generales de biología molecular conocidos para los expertos en la materia, tal como mediante ensayos de transcripción en donde los promotores se pueden ensayar de forma rutinaria para su fuerza. Estará claro para el experto en la materia que los elementos de un promotor se pueden intercambiar sin cambiar el promotor entero, por ejemplo añadir, delecionado, o mutar secuencias conocidas de unión a factores de transcripción a un promotor puede tener influencia en su fuerza. Se puede mutar al menos parte de las secuencias del promotor cambiando la secuencia mediante mutaciones, tal como adiciones, deleciones, o intercambio de uno o más nucleótidos, incluyendo tramos de nucleótidos con una función conocida. La sustitución de las secuencias del promotor se realiza cambiando una parte o el total de estas secuencias por un promotor diferente. Tal cambio se puede realizar según técnicas estándar de biología molecular, todas bien conocidas para el experto en la materia. Se puede construir cualquier promotor en asociación operable con el gen pIX de elección, y probar su efecto.

En otro aspecto, un promotor heterólogo no está relacionado con los promotores de pIX proximales no endógenos adenovirales. Por lo tanto, los promotores heterólogos también pueden ser promotores víricos, incluyendo pero no limitados a promotores derivados de citomegalovirus (CMV, por ejemplo el promotor del gen inmediato temprano del CMV humano, referido de aquí en adelante como el promotor CMV), el virus del sarcoma de Rous (RSV, por el ejemplo el promotor de la repetición terminal larga del RSV, al que se hace referencia aquí como el promotor RSV), TK, HBV, SV40 y similares. En una forma de realización, se usa un promotor E1B de adenovirus como un promotor heterólogo. También se pueden usar promotores celulares como promotores heterólogos, y estos incluyen pero no están limitados a promotores de PGK, metalotioneína, EF1-\alpha, \beta-actina, y similares. También se pueden usar para la invención, promotores sintéticos o híbridos, que comprenden elementos de uno o más promotores, y todos están incluidos en el ámbito del término promotor heterólogo. Los promotores usados pueden ser constitutivos o inducibles. En el contexto de un promotor inducible un promotor se considera adecuado para la invención si produce sobreexpresión en su estado inducido. Cualquier secuencia de promotor que da como resultado la sobreexpresión de pIX según la invención se puede usar como un promotor heterólogo según la invención. Además de la fuerza del promotor, otro aspecto que determina la utilidad de un promotor particular cuando está presente en el vector adenoviral recombinante es su tamaño, ya que los promotores más largos tomarán el espacio disponible para el transgén. Un experto en la materia será capaz de usar la presente invención para permitir la optimización del vector experimentalmente con respecto a la longitud y fuerza del promotor por lo que se refiere al tamaño de inserto, para determinar el vector recombinante más estable.

Estará claro que un promotor heterólogo puede todavía contener o incluir una parte o el total de las secuencias corriente arriba de pIX proximales endógenas, o de forma alternativa cambiar completamente estas secuencias, siempre que el promotor heterólogo según la invención pueda producir la sobreexpresión de la información genética que codifica pIX en una célula empaquetadora de elección. También estará claro para el experto en la materia que cuando un promotor adenoviral no de pIX endógeno (por ejemplo, el promotor de E1A, E2A, etc.) o un promotor heterólogo que por ejemplo regula el transgén se usa para dirigir la expresión de pIX mediante el uso de un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) entre el gen de adenovirus no pIX o el transgén y la secuencia codificante de pIX (en cualquier orden), esto se debe contemplar como que está dentro del ámbito del término "promotor heterólogo" según la invención.

Un nivel aumentado o elevado del producto del gen pIX en la invención es el resultado de la sobreexpresión del gen pIX en una célula empaquetadora de elección. La sobreexpresión del gen pIX como se usa aquí se define como un nivel de expresión de pIX, bien a nivel de ARN o de proteína o de ambos, que es mayor que el nivel de expresión de pIX obtenido cuando la región codificante de pIX está detrás de las "secuencias corriente arriba de pIX proximales endógenas" como se ha definido aquí, en una célula empaquetadora determinada. "Sobreexpresión" tiene sentido en el contexto de la presente invención para una combinación promotor heterólogo-pIX particular de un adenovirus en combinación con una célula empaquetadora particular de elección. Los métodos para determinar los niveles de expresión son generalmente bien conocidos para los expertos en la materia, e incluyen pero no están limitados a RT-PCR, método Northern, inmunotransferencia, y similares. Para la presente invención, se mediría la sobreexpresión determinando los niveles de expresión en un adenovirus recombinante con un inserto determinado (por ejemplo, luciferasa) en una célula empaquetadora determinada de elección, en donde la información genética que codifica pIX está detrás de las secuencias corriente arriba de pIX proximales endógenas sin las secuencias de E1B 55K, y comparando estos niveles de expresión con aquellos en un adenovirus recombinante que es el mismo excepto que la región codificante de pIX está regulada por un promotor heterólogo o por secuencias del gen E1B 55K endógeno (su promotor "natural" que ha sido al menos parcialmente reconstituido). La sobreexpresión de pIX se indica mediante una proporción mayor de 1 para el nivel de expresión obtenido por el promotor heterólogo o "natural" sobre el obtenido por las secuencias corriente arriba de pIX proximales endógenas sin las secuencias de E1B 55K. La elección de una célula empaquetadora se determina por factores tales como el serotipo de los elementos del adenovirus recombinante que interacciona con las funciones adenovíricas complementarias en la célula empaquetadora, la pureza del producto (tal como ausencia de adenovirus competentes para replicación del lote generado), facilidad de uso, características de crecimiento, y similares. Los ejemplos de células empaquetadoras son conocidos para el experto en la materia, e incluyen células 293, células 911, y células PER.C6^{TM} como se usan aquí, así como derivadas de las mismas adaptadas para complementación de vectores adenovirales de serotipos específicos, tal como PER55K.

Estará claro que en todas las formas de realización de la invención, las secuencias codificantes de pIX y las secuencias reguladoras que dirigen la expresión de pIX se pueden colocar en su localización natural en el genoma del adenovirus, así como en zonas diferentes del genoma del adenovirus, por ejemplo, en la región que originalmente contenía las secuencias de E3.

Los adenovirus recombinantes con estabilidad aumentada son capaces de incorporar genomas mayores en partículas virales (viriones). Por lo tanto, aumentar la estabilidad de los adenovirus recombinantes como se usa aquí permitirá que los adenovirus recombinantes según la invención incluyan más información genética exógena, que comprende un gen de interés. Además, los adenovirus recombinantes con estabilidad aumentada según la invención pueden ser capaces de ser propagados durante más pases sin signos de inestabilidad. La estabilidad se puede medir por varios métodos conocidos para los expertos en la materia, incluyendo pero no limitados a PCR en el virus recombinante para demostrar la presencia de los vectores adenovirales recombinantes deseados. La inestabilidad llevará a subproductos, que también se pueden ver mediante métodos de PCR, y similares. También se pueden usar análisis de restricción del ADN vírico, determinación de la infectividad relativa de las partículas de virus, determinación de las partículas adenovirales para determinar la estabilidad de los vectores adenovirales recombinantes (Caravokyri y Leppard, 1995). Los métodos para determinar la estabilidad/inestabilidad de los vectores adenovirales recombinantes también se dan en el ejemplo 3 de esta solicitud. Un adenovirus recombinante, también denominado vector adenoviral recombinante, o vector adenoviral, como se usa aquí deriva de un adenovirus, carece al menos de parte de la región E1 (que comprende los genes E1A y E1B) de un adenovirus y puede comprender información genética exógena de la que se desea la distribución y/o expresión mediante dicho vector. La información genética exógena (o extraña) como se usa aquí, es cualquier información genética que no está presente de forma natural en un adenovirus, y a la que también se refiere como transgén. Esto incluye pero no está limitado a genes de interés, casetes de expresión, y similares. Tal información genética exógena puede llenar el espacio en el genoma que está disponible por la deleción de las secuencias adenovíricas de E1. Los vectores adenovirales recombinantes son útiles para varios fines, tal como en aplicaciones de terapia génica, preparación de vacunas, y similares. Además de la deleción de la región E1, también se pueden delecionar secuencias de E3 de tales vectores adenovirales, para aumentar la capacidad para información genética exógena en ciertas formas de realización preferidas. Se pueden usar otras deleciones y varias combinaciones de deleciones de parte o totales de las regiones E2, E3, y E4 combinadas con la deleción de E1, si es necesario en combinación con una célula empaquetadora que comprenda la información genética de la que carece el vector adenoviral, cuando sea necesario para la replicación del vector adenoviral. Todos los adenovirus recombinantes que tienen una deleción en la región E1 combinada con opcionalmente cualquier otra deleción en el genoma del adenovirus, se considera que están incluidos en el ámbito de la presente invención. Los adenovirus de la presente invención se pueden usar en diferentes escenarios tal como terapia génica o vacunaciones profilácticas y/o terapéuticas, incluyendo vacunas contra tumores y vacunas antivíricas. Para esto, el vector adenoviral funciona como un vehículo de distribución génica, en donde se incorpora en genoma adenoviral un gen no nativo. La partícula adenoviral se puede dirigir posteriormente específicamente a células diana de interés; el adenovirus se une a esa célula específica bien a través de unión cápside-receptor o por otros medios, y administra el transgén. El direccionamiento de los adenovirus se puede realizar de muchas formas diferentes. Los expertos en la materia del direccionamiento de vectores adenovirales sabrán de todas las diferentes posibilidades que se aplican para administrar vectores adenovirales a las células de interés. Tales posibilidades incluyen pero no están limitadas a alteraciones de la cápside (modificaciones de fibra, hexón y/o penton, tal como deleciones, intercambios entre fibras de diferentes serotipos, y adiciones de péptidos y/o otros grupos de unión), en donde se producen fibras quiméricas que reconocen un receptor presente en la célula de interés, o en donde se utiliza la unión de la base del pentón. Otras posibilidades son unir grupos de direccionamiento a las proteínas de la cápside, en donde por ejemplo se unen péptidos de unión, proteínas de unión fuertes y conocidas, o anticuerpos o partes de los mismos a las proteínas de la cápside para alcanzar un direccionamiento específico. Tales vectores pueden ser todos producidos usando métodos y medios proporcionados por la presente invención. Por lo tanto, la presente invención también divulga vectores adenovirales recombinantes según la invención, que comprenden además una secuencia que codifica una proteína no adenovírica. Tales secuencias pueden estar presentes en diferentes localizaciones dentro del esqueleto adenoviral, pero están preferiblemente localizadas en la región E1, que falta en los vectores adenovirales recombinantes de la invención. La región E1 se complementa por los elementos de complementación presentes en las células de complementación. La dirección del promotor, transgén y otras secuencias reguladoras pueden estar dirigidas hacia la repetición terminal invertida de la izquierda, así como hacia la de la derecha.

También se contempla la producción de vectores víricos basados en adenovirus y/o en otros virus tal como el virus adeno-asociado (AAV), en donde la combinación, tal como un virus quimérico Ad-AAV, se puede integrar en el genoma de la célula huésped. Se conocen varios métodos en la técnica para generar adenovirus de integración. En general, la invención también es útil para la producción de formas de adenovirus que (de forma específica o no específica) se pueden integrar.

Como se ha mencionado, se pueden clonar varios transgenes no adenovirales en los vectores adenovirales de la presente invención. Estos no sólo incluyen secuencias reguladoras de ácidos nucleicos tal como potenciadores, promotores (por ejemplo, promotores no adenovirales fuertes tal como el promotor del citomegalovirus, el promotor del SV40 y el promotor del RSV) y señales de poliadenilación, sino también genes heterólogos para fines terapéuticos. Por lo tanto, en un aspecto de la invención, se proporcionan vectores adenovirales recombinantes según la invención, en donde dicha proteína no adenovírica se selecciona del grupo que consiste en: un polipéptido que induce muerte celular, un antígeno específico de tumor, una proteína vírica, una hormona y una citoquina. Los ejemplos no limitantes de factores, proteínas, polipéptidos y péptidos no adenovirales son factores de transcripción, proteínas de señalización intracelular, fosfatasas, quinasas, factores inhibidores de apoptosis, antagonistas de receptores, formas solubles de receptores unidos a membrana, inhibidores de ARN, ARN's antisentido, factores señuelo, ribozimas, y más específicamente, timidina quinasa, eritropoyetina, proteína nueva estimulante de eritropoyesis (NESP), IL3, ceNOS, gamma interferón y gp100. Se pueden clonar proteínas víricas no adenovíricas en los vectores adenovirales recombinantes proporcionados por los métodos y medios de la presente invención para fines de vacunación. Tales proteínas víricas incluyen, pero no están limitadas a, gag, pol, env, nef, etc. para vacunas contra VIH, proteínas E6 y E7 para vacunas contra el virus del papiloma humano, proteínas del circumsporozoito del protozoo Plasmodium para vacunas contra la malaria, componentes de rotavirus para vacunas contra rotavirus, proteínas del ébola para vacunas contra el ébola, los productos de los gene F y G del virus respiratorio sincicial para vacunas contra el virus respiratorio sincicial, HA y NA para vacunas contra la gripe, etc.

Los adenovirus según la invención son preferiblemente adenovirus humanos, es decir, derivados de adenovirus que son capaces de infectar células humanas, pero la invención es igualmente útil para adenovirus no humanos. El experto en la materia será consciente del hecho de que además de todos los adenovirus humanos se han identificado en la técnica numerosos adenovirus no humanos. Obviamente, también se pueden aplicar los adenovirus no humanos para alcanzar los mismos resultados que se han divulgado por la presente invención. Ejemplos no limitantes de adenovirus no humanos que se pueden producir usando los métodos y medios de la presente invención son adenovirus caninos, bovinos, de mono y de aves. Serotipos como se usa aquí por lo tanto va más allá de los serotipos restringidos a especies.

"Derivado de" como se usa aquí, significa que las secuencias de ácido nucleico, genes, o proteínas que normalmente se encuentran en un adenovirus, se usan para la generación de adenovirus recombinantes según la invención. Los métodos para generar tales adenovirus recombinantes son bien conocidos para el experto en la materia, e incluyen pero no están limitados a métodos generales de biología molecular tal como clonación de información genética en constelaciones deseadas mediante el uso de enzimas de restricción y similares. "Derivado de" también supone incluir la construcción sintética de información genética basada en el conocimiento de tal información genética. Tales métodos incluyen pero no están limitados al uso de material genético de adenovirus como molde de PCR para hacer una nueva construcción adenovírica que se basa en la secuencia de los adenovirus molde, la construcción de información genética completamente sintética con una secuencia deseada, por ejemplo uniendo oligonucleótidos sintéticos a una construcción deseada, y similares. Se debe entender que "derivado de" no significa necesariamente una clonación directa del ADN salvaje. El experto en la materia será consciente también de las posibilidades de la biología molecular para obtener formas mutantes de un trozo determinado de ácido nucleico. Estas mutaciones pueden dar una funcionalidad diferente, pero también pueden ser silenciosas en el sentido de que ciertas mutaciones no cambian la funcionalidad de ese trozo particular de ADN y su proteína codificada. Por lo tanto, los términos "parte funcional, derivado y/o análogo del mismo" se deben entender como equivalentes del ácido nucleico con el que están relacionados. El experto en la materia apreciará el hecho de que ciertas deleciones, intercambios, mutaciones (puntuales), adiciones, etc. pueden aún producir un ácido nucleico que tiene una función similar al ácido nucleico original. Se debe entender por lo tanto que tales alteraciones que no cambian significativamente la funcionalidad de las proteínas tal como la proteína pIX, E4-orf6 y el producto del gen E1B-55K están dentro del ámbito de la presente invención. Estará claro para los expertos en la materia, que el método para obtener la información genética que codifica el adenovirus recombinante puede variar sin separarse del ámbito de la presente invención.

Los adenovirus humanos se han clasificado en subgrupos A-F, que abarcan 51 serotipos (ver por ejemplo EP 0978566). Para algunas aplicaciones, puede ser beneficioso usar vectores adenovirales derivados de adenovirus de subgrupos específicos o de ciertos serotipos que tienen un tropismo tisular para un tipo de célula determinado, por ejemplo células dendríticas (WO 02/24730). La ausencia general de anticuerpos neutralizantes en la población contra adenovirus de ciertos subgrupos o de un serotipo específico también es un parámetro importante para determinar el serotipo de elección (WO 00/70071). Debido a la similitud entre los virus del subgrupo B (ver por ejemplo los ejemplos 4 y 11) se espera que la invención sea particularmente adecuada para los adenovirus del subgrupo B. Por lo tanto, la presente invención se refiere a vectores adenovirales derivados de un adenovirus clasificado en el subgrupo B. El subgrupo B de adenovirus humanos comprende Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35, y Ad50. Formas de realización preferidas de la presente solicitud se refieren a vectores adenovirales recombinantes derivados de los serotipos Ad35 o Ad11. Además de elegir un serotipo para aplicaciones específicas, se pueden usar los denominados adenovirus quiméricos. Estos comprenden partes o el total de secuencias genéticas que codifican proteínas de la cubierta, tal como fibra, pentón, o hexón, de uno o más serotipos de adenovirus unidos a la información genética restante (la parte "principal" del vector adenoviral) de otros serotipos, que se puede usar para disminuir la inmunogenicidad o cambiar el tropismo tisular del vector adenoviral "principal" (EP 0978566). La parte "principal" como se usa aquí significa que contribuye con la mayoría de la información genética a dicho virus quimérico, y un adenovirus quimérico estará por lo tanto incluido en el grupo del serotipo de la parte "principal" de tal virus. Estará claro para los expertos en la materia que la presente invención también se puede usar para tales adenovirus quiméricos cuando estos se pudieran enfrentar a problemas de inestabilidad similares. Se puede esperar por ejemplo que un adenovirus quimérico que comprende secuencias de Ad35 como la parte principal y que comprende una fibra que deriva de por ejemplo un adenovirus Ad11 puede tener inestabilidad similar tras la propagación como se describe para los vectores adenovirales recombinantes de Ad35 descritos aquí. Por lo tanto, cuando los adenovirus recombinantes se mencionan en esta solicitud, se considera que los vectores adenovirales quiméricos están incluidos en la presente invención.

Los elementos necesarios para la producción y ensamblaje de vectores adenovirales recombinantes son conocidos por el experto en la materia (descritos anteriormente; patente de EE.UU. 5994128; Russell, 2000). La producción de adenovirus recombinantes con E1 delecionada en forma de viriones se hace en células empaquetadoras, también denominadas células de complementación. Tales células proporcionan en trans la información genética del adenovirus que falta en dichos adenovirus recombinantes, necesaria para producir virus recombinantes (viriones recombinantes). Células empaquetadoras bien conocidas son células 293, células 911 y células PER.C6^{TM} (supra). Para la mayoría de los fines es preferible usar una célula empaquetadora y un vector adenoviral recombinante que carecen de secuencias que se solapan que de otra manera producirían recombinación homóloga dando como resultado adenovirus competentes para replicación (patente de EE.UU. 5994128). PER.C6^{TM}, depositada con el no. 96022940 en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales en el Centro de Microbiología Aplicada e Investigación, es por lo tanto una célula empaquetadora muy adecuada para la propagación de adenovirus recombinantes. Otros métodos para disminuir la generación de adenovirus competentes para replicación también se han previsto y están relacionados por ejemplo con la manipulación de secuencias adenovíricas para reducir la homología entre secuencias presentes en la célula empaquetadora y el vector (por ejemplo, Hehir et al., 1996; Robert et al., 2001). Las células empaquetadoras pueden, además de la región E1 obligatoria, comprender otras secuencias adenovíricas para complementar otras funciones adenovíricas cuando estas faltan funcionalmente en el adenovirus recombinante usado, tal como por ejemplo partes o el total de E2, E4, y similares. La información de complementación en las células empaquetadoras puede estar presente bien integrada en el genoma, o como copias extracromosómicas, por ejemplo en plásmidos, vectores, cósmidos, y similares. Otros métodos hacen uso de los llamados virus auxiliares, que comprenden información genética que falta en el adenovirus recombinante. Los vectores adenovirales recombinantes también se usan como los denominados virus auxiliares para la producción de adenovirus recombinantes que contienen un genoma donde se ha delecionado la mayoría o todos los genes adenovirales (vectores "gutless" o adenovirus dependientes de auxiliar). En la producción final de tales adenovirus "gutless" es necesario evitar el empaquetamiento del adenovirus auxiliar. El experto en la materia está familiarizado con los métodos para lograr esto, por ejemplo usando una recombinasa específica de sitio en un sitio manipulado en la señal de empaquetamiento para delecionar esta señal de empaquetamiento. Con frecuencia es necesario separar el virus auxiliar que queda de los virus "gutless" deseados usando separación por gradiente de CsCl. Esto es más fácil de alcanzar cuando las longitudes del genoma de los virus auxiliares y "gutless" difieren al máximo. Por lo tanto, se prefiere un virus auxiliar grande sobre uno pequeño. Como estará claro para el experto en la materia, la presente invención se puede aplicar igualmente para aumentar la estabilidad del adenovirus recombinante mediante el uso de un virus auxiliar recombinante que tiene aumentada la expresión de pIX, que se puede alcanzar mediante los métodos descritos en la presente invención. Cualquier célula que contiene información genética que se pueda usar para complementar el adenovirus recombinante, para generar partículas de virus recombinantes, se considera que está incluida en el ámbito del significado de célula empaquetadora. Estará claro para el experto en la materia que la ventaja obtenida por la presente invención no depende de la célula empaquetadora usada.

La información genética que codifica pIX puede estar presente en el vector adenoviral recombinante pero también puede estar presente independiente de dicho vector adenoviral recombinante, y tal información genética extravírica puede estar presente bien integrada en el genoma, o como copias extracromosómicas, por ejemplo, en plásmidos, vectores, cósmidos, y similares. La introducción de material genético en una célula empaquetadora se puede hacer según varios métodos, tal como transfección mediante lipofectamina, precipitación con fosfato de calcio, infección vírica, y similares. Tales métodos son generalmente bien conocidos por el experto en la materia, y el método usado para la introducción de información genética no es crítico para el ámbito de la invención. pIX funcional en formato expresable como se usa aquí significa información genética que codifica pIX en unión operable a un promotor u otra secuencia reguladora capaz de dirigir la expresión de dicha información genética que codifica pIX en la célula empaquetadora. La introducción de la información genética en la célula empaquetadora se puede hacer bien antes de, al mismo tiempo que, o después de la introducción del vector adenoviral recombinante. Se determinó que la expresión episomal constitutiva de pIX en una línea celular empaquetadora basado en 293 complementa la deficiencia de pIX del adenovirus mutante de tipo 5 (Caravokyri y Leppard, 1995). Sin embargo, para tales aplicaciones se requieren plásmidos episomales especiales que contienen un casete de expresión de EBNA1, y la propagación de vectores adenovirales en tales líneas celulares tiene la desventaja de que partes del episoma se convertirán muy probablemente en parte del vector adenoviral recombinante. Por lo tanto, en formas de realización preferidas de la presente invención, la información genética que codifica pIX funcional está presente en el vector adenoviral.

En intentos de disminuir la cantidad de recombinación que produce adenovirus competentes para replicación, algunos autores han usado un gen pIX derivado de Ad7 -un virus del grupo B- que estaba dirigido por un promotor mutado de pIX de Ad5, para disminuir el solapamiento entre los ácidos nucleicos de la célula empaquetadora (que contiene la secuencia derivada de Ad5) y el vector adenoviral recombinante (Robert et al., 2000). Sin embargo, esos experimentos no se hicieron para aumentar la estabilidad del vector viral, y esta estabilidad no se midió en esos experimentos. En la presente solicitud, las secuencias que regulan la transcripción de pIX en el vector adenoviral se cambian con el propósito de aumentar la estabilidad del virus y/o aumentar la capacidad para material genético exógeno en los viriones. La invención demuestra que un vector adenoviral recombinante derivado de Ad35 que comprende un gen pIX bajo el control de un promotor proximal de pIX derivado de Ad5 es más estable/puede llevar más información genética exógena que el virus correspondiente con las secuencias corriente arriba de pIX proximales endógenas (es decir, derivadas de Ad35). Por lo tanto, la presente invención también proporciona un adenovirus recombinante que comprende una secuencia que codifica pIX funcional y que tiene al menos una deleción en la región E1, en donde la secuencia que codifica pIX está bajo el control de un promotor heterólogo, y en donde dicho adenovirus recombinante deriva de un adenovirus diferente de un adenovirus de serotipo 5. En ciertas formas de realización, dicho promotor heterólogo es un promotor de pIX proximal no endógeno. En formas de realización preferidas la información genética que codifica pIX
deriva de Ad35 o Ad11. En tales formas de realización, un promotor de pIX no endógeno es un promotor de Ad5.

En otro aspecto, la invención proporciona un vector adenoviral recombinante obtenible mediante un método según la invención. Tales vectores adenovirales recombinantes son útiles, por ejemplo en la preparación de vacunas (WO 00/70071, WO 01/38362; WO 02/24730), como vehículos de distribución de genes, y similares. Se puede usar el elegir un serotipo principal deseado para tales vectores adenovirales recombinantes para obtener un tropismo tisular alterado comparado con los muy usados vectores adenovirales Ad5, y/o se puede usar porque son menos inmunogénicos que tales vectores derivados de Ad5 (WO 00/70071).

Para la generación de vectores adenovirales recombinantes, es conveniente clonar el transgén en un plásmido (plásmido adaptador), que contenga la parte izquierda de un adenovirus que carece de las secuencias de E1 y que tenga sitios de restricción para la clonación. El vector adenoviral recombinante se genera después mediante recombinación homóloga con un cósmido que comprende la parte derecha del adenovirus que tiene en el extremo 5' secuencias que solapan con el extremo 3' del plásmido adaptador (ver los ejemplos de la presente solicitud; método descrito en WO 99/38362). De esta manera es otro aspecto de la presente invención proporcionar una secuencia de ácido nucleico recombinante que comprende una ITR izquierda adenovírica, una señal de empaquetamiento, otras secuencias adenovíricas con una deleción en la región E1, al menos parte del marco abierto de lectura de E1B 55K y secuencias codificantes de pIX.

La invención proporciona además una célula empaquetadora de adenovirus recombinante que comprende un adenovirus recombinante según la invención. En una forma de realización dicha célula empaquetadora de adenovirus recombinantes comprende un ácido nucleico capaz de complementar una deficiencia en E1B 55K de dicho adenovirus recombinante y en donde dicho adenovirus recombinante comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una parte de la secuencia que codifica un producto del gen E1B 55K que aumenta la expresión del gen pIX, con la condición que la última molécula de ácido nucleico recombinante no codifique un producto funcional del gen E1B 55K, y en donde dicha célula y dicho adenovirus recombinante no comprenden solapamiento de secuencias que lleve a la formación de un adenovirus recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína E1B 55K funcional. Esta forma de realización es particularmente útil para prevenir la formación de adenovirus recombinantes que comprenden funciones adicionales del adenovirus.

La invención se ilustrará ahora con algunos ejemplos, que no se pretende que limiten el ámbito de la invención.

Ejemplos

Se usaron métodos estándar de biología molecular (por ejemplo, Sambrook y Russel, 2001), a menos que se indique de otra manera. Las secuencias de los cebadores se proporcionan en la Tabla IV.

Ejemplo 1 Líneas celulares de complementación basadas en PER.C6^{TM} para adenovirus Ad35 con E1 delecionada

Se sembraron células PER.C6 en placas de cultivo de 10 cm a una densidad de 3x106 células/placa en medio de cultivo de PER.C6 (DMEM (Gibco BRL) complementado con SBF (Gibco BRL) hasta el 10% y MgCl2 10 mM (solución madre 4,9 M, Sigma)). Dos días después, se transfectaron 9 placas con 1 \mug de ADN pIG35.55K linearizado con ScaI (descrito más adelante) y se transfectaron 9 placas con 1,5 \mug de ADN pIG35.55K linearizado con ScaI. Se transfectaron placas control separadas con 1 ó 1,5 \mug de pAdApt35.LacZ linearizado con ScaI (descrito en WO 00/70071) para medir la eficacia de transfección y con 1 ó 1,5 \mug de pcDNA.nlsLacZ linearizado con ScaI. pcDNA.nlsLacZ (descrito en WO 99/55132) es un plásmido basado en pcDNA3 (Invitrogen) con el gen nlsLacZ dirigido por el promotor CMV. pcDNA.nlsLacZ también contiene un casete de expresión de neo^{r}. Como control negativo se transfectó una placa extra con pAdApt35.LacZ linearizado, una construcción que carece del gen de selección neo^{r}. Todas las transfecciones se realizaron con el kit de transfección LipofectAmina (Invitrogen/Life Technologies) según las instrucciones del fabricante usando 5 ml de reactivo LipofectAmina/\mug de ADN. Las células se incubaron durante 4 horas con la mezcla de transfección después de lo cual el medio se cambió por medio de cultivo de PER.C6. Al día siguiente el medio se cambió por medio de cultivo que contenía 0,5 mg/ml de G418 (Gibco BRL) excepto en las dos placas que se transfectaron con 1 ó 1,5 \mug de pAdApt35.LacZ. Estas últimas placas se usaron para medir la expresión de LacZ dos días después de la transfección. Después de la tinción con X-gal de estos dos cultivos se estimó la eficacia de transfección en aproximadamente el 40% con ligeramente más células azules en la placa transfectada con 1,5 \mug de ADN. El medio de selección se cambió por medio fresco dos veces por semana en las placas transfectadas restantes. En las dos semanas tras la primera adición de medio de selección la mayoría de las células en la placa del control negativo (transfectadas con 1,5 \mug de pAdApt35.LacZ) estaban muertas. En las placas transfectadas con pcDNA.nlsLacZ los clones empezaban a ser visibles. Puesto que las células transfectadas con pIG35.55K parecían ser más resistentes a G418, la concentración se subió a 0,75 mg/ml 3 semanas después de la transfección. Tres días y siete días después se recogieron un total de 196 clones celulares de las placas transfectadas con pIG35.55K y se sembraron en pocillos separados de placas de 96 pocillos.

Las células que quedaron tras recoger las colonias en dos placas de 10 cm de la transfección con 1 \mug de ADN pIG35.55K se tripsinizaron, se juntaron y se expandieron para dar un conjunto PER55K(1.0). Lo mismo se hizo para dos placas de la transfección con 1,5 \mug. El conjunto de células PER55K(1.0) se expandió y se sembró en 4 botellas T25 a una densidad de 3,5x106 células/botella para transfección para ensayar la generación de virus. Además, se sembraron 3 botellas T25 con células PER.C6 parentales a la misma densidad. Se digirió pAdApt35.eGFP (un plásmido adaptador basado en pAdApt35IP1 (descrito en WO 00/70071) pero que también contiene la proteínas fluorescente verde como gen marcador, que se clonó en pAdApt35IP1 como un fragmento HindIII-BamHI derivado de pIPspAdapt.eGFP (descrito en WO 02/24993)) con PacI para libelar las secuencias adenovíricas del esqueleto del plásmido. Se digirió pWE.Ad35.pIX-rITR (descrito en WO 00/70071) con NotI para liberar las secuencias adenovíricas del esqueleto del cósmido. Se transfectaron 2 botellas con células PER.C6 y 2 botellas con células PER55K(1.0) cada una con 2 \mug de pAdApt35.eGFP digerido y 6 \mug de pWE.Ad35.pIX-rITR digerido. Una botella de cada línea celular se transfectó con 8 \mug de pAdApt35.LacZ para medir la eficacia de transfección. La botella restante con células PER55K(1.0) sirvió como control negativo y se trató como las otras pero no recibió la mezcla de transfección. Todas las transfecciones se realizaron con LipofectAmina (Invitrogen/Life Technologies) según las instrucciones del fabricante usando para cada transfección un total de 8 \mug de ADN y 40 \mul de reactivo LipofectAmina. La mezcla de transfección se eliminó tras 4 horas de incubación y se añadió medio de cultivo fresco. Las transfecciones se realizaron el día después de la siembra de las células y de nuevo dos días después las células en las botellas T25 se transfirieron a botellas T80 excepto para las transfecciones control con LacZ. Estas se tiñeron con solución X-gal después de una fijación suave. Tras cinco horas de incubación con la solución de tinción, se estimó el porcentaje de células azules en aproximadamente el 90% en ambas botellas mostrando que la transfección había ido bien para ambas líneas celulares. Cuatro días después del pase a las botellas T80 los cultivos de PER55K(1.0) transfectados mostraron CPE inicial (efecto citopático, indicador de replicación de virus) con aproximadamente 100 sucesos/botella. Las células PER55K(1.0) no transfectadas se hicieron crecer a confluencia sin evidencia de CPE. En los cultivos de PER.C6 transfectados sólo fueron visibles tres sucesos de CPE en la monocapa confluente de células. De nuevo tres días después, los cultivos PER55K(1.0) transfectados mostraron CPE total, con todas las células redondeadas y despegadas en grumos. Por el contrario, en los cultivos de PER.C6 los pocos sucesos de CPE no habían progresado y las células estaban aún en monocapa. Esto confirma observaciones anteriores que la generación de virus basados en Ad35 con E1 delecionada en PER.C6 es muy ineficaz. También los cultivos no transfectados de PER55K(1.0) mostraron, como se esperaba, una monocapa confluente sin CPE. Se recogieron las células y el medio en las botellas de PER55K(1.0) con CPE total y se sometieron a dos ciclos congelación/descongelación tras lo que los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 3000 rpm durante 10 minutos en una centrífuga de mesa. Uno de los lisados crudos resultantes se usó para infectar un cultivo nuevo de células PER55K(1.0) en una botella T175 (1,5 ml/botella). Las células y el medio se recogieron a CPE total cuatro días después. Esto muestra que se habían formado virus infecciosos en las transfecciones iniciales. La expresión de GFP se confirmó mediante microscopía de fluorescencia de células A549 infectadas con los lisados crudos. El lisado crudo se usó después para analizar la complementación de este virus Ad35.AdApt.eGFP con E1 delecionada en los clones individuales como se describe a continuación.

Los clones descritos anteriormente que se recogieron de las células PER.C6 transfectadas con pIG35.55K se expandieron y se ensayaron funcionalmente para su capacidad de mantener la replicación de Ad35.AdApt.eGFP. A tal efecto, los clones se sembraron a dos densidades en placas de 6 pocillos y un día después se infectaron con 15 ml del lisado crudo descrito anteriormente. Se siguió el CPE al día siguiente. De los 146 clones ensayados de esta manera 19 dieron CPE total en el día 2 ó 3 y 68 dieron CPE total en el día 5 ó 6. El resto de los clones tuvo sólo CPE parcial o mostraron algunos sucesos que no progresaron. Los últimos eran indistinguibles de las células PER.C6 que se llevaron juntamente como control negativo.

Basado en estos resultados se hizo una selección de 24 clones que se cribaron adicionalmente para la capacidad de generar virus recombinantes con E1 delecionada tras transfección del plásmido adaptador pAdApt35.GFP y el clon largo del cósmido pWE.Ad.pIX-rITR. Para esto, los clones se sembraron en botellas T25 y se transfectaron con 2 \mug del adaptador y 6 \mug del plásmido esqueleto usando LipofectAmina como se ha descrito anteriormente. Dos días tras la transfección, las células se transfirieron a botellas T80 para prevenir la sobreconfluencia de los cultivos. De los 24 clones 5 dieron CPE total tres días tras el pase a T80 y otros 13 clones dieron CPE progresiva a total el día después. Los 6 clones restantes no mostraron CPE o solo inicial. En comparación: la generación rutinaria de vectores Ad5 con E1 delecionada en células PER.C6 generalmente da como resultado CPE total de cuatro a seis días tras la transferencia a botellas T80.

Esto muestra que los nuevos clones complementan de forma eficaz vectores adenovirales con E1 delecionada. Uno de los clones (clon #16) descritos anteriormente se usó para generar y producir múltiples lotes de virus Ad35 con E1 y E1/E3 delecionadas que contenían diferentes transgenes. Para ello, los virus en lisados crudos resultantes de las transfecciones como se han descrito anteriormente, pero usando diferentes plásmidos adaptadores, se purificaron por placa en la nueva línea celular. Se ensayaron las placas individuales para la actividad del transgén y después se amplificaron para producción a escala media en 4-8 botellas de capa triple (3x175 cm/botella). Las células se recogieron a CPE total y el virus se liberó y se purificó como se hace rutinariamente para los adenovirus. La cantidad de partículas de virus se determinó mediante HPLC (Shabram et al., 1997). La tabla I presenta los rendimientos tras el procesamiento posterior de las producciones a escala media de virus Ad35 con E1 y E1/E3 delecionadas en botellas de triple capa con células PER55K del clon #16. La cantidad de partículas de virus purificada es comparable con los rendimientos de vectores basados de Ad5 en células PER.C6.

Se concluye que se han generado múltiples líneas celulares que complementan de forma eficaz vectores basados en Ad35 con E1 completamente delecionada. De esta manera, la expresión de E1B-55K de Ad35 en una línea celular de complementación de Ad5 facilita la replicación de vectores Ad35.

Ejemplo 2 Generación de pWE.Ad.pIX-rITR\DeltaE3

La región temprana 3 de los adenovirus humanos contiene múltiples regiones codificantes de proteínas que interfieren con la respuesta inmune del huésped a la infección adenovírica. Cuando se usan vectores adenovirales como soporte de vacunas no se quiere tal interferencia. Por lo tanto, se construyó un cósmido con esqueleto de Ad35 que carece de la región E3.

Para esto, se digirió la construcción pBr.Ad35.PRn (Fig. 15; descrito en el ejemplo 13 en la publicación EP 1054064) con StuI y MluI y se purificó el fragmento del vector de 17,3 kb a partir de un gel de bajo punto de fusión (LMP) usando la enzima agarasa (Roche) según las instrucciones del fabricante. A continuación, se generó un fragmento de PCR en pBr.Ad35.PRn usando los cebadores 35E3for y 35E3rev. Para la amplificación se usó ADN polimerasa Pwo (Roche) según las instrucciones del fabricante y el programa se ajustó a: 94ºC durante 2 minutos, 30 ciclos de (94ºC durante 30 segundos, 58ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto) y una incubación final a 68ºC durante 8 minutos. El producto de PCR de 833 bp se purificó usando el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) y se digirió con MluI y StuI. El ADN digerido se purificó del gel usando el kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen). Ambos fragmentos aislados se ligaron y se transformaron en células competentes DH5a (Invitrogen/Life Technologies) para dar pBr.Ad35.PRn\DeltaE3 (Fig. 25). El plásmido se comprobó mediante análisis de restricción y secuenciación del inserto amplificado por PCR. La deleción de E3 se clonó después en esqueleto del cósmido pWE.Ad35.pIX-rITR. Para ello, se digirió pWE.Ad35.pIX-rITR con PacI y el ADN se purificó mediante precipitación con isopropanol y lavados con EtOH al 70%. Tras la resuspensión en agua milliQ, el ADN se digirió con SwaI y se purificó el vector de 22,8 kb que contenía el fragmento de un gel LMP usando la enzima agarasa como antes. La construcción pBr.Ad35.PRn\DeltaE3 se digirió con PacI y SwaI de la misma manera y el fragmento de 16,6 kb también se aisló usando la enzima agarasa. Ambos fragmentos aislados se ligaron usando 0,5-0,6 \mug de cada fragmento. Los fragmentos ligados se empaquetaron después usando extractos de empaquetamiento del fago \lambda (Stratagene) según las instrucciones del fabricante y se mezclaron con células STBL-2. Las bacterias se sembraron en placas de LB+Amp y las colonias resultantes se analizaron para la presencia de la construcción correcta. Esto produjo la construcción pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3 (Fig. 1). La deleción de E3 se extiende desde el nucleótido 27648 al 30320 de la secuencia de Ad35 (descrito en WO 00/70071) y de esta manera abarca una región de 2,6 kb.

La cotransfección de pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3 digerido con NotI y pAdApt35.eGFP digerido con pIPsp-1 (New England Biolabs) en las células PER55-clon #16 (descrito anteriormente) dio lugar a un virus basado en Ad35 que expresaba GFP. Tras el aislamiento del ADN vírico de estos virus, la amplificación por PCR de la región E3 mostró que los virus tenían 2,6 kb de secuencias de E3 delecionadas como se esperaba.

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Ejemplo 3 Límites en el tamaño de empaquetamiento de vectores basados en Ad35 con E1 delecionada

Se generaron vectores basados en Ad35 con E1 delecionada y E1/E3 delecionadas que contenían diferentes insertos mediante transfección de células PER55K-clon #16 (ver el ejemplo 1) con

1,5 \mug de un plásmido adaptador de Ad35 que lleva un transgén específico digerido con las enzimas PacI o pIPsp-1 para liberar el inserto del adenovirus de las secuencias del vector plásmido y,

4,5 \mug de pWE.Ad35.pIX-rITR digerido con NotI o con pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3 digerido con la enzima NotI.

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El flanco derecho de los plásmidos adaptadores y el extremo izquierdo del plásmido esqueleto contienen secuencias homólogas que median sucesos de recombinación que llevan a un genoma viral con E1 delecionada completa (como se describe en WO 00/70071).

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Las transfecciones se hicieron con 30 \mul de reactivo Lipofectamina (Invitrogen/Life Technologies) para cada serie de construcciones según las instrucciones del fabricante. Las mezclas de transfección se añadieron a las células PER55K clon 16 al 70% de confluencia en botellas T25. Se transfectaron las siguientes combinaciones:

1. pAdApt35IP1 + pWE.Ad35.pIX-rITR

2. pAdApt35IP1 + pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3

3. pAdApt35eGFP + pWE.Ad35.pIX-rITR

4. pAdApt35eGFP + pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3

5. pAdApt35Luc + pWE.Ad35.pIX-rITR

6. pAdApt35Luc + pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3

7. pAdApt35LacZ + pWE.Ad35.pIX-rITR

8. pAdApt35LacZ + pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3

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Los plásmidos adaptadores se digirieron con la enzima pIPsp-1 para liberar las secuencias de adenovirus del esqueleto del vector plásmido. pWE.Ad35.pIX-rITR y pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3 se digirieron con NotI antes de la transfección por la misma razón. La generación de los plásmidos adaptadores y del cósmido de esqueleto pWE.Ad35.pIX-rITR se ha descrito previamente en WO 00/70071. La generación de pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3 se ha descrito anteriormente.

Dos días después de la transfección las células se pasaron a T80 y se incubaron adicionalmente hasta que se obtuvo CPE total. Las células y el medio se recogieron 1-2 días después de notar la CPE total. Las mezclas se sometieron a un ciclo de congelación/descongelación y se centrifugaron a 1500 rpm durante 15 minutos para sedimentar los restos celulares, después de lo cual se recogieron los sobrenadantes. Los lisados crudos obtenidos de esta manera se usaron para obtener el ADN vírico. Para ello, se incubaron 275 \mul de material de lisado crudo con 10 \mul de DNasaI 10 mg/ml a 37ºC durante 30 minutos. Posteriormente, se añadieron 6,0 \mul de EDTA 0,5 M (pH 8,0), 7,5 \mul de SDS al 20% y 1,5 \mul de proteinasa K 20 mg/ml y se mezclaron mediante agitación. La mezcla se incubó después a 50ºC durante 1 hora. Por último, el ADN vírico se aisló usando el kit GeneClean Spin Kit (Bio 101, Inc.). Tras la elución del ADN vírico en 20 \mul de H2O milliQ, la región del transgén se analizó mediante amplificación por PCR. Para ello, se usaron los cebadores AdApt35CMVF y 35pIXR. Las amplificaciones se hicieron con 2 \mul del ADN vírico aislado usando ADN polimerasa Taq (Invitrogen). Las mezclas de reacción contenían 5 \mul de tampón 10x (Invitrogen), 2 \mul de MgCl2 50 mM, 5 \mul de dNTPs 2 mM, 3 \mul de cada cebador (solución madre 10 \muM) y 2,5 unidades de enzima Taq en un volumen total de 50 \mul. El programa se ajustó a 94ºC durante 2 minutos seguido por 30 ciclos de (94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 4 minutos). Las reacciones control se hicieron en 5 ng de plásmidos adaptadores. Después de terminar la PCR, se cargaron 5 \mul de la reacción en un gel para su análisis. La figura 2 muestra los resultados para las transfecciones mencionadas anteriormente. Los cebadores amplifican secuencias desde el extremo 5' del promotor CMV hasta el extremo 5' de la región codificante de pIX. Como se puede ver en la figura 2, los virus sin transgén o con inserto de GFP muestran la banda esperada (comparar con los controles de plásmido; carriles PL para cada virus). Se ven fragmentos más pequeños con los insertos mayores, luciferasa y LacZ, y estas deleciones se vuelven más prominentes con la mayor longitud total del virus (comparar los virus LacZ o Luc con y sin E3). De esta manera, la longitud creciente del genoma se corresponde con la aparición de deleciones en la región del transgén. El hecho de que la longitud total del genoma (también indicado en la Fig. 2) de Ad35.AdApt.eGFP y Ad35.AdApt.LacZ\DeltaE3, 33,7 y 33,4 kb respectivamente, sea comparable mientras que las deleciones solo se encuentran en la muestra del virus LacZ, indica que bien la secuencia o el tamaño del inserto en la región E1 anterior también puede tener influencia en la aparición de deleciones.

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Ejemplo 4 Comparación de secuencias de la región del gen pIX de adenovirus de serotipo 5 y 35

El descubrimiento de que al aumentar la longitud del genoma de los virus Ad35 recombinantes, se producen deleciones en la región del transgén podría sugerir, en analogía con los virus Ad5 deficientes en pIX (Ghosh-Choudhury et al., 1987), que hay un problema con la estabilidad de las cápsides. El hecho de que se puedan hacer los virus Ad35.E1B+AdApt.Luc (donde las secuencias de E1A se cambian por el casete AdApt.Luc), con una longitud total de 36,7 kb, indica que la deleción de E1B tiene un papel. Esto podría ser bien a través de una función de una de las proteínas de E1B por si mismas o a través de una función de secuencias reguladoras desconocidas en esta región que tienen influencia en la expresión de otras proteínas adenovíricas. No se ha descrito, que se sepa, que las proteínas de E1B por si mismas tengan influencia en la capacidad de empaquetamiento de adenovirus. Sin embargo, se ha descrito que la proteína E1B-21K estabiliza ADN transfectado de forma no específica (Herrman y Mathews, 1989) y que mutaciones en la proteína 21K producen degradación de ADN celular y vírico durante la infección (Pilder et al., 1984; White et al., 1984). Puesto que la proteína E1B-21K de Ad5 se expresa en células PER.C6, estos descubrimientos no proporcionan ninguna explicación para estas observaciones. El gen pIX está localizado directamente en el 3' de la región codificante de E1B-55K. Se sabe que para Ad5 el promotor y las secuencias codificantes de pIX están localizadas en la región de transcripción E1B ya que pIX y E1B comparten la señal de poliadenilación. Se han estudiado las secuencias mínimas de promotor necesarias para la expresión de pIX en el caso de Ad5 (Babiss y Vales, 1991). Se mostró que un fragmento del promotor que contiene el sitio SP1 corriente arriba y la secuencia de la caja TATA era suficiente para la expresión de pIX. Se mostró que el espaciamiento entre el sitio Sp1 y la caja TATA así como la secuencia misma de la caja TATA, tenían influencia en el nivel de expresión de pIX. No se sabe si la región correspondiente en Ad35 es también suficiente para dirigir la expresión de pIX a un nivel lo suficientemente alto para virus estables. La comparación de secuencias reveló que tanto el sitio Sp1 como la secuencia TATA son diferentes de las encontradas en el promotor de pIX en Ad5. Usando la información de secuencias disponible de Genbank, se hizo una comparación de las secuencias corriente arriba proximales de pIX (es decir entre el codón de terminación de E1B-55K y el codón de iniciación del gen pIX) de serotipos de diferentes subgrupos. Se usaron los siguientes adenovirus con SEQ ID NOs. y secuencias de referencia de Genbank para la comparación: Ad2 (SEQ. ID. NO. 45; Genbank NC_001405), Ad5 (SEQ. ID. NO. 46; Genbank M73260), Ad12 (SEQ. ID. NO. 47; Genbank NC_001460), Ad9 (SEQ. ID. NO. 48; Genbank AF099665), Ad40 (SEQ. ID. NO. 49; Genbank L19443), Ad4 (SEQ. ID. NO. 50; NC_003266), Simio 25 (SEQ. ID. NO. 51; Genbank AF394196), Ad7 (SEQ. ID. NO. 54; Genbank AD7001). La secuencia de Ad35 (SEQ. ID. NO. 52) se publicó en WO 00/70071. La secuencia de Ad1 (SEQ. ID. NO. 53) se ha publicado antes y se proporciona aquí. La Fig. 3A muestra un alineamiento de las secuencias mencionadas anteriormente entre el codón de terminación de la proteína E1B-55K (los 3 primeros nucleótidos en todas las secuencias) y el codón de iniciación de la proteína pIX (los 3 últimos nucleótidos). El sitio Sp1 y la secuencia TATA en Ad2 y Ad5 están en una caja. En la mayoría de los casos hay insuficiente homología para señalar directamente las cajas Sp1 y TATA en las otras secuencias. Por lo tanto, se usaron las secuencias consenso para las cajas GC y TATA como publicó Bucher, P (1990) para identificar Sp1 y la caja TATA putativas en las varias secuencias. La Fig. 3b muestras las secuencias putativas de Sp1 y caja TATA y el espaciamiento entre ellas. Ad12, Ad9 y Ad40, que pertenecen respectivamente a los subgrupos A, D y F, tienen secuencias Sp1 y TATA que se parecen bastante a la secuencia consenso. Sin embargo, la distancia entre las dos cajas es más pequeña que para Ad5 y Ad2. Esto no es insólito ya que el promotor E1B de Ad5 también contiene una caja Sp1 y una secuencia TATA con un espaciamiento de 11 nucleótidos. Sin embargo, una deleción de 9 nucleótidos (de los 20) en la secuencia del promotor de pIX en Ad5 entre las cajas Sp1 y TATA produjo niveles reducidos de pIX (Babiss y Vales, 1991). Los serotipos Ad35, Ad11 y Ad7del subgrupo B así como el virus Ad4 del subgrupo E, tienen secuencias de la caja TATA divergentes y espaciamiento diferente entre la secuencia Sp1 y la caja TATA putativas. La región proximal de pIX en el adenovirus humano de tipo 4 es idéntica a aquella del adenovirus de simio 25 (CV68), un serotipo que se ha propuesto recientemente como vector terapéutico (Farina et al., 2001). De esta manera, también para vectores deficientes en replicación basados en adenovirus no humanos la expresión de pIX puede ser insuficiente para cápsides estables.

También pudiera ser que la expresión de pIX se regule de forma diferente en virus Ad35 y otros adenovirus humanos y no humanos y que las secuencias reguladoras, o incluso las secuencias del promotor mismo, estuvieran situadas más lejos corriente arriba en las secuencias de E1B o incluso más allá. De forma alternativa, también es posible que, puesto que la expresión de pIX se activa por las proteínas E1A, se obtuvieran altos niveles de expresión de pIX en presencia de proteínas de E1A que pertenecen al mismo serotipo o subgrupo.

Se ensayó si cambiar las secuencias corriente arriba de pIX proximales endógenas por un promotor heterólogo para aumentar la expresión de pIX en el vector, produciría virus más estables y una capacidad de empaquetamiento mejor (infra). De forma alternativa, la función de pIX se puede administrar en trans a través de la línea celular de empaquetamiento. Como un ejemplo no limitante se describen virus recombinantes basados en Ad35 que tienen un promotor de pIX proximal no endógeno como se encuentra en los virus Ad5, y se muestra que estos virus tienen una mejor estabilidad que los vectores recombinantes sin cambiar.

Ejemplo 5 Generación de plásmidos adaptadores con un promotor de pIX de Ad5

pAdApt535 es una plásmido adaptador de Ad35 que tiene parte de las secuencias del promotor de pIX de Ad5 pero es por lo demás idéntico al plásmido adaptador de Ad35 pAdApt35IP1 (ver WO 00/70071). Su construcción se describe a continuación:

Se generó un primer fragmento de PCR con los cebadores SV40for y pIX5Rmfe. La reacción se hizo con ADN polimerasa Pwo (Roche) según las instrucciones del fabricante pero con DMSO al 3% en la mezcla final. Se usó pAdApt, un plásmido adaptador para virus Ad5 con E1 delecionada (10 ng; ver WO 00/70071) como molde. El programa se ajustó como sigue: 2 minutos a 94ºC y después 30 ciclos de (94ºC durante 30 segundos (fusión), 52ºC durante 30 segundos (alineamiento) y 72ºC durante 30 segundos (elongación)) seguido por 8 minutos a 72ºC. Los fragmentos de PCR resultantes contenían el extremo 3' de la señal de poliadenilación del SV40 de pAdApt y la región del promotor de pIX de Ad5 como está presente en el número de acceso de Genbank M73260 desde el nucleótido 3511 hasta el nucleótido 3586 y un sitio MfeI en extremo 3'.

Se generó un segundo fragmento de PCR como se ha descrito antes pero con los cebadores pIX35Fmfe y 35R4. Se usaron 100 ng de pAdApt35IP1 como molde, el alineamiento se ajustó a 58ºC durante 30 segundos y la elongación del programa de PCR se ajustó a 72ºC durante 90 segundos. Esta PCR amplifica las secuencias de Ad35 desde el nucleótido 3467 hasta el nucleótido 4669 (numeración de secuencia como en WO 00/70071) y añade un sitio MfeI al extremo 5'.

Ambos fragmentos de PCR se digirieron después con MfeI y se purificaron usando el kit de purificación de PCR Qiagen (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Se estimó la concentración de los fragmentos purificados corriendo una muestra en un gel de agarosa y se mezclaron cantidades equimolares aproximadas de los dos fragmentos en una reacción de ligación que contenía 5 \mug de ADN, 4 \mul de tampón de ligasa 10x y 2 \mul de enzima ligasa (New England Biolabs) en un volumen de 40 \mul. Tras una incubación de >2 horas a temperatura ambiente, la mezcla se cargó en un gel de agarosa al 1,2% en TAE y los fragmentos de ADN de 1,4 kb de longitud se aislaron con el kit Geneclean II (Bio101, Inc.) según las instrucciones del fabricante.

El ADN se eluyó en 30 \mul de H2O estéril y se usó 1 \mul en una reacción de amplificación de PCR con los cebadores SV40for y 35R4 como se ha descrito anteriormente. La PCR se hizo como se ha descrito anteriormente con una temperatura de alineamiento de 52ºC y un tiempo de elongación de 90 segundos. El producto resultante se aisló del gel usando el kit de extracción de gel de Qiagen y se digirió con AgeI y BglII. La banda de 0,86 kb resultante se aisló del gel usando el kit Geneclean II según las instrucciones del fabricante.

También se digirió pAdApt35.Luc (descrito en WO 00/70071) con BglII y AgeI y el fragmento del vector de 5,8 kb se aisló del gel usando el kit Geneclean II como antes. Este fragmento se ligó con el fragmento BglII-AgeI aislado descrito anteriormente que contenía el promotor quimérico de pIX Ad5-Ad35, para dar pAdApt535.Luc (Fig. 4).

Se hicieron después otros plásmidos adaptadores que contenían el promotor de pIX de Ad5 como sigue:

Se digirió pAdApt535.Luc con BglII y ApaI y el inserto de 1,2 kb se purificó del gel usando el kit Geneclean II según las instrucciones del fabricante. También se digirió pAdApt35IP1 con BglII y ApaI y el fragmento del vector de 3,6 kb se aisló como antes. La ligación de ambos fragmentos aislados dio como resultado pAdApt535 (Fig. 5). A continuación, se usó pAdApt535 para clonar otros genes marcadores como eGFP (derivada de pAdApt35.eGFP) y LacZ (derivada de pAdApt35.LacZ) en el sitio múltiple de clonación usando técnicas estándar de clonación dando lugar a pAdApt535.eGFP y pAdApt535.LacZ.

Ejemplo 6 Generación de vectores basados en Ad35 con E1 delecionada con plásmidos adaptadores que contienen el promotor de pIX de Ad5

Se generaron virus recombinantes mediante transfección de plásmidos adaptadores y cósmidos de esqueletos de vectores de Ad35 en células PER55K clon 16 como se ha descrito anteriormente. Para ello, se usaron la siguiente serie de plásmidos:

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T1. pAdApt535eGFP + pWE.Ad35.pIX-rITR

T2. pAdApt535eGFP + pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3

T3. pAdApt35Luc + pWE.Ad35.pIX-rITR

T4. pAdApt535Luc + pWE.Ad35.pIX-rITR

T5. pAdApt535Luc + pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3

T6. pAdApt535LacZ + pWE.Ad35.pIX-rITR

T7. pAdApt535LacZ + pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3

T8. pAdApt35LacZ + pWE.Ad35.pIX-rITR

T9. pAdApt535LacZ + pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3

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Los plásmidos AdApt se digirieron con PacI excepto pAdApt535.Luc y pAdApt35.Luc que se digirieron con la enzima pIPsp-1 y pWE.Ad35.pIX-rITR y pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3 se digirieron con NotI antes de la transfección. Se mezclaron 2 \mug de cada plásmido adaptador y 6 \mug de ADN esqueleto con 40 \mul de Lipofectamina (Invitrogen/Life Technologies) según las instrucciones del fabricante y se incubaron con células PER55K clon 16 en botellas T25 al 70% de confluencia. El medio de transfección se eliminó después de 4 horas y las células se incubaron adicionalmente a 37ºC/CO2 al 10%. Dos días después de la transfección, las células se pasaron a botellas T80 y se puntuó la aparición de efecto citopático (CPE) en los días siguientes. Cinco días después todos los cultivos mostraron CPE progresivo o total excepto T6 (no CPE) y T8 (sucesos de CPE). De nuevo dos días después, T6 y T8 mostraron CPE inicial y todos los otros CPE total. Todos los cultivos se recogieron recogiendo el medio y las células. Las mezclas se almacenaron a -20ºC. Tras descongelar las muestras, las mezclas se centrifugaron a 1500 rpm durante 15 minutos para precipitar los restos celulares y se recogieron los sobrenadantes. Se usaron 2 ml de algunas muestras (los cuatro virus que expresan LacZ, T6-T9) para infectar de nuevo de células PER55K clon 16 al 80% de confluencia en una botella T80 para amplificar más el título del virus. Se recogieron las células y el medio tras CPE progresivo (T6+T8) o total (T7+T9) y se prepararon lisados crudos como se ha descrito anteriormente.

Los lisados crudos obtenidos de esta manera se usaron para aislar ADN vírico. Para ello, se incubaron 275 \mul de material de lisado crudo con 10 \mul de DNasaI 10 mg/ml a 37ºC durante 30 minutos. Posteriormente, se añadieron 6,0 \mul de EDTA 0,5 M (pH 8,0), 7,5 \mul de SDS al 20% y 1,5 \mul de proteinasa K 20 mg/ml y se mezclaron mediante agitación. La mezcla se incubó entonces a 50ºC durante 1 hora. Por último, el ADN vírico se aisló usando el kit GeneClean Spin Kit (Bio 101, Inc.). El ADN vírico se eluyó en 50 \mul de H2O milliQ y se usaron muestras de 5 \mul para analizar la región del transgén. Se debe notar que los cósmidos esqueleto pWE.Ad35.pIX-rITR+/-E3 no se cambiaron y por lo tanto todavía contenían el promotor de pIX de Ad35. Puesto que este promotor está localizado en el extremo 5' más alejado del cósmido, las posibilidades de un suceso de recombinación que dieran como resultado el promotor salvaje de Ad35 se consideraron pequeñas. Sin embargo, no se podría excluir en esta situación que se generaran virus que todavía contuvieran el promotor de pIX de Ad35. Por lo tanto, se realizaron dos amplificaciones específicas por PCR en cada preparación de virus: la primera se hizo con la serie de cebadores 1 (específicos para Ad35): AdApt35CMVF y AdApt35pIXrev. Esta PCR amplifica específicamente la región del transgén en virus que contienen el promotor de pIX de Ad35. La reacción de PCR se hizo con 5 \mul de las muestras de ADN vírico aislado con Taq polimerasa recombinante (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante pero usando MgCl2 4 mM y 4 unidades de enzima Taq en las reacciones. El programa de PCR se ajustó a 94ºC durante 2 minutos seguido por 30 ciclos de (94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 5 minutos) y finalizó con un paso final de 8 minutos a 68ºC.

La segunda se hizo con los cebadores AdApt35CMVF y pIX5Rmfe y de esta manera específicamente amplifica la región del transgén en virus que contienen el promotor de pIX de Ad5 (serie de cebadores 2).

La amplificación por PCR se hizo con 5 \mul de ADN vírico aislado usando ADN polimerasa Pwo (2,5 unidades/\mul Genaxis) en un volumen de 50 \mul que contenía 0,3 \mul de cada cebador (solución madre 100 \muM), 5 \mul de mezcla de dNTPs 2 mM, 5 \mul de tampón 10x completo (incluyendo Mg2+), 1,5 \mul de DMSO y 0,8 \mul de enzima Pwo. El programa de PCR se ajustó a 94ºC durante 2 minutos seguido por 30 ciclos de (94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 5 minutos) y finalizó con un paso final de 8 minutos a 68ºC. Durante la PCR las rampas de calentamiento y enfriamiento se ajustaron a 2ºC/segundo. Después, se añadieron 5 \mul de tampón de carga a las muestras y se cargaron 8 \mul de la mezcla en un gel para su análisis.

Los virus Ad35 con deleciones en E1 y E1/E3 que contenían la secuencia del promotor de pIX de Ad5 y el transgén eGFP (transfecciones T1 y T2) tenían bandas amplificadas por PCR a la altura esperada sin fragmentos más cortos. La Fig. 6a muestra los resultados para las amplificaciones por PCR en los virus con deleción de E1 que llevan luciferasa (transfecciones T3 y T4). Los carriles 5-8 son las PCRs control en los plásmidos AdApt535Luc (carriles 5 y 6) y AdApt35Luc (carriles 7 y 8) con ambas series de cebadores. Los carriles 1-4 son las PCRs en los ADN víricos aislados. La serie de cebadores 1 (específicos para la región pIX de Ad35) amplifica una banda de la longitud esperada y muestra además fragmentos más cortos en virus Ad35.AdApt35.Luc (carril 4; comparar también la Fig. 2 luciferasa+E3). Por el contrario, la serie de cebadores 2 (específicos para el promotor de pIX de Ad5) sólo muestra banda del tamaño esperado sin fragmentos de deleción cuando se hacen los virus con el plásmido AdApt535.Luc (carril 1). A partir de esto se concluye que la inserción de secuencias del promotor de pIX de Ad5 aumenta la estabilidad y la capacidad de empaquetamiento de virus Ad35 con E1 delecionada. La figura 6b confirma estos resultados para virus Ad35 con deleción E1/E3 que llevan el transgén LacZ. Los carriles 1-4 son las PCR controles en los plásmidos AdApt535.LacZ y AdApt35.LacZ con cada serie de cebadores. Se ven algunas bandas de fondo especialmente con la serie de cebadores 1 (carriles 2 y 4) pero también se ve una banda específica fuerte a la altura esperada para cada serie de cebadores en las muestras homólogas (carriles 1 y 4). El ADN vírico se aisló tras la transfección y tras una ronda de amplificación como se describe anteriormente. De forma sorprendente, la serie de cebadores 2 genera el fragmento esperado en los virus Ad35.AdApt535.LacZ sin fragmentos de deleción (carriles 5 y 9) mientras que la muestra con virus que contienen la secuencia del promotor de pIX de Ad35 claramente muestra fragmentos de deleción además de un fragmento de la longitud correcta (visible tras amplificación (carril 11).

En conjunto, estos resultados muestran que la sustitución de las secuencias del promotor de pIX de Ad35 por las secuencias del promotor de pIX de Ad5 aumenta la estabilidad de la región del transgén en virus con genomas mayores. Promotores más fuertes o elementos adicionales de promotor pueden incluso aumentar este efecto.

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Ejemplo 7 Generación de pWE.Ad35-3481

Como se ha indicado anteriormente, el inserto de adenovirus en el cósmido pWE.Ad35.pIX-rITR contiene el promotor de pIX de Ad35 en su extremo 5'. Esto podría producir reinserción del promotor de pIX de Ad35 en virus generados con los plásmidos adaptadores basados en pAdApt535. Por lo tanto, se hizo una nueva versión del cósmido de esqueleto de Ad35 que carece de las secuencias del promotor de pIX. Para ello, se generó un fragmento de PCR con los cebadores pIXcosF-2 y Adapt35-3. La amplificación se hizo con ADN polimerasa Pwo (2,5 unidades/\mul Genaxis) en un volumen de 50 \mul que contenía 3 \mul de cada cebador (solución madre 10 \muM), 5 \mul de mezcla de dNTPs 2 mM, 5 \mul de tampón 10x completo (incluyendo Mg2+), 1,5 \mul de DMSO, 0,5 \mul de enzima Pwo y 10 ng de molde pAdApt35IP1. El programa de PCR se ajustó a 94ºC durante 2 minutos seguido por 5 ciclos de (94ºC durante 30 segundos, 58ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1,5 minutos) y después 25 ciclos de (94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1,5 minutos) y finalizó con un paso final de 8 minutos a 68ºC. El producto de PCR resultante de 1,2 kb contiene las secuencias de Ad35 desde el nucleótido 3481 hasta el nucleótido 4663 (numeración según la secuencia de Ad35 publicada en WO 00/70071) con un sitio AatII y uno NotI unidos al extremo 5'. El producto de PCR se purificó usando el kit de purificación de PCR (Qiagen) según las instrucciones del fabricante y se clonó en el vector pPCR-Script Amp (Stratagene) según las instrucciones del fabricante. La secuencia del fragmento clonado se verifica después mediante secuenciación y posteriormente se elimina de la construcción mediante digestión con AatII y AgeI. El fragmento de 780 bp resultante se purifica del gel usando el kit de centrifugación Geneclean (Bio101, Inc.) según las instrucciones del fabricante.

La construcción pWE.Ad35\DeltaNdeI (descrita más adelante) también se digiere con AatII y AgeI y el fragmento de vector de 12 kb resultante se aísla del gel usando el kit de centrifugación Geneclean (Bio101, Inc.) según las instrucciones del fabricante. La ligación de ambos fragmentos aislado da como resultado la construcción pWE.Ad35-3481\DeltaNdeI.

La generación de la construcción pWE.Ad35\DeltaNdeI se describe en WO 00/70071 y contiene las secuencias de Ad35 desde el nucleótido 3401 al sitio NdeI en el nucleótido 6541 y las secuencias de Ad35 desde el sitio NdeI en el nucleótido 33167 hasta el final de la ITR derecha por lo que ambos fragmentos de Ad35 están unidos a través del sitio NdeI (ver también la figura 13 en WO 00/70071).

pWE.Ad35-3481\DeltaNdeI se lineariza después con NdeI, se desfosforila con enzima CIP (New England Biolabs) y se purifica del gel usando el kit de centrifugación Geneclean (Bio101, Inc.) según las instrucciones del fabricante. Este fragmento de vector se liga después con un fragmento NdeI de 26,6 kb aislado del ADN de Ad35 salvaje después de lo cual la mezcla se usa para empaquetar el cósmido usando extractos de empaquetamiento del fago \lambda (Stratagene) según las instrucciones del fabricante. La mezcla resultante se usa para transformar bacterias STBL-2 (Invitrogen), dando lugar a pWE.Ad35-3481.

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Ejemplo 8 Construcción de pIG35.55K

La construcción pIG35.55K contiene las secuencias codificantes del gen E1B-55K de Ad35 operativamente unidas al promotor de la fosfoglicerato quinasa humana (hPGK) y la secuencia de poliadenilación de HBV. Además, contiene el gen de resistencia a neomicina operativamente unido al promotor de RSV y a HBV pA. La construcción de pIG35.55K se describe a continuación.

Se digirió la construcción pIG270 (descrita en WO 00/70071) con EcoRI, se trató con enzima de Klenow y se purificó usando un kit de purificación de PCR (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. El ADN recuperado se digirió después con AgeI y el fragmento del vector de \sim5 kb se aisló del gel usando el kit Geneclean (Bio101, Inc.) según las instrucciones del fabricante. A continuación, se amplificaron las secuencias E1B-55K de Ad35 mediante PCR en el ADN molde pIG270 usando los cebadores 35D21 y 35B3. La amplificación por PCR se hizo con ADN polimerasa Pwo (Roche) en 2 ng de ADN molde según las instrucciones del fabricante pero usando DMSO a una concentración final del 3% en la mezcla de PCR. El programa se ajustó a: 94ºC durante 2 minutos seguido por 25 ciclos de (94ºC durante 30 segundos, 56ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos) y finalizó con una incubación final a 72ºC durante 10 minutos. El fragmento de PCR resultante se purificó usando el kit de purificación de PCR (Qiagen) y se digirió con NcoI. Tras el tratamiento con Klenow para rellenar los extremos protuberantes, el ADN se digirió adicionalmente con AgeI y se purificó de nuevo por columna. El fragmento de PCR tratado de esta manera se clonó entonces en el fragmento de vector digerido con EcoRI/AgeI preparado anteriormente para dar pIG270.\DeltaE1A\Delta21K. pIG270.\DeltaE1A\Delta21K se digirió con AvrII y XbaI y los extremos protuberantes se rellenaron usando la enzima Klenow. Se aisló el fragmento de 2,9 kb que contenía el promotor PGK y las secuencias E1B-55K de Ad35 del gel como se ha descrito anteriormente. A continuación, se digirió pRSVneo4 (construcción descrita más adelante) con BglII, se hicieron los extremos romos con la enzima Klenow, se desfosforiló y se aisló del gel. Se ligó entonces el fragmento romo AvrII/XbaI de pIG270.\DeltaE1A\Delta21K en el fragmento de vector pRSVneo4 preparado anteriormente para dar pIG35.55K.

pRSVneo4 se generó como sigue: se digirió la construcción pRSVhbvNeo (descrita en WO 00/70071) con ScaI y BamHI y se rellenaron los extremos protuberantes usando la enzima Klenow. Se aisló el fragmento de 1070 bp que contenía el gen de resistencia a ampicilina y el promotor RSV del gel usando el kit Geneclean (BIO 101, Inc.). A continuación, se digirió pRSVhbvNeo con ScaI y EcoRI, se hicieron los extremos romos con Klenow y se aisló el fragmento de 3,2 kb que contenía el gen neo, HBV pA, vector y parte del gen de ampicilina como antes. Los dos fragmentos se ligaron después para dar pRSVneo4.

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Ejemplo 9 La expresión aumentada de pIX mediada por el promotor RSV aumenta la estabilidad de los virus Ad35

Como ejemplo de un promotor heterólogo que dirige la expresión del gen pIX, se insertó el promotor de RSV en los plásmidos adaptadores de Ad35 que contenían los genes indicadores LacZ o luciferasa. El promotor RSV corresponde a un fragmento NruI/ApaLI obtenible de pRc-RSV (Invitrogen). Los extremos protuberantes se rellenaron con enzima Klenow (New England Biolabs) según las instrucciones del fabricante. El fragmento de 388 bp que contenía el promotor RSV se aisló de un gel de agarosa usando el kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen). Se linealizaron los plásmidos adaptadores pAdApt35.Luc y pAdApt35.LacZ con BglII seguido por tratamiento con Klenow para hacer romos los extremos. BglII digiere justo detrás de la secuencia de poliadenilación de SV40 del casete de expresión del transgén. Para una descripción de los plásmidos adaptadores basados en pAdApt35 ver WO 00/70071. Los plásmidos adaptadores tratados se desfosforilaron después usando fosfatasa alcalina de gamba (SAP) según las instrucciones del fabricante (Roche). El fragmento aislado del promotor RSV se ligó después con cada uno de los vectores tratados y se transformó en bacterias DH5\alpha competentes (Invitrogen). Se analizaron las colonias para la inserción del promotor RSV orientado hacia delante relativo al gen pIX produciendo pAdApt35.Luc.rsv y pAdApt35.LacZ.rsv.

Además, se generó un plásmido adaptador de secuencias que se aislaron mediante PCR de un virus recombinante Ad35 que era resultado de la deleción de la región del transgén. El análisis de la preparación de un lisado crudo obtenido de un transfección de las construcciones pAdApt35.LacZ y de esqueleto de Ad35 pWE.Ad35.pIX-rITR y posterior purificación en placa mostró que el virus tenía una deleción en la región del transgén de aproximadamente 2,8 kb. Las secuencias 5' de este virus se amplificaron mediante PCR a partir de ADN aislado usando los cebadores 35F1 y 35R4. La reacción se hizo con ADN polimerasa Pwo (Roche) según las instrucciones del fabricante. Las condiciones del programa fueron las siguientes: 94ºC durante 2 minutos después 5 ciclos de (94ºC durante 30 segundos, 48ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2,5 minutos) seguido por 25 ciclos de (94ºC durante 30 segundos, 56ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2,5 minutos) y finalizó mediante 8 minutos a 68ºC.

El fragmento resultante de 2 kb se purificó mediante el kit de purificación de PCR (Qiagen) y se clonó en el vector pCR-Script-Amp (Stratagene) según las instrucciones del fabricante dando como resultado pCR.Ad3502,8kb. Este plásmido se secuenció para determinar la extensión de la deleción. La deleción afectaba a la mayoría del promotor CMV, el transgén y el poli-A de SV40. Esto resultó en la unión de las 317 bp en 5' del promotor CMV a las secuencias corriente arriba del gen pIX de Ad35. Este fragmento de CMV contiene tres cajas GC y una repetición de 21 bp (Boshart et al., 1985). Posiblemente, las secuencias restantes del promotor de CMV podrían aumentar la expresión de pIX dando como resultado un virus más estable. Una posibilidad alternativa era que siendo el virus más pequeño, en si mismo produjera un aumento de la estabilidad. Para investigar esto, se clonó de nuevo un casete de expresión completo de la siguiente manera, y se generaron virus con este nuevo plásmido adaptador. El vector basado en pCR-Script que contenía las secuencias amplificadas (renombrado pCR.C4) tenía un sitio AvrII único que precedía las secuencias \DeltaCMV-pIX. El vector se linearizó con AvrII, se hicieron los extremos romos con enzima Klenow y se desfosforiló usando la enzima SAP (Roche) como se ha descrito anteriormente. Se digirieron los plásmidos adaptadores pAdApt35.LacZ (Ejemplo 5) y pAdApt.Luc (WO 00/70071) con AvrII y BglII y el ADN se trató con Klenow para rellenar los extremos protuberantes. Los fragmentos correspondientes a los casetes de expresión de LacZ y luciferasa (CMV-TG-pA) se aislaron del gel como antes y se ligaron con el vector pCR.C4 linearizado con AvrII. La transformación en células competentes se hizo como antes y la selección de colonias que tenían los casetes en orientación hacia delante relativa a la ITR izquierda, produjo pCR.C4.LacZ y pCR.C4.Luc.

Se generaron virus Ad35 según se ha descrito en el ejemplo 6 usando los nuevos plásmidos adaptadores:
pCR.C4.LacZ digerido con PacI, pCR.C4.Luc digerido con ApaI y pAdApt35.LacZ.rsv y pAdApt35.Luc.rsv digerido cada uno con PI-PspI.

Los plásmidos adaptadores se cotransfectaron en células PER55K (WO 02/40665) con pWE.Ad35.pIX-rITR o pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3 digeridos con NotI. Además, se digirió un plásmido adaptador pBr.Ad35.\DeltaE1A\Delta21K.Luc (construcción descrita más adelante) con PI-PspI y se cotransfectó con pWE.Ad35.pIX-rITR digerido con NotI. Tras efecto citopatogénico (CPE) total los cultivos se recogieron mediante un ciclo de congelación/descongelación y se centrifugaron para eliminar los restos celulares. Se usaron después 300 \mul de los lisados clarificados resultantes para reinfectar células PER55K sembradas el día anterior en botellas T80. Tras CPE total, se prepararon lisados crudos y se usaron para infectar células A549 para ensayar la expresión del transgén y para realizar un ensayo de placa en células PER55K.

Las células A549 se sembraron en placas de 6 pocillos a 5x105 células/pocillo y tras 5 horas se infectaron con 10, 1 ó 0,1 \mul de cada una de las soluciones de virus con LacZ y se incubaron durante dos días. Las células A549 se tiñeron después para la actividad de LacZ y se contaron las células azules. El porcentaje de células azules se da en la tabla II.

Los virus que expresan LacZ son claramente más estables cuando el promotor RSV dirige la expresión del gen pIX comparados con el promotor CMV delecionado. Estos resultados se confirman con los virus con luciferasa. Para medir la actividad de los virus con luciferasa se sembraron células A549 en placas de 24 pocillos a 1x105 células/pocillo y se infectaron con 10, 1, 0,1 ó 0,001 \mul de cada una de las soluciones de virus y se incubaron. Después de dos días, las células se lavaron con PBS dos veces y se suspendieron en 100 \mul de tampón de lisis (Promega) y se almacenaron a -20ºC hasta su uso. La luciferasa se midió usando el sistema de ensayo de luciferasa Steady-Glo (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan en la Tabla III.

En el ejemplo 3 se describió que los virus Ad35 con E1 completamente delecionada que contenían la región E3 y un casete de expresión AdApt.Luc o AdApt.LacZ no eran estables. Aparentemente, en las nuevas construcciones descritas el promotor CMV delecionado delante de pIX no prevenía la deleción de la región del transgén. Con el promotor RSV dirigiendo el gen pIX sin embargo, ahora se es capaz de generar virus de mayor longitud que los salvajes. Ad35.AdApt.Luc.rsv y Ad35.AdApt.LacZ.rsv tienen 35 kb y 36,5 kb respectivamente (ver también la figura 2). Ad35.\DeltaE1A\Delta21K.Luc (36,4 kb) también mostró alta actividad del transgén.

A continuación se probó si los virus estarían intactos después de la purificación en placa. Para ello, se sembraron células PER55K en placas de 6 pocillos a 0,9x106 células/pocillo y se infectaron con diferentes diluciones de 10 diez veces de los lisados crudos de Ad35.AdApt.LacZ. Se sembraron diluciones de 10-5 a 10-8 y al día siguiente se añadió un recubrimiento de agar. Para ello, las células se lavaron primero con PBS y después se añadieron 3 ml de una solución precalentada de agar preparada mezclando 2xMEM (GibcoBRL; 9,14 ml), SBT (Gibco; 0,36 ml), MgCl (4,9 M; 0,037 ml) con agarosa (Seaplaque GTG; al 2,5% en H2O, 7,2 ml). Después de la solidificación las placas se incubaron a 37ºC/CO2 al 5%. Cuatro días después las placas eran visibles y se añadió una solución de tinción de LacZ a los pocillos sobre el agar y se dejó drenar. Todos los virus mostraron placas claras, separadas en el rango de 10-7 a 10-9 pero sólo en el caso de los virus con el promotor RSV dirigiendo el gen pIX todas las placas se tiñeron de azul. En ambos casos donde el promotor CMV delecionado dirige pIX al menos parte de las placas no se tiñeron. Esto claramente muestra que el tamaño de genoma empaquetable/estabilidad aumenta en virus que tienen el promotor RSV regulando pIX.

Esta invención proporciona por primera vez un adenovirus recombinante estable derivado de o basado en un adenovirus de serotipo 35 que carece de la expresión de un gen de E1B funcional. Tal adenovirus tiene al menos una deleción en la región E1. En formas de realización particulares proporcionadas por la invención, dichos adenovirus recombinantes estables tienen secuencias de insertos exógenos de más de 4,2 kb, y un tamaño de genoma empaquetado de más de 33,4 kb, usando métodos según la invención. Es por lo tanto un objeto de la presente invención proporcionar un adenovirus recombinante estable que: a) lleva una secuencia exógena de ácido nucleico de más de 4,2 kb y/o b) tiene un tamaño de genoma empaquetado de más de 33,4 kb. En formas de realización particulares, la invención proporciona un adenovirus recombinante basado en Ad35 o Ad11 que: a) lleva una secuencia exógena de ácido nucleico de al menos 4,6 kb y/o b) tiene un tamaño de genoma empaquetado de más de 33,8 kb. De forma alternativa o además de eso, dichos tamaños de genoma empaquetados son de al menos 34,6, 35,0, 36,1 y 36,5 respectivamente. Las secuencias exógenas en estas formas de realización pueden incluir un promotor heterólogo que dirige la expresión de pIX. En otro aspecto, dicho adenovirus recombinante estable es de serotipo 11. Un adenovirus recombinante estable según este aspecto de la invención se puede pasar a una célula empaquetadora para proporcionar un lote de los adenovirus recombinantes, con menos del 10%, preferiblemente menos del 5%, preferiblemente ningún clon separado que de lugar a deleciones en las secuencias exógenas en el adenovirus recombinante, como se puede medir por ejemplo mediante el método de PCR ejemplificado en el ejemplo 3.

pBr.Ad35.\DeltaE1A\Delta21K.Luc (ver anteriormente) se hizo como sigue. Se digirió la construcción
pBr.Ad35.\DeltaE1A\Delta21K (WO 02/40665) con HpaI, se desfosforiló con CIP (New England Biolabs) y el fragmento de vector de 5 kb se aisló del gel. La construcción pBr.Ad35.\DeltaE1A.Luc también se digirió con HpaI y el inserto de 3,3 kb se aisló del gel y se ligó con el fragmento del vector aislado. Tras la transformación en células competentes STBL-2 (Invitrogen), se seleccionó una colonia con el inserto en la orientación correcta. Esto produjo la construcción pBr.Ad35.\DeltaE1A\Delta21K.Luc. pBr.Ad35.\DeltaE1A.Luc (también denominada pBr.Ad35.E1B+Luc, porque aún contiene la región E1B) se hizo insertando el casete AdApt.Luc, tomado de pAdApt.Luc tras digestión con AvrII y BglII y los extremos hechos romos con enzima Klenow, en el fragmento del vector pBr.Ad35.leftITR-pIX (WO 02/40665) digerido con SnaBI y HindIII y hechos romos los extremos con Klenow. Se seleccionaron las colonias con el casete de expresión en la orientación hacia delante, dando pBr.Ad35.\DeltaE1A.Luc.

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Ejemplo 10 Identificación de las secuencias reguladoras de pIX

Los ejemplos anteriores muestran que los virus Ad35 recombinantes en los que las regiones codificantes para E1A y E1B se eliminan completamente se vuelven progresivamente más inestables si se aumenta el tamaño del genoma. En esta solicitud se muestra que la adición de un promotor heterólogo que dirige la expresión de pIX puede salvar esta inestabilidad. En WO 02/40665 y anteriormente se divulga que se pueden producir virus Ad35 que retienen la secuencia codificante de E1B-55K completa en células PER.C6 y son estables. Lo mismo es cierto para virus que mantienen la secuencia codificante completa de E1B (WO 00/70071; Abrahamsen et al., 1997). En conjunto estos resultados plantean la posibilidad de que la expresión del gen pIX esté regulada de forma diferente en los virus del subgrupo B comparados con el gen pIX en el subgrupo C. Puesto que los virus que mantienen el gen E1B-55K dirigido por el promotor E1B son estables (ver anteriormente), las secuencias reguladoras de pIX estarán probablemente localizadas en esta región. Para investigar esto se generaron una serie de construcciones que mantienen diferentes longitudes del extremo 3' de la secuencia de 55K. Para ello, primero se genera pBr.Ad35\DeltaSM.AdAptLacZ como sigue. Se digiere la construcción pBr.Ad35.lITR-pIX (descrita en WO 00/70071) con SnaBI y MfeI, se hacen los extremos romos con Klenow y se desfosforila con enzima SAP (Roche). El fragmento del vector de 4,4 kb se aísla después de un gel de agarosa. Se digiere la construcción pAdApt.LacZ (un plásmido adaptador pAdApt basado en Ad5 con inserto del transgén LacZ; WO 99/55132) con AvrII y BglII (y, opcionalmente, con SalI para aumentar la diferencia del tamaño de los fragmentos) y se hacen romos los extremos con la enzima Klenow. El inserto de 4,2 kb CMV.LacZ.pA se aísla después del gel. Ambos fragmentos aislados se ligan para dar pBr.Ad35\DeltaSM.AdAptLacZ (Figura 7). La orientación se puede comprobar mediante digestión de restricción ya que la ligación en la orientación correcta restablece tanto el sitio AvrII como el sitio MfeI. La construcción pBr.Ad35\DeltaSM.AdAptLacZ mantiene las secuencias 3' de 0,6 kb de E1B-55K (nucleótidos de Ad35 salvaje 2804-3400) en la posición salvaje relativa al gen pIX. Anteriormente, se ha mostrado que estas secuencias de 55K no llevan a expresión de una proteína E1B-55K funcional ya que no parecía posible la propagación en células PER.C6 (pBr.Ad35\DeltaSM; WO 02/40665). Empezando de pBr.Ad35\DeltaSM.AdAptLacZ se pueden hacer diferentes deleciones de la región E1B-55K de 680 bp (0,7 kb) mediante digestión con MfeI (isoesquizómero de MunI) y bien StuI, NsiI o BglII seguido mediante hacer romos los extremos protuberantes usando Klenow o ADN polimerasa de T4 en el caso de protuberancias en 5' o 3' respectivamente. La religación de ADN digerido produce plásmidos adaptadores funcionales que usan después para generar virus recombinantes en células PER55K mediante cotransfección con pWE.Ad35.pIX-rITR como se ha descrito anteriormente. Se hicieron construcciones adicionales usando las enzimas DraIII, Bsu36I, BssHII o BamHI, y digestión parcial del vector (el gen LacZ también contiene un sitio de reconocimiento para estas enzimas) usando métodos conocidos en la técnica, seguido por selección del clon correcto. La estabilidad se ensaya como se ha descrito anteriormente para la construcción Ad35.AdApt.LacZ.rsv. Las construcciones que son estables (es decir no tienen deleciones en la región del transgén) contienen regiones reguladoras adecuadas para la expresión de pIX. Además, es posible ensayar directamente la actividad de promotor de una secuencia determinada insertando la secuencia corriente arriba de un gen indicador. pGL3basic (Promega) es tal construcción de gen indicador. La región entre MunI y el inicio del gen pIX se amplificó usando la serie de cebadores Ad3555KmfeF y Ad35pIXNcoR. Esta PCR (2 minutos a 94ºC; y después 30 ciclos de [30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 59ºC y 60 segundos a 72ºC]; seguida de 8 minutos a 68ºC; enzima: Pwo (Genxis) según las instrucciones del fabricante, con DMSO al 3% adicional) amplificó secuencias de Ad35 de 2804 al 3491 (numeración como en Ad35 salvaje) cambiando de esta manera la secuencia alrededor del codón de iniciación de pIX a un sitio NcoI e introduciendo un sitio HindIII en el extremo 5'. Este fragmento amplificado se digiere con HindIII y NcoI y se clona en pGL3basic digerido con las mismas enzimas generando pGL3-MN. pGL3-MN se usa después para delecionar secuencias corriente arriba de la región codificante de la luciferasa combinando la digestión con HindIII con por ejemplo PacI, NsiI, StuI, Bsu36I, BssHII o BglII, seguido de hacer romos los extremos protuberantes y religación. La actividad promotor se ensayó mediante transfección transitoria de las construcciones obtenidas en células PER.C6 usando el reactivo lipofectamina según las instrucciones del fabricante. La actividad luciferasa se analiza dos días después de la transfección usando el sistema de ensayo de luciferasa Steady-Glo (Promega) según las instrucciones del fabricante.

De forma alternativa, en el vector pGL3basic se insertan diferentes regiones, regiones que se generan mediante amplificación por PCR usando un cebador 5' (directo) dirigido a una secuencia específica en la región E1B-55K de Ad35 y que tiene un sitio HindIII unido al extremo 5' combinado con el cebador Nco-pIXrev. De esta manera uno no se limita a la presencia de un sitio de restricción único para la clonación.

La situación del promotor de de pIX se investigó más usando software para encontrar secuencias de promotor putativas (Reese y Eeckman, 1995). La figura 8 muestra las puntuaciones de promotor (mínimo fijado en 0,65) para el promotor de E1B directamente unido a la secuencia codificante de 55K (como en pBr.Ad35.\DeltaE1A\Delta21K). La región marcada A corresponde al promotor de E1B y las regiones B y C se sitúan en la región codificante de 55K. La región corriente arriba de pIX no es reconocida como secuencia de promotor. La región C tiene la puntuación más alta (0,96) de las tres (incluso mayor que el promotor conocido de E1B) y por lo tanto puede comprender secuencias que tienen influencia en la expresión de pIX. Para localizar e identificar un posible promotor de pIX de forma experimental, se generan una serie de fragmentos pequeños que corresponden a diferentes partes (superpuestas) del extremo 3' de la secuencia codificante de 55K. La figura 9 muestra de forma esquemática estos fragmentos y su localización relativa a la región putativa del promotor y del gen pIX. Los fragmentos se generan mediante digestión de restricción usando las enzimas indicadas. Los fragmentos se hacen romos con Klenow (extremos 5' protuberantes) o ADN polimerasa de T4 (extremos 3' protuberantes) y se clonan en el sitio NcoI del vector pGL3basic (Promega) también hecho romo mediante tratamiento con Klenow y desfosforilado mediante tratamiento con SAP (Roche). Tras la transformación en bacterias competentes se comprueba la orientación del inserto en los plásmidos obtenidos por digestión de restricción. Se analiza después la actividad del promotor mediante transfección transitoria de las construcciones con luciferasa obtenidas en células PER.C6 usando el reactivo lipofectamina según las instrucciones del fabricante. El plásmido pGL3basic vacío sirve como control negativo. Se hacen controles adicionales clonando i) un fragmento BglII-MfeI de pAdApt535 que contiene el promotor de pIX de Ad5, ii) un fragmento del promotor RSV de 388 bp NruI-ApaLI (descrito anteriormente), o iii) la región corriente arriba de pIX de Ad35 como un fragmento de PCR en sitio NcoI romo de pGL3basic como se ha descrito anteriormente. La región corriente arriba de pIX de Ad35 se amplifica en pAdApt35IP1 usando los cebadores SV40for y Ad35pIXrev fosforilado en 5'. Tras la amplificación el ADN se digiere con BglII y se trata con Klenow.

Las construcciones también se transfectan en células humanas que no contienen adenovirus E1 (por ejemplo A549, HeLa) para investigar la dependencia de la expresión de E1A.

Los fragmentos también se clonan en plásmido adaptador pBr.Ad35\DeltaSM.AdAptLacZ (ver anteriormente) para ser capaces de generar virus recombinantes y estudiar la estabilidad del genoma vírico. Para ello, la construcción pBr.Ad35\DeltaSM.AdAptLacZ se digiere con MfeI y BglII, se hacen romos los extremos con la enzima Klenow y se desfosforila. Después de aislar del gel el fragmento del vector, el ADN se puede ligar con los fragmentos descritos anteriormente (ver Fig. 9) para dar lugar a una serie de plásmidos adaptadores que tiene longitudes variables de fragmentos de 55K corriente arriba del gen pIX. Se pueden generar virus con la construcción pWE.Ad35.pIX-rITR como se ha descrito antes. Las transfecciones control se hacen con las construcciones pBr.Ad35\DeltaSM.AdAptLacZ, pAdApt35.LacZ y pAdApt35.LacZ.rsv. Tras la aparición de CPE total, se recogen las células y el medio mediante un ciclo de congelación/descongelación y se usan para reinfectar células PER55K nuevas. Las células y el medio se recogen de nuevo a CPE total, se preparan lisados crudos y se usan para realizar un ensayo en placa. Tras la aparición de las placas, se añade una solución de tinción X-gal para ensayar la expresión de LacZ.

Los resultados de los experimentos anteriores ayudan a encontrar la posición de las secuencias reguladoras de pIX en la región E1B-55K de Ad35.

Aún como otra alternativa, la expresión del gen pIX puede estar dirigida por el promotor de E1B como un promotor heterólogo para generación de virus recombinantes. Para ello, se digiere pAdApt535.LacZ con BglII y MfeI seguido por tratamiento con Klenow para hacer romos los extremos y desfosforilación. El fragmento de vector de 4,8 kb tratado de esta manera se aísla después del gel. La región del promotor de E1B se aísla como un fragmento de PCR usando pBR.Ad35.leftITR-pIX como ADN diana y los cebadores Epr-F y Epr-R, en donde ambos candores están fosforilados. La PCR se hace con ADN polimerasa Pwo (Genaxis/Inno-train Diagnostik Gmbh) según las instrucciones del fabricante. El fragmento de 151 bp resultante se clona entonces en el vector aislado para dar pAdApt35Epr.LacZ.

Este plásmido se usa después para generar virus basados en Ad35 y ensayar la estabilidad como se ha descrito anteriormente.

Para identificar los diferentes transcritos que contienen secuencias de pIX, se aísla ARN de células infectadas y se identifican los ARNs que contienen pIX mediante hibridación con una sonda específica marcada. Para ello, se infectan las células PER55K a una multiplicidad de infección de 10 y 50 con los siguientes virus: wtAd35, Ad35.E1B.AdApt.Luc, Ad35\DeltaE3.AdApt.Luc, Ad35\DeltaE3.AdApt535.Luc, Ad35.AdApt.Luc.rsv. Las células infectadas se recogen después de 8 horas (wtAd35 también después de 2 y 18 horas) y se aísla el ARN usando el reactivo TRI-zol (Invitrogen). Este ARN se fracciona por tamaño en un gel de agarosa al 1,5%, se transfiere a un Northern blot y se hibrida con una sonda marcada con 32-P derivada de la región codificante de pIX. Se conocen procedimientos en la técnica (descritos en Molecular Cloning: A laboratory manual, por Sambrook y Russell, 2001, o versiones anteriores). Se puede determinar la longitud del ARN si se incluyen marcadores de tamaño de ARN conocidos y darán una indicación de las especies de ARN que contienen secuencias de pIX. Para identificar los ARNs que empiezan en el promotor de E1B, se puede lavar completamente la transferencia y volver a hibridarla con una sonda 5' de 21K. Los transcritos que contienen pIX que no hibridan con la sonda de E1B-21K están posiblemente generados por un promotor diferente del promotor E1B.

Debido a posibles (y esperados) sucesos de ayuste todavía es difícil determinar precisamente los sitios de inicio de la transcripción a través de este método. Esto se puede alcanzar como sigue. El ARN aislado se transcribe de forma inversa a ADNc y el ADNc se usa para amplificar específicamente los extremos 5' de los ARNs que contienen pIX usando el sistema GeneRacer (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante con los cebadores inversos dirigidos a las secuencias codificantes de pIX: pIXrev y el cebador anidado pIXrev-N2. La clonación y secuenciación de los fragmentos amplificados da la localización de los sitios de inicio de la transcripción y las secuencias 5' de los ARNms que contienen secuencias de pIX. De esta manera se identifican los posibles ARNm que codifican pIX. También se puede determinar de esta manera la correlación entre los niveles de expresión de pIX y la estabilidad de los adenovirus recombinantes correspondientes.

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Ejemplo 11 Secuencias de E1B y pIX de adenovirus del grupo B

Los ejemplos anteriores usan el virus Ad35 como ejemplo. Otros miembros del subgrupo B que tienen homología considerable entre ellos podrían tener regulación de pIX comparable.

Para investigar esto, se alinearon las secuencias de E1B y pIX de los miembros del subgrupo B. La secuencia de Ad7 (SEQ. ID. NO. 57) está disponible a través del número de acceso de Genbank X03000. La secuencia de Ad11 (SEQ. ID. NO. 56) se reveló mediante secuenciación al azar de ADN aislado de virus Ad11p salvajes realizada por Lark Technologies (UK) similar a la descrita (WO 00/70071) para la secuencia de AD35 (SEQ. ID. NO. 55). Ad11 y Ad35 son muy homólogos entre sí (en conjunto el 98,1% de similitud), y las principales diferencias están localizadas en el hexón y la protuberancia de la fibra.

La secuencia de Ad11 también se divulga en WO 02/053759.

En el alineamiento se usa la secuencia entre el sitio de poliadenilación (pA) de E1A y el pA corriente abajo del gen pIX (Fig. 10). Ad35 tiene una similitud en conjunto (en esta región) del 98,4% respecto a Ad11 y del 82,9% respecto de Ad7. Esto hace muy probable que la expresión de pIX está regulada de la misma manera en estos virus.

Por lo tanto, los métodos y medios según la invención como se ejemplifican en los ejemplos anteriores se pueden usar de acuerdo con esto para aumentar la estabilidad y/o la capacidad de inserto de otros adenovirus recombinantes del subgrupo B, ejemplificado aquí por Ad11 y Ad7.

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Ejemplo 17 Virus Ad35 con E1 delecionada con un promotor heterólogo que dirige la expresión de pIX

Para investigar el efecto de una secuencia de promotor heterólogo que activa el gen pIX en virus con deleción completa de E1, se usó una serie de plásmidos adaptadores para generar virus Ad35 recombinantes. Para ello se digirieron pAdApt35LacZ, pAdApt35.LacZ.rsv (ejemplo 9), pAdApt535.LacZ (ejemplo 5) y pAdApt35BLacZ (que contenía la secuencia del promotor E1B de Ad35 delante del gen pIX; descrito más adelante) con pIPsp-1 y se usaron para generar virus con los cósmidos digeridos con NotI pWE/Ad35-3481 y pWE/Ad35-3481\DeltaE3 (ejemplo 7) como se describe en el ejemplo 2 (y en WO 00/70071). Además, se generaron virus con el plásmido adaptador pBr.Ad35\DeltaSM.AdAptLacZ (Figura 7; ejemplo 10). En este plásmido adaptador se ha delecionado E1A y una gran parte de las secuencias de E1B. Mantiene 0,6 kb de la secuencia 3' de E1B-55K y también tiene secuencias salvajes entre el codón de terminación de 55K y el codón de iniciación de pIX.

Tras CPE total, se recogieron las células y el medio, se congelaron/descongelaron y se centrifugaron para eliminar los restos celulares. El sobrenadante (lisados clarificados) de cada una de las transfecciones se usó después para realizar un ensayo en placa como se ha descrito en el ejemplo 9. Los lisados clarificados se diluyeron serialmente diez veces y se sembraron diluciones de 10^{-5} a 10^{-9}.

Una semana después de la adición del recubrimiento de agar, las placas se hicieron visibles y se tiñeron con X-gal para medir la actividad LacZ. La tabla VI resume los resultados de estos experimentos. Todos los virus Ad35 que tienen secuencias adicionales o diferentes que sólo la secuencia corriente arriba de pIX proximal endógena que regula pIX cumplen mejor y tienen un número mayor de placas que expresan en este ensayo comparados con los virus Ad35.AdApt.LacZ con E1 delecionada. Obsérvese que la longitud total del genoma de los virus Ad35\DeltaSM.LacZ (106% comparado con el Ad35 salvaje) excede de la longitud máxima empaquetable determinada para los virus Ad5 (105%). Esto puede tener influencia en los resultados obtenidos para este virus. Los Ad35.AdApt.LacZ.rsv (105%) también están en límite del tamaño empaquetable teórico. En conjunto los resultados muestran que un promotor heterólogo que dirige la expresión de pIX mejora el tamaño de empaquetamiento máximo tolerado y la estabilidad de los virus Ad35 con E1 delecionada. Lo mismo es cierto para virus que tiene una secuencia proximal endógena más larga (Ad35\DeltaSM.LacZ) sugiriendo que las secuencias adicionales (E1B55K) aquí contienen elementos reguladores para la expresión de pIX.

pAdapt35BLacZ es un plásmido adaptador de Ad35 con la secuencia del promotor de E1B de Ad35 que regula el gen pIX.

El plásmido adaptador pAdapt35BLacZ se generó como sigue:

Se amplificó el fragmento del promotor E1B usando los cebadores 35E1Blong y Ad35E1bpromrev. Ambos cebadores estaban fosforilados. La reacción se hizo con ADN polimerasa Pwo (Inno-train, Diagnostic GmbH) según las instrucciones del fabricante. Como ADN molde se usó pBr.Ad35.leftITR-pIX, (25 ng, descrito en WO 02/40665). El programa se ajustó como sigue: 2 minutos a 94ºC y después 30 ciclos de (94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minutos) y finalizó con 10 minutos a 72ºC. La pendiente enfriamiento/calentamiento se fijó a 2ºC/segundo. Esta PCR produce la amplificación del promotor potencial de E1B de Ad35 de 125 nucleótidos. Se digirió después la construcción pAdApt535.LacZ (ejemplo 5) con MfeI y BglII. Después de la digestión el vector se trató con enzima Klenow para crear extremos romos. Se realizó un paso de desfoforilación usando SAP (Roche). El fragmento de vector de 8 kb tratado de esta manera se aisló después del gel. La región del promotor de E1B también se aisló del gel. Estos dos fragmentos se ligaron y se transformaron en células competentes DH5\alpha-T1r (Invitrogen). Se confirmó la orientación correcta del promotor de E1B en el plásmido resultante digiriendo con HpaI y ApaLI. Después de la selección del clon correcto la secuencia del promotor de E1B insertada también se verificó mediante secuenciación.

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Ejemplo 18 El promotor del gen pIX está localizado en el extremo 3' de la secuencia codificante de E1B-55K en los virus Ad35 y Ad11

Basado en los resultados descritos anteriormente se esperaba que el promotor de pIX en los virus del subgrupo B estuviera localizado en la región codificante de E1B-55K. Para investigar esto de forma directa, se propuso identificar el sitio caperuza del ARNm de pIX según se ha descrito en el ejemplo 10. Para ello, se usaron los virus wtAd35, wtAd11, y Ad35.E1B^{+}.AdApt.Luc para infectar células PER55K clon 16 a una MOI de 50 VP/célula. Como control se llevó wtAd5 puesto que se conoce el promotor y el sitio de iniciación del ARN, de este virus. Se aisló el ARN de los cultivos infectados a 16-18 horas tras la infección usando el agente TRIzol (Invitrogen) como describe el fabricante. Al final del procedimiento, el ARN aislado se almacenó en formamida al 100%. Se usó el kit GeneRacer (Invitrogen) para amplificar el extremo 5' de los transcritos de pIX, para localizar el inicio de la transcripción. Antes de empezar el protocolo de GeneRacer, se purificaron 5 \mug de ARN de la formamida mediante precipitación con acetato de sodio como se describe en el protocolo de GeneRacer. El ARN purificado se trató según el protocolo del fabricante para amplificación del extremo 5' del ARNm de pIX. Después del tratamiento con fosfatasa y posterior eliminación de la estructura de caperuza con pirofosfatasa ácida de tabaco y ligación del oligo ARN de Generacer, se uso la transcriptasa inversa SuperScript^{TM} II del kit para síntesis de ADNc. El ADNc se sintetizó mediante transcripción inversa usando un cebador (inverso) específico de gen para pIX. Para Ad35 (virus salvaje y E1B+Luc) y wtAd11 se usó el cebador pIXrev, para Ad5 se usó el cebador pIXrev-Ad5. El ADNc resultante (1 \mul de concentración desconocida) se usó como molde de PCR para generar ADNdc. Esta PCR se hizo usando ADN polimerasa Pwo (Roche) según las instrucciones del fabricante, y con adición de DMSO (Sigma, 3% vol/vol). La amplificación se hizo con el cebador 5' de GeneRacer del kit que es específico para los oligonucleótidos ligados al extremo 5' del ARNm, y los cebadores inversos específicos de gen, como se ha mencionado anteriormente. Las condiciones de reacción fueron como sigue: desnaturalización a 94ºC durante 2 minutos seguido por 30 ciclos de (94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos) y finalizó mediante una elongación a 68ºC durante 8 minutos. Los fragmentos de ADN resultantes se separaron por tamaño mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,0%. Para Ad5 se obtuvo un fragmento de 480 bp y para Ad35 (ambos virus) y Ad11 un fragmento de 200 bp. Ad11 también mostró un fragmento de 2 kb. Todos los fragmentos se cortaron y se purificaron del gel de agarosa. Los fragmentos de ADN purificados se clonaron en el vector pCR4Blunt-TOPO® (Invitrogen). Los vectores se secuenciaron usando los cebadores de M13 directo e inverso comerciales. Las secuencias resultantes se alinearon frente a las secuencias salvajes para localizar el inicio de transcripción de pIX. La banda de 200 bp aislada de las preparaciones de ADNc de Ad35 y Ad11 constituyó el genuino ARNm de pIX, el fragmento de 2 kb aislado de Ad11 resultó ser originario del promotor de E1B. La Fig. 30 muestra un alineamiento de las secuencias de ADNc de Ad35 (SEQ. ID. NO. 59) y Ad11 (SEQ. ID. NO: 58) con la secuencia de Ad35 salvaje (SEQ. ID. NO. 60). El alineamiento revela la localización de la secuencia del intrón eliminado en el ARNm de pIX. En la Fig. 31 se muestran esquemáticamente la localización del sitio caperuza y los sitios de ayuste identificados en la región E1B-pIX de Ad35. Para Ad5 se identificó el ARNm esperado de pIX (Babiss y Vales, 1991) con el sitio caperuza localizado en la posición 3580 (no mostrado; numeración como en el número de acceso de genbank M73260). Para Ad35 el sitio caperuza estaba localizado en el extremo 3' del gen E1B-55K en la posición 3339 en un residuo de A (secuencia de Ad35 WO 00/70071). En Ad11 el sitio caperuza se encontró de forma similar en un residuo de T (posición 3339 en el No. de acceso de Genbank AY63756). De forma interesante, la secuencia entre el codón de terminación del gen 55K y el codón de iniciación del pIX, donde se localiza el promotor de pIX en los virus Ad5, está eliminada del ARNm en los virus Ad35 y Ad11. Estos resultados proporcionan una clara evidencia de que en Ad35 y Ad11 la expresión del gen pIX está regulada desde un promotor situado en el extremo 3' del gen 55K.

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Ejemplo 19 Los virus Ad35 con E1 delecionada que retienen un tramo corto de la secuencia 3' de E1B-55K tienen una capacidad de empaquetamiento mayor

Con la identificación del sitio de caperuza del ARNm de pIX se hace posible incluir el promotor natural de Ad35 para la expresión correcta de pIX y también limitar tanto como sea posible las secuencias de E1B-55K en el vector vírico. Aquí se muestra, como ejemplo no limitante, la construcción de un plásmido adaptador de Ad35 que retiene 166 bp del extremo 3' de la secuencia codificante de 55K (pAdApt35Bsu.Luc) y la generación de un virus Ad35Luc con E1 delecionada con estabilidad y/o capacidad de empaquetamiento aumentada. Esta secuencia de 166 bp no codifica un producto funcional del gen 55K pero contiene el sitio caperuza del ARNm de pIX identificado en el ejemplo anterior en su posición natural relativa a la secuencia codificante de pIX.

La construcción pAdApt35Bsu.Luc se generó como sigue:

Primero se generó un fragmento de PCR usando 40 ng de pBr.Ad35.leftITR-pIX como ADN diana (descrito en WO 02/40665) y los cebadores Bsu55KF y Age-pIXR. La PCR se realizó con ADN polimerasa Pwo (Genaxis) según las instrucciones del fabricante. Además, se usó DMSO al 3% vol/vol (Sigma). El programa se fijó como sigue: 2 minutos a 94ºC, después 30 ciclos de (94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1,5 minuto) y finalizó mediante 8 minutos a 68ºC. El producto de 1,2 kb resultante se clonó directamente en el vector pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) según el protocolo del fabricante, produciendo pCR4Blunt-TOPO.Bsu-Age. La construcción se comprobó mediante digestión con PvuII (New England Biolabs). El fragmento Bsu-Age se aisló del plásmido pCR4Blunt-TOPO.Bsu-Age mediante digestión con Bsu36I (New England Biolabs) y se trató con la enzima Klenow (New England Biolabs) para hacer los extremos romos. El ADN se purificó después usando el kit de purificación de PCR (Qiagen) y se digirió con AgeI (New England Biolabs). El fragmento de 1 kb se aisló del gel usando el kit Gene clean II (Bio101, Inc.). En paralelo, se digirió la construcción pAdApt35.Luc (descrita en WO 00/70071) con BglII y se trató con la enzima Klenow. El ADN se purificó usando el kit de purificación de PCR (Qiagen). El ADN purificado se digirió con AgeI (New England Biolabs) y se desfosforiló con SAP (Roche). El fragmento de 5,8 kb se aisló del gel con el kit Gene clean II (Bio101). Los dos fragmentos se mezclaron en cantidades equimolares en una reacción de ligación y se transformaron células EM DH10B resistentes a T1 (Invitrogen). Esto produjo el plásmido pAdApt35Bsu.Luc.

Para generar virus con E1 delecionada pAdApt35Bsu.Luc se digirió con pIPsp-I y se cotransfectó en células PER55K clon 16 con pWE.Ad35-3481 (ejemplo 7) y con pWE.Ad35-3481\DeltaE3 digerido con NotI como se ha descrito antes. pWE.Ad35-3481\DeltaE3 contiene la misma deleción de E3 que la descrita para pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3 (ejemplo 2) y se generó según el método descrito en el ejemplo 7 usando la construcción pWE.Ad35-3481\DeltaNdeI y un fragmento NdeI de 26,6 kb de pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3.

Además, se generaron virus Ad35 con E1 delecionada que contenían las secuencias E4-Orf6 y E4-Orf6/7 de Ad5 en el esqueleto vírico remplazando las secuencias nativas de Ad35 (ver WO 03/104467 para la generación de tales virus en células PER.C6 no modificadas). En el ejemplo presente pAdApt35Bsu.Luc digerido con pIPsp-I se contransfecta con pWE.Ad35.pIX-EcoRV digerido con NotI/EcoRV y con pBr.Ad35.PR5Orf6 digerido con PacI/NotI (con y sin región E3). Todas las transfecciones dieron lugar a CPE total en una semana tras la transfección y las células y el medio se recogieron como se ha descrito anteriormente. Los virus se purificaron por placa después y las soluciones de virus amplificados en las células de complementación apropiadas y originados de placas individuales se analizaron mediante PCR para la integridad de la región del transgén. Las PCRs del transgén se hicieron como se describe en el ejemplo 3 usando los cebadores AdAptCMVF y pIXrevN2. La Fig. 32 muestra un ejemplo de los resultados de PCR en placas que se originan de los virus Ad35Bsu.Luc y de Ad35Bsu.Luc.Orf6.

Con independencia de la presencia de la región E3 o de la secuencia E4-Orf6 en el esqueleto vírico, todas las placas probadas (5-10 para cada virus) contenían un transgén intacto. Se dio una excepción en una de las placas de los virus Ad35Bsu.Luc que mostró una banda tenue a aproximadamente 1,6 kb (Fig. 32; carril 12) que se origina probablemente de una cantidad pequeña de virus con una deleción. La banda tenue a aproximadamente 500 bp que se produce en todas las muestras de virus, es una banda de fondo de los cebadores en el esqueleto vírico. La observación de que los virus Ad35 que contienen E3 con un casete de expresión de luciferasa se demuestra estable tras la purificación por placa está en contra de resultados previos con virus Ad35.AdApt.Luc que tienen E1 completamente delecionada y no contienen los 166 bp 3' de la secuencia codificante de 55K. Usando plásmidos pAdApt35.Luc estándar, no se fue capaz de generar virus purificados en placa que contuvieran la región E3. De esta manera con la incorporación de las secuencias extra de 55K en el esqueleto ahora se pueden hacer virus de más de 34,6 kb de longitud total sin inestabilidad grave. Esto se acerca mucho a la longitud de un virus Ad35 salvaje. Si se usara un esqueleto con E3 delecionada, la capacidad para secuencias exógenas estaría teóricamente por encima de 5 kb. Obviamente, es posible incorporar más secuencias de E1B-55K que en el ejemplo presente y/o combinar las secuencias 3' de 55K con secuencias de un potenciador heterólogo sin separase de la invención divulgada aquí.

Tablas TABLA I Rendimientos de los virus Ad35 con E1 y E1/E3 delecionadas producidos en células del clon #16 en botellas de triple capa

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TABLA II Ensayo de actividad del transgén (LacZ) en A549 usando lisados crudos de virus de segundo pase. Se da el % de células azules para cada cantidad de virus usados para la infección

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TABLA III Ensayo de actividad del transgén (Luciferasa) en A459 usando lisados crudos de virus de segundo pase. La actividad se expresa en unidades relativas de luz (RLU)

3

TABLA IV Secuencias de cebadores

4

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TABLA VI Porcentaje de placas positivas para LacZ de virus Ad35 que tienen diferentes secuencias de promotor que dirigen la expresión de pIX

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(NP= sin placas visibles)

6

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<150> EP02102631.5

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<151> 25-11-2002

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<150> PCT/NL02/00281

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<151> 25-04-2002

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<150> PCT/NL02/00656

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<151> 15-10-2002

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<160> 65

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<170> PatentIn version 3.2

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<210> 19

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador 35E3for

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<400> 19

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7

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> cebador 35E3rev

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<400> 20

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8

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<210> 21

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador AdApt35CMVF

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<400> 21

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9

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<210> 22

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> cebador 35pIXR

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<400> 22

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10

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<210> 23

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> cebador SV40for

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<400> 23

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11

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<210> 24

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador pIXRmfe

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<400> 24

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12

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<210> 25

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador pIXFmfe

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<400> 25

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13

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<210> 26

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador AdApt35pIXr

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<400> 26

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14

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<210> 27

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<211> 40

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador pIXcosF-2

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<400> 27

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15

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<210> 28

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador Adapt35-3

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<400> 28

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16

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<210> 29

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador 35D21

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<400> 29

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17

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<210> 30

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador 35B3

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<400> 30

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18

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<210> 31

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<211> 44

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador 35F1

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<400> 31

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19

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<210> 32

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<211> 40

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> cebador 35R4

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<400> 32

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20

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<210> 33

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> cebador Ad3555KMfeF

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<400> 33

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21

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<210> 34

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador Ad35pIXNcoR

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<400> 34

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22

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<210> 35

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador Ad35pIXrev

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<400> 35

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23

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

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<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador Epr-F

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

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24

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<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador Epr-R

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<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador pIXrev

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<400> 38

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26

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<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador pIXrev-N2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

27

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador 35E1Blong

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador Ad35E1bpromrev

\newpage

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<400> 41

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29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador pIXrev-Ad5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador Bsu55KF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador Age-pIXR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Adenovirus tipo 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica mezclada

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia corriente arriba proximal de pIX de Ad2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de terminación de EB1 55K

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(3)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio Sp1

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)...(24)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> señal TATA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (45)...(51)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de iniciación de pIX

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (99)...(102)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Adenovirus tipo 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica mezclada

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia proximal corriente arriba de pIX de Ad5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de terminación de EB1 55K

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(3)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio Sp1

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)...(24)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> señal TATA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (45)...(51)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de iniciación de pIX

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (103)...(105)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Adenovirus tipo 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica mezclada

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia proximal corriente arriba de pIX de Ad12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de terminación de EB1 55K

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(3)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de iniciación de pIX

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (81)...(84)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Adenovirus tipo 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica mezclada

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia proximal corriente arriba de pIX de Ad9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de terminación de EB1 55K

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(3)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de iniciación de pIX

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (91)...(93)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Adenovirus tipo 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica mezclada

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia proximal corriente arriba de pIX de Ad40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de terminación de EB1 55K

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(3)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de iniciación de pIX

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (71)...(73)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Adenovirus tipo 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica mezclada

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia proximal corriente arriba de pIX de Ad4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de terminación de EB1 55K

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(3)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de iniciación de pIX

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (88)...(90)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Adenovirus de simio tipo 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica mezclada

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia proximal corriente arriba de pIX de sAd25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de terminación de EB1 55K

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(3)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de iniciación de pIX

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (88)...(90)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Adenovirus tipo 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica mezclada

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia proximal corriente arriba de pIX de Ad35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de terminación de EB1 55K

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(3)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de iniciación de pIX

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (87)...(89)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Adenovirus tipo 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica mezclada

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia proximal corriente arriba de pIX de Ad11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de terminación de EB1 55K

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(3)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de iniciación de pIX

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (87)...(89)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Adenovirus tipo 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica mezclada

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia proximal corriente arriba de pIX de Ad7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de terminación de EB1 55K

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(3)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de iniciación de pIX

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (98)...(100)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2430

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Adenovirus tipo 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica mezclada

\vskip0.400000\baselineskip

<223> región E1B-pIX de Ad35

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2429

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Adenovirus tipo 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica mezclada

\vskip0.400000\baselineskip

<223> región E1B-pIX de Ad11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2426

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Adenovirus tipo 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica mezclada

\vskip0.400000\baselineskip

<223> región E1B-pIX de Ad7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

47

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Adenovirus tipo 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica mezclada

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADNc de pIX de Ad11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 227

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Adenovirus tipo 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica mezclada

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADNc de pIX de Ad35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Adenovirus tipo 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica mezclada

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de Ad35 salvaje nt 3339-3628

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (62)...(138)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codón de iniciación de pIX

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (146)...(148)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

51

Claims (19)

1. Un adenovirus recombinante del subgrupo B que tiene una deleción en la región E1 y adenovirus que no codifica un producto funcional del gen E1B 55K, comprendiendo dicho adenovirus:

(i)

la secuencia del adenovirus localizada entre el codón de terminación de la secuencia codificante de E1B 55K y el codón de iniciación de la secuencia codificante de pIX; y

(ii)

una secuencia codificante de pIX funcional bajo el control de una secuencia que tiene actividad de promotor, en donde dicha secuencia que tiene actividad de promotor consiste en hasta 0,7 kb de secuencias del adenovirus que están directamente corriente arriba del codón de iniciación de pIX, comprendiendo dicha secuencia la secuencia mínima requerida para actividad de promotor que está presente en las últimas 166 bp de la secuencia codificante de E1B 55K.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Un adenovirus recombinante según la reivindicación 1, en donde dicha secuencia que tiene actividad de promotor contiene hasta 600 nucleótidos de las secuencias del adenovirus que están directamente corriente arriba de la secuencia codificante de pIX.

3. Un adenovirus recombinante según la reivindicación 1, en donde dicha secuencia que tiene actividad de promotor contiene hasta 300 nucleótidos de las secuencias de adenovirus que están directamente corriente arriba de la secuencia codificante de pIX.

4. Un adenovirus recombinante según la reivindicación 1, en donde dicha secuencia que tiene actividad de promotor contiene hasta 250 nucleótidos de las secuencias de adenovirus que están directamente corriente arriba de la secuencia codificante de pIX.

5. Un adenovirus recombinante del subgrupo B que comprende una secuencia codificante de pIX funcional y que tiene una deleción en la región E1, en donde la secuencia codificante de pIX está bajo el control de un promotor heterólogo para dirigir la expresión en una célula empaquetadora determinada.

6. Un adenovirus recombinante según la reivindicación 5, en donde dicho promotor heterólogo comprende una secuencia de ácido nucleico elegida del grupo que consiste en un promotor de pIX proximal no endógeno, un promotor vírico, un promotor celular, un promotor sintético y un promotor híbrido.

7. Un adenovirus recombinante según la reivindicación 6, en donde dicho promotor heterólogo se elige del grupo que consiste en secuencias que al menos en parte derivan del promotor de pIX proximal de Ad5, un promotor del virus del sarcoma de Rous y un promotor de E1B de adenovirus.

8. Un adenovirus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicho adenovirus deriva de un adenovirus de serotipo 35 o un adenovirus de serotipo 11.

9. Un adenovirus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado en que comprende además una secuencia que codifica una proteína E4-Orf6 funcional derivada de un adenovirus del subgrupo C.

10. Un ácido nucleico aislado que tras introducción en una célula empaquetadora adecuada constituye el genoma de un adenovirus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 2-9.

\vskip1.000000\baselineskip

11. Un método para aumentar la estabilidad y/o la capacidad de empaquetamiento de un adenovirus recombinante del subgrupo B que tiene una deleción en la región E1, que comprende el paso de expresar los elementos necesarios para la producción y ensamblaje de dicho adenovirus recombinante en partículas de virus en una célula empaquetadora, caracterizado en que los siguientes elementos se mantienen o reintroducen en dicho adenovirus:

(i)

la secuencia del adenovirus localizada entre el codón de terminación de la secuencia codificante de E1B 55K y el codón de iniciación de la secuencia codificante de pIX; y

(ii)

una secuencia codificante de pIX funcional bajo el control de una secuencia que tiene actividad de promotor, en donde dicha secuencia que tiene actividad de promotor consiste en hasta 0,7 kb de secuencias del adenovirus que están directamente corriente arriba del codón de iniciación de pIX, comprendiendo dicha secuencia la secuencia mínima requerida para actividad de promotor que está presente en las últimas 166 bp de la secuencia codificante de E1B 55K.

\vskip1.000000\baselineskip

12. Un método según la reivindicación 11, en donde dicha secuencia que tiene actividad de promotor contiene hasta 600 nucleótidos de las secuencias de adenovirus que están directamente corriente arriba de la secuencia codificante de pIX.

13. Un método según la reivindicación 11, en donde dicha secuencia que tiene actividad de promotor contiene hasta 300 nucleótidos de las secuencias de adenovirus que están directamente corriente arriba de la secuencia codificante de pIX.

14. Un método según la reivindicación 11, en donde dicha secuencia que tiene actividad de promotor contiene hasta 250 nucleótidos de las secuencias de adenovirus que están directamente corriente arriba de la secuencia codificante de pIX.

15. Un método para aumentar la estabilidad y/o la capacidad de empaquetamiento de un adenovirus recombinante del subgrupo B que tiene una deleción en la región E1, que comprende el paso de expresar los elementos necesarios para la producción y ensamblaje de dicho adenovirus recombinante en partículas de virus en una célula empaquetadora, en donde las secuencias codificantes de pIX están bajo el control de un promotor heterólogo.

16. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 11-15, en donde dicho adenovirus recombinante deriva de un adenovirus de serotipo 35 o un adenovirus de serotipo 11.

17. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 15-16, en donde dicho promotor heterólogo se elige del grupo que consiste en un promotor de pIX proximal no endógeno, un promotor vírico, un promotor celular, un promotor sintético y un promotor híbrido.

18. Un método según la reivindicación 17, en donde dicho promotor heterólogo se elige del grupo que consiste en el promotor de pIX proximal de Ad5, un promotor del virus del sarcoma de Rous y un promotor de E1B de adenovirus.

19. Una célula empaquetadora de un adenovirus recombinante que comprende un adenovirus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-9.