ES2267864T3

ES2267864T3 - Lineas celulares complementadoras.

Info

Publication number: ES2267864T3
Application number: ES01996603T
Authority: ES
Inventors: Ronald Vogels; Menzo Jans Emco Havenga; Majid Mehtali
Original assignee: Crucell Holand BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 2000-11-15
Filing date: 2001-11-14
Publication date: 2007-03-16
Anticipated expiration: 2021-11-14
Also published as: US20030119192A1; US20080199433A1; EP1349926A2; US7250293B2; US20030171336A1; NZ525997A; PT1349926E; DE60121471T2; US20050277194A1; AU2002218569B2; JP2004513657A; US6492169B1; US9228205B2; US7344883B2; US20150010952A1; ATE332965T1; DK1349926T3; WO2002040665A2; CY1105232T1; AU1856902A

Abstract

Una línea celular de empaquetamiento capaz de complementar adenovirus recombinantes basados en un serotipo del subgrupo B, donde dicha línea celular deriva de una célula humana que ha sido transformada por las secuencias codificadoras de E1 de un adenovirus donde la secuencia que codifica la proteína E1B-55K es del subgrupo B.

Description

Líneas celulares complementadoras.

Campo técnico

La invención se refiere al campo de la biotecnología generalmente, y más específicamente a líneas celulares complementadoras basadas en adenovirus.

Antecedentes

Típicamente, las células vectoras y de empaquetamiento deben ser adaptadas entre sí de manera que tengan todos los elementos necesarios, pero no tengan elementos solapantes que conduzcan a virus de replicación competente mediante recombinación. Por lo tanto, las secuencias necesarias para la transcripción apropiada del constructo de empaquetamiento pueden ser secuencias reguladoras heterólogas derivadas, por ejemplo, de otros serotipos de adenovirus (ad) humanos, adenovirus no humanos, otros virus como, pero no limitados a, SV40, virus de la hepatitis B (HBV), Virus del Sarcoma de Rous (RSV), citomegalovirus (CMV), etc. o de eucariotas superiores tales como mamíferos. En general, entre estas secuencias se incluyen un promotor, un intensificador y secuencias de poli-adenilación.

PER.C6 (número de consigna ECACC 96022940) es un ejemplo de una línea celular desprovista de solapamiento de secuencia entre el constructo de empaquetamiento y el vector adenoviral (Fallaux y col., 1998). Los virus recombinantes basados en los adenovirus del subgrupo C tales como Ad5 y Ad2 pueden ser propagados eficazmente en estas células de empaquetamiento. La generación y propagación de adenovirus de otros serotipos, como los virus del subgrupo B, han demostrado ser más difíciles en las células PER.C6. No obstante, como se describe en la solicitud de Patente Europea 00201738.2, se pueden elaborar virus recombinantes basados en el virus del subgrupo B Ad35 mediante co-transfección de un constructo de expresión conteniendo las secuencias de la región 1 temprana de Ad35 (Ad35-E1). Además, se demostró que los virus basados en Ad35 que tiene las secuencias E1A suprimidas replican eficazmente en células PER.C6. De este modo, las proteínas E1A de AD5 complementan las funciones de Ad35-E1A, mientras al menos parte de las funciones de E1B de Ad35 son necesarias. Esta especificidad del serotipo en las funciones de E1B también han sido descritas recientemente para los virus recombinantes Ad7. En un intento de generar adenovirus recombinantes derivados del subgrupo B de virus Ad7, Abrahamsen y col., (1997) no fueron capaces de generar virus con E1 suprimida en células 293 sin contaminación de Ad7 de tipo salvaje (wt). Se demostró que los virus que fueron elegidos tras la purificación en placa sobre células 293-ORF6 (Brough y col., 1996) habían incorporado las secuencias E1B de Ad7 mediante recombinación no homóloga. De este modo, se demostró que la propagación eficaz de virus recombinantes Ad7 era posible solamente en presencia de la expresión de Ad7-E1B y de la expresión de Ad5-E4-ORF6. Se sabe que las proteínas E1B interaccionan con las proteínas celulares y virales (Bridge y col., 1993; White, 1995). Posiblemente, el complejo formado entre la proteína E1B de 55K y E4-ORF6 que es necesario para incrementar la exportación de ARNm de las proteínas virales y para inhibir la exportación de la mayoría de los ARNm celulares, es crítico y en algún modo específico del serotipo.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona nuevas líneas celulares de empaquetamiento capaces de complementar adenovirus recombinantes basados en serotipos distintos de los virus del subgrupo C, tales como los serotipos del subgrupo B, como los adenovirus de tipo 35.

En un aspecto la invención proporciona líneas celulares de empaquetamiento capaces de complementar adenovirus recombinantes basados en un serotipo del subgrupo B, preferiblemente del serotipo 35. Con los términos "basado en o derivado de un adenovirus" se quiere significar que se utiliza ácido nucleico correspondiente al ácido nucleico encontrado en dicho serotipo. El ácido nucleico utilizado puede ser derivado mediante clonación por PCR u otros métodos conocidos en la técnica.

En un aspecto de la invención, las nuevas células de empaquetamiento derivan de células humanas diploides, primarias tales como, pero no limitadas a, retinoblastos humanos primarios, células de riñón embriónico humano primarias o amniocitos humanos primarios. La transfección de células primarias o derivados de las mismas con el gen E1A de adenovirus solo puede inducir una proliferación ilimitada (inmortalización), pero no produce una transformación completa. No obstante, la expresión de E1A en la mayoría de los casos produce una inducción de la muerte celular programada (apoptosis), y ocasionalmente se obtiene la inmortalización (Jochemsen y col., 1987). Se requiere la expresión simultánea del gen E1B para evitar la inducción de la apoptosis y para que se produzca una transformación morfológica completa (revisado en White, 1995). Por lo tanto, en un aspecto de la invención, las células humanas primarias o los derivados de las mismas son transformados mediante la expresión de proteínas E1 de adenovirus de un subgrupo distinto del subgrupo C, preferiblemente del subgrupo B, más preferiblemente del adenovirus de tipo 35. La actividad combinada de las proteínas E1A y E1B establece un crecimiento indefinido de las células y permite la complementación de adenovirus recombinantes.

La transformación morfológica completa de las células primarias por los genes E1 de adenovirus es el resultado de las actividades combinadas de las proteínas codificadas por las regiones E1A y E1B. Los papeles de las diferentes proteínas E1 en la infección lítica y en la transformación han sido estudiados extensamente (revisado por Zantema y van der Eb, 1995; White, 1995, 1996). Las proteínas E1A de adenovirus son esenciales para la transformación de células primarias. Las proteínas E1A ejercen este efecto a través de la interacción directa con numerosas proteínas celulares que están implicadas en la regulación de la transcripción. Entre estas se incluyen la familia pRB de proteínas, p300/CBP y la proteína de unión TATA. Además de esto E1A incrementa el nivel de proteína p53 en las células. En ausencia de actividad de E1B de adenovirus la elevación en los niveles de p53 conduce a la inducción de la apoptosis. Ambas proteínas codificadas por la región E1B neutralizan la inducción de la apoptosis aunque mediante mecanismos diferentes. E1B-21K parece neutralizar la apoptosis de una manera similar a Bcl-2 por medio de la interacción con las proteínas efectoras aguas abajo de la ruta de la apoptosis (Han y col., 1996), mientras E1B-55K, funciona a través de la interacción directa con p53. Importantemente, el mecanismo molecular mediante el cual funcionan las proteínas E1B-55K de Ad2 y 5 (subgrupo C) y Ad12 (subgrupo A) en la capacidad para neutralizar p53 pueden diferir. Mientras E1B-55K de Ad5 se une a p53 fuertemente y el complejo se localiza en el citoplasma, E1B-55K de Ad12 se une a p53 débilmente y ambas proteínas se localizan en el núcleo (Zantema y col., 1985; Grand y col., 1999). Ambas proteínas, no obstante, inhiben la transactivación de otros genes por p53 (Yew y Berk, 1992).

En células de roedores, la actividad de E1A junto con E1B-21K o 55K es suficiente para la transformación completa a través de la expresión aunque la expresión de ambas proteínas E1B juntas es dos veces más eficaz (Rao y col., 1992). Sin embargo, en células humanas, la actividad de la proteína E1B-55K parece ser más importante dada la observación de que E1B-55K es indispensable para el establecimiento de células transformadas (Gallimore, 1986).

En el Ejemplo 6 de la presente se describe la generación de pIG270. En este constructo los genes Ad35-E1 son expresados a partir del promotor hPGK y la transcripción es terminada por HBVpA. El promotor hPGK constituye un fragmento HincII-EcoRI de la secuencia promotora descrita por Singer-Sam y col. (1984). HBVpA está localizado en un fragmento BamHI-BglII del genoma del virus de la Hepatitis B (Simonsen y Levinson, 1983; ver también Genbank HBV-AF090841). Como se ha mencionado antes, las secuencias promotora y de poliadenilación de los constructos de expresión de E1 descritos en esta invención puede derivar de otras fuentes sin apartarse de la invención. Asimismo, se pueden utilizar otros fragmentos funcionales de las secuencias hPGK y HBVpA mencionadas antes.

La funcionalidad de pIG270 fue demostrada mediante la transformación de células Baby Rat Kidney primarias (BRK). La comparación con un constructo de expresión de Ad5-E1 equivalente ilustra que los genes eran menos eficaces al transformar estas células. Se ha encontrado lo mismo para los genes E1 de Ad12 (Bernards y col., 1982).

No está claro qué proteína o proteínas E1 determinan la diferencia en la eficacia de transformación de las secuencias E1 observadas para adenovirus de diferentes subgrupos. En el caso de Ad12, los estudios de transfección con genes E1A/E1B quiméricos sugieren que la eficacia de la transformación de las células BBK era determinada por las proteínas E1A (Bernards y col., 1982). Más abajo se muestra que la proteína E1B-55K contiene las funciones específicas del serotipo necesarias para la complementación de los adenovirus con E1 suprimida. Si estas funciones están relacionadas con la regulación de la distribución de ARNm u otra función viral tardía, es poco probable que éstas estén implicadas en la eficacia de la transformación.

El análisis de los dominios funcionales en las proteínas E1B-55K de Ad2 o Ad5 utilizando mutantes de inserción ha revelado que las funciones relacionadas con la replicación viral, la síntesis de proteínas tardía y la inhibición de la síntesis de proteínas del huésped ("Shut-off") no están confinadas a dominios específicos sino que están distribuidas a lo largo de la proteína (Yew y col., 1990). Utilizando el mismo grupo de mutantes, se encontró que los dominios importantes para la interacción con p53 y E4-Orf6 estaban más restringidos. Además de una región de unión común (aminoácidos 262 a 326), la unión a p53 estaba afectada por las mutaciones en el aa 180 y la unión E4-Orf6 estaba afectada por las mutaciones en el aa 143 (Yew y Berk, 1992; Rubenwolf y col., 1997).

En conjunto estos resultados indican que es difícil separar las funciones de E1B-55K relacionadas con la transformación (unión a p53) y la síntesis de proteínas tardía (unión a Orf6).

La invención describe nuevos constructos E1 que combinan la elevada eficacia de la transformación de un serotipo con la función de complementación específica del serotipo de otro serotipo. Estos nuevos constructos se utilizan para transformar las células retinoblásticas embriónicas humanas primarias y los amniocitos humanos.

En otro aspecto de la invención, las secuencias E1 transformantes derivan de diferentes serotipos. Como se describe en la solicitud de Patente Europea 00201738.2, las secuencias E1 de Ad35 son capaces de transformar células Baby Rat Kidney (BRK), aunque con una eficacia menor que la observada con las secuencias E1 de Ad5. Esto también fue observado para las secuencias E1 de Ad12 (Bernards y col., 1982). Por lo tanto, en este aspecto de la invención, se transforman células humanas diploides primarias o derivados de las mismas con el constructo E1 quimérico que consta de parte de las secuencias E1 de un serotipo que permite la transformación eficaz de células humanas primarias o derivados de las mismas y parte de las secuencias E1 de otro serotipo cuyas secuencias E1 proporcionan la función o las funciones que permiten una propagación eficaz de los virus con E1 suprimida de ese serotipo. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la región E1A deriva de un adenovirus del subgrupo C, como, pero no limitado a, Ad5, y las secuencias codificadoras de E1B derivan de un adenovirus alternativo más concretamente de un adenovirus del subgrupo B, más concretamente de un adenovirus de tipo 35. Las secuencias codificadoras de E1B-21K también pueden ser quiméricas comprendiendo secuencias codificadoras tanto del subgrupo C como del subgrupo B. Preferiblemente, todas o la mayoría de las E1B-21K comprenden secuencias codificadoras del subgrupo C. En una realización más preferida, las secuencias codificadoras de E1A y las secuencias codificadoras de E1B-21K derivan de un adenovirus del subgrupo C, como, pero no limitado a, Ad5. En una realización la célula comprende adicionalmente secuencias codificadoras de E1B-55K que están, preferiblemente, en tanto que no se solapen con las secuencias codificadoras de 21K derivadas de un adenovirus del subgrupo B, más concretamente de un adenovirus de tipo 35. En una realización aún más preferida, todas las secuencias codificadoras de E1 derivan de un adenovirus del subgrupo C, como, pero no limitado a Ad5, excepto para al menos parte de las secuencias codificadoras de E1B-55K que son necesarias para la complementación específica del serotipo de un subgrupo de adenovirus alternativo, más concretamente el subgrupo B de adenovirus, más concretamente el adenovirus de tipo 35. Asimismo la invención proporciona una línea celular de empaquetamiento donde las células humanas diploides, primarias o los derivados de las mismas han sido transformadas con un constructo de E1 de adenovirus quimérico que comprende parte de una primera secuencia codificadora de E1 de adenovirus de un primer serotipo de adenovirus que permite la transformación eficaz de células humanas primarias y derivados de las mismas; y parte de una segunda secuencia codificadora de E1 de adenovirus de un segundo serotipo de adenovirus, donde dicha segunda secuencia codificadora de E1 de adenovirus proporciona la función o las funciones de E1B de adenovirus específicas del serotipo que permiten la propagación eficaz de virus con E1 de adenovirus recombinante suprimida de dicho segundo serotipo de adenovirus. Preferiblemente, dicho primer serotipo de adenovirus es un adenovirus del subgrupo C y dicho segundo serotipo de adenovirus es un adenovirus del subgrupo B, más concretamente un adenovirus de tipo 35. En una realización la línea de células de empaquetamiento de la invención comprende E1B-55k de adenovirus bovino. Semejante línea celular que expresa E1B-55k bovina es particularmente adecuada para obtener elevados rendimientos de un adenovirus recombinante bovino complementado.

Las células humanas diploides primarias o los derivados de las mismas son transformadas por las secuencias E1 de adenovirus o bien conectadas operativamente sobre una molécula de ADN o bien localizadas sobre dos moléculas de ADN separadas. En el último caso, una molécula de ADN porta al menos parte de las secuencias E1 del serotipo que permite la transformación eficaz y la segunda molécula de ADN porta al menos parte de las secuencias necesarias para la complementación específica del serotipo. Asimismo se proporciona un constructo híbrido que comprende secuencias E1 del serotipo que permite la transformación eficaz y secuencias E1 de otro serotipo necesario para la complementación específica del serotipo. Las secuencias que proporcionan la complementación específica del serotipo también pueden contener por supuesto actividades adicionales que contribuyan a la transformación. Preferiblemente, dichas secuencias que permiten una transformación eficaz comprenden E1A. Preferiblemente dichas secuencias y dichas secuencias necesarias para la complementación específica del serotipo comprenden preferiblemente secuencias E1B. Más preferiblemente dichas secuencias que permiten la transformación eficaz comprenden las secuencias E1A y E1B-21K y dichas secuencias necesarias para la complementación específica del serotipo comprenden secuencias E1B-55K. También se proporcionan células transformadas por semejante constructo híbrido. Tales células pueden ser utilizadas favorablemente para la propagación de adenovirus con E1 suprimida recombinantes de dicho otro serotipo. Por supuesto también es posible proporcionar ambas funciones de secuencias E1 sobre constructos separados. En todos los aspectos, las secuencias están conectadas operativamente a secuencias reguladoras que permiten la transcripción y la traducción de las proteínas codificadas. Preferiblemente una célula de empaquetamiento de la invención comprende adicionalmente un ADN que codifica al menos E4-orf6 de un adenovirus del subgrupo B, preferiblemente un adenovirus del serotipo 35. Preferiblemente, dicho E4-orf6 está derivado de otro serotipo. Preferiblemente dicha célula comprende E1B-55K y E4-orf6 del mismo serotipo que el vector recombinante que va a ser propagado/complementado o producido de otro modo.

En otro aspecto de la invención, se describen nuevas células de empaquetamiento que están derivadas de PER.C6 (número de consigna ECACC 96022940; Fallaux y col., (1998) y contienen secuencias Ad35-E1 integradas en su genoma. Estas secuencias Ad35-E1 están presentes en una casete de expresión funcional, pero preferiblemente no contienen secuencias solapantes con las secuencias presentes en el vector viral recombinante. Preferiblemente, la casete de expresión funcional consta de un promotor heterólogo y una señal de poliadenilación conectada funcionalmente a las secuencias Ad35-E1. Más específicamente, las secuencias codificadoras Ad35-E1 están conectadas funcionalmente al promotor del gen del fosfoglicerato humano (hPGK) y la señal de poli-adenilación del virus de la hepatitis B (HBV-pA). Preferiblemente, las secuencias codificadoras Ad35-E1 comprenden las regiones codificadoras de las proteínas E1A y las secuencias promotoras de E1B conectadas a las secuencias codificadoras de E1B hasta e incluyendo el codón de terminación de la proteína E1B de 55K. Más preferiblemente, las secuencias Ad35-E1 comprenden del nucleótido 468 al nucleótido 3400 de la secuencias de Ad35 wt. Para poder seleccionar las células transfectadas, se ha de incorporar un marcador de selección dominante como, pero no limitado, el gen neo^{r} sobre el vector de expresión o el vector de expresión Ad35 es transfectado simultáneamente con un vector de expresión separado que media la expresión del marcador de selección. En ambos casos, el marcador de selección se integra en el genoma celular. Se pueden utilizar otras líneas celulares transformadas con Ad5-E1 como 293 (Graham y col., 1977) y 911 (Fallaux y col. 1996) o líneas celulares humanas establecidas como las células A549 sin apartarse de la presente invención.

En otro aspecto de la invención, se describen células derivadas de PER.C6 que expresan secuencias E1B de Ad35 funcionales. En una realización, las secuencias codificadoras de Ad35-E1B están conducidas por el promotor de E1B y terminadas por una señal de poli-adenilación heteróloga como, pero no limitada a, HBVpA. En una realización preferida, las secuencias codificadoras Ad35-E1B están conducidas por un promotor heterólogo como, pero no limitado a, el promotor hPGK o el promotor del Factor de Elongación 1\alpha (EF-1\alpha) y terminadas por una señal pA heteróloga como, pero no limitada a, HBVpA. Estas secuencias Ad35-E1B comprenden preferiblemente las regiones codificadoras de las proteínas E1B 21K y E1B 55K localizadas entre los nucleótidos 1611 y 3400 de la secuencias de Ad35 de tipo salvaje (wt). Más preferiblemente, las secuencias Ad35-E1B comprenden los nucleótidos 1550 a 3400 de la secuencia de Ad35 wt. En una realización aún más preferida, las secuencias de E1B comprenden las secuencias codificadoras del gen E1B-55K localizado entre los nucleótidos 1916 y 3400 de la secuencia de Ad35 wt. En una realización aún más preferida la línea celular de empaquetamiento o una línea celular de la invención carecen de una secuencia codificadora funcional para E1B 21K. Tales líneas celulares producen en general significativamente más adenovirus recombinante que las líneas celulares E1B-21K positivas.

La invención proporciona adicionalmente un método para complementar un adenovirus recombinante que comprende proporcionar una línea celular de empaquetamiento o una línea celular según la invención, con dicho adenovirus recombinante y cultivar dicha célula para permitir la complementación. En una realización preferida dicho método comprende adicionalmente cosechar adenovirus recombinantes complementados. Preferiblemente dicho adenovirus recombinante deriva de adenovirus del subgrupo B. Más preferiblemente dicho adenovirus recombinante deriva de adenovirus del serotipo 35.

En otro aspecto la invención proporciona un adenovirus recombinante obtenido mediante un método de la invención o con una célula de empaquetamiento de la invención. Semejante adenovirus puede ser obtenido esencialmente libre de adenovirus de tipo salvaje contaminante, o de adenovirus de replicación competente. Semejantes preparaciones de adenovirus recombinante son muy adecuadas para la administración de secuencias terapéuticas a tejidos somáticos in vivo por ejemplo en un entorno de terapia génica. Se prefieren los adenovirus recombinantes que comprenden la deleción de un ácido nucleico que codifica al menos una proteína de la región E1. Preferiblemente, semejante adenovirus comprende adicionalmente una deleción de un ácido nucleico que codifica al menos una proteína de la región E3. Preferiblemente, semejante adenovirus comprende adicionalmente una deleción de un ácido nucleico que codifica al menos una proteína de la región E4. Preferiblemente, semejante adenovirus comprende adicionalmente una deleción de un ácido nucleico que codifica al menos una proteína de E4-Orf6. Por esta razón la invención también proporciona el uso de un adenovirus recombinante de la invención para la preparación de un medicamento.

Con el término proteína E1B-55K según se utiliza aquí, se quiere significar la proteína codificada por la región E1B en un serotipo de adenovirus que tiene una función similar en dicho serotipo a la proporcionada por la proteína E1B-55K de Ad5.

Con el término proteína E1B-21K según se utiliza aquí, se quiere significar la proteína incluida por la región E1B en un serotipo de adenovirus que tiene una función similar en dicho serotipo a la proporcionada por la proteína E1B-19K de Ad5. La misma terminología se aplica para las secuencias que codifican estas proteínas. Cuando se hace referencia a las secuencias Ad35-E1 de un nucleótido especificado al nucleótido 3400 se quiere significar "hasta e incluyendo el nucleótido 3400".

Las líneas celulares sujeto de esta invención son útiles, entre otras cosas, para la producción de adenovirus recombinantes diseñados para la terapia génica y la vacunación. Las líneas celulares, derivadas de células de origen humano, también son útiles para la producción de proteínas terapéuticas recombinantes humanas como, pero no limitadas a factores de crecimiento humanos, anticuerpos humanos. Además las líneas celulares son útiles para la producción de virus humanos distintos de adenovirus como, pero no limitados a, virus de la influenza, virus herpes simplex, rotavirus, virus del sarampión.

Un derivado preferido de células humanas diploides, primarias es la línea celular PER.C6 (número de consigna ECACC 960022940).

Está dentro del conocimiento práctico del artesano proporcionar proteínas que tengan una función de una clase similar a la de la proteína E1 de adenovirus referida en este documento. Por ejemplo se puede proporcionar una parte funcional y/o se puede proporcionar un derivado con una función de una clase similar, no necesariamente en cantidad.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1: Gráfico de barras que muestra el porcentaje de muestras de suero positivas para la neutralización para cada adenovirus wt humano sometido a ensayo (ver, Ejemplo 1 para la descripción del análisis de neutralización).

Fig. 2: Gráfico que muestra la ausencia de correlación entre la proporción VP/DICC50 y el porcentaje de neutralización.

Fig. 3: Gráfico de barras que presenta el porcentaje de muestras de suero que muestran actividad neutralizadora para una selección de serotipos de adenovirus. Los sueros estaban derivados de voluntarios sanos de Bélgica y Reino Unido.

Fig. 4: Gráfico de barras que presenta el porcentaje de muestras de suero que muestran actividad neutralizadora para los serotipos 5, 11, 26, 34, 35, 48 y 49 de adenovirus. Los sueros estaban derivados de cinco localizaciones diferentes de Europa y Estados Unidos.

Fig. 5: Secuencia de adenovirus humano de tipo 35.

Fig. 6: Mapa de pAdApt35IP1.

Fig. 7: Representación esquemática de las etapas acometidas para construir pWE.Ad35.pIX-rITR.

Fig. 8: Mapa de pWE.Ad35.pIX-rITR.

Fig. 9: Mapa de pRSV.Ad35-E1.

Fig. 10: Mapa de PGKneopA.

Fig. 11: Mapa de pRSVpNeo.

Fig. 12: Mapa de pRSVhbvNeo.

Fig. 13: Mapa de pIG.E1A.E1B.

Fig. 14: Mapa de pIG135.

Fig. 15: Mapa de pIG270.

Fig. 16: Mapa de pBr.Ad35.leftITR-pIX.

Fig. 17: Mapa de pBr.Ad35.leftITR-pIX\DeltaE1A.

Fig. 18: Mapa de pBr.Ad35.\Delta21K.

Fig. 19: Mapa de pBr.Ad35.\Delta55K1.

Fig. 20: Mapa de pBrAd35\DeltaSM.

Fig. 21: Representación esquemática de constructos de deleción Ad35-E1A/E1B.

Fig. 22: Mapa de pIG.35BL.

Fig. 23: Mapa de pRSVneo4.

Fig. 24: Mapa de pIG35Bneo.

Fig. 25: Mapa de pIG35.55K.

Fig. 26: Mapa de pIG535.

Fig. 27: Mapa de pIG635.

Fig. 28: Mapa de pIG735.

Fig. 29: Mapa de pCC271.

Fig. 30: Mapa de pCC535s.

Fig. 31: Mapa de pCR535E1B.

Fig. 32: Mapa de pCC2155s.

Fig. 33: Mapa de pCC536s.

Fig. 34: Mapa de pIG536.

Fig. 35: Mapa de pBr.Ad35.PRn.

Fig. 36: Mapa de pBr.Ad35.PRn\DeltaE3.

Fig. 37: Mapa de pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3.

Fig. 38: Alineamiento de las secuencias de aminoácidos E1B-21K (A) y E1B-55K (B) en pCC536s con las secuencias wtAd5 y wtAd35.

Descripción detallada de la invención

La invención se explica adicionalmente mediante el uso de los siguientes ejemplos ilustrativos.

Ejemplos Ejemplo 1 Un análisis de elevado rendimiento para la detección de la actividad neutralizadora en suero humano

Para permitir el rastreo de una gran cantidad de suero humano en cuanto a la presencia de anticuerpos neutralizadores frente a todos los serotipos de adenovirus, se desarrolló un análisis de 96 pocillos automatizado.

Suero humano

Se seleccionó un panel de 100 individuos. Los voluntarios (50% hombres, 50% mujeres) eran individuos sanos entre 20 y 60 años de edad sin restricción de raza. Todos los voluntarios firmaron un informe de consentimiento. Se excluyeron las personas implicadas profesionalmente en la investigación de adenovirus.

Se recogieron aproximadamente 60 ml de sangre en tubos secos. En las dos horas posteriores a la toma de muestras, la sangre fue centrifugada a 2500 rpm durante 10 minutos. Se transfirieron aproximadamente 30 ml de suero a tubos de polipropileno y se almacenaron congelados a -20ºC hasta su uso adicional.

El suero se descongeló y se inactivó con calor a 56ºC durante 10 minutos y después se formaron alícuotas para evitar ciclos repetidos de congelación/descongelación. Parte se utilizó para realizar cinco etapas de diluciones a la mitad en medio (DMEM, Gibco, BRL) en una cantidad suficiente para llenar aproximadamente 70 placas de 96 pocillos. Las alícuotas de sueros no diluidos y diluidos fueron pipeteadas en placas de pocillos profundos (formato de 96 pocillos) y utilizando un Platemate programado dispensadas en alícuotas de 100 \mul en placas de 96 pocillos. De este modo las placas fueron cargadas con ocho sueros diferentes por duplicado (100 \mul/pocillo) conforme al siguiente esquema:

1

Donde S1/2 a S8/2 en las columnas 1 y 6 representan 1 X sueros diluidos y Sx/4, Sx/8, Sx/16 y Sx/32 las diluciones seriadas al doble. Las últimas placas también contenían cuatro pocillos cargados con 100 \mul de suero de ternera fetal como control negativo. Las placas se mantuvieron a -20ºC hasta su uso adicional.

Preparación de soluciones de partida de adenovirus humano

Se inocularon prototipos de todos los adenovirus humanos conocidos en matraces T25 sembrados con células PER.C6 (Fallaux y col., 1998) y se cosecharon tras un CPE completo. Tras congelar/descongelar se utilizaron 1-2 ml de productos lisados brutos para inocular un matraz T80 con células PER.C6 y el virus fue cosechado a un CPE completo. El marco temporal entre la inoculación y la aparición del CPE así como la cantidad de virus necesaria para re-infectar un nuevo cultivo, diferían entre los serotipos. Las soluciones de partida de adenovirus fueron preparadas mediante congelación/descongelación y se utilizaron para inocular 3-4 matraces de tres capas T175 cm^{2} con células PER.C6. Tras la aparición del CPE, las células se cosecharon golpeando suavemente con los dedos el matraz, se sedimentaron y el virus se aisló y se purificó mediante un gradiente en CsCl de dos etapas como sigue. Los sedimentos celulares fueron disueltos en 50 ml de tampón NaPO_{4} 10 mM (pH 7,2) y congelados a -20ºC. Después de descongelar a 37ºC, se añadieron 5,6 ml de desoxicolato de sodio (5% p/v). La solución se mezcló suavemente y se incubó durante 5-15 minutos a 37ºC para lisar completamente las células. Después de homogeneizar la solución, se añadieron 1875 \mul de MgCl_{2} 1M. Tras la adición de 375 \mul de ADNasa (10 mg/ml) la solución se incubó durante 30 minutos a 37ºC. Los restos celulares se separaron por centrifugación a 1880xg durante 30 minutos a la temperatura ambiente sin interrupción. El sobrenadante se purificó con posterioridad de las proteínas mediante extracción con FREON (3x). El sobrenadante aclarado se cargó en un gradiente por bloques de cloruro de cesio tamponado con Tris/HCl 1 M (intervalo: 1,2/1,4 g/ml) y se centrifugó a 21.000 rpm durante 2,5 horas a 10ºC. La banda de virus se aísla, después de lo cual se realiza una segunda purificación utilizando un gradiente continuo tamponado con Tris/HCl 1M de 1,33 gr/ml de cloruro de cesio. El virus fue centrifugado después durante 17 horas a 55.000 rpm a 10ºC. La banda de virus se aísla y se añade sacarosa (50% p/v) a una concentración final del 1%. El exceso de cloruro de cesio se separa mediante diálisis (tres veces 1 hora a la temperatura ambiente) y portas para diálisis (Slide-a-lizer, corte 10.000 kDa, Pierce, USA) frente a 1,5 litros de PBS suplementado con CaCl_{2} (0,9 mM), MgCl_{2} (0,5 mM) y una concentración creciente de sacarosa (1, 2, 5%). Después de la diálisis, el virus es separado del "slide-a-lizer" después de lo cual se toman alícuotas en porciones de 25 y 100 \mul tras lo cual el virus es almacenado a -85ºC.

Para determinar el número de partículas de virus por mililitro, se hacen pasar 50 \mul del lote de virus por una cromatografía líquida de alta presión (HPLC) como describen Shabram y col. (1997). Los virus se hicieron eluir utilizando un gradiente de NaCl que oscilaba de 0 a 600 mM. Como se representa en la tabla I, la concentración de NaCl a la cual eluían los virus difería significativamente entre los serotipos.

La mayor parte de los adenovirus humanos replicaban bien en las células PER.C6 con pequeñas excepciones. Los adenovirus de tipo 8 y 40 se hicieron crecer en células 911-E4 (He y col., 1998). Las soluciones de partida purificadas contenían entre 5x10^{10} y 5x10^{12} partículas de virus/ml (VP/ml; ver la tabla I).

Titulación de soluciones de partida de adenovirus humano purificado

Los adenovirus fueron titulados en células PER.C6 para determinar la cantidad de virus necesaria para obtener un CPE completo en cinco días, la duración del análisis de neutralización. A este fin, se dispensaron 100 \mul de medio en cada pocillo de las placas de 96 pocillos. Se añadieron 25 \mul de soluciones de partida de adenovirus prediluidas 10^{4}, 10^{5}, 10^{6} o 10^{7} veces a la columna 2 de una placa de 96 pocillos y se mezclaron pipeteando arriba y abajo 10 veces. Después se llevaron 25 \mul de la columna 2 a la columna 3 y de nuevo se mezclaron. Esto se repitió hasta la columna 11 después de lo cual se descartaron 25 \mul de la columna 11. De este modo se obtuvieron diluciones seriadas en etapas de 5 partiendo de una solución de partida prediluida. Después se añadieron 3x10^{4} células PER.C6 en un volumen de 100 \mul y las placas se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante cinco o seis días. Se controló microscópicamente el CPE. Se utilizó el método de Reed y Muensch para calcular la dosis inhibidora del cultivo celular en un 50%
(DICC50).

Análogamente, se crearon placas idénticas que fueron analizadas utilizando el análisis MTT (Promega). En este análisis se cuantifican células vivas mediante tinción colorimétrica. A este fin, se añadieron 20 \mul de MTT (7,5 mgr/ml en PBS) a los pocillos y se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante dos horas. El sobrenadante fue separado y se añadieron a los pocillos 100 \mul de una solución 20:1 de isopropanol/Gritón-X100. Las placas se pusieron en un sacudidor de 96 pocillos durante 3-5 minutos para solubilizar la tinción precipitada. Se midió la absorbancia a 540 nm y a 690 nm (fondo). Mediante este análisis se pueden distinguir los pocillos con CPE en marcha o con CPE completo.

Análisis de neutralización

Se descongelaron placas de 96 pocillos con muestras de suero humano diluido a 37ºC, CO_{2} al 5%. Se prepararon soluciones de partida de adenovirus diluidas a 200 DICC50 por 50 \mul y se añadieron alícuotas de 50 \mul a las columnas 1-11 de las placas con suero. Las placas fueron incubadas durante 1 hora a 37ºC, CO_{2} al 5%. Después se dispensaron 50 \mul de células PER.C6 a 6x10^{5}/ml en todos los pocillos y se incubaron durante 1 día a 37ºC, CO_{2} al 5%. El sobrenadante se separó utilizando puntas de pipeta nuevas para cada fila y se añadieron 200 \mul de medio fresco a todos los pocillos para evitar los efectos tóxicos del suero. Las placas fueron incubadas durante otros 4 días a 37ºC, CO_{2} al 5%. Además, se establecieron placas de control paralelas por duplicado con sueros de control positivos diluidos generados en conejos y específicos para cada serotipo que se iba a someter a ensayo en las filas A y B y con suero de control negativo (FCS) en las filas C y D. Asimismo, en cada una de las filas E-H se realizó una titulación como se ha descrito antes con etapas de dilución a la quinta parte partiendo de una DICC50 de 200 de cada virus que va a ser sometido a ensayo. El día 5 una de las placas de control fue analizada microscópicamente y con el análisis MTT. Se calculó el título experimental a partir de la placa de titulación de control observada microscópicamente. Si se encontraba que el CPE era completo, es decir la primera dilución en el experimento de titulación de control analizada mediante MTT muestra una clara muerte celular, todas las placas de análisis eran tratadas. Si no, se dejaba continuar el análisis durante uno o más días hasta que el CPE completo era evidente después de lo cual se trataban todas las placas. En la mayoría de los casos, los análisis se terminaban el día 5. Para Ad1, 5, 33, 39, 42 y 43 el análisis se dejó durante seis días y para Ad2 durante ocho días.

Se considera que una muestra de suero es "no neutralizadora" cuando a la concentración de suero más elevada se observa una protección máxima del 40% en comparación con los controles sin suero.

Los resultados del análisis de los adenovirus del prototipo 44 frente al suero de 100 voluntarios sanos se muestran en la Fig. 1. Como se esperaba, el porcentaje de las muestras de suero que contenían anticuerpos neutralizadores para Ad2 y Ad5 era muy elevado. Esto también se verificaba para la mayor parte de los adenovirus de numeración inferior. Sorprendentemente, ninguna de las muestras de suero contenía anticuerpos neutralizadores para el Ad35. Asimismo, el número de individuos con títulos de anticuerpos neutralizadores para los serotipos 26, 34 y 48 era muy bajo. Por lo tanto, los adenovirus con E1 suprimida recombinante basados en Ad35 o uno de los otros serotipos mencionados antes tienen una importante ventaja en comparación con los vectores recombinantes basados en Ad5 respecto al aclaramiento de los virus por los anticuerpos neutralizadores.

Asimismo, los vectores basados en Ad5 que tienen (partes de) las proteínas de la cápsida implicadas en la respuesta inmunogénica del huésped remplazadas por las correspondientes (partes de) proteínas de la cápsida de Ad35 o uno de los otros serotipos serán menos, o incluso no serán, neutralizados por la inmensa mayoría de los sueros humanos.

Como se puede observar en la Tabla I la razón VP/DICC50 calculada a partir de las partículas de virus por ml y la DICC50 obtenida para cada virus en los experimentos era muy variable y oscilaba entre log 0,4 y 5. Esto estaba causado probablemente por las diferentes eficacias de infección de las células PER.C6 y por las diferencias en la eficacia de replicación de los virus. Además, las diferencias en las calidades de los lotes pueden jugar un papel. Una elevada proporción VP/DICC50 representa que se había puesto más virus en los pocillos para obtener el CPE en 5 días. Como consecuencia el resultado del estudio de neutralización podría estar influido puesto que más partículas de virus (inactivas) podían proteger los anticuerpos. Para verificar si este fenómeno había tenido lugar, se trazó la proporción VP/DICC50 frente al porcentaje de las muestras de suero que se había encontrado que eran positivas en el análisis (Fig. 2). El gráfico muestra claramente que no hay correlación negativa entre la cantidad de virus del análisis y la neutralización en suero.

Ejemplo 2 La prevalencia de la actividad neutralizadora (NA) para Ad35 es baja en sueros humanos de diferentes localizaciones geográficas

En el ejemplo 1 los autores de la presente invención han descrito el análisis de la actividad neutralizadora (NA) en sueros humanos de una localización en Bélgica. Sorprendentemente, de un panel de 44 serotipos de adenovirus sometidos a ensayo, un serotipo, Ad35, no era neutralizado en ninguno de los 100 sueros analizados. Además, se encontró que unos pocos serotipos, Ad26, Ad34 y Ad48 eran neutralizados en un 8%, o menos, de los sueros sometidos a ensayo. Este análisis fue ampliado adicionalmente a otros serotipos de adenovirus no sometidos a ensayo previamente y, utilizando una selección del primer rastreo, también se amplió a sueros de diferentes localizaciones geográficas.

A este fin, los adenovirus fueron propagados, purificados y sometidos a ensayo en cuanto a la neutralización en el análisis de inhibición de CPE como se describe en el ejemplo 1. Utilizando los sueros del mismo lote que en el ejemplo 1, se sometieron a ensayo para la neutralización los serotipos de adenovirus 7B, 11, 14, 18 y 44/1876. Se encontró que estos virus eran neutralizados respectivamente en el 59, 13, 30, 98 y 54% de los sueros. Así, de esta serie Ad11 es neutralizado con una frecuencia relativamente baja.

Puesto que se sabe que la frecuencia de aislamiento de los serotipos de adenovirus de tejido humano así como la prevalencia de NA para los serotipos de adenovirus pueden diferir en las diferentes localizaciones geográficas, los autores de la presente invención sometieron a ensayo una selección de los serotipos de adenovirus contra sueros de diferentes lugares. Se obtuvieron sueros humanos de dos lugares adicionales en Europa (Bristol, Reino Unido y Leiken, Países Bajos) y de dos lugares en los Estados Unidos (Stanford, CA y Great Neck, NY). Los adenovirus que se encontró que eran neutralizados en el 20% o menos de los sueros del primer rastreo, así como Ad2, Ad5, Ad27, Ad30, Ad38, Ad43, fueron sometidos a ensayo en cuanto a la neutralización en sueros del Reino Unido. Los resultados de estos experimentos se presentan en la Figura 3. Los adenovirus de serotipos 2 y 5 fueron neutralizados de nuevo en un elevado porcentaje de sueros humanos. Además, algunos de los serotipos que eran neutralizados en un bajo porcentaje de sueros en el primer rastreo son neutralizados en un porcentaje mayor de los sueros del Reino Unido, v.g. Ad26 (7% vs. 30%), Ad28 (13% v. 50%), Ad34 (5% vs. 27%) y Ad48 (8% vs. 32%). La actividad neutralizadora frente a Ad11 y Ad49 que se encontraban en un porcentaje relativamente bajo de sueros en el primer rastreo, se encuentran en un porcentaje incluso menor de sueros en este segundo rastreo (13% vs. 5% y 20% vs. 11%, respectivamente). Se encontró ahora que el serotipo de Ad35 que no era neutralizado en ninguno de los sueros en el primer rastreo, era neutralizado en un bajo porcentaje (8%) de sueros del Reino Unido. La prevalencia de NA en sueros humanos del Reino Unido es la más baja para los serotipos Ad11 y Ad35.

Para un análisis adicional, se obtuvieron sueros de dos localizaciones en los Estados Unidos (Stanford, CA y Great Neck, NY) y de Países Bajos (Leiden). La Figura 4 presenta una visión de conjunto de los datos obtenidos con estos sueros y los datos previos. No todos los virus fueron sometidos a ensayo en todos los sueros, excepto para Ad5, Ad11 y Ad35. La conclusión global de este rastreo comprensivo de sueros humanos es que la prevalencia de actividad neutralizadora para Ad35 es la más baja de todos los serotipos en todos los países del oeste: como media el 7% de los sueros humanos contienen actividad neutralizadora (5 localizaciones diferentes). Otro grupo B de adenovirus, Ad11 también es neutralizado en un bajo porcentaje de sueros humanos (media 11% en sueros de 5 localizaciones diferentes). El adenovirus de tipo 5 es neutralizado en un 56% de los sueros humanos obtenidos de 5 localizaciones diferentes. Aunque no sometidos a ensayo en todos los sueros, el serotipo 49 del grupo D también es neutralizado con una frecuencia relativamente baja en muestras de Europa y de una localización de los Estados Unidos (media 14%).

En los experimentos de neutralización descritos aquí se evalúa que un suero no es neutralizador cuando en el pocillo con la concentración de suero más elevada la protección máxima de CPE es del 40% en comparación con los controles sin suero. La protección se calcula como sigue:

% protección = \frac{\text{DO pocillo correspondiente - DO control virus}}{\text{DO control no infectado - DO control virus}} x 100

Como se ha descrito en el ejemplo 1, el suero es cultivado en placa en cinco diluciones diferentes que oscilan entre diluciones por 4 y por 64. Por lo tanto, es posible distinguir entre títulos bajos (es decir neutralización sólo en las concentraciones de suero más elevadas) y títulos elevados de NA (es decir también neutralización en pocillos con la concentración de suero más baja). De los sueros humanos utilizados en el rastreo de los autores de la presente invención que se encontró que contenían actividad neutralizadora para Ad5, resultó que el 70% tenía títulos elevados mientras que de los sueros que contenían NA para Ad35, sólo el 15% tenían títulos elevados. De los sueros que eran positivos en cuanto a NA para Ad11 sólo el 8% tenían títulos elevados. Para Ad49 este era del 5%. Por lo tanto, no sólo la frecuencia de NA para Ad35, Ad11 y Ad49 es mucho más baja en comparación con Ad5, si no que de los sueros que contienen NA para estos virus, la inmensa mayoría tiene títulos bajos. Los vectores adenovirales basados en Ad11, Ad35 o Ad49 tienen por lo tanto una clara ventaja sobre los vectores basados en Ad5 cuando se utilizan como vehículos de terapia génica o vectores de vacunación in vivo o en cualquier aplicación en la que la eficacia de infección sea impedida por la actividad neutralizadora.

En los siguientes ejemplos se describe la construcción de un sistema vector para la generación de vectores basados en Ad35 libres de RCA, seguros.

Ejemplo 3 Secuencia de adenovirus humano de tipo 35

Los virus Ad35 fueron propagados en células PER.C6 y el ADN fue aislado como sigue. A 100 \mul de solución de partida del virus (AD35: 3,26 x 10^{12} VP/ml), se le añadieron 10 \mul de tampón con ADNasa 10X (Tris-HCl 130 mM, pH 7,5; CaCl_{2} 1,2 M; MgCl_{2} 50 mM). Tras la elución de 10 \mul de ADNasa de 10 mg/ml (Roche Diagnostics), la mezcla fue incubada durante 1 hora a 37ºC. Tras la adición de 2,5 \mul de EDTA 0,5 M, 3,2 \mul de SDS al 20% y 1,5 \mug de Proteinase K (Roche Diagnostics; 20 mg/ml), las muestras fueron incubadas a 50ºC durante 1 horas. A continuación, el ADN viral fue aislado utilizando el estuche de centrifugación GENECLEAN (Bio101 Inc.) según la instrucciones del fabricante. El ADN se hizo eluir de la columna de centrifugación con 25 \mul de agua estéril MilliQ. La secuencia total fue generada por Qiagen Sequence Services (Qiagen GmbH, Alemania). El ADN viral total fue sometido a cizalla mediante sonicación y los extremos del ADN se volvieron romos mediante ADN polimerasa de T4. Los fragmentos romos sometidos a cizalla fueron fraccionados por tamaños sobre geles de agarosa y se obtuvieron las porciones de gel correspondientes a los fragmentos de ADN de 1,8 a 2,2 kb. El ADN fue purificado a partir de las porciones de gel mediante el protocolo de extracción de gel de QIAquick y subclonado en un banco de secuenciación aleatoria "shotgun" de vectores de clonación del plásmido pUC19. Se utilizó una disposición de los clones en placas de 96 pocillos cubriendo el ADN diana 8 (+/- 2) veces para generar la secuencia total. La secuenciación se realizó en Termociclers Perkin-Elmer 9700 utilizando la química de BigDyeTerminator y la ADN polimerasa de AmpliTaq FS seguido de purificación de las reacciones de secuenciación utilizando la tecnología QIAGEN DyeEx 96. Los productos de la reacción de secuenciación fueron sometidos después a separación automatizada y detección de fragmentos en secuenciadores de 96 calles ABI 377 XL. La secuencia inicial, la secuencia contigua y los espacios fueron rellenados mediante lecturas de paseo con cebador sobre el ADN diana o mediante secuenciación directa de los productos de la PCR. Los extremos de los virus resultaron estar ausentes en el banco de secuenciación aleatoria "shotgun", muy probablemente debido a las dificultades de clonación resultantes de los aminoácidos de pTP que permanecen unidos a las secuencias ITR tras la digestión con proteinasa K del ADN viral. Los pases de secuencia adicionales sobre el ADN viral resolvían la mayor parte de la secuencia de esas regiones, sin embargo era difícil obtener una secuencia clara de los nucleótidos más terminales. En el extremo 5' la porción de la secuencia obtenida era 5'-CCAATAATATACCT-3' (SEC ID NUM.__) mientras en el extremo 3' la porción de la secuencia obtenida era
5'-AGGTATATTATTGATGATGGG-3' (SEC ID NUM.__). La mayoría de los adenovirus humanos tienen una secuencia terminal 5'-CATCATCAATAATATACC-3' (SEC ID NUM.__). Además, un clon que representaba el extremo 3' del ADN de Ad35 obtenido tras clonar el fragmento EcoRI de Ad35 de 7 kb terminal en pBr322 también resultó tener la secuencia CATCATCAATAAT...típica. Por lo tanto, Ad35 puede tener la secuencia del extremo típica y las diferencias obtenidas al secuenciar directamente el ADN viral se deben a artefactos correlacionados con pases de secuencia "run-off" y la presencia de aminoácidos residuales de pTP.

La secuencia total de Ad35 con secuencias terminales corregidas se da en la Figura 5. Basándose en la homología de la secuencia con Ad5 (Genbank #M72360) y Ad7 (secuencia parcial Genbank #X03000) y en la localización de los marcos de lectura abiertos, la organización del virus es idéntica a la organización general de la mayoría de los adenovirus humanos, especialmente los virus del subgrupo B. La longitud total del genoma es de 34794 pares de bases.

Ejemplo 4 Construcción de un sistema vector basado en plásmidos para generar virus basados en Ad35 recombinantes

Un sistema vector basado en plásmidos funcional para generar vectores adenovirales recombinantes comprende los siguientes componentes:

1.: Un plásmido adaptador que comprende una ITR izquierda y secuencias de empaquetamiento derivadas de Ad35 y al menos un sitio de restricción para la inserción de una casete de expresión heteróloga y carente de secuencias E1. Además, el plásmido adaptador contiene las secuencias 3' de Ad35 de la región codificadora de E1B incluyendo el promotor pIX y secuencias codificadoras suficientes para mediar la recombinación homóloga del plásmido adaptador con una segunda molécula de ácido nucleico.

2.: Una segunda molécula de ácido nucleico, que comprende secuencias homólogas al plásmido adaptador, y secuencias de Ad35 necesarias para la replicación y el empaquetamiento del virus recombinante, esto es, genes tempranos, intermedios y tardíos que no están presentes en la célula de empaquetamiento.

3.: Una célula de empaquetamiento que proporciona al menos proteínas E1 funcionales capaces de complementar la función E1 de Ad35.

Otros métodos para la generación de adenovirus recombinantes en células de empaquetamiento complementadoras son conocidos en la técnica y pueden ser aplicados a los virus Ad35 sin apartarse de la invención. Como ejemplo, se describe con detalle más abajo un sistema basado en plásmidos, como se ha esbozado antes.

1) Construcción de plásmidos adaptadores de Ad35

El plásmido adaptador pAdApt (Descrito en la Solicitud de Patente Internacional WO99/55132) fue modificado primero para obtener plásmidos adaptadores que contienen poliligadores ampliados y que tienen los sitios de restricción únicos convenientes flanqueando la ITR izquierda y la secuencia de adenovirus en el extremo 3' para permitir la liberación del inserto de adenovirus de las secuencias del vector plasmídico. La construcción de estos plásmidos se describe más abajo con detalle: El plásmido adaptador pAdApt fue digerido con SalI y tratado con Shrimp Alkaline Phosphatase para reducir la re-ligadura. Un conector, compuesto por los siguientes dos oligos fosforilados y recocidos: ExSalPacF 5' - TCG ATG GCA AAC AGC TAT TAT GGG TAT TAT GGG TTC GAA TTA ATT AA- 3' (SEC ID NUM.__); y ExSalPacR 5' - TCG ATT AAT TAA TTC GAA CCC ATA ATA CCC ATA ATA GCT GTT TGC CA- 3' (SEC ID NUM.__); fue ligado directamente en el constructo digerido, remplazando de ese modo el sitio de restricción SalI por Pi-PsPI, SwaI y PacI. Este constructo fue denominado conector pADAPT+ExSalPac. Además, parte de la ITR izquierda de pAdApt fue amplificada mediante PCR utilizando los siguientes cebadores: PCLIPMSF: 5' -CCC CAA TTG GTC GAC CAT CAT CAA TAA TAT ACC TTA TTT TGG -3' (SEC ID NUM.__) y pCLIPBSRGI: 5' - GCG AAA ATT GTC ACT TCC TGT G - 3' (SEC ID NUM.__). El fragmento amplificado fue digerido con MunI y BsrGI y clonado en pAd5/Clip (descrito en la Solicitud de Patente Internacional WO99/55132), que estaba parcialmente digerido con EcoRI y tras la purificación digerido con BsrGI, re-insertando de ese modo la ITR izquierda y la señal de empaquetamiento. Tras el análisis con la enzima de restricción, el constructo fue digerido con ScaI y SgrAI y el fragmento de 800 pb fue aislado del gel y ligado en el conector pADAPT+ExSalPac digerido con ScaI/SgrAI. El constructo resultante, denominado pIPspSalAdapt, fue digerido con SalI, desfosforilado, y ligado al conector de doble hebra ExSalPacF/ExSalPacR fosforilado mencionado antes. Un clon en el que el sitio PacI era el más cercano a la ITR fue identificado mediante análisis de restricción y las secuencias fueron confirmadas mediante análisis de la secuencia. Este constructo pAdApt novedoso, denominado pIPspAdapt alberga por tanto dos conectores ExSalPac que contienen las secuencias de reconocimiento para PacI, PI-PspI y BstBI, que rodean la porción adenoviral del constructo adaptador adenoviral, y que puede ser utilizado para linealizar el ADN plasmídico antes de la co-transfección con fragmentos coadyuvantes adenovirales.

Con el fin de incrementar adicionalmente las permutaciones de clonación transgénica se construyeron numerosas variantes de poliligadores basadas en pIPspAdapt. Para este fin se digirió primero pIPspAdapt con EcoRI y se desfosforiló. Un conector compuesto por los dos oligos fosforilados y recocidos siguientes: Ecoconector+: 5' - AAT TCG GCG CGC CGT CGA CGA TAT CGA TAG CGG CCG C - 3' (SEC ID NUM.__) y Ecoconector-: 5' - AAT TGC GGC CGC TAT CGA TAT CGT CGA CGG CGC GCC G - 3' (SEC ID NUM.__) fue ligado en este constructo, creando de este modo sitios de restricción para AscI, SalI, EcoRV, ClaI y NotI. Se obtuvieron ambas orientaciones de este conector y se confirmaron las secuencias mediante análisis de restricción y análisis de la secuencia. El plásmido que contenía el poliligador en el orden 5' HindIII, KpnI, AgeI, EcoRI, AscI, SalI, EcoRV, ClaI, NotI, NheI, HpaI, BamHI y XbaI fue denominado pIPspAdapt1 mientras el plásmido que contenía el poliligador en el orden HindII, KpnI, AgeI, NotI, ClaI, EcoRV, SalI, AscI, EcoRI, NheI, HpaI, BamHI y XbaI fue denominado pIPspAdapt2.

Para facilitar la clonación de los otros constructos efectores o de cambio de sentido, se diseñó un conector compuesto por los dos oligonucleótidos siguientes, para invertir el poliligador del pIPspAdapt: HindXba+ 5'-AGC TCT AGA GGA TCC GTT AAC GCT AGC GAA TTC ACC GGT ACC AAG CTT A-3' (SEC ID NUM.__); HindXba-5'-CTA GTA AGC TTG GTA CCG GTG AAT TCG CTA GCG TTA ACG GAT CCT CTA G-3' (SEC ID NUM.__). Este conector fue ligado en pIPspAdapt digerido con HindIII/XbaI y el constructo correcto fue aislado. La confirmación se realizó mediante análisis con enzimas de restricción y secuenciación. Este nuevo constructo, pIPspAdaptA, fue digerido con EcoRI y el Ecoconector mencionado antes fue ligado en este constructo. Se obtuvieron ambas orientaciones de este conector, dando como resultado pIPspAdapt3, que contiene el poliligador en el orden XbaI, BamHI, HpaI, NheI, EcoRI, AscI, SalI, EcoRV, ClaI, NotI, AgeI, KpnI y HindIII. Todas las secuencias fueron confirmadas mediante análisis con enzimas de restricción y secuenciación.

Después se construyeron plásmidos adaptadores basados en Ad35 como sigue:

La ITR izquierda y la secuencia de empaquetamiento correspondiente a los nucleótidos 1 a 464 de las secuencias de Ad35 wt (Figura 5) fueron amplificadas mediante PCR sobre wtAd35 ADN utilizando los siguientes cebadores:

Cebador 35F1:

\hskip0,3cm 5'-CGG AAT TCT TAA TTA ATC GAC ATC ATC AAT AAT ATA CCT TAT AG-3'

(SEC ID NUM.__)

Cebador 35R2:

\hskip0,3cm 5'-GGT GGT CCT AGG CTG ACA CCT ACG TAA AAA CAG-3'

(SEC ID NUM.__)

La amplificación introduce un sitio PacI en el extremo 5' y un sitio AvrII en el sitio 3' de la secuencia.

Para la amplificación se utilizó la enzima ADN polimerasa Platinum Pfx (LTI) según las instrucciones del fabricante pero con los cebadores a 0,6 \muM con DMSO añadido a una concentración final del 3%. El programa de amplificación fue el siguiente: 2 minutos a 94ºC, (30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 56ºC, 1 minuto a 68ºC) durante 30 ciclos, seguido de 10 minutos a 68ºC. El producto de la PCR fue purificado utilizando un estuche de purificación PCR (LTI) según las instrucciones de fabricante y digerido con PacI y AvrII. El fragmento digerido fue purificado después en gel utilizando el estuche Geneclean (Bio 101, Inc.). El plásmido adaptador basado en Ad5 pIPspAdapt-3 fue digerido con AvrII y después parcialmente con PacI y el fragmento de 5762 pb fue aislado en una porción de gel de agarosa LMP y ligado con el fragmento de PCR mencionado antes digerido con las mismas enzimas y transformado en células DH10B electrocompetentes (LTI). El clon resultante se denomina pIPspAdapt3-Ad35lITR.

Paralelamente, se amplificó una segunda porción de ADN de Ad35 utilizando los siguientes cebadores:

335F3: 5'-TGG TGG AGA TCT GGT GAG TAT TGG GAA AAC-3'	(SEC ID NUM.__)
435R4: 5'-CGG AAT TCT TAA TTA AGG GAA ATG CAA ATC TGT GAG G-3'	(SEC ID NUM.__)

Las secuencias de este fragmento corresponden a los nucl. 3401 a 4669 de wtAd35 (Figura 5) y contiene 1,3 kb de secuencias que comienzan directamente 3' desde la secuencia codificadora de E1B 55k. La amplificación y purificación se realizaron como se ha descrito aquí antes para el fragmento que contiene la ITR izquierda y la secuencia de empaquetamiento. El fragmento de PCR fue digerido después con PacI y subclonado en el vector pNEB193 (New England Biolabs) digerido con SmaI y PacI. La integridad de la secuencia del clon resultante fue verificada mediante análisis de la secuencia. Después pNEB/Ad35pF3R4 fue digerido con BglII y PacI y el inserto de Ad35 fue aislado del gel utilizando el estuche QIAExII (Qiagen). PIPspAdapt3-Ad35lITR fue digerido con BglII y después parcialmente con PacI. El fragmento de 3624 pb (conteniendo secuencias del vector, la ITR de Ad35 y las secuencias de empaquetamiento así como el promotor de CMV, la región de clonación múltiple y la señal poliA), también fue aislado utilizando el estuche QIAExII (Qiagen). Ambos fragmentos fueron ligados y transformados en células DH10B competentes (LTI). El clon resultante, pAdApt35IP3, tiene la casete de expresión de pIPspAdapt3 pero contiene la ITR izquierda de Ad35 y las secuencias de empaquetamiento y un segundo fragmento correspondiente a los nucl. 3401 a 4669 de Ad35. Una segunda versión del plásmido adaptador de Ad35 que tenía el sitio de clonación múltiple en la orientación contraria se elaboró como sigue:

PIPspAdapt1 fue digerido con NdeI y BglII y la banda de 0,7 kpb que contiene parte del promotor de CMV, MCS y poliA de SV40 fue aislado e insertado en los sitios correspondientes de pAdApt35IP3 generando pAdApt35IPl (Figura 6).

Los plásmidos adaptadores pAdApt35.LacZ y pAdApt35.Luc fueron generados después insertando los transgenes de pcDNA.LacZ (digerido con KpnI y BamHI) en los sitios correspondientes en pAdApt35IPl. La generación de pcDNA.LacZ y pAdApt.Luc se describe en WO99/55132.

2) Construcción del cósmido pWE.Ad35.pXI-rITR

La Figura 7 presenta las diversas etapas acometidas para construir el clon cosmídico que contiene las secuencias de Ad35 de los pb 3401 a 34794 (extremo de la ITR derecha) que se describen con detalle más abajo.

Se generó un primer fragmento de PCR (pIX-NdeI) utilizando el siguiente grupo de cebadores:

535F5: 5'-CGG AAT TCG CGG GCG CCG CGG TGA GTA TTG GGA AAA C-3'	(SEC ID NUM.__)
635R6: 5'-CGC CAG ATC GTC TAC AGA ACA G-3'	(SEC ID NUM.__)

Se utilizó la ADN polimerasa Pwo (Roche) según las instrucciones del fabricante, sin embargo, con una concentración final de 0,6 \muM de ambos cebadores y utilizando 50 ngr de ADN de Ad35 wt como molde. La amplificación se realizó como sigue: 2 minutos a 94ºC, 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 65ºC y 1 minuto 45 segundos a 72ºC, seguido de 8 minutos a 68ºC. Para permitir la clonación en el vector de clonación TA PCR2.1, se realizó una última incubación con 1 unidad de polimerasa superTaq (HT Biotechnology LTD) durante 10 minutos a 72ºC.

El fragmento amplificado de 3370 pb contiene las secuencias de Ad35 desde el pb 3401 al 6772 con un sitio NotI añadido en el extremo 5'. Los fragmentos fueron purificados utilizando el estuche de purificación por PCR (LTI).

Se generó un segundo fragmento de PCR (NdeI-rITR) utilizando los siguientes cebadores:

735F7: 5'-GAA TGC TGG CTT CAG TTG TAA TC-3'	(SEC ID NUM.__)
835R8: 5'-CGG AAT TCG CGG CCG CAT TTA AAT CAT CAT CAA TAA TAT ACC-3'	(SEC ID NUM.__)

La amplificación se realizó con ADN polimerasa pfx (LTI) según las instrucciones del fabricante pero con 0,6 \muM de ambos cebadores y DMSO al 3% utilizando 10 ngr. De ADN de wtAd35 como molde. El programa era el siguiente:

3 minutos a 94ºC y 5 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 45 segundos a 40ºC, 2 minutos 45 segundos a 68ºC seguido de 25 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC, 2 minutos 45 segundos a 68ºC. Para permitir la clonación en el vector de clonación TA PCR2.1, se realizó una última incubación con 1 unidad de polimerasa superTaq durante 10 minutos a 72ºC. El fragmento amplificado de 1,6 kb que oscilaba del nucl. 33178 al extremo de la ITR derecha de Ad35, fue purificado utilizando el estuche de purificación por PCR (LTI). Ambos fragmentos de PCR purificados fueron ligados en el vector PCR2.1 del estuche de clonación TA (Invitrogen) y transformados en células competentes STBL-2 (LTI). Los clones que contenían el inserto esperado fueron secuenciados para confirmar la amplificación correcta. A continuación, ambos fragmentos fueron separados por corte del vector mediante digestión con NotI y NdeI y purificados en gel utilizando el estuche Geneclean (Bio 101, Inc.). El vector cosmídico pWE15 (Clontech) fue digerido con NotI, desfosforilado y también purificado en gel. Estos tres fragmentos fueron ligados y transformados en células competentes STBL2 (LTI). Uno de los clones correctos que contenía ambos fragmentos de la PCR fue digerido después con NdeI y el fragmento lineal fue purificado en gel utilizando el estuche Geneclean. El ADN de Ad35 wt fue digerido con NdeI y el fragmento de 26,6 kb fue purificado en gel LMP utilizando enzima Agarase (Roche) según las instrucciones del fabricante. Estos fragmentos fueron ligados entre sí y empaquetados utilizando los extractos de empaquetamiento del fago \lambda1 (Stratagene) según el protocolo del fabricante. Tras la infección en células STBL-2, las colonias se hicieron crecer sobre placas y se analizaron en cuanto a la presencia del inserto completo. Se seleccionó un clon con el fragmento grande insertado en la orientación correcta y que tiene los patrones de restricción correctos tras las digestiones independientes con tres enzimas (NcoI, PvuII y ScaII). Este clon fue denominado pWE.Ad35p9-rITR. Contiene las secuencias de Ad35 desde el pb 3402 al extremo y está flanqueado por sitios NotI
(Figura 8).

3) Generación de virus recombinantes basados en Ad35 sobre PER.C6

El virus Ad35 de tipo salvaje se puede hacer crecer sobre células de empaquetamiento PER.C6 a títulos muy elevados. No obstante, no se sabe si la región E1 de Ad5 que está presente en PER.C6 es capaz de complementar los virus recombinantes de Ad35 con E1 suprimida. Para someter a ensayo esto, las células PER.C6 cotransfectadas con el plásmido adaptador pAdApt35.LacZ descrito antes y el fragmento del esqueleto grande pWE.Ad35.pIX-rITR. Primero, pAdApt35.LacZ fue digerido con PacI y pWE.Ad35.pIX-rITR fue digerido con NotI. Sin purificación adicional se mezclaron 4 \mugr de cada constructo con DMEM (LTI) y transfectado en células PER.C6, sembrados a una densidad de 5x10^{6} células en un matraz T25 el día antes, utilizando Lipofectamine (LTI) según las instrucciones del fabricante. Como control positivo, se co-transfectaron 6 \mugr de ADN de pWE.Ad35.pIX-rITR digerido con PacI con un fragmento NheI de 6,7 kb aislado de ADN de Ad35 wt que contenía el extremo izquierdo del genoma viral incluyendo la región E1. Al día siguiente se renovó el medio (DMEM con FBS al 10% y MgCl_{2} 10 mM) y las células fueron incubadas adicionalmente. A los 2 días de la transfección, las células fueron tratadas con tripsina y transferidas a matraces T80. El matraz de control positivo mostraba CPE a los cinco días de la transfección, mostrando que el constructo pWE.Ad35.pIX-rITR es funcional al menos en presencia de proteínas E1 de Ad35. La transfección con el plásmido adaptador LacZ de Ad35 y pWE.Ad35.pIX-rITR no daba lugar a CPE. Estas células fueron cosechadas en el medio el día 10 y congeladas/descongeladas una vez para liberar el virus de las células. Se añadieron 4 ml del material cosechado a un matraz T80 con las células PER.C6 (a una confluencia del 80%) y se incubaron durante otros cinco días. Esta cosecha/re-infección se repitió dos veces pero no hubo evidencia de CPE asociado con virus. A partir de este experimento parece que las proteínas E1 de Ad5 no son, o no son bastante, capaces de complementar los virus recombinantes de Ad35, sin embargo, puede ser que el solapamiento de la secuencia del plásmido adaptador y el plásmido con el esqueleto de pWE.Ad35.pIX-rITR no sea lo bastante grande para recombinar eficazmente y dar origen a un genoma de virus recombinante. La transfección de control positiva se realizó con un fragmento del extremo izquierdo de 6,7 kb y por lo tanto el solapamiento de la secuencia era de aproximadamente 3,5 kb. El plásmido adaptador y el fragmento pWE.Ad35.pIX-rITR tienen un solapamiento de la secuencia de 1,3 kb. Para verificar si el solapamiento de la secuencia de 1,3 kb es demasiado pequeño para una recombinación homóloga eficaz, se realizó una cotransfección con pWE.Ad35.pIX-rITR digerido con PacI y un fragmento de PCR de ADN wt de Ad35 generado con 35F1 y 35R4 mencionados antes utilizando los mismos procedimientos descritos antes. El fragmento de PCR contiene por tanto las secuencias del extremo izquierdo hasta el pb 4669 y por lo tanto tiene las mismas secuencias solapantes con pWE.Ad35.pIX-rITR que el plásmido adaptador pAdApt.LacZ pero tiene secuencias E1 de Ad35. Tras la purificación en columna de PCR, el ADN fue digerido con SalI para separar posibles secuencias molde intactas. Una transfección con el producto de la PCR digerido sólo servía como control negativo. Cuatro días después de la transfección, se produjo CPE en las células transfectadas con el producto de la PCR y el fragmento pIX-rITR de Ad35, y no en el control negativo. Este resultado muestra que la secuencia solapante de 1,3 kb es suficiente para generar virus en presencia de proteínas E1 de Ad35. A partir de estos experimentos los autores de la presente invención concluyen que la presencia de al menos una de las proteínas E1 de Ad35 es necesaria para generar vectores basados en Ad35 recombinantes a partir de ADN plasmídico en líneas celulares complementadoras
de Ad5.

Ejemplo 5 1) Construcción de plásmidos de expresión Ad35.E1

Puesto que las proteínas E1 de Ad35 en PER.C6 no son capaces de complementar los virus recombinantes de Ad35 eficazmente, las proteínas E1 de Ad35 han de ser expresadas en células complementadoras de Ad5 (v.g. PER.C6). Alternativamente se ha de elaborar una nueva línea celular de empaquetamiento que exprese las proteínas E1 de Ad35, partiendo o bien de células humanas primarias diploides o bien de líneas celulares establecidas que no expresen las proteínas E1 de adenovirus. Para estudiar la primera posibilidad, se clonó la región E1 de Ad35 en plásmidos de expresión como se describe más abajo.

Primero, se amplificó la región E1 de Ad35 desde el pb 468 al pb 3400 a partir de ADN de wtAd35 utilizando el siguiente grupo de cebadores:

135F11: 5'-GGG GTA CCG AAT TCT CGC TAG GGT ATT TAT ACC-3'	(SEC ID NUM.__)
235F10: 5'-GCT CTA GAC CTG CAG GTT AGT CAG TTT CTT CTC CAC TG-3'	(SEC ID NUM.__)

Esta PCR introduce un sitio KpnI y EcoRI en el extremo 5' y un sitio SbfI y XbaI en el extremo 3'.

La amplificación en 5 ngr de ADN molde se realizo con ADN polimerasa Pwo (Roche) utilizando las instrucciones del fabricante, no obstante, con ambos cebadores a una concentración final de 0,6 \muM. El programa era el siguiente: 2 minutos a 94ºC, 5 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 56ºC y 2 minutos a 72ºC, seguido de 25 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC y 2 minutos a 72ºC, seguido de 10 minutos a 72ºC. El producto de la PCR fue purificado mediante un estuche de purificación de PCR (LTI) y digerido con KpnI y XbaI. El fragmento de la PCR digerido fue ligado después al vector de expresión pRSVhbvNeo (ver más abajo), también digerido con KpnI y XbaI. Las ligaduras fueron transformadas en células STBL-2 competentes (LTI) según las instrucciones del fabricante y las colonias fueron analizadas en cuanto a la correcta inserción de las secuencias E1 de Ad35 en el poliligador entre el promotor de RSV y poliA de HBV. El clon resultante fue denominado pRSV.Ad35-E1 (Figura 9). Las secuencias de Ad35 en pRSV.Ad35-E1 fueron verificadas mediante análisis de la secuencia.

Se generó pRSVhbvNeo como sigue: pRc-RSV (Invitrogen) fue digerido con PvuII, desfosforilado con la enzima TSAP (LTI) y el fragmento vector de 3 kb fue aislado en agarosa de bajo punto de fusión (LMP). El plásmido pPGKNeopA (Figura 10) descrito en la Solicitud de Patente Internacional WO96/35798, fue digerido con SspI completamente para linealizar el plásmido y facilitar la digestión parcial con PvuII. Tras la digestión parcial con PvuII, los fragmentos resultantes fueron separados en un gel de agarosa LMP y el fragmento PvuII de 2245 pb, que contenía el promotor de PGK, el gen de resistencia a la neomicina y HBVpoliA, fue aislado. Ambos fragmentos aislados fueron ligados para dar el vector de expresión pRSV-pNeo que ahora tiene la casete de expresión SV40prom-neo-SV40poliA original remplazada por la casete PGKprom-neo-HBVpoliA (Figura 11). Este plásmido fue modificado adicionalmente para remplazar BGHpA por HBVpA como sigue: se linealizó pRSVpNeo con ScaI y se digirió adicionalmente con XbaI. El fragmento de 1145 pb, que contenía parte del gen Amp y las secuencias promotoras de RSV y una secuencia poliligadora, fue aislado en gel utilizando el estuche GeneClean (Bio Inc. 101). A continuación pRSVpNeo fue linealizado con ScaI y adicionalmente digerido con EcoRI parcialmente y el fragmento de 3704 pb que contenía la casete PGKneo y las secuencias del vector fueron aislados en gel como antes. Un tercer fragmento, que contenía la secuencia poliA de HBV flanqueada por XbaI y EcoRI en el extremo 5' y 3' respectivamente, fue generado después mediante amplificación por PCR en pRSVpNeo utilizando el siguiente grupo de
cebadores:

3HBV-F: 5'-GGC TCT AGA GAT CCT TCG CGG GAC GTC-3'	(SEC ID NUM.__)
y
4HBV-R: 5'-GGC GAA TTC ACT GCC TTC CAC CAA GC-3'	(SEC ID NUM.__)

La amplificación se realizó con la enzima Elongase (LTI) según las instrucciones del fabricante con las siguientes condiciones: 30 segundos a 94ºC, después 5 ciclos de 45 segundos a 94ºC, 1 minuto a 42ºC y 1 minuto a 68ºC, seguido de 30 ciclos de 45 segundos a 94ºC, 1 minuto a 65ºC y 1 minuto a 68ºC, seguido de 10 minutos a 68ºC. El fragmento de la PCR de 625 pb fue purificado después utilizando el estuche de purificación de PCR Qiaquick, digerido con EcoRI y XbaI y purificado en gel utilizando el estuche GeneClean. Los tres fragmentos aislados y transformados en células DH5\alpha competentes (LTI) para dar el constructo pRSVhbvNeo (Figura 12). En este constructo las regiones reguladoras de la transcripción de la casete de expresión de RSV y el gen marcador se modifican para reducir el solapamiento con los vectores adenovirales que a menudo contienen secuencias reguladoras de la transcripción de CMV
y SV40.

2) Generación de virus recombinantes de Ad35 en células PER.C6 cotransfectadas con un constructo de expresión de Ad35-E1

Se sembraron células PER.C6 a una densidad de 5 x 10^{6} células en un matraz T25 y al día siguiente se transfectaron con una mezcla de ADN que contenía:

-: 1 \mug pAdApt35.Lacz digerido con PacI

-: 5 \mug pRSV.Ad35E1 no digerido

-: 2 \mug pWE.Ad35.pIX-rITR digerido con NotI.

La transfección se realizó utilizando Lipofectamine según las instrucciones del fabricante. Cinco horas después de la adición de la mezcla de transfección a las células, el medio se separó y se remplazó por medio de nueva aportación. Al cabo de dos días las células fueron transferidas a matraces T80 y cultivadas adicionalmente. Una semana después de la transfección se añadió 1 ml del medio a células A549 y al día siguiente las células se tiñeron para la expresión de LacZ. Las células de color azul eran claramente visibles dos horas después de la tinción indicando que se habían producido virus que expresaban LacZ recombinantes. Las células fueron cultivadas adicionalmente pero no se observó una clara aparición de CPE. Sin embargo, al cabo de 12 días aparecían grupos de células en la monocapa y 18 días después de la transfección las células se despegaban. Las células y el medio se cosecharon después, se congelaron-descongelaron una vez y se utilizó 1 ml del producto lisado bruto para infectar células PER.C6 en una placa de 6 pocillos. Dos días después de la infección las células fueron teñidas para la actividad LacZ. Al cabo de dos horas se habían teñido de azul el 15% de las células. Para someter a ensayo la presencia de virus wt y/o de replicación competente, se infectaron células A549 con estos virus y se cultivaron adicionalmente. No se encontraron signos de CPE indicando la ausencia de virus de replicación competente. Estos experimentos muestran que los virus AdApt35.LacZ recombinantes se habían construido en células PER.C6 cotransfectadas con un constructo de expresión Ad35.E1.

Los virus recombinantes Ad35 escapan a la neutralización en suero humano conteniendo actividad neutralizadora para los virus Ad5.

Después se utilizaron virus AdApt35.LacZ para investigar la infección en presencia de suero que contiene actividad neutralizadora para los virus Ad5. El virus LacZ basado en Ad5 purificado servía como control positivo para NA. A este fin, se sembraron células PER.C6 en una placa de 24 pocillos a una densidad de 2 x 10^{5} células/pocillo. Al día siguiente, una muestra de suero humano con una elevada actividad neutralizadora para Ad5 fue diluida en medio de cultivo en cinco etapas de diluciones a la quinta. Después se mezclaron 0,05 ml de suero diluido con 4 x 10^{6} partículas de virus AdApt5.LacZ en 0,5 ml de medio y al cabo de 30 minutos de incubación a 37ºC, se añadieron 0,5 ml de la mezcla a las células PER.C6 por duplicado. Para los virus AdApt35.LacZ, se mezclaron 0,05 ml de las muestras de suero diluido con 0,5 ml de producto lisado bruto conteniendo virus AdApt35.LacZ y tras la incubación se añadieron 0,5 ml de esta mezcla a las células PER.C6 in duplo. Las muestras de virus incubadas en medio sin suero fueron utilizadas como controles positivos para la infección. A las dos horas de la infección a 37ºC, se añadió medio hasta alcanzar un volumen final de 1 ml y las células fueron incubadas adicionalmente. Dos días después de la infección, las células fueron teñidas para la actividad LacZ. Los resultados se muestran en la Tabla 2. A partir de estos resultados, resulta evidente que mientras que los virus AdApt5.LacZ son neutralizados eficazmente, los virus AdApt35.LacZ permanecen infecciosos con independencia de la presencia de suero humano. Esto demuestra que los virus basados en Ad35 recombinantes escapan a la neutralización en sueros humanos que contienen NA para virus basados en Ad5.

Ejemplo 6 Generación de líneas celulares capaces de complementar los virus Ad35 con E1 suprimida Generación de pIG135 y pIG270

El constructo pIG.E1A.E1B (Fig. 13) contiene las secuencias de la región E1 de Ad35 correspondientes a los nucleótidos 459 a 3510 de la secuencia de Ad5 wt (número de acceso Genbank M72360) conectado operativamente al promotor de la fosfoglicerato quinasa humana (PGK) y a las secuencias poliA del Virus de la Hepatitis B. La generación de este constructo se describe en La Solicitud de Patente Internacional Núm. WO97/00326. Las secuencias E1 de Ad5 fueron remplazadas por las correspondientes secuencias de Ad35 como sigue. PRSV.Ad35-E1 (descrito en el Ejemplo 5) fue digerido con EcoRI y Sse8387I y el fragmento de 3 kb correspondiente a las secuencias E1 de Ad35 fue aislado en gel. El constructo pIG.E1A.E1B fue digerido con Sse8387I completamente y parcialmente con EcoRI. El fragmento de 4,2 kb correspondiente a las secuencias vectoras sin la región E1 de Ad5 pero conservando el promotor PGK fue separado de otros fragmentos en gel de agarosa LMP y la banda correcta fue separada cortando del gel. Ambos fragmentos obtenidos fueron ligados dando como resultado pIG.Ad35-E1. Este vector fue modificado adicionalmente para separar las secuencias LacZ presentes en el esqueleto del vector pUC119. A este fin, el vector fue digerido con BsaAI y BstXI y el fragmento grande fue aislado del gel. Se preparó un oligo de doble hebra recociendo los dos oligos siguientes:

\newpage

1BB1: 5'-GTG CCT AGG CCA CGG GG-3'	(SEC ID NUM.__)
y
2BB2: 5'-GTG GCC TAG GCA C-3'	(SEC ID NUM.__)

La ligadura del oligo y el fragmento del vector dio como resultado el constructo pIG135 (Fig. 14). La inserción correcta del oligo restaura los sitios BsaAI y BstXI e introduce un sitio AvrII único. A continuación, los autores de la presente invención introdujeron un sitio único en el extremo 3' de la casete de expresión Ad35-E1 en pIG135. A este fin, el constructo fue digerido con SapI y los extremos 3' sobresalientes se volvieron romos mediante tratamiento con ADN polimerasa de T4. El plásmido lineal tratado de este modo fue digerido adicionalmente con BsrGI y el vector grande que contenía el fragmento fue aislado en gel. Para restaurar el extremo 3' de la secuencia poliA de HBV y para introducir un sitio único, se generó un fragmento de PCR utilizando los siguientes cebadores:

3270F: 5'-CAC CTC TGC CTA ATC ATC TC -3'	(SEC ID NUM.__)
y
4270r: 5'-GCT CTA GAA ATT CCA CTG CCT TCC ACC -3'	(SEC ID NUM.__)

La PCR se realizó en el ADN de pIG.Ad35.E1 utilizando la polimerasa Pwo (Roche) según las instrucciones del fabricante. El producto de la PCR obtenido fue digerido con BsrGI y desfosforilado utilizando la enzima Tsap (LTI), la última para prevenir la dimerización del inserto en el sitio BsrGI. El fragmento de la PCR y el fragmento vector fueron ligados para rendir el constructo pIG270 (Fig. 15).

Las secuencias de Ad35 son capaces de transformar células primarias de rata

Se sacrificaron ratas WAG/RIJ recién nacidas con 1 semana de gestación y se aislaron los riñones. Tras la cuidadosa eliminación de la cápsula, los riñones fueron disgregrados en un sola suspensión celular mediante múltiples ciclos de incubación en tripsina/EDTA (LTI) a 37ºC y recolección de las células flotantes en PBS frío conteniendo FBS al 1%. Cuando la mayor parte del riñón se hubo tratado con tripsina todas las células fueron resuspendidas en DMEM suplementado con FBS al 10% y filtradas a través de coágulo de queso estéril. Las células de Baby Rat Kidney (BRK) obtenidas de un riñón fueron cultivadas en 5 placas (Greiner, 6 cm). Cuando se alcanzaba una confluencia del 70-80%, las células eran transfectadas con 1 o 5 \mugr de ADN/placa utilizando el estuche de precipitación con CaPO_{4} (LTI) según las instrucciones del fabricante. Los siguientes constructos fueron utilizados en transfecciones separadas: pIG.E1A.E1B (que expresaba la región Ad5-E1), pRSV.Ad35-E1, pIG.Ad35-E1 y pIG270 (expresando la región Ad35-E1). Las células fueron incubadas a 37ºC, CO_{2} al 5% hasta que aparecieron focos de células transformadas. La Tabla III muestra el número de focos que resultan de diversos experimentos de transfección utilizando ADN circular o lineal. Como se esperaba, la región Ad5-E1 transformaba eficazmente las células BRK. También aparecían focos en la capa de células transfectadas con Ad35-E1 aunque con menor eficacia. Los focos transformados con Ad35 aparecían en un momento puntual más tardío: \sim2 semanas después de la transfección en comparación con los 7-10 días para Ad5-E1. Estos experimentos muestran claramente que los genes E1 del virus del grupo B Ad35 son capaces de transformar células primarias de roedor. Esto demuestra la funcionalidad de los constructos de expresión Ad35-E1 y confirma descubrimientos anteriores de la capacidad de transformación de los virus del grupo B Ad3 y Ad7 (Dijkema, 1979). Para someter a ensayo si las células de los focos estaban realmente transformadas se escogieron unos pocos focos y se ampliaron. De los 7 focos elegidos, resultó que al menos 5 crecían en forma de líneas celulares establecidas.

Generación de nuevas células de empaquetamiento derivadas de amniocitos humanos primarios

Se centrifugó fluido amniótico obtenido tras la amniocentesis y las células fueron resuspendidas en medio AmnioMax (LTI) y cultivadas en matraces para el cultivo de tejidos a 37ºC y CO_{2} al 10%. Cuando las células estaban creciendo bien (aproximadamente una división celular/24 horas), el medio fue remplazado por una mezcla 1:1 de medio completo AmnioMax y medio MDEM con bajo contenido de glucosa (LTI) suplementado con Glutamax I (concentración final 4 mM, LTI) y glucosa (concentración final 4,5 gr/litro, LTI) y FBS al 10% (LTI). Para la transfección, se cultivaron en placa \sim5x10^{5} células en placas para el cultivo de tejidos de 10 cm. El día después, las células fueron transfectadas con 20 \mugr de pIG270 circular/placa utilizando el estuche de transfección CaPO_{4} (LTI) según las instrucciones del fabricante y las células fueron incubadas durante la noche con el producto precipitado de ADN. Al día siguiente, las células fueron lavadas 4 veces con PBS para separar el producto precipitado e incubadas adicionalmente durante más de tres semanas hasta que aparecieron focos de células transformadas. Una vez a la semana el medio era remplazado por medio de nueva aportación. Se utilizaron otros agentes de transfección similares, pero no limitados a, Lipofectamine (LTI) o PEI (Polietilenimina, elevado peso molecular, sin agua, Aldrich). De estos tres agentes PEI alcanzaba la mejor eficacia de transfección en amniocitos humanos primarios: \sim1% células azules 48 horas después de la transfección de pAdApt35.LacZ.

Los focos son aislados como sigue. Se separa el medio y se remplaza por PBS después de lo cual los focos son aislados raspando suavemente las células utilizando una pipeta Gilson de 50-200 \mul con una punta de filtro desechable. Las células contenidas en 10 \mul de PBS se llevaron a una placa de 96 pocillos conteniendo 15 \mul de tripsina/EDTA (LTI) y se obtuvo una única suspensión celular pipeteando arriba y abajo y con una corta incubación a la temperatura ambiente. Tras la adición de 200 \mul de la mezcla 1:1 de medio completo Amniomax y DMEM con suplementos y FBS al 10% descrita antes, las células fueron incubadas adicionalmente. Los clones que continuaban creciendo fueron ampliados y analizados en cuanto a su capacidad para complementar el crecimiento de los vectores adenovirales con E1 suprimida de diferentes subgrupos, específicamente los derivados de virus del grupo B específicamente de Ad35 y Ad11.

Generación de nuevas líneas celulares de empaquetamiento a partir de células HER

Se aislaron células HER y se cultivaron en medio DMEM suplementado con FBS al 10% (LTI). El día antes de la transfección, se cultivan en placa \sim5x10^{5} células en placas de 6 cm y se cultivan durante la noche a 37ºC y CO_{2} al 10%. La transfección se realiza utilizando el estuche de precipitación con CaPO_{4} (LTI) según las instrucciones del fabricante. Cada placa es transfectada con 8-10 \mugr de ADN de pIG270, ya sea en forma de un plásmido circular o en forma de un fragmento purificado. Para obtener el fragmento purificado, pIG270 fue digerido con AvrII y XbaI y el fragmento de 4 kb correspondiente a la casete de expresión de E1 de Ad35 fue aislado en gel mediante tratamiento con Agarase (Roche). Al día siguiente, el producto precipitado es lavado cuidadosamente por medio de cuatro lavados con PBS estéril. Después se añade medio de nueva aportación y las células transfectadas son cultivadas adicionalmente hasta que aparecen focos de células transformadas. Cuando son bastante grandes (>100 células) los focos son seleccionados y llevados a 96 pocillos como se ha descrito antes. Los clones de células HER transformadas que continúan creciendo, son ampliados y sometidos a ensayo en cuanto a su capacidad para complementar el crecimiento de vectores adenovirales con E1 suprimida de diferentes subgrupos, específicamente los derivados de los virus del grupo B específicamente de Ad35 y Ad11.

Nuevas líneas celulares de empaquetamiento derivadas de PER.C6

Como se describe en el Ejemplo 5, es posible generar y hacer crecer virus con E1 suprimida de Ad35 sobre células PER.C6 con la cotransfección de un constructo de expresión de Ad35-E1, v.g. pRSV.Ad35.E1. Sin embargo, la producción a gran escala de adenovirus recombinantes utilizando este método es engorrosa debido a que para cada etapa de amplificación se necesita una etapa de transfección del constructo Ad35-E1. Además, este método aumenta el riesgo de recombinación no homóloga entre el genoma del plásmido y del virus con elevadas posibilidades de generación de virus recombinantes que incorporen secuencias de E1 dando como resultado virus de replicación competente. Para evitar esto, la expresión de proteínas Ad35-E1 en PER.C6 tiene que estar mediada por copias integradas del plásmido de expresión en el genoma. Puesto que las células PER.C6 ya están transformadas y expresan las proteínas Ad5-E1, la adición de expresión de Ad35-E1 extra puede ser tóxica para las células, no obstante, no es imposible transfectar establemente células transformadas con proteínas E1 puesto que han sido generadas células A549 que expresan
Ad5-E1.

En un intento de generar adenovirus recombinantes derivados del virus del subgrupo B Ad7, Abrahamsen y col. (1997) no fueron capaces de generar virus con E1 suprimida sobre células 293 sin contaminación de Ad7 wt. Se demostró que los virus que fueron escogidos tras la purificación en placa sobre células 293 ORF6 (Brough y col., 1996) tenían incorporadas secuencias E1B de Ad7 mediante recombinación no homóloga. De este modo, la propagación eficaz de virus recombinantes de Ad7 fue demostrada solamente en presencia de expresión de Ad7-E1B y de la expresión de Ad5-E4-ORF6. Se sabe que las proteínas E1B interaccionan con las proteínas celulares así como virales (Bridge y col., 1993; White, 1995). Posiblemente, el complejo formado entre la proteína E1B de 55 K y E4-ORF6 que es necesario para incrementar la exportación de ARNm de proteínas virales y para inhibir la exportación de la mayor parte de los ARNm celulares, es crítica y en cierto modo específica del serotipo. Los experimentos anteriores sugieren que las proteínas E1A de Ad5 son capaces de complementar una deleción Ad7-E1A y de que la expresión de Ad7-E1B en células de empaquetamiento de adenovirus como tal no sea suficiente para generar una línea celular complementadora estable. Para someter a ensayo si una o ambas proteínas Ad35-E1B es o son el factor limitante en la eficaz propagación del vector de Ad35 sobre las células PER.C6, los autores de la presente invención han generado un plásmido adaptador de Ad35 que contiene el promotor de E1B y las secuencias de E1B pero carece del promotor y la región codificadora para E1A. A este fin, el extremo izquierdo del ADN de Ad35 wt fue amplificado utilizando los cebadores 35F1 y 35R4 (ambos descritos en el Ejemplo 4) con ADN polimerasa Pwo (Roche) según las instrucciones del fabricante. El producto de la PCR de 4,6 kb fue purificado utilizando el estuche de purificación de PCR (LTI) y digerido con las enzimas SnaBI y ApaI. El fragmento de 4,2 kb resultante fue purificado después en gel utilizando el estuche QIAExII (Qiagen). A continuación, pAdApt35Ip1 (Ejemplo 4) fue digerido con SnaBI y ApaI y el fragmento que contiene el vector de 2,6 kb fue aislado en gel utilizando el estuche GeneClean (BIO 101, Inc.). Ambos fragmentos aislados fueron ligados para dar pBr/Ad35.leftITR-pIX (Fig. 16). La amplificación correcta durante la PCR fue verificada mediante un ensayo de funcionalidad como sigue: El ADN fue digerido con BstBI para liberar el inserto de Ad35 de las secuencias vectoras y 4 \mugr de este ADN fueron cotransfectados con 4 \mugr de pWE/Ad35.pIX-rITR digerido con NotI (Ejemplo 4) en células PER.C6. Las células transfectadas se pasaron a matraces T80 el día 2 y de nuevo dos días después se había formado CPE mostrando que el nuevo constructo pBr/Ad35.leftITR-pIX contiene secuencias E1 funcionales. El constructo pBr/Ad35.leftITR-pIX fue modificado después como sigue. El ADN fue digerido con SnaBI y HindIII y el saliente HindIII 5' fue rellenado utilizando la enzima de Klenow. La religadura del ADN digerido y la transformación en células competentes (LTI) produjeron el constructo pBr/Ad35leftITR-pIX\DeltaDE1A (Fig. 17). Este último constructo contiene el extremo izquierdo de 4,6 kb de Ad35 excepto para las secuencias de E1A entre el pb 450 y 1341 (numeración según wtAd35, Figura 5) y por tanto carece del promotor E1A y de la mayoría de las secuencias codificadoras de E1A. Después pBr/Ad35.leftITR-pIX\DeltaDE1A fue digerido con BstBI y 2 \mugr de este constructo fueron cotransfectados con 6 \mugr de pWE/Ad35.pIX-rITR digerido con NotI (Ejemplo 4) en células PER.C6. Una semana después de la transfección se había formado un CPE completo en los matraces transfectados.

Este experimento muestra que las proteínas Ad35-E1A son complementadas funcionalmente por la expresión de Ad5-E1A en células PER.C6 y que al menos una de las proteínas Ad35-E1b no puede ser complementada por la expresión de Ad5-E1 en PER.C6. Adicionalmente muestra que es posible elaborar una línea celular complementadora para los virus con E1 suprimida de Ad35 expresando las proteínas Ad35-E1B en PER.C6. La expresión estable de las secuencias Ad35-E1B a partir de copias integradas en el genoma de las células PER.C6 puede ser dirigida por el promotor E1B y terminada mediante una señal de poli-adenilación heteróloga como, pero no limitada a, HBVpA. La señal pA heteróloga es necesaria para evitar el solapamiento entre el inserto E1B y el vector recombinante, puesto que la terminación de E1B natural está localizada en la unidad de transcripción pIX que tiene que estar presente en el vector adenoviral. Alternativamente, las secuencias de E1B pueden ser dirigidas por un promotor heterólogo como, pero no limitado a, el promotor PGK humano o por un promotor inducible como, pero no limitado a, el promotor 7xtetO (Gossen y Bujard, 1992). También en estos casos la terminación de la transcripción está mediada por una secuencia pA heteróloga, v.g. la pA de HBV. Las secuencias Ad35-E1B comprenden al menos una de las regiones codificadoras de las proteínas E1B de 21K y E1B de 55K localizadas entre los nucleótidos 1611 y 3400 de la secuencia de Ad35 wt. El inserto también puede incluir (parte de) las secuencias Ad35-E1B entre los nucleótidos 1550 y 1611 de la secuencia de Ad35 wt.

Ejemplo 7 Los virus basados en Ad35 con los genes E1A y E1B-21K suprimidos se propagan eficazmente en líneas celulares complementadoras de Ad5

La generación de virus basados en Ad35 que tienen E1A suprimido y conservan la región E1B completa se describe en el Ejemplo 6 de esta solicitud. Tales virus pueden ser generados y propagados sobre la línea celular complementadora de Ad5 PER.C6. La región E1B comprende secuencias codificadoras parcialmente solapantes para las dos proteínas principales 21K y 55K (Bos y col., 1981). Si bien durante la infección adenoviral wt productiva tanto 21K como 55K están implicadas en la neutralización de los efectos que inducen la apoptosis de las proteínas E1A, se ha sugerido que la proteína E1B 55K tiene funciones adicionales durante la fase tardía de la infección del virus. Entre estas se incluyen la acumulación de los ARNm virales, el control de la expresión génica viral tardía y la inhibición de la síntesis de proteínas del huésped ("Shut-off") de la mayor parte de los ARNm del huésped a nivel del transporte de ARNm (Babis y col., 1984, 1985; Pilder y col., 1986). Un complejo formado entre E1B-55K y la proteína ORF6 codificada por la región temprana del adenovirus 4 (Leppard y Shenk, 1989; Bridge y Ketner, 1990) ejerce al menos parte de estas funciones.

Para analizar cuál de las proteínas E1B es requerida para la propagación de los virus recombinantes con Ad35-E1A suprimida en las células de empaquetamiento PER.C6, se suprimió además la región E1B en el constructo pBr.Ad35.leftITR-pIX\DeltaE1A (ver el Ejemplo 6 y la Fig. 17). Un primer constructo, pBr.Ad35\Delta21K, conserva la secuencia E1B-55K completa y tiene las regiones E1A y E1B-21K suprimidas. A este fin, pBr.Ad35.leftITR-pIX\DeltaE1A fue digerido con NcoI y BspE1 y el fragmento vector de 5 KB fue aislado en gel de agarosa utilizando el estuche de Geneclean (BIO 101, Inc.) según las instrucciones del fabricante. Después se generó un fragmento de PCR con pBr.Ad35.leftITR-pIX\DeltaE1A como ADN molde utilizando los siguientes cebadores:

135D21: 5'-TTA GAT CCA TGG ATC CCG CAG ACT C-3'	(SEC ID NUM: __)
y
235B3: 5'-CCT CAG CCC CAT TTC CAG-3'	(SEC ID NUM: __)

La amplificación se realizó utilizando la ADN polimerasa Pwo (Roche) según las recomendaciones del fabricante con la adición de DMSO (concentración final 3%) a la mezcla de reacción. El programa de PCR fue el siguiente: 94ºC durante 2', después 30 ciclos de 94ºC durante 30'', 58ºC durante 30'' y 72ºC durante 45'' y una etapa final de 68ºC durante 8' para asegurar los extremos romos.

Esta PCR amplifica las secuencias Ad35-E1B desde el nucl. 1908 al 2528 (secuencia Ad35, Fig. 5) e introduce un sitio NcoI en el codón de iniciación de la secuencia codificadora E1B-55K (negrita en el cebador 35d21). El fragmento de la PCR de 620 pb fue purificado utilizando el estuche de purificación de PCR (Qiagen) y después fue digerido con NcoI y BspE1, purificado en gel de agarosa como antes y ligado al fragmento vector digerido con NcoI/BspE1 descrito antes para dar pBr.Ad35\Delta21K (Fig. 18).

Puesto que las regiones codificadoras de las proteínas 21K y 55K se solapan, solamente es posible suprimir parte de las secuencias codificadoras de 55K mientras se conserva 21K. A este fin, pBr.Ad35.leftITR-pIX\DeltaE1A fue digerido con BglII y el fragmento vector fue religado para dar pBr.Ad35\Delta55K1 (Fig. 19). Esta deleción elimina las secuencias codificadoras de E1B desde el nucl. 2261 al 3330 (secuencia de Ad35 de la Fig. 5). En este constructo se conservan los 115 aminoácidos N-terminales y se fusionan a 21 aminoácidos adicionales fuera del propio marco de lectura antes de encontrar un codón de terminación. La región codificadora de 21K está intacta en el constructo pBr.Ad35\Delta55K1.

Se generó un tercer constructo que tiene una deleción de las secuencias de E1A, 21K y la mayor parte de 55K como sigue. pBr.Ad35.leftITR-pIX (Fig. 16) fue digerido con SnaBI y MfeI (isosquizómero de MunI) y el saliente 5' resultante de la digestión con MfeI fue rellenado utilizando la enzima de Klenow. El fragmento vector de 4,4 kb fue aislado del gel utilizando el estuche de Geneclean (Bio 101, Inc.) según las instrucciones del fabricante y religado para dar el constructo pBr.Ad35\DeltaSM (Fig. 20). En este constructo, las secuencias de Ad35 entre el nucl. 453 y el 2804 están suprimidas, de este modo se conservan 596 nucl. del extremo 3' de E1b-55K. Se realizó una deleción adicional de las secuencias de 55K en el constructo pBr.Ad35\DeltaE1A.\Delta E1B mediante digestión de Pbr.Ad35.leftITR-pIX con SnaBI y BglII, tratamiento de Klenow para rellenar los extremos cohesivos BglII, y religadura. La Fig. 21 muestra una representación esquemática de los constructos mencionados antes.

Para someter a ensayo si se pueden generar virus basados en Ad35 con estos constructos, cada uno de los constructos fue cotransfectado con pWE.Ad35pIX-rITR digerido con NotI (ver el Ejemplo 4) sobre células PER.C6. A este fin, los respectivos fragmentos fueron amplificados mediante PCR utilizando los cebadores 35F1 y 35R4 (ver, Ejemplo 4). Esta amplificación mediante PCR fue realizada debido a que algunos de los constructos eran difíciles de aislar en cantidades suficientemente grandes. De este modo, se aseguraba igual calidad de los diferentes fragmentos adaptadores. Para la amplificación se utilizó ADN polimerasa Pwo (Roche) según las instrucciones del fabricante pero con DMSO (concentración final del 3%) añadido a la mezcla de PCR. De cada molde se utilizaron \sim50 ng de ADN. Las condiciones para la PCR fueron las siguientes: 94ºC durante 2', después 5 ciclos de 94ºC durante 30'', 48ºC durante 45'' y 72ºC durante 4' seguido de 25 ciclos de 94ºC durante 30'', 60ºC durante 30'' y 72ºC durante 4' y una etapa final de 68ºC durante 8'.

Se generaron 4 fragmentos de PCR a partir de pBr.Ad35leftITR-pIX, pBr.Ad35.leftITR-pIX\DeltaE1A, pBr.Ad35\Delta21K, pBr.Ad35\Delta55k1, pBr.Ad35\DeltaSM y pBr.Ad35\DeltaE1A\DeltaE1B. Todos los fragmentos fueron generados utilizando el estuche de purificación para PCR (Qiagen) según las instrucciones del fabricante y las concentraciones finales fueron estimadas en un gel de agarosa teñido con EtBr utilizando el sistema Eagle Eye II Still Video y el soporte lógico EagleSight (Stratagene) con el marcador de peso molecular SmartLadder (Eurogentec) como referencia. Las células PER.C6 fueron sembradas a una densidad de 2,5 x 10^{6} células en un matraz de cultivo T25 en DMEM conteniendo suero de ternera fetal al 10% (FCS) y MgSO_{4} 10 mM y cultivadas en una estufa humidificada a 37ºC, CO_{2} al 10%. Al día siguiente, se co-transfectaron 3 mg de cada uno de los fragmentos de la PCR con 5 \mug de pWE.Ad35pIX-rITR digerido con NotI utilizando LipofectAmine (GIBCO, Life Technologies Inc.) según las instrucciones del fabricante. Dos días después de la transfección, todas las células se hicieron pasar a un matraz T80 y se cultivaron adicionalmente. Después los cultivos fueron controlados en cuanto a la aparición de CPE. Conforme al resultado de los experimentos anteriores descritos en los Ejemplos 4 y 6, pBr.Ad35.leftITR-pIX y pBr.Ad35.leftITR-pIX\DeltaE1A mostraban un CPE casi completo una semana después de la transfección. De los fragmentos con diferentes deleciones de E1B solamente pBr.Ad35\Delta21K mostraba CPE al mismo tiempo que los dos fragmentos anteriores. Los constructos pBr.Ad35\Delta55K1, pBr.Ad35\DeltaSM y pBr.Ad35\DeltaE1A\DeltaE1B no producían CPE en absoluto, tampoco después de cosechar mediante congelación-descongelación y re-infectar el producto lisado bruto sobre células PER.C6 de nueva aportación.

A partir de estos experimentos, se puede concluir que Ad35-E1B-55K, y no E1B-21K, es necesario para la generación y propagación de virus basados en Ad35 sobre líneas celulares complementadoras de Ad5. Por lo tanto, los virus basados en Ad35 que tienen una deleción de los genes E1A y E1B 21K y que tienen el gen E1B-55K o un fragmento funcional del mismo, pueden ser desarrollados sobre líneas celulares complementadoras de Ad5. Alternativamente, los virus basados en Ad35 pueden ser desarrollados sobre células PER.C6 que expresan establemente la región E1B completa o el gen E1B-55K o un fragmento funcional del mismo. El gen E1B-55K de Ad35 o partes funcionales del mismo pueden ser expresados a partir de un promotor heterólogo, como, pero no limitado al, promotor PGK humano, el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV), el promotor del virus del sarcoma de Rous, etc. y terminados por una secuencia de poli-adenilación heteróloga (pA), como, pero no limitada a la secuencia de poli-adenilación del virus de la hepatitis B (HBV pA), la secuencia de poli-adenilación del Virus de Simios 40 (SV40pA), etc. Como ejemplos no limitantes se describen más abajo las células PER.C6 que expresan la región Ad35-E1B conducida por el promotor E1B y HBVpA, las células PER.C6 que expresan la región Ad35-E1B conducida por el promotor PGK humano HBVpA y las células PER.C6 que expresan un fragmento funcional de E1B-55K de Ad35 conducido por el promotor PGK humano y HBVpA.

Generación de pIG35BL y pIG35BS

Los autores de la presente invención describen la generación de dos constructos de expresión, pIG.35BS y pIG.
35BL, que portan ambos los genes Ad35-E1B y un marcador de selección de neomicina. Los dos constructos difieren en la longitud del fragmento que contiene el promotor E1B. En 35BL el fragmento promotor es más largo e incluye el extremo 3' de la región E1A (secuencia codificadora de 103 nucl. y pA). La región E1B está terminada por el HBVpoliA, el gen neo^{r} está conducido por una casete con el promotor de hPGK/HBVpA.

PIG.35BL fue elaborado como sigue. El constructo pRSV.Ad35E1 (descrito en el Ejemplo 5, Fig. 9) fue digerido con NruI y HindIII y los extremos sobresalientes fueron rellenados mediante el tratamiento de Klenow. El fragmento vector de 7 kb fue separado del fragmento más pequeño del gel y aislado utilizando el estuche Geneclean (BIO 101, Inc.). Tras la religadura del ADN y la transformación en células STBL2 competentes (Gibco, LT1) se aislaron los clones correctos. PIG.35BL (Fig. 22) contiene 273 nucl. aguas arriba del sitio de inicio de la región codificadora
E1B-21K.

pIG.35BS fue elaborado de la misma manera que pIG.35BL excepto que el pRSV.Ad35E1 fue digerido con NruI y HpaI (ambas enzimas dejan extremos romos), dando como resultado un fragmento más corto aguas arriba de la región codificadora de E1B-21K: 97 nucleótidos.

Para generar células que expresaban Ad35-E1B, se sembraron células PER.C6 en placas de 10 cm a 1x10^{6} células/placa. Dos días más tarde las células fueron transfectadas con constructos linealizados con ScaI. Cuatro placas fueron infectadas con 1 y cuatro con 2 \mug de ADN (total 16 placas; Lipofectamine (Gibco, LTI), no se utilizó ADN portador) según las instrucciones del fabricante. Al día siguiente, las células transfectadas recibieron medio conteniendo G418 (0,75 mg/ml). Las transfecciones de control utilizando constructos de expresión LacZ (2 \mug) fueron teñidas al cabo de 48 horas y mostraban una eficacia de transfección de \sim25%. Cuatro días después de la adición del medio de selección las células comenzaron a morir y de nuevo tres días más tarde empezaban a ser visibles los clones. Una semana más tarde, se escogieron los primeros clones. La transfección con 1 \mug dio como resultado menos clones y también inicialmente más pequeños (total \sim20 clones/placa frente a >50 clones/placa para la transfección con 2 \mug de ADN). La transfección control positiva utilizando 2 \mug de pcDNA3 (Invitrogen) dio como resultado \sim 50
clones.

En total, se escogieron 120 clones y 107 fueron establecidos con éxito (55 de pIG35BS y 52 de pIG35BL).

Generación de pIG35Bneo

PIG35Bneo es un plásmido de expresión Ad35-E1B del cual se expresan los genes E1B a partir de un promotor heterólogo (hPGK) y también contiene una casete de expresión de resistencia a la neomicina. Para evitar la inestabilidad del plásmido debida a los eventos de recombinación en secuencias homólogas, el promotor de RSV conduce el gen neo^{r}. Para lograr esto, el constructo pRSVhbv.Neo (descrito en el Ejemplo 5, Fig. 12) fue digerido con ScaI y BamHI y los extremos sobresalientes fueron rellenados utilizando la enzima de Klenow. El fragmento de 1070 pb que contenía parte del gen de la Ampicilina y el promotor de RSV fue aislado del gel utilizando el estuche Geneclean (BIO 101, Inc.). A continuación, pRSVhbvNeo fue digerido con ScaI y EcoRI, los extremos se volvieron romos con Klenow y el fragmento de 3,2 kb que contenía el gen neo, HBVpA, el vector y parte del gen de la Ampicilina fue aislado como antes. Los dos fragmentos fueron ligados después para dar pRSVneo4 (Fig. 23). El constructo pIG270 (Fig. 15, descrito en el Ejemplo 6) fue digerido después con EcoRI y NcoI y los extremos cohesivos se volvieron romos con la enzima de Klenow. El fragmento que contenía el vector fue aislado del gel como se ha descrito antes y religado para dar pIG270delE1A. Este constructo fue digerido con AvrII y XbaI y los extremos sobresalientes fueron rellenados utilizando la enzima de Klenow. El fragmento de 2,9 kb que contenía el promotor hPGK y las secuencias Ad35.E1B fue aislado del gel como antes. A continuación, pRSVneo4 fue digerido con BglII, sus extremos se volvieron romos con la enzima de Klenow, se desfosforiló y se aisló del gel. El fragmento AvrII/XbaI de Ad35.E1B de extremos romos fue ligado después con el fragmento vector pRSVneo4 preparado antes y los clones resultantes fueron analizados. Un clon que contenía ambas casetes de expresión en la misma orientación fue seleccionado y denominado pIG35Bneo (Fig. 24). El análisis detallado de este clon reveló que se encontraba presente un sitio BglII extra debido probablemente a una reacción de Klenow incompleta (sitio BglII en el nucl. 2949 de la
Fig. 24).

Generación de pIG35.55K

El constructo pIG35.55K es similar a pIG35Bneo, no obstante, carece de la región codificadora de Ad35.E1B-21K. A este fin, ambas secuencias E1A y E1B-21K son suprimidas primero de pIG270 como sigue:

El constructo pIG270 es digerido con EcoRI, tratado con la enzima de Klenow y purificado utilizando un estuche de purificación mediante PCR (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. El ADN recuperado es digerido después con AgeI y el fragmento vector de \sim5 kb fue aislado del gel como antes. A continuación, las secuencias E1B-55K de Ad35 son amplificadas mediante PCR sobre ADN molde de pIG270 utilizando los siguientes cebadores:

535D21: 5'-TTA GAT CCA TGG ATC CCG CAG ACT C-3'	(SEC ID NUM. __)
y
635B: 5'-CCT CAG CCC CAT TTC CAG-3'	(SEC ID NUM. __)

Las condiciones utilizadas para la amplificación son las descritas previamente. El fragmento de la PCR es purificado utilizando el estuche de purificación para PCR (Qiagen) y digerido con NcoI. Tras el tratamiento de Klenow para rellenar los extremos sobresalientes, el ADN es digerido adicionalmente con AgeI y de nuevo purificado en columna. El fragmento de PCR tratado de este modo es clonado después en el fragmento vector digerido con EcoRI/AgeI preparado antes para dar pIG270.\DeltaE1A\Delta21K. Las últimas etapas para obtener pIG35.55K (Fig. 25) son equivalentes a las últimas etapas descritas antes para la generación de pIG35Bneo partiendo de pIG270\DeltaE1A\Delta21K en lugar de pIG270.\DeltaE1A.

PIG35.55K es linealizado después con ScaI y utilizado para transfectar células PER.C6 como se ha descrito antes. Los clones que son resistentes a la selección con G418 son escogidos y analizados en cuanto a su capacidad para complementar la propagación de los virus Ad35 con E1 suprimida.

Ejemplo 8 Nuevas líneas celulares de empaquetamiento para la generación y propagación de vectores basados en Ad35 con E1 suprimida derivados de células humanas primarias

La transformación morfológica completa de células primarias mediante genes E1 de adenovirus es el resultado de las actividades combinadas de las proteínas codificadas por las regiones E1A y E1B. Los papeles de las diferentes proteínas E1 en la infección lítica y la transformación han sido estudiados extensamente (revisado en Zantema y van der Eb, 1995; White, 1995, 1996). Las proteínas E1A de adenovirus son esenciales para la transformación de células primarias. Las proteínas E1A ejercen su efecto a través de la interacción directa con numerosas proteínas celulares que están implicadas en la regulación de la transcripción. Entre estas se incluyen la familia pRB de proteínas, p300/CBP y la proteína de unión TATA. Además de esto E1A incrementa el nivel de proteína p53 en las células. En ausencia de actividad E1B de adenovirus el aumento de los niveles de p53 conduce a la inducción de la apoptosis. Ambas proteínas codificadas por la región E1B contrarrestan la inducción de la apoptosis aunque mediante mecanismos diferentes. E1B-21K neutraliza la apoptosis de una manera similar a Bcl-2 por medio de la interacción con las proteínas efectoras aguas abajo de la ruta de apoptosis (Han y col., 1996), mientras E1B-55K funciona a través de la interacción directa con p53. Importantemente, el mecanismo molecular mediante el cual las proteínas E1B-55K de Ad2 y 5 (subgrupo C) y Ad12 (subgrupo A) funcionan en su capacidad para neutralizar p53 puede diferir. Mientras E1B-55K de Ad5 se une a p53 fuertemente y el complejo localiza el citoplasma, E1B-55K de Ad12 se une a p53 débilmente y ambas proteínas son localizadas en el núcleo (Zantema y col., 1985; Grand y col., 1999). Ambas proteínas, sin embargo, inhiben la transactivación de otros genes por p53 (Yew y Berk, 1992).

En células de roedor, la actividad de E1A junto con E1B-21K o 55K es suficiente para la transformación completa aunque la expresión de ambas proteínas E1B juntas es dos veces más eficaz (Rao y col., 1992). En células humanas no obstante, la actividad de la proteína E1B-55K parece ser más importante dada la observación de que E1B-55K es indispensable para el establecimiento de células transformadas (Gallimore, 1986). En el Ejemplo 6 de la presente se describe la generación de pIG270. En este constructo los genes Ad35-E1 son expresados a partir del promotor hPGK y la transcripción es terminada por HBVpA. El promotor hPGK constituye un fragmento HincII-EcoRI de la secuencia promotora descrita por Singer-Sam y col. (1984). La HBVpA es localizada en un fragmento BamHI-BglII del genoma del virus de la Hepatitis B (Simonsen y Levinson, 1983; ver también Genbank HBV-AF090841). Como se ha mencionado antes, las secuencias promotora y de poliadenilación de los constructos de expresión de E1 descritos en esta invención pueden estar derivadas de otras fuentes sin apartarse de la invención. Asimismo, se pueden utilizar otros fragmentos funcionales de las secuencias hPGK y HBVpA mencionadas antes.

La funcionalidad de pIG270 fue demostrada mediante la transformación de células Baby Rat Kidney (BRK) primarias. La comparación con un constructo de expresión Ad5-E1 equivalente enseñó que los genes Ad35-E1 eran menos eficaces al transformar estas células. Lo mismo se ha descubierto para los genes E1 de Ad12 (Bernards y col.,
1982).

No está claro qué proteína determina la diferencia en la eficacia de transformación de las secuencias E1 observadas para adenovirus de diferentes subgrupos. En el caso de Ad12, los estudios de transfección con genes E1A/E1B quiméricos sugirieron que la eficacia de transformación de las células BRK estaba determinada por las proteínas E1A (Bernards y col., 1982). Más abajo se muestra que la proteína E1B-55K contiene funciones específicas del serotipo necesarias para la complementación de adenovirus con E1 suprimida. Si estas funciones están relacionadas con la regulación de la distribución del ARNm u otra función viral tardía, es poco probable que éstas estén implicadas en la eficacia de transformación.

El análisis de los dominios funcionales en las proteínas E1B-55K de Ad2 o Ad5 utilizando mutantes de inserción han revelado que las funciones relacionadas con la replicación viral, la síntesis de proteínas tardía y la inhibición de la síntesis de proteínas del huésped ("Shut-off") no están confinadas a dominios específicos sino que están distribuidas a lo largo de la proteína (Yew y col., 1990). Utilizando el mismo grupo de mutantes, se encontró que los dominios importantes para la interacción con p53 y E4-Orf6 estaban más restringidos. Además de una región de unión común (aminoácidos 262 a 326), la unión a p53 estaba afectada por las mutaciones en el aa 180 y la unión E4-Orf6 estaba afectada por las mutaciones en el aa 143 (Yew y Berk, 1992; Rubenwolf y col., 1997).

La invención describe nuevos constructos E1 que combinan la elevada eficacia de la transformación de un serotipo con la función de complementación específica del serotipo de otro serotipo. Estos nuevos constructos se utilizan para transformar las células retinoblásticas embriónicas humanas primarias y amniocitos humanos.

Generación de pIG535, pIG635 y pIG735

El constructo pIG535 contiene la región E1A de Ad5 y las secuencias promotoras de E1B conectadas a las secuencias E1B de Ad35. A este fin, pIG270 (Fig. 15; ver ejemplo 6) fue digerido con EcoRI y NcoI. El fragmento vector de 5,3 kb fue aislado después del gel utilizando el estuche Geneclean (BIO 101, Inc.) según las instrucciones del fabricante. A continuación, el constructo pIG.E1A.E1B (Fig. 13; ver Ejemplo 6) fue digerido con EcoRI y XbaI y el fragmento de 890 pb resultante fue aislado como antes. Un tercer fragmento fue generado mediante amplificación por PCR sobre pIG.E1A.E1B utilizando los siguientes cebadores:

15E1A-F: 5'-GAG ACG CCC GAC ATC ACC TG-3'	(SEC ID NUM: __)
y
25E1B-R: 5'-CAA GCC TCC ATG GGG TCA GAT GTA GTA AC-3'	(SEC ID NUM: __)

Se utilizó el siguiente programa de PCR: 94ºC durante 2' seguido de 30 ciclos de 94ºC durante 30'', 60ºC durante 30'' y 72ºC durante 1', y una etapa final a 72ºC durante 10' para asegurar los extremos romos.

El fragmento de la PCR de 400 pb resultante fue digerido con XbaI y NcoI. Tras el aislamiento en gel como antes, los tres fragmentos fueron ligados y transformados en bacterias STLB-2. Se seleccionó una colonia que contenía los tres fragmentos en el orden correcto y se denominó pIG535 (Fig. 26).

El constructo pIG635 contiene la E1A de Ad5 y una región E1B de Ad5-Ad35 quimérica de manera que la secuencia 21K es esencialmente de Ad5 y está conectada a las secuencias E1B-55K de Ad35 con tal que no se solape con las secuencias 21K. Primero, parte de las secuencias E1 de Ad5 son amplificadas mediante PCR utilizando pIG.E1A.E1B como molde y los siguientes cebadores:

45AK: 5'-GAG CGA AGA AAC CCA TCT GAG-3'	(SEC ID NUM: __)
y
52155R: 5'-GGT CCA GGC CGG CTC TCG G-3'	(SEC ID NUM: __)

La amplificación se completa con ADN polimerasa Pwo (Roche) según las instrucciones del fabricante. El fragmento de 210 pb es purificado después de las secuencias cebadoras utilizando el estuche de purificación mediante PCR (Qiagen).

Un segundo fragmento de PCR es amplificado a partir del ADN de pIG270 como se ha descrito antes pero con los siguientes cebadores:

62155F: 5'-CCG AGA GCC GGCCTG GAC-3'	(SEC ID NUM: __)
y
735F10: 5'-GCT CTA GAC CTG CAG GTT AGT CAG TTT CTT CTC CAC TG-3'	(SEC ID NUM: __)

El fragmento amplificado de 1,3 kb es purificado como antes y mezclado a una razón molar 1:1 con el primer fragmento de PCR. Después, la mezcla es sometida primero a reacción de PCR sin la adición de cebadores utilizando ADN polimerasa Pwo y el siguiente programa: 94ºC durante 2' y después 5 ciclos de 94ºC durante 30'', 60ºC durante 30'', 72ºC durante 90''. Con posterioridad, se añaden los cebadores 5AK y 35F10 a una concentración 0,6 \muM después de lo cual una última PCR amplifica un fragmento de 1,5 kb. A este fin, la temperatura se ajustó como sigue: 94ºC durante 2', después 30 ciclos de 94ºC durante 30'', 60ºC durante 3'' y 72ºC durante 90'', seguido de una etapa final a 72ºC durante 10' para asegurar los extremos romos. El producto resultante es purificado utilizando el estuche de purificación mediante PCR (Qiagen) como antes y digerido con KpnI y SbfI (isosquizómero de Sse83871). El ADN digerido es aislado después del gel utilizando el estuche Genclean (BIO Inc., 101). El constructo pIG.E1A.E1B es digerido con KpnI y SbfI y el fragmento que contiene el vector es aislado del gel como antes. Este fragmento es ligado al producto de la PCR final preparado antes y la mezcla de ligadura es transformada en células STBL-2 (Gibco, LTI) según las instrucciones del fabricante. Esto da el constructo pIG635 (Fig. 27).

En el constructo pIG735, el límite entre las secuencias derivadas de Ad5 y las secuencias derivadas de Ad35 está localizado más 3' que en el constructo pIG635. Primero, se introduce un sitio BspEI en la secuencia Ad5 del constructo pIG.E1A.E1B sin cambiar la secuencia de aminoácidos. A este fin, las secuencias Ad5 de pIG.E1A.E1B son amplificadas utilizando los siguientes cebadores de PCR:

5AK: ver arriba, y Bsp-R: 5'-GCT CTA GAC CTG CAG GGT AGC AAC AAT TCC GGA TAT TTA CAA G-3' (SEC ID NUM: __). La amplificación se completa utilizando ADN polimerasa Pwo (Roche) según las instrucciones del fabricante. Se utiliza el siguiente programa de PCR: 94ºC durante 2' seguido de 30 ciclos de 94ºC durante 30'', 60ºC durante 30'' y 72ºC durante 30'', y una etapa final a 72ºC durante 10' para asegurar los extremos romos. El fragmento de 0,6 kb resultante es purificado como antes y digerido con KpnI y SbfI y ligado con el fragmento vector pIG.E1A.E1B digerido con KpnI/SbfI descrito antes. La selección de las colonias tras la transformación de bacterias STBL-2 (Life Techn. Inc.) da el constructo pIG.E1A\Delta55K. pIG.E1A\Delta55K es digerido después con SbfI y parcialmente con BspEI. El fragmento vector digerido con SbfI-BspE1 parcial de 6,4 kb es aislado después del gel utilizando el estuche Genclean (BIO 101, Inc.). A continuación, pIG270 es digerido con BspEI y SbfI y el fragmento de 915 pb resultante es aislado del gel como antes. Este fragmento es ligado después al fragmento vector pIG.E1A\Delta55K digerido con SbfI/BspEI parcial preparado antes y transformado en células competentes STBL-2. Esto da el constructo pIG735 (Fig. 28). Los clones son analizados mediante digestión con enzimas de restricción y secuenciación para asegurar la correcta ligadura de los fragmentos. Los constructos pIG535, pIG635 y pIG735 pueden ser utilizados para generar líneas celulares complementadoras a partir de células humanas primarias como se describe en el
Ejemplo 6.

Ejemplo 9 Líneas celulares complementadoras basadas en PER.C6 para virus Ad35 con E1 suprimida

Las células PER.C6 fueron sembradas en placas de cultivo de 10 cm a una densidad de 3x10^{6} células/pocillo en DMEM (Gibco BRL) complementado con FBS (Gibco BRL) hasta el 10% y MgCl_{2} 10 mM (solución de partida 4,9 M, Sigma). Dos días más tarde, 9 placas fueron transfectadas con 1 \mug de ADN de pIG35.55K linealizado con ScaI (ver Ejemplo 7) y 9 placas fueron transfectadas con 1,5 \mug de ADN de pIG35.55K linealizado con ScaI. Las placas de control separadas fueron transfectadas con 1 o 1,5 \mug de pAdApt35.LacZ linealizado con ScaI para controlar la eficacia de transfección y con 1 o 1,5 \mug de pcDNA.nlsLacZ linealizado con ScaI. PcDNA.nlsLacZ es un plásmido basado en pcDNA3 (Invitrogen) con el gen nlsLacZ (Bonnerot y col., 1987) conducido por el promotor de CMV. PcDNA.nlsLacZ también contiene una casete de expresión neo^{r}. Como control negativo una placa extra fue transfectada con pAdApt35.LacZ linealizado, un constructo que carece del gen de selección neo^{r}. Todas las transfecciones fueron realizadas con el estuche de LipofectAmine (Invitrogen/Life Technologies) según las instrucciones del fabricante utilizando 5 ml de reactivo LipofectAmine/\mug de ADN. Las células fueron incubadas durante 4 horas con la mezcla de transfección después de lo cual el medio fue remplazado con medio de cultivo de PER.C6. Al día siguiente el medio fue remplazado por medio de cultivo conteniendo 0,5 mg/ml de G418 (Gibco BRL) excepto en las dos placas que fueron transfectadas con 1 o 1,5 \mug de pAdApt35.LacZ. Estas últimas placas fueron utilizadas para controlar la expresión de LacZ dos días después de la transfección. Tras la tinción con X-gal de estos cultivos se estimó la eficacia de transfección en aproximadamente el 40% con células ligeramente más azules en la placa transfectada con 1,5 \mug de ADN. El medio de selección fue aportado nuevamente dos veces a la semana en las placas transfectadas restantes. A las dos semanas de la primera adición del medio de selección la mayor parte de las células de la placa de control negativa (transfectada con 1,5 \mug de pAdApt35.LacZ) habían muerto. En las placas transfectadas con pcDNA.nlsLacZ los clones celulares empezaban a ser visibles. Puesto que las células transfectadas con pIG35.55K parecían ser más resistentes a G418, la concentración aumentaba a 0,75 mg/ml 3 semanas después de la transfección. Tres días y siete días más tarde se escogieron un total de 196 clones celulares de las placas transfectadas con pIG35.55K y se seleccionaron en pocillos separados de placas de 96 pocillos.

Las células que quedaban después de la selección de colonias de 2 placas de 10 cm de la transfección con 1 \mug de ADN de pIG35.55K fueron tratadas con tripsina, reunidas y expandidas para dar la reserva PER55K(1,0). Se hizo lo mismo para dos placas de la transfección con 1,5 \mug. La reserva celular de PER55K(1,0) fue expandida y sembrada en 4 matraces T25 a una densidad de 3,5x10^{6} células/matraz para la transfección para someter a ensayo la generación de virus. Además, se sembraron 3 matraces T25 con células PER.C6 parentales a la misma densidad. pAdApt35.eGFP (un plásmido adaptador que contiene la proteína verde fluorescente como gen marcador; ver Ejemplo 4) fue digerido con PacI para liberar las secuencias adenovirales del esqueleto plasmídico. pWE.Ad35.pIX-rITR (ver Ejemplo 4) fue digerido con NotI para liberar secuencias adenovirales del esqueleto cosmídico. Dos matraces con células PER.C6 y 2 matraces con células PER55K(1,0) fueron transfectados con 2 \mug de pAdApt35.eGFP digerido y 6 \mug de pWE.Ad35.pIX-rITR digerido cada uno. Un matraz de cada línea celular fue transfectado con 8 \mug de pAdApt35.LacZ para controlar la eficacia de transfección. El matraz restante con PER55K(1,0) servía como control negativo y fue tratado como los otros pero no recibió la mezcla de transfección. Todas las transfecciones fueron realizadas con LipofectAmine (Invitrogen/Life Techn.) según las instrucciones del fabricante utilizando para cada transfección un total de 8 \mug de ADN y 40 \mul de reactivo LipofectAmine. La mezcla de reacción fue separada al cabo de 4 horas de incubación y se añadió medio de cultivo de nueva aportación. Las transfecciones se realizaron el día después de la siembra de las células y de nuevo dos días más tarde las células de los matraces T25 fueron transfectadas a un matraz T80 excepto para las tranfecciones de control de LacZ. Estas fueron teñidas con solución X-gal tras una fijación suave. Al cabo de cinco horas de incubación con la solución de tinción, se estimó el porcentaje de células azules en aproximadamente el 90% en ambos matraces mostrando que la transfección iba bien para ambas líneas celulares. Cuatro días después del paso a los matraces T80 los cultivos PER55K(1,0) transfectados mostraban el inicio del CPE (efecto citopatogénico, indicativo de replicación del virus) con aproximadamente 100 eventos/matraz. Las células PER55K(1,0) no transfectadas se hicieron crecer hasta la confluencia sin evidencia de CPE. En los cultivos de PER.C6 transfectados solamente fueron visibles tres eventos de CPE en la monocapa confluente de células. De nuevo tres días más tarde, los cultivos de PER55K(1,0) transfectados mostraban un CPE completo, con todas las células redondeadas y despegadas en grupos. En contraste, en los cultivos de PER.C6 los pocos eventos de CPE no habían progresado y las células todavía estaban en monocapa. Esto confirma las primeras observaciones de que la generación de virus basados en Ad35 con E1 suprimida sobre PER.C6 es muy ineficaz. Asimismo los cultivos de PER55K(1,0) no transfectados mostraban, como se esperaba, una monocapa confluente sin CPE. Las células y el medio de los matraces PER55K(1,0) con un CPE completo fueron cosechadas y sometidas a ciclos de congelación/descongelación después de lo cual los restos celulares fueron separados mediante centrifugación a 3.000 rpm durante 10 minutos en una centrífuga de mesa. Uno de los productos lisados brutos resultantes fue utilizado para infectar un cultivo fresco de células PER55K(1,0) en un matraz T175 (1,5 ml/matraz). Las células y el medio fueron cosechados a un CPE completo cuatro días más tarde. Esto muestra que se había formado virus infeccioso en las transfecciones iniciales. La expresión de GFP fue confirmada mediante microscopía fluorescente de las células A549 infectadas con el producto lisado bruto. El producto lisado bruto fue utilizado después para analizar la complementación de este virus Ad35.AdApt.eGFP con E1 suprimida en los clones iniciales como se describe más abajo.

Los clones descritos antes que fueron escogidos de las células PER.C6 transfectadas con pIG35.55K fueron expandidos y fueron sometidos a ensayo funcionalmente en cuanto a la capacidad para sustentar la replicación de Ad35.AdApt.eGFP. A este fin, los clones fueron sembrados a dos densidades en placas de 6 pocillos y un día más tarde infectados con 15 ml del producto lisado bruto descrito antes. El CPE fue controlado al día siguiente. De los 146 clones sometidos a ensayo de esta manera 19 dieron un CPE completo el día 2 o 3 y 68 dieron un CPE completo el día 5 o 6. Los clones restantes tenían solamente un CPE parcial o mostraban pocos eventos no progresivos. El último era indistinguible de las células PER.C6 que fueron tomadas como control negativo.

Basándose en estos resultados se realizó una selección de 24 clones que fueron rastreados adicionalmente en cuanto a su capacidad para generar virus con E1 suprimida recombinantes tras la transfección del plásmido adaptador pAdApt35.GFP y el clon cosmídico pWE.Ad35.pIX-rITR grande. A este fin, los clones fueron cultivados en placa en matraces T25 y transfectados con 2 \mug del adaptador y 6 \mug del plásmido esqueleto utilizando LipofectAmine como se ha descrito antes. Dos días después de la transfección, las células fueron transferidas a matraces T80 para evitar la sobreconfluencia de los cultivos. De los 24 clones 5 daban un CPE completo tres días después del paso a T80 y otros 13 clones progresaban a un CPE completo el día después. Los 6 clones restantes no mostraban CPE o solamente empezaban. En comparación: la generación de rutina de vectores de Ad5 con E1 suprimida sobre células PER.C6 produce generalmente un CPE completo de cuatro a seis días después de la transferencia a los matraces
T80.

Esto muestra que los nuevos clones complementan eficazmente los vectores de adenovirus con E1 suprimida. Uno de estos clones (clon #16) descrito antes fue utilizado para generar y producir múltiples lotes de virus Ad35 con E1 y E1/E3 suprimidas conteniendo diferentes transgenes. A este fin, los virus de los productos lisados brutos resultantes de las transfecciones descritas antes, pero utilizando plásmidos adaptadores diferentes, fueron purificados en placa sobre la nueva línea celular. Las placas individuales fueron sometidas a ensayo en cuanto a la actividad transgénica y después amplificadas para la producción a escala media en 4-8 matraces de triple capa (3x175 cm/matraz). Las células fueron cosechadas a un CPE completo y el virus fue liberado y purificado como se hace rutinariamente para los adenovirus y se describe en el Ejemplo 1. La etapa de extracción con freón para separar los restos celulares fue sustituida, sin embargo, por una etapa de centrifugación. De este modo tras la incubación con ADNasa I, el desecho celular fue centrifugado en tubos cónicos de 50 ml (Greiner) a 8.000 rpm en una centrífuga de mesa (Beckman Coulter Allegra 21R con un rotor de ángulo fijo) durante 30 minutos a 4ºC. Esta etapa se repitió en un tubo de 50 ml nuevo hasta que el sobrenadante estuvo claro (normalmente una vez). La cantidad de partículas de virus fue determinada mediante HPLC (Shabram y col., 1997). La Tabla IV presenta los rendimientos después del tratamiento aguas abajo de las producciones de media escala de virus Ad35 con E1 y E1/E3 suprimidas en matraces de triple capa con PER55K clon #16. La cantidad de partículas de virus purificadas es comparable con los rendimientos de los vectores basados en Ad5 en células PER.C6.

Los autores de la presente invención concluyen que han generado múltiples líneas celulares que complementan eficazmente vectores basados en Ad35 con E1 completamente suprimida. De este modo, la expresión de E1B-55K de Ad35 en una línea celular complementadora de Ad5 facilita la replicación de los vectores de Ad35.

Ejemplo 10 Nuevas líneas celulares complementadoras a partir de células primarias

El Ejemplo 8 describía la generación del constructo pIG535, un plásmido de expresión con Ad5E1A-Ad35E1B híbrido. pCC536 y pIG536 también son constructos con E1 de Ad5-Ad35 híbrida pero con la región E1A, el promotor de E1B y la mayor parte del gen E1B-19K derivado de Ad5 y la mayor parte del gen E1B-55K derivado de Ad35. Los constructos pCC536s y pIG536 difieren solamente en la secuencia de poliadenilación heteróloga que termina el transcrito E1B: pIG536 tiene la secuencia HBV pA y pCC536s tiene una secuencia pA sintética (SpA). La secuencia SpA consta del elemento de secuencia aguas arriba (USE) del gen del complemento C2 humano (Moreira y col., 1995) y la secuencia pA sintética (SPA) descrita por Levitt y col., 1989.

La secuencia poliA sintética se construye utilizando los siguientes oligos:

: C2SPA-1: 5'-CCC TGC AGG GAC TTG ACT CAT GCT TGT TTC ACT TTC ACA TGG AAT TTC CCA GTT ATG AAA TTA ATA AAG-3'

: C2SPA-2: 5'-GTC TAG ACA CAC AAA AAA CCA ACA CAC TAT TGC AAT GAA AAT AAA TTT CCT TTA TTA ATT TCA TAA CTG-3'.

Los oligonucleótidos fueron mezclados a una concentración 10 \muM en 1x tampón de recocido (Tris HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM) y, utilizando una máquina para PCR, se calentó la solución a 94ºC durante 5 minutos y después se enfrió a 65ºC a 0,5ºC/segundo y tras la incubación a 65ºC durante 5 minutos se enfrió adicionalmente a 20ºC a 0,05ºC/segundo. Con posterioridad, se añadieron 10 \mul de dNTP 2 mM, 0,5 \mul de MgCl_{2} 1M y 3 \mul de fragmento de Klenow (New England Biolabs) a 87 \mul de la muestra recocida y la mezcla se incubó a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Después se amplificó un \mul de la muestra recocida y tratada con Klenow utilizando los siguientes cebadores:

: C2for: 5'-CGG GAT CCC CTG CAG GGA CTT GAC-3'

y

: SPArev: 5'-TTG CGA CTT AAG TCT AGA CAC ACA AAA AAC C-3'

utilizando ADN polimerasa Pwo (Roche) según las instrucciones del fabricante pero con la adición de DMSO (Sigma) a una concentración final del 3%. El programa de la PCR se ajustó a 94ºC durante 2 minutos, seguido de 30 ciclos de (94ºC durante 30'', 55ºC durante 30'' y 72ºC durante 20''). Cuando se describen en este documento programas de PCR ' significa tiempo en minutos y '' significa tiempo en segundos. Después el ADN amplificado fue purificado utilizando el estuche de purificación para PCR QIAquick (Qiagen) y digerido con XbaI y SbfI. El producto digerido fue purificado de nuevo con el estuche de purificación de PCR para separar los pequeños extremos digeridos. El constructo pIG270 también fue digerido con XbaI y SbfI (isosquizómero de Sse8387I) y el fragmento que contenía el vector de 5,9 kb resultante fue aislado del gel utilizando el estuche GeneClean II (Bio101, Inc). El vector tratado y el inserto de la PCR fueron ligados después para dar pCC271 (Figura 29). pCC271 contiene de este modo el promotor de PKG, la región E1 de Ad35 (nucl. 468 a 3400 inclusive de la secuencia de Ad35 del ejemplo 3 y la figura 5) y la pA sintética (SpA). La secuencia pA sintética también fue clonada en el constructo pIG535 como sigue.

pIG535 fue digerido con EcoRI, PstI y ScaI (Todas las enzimas de New England Biolabs digeridas en tampón NEB 3) y el inserto de 3 kb correspondiente a la región E1 de Ad5-Ad35 quimérica fue purificada utilizando el estuche GeneClean II (Bio 101, Inc.). El constructo pCC271 fue digerido con EcoRI y PstI y el fragmento vector de 3 kb conteniendo sPa y el promotor de PGK fue aislado como antes. Ambos fragmentos aislados fueron ligados y transformados en células competentes STBL-2 (Invitrogen/Life Technologies) para dar pCC535s (Figura 30). pCC535s contiene las mismas secuencias E1 de Ad5-Ad35 que pIG535 sin embargo, una secuencia pA diferente.

Para la construcción de pCC536s, se elaboró un subclon con las nuevas secuencias E1B híbridas. A este fin, las secuencias E1A/E1B22K de Ad5 fueron amplificadas utilizando los cebadores

: 5AK: 5'-GAG CGA AGA AAC CCA TCT GAG-3' y

: 2155R: 5'-GGT CCA GGC CGG CTC TCG G-3'

con pIG.E1A.E1B (ver el Ejemplo 6 y la Figura 13) como ADN molde utilizando ADN polimerasa Pwo (Roche) según las instrucciones del fabricante y además una concentración final de DMSO del 3%. El programa fue ajustado a: 94ºC durante 2' seguido de 30 ciclos de (94ºC durante 30'', 58ºC durante 30'' y 72ºC durante 30'') y se terminó con 68ºC durante 8'. Esto dio como resultado un fragmento de 210 pb correspondiente a los nucl. 2022-2233 de la secuencia de Ad5. Se realizó una segunda PCR sobre pCC271 con los cebadores

2155F: 5'-CCG AGA GCC GGC CTG GAC C-3' y

35F10: 5'-GCT CTA GAC CTG CAG GTT AGT CAG TTT CTT CTC CAC TG-3'.

Se utilizó el mismo programa de PCR pero ahora con un tiempo de elongación de 90''. El fragmento de 1,3 kb resultante corresponde a los nucl. 2112 a 3400 de la secuencia de Ad35 con un sitio SbfI en el extremo 3'. Obsérvese que los cebadores 2155F y 2155R son totalmente complementarios permitiendo el ensamblaje de los dos fragmentos como sigue:

Ambos fragmentos de la PCR fueron purificados en gel utilizando el estuche de extracción en gel Qiagen. Después se mezclaron alícuotas de las muestras purificadas a una razón equimolar y se utilizaron como molde para una amplificación mediante PCR del ensamblaje con los cebadores 5AK y 35F10 con ADN polimerasa Pwo como antes utilizando los ajustes de programa:

94ºC durante 2', y 5 ciclos de (94ºC durante 30'', 60ºC durante 302 y 72ºC durante 2') seguido de 25 ciclos de (94ºC durante 30'', 58ºC durante 30'' y 72ºC durante 90''). El fragmento de 1,5 kb resultante fue purificado del gel utilizando el estuche de extracción en gel QIAquick (Qiagen), ligado al vector de clonación pCR-Script/Amp (Stratagene) y transformado en células competentes DH5a (Invitrogen/Life Technologies) dando como resultado pCR535E1B (Figura 31). Este constructo fue verificado mediante análisis de restricción y secuenciado para confirmar la correcta amplificación de las secuencias diana.

pCR535E1B fue digerido después con NotI y los extremos sobresalientes se volvieron romos con el fragmento de Klenow. El ADN fue purificado después utilizando el estuche de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) y el ADN eluido fue digerido con PstI. El fragmento de 1,5 kb conteniendo las secuencias de E1 quiméricas del vector pCR535E1B fue purificado en gel utilizando el estuche GeneClean II (Bio 101, Inc.). Este fragmento fue ligado al vector pCC535s digerido con PvuII y PstI, y transformado en células STBL-2 competentes (Invitrogen/Life Technologies) para dar pCC2155s (Figura 32). Para completar el constructo pCC536s las secuencias Ad5-E1 fueron clonadas después en el subclon pCC2155s. A este fin, pIG.E1A.E1B fue digerido con EcoRI y KpnI y el fragmento de 1,6 kb correspondiente a E1A de Ad5 y E1B 21K de Ad5 (nucl. 459 a 2048 de la secuencia de Ad5) fue aislado del gel utilizando el estuche de GeneClean. pCC2155s fue digerido con EcoRI y KpnI y el fragmento que contenía el vector también fue purificado en gel. La ligadura de ambos fragmentos aislados y la transformación en células electrocompetentes DH19B (Invitrogen/Life Technologies) dio como resultado pCC536s (Figura 33). Las secuencias E1B híbridas se muestran en la Figura 38 con más detalle. La Fig. 38A muestra un alineamiento de las secuencias de la proteína de E1B-21K en el constructo pCC536s con las secuencias de Ad35 y Ad5 de tipo salvaje (wt). Como se puede observar la mayor parte de la proteína E1B-21K de pCC536s deriva de Ad5 excepto los 6 aminoácidos C-terminales que son idénticos a E1B-21K de Ad35. La Figura 38B muestra el mismo alineamiento para las proteínas E1B-55K. En este caso los aminoácidos N-terminales de pCC536s son idénticos a Ad5 hasta el aa 65. El resto es idéntico a E1B-55K de Ad35. Obviamente, se pueden diseñar diferentes constructos E1B-55K híbridos utilizando el método general esbozado antes sin apartarse de la invención.

El constructo pIG536 fue elaborado remplazando un fragmento con el sPA de pCC536s por el fragmento correspondiente de pIG270 (ejemplo 6, Figura 15) conteniendo el HBVpA. A este fin, pIG270 fue digerido con BamHI y BglI y el inserto de 1,8 Kb fue aislado del gel utilizando el estuche GeneClean II (Bio 101, Inc.). pCC536s fue digerido con las mismas enzimas y el fragmento que contenía el vector de 4,8 kb fue purificado del gel como antes. La ligadura de ambos fragmentos aislados y las transformaciones en células STBL-2 competentes (Invitrogen/Life Technologies) dio el constructo pIG536 (Figura 34).

Los constructos E1 generados fueron sometidos a ensayo en células de riñón de cría de rata (BRK) primarias como se describe en el Ejemplo 6. Los resultados (Tabla V) confirman la primeras observaciones de que los genes de Ad5-E1 transforman más eficazmente las células BRK primarias que los genes de E1 de Ad35. Los constructos de expresión de E1 de Ad5-Ad35 quiméricos, pCC535s y pCC536s, producían más colonias transformadas que los constructos de E1 de Ad35 completos, pIG270 y pCC271. Además, el uso de una secuencia de poliadenilación sintética en pCC535s daba como resultado ligeramente más focos en comparación con la variante con pA de HBV pIG535.

Se aislaron células retinoblásticas embriónicas humanas (HER) de ojos de fetos abortados de 18 y 21 semanas de edad. Los ojos se llevaron a una placa de 6 cm con PBS y se limpiaron de tejido externo. Se realizó una incisión para alcanzar el lado interno y la capa de células grises del fondo interno de los ojos que contenía los retinoblastos, fue separada raspando. Esta capa fue transferida a un tubo de 14 ml en 2 ml de PBS y se dejó que el tejido sedimentara, después de lo cual se separó el PBS. Se añadieron 2 ml de tripsina (0,25%, sin EDTA, GibcoBRL) y se incubaron durante 5 minutos a 37ºC con agitación ocasional. Las porciones de tejido se dejaron sedimentar y 1 ml de tripsina con células fue transferido a un nuevo tubo. A este tubo se le añadieron 4 ml de medio de cultivo (DMEM con FCS al 10%) y el tubo se almacenó sobre hielo. Las porciones de tejido que quedaban en tripsina se llevaron a una placa de 6 cm y se cortaron en trozos más pequeños. Estos fueron incubados de nuevo, tras la adición de 2 ml de tripsina de nueva aportación, en un tubo de 14 ml a 37ºC con agitación ocasional. Después esta mezcla se añadió a las primeras células aisladas en medio de cultivo y el total fue centrifugado a 1.000 rpm en una centrífuga de mesa. El sobrenadante fue separado y las células fueron resuspendidas en 10 ml de medio de cultivo. Las células HER aisladas fueron cultivadas en placa en dos placas de 6 cm e incubadas a 37ºC/CO_{2} al 10%. Tras una confluencia del 90% los cultivos fueron divididos 1:3 e incubados adicionalmente. Este procedimiento fue repetido hasta que se obtuvieron suficientes placas para utilizarlas para la transfección y adicionalmente para el cultivo. Las transfecciones fueron realizadas a diferentes números de pases utilizando el estuche de cotransfección CaPO_{4} (Invitrogen/Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. Para cada placa (confluencia del 50-70%) se utilizaron 20 \mug de ADN. Las transfecciones iniciales fueron realizadas con pIG.E1A.E1B, un constructo de expresión de Ad5-E1, y con pIG535, el constructo de expresión de Ad5-E1A/Ad35-E1B híbrido. A las 2-3 semanas de la transfección los focos transformados se hicieron visibles en las placas transfectadas con pIG.E1A.E1B. Se encontró una media de 15-20 focos/placa en las placas que fueron transfectadas con pIG.E1A.E1B. Se escogieron más de 30 clones y se transfirieron a placas de 96 pocillos. Tras la confluencia las células se hicieron pasar a placas de cultivo más grandes o matraces y finalmente se congelaron las viables en ampollas en N_{2} líquido de un matraz T175. Todos los clones escogidos fueron establecidos de esta manera. Los focos transformados aparecieron mucho más tarde en las placas que fueron transfectadas con pIG535, los primeros aproximadamente cinco semanas después de la transfección. Se encontró una media de 3-4 clones por placa. Se escogieron un total de 46 clones desde 7 semanas a 3 meses después de las transfecciones de los cuales 14 eran viables y pudieron ser pasados múltiples veces. De estos, 2 clones (clon #45 y #75) se hicieron crecer en un matraz T175 y los viables se congelaron en ampollas en N_{2} líquido.

Asimismo se transfectaron células HER primarias con los constructos pCC535s y pCC536s. La transfección de pCC535s permite una media de 2 clones/placa y se seleccionaron un total de 50 clones. De estos clones seleccionados 2 pudieron ser establecidos. A partir de la transfección con pCC536s, al menos un clon pudo ser establecido.

Los experimentos descritos antes muestran que las células HER primarias pueden ser transformadas con secuencias E1 de Ad5-Ad35 híbridas. La eficacia de la transformación era inferior a la obtenida con las región E1 de Ad5 completa. Los autores de la presente invención sometieron a ensayo entonces si las nuevas líneas celulares podían complementar vectores con E1 suprimida basados en Ad35 recombinantes. A este fin, el clon #45 que se obtuvo a partir de la transfección con pIG535 fue sembrado en matraces T25 a una densidad de 7x10^{6} células/matraz e infectado con virus Ad35.AdApt.eGFP (ver ejemplo 9) a una multiplicidad de infección (moi) de 5 y 25 partículas de virus/célula. Se observó un CPE completo a los 4 y 5 días para la moi de 25 y 5 respectivamente. Como comparación cultivos paralelos de células con el clon #45 que fueron infectadas con Ad5.AdApt.eGFP daban un CPE completo los días 7 y 8 para la moi de 25 y 5 respectivamente. La eficacia de infección inicial era comparable para los virus Ad5 y Ad35, un \sim80% (moi=5) y un \sim95% (moi=25) de las células fueron infectadas con virus GFP al día siguiente de la infección medido mediante microscopía de fluorescencia. Las células del clon #75 fueron sembradas en una placa de 6 pocillos a una densidad de 2x10^{6} células/pocillo e infectadas con Ad35.AdApt.eGFP o Ad5.AdApt.eGFP a un moi de 5 (VP/célula). De nuevo la eficacia de infección inicial era comparable para ambos virus. Se observó un CPE completo el día 4 en el caso de la infección con Ad35.AdApt.eGFP mientras las células con el clon #75 infectadas con Ad5.AdApt.eGFP daban un CPE completo el día 7. La diferencia en la eficacia de replicación sobre células complementadoras de Ad35 entre los vectores recombinantes de Ad35 y Ad5 está incluso más clara cuando el virus es generado mediante transfección plasmídica. Esto se ejemplifica mediante el siguiente experimento de transfección. Las células con el clon #45 fueron sembradas en matraces T25 a una densidad de 3,5x10^{6} células y transfectadas tres días más tarde utilizando reactivo LipofectAmine (Invitrogen/Life Technologies) según las instrucciones del fabricante y descritas antes. Se transfectaron simultáneamente 2 \mug de plásmido adaptador pAdApt35.eGFP digerido con PacI con 6 \mug de cósmido con el esqueleto de pWE.Ad35.pIX-rITR o pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3 digerido con NotI. Se transfectaron simultáneamente 2 \mug de pAdApt.eGFP (plásmido adaptador de Ad5, descrito en WO 00/70071) digerido con PacI con 6 \mug de pWE.Ad5.AflII-rITRsp (plásmido con el esqueleto de Ad5, descrito en WO 00/70071) también digerido con pacI. Un T25 no fue transfectado y sirvió como control negativo. Un día después se controlaron las eficacias de transfección mediante microscopía fluorescente y se estimó un 10-15% en todas las transfecciones de eGFP. A los tres días de la transfección las células fueron transferidas a matraces T80 e incubadas adicionalmente a 37ºC/CO_{2} al 10%. De nuevo tres días más tarde se hicieron visibles los eventos de CPE en los cultivos transfectados con pAdApt35.eGFP y pWE.Ad35pIX-rITR+ o -E3. Las transfecciones con el esqueleto con E3 suprimida contenían más células fluorescentes verdes y más eventos de CPE. La transfección con los plásmidos de Ad5 mostraba solamente alrededor de un 20% de células fluorescentes verdes, de las cuales la mayor parte estaban tiñendo, y no había eventos de CPE. Dos días más tarde esta diferencia se había vuelto mayor puesto que los cultivos transfectados con pAdApt35.eGFP y pWE.Ad35pIX-rITR\DeltaE3 mostraban claramente un 80% de CPE y los cultivos transfectados con los constructos pAdApt35.eGFP y pWE.Ad35pIX-rITR mostraban eventos de CPE progresivos. El cultivo transfectado con Ad5 no mostraba progreso alguno. En la Tabla VI se resumen estos resultados. Los autores de la presente invención concluyen que las nuevas líneas celulares complementadoras descritas antes sustentan eficazmente la replicación de virus basados en Ad35 con E1 suprimida y que la generación y replicación de los virus basados en Ad5 con E1 suprimida es menos eficaz. Aparentemente, las proteínas Ad35-E1B55K tampoco forman un complejo funcional con la proteínas Ad5-E4Orf6. De este modo se ha demostrado ahora también la especificidad de serotipo para la complementación para vectores de Ad5 recombinantes sobre células de empaquetamiento
de Ad35.

Ejemplo 11 Generación de pWE.Ad.pIX-rITR\DeltaE3

La región temprana 3 de los adenovirus humanos contiene múltiples regiones codificadoras para proteínas que interfieren en la respuesta inmunitaria del huésped a la infección adenoviral. Cuando se utilizan vectores adenovirales como portador de vacunas semejante interferencia no es deseable. Por lo tanto, los autores de la presente invención construyeron un cósmido con un esqueleto de Ad35 que carecía de la región E3.

A este fin, el constructo pBr.Ad35.PRn (Figura 35; descrito en el ejemplo 13 en la publicación EP 1 054 064 A1) fue digerido con StuI y MluI y el fragmento de 17,3 kb fue purificado del gel de bajo punto de fusión (LMP en sus siglas en inglés) utilizando la enzima agarasa (Roche) según las instrucciones del fabricante. A continuación, se generó un fragmento de PCR sobre pBr.Ad35 utilizando los cebadores:

: 35E3for: 5'-AAT GAC TAA TGC AGG TGC GC-3' y

: 35E3rev: 5'-CGA CGC GTT GTA GTC GTT GAG CTT CTA G-3'.

Para la amplificación se utilizó la ADN polimerasa Pwo (Roche) según las instrucciones del fabricante y el programa se ajustó a: 94ºC durante 2', 30 ciclos de (94ºC durante 30'', 58ºC durante 30''' y 72ºC durante 1') y una incubación final a 68ºC durante 8'. El producto de la PCR de 833 pb fue purificado utilizando el estuche de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) y digerido con MluI y StuI. El ADN digerido fue purificado del gel utilizando el estuche de extracción en gel QIAquick (Qiagen). Ambos fragmentos aislados fueron ligados y transformados en células DH5a competentes (Invitrogen/Life Technologies) para dar pBr.Ad35.PRn\DeltaE3 (Figura 36). El plásmido fue verificado mediante análisis con enzimas de restricción y secuenciación del inserto amplificado mediante PCR. La deleción de E3 fue clonada después en el esqueleto del cósmido pWE.Ad35.pIX-rITR. A este fin, pWE.Ad35.pIX-rITR (ver el Ejemplo 4 y la Figura 8) fue digerido con PacI y el ADN fue purificado mediante precipitación con isopropanol y lavado con EtOH al 70%. Tras la resuspensión en agua miliQ, el ADN fue digerido con SwaI y el fragmento que contenía el vector de 22,8 kb fue purificado del gel de LMP utilizando la enzima agarasa como antes. El constructo pBr.Ad35.PRn\DeltaE3 fue digerido con PacI y SwaI de la misma manera y el fragmento de 16,6 kb también fue aislado utilizando la enzima agarasa. Ambos fragmentos aislados fueron ligados utilizando 0,5-0,6 \mug de cada fragmento. Los fragmentos ligados fueron empaquetados después utilizando los extractos de empaquetamiento del fago \lambda (Stratagene) según las instrucciones del fabricante y mezclados con células STBL-2. Las bacterias fueron cultivadas en placa sobre placas de LB+Amp y las colonias resultantes fueron analizadas en cuanto a la presencia del constructo correcto. Esto dio el constructo pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3 (Figura 37). La deleción de E3 se extiende desde el nucl. 27648 al 30320 de la secuencia de Ad35 (ejemplo 3) y de este modo abarca una región de 2,6 kb. La transfección simultánea de pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3 digerido con NotI y pAdApt35.eGFP digerido con pIPsp-I sobre las células con el clon #16 PER55 (ver ejemplo 9) como se ha descrito antes dio lugar a virus basados en Ad35 que expresaban GFP. Tras el aislamiento del ADN viral de estos virus, la amplificación mediante PCR de la región E3 mostró que los virus tenían suprimidas 2,6 kb de las secuencias de E3 como se esperaba.

TABLA I

2

TABLA I (continuación)

3

Leyenda de la Tabla I:

Todos los adenovirus humanos utilizados en los experimentos de neutralización fueron producidos sobre células PER.C6 (Fallaux y col., 1998) y purificados en CsCl como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se muestra la concentración de NaCl a la cual eluían los diferentes serotipos de la columna de HPLC. Las partículas de virus/ml (VP/ml) fueron calculadas a partir de un patrón de Ad5. El título del experimento (DICC50) fue determinado sobre células PER.C6 como se describe en el Ejemplo 1 mediante las titulaciones realizadas paralelamente con el experimento de neutralización. Se muestra la DICC50 para los 44 virus utilizados en este estudio y se refleja la dilución del virus necesaria para obtener un CPE en el 50% de los pocillos al cabo de 5 días. La proporción de VP/DICC50 se representa en log_{10} y es una medida de la infectividad de los diferentes lotes sobre las células PER.C6.

TABLA II Los virus AdApt35.LacZ escapan a la neutralización por el suero humano

4

TABLA III Los números de focos obtenidos con los diferentes constructos de expresión de E1 en experimentos de transformación de BRK

: Media # de focos/placa:

5

TABLA IV Rendimientos de virus Ad35 con E1 y E1/E3 suprimidas en células con el clon #16 producidas en matraces de triple capa

6

TABLA V Eficacias de transformación sobre células BRK con diferentes constructos de expresión de Ad-E1

	Constructo	ADN transfectado (\mug)	# focos por placa

Experimento 1	pIG.E1A.E1B	5	44
	pIG270	5	0
	pCC271	5	0
	pIG535	5	1
	pCC535s	5	2,5
Experimento 2	pIG.E1A.E1B	4	15
	pCC271	4	0
	pCC535s	4	3
	pCC536s	4	3

7

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p1-23.

Claims

1. Una línea celular de empaquetamiento capaz de complementar adenovirus recombinantes basados en un serotipo del subgrupo B, donde dicha línea celular deriva de una célula humana que ha sido transformada por las secuencias codificadoras de E1 de un adenovirus donde la secuencia que codifica la proteína E1B-55K es del subgrupo B.

2. La línea celular de empaquetamiento según la reivindicación 1, donde dicha célula humana es una célula diploide primaria, o un derivado de la misma.

3. La línea celular de empaquetamiento de la reivindicación 1 o 2, donde dicho adenovirus del subgrupo B es del serotipo 35.

4. La línea celular de empaquetamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde dichas secuencias codificadoras de E1 están conectadas operativamente a secuencias reguladoras que permiten la transcripción y la traducción de las proteínas codificadas.

5. La línea celular de empaquetamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dichas secuencias codificadoras de E1 de adenovirus están conectadas operativamente sobre una molécula de ADN o localizadas sobre dos moléculas de ADN separadas.

6. La línea celular de empaquetamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde las células humanas primarias han sido seleccionadas del grupo formado por retinoblastos primarios, células de riñón embriónicas primarias y amniocitos primarios.

7. La línea celular de empaquetamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde dicho adenovirus del subgrupo B es un adenovirus de serotipo 35, y donde todas las secuencias codificadoras de E1 son del serotipo 35.

8. La línea celular de empaquetamiento de la reivindicación 7, donde dichas secuencias codificadoras de E1 comprenden regiones codificadoras de las proteínas E1A y la secuencia promotora de E1B conectada a las secuencias codificadoras de E1B hasta e incluyendo el codón de terminación de la proteína E1B-55K.

9. La línea celular de empaquetamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde dicho adenovirus del subgrupo B es un adenovirus de serotipo 35, y donde las secuencias codificadoras de E1 comprenden los nucleótidos 468 a 3400 de una secuencia de Ad35 de tipo salvaje.

10. Una línea celular de empaquetamiento capaz de complementar adenovirus recombinantes basados en un serotipo del subgrupo B, donde dicha línea celular está derivada de una célula que ha sido transformada por un constructo de E1 de adenovirus quimérico que comprende secuencias codificadoras de E1A y al menos parte de las secuencias codificadoras de E1B-21K de un adenovirus que no es del subgrupo B, y que comprende adicionalmente secuencias codificadoras de E1B-55K de un adenovirus del subgrupo B.

11. La línea celular de empaquetamiento de la reivindicación 10, donde las secuencias codificadoras de E1B-55K que no se solapan con las secuencias codificadoras de E1B-21K son de un adenovirus del subgrupo B.

12. La línea celular de empaquetamiento de la reivindicación 8 o 9, donde el adenovirus del subgrupo B es un adenovirus de serotipo 35.

13. La línea celular de empaquetamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, donde dichas secuencias codificadoras de E1 de adenovirus están conectadas operativamente a secuencias reguladoras que permiten la transcripción y la traducción de las proteínas codificadas.

14. La línea celular de empaquetamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, donde dicha célula es una célula humana diploide, primaria, o un derivado de la misma.

15. La línea celular de empaquetamiento de la reivindicación 14, donde las células humanas primarias han sido seleccionadas del grupo formado por retinoblastos primarios, células de riñón embriónico primarias y amniocitos primarios.

16. Una línea celular de empaquetamiento capaz de complementar adenovirus recombinantes basados en un serotipo del subgrupo B, donde dicha línea celular está derivada de una célula que ha sido transformada por las secuencias codificadoras de E1 de un adenovirus que no es del subgrupo B, y donde dicha célula comprende adicionalmente una secuencia codificadora de E1B-55K de un adenovirus del subgrupo B integrada en el genoma de dicha
célula.

17. La línea celular de empaquetamiento de la reivindicación 16, donde dicho adenovirus del subgrupo B es un adenovirus de serotipo 35.

18. La línea celular de empaquetamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17, donde dichas secuencias codificadoras de E1 están conectadas operativamente a secuencias reguladoras que permiten la transcripción y la traducción de las proteínas codificadas.

19. La línea celular de empaquetamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 16-18, donde dicha secuencia codificadora de E1B-55K está conducida por un promotor de E1B y terminada por una señal de poli-adenilación heteróloga.

20. La línea celular de empaquetamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 16-18, donde dicha secuencia codificadora de E1B-55K está conducida por un promotor heterólogo.

21. La línea celular de empaquetamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 16-20, donde dichas secuencias codificadoras de E1 de adenovirus están conectadas operativamente sobre una molécula de ADN o localizadas sobre dos moléculas de ADN separadas.

22. La línea celular de empaquetamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 16-21, donde dicha célula es una célula humana diploide primaria, o un derivado de la misma.

23. La línea celular de empaquetamiento de la reivindicación 22, donde las células humanas primarias han sido seleccionadas del grupo formado por retinoblastos primarios, células de riñón embriónico primarias y amniocitos primarios.

24. La línea celular de empaquetamiento de la reivindicación 22, donde dicha célula que es transformada por las secuencias codificadoras de E1 de adenovirus del subgrupo C es una célula PER.C6 (número de consigna ECACC 96022940), una célula 293, una célula 911, o una célula A549, o un derivado de una cualquiera de estas células.

25. La línea celular de empaquetamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-24, donde dichas secuencias de E1 del adenovirus del subgrupo B no contienen secuencias solapantes con secuencias presentes en un vector viral recombinante asociado.

26. La línea celular de empaquetamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10-25, donde dicho adenovirus que no es del subgrupo B es un adenovirus de serotipo 5.

27. Un método para complementar un adenovirus recombinante basado en un serotipo del subgrupo B, comprendiendo dicho método proveer a una línea celular de empaquetamiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-26 un ácido nucleico que codifica dicho adenovirus recombinante y cultivar dicha línea celular para permitir la complementación.

28. Un método según la reivindicación 27, que comprende adicionalmente cosechar el adenovirus recombinante complementado.

29. Un método según la reivindicación 27 o 28, donde dicho adenovirus recombinante está basado en el serotipo 35.