CN104379733B - 具改变末端的重组腺病毒群 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含多个重组腺病毒颗粒的组合物，这些重组腺病毒颗粒是血清型5、26、34、35、48、49或50的重组人类腺病毒、或重组猿腺病毒，其特征在于所述组合物中的基本上所有腺病毒颗粒的基因组皆包含核苷酸序列CTATCTAT作为5’末端核苷酸。本发明亦提供产生这些组合物的方法。

Description

具改变末端的重组腺病毒群
本发明是关于医学领域及应用于疫苗接种及基因疗法中的基因递送领域。更具体而言，本发明是关于重组腺病毒载体群。
背景技术
重组人类及动物腺病毒广泛用于其于基因疗法及疫苗接种中的应用。腺病毒载体(vector)用作欲引入宿主细胞中的目标基因的载体(carrier)，例如用以表达编码期望抗原的基因或其部分以引发免疫反应。
已鉴别出50种以上不同人类腺病毒血清型。其中，在历史上已最广泛地研究腺病毒血清型5(Ad5)以用作基因载体。最近，鉴于人类群体中抵抗这些血清型的预先存在的中和抗体的含量较低，已研究若干其他血清型(例如人类Ad11、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49及Ad50)及猿腺病毒作为载体(例如，参见WO00/70071)。这些载体的有前景的实例是重组Ad35(rAd35)及rAd26，在临床试验中对其进行研究。
已详细研究具有约34-38kb的双链DNA基因组的腺病毒的分子生物学。所有腺病毒的特征均在于不同反转末端重复(ITR)的大小为约100bp(Dan等人，2001,VirusGenes22:175-179；Liu等人，2003,CurrTopMicrobiolImmunol272:131-164)，其在不同组的血清型中保留(Shinagawa等人，1987,Gene55:85-93)。基因组端在基因组的5’端处共价附接至末端蛋白(TP)。ITR具有复制起点(Bernstein等人，1986,MolCellBiol6:2115-2124；Challberg及Rawlins,1984,ProcNatlAcadSciUSA81:100-104；Guggenheimer等人，1984,ProcNatlAcadSciUSA81:3069-3073；Harris及Hay，1988,JMolBiol201:57-67；Hay,1985,EMBOJ4:421-426；vanBergen等人，1983,NucleicAcidsRes11:1975-1989；Wang及Pearson，1985,NucleicAcidsRes13:5173-5187)且对DNA复制至关重要，含有促进复制的细胞蛋白的结合位点并有利于狭长结构形成。ITR序列具有在核苷酸9-18范围内的短的高度保留典型“核心区”(Liu等人，同上)。然而，此核心区之前的末端8个核苷酸在腺病毒类型与分离株之间变化(Alestrom等人，1982,Gene18:193-197；Dan等人，同上；Jacobs等人，2004,JGenVirol85:3361-3366；Purkayastha等人，2005,JClinMicrobiol43:3083-3094；Rademaker等人，2006,JGenVirol87:553-562；Shinagawa等人，1987，同上；Shinagawa等人，1983,Virology125:491-495；Shinagawa及Padmanabhan，1980,ProcNatlAcadSciUSA77:3831-3835；Tokunaga等人，1982,Gene18:329-334；Houng等人，2006,JClinVirol35:381-387)。尽管大多数腺病毒在末端8个核苷酸中展示CATCATCA序列，但已阐述若干可替代的序列。
鉴于多种似乎适于使用这些基因转移运载体治疗或预防的疾病以及大量人受这些疾病影响且世界范围内人群不断增长，对重组腺病毒的需求大幅提高。
对于意欲投与人类的临床群而言，重组腺病毒(rAd)的大规模生产必须安全且有效，且符合优良制造规范(GMP)指南。此方面中重要的一个方面是这些所产生的rAd群的同源性。
现在本文中惊人地报导，在某些rAd的基因组5’端上的8个最末端碱基的序列中发现变化，从而产生关于这些序列展示异源性的群。
因此，业内仍需要大规模提供rAd群，这些群展示改良的同源性。本发明提供这些群以及其获得方法。另外，本发明的群中的rAd在生产过程中展示改良的复制。
发明概述
本发明提供包含多个重组腺病毒颗粒的组合物，其中重组腺病毒是血清型5、11a、26、34、35、48、49或50的重组人类腺病毒、或重组猿腺病毒，该组合物的特征在于该组合物中的基本上所有腺病毒颗粒的基因组皆包含核苷酸序列CTATCTAT作为5’末端核苷酸。
本发明进一步提供制备(优选至少1×107个)重组腺病毒颗粒群的方法，基本上所有这些重组腺病毒颗粒在其基因组的5’末端中皆具有相同核苷酸序列，该方法包含：a)实施分子克隆步骤以将腺病毒基因组的天然5’末端更换为包含核苷酸序列CTATCTAT作为末端核苷酸的改变5’末端，b)在宿主细胞中使具有改变5’末端的重组腺病毒繁殖，及c)收获重组腺病毒以获得重组腺病毒颗粒群，基本上所有这些重组腺病毒颗粒皆包含核苷酸序列CTATCTAT作为其基因组的5’末端核苷酸。
本发明亦提供制备重组腺病毒颗粒群的方法，基本上所有这些重组腺病毒颗粒在其基因组的5’末端中皆具有相同核苷酸序列，该方法包含：a)纯化腺病毒的噬菌斑，其中重组腺病毒是血清型5、11a、26、34、35、48、49或50的重组人类腺病毒、或重组猿腺病毒，以从单噬菌斑分离腺病毒或重组腺病毒，其中该腺病毒或重组腺病毒包含核苷酸序列CTATCTAT作为其基因组的5’末端核苷酸，b)在宿主细胞中使从步骤a)的单噬菌斑获得的重组腺病毒繁殖，及c)收获重组腺病毒以获得重组腺病毒颗粒群，基本上所有这些重组腺病毒颗粒皆包含核苷酸序列CTATCTAT作为其基因组的5’末端核苷酸。
在某些实施例中，本发明组合物或方法中的重组腺病毒是重组人类腺病毒，且优选并非血清型3、4、7、8、9、11p、15、21、29、37或53的人类腺病毒。在某些实施例中，本发明组合物或方法中的重组腺病毒是血清型5、26、35、49或50的重组人类腺病毒。优选地，重组腺病毒是血清型26或35的重组人类腺病毒。
在某些实施例中，重组腺病毒缺少E1区的至少一部分。
在某些实施例中，重组腺病毒包含转基因。
在某些实施例中，组合物或重组腺病毒群包含至少1×107个、优选至少1×108个、优选至少1×109个、优选至少1×1010个重组腺病毒颗粒。
在某些实施例中，本发明方法的步骤b)是在优选具有介于约2升与20000升之间的体积的生物反应器中实施。
在某些实施例中，本发明方法进一步包含纯化重组腺病毒。
在本发明组合物或方法的某些实施例中，将重组腺病毒配制成医药组合物。
附图简单说明
图1.可替代的ITR序列的出现。关于详情，参见实例3。
图2.具有可替代及初始ITR序列的Ad35及Ad5载体的复制动力学。关于详情，参见实例5。
发明的详细说明
本文中阐述，在最初含有其他末端序列的不同重组腺病毒的若干传代后，惊人地发现具体5’末端序列(CTATCTAT)，且此序列的存在可促使改良的腺病毒产生。
诸位发明者藉由构建和/或包括用以获得血清型重组腺病毒的主动选择步骤将此惊人观察转化为实际使用，这些血清型重组腺病毒据报导在其野生型基因组中具有不同末端序列，其中基因组包含核苷酸序列CTATCTAT作为5’末端核苷酸。
因此，本发明是关于在重组腺病毒基因组的末端处的特定序列(CTATCTAT)及其用于产生重组腺病毒的用途。此末端序列可用于在其野生型基因组的5’末端处不含有此序列的任一腺病毒血清型中。
原则上，本发明的腺病毒组合物(群)可在其100％5’末端基因组端处含有序列CTATCTAT(此乃因已根据本发明主动产生和/或选择起始腺病毒)。鉴于可偶尔且随机发生于任一生物系统中的一些天然突变，实际数目可能稍微低于100％，但在优选实施例中，除CTATCTAT外的末端序列的量低于本发明腺病毒群中的检测极限。因此，根据本发明，重组腺病毒颗粒的组合物或群中的基本上所有腺病毒基因组皆包含核苷酸序列CTATCTAT作为5’末端序列。本文所用术语‘基本上所有’是指至少90％、优选至少98％、更优选至少99％、仍更优选至少99.9％、至多100％(组合物中的腺病毒颗粒)。举例而言，此可藉由诸如PCR等方法测定，该方法可在1000个颗粒中容易地检测1个颗粒，且在本发明的重组腺病毒颗粒的组合物中，未检测到具有初始末端序列的腺病毒。
本发明的腺病毒‘群’意指在单一生产容器中在一个生产过程中产生的组合物，或者其可指存于单一容器(例如，生物反应器、袋、烧瓶、瓶子、多剂量小瓶、单剂量小瓶、注射器等)中的组合物中的多个腺病毒颗粒。本发明的腺病毒群或本发明的包含腺病毒的组合物优选包含至少107个重组腺病毒颗粒，且在某些实施例中包含至少108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018个或更多个腺病毒颗粒，至多1020个腺病毒颗粒(例如，如在大规模生物反应器中在单一生产过程中产生)。群或组合物可包含或可不包含除重组腺病毒外的其他组份。
本文所用的针对腺病毒的术语‘重组’暗指，其是由人工加以修饰，例如其具有于其中主动克隆的改变末端和/或其包含异源基因，亦即，其并非天然野生型腺病毒。
如业内惯例，本文中的序列是从5’至3’方向提供。
“腺病毒衣壳蛋白”是指腺病毒的衣壳上参与测定特定腺病毒的血清型和/或向性的蛋白质。腺病毒衣壳蛋白通常包括纤维、五邻体和/或六邻体蛋白。属于(或‘基于’)本发明某一血清型的腺病毒通常包含该某一血清型的纤维、五邻体和/或六邻体蛋白，且优选包含该某一血清型的纤维、五邻体及六邻体蛋白。这些蛋白质通常是由重组腺病毒的基因组编码。某一血清型的重组腺病毒可视情况包含和/或编码其他腺病毒血清型的其他蛋白质。
重组腺病毒是藉由至少在序列上衍生自野生型而‘基于‘如本文所用的腺病毒。此可藉由分子克隆使用野生型基因组或其部分作为起始材料来完成。亦可使用野生型腺病毒基因组的已知序列以藉由DNA合成重新生成基因组(的部分)，其可使用常规程序由从事于DNA合成和/或分子克隆领域的服务公司(例如GeneArt、GenScripts、Invitrogen、Eurofins)实施。因此，作为非限制性实例，不基于人类Ad4的重组腺病毒是不包含人类Ad4的五邻体、六邻体及纤维的重组腺病毒；将包含Ad35的六邻体、五邻体及纤维的重组腺病毒视为基于Ad35的重组腺病毒等。
由于已对腺病毒血清型及其基因组构造实施广泛研究，故本领域内的普通技术人员了解腺病毒基因组中的ITR的界限。序列CTATCTAT在基因组的最远末端处位于本发明重组腺病毒中。举例而言，wtAd5的左ITR的上链(upperstrand)始于5’-CATCATCA…-3’且该序列根据本发明变为优选序列5’-CTATCTAT…-3’。本领域内的普通技术人员了解以下事实：在右ITR处，从5’至3'的此序列位于下链(lowerstrand)中。
可藉由不同方式将初始(亲本)序列变为本发明的改变的序列，这些方式本身为彼等本领域内的普通技术人员已知且常用。实例是序列的直接PCR生成或从经鉴别在末端处含有指定序列的初始腺病毒基因组亚克隆。
在藉由(例如)在质粒/黏粒同源重组程序中使用分子生物学技术改变一个末端的序列(例如，参见WO99/55132)、同时另一末端仍未改变时，所得腺病毒将在产生及复制期间拷贝左或右ITR，从而产生腺病毒仅具有修改末端及腺病毒仅具有未修改末端的混合群体(如本文中所概述，若由于由此末端序列赋予的生长优势而在活体外培养并繁殖，则其将朝向具有愈来愈多具有末端序列CTATCTAT的改变末端的群体演化)。优选地，本发明重组腺病毒包含在左及右基因组末端处包含序列CTATCTAT的基因组。
因此，本发明重组腺病毒包含核苷酸序列CTATCTAT作为基因组的5’末端核苷酸。
本发明载体是重组腺病毒，亦称作重组腺病毒载体。业内熟知重组腺病毒载体的制备。
在某些实施例中，本发明腺病毒载体缺乏病毒复制所需的腺病毒基因组的E1区(例如E1a区和/或E1b区)的至少一种基本基因功能。在某些实施例中，本发明腺病毒载体缺乏非基本E3区的至少一部分。在某些实施例中，载体缺乏E1区的至少一种基本基因功能及非基本E3区的至少一部分。腺病毒载体可为“多重缺乏”，意指腺病毒载体缺乏腺病毒基因组的两个或更多个区中的每一者中的一或多种基本基因功能。举例而言，上述E1缺乏或E1-、E3缺乏性腺病毒载体可进一步缺乏E4区的至少一种基本基因和/或E2区(例如，E2A区和/或E2B区)的至少一种基本基因。
腺病毒载体、其构建方法及其繁殖方法已为业内熟知且阐述于以下中：例如美国专利第5,559,099号、第5,837,511号、第5,846,782号、第5,851,806号、第5,994,106号、第5,994,128号、第5,965,541号、第5,981,225号、第6,040,174号、第6,020,191号及第6,113,913号及ThomasShenk,“AdenoviridaeandtheirReplication”，M.S.Horwitz,“Adenoviruses”，分别第67及68章，Virology,B.N.Fields等人编辑，第3版，RavenPress有限公司，NewYork(1996)及其中提及的其他参考文献。通常，腺病毒载体的构建涉及使用标准分子生物技术，例如彼等阐述于以下中者：例如，Sambrook等人，MolecularCloning,aLaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)；Watson等人，RecombinantDNA，第2版，ScientificAmericanBooks(1992)；及Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,NY(1995)以及其中提及的其他参考文献。
本发明腺病毒属于腺病毒科家族且优选是属于哺乳动物腺病毒属者。其可为人类腺病毒，且亦可为感染其他物种的腺病毒，包括但不限于牛腺病毒(例如牛腺病毒3，BAdV3)、犬腺病毒(例如CAdV2)、猪腺病毒(例如PAdV3或5)或猿腺病毒(其包括猴腺病毒及类人猿腺病毒(例如黑猩猩腺病毒))。优选地，腺病毒是人类腺病毒(HAdV或AdHu；在本发明中，若提及Ad而未指示物种，则意指人类腺病毒，例如简单标号“Ad5”意指与HAdV5相同，其是人类腺病毒血清型5)或猿腺病毒(例如黑猩猩腺病毒(ChAd、AdCh或SAdV))。
优选地，本发明重组腺病毒是已报导野生型在5’末端处具有不同序列(不同于CTATCTAT，例如经常出现的序列CATCATCA)的腺病毒。不同腺病毒血清型的所报导或推断的5’末端8个核苷酸绘示于表I中。US2009/227000报导在5’末端处具有CTATCTAT的Ad11p。已使用人类腺病毒实施最先进研究，且根据本发明的某些方面，人类腺病毒优选。在某些优选实施例中，本发明重组腺病毒是基于人类腺病毒，且并非基于人类腺病毒血清型3、4、7、8、9、11p、15、21、29、37或53。在优选实施例中，重组腺病毒是基于人类腺病毒血清型1、2、5、6、10、11a、12、14、16、17、18、19、22、26、28、31、34、35、36、40、41、46、48、49、50、53、54、55、56或57。更优选地，重组腺病毒是基于人类腺病毒血清型5、11a、26、34、35、48、49或50。根据本发明的尤其优选的实施例，腺病毒是血清型26、35、48、49或50中的一者的人类腺病毒。这些血清型的优势是在人类群体中低血清阳性率和/或低预先存在的中和抗体效价。重组腺病毒的最优选血清型是人类血清型35或人类血清型26，在临床试验中对二者进行评价。rAd26载体的制备阐述于(例如)WO2007/104792及Abbink等人，(2007)Virol81(9):4654-63中。Ad26的例示性基因组序列参见GenBankAccessionEF153474及WO2007/104792的SEQIDNO:1。rAd35载体的制备阐述于(例如)美国专利第7,270,811号、WO00/70071及Vogels等人，(2003)JVirol77(15):8263-71中。Ad35的例示性基因组序列参见GenBankAccessionAC_000019及WO00/70071的图6。
猿腺病毒在人类群体中通常亦具有低血清阳性率和/或低预先存在的中和抗体效价，且已报导大量使用黑猩猩腺病毒载体的工作(例如US6083716；WO2005/071093；WO2010/086189；WO2010085984；Farina等人，2001,JVirol75:11603-13；Cohen等人，2002,JGenVirol83:151-55；Kobinger等人，2006,Virology346:394-401；Tatsis等人，2007,MolecularTherapy15:608-17；亦参见Bangari及Mittal,2006,Vaccine24:849-62的综述及Lasaro及Ertl,2009,MolTher17:1333-39的综述)。因此，在其他优选实施例中，本发明重组腺病毒是基于猿腺病毒，例如黑猩猩腺病毒。在某些实施例中，重组腺病毒是基于猿腺病毒类型1、7、8、21、22、23、24、25、26、27.1、28.1、29、30、31.1、32、33、34、35.1、36、37.2、39、40.1、41.1、42.1、43、44、45、46、48、49、50或SA7P。
已知大多数上述人类及非人类腺病毒的序列，且对于其他序列，可使用常规程序获得。
本发明重组腺病毒可为可复制性或复制缺陷性病毒。
在某些实施例中，腺病毒是复制缺陷性病毒，此乃因(例如)其在基因组的E1区中含有缺失。如本领域内的普通技术人员已知，在自腺病毒基因组缺失基本区的情形下，必须反向提供(优选由生产细胞)由这些区编码的功能，亦即，在自腺病毒缺失部分或整个E1、E2和/或E4区时，这些功能必须存于生产细胞中，例如在其基因组中整合或呈所谓辅助腺病毒或辅助质粒形式。腺病毒亦可具有E3区的缺失，其对于复制并非必需的，且因此，不必补偿该缺失。
可使用的生产细胞(在业内及本文中有时亦称作‘包装细胞‘或’互补细胞’或‘宿主细胞’)可为可繁殖期望腺病毒的任何生产细胞。举例而言，重组腺病毒载体的繁殖是在补偿腺病毒缺陷的生产细胞中完成。这些生产细胞优选在其基因组中至少具有腺病毒E1序列，且藉此能够补偿具有E1区缺失的重组腺病毒。可使用任何E1补偿生产细胞，例如由E1永生化的人类视网膜细胞，例如911或PER.C6细胞(参见美国专利5,994,128)、E1转换羊水细胞(参见欧洲专利1230354)、E1转换A549细胞(例如，参见WO98/39411、美国专利5,891,690)、GH329:HeLa(Gao等人，2000，HumanGeneTherapy11:213-219)、293及诸如此类。在某些实施例中，生产细胞系(例如)HEK293细胞、或PER.C6细胞、或911细胞、或IT293SF细胞及诸如此类。
对于并非衍生自亚群C或E腺病毒的E1缺乏性腺病毒而言，优选用亚群C腺病毒(例如Ad5)的E4-orf6更换亚群C或E腺病毒的E4-orf6编码序列。这允许这些腺病毒在表达Ad5的E1基因的熟知互补细胞系(例如293细胞或PER.C6细胞)中繁殖(例如，参见Havenga等人，2006,J.Gen.Virol.87:2135-2143；WO03/104467，其全文以引用方式并入本文中)。
在替代实施例中，无需将(例如Ad5的)异源E4orf6区放置于腺病毒载体中，而是使E1缺乏性非亚群C或E载体在表达E1及兼容E4orf6的细胞系(例如表达Ad5的E1及E4orf6的293-ORF6细胞系)中繁殖(例如，参见Brough等人，1996,JVirol70:6497-501，其阐述293-ORF6细胞的生成；Abrahamsen等人，1997,JVirol71:8946-51及Nan等人，2003,GeneTherapy10:326-36，其各自阐述使用该细胞系的E1缺失非亚群C腺病毒载体的生成)。
或者，可使用表达来自欲繁殖的血清型的E1的互补细胞(例如，参见WO00/70071、WO02/40665)。
对于具有E1区缺失的亚群B腺病毒(例如Ad35)而言，优选保留腺病毒中的E1B55K开放读码框的3’端，例如在pIX开放读码框的正上游的166bp或包含此的片段(例如在pIX起始密码子(在5’端处由Ad35基因组中的Bsu36I限制位点标记)的正上游的243bp片段)，此乃因此由于pIX基因的启动子部分驻留于此区域中而增加腺病毒的稳定性(例如，参见Havenga等人，2006,J.Gen.Virol.87:2135-2143；WO2004/001032，其以引用方式并入本文中)。
本发明腺病毒中的“异源核酸”(本文中亦称作‘转基因’)是非天然存在于腺病毒中的核酸。藉由(例如)标准分子生物学技术将其引入腺病毒中。在某些实施例中，其可编码目标蛋白或其部分。举例而言，可将其克隆至腺病毒载体的缺失E1或E3区中。转基因通常以可操作方式连接至表达控制序列。举例而言，其作法为放置受启动子控制下的编码转基因的核酸。可增加其他调节序列。许多启动子可用于表达转基因，且已为本领域内的普通技术人员已知。可在真核细胞中获得表达的合适启动子的非限制性实例是CMV-启动子(US5,385,839)，例如CMV即刻早期启动子，例如包含来自CMV即刻早期基因增强子/启动子的nt.-735至+95。聚腺苷酸化信号(例如牛生长激素聚A信号)(US5,122,458)可存在于转基因后方。
在某些实施例中，可能需要从单一腺病毒表达一种以上蛋白质，且在这些情形下可连接更多编码序列，以从单一表达序列盒形成单一转录物，或可在从腺病毒基因组的不同部分中克隆的两个分开的表达序列盒中存在更多编码序列。
转基因的身份对于本发明并不重要，本发明适于包含任一转基因的腺病毒。适宜转基因已为本领域内的普通技术人员熟知，且可(例如)包括转基因开放读码框，例如编码具有治疗效应的多肽的开放读码框，例如：供基因疗法目的，或当以rAd载体用于疫苗接种目的时，则为编码可针对其诱发所需免疫反应的多肽的开放读码框。尤其优选的异源核酸是编码抗原决定簇的目标基因，可针对这些抗原决定簇产生所需的免疫反应。这些抗原决定簇亦通常称作抗原。任一所需抗原皆可由腺病毒载体编码。在本发明的典型实施例中，抗原是来自可引起疾病或病况的有机体的肽、多肽或蛋白。因此，在进一步优选实施例中，该目标异源核酸可编码免疫原性决定簇。更优选地，该免疫原性决定簇是来自细菌、病毒、酵母或寄生虫的抗原。由这些有机体引起的疾病通常称作‘感染病’(且因此并不限于‘感染’的有机体，且亦包括彼等进入宿主且引起疾病的那些)。所谓‘自体抗原’(例如肿瘤抗原)亦构成现有技术的一部分，且可由本发明重组腺病毒中的异源核酸编码。获取抗原决定簇(或抗原)的非限制实例是引起疟疾的有机体(例如恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum))、引起分枝杆菌的有机体(例如结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis))、酵母或病毒。在其他优选实施例中，来自病毒(例如黄病毒(例如，西尼罗河病毒(WestNileVirus)、C型肝炎病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒(DengueVirus))、埃博拉病毒(ebolavirus)、人类免疫缺陷病毒(HIV)及马尔堡病毒(Marburgvirus))的抗原可用于本发明组合物中。在一个实施例中，该抗原是来自恶性疟原虫的CS蛋白或其免疫原性部分(例如编码CS的腺病毒载体的CS蛋白或其免疫原性部分，例如，参见Havenga等人，2006,J.Gen.Virol.87:2135-2143；Ophorst等人，2007,Vaccine25:1426-36；WO2004/055187，其全部内容皆以引用方式并入本文中)。在另一实施例中，抗原决定簇是来自结核分枝杆菌的一种抗原的蛋白或若干抗原的融合蛋白(例如Ag85A、Ag85B和/或TB10.4蛋白或其免疫原性部分)(关于这些TB疫苗病毒的构建及产生，参见(例如)WO2006/053871，其以引用方式并入本文中)。在又一实施例中，该抗原决定簇是病毒糖蛋白或其免疫原性部分(例如来自纤丝病毒(例如埃博拉病毒或马尔堡病毒)的GP)(例如Sullivan等人，(2003)Nature424(6949):681-684；Sullivan等人，(2006)PLoSMed3(6):e177；Geisbert等人，(2011)JVirol85:4222-4233)。在又一些实施例中，该免疫原性决定簇是来自HIV蛋白(例如gag、pol、env、nef或其变体)(例如腺病毒基HIV疫苗的蛋白，例如，参见WO2009/026183、WO2010/096561、WO2006/120034、WO02/22080、WO01/02607)。在其他实施例中，该抗原决定簇是来自流感病毒的HA、NA、M或NP蛋白或这些中任一者的免疫原性部分(例如Zhou等人，2010,MolTher18:2182-9；Hu等人，2011,VirusRes155:156-62；由Vemula及Mittal，2010,ExpertOpinBiolTher10:1469-87综述)。在其他实施例中，抗原决定簇是来自麻疹病毒的HA蛋白或其免疫原性部分(例如WO2004/037294)。在其他实施例中，抗原决定簇是狂犬病病毒糖蛋白(例如Zhou等人，2006,MolTher14:662-672)。
本发明亦提供制备重组腺病毒颗粒群的方法，基本上所有这些重组腺病毒颗粒在其基因组的5’末端中皆具有相同核苷酸序列，该方法包含：a)实施分子克隆步骤以将腺病毒基因组的天然5’末端更换为包含核苷酸序列CTATCTAT作为末端核苷酸的改变5’末端，b)在宿主细胞中使具有改变5’末端的重组腺病毒繁殖，及c)收获重组腺病毒以获得重组腺病毒颗粒群，基本上所有这些重组腺病毒颗粒皆包含核苷酸序列CTATCTAT作为其基因组的5’末端核苷酸。在此优选方面中，藉由分子克隆技术主动改变基因组的5’末端，这些技术为分子生物学技术领域内的普通技术人员熟知且常用。本文中此有利的CTATCTAT末端序列的鉴别使得此主动步骤成为可能。此步骤是有利的，只要任何具有不同5’末端序列(亦即，并非CTATCTAT)的腺病毒用作生成本发明重组腺病毒的(群或组合物)(例如如本文所指示的本发明优选血清型)的起始材料或基础。优势是自开始控制并确定，期望CTATCTAT序列存于步骤b)的种子腺病毒的所有基因组中，且鉴于如本文所报导的此序列的稳定性，步骤c)中所得的腺病毒群将包含基本上所有皆具有相同期望5’末端序列的腺病毒颗粒。
然而，作为分子克隆路径的替代方式，现亦可使用天然诱导的变化形式且选择在其末端处具有改变序列CTATCTAT的腺病毒，以获得具有稳定5’末端的必需起始材料，用以以任一期望规模繁殖成腺病毒群。因此，作为替代实施例，本发明亦提供制备重组腺病毒颗粒群的方法，基本上所有这些重组腺病毒颗粒在其基因组的5’末端中皆具有相同核苷酸序列，该方法包含：a)对腺病毒(并非人类腺病毒血清型3、4、7、8、9、11p、15、21、29、37或53或其重组形式)实施噬菌斑纯化，以从单噬菌斑分离腺病毒或重组腺病毒，其中该腺病毒或重组腺病毒包含核苷酸序列CTATCTAT作为其基因组的5’末端核苷酸，b)在宿主细胞中使从步骤a)的单噬菌斑获得的重组腺病毒繁殖，及c)收获重组腺病毒以获得重组腺病毒颗粒群，基本上所有这些重组腺病毒颗粒皆包含核苷酸序列CTATCTAT作为其基因组的5’末端核苷酸。此处，主动步骤是制备(重组)腺病毒的单噬菌斑及测试/确认其基因组在其5’末端处包含期望序列CTATCTAT。技术人员将了解，此实施例的步骤a)可利用已经重组的腺病毒或利用仍野生型腺病毒分离株实施，其中在后一情形下，在步骤b)之前，实施用以获得重组腺病毒(例如藉由克隆，以在基因组中引入转基因)的步骤。可使用腺病毒操作领域中的普通技术人员的完全常规程序实施用以确保用于进一步工作的起始材料是同源的且衍生自单一分离株的噬菌斑纯化步骤。之前尚未阐述包含核苷酸序列CTATCTAT作为其基因组的5’末端核苷酸的(重组)腺病毒的主动选择，且在本发明之前，此也不具有任何意义。相反，在本发明之前，此序列的鉴别会视为异常情况且该噬菌斑会因具有遗传改变而被弃去。本发明的优点是选择该(重组)腺病毒作为起始材料以确保遗传稳定性，从而产生在其基因组中基本上所有皆包含相同期望5’末端核苷酸的重组腺病毒群。本发明重组腺病毒潜在地具有改良的复制特性。
本发明方法的宿主细胞可为包装细胞，其可补偿重组腺病毒基因组的缺陷(例如E1)。本发明方法的步骤b)及c)是本领域内的普通技术人员熟知的重组腺病毒群的制备中的标准常规步骤。
在某些实施例中，这些方法的步骤b)是在可具有介于约1升至约20000升之间的体积的生物反应器中实施。这使得能够获得足够量的期望腺病毒组合物以工业规模使用。如本发明中所用针对数值的术语‘约’意指该值±10％。在某些实施例中，工作体积介于10L与10000L之间，例如介于20L与2000L之间。工作体积是生物反应器中的有效培养物体积。生物反应器的体积可由本领域内的普通技术人员依据实际需求来选择。本发明确保最终产物针对如此产生的群中的基本上所有腺病毒颗粒将具有相同末端，亦即，在遗传上同源，此为医药产品所期望。
大多数大规模悬浮培养物是以间歇或进料间歇过程操作，此乃因其对于操作及放大最简单直接。现在，基于灌注原则的连续过程变得更常见且亦适宜(例如，参见WO2010/060719及WO2011/098592，二者皆以引用方式并入本文中，其阐述适于获得并纯化大量重组腺病毒的方法)。
生产细胞经培养以增加细胞及病毒数目和/或病毒效价。培养细胞以使得其能够使本发明的目标病毒代谢、和/或生长和/或分裂和/或产生。这可藉由如本领域内的普通技术人员熟知的方法完成，且包括(但不限于)(例如)在适当培养基中为细胞提供营养物。适宜培养基已为本领域内的普通技术人员所熟知且通常可从商业来源大量获得或根据标准方案常规制得。培养可在(例如)盘、辊瓶或生物反应器中使用间歇、进料间歇、连续系统及诸如此类完成。已知适于培养细胞的条件(例如，参见TissueCulture、AcademicPress、Kruse及Paterson编辑，(1973)，及R.I.Freshney,Cultureofanimalcells:Amanualofbasictechnique，第4版(Wiley-Liss公司，2000,ISBN0-471-34889-9)。
腺病毒典型地将暴露于培养物中的适当生产细胞，从而容许病毒摄取。最优选搅动通常介于约50rpm与300rpm之间，通常约100rpm至200rpm，例如约150rpm；典型DO是20％至60％，例如40％；最优选pH介于6.7与7.7之间；最优选温度介于30℃与39℃之间，例如34℃至37℃；且最优选MOI介于5与1000之间，例如约50至300。腺病毒典型地自发感染生产细胞，且使生产细胞与rAd颗粒接触即足以感染细胞。通常向培养物中添加腺病毒种子储液以起始感染，且随后腺病毒在生产细胞中繁殖。这对于本领域内的普通技术人员均是常见的。本发明的该腺病毒种子储液包含重组腺病毒颗粒，其中该种子储液中的基本上所有腺病毒颗粒的基因组皆包含序列CTATCTAT作为5’末端核苷酸。
在腺病毒感染后，病毒在细胞内复制且藉此扩增，即一种在本文中称作腺病毒的繁殖的过程。腺病毒感染最后引起受感染的细胞裂解。因此，腺病毒的裂解特性容许两种不同模式的病毒产生。第一模式是在细胞裂解之前利用外部因素使细胞裂解来收获病毒。第二模式是在由所产生病毒(几乎)完全细胞裂解后收获病毒上清液(例如，参见美国专利6,485,958，其阐述在宿主细胞未由外部因素裂解情况下腺病毒的收获)。优选利用外部因素使细胞主动裂解用以收获腺病毒。
可用于活性细胞裂解的方法已为本领域内的普通技术人员已知，且已(例如)论述于WO98/22588第28-35页中。就此而言有用的方法是(例如)冷冻-解冻、固体剪切、高渗和/或低渗裂解、液体剪切、超音波处理、高压挤出、洗涤剂裂解、上述的组合及诸如此类。在本发明的一个实施例中，使用至少一种洗涤剂使细胞裂解。使用洗涤剂进行裂解的优势在于其是容易的方法，且易于缩放。
可使用的洗涤剂及其利用方式通常为本领域内的普通技术人员已知。若干实例论述于(例如)WO98/22588第29-33页中。洗涤剂可包括阴离子型、阳离子型、两性离子型及非离子型洗涤剂。洗涤剂的浓度可在(例如)约0.1％-5％(w/w)范围内变化。在一个实施例中，所用洗涤剂是TritonX-100。
可利用核酸酶来移除杂质(即大部分来自生产细胞)核酸。适用于本发明中的例示性核酸酶包括或业内常用的任何其他DNase和/或RNase。在优选实施例中，核酸酶是，其藉由水解特定核苷酸之间的内部磷酸二酯键快速水解核酸，藉此降低细胞裂解物的黏度。可从MerckKGaA(编码W214950)商业获得。所利用核酸酶的浓度优选在1-100单位/ml范围内。或者或除核酸酶处理外，亦可在腺病毒纯化期间使用选择性沉淀试剂(例如溴化度米芬(domiphenbromide))从腺病毒制剂选择性沉淀出宿主细胞DNA(例如，参见US7,326,555；Goerke等人，2005,Biotechnologyandbioengineering，第91卷：12-21；WO2011/045378；WO2011/045381)。
从生产细胞的培养物收获腺病毒的方法已详尽阐述于WO2005/080556中。
在某些实施例中，进一步纯化所收获腺病毒。腺病毒的纯化可以若干步骤实施，这些步骤包含澄清、超滤、透析或利用层析分离，如(例如)以引用方式并入本文中的WO05/080556中所述。澄清可藉由过滤步骤完成，从而从细胞裂解物移除细胞碎屑及其他杂质。使用超滤浓缩病毒溶液。使用超滤机的透析或缓冲液更换是移除及更换盐、糖及诸如此类的方式。本领域内的普通技术人员知晓如何发现每一纯化步骤的最优选条件。全文以引用方式并入本文中的WO98/22588亦阐述产生并纯化腺病毒载体的方法。这些方法包含使宿主细胞生长、用腺病毒感染宿主细胞、收获宿主细胞并使其裂解、浓缩粗制裂解物、更换粗制裂解物的缓冲液、用核酸酶处理裂解物及使用层析进一步纯化病毒。
优选地，纯化利用至少一个层析步骤，如(例如)WO98/22588第61-70页中所论述。已针对腺病毒的进一步纯化阐述许多方法，其中层析步骤包括于该方法中。本领域内的普通技术人员应了解这些方法，且可改变利用层析步骤以使方法优化的精确方式。举例而言，可藉由阴离子交换层析步骤纯化腺病毒，例如参见WO2005/080556。已阐述许多其他腺病毒纯化方法且其在熟练人员的能力范围内。用于产生及纯化腺病毒的其他方法揭示于(例如)WO00/32754、WO04/020971、US5,837,520、US6,261,823及WO2006/108707中，其均以引用方式并入本文中。
对于投与人类而言，本发明可利用包含rAd及医药上可接受的载剂或赋形剂的医药组合物。在本发明上下文中，术语“医药上可接受的”意指所用剂量及浓度下的载剂或赋形剂将不会在投与其的个体中引起任何不期望或有害效应。这些医药上可接受的载剂及赋形剂已为业内所熟知(参见Remington'sPharmaceuticalSciences，第18版，A.R.Gennaro编辑，MackPublishing公司[1990]；PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins,S.Frokjaer及L.Hovgaard编辑，Taylor&Francis[2000]；及HandbookofPharmaceuticalExcipients，第3版，A.Kibbe编辑，PharmaceuticalPress[2000])。纯化rAd优选以无菌溶液形式配制及投与，但亦可采用冻干制剂。藉由无菌过滤或业内本身已知的其他方法制备无菌溶液。随后将溶液冻干或填充至医药剂型容器中。溶液的pH通常在pH3.0至9.5(例如pH5.0至7.5)范围内。rAd通常存于具有适宜缓冲液的溶液中，且rAd溶液亦可含有盐。视情况可存在稳定剂，例如白蛋白。在某些实施例中，添加洗涤剂。在某些实施例中，可将rAd配制成可注射制剂。这些配制物含有有效量的rAd，是无菌液体溶液、液体悬浮液或冻干形式且视情况含有稳定剂或赋形剂。亦可将腺病毒疫苗气溶胶化用于鼻内投与(例如，参见WO2009/117134)。
举例而言，腺病毒可储存于亦用于腺病毒世界标准(AdenovirusWorldStandard)的缓冲液中(Hoganson等人，Developmentofastableadenoviralvectorformulation,Bioprocessing，2002年3月，第43-48页)：20mMTrispH8、25mMNaCl、2.5％甘油。适于投与人类的另一有用的配制缓冲液是20mMTris、2mMMgCl2、25mMNaCl、10％w/v蔗糖、0.02％w/v聚山梨醇酯-80。显而易见，可使用许多其他缓冲液，且适于纯化(腺)病毒制剂的储存及医药投与的配制物的若干实例可(例如)参见欧洲专利第0853660号、美国专利6,225,289及国际专利申请案WO99/41416、WO99/12568、WO00/29024、WO01/66137、WO03/049763、WO03/078592、WO03/061708。
在某些实施例中，包含腺病毒的组合物进一步包含一或多种佐剂。业内已知佐剂可进一步增加对所施加抗原决定簇的免疫反应，且包含腺病毒及适宜佐剂的医药组合物揭示于(例如)WO2007/110409中，其以引用方式并入本文中。术语“佐剂”及“免疫刺激剂”在本文中可互换使用，且定义为一或多种引起免疫系统刺激的物质。在此上下文中，佐剂用于增强对本发明腺病毒载体的免疫反应。适宜佐剂的实例包括铝盐，例如氢氧化铝和/或磷酸铝；油-乳液组合物(或水包油组合物)，包括角鲨烯-水乳液，例如MF59(例如，参见WO90/14837)；皂苷配制物，例如QS21及免疫刺激复合物(ISCOMS)(例如，参见US5,057,540、WO90/03184、WO96/11711、WO2004/004762、WO2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例是单磷酰脂质A(MPL)、3-O-去酰基化MPL(3dMPL)、含有CpG基因的寡核苷酸、ADP核糖基化细菌毒素或其突变体，例如大肠杆菌热不稳定肠毒素LT、霍乱毒素CT及诸如此类。亦可藉由(例如)使用编码C4结合蛋白(C4bp)的寡聚结构域至目标抗原的融合的异源核酸使用编码载体的佐剂(例如Solabomi等人，2008,InfectImmun76:3817-23)。在某些实施例中，本发明组合物包含铝作为佐剂，例如呈氢氧化铝、磷酸铝、磷酸铝钾或其组合形式，浓度为0.05mg至5mg(例如0.075mg至1.0mg)铝含量/剂量。
在其他实施例中，组合物不包含佐剂。
腺病毒组合物可投与个体(例如人类个体)。一次投与期间提供至个体的腺病毒的总剂量可如本领域内的普通技术人员已知变化，且通常介于1×107个病毒颗粒(vp)与1×1012个vp之间，优选介于1×108个vp与1×1011个vp之间，例如介于3×108个vp与5×1010个vp之间，例如介于109个vp与3×1010个vp之间。
可使用标准投与路径实施腺病毒组合物的投与。非限制实施例包括非经肠投与(例如藉由注射，例如皮内、肌内等)，或皮下或经皮，或黏膜投与(例如鼻内、经口及诸如此类)。在一个实施例中，藉由(例如)肌内注射将组合物投与至臂三角肌或股外侧肌中。本领域内的普通技术人员知晓投与组合物(例如疫苗)以诱导疫苗中对抗原的免疫反应的各种可能性。
本文所用个体优选是哺乳动物，例如啮齿类动物(例如小鼠)、或非人类灵长类或人类。优选地，个体是人类个体。
亦可提供一或多种腺病毒疫苗的一或多次加强投与。若实施加强疫苗接种，则该免疫疫苗接种通常将在首次投与个体组合物(在这些情形下称作‘引发疫苗接种’)后介于1周与1年之间、优选介于2周与4个月之间的时间点投与同一个体。在替代加强方案中，亦可向个体投与不同载体(例如一或多种不同血清型腺病毒)、或其他载体(例如MVA或DNA)或蛋白质作为引发或加强疫苗接种。
在以下实例中进一步解释本发明。这些实例并不以任何方式限制本发明。其仅用于澄清本发明。
实例
方法
质粒：
对于Ad35及Ad5而言，分别藉由克隆至pAdapt中将可替代的ITR序列引入左ITR中且藉由克隆至pBr质粒中引入右ITR中(例如，参见HavengaM.等人，2006,J.Gen.Virol.87:2135-2143；HavengaM.等人，2001,J.Virol.75:3335-3342)。为将可替代的ITR序列引入左ITR中，使用含有ScaI位点(GTGACTGGTGAGTACTC[SEQIDNO:1])的正向引物、含有AvrII位点(GACCACCTAGGCTGAC[SEQIDNO:2])的反向引物及具有可替代的ITR序列(对于1的altITR：TTAATTAATCGATCTATCTATATAATATACCTTATAG[SEQIDNO:3]，对于2的altITR：GATCTATCTATATAATATACCTTATAGATGGAATGG[SEQIDNO:4]，altITR反向：ATTATATAGATAGATCGATTAATTAATTCGAACCC[SEQIDNO:5])的融合正向及反向引物实施融合PCR。两个部分重迭ITR正向引物在PCR中用于融合PCR片段之一以增加对模板中极端AT富区的PCR效率。首先将融合PCR产物亚克隆至pTopo载体中以有利于亚克隆且随后经由具有指示转基因的AvrII及ScaI位点插入pAdapt35质粒中。
为将可替代的ITR序列引入右ITR中，使用含有NdeI位点的正向引物及含有NruI位点的反向引物及具有可替代的ITR序列的融合正向及反向引物使用如针对左ITR所述的相同融合PCR策略实施融合PCR。随后使用NdeI及NruI将融合PCR产物亚克隆至pTopo中且随后亚克隆至pBR.Ad35.PR.dE3orf6/7质粒中。
为生成具有更替ITR的Ad5载体，使用如上文所述的相同策略。
细胞培养：
将PER.C6细胞(Fallaux等人，1998)维持于具有补充有10mMMgCl2的10％胎牛血清(FBS)的杜贝克氏改良鹰氏培养基(Dulbecco'smodifiedEagle'smedium)(DMEM)中。A549、HEK293、Hep2、HeLa及MRC5细胞系从ATCC获得且将其维持于具有10％FBS的DMEM中。
腺病毒生成、感染及传代：
若无另外说明，则所有病毒均是在PER.C6中藉由单一或双重同源重组生成且如先前所述产生(Havenga等人，2006)。简言之，在PER.C6中使用Lipofectamine根据由制造商提供的说明书(LifeTechnologies)转染质粒。在全CPE后一天收获细胞，冷冻-解冻，以3,000rpm离心5min，且储存于-20℃下。使用3ml至5ml粗制裂解物以接种含有PER.C6细胞的70％铺满层的4×T175三层烧瓶。使用两步骤CsCl纯化方法纯化病毒。最后，于-85℃下以等份储存病毒。
为研究自初始ITR序列至可替代的ITR序列的转换，在噬菌斑纯化后使用粗制病毒材料使不同病毒连续传代或如上文所述纯化病毒群。为此，用各别病毒载体感染细胞。全CPE后一天，收获并冷冻细胞及上清液。藉由解冻自细胞释放病毒颗粒并使用此粗制病毒材料感染新细胞。
从感染细胞的病毒DNA分离：
如下实施ITR特异性PCR的DNA分离。藉由重复冷冻-解冻循环从粗制病毒材料释放病毒颗粒。其后，藉由DNAseI处理移除宿主细胞DNA。藉由与10％SDS一起培育破坏病毒颗粒且用蛋白酶K处理。随后使用GeneCleanSpinKit(MPBiochemicals)纯化病毒DNA并用于PCR分析。
使用粗制裂解物以分离DNA用以ITR序列分析。出于此目的，藉由从20ml粗制细胞裂解物PEG分离来分离DNA，藉由连续冷冻-解冻循环裂解并用DNAseI(0.01mg/mlRoche)及RnaseT1(10U/mlRoche)处理，之后NaCl灭活(1M)。将病毒颗粒使用10％PEG6000(BDHiochemical)在冰上沉淀1h，之后以9000xg进行离心步骤且重新悬浮于1mlSM缓冲液(0.1MNaCl、8mMMgSO4、50mMTrisHClpH7.5、0.002％明胶)中使用10％SDS破坏病毒衣壳蛋白并进行蛋白酶K处理并藉由苯酚-氯仿沉淀萃取DNA。藉由EcoRI(Ad26)、SphI(Ad48、Ad5)、AgeI(Ad49、Ad11)、NheI(Ad50)消解全长DNA且最后藉由Baseclear、Leiden测序。
ITR特异性PCR
由于ITR区是富含AT，故使用锁定核酸(LNA)引物确保足够引物结合至模板。引物是购自Eurogentech。使用以下引物。小写字母指示LNA核苷酸。ori.ITR：CatcaTcaATAATATACC[SEQIDNO:6]，Ad35altITR：CtatcTatATAATATACC[SEQIDNO:7]，Ad35左ITR反向：CTAAGTAGTTCCGTGAGAAAAG[SEQIDNO:8]。Ad35右ITR正向：GGTACGTCACATCCCATTAA[SEQIDNO:9]，Ad5左ITR反向：CACTTTTGCCACATCCGTC[SEQIDNO:10]，Ad5右ITR：CCCACGTTACGTCACTTC[SEQIDNO:11]。在琼脂糖凝胶上分析PCR产物。
藉由qPCR的复制动力学
藉由使用1000个VP/细胞感染293及PER.C6细胞3小时来分析复制动力学且随后洗涤。在藉由VPqPCR感染后的指定时间点分析病毒颗粒于细胞及上清液中的存在。为此，使用0.5％TritonX-100(Sigma)使感染细胞裂解，于-80度下培育1小时并解冻。
使用基因表达主混合物(AppliedBiosystems)根据制造商的推荐实施对存于所有所用腺病毒载体中的CMV启动子具有特异性的qPCR。引物/探针组合序列：CMV：TGGGCGGTAGGCGTGTA[SEQIDNO:12]，CMV反向：CGATCTGACGGTTCACTAAACG[SEQIDNO:13]，探针5’-VIC-TGGGAGGTCTATATAAGC-MGB-NFQ-3’[SEQIDNO:14]，购自AppliedBiosystems。为测定个别试样中的病毒颗粒的量，生成标准曲线。
列对准
腺病毒ITR序列是从BLASTsearch获得。使用CLC软件产生对准。对准是基于已公开序列。然而，对于一些已公开序列而言，尚未对ITR进行特异性测序。相反，假定亚型间保留，此可能导致保留CATCATCA序列比例过高。若公开一种腺病毒血清型的若干序列，若其在末端8个核苷酸中彼此不同，则仅包括这些序列。
实例1.PER.C6细胞上的Ad35疫苗载体产生期间可替代的ITR序列的检测
对于如前文所述表达结核分枝杆菌抗原Ag85A、Ag85B及TB10.4抗原的Ad35疫苗载体的生成(WO2006/053871；(Radosevic等人，2007,Infect.Immun.75:4105-4115)，用线性化质粒转染PER.C6细胞，从而产生能够在PER.C6细胞中复制的Ad35.TBS病毒。
在产生之前，两次连续噬菌斑纯化确保从单一遗传上稳定的纯系的病毒种子衍生。在生产过程的不同阶段藉由一致PCR及蛋白质印迹法表征所得病毒且在作为种子病毒用于大规模生产之前对其进行完全测序。
基因组序列是稳定的且因此与由挽救质粒编码的基因组相同，左及右ITR处的末端8个核苷酸除外。质粒编码序列CATCATCA(下文中命名为初始ITR序列)转换成序列CTATCTAT(称作可替代的ITR序列)，从而导致与质粒序列相比6个核苷酸发生变化。此发现是惊人的，此乃因认为腺病毒基因组高度稳定，藉此促使其适用作疫苗载体。
为进一步研究末端ITR序列中的不一致性，在疫苗载体产生期间的不同步骤时对ITR进行测序：此分析揭示在噬菌斑纯化后5个传代(VPN5)时，仍存在初始ITR序列。然而，亦检测具有亚峰的序列，指示不同生产过程的5个传代次数时的混合序列。除末端8个核苷酸内的亚峰外，剩余序列皆不展示任何不一致性。在VPN6时，序列混合，可能包含大约相同比例的初始及可替代的序列且在在VPN7时转化成相异可替代的序列。
实例2.针对不同Ad35载体以及野生型病毒发生ITR异源性
为论述所观察现象是否是可忽略事件且检验自初始CATCATCA转换成可替代的CTATCTATITR序列的频率，分析源自相同病毒挽救的四种噬菌斑。从所有噬菌斑繁殖的病毒在重复传代后转换成可替代的ITR序列。
此外，在表达不同转基因且独立于pIX启动子的部分缺失的Ad35载体的传代期间观察可替代的ITR(表II)。
此外，不仅针对基于Ad35的载体、且亦针对Ad35野生型病毒(不包括载体假像)观察混合序列。
实例3.可替代的ITR序列在10个病毒传代期间在Ad35.TBS中稳定
为论述转换成可替代的ITR序列在若干病毒传代中是否稳定，构建具有初始或可替代的ITR序列的Ad35.TBS(称作Ad35.TBS.oriITR及Ad35.TBS.altITR)。这些病毒在PER.C6细胞中经受传代且藉由每一病毒传代次数的PCR分析监测8个末端ITR核苷酸的序列。为区分初始序列与可替代的序列，利用使初始或可替代的ITR序列特异性扩增的不同PCR引物组。每一病毒传代的分析鉴别在VPN3与VPN6之间初始序列减少且在Ad35.TBS.oriITR传代VPN6时出现可替代的序列(图1A)。在4次传代中保留可替代的序列(图1A)。在人工产生的Ad35.TBS.alt传代期间，在10个病毒传代中仅可替代的PCR序列可检测到(图1B)，不包括恢复至初始序列或在基因组的此部分中的一般不稳定。
此外，具有原本相同的更替或初始ITR序列的Ad35载体混合亦导致可替代的ITR序列过度生长，指示可替代的ITR序列相对于初始ITR序列具有生长优势。
由于检测在Ad35(B组载体)中自初始ITR序列至可替代的ITR序列转换，另外分析Ad5.空白.oriITR及Ad35.空白.altITR，即具有初始或可替代的ITR序列的C组载体。与利用Ad35载体的结果相反，Ad5不会在ITR序列中展示转换，但在10次病毒传代中保留初始ITR(图1C)(然而，参见以下实例8，显示在进一步传代时亦在Ad5中发现可替代的序列)。此外，具有可替代的ITR的人工生成的Ad5在10次病毒传代中稳定且不会恢复至初始ITR序列(图1D)。
实例4.具有可替代的ITR序列的Ad35在感染后诱导CPE的时间点比Ad35.oriITR更早
由于观察到具有可替代的ITR的病毒基因组过度生长，故推断具有可替代的ITR的病毒应比具有初始ITR的那些将对Ad35具有更高复制优势。为对此进行测试，使用具有初始或可替代的ITR序列的Ad35病毒且分析其生长动力学。由于由腺病毒感染E1-互补细胞系所诱导的CPE是复制速度的良好指针，故首先感染293细胞，并在以100个VP/细胞及1000个VP/细胞的MOI感染后24h、48h、72h及96h(hpi)时观察细胞病变效应。感染后24h时，100个VP/细胞及1000个VP/细胞均未观察到CPE。然而，在48hpi时，针对Ad35.dE1.altITR以100个VP/细胞及1000个VP/细胞观察到前期CPE，从而在96hpi时发展成全CPE。反之，在感染后这些时间点Ad35.dE1.oriITR仅观察到有限CPE。
实例5.可替代的ITR序列赋予基因组复制优势
为了定量复制动力学的可能差异时，采用qPCR分析法量测感染后不同时间点的基因组复制。更特定而言，以1000个VP/细胞感染293细胞，使其裂解并使用检测存于病毒载体中的CMV启动子的TaqMan分析法进行qPCR分析。如图2中所示，尽管Ad35.oriITR及Ad35.altITR在最后一次量测时间点(90hpi)时均生长至约1010个VP/ml的相同效价，但Ad35.oriITR仍显示延迟生长。在感染后早期时间点，Ad35.altITR显示比Ad35.oriITR陡峭的基因组扩增曲线，从而达成平稳期(图2A)。反之，具有可替代的或初始ITR的病毒的Ad5的复制动力学则无差异(图2B)。
在PER.C6细胞上确证针对Ad35.altITR而非针对Ad5.altITR观察到的此基因组复制优势(图2C-D)，最初在这些细胞上观察到可替代的基因组形式的过度生长。
实例6.可替代的ITR序列已出现在公开人类腺病毒序列中
分析该可替代的ITR序列是否已出现在公开腺病毒序列中。此外，由已公开的人类及非人类ITR的核苷酸1-8进行对准排列。人类病毒主要具有初始CATCATCA序列且因此分类为“保留人类序列”(表I)。
另外，1至6个核苷酸与CATCATCA不同的序列经鉴别且称作“可变人类腺病毒序列”。“可变序列”中的主要序列是亦藉由使Ad35衍生的载体传代鉴别的可替代的序列CTATCTAT。非人类序列的对准(表I)显示CATCATCA是最常见序列。再次发现可替代的序列，例如先前鉴别的发现于家禽腺病毒中的可替代的序列GATGATGT。大多数已公开ITR序列与deJong(deJong等人，2003,CurrTopMicrobiolImmunol272:187-211；King及vanderVliet,1994,EMBOJ13:5786-5792)的复制模型一致，具有在复制起始期间跳回机制所需要的小的两个、三个或四个核苷酸同向重复。
应注意，表I显示可不为天然ITR序列的平衡表示的已公开ITR序列。在一些情形下，尚未对ITR的末端核苷酸进行测序，而是简单地推断为CATCATCA。另外，在测序之前，从诊断交叉的腺病毒的生长是常见的，涉及若干可引起核苷酸变化的复制循环。然而，应注意，在病毒宿主共演化长时段后仍在自然界中检测到初始序列CATCATCA，且因此可替代的序列CTATCTAT在细胞培养物中比在自然界中可更有益。
实例7.重复传代导致多个细胞系上的ITR序列转换。
为排除所观察的自初始ITR至可替代的ITR的转换是限于产生E1-互补细胞系的现象，将含有初始ITR序列CATCATCA的Ad35.wt病毒在多种细胞类型上传代。因此，使用含有完全Ad35野生型基因组的质粒在A549、HEK293、PER.C6、Hep2、HeLa及MRC5细胞上挽救Ad35wt。选择特定细胞系以呈现癌及非癌起源、上皮及成纤维细胞系及不同倍数性的多种细胞类型，包括衍生自不同组织的细胞系(表III)。
表III中的结果显示，在VPN10时对于辅助细胞系HEK293及PER.C6细胞观察到转换至可替代的ITR，但尽管于较迟传代次数时，对于其他测试细胞系亦观察到转换或混合表型。
实例8.延长传代在大多数测试腺病毒载体中诱导ITR异源性或完全转换成可替代的ITR序列
研究基于各种血清型的腺病毒载体转换至可替代的CTATCTAT序列的一般性。此处，将Ad26、Ad48、Ad49、Ad11(a)、Ad50及Ad5衍生的腺病毒载体在PER.C6细胞上传代。在噬菌斑纯化后使病毒载体传代直至VPN15并藉由在VPN10及VPN15时测序进行分析。每一载体血清型包括两种不同转基因以另外排除不同转基因的效应。
此组实验的结果示于表IV中。惊人地，发现除Ad48外的所有测试载体皆转换至可替代的ITR序列或展示混合表型，表明其可在较迟病毒传代次数时转化。与针对Ad5先前所观察一致，在VPN10时保留初始ITR序列，然而在VPN15时开始混合。相比而言，Ad48衍生的载体仅是保留初始ITR序列直至VPN15者。
然而，为保证安全，建议使所有重组腺病毒(包括基于Ad5或甚至Ad48者)配备本发明可替代的ITR序列，以防止在大体积培养期间或在延长传代后由于基因组端处的突变而存在潜在群异源性。此将确保获得重组腺病毒群，其中基本上所有腺病毒颗粒的基因组皆包含本发明的5’末端序列CTATCTAT。此外，具有此可替代的ITR序列的腺病毒载体的挽救可加速疫苗载体产生。
表I.腺病毒血清型的5’末端序列
表II.在传代后不同rAd35病毒的ITR
病毒 pIX启动子 基因组大小(kbp) PP编号 ITR
Ad35.TBS + 32.4 2 混合
Ad35.Ebo.GP.Z + 32.4 2 可替代的
Ad35.Ebo.GP.S/G + 32.4 2 混合
Ad35.CS + 31.5 1 混合
Ad35.CS - 31.3 1 初始
Ad35.Luc + 32.0 1 混合
Ad35.Luc - 31.9 1 混合
Ad35.eGFP + 31.1 1 混合
Ad35.eGFP - 30.9 1 混合
Ad35.空白 + 30.4 1 可替代的
Ad35.空白 - 30.2 1 可替代的
Ad35.SIV-Gag + 31.9 1 可替代的
Ad35野生型 NA 34.8 1 混合
表III.不同细胞系上的ITR转换
表IV.不同载体的ITR转换
载体 亚群 VPN 10 VPN 15
Ad26.eGFP D 混合 可替代的
Ad26.Luc D 混合 可替代的
Ad48.eGFP D 初始 初始
Ad48.Luc D 初始 初始
Ad49.eGFP D 可替代的 Nd
Ad49.Luc D 混合 可替代的
Ad11.Env B 可替代的 Nd
Ad11.SivGag B 可替代的 Nd
Ad50.eGFP B 可替代的 Nd
Ad50.Luc B 混合 可替代的
Ad5.eGFP C 初始 混合
Ad5.Luc C 初始 混合

Claims (46)

1.一种包含腺病毒颗粒的组合物，其中该腺病毒是血清型5、11a、26、35、49或50的重组人类腺病毒、或重组猿腺病毒，其中在所述组合物中的基本上所有腺病毒颗粒的基因组皆具有多核苷酸CTATCTAT作为5’末端核苷酸，并且其中所述腺病毒包含转基因。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中该腺病毒是血清型5、26、35、49或50的人类腺病毒。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中该腺病毒是血清型26或35的人类腺病毒。
4.根据权利要求1所述的组合物，其是医药组合物。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中该腺病毒缺少E1区的至少一部分。
6.根据权利要求1所述的组合物，其包含至少1×107个重组腺病毒颗粒。
7.一种制备重组腺病毒颗粒群的方法，基本上所有重组腺病毒颗粒在其基因组的5’末端中皆具有相同多核苷酸，该方法包含：
a)进行分子克隆步骤，以将腺病毒基因组的天然发生5’末端更换为包含多核苷酸CTATCTAT作为末端核苷酸的改变5’末端，
b)使具有该改变5’末端的该重组腺病毒在宿主细胞中繁殖，及
c)收获该重组腺病毒，以获得重组腺病毒颗粒群，基本上所有重组腺病毒颗粒皆具有该多核苷酸CTATCTAT作为其基因组的5’末端核苷酸。
8.一种制备重组腺病毒颗粒群的方法，基本上所有重组腺病毒颗粒在其基因组的5’末端中皆具有相同多核苷酸，该方法包含：
a)纯化腺病毒的噬菌斑，其中该重组腺病毒是血清型5、11a、26、35、49或50的重组人类腺病毒、或重组猿腺病毒，以从单噬菌斑分离腺病毒或重组腺病毒，其中所述腺病毒或重组腺病毒具有多核苷酸CTATCTAT作为其基因组的5’末端核苷酸，
b)使从步骤a)的该单噬菌斑获得的重组腺病毒在宿主细胞中繁殖，及
c)收获该重组腺病毒，获得重组腺病毒颗粒群，基本上所有重组腺病毒颗粒皆具有该多核苷酸CTATCTAT作为其基因组的5’末端核苷酸。
9.根据权利要求7所述的方法，其中该群包含至少1×107个重组腺病毒颗粒。
10.根据权利要求7所述的方法，其中该重组腺病毒是血清型5、26、35、49或50的重组人类腺病毒。
11.根据权利要求7所述的方法，其中该重组腺病毒是血清型26或35的重组人类腺病毒。
12.根据权利要求7所述的方法，其中该重组腺病毒缺少E1区的至少一部分。
13.根据权利要求7所述的方法，其进一步包括纯化该重组腺病毒。
14.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括将该重组腺病毒配制成医药组合物。
15.根据权利要求7所述的方法，其中步骤b)是在生物反应器中进行。
16.根据权利要求6所述的组合物，其包含至少1×108个重组腺病毒颗粒。
17.根据权利要求16所述的组合物，其包含至少1×109个重组腺病毒颗粒。
18.根据权利要求17所述的组合物，其包含至少1×1010个重组腺病毒颗粒。
19.根据权利要求1所述的组合物，其中该腺病毒是血清型35的人类腺病毒。
20.根据权利要求1所述的组合物，其中该腺病毒是血清型26的人类腺病毒。
21.根据权利要求2所述的组合物，其是医药组合物。
22.根据权利要求3所述的组合物，其是医药组合物。
23.根据权利要求19所述的组合物，其是医药组合物。
24.根据权利要求20所述的组合物，其是医药组合物。
25.根据权利要求2所述的组合物，其中该重组腺病毒缺少E1区的至少一部分。
26.根据权利要求3所述的组合物，其中该重组腺病毒缺少E1区的至少一部分。
27.根据权利要求19所述的组合物，其中该重组腺病毒缺少E1区的至少一部分。
28.根据权利要求20所述的组合物，其中该重组腺病毒缺少E1区的至少一部分。
29.根据权利要求23所述的组合物，其中该重组腺病毒缺少E1区的至少一部分。
30.根据权利要求24所述的组合物，其中该重组腺病毒缺少E1区的至少一部分。
31.根据权利要求2所述的组合物，其包含至少1×1010个重组腺病毒颗粒。
32.根据权利要求3所述的组合物，其包含至少1×1010个重组腺病毒颗粒。
33.根据权利要求4所述的组合物，其包含至少1×1010个重组腺病毒颗粒。
34.根据权利要求5所述的组合物，其包含至少1×1010个重组腺病毒颗粒。
35.根据权利要求19所述的组合物，其包含至少1×1010个重组腺病毒颗粒。
36.根据权利要求20所述的组合物，其包含至少1×1010个重组腺病毒颗粒。
37.根据权利要求21所述的组合物，其包含至少1×1010个重组腺病毒颗粒。
38.根据权利要求22所述的组合物，其包含至少1×1010个重组腺病毒颗粒。
39.根据权利要求23所述的组合物，其包含至少1×1010个重组腺病毒颗粒。
40.根据权利要求24所述的组合物，其包含至少1×1010个重组腺病毒颗粒。
41.根据权利要求25所述的组合物，其包含至少1×1010个重组腺病毒颗粒。
42.根据权利要求26所述的组合物，其包含至少1×1010个重组腺病毒颗粒。
43.根据权利要求27所述的组合物，其包含至少1×1010个重组腺病毒颗粒。
44.根据权利要求28所述的组合物，其包含至少1×1010个重组腺病毒颗粒。
45.根据权利要求29所述的组合物，其包含至少1×1010个重组腺病毒颗粒。
46.根据权利要求30所述的组合物，其包含至少1×1010个重组腺病毒颗粒。
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