PT1816204E - Adenovírus recombinante do serótipo ad26 - Google Patents

Adenovírus recombinante do serótipo ad26 Download PDF

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PT1816204E PT07106044T PT07106044T PT1816204E PT 1816204 E PT1816204 E PT 1816204E PT 07106044 T PT07106044 T PT 07106044T PT 07106044 T PT07106044 T PT 07106044T PT 1816204 E PT1816204 E PT 1816204E
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Ronald Vogels
Menzo Jans Emko Havenga
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Description

ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Adenovírus recombinante do serótipo Ad26" 0 presente invento refere-se ao campo da terapia genética, em particular à terapia genética envolvendo elementos derivados de virus, mais em particular elementos de adenovirus. Os adenovirus têm sido propostos como veículos adequados para entregar genes ao hospedeiro. Os adenovírus possuem várias características que os tornam particularmente úteis para o desenvolvimento de vectores de transferência de genes em terapia genética humana: 0 genoma do adenovírus está bem caracterizado. Consiste numa molécula de ADN de cadeia dupla linear de aproximadamente 36 000 pares de bases. O ADN de adenovírus contém Repetições Terminais Invertidas (ITR) idênticas de aproximadamente 90-140 pares de bases, dependendo o comprimento exacto do serótipo. As origens virais de replicação estão nas ITR exactamente nas extremidades do genoma; A biologia dos adenovírus está caracterizada em detalhe; o adenovírus não está associado a patologias graves humanas em indivíduos imunocompetentes. O vírus é extremamente eficiente a introduzir o seu ADN na célula hospedeira; o vírus pode infectar uma grande variedade de células e tem um espectro largo de hospedeiros; O vírus pode ser produzido com títulos virais altos em grandes quantidades; O vírus pode ser tornado deficiente para replicação por deleção da região precoce 1 (EI) do genoma virai (Brody et al, 1994) . A maioria dos vectores adenovirais usados actualmente em terapia genética tem uma deleção na região El, onde se pode introduzir a informação genética desejada.
Com base nestas características, os métodos preferidos de transferência de genes para células alvo humanas in vivo, utilizam vectores adenovirais como veículos de entrega de genes. Porém, ainda existem desvantagens associadas à utilização terapêutica de vectores adenovirais em humanos. Uma desvantagem importante é a existência de imunidade contra adenovírus preexistente muito espalhada entre a população. A exposição a adenovírus do tipo selvagem é muito comum em humanos, como tem sido extensivamente documentado [revisto em Wadell, 1984]. Esta exposição tem resultado em respostas imunes contra a maioria dos tipos de adenovírus, não só contra 2 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ adenovírus aos quais os indivíduos foram de facto expostos, mas também contra adenovírus que possuem epítopos (neutralizantes) semelhantes. Este fenómeno de anticorpos preexistentes em humanos, em combinação com uma forte resposta imune secundária humoral e celular contra o vírus, pode afectar seriamente a transferência de genes por meio de vectores adenovirais recombinantes.
Até à data, foram propostos seis subgrupos diferentes de adenovírus humanos os quais abrangem no total 51 serótipos de adenovírus distintos (refira-se à Tabela 1) . Um serótipo é definido com base na sua distinção imunológica como determinado por neutralização quantitativa com anti-soros animais (cavalo, coelho). Quando a neutralização exibe um certo grau de reacção cruzada entre dois vírus, assume-se distinção de serótipo se A) as hemaglutininas não são relacionadas, como demonstrado pela falta de reacção cruzada na hemaglutinação-inibição, ou B) existem diferenças biofísicas/bioquímicas substanciais no adn (Francki et al, 1991). Os últimos nove serótipos identificados (42-51) foram isolados pela primeira vez de pacientes infectados por HIV (Hierholzer et al 1988; Schnurr et al 1993;). Por razões pouco compreendidas, a maioria destes pacientes imunocomprometidos espalham adenovírus que, raramente ou nunca eram isolados de indivíduos imunocompetentes (Hierholzer et al 1988, 1992; Khoo et al, 1995, De Jong et al, 1998) . A grande maioria de indivíduos já foi exposta a adenovírus, especialmente aos bem investigados serótipos 5 e tipo 2 (Ad5 e Ad2) de adenovírus ou serótipos imunologicamente relacionados. Note-se que estes dois serótipos são também os mais extensivamente estudados para utilização em terapia genética humana. 0 adenovírus recombinante de acordo com o invento pode também compreender elementos de outros (adeno)vírus, desde que se substitua um elemento que possa conduzir à imunidade contra este veículo de entrega de genes por um elemento do adenovírus 35 ou um seu homólogo funcional, que possua menos desta desvantagem e que preferivelmente evite esta desvantagem. No presente invento um veículo de entrega de genes é qualquer veículo que é capaz de entregar um ácido 3 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ nucleico de interesse a uma célula hospedeira. De acordo com o invento, tem que compreender um elemento do adenovirus 35 ou um equivalente funcional deste elemento, o qual tem que ter um efeito benéfico em relação à resposta imune contra este veiculo. Basicamente todos os outros elementos que constituem o veiculo podem ser quaisquer elementos conhecidos na arte ou desenvolvidos na arte, desde que em conjunto sejam capazes de entregar o referido ácido nucleico de interesse. Em principio, o perito na especialidade pode utilizar e/ou produzir quaisquer produtos ou sistemas de produção adenovirais que possam ser, ou foram, aplicados no campo adenoviral.
Tipicamente os produtos do invento podem ser feitos em células de empacotamento utilizáveis para, por exemplo, o adenovirus 5, tipicamente os vectores baseados no adenovirus 35, podem ser produzidos e/ou utilizados da mesma maneira que aqueles de outros adenovirus, por exemplo, o adenovirus 2 e/ou 5. Uma boa apreciação sobre as possibilidades de vectores mínimos, sistemas de empacotamento, amplificação intracelular, sistemas baseados em vectores e plasmídeos, pode ser encontrada nos pedidos copendentes do requerente (PCT/NL99/00235 e PCT/NL96/00244). Sistemas de entrega não virais podem também ser proporcionados com elementos de acordo com o invento assim como o podem os sistemas de entrega virais. Ambos os tipos de sistemas são bem conhecidos na arte em muitas preparações diferentes e por isso não precisam de ser mais desenvolvidos aqui. Uma revisão sobre os muitos sistemas diferentes e suas propriedades pode ser encontrada em Robbins e Ghivizzani (1998) e em Prince (1998).
Os veículos de entrega de genes contêm tipicamente um ácido nucleico de interesse. Um ácido nucleico de interesse pode ser um gene ou uma parte funcional de um gene (onde um gene é qualquer ácido nucleico que pode ser expresso) ou um precursor de um gene ou um gene transcrito em qualquer nível de ácido nucleico (ADN e/ou ARN: de cadeia dupla ou única). Os genes de interesse são bem conhecidos na arte e incluem tipicamente aqueles que codificam proteínas terapêuticas tais como TPA, EPO, citoquinas, anticorpos ou seus derivados, etc. Uma revisão geral sobre proteínas terapêuticas a aplicar em terapia genética é listada a seguir. Factores imunoestimulantes como antigénios específicos de tumores, citoquinas, etc; Exemplos não limitativos de factores anti- 4 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ angiogénicos, endostatina, angiostatina, ATF-BPTI CDT-6, mutantes de VEGF negativos dominantes, etc.; Exemplos não limitativos de factores angiogénicos, VEGF, factores de crescimento de fibroblastos, óxido nítrico-sintases, péptido natriurético do tipo C, etc.; Proteínas de inibição de inflamação como CD40 solúvel, FasL, IL-12, IL-10, IL-4, IL-13 e anticorpos de cadeia simples excretados contra CD4, CD5, CD7, CD52, IL-2, IL-1, IL-6, TNF, etc., ou anticorpos de cadeia simples excretados contra o receptor de células T nas células T autorreactivas. Também se podem utilizar mutantes negativos dominantes de PML para inibir a resposta imune. Adicionalmente, podem ser utilizados antagonistas de citoquinas promotoras de inflamação, por exemplo IL-1RA (antagonista do receptor) e receptores solúveis como sIL-lRI, sIL-lRII, sTNFRI e sTNFRII. Também podem ser usados genes de inibição de crescimento e/ou da resposta imune tais como ceNOS, Bcl3, cacto e ΙκΒα, β ou γ e proteínas indutoras de apoptose tal como a proteína VP3 do vírus da anemia da galinha. Além disso, podem utilizar-se genes suicidas como de HSV-TK, citosina-desaminase, nitro-redutase e linamerase.
Um ácido nucleico de interesse pode também ser um ácido nucleico que possa hibridar com uma sequência de ácido nucleico presente na célula hospedeira, inibindo deste modo a expressão ou a transcrição ou a tradução do dito ácido nucleico. Pode também bloquear através de co-supressão.
Resumidamente, um ácido nucleico de interesse é qualquer ácido nucleico que se deseje proporcionar a uma célula de modo a induzir uma resposta da célula, resposta essa que pode ser a produção de uma proteína, a inibição desta produção, apoptose, necrose, proliferação, diferenciação, etc. 0 presente invento é o primeiro a divulgar o adenovírus 35 ou um seu homólogo funcional para uso terapêutico, pelo que o invento também proporciona um adenovírus do serótipo 35 ou um seu homólogo funcional ou um vírus quimérico seu derivado, ou um veículo de entrega de genes baseado no dito vírus, no seu homólogo ou na sua quimera, para utilização como fármaco. 0 serótipo do presente invento, adenovírus do tipo 35, é em si conhecido na arte. É um adenovírus do grupo B pouco comum que foi isolado de pacientes com a síndrome da imunodeficiência adquirida e outros distúrbios de imunodeficiência (Flomenberg et al., 1987; De Jong et al., 1983). Foi demonstrado que o Ad35 difere 5 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ do subgrupo C (incluindo Ad2 e Ad5), mais completamente caracterizado, em relação a propriedades patogénicas (Basler et al., 1996). Foi sugerido que esta diferença pode ser correlacionada com diferenças na região E3 do genoma de Ad35 (Basler et al., 1996). 0 ADN de Ad35 foi parcialmente clonado e mapeado (Kang et al., 1989a e b; Valderrama-Leon et al., 1985) .
Os serótipos de adenovírus do tipo B tais como 34 e 35 têm uma região E3 diferente dos outros serótipos. Tipicamente esta região está envolvida na supressão da resposta imune a produtos adenovirais. Assim o invento proporciona um veiculo de entrega de genes de acordo com o invento pelo qual os ditos elementos envolvidos em evitar ou diminuir a resposta imune compreendem produtos de expressão de E3 do adenovírus 35 ou os genes que os codificam ou equivalentes funcionais de qualquer um ou de ambos.
Outra parte de adenovírus envolvida em respostas imunes é a cápside, em particular as proteínas pentão ("penton”) e/ou hexão ("hexon"). Assim o invento também proporciona um veículo de entrega de genes de acordo com o invento através do qual os elementos compreendem pelo menos uma proteína da cápside do adenovírus 35 ou sua parte funcional, tal como proteínas de fibra, pentão e/ou hexão ou um gene que codifica pelo menos uma destas. Não é necessário que uma proteína, na sua totalidade, relevante para a resposta imune, seja de origem no adenovírus 35 (ou um seu homólogo funcional). É bem possível inserir uma parte de uma proteína da fibra, hexão ou pentão de adenovírus noutra fibra, pentão ou hexão. Assim se obtêm as proteínas quiméricas.
Também é possível ter um pentão de um certo adenovírus, um hexão de outro e uma fibra ou uma região E3 de ainda outro adenovírus. De acordo com o invento pelo menos umas das proteínas ou genes que as codificam deverá compreender um elemento do adenovírus 35 ou um seu homólogo funcional, pelo que o referido elemento tem um efeito na resposta imune do hospedeiro. Assim, o invento proporciona uma entrega de genes de acordo com o invento, que é uma quimera do adenovírus 35 com pelo menos um outro adenovírus. Desta maneira pode-se também modificar o vírus resultante noutros aspectos além de 6 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ apenas a resposta imune. Pode aumentar-se a sua eficiência de infecção com elementos por ela responsáveis; pode melhorar-se a sua replicação numa célula de empacotamento, ou pode alterar-se o seu tropismo.
Assim, o invento proporciona, por exemplo, um veiculo de entrega de genes de acordo com o invento que tem um tropismo diferente do adenovirus 35. Claro que o tropismo deverá ser alterado preferivelmente de modo a que o veiculo de entrega de genes seja entregue preferencialmente a um subconjunto de células do hospedeiro, isto é, as células alvo. Mudanças no tropismo e outras alterações que podem ser aplicadas no presente invento de veículos de entrega de genes adenovirais ou outros, são divulgadas nos pedidos copendentes do requerente (nos. 98204482.8, 99200624.7 e 98202297.2). Claro que o presente pedido também proporciona cada um e todos os blocos de construção necessários e/ou úteis para ir dar aos veículos de entrega de genes e/ou às quimeras, etc. do presente invento, isto inclui células de empacotamento tais como PER.C6 (Número de depósito ECACC 96022940) ou células nessas baseadas, mas adaptadas a Ad35 ou um seu homólogo funcional; também inclui quaisquer ácidos nucleicos codificantes de partes funcionais do adenovirus 35 ou um seu homólogo funcional, tal como construções auxiliares e construções de empacotamento, assim como vectores compreendendo genes de interesse e, por exemplo, uma ITR, etc.
Tipicamente o pedido do requerente (PCT/NL96/00244) divulga elementos necessários e úteis para se chegar aos veículos de entrega de genes inventados. Assim, o invento também proporciona um ácido nucleico que codifica pelo menos uma parte funcional de um veículo de entrega de genes de acordo com o invento, ou um vírus, um seu homólogo ou uma sua quimera, de acordo com o invento.
De acordo com o invento, estes elementos, que codificam funções que acabarão no resultante veículo de entrega de genes, têm que compreender, ou ser codificados por um ácido nucleico codificante de, pelo menos um dos elementos do serótipo 35 de adenovirus ou um seu equivalente funcional, responsável por evitar ou diminuir a actividade neutralizante 7 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ contra elementos adenovirais do hospedeiro ao qual o gene é para ser entregue.
Tipicamente o gene de interesse estará presente no mesmo ácido nucleico o que significa que este ácido nucleico tem tal gene ou que tem um local para lá se introduzir um gene de interesse.
Tipicamente este ácido nucleico compreende também pelo menos uma ITR, e se for um ácido nucleico a ser empacotado, também um sinal de empacotamento. Porém, como antes mencionado, todos os elementos e/ou blocos de construção necessários e úteis ao presente invento podem ser encontrados no pedido do requerente (PCT/NL96/00244). Um conjunto de melhorias adicionais no campo da produção de veículos de entrega de genes adenovirais é o sistema de plasmídeo do requerente divulgado em PCT/NL99/00235 mencionado antes aqui. Este sistema funciona numa concretização como uma recombinação homóloga de um plasmídeo adaptador e um plasmídeo mais longo, em conjunto compreendendo todos os elementos do ácido nucleico a ser incorporado no veículo de entrega de genes. Estes métodos também podem ser aplicados aos veículos de entrega de genes presentemente inventados e aos seus elementos de construção.
Assim o invento também proporciona um ácido nucleico de acordo com o invento compreendendo ainda uma região de nucleótidos desenhada ou utilizável para recombinação homóloga, preferivelmente como parte de pelo menos um conjunto de dois ácidos nucleicos compreendendo um ácido nucleico de acordo com o invento, pelo qual o dito conjunto de ácidos nucleicos é capaz de um único evento de recombinação homóloga entre um e outro, o que resulta num ácido nucleico que codifica um veículo de entrega de genes funcional.
Proporcionam-se ambas as células de empacotamento vazias (nas quais o vector a ser empacotado para realizar um veículo de entrega de genes de acordo com o invento ainda tem de ser introduzido ou produzido) assim como as células compreendendo um vector de acordo com o invento para ser empacotado. Portanto o invento também abrange uma célula compreendendo um ácido nucleico de acordo com o invento ou um conjunto de 8 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ ácidos nucleicos de acordo com o invento, preferivelmente uma célula que complementa os elementos necessários para a replicação adenoviral, os quais estão ausentes do ácido nucleico a ser empacotado, ou de um conjunto de ácidos nucleicos de acordo com o invento. No presente invento determinou-se que vectores do adenovirus 35 eliminados em El, não são capazes de replicação em células que proporcionam proteínas do adenovirus 5 em trans. Por isso o invento ainda proporciona uma célula capaz de proporcionar proteínas El do adenovirus 35 em trans. Esta célula é tipicamente uma célula humana derivada da retina ou do rim. Células embrionárias tais como amniócitos, demonstraram ser particularmente adequadas para a geração de uma linha celular complementar de El. Estas células são por isso preferidas no presente invento. A complementação específica do serótipo por proteínas El pode ser devida a uma ou mais proteína (s) codificadas pela região El. É por isso essencial que pelo menos uma proteína específica do serótipo seja proporcionada em trans na linha celular complementar. As proteínas El específicas de não serótipos essenciais para a complementação eficaz de um adenovirus eliminado em El podem ser derivadas de outros serótipos de adenovirus. Preferivelmente, pelo menos uma proteína El da região ElB do adenovirus 35 é proporcionada em trans para complementar os vectores baseados no adenovirus 35 eliminados em El.
Numa concretização introduz-se ácido nucleico codificante de uma ou mais proteínas El específicas do serótipo numa célula PER.C6 ou uma célula originada de uma célula PER.C6 (Número de depósito ECACC 96022940), ou uma célula de empacotamento semelhante complementando com elementos de Ad 35 ou de um seu homólogo funcional.
Como já aludido o invento também abrange um método para produzir um veículo de entrega de genes de acordo com o invento, compreendendo a expressão de um ácido nucleico de acordo com o invento numa célula de acordo com o invento e colhendo o resultante veículo de entrega de genes. O anterior refere-se ao preenchimento da célula de empacotamento vazia com os ácidos nucleicos relevantes. O formato da célula preenchida é, claro, também parte do presente invento, o qual proporciona um método para produzir um veículo de entrega de 9 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ genes de acordo com o invento, compreendendo a cultura de uma célula de empacotamento (célula produtora) preenchida de acordo com o invento num meio de cultura adequado e colhendo o resultante veiculo de entrega de genes.
Os veiculos de entrega de genes resultantes obtidos por qualquer método de acordo com o invento são também parte do presente invento, claro, particularmente também um veiculo de entrega de genes de acordo com o invento, o qual é derivado de uma quimera de um adenovirus e um virus de integração. É bem conhecido que os veiculos de entrega de genes adenovirais normalmente não se integram no genoma do hospedeiro. Por isso, para genes de expressão de longo termo numa célula hospedeira é preferível preparar quimeras que possuam aquela capacidade. Estas quimeras foram divulgadas no nosso pedido copendente PCT/NL98/00731. Um exemplo muito bom de tal quimera de adenovirus é um vírus de integração onde o referido vírus de integração é um vírus adeno-associado. Como antes aqui referido, outras quimeras úteis que também podem ser combinadas com as anteriores (seja na troca de proteínas completas ou partes dessas ou ambas) são quimeras que possuem tropismo alterado. Um exemplo muito bom é uma quimera de Ad 35 e Ad 16, possivelmente com elementos de, por exemplo, Ad 2 ou Ad 5, onde a parte determinante do tropismo de Ad 16 ou de seu equivalente funcional é usada para direccionar o veículo de entrega de genes a sinoviócitos e/ou células de músculos lisos (refira-se aos nossos pedidos copendentes nos. 98204482.8 e 99200624.7). Células dendríticas (DC) e células estaminais hemopoiéticas (HSC) não são facilmente transduzidas com veículos de entrega de genes derivados de Ad2 ou Ad5. O presente invento proporciona veículos de entrega de genes que possuem uma capacidade de transdução aumentada das células DC e HSC. Estes veículos de entrega de genes compreendem pelo menos a parte determinante do tropismo de tecidos de um adenovirus Ad35. Portanto o invento proporciona ainda o uso de uma parte determinante do tropismo de tecidos de uma cápside do adenovirus 35 para transduzir células dendríticas e/ou células estaminais hemopoiéticas. Outros adenovirus do tipo B também são adequados. Uma parte determinante do tropismo de tecidos compreende pelo menos o nó ("knob") e/ou o eixo ("shaft") de uma proteína da fibra. Claro que é muito possível 10 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ para um perito na especialidade determinar as sequências de aminoácidos responsáveis pelo tropismo de tecidos na proteína da fibra. Este conhecimento pode ser usado para conceber proteínas quiméricas compreendendo estas sequências de aminoácidos. Estas proteínas quiméricas são por isso também parte do invento. As células DC são células de apresentação de antigénios muito eficientes. Ao introduzir o veículo de entrega de genes nestas células o sistema imune do hospedeiro pode ser activado para antigénios específicos. Estes antigénios podem estar codificados por ácido nucleico entregue às DC ou pelas proteínas do próprio veículo de entrega de genes. Assim, o presente invento também proporciona um veículo de entrega de genes com a capacidade para evadir o sistema imune do hospedeiro como uma vacina. O vector sendo capaz de evadir o sistema imune tempo suficiente para encontrar eficientemente células alvo e ao mesmo tempo capaz de entregar antigénios específicos a células que apresentam antigénios, permitindo deste modo a indução e/ou estimulação de uma resposta imune eficiente em relação ao antigénio(s) específico(s) . Para modular adicionalmente a resposta imune, o veículo de entrega de genes pode compreender proteínas e/ou ácido nucleico codificante destas proteínas capazes de modular uma resposta imune. Encontram-se exemplos não limitativos destas proteínas entre interleucinas, as moléculas de adesão, as proteínas co-estimulantes, os interferões, etc. Por isso, o invento proporciona ainda uma vacina compreendendo um veículo de entrega de genes do invento. O invento ainda proporciona um vector adenoviral com a capacidade para transduzir eficientemente DC e/ou HSC, o veículo compreendendo pelo menos uma parte determinante do tropismo de tecidos do serótipo de adenovírus 35. O invento ainda proporciona a utilização destes veículos de entrega para a transdução de células HSC e/ou DC. Encontram-se tropismos de tecidos semelhantes entre outros adenovírus do serótipo B, particularmente no serótipo 11, e estes fazem também parte do invento. Claro que também é possível proporcionar outros veículos de entrega de genes com a parte determinante do tropismo de tecidos, deste modo proporcionando estes veículos de entrega com uma capacidade de transdução de DC e/ou HSC aumentada. Estes veículos de entrega de genes são por isso também parte do invento. 11 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Os veículos de entrega de genes de acordo com o invento podem ser utilizados para entregar genes ou ácidos nucleicos de interesse a células hospedeiras. Isto será tipicamente uma utilização farmacêutica. Este uso está incluído no presente invento. Composições adequadas a este uso são também parte do presente invento. A quantidade de veículo de entrega de genes que tem de estar presente por dose ou por infecção (m.o.i) depende da condição a ser tratada, a via de administração (tipicamente parentérica), o objecto e a eficiência da infecção, etc. Estudos de determinação de doses são bem conhecidos na arte e aqueles já levados a cabo com outros veículos de entrega de genes (adenovirais) podem ser usados tipicamente como guia para determinar as doses adequadas dos veículos de entrega de genes de acordo com o invento. Tipicamente isto é também onde se pode encontrar excipientes adequados, meios de administração adequados, meios adequados de prevenir infecção com o veículo onde não é desejado, etc. Assim, o invento também proporciona uma formulação farmacêutica compreendendo um veículo de entrega de genes de acordo com o invento e um excipiente adequado, assim como uma formulação farmacêutica compreendendo um adenovírus, sua uma quimera ou um seu homólogo funcional, de acordo com o invento, e um excipiente adequado.
Breve descrição dos desenhos:
Figura 1: Gráfico de barras mostrando a percentagem de amostras de soro positivas para neutralização para cada adenovírus do tipo selvagem humano testado (refira-se ao Exemplo 1 para descrição do ensaio de neutralização).
Figura 2: Gráfico mostrando a ausência de correlação entre a razão VP/CCID50 e a percentagem de neutralização.
Figura 3: Representação esquemática de uma mapa de restrição parcial de Ad35 (reproduzido de Kang et al., 1989) e os clones gerados para realizar vírus recombinantes baseados em Ad35.
Figura 4: Gráfico de barras apresentando a percentagem de amostras de soro que exibem actividade neutralizante de uma selecção de serótipos de adenovírus. Os soros foram derivados de voluntários saudáveis da Bélgica e do Reino Unido. 12 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Figura 5: Gráfico de barras apresentando a percentagem de amostras de soro que exibem actividade neutralizante aos serótipos de adenovírus 5, 11, 26, 34, 35, 48 e 49. Os soros foram derivados de cinco localizações diferentes na Europa e nos Estados Unidos.
Figura 6: Sequência de adenovírus humano do tipo 35. Como elucidado no texto, a sequência nucleotídica das extremidades terminais do vírus não estão resolvidas em definitivo.
Figura 7: Mapa de pAdApt
Figura 8: Mapa de plPspAdapt
Figura 9: Mapa de pIPspAdaptl
Figura 10: : Mapa de pIPspAdapt3 Figura 11: : Mapa de pAdApt35IP3 Figura 12: : Mapa de pAdApt35IPl
Figura 13: Representação esquemática dos passos tomados para construir pWE.Ad35.pIX-rITR
Figura 14: : Mapa de pWE.Ad35.pIX-rITR Figura 15: : Mapa de pRSV.Ad35-El Figura 16: : Mapa de PGKneopA Figura 17: : Mapa de pRSVpNeo Figura 18: : Mapa de pRSVhbvNeo
Figura 19: Análise por citometria de fluxo da expressão da proteína fluorescente verde (GFP) em células TF-1 humanas. Usaram-se células TF-1 não transduzidas para preparar um nível de fundo de 1%. A expressão de GFP em células transduzidas com Ad5, Ad5.Fibl6, Ad5.Fibl7, Ad5.Fib40-L, Ad5.Fib35, e Ad5.Fib51, é apresentada. 13 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Figura 20: Transdução de estroma primário humano do tipo fibroblastos. As células foram analisadas 48 horas após uma exposição de duas horas a diferentes vírus quiméricos de fibra. Mostra-se a percentagem de células encontradas positivas para o transgene: proteína fluorescente verde (GFP) usando um citómetro de fluxo. Usaram-se células de estroma não transduzidas para preparar um fundo de 1%. Os resultados de diferentes testes (n=3) são apresentados com ± desvio padrão.
Figura 21: Transdução de estroma primário humano do tipo fibroblastos, células CD34+ e células CD34+Lin”. As células foram analisadas 5 dias após uma exposição de duas horas a diferentes vírus quiméricos de fibra. Mostra-se a percentagem de células encontradas positivas para o transgene: proteína fluorescente verde (GFP) usando um citómetro de fluxo. Células não transduzidas foram usadas para preparar um fundo de 1%. Também se mostra o número de eventos positivos para GFP dividido pelo número total de eventos analisados (entre parênteses).
Figura 22 A) Análise por citometria de fluxo de células positivas para GFP após transdução de células CD34+ com Ad5.Fib51. Todas as células gated em R2-R7 são positivas para CD34 mas diferem na sua expressão de marcadores de diferenciação precoces CD33, CD38, e CD71 (Lin). As células em R2 são negativas para CD333, CD38, CD71 enquanto que as células em R7 são positivas para estes marcadores. Para demonstrar a especificidade de Ad5.Fib51, determinou-se a percentagem de células positivas para GFP em R2-R7 a qual demonstrou declinar desde 91% (R2) até 15% (R7) . B) Teste idêntico ao apresentado em A (o eixo X é R2-R7) mas para os outros vírus Ad quiméricos de fibra, mostrando que Ad5.Fib35, e Ad5.Fibl6 se comportam de maneira semelhante à de Ad5.Fib51.
Figura 23: Alinhamento de proteínas quiméricas da fibra de Ad5fibl6, Ad5fib35 e Ad5fib51 com a sequência de fibra de Ad5.
Figura 24: Toxicidade da exposição a adenovírus de células primitivas humanas da medula óssea e células estaminais. As culturas celulares foram contadas precisamente antes e também 5 dias depois da transdução com o adenovírus. Mostra-se a 14 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ percentagem de células primitivas humanas da medula óssea (CD34+) e HSCs (CD34+Lin~) recuperadas comparado ao dia 0.
Figura 25: Transdução de DC imaturas a uma dose de virus de 100 ou 1000 partículas de virus por célula. Os virus testados são Ad5 e vectores baseados em Ad5 transportando fibra do serótipo 12 (Ad5.Fibl2), 16 (Ad5.Fibl6), 28 (Ad5.Fib28), 32 (Ad5.Fib32), a fibra longa de 40 (Ad5.Fib40-L, 49 (Ad5.Fib49), 51 (Ad5.Fib51). A expressão do transgene da luciferase é expressa em Unidades Relativas de Luz por micrograma de proteina.
Figura 26: Análise por citometria de fluxo da expressão de LacZ em DC imaturas e maduras transduzidas com 10 000 partículas de virus por célula de Ad5 ou dos vectores quiméricos da fibra de Ad5.Fibl6, Ad5.Fib40-L ou Ad5.Fib51. As percentagens de células classificadas positivas estão apresentadas no canto de cima esquerdo de cada histograma.
Figura 27: Expressão do transgene da luciferase em DC humanas imaturas medida 48 horas após transdução com 1000 ou 5000 partículas de virus por célula. Os vírus testados eram vírus quiméricos de fibra transportando a fibra dos membros do subgrupo B (serótipos 11, 16, 35, e 51).
Figura 28: Expressão da proteína fluorescente verde (GFP) em DC imaturas humanas 48 horas após transdução com 1000 partículas de vírus por célula de Ad5, Ad5.Fibl6, e Ad5.Fib35. As células não transduzidas foram usadas para preparar um nível de fundo de aproximadamente 1% (-).
Figura 29: Transdução de DC de ratinho e chimpanzé. A expressão do transgene da luciferase medida nas DC de ratinho 48 horas após transdução é expressa em Unidades Relativas de Luz por micrograma de proteína. Mediram-se as DC de chimpanzé 48 horas após transdução usando um citómetro de fluxo. A expressão de GFP demonstra uma transdução inadequada de Ad (35) em contraste com Ad5.Fib35 (66%).
Figura 30: Crescimento de PER.C6 dependente da temperatura. Efectuou-se uma cultura de células PER.C6 em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com soro fetal bovino a 15 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 10% (FBS, Gibco BRL) e MgCl2 10mM numa atmosfera de CO2 a 10% a 32°C, 37°C ou 39°C. No dia 0, semeou-se um total de 1 x 106 células PER.C6 por balão de cultura de tecidos de 25cm2 (Nunc) e a cultura de células prosseguiu a 32°C, 37°C ou 39°C. No dia 1-8, as células foram contadas. A taxa de crescimento e a densidade final das células da cultura de PER.C6 a 39°C são comparáveis àquelas a 37°C. A taxa de crescimento e a densidade final da cultura de PER.C6 a 32°C eram ligeiramente inferiores àquelas obtidas 37°C ou 39°C. Células PER.C6 foram semeadas a uma densidade de 1 x 106 células por balão de cultura de tecidos de 25 cm2 e a cultura prosseguiu a 32, 37 ou 39°C. Aos tempos indicados, as células foram contadas num contador de células Burker. As PER.C6 crescem bem tanto a 32°C, como 37°C ou 39°C.
Figura 31: Niveis de DBP em células PER.C6 transfectadas com pcDNA3, pcDNA3wtE2A ou pcDNA3tsl25E2A. Fraccionaram-se quantidades iguais de extracto de células completas por SDS-PAGE em géis a 10%. As proteínas foram transferidas para membranas Immobilon-P e a proteína DBP foi visualizada usando o anticorpo monoclonal B6 de aDBP num sistema de detecção ECL. Todas as linhas celulares derivadas da transfecção de pcDNA3tsl25E2A expressam a proteína DBP codificada por E2A de 72-kDa (painel esquerdo, filas 4-14; painel do meio, filas 1-13; painel direito, filas 1-12). Em contraste, a única linha celular derivada da transfecção de pcDNAwtE2A não expressava a proteína DBP (painel esquerdo, fila 2). Não se detectou proteína DBP no extracto de uma linha celular derivada da transfecção de pcDNA3 (painel esquerdo, fila 1), que servia como controlo negativo. Extracto de células PER.C6 transientemente transfectadas com pcDNA3tsl25 (painel esquerdo, fila 3) serviu como controlo positivo para o procedimento de transferência de Western. Estes resultados confirmam que a expressão constitutiva de E2A do tipo selvagem é tóxica para células e que usar o mutante tsl25 de E2A pode evitar esta toxicidade.
Figura 32: Crescimento da suspensão de PER.C6tsl25E2A C5-9. Efectuou-se uma cultura da linha celular PER.C6tsE2A.c5-9 de expressão de tsE2A em suspensão isenta de soro em Ex-cell™. Nos tempos indicados, as células foram contadas com um contador de células Burker. Os resultados de 8 culturas 16 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ independentes são apresentados. PER.C6tsE2A cresce bem em suspensão em meio Ex-cell™ isento de soro.
Figura 33: Curva de crescimento de per.C6 e PER.C6tsE2A. Fez-se uma cultura de células PER.C6 ou PER.C6tsl25E2A (c8—4) a 37°C e 39°C respectivamente. No dia 0, semeou-se um total de 1 x 106 células por balão de cultura de tecidos de 25cm2. Nos tempos indicados, as células foram contadas. O crescimento das células PER.C6 a 37°C é comparável ao crescimento de PER.C6tsl25E2A c8-4 a 39°C. Isto mostra que a expressão excessiva constitutiva de tsl25E2A não tem efeitos adversos no crescimento de células a uma temperatura não permissiva de 39°C.
Figura 34: Estabilidade de PER.C6tsl25E2A. Efectuaram-se várias passagens de cultura do clone 8-4 da linha celular PER.C6tsl25E2A a 39°C em meio isento de G418. Quantidades iguais de extracto de células completas de diferentes números de passagens foram fraccionadas por SDS-page em gel a 10%. As proteínas foram transferidas para membranas Immobilon-P e a proteina DBP foi visualizada usando o anticorpo monoclonal B6 de aDBP num sistema de detecção ECL. A expressão de DBP codificada por tsl25E2A é estável por pelo menos 16 passagens, o que é equivalente a aproximadamente 40 duplicações de células. Não se observou decréscimo nos níveis de DBP durante este período de cultura, indicando que a expressão de tsl25E2A é estável, mesmo na ausência de pressão de selecção por G418.
Figura 35: Actividade de tTA em células PER.C6/tTA (A) e PER/E2A/tTA (B) resistentes a higromicina. Dezasseis colónias de células independentes resistentes a higromicina PER.C6/tTA e 23 colónias de células independentes resistentes a higromicina PER/E2A/tTA foram crescidas em poços de 10 cm2 até subconfluência e transfectadas com 2 pg de pUHC 13-3 (um plasmídeo que contém o gene repórter da luciferase sob controlo do promotor 7xtetO). Metade das culturas foi mantida em meio contendo dodoxiciclina para inibir a actividade de tTA. As células foram colhidas 48 horas após transfecção e a actividade da luciferase foi medida. A actividade da luciferase é indicada em Unidades Relativas de Luz (RLU) por pg de proteína. 17 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Descrição detalhada
Como descrito atrás, os serótipos de adenovírus mais extensivamente estudados não são idealmente adequados para entregar material genético adicional a células hospedeiras. Isto deve-se em parte à imunidade contra estes serótipos preexistente entre a população. Esta presença de anticorpos preexistentes em seres humanos, em combinação com uma forte resposta imune secundária humoral e celular contra o virus afectará a terapia genética adenoviral. 0 presente invento proporciona o uso de pelo menos elementos de um serótipo de adenovírus os quais são muito apropriados como vectores em terapia genética. 0 presente invento também divulga um rastreio automático de elevado rendimento de todos os serótipos de adenovírus conhecidos contra o soro de muitos indivíduos. Surpreendentemente, em qualquer soro avaliado não se encontrou capacidade de neutralização contra um serótipo em particular, o adenovírus 35 (Ad35). Isto torna o serótipo do presente invento extremamente útil como um sistema de vector em terapia genética humana.
Este sistema de vector é capaz de transferir eficientemente material genético a uma célula humana sem o problema inerente da imunidade preexistente.
Tipicamente, um vírus é produzido utilizando um vector adenoviral (tipicamente um vector plasmídico, cosmídico ou de baculovírus). Claro que estes vectores são também parte do presente invento. 0 invento também proporciona vectores derivados de adenovírus que foram tornados deficientes para replicação por deleção ou inactivação da região El. Claro que também se pode inserir um gene de interesse, por exemplo, no local em El do adenovírus original do qual o vector é derivado.
Em todos os aspectos do invento os adenovírus podem conter deleções na região El e inserções de genes heterólogos ligados ou não a um promotor. Além disso, os adenovírus podem conter deleções nas regiões E2, E3 ou E4 e inserções ou genes 18 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ heterólogos ligados a um promotor. Nestes casos são requeridas linhas celulares complementares de E2 e/ou E4 para se gerar adenovirus recombinantes.
Pode optar-se por utilizar o próprio serótipo de Ad35 na preparação de adenovirus recombinantes para serem utilizados em terapia genética. Alternativamente, pode optar-se por usar elementos derivados do serótipo do presente invento nestes adenovirus recombinantes. Pode-se, por exemplo, desenvolver um adenovirus quimérico que combina as propriedades desejadas de serótipos diferentes. Alguns serótipos têm um espectro de hospedeiros algo limitado mas têm a vantagem de serem menos imunogénicos, outros são o oposto. Alguns têm o problema de uma virulência limitada, mas têm um vasto espectro de hospedeiros e/ou uma imunogenicidade reduzida. Estes adenovirus quiméricos são conhecidos na arte, e entende-se que estão dentro do âmbito do presente invento. Assim, numa concretização o invento proporciona um adenovirus quimérico compreendendo pelo menos uma parte do genoma do adenovirus do presente serótipo, proporcionando-o com a ausência de imunidade preexistente, e pelo menos uma parte do genoma adenoviral de outro serótipo de adenovirus resultando num adenovirus quimérico. Desta maneira o adenovirus quimérico produzido é tal que combina a ausência de imunidade preexistente do serótipo do presente invento com outras caracteristicas de outro serótipo. Estas caracteristicas podem ser estabilidade à temperatura, montagem, ancoragem, infecção redireccionada, rendimento de produção, infecção redireccionada ou melhorada, estabilidade do ADN na célula alvo, etc.
Geralmente será necessário uma célula de empacotamento de maneira a produzir uma quantidade suficiente de adenovirus. Para a produção de adenovirus recombinantes para fins de terapia genética, existem disponíveis várias linhas celulares. Estas incluem, mas não estão limitadas a, as conhecidas linhas celulares PER.C6 (Número de depósito ECACC 96022940), 911, 293, e EI A549.
Um aspecto importante do presente invento são os meios para produzir o adenovirus. Tipicamente, não se requer que um lote de adenovirus para aplicações clínicas contenha 19 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ adenovírus competentes para a replicação. Por isso, em geral é desejável omitir vários genes (excepto um) do genoma adenoviral no vector adenoviral e fornecer estes genes ao genoma da célula na qual o vector é levado a produzir o adenovírus quimérico. Esta célula é normalmente denominada célula de empacotamento. Assim, o invento também proporciona uma célula de empacotamento para produzir um adenovírus (um veículo de entrega de genes) de acordo com o invento, compreendendo em trans todos os elementos necessários à produção de adenovírus que não estão presentes no vector adenoviral de acordo com o invento. Tipicamente o vector e a célula de empacotamento têm de ser adaptados um ao outro na medida em que possuem todos os elementos necessários, mas não têm a sobreposição de elementos que resulta em vírus competentes para a replicação por recombinação.
Assim o invento também proporciona um kit de partes compreendendo uma célula de empacotamento de acordo com o invento e um vector recombinante de acordo com o invento, onde existe essencialmente não sobreposição de sequências entre a referida célula e o referido vector levando a recombinação que resulta na produção de adenovírus competentes para a replicação.
Assim o invento proporciona métodos para produzir adenovírus, os quais ao serem aplicados escaparão à imunidade humoral preexistente, compreendendo proporcionar um vector com elementos derivados de um serótipo de adenovírus contra o qual não existe virtualmente imunidade natural e transfectar o dito vector numa célula de empacotamento de acordo com o invento e permitindo a produção de partículas virais.
Num aspecto este invento descreve a utilização de serótipos de adenovírus do presente invento para superar a actividade natural ou induzida de neutralização do hospedeiro dirigida a adenovírus administrados in vivo em aplicações terapêuticas. A necessidade de um novo serótipo é acentuada pelas observações de que 1) a entrega sistémica repetida do serótipo de adenovírus 5 recombinante é mal sucedida devido à formação de títulos altos de anticorpos neutralizantes contra o serótipo de adenovírus 5 recombinante (Schulick et al, 20 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 1997), e 2) a imunidade humoral ou preexistente está muito espalhada na população.
Noutro aspecto, este invento proporciona a utilização de veiculos de entrega de genes do invento ou a utilização do serótipo de adenovirus 35 para fins de vacinação. Este uso evita, pelo menos em parte, respostas imunes indesejáveis do hospedeiro. Exemplos não limitativos de respostas imunes indesejáveis são a provocação de uma resposta imune contra o veiculo de entrega de genes ou o serótipo de adenovirus 35 e/ou reforçar uma resposta imune contra o veiculo de entrega de genes ou o serótipo de adenovirus 35. Noutro aspecto do invento faz-se o uso alternado de vectores Ad pertencentes a diferentes serogrupos. Este aspecto do invento ultrapassa portanto a incapacidade de repetir a administração de um adenovirus para fins de terapia génica.
Exemplos
Exemplo 1
Um ensaio de elevado rendimento para detecção de actividade neutralizante no soro humano
De modo a possibilitar o rastreio de uma grande quantidade de soro humano para a presença de anticorpos neutralizantes de todos os serótipos de adenovirus, desenvolveu-se um ensaio automático de 96 poços.
Soro humano
Seleccionou-se um painel de 100 indivíduos. Os voluntários (50% masculino, 50% feminino) eram indivíduos saudáveis entre os 20 e 60 anos de idade sem restrição de raça. Todos os voluntários assinaram uma forma de consentimento informativa. Pessoas envolvidas profissionalmente na pesquisa de adenovirus foram excluídas.
Aproximadamente 60 ml de sangue foi tirado para tubos secos. No espaço de duas horas depois da recolha de amostras, o sangue foi centrifugado a 2500 rpm por 10 minutos. Aproximadamente 30 ml de soro foi transferido para tubos de polipropileno e armazenado congelado a -20°C até ser usado. 21 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ Ο soro foi descongelado e inactivado por calor a 56°C por 10 minutos e a seguir separado em aliquotas para evitar ciclos repetidos de congelação/descongelação. Parte foi usado para fazer cinco passos de diluições de duas vezes em meio (DMEM, Gibco BRL) em quantidade suficiente para encher aproximadamente 70 placas de 96 poços. Aliquotas de soros diluídos e não diluídos foram pipetadas para placas de poços fundos (formato de 96 poços) e utilizando um PlateMate programado foram doseadas aliquotas de 100 μΐ para placas de 96 poços. Desta maneira as placas foram cheias com oito soros diferentes em duplicado (100 μΐ/poço) de acordo com o esquema seguinte:
Sl/2 Sl/4 Sl/8 Sl/16 Sl/32 S5/2 S5/4 S5/8 S5/16 S5/32 - - Sl/2 Sl/4 Sl/8 Sl/16 Sl/32 S5/2 S5/4 S5/8 S5/16 S5/32 - - S2/2 S2/4 S2/8 S2/16 S2/32 S6/2 S6/4 S6/8 S6/16 S6/32 - - S2/2 S2/4 S2/8 S2/16 S2/32 S6/2 S6/4 S 6 / 8 S6/16 S6/32 - - S3/2 S3/4 S3/8 S3/16 S3/32 S7/2 S7/4 S7/8 S7/16 S7/32 - - S3/2 S3/4 S3/8 S3/16 S3/32 S7/2 S7/4 S7/8 S7/16 S7/32 - - S4/2 S4/4 S3/8 S3/16 S3/32 S8/2 S8/4 S8/8 S8/16 S8/32 - - S4/2 S4/4 S3/8 S3/16 S3/32 S8/2 S8/4 S8/8 S8/16 S8/32 - - onde de Sl/2 a S8/2 nas colunas 1 e 6 representam soro diluído lx e Sx/4, Sx/8, Sx/16 e Sx/32 as diluições 2 vezes em série. As últimas placas também contêm quatro poços cheios com 100 μΐ de soro fetal de vitelo como controlo negativo. As placas foram mantidas a -20°C até serem usadas.
Preparação de soluções-mãe de adenovlrus humano
Inocularam-se protótipos de todos os adenovírus humanos conhecidos em balões T25 semeados com células PER.C6 (Número de depósito ECACC 96022940) (Fallaux et al., 1998) e colheram-se a CPE completo. Depois de congelar/descongelar, usou-se 1-2 ml dos lisados brutos para inocular um balão T80 com células PER.C6 (Número de depósito ECACC 96022940) e o vírus foi colhido a CPE completo. O período de tempo entre a inoculação e a ocorrência de CPE assim como a quantidade de vírus necessária para reinfectar uma nova cultura, diferiu entre os serótipos. As soluções-mãe de adenovírus foram preparadas por congelação/descongelação e usadas para inocular 22 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 3-4 balões de Τ175 cm2 de três camadas com células PER.C6 (Número de depósito ECACC 96022940) . Logo após a ocorrência de
CPE, as células foram colhidas escorrendo o liquido do balão, foram feitas em pelete, e o virus foi isolado e purificado por meio de um gradiente de CsCl de dois passos como se segue. As peletes de células foram dissolvidas em 50 ml de tampão NaP04 10 mM (pH 7,2) e congeladas a -20°C. Depois de descongelar a 37°C, adicionou-se 5,6 ml de desoxicolato de sódio (5% p/v). A solução foi misturada gentilmente e incubada por 5-15 minutos a 37°C para lisar completamente as células. Depois de homogeneizar a solução, adicionou-se 1875 μΐ de MgCl2 1M. A seguir à adição de 3 75 μΐ de ADNase (10 mg/ml) a solução foi incubada por 30 minutos a 37°C. Detritos de células foram removidos por centrifugação a 1880xg por 30 minutos à temperatura ambiente sem interrupção. O sobrenadante foi subsequentemente purificado de proteínas por extracção com fréon (3x). O sobrenadante límpido foi colocado num gradiente em blocos (gama: 1,2/1,4 gr/ml) de cloreto de césio tamponado com Tris/HCl 1M e centrifugado a 21000 rpm por 2,5 horas a 10°C. A banda de vírus foi isolada depois de se levar a cabo uma segunda purificação usando um gradiente contínuo de 1,33 g/ml de cloreto de césio tamponado com Tris/HCl 1M. O vírus foi então centrifugado por 17 horas a 55000 rpm a 10°C. A banda de vírus foi isolada e adicionou-se sacarose (50% p/v) até uma concentração final de 1%. O excesso de cloreto de césio foi removido por diálise (três vezes 1 h à temperatura ambiente) em lâminas de diálise (Slide-a-lizer, ponto crítico a 10000 kDa, Pierce, USA) contra 1,5 1 de PBS suplementado com CaCl2 (0,9 mM), MgCl2 (0,5 mM) e uma concentração crescente de sacarose (1, 2, 5%). No final da diálise, o vírus foi removido do Slide-a-lizer, a seguir foi dividido em alíquotas de 25 e 100 μΐ, logo após o qual foi armazenado a -85°C.
Para determinar o número de partículas de vírus por milímetro, submeteu-se 50 μΐ do lote de vírus a cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) como descrito por Shabram et al (1997) .
Os vírus foram eluídos com um gradiente de NaCl indo de 0 a 600 mM. Como apresentado na Tabela I, a concentração de NaCl à qual os vírus foram eluídos diferiu significativamente entre os serótipos. 23 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ A maioria dos adenovírus humanos replicou bem nas células PER.C6 ((Número de depósito ECACC 96022940) salvo umas poucas excepções. Os adenovírus do tipo 8 e 40 foram replicados em células 911-E4 (He et al., 1998). As soluções-mãe purificadas continham entre 5xl010 e 5xl012 partículas de vírus/ml (VP/ml; refira-se à Tabela I).
Titulação das soluções-mãe de adenovírus humano purificadas
Os adenovírus foram titulados em células PER.C6 (Número de depósito ECACC 96022940) para determinar a quantidade de vírus necessária para se obter CPE completo em cinco dias, a duração do ensaio de neutralização. Para isto, 100 μΐ de meio foi doseado a cada poço das placas de 96 poços. À coluna 2 de uma placa de 96 poços adicionou-se 25 μΐ de soluções-mãe de adenovírus pré-diluídas ΙΟ4, ΙΟ5, 106 ou 107 vezes e misturou-se pipetando 10 vezes para cima e para baixo. A seguir transferiu-se 25 μΐ da coluna 2 para a coluna 3 e misturou-se novamente. Isto foi repetido até à coluna 11, a seguir ao qual se rejeitou 25 μΐ da coluna 11. Desta maneira diluições em série em passos de 5 foram obtidas a partir de uma solução-mãe pré-diluída. A seguir adicionou-se 3xl04 células PER.C6 (Número de depósito ECACC 96022940) a um volume de 100 μΐ e as placas foram incubadas a 37°C, C02 a 5% por cinco ou seis dias. O CPE foi monitorado microscopicamente. O método de Reed e Muensch foi usado para se calcular a dose de inibição de 50% da cultura de células (CCID50).
Em paralelo, prepararam-se placas idênticas que foram analisadas por meio de um ensaio MTT (Promega). Neste ensaio quantificaram-se células vivas por coloração colorimétrica. Para este fim, adicionou-se 20 μΐ de MTT (7,5 mgr/ml em PBS) aos poços e incubou-se a 37°C, C02 a 5% por duas horas. O sobrenadante foi removido e 100 μΐ de uma solução de isopropanol/triton-XlOO a 20:1 foi adicionado aos poços. As placas foram colocadas num agitador de 96 poços por 3-5 minutos até se solubilizar a coloração precipitada. A absorvância foi medida a 540 nm e a 690 nm (fundo). Por meio deste ensaio, os poços com CPE em progresso ou CPE completo podem ser distinguidos. 24 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Ensaio de neutralização
Placas de 96 poços com amostras diluídas de soro humano foram descongeladas a 37°C, C02 a 5%. Soluções-mãe de adenovírus diluídas a CCID50 200 por 50 μΐ foram preparadas e alíquotas de 50 μΐ foram adicionadas às colunas 1-11 das placas com soro. As placas foram incubadas por 1 hora a 37°C, C02 a 5%. A seguir doseou-se 50 μΐ de células per.C6 (Número de depósito ECACC 96022940) a 6xl05/ml em todos os poços e incubou-se por 1 dia a 37°C, C02 a 5%. O sobrenadante foi removido utilizando pontas novas de pipeta por cada fila e adicionou-se 200 μΐ de meio novo a todos os poços para evitar efeitos tóxicos do soro. As placas foram incubadas por mais 4 dias a 37°C, C02 a 5%. Para além disto, prepararam-se placas de controlo paralelas em duplicado, com soro de controlo positivo diluído gerado em coelhos e específico para cada serótipo a ser testado nas filas A e B, e com soro de controlo negativo (FCS) nas filas C e D. Adicionalmente, em cada uma das filas E-H efectuou-se uma titulação como descrito anteriormente com passos de diluições de cinco vezes começando com CCID50 200 para cada vírus a ser testado. No dia 5 uma das placas de controlo foi analisada microscopicamente e por meio de um ensaio MTT. O título experimental foi calculado a partir da placa de titulação do controlo observada microscopicamente.
Quando o CPE se encontrava completo, isto é, a primeira diluição do teste de titulação do controlo analisado por MTT exibia uma morte clara de células, todas as placas de ensaio eram processadas. Se não, o ensaio era deixado a prosseguir por um dia ou mais até ser evidente CPE completo, a seguir ao qual todas as placas eram processadas. Na maioria dos casos o ensaio terminou no dia 5. Para Adi, 5, 33, 39, 42 e 43 o ensaio foi deixado por seis dias e para Ad2 por oito dias.
Uma amostra de soro é considerada não neutralizante quando à concentração mais alta de soro se observa uma protecção máxima de 40% relativamente aos controlos sem soro.
Os resultados das análises de 44 protótipos de adenovírus contra o soro de 100 voluntários saudáveis estão apresentados na Figura 1. Como se esperava, a percentagem de amostras de 25 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ soro que continha anticorpos neutralizantes de Ad2 e Ad5 era muito alta. Isto também era verdade para a maioria dos adenovirus de baixa numeração. Surpreendentemente, nenhuma das amostras de soro continha anticorpos neutralizantes do serótipo de adenovirus 35.
Além disso, o número de indivíduos com títulos de anticorpo neutralizante dos serótipos 26, 34 e 48 era muito baixo.
Por isso, os adenovirus recombinantes eliminados em El baseados em Ad35 ou um dos outros serótipos mencionados atrás têm uma vantagem importante em relação aos vectores recombinantes baseados em Ad5 no que diz respeito à eliminação dos vírus por anticorpos neutralizantes.
Além disso, vectores baseados em Ad5 que possuem as proteínas da cápside (partes de) envolvidas na resposta imunogénica do hospedeiro substituídas pelas correspondentes proteínas da cápside (partes de) de Ad35, ou um dos outros serótipos, serão menos neutralizadas, ou até nem serão neutralizadas, pela vasta maioria dos soros humanos.
Como pode se pode observar na Tabela I, a razão VP/CCID50 calculada a partir das partículas de vírus por ml e a CCID50 obtida para cada vírus nos testes, variava muito indo de 0,4 a 5 log. Isto é provavelmente causado pelas diferentes eficiências de infecção das células PER.C6 (Número de depósito ECACC 96022940) e pelas diferenças na eficiência de replicação dos vírus. Além disso, as diferenças nas qualidades dos lotes podem ter influência. Uma razão VP/CCID50 elevada significa que se adicionou mais vírus aos poços para se obter CPE em 5 dias. Como consequência, o resultado do estudo de neutralização pode ser tendencioso já que mais partículas de vírus (inactivas) poderão proteger os anticorpos. Para verificar se este fenómeno tinha acontecido, a razão VP/CCID50 foi representada graficamente em relação à percentagem de amostras de soro positivas observadas no ensaio (Figura 2). O gráfico mostra claramente que não existe uma correlação negativa entre a quantidade de vírus no ensaio e a neutralização no soro. 26 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Exemplo 2
Geração de vectores plasmídicos de Ad5 para a produção de vírus recombinantes e fácil manipulação de genes adenovirais pBr/Ad.Bam-rITR (Depósito ECACC P97082122)
De maneira a facilitar a clonagem das extremidades lisas das sequências de ITR, ADN do adenovírus humano do tipo 5 (Ad5) do tipo selvagem foi tratado com a enzima Klenow na presença de excesso de dNTP. A seguir à inactivação da enzima Klenow e purificação por extracção com fenol/clorofórmio seguido de precipitação por etanol, o ADN foi digerido com
BamRI. Esta preparação de ADN foi utilizada sem purificação adicional numa reacção de ligação com ADN do vector derivado de pBr322 preparado como se segue: ADN de pBr322 foi digerido com EcoRV e BamRI, desfosforilado por tratamento com a enzima TSAP (Life Technologies) e purificado em gel de agarose LMP (SeaPlaque GTG). Após transformação em DH5a de E.coli competentes (Life Techn.) e análise das colónias resistentes a ampicilina, seleccionou-se um clone que exibia um padrão de digestão como seria esperado de uma inserção estendendo-se desde o local BamRI em Ad5 à ITR direita.
Uma análise de sequências da borda de clonagem da ITR direita revelou que faltava a maior parte do resíduo G a 3' da ITR, e o que restava da ITR estava correcto. 0 referido resíduo G ausente é complementado pela outra ITR durante a replicação. pBr/Ad.Sal-rITR (Depósito ECACC P97082119) pBr/Ad.Bam-rITR foi digerido com BamRI e Sall. 0 fragmento do vector incluindo a inserção de adenovírus foi isolado em agarose LMP (SeaPlaque GTG) e ligado a um fragmento de SalI-BamRl com 4,8 kb obtido a partir de ADN de Ad5 do tipo selvagem e purificado com o kit Geneclean II (Bio 101, Inc.). Seleccionou-se um clone e a integridade das sequências de Ad5 foi determinada por análise de enzimas de restrição. O clone pBr/Ad.Sal-rITR continha sequências de adeno do tipo 5 desde o local Sall a pb 16746 até à ITR da direita inclusive (faltando a maior parte do resíduo G a 3'). 27 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ pBr/Ad. Cla-Bam (Depósito ECACC P97082117) ADN de adeno do tipo 5 do tipo selvagem foi digerido com Ciai e Bamtil, e o fragmento com 20,6 kb foi isolado do gel por electroeluição. O pBr322 foi digerido com as mesmas enzimas e purificado do gel de agarose por Geneclean. Ambos os fragmentos foram ligados e transformados em DH5a competentes. O clone resultante pBr/Ad.Cla-Bam foi analisado por digestão de enzimas de restrição e mostrou conter uma inserção com sequências de adenovirus desde pb 919 até 21566. pBr/Ad.Aflll-Bam (Depósito ECACC P97082114) O clone pBr/Ad.Cla-Bam foi linearizado com PcoRI (em PB r322) e digerido parcialmente com AflII. Após inactivação por calor de AflII por 20' a 65°C as extremidades do fragmento foram preenchidas com enzima Klenow. O ADN foi então ligado a um ligante oligo de cadeia dupla liso contendo um local PacI (5'-AATTGTCTTAATTAACCGCTTAA-3'). Este ligante foi realizado pela hibridação dos dois seguintes oligonucleótidos: 5'-AATTGTCTTAATTAACCGC-3' e 5'-AATTGCGGTTAATTAAGAC-3' , seguido de corte liso com a enzima Klenow. A seguir à precipitação do ADN ligado para se mudar de tampão, as ligações foram digeridas com um excesso de enzima PacI para remover concatâmeros do oligo. O fragmento parcial de 22016 pb contendo sequências de Ad5 desde pb 3534 até 21566 e as sequências do vector, foi isolado em agarose LMP (SeaPlaque GTG), ligado novamente e transformado em DH5a competentes. Um clone que tinha sido encontrado com um local PacI e que tinha retido o grande fragmento de adeno foi seleccionado e sequenciado na extremidade 5' para se verificar a inserção correcta do ligante PacI no local Aflll (perdido). pBr/Ad.Bam-r.ITRpac#2 (Depóstio ECACC P97082120) e pBr/Ad.Bam-rITRpac#8 (Depósito ECACC P97082121)
De modo a permitir a inserção de um local PacI próximo da ITR de Ad5 no clone pBr/Ad.Bam-rITR removeram-se cerca de 190 nucleótidos entre o local Ciai no esqueleto de pBr322 e o princípio das sequências de ITR. Isto foi feito como se segue: pBr/Ad.Bam-rITR foi digerido com Ciai e tratado com nuclease Bal31 por períodos de tempo variáveis (2', 5', 10' e 15'). O 28 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ grau de remoção do nucleótido foi seguido por reacções separadas no ADN de pBr322 (também digerido no local Ciai), empregando-se tampões e condições idênticas. A enzima Bal31 foi inactivada por incubação a 75°C por 10', o adn foi precipitado e ressuspenso num volume mais pequeno de tampão TE.
Para assegurar extremidades lisas, os ADN foram ainda tratados com ADN-polimerase de T4 na presença de excesso de dNTP. A seguir à digestão do ADN de pBr322 (controlo) com Sal I, observou-se uma degradação satisfatória (150 pb) nas amostras tratadas para 10' ou 15'. As amostras de pBr/Ad.Bam-rITR tratadas de 10' ou 15' foram então ligadas aos ligantes Pacl lisos descritos atrás (Refira-se a pBr/Ad.Af111-Bam). As ligações foram purificadas por precipitação, digeridas com excesso de Pacl e separadas dos ligantes num gel de agarose LMP. A seguir à religação, os ADN foram transformados em DH5a competentes e as colónias analisadas. Seleccionaram-se dez clones que exibiam uma deleção com o comprimento desejado aproximadamente e estes foram analisados adicionalmente por sequenciação T-track (kit de sequenciação de T7, Pharmacia Biotech). Dois clones foram encontrados com o ligante Pacl inserido imediatamente a jusante da ITR direita. A seguir à digestão com Pacl, o clone #2 tinha 28 pb e o clone #8 tinha 27 pb fixadas à ITR. pWE/Ad.AflII-rITR (Depósito ECACC P97082116) O vector cosmídico pWE15 (Clontech) foi usado para clonar inserções maiores de Ad5. Primeiro, um ligante contendo um local Pacl único foi inserido nos locais PcoRI de pWE15 criando pWE.pac. Para este fim, o oligo Pacl de cadeia dupla como descrito para pBr/Ad.AfIII-BamHI foi usado mas desta vez com as suas extremidades protuberantes PcoRl. Os seguintes fragmentos foram então isolados por electroeluição da gel de agarose: pWE.pac digerido com Pacl, pBr/Af111-Bam digerido com Pacl e BamHi e pBr/Ad.Bam-rlTR#2 digerido com BamHi e Pacl. Estes fragmentos foram ligados juntos e empacotados usando extractos de empacotamento de fago λ (Stratagene) de acordo com o protocolo do fabricante. Após infecção das bactérias
hospedeiras, as colónias foram crescidas em placas e analisadas para a presença da inserção completa. O 29 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ pWE/Ad.AfΙΙΙ-rlTR continha todas as sequências do adenovirus do tipo 5 desde pb 3534 (local Aflll) até à ITR direita inclusive (faltando a maior parte do resíduo G a 3'). pBr/Ad.UTR-Sal (9.4) (Depósito ECACC P97082115) ADN de adeno 5 do tipo selvagem foi tratado com a enzima Klenow na presença de excesso de dNTP e subsequentemente foi digerido com Sall. Dois dos fragmentos resultantes, designados de ITR-Sal(9.4) esquerdo e ITR-Sal(16.7) direito, respectivamente, foram isolados em agarose LMP (Seaplaque GTG) . ADN de pBr322 foi digerido com EcoRV e Sall e tratado com fosfatase (Life Technologies). 0 fragmento do vector foi isolado pelo método Geneclean (BIO 101, Inc.) e foi ligado aos fragmentos Sall de Ad5. Apenas a ligação com o fragmento de 9,4 kb deu colónias com uma inserção. A seguir à análise e sequenciação da borda de clonagem seleccionou-se um clone que continha a sequência de ITR completa e estendia-se até ao local Sall a pb 9462. pBr/Ad.UTR-Sal (16.7) (depósito ECACC P97082118) O pBr/Ad.ÍITR-Sal(9.4) foi digerido com Sall e desfosforilado (TSAP, Life Technologies). Para prolongar este clone até ao terceiro local Sall no Ad5, o pBr/Ad.Cla-Bam foi linearizado com BamRI e parcialmente digerido com Sall. Um fragmento Sall com 7,3 kb contendo sequências de adenovirus desde 9462-16746 foi isolado em gel de agarose lmp e ligado ao fragmento do vector pBr/Ad.1ITR-Sal(9.4) digerido por SalI.
pWE/Ad. Afl II-EcoRI O pWE.pac foi digerido com Ciai e as extremidades protuberantes 5' foram preenchidas usando enzima Klenow. O ADN foi então digerido com Pacl e isolado da gel de agarose. O pWE/AfΙΙΙ-rlTR foi digerido com EcoRI e a seguir ao tratamento com a enzima Klenow foi digerido com Pacl. O fragmento maior com 24 kb contendo as sequências adenovirais foi isolado da gel de agarose e ligado ao vector pWE.pac digerido com Ciai e liso por meio do kit Ligation Express™ da Clontech. Após transformação de células Ultracompetent XLIO-Gold de Stratagene, identificaram-se clones que continham a inserção esperada. O pWE/Af111-EcoRl continha sequências de Ad5 desde pb 3534-27336. 30 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Geração de pWE/Ad.AflII-rITRsp A ITR a 3' no vector pWE/Ad.Af111-rITR não incluem o nucleótido do terminal G. Além disso, o local PacI está localizado a quase 30 pb da ITR direita. Ambas estas caracteristicas podem diminuir a eficiência de geração de virus devido à iniciação ineficiente da replicação na ITR a 3'. Repare-se que durante a geração de virus a ITR esquerda no plasmideo adaptador estão intactas e permitem a replicação do ADN do virus depois da recombinação homóloga.
Para melhorar a eficiência de iniciação da replicação na ITR a 3', o pWE/Ad.Af111-rITR foi modificado como se segue: a construção pBr/Ad.Bam-rITRpac#2 foi primeiro digerida com PacI e a seguir parcialmente digerida com Avrll e o fragmento contendo o vector de 17,8 kb foi isolado e desfosforilado por meio da enzima SAP (Boehringer Mannheim). Este fragmento não tem as adeno-sequências desde o nucleótido 35464 até à ITR a 3'. Usando ADN de pWE/Ad.Af 111-rITR como molde e os iniciadores ITR-EPH: 5'-CGG AAT TCT TAA TTA AGT TAA CAT CAT CAA TAA TAT ACC-3' e
Adi01: 5'-TGA TTC ACA TCG GTC AGT GC-3' gerou-se um fragmento de PCR de 630 pb correspondente às sequências de Ad5 a 3'. Este fragmento de PCR foi subsequentemente clonado no vector pCR2.1 (Invitrogen) e os clones contendo o fragmento de PCR foram isolados e sequenciados para se verificar a amplificação correcta do ADN. O clone de PCR foi então digerido com PacI e Avrll e a inserção de adeno com 0,5 kb foi ligada ao fragmento do pBr/Ad.Bam-rITRpac#2 digerido com PacI e parcialmente com Avrll gerando pBr/Ad.Bam-rITRsp. A seguir utilizou-se esta construção para gerar um clone cosmidico (como descrito atrás) com uma inserção correspondente às adeno-sequências 3534 a 35938. Este clone foi denominado pWE/Af111-rlTRsp.
Geração de pWE/Ad.AfHI-rITRAE2A: A deleção das sequências de codificação de E2A do pWE/Ad.Af111-rITR (Depósito ECACC P97082116) foi conseguida como se segue. 31 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
As sequências adenovirais que flanqueiam a região de codificação E2A nos locais à esquerda e à direita foram amplificadas do plasmideo pBr/Ad.Sal.rlTR (Depósito ECACC P97082119) numa reacção de PCR com o sistema Expand PCR (Boehringer) de acordo com o protocolo do fabricante. Os seguintes iniciadores foram usados:
Sequências flanqueadoras à direita (nucleótidos 24033 a 25180do de Ad5 correspondentes): ΔΕ2Α.SnaBI: 5'-GGC GTA CGT AGC CCT GTC GAA AG-3'
ΔΕ2Α. DBP-start: 5'-CCA ATG CAT TCG AAG TAC TTC CTT CTC CTA TAG GC-3' O fragmento de ADN amplificado foi digerido com SnaBI e Nsil (o local Nsil é gerado no iniciador ΔΕ2Α.DBP-start, sublinhado).
Sequências flanqueadoras à esquerda (nucleótidos 21557 a 22442 de Ad5 correspondentes): ΔΕ2Α.DBP-stop: 5'-CCA ATG CAT ACG GCG CAG ACG G-3' ΔΕ2Α.BamHI: 5'-GAG GTG GAT CCC ATG GAC GAG-3' O ADN amplificado foi digerido com BamHI e Nsil (o local Nsil é gerado no iniciador ΔΕ2Α.DBP-stop, sublinhado).
Subsequentemente, os fragmentos de ADN digeridos foram ligados em pBr/Ad.Sal-rlTR digerido por SnaBI/BamHI. A sequenciação confirmou a substituição exacta da região de codificação de DBP por um único local Nsil no plasmideo pBr/Ad.Sal-rITRAE2A. O local Nsil único pode ser usado para introduzir uma cassete de expressão para um gene a ser transduzido pelo vector recombinante. A deleção das sequências de codificação de E2A foi realizada de tal modo que os locais aceitadores de splice do gene L4 de codificação de 100 K na posição 24048 na cadeia do topo foram deixados intactos. Além disso, os sinais de poliadenilação dos originais ARN de E2A e ARN de L3 no local à esquerda das sequências de codificação de E2A foram deixados 32 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ intactos. Isto assegura a expressão correcta dos genes L3 e do gene que codifica a proteína L4 de 100K durante o ciclo de vida do adenovírus. A seguir gerou-se o plasmídeo pWE/Ad.AfHI-rITRAE2A. 0 plasmídeo pBr/Ad.Sal-rITRAE2A foi digerido com Bamtil e Spel. 0 fragmento com 3,9 Kb, no qual a região de codificação de E2A tinha sido substituída pelo único local Nsil, foi isolado. 0 pWE/Ad.Aflii-rlTR foi digerido com Bamtil e Spel. 0 fragmento de ADN de 35 Kb, do qual se tinha removido o fragmento Bamtil/Spel contendo a sequência de codificação de E2A, foi isolado. Os fragmentos foram ligados e empacotados usando os extractos de empacotamento de fago λ de acordo com o protocolo do fabricante (Stratagene), originando o plasmídeo pWE/Ad.Af HI-rITRAE2A.
Este clone cosmídico pode ser usado para gerar vectores adenovirais que são eliminados para E2A por cotransfecção do ADN digerido com Paci juntamente com plasmídeos adaptadores digeridos, para células de empacotamento que expressam o produto do gene E2A funcional.
Construção de plasmídeos adaptadores A ausência de sobreposição de sequências entre o adenovírus recombinante e as sequências El na linha celular de empacotamento é essencial para a geração segura e isenta de RCA e propagação de vírus novos recombinantes. 0 plasmídeo adaptador pMLPI.TK (descrito em PCT/NL96/00244) é um exemplo de uma plasmídeo adaptador desenhado para se utilizar de acordo com o invento em combinação com as linhas celulares de empacotamento melhoradas do invento. Este plasmídeo foi usado como material de partida para se realizar um novo vector no qual moléculas de ácido nucleico compreendendo o promotor específico e as sequências do gene podem ser facilmente trocadas.
Em primeiro lugar, gerou-se um fragmento de PCR a partir do ADN molde de ρΖίρΔΜο+PyFlOl(N“) (descrito em PCT/NL96/00195) com os seguintes iniciadores: LTR-1: 5'-CTG TAC GTA CCA GTG CAC TGG CCT AGG CAT GGA AAA ATA CAT AAC TG-3' e LTR-2: 5' -GCG GAT CCT TCG AAC CAT GGT AAG CTT GGT ACC GCT 33 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ AGC GTT AAC CGG GCG ACT CAG TCA ATC G-3' . Utilizou-se ADN-polimerase Pwo (Boehringer Mannheim) de acordo com o protocolo do fabricante com os seguintes ciclos de temperatura: uma vez por 5' a 95°C; 3' a 55°C; e 1' a 72°C, e 30 ciclos de 1' a 95°C, 1' a 60°C, 1' a 72°C, seguido de uma vez por 10' a 72°C. O produto de PCR foi então digerido com Bamhl e ligado ao vector pMLPlO (Levrero et al.f 1991) digerido com PvuII e Bamhl, deste modo gerando o vector pLTRlO. Este vector contém sequências adenovirais desde pb 1 até pb 454 seguido por um promotor consistindo em uma parte de LTR de Mo-MuLV tendo as suas sequências potenciadoras do tipo selvagem substituídas pelo potenciador de um poliomavírus mutante (PyFlOl). O fragmento promotor foi denominado L420. A seguir, inseriu-se a região de codificação do gene de HSA murino. O pLTRlO foi digerido com BstBI seguido por tratamento com Klenow e digestão com Ncol. O gene de HSA foi obtido através de amplificação por PCR em pUC18-HSA (Kay et al., 1990) usando os seguintes iniciadores: HSA1, 5'-GCG CCA CCA TGG GCA GAG CGA TGG TGG C-3' e HSA2, 5'-GTT AGA TCT AAG CTT GTC GAC ATC GAT CTA CTA ACA GTA GAG ATG TAG AA-3'. O fragmento amplificado de 269 pb foi subclonado num vector vaivém usando-se os locais Ncol e BglII. Confirmou-se por sequenciação a incorporação da sequência de codificação correcta do gene de HSA, mas com uma extra inserção TAG directamente a seguir ao codão de paragem de TAG. A região de codificação do gene de HSA, incluindo a duplicação de TAG foi a seguir excisada como um fragmento Ncol(coesivo)-Sali(liso) e clonada no fragmento Ncol(coesivo)/BstBI(liso) com 3,5 kb de pLTRlO, resultando em pLTR-HSAl0.
Por fim, o pLTR-HSAlO foi digerido com EcoRI e Bamhl a seguir ao qual o fragmento contendo a itr esquerda, o sinal de empacotamento, o promotor L420 e o gene de HSA, foi inserido no vector pMLPl.TK digerido com as mesmas enzimas e deste modo substituindo as sequências do promotor e do gene. Isto resultou no novo plasmídeo adaptador pAd/L420-HSA que continha locais de reconhecimento convenientes para várias enzimas de restrição ao redor das sequências do promotor e do gene. SnaBI e Avrll podem ser combinadas com Hpal, NheI, Kpnl, HindIII para trocar sequências promotoras, enquanto que os últimos locais podem ser combinados com os locais Ciai ou Bamhl a 3' 34 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ da região de codificação de HSA para substituir genes nesta construção.
Outro plasmideo adaptador que foi desenhado para permitir a troca fácil de moléculas de ácido nucleico foi realizado substituindo as sequências do promotor, do gene e de poliA em pAd/L420-HSA com o promotor de CMV, um local de clonagem múltiplo, um intron e um sinal de poliA. Com este fim, pAd/L420-HSA foi digerido com ãvrll e Bglii seguido de tratamento com Klenow para se obter extremidades lisas. 0 fragmento de 5,1 kb com o vector pBr322 e as sequências adenovirais foi isolado e ligado a um fragmento de 1570 pb liso de pcDNAl/amp (Invitrogen) obtido por digestão com Hhal e Avrll seguido por tratamento com ADN-polimerase de T4. Este plasmideo adaptador foi denominado pAd5/CLIP. De modo a permitir a remoção de sequências de vector da ITR esquerda em pAd5/Clip, este plasmideo foi digerido parcialmente com EcoRI e o fragmento linear foi isolado. Um oligo da sequência 5'-TTAAGTCGAC-3' foi hibridado a si próprio resultando num ligante com um local SalI e ressalto ("overhang") EcoRI. O ligante foi ligado ao vector pAd5/Clip parcialmente digerido e seleccionaram-se clones que tinham o ligante inserido no local EcoRI a 23 pb a montante da ITR esquerda do adenovirus em pAd5/Clip resultando em pAd5/ClipSal. Da mesma maneira, o local EcoRI em pAd5/Clip foi alterado para um local EacI por inserção de um ligante da sequência 5'-AATTGTCTTAATTAACCGCAATT-3'. O vector pAd5/Clip foi parcialmente digerido com EcoRI, desfosforilado e ligado ao ligante Pacl com o ressalto EcoRI. A mistura de ligação foi digerida com Pacl para remover concatâmeros, isolada do gel de agarose e ligada novamente. O vector resultante foi denominado pAd5/Clippac. Estas alterações permitem maior flexibilidade para se libertar a ITR esquerda das sequências do vector plasmidico. O vector pAd5/L420-HSA foi também modificado para se criar um local Sall ou Pacl a montante da ITR esquerda. Para este fim, o pAd5/L420-HSA foi digerido com EcoRI e foi ligado ao ligante Pacl descrito anteriormente. A mistura de ligação foi digerida com Pacl e ligada novamente a seguir ao isolamento do ADN linear do gel de agarose para se remover os ligantes concatamerisados. Isto resultou no plasmideo 35 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ adaptador pAd5/L420-HSApac. Esta construção foi usada para gerar pAd5/L420-HSASal como se segue: pAd5/L420-HSApac foi digerido com Seal e BsrGI e o fragmento do vector foi ligado ao fragmento de 0,3 kb isolado após digestão de pAd5/ClipSal com as mesmas enzimas.
Geração dos plasmldeos adaptadores pAdMire e pAdApt
Para criar um plasmideo adaptador que contenha apenas uma sequência poliligante e não sequências de promotor ou de poliA, pAd5/L420-HSApac foi digerido com Avrll e BglII. O fragmento do vector foi ligado a um oligonucleótido ligante digerido com as mesmas enzimas de restrição. O ligante foi efectuado por hibridação de oligos da seguinte sequência: PLL-1: 5'- GCC ATC CCT AGG AAG CTT GGT ACC GGT GAA TTC GCT AGC GTT AAC GGA TCC TCT AGA CGA GAT CTG G-3' e PLL-2: 5'- CCA GAT CTC GTC TAG AGG ATC CGT TAA CGC TAG CGA ATT CAC CGG TAC CAA GCT TCC TAG GGA TGG C-3'.
Os ligantes hibridados foram digeridos com Avrll e BglII e separados de extremidades pequenas por purificação em coluna (kit para remoção de nucleótidos de Qiaquick) de acordo com as recomendações do fabricante. O ligante foi então ligado ao fragmento de pAd5/L420-HSApac digerido com Avrll/Bglll. Um clone denominado AdMire, que tinha o ligante incorporado, foi seleccionado e sequenciado para se verificar a integridade da inserção. O plasmideo adaptador AdMire permite a inserção fácil de cassetes de expressão completas.
Um plasmideo adaptador contendo o promotor do CMV humano que medeia níveis de expressão elevados em células humanas foi construído como se segue: pAd5/L420-HSApac foi digerido com Avrll e as extremidades protuberantes 5' foram preenchidas usando enzima Klenow. Uma segunda digestão com HindIII resultou na remoção das sequências do promotor L420. O fragmento do vector foi isolado e ligado a um fragmento de PCR contendo a sequência do promotor de CMV. O fragmento de PCR foi obtido a seguir à amplificação das sequências de CMV do pCMVLacI (Stratagene) com os seguintes iniciadores: 36 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ CMVplus: 5'-GATCGGTACCACTGCAGTGGTCAATATTGGCCATTAGCC-3' e CMVminA: 5'-GATCAAGCTTCCAATGCACCGTTCCCGGC-3'. 0 fragmento de PCR foi primeiro digerido com Pstl (sublinhado em CMVplus) a seguir ao qual as extremidades protuberantes 3' foram removidas por tratamento com ADN-polimerase de T4. A seguir o ADN foi digerido com HindIII (sublinhado em CMVminA) e ligado ao fragmento do vector pAd5/L420-HSApac descrito anteriormente digerido com Avrll e HindIII. 0 plasmideo resultante foi denominado pAd5/CMV-HSApac. Este plasmideo foi então digerido com HindIII e BamHl e o fragmento do vector foi isolado e ligado à sequência poliligante obtida após digestão de AdMire com HindIII e BglII. 0 plasmideo resultante foi denominado pAdApt. 0 plasmideo adaptador pAdApt contém os nucleótidos -735 a +95 do promotor do CMV humano (Boshart et al., 1985). Uma segunda versão deste plasmideo adaptador contendo um local Sall no lugar do local Paci a montante da ITR esquerda foi realizada pela inserção do fragmento Scal-BsrGI com 0,7 kb do pAd5/Clipsal em pAdApt digerido com Seal e parcialmente digerido com SsrGI. Este clone foi denominado pAdApt.sal.
Geração de adenovírus recombinantes baseados em Ad5
Adenovirus recombinantes isentos de RCA podem ser gerados muito eficientemente utilizando os plasmideos adaptadores descritos atrás e as construções pWe/Ad.AflII-rITR ou pWE/Ad.Af111-rITrsp.
Geralmente, o plasmideo adaptador contendo o transgene desejado na cassete de expressão desejada é digerido com enzimas adequadas para libertar a inserção das sequências de vector nas extremidades 3' e/ou 5'. Os plasmideos adenovirais de complementação pWE/Ad.Af111-rlTR ou pWE/Ad.Af111-rITRsp são digeridos com Paci para libertar as sequências adeno dos plasmideos do vector. Como exemplo não limitativo, descreve-se a geração de AdApt-LacZ. O plasmideo adaptador pAdApt-LacZ foi gerado como se segue. O gene LacZ de E.coli foi amplificado do plasmideo pMLP.nlsLacZ (EP 95-202 213) por PCR com os iniciadores 5'-GGGGTGGCCAGGGTACCTCTAGGCTTTTGCAA-3' e 5'-GGGGGGATCCATAAACAAGTTCAGAATCC-3'. A reacção de PCR foi 37 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ conduzida com Εχ Tag (Takara) de acordo com o protocolo dos fornecedores no seguinte programa de amplificação: 5 minutos a 94°C, 1 ciclo; 45 segundos a 94°C e 30 segundos a 60°C e 2 minutos a 72°C, 5 ciclos; 45 segundos a 94°C e 30 segundos a 65°C e 2 minutos a 72°C, 25 ciclos; 10 minutos a 72°C; 45 segundos a 94°C e 30 segundos a 60°C e 2 minutos a 72°C, 5 ciclos, I ciclo. O produto de PCR foi subsequentemente digerido com Kpnl e BamHl e o fragmento de ADN digerido foi ligado em pcDNA3 digerido com Kpnl/BamHl (Invitrogen), dando origem a pcDNA3.nlsLacZ. A construção pcDNA3.nlsLacZ foi então digerida com Kpnl e Bamhl e o fragmento LacZ com 3 kb foi isolado do gel com o kit Geneclean Spin (Bio 101, Inc.). O pAdApt foi também digerido com Kpnl e Bamtil e o fragmento linear do vector foi isolado da gel como anteriormente. Ambos os fragmentos isolados foram ligados e um clone contendo a inserção LacZ foi seleccionado. A construção pAdApt-LacZ foi digerida com Sal I, purificada com o kit
Geneclean Spin e subsequentemente digerida com Paci. O pWE/Ad.Af111-rITRsp foi digerido com PacI. Ambas as misturas de digestão foram tratadas por 30' a 65°C para inactivar as enzimas. As amostras foram colocadas em gel para se estimar a concentração. Semearam-se 2,5xl06 células PER.C6 (Número de depósito ECACC 96022940) em balões T25 em DMEM com FCS a 10% e MgCl 10 mM. No dia seguinte, transfectou-se quatro microgramas de cada plasmídeo para células PER.C6 (Número de depósito ECACC 96022940) usando reagentes de transfecção de lipofectamina (Life Technologies Inc.) de acordo com as instruções do fabricante. No dia seguinte o meio foi substituído por meio de cultura novo e a cultura de células continuou a 37°C, CO2 a 10%. Novamente, 24 h mais tarde, as células foram tripsinizadas, semeadas em balões T80 e a cultura prosseguiu a 37°C, C02 a 10%. Obteve-se CPE completo 6 dias depois de semear o balão T80. As células foram colhidas no meio e sujeitas a um ciclo de congelação/descongelação. O lisado bruto obtido desta maneira foi usado para purificar a mistura de vírus por formação de placas fágicas. Dez placas foram escolhidas, expandidas numa placa de 24 poços e testadas para a expressão de LacZ a seguir à infecção de células A549. Os vírus das dez placas todas expressavam LacZ. 38 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Exemplo 3
Geração de adenovírus recombinantes quiméricos
Geração de adenovírus quiméricos de hexão baseados em Ad5
Os anticorpos neutralizantes do soro humano são dirigidos principalmente à proteína do hexão e a um grau menor, à proteína do pentão. As proteínas do hexão de diferentes serótipos exibem regiões altamente variáveis presentes em ansas ("loops") que se preveem estar expostas ao exterior do vírus (Athappilly et al.r 1994; J. Mol. Biol. 242, 430-455). A maioria de epítopos específicos de tipo foi mapeado nestas regiões altamente variáveis (Toogood et ai., 1989; J. Gen Virol. 70, 3203-3214). Assim, a substituição das sequências de hexão (parte de) com as correspondentes sequências de um serótipo diferente é uma estratégia eficaz para evitar os anticorpos neutralizantes (preexistentes) de Ad5. As sequências de codificação de hexão do serótipo de adenovírus 5 estão localizadas entre os nucleótidos 18841 e 21697.
Para facilitar a troca fácil das sequências de codificação de hexão de serótipos de adenovírus alternativos para o esqueleto do serótipo de adenovírus 5, gerou-se primeiro um vector vaivém.
Este subclone, de código pBr/Ad.Eco-Pmel, foi gerado digerindo primeiro o plasmídeo pBr322 com EcoRi e EcoRV e inserindo o fragmento Pmel-EcoRI de 14 kb de pWE/Ad.Af111-Eco. Neste vector vaivém fez-se uma deleção de um fragmento SanDI de 1430 pb por digestão com SanDI e religação para dar pBr/Ad.Eco-Pmel ASanDI. O fragmento removido contém locais Spel e Muni únicos. O ADN do serótipo de adenovírus 5 que codifica o hexão foi eliminado de pBr/Ad.Eco-Pmel ASanDI.
Para este fim, as sequências flanqueadoras do hexão foram amplificadas por PCR e ligadas uma à outra gerando-se deste modo locais de restrição únicos substituindo a região de codificação do hexão. Para estas reacções de PCR foram requeridos quatro oligonucleótidos diferentes: Ahexl-Ahex4.
Ahexl: 5'- CCT GGT GCT CCC AAC AGC-3'
Ahex2: 5'- CCG GAT CCA CTA GTG GAA AGC GGG CGC GCG-3' 39 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Ahex3: 5'- CCG GAT CCA ATT GAG NAG CAA GCA ACA TCA ACA AC-3' Ahex4: 5'- GAG AAG GGC ATG GAG GCT G-3' 0 produto de ADN amplificado de ± 1100 pb obtido com os oligonucleótidos Ahexl e Ahex2 foi digerido com BamEI e Fsel. O produto de ADN amplificado de ± 1600 pb obtido com os oligonucleótidos Ahex3 e Ahex4 foi digerido com Bamtil e Sbfl. Estes fragmentos de PCR digeridos foram subsequentemente purificados do gel de agarose, e numa reacção de ligação de três partes usando a enzima ligase de T4, foram ligados a pBr/Ad.Eco-Pmel ASanDI digerido com Fsel e Sbfl. A construção resultante foi codificada de pBr/Ad.Eco-PmeAHexon. Esta construção foi sequenciada em parte para confirmar a sequência nucleotidica correcta e a presença de locais únicos de restrição Muni e Spel. O pBr/Ad.Eco-PmeAHexon serve como um vector vaivém para introduzir sequências de hexão heterólogas amplificadas do ADN de vírus de diferentes serótipos usando iniciadores que introduzem os locais únicos de restrição Muni e Spel nas extremidades 5' e 3' respectivamente das sequências de hexão. Para gerar vectores baseados em Ad5 que contêm sequências de hexão dos serótipos para os quais indivíduos saudáveis não têm, ou têm muito baixos títulos de NAB, as sequências de hexão de Ad35, Ad34, Ad26 e Ad48 foram amplificadas usando os seguintes iniciadores:
Hex-up2: 5'-GACTAGTCAAGATGGCYACCCCHTCGATGATG-3' e
Hex-do2: 5'-GCTGGCCAATTGTTATGTKGTKGCGTTRCCGGC-3'.
Estes iniciadores foram desenhados usando sequências de regiões de codificação de hexão publicadas (por exemplo sequências de hexão de Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad7, Adi6, Ad40 e Ad41 podem ser obtidas de Genbank). Nucleótidos degenerados foram incorporados em posições que mostram variação entre serótipos.
Os produtos de PCR foram digeridos com Spel e Muni e clonados na construção pBr/Ad.Eco-PmeAHexon digerida com as mesmas enzimas. 40 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
As sequências modificadas de hexão foram subsequentemente introduzidas na construção pWE/Ad.Af111-rlTR por troca do fragmento Asei gerando pWE/Ad.Af111-rITRHexXX onde XX significa o serótipo usado para amplificar sequências de hexão.
As construções pWE/Ad.Aflll-rlTRHexXX foram então usadas para realizar vírus da mesma maneira como descrito anteriormente para os vírus recombinantes Ad5.
Geração de vírus recombinantes quiméricos de pentão baseados em Ad5 0 gene do pentão do adenovírus do tipo 5 está localizado entre as sequências 14156 e 15869. A base do pentão é a proteína da cápside do adenovírus que medeia a internalização do vírus na célula alvo. Pelo menos alguns serótipos (do tipo C e B) mostraram realizar isto por interacção de uma sequência RGD no pentão com integrinas da superfície celular.
Contudo, os adenovírus do tipo F não têm uma sequência RGD e para a maioria dos vírus dos grupos A e D, a sequência de pentão não é conhecida. Assim, o pentão pode estar envolvido na especificidade da célula alvo. Além disso, como uma proteína da cápside, a proteína do pentão está envolvida na imunogenicidade do adenovírus (Gahery-Segard et al., 1998). Portanto, a substituição das sequências de pentão de Ad5 por sequências de pentão de serótipos para os quais não existem, ou existem baixos títulos de NAB, em adição à substituição das sequências de hexão, evitará a eliminação do vector adenoviral mais eficientemente do que somente a substituição do hexão. A substituição de sequências de pentão pode também afectar a especificidade da infecção.
Para ser possível introduzir sequências de pentão heterólogas em Ad5 fez-se uso do sistema baseado em plasmídeo descrito atrás.
Primeiro, realizou-se um vector vaivém para sequências de pentão pela inserção do fragmento Nhel-EcoRV de 7,2 kb da construção pWE/Ad.Af111-EcoRI em pBr322 digerido com as mesmas enzimas. 0 vector resultante foi denominado pBr/XN. Deste 41 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ plasmídeo eliminaram-se sequências de pentão de Ad5 e substituíram-se por locais de restrição únicos que foram então usados para se introduzir novas sequências de pentão de outros serótipos. Para este fim, as sequências flanqueadoras à esquerda do pentão em pBr/XN foram amplificadas por PCR usando os seguintes iniciadores: DP5-F: 5'- CTG TTG CTG CTG CTA ATA GC-3' e DP5-R: 5'- CGC GGA TCC TGT ACA ACT AAG GGG AAT ACA AG-3' 0 DP5-R tem um local BamRI (sublinhado) para ligação à sequência flanqueadora da direita e também introduz um único local BsrGI (a negrito) na extremidade 5' da região anterior do pentão de Ad5. A sequência flanqueadora da direita foi amplificada usando: DP3-F: 5'-CGC GGA TCC CTT AAG GCA AGC ATG TCC ATC CTT-3' e DP3-3R: 5'- AAA ACA CGT TTT ACG CGT CGA CCT TTC-3' 0 DP3-F tem um local BamHl (sublinhado) para ligação à sequência flanqueadora da esquerda e também introduz um único local AflII (a negrito) na extremidade 3' da região anterior do pentão de Ad5.
Os dois fragmentos resultantes de PCR foram digeridos com BamHl e ligados um ao outro. A seguir esta mistura de ligação foi digerida com Avrll e Bglll. 0 pBr/XN foi também digerido com Avrll e BglII e o fragmento do vector foi ligado aos fragmentos de PCR ligados e digeridos. 0 clone resultante foi denominado pBr/Ad.Apenton. As sequências de codificação do pentão de Ad35, Ad34, Ad26 e Ad48 foram amplificadas por PCR de tal modo que as extremidades 5' e 3' continham os locais BsrGI e Aflll respectivamente. Para este fim, usaram-se os seguintes iniciadores:
Para Ad34 e Ad35: P3-for: 5'-GCT CGA TGT ACA ATG AGG AGA CGA GCC GTG CTA-3' P3-rev: 5'-GCT CGA CTT AAG TTA GAA AGT GCG GCT TGA AAG-3'
Para Ad26 e Ad48: P17F: 5'-GCT CGA TGT ACA ATG AGG CGT GCG GTG GTG TCT TC-3' 42 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ P17R: 5'-GCT CGA CTT AAG ΤΤΑ GAA GGT GCG ACT GGA AAG C-3'
Os produtos amplificados por PCR foram digeridos com BfrI e BsrGi e clonados em pBr/Ad.Apenton digerido com as mesmas enzimas. A introdução destas sequências de pentão heterólogas em pBr/Ad.Apenton gerou construções denominadas pBr/Ad.pentonXX onde XX representa o número do serótipo correspondente ao serótipo usado para se amplificar as sequências de pentão inseridas. Subsequentemente, as novas sequências de pentão foram introduzidas no vector pWE/Ad.AfllII-rITR tendo um hexão modificado. Por exemplo, sequências de pentão de Ad35 foram introduzidas na construção pWE/Ad.AfHl-rITRHex35 por troca do fragmento Fsel comum. Também se realizaram outras combinações de sequências de pentão e hexão. Vírus com sequências de pentão e hexão modificadas foram realizados como descrito anteriormente usando cotransfecção com um plasmídeo adaptador em células PER.C6 (Número de depósito ECACC 96022940). Além disso, introduziram-se sequências de pentão na construção pWE/Ad.Af111-rITR. As últimas construções contêm só um pentão modificado e vírus gerados destas construções serão usados para estudar a contribuição das sequências de pentão para a neutralização de adenovírus e também para análise de possíveis alterações na eficiência de infecção e especificidade.
Geração de vírus quiméricos de fibra baseados em Ad5 A infecção por adenovírus é mediada por duas proteínas da cápside de fibra e pentão. A ligação do vírus às células é conseguida por interacção da proteína da fibra protuberante com um receptor na superfície celular. A internalização toma lugar a seguir à interacção da proteína do pentão com integrinas na superfície celular. Pelo menos alguns adenovírus dos subgrupos C e B demonstraram utilizar um receptor diferente para a ligação celular e por isso têm eficiências de infecção diferentes em diferentes tipos de células. Assim é possível alterar o espectro de infecção de adenovírus mudando a fibra do cápside. A sequência de codificação da fibra do serótipo de adenovírus 5 está localizada entre os nucleótidos 31042 e 32787. Para remover o ADN do serótipo de adenovírus 5 que codifica fibra começou-se com a construção 43 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ pBr/Ad.Bam-rITR. Primeiro, removeu-se um local Nde I desta construção. Para este fim, o ADN do plasmideo pBr322 foi digerido com Nde1, a seguir ao qual, as extremidades protuberantes foram preenchidas usando a enzima Klenow. Este plasmideo pBr322 foi então ligado novamente, digerido com NdeI e transformado em DH5a de E.coli. 0 plasmideo pBr/ANdel obtido foi digerido com Seal e Sall e o fragmento do vector de 3198 pb resultante foi ligado ao fragmento Scal-Sall de 15349 pb derivado de pBr/Ad.BamrlTR, resultando no plasmideo pBr/Ad.Bam-rITRANdel o qual continha assim um local NdeI único. A seguir efectuou-se PCR com os oligonucleótidos NY-up: 5'- CGA CAT ATG TAG ATG CAT TAG TTT GTG TTA TGT TTC AAC GTG-3' e NY-down: 5'-GGA GAC CAC TGC CAT GTT-3'
Durante a amplificação, ambos os sitios de restrição, NdeI (a negrito) e a NsiI (sublinhado) foram introduzidos para facilitar a clonagem dos ADN da fibra amplificados. A amplificação consistiu de 25 ciclos, cada um de 45 s. a 94°C, 1 min. a 60°C, e 45 s. a 72°C. A reacção de PCR continha 25 pmol dos oligonucleótidos NY-up ou NY-down, dNTP 2mM, tampão de PCR com MgCl2 1,5 mM, e 1 unidade de polimerase estável ao calor Elongase (Gibco, Holanda). Um décimo do produto de PCR foi passado em gel de agarose que demonstrou que o esperado fragmento de ADN de ± 2200 pb tinha sido amplificado. Este fragmento de PCR foi subsequentemente purificado com o sistema de kit Geneclean (BiolOl Inc.). A seguir, tanto a construção pBr/Ad.Bam-rITRANdel assim como o produto de PCR foram digeridos com enzimas de restrição NdeI e Sbfl. O fragmento de PCR foi subsequentemente clonado usando a enzima ligase de T4 no pBr/Ad.Bam-rlTRANdel digerido por NdeI e Sbfl, gerando pBr/Ad.BamRÚFib.
Este plasmideo permite a inserção de qualquer sequência de fibra amplificada por PCR através dos locais únicos NdeI e NsiI que estão inseridos em lugar da sequência de fibra removida. Os virus podem ser gerados por uma recombinação homóloga dupla em células de empacotamento descritas na patente No. PCT/NL96/00244 usando um plasmideo adaptador, a 44 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ construção pBr/Ad.Aflll-EcoRI digerida com PacI e EcoRl e uma construção pBr/Ad.BamRAFib na qual sequências heterólogas de fibra foram inseridas. Para aumentar a eficiência de geração de virus, a construção pBr/Ad.BamRAFib foi modificada de modo a gerar um local PacI a flanquear a ITR direita. Para isto, digeriu-se pBr/Ad.BamRAFib com Avrll e o fragmento de adeno com 5 kb foi isolado e introduzido no vector pBr/Ad.Bam-rITR.pac#8 descrito atrás substituindo o fragmento Avrll correspondente. A construção resultante foi denominada pBr/Ad.BamRAF ib.pac.
Uma vez que uma sequência de fibra heteróloga é introduzida em pBr/Ad.BamRAFib.pac, o clone de adenovirus do lado direito de fibra modificada é introduzido num grande clone cosmidico como descrito anteriormente para pWE/Ad.AfIII-rlTR. Este cosmideo grande permite a geração de adenovirus através de apenas uma recombinação homóloga. Virus baseados em Ad5 com fibras modificadas foram realizados e descritos (nos. 98204482.8 e 99200624.7). Além disso, as sequências de pentão e hexão dos serótipos deste invento são combinadas com as sequências de fibra desejadas para gerar virus os quais infectam a célula alvo seleccionada muito eficientemente. Por exemplo, as células de músculos lisos, células endoteliais ou sinoviócitos, todos de origem humana, são infectados muito bem com virus baseados em Ad5 com uma fibra de virus do subgrupo B, especialmente do tipo 16 de adenovirus.
Os exemplos descritos atrás nos quais sequências especificas podem ser eliminadas do esqueleto de Ad5 de plasmideos e substituídas por sequências correspondentes de outros serótipos, mostra claramente a flexibilidade do sistema. É evidente que através dos métodos descritos anteriormente, qualquer combinação de genes da cápside de serótipos diferentes pode ser realizada. Assim, os adenovirus quiméricos recombinantes baseados em Ad5 são desenhados com as sequências de hexão e pentão desejadas tornando o vírus menos sensível à neutralização, e com as sequências de fibra desejadas para permitir infecção eficiente de tecidos alvo específicos. 45 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Exemplo 4
Construção de um sistema baseado em plasmídeos para gerar vírus recombinantes de Ad35 Já foram publicados mapas de restrição parcial de Ad35 (Valderrama-Leon et al., 1985; Kang et al., 1989; Li et al. 1991). Um exemplo de um sistema funcional baseado em plasmídeos para gerar adenovírus recombinantes com base em Ad35 consiste dos seguintes elementos: 1. Um plasmídeo adaptador compreendendo uma ITR esquerda e sequências de empacotamento derivadas de Ad35 e pelo menos um local de restrição para inserção de uma cassete de expressão heteróloga e sem sequências El. Além disso, o plasmídeo adaptador contém sequências de Ad35 a 3' da região de codificação ElB incluindo o promotor pIX e suficientes sequências de codificação para mediar a recombinação homóloga do plasmídeo adaptador com um segundo nucleótido. 2. Um segundo nucleótido compreendendo sequências homólogas ao plasmídeo adaptador e sequências de Ad35 necessárias à replicação e empacotamento do vírus recombinante, isto é, genes precoces, intermediários e tardios que não estão presentes na célula de empacotamento. 3. Uma célula de empacotamento que proporciona pelo menos proteínas El funcionais capazes de complementar a função El de Ad35 . ADN de Ad35 foi isolado de um lote purificado de vírus como se segue. A 100 μΐ de solução-mãe de vírus (Ad35: 3.26xl012 VP/ml) adicionou-se 10 μΐ de tampão lOx ADNase (Tris-HCl 130 mM pH 7,5; CaCl2 1,2 M; MgCl2 50mM) . A seguir à adição de 10 μΐ de ADNase I a 10 mg/ml (Roche Diagnostics) a mistura foi incubada por 1 h. a 37°C. Após adição de 2,5 μΐ de EDTA 0,5 M, 3,2 μΐ de SDS a 20% e 1,5 μΐ de ProteinaseK (Roche Diagnostics; 20 mg/ml), as amostras foram incubadas a 50°C por 1 h. A seguir, o ADN virai foi isolado usando o kit Geneclean spin (BiolOl Inc.) de acordo com as instruções do fabricante. O ADN foi eluído da coluna de spin com 25 μΐ de água estéril MilliQ. 46 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Os seguintes tamanhos de fragmentos de ADN e numeração de fragmentos serão usados de acordo com Kang et al. (1989). O ADN de Ad35 foi digerido com EcoRl e os três fragmentos (aproximadamente 22,3 (A), 7,3 (B) e 6 kb (C)) foram isolados do gel usando o kit Geneclean (BiolOl, Inc.). 0 pBr322 foi digerido com EcoRl ou com EcoRl e EcoRV e os fragmentos digeridos foram isolados do gel e desfosforilados com a enzima Tsap (Gibco BRL). A seguir, o fragmento C de Ad35 com 6 kb foi ligado ao fragmento de pBr322xEcoRi e o fragmento de ADN contendo a ITR (EcoRI-B) foi ligado ao fragmento de pBr322xEcoRI/EcoRV. As ligações foram incubadas a 16°C durante a noite e transformadas em bactérias DH5a competentes (Life Techn.). Mini-preparações de colónias obtidas foram analisadas para a inserção correcta dos fragmentos de Ad35 por análise de restrição. Ambos os fragmentos de Ad35, o de 6 kb e o de 7,3 kb, foram encontrados correctamente inseridos em pBr322. 0 fragmento de 6kb foi isolado em ambos os sentidos, pBr/Ad35-Eco6.0+ e pBr/Ad35-Eco6.0“ onde o + significa o sentido de 5' a 3' relativamente a pBr322. O clone com a inserção B de Ad35 com 7,3 kb, denominado pBr/Ad35-Eco7.3 foi sequenciado parcialmente para se verificar a ligação correcta da ITR a 3'. Determinou-se que a ITR tinha a sequência 5'- CATCATCAAT...-3' na cadeia mais baixa. A seguir o pBr/Ad35-Eco7.3 foi estendido à extremidade 5' por inserção do fragmento de Ad35 com 6kb. Para este fim, o pBr/Ad35-Eco7.3 foi digerido com EcoRl e desfosforilado. O fragmento foi isolado do gel e ligado ao fragmento EcoRl de Ad35 com 6kb. Após transformação, os clones foram testados para a orientação correcta da inserção e um clone foi seleccionado, denominando-se pBr/Ad35-Ecol3.3.
Este clone foi então estendido com o fragmento Sall D de *5,4 kb obtido a seguir à digestão de Ad35 do tipo selvagem com SalI. Para isto, o local Sall no esqueleto de pBr322 foi removido por digestão parcial de pBr/Ad35-Ecol3.3 com SalI, preenchendo-se as extremidades pegajosas por meio de tratamento com Klenow e religação. Um clone que continha um único local SalI na inserção adenoviral foi seleccionado. Este clone, denominado pBrásal/Ad35-Ecol3.3, foi então linearizado com Aatll que está presente no esqueleto de pBr322 e foi ligado a um ligante Sall com as extremidades complementares AatlI. O ADN foi então digerido com excesso de Sall e o fragmento linear foi isolado e ligado ao fragmento Sall D de 47 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 5.4 kb de Ad35. Um clone que continha o fragmento Sal I inserido no sentido correcto em pBr/Ad35-Ecol3.3 foi seleccionado. 0 clone resultante, pBr/Ad35.Sal2-rITR continha o 3' com *17 kb de Ad35 incluindo a ITR direita. Para permitir a libertação da ITR direita das sequências de vector durante a geração do virus, introduziu-se por PCR um local NotI a flanquear a ITR direita. 0 fragmento EcoRl A de Ad35 com 22,3 kb foi também clonado em pBr322xEcoRI/EcoRV. Seleccionou-se um clone, denominado pBr/Ad35-EcoA3', que parecia ter uma deleção de aproximadamente 7kb na extremidade 5'. 0 clone continha o local Sall a 9,4 kb no ADN de Ad35 do tipo selvagem e aproximadamente 1,5 kb de sequências a montante. Usando este local Sall e o único local NdeI no esqueleto de pBr322 este clone foi prolongado à extremidade 5' por inserção de um fragmento de Ad35 de aproximadamente 5 kb a 5' do primeiro Sall em Ad35 de tal modo que se criou um local de restrição NotI na extremidade 5' de Ad35 por inserção de um ligante.
Este clone, denominado pBr/Ad35.pIX-EcoA, não contém as sequências da extremidade esquerda (ITR, sequências de empacotamento e El) e na extremidade 3' tem aproximadamente 3.5 kb de sobreposição com o clone pBr/Ad35.sal2-rITR.
De modo a criar um plasmideo adaptador, o Ad35 foi digerido com Sall e o fragmento B da extremidade esquerda com *9,4 kb foi isolado. 0 pBr322 foi digerido com EcoRV e SalI, isolado do gel e desfosforilado com a enzima Tsap. Ambos os fragmentos são ligados e seleccionam-se clones com a inserção correcta e a sequência correcta da ITR esquerda. Para permitir a libertação da ITR esquerda das sequências de vector durante a geração de virus, um local NotI a flanquear a ITR esquerda é introduzido por PCR. As sequências El deste clone são eliminadas e substituídas por uma sequência poliligante usando PCR. A sequência poliligante é usada para introduzir uma cassete de expressão para um gene de escolha.
Clones recombinantes de Ad35 são gerados por transfecção de células PER.C6 com o plasmideo adaptador, pBr/Ad35.pIX-£coA e pBr/Ad35.Sal2-rITR como a Figura 3 mostra. A recombinação homóloga dá origem a vírus recombinantes. 48 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Exemplo 5 A prevalência de actividade neutralizante (NA) de Ad35 é baixa no soro humano de diferentes localizações geográficas
No Exemplo 1 descreveu-se a análise da actividade neutralizante (NA) no soro humano de uma localização na Bélgica. Espantosamente, de um painel de 44 serótipos de adenovirus testados, um serótipo, o Ad35, não foi neutralizado em qualquer um dos 100 soros ensaiados. Além disso, determinou-se que uns poucos serótipos, Ad26, Ad34 e Ad48, eram neutralizados em 8%, ou menos, dos soros testados. Esta análise foi alargada a outros serótipos de adenovirus ainda não testados e, usando uma selecção de serótipos do primeiro rastreio, foi também estendida a soros de diferentes localizações geográficas.
Para este fim, os adenovirus foram propagados, purificados e testados para neutralização no ensaio de inibição de CPE como descrito no Exemplo 1. Usando os soros do mesmo lote do Exemplo 1, os serótipos de adenovirus 7B, 11, 14, 18 e 44/1876 foram testados para neutralização.
Determinou-se que estes virus eram neutralizados em respectivamente 59, 13, 30, 98 e 54 % dos soros. Assim, desta série, Adll é neutralizado com uma frequência relativamente baixa.
Como é sabido que a frequência de isolamento de serótipos de adenovirus do tecido humano assim como a prevalência de NA de serótipos de adenovirus pode diferir para diferentes localizações geográficas, ainda foi testada uma selecção de serótipos de adenovirus contra o soro proveniente de diferentes lugares. Obteve-se soro humano de dois lugares adicionais na Europa (Bristol, Reino Unido e Leiden, Holanda) e de dois lugares nos Estados Unidos (Stanford, CA e Great Neck, NY) . Os adenovirus que foram encontrados neutralizados em 20% ou menos do soro no primeiro rastreio, assim como Ad2, Ad5, Ad27, Ad30, Ad38, Ad43, foram testados para neutralização nos soros do Reino Unido. Os resultados destes testes estão apresentados na Figura 4. 49 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Os serótipos de adenovírus 2 e 5 foram neutralizados novamente numa percentagem elevada de soro humano. Além disso, alguns dos serótipos que foram neutralizados com uma baixa percentagem de soro no primeiro rastreio, foram neutralizados com uma percentagem mais alta de soro do Reino Unido, por exemplo Ad26 (7% vs. 30%), Ad28 (13% vs. 50%), Ad34 (5% vs. 27%) e Ad48 (8% vs. 32%). A actividade de neutralização contra a Adll e Ad49 que foi encontrada a uma percentagem relativamente baixa de soro no primeiro rastreio, foi encontrada a uma percentagem ainda mais baixa neste segundo rastreio (13% vs. 5% e 20% vs. 11% respectivamente) . O serótipo Ad35 que não tinha sido neutralizado em qualquer dos soros no primeiro rastreio, foi agora neutralizado a uma percentagem baixa (8%) de soro do Reino Unido. A prevalência de NA no soro humano do Reino Unido é a mais baixa em relação aos serótipos Adll e Ad35.
Para análises adicionais, obteve-se soro de duas localizações nos Estados Unidos (Stanford, CA e Great Neck, NY) e da Holanda (Leiden). A Figura 5 apresenta uma apreciação dos resultados obtidos com estes soros e os resultados anteriores. Nem todos os vírus foram testados em todos os soros, excepto para Ad5, Adll e Ad35. A conclusão geral deste rastreio abrangente do soro humano é que a prevalência de actividade neutralizante contra Ad35 é a mais baixa de todos os serótipos nos países ocidentais: em média 7% do soro humano contém actividade neutralizante (5 localizações diferentes).
Outro adenovírus do grupo B, Adll, é também neutralizado a uma percentagem baixa de soro humano (em média 11% no soro de 5 localizações diferentes) . O adenovírus do tipo 5 é neutralizado em 56% do soro humano obtido de 5 localizações diferentes.
Embora não tenha sido testado em todos os soros, o serótipo 49 do grupo D é também neutralizado com uma frequência relativamente baixa em amostras da Europa e de uma localização dos Estados Unidos (14% em média).
Nos testes de neutralização descritos atrás, um soro é considerado não neutralizante quando no poço com a concentração mais alta de soro, a máxima protecção de CPE é 50 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 40% comparado com os controlos sem soro. A protecção é calculada como se segue: DO poço correspondente-OD vírus controlo %Protecção=-—-^-;- x 100% DO controlo não infectado-OD vírus controlo
Como descrito no Exemplo 1, o soro é plaqueado em cinco diluições diferentes indo desde 4x a 64x diluído.
Portanto, é possível distinguir entre títulos baixos (i.e. neutralização só às mais altas concentrações de soro) e títulos elevados de NA (i.e. neutralização também em poços com a concentração mais baixa de soro) . Relativamente ao soros humanos usado neste rastreio que foram encontrados com actividade neutralizante de Ad5, 70% tinha títulos altos enquanto que do soro com NA de Ad35, só 15% tinha títulos elevados. Entre os soros positivos para NA de Adll, só 8% tinha títulos altos.
Para Ad49 este valor era de 5%. Portanto, não só é a frequência de NA de Ad35, Adll e Ad49 mais baixa quando comparado a Ad5, mas dos soros que contêm NA destes vírus, a vasta maioria possui títulos baixos. Vectores adenovirais baseados em Adll, Ad35 ou Ad49 têm por isso uma vantagem clara relativamente a vectores baseados em Ad5 quando utilizados como veículos de terapia genética ou vectores de vacinação in vivo ou em qualquer aplicação onde a eficiência de infecção é comprometida pela actividade neutralizante.
Nos seguintes exemplos, descreve-se a construção de um sistema de vector para a geração de vectores seguros baseados em Ad35 e isentos de RCA.
Exemplo 6
Sequência do adenovírus humano do tipo 35 Vírus de Ad35 foram propagados em células PER.C6 e o ADN foi isolado como descrito no Exemplo 4. A sequência total foi gerada por Qiagen Sequence Services (Qiagen GmbH, Germany). O ADN virai total foi desfeito por tratamento com ultra-sons e as extremidades do ADN foram lisas com ADN-polimerase de T4. 51 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Os fragmentos lisos desfeitos foram fraccionados em tamanho em gel de agarose e tiras de gel correspondendo aos fragmentos de ADN de 1,8 a 2,2 kb foram obtidas. 0 ADN foi purificado das tiras de gel com o protocolo de extracção do gel de QIAquick e foi subclonado numa biblioteca shotgun de vectores de clonagem do plasmídeo pUC19. Uma matriz de clones em placas de 96 poços cobrindo o ADN alvo 8 (±2) vezes foi usada para gerar a sequência total. A sequenciação foi efectuada em termocicladores Perkin-Elmer 9700 usando a química BigDyeTerminator e ADN-polimerase AmpliTaq FS seguido de purificação das reacções de sequenciação por meio da tecnologia QIAGEN DyeEx 96. Os produtos de reacção de sequenciação foram então sujeitos a separação automática e detecção de fragmentos em sequenciadores de fila ABI 377 XL 96. A sequência contígua à sequência inicial e os espaços foram preenchidos por primer walking reads no ADN alvo ou por sequenciação directa dos produtos de PCR. As extremidades do vírus revelaram estar ausentes na biblioteca shotgun, mais provavelmente devido a dificuldades de clonagem resultantes dos aminoácidos de pTP que ficam ligados às sequências de ITR a seguir à digestão de ADN virai por proteinase K.
Sequenciação adicional do ADN virai resolveu a maioria das sequências naquelas regiões, porém, foi difícil obter uma sequência definida da maior parte dos nucleótidos terminais. Na extremidade 5' obteve-se a sequência 5'-CCAATAATATACCT...-3' enquanto que na extremidade 3' a sequência obtida foi 5'-...AGGTATATTATTGATGATGGG-3'. A maioria dos adenovírus humanos têm uma sequência terminal 5'-CATCATCAATAATATACC-3'. Além disso, um clone representando a extremidade 3' do ADN de Ad35 obtido após clonagem do fragmento EcoRl de Ad35 com 7 kb terminal em pBr322 (refira-se ao Exemplo 4) também revelou ter a sequência típica CATCATCAATAAT.... Por isso, Ad35 pode ter a sequência terminal típica e as diferenças obtidas na sequenciação directamente no ADN virai são devidas a artefactos relacionados com testes de sequenciação apressados e à presença de aminoácidos residuais de pTP. A sequência total de Ad35 com as sequências terminais corrigidas é dada na Figura 6. Homologia de sequências de bases com Ad5 (Genbank # M72360) e Ad7 (sequência parcial 52 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Genbank # XO 3 Ο Ο Ο) e na localização de enquadramentos de leitura abertos, a organização do virus é idêntica à organização geral da maioria dos adenovirus humanos, especialmente dos virus do subgrupo B. O comprimento total do genoma é de 34794 pares de bases.
Exemplo 7
Construção de um sistema de vectores baseado em plasmídeos para gerar virus recombinantes baseados em Ad35
Um sistema funcional de vectores baseado em plasmideos para gerar vectores adenovirais recombinantes compreende os seguintes componentes: 1. Um plasmideo adaptador compreendendo a ITR esquerda e sequências de empacotamento derivadas de Ad35 e pelo menos um local de restrição para inserção de uma cassete de expressão heteróloga e isento de sequências El. Além disso, o plasmideo adaptador contém sequências de Ad35 a 3' da região de codificação ElB incluindo o promotor pIX e sequências de codificação suficientes para mediar a recombinação homóloga do plasmideo adaptador com uma segunda molécula de ácido nucleico. 2. Uma segunda molécula de ácido nucleico, compreendendo sequências homólogas do plasmideo adaptador, e sequências de Ad35 necessárias para a replicação e empacotamento do virus recombinante, isto é, genes precoces, intermediários e tardios que não estão presentes na célula de empacotamento. 3. Uma célula de empacotamento que proporciona pelo menos proteínas El funcionais capazes de complementar a função El de Ad35 .
Outros métodos para gerar adenovirus recombinantes em células de empacotamento complementares são conhecidos na arte e podem ser aplicados aos virus Ad35 sem se afastar do invento. Como exemplo, a construção de um sistema baseado em plasmideos, como descrito em geral atrás, é a seguir descrito em pormenor. 53 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 1) Construção de plasmídeos adaptadores de Ad35.
Para este fim, o plasmídeo adaptador pAdApt (Figura 7; descrito no Exemplo 2) foi primeiro modificado para se obter plasmídeos adaptadores contendo poligantes prolongados e com locais de restrição únicos convenientes a flanquear a ITR esquerda e a sequência de adenovírus na extremidade 3' para permitir a libertação da inserção de adenovírus das sequências do vector plasmídico. A construção destes plasmídeos é descrita em detalhe a seguir: o plasmídeo adaptador pAdApt (Exemplo 2) foi digerido com Sall e tratado com fosfatase alcalina de camarão para reduzir a religação. Um ligante, composto dos dois seguintes oligos fosforilados e hibridados: ExSalPacF 5' - TCG ATG GCA AAC AGC TAT TAT GGG TAT TAT GGG TTC GAA TTA ATT AA- 3' ; e ExSalPacR 5' - TCG ATT AAT TAA TTC GAA CCC ATA ATA CCC ATA ATA GCT GTT TGC CA- 3' ; foi ligado directamente à construção digerida, substituindo deste modo o local de restrição Sal I por PI-PspI, SwaI e Pacl. Esta construção foi denominada ligante pADAPT+ExSalPac. Além disso, parte da ITR esquerda de pAdApt foi amplificada por PCR usando os seguintes iniciadores: PCLIPMSF: 5'- CCC CAA TTG GTC GAC CAT CAT CAA TAA TAT ACC TTA TTT TGG -3' e pCLIPBSRGI: 5'- GCG AAA ATT GTC ACT TCC TGT G - 3'. 0 fragmento amplificado foi digerido com Muni e BsrGI e clonado em pAd5/Clip (refira-se ao Exemplo 2), o qual foi parcialmente digerido com EcoRI e, após purificação, foi digerido com BsrGI, deste modo re-inserindo a ITR esquerda e o sinal de empacotamento. Após análise por enzimas de restrição, a construção foi digerida com Seal e SgrAI e um fragmento de 800 pb foi isolado do gel e ligado ao ligante pADAPT+ExSalPac digerido por Seal/SgrAI. A construção resultante, denominada pIPspSalAdapt, foi digerida com Sall, desfosforilada e ligada ao ligante ExSalPacF/ExSalPacR de cadeia dupla fosforilado mencionado antes. Um clone no qual o local Pacl estava mais próximo da ITR, foi identificado por análise de restrição e as sequências foram confirmadas por análise de sequências. Esta nova construção de pAdApt, denominada plPspAdapt (Figura 8) abriga assim dois ligantes ExSalPac contendo sequências de reconhecimento para Pacl, PI-PspI e BstBI, as quais rodeiam a parte adenoviral da construção adaptadora adenoviral, e as quais podem ser usadas para linearizar o ADN do plasmídeo antes de cotransfecção com fragmento auxiliares adenovirais. 54 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
De maneira a aumentar ainda mais as permutações de clonagem de transgenes, construiram-se vários poliligantes diferentes com base em PpiPspAdapt. Para este fim, o
pIPspAdapt foi primeiro digerido com EcoRI e desfosforilado. Um ligante composto dos dois seguintes oligos fosforilados e hibridados: Ecolinker+: 5'-AAT TCG GCG CGC CGT CGA CGA TAT CGA
TAG CGG CCG C-3' e Ecolinker-: 5'-AAT TGC GGC CGC TAT CGA TAT CGT CGA CGG CGC GCC G-3' foi ligado a esta construção, criando deste modo locais de restrição para Asei, SalI, EcoRV, Ciai e Not I. Obtiveram-se ambas as orientações deste ligante e as sequências foram confirmadas por análise de restrição e análise de sequências. 0 plasmideo contendo o poliligante na ordem 5' Hindlll, Kpnl, AgeI, EcoRI, Ascl, Sall, EcoRV, Ciai, Not I, NheI, Hpal, BamRI e Xbal foi denominado pIPspAdaptl (Figura 9) enquanto o plasmideo contendo o poliligante na ordem Hindlll, Kpnl, AgeI, NotI, Ciai, EcoRV, Sall, Asei, EcoRI, Nhel, Hpal, BamRI e Xbal foi denominado pIPspAdapt2.
Para facilitar a clonagem de outras construções sense ou antísense, desenhou-se um ligante para inverter o poliligante de pIPspAdapt, composto dos dois seguintes oligonucleótidos: HindXba+ 5' -AGC TCT AGA GGA TCC GTT AAC GCT AGC GAA TTC ACC GGT ACC AAG CTT A-3'; HindXba- 5'-CTA GTA AGC TTG GTA CCG GTG AAT TCG CTA GCG TTA ACG GAT CCT CTA G-3'.
Este ligante foi ligado em pIPspAdapt digerido por Hindlll/Xbal e a construção correcta foi isolada. A confirmação foi feita por análise de enzimas de restrição e sequenciação. Esta nova construção, pIPspAdaptA, foi digerida com EcoRI e o Ecolinker mencionado atrás foi ligado a esta construção. Obtiveram-se ambas as orientações deste ligante, resultando em pIPspAdapt3 (Figura 10), o qual continha o poliligante na ordem Xbal, BamRI, Hpal, Nhel, EcoRI, Asei, Sall, EcoRV, Ciai, NotI, AgeI, Kpnl e Hindlll. Todas as sequências foram confirmadas por análise de enzimas de restrição e sequenciação.
Plasmídeos adaptadores baseados em Ad35 foram então construídos como se segue: 55 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ A ITR esquerda e a sequência de empacotamento correspondente aos nucleótidos 1 a 464 das sequências de Ad35 do tipo selvagem (Figura 6) foram amplificados por PCR no ADN de Ad35 do tipo selvagem usando os seguintes iniciadores:
Iniciador 35F1: 5'-CGG AAT TCT TAA TTA ATC GAC ATC ATC AAT AAT ATA CCT TAT AG-3' Iniciador 35R2 : 5'-GGT GGT CCT AGG CTG ACA CCT ACG TAA AAA CAG-3' A amplificação introduz um local PacI na extremidade 5'e um local Avrll na extremidade 3' da sequência.
Para a amplificação usou-se a enzima ADN-polimerase de Platinum Pfx (LTI) de acordo com as instruções do fabricante mas com iniciadores a 0,6 μΜ e com DMSO adicionado a uma concentração final de 3%. O programa de amplificação foi como se segue: 2 min. a 94°C, (30 s. a 94°C, 30 s. a 56°C, 1 min. a 68°C) por 30 ciclos, seguido de 10 min. a 68°C. O produto de PCR foi purificado utilizando o kit de purificação PCR (LTI) de acordo com as instruções do fabricante, e foi digerido com PacI e Avrll. O fragmento digerido foi então purificado do gel usando um kit Geneclean (Bio 101, Inc.). O plasmideo adaptador baseado em Ad5 plPspAdApt-3 (Figura 10) foi digerido com Avrll e depois parcialmente com PacI e o fragmento de 5762 pb foi isolado numa tira de gel de agarose LMP e ligado com o fragmento de PCR mencionado atrás digerido com as mesmas enzimas e transformado em células DH10B electrocompetentes (LTI). O clone resultante foi denominado pIPspAdApt3-Ad351ITR.
Em paralelo, uma segunda porção de ADN de Ad35 foi amplificada usando os seguintes iniciadores: 35F3: 5'-TGG TGG AGA TCT GGT GAG TAT TGG GAA AAC-3' 35R4: 5'-CGG AAT TCT TAA TTA AGG GAA ATG CAA ATC TGT GAG G-3' A sequência deste fragmento corresponde aos nucleótidos 3401 a 4669 de Ad35 do tipo selvagem (Figura 6) e contém 56 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 1,3 kb de sequências começando directamente a 3' da sequência de codificação de 55 k de ElB. A amplificação e purificação foram efectuadas como antes descrito para o fragmento contendo a ITR esquerda e a sequência de empacotamento. 0 fragmento de PCR foi então digerido com Pacl e subclonado no vector pNEBl93 (New England Biolabs) digerido com Smal e Pacl. A integridade da sequência do clone resultante foi verificada por análise de sequências. 0 pNEB/Ad35pF3R4 foi então digerido com BglII e Pacl e a inserção de Ad35 foi isolada do gel usando o kit QlAExll (Qiagen). 0 pIPspAdApt3-Ad351ITR foi digerido com BglII e depois parcialmente com Pacl. 0 fragmento de 3624 pb (contendo sequências do vector, a ITR de Ad35 e sequências de empacotamento assim como o promotor de CMV, a região de clonagem múltipla e o sinal de poliA), foi também isolado utilizando o kit de QIAExII (Qiagen).
Ambos os fragmentos foram ligados e transformados em células DH10B competentes (LTI). 0 clone resultante, pAdApt35lP3 (Figura 11), tem a cassete de expressão de pIPspAdApt3 mas contém a ITR esquerda de Ad35 e as sequências de empacotamento e um segundo fragmento correspondente aos nucleótidos 3401 a 4669 de Ad35. Uma segunda versão do plasmideo adaptador de Ad35 tendo um local de clonagem múltiplo no sentido oposto foi feito como se segue: plPspAdaptl (Figura 9) foi digerido com Ndel e BglII e a banda de 0,7 kpb contendo parte do promotor de CMV, o MCS e poliA de SV40 foi isolada e inserida nos correspondentes locais de pAdApt35lP3 originando pAdApt35lPl (Figura 12).
Os plasmídeos adaptadores pAdApt35.LacZ e pAdApt35.Luc foram então gerados pela inserção dos transgenes de pcDNA.LacZ (digerido com Kpnl e BamHI) e pAdApt.Luc (digerido com HindIII e BamHI) nos correspondentes locais em pAdApt35iPl. A geração de pcDNA.LacZ e pAdApt.Luc está descrita em W099/55132. 57 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
2) Construção do cosmídeo pWE.Ad35.pXl-rlTR A Figura 13 apresenta os vários passos tomados para construir o clone cosmidico contendo sequências de Ad35 desde pb 3401 a 34794 (extremidade da ITR direita) que estão descritas em detalhe a seguir.
Um primeiro fragmento de PCR (pIX-Ndel) foi gerado utilizando-se o seguinte conjunto iniciador: 35F5: 5'-CGG AAT TCG CGG CCG CGG TGA GTA TTG GGA AAA C -3' 35R6: 5'-CGC CAG ATC GTC TAC AGA ACA G-3'
Utilizou-se ADN-polimerase Pwo (Roche) de acordo com as instruções do fabricante, porém, com uma concentração final de 0,6 μΜ de ambos os iniciadores e usando 50 ng de ADN de Ad35 do tipo selvagem como molde. A amplificação foi feita como se segue: 2 min. a 94°C, 30 ciclos de 30 s. a 94°C, 30 s. a 65°C e 1 min. 45 s. a 72°C, seguido de 8 min. a 68°C. De modo a permitir clonagem no vector de clonagem PCR2.1 de TA, fez-se uma última incubação com 1 unidade de polimerase superTac (HT Biotechnology LTD) por 10 min. a 72°C. O fragmento amplificado de 3370 pb contém as sequências de Ad35 desde pb 3401 a 6772 com um local NotI adicionado à extremidade 5'.
Os fragmentos foram purificados usando o kit de purificação PCR (LTI).
Um segundo fragmento de PCR (Ndel-rITR) foi gerado por meio dos seguintes iniciadores: 35F7: 5'-GAA TGC TGG CTT CAG TTG TAA TC -3' 35R8: 5'- CGG AAT TCG CGG CCG CAT TTA AAT CAT CAT CAA TAA TAT ACC-3' A amplificação foi feita com ADN-polimerase pfx (LTI) de acordo com as instruções do fabricante mas com 0,6 μΜ de ambos os iniciadores e DMSO a 3% usando 10 ng. de ADN de Ad35 do 58 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ tipo selvagem como molde. O programa foi como se segue: 3 min. a 94°C e 5 ciclos de 30 s. a 94°C, 45 s. a 40°C, 2 min. 45 s. a 68°C seguido de 25 ciclos de 30 s. a 94°C, 30 s. a 60°C, 2 min. 45 s. a 68°C. De modo a permitir clonagem no vector de clonagem PCR2.1 de TA, fez-se uma última incubação com 1 unidade de polimerase superTaq por 10 min. a 72°C. O fragmento amplificado de 1,6 kb indo desde o nucleótido 33178 até à extremidade da ITR direita de Ad35, foi purificado usando o kit de purificação PCR (LTI).
Ambos os fragmentos purificados por PCR foram ligados no vector PCR2.1 do kit de clonagem de TA (Invitrogen) e transformados em células STBL-2 competentes (LTI). Os clones contendo a inserção esperada foram sequenciados para confirmar a amplificação correcta. A seguir, ambos os fragmentos foram excisados do vector por digestão com NotI e NdeI e purificados do gel usando o kit Geneclean (BIO 101, Inc.). O vector cosmidico pWEl5 (Clontech) foi digerido com Not I, desfosforilado e foi também purificado do gel. Estes três fragmentos foram ligados e transformados em células STBL2 competentes (LTI). Um dos clones correctos que continha ambos os fragmentos de PCR foi então digerido com NdeI e o fragmento linear foi purificado do gel usando o kit Geneclean. ADN de Ad35 do tipo selvagem foi digerido com NdeI e o fragmento de 26,6 kb foi purificado do gel LMP por meio da enzima agarase (Roche) de acordo com as instruções do fabricante. Estes fragmentos foram ligados juntos e empacotados usando extractos de empacotamento de fago λ (Stratagene) de acordo com o protocolo do fabricante. A seguir à infecção de células STBL-2, colónias cresceram em placas e foram analisadas para a presença da inserção completa. Após digestões independentes com três enzimas (Ncol, PvuII e Seal), seleccionou-se um clone com o fragmento grande inserido na orientação correcta e tendo os padrões correctos de restrição. Este clone foi denominado pWE.Ad35.plX-rlTR e contém as sequências de Ad35 desde pb 3401 até à extremidade e é flanqueado pelos locais Not I (Figura 14). 3) Geração de virus recombinantes baseados em Ad35 em PER.C6.
Os virus Ad35 do tipo selvagem podem crescer em células de empacotamento PER.C6 até títulos muito elevados. Contudo, 59 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ não se sabe se a região El de Ad5 que está presente em PER.C6 é capaz de complementar os vírus recombinantes de Ad35 eliminados em El. Para testar isto, células PER.C6 foram cotransfectadas com o plasmídeo adaptador pAdApt35.LacZ descrito antes e o fragmento de esqueleto grande pWE.Ad35.pIX-rlTR. Primeiro, o pAdApt35. LacZ foi digerido com PacI e o pWE.Ad35.plX-rlTR foi digerido com NotI. Sem purificação adicional, misturou-se 4 pg de cada construção com DMEM (LTI) e transfectou-se para células PER.C6, semeadas no dia anterior a uma densidade de 5xl06 células num balão T25, usando Lipofectamin (LTI) de acordo com as instruções do fabricante. Como controlo positivo, 6 pg de ADN de pWE.Ad35.pIX-rITR digerido com PacI foi cotransfectado com um fragmento NheI de 6,7 kb isolado do ADN de Ad35 do tipo selvagem contendo a extremidade esquerda do genoma virai incluindo a região El.
No dia seguinte o meio (DMEM com FBS a 10% e MgCl2 lOmM) foi renovado e células foram mais incubadas. No dia 2 a seguir à transfecção, as células foram tripsinizadas e transferidas para balões T80. O balão do controlo positivo exibiu CPE cinco dias após transfecção, demonstrando que a construção pWE.Ad35.pIX-rITR é funcional pelo menos na presença de proteínas El de Ad35. A transfecção com o plasmídeo adaptador de LacZ de Ad35 e pWE.Ad35.pIX-rITR não deu origem a CPE. Estas células foram colhidas no meio no dia 10 e foram congeladas/descongeladas uma vez para libertar o vírus das células. Adicionou-se 4 ml do material colhido a um balão T80 com células PER.C6 (80% de confluência) e incubou-se por mais cinco dias. Esta colheita/reinfecção foi repetida duas vezes mas não houve evidência de CPE associado a vírus.
Deste teste parece que as proteínas El de Ad5 não são capazes, ou não suficientemente capazes de complementar os vírus recombinantes de Ad35, porém, pode ser que a sobreposição de sequências do plasmídeo adaptador e do plasmídeo de esqueleto pWE.Ad35.pIX-rITR não seja suficientemente grande para recombinar eficientemente e dar origem a um genoma virai recombinante. A transfecção do controlo positivo foi feita com um fragmento da extremidade esquerda com 6,7 kb e por isso a sobreposição de sequências foi cerca de 3,5 kb. O plasmídeo adaptador e o fragmento de pWE. Ad35.pIX-rITR têm uma sobreposição de sequências de 60 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 1.3 kb. Para verificar se a sobreposição de sequências de 1.3 kb é demasiado pequena para recombinação homóloga eficiente, fez-se uma cotransfecção com pWE.Ad35.pIX-rITR digerido com Paci e um fragmento de PCR do adn de Ad35 do tipo selvagem gerado com 35F1 e 35R4 mencionados anteriormente usando os mesmos procedimentos antes descritos. O fragmento de PCR contém assim sequências da extremidade esquerda até pb 4669 e por isso tem a mesma sobreposição de sequências com pWE.Ad35.pix-riTR que o plasmideo adaptador pAdApt35.Lacz mas tem sequências El de Ad35. A seguir à purificação por PCR em coluna, o ADN foi digerido com Sall para remover possíveis sequências molde intactas. A transfecção apenas com o produto de PCR digerido serviu como controlo negativo. Quatro dias depois de transfecção, ocorreu CPE nas células transfectadas com o produto de PCR e o fragmento pIX-rITR de Ad35, e não no controlo negativo. Isto mostra que 1,3 kb de sobreposição de sequências é suficiente para gerar vírus na presença de proteínas El de Ad35. Destes testes, conclui-se que é necessária a presença de pelo menos uma das proteínas El de Ad35 para gerar vectores recombinantes baseados em Ad35 de ADN de plasmideo em linhas celulares complementares de Ad5.
Exemplo 8 1) Construção de plasmídeos de expressão de El de Ad35
Como as proteínas El de Ad5 em PER.C6 não são capazes de complementar eficientemente vírus recombinantes de Ad35, as proteínas El de Ad35 têm de ser expressas em células complementares de Ad5 (por exemplo PER.C6) ou tem de se realizar uma nova linha celular de empacotamento expressando proteínas El de Ad35, partindo de células humanas primárias diplóides ou de linhas celulares estabelecidas que não expressam proteínas El adenovirais. Considerando a primeira possibilidade, a região El de Ad35 foi clonada em plasmídeos de expressão como descrito a seguir.
Primeiro a região El de Ad35 desde pb 468 a pb 3400 foi amplificada do ADN de Ad35 do tipo selvagem usando o seguinte conjunto iniciador: 61 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 35F11: 5'-GGG GTA CCG ΑΑΤ TCT CGC TAG GGT ATT ΤΑΤ ACC-3'
35F10: 5' -GCT CTA GAC CTG CAG GTT AGT CAG ΤΤΤ CTT CTC CAC TG-3 '
Este PCR introduz um local Kpnl e EcoRI na extremidade 5' e um local Sbfl e Xbal na extremidade 3'.
Amplificação em 5 ng. de ADN molde foi levada a cabo com ADN-polimerase Pwo (Roche) seguindo as instruções do fabricante, porém, com ambos os iniciadores a uma concentração final de 0,6 μΜ. O programa foi como se segue: 2 min. a 94°C, 5 ciclos de 30 s. a 94°C, 30 s. a 56°C e 2 min. a 72°C, seguido de 25 ciclos de 30 s. a 94°C, 30 s. a 60°C e 2 min. a 72°C, seguido de 10 min. a 72°C. O produto de PCR foi purificado com o kit de purificação PCR (LTI) e foi digerido com Kpnl e Xbal. O fragmento de PCR digerido foi então ligado ao vector de expressão pRSVhbvNeo (refira-se adiante), também digerido com Kpnl e Xbal. As ligações foram transformadas em células STBL-2 competentes (LTI) de acordo com as instruções do fabricante e as colónias foram analisadas para a inserção correcta de sequências El de Ad35 no poliligante entre o promotor de RSV e poliA de HBV. O clone resultante foi denominado pRSV.Ad35-El (Figura 15). As sequências de Ad35 em pRSV.Ad35-El foram verificadas por análise de sequências. pRSVhbvNeo foi gerado como se segue: pRc-RSV (Invitrogen) foi digerido com PvuII, desfosforilado com a enzima TSAP (LTI) e o fragmento de vector de 3 kb foi isolado em agarose de baixo ponto de fusão (LMP). O plasmídeo pPGKneopA (Figura 16; descrito em W096/35798), foi digerido com SspI completamente para se linearizar o plasmídeo e facilitar a digestão parcial com PvuII. A seguir à digestão parcial com PvuII, os fragmentos resultantes foram separados em gel de agarose LMP e o fragmento PvuII de 2245 pb, contendo o promotor de PGK, o gene de resistência à neomicina e poliA de HBV, foi isolado. Ambos os fragmentos isolados foram ligados para dar o vector de expressão pRSV-pNeo que agora tem a cassete de expressão original SV40prom-neo-SV40poliA substituída por uma cassete PGKprom-neo-HBVpolyA (Figura 17) . Este plasmídeo foi ainda 62 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ modificado para se substituir o pA de BGH por pA de HBV como se segue: o pRSVpNeo foi linearizado com Seal e digerido adicionalmente com Xbal. 0 fragmento de 1145 pb, contendo parte do gene Amp e as sequências promotoras de RSV e a sequência poliligante, foi isolado do gel usando o kit GeneClean (Bio Inc. 101). A seguir o pRSVpNeo foi linearizado com Seal e digerido ainda com EcoRi parcialmente e o fragmento de 3704 pb contendo a cassete PGKneo e as sequências do vector foi isolado do gel como atrás. Um terceiro fragmento, contendo a sequência de poliA de HBV flanqueada por Xbal e EcoRi nas extremidades 5' e 3' respectivamente, foi então gerado por amplificação com PCR em pRSVpNeo utilizando o seguinte conjunto iniciador: HBV-F: 5'- GGC TCT AGA GAT CCT TCG CGG GAC GTC -3' e HBV-R: 5'- GGC GAA TTC ACT GCC TTC CAC CAA GC -3'. A amplificação foi efectuada com a enzima Elongase (LTI) de acordo com as instruções do fabricante nas seguintes condições: 30 segundos a 94°C, a seguir 5 ciclos de 45 segundos a 94°C, 1 minuto a 42°C e 1 minuto a 68°C, seguido de 30 ciclos de 45 segundos a 94°C, 1 minuto a 65°C e 1 minuto a 68°C, seguido de 10 minutos a 68°C. O fragmento de PCR de 625 pb foi então purificado utilizando o kit de purificação Qiaquick PCR, foi digerido com EcoRI e Xbal e purificado do gel usando o kit Geneclean. Os três fragmentos isolados foram ligados e transformados em células DH5a competentes (LTI) para dar origem à construção pRSVhbvNeo (Figura 18) . Nesta construção as regiões reguladoras de transcrição da cassete de expressão de RSV e o marcador selectivo de neomicina estão modificados para reduzir a sobreposição com vectores adenovirais que contêm frequentemente sequências reguladoras de transcrição de CMV e SV40. 2) Geração de vírus recombinantes de Ad35 em células PER.C6 cotransfectadas com uma construção de expressão de El de Ad35. Células PER.C6 foram semeadas a uma densidade de 5xl06 células num balão T25 e no dia seguinte foram transfectadas com uma mistura de ADN contendo: 63 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 1 pg de pAdApt35.LacZ digerido com PacI 5 pg de pRSV.Ad35El não digerido
2 pg de pWE.Ad35.pIX-rITR digerido com NotI
Efectuou-se transfecção usando Lipofectamina de acordo com as instruções do fabricante. Cinco horas depois da adição da mistura de transfecção às células, o meio foi removido e substituído por meio novo. Ao fim de dois dias, as células foram transferidas para balões T80 e a cultura prosseguiu. Uma semana após transfecção adicionou-se 1 ml do meio a células A549 e no dia seguinte as células foram coradas para expressão de LacZ. Ao fim de duas horas de serem coradas, células azuis eram claramente visíveis indicando que tinham sido produzidos virus recombinantes expressando LacZ. A cultura de células prosseguiu ainda mas não se observou aparecimento óbvio de CPE. Porém, ao fim de 12 dias, apareceram agregados de células na monocamada e 18 dias após transfecção as células separaram-se. As células e o meio foram então colhidos, congelados-descongelados uma vez e 1 ml de lisado bruto foi usado para infectar células PER.C6 numa placa de 6 poços. Dois dias a seguir à infecção as células foram coradas por actividade de LacZ. Ao fim de duas horas, 15% das células estavam manchadas de azul. De modo a testar a presença de virus competentes para replicação e/ou do tipo selvagem, células A549 foram infectadas com estes virus e a cultura prosseguiu. Não se observaram sinais de CPE indicando a ausência de virus competentes para a replicação.
Estes testes mostram que virus recombinantes AdApt35.LacZ foram realizados em células PER.C6 cotransfectadas com a construção de expressão de El de A35. 3) Vírus recombinantes de Ad35 escapam neutralização no soro humano contendo actividade neutralizante de vírus Ad5.
Os vírus AdApt35.LacZ foram então usados para investigar infecção na presença de soro que possui actividade neutralizante dos vírus Ad5. 0 vírus de LacZ baseado em Ad5 purificado serviu como controlo positivo para NA. Para este fim, células PER.C6 foram semeadas numa placa de 24 poços a uma densidade de 2xl05 células/poço. No dia seguinte, uma amostra de soro humano com elevada actividade neutralizante de 64 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Ad5 foi diluída em meio de cultura em cinco passos de diluições de cinco vezes. Misturou-se então 0,5 ml de soro diluído com 4xl06 partículas do vírus AdAptõ.LacZ em 0,5 ml de meio e ao fim de 30 minutos de incubação a 37°C, adicionou-se 0,5 ml da mistura a células PER.C6 em duplicado. Para os vírus AdApt35.LacZ, misturou-se 0,5 ml das amostras de soro diluído com 0,5 ml de lisado bruto contendo o vírus AdApt35.LacZ e a seguir à incubação adicionou-se 0,5 ml desta mistura a células PER.C6 em duplicado.
As amostras de vírus incubadas em meio sem soro foram usadas como controlo positivo para a infecção. Ao fim de duas horas de infecção a 37°C, adicionou-se meio até atingir um volume final de 1 ml e a cultura de células continuou. Dois dias após infecção, as células foram coradas para actividade LacZ. Os resultados estão apresentados na Tabela II. Destes resultados é evidente que enquanto os vírus AdApt5.LacZ são neutralizados eficientemente, os vírus AdApt35.LacZ permanecem infecciosos independentemente da presença de soro humano. Isto prova que vírus recombinantes baseados em Ad35 escapam à neutralização em soro humano que contém NA contra vírus baseados em Ad5.
Exemplo 9
Um vector quimérico de Ad5/fibra35 com especificidade pelo tipo de célula para células estaminais CD34+Lin~
No exemplo 3 descreveu-se a geração de uma biblioteca de adenovírus baseada em Ad5 abrigando proteínas da fibra de outros serótipos. Como exemplo não limitativo da utilização desta biblioteca descreve-se aqui a identificação de adenovírus de fibra modificada que exibem infecção melhorada das células estaminais hemopoiéticas.
Isolaram-se células da medula óssea humana, do sangue do cordão umbilical, ou sangue periférico mobilizado transportando o fenótipo de citometria de fluxo de ser positivo para o antigénio CD34 e negativo para os marcadores de diferenciação precoces CD33, CD38, e CD71 (lin-) vulgarmente referidos como células estaminais hemopoiéticas (HSC) . A modificação genética destas células é de maior 65 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ interesse já que todas as linhagens hemopoiéticas são derivadas destas células e por isso a HSC é uma célula alvo para o tratamento de muitos distúrbios hemopoiéticos humanos congénitos ou adquiridos. Exemplos de doenças que podem ser corrigidas por modificação genética de HSC, incluem mas não estão limitados à doença de Hurler, sindrome de Hunter, sindrome de Sanfilippo, doença de Morquio, doença de Gaucher, doença de Farber, doença de Niemann-Pick, doença de Krabbe, leucodistrofia metacromática, doença da célula I, sindrome da imunodeficiência grave, deficiência de Janus Quinasa 3 (Jak-3), fucosidose, talassemia, e porfiria eritropoiética. Além destes distúrbios hemopoiéticos, também as estratégias para prevenir ou tratar a sindrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) e cancros hemopoiéticos estão baseados na modificação genética de HSC ou células derivadas de HSC tais como linfócitos T CD4+ no caso da SIDA. Os exemplos listados antes têm assim o objectivo de introduzir ADN nas HSC de modo a complementar a um nível genético para uma deficiência de genes e proteínas. No caso de estratégias para SIDA ou cancro, o ADN a ser introduzido nas HSC pode ser na forma de genes antivirais ou genes suicidas.
Além dos exemplos mencionados anteriormente, existem várias outras áreas nas quais a transdução eficiente de HSC por meio de vectores adenovirais tem um papel importante. Por exemplo no campo da engenharia de tecidos. Nesta área é importante motivar a diferenciação de HSC em linhagens específicas. Alguns exemplos não limitativos são, formação de osso ex vivo, formação de cartilagem, formação de pele, assim como a geração de precursores de células T ou precursores de células endoteliais. A geração de osso, cartilagem ou pele em biorreactores pode ser usada para transplantação a seguir a fracturas de ossos ou lesões da medula espinal ou ferimentos por queimaduras graves.
Naturalmente, as células transduzidas podem também ser directamente reinfundidas num paciente. A formação de grandes números de precursores de células endoteliais de hsc é de interesse porque estes percursores de células endoteliais podem alojar-se, a seguir à reinfusão, em locais de lesão cardiovascular tais como isquemia. De maneira semelhante, a formação de grandes números de células T das hsc é de 66 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ interesse porque estes precursores de células T podem ser iniciados, ex vivo, para erradicar certos alvos no corpo humano após reinfusão das células T iniciadas. Os alvos preferidos do corpo humano podem ser tumores ou células infectadas por virus.
Dos exemplos descritos atrás, pode concluir-se que a entrega eficiente de genes às hsc é de maior interesse no campo da terapia genética. Por isso, a alteração da gama de células hospedeiras do serótipo de adenovirus 5 de modo a ser possível direccionar às hsc in vitro assim como in vivo é um objectivo principal do invento. Para identificar um adenovirus quimérico com características preferidas de infecção para hsc humanas, gerou-se uma biblioteca de vírus baseados em Ad5 transportando a molécula da fibra de serótipos alternativos (serótipos 8, 9, 13, 16, 17, 32, 35, 45, 40-L, 51). A geração desta biblioteca de fibra modificada está descrita no Exemplo 3. Ad5 foi incluído como uma referência. Um pequeno painel desta biblioteca foi testado em TF-1 humanas (eritroleucemia, ATCC CRL-2003) enquanto que todos os vírus quiméricos gerados foram testados em células estromais primárias humanas e hsc humanas. Células TF-1 humanas foram mantidas rotineiramente em DMEM suplementado com FCS a 10% e 50 ng/ml de IL-3 (Sandoz, Basel, Suíça). Estroma humano primário do tipo fibroblastos, isolado de um aspirado de medula óssea, foi mantido rotineiramente em DMEM/FCS a 10%. O estroma foi semeado a uma concentração de lxlO5 células por poço em placas de 24 poços. Ao fim de 24 horas de semear as células, as células foram expostas por 2 horas a 1000 partículas de vírus por célula de Ad5, Ad5.Fibl6, Ad5.Fibl7, Ad5.Fib35, Ad5.Fib40-L, ou
Ad5.Fib51, todas contendo a proteína fluorescente verde (GFP) como marcador. Ao fim de 2 horas as células foram lavadas com PBS e semeadas novamente em meio sem a adição de vírus. Células TF-1 foram semeadas a uma concentração de 2xl05 células por poço em placas de 24 poços e foram também expostas por 2 horas a 1000 partículas de vírus de diferentes adenovirus quiméricos. O vírus foi então removido por lavagem das células ao fim de 2 horas de exposição. Ambos os tipos de célula foram colhidos 48 horas depois da exposição ao vírus e analisados para a expressão de GFP por meio de um citómetro de fluxo. Os resultados obtidos nas células TF-1, apresentados na Figura 19, mostram que os adenovirus quiméricos que 67 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ transportam uma fibra dos serótipos 16, 35, ou 51 (todos derivados do subgrupo B de adenovirus) têm caracteristicas preferidas de infecção comparado a Ad5 (subgrupo C), Ad5.Fibl7 (subgrupo D), ou Ad5.Fib40-L (subgrupo F) . Testou-se estroma primário humano já que estas células são usadas normalmente como uma célula "alimentadora" de modo a permitir proliferação e manutenção de hsc em condições de cultura ex vivo. Em contraste com a transdução de células TF-1, nenhum dos adenovirus quiméricos de fibra foi capaz de transduzir eficientemente estroma primário humano (Figura 20) . Razoável infecção do estroma primário humano do tipo fibroblastos foi verificada só com Ad5 apesar de se observar que nenhuma das moléculas receptoras conhecidas estava expressa nestas células (refira-se à Tabela III) . A ausência de infecção do estroma humano por meio dos virus quiméricos é vantajosa já que em circunstâncias de co-cultura, o adenovirus quimérico não será absorvido primariamente pelas células "alimentadoras" do estroma.
De modo a testar a capacidade de transdução dos virus quiméricos de fibra, utilizou-se uma combinação de sangue do cordão umbilical (3 indivíduos) para isolar células estaminais. Células CD34+ foram isoladas de uma preparação celular mononuclear utilizando um sistema de separação de laboratório MACS (Miltenyi Biotec) empregando o protocolo fornecido pelo fabricante. Semearam-se 2xl05 células CD34+ num volume de 150 μΐ de DMEM (isento de soro; Gibco, Gaitherburg, MD) e adicionou-se 10 μΐ de adenovirus quimérico (para dar uma razão final de partículas de vírus/célula de 1000) . Os adenovirus quiméricos testados foram Ad5, Ad5.Fibl6, Ad5.Fib35, Ad5Fibl7, Ad5.Fib51, todos contendo proteína fluorescente verde (GFP) como marcador. As células foram incubadas por 2 horas numa atmosfera humidificada de C02 a 10% a 37°C. A seguir, as células foram lavadas uma vez com 500 μΐ de dmem e ressuspensas em 500 μΐ de meio StemPro-34 SF (Life Technologies, Grand Island, NY). A cultura de células prosseguiu então por 5 dias em placas de 24 poços (Greiner, Frickenhausen, Alemanha) em estroma humano da medula óssea preestabelecido (ref 1), 68 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
irradiado (20 Gy) numa atmosfera humidificada de CO2 a 10% a 37°C. Ao fim de 5 dias, a população completa de células foi colhida por tripsinização com 100 μΐ de Tripsina-EDTA a 0,25% (Gibco) . O número de células antes e após 5 dias de cultura foi determinado por meio de um hemocitómetro. O número de células CD34+ e CD34++CD33, 38, 71~ células em cada amostra foi calculado do número total de células recuperado e a frequência das células CD34++CD33, 38, 71- em toda a população foi determinada por análise FACS. A eficiência de transdução foi determinada por análise FACS monitorando a frequência de células expressando GFP em subpopulações distintas assim como a intensidade de GFP por célula individual. Os resultados deste teste, apresentados na Figura 21, demonstram que o serótipo de adenovirus 5 ou o adenovírus quimérico Ad5.Fibl7 não infecta células CD34+Lin~ como comprovado pela ausência de expressão de GFP. Em contraste, com os virus quiméricos que transportam a molécula da fibra dos serótipos 16, 51, ou 35, contam-se percentagens elevadas de células positivas para GFP nesta população de células. A especificidade para CD34+Lin é demonstrada já que se observa pouca expressão de GFP em células CD34+ que também expressam CD33, CD38, e CD71. A subfraccionamento das células CD34+Lin~ (Figura 22) mostrou que a percentagem de células positivas para GFP declina usando-se Ad5.Fibl6, Ad5.Fib35, ou Ad5.Fib51 quando as células se tornam mais e mais positivas para os marcadores de diferenciação precoces CD33 (mielóide), CD71 (eritróide), e CD38 (marcador de diferenciação precoce vulgar).
Este resultados demonstram assim a especificidade dos adenovirus quiméricos Ad5.Fibl6, Ad5.Fib35, e Ad5.Fib51 para hsc. A Figura 23 mostra um alinhamento da fibra de Ad5 com as proteínas da fibra do grupo B quiméricas derivadas de Adi6, 35 e 51. A toxicidade de adenovírus pode ser determinada pela determinação do número de células recuperadas a seguir ao procedimento de transdução. A recuperação da quantidade de células CD34+ assim como da quantidade de CD34+Lin~ (Figura 24) demonstra que uma exposição de 2 horas a 1000 partículas de adenovírus não teve efeito no número de células recuperado. 69 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Exemplo 10
Um vector quimérico de Ad5/fibra35 com especificidade pelo tipo de célula para células dendriticas Células dendriticas são células que apresentam
antigénios (APC), especializadas a iniciar uma resposta imune primária e capazes de promover uma resposta imune do tipo memória. Dependendo do seu estágio de desenvolvimento, DC apresentam funções diferentes: DC imaturas são muito eficientes a receber e processar antigénios para apresentação por moléculas do complexo de histocompatibilidade (MHC) de classe I e classe II, enquanto que DC maduras, sendo menos eficazes a capturar e processar antigénios, têm melhor desempenho a estimular células T CD8+ e CD4+ não imunizadas e de memória, devido à expressão elevada de moléculas MHC e moléculas co-estimulantes na sua superfície celular. As DC imaturas amadurecem in vivo a seguir à captura do antigénio, viajam até às áreas da célula T em órgãos linfóides, e iniciam a activação de células T.
Como as DC são as células responsáveis por desencadear uma resposta imune, há muito tempo que existe interesse em carregar DC com proteínas imunoestimulantes, péptidos, ou os genes que codificam estas proteínas, de modo a activar o sistema imune. As aplicações desta estratégia encontram-se na área de tratamento do cancro assim como na área de vacinação. Até ao presente, estratégias anti-cancro concentraram-se principalmente em carregar DC ex vivo com antigénios (proteínas ou péptidos). Estes estudos revelaram que este procedimento resultou na indução da actividade de células T citotóxicas. Os antigénios usados para carregar as células são geralmente identificados como sendo específicos de tumores. Alguns exemplo não limitativos destes antigénios são GP100, mage, ou Mart-1 para melanoma.
Além do tratamento do cancro, muitas outras doenças humanas potenciais estão actualmente a ser prevenidas através de vacinação. Na estratégia da vacinação, um agente patogénico "debilitado" é apresentado ao sistema imune através da acção de células que apresentam o antigénio, i.e., as DC imaturas. Exemplos bem conhecidos de prevenção de doenças através de estratégias de vacinação incluem Hepatite A, B, e C, 70 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ influenza, raiva, febre amarela, sarampo. Além destes programas de vacinação bem conhecidos, estão a ser desenvolvidos programas de investigação para o tratamento da malária, Ebola, cegueira do rio, hiv e muitas outras doenças.
Muitos dos agentes patogénicos mencionados atrás são considerados perigosos para gerar uma vacina de um agente patogénico "debilitado". Esta última requer o isolamento e caracterização de proteínas de cada agente patogénico que é capaz de montar uma resposta imune "totalmente desencadeada" resultando assim na protecção completa contra a provocação por agentes patogénicos do tipo selvagem.
Para que esta estratégia de carregar DC com proteínas imunoestimulantes ou péptidos seja terapeuticamente viável, pelo menos dois critérios distintos têm de ser satisfeitos, 1) o isolamento de grandes números de DC que possam ser isoladas, manipuladas, e reinfundidas num paciente, tornando o procedimento autólogo. Até à data, tem sido possível obter estas grandes quantidades de DC imaturas de monócitos de sangue periférico de cultura de qualquer doador 2) um vector que possa transduzir DC eficientemente de tal modo que o ADN que codifica para uma proteína imunoestimulante possa ser transferido. O último é extremamente importante já que se tornou evidente que o tempo requerido para as DC viajarem até aos órgãos linfóides é tal que a maioria das proteínas ou péptidos já estão libertados das DC resultando numa iniciação imune incompleta. Como as DC são diferenciadas terminalmente, tal como células que não dividem, vectores recombinantes adenovirais estão a ser considerados para entregar o ADN que codifica para antigénios a DC. Idealmente este adenovírus deverá ter uma afinidade elevada por células dendríticas mas não deverá ser reconhecido por anticorpos neutralizantes do hospedeiro de maneira a que se consiga a transdução in vivo de DC. O último omitiria a necessidade para manipulações ex vivo de DC mas resultaria num procedimento médico idêntico aos programas de vacinação que estão actualmente implementados, i.e. predominantemente injecção intramuscular ou subcutânea. Assim, DC transduzidas por vectores adenovirais que codificam uma proteína imunogénica podem ser idealmente apropriadas para servir como adjuvantes naturais para imunoterapia e vacinação. 71 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Dos exemplos descritos atrás, pode concluir-se que a entregue eficiente de genes a DC é de grande interesse no campo da terapia genética. Por isso, a alteração da gama de células hospedeiras do serótipo de adenovirus 5 de modo a ser possível direccionar às DC in vitro assim como in vivo é um interesse principal do invento. Para identificar um adenovirus quimérico com características de infecção preferidas para DC humanas, gerou-se uma biblioteca de vírus baseados em Ad5 transportando a molécula da fibra de serótipos alternativos (serótipos 8, 9, 13, 16, 17, 32, 35, 45, 40-L, 51) . Ad5 foi incluído como referência. A susceptibilidade do monócito humano derivado de DC imaturas e maduras a adenovirus quiméricos recombinantes que expressam fibras diferentes foi avaliada. PBMC humanas de doadores saudáveis foram isoladas através de centrifugação por densidade Ficoll-Hypaque. Os monócitos foram isolados das PBMC por enriquecimento para células CD14+ utilizando coloração com o anticorpo monoclonal anti-CDl4 humanas marcado com FITC (Becton Dickinson), microcontas anti-FITC e colunas de separação MACS (Miltenyi Biotec).
Este procedimento normalmente resulta numa população de células em que < 90 % são CD14+ como analisado por FACS. As células foram colocadas em cultura usando o meio RPMi-1640 (Gibco) contendo soro fetal bovino a 10% (Gibco), 200 ng/ml de rhu GM-CSF (R&D/ITK Diagnostics), 100 ng/ml de rhu IL-4 (R&D/ITK diagnostics) e a cultura prosseguiu por 7 dias com as culturas sendo alimentadas com meio novo contendo citoquinas em dias alternados. As DC imaturas que resultaram deste procedimento ao fim de 7 dias expressavam um fenótipo CD83~, CD14 low ou CD14~, HLA-DR+, como foi demonstrado por análise FACS. As DC imaturas são amadurecidas por cultura das células em meio contendo 100 ng/ml de TNF-a por 3 dias, após o qual expressam CD83 na sua superfície celular.
Num teste piloto, 5xl05 DC imaturas foram semeadas em poços de placas com 24 poços e expostas por 24 horas a 100 e 1000 partículas de vírus por célula de cada vírus recombinante da fibra. O vírus testado foi o serótipo de adenovirus 5 (Ad5), e os vírus quiméricos de fibra baseados em Ad5: Ad5.Fibl2, Ad5.Fibl6, Ad5.Fib28, Ad5.Fib32, Ad5.Fib40-L (fibra 72 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ longa do serótipo 40), Ad5.Fib49, e Ad5.Fib51 (onde Fibxx refere-se ao serótipo do qual a molécula de fibra é derivada). Estes virus são derivados dos subgrupos C, A, B, D, D, F, D, e B respectivamente. Ao fim de 24 horas as células foram lisadas (Triton X-100 a 1%/PBS) e a actividade da luciferase foi determinada usando um protocolo fornecido pelo fabricante (Promega, Madison, WI, USA). Os resultados deste teste, apresentados na Figura 25, demonstram que Ad5 infecta de forma inadequada DC imaturas como comprovado pelo baixo nivel de expressão de transgene. Em contraste, Ad5.Fibl6 e Ad5.Fib51 (ambos virus quiméricos de fibra do grupo B) e também Ad5.Fib40-L (Subgrupo F) exibem uma infecção eficiente de DC imaturas com base na expressão transgénica da luciferase.
Num segundo teste, 5xl05 DC imaturas e maduras foram infectadas com 10000 partículas de virus por célula de Ad5, Ad5.Fibl6, Ad5.Fib40-L, e Ad5.Fib51, todas transportando o gene LacZ como marcador. A expressão de LacZ foi monitorada por análise de citometria de fluxo utilizando-se um sistema de kit CM-FDG e as instruções fornecidas pelo fabricante (Molecular Probes, Leiden, Holanda). Os resultados deste teste, apresentados na Figura 26, correlacionam com os resultados do teste anterior relativamente a Ad5.Fibl6 e Ad5.Fib51 serem superiores a Ad5 a transduzir DC humanas maduras e imaturas. Além disso, este teste mostra que Ad5.Fib40-L não é tão bom como Ad5.Fibl6 e Ad5.Fib51 mas é melhor do que Ad5.
Com base nestes resultados testaram-se outros adenovirus quiméricos contendo fibras de virus do grupo B, por exemplo, Adõ.Fibll e Ad5.Fib35, para a sua capacidade para infectar DC. Focou-se em DC imaturas já que estas são as células que processam um produto transgénico expresso em péptidos apresentados pelo MHC das classes I e li. DC imaturas foram semeadas a uma densidade de células de 5xl05 células/poço em placas de 24 poços (Costar) e foram infectadas com 1000 e 5000 partículas de vírus por célula a seguir ao qual a cultura de células prosseguiu por 48 horas em condições adequadas a DC imaturas antes da lise das células e medições da actividade da luciferase. Os resultados deste teste, apresentados na Figura 27, demonstram que adenovirus quiméricos baseados Ad5 contendo fibras de vírus do grupo B infectam eficientemente DC imaturas. Num quarto teste, infectaram-se novamente DC 73 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ imaturas de maneira idêntica à descrita nos testes anteriores mas desta vez utilizou-se Ad5, Ad5.Fibl6, e Ad5.Fib35 transportando a proteína verde fluorescente (GFP) como gene marcador. Os resultados da expressão de GFP medidos por um citómetro de fluxo ao fim de 48 horas de exposição ao vírus estão apresentados na Figura 28 e correlacionam com os resultados obtidos até aqui.
Portanto, os resultados até aqui são consistentes em que vectores baseados em Ad5 transportando uma fibra de um adenovírus alternativo derivado do subgrupo B, fibra predominantemente de 35, 51, 16, e 11, são superiores a Ad5 para transduzir DC humanas.
Os adenovírus divulgados aqui são muito apropriados para a vacinação de animais. Para ilustrar isto, DC derivadas de ratinho e chimpanzé foram testadas para determinar se estes vírus podem ser usados nestes modelos animais. Este último em particular já que o receptor para o adenovírus humano derivado do subgrupo B é desconhecido até à data e por isso não se sabe se esta proteína está conservada entre a espécie. Para ambas as espécies semearam-se DC imaturas a uma densidade de 105 células por poço em placas de 24 poços. As células foram subsequentemente expostas por 48 horas a 1000 partículas de vírus por célula de Ad5, Ad5Fibl6, e Ad5.Fib51 no caso das DC de ratinho e Ad5, e Ad.Fib35 no caso das DC de chimpanzé (refira-se à Figura 29). O teste do ratinho foi efectuado com vírus transportando luciferase como marcador e mostrou aproximadamente 10-50 vezes de aumento na actividade da luciferase comparado com Ad5. As DC de chimpanzé foram infectadas com vírus com GFP e foram analisadas por meio de um citómetro de fluxo. Estes resultados, também apresentados na Figura 29, mostram que Ad5 (3%) transduz DC de chimpanzé muito mal comparado a Ad5.Fib35 (66,5%).
Exemplo 11
Construção de um sistema de vectores baseado em plasmídeos para gerar vírus recombinantes baseados em Adll.
Os resultados dos testes de neutralização descritos no Exemplo 5 mostram que Adll, tal como Ad35, não foi neutralizado na vasta maioria das amostras de soro humano. 74 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Portanto, adenovírus recombinantes baseados em Adll são preferidos aos vulgarmente utilizados vectores baseados em Ad2 e Ad5, como vectores para vacinação e tratamento por terapia génica. Tanto o Ad35 como o Adll são vírus do grupo B e são classificados como vírus que pertencem ao grupo 2 da homologia do ADN (Wadell, 1984).
Assim, os genomas de Ad35 e Adll são muito semelhantes. Para se gerar um sistema baseado em plasmídeos de modo a produzir vírus recombinantes baseados em Adll, o plasmídeo adaptador pAdApt35lPl gerado no Exemplo 7 foi modificado como se segue. A construção pAdApt35IPl é digerida com Avrll e a seguir parcialmente com Pacl. A mistura de digestão é separada em gel e o fragmento de 4,4 kb contendo a cassete de expressão e o esqueleto do vector é isolado por meio de um kit Geneclean (BIO 101, Inc.). A seguir, a amplificação por PCR é efectuada em ADN de Adll do tipo selvagem com os iniciadores 35F1 e 35R2 (refira-se ao Exemplo 7) usando ADN-polimerase Pwo de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento obtido por PCR de 0,5 kb é purificado com o kit de purificação PCR (LTI) e ligado ao fragmento de pAdApt35lPl preparado atrás. Isto resulta na construção pAdAptll-35IPl na qual o fragmento de adenovírus a 5' é permutado pela correspondente sequência de Adll. A seguir, pAdAptll-35IPl é digerido com BglII e parcialmente com Pacl. Os fragmentos obtidos são separados em gel e o fragmento de 3,6 kb contendo as sequências de vector, o fragmento de adenovírus a 5' e a cassete de expressão é purificado da gel como anteriormente. A seguir, o fragmento de PCR é gerado usando os iniciadores 35F3 e 35R4 (refira-se ao Exemplo 7) em ADN de Adll do tipo selvagem. A amplificação é efectuada como anteriormente e o fragmento de 1,3 kb obtido é purificado e digerido com BglII e Pacl. Os fragmentos isolados são então ligados para dar a construção pAdAptllIPl. Este plasmídeo adaptador contém agora sequências de Adll em vez de sequências de Ad35. A amplificação correcta das sequências de Adll amplificadas por PCR, é verificada por comparação da sequência deste clone com a correspondente sequência de ADN de Adll. A última é obtida por sequenciação directa no ADN de Adll usando os iniciadores de PCR indicados. O clone cosmídico grande contendo o 75 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ esqueleto de Adll é gerado como se segue. Primeiro, um fragmento de PCR é amplificado em ADN de Adll usando os iniciadores 35F5 e 35R6 com ADN-polimerase Pwo como descrito no Exemplo 7 para o ADN de Ad35. 0 fragmento de PCR é então purificado com o kit de purificação PCR (LTI) e digerido com NotI e NdeI. 0 resultante fragmento de 3,1 kb é isolado do gel utilizando-se o kit Geneclean (Bio 101, Inc.). Um segundo fragmento de PCR é então gerado em ADN de Adll com os iniciadores 35F7 e 35R8 (refira-se ao Exemplo 7) com ADN-polimerase Pwo de acordo com as instruções do fabricante, e é purificado com o kit de purificação PCR (LTI). Este fragmento amplificado é também digerido com NdeI e NotI e o fragmento resultante com 1,6 kb é purificado do gel como anteriormente.
Os dois fragmentos de PCR digeridos são então ligados um ao outro com o vector cosmídico pWE15, digerido previamente com NotI e desfosforilado com a enzima Tsap (LTI) de acordo com as instruções do fabricante. Um clone que possui uma cópia de ambos os fragmentos inseridos é seleccionado. Os clones correctos são seleccionados pela digestão analítica com NotI, o que resulta num fragmento de 4,7 kb. A confirmação é obtida por uma reacção de PCR com os iniciadores 35F5 e 35R8 que dá origem a um fragmento do mesmo tamanho. O clone correcto é então linearizado com NdeI e isolado do gel. A seguir, ADN de Adll do tipo selvagem é digerido com NdeI e o fragmento grande de 27 kb é isolado do gel de agarose de baixo ponto de fusão com enzima de agarase (Roche) de acordo com as instruções do fabricante. Ambos os fragmentos são então ligado e empacotados usando extractos de empacotamento de fago λ (Stratagene) de acordo com o protocolo do fabricante. A seguir à infecção de células STBL-2 (LTI), as colónias são crescidas em placas e analisadas para a presença da inserção completa. A funcionalidade dos clones seleccionados é então testada por cotransfecção em PER.C6. Para este fim, o ADN é digerido com NotI e 6 pg é cotransfectado com 2 pg de um fragmento de PCR gerado em ADN de Adll com os iniciadores 35F1 e 35R4 (refira-se ao Exemplo 7) . Os clones correctos dão CPE no espaço de uma semana a seguir à transfecção. O clone correcto é denominado pWE.Adll.plX-rlTR. 76 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Usando ο procedimento descrito atrás, gerou-se um sistema baseado em plasmideos consistindo em um plasmideo adaptador adequado à inserção de genes estranhos e um grande fragmento auxiliar contendo o esqueleto virai. Vírus recombinantes baseados em Adll são realizados pelos métodos descritos aqui para vírus recombinantes baseados em Ad35.
Exemplo 12
Neutralização de adenovírus em amostras derivadas de pacientes
Nos testes de neutralização descritos nos Exemplos 1 e 5, todas as amostras foram derivadas de voluntários saudáveis.
Como uma das aplicações de vectores não neutralizados é no campo da terapia genética, será interessante investigar se o Ad35 também é neutralizado com baixa frequência e com títulos baixos em grupos de pacientes que são candidatos a tratamento com terapia genética. - Pacientes com doenças cardiovasculares 26 amostras aos pares de soro e fluído pericárdico (PF) foram obtidas de pacientes com insuficiência cardíaca. Estas foram testadas contra Ad5 e Ad35 usando o ensaio de neutralização descrito no Exemplo 1. Os resultados confirmaram os resultados anteriores obtidos com amostras de voluntários saudáveis. 70% das amostras de soro continham NA de Ad5 e 4% continha NA de Ad35. Nas amostras de fluído pericárdico os títulos eram mais baixos resultando num total de 40% com NA de Ad5 e nada com NA de Ad35. Havia uma boa correlação entre a NA no PF e no soro, i.e. não havia amostras positivas no PF sem NA na amostra par do soro. Estes resultados mostram que vectores não neutralizados baseados em Ad35 são preferidos relativamente a vectores de Ad5 para o tratamento de doenças cardiovasculares. Como é verdade para todas as formas de vectores não neutralizados nesta aplicação, o vector pode ser baseado no genoma do serótipo não neutralizado ou pode ser baseado em Ad5 (ou outro serótipo) embora apresentando pelo menos as proteínas da cápside principais (hexão, pentão e opcionalmente fibra) do serótipo não neutralizado. 77 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ - Pacientes com Artrite Reumatóide O determinante molecular básico de artrite ainda não é conhecido mas ambas, uma disfunção das células T e a produção do factor de crescimento desequilibrado nas articulações, são conhecidas por causar inflamação e hiperplasia do tecido sinovial. Os sinoviócitos começam a proliferar e invadem a cartilagem e osso, o que leva à destruição destes tecidos. 0 tratamento corrente começa (ainda num estágio inicial) com administração de drogas anti-inflamatórias (anti-TNF, ILl-RA, IL-10) e/ou drogas convencionais (por exemplo, MTX, sulfasalazina). No estágio adiantado de RA realiza-se sinovectomia que é baseada em cirurgia, radiação, ou intervenção quimica. Uma opção alternativa ou adicional é o tratamento por terapia genética onde um vector adenoviral é levado directamente às articulações dos pacientes e expressa uma droga anti-inflamatória ou um gene suicida. Estudos prévios levados a cabo em macacos Rhesus que sofriam de artrite induzida por colagénio mostraram que vectores baseados em Ad5 transportando um gene marcador podem transduzir sinoviócitos. Não se sabe se numa situação humana a transferência adenoviral é comprometida pela presença de NA. Para investigar a presença de NA no fluido sinovial (SF) de pacientes com RA, obtiveram-se amostras de SF de um painel de 53 pacientes seleccionados aleatoriamente que sofriam de artrite reumatóide (RA).
Estes foram testados contra vários adenovirus do tipo selvagem usando o ensaio de neutralização como descrito no Exemplo 1. Os resultados deste rastreio estão apresentados na Tabela III. Determinou-se que o adenovirus do tipo 5 era neutralizado em 72% das amostras de SF. A maioria destas amostras continha títulos elevados de NA assim como também a diluição mais elevada da amostra de SF que foi testada (64x), neutralizaram vírus Ad5. Isto significa que a entrega do vector adenoviral aos sinoviócitos nas articulações de pacientes com RA será muito ineficiente. Ainda mais, como os títulos no SF são tão elevados duvida-se se o lavado das articulações antes da injecção de vector removerá suficiente NA. Dos outros serótipos que foram testados, Ad35 mostrou ser neutralizado só em 4% das amostras. Assim, estes resultados confirmam os resultados obtidos nas amostras de soro de pacientes saudáveis e mostram que no tratamento de artrite 78 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ reumatóide, vectores baseados em Ad35 ou vectores quiméricos que apresentam pelo menos algumas das proteínas da cápside de Ad35, são os vectores preferidos.
Exemplo 13
Modificações no esqueleto de vírus baseados em Ad35 1) Geração de pBr/Ad35.Pac-rITR e pBr/Ad35.PRn 0 Exemplo 4 descreve a geração do subclone de Ad35 pBr/Ad35.Ecol3.3. Este clone contém sequências de Ad35 desde pb 21943 até à extremidade da ITR direita clonadas nos locais EcoRI e PcoRV de pBr322. Para prolongar estas sequências ao local Pacl localizado a pb 18137 em Ad35, pBr/Ad35.Ecol3.3 (refira-se ao Exemplo 4) foi digerido com Aatll e SnaBI e o fragmento grande contendo o vector foi isolado do gel usando o kit de extracção por gel QIAEX II (Qiagen) . O ADN de Ad35 do tipo selvagem foi digerido com Pacl e SnaBI e o fragmento de 4,6 kb foi isolado como anteriormente. Este fragmento foi então ligado a um ligante de cadeia dupla (ds) contendo um Pacl e um ressalto Aatll. Este ligante foi obtido após hibridação dos seguintes oligonucleótidos: A-Pl: 5'-CTG GTG GTT AAT-3' A-P2: 5'-TAA CCA CCA GAC GT-3' A mistura de ligação contendo o ligante ds e um fragmento de Ad35 PacI-SnaBI foi separado do ligante não ligado num gel LMP. A banda de 4,6 kb foi cortada do gel, fundida a 65°C, e ligada depois ao fragmento do vector pBr/Ad35.Ecol3.3 purificado digerido com Aatll e SnaBI. As ligações foram transformadas em células DH10B electrocompetentes (Life Technologies Inc.). 0 clone resultante, pBr/Ad35.Pac-rITR, continha sequências de Ad35 desde o local Pacl a pb 18137 até aa ITR direita.
A seguir, um local de restrição único foi introduzido na extremidade 3' da ITR direita de modo a se poder libertar a ITR das sequências do vector. Para este fim, usou-se um fragmento de PCR que cobria sequências de Ad35 desde o local NdeI a pb 33165 até à ITR direita tendo os locais de restrição Swal, NotI e PcoRI fixados à ITR direita. 0 fragmento de PCR 79 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ foi gerado com os iniciadores 35F7 e 35R8 (descrito no Exemplo 7). Após purificação, o fragmento de PCR foi clonado no vector de clonagem AT (Invitrogen) e sequenciado para se verificar a amplificação correcta. 0 clone correcto amplificado foi então digerido com EcoRIr liso com a enzima Klenow e subsequentemente digerido com NdeI e o fragmento de PCR foi isolado. Em paralelo, o NdeI no vector pBr em pBr/Ad35.Pac-rlTR foi removido como se segue: um vector pBr322 do qual se removeu o local Ndel por digestão com NdeI, tratamento com Klenow e religação, foi digerido com Aatll e NheI. 0 fragmento do vector foi isolado em gel LMP e ligado ao fragmento AatlI-Nhel de Ad35 com 16,7 kb de pBr/Ad35.Pac-rlTR que foi também isolado num gel LMP. Isto originou pBr/Ad35.Pac-rITR.ANdel. A seguir pBr/Ad35.Pac-rlTR.ANdel foi digerido com Nhel, as extremidades foram preenchidas usando a enzima Klenow e o ADN foi então digerido com NdeI. 0 fragmento grande contendo o vector e as sequências de Ad35 foi isolado. A ligação deste fragmento do vector e o fragmento de PCR resultou em pBr/Ad35.PRn. Neste clone podem ser manipuladas sequências especificas que codificam para fibra, E2A, E3, E4 ou hexão. Além disso, sequências promotoras que motivam por exemplo as proteínas E4 ou E2 podem ser alteradas ou eliminadas e trocadas por promotores heterólogos. 2) Geração de vírus baseados em Ad35 com proteínas da fibra de serótipos diferentes.
Adenovírus infectam células humanas com eficiências diferentes. A infecção é conseguida por um processo de dois passos envolvendo: 1. as proteínas da fibra que intervêm na ligação do vírus a receptores específicos das células, e 2. as proteínas de pentão que medeiam a internalização por interacção da sequência RGD por exemplo com as integrinas presentes na superfície celular. Não se conhece o receptor celular para a proteína da fibra dos vírus do subgrupo B do qual Ad35 é um membro. Existem diferenças óbvias na eficiência de infecção de células humanas pelos vírus do subgrupo B comparado aos vírus do subgrupo C tal como Ad5 (refira-se a WO 00/03029 e EP 99200624.7). Mesmo dentro de um subgrupo, as eficiências de infecção de certas células humanas podem diferir entre vários serótipos. Por exemplo, a fibra de Adi6, 80 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ quando presente num vírus recombinante baseado em Ad5 infecta células endoteliais primárias, células de músculos lisos e sinoviócitos de origem humana e do macaco Rhesus melhor do que vírus quiméricos de Ad5 que transportam a fibra de Ad35 ou Ad51. Assim, para se obter eficiências elevadas de infecção por vírus baseados em Ad35, pode ser necessário mudar a proteína da fibra por uma proteína da fibra de um serótipo diferente. A tecnologia para tais fibras quiméricas está descrita para vírus baseados em Ad5 no Exemplo 3, e está exemplificada a seguir para os vírus Ad35.
Primeiro, a maioria das sequências de fibra são eliminadas do esqueleto de Ad35 na construção pBr/Ad35.PRn como se segue:
As sequências flanqueadoras da esquerda e parte da proteína da fibra em Ad35 indo desde pb 30225 a montante de um local único MluI até pb 30872 (números de acordo com a sequência de Ad35 do tipo selvagem como divulgado na Figura 6) na cauda da fibra são amplificadas usando os iniciadores: DF35-1: 5'-CAC TCA CCA CCT CCA ATT CC-3', e DF35-2: 5'-CGG GAT CCC GTA CGG GTA GAC AGG GTT GAA GG-3'
Esta amplificação por PCR introduz um local BsíWI único na cauda do gene da fibra.
As sequências flanqueadoras da direita indo desde a extremidade da proteína da fibra a pb 31798 até pb 33199 (numeração de acordo com a sequência de Ad35 do tipo selvagem, Figura 6), a 3' do único local Ndel são amplificadas usando os iniciadores DF35-3: 5'-CGG GAT CCG CTA GCT GAA ATA AAG TTT AAG TGT TTT TAT TTA AAA TCA C-3', e DF35-4: 5'-CCA GTT GCA TTG CTT GGT TGG-3'.
Este PCR introduz um local Nhe I único no lugar das sequências da fibra. A amplificação por PCR é levada a cabo com ADN-polimerase Pwo (Roche) de acordo com as instruções do fabricante. A seguir à amplificação, os produtos de PCR são purificados usando um kit de purificação PCR e os fragmentos 81 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ são digeridos com BamEl e ligados um ao outro. Os fragmentos ligados de 2 kb são purificado do gel e clonados no vector PCR Script Amp (Stratagene) . A amplificação correcta é verificada por sequenciação. 0 fragmento de PCR é então excisado com um fragmento Mlul/Ndel e clonado em pBr/Ad35.PRn digerido com as mesmas enzimas. Isto gera pBr/Ad35.PRAfib, um vector vaivém apropriado para introduzir sequências de fibra de serótipos alternativos. Esta estratégia é análoga à estratégia de modificação de fibra para virus baseados em Ad5 como divulgado em WO00/03029. Iniciadores que estão listados na Tabela I daquela aplicação foram usados para amplificar sequências de fibra de vários subgrupos de adenovirus. Para amplificação de fibras clonadas em pBr/Ad35.PRAfib podem usar-se as mesmas sequências iniciadoras (degeneradas), porém, o local NdeI nos iniciadores da frente (oligonucleótidos A to E da cauda) deverá ser mudado para um local BsíWI e o local NsiI no oligo inverso (oligonucleótido 1 a 8 do nó) deverá ser mudado para um local NheI. Assim 16 sequências de fibra são amplificadas usando os seguintes iniciadores degenerados: 5'- CCK GTS TAC CCG TAC GAA GAT GAA AGC-3' e 5'-CCG GCT AGC TCA GTC ATC TTC TCT GAT ATA-3'. As sequências amplificadas são então digeridas com BsiWI e NheI e clonadas em pBr/Ad35.PRAfib digerido com as mesmas enzimas para gerar pBr/Ad35.PRfibl6. Esta última construção é então digerida com PacI e Swal e a inserção é isolada do gel. 0 fragmento PacI/Swal de Ad35 com fibra modificada é então clonado nos locais correspondentes de pWE/Ad35.pIX-rITR para dar pWE/Ad35.ρΐΧ-rITR.fibl6. Este esqueleto cosmídico pode então ser usado com um plasmideo adaptador baseado em Ad35 para gerar virus recombinantes de Ad35 que apresentam a fibra de Adl6. Outras sequências da fibra podem ser amplificadas com iniciadores (degenerados) como antes mencionado. Se uma das sequências de fibras possui um local interno BsíWI ou NheI, o fragmento de PCR tem de ser digerido parcialmente com aquela enzima. 3) Geração de virus baseados em Ad35 com expressão de E4, indutível, independente de El. 0 promotor E4 de adenovirus é activado por expressão de proteínas El. Não se sabe se as proteínas El de Ad35 são capazes de mediar a activação do promotor E4 de Ad35. 82 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Assim, para permitir a produção de vírus recombinantes de Ad35 em células PER.C6, pode ser vantajoso tornar a expressão de E4 independente de El. Isto pode ser conseguido pela substituição do promotor E4 de Ad35 por sequências promotoras heterólogas tal como, mas não limitado a, o promotor 7xTetO.
Vectores recombinantes baseados em Ad5 eliminados em El demonstram possuir expressão residual de genes virais do esqueleto do vector em células alvo, apesar da ausência de expressão de El. A expressão de genes virais aumenta a toxicidade e pode desencadear uma resposta imune do hospedeiro à célula infectada. Para a maioria das aplicações de vectores adenovirais no campo da terapia genética e vacinação, é preferível reduzir ou diminuir a expressão dos genes virais do esqueleto. Uma maneira de alcançar isto é eliminar todas as sequências do esqueleto virai, ou tantas quanto possível. Ao eliminar os genes E2A, E2B ou E4 e/ou as funções de genes tardios, tem de se complementar para estas funções durante a produção. Esta complementação pode ser por meio de um vírus auxiliar ou através de uma adição estável destas funções à célula produtora, com ou sem regulação da transcrição indutível. Métodos para realizar isto foram descritos para Ad5 e são conhecidos na arte. Um método específico é a substituição do promotor E4 por sequências promotoras que não estão activas em células alvo. As proteínas E4 podem ter um papel na replicação de adenovírus por exemplo, através da activação do promotor E2 e na expressão de genes tardios por meio da regulação de splicing e exportação nuclear de transcrições de genes tardios. Além disso, pelo menos algumas das proteínas E4 são tóxicas a células. Assim, a redução ou eliminação da expressão de E4 nas células alvo melhorará ainda os vectores baseados em Ad35. Uma maneira de se alcançar isto é substituir o promotor E4 por um promotor heterólogo que é inactivo nas células alvo.
Um exemplo de um sistema promotor heterólogo/activador que é inactivo em células alvo é o sistema TetO indutível por tetraciclina (Gossen e Bujard, 1992). Podem usar-se outros sistemas procarióticos ou sintéticos de promotores/activadores. Neste exemplo, o promotor E4 no esqueleto do vector virai é substituído por um fragmento de 83 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ ADN contendo 7 repetições do elemento responsivo a tetraciclina do operão tet (7xTetO).
Um transactivador forte para este promotor é uma proteína de fusão contendo o domínio de ligação do ADN do repressor tet e o domínio de activação de VP16 (proteína transactivadora de Tet, Tta) . Uma expressão forte de E4 independente de El pode ser conseguida em células PER.C6 expressando Tta. Células PER.C6 que expressam Tta foram geradas e descritas (refira-se ao Exemplo 15). Vírus eliminados em El derivados de Ad5 com E4 sob controlo de 7xTetO podem ser gerados e propagados nestas células. Após infecção de células de origem humana ou animal (que não expressam o transactivador Tta), a expressão de E4 foi encontrada muito diminuída comparada aos vírus eliminados em El com o promotor E4 normal. A seguir descreve-se a construção de pWE/Ad35.pIX-rITR.TetO-E4, um vector auxiliar cosmídico para produzir vírus com a substituição do promotor E4.
Primeiro, um fragmento é gerado por amplificação com PCR em ADN de pBr/Ad35.PRn usando os seguintes iniciadores: 355ITR: 5'- GAT CCC GAG CTC ACA ACG TCA TTT TCC CAC G-3', e 353ITR: 5'-CGG AAT TCG CGG CCG CAT TTA AAT C-3'
Este fragmento contém sequências entre pb 34656 (numeração de acordo com Ad35 do tipo selvagem) e o local NotI a 3' da ITR direita em pBr/Ad35.PRn e introduz um local Sstl a 5' da sequência da ITR direita.
Um segundo fragmento de PCR foi gerado no ADN de pBr/Ad35.PRn usando os iniciadores: 35DE4: 5'-CCC AAG CTT GCT TGT GTA TAT ATA TTG TGG-3' e 35F7: Refira-se ao exemplo 7.
Este PCR amplifica sequências de Ad35 entre pb 33098 e 34500 (numeração de acordo com Ad35 do tipo selvagem) e introduz um local HindlII a montante da Tata-box de E4. Com esta duas reacções de PCR as sequências flanqueadoras à esquerda e à direita do promotor E4 são amplificadas. Para a 84 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ amplificação, usou-se ADN-polimerase Pwo de acordo com as instruções do fabricante. Um terceiro fragmento contendo o promotor 7xTetO foi isolado da construção pAA0-E-TATA-7xTet0 por digestão com Sstl e Hindiu. A geração de pAAO-E-TATA-7xTetO é descrita adiante. 0 primeiro fragmento de PCR (355/353) foi então digerido com Sstl e Not I e ligado ao fragmento de 7xTetO. A mistura de ligação foi então digerida com HindiII e NotI e o fragmento de 0,5 kb foi isolado do gel. O segundo fragmento de PCR (35DE4/35F7) foi digerido com Ndei e HindIII e purificado do gel. Estes dois fragmentos foram então ligados a pBr/Ad35.PRn digerido com NdeI e NotI para dar pBr/Ad35.PR.TetOE4. A modificação do promotor E4 é então transferida ao clone cosmidico auxiliar de Ad35 pela troca do fragmento Pacl/Swal do último com o de pBr/Ad35.PR.TetOE4 para dar pWE/Ad35.pIX-rITR.TetOE4. pAAO-E-TATA.7xTetO foi gerado como se segue. Dois oligonucleótidos foram sintetizados: TATAplus: 5' -AGC TTT CTT ATA AAT TTT CAG TGT TAG ACT AGT AAA TTG CTT AAG-3' e
TATAmin: 5'-AGC TCT TAA GCA ATT TAC TAG TCT AAC ACT GAA AAT TTA TAA GAA-3' (As sequências sublinhadas formam uma TATA box modificada).
Os oligonucleótidos foram hibridados para dar um fragmento de ADN de cadeia dupla com ressaltos a 5' que são compatíveis com ADN digerido por HindIII. O produto da reacção de hibridação foi ligado ao vector pGL3-Enhancer Vector (Promega) digerido com Hindiu para dar pAAO-E-TATA. O clone que tinha o local HindIII na extremidade 5' da inserção restaurada foi seleccionado para clonagem adicional. A seguir, a sequência do operador tet heptamerizada foi amplificada do plasmídeo pUHC-13-3 (Gossen e Bujard, 1992) numa reacção de PCR usando o sistema Expand PCR (Roche) de acordo com o protocolo do fabricante. Os seguintes iniciadores foram usados: tet3: 5'- CCG GAG CTC CAT GGC CTA ACT CGA GTT TAC CAC TCC C-3' tet5: 5'-CCC AAG CTT AGC TCG ACT TTC ACT TTT CTC-3' O fragmento amplificado foi digerido com Sstl e HindIII (estes locais estão presentes em tet3 e tet5 respectivamente) 85 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ e foi clonado em pAAO-E-TATA digerido por Sstl/Hindlll dando origem a pAA0-E-TATA-7xtet0.
Para testar a funcionalidade do clone cosmídico pWE/Ad35.pIX-rITR.TetOE4 gerado, o ADN foi digerido com NotI. A extremidade esquerda do ADN de Ad35 do tipo selvagem foi então amplificada usando os iniciadores 35F1 e 35R4 (refira-se ao exemplo 7). Após amplificação, a mistura de PCR foi purificada e digerida com SalI para remover ADN virai intacto. A seguir, cotransfectou-se 4 g de ambos, pWE/Ad35.pIX-rITR.TetOE4 digerido e o fragmento de PCR, para células PER. C6-tTA que tinham sido semeadas em balões T25 no dia anterior. As células transfectadas foram transferidas para balões T80 dois dias depois e outros dois dias mais tarde obteve-se CPE, mostrando que o esqueleto cosmídico era funcional.
Exemplo 14
Geração de linhas celulares capazes de complementar vírus Ad35 eliminados em El
Geração de pIG135 e pIG270 A construção pIG.ElA.ElB contém sequências da região El de Ad5 correspondentes aos nucleótidos 459 a 3510 da sequência de Ad5 do tipo selvagem (Número de acesso do Genbank M72360) ligadas operativamente ao promotor da fosfoglicerato-quinase humana (PGK) e as sequências de poliA do vírus da Hepatite B. A geração desta construção está descrita em WO97/00326. As sequências El de Ad5 foram substituídas pelas correspondentes sequências de Ad35 como se segue. pRSV.Ad35-El (descrito no Exemplo 8) foi digerido com EcoRI e Sse8387I e o fragmento de 3 kb correspondente às sequências El de Ad35 foi isolado do gel. A construção pIG.ElA.ElB foi digerida completamente com Sse8387I e parcialmente com EcoRI. O fragmento de 4,2 kb correspondente às sequências do vector sem a região El de Ad5, mas retendo o promotor de PGK, foi separado de outros fragmentos no gel de agarose LMP e a banda correcta foi excisada do gel. Ambos os fragmentos obtidos foram ligados resultando em pIG.Ad35-El.
Este vector foi modificado ainda para se remover as sequências de LacZ presentes no esqueleto do vector pUC119. 86 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Para este fim, o vector foi digerido com BsaAl e BstXI e o fragmento grande foi isolado do gel. Um oligo de dupla cadeia foi preparado pela hibridação dos dois seguintes oligos: BB1: 5'-GTG CCT AGG CCA CGG GG-3' e BB2: 5'-GTG GCC TAG GCA C-3' A ligação do oligo e do fragmento do vector resultou na construção plG135. A inserção correcta do oligo restaura os locais BsaAl e BstXI e introduz um local único Avrll. A seguir, introduziu-se um local único na extremidade 3' da cassete de expressão de El de Ad35 em plG135. Para este fim, a construção foi digerida com SapI e as extremidades protuberantes 3' foram lisas por tratamento com ADN-polimerase de T4. 0 plasmideo linear assim tratado foi ainda digerido com BsrGI e fragmento grande contendo o vector foi isolado do gel. Para restaurar a extremidade 3' da sequência de poliA de HBV e para introduzir um local único, um fragmento de PCR foi gerado usando os seguintes iniciadores: 270F: 5'- CAC CTC TGC CTA ATC ATC TC -3' e 270R: 5'- GCT CTA GAA ATT CCA CTG CCT TCC ACC -3' 0 PCR foi realizado no ADN de pIG.Ad35.El usando polimerase Pwo (Roche) de acordo com as instruções do fabricante. 0 produto de PCR obtido foi digerido com BsrGI e desfosforilado com a enzima Tsap (LTI), a última para evitar dimerização da inserção no local BsrGI. 0 fragmento de PCR e o fragmento do vector foram ligados para dar a construção plG2 70.
As sequências El de Ad35 são capazes de transformar células primárias de rato
Ratos WAG/RIJ acabados de nascer foram sacrificados a 1 semana de gestação e os rins foram isolados. A seguir à remoção cuidadosa da cápsula, os rins foram desintegrados a uma simples suspensão celular por ciclos múltiplos de incubação em tripsina/EDTA (LTI) a 37°C e recolha das células flutuantes em PBS frio contendo FBS a 1%. Quando a maior parte do rim se encontrava tripsinizado, todas as células foram ressuspensas em DMEM suplementado com FBS 10% e filtradas 87 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ através de um pano estéril para queijo. Células de rim de rato bebé (BRK) obtidas de um rim foram plaqueadas em 5 placas (Greiner, 6 cm) . Quando se atingiu uma confluência de 70-80%, as células foram transfectadas com 1 ou 5 pg de ADN/placa usando o kit de precipitação com CaP04 (LTI) de acordo com as instruções do fabricante. As seguintes construções foram usadas em transfecções separadas: pIG.ElA.ElB (expressando a região EI de Ad5), pRSV.Ad35-El, pIG.Ad35-El e pIG270 (a última expressando El de Ad35). As células foram incubadas a 37°C, C02 a 5% até surgirem focos das células transformadas. A Tabela IV mostra o número de focos que resultou de vários teste de transfecção usando ADN circular ou linear. Como esperado, a região El de Ad5 transformou eficientemente as células BRK. Também apareceram focos na camada de células transfectadas de El de Ad35 embora com eficiência mais baixa. Os focos do Ad35 transformado surgiram mais tarde: *2 semanas após transfecção comparado com 7-10 dias para El de Ad5. Estes testes mostram claramente que os genes El do grupo B do virus Ad35 são capazes de transformar células primárias de roedor.
Isto prova a funcionalidade das construções de expressão de El de Ad35 e confirma o que foi determinado mais cedo sobre a capacidade de transformação dos vírus Ad3 e Ad7 do grupo B (Dijkema, 1979) .
Para testar se as células nos focos estavam realmente transformadas, colheram-se e expandiram-se alguns focos. Dos 7 focos colhidos pelo menos 5 replicaram como linha celulares estabelecidas.
Geração de novas células de empacotamento derivadas de amniócitos humanos primários
Fluido amniótico obtido após amniocentese foi centrifugado e as células foram ressuspensas em meio AmnioMax (LTI) e deixadas em cultura em balões para cultura de tecidos a 37°C e C02 a 10%. Quando as células estavam a crescer bem (aproximadamente uma divisão celular/24 h.), o meio foi substituído por uma mistura 1:1 de meio completo AmnioMax e meio DMEM de baixa glicose (LTI) suplementado com Glutamax I (concentração final de 4 mM, LTI) e glicose (concentração final de 4,5 g/L, LTI) e FBS a 10% (LTI). Para a transfecção, 88 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ plaquearam-se ^SxlO5 células em placas para cultura de tecidos de 10 cm. No dia seguinte, as células foram transfectadas com 20 pg de pIG270 circular/placa usando o kit de transfecção com CaP04 (LTI) de acordo com as instruções do fabricante e as células foram incubadas durante a noite com o precipitado de ADN. No dia seguinte, as células foram lavadas 4 vezes com PBS para remover o precipitado e foram ainda incubadas três semanas até surgirem focos das células transformadas.
Uma vez por semana o meio foi substituído por meio novo. Outros agentes de transfecção foram usados, tais como, mas não limitado a, Lipofectamina (LTI) ou PEI (Polietilenoimina, peso molecular elevado, isento de água, Aldrich). Destes três agentes, PEI atingiu a melhor eficiência de transfecção em amniócitos humanos primários: «1% de células azuis em 48 h após transfecção de pAdApt35.LacZ.
Focos foram isolados como se segue. O meio foi removido e substituído por PBS a seguir ao qual, os focos foram isolados raspando gentilmente as células com uma pipeta Gilson de 50-200 μΐ com uma ponta de filtro descartável. As células contidas em 10 μΐ de PBS foram transferidas para uma placa de 96 poços contendo 15 μΐ de tripsina/EDTA (LTI) e uma simples suspensão celular foi obtida pipetando para cima e para baixo e com uma curta incubação à temperatura ambiente. A seguir à adição de 200 μΐ do descrito atrás, uma mistura 1:1 de meio completo AmnioMax e DMEM com suplemento de FBS a 10%, a incubação das células continuou. Clones que continuavam a crescer foram expandidos e analisados para a sua capacidade para complementar o crescimento de vectores adenovirais eliminados em El de vários subgrupos, especificamente aqueles derivados de vírus do grupo B, mais especificamente de Ad35 ou Adll.
Geração de novas linhas celulares de empacotamento a partir de retinoblastos embrionários humanos Células da retina humana foram isoladas dos olhos de fetos abortados e postas em cultura em meio DMEM (LTI) suplementado com FBS a 10% (LTI). No dia antes de transfecção, plaquearam-se *5xl05 células em placas de 6 cm e a cultura 89 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ prosseguiu durante a noite a 37°C e CO2 10%. A transfecção foi feita usando o kit de precipitação com CaP04 (LTI) de acordo com as instruções do fabricante. Cada placa foi transfectada com 8-10 pg de ADN de piG270, como um plasmideo circular ou como um fragmento purificado. Para se obter o fragmento purificado, pIG270 foi digerido com Avrll e Xbal e o fragmento de 4 kb correspondente à cassete de expressão de El de Ad35 foi isolado do gel por tratamento com agarase (Roche). No dia seguinte, o precipitado foi lavado cuidadosamente com quatro lavagens de PBS estéril. A seguir adicionou-se meio novo e a cultura de células transfectadas prosseguiu até surgirem focos de células transformadas. Quando os focos estavam suficientemente grandes (>100 células), foram colhidos e transferido para 96 poços como descrito antes. Os clones de retinoblastos embrionários humanos transformados que continuaram a crescer, foram expandidos e testados na sua capacidade para complementar o crescimento de vectores adenovirais eliminados em El de diferentes subgrupos, especificamente aqueles derivados de virus do grupo B, mais especificamente de Ad35 ou Adll.
Novas linhas celulares de empacotamento derivadas de PER.C6
Como descrito no Exemplo 8, é possível gerar e crescer virus eliminados em El de Ad35 em células PER.C6 com cotransfecção de uma construção de expressão de El de Ad35, por exemplo, pRSV.Ad35.El. Porém, a produção à escala grande de adenovirus recombinantes usando este método é ineficiente porque é necessário uma transfecção da construção de expressão El de Ad35 por cada passo de amplificação. Além disso, este método aumenta o risco de recombinação não homóloga entre o plasmideo e o genoma do virus com altas probabilidades de se gerar virus recombinantes que incorporam sequências El resultando em virus competentes para a replicação. Para evitar isto, a expressão de proteínas El de Ad35 em PER.C6 tem de ser mediada por cópias integradas do plasmideo de expressão no genoma. Como as células PER.C6 já estão transformadas e expressam proteínas El de Ad5, a adição de extra expressão de El de Ad35 pode ser tóxica para as células, contudo, não será impossível transfectar estavelmente células transformadas com proteínas El já que células A549 de expressão de El de Ad5 têm sido geradas. 90 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Numa tentativa de gerar adenovírus recombinantes derivados do vírus Ad7 do subgrupo B, Abrahamsen et ai. (1997) não foram capazes de gerar vírus eliminados em El em células 293 sem contaminação de Ad7 do tipo selvagem. Os vírus que foram colhidos após purificação por formação de placas fágicas em células 293-ORF6 (Brough et al., 1996) mostraram ter incorporado sequências ElB de Ad7 por recombinação não homóloga. Assim, a propagação eficiente de vírus recombinantes de Ad7 provou só ser possível na presença da expressão de ElB de Ad7 e da expressão de Ad5-E4-ORF6. As proteínas ElB são conhecidas por interactuar com proteínas celulares assim como virais (Bridge et al.r 1993; White, 1995). Possivelmente, o complexo formado entre a proteína ElB de 55K e E4-ORF6, o qual é necessário para aumentar a exportação de ARNm de proteínas virais e para inibir a exportação da maior parte dos ARNm celulares, é crítico e de algum modo específico do serótipo. Os testes precedentes sugerem que as proteínas EIA de Ad5 são capazes de complementar uma deleção em EIA de Ad7 e que a expressão de ElB de Ad7 em células de empacotamento de adenovírus em si não é suficiente para gerar uma linha celular complementar estável. Para testar se uma ou ambas as proteínas ElB de Ad35 é/são o factor limitativo na propagação eficiente do vector de Ad35 em células PER.C6, gerou-se um plasmídeo adaptador de Ad35 que contém o promotor ElB e sequências ElB, mas a que falta o promotor e a região de codificação para EIA. Para este fim, a extremidade esquerda do ADN de Ad35 do tipo selvagem foi amplificada usando os iniciadores 35F1 e 35R4 (ambos descritos no Exemplo 7) com ADN-polimerase Pwo (Roche) de acordo com as instruções do fabricante. O produto de PCR de 4,6 kb foi purificado utilizando-se o kit de purificação PCR (lti) e foi digerido com as enzimas SnaBl e Apal. O fragmento de 4,2 kb resultante foi então purificado do gel usando o kit QlAExll (Qiagen). A seguir, o pAdApt35IPl (Exemplo 7) foi digerido com SnaBl e Apal e o fragmento contendo o vector de 2,6 kb foi isolado do gel utilizando-se um kit GeneClean (BIO 101, Inc) . Ambos os fragmentos isolados foram ligados para dar pBr/Ad35.leftlTR-pIX. A amplificação correcta durante PCR foi verificada por um teste de funcionalidade como se segue: O ADN foi digerido com BstBI para libertar a inserção de Ad35 das 91 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ sequências do vector e 4 μξ deste ADN foi cotransfectado com 4 pg de pWE/Ad35.pIX-rlTR digerido com NotI (Exemplo 7) para células PER.C6.
As células transfectadas foram passadas para balões T80 no dia 2 e novamente dois dias mais tarde tinha-se formado CPE demonstrando que a nova construção pBr/Ad35.leftITR-pIX continha sequências El funcionais. A construção pBr/Ad35.leftlTR-ρΐχ foi ainda modificada como se segue. O ADN foi digerido com SnaBI e HindiII e o ressalto HindII a 5' foi preenchido usando a enzima Klenow. A religação do ADN digerido e transformação em células competentes (LTI) resultou na construção pBr/Ad351ITR-pIXAElA. Esta última construção contém a extremidade esquerda de 4,6 kb de Ad35 excepto as sequências EIA entre pb 450 e 1341 (numeração de acordo com Ad35 do tipo selvagem, Figura 6) e assim não tem o promotor EIA e a maioria das sequências de codificação de ElA. pBr/Ad35.leftlTR-ρΐΧΔΕΐΑ foi então digerido com HstBI e 2 pg desta construção foi cotransfectada com 6 pg de pWE/Ad35.pIX-rlTR digerido com NotI (Exemplo 7) para células PER.C6. Uma semana a seguir à transfecção tinha-se formado CPE completo nos balões transfectados.
Este teste demonstra que proteínas ElA de Ad35 são funcionalmente complementadas pela expressão de ElA de Ad5 em células PER.C6 e que pelo menos uma das proteínas ElB de Ad35 não pode ser complementada pela expressão de El de Ad5 em PER.C6. Mostra ainda que é possível realizar uma linha celular complementar para vírus Ad35 eliminados em El pela expressão de proteínas ElB de Ad35 em PER.C6. A expressão estável de sequências de ElB de Ad35 de cópias integradas no genoma de células PER.C6 pode ser motivada pelo promotor ElB e terminada por um sinal de poliadenilação heterólogo tal como, mas não limitado a, pA de HBV. O sinal de pA heterólogo é necessário para se evitar sobreposição entre a inserção ElB e o vector recombinante, já que a terminação ElB natural está localizada na unidade de transcrição pIX, a qual tem de estar presente no vector adenoviral. 92 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Alternativamente, as sequências E1B podem ser motivadas por um promotor heterólogo tal como, mas não limitado a, o promotor de PGK humano por um promotor indutível tal como, mas não limitado a, o promotor 7xtet0 (Gossen e Bujard, 1992). Também nestes casos a terminação da transcrição é mediada pela sequência do pA heterólogo, por exemplo, pA de HBV. As sequências ElB de Ad35 compreendem pelo menos uma das regiões de codificação de ElB de 21K e as proteínas ElB de 55K localizadas entre os nucleótidos 1611 e 3400 da sequência de Ad35 do tipo selvagem. A inserção pode também incluir sequências de ElB de Ad35 (parte de) entre os nucleótidos 1550 e 1611 da sequência de Ad35 do tipo selvagem.
Exemplo 15
Geração de linhas celulares produtoras para a produção de vectores adenovirais recombinantes eliminados na região precoce 1 e região precoce 2A
Geração de células PER.C6-tTA
Aqui descreve-se a geração de linhas celulares para a produção de vectores adenovirais recombinantes que estão eliminados na região precoce 1 (El) e a região precoce 2a (E2A).
As linhas celulares produtoras complementam para a deleção de El e E2A de vectores adenovirais recombinantes em trans pela expressão constitutiva de ambos os genes, El e E2A. A preestabelecida linha celular PER.C6 de retinoblasto embrionário humano transformado por El de Ad5 (WO 97/00326) foi equipada adicionalmente com cassetes de expressão de E2A. O gene E2A adenoviral codifica uma proteína de ligação do ADN de 72 kDa, a qual tem uma afinidade elevada por ADN de cadeia simples.
Devido á sua função, a expressão constitutiva de DBP é tóxica para células. O mutante tsl25E2A codifica um DBP o qual tem uma substituição Pro->Ser do aminoácido 413. Devido a esta mutação, o DBP codificado por tsl25E2A é completamente activo à temperatura permissiva de 32°C, mas não se liga a ADNss à temperatura não permissiva de 39°C. Isto permite a geração de 93 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ linhas celulares que expressam constitutivamente E2A, o qual não é funcional e é não tóxico à temperatura não permissiva de de 39°C. E2A que é sensível à temperatura, torna-se gradualmente funcional à medida que a temperatura diminui e torna-se completamente funcional a uma temperatura de 32°C, que é a temperatura permissiva. A. Geração de plasmídeos que expressam E2A do tipo selvagem ou 0 gene tsl25E2A sensível à temperatura. pcDNA3wtE2A: A região de codificação da região precoce do tipo selvagem completa 2A (E2A) foi amplificada do plasmídeo pBR/Ad.Bam-rITR (Depósito ECACC P97082122) com os iniciadores DBPpcrl e DBPpcr2 utilizando-se o sistema de PCR Expand™ Long Template de acordo com o protocolo padrão do fornecedor (Boehringer Mannheim). 0 PCR foi efectuado num Biometra Trio Thermoblock, com o seguinte programa de amplificação: 94°C por 2 minutos, 1 ciclo; 94°C por 10 segundos + 51°C por 30 segundos + 68°C por 2 minutos, 1 ciclo; 94°C por 10 segundos + 58°C por 30 segundos + 68°C por 2 minutos, 10 ciclos; 94°C por 10 segundos + 58°C por 30 segundos + 68°C por 2 minutos com 10 segundos de extensão por ciclo, 20 ciclos; 68°C por 5 minutos, 1 ciclo. O iniciador DBPpcrl: CGG GAT CCG CCA CCA TGG CCA GTC GGG AAG AGG AG (5' a 3') contém um local único de restrição BamRI (sublinhado) a 5' da sequência de Kozak (itálico) e o codão de início da sequência de codificação de E2A. O iniciador DBPpcr2: CGG AAT TCT TAA AAA TCA AAG GGG TTC TGC CGC (5' a 3') contém um único local de restrição EcoRI (sublinhado) a 3' do codão de paragem da sequência de codificação de E2A. Os caracteres a negrito referem-se a sequências derivadas da região de codificação E2A. O fragmento de PCR foi digerido com BamRI/EcoRI e clonado em pcDNA3 digerido com BamRI/EcoRI (Invitrogen), dando origem a pcDNA3wtE2A. pcDNA3tsE2A: A região de codificação de tsl25E2A completa foi amplificada de ADN isolado do mutante de adenovírus sensível à temperatura H5tsl25. O procedimento de amplificação por PCR foi idêntico ao da amplificação de E2A do tipo selvagem. O fragmento de PCR foi digerido com BamRI/EcoRI e clonado em pcDNA3 digerido com BamRI/EcoRI (Invitrogen), dando 94 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ origem a pcDNA3tsE2A. A integridade das sequências de codificação de E2Awt e E2Ats foi confirmada por sequenciação. B. Caracteristicas de crescimento de células produtoras para a produção de vectores adenovirais recombinantes de cultura a 32, 37 e 39°C.
Realizou-se uma cultura de células PER.C6 em meio de Eagle modificado por Dulbecco (dmem, Gibco BRL) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS, Gibco BRL) e MgCl2 10 mM numa atmosfera de C02 a 10% a 32°C, 37°C ou 39°C. No dia 0, semeou-se um total de lxlO6 células PER.C6 por balão de cultura de tecidos de 25cm2 (Nunc) e a cultura de células prosseguiu a 32°C, 37°C ou 39°C. No dia 1-8, as células foram contadas. A Figura 30 mostra que a taxa de crescimento e a densidade final de células da cultura de PER.C6 a 39°C são comparáveis àquelas a 37°C. A taxa de crescimento e a densidade final da cultura de PER.C6 a 32°C eram ligeiramente inferiores às obtidas a 37°C ou 39°C. Não se observou morte significativa de células a qualquer das temperaturas de incubação. Assim PER.C6 tem um desempenho muito bom a ambas temperaturas, 32°C e 39°C, as temperaturas permissiva e não permissiva para tsl25E2A, respectivamente. C. Transfecção de PER.C6 com vectores de expressão de E2A; formação de colónias e geração de linhas celulares.
Um dia antes da transfecção, semearam-se 2 x 106 células PER.C6 por placa de cultura de tecidos de 6 cm (Greiner) em DMEM suplementado com FBS a 10% e MgCl2 lOmM, e incubaram-se a 37°C numa atmosfera de C02 a 10%. No dia seguinte, as células foram transfectadas com 3, 5 ou 8 pg por placa de ADN do plasmideo pcDNA3, pcDNA3wtE2A ou pcDNA3tsE2A, usando o kit de reagentes LipofectAMlNE PLUS™ de acordo com o protocolo padrão do fornecedor (Gibco BRL), excepto que as células foram transf ectadas a 39°C numa atmosfera de C02 a 10%. A seguir à transfecção, as células foram mantidas constantemente a 39°C, a temperatura não permissiva para tsl25E2A. Três dias mais tarde, as células foram postas em DMEM suplementado com FBS a 10%, MgCl2 lOmM e 0,25 mg/ml de G418 (Gibco BRL), e as primeiras colónias resistentes a G418 surgiram 10 dias após transfecção. Como se mostra na Tabela 1, havia uma diferença 95 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ dramática entre ο número total de colónias obtido após transfecção de pcDNA3 (*200 colónias) ou pcDNA3tsE2A (*100 colónias) e pcDNA3wtE2A (só 4 colónias). Estes resultados indicam que a toxicidade de E2A expresso constitutivamente pode ser pode ser superada usando um mutante de E2A (tsl25E2A) sensível à temperatura e efectuando a cultura de células à temperatura não permissiva de 39°C.
De cada transfecção, colheu-se um número de colónias raspando as células da placa com uma pipeta. As células separadas foram subsequentemente colocadas em placas de cultura de tecidos de 24 poços (Greiner) e a cultura continuou a 39°C numa atmosfera de CO2 a 10% em DMEM, suplementada com FBS a 10%, MgCl2 lOmM e 0,25mg/ml de G418. Como se mostra na Tabela 1, 100% das colónias transfectadas de pcDNA3 (4/4) e 82% das colónias transfectadas de pcDNA3tsE2A (37/45) ficaram estabelecidas em linhas celulares estáveis (as 8 restantes colónias transfectadas de pcDNA3tsE2A cresceram lentamente e foram rejeitadas). Em contraste, só 1 colónia transfectada de pcDNA3wtE2A ficou estabelecida. As outras 3 morreram imediatamente depois de serem colhidas. A seguir, os níveis de expressão de E2A em diferentes linhas celulares foram determinados por transferência Western. As linhas celulares foram semeadas em placas de cultura de tecidos de 6 poços e culturas sub-confluentes foram lavadas duas vezes com PBS (NPBI) e lisadas e raspadas em RIPA (NP-40 a 1%, desoxicolato de sódio a 0,5% e SDS a 0,1% em PBS, suplementado com fenilmetilsulfonilfluoreto lmM e 0,1 mg/ml de inibidor de tripsina) . Ao fim de 15 minutos de incubação no gelo, os lisados foram limpos por centrifugação. As concentrações em proteína foram determinadas pelo ensaio para proteínas Bio-Rad, de acordo com os procedimentos padrão do fornecedor (BioRad). Quantidades iguais de extracto de células completas foram fraccionadas por SDS-PAGE em gel a 10%. As proteínas foram transferidas para membranas Immobilon-P (Millipore) e incubadas com o anticorpo monoclonal B6 de aDBP. O anticorpo secundário era anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado a peroxidase de rábano (BioRad). O procedimento de transferência Western e incubações foram efectuados de acordo com o protocolo proporcionado por Millipore. Os complexos foram visualizados com o sistema de detecção ECL de acordo com o protocolo do fabricante (Amersham). A Figura 31 mostra que todas as linhas celulares derivadas da transfecção de 96 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ pcDNA3tsE2A expressavam a proteína E2A de 72-kDa (painel esquerdo, filas 4-14; painel do meio, filas 1-13; painel direito, filas 1-12). Em contraste, a única linha celular derivada da transfecção de pcDNAwtE2A não expressava a proteína E2A (painel esquerdo, fila 2). Não se detectou proteína E2A no extracto de uma linha celular derivada da transfecção de pcDNA3 (painel esquerdo, fila 1), a qual serviu como controlo negativo. Extracto de células PER.C6 transientemente transfectadas com pcDNA3tsl25 (painel esquerdo, fila 3) serviu como um controlo positivo para o procedimento de transferência Western. Estes resultados confirmaram que a expressão constitutiva de E2Awt é tóxica para células e que o emprego do mutante tsl25 de E2A poderia evitar esta toxicidade. D. Complementação da deleção em E2A em vectores adenovirais em células PER.C6 expressando constitutivamente tsl25E2A a comprimento total. 0 adenovírus Ad5.dl802 é um vector derivado de Ad5 eliminado na maior parte da região de codificação E2A e não produz DBP funcional. Usou-se Ad5.dl802 para testar a actividade de trans-complementação de E2A de células PER.C6 que expressam constitutivamente tsl25E2A. Efectuou-se uma cultura de células PER.C6 parentais ou do clone 3-9 de PER.C6tsE2A em DMEM suplementado com FBS a 10% e MgCl2 lOmM a 39°C e C02 a 10% em balões de 25 cm2 e as células foram infectadas ou infectadas simuladamente com Ad5.dl802 a um m.o.i. de 5. Subsequentemente realizou-se uma cultura a 32°C das células infectadas e as células foram avaliadas para o aparecimento de um efeito citopático (CPE) como determinado por alterações na morfologia celular e separação das células do balão. CPE completo surgiu no clone 3-9 de PER.C6tsE2A infectado por Ad5.dl802 no espaço de 2 dias. Não apareceu CPE nas células PER.C6 infectadas por Ad5.dl802 ou nas células infectadas simuladamente. Estes resultados mostram que células PER.C6 que expressam constitutivamente tsl25E2A complementaram em trans para a deleção de E2A no vector Ad5.dl802 à temperatura permissiva de 32°C. 97 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ Ε. Cultura de suspensão isenta de soro das linhas celulares PER.C6tsE2A.
Produção à grande escala de vectores recombinantes adenovirais para terapia genética humana requer um método de cultura fácil que possa aumentar de escala para a linha celular produtora, preferivelmente uma cultura de suspensão em meio destituído de quaisquer constituintes humanos ou animais. Com esse fim, fez-se uma cultura da linha celular PER.C6tsE2A c5-9 (designada c5-9) a 39°C e C02 a 10% num balão de cultura de tecidos de 175 cm2 (Nunc) em DMEM suplementado com FBS a 10% e MgCl2 lOmM. Na sub-confluência (70-80% confluente), as células foram lavadas com PBS (NPBI) e o meio foi substituído por 25 ml de meio de suspensão isento de soro Ex-cell™ 525 (JRH) suplementado com 1 x L-Glutamina (Gibco BRL), daqui para a frente designado por SFM. Dois dias mais tarde, as células foram separadas do balão com pancadas leves e foram centrifugadas a 1 000 rpm por 5 minutos. A pelete de células foi ressuspensa em 5 ml de SFM e transferiu-se 0,5 ml da suspensão de células para um balão de cultura de tecidos de 80 cm2 (Nunc), juntamente com 12 ml de SFM novo. Ao fim de 2 dias, as células foram colhidas (todas as células estavam em suspensão) e contadas num contador de células Burker. A seguir, as células foram semeadas num Erlenmeyer de cultura de tecidos de 125 ml (Corning) a uma densidade de 3 x 105 células por ml num volume total de 20 ml de SFM. A cultura de células prosseguiu a 125 RPM num agitador orbital (GFL) a 39°C numa atmosfera de C02 a 10%. As células foram contadas no dia 1-6 num contador de células Burker. Na Figura 4, apresenta-se a curva de crescimento médio de 8 culturas. PER.C6tsE2A c5-9 desempenhou bem na cultura de suspensão isenta de soro. A máxima densidade celular de aproximadamente 2 x 106 células per ml foi atingida em 5 dias de cultura. F. Características de crescimento de PER.C6 e PER.C6/E2A a 37°C e 39°C.
Efectuou-se uma cultura de células PER.C6 ou células PER.C6tsl25E2A (c8—4) em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco BRL) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco BRL) e MgCl2 lOmM numa atmosfera de C02 a 10% a 37°C (PER.C6) ou 39°C (PER.C6tsl25E2A c8-4). No dia 0, semearam-se um total de 1 x 106 células por balão de cultura 98 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ de tecidos de 25cm2 (Nunc) e a cultura de células efectuou-se às respectivas temperaturas. Nos tempos indicados, as células foram contadas. 0 crescimento de células PER.C6 a 37°C era comparável ao crescimento de PER.C6tsl25E2A c8-4 a 39°C (Figura 33).
Isto demonstra que a expressão constitutiva de DBP codificado por tsl25E2A não teve efeitos adversos no crescimento de células à temperatura não permissiva de 39°C.
G. Estabilidade de PER.C6tsl25E2A
Efectuaram-se várias passagens de cultura do clone 8-4 da linha celular PER.C6tsl25E2A a 39°C e C02 a 10% num balão de cultura de tecidos de 25 cm2 (Nunc) em DMEM suplementado com FBS a 10% e MgCl2 10 mM na ausência de pressão de selecção (G418). Na sub-confluência (70-80% confluente), as células foram lavadas com PBS (NPBI) e lisadas e raspadas em RIPA (NP-40 a 1%, desoxicolato de sódio a 0,5% e SDS a 0,1% em PBS, suplementado com fenilmetilsulfonilfluoreto lmM e 0,1 mg/ml de inibidor de tripsina) . Ao fim de 15 minutos de incubação no gelo, os lisados foram limpos por centrifugação. As concentrações em proteina foram determinadas pelo ensaio para proteínas BioRad de acordo com os procedimentos padrão do fornecedor (BioRad). Quantidades iguais de extracto de células completas foram fraccionadas por SDS-PAGE em 10% de gel. As proteínas foram transferidas para membranas Immobilon-P (Millipore) e incubadas com o anticorpo monoclonal B6 de aDBP. O anticorpo secundário era anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado a peroxidase de rábano (BioRad). O procedimento de transferência Western e incubações foram efectuados de acordo com o protocolo proporcionado por Millipore. Os complexos foram visualizados com o sistema de detecção ECL de acordo com o protocolo do fabricante (Amersham). A expressão de DBP codificado por tsl25E2A era estável por pelo menos 16 passagens, o que é equivalente a aproximadamente 40 duplicações de células (Figura 34) . Não se observou decréscimo nos níveis de DBP durante este período de cultura, indicando que a expressão de tsl25E2A era estável mesmo na ausência de pressão de selecção por G418. 99 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Exemplo 16
Geração de linhas celulares de empacotamento de expressão
de tTA A. Geração de um plasmídeo do qual o gene tTA é expresso pcDNA3.1-tTA: 0 gene tTA, uma fusão dos genes tetR e VP16, foi removido do plasmídeo pUHD 15-1 (Gossen e Bujard, 1992) por digestão com as enzimas de restrição BamRI e EcoRI. Primeiro, pUHDl5-l foi digerido com EcoRI. 0 plasmídeo linearizado foi tratado com a enzima Klenow na presença de dNTP para preencher as extremidades pegajosas EcoRI. A seguir, o plasmídeo foi digerido com BamRI. 0 fragmento resultante de 1025 pb de comprimento, foi purificado da agarose. Subsequentemente, o fragmento foi usado numa reacção de ligação com pcDNA3.1 HYGRO (-)(Invitrogen) digerido com EamHI/EcoRV dando origem a pcDNA3.1-tTA. Após transformação em competentes DH5a de E.Coli (Life Techn.) e análise das colónias resistentes a ampicilina, seleccionou-se um clone que exibia um padrão de digestão como esperado para pcDNA3.1-tTA. B. Transfecção de PER.C6 e PER.C6/E2A com o vector de expressão de tTA; formação de colónias e geração de linhas celulares
Um dia antes de transfecção, semearam-se 2xl06 células PER.C6 ou células PER.C6/E2A por placa de cultura de tecidos de 60 mm (Greiner) em meio essencial modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco BRL) suplementado com FBS a 10% (JRH) e MgCl2 10 mM, e foram incubadas a 37°C numa atmosfera de C02 a 10%. No dia seguinte as células foram transfectadas com 4-8 pg de ADN do plasmídeo pcDNA3.1-tTA usando o kit de reagentes
LipofectAMINE PLUS™ de acordo com o protocolo padrão do fornecedor (Gibco BRL). As células foram incubadas com a mistura de LipofectAMINE PLUS™-ADN por quatro horas a 37°C e C02 a 10%. A seguir, 2 ml de DMEM suplementado com FBS a 20% e MgCl2 10 mM foi adicionado e as células foram mais incubadas a 37°C e C02 a 10%. No dia seguinte, as células foram lavadas com PBS e incubadas em DMEM novo suplementado com FBS a 10%, MgCl2 10 mM a 37°C (PER.C6) ou 39°C (Per.C6/E2A) numa atmosfera de C02 a 10% por três dias. A seguir, o meio foi 100 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ trocado por meio de selecção; as células PER.C6 foram incubadas com DMEM suplementado com PBS a 10%, MgCl2 10 mM e 50 pg/ml de higromicina B (GIBCO) enquanto as células PER.C6/E2A eram mantidas em DMEM suplementado com PBS a 10%, MgCl2 10 mM e 100 pg/ml de higromicina B.
As colónias de células que resistiram à selecção surgiram no espaço de três semanas enquanto que as células não resistentes morreram neste período.
De cada transfecção, várias colónias de células independentes resistentes a higromicina foram colhidas raspando as células da placa com uma pipeta e foram colocadas em placas de 2,5 cm2 (Greiner) para crescimento adicional em DMEM contendo FBS a 10%, MgCl2 10 mM e suplementado com 50 pg/ml (células PERC.6) ou 100 pg/ml (células PERC.6/E2A) de higromicina numa atmosfera de C02 a 10% e a 37°C ou 39°C, respectivamente. A seguir, determinou-se se estas colónias de células resistentes a higromicina expressavam a proteína tTA funcional.
Assim, culturas de células PER.C6/tTA ou PER/E2A/tTA foram transfectadas com o plasmídeo pUHC 13-3 que continha o gene repórter da luciferase sob controlo do promotor 7xtetO (Gossens e Bujard, 1992) . Para demonstrar que a expressão da luciferase tinha sido mediada por tTA, metade das culturas foi mantida em meio sem doxiciclina. A outra metade foi mantida em meio com 8 pg/ml de doxiciclina (Sigma). Esta droga é um análogo da tetraciclina e liga-se a tTA inibindo a sua actividade. Todas as linhas celulares PER.C6/tTA e PER/E2A/tTA originaram níveis elevados de luciferase, indicando que todas as linhas celulares expressavam a proteina tTA (Figura 35) . Além disso, a expressão da luciferase era muito suprimida quando as células eram tratadas com doxiciclina. Em conjunto, os resultados mostram que todos os clones das células PER.C6 e PER/E2A resistentes a higromicina estabelecidos e isolados expressaram tTA funcional. 101 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Tabela ι
Serótipo Eluição [NaCl] mM VP/ml CCID50 loglO razão VP/CCID50 1 597 8,66xl010 5,OOxlO7 3,2 2 574 1,04xl012 3,66xlOn 0,4 3 131 1,19χ10η 1,28x107 4,0 4 260 4,84χ10η 2,50xl08 3,3 5 533 5,40x1o11 1,12xl08 1,7 6 477 1,05xl012 2,14xl010 1,7 7 328 1,68xl012 2,73xl09 2,4 9 379 4,99x1o11 3,75xl07 4,1 10 387 8,32xl012 1,12xl09 3,9 12 305 3,64xlOn 1,46x107 4,4 13 231 4,37xl012 7,31xl08 3,8 15 443 5,33xl012 1,25xl09 3,6 16 312 1, 75xl012 5,59xl08 3,5 17 478 1,39xl012 1,45xl09 3,0 19 430 8,44xlOn 8,55xl07 4,0 20 156 1,41χ10η 1,68x107 3,9 21 437 3,21χ10η 1,12xl08 3,5 22 365 1,43xl012 5,59xl07 3,4 23 132 2,33xlOn 1,57xl07 4,2 24 405 5,12xl012 4,27xl08 4,1 25 405 7,24X1011 5,59x107 4,1 26 356 1,13xl012 1,12xl08 4,0 27 342 2, OOxlO12 1,28xl08 4,2 28 347 2,77xl012 5,OOxlO7 4,7 29 386 2,78x1o11 2,OOxlO7 4,1 30 409 1,33xl012 5,59xl08 3,4 31 303 8,48xl010 2,19xl07 3,6 33 302 1,02xl012 1,12x107 5,0 34 425 1,08xl012 1,63χ10η O co 35 446 3,26xl012 1,25χ10η 1,4 36 325 9,26xl012 3,62xl09 3,4 37 257 5,86xl012 2,8xl09 3,3 38 337 3,61xl012 5,59x107 4,8 39 241 3,34xl012 1,17x107 4,5 42 370 1,95xl012 1,12xl08 4,2 43 284 2,42xl012 1,81xl08 4,1 44 295 8,45xlOn 2,OOxlO7 4,6 45 283 5,20χ10η 2,99x107 4,2 4 6 282 9, 73xl012 2,50xl08 4,6 47 271 5,69x1o11 3,42xl07 4,2 48 264 1,68xl012 9,56xl08 3,3 49 332 2,20xl012 8,55x107 4,4 50 459 7,38xl012 2,80xl09 3,4 51 450 8,41xlOn 1,88x10® 3,7 102 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Legenda da Tabela I:
Todos os adenovírus humanos usados nos testes de neutralização foram produzidos em células PER.C6 (Número de depósito ECACC 96022940) (Fallaux et al.r 1998) e purificados em CsCl como descrito no Exemplo 1. A concentração de NaCl à qual os diferentes serótipos foram eluidos da coluna de HPLC está indicada. As partículas de virus/ml (VP/ml) foram calculadas a partir de um padrão de Ad5. O titulo do teste (CCID50) foi determinado em células PER.C6 (Número de depósito ECACC 96022940) como descrito no Exemplo 1 por titulações efectuadas em paralelo com o teste de neutralização. O CCID50 é apresentado para os 44 virus usados neste estudo e reflecte a diluição do virus necessária para se obter CPE em 50% dos poços ao fim de 5 dias. A razão VP/CCID50 está representada em logio e é uma medição da ineficácia dos diferentes lotes em células PER.C6 (Número de depósito ECACC 96022940) .
Tabela II
Virus AdApt35.LacZ escapam neutralização por soro humano Vírus Diluição do Soro Humano Sem soro lOx 50x 250x 1250x 6250x AdApt5.LacZ moi:5 VP/célula 100% 0% 0% 1% 40% 80% AdApt35.LacZ 250 μΐ lisado bruto 100% 100% 100% 100% 100% 100%
Tabela III
Percentagem de amostras de fluido sinovial (SF) contendo actividade neutralizante (NA) de adenovírus do tipo selvagem de diferentes serótipos. % amostras de SF com NA (todas positivas) % de amostras de SF com NA (positivas a diluição h64 x) Ad5 72 59 Ad2 6 66 34 Ad34 45 19 Ad35 4 0 Ad4 8 42 4 103 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ
Tabela ιν. Números de focos obtidos com as diferentes construções de expressão em testes de transformação de BRK. Número médio de focos/placa:
Construção 1 pg 5 pg Teste 1 pIG.ElA.ElB nd 60 pIG.ElA.ElB nd 35 pRSVAd35El 0 3 pIG.Ad35.El 3 7 Teste 2 pIG.ElA.ElB 37 nd pIGAd35.El nd 2 Teste 3 pIG.ElA.ElB nd 140 pIG.Ad35.El nd 20 pIG270 nd 30
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Lisboa, 2011-01-17

Claims (3)

  1. ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Adenovírus recombinante que compreende uma deleção na região El, sendo que a referida deleção torna o referido adenovírus incompetente para replicação, em que o referido adenovirus é um adenovírus humano do serótipo 26 (Ad26).
  2. 2. Adenovirus recombinante de acordo com a reivindicação 1, em que o referido adenovirus compreende um gene de interesse.
    3. Adenovirus recombinante de acordo com a reivindicação 2, em que o referido gene de interesse está incorporado na posição da deleção em El. 4. Ácido nucleico que codifica um adenovirus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3.
    5. Célula isolada compreendendo um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 4.
    6. Célula de acordo com a reivindicação 5, que complementa os elementos necessários para a replicação adenoviral que estão ausentes do ácido nucleico de acordo com a reivindicação 4.
    7. Célula de acordo com a reivindicação 6, que é originária de uma célula PER.C6 (Número de Depósito ECACC 96022940).
    8. Método in vitro para produzir um adenovírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, compreendendo a expressão de um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 4 numa célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-7, e a colheita do adenovírus recombinante resultante. Lisboa, 2011-01-17 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 1/44
    ΕΡ 1 816 204/PT 2/44 α CM Ití U 201 rí &[
  3. «3 t rt (N r O OSaiDO/dA fio^i ΕΡ 1 816 204/PT 3/44
    EP 1 816 204/PT 4/44 Figura
    ;ipos a© adenoviru: ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 5/44
    ofàezn^unsu οριιτςττχθ eo^os ap % ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 6/44 Figura G; Seguâneia total de Ad35 ! CATCATCAAT AATATACCTT ATAGATQCAA TGETGCCAAT ATGTAAA7GA GGTGATTTTA AAAAGTGTSG 71 fiCCfiTGTGGT GATTGGCTGT SGGGTTAACG GTTAAAAGCG GCGGCGCGGC CSTGGGAAAA TGACG77TTA 14t TSGGGGTGGA GTTT7T7TGC AAQTTG7CGC GGGAAATG7T ACGCATAAAA AGGCTÍCTTT TCTCACGGAA 211 CTACTTAGTT TTCCCACGGT A7TTAACAGG AAATGAGGTA GTTTTSACCG GATGCAAGTe AAAATTGCTG aat ATT7TCGCGC GAAAACTGAA TGAGGAAGTG T7TTTXTGAA TAATG7GGTA TTTAtGGCAG GGTGQAQTAT 361 T7GTTCAGGG CCAGSTAGAC TTTGACCCAT TACSrGGAGG TTTCGATTAC CG7GT77TTT ACCTGAAITT 421 CCÊEGTACCB TGTCAAAGTC TTCTGT77T7 ACGTAGGTíT CAGCTGATC5 CTAG6G7ATT TATAGCTCAS 431 GGTTTGTGTC AAGAGGCCAC TCTTGAGTGC CAGCGAGAAG AGTTTTCTCC TCTGCGCCGG CAGT7TAA7A 661 ATAAAAAAAT QAGASATTTG CSATTTCTGC CTCAGGAAAT AATCTCTGCT GACACTGGAA ATGAAATATT S3I GGAGCTTGTG STGCACGCCC TGATGGGAGA CGÀTCCGGAG CCACCTGTGC AGCTTTTTGA GCCTCC7ACG 701 CTTCAGSAAC 7STATGAT7T ASAGSTAGAG GGATCGGAGG ATTCTAA7GA GGAAGCTGTG AATGGC7TTT 771 TTACCGATTC TATGC7TTTA GCTGCTAATG AAGGATTAGA ATT AGÀTCC6 CCT7TGGACA CTTTCAATAC 841 rCCAGSGGTG A7TGTGGAAA 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AGATGCT5CA TGATGGA7AT GiGGCCTÊSA 2501 GTAG7CGG7A TGGAAGCAG7 CACTTTTGTA AATfiTTAAGT T7AGGGGAGA TGGTTATAAT GSAATAGTGT 2861 7TATG8CCAA TACCAAACTT ATATTGCATG GTTGTAGCTT T7TTGGTTTG AACAATACCT GTG7AGATGC 2731 CTGGGGACAG GTTAGTGTAC GCGGGTtlTAG TT7CTATGCG TS7TGGAT7G CCACAGCTGG CAGAACCAAG 2801 AGICAATTG7 CTCTGAAGAA AFGCATATTC CAAAGATGTA ACCTGGSCAT TCTSAA7GAA GSCGAAGCAA 2871 GGGTCCGTCA CTGCGCTTCT ACAGATACTG GATG77TTAT TTTAATTAAG GGAAATGCCA GCGTAAAGCA 2941 TAACATGA7T TSTGGTGCTT CCGA7GAGAG GCCTTATCAA A7SCTCACTr Q.TGCTGGTGG GCATTGTAAT 3011 A7GC7GGCTA CrGTGCATAT TGTTTCCCA7 CAACGCAAAA AATGGCCTGT TTTTGATCAC AATGTG7TGA 3081 CCAAG7GCAC CATGCA7GCA GGTGSGCGTA GAGGAA7G7T TATGCCTTAC CAGTGTAACA TGAATCATGT 3151 GAAAGTGTTG rtGGAACCAG ATGCCTTTTC CAGAATGAGC CTAACAGSAA TC7TTGACAT GAACACGCAA 3221 A7CTGGAAGA fCCTGAGGTA TGATGA7ACG AGATCQAGGG TGCGCGCATG CGAATGCGGA GGCAAGCATS 3291 CCAGGTTCCA GCÇGGTGTGT GTAGATGTSÀ CCGAAGATCT CAGACCGGAT CATT7GGTTA TTGCCCGCAC 3361 TGGAGCAGÃfi TTCGGATCCA GTGGA5AASA AACTGAC7AA G5TGAGTA7T GGGAAAACTT TGGGSTGGGA 3431 TTTTCAGAT5 GACAGATTGA QÍAAAAATTT GTTTTTTC7H TCT7GCAGCT GACATQAUTG GAAATGC77C 3501 ÍTTTAAGGGS GGAG7G77CA GCCC77A7CT GACAGSGCGT CTCCCATCC7 GGGCAGGAGT TCGTCAGAAT 3571 GTTATGGGAT CTACT3TGGA 7GGAAGACCC G7TCAACCC5 CCAAT7CTTC AACGC7GACC 7ATGCTACTT 3641 TAAGTTCTTC ACCTTTGGAC GCAGC7GCAG CCGCTSCCGC CGCCTCTGTC SCGGCTAACA C7G7GCTÍGB 3711 AATGâGTTAC 7A7GQAAGCA 7CG7GQCTAA 7TCCAC7TCC TC7AATÁACC C7TC7ACACT GACTCAGGAC 3781 AÁGT7ACT7G TCCTTTTGGC CCAGCT8GAG GCTTTSACCC AACflTCTGQG TGAACTTTCT CAGCAGSTGG 3851 CCGAG77ECG AG7ACAAACT GAGTCTflCTG 7CGQCACGGC AAAGTCTAAA TAAAAAAAAT TCCASAAFCã 3921 ATGAATAAAT AAACGAGCT7 G7TGTTQATT 7AAAATCAAG 7GTTTT7AT7 TCATTT77CG CGCACGGTAT 3391 GGCCTGGACC ACCGATC7CG A7CATTGA2A AC7CGSTGGA TTTTTICCAG AATCCTATAG AGGTGsGATT 40Θ1 GAATGTTTAG A7ACÂTGGGC ATTAGCCCGT CTTTGGGGtG GAGATAGCTC CATTGAAGGG ATTCArGCTC 4131 CGGGGTAGTC 7TGTAAA7CA CCCAG7CA7A ACAAGGTCGC AGTGCATâGT 67TGCACAAT ATC7TTTAGA 42D1 A5TAGGC7GA 77GCCACAGA TAAGCCCTTG STGTAGG7G7 7TACAAACCG GTTGAGC7GG GAGGGGTSCA 4271 TTCGAGG7GA AA7TA7G7GC ATT7TGGATT fiSATTT7TAA GTTGGGAATA T7GCCGCCAA eATCCCGTCT ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 7/44 Figura 5, continuação 4341 TGGGTTCATG 7TA7SAAGGA CTACCAAGAC GGT3TA7CCG GTACAT77AG GAAATTTATC GTGCAGC7TG 441I GATGGAAAAG CGTGGAAAAA T7TSGAGACA CCCT7G7GTC C7CCGAGAT7 TTCCA7GCAC TCATCCATGA 4481 TAATAGCAAT GGGGCCGTG8 QCA3CQGCGC SGGCAAACAC GTTCCGTGGG TCTGACACAT CArASTTATG 4681 TTCCTGAGTT AAA7CATCAT AAGCCATTT7 AATGAATTTfl GGGCGGAGCG TACCAGATTS GSG7ATGAAT 4821 GTTCCTTCGG GCCCCGGAfiC ATAflTTCCCC TCACAGATTT GCATTTCCCA ASCTTTCAGT TCTGAGGSTG 4691 SAATCATGTC CACCTSGSGS GCTATGAAGA ACACCGTT7C GGGGSCGGSG GTGATTAfirT GSGArGATAÕ 4751 CAAGTTTCTG AGCAATTGAG AT77GCCACA 7CCGGTGGGG CCATAAATAA 77CCBATTAC ASGTTGCAGG 4831 TGGTAGTTTA GGGAACGGCA ACTGCCGTCT 7CTCGAAGCA AGGGGGCCAC CTCGTTCATC A77TCCC77A · 4Ô0I CATGCATATT 7TCCCGCACC AAATCCATTA GGAGGCGCTC TCCTCCTAGT GATAGAAGT7 CTTGTAGTGA 4S7i GGAAAAGTTT TTCAGCGG7T TTAGACCGTC AGCCA7GGGC ATTTTSGAAA GAGT77GC7G CAAAAG7TC7 5041 AGTCTGT7CC ACAGTTCAGT GATGTGTTCT ATGSCATCTC QATCCAGCAG ACCTCÇTCGT TTGGCGGGT7 5111 TGGACGGCTC CTGGAG7AGG QTATUAQACG ATG0GCGTCC AGCGCTGCCA G58:TCQ8TC CTTCCAGGG7 5131 CTCAGTGTTC GAS7CAGSGT TGTTTCCGTC ACAGTGAAGG GGTQ7GCGCC 7GCrTGGGCG CTTGCCAGQG 5251 TGCGCT7CAG ACTCATTCTG CTGG7GGASA ACTTCTG7CG CTTGGCGCCC TGTATGTCG8 CCAAGTAGCA 5321 GTTTACCATG AGTTCGTAGT 7GAGCGCC7C HGCTGCGTGG CCTTTGGCGC GâASCTTACC TTTGSAAGTT 5391 7TCTTGCATA CCGGGCAGTA TAGGCATTTC AGCGCATACA GCTTGGGCGC ÀASSAAAATG GATTCTGGSG 5461 AGTATGCATC CGCGCCGCAG GAGGCQCAAA CAGTTTCACA TTCCACCAGC CASSTTAAAT CCGGTTCATT 5531 GGGGTCAAAA ACAAQTTTTC CGCCATATTT TTTQATGCGT TTCTTACC7T TGSTCTC8AT AAGT7CGTST 5601 CCTCGTTGAG TGACAAACAG GCTGTCCGTA TCTCCGTAÚA CTGATT7TAC AGGCCTCTTC 7CCAGTGGAG 5671 TGCCTCGSTC TTCTTCGTAC AGQÀACTCT6 ACCACTCTGA TACAAAGSCG CGCGTCCAGG CCAGCACAAA 5741 SSAGGCTATG TGGGAGGGST AGCGATCGTT STCAACCAGQ SGGTCCACCT 7T7CCAAAG7 ATGCAAACAC 5811 ATGTCACCCT CTTCAACATC CAGGAATGTG A7TSGCTTGT AGGTSTATTT CACGTGACCT GGGGTCCCCG 5381 CTSGGGGSG7 ATAAAAGGGG GCGGTTCTTT SCTCTTCCTC 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TTGGSTTTTT CTGTTCTGTA GACGATCTQG CGAAAGATG5 CGTGAGAATT 6751 GGAADAGATG GTGGGTC77T GAAAAATGTT GAAATGGGCA TGAGG7AGAC CTACAGAGTC TCTGACAAAG 6BS1 TGGGCATAAG AT7C7TGAÂS CTTGGTTACC AG77CGGCGG TGACAAGTAC GTCTAGGGCG CAG7AG7CAA 6931 G7GT7TCTTG AA7GA7G7CA 7AACCTGfiTT GSTT777CI7 T7CCCAnAGT TCGCGG7TGA GAAGGTA77C 7001 TTCSCSATCC T7CCAGTACT CTTCTAGCGG AAACCCSTCT T7GTCTGCAC GGTAAGATCC TAGCA7GTAG 7071 AACTGATTAA C7GCCTTG7A AGGGCAGCAG CCC7rcTCTA CGGGTAGAGA STATGCTTGA GCAQC7TTTC 7141 GTAÇCGAA6C GTGASTAAGG GCAAAGG7GT CTCTGACCAT GACTTTGAGA AAT7GG7ATT TGAAGTCCAT 7211 G7CG7CACAS QCTCCCTGT7 CCCAGAG7TG GAAG7CTACC CG7T7C7TGT AGGCGGSS77 SGGCAAAGCG 72BI AAAGTAACAT CATTGAASAG AATCT7ACCS GCTC7GGGCA TAAAA7T5CG AG7GATSCGG AAAGGC7GTG 7351 GTACTTCCGC TCGATTGTTG ATCACCTGG8 CAGC7AGGAC GA7T7CGTCS AAACCBTTfiA TG7TGTG7CC 7421 TACGATQTAT AAT7CTATGA AACGCGECGT GCCTCTGACS TGAGGTAfiCT 7AC7GAGCTC ATCAAAGG7T 7491 AGG7C75TGG GGTCAGA7AA GGCG7AGTGT TCGAGAGCCC ÂT7CGTGGAG G7GAGGATTT SCATGTAGGA 7501 ATGATGACCA AAGATC7ACC GCCAGTGC7S 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TAAACAACGT G7TCAATAAA CATCACTTTA ΤΤΤΠΤΤΑΟΑ TG7ATCAAGG 21841 CTCTGSATTA CTTATTTATT TACAAGTCGA ATGGSTTCTG ACQAGAATCA GAATGACCCG CAGGCAGTfiA 21911 TACSrnSCGG AACTGATACT TGGGTTGCCA CTTGAATTCG GSAATCACCA ACTTGGGAAC CGGTATATCG 21981 GGCAEEATGT CACTCCACAG CTTTCTGGTC AGCTGCAAAS CTCCAAGCAG GTCAGGAGCC GAAATCTTGA 22051 AATCACAATT AGGACCASTS CTCTGAGCGC GAGAGTTGCG GTACACCSGA TTGCAGCACT GAAACACCAT 22121 CASCGACGGA TGTCTCACSC TTGCCAGCAC GQTGGGATCT GCAAtCATSC CCACATCCAG ATCTTCAGGA 22191 TTSGCAATGC TGAACGGGGT CATCTTGCAG GTCTGCCTAC CCATGGCGGG CACCCAATTA GGCTTGTSGT ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 11/44 Figura 6, continuação 22261 TGCAATCSCA G7GCAGGGGG ATCAGTA7CA 22331 CATGAAAGCA 7CA7AT7GC7 TGAAAGCCT6 22401 CTGCTCGAAA ACTGGTTAQC TSCACAGCCG 22471 GCACCACACT TC7GCCCCAG C5GTTTTGGG 22541 TCCGTTCTCG C7GSCCÀCAT CCATC7CGAT 22611 TTCAGCTTSC CCTCATAATC ATTGCAGCCA 22631 GGGCGATCrS AGAAAAAGAA TGTATCATTC 22751 ACTAGTSAAA GTTAACTGGA TGCCTCGG7S 22331 TCSTGTTGCT CAGGCATTAS TTTAAAACAG 2239! GACACA7CAC T7CCATGCCT T7C7CCCAAG 22961 GSCAfiCAGC7 CCTTTAQCCA GAGGG7CATC 2303í ACSATGCfiCA CGGGCGGGTA GCTGAAACCC 23101 CTTGACTGA7 STCTTGCATS GGGATATGTT 23171 AGGACTGTCG CTCCGTTCCG GAGACAGGGA 23241 Ô7AGAAGAAC CTGACCCCAC ACGGCSACAG 23311 GQC7GCGSTC CGACCTEGAA GSCGSATGAC 23381 GCGGTCGCTT AAC7GA77TC CTTCSCGGCT 23451 AAACTCAGCC AT7SC7GTCA ACATCGCCAC 23521 GCAGAGCTTA AGCA7TCCAC CGCCCAG7CC 23591 TGTCATeACA TGCAGAATM AAAAGCGAAA 23861 CACCGGTGGA ACACGAGSAA GAGTTGAAAC 23731 ASCAGA7AAC TATCACCAAS ATGCTGGAAA 23301 GAA6ACGCGC TCCTTAAACA TCTAGCAAGA idijO; l I UM 1 UHUIUIUQH^ 23941 CAAACSTCAG CCAAACGGCA CCTGCGAGCC 24011 GAAGTACTGG CTACCTATCÂ CA7CTTTTTT 24Q81 CCCGCGtCGA 7SCCCTACTC AAtCTGGGAC 24151 TCCAAA9ATC 77CSAGGGTC TGGGCAATAA 24221 GGCATSGATG AGCATCACAG CGTTCTGGTG 24291 SAAGCSTCGA GGTCACACAC TTCGCA7ATC 24361 SGACCAGTTA CTCATTAAGC GCGCAAGTCC 24431 G8TAAACCAG 7GGTCAGTGA TSAGCAGCTA 24501 ASCfiTCGCAA GCT7ATGA7G GCCGTGG7GC 24571 CGATTCAGAA ACC7TGCGCA AACTCGAAGA 24641 GCATGCAAGA TATCTAACGf QGMCTCACC 24711 TAGQACAAAG CGTQC7GCAC AGCACCCT7A 24781 TC7CTACCTB TGCCACACGT êGCAAACCSG 24SS1 AAAGASCTTG ACAAGC7CT7 ACA0AAATCT 24921 CTTECGACCT GGCAGACCTC ATCTTCCCAG 24991 TATGAGCCAG AGCATGC77A ACAATTTTCG 25061 TGCTGCGCAC TGCCCTCCGA CTTTGTGCCT 25131 GCTACCTG7T CCGTCTGGCC AACTATETC7 25201 CTFGCTGGAG TGCCACTGCC SCTGCAATC7 25271 ATGAGCGAAA CCCAGATAAT AGGCACCTTT 26341 CT3GGCAAAG TTTAAAACTG ACCCCGGGAC 25411 TTACCACCCC TATGAAATCA AGTTCTATGA 25481 GTCATCACCC AUGGGGCAAT 7C7GGCCCAA 25551 AAAAGGGTAA GGGGGTCTAC CTTGACCCCO 25621 CCCAACGACE AGAAAACAAG AAGTTGAAGG 2559! CAGTCAGGCA GAGGAGGCGG AGGAGQACAG 26761 AACGAGGASG CAGAGQAGGT GGAAGAAGTA 2583í ACAGCGCTAC CA7CTCCGCT CCGAGTCGAG 2590! ACSCTTCCCG AACCCAACCA GCGCTTCCAA 25371 GGGCATAAGA ATGCCATCAT CTCCTGCT7G 26041 TGCTAT7CCA CCATGSSG7G AAC7TTCCGC 26111 CTATAGCCAG CAAATCCCGA CAGTCTCGAC 261S1 AGCGGCAGTT AGAAAATACA CAACAAGTGC 26251 CAAACCCGAG AGT7AASAAA TCSGATCTTT 28321 AGCAGGAACT GAAAATAAAA AACCGATCTC 26391 AGA7CAACTT CAGCGCACTC 7CGAGGACGC 26461 GABTAGGCAG CGACCGCGCT TATTCAAAAA 26531 CCCACGCCTT ACATG7SGAS T7ATCAACCC 26601 CCCGCATGAA TTGGCTCAGC GCÇGGGCCT7 29671 CCAAATACTT TTGfiAACAGT CASCTCTTAC 7CT7GGCC7G ATCC7GTC7G A7TCCTGGAT ACACGGCÍGT CTGGGCTTTA CTACCCTCGG TAÍAAAACAT CCCGCAGGAC GCATCATTCA CACAGCAGCG GGCGTCAT7G TTGGCTATTT TGATT7TGGT ÍCGCTCGGGA TTCTCCTTTA AGGCTCGTTS AA7CTGC7CC 77CTGAA7CA TAATATTGCC ATGCAGGCAC TGAQGCCACA ACGCACAGCC TGTACATTCC CAA7TA7GST CCTGCAGAAA TGTTCCCATC A7CGTGCTCA G7GTC7TGTG C7CTTCG777 ACG7ACTGGT GACASATGCG CT7G7ATT5T GTTCTAAGrT CGÍTATCCAG CCTGTACTTG TCCA7CAGCA CAGACACCAG GGGCAAGCTA ATCGSATTGT TAACAGTGCA TTTAGCGATC TTCTCAATGC TTCTT77GCC ATCCTTCTCA AC7GC7ACAA GT7GCGCCTC ΤΓΟΤΟΠΤ07 TCrTCSCTGT TGGTC7TCCT TGGC7TCT7T TTGGGGGGTA TCGGAGGAGG GGATTGTGAC GTT7CGCTCA CCATTACCAA C7GAC7GTCG GTGTT7TTCT rCGGGGGCAS AGGTGGAGGC GA7TGCGAAG TGGCAGAACC CET7CCGCGT TCGGGGSTGT GC7CCCTGTG GGCCA7TGTG 7TCTCCTAGS CASAQAAACA ACAGACA7GG GAS7GGCA7C AGATCTCG7C CTCAGCGACG AGSAAAAGGA TGCCACCACC rCTACCCTAG AAGATAAGGA GSTCGACGCA GAGTCTGASA CAGACATCGA GCAAQACCCG GGCTATGTQA GCT7TCTASA GAGAGAGGAT GAAAACTGCC OAAAACAGCG 7ASGGATCAS AACACCGACT ACCTCA7AGG GC77SACGGS CAGTCGCTCA TAGTCAAGGA TGCATTAtTG GACASAACTG I HLSA UL. I I KhUb II I II I H, UIHI<I U.I.L.V. AAATCCTCÈC TTAAACTTTT ATCCAGCTTT TSCTGTGCCA AAAAA7CAAA AAATTCCAGT CTCCTGCCGC GCTAATCGCA CTGQTTCACE CT7ACCTGAT ATASCTTCCT TGBAAGAGGT TGAEACTCGG GCCSCAAA7G C7CTGCAAAA GGGAGAAAAT GAATTGGAAG GCGATAATGC CAGAC7CGCA GTAC7CAAGC CCGCTGTCAA CCrGCCCCCT AAAGTCATGA CG8CâG7CAt CCTTTCAGAA SACATGCATG ACCCAGATGC CTG7SATÇAG ACCCGA7GÊC TGGGCACCGA CTCTCCCCGG GA77TGGAAG T9GTTACCGT AGAACTAGAG TGTCTCCGAC GTT7CT.77AC GAATCTGCAC 7ACACTTTTA GACACGGCTT TGTGCSGCAS AACCTGGTri CCTACATGGG TATTCTGCAT GAGAAJCGCC AGGGGGAAGC CCGCCGTGAT TACA7CCGCG ATTST57CTA CATGGG7G7A 75GGAGCAAT G7TTAGMGA ACAGÀACTTS C7TAAGGT7C TGTGGACAGS GTTCGACGAG GGCACCBTCS AGCSTCTCAG SGTTACTTTG CSAAACGGAT TGCCTGACTT CTCTTTCATC CTGGAACGCT CCGGTATCCT GCCCGCCACC CTCACCTACC GCSAGTGCCC CCCBCCGCTA 7SGASTCA0T CCTACCACTC 5GATG.TGATC GAGGATGTSA GCGGAGACGG Ê7GCACGCCC CACCGGTCCC 7AGCT7GCAA CCCCCAGTTG GAATTGCAAG SCCCCAGCAG CCAAGGC8A7 GGSTC7TÇTC TGTGGACCTC CGCC7ACTTG CGCAAGTT75 CTCCGGMGA GGACCAATCA CAGCCTCCAA A5GCCGAAC7 7TCSGCTTGC 77GCAAGCCA TCCMAAATC CCGCCAAGAA 7T7CTACTSA AGACCSGCSA GSAAC7CAAC ACAAGGTTGC C7CAGÊA7GT TâCAGCCGCC GCCCCCAGAA GATATGGAGG AAGAT7GGGA 7CTGSAGGAC AGTCTGGAGG AAGACAGTTT GGAGSAGGAA ACCfiCCGACA AACAGT7A7C CTCfiGCtaCG GAGACAAGCA 5AACCCGGCG SCGTCCCASC AGTAGATSSG ACGASACCGG GACCSGTAAE AASGATCGGC AGGGATACAA QTCCTSKSS CATSAGTGCG SGGSCAACAT ATCCTTCACG CGGCGCTACT SCAATGT7TT GCATTACTAC CGTCACCÍCC ACAGCCCCTA ASATAAAGAC AGCSGCGGC& ACCTCCAACA GAAAACCAGC AGCAACAGQA âGATTAAAfiA TTaCAGCCAA CGAGCCAGCS CCAACCCTG7 ATGCCATC77 CCAGCAGAGT CGSGGTCAAG TGCGI7CQCT CACCAGAAGT 7GT7TGTA7C ACAAGAGCGA CGAGGCTCTC ÍTCAACAAGT ACTGCGCGCT GACTC7TAAA AGGCGGGAAT 7ACATCA7CC TCGACAtGAG TAAAGAAATT CAAATGG3AÍ 7GGCAGCAGG CGCC7CCCAG GACTACTCCA CTATGAXTTC 7CGAG7TAAT GA7A7ACGCG CCTACCGAAA CACCACGCCC CGCCAACAC: TTAA7CCCAG AAATT5GCCG ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 12/44 Figura 6, continuação 26741 26811 26801 26961 27021 27091 27161 27231 27301 27371 27*41 27611 275B1 27S51 27721 27791 27361 27931 28001 28071 28141 28211 282 Bt « 28421 28491 23561 23631 23701 28771 20841 28911 28331 29061 29121 29191 29261 29331 29401 29471 29541 29611 29881 29751 29321 29891 29961 30031 3Q1Q1 30171 30241 30311 30381 30451 30521 30591 30661 30731 30801 30871 30941 310Π 31081 31151 CCCACCACTG TATTACTrCC CTGSCGGCTC CACCCTATGT TATCCAGCTC AACSÂCGAG7 GGCTGCGGGA GATCT7CCTT GCTCGGGCGG AATCGGGACC CGGATCTCCT GGQCACTAK TACSATTGAT GTCTQGTGAÇ CTGCTTTGCC CGGSAACTTA CACGGAGTGC GGArTACTAT TGCTGAfCGA GCGAGACCAG TGAAAGCCTT TGCTG7CTTA GCTTCTTCAA CCCGGATTTT ACCTTTCCTA CTCACAAACT CTACTTTCAA AACCQGAGGrt AGTACTAGBA ATTCTT5CGG CTAGTGGTGT TGTGGTATTG GGAACCGGGT TCTGCCAAT7 CCCGACACAA GCCGCATCTG ACAATAACAA ÂACCTGEAAC CTCTGTCCGA GGTCCTGACG CTGGCCATGT 1CATGAECAA TTGCTTATTG CTTGTECGn TCGCATCAAA AACGCCAATA TCGAGACBCC CAGSCCGAAG CGTCACAGGC CTCGGCATAA CGGTGAGCTC TCCGCTTGGT CACCCCTCGT CAGGCTGTTC GTTCAATTTG TAGAGGAGTT CGGACGAGTT CATACCGÀAC GCGGCTGAGC TATCTCSBCT ΓΤδΑβΤΤΟΑΤ ctacttcgaa CGAAGGCAAA ATAGACTCTC GGAAACACCA CGQTTTCCAT TGTGTACTGA GTTTAATAAA ACAACCAGAA GAACAAAACt AGAAGCTCAA CBACTACACC GAGCTCCACG G7CTCCCTAC GTGSGCTTGT GATTATTCTT GTTTAAAAAA TGG6GCCCAT ACGATCCATG TCTAGACTTT TGGAGTTCTT ATTAAGTGCG AATACCTTAT CCACCÀCATfi GTTCCATCCG CATTAETAAC ACAGTATTCT CTATGGCCTC TGCCTTCTTA CTGCTmCT ACAAAGAAAA AATGCCTTAA fiCCGCCCTAG TGTÀCCAGGA TCCAÀATGAC TAATGCAGGT TATAAAACGC CTQATGATCA CTACGACCAG ACGGMTCTT TGACTTTGGA AAGTtCGTCT TACTCCCTCT GTCTACTTCA TTCGACGCGA TTAGCGAGTC GCGACATCTA GACCACTGCC CTCCCCAAGG ATCACCCPCA GCCTGCAACG AATTTTCrCC CTACTGCATT TGTAATCACC AACTGAATTA AGACTCTCCT TTTCCTGTCG TCCAGGACTC GCTTT7CCAG AAGCATTTTC AGAAAACCCT TGGGTGGAAG rGCTACCTAT ACACACCTTG ACTAGTCTTG CTTGTTTTAC GACCCAGAAA ACTGCACACT GATGGGAATG CAGGTCCGTT GGAGCCASGA GTTCCCGAGT AACACTTTGA TTTTTTCTGA CTAGCAASGA CAACATCGTA G7GCGTATGC ATACÀCCTGC Uvtwl I IWlil y t lAtirtUAuA GGACAAACAG TCGTCTCTA7 TCAICTfiSAC CAAACTGQGA AACTTGCAÀC ATACAAAATC GACAGATACA STAGTCAATA AÍATGGCAAA sattcgatcc AAACATCCCA GATTCAATGA ATGGTTTTAT ATGCT7GTCS TTTAATTTCT TTTTATACAG ACTtCTGCTC GCTCÂCACCT ATGTETTTTG GTGGAGAATA CTGCAACGGC AGAGACCTAA TATAAAAGTA GTTTAGATTA TCTCPAGCAG CA5TGTCGCT GAATAATTCT ACAACTTCAC GGAATATCTA TTCTtGTTrT ATCCATTACT TAGATT7GAT GTACCTAGAA ATTTCTTCTT CCACAGCAAC CCCAGACTST CGTATGTAGC ATAGTCTGCC TÀCCTGCGCC ACCATCCCGA CAGSCTATAC TACCAATATT CTCCACCAGA ACACCTTAGA ATCAGAAATC CCCCCAAATT TTTTTGATAT ACCCCCTATT AGGAACACAT TCCCCCACAA CCCACTACTC CCFGCTATTA TTCCGCCSAG GAÍCTGCTCG CAGCAGCAGG AACGCG7GGC TCTGmSGT AAAACAAGCC TGÔCCCCCAA CGACAAAAAT GATACTAAGG GTTSCATTCA SCSGCCTAAG AGACCTGCTA GCAATAAGGT CTCTGTTGAA AACCCCGTTC AGCGGCATAC CACAATCTTC ATGTCTTTcr CCCCTATGAA GATGAAAGCA ACACÁAAGCC CAGACGGAGT AGCTAAAAGT GSGAGGGGGA AGCACCCATT ACTAAAAATA AAACfATGTG CCAAATTGGfl AAGTCCCGCT GCGCAGTTAG GAGGCCSAGG TCAGATTGCC TCGCAACCCC ACCCCTTCTC AGTGGACGGC GCCGCTTTC5 AGGTCCGGCC CAGCGGCCCG CCGGATTGCA ACGGACTBCC TGTTAACTTC CCTACTAATA CGGGCCTTGT CTTCACTTTC TTTCGCTTTT TACTTTrsCA SAAATTACAC GGTACACTGT AATGTGCGAT ACGTTCTECA TTGTAACCAC CCCACTAGGA CATAATTACA AGCGTTGATT AC7TTGATAT TTACATTGAT TAATGTTA3C TAEAAATTAC TTSGTTCSTG GATGACAA7T CTCTAGAAAC TTGCAAT7G7 TGCAGCQGTG CIACAAAAAG TTTCATCCTA CCATGGTTTC CACTACCACA CACrSTAACT ATAGSCTCAA TATEACAATS GATGGTTTAC CCATTATCAA ÇGTGACAGCA ΓΑΑΟΑΤΤΑΤΤ STACTGCCAT AACAATACAA TTTÉOAATCC ATACAACAAT TPCCACTTCA TACCATAACC TACTACGCCT ATTTAATTTG TTCTTTTTTT CACCATACTC ATCTGTGCTT ataggagcat TTGCTTCCTA rGGTTATTAA TTTTTTCCAA ATACCGCAAC CAAAATATCG TTTGCTTCTA TTGCTTCCCT AAATSCAAAT TCCAACAACC TAATAATGAT TGCTSGAA7A TGATTTTGSC TSGAATGCtC AACATGCAAC ATCCAATAGC GTTACTFCAA CCTAACCGGC ATATGGACGG CCGCSTCTCA CAAAGAGCTC AôÀGATQTCA AAGATATCCT ACGAGATCAC TTACCTGGAT GGTGGGAATC CTGCTCCTGC GATTCCÀTCG CCAATGAAir AAAAAAAAAT ATTTTCTCCC ASCAGCACCT TTTCTCCATA CTTTAAAGGE TCCCAGATGA CCAAGAGAST CCTCCCAACA CCCCTTTATA TCTTACTTTA AAATG1TTAA CTTACAGTSG ATGACACTGA ATCACTCTGT AGAACTATCC AÁATGGâTTA AAATTTAACA CTCTCATAGG ACCCCCAATC AATCTGTAAC AAAACAAAAC AAAGTTTACA GCGGTTACTA TTACCCAGT7 GAAAACCACG TTTTACATCT CCCACCACAC GCAGTGGTGA TGGCACTAAT AAAAACAAGA TCTCCTACTA TTCCTTATGC rTACTAGTCT ACTGCACACT AAAAGGACCT AAAACCATÊT GACCAACC7G AATGACAAAG GCTTCTATTA CTACCACTCC AGCACCCCGC AACCTTTGCC GCG6TTTTAA ACAATCAGCA TCATCGCTGC GCPGCTATAS AAAAGACAAA TTAT7TACAG TAT8GTGAAC TTAATGTTTE CGCTACTTTC TGCAETTTTT GCTTTTGTTA CTrCTAGACT 6GATCCTTGT CGGCACTTCT TAGACTCATC ACGffiTSTCTC AACCCCAGCT GTSGTCATTT CTTGCTTGCT ATPAATATAA tctbítgcac CCAATGCACA TGATCATCCA GC.TAATAÊAT TACQAAASTÔ GOAGATBACT GAAACACTCA GAACAACGAC TTGCCCAACT TCCAAATTCA CCAATOCAAA CSCTACTGAC CATCGCCTCT AACCCCATAâ TTATCACCCA AGTGCACCTA CACCCTfiCTG GATTAATAAA AAATCACTTA CACTTCCCTC TTCCCAACTÇ GATGTCAAAÍ T7TAGCTCGT CCGGCTEAST 4ACTCCTTCA AACCCABGGT TTATTTCCCC CCCCACTAAC AACCACAGGC TGSTACCTTA CAAGAAAACA ATTQGAAATB 0ATTAGAAAC ACGQTGACAT ΤΤΟΤΑΓΑΑΑΟ ACTTCAfiftSG CAATAATASt TTATBGTTAT AAAATSCCAA CCGACQAAAA AATAATATGC ASGCTTAACA CGCAACTCTG CAASGTGQTC GTAGATTTTT TQGAACCGAC ACAACTACTT AACGCACTGT AfiTGACAATT CATAAAGSTÊ ACCAArCATS ACAGCAGTAG crrecArcTG GCGAATTSCC TAAAAGCATG SCCTATASTÀ ATCGAfíAAAA CATAATTTCA CAAGACCCAG AACCACAACC CCACCTCCAA ACGCATCCGC AAAGGCATAT CT7ACGAACT ACAAAGTSGA AAGACCCTAT CTTGAAATCA TGGTATTCrA CTCCTGTACC ACCCTSTCTA AAATSGCTTC GGATETCTAC PACGTGCTAC TCAAAACAAT GATAGTATTA ΕΡ 1 816 204/PT 13/44 rigura S, continuação 31221 ACACETTATG GACTGGAATA AACCCTCCAC CTAACT5TCA AATTGTGGAA AACACTAATA GAAATGATGG 31231 CAAACTTACT TTAGTATTAS TAAAAAATGG AGGGCTTETT AA7GGCTACG TGTC7CTAG7 TSGTGTATCA 31361 SACACTGTGA ACCAAAT3TT· CACACAAAAG ACAGCAAACA TCCAATTAAG ΑΤΤΑΓΛΤΤΤΤ GACTCTTCTG 31431 GAAATCTATT AACTGAGGAA TCAGACTTAA AAATTCCACT TAAAAATAAA TCTTCTACAG CGACGAGT6A 31501 AACTGTAGEC AGCAGCAAAG CCTTTATGGC AAGTACTACA GCTTATCCCT TCAACACCAC TACTAfiGGAT 31571 AGTGAAAACT ACATTCA7GG AATATGTTAC TACATGACTA GTTATSATAS ÀAGTCTATTT CCCTTGAACA 31641 TTTCTATAAT GCTAAACAGC CSTATGATTT CTTCCAAT8T TGCCTATGCC ATACAATTTO AATGGAATCT 31711 AAATGCAAGT GAATCTCCAG AAAGCAACAT ASETACGCTG ACCACA7CCC CCTTTTTCTT TTCTTACATT 3173! ACAGAAGACG ACAACTAAAA TAAAGTTTAA STGTTTTTAT TTAAAATCAC AAAATTCGAG TAGTTATTTT 31661 GCCTCCACCT TCCCATTTGA CAGAATACAC CAATCTCTCC CCACGCACAG CTTTAAACAT 7TGGATACCA 31921 TTAGASATAG ACA7TGTTTT AGATTCCACA 77CCAAACAQ T77CA3A5CS AGCCAATCTG GGGTCAGTGA 31931 TAGATAAAAA TCCATCGCGA 7AG7CTTT7A AAGCGCTT7C ACAGTCCAAC 7GC7SCGBA7 GCGACTCCGG 32061 AGTTTSGATC ACGGTCATCT GGAAGAAGAA CGA7GSGAA7 CA7AA7CCGA AAACGG7A7C SGACGATTGT 32131 GTCTCATCAA ACCCACAAGC AGCCGCTGTC TGCGTCGCTC CS7GCGACTG CTGFTTATGG SATCAGGGTC 32201 CACAG777CC TGAAGCATGA TTTTAA7AGC CCT7AACATC AACTTTCTGG TGCSATGCGC SCAGCAACGC 32271 ATTCTGATTT CACTCAAATC 7T7GCAG7AG GTACAACACA TTATTACAAT AT7G7TTAA7 AAACCATAA7 32341 TAAAAGCGC7 CCAGCCAAAA CTCATATCTG A7A7AA7CGC CCCTSCATGA CCAFCATACC AAAGTTTAA7 32411 A7AAA77AAA TtJACGTTCCC TCAAAAACAC ACTACCCACA 7ACATGATC7 CTTTTGGCAT GTGCATATTA 32481 ACAATCTGTC 7G7ACCA7GG ACAACGTTGG TTAATCATGC AACCCAATA7 AACCÍKCGG AACCACACTG 32551 CCAACACCGC TCCGCCAGCC ATGCAT7GAA GTQAACCCTG C7GATTACAA TGACAATGAA GAACCCAA7T 32621 CTCTCSACCS TGAATCAC7T GAGAATGAAA AATATCTAÍA GTGGCACAAC ATAGACATAA ATGCATSCAT 32691 CTTÇTCATAA TTTTTMCTC CTCAGGATT7 AGAAACA7A7 CCCAGGGAAT AGGAAGCTC7 TGCAGAACAfi 32761 TAAAGC7GSC AGAACAAGGA ACACCACSAA CACAACTTAC ACTATGCATA G7CATAGTAT CACAATCTGG ΟώΟϋ I íubíUI itiftli J t iWataul l t uri | i 1 íUvfWttU nrtiiQlliliirtn wiueuim.14 32901 GTGTAAGGGT GATSTCTGGC GCATííATGTC GAGCGTSCGC GCAACCTTGT CA7AATGSAG TTGCTTCC7G 32971 ÁCAT7CTCGT A7T7TG7A7A SCAAAACGCG GCCC7GBCAS AACACACTCT TC77CGCCT7 CTATCCTGCC 33041 GCT7AGCG7S TTCCGTGTGA 7AG77CAAS7 ACAGCCACAC 7C7TAAST7G GTCAAAAGAA TGCTSGCTTC 33111 AST7GTAATC AAAACTCCA7 CGCATCTAAT 7S77C7GAGS AAATCATCCA CGGTAGCATA 7GCAAATCCC 33181 AACCAAGCAA TGCAACTSSA 7TGCGT7TCA AGCAGGAGAS GAGAGGSAAG AGACGGAAGA ACCATGTTAA 33251 TTTT7ATTCC AAACGATCTC GCAGTACTTC AAATTGTAGA TCGCGCASAT GGCATCTCTC SCCCCCACTG 33321 7G7TGGTGAA AAAGCACAGC 7AAA7CAAAA GAAATQCSAT T7TCAAGGTS CTCAACGGTG QCTTCGAACA 33391 AAGCCTCCAC GCGCACATCC AAGAACMAA GAATACCAAA AGAAGGAGCA 7TTTCTAAC7 CCTCAATCAT 33481 CA7A7TACA7 7CC7GCACCA TTCCCACATA A777rCAGCT T7CCAGCCTT SM7TAT7CG 7GTCAG77C7 3353t 7G7GG7AAA7 CCAATCCACA CA77ACAAAC AGG7CCCGGA GGGCGCCCTC CACCACCATT C7TAAACACA 33601 CCCTCATAAT GACAAAATAT CT7GC7CCTG 7GTCACC7G7 AGCGAA77GA GAA7SGCAAC A TE A ATT GA C 33671 · ATGCCCTTGfi CTCTAAGTTC TTCTTTAAGT TC7AGTTGTA AAAACTCTCT CATA7TATCA CCAAACTGC7 33741 TAGCCAGAAG CCCCCCGGGA ACAAGAGCAG GGGACGC7AC AG7GCAGTAC AAGCGCAGAC CTCCCCAA7T 33811 GGCTCCAGCA AAAACAAGAT TGGAATAAGC ATAT7GGGAA CCACCAGTAA 7ATCATCGAA STTGCTGSAA 33881 ATATAATCAS GCAGAGTTTC TTBTAGAAAf TGAA7AAAAG AAAAATTTGC CAAAAAAACA 7TCAAAACCT 33951 CTGGGATGCA AATGCAATAG GTTACCGCGC 7GCGCTCCAA CATTGTTAGT TTTGAATTAS 7CTGCAAAAA 34021 ΤΑΑΑΑΑΑΑΑΛ ACAAGCGTCA TATCATAGTA GCCTGACSAA CAGGTGGATA AATCAGTCTT 7CCATCACAA 34091 GACAAGCCAC AGGGTC7CCA CCTCGACCC7 CGTAAAACCT G7CATCSTGA TTAAACAACA CCACCGAAAG 34161 TTCCTCGCGG 7GACCAGCAT GAATAAQTCT TGATSAASCA TACAATCCAG ACATGTTAGC A7CAG77AAG 34231 GAGAAAAAAC AGCCAACATA GCCTTTGGGT A7AA7TA7GC 7TAATCGTAA G7ATAGCAAA GCCACCCCTC 34301 QCGGATACAA AGTAAAAGGC ACASQAGAAr AAAAAATATA A77ATTTCTC TGCTGCTGTT 7AGGCAACGT 34371 CGCCCCCGGT CCCTCTAAA7 ACACATACAA AGCCTCA7CA GCCATGGCTT ACCAGAQAAA GTACAGCGGG 34441 CACACAAACC ACAASCTCTA AAGTCACTCT CCAACCTS7C CACAA7ATAT ATACACAAGC CCTAAACTGA 34511 CGTAATGGGA CTAAAGTGTA AAAAATCCCG CCAAACCCAA CACACACCCC GAAACTGCST CACCAGGGAA 3458! AAGTACA6TT TCACTTCCGC AATCCCAACA AGCGTCAC77 CCTCTTTCTC ACGGTACGTC ACATCCCATT 34651 AACTTACAAC G7CATTTTCC CACGGCCGCG CCGCCCCTTT TAACCSTTAA CCCCACA9CC AATCACCACA 34721 CGGGCCACAC 777T7AAAAT CACCTCATTr ACATATT5SC ACCA77CCAT CTATAAGGTA 7ATTATT6A7 34791 GATG ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 14/44 Figura 7 Pacl (1) Seal (5689) SrtaSI (490) Spal (668) SnaB! (10Q7) Sa(i <41 ia;
    Aílft (1557) !unt (1943) Xfeol (3B12). 8811107! (3735) AvrJI (508) Hindi M (1345) i \ _r-l MnC?A\ Kpnl (1351) ÉcaRI (1360) lhal (1368) Hpai (1372) iHI (1378; bal (1384) fcal (1536) g!II (1529) ΕΡ 1 816 204/FT 15/44 figura 8 Soai (5SSÍ) asiei 1 Pací (47) Pl-Pspl \ J SgrAn244) Avril (53D
    gsrriH! ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 16/44 Figura 9 estai Pacl Pl-Fspl
    Hindll E Kpnl ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 17/44 Figura 10 Bat.BI Paci ¢471 BamHI
    ΕΡ 1 816 204/PT 18/44 Figura li SstBt Pl-Papl (12) Paa! (4-7} Seal (4400)
    Ndel (91Θ) PI-Papi (2366) SetSl Fac! (2835) Age1(2432) BatnHI (1359) Hpal (1385) Nhei(1371) HcoRl (1377) 'Aacl (1383) 'Sail (1391) €wRV (138η ‘ tal (1400) ctl (1-407) Ãgel (1420) n( (1423) ndlll (1429) Xbal (1435) Xbat <1S77) 50] ΕΡ 1 816 204/PT 19/44 Figura 12 BslSÍ Pac! (4?) PI-PsjjJ (12) Ndel (916)
    Pt-Papt (288S)· HTfTdlll (1359} ΚρπΙ (13Θ5) Ageí (1363) EeoRI (1374) Aacl (1350) bafl (1380) tccRV (1394) :ΐ®Ι(1397} >ÍOí! (1404) 'Nhei (1417) pai (1423) amHI (1429) Xíaí (1435) Xbai (1577) BglH(1530) BsiSI Pact (2655) ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 20/44
    TTector coajuídico pWE15 ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 21/44 Figura 14
    ΕΡ 1 816 204/PT 22/44 Figura 15
    ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 23/44 Figura 16
    Pvuil (2579) ΕΡ 1 816 204/PT 24/44 Figura 17
    Ssessan ΕΡ 1 816 204/PT 25/44 Figura IS
    ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 26/44
    Controlo
    1Β-. 10* 10^ 1Qd ία* SFP Ad5 AdSfibl 6
    Ad5fib35 Ad5f)b17 Ad£fib40-L Ad5fib51 tSP» EP 1 816 204/PT 27/44 Figura 20
    EP 1 816 204/PT 28/44 Figura 21 S0X0J3B00 (WW8QÍ.) (ost/eO
    ias urasseidíxâ stíB se^n-cfo % EP 1 816 204/PT 29/44 Figura 22a
    Pico Ch 352 12B 107 EP 1 816 204/PT 30/44 w (0 p- Γ4 io «o T" «0 o> 1" T" T· (*J m n Λ C n s Λ J3 5 tí o Έ E E u. E E IL E E tn w IO η o •0 in <n « m 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Figura 22b
    RtfprsasSo do reeaptor da superfície (Lin) ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 31/44 Figura 23 SS SQB 31SBH YferielsysoH- e EI I Kl tQBRRARPSEDTPHPirY. _ Λ MLLQítK&ARSSSBTyHyVYPY 1 Hl.iiOíílCílftRPSEIlTPJtPVY?Y 1 HLI.OKKAARPSEDTrHFVYP
    JrthM ptstsín· 73? 912) 35 pdtoíBft í 9 P Mb 51 tnettx*
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    ATvsBtAyyssn arfJsnTn _ jey-ttiM ΟΔ9Β ΤΓ BTIi PIHHJTT t BJIK t, I !«YJV sll V qwa ΒΤ7Ϊ ÇM? T ff K T AH E íjl|llXa 1 1V sk Y_dvÍ3DTY HOMPT Ο «3»ΤΠ _ kKí**tVI*tis \ k| p sbt k civ i κ s u b d si) c|d x u t u v u e|s iri wh j a qo i V a η υ η t η ola x u * u v u i eti 9 S dfljyLZJmLLH Dia s L T ti V L
    Mi 5 proteína MÍ 16 proteína Mi 25 pTOtofilB MÍ 51 pobBuu 43a as 174 174 477 2132URU sn283SSO29 PPB3S Μίβ 33 pciaalsi OTT xri^s dit. TSSS hU l T.a a.s Mb 3 pcafcQHia Mi 26 Bcataina Elb 35 ptraCaúfta FlL· 51 frotefn* I.DPB 71[HFRMgn L TBflTA YTW ava WMPffLS AY9 it S Η6ΚΤ A at.KSaEfMFlKaffOMMA JSgÍjjjãf^g ffWMgTB SfFrr - --|T Y DLm: P6KNKS ST A - TSEIVR 3 38»Ϊ·Μ F8T3ft¥EF*»--JlT ÍW-Llir pmHKSSf A-TSlJÃIarTÍ3gg»lpMg|3 T *T1 AY PI? 8Γ---ItIt Mb 5 proteína Mil 16 proteína Mb 25 proteína Mb Sl proteína KSMtYSOVY IA T E T L Η E I ÇROS --EI nuse
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    r9tfPWScffHTiH a- - ·1ι r P Ϊ «fsTHABTÃTirT S V T t 3jT 3 p[b«h tiiua es eass i«í t.iÍT3 rldrili-i » ntbnB.nTmiiM
    3ΪΙΑ 0 3 YlÍRB 9YQTB a yiLlb Mi 3 pntafiiA E3b25 pcacolxi» 9ib35 pMt«CM Fib 51 pcafc«(m 548 31? 29 29 S9 εΠ 256 D . 22S 0 . 325 9cota&» Sib 15 peafcoCnK praorina 51 pvoeMoft ΕΡ 1 816 204/PT 32/44
    Sp ΗΚΙΟχΒΛ %J ΒΒχΐΐχΒΟ 3ρ OgÓMe.2nSBH ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 33/44 Figura 25
    Vírus íiijca ee<j<Mabiaaaee QIOOQ 1QG 12 16 28 32 40-1 49 51 ΕΡ 1 816 204/PT 34/44
    ΕΡ 1 816 204/PT 35/44 Figura 27 30000ο 25000 0 20000 0 15000 Ο 10000ο 5000 0 ΟFí 1® Fi 1t Fi 3® Fí 5ΐ nov us r
    ΕΡ 1 816 204/PT 36/44 Figura 28
    ΕΡ 1 816 2Ο4/PT 37/44 Figura 29
    EP 1 816 204/PT 38/44 u U o o 0 o <N r*· Ci r» fH PI Figura 30 Crescimento dependente da temperatura de PBR.ee
    τ 00 -- N I ♦ -- (£>
    in Dias em cultura EP 1 816 204/PT 39/44
    Híveis d.e DBP em células PER,CS transfectadas com pcDNA3 peDNA3wtE2A ou pcDNA3tsl25E2A
    'í ίο o 9 9 ° H * J 1 i .1 ,L ^ t* U) ΙΠ U5 lí) W lí! i I r Λ W ^ Ifl N CO O) O r o Ifl CO C3 05 co oo co ca β T i i i CG 00 OO CO M « «5 h, J 1 I f 1 in ίο ΐΰ ΐή uo
    « £ < Iz <o « §1U α D JJ fi 0] H to a R 4J ei « «f 1111 « O <0 « ΙΛ tO C0 Oi O III I —oon « i T *5*ιό 1Λ <a 4J rf! n W <0 EP 1 816 204/PT 40/44 Figura 32 Crescimento da suspensão de J?ER.C6fcsl25E2A C5-
    r CO - co (d u 3 4J iH 3 O L ^ 8
    (D co <0 CD to o O O O O o o + + -f + + + UJ LU Ui LU UJ LU IO * O * to O o O Λ CM CM LO O χυι/3ΏχηχΘ0 EP 1 816 204/PT 41/44 Figura 33 Curva de crescimento de PER,C6 e PER.C6fcsE2A
    gOL X sst^tfD Horas em cultura ΕΡ 1 816 204/PT 42/44
    ΕΡ 1 816 204/ΡΤ 43/44
    EP 1 816 204/PT 44/44 Figura 3 SB Activldadíi de fcTA era clonets d« Per/E2A/fcTA
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