CN102260712B - 溶肿瘤能力增强的B型人腺病毒Ad11突变体的构建和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及B型重组人腺病毒载体Ad11-5EP和Ad11-5ETel-GFP的构建方法及其应用。腺病毒载体Ad11-5EP的构建是利用同源重组将Ad5E1A编码序列上游的365bp段基因(包括Ad5E1A的增强子和启动子)，置换到B型人腺病毒11亚型Ad11的相应区域，构建成载体Ad11-5EP。B型重组人腺病毒载体Ad11-5ETel-GFP的构建方法，是由构建的穿梭载体pSSENTel、pSSGFP与Ad11-5EP基因组同时同源重组产生Ad11-5ETel-GFP。Ad11-5EP载体比野生型Ad11有更强的溶肿瘤作用，增强了对肿瘤细胞的杀伤能力。通过肿瘤生长和肿瘤清除率的测定表明，Ad11-5EP能有效地降低肿瘤的生长速度，并且荷瘤鼠无瘤率显著好于Ad11；构建的Ad11-5ETel-GFP可用于治疗肿瘤或检测血循环中的肿瘤细胞，该载体可特异、敏感、经济的用于循环血液中肿瘤细胞的检测。
Description
技术领域
本发明涉及腺病毒载体及其应用，特别是涉及B型重组人腺病毒载体Ad11-5EP和Ad11-5ETel-GFP的构建方法及其应用。
技术背景
近年来，肿瘤病毒治疗特别是腺病毒在肿瘤治疗方面的应用发展非常迅速。2005年，E1B 55K和E3B缺陷型腺病毒(H101)首次在中国被批准用于治疗头颈部肿瘤，然而，腺病毒来源的H101对某些恶性肿瘤的疗效很差，比如发病高致死性强的胰腺癌。限制肿瘤疗效的原因之一是这些肿瘤低表达腺病毒受体(CAR)，而且，静脉注射的腺病毒很快被抗体及补体中和而灭活，此外，腺病毒还可以被Kuffer细胞吞噬，病毒hexon蛋白与凝血因子X结合，然后转导肝细胞，所以过量腺病毒容易导致明显的肝细胞毒性及肝损伤。
Ad11 是B型人腺病毒的一种亚型。在溶肿瘤治疗方面，Ad11明显优越于Ad5。除了CD46受体外，Ad11还可以结合其他细胞表面受体X。Tuve等报道Ad11是B腺病毒亚群中唯一的既结合CD46又结合X的病毒，说明Ad11可以感染更广范的肿瘤细胞，由此解决了Ad5应用中病毒受体下调而导致感染率低的难题。Ad11较Ad5另外一个优越之处在于人群中Ad11的中和抗体较低为10-31％， Ad5是45-90％，并且中间无交叉活性。当静脉注射Ad11到表达CD46的转基因鼠时，未发现明显的肝内转导和肝毒性现象。而且，Ad11能够高效转导树突状细胞，因此重组Ad11可以表达肿瘤特异抗原，通过增强免疫反应来更好的用于肿瘤免疫治疗。
关于Ad5以外的其它腺病毒血清型作为疫苗或基因转换载体的应用已经有了大量报道。但它们作为溶肿瘤病毒的研究才刚刚起步，相关报道也不深入。Sandberg等最近体内外研究显示，Ad11能够有效地在前列腺癌细胞系PC-3中转导、复制并裂解，但该作者没有与通用的Ad5进行比较。Shashkova等应用人肿瘤细胞系体外试验及人前列腺癌细胞系DU 145体内研究，比较了Ad5、Ad6、Ad11和Ad35之间的溶肿瘤效率，发现Ad5、Ad6和Ad11有相似的抗肿瘤效果，而Ad35则无抗肿瘤作用。重要的是，仅仅Ad5产生了肝脏毒性。后来人们因此建立了嵌合型溶肿瘤Ad5(将Ad5的纤毛替换成B亚群腺病毒的)，目的是使嵌合型溶肿瘤Ad5通过结合细胞膜上CD46受体来提高抗肿瘤效果。但是与完整的B亚群腺病毒相比较，这种方法仍不能克服针对Ad5 hexon抗体的中和能力。
循环肿瘤细胞（Circulating tumour cells,CTCs）数与肿瘤患者的临床分期、疗效及短的生存率相关。肿瘤患者外周血液的CTCs水平可作为监控和调整治疗及判断预后的依据。这就迫切需要一种特异的、敏感的方法去检测这些细胞。近年来，免疫细胞计数分析和定量PCR等方法的应用已经能够在血液中检测出少量的CTCs，然而缺少特异的生物学标志物及高额的检测费用限制了这些方法的普及应用。
复制选择性溶肿瘤腺病毒是一类新的肿瘤治疗药物。值得注意的是，最近已经报导用表达GFP的复制选择性溶肿瘤腺病毒Ad5在上亿外周血细胞中检测CTCs。然而，肿瘤细胞的遗传性变化是影响腺病毒感染的重要因素，肿瘤细胞中低表达CAR会显著降低Ad5的感染能力，进而影响肿瘤细胞的阳性检出率。并且发现，除了已知的影响机制如CAR低表达以外，另外一些肿瘤相关基因如CEACAM6也能影响Ad5进入到细胞核中，进而减少了Ad5对肿瘤细胞的感染能力。这些数据表明在一些肿瘤细胞中用Ad5检测CTCs的方法可能敏感性较低。
发明内容
本发明要解决的技术问题：提供一种具有肿瘤靶向性和抗肿瘤效果的腺病毒载体Ad11-5EP，还提供一种用于治疗肿瘤或检测血循环中肿瘤细胞的B型重组人腺病毒载体Ad11-5ETel-GFP。
本发明的技术方案：
发明人首次在人肿瘤细胞系中体外比较了Ad11和Ad5的抗肿瘤潜能，发现在25个被检细胞系中仅仅有9个对Ad11敏感。其中PC-3对Ad5不敏感而对Ad11敏感。与Ad5相比较，Ad11在体内明显抑制PC-3细胞的皮下肿瘤生长，并且提高了荷瘤动物的无瘤率。同样，用对Ad5敏感而对Ad11不敏感的MIA PaCa-2细胞重复上述实验，Ad11的抗肿瘤能力明显降低。
尽管人肿瘤细胞中普遍高表达Ad11的受体，但野生型Ad11却不能有效地杀死这些肿瘤细胞。发明人对此进行了广泛而深入的研究。用两种不同的方法，发明人论证了与Ad5相比，有更多的Ad11吸附在肿瘤细胞膜上，这一结果与该细胞是否对Ad11敏感无关。吸附的Ad11病毒颗粒能够有效地进入到细胞核内，说明与Ad5相比在病毒感染的早期阶段细胞核内就有较高水平的Ad11。发明人调查比较了两种病毒在肿瘤细胞中的早期基因表达，用特异引物作定量PCR方法来检测比较E1A的mRNA水平。在所有这些细胞系中病毒感染2小时后，发现较高水平的Ad11感染产生了较高水平的E1A mRNA表达。其中Ad11不敏感细胞中(MIA PaCa-2和LNCaP)Ad5的E1A mRNA表达水平在感染2小时后明显降低。同样，Ad11敏感的Capan-2和PC-3细胞Ad11 E1A mRNA呈较高水平。Ad11 E1A mRNA直接影响着病毒的复制，所以Ad11 E1A mRNA在MIA PaCa-2和LNCaP细胞中的下调会降低病毒复制水平，相应地降低hexon蛋白的合成能力，这一发现与最初观察到的Ad11低水平的病毒子的产生及细胞毒性相一致。这些结果表明Ad11的复制及其杀伤能力与它的感染性无关，而与它的早期基因的增强子和启动子活性有关。
为了解决上述问题，本发明构建了一种肿瘤靶向性腺病毒载体(Ad11-5EP)。实验表明Ad11-5EP是一个非常有用的基本载体，可用于开发新的复制选择性溶肿瘤腺病毒，以期治疗更广泛的人类肿瘤。
为了进一步探索该新型腺病毒载体的应用，增强检测血循环肿瘤细胞的敏感性，在Ad11-5EP基础上，Ad5启动子被人端粒酶基因启动子所取代，然后通过同源重组产生了一个表达信号基因的复制选择型腺病毒(Ad11-5ETel-GFP)。由于端粒酶在95％人肿瘤细胞中高表达，所以Ad11-5ETel-GFP只能选择性地在肿瘤细胞中复制并表达GFP，而在正常上皮细胞中没有活性。
本发明的具体技术方案如下：
一种B型重组人腺病毒载体Ad11-5EP的构建方法，利用同源重组将Ad5 E1A编码序列上游的365bp段基因，包括Ad5 E1A的增强子和启动子，置换到B型人腺病毒11亚型Ad11的相应区域，构建成B型重组人腺病毒载体Ad11-5EP。
所述同源重组时，左臂序列是Ad11基因组前392bp段基因，右臂为Ad5 E1A 增强子及启动子序列的195-559bp段基因和 Ad11 E1A 的568-1125bp段基因，按顺序连接到一起形成片段，左臂和右臂分别连接到pSS-ChI两侧多克隆位点上，建立穿梭载体pSS-A1A7；pSS-A1A7被PmeI酶切并纯化，PmeI消化片段同时与pAd11在BJ5183细胞内进行同源重组，然后在含氨苄青霉素及氯霉素两种抗生素的琼脂板上筛选；阳性克隆分别经SwaI酶切，移除抗氯霉素基因表达盒序列，生成pAd11-Ad5EP，pAd11-Ad5EP经NotI酶切线性化后，转染到293细胞中产生腺病毒Ad11-5EP。
所述氨苄青霉素、氯霉素的浓度分别为100mg/ml、25mg/ml。
利用B型重组人腺病毒载体Ad11-5EP改造复制选择性溶肿瘤腺病毒的方法为下列方法其中之一：
(1)删除腺病毒在正常细胞中生存必需的但在肿瘤细胞中不需要的基因E1A CR2区域或抗凋亡基因E1B 21K；
(2)插入肿瘤特异启动子，驱动E1A基因的表达；
(3)根据肿瘤细胞表面特异受体，改造腺病毒的嗜细胞性；
(4)结合MicroRNA技术，赋予病毒选择性地在肿瘤细胞中进行复制。
一种B型重组人腺病毒载体Ad11-5ETel-GFP的构建方法，包括以下步骤：
（1）先用两个不同的抗生素抗性表达盒构建载体pSS-ChI 和pSS-kna，在抗氯霉素基因表达盒序列两侧引入SwaI酶切位点，在抗卡那霉素基因表达盒序列两侧引入sbfI酶切位位点；
（2）从pUC18克隆得到pBR32复制的起始序列，通过人工合成的包含多克隆位点的核苷酸序列与抗氯霉素基因表达盒序列相连接产生pSS-ChI，同源重组抗氯霉素基因表达盒序列上游左臂序列和下游右臂序列，将抗氯霉素上游左臂序列和下游右臂序列分别平端或粘端插入到pSS-ChI两侧的多克隆位点内，构建重组用的穿梭载体；
（3）从pUC18克隆得到pBR32复制的起始序列，通过人工合成的包含多克隆位点的核苷酸序列与抗卡那霉素基因表达盒序列相连接产生pSS-kna，同源重组抗卡那霉素基因上游左臂序列和下游右臂序列，将抗卡那霉素基因上游左臂序列和下游右臂序列分别平端或粘端插入到pSS-kna两侧的多克隆位点内，构建重组用的穿梭载体；
（4）pSSENTel的构建，左臂序列是Ad11基因组的前392bp序列，右臂为Ad5 E1A 增强子的195-378bp段基因、人 TERT 启动子的-714-0bp段基因 和 Ad11 E1A的568-1125bp序列按顺序连接在一起形成的片段，同时在人 TERT 启动子的两侧分别引入两个限制性酶切位点XbaI 和NcoI，左臂和右臂分别平端插入到pSS-ChI的相应两侧SnabI和EcoRV，最终生成pSSENTel；
（5）pSSGFP的构建，左臂为Ad11 基因组从27301 到 27837bp的DNA片段与EGFP基因通过NcoI的连接产物，并在EGFP的3’处引入SnaBI位点；右臂是Ad11 基因组从28337 到 28920bp的DNA片段，左臂和右臂分别平端插入到pSS-kna两侧的SnabI和EcoRV位点，最终生成pSSGFP；
（6）pSSENTel和pSSGFP分别被PmeI酶切并纯化，两个PmeI消化片段同时与pAd11在BJ5183细胞内进行同源重组，然后在含氨苄青霉素、卡那霉素及氯霉素三种抗生素的琼脂板上进行筛选；阳性克隆分别经SwaI 和 SbfI酶切，移除抗氯霉素基因表达盒序列和卡那霉素基因表达盒序列，生成pAd11-5ETel-GFP；pAd11-5ETel-GFP经NotI酶切线性化后，转染到293细胞中产生腺病毒Ad11-5ETel-GFP。
所述氨苄青霉素、卡那霉素及氯霉素浓度依次为100mg/ml、50ug/ml、25mg/ml。
所述pSSENTel中的Tel序列能够被其他肿瘤特异基因的启动子所取代，生成一个肿瘤特异的溶肿瘤腺病毒；所述pSSGFP中的GFP序列能够被另外信号基因或治疗基因取代。
所述pSSGFP中的Ad11 18.5基因的启动子能够被更强的肿瘤特异启动子所取代。
所述的B型人腺病毒载体Ad11-5EP在用于治疗肿瘤中的应用。
所述的B型重组人腺病毒载体Ad11-5ETel-GFP在用于治疗肿瘤或检测血循环中肿瘤细胞的应用。
本发明的积极有益效果：
（1）本发明的肿瘤靶向性腺病毒载体Ad11-5EP，是在野生型Ad11的基础上，其E1A的增强子和启动子被Ad5 E1A的增强子和启动子所取代得到的，该载体比野生型Ad11有更强的溶肿瘤作用，从而增强了对肿瘤细胞的杀伤能力。
（2）本发明的肿瘤靶向性腺病毒载体Ad11-5EP，具有肿瘤靶向性和抗肿瘤效果。通过溶肿瘤潜能试验表明， Ad11-5EP比Ad5显示出更好的细胞杀伤能力，比Ad11产生更强的细胞毒性。通过肿瘤生长和肿瘤清除率的测定表明， Ad11-5EP能有效地降低肿瘤的生长速度，并且荷瘤鼠无瘤率显著好于Ad11。
（3）本发明的肿瘤靶向性腺病毒载体Ad11-5EP可作为一种肿瘤靶向性基因工程药物治疗肿瘤，将会产生较好的社会效益和经济效益。
（4）本发明的B型重组人腺病毒载体Ad11-5ETel-GFP的构建方法，由构建的穿梭载体pSSENTel、pSSGFP与Ad11-5EP基因组同时进行同源重组产生重组病毒Ad11-5ETel-GFP。Ad11-5ETel-GFP可用于治疗肿瘤或检测血循环中肿瘤细胞，通过Ad11-5ETel-GFP中的GFP在人正常上皮细胞及癌细胞中的表达试验以及检测CTCs的实验表明，d11-5ETel-GFP对肿瘤细胞非常敏感，它能够感染大多数肿瘤细胞，用该载体可特异的、敏感的、经济的用于循环血液中肿瘤细胞的检测。
附图说明
图1：B型重组人腺病毒载体Ad11-5EP的构建示意图。
图2：Ad11-5EP对Ad11敏感人肿瘤细胞的溶肿瘤潜能的比较。
图3：Ad11-5EP对Ad11不敏感人肿瘤细胞的溶肿瘤潜能的比较；
图2、图3中，□表示Ad5， 
表示Ad11，
表示 Ad11-5EP。
图4：MIA PaCa-2细胞皮下种植异体肿瘤模型中Ad5、Ad11和Ad11-5EP处理后肿瘤的生长曲线图。
图5：MIA PaCa-2细胞皮下种植异体肿瘤模型中Ad5、Ad11和Ad11-5EP处理后动物肿瘤清除率；
图4、图5中，1表示PBS，2表示Ad11，3表示Ad11-5EP，4表示 Ad5。
图6：穿梭载体pSSENTel和pSSGFP及复制选择性溶肿瘤腺病毒质粒pAd11-5ETel-GFP的构建过程示意图。
图7：Ad11-5ETel-GFP中的GFP在人正常上皮细胞及癌细胞中的表达比较图；
图中，1为白光下图像，2为荧光下图像。
图8：Ad11-5ETel-GFP检测血液中肿瘤细胞数的统计柱状图。
图9：Ad11-5ETel-GFP荧光显微镜下检测的血液中肿瘤细胞数图像。
具体实施方式
以下通过实例对本发明进一步说明，并不是限定本发明的保护范围，本领域的技术人员根据说明书可以对这些实施方案进行修改，只要不脱离本发明的精神和范围都可以得到类似或相同的结果，均在本发明的保护范围之内。
实例1：B型重组人腺病毒载体Ad11-5EP的构建方法
利用同源重组将Ad5 E1A编码序列上游的365bp段基因，包括Ad5 E1A的增强子和启动子，置换到B型人腺病毒11亚型Ad11的相应区域，构建成B型重组人腺病毒载体Ad11-5EP。
左臂序列是Ad11基因组前392bp，右臂为Ad5 E1A 增强子及启动子序列 (195-559bp)和 Ad11 E1A (568-1125bp)按顺序连接到一起的片段，左臂和右臂分别连接到pSS-ChI两侧多克隆位点上，建立穿梭载体pSS-A1A7。pSS-A1A7被PmeI酶切并纯化。PmeI消化片段同时与pAd11在BJ5183细胞内进行同源重组，然后在含氨苄青霉素及氯霉素两种抗生素（浓度依次为100mg/ml、25mg/ml）的琼脂板上筛选。阳性克隆分别经SwaI酶切，以移除抗氯霉素基因表达盒序列，最终生成pAd11-Ad5EP。pAd11-Ad5EP经NotI酶切线性化后，转染到293细胞中产生腺病毒Ad11-Ad5EP（参见图1）。
实例2：Ad5、Ad11和Ad11-5EP在Ad11敏感及不敏感人肿瘤细胞中的溶肿瘤潜能。
在Ad11敏感人肿瘤细胞Capan-2、PaTu8988s、PC-3、MCF7、HT-29和不敏感人肿瘤细胞MIA PaCa-2、MDA-MB-231、HCT116、LNCaP和A549中对Ad5、Ad11和Ad11-5EP进行体外杀伤实验，用2%胎牛血清的培养基将上述10种细胞制成细胞悬液，接种于96孔板中央，14～18h之后，倍比稀释病毒。以1x104 pt/细胞为起始浓度，10倍比稀释病毒溶液，加入10μl/孔感染96孔板中各种细胞，感染后6天加入MTS检测它们的溶肿瘤潜能。
结果显示：在所有Ad11敏感细胞系中，Ad11-5EP比Ad5显示出更好的细胞杀伤能力，比Ad11产生更强的细胞毒性（参见图2）。而在Ad11不敏感的细胞系中，Ad11-5EP的性能得到显著提高（参见图3）。Ad11-5EP在90％（9／10）的细胞系中都显示高敏感性，说明比Ad5和Ad11拥有更好的杀伤肿瘤的效力，Ad11-5EP在体外扩大了有效杀伤肿瘤细胞的范围。
实例3：Ad5、Ad11和Ad11-5EP在MIA PaCa-2细胞皮下种植异体肿瘤模型中的抗肿瘤效果。
在BALA/c裸鼠(n＝8／组)右侧背部皮下接种MIA PaCa-2细胞（因为MIA PaCa-2对Ad11不敏感而对Ad5敏感），构建皮下移植瘤模型，当肿瘤体积达到180 mm3时，第1、3、5天瘤内分别注射PBS或病毒(Ad5、Ad11和Ad11-5EP，1X1010病毒颗粒／注射)，观察肿瘤生长和肿瘤清除率。结果发现Ad11-5EP如Ad5一样能有效地降低肿瘤的生长（参见图4），并且荷瘤鼠无瘤率显著好于Ad11处理组（参见图5）。
实例4：B型重组人腺病毒载体Ad11-5ETel-GFP的构建方法。
（1）先用两个不同的抗生素抗性表达盒构建两个不同载体pSS-ChI 和pSS-kna，其中抗氯霉素基因表达盒序列两侧引入SwaI酶切位点，而抗卡那霉素基因表达盒序列两侧为sbfI切位位点；
（2）从pUC18克隆得到pBR32复制起始序列，然后通过人工合成的包含多克隆位点（PmeI-KpnI-SacII-NotI-XhoI-XbaI-SgfI-SnabI-SwaI和SwaI-EcoRV-FseI-HindIII-SrfI-SalI-BglII-PmeI）的核苷酸序列与抗氯霉素基因表达盒序列相连接产生pSS-ChI，同源重组需要的上游(左臂)和下游(右臂)序列分别平端或粘端插入到两侧的多克隆位点内，构建成重组用的穿梭载体；
（3）从pUC18克隆得到pBR32复制起始序列，然后通过人工合成的包含多克隆位点（PmeI-KpnI-SacII-NotI-XhoI-XbaI-SgfI-SnabI-SwaI-SbfI和SbfI-SwaI-EcoRV-FseI-HindIII-SrfI-SalI-BglII-PmeI）的核苷酸序列与抗卡那霉素基因表达盒序列相连接产生pSS-kna，同源重组需要的上游(左臂)和下游(右臂)序列分别平端或粘端插入到pSS-kna两侧的多克隆位点内构建成重组用的穿梭载体；
（4）pSSENTel，左臂序列是Ad11基因组前392bp，右臂为Ad5 E1A 增强子(195-378bp)、人 TERT 启动子 (-714-0bp) 和 Ad11 E1A (568-1125bp)按顺序连接到一起的片段，在人 TERT 启动子两侧分别引入两个限制性酶切位点XbaI 和NcoI，左臂和右臂分别平端插入到pSS-ChI的相应两侧(SnabI和EcoRV)，最终生成pSSENTel；
（5）pSSGFP，左臂为DNA片段(Ad11 基因组 DNA 从27301 到 27837bp)与EGFP基因通过NcoI的连接产物，在EGFP的3’引入一个SnaBI位点，右臂是Ad11 基因组 DNA 从28337 到 28920bp的DNA片段，左臂和右臂分别平端插入到pSS-kna相应两侧的SnabI和EcoRV位点，最终生成pSSGFP；
（6）pSSENTel和pSSGFP分别被PmeI酶切并纯化，两个PmeI消化片段同时与pAd11在BJ5183细胞内进行同源重组，然后在含氨苄青霉素、卡那霉素及氯霉素三种抗生素（浓度依次为100mg/ml、50ug/ml、25mg/ml）的琼脂板上筛选。阳性克隆分别经SwaI 和 SbfI酶切，以移除抗氯霉素基因表达盒序列和卡那霉素基因表达盒序列，最终生成pAd11-5ETel-GFP（参见图6）。
pAd11-5ETel-GFP经NotI酶切线性化后，转染到293细胞中产生腺病毒Ad11-5ETel-GFP。
实例5：Ad11-5ETel-GFP中的GFP在人正常上皮细胞及癌细胞中的表达。
Ad11-5ETel-GFP感染人胰腺癌细胞系SUIT-2和人正常支气管上皮细胞系NHBE（感染浓度100pfu/细胞），24小时后用免疫荧光显微镜观察GFP的表达。GFP在肿瘤细胞SUIT-2中呈现高表达，而在正常细胞NHBE中较低（参见图7），说明Ad11-5ETel-GFP对肿瘤细胞敏感。
实例6：Ad11-5ETel-GFP检测循环肿瘤细胞CTCs。
分别将10、25、50、100、200个人胰腺癌细胞SUIT-2混入3ml血液中，裂解红细胞后离心收集有核细胞，然后用900μl DMEM培养基重悬有核细胞，加入1x104 pfu 的Ad11-5ETel-GFP，孵育24小时，最后用免疫荧光显微镜计数GFP阳性细胞（参见图8）。外周血细胞混入0、10、100、1000个人胰腺癌细胞SUIT-2细胞（感染浓度100pfu/细胞），24小时后用免疫荧光显微镜下观察荧光细胞（参见图9），结果表明d11-5ETel-GFP对肿瘤细胞非常敏感。
Claims (7)
1.一种B型重组人腺病毒载体Ad11-5EP的构建方法，其特征是：利用同源重组将Ad5 E1A编码序列上游的365bp段基因，包括Ad5 E1A的增强子和启动子，置换到B型人腺病毒11亚型Ad11的相应区域，构建成B型重组人腺病毒载体Ad11-5EP。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征是：所述同源重组时，左臂序列是Ad11基因组前392bp段基因，右臂为Ad5 E1A 增强子及启动子序列的195-559bp段基因和 Ad11 E1A 的568-1125bp段基因，按顺序连接到一起形成片段，左臂和右臂分别连接到pSS-ChI两侧多克隆位点上，建立穿梭载体pSS-A1A7；pSS-A1A7被PmeI酶切并纯化，PmeI消化片段同时与pAd11在BJ5183细胞内进行同源重组，然后在含氨苄青霉素及氯霉素两种抗生素的琼脂板上筛选；阳性克隆分别经SwaI酶切，移除抗氯霉素基因表达盒序列，生成pAd11-Ad5EP，pAd11-Ad5EP经NotI酶切线性化后，转染到293细胞中产生腺病毒Ad11-5EP。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征是：所述氨苄青霉素、氯霉素的浓度分别为100mg/ml、25mg/ml。
4.利用权利要求1中所述的B型重组人腺病毒载体Ad11-5EP改造复制选择性溶肿瘤腺病毒的方法为下列方法其中之一：
(1)删除腺病毒在正常细胞中生存必需但在肿瘤细胞中不需要的基因E1A CR2区域或抗凋亡基因E1B 21K；
(2)插入肿瘤特异启动子，驱动E1A基因的表达；
(3)根据肿瘤细胞表面特异受体，改造腺病毒的嗜细胞性；
(4)结合MicroRNA技术，赋予病毒选择性地在肿瘤细胞中进行复制。
5.一种B型重组人腺病毒载体Ad11-5ETel-GFP的构建方法，其特征是：所述方法包括以下步骤：
（1）先用两个不同的抗生素抗性表达盒构建载体pSS-ChI 和pSS-kna，在抗氯霉素基因表达盒序列两侧引入SwaI酶切位点，在抗卡那霉素基因表达盒序列两侧引入sbfI酶切位位点；
（2）从pUC18克隆得到pBR32复制的起始序列，通过人工合成的包含多克隆位点的核苷酸序列与抗氯霉素基因表达盒序列相连接产生pSS-ChI，同源重组抗氯霉素基因表达盒序列上游左臂序列和下游右臂序列，将抗氯霉素上游左臂序列和下游右臂序列分别平端或粘端插入到pSS-ChI两侧的多克隆位点内，构建重组用的穿梭载体；
（3）从pUC18克隆得到pBR32复制的起始序列，通过人工合成的包含多克隆位点的核苷酸序列与抗卡那霉素基因表达盒序列相连接产生pSS-kna，同源重组抗卡那霉素基因上游左臂序列和下游右臂序列，将抗卡那霉素基因上游左臂序列和下游右臂序列分别平端或粘端插入到pSS-kna两侧的多克隆位点内，构建重组用的穿梭载体；
（4）pSSENTel的构建，左臂序列是Ad11基因组的前392bp序列，右臂为Ad5 E1A 增强子的195-378bp段基因、人 TERT 启动子的-714-0bp段基因 和 Ad11 E1A的568-1125bp序列按顺序连接在一起形成的片段，同时在人 TERT 启动子的两侧分别引入两个限制性酶切位点XbaI 和NcoI，左臂和右臂分别平端插入到pSS-ChI的相应两侧SnabI和EcoRV，最终生成pSSENTel；
（5）pSSGFP的构建，左臂为Ad11 基因组从27301 到 27837bp的DNA片段与EGFP基因通过NcoI的连接产物，并在EGFP的3’处引入SnaBI位点；右臂是Ad11 基因组从28337 到 28920bp的DNA片段，左臂和右臂分别平端插入到pSS-kna两侧的SnabI和EcoRV位点，最终生成pSSGFP；
（6）pSSENTel和pSSGFP分别被PmeI酶切并纯化，两个PmeI消化片段同时与pAd11在BJ5183细胞内进行同源重组，然后在含氨苄青霉素、卡那霉素及氯霉素三种抗生素的琼脂板上进行筛选；阳性克隆分别经SwaI 和 SbfI酶切，移除抗氯霉素基因表达盒序列和卡那霉素基因表达盒序列，生成pAd11-5ETel-GFP；pAd11-5ETel-GFP经NotI酶切线性化后，转染到293细胞中产生腺病毒Ad11-5ETel-GFP。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征是：所述氨苄青霉素、卡那霉素及氯霉素浓度依次为100mg/ml、50ug/ml、25mg/ml。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征是：所述pSSENTel中的Tel序列能够被其他肿瘤特异基因的启动子所取代，生成一个肿瘤特异的溶肿瘤腺病毒；所述pSSGFP中的GFP序列能够被另外信号基因或治疗基因取代。
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