CN110093323B - 重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B及其构建方法和应用 - Google Patents

重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组溶瘤腺病毒OncoAd‑P28GANK‑E1A‑△E1B及其构建方法和其在制备治疗肝癌药物中的应用。本发明还公开了一种肝癌特异性P28GANK启动子及其筛选方法和在制备治疗肝癌药物中的应用。本发明的P28GANK启动子具有高效的肝癌特异性，用其构建获得的重组溶瘤腺病毒OncoAd‑P28GANK‑E1A‑△E1B毒性低、抗肝癌效果好，且抗肝癌效果优于重组溶瘤腺病毒GP73‑E1A‑△E1B。

Description

重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B及其构建方法和 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是关于一种重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B及其构建方法和应用。
背景技术
肝癌是全球第五大常见的恶性肿瘤，具有高发病率和死亡率的特点，在肿瘤致死原因中排第三位，严重危害人类的生命健康和安全。肝癌的发病机制复杂，尚未完全清楚。目前临床上治疗肝癌一般采用介入治疗、化疗、外科手术、放疗及联合治疗等方式，这些传统方式主要表现在治愈率低、复发率及死亡率高、预后较差。对于中晚期的癌症患者来说，这些传统的方法难以奏效，急需新的治疗手段来延长患者的生命，提高他们的生活质量。全球肝癌统计数据发现，男性的肝癌发生率要高于女性，在发展中国家，肝癌致死率排名第二，而我国的肝癌发生率和死亡率占全球的一半，因此，我们亟需寻找新的癌症治疗方法。
靶向基因-病毒治疗策略，以溶瘤病毒为载体，携带抗癌基因，利用其在肿瘤细胞内特异性增殖，裂解，成千上万倍的提高抗癌基因的表达量。该策略克服了基因治疗靶向性低，转染效率低等的缺点，充分利用溶瘤病毒复制转移能力强，体积小的优势，进一步提高抗肿瘤的效果。
中国专利文献CN103981185A公开了一种肝癌特异性GP73核心启动子，通过筛选该启动子具有高效的肝癌特异性，同时，该文献还公开了携带GP73启动子靶向肝癌腺病毒载体GD55的构建和应用，所获得的双靶向腺病毒GD55-gene溶瘤腺病毒能选择性的杀死肿瘤细胞，而不影响正常细胞，因此能有效地抑制肿瘤生长，为治疗癌症提供了一个优良的新型技术平台。为此，发明人尝试开发新的靶向药物，以期获得更高效和更稳定的疗效，为肝癌的治疗找到新的方向和启示。
P28GANK又称P28，Gankyri，PSMD10，是一种由226个氨基酸组成，分子量为25kDa的蛋白质。经研究，这种蛋白是人26S蛋白酶体调节亚单位19S/PA700复合物中的一种非ATP酶亚基。最初，P28GANK是通过cDNA文库经过消减杂交法克隆而得到的一个在肝癌细胞中差异表达的基因，P28GANK蛋白在哺乳动物中高度保守，它能介导蛋白质与蛋白质之间的相互作用，从而发挥多种生物学功能。
P28GANK基因在肝癌细胞中呈特异性的高表达状态，Fujita等人对肝癌患者样品进行mRNA表达检测，发现P28GANK的mRNA的表达水平在肝癌组织中比癌旁组织高出3.4倍(Higashitsuji,H.,et al.,Reduced stability of retinoblastoma protein bygankyrin,an oncogenic ankyrin-repeat protein overexpressed in hepatomas.NatMed,2000.6(1):p.96-9)。王红阳等对64例肝癌样本进行了Northern blot检测，结果显示，P28GANK在肝癌细胞中检出率高达96.9％，表达明显升高的样本占了91.9％，P28GANK蛋白同时在肝硬化组织中也有一定水平的表达，但是在正常的细胞中，没有检出P28GANK的表达。同时王红阳等在HepG2、HuH-7、SK-Hep-1、Hep3四种肝癌细胞中均检测到了该基因的高表达(Fu,X.Y.,et al.,Overexpression of p28/gankyrin in human hepatocellularcarcinoma and its clinical significance.World J Gastroenterol,2002.8(4):p.638-43)。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B。本发明的第二个目的是提供一种所述重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B的构建方法。本发明的第三个目的是提供一种所述重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B在制备治疗肝癌药物中的应用。本发明的第四个目的是提供一种治疗肝癌的药物组合物。本发明的第五个目的是筛选一种肝癌特异性P28GANK启动子，以获得一种高靶向性和高特异性的携带P28GANK启动子的核心序列的溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B，为治疗癌症提供了一个优良的新型技术平台。本发明的第六个目的是提供一种所述肝癌特异性P28GANK启动子的筛选方法。本发明的第七个目的是提供一种所述肝癌特异性P28GANK启动子在制备治疗肝癌药物中的应用。
本发明克隆了P28GANK蛋白的启动子序列，通过体外Dual-Luciferase双荧光检测系统，对其启动子活性进行了检测，筛选出了启动子活性较高的长度为196bp的核心序列。接着，用筛选出的P28GANK启动子替换了腺病毒内源的E1A启动子，构建了肝癌特异性启动子P28GANK调控E1A区，同时，敲除腺病毒基因组E1B基因区域，获得重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B。并通过实验研究发现，与对照组GP73启动子控制的溶瘤腺病毒相比，重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-△E1B杀伤肝癌细胞的能力显著增强，同时，对正常的肝细胞QSG-7701几乎不存在毒性。为此，发明人尝试开发新的靶向药物，以期获得更高效和更稳定的疗效，为肝癌的治疗找到新的方向和启示。
基于以上目的，本发明的第一个方面，提供一种重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B，该重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-△E1B由SEQ ID NO：19所示的P28GANK启动子替换了腺病毒内源的E1A启动子，构建了肝癌特异性启动子P28GANK调控E1A区，同时，敲除腺病毒基因组E1B基因区域。
本发明的第二个方面，提供了所述重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B的构建方法，包括以下步骤：
步骤一、以PGL3-F4(+1/-194)质粒为模板，采用如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的特异性引物，进行PCR扩增，得到一段从酶切位点Xhol到SnabI的核酸片段，即P28GANK启动子片段；
步骤二、以pZXC2质粒为模板，采用如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的特异性引物，进行PCR扩增，得到一段从酶切位点SnabI到Xbal的核酸片段，即P-E1A基因片段；
步骤三、以步骤一的P28GANK启动子片段和步骤二的P-E1A基因片段为模板，采用如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：13所示的特异性引物，进行Overlap PCR，得到一段从酶切位点Xhol到Xbal的核酸片段，即P28GANK-E1A片段；
步骤四、将Overlap PCR得到的P28GANK-E1A片段用XhoI和XbaI双酶切，然后与同样用XhoI和XbaI双酶切的pShuttle-sur-E1A-△E1B质粒相连接，得到pShuttle-P28GANK-E1A-△E1B；
步骤五、将构建好的pShuttle-P28GANK-E1A-△E1B重组质粒用限制性内切酶PmeI线性化，去磷后转化到带有腺病毒骨架质粒pAdEasy-E3的BJ5183感受态中，使二者发生同源重组，筛选并获得阳性重组克隆的腺病毒质粒；
步骤六、将阳性重组克隆的腺病毒质粒用限制性内切酶PacI线性化，转染入人胚胎肾细胞株HEK-293，获得重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B。
根据本发明，步骤一和步骤二的PCR反应体系均为：模板1μL；上游引物1μL；下游引物1μL；KOD 1μL；MgSO4 3μL；dNTPs 5μL；PCR Buffer 5μL；dd H2O 33μL；
步骤一和步骤二的PCR反应条件均为：95℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃1min；共30个循环；68℃10min；4℃15min。
根据本发明，步骤三的Overlap PCR反应体系为：P28GANK启动子片段1μL；P-E1A基因片段1μL；上游引物1μL；下游引物1μL；KOD 1μL；MgSO4 3μL；dNTPs 5μL；PCR Buffer 5μL；dd H2O 32μL；
步骤三的PCR反应条件均为：95℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃1min；共30个循环；68℃10min；4℃15min。
本发明的第三个方面，提供了上述所述的重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B在制备治疗肝癌药物中的应用。
本发明的第四个方面，提供了一种治疗肝癌的药物组合物，所述药物组合物包括上述所述的重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B。
本发明的第五个方面，提供一种肝癌特异性P28GANK启动子，所述肝癌特异性P28GANK启动子为如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19所示的序列。
优选的，所述肝癌特异性P28GANK启动子为如SEQ ID NO：19所示的序列。
本发明的第六个方面，提供上述所述的肝癌特异性P28GANK启动子的筛选方法，包括如下步骤：
步骤一、以HEK-293细胞基因组为模板，采用如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的特异性引物，进行PCR扩增，得到长度为3898bp的P28GANK启动子片段，将该启动子片段构建到报告质粒PGL3-Basic上，得到PGL3-L1；
步骤二、以pGL3-L1为模板，采用如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6和SEQ ID NO：7所示的引物，PCR得到不同长度的启动子片段，用NheI和Xhol双酶切不同长度的启动子片段，并与用NheI和Xhol双酶切的质粒GL3-Basic连接，获得PGL3-F1、PGL3-F2、PGL3-F3、PGL3-F4；
步骤三、将构建好的上述质粒，与带有海肾荧光素基因Renilla的报告质粒按照1：100的比例共同转染正常肝细胞和肝癌细胞，转染48h后，用Dual-Luciferase双荧光素酶检测试剂盒检测P28GANK启动子的活性，此次实验中，海肾荧光素基因Renilla作为内参使用。
根据本发明，所述步骤一和步骤二的PCR反应体系均为：模板1μL；上游引物1μL；下游引物1μL；KOD 1μL；MgSO4 3μL；dNTPs 5μL；PCR Buffer 5μL；dd H2O 33μL。
根据本发明，所述步骤一和步骤二的PCR反应条件均为：95℃2min；98℃15s，55℃30s，68℃3min；共30个循环；68℃10min；4℃15min。
本发明的第七个方面，提供上述所述的肝癌特异性P28GANK启动子在制备治疗肝癌药物中的应用。
本发明的有益效果是：首先，本发明克隆了P28GANK启动子，筛选到了具有高效肝癌特异性的P28GANK启动子的核心序列；其次，在制备肝癌药物中，构建了靶向肝癌的重组溶瘤腺病毒；再次，所获得的重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B的毒性低、抗肝癌效果好，且抗肝癌效果优于重组溶瘤腺病毒GP73-E1A-△E1B。
附图说明
图1为P28GANK基因的本底表达示意图。
图2为P28GANK启动子的PCR结果。
图3为P28GANK启动子的截短示意图。
图4为不同长度的P28GANK启动子PCR结果。
图5为携带不同长度P28GANK的启动子的PGL3系列质粒酶切鉴定结果。
图6为不同长度的P28GANK启动子在肝癌细胞中的活性检测结果。
图7为p+1/-194启动子片段在5种肝癌细胞和一种肝正常细胞中的活性检测结果。
图8为+1/-194片段序列的转录因子结合位点的分析。
图9为P28GANK启动子的PCR产物。
图10为GP73启动子的PCR产物。
图11为用于和P28GANK启动子拼接的PCR产物。
图12为用于和GP73启动子拼接的PCR产物。
图13为重组溶瘤腺病毒质粒酶切鉴定图。其中，M：DNA Maker；泳道1-3：pShuttle-P28GANK-E1A-△E1B的MluI酶切鉴定结果；泳道4-6：pShuttle-GP73-E1A-△E1B的MluI酶切鉴定结果。
图14为重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B的鉴定结果。其中，M：DNAMaker；泳道3-4：重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B。
图15为重组溶瘤腺病毒GP73-E1A-△E1B的鉴定结果。其中，M：DNA Maker；泳道1-2：重组溶瘤腺病毒GP73-E1A-△E1B。
图16为重组溶瘤腺病毒野毒鉴定结果。其中，M：DNA Maker；泳道2：重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B；泳道5：重组溶瘤腺病毒GP73-E1A-△E1B；泳道7：阳性对照；泳道8：阴性对照。
图17为重组溶瘤腺病毒E1A鉴定结果M：DNA Maker；泳道2：重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B；泳道5：重组溶瘤腺病毒GP73-E1A-△E1B；泳道7：阳性对照。
图18为重组溶瘤腺病毒E1A western blotting鉴定结果。
图19为CCK8检测重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B和重组溶瘤腺病GP73-E1A-△E1B对肝癌细胞的杀伤性和对肝正常细胞的安全性结果。
图20为结晶紫法检测重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B和重组溶瘤腺病毒GP73-E1A-△E1B对肝细胞的杀伤性和对肝正常细胞QSG-7701和对人正常的肺上皮细胞Beas-2B的安全性结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。除非另外说明，本发明所采用的技术，均是本领域常规技术，如分子克隆技术、微生物学技术、细胞生物学技术等。
其中，以下实施例的重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B简称P28GANK-△E1B，重组溶瘤腺病毒GP73-E1A-△E1B简称GP73-△E1B。
以下为本实施例所用的试验材料、质粒：
1、带有腺病毒骨架质粒pAdEasy-E3的BJ5183感受态，按照中国专利CN106190992A公开的构建方法获得。
2、QSG-7701、Hep3B、97-H、SMMC-7721、HepG2、Huh-7细胞购于中科院上海生命科学研究院细胞库。
3、Dual-Luciferase双荧光素酶检测试剂盒购买自Promega公司。
4、HEK-293细胞购于中科院上海生命科学研究院细胞库。
5、pZXC2质粒，按照中国专利CN200480013151.5公开的构建方法获得。
6、pShuttle-pSur-E1A-△E1B质粒，参照中国专利申请201710060962.X的构建方法获得。
实施例1 P28GANK基因在不同肝癌细胞系中的本底表达情况
将肝正常细胞QSG-7701与肝癌细胞Hep3B、97-H、SMMC-7721、HepG2、Huh-7分别以2.5×105的密度铺于6孔板，培养48h后收取总蛋白，进行Western blotting检测P28GANK蛋白的表达量，结果如图1所示。
Western blotting结果显示，P28GANK蛋白在肝癌细胞系Hep3B、97-H、Huh-7、HepG2、SMMC-7721中的表达量要明显高于肝正常细胞系QSG-7701。
实施例2 P28GANK启动子的获得
以HEK-293细胞基因组为模板，进行PCR扩增，得到长度为3894bp的P28GANK启动子片段，按操作说明书将该启动子片段构建到报告质粒PGL3-Basic上，得到PGL3-L1。结果如图2所示。
(1)PCR引物序列F：CCGGGCTCGAGCATTTTCTGAGAC，(SEQ ID NO：1)
R：AATGCCAAGCTTCACCGGCCTTC，(SEQ ID NO：2)
(2)PCR反应体系，如表1所示。
表1 HEK-293细胞基因组的PCR反应体系
实施例3不同片段长度的P28GANK启动子的获得和PGL3系列质粒的构建和鉴定
1、以pGL3-L1为模板，根据设计的引物，PCR得到不同长度的启动子片段，如图3和图4所示。
其中，图4的泳道1：DNA Marker；泳道2：F1和R引物PCR得到3826bp片段，命名为F1，为图3中的+1/-3824；泳道3：F2和R引物PCR得到1197bp片段，命名为F2，为图3中的+1/-1195；泳道4：F3和R引物PCR得到488片段，命名为F3，为图3中的+1/-486；泳道5：F4和R引物PCR得到196bp片段，命名为F4，为图3中的+1/-194。
(1)PCR引物序列：
F1：CGCGTGCTAGCCGAGATCAGCCTGGGCAAC，(SEQ ID NO：3)
F2：CGCGTGCTAGCGGGAACACTAATTCTGAGCCCC，(SEQ ID NO：4)
F3：CGCGTGCTAGCAACCCCCACTTCTTTCCACTCC，(SEQ ID NO：5)
F4：CGCGTGCTAGCATCCTGGGCCAATTCCACCG，(SEQ ID NO：6)
R：CAGATCTCGAGCACCGGCCTTCCTCGTTC，(SEQ ID NO：7)
(2)PCR反应体系，如表2所示。
表2 pGL3-L1的PCR反应体系
2、将PCR得到的不同长度的产物F1、F2、F3、F4和报告质粒pGL3-Basic均用NheI和Xhol双酶切，将得到的线性化片段用琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒回收，然后二者用连接酶16℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂板，在LB平板上挑取单克隆并于37℃振荡培养12小时后，抽提质粒。取10μl质粒用NheI和Xhol双酶切鉴定，将酶切结果正确的质粒送到上海杰李生物公司测序，将鉴定正确的质粒储存于-20℃冰箱。因此得到4种质粒，PGL3-F1，PGL3-F2，PGL3-F3，PGL3-F4。图5为携带不同长度P28GANK的启动子的PGL3系列质粒酶切鉴定结果。
其中，图5的泳道1：PGL3-F1质粒酶切结果；泳道2：PGL3-F2质粒酶切结果；泳道3：PGL3-F3质粒酶切结果；泳道4：PGL3-F4质粒酶切结果；泳道5：DNA maker。
结论：成功构建得到4种质粒，分别为PGL3-F1，PGL3-F2，PGL3-F3，PGL3-F4。
其中，F1的碱基序列为：
cgagatcagcctgggcaacatagtgagaccctgtatctataaaaaatcataaattggctgagtgtgttggtgcatgcctgtagttccagctgctccagaggctgagatgacaggattgcttgtgctagggaggtggaggctgcagtgagccgtgatcgtgccactgcactccagcctgggcaacagaagaagaccctgtctcaataaaaaataaaataggctgggcacagtggctcatgcctgtaatcccagcactttgggaggatcacctgaggtcaggagttagagaccagcctggccaatatggcgaaaccctgtctctactaaaaatacaaaacttagccaggcgtggtggcatgcgcctcaggaggctgaggcaggagaatcgcttgagcctgggaggcaaagatagcagtgtgccaagatcgtgccactgcattccagcctgggtgacagagtgagactctgtctcaaaataaaatgaaataaaagttaaaacaagaagcaagatatctatttccataagaatttgcagcatatatattttctgaattcagactacagttccagcagcagtttttgaaccctgaagcaagtgcaaaggatattccatattccaaaatccctttaactgtgcaattgagcagctttcaccaaactttcaattggaagtgattaacctgccacataatgctaaaaggcactattaagagaagaacagaattctattccacgcaatgaatatgctcaattaaaatcatgtttgaggatagtgtatgataagaatgtggtacttgacctctgcagactttcttccaaacacataatgccagtctaagcataaaattgaggggttttctacaaaatacctgaccagtactccttaaaactatcaaggtcaccaaaacaagaaaagtgtgagaaagtgtcacaaaccagaagaggctaaggagatacaatgactaaacgtaatgtggtatcctggatgggacagcatctctagagataaactagtgaaacttgaaaaaaaaaagcatggggtatagttaatagcaatataccactgtgggcttattagttgtgacatagatagcatagcaatgtaagacgttaatgataagagattcagcaaatggtgctaggacaatttctacatccacatgcaaaaagatgaatttagactctcacctcacatcacagagaaaaaatgaactcaaaatgaatcatagacttaaatgtaagagatgaagtaataaagcttttagaagaaaacattggagaaaatcactgagaccttgcaattaggcaaagacttcttaagtacaacaccaaaagaatggtccatgaaagaaaaaaaaatgataaattgaacctcacccaaattcaaaacgttttcacttcaaaagacaccatcaaaaaaagaaaaaggcaagcaacagactgggagaatatatgtgcatatcatatatctctcagggacttgatctagaatatataaaccatccttacaactcaacactaaaaaaacaaataactcaatttaaaaacagacaaaagatataacagacacttcactgaagaagatatatgaatggctaataagcacatgaaaatatgctcaccgtattataaattataatttataaattaaaaccacaatgagacaccacttcacacccacttagaatggctataacaaaaaacacagtaaataacaaatgttggcaaggatgtggagaaacaggaactctcatacattgctagtggaagtgcaaaatgttgctgccattttggaaaacagttttgcagtttcttaagaagttaagcataaattttccctgtgatccagtaactccacccttaagtatctatcaaagagaaatgaaaaaaatatgtccgcacgaagacttacatactaatcttcttagcagcactagtcatagtagccaaaaattggaaactgatgtgcctatctaatagtgagtagacagataaaaatgtgttatatccataaaatggaatactattcagcaataaaaaagtaaggaagtactgatacatactacaatatggatgaatctcaaaaatattatgctaagtgaaagaaatcagacacaaagactgcatattgtatgatttcatttatataaaatgtccagaataggcaaatttatagaaacaaaaaagtagattagtggttgtctggggctgggaatgggacagaggattgattaactataaataggcatgagggaccttactggagggatcaaaaagttctaaaactgatttatggtgatggttgccccacttcagtaaagttaccaaaaatcatttaattatgcacttgaaatcagtgaattttatgatatgtaaaatgtgcctcattttgagtgagtgttatacaggaactctactaaccttgcaacttttctataaatctacaactattctgaaatttttgaaaaattaaataaaaataaaaataaaaaagtatatgtttatgaattgatatcagtatttggcagtacctatctatgtaaaatgacattttcaaagattaaataggtaaaaatttcctaacagatcagcattaacagatgaacacttaaaatcaattttgacaatagggaacactaattctgagccccaattaagcaaaatattatcccctaaaaagaattctattcttctcattggtagtcttcctgtattacaaaaaaagtactcaattactattatattttgaatttcatcaataaaaatttgttgaaatttgttttctcttttgtcataaaagtaccaacaaaatattcttgattttgccttttggcctacaaagcctaaaatatttactatctggctctttacagaaagtttcccaactcctgttctacactataacaggataaacataaacatcatgagtctctttcttgaatgtattcttatcgttacctagttgtggcataatgtcctctggatatgccctataaaggatcagtcttgcattgcttctgctatggcactatttgggatttctataaaaagaaacactattagcttaatagttgtagcaaagccttgacaacatagttaatatcgtgatattaaaatgccaacaccacagcccggtatccttaagatgaccctcatcaagctgtgatgtcaccaggctatggactcaccgaggtctcttagatatcaggtggctcccacggcatcacaccctgcctttggcatcaccctggcacatcacctcagtacggtgccatatgctatcactgctgtggtagaaccctgtcctgatgccacaccgccgagatgtcagagtaattaacccccacttctttccactccctaggcggtggcagggagggggagggtagccacagtcaccggttcgagctcagtaggtagtactcagctccaacccttgtcccttccgcctgccactgcaggtcaggaaccccgggggacaggacctttaggctctcataactcttgccctgcccccgaacctgtttcatatggccgactcaacgacccgccagcgactacccaccccggctctttcacacggttccactcaaagccgctccccgtacctgactccattctccagctgtcatcctgggccaattccaccggcaacttgactacggacggacggtcgctaggatccctgggacttgtagttctgcactgctaggggccaagtctgtgagggcagcaaaggcgcctccctgcccggaactgctctcaaactgcaactcccagaggcgccgcgcgacgggaaaagaaaagggaacgaggaaggccggtg，(SEQ ID NO：16)
F2的碱基序列为：
gggaacactaattctgagccccaattaagcaaaatattatcccctaaaaagaattctattcttctcattggtagtcttcctgtattacaaaaaaagtactcaattactattatattttgaatttcatcaataaaaatttgttgaaatttgttttctcttttgtcataaaagtaccaacaaaatattcttgattttgccttttggcctacaaagcctaaaatatttactatctggctctttacagaaagtttcccaactcctgttctacactataacaggataaacataaacatcatgagtctctttcttgaatgtattcttatcgttacctagttgtggcataatgtcctctggatatgccctataaaggatcagtcttgcattgcttctgctatggcactatttgggatttctataaaaagaaacactattagcttaatagttgtagcaaagccttgacaacatagttaatatcgtgatattaaaatgccaacaccacagcccggtatccttaagatgaccctcatcaagctgtgatgtcaccaggctatggactcaccgaggtctcttagatatcaggtggctcccacggcatcacaccctgcctttggcatcaccctggcacatcacctcagtacggtgccatatgctatcactgctgtggtagaaccctgtcctgatgccacaccgccgagatgtcagagtaattaacccccacttctttccactccctaggcggtggcagggagggggagggtagccacagtcaccggttcgagctcagtaggtagtactcagctccaacccttgtcccttccgcctgccactgcaggtcaggaaccccgggggacaggacctttaggctctcataactcttgccctgcccccgaacctgtttcatatggccgactcaacgacccgccagcgactacccaccccggctctttcacacggttccactcaaagccgctccccgtacctgactccattctccagctgtcatcctgggccaattccaccggcaacttgactacggacggacggtcgctaggatccctgggacttgtagttctgcactgctaggggccaagtctgtgagggcagcaaaggcgcctccctgcccggaactgctctcaaactgcaactcccagaggcgccgcgcgacgggaaaagaaaagggaacgaggaaggccggtg，(SEQ ID NO：17)
F3的碱基序列为：
Aacccccacttctttccactccctaggcggtggcagggagggggagggtagccacagtcaccggttcgagctcagtaggtagtactcagctccaacccttgtcccttccgcctgccactgcaggtcaggaaccccgggggacaggacctttaggctctcataactcttgccctgcccccgaacctgtttcatatggccgactcaacgacccgccagcgactacccaccccggctctttcacacggttccactcaaagccgctccccgtacctgactccattctccagctgtcatcctgggccaattccaccggcaacttgactacggacggacggtcgctaggatccctgggacttgtagttctgcactgctaggggccaagtctgtgagggcagcaaaggcgcctccctgcccggaactgctctcaaactgcaactcccagaggcgccgcgcgacgggaaaagaaaagggaacgaggaaggccggtg，(SEQ ID NO：18)
F4的碱基序列为：
Atcctgggccaattccaccggcaacttgactacggacggacggtcgctaggatccctgggacttgtagttctgcactgctaggggccaagtctgtgagggcagcaaaggcgcctccctgcccggaactgctctcaaactgcaactcccagaggcgccgcgcgacgggaaaagaaaagggaacgaggaaggccggtg，(SEQ ID NO：19)
实施例5利用双荧光素酶报告实验鉴定启动子的核心区
将构建好的携带不同长度片段的P28GANK启动子质粒(带有Luc荧光素酶报告基因)，与带有海肾荧光素基因Renilla的报告质粒按照1：100的比例共同转染正常肝细胞和肝癌细胞，转染48h后，用Dual-Luciferase双荧光素酶检测试剂盒检测P28GANK启动子的活性。此次实验中，海肾荧光素基因Renilla作为内参使用。结果如图6和图7所示。
图6的结果显示：
(1)PGL3-F4启动子片段(+1/-194)在肝癌细胞系HepG2、Hep3B、Huh-7、SMMC7721、97-H中启动效果都要比启动子GP73强。
(2)PGL3-F3启动子片段(+1/-486)在肝癌细胞系HepG2、Hep3B、Huh-7、SMMC7721、97-H中启动效果都要比启动子GP73强。
(3)PGL3-F2启动子片段(+1/-1195)在肝癌细胞系Hep3B、Huh-7、SMMC7721、97-H中启动效果都要比启动子GP73强，在肝癌细胞系HepG2中的启动效果与比启动子GP73的启动效果基本一致。
(4)PGL3-F1启动子片段(+1/-3824)在肝癌细胞系Hep3B、SMMC7721、97-H中启动效果都要比启动子GP73强，在肝癌细胞系Hep3B、Huh-7、HepG2中的启动效果与比启动子GP73的启动效果基本一致。
图7的结果显示：PGL3-F4启动子片段(+1/-194)在肝癌细胞系Huh-7、HepG2、Hep3B中的启动效果比在正常细胞QSG-7701中强。
实施例6对筛选出的P28GANK启动子的核心序列(p+1/-194)进行序列分析
利用双荧光素酶报告实验检测之后，综合比较选择+1/-194片段经行分析，将+1/-194启动子序列输入Consite网站进行序列分析，网站分析结果如图8所示。
结论：+1/-194片段序列含有SP1等许多转录因子的结合位点。
实施例7重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B和重组溶瘤腺病毒GP73-E1A-△E1B的构建方法如下：
步骤一：pShuttle-P28GANK-E1A-△E1B质粒和pShuttle-GP73-E1A-△E1B质粒的构建
1、pShuttle-P28GANK-E1A-△E1B质粒的构建
(1)以PGL3-F4质粒为模板，设计如下引物对：
F1-P28GANK：GGCCGCCTCGAGATCCTGGGCCAATTCCACC，(SEQ ID NO：8)
R1-P28GANK：
TAATAACACCTCCGTGGCAGATAATATGTCTCATTTTCAGTACGTATCGAGCACCGGCCTTCCTC，(SEQ ID NO：9)
进行PCR扩增，得到一段长度为259bp的片段(P28GANK启动子)，如图9所示。
(2)PCR反应体系，如表3所示。
表3 PGL3-F4质粒的PCR反应体系
2、pShuttle-GP73-E1A-△E1B质粒的构建
(1)以PGL3-GP73质粒为模板，设计如下引物对：
F1-GP73：GGCCGCCTCGAGTCATCTGAGGCGCTGTTTCAAATG，(SEQ ID NO：10)
R1-GP73：GGTAATAACACCTCCGTGGCAGATAATATGTCTCATTTTCAGTACGTACCGGCCTCCGCAGCGGCAA，(SEQ ID NO：11)
进行PCR扩增，得到一段长度为719bp的片段(GP73启动子)，如图10所示。
(2)PCR反应体系，如表4所示。
表4 PGL3-GP73质粒的PCR反应体系
步骤二、pZXC2的E1A部分的PCR产物的构建
1、P-E1A基因片段的构建
(1)以pZXC2质粒为模板，设计引物对如下：
F2-P28GANK：GACGGGAAAAGAAAAGGGAACGAGGAAGGCCGGTGCTCGATACGTACTGAAAATGAGACATA，(SEQ ID NO：12)
R2-P28GANK：ACGCTAGTCTAGACACAGGTGATGTCG，(SEQ ID NO：13)
进行PCR扩增，得到一段长度为844bp的片段(P-E1A基因)，如图11所示。
(2)PCR反应体系，如表5所示。
表5 pZXC2质粒的PCR反应体系
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2、G-E1A基因片段的构建
(1)以pZXC2质粒为模板，设计引物对如下：
F2-GP73：GCTGCTCGGGGGCGGGGCCTTGCCGCTGCGGAGGCCGGTACGTACTGAAAATGAGACA,(SEQ ID NO：14)
R2-GP73：ACGCTAGTCTAGACACAGGTGATGTCG，(SEQ ID NO：15)
进行PCR扩增，得到一段长度842bp的片段(G-E1A基因)，如图12所示。
(2)PCR反应体系，如表6所示。
表6 pZXC2质粒的PCR反应体系
/>
步骤三、Overlap PCR拼接启动子和E1A部分片段
1、Overlap PCR拼接P28GANK启动子片段和P-E1A基因片段
(1)以步骤一的P28GANK启动子片段和步骤二的P-E1A基因片段为模板，使用如下引物对：
F1-P28GANK：GGCCGCCTCGAGATCCTGGGCCAATTCCACC，(SEQ ID NO：8)
R2-P28GANK：ACGCTAGTCTAGACACAGGTGATGTCG，(SEQ ID NO：13)
进行Overlap PCR，得到一段从酶切位点Xhol到Xbal，长度为1010bp的片段(P28GANK-E1A)。
(2)PCR反应体系，如表7所示。
表7 P28GANK启动子片段和P-E1A基因片段的PCR反应体系
2、Overlap PCR拼接GP73启动子片段和G-E1A基因片段
(2)以步骤一的GP73启动子片段和步骤二的G-E1A基因片段为模板，设计如下引物对：
F1-GP73：GGCCGCCTCGAGTCATCTGAGGCGCTGTTTCAAATG，(SEQ ID NO：10)
R2-GP73：ACGCTAGTCTAGACACAGGTGATGTCG，(SEQ ID NO：15)
进行Overlap PCR，得到一段从酶切位点Xhol到Xbal，长度为1468bp的片段(GP73-E1A)。
(2)PCR反应体系，如表8所示。
表8 GP73启动子片段和G-E1A基因片段的PCR反应体系
步骤四、pShuttle-P28GANK-E1A-△E1B和pShuttle-GP73-E1A-△E1B重组质粒的构建
将Overlap PCR得到的P28GANK-E1A片段和GP73-E1A片段用XhoI和XbaI双酶切，与同样用XhoI和XbaI双酶切的pShuttle-pSur-E1A-△E1B相连，得到pShuttle-P28GANK-E1A-△E1B和pShuttle-GP73-E1A-△E1B重组质粒。
步骤五、重组腺病毒质粒的构建
将构建好的pShuttle-P28GANK-E1A-△E1B和pShuttle-GP73-E1A-△E1B重组质粒用PmeI线性化，使用去磷酸酶去磷(37℃反应5min，然后75℃5min使酶失活)，转化到带有腺病毒骨架质粒pAdeasy-E3的大肠杆菌BJ5183感受态中，使二者发生同源重组。涂板，挑取单克隆摇菌，抽提质粒用限制性内切酶MluI酶切鉴定，如图13所示。
结果显示：酶切结果为5条带，大致为1k，1.8k，4k，5.8k，20k。然后将鉴定正确的质粒转化到DH5α，因为BJ5183中的质粒是不稳定的。抽取DH5α中的质粒用MluI酶切鉴定，得到稳定的阳性重组腺病毒质粒。
步骤六、重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B(P28GANK-△E1B)和重组溶瘤腺病毒GP73-E1A-△E1B(GP73-△E1B)的构建及包装鉴定
将步骤五中酶切鉴定正确的阳性重组克隆的腺病毒质粒用PacI线性化，切去原核表达元件，转染状态良好的人胚胎肾细胞HEK-293细胞，转染后大约7-10天左右，显微镜下观察细胞有无出现病变，如有空斑产生，则收取细胞及培液，-80℃冰箱反复冻融3次，再重新加到293细胞中，待细胞病变后取培养液，用血液基因组抽提试剂盒抽取腺病毒的基因组，进行启动子鉴定、野毒鉴定、重组溶瘤腺病毒E1A鉴定。启动子鉴定结果、野毒鉴定结果、重组溶瘤腺病毒E1A鉴定结果分别如图14-17所示。
启动子鉴定结果表明：病毒包装成功，启动子已成功包入重组腺病毒。
野毒鉴定结果表明：重组腺病毒未有野毒污染。
重组溶瘤腺病毒E1A鉴定结果表明：病毒包装成功，病毒的E1A基因存在。
结论：获得了重组溶瘤腺病毒P28GANK-△E1B和重组溶瘤腺病毒GP73-△E1B。
步骤七、Western blot鉴定E1A蛋白的表达
为了鉴定病毒的E1A基因是否正常表达，将肝正常细胞QSG-7701，肝癌细胞Huh-7以250000cell/孔的密度铺于6孔板中，12h后，分别向细胞中加入10MOI的重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B和重组溶瘤腺病毒GP73-E1A-△E1B，48小时后，收集细胞蛋白样品进行Western blotting，以β-tubulin为内参。结果如图18所示。
结果显示：重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B和重组溶瘤腺病毒GP73-E1A-△E1B的E1A基因均正常表达，进一步证明病毒包装成功。
实施例8CCK8法检测重组溶瘤腺病毒对肝癌细胞的杀伤力与安全性评价
为了比较重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B和重组溶瘤腺病毒GP73-E1A-△E1B对肝癌细胞的杀伤力，以及对正常细胞的安全性，将肝正常细胞QSG-7701、肝癌细胞HepG2、肝癌细胞Hep3B和肝癌细胞Huh-7以5000cell/孔的密度铺于96孔板中，12h后，分别向细胞中加入10MOI的重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B和重组溶瘤腺病毒GP73-E1A-△E1B，24h后，用CCK8法检测这两种重组溶瘤腺病毒对肝癌细胞的杀伤能力。如图19所示。
实验结果显示，P28GANK和GP73启动子控制的溶瘤腺病毒对肝正常细胞QSG-7701的毒性都比较小，而对于肝癌细胞HepG2、Hep3B和Huh-7都具有很强的杀伤力，且重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B能更强的杀伤肝癌细胞。
实施例9结晶紫染色法检测重组溶瘤腺病毒对肝癌细胞的杀伤力与安全性评价
为了比较重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B和重组溶瘤腺病毒GP73-E1A-△E1B对肝癌细胞的杀伤力，以及对正常细胞的安全性，将肝正常细胞QSG-7701、人正常的肺上皮细胞Beas-2B、肝癌细胞Hep3B和肝癌细胞Huh-7以60000cell/孔的密度铺于24孔板中，12h后，分别向细胞中加入0、0.1、1、2、5、10MOI的OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B重组病毒和GP73-E1A-△E1B重组病毒，96h后，用结晶紫染色检测这两种重组溶瘤腺病毒对肝癌细胞的杀伤能力。结果如图20所示。
结晶紫的实验结果图显示，P28GANK和GP73启动子控制的溶瘤腺病毒对肝正常细胞QSG-7701和对人正常的肺上皮细胞Beas-2B的毒性都比较小，同时对肝癌细胞Hep3B和Huh-7都具有很强的杀伤力，且重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B能更强的杀伤肝癌细胞。
综上所述，重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B对肝癌细胞的杀伤能力明显优于重组溶瘤腺病毒GP73-E1A-△E1B的杀伤能力。

Claims (4)

1.一种重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B，其特征在于，所述重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B如SEQ ID NO：19所示的P28GANK启动子替换了腺病毒内源的E1A启动子，构建了肝癌特异性启动子P28GANK调控E1A区，同时，腺病毒基因组敲除了E1B基因区域；
所述的重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B通过以下步骤构建得到：
步骤一、以PGL3-F4质粒为模板，采用如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的特异性引物，进行PCR扩增，得到一段从酶切位点Xhol到SnabI的核酸片段，即P28GANK启动子片段；其中，PGL3-F4质粒中F4的序列如SEQ ID NO：19所示；
步骤二、以pZXC2质粒为模板，采用如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的特异性引物，进行PCR扩增，得到一段从酶切位点SnabI到Xbal的核酸片段，即P-E1A基因片段；
步骤三、以步骤一的P28GANK启动子片段和步骤二的P-E1A基因片段为模板，采用如SEQID NO：8和SEQ ID NO：13所示的特异性引物，进行Overlap PCR，得到一段从酶切位点Xhol到Xbal的核酸片段，即P28GANK-E1A片段；
步骤四、将Overlap PCR得到的P28GANK-E1A片段用XhoI和XbaI双酶切，然后与同样用XhoI和XbaI双酶切的pShuttle-pSur-E1A-△E1B质粒相连接，得到pShuttle-P28GANK-E1A-△E1B；
步骤五、将构建好的pShuttle-P28GANK-E1A-△E1B重组质粒用限制性内切酶PmeI线性化，去磷后转化到带有腺病毒骨架质粒pAdEasy-E3的BJ5183感受态中，使二者发生同源重组，筛选并获得阳性重组克隆的腺病毒质粒；
步骤六、将阳性重组克隆的腺病毒质粒用限制性内切酶PacI线性化，转染入人胚胎肾细胞株HEK-293，获得重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B。
2.一种如权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B在制备治疗肝癌药物中的应用。
3.一种治疗肝癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B。
4.一种肝癌特异性P28GANK启动子，其特征在于，所述肝癌特异性P28GANK启动子为如SEQ ID NO：19所示的序列。
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