KR20180107105A - 항-tcr-복합체 항체 또는 단편을 암호화하는 군 b 아데노바이러스 - Google Patents

항-tcr-복합체 항체 또는 단편을 암호화하는 군 b 아데노바이러스 Download PDF

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앨리스 클레어 노엘 브롬리
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싸이오서스 테라퓨틱스 엘티디.
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Abstract

본 개시내용은 Ad11 및 에나데노터시레브로 이루어진 군으로부터 선택된 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스로서, 상기 바이러스는 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위한 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하고, 상기 항체 또는 결합 단편은 T-세포 수용체 복합체(TCR)의 CD3 단백질에 특이적이되, 상기 바이러스는 B7 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하지 않는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스, 이를 포함하는 약제학적 조성물, 및 치료, 특히 암의 치료에 사용하기 위한 이들 중 임의의 것의 용도에 관한 것이다.

Description

항-TCR-복합체 항체 또는 단편을 암호화하는 군 B 아데노바이러스
본 개시내용은 특히 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위한, T-세포 수용체 복합체(TCR) 내의 CD3에 특이적인 적어도 효능성 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 EnAd 또는 Ad11로부터 유래된 암살상 바이러스(oncolytic virus), 이를 포함하는 조성물 및 암의 치료를 위한 상기 바이러스 및 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 출원은 영국 특허 제GB1522334.0호, 제GB1607463.5호, 제GB1617207.4호 및 제GB1617206.6호로부터의 우선권을 주장하며, 이들 각각은 이들의 전문이 본 출원에 포함된다.
암은 환자 및 그들의 사랑하는 사람의 고난과 고통, 그리고 또한 환자의 치료, 치유 및 지원의 높은 재정적 비용면에서 사회에 여전히 큰 사회적 부담이다. 현재 건강한 개인의 면역계는 암성 세포를 일상적으로 제거한다고 생각된다. 그러나, 암을 갖는 환자에서, 이러한 제거에 관여되는 방어 기전 중 하나 이상은 하향 조절되거나 완전히 차단된다.
현재 종양은 이의 미세환경을 변화시켜 그것을 이의 성장에 대해서 허용성으로 만든다고 공지되어 있다. 이것은 예를 들어, 종양 혈관신생을 촉진시키고/거나 국지적인 면역 억제 또는 면역 관용을 유도하는 종양 방출 세포외 신호에 의해서 일어난다.
T-세포 상의 T-세포 수용체 복합체(TCR)는 항원이 세포 표면 상의 주조직 적합성(MHC) 분자 상에 제시된 펩타이드 형태로 존재하는 경우 특정 항원을 특이적으로 인식한다. T-세포 수용체 복합체(TCR)는 알파 쇄와 베타 쇄 또는 감마 쇄와 델타 쇄의 항원-결합 이종이량체를 면역글로불린 패밀리 단백질 CD3 엡실론 쇄, 델타 쇄, 감마 쇄 및 제타 쇄와 함께 포함한다. 표면 CD3 엡실론 쇄, 델타 쇄 및 감마 쇄는 TCR 복합체의 조립 및 안정한 표면 발현에 중요한 역할을 한다. 제타 쇄 동종이량체는 거의 완전히 세포내에 존재하고, TCR 복합체가 세포 표면 상의 항원-MHC 복합체에 의해서 또는 TCR 복합체, 예컨대 항-CD3 항체(이의 결합 단편 포함)에 대한 약리학적 양상, 예를 들어 항체에 의해서 가교-결합될 때 복합체의 주요 신호전달 분자로서 기능한다.
종양 내의 미세환경이 항-종양 면역 반응의 발달 및 활성도를 억제할 수 있고, 광범위한 기전이 잠재적으로 역할을 할 것이라는 것이 다수의 상이한 전임상 및 임상 연구로부터 명백하다. 특히 면역억제 기전은 T-세포 반응이 종양 세포의 사멸을 매개하는 것을 궁극적으로 예방한다. 억제 기전은 T-세포가 종양 조직에 도입되는 것을 배제하여 종양에 도입되지 않은 T-세포의 활성화 또는 활성도를 저해하는 것 및 종양 세포 단백질을 인식하거나 이것에 반응하는 T-세포의 능력을 감소시키는 종양 세포 단백질을 조절하는 것을 포함할 수 있다. 종양 진행을 지지하는 데 있어서의 이러한 면역억제 경로의 중요성은 이러한 두 억제 경로에서의 수용체에 대한 항체, CTLA4 및 PD-1/PDL1에 의해서 나타난 임상 효능에 의해서 특히 주목되어 왔고, 이는 흑색종 및 다른 암의 치료에 대한 이의 시판 승인으로 이어졌다.
시험관내에서 자극된 T 세포의 입양 전달이, 예를 들어 암, 예컨대 비인두암의 치료를 위한 활성화된 세포용해 T 세포를 제공하는 것으로 제안되어 왔지만, 이것은 어렵고, 고비용이고, 불편한 요법일 수 있다. 추가로, 때때로, 이러한 요법은 특정 환자 하위집단에서만 효과적이다.
일부 임상 시험은 암 항원 및 아주반트, 예컨대 모노포스포릴 A 및 CpG를 함유하는 백신 형태의 암 항원, 예를 들어 MAGE로 수행되어 왔다. 그러나, 이러한 접근법은 예상된 높은 임상 성공을 전달하는 데 실패하였다. 따라서, 암의 치료를 위해서 암 세포에 초점을 맞춘 T 세포의 진정한 생체내 자극 또는 활성화는 실질적으로 현실성이 없고, 현재 시점에 존재하지 않는다.
본 발명자들은 적어도 효능성 항-TCR 항체 또는 결합 단편을 이의 표면 상에서 발현시키도록 제조된 암 세포가 이의 표면 상에서 단백질을 발현시키지 않는 비변형된 암 세포보다 면역계에 의해서 더 효과적으로 다루어진다는 것을 나타내는 데이터를 생성하였다.
이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 본 발명자들은 암 세포를 적어도 효능성 항-TCR 항체를 발현시키도록 만드는 것이 암과 싸우는 환자의 면역계에 초점을 맞추고, 이를 시작하는 방식이며, 예를 들어, 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편은 T 세포와 관계되고/거나 이를 활성화시킬 수 있다고 여긴다. 환자-특이적 신생항원을 비롯한, 암-특이적 항원을 생리학적으로 인식할 T-세포의 이러한 활성화는 또한 효능성 항-TCR 항체 또는 이의 단편을 발현시키지 않는 동일한 종양 부위 또는 다른 종양 부위(예를 들어, 전이)의 영역으로 이동할 수 있는 효과기 또는 기억 T-세포의 생성으로 이어질 수 있다. 따라서 이러한 요법은 활성화된 T 세포의 형태의 연장된 면역 반응을 암 세포에 생성하여 이의 생리학적 암-특이적 항원을 발현시켜서 환자에서 전신적으로 암과 싸울 가능성을 갖는다.
명백하게는 신체 자신의 면역 반응과 관계되어 암과 싸우는 암 치료는 상당히 이로울 것이다. 추가로, 이러한 요법은 암 세포에 상당히 초점을 맞추고 있고, 따라서 오프-타킷 효과 및 독성이 전통적인 요법, 예컨대 화학요법보다 훨씬 낮을 가능성이 있다.
암 세포는 암 세포를 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하는 복제 적격 암살상 바이러스 또는 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터로 감염시킴으로써 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편을 발현시키도록 제조될 수 있다.
본 개시내용은 하기를 제공한다:
1. Ad11 및 에나데노터시레브(enadenotucirev)로 이루어진 군으로부터 선택된 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스로서, 상기 바이러스는 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위한 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하고, 상기 항체 또는 결합 단편은 T-세포 수용체 복합체(TCR)의 CD3 단백질에 특이적이고, 상기 바이러스는 B7 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하지 않는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스.
2. 단락 1에 있어서, 상기 바이러스는 Ad11인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스.
3. 단락 1 또는 단락 2에 있어서, 상기 바이러스는 복제 적격성인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 암살상 바이러스.
4. 단락 1 또는 단락 2에 있어서, 상기 바이러스는 복제 결핍성인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 암살상 바이러스.
5. 단락 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 항체는 막관통 도메인 또는 GPI 앵커(anchor)를 더 포함하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
6. 단락 5에 있어서, 상기 막관통 도메인은 서열번호 10 내지 14에 제시된 서열로부터 선택되는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나에 있어서, 상기 암살상 아데노바이러스는 EnAd인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
8. 단락 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 결합 단편은 전장 항체, Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체, scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, 비스-scFv, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 휴마바디, 이들 중 임의의 것의 다이설파이드 안정화된 형태 및 이들의 에피토프-결합 단편을 포함하는 군으로부터 선택된, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
9. 단락 1 내지 8에 있어서, 상기 항체 결합 단편은 단일 쇄 Fv인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
10. 단락 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 암살상 바이러스는 적어도 1종의 추가 이식유전자를 암호화하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
11. 단락 10에 있어서, 상기 암살상 바이러스는 적어도 2종의 추가 이식유전자를 암호화하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
12. 단락 10 또는 11에 있어서, 상기 추가 이식유전자(들)는 사이토카인, 케모카인, 길항성 항체 분자 또는 이의 결합 단편, 효능성 항체 분자 또는 이의 결합 단편 면역조절제 및 이들의 조합물을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택된 단백질을 암호화하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
13. 단락 12에 있어서, 적어도 1종의 추가 이식유전자는 항체 분자 또는 이의 결합 단편(예를 들어, 이것은 표면 발현 형태 및/또는 분비 형태로 존재할 수 있음)을 암호화하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
14. 단락 13에 있어서, 상기 항체 분자 또는 결합 단편은 저해제인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
15. 단락 14에 있어서, 상기 제해제는 혈관신생 인자의 저해제 또는 T 세포 불활성화 인자의 저해제인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
16. 단락 13 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 항체 분자 또는 결합 단편은 효능제인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
17. 단락 16에 있어서, 상기 효능제는 CD40, CD40 리간드(CD154라고도 공지됨), GITR, OX40, CD27, 4-1BB 및 이들의 조합물, 예컨대 CD40, GITR, OX40, CD27 및 4-1BB에 대한 항체를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
18. 단락 17에 있어서, 상기 항체 분자 또는 이의 결합 단편은 CD40L에 특이적인 결합 도메인을 포함하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
19. 단락 17 또는 18에 있어서, 상기 항체 분자 또는 이의 결합 단편은 CD40에 특이적인 결합 도메인을 포함하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
20. 단락 17 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 분자 또는 이의 결합 단편은 GITR에 특이적인 결합 도메인을 포함하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
21. 단락 17 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 분자 또는 이의 결합 단편은 OX40에 특이적인 결합 도메인을 포함하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
22. 단락 17 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 분자 또는 이의 결합 단편은 CD27에 특이적인 결합 도메인을 포함하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
23. 단락 17 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 분자 또는 이의 결합 단편은 4-1BB에 특이적인 결합 도메인을 포함하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
24. 단락 12 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역조절제는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, B7-H3, B7-H4, HVEM, ILT-2, ILT-3, ILT-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, LIGHT 또는 CD160, 예를 들어 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, CD16, CD25, CD33, CD332, CD127, CD31, CD43, CD44, CD162, CD301a, CD301b 및 갈렉틴(Galectin)-3, FLT-3, FLT-3 리간드, TLR, TLR 리간드, CCR7, CD1a, CD1c, CD11b, CD11c, CD80, CD83, CD86, CD123, CD172a, CD205, CD207, CD209, CD273, CD281, CD283, CD286, CD289, CD287, CXCR4, GITR 리간드, IFN-α2, IL-12, IL-23, ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT7, TSLP 수용체, CD141, CD303, CADM1, CLEC9a, XCR1 및 CD304, OX40, OX40 리간드, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40 리간드, CD70, CD137, GITR, 4-1BB, ICOS 및 ICOS 리간드 및 이들의 조합물을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택된 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
25. 단락 24에 있어서, 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CTLA-4이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
26. 단락 24 또는 25에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 PD-1이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
27. 단락 24 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 PD-L1이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
28. 단락 24 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 PD-L2이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
29. 단락 24 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 VISTA이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
30. 단락 24 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 B7-H3이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
31. 단락 24 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 B7-H4이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
32. 단락 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 HVEM이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
33. 단락 24 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 ILT-2이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
34. 단락 24 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 ILT-3이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
35. 단락 24 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 ILT-4이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
36. 단락 24 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 TIM-3이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
37. 단락 24 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 LAG-3이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
38. 단락 24 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 BTLA이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
39. 단락 24 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 LIGHT이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
40. 단락 24 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD160이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
41. 단락 24 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD16이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
42. 단락 24 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD25이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
43. 단락 24 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD33이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
44. 단락 24 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD332이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
45. 단락 24 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD127이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
46. 단락 24 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD31이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
47. 단락 24 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD43이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
48. 단락 24 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD44이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
49. 단락 24 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD162이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
50. 단락 24 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD301a이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
51. 단락 24 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD301b이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
52. 단락 24 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 갈렉틴-3이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
53. 단락 24 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 FLT-3이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
54. 단락 24 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 FLT-3 리간드인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
55. 단락 24 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 TLR인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
56. 단락 24 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 TLR-리간드인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
57. 단락 24 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CCR7이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
58. 단락 24 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD1a이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
59. 단락 24 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD1c이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
60. 단락 24 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD11b이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
61. 단락 24 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD11c이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
62. 단락 24 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD80인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
63. 단락 24 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD83이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
64. 단락 24 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD86인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
65. 단락 24 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD123이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
66. 단락 24 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD172a이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
67. 단락 24 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD205이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
68. 단락 24 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD207이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
69. 단락 24 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD209이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
70. 단락 24 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD273이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
71. 단락 24 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD281이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
72. 단락 24 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD283이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
73. 단락 24 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD286이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
74. 단락 24 내지 73 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD289이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
75. 단락 24 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD287이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
76. 단락 24 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CXCR4이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
77. 단락 24 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 GITR 리간드이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
78. 단락 24 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 IFN-α2에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
79. 단락 24 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 IL-12인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
80. 단락 24 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 IL-23인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
81. 단락 24 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 ILT1에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
82. 단락 24 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 ILT5에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
83. 단락 24 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 ILT7에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
84. 단락 24 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 TSLP에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
85. 단락 24 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD141이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
86. 단락 24 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD303이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
87. 단락 24 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CADM1이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
88. 단락 24 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CLEC9a이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
89. 단락 24 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 XCR1이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
90. 단락 24 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD304이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
91. 단락 24 내지 90 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 OX40이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
92. 단락 24 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 OX40 리간드이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
93. 단락 24 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD27이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
94. 단락 24 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD28이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
95. 단락 24 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD30이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
96. 단락 24 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD40이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
97. 단락 24 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD40 리간드이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
98. 단락 24 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD70이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
99. 단락 24 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 CD137이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
100. 단락 24 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 GITR이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
101. 단락 24 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 4-1BB이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
102. 단락 24 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 ICOS이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
103. 단락 24 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드는 ICOS 리간드이거나 또는 이것에 결합하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
104. 제10항 내지 제103항 중 어느 하나에 있어서, 적어도 1종의 추가 이식유전자는 사이토카인(분비 또는 세포막 연관 분자를 포함함)을 암호화하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
105. 제11항 내지 제104항 중 어느 하나에 있어서, 제2 추가 이식유전자는 사이토카인(분비 또는 세포막 연관 분자를 포함함)을 암호화하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
106. 제104항 또는 제105항에 있어서, 상기 암호화된 사이토카인은 TNF 알파 슈퍼 패밀리(TNFSF는 TNF-알파, TNF-C, OX40L, CD154, FasL, LIGHT, TL1A, CD70, Siva, CD153, 4-1BB 리간드, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR 리간드, EDA-A, EDA-A2를 포함함), TGF-베타 슈퍼패밀리, IL-1 패밀리(즉, IL-1 및 IL-18), IL-2 패밀리, IL-10 패밀리, IL-17 패밀리, 인터페론 패밀리로부터 독립적으로 선택되는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
107. 단락 106에 있어서, 상기 사이토카인은 TNF-알파인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
108. 단락 106 또는 107에 있어서, 상기 사이토카인은 TNF-C인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
109. 단락 106 내지 108 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 OX40L인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스
110. 단락 106 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 CD154인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
111. 단락 106 내지 110 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 FasL인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
112. 단락 106 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 LIGHT인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
113. 단락 106 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 TL1A인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
114. 단락 106 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 CD70인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
115. 단락 106 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 Siva인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
116. 단락 106 내지 115 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 CD153인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
117. 단락 106 내지 116 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 4-1BB인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
118. 단락 106 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 TRAIL인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
119. 단락 106 내지 118 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 RANKL인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
120. 단락 106 내지 119 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 TWEAK인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
121. 단락 106 내지 120 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 APRIL인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
122. 단락 106 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 BAFF인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
123. 단락 106 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 CAMLG인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
124. 단락 106 내지 123 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 NGF인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
125. 단락 106 내지 124 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 BDNF인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
126. 단락 106 내지 125 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 NT-3인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
127. 단락 106 내지 126 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 GITR인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
128. 단락 106 내지 127 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 EDA-A인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
129. 단락 106 내지 128 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 EDA-A2인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
130. 단락 106 내지 129 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 TGF-베타 슈퍼패밀리로부터 유래된, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
131. 단락 106 내지 130 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-1인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
132. 단락 106 내지 131 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-8인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
133. 단락 106 내지 132 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
134. 단락 106 내지 133 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-10인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
135. 단락 106 내지 134 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-17인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
136. 단락 106 내지 135 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 인터페론 패밀리로부터 유래된, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
137. 제106항에 있어서, 상기 암호화된 사이토카인은 TNF-알파, IL-1, IL-8, IL-10, IL-17, 인터페론, LIGHT, TL1A, Siva, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, NGF, BDNF, NT-3 및 EDA-A2로부터 독립적으로 선택되는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
138. 제106항 또는 제137항에 있어서, 상기 암호화된 사이토카인은 TNF-C, OX401, CD154, FasL, CD70, CD153, 4-1BB 리간드 및 EDA-A로부터 독립적으로 선택되는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
139. 제106항, 제137항 또는 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, Flt3 리간드, GM-CSF, IL-15 및 IL-12를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
140. 단락 139에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
141. 단락 139 또는 140에 있어서, 상기 사이토카인은 IFN-알파인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
142. 단락 139 내지 141 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 IFN-베타인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
143. 단락 139 내지 142 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 IFN-감마인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
144. 단락 139 내지 143 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 Flt3 리간드인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
145. 단락 139 내지 144 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 GM-CSF인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
146. 단락 139 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-15인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
147. 단락 139 내지 146 중 어느 하나에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-12인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
148. 단락 10 내지 147 중 어느 하나에 있어서, 적어도 1종의 추가 이식유전자는 케모카인을 암호화하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
149. 제148항에 있어서, 상기 케모카인은 MIP-1 알파, RANTES, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19 및 CCL21을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
150. 제149항에 있어서, 상기 암호화된 케모카인은 MIP-1 알파인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
151. 단락 149 또는 150에 있어서, 상기 암호화된 사이토카인은 RANTES인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
152. 단락 149 내지 151 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 케모카인은 IL-8인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
153. 단락 149 내지 152 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 케모카인은 CCL5인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
154. 단락 149 내지 153 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 케모카인은 CCL17인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
155. 단락 149 내지 154 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 케모카인은 CCL20인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
156. 단락 149 내지 155 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 케모카인은 CCL22인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
157. 단락 149 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 케모카인은 CXCL9인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
158. 단락 149 내지 157 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 케모카인은 CXCL10인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
159. 단락 149 내지 158 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 케모카인은 CXCL11인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
160. 단락 149 내지 159 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 케모카인은 CXCL12인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
161. 단락 149 내지 160 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 케모카인은 CXCL13인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
162. 단락 149 내지 161 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 케모카인은 CCL2인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
163. 단락 149 내지 162 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 케모카인은 CCL19인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
164. 단락 149 내지 163 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 케모카인은 CCL21인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
165. 제149항 또는 제150항에 있어서, 상기 바이러스는 i) MIP-1α와 Flt3, 및 ii) MIP-1α와 IFNα로부터 선택된 사이토카인과 케모카인 조합물을 암호화하는 이식유전자를 포함하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
166. 제1항 내지 제166항 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-CD3 항체 또는 결합 단편은 뮤로모납-CD3(OKT3), 오텔릭시주맙, 테플리주맙 또는 비실리주맙으로부터의 VH 영역 및 VL 영역을 포함하는 적어도 결합 도메인을 갖는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
167. (예를 들어, 암성 세포에 초점을 맞추기 위해서, T 세포, 예를 들어, 암 세포 환경 내의 T 세포를 생체내 자극함으로써) 암 환자를 치료하는 방법으로서,
치료적 유효량의 Ad11 및 에나데노터시레브로 이루어진 군으로부터 선택된 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스를 투여하는 단계로서, 상기 바이러스는 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위한 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하고, 상기 항체 또는 결합 단편은 T-세포 수용 복합체(TCR)의 CD3 단백질에 특이적이되, 상기 바이러스는 B7 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하지 않는, 상기 투여하는 단계를 포함하되,
상기 바이러스 또는 바이러스 벡터는 상기 암성 세포를 선택적으로 감염시키고, 상기 세포의 상기 표면 상에서 제1항 내지 제266항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같이, 상기 암호화된 항-CD3 항체 또는 결합 단편을 발현시키는, 암 환자를 치료하는 방법.
168. Ad11 및 에나데노터시레브로 이루어진 군으로부터 선택된 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스로서, 상기 바이러스는 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위한 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하고, 상기 항체 또는 결합 단편은 T-세포 수용 복합체(TCR)의 CD3 단백질에 특이적이되, 상기 바이러스는 B7 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하지 않는, 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제166항 중 어느 하나에 정의된 바와 같은, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스.
169. 제168항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스.
170. 제169항에 있어서, 상기 치료는 암성 세포에 초점을 맞추기 위해서, T 세포, 예를 들어, 암 세포 환경 내의 T 세포를 생체내 자극함으로써 수행되는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스.
171. Ad11 및 에나데노터시레브로 이루어진 군으로부터 선택된 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스로서, 상기 바이러스는 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위한 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하고, 상기 항체 또는 결합 단편은 T-세포 수용 복합체(TCR)의 CD3 단백질에 특이적이되, 상기 바이러스는 B7 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하지 않는, 의약의 제조에 사용하기 위한, 제1항 내지 제116항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스.
일 실시형태에서 본 개시내용의 바이러스에 의해서 암호화된 1종 이상의 이식유전자는 내인성 프로모터, 특히 주요 후기 프로모터(major late promoter)의 제어 하에 있다.
일 실시형태에서 본 개시내용의 바이러스에 의해서 암호화된 1종 이상의 이식유전자는 외인성 프로모터, 예컨대 CMV 프로모터의 제어 하에 있다.
일 실시형태에서 바이러스(완전 바이러스 서열의 부분으로서 개시된 것을 비롯한, 본 명세서에 개시된 이식유전자 카세트를 포함하는 복제 결핍 또는 복제 적격 바이러스)가 제공된다.
일 실시형태에서 암 세포 상에서의 표면 발현을 위한 본 개시내용의 바이러스에 의해서 암호화된 단백질 또는 펩타이드는 면역원성 단백질, 예를 들어 비-인간 단백질이다.
일 양상에서 본 개시내용은 상기 암성 세포의 표면 상에서의 발현을 위해서, 치료적 유효량의 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편(예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편)을 암호화하는 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스를 투여함으로써 생체내에서 T 세포를 자극하여 암성 세포에 초점을 맞춤으로써 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
따라서 하기 단계에 의해서 암성 세포에 초점을 맞추기 위해서, T 세포, 예를 들어, 암 세포 환경 내의 T 세포를 생체내 자극함으로써 암 환자를 치료하는 방법이 제공된다:
치료적 유효량의 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편(예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편)을 암호화하는 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 암살상 복제 적격 바이러스를 투여하는 단계로서, 상기 바이러스 또는 바이러스 벡터는 상기 암성 세포를 선택적으로 감염시키고, 세포의 표면 상에서 상기 암호화된 항-TCR 항체 또는 결합 단편을 발현시키는, 상기 투여하는 단계.
또한 상기 암성 세포에 초점을 맞추기 위해서, T-세포, 특히 암 세포 환경 내의 T 세포의 생체내 자극에 의해서 암 환자를 치료하는 데 사용하기 위한, 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편(예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편)을 암호화하는 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스가 제공된다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 바이러스 또는 바이러스 벡터는 상기 암성 세포를 선택적으로 감염시키고, 세포의 표면 상에서 상기 암호화된 항-TCR 항체 또는 결합 단편(예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편)을 발현시킨다.
일 실시형태에서 상기 암성 세포에 초점을 맞추기 위해서, T-세포, 특히 암 세포 환경 내의 T 세포의 생체내 자극에 의해서 암을 치료하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편(예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편)을 암호화하는, 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하는 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스가 제공된다.
제2 독립적인 실시형태에서 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위해서, 치료적 유효량의 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편(예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편)을 암호화하는 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 암살상 복제 적격 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는, 암 환자를 치료하는 방법이 제공되되, 예를 들어 단 바이러스가 복제 적격 암살상 아데노바이러스이면, 그 내의 이식유전자 또는 이식유전자들은 외인성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나 바이러스는 B7 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하지 않는다.
따라서 암의 치료에 사용하기 위한, 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위해서, 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편(예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편)을 암호화하는 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 암살상 복제 적격 바이러스가 제공되되, 예를 들어 단 바이러스가 복제 적격 암살상 아데노바이러스이면, 그 내의 이식유전자 또는 이식유전자들은 외인성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나 바이러스는 B7 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하지 않는다. 일 실시형태에서, 암의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위한, 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편(예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편)을 암호화하는 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 암살상 복제 적격 바이러스가 제공되되, 예를 들어 단 바이러스가 복제 적격 암살상 아데노바이러스이면, 그 내의 이식유전자 또는 이식유전자들은 외인성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나 바이러스는 B7 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하지 않는다.
독립적인 양상에서, 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위해서 항 TCR 항체 또는 이의 결합 단편(예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편)을 암호화하는 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스가 제공된다.
따라서 제3 양상에서 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위해서, 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편(예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편)을 암호화하는 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스가 제공되되, 예를 들어 단 바이러스가 복제 적격 암살상 아데노바이러스이면, 그 내의 이식유전자 또는 이식유전자들은 외인성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나 바이러스는 B7 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하지 않는다.
본 개시내용의 일 실시형태에서 바이러스는 복제 적격성이다. 일 실시형태에서 본 개시내용은 복제 적격 암살상 아데노바이러스가 아니다.
본 개시내용의 일 실시형태에서 복제 결핍성인, 바이러스 벡터는 예를 들어 바이러스 복제에 필수적인 유전자 중 일부 또는 전부, 예컨대 아데노바이러스에서 E1 영역이 결실되어 있다.
본 개시내용의 일 실시형태에서 바이러스 또는 바이러스 벡터는 약독화(attenuated)된다.
본 개시내용의 일 실시형태에서 암살상 바이러스 또는 바이러스 벡터는 아데노바이러스(예컨대 Ad5, Ad3, Ad11, Ad11/Ad3 및 Ad5/3), 단순 허피스 바이러스(예컨대 HSV-1), 레오바이러스, 백시나(vaccina) 바이러스, 세네카 밸리(Seneca valley) 바이러스, 콕사키 바이러스, 마라바 바이러스, 홍역 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 및 뉴캐슬병 바이러스(이식유전자를 포함하는 이들의 돌연변이된 버전, 변이체 또는 유도체 포함)로부터 선택된다.
일 실시형태에서 바이러스 또는 바이러스 벡터는 온코린(H101), 탈리모젠, 레오라이신, 펙사스티모젠 데바시렙벡(JX-594), 카바탁, 세프레흐비어, CGTG-102, MV-NIS, PV701, CL-ONC1, CG0070 및 에나데노터시레브(EnAd)(이식유전자를 포함하는 이들의 돌연변이된 버전, 변이체 또는 유도체 포함)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 일 실시형태에서 암살상 바이러스는 아데노바이러스, 예를 들어 군 B 바이러스, 예컨대 Ad11, 보다 구체적으로는 EnAd이다.
본 개시내용의 일 실시형태에서 암살상 바이러스는 아데노바이러스가 아니고, 예를 들어 군 B 아데노바이러스가 아니고, 예컨대 Ad11가 아니고, 보다 구체적으로는 EnAd가 아니다.
일 실시형태에서 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편은 항원 결합에 직접 관여되는 TCR 알파, 베타, 감마 또는 델타 단백질 또는 이들의 조합물, 예를 들어 항-TCR 베타 쇄 항체에 특이적이다.
일 실시형태에서 항-TCR 항체 또는 결합 단편은 CD3 델타, 엡실론, 감마 또는 이들의 조합물에 특이적이고, 특히 CD3 엡실론에 특이적이다.
일 실시형태에서 결합 도메인은 항체 뮤로모납-CD3(OKT3이라고도 공지됨), 오텔릭시주맙(TRX4라고도 공지됨), 테플리주맙(hOKT3γ1(Ala-Ala)이라고도 공지됨), 또는 비실리주맙으로부터의 VH 및 VL을 포함한다.
본 개시내용의 일 실시형태에서 복제 적격 바이러스가 아데노바이러스인 경우 효능성 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편의 결합 도메인은 항체 뮤로모납-CD3(OKT3이라고도 공지됨), 오텔릭시주맙(TRX4라고도 공지됨), 테플리주맙(hOKT3γ1(Ala-Ala)라고도 공지됨), 또는 비실리주맙으로부터의 VH 및 VL을 포함하지 않는다.
본 개시내용의 일 실시형태에서 암살상 바이러스 또는 바이러스 벡터는 추가 이식유전자, 예를 들어, 사이토카인, 케모카인, 길항성 항체 분자 또는 이의 단편, 효능성 항체 분자 또는 이의 단편, 효소, 면역조절제 및 이들의 조합물을 포함하는 군으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 추가 이식유전자를 암호화한다.
일 실시형태에서 추가 이식유전자는 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화한다. 개시내용의 암살상 바이러스 또는 바이러스 벡터에 의해서 암호화될 수 있는 항체 결합 단편은 일 실시형태에서 Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체, scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, 비스-scFv, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 이들 중 임의의 것의 다이설파이드 안정화된 형태 및 이들의 에피토프-결합 단편, 특히 scFv로부터 독립적으로 선택된다.
일 실시형태에서 암호화된 항체는 전장 항체이다.
본 개시내용의 일 실시형태에서 추가 이식유전자는 T 세포를 활성화시키는 항체 또는 결합 단편을 암호화하고, 예를 들어 T 세포 신호전달을 자극하는 효능제, 예컨대 CD28에 특이적인 항체 또는 결합 단편, 특히 CD28에 특이적인 효능제이다.
본 개시내용에 따른 일 실시형태에서 암호화된 사이토카인은 IL-2, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, Flt3 리간드, GM-CSF, IL-15, IL-12 및 이들의 조합물을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 일 실시형태에서, 추가 이식유전자는 분비 또는 막 연관 사이토카인을 암호화한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 사이토카인은 표적 세포 상의 특이적 수용체에 결합하여, 림프구 및/또는 다른 세포에 다양한 효과를 발휘함으로써 면역 반응의 본성, 강도 및 기간을 조절할 수 있는 저분자량 단백질을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 사이토카인은 융합 단백질(예를 들어 면역글로불린 Fc 도메인에 융합된 분자)을 비롯한, 세포 표면 리간드 또는 수용체의 분비 버전을 포함한다.
본 개시내용에 따른 일 실시형태에서 암호화된 사이토카인은 TNF 알파 슈퍼 패밀리(TNFRSF는 TNF-알파, TNF-C, OX40L, CD154, FasL, LIGHT, TL1A, CD70, Siva, CD153, 4-1BB 리간드, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR 리간드, EDA-A, EDA-A2를 포함함), TGF-베타 슈퍼패밀리, IL-1 패밀리(즉, IL-1 및 IL-8), IL-2 패밀리, IL-10 패밀리, IL-17 패밀리, 인터페론 패밀리로부터 선택된다.
본 개시내용에 따른 일 실시형태에서 케모카인은 MIP-1 알파, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21 및 이들의 조합물을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서 추가 이식유전자는 제1 항체 또는 이의 결합 단편 및 제2 항체 또는 이의 결합 단편(본 명세서에서 항체/항체 조합물이라 지칭됨)을 암호화한다.
일 실시형태에서 추가 이식유전자 또는 이식유전자는 항체 또는 결합 단편 및 사이토카인(본 명세서에서 항체/사이토카인 조합물이라 지칭됨)을 암호화한다.
일 실시형태에서 추가 이식유전자 또는 이식유전자는 제1 사이토카인 및 제2 사이토카인(본 명세서에서 사이토카인/사이토카인 조합물이라 지칭됨)을 암호화한다.
일 실시형태에서 추가 이식유전자 또는 이식유전자들은 제1 케모카인 및 제2 케모카인(본 명세서에서 케모카인/케모카인 조합물이라 지칭됨)을 암호화한다.
일 실시형태에서 추가 이식유전자 또는 이식유전자는 케모카인 및 사이토카인(본 명세서에서 사이토카인/케모카인 조합물이라 지칭됨)을 암호화한다.
다수의 이식유전자가 존재하는 경우, 하나가 하나의 실체, 예컨대 사이토카인 또는 항체 등을 일반적으로 암호화할 것이고, 상이한 유전자가 그 실체, 예를 들어 케모카인 또는 항체 등을 암호활 것이다.
본 개시내용에 따른 일 실시형태에서 암살상 바이러스 또는 바이러스 벡터는 사이토카인, 케모카인 조합물, 예를 들어 MIP-1α와 Flt3 또는 MIP-1α와 IFNα를 암호화한다.
일 실시형태에서 항-TCR 항체 또는 결합 단편은 뮤로모납-CD3(OKT3)으로부터의 VH 영역 및 VL 영역, 서열번호 1 및 2에 제시되고 이의 단쇄 Fv 버전이 서열번호 3에 제시된 가변 영역, 오텔릭시주맙, 테플리주맙(서열번호 6 및 7에 제시된 가변 영역) 또는 비실리주맙을 포함하는 적어도 결합 도메인을 갖는다.
일 실시형태에서 바이러스에 의해서 암호화된 이식유전자, 예를 들어 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편(예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편)은 막관통 도메인 또는 GPI 앵커를 포함한다.
일 실시형태에서 항-CD3 항체 또는 결합 단편은 표면에서만 발현되고, 즉 분비 단백질로서 발현되지 않는다.
일 실시형태에서 막관통 도메인 및 분비 신호 서열의 조합물을 사용하여 감염된 암 세포의 표면 상에서 바이러스(예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같음)에 의해서 암호화된 단백질을 발현시킨다. 본 발명자들은 암호화된 단백질이 바이러스에 의한 감염에 허용된 세포, 즉, 암 세포 상에서만 발현된다는 것을 발견하였다.
일 실시형태에서 감염된 암세포의 표면 상에서 단백질을 발현시키도록 사용되는 단편(예컨대 막관통 단편)은 서열번호 10, 11, 12, 13 또는 14에 제공된 TM 도메인 서열(최소 부분)을 포함하는 군으로부터 선택된다.
Figure pct00001
일 실시형태에서 막관통 도메인은 B7 단백질로부터 유래된다.
일 실시형태에서 본 개시내용에 따른 암살상 바이러스 또는 바이러스 벡터, 특히 복제 적격 아데노바이러스, 예컨대 Ad11 또는 EnAd는 B7 단백질도 이의 활성 단편도 암호화하지 않는다.
도 1은 T 세포 수용체(알파-베타 항원 인식 쇄를 갖는 예)의 도면.
도 2는 인간 CD80을 발현시키는 바이러스를 위한 이식유전자 카세트의 개략도(도 2A), 인간 IFNα와 인간 CD80을 공동-발현시키는 바이러스를 위한 이식유전자 카세트의 개략도(도 2B), OKT3 scFv와 인간 CD80을 공동-발현시키는 바이러스를 위한 이식유전자 카세트의 개략도(도 2C), 인간 Flt3L, 인간 MIP-1α 및 인간 IFNα를 공동-발현시키는 바이러스를 위한 이식유전자 카세트의 개략도(도 2D), 인간 Flt3L, 인간 MIP-1α 및 인간 CD80을 공동-발현시키는 바이러스를 위한 이식유전자 카세트의 개략도(도 2E), 인간 IFNα, 인간 MIP-1α 및 인간 CD80을 공동-발현시키는 바이러스를 위한 이식유전자 카세트의 개략도(도 2F), 및 오픈 리딩 프레임(ORF) 또는 OKT3 scFv의 개략도(도 2G).
도 3은 NG-348A(도 3A), NG-420(도 3B) 및 NG-420A(도 3C) 이식유전자 카세트의 개략도.
도 4는 NG-347 또는 NG-348 바이러스로 감염된 A549 종양 세포의 세포 표면 상에서 48시간까지 높은 CD80 발현을 나타내지만, EnAd 감염 이후에 CD80 발현이 낮거나 없음을 나타낸 도면.
도 5는 NG-348 바이러스로 감염된 DLD-1 종양 세포의 세포 표면 상에서 48시간까지 높은 CD80 발현을 나타내지만, EnAd 감염 이후에 CD80 발현이 낮거나 없음을 나타낸 도면.
도 6은 NG-348로 감염되고, 인간 CD3+ T-세포와 공배양된(그러나 감염은 EnAd로 수행된 경우가 아님) EpCam+ A549 세포 상에서의 CD80 발현을 나타낸 도면.
도 7은 CD25가 NG-348 감염된 A549 세포와의 공배양 이후(그러나 감염은 EnAd로 수행된 경우가 아님) 인간 CD3+ T-세포 상에서 상향조절된 것을 나타낸 도면(도 7A), CD25+ 세포의 백분율(도 7B) 및 세포당 CD25 발현 수준(도 7C)은 증가되었다.
도 8은 CD25가 NG-348 감염된 A549 세포와의 공배양 이후(그러나 감염은 EnAd로 수행된 경우가 아님) CD4+ 및 CD4-(주로 CD8) 인간 CD3+ T 세포 하위세트 둘 모두 상에서 하향조절된 것을 나타낸 도면.
도 9는 NG-348 또는 EnAd 감염된 A549 세포와의 공배양 이후 인간 CD3+ T 세포 상에서의 HLA-DR 발현의 낮은 수준을 나타낸 도면.
도 10은 NG-348 감염된 A549 세포와의 공배양 이후(그러나 감염은 EnAd로 수행된 경우가 아님) 살아있는 CD3+ T 세포의 표면 상에서 CD107a 발현의 유도를 나타낸 도면.
도 11은 NG-348 감염된 A549 세포와의 공배양 이후(그러나 감염은 EnAd로 수행된 경우가 아님) CD4+ 및 CD4- CD3+ T 세포 하위세트 둘 모두의 표면 상에서 CD107a 발현의 유도를 나타낸 도면.
도 12는 NG-348 감염된 A549 세포와의 공배양 이후 CD3+ T 세포에 의한 IL-2(도 12A) 및 IFNγ(도 12B) 생산의 유도를 나타낸 도면(그러나 감염이 EnAd으로 수행된 경우 IL-2는 없고, IFNγ는 매우 낮은 수준임).
도 13은 NG-348 감염된 A549 세포와의 공배양 이후 CD4+(도 13A) 및 CD8+(도 13B) CD3+ T 세포 둘 모두에 의한 IFNγ 생산의 유도를 나타낸 도면(그러나 감염이 EnAd으로 수행된 경우 (CD4+ 세포)는 없거나 (CD8+ 세포) IFNγ는 낮음).
도 14는 A549 종양 세포와 비교된 MRC-5 섬유모세포 세포에서의 EnAd, NG-347 및 NG-348에 대한 게놈 복제 및 헥손 유전자 발현(mRNA 수준)을 나타낸 도면.
도 15는 A549 종양 세포와 비교된 MRC-5 섬유모세포 세포에서의 바이러스 NG-348에 대한 CD80 및 항-CD3-scFv 이식유전자 mRNA 및 CD80 이식유전자 단백질(유세포 분석법) 발현을 나타낸 도면.
도 16은 A549 종양 세포와 비교된 MRC-5 섬유모세포 세포에서 바이러스 NG-347에 대한 CD80 이식유전자 mRNA 및 CD80 이식유전자 단백질을 나타낸 도면.
도 17은 A549 종양 세포와 비교된 MRC-5 섬유모세포 세포에서 바이러스 NG-347에 의해서 생성된 MIP-1α 및 IFNα의 mRNA 및 분비된 단백질 수준을 나타낸 도면.
도 18은 정제된 인간 T-세포 배양물 중에서 EnAd, NG-347, 및 NG-348에 대한 게놈 복제 및 헥손 유전자 발현(mRNA 수준)을 나타낸 도면.
도 19는 A549 종양 세포와 비교된 인간 T-세포에서의 바이러스 NG-348에 대한 CD80 및 항-CD3 scFv 이식유전자 mRNA 및 단백질 발현(유세포 분석법)을 나타낸 도면.
도 20은 A549 종양 세포와 비교된 정제된 인간 T-에서 바이러스 NG-347에 대한 CD80 이식유전자 mRNA 및 CD80 이식유전자 단백질을 나타낸 도면.
도 21은 A549 종양 세포와 비교된 T 세포에서 바이러스 NG-347에 의해서 생성된 IFNα 및 MIP-1α 이식유전자 mRNA를 나타낸 도면.
도 22는 A549 종양 세포와 비교된 인간 PBMC에 의한 NG-347 및 NG-348 게놈 복제 및 헥손 유전자 발현을 나타낸 도면.
도 23은 A549 종양 세포와 비교된 PBMC에 의한 바이러스 NG-348에 의해서 생성된 CD80 및 항-CD3 scFv mRNA를 나타낸 도면.
도 24는 A549 종양 세포와 비교된 PBMC에 의한 바이러스 NG-347에 의해서 생성된 CD80, IFNα 및 MIP-1α mRNA를 나타낸 도면.
도 25는 세포 표면 상에서의 CD14 발현의 하향 조절 및 CD80의 상향조절에 의해서 측정된 바와 같은, EnAd, NG-347 및 NG-348 바이러스 입자에 의한 인간 수지상 세포의 유사한 활성화를 나타낸 도면.
도 26은 EnAd와 비교된 NG-348(A) 또는 NG-347(B)와 함께 배양된 PBMC로부터의 유사한 입자-매개된 MIP-1α 및 IFNα 단백질 분비를 나타낸 도면.
도 27은 A549 종양 세포와의 공배양물과 비교된 MRC-5 섬유모세포와 T-세포 또는 PBMC의 공배양물 중에서의 NG-347 또는 NG-348 게놈 복제를 나타낸 도면.
도 28은 A549 종양 세포와 비교된 MRC-5 섬유모세포 세포와 공배양되고, EnAd 또는 바이러스 NG-348로 처리된 PBMC 또는 T-세포에 의해서 분비된 INFγ를 나타낸 도면.
도 29는 EnAd, NG-347 또는 NG-348 바이러스 입자로 처리된 인간 수지상 세포에 의해서 분비된 MIP-1α 및 IFNα를 나타낸 도면.
도 30은 EnAd, NG-347 또는 NG-348 감염된 A549 종양 세포와 공배양된 주카트듀얼(JurkatDual) 리포터 T-세포에서의 NFκB 및 IFN 리포터 유전자 활성화를 나타낸 도면.
도 31은 EnAd, NG-347, NG-348 또는 NG-420 처리된 A549 HCT-116, DLD 및 HT29 종양 세포와 공배양된 주카트듀얼 리포터 T-세포에 의해서 생성된 NFκB-루시페라제 리포터 활성도를 나타낸 도면.
도 32는 첨가된 바이러스 입자의 함수로서의 바이러스 NG-348 및 바이러스 NG-420으로 감염된 A549 또는 HT29 종양 세포와 공배양된 주카트듀얼 세포에 의해서 생성된 NF-κB-루시페라제 리포터 활성도를 나타낸 도면.
도 33은 혈액 중에서 EnAd 및 바이러스 NG-348의 약동학; EnAd 또는 바이러스 NG-348에 대한 노출 후 혈액 사이토카인 수준; CD1 마우스에 IV 투여 6시간 또는 24시간 후 EnAd 또는 NG-348 바이러스의 조직 생물분포를 나타낸 도면.
도 34는 피하 HCT-116 종양 이종이식편을 보유한 CB17-SCID 마우스에 IV 투여한 후 EnAd, NG-347 및 NG-348 바이러스의 혈액에서의 약동학을 나타낸 도면.
도 35는 종양-보유 CB17-SCID 마우스에서 정맥내 투여 6시간 후 EnAd, NG-347 및 NG-348 바이러스의 조직 분포, 및 EnAd, NG-347 및 NG-348을 정맥내 또는 종양내 투여한 후 7일 및 14일 내지 21일에 HCT-116 종양 이종이식편에서 바이러스 게놈을 나타낸 도면.
도 36은 정맥내 또는 종양내 투여 후 7일 또는 14일 내지 21일에 EnAd, NG-347 또는 NG-348 바이러스에 의해서 HCT-116 종양 이종이식편에서 생성된 바이러스 헥손 mRNA를 나타낸 도면.
도 37은 바이러스 NG-348로의 정맥내 투여 7일 또는 21일 후에 HCT-116 종양 이종이식편에서 헥손 및 CD80 이식유전자에 대한 mRNA 수준을 나타낸 도면.
도 38은 바이러스 NG-348로의 정맥내 투여 7일 또는 14일 내지 21일 후에 HCT-116 종양 이종이식편에서 항-CD3 scFv 및 CD80을 암호화하는 이식유전자에 대한 mRNA 수준을 나타낸 도면.
도 39는 바이러스 NG-347로의 정맥내 투여 7 또는 14일 내지 21일 후 HCT-116 종양 이종이식편에서 MIP1a 및 IFNα 이식유전자의 mRNA 수준을 나타낸 도면.
도 40은 바이러스 NG-348의 정맥내 투여 7일 및 21일 후 HCT-116 종양 이종이식편에서의 CD80 단백질 발현을 나타내고; 바이러스 NG-347의 정맥내 투여 후 HCT-116 종양에서 MIP1a 및 CD80 단백질 발현을 나타낸 도면.
도 41은 CD69가 감염이 EnAd로 수행된 경우보다 NG-347 감염된 A549와의 공배양 이후 더 많은 인간 CD3+ T-세포 상에서 상향조절된다는 것을 나타낸 도면.
도 42는 NG-347 감염된 A549 세포와의 공배양 이후(그러나 감염은 EnAd로 수행된 경우가 아님) 인간 CD3+ T 세포에 의한 IFNγ 생산의 유도를 나타낸 도면.
도 43은 HT-29 세포독성 검정에서 EnAd, 및 NG-348 바이러스의 대등한 암살상 효력(도 43) 및 감염력(도 43 표)을 나타낸 도면.
도 44는 문헌[Nature Reviews Immunology 3, 745-756 (September 2003)]으로부터의, TNF 슈퍼패밀리의 신호전달 경로를 나타낸 도면.
도 45 내지 도 53은 다양한 아미노산 및 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타낸 도면.
서열 목록의 요약
본 출원은 연관 서열 목록에서 119개의 서열을 함유한다.
서열번호 1 항체 OKT3의 VH 영역의 아미노산 서열.
서열번호 2 항체 OKT3의 VH 영역의 아미노산 서열.
서열번호 3 OKT3 VH 및 VL을 함유하는 scFv의 아미노산 서열.
서열번호 4 서열번호 3의 scFv의 막 앵커링된 버전의 아미노산 서열.
서열번호 5 V5 태그를 갖는, 서열번호 4의 아미노산 서열.
서열번호 6 테플리주맙 VH의 아미노산 서열.
서열번호 7 테플리주맙 VL의 아미노산 서열.
서열번호 8 테플리주맙 중쇄의 아미노산 서열.
서열번호 9 테플리주맙 경쇄의 아미노산 서열.
서열번호 10 PDGFR 수용체 A의 아미노산 서열.
서열번호 11 PDGFR 수용체 B의 아미노산 서열.
서열번호 12 인슐린-유사 성장 인자 1의 아미노산 서열.
서열번호 13 IL-6R의 아미노산 서열.
서열번호 14 CD28의 아미노산 서열.
서열번호 15 PDGFR TM 도메인의 아미노산 서열.
서열번호 16 c-myc 태그의 아미노산 서열.
서열번호 17 스페이서를 갖는 c-myc 태그의 아미노산 서열.
서열번호 18 N-말단 c-myc 태그를 갖는 PDGFR TM 도메인의 아미노산 서열.
서열번호 19 HuVH 인간 VH 리더 서열의 아미노산 서열.
서열번호 20 링커의 아미노산 서열.
서열번호 21 EnAd 게놈의 폴리뉴클레오타이드 서열.
서열번호 22 내지 30 힌지 링커 서열의 아미노산 서열.
서열번호 31 내지 70 가요성 링커 서열의 아미노산 서열.
서열번호 71 내지 86 링커 서열의 아미노산 서열.
서열번호 87 EnAd 게놈(BP 10355-5068)의 E2B 영역의 폴리뉴클레오타이드 서열.
서열번호 88 BX 내에 포함시키기에 적합한 비-암호 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열.
서열번호 89 BY 내에 포함시키기에 적합한 비-암호 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열.
서열번호 90 및 91 스플라이스 억셉터 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열.
서열번호 92 시작 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열.
서열번호 93 IRES의 폴리뉴클레오타이드 서열.
서열번호 94 고효율 자가-절단성 P2A 펩타이드 서열의 아미노산 서열.
서열번호 95 고효율 자가-절단성 F2A 펩타이드 서열의 아미노산 서열.
서열번호 96 고효율 자가-절단성 E2A 펩타이드 서열의 아미노산 서열.
서열번호 97 고효율 자가-절단성 T2A 펩타이드 서열의 아미노산 서열.
서열번호 98 인간 CD80 아미노산 서열의 아미노산 서열.
서열번호 99 폴리아데닐화 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열(SV40 후기 폴리A 서열).
서열번호 100 NG-348 바이러스 게놈 서열의 폴리뉴클레오타이드.
서열번호 101 V5 태그의 아미노산
서열번호 102 NG-348A 바이러스 게놈 서열의 폴리뉴클레오타이드.
서열번호 103 NG-420 바이러스 게놈 서열의 폴리뉴클레오타이드.
서열번호 104 NG-420A 바이러스 게놈 서열의 폴리뉴클레오타이드.
서열번호 105 인간 인터페론-a 아미노산 서열의 아미노산 서열.
서열번호 106 인간 가요성 Flt3 리간드 아미노산 서열의 아미노산 서열.
서열번호 107 인간 마크로파지 염증 단백질 1a 아미노산 서열(LD78b 아이소폼)의 아미노산 서열.
서열번호 108 항-인간 CD3 단일 쇄 Fv의 아미노산 서열 막 앵커링된 형태.
서열번호 109 NG-330 바이러스 게놈의 폴리뉴클레오타이드 서열.
서열번호 110 NG-343 바이러스 게놈의 폴리뉴클레오타이드 서열.
서열번호 111 NG-345 바이러스 게놈의 폴리뉴클레오타이드 서열.
서열번호 112 NG-346 바이러스 게놈의 폴리뉴클레오타이드 서열.
서열번호 113 NG-347 바이러스 게놈의 폴리뉴클레오타이드 서열.
서열번호 114 EnAd로부터의 E3 영역의 폴리뉴클레오타이드.
서열번호 115 BY 내에 포함시키기에 적합한 비-암호 서열의 폴리뉴클레오타이드.
서열번호 116 NG-348 바이러스 게놈의 폴리뉴클레오타이드 서열.
서열번호 117 막 테더링된 OKT3-scFv의 폴리뉴클레오타이드 서열.
서열번호 118 NG-348로부터의 이식유전자 카세트의 폴리뉴클레오타이드 서열.
서열번호 119 플라스미드 pEnAd2.4에서와 같은 이식유전자 카세트 삽입을 위한 혼입된 클로닝 부위를 갖는 완전 합성 EnAd 게놈의 폴리뉴클레오타이드 서열.
암 환경 내의 T 세포는 종양 내부의 T 세포 및 종양 부근의 T 세포, 예를 들어 종양 외부에 존재하지만 종양 또는 암성 세포와 관계될 수 있는 T 세포, 특히 종양 또는 암성 세포와 물리적으로 관계될 수 있는 T 세포를 포함한다.
T 세포가 종양 내에 침투하여 내부로 들어가면 이것은 불활성화된다는 것을 시사하는 증거가 있다. 이롭게는 본 개시내용의 방법은 종양 내부에서 T 세포를 활성화시킬 수 있다. 일 실시형태에서 종양 내부의 T 세포는 본 개시내용에 따른 암살상 바이러스 또는 바이러스 벡터에 의해서 활성화된다.
일 실시형태에서 본 개시내용에 사용된 막관통 테더 또는 앵커 서열은 예컨대 서열번호 15의 서열에 제시된 PDGFR TM 도메인(예를 들어, ala513-arg561)을 포함한다.
일 실시형태에서 본 개시내용에 사용된 테더 또는 앵커 서열은 PDGF 수용체 또는 이의 단편, 예컨대 PDGFR TM 도메인에 부착된 태그를 포함한다. 적합한 태그는 His-태그, Flag-태그, c-myc 태그 등을 포함한다. 보다 구체적으로 테더 또는 앵커는 예를 들어, 서열번호 16 EQKLISEEDL의 c-myc 태그를 포함할 수 있고, 그 다음 예컨대 서열번호 15의 서열에 제시된 바와 같은, PDGFR TM 도메인(ala513-arg561)이 사용된다.
일 실시형태에서 c-myc 태그는 예를 들어 서열번호 17 gsEQKLISEEDLn의 서열에 제시된 바와 같이 3' 및/또는 5' 단부에서 스페이서 또는 스페이서 아미노산을 포함한다.
일 실시형태에서 사용된 테더 또는 앵커 서열은 서열번호 18의 서열에 제시되어 있다.
일반적으로 테더 또는 앵커가 부착된 단백질/폴리펩타이드는 종결 코돈을 포함하지 않는다.
일 실시형태에서 암 세포 표면 상에서 발현될 단백질에 대한 리더 서열은 인간, 예를 들어 인간 VH 리더 서열(HuVH)(서열번호 19)이다.
일 실시형태에서 ORF 카세트의 구조는 하기와 같다:
Figure pct00002
식 중,
LS는 리더 서열, 예를 들어 인간 리더 서열이고;
POLY는 관심 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 특히 본 명세서에 개시된 것이고;
TAG는 태그, 예를 들어 본 명세서에 개시된 것, 예컨대 c-myc, 특히 본 명세서에 기술된 바와 같은 것이고;
TM_D는 TM 도메인, 예를 들어 또한 본 명세서에 기술된 PDGFR TM 도메인이다.
폴리펩타이드가 scFv인 경우, ORF는 하기와 같을 수 있다:
Figure pct00003
식 중,
LS는 리더 서열, 예를 들어 인간 리더 서열이고;
VAR1은 가변 영역, 예컨대 VH 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이고;
LINK는 예를 들어 본 명세서에 개시된 바와 같은 링커, 예컨대 G4S의 단위를 기반으로 하는 링커, 특히 서열번호 20 GGGGSGGGGSGGGGS의 서열이고;
VAR2는 가변 영역, 예컨대 VL 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이고;
TAG는 태그, 예를 들어 본 명세서에 개시된 것, 예컨대 c-myc, 특히 본 명세서에 기술된 서열이고;
TM_D는 TM 도메인, 예를 들어 PDGFR TM 도메인, 예를 들어 본 명세서에 기술된 서열이다.
본 개시내용은 또한 실시형태, 특히 본 명세서에 구체적으로 기술된 것으로 확장되며, 이것은 폴리펩타이드 쇄의 N-또는 C-말단에서 태그를 포함하여, 그것은 막의 내부에 또는 외부 상에 존재한다. 따라서 막 내부에 위치된 C-말단 태그가 이로운데, 그 이유는 그것이 폴리펩타이드의 결합 또는 기능을 방해할 가능성이 없기 때문이다.
감염된 암세포의 표면 상에서 단백질을 발현시키기 위해서 막관통 도메인을 사용하는 대안적인 방법은 세포외 단백질 또는 단편의 C-말단 아미노산에 부착된 당인지질 앵커(GPI 앵커라고도 지칭됨)를 사용하는 접근법을 포함한다(Low et al 1986, Cross 1987, Low and Saltie1 1988, Ferguson and William 1988). 공지된 당인지질 앵커는 Thy-1, N-CAM 및 DAF로부터의 것을 포함한다.
일 실시형태에서 막관통 도메인과 분비 신호 서열의 조합물을 사용하여 감염된 암 세포의 표면 상에서 바이러스(예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같음)에 의해서 암호화된 단백질을 발현시킨다. 본 발명자들은 암호화된 단백질이 암살상 바이러스에 의한 감염에 허용된 세포, 즉, 암 세포 상에서만 발현된다.
일 실시형태에서 감염된 암세포의 표면 상에서 단백질을 발현시키도록 사용되는 단편(예컨대 막관통 단편)은 서열번호 10 내지 15(또는 10 내지 14)에 제공된 TM 도메인 서열(최소 부분)을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서 CD80 또는 CD86으로부터의 막관통 도메인은 암 세포의 표면 상에서 단백질을 발현시키기 위해서 사용된다.
일 실시형태에서 감염된 암 세포의 표면 상에서 단백질을 발현시키기 위해서 사용되는 단편(예컨대 막관통 단편)은 예를 들어 PDGF 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, IL-6 수용체, CD28, 글리코포린, LDL 수용체, 인플루엔자 HA 단백질, 인슐린 수용체, 아시알로당단백질 수용체, 트랜스페린 수용체를 비롯한 단백질로부터의 막관통 알파 헬릭스를 형성하는 약 20 내지 25개의 소수성 아미노산으로부터 선택된다.
일 실시형태에서 사용되는 막관통 도메인은 B형 간염으로부터의 S 항원 또는 G 단백질-커플링된 수용체로부터 유래된다.
일 실시형태에서 B7 단백질 또는 단편의 전장 세포외 도메인 및 또한 B7이 아닌 단백질로부터 유래된 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질은 B7 단백질이 암 세포 표면으로부터의 원위의 융합 단백질의 말단 단부에, 즉 세포외 공간과 마주하는 암 세포의 외부 상에 위치되도록 배열된다.
내인성 프로모터의 제어 하에서 B7 또는 활성 단편을 암호화하는 DNA 서열을 갖는 것이 또한 이로운데, 그 이유는 단백질이 구성적으로 발현되는 것과 달리 바이러스 생명 주기에 따라서 발현되기 때문이다. 현재 상황에서 외인성 프로모터, 예를 들어 CMV 프로모터와 같은 강한 프로모터 하에서의 연속적인 발현은 치료 효과에 필수적이고 오프-타깃 효과를 유발하는 더 많은 B7 단백질을 생성할 수 있다.
일 실시형태에서 본 개시내용에 따른 암살상 바이러스는 아데노바이러스, 예를 들어 군 B 아데노바이러스이다. 일 실시형태에서 본 개시내용에 따른 바이러스는 키메라 바이러스, 예를 들어 EnAd이다. 일 실시형태에서 아데노바이러스는 복제 적격성이다.
일 실시형태에서 암살상 바이러스 복제 가능성, 예를 들어 복제 적격성이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 복제 가능성은 숙주 세포에서 복제할 수 있는 바이러스이다. 일 실시형태에서 복제 가능성은 복제 적격 및 복제 선택 바이러스를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 복제 적격성은 야생형 바이러스에 의해서 요구되는 임의의 추가적인 상보성 없이, 예를 들어 결함이 있는 세포 머시너리에 의존하지 않고, 인간 세포, 예컨대 암 세포에서 복제할 수 있는 암살상 바이러스를 의미하도록 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 복제 선택성 또는 선택성 복제는 상기 암 세포에 특이적이거나 그 내에서 상향조절된 요소, 예를 들어 결함이 있는 세포 머시너리, 예컨대 p53 돌연변이를 사용하여 암 세포에서 복제하는 암살상 바이러스를 의미하고, 이에 의해서 건강/정상 세포에 비해서 어느 정도 선택성을 허용한다.
"복제 가능 암살상 바이러스"는 암 세포를 우선적으로 감염시키는 복제 가능 바이러스이다. 즉, 이것은 비-종양 세포보다 우세하게 종양 세포를 감염시킴으로써 종양 선택적이다. EnAd는 복제 적격 바이러스의 예이다.
일 실시형태에서 바이러스는 복제 결핍성이고, 바이러스 벡터로서 제공된다. 바이러스 벡터는 복제를 허용하도록 보족 유전자를 제공하기 위해서 패키징 세포 또는 헬퍼를 요구한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터는 암 세포를 우선적으로 감염시키는 복제 결핍 바이러스를 지칭한다. 즉, 이것은 비-종양 세포보다 우세하게 종양 세포를 감염시킴으로써 종양 선택적이고, 예를 들어 바이러스 벡터는 복제에 필수적인 유전자를 결실시킴으로써 복제 적격 암살상 바이러스로부터 유래된다.
일 실시형태에서 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터는 본 개시내용에 따른다.
일 실시형태에서 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편(예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편)을 암호화하는 유전자는 아데노바이러스 유전자 L5의 종결 코돈과 폴리A 인식 부위 사이 및 유전자 E4의 종결 코돈과 폴리A 인식 부위 사이에 위치된다.
일 실시형태에서 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편(예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편)을 암호화하는 유전자는 예를 들어 서열번호 21에 제시된 바와 같은, EnAd 게놈의 약 bp 29356과 약 29357 사이, 또는 그와 동등한 위치에 위치된다. 통상의 기술자는 위치의 절대 수치 값이 넘버링이 할당되는 기반으로 변화될 수 있음을 이해할 것이다.
CD3 항체 성분은 암성 세포에 초점을 맞추기 위해서, T 세포, 예를 들어 암 세포 환경 내의 T 세포의 생체내 자극을 용이하게 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 면역조절제는 면역 반응의 조절자를 의미한다. 면역조절제는 면역강화, 면역억제 또는 면역 관용의 유도에서와 같이 면역 반응을 목적하는 수준으로 조정하는 기능을 한다.
일 실시형태에서 면역조절제는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, B7-H3, B7-H4, HVEM, ILT-2, ILT-3, ILT-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, LIGHT 또는 CD160, 예를 들어 CTLA-4, PD-1, PD-L1 및 PD-L2를 포함하는 군으로부터 선택된 표적에 특이적인 항체 또는 결합 단편(특히 저해제 항체 또는 결합 단편)이다.
일 실시형태에서 면역조절제는 CD16, CD25, CD33, CD332, CD127, CD31, CD43, CD44, CD162, CD301a, CD301b 및 갈렉틴-3을 포함하는 군으로부터 선택된 표적에 특이적인 항체 또는 결합 단편(특히 저해제 항체 또는 결합 단편)이다.
일 실시형태에서 면역조절제는 하기를 포함하는 군으로부터 선택된 표적에 특이적인 항체 또는 결합 단편이다: FLT-3, FLT-3 리간드, TLR, TLR 리간드, CCR7, CD1a, CD1c, CD11b, CD11c, CD80, CD83, CD86, CD123, CD172a, CD205, CD207, CD209, CD273, CD281, CD283, CD286, CD289, CD287, CXCR4, GITR 리간드, IFN-α2, IL-12, IL-23, ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT7, TSLP 수용체, CD141, CD303, CADM1, CLEC9a, XCR1 및 CD304.
일 실시형태에서 면역조절제는 OX40, OX40 리간드, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40 리간드, CD70, CD137, GITR, 4-1BB, ICOS 및 ICOS 리간드, 예를 들어 CD40 및 CD40 리간드를 포함하는 군으로부터 선택된 표적에 특이적인 항체 또는 결합 단편이다.
일 실시형태에서 면역조절제는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, B7-H3, B7-H4, HVEM, ILT-2, ILT-3, ILT-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, LIGHT 또는 CD160, 예를 들어 CTLA-4, PD-1, PD-L1 및 PD-L2를 포함하는 군으로부터 선택된 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드이다.
일 실시형태에서 면역조절제는 CD16, CD25, CD33, CD332, CD127, CD31, CD43, CD44, CD162, CD301a, CD301b 및 갈렉틴-3을 포함하는 군으로부터 선택된 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드이다.
일 실시형태에서 면역조절제는 하기를 포함하는 군으로부터 선택된 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드이다: FLT-3, FLT-3 리간드, TLR, TLR 리간드, CCR7, CD1a, CD1c, CD11b, CD11c, CD80, CD83, CD86, CD123, CD172a, CD205, CD207, CD209, CD273, CD281, CD283, CD286, CD289, CD287, CXCR4, GITR 리간드, IFN-α2, IL-12, IL-23, ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT7, TSLP 수용체, CD141, CD303, CADM1, CLEC9a, XCR1 및 CD304.
일 실시형태에서 면역조절제는 OX40, OX40 리간드, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40 리간드, CD70, CD137, GITR, 4-1BB, ICOS 및 ICOS 리간드, 예를 들어 CD40 및 CD40 리간드를 포함하는 군으로부터 선택된 면역 세포 표면을 위한 막-연관 단백질 리간드이다.
일 실시형태에서 면역조절제는 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-9, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-33, IL-35, 인터류킨-2(IL-2), IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, IL-25, IL-1RA, IFNα, IFNβ, IFNγ, TNFα, TGFβ, 림포톡신 α(LTA) 및 GM-CSF를 포함하는 군으로부터 선택된 표적에 특이적인 항체 또는 결합 단편이다.
일 실시형태에서 본 개시내용에 따른 암살상 아데노바이러스는 식 (I)을 갖는다:
Figure pct00004
식 중:
B1은 결합이거나 또는 E1A, E1B 또는 E1A-E1B를 포함하고;
BA는 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4이고;
B2는 결합이거나 또는 예를 들어, 내인성 또는 외인성 프로모터 하의 E3 또는 이식유전자를 포함하고;
BX는 결합이거나 또는 제한 부위, 1종 이상의 이식유전자 또는 둘 모두를 포함하는 DNA 서열이고;
BB는 L5를 포함하고;
BY는 B7 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 이식유전자를 포함하고;
B3은 결합이거나 또는 E4를 포함한다.
일 실시형태에서 암살상 바이러스는 식 (Ia)를 갖는다:
Figure pct00005
식 중:
B1은 결합이거나 또는 E1A, E1B 또는 E1A-E1B를 포함하고;
BA는 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4이고;
B2는 결합이거나 또는 E3을 포함하고;
BB는 L5를 포함하고;
BY는 B7 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 이식유전자를 포함하고;
B3은 결합이거나 또는 E4를 포함한다.
일 실시형태에서 식 (I) 및/또는 (Ia)의 작제물에서의 바이러스 게놈은 Ad11 또는 EnAd, 특히 EnAd로부터 유래된다.
일 실시형태에서 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편(예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편)을 암호화하는 이식유전자는, 내인성 프로모터, 예를 들어 주요 후기 프로모터의 제어 하에 있다.
일 실시형태에서 BY는 이식유전자 카세트를 포함하는데, 상기 카세트는 B7 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 이식유전자 및 조절 요소, 예컨대 조절 요소의 조합물을 포함한다.
일 실시형태에서 조절 요소는 스플라이스 억셉터 서열이다.
일 실시형태에서 조절 요소는 코작 서열이다.
일 실시형태에서, 예를 들어 이식유전자가 다시스트론성 RNA 분자를 암호화하는 경우, 조절 요소는 IRES 서열이다.
일 실시형태에서 조절 서열은 고효율 자가-절단성 펩타이드 서열, 예컨대 P2A, T2A, F2A, E2A이다.
일 실시형태에서 조절 서열은 폴리A 테일이다.
일 실시형태에서 적어도 2종의 조절 서열, 예를 들어 스플라이스 억셉터와 코작 서열 또는 스플라이스 억셉터와 폴리A 테일, 또는 스플라이스 억셉터와 IRES 서열, 또는 스플라이스 억셉터와 P2A 서열이 존재한다.
일 실시형태에서 적어도 3종의 조절자 서열, 예를 들어 스플라이스 억셉터 서열, 코작 서열 및 폴리A 테일, 또는 스플라이스 억셉터 서열 IRES 또는 2A 서열 및 폴리A 테일; 또는 스플라이스 억셉터 서열, 코작 서열 및 IRES 또는 2A 서열이 존재한다.
일 실시형태에서 적어도 4종의 조절 서열, 예를 들어 스플라이스 억셉터 서열, 코작 서열, IRES 또는 2A 서열 및 폴리A 테일, 특히 스플라이스 억셉터 서열, 코작 서열, IRES 또는 2A 서열 및 폴리A 테일의 순서로 L5로부터 E4까지의 조절 서열이 존재한다.
일 실시형태에서 이식유전자는 IRES 및 2A 조절 서열 둘 모두를 포함하는 다시스트론성 RNA 분자를 암호화한다.
일 실시형태에서 비-아데노바이러스는 B7-1, B7-2, B7-DC, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6, B7-H7, 이들의 활성 단편 및 이들의 조합물로부터 독립적으로 선택된 B7 단백질을 암호화한다. 일 실시형태에서 B7 단백질은 B7-1(CD80), B7-2(CD86) 또는 이들 중 임의의 것의 활성 단편 및 이들의 조합물, 특히 B7-1 또는 이의 활성 단편이다.
일 실시형태에서 B7 단편은 B7 단백질, 특히 본 명세서에 기술된 것, 예컨대 B7-1로부터의 막관통 도메인을 포함하거나 그것으로 이루어진다. 이러한 도메인은 세포 표면 상에서 발현에 기여한다고 생각된다.
일 실시형태에서 B7 단백질의 세포질 도메인이 존재한다. 일 실시형태에서 세포질 도메인은 존재하지 않는다. 세포질 도메인의 부재는 암 세포로의 세포내 신호전달을 감소 또는 제거할 수 있는데, 이것은 하기에 논의된 하나 이상의 실시형태와 관련된다.
단편 또는 전장 B7 단백질에서의 요소는 동일하거나 또는 상이한 B7 단백질로부터 유래될 수 있다. 따라서 일 실시형태에서 B7 단편 또는 단백질은 키메라이다.
일 실시형태에서 본 개시내용의 바이러스는 감염된 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위한 다수의 단백질을 암호화하고, 예를 들어 비-아데노바이러스는 적어도 1종의 B7 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하고, 예를 들어 2종, 3종, 4종 또는 그 초과의 상이한 단백질이 암호화되고, 특히 2종 또는 3종의 단백질이 암 세포 표면 상에서의 발현 또는 세포외 공간으로의 분비를 위해서 바이러스에 의해서 암호화된다.
일 실시형태에서 B7 단백질 또는 활성 단편은 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위해서 본 개시내용의 비-아데노바이러스에 의해서 암호화되고, 동일한 B7 단백질 또는 상이한 B7 단백질(활성 단편 포함)의 가요성 형태(이것은 세포로부터 방출 또는 분비됨)이 또한 이러한 바이러스에 의해서 암호화된다.
일 실시형태에서 적어도 2종의 상이한 B7 단백질 또는 활성 단편이 본 개시내용의 비-아데노바이러스에 의해서 암호화된다.
일 실시형태에서 다수의 단백질이 암 세포막에서 독립적으로 가공 및 발현되는 별개의 단백질로서 발현되도록 암호화될 수 있다. 암 세포의 표면 상에서의 단백질의 독립성은 면역 활성화에 긍정적으로 기여할 수 있다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 지질 패킹은 암 세포의 막에서 지질 이중층의 유동성(즉, 점도)에 영향을 줄 수 있다. 막의 점도는 막 내에서 단백질 및 다른 생물-분자의 회전 및 배향에 영향을 미칠 수 있고, 이에 의해서 이들 분자의 기능에 영향을 미친다. 따라서 바이러스에 의해서 암호화된 단백질이 감염된 암 세포의 막 내에서 개별 단백질 및 별개의 단백질로서 위치된 경우, 지질 이중층의 유동성은 생물학적 기능에 도움이 되는 자연 포맷과 유사한 특히 적합한 포맷일 수 있는 분자의 독립적인 이동을 허용한다.
일 실시형태에서 독립적으로 가공 및 발현된 단백질은 암 세포막에서 상이한 위치, 예컨대 물리적으로 분리된 위치 내에 위치된다(앵커링된다).
일 실시형태에서 바이러스에 의해서 암호화되고, 감염된 암 세포의 표면 상에서 발현된 1종 이상의 단백질(예를 들어 단백질 전부)은 융합 단백질이 아니다.
따라서 일 실시형태에서 본 개시내용에 따른 바이러스는 예를 들어, 감염된 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위해서 상기 다수의 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
따라서 일 실시형태에서 본 개시내용에 따른 바이러스는 바이러스 게놈 내의 동일하거나 또는 상이한 위치에서 2종 이상의 이식유전자를 포함한다. 바이러스 게놈 내의 동일한 위치에 위치된 경우, 다수의 단백질은 암 세포의 표면에서 여전히 독립적으로 발현될 것이다.
일 실시형태에서 다수의 단백질(융합 단백질 포함)은 바이러스 게놈 내의 상이한 위치, 예를 들어 E3에서 암호화되고, BX 및/또는 BY는 감염된 암 세포의 표면 상에서 별개로 발현된다.
일 실시형태에서 다수의 단백질(융합 단백질 포함)은 바이러스 게놈 내의 동일한 위치에서 암호화되고, 감염된 암 세포 표면 상에서 함께 발현되고, 예를 들어 여기서 암호화된 단백질은 융합 단백질로서 제공되고, 여기서 융합 단백질은 B7 단백질 또는 이의 활성 단편을 포함한다.
일 실시형태에서 융합 단백질에서의 B7 단백질은 또 다른 관심 단백질 또는 이의 활성 단편에 융합 또는 연결된 전장 단백질, 특히 본 명세서에 기술된 단백질, 예컨대 B7-1 및/또는 B7-2이다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 B7 단백질로부터의 막관통을 포함한다. 일 실시형태에서 B7은 막관통 도메인을 제외한 활성 단편이다. 후자의 실시형태에서 B7 단백질로부터 유래된 것이 아닌 막관통은 융합 단백질이 감염된 암 세포의 표면 상에 존재하는 것을 보장하기 위해서 사용될 수 있다.
일 실시형태에서 다수의 단백질은 바이러스 내의 동일한 위치에서 암호화되고, 감염된 암 세포의 표면 상에서 함께 융합 단백질로서 발현된다.
바이러스에서의 위치가 동일한 경우, 그 유전자는 예를 들어 IRES 서열 또는 2A 펩타이드에 의해서 연결될 수 있다.
일 실시형태에서 본 개시내용에 따른 바이러스는 예를 들어, 사이토카인, 케모카인, 리간드, 길항성 항체 분자 및 효능성 항체 분자를 포함하는 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화하는, "제2" 이식유전자 및 임의로 제3 이식유전자(즉, 상기 다수의 단백질 중 1종 이상)를 포함한다.
일 실시형태에서 추가적인 단백질 또는 단백질들은 암 세포의 표면 상에서의 발현에 적합한 형태의 CD3, CD28, CD80, CD86, 4-1BB, GITR, OX40, CD27, CD40 및 조합물에 결합하는 항체, 항체 단편 또는 단백질 리간드를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일 실시형태에서 제1 이식유전자가 TCR의 알파 및/또는 베타 쇄에 특이적인 경우, 추가 단백질은 예를 들어 뮤로모납-CD3(라고도 공지됨 OKT3), 오텔릭시주맙(TRX4라고도 공지됨), 테플리주맙(hOKT3γ1(Ala-Ala)라고도 공지됨) 또는 비실리주맙으로부터 독립적으로 선택된, 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편이다.
일 실시형태에서 항-TCR 항체는 또 다른 단백질의 막관통 영역, 예를 들어 IgG의 세포 표면 형태 또는 PDGF 수용체로부터의 막관통 도메인을 갖는 융합 단백질의 부분인, 항체 단편(예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편), 예를 들어 scFv 형태로 존재한다.
일 실시형태에서 항체 저해제(길항성 항체)는 혈관신생 인자의 저해제, 예컨대 항-VEGF 항체 분자, 및 T 세포 불활성화 인자의 저해제, 예컨대 항-CTLA-4, 항-PD1 또는 항-PDL1 항체 분자를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일 실시형태에서 항체 분자는 CD40, GITR, OX40, CD27 및 4-1BB에 대한 항체를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택된 효능제이다.
일 실시형태에서 추가적인 이식유전자는 IL-2, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, GM-CSF, IL-15, IL-12 및 fms-관련된 타이로신 카이나제 3 리간드(FLT3L)를 포함하는 군으로부터 선택된 사이토카인, 또는 이의 가요성 변이체를 암호화한다. 이롭게는, 특히 암 세포로부터 분비된 유리 단백질로서의 바이러스에 의해서 발현된 단백질의 이러한 군 중 1종 이상은 암 생체내에서 면역 반응을 세포에 대해서 자극시키기에 특히 적합할 수 있다.
일 실시형태에서 추가적인 이식유전자는 MIP1-알파, RANTES, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19 및 CCL21을 포함하는 군으로부터 선택된, 케모카인을 암호화한다. 이롭게는, 단백질의 이러한 군 중 1종 이상은 바이러스에 의해서 발현되는데, 그 이유는 암 세포로부터 분비될 수 있는 유리 단백질이 면역 세포를 생체내에서 암 세포에 대해서 매력적으로 만들고, 면역 반응을 자극시키기에 특히 적합할 수 있기 때문이다.
일 실시형태에서 추가적인 이식유전자는 CXCR2, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CXCR3, CXCR4, CXCR5 및 CRTH2를 포함하는 군으로부터 선택된, 케모카인 수용체에 대해서 특이적인 리간드를 암호화한다.
일 실시형태에서 감염된 암 세포의 표면 상에서 발현된 적어도 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편(예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편)에 더하여, 1종 이상의 분자가 또한 표면 상에서 발현 및/또는 분비된다.
따라서 일 실시형태에서 비-아데노바이러스는 B7-1, B7-2 또는 이들 중 임의의 것의 활성 단편 또는 이들의 조합물을 암호화한다.
따라서 일 실시형태에서 비-아데노바이러스는 감염된 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위해서 B7-1, B7-2 또는 이들 중 임의의 것의 활성 단편 또는 이들의 조합물 및 또한 암 세포 표면 상에서의 발현을 위해서 항-TCR(효능제, 예컨대 CD3 효능제) 항체 또는 항체 단편(예컨대 scFv)을 암호화하고, 특히 여기서 이러한 단백질은 세포 표면 상에서 개별 단백질로서 발현된다.
따라서 일 실시형태에서 비-아데노바이러스는 감염된 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위해서 B7-1, B7-2 또는 이들 중 임의의 것의 활성 단편 또는 이들의 조합물 및 또한 암 세포 표면 상에서의 발현을 위해서 또는 예를 들어 분비에 의한 또는 감염된 암 세포의 용해/사멸 후에 암 세포로부터의 방출을 위해서 또는 항-VEGF(길항제) 항체를 암호화한다.
따라서 일 실시형태에서 비-아데노바이러스는 감염된 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위해서 B7-1, B7-2 또는 이들 중 임의의 것의 활성 단편 또는 이들의 조합물 및 또한 암 세포 표면 상에서의 발현을 위해서 또는 예를 들어 분비에 의한 또는 감염된 암 세포의 용해/사멸 후에 암 세포로부터의 방출을 위해서 CD3, CD28, CD80, CD86, 4-1BB, GITR, OX40, CD27, CD40에 결합하는 항체, 항체 단편 또는 단백질 리간드를 암호화한다.
따라서 일 실시형태에서 비-아데노바이러스는 감염된 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위해서 B7-1, B7-2 또는 이들 중 임의의 것의 활성 단편 또는 이들의 조합물 및 예를 들어, 특히 분비에 의한 또는 감염된 암 세포의 세포 용해/사멸 후에 암 세포로부터의 방출을 위해서 IL-2, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, GM-CSF, IL-15, IL-12 및 FLT3L로부터 선택된 사이토카인을 암호화한다.
따라서 일 실시형태에서 비-아데노바이러스는 감염된 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위해서 B7-1, B7-2 또는 이들 중 임의의 것의 활성 단편 또는 이들의 조합물 및 예를 들어 특히 분비에 의한 또는 감염된 암 세포의 세포 용해/사멸 후에 암 세포로부터의 방출을 위해서 MIP1-알파, RANTES, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21로부터 선택된 케모카인을 암호화한다.
따라서 일 실시형태에서 비-아데노바이러스는 감염된 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위해서 B7-1, B7-2 또는 이들 중 임의의 것의 활성 단편 또는 이들의 조합물 및 또한 암 세포 표면 상에서의 발현을 위해서 항-TCR(효능제, 예컨대 CD3 효능제) 항체 또는 항체 단편(예컨대 ScFv)(특히 단백질이 세포 표면 상에서 개별 단백질로서 발현되는 경우)을 암호화하고, 예를 들어 암 세포, 특히 분비에 의한 또는 감염된 암 세포의 세포 용해/사멸 후에, 암 세포로부터의 방출을 위해서 IL-2, IFN-알파, IFN-감마, GM-CSF, IL-15, IL-12, FLT3L, MIP1-알파, RANTES, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21로부터 선택된 사이토카인 또는 케모카인을 추가로 암호화한다.
따라서 일 실시형태에서 비-아데노바이러스는 감염된 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위해서 B7-1, B7-2 또는 이들 중 임의의 것의 활성 단편 또는 이들의 조합물 및 또한 암 세포 표면 상에서의 발현을 위해서 항-TCR(효능제) 항체 또는 항체 단편(예컨대 ScFv)(특히 단백질이 세포 표면 상에서 개별 단백질로서 발현되는 경우)을 암호화하고, 또한 암 세포 표면 상에서의 발현을 위해서 또는 암 세포, 예를 들어 분비에 의한 또는 감염된 암 세포의 용해/사멸 후에 암 세포로부터의 방출을 위해서 CD28, CD80, CD86, 4-1BB, GITR, OX40, CD27, CD40 또는 항-VEGF(길항제) 항체에 결합하는 항체, 항체 단편 또는 단백질 리간드를 추가로 암호화한다.
따라서 일 실시형태에서 비-아데노바이러스는 감염된 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위해서 B7-1, B7-2 또는 이들 중 임의의 것의 활성 단편 또는 이들의 조합물 및 예를 들어 특히 분비에 의한 또는 감염된 암 세포의 세포 용해/사멸 후에 암 세포로부터의 방출을 위해서 IL-2, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, GM-CSF, IL-15, 및 IL-12, FLT3L, MIP1-알파, RANTES, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21로부터 선택된 2종의 상이한 사이토카인 또는 케모카인을 암호화한다.
따라서 일 실시형태에서 비-아데노바이러스는 감염된 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위해서 B7-1, B7-2 또는 이들 중 임의의 것의 활성 단편 또는 이들의 조합물 및 또한 암 세포 표면 상에서의 발현을 위해서 항-TCR(효능제, 예컨대 CD3 효능제) 항체 또는 항체 단편(예컨대 scFv)(특히 단백질이 세포 표면 상에서 개별 단백질로서 발현되는 경우)을 암호화하고, 특히 감염된 암 세포의 세포 용해/사멸 이전 및 이후에 분비에 의해서 암 세포로부터 방출될 수 있는 IL-2, IFN-알파, IFN-감마, GM-CSF, IL-15 및 IL-12로부터 선택된 사이토카인 및 또는 RANTES(CCL5), MIP1α(LD78α(CCL3) 또는 LD78β(CCL3L1) 아이소폼), MIP1β로부터 선택된 케모카인을 추가로 암호화한다.
특히 상기 실시형태 중 임의의 것과 조합될 수 있는 일 실시형태에서 바이러스는 항-PD-1 항체(길항제)를 추가로 암호화한다.
일 실시형태에서 세포막 발현을 위해서 이식유전자 카세트에서 암호화된 단백질 또는 단백질들은 또한 막관통 도메인과 세포외 리간드 결합 도메인 사이에 펩타이드 링커 또는 스페이서를 포함할 수 있다. 이러한 링커 또는 스페이서는 세포 표면 발현된 단백질에 가요성을 부여하여 인접한 세포 상의 이의 표적 분자와 상호작용하는 단백질의 능력을 향상시킬 수 있다. 이러한 링커 또는 스페이서는 또한 다이설파이드 결합 형성 또는 단백질-단백질 상호작용을 통해서, 세포 표면에서 단백질의 이량체화 또는 삼량체화를 촉진시키도록 설계 또는 선택될 수 있다. 예를 들어 면역글로불린 분자 또는 CD8의 힌지 영역은 가요성 및 이량체화 둘 모두를 향상시키기 위해서 사용될 수 있다.
일 실시형태에서 이식유전자 카세트에서 암호화된 단백질 또는 단백질들은 또한 펩타이드 태그를 포함할 수 있다. 펩타이드 태그는 c-myc, 폴리-히스티딘, V5 또는 FLAG 태그를 포함할 수 있고, 세포내에서 또는 세포외에서, 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단 상에 위치될 수 있거나, 또는 예를 들어, 세포외 루프에서 또는 막관통 도메인과 세포외 도메인 사이에서 단백질 내에 암호화될 수 있다. 펩타이드 태그는 상이한 단백질 도메인들, 예컨대 막관통 도메인과 세포외 도메인 사이에서 스페이서 또는 링커로서 사용될 수 있고, 단백질의 검출 또는 정제를 위해서 사용될 수 있다.
일 실시형태에서 1종 이상의 추가적인 이식유전자(B7 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자 제외)는 외인성 또는 내인성 프로모터, 예를 들어 내인성 프로모터의 제어 하에 있다. 일 실시형태에서 E3 영역(B2)에서의 이식유전자는 외인성 프로모터의 제어 하에 있다.
일 실시형태에서 1종 이상의 추가적인 이식유전자 유전자는 특히 외인성 프로모터의 제어 하에서, 아데노바이러스 게놈 내의 E3 영역과 파이버(fibre) L5 사이, 예를 들어 식 (I)의 작제물에서 위치 BX에 존재한다. 일 실시형태에서 BX 내의 이식유전자는 외인성의 제어 하에 있다.
일 실시형태에서 1종 이상의 추가적인 이식유전자 유전자는 특히 내인성 프로모터, 예컨대 주요 후기 프로모터의 제어 하에서, 아데노바이러스 게놈 내의 E4 영역과 파이버 L5 사이, 예를 들어 식 (I) 또는 (Ia)의 작제물에서 위치 BY에 존재한다. 이것은 영역 BY에서 암호화된 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편(예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편)을 암호화하는 유전자에 더하여 존재할 수 있다.
일 실시형태에서 본 개시내용에 따른 암살상 바이러스 또는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물, 예를 들어, 특히 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 예컨대 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일 실시형태에서 치료에 사용하기 위한, 특히 암의 치료에 사용하기 위한, 본 개시내용에 따른 암살상 바이러스 또는 바이러스 벡터 또는 이를 포함하는 조성물이 제공된다.
일 실시형태에서 치료적 유효량의 본 개시내용에 따른 암살상 바이러스 또는 바이러스 벡터 또는 이를 포함하는 조성물, 예컨대 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
일 실시형태에서 암, 특히 암종, 예를 들어 직장결장암, 폐암, 방광암, 신장암, 췌장암, 간암, 두경부암, 유방암 또는 난소암의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 개시내용에 따른 암살상 바이러스 또는 바이러스 벡터 또는 이를 포함하는 조성물의 용도가 제공된다.
일 실시형태에서 본 개시내용에 따른 바이러스 중 적어도 50%(예를 들어 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%)의 게놈 서열을 포함하고, 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편(예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편)을 암호화하는 서열, 예를 들어 본 명세서에 개시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 일 실시형태에서 폴리뉴클레오타이드 서열은 플라스미드의 형태로 존재한다.
일 실시형태에서 본 개시내용에 따른 암살상 바이러스 또는 바이러스 벡터 또는 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 예컨대 HEK293 세포 또는 이의 유도체가 제공된다.
일 실시형태에서 항-TCR 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 결합 단편)를 암살상 바이러스 또는 바이러스 벡터 내에 삽입하는 단계를 포함하는 본 개시내용에 따른 암살상 바이러스 또는 바이러스 벡터의 제조 방법에 제공된다.
일 실시형태에서 복제에 적합한 조건 하에서 바이러스의 존재 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 본 개시내용에 따른 바이러스 또는 바이러스 물질을 복제하는 방법이 제공된다. 일반적으로 방법은 바이러스를, 예를 들어 상청액으로부터 또는 숙주 세포의 용해 후에 수거하는 추가 단계를 포함할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 이식유전자는 바이러스 또는 바이러스 벡터의 게놈 서열에 삽입된 유전자를 지칭하는데, 여기서 유전자는 바이러스에 대해서 비자연성(외인성)이거나 또는 바이러스에서의 특정 위치에서 일반적으로 발견되지 않는다. 이식유전자의 예가 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 이식유전자는 삽입되는 경우 전장 유전자의 기능 또는 기능의 대부분, 예를 들어, 기능의 50% 이상을 수행하기에 적합한 유전자의 부분인 유전자의 기능적 단편을 또한 포함한다.
이식유전자 및 암호 서열은 그 맥락이 달리 나타내지 않는 한, 바이러스 게놈 내의 삽입물의 맥락에서 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 암호 서열은, 예를 들어 기능성 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 의미한다. 전형적으로 암호 서열은 관심 기능성 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 이식유전자를 위한 cDNA이다. 관심 기능성 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질은 하기에 기술되어 있다.
일 실시형태에서 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 이식유전자는 하나의 유기체로부터 단리되고, 상이한 유기체, 즉 본 개시내용의 바이러스에 도입되는 유전자 또는 cDNA 서열을 함유하는 DNA의 분절을 지칭한다. 일 실시형태에서 DNA의 이러한 비-네이티브 분절은 일반적으로 기능성 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 생산하는 능력을 보유할 것이다. 사용되는 이식유전자는 예를 들어 키메라 단백질 또는 융합 단백질을 암호화할 수 있다.
명백하게 바이러스 게놈은 DNA의 암호 서열을 함유한다. 바이러스의 게놈 서열 내의 내인성(자연 발생 유전자)은 이후에 재조합 기술에 의해서 변형되지 않는 한, 예컨대 그것이 비-자연 위치 또는 비-자연 환경에 존재하지 않는 한, 본 명세서의 맥락 내에서 이식유전자인 것으로 간주되지 않는다.
따라서 일 실시형태에서 삽입된 이식유전자는 인간 또는 인간화 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 융합 단백질은 적어도 2종의 단백질 또는 단편 또는 적어도 1종의 단백질과 예를 들어 링커에 의해서 서로에 직접 융합되거나 부착된 적어도 1종의 단편의 조합물을 지칭한다. 일 실시형태에서 본 개시내용의 융합 단백질은 B7 단백질 또는 이의 활성 단편을 포함하지 않는다. B7 단편 또는 단백질 및 추가적인 단백질은 본 명세서에서 키메라 단백질이라고 지칭되지 않는다. 상이한 B7 단백질로부터의 단편을 함유하는 단백질 만이 본 명세서에서 키메라라고 지칭된다.
주어진 단백질 단편의 활성도는 예를 들어, 비교인자로서 전장 단백질을 사용하여 상응하는 시험관내 검정으로 분석될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 키메라 단편은 상이한 기원으로부터의 2종 이상의 단백질로부터의 서열을 포함하는 단편을 지칭한다.
B7 단백질은 B7-1(CD80 유니프로트 번호 P33681이라고도 공지됨), B7-2(CD86 유니프로트 번호 P42081이라고도 공지됨)를 포함한다. 이들 단백질은 CD28 및 CTLA-4에 결합한다.
일 실시형태에서 CD80은 하기 서열을 갖는다:
Figure pct00006
다른 B7 단백질은 B7-DC(PDCD1LG2 및 PD-L2 유니프로트 번호 Q9BQ51이라고도 공지됨), B7-H1(PD-L1 및 CD274 유니프로트 번호 Q9NZQ7이라고도 공지됨)를 포함한다. 이들 단백질 둘 모두는 PD-1에 결합한다.
프로그래밍된 사멸-리간드 1(programmed death-ligand 1: PD-L1)은 면역계를 억제하는 데 중요한 역할을 한다고 예상된 40kDa 타입 1 막관통 단백질이다. PD-L1의 상향조절은 암이 숙주 면역계를 회피하도록 할 수 있는 것으로 보인다. 신장 세포 암종을 갖는 환자로부터의 196개의 종양 시편의 분석은 PD-L1의 높은 종양 발현이 증가된 종양 침입력 및 4.5-배 증가된 사망 위험과 연관되었다는 것을 발견하였다. PD-L1의 더 높은 발현을 갖는 난소암 환자는 더 낮은 발현을 갖는 환자보다 상당히 더 불량한 예후를 가졌다. PD-L1 발현은 상피내 CD8+ T-림프구 계수치와 역의 상관관계가 있는데, 이는 종양 세포 상의 PD-L1이 항종양 CD8+ T 세포를 억제할 수 있다는 것을 시사한다. 그 효과는 종양 유형 의존성일 수 있고; 비-소세포 폐암을 갖는 환자에 대한 연구는 더 높은 PD-L1 단백질 및 mRNA 발현이 증가된 국소적 림프구 침윤 및 더 긴 생존과 연관된다는 것을 나타냈다. 다수의 항-PDL1 항체가 임상 시험에서 몇몇 암을 치료하기 위해서 흥미로운 것으로 밝혀져 있다.
일 실시형태에서 적어도 세포질(B7-DC 및/또는 B7-H1의 세포내 도메인)이 결실되거나 비-기능성이다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 세포내 도메인의 제거는 용해에 내성인 암 세포를 감소시킨다는 것을 시사하는 증가가 있다(Blood 2008, April 1; 111(7) 3635-3643).
일 실시형태에서 B7-DC 및/또는 B7-H1의 막관통 도메인 단편 만이 사용된다. 일 실시형태에서 하기 단백질은 전장 단백질 B7-DC 및 B7-H1로서 제공되지 않는다.
다른 B7 단백질은 B7-H2(ICOSLG, B7RP1, CD275 유니프로트 번호 O75144라고도 공지됨)(이것은 ICOS에 결합함), B7-H3(CD276 유니프로트 번호 Q5ZPR3이라고도 공지됨), B7-H4(VTCN1 유니프로트 번호 Q727D3이라고도 공지됨), B7-H5(VISTA라고도 공지됨, 혈소판 수용체 Gi24, SISP1), B7-H6(NCR3LG1, NR3L1이라고도 공지됨)(이것은 NKp30에 결합함), B7-H7(HHLA2라고도 공지됨)(이것은 CD28H에 결합함)를 포함한다.
일 실시형태에서 단편은 임의의 하나의 B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6 및 B7-H7의 막관통 도메인 만을 포함한다.
개별 단백질은 단일 단백질, 즉 융합 단백질(키메라 단백질 포함)의 부분 및 또한 융합 단백질이 아닌 단백질 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 일 실시형태에서 개별 단백질은 단일 단백질(이의 활성 단편 포함)이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 GPI 앵커는 번역후 변형 동안 단백질의 C-말단에 부착될 수 있는 당지질을 지칭한다. 그것은 탄수화물-함유 링커(이노시톨 잔기에 글리코시드 결합된 글루코사민 및 만노스)를 통해서 그리고 성숙 단백질의 C-말단 아미노산에 대한 에탄올아민 포스페이트(EtNP)를 통해서 연결된 포스파티딜이노시톨기로 구성된다. 소수성 포스파티딜-이노시톨기 내의 2개의 지방산은 단백질을 세포막에 앵커링시킨다.
글리피화된(glypiated)(GPI-연결된) 단백질은 신호 펩타이드를 함유하고, 따라서 그것을 소포체(ER)로 안내한다. C-말단은 ER 막에 삽입되어 존재하는 소수성 아미노산으로 구성된다. 이어서 소수성 단부는 절단되어, GPI-앵커에 의해서 대체된다. 단백질이 분비 경로를 통해서 가공되기 때문에, 그것은 소포를 통해서 골지체로 전달되고, 결국 세포막의 외부 리플릿(exterior leaflet)에 부착되어 유지되는 세포외 공간으로 전달된다. 글리피화는 막에 대한 이러한 단백질의 부착의 유일한 수단이기 때문에, 포스포리파제에 의한 이러한 기의 절단은 막으로부터의 단백질에 제어된 방출을 유발할 것이다. 후자 기전이 시험관내에서 사용되고; 즉 효소 검정법에서 막으로부터 방출된 막 단백질은 글리피화된 단백질이다.
포스포리파제 C(PLC)는 GPI-앵커링된 단백질에서 발견되는 포스포-글리세롤 결합을 전달하는 것으로 공지된 효소이다. PLC로의 처리는 외부 세포막으로부터 GPI-연결된 단백질의 방출을 유발할 것이다. T-세포 마커 Thy-1 및 아세틸콜린에스터라제, 뿐만 아니라 장 및 태반 알칼린 포스파타제 둘 모두는 GPI-연결된 것으로 공지되어 있고, PLC로의 처리에 의해서 방출된다. GPI-연결된 단백질은 지질 유동섬(lipid raft) 내에 우선적으로 위치된다고 생각되는데, 이는 원형질막 미세도메인 내에서의 높은 수준의 조직을 시사한다.
퍼거슨(Ferguson), 키노시타(Kinoshita) 및 하트(Hart)에 의해서 작성된 GPI 앵커의 검토는 문헌[Chapter 11 of Essentials of Glycobiology 2nd Edition]으로부터 입수 가능하다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 바이러스는 그 맥락이 달리 나타내지 않는 한 암살상 복제 적격 바이러스(또는 아데노바이러스) 또는 복제 결핍 바이러스 벡터(아데노바이러스 벡터)를 지칭한다.
일 실시형태에서 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스이다. "아데노바이러스", "혈청형(serotype)" 또는 "아데노바이러스 혈청형"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 50개를 초과하는 현재 공지된 아데노바이러스 혈청형 중 임의의 것으로 배정될 수 있는 임의의 아데노바이러스를 지칭하는데, 이것은 하위 군 A 내지 F로 분류되고, 임의의, 아직 식별되지 않거나 또는 분류되지 않은 아데노바이러스 혈청형으로 추가로 확장된다. 예를 들어, 문헌[Strauss, "Adenovirus infections in humans," in The Adenoviruses, Ginsberg, ea., Plenum Press, New York, NY, pp. 451-596 (1984)] 및 [Shenk, "Adenoviridae: The Viruses and Their Replication," in Fields Virology, Vol.2, Fourth Edition, Knipe, 35ea., Lippincott Williams & Wilkins, pp. 2265-2267 (2001)]을 참고하기 바라며, 표에 제시된 바와 같다.
Figure pct00007
일 실시형태에서 아데노바이러스는 예를 들어 하기를 포함하거나 이들로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하위군 B이다: Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34 및 Ad51, 예컨대 Ad11, 특히 Ad11p(슬로비스키 균주(Slobitski strain)). 일 실시형태에서 본 발명의 아데노바이러스는 하위군 B 아데노바이러스, 예컨대 Ad11, 특히 Ad11p의 캡시드, 예컨대 헥손 및/또는 파이버를 갖는다. 일 실시형태에서 아데노바이러스는 Ad11이거나 또는 Ad11, 예컨대 Ad11p의 파이버 및/또는 헥손 및/또는 펜톤을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 Ad11 바이러스의 유도체는 적어도 Ad11의 캡시드를 갖는 바이러스를 지칭한다.
일 실시형태에서 그것은 군 A 바이러스가 아니다.
에나데노터시레브(EnAd)는 Ad11p로부터의 파이버, 펜톤 및 핵손을 갖는, 이전에 EnAd라 공지된 키메라 암살상 아데노바이러스(WO2005/118825)이고, 따라서 그것은 하위군 B 바이러스이다. 그것은 Ad11p 및 Ad3으로부터의 DNA를 포함하는 키메라 E2B 영역을 갖는다. E3 영역의 거의 전부 및 E4 영역의 부분은 EnAd에서 결실되어 있다. 따라서, 생존을 유지하면서 추가적인 유전 물질을 수용하기 위해서 게놈 내에 상당한 공간을 갖는다. 추가로, EnAd는 하위군 B 아데노바이러스이기 때문에, 인간에서 미리 존재하는 면역은 예를 들어, Ad5보다 덜 일반적이다. Ad11 파이버, 펜톤 및 헥손을 갖는 키메라 암살상 바이러스의 다른 예는 OvAd1 및 OvAd2를 포함한다(국제 특허 제WO2006/060314호 참고).
EnAd는 종양 세포를 우선적으로 감염시키고, 이들 세포에서 신속하게 복제하고, 세포 용해를 유발하는 것 같다. 이것은 결국 염증 면역 반응을 생성하고, 이에 의해서 신체를 자극하여 또한 암과 싸울 수 있다. EnAd의 성공의 부분은 생체내에서 바이러스의 신속한 복제에 관련된다고 추정된다.
중요하게는, EnAd가 (예를 들어 정맥내 또는 복강내 주사 또는 주입에 의해서) 전신에 투여고, 이어서 그 다음 선택적으로 감염시키고, 종양 세포 내에서 단백질을 발현시킬 수 있다는 것이 임상적으로 입증되었다. Ad11p 및 다른 군 B 아데노바이러스, 특히 Ad11p의 캡시드 단백질을 발현시키는 것(예컨대 본 명세서에 기술된 것)에 의해서 공유될 수 있는 EnAd의 이러한 특성은, 이식유전자를 종양에 직접 주사(이것은 많은 암에 실현 가능하지 않음)할 필요 없이 암 세포의 표면 상에서 단백질을 발현시키는 것을 가능하게 한다.
EnAd가 종양 세포를 선택적으로 용해시키면서, 추가 이로운 특성, 예를 들어 바이러스의 치료 활성도를 증가시키는 것, 또는 바이러스를 이식유전자, 예컨대 세포 신호전달 단백질 또는 항체를 암호화하는 이식유전자 또는 세포 신호전달 단백질(들)을 자극하는 실체를 암호화하는 이식 유전자로 무장시킴으로써 바이러스의 부작용을 감소시키는 것을 도입하는 것이 가능할 수 있다.
이롭게는 바이러스를, 암 세포 내부에서 발현될 수 있는 특정 단백질을 암호화하는 DNA로 무장시키는 것은, 예를 들어 세포를 면역계에 대해서 더 잘 보이게 하거나 또는 치료 유전자/단백질을 표적 종양 세포에 우선적으로 전달함으로써, 종양 세포와 싸우기 위해서 신체 자신의 방어를 사용할 수 있게 한다.
일 실시형태에서 본 개시내용의 암살상 바이러스 또는 바이러스 물질은 종양과 싸우도록 환자의 면역계를 자극시키고, 예를 들어 항-CD3 항체는 생체내에서 T 세포를 자극시킨다.
일 실시형태에서 암살상 바이러스는 동일한 혈청형 예를 들어, Ad11, 특히 Ad11p(예를 들어, 후자의 게놈 서열의 위치 30812-31789, 18254-21100 및 13682-15367에서 발견됨)로부터의 파이버, 헥손 및 펜톤 단백질을 갖고, 여기서 뉴클레오타이드 위치는 젠뱅크(Genbank) ID 217307399(수탁 번호: GC689208)에 대한 것이다.
일 실시형태에서 아데노바이러스는 에나데노터시레브(EnAd 및 이전에 ColoAd1이라고도 공지됨)이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 에나데노터시레브는 서열번호 21의 키메라 아데노바이러스를 지칭한다. 그것은 야생형 아데노바이러스에 비해서 향상된 치료 특성을 갖는 복제 적격 암살상 키메라 아데노바이러스이다(국제 특허 제WO2005/118825호 참고). EnAd는 Ad11p 및 Ad3으로부터의 DNA, 및 E3/E4에서의 결실을 특징으로 하는, 키메라 E2B 영역을 갖는다. 에나데노터시레브에서의 구조적 변화는 Ad11p보다 대략 3.5kb 더 작은 게놈을 유발하고, 이에 의해서 이식유전자의 삽입을 위해서 추가적인 "공간"을 제공한다.
본 개시내용의 융합 단백질에 사용하기에 적합한 링커는 하기를 포함한다:
Figure pct00008
서열번호 22 내지 30(연관된 서열 목록 참고)에 제시된 힌지 링커 서열;
Figure pct00009
가요성 링커 서열 GS 및 또한 서열번호 31 내지 70(연관된 서열 목록 참고)에 제시된 서열;
Figure pct00010
서열번호 73 내지 86에 제시된 링커 서열.
강성 링커의 예는 펩타이드 서열 GAPAPAAPAPA(서열번호 71), PPPP(서열번호 72) 및 PPP를 포함한다
식 (I) 및 (Ia)과 관련된 정의
결합은 하나의 DNA 서열을 또 다른 DNA 서열에 연결하는, 예를 들어 바이러스 게놈의 하나의 섹션을 또 다른 것에 연결하는 공유 결합을 지칭한다. 따라서 본 명세서에서 식 (I) 및 (Ia)에서의 변수가 결합을 나타내는 경우, 결합에 의해서 표현된 특징부 또는 요소는 존재하지 않고, 즉 결실된다.
아데노바이러스의 구조는 일반적으로 유사하기 때문에 하기의 요소는 구조적 요소 및 통상의 기술자에게 공지된, 이를 지칭하는 일반적으로 사용되는 명명법의 측면에서 논의된다. 요소가 본 명세서에서 지칭된 경우, 본 발명자들은 요소를 암호화하는 DNA 서열 또는 아네노바이러스 내의 요소의 동일한 구조 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 지칭한다. 후자는 DNA 암호의 중복으로 인해서 관련된다. 최적화된 결과를 위해서는 코돈 사용에 대한 바이러스의 선호도를 고려할 필요가 있을 수 있다.
본 개시내용의 바이러스에서 사용되는 아데노바이러스로부터의 임의의 구조적 요소는 자연 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어질 수 있거나 또는 주어진 길이에 대해서 적어도 95%, 예컨대 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 유사성을 가질 수 있다. 본래 서열은 유전 물질의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%를 누락하도록 변형될 수 있다. 통상의 기술자는 변화시키는 경우 구조 단백질의 발현이 방해되지 않도록 바이러스의 리딩 프레임이 방해되지 않아야 한다는 것을 인식한다.
일 실시형태에서 주어진 요소는 전장 서열, 즉 전장 유전자이다.
일 실시형태에서 주어진 요소는 전장보다 짧고, 전장 서열과 동일하거나 또는 상응하는 기능을 보유한다.
일 실시형태에서 본 개시내용의 작제물에서 임의적인 주어진 요소의 경우, DNA 서열은 전장보다 짧을 수 있고, 기능성을 갖지 않고, 예를 들어, E3 영역이 전체적으로 또는 부분적으로 결실될 수 있다.
아데노바이러스의 구조 또는 기능 단백질을 암호화하는 구조 유전자는 일반적으로 DNA의 비-암호 영역에 연결된다. 따라서 이식유전자를 본 개시내용의 바이러스에 삽입하려는 목적을 위해서 관심 구조 요소(특히 이의 비-암호 영역)의 게놈 서열을 절단하는 부분에 대한 일부 유연성이 존재한다. 따라서 본 명세서의 목적을 위해서, 요소는 그것이 목적에 부합하고, 관련없는 물질을 암호화하지 않는 정도까지 참조의 구조 요소인 것으로 간주될 것이다. 따라서, 적절한 경우 유전자는 예를 들어, 바이러스의 자연 구조에서 발견되는 바와 같은 적합한 비-암호 영역과 연관될 것이다.
따라서 일 실시형태에서 삽입물, 예컨대 제한 부위 및/또는 이식유전자를 암호화하는 DNA는 게놈 바이러스 DNA의 비-암호 영역, 예컨대 인트론 또는 유전자간 서열에 삽입된다. 그렇긴 하지만, 아데노바이러스의 이러한 일부 비-암호 영역이 예를 들어, 대안적인 스플라이싱, 전사 조절 또는 번역 조절의 기능을 가질 수 있고, 이는 고려될 필요가 있을 수 있다.
L5 영역과 연관된, 본 명세서에서 식별된 부위는 복합체 실체, 예컨대 RNAi, 사이토카인, 단일 쇄 또는 다량체 단백질, 예컨대 항체를 암호화하는 다양한 DNA 서열을 수용하기에 적합하다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 유전자는 암호 서열 및 이와 연관된 임의의 비-암호 서열, 예를 들어 인트론 및 연관된 엑손을 지칭한다. 일 실시형태에서 유전자는 필수 구조 성분, 예를 들어 암호 영역 만을 포함하거나, 이들로만 이루어진다.
하기에 아데노바이러스의 특이적인 구조 요소에 관련된 논의가 이어진다.
반전 말단 반복부(ITR) 서열은 모든 공지된 아데노바이러스에 공통적이고, 이의 대칭성으로 인해서 이렇게 명명되며, 바이러스 염색체 복제 기점이다. 이들 서열의 또 다른 특성은 헤어핀을 형성하는 이의 능력이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 5'ITR은 아데노바이러스의 5' 단부로부터의 ITR의 부분 또는 전부를 지칭하는데, 이것은 적절한 위치에서 아데노바이러스에 혼입되는 경우 ITR의 기능을 보유한다. 일 실시형태에서 5'ITR은 서열번호 82의 약 1bp 내지 138bp의 서열 또는 전체 길이를 따라서 이와 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열, 특히 서열번호 21의 약 1bp 내지 138bp로 이루어진 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 3'ITR은 아데노바이러스의 3' 단부로부터의 ITR의 부분 또는 전부를 지칭하는데, 이것은 적절한 위치에서 아데노바이러스에 혼입되는 경우 ITR의 기능을 보유한다. 일 실시형태에서 3'ITR은 서열번호 82의 약 32189bp 내지 32326bp의 서열 또는 전체 길이를 따라서 이와 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열, 특히 서열번호 21의 약 32189bp 내지 32326bp로 이루어진 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 B1은 아데노바이러스로부터의 E1A의 부분 또는 전부, 아데노바이러스로부터의 E1B 영역의 부분 또는 전부, 및 독립적으로 아데노바이러스의 E1A 및 E1B 영역의 부분 또는 전부를 암호화하는 DNA 서열을 지칭한다.
B1이 결합인 경우, E1A 및 E1B 서열은 바이러스로부터 누락될 것이다. 일 실시형태에서 B1은 결합이고, 따라서 바이러스는 벡터이다.
일 실시형태에서 B1은 이식유전자를 추가로 포함한다. E1 영역은 (즉, 서열의 "중간" 내의) E1 영역 내로 파괴적 방식으로 삽입될 수 있는 이식유전자를 수용할 수 있거나, 또는 E1 영역의 부분 또는 전부는 결실되어 유전 물질을 수용하기 위한 더 많은 공간을 제공할 수 있다는 것이 관련 기술 분야에 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 E1A는 아데노바이러스 E1A 영역의 부분 또는 전부를 암호화하는 DNA 서열을 지칭한다. 본 명세서에서 후자는 폴리펩타이드/단백질 E1A를 지칭한다. 그것은 E1A 유전자에 의해서 암호화된 단백질이 보존성 또는 비-보존성 아미노산 변화를 갖도록; 그것이 야생형(즉, 상응하는 비-돌연변이된 단백질)과 동일한 기능을 갖도록; 야생형 단백질에 비해서 증가된 기능을 갖도록; 야생형 단백질에 비해서 감소된 기능을 갖도록, 예컨대 기능을 갖지 갖도록; 또는 적절한 경우 야생형 단백질 또는 이들의 조합물에 비해서 새로운 기능을 갖도록 돌연변이될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 E1B는 아데노바이러스 E1B 영역(즉, 폴리펩타이드 또는 단백질)의 부분 또는 전부를 암호화하는 DNA 서열을 지칭하고, 그것은 E1B 유전자/영역에 의해서 암호화된 단백질이 보존성 또는 비-보존성 아미노산 변화를 갖도록; 그것이 야생형(즉, 상응하는 비-돌연변이된 단백질)과 동일한 기능을 갖도록; 야생형 단백질에 비해서 증가된 기능을 갖도록; 야생형 단백질에 비해서 감소된 기능을 갖도록, 예컨대 기능을 갖지 않도록; 또는 적절한 경우 야생형 단백질 또는 이들의 조합물에 비해서 새로운 기능을 갖도록 돌연변이될 수 있다.
따라서 B1은 야생형 E1 영역, 예컨대 야생형 E1A 및/또는 E1B에 비해서 변형 또는 비변형될 수 있다. 통상의 기술자는 E1A 및/또는 E1B가 존재하거나 (부분적으로) 결실되거나 돌연변이화되는지를 용이하게 식별될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 야생형은 공지된 아데노바이러스를 지칭한다. 공지된 아데노바이러스는 서열이 입수가능한지의 여부에 관계없이, 식별 및 명명된 것이다.
일 실시형태에서 B1은 서열번호 21의 139bp 내지 3932bp의 서열을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 BA는 적절한 경우 임의의 비-암호 서열(특히 아데노바이러스로부터의 자연 서열에 상응함)을 비롯한 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4 영역을 암호화하는 DNA 서열을 지칭한다. 일반적으로, 이러한 서열은 이식유전자를 포함하지 않을 것이다. 일 실시형태에서 서열은 공지된 아데노바이러스, 예를 들어 표 1에 제시된 혈청형, 특히 군 B 바이러스, 예를 들어 Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35, Ad51 또는 이들의 조합물, 예컨대 Ad3, Ad11 또는 이들의 조합물로부터의 인접 서열과 실질적으로 유사하거나 동일하다. 일 실시형태에서 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4는 영역과 연관된 이들 요소 및 다른 구조 요소를 포함하는 것으로 지칭하고, 예를 들어, BA는 일반적으로 예를 들어 IV2A IV2a-E2B-L1-L2-L3-E2A-L4와 같은 단백질 IV2a를 암호화하는 서열을 포함할 것이다.
일 실시형태에서 E2B 영역은 키메라이다. 즉, 2종 이상의 상이한 아데노바이러스 혈청형, 예를 들어 Ad3 및 Ad11, 예컨대 Ad11p로부터의 DNA 서열을 포함한다. 일 실시형태에서 E2B 영역은 서열번호 21의 5068bp 내지 10355bp의 서열 또는 전체 길이에 걸쳐서 이와 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 갖는다.
일 실시형태에서 성분 BA 내의 E2B는 서열번호 87(국제 특허 제WO2005/118825호에 개시된 서열번호 3에 상응함)에 제시된 서열을 포함한다.
일 실시형태에서 BA는 서열번호 21의 3933bp 내지 27184bp의 서열을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 E3은 아데노바이러스 E3 영역(즉, 단백질/폴리펩타이드)의 부분 또는 전부를 암호화하는 DNA 서열을 지칭하고, 그것은 E3 유전자에 의해서 암호화된 단백질이 보존성 또는 비-보존성 아미노산 변화를 갖도록; 그것이 야생형(상응하는 비돌연변이된 단백질)과 동일한 기능을 갖도록; 야생형 단백질에 비해서 증가된 기능을 갖도록; 야생형 단백질에 비해서 감소된 기능을 갖도록, 예컨대 기능을 갖지 갖도록; 또는 적절한 경우 야생형 단백질 또는 이들의 조합물에 비해서 새로운 기능을 갖도록 돌연변이될 수 있다.
일 실시형태에서 E3 영역은 표 1에 제공된 아데노바이러스 혈청형 또는 이들의 조합물, 특히 군 B 혈청형, 예를 들어 Ad3, Ad7, Ad11 (특히 Ad11p), Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35, Ad51 또는 이들의 조합물, 예컨대 Ad3, Ad11(특히 Ad11p) 또는 이들의 조합물을 형성한다.
일 실시형태에서 E3 영역은 부분적으로 결실되고, 예를 들어 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%가 결실된다.
일 실시형태에서 B2는 결합이고, 여기서 E3 영역을 암호화하는 DNA는 존재하지 않는다.
일 실시형태에서 E3 영역을 암호화하는 DNA는 이식유전자에 의해서 대체 또는 중단될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "본 명세서에서 사용되는 바와 같은 이식유전자에 의해서 대체된 E3 영역"은 이식유전자에 의해서 대체된 E3 영역의 부분 또는 전부를 포함한다.
일 실시형태에서 B2 영역은 서열번호 21의 27185bp 내지 28165bp의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서 B2는 서열번호 21의 27185bp 내지 28165bp의 서열로 이루어진다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 BX는 BB에서 L5 유전자의 5' 단부 부근의 DNA 서열을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 L5 유전자의 5' 단부 부근 또는 이에 근접한은 L5 유전자의 5' 단부 또는 이와 고유하게 연관된 비-암호 영역에 가까운(인접한) 것, 즉 L5 유전자의 5' 프라임 단부 또는 이와 고유하게 연관된 비-암호 영역에 접경 또는 인접한 것을 지칭한다. 대안적으로, 부근 또는 근접한은 L5 유전자에 가까이 있어서, BX 영역과 L5 유전자의 5' 단부 사이에 암호 서열이 존재하지 않는 것을 지칭한다.
따라서 일 실시형태에서 BX는 예를 들어 L5 유전자의 암호 서열의 시작을 나타내는 L5의 염기에 의해서 직접 연결된다.
따라서 일 실시형태에서 BX는 예를 들어, 비-암호 서열의 시작을 나타내는 L5의 염기에 직접 연결되거나, 또는 L5와 본래 연관된 비-암호 영역에 직접 연결된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 L5와 본래 연관된 비-암호 영역은 L5 유전자의 부분이거나 또는 이와 인접하지만, 또 다른 유전자의 부분이 아닌 비-암호 영역의 부분 또는 전부를 지칭한다.
일 실시형태에서 BX는 서열번호 88의 서열을 포함한다. 이러한 서열은 인공 비-암호 서열이고, 여기서 예를 들어 이식유전자(또는 이식유전자 카세트), 제한 부위 또는 이들의 조합물을 포함하는 DNA 서열이 그 내에 삽입될 수 있다. 이러한 서열이 이로운데, 그 이유는 이것이 바이러스 안정성 및 생존력에 대한 파괴 효과를 최소화하면서 이식유전자의 정확한 위치에 대해서 약간의 융통성을 허용하는 데 있어서 완충제로서 작용하기 때문이다.
삽입(들)은 서열번호 82 내에서 5' 단부로부터, 3' 단부 또는 bp 1 내지 201 사이의 임의의 위치에서, 예를 들어 염기쌍 1/2, 2/3, 3/4, 4/5, 5/6, 6/7, 7/8, 8/9, 9/10, 10/11, 11/12, 12/13, 13/14, 14/15, 15/16, 16/17, 17/18, 18/19, 19/20, 20/21, 21/22, 22/23, 23/24, 24/25, 25/26, 26/27, 27/28, 28/29, 29/30, 30/31, 31/32, 32/33, 33/34, 34/35, 35/36, 36/37, 37/38, 38/39, 39/40, 40/41, 41/42, 42/43, 43/44, 44/45, 45/46, 46/47, 47/48, 48/49, 49/50, 50/51, 51/52, 52/53, 53/54, 54/55, 55/56, 56/57, 57/58, 58/59, 59/60, 60/61, 61/62, 62/63, 63/64, 64/65, 65/66, 66/67, 67/68, 68/69, 69/70, 70/71, 71/72, 72/73, 73/74, 74/75, 75/76, 76/77, 77/78, 78/79, 79/80, 80/81, 81/82, 82/83, 83/84, 84/85, 85/86, 86/87, 87/88, 88/89, 89/90, 90/91, 91/92, 92/93, 93/94, 94/95, 95/96, 96/97, 97/98, 98/99, 99/100, 100/101, 101/102, 102/103, 103/104, 104/105, 105/106, 106/107, 107/108, 108/109, 109/110, 110/111, 111/112, 112/113, 113/114, 114/115, 115/116, 116/117, 117/118, 118/119, 119/120, 120/121, 121/122, 122/123, 123/124, 124/125, 125/126, 126/127, 127/128, 128/129, 129/130, 130/131, 131/132, 132/133, 133/134, 134/135, 135/136, 136/137, 137/138, 138/139, 139/140, 140/141, 141/142, 142/143, 143/144, 144/145, 145/146, 146/147, 147/148, 148/149, 150/151, 151/152, 152/153, 153/154, 154/155, 155/156, 156/157, 157/158, 158/159, 159/160, 160/161, 161/162, 162/163, 163/164, 164/165, 165/166, 166/167, 167/168, 168/169, 169/170, 170/171, 171/172, 172/173, 173/174, 174/175, 175/176, 176/177, 177/178, 178/179, 179/180, 180/181, 181/182, 182/183, 183/184, 184/185, 185/186, 186/187, 187/188, 189/190, 190/191, 191/192, 192/193, 193/194, 194/195, 195/196, 196/197, 197/198, 198/199, 199/200 또는 200/201 사이의 어느 위치에서나 일어날 수 있다.
일 실시형태에서 BX는 bp 27과 bp 28 사이에 삽입된 DNA 서열을 갖는 서열번호 21 또는 서열번호 21의 위치 28192bp와 28193bp 사이에 상응하는 위치를 포함한다.
일 실시형태에서 BX는 서열번호 21의 28166bp 내지 28366bp의 서열을 갖는다. 일 실시형태에서 BX는 결합이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 BB는 L5 영역을 암호화하는 DNA 서열을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 L5 영역은 그 맥락이 적절한 경우, 파이버 폴리펩타이드/단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 서열을 지칭한다. 파이버 유전자/영역은 아데노바이러스의 주요 캡시드 성분인 파이버 단백질을 암호화한다. 파이버는 수용체 인식에서 기능을 하고, 세포에 선택적으로 결합하고, 세포를 감염시키는 아데노바이러스의 능력에 기여한다.
본 개시내용의 바이러스에서 파이버는 임의의 아데노바이러스 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 상이한 혈청형 중 하나에 대해서 파이버를 변화시킨 결과로서의 키메라인 아데노바이러스는 공지되어 있다. 일 실시형태에서 파이버는 군 B 바이러스, 특히 Ad11, 예컨대 Ad11p로부터 유래된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 BY와 관련하여 DNA 서열은 BB의 L5 유전자의 3' 단부 부근의 DNA 서열을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 L5 유전자의 3' 단부 부근 또는 이에 근접한은 L5 유전자의 3' 단부 또는 이와 고유하게 연관된 비-암호 영역에 가까운(인접한) 것, 즉 L5 유전자의 3' 프라임 단부 또는 이와 고유하게 연관된 비-암호 영역(L5에 대해서 내인성인 비-암호 영역의 전부 또는 부분)에 접경 또는 인접한 것을 지칭한다. 대안적으로, 부근 또는 근접한은 L5 유전자에 가까이 있어서, BY 영역과 L5 유전자의 3' 단부 사이에 암호 서열이 존재하지 않는 것을 지칭한다.
따라서 일 실시형태에서 BY는 암호 서열의 "끝"을 나타내는 L5의 염기에 의해서 직졉 연결된다.
따라서 일 실시형태에서 BY는 비-암호 서열의 "끝"을 나타내는 L5의 염기에 직접 연결되거나, 또는 L5와 본래 연관된 비-암호 영역에 직접 연결된다.
고유하게 및 자연적으로는 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 일 실시형태에서 BY는 서열번호 89의 서열을 포함한다. 이러한 서열은 인공 비-암호 서열이고, 여기서 예를 들어 이식유전자(또는 이식유전자 카세트), 제한 부위 또는 이들의 조합물을 포함하는 DNA 서열이 삽입될 수 있다. 이러한 서열이 이로운데, 그 이유는 이것이 바이러스 안정성 및 생존력에 대한 파괴 효과를 최소화하면서 이식유전자의 정확한 위치에 대해서 약간의 융통성을 허용하는 데 있어서 완충제로서 작용하기 때문이다.
삽입(들)은 서열번호 88 내에서 5' 단부로부터, 3' 단부 또는 bp 1 내지 35 사이의 임의의 위치에서, 예를 들어 염기쌍 1/2, 2/3, 3/4, 4/5, 5/6, 6/7, 7/8, 8/9, 9/10, 10/11, 11/12, 12/13, 13/14, 14/15, 15/16, 16/17, 17/18, 18/19, 19/20, 20/21, 21/22, 22/23, 23/24, 24/25, 25/26, 26/27, 27/28, 28/29, 29/30, 30/31, 31/32, 32/33, 33/34 또는 34/35 사이의 어느 위치에서나 일어날 수 있다.
일 실시형태에서 BY는 bp 12와 bp 13 사이에 삽입된 DNA 서열을 갖는 서열번호 89 또는 서열번호 21의 29356bp 및 29357bp에 상응하는 위치를 포함한다. 일 실시형태에서 삽입체는 제한 부위 삽입체이다. 일 실시형태에서 제한 부위 삽입체는 하나 이상의 제한 부위를 포함한다. 일 실시형태에서 제한 부위는 2개의 제한 부위를 포함하는 19bp 제한 부위 삽입체이다. 일 실시형태에서 제한 부위 삽입체는 1개의 제한 부위를 포함하는 9bp 제한 부위 삽입체이다. 일 실시형태에서 제한 부위 삽입체는 하나 또는 2개의 제한 부위 및 적어도 하나의 이식유전자, 예를 들어 하나 또는 2개 또는 3개의 이식유전자, 예컨대 하나 또는 2개의 이식유전자를 포함한다. 일 실시형태에서 제한 부위는 2개의 제한 부위 및 적어도 하나의 이식유전자, 예를 들어 하나 또는 2개의 이식유전자를 포함하는 19bp 제한 부위 삽입체이다. 일 실시형태에서 제한 부위 삽입체는 1개의 제한 부위 및 적어도 하나의 이식유전자, 예를 들어 하나 또는 2개의 이식유전자를 포함하는 9bp 제한 부위 삽입이다. 일 실시형태에서 2개의 제한 부위는 하나 이상, 예컨대 2개의 이식유전자(예를 들어, 이식유전자 카세트 내에)를 샌드위칭한다. 일 실시형태에서 BY가 2개의 제한 부위를 포함하는 경우 상기 제한 부위는 서로 상이하다. 일 실시형태에서 BY에서 상기 하나 이상의 제한 부위는 이들이 삽입된 특정 아데노바이러스 게놈에서 비-자연 발생이다(예컨대 독특하다). 일 실시형태에서 예를 들어, BY에서 상기 하나 이상의 제한 부위는 게놈의 다른 부분, 예컨대 BX에 도입된 자연 발생 제한 부위 또는 제한 부위와 상이한 아데노바이러스 게놈에서의 다른 위치에 위치된 다른 제한 부위와 상이하다. 따라서 일 실시형태에서 제한 부위 또는 부위들은 섹션 내의 DNA가 특이적으로 절단되는 것을 허용한다.
일 실시형태에서 BY는 서열번호 21의 29345bp 내지 29379bp의 서열을 갖는다. 일 실시형태에서 BY는 결합이다.
일 실시형태에서 삽입체는 서열번호 89에서 bp 12 이후이다.
일 실시형태에서 삽입체는 서열번호 21의 약 29356bp 위치이다.
일 실시형태에서 삽입체는 하나 이상의 이식유전자, 예를 들어 1, 2 또는 3개, 예컨대 1 또는 2개를 포함하는 이식유전자 카세트이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 E4는 아데노바이러스 E4 영역(즉, 폴리펩타이드/단백질 영역)의 부분 또는 전부를 암호화하는 DNA 서열을 지칭하고, 그것은 E4 유전자에 의해서 암호화된 단백질이 보존성 또는 비-보존성 아미노산 변화를 갖도록; 그것이 야생형(상응하는 비-돌연변이된 단백질)과 동일한 기능을 갖도록; 야생형 단백질에 비해서 증가된 기능을 갖도록; 야생형 단백질에 비해서 감소된 기능을 갖도록, 예컨대 기능을 갖지 않도록; 또는 적절한 경우 야생형 단백질 또는 이들의 조합물에 비해서 새로운 기능을 갖도록 돌연변이될 수 있다.
일 실시형태에서 E4 영역은 부분적으로 결실되고, 예를 들어 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5%가 결실된다. 일 실시형태에서 E4 영역은 서열번호 21의 32188bp 내지 29380bp의 서열을 갖는다.
일 실시형태에서 E4는 결실된 E4orf4 영역을 제외하고 존재한다.
일 실시형태에서 B3은 결합이고, 즉 여기서 E4는 존재하지 않는다.
일 실시형태에서 B3은 서열번호 21의 32188bp 내지 29380bp의 서열을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 수치 범위는 종점을 포함한다.
통상의 기술자는 본 명세서에서의 식, 예컨대 식 (I), (Ia)에서의 요소는 인접하고, 본 명세서에 언급된 유전자 및 암호 DNA 서열(구조 특징부)뿐만 아니라 비-암호 DNA 서열을 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 하나 이상의 실시형태에서 본 개시내용의 식은 아데노바이러스 게놈에서 자연 발생 서열을 기술하는 것을 시도하고 있다. 이러한 맥락에서 식이 게놈의 관련 섹션을 특징으로 하는 주요 요소를 지칭하고, DNA의 게놈 스트레치의 철저한 설명인 것으로 의도되지 않는다는 것은 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 E1A, E1B, E3 및 E4는 각각 독립적으로 야생형 및 이의 등가물, 본 명세서에 기술된 각 영역이 돌연변이되거나 부분적으로 결실된 형태, 특히 공지된 아데노바이러스로부터의 야생형 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "삽입체"는 참조 서열을 중단시키도록 5' 단부, 3' 단부에 또는 주어진 DNA 서열 참조 분절 내에 혼입된 DNA 서열을 지칭한다. 후자는 삽입체가 위치되는 상대적인 참조 지점으로 사용된 참조 서열이다. 본 개시내용의 맥락에서, 삽입체는 일반적으로 서열 번호 88 또는 서열 번호 89 내에서 발생한다. 삽입체는 제한 부위 삽입체, 이식유전자 카세트 또는 둘 모두일 수 있다. 서열이 중단되는 경우, 바이러스는 본래 서열을 포함하지만, 일반적으로 이는 삽입체를 샌드위치시키는 2개의 단편으로서 존재할 것이다.
일 실시형태에서 이식유전자 또는 이식유전자 카세트는 비편향 삽입 트랜스포존, 예를 들면, TN7 트랜스포존 또는 이의 부분을 포함하지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 Tn7 트랜스포존은 국제 특허 제WO2008/080003호에 기술된 바와 같은 비편향 삽입 트랜스포존을 지칭한다.
일 실시형태에서 이식유전자 또는 이식유전자 카세트는 조절 요소 또는 서열을 추가로 포함한다.
다른 조절 서열
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "유전자 발현의 조절제"(또는 조절제/조절 요소)는 전형적으로 전사 또는 번역을 개시하거나 강화시킴으로써 유전자 발현에서 역할을 하는 유전적 특징, 예를 들면, 프로모터, 인핸서 또는 스플라이스 억셉터 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "스플라이스 억셉터 서열", "스플라이스 억셉터" 또는 "스플라이스 부위"는 mRNA 분자가 스플라이스오솜 복합체의 작은 핵 리보핵산단백질에 의해 인식되는 때를 측정하는 조절 서열을 지칭한다. 일단 조립되면, 스플라이스오솜은 단일 폴리펩타이드 또는 단백질을 생성하도록 번역될 수 있는 성숙 mRNA 분자를 생성하는 상류 스플라이스 공여체 부위로 mRNA 분자의 스플라이스 억셉터 부위 사이의 스플라이싱을 촉매작용한다.
상이한 크기의 스플라이스 억셉터 서열이 본 개시내용에 사용될 수 있고, 이들은 짧은 스플라이스 억셉터(소)(SSA), 스플라이스 억셉터(중) 및 분지된 스플라이스 억셉터(대)로서 기술될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 SSA는 전형적으로 단지 스플라이스 부위를 포함하는 짧은 스플라이스 억셉터, 예를 들어, 4bp를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 SA는 전형적으로 짧은 스플라이스 억셉터 및 폴리피리미딘 트랙을 포함하는 스플라이스 수용체, 예를 들어, 16bp를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 bSA는 전형적으로 짧은 스플라이스 억셉터, 폴리피리미딘 트랙 및 분지점을 포함하는 분지된 스플라이스 억셉터, 예를 들어, 26bp를 의미한다.
일 실시형태에서 본 개시내용의 작제물에서 사용되는 스플라이스 억셉터는 CAGG 또는 서열번호 90 또는 91이다. 일 실시형태에서 SSA는 뉴클레오타이드 서열 CAGG를 갖는다. 일 실시형태에서 SA는 서열번호 90의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일 실시형태에서 SA는 서열번호 91의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
일 실시형태에서 스플라이스 부위는 CCACC를 포함하는 컨센서스 코작 서열에 의해 즉시 처리된다(즉, 5' 에서 3' 방향으로 따른다). 일 실시형태에서 스플라이스 부위 및 코작 서열은 최대 100bp 이하로 산재된다. 일 실시형태에서 코작 서열은 CCACC의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
전형적으로, 내인성 또는 외인성 프로모터(예컨대, 내인성 프로모터)의 제어 하인 경우, 암호 서열은 코작 서열이 바로 선행될 것이다. 암호 영역의 시작은 개시 코돈(AUG)으로 나타내고, 예를 들어, 서열 (gcc)gccRccAUGg[서열 번호 92]의 맥락으로 존재하고, 암호 서열의 개시의 시작은 염기로 굵게 나타낸다. 소문자는 (그럼에도 불구하고 변할 수 있는) 이 위치에서 공통 염기를 나타내고, 대문자는 고도로 보존된 염기를 나타내고, 즉 'AUGG' 서열은 일정하거나, 이제까지의 경우 드물게 변하고; 'R'는 퓨린(아데닌 또는 구아닌)이 일반적으로 이 위치에서 관찰되고, 괄호의 서열(gcc)은 불확실한 중요성이다. 따라서 일 실시형태에서 개시 코돈 AUG는 코작 서열에 혼입된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 내부 리보솜 도입 DNA 서열은 내부 리보솜 도입 서열(IRES)을 암호화하는 DNA 서열을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 IRES는 mRNA 서열 내에서 시작하는 개시를 비롯한, 메신저 RNA(mRNA) 서열 번역의 개시를 가능하게 하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이는 카세트가 다시스트론성 mRNA를 암호화할 때 특히 유용하다. IRES를 사용하면 다수의 개별 단백질 또는 펩타이드로 번역되는 다시스트론성 mRNA가 생성된다. 일 실시형태에서, 내부 리보솜 도입 DNA 서열은 서열 번호 93의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일 실시형태에서, 특정 IRES는 게놈에 단지 한번 사용된다. 이는 게놈의 안정성에 대한 이점을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "고도 자가-절단 효율 2A 펩타이드" 또는 "2A 펩타이드"는 번역 후 효율적으로 절단되는 펩타이드를 지칭한다. 적합한 2A 펩타이드는 P2A, F2A, E2A 및 T2A를 포함한다. 본 발명자들은 주어진 2A 펩타이드를 암호화하는 특이적 DNA 서열이 한번 사용되면, 동일한 특이적 DNA 서열은 다시 사용될 수 없다는 것을 주목하였다. 그러나, DNA 암호의 중복성은 동일한 2A 펩타이드로 번역되는 DNA 서열을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 2A 펩타이드를 사용하는 것은 카세트가 다시스트론성 mRNA를 암호화할 때 특히 유용하다. 2A 펩타이드를 사용하여 다수의 개별 단백질 또는 펩타이드를 생성하기 위해 번역 후 변형되는 번역되는 단일 폴리펩타이드 쇄를 생성한다.
일 실시형태에서 사용된 암호화된 P2A 펩타이드는 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시형태에서 사용된 암호화된 F2A 펩타이드는 서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시형태에서 사용된 암호화된 E2A 펩타이드는 서열번호 96의 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시형태에서 사용된 암호화된 T2A 펩타이드는 서열번호 97의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시형태에서 이식유전자에 의해 암호화된 mRNA 또는 각 mRNA는, 예컨대, 전형적으로 mRNA 서열의 단부에서 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 따라서 일 실시형태에서 이식유전자 또는 이식유전자 카세트는 폴리아데닐화 신호 서열을 암호화하는 적어도 하나의 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "폴리A", "폴리아데닐화 신호" 또는 "폴리아데닐화 서열"은 일단 전사되면, 초기 mRNA 분자를 절단하여 폴리아데닐화하는 다중단백질 복합체에 의해 인식될 수 있는, 일반적으로 AATAAA 부위를 함유하는 DNA 서열을 의미한다.
일 실시형태에서 작제물은 폴리아데닐화 서열을 포함하지 않는다. 일 실시형태에서 유전자 발현의 조절제는 스플라이스 억셉터 서열이다.
일 실시형태에서 단백질/폴리펩타이드/펩타이드, 예컨대 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열은 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서 본 명세서에 개시된 서열을 갖는 바이러스 또는 작제물이 제공된다.
항체
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 항체 분자는 전장 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 임의의 작제물, 다중특이적 항체 포맷을 포함한다. 따라서 본 발명의 항체 분자는 전장 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전 항체 분자 또는 이의 단편을 포함하고, Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, 단일 도메인 항체(예를 들어, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, 비스-scFv, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디 및 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(예를 들어 문헌[Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136]; [Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217] 참고). 이러한 항체 단편을 생성하고 제조하는 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181] 참고). 본 개시내용에 사용하기 위한 다른 항체 단편은 국제 특허 출원 제WO2005/003169호, 제WO2005/003170호 및 제WO2005/003171호에 기술된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가 항체는 다중 특이성, 예를 들어, 이중 특이성을 포함할 수 있거나, 단일 특이적일 수 있다(예를 들어 국제 특허 제WO 92/22853호 및 제WO05/113605호 참고). 이중특이적 및 다중특이적 항체 변이체가 이러한 예에서 특히 고려되는데, 그 이유는 2종의 독립적인 표적 단백질을 중화시키는 것이 목적이기 때문이다.
맥락이 달리 나타내지 않는 한, 항체는 일반적으로 전장 항체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 항체 결합 단편은, 표적 항원에 대한 특이성을 보유하는 전장 항체보다 더 작은 것을 지칭한다. 항체 결합 단편은 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, 단일 도메인 항체(예를 들어, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, ds-scFv를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서 본 개시내용의 기술에서 사용되는 항체 또는 이의 결합 단편은 단클론성이다.
단클론성 항체는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 하이브리도마 기술(Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985)로 제조할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 항체는 또한, 예를 들어, 문헌[Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 93(15):7843-78481]; 국제 특허 제WO92/02551호; 제WO2004/051268호 및 국제 특허 출원 번호 제WO2004/106377호)에 기술된 방법에 의해 특이적 항체의 생산을 위해 선택된 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNA를 클로닝하고 발현시킴으로써 단일 림프구 항체 방법을 사용하여 생성할 수 있다.
본 개시내용의 항체 분자에서 사용된 결합 도메인은 인간화될 수 있다. (CDR-이식된 항체를 포함하는) 인간화된 항체는 비인간 종으로부터 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 항체 분자 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역이다(예를 들어, 미국 특허 제US 5,585,089호; 국제 특허 제WO91/09967호 참고). 단지 전체 CDR보다 CDR의 특이성 결정 잔기를 전달하는 것이 필요할 수 있음이 인식될 것이다(예를 들어, 문헌[Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34] 참고). 인간화된 항체는 임의로, 예를 들어, CDR이 유래되었던 비인간 종으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
CDR 또는 특이성 결정 잔기가 이식된 경우, 임의의 적절한 억셉터 가변 영역 프레임워크 서열은 마우스, 영장류 및 인간 프레임워크 영역을 비롯한, CDR이 유래된 공여체 항체의 부류/유형을 고려하여 사용될 수 있다. 적합하게는, 본 발명에 따른 인간화된 항체는 인간 억셉터 프레임워크 영역뿐만 아니라 본 명세서에 제공된 CDR 중 하나 이상을 포함하는 가변 도메인을 갖는다.
본 발명에서 사용될 수 있는 인간 프레임워크의 예는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM이다(상기 문헌[Kabat et al.]). 예를 들어, KOL 및 NEWM은 중쇄에 대해서 사용될 수 있고, REI는 경쇄에 대해서 사용될 수 있고, EU, LAY 및 POM은 중쇄 및 경쇄 둘 모두에서 대해서 사용될 수 있다. 대안적으로, 인간 생식계열 서열이 사용될 수 있고; 이들은 http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/에서 입수 가능하다.
본 발명의 인간화된 항체에서, 억셉터 중쇄 및 경쇄는 반드시 동일한 항체로부터 유래될 필요는 없고, 바람직한 경우, 상이한 쇄로부터 유래된 프레임워크 영역을 갖는 복합 쇄를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 인간화된 항체에서, 프레임워크 영역은 억셉터 항체의 것과 정확히 동일한 서열을 가질 필요가 없다. 예를 들어, 비정상 잔기가 억셉터 쇄 부류 또는 유형을 위해서 더 자주-발생하는 잔기로 변화될 수 있다. 대안적으로, 억셉터 프레임워크 영역에서 선택된 잔기는 그것이 공여체 항체에서 동일한 위치에서 발견되는 잔기에 상응하도록 변화될 수 있다(문헌[Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324] 참고). 이러한 변화는 공여체 항체의 친화도를 회복시키는 데 필수적인 최소한으로 유지되어야 한다. 변화될 필요가 있을 수 있는 억셉터 프레임워크 영역에서 잔기를 선택하기 위한 프로토콜은 국제 특허 제WO 91/09967호에 언급되어 있다.
존재하는 경우, 본 발명의 항체 분자의 불변 영역 도메인은 항체 분자의 제안된 기능 및 특히 필요할 수 있는 효과기 기능을 고려하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히, 항체 분자가 치료적 용도를 위해서 의도되고, 항체 효과기 기능이 요구되는 경우, 인간 IgG 불변 영역 도메인, 특히 IgG1 및 IgG3 아이소타입이 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체 분자가 치료적 목적을 위해서 의도되고, 예를 들어, 항원을 단순히 중화 또는 효능화하기 위해서 항체 효과기 기능이 요구되지 않는 경우, IgG2 및 IgG4 아이소타입이 사용될 수 있다. 이들 불변 영역 도메인의 서열 변이체가 또한 사용될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 예를 들어, 문헌[Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108]에 기술된 바와 같이 위치 241에서의 세린이 프롤린으로 변화된 IgG4 분자가 사용될 수 있다. 또한 관련 기술 분야의 통상의 기술자는, 항체가 다양한 번역 후 변형을 겪을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 변형의 유형 및 정도는 보통 항체를 발현시키는 데 사용되는 숙주 세포주뿐만 아니라 배양 조건에 좌우된다. 이러한 변형은 글리코실화, 메티오닌 산화, 다이케토피페라진 형성, 아스파테이트 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화에서의 변형을 포함할 수 있다. 빈번한 변형은 카복시펩티다제의 작용으로 인한 카복시-말단 염기성 잔기(예컨대 라이신 또는 아르기닌)의 손실이다(문헌[Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995)]에 기술된 바와 같음).
제형
본 개시내용은 본 명세서에 기술된 바와 같은 바이러스의 약제학적 제형으로 확장된다.
일 실시형태에서 예를 들어 본 개시내용에 따른 복제 가능 암살상 바이러스 또는 복제 결핍 바이러스 벡터의 주입 또는 주사를 위한 액체 비경구 제형이 제공되며, 여기서 제형은 용량 부피당 1x1010 또는 1x1014 바이러스 입자 범위의 용량을 제공한다.
비경구 제형은 GI 관을 통해 전달되지 않도록 설계된 제형을 의미한다. 전형적인 비경구 전달 경로는 주사, 이식 또는 주입을 포함한다. 제형은 볼러스 전달(bolus delivery)을 위한 형태로 제공된다.
일 실시형태에서 비경구 제형은 주사의 형태이다. 주사는 정맥내, 피하, 종양내, 근육내 주사를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 주사는 주사기를 통해 체내로의 액체의 삽입을 의미한다. 일 실시형태에서 본 개시내용의 방법은 종양내 주사를 포함하지 않는다.
일 실시형태에서 비경구 제형은 주입 형태이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 주입은 드립, 주입 펌프, 주사기 드라이버 또는 동등의 장치에 의한 더 느린 속도로의 유체의 투여를 의미한다. 일 실시형태에서 주입은 1.5분 내지 120분, 예컨대 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 65, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 또는 115분의 범위의 기간에 걸쳐서 투여된다.
일 실시형태에서 제형의 1회 용량은 주사기 드라이버에 의해 투여되는 것과 같이 100㎖ 미만, 예를 들어, 30㎖이다.
일 실시형태에서 주사는, 예를 들어, 1.5 내지 30분의 기간 동안 느린 주사로서 투여된다.
일 실시형태에서 제형은 정맥내(i.v.) 투여용이다. 이 경로는, 대부분의 기관 및 조직으로의 신속한 접근을 가능하게 하기 때문에 암살상 바이러스의 전달을 위해서 특히 효과적이고, 전이, 예를 들어, 확립된 전이, 특히 간 및 폐와 같은 고도로 혈관성 영역에 위치된 것의 치료를 위해서 특히 유용하다.
치료적 제형은 전형적으로 제조 및 저장 조건하에서 멸균 및 안정할 것이다. 조성물은 용액, 마이크로에멀션, 리포좀, 또는 인간에게 투여하기에 적합한 임의의 비경구 제형으로 제형화될 수 있고, 예비충전된 장치, 예를 들어, 주사기 또는 바이알, 특히 단일 용량으로서 제형화될 수 있다.
제형은 일반적으로 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체, 예를 들어, 바이러스와 상용성이고 바이러스가 필요한 시간 기간 동안 안정한 무독성의 등장성 담체를 포함할 것이다.
담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 분산제 또는 계면활성제, 예컨대, 레시틴 또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리소르베이트 80 또는 40을 사용하여 유지시킬 수 있다. 분산액에서, 필요한 입자 크기의 유지는 계면활성제의 존재에 의해서 보조될 수 있다. 등장성 제제의 예는 조성물 중에 당, 폴리알코올, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함한다.
일 실시형태에서, 사용된 비경구 제형은 하기 완충제 중 하나 이상, 예를 들어, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산, 포스페이트 완충제 및/또는 트리스 완충제, 당, 예를 들어, 덱스트로스, 만노스, 수크로스 또는 유사물, 염, 예를 들어, 염화나트륨, 염화마그네슘 또는 염화칼륨, 세제, 예를 들어, 비이온성 계면활성제, 예를 들어, brij, PS-80, PS-40 또는 유사물을 포함할 수 있다. 제형은 또한 방부제, 예컨대, EDTA 또는 에탄올 또는 EDTA와 에탄올의 조합물을 포함할 수 있고, 이는 가능한 하나 이상의 분해 경로를 방지하는 것으로 생각된다.
일 실시형태에서, 제형은 본 개시내용에 따른 정제된 암살상 바이러스, 예를 들어, 용량당 1x1010 내지 1x1014개 바이러스 입자, 예컨대, 용량당 1x1010 내지 1x1012개 바이러스 입자를 포함할 것이다. 일 실시형태에서, 제형 중 바이러스의 농도는 2 x 108 내지 2 x 1014vp/㎖ 범위, 예를 들어, 2 x 1012vp/㎖이다.
일 실시형태에서, 비경구 제형은 글리세롤을 포함한다.
일 실시형태에서, 제형은 본 명세서에 기술된 암살상 아데노바이러스, HEPES (N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산), 글리세롤 및 완충제를 포함한다.
일 실시형태에서, 비경구 제형은 본 개시내용의 바이러스, 예를 들어 5mM HEPES, 예를 들어, 5 내지 20%(v/v) 글리세롤, 예를 들어, pH를 7 내지 8로 조정하기 위한 염산 및 주사용수로 이루어진다.
일 실시형태에서, 0.7㎖의 본 개시내용의 바이러스를 2 x 1012vp/㎖의 농도로 최종 pH 7.8로 5mM HEPES, 20% 글리세롤 중에서 제형화한다.
약제학적으로 허용 가능한 담체의 철저한 논의는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)]에서 입수 가능하다.
일 실시형태에서, 제형은 흡입을 포함하는 국소 투여용 제형으로서 제공된다.
적합한 흡입 가능한 제제는 흡입 가능한 분말, 추진제 가스를 함유하는 계량 에어로졸 또는 추진제 가스를 함유하지 않는 흡입 가능한 용액을 포함한다. 본 개시내용에 따른 흡입 가능한 분말은 일반적으로 생리학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 본 명세서에 기술된 바이러스를 함유할 것이다.
이러한 흡입 가능한 분말은 단당류(예를 들어, 글루코스 또는 아라비노스), 이당류(예를 들어, 락토스, 사카로스, 말토스), 올리고당류 및 다당류(예를 들어, 덱스트란), 폴리알코올(예를 들어, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨), 염(예를 들어, 염화나트륨, 탄산칼슘) 또는 이들 서로의 혼합물을 포함할 수 있다. 단당류 또는 이당류가 적합하게 사용되고, 특히 배타적이지는 않지만, 락토스 또는 글루코스는 그들의 수화물 형태로 사용된다.
폐에 침착하는 입자는 10㎛ 미만, 예를 들어, 1 내지 9㎛, 예를 들어, 0.1 내지 5㎛, 특히 1 내지 5㎛의 입자 크기를 필요로 한다. 바이러스를 운반하는 입자 크기가 가장 중요하고, 따라서, 일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 바이러스는 입자, 예를 들어, 주어진 크기의 락토스 입자 상에 흡착되거나 흡수될 수 있다.
흡입 가능한 에어로졸을 제조하기 위해 사용될 수 있는 추진제 가스는 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 적합한 추진제 가스는 탄화수소, 예를 들어, n-프로판, n-부탄 또는 이소부탄 및 할로탄화수소, 예를 들어, 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 사이클로프로판 또는 사이클로부탄의 염화 및/또는 플루오린화 유도체로부터 선택된다. 상기 언급된 추진제 가스는 그 자체로 또는 이의 혼합물로 사용될 수 있다.
특히 적합한 추진제 가스는 TG 11, TG 12, TG 134a 및 TG227로부터 선택된 할로겐화 알칸 유도체이다. 상기한 할로겐화 탄화수소 중에서, TG134a(1,1,1,2-테트라플루오로에탄) 및 TG227(1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판) 및 이의 혼합물이 특히 적합하다.
추진제 가스를 함유한 흡입 가능한 에어로졸은 또한 다른 성분, 예를 들어, 공용매, 안정화제, 표면 활성제(계면활성제), 산화방지제, 윤활제 및 pH를 조정하기 위한 수단을 함유할 수 있다. 이러한 성분 모두는 관련 기술 분야에 공지되어 있다.
본 개시내용에 따른 추진제 가스를 함유하는 흡입 가능한 에어로졸은 최대 5중량%의 활성 물질을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 에어로졸은, 예를 들어, 0.002 내지 5중량%, 0.01 내지 3중량%, 0.015 내지 2중량%, 0.1 내지 2중량%, 0.5 내지 2중량% 또는 0.5 내지 1중량%의 활성 성분을 함유한다.
대안적으로, 폐로의 국소 투여는 또한, 예를 들어, 네불라이저, 예를 들어, 압축기에 연결된 네불라이저(예를 들어, 미국 버지니아주 리치몬드 소재의 파리 레스퍼러토리 이큅먼트, 인코포레이티드(Pari Respiratory Equipment, Inc.)에 의해 제조된 파리 마스터(Pari Master)(R) 압축기에 연결된 파리 LC-제트 플러스(R) 네불라이저)와 같은 장치를 사용하여 액체 용액 또는 현탁 제형의 투여에 의해서일 수 있다.
본 발명의 바이러스는, 예를 들어, 비경구 제형에 대해 이미 상기에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 용액 또는 현탁액 형태로 용매에 전달되어 분산될 수 있다. 이는 적합한 생리학적 용액, 예를 들어, 식염수 또는 다른 약리학적으로 허용 가능한 용매 또는 완충 용액에 현탁될 수 있다. 관련 기술 분야에 공지된 완충 용액은 pH 약 4.0 내지 5.0을 달성하도록 물 1㎖당 0.05㎎ 내지 0.15㎎의 이나트륨 에데테이트, 8.0㎎ 내지 9.0㎎의 NaCl, 0.15㎎ 내지 0.25㎎의 폴리소르베이트, 0.25㎎ 내지 0.30㎎의 무수 시트르산 및 0.45㎎ 내지 0.55㎎의 나트륨 시트레이트를 함유할 수 있다.
치료적 현탁액 또는 용액 제형은 또한 1종 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 부형제는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 완충제(예를 들어, 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제, 아세테이트 완충제 및 중탄산염 완충제), 아미노산, 우레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예를 들어, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포좀, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 리포좀 또는 생분해성 미소구체로 캡슐화될 수 있다. 제형은 일반적으로 멸균 제조 공정을 사용하여 실질적으로 멸균 형태로 제공될 것이다.
이는 멸균 완충 용매 용액 중의 항체의 무균 현탁액의 제형화에 사용된 완충 용매/용액의 여과 및 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 친숙한 방법에 의해 제형을 멸균 용기에 분산시킴으로써 생산 및 멸균을 포함할 수 있다.
본 개시내용에 따른 네불라이징 가능한 제형은, 예를 들어, 포일 봉투로 포장된 단일 용량 단위(예를 들어, 밀봉된 플라스틱 용기 또는 바이알)로 제공될 수 있다. 각 바이알은 용매/용액 완충제의 용적의 단위 용량, 예를 들어, 2㎖를 함유한다.
치료
추가의 양상에서, 본 개시내용은 치료, 특히 암의 치료용으로 사용하기 위한, 본 명세서에 기술된 바와 같은 바이러스 또는 바이러스 벡터 또는 이의 제형으로 확장된다.
일 실시형태에서, 치료 방법은 종양의 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 종양은 또한 신생물이라고 명명되는, 제어되지 않고 진행성인 과도한 세포 분열로부터 생성되는 조직의 비정상적 괴상을 지칭하는 것으로 의도된다. 종양은 양성(암이 아닌) 또는 악성일 수 있다. 종양은 암 또는 전이의 모든 형태를 포함한다.
일 실시형태에서, 종양은 고형 종양이다. 고형 종양은 국소화되거나 전이될 수 있다.
일 실시형태에서, 종양은 상피 기원이다.
일 실시형태에서, 종양은 악성 종양, 예를 들어, 직장결장암, 간암, 전립선암, 췌장암, 유방암, 난소암, 갑상선암, 신장암, 방광암, 두경부암 또는 폐암이다.
일 실시형태에서, 종양은 직장결장 악성 종양이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 악성 종양은 암성 세포를 의미한다.
일 실시형태에서, 암살상 바이러스 또는 바이러스 벡터는 전이를 치료 또는 예방하는 데 사용된다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 방법 또는 제형은 약물 내성 암을 치료하는 데 사용된다.
일 실시형태에서, 바이러스 또는 바이러스 벡터는 추가의 암 치료 또는 요법의 투여와 조합하여 투여된다.
일 실시형태에서, 암, 예를 들어, 상기에 기술된 암의 치료를 위한 의약을 제조하는데 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 바이러스, 바이러스 벡터 또는 제형이 제공된다.
추가의 양상에서, 치료적 유효량의 본 개시내용에 따른 바이러스 또는 제형을 이를 필요로 하는 환자, 예를 들어, 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법이 제공된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 암살상 바이러스 또는 제형은 다른 요법과 조합하여 투여된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "조합하여"는 암살상 바이러스 또는 바이러스 벡터가 암 치료 또는 요법 이전, 동시 및/또는 후에 투여되는 경우를 포함하도록 의도된다.
암 요법은 수술, 방사선 요법, 표적화 요법 및/또는 화학요법을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 암 치료는 치료적 화합물 또는 생물학적 작용제, 예를 들어, 암을 치료하고자 하는 항체로의 치료 및/또는 이의 유지 요법을 지칭한다.
일 실시형태에서, 암 치료는 화학치료제, 표적화 항암제, 방사선 요법, 방사성 동위 원소 요법 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 임의의 다른 항암 요법으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 또는 바이러스 벡터는 예를 들어, 전이를 치료하고/하거나 전이 또는 추가의 전이를 예방하기 위해 종양을 축소하는 수술(신보조 요법)과 같은 요법에 대한 예비 치료로서 사용될 수 있다. 암살상 바이러스 또는 바이러스 벡터는 전이를 치료하고/하거나 전이 또는 추가의 전이를 예방하기 위해 수술(보조 요법)과 같은 요법 후에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "동시에"는 암살상 바이러스 또는 바이러스 베터 제형과 동시에 또는 거의 동시에 추가적인 암 치료제를 투여하는 것이다. 치료는 동일 제형 내에 함유되거나 별도의 제형으로 투여될 수 있다.
일 실시형태에서, 바이러스 또는 바이러스 벡터는 화학치료제의 투여와 조합하여 투여된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 화학치료제는 악성 세포 및 조직에 선택적으로 파괴적인 특정 항종양성 화학 작용제 또는 약물을 지칭하도록 의도된다. 예를 들어, 알킬화제, 항대사성물질, 안트라사이클린, 식물성 알칼로이드, 토포아이소머라제 저해제 및 다른 항종양제이다. 화학치료제의 다른 예는 독소루비신, 5-플루오로우라실(5-FU), 파클리탁셀, 카페시타빈, 이리노테칸, 및 플라틴, 예를 들어, 시스플라틴 및 옥살리플라틴을 포함한다. 바람직한 용량은 치료되는 암의 성질에 따라 의사가 선택할 것이다.
일 실시형태에서, 치료제는 면역 반응 및/또는 종양의 혈관신생을 제어 하는데 도움이 될 수 있는 간시클로비어이다.
일 실시형태에서, 치료제는 면역 관문 저해제, 예컨대 PD-1 저해제, PD-L1 저해제이고, 특히 여기서 저해제는 단클론성 항체 또는 항체 단편이다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 방법에 사용된 하나 이상의 요법은 메트로놈성이고, 그것은 종종 다른 치료 방법과 동시에 제공된, 저용량의 항암 약물로의 연속적 또는 빈번한 치료이다.
하위군 B 암살상 아데노바이러스, 특히 Ad11 및 이로부터 유래된 것, 예를 들어, EnAd는, 이들이 주로 괴사성 기전에 의해 암 세포를 사멸시키는 아폽토시스와 매우 독립적인 작용 기전을 갖는 것처럼 보이기 때문에 화학치료제와 특히 상승적일 수 있다. 또한, 화학요법 동안 발생하는 면역억제는 암살상 바이러스가 보다 큰 효율로 기능하도록 할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 치료적 용량은 예를 들어, 적합한 치료 요법에 사용되는 경우, 의도된 치료 효과를 달성하기에 적합한, 예를 들어, 질환의 증상 또는 상태를 경감시키는 바이러스 또는 바이러스 벡터의 양을 지칭한다. 용량은 다수의 바이러스 입자가 하기를 유발하기에 충분할 수 있을 때 암 또는 전이를 치료하는 데 있어서 치료 용량으로 간주될 수 있다: 종양 또는 전이성 성장을 둔화시키거나 정지시킴, 또는 종양 또는 전이의 크기가 축소되는 것으로 발견되고/되거나 환자의 수명이 연장됨. 적합한 치료 용량은 일반적으로 치료 효과와 내성 독성 사이의 균형, 예를 들어, 부작용 및 독성이 요법에 의해 달성된 이익이 제공되는 것을 허용하는 경우이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 암살상 바이러스의 비경구 제형의 다회 용량을 단일 치료 사이클로 전신으로 투여하는 것이 제공되며, 예를 들어 여기서 각각의 투여에서 제공된 총 용량은 용량당 1x1010 내지 1x1014의 범위이다.
일 실시형태에서 바이러스 또는 바이러스 벡터의 1회 이상의 용량(예를 들어 각각의 용량)은 바이러스 입자 전달률이 2x1010개 입자/분 내지 2x1012개 입자/분의 범위이도록 투여된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 바이러스 또는 치료 작제물(이를 포함하는 제형 포함)은 매주, 예를 들면, 1주에 1회 투여되고, 용량은 1일, 3일, 5일째에 투여되고, 각각 후속주에 1회 용량이 따른다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 바이러스 또는 치료 작제물(이를 포함하는 제형 포함)은 2주 또는 3주에 한번, 예를 들어, 1주에 1일, 3일 및 5일째에 한 번 투여하고, 2주 또는 3주째에 또한 이의 1일, 3일 및 5일째에 투여한다. 이 투여 치료요법은 경우에 따라 여러 번 반복될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 바이러스 또는 치료 작제물(이를 포함하는 제형 포함)은 매월 투여된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 바이러스, 바이러스 벡터 및 작제물은 재조합 기술로 제조된다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 무장된 바이러스 또는 바이러스 벡터 게놈이, 게놈 또는 게놈의 모두의 일부를 포함하는 플라스미드를 전체적으로 합성하는 것을 비롯한, 다른 기술적 수단에 의해 제조할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 게놈을 합성하는 경우, 후자가 클로닝 방법을 사용한 유전자의 삽입 후 인공물이기 때문에, 삽입 영역은 제한 부위 뉴클레오타이드를 포함하지 않을 수 있음을 이해할 것이다.
일 실시형태에서, 무장된 바이러스 또는 바이러스 벡터 게놈은, 완전히 합성적으로 제조된다.
본 개시내용은 본 명세서에서 이식유전자 또는 이식유전자 카세트를 삽입함으로써 수득된 또는 수득 가능한 식 I 또는 이의 하위식의 바이러스로 추가로 확장된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "이다"는 포함함을 의미한다.
본 명세서의 맥락에서, "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)"으로 해석되어야 한다.
특정 특징부/요소를 포함하는 본 개시내용의 실시형태는 또한 관련 요소/특징부로 "이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진" 대안의 실시형태로 확장되도록 의도된다.
기술적으로 적절한 경우, 본 개시내용의 실시형태는 조합될 수 있다. 특허 및 출원과 같은 기술적 참조 문헌은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 구체적이고 명시적으로 인용된 임의의 실시형태는 단독으로 또는 하나 이상의 추가의 실시형태와 함께 면책 조항의 기준을 형성할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에서 단지 예시의 방식으로 추가로 기술된다.
실시예
실시예 1: 항원 CD80 및 인간 CD3 복합체의 ε 쇄(CD3ε)에 대한 막-앵커링된 단일 쇄 Fv 단편 항체를 활성화시키는 T 세포를 발현시키는 EnAd 바이러스의 생산
플라스미드 pEnAd2.4를 사용하여 항원 CD80(서열번호 98) 및 단일 쇄 Fv 항-인간 CD3e의 막-앵커링된 키메라 형태(서열번호 4)를 활성화시키는 인간 T 세포를 암호화하는 카세트의 직접 삽입에 의해서 플라스미드 pNG-348을 생성하였다. pNG-348 카세트는 5' 짧은 스플라이스 억셉터 서열(CAGG); 막-앵커링된 항-인간 CD3e ScFv cDNA; 고효율 자가-절단성 P2A 펩타이드 서열(서열번호 94); 인간 CD80 cDNA 서열 및 3' 폴리아데닐화 서열(서열번호 99)을 함유한다. 삽입된 이식유전자 카세트의 개략도가 도 2C에 도시되어 있다. 플라스미드의 작제는 DNA 서열결정에 의해서 확인된다.
바이러스 생산 및 특징규명
플라스미드 pNG-348을 효소 AscI로의 제한 소화에 의해서 선형화하여 바이러스 게놈 NG-348(서열번호 100)을 생산한다. 바이러스 NG-348을 하기에 제공된 방법에 따라서 증폭시키고, 정제한다.
소화된 DNA를 페놀/클로로폼 추출에 의해서 정제하였고, 16시간 동안, -20℃에서 95% 초과의 분자 생물학 등급 에탄올 300㎕ 및 10㎕ 3M 아세트산나트륨 중에서 침전시켰다. 침전된 DNA를 14000rpm에서, 5분 원심분리함으로써 펠릿화하고, 500㎕ 70% 에탄올 중에서 세척하고, 그 후 다시 14000rpm, 5분 원심분리하였다. 깨끗한 DNA 펠릿을 공기 건조시키고, 15㎕ 리포펙타민 형질주입 시약을 함유하는 500㎕ OptiMEM 중에 재현탁시키고, 30분 동안 RT에서 인큐베이션시켰다. 이어서 형질주입 혼합물을 70% 컨플루언시까지 성장한 293개 세포를 함유하는 T-25 플라스크에 적가하였다. 세포를 형질주입 믹스와 2시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후, 4㎖의 세포 배지(2% FBS가 보충된 글루타민을 갖는 DMEM 고 클루코스)를 세포에 첨가하고, 플라스크를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다.
형질주입된 293개 세포를 24시간 마다 모니터링하였고, 48 내지 72시간 마다 추가 배지를 보충하였다. 바이러스의 생산을 세포 단층에서의 유의한 세포변성 효과(significant cytopathic effect: CPE)의 관찰에 의해서 모니터링하였다. 일단 과도한 CPE가 관찰되면, 바이러스를 3회 동결-해동 사이클에 의해서 293개의 세포로부터 수거하였다. 바이러스 스톡을 증폭시키기 위해서 수거된 바이러스를 사용하여 293개의 세포를 재-감염시켰다. 증폭 동안 살아있는 바이러스 생산이 세포 단층에서의 유의한 CPE에 의해서 확인되었다. 일단 CPE가 관찰되면, 바이러스를 3회 동결-해동 사이클에 의해서 293개의 세포로부터 수거하였다. 증폭된 스톡을 추가 증폭을 위해서 사용하였고, 그 후 바이러스를 이중 염화세슘(caesium chloride) 밴딩에 의해서 정제하여 NG-330 바이러스 스톡을 생산하였다.
실시예 2: 항원 CD80 및 인간 CD3 복합체의 ε 쇄(CD3ε)에 대한 막-앵커링된 단일 쇄 Fv 단편 항체를 활성화시키는 T 세포를 발현시키는 EnAd 바이러스의 생산
플라스미드 pEnAd2.4를 사용하여 항원 CD80(서열번호 98) 및 C-말단 V5 태그를 갖는 단일 쇄 Fv 항-인간 CD3e의 막-앵커링된 키메라 형태(서열번호 5)를 활성화시키는 인간 T 세포를 암호화하는 카세트의 직접 삽입에 의해서 플라스미드 pNG-348A를 생성하였다. pNG-348 카세트는 5' 짧은 스플라이스 억셉터 서열(CAGG); 막-앵커링된 항-인간 CD3e ScFv cDNA; C-말단 V5 태그(서열번호 101); 고효율 자가-절단성 P2A 펩타이드 서열(서열번호 94); 인간 CD80 cDNA 서열 및 3' 폴리아데닐화 서열(서열번호 99)을 함유한다. NG-348A 이식유전자 카세트의 개략도가 도 26A에 도시되어 있다. 플라스미드의 작제는 DNA 서열결정에 의해서 확인된다.
바이러스 생산 및 특징규명
플라스미드 pNG-348A를 효소 AscI로의 제한 소화에 의해서 선형화하여 바이러스 게놈 NG-348A(서열번호 102)를 생산한다. 바이러스 NG-348A를 실시예 1에 상술된 방법에 따라서 증폭시키고, 정제한다.
실시예 3: 인간 CD3 복합체의 ε 쇄(CD3ε)에 대한 막-앵커링된 단일 쇄 Fv 단편 항체를 발현시키는 EnAd 바이러스의 생산
플라스미드 pEnAd2.4를 사용하여 C-말단 V5 태그를 갖는 단일 쇄 Fv 항-인간 CD3e의 막-앵커링된 키메라 형태(서열번호 5) 또는 V5 태그를 갖지 않는 것(서열번호 4)을 암호화하는 카세트의 직접 삽입에 의해서 플라스미드 pNG-420 및 pNG-420A를 생성하였다. pNG-420 카세트는 5' 짧은 스플라이스 억셉터 서열(CAGG); 막-앵커링된 항-인간 CD3e ScFv cDNA 및 3' 폴리아데닐화 서열(서열번호 99)을 함유한다. pNG-420A 카세트는 5' 짧은 스플라이스 억셉터 서열(CAGG); 막-앵커링된 항-인간 CD3e scFv cDNA; C-말단 V5 태그(서열번호 101) 및 3' 폴리아데닐화 서열(서열번호 99)을 함유한다. NG-420 및 NG-420A 이식유전자 카세트의 개략도가 도 3B 및 도 3C에 도시되어 있다. 각각의 플라스미드의 작제는 DNA 서열결정에 의해서 확인된다.
바이러스 생산 및 특징규명
플라스미드 pNG-420 및 pNG-420A를 효소 AscI로의 제한 소화에 의해서 선형화하여 바이러스 게놈 NG-420(서열번호 103) 및 NG-420A(서열번호 104)를 생산한다. 바이러스 NG-420 및 NG-420A를 실시예 1에 상술된 방법에 따라서 증폭시키고, 정제한다.
실시예 4: 결장 암종 세포에서 NG-347 및 NG-348 바이러스의 암살상 활성도 및 감염력
바이러스 암살상 효력
HT-29 결장 암종 세포를 2.5e4개 세포/웰의 세포 밀도로 96웰 플레이트에 시딩하였다. 플레이트를 4시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시키고, 그 후 세포를 100 내지 0.39개 입자/세포(ppc)의 감염 밀도 범위로 EnAd, NG-347 또는 NG-348 바이러스 입자로 감염시켰다. HT-29 세포 생존력을 셀 타이터(Cell Titre) 96 MTS 시약(프로메가(Promega): G3581)을 사용하여 감염 72시간 후에 평가하였다. 각각의 감염 밀도에서의 % 세포 생존의 정량화는 NG-348 암살상 효력이 EnAd와 대등함을 입증하였다(도 43).
바이러스 입자 감염력
HT-29 결장 암종 세포를 4e5개 세포/웰의 세포 밀도로 12웰 플레이트에 시딩하였다. 플레이트를 24시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시키고, 그 후 세포를 1.6e7 내지 2e6vp/㎖의 감염 밀도 범위로 EnAd, NG-347 또는 NG-348 바이러스 입자로 감염시켰다. HT-29 세포의 감염을 바이러스 단백질 헥손의 항체 염색에 의해서 검출하였다. 염색된 세포를 시험된 각각의 희석물에 대해서 6회 반복 웰을 가로질러서, 웰당 6개의 시야의 수동 계수에 의해서 정량분석하였다. 입자 대 감염력비(P:I)를 바이러스 역가로부터 각각의 바이러스에 대해서 계산하였고, NG-348이 EnAd 참조 대조군과 유사한 감염력비를 갖는 것으로 입증되었다(도 43 표).
실시예 5: NG-347 및 NG-348 감염된 암종 세포주에서 항원, CD80을 활성화시키는 T 세포의 세포 표면 발현
CD80 이식유전자 발현(유세포 분석법에 의해서 평가됨)을 NG-348 및 EnAd 처리된 결장 암종 세포주, DLD-1 또는 폐 암종 세포주, A549에서 비교하였다. A549 또는 DLD-1 암종 세포주를 7.5e5 세포/웰의 세포 밀도로 12웰 플레이트에 시딩하였다. 플레이트를 18시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시키고, 그 후 세포를 10 EnAd, NG-348 바이러스 입자로 감염시키거나 감염시키지 않았다. CD80 단백질 발현을 감염 후 24, 48, 72 또는 96시간에 A549 또는 DLD-1 세포의 표면 상에서 비교하였다. 각각의 시간 지점에서 세포를 하기에 상술된 방법에 따라서 수거 및 염색하였다.
CD80 세포 표면 발현의 경우, 이어서 세포를 5℃에서 1시간 동안 완충제, Cy5에 접합된 마우스 아이소타입 대조군 항체 또는 Cy5에 접합된 항-인간 CD80 항체(클론 2D10)와 함께 인큐베이션시켰다. 모든 샘플을 또한 좀비 아쿠아(Zombie Aqua) 라이브/데드로 공염색하여 살아있는 세포를 구별하였다. 샘플을 1% BSA/PBS로 3회 세척하고, 그 후 세포 생존력 및 세포 표면 상에서의 CD80 단백질 발현에 대해서 유세포 분석법(FACS, 아튠(Attune))에 의해서 분석하였다. IFNα 발현 데이터와 일치하게, CD80 발현은 HT-29 세포 상에서만 검출될 수 있었고, 섬유모세포 또는 기관지 상피 세포주 상에서는 검출 가능하게 발현되지 않았다.
세포를 유세포 분석법에 의해서 세포 생존력 및 세포 표면에서의 CD80 단백질 발현에 대해서 분석하였다. A549 세포에서 감염 후 72시간에서 CD80 발현의 분석은 CD80이 NG-348 처리된 세포의 95% 초과의 표면 상에서 검출될 수 있다는 것을 나타내었다(도 4A 및 도 4B). 감염 후 96시간에서 바이러스 처리는 대부분의 A549 세포를 용해시켰고, 따라서 FACs 분석을 수행하지 않았다. DLD-1의 경우 세포 발현은 NG-348로의 처리 후 96시간까지 세포의 50% 초과 상에서 검출될 수 있었다(도 5A 및 도 5B). 염색은 EnAd 또는 비처리된 대조군 상에서 검출되지 않았다.
실시예 6: NG-348 감염된 암종 세포주에 의해서 매개된 T 세포 활성화 및 탈과립화
NG-348 또는 EnAd 바이러스 입자로 감염되거나 또는 감염되지 않은 A549 폐 암종 세포를 인간 PBMC 공여체로부터 단리된 T 세포와 공배양하였다. CD80을 암호화한 NG-348 바이러스의 발현 선택성을 유세포 분석법에 의해서 A549 세포 및 T 세포 둘 모두의 표면 상에서 평가하였다. 세포 표면 활성화 마커(유세포 분석법에 의해서), 탈과립화에 대한 마커로서의 CD107a 세포 표면 발현(유세포 분석법에 의해서) 및 자극성 사이토카인, IL-2 및 IFNγ의 분비(ELISA에 의해서)를 평가함으로써 T 세포 활성화를 평가하였다.
A549 세포를 5e5개 세포/웰의 밀도로 12웰 플레이트에 시딩하였다. 플레이트를 18시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시키고, 그 후 세포를 10개 EnAd 또는 NG-348 바이러스 입자/세포(ppc)로 감염시키거나 감염시키지 않았다. 감염 후 48시간에, PBMC(MAC)로부터의 음성 선택에 의해서 단리된 CD3+ T 세포를 8 T 세포:1 종양 세포의 비로 A549 세포 단층에 첨가하였다. 종양 세포. 공배양을 16시간 동안 수행하였고, 그 지점 후에 세포 상청액을 ELISA 분석을 위해서 수집하였고, 종양 세포 및 T 세포를 유세포 분석법 분석을 위해서 수거하였다. 비-접착성 세포를 함유하는 배양 배지를 공배양 웰로부터 제거하고, 원심분리하였다(300xg). 상청액을 조심스럽게 제거하고, PBS 5% BSA로 1/2로 희석시키고, ELISA 분석을 위해서 저장하였다. 접착성 세포 단층을 PBS로 1회 세척하고, 이어서 트립신을 사용하여 탈착시켰다. 트립신을 완전 배지를 사용하여 불활성화시키고, 세포를 배양 상청액으로부터 수집된 세포 펠릿에 첨가하였다. 세포를 원심분리(300xg)하고, 상청액을 폐기하고, 세포 펠릿을 200㎕의 PBS 중에서 세척하였다. 세포를 다시 원심분리하고, 이어서 라이브/데드 아쿠아(라이프 테크(Life tech))를 함유하는 FAC 완충제(5% BSA PBS) 50㎕ 중에 15분 동안 RT에서 재현탁시켰다. 세포를 FACs 완충제로 1회 세척하고, 그 후 직접 접합된 항체: BV605에 접합된 항-CD3; BV421에 접합된 항-CD25; FITC에 접합된 항-CD107a; PE에 접합된 항-EpCam 또는 PE에 접합된 항-CD4; 및 PE/Cy5에 접합된 항-CD80 또는 PE/Cy5에 접합된 항-HLA-DR 중 어느 하나의 패널로 염색하였다. 각각의 공배양 조건으로부터의 세포의 샘플을 또한 관련 아이소타입 대조군 항체로 염색하였다. 모든 염색은 50㎕/웰의 총 부피의 FACs 완충제 중에서 15분 동안, 4℃에서 수행하였다. 이어서, 세포를 FACs 완충제(200㎕)로 세척하고, 200㎕의 FACs 완충제 중에서 재현탁시키고, 유세포 분석법(아튠)에 의해서 분석하였다.
CD80의 선택적인 발현
실시예 14에 제시된 결과와 유사하게, CD80 발현은 NG-348 감염된 EpCam+ A549 세포의 80% 초과의 표면에서 검출 가능하였지만, EnAd 감염되거나 감염되지 않은 대조군 세포에서는 그렇지 않았다(도 6). 이에 반해서 CD3+ T 세포는 세포 표면에서 CD80의 검출 가능한 발현을 나타내지 않았는데, 이는 적어도 이들 실험 조건 하에서, 이식유전자 발현은 공배양물 중에서 종양 세포에 대해서 선택적인 것을 나타낸다.
T 세포 활성화 마커의 상향조절
살아있는 CD3+, 단일 세포 상에서의 T 세포 활성화 마커 CD25 및 HLA-DR의 발현에 의해서 T 세포 활성화의 유세포 분석법 분석을 평가하였다. 이들 데이터는 CD25를 발현시키는 T 세포의 수(도 7A 및 7B) 및 T 세포 표면 상에서의 CD25 발현의 평균 수준(도 7C) 둘 모두가 EnAd 또는 감염되지 않은 대조군보다 NG-348 감염된 A549 세포와 함께 배양된 T 세포에 대해서 상당히 더 높다는 것을 나타내었다. 구체적으로, 미처리 대조군과 EnAd를 비교하는 경우 T 세포 활성화 상태에서는 변화가 없는 반면(각각, CD25를 발현시키는 T 세포 26.9 % ± 3.4% 및 25.3 ± 3.5%), CD25는 NG-348과 함께 공배양된 세포 대부분을 하향조절하였다(83.2 ± 1.5%). CD4의 이의 발현을 기반으로 하여 CD3+ T 세포를 게이팅함으로써 CD25 발현을 또한 CD4 및 CD8 T 세포 하위세트 상에서 분석하였다. 이들 분석은 CD25 발현이 EnAd 및 감염되지 않은 대조군에 비해서 NG-348 처리된 공배양물 중에서 CD4+ 및 CD4- T 세포 하위세트 둘 모두에 대해서 상당히 상향조절된다는 것을 나타내었다(도 8).
CD25와 대조적으로, HLA-DR을 발현시키는 세포의 수는 모든 시험된 조건에 대해서 5% 미만으로 낮았다(도 9A). 이는 유세포 분석법 분석이 수행된 공배양 후 초기 시간 지점으로 인한 것 같다. 그러나, 대조군에 비해서 NG-348 처리된 공배양물로부터의 HLA-DR 염색 CD3+HLA-DR+ 세포의 평균 형광 강도는 약간이지만 유의하게 증가하였다(도 9B).
T 세포 탈과립화의 자극
살아있는, CD3+ T 세포의 표면 상에서의 CD107a 발현의 분석은, A549 세포가 EnAd(세포의 0.6% ± 0.2%) 또는 미처리 대조군(세포의 0.1% ± 0.02%)과 비교하여 NG-348(세포의 8.3% ± 1.7%)로 감염된 경우 탈과립화를 갖고, 따라서 CD107a로 염색된 T 세포의 수가 상당히 증가함을 나타내었다(도 10). CD25 상향조절과 유사하게, CD4+ 및 CD4- T 세포 하위세트 둘 모두는 EnAd 또는 A549 대조군과 비교하여 상당히 증가된 CD107a 발현을 나타내었다(도 11).
자극성 사이토카인 IL-2 및 IFNγ의 분비
IL-2 또는 IFNγ 발현의 검출을 위해서, 공배양물 상청액을 5% BSA/PBS 검정 완충제 중에 (1:100 내지 1:1000 범위로) 희석시키고, 제조사의 프로토콜에 따라서 인간 IL-2 레디 셋 고 키트(Ready Set go Kit)(어피메트릭스(Affymetrix)) 또는 인간 IFN 감마 레디 셋 고 키트(어피메트릭스)를 사용하여 ELISA를 수행하였다.
분비된 IL-2 또는 IFNγ의 농도를 표준 곡선으로부터 내삽함으로써 결정하였다. IL-2의 발현은 NG-348 감염된 A549 세포를 사용한 공배양물의 상청액에서만 검출될 수 있었고, EnAd, 또는 미처리 대조군에서는 검출 가능하지 않았다(도 12A). IFNγ의 발현은 NG-348 감염된 A549 세포로부터의 공배양물의 상청액 중에서 매우 높은 수준(300ng/㎖ 초과)으로 검출될 수 있었는데, 이는 EnAd 또는 미처리 대조군보다 상당히 더 높았다(도 12B).
실시예 7: CD4 및 CD8 T 세포의 T 세포 활성화는 NG-348 감염된 암종 세포주에 의해서 독립적으로 매개될 수 있다.
NG-348 또는 EnAd 바이러스 입자로 감염되거나 또는 감염되지 않은 A549 폐 암종 세포를 인간 PBMC 공여체로부터 단리된 CD4+ T 세포 CD8+ T 세포와 공배양하였다. 자극성 IFNγ의 배양 상청액으로의 분비에 의해서 T 세포 활성화를 평가하였다.
실시예 14에 상술된 방법에 따라서 A549 세포를 시딩하고, NG-348 또는 EnAd 바이러스 입자로 감염시키거나 감염시키지 않았다. 감염 후 48시간에, PBMC 공여체로부터 음성 선택에 의해서 단리된 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포를 8 T 세포 대 1 종양 세포의 비로 A549 세포 단층에 첨가하였다. 공배양 16시간 후, 상술된 방법에 따라서 상청액을 수거하고, IFNγ에 대해서 평가하였다.
ELISA에 의한 lFNα 발현의 분석
24, 48 또는 72시간 동안 10ppc의 EnAd 또는 NG-343로 감염되거나 또는 감염되지 않은 HT-29 또는 A549 세포주의 상청액을 ELISA에 의해서 분비된 IFNα의 발현에 대해서 분석하였다.
배양 상청액을 각각의 웰로부터 제거하고, 5분 동안 1200rpm에서 원심분리하여 세포 잔해를 제거하였다. 상청액을 5% BSA/PBS 검정 완충제 중에 희석(1:2 또는 1:50 또는 1:100)시키고, 제조사의 프로토콜에 따라서 버키카인(Verikine) 인간 IFN 알파 키트(Pbl 어세이 사이언스(Pbl assay science))를 사용하여 ELISA를 수행하였다.
분비된 IFNα의 농도를 표준 곡선으로부터 내삽함으로써 결정하였다. 세포 상청액 중에서 감염의 기간에 걸쳐서 증가된 IFNα 발현을 HT-29 및 A549 세포주 둘 모두에서 검출하였다.
CD4+ T 세포의 경우 IFNγ의 발현은 NG-348 감염된 A549 세포로부터의 공배양물의 상청액에서만 검출되었고, EnAd 또는 미처리 대조군에서는 검출 가능하지 않았다(도 13A). CD8+ T 세포의 경우 IFNγ의 발현은 EnAd 또는 미처리 대조군의 경우보다 NG-348 감염된 A549 세포의 경우 상당히 더 높은 수준으로 검출되는데(도 13B), 이는 CD8 및 CD4 세포 둘 모두가 종양 세포주에서 NG-348 바이러스 활성도에 의해서 IFNγ를 분비하도록 활성화될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 8
A549 인간 폐 암종 세포 및 MRC5 인간 섬유모세포 세포를 EnAd, NG-347 또는 NG-348 바이러스(10ppc에서)와 함께 배양하여 이들 세포 유형에 의해서 바이러스 게놈 복제, 바이러스 헥손 및 이식유전자 발현을 비교하였다. 72시간 배양 후, 세포를 표면 마커 또는 상청액의 FACS 분석을 위해서 염색하였고, 세포 용해물을 헥손 또는 이식유전자 발현의 바이러스 게놈 복제(qPCR) 또는 mRNA(RT-qPCR) 분석을 위해서 준비하였다.
2개의 이식유전자 보유 바이러스, NG-347 및 NG-348에 대한 바이러스 게놈 복제 및 헥손 mRNA 발현은 모 바이러스, EnAd에 대한 것과 동등하였다(도 14). NG-348의 경우(도 15), CD80 및 항-인간 CD3-ScFv 이식유전자 mRNA 발현 수준은 A549 종양 세포에서 높았고, 비-종양 MRC5 세포의 경우에는 단지 낮은 수준의 신호를 가졌다. FACS에 의해서 평가된 세포의 표면 상에서의 CD80 단백질 발현은 대부분의 NG-348 처리된 A549 세포 상에서 검출되었지만, MRC5 세포 상에서는 검출 가능하지 않았고, CD80은 미처리 또는 EnAd로 처리된 세포 유형 상에서 검출되지 않았다. 유사하게, NG-347 처리 이후의 CD80 이식유전자 mRNA 및 단백질 발현은 MRC5 세포가 아닌 A549 종양 세포에서 선택적으로 검출되었다(도 16).
EnAd 및 NG-347 처리된 세포 배양물의 경우, 세포 용해물 중의 MIP-1α 및 IFNα mRNA의 수준 및 상청액 중의 분비된 단백질의 수준을 각각 RT-qPCR 및 특이적 ELISA에 의해서 측정하였다. 데이터(도 17)는 A549 종양 세포에 의한 두 이식유전자 모두의 선택적인 발현을 나타내고, MRC5 상청액 중에서 MIP1α 케모카인 또는 IFNα 사이토카인은 검출 가능하지 않았다.
실시예 9
단리된 CD3+ T 세포를 3일 동안 각각의 바이러스 500ppc 또는 5000ppc와 배양함으로써 인간 T-세포를 갖는 EnAd, NG-347 및 NG-348 바이러스의 선택성/활성도를 평가하였다.
a) CD69, CD4, CD80, CD25 및 CD3을 표적으로 하는 항체로 염색된 T 세포의 유세포 분석법 분석, b) 인간 MIP1α, IFNα 및 IFNγ 단백질 분비의 ELISA 분석, c) 바이러스 복제의 qPCR 분석 및 d) 유전자 발현의 RT-qPCR 분석에 의해서 선택성/활성도를 평가하였다. 도 18에 나타낸 바와 같이, T-세포는 바이러스 헥손 RT-qPCR 검정에서 배경 신호 만을 갖는 시험된 바이러스 중 어떤 것에 대해서도 바이러스 게놈 복제를 뒷받침하지 않았다. A549 종양 세포는 헥손 mRNA 발현의 높은 수준을 뒷받침하였다. T-세포에 의한 이식유전자 mRNA 발현에 대한 RT-qPCR 분석은 NG-347 및 NG-348 둘 모두에 의해서 CD80에 대해서 배경 신호(1카피/세포 미만) 만을 나타내었고, 높은 바이러스 노출(5000ppc)에도 불구하고, NG-348에 의해서 항-CD3-ScFv mRNA의 유의한 발현의 유사한 결여를 나타내었다. 두 이식유전자 모두의 높은 수준의 발현은 처리된(10ppc) A549 종양 세포에서 검출되었다(도 19 및 도 20). IFNα 및 MIP1α 이식유전자 mRNA의 발현은 또한 5000ppc로 처리된 T-세포에 의해서가 아니라 NG-347(EnAd 아님) 처리된 A549 종양 세포(10ppc에서)에 의해서 선택적으로 검출되었다(도 21). 또한, CD80 세포 표면 단백질 발현은 NG-347 및 NG-348 둘 모두에 대해서 T-세포가 아닌 A549 세포에서만 검출 가능하였다(도 19 및 도 20). EnAd 처리는 어느 하나의 세포 유형에 의해서도 CD80 발현으로 이어지지 않았고, A549 세포사(염료 흡수에 의해서 평가됨)는 모든 3개의 바이러스에 대해서 유사하게 높았고; 본 실험에서 사용된 매우 높은 수준의 바이러스 입자로 인해서 모든 바이러스에 의해서 낮은 수준의 비-특이적 T-세포사가 유도되었다(도 19 및 도 20). 500ppc에서 바이러스를 사용하는 경우 유사한 이식유전자 mRNA 및 단백질 발현 데이터가 수득되었다(데이터 나타내지 않음).
종양 세포의 부재 하에서, 정제된 인간 T-세포는 바이러스 중 임의의 것과 배양되는 경우 활성화 마커 CD25 또는 CD69를 상향조절하도록 활성화되지 않았다.
Figure pct00011
실시예 10
정제된 T-세포가 아니라 미분리 인간 PBMC를 사용하여, 동일한 활성도 평가를 비롯하여, 실시예 9에 기술된 것과 유사한 바이러스 선택성 실험을 수행하였다. 실시예 9에서의 인간 T-세포에서와 같이, 본 연구로부터의 데이터는 총괄적으로 인간 PBMC에 의한 바이러스 복제 및 이식유전자 발현의 결여를 입증한다. 도 12 내지 도 14는 5000ppc의 EnAd, NG-347 또는 NG-348을 사용한 데이터를 나타내지만, 500ppc를 사용하여 동일한 데이터가 생성되었다(도시되지 않음). 도 12는 바이러스 게놈 복제 및 헥손 mRNA 발현을 나타내고, 도 13 및 도 14는 이식유전자 mRNA 발현을 나타낸다. 배양 배지 중에 스파이킹된 각각의 바이러스를 사용한 검정에서 생성된 신호에 따라서 검정 배경을 설정하고, 이어서 세포 용해물 샘플에서와 동일한 방식으로 가공하였다. 바이러스 중 임의의 것을 갖는 이들 PBMC 배양물 중에서 CD3+ T-세포 또는 CD40+ 세포(주로 B-세포) 상에서의 CD80 이식유전자의 발현은 검출 가능하지 않았다(나타내지 않음).
PBMC 배양물 중에서 선천적 면역 세포(단핵구, DC)의 NG-347 및 NG-348 바이러스 입자-매개된 활성화는, CD14 발현의 하향조절 및 HLA-DR 및 내인성 세포 표면 CD80의 상향조절, 뿐만 아니라 MIP1α 및 IFNα의 분비에 대해서 도 15 및 도 16에 도시된 바와 같이, EnAd의 것과 유사하였다(NG-347이 이의 게놈에서 이들 분자 둘 모두를 암호화함에도 불구하고, 이식유전자를 암호화하지 않는 EnAd 및 NG-348에 대한 것보다 생산 수준이 증가하지 않았다는 것을 주목해야 한다).
실시예 11
본 실시예는 본 연구에서 실시예 9 및 22 10에서의 실험에 대한 설계와 유사하며, 인간 PBMC 또는 정제된 T-세포를 바이러스 예비 처리된 (48시간) A549 종양 세포 또는 MRC5 섬유모세포와 공배양하였다. A549 또는 MRC5 세포를 10ppc의 EnAd, NG-347, NG-348로 처리하거나 처리하지 않았고(UTC), 48시간 동안 배양하여 바이러스 복제 및 임의의 이식유전자 발현에 충분한 시간을 허용하였다. 이어서 PBMC 또는 T-세포를 배양물에 첨가하고, 24 또는 48시간 동안 정치시켜 T-세포를 활성화시키는 바이러스 처리된 세포의 능력을 평가하였다.
도 17은 PBMC 또는 T-세포 공배양물 중에서 3종의 바이러스의 대등한 복제를 나타내는 바이러스 게놈 복제를 나타내는데, 두 세포 유형 모두에서, 복제 수준은 A549 종양 세포에서는 높고, MRC5 섬유모세포에서는 낮다.
CD25 표면 발현의 상향조절에 의해서 측정된 바와 같은 T-세포 활성화 및 CD107a의 상향조절에 의해서 측정된 바와 같은 세포 표면 상에서의 CD8 효과기 T-세포 탈과립화, 및 세포내 사이토카인 염색에 의해서 측정된 IFNγ 생산은 모두 EnAd와 비교하여 NG-348 처리된 A549 세포에 의해서 선택적으로 자극되었으며, MRC 공배양물에서는 어떤 자극도 매개되지 않았다.
Figure pct00012
공배양물 상청액으로의 IFNγ 분비를 또한 ELISA에 의해서 정량화하였다. 데이터(도 28)는 유사하게 MRC5 섬유모세포가 아닌, NG-348 처리된 A549 종양 세포와 공배양된 T-세포의 선택적인 활성화를 입증하며, 정제된 T-세포 또는 PBMC가 본 검정에서 사용되었다.
정제된 T-세포 또는 PBMC와 A549 종양 세포 또는 MRC5 섬유모세포의 공배양물로부터 T-세포에 대한 CD69 수준을 측정함으로써 T-세포를 활성화시키는 NG-347의 능력을 또한 평가하였다. 표 8에 나타낸 바와 같이, EnAd와 비교하여 A549 종양 세포의 NG-347 처리에서 CD69 양성 T-세포의 약간의 증가가 인지되었고, 이는 그 자체로 이러한 초기 활성화 마커의 상향조절로 이어진다. 이러한 효과는 MRC5 공배양물에서는 인지되지 않았다. CD80 발현이 T-세포 상에서 검출되지 않았다(나타내지 않음).
Figure pct00013
별도의 실험에서, NG-347로 처리되고, 인간 CD3+ T-세포와 공배양된 A549 세포는 T-세포 상에서 CD69 활성화 마커를 상향조절하였고, IFNγ를 분비하였다(도 41 및 도 42 참고).
실시예 12
CD 14+ 단핵 세포를 항체 코팅된 자성 비드 분리에 의해서 PBMC로부터 단리하고, 인간 IL-4 및 GM-CSF와 함께 배양하여 그것을 수지상 세포와 구별하였다. 배양 3일 후, 세포를 5000ppc에서 EnAd, NG-347 또는 NG-348로 처리하거나 또는 처리하지 않았다. 양성 활성화 대조군으로서, 일부 세포를 LPS로 자극시켰다. 2일 후 상청액을 사이토카인 ELISA를 위해서 취하고, 세포를 표면 활성화 마커 발현에 대해서 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 표 9에 나타낸 바와 같이, 모든 바이러스는 공자극성 분자 CD80 및 CD86의 상향조절을 유도하였는데, 이는 이러한 미리 식별된 입자-매개된 선천적 면역 세포 활성화 효과가 NG-347 및 NG-348의 게놈 내로의 이식유전자 혼입에 의해서 변경되지 않았음을 나타낸다. 모든 바이러스는 또한 MIP1α 및 IFNα의 유사한 수준의 분비를 자극시켰다(도 29).
Figure pct00014
실시예 13
실험 세트에서, 주카트듀얼 세포를 NG-347, NG-348 및 NG-420 바이러스에 의한 이식유전자 발현의 기능성을 평가하기 위해서 T-세포 활성화 리포터 검정으로서 종양 세포와 함께 공배양물 중에서 사용하였고, EnAd를 음성 대조군으로서 제공하였다. 주카트듀얼 세포는 2종의 상이한 리포터 유전자: T-세포 수용체 복합체를 통해서 신호전달에 반응성인 루시페라제의 분비형을 생산하는 NFκB 리포터 유전자 및 IFNα-반응성의 분비된 알칼린 포스파타제(SEAP) 리포터 유전자를 안정하게 발현시킨다. A549 세포를 '10ppc에서 2일 동안 바이러스와 함께 미리 배양하고, 이어서 주카트듀얼 세포를 밤새 공배양(18 내지 24시간)을 위해서 첨가하고, 이어서 상청액을 루시페라제 및 SEAP 활성도의 검정을 위해서 수집하였다. 도 43에 나타낸 바와 같이, NG-347 감염된 A549 세포는 SEAP 생산(이는 IFNα의 생산에 부합함)을 선택적으로 유도하였지만(도 7 참고), 루시페라제 활성도를 유도하지 않았다. 이에 반해서, 막 항-CD3-ScFv를 발현시켜 T-세포 수용체 복합체를 활성화시키는 NG-348은 루시페라제를 유도하였지만, SEAP는 유도하지 않았다. 또 다른 실험에서 A549 폐 암종 세포 및 HCT-116, HT-29 및 DLD 결장 암종 세포를 48시간 동안 10ppc의 EnAd, NG-347, NG-348 또는 NG-420 바이러스와 미리 배양하고, 그 후 주카트듀얼 세포와 밤새 공배양하였고, 루시페라제의 수준에 대해서 시험된 상청액은 유도된 활성화 수준을 나타내었다. 도 31에 나타낸 바와 같이, 세포 표면 항-CD3-ScFv를 암호화하는, NG-348 또는 NG-420 바이러스와 함께 배양된 모든 4종의 종양 세포 유형은 주카트듀얼 세포를 활성화시킨 반면, EnAd 및 NG-347은 그렇지 않았고, 루시페라제의 수준은 비감염된 종양 세포 대조군(UIC)의 것과 유사하였다.
또 다른 실험에서, A549 또는 HT-29 종양 세포를 상이한 양의 NG-348 또는 NG-420과 미리 배양하고, 그 다음 주카트듀얼 세포를 첨가하고, 이의 루시페라제 분비를 측정하였다. 도 32에서의 데이터는 주카트듀얼 세포에서 NFKB 활성도의 활성화가 종양 세포를 처리하는 데 사용된 바이러스의 용량에 좌우된다는 것을 나타낸다.
실시예 14
면역적격 CD1 마우스에서 IV 투여 이후에 EnAd 및 NG-348의 생체내 약동학, 생물분포 및 입자-매개된 전신 사이토카인 유도 활성을 비교하였다. 마우스에게 5x109개 입자의 EnAd 또는 NG-348을 정맥내 투여하고, 투여 2, 10, 30, 60 및 120분 후에 채혈하였다. 전혈을 DNA 추출하였고, qPCR에 의해서 바이러스 게놈의 수준에 대해서 분석하였다(도 33). 혈액으로부터의 두 바이러스 모두의 클러어런스는 유사한 속도론을 따랐다. 유사하게, MCP-1 사이토카인 반응(선천적 면역, 예컨대 간 쿠퍼 세포의 입자-매개된 활성화의 척도)의 유도 또한 조직 생물분포 패턴에서와 같이 두 바이러스 모두에 대해서 유사하였다(도 33).
실시예 15
CB17 SCID 마우스에게 HCT116 세포를 피하로 이식하고, 종양이 70㎣을 초과하면, EnAd, NG-347 또는 NG-348 바이러스(5x109개 바이러스 입자), 또는 대조군을 종양내(IT) 또는 정맥내(IV)로 주사하였다. IV 투여된 마우스의 경우, 혈액 샘플을 IV 투여 3, 15 및 30분 후에 각각의 군으로부터의 3마리의 마우스로부터 채취하고, DNA 추출하고, qPCR(약동학 [PK] 분석)에 의해서 혈액 중의 바이러스 게놈의 수준을 평가하였다. 데이터(도 34)는 NG-347 및 NG-348이 EnAd와 (그리고 서로) 유사한 PK를 갖는다는 것을 나타낸다. 6시간 후, 종양, 간, 폐 및 비장을 각각의 군으로부터의 3마리의 마우스로부터 절제하였다. 균질화된 조직을 DNA 추출하고, qPCR(생물분포 분석)에 의해서 바이러스 게놈의 수준에 대해서 분석하였다. 데이터(도 35A)는 3종의 바이러스에 대해서 유사한 조직 생물분포를 나타낸다. 7일 또는 14 내지 21일 후, 종양을 각각의 군으로부터의 3마리의 마우스로부터 절제하고, 균질화시켜 종양 용해물을 생성하고, 이것을 사용하여 DNA 및 RNA 둘 모두를 준비하였다. 두 시간 지점에서 종양 중의 바이러스 게놈의 수준을 추출된 DNA의 qPCR 분석에 의해서 측정하였다. 데이터(도 35B)는 IV 투여된 마우스 및 IT 투여된 마우스 둘 모두로부터의 종양이 투여된 바이러스의 양보다 더 높은 바이러스 게놈의 수준을 갖는다는 것을 나타내는데, 이는 조직에서 바이러스 복제를 나타내고, IT 투여는 7일에 IV보다 더 높은 게놈 수준을 제공하지만, 둘 모두는 14 내지 21일 기간에서 유사하게 높다. 모든 3종의 바이러스는 유사한 수준으로 복제하였다.
유사하게, RT-qPCR에 의해서 검출된 종양 용해물 중의 바이러스 헥손 mRNA의 수준은 시험된 두 시간 지점 모두에서 EnAd, NG-347 및 NG-348 사이에서 대등하였다(도 36 및 도 37). EnAd 투여로의 검정 배경 판독으로, NG-348 치료의 경우 항-CD3-ScFv 및 CD80 mRNA의 유사한 수준이 두 시간 지점 모두 및 두 투여 경로 모두에서 검출되었다(도 37 및 도 38). MIP1α 및 IFNα mRNA 수준을 또한 IT 또는 IV에 의한 NG-347 투여 이후에 선택적으로 검출하였다(도 39).
NG-347 및 NG-348 둘 모두에 의해서 암호화된 CD80 단백질, 및 NG-347에 의해서 암호화된 MIP1a 단백질의 수준을 특이적 ELISA를 사용하여 종양 용해물 중에서 측정하였다. 도 40에서의 데이터는 단일 IV 바이러스 투여 이후에, 두 단백질 모두가 또한 종양 추출물 중에서 선택적으로 검출될 수 있다는 것을 나타낸다. 동일한 마우스로부터의 혈액 샘플에서는 어떤 단백질도 검출되지 않았다.
실시예 16
생체내에서 NG-348 바이러스의 활성도 및 종양 세포 의존성을 평가하기 위해서, 인간 PBMC(5x107개 세포), A549 인간 종양 세포(5x106) 및 EnAd 또는 NG-348(5x109ppc에서) 중 어느 하나의 상이한 조합물을 면역결핍 SCID-베이지 마우스의 복막에 주사하였고, 바이러스 또는 대조군(염수)을 세포 주사 후에 15분 이내에 투여하였다. 3일 후, 복강을 5㎖ 염수로 세척하고, 회수된 세포를 T-세포 활성화 마커(CD25, CD69 및 HLA-DR)의 패널로 유세포 분석법 분석에 의해서 분석하여 CD3+ T-세포 집단 상에서의 게이팅 후, T-세포 활성화의 수준을 평가하였다. 2회의 별개의 실험으로부터의 데이터는 NG-348이 종양 세포 의존적인 방식으로 생체내에서 인간 T-세포 활성화를 선택적으로 유발하는 것을 입증한다.
Figure pct00015
SEQUENCE LISTING <110> PsiOxus Therapeutics Limited <120> Virus Encoding An Anti-TCR-Complex Antibody or Fragment <130> WO 2017/103290 <140> PCT/EP2016/081817 <141> 2016-12-19 <150> GB1522334.0 <151> 2015-12-17 <150> GB1607463.5 <151> 2016-04-29 <150> GB1617207.4 <151> 2016-10-10 <150> GB1617206.6 <151> 2016-10-10 <160> 119 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Muromonab-CD3 (OKT3) VH <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 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<220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> X represents an amino acid <400> 43 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Ser Gly Ala Ser Ala Ser 1 5 10 <210> 44 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> flexible linker sequence <400> 44 Pro Gly Gly Asn Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr 1 5 10 15 Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr 20 25 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> flexible linker sequence <400> 45 Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr 1 5 10 <210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> flexible linker sequence <400> 46 Ala Thr Thr Thr Gly Ser 1 5 <210> 47 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 47 Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Ser Pro Pro Ser Lys Glu 1 5 10 15 Ser His Lys Ser Pro 20 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 48 Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 1 5 10 15 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 49 Gly Gly Gly Gly Ile Ala Pro Ser Met Val Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 50 Gly Gly Gly Gly Lys Val Glu Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 51 Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Ser His Asp Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 52 Gly Gly Gly Gly Asn Leu Ile Thr Ile Val Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 53 Gly Gly Gly Gly Val Val Pro Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 54 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 54 Gly Gly Glu Lys Ser Ile Pro Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 55 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 55 Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Pro Pro Phe Pro Phe Gly Phe Pro Ser Val 1 5 10 15 Arg Pro <210> 56 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 56 Tyr Pro Arg Ser Ile Tyr Ile Arg Arg Arg His Pro Ser Pro Ser Leu 1 5 10 15 Thr Thr <210> 57 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 57 Thr Pro Ser His Leu Ser His Ile Leu Pro Ser Phe Gly Leu Pro Thr 1 5 10 15 Phe Asn <210> 58 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 58 Arg Pro Val Ser Pro Phe Thr Phe Pro Arg Leu Ser Asn Ser Trp Leu 1 5 10 15 Pro Ala <210> 59 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 59 Ser Pro Ala Ala His Phe Pro Arg Ser Ile Pro Arg Pro Gly Pro Ile 1 5 10 15 Arg Thr <210> 60 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 60 Ala Pro Gly Pro Ser Ala Pro Ser His Arg Ser Leu Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 Phe Gly <210> 61 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 61 Pro Arg Asn Ser Ile His Phe Leu His Pro Leu Leu Val Ala Pro Leu 1 5 10 15 Gly Ala <210> 62 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 62 Met Pro Ser Leu Ser Gly Val Leu Gln Val Arg Tyr Leu Ser Pro Pro 1 5 10 15 Asp Leu <210> 63 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 63 Ser Pro Gln Tyr Pro Ser Pro Leu Thr Leu Thr Leu Pro Pro His Pro 1 5 10 15 Ser Leu <210> 64 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 64 Asn Pro Ser Leu Asn Pro Pro Ser Tyr Leu His Arg Ala Pro Ser Arg 1 5 10 15 Ile Ser <210> 65 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 65 Leu Pro Trp Arg Thr Ser Leu Leu Pro Ser Leu Pro Leu Arg Arg Arg 1 5 10 15 Pro <210> 66 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 66 Pro Pro Leu Phe Ala Lys Gly Pro Val Gly Leu Leu Ser Arg Ser Phe 1 5 10 15 Pro Pro <210> 67 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 67 Val Pro Pro Ala Pro Val Val Ser Leu Arg Ser Ala His Ala Arg Pro 1 5 10 15 Pro Tyr <210> 68 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 68 Leu Arg Pro Thr Pro Pro Arg Val Arg Ser Tyr Thr Cys Cys Pro Thr 1 5 10 15 Pro <210> 69 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 69 Pro Asn Val Ala His Val Leu Pro Leu Leu Thr Val Pro Trp Asp Asn 1 5 10 15 Leu Arg <210> 70 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 70 Cys Asn Pro Leu Leu Pro Leu Cys Ala Arg Ser Pro Ala Val Arg Thr 1 5 10 15 Phe Pro <210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 71 Gly Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 <210> 72 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 72 Pro Pro Pro Pro 1 <210> 73 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 73 Asp Leu Cys Leu Arg Asp Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 <210> 74 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 74 Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 <210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 75 Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Gly Asp 1 5 10 15 <210> 76 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 76 Gln Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Glu Asp Asp Glu 20 <210> 77 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 77 Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Gly Arg Ser Val 20 <210> 78 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 78 Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Gly Arg Ser Val Lys 20 <210> 79 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 79 Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp 1 5 10 15 <210> 80 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 80 Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu 1 5 10 15 Asp Asp <210> 81 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 81 Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp 1 5 10 15 <210> 82 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 82 Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp 1 5 10 15 <210> 83 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 83 Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Ala Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu 1 5 10 15 Asp Asp <210> 84 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 84 Glu Val Arg Ser Phe Cys Thr Arg Trp Pro Ala Glu Lys Ser Cys Lys 1 5 10 15 Pro Leu Arg Gly 20 <210> 85 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 85 Arg Ala Pro Glu Ser Phe Val Cys Tyr Trp Glu Thr Ile Cys Phe Glu 1 5 10 15 Arg Ser Glu Gln 20 <210> 86 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 86 Glu Met Cys Tyr Phe Pro Gly Ile Cys Trp Met 1 5 10 <210> 87 <211> 5288 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence corresponding to E2B region of the ENAD GENOME (BP 10355-5068) <400> 87 ctatggcatc tcgatccagc agacctcctc gtttcgcggg tttggacggc tcctggaata 60 gggtatgaga cgatgggcgt ccagcgctgc cagggttcgg tccttccagg gtctcagtgt 120 tcgagtcagg gttgtttccg tcacagtgaa ggggtgtgcg cctgcttggg cgcttgccag 180 ggtgcgcttc agactcatcc tgctggtcga aaacttctgt cgcttggcgc cctgtatgtc 240 ggccaagtag cagtttacca tgagttcgta gttgagcgcc tcggctgcgt ggcctttggc 300 gcggagctta cctttggaag ttttcttgca taccgggcag tataggcatt tcagcgcata 360 caacttgggc gcaaggaaaa cggattctgg ggagtatgca tctgcgccgc aggaggcgca 420 aacagtttca cattccacca gccaggttaa atccggttca ttggggtcaa aaacaagttt 480 tccgccatat tttttgatgc gtttcttacc tttggtctcc atgagttcgt gtcctcgttg 540 agtgacaaac aggctgtccg tgtccccgta gactgatttt acaggcctct tctccagtgg 600 agtgcctcgg tcttcttcgt acaggaactc tgaccactct gatacaaagg cgcgcgtcca 660 ggccagcaca aaggaggcta tgtgggaggg gtagcgatcg ttgtcaacca gggggtccac 720 cttttccaaa gtatgcaaac acatgtcacc ctcttcaaca tccaggaatg tgattggctt 780 gtaggtgtat ttcacgtgac ctggggtccc cgctgggggg gtataaaagg gggcggttct 840 ttgctcttcc tcactgtctt ccggatcgct gtccaggaac gtcagctgtt ggggtaggta 900 ttccctctcg aaggcgggca tgacctctgc actcaggttg tcagtttcta agaacgagga 960 ggatttgata ttgacagtgc cggttgagat gcctttcatg aggttttcgt ccatctggtc 1020 agaaaacaca atttttttat tgtcaagttt ggtggcaaat gatccataca gggcgttgga 1080 taaaagtttg gcaatggatc gcatggtttg gttcttttcc ttgtccgcgc gctctttggc 1140 ggcgatgttg agttggacat actcgcgtgc caggcacttc cattcgggga agatagttgt 1200 taattcatct ggcacgattc tcacttgcca ccctcgatta tgcaaggtaa ttaaatccac 1260 actggtggcc acctcgcctc gaaggggttc attggtccaa cagagcctac ctcctttcct 1320 agaacagaaa gggggaagtg ggtctagcat aagttcatcg ggagggtctg catccatggt 1380 aaagattccc ggaagtaaat ccttatcaaa atagctgatg ggagtggggt catctaaggc 1440 catttgccat tctcgagctg ccagtgcgcg ctcatatggg ttaaggggac tgccccatgg 1500 catgggatgg gtgagtgcag aggcatacat gccacagatg tcatagacgt agatgggatc 1560 ctcaaagatg cctatgtagg ttggatagca tcgcccccct ctgatacttg ctcgcacata 1620 gtcatatagt tcatgtgatg gcgctagcag ccccggaccc aagttggtgc gattgggttt 1680 ttctgttctg tagacgatct ggcgaaagat ggcgtgagaa ttggaagaga tggtgggtct 1740 ttgaaaaatg ttgaaatggg catgaggtag acctacagag tctctgacaa agtgggcata 1800 agattcttga agcttggtta ccagttcggc ggtgacaagt acgtctaggg cgcagtagtc 1860 aagtgtttct tgaatgatgt cataacctgg ttggtttttc ttttcccaca gttcgcggtt 1920 gagaaggtat tcttcgcgat ccttccagta ctcttctagc ggaaacccgt ctttgtctgc 1980 acggtaagat cctagcatgt agaactgatt aactgccttg taagggcagc agcccttctc 2040 tacgggtaga gagtatgctt gagcagcttt tcgtagcgaa gcgtgagtaa gggcaaaggt 2100 gtctctgacc atgactttga ggaattggta tttgaagtcg atgtcgtcac aggctccctg 2160 ttcccagagt tggaagtcta cccgtttctt gtaggcgggg ttgggcaaag cgaaagtaac 2220 atcattgaag agaatcttgc cggccctggg catgaaattg cgagtgatgc gaaaaggctg 2280 tggtacttcc gctcggttat tgataacctg ggcagctagg acgatctcgt cgaaaccgtt 2340 gatgttgtgt cctacgatgt ataattctat gaaacgcggc gtgcctctga cgtgaggtag 2400 cttactgagc tcatcaaagg ttaggtctgt ggggtcagat aaggcgtagt gttcgagagc 2460 ccattcgtgc aggtgaggat tcgctttaag gaaggaggac cagaggtcca ctgccagtgc 2520 tgtttgtaac tggtcccggt actgacgaaa atgccgtccg actgccattt tttctggggt 2580 gacgcaatag aaggtttggg ggtcctgccg ccagcgatcc cacttgagtt ttatggcgag 2640 gtcataggcg atgttgacga gccgctggtc tccagagagt ttcatgacca gcatgaaggg 2700 gattagctgc ttgccaaagg accccatcca ggtgtaggtt tccacatcgt aggtgagaaa 2760 gagcctttct gtgcgaggat gagagccaat cgggaagaac tggatctcct gccaccagtt 2820 ggaggaatgg ctgttgatgt gatggaagta gaactccctg cgacgcgccg agcattcatg 2880 cttgtgcttg tacagacggc cgcagtagtc gcagcgttgc acgggttgta tctcgtgaat 2940 gagttgtacc tggcttccct tgacgagaaa tttcagtggg aagccgaggc ctggcgattg 3000 tatctcgtgc tttactatgt tgtctgcatc ggcctgttca tcttctgtct cgatggtggt 3060 catgctgacg agccctcgcg ggaggcaagt ccagacctcg gcgcggcagg ggcggagctc 3120 gaggacgaga gcgcgcaggc tggagctgtc cagggtcctg agacgctgcg gactcaggtt 3180 agtaggcagt gtcaggagat taacttgcat gatcttttgg agggcgtgcg ggaggttcag 3240 atagtacttg atctcaacgg gtccgttggt ggagatgtcg atggcttgca gggttccgtg 3300 tcccttgggc gctaccaccg tgcccttgtt tttcattttg gacggcggtg gctctgttgc 3360 ttcttgcatg tttagaagcg gtgtcgaggg cgcgcaccgg gcggcagggg cggctcggga 3420 cccggcggca tggctggcag tggtacgtcg gcgccgcgcg cgggtaggtt ctggtactgc 3480 gccctgagaa gactcgcatg cgcgacgacg cggcggttga catcctggat ctgacgcctc 3540 tgggtgaaag ctaccggccc cgtgagcttg aacctgaaag agagttcaac agaatcaatc 3600 tcggtatcgt tgacggcggc ttgcctaagg atttcttgca cgtcaccaga gttgtcctgg 3660 taggcgatct ccgccatgaa ctgctcgatc tcttcctctt gaagatctcc gcggcccgct 3720 ctctcgacgg tggccgcgag gtcgttggag atgcgcccaa tgagttgaga gaatgcattc 3780 atgcccgcct cgttccagac gcggctgtag accacggccc ccacgggatc tctcgcgcgc 3840 atgaccacct gggcgaggtt gagctccacg tggcgggtga agaccgcata gttgcatagg 3900 cgctggaaaa ggtagttgag tgtggtggcg atgtgctcgg tgacgaagaa atacatgatc 3960 catcgtctca gcggcatctc gctgacatcg cccagagctt ccaagcgctc catggcctcg 4020 tagaagtcca cggcaaaatt aaaaaactgg gagtttcgcg cggacacggt caactcctct 4080 tccagaagac ggataagttc ggcgatggtg gtgcgcacct cgcgctcgaa agcccctggg 4140 atttcttcct caatctcttc ttcttccact aacatctctt cctcttcagg tggggctgca 4200 ggaggagggg gaacgcggcg acgccggcgg cgcacgggca gacggtcgat gaatctttca 4260 atgacctctc cgcggcggcg gcgcatggtt tcagtgacgg cgcggccgtt ctcgcgcggt 4320 cgcagagtaa aaacaccgcc gcgcatctcc ttaaagtggt gactgggagg ttctccgttt 4380 gggagggaga gggcgctgat tatacatttt attaattggc ccgtagggac tgcacgcaga 4440 gatctgatcg tgtcaagatc cacgggatct gaaaaccttt cgacgaaagc gtctaaccag 4500 tcacagtcac aaggtaggct gagtacggct tcttgtgggc gggggtggtt atgtgttcgg 4560 tctgggtctt ctgtttcttc ttcatctcgg gaaggtgaga cgatgctgct ggtgatgaaa 4620 ttaaagtagg cagttctaag acggcggatg gtggcgagga gcaccaggtc tttgggtccg 4680 gcttgctgga tacgcaggcg attggccatt ccccaagcat tatcctgaca tctagcaaga 4740 tctttgtagt agtcttgcat gagccgttct acgggcactt cttcctcacc cgttctgcca 4800 tgcatacgtg tgagtccaaa tccgcgcatt ggttgtacca gtgccaagtc agctacgact 4860 ctttcggcga ggatggcttg ctgtacttgg gtaagggtgg cttgaaagtc atcaaaatcc 4920 acaaagcggt ggtaagctcc tgtattaatg gtgtaagcac agttggccat gactgaccag 4980 ttaactgtct ggtgaccagg gcgcacgagc tcggtgtatt taaggcgcga ataggcgcgg 5040 gtgtcaaaga tgtaatcgtt gcaggtgcgc accagatact ggtaccctat aagaaaatgc 5100 ggcggtggtt ggcggtagag aggccatcgt tctgtagctg gagcgccagg ggcgaggtct 5160 tccaacataa ggcggtgata gccgtagatg tacctggaca tccaggtgat tcctgcggcg 5220 gtagtagaag cccgaggaaa ctcgcgtacg cggttccaaa tgttgcgtag cggcatgaag 5280 tagttcat 5288 <210> 88 <211> 201 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A non-coding sequence suitable for inclusion into BX <400> 88 aaaatgatta ataaaaaatc acttacttga aatcagcaat aaggtctctg ttgaaatttt 60 ctcccagcag cacctcactt ccctcttccc aactctggta ttctaaaccc cgttcagcgg 120 catactttct ccatacttta aaggggatgt caaattttag ctcctctcct gtacccacaa 180 tcttcatgtc tttcttccca g 201 <210> 89 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A non-coding sequence suitable for inclusion into BY <400> 89 caaataaagt ttaacttgtt tatttgaaaa tcaa 34 <210> 90 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Splice acceptor sequence <400> 90 tttctctctt cagg 14 <210> 91 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Splice acceptor sequence <400> 91 tgctaatctt cctttctctc ttcagg 26 <210> 92 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence comprising a start codon <400> 92 gccgccrcca ugg 13 <210> 93 <211> 550 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal Ribosome Entry Sequence (IRES) <400> 93 gttactggcc gaagccgctt ggaataaggc cggtgtgcgt ttgtctatat gttattttcc 60 accatattgc cgtcttttgg caatgtgagg gcccggaaac ctggccctgt cttcttgacg 120 agcattccta ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc aaggtctgtt gaatgtcgtg 180 aaggaagcag ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc gaccctttgc 240 aggcagcgga accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg gccaaaagcc acgtgtataa 300 gatacacctg caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat agttgtggaa 360 agagtcaaat ggctcccctc aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc ccagaaggta 420 ccccattgta tgggatctga tctggggcct cggtgcacat gcttttcatg tgtttagtcg 480 aggttaaaaa acgtctaggc cccccgaacc acggggacgt ggttttcctt tgaaaaacac 540 gatgataata 550 <210> 94 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> High efficiency self-cleavable P2A peptide sequence <400> 94 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 95 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> High efficiency self-cleavable F2A peptide sequence <400> 95 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 96 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> High efficiency self-cleavable E2A peptide sequence <400> 96 Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp 1 5 10 15 Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 97 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> High efficiency self-cleavable T2A peptide sequence <400> 97 Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 98 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD80 amino acid sequence <400> 98 Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr 1 5 10 15 Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys 20 25 30 Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu 35 40 45 Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile 50 55 60 Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp 65 70 75 80 Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr 85 90 95 Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly 100 105 110 Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg 115 120 125 Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr 130 135 140 Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile 145 150 155 160 Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu 165 170 175 Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp 180 185 190 Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met 195 200 205 Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg 210 215 220 Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro 225 230 235 240 Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly 245 250 255 Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg 260 265 270 Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val 275 280 285 <210> 99 <211> 192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> poly adenylation sequence (SV40 late polyA sequence) <400> 99 cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 60 aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 120 ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt 180 gggaggtttt tt 192 <210> 100 <211> 34522 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-348 virus genome sequence comprising the EnAd genome with a transgene cassette that encodes a membrane-anchored chimeric form of the single chain Fv anti-human CD3e and the T lymphocyte activation antigen, CD80 inserted in the region BY. <400> 100 tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60 aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120 ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180 gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240 aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300 tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360 ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420 ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480 tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540 tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600 aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660 cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720 agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780 tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840 tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900 ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960 aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020 tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080 aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140 tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200 attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260 atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320 caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380 cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440 agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500 ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560 taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620 gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680 tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740 aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800 ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860 caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920 tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980 gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040 gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100 aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160 gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220 taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280 gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340 agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400 tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460 acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520 ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580 gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640 tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700 ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760 tttctatgcg tgttggattg 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aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660 gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720 tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780 aagttacttg tccttttggc ccagctggag gctttgaccc aacgtctggg tgaactttct 3840 cagcaggtgg tcgagttgcg agtacaaact gagtctgctg tcggcacggc aaagtctaaa 3900 taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960 gtttttattt catttttcgc gcacggtatg ccctagacca ccgatctcta tcattgagaa 4020 ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080 ttaggccgtc tttggggtgg agatagctcc attgaaggga ttcatgctcc ggggtagtgt 4140 tgtaaatcac ccagtcataa caaggtcgca gtgcatggtg ttgcacaata tcttttagaa 4200 gtaggctgat tgccacagat aagcccttgg tgtaggtgtt tacaaaccgg ttgagctggg 4260 atgggtgcat tcggggtgaa attatgtgca ttttggattg gatttttaag ttggcaatat 4320 tgccgccaag atcccgtctt gggttcatgt tatgaaggac caccaagacg gtgtatccgg 4380 tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440 ccttgtgtcc tccaagattt tccatgcact catccatgat aatagcaatg gggccgtggg 4500 cagcggcgcg ggcaaacacg ttccgtgggt ctgacacatc atagttatgt tcctgagtta 4560 aatcatcata agccatttta atgaatttgg ggcggagagt accagattgg ggtatgaatg 4620 ttccttcggg ccccggagca tagttcccct cacagatttg catttcccaa gctttcagtt 4680 ccgagggtgg aatcatgtcc acctgggggg ctatgaaaaa caccgtttct ggggcggggg 4740 tgattaattg tgatgatagc aaatttctga gcaattgaga tttgccacat ccggtggggc 4800 cataaatgat tccgattacg ggttgcaggt ggtagtttag ggaacggcaa ctgccgtctt 4860 ctcgaagcaa gggggccacc tcgttcatca tttcccttac atgcatattt tcccgcacca 4920 aatccattag gaggcgctct cctcctagtg atagaagttc ttgtagtgag gaaaagtttt 4980 tcagcggttt cagaccgtca gccatgggca ttttggagag agtttgctgc aaaagttcta 5040 gtctgttcca cagttcagtg atgtgttcta tggcatctcg atccagcaga cctcctcgtt 5100 tcgcgggttt ggacggctcc tggaataggg tatgagacga tgggcgtcca gcgctgccag 5160 ggttcggtcc ttccagggtc tcagtgttcg agtcagggtt gtttccgtca cagtgaaggg 5220 gtgtgcgcct gcttgggcgc ttgccagggt gcgcttcaga ctcatcctgc tggtcgaaaa 5280 cttctgtcgc ttggcgccct gtatgtcggc caagtagcag tttaccatga gttcgtagtt 5340 gagcgcctcg gctgcgtggc ctttggcgcg gagcttacct ttggaagttt tcttgcatac 5400 cgggcagtat aggcatttca gcgcatacaa cttgggcgca aggaaaacgg attctgggga 5460 gtatgcatct gcgccgcagg aggcgcaaac agtttcacat tccaccagcc aggttaaatc 5520 cggttcattg gggtcaaaaa caagttttcc gccatatttt ttgatgcgtt tcttaccttt 5580 ggtctccatg agttcgtgtc ctcgttgagt gacaaacagg ctgtccgtgt ccccgtagac 5640 tgattttaca ggcctcttct ccagtggagt gcctcggtct tcttcgtaca ggaactctga 5700 ccactctgat acaaaggcgc gcgtccaggc cagcacaaag gaggctatgt gggaggggta 5760 gcgatcgttg tcaaccaggg ggtccacctt ttccaaagta tgcaaacaca tgtcaccctc 5820 ttcaacatcc aggaatgtga ttggcttgta ggtgtatttc acgtgacctg gggtccccgc 5880 tgggggggta taaaaggggg cggttctttg ctcttcctca ctgtcttccg gatcgctgtc 5940 caggaacgtc agctgttggg gtaggtattc cctctcgaag gcgggcatga cctctgcact 6000 caggttgtca gtttctaaga acgaggagga tttgatattg acagtgccgg ttgagatgcc 6060 tttcatgagg ttttcgtcca tctggtcaga aaacacaatt tttttattgt caagtttggt 6120 ggcaaatgat ccatacaggg 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cgcggttgag aaggtattct tcgcgatcct tccagtactc 7020 ttctagcgga aacccgtctt tgtctgcacg gtaagatcct agcatgtaga actgattaac 7080 tgccttgtaa gggcagcagc ccttctctac gggtagagag tatgcttgag cagcttttcg 7140 tagcgaagcg tgagtaaggg caaaggtgtc tctgaccatg actttgagga attggtattt 7200 gaagtcgatg tcgtcacagg ctccctgttc ccagagttgg aagtctaccc gtttcttgta 7260 ggcggggttg ggcaaagcga aagtaacatc attgaagaga atcttgccgg ccctgggcat 7320 gaaattgcga gtgatgcgaa aaggctgtgg tacttccgct cggttattga taacctgggc 7380 agctaggacg atctcgtcga aaccgttgat gttgtgtcct acgatgtata attctatgaa 7440 acgcggcgtg cctctgacgt gaggtagctt actgagctca tcaaaggtta ggtctgtggg 7500 gtcagataag gcgtagtgtt cgagagccca ttcgtgcagg tgaggattcg ctttaaggaa 7560 ggaggaccag aggtccactg ccagtgctgt ttgtaactgg tcccggtact gacgaaaatg 7620 ccgtccgact gccatttttt ctggggtgac gcaatagaag gtttgggggt cctgccgcca 7680 gcgatcccac ttgagtttta tggcgaggtc ataggcgatg ttgacgagcc gctggtctcc 7740 agagagtttc atgaccagca tgaaggggat tagctgcttg ccaaaggacc ccatccaggt 7800 gtaggtttcc acatcgtagg tgagaaagag cctttctgtg cgaggatgag agccaatcgg 7860 gaagaactgg atctcctgcc accagttgga ggaatggctg ttgatgtgat ggaagtagaa 7920 ctccctgcga cgcgccgagc attcatgctt gtgcttgtac agacggccgc agtagtcgca 7980 gcgttgcacg ggttgtatct cgtgaatgag ttgtacctgg cttcccttga cgagaaattt 8040 cagtgggaag ccgaggcctg gcgattgtat ctcgtgcttt actatgttgt ctgcatcggc 8100 ctgttcatct tctgtctcga tggtggtcat gctgacgagc cctcgcggga ggcaagtcca 8160 gacctcggcg cggcaggggc ggagctcgag gacgagagcg cgcaggctgg agctgtccag 8220 ggtcctgaga cgctgcggac tcaggttagt aggcagtgtc aggagattaa cttgcatgat 8280 cttttggagg gcgtgcggga ggttcagata gtacttgatc tcaacgggtc cgttggtgga 8340 gatgtcgatg gcttgcaggg ttccgtgtcc cttgggcgct accaccgtgc ccttgttttt 8400 cattttggac ggcggtggct ctgttgcttc ttgcatgttt agaagcggtg tcgagggcgc 8460 gcaccgggcg gcaggggcgg ctcgggaccc ggcggcatgg ctggcagtgg tacgtcggcg 8520 ccgcgcgcgg gtaggttctg gtactgcgcc ctgagaagac tcgcatgcgc gacgacgcgg 8580 cggttgacat cctggatctg acgcctctgg gtgaaagcta ccggccccgt gagcttgaac 8640 ctgaaagaga gttcaacaga atcaatctcg gtatcgttga cggcggcttg cctaaggatt 8700 tcttgcacgt caccagagtt gtcctggtag gcgatctccg ccatgaactg ctcgatctct 8760 tcctcttgaa gatctccgcg gcccgctctc tcgacggtgg ccgcgaggtc gttggagatg 8820 cgcccaatga gttgagagaa tgcattcatg cccgcctcgt tccagacgcg gctgtagacc 8880 acggccccca cgggatctct cgcgcgcatg accacctggg cgaggttgag ctccacgtgg 8940 cgggtgaaga ccgcatagtt gcataggcgc tggaaaaggt agttgagtgt ggtggcgatg 9000 tgctcggtga cgaagaaata catgatccat cgtctcagcg gcatctcgct gacatcgccc 9060 agagcttcca agcgctccat ggcctcgtag aagtccacgg caaaattaaa aaactgggag 9120 tttcgcgcgg acacggtcaa ctcctcttcc agaagacgga taagttcggc gatggtggtg 9180 cgcacctcgc gctcgaaagc ccctgggatt tcttcctcaa tctcttcttc ttccactaac 9240 atctcttcct cttcaggtgg ggctgcagga ggagggggaa cgcggcgacg ccggcggcgc 9300 acgggcagac ggtcgatgaa tctttcaatg acctctccgc ggcggcggcg catggtttca 9360 gtgacggcgc ggccgttctc gcgcggtcgc agagtaaaaa caccgccgcg catctcctta 9420 aagtggtgac tgggaggttc tccgtttggg agggagaggg cgctgattat acattttatt 9480 aattggcccg tagggactgc acgcagagat ctgatcgtgt caagatccac gggatctgaa 9540 aacctttcga cgaaagcgtc taaccagtca cagtcacaag gtaggctgag tacggcttct 9600 tgtgggcggg ggtggttatg tgttcggtct gggtcttctg tttcttcttc atctcgggaa 9660 ggtgagacga tgctgctggt gatgaaatta aagtaggcag ttctaagacg gcggatggtg 9720 gcgaggagca ccaggtcttt gggtccggct tgctggatac gcaggcgatt ggccattccc 9780 caagcattat cctgacatct agcaagatct ttgtagtagt cttgcatgag ccgttctacg 9840 ggcacttctt cctcacccgt tctgccatgc atacgtgtga gtccaaatcc gcgcattggt 9900 tgtaccagtg ccaagtcagc tacgactctt tcggcgagga tggcttgctg tacttgggta 9960 agggtggctt gaaagtcatc aaaatccaca aagcggtggt aagctcctgt attaatggtg 10020 taagcacagt tggccatgac tgaccagtta actgtctggt gaccagggcg cacgagctcg 10080 gtgtatttaa ggcgcgaata ggcgcgggtg tcaaagatgt aatcgttgca ggtgcgcacc 10140 agatactggt accctataag aaaatgcggc ggtggttggc ggtagagagg ccatcgttct 10200 gtagctggag cgccaggggc gaggtcttcc aacataaggc ggtgatagcc gtagatgtac 10260 ctggacatcc aggtgattcc tgcggcggta gtagaagccc gaggaaactc gcgtacgcgg 10320 ttccaaatgt tgcgtagcgg catgaagtag ttcattgtag gcacggtttg accagtgagg 10380 cgcgcgcagt cattgatgct ctatagacac ggagaaaatg aaagcgttca gcgactcgac 10440 tccgtagcct ggaggaacgt gaacgggttg ggtcgcggtg taccccggtt cgagacttgt 10500 actcgagccg gccggagccg cggctaacgt ggtattggca ctcccgtctc gacccagcct 10560 acaaaaatcc aggatacgga atcgagtcgt tttgctggtt tccgaatggc agggaagtga 10620 gtcctatttt ttttttttgc cgctcagatg catcccgtgc tgcgacagat gcgcccccaa 10680 caacagcccc cctcgcagca gcagcagcag caatcacaaa aggctgtccc tgcaactact 10740 gcaactgccg ccgtgagcgg tgcgggacag cccgcctatg atctggactt ggaagagggc 10800 gaaggactgg cacgtctagg tgcgccttca cccgagcggc atccgcgagt tcaactgaaa 10860 aaagattctc gcgaggcgta tgtgccccaa cagaacctat ttagagacag aagcggcgag 10920 gagccggagg agatgcgagc ttcccgcttt aacgcgggtc gtgagctgcg tcacggtttg 10980 gaccgaagac gagtgttgcg ggacgaggat ttcgaagttg atgaaatgac agggatcagt 11040 cctgccaggg cacacgtggc tgcagccaac cttgtatcgg cttacgagca gacagtaaag 11100 gaagagcgta acttccaaaa gtcttttaat aatcatgtgc gaaccctgat tgcccgcgaa 11160 gaagttaccc 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cacctcattt acatattggc accattccat ctataaggta tattatatag ataga 34555 <210> 103 <211> 33595 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-420 virus genome sequence comprising the EnAd genome with a transgene cassette that encodes a membrane-anchored chimeric form of the single chain Fv anti-human CD3e inserted in the region BY. <400> 103 tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60 aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120 ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180 gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240 aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300 tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360 ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420 ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480 tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540 tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600 aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660 cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720 agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780 tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840 tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900 ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960 aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020 tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080 aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140 tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200 attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260 atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320 caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380 cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440 agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500 ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560 taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620 gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680 tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740 aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800 ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860 caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920 tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980 gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040 gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100 aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160 gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220 taagagggag agggcatcta gtggtactga 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tttaggataa 1740 aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800 ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860 caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920 tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980 gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040 gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100 aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160 gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220 taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280 gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340 agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400 tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460 acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520 ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca 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gacgaaaatg 7620 ccgtccgact gccatttttt ctggggtgac gcaatagaag gtttgggggt cctgccgcca 7680 gcgatcccac ttgagtttta tggcgaggtc ataggcgatg ttgacgagcc gctggtctcc 7740 agagagtttc atgaccagca tgaaggggat tagctgcttg ccaaaggacc ccatccaggt 7800 gtaggtttcc acatcgtagg tgagaaagag cctttctgtg cgaggatgag agccaatcgg 7860 gaagaactgg atctcctgcc accagttgga ggaatggctg ttgatgtgat ggaagtagaa 7920 ctccctgcga cgcgccgagc attcatgctt gtgcttgtac agacggccgc agtagtcgca 7980 gcgttgcacg ggttgtatct cgtgaatgag ttgtacctgg cttcccttga cgagaaattt 8040 cagtgggaag ccgaggcctg gcgattgtat ctcgtgcttt actatgttgt ctgcatcggc 8100 ctgttcatct tctgtctcga tggtggtcat gctgacgagc cctcgcggga ggcaagtcca 8160 gacctcggcg cggcaggggc ggagctcgag gacgagagcg cgcaggctgg agctgtccag 8220 ggtcctgaga cgctgcggac tcaggttagt aggcagtgtc aggagattaa cttgcatgat 8280 cttttggagg gcgtgcggga ggttcagata gtacttgatc tcaacgggtc cgttggtgga 8340 gatgtcgatg gcttgcaggg ttccgtgtcc cttgggcgct accaccgtgc ccttgttttt 8400 cattttggac ggcggtggct ctgttgcttc ttgcatgttt agaagcggtg tcgagggcgc 8460 gcaccgggcg gcaggggcgg ctcgggaccc ggcggcatgg ctggcagtgg tacgtcggcg 8520 ccgcgcgcgg gtaggttctg gtactgcgcc ctgagaagac tcgcatgcgc gacgacgcgg 8580 cggttgacat cctggatctg acgcctctgg gtgaaagcta ccggccccgt gagcttgaac 8640 ctgaaagaga gttcaacaga atcaatctcg gtatcgttga cggcggcttg cctaaggatt 8700 tcttgcacgt caccagagtt gtcctggtag gcgatctccg ccatgaactg ctcgatctct 8760 tcctcttgaa gatctccgcg gcccgctctc tcgacggtgg ccgcgaggtc gttggagatg 8820 cgcccaatga gttgagagaa tgcattcatg cccgcctcgt tccagacgcg gctgtagacc 8880 acggccccca cgggatctct cgcgcgcatg accacctggg cgaggttgag ctccacgtgg 8940 cgggtgaaga ccgcatagtt gcataggcgc tggaaaaggt agttgagtgt ggtggcgatg 9000 tgctcggtga cgaagaaata catgatccat cgtctcagcg gcatctcgct gacatcgccc 9060 agagcttcca agcgctccat ggcctcgtag aagtccacgg caaaattaaa aaactgggag 9120 tttcgcgcgg acacggtcaa ctcctcttcc agaagacgga taagttcggc gatggtggtg 9180 cgcacctcgc gctcgaaagc ccctgggatt tcttcctcaa tctcttcttc ttccactaac 9240 atctcttcct cttcaggtgg ggctgcagga ggagggggaa cgcggcgacg 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Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 145 150 155 160 Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys 165 170 175 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser 180 185 190 Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 195 200 205 Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser 210 215 220 Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 245 250 255 Glu Ile Asn Arg Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 260 265 270 Asn Ala Val Gly Gln Asp Thr Gln Glu Val Ile Val Val Pro His Ser 275 280 285 Leu Pro Phe Lys Val Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val 290 295 300 Leu Thr Ile Ile Ser Leu Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys 305 310 315 320 Pro Arg <210> 109 <211> 33493 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-330 virus genome sequence comprising the EnAd genome with a transgene cassette that encodes the T lymphocyte activation antigen, CD80, inserted in the region By. The transgene cassette contains a 5' SSA, human CD80 cDNA sequence and a 3' poly(A) <400> 109 tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60 aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120 ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180 gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240 aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300 tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360 ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420 ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480 tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540 tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600 aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660 cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720 agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780 tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840 tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900 ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960 aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020 tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080 aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140 tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200 attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260 atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320 caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380 cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440 agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500 ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560 taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620 gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680 tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740 aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800 ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860 caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920 tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980 gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040 gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100 aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160 gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220 taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280 gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340 agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400 tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460 acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520 ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580 gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640 tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700 ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760 tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820 atgcatattt caaagatgta acctgggcat tctgaatgaa ggcgaagcaa gggtccgcca 2880 ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttgattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940 taacatgatt tgcggtgctt ccgatgagag gccttatcaa atgctcactt gtgctggtgg 3000 gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060 ttttgatcac aatgtgatga cgaagtgtac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120 tatgccttac cagtgtaaca tgaatcatgt gaaagtgttg ttggaaccag atgccttttc 3180 cagaatgagc ctaacaggaa tttttgacat gaacatgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240 tgatgatacg agatcgaggg tacgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300 gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360 tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420 tggggtggga ttttcagatg gacagattga gtaaaaattt gttttttctg tcttgcagct 3480 gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540 ctcccatcct gggcaggagt tcgtcagaat gttatgggat ctactgtgga tggaagaccc 3600 gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660 gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720 tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780 aagttacttg tccttttggc ccagctggag gctttgaccc aacgtctggg tgaactttct 3840 cagcaggtgg tcgagttgcg agtacaaact gagtctgctg tcggcacggc aaagtctaaa 3900 taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960 gtttttattt catttttcgc gcacggtatg ccctagacca ccgatctcta tcattgagaa 4020 ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080 ttaggccgtc tttggggtgg agatagctcc attgaaggga ttcatgctcc ggggtagtgt 4140 tgtaaatcac ccagtcataa caaggtcgca gtgcatggtg ttgcacaata tcttttagaa 4200 gtaggctgat tgccacagat aagcccttgg tgtaggtgtt tacaaaccgg ttgagctggg 4260 atgggtgcat tcggggtgaa attatgtgca ttttggattg gatttttaag ttggcaatat 4320 tgccgccaag atcccgtctt gggttcatgt tatgaaggac caccaagacg gtgtatccgg 4380 tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440 ccttgtgtcc tccaagattt tccatgcact catccatgat aatagcaatg gggccgtggg 4500 cagcggcgcg ggcaaacacg ttccgtgggt ctgacacatc atagttatgt tcctgagtta 4560 aatcatcata agccatttta atgaatttgg ggcggagagt accagattgg ggtatgaatg 4620 ttccttcggg ccccggagca tagttcccct cacagatttg catttcccaa gctttcagtt 4680 ccgagggtgg aatcatgtcc acctgggggg ctatgaaaaa caccgtttct ggggcggggg 4740 tgattaattg tgatgatagc aaatttctga gcaattgaga tttgccacat ccggtggggc 4800 cataaatgat tccgattacg ggttgcaggt ggtagtttag ggaacggcaa ctgccgtctt 4860 ctcgaagcaa gggggccacc tcgttcatca tttcccttac atgcatattt tcccgcacca 4920 aatccattag gaggcgctct cctcctagtg atagaagttc ttgtagtgag gaaaagtttt 4980 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cccccctctg atacttgctc gcacatagtc atatagttca tgtgatggcg ctagcagccc 6720 cggacccaag ttggtgcgat tgggtttttc tgttctgtag acgatctggc gaaagatggc 6780 gtgagaattg gaagagatgg tgggtctttg aaaaatgttg aaatgggcat gaggtagacc 6840 tacagagtct ctgacaaagt gggcataaga ttcttgaagc ttggttacca gttcggcggt 6900 gacaagtacg tctagggcgc agtagtcaag tgtttcttga atgatgtcat aacctggttg 6960 gtttttcttt tcccacagtt cgcggttgag aaggtattct tcgcgatcct tccagtactc 7020 ttctagcgga aacccgtctt tgtctgcacg gtaagatcct agcatgtaga actgattaac 7080 tgccttgtaa gggcagcagc ccttctctac gggtagagag tatgcttgag cagcttttcg 7140 tagcgaagcg tgagtaaggg caaaggtgtc tctgaccatg actttgagga attggtattt 7200 gaagtcgatg tcgtcacagg ctccctgttc ccagagttgg aagtctaccc gtttcttgta 7260 ggcggggttg ggcaaagcga aagtaacatc attgaagaga atcttgccgg ccctgggcat 7320 gaaattgcga gtgatgcgaa aaggctgtgg tacttccgct cggttattga taacctgggc 7380 agctaggacg atctcgtcga aaccgttgat gttgtgtcct acgatgtata attctatgaa 7440 acgcggcgtg cctctgacgt gaggtagctt actgagctca tcaaaggtta ggtctgtggg 7500 gtcagataag gcgtagtgtt cgagagccca ttcgtgcagg tgaggattcg ctttaaggaa 7560 ggaggaccag aggtccactg ccagtgctgt ttgtaactgg tcccggtact gacgaaaatg 7620 ccgtccgact gccatttttt ctggggtgac gcaatagaag gtttgggggt cctgccgcca 7680 gcgatcccac ttgagtttta tggcgaggtc ataggcgatg ttgacgagcc gctggtctcc 7740 agagagtttc atgaccagca tgaaggggat tagctgcttg ccaaaggacc ccatccaggt 7800 gtaggtttcc acatcgtagg tgagaaagag cctttctgtg cgaggatgag agccaatcgg 7860 gaagaactgg atctcctgcc accagttgga ggaatggctg ttgatgtgat ggaagtagaa 7920 ctccctgcga cgcgccgagc attcatgctt gtgcttgtac agacggccgc agtagtcgca 7980 gcgttgcacg ggttgtatct cgtgaatgag ttgtacctgg cttcccttga cgagaaattt 8040 cagtgggaag ccgaggcctg gcgattgtat ctcgtgcttt actatgttgt ctgcatcggc 8100 ctgttcatct tctgtctcga tggtggtcat gctgacgagc cctcgcggga ggcaagtcca 8160 gacctcggcg cggcaggggc ggagctcgag gacgagagcg cgcaggctgg agctgtccag 8220 ggtcctgaga cgctgcggac tcaggttagt aggcagtgtc aggagattaa cttgcatgat 8280 cttttggagg gcgtgcggga ggttcagata gtacttgatc tcaacgggtc cgttggtgga 8340 gatgtcgatg gcttgcaggg ttccgtgtcc cttgggcgct accaccgtgc ccttgttttt 8400 cattttggac ggcggtggct ctgttgcttc ttgcatgttt agaagcggtg tcgagggcgc 8460 gcaccgggcg gcaggggcgg ctcgggaccc ggcggcatgg ctggcagtgg tacgtcggcg 8520 ccgcgcgcgg gtaggttctg gtactgcgcc ctgagaagac tcgcatgcgc gacgacgcgg 8580 cggttgacat cctggatctg acgcctctgg gtgaaagcta ccggccccgt gagcttgaac 8640 ctgaaagaga gttcaacaga atcaatctcg gtatcgttga cggcggcttg cctaaggatt 8700 tcttgcacgt caccagagtt gtcctggtag gcgatctccg ccatgaactg ctcgatctct 8760 tcctcttgaa gatctccgcg gcccgctctc tcgacggtgg ccgcgaggtc gttggagatg 8820 cgcccaatga gttgagagaa tgcattcatg cccgcctcgt tccagacgcg gctgtagacc 8880 acggccccca cgggatctct cgcgcgcatg accacctggg cgaggttgag ctccacgtgg 8940 cgggtgaaga ccgcatagtt gcataggcgc tggaaaaggt agttgagtgt ggtggcgatg 9000 tgctcggtga cgaagaaata catgatccat cgtctcagcg gcatctcgct gacatcgccc 9060 agagcttcca agcgctccat ggcctcgtag aagtccacgg caaaattaaa aaactgggag 9120 tttcgcgcgg acacggtcaa ctcctcttcc agaagacgga taagttcggc gatggtggtg 9180 cgcacctcgc gctcgaaagc ccctgggatt tcttcctcaa tctcttcttc ttccactaac 9240 atctcttcct cttcaggtgg ggctgcagga ggagggggaa cgcggcgacg ccggcggcgc 9300 acgggcagac ggtcgatgaa tctttcaatg acctctccgc ggcggcggcg catggtttca 9360 gtgacggcgc ggccgttctc gcgcggtcgc agagtaaaaa caccgccgcg catctcctta 9420 aagtggtgac tgggaggttc tccgtttggg agggagaggg cgctgattat acattttatt 9480 aattggcccg tagggactgc acgcagagat ctgatcgtgt caagatccac gggatctgaa 9540 aacctttcga cgaaagcgtc taaccagtca cagtcacaag gtaggctgag tacggcttct 9600 tgtgggcggg ggtggttatg tgttcggtct gggtcttctg tttcttcttc atctcgggaa 9660 ggtgagacga tgctgctggt gatgaaatta aagtaggcag ttctaagacg gcggatggtg 9720 gcgaggagca ccaggtcttt gggtccggct tgctggatac gcaggcgatt ggccattccc 9780 caagcattat cctgacatct agcaagatct ttgtagtagt cttgcatgag ccgttctacg 9840 ggcacttctt cctcacccgt tctgccatgc atacgtgtga gtccaaatcc gcgcattggt 9900 tgtaccagtg ccaagtcagc tacgactctt tcggcgagga tggcttgctg tacttgggta 9960 agggtggctt gaaagtcatc aaaatccaca aagcggtggt aagctcctgt attaatggtg 10020 taagcacagt tggccatgac tgaccagtta actgtctggt gaccagggcg cacgagctcg 10080 gtgtatttaa ggcgcgaata ggcgcgggtg tcaaagatgt aatcgttgca ggtgcgcacc 10140 agatactggt accctataag aaaatgcggc ggtggttggc ggtagagagg ccatcgttct 10200 gtagctggag cgccaggggc gaggtcttcc aacataaggc ggtgatagcc gtagatgtac 10260 ctggacatcc aggtgattcc tgcggcggta gtagaagccc gaggaaactc gcgtacgcgg 10320 ttccaaatgt tgcgtagcgg catgaagtag ttcattgtag gcacggtttg accagtgagg 10380 cgcgcgcagt cattgatgct ctatagacac ggagaaaatg aaagcgttca gcgactcgac 10440 tccgtagcct ggaggaacgt gaacgggttg ggtcgcggtg taccccggtt cgagacttgt 10500 actcgagccg gccggagccg cggctaacgt ggtattggca ctcccgtctc gacccagcct 10560 acaaaaatcc aggatacgga atcgagtcgt tttgctggtt tccgaatggc agggaagtga 10620 gtcctatttt ttttttttgc cgctcagatg catcccgtgc tgcgacagat gcgcccccaa 10680 caacagcccc cctcgcagca gcagcagcag caatcacaaa aggctgtccc tgcaactact 10740 gcaactgccg ccgtgagcgg tgcgggacag cccgcctatg atctggactt ggaagagggc 10800 gaaggactgg cacgtctagg tgcgccttca cccgagcggc atccgcgagt 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tcgacatggg agctgacttg 11700 cagtggcagc ctagtcgcag ggctctgagc gccgcgacgg caggatgtga gcttccttac 11760 atagaagagg cggatgaagg cgaggaggaa gagggcgagt acttggaaga ctgatggcac 11820 aacccgtgtt ttttgctaga tggaacagca agcaccggat cccgcaatgc gggcggcgct 11880 gcagagccag ccgtccggca ttaactcctc ggacgattgg acccaggcca tgcaacgtat 11940 catggcgttg acgactcgca accccgaagc ctttagacag caaccccagg ccaaccgtct 12000 atcggccatc atggaagctg tagtgccttc ccgctctaat cccactcatg agaaggtcct 12060 ggccatcgtg aacgcgttgg tggagaacaa agctattcgt ccagatgagg ccggactggt 12120 atacaacgct ctcttagaac gcgtggctcg ctacaacagt agcaatgtgc aaaccaattt 12180 ggaccgtatg ataacagatg tacgcgaagc cgtgtctcag cgcgaaaggt tccagcgtga 12240 tgccaacctg ggttcgctgg tggcgttaaa tgctttcttg agtactcagc ctgctaatgt 12300 gccgcgtggt caacaggatt atactaactt tttaagtgct ttgagactga tggtatcaga 12360 agtacctcag agcgaagtgt atcagtccgg tcctgattac ttctttcaga ctagcagaca 12420 gggcttgcag acggtaaatc tgagccaagc ttttaaaaac cttaaaggtt tgtggggagt 12480 gcatgccccg gtaggagaaa gagcaaccgt 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agagaaaaag aaaactacat ttacggaact tgttactaca cagctagtga 29160 tcgcactgct tttcccattg acatatctgt catgcttaac cgaagagcaa taaatgacga 29220 gacatcatat tgtattcgta taacttggtc ctggaacaca ggagatgccc cagaggtgca 29280 aacctctgct acaaccctag tcacctcccc atttaccttt tactacatca gagaagacga 29340 ctgacaaata aagtttgcga tcgccaggcc caccatgggc cacacacgga ggcagggaac 29400 atcaccatcc aagtgtccat acctcaattt ctttcagctc ttggtgctgg ctggtctttc 29460 tcacttctgt tcaggtgtta tccacgtgac caaggaagtg aaagaagtgg caacgctgtc 29520 ctgtggtcac aatgtttctg ttgaagagct ggcacaaact cgcatctact ggcaaaagga 29580 gaagaaaatg gtgctgacta tgatgtctgg ggacatgaat atatggcccg agtacaagaa 29640 ccggaccatc tttgatatca ctaataacct ctccattgtg atcctggctc tgcgcccatc 29700 tgacgagggc acatacgagt gtgttgttct gaagtatgaa aaagacgctt tcaagcggga 29760 acacctggct gaagtgacgt tatcagtcaa agctgacttc cctacaccta gtatatctga 29820 ctttgaaatt ccaacttcta atattagaag gataatttgc tcaacctctg gaggttttcc 29880 agagcctcac ctctcctggt tggaaaatgg agaagaatta aatgccatca acacaacagt 29940 ttcccaagat cctgaaactg agctctatgc tgttagcagc aaactggatt tcaatatgac 30000 aaccaaccac agcttcatgt gtctcatcaa gtatggacat ttaagagtga atcagacctt 30060 caactggaat acaaccaagc aagagcattt tcctgataac ctgctcccat cctgggccat 30120 taccttaatc tcagtaaatg gaatttttgt gatatgctgc ctgacctact gctttgcccc 30180 aagatgcaga gagagaagga ggaatgagag attgagaagg gaaagtgtac gccctgtata 30240 agctagcttg actgactgag atacagcgta ccttcagctc acagacatga taagatacat 30300 tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat 30360 ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa 30420 caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa 30480 gtaaaacctc tacaaatgtg gtagtcgtca gctatcctgc aggaacttgt ttatttgaaa 30540 atcaattcac aaaatccgag tagttatttt gcctccccct tcccatttaa cagaatacac 30600 caatctctcc ccacgcacag ctttaaacat ttggatacca ttagatatag acatggtttt 30660 agattccaca ttccaaacag tttcagagcg agccaatctg gggtcagtga tagataaaaa 30720 tccatcggga tagtctttta aagcgctttc acagtccaac tgctgcggat 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ctgcttagcc agaagccccc cgggaacaag 32460 agcaggggac gctacagtgc agtacaagcg cagacctccc caattggctc cagcaaaaac 32520 aagattggaa taagcatatt gggaaccgcc agtaatatca tcgaagttgc tggaaatata 32580 atcaggcaga gtttcttgta aaaattgaat aaaagaaaaa tttgccaaaa aaacattcaa 32640 aacctctggg atgcaaatgc aataggttac cgcgctgcgc tccaacattg ttagttttga 32700 attagtctgc aaaaataaaa aaaaaaacaa gcgtcatatc atagtagcct gacgaacaga 32760 tggataaatc agtctttcca tcacaagaca agccacaggg tctccagctc gaccctcgta 32820 aaacctgtca tcatgattaa acaacagcac cgaaagttcc tcgcggtgac cagcatgaat 32880 aattcttgat gaagcataca atccagacat gttagcatca gttaacgaga aaaaacagcc 32940 aacatagcct ttgggtataa ttatgcttaa tcgtaagtat agcaaagcca cccctcgcgg 33000 atacaaagta aaaggcacag gagaataaaa aatataatta tttctctgct gctgttcagg 33060 caacgtcgcc cccggtccct ctaaatacac atacaaagcc tcatcagcca tggcttacca 33120 gacaaagtac agcgggcaca caaagcacaa gctctaaagt gactctccaa cctctccaca 33180 atatatatat acacaagccc taaactgacg taatgggagt aaagtgtaaa aaatcccgcc 33240 aaacccaaca cacaccccga aactgcgtca ccagggaaaa gtacagtttc acttccgcaa 33300 tcccaacagg cgtaacttcc tctttctcac ggtacgtgat atcccactaa cttgcaacgt 33360 cattttccca cggtcgcacc gcccctttta gccgttaacc ccacagccaa tcaccacacg 33420 atccacactt tttaaaatca cctcatttac atattggcac cattccatct ataaggtata 33480 ttatatagat aga 33493 <210> 110 <211> 34119 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-343 virus genome sequence comprising the EnAd genome with a transgene cassette that encodes IFNa, and CD80, inserted in the region By. The transgene cassette contains a 5' SSA, IFNa cDNA sequence, P2A peptide, CD80 cDNA sequence and a 3' poly(A) <400> 110 tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60 aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120 ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180 gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240 aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300 tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360 ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420 ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480 tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540 tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600 aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660 cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720 agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780 tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840 tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900 ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960 aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020 tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080 aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140 tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200 attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260 atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320 caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380 cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440 agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500 ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560 taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620 gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680 tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740 aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800 ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860 caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920 tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980 gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040 gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100 aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160 gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220 taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280 gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340 agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400 tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag 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gaaaaatttg ccaaaaaaac attcaaaacc tctgggatgc aaatgcaata ggttaccgcg 33300 ctgcgctcca acattgttag ttttgaatta gtctgcaaaa ataaaaaaaa aaacaagcgt 33360 catatcatag tagcctgacg aacagatgga taaatcagtc tttccatcac aagacaagcc 33420 acagggtctc cagctcgacc ctcgtaaaac ctgtcatcat gattaaacaa cagcaccgaa 33480 agttcctcgc ggtgaccagc atgaataatt cttgatgaag catacaatcc agacatgtta 33540 gcatcagtta acgagaaaaa acagccaaca tagcctttgg gtataattat gcttaatcgt 33600 aagtatagca aagccacccc tcgcggatac aaagtaaaag gcacaggaga ataaaaaata 33660 taattatttc tctgctgctg ttcaggcaac gtcgcccccg gtccctctaa atacacatac 33720 aaagcctcat cagccatggc ttaccagaca aagtacagcg ggcacacaaa gcacaagctc 33780 taaagtgact ctccaacctc tccacaatat atatatacac aagccctaaa ctgacgtaat 33840 gggagtaaag tgtaaaaaat cccgccaaac ccaacacaca ccccgaaact gcgtcaccag 33900 ggaaaagtac agtttcactt ccgcaatccc aacaggcgta acttcctctt tctcacggta 33960 cgtgatatcc cactaacttg caacgtcatt ttcccacggt cgcaccgccc cttttagccg 34020 ttaaccccac agccaatcac cacacgatcc acacttttta aaatcacctc atttacatat 34080 tggcaccatt ccatctataa ggtatattat atagataga 34119 <210> 111 <211> 34131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-345 virus genome sequence comprising the EnAd genome with a transgene cassette that encodes Flt3 Ligand, MIP1a and IFNa, inserted in the region BY. The transgene cassette contains a 5' SSA, Flt3 Ligand cDNA , P2A peptide sequence, MIP1a cDNA sequence <400> 111 tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60 aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120 ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180 gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240 aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300 tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360 ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420 ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480 tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540 tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600 aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660 cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720 agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780 tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840 tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900 ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960 aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020 tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080 aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140 tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200 attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260 atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320 caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380 cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440 agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500 ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560 taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620 gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680 tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740 aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800 ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860 caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920 tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980 gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040 gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100 aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160 gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220 taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280 gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340 agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400 tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga 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tcatttacat attggcacca ttccatctat aaggtatatt atatagatag a 34131 <210> 112 <211> 34432 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-346 virus genome sequence comprising a transgene cassette that encodes Flt3 Ligand, MIP1a and CD80, employing SSA and P2A sequence, inserted in the region BY <400> 112 tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60 aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120 ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180 gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240 aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300 tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360 ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420 ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480 tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540 tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600 aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660 cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720 agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780 tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840 tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900 ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960 aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020 tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080 aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140 tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200 attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260 atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320 caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380 cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440 agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500 ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560 taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620 gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680 tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740 aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800 ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860 caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920 tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980 gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040 gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100 aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160 gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220 taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280 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tatgccttac cagtgtaaca tgaatcatgt gaaagtgttg ttggaaccag atgccttttc 3180 cagaatgagc ctaacaggaa tttttgacat gaacatgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240 tgatgatacg agatcgaggg tacgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300 gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360 tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420 tggggtggga ttttcagatg gacagattga gtaaaaattt gttttttctg tcttgcagct 3480 gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540 ctcccatcct gggcaggagt tcgtcagaat gttatgggat ctactgtgga tggaagaccc 3600 gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660 gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720 tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780 aagttacttg tccttttggc ccagctggag gctttgaccc aacgtctggg tgaactttct 3840 cagcaggtgg tcgagttgcg agtacaaact gagtctgctg tcggcacggc aaagtctaaa 3900 taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960 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cataaatgat tccgattacg ggttgcaggt ggtagtttag ggaacggcaa ctgccgtctt 4860 ctcgaagcaa gggggccacc tcgttcatca tttcccttac atgcatattt tcccgcacca 4920 aatccattag gaggcgctct cctcctagtg atagaagttc ttgtagtgag gaaaagtttt 4980 tcagcggttt cagaccgtca gccatgggca ttttggagag agtttgctgc aaaagttcta 5040 gtctgttcca cagttcagtg atgtgttcta tggcatctcg atccagcaga cctcctcgtt 5100 tcgcgggttt ggacggctcc tggaataggg tatgagacga tgggcgtcca gcgctgccag 5160 ggttcggtcc ttccagggtc tcagtgttcg agtcagggtt gtttccgtca cagtgaaggg 5220 gtgtgcgcct gcttgggcgc ttgccagggt gcgcttcaga ctcatcctgc tggtcgaaaa 5280 cttctgtcgc ttggcgccct gtatgtcggc caagtagcag tttaccatga gttcgtagtt 5340 gagcgcctcg gctgcgtggc ctttggcgcg gagcttacct ttggaagttt tcttgcatac 5400 cgggcagtat aggcatttca gcgcatacaa cttgggcgca aggaaaacgg attctgggga 5460 gtatgcatct gcgccgcagg aggcgcaaac agtttcacat tccaccagcc aggttaaatc 5520 cggttcattg gggtcaaaaa caagttttcc gccatatttt ttgatgcgtt tcttaccttt 5580 ggtctccatg agttcgtgtc ctcgttgagt gacaaacagg ctgtccgtgt ccccgtagac 5640 tgattttaca ggcctcttct ccagtggagt gcctcggtct tcttcgtaca ggaactctga 5700 ccactctgat acaaaggcgc gcgtccaggc cagcacaaag gaggctatgt gggaggggta 5760 gcgatcgttg tcaaccaggg ggtccacctt ttccaaagta tgcaaacaca tgtcaccctc 5820 ttcaacatcc aggaatgtga ttggcttgta ggtgtatttc acgtgacctg gggtccccgc 5880 tgggggggta taaaaggggg cggttctttg ctcttcctca ctgtcttccg gatcgctgtc 5940 caggaacgtc agctgttggg gtaggtattc cctctcgaag gcgggcatga cctctgcact 6000 caggttgtca gtttctaaga acgaggagga tttgatattg acagtgccgg ttgagatgcc 6060 tttcatgagg ttttcgtcca tctggtcaga aaacacaatt tttttattgt caagtttggt 6120 ggcaaatgat ccatacaggg cgttggataa aagtttggca atggatcgca tggtttggtt 6180 cttttccttg tccgcgcgct ctttggcggc gatgttgagt tggacatact cgcgtgccag 6240 gcacttccat tcggggaaga tagttgttaa ttcatctggc acgattctca cttgccaccc 6300 tcgattatgc aaggtaatta aatccacact ggtggccacc tcgcctcgaa ggggttcatt 6360 ggtccaacag agcctacctc ctttcctaga acagaaaggg ggaagtgggt ctagcataag 6420 ttcatcggga gggtctgcat ccatggtaaa gattcccgga agtaaatcct tatcaaaata 6480 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gacctcggcg cggcaggggc ggagctcgag gacgagagcg cgcaggctgg agctgtccag 8220 ggtcctgaga cgctgcggac tcaggttagt aggcagtgtc aggagattaa cttgcatgat 8280 cttttggagg gcgtgcggga ggttcagata gtacttgatc tcaacgggtc cgttggtgga 8340 gatgtcgatg gcttgcaggg ttccgtgtcc cttgggcgct accaccgtgc ccttgttttt 8400 cattttggac ggcggtggct ctgttgcttc ttgcatgttt agaagcggtg tcgagggcgc 8460 gcaccgggcg gcaggggcgg ctcgggaccc ggcggcatgg ctggcagtgg tacgtcggcg 8520 ccgcgcgcgg gtaggttctg gtactgcgcc ctgagaagac tcgcatgcgc gacgacgcgg 8580 cggttgacat cctggatctg acgcctctgg gtgaaagcta ccggccccgt gagcttgaac 8640 ctgaaagaga gttcaacaga atcaatctcg gtatcgttga cggcggcttg cctaaggatt 8700 tcttgcacgt caccagagtt gtcctggtag gcgatctccg ccatgaactg ctcgatctct 8760 tcctcttgaa gatctccgcg gcccgctctc tcgacggtgg ccgcgaggtc gttggagatg 8820 cgcccaatga gttgagagaa tgcattcatg cccgcctcgt tccagacgcg gctgtagacc 8880 acggccccca cgggatctct cgcgcgcatg accacctggg cgaggttgag ctccacgtgg 8940 cgggtgaaga ccgcatagtt gcataggcgc tggaaaaggt agttgagtgt ggtggcgatg 9000 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gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860 caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920 tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980 gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040 gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100 aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160 gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220 taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280 gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340 agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400 tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460 acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520 ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580 gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640 tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700 ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760 tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820 atgcatattt caaagatgta acctgggcat tctgaatgaa ggcgaagcaa gggtccgcca 2880 ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttgattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940 taacatgatt tgcggtgctt ccgatgagag gccttatcaa atgctcactt gtgctggtgg 3000 gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060 ttttgatcac aatgtgatga cgaagtgtac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120 tatgccttac cagtgtaaca tgaatcatgt gaaagtgttg ttggaaccag atgccttttc 3180 cagaatgagc ctaacaggaa tttttgacat gaacatgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240 tgatgatacg agatcgaggg tacgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300 gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360 tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420 tggggtggga ttttcagatg gacagattga gtaaaaattt gttttttctg tcttgcagct 3480 gtcatgagtg gaaacgcttc 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gggttcatgt tatgaaggac caccaagacg gtgtatccgg 4380 tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440 ccttgtgtcc tccaagattt tccatgcact catccatgat aatagcaatg gggccgtggg 4500 cagcggcgcg ggcaaacacg ttccgtgggt ctgacacatc atagttatgt tcctgagtta 4560 aatcatcata agccatttta atgaatttgg ggcggagagt accagattgg ggtatgaatg 4620 ttccttcggg ccccggagca tagttcccct cacagatttg catttcccaa gctttcagtt 4680 ccgagggtgg aatcatgtcc acctgggggg ctatgaaaaa caccgtttct ggggcggggg 4740 tgattaattg tgatgatagc aaatttctga gcaattgaga tttgccacat ccggtggggc 4800 cataaatgat tccgattacg ggttgcaggt ggtagtttag ggaacggcaa ctgccgtctt 4860 ctcgaagcaa gggggccacc tcgttcatca tttcccttac atgcatattt tcccgcacca 4920 aatccattag gaggcgctct cctcctagtg atagaagttc ttgtagtgag gaaaagtttt 4980 tcagcggttt cagaccgtca gccatgggca ttttggagag agtttgctgc aaaagttcta 5040 gtctgttcca cagttcagtg atgtgttcta tggcatctcg atccagcaga cctcctcgtt 5100 tcgcgggttt ggacggctcc tggaataggg tatgagacga tgggcgtcca gcgctgccag 5160 ggttcggtcc ttccagggtc tcagtgttcg agtcagggtt gtttccgtca cagtgaaggg 5220 gtgtgcgcct gcttgggcgc ttgccagggt gcgcttcaga ctcatcctgc tggtcgaaaa 5280 cttctgtcgc ttggcgccct gtatgtcggc caagtagcag tttaccatga gttcgtagtt 5340 gagcgcctcg gctgcgtggc ctttggcgcg gagcttacct ttggaagttt tcttgcatac 5400 cgggcagtat aggcatttca gcgcatacaa cttgggcgca aggaaaacgg attctgggga 5460 gtatgcatct gcgccgcagg aggcgcaaac agtttcacat tccaccagcc aggttaaatc 5520 cggttcattg gggtcaaaaa caagttttcc gccatatttt ttgatgcgtt tcttaccttt 5580 ggtctccatg agttcgtgtc ctcgttgagt gacaaacagg ctgtccgtgt ccccgtagac 5640 tgattttaca ggcctcttct ccagtggagt gcctcggtct tcttcgtaca ggaactctga 5700 ccactctgat acaaaggcgc gcgtccaggc cagcacaaag gaggctatgt gggaggggta 5760 gcgatcgttg tcaaccaggg ggtccacctt ttccaaagta tgcaaacaca tgtcaccctc 5820 ttcaacatcc aggaatgtga ttggcttgta ggtgtatttc acgtgacctg gggtccccgc 5880 tgggggggta taaaaggggg cggttctttg ctcttcctca ctgtcttccg gatcgctgtc 5940 caggaacgtc agctgttggg gtaggtattc cctctcgaag gcgggcatga cctctgcact 6000 caggttgtca gtttctaaga acgaggagga tttgatattg acagtgccgg ttgagatgcc 6060 tttcatgagg ttttcgtcca tctggtcaga aaacacaatt tttttattgt caagtttggt 6120 ggcaaatgat ccatacaggg cgttggataa aagtttggca atggatcgca tggtttggtt 6180 cttttccttg tccgcgcgct ctttggcggc gatgttgagt tggacatact cgcgtgccag 6240 gcacttccat tcggggaaga tagttgttaa ttcatctggc acgattctca cttgccaccc 6300 tcgattatgc aaggtaatta aatccacact ggtggccacc tcgcctcgaa ggggttcatt 6360 ggtccaacag agcctacctc ctttcctaga acagaaaggg ggaagtgggt ctagcataag 6420 ttcatcggga gggtctgcat ccatggtaaa gattcccgga agtaaatcct tatcaaaata 6480 gctgatggga gtggggtcat ctaaggccat ttgccattct cgagctgcca gtgcgcgctc 6540 atatgggtta aggggactgc cccatggcat gggatgggtg agtgcagagg catacatgcc 6600 acagatgtca tagacgtaga tgggatcctc aaagatgcct atgtaggttg gatagcatcg 6660 cccccctctg atacttgctc gcacatagtc atatagttca tgtgatggcg ctagcagccc 6720 cggacccaag ttggtgcgat tgggtttttc tgttctgtag acgatctggc gaaagatggc 6780 gtgagaattg gaagagatgg tgggtctttg aaaaatgttg aaatgggcat gaggtagacc 6840 tacagagtct ctgacaaagt gggcataaga ttcttgaagc ttggttacca gttcggcggt 6900 gacaagtacg tctagggcgc agtagtcaag tgtttcttga atgatgtcat aacctggttg 6960 gtttttcttt tcccacagtt cgcggttgag aaggtattct tcgcgatcct tccagtactc 7020 ttctagcgga aacccgtctt tgtctgcacg gtaagatcct agcatgtaga actgattaac 7080 tgccttgtaa gggcagcagc ccttctctac gggtagagag tatgcttgag cagcttttcg 7140 tagcgaagcg tgagtaaggg caaaggtgtc tctgaccatg actttgagga attggtattt 7200 gaagtcgatg tcgtcacagg ctccctgttc ccagagttgg aagtctaccc gtttcttgta 7260 ggcggggttg ggcaaagcga aagtaacatc attgaagaga atcttgccgg ccctgggcat 7320 gaaattgcga gtgatgcgaa aaggctgtgg tacttccgct cggttattga taacctgggc 7380 agctaggacg atctcgtcga aaccgttgat gttgtgtcct acgatgtata attctatgaa 7440 acgcggcgtg cctctgacgt gaggtagctt actgagctca tcaaaggtta ggtctgtggg 7500 gtcagataag gcgtagtgtt cgagagccca ttcgtgcagg tgaggattcg ctttaaggaa 7560 ggaggaccag aggtccactg ccagtgctgt ttgtaactgg tcccggtact gacgaaaatg 7620 ccgtccgact gccatttttt ctggggtgac gcaatagaag gtttgggggt cctgccgcca 7680 gcgatcccac ttgagtttta tggcgaggtc ataggcgatg ttgacgagcc gctggtctcc 7740 agagagtttc atgaccagca tgaaggggat tagctgcttg ccaaaggacc ccatccaggt 7800 gtaggtttcc acatcgtagg tgagaaagag cctttctgtg cgaggatgag agccaatcgg 7860 gaagaactgg atctcctgcc accagttgga ggaatggctg ttgatgtgat ggaagtagaa 7920 ctccctgcga cgcgccgagc attcatgctt gtgcttgtac agacggccgc agtagtcgca 7980 gcgttgcacg ggttgtatct cgtgaatgag ttgtacctgg cttcccttga cgagaaattt 8040 cagtgggaag ccgaggcctg gcgattgtat ctcgtgcttt actatgttgt ctgcatcggc 8100 ctgttcatct tctgtctcga tggtggtcat gctgacgagc cctcgcggga ggcaagtcca 8160 gacctcggcg cggcaggggc ggagctcgag gacgagagcg cgcaggctgg agctgtccag 8220 ggtcctgaga cgctgcggac tcaggttagt aggcagtgtc aggagattaa cttgcatgat 8280 cttttggagg gcgtgcggga ggttcagata gtacttgatc tcaacgggtc cgttggtgga 8340 gatgtcgatg gcttgcaggg ttccgtgtcc cttgggcgct accaccgtgc ccttgttttt 8400 cattttggac ggcggtggct ctgttgcttc ttgcatgttt agaagcggtg tcgagggcgc 8460 gcaccgggcg gcaggggcgg ctcgggaccc ggcggcatgg ctggcagtgg tacgtcggcg 8520 ccgcgcgcgg gtaggttctg gtactgcgcc ctgagaagac tcgcatgcgc gacgacgcgg 8580 cggttgacat cctggatctg acgcctctgg gtgaaagcta ccggccccgt gagcttgaac 8640 ctgaaagaga gttcaacaga atcaatctcg gtatcgttga cggcggcttg cctaaggatt 8700 tcttgcacgt caccagagtt gtcctggtag gcgatctccg ccatgaactg ctcgatctct 8760 tcctcttgaa gatctccgcg gcccgctctc tcgacggtgg ccgcgaggtc gttggagatg 8820 cgcccaatga gttgagagaa tgcattcatg cccgcctcgt tccagacgcg gctgtagacc 8880 acggccccca cgggatctct cgcgcgcatg accacctggg cgaggttgag ctccacgtgg 8940 cgggtgaaga ccgcatagtt gcataggcgc tggaaaaggt agttgagtgt ggtggcgatg 9000 tgctcggtga cgaagaaata catgatccat cgtctcagcg gcatctcgct gacatcgccc 9060 agagcttcca agcgctccat ggcctcgtag aagtccacgg caaaattaaa aaactgggag 9120 tttcgcgcgg acacggtcaa ctcctcttcc agaagacgga taagttcggc gatggtggtg 9180 cgcacctcgc gctcgaaagc ccctgggatt tcttcctcaa tctcttcttc ttccactaac 9240 atctcttcct cttcaggtgg ggctgcagga ggagggggaa cgcggcgacg ccggcggcgc 9300 acgggcagac ggtcgatgaa tctttcaatg acctctccgc ggcggcggcg catggtttca 9360 gtgacggcgc ggccgttctc 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gaggtcttcc aacataaggc ggtgatagcc gtagatgtac 10260 ctggacatcc aggtgattcc tgcggcggta gtagaagccc gaggaaactc gcgtacgcgg 10320 ttccaaatgt tgcgtagcgg catgaagtag ttcattgtag gcacggtttg accagtgagg 10380 cgcgcgcagt cattgatgct ctatagacac ggagaaaatg aaagcgttca gcgactcgac 10440 tccgtagcct ggaggaacgt gaacgggttg ggtcgcggtg taccccggtt cgagacttgt 10500 actcgagccg gccggagccg cggctaacgt ggtattggca ctcccgtctc gacccagcct 10560 acaaaaatcc aggatacgga atcgagtcgt tttgctggtt tccgaatggc agggaagtga 10620 gtcctatttt ttttttttgc cgctcagatg catcccgtgc tgcgacagat gcgcccccaa 10680 caacagcccc cctcgcagca gcagcagcag caatcacaaa aggctgtccc tgcaactact 10740 gcaactgccg ccgtgagcgg tgcgggacag cccgcctatg atctggactt ggaagagggc 10800 gaaggactgg cacgtctagg tgcgccttca cccgagcggc atccgcgagt tcaactgaaa 10860 aaagattctc gcgaggcgta tgtgccccaa cagaacctat ttagagacag aagcggcgag 10920 gagccggagg agatgcgagc ttcccgcttt aacgcgggtc gtgagctgcg tcacggtttg 10980 gaccgaagac gagtgttgcg ggacgaggat ttcgaagttg atgaaatgac agggatcagt 11040 cctgccaggg cacacgtggc tgcagccaac cttgtatcgg cttacgagca gacagtaaag 11100 gaagagcgta acttccaaaa gtcttttaat aatcatgtgc gaaccctgat tgcccgcgaa 11160 gaagttaccc ttggtttgat gcatttgtgg gatttgatgg aagctatcat tcagaaccct 11220 actagcaaac ctctgaccgc ccagctgttt ctggtggtgc aacacagcag agacaatgag 11280 gctttcagag aggcgctgct gaacatcacc gaacccgagg ggagatggtt gtatgatctt 11340 atcaacattc tacagagtat catagtgcag gagcggagcc tgggcctggc cgagaaggtg 11400 gctgccatca attactcggt tttgagcttg ggaaaatatt acgctcgcaa aatctacaag 11460 actccatacg ttcccataga caaggaggtg aagatagatg ggttctacat gcgcatgacg 11520 ctcaaggtct tgaccctgag cgatgatctt ggggtgtatc gcaatgacag aatgcatcgc 11580 gcggttagcg ccagcaggag gcgcgagtta agcgacaggg aactgatgca cagtttgcaa 11640 agagctctga ctggagctgg aaccgagggt gagaattact tcgacatggg agctgacttg 11700 cagtggcagc ctagtcgcag ggctctgagc gccgcgacgg caggatgtga gcttccttac 11760 atagaagagg cggatgaagg cgaggaggaa gagggcgagt acttggaaga ctgatggcac 11820 aacccgtgtt ttttgctaga tggaacagca agcaccggat cccgcaatgc gggcggcgct 11880 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tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320 caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380 cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440 agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500 ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560 taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620 gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680 tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740 aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800 ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860 caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920 tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980 gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040 gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100 aagaggacaa 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acaccttatg gacaggagtc aaccccaccg aagccaactg 28800 tcaaatcatg aactccagtg aatctaatga ttgcaaatta attctaacac tagttaaaac 28860 tggagcacta gtcactgcat ttgtttatgt tataggagta tctaacaatt ttaatatgct 28920 aactacacac agaaatataa attttactgc agagctgttt ttcgattcta ctggtaattt 28980 actaactaga ctctcatccc tcaaaactcc acttaatcat aaatcaggac aaaacatggc 29040 tactggtgcc attactaatg ctaaaggttt catgcccagc acgactgcct atcctttcaa 29100 tgataattct agagaaaaag aaaactacat ttacggaact tgttactaca cagctagtga 29160 tcgcactgct tttcccattg acatatctgt catgcttaac cgaagagcaa taaatgacga 29220 gacatcatat tgtattcgta taacttggtc ctggaacaca ggagatgccc cagaggtgca 29280 aacctctgct acaaccctag tcacctcccc atttaccttt tactacatca gagaagacga 29340 ctgacaaata aagtttgcga tcgctaccct gcaggaactt gtttatttga aaatcaattc 29400 acaaaatccg agtagttatt ttgcctcccc cttcccattt aacagaatac accaatctct 29460 ccccacgcac agctttaaac atttggatac cattagatat agacatggtt ttagattcca 29520 cattccaaac agtttcagag cgagccaatc tggggtcagt gatagataaa aatccatcgg 29580 gatagtcttt taaagcgctt tcacagtcca actgctgcgg atgcgactcc ggagtctgga 29640 tcacggtcat ctggaagaag aacgatggga atcataatcc gaaaacggta tcggacgatt 29700 gtgtctcatc aaacccacaa gcagccgctg tctgcgtcgc tccgtgcgac tgctgtttat 29760 gggatcaggg tccacagtgt cctgaagcat gattttaata gcccttaaca tcaactttct 29820 ggtgcgatgc gcgcagcaac gcattctgat ttcactcaaa tctttgcagt aggtacaaca 29880 cattattaca atattgttta ataaaccata attaaaagcg ctccagccaa aactcatatc 29940 tgatataatc gcccctgcat gaccatcata ccaaagttta atataaatta aatgacgttc 30000 cctcaaaaac acactaccca catacatgat ctcttttggc atgtgcatat taacaatctg 30060 tctgtaccat ggacaacgtt ggttaatcat gcaacccaat ataaccttcc ggaaccacac 30120 tgccaacacc gctcccccag ccatgcattg aagtgaaccc tgctgattac aatgacaatg 30180 aagaacccaa ttctctcgac cgtgaatcac ttgagaatga aaaatatcta tagtggcaca 30240 acatagacat aaatgcatgc atcttctcat aatttttaac tcctcaggat ttagaaacat 30300 atcccaggga ataggaagct cttgcagaac agtaaagctg gcagaacaag gaagaccacg 30360 aacacaactt acactatgca tagtcatagt atcacaatct ggcaacagcg ggtggtcttc 30420 agtcatagaa gctcgggttt cattttcctc acaacgtggt aactgggctc tggtgtaagg 30480 gtgatgtctg gcgcatgatg tcgagcgtgc gcgcaacctt gtcataatgg agttgcttcc 30540 tgacattctc gtattttgta tagcaaaacg cggccctggc agaacacact cttcttcgcc 30600 ttctatcctg ccgcttagcg tgttccgtgt gatagttcaa gtacaaccac actcttaagt 30660 tggtcaaaag aatgctggct tcagttgtaa tcaaaactcc atcgcatcta atcgttctga 30720 ggaaatcatc caagcaatgc aactggattg tgtttcaagc aggagaggag agggaagaga 30780 cggaagaacc atgttaattt ttattccaaa cgatctcgca gtacttcaaa ttgtagatcg 30840 cgcagatggc atctctcgcc cccactgtgt tggtgaaaaa gcacagctag atcaaaagaa 30900 atgcgatttt caaggtgctc aacggtggct tccagcaaag cctccacgcg cacatccaag 30960 aacaaaagaa taccaaaaga aggagcattt tctaactcct caatcatcat attacattcc 31020 tgcaccattc ccagataatt ttcagctttc cagccttgaa ttattcgtgt cagttcttgt 31080 ggtaaatcca atccacacat tacaaacagg tcccggaggg cgccctccac caccattctt 31140 aaacacaccc tcataatgac aaaatatctt gctcctgtgt cacctgtagc gaattgagaa 31200 tggcaacatc aattgacatg cccttggctc taagttcttc tttaagttct agttgtaaaa 31260 actctctcat attatcacca aactgcttag ccagaagccc cccgggaaca agagcagggg 31320 acgctacagt gcagtacaag cgcagacctc cccaattggc tccagcaaaa acaagattgg 31380 aataagcata ttgggaaccg ccagtaatat catcgaagtt gctggaaata taatcaggca 31440 gagtttcttg taaaaattga ataaaagaaa aatttgccaa aaaaacattc aaaacctctg 31500 ggatgcaaat gcaataggtt accgcgctgc gctccaacat tgttagtttt gaattagtct 31560 gcaaaaataa aaaaaaaaac aagcgtcata tcatagtagc ctgacgaaca gatggataaa 31620 tcagtctttc catcacaaga caagccacag ggtctccagc tcgaccctcg taaaacctgt 31680 catcatgatt aaacaacagc accgaaagtt cctcgcggtg accagcatga ataattcttg 31740 atgaagcata caatccagac atgttagcat cagttaacga gaaaaaacag ccaacatagc 31800 ctttgggtat aattatgctt aatcgtaagt atagcaaagc cacccctcgc ggatacaaag 31860 taaaaggcac aggagaataa aaaatataat tatttctctg ctgctgttca ggcaacgtcg 31920 cccccggtcc ctctaaatac acatacaaag cctcatcagc catggcttac cagacaaagt 31980 acagcgggca cacaaagcac aagctctaaa gtgactctcc aacctctcca caatatatat 32040 atacacaagc cctaaactga cgtaatggga gtaaagtgta aaaaatcccg ccaaacccaa 32100 cacacacccc gaaactgcgt caccagggaa aagtacagtt tcacttccgc aatcccaaca 32160 ggcgtaactt cctctttctc acggtacgtg atatcccact aacttgcaac gtcattttcc 32220 cacggtcgca ccgccccttt tagccgttaa ccccacagcc aatcaccaca cgatccacac 32280 tttttaaaat cacctcattt acatattggc accattccat ctataaggta tattatatag 32340 ataga 32345

Claims (34)

  1. Ad11 및 에나데노터시레브(enadenotucirev)로 이루어진 군으로부터 선택된 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터(replication deficient oncolytic viral vector) 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스(replication capable group B oncolytic adenovirus)로서, 상기 바이러스는 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위한 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하고, 상기 항체 또는 결합 단편은 T-세포 수용체 복합체(TCR)의 CD3 단백질에 특이적이되, 상기 바이러스는 B7 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하지 않는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 Ad11인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 바이러스는 복제 적격성(replication competent)인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 암살상 바이러스.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 바이러스는 복제 결핍성인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 암살상 바이러스.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암호화된 항체는 막관통 도메인 또는 GPI 앵커(anchor)를 더 포함하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  6. 제5항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 서열번호 10 내지 14에 제시된 서열로부터 선택되는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암살상 아데노바이러스는 EnAd인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 결합 단편은 전장 항체, Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체, scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, 비스-scFv, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 휴마바디, 이들 중 임의의 것의 다이설파이드 안정화된 형태 및 이들의 에피토프-결합 단편을 포함하는 군으로부터 선택된, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 결합 단편은 단일 쇄 Fv인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암살상 바이러스는 적어도 1종의 추가 이식유전자를 암호화하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  11. 제10항에 있어서, 상기 암살상 바이러스는 적어도 2종의 추가 이식유전자를 암호화하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 추가 이식유전자(들)는 사이토카인, 케모카인, 길항성 항체 분자 또는 이의 결합 단편, 효능성 항체 분자 또는 이의 결합, 단편 면역조절제 및 이들의 조합물을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택된 단백질을 암호화하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  13. 제12항에 있어서, 적어도 1종의 추가 이식유전자는 항체 분자 또는 이의 결합 단편(예를 들어, 이것은 표면 발현 형태 및/또는 분비 형태로 존재할 수 있음)을 암호화하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항체 분자 또는 결합 단편은 저해제인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제해제는 혈관신생 인자의 저해제 또는 T 세포 불활성화 인자의 저해제인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자 또는 결합 단편은 효능제인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  17. 제16항에 있어서, 상기 효능제는 CD40, GITR, OX40, CD27 및 4-1BB 대한 항체를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역조절제는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, B7-H3, B7-H4, HVEM, ILT-2, ILT-3, ILT-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, LIGHT 또는 CD160, 예를 들어 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, CD16, CD25, CD33, CD332, CD127, CD31, CD43, CD44, CD162, CD301a, CD301b 및 갈렉틴(Galectin)-3, FLT-3, FLT-3 리간드, TLR, TLR 리간드, CCR7, CD1a, CD1c, CD11b, CD11c, CD80, CD83, CD86, CD123, CD172a, CD205, CD207, CD209, CD273, CD281, CD283, CD286, CD289, CD287, CXCR4, GITR 리간드, IFN-α2, IL-12, IL-23, ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT7, TSLP 수용체, CD141, CD303, CADM1, CLEC9a, XCR1 및 CD304, OX40, OX40 리간드, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40 리간드, CD70, CD137, GITR, 4-1BB, ICOS 및 ICOS 리간드를 포함하는 군으로부터 선택된 면역 세포 표면 수용체를 위한 막-연관 단백질 리간드인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 추가 이식유전자는 사이토카인(분비 또는 세포막 연관 분자 포함)을 암호화하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 추가 이식유전자는 사이토카인(분비 또는 세포막 연관 분자 포함)을 암호화하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 암호화된 사이토카인은 TNF 알파 슈퍼 패밀리(TNFSF는 TNF-알파, TNF-C, OX40L, CD154, FasL, LIGHT, TL1A, CD70, Siva, CD153, 4-1BB 리간드, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR 리간드, EDA-A, EDA-A2를 포함함), TGF-베타 슈퍼패밀리, IL-1 패밀리(즉, IL-1 및 IL-18), IL-2 패밀리, IL-10 패밀리, IL-17 패밀리, 인터페론 패밀리로부터 독립적으로 선택되는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  22. 제21항에 있어서, 상기 암호화된 사이토카인은 TNF-알파, IL-1, IL-8, IL-10, IL-17, 인터페론, LIGHT, TL1A, Siva, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, NGF, BDNF, NT-3 및 EDA-A2로부터 독립적으로 선택되는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 암호화된 사이토카인은 TNF-C, OX401, CD154, FasL, CD70, CD153, 4-1BB 리간드 및 EDA-A로부터 독립적으로 선택되는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, Flt3 리간드, GM-CSF, IL-15 및 IL-12를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  25. 제10항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 추가 이식유전자는 케모카인을 암호화하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  26. 제25항에 있어서, 상기 케모카인은 MIP-1 알파, RANTES, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19 및 CCL21을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  27. 제26항에 있어서, 상기 암호화된 케모카인은 MIP-1 알파인, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  28. 제27항에 있어서, 상기 바이러스는 i) MIP-1α와 Flt3, 및 ii)MIP-1α와 IFNα로부터 선택된 사이토카인과 케모카인 조합물을 암호화하는 이식유전자를 포함하는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD3 항체 또는 결합 단편은 뮤로모납-CD3(OKT3), 오텔릭시주맙, 테플리주맙 또는 비실리주맙으로부터의 VH 영역 및 VL 영역을 포함하는 적어도 결합 도메인을 갖는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 적격 암살상 바이러스.
  30. (예를 들어, 암성 세포에 초점을 맞추기 위해서, T 세포, 예를 들어, 암 세포 환경 내의 T 세포를 생체내 자극함으로써) 암 환자를 치료하는 방법으로서,
    치료적 유효량의 Ad11 및 에나데노터시레브로 이루어진 군으로부터 선택된 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스를 투여하는 단계로서, 상기 바이러스는 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위한 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하고, 상기 항체 또는 결합 단편은 T-세포 수용 복합체(TCR)의 CD3 단백질에 특이적이되, 상기 바이러스는 B7 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하지 않는, 상기 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 바이러스 또는 바이러스 벡터는 상기 암성 세포를 선택적으로 감염시키고, 상기 세포의 상기 표면 상에서 제1항 내지 제266항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같이, 상기 암호화된 항-CD3 항체 또는 결합 단편을 발현시키는, 암 환자를 치료하는 방법.
  31. Ad11 및 에나데노터시레브로 이루어진 군으로부터 선택된 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스로서, 상기 바이러스는 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위한 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하고, 상기 항체 또는 결합 단편은 T-세포 수용 복합체(TCR)의 CD3 단백질에 특이적이되, 상기 바이러스는 B7 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하지 않는, 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제26항 중 어느 하나에 정의된 바와 같은, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스.
  32. 제31항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스.
  33. 제32항에 있어서, 상기 치료는 암성 세포에 초점을 맞추기 위해서, T 세포, 예를 들어, 암 세포 환경 내의 T 세포를 생체내 자극함으로써 수행되는, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스.
  34. Ad11 및 에나데노터시레브로 이루어진 군으로부터 선택된 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스로서, 상기 바이러스는 암 세포의 표면 상에서의 발현을 위한 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하고, 상기 항체 또는 결합 단편은 T-세포 수용 복합체(TCR)의 CD3 단백질에 특이적이되, 상기 바이러스는 B7 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하지 않는, 의약의 제조에 사용하기 위한, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 복제 결핍 암살상 바이러스 벡터 또는 복제 가능 군 B 암살상 아데노바이러스.
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