CN108697745A - 编码抗tcr复合体抗体或片段的b组腺病毒 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种复制缺乏型溶瘤病毒载体或能复制型B组溶瘤腺病毒，其选自由Ad11和艾纳德诺(enadenotucirev)组成的组，其中所述病毒编码用于在癌细胞表面上表达的抗体或其结合片段，其中所述抗体或结合片段对T细胞受体复合体(TCR)中的CD3蛋白质具有特异性，其中所述病毒不编码B7蛋白质或其活性片段；包含所述病毒载体或病毒的医药组合物；和前述中的任一种用于治疗、尤其用于治疗癌症的用途。

Description

编码抗TCR复合体抗体或片段的B组腺病毒
技术领域
本公开涉及一种包含转基因的衍生自EnAd或Ad11的溶瘤病毒，所述转基因编码至少一种对T细胞受体复合体(TCR)中的CD3具有特异性、尤其用于在癌细胞表面上表达的促效抗体或其结合片段；包含所述溶瘤病毒的组合物；和所述病毒和组合物用于治疗癌症的用途。
本申请要求GB1522334.0、GB1607463.5、GB1617207.4和GB1617206.6的优先权，其各自整体并入本申请中。
背景技术
就患者和其关切者的困难和痛苦而言，并且就治疗、照看和支持患者的的高财务费用而言，癌症对社会来说仍为巨大社会负担。现在认为健康个体的免疫系统按常规会清除癌细胞。然而，在患有癌症的那些患者中，与这一清除作用有关的防御机制中的一种或多种会下调或关闭。
当前已知肿瘤会改变其微环境以使所述微环境容许其生长。这通过肿瘤释放细胞外信号来进行，所述细胞外信号例如会促进肿瘤血管生成和/或诱导局部免疫抑制或免疫耐受。
T细胞上的T细胞受体复合体(TCR)识别特定抗原，特别是当所述抗原呈细胞表面上以主要组织相容(MHC)分子呈递的肽形式时。T细胞受体复合体(TCR)包含α和β或γ和δ链的抗原结合异二聚体，以及免疫球蛋白家族蛋白质CD3ε、δ、γ和ξ链。表面CD3ε、δ和γ链在TCR复合体组装和稳定的表面表达方面起重要作用。ξ链同二聚体几乎完全存在于细胞内且当TCR复合体与细胞表面上的抗原-MHC复合体在生理学上交联或通过药理学模式交联时，充当复合体的关键信号传导分子，例如针对TCR复合体的抗体，例如抗CD3抗体(包括其结合片段)。
从许多不同临床前和临床研究清楚可知，肿瘤内的微环境能抑制抗肿瘤免疫响应的产生和活性，并且多种机制表明在潜在地发挥作用。具体地说，免疫抑制机制根本上防止T细胞响应介导杀死肿瘤细胞。抑制机制可以包括排斥T细胞进入肿瘤组织、抑制进入肿瘤的T细胞活化和调节肿瘤细胞蛋白以降低T细胞识别或响应于其的能力。此类免疫抑制路径在支持肿瘤进展方面的重要性已尤其在针对两种此类抑制路径CTLA4和PD-1/PDL1的受体的抗体所展示的临床功效中突显出来，所述抗体已获销售批准用于治疗黑色素瘤和其它癌症。
尽管已提出试管内刺激过的T细胞的过继转移提供活化的溶胞T细胞，例如用于治疗癌症，例如鼻咽癌，但这可能是个困难、昂贵且不方便的疗法。另外，有时这些疗法只对特定的患者子群有效。
已使用癌症抗原进行一些临床试验，例如呈疫苗形式的MAGE，其含有癌症抗原和佐剂，例如单磷酰基A和CpG。然而，这些方法尚不能实现所预期的临床高成功性。因此，真正的活体内刺激或活化T细胞聚焦于癌细胞以治疗癌症既不实用，也不现实。
本发明人已经产生的数据表明，免疫系统对付使得在表面上表达至少一种促效抗TCR抗体或结合片段的癌细胞比在表面上不表达所述蛋白质的未修饰癌细胞更有效。
尽管不希望受理论束缚，但本发明人相信，使癌细胞表达至少一种促效抗TCR抗体是一种聚集或快速启动患者免疫系统来对抗癌症的方式，例如抗TCR抗体或其结合片段可以与T细胞接合且/或活化T细胞。生理学上识别癌症特异性抗原(包括患者特异性新抗原)的T细胞的此类活化还能够引起效应子和记忆T细胞后代的产生，其能迁移到不表达促效抗TCR抗体或其片段的相同肿瘤区域或其它肿瘤部位(例如转移)。因此，这种疗法潜在地产生延长的免疫响应，其以活化T细胞形式针对表达其生理学癌症特异性抗原的癌细胞，从而全身性对抗患者的癌症。
显然，与对抗癌症的身体自身免疫响应衔接的癌症疗法是极其有利的。另外，所述疗法完全聚焦于癌细胞且因此，脱靶效应和毒性可能比例如化学疗法等传统疗法小得多。
可以通过使癌细胞感染编码抗TCR抗体或其结合片段的复制胜任型溶瘤病毒或复制缺乏型溶瘤病毒载体而使得癌细胞表达抗TCR抗体或其结合片段。
发明内容
本公开提供：
1.一种复制缺乏型溶瘤病毒载体或能复制型B组溶瘤腺病毒，其选自由Ad11和艾纳德诺组成的组，其中所述病毒编码用于在癌细胞表面上表达的抗体或其结合片段，其中所述抗体或结合片段对T细胞受体复合体(TCR)中的CD3蛋白质具有特异性，其中所述病毒不编码B7蛋白质或其活性片段。
2.根据段落1的复制缺乏型溶瘤病毒载体或能复制型B组溶瘤腺病毒，其中所述病毒是Ad11。
3.根据段落1或段落2的复制缺乏型溶瘤病毒载体或能复制型溶瘤病毒，其中所述病毒是复制胜任型。
4.根据段落1或段落2的复制缺乏型溶瘤病毒载体或能复制型溶瘤病毒，其中所述病毒是复制缺乏型。
5.根据段落1到4中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的抗体进一步包含跨膜域或GPI锚。
6.根据段落5的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述跨膜域是选自SEQ ID NO:10到14中所示的序列。
7.根据权利要求1到6中任一项的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是EnAd。
8.根据段落1到7中任一段落的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述抗体或结合片段是选自包含以下的组：全长抗体、Fab、经修饰的Fab、Fab'、经修饰的Fab'、F(ab')2、Fv、单域抗体、scFv、二价、三价或四价抗体、双scFv、双链抗体、三链抗体、四链抗体、人源抗体、前述中的任一种的二硫键稳定形式，和其抗原决定基结合片段。
9.根据段落1到8的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述抗体结合片段是单链Fv。
10.根据段落1到9中任一段落的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒编码至少一种其它转基因。
11.根据段落10的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒编码至少两种其它转基因。
12.根据段落10或11的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述其它转基因编码独立地选自包含以下的组的蛋白质：细胞因子、趋化因子、拮抗性抗体分子或其结合片段、促效性抗体分子或其结合片段、免疫调节剂、酶和其组合。
13.根据段落12的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中至少一种其它转基因编码抗体分子或其结合片段(例如其可以呈表面表达形式和/或分泌形式)。
14.根据段落13的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述抗体分子或结合片段是抑制剂。
15.根据段落14的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述抑制剂是血管生成因子抑制剂或T细胞去活化因子抑制剂。
16.根据段落13到15中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中抗体分子或结合片段是促效剂。
17.根据段落16的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述促效剂独立地选自包含以下的组：针对CD40、CD40配体(也称为CD154)、GITR、OX40、CD27、4-1BB和其组合(例如CD40、GITR、OX40、CD27和4-1BB)的抗体分子或结合片段。
18.根据段落17的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述抗体分子或其结合片段包含对CD40L具有特异性的结合域。
19.根据段落17或18的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述抗体分子或其结合片段包含对CD40具有特异性的结合域。
20.根据段落17到19中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述抗体分子或其结合片段包含对GITR具有特异性的结合域。
21.根据段落17到20中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述抗体分子或其结合片段包含对OX40具有特异性的结合域。
22.根据段落17到21中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述抗体分子或其结合片段包含对CD27具有特异性的结合域。
23.根据段落17到22中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述抗体分子或其结合片段包含对4-1BB具有特异性的结合域。
24.根据段落12到23中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述免疫调节剂是独立地选自包含以下的组的针对免疫细胞表面受体的膜结合蛋白质配体：CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、VISTA、B7-H3、B7-H4、HVEM、ILT-2、ILT-3、ILT-4、TIM-3、LAG-3、BTLA、LIGHT或CD160，例如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、CD16、CD25、CD33、CD332、CD127、CD31、CD43、CD44、CD162、CD301a、CD301b和半乳糖凝集素-3、FLT-3、FLT-3配体、TLRs、TLR配体、CCR7、CD1a、CD1c、CD11b、CD11c、CD80、CD83、CD86、CD123、CD172a、CD205、CD207、CD209、CD273、CD281、CD283、CD286、CD289、CD287、CXCR4、GITR配体、IFN-α2、IL-12、IL-23、ILT1、ILT2、ILT3、ILT4、ILT5、ILT7、TSLP受体、CD141、CD303、CADM1、CLEC9a、XCR1和CD304、OX40、OX40配体、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40配体、CD70、CD137、GITR、4-1BB、ICOS、ICOS配体和其组合。
25.根据段落24的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的膜结合蛋白质配体是或结合到CTLA-4。
26.根据段落24或25的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到PD-1。
27.根据段落24到26中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到PD-L1。
28.根据段落24到27中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到PD-L2。
29.根据段落24到28中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到VISTA。
30.根据段落24到29中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到B7-H3。
31.根据段落24到30中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到B7-H4。
32.根据段落24到31中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到HVEM。
33.根据段落24到32中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到ILT-2。
34.根据段落24到33中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到ILT-3。
35.根据段落24到34中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到ILT-4。
36.根据段落24到35中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到TIM-3。
37.根据段落24到36中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到LAG-3。
38.根据段落24到37中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到BTLA。
39.根据段落24到38中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到LIGHT。
40.根据段落24到39中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD160。
41.根据段落24到40中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD16。
42.根据段落24到41中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD25。
43.根据段落24到42中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD33。
44.根据段落24到43中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD332。
45.根据段落24到44中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD127。
46.根据段落24到45中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD31。
47.根据段落24到46中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD43。
48.根据段落24到47中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD44。
49.根据段落24到48中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD162。
50.根据段落24到49中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD301a。
51.根据段落24到50中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD301b。
52.根据段落24到51中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合半乳糖凝集素-3。
53.根据段落24到52中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合FLT-3。
54.根据段落24到53中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是FLT-3配体。
55.根据段落24到54中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是TLR。
56.根据段落24到55中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是TLR配体。
57.根据段落24到56中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CCR7。
58.根据段落24到57中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD1a。
59.根据段落24到58中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD1c。
60.根据段落24到59中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD11b。
61.根据段落24到60中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD11c。
62.根据段落24到61中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是CD80。
63.根据段落24到62中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD83。
64.根据段落24到63中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是CD86。
65.根据段落24到64中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD123。
66.根据段落24到65中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD172a。
67.根据段落24到66中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD205。
68.根据段落24到67中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD207。
69.根据段落24到68中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD209。
70.根据段落24到69中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD273。
71.根据段落24到70中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD281。
72.根据段落24到71中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD283。
73.根据段落24到72中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD286。
74.根据段落24到73中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD289。
75.根据段落24到74中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD287。
76.根据段落24到75中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CXCR4。
77.根据段落24到76中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到GITR配体。
78.根据段落24到77中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体结合到IFN-α2。
79.根据段落24到78中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是IL-12。
80.根据段落24到79中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是IL-23。
81.根据段落24到80中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到ILT1。
82.根据段落24到81中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体结合到ILT5。
83.根据段落24到82中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体结合到ILT7。
84.根据段落24到83中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体结合到TSLP受体。
85.根据段落24到84中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD141。
86.根据段落24到85中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD303。
87.根据段落24到86中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CADM1。
88.根据段落24到87中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CLEC9a。
89.根据段落24到88中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到XCR1。
90.根据段落24到89中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD304。
91.根据段落24到90中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到OX40。
92.根据段落24到91中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到OX40配体。
93.根据段落24到92中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD27。
94.根据段落24到93中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD28。
95.根据段落24到94中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD30。
96.根据段落24到95中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD40。
97.根据段落24到96中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD40配体。
98.根据段落24到97中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD70。
99.根据段落24到98中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到CD137。
100.根据段落24到99中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到GITR。
101.根据段落24到100中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到4-1BB。
102.根据段落24到101中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到ICOS。
103.根据段落24到102中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中针对免疫细胞表面受体的所述膜结合蛋白质配体是或结合到ICOS配体。
104.根据权利要求10到103中任一项的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中至少一种其它转基因编码细胞因子(包括分泌的和/或细胞膜结合的分子)。
105.根据权利要求11到104中任一项的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中第二种另外的转基因编码细胞因子(包括分泌的或细胞膜结合的分子)。
106.根据权利要求104或105中任一项的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的细胞因子独立地选自TNFα超家族(TNFSF包括TNF-α、TNF-C、OX40L、CD154、FasL、LIGHT、TL1A、CD70、Siva、CD153、4-1BB配体、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、CAMLG、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITR配体、EDA-A、EDA-A2)、TGF-β超家族、IL-1家族(即，IL-1和IL-18)、IL-2家族、IL-10家族、IL-17家族、干扰素家族。
107.根据段落106的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是TNF-α。
108.根据段落106或107的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是TNF-C。
109.根据段落106到108中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是OX40L。
110.根据段落106到109中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是CD154。
111.根据段落106到110中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是FasL。
112.根据段落106到111中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是LIGHT。
113.根据段落106到112中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是TL1A。
114.根据段落106到113中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是CD70。
115.根据段落106到114中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是Siva。
116.根据段落106到115中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是CD153。
117.根据段落106到116中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是4-1BB配体。
118.根据段落106到117中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是TRAIL。
119.根据段落106到118中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是RANKL。
120.根据段落106到119中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是TWEAK。
121.根据段落106到120中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是APRIL。
122.根据段落106到121中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是BAFF。
123.根据段落106到122中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是CAMLG。
124.根据段落106到123中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是NGF。
125.根据段落106到124中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是BDNF。
126.根据段落106到125中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是NT-3。
127.根据段落106到126中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是GITR配体。
128.根据段落106到127中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是EDA-A。
129.根据段落106到128中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是EDA-A2。
130.根据段落106到129中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子来自TGF-β超家族。
131.根据段落106到130中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是IL-1。
132.根据段落106到131中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是IL-8。
133.根据段落106到132中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是IL-2。
134.根据段落106到133中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是IL-10。
135.根据段落106到134中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是IL-17。
136.根据段落106到135中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子来自干扰素家族。
137.根据权利要求106的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的细胞因子独立地选自TNF-α、IL-1、IL-8、IL-10、IL-17、干扰素、LIGHT、TL1A、Siva、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、NGF、BDNF、NT-3和EDA-A2。
138.根据权利要求106或137中任一项的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的细胞因子独立地选自TNF-C、OX40l、CD154、FasL、CD70、CD153、4-1BB配体和EDA-A。
139.根据权利要求106、137或138中任一项的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子独立地选自包含以下的组：IL-2、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、Flt3配体、GM-CSF、IL-15和IL-12。
140.根据段落139的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是IL-2。
141.根据段落139或140的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是IFN-α。
142.根据段落139到141中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是IFN-β。
143.根据段落139到142中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是IFN-γ。
144.根据段落139到143中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是Flt3配体。
145.根据段落139到144中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是GM-CSF。
146.根据段落139到145中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是IL-15。
147.根据段落139到146中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子是IL-12。
148.根据段落10到147中任一段所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中至少一种其它转基因编码趋化因子。
149.根据权利要求148的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述趋化因子独立地选自包含以下的组：MIP-1α、RANTES、IL-8、CCL5、CCL17、CCL20、CCL22、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL12、CCL2、CCL19和CCL21。
150.根据权利要求149的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的趋化因子是MIP-1α。
151.根据段落149或150的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的趋化因子是RANTES。
152.根据段落149到151中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的趋化因子是IL-8。
153.根据段落149到152中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的趋化因子是CCL5。
154.根据段落149到153中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的趋化因子是CCL17。
155.根据段落149到154中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的趋化因子是CCL20。
156.根据段落149到155中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的趋化因子是CCL22。
157.根据段落149到156中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的趋化因子是CXCL9。
158.根据段落149到157中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的趋化因子是CXCL10。
159.根据段落149到158中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的趋化因子是CXCL11。
160.根据段落149到159中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的趋化因子是CXCL12。
161.根据段落149到160中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的趋化因子是CXCL13。
162.根据段落149到161中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的趋化因子是CCL2。
163.根据段落149到162中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的趋化因子是CCL19。
164.根据段落149到163中任一段的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的趋化因子是CCL21。
165.根据权利要求149或150的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述病毒包含编码细胞因子与趋化因子组合的转基因，所述组合选自i)MIP-1α与Flt3，和ii)MIP-1α与IFNα。
166.根据权利要求1到166中任一项的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述抗CD3抗体或结合片段至少具有包含来自莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3(OKT3)、奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利珠单抗(teplizumab)或维西珠单抗(visilizumab)的VH和VL区的结合域。
167.一种治疗癌症患者的方法(例如通过活体内刺激T细胞，例如癌细胞环境中的T细胞聚焦于癌细胞)，包含以下步骤：
投与治疗有效量的复制缺乏型溶瘤病毒载体或能复制型B组溶瘤腺病毒，其选自由Ad11和艾纳德诺组成的组，其中所述病毒编码用于在癌细胞表面上表达的抗体或其结合片段，其中所述抗体或结合片段对T细胞受体复合体(TCR)中的CD3蛋白质具有特异性，其中所述病毒不编码B7蛋白质或其活性片段，
其中所述病毒或病毒载体选择性地感染所述癌细胞且在所述细胞的表面上表达所述经编码的抗TCR抗体或结合片段，如权利要求1到166中任一项所定义。
168.一种复制缺乏型溶瘤病毒载体或能复制型B组溶瘤腺病毒，其选自由Ad11和艾纳德诺组成的组，其中所述病毒编码用于在癌细胞表面上表达的抗体或其结合片段，其中所述抗体或结合片段对T细胞受体复合体(TCR)中的CD3蛋白质具有特异性，其中所述病毒不编码B7蛋白质或其活性片段，如权利要求1到166中任一项所定义，其用于治疗。
169.根据权利要求168所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或能复制型B组溶瘤腺病毒，其用于治疗癌症。
170.根据权利要求169所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或能复制型B组溶瘤腺病毒，其中所述治疗是通过活体内刺激T细胞，例如癌细胞环境中的T细胞聚焦于癌细胞来进行。
171.一种复制缺乏型溶瘤病毒载体或能复制型B组溶瘤腺病毒，其选自由Ad11和艾纳德诺组成的组，其中所述病毒编码用于在癌细胞表面上表达的抗体或其结合片段，其中所述抗体或结合片段对T细胞受体复合体(TCR)中的CD3蛋白质具有特异性，其中所述病毒不编码B7蛋白质或其活性片段，如权利要求1到166中任一项所定义，其用于制造药剂。
在一个实施例中，一种或多种由本公开的病毒编码的转基因处于内源启动子的控制下，具体地说，处于主要晚期启动子的控制下。
在一个实施例中，一种或多种由本公开的病毒编码的转基因处于外源启动子(例如CMV启动子)的控制下。
在一个实施例中，提供一种病毒(复制缺乏型或复制胜任型病毒，其包含本文公开的转基因盒，包括作为完整病毒序列的一部分公开)。
在一个实施例中，由本公开的病毒编码的用于在癌细胞表面上表达的蛋白质或肽是免疫原性蛋白质，例如非人类蛋白质。
在一个方面中，本公开提供一种如下通过刺激活体内T细胞聚焦于癌细胞来治疗癌症患者的方法：投与治疗有效量的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，所述病毒载体或病毒编码用于在所述癌细胞的表面上表达的抗TCR抗体或其结合片段(例如抗CD3抗体或其结合片段)。
因此,提供一种如下通过活体内刺激T细胞(例如癌细胞环境中的T细胞)聚焦于癌细胞来治疗癌症患者的方法：
投与治疗有效量的编码抗TCR抗体或其结合片段(例如抗CD3抗体或其结合片段)的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述病毒或病毒载体选择性地感染所述癌细胞且在所述细胞的表面上表达所述经编码的抗TCR抗体或结合片段。
还提供一种编码用于在癌细胞表面上表达的抗TCR抗体或其结合片段(例如抗CD3抗体或其结合片段)的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其通过活体内刺激T细胞(具体地说，癌细胞环境中的T细胞)聚焦于所述癌细胞而用于治疗癌症患者。如本文所述，病毒或病毒载体选择性地感染所述癌细胞且在所述细胞的表面上表达所述经编码的抗TCR抗体或结合片段(例如抗CD3抗体或其结合片段)。
在一个实施例中，提供一种复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其编码用于在癌细胞表面上表达的抗TCR抗体或其结合片段(例如抗CD3抗体或其结合片段)，所述病毒载体或病毒用于制造供治疗癌症用的药剂，其通过活体内刺激T细胞(具体地说，癌细胞环境中的T细胞)聚焦于所述癌细胞来治疗癌症。
在第二个独立实施例中，提供一种治疗癌症患者的方法，包含投与治疗有效量的的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，所述病毒载体或病毒编码用于在癌细胞表面上表达的抗TCR抗体或其结合片段(例如抗CD3抗体或其结合片段)，其条件例如是，如果所述病毒是复制胜任型溶瘤腺病毒，则其中的一种或多种转基因处于外源启动子的控制下，且/或所述病毒不编码B7蛋白质或其活性片段。
因此，提供一种用于治疗癌症的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其编码用于在癌细胞表面上表达的抗TCR抗体或其结合片段(例如抗CD3抗体或其结合片段)，其条件例如是如果所述病毒是复制胜任型溶瘤腺病毒，则其中的一种或多种转基因处于外源启动子的控制下，且/或所述病毒不编码B7蛋白质或其活性片段。
在一个实施例中，一种用于制造供治疗癌症用的药剂的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其编码用于在癌细胞表面上表达的抗TCR抗体或其结合片段(例如抗CD3抗体或其结合片段)，其条件例如是，如果所述病毒是复制胜任型溶瘤腺病毒，则其中的一种或多种转基因处于外源启动子的控制下，且/或所述病毒不编码B7蛋白质或其活性片段。
在一个独立方面中，提供一种复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其编码用于在癌细胞表面上表达的抗TCR抗体或其结合片段(例如抗CD3抗体或其结合片段)。
因此，在第三方面中，提供一种复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其编码用于在癌细胞表面上表达的抗TCR抗体或其结合片段(例如抗CD3抗体或其结合片段)，其条件例如是如果所述病毒是复制胜任型溶瘤腺病毒，则其中的一种或多种转基因处于外源启动子的控制下，且/或所述病毒不编码B7蛋白质或其活性片段。
在本公开的一个实施例中，所述病毒是复制胜任型。在一个实施例中，本公开不是复制胜任型溶瘤腺病毒。
在本公开的一个实施例中，复制缺乏型病毒载体例如部分地或完全地缺失病毒复制所必需的基因，例如腺病毒中的E1区域。
在本公开的一个实施例中，所述病毒或病毒载体被减毒。
在本公开的一个实施例中，所述溶瘤病毒或病毒载体是选自腺病毒(例如Ad5、Ad3、Ad11、Ad11/Ad3和Ad5/3)、单纯疱疹病毒(例如HSV-1)、呼肠孤病毒、牛痘病毒、塞内加谷病毒、柯萨奇病毒、马拉巴病毒、麻疹病毒、水泡性口炎病毒和新城疫病毒，包括其含有转基因的突变型、变异体或衍生物。
在一个实施例中，所述病毒或病毒载体是选自包含以下的组：安柯瑞(H101)、塔力莫(Talimogene)、瑞奥素、培沙得瓦(JX-594)、卡瓦塔克、赛普瑞韦、CGTG-102、MV-NIS、PV701、CL-ONC1、CG0070和艾纳德诺(EnAd)，包括其含有转基因的突变型、变异体或衍生物。
在本公开的一个实施例中，所述溶瘤病毒是腺病毒，例如B组病毒，例如Ad11，更具体地说，EnAd。
在本公开的一个实施例中，所述溶瘤病毒不是腺病毒，例如不是B组腺病毒，例如不是Ad11，更具体地说，不是EnAd。
在一个实施例中，抗TCR抗体或其结合片段特异性针对直接涉及抗原结合的TCRα、β、γ或δ蛋白质，或其组合，例如抗TCRβ链抗体。
在一个实施例中，所述抗TCR抗体或结合片段特异性针对CD3δ、ε、γ或其组合，具体地说，特异性针对CD3ε。
在一个实施例中，所述结合域包含来自抗体莫罗单抗-CD3(也称为OKT3)、奥昔珠单抗(也称为TRX4)、替利珠单抗(也称为hOKT3γ1(Ala-Ala))或维西珠单抗的VH和VL。
在本公开的一个实施例中，当复制胜任型病毒是腺病毒时，促效性抗TCR抗体或其结合片段的结合域不包含来自抗体莫罗单抗-CD3(也称为OKT3)、奥昔珠单抗(也称为TRX4)、替利珠单抗(也称为hOKT3γ1(Ala-Ala))或维西珠单抗的VH和VL。
在本公开的一个实施例中，所述溶瘤病毒或病毒载体编码另一种转基因，例如编码选自包含以下的组的蛋白质的另一种转基因：细胞因子、趋化因子、拮抗性抗体分子或其片段、促效性抗体分子或其片段、免疫调节剂和其组合。
在本公开的一个实施例中，所述溶瘤病毒或病毒载体编码至少两种其它转基因，例如编码独立地选自包含以下的组的蛋白质的其它转基因：细胞因子、趋化因子、拮抗性抗体分子或其片段、促效性抗体分子或其片段、酶、免疫调节剂和其组合。
在一个实施例中，其它转基因编码抗体或其结合片段。
在一个实施例中，可以由本公开的溶瘤病毒或病毒载体编码的抗体结合片段独立地选自Fab、经修饰的Fab、Fab'、经修饰的Fab'、F(ab')2、Fv、单域抗体、scFv、二价、三价或四价抗体、双scFv、双链抗体、三链抗体、四链抗体、前述中的任一种的二硫键稳定形式和其抗原决定基结合片段，具体地说，scFv。
在一个实施例中，所编码的抗体是全长抗体。
在本公开的一个实施例中，所述其它转基因编码活化T细胞的抗体或结合片段，例如刺激T细胞信号传导的促效剂，如特异性针对CD28的抗体或结合片段，具体地说，特异性针对CD28的促效剂。
在根据本发明的一个实施例中，所编码的细胞因子是选自包含以下的组：IL-2、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、Flt3配体、GM-CSF、IL-15、IL-12和其组合。
在本公开的一个实施例中，所述其它转基因编码分泌的或膜结合的细胞因子。
如本文所用的细胞因子意指低分子量蛋白质，其通过结合到靶细胞上的特异性受体且向淋巴细胞和/或其它细胞施加多种影响而能够调控免疫响应的性质、强度和持续时间。如本文所用，术语细胞因子包括细胞表面配体或受体的分泌型，包括融合蛋白(例如分子与免疫球蛋白Fc域的融合)。
在根据本发明的一个实施例中，所编码的细胞因子选自TNFα超家族(TNFRSF包括TNF-α、TNF-C、OX40L、CD154、FasL、LIGHT、TL1A、CD70、Siva、CD153、4-1BB配体、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、CAMLG、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITR配体、EDA-A、EDA-A2)、TGF-β超家族、IL-1家族(即IL-1和IL-8)、IL-2家族、IL-10家族、IL-17家族、干扰素家族。
在根据本发明的一个实施例中，所述趋化因子是选自包含以下的组：MIP-1α、IL-8、CCL5、CCL17、CCL20、CCL22、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL12、CCL2、CCL19、CCL21和其组合。
在一个实施例中，所述其它转基因编码第一抗体或其结合片段和第二抗体或其结合片段(本文中称为抗体/抗体组合)。
在一个实施例中，所述其它转基因编码抗体或结合片段和细胞因子(在本文中称为抗体/细胞因子组合)。
在一个实施例中，所述其它转基因编码第一细胞因子和第二细胞因子(在本文中称为细胞因子/细胞因子组合)。
在一个实施例中，所述其它转基因编码第一趋化因子和第二趋化因子(在本文中称为趋化因子/趋化因子组合)。
在一个实施例中，所述其它转基因编码趋化因子和细胞因子(在本文中称为细胞因子/趋化因子组合)。
在存在多种转基因的情况下，一种转基因通常编码一种实体，例如细胞因子或抗体等，且不同基因将编码例如趋化因子或抗体等实体。
在根据本发明的一个实施例中，所述溶瘤病毒或病毒载体编码细胞因子、趋化因子组合，例如MIP-1α与Flt3或MIP-1α与IFNα。
在一个实施例中，抗TCR抗体或结合片段至少具有包含来自莫罗单抗-CD3(OKT3)(其可变区展示于SEQ ID NO:1和2中且其单链Fv形式展示于SEQ ID NO:3中)、奥昔珠单抗、替利珠单抗(其可变区展示于SEQ ID NO:6和7中)或维西珠单抗的VH和VL区的结合域。
在一个实施例中，由所述病毒编码的转基因，例如抗TCR抗体或其结合片段(例如抗CD3抗体或其结合片段)，包含跨膜域或GPI锚。
在一个实施例中，所述抗CD3抗体或结合片段只在表面上表达，即其不作为分泌性蛋白表达。
在一个实施例中，跨膜域和分泌性信号序列的组合用于在感染的癌细胞表面上表达由病毒(例如如本文所述)编码的蛋白质。本发明人已证明，所编码的蛋白质只在容许被所述病毒感染的细胞(即癌细胞)上表达。
在一个实施例中，用于在感染的癌细胞的表面上表达蛋白质的片段(例如跨膜片段)选自包含以下的组：SEQ ID NO:10、11、12、13或14中所指定的TM域序列(最小部分)。
SEQ ID NO: 名称 序列
10 PDGFR受体A AVLVLLVIVIISLIVLVVIW
11 PDGFR受体B VVISAILALVVLTIISLIILI
12 胰岛素样生长因子1 IIIGPPLIFVFLFSVVIGSIYLFL
13 IL6-R SSSVPLPTFLVAGGSLAFGTLLCIAIVL
14 CD28 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
在一个实施例中，所述跨膜域来自B7蛋白质。
在一个实施例中，根据本发明的溶瘤病毒或病毒载体，具体地说，复制胜任型腺病毒，例如Ad11或EnAd，不编码B7蛋白质，也不编码其活性片段。
附图说明
图1展示T细胞受体(具有α-β抗原识别链的实例)的图示
图2展示表达人类CD80(图2A)、共表达人类IFNα和人类CD80(图2B)、共表达OKT3scFv和人类CD80(图2C)、共表达人类Flt3L、人类MIP1α和人类IFNα(图2D)、共表达人类Flt3L、人类MIP1α和人类CD80(图2E)、共表达人类IFNα、人类MIP1α和人类CD80(图2F)的病毒用的转基因盒示意图，以及开放阅读框架(ORF)或OKT3 scFv的示意图(图2G)
图3展示NG-348A(图3A)、NG-420(图3B)和NG-420A(图3C)转基因盒的示意图
图4展示NG-347或NG-348病毒感染的A549肿瘤细胞的细胞表面上的高CD80表达(截至48小时)，但在EnAd感染之后存在极少的或不存在CD80表达
图5展示NG-348病毒感染的DLD-1肿瘤细胞的细胞表面上的高CD80表达(截至48小时)，但EnAd感染之后存在极少的或不存在CD80表达
图6展示被NG-348感染且与人类CD3+T细胞共培养的EpCam+A549细胞上的CD80表达，但在EnAd感染时不存在所述表达
图7展示CD25在和被NG-348感染的A549细胞共培养之后的人类CD3+T细胞上上调，但在EnAd感染时不存在所述上调(图7A)，其中CD25+细胞百分比(图7B)与每个细胞的CD25表达水平(图7C)均增加。
图8展示CD25在和被NG-348感染的A549细胞共培养之后的CD4+与CD4-(主要为CD8)人类CD3+T细胞亚群上上调，但在用EnAd感染时不存在所述上调。
图9展示和被NG-348或EnAd感染的A549细胞共培养之后的人类CD3+T细胞上的HLA-DR低表达水平
图10展示与NG-348感染的A549细胞共培养之后的活CD3+T细胞表面上的CD107a表达的诱导，但在EnAd感染时未出现所述诱导。
图11展示与NG-348感染的A549细胞共培养之后的CD4+和CD4-CD3+T细胞亚群的表面上的CD107a表达的诱导，但在EnAd感染时未出现所述诱导。
图12展示CD3+T细胞在与NG-348感染的A549细胞共培养之后诱导IL-2(图12A)和IFNγ(图12B)产生，但用EnAd感染时，未产生IL-2而只能产生低含量的IFNγ。
图13展示CD4+(图13A)和CD8+(图13B)CD3+T细胞在与NG-348感染的A549细胞共培养之后诱导IFNγ产生，但用EnAd感染时，未产生(CD4+细胞)IFNγ或产生低(CD8+细胞)IFNγ。
图14展示与A549肿瘤细胞相比，EnAd、NG-347和NG-348在MRC-5成纤维细胞中的基因组复制和六邻体基因表达(mRNA层面)
图15展示与A549肿瘤细胞相比，病毒NG-348在MRC-5成纤维细胞中产生的CD80和抗CD3-scFv转基因mRNA和CD80转基因蛋白(流式细胞术)表达
图16展示与A549肿瘤细胞相比，病毒NG-347在MRC-5成纤维细胞中产生的CD80转基因mRNA和CD80转基因蛋白。
图17展示与A549肿瘤细胞相比，病毒NG-347在MRC-5成纤维细胞中产生的MIP1α和IFNα的mRNA和分泌性蛋白含量。
图18展示EnAd、NG-347和NG-348在提纯的人类T细胞培养物中的基因组复制和六邻体基因表达(mRNA层面)。
图19展示与A549肿瘤细胞相比，病毒NG-348在人类T细胞中产生的CD80和抗CD3scFv转基因mRNA和蛋白质表达(流式细胞术)
图20展示与A549肿瘤细胞相比，病毒NG-347在提纯的人类T细胞中产生的CD80转基因mRNA和CD80转基因蛋白
图21展示与A549肿瘤细胞相比，病毒NG-347在T细胞中产生的IFNα和MIP1α转基因mRNA
图22展示与A549肿瘤细胞相比，NG-347和NG-348在人类PBMCs中的基因组复制和六邻体基因表达
图23展示与A549肿瘤细胞相比，病毒NG-348在PBMCs中产生的CD80和抗CD3scFvmRNA
图24展示与A549肿瘤细胞相比，病毒NG-347在PBMCs中产生的CD80、IFNα和MIP1αmRNA
图25展示EnAd、NG-347和NG-348病毒颗粒使人类树突状细胞发生类似的活化，如根据细胞表面上的CD14表达下调和CD80上调所度量
图26展示颗粒介导的与NG-348(A)或NG-347(B)一起培养的PBMC分泌MIP1α和IFNα蛋白质与EnAd类似。
图27展示相较于与A549肿瘤细胞共培养，NG-347或NG-348在共培养物或T细胞或PBMCs与MRC-5成纤维细胞中的基因组复制
图28展示与A549肿瘤细胞相比，与MRC-5成纤维细胞共培养且经EnAd或病毒NG-348处理的PBMCs或T细胞所分泌的INFγ。
图29展示经EnAd、NG-347或NG-348病毒颗粒处理的人类树突状细胞所分泌的MIP1α和IFNα
图30展示与EnAd、NG-347或NG-348感染的A549肿瘤细胞共培养的JurkatDual报告T细胞中的NFKB和IFN报告基因活化
图31展示与EnAd、NG-347、NG-348或NG-420处理的A549HCT-116、DLD和HT29肿瘤细胞共培养的JurkatDual报告T细胞所产生的NF-KB荧光素酶报告基因活性
图32展示与病毒NG-348和病毒NG-420感染的A549或HT29肿瘤细胞共培养的JurkatDual细胞所产生的NF-κB荧光素酶报告基因活性与所添加的病毒颗粒的关系
图33展示EnAd和病毒NG-348在血液中的药物动力学；暴露于EnAd或病毒NG-348之后的血液细胞因子含量；静脉内投与CD1小鼠之后6或24小时，EnAd或NG-348病毒的组织生物分布
图34展示向携带皮下HCT-116肿瘤异种移植物的CB17-SCID小鼠静脉内投药之后，EnAd、NG-347和NG-348病毒在血液中的药物动力学。
图35展示在带有肿瘤的CB17-SC1D小鼠中静脉内给药后6小时，EnAd、NG-347和NG-348病毒的组织分布，和静脉内或肿瘤内给与EnAd、NG-347和NG-348之后第7天和第14-21天时，HCT-116肿瘤异种移植物中的病毒基因组
图36展示静脉内或肿瘤内给药之后第7天或第14-21天，EnAd、NG-347或NG-348病毒在HCT-116肿瘤异种移植物中产生的病毒六邻体mRNA
图37展示静脉内给与病毒NG-348之后7天或21天，HCT-116肿瘤异种移植物中的六邻体和CD80转基因的mRNA水平
图38展示静脉内给与病毒NG-348之后7天或14-21天，HCT-116肿瘤异种移植物中的编码抗CD3 scFv和CD80的转基因的mRNA水平
图39展示静脉内给与病毒NG-347之后7天或14-21天，HCT-116肿瘤异种移植物中的MIP1α和IFNα转基因的mRNA水平
图40展示静脉内给与病毒NG-348之后7天和21天，HCT-116肿瘤异种移植物中的CD80蛋白质表达；并且展示静脉内给与病毒NG-347之后HCT-116肿瘤中的MIP1α和CD80蛋白质表达。
图41展示与EnAd感染时相比，CD69在与NG-347感染的A549细胞共培养之后的更多人类CD3+T细胞上受到上调
图42展示与NG-347感染的A549细胞共培养之后，诱导人类CD3+T细胞产生IFNγ，但用EnAd感染时则未出现所述诱导
图43展示EnAd和NG-348病毒在HT-29细胞毒性分析中类似的溶瘤效能(图43)和感染性(图43表格)
图44展示TNF超家族的信号传导路径，得自《自然综述免疫学(Nature ReviewsImmunology)》3,745-756(2003年9月)。
图45-53展示多种氨基酸和多核苷酸序列。
序列表概述
本申请的随附序列表中含有119种序列。
SEQ ID NO:1：抗体OKT3的VH区域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2：抗体OKT3的VH区域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3：含有OKT3 VH和VL的scFv构建体的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4：具有SEQ ID NO:3的scFv的膜锚定型的氨基酸序列
SEQ ID NO:5：具有V5标签的SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6：替利珠单抗VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7：替利珠单抗VL的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8：替利珠单抗重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9：替利珠单抗轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10：PDGFR受体A的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11：PDGFR受体B的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12：胰岛素样生长因子1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13：IL-6R的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14：CD28的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15：PDGFR TM域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16：c-myc标签的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17：具有间隔子的c-myc标签的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18：具有N末端c-myc标签的PDGFR TM域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19：HuVH人类VH前导序列的氨基酸序列
SEQ ID NO:20：连接子的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21：EnAd基因组的多核苷酸序列
SEQ ID NO:22到30：铰链连接序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31到70：柔性连接序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:71到86：连接序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:87：EnAd基因组的E2B区(BP 10355-5068)的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:88：适于纳入BX中的非编码序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:89：适于纳入BY中的非编码序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:90和91：剪接受体序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:92：包含起始密码子的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:93：IRES的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:94：高效率自我裂解型P2A肽序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:95：高效率自我裂解型F2A肽序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:96：高效率自我裂解型E2A肽序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:97：高效率自我裂解型T2A肽序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:98：人类CD80氨基酸序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:99：多聚腺苷酸化序列(SV40晚期多腺苷酸序列)的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:100：NG-348病毒基因组序列的多核苷酸。
SEQ ID NO:101：V5TAG的氨基酸
SEQ ID NO:102：NG-348A病毒基因组序列的多核苷酸。
SEQ ID NO:103：NG-420病毒基因组序列的多核苷酸。
SEQ ID NO:104：NG-420A病毒基因组序列的多核苷酸。
SEQ ID NO:105：人类干扰素-a氨基酸序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:106：人类可溶性Flt3配体氨基酸序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:107：人类巨噬细胞发炎蛋白1a氨基酸序列(LD78b同功异型物)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:108：膜锚定的抗人类CD3单链Fv形式的氨基酸序列。
SEQ ID NO:109：NG-330病毒基因组的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:110：NG-343病毒基因组的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:111：NG-345病毒基因组的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:112：NG-346病毒基因组的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:113：NG-347病毒基因组的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:114：EnAd的E3区的多核苷酸。
SEQ ID NO:115：适于纳入BY中的非编码序列的多核苷酸。
SEQ ID NO:116：NG-348病毒基因组的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:117：膜拴系的OKT3-scFv的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:118：NG-348的转基因盒的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:119：完整合成EnAd基因组的多核苷酸序列，其中并有克隆位点供转基因盒插入质粒pEnAd2.4
具体实施方式
癌症环境中的T细胞包括肿瘤内部的T细胞和肿瘤附近的T细胞，例如位于肿瘤外部、但能够与肿瘤或癌细胞接合的T细胞，具体地说，与肿瘤或癌细胞在物理上接合的T细胞。
有证据表明，T细胞渗入肿瘤且一旦进入肿瘤内部，则其被解除活化。有利地，本公开的方法能够活化肿瘤内部的T细胞。在一个实施例中，肿瘤内部的T细胞被根据本发明的溶瘤病毒或病毒载体活化。
在一个实施例中，本公开中使用的跨膜系链或锚序列包含PDGFR TM域(例如ala513-arg561)，例如SEQ ID NO:15序列中所示。
在一个实施例中，本公开中所使用的系链或锚序列包含附接到PDGF受体或其片段(例如PDGFR TM域)上的标签。适合的标签包括His标签、Flag标签、c-myc标签等。更具体地说，系链或锚可以包含c-myc标签，例如SEQ ID NO:16EQKLISEEDL的c-myc标签，继之使用PDGFR TM域(ala513-arg561)，例如SEQ ID NO:15序列中所示。
在一个实施例中，c-myc标签包含位于3'和/或5'端的间隔子或间隔子氨基酸，例如SEQ ID NO:17gsEQKLISEEDLn序列中所示。
在一个实施例中，所用的系链或锚序列展示于SEQ ID NO:18序列中。
一般来说，系链或锚所附接的蛋白质/多肽不包含终止密码子。
在一个实施例中，在癌细胞表面上表达的蛋白质的前导序列是人类前导序列，例如人类VH前导序列(HuVH)(SEQ ID NO.19)。
在一个实施例中，ORF盒的结构如下：
LS-POLY-TAG-TM_D
其中
LS是前导序列，例如人类前导序列；
POLY是编码所关注的多肽或蛋白质的多核苷酸，具体地说，本文所公开的多核苷酸；
标签是标签，例如本文所公开的标签，例如c-myc，具体如本文所述；
TM_D是TM域，例如PDGFR TM域，也如本文所述。
如果多肽是scFv，则ORF可以如下：
LS-VAR1-LINK-VAR2-TAG-TM_D
其中
LS是前导序列，例如人类前导序列；
VAR1是编码可变区(例如VH区)的多核苷酸；
LINK是连接子，例如如本文所公开，例如基于G4S单元的连接子，具体地说，SEQ IDNO:20GGGGSGGGGSGGGGS序列；
VAR2是编码可变区(例如VL区)的多核苷酸；
TAG是标签，例如本文所公开的标签，例如c-myc，具体地说，本文所述的序列；
TM_D是TM域，例如PDGFR TM域，例如本文所述的序列。
本公开还扩展到包含位于多肽链的N端或C端的标签、以便其存在于膜的内部或膜外部的实施例，具体地说，本文中特别描述的那些实施例。因此，位于膜内部的C端标签有利，原因是其不大可能干扰多肽的结合或功能。
使用跨膜域以便在感染的癌细胞表面上表达蛋白质的替代方法包括使用与细胞外蛋白质或片段的C端氨基酸附接的糖磷脂锚(也称为GPI锚)的方法(Low等人，1986，《杂交(Cross)》1987；Low和Saltiel，1988；Ferguson和William，1988)。已知的糖磷脂锚包括来自Thy-1、N-CAM和DAF的那些锚。
在一个实施例中，跨膜域和分泌性信号序列的组合用于在感染的癌细胞表面上表达由病毒(例如如本文所述)编码的蛋白质。本发明人已证明，所编码的蛋白质仅在容许溶瘤病毒(即癌细胞)感染的细胞上表达。
在一个实施例中，用于蛋白质在感染的癌细胞的表面上表达的片段(例如跨膜片段)选自包含以下的组：SEQ ID NO:10到15(或10到14)中所指定的TM域序列(最小部分)。
在一个实施例中，来自CD80或CD86的跨膜域用于蛋白质在癌细胞表面上表达。
在一个实施例中，用于蛋白质在感染的癌细胞的表面上表达的片段(例如跨膜片段)选自约20到25个形成跨膜α螺旋的疏水性氨基酸，其例如来自包括以下的蛋白质：PDGF受体、胰岛素样生长因子受体、IL-6受体、CD28、血型糖蛋白、LDL受体、流感HA蛋白、胰岛素受体、去唾液酸糖蛋白受体、转铁蛋白受体。
在一个实施例中，所用跨膜域来源于G蛋白偶联受体或B型肝炎的S抗原。
在一个实施例中，包含B7蛋白质或片段的全长胞外域和来源于除B7外的蛋白质的跨膜域的融合蛋白被排列成使得B7蛋白质定位于融合蛋白的远离癌细胞表面的末端处，即位于面向细胞外空间的癌细胞的外部。
与组成型表达相反，由于蛋白质根据病毒寿命周期表达，因此使编码B7或活性片段的DNA序列处于内源启动子的控制下也是有利的。在本发明情形下，在外生性启动子(例如类似于CMV启动子的强启动子)下的连续表达可以产生比治疗效果所需更多的B7蛋白而引起脱靶效应。
在一个实施例中，根据本公开的溶瘤病毒是腺病毒，例如B组腺病毒。在一个实施例中，根据本发明的病毒是嵌合病毒，例如EnAd。在一个实施例中，所述腺病毒是复制胜任型。
在一个实施例中，溶瘤病毒是能复制型，例如复制胜任型。
如本文所使用的能复制型是能在宿主细胞中复制的病毒。在一个实施例中，能复制型涵盖复制胜任型和复制选择型病毒。
如本文所使用的复制胜任型意指溶瘤病毒能够在人类细胞(例如癌细胞)中复制而不存在野生型病毒所必需的任何额外互补，例如不依赖于缺乏型细胞机构。
如本文所使用的复制选择型或选择性复制意指溶瘤病毒利用对所述癌细胞具有特异性的元件(例如缺乏型细胞机构，例如p53突变)而能够在癌细胞中复制或在其中上调，由此允许相对于健康/正常细胞达成一定的选择程度。
“能复制型溶瘤病毒”是优先感染癌细胞的能复制型病毒。即，它们通过优先感染肿瘤细胞而非非肿瘤细胞而具有肿瘤选择性。EnAd是复制胜任型病毒的一个实例。
在一个实施例中，病毒为复制缺乏型并且作为病毒载体提供。病毒载体需要包装细胞或辅助细胞来提供允许复制的互补基因。
如本文所使用的复制缺乏型溶瘤病毒载体是指优先感染癌细胞的复制缺乏型病毒。即，它们通过优先感染肿瘤细胞而非非肿瘤细胞而具有肿瘤选择性，例如通过使复制胜任型溶瘤病毒缺失复制所必需的基因而得到病毒载体。
在一个实施例中，根据本发明的复制缺乏型溶瘤病毒载体
在一个实施例中，编码抗TCR抗体或其结合片段(例如抗CD3抗体或其结合片段)的基因定位于腺病毒基因L5的终止密码子与多腺苷酸识别位点之间以及基因E4的终止密码子与多腺苷酸识别位点之间。
在一个实施例中，编码抗TCR抗体或其结合片段(例如抗CD3抗体或其结合片段)的基因定位于EnAd基因组的约bp 29356与约29357之间，例如SEQ ID NO:21中所示，或其等效位置。技术人员应理解，位置的绝对数值可基于编号如何分配而改变。
CD3抗体组分有助于活体内刺激T细胞(例如癌细胞环境中的T细胞)聚焦于癌细胞。
如本文所使用的免疫调节剂意指免疫响应的调节剂。免疫调节剂的作用是将免疫响应调节到所期望的水平，如免疫增强、免疫抑制或诱导免疫耐受性。
在一个实施例中，免疫调节剂是特异性针对选自包含以下的组的标靶的抗体或结合片段(具体地说，抑制剂抗体或结合片段)：CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、VISTA、B7-H3、B7-H4、HVEM、ILT-2、ILT-3、ILT-4、TIM-3、LAG-3、BTLA、LIGHT或CD160，例如CTLA-4、PD-1、PD-L1和PD-L2。
在一个实施例中，免疫调节剂是特异性针对选自包含以下的组的标靶的抗体或结合片段(具体地说，抑制剂抗体或结合片段)：CD16、CD25、CD33、CD332、CD127、CD31、CD43、CD44、CD162、CD301a、CD301b和半乳糖凝集素-3。
在一个实施例中，免疫调节剂是特异性针对选自包含以下的组的标靶的抗体或结合片段：FLT-3、FLT-3配体、TLRs、TLR配体、CCR7、CD1a、CD1c、CD11b、CD11c、CD80、CD83、CD86、CD123、CD172a、CD205、CD207、CD209、CD273、CD281、CD283、CD286、CD289、CD287、CXCR4、GITR配体、IFN-α2、IL-12、IL-23、ILT1、ILT2、ILT3、ILT4、ILT5、ILT7、TSLP受体、CD141、CD303、CADM1、CLEC9a、XCR1和CD304。
在一个实施例中，免疫调节剂是选自包含以下的组的特异性针对标靶的抗体或结合片段：OX40、OX40配体、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40配体、CD70、CD137、GITR、4-1BB、ICOS和ICOS配体，例如CD40和CD40配体。
在一个实施例中，免疫调节剂是针对选自包含以下的组的免疫细胞表面受体的膜结合蛋白质配体：CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、VISTA、B7-H3、B7-H4、HVEM、ILT-2、ILT-3、ILT-4、TIM-3、LAG-3、BTLA、LIGHT或CD160，例如CTLA-4、PD-1、PD-L1和PD-L2。
在一个实施例中，免疫调节剂是针对选自包含以下的组的免疫细胞表面受体的膜结合蛋白质配体：CD16、CD25、CD33、CD332、CD127、CD31、CD43、CD44、CD162、CD301a、CD301b和半乳糖凝集素-3。
在一个实施例中，免疫调节剂是针对选自包含以下的组的免疫细胞表面受体的膜结合蛋白质配体：FLT-3、FLT-3配体、TLRs、TLR配体、CCR7、CD1a、CD1c、CD11b、CD11c、CD80、CD83、CD86、CD123、CD172a、CD205、CD207、CD209、CD273、CD281、CD283、CD286、CD289、CD287、CXCR4、GITR配体、IFN-α2、IL-12、IL-23、ILT1、ILT2、ILT3、ILT4、ILT5、ILT7、TSLP受体、CD141、CD303、CADM1、CLEC9a、XCR1和CD304。
在一个实施例中，免疫调节剂是选自包含以下的组的特异性针对免疫细胞表面的膜结合蛋白质配体：OX40、OX40配体、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40配体、CD70、CD137、GITR、4-1BB、ICOS和ICOS配体，例如CD40和CD40配体。
在一个实施例中，免疫调节剂是特异性针对选自包含以下的组的标靶的抗体或结合片段：IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-9、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-33、IL-35、白介素-2(IL-2)、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、IL-25、IL-1RA、IFNα、IFNβ、IFNγ、ΤΝFα、TGFβ、淋巴毒素α(LTA)和GM-CSF。
在一个实施例中，根据本发明的溶瘤腺病毒具有式(I)：
5'ITR-B1-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3'ITR (I)
其中：
B1是一键或包含：E1A、E1B或E1A-E1B；
BA是E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；
B2是一键或包含E3或转基因，例如处于内源或外源启动子下；
BX是一键或包含以下的DNA序列：限制位点、一种或多种转基因或这两者；
BB包含L5；
BY包含编码B7蛋白质或其活性片段的转基因；并且
B3是一键或包含E4。
在一个实施例中，溶瘤病毒具有式(Ia)：
5'ITR-B1-BA-B2-BB-BY-B3-3'ITR (Ia)
其中：
B1是一键或包含：E1A、E1B或E1A-E1B；
BA是E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；
B2是一键或包含E3；
BB包含L5；
BY包含编码B7蛋白质或其活性片段的转基因；并且
B3是一键或包含E4。
在一个实施例中，式(I)和/或(Ia)的构建体中的病毒基因组来自Ad11或EnAd，尤其EnAd。
在一个实施例中，编码抗TCR抗体或其结合片段(例如抗CD3抗体或其结合片段)的转基因处于内源启动子(例如主要晚期启动子)的控制下。
在一个实施例中，BY包含转基因盒，所述盒包含编码B7蛋白质或其片段的转基因和调控元件，例如调控元件的组合。
在一个实施例中，调控元件是剪接受体序列。
在一个实施例中，调控元件是Kozak序列。
在一个实施例中，例如在转基因编码多顺反子RNA分子的情况下，调控元件是IRES序列。
在一个实施例中，调控序列是高效率的自我裂解型肽序列，例如P2A、T2A、F2A、E2A。
在一个实施例中，调控序列是多腺苷酸尾。
在一个实施例中，存在至少两种调控序列，例如剪接受体和Kozak序列或剪接受体和多腺苷酸尾，或剪接受体和IRES序列，或剪接受体和P2A序列。
在一个实施例中，存在至少三种调控序列，例如剪接受体序列、Kozak序列和多腺苷酸尾；或剪接受体序列、IRES或2A序列和多腺苷酸尾；或剪接受体序列、Kozak序列和IRES或2A序列。
在一个实施例中，存在至少四种调控序列，例如剪接受体序列、Kozak序列、IRES或2A序列和多腺苷酸尾，具体地说，从L5到E4依序为剪接受体序列、Kozak序列、IRES或2A序列和多腺苷酸尾。
在一个实施例中，转基因编码包含IRES和2A调控序列的多顺反子RNA分子。
在一个实施例中，非腺病毒编码独立地选自以下的B7蛋白质：B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6、B7-H7、前述的活性片段，和其组合。在一个实施例中，B7蛋白质是B7-1(CD80)、B7-2(CD86)或前述中的任一种的活性片段和其组合，尤其B7-1或其活性片段。
在一个实施例中，B7片段包含或其组成为来自B7蛋白质(具体地说，本文所述的跨膜域，例如B7-1)的跨膜域。这个域被认为对细胞表面上的表达有贡献。
在一个实施例中，存在B7蛋白质的细胞质域。在一个实施例中，不存在细胞质域。细胞质域的不存在可以减少或排除向癌细胞的细胞内信号传导，这与下文论述的一或多个实施例有关。
片段或全长B7蛋白质中的元件可来自相同或不同B7蛋白质。因此，在一个实施例中，B7片段或蛋白质为嵌合的。
在一个实施例中，本公开的病毒编码用于在感染的癌细胞的表面上表达的多种蛋白质，例如非腺病毒所编码的至少一种是B7蛋白质或其活性片段，例如所述病毒编码两种、三种、四种或超过四种不同蛋白质，具体地说，编码两种或三种蛋白质，用于在癌细胞表面上表达或分泌到细胞外空间中。
在一个实施例中，B7蛋白质或活性片段由本公开的非腺病毒编码以在癌细胞的表面上表达，并且所述病毒还编码从细胞中分泌/释放的相同B7蛋白质或不同B7蛋白质(包括活性片段)的可溶形式。
在一个实施例中，至少两种不同B7蛋白质或活性片段由本公开的非腺病毒编码。
在一个实施例中，多种蛋白质可以被编码而以单独蛋白质形式表达，其独立地被处理且表达于癌细胞膜中。蛋白质不依赖于癌细胞表面可以对免疫活化作出积极贡献。尽管不希望受理论束缚，但脂质堆积能影响癌细胞膜中的脂质双层的流动性(即，粘度)。膜的粘度能影响蛋白质和其它生物分子在膜内的旋转和定向，由此影响这些分子的功能。因此，当病毒编码的蛋白质以个别和单独蛋白质形式定位于感染的癌细胞的膜中时，脂质双层的流动性允许分子独立运动，这可以是与有益于生物功能的天然形式相似的特别适合形式。
在一个实施例中，经独立处理和表达的蛋白质定位于(锚定于)癌细胞膜中的不同位置，如物理上分开的位置。
在一个实施例中，病毒所编码且在感染的癌细胞表面上表达的一种或多种蛋白质(例如所有蛋白质)不是融合蛋白。
因此，在一个实施例中，根据本公开的病毒包含编码用于例如在表面或感染的癌细胞上表达的所述多种蛋白质的DNA序列。
因此，在一个实施例中，根据本公开的病毒包含两种或更多种转基因，其处于病毒基因组中的相同或不同位置处。当位于病毒基因组中的相同位置处时，多种蛋白质仍将在癌细胞表面处得到独立的表达。
在一个实施例中，多种蛋白质(包括融合蛋白)编码于病毒基因组中的不同位置处，例如E3、BX和/或BY处并且在感染的癌细胞的表面上分别表达。
在一个实施例中，多种蛋白质(包括融合蛋白)编码于病毒基因组中的相同位置处并且在感染的癌细胞的表面上一起表达，例如在所编码的蛋白质以融合蛋白形式提供的情况下，其中所述融合蛋白包含B7蛋白质或其活性片段。
在一个实施例中，融合蛋白中的B7蛋白质是全长蛋白质，具体地说，本文所述的蛋白质，例如B7-1和/或B7-2，其与所关注的另一种蛋白质或其活性片段融合或连接。在一个实施例中，融合蛋白包含来自B7蛋白质的跨膜。在一个实施例中，B7是不包括跨膜域的活性片段。在后面的实施例中，除来源于B7蛋白质的跨膜之外的跨膜可以用于确保融合蛋白呈递于感染的癌细胞的表面上。
在一个实施例中，多种蛋白质在病毒中的相同位置处编码并且在感染的癌细胞的表面上一起以融合蛋白形式被表达。
如果病毒中的位置相同，则所述基因可以例如通过IRES序列或2A肽连接。
在一个实施例中，根据本发明的病毒包含“第二”转基因和任选存在的第三转基因(即，所述多种蛋白质中的一种或多种，例如编码选自包含以下的组的多肽：细胞因子、趋化因子、配体、拮抗性抗体分子和促效性抗体分子。
在一个实施例中，其它蛋白质独立地选自包含以下的组：呈适于在癌细胞表面上表达的形式的抗体、抗体片段或蛋白质配体，其结合CD3、CD28、CD80、CD86、4-1BB、GITR、OX40、CD27、CD40和组合。
在第一转基因对TCR的α和/或β链具有特异性的一个实施例中，其它蛋白质是抗CD3抗体或其结合片段，例如独立地选自莫罗单抗-CD3(也称为OKT3)、奥昔珠单抗(也称为TRX4)、替利珠单抗(也称为hOKT3γ1(Ala-Ala))或维西珠单抗。
在一个实施例中，抗TCR抗体呈抗体片段(例如抗CD3抗体或其结合片段)形式，例如scFv形式，其是具有另一种蛋白质的跨膜区域(例如来自PDGF受体或来自呈细胞表面形式的IgG的跨膜域)的融合蛋白的一部分。
在一个实施例中，抗体抑制剂(拮抗性抗体)独立地选自包含以下的组：血管生成因子抑制剂，例如抗VEGF抗体分子；和T细胞不活化因子抑制剂，例如抗CTLA-4、抗PD1或抗PDL1抗体分子。在一个实施例中，抗体分子是独立地选自包含CD40、GITR、OX40、CD27和4-1BB抗体的组的促效剂。
在一个实施例中，其它转基因编码细胞因子或其可溶性变异体，其选自包含以下的组：IL-2、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、IL-15、IL-12和fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3L)。有利地，病毒所表达的此组蛋白质中的一种或多种(具体地说，从癌细胞分泌的游离蛋白质)可以特别适合于在活体内刺激针对癌细胞的免疫响应。
在一个实施例中，其它转基因编码选自包含以下的组的趋化因子：MIP1-α、RANTES、IL-8、CCL5、CCL17、CCL20、CCL22、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL12、CCL2、CCL19和CCL21。有利地，此组蛋白质中的一种或多种是以可从癌细胞分泌的游离蛋白质形式被所述病毒表达，且可以特别适合于在活体内吸引免疫细胞且刺激针对癌细胞的免疫响应。
在一个实施例中，其它转基因编码对选自包含以下的组的趋化因子受体具有特异性的配体：CXCR2、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR3、CXCR4、CXCR5和CRTH2。
在一个实施例中，除在感染的癌细胞表面上至少表达抗TCR抗体或其结合片段(例如抗CD3抗体或其结合片段)之外，所述表面上还表达且/或分泌一种或多种分子。
因此，在一个实施例中，非腺病毒编码B7-1、B7-2或前述中的任一种的活性片段或其组合。
因此，在一个实施例中，非腺病毒编码用于在感染的癌细胞表面上表达的B7-1、B7-2或前述中的任一种的活性片段或其组合，和也在癌细胞表面上表达的抗TCR(促效剂，例如CD3促效剂)抗体或抗体片段(例如scFv)，具体地说，其中所述蛋白质以个别蛋白质形式在细胞表面上表达。
因此，在一个实施例中，非腺病毒编码用于在感染的癌细胞表面上表达的B7-1、B7-2或前述中的任一种的活性片段或其组合，和也在癌细胞表面上表达或由癌细胞释放(例如感染的癌细胞所分泌或裂解/死亡之后释放)的抗VEGF(拮抗剂)抗体。
因此，在一个实施例中，非腺病毒编码用于在感染的癌细胞表面上表达的B7-1、B7-2或前述中的任一种的活性片段或其组合，和也在癌细胞表面上表达或从癌细胞中释放(例如感染的癌细胞所分泌或在感染的癌细胞溶解/死亡之后释放)的结合CD3、CD28、CD80、CD86、4-1BB、GITR、OX40、CD27、CD40的抗体、抗体片段或蛋白质配体。
因此，在一个实施例中，非腺病毒编码用于在感染的癌细胞表面上表达的B7-1、B7-2或前述中的任一种的活性片段或其组合，和选自IL-2、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、IL-15、IL-12和FLT3L的细胞因子，所述细胞因子例如从癌细胞中释放，具体地说，由感染的癌细胞分泌或在感染的癌细胞发生细胞溶解/死亡之后释放。
因此，在一个实施例中，非腺病毒病毒编码用于在感染的癌细胞表面上表达的B7-1、B7-2或前述中的任一种的活性片段或其组合，和选自MIP1-α、RANTES、IL-8、CCL5、CCL17、CCL20、CCL22、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL12、CCL2、CCL19、CCL21的趋化因子，其例如从癌细胞中释放，具体地说，由感染的癌细胞分泌或在感染的癌细胞发生细胞溶解/死亡之后释放。
因此，在一个实施例中，非腺病毒编码用于在感染的癌细胞表面上表达的B7-1、B7-2或前述中的任一种的活性片段或其组合，和也在癌细胞表面上表达的抗TCR(促效剂，例如CD3促效剂)抗体或抗体片段(例如ScFv)(具体地说，其中蛋白质以个别蛋白质形式在细胞表面上表达)，并且进一步编码选自IL-2、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、IL-15、IL-12、FLT3L、MIP1-α、RANTES、IL-8、CCL5、CCL17、CCL20、CCL22、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL12、CCL2、CCL19、CCL21的细胞因子或趋化因子，其例如从癌细胞中释放，具体地说，感染的癌细胞所分泌或在感染的癌细胞发生细胞溶解/死亡之后所释放。
因此，在一个实施例中，非腺病毒编码用于在感染的癌细胞表面上表达的B7-1、B7-2或前述中的任一种的活性片段或其组合，和也在癌细胞表面上表达的抗TCR(促效剂)抗体或抗体片段(例如ScFv)(具体地说，其中蛋白质以个别蛋白质形式在细胞表面上表达)，并且进一步编码结合CD28、CD80、CD86、4-1BB、GITR、OX40、CD27、CD40的抗体、抗体片段或蛋白质配体，或抗VEGF(拮抗剂)抗体，其也在癌细胞表面上表达或从癌细胞中释放，例如感染的癌细胞所分泌或在感染的癌细胞溶解/死亡之后所释放。
因此，在一个实施例中，非腺病毒编码用于在感染的癌细胞表面上表达的B7-1、B7-2或前述中的任一种的活性片段或其组合，和两种不同的选自IL-2、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、IL-15和IL-12、FLT3L、MIP1-α、RANTES、IL-8、CCL5、CCL17、CCL20、CCL22、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL12、CCL2、CCL19、CCL21的细胞因子或趋化因子，其例如从癌细胞中释放，具体地说，感染的癌细胞所分泌或在感染的癌细胞发生细胞溶解/死亡之后所释放。
因此，在一个实施例中，非腺病毒编码用于在感染的癌细胞表面上表达的B7-1、B7-2或前述中的任一种的活性片段或其组合，和也在癌细胞表面上表达的抗TCR(促效剂，例如CD3促效剂)抗体或抗体片段(例如scFv)(具体地说，其中蛋白质以个别蛋白质形式在细胞表面上表达)，并且进一步编码选自IL-2、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、IL-15和IL-12的细胞因子和/或选自RANTES(CCL5)、MIP1α(LD78α(CCL3)或LD78β(CCL3L1)同功异型物)、MIP1β的趋化因子，其可以从癌细胞中释放，具体地说，感染的癌细胞所分泌或在感染的癌细胞发生细胞溶解/死亡之后所释放。
在尤其可与上述实施例中的任一个组合的一个实施例中，病毒进一步编码抗PD-1抗体(拮抗剂)。
在一个实施例中，在转基因盒中编码的用于细胞膜表达的蛋白质还可以包含介于跨膜域与细胞外配体结合域之间的肽连接子或间隔子。此类连接子或间隔子可以使细胞表面所表达的蛋白质增添柔性，从而增强蛋白质与其在邻近细胞上的靶分子的相互作用。此类连接子或间隔子还可以经设计或选择以促进细胞表面处的蛋白质通过二硫键形成或蛋白质-蛋白质相互作用而发生二聚合或三聚合。举例来说，免疫球蛋白分子或CD8的铰链区可以用于增强柔性和二聚合。
在一个实施例中，转基因盒中所编码的蛋白质还可以包含肽标签。肽标签可包括c-myc、聚组氨酸、V5或FLAG标签并且可以细胞内或细胞外方式定位于多肽的N端或C端上，或可以在蛋白质内编码，例如在细胞外环中或在跨膜域与胞外域之间编码。肽标签可以用作不同蛋白质结构域之间(例如跨膜域与胞外域之间)的间隔子或连接子，且用于检测或提纯蛋白质。
在一个实施例中，一种或多种其它转基因(除编码B7蛋白质或其片段的基因之外)处于外源或内源启动子(例如内源启动子)的控制下。在一个实施例中，E3区域中的转基因(B2)处于外源启动子的控制下。
在一个实施例中，一种或多种其它转基因位于腺病毒基因组中的E3区域与纤维L5之间，例如式(I)构建体中的位置BX，具体地说，处于外源启动子的控制下。在一个实施例中，BX中的转基因处于外源启动子的控制下。
在一个实施例中，一种或多种其它转基因基因处于E4区和腺病毒基因组中的纤维L5之间，例如处于式(I)或(Ia)构建体中的位置BY处，尤其处于内生性启动子，如主要晚期启动子的控制下。除此之外，编码抗TCR抗体或其结合片段(例如抗CD3抗体或其结合片段)的基因可以在区域BY中编码。
在一个实施例中，提供一种包含根据本发明的溶瘤病毒或病毒载体的组合物，例如医药组合物，具体地说，其包含医药学上可接受的赋形剂，例如稀释剂或载剂。
在一个实施例中，提供根据本发明的溶瘤病毒或病毒载体，或包含其的组合物，其用于治疗，具体地说，用于治疗癌症。
在一个实施例中，提供一种治疗有需要的患者的方法，所述方法包含投与治疗有效量的根据本发明的溶瘤病毒或包含其的组合物，例如医药组合物。
在一个实施例中，提供一种根据本发明的溶瘤腺病毒或病毒载体或包含其的组合物的用途，其用于制造供治疗癌症(具体地说，癌瘤，例如结肠直肠癌、肺癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、肝癌、头颈癌、乳癌或卵巢癌)的药剂。
在一个实施例中，提供一种多核苷酸，其包含根据本发明的病毒的至少50％(例如55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％)的基因组序列且包含编码抗TCR抗体或其结合片段(例如抗CD3抗体或其结合片段)的序列(例如本文所公开的序列)。在一个实施例中，多核苷酸序列呈质粒形式。
在一个实施例中，提供一种宿主细胞，例如哺乳动物细胞，如HEK293细胞或其衍生物，其包含根据本发明的溶瘤病毒或病毒载体或根据本发明的多核苷酸序列。
在一个实施例中，提供一种制备根据本发明的溶瘤病毒或病毒载体的方法，包含将编码抗TCR抗体或其结合片段(例如抗CD3抗体或其结合片段)的多核苷酸插入溶瘤病毒或病毒载体中的步骤。
在一个实施例中，提供一种复制病毒或根据本发明的病毒的方法，包含在病毒存在下在适于复制的条件下培养宿主细胞的步骤。一般来说，所述方法将包含收获病毒(例如从上清液中或在宿主细胞溶解之后)的另一步骤。
如本文所用的转基因是指一种已插入病毒或病毒载体的基因组序列中的基因，其中所述基因对于所述病毒(外源)来说是非天然的或通常不存在于所述病毒中的那个特定位置。转基因的实例在本文中给出。如本文所用的转基因还包括所述基因的功能片段，所述功能片段是所述基因的一部分，当插入时，其适合于发挥全长基因的功能或大部分功能，例如50％或更高的功能。
除非上下文另外指明，否则在插入病毒基因组中的情形下，转基因和编码序列在本文中可互换地使用。如本文所用的编码序列意指例如编码功能RNA、肽、多肽或蛋白质的DNA序列。典型地，编码序列是编码所关注的功能RNA、肽、多肽或蛋白质的转基因的cDNA。所关注的功能RNA、肽、多肽和蛋白质在下文中加以论述。
在一个实施例中，如本文所用的转基因是指含有基因或cDNA序列的DNA区段，所述基因或cDNA序列已从一种生物体中分离且引入不同生物体(即，本公开的病毒)中。在一个实施例中，DNA的这一非原生区段通常保持产生功能RNA、肽、多肽或蛋白质的能力。所用转基因可以例如编码嵌合蛋白或融合蛋白。
显然，病毒基因组含有DNA编码序列。在本说明书的上下文中，病毒基因组序列中的内源基因(天然存在的基因)不视为转基因，除非其然后通过重组技术被修饰，例如使其处于非天然位置或处于非天然环境中。
因此，在一个实施例中，所插入的转基因编码人类或人源化蛋白质、多肽或肽。
如本文所使用的融合蛋白是指至少两种蛋白质或片段，或至少一种蛋白质和至少一种片段的组合，其直接融合或通过例如连接子彼此附接。在一个实施例中，本公开的融合蛋白不包含B7蛋白质或其活性片段。包含B7片段或蛋白质和其它蛋白质的融合蛋白在本文中不会被称作嵌合蛋白。只有含有来自不同B7蛋白质的片段的蛋白质在本文中称为嵌合蛋白。
可以在相关试管内分析中，例如使用全长蛋白质作为比较物，分析所指定蛋白质片段的活性。
如本文所用的嵌合片段是指包含来自不同来源的两种或更多种蛋白质的序列的片段。
B7蛋白质包括B7-1(也称作CD80，uniprot编号P33681)、B7-2(也称作CD86，uniprot编号P42081)。这些蛋白质结合CD28和CTLA-4。
在一个实施例中，CD80具有以下序列：MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTKQEHFPDNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV。
其它B7蛋白质包括B7-DC(也称作PDCD1LG2和PD-L2，uniprot编号Q9BQ51)、B7-H1(也称作PD-L1和CD274：uniprot编号Q9NZQ7)。这两种蛋白质均结合PD-1。
程序性死亡配体1(PD-L1)是40kDa的1型跨膜蛋白，已推测其在抑制免疫系统方面起主要作用。显然，PD-L1的上调可使癌症避开宿主免疫系统。分析196个来自肾细胞癌患者的肿瘤试样发现，PD-L1的高肿瘤表达与增加的肿瘤侵袭性和增加4.5倍的死亡风险相关。相较于表达较低者，PD-L1表达较高的卵巢癌患者具有显著较差的预后。PD-L1表达与上皮内的CD8+T淋巴细胞计数成逆相关，表明肿瘤细胞上的PD-L1可抑制抗肿瘤CD8+T细胞。效果可能与肿瘤类型相关；对非小细胞肺癌患者的研究表明，较高的PD-L1蛋白质和mRNA表达与增加的局部淋巴细胞性浸润和较长存活期相关。多种抗PDL1抗体已表明正受到关注地在临床试验中用于治疗若干癌症。
在一个实施例中，至少B7-DC和/或B7-H1的细胞质(胞内域)为缺失的或非功能性的。尽管不希望受理论束缚，但有证据表明去除胞内域会降低癌细胞对溶解的抗性《血液(Blood)》2008年4月1日；111(7)3635-3643。
在一个实施例中，仅使用B7-DC和/或B7-H1的跨膜域片段。在一个实施例中，以下蛋白质不作为全长蛋白质B7-DC和B7-H1提供。
其它B7蛋白质包括结合ICOS的B7-H2(也称作ICOSLG、B7RP1、CD275：uniprot编号075144)、B7-H3(也称作CD276：uniprot编号Q5ZPR3)、B7-H4(也称作VTCN1：uniprot编号Q727D3)、B7-H5(也称作VISTA、血小板受体Gi24、S1SP1)、结合NKp30的B7-H6(也称作NCR3LG1、NR3L1)、结合CD28H的B7-H7(也称作HHLA2)。
在一个实施例中，片段仅包含B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6和B7-H7中的任一种的跨膜域。
个别蛋白质包括单一蛋白质，即并非融合蛋白(包括嵌合蛋白)的一部分的蛋白质或其活性片段，以及融合蛋白。在一个实施例中，个别蛋白质是单一蛋白质(包括其活性片段)。
如本文所用的GPI锚是指在翻译后修饰期间可附接到蛋白质的C端的糖脂。其由通过含碳水化合物的连接子(通过糖苷键结合到肌醇残留物的葡糖胺和甘露糖)和通过与成熟蛋白质的C端氨基酸桥接的乙醇胺磷酸酯(EtNP)连接的磷脂酰肌醇基团构成。疏水性磷脂酰肌醇基团中的两种脂肪酸将蛋白质锚定于细胞膜。
磷脂酰肌醇化(经GPI连接)蛋白质通常含有信号肽，由此将其引导到内质网(ER)中。C端由保持插入ER膜中的疏水性氨基酸构成。疏水端随后裂解并由GPI锚替代。随着蛋白质通过分泌路径行进，其通过囊泡被转移到高尔基体并且最终被转移到胞外空间，在所述胞外空间中，其仍附接到细胞膜的外小叶。由于磷脂酰肌醇化是将此类蛋白质附接到膜的唯一手段，因此磷脂酶所引起的基团裂解将引起蛋白质从膜中可控释放。后一机制在试管内使用；即，在酶分析中从膜中释放的膜蛋白是磷脂酰肌醇化蛋白质。
磷脂酶C(PLC)是一种已知使经GPI锚定的蛋白质中所发现的磷酸甘油键裂解的酶。PLC处理将引起经GPI连接的蛋白质从外细胞膜释放。已知T细胞标记物Thy-1和乙酰胆碱酯酶，以及肠和胎盘碱性磷酸酶为经GPI连接的并且通过PLC处理进行释放。经GPI连接的蛋白质被认为优先位于脂筏(lipid raft)处，表明质膜微域中的高组织水平。
可以在《糖生物学概要(Essentials of Glycobiology)》(第2版)第11章中获得Ferguson、Kinoshita和Hart编写的GPI锚综述。
如本文所用的病毒是指一种复制胜任型溶瘤病毒(或腺病毒)或复制缺乏型病毒载体(腺病毒载体)，除非上下文另有指示。
在一个实施例中，腺病毒是人类腺病毒。如本文所用的“腺病毒”、“血清型”或“腺病毒血清型”是指可以指定为当前已知的逾50种腺病毒血清型中的任一种的任何腺病毒，其分成子组A-F，并且进一步扩展到迄今未鉴别或未分类的任何腺病毒血清型。参见例如Strauss，“人类中的腺病毒感染(Adenovirus infections in humans)”，于《腺病毒(Adenoviruses)》中，Ginsberg,ea.，Plenum Press，纽约，NY，第451-596页(1984)和Shenk，“腺病毒科：病毒和其复制(Adenoviridae:The Viruses and Their Replication)”，《病毒学领域(Fields Virology)》，第2卷，第四版，Knipe，35ea.,Lippincott Williams&Wilkins，第2265-2267页(2001)，如所示：
子组 腺病毒血清型
A 12,18,31
B 3,7,11,14,16,21,34,35,51
C 1,2,5,6
D 8-10,13,15,17,19,20,22-30,32,33,36-39,42-49,50
E 4
F 40,41
在一个实施例中，腺病毒为子组B，例如独立地选自包含以下或由以下组成的组：Ad3、Ad7、Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34和Ad51，例如Ad11，尤其Ad11p(Slobitski病毒株)。在一个实施例中，本发明的腺病毒具有衣壳，例如子组B腺病毒(例如Ad11，尤其Ad11p)的六邻体和/或纤维。在一个实施例中，腺病毒为Ad11或具有Ad11(例如Ad11p)的纤维和/或六邻体和/或五邻体。
如本文所用的Ad11病毒衍生物是指至少具有Ad11衣壳的病毒。
在一个实施例中，其不是A组病毒。
艾纳德诺(EnAd)是嵌合溶瘤腺病毒，先前被称为EnAd(W02005/118825)，其具有来自Ad11p的纤维、五邻体和六邻体，因此其是子组B病毒。其具有嵌合E2B区，包含来自Ad11p和Ad3的DNA。EnAd中缺失几乎所有的E3区和E4区的一部分。因此，其在基因组中具有大量空间以容纳其它遗传物质、同时保持活性。此外，由于EnAd为子组B腺病毒，因此相较于例如Ad5，人类中预先存在的免疫性较不常见。具有Ad11纤维、五邻体和六邻体的嵌合溶瘤病毒的其它实例包括OvAd1和OvAd2(参见W02006/060314)。
EnAd似乎优先感染肿瘤细胞，在这些细胞中快速复制并引起细胞裂解。这又能产生炎性免疫响应，由此刺激身体也和癌症抗争。假设EnAd的一部分成功与活体内病毒的快速复制相关。
重要的是，临床上已证实EnAd可以全身性投与(例如通过静脉内或腹膜内注射或输注)，接着随后选择性地感染肿瘤细胞且表达肿瘤细胞内的蛋白质。EnAd的可以与Ad11p和其它B组腺病毒(具体地说，表达Ad11p的衣壳蛋白的那些腺病毒(例如本文所述的那些))共有的这一特性使得蛋白质可以在癌细胞的表面上表达而不必将转基因直接注入肿瘤中，将转基因注入肿瘤中对于多种癌症而言是不可行的。
如本文所用的Ad11病毒衍生物是指至少具有Ad11衣壳的病毒。
EnAd选择性地溶解肿瘤细胞的同时，可引入其它有益特性，例如通过向其提供转基因(例如编码细胞信号传导蛋白或抗体的转基因，或编码刺激细胞信号传导蛋白的实体的转基因)来增强病毒的治疗活性或减少病毒的副作用。
有利的是，向病毒提供编码能在癌细胞内部表达的某些蛋白质的DNA可以允许身体自身的防御系统更有效地用于抗击肿瘤细胞，例如通过使细胞更易被免疫系统看到或通过递送优先靶向肿瘤细胞的治疗基因/蛋白质。
在一个实施例中，本公开的一种或多种溶瘤病毒刺激患者的免疫系统对抗肿瘤，例如抗CD3抗体活体内刺激T细胞。
在一个实施例中，溶瘤病毒具有来自相同血清型(例如Ad11，尤其Ad11p)的纤维、六邻体和五邻体蛋白质，例如在后者基因组序列的位置30812-31789、18254-21100和13682-15367所发现的纤维、六邻体和五邻体蛋白质，其中核苷酸位置是以基因库ID217307399(寄存编号：GC689208)为准。
在一个实施例中，腺病毒是艾纳德诺(也称作EnAd，并且先前称作ColoAd1)。如本文所用的艾纳德诺是指SEQ ID NO:21的嵌合腺病毒。其为复制胜任型溶瘤嵌合腺病毒，其治疗特性相较于野生型腺病毒增强(参见W02005/118825)。EnAd具有嵌合E2B区域，其特征是DNA来自Ad11p和Ad3，且在E3/E4中具有缺失。艾纳德诺的结构变化使得基因组比Ad11p小约3.5kb，由此为转基因的插入提供额外的“空间”。
适用于本公开的融合蛋白的连接子包括：
●SEQ ID NO:22到30中所示的铰链连接序列(参见随附序列表)；
●柔性连接序列GS以及SEQ ID NO:31到70中所示的序列(参见随附序列表)；
●SEQ ID NO:73到86中所示的连接序列
刚性连接子的实例包括肽序列GAPAPAAPAPA(SEQ ID NO:71)、PPPP(SEQ ID NO:72)和PPP。
与式(I)和(Ia)相关的定义
键(bond)是指连接一个DNA序列与另一个DNA序列(例如连接病毒基因组的一段与另一段)的共价键。因此，当式(I)和(Ia)中的变量在本文中表示键时，由所述键表示的特征或元素不存在，即缺失。
由于腺病毒的结构一般相似，因此以下元件按照结构元件和技术人员已知的称呼其的常用术语论述。如果本文中提及一种元件，则我们是指编码所述元件的DNA序列或编码腺病毒中的所述元件的相同结构蛋白的DNA序列。由于DNA代码的重复性，因此后者为恰当的。根据优化结果，可能需要考虑病毒的密码子使用偏好。
本公开的病毒中所用的腺病毒的任何结构元件可包含天然序列或由天然序列组成或可在指定长度上具有至少95％，例如96％、97％、98％、99％或100％的相似度。原始序列可加以修饰而省略10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的遗传物质。技术人员意识到当作出改变时，不得中断病毒的阅读框以致结构性蛋白的表达被中断。
在一个实施例中，指定的元件是全长序列，即，全长基因。
在一个实施例中，指定的元件小于全长并且保留与全长序列相同或对应的功能。
在一个实施例中，对于本公开的构建体中任选存在的指定元件来说，DNA序列可小于全长并且不具有功能性，例如E3区可完全或部分缺失。
编码腺病毒的结构性或功能性蛋白质的结构性基因通常通过DNA的非编码区来连接。因此，在所关注的结构元件的基因组序列(具体地说，其非编码区)“切割”处的周围存在一些柔性，用于将转基因插入于本公开的病毒中的目的。因此，出于本说明书的目的，所述元件将被视为结构元件，提及其的程度是其适于目的且不编码外来材料。因此，适当时，基因将与适合的非编码区相关，例如如病毒的天然结构中所发现。
因此，在一个实施例中，将插入序列(例如编码限制位点和/或转基因的DNA)插入基因组病毒DNA的非编码区，例如内含子或基因间序列。腺病毒的已述这些非编码区可以具有例如选择性剪接、转录调节或翻译调节的功能，并且可能需要将这考虑在内。
本文中所鉴别的与L5区相关的位点适于容纳编码复杂实体(例如RNAi、细胞因子、单链或多聚体蛋白质，例如抗体)的多种DNA序列。
如本文所用的基因是指与其相关的编码序列和任何非编码序列，例如内含子和相关外显子。在一个实施例中，基因仅包含或仅由基本结构组分(例如编码区)组成。
下文为与腺病毒的特定结构元件有关的论述。
反向末端重复(ITR)序列是所有已知腺病毒共有的且由于其对称性而如此命名，并且是病毒染色体复制起点。这些序列的另一种特性是其能够形成发夹结构(hairpin)。
如本文所用的5'ITR是指来自腺病毒5'端的一部分或全部ITR，当并入腺病毒中的适宜位置时，其保留ITR的功能。在一个实施例中，5'ITR包含或由以下组成：SEQ ID NO:82的约1bp到138bp的序列或沿全长与其90、95、96、97、98或99％一致的序列，具体地说，由SEQID NO:21的约1bp到138bp组成的序列。
如本文所用的3'ITR是指来自腺病毒3'端的一部分或全部ITR，当并入腺病毒中的适宜位置时，其保留ITR的功能。在一个实施例中，3'ITR包含或由以下组成：SEQ ID NO:82的约32189bp到32326bp的序列或沿全长与其90、95、96、97、98或99％一致的序列，具体地说，由SEQ ID NO:21的约32189bp到32326bp组成的序列。
如本文所用的B1是指DNA序列，其编码：腺病毒的E1A的一部分或全部、腺病毒的E1B区的一部分或全部，和独立地，腺病毒的E1A和E1B区的一部分或全部。
如果B1是一键，则从病毒中省去E1A和E1B序列。在一个实施例中，B1是一键且因此，所述病毒是载体。
在一个实施例中，B1进一步包含转基因。所属领域中已知，E1区能够容纳可以中断方式插入E1区中(即，序列“中间”)的转基因，或可以缺失E1区的一部分或全部以提供容纳遗传物质的更多空间。
如本文所用的E1A是指编码腺病毒E1A区的一部分或全部的DNA序列。此处，后者是指多肽/蛋白质E1A。可以使其突变，以便由E1A基因编码的蛋白质发生保守性或非保守性氨基酸变化，使得其具有：与野生型(即，相应的未突变蛋白质)相同的功能；功能相较于野生型蛋白质增强；功能相较于野生型蛋白质减少，例如无功能；或相较于野生型蛋白质具有新功能，或前述者的组合(若适当)。
如本文所用的E1B是指编码腺病毒E1B区(即，多肽或蛋白质)的一部分或全部的DNA序列，可以使其突变以便由E1B基因/区域编码的蛋白质发生保守性或非保守性氨基酸变化，使得其具有：与野生型(即，相应的未突变蛋白质)相同的功能；功能相较于野生型蛋白质增强；功能相较于野生型蛋白质减少，例如无功能；或相较于野生型蛋白质具有新功能，或前述者的组合(若适当)。
因此，相对于野生型E1区，例如野生型E1A和/或E1B，B1可以被修饰或不被修饰。技术人员能够容易地鉴别E1A和/或E1B是否存在或发生(部分)缺失或突变。
如本文所用，野生型是指已知腺病毒。已知的腺病毒是已鉴别且命名的腺病毒，不论序列是否可获得。
在一个实施例中，B1具有SEQ ID NO:21的139bp到3932bp的序列。
如本文所用的BA是指编码E2B-L1-L2-L3-E2A-L4区的DNA序列，适当时包括任何非编码序列(具体地说，对应于来自腺病毒的天然序列)。通常，这一序列将不包含转基因。在一个实施例中，序列与来自已知腺病毒(例如表1中所示的血清型，具体地说，B组病毒，例如Ad3、Ad7、Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、Ad51或其组合，例如Ad3、Ad11或其组合)的邻接序列基本上相似或一致。在一个实施例中，E2B-L1-L2-L3-E2A-L4是指包含这些元件和与所述区域相关的其它结构元件，例如BA通常包括编码蛋白质IV2a的序列，例如如下：IV2AIV2a-E2B-L1-L2-L3-E2A-L4。
在一个实施例中，E2B区为嵌合的。即，包含来自两种或更多种不同腺病毒血清型(例如来自Ad3和Ad11，例如Ad11p)的DNA序列。在一个实施例中，E2B区具有SEQ ID NO:21的5068bp到10355bp的序列或在全长上与其95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。
在一个实施例中，组分BA中的E2B包含SEQ ID NO:87中所示的序列(其对应于W02005/118825中所公开的SEQ ID NO:3)。
在一个实施例中，BA具有SEQ ID NO:21的3933bp到27184bp的序列。
如本文所用的E3是指编码腺病毒E3区(即，蛋白质/多肽)的一部分或全部的DNA序列，可以使其突变，以便由E3基因编码的蛋白质发生保守性或非保守性氨基酸变化，使得其具有与野生型(相应的未突变蛋白质)相同的功能；功能相较于野生型蛋白质增强；功能相较于野生型蛋白质减少，例如无功能；或相较于野生型蛋白质具有新功能；或前述者的组合(适当时)。
在一个实施例中，E3区形成表1中指定的腺病毒血清型或其组合，具体地说，B组血清型，例如Ad3、Ad7、Ad11(具体地说，Ad11p)、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、Ad51或其组合，例如Ad3、Ad11(具体地说，Ad11p)或其组合。
在一个实施例中，E3区为部分缺失的，例如缺失95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％。
在一个实施例中，B2为一键，其中不存在编码E3区的DNA。
在一个实施例中，编码E3区的DNA可置换成或间杂有转基因。由如本文所用的转基因置换的如本文所用的“E3区包括E3区的一部分或全部被转基因置换。
在一个实施例中，B2区包含SEQ ID NO:21的27185bp到28165bp的序列。
在一个实施例中，B2由SEQ ID NO:21的27185bp到28165bp的序列组成。
如本文所用的BX是指BB中的L5基因的5'端附近的DNA序列。如本文所采的L5基因的5'端的附近或邻近是指：邻近(相邻)于L5基因的5'端或与其固有地结合的非编码区，即，邻接或相邻于L5基因的5'端或与其固有地结合的非编码区。或者，在附近或或邻近可指闭合L5基因，使得在BX区和L5基因的5'端之间不存在编码序列。
因此，在一个实施例中，BX直接连接到L5的代表例如L5基因的编码序列的起点的碱基。
因此，在一个实施例中，BX直接连接到L5的代表例如非编码序列起点的碱基，或直接连接到与L5天然结合的非编码区。如本文所用的与L5天然结合的非编码区是指非编码区的一部分或全部，其是L5基因的一部分或与其邻接，而非另一基因的一部分。
在一个实施例中，BX包含SEQ ID NO:88的序列。这一序列是人工非编码序列，其中例如包含转基因(或转基因盒)、限制位点或其组合的DNA序列可插入其中。这一序列有利的原因在于，其充当缓冲区，以允许其在转基因的确切位置上允许一些柔性，同时使对病毒稳定性和存活力的干扰效应降到最低。
插入可以发生于SEQ ID NO:82内的相对于5'端、3'端的任何位置或bp 1到201之间的任一点，例如碱基对1/2、2/3、3/4、4/5、5/6、6/7、7/8、8/9、9/10、10/11、11/12、12/13、13/14、14/15、15/16、16/17、17/18、18/19、19/20、20/21、21/22、22/23、23/24、24/25、25/26、26/27、27/28、28/29、29/30、30/31、31/32、32/33、33/34、34/35、35/36、36/37、37/38、38/39、39/40、40/41、41/42、42/43、43/44、44/45、45/46、46/47、47/48、48/49、49/50、50/51、51/52、52/53、53/54、54/55、55/56、56/57、57/58、58/59、59/60、60/61、61/62、62/63、63/64、64/65、65/66、66/67、67/68、68/69、69/70、70/71、71/72、72/73、73/74、74/75、75/76、76/77、77/78、78/79、79/80、80/81、81/82、82/83、83/84、84/85、85/86、86/87、87/88、88/89、89/90、90/91、91/92、92/93、93/94、94/95、95/96、96/97、97/98、98/99、99/100、100/101、101/102、102/103、103/104、104/105、105/106、106/107、107/108、108/109、109/110、110/111、111/112、112/113、113/114、114/115、115/116、116/117、117/118、118/119、119/120、120/121、121/122、122/123、123/124、124/125、125/126、126/127、127/128、128/129、129/130、130/131、131/132、132/133、133/134、134/135、135/136、136/137、137/138、138/139、139/140、140/141、141/142、142/143、143/144、144/145、145/146、146/147、147/148、148/149、150/151、151/152、152/153、153/154、154/155、155/156、156/157、157/158、158/159、159/160、160/161、161/162、162/163、163/164、164/165、165/166、166/167、167/168、168/169、169/170、170/171、171/172、172/173、173/174、174/175、175/176、176/177、177/178、178/179、179/180、180/181、181/182、182/183、183/184、184/185、185/186、186/187、187/188、188/189、189/190、190/191、191/192、192/193、193/194、194/195、195/196、196/197、197/198、198/199、199/200或200/201之间。
在一个实施例中，BX包含bp 27和bp 28之间或对应于SEQ ID NO:21的位置28192bp和28193bp之间的位置插有DNA序列的SEQ ID NO:21。
在一个实施例中，BX具有SEQ ID NO:21的28166bp到28366bp的序列。在一个实施例中，BX为一键。
如本文所用的BB是指编码L5区的DNA序列。如本文所用，L5区是指在所述背景下，适当时，含有编码纤维多肽/蛋白质的基因的DNA序列。纤维基因/区编码纤维蛋白质，其为腺病毒的主要衣壳组分。纤维在受体识别中发挥作用并促成腺病毒选择性地结合和感染细胞的能力。
在本公开的病毒中，纤维可以来自任何腺病毒血清型且作为改变不同血清型之一的纤维的结果而嵌合的腺病毒已为人所知。在一个实施例中，纤维来自B组病毒，具体地说，Ad11，例如Ad11p。
如本文所用的与BY有关的DNA序列是指在BB的L5基因的3'端附近的DNA序列。如本文所用的在L5基因的3'端附近或邻近是指：邻近(相邻)于L5基因的3'端或与其固有地结合的非编码区，即，邻接或相邻于L5基因的3'端或与其固有地结合的非编码区(即，L5内源性非编码序列的全部或一部分)。或者，附近或或邻近可以指闭合L5基因，使得BY区和L5基因的3'端之间不存在编码序列。
因此，在一个实施例中，BY直接连接到L5的代表编码序列的“末端”的碱基。
因此，在一个实施例中，BY直接连接到L5的代表例如非编码序列“末端”的碱基，或直接连接到与L5天然结合的非编码区。
固有地和天然地在本文中可互换地使用。在一个实施例中，BY包含SEQ ID NO:89的序列。这一序列是非编码序列，其中可以插入DNA序列，例如包含转基因(或转基因盒)、限制位点或其组合的DNA序列。这一序列有利的原因在于，其充当缓冲区，以允许其在转基因的确切位置上允许一些柔性，同时使对病毒稳定性和存活力的干扰效应降到最低。
插入可以发生于SEQ ID NO:88内的相对于5'端、3'端的任何位置或bp 1到35之间的任一点，例如碱基对1/2、2/3、3/4、4/5、5/6、6/7、7/8、8/9、9/10、10/11、11/12、12/13、13/14、14/15、15/16、16/17、17/18、18/19、19/20、20/21、21/22、22/23、23/24、24/25、25/26、26/27、27/28、28/29、29/30、30/31、31/32、32/33、33/34或34/35之间。
在一个实施例中，BY包含位置bp 12和13之间或对应于SEQ ID NO:21的29356bp和29357bp的位置插有DNA序列的SEQ ID NO:89。在一个实施例中，所述插入是限制位点插入。在一个实施例中，限制位点插入包含一个或两个限制位点。在一个实施例中，限制位点为包含2个限制位点的19bp限制位点插入。在一个实施例中，限制位点插入为包含1个限制位点的9bp限制位点插入。在一个实施例中，限制位点插入包含一个或两个限制位点和至少一种转基因，例如一种或两种或三种转基因，例如一种或两种转基因。在一个实施例中，限制位点为包含2个限制位点和至少一种转基因(例如一种或两种转基因)的19bp限制位点插入。在一个实施例中，限制位点插入是包含1个限制位点和至少一种转基因(例如一种或两种转基因)的9bp限制位点插入。在一个实施例中，两个限制位点夹着一种或多种(例如两种)转基因(例如转基因盒中)。在一个实施例中，当BY包含两个限制位点时，所述限制位点彼此不同。在一个实施例中，BY中的所述一个或多个限制位点在其已插入的特定腺病毒基因组中是非天然存在的(例如独特的)。在一个实施例中，BY中的所述一个或多个限制位点与位于腺病毒基因组中的其他处的其它限制位点不同，例如与天然存在的限制位点或引入基因组的其它部分(例如BX)中的限制位点不同。因此，在一个实施例中，限制位点允许区段中的DNA以特定方式被切割。
在一个实施例中，BY具有SEQ ID NO:21的29345bp到29379bp的序列。在一个实施例中，BY为一键。
在一个实施例中，插入位于SEQ ID NO:89中的bp 12之后。
在一个实施例中，插入位于SEQ ID NO:21的大致位置29356bp。
在一个实施例中，插入是包含一种或多种(例如1、2或3种，例如1或2种)转基因的转基因盒。
如本文所用的E4是指编码腺病毒E4区域(即，多肽/蛋白质区域)的一部分或全部的DNA序列，其可以突变，以便由E4基因编码的蛋白质发生保守性或非保守性氨基酸变化，且具有与野生型(相应的未突变蛋白质)相同的功能；功能相较于野生型蛋白质增强；功能相较于野生型蛋白质减少(例如无功能)；或相较于野生型蛋白质具有新功能；或前述者的组合(适当时)。
在一个实施例中，E4区为部分缺失的，例如缺失95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。在一个实施例中，E4区域具有SEQ ID NO:21的32188bp到29380bp的序列。
在一个实施例中，除了缺失E4orf4区外，存在E4。
在一个实施例中，B3为一键，即其中E4不存在。
在一个实施例中，B3具有由SEQ ID NO:21的32188bp到29380bp组成的序列。
如本文所用的数值范围包括端点。
技术人员将了解，本文的式(例如式(I)、(Ia)中的元件为相邻的并且可以体现本文中提到的非编码DNA序列以及基因和编码DNA序列(结构特征)。在一个或多个实施例中，本公开的式试图描述腺病毒基因组中天然存在的序列。在此情形下，对于技术人员显而易见的是，所述式是指表征基因组的相关区段的主要元件并且并非旨在详尽描述DNA的基因组片段。
如本文所用的E1A、E1B、E3和E4各自独立地指来自已知腺病毒的野生型和其等效物、如本文所述的每个区域的突变或部分缺失形式，尤其野生型序列。
“如本文所用的“插入”是指并入5'端、3'端或指定的DNA序列参照区段中以使得其中断参考序列的DNA序列。后者是参考序列，其用作参考点，插入序列相对于参考点定位。在本公开的上下文中，插入通常发生于SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:89内。插入可以是限制位点插入、转基因盒或这两者。当序列被中断时，病毒仍将包含原始序列，但通常其将呈包夹插入序列的两个片段形式。
在一个实施例中，转基因或转基因盒不包含无偏移插入的转座子，例如TN7转座子或其一部分。如本文所用的Tn7转座子是指如W02008/080003中所述的无偏移插入转座子。
在一个实施例中，转基因或转基因盒进一步包含调控元件或序列。
其它调控序列
如本文所用的“基因表达的调控因子”(或调控因子/调控元件)是指在基因表达中起作用(典型地通过诱导或增强转录或翻译而起作用)的基因特征，例如启动子、增强子或剪接受体序列。
如本文所用的“剪接受体序列”、“剪接受体”或“剪接位点”是指当mRNA分子被剪接体复合体的小核核糖核蛋白识别时确定的调控序列。组装后，剪接体催化mRNA分子的剪接受体位点剪接到上游剪接供体位点，从而产生成熟mRNA分子，所述mRNA分子能被翻译而产生单一多肽或蛋白质。
本发明中可以采用不同尺寸的剪接受体序列并且这些序列可被描述为短剪接受体(小)、剪接受体(中)和分支剪接受体(大)。
如本文所用的SSA意指短剪接受体，典型地仅包含剪接位点，例如4bp。如本文所用的SA意指剪接受体，典型地包含短剪接受体和多嘧啶段，例如16bp。如本文所用的bSA意指分支剪接受体，典型地包含短剪接受体、多嘧啶段和分支点，例如26bp。
在一个实施例中，本公开的构建体中所用的剪接受体是CAGG或SEQ ID NO:90或91。在一个实施例中，SSA具有核苷酸序列CAGG。在一个实施例中，SA具有SEQ ID NO:90的核苷酸序列。在一个实施例中，SA具有SEQ ID NO:91的核苷酸序列。
在一个实施例中，剪接位点紧挨在包含CCACC的Kozak共同序列后(即，沿着5'到3'方向)。在一个实施例中，剪接位点和Kozak序列按照高达100bp或更小的bp散置。在一个实施例中，Kozak序列具有CCACC的核苷酸序列。
典型地，当处于内源或外源启动子(例如内源启动子)的控制下时，编码序列将紧挨在Kozak序列后。编码区的起点由起始密码子(AUG)指示，例如在序列(gcc)gccRccAUGg[SEQ ID NO:92]的背景下，编码序列的起始起点用呈粗体的碱基指示。小写字母表示这一位置处的共同碱基(然而可以改变)并且大写字母指示高度保守碱基，即‘AUGG’序列不变或即使有变化也很少；‘R’指示在这一位置处通常会观察到嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)并且括号中的序列(gcc)的意义不确定。因此，在一个实施例中，起始密码子AUG并入Kozak序列中。
如本文所用的内部核糖体进入DNA序列是指编码内部核糖体进入序列(IRES)的DNA序列。如本文所用的IRES意指允许信使RNA(mRNA)序列开始翻译的核苷酸序列，包括在mRNA序列内起始。当盒编码多顺反子mRNA时，这尤其有用。使用IRES引起多顺反子mRNA翻译成多种个别蛋白质或肽。在一个实施例中，内部核糖体进入DNA序列具有SEQ ID NO:93的核苷酸序列。在一个实施例中，特定IRES只能在基因组中使用一次。就基因组的稳定性来说，这样可以有益处。
如本文所用的“高效率自我裂解型2A肽”或“2A肽”是指在翻译之后高效裂解的肽。适合的2A肽包括P2A、F2A、E2A和T2A。本发明人已提到编码指定2A肽的特异性DNA序列被使用一次后，同一特异性DNA序列可能不会被再次使用。然而，可以利用DNA代码的冗余来产生DNA序列，所述DNA序列翻译成相同2A肽。当盒编码多顺反子mRNA时，使用2A肽尤其有用。使用2A肽产生所翻译的单一多肽链，其在翻译后被修饰而产生多种个别蛋白质或肽。
在一个实施例中，所用经编码的P2A肽具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列。在一个实施例中，所用经编码的F2A肽具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列。在一个实施例中，所用经编码的E2A肽具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列。在一个实施例中，所用经编码的T2A肽具有SEQID NO:97的氨基酸序列。
在一个实施例中，mRNA或由转基因编码的每种mRNA包含多聚腺苷酸化信号序列，例如典型地位于mRNA序列末端的多聚腺苷酸化信号序列。因此，在一个实施例中，转基因或转基因盒包含编码多聚腺苷酸化信号序列的至少一个序列。
如本文所用的“多腺苷酸”、“多聚腺苷酸化信号”或“多聚腺苷酸化序列”意指通常含有AATAAA位点的DNA序列，其在转录后能被多蛋白复合体识别，从而使新生mRNA分子裂解且发生多聚腺苷酸化。
在一个实施例中，构建体不包括多聚腺苷酸化序列。在一个实施例中，基因表达的调控因子是剪接受体序列。
在一个实施例中，编码蛋白质/多肽/肽(例如抗体或抗体片段)的序列进一步包含多聚腺苷酸化信号。
在一个实施例中，提供具有本文所公开的序列的病毒或构建。
抗体
如本文所用的抗体分子包括包含全长抗体或其结合片段、多特异性抗体形式的任何构建体。因此，本发明的抗体分子包括具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段且可以是但不限于Fab、经修饰的Fab、Fab'、经修饰的Fab'、F(ab')2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、单域抗体(例如VH或VL或VHH)、scFv、二价、三价或四价抗体、双scFv、双链抗体、三链抗体、四链抗体，和上述任一者的抗原决定基结合片段(参见例如Holliger和Hudson，2005，《自然生物技术(Nature Biotech)》23(9):1126-1136；Adair和Lawson，2005，《线上药物设计评论(Drug Design Reviews-Online)》2(3)，209-217)。用于产生和制造这些抗体片段的方法在所属领域中是众所周知的(参见例如Verma等人，1998，《免疫学方法杂志(Journal ofImmunological Methods)》216，165-181)。用于本发明中的其它抗体片段包括国际专利申请W02005/003169、W02005/003170和W02005/003171中所述的Fab和Fab'片段。多价抗体可以包含多特异性，例如双特异性，或可以具有单特异性(参见例如WO 92/22853和WO05/113605)。由于目的是中和两种独立的靶蛋白，因此在此实例中特别考虑双特异性和多特异性抗体变异体：
除非上下文另有指示，否则抗体通常是指全长抗体。
如本文所用的抗体结合片段是指小于全长抗体，其保持针对靶抗原的特异性。抗体结合片段可以包括Fab、Fab'、经修饰的Fab'、F(ab')2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、单域抗体(例如VH或VL或VHH)、scFv、ds-scFv。
在一个实施例中，本公开的技术中所用的抗体或其结合片段是单克隆的。
本公开中使用的单克隆抗体可以利用所属领域中已知的任何方法制备，例如融合瘤技术(Kohler和Milstein，1975，《自然》，256:495-497)、三源融合瘤技术，人类B细胞融合瘤技术(Kozbor等人，1983，《今日免疫学(Immunology Today)》，4:72)，和EBV-融合瘤技术(Cole等人，《单克隆抗体和癌症疗法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)》，第77-96页，Alan R Liss,Inc.，1985)。
用于本发明中的抗体还可以使用单一淋巴细胞抗体方法、通过克隆和表达免疫球蛋白可变区cDNA来产生，所述免疫球蛋白可变区cDNA由针对产生特异性抗体所选的单一淋巴细胞产生，例如Babcook,J.等人所述的方法，1996，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》93(15):7843-7848l；WO92/02551；WO2004/051268和国际专利申请第WO2004/106377号。
本公开的抗体分子中所用的结合域可以进行人源化。
人源化抗体(包括CDR移植的抗体)是具有一个或多个来自非人类物种的互补决定区(CDRs)和来自人类免疫球蛋白分子的构架区的抗体分子(参见例如US 5,585,089；WO91/09967)。应了解，可能只需要转移CDR的特异性决定残基，而非完整CDR(参见例如Kashmiri等人，2005，《方法(Methods)》36，25-34)。人源化抗体可以任选地进一步包含一个或多个来源于产生CDR的非人类物种的构架残基。
当CDR或特异性决定残基被移植时，可以结合产生CDR的供体抗体的类别/类型来使用任何适当的受体可变区构架序列，包括小鼠、灵长类动物和人类构架区。根据本发明的人源化抗体宜具有包含人类受体构架区以及本文所提供的一个或多个CDR的可变域。
可以用于本发明的人类构架的实例是KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等人，同上)。举例来说，KOL和NEWM可用于重链，REI可用于轻链，且EU、LAY和POM可用于重链和轻链。或者，可以使用人类胚系序列，这些可在http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/获得。
在本发明的人源化抗体中，受体重链和轻链不一定需要来源于相同抗体且必要时，可以包含具有来源于不同链的构架区的复合链。
另外，在本发明的人源化抗体中，构架区不必具有与受体抗体的序列完全相同的序列。举例来说，异常残基可以变为对于那种受体链类别或类型来说较频繁存在的残基。或者，可以改变受体构架区域中的所选残基，以便其对应于在与供体抗体相同的位置所发现的残基(参见Reichmann等人，1998，《自然》，332，323-324)。应该保持为了恢复供体抗体的亲和力所必需的最小程度的此类变化。选择可能需要变化的受体构架区域中的残基的方案阐述于WO 91/09967中。
本发明的抗体分子的恒定区结构域(若存在)可以结合所提出的抗体分子功能(具体地说，可能必需的效应功能)来选择。举例来说，恒定区结构域可以是人类IgA、IgD、IgE、IgG或IgM域。具体地说，当抗体分子旨在用于治疗用途且需要抗体效应功能时，可以使用人类IgG恒定区结构域，尤其是IgG1和IgG3同型。或者，当抗体分子旨在用于治疗目的且不需要抗体效应功能(例如简单地对抗原进行中和或促效)时，可以使用IgG2和IgG4同型。应了解，还可使用这些恒定区结构域的序列变异体。举例来说，可以使用其中位置241处的丝氨酸已变为脯氨酸的IgG4分子，如Angal等人，《分子免疫学(Molecular Immunology)》，1993，30(1)，105-108中所述。所属领域的技术人员还将了解，抗体可以经历多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可以包括以下的变化：糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺去酰胺化。频繁的修饰是羧基端碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸)由于羧基肽酶作用而引起的损失(如Harris,RJ.《色谱杂志(Journal of Chromatography)》705:129-134，1995中所述)。
配制物
本发明还涉及扩展到如本文所述的病毒的医药配制物。
在一个实施例中，提供根据本发明的能复制型溶瘤病毒或复制缺乏型病毒载体的肠胃外液体配制物，例如输注或注射用的肠胃外液体配制物，其中所述配制物提供单位体积剂量1x1010到1x1014个病毒颗粒范围内的剂量。
肠胃外配制物意指被设计成不通过胃肠道递送的配制物。典型的肠胃外递送途径包括注射、植入或输注。在一个实施例中，配制物以大丸剂递送(bolus delivery)形式提供。
在一个实施例中，肠胃外配制物呈注射形式。注射包括静脉内、皮下、肿瘤内或肌肉内注射。如本文所用的注射意指通过注射器将液体插入体内。在一个实施例中，本公开方法不涉及肿瘤内注射。
在一个实施例中，肠胃外配制物呈输注形式。
如本文所用的输注意指通过滴液、输注泵、注射驱动器或等效装置以较慢速率投与流体。在一个实施例中，输注投与的时间段在1.5分钟到120分钟范围内，例如约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110或115分钟。
在一个实施例中，如通过注射驱动器投与的配制物的一次剂量小于100ml，例如30ml。
在一个实施例中，注射是以缓慢注射形式投与，例如历时1.5到30分钟。
在一个实施例中，配制物是静脉内(i.v.)投与。这一途径对于递送溶瘤病毒尤其有效，因为其使得可快速进入大多数器官和组织并且尤其适用于治疗转移瘤，例如已获确认的转移瘤，尤其位于高度血管化区域，例如肝和肺的转移瘤。
治疗配制物在制造和储存条件下通常是无菌和稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质粒或适于投与人类的其它肠胃外配制物并且可以在预填充装置中配制，如注射器或小瓶，尤其单次剂量。
配制物通常包含与病毒相容的医药学上可接受的稀释剂或载剂，例如无毒等张载剂，并且其中病毒在必要的时间段期间是稳定的。
载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及其适合混合物的溶剂或分散介质。适当的流动性可以例如通过使用分散剂或表面活性剂(例如卵磷脂或非离子型表面活性剂，例如聚山梨醇酯80或40)来维持。在分散液中，表面活性剂的存在可以有助于维持所需粒径。组合物中的等张剂的实例包括糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。
在一个实施例中，所用肠胃外配制物可包含以下中的一种或多种：缓冲液，例如4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、磷酸盐缓冲液和/或Tris缓冲液；糖，例如右旋糖、甘露糖、蔗糖或类似物；盐，例如氯化钠、氯化镁或氯化钾；洗涤剂，例如非离子型表面活性剂，如brij、PS-80、PS-40或类似物。配制物还可以包含防腐剂，例如EDTA或乙醇或EDTA与乙醇的组合，其被认为会阻止一种或多种可能降解的路径。
在一个实施例中，配制物将包含根据本发明的提纯的溶瘤病毒，例如每剂量1×1010到1×1014个病毒颗粒，例如每剂量1×1010到1×1012个病毒颗粒。在一个实施例中，病毒在配制物中的浓度是在2×l08到2×l014vp/ml范围内，例如2×1012vp/ml。
在一个实施例中，肠胃外配制物包含甘油。
在一个实施例中，配制物包含如本文所述的溶瘤腺病毒、HEPES(N-2-羟基乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸)、丙三醇和缓冲液。
在一个实施例中，肠胃外配制物由本发明病毒、HEPES(例如5mM)、甘油(5-20％(v/v))、盐酸(例如以将pH调节到7-8范围内)和注射用水组成。
在一个实施例中，在5mM HEPES、20％丙三醇中配制浓度为2×1012vp/mL的0.7mL本公开病毒，最终pH为7.8。
医药学上可接受的载剂的充分论述可获得于《雷明顿氏医药科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》(Mack Publishing Company,N.J.1991)。
在一个实施例中，配制物是以用于体表投药(包括吸入)的配制物形式提供。
适合的可吸入制剂包括可吸入粉末、含有推进剂气体的定量气溶胶或不含推进剂气体的可吸入溶液。根据本发明的可吸入粉末通常含有如本文所述的病毒和生理学上可接受的赋形剂。
这些可吸入粉末可以包括单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二糖(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖)、寡糖和多糖(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇)、盐(例如氯化钠、碳酸钙)或这些物质彼此的混合物。宜使用单糖或二糖，使用乳糖或葡萄糖，尤其但非排他地呈其水合物形式。
沉积在肺中的颗粒需要小于10微米，例如1-9微米，例如0.1到5μm，尤其1到5μm。携带病毒的粒径至关重要且因此在一个实施例中，根据本发明的病毒可以吸附或吸收到颗粒上，例如指定尺寸的乳糖颗粒。
可用于制备可吸入气溶胶的推进剂气体为所属领域中已知的。适合的推进剂气体选自烃类，例如正丙烷、正丁烷或异丁烷；和卤代烃类，例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化衍生物。上述推进剂气体可单独或以其混合物形式使用。
尤其适合的推进剂气体为选自TG11、TG12、TG134a和TG227的卤化烷烃衍生物。在上述卤化烃中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)和其混合物尤其适合。
含推进剂气体的可吸入气溶胶还可含有其它成分，例如共溶剂、稳定剂、表面活性剂(surface-active agent/surfactant)、抗氧化剂、润滑剂和用于调节pH的方式。所有这些成分为所属领域中已知的。
根据本发明的含推进剂气体的可吸入气溶胶可含有高达5重量％的活性物质。根据本发明的气溶胶含有例如0.002到5重量％、0.01到3重量％、0.015到2重量％、0.1到2重量％、0.5到2重量％或0.5到1重量％的活性成分。
或者，体表投与肺还可以是投与液体溶液或悬浮液配制物，例如使用例如雾化器等装置，例如连接到压缩机的雾化器(例如连接到Pari Respiratory Equipment,Inc.,Richmond,Va.所制造的Pari Master(R)压缩机的Pari LC-Jet Plus(R)雾化器)。
本发明的病毒可以分散于溶剂中递送，例如以溶液或悬浮液形式，例如上文已针对肠胃外配制物所述。其可悬浮于适当的生理学溶液中，例如生理盐水或药理学可接受的其它溶剂或缓冲溶液。所属领域中已知的缓冲溶液每1ml水可以含有0.05mg到0.15mg乙二胺四乙酸二钠、8.0mg到9.0mg NaCl、0.15mg到0.25mg聚山梨醇酯、0.25mg到0.30mg无水柠檬酸和0.45mg到0.55mg柠檬酸钠以便实现约4.0到5.0的pH。
治疗性悬浮液或溶液配制物还可含有一种或多种赋形剂。赋形剂在所属领域中是众所周知的并且包括缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和碳酸氢盐缓冲液)、氨基酸、尿素、乙醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质粒、甘露糖醇、山梨糖醇和甘油。溶液或悬浮液可包封于脂质粒或可生物降解微球体中。所述配制物通常采用无菌制造工艺以基本上无菌形式提供。
这可以包括利用所属领域的一般技术人员熟悉的方法通过过滤用于配制物的缓冲溶剂/溶液、抗体在无菌缓冲溶剂溶液中的无菌悬浮液并且将配制物分配于无菌容器中来制造和灭菌。
根据本发明的可雾化配制物可以例如填充在箔包膜中的单次剂量单元(例如密封的塑料容器或小瓶)形式提供。每个小瓶含有一定体积(例如2mL)溶剂/溶液缓冲液的单位剂量。
疗法
在另一个方面中，本公开扩展到如本文所述的用于治疗(具体地说，治疗癌症)的病毒或病毒载体或其配制物。
在一个实施例中，治疗方法用于治疗肿瘤。
如本文所用的肿瘤意指由不可控和进行性的过度细胞分裂造成的异常组织块，也被称为赘瘤。肿瘤可为良性(未癌变)或恶性的。肿瘤涵盖癌症和转移的全部形式。
在一个实施例中，肿瘤是实体肿瘤。实体肿瘤可以是局部或转移的。
在一个实施例中，肿瘤具有上皮来源。
在一个实施例中，肿瘤为恶性肿瘤，例如结肠直肠癌、肝细胞瘤、前列腺癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、甲状腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌或肺癌。
在一个实施例中，肿瘤是结肠直肠恶性疾病。
如本文所用的恶性疾病意指癌细胞。
在一个实施例中，使用溶瘤病毒或病毒载体治疗或预防转移。
在一个实施例中，使用本文中的方法或配制物治疗耐药性癌症。
在一个实施例中，病毒或病毒载体是与其它癌症治疗或疗法组合投与。
在一个实施例中，提供根据本发明的病毒、病毒载体或配制物，其用于制造供治疗癌症(例如上述癌症)的药剂。
在另一方面中，提供一种治疗癌症的方法，所述方法包含向有需要的患者(例如人类患者)投与治疗有效量的根据本发明的病毒或配制物。
在一个实施例中，本文中的溶瘤病毒或配制物与另一种疗法组合投与。
如本文所用的“组合”旨在涵盖其中溶瘤病毒或病毒载体在癌症治疗或疗法之前、同时和/或之后投与的情况。
癌症疗法包括手术、放射疗法、靶向疗法和/或化学疗法。
如本文所用的癌症治疗是指用治疗化合物或生物学药剂治疗，例如旨在治疗癌症的抗体和/或其维持疗法。
在一个实施例中，癌症治疗是选自任何其它抗癌疗法，包括化疗剂、靶向抗癌剂、放射疗法、放射性同位素疗法或其任何组合。
在一个实施例中，本公开的病毒或病毒载体可以用作疗法(例如手术)的预治疗(新辅助疗法)，以缩小肿瘤、治疗转移和/或防止转移或进一步转移。可在疗法(例如手术)之后使用溶瘤病毒或病毒载体(辅助疗法)以治疗转移和/或防止转移或进一步转移。
如本文所用的同时是另一种癌症疗法与溶瘤病毒或病毒载体配制物同时或大致同时投与。治疗可含于相同配制物中或以单独配制物形式投与。
在一个实施例中，病毒或病毒载体是与化疗剂的投与组合投与。
如本文所用的化疗剂意指选择性地破坏恶性细胞和组织的特异性抗赘瘤化学药剂或药物。例如，烷基化剂、抗代谢物、蒽环霉素(anthracyclines)、植物碱、拓扑异构酶抑制剂和其它抗肿瘤药剂。化学疗法的其它实例包括小红莓、5-氟尿嘧啶(5-FU)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、卡培他滨(capecitabine)、伊立替康(irinotecan)和铂，例如顺铂(cisplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)。从业者可以基于所治疗的癌症的性质来选择优选剂量。
在一个实施例中，治疗剂为更昔洛韦(ganciclovir)，其可有助于控制免疫响应和/或肿瘤血管形成。
在一个实施例中，治疗剂是检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂，具体地说，其中抑制剂是单克隆抗体或抗体片段。
在一个实施例中，本文的方法中采用的一种或多种疗法是有节奏的，即用低剂量的抗癌药物连续或频繁治疗，通常伴随其它治疗方法给予。
子组B溶瘤腺病毒，具体地说，Ad11和其衍生的那些腺病毒(例如EnAd)尤其可以与化学治疗剂协同作用，原因是其作用机制似乎在于很大程度上不依赖于细胞凋亡，其通过主要的坏死机制杀死癌细胞。此外，在化学疗法期间发生的免疫抑制可使溶瘤病毒以较高效率发挥功能。
如本文所使用的治疗剂量是指当在适合的治疗方案中使用时适于实现预期治疗效果(例如改善疾病的症状或病状)的病毒或病毒载体的量。当病毒颗粒数量可足以引起以下时，剂量可被视为癌症或转移治疗中的治疗剂量：肿瘤或转移性生长减缓或停止，或发现肿瘤或转移尺寸缩小，和/或患者生命期延长。适合的治疗剂量通常在治疗效果与可耐受毒性之间实现平衡，例如在副作用和毒性可耐受(假定治疗达成益处)的情况下。
在一个实施例中，提供以单次治疗循环中全身性地投与根据本发明的溶瘤腺病毒的肠胃外调配物的多次剂量，例如其中每次投药给予的总剂量在每剂量1×1010到1×1014个病毒颗粒的范围内。
在一个实施例中，投与一次或多次剂量(例如每次给药)的病毒或病毒载体，使得病毒颗粒递送速率在2×1010个颗粒/分钟到2×1012个颗粒/分钟范围内。
在一个实施例中，每周投与根据本发明的病毒或治疗构建体(包括包含所述病毒或治疗构建体的配制物)，例如在第1周的第1天、第3天、第5天投与一次剂量，随后在后续每周投与一次剂量。
在一个实施例中，每两周或每三周投与根据本发明的病毒或治疗构建体(包括包含所述病毒或治疗构建体的配制物)，例如在第1周的第1天、第3天、第5天投与一次，并且在第2周或第3周的第1天、第3天、第5天还投与。这一给药方案适当时可以重复多次。
在一个实施例中，根据本发明的病毒或治疗构建体(包括包含所述病毒或治疗构建体的配制物)每月投与。
在一个实施例中，本公开的病毒、病毒载体和构建体是通过重组技术制备。技术人员应了解，所提供的病毒或病毒载体基因组可以通过其它技术手段来制造，包括完全合成基因组或包含基因组一部分或全部的质粒。技术人员将了解，在合成基因组的情况下，插入的区域可不包含限制位点核苷酸，因为后者是使用克隆方法插入基因之后的假象。
在一个实施例中，所提供的病毒或病毒载体基因组完全以合成方式制造。
在本文中，本公开进一步扩展到式(I)或其子式的病毒，其通过或可通过插入转基因或转基因盒而获得。
如本文所用的“是(Is)”意指包含。
在本说明书的上下文中，“包含”可以理解为“包括”。
包含某些特征/元件的本发明实施例还打算延伸到替代实施例“由相关元件/特征组成”或“基本上由相关元件/特征组成”。
在技术上适当的情况下，本发明的实施例可以组合。技术参考文献(例如专利和申请)是以引入的方式并入本文中。
本文中特定且明确叙述的任何实施例可以单独地或与一个或多个其它实施例组合形成免责声明的基础。
本发明在以下实例中仅借助于说明来进一步描述。
实例
实例1：表达T细胞活化抗原CD80的EnAd病毒和针对人类CD3复合体ε链(CD3ε)的膜锚定单链Fv片段抗体的产生
使用质粒pEnAd2.4，通过直接插入盒子来产生质粒pNG-348，所述盒子编码人类T细胞活化抗原CD80(SEQ ID NO 98)和膜锚定的单链Fv抗人类CD3e嵌合形式(SEQ ID NO4)。pNG-348盒含有：5'短剪接受体序列(CAGG)；膜锚定的抗人类CD3e ScFv cDNA；高效率自我裂解型P2A肽序列(SEQ ID NO.94)；人类CD80cDNA序列和3'多聚腺苷酸化序列(SEQ IDNO.99)。所插入的转基因盒示意图展示于图2C中。通过DNA测序来确认质粒的构建。
病毒产生和表征
通过酶AscI的限制消化来使质粒pNG-348线性化以产生病毒基因组NG-348(SEQID NO:100)。根据下文指定的方法扩增和提纯病毒NG-348。
消化过的DNA通过苯酚/氯仿萃取而提纯且在300μl>95％分子生物学级乙醇和10μl 3M乙酸钠中、在-20℃沉淀16小时。沉淀的DNA通过以14000rpm离心5分钟而集结，并且在500μl 70％乙醇中洗涤，之后以14000rpm再次离心5分钟。将干净的DNA集结粒风干，再悬浮于含有15μl脂染胺转染试剂的500μl OptiMEM中且在室温下培育30分钟。然后将转染混合物逐滴添加到含有生长到70％汇合度的293细胞的T-25烧瓶中。细胞在37℃、5％CO2下用转染混合物培育2小时之后，将4ml细胞培养基(补充有2％FBS的含有谷氨酸盐的高葡萄糖DMEM)添加到细胞中且在37℃、5％CO2下培育烧瓶。
每24小时监测所转染的293细胞且每48-72小时用额外培养基补充。通过观察细胞单层中的显著细胞病变效应(CPE)来监测病毒的产生。观察到广泛的CPE后，通过三次冷冻-解冻循环从293细胞中收集病毒。所收集的病毒用于再感染293细胞以便扩增病毒原液。通过观察细胞单层中的显著CPE来确认扩增期间的活病毒产生。观察到CPE后，通过三次冷冻-解冻循环从293细胞中收集病毒。扩增的原液用于进一步扩增，之后通过双重氯化铯色带来提纯病毒以产生NG-330病毒原液。
实例2：表达T细胞活化抗原CD80的EnAd病毒和针对人类CD3复合体ε链(CD3ε)的膜锚定单链Fv片段抗体的产生
使用质粒pEnAd2.4，通过直接插入盒子来产生质粒pNG-348A，所述盒子编码人类T细胞活化抗原CD80(SEQ ID NO 98)和膜锚定的具有C端V5标签的单链Fv抗人类CD3e嵌合形式(SEQ ID NO:5)。pNG-348盒含有：5'短剪接受体序列(CAGG)、膜锚定的抗人类CD3e ScFvcDNA；C端V5标签(SEQ ID NO:101)；高效率自我裂解型P2A肽序列(SEQ ID NO:94)；人类CD80cDNA序列和3'多聚腺苷酸化序列(SEQ ID NO:99)。NG-348A转基因盒示意图展示于图26A中。通过DNA测序来确认质粒的构建。
病毒产生和表征
通过酶AscI的限制消化来使质粒pNG-348A线性化以产生病毒基因组NG-348A(SEQID NO:102)。根据实例1中详述的方法扩增和提纯病毒NG-348A。
实例3：表达膜锚定的针对人类CD3复合体ε链(CD3ε)的单链Fv片段抗体的EnAd病毒的产生
使用质粒pEnAd2.4，通过直接插入盒子来产生质粒pNG-420和pNG-420A，所述盒子编码膜锚定的具有C端V5标签(SEQ ID NO:5)或无V5标签(SEQ ID NO:4)的单链Fv抗人类CD3e嵌合形式。pNG-420盒含有：5'短剪接受体序列(CAGG)；膜锚定的抗人类CD3e scFvcDNA和3'多聚腺苷酸化序列(SEQ ID NO:99)。pNG-420A盒含有：5'短剪接受体序列(CAGG)；膜锚定的抗人类CD3e scFv cDNA；C端V5标签(SEQ ID NO:101)和3'多聚腺苷酸化序列(SEQID NO:99)。NG-420和NG-420A转基因盒的示意图展示于图3B和3C中。通过DNA测序来确认各种质粒的构建。
病毒产生和表征
通过酶AscI的限制消化来使质粒pNG-420和pNG-420A线性化以产生病毒基因组NG-420(SEQ ID NO:103)和NG-420A(SEQ ID NO:104)。根据实例1中详述的方法扩增和提纯病毒NG-420和NG-420A。
实例4：NG-347和NG-348病毒在结肠癌细胞中的溶瘤活性和感染性
病毒溶瘤效能
按照2.5e4个细胞/孔的细胞密度将HT-29结肠癌细胞接种于96孔板中。培养板在37℃、5％CO2下培育4小时，之后按照每个细胞100-0.39个颗粒(ppc)范围内的感染密度用EnAd、NG-347或NG-348病毒颗粒感染细胞。感染后72小时，使用Cell Titre 96MTS试剂(Promega：G3581)评估HT-29细胞存活率。每种感染密度下的细胞存活率％的定量证实NG-348溶瘤效能类似于EnAd(图43)。
病毒颗粒感染性
按照4e5个细胞/孔的细胞密度将HT-29结肠癌细胞接种于12孔板中。培养板在37℃、5％CO2下培育24小时，之后按照1.6e7-2e6vp/mL范围的感染密度用EnAd、NG-347或NG-348病毒颗粒感染细胞。通过病毒蛋白质六邻体的抗体染色来检测HT-29细胞的感染。通过对每孔6个视场进行人工计数来定量染色细胞，每种稀释度测试6个重复孔。根据病毒滴度计算每种病毒的颗粒对感染率(P:I)并且证实NG-348的感染率与EnAd参考对照物类似(图43表)。
实例5：T细胞活化抗原CD80在NG-347和NG-348感染的癌瘤细胞系的细胞表面上的表达
比较CD80转基因在经NG-348和EnAd处理的结肠癌细胞系DLD-1或肺癌细胞系A549中的表达(通过流式细胞术评估)。按照7.5e5个细胞/孔的细胞密度将A549或DLD-1癌瘤细胞系接种于12孔板中。培养板在37℃、5％CO2下培育18小时，之后按照每个细胞10个EnAd、NG-348病毒颗粒(ppc)感染细胞或不感染。比较感染后第24、48、72或96小时时A549或DLD-1细胞表面上的CD80蛋白表达。根据下文详述的方法，在每个时间点收集细胞且染色。
对于CD80细胞表面表达来说，然后将细胞在5℃和缓冲液、与Cy5结合的小鼠同型对照抗体或与Cy5结合的抗人类CD80抗体(克隆系2D10)一起培育1小时。所有样品还与活/死Zombie Aqua共染色以区分活细胞。用1％BSA/PBS洗涤样品3次，之后通过流式细胞术(FACS，Attune)分析细胞存活率和细胞表面上的CD80蛋白表达。根据IFNα表达数据，只能检测到HT-29细胞上的CD80表达，而成纤维细胞或支气管上皮细胞系上的表达则检测不到。
通过流式细胞术分析细胞的细胞存活率和细胞表面上的CD80蛋白表达。分析感染后72小时A549细胞中的CD80表达表明，在>95％的经NG-348处理的细胞的表面上能检测到CD80(图4A和4B)。感染后96小时，病毒处理已使大多数A549细胞溶解，因此不进行FACs分析。对于DLD-1细胞来说，NG-348处理后96小时，能检测到>50％的细胞上的表达(图5A和5B)。在EnAd或未处理对照物上未检测到染色。
实例6：经NG-348感染的癌瘤细胞系介导的T细胞活化和脱颗粒
经NG-348或EnAd病毒颗粒感染或未被感染的A549肺癌细胞与从人类PBMC供者中分离的T细胞共培养。通过流式细胞术评估A549与T细胞表面上的编码CD80的NG-348病毒的表达选择性。通过分析细胞表面活化标记物(根据流式细胞术)、作为脱颗粒标记物的CD107a细胞表面表达(根据流式细胞术)和刺激细胞因子IL-2和IFNγ的分泌(根据ELISA)评估T细胞活化。
按照5e5个细胞/孔的密度将A549细胞接种于12孔板中。培养板在37℃、5％CO2下培育18小时，之后按照每个细胞10个EnAd或NG-348病毒颗粒(ppc)感染细胞或不感染。在感染后48小时，按照8个T细胞:1个肿瘤细胞的比率将通过从PBMC(MAC)中进行阴性选择而分离的CD3+T细胞添加到A549细胞单层中。进行共培养16小时，在这一时间点之后，收集细胞上清液用于ELISA分析并且收集肿瘤细胞和T细胞用于流式细胞术分析。
从共培养孔中移出含有未粘附细胞的培养基且离心(300×g)。小心地移出上清液，用PBS 5％BSA以1:2稀释且储存用于ELISA分析。用PBS洗涤粘附细胞单层一次，然后使用胰蛋白酶拆分。使用完整培养基使胰蛋白酶不活化并且将细胞添加到已从培养物上清液收集的细胞团中。使细胞离心(300×g)，丢弃上清液且在200μLPBS中洗涤细胞团。再次使细胞离心，然后在室温下再悬浮于50μL含有活/死Aqua(Life tech)的FACs缓冲液(5％BSAPBS)中持续15分钟。细胞用FACS缓冲液洗涤一次，随后用一组直接结合的抗体染色：抗CD3与BV605结合物；抗CD25与BV421结合物；抗CD107a与FITC结合物；抗EpCam与PE结合物或抗CD4与PE结合物；和抗CD80与PE/Cy5结合物或抗HLA-DR与PE/Cy5结合物。得自各种共培养条件的细胞样品也用相关同型对照抗体染色。所有染色均在FACS缓冲液中、在4℃、按照每孔50μL总体积进行15分钟。然后用FACs缓冲液(200μL)洗涤细胞，之后再悬浮于200μLFACs缓冲液中且通过流式细胞术(Attune)来分析。
CD80的选择性表达
与实例14中所示的结果相似，可在>80％的经NG-348感染的EpCam+A549细胞的表面上检测到CD80表达，但在经EnAd感染或未感染的对照细胞上则检测不到(图6)。相比之下，CD3+T细胞的细胞表面上检测不到CD80的表达，这表明至少在这些实验条件下，转基因表达对于共培养物中的肿瘤细胞具有选择性。
T细胞活化标记物的上调
根据CD3+单一活细胞上的T细胞活化标记物CD25和HLA-DR的表达，对流式细胞术分析的T细胞活化进行评估。这些数据表明，对于与经NG-348感染的A549细胞一起培养的T细胞来说，表达CD25的T细胞的数量(图7A和7B)和T细胞表面上的CD25表达平均水平(图7C)显著高于EnAd或未感染对照物。具体地说，当比较未处理对照物与EnAd(分别为26.9％±3.4％和25.3±3.5％的表达CD25的T细胞)时，T细胞活化状态无差异，而CD25在与NG-348共培养的大多数细胞上上调(83.2±1.5％)。还通过闸选CD3+T细胞(基于其CD4表达)来分析CD4和CD8T细胞亚群上的CD25表达。这些分析表明，与EnAd和未感染对照物相比，经NG-348处理的共培养物中的CD4+和CD4-T细胞亚群上的CD25表达显著上调(图8)。
对于所测试的全部条件来说，与CD25相比，表达HLA-DR的细胞数量较低(<5％)(图9A)。这可能归因于共培养之后进行流式细胞术分析的时间点较早。然而，相较于对照物，经NG-348处理的共培养物中的HLA-DR染色CD3+HLA-DR+细胞的平均荧光强度存在稍微、但显著的增加(图9B)。
刺激T细胞脱颗粒
分析CD3+活T细胞表面上的CD107a表达表明，与EnAd(0.6％±0.2％的细胞)或未处理对照物(0.1％±0.02％的细胞)相比，当A549细胞被NG-348感染(8.3％±1.7％的细胞)时，已脱颗粒且因此被CD107a染色的T细胞数量显著增加(图10)。类似于CD25上调，CD4+与CD4-T细胞亚群的CD107a表达相较于EnAd或A549对照显著增加(图11)。
刺激细胞因子IL-2和IFNγ的分泌
为了检测IL-2或IFNγ表达，将共培养物上清液在5％BSA/PBS分析缓冲液中稀释(在1:100到1:1000范围内)中并且使用人类IL-2Ready set go试剂盒(Affymetrix)或人类IFNγReadyset go试剂盒(Affymetrix)、根据制造商方案进行ELISA。
通过从标准曲线内插来测定所分泌的IL-2或IFNγ的浓度。在使用被NG-348感染的A549细胞的共培养物的上清液中，只能检测到IL-2的表达，且在EnAd或未处理对照物中检测不到IL-2的表达(图12A)。在被NG-348感染的A549细胞的共培养物上清液中，还能够检测到IFNγ的表达，其表达水平非常高(>300ng/mL)，显著高于EnAd或未处理对照物(图12B)。
实例7：CD4和CD8 T细胞的T细胞活化能够独立地被NG-348感染的癌瘤细胞系介导
经NG-348或EnAd病毒颗粒感染或未感染的A549肺癌细胞与从人类PBMC供者中分离的CD4+T细胞或CD8+T细胞共培养。根据分泌到培养物上清液中的刺激性IFNγ来评估T细胞活化。
根据实例14中详述的方法接种A549细胞且用NG-348或EnAd病毒颗粒感染或不感染。感染后48小时，按照8个T细胞与1个肿瘤细胞的比率将通过从PBMC供者中进行阴性选择而分离出的CD4+T细胞或CD8+T细胞添加到A549细胞单层中。共培养16小时之后，根据详述的方法收集上清液且评估IFNγ。
通过ELISA分析IFNα表达
通过ELISA分析经10ppc EnAd或NG-343感染24、48或72小时或未被感染的HT-29或A549细胞系上清液中的所分泌IFNα的表达。
从每个孔中移出培养物上清液且以1200rpm离心5分钟以去除细胞碎片。将上清液在5％BSA/PBS分析缓冲液稀释(1:2或1:50或1:100)，并且使用Verikine人类IFNα试剂盒(Pbl assay science)、根据制造商方案进行ELISA。
通过从标准曲线内插来测定所分泌的IFNα的浓度。在感染过程中、在细胞上清液中增加的IFNα表达在HT-29和A549细胞系中均检测到。
对于CD4+T细胞来说，IFNγ表达只在NG-348感染的A549细胞的共培养物上清液中检测到且在EnAd或未处理对照物中检测不到(图13A)。对于CD8+T细胞来说，检测到NG-348感染的A549细胞中的IFNγ表达水平显著地高于EnAd或未处理对照物(图13B)，这证明CD8与CD4细胞均能被肿瘤细胞系中的NG-348病毒活性活化而分泌IFNγ。
实例8
A549人类肺癌细胞和MRC5人类成纤维细胞与EnAd、NG-347或NG-348病毒(10ppc)一起培养，以比较这些细胞类型的病毒基因组复制、病毒六邻体和转基因表达。在72小时培养之后，对细胞进行染色，以便对为了病毒基因组复制(qPCR)而制备的表面标记物或上清液和细胞溶解物进行FACS分析，或对六邻体或转基因表达进行mRNA(RT-qPCR)分析。
携带两种转基因的病毒NG-347和NG-348的病毒基因组复制和六邻体mRNA表达与亲代病毒EnAd的病毒基因组复制和六邻体mRNA表达是相等的(图14)。对于NG-348来说(图15)，A549肿瘤细胞的CD80和抗人类CD3-ScFv转基因mRNA表达水平较高，而非肿瘤MRC5细胞的信号水平较低。通过FACS评估的细胞表面上的CD80蛋白表达在大多数经NG-348处理的A549细胞上被检测到，但在MRC5细胞上检测不到，而在未处理或经EnAd处理的细胞类型上未检测到CD80。类似地，NG-347处理之后的CD80转基因mRNA和蛋白质表达被选择性地在A549肿瘤细胞中检测到，而在MRC5细胞中未检测到(图16)。
对于经EnAd和NG-347处理的细胞培养物来说，分别通过RT-qPCR和特异性ELISA来测量细胞溶解物中的MIP1α和IFNαmRNA含量和上清液中的分泌蛋白质含量。数据(图17)表明A549肿瘤细胞选择性地表达两种转基因，其中在MRC5上清液中检测不到MIP1α趋化因子或IFNα细胞因子。
实例9
通过将分离出的CD3+T细胞与500ppc或5000ppc的每种病毒一起培养3天来评估EnAd、NG-347和NG-348病毒对人类T细胞的选择性/活性。选择性/活性如下评估：a)对经靶向CD69、CD4、CD80、CD25和CD3的抗体染色的T细胞进行流式细胞术分析；b)对人类MIP1α、IFNα和IFNγ蛋白质分泌进行ELISA分析；c)对病毒复制进行qPCR分析和d)对基因表达进行RT-qPCR分析。
如图18所示，T细胞不支持所测试的任何病毒的病毒基因组复制，在病毒六邻体RT-qPCR分析中只有背景信号。A549肿瘤细胞支持六邻体mRNA的高水平表达。RT-qPCR分析T细胞的转基因mRNA表达表明，NG-347与NG-348均只存在CD80的背景信号(<1个拷贝/细胞)，且NG-348类似地缺乏抗CD3-ScFv mRNA的显著表达，尽管病毒暴露较高(5000ppc)。检测到经处理(10ppc)的A549肿瘤细胞存在两种转基因的高水平表达(图19和20)。也选择性地检测到经NG-347(而非EnAd)处理的A549肿瘤细胞(10ppc)存在IFNα和MIP1α转基因mRNA的表达，而经5000ppc处理的T细胞则未检测到所述表达(图21)。另外，对于NG-347和NG-348来说，只能检测到A549细胞存在CD80细胞表面蛋白质表达，而T细胞则检测不到(图19和20)。EnAd处理未引起任一种细胞类型的CD80表达，且对于所有三种病毒来说，A549细胞死亡(如根据染料吸收量所评估)均类似地较高；由于实验中使用了非常高的病毒颗粒含量，因此所有病毒诱导的非特异性T细胞死亡水平都较低(图19和20)。当使用500ppc病毒时，获得类似的转基因mRNA和蛋白质表达数据(数据未展示)。
在不存在肿瘤细胞的情况下，当与所述病毒中的任一种培养时，提纯的人类T细胞未被活化以上调活化标记物CD25或CD69。
经5000ppc的不同病毒处理的提纯的人类CD3+T细胞缺乏对活化标记物CD25和CD69的表达
实例10
使用未分离的人类PBMC而非提纯的T细胞进行与实例9中所述类似的病毒选择性实验，包括进行相同活性评估。如同实例9中的人类T细胞，得自这一研究的数据共同证实利用人类PBMC缺乏病毒复制和转基因表达。图12-14展示使用5000ppc的EnAd、NG-347或NG-348的数据，但使用500ppc产生类似数据(未图示)。图12展示病毒基因组复制和六邻体mRNA表达，并且图13和14展示转基因mRNA表达。根据培养基中外加相应病毒的分析中所产生的信号设定分析背景，且然后按照与细胞溶解物样品相同的方式进行处理。在具有所述病毒中的任一种的这些PBMC培养物中，检测不到CD3+T细胞或CD40+细胞(主要是B细胞)上存在CD80转基因的表达(未图示)。
NG-347和NG-348病毒颗粒介导PBMC培养物中的先天性免疫细胞(单核细胞，DC)活化类似于EnAd，如图15和16中关于CD14表达下调以及HLA-DR和内源细胞表面CD80上调以及MIP1α和IFNα分泌所示(应注意，尽管NG-347编码这两种分子的基因组，但相对于不编码转基因的EnAd和NG-348，产生水平不增加)。
实例11
这个实例的设计类似于实例9和22 10中的实验，在这些研究中，人类PBMC或提纯的T细胞与经病毒预处理(48小时)的A549肿瘤细胞或MRC5成纤维细胞共培养。用10ppc的EnAd、NG-347、NG-348处理或不处理(UTC)A549或MRC5细胞且培养48小时以允许病毒复制和任何转基因表达有足够的时间完成。然后将PBMC或T细胞添加到培养物中且搁置24或48小时以评估经病毒处理的细胞活化T细胞的能力。
图17展示病毒基因组复制数据，其表明三种病毒在PBMC或T细胞与这两种细胞类型的共培养物中的复制类似，在A549肿瘤细胞中的复制水平较高且在MRC5成纤维细胞中的复制水平较低。
相较于EnAd，如根据CD25表面表达上调所测量的T细胞活化和如根据细胞表面上的CD107a上调和IFNγ产生(通过细胞内细胞因子染色所测量)所测量的CD8效应子T细胞脱颗粒都选择性地受到经NG-348处理的A549细胞的刺激，MRC共培养物未介导刺激。
流式细胞术分析人类CD3+ T细胞在T细胞和PBMC与病毒共培养物中的活化
细胞 处理 ％CD25+ ％CD8+CD107a+ ％IFNγ+
A549+T细胞 未处理 37.5 0.1 0.1
A549+T细胞 EnAd 38.4 0.1 0.2
A549+T细胞 NG-348 88.2 17.9 12.0
MRC5+T细胞 未处理 38.8 0.3 0.4
MRC5+T细胞 EnAd 38.9 0.2 0.4
MRC5+T细胞 NG-348 39.1 0.3 0.3
A549+PBMCs 未处理 28.3 ND ND
A549+PBMCs EnAd 29.4 ND ND
A549+PBMCs NG-348 73.7 ND ND
MRC5+PBMCs 未处理 23.0 ND ND
MRC5+PBMCs EnAd 23.3 ND ND
MRC5+PBMCs NG-348 21.7 ND ND
ND＝未测定
还通过ELISA来定量分泌到共培养物上清液中的IFNγ。数据(图28)类似地证明，与经NG-348处理的A549肿瘤细胞而非MRC5成纤维细胞共培养的T细胞被选择性活化，其中分析中使用提纯的T细胞或PBMC。
NG-347活化T细胞的能力还通过测量提纯的T细胞或PBMC与A549肿瘤细胞或MRC5成纤维细胞的共培养物中的T细胞上的CD69含量来评估。如表8中所示，相较于EnAd，发现NG-347处理A549肿瘤细胞引起CD69阳性T细胞小幅度增加，其自身引起这一早期活化标记物上调。这些效应在MRC5共培养物中未发现。T细胞上未检测到CD80表达(未展示)。
经NG-347或EnAd处理的共培养物中的T细胞上的CD69表达
细胞 处理 ％CD69+
A549+T细胞 未处理 2.1
A549+T细胞 EnAd 18.7
A549+T细胞 NG-348 35.0
MRC5+T细胞 未处理 3.8
MRC5+T细胞 EnAd 3.6
MRC5+T细胞 NG-348 4.4
A549+PBMCs 未处理 1.2
A549+PBMCs EnAd 19.1
A549+PBMCs NG-348 28.7
MRC5+PBMCs 未处理 2.6
MRC5+PBMCs EnAd 2.7
MRC5+PBMCs NG-348 3.9
在个别实验中，经NG-347处理并且与人类CD3+T细胞共培养的A549细胞引起T细胞上的CD69活化标记物上调和IFNγ分泌(参见图41和42)。
实例12
通过涂有抗体的磁珠分离将CD 14+单核细胞性细胞与PBMC分离且与人类IL-4和GM-CSF一起培养以使其分化成树突状细胞。培养3天之后，细胞用5000 ppc EnAd、NG-347或NG-348处理或不处理。作为阳性活化对照，一些细胞用LPS刺激。两天之后，取上清液用于细胞因子ELISA并且将细胞染色用于表面活化标记物表达且通过流式细胞术加以分析。如表9中所示，所有病毒均诱导共刺激分子CD80和CD86上调，表明先前鉴别的这种颗粒介导先天性免疫细胞活化作用不因转基因并入NG-347和NG-348基因组中而改变。所有病毒还刺激了类似水平的MIP1α和IFNα分泌(图29)。
颗粒介导EnAd、NG-347和NG-348活化人类树突状细胞
DC处理 ％CD80+ ％CD86+
未处理 3.0 10.4
EnAd 81.6 99.3
NG-347 82.1 99.4
NG-348 62.5 99.5
LPS阳性对照 97.5 98.5
实例13
在一组实验中，共培养物中使用JurkatDual细胞，其中肿瘤细胞在评估NG-347、NG-348和NG-420病毒实现转基因表达的功能的分析中作为T细胞活化报告体，EnAd充当阴性对照。JurkatDual细胞稳定表达两种不同报告基因：NFKB报告基因，其响应于通过T细胞受体复合体的信号传导而产生荧光素酶的分泌形式；和IFNα响应性分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告基因。A549细胞与'10 ppc病毒一起预培养两天，然后添加JurkatDual细胞共培养整夜(18-24小时)，然后收集上清液以分析荧光素酶和SEAP活性。如图43中所示，经NG-347感染的A549细胞选择性地诱导SEAP产生，这与其产生IFNα一致(参见图7)，但不诱导荧光素酶活性。相比之下，表达膜抗CD3-ScFv以活化T细胞受体复合体的NG-348诱导荧光素酶，但不诱导SEAP。
在另一个实验中，A549肺癌细胞和HCT-116、HT-29和DLD结肠癌细胞与10ppcEnAd、NG-347、NG-348或NG-420病毒一起预培养48小时，随后与JurkatDual细胞共培养整夜，其中测试上清液中的荧光素酶含量指示所诱导的活化水平。如图31中所示，与编码细胞表面抗CD3-ScFv的NG-348或NG-420病毒一起培养的所有四种肿瘤细胞类型活化JurkatDual细胞，而EnAd和NG-347则不会，其中荧光素酶的含量与未感染的肿瘤细胞对照物(UIC)相似。
在另一个实验中，A549或HT-29肿瘤细胞与不同量的NG-348或NG-420一起预培养，之后添加JurkatDual细胞且测量其荧光素酶分泌。图32中的数据表明，JurkatDual细胞中的NFKB活性的活化取决于用于处理肿瘤细胞的病毒的剂量。
实例14
比较EnAd和NG-348在静脉内给予免疫胜任型CD1小鼠之后的活体内药物动力学、生物分布和颗粒介导性全身细胞因子诱导活性。小鼠静脉内给予5x109个EnAd或NG-348颗粒且在给予后2、10、30、60和120分钟抽血。提取全血中的DNA且利用qPCR分析病毒基因组含量(图33)。两种病毒从血液中的清除遵循类似的动力学。类似地，MCP-1细胞因子响应的诱导(颗粒介导先天免疫(例如肝脏Kupffer细胞)活化的量度)对于两种病毒来说也相似，组织生物分布模式也相似(图33)。
实例15
一旦肿瘤大于70mm3，则将HCT116细胞皮下植入CB17 SC1D小鼠且肿瘤内(IT)或静脉内(IV)注射EnAd、NG-347或NG-348病毒(5×l09个病毒颗粒)或对照物。对于静脉内给予的小鼠来说，在静脉内给予之后3、15和30分钟，从每组三只小鼠中采集血液样品，提取DNA且通过qPCR评估血液中的病毒基因组含量(药物动力学[PK]分析)。数据(图34)表明，NG-347和NG-348具有与EnAd(和彼此)类似的PK。6小时之后，从每组3只小鼠中切除肿瘤、肝脏、肺和脾。提取均质化组织中的DNA且通过qPCR分析病毒基因组含量(生物分布分析)。数据(图35A)表明三种病毒的组织生物分布相似。7天或14-21天之后，从每组三只小鼠中切除肿瘤且均质化以产生肿瘤溶解物，其用于制备DNA和RNA。通过所提取的DNA进行qPCR分析来测量两个时间点的肿瘤中的病毒基因组含量。数据(图35B)表明，静脉内和肿瘤内给予的小鼠的肿瘤的病毒基因组含量高于所给予的病毒量，这表明病毒在组织中复制，其中肿瘤内给予引起的基因组含量在第7天高于静脉内给予，但在14-21天时间范围内均类似地高。所有三种病毒的复制水平相似。
类似地，在所测试的两个时间点，在EnAd、NG-347和NG-348之间，通过RT-qPCR检测的肿瘤溶解物中的病毒六邻体mRNA含量相似(图36和37)。对于NG-348处理来说，在两个时间点针对两种给药途径检测到的抗CD3-ScFv和CD80 mRNA含量类似，其中给予EnAd只有分析背景读数(图37和38)。肿瘤内或静脉内给予NG-347之后，还选择性地检测到MIP1α和IFNαmRNA含量(图39)。
使用特异性ELISA测量由NG-347与NG-348编码的CD80蛋白质以及由NG-347编码的MIP1a蛋白质在肿瘤溶解物中的含量。图40中的数据表明，在静脉内单次病毒剂量之后，也能够在肿瘤提取物中选择性地检测到两种蛋白质。在得自同一小鼠的血液样品中，两种蛋白质都未检测到。
实例16
为了评估NG-348病毒在活体内的活性和肿瘤细胞依赖性，将人类PBMCs(5x107个细胞)、A549人类肿瘤细胞(5x106)和EnAd或NG-348(5x109ppc)的不同组合注射到免疫缺乏型SCID米色小鼠的腹膜内，其中病毒或对照物(生理盐水)是在所述细胞注射之后的15分钟内给予。3天之后，用5mL生理盐水灌洗腹膜腔且用一组T细胞活性标记物(CD25、CD69和HLA-DR)、通过流式细胞术分析来分析所回收的细胞以评估T细胞活性水平，之后对CD3+T细胞群进行闸选。来自两个单独实验的数据(表10)证实NG-348按照肿瘤细胞依赖性方式在活体内选择性地引起人类T细胞活化。
NG-348使人类T细胞在带有A549肿瘤的小鼠中发生活体内活化

Claims (34)

1.一种复制缺乏型溶瘤病毒载体或能复制型B组溶瘤腺病毒，其选自由Ad11和艾纳德诺(enadenotucirev)组成的组，其中所述病毒编码用于在癌细胞表面上表达的抗体或其结合片段，其中所述抗体或结合片段对T细胞受体复合体(TCR)中的CD3蛋白质具有特异性，其中所述病毒不编码B7蛋白质或其活性片段。
2.根据权利要求1所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或能复制型B组溶瘤腺病毒，其中所述病毒是Ad11。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或能复制型溶瘤病毒，其中所述病毒是复制胜任型。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或能复制型溶瘤病毒，其中所述病毒是复制缺乏型。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的所述抗体进一步包含跨膜域或GPI锚。
6.根据权利要求5所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述跨膜域是选自SEQ ID NO:10到14中所示的序列。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述溶瘤腺病毒是EnAd。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述抗体或结合片段是选自包含以下的组：全长抗体、Fab、经修饰的Fab、Fab'、经修饰的Fab'、F(ab')2、Fv、单域抗体、scFv、二价、三价或四价抗体、双scFv、双链抗体、三链抗体、四链抗体、人源抗体、前述中的任一种的二硫键稳定形式，和其抗原决定基结合片段。
9.根据权利要求1到8所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述抗体结合片段是单链Fv。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒编码至少一种其它转基因。
11.根据权利要求10所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒编码至少两种其它转基因。
12.根据权利要求10或11所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述其它转基因编码独立地选自包含以下的组的蛋白质：细胞因子、趋化因子、拮抗性抗体分子或其结合片段、促效性抗体分子或其结合片段、免疫调节剂，和其组合。
13.根据权利要求12所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中至少一种其它转基因编码抗体分子或其结合片段(例如其可以呈表面表达形式和/或分泌形式)。
14.根据权利要求13所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述抗体分子或结合片段是抑制剂。
15.根据权利要求14所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述抑制剂是血管生成因子抑制剂或T细胞去活化因子抑制剂。
16.根据权利要求13到15中任一项所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中抗体分子或结合片段是促效剂。
17.根据权利要求16所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述促效剂独立地选自包含以下的组：针对CD40、GITR、OX40、CD27和4-1BB的抗体。
18.根据权利要求12到17中任一项所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述免疫调节剂是针对免疫细胞表面受体的膜结合蛋白质配体，所述配体选自包含以下的组：CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、VISTA、B7-H3、B7-H4、HVEM、ILT-2、ILT-3、ILT-4、TIM-3、LAG-3、BTLA、LIGHT或CD160，例如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、CD16、CD25、CD33、CD332、CD127、CD31、CD43、CD44、CD162、CD301a、CD301b和半乳糖凝集素-3、FLT-3、FLT-3配体、TLRs、TLR配体、CCR7、CD1a、CD1c、CD11b、CD11c、CD80、CD83、CD86、CD123、CD172a、CD205、CD207、CD209、CD273、CD281、CD283、CD286、CD289、CD287、CXCR4、GITR配体、IFN-α2、IL-12、IL-23、ILT1、ILT2、ILT3、ILT4、ILT5、ILT7、TSLP受体、CD141、CD303、CADM1、CLEC9a、XCR1和CD304、OX40、OX40配体、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40配体、CD70、CD137、GITR、4-1BB、ICOS和ICOS配体。
19.根据权利要求10到18中任一项所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中至少一种其它转基因编码细胞因子(包括分泌的和/或细胞膜结合的分子)。
20.根据权利要求11到19中任一项所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中第二种另外的转基因编码细胞因子(包括分泌的或细胞膜结合的分子)。
21.根据权利要求19或20中任一项所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的所述细胞因子独立地选自TNFα超家族(TNFSF包括TNF-α、TNF-C、OX40L、CD154、FasL、LIGHT、TL1A、CD70、Siva、CD153、4-1BB配体、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、CAMLG、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITR配体、EDA-A、EDA-A2)、TGF-β超家族、IL-1家族(即，IL-1和IL-18)、IL-2家族、IL-10家族、IL-17家族、干扰素家族。
22.根据权利要求21所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的所述细胞因子独立地选自TNF-α、IL-1、IL-8、IL-10、IL-17、干扰素、LIGHT、TL1A、Siva、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、NGF、BDNF、NT-3和EDA-A2。
23.根据权利要求21或22所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的所述细胞因子独立地选自TNF-C、OX40l、CD154、FasL、CD70、CD153、4-1BB配体和EDA-A。
24.根据权利要求21到23中任一项所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述细胞因子独立地选自包含以下的组：IL-2、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、Flt3配体、GM-CSF、IL-15和IL-12。
25.根据权利要求10到24中任一项所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中至少一种其它转基因编码趋化因子。
26.根据权利要求25所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述趋化因子独立地选自包含以下的组：MIP-1α、RANTES、IL-8、CCL5、CCL17、CCL20、CCL22、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL12、CCL2、CCL19和CCL21。
27.根据权利要求26所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所编码的所述趋化因子是MIP-1α。
28.根据权利要求27所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述病毒包含编码细胞因子与趋化因子组合的转基因，所述组合选自i)MIP-1α与Flt3，和ii)MIP-1α与IFNα。
29.根据权利要求1到28中任一项所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或复制胜任型溶瘤病毒，其中所述抗CD3抗体或结合片段至少具有包含来自莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3(OKT3))、奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利珠单抗(teplizumab)或维西珠单抗(visilizumab)的VH和VL区的结合域。
30.一种治疗癌症患者的方法(例如通过活体内刺激T细胞，例如癌细胞环境中的T细胞聚焦于癌细胞)，包含以下步骤：
投与治疗有效量的复制缺乏型溶瘤病毒载体或能复制型B组溶瘤腺病毒，其选自由Ad11和艾纳德诺组成的组，其中所述病毒编码用于在癌细胞表面上表达的抗体或其结合片段，其中所述抗体或结合片段对T细胞受体复合体(TCR)中的CD3蛋白质具有特异性，其中所述病毒不编码B7蛋白质或其活性片段，
其中所述病毒或病毒载体选择性地感染所述癌细胞且在所述细胞的表面上表达所述经编码的抗CD3抗体或结合片段，如权利要求1到26中任一项所定义。
31.一种复制缺乏型溶瘤病毒载体或能复制型B组溶瘤腺病毒，其选自由Ad11和艾纳德诺组成的组，其中所述病毒编码用于在癌细胞表面上表达的抗体或其结合片段，其中所述抗体或结合片段对T细胞受体复合体(TCR)中的CD3蛋白质具有特异性，其中所述病毒不编码B7蛋白质或其活性片段，如权利要求1到29中任一项所定义，其用于治疗。
32.根据权利要求31所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或能复制型B组溶瘤腺病毒，其用于治疗癌症。
33.根据权利要求32所述的复制缺乏型溶瘤病毒载体或能复制型B组溶瘤腺病毒，其中所述治疗是通过活体内刺激T细胞，例如癌细胞环境中的T细胞聚焦于癌细胞来进行。
34.一种复制缺乏型溶瘤病毒载体或能复制型B组溶瘤腺病毒，其选自由Ad11和艾纳德诺组成的组，其中所述病毒编码用于在癌细胞表面上表达的抗体或其结合片段，其中所述抗体或结合片段对T细胞受体复合体(TCR)中的CD3蛋白质具有特异性，其中所述病毒不编码B7蛋白质或其活性片段，如权利要求1到26中任一项所定义，其用于制造药剂。
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