KR20190035714A - 치료 폴리펩티드의 위형된 종양용해성 바이러스 전달 - Google Patents

치료 폴리펩티드의 위형된 종양용해성 바이러스 전달 Download PDF

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KR20190035714A
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Abstract

본 명세서에는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 위형 종양용해성 바이러스가 기술된다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 인게이저 분자 및 1종 이상의 치료 분자를 암호화하는 핵산을 포함한다. 위형 종양용해성 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물 및 상기 위형 종양용해성 바이러스를 사용하여 암을 치료하는 방법이 본 명세서에 추가로 제공된다.

Description

치료 폴리펩티드의 위형된 종양용해성 바이러스 전달
관련 출원에 대한 참고
본 출원은 2016년 6월 30일자로 출원된 미국 가출원 제62/357,195호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 내용은 이의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.
전자적으로 제출되어 출원된 텍스트의 설명
본 명세서와 함께 전자적으로 제출되어 출원된 텍스트의 내용은 이의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능한 포맷 카피(파일명: ONCR_004_02WO_ST25.txt; 기록일: 2017년 6월 30일; 파일 크기: 193킬로바이트).
특정 혈액 종양 및 고형 종양을 갖는 환자는 새로운 요법을 여전히 필요로 한다. 세포독성 T 세포를 종양 세포에 안내하기 위한 이중특이적 항체, 및 면역 효과기 세포에 대한 항원 특이성을 조작하기 위한 키메라 항원 수용체(CAR)의 사용은 치료적 이점을 제공하는 것으로 입증되어 있다. 또한, 종양용해성 바이러스(oncolytic virus) 기술은 고형 종양의 현재 치료 기준에 대한 유용한 부가이고, 안전성 프로파일을 갖고, 종양 세포를 감염시키고, 종양 세포에서 복제하고, 종양 세포를 용해시키는 능력을 갖는다고 예상된다. 그러나, 이중특이적 항체, CAR 및 종양용해성 바이러스의 항종양 효능은 최상이 아니며, 이는 종양학, 항체 및 종양용해성 바이러스 요법의 추가 발전을 위한 계속적인 요구를 나타낸다.
본 발명은 (i) 인게이저(engager) 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산 서열로서, 상기 인게이저 폴리펩타이드는 효과기 세포 상에서 발현된 항원에 대해서 특이적인 활성화 도메인 및 표적 세포 상에서 발현된 세포-표면 항원에 대해서 특이적인 항원 인식 도메인을 포함하는, 상기 제1 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산을 포함하는 위형 종양용해성 바이러스를 제공한다. 일부 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 종양 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 표 2로부터 선택된다.
본 발명은 (i) 인게이저 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산 서열로서, 상기 인게이저 폴리펩타이드는 효과기 세포 상에서 발현된 항원에 대해서 특이적인 활성화 도메인 및 세포 표면 상에서 발현된 저해성 항원에 결합하는 치료 분자 도메인(therapeutic molecule domain)을 포함하는, 상기 제1핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산을 포함하는 위형 종양용해성 바이러스를 제공한다. 일부 실시형태에서, 치료 분자 도메인은 PD1, PDL1 또는 CD47에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 치료적 폴리펩타이드(therapeutic polypeptide)를 암호화하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료적 폴리펩타이드는 면역 조정인자 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 면역 조정인자 폴리펩타이드는 사이토카인, 공자극성 분자, 면역 관문 폴리펩타이드, 항-혈관형성 인자, 기질 메탈로프로테아제(MMP) 또는 핵산으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 면역 관문 폴리펩타이드는 (i) PD-1, PDL-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, 뉴로필린 또는 CCR4의 저해제; (ii) GITR, OX-40 또는 CD28의 효능제; 또는 (iii) (i)과 (ii)의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 관문 폴리펩타이드는 MMP를 포함하고, 여기서 MMP는 MMP9이다. 일부 실시형태에서, 면역 관문 폴리펩타이드는 사이토카인을 포함하고, 여기서 사이토카인은 IL-15, IL-12 및 CXCL10으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 인게이저 분자에 의해서 결속된 효과기 세포는 T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 대식세포이다. 일부 실시형태에서, 효과기 분자의 활성화 도메인은 CD3, CD4, CD5, CD8, CD16, CD28, CD40, CD134, CD137 또는 NKG2D에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 핵산은 다시스트론성(multicistronic) 서열이다. 일부 실시형태에서, 다시스트론성 서열은 이시스트론성(bicistronic) 서열 또는 삼시스트론성(tricistronic) 서열이다. 일부 실시형태에서, 다시스트론성 서열은 피코나바이러스-2a-유사 서열을 포함하고, 여기서 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 재조합 핵산 내에 존재하는 단일 프로모터 서열로부터 발현된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 (i) 인게이저 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산 서열로서, 상기 인게이저 폴리펩타이드는 효과기 세포 상에서 발현된 항원에 대해서 특이적인 활성화 도메인 및 표적 세포 상에서 발현된 종양 세포 항원에 대해서 특이적인 항원 인식 도메인을 포함하되, 상기 효과기 세포 상에서 발현된 상기 항원은 CD3이고, 그리고 상기 종양 세포 항원은 CD19인, 상기 제1 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산을 포함하는 위형 종양용해성 바이러스를 제공한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 44와 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 43을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 (ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함하며, 여기서 치료 분자는 IL-12이다. 이러한 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 54와 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 (ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함하며, 여기서 치료 분자는 IL-15이다. 이러한 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 53과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 (ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함하며, 여기서 치료 분자는 CXCL10이다. 이러한 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 55와 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 (ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함하며, 여기서 치료 분자는 MMP9이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 (i) 인게이저 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산 서열로서, 상기 인게이저 폴리펩타이드는 효과기 세포 상에서 발현된 항원에 대해서 특이적인 활성화 도메인 및 저해성 항원에 대해서 특이적인 치료 분자 도메인을 포함하되, 상기 효과기 세포 상에서 발현된 상기 항원은 CD3이고, 그리고 상기 저해성 항원은 PDL1인, 상기 제1 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산을 포함하는 위형 종양용해성 바이러스를 제공한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 50과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 49를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 (ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함하며, 여기서 치료 분자는 IL-12이다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 63과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 (ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함하며, 여기서 치료 분자는 IL-15이다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 62와 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 (ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함하며, 여기서 치료 분자는 CXCL10이다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 64와 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 (ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함하며, 여기서 치료 분자는 MMP9이다. 일부 실시형태에서, 인게이저 분자는 제3 결합 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 결합 도메인은 면역글로불린 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 52와 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 51을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 (i) 인게이저 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산 서열로서, 상기 인게이저 폴리펩타이드는 효과기 세포 상에서 발현된 항원에 대해서 특이적인 활성화 도메인 및 저해성 항원에 대해서 특이적인 치료 분자 도메인을 포함하되, 상기 효과기 세포 상에서 발현된 상기 항원은 CD3이고, 그리고 상기 저해성 항원은 SIRP1α인, 상기 제1 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산을 포함하는 위형 종양용해성 바이러스를 제공한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 46 또는 48과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 45 또는 47을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 (ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함하며, 여기서 치료 분자는 IL-12이다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 58 또는 59와 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 (ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함하며, 여기서 치료 분자는 IL-15이다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 56 또는 57과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 (ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함하며, 여기서 치료 분자는 CXCL10이다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 60 또는 61과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 (ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함하며, 여기서 치료 분자는 MMP9이다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 65 또는 66과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 (ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함하며, 여기서 치료 분자는 IgG1 Fc 도메인에 연결된 항-PDL1 scFv이다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 68 또는 70과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 67 또는 69를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 위형 종양용해성 바이러스는 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스 1(HSV1), 점액종 바이러스, 레오바이러스, 폴리오바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 홍역 바이러스(MV), 라사 바이러스(LASV) 또는 뉴캐슬병 바이러스(NDV)로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 인간 대상체 참조 바이러스와 비교할 때 인간 대상체에서 감소된 향신경성 활성도 및/또는 신경독성 활성도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 바이러스는 i) 비-위형 종양용해성 바이러스 또는 ii) 백시니아 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 약화된 종양용해성 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 백시니아 바이러스가 아니다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 위형 종양용해성 바이러스는 단일 재조합 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 복수의 재조합 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 종양용해성 바이러스는 표적 세포를 선택적으로 감염시킨다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 종양 세포이고, 여기서 종양용해성 바이러스는 종양 세포 내에서 선택적으로 복제될 수 있다.
일부 실시형태에서, 인게이저 폴리펩타이드는 이분(bipartite) 폴리펩타이드이고, 항체, 항체 도메인, 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인, 이중-가변-도메인 항체(DVD-Ig), Tandab, 다이아바디(diabody), 플렉시바디(flexibody), 독-앤-락(dock-and-lock) 항체, 스콜피온(Scorpion) 폴리펩타이드, 단일 쇄 가변 단편(scFv), BiTE, 듀오바디(DuoBody), Fc-조작된 IgG, Fcab, Mab2 또는 DART 폴리펩타이드로 구성된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 위형 종양용해성 바이러스 중 임의의 것을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 면역 반응을 유도한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 표적 세포에 대해서 선택적으로 세포독성이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 고형 종양 세포 또는 혈액암 세포이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 1종 이상의 종양 항원을 발현한다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 종양 항원은 표 2로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 치료적 유효량의 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스 또는 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 1종 이상의 추가적인 요법을 필요로 하는 대상체에게 1종 이상의 추가적인 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 추가적인 요법은 수술, 방사선, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 1종 이상의 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에서 1종 이상의 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 치료적 유효량의 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스 또는 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물를 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 1종 이상의 종양은 종양 항원을 발현한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 치료를 위한 환자를 선택하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 환자로부터 유래된 1종 이상의 종양 세포 상에서 종양 항원의 발현을 결정하는 단계; 및 (b) 환자로부터 수득된 종양 세포가 1종 이상의 종양 항원을 발현하는 경우 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스 또는 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물를 투여하는 단계를 제공한다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 종양 항원은 표 2로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 인게이저 폴리펩타이드 및 치료적 폴리펩타이드를 종양 부위에 전달하는 방법을 제공하며, 이 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스 또는 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 CD3에 대해서 지향되는 제2 scFv에 연결된 CD19에 대해서 지향되는 제1 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 CD19-CD3 이분 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 도시한 도면.
도 2는 이시스트론성 유전자에 의해서 암호화된 CD19-CD3-IL15 작제물의 아미노산 서열을 도시한 도면. 제1 유전자는 CD3에 대해서 지향되는 제2 scFv에 연결된 CD19에 대해서 지향되는 제1 scFv를 포함하는 이분 폴리펩타이드를 암호화한다. IL-15를 암호하하는 제2 유전자는 T2A 자가-절단 폴리펩타이드 링커에 의해서 이분 유전자 서열에 연결된다.
도 3은 다시스트론성 유전자에 의해서 암호화된 CD19-CD3-IL12 작제물의 아미노산 서열을 도시한 도면. 제1 유전자는 CD3에 대해서 지향되는 제2 scFv에 연결된 CD19에 대해서 지향되는 제1 scFv를 포함하는 이분 폴리펩타이드를 암호화한다. IL-12의 p35 소단위를 암호화하는 제2 유전자는 T2A 자가-절단 폴리펩타이드 링커에 의해서 이분 유전자 서열에 연결되고, IL-12의 p40 소단위를 암호화하는 제3 유전자는 T2A 자가-절단 폴리펩타이드 링커에 의해서 연결된다.
도 4는 이시스트론성 유전자에 의해서 암호화된 CD19-CD3-CXCL10 작제물의 아미노산 서열을 도시한 도면. 제1 유전자는 CD3에 대해서 지향되는 제2 scFv에 연결된 CD19에 대해서 지향되는 제1 scFv를 포함하는 이분 폴리펩타이드를 암호화한다. CXCL10을 암호하하는 제2 유전자는 T2A 자가-절단 폴리펩타이드 링커에 의해서 이분 유전자 서열에 연결된다.
도 5는 단일 아미노산 링커에 의해서 CD3에 대해서 지향되는 scFv에 연결된 SIRP1α의 제1의 120개의 아미노산을 포함하는 제1 단백질을 포함하는 SIRP1α-CD3 이분 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 도시한 도면.
도 6은 G4S 모티프 링커에 의해서 CD3에 대해서 지향되는 scFv에 연결된 SIRP1α의 제1의 120개의 아미노산을 포함하는 제1 단백질을 포함하는 SIRP1α-CD3-LL 이분 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 도시한 도면.
도 7는 이시스트론성 유전자에 의해서 암호화된 SIRP1α-CD3-IL15 작제물의 아미노산 서열을 도시한 도면. 제1 유전자는 단일 아미노산 링커에 의해서 CD3에 대해서 지향되는 scFv에 연결된 SIRP1α의 제1의 120개의 아미노산을 포함하는 이분 폴리펩타이드를 암호화한다. IL-15를 암호하하는 제2 유전자는 T2A 자가-절단 폴리펩타이드 링커에 의해서 이분 유전자 서열에 연결된다.
도 8은 이시스트론성 유전자에 의해서 암호화된 SIRP1α-CD3-IL15-LL 작제물의 아미노산 서열을 도시한 도면. 제1 유전자는 G4S 모티프 링커에 의해서 CD3에 대해서 지향되는 scFv에 연결된 SIRP1α의 제1의 120개의 아미노산을 포함하는 이분 폴리펩타이드를 암호화한다. IL-15를 암호하하는 제2 유전자는 T2A 자가-절단 폴리펩타이드 링커에 의해서 이분 유전자 서열에 연결된다.
도 9는 다시스트론성 유전자에 의해서 암호화된 SIRP1α-CD3-IL12 작제물의 아미노산 서열을 도시한 도면. 제1 유전자는 단일 아미노산 링커에 의해서 CD3에 대해서 지향되는 scFv에 연결된 SIRP1α의 제1의 120개의 아미노산을 포함하는 이분 폴리펩타이드를 암호화한다. IL-12의 p35 소단위를 암호화하는 제2 유전자는 T2A 자가-절단 폴리펩타이드 링커에 의해서 이분 유전자 서열에 연결되고, IL-12의 p40 소단위를 암호화하는 제3 유전자는 T2A 자가-절단 폴리펩타이드 링커에 의해서 연결된다.
도 10는 다시스트론성 유전자에 의해서 암호화된 SIRP1α-CD3-IL12-LL 작제물의 아미노산 서열을 도시한 도면. 제1 유전자는 G4S 모티프 링커에 의해서 CD3에 대해서 지향되는 scFv에 연결된 SIRP1α의 제1의 120개의 아미노산을 포함하는 이분 폴리펩타이드를 암호화한다. IL-12의 p35 소단위를 암호화하는 제2 유전자는 T2A 자가-절단 폴리펩타이드 링커에 의해서 이분 유전자 서열에 연결되고, IL-12의 p40 소단위를 암호화하는 제3 유전자는 T2A 자가-절단 폴리펩타이드 링커에 의해서 연결된다.
도 11은 이시스트론성 유전자에 의해서 암호화된 SIRP1α-CD3-CXCL10 작제물의 아미노산 서열을 도시한 도면. 제1 유전자는 단일 아미노산 링커에 의해서 CD3에 대해서 지향되는 scFv에 연결된 SIRP1α의 제1의 120개의 아미노산을 포함하는 이분 폴리펩타이드를 암호화한다. CXCL10을 암호하하는 제2 유전자는 T2A 자가-절단 폴리펩타이드 링커에 의해서 이분 유전자 서열에 연결된다.
도 12는 이시스트론성 유전자에 의해서 암호화된 SIRP1α-CD3-CXCL10-LL 작제물의 아미노산 서열을 도시한 도면. 제1 유전자는 G4S 모티프 링커에 의해서 CD3에 대해서 지향되는 scFv에 연결된 SIRP1α의 제1의 120개의 아미노산을 포함하는 이분 폴리펩타이드를 암호화한다. CXCL10을 암호하하는 제2 유전자는 T2A 자가-절단 폴리펩타이드 링커에 의해서 이분 유전자 서열에 연결된다.
도 13은 CD3에 대해서 지향되는 제2 scFv에 연결된 PDL1에 대해서 지향되는 제1 scFv를 포함하는 PDL1-CD3 이분 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 도시한 도면.
도 14는 이시스트론성 유전자에 의해서 암호화된 PDL1-CD3-IL15 작제물의 아미노산 서열을 도시한 도면. 제1 유전자는 CD3에 대해서 지향되는 제2 scFv에 연결된 PDL1에 대해서 지향되는 제1 scFv를 포함하는 이분 폴리펩타이드를 암호화한다. IL-15를 암호하하는 제2 유전자는 T2A 자가-절단 폴리펩타이드 링커에 의해서 이분 유전자 서열에 연결된다.
도 15는 다시스트론성 유전자에 의해서 암호화된 PDL1-CD3-IL12 작제물의 아미노산 서열을 도시한 도면. 제1 유전자는 CD3에 대해서 지향되는 제2 scFv에 연결된 PDL1에 대해서 지향되는 제1 scFv를 포함하는 이분 폴리펩타이드를 암호화한다. IL-12의 p35 소단위를 암호화하는 제2 유전자는 T2A 자가-절단 폴리펩타이드 링커에 의해서 이분 유전자 서열에 연결되고, IL-12의 p40 소단위를 암호화하는 제3 유전자는 T2A 자가-절단 폴리펩타이드 링커에 의해서 연결된다.
도 16은 이시스트론성 유전자에 의해서 암호화된 PDL1-CD3-CXCL10 작제물의 아미노산 서열을 도시한 도면. 제1 유전자는 CD3에 대해서 지향되는 제2 scFv에 연결된 PDL1에 대해서 지향되는 제1 scFv를 포함하는 이분 폴리펩타이드를 암호화한다. CXCL10을 암호하하는 제2 유전자는 T2A 자가-절단 폴리펩타이드 링커에 의해서 이분 유전자 서열에 연결된다.
도 17은 G4S 모티프 링커에 의해서 PDL1에 대해서 지향되는 제2 scFv에 연결되고, 그 다음 IgG1 힌지에 의해서 인간 IgG1의 CH2-CH3 도메인에 연결되는, CD3에 대해서 지향되는 제1 scFv를 포함하는 PDL1-CD3-Fc 삼분(tripartite) 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 도시한 도면.
도 18은 이시스트론성 유전자에 의해서 암호화된 SIRP1α-CD3- MMP9-SL 작제물의 아미노산 서열(도 18A) 및 이시스트론성 유전자에 의해서 암호화된 SIRP1α-CD3-MMP9-LL 작제물의 아미노산 서열(도 18B)을 도시한 도면.
도 19A 내지 19C는 CD19-CD3 BiTE 작제물(도 19A), SIRP1α-CD3 BiTE 작제물(도 19B) 및 PDL1-CD3-Fc 삼분 T 세포 인게이저(도 19C) CD3+ T 세포의 결합을 도시한 도면.
도 20은 도 19에 도시된 T 세포 인게이저 작제물 결합의 정량을 도시한 도면.
도 21은 항-CD3 항체, OKT3의 사용을 통한 CD19-CD3 BiTE 작제물(도 21A), SIRP1α-CD3 BiTE 작제물(도 21B) 및 PDL1-CD3-Fc 삼분 T 세포 인게이저(도 21C)의 CD3-특이적 결합을 도시한 도면.
도 22는 SIRP1α-CD3 BiTE 작제물의 CD47-결합 SIRP1α 아암의 특이성을 도시한 도면.
도 23A 및 도 23B는 Raji 세포(CD19+CD47+)에 대한 CD19-CD3 및 SIRP1α-CD3 BiTE 작제물의 결합을 나타낸 도면(도 23A). 결합%는 도 23B에 정량되어 있다.
도 24A 및 도 24B는 U2OS 세포(CD19-CD47+)에 대한 CD19-CD3 및 SIRP1α-CD3 BiTE 작제물의 결합을 나타낸 도면(도 24A). 결합%는 도 24B에 정량되어 있다.
도 25A 및 도 25B는 GBM30-luc 세포(CD19-CD47+)에 대한 CD19-CD3 및 SIRP1α-CD3 BiTE 작제물의 결합을 나타낸 도면(도 25A). 결합%는 도 25B에 정량되어 있다.
도 26A 및 도 26B는 U251 세포(CD19-CD47+)에 대한 CD19-CD3 및 SIRP1α-CD3 BiTE 작제물의 결합을 나타낸 도면(도 26A). 결합%는 도 26B에 정량되어 있다.
도 27A 내지 도 27C는 U251 세포에 대한 PDL1-Fc-CD3 삼분 T 세포 인게이저의 결합을 도시한 도면. PDL1-Fc-CD3 작제물의 결합(도 27B)을 항-PDL1 항체의 결합(도 27A)과 비교한다. 결합은 FcγR에 의해서 매개되지 않는데, 그 이유는 U251 세포가 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII를 발현하지 않기 때문이다(도 27C).
도 28은 Raji 세포의 CD19-CD3 BiTE, SIRP1α-CD3 BiTE 및 PDL1-CD3-Fc 삼분 T 세포 인게이저-매개된 T 세포-의존형 세포독성(TDCC)을 나타낸 도면.
도 29는 THP1 세포의 CD19-CD3 BiTE 및 PDL1-CD3-Fc 삼분 T 세포 인게이저-매개된 TDCC를 도시한 도면.
도 30은 U251 세포의 CD19-CD3 BiTE 및 PDL1-CD3-Fc 삼분 T 세포 인게이저-매개된 TDCC를 도시한 도면.
도 31은 오스테오폰틴-융합 대조군 작제물과 비교한 293F 세포의 SIRP1α-CD3 BiTE-매개된 TDCC를 도시한 도면.
도 32는 종양용해성-HSV 벡터로부터의 SIRP1α-CD3 BiTE 작제물의 발현을 도시한 도면. 짧은 링커를 갖는 SIRP1α-CD3 BiTE 작제물(레인 1 내지 4 및 레인 5 및 6에서 ONCR085, 도 5에 도시됨) 및 긴 링커를 갖는 SIRP1α-CD3 BiTE 작제물(레인 7 내지 8에서 ONCR087, 도 6에 도시됨)의 발현을 나타낸다.
도 33은 종양용해성-HSV 벡터로부터의 PDL1-CD3-Fc BiTE 작제물의 발현을 도시한 도면. 정제된 PDL1-CD3-Fc BiTE 단백질을 레인 1 내지 4에 나타낸다. 농축된 바이러스 상청액을 레인 5 및 6에 나타낸다.
도 34A 및 도 34B는 바이러스에 의해서 생산된 SIRP1α-CD3, SIRP1α-CD3-LL 및 PDL1-CD3-Fc BiTE 작제물에 의한 U251 세포의 TDCC를 도시한 도면. 제시된 BiTE 작제물 및 CD8+ T 세포와 함께 인큐베이션시킨 후 U251 세포 배양물의 사진을 도 34A에 나타낸다. 세포 사멸%에 의해서 측정되고, 유세포 분석법에 의해서 정량된 바이러스에 의해서 생산된 BiTE 작제물의 활성도를 도 34B에 나타낸다.
도 35는 아미콘(Amicon) 한외여과가 다클론성 항-HSV 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해서 결정되는 경우 샘플로부터 바이러스를 효과적으로 제거하는 것을 도시하고, BiTE-사멸은 BiTE로 인한 것이며, 바이러스 감염에 의한 것이 아님을 나타내었다.
도 36은 위형 종양용해성 바이러스 및 재조합 종양용해성 바이러스의 생산 및 각각의 위형 종양용해성 바이러스 및 재조합 종양용해성 바이러스에 의한 표적 세포의 감염의 대표적인 도면.
도 37은 이시스트론성 유전자에 의해서 암호화된 SIRP1α-CD3-PDL1-Fc(SL) 작제물의 아미노산 서열(여기서 제1 유전자는 IgG1 Fc 도메인에 연결된 항-PDL1 scFv를 암호화하고, 제2 유전자는 단일 아미노산 링커에 의해서 CD3에 대해서 지향되는 scFv에 연결된 SIRP1α의 제1의 120개의 아미노산을 포함하는 이분 폴리펩타이드를 암호화함)을 도시한 도면.
도 38은 이시스트론성 유전자에 의해서 암호화된 SIRP1α-CD3-PDL1-Fc(LL) 작제물의 아미노산 서열(여기서 제1 유전자는 IgG1 Fc 도메인에 연결된 항-PDL1 scFv를 암호화하고, 제2 유전자는 G4S 모티프 링커에 의해서 CD3에 대해서 지향되는 scFv에 연결된 SIRP1α의 제1의 120개의 아미노산을 포함하는 이분 폴리펩타이드를 암호화함)을 도시한 도면.
도 39는 SIRP1α-CD3-PDL1-Fc 발현 플라스미드의 개략도. 2종의 플라스미드 작제물, 즉, SIRP1α-CD3-PDL1-Fc(SL)에 대해서 1종 및 SIRP1α-CD3-PDL1-Fc(LL)에 대해서 1종을 생성하였다.
도 40은 형질주입된 293 T 세포의 상청액으로부터의 SIRP1α-CD3 BiTE(SL), SIRP1α-CD3 BiTE(LL) 및 항-PDL1-Fc 화합물의 정제를 도시한 도면. 도 40A는 쿠마시(Coomassie)에 의해서 평가된 항-PDL1-Fc 화합물의 정제를 나타낸 도면. 도 40B는 항-His 검출 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해서 평가된 바와 같은 SIRP1α-CD3 BiTE 화합물의 정제를 도시한 도면.
도 41은 PD1/PDL1 차단 검정의 결과를 도시한 도면. 검정의 개략도를 도 41A 및 도 41B에 나타낸다. 형질주입된 293개의 세포로부터 생산된 항-PDL1-Fc 화합물을 사용한 PD1/PDL1 차단 검정의 결과를 도 41C에 나타낸다.
본 개시내용은 고형 종양(예를 들어, 후기 고형 종양) 및 혈액 악성 종양을 비롯한 암의 치료를 위한 다분(multipartite) 폴리펩타이드 및/또는 다른 치료적 폴리펩타이드를 생산하는 신규의 조작된 종양용해성 바이러스, 특히 위형 종양용해성 바이러스를 제공한다. 일부 실시형태에서, 종양용해성 바이러스는 종양 세포 및/또는 주변 종양 기질에 대해서 특이적인 바이러스 감염을 초래하기 위해서 그리고/또는 본 명세서에 제공된 바와 같은 다른 이로운 목적을 위해서 바이러스의 향성(tropism)을 조절하기 위해서 위형 또는 다른 재조합 기술에 의해서 조작된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스에 의해서 생산된 다분 및/또는 치료적 폴리펩타이드는 예컨대, 표적 세포(예를 들어, 종양 세포)의 효과기-세포 매개된 용해에 의해서, 종양용해성 바이러스의 항-종양 효과를 매개 또는 향상시킨다. 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스는 다분 폴리펩타이드의 발현, 및 표적 세포의 바이러스-매개된 파괴 및 다분 폴리펩타이드의 발현의 결과로서 표적 세포의 효과기 세포-매개된 세포용해를 비롯한, 다중(예를 들어, 이중) 작용 모드를 가질 수 있다. 본 개시내용은 조작된 종양용해성 바이러스를 포함하는 치료 조성물 및 고형 종양 및 혈액 악성 종양의 치료에 사용하는 방법을 추가로 제공한다.
요약
일부 실시형태에서, 본 발명은 위형 종양용해성 바이러스, 이의 조성물 및 암의 치료를 위한 사용 방법을 제공한다. 본 명세서에 제공된 위형 종양용해성 바이러스는 인게이저 폴리펩타이드 및/또는 다른 치료 분자(예를 들어, 치료적 폴리펩타이드)를 암호화하는 재조합 핵산을 포함한다. 전형적으로, 인게이저 폴리펩타이드는 효과기 세포 인게이저로서 기능하고, 일반적으로 효과기 세포(예를 들어, 활성화 도메인 또는 인게이저 도메인) 상에서 발현된 활성화 분자에 대해서 지향되는 제1 도메인 및 표적 세포 항원(예를 들어, 항원 인식 도메인) 또는 세포-표면 분자(예를 들어, 치료 분자 도메인)에 대해서 지향되는 제2 도메인을 포함한다. 또한 이분, 삼분 또는 다분 폴리펩타이드(예를 들어, 하나 또는 다수의 인게이저 도메인, 하나 또는 다수의 항원 인식 도메인 또는 하나 또는 다수의 치료 분자 도메인, 및 임의로 하나 또는 다수의 다른 기능성 도메인을 포함함)가 제공된다.
또한 암의 치료 방법이 제공되며, 이 방법은 이를 필요로 하는 인간 대상체에게 치료적 유효량의 종양용해성 바이러스 또는 본 명세서에 제공된 이의 약제학적 조성물을 전달하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 인간 대상체에게 추가적인 암 요법, 예컨대, 수술, 방사선, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법 또는 이들의 조합물을 전달하는 단계를 포함한다.
정의
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 그 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다.
본 명세서 전체에서, 그 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함한다" 또는 변형, 예컨대, "포함하다" 또는 "포함하는"은 언급된 요소 또는 정수 또는 요소 또는 정수의 군을 포함하는 것을 의미하지만, 임의의 다른 요소 또는 정수 또는 요소 또는 정수의 군을 배제하지 않는다.
본 출원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략적으로"는 동등한 것으로서 사용된다. 약/대략적으로와 함께 또는 그것 없이 본 출원에서 사용된 임의의 수치는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 인지되는 임의의 일반적인 변동을 포괄하는 의미이다. 특정 실시형태에서, 용어 "대략적으로" 또는 "약"은 달리 언급하거나 또는 그 문맥이 달리 입증하지 않는 한 언급된 참조 값의 양방향(초과 또는 미만)으로의 30%, 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만에 포함되는 다양한 값을 지칭한다(이러한 수치가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우 제외).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "대상체" 또는 "대상체들" 또는 "개체"는 포유동물, 예컨대, 인간 또는 비-인간 포유동물, 예컨대, 애완 동물, 농업용 동물 또는 야생 동물, 뿐만 아니라 조류 및 수중 동물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 가축, 예컨대, 소, 양, 염소, 젖소, 돼지 등; 가금류, 예컨대, 닭, 오리, 거위, 칠면조 등; 및 애완동물, 예컨대, 개 및 고양이이다. 일부 실시형태에서(예를 들어, 특히 연구 문맥에서) 대상체는 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터), 토끼, 영장류 또는 돼지, 예컨대, 근친 교배 돼지 등이다. 특별한 실시형태에서, 대상체는 인간이다. "환자"는 질환, 장애 또는 병태을 앓고 있거나 또는 이의 발생 위험이 있거나 또는 본 명세서에 제공된 조성물 및 방법을 달리 필요로 하는 대상체이다. 이러한 용어 중 어느 것도 헬쓰 케어 종사자(예를 들어, 의사, 공인 간호사, 임상 간호사, 의료 보조자, 잡역부 또는 호스피스 종사자)의 감독(예를 들어, 지속적 또는 간헐적)을 특징으로 하는 상황을 필요로 하거나 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 병태의 치료 또는 개선에서의 성공의 임의의 표시를 지칭한다. 치료하는 또는 치료는 생체내 및/또는 시험관내에서 수행될 수 있고, 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스 또는 이의 조성물을 이를 필요로 하는 환자 또는 대상체에게 전달하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료하는은 예를 들어, 질환 또는 병태의 1종 이상의 증상의 중증도를 감소, 지연 또는 완화시키는 것 및/또는 대상체 또는 환자가 질환, 결함, 장애 또는 부정적인 병태를 겪는 빈도를 감소시키는 것을 포함한다. 본 명세서에서, "치료하다 또는 예방하다"는 본 명세서에서 일부 수준의 질환 또는 병태의 치료 또는 개선을 초래하는 방법을 지칭하기 위해서 본 명세서에서 사용되며, 병태의 예방을 포함하지만 이것으로 전적으로 제한되지 않는, 그 목적을 달성하는 것에 관련된 다양한 결과를 고려한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "예방하는"은 환자 또는 대상체에서 질환 또는 병태, 예를 들어, 종양 형성의 예방을 지칭하고, "예방적 치료"로서 또한 지칭될 수 있다. 질환 발생의 예방은 질환의 증상의 완전한 예방, 질환 발병의 지연 또는 후속하여 발생하는 질환에서의 증상의 중증도의 경감을 지칭할 수 있다. 비제한적인 예시적인 예로서, 종양 또는 다른 형태의 암의 발생 위험이 있는 개체를 본 발명의 방법에 의해서 치료하여, 종양 또는 다른 형태의 암이 이후에 발생하지 않으면, 질환이 그 개체에서 적어도 일정 시간 기간에 걸쳐서 예방되었다.
용어 "치료적 유효량" 및 "치료적 유효 용량"은 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되고, 이로운 효과를 제공하거나 또는 해로운 이롭지 않은 사건을 달리 감소시키기에 충분한 종양용해성 바이러스 또는 이의 조성물의 양(예를 들어, 질환을 치료하기에 충분한 양 또는 용량)을 지칭한다. 치료적 유효량 또는 치료적 유효 용량에 포함되는 종양용해성 바이러스의 정확한 양 또는 용량은 치료 목적; 대상체 또는 환자의 체중, 성별, 연령 및 일반적인 건강; 투여 경로; 투여 시간; 및 치료하고자 하는 질환의 본성을 비롯한 다양한 인자에 좌우될 것이다. 주어진 대상체 또는 환자를 위한 치료적 유효량은 공지된 기술을 사용하여 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 확인 가능하다(예를 들어, 문헌[Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); 및 Pickar, Dosage Calculations (1999)] 참고).
"위형"은 바이러스 입자를 지칭하며, 여기서 바이러스 입자(예를 들어, 엔벨로프 또는 캡시드)의 일부는 이종 단백질, 예컨대, 이종 바이러스로부터 유래된 바이러스 단백질 또는 비-바이러스 단백질을 포함한다. 비-바이러스 단백질은 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 위형 바이러스는 i) 비-위형 바이러스에 비해서 변경된 향성, 및/또는 ii) 이롭지 않은 효과의 제거 또는 감소가 가능하다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 위형 바이러스는 비-위형 바이러스와 비교할 때 비-종양 세포 또는 비-종양 조직의 감소된 감염 또는 감소된 독성을 나타낸다.
용어 "표적화 모이어티"는 본 명세서에서 바이러스 입자와 선택된 세포 유형 간의 직접적인 상호작용을 위해서 선택된 세포 유형의 세포 표면 상의 단백질에 결합할 수 있는 바이러스 입자에 연결된 이종 단백질을 지칭한다. 표적화 모이어티는 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결될 수 있고, 일반적으로 엔벨로프 단백질, 예를 들어, E1, E2 또는 E3에 연결된다. 대표적인 표적화 모이어티는 항체, 항원 이의 결합 단편 및 수용체 리간드를 포함한다. 바이러스 "엔벨로프" 단백질 또는 "Env" 단백질은, 비리온의 표면 지질 이중층 상에 존재하고, 기능이 감염에 민감한 숙주 세포에 대한 흡수 및 이의 침투를 매개하는 것인 임의의 폴리펩타이드 서열을 지칭한다.
용어 "벡터"는 본 명세서에서 또 다른 핵산 분자를 전달 또는 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하기 위해서 사용된다. 전달된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 연결, 예를 들어, 그 내에 삽입된다. 벡터는 세포 내에서 자율적인 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나 또는 숙주 세포 DNA 내의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스(즉, 바이러스 벡터 또는 종양용해성 바이러스 벡터)이고, 수송된 핵산 서열은 인게이저 분자 및/또는 치료 분자를 암호화하는 재조합 핵산 서열이다. 바이러스 벡터는 때로는 "재조합 바이러스" 또는 "바이러스"라 지칭될 수 있다. 용어 "종양용해성 바이러스" 및 "종양용해성 벡터"는 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다.
"핵산 게놈" 또는 "바이러스 게놈"은 게놈의 복제 및/또는 통합에 필요한 임의의 단백질을 비롯한 바이러스 입자의 게놈을 암호화하는 바이러스 입자의 핵산 성분을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 바이러스 벡터로서 작용하고, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이종 유전자를 포함할 수 있다. 프로모터는 유전자에 대해서 네이티브 또는 이종일 수 있고, 기원이 바이러스성 또는 비-바이러스성일 수 있다. 본 명세서에 기술된 바이러스 게놈은 임의의 바이러스를 기반으로 할 수 있고, RNA 또는 DNA 게놈일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 바람직하게는, 핵산 게놈은 랍도바이러스과(Rhabdoviridae)로부터 유래된다.
"레트로바이러스 벡터"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 레트로바이러스과의 바이러스를 기반으로 하는 바이러스 벡터를 지칭한다. 이의 야생형(WT) 형태에서, 레트로바이러스 벡터는 전형적으로 핵산 게놈을 함유한다. 본 명세서에는 이종 유전자, 예컨대, 본 명세서에 기술된 재조합 핵산 서열을 또한 포함하는 위형 레트로바이러스 벡터가 제공된다.
용어 "항체 단편 또는 이의 유도체"는 적어도 하나의 CDR을 함유하고 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 이러한 용어는 추가로 단일 쇄 항체 또는 이의 단편, 합성 항체, 항체 단편, 예컨대, 낙타 Ig, Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단일 쇄 Fv 항체("scFv"), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 다이설파이드 안정화된 Fv 단백질("dsFv"), 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디) 등 또는 이들 중 임의의 것의 화학적으로 변형된 유도체에 관련된다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 상응하는 면역글로불린 쇄(들)는 단독으로 또는 조합으로 예를 들어, 아미노산 결실(들), 삽입(들), 치환(들), 부가(들), 및/또는 재조합(들) 및/또는 임의의 다른 변형(들)(예를 들어, 번역후 및 화학적 변형, 예컨대, 글리코실화 및 포스포릴화)를 사용함으로써 추가로 변형된다. 면역글로불린 쇄의 아미노산 서열에 근본적인 DNA 서열 내에 이러한 변형을 도입하는 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
용어 "단일쇄"는 본 개시내용에 따라서 사용되는 바와 같이 바람직하게는 단일 핵산 분자에 의해서 암호화된 동일 선형(co-linear) 아미노산 서열의 형태의, 2개 이상의 폴리펩타이드 서열의 공유 링키지를 지칭한다.
용어 "에 결합하는" 및 "와 상호작용하는"은 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되며, 서로와 적어도 2개의"항원-상호작용-부위"의 상호작용을 지칭한다. "항원-상호작용-부위"는 항원 또는 항원의 기와 특이적으로 상호작용할 수 있는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 모티프를 지칭한다. 결합/상호작용은 또한 "특이적 상호작용" 또는 "특이적 결합"을 정의하는 것으로 이해된다.
용어 "특이적 결합" 또는 "특이적 상호작용"은 본 명세서에 정의된 바와 같은 표적 분자의 적어도 2개의 아미노산과 특이적으로 상호작용할 수 있고/할 수 있거나 이것에 특이적으로 결합할 수 있는 항원-상호작용-부위를 지칭한다. 이 용어는 본 명세서에 정의된 표적 분자의 특이적 영역(예를 들어, 에피토프) 사이를 구별하는 항원-상호작용-부위의 능력에 관한 것이어서, 이것은 유사한 구조의 폴리펩타이드와 교차 반응하지 않거나 본질적으로 교차 반응하지 않는다. 일부 실시형태에서, 에피토프는 선형이다. 일부 실시형태에서, 에피토프는 인간 표적 분자 또는 이의 부분의 2개의 영역으로 이루어진 입체 배좌 에피토프, 구조 에피토프 또는 불연속적 에피토프이다. 본 개시내용과 관련하여, 입체 배좌 에피토프는 접힌 단백질의 표면 상에 함께 모인 1차 서열 내에서 분리된 2개 이상의 별개의 아미노산 서열에 의해서 정의된다. 관찰 시의 항원 결합 작제물의 패널의 특이성 및/또는 교차 반응성은 예를 들어, 종래의 조건 하에서 관심대상 폴리펩타이드에 대한 작제물의 패널의 결합뿐만 아니라 (구조적으로 및/또는 기능적으로) 더 또는 덜 밀접하게 관련된 폴리펩타이드의 수를 평가함으로써 시험될 수 있다(예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 and Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999] 참고). 관심대상 폴리펩타이드/단백질에 결합하고, 다른 폴리펩타이드의 임의의 것에 결합하지 않거나 본질적으로 결합하지 않는 이러한 작제물 만이 관심대상 폴리펩타이드/단백질에 대해서 특이적이라고 간주된다. 항원-상호작용-부위와 특이적 항원의 특이적 상호작용의 예는, 특히, 이의 특이적 수용체에 결합할 때 신호를 유도하는 리간드의 상호작용, 이의 수용체에 대한 리간드, 예컨대, 특이적 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인의 특이성, 및 항원 에피토프에 대한 항체의 항원 결합 부위의 결합을 포함한다.
일부 예에서, 항원-상호작용-부위와 특이적 항원의 특이적 상호작용은 예를 들어, 항원의 입체 변화, 항원의 올리고머화의 변화의 유도 등으로 인해서 신호의 개시를 초래한다. 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 "열쇄-자물쇄-원리"를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 항원-상호작용-부위의 아미노산 서열 내의 특이적 모티프는 항원 내의 특이적 모티프와 상호작용하고, 이의 1차, 2차 또는 3차 구조의 결과로서, 또는 상기 구조의 2차 변형의 결과로서 서로에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원-상호작용-부위와 이의 특이적 항원의 특이적 상호작용은 항원에 대한 부위의 단순한 결합을 초래한다.
종양용해성 바이러스
종양용해성 바이러스는 종양 세포를 감염시키고, 종양 세포 내에서 복제하고, 종양 세포를 용해시킬 수 있고, 추가로 연속적인 복제 라운드에서 다른 종양 세포로 확산될 수 있다. 과거의 종양용해성 바이러스 요법은 전임상 모델 및 임상 연구에서 가능성을 나타내었지만, 이러한 종양용해성 바이러스, 예컨대, 백시니아의 항-종양 효능은 최적이 아니었다. 예를 들어, 이러한 바이러스는 종양 전체에서 제한된 바이러스 확산 및/또는 종양 내에서 항-종양 T 세포 반응의 제한된 활성화를 나타내었다. 따라서, 본 개시내용은 1) 종양 침윤 및 효과기 세포(예를 들어, T 세포)의 활성화를 용이하게 하고, 2) 바이러스로 감염되지 않은 종양 세포를 효과적으로 용해(바이-스탠더 살해(by-stander killing)라고도 공지됨)시키는 종양용해성 바이러스를 제공한다.
일부 실시형태에서, 하기 특성 중 1종 이상을 포함하는 이점을 갖는 바이러스 벡터가 제공된다:
(i) 벡터는 종양용해성이고, 다른 이미 기술된 종양용해성 바이러스 벡터에 비해서 특별하게 높은 종양용해성 활성도를 가짐;
(ii) 벡터는 종양 세포 내에서 우선적으로 복제하고, 종양용해성 바이러스 벡터에 비해서 특별하게 높은 복제 능력을 가짐;
(iii) 벡터는 분화 중인 세포뿐만 아니라 휴지기 세포를 능동적으로 감염시킴;
(iv) 벡터는 강한 선천적인 채액성 세포 면역 반응을 유도함;
(v) 벡터는 순수하게 세포질에서(cytoplasmatically) 복제하고, 즉, RNA 바이러스로서 이것은 숙주 세포 게놈 내에 통합될 수 없거나 또는 복제-수용성 바이러스 내에서 재조합될 수 없음;
(vi) 벡터는 패키징하기에 용이함; 및/또는
(vii) 네이티브 바이러스 당단백질은 외부 엔벨로프 단백질과 상호 교환 가능함.
본 발명의 일부 실시형태는 재조합 수포성 구내염 바이러스(VSV) 및 VSV 벡터에 관한 것이다. VSV 게놈은 5종의 유전자, l, m, n, p 및 g를 포함하는데, 이것은 단백질 L, M, N, P 및 G를 암호화하고, 바이러스의 재생에 필수적이다. N은 VSV 게놈 RNA를 패키징하는 핵단백질이다. VSV 게놈은 RNA-단백질 복합체로서 복제되고, L 및 P는 VSV 게놈을 복제하고, VSV mRNA를 전사시키는 중합효소 복합체를 함께 형성한다. M은 지질 엔벨로프와 핵캡시드 간의 구조적 지지를 제공하는 매트릭스 단백질이고, 세포막에서 발아(sprouting)하는 입자에 중요하다. G는 바이러스 엔벨로프 내에 혼입된 엔벨로프 단백질이고, 바이러스의 감염성 및 향성에 필수적이다.
위형 종양용해성 바이러스
일부 실시형태에서, 본 발명은 위형일 수 있거나 달리 조작될 수 있는 종양용해성 바이러스를 제공한다. "위형 바이러스"는 바이러스 코트 단백질(예를 들어, 엔벨로프 단백질) 중 1종 이상이 대체되거나 조작된 바이러스를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 위형 바이러스는 상응하는 비-위형 바이러스가 감염시킬 수 없는 세포 또는 조직 유형을 감염시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 위형 바이러스는 비-위형 바이러스에 비해서 세포 또는 조직 유형을 우선적으로 감염시킬 수 있다.
일반적으로, 바이러스는 이것이 가장 효율적으로 감염시키는 자연 숙주 세포 집단을 갖는다. 예를 들어, 레트로바이러스는 제한된 자연 숙주 세포 범위를 갖는 반면, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스는 비교적 더 넓은 범위의 숙주 세포를 효율적으로 감염시킬 수 있지만, 일부 세포 유형은 이러한 바이러스에 의한 감염에 대해서 난치성이다. 바이러스(예를 들어, 엔벨로프 단백질 또는 캡시드 단백질)의 표면 상의 단백질은 민감한 숙주 세포에 대한 부착 및 이것 내로의 도입을 매개함으로써, 바이러스의 향성, 즉, 특정 세포 또는 조직 유형을 감염시키는 특정 바이러스의 능력을 결정한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스는 바이러스의 표면 상에 단일 유형의 단백질을 포함한다. 예를 들어, 레트로바이러스 및 아데노-연관 바이러스는 이의 막을 코팅하는 단일 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스는 바이러스의 표면 상에 하나 초과의 유형의 단백질을 포함한다. 예를 들어, 아데노바이러스는 바이러스의 표면으로부터 멀리 연장되는 엔벨로프 단백질 및 섬유 둘 모두로 코팅된다.
바이러스의 표면 상의 단백질은 세포-표면 분자, 예컨대, 헤파린 설페이트에 결합함으로써, 잠재적인 숙주 세포의 표면에 바이러스를 국지화할 수 있다. 바이러스의 표면 상의 단백질은 또한 바이러스 유입을 매개하기 위해서 바이러스 단백질의 구조적 변화를 유도하는 숙주 세포 상에서 발현된 특이적 단백질 수용체와 바이러스 간의 상호작용을 매개할 수 있다. 대안적으로, 바이러스의 표면 상의 단백질과 세포 수용체 간의 상호작용은 엔도솜 내로의 바이러스 내재화를 용이하게 할 수 있고, 여기서 엔도솜 내강의 산성화는 바이러스 코트의 재접힘을 유도한다. 두 경우에, 잠재적인 숙주 세포 내로의 바이러스 유입은 바이러스의 표면 상의 적어도 하나의 분자와 세포의 표면 상의 적어도 하나의 분자 간의 바람직한 상호작용을 요구한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스는 바이러스 코트(예를 들어, 바이러스 엔벨로프 또는 바이러스 캡시드)를 포함하고, 여기서 바이러스 코트의 표면 상에 존재하는 단백질(예를 들어, 바이러스 엔벨로프 단백질 또는 바이러스 캡시드 단백질)은 바이러스 유입에 대한 잠재적인 표적 세포의 인식을 조정한다. 일부 예에서, 바이러스에 의한 유입에 대해서 잠재적인 표적 세포를 결정하는 이러한 과정을 숙주 향성이라 지칭한다. 일부 실시형태에서, 숙주 향성은, 수용체의 바이러스 인식이 세포 수준에서 일어나는 세포 향성 또는 세포 수용체의 바이러스 인식이 조직 수준에서 일어나는 조직 향성이다. 일부 예에서, 바이러스의 바이러스 코트는 단일 유형의 세포 상에 존재하는 수용체를 인식한다. 다른 예에서, 바이러스의 바이러스 코트는 다수의 세포 유형(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 초과의 상이한 세포 유형) 상에 존재하는 수용체를 인식한다. 일부 예에서, 바이러스의 바이러스 코트는 단일 유형의 조직 상에 존재하는 세포 수용체를 인식한다. 다른 예에서, 바이러스의 바이러스 코트는 다수의 조직 유형(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 초과의 상이한 조직 유형) 상에 존재하는 세포 수용체를 인식한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스는 특정 세포 또는 조직 유형에 대한 바이러스 유입을 용이하게 하기 위해서 상이한 바이러스로부터의 표면 단백질을 혼입하도록 변형된 바이러스 코트를 포함한다. 이러한 종양용해성 바이러스를 본 명세서에서 위형 종양용해성 바이러스라 지칭한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 바이러스 코트를 포함하는데, 여기서 제1 바이러스의 바이러스 코트는 제2의 바이러스 코트와 교환되고, 여기서 제2 바이러스의 바이러스 코트는 위형 종양용해성 바이러스가 특정 세포 또는 조직 유형을 감염시킬 수 있게 한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 코트는 바이러스 엔벨로프를 포함한다. 일부 예에서, 바이러스 엔벨로프는 인지질 이중층 및 단백질, 예컨대, 숙주막으로부터 수득된 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 엔벨로프는 숙주 세포에 의해서 발현된 수용체에 대한 인식 및 부착을 위한 당단백질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 코트는 캡시드를 포함한다. 일부 예에서, 캡시드는 프로모터라 지칭되는 올리고머 단백질 소단위로부터 조립된다. 일부 실시형태에서, 캡시드는 하나의 유형의 프로모터 또는 단백질로부터 조립되거나 또는 2, 3, 4 또는 그 초과의 유형의 프로모터 또는 단백질로부터 조립된다.
일부 실시형태에서, 종양용해성 요법의 목적을 위해서 종양용해성 바이러스에 의한 형질도입에 민감한 세포의 범위를 제한 또는 확장시키는 것이 이롭다. 이를 위해서, 내인성 바이러스 코트 단백질(예를 들어, 바이러스 엔벨로프 또는 캡시드 단백질)이 다른 바이러스로부터의 바이러스 코트 단백질 또는 키메라 단백질에 의해서 대체된 다수의 바이러스를 개발하였다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 비리온 내의 혼입에 필수적인 바이러스 단백질, 뿐만 아니라 특이적 숙주 세포 단백질과 상호작용하도록 설계된 단백질 또는 핵산의 부분, 예컨대 표적화 모이어티로 구성된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 위형 종양용해성 바이러스는 바이러스 향성을 제한 또는 제어하기 위해서(즉, 위형 종양용해성 바이러스가 감염시킬 수 있는 세포 또는 조직 유형의 수를 감소시키기 위해서) 위형화된다. 향성을 제한하도록 채택된 대부분의 전략은 키메라 바이러스 코트 단백질(예를 들어, 엔벨로프 단백질) 연결된 항체 단편을 사용하였다. 이러한 바이러스는 종양용해성 요법의 개발을 위해서 상당히 유망하였다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 위형 종양용해성 바이러스는 바이러스 향성을 확장시키기 위해서(즉, 위형 종양용해성 바이러스가 감염시킬 수 있는 세포 또는 조직 유형의 수를 증가시키기 위해서) 위형화된다. 바이러스(예를 들어, 엔벨로핑된 바이러스)의 세포 향성을 확장시키기 위한 하나의 기전은 표현형적으로 혼합된 입자 또는 위형의 형성, 즉 2종 이상의 바이러스로 감염된 세포 내에서 바이러스 조립 동안 일반적으로 일어나는 과정을 통한 것이다. 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1). HIV1은 적절한 공동-수용체를 갖는 CCR4를 발현하는 세포를 감염시킨다. 그러나, HIV1은 표현형 혼합을 통한 이종 당단백질(GP)의 혼입에 의해서 위형을 형성하여, 그 바이러스는 CD4 수용체 및/또는 적절한 공동-수용체를 발현하지 않는 세포를 감염시킴으로써, 바이러스의 향성을 확장시킬 수 있다. 몇몇 연구는, 친이종(xenotropic) 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 앰포트로픽(amphotropic) MLV 또는 단순 포진 바이러스로 감염된 세포에서 생산된 야생형 HIV-1은 확장된 숙주 범위를 갖는 표현형적으로 혼합된 비리온을 발생시키는데, 이는 위형 비리온이 생산되었음을 입증하였다. 바이러스 GP의 표현형 혼합은 또한 공동감염된 세포 배양물에서 HIV-1과 VSV 사이에서 일어난다고 밝혀져 있다. 이러한 이전 관찰은 이종 GP를 보유한 HIV-1-기반 렌티바이러스 벡터의 후속 설계에 대한 열쇠였다.
각각 특이적 이점 및 단점을 갖는, 표현형 렌티바이러스를 위한 대안적인 GP의 계속적으로 증가되는 목록이 존재한다. 위형 렌티바이러스에 대한 VSV G-단백질(VSV-G)의 광범위한 사용은 이러한 GP를 사실상 위형을 형성하기 위해서 다른 바이러스 GP의 유용성이 비교되는 표준품으로 만들었다. 렌티바이러스 위형의 추가적인 비제한적인 예는 라이사바이러스(lyssavirus)-유래된 GP 보유 위형, 림프구성 맥락 수막염 바이러스 GP 보유 위형 렌티바이러스, 알파바이러스 GP 보유 렌티바이러스 위형(예를 들어, RRV 및 SFV GP를 갖는 렌티바이러스 벡터 위형, 신드비스(sindbis) 바이러스 GP를 갖는 렌티바이러스 벡터 위형), 필로바이러스 GP 보유 위형, 및 바쿨로바이러스 GP64 함유 렌티바이러스 벡터 위형을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된(예를 들어, 위형) 바이러스는 전형적으로 종양 세포 상에서 발현된 단백질, 지질 또는 탄수화물에 대한 결합에 의해서 종양 및/또는 종양 세포에 결합할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 바이러스는 바이러스를 특정 숙주 세포에 안내하는 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 관련 기술 분야에 공지되거나 또는 별개로 발현되거나 또는 특정 세포 또는 조직 유형(예를 들어, 종양 또는 종양 세포, 또는 종양 연관된 기질 또는 기질 세포) 상에 달리 존재하는 임의의 세포 표면 생물학적 물질은 본 발명의 종양용해성 바이러스를 위한 잠재적인 표적으로서 사용될 수 있다. 특별한 실시형태에서, 세포 표면 물질은 단백질이다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 질환, 예컨대, 암(예를 들어, 유방, 폐, 난소, 전립선, 결장, 림프종, 백혈병, 흑색종 등); 자가면역 질환(예를 들어, 중근 근무력증, 다발성 경화증, 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 진성 당뇨병 등); HIV, HCV, HBV, CMV 및 HPV에 의한 감염을 비롯한 감염성 질환; 및 겸상 적혈구 빈혈, 낭성 섬유증, Tay-Sachs, J3-지중해빈혈, 신경섬유종증, 다발성 낭포신 질환, 혈우병 등을 비롯한 유전 질환을 나타내는 세포 표면 항원에 결합한다. 특정 실시형태에서, 표적화 모이어티는 특정 세포 또는 조직 유형에 특이적인 세포 표면 항원, 예를 들어, 신경, 폐, 신장, 근육, 혈관, 갑상선, 눈, 유방, 난소, 고환 또는 전립선 조직에 존재하는 세포-표면 항원을 표적으로 한다.
표적화를 위한 예시적인 항원 및 세포 표면 분자는 예를 들어, P-당단백질, Her2/Neu, 에리쓰로포이에틴(erythropoietin)(EPO), 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGF-R), 카데린, 암배아 항원(CEA), CD4, CD8, CD19, CD20, CD33, CD34, CD45, CD117(c-키트), CD133, HLA-A. HLA-B, HLA-C, 케모카인 수용체 5(CCR5), 줄기 세포 마커 ABCG2 수송인자, 난소 암 항원 CA125, 면역글로불린, 인테그린, 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 수지상 세포-특이적 세포내 접착 분자 3-그래빙 논인테그린(grabbing nonintegrin)(DC-SIGN), 티로글로불린, 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 근원성 분화 촉진 인자-1(MyoD-1), Leu-7(CD57), LeuM-1, 단클론성 항체 Ki-67(Ki-67)에 의해서 정의된 세포 증식-연관 인간 핵 항원, 바이러스 엔벨로프 단백질, HIV gp120, 트랜스페린 수용체 등을 포함한다. 표적화를 위한 추가적인 항원 및 세포 표면 분자를 표 2에 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 위형 종양용해성 바이러스는 종양 세포를 선택적으로 유입, 복제 및/또는 용해시킬 수 있다. 이러한 실시형태를 도 36에 도시하는데, 여기서 위형 종양용해성 바이러스는 위형 종양용해성 바이러스가 표적 세포로 유입될 수 있게 하는 상이한(즉, 이종) 바이러스로부터 유래된 바이러스 당단백질의 혼입으로 인해서 표적 세포에 대한 유입의 이득을 얻는다. 이에 반해서, 비-위형 종양용해성 바이러스는 엔벨로프 단백질의 비-허용적 본성으로 인해서 표적 세포 내로의 유입의 이득을 얻을 수 없다. 일부 예에서, 종양 세포를 선택적으로 유입시키고/거나 복제하고/거나 용해시키는 위형 종양용해성 바이러스의 능력은 감소된 또는 달리 효과가 없는 세포 인터페론(IFN) 반응으로 인한 것이다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 세포 IFN 반응을 방해하거나 손상시킴으로써, 위형 또는 조작된 바이러스의 복제를 향상시키는, 인게이저 분자 및/또는 치료 분자, 예컨대, 면역 조정 폴리펩타이드를 생산한다.
본 명세서에 기술된 위형 종양용해성 바이러스는 다양한 바이러스로부터 유래될 수 있고, 이의 비제한적인 예는 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스 1(HSV1), 점액종 바이러스, 레오바이러스, 폴리오바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 홍역 바이러스(MV), 라사 바이러스(LASV) 및 뉴캐슬병 바이러스(NDV)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 위형 종양용해성 바이러스는 실질적으로 임의의 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 종양용해성 요법에 사용하기 위한 예시적인 렌티바이러스는 VSV로부터의 엔벨로프 단백질, G-단백질(GP)로 코팅된 유인원 면역결핍 바이러스이다. 일부 예에서, 이러한 바이러스는 VSV G-위형 렌티바이러스라 지칭되며, 세포의 거의 전체 집합을 감염시킨다고 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 위형 종양용해성 바이러스는 건강한 뇌 세포, 즉, 뉴런에 대한 위형 VSV 바이러스이고, 상당히 감소된 독성을 나타낸다. 향신경성은 종양용해성 VSV의 모든 응용에서 용량-제한 인자이기 때문에, 본 발명의 일부 실시형태에 따른 벡터의 사용은 고형 종양의 모든 종양 유형에 대해서 사용된다는 것이다.
일부 실시형태에서, 위형 VSV 벡터는 하기를 비롯한 1종 이상의 주요 속성을 갖지만: (i) VSV는 세포-독성이 아님; (ii) 벡터는 감염력의 손실 없이 초원심분리에 의해서 농축됨; 및 (iii) 벡터는 종양 세포에 대해서 향성을 나타냄, 뉴런 및 다른 비-종양 세포는 비효율적으로 감염된다. 치료 용도에서 복제 가능한 바이러스의 사용 동안 안정성을 증가시키기 위해서, 본 발명의 일부 실시형태는 적어도 2종의 복제-결핍 상호 보완 벡터에 의해서 감염된 세포 내에서만 VSV 바이러스의 복제, 종양용해 및 생산이 일어나는 것을 보장하는 벡터 시스템을 제공한다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스를 생성시키기 위한 유전 물질(예를 들어, 바이러스 코트 단백질 또는 코어 유전 물질)은 DNA 바이러스, RNA 바이러스 또는 두 바이러스 유형 모두로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, DNA 바이러스는 단일-가닥(ss) DNA 바이러스, 이중-가닥(ds) DNA 바이러스 또는 ss 및 ds DNA 영역 둘 모두를 함유하는 DNA 바이러스이다. 일부 실시형태에서, RNA 바이러스는 단일-가닥(ss) RNA 바이러스 또는 이중-가닥(ds) RNA 바이러스이다. 일부 실시형태에서, ssRNA 바이러스는 추가로 포지티브-센스 RNA 바이러스 또는 네거티브-센스 RNA 바이러스로 추가로 분류된다.
일부 예에서, 위형 종양용해성 바이러스를 생성시키기 위한 유전 물질은 하기 과 중 임의의 하나의 dsDNA 바이러스로부터 수득된다: 미오바이러스과(Myoviridae), 포도바이러스과(Podoviridae), 시포바이러스과(Siphoviridae), 알로허피스바이러스과(Alloherpesviridae), 허피스바이러스과(herpesviridae), 말라코허피스바이러스과(Malacoherpesviridae), 리포트릭스바이러스과(Lipothrixviridae), 루디바이러스과(Rudiviridae), 아데노바이러스과, 암풀라바이러스과(Ampullaviridae), 아스코바이러스과(Ascoviridae), 아스파바이러스과(Asfaviridae), 바큘로바이러스과(Baculoviridae), 비카우다바이러스과(Bicaudaviridae), 클라바바이러스과(Clavaviridae), 코티코바이러스과(Corticoviridae), 푸셀로바이러스과(Fuselloviridae), 글로불로바이러스과(Globuloviridae), 구타바이러스과(Guttaviridae), 하이트로사바이러스과(Hytrosaviridae), 이리도바이러스과(Iridoviridae), 마세일레바이러스과(Marseilleviridae), 미미바이러스과(Mimiviridae), 니마바이러스과(Nimaviridae), 판도라바이러스과(Pandoraviridae), 파필로마바이러스과(Papillomaviridae), 피코드나바이러스과(Phycodnaviridae), 플라스마바이러스과(Plasmaviridae), 폴리드나바이러스(Polydnaviruses), 폴리오마바이러스(Polyomaviridae), 폭스바이러스과(Poxviridae), 스파에롤리포바이러스과(Sphaerolipoviridae) 또는 텍티바이러스과(Tectiviridae).
일부 경우에, 위형 종양용해성 바이러스를 생성시키기 위한 유전 물질은 하기 과 중 임의의 하나의 ssDNA 바이러스로부터 수득된다: 아넬로바이러스과(Anelloviridae), 바실라리오드나바이러스과(Bacillariodnaviridae), 비드나바이러스과(Bidnaviridae), 서코바이러스과(Circoviridae), 제미니바이러스과(Geminiviridae), 이노바이러스과(Inoviridae), 마이크로바이러스과(Microviridae), 나노바이러스과(Nanoviridae), 파보바이러스과(Parvoviridae) 또는 스피라바이러스과(Spiraviridae).
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스를 생성시키기 위한 유전 물질은 ssDNA 및 dsDNA 영역 둘 모두를 함유하는 DNA 바이러스로부터 수득된다. 일부 경우에, DNA 바이러스는 플레오리포바이러스(pleolipoviruse)로부터 유래된다. 일부 경우에, 플레오리포바이러스는 할로아르쿨라 히스파니카 플레오모르픽 바이러스 1(Haloarcula hispanica pleomorphic virus 1), 할로게오메트리컴 플레오모픽 바이러스 바이러스 1(Halogeometricum pleomorphic virus 1), 할로루브럼 플레오모픽 바이러스 1(Halorubrum pleomorphic virus 1), 할로루브럼 플레오모픽 바이러스 2, 할로루브럼 플레오모픽 바이러스 3 또는 할로루브럼 플레오모픽 바이러스 6을 포함한다.
일부 경우에, 위형 종양용해성 바이러스를 생성시키기 위한 유전 물질은 하기 과 중 임의의 하나의 dsDNA 바이러스로부터 수득된다: 비르나바이러스과(Birnaviridae), 크라이소바이러스과(Chrysoviridae), 카이스토바이러스과(Cystoviridae), 엔도나바이러스과(Endornaviridae), 하이포바이러스과(Hypoviridae), 메가비르나바이러스과(Megavirnaviridae), 파티티바이러스과(Partitiviridae), 피코비르나바이러스과(Picobirnaviridae), 레오바이러스과(Reoviridae), 로타바이러스(Rotavirus) 또는 토티바이러스과(Totiviridae).
일부 예에서, 위형 종양용해성 바이러스를 생성시키기 위한 유전 물질은 하기 과 중 임의의 하나의 포지티브-센스 ssRNA바이러스로부터 수득된다: 알파플렉시바이러스과(Alphaflexiviridae), 알파테트라바이러스과(Alphatetraviridae), 알버나바이러스과(Alvernaviridae), 아르테리바이러스과(Arteriviridae), 아스트로바이러스과(Astroviridae), 바르나바이러스과(Barnaviridae), 베타플렉시바이러스과(Betaflexiviridae), 브로모바이러스과(Bromoviridae), 칼리시바이러스과(Caliciviridae), 카르모테트라바이러스과(Carmotetraviridae), 클로스테로바이러스과(Closteroviridae), 코로나바이러스과(Coronaviridae), 디시스트로바이러스과(Dicistroviridae), 플라비바이러스과(Flaviviridae), 감마플렉시바이러스과(Gammaflexiviridae), 이플라바이러스과(Iflaviridae), 레비바이러스과(Leviviridae), 루테오바이러스과(Luteoviridae), 마르나바이러스과(Marnaviridae), 메소니바이러스과(Mesoniviridae), 나르나바이러스과(Narnaviridae), 노다바이러스과(Nodaviridae), 퍼무토테트라바이러스과(Permutotetraviridae), 피코나바이러스과, 포티바이러스과(Potyviridae), 로니바이러스과(Roniviridae), 세코바이러스과(Secoviridae), 토가바이러스과(Togaviridae), 톰부스바이러스과(Tombusviridae), 티모바이러스과(Tymoviridae) 또는 비르가바이러스과(Virgaviridae).
일부 경우에, 위형 종양용해성 바이러스를 생성시키기 위한 유전 물질은 하기 과 중 임의의 하나의 네거티브-센스 ssRNA 바이러스로부터 수득된다: 보르나바이러스과(Bornaviridae), 필로바이러스과(Filoviridae), 파라마이옥소바이러스과(Paramyxoviridae), 랍도바이러스과, 나이아미바이러스과(Nyamiviridae), 바에나바이러스과(Arenaviridae), 부나이아바이러스과(Bunyaviridae), 오피오바이러스과(Ophioviridae) 또는 오쏘마이옥소바이러스과(Orthomyxoviridae).
일부 예에서, 위형 종양용해성 바이러스를 생성시키기 위한 유전 물질은 아이소카헤드럴(isocahedral) 또는 복합체인 캡시드 대칭을 포함하는 종양용해성 DNA 바이러스로부터 수득된다. 일부 경우에, 아이소사헤드럴(isosahedral) 종양용해성 DNA 바이러스는 네이키드이거나 또는 엔벨로프를 포함한다. 종양용해성 DNA 바이러스의 예시적인 과는 아데노바이러스과(예를 들어, 아데노바이러스, 36 내지 38kb의 게놈 크기를 가짐), 허피스바이러스과(Herpesviridae)(예를 들어, HSV1, 120 내지 200kb의 게놈 크기를 가짐), 및 폭스바이러스과(Poxviridae)(예를 들어, 백시니아 바이러스 및 점액종 바이러스, 130 내지 280kb의 게놈 크기를 가짐).
일부 경우에, 위형 종양용해성 바이러스를 생성시키기 위한 유전 물질은 20면체 또는 나선형 캡시드 대칭을 갖는 것을 포함하는 종양용해성 RNA 바이러스로부터 수득된다. 일부 경우에, 20면체 종양용해성 바이러스는 엔벨로프 없이 네이키드이고, 레오바이러스과(예를 들어, 레오바이러스, 22 내지 27kb의 게놈을 가짐) 및 피코나바이러스과(예를 들어, 폴리오바이러스, 7.2 내지 8.4kb의 게놈 크기를 가짐). 다른 경우에, 나선형 종양용해성 RNA 바이러스는 엔벨로핑되고, 랍도바이러스과(예를 들어, VSV, 13 내지 16kb의 게놈 크기를 가짐) 및 파라마이옥소바이러스과(예를 들어, MV 및 NDV, 16 내지 20kb의 게놈 크기를 가짐)를 포함한다.
일부 예에서, 위형 종양용해성 바이러스를 생성하기 위한 유전 물질은 바이러스, 예컨대, 아벨슨(Abelson) 백혈병 바이러스, 아벨슨 뮤린 백혈병 바이러스, 아벨슨 바이러스, 급성 폐쇄성 후두염 바이러스, 아델라이데 리버(Adelaide River) 바이러스, 아데노 연관 바이러스 군, 아데노바이러스, 아프리카 말병(African horse sickness) 바이러스, 아프리카 돼지 열 바이러스, AIDS 바이러스, 알류산 밍크병(Aleutian mink diease) 파보바이러스, 알파레트로바이러스, 알파바이러스, ALV 관련 바이러스, 아마파리 바이러스, 아프토바이러스, 아쿠아레오바이러스, 아보바이러스, 아보바이러스 C, 아보바이러스 군 A, 아보바이러스 군 B, 아레나바이러스 군, 아르헨티나 출혈열(Argentine hemorrhagic fever) 바이러스, 아르헨티나 출혈열 바이러스, 아르테리바이러스, 아스트로바이러스, 아텔린 허피스바이러스(Ateline herpesvirus) 코트 군, 아우제즈키병(Aujezky's disease) 바이러스, 아우라 바이러스, 아우스덕병(Ausduk diease) 바이러스, 호주 박쥐 라이사바이러스(Australian bat lyssavirus) 코트, 아비아데노바이러스, 조류 적혈모구증(avian erythroblastosis) 바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 림프종증 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 파라마익소바이러스, 조류 폐뇌염 바이러스, 조류 세망내피증 바이러스, 조류 육종 바이러스, 조류 유형 C 레트로바이러스 군, 아비헤파드나바이러스(Avihepadnavirus) 코트, 아비폭스바이러스(Avipoxvirus) 코트, B 바이러스, B19 바이러스, 바반키(Babanki) 바이러스, 개코원숭이 허피스바이러스, 바쿨로바이러스, 바마 포레스트(Barmah Forest) 바이러스, 베바루(Bebaru) 바이러스, 베리마흐(Berrimah) 바이러스, 베타레트로바이러스, 비르나바이러스, 비트너(Bittner) 바이러스, BK 바이러스, 블랙 크릭 캐널(Black Creek Canal) 바이러스, 블루텅(bluetongue) 바이러스, 볼리비아 출혈 열(Bolivian hemorrhagic fever) 바이러스, 보마병(Boma disease) 바이러스, 양 바이러스의 보더병(border disease), 보르나 바이러스, 소 알파허피스바이러스 1, 소 알파허피스바이러스 2, 소 코로나바이러스, 소 유행렬(bovine ephemeral fever) 바이러스, 소 면역결핍 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 소 백혈증 바이러스, 소 유두염 바이러스, 소 파필로마바이러스, 소 구진성 구내염 바이러스, 소 파보바이러스, 소 세포융합 바이러스, 소 유형 C 온코바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스, 버기 크릭(Buggy Creek) 바이러스, 불렛형(bullet shaped) 바이러스 군, 부나이암웨라(Bunyamwera) 바이러스 슈퍼그룹, 부나이아바이러스(Bunyavirus), 버킷(Burkitt's) 림프종 바이러스, "밤바열(Bwamba Fever), CA 바이러스, 칼리시바이러스(Calicivirus), 캘리포니아 뇌염(California 뇌염) 바이러스, 카멜폭스(camelpox) 바이러스, 카나리폭스(canarypox) 바이러스, 개 허피스바이러스, 개 코로나바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 개 허피스바이러스, 개 미소 바이러스(canine minute virus), 개 파보바이러스, 카노 델가디토(Cano Delgadito) 바이러스, 염소 관절염 바이러스, 염소 뇌염 바이러스, 염소 허피스 바이러스, 카프리폭스(Capripox) 바이러스, 카디오바이러스, 카비드(caviid) 허피스바이러스 1, 서코피테시드(Cercopithecid) 허피스바이러스 1, 서코피테신(cercopithecine) 허피스바이러스 1, 서코피테신 허피스바이러스 2, 찬디푸라(Chandipura) 바이러스, 창기놀라(Changuinola) 바이러스, 얼룩 메기(channel catfish) 바이러스, 샤르빌(Charleville) 바이러스, 수두 바이러스, 치쿤구니야(Chikungunya) 바이러스, 침팬지 허피스바이러스, 처브(chub) 레오바이러스, 연어(chum salmon) 바이러스, 코칼(Cocal) 바이러스, 은연어(Coho salmon) 레오바이러스, 구진(coital exanthema) 바이러스, 콜로라도 진드기 열(Colorado tick fever) 바이러스, 콜티바이러스, 콜롬비아 SK 바이러스, 감기 바이러스, 점염성 농창(contagious eethyma) 바이러스, 전염성 농포성 피부염(contagious pustular dermatitis) 바이러스, 코로나바이러스, 코리파타(Corriparta) 바이러스, 코리자(coryza) 바이러스, 카우폭스(cowpox) 바이러스, 콕사키(coxsackie) 바이러스, CPV(세포질 다각체병 바이러스: 세포질 polyhedrosis virus), 귀뚜라미 마비(cricket paralysis) 바이러스, 크림-콩고 출혈열(Crimean-Congo 출혈열) 바이러스, 크루프(croup) 연관 바이러스, 크립토바이러스, 카이포바이러스, 사이토메갈로바이러스, 사이토메갈로바이러스 군, 세포질 다각체 바이러스, 사슴 파필로마바이러스, 델타레트로바이러스, 뎅기 바이러스, 덴소바이러스, 데펜도바이러스(Dependovirus), 도리(Dhori) 바이러스, 디플로마(diploma) 바이러스, 초파리 C 바이러스, 오리 B형 간염 바이러스, 오리 간염 바이러스 1, 오리 간염 바이러스 2, 듀오바이러스, 듀벤헤이즈(Duvenhage) 바이러스, 변형 날개(Deformed wing) 바이러스 DWV, 동부 마 뇌염 바이러스, 동부 마 뇌척수염 바이러스, EB 바이러스, 에볼라 바이러스, 에볼라-유사 바이러스, 에코 바이러스, 에코바이러스, 에코바이러스 10, 에코바이러스 28, 에코바이러스 9, 사지부전증 바이러스, EEE 바이러스, EIA 바이러스, EIA 바이러스, 뇌염 바이러스, 뇌척수 심근염 군 바이러스, 뇌척수 심근염 바이러스, 엔테로바이러스, 효소 증가 바이러스, 효소 증가 바이러스(LDH), 유행성 출혈열 바이러스, 동물 유행성 출혈병(epizootic hemorrhagic diease) 바이러스, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스, 말과 알파허피스바이러스 1, 말과 알파허피스바이러스 4, 말과 허피스바이러스 2, 말 흡수 바이러스, 말 동맥염 바이러스, 말 뇌증 바이러스, 말 감염성 빈혈증 바이러스, 말 홍역바이러스, 말 말비강폐렴 바이러스, 말 리노바이러스, 유베난구(Eubenangu) 바이러스, 유러피언 엘크(European elk) 파필로마바이러스, 유러피언 돼지 열 바이러스, 에버글레이즈(Everglades) 바이러스, 이아아크(Eyach) 바이러스, 필드 허피스바이러스 1, 고양이 칼리시바이러스, 고양이 피브로육종 바이러스, 고양이 허피스바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 고양이 백혈병/육종 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 고양이 파보바이러스, 고양이 육종 바이러스, 고양이 세포융합 바이러스, 필로바이러스, 플랜더스(Flanders) 바이러스, 플라비바이러스, 구제역(foot and mouth disease) 바이러스, 포트 모건(Fort Morgan) 바이러스, 포 코너스 한타(Four Corners hantavirus), 가금류아데노바이러스 1, 계두 바이러스, 프렌드(Friend) 바이러스, 감마레트로바이러스, GB 간염 바이러스, GB 바이러스, 저먼 홍역 바이러스, 게타(Getah) 바이러스, 긴판원숭이 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus), 선열(glandular fever) 바이러스, 산양두창 바이러스, 글든 쉬너(golden shinner) 바이러스, 고노메타(Gonometa) 바이러스, 거위 파보바이러스, 과립증 바이러스, 그로스 바이러스(Gross' virus), 들다람쥐 B형 간염 바이러스, 군 A 아르보바이러스, 구아나리토(Guanarito) 바이러스, 기니피그 거대세포바이러스, 기니피그 유형 C 바이러스, 한탄 바이러스, 한타바이러스, 하드 클램(hard clam) 레오바이러스, 토끼 섬유종 바이러스, HCMV(인간 거대세포바이러스), 적혈구흡착 바이러스 2, 일본 혈구응집성 바이러스, 출혈열 바이러스, 헨드라 바이러스, 헤니파바이러스, 헤파드나바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스 군, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, 델타형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, F형 간염 바이러스, G형 간염 바이러스, 비(non)A 비B 간염 바이러스, 간염 바이러스, 간염 바이러스(비인간), 간뇌척수염 레오바이러스 3, 간바이러스, 헤론 B형 간염 바이러스, 허피스 B 바이러스, 단순 포진 바이러스, 단순 포진 바이러스 1, 단순 포진 바이러스 2, 허피스바이러스, 허피스바이러스 7, 허피스바이러스 거미원숭이, 허피스바이러스 인간, 허피스바이러스 감염, 허피스바이러스 다람쥐원숭이(saimiri), 허피스바이러스 수이스(suis), 허피스바이러스 수두, 하이랜드(Highlands) J 바이러스, 히람 랍도바이러스(Hirame rhabdovirus), 돼지 콜레라 바이러스, 인간 아데노바이러스 2, 인간 알파허피스바이러스 1, 인간 알파허피스바이러스 2, 인간 알파허피스바이러스 3, 인간 B 림프친화성 바이러스, 인간 베타허피스바이러스 5, 인간 코로나바이러스, 인간 거대세포바이러스 군, 인간 포미(foamy) 바이러스, 인간 감마허피스바이러스 4, 인간 감마허피스바이러스 6, 인간 A형 간염 바이러스, 인간 허피스바이러스 군 1, 인간 허피스바이러스 군 2, 인간 허피스바이러스 군 3, 인간 허피스바이러스 군 4, 인간 허피스바이러스 6, 인간 허피스바이러스 8, 인간 면역결핍 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 1, 인간 면역결핍 바이러스 2, 인간 파릴로마바이러스, 인간 T 세포 백혈병 바이러스, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 I, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 II, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 III, 인간 T 세포 림프종 바이러스 I, 인간 T 세포 림프종 바이러스 II, 인간 T 세포 림프친화성 바이러스 유형 1, 인간 T 세포 림프친화성 바이러스 유형 2, 인간 T 림프친화성 바이러스 I, 인간 T 림프친화성 바이러스 II, 인간 T 림프친화성 바이러스 III, 치츠노바이러스, 영아 위장염(infantile gastroenteritis) 바이러스, 감염성 소 비강기관지염 바이러스, 감염성 조혈 괴사 바이러스, 감염성 췌장 괴사 바이러스, 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 B, 인플루엔자 바이러스 C, 인플루엔자 바이러스 D, 인플루엔자 바이러스 pr8, 곤충 무지개 바이러스, 곤충 바이러스, 이리도바이러스, 일본 B 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, JC 바이러스, 주닌(Junin) 바이러스, 카포시 육종-연관 허피스바이러스, 케머로보(Kemerovo) 바이러스, 킬함 래트(Kilham's rat) 바이러스, 클라마트(Klamath) 바이러스, 콜롱고(Kolongo) 바이러스, 한국 출혈열 바이러스, 쿰바(kumba) 바이러스, 키사투 포레스트병(Kysanur forest disease) 바이러스, 키질라가크(Kyzylagach) 바이러스, 라 크로세(La Crosse) 바이러스, 락트산 탈수소효소(lactic 데하이드로게나제) 상승 바이러스, 락트산 탈수소효소 바이러스, 라고스 박쥐 바이러스, 랑거(Langur) 바이러스, 라핀 파보바이러스, 라사 열 바이러스, 라사 바이러스, 레이턴트 래트(latent rat) 바이러스, LCM 바이러스, 리키(Leaky) 바이러스, 렌티바이러스, 레포리폭스바이러스, 백혈병 바이러스, 류코바이러스, 괴피병 바이러스, 임파선염 연관 바이러스, 림포크립토바이러스(Lymphocryptovirus), 림프구성 맥락 수막염 바이러스, 림프구증식성바이러스 군, 마추포(Machupo) 바이러스, 광 소양증(mad itch) 바이러스, 포유동물 B형 종양바이러스 군, 포유동물 B형 레트로바이러스, 포유동물 C형 레트로바이러스 군, 포유동물 D형 레트로바이러스, 유선 종양 바이러스, 마푸에라(Mapuera) 바이러스, 마르부르그(Marburg) 바이러스, 마르부르그 유사 바이러스, 마손 파이저(Mason Pfizer) 원숭이 바이러스, 마스트아데노바이러스(Mastadenovirus), 마야로(Mayaro) 바이러스, ME 바이러스, 홍역 바이러스, 멘앵글(Menangle) 바이러스, 멘고(Mengo) 바이러스, 멘고바이러스, 미들부르그(Middelburg) 바이러스, 착유부결절(milkers nodule) 바이러스, 밍크 장염 바이러스, 미세 마우스 바이러스(minute virus of mice), MLV 관련 바이러스, MM 바이러스, 모콜라(Mokola) 바이러스, 몰루스시폭스바이러스(Molluscipoxvirus), 물사마귀(Molluscum contagiosum) 바이러스, 원숭이 B 바이러스, 원숭이폭스 바이러스, 모노네가비랄레스(Mononegavirales), 모르빌리바이러스(Morbillivirus), 마운트 엘곤 박쥐(Mount Elgon bat) 바이러스, 마우스 거대세포바이러스, 마우스 뇌척수염 바이러스, 마우스 간염 바이러스, 마우스 K 바이러스, 마우스 백혈병 바이러스, 마우스 유방 종양 바이러스, 미세 마우스 바이러스(마우스 minute virus), 마우스 폐렴 바이러스, 마우스 염회백수 바이러스, 마우스 폴리오마바이러스, 마우스 육종 바이러스, 마우스폭스 바이러스, 모잠비크(Mozambique) 바이러스, 무캄보(Mucambo) 바이러스, 뮤코잘병(mucosal disease) 바이러스, 볼거리 바이러스, 무리드(murid) 베타헤르페스바이러스 1, 무리드 거대세포바이러스 2, 뮤린 거대세포바이러스 군, 뮤린 뇌척수염 바이러스, 뮤린 간염 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 뮤린 노들 유도 바이러스(murine nodule inducing virus), 뮤린 폴리오마바이러스, 뮤린 육종 바이러스, 무로메갈로바이러스(Muromegalovirus), 머레이 계곡(Murray Valley) 뇌염 바이러스, 점액종 바이러스, 믹소바이러스(Myxovirus), 믹소바이러스 멀티폼(Myxovirus multiforme), 믹소바이러스 이하선염(Myxovirus parotitidis), 나이로비 면양병(Nairobi sheep disease) 바이러스, 나이로비바이러스(Nairovirus), 나니어나바이러스(Nanirnavirus), 나리바(Nariva) 바이러스, 은두모(Ndumo) 바이러스, 니틀링(Neethling) 바이러스, 닐슨만(Nelson Bay) 바이러스, 향신경성(neurotropic) 바이러스, 신세계 아레나바이러스(New World Arenavirus), 신생아 간질성 폐렴(newborn pneumonitis) 바이러스, 뉴캐슬병(Newcastle disease) 바이러스, 니파(Nipah) 바이러스, 비세포병원성(noncytopathogenic) 바이러스, 노워크(Norwalk) 바이러스, 핵다각체병 바이러스(NPV), 니플 넥(nipple neck) 바이러스, 옹니옹 바이러스(O'nyong'nyong virus), 옥켈보(Ockelbo) 바이러스, 발암성 바이러스, 발암성 바이러스유사 입자, 온코르나바이러스(oncornavirus), 오르비바이러스(Orbivirus), 오르프(Orf) 바이러스, 오로퓨스(Oropouche) 바이러스, 오쏘헤파드나바이러스, 오쏘믹소바이러스(Orthomyxovirus), 오쏘폭스바이러스, 오쏘레오바이러스, 오룬고(Orungo), 양(ovine) 파필로마바이러스, 양 카타르 열(ovine catarrhal fever) 바이러스, 올빼미원숭이 허피스바이러스, 팔리암(Palyam) 바이러스, 파필로마바이러스, 파필로마바이러스 실빌라기(sylvilagi), 파포바바이러스(Papovavirus), 파라인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 1형, 파라인플루엔자 바이러스 2형, 파라인플루엔자 바이러스 3형, 파라인플루엔자 바이러스 4형, 파라믹소바이러스, 파라폭스바이러스, 파라종두증 바이러스, 파보바이러스, 파보바이러스 B19, 파보바이러스 군, 페스티바이러스(Pestivirus), 플레보바이러스(Phlebovirus), 물범 디스탬퍼(phocine distemper) 바이러스, 피코드나바이러스,피코나바이러스,돼지 거대세포바이러스 - 구두(pigeonpox) 바이러스, 피리(Piry) 바이러스, 픽수나(Pixuna) 바이러스, 마우스의 폐렴 바이러스, 뉴모바이러스(Pneumovirus), 염회백수 바이러스, 폴리오바이러스, 폴리드나바이러스(Polydnavirus), 다각체(polyhedral) 바이러스, 폴리오마 바이러스, 폴리오마바이러스, 폴리오마바이러스 보비스(bovis), 폴리오마바이러스 세로피테시(Polyomavirus cercopitheci), 폴리오마바이러스 호미니스 2, 폴리오마바이러스 마카카애(maccacae) 1, 폴리오마바이러스 무리스(muris) 1, 폴리오마바이러스 무리스 2, 폴리오마바이러스 파피오니스(papionis) 1, 폴리오마바이러스 파피오니스 2, 폴리오마바이러스 실빌라기(sylvilagi), 폰진(Pongine) 헤르페스바이러스 1, 돼지 유행성 설사증 바이러스, 돼지 혈구응집 뇌척수염 바이러스, 돼지 파보바이러스, 돼지 전염성 위장염 바이러스, 돼지 C형 바이러스, 폭스 바이러스, 폭스바이러스, 폭스바이러스 두창(variolae), 프로스펙트 힐(Prospect Hill) 바이러스, 프로바이러스(Provirus), 위우두 바이러스(pseudocowpox virus), 위광견병(pseudorabies) 바이러스, 피타신팍스(psittacinepox) 바이러스, 퀄리폭스(quailpox) 바이러스, 토끼 섬유종 바이러스, 토끼 신장 공포성(rabbit kidney vaculolating) 바이러스, 토끼 파필로마바이러스, 광견병 바이러스, 라쿤 파보바이러스, 라쿤팍스(raccoonpox) 바이러스, 라니케트(Ranikhet) 바이러스, 래트(rat) 거대세포바이러스, 래트 파보바이러스, 래트 바이러스, 라우셔 바이러스(Rauscher's virus), 재조합 종두증 바이러스, 재조합 바이러스, 레오바이러스, 레오바이러스 1, 레오바이러스 2, 레오바이러스 3, 파충류 C형 바이러스, 호흡기 감염 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 호흡기 바이러스, 세망내피증 바이러스, 랍도바이러스(Rhabdovirus), 랍토바이러스 카피아(Rhabdovirus carpia), 라디노바이러스(Rhadinovirus), 리노바이러스, 리지디오바이러스(Rhizidiovirus), 리프트 계곡열(Rift Valley fever) 바이러스, 릴리 바이러스(Riley's virus), 우역(rinderpest) 바이러스, RNA 종양 바이러스, 로스 리버(Ross River) 바이러스, 로타바이러스, 홍역(rougeole) 바이러스, 라우스 육종(Rous sarcoma) 바이러스, 풍진 바이러스, 홍역(rubeola) 바이러스, 루비바이러스(Rubivirus), 러시아 오텀(Russian autumn) 뇌염 바이러스, SA 11 유인원 바이러스, SA2 바이러스, 사비아 바이러스, 사기야마(Sagiyama) 바이러스, 사이미린(Saimirine) 헤르페스바이러스 1, 침샘 바이러스, 모래파리열(sandfly fever) 바이러스 군, 산드짐바(Sandjimba) 바이러스, SARS 바이러스, SDAV(타액선누선염 바이러스), 물개팍스(sealpox) 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 서울 바이러스, 양폭스(sheeppox) 바이러스, 쇼프 섬유종 바이러스, 쇼프 유두종 바이러스, 유인원 포미 바이러스, 유인원 A형 간염 바이러스, 유인원 인간 면역결핍 바이러스, 유인원 면역결핍 바이러스, 유인원 파라인플루엔자 바이러스, 유인원 T 세포 림프친화성 바이러스, 유인원 바이러스, 유인원 바이러스 40, 단순바이러스, 신 놈브레(Sin Nombre) 바이러스, 신드비스 바이러스, 천연두 바이러스, 남아메리카 출혈열 바이러스, 스패로폭스(sparrowpox) 바이러스, 스푸마바이러스(Spumavirus), 다람쥐 섬유종 바이러스, 다람쥐 원숭이 레트로바이러스, SSV 1 바이러스 군, STLV(유인원 T 림프친화성 바이러스) I형, STLV (유인원 T 림프친화성 바이러스) II형, STLV (유인원 T 림프친화성 바이러스) III형, 구내염 구진성(stomatitis papulosa) 바이러스, 하악(submaxillary) 바이러스, 수이드(suid) 알파허피스바이러스 1, 수이드 허피스바이러스 2, 수이폭스바이러스, 렙토스피라증(swamp fever) 바이러스, 돼지폭스 바이러스, 스위스 마우스(Swiss mouse) 백혈병 바이러스, TAC 바이러스, 타카리브 컴플렉스(Tacaribe complex) 바이러스, 타카리브 바이러스, 타나폭스(Tanapox) 바이러스, 타테라폭스 바이러스, 텐크 레오바이러스, 테일러 뇌척수염 바이러스(Theiler's encephalomyelitis virus), 테일러 바이러스, 토고토(Thogoto) 바이러스, 토타팔라얌(Thottapalayam) 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 티오만(Tioman) 바이러스, 토가바이러스(Togavirus), 토로바이러스(Torovirus), 종양 바이러스, 튜파이아(Tupaia) 바이러스, 칠면조 비강기관지염 바이러스, 칠면조폭스 바이러스, C형 레트로바이러스, D형 온코바이러스, 유형 D 레트로바이러스 군, 궤양성 질환 랍도바이러스, 우나(Una) 바이러스, 운쿠니에미(Uukuniemi) 바이러스 군, 백시니아 바이러스, 공포성 바이러스, 대상 포진 바이러스, 바리셀로바이러스(Varicellovirus), 바리콜라(Varicola) 바이러스, 대두창 바이러스, 두창 바이러스, 바신 기수병(Vasin Gishu disease) 바이러스, VEE 바이러스, 베네수웰라 말 뇌염 바이러스, 베네수엘라 말 뇌척수염 바이러스, 베네수엘라 출혈열 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 베시쿨로바이러스(Vesiculovirus), 빌류이스크(Vilyuisk) 바이러스, 독사(viper) 레트로바이러스, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스, 비스나 매디(Visna Maedi) 바이러스, 비스나(Visna) 바이러스, 볼폭스(volepox) 바이러스, VSV(vesicular stomatitis virus), 왈랄(Wallal) 바이러스, 와레고(Warrego) 바이러스, 사마귀(wart) 바이러스, WEE 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스, 서부 말 뇌척수염 바이러스, 화타로아(Whataroa) 바이러스, 겨울 구토 바이러스(Winter Vomiting Virus), 마멋 B형 간염 바이러스, 양털원숭이 육종 바이러스, 상처 종양 바이러스, WRSV 바이러스, 야바 원숭이 종양 바이러스(Yaba monkey tumor virus), 야바(Yaba) 바이러스, 야타폭스바이러스, 황열 바이러스, 및 육 보그다보박(Yug Bogdanovac) 바이러스.
위형 종양용해성 바이러스의 생산 방법
일부 예에서, 본 명세서에 기술된 위형 종양용해성 바이러스는 관련 기술 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 생성된다. 일부 예에서, 방법은 하나 이상의 형질주입 단계 및 하나 이상의 감염 단계를 포함한다. 일부 예에서, 세포주, 예컨대, 포유동물 세포주, 곤충 세포주 또는 식물 세포주는 본 명세서에 기술된 위형 종양용해성 바이러스로 감염되어 1종 이상의 바이러스를 생산한다. 예시적인 포유동물 세포주는 하기를 포함한다: 293A 세포주, 293FT 세포주, 293F 세포, 293 H 세포, CHO DG44 세포, CHO-S 세포, CHO-K1 세포, Expi293F(상표명) 세포, Flp-In(상표명) T-REx(상표명) 293 세포주, Flp-In(상표명)-293 세포주, Flp-In(상표명)-3T3 세포주, Flp-In(상표명)-BHK 세포주, Flp-In(상표명)-CHO 세포주, Flp-In(상표명)-CV-1 세포주, Flp-In(상표명)-Jurkat 세포주, FreeStyle(상표명) 293-F 세포, FreeStyle(상표명) CHO-S 세포, GripTite(상표명) 293 MSR 세포주, GS-CHO 세포주, HepaRG(상표명) 세포, T-REx(상표명) Jurkat 세포주, Per.C6 세포, T-REx(상표명)-293 세포주, T-REx(상표명)-CHO 세포주, T-REx(상표명)-HeLa 세포주, 3T6, A549, A9, AtT-20, BALB/3T3, BHK-21, BHL-100, BT, Caco-2, Chang, Clone 9, Clone M-3, COS-1, COS-3, COS-7, CRFK, CV-1, D-17, Daudi, GH1, GH3, H9, HaK, HCT-15, HEp-2, HL-60, HT-1080, HT-29, HUVEC, I-10, IM-9, JEG-2, Jensen, K-562,KB, KG-1, L2, LLC-WRC 256, McCoy, MCF7, VERO, WI-38, WISH, XC 또는 Y-1. 예시적인 곤충 세포주는 초파리 S2 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, High Five(상표명) 세포 또는 expresSF+(등록상표) 세포를 포함한다. 예시적인 식물 세포주는 해조류 세포, 예컨대, 예를 들어, 파에오사이스티스 파우체티(Phaeocystis pouchetii)를 포함한다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법이 재조합 종양용해성 벡터 및 벡터 작제물, 예컨대, 위형 종양용해성 벡터의 대규모 생산을 위해서 사용된다. 예를 들어, 마스터 및 워킹 시드 스톡을 자격이 있는 1차 CEF에서 GMP 조건 하에서 또는 다른 방법에 의해서 제조할 수 있다. 일부 예에서, 세포를 큰 표면적 플라스크 상에서 플레이팅하고, 컨플루언시(confluency) 근처까지 성장시키고, 선택된 MOI에서 감염시켰다. 이어서, 생산된 바이러스를 정제할 수 있다. 일부 경우에, 세포를 수거하고, 세포내 바이러스를 기계적 붕괴에 의해서 방출시킨다. 일부 실시형태에서, 세포 잔해를 큰 기공 심층 여과(depth filtration)에 의해서 제거하고/하거나 숙주 세포 DNA를 엔도뉴클레아제를 사용하여 소화시킨다. 일부 경우에, 그 후에 바이러스 입자를 정제하고, 접선 유동 여과(tangential-flow filtration)에 의해서 농축하고, 그 다음 투석여과한다. 생성된 농축된 바이러스를 1종 이상의 안정화제를 함유하는 완충액으로 희석시킴으로써 제형화하고, 바이알에 넣고, 동결건조시킬 수 있다. 조성물 및 제형을 추가 사용을 위해서 저장할 수 있다. 일부 실시형태에서, 동결건조된 바이러스를 1종 이상의 희석제의 첨가에 의해서 재구성한다.
인게이저 분자
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 종양용해성 바이러스 벡터는 인게이저 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 인게이저 폴리펩타이드를 포함도록 추가로 조작된 위형 종양용해성 바이러스이다. 본 발명의 인게이저 분자는 각각 상이한 세포 표면 분자에 결합할 수 있는 적어도 2개의 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인게이저 폴리펩타이드는 각각 표적 세포 및 효과기 세포에 의해서 발현된 특정 세포 표면 단백질(예를 들어, 세포-표면 수용체 또는 리간드)을 인식하는 활성화 도메인 및 항원 인식 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항원 인식 도메인"은 표적 세포(예를 들어, 종양 항원)의 세포 표면 상에 존재하는 1종 이상의 분자에 결합하는 폴리펩타이드이고, "활성화 도메인"은 효과기 세포의 세포 표면 상에 존재하는 1종 이상의 분자(예를 들어, 활성화 분자)에 결합하는 폴리펩타이드이다. 활성화 도메인은 또한 "인게이저 도메인"이라고 지칭될 수 있다.
일부 실시형태에서, 인게이저 폴리펩타이드는 치료 분자 도메인 및 활성화 도메인을 포함한다. 치료 분자 도메인은 효과기 세포 상에서 발현된 특정 세포 표면 단백질(예를 들어, 세포-표면 수용체 또는 리간드)에 결합하고, 활성화 도메인에 의해서 인식되는 세포 표면 단백질과 구별되는 폴리펩타이드이다. 특별한 실시형태에서, 치료 분자 도메인은 효과기 세포 기능(예를 들어, 면역 관문 분자 또는 다른 저해성 분자)의 음성 조절인자인 세포 표면 단백질에 결합한다. 치료 도메인에 의한 표적화를 위한 예시적인 세포-표면 항원은 CD47, PD1, PDL1, CTLA4, TIM2, LAG3, BTLA, KIR, TIGIT, OX40, FITR, CD27, SLAMF7 및 CD200을 포함한다.
일부 실시형태에서, 효과기 세포의 표면 상에 존재하는 분자에 대한 활성화 도메인의 결합은 효과기 세포의 활성화를 초래한다. 특정 실시형태에서, 효과기 세포 상의 분자에 대한 활성화 도메인의 결합 및 표적 세포 상에 존재하는 분자에 대한 항원 인식 도메인의 결합은 효과기 세포를 표적 세포에 근접하게 하고, 이에 따라서 효과기 세포에 의한 표적 세포의 파괴를 용이하게 한다. 특정 실시형태에서, 효과기 세포 상의 활성화 분자에 대한 활성화 도메인의 결합 및 효과기 세포 상에 존재하는 저해성 분자에 대한 치료 분자 도메인의 결합은 효과기 세포의 활성화를 향상시킴으로써, 효과기 세포에 의한 1종 이상의 방관자(bystander) 표적 세포의 파괴를 용이하게 한다.
특정 실시형태에서, 인게이저 분자은 단백질, 예를 들어, 조작된 단백질이다. 일부 실시형태에서, 인게이저 분자는 이분 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 인게이저 분자는 삼분 또는 다분 폴리펩타이드이다. 이러한 실시형태에서, 인게이저 분자는 하나 이상의 활성화 도메인 및/또는 항원 인식 도메인 또는 1종 이상의 공자극성 도메인, 1종 이상의 이량체화 또는 삼량체화 도메인 또는 세포 표면 상에서 발현된 분자에 결합할 수 있는 다른 도메인을 비롯한 다른 도메인을 포함할 수 있다. 대안적으로, 1종 이상의 추가적인 도메인이 별개의 폴리펩타이드 상에 임의로 존재한다. 일부 실시형태에서, 인게이저 분자는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인게이저 분자는 삼기능성 항체, Fab2, 이중특이적 scFv 예컨대, 이중특이적 T-세포 인게이저(BiTE), 2가 미니바디, 이중특이적 다이아바디, 듀오바디 또는 Mab2이다. 특정 실시형태에서, 인게이저 분자는 이분 T 세포 인게이저(BiTE) 또는 삼분 T 세포 인게이저(TiTE)이다.
일부 실시형태에서, 인게이저 분자의 활성화 도메인, 항원 인식 도메인 및/또는 치료 분자 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 예를 들어, 단일 쇄 가변 단편(scFv), 단클론성 항체, Fv, Fab, 미니바디, 다이아바디를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인게이저 분자의 활성화 도메인, 항원 인식 도메인, 및/또는 치료 분자 도메인은 리간드, 펩타이드, 가용성 TCR 또는 이들의 조합물을 인식하고 이것과 상호작용하는 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 항체-유래 단편 또는 유도체는 화학, 생화학 또는 분자 생물학 방법에 의해서 변형될 수 있다. 상응하는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 특히 실험 매뉴얼에 기술되어 있다(문헌[Sambrook et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition 1989 and 3rd edition 2001; Gerhardt et al.; Methods for General and Molecular Bacteriology; ASM Press, 1994; Lefkovits; Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002] 참고). 일부 예에서, 본 명세서에 기술된 인게이저 분자의 작제에 사용되는 폴리펩타이드, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화 또는 탈면역화(deimmunized) 작제물이다. 폴리펩타이드, 특히, 항체 작제물의 인간화 및/또는 탈면역화 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 인게이저 중 임의의 것의 경우, 각각의 도메인은 N-말단에서부터 C-말단으로 임의의 순서로 존재한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 인게이저 분자는 N-말단 활성화 도메인 및 C-말단 항원 인식 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인게이저 분자는 N-말단 항원 인식 도메인 및 C-말단 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인게이저 분자는 N-말단 활성화 도메인 및 C-말단 치료 분자 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인게이저 분자는 N-말단 치료 분자 도메인 및 C-말단 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, T-세포는 활성화 도메인에 대한 N-말단에 항원 인식 도메인 또는 치료 분자 도메인을 갖는 인게이저 분자를 분비하도록 변형된다.
특별한 실시형태에서, 인게이저 분자의 도메인 중 2개 이상은 링커에 의해서 연결된다. 일부 예에서, 링커는 임의의 적합한 길이를 갖고, 이러한 파라미터는 관련 기술 분야에서 일상적으로 최적화된다. 예를 들어, 링커는 제1 도메인 및 제2 도메인 각각이 서로와 독립적으로 이의 차별적인 결합 특이성을 보유하는 것을 보장하기에 충분한 길이 및 서열을 갖는다. 용어 "펩타이드 링커"는 정의된 작제물의 제1 도메인(예를 들어, 활성화 도메인) 및 제2 도메인(예를 들어, 항원 인식 도메인 또는 치료 분자 도메인)의 아미노산 서열이 함께 연결되는 아미노산 서열을 지칭한다. 일부 예에서, 이러한 펩타이드 링커의 하나의 기술적 특징은 상기 펩타이드 링커가 임의의 중합 활성도를 포함하지 않고/않거나 2차 구조의 형성을 촉진시키지 않는다는 것이다. 이러한 펩타이드 링커는 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Dall'Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273); Cheadle et al.(Mol Immunol (1992) 29, 21-30); 및 Raag and Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80)]에 기술되어 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드 링커는 5개 미만의 아미노산, 4개 미만의 아미노산, 3개 미만의 아미노산, 2개 미만의 아미노산 또는 1개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 단일 아미노산 링커이다. 이러한 실시형태에서, 단일 아미노산은 전형적으로 글리신(Gly)이다. 일부 실시형태에서, 임의의 2차 구조를 또한 촉진시키지 않는 펩타이드 링커가 바람직하다. 포유동물 또는 박테리아 세포에서의 융합된 작동 가능하게 연결된 작제물의 제조 방법 및 이의 발현 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 국제 PCT 공개 제WO 99/54440호; 문헌[Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. 1989 and 1994; 및 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001] 참고).
일부 실시형태에서, 인게이저 분자는 단일 쇄 이중특이적 항체 작제물이다. 용어 "단일 쇄 이중특이적 항체 작제물"은 2개의 항체-유래 결합 도메인을 작제물을 지칭한다. 결합 도메인 중 하나는 효과기 세포(예를 들어, CD3) 상에서 발현된 활성화 분자에 특이적으로 결합/상호작용할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 유도체의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 둘 모두의 가변 영역(또는 이의 부분)을 포함한다. 제2 결합 도메인은 표적 세포(예를 들어, CD19) 상에서 발현된 표적 항원 또는 효과기 세포(예를 들어, 저해제 분자)에 의해서 발현된 항원에 특이적으로 결합/상호작용할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 유도체의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 둘 모두의 가변 영역(또는 이의 부분)을 포함한다. 특별한 실시형태에서, 2개의 항체 또는 항원 결합 단편 또는 유도체 각각은 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR), 특히 CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 쇄 이중특이적 항체 작제물은 이중특이적 scFv 또는 다이아바디이다.
특이적 실시형태에서, 단일 쇄 이중특이적 항체 작제물은 단일 쇄 이중특이적 scFv이다. scFv는 일반적으로 링커 펩타이드에 의해서 연결된 VH 도메인 및 VL 도메인을 함유한다. 일부 실시형태에서, 단일 쇄 이중특이적 scFv는 세포로부터의 분비를 가능하게 하는 단일 펩타이드로 구성되며, 그 다음 2개의 scFv는 1종 이상의 링커 펩타이드(Lx, Ly, Lz)에 의해서 연결된다. 이중특이적 단일 쇄 분자는 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 국제 PCT 공개 제WO 99/54440호; 문헌[Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970; Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025; Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193- 197; Loftier, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103; 및 Bruhl, J. Immunol., (2001), 166, 2420-2426]에 기술되어 있다.
일부 실시형태에서, 단일 쇄 이중특이적 scFv 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 분자 포맷은 단일 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열(예컨대, 서열번호 2 및 4의 신호 서열), 그 다음 2개 이상의 항체-유래 영역(예를 들어, 제1 scFv 및 제2 scFv)을 포함한다. 각각의 항체-유래 영역(예를 들어, scFv)은 하나의 VH 및 하나의 VL 쇄를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 2개 이상의 항체-유래 영역은 scFv이고, 펩타이드 링커에 의해서 연결되어 단일 쇄 이중특이적 scFv 작제물을 형성한다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 scFv는 탠덤 바이-scFv 또는 다이아바디이다. 이중특이적 scFv는 하기를 비롯하여 상이한 포맷으로 배열될 수 있다: VHO-Lx-VLa-Ly-VH-Lz-ViJ3, VLa-Lx-VHa-Ly-VH-Lz-ViJ3, VLa-Lx-VH-Ly-VL-Lz-VH, VH-Lx-VLa-Ly-VL-Lz-VH, VH-Lx-VL-Ly-VH-Lz-VLa, VLa-Lx-VL-Ly-VH-Lz-VH, VH-Lx-VH-Ly-VL-Lz-VLa, VLa-Lx-VH-Ly-VL-Lz-VH, VH-Lx-VLa-Ly-VH-Lz-VL, VL-Lx-VLa-Ly-VH-Lz-VH, VH-Lx-VH-Ly-VLa-Lz-VL, VL-Lx-VH-Ly-VLa-Lz-VH.
일부 실시형태에서, 인게이저 분자는 다수(예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 그 초과)의 항원 결합 도메인을 포함하여 다수의 항원의 표적화가 가능하다. 일부 실시형태에서, 인게이저 분자는 다수(예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 그 초과)의 활성화 도메인을 포함하여 효과기 세포를 활성화시킨다. 일부 실시형태에서, 인게이저 분자는 다수(예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 그 초과)의 치료 분자 도메인을 포함하여 효과기 세포를 활성화시킨다.
본 개시내용의 구체적인 실시형태에서, 인게이저 분자는 재조합 방식으로 생산된 작제물의 단리 및/또는 제조를 위한 추가적인 도메인, 예컨대, 태그 및 표지를 포함한다. 태그 또는 표지는 짧은 펩타이드 서열, 예컨대, 히스티딘 태그(서열번호 12)일 수 있거나 또는 영상화될 수 있는 태그 또는 표지, 예컨대, 형광 또는 방사성 표지일 수 있다.
특별한 실시형태에서, 본 발명의 인게이저 분자는 표적 세포 상에서 발현된 표적 항원의 특정 입체 배좌/구조 에피토프(들) 및 효과기 세포 상에서 발현된 활성화 분자(예를 들어, 인간 CD3 복합체 또는 이의 부분의 두 영역 중 하나에 특이적으로 결합하는 활성화 도메인)에 특이적으로 결합/상호작용한다. 특별한 실시형태에서, 본 발명의 인게이저 분자는 효과기 세포 상에서 발현된 활성화 분자 및 효과기 세포 상에서 발현된 상이한 세포-표면 단백질의 특정 입체 배좌/구조 에피토프(들)에 특이적으로 결합/상호작용한다. 따라서, 특이성은 일부 예에서 관련 기술 분야에 공지된 방법 및 본 명세서에 개시되고, 기술된 바와 같은 방법에 의해서 실험적으로 결정된다. 이러한 방법은 웨스턴 블롯, 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA), 방사성면역검정(RIA), 방사성면역침전(radioimmunoprecipitation: RIP), 전기화학발광(ECL), 면역방사측정 검정(IRMA), 효소 면역검정(EIA) 및 펩타이드 스캔을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
활성화 분자 및 표적 세포 항원
일부 실시형태에서, 효과기 세포의 세포 표면 상의 활성화 분자에 대한 인게이저 분자의 활성화 도메인의 결합은 효과기 세포의 활성화를 초래한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효과기 세포"는 표적 세포의 사멸을 용이하게 할 수 있는 임의의 포유동물 세포 유형을 지칭한다. 특별한 실시형태에서, 본 발명의 효과기 세포는 면역세포, 예컨대, T 세포, B 세포, 선천적 림프구, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T 세포(NKT), 과립구(예를 들어, 호중구, 호염구, 비만 세포 또는 호산구), 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포이다. 예시적인 효과기 세포 유형은 T 세포, NK 세포, NKT 세포 및 대식세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 효과기 세포의 활성화는 하기 중 하나 이상을 초래할 수 있다: (i) 효과기 세포의 증가된 증식; (ii) 효과기 세포의 1종 이상의 세포 표면 단백질의 발현 또는 활성도의 변화; (iii) 효과기 세포에 의해서 발현된 1종 이상의 세포내 단백질의 발현 또는 활성도의 변화; (iv) 효과기 세포, 예컨대, 사이토카인, 케모카인 또는 반응성 산소 종에 의해서 생산 및/또는 분비되는 인자의 양 또는 본성의 변화; (v) 효과기 세포의 모폴로지의 변화; (vi) 예컨대, 1종 이상의 케모카인 수용체의 증가된 또는 감소된 발현을 통한, 효과기 세포의 주화성 가능성의 변화; (vii) 효과기 세포의 기능적 활성도의 변화, 예컨대, 증가된 세포용해 활성도 및/또는 증가된 식세포 활성도. 효과기 세포의 활성화 또는 효과기 세포의 집단은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 수단에 의해서 결정될 수 있다. 예를 들어, 증식, 단백질 발현, 생산 또는 분비의 변화는 유세포 분석법, 웨스턴 블롯, ELISA, 면역조직화학, 면역침전 또는 면역형광에 의해서 결정될 수 있고, 세포 모폴로지의 변화는 관련 기술 분야에 공지된 다수의 유형의 현미경에 의해서 결정될 수 있다.
통상의 기술자는, 활성화 분자의 본성은 효과기 세포의 본성에 따라서 달라질 수 있지만, 상이한 군의 효과기 세포는 활성화 분자의 특정 유형의 발현을 공유할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, T 세포는 NK 세포 또는 대식세포와 상이한 표면 수용체, 즉 상이한 활성화 수용체를 발현한다. 예시적인 예로서, CD3은 NK 세포 또는 대식세포에 의해서 발현되지 않는 T-세포에 의해서 발현된 활성화 수용체이지만, CD1, CD16, NKG2D, 및/또는 NKp30은 T 세포에 의해서 발현되지 않는 NK 세포에 의해서 발현된 활성화 수용체이다. 따라서, 일부 예에서, T-세포를 활성화시키는 인게이저 분자는 NK 세포, 대식세포, NKT 세포 또는 다른 유형의 효과기 세포를 활성화시키는 인게이저 분자와 상이한 활성화 도메인을 갖는다. 예시적인 활성화 분자는 하기에 기술되고, 표 1에 제시된다.
일부 실시형태에서, 효과기 세포는 T 세포이고, 인게이저 분자의 활성화 도메인은 T 세포에 의해서 발현되는 활성화 분자에 결합한다. T-세포 레퍼토리(repertoire)는 NKT 세포, 세포독성 T 세포(Tc 또는 CTL), 기억 T 세포, 헬퍼 T 세포(예를 들어, Th1, Th2, Th17, Th9, 및/또는 Th22 세포), 억제인자 T 세포(예를 들어, 조절인자 T 세포(Treg)), 점막-연관 불변 T 세포, 및 γδ T 세포를 비롯한, 다수의 하위 유형의 T 세포로 구성된다. 일부 예에서, 하나의 T 세포 하위유형에 의해서 발현된 1종 이상의 표면 수용체는 또 다른 T 세포 하위유형에 의해서 발현되지 않는다. 일부 예에서, 하나의 T 세포 하위유형에 의해서 발현된 1종 이상의 표면 수용체는 적어도 1종의 다른 T 세포 하위유형에 의해서 발현된다. 일부 예에서, 하나의 T 세포 하위유형에 의해서 발현된 1종 이상의 표면 수용체는 모든 또는 대부분의 T 세포 하위유형에 의해서 일반적으로 발현된다. 예를 들어, CD3은 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 신호전달 성분이고, 다수의 T 세포 하위유형에서 발현된다. T 세포(예를 들어, NKT, Tc, 기억 T 세포 또는 헬퍼 T 세포)에 의해서 발현되는 예시적인 활성화 분자는 CD3(예를 들어, CD3γ, CD3δ, CD3ε 또는 CD3ξ), CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD25, CD27, CD28, CD30, CD38, CD40, CD57, CD69, CD70, CD73, CD81, CD82, CD134, CD137, CD152 또는 CD278 중 1종 이상의 성분을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 효과기 세포는 NKT-세포이다. 이러한 실시형태에서, 활성화 분자는 CD3 또는 불변 TCR을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 효과기 세포는 NK 세포이고, 인게이저 분자의 활성화 도메인은 NK 세포에 의해서 발현되는 활성화 분자에 결합한다. NK 세포에 의해서 발현되는 예시적인 활성화 분자는 CD16, CD94/NKG2(예를 들어, NKG2D), NKp30, NKp44, NKp46 또는 킬러 활성화 수용체(KAR)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
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일부 실시형태에서, 표적 세포 및 과기 세포에 대한 인게이저 분자의 결합(예를 들어, 효과기 세포 상의 분자에 대한 활성화 도메인의 결합 및 표적 세포 상에 존재하는 분자에 대한 항원 인식 도메인의 결합)은 효과기 세포를 표적 세포에 근접하게 하고, 이에 따라서 효과기 세포에 의한 표적 세포의 파괴를 용이하게 한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표적 세포"는 사멸, 공격, 파괴 및/또는 제어되어야 하는 포유동물 세포를 지칭한다. 특히, 표적 세포는 일부 방식에서 동일한 세포 유형의 정상 세포, 예컨대, 암성 세포, 박테리아에 의해서-감염된 세포, 바이러스에 의해서-감염된 세포, 진군에 의해서-감염된 세포, 및/또는 자가면역세포에 비해서 변경된 세포이다. 특별한 실시형태에서, 본 발명의 표적 세포 암성 세포(예를 들어, 종양 세포)이다. 표적 세포의 파괴(즉, 사멸)는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 수단, 예컨대, 유세포 분석법(예를 들어, 아넥신(Annexin)V, 프로피디움 아이오다이드 또는 다른 수단), 세포 계수치, 및/또는 표적 세포의 세포 모폴로지를 결정하기 위한 현미경에 의해서 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 인게이저 분자의 항원 인식 도메인은 표적 세포에 의해서 발현된 표면 항원(예를 들어, 표적 세포 항원)과 항원 인식 도메인 간의 상호 작용을 통해서 표적 세포(예를 들어, 종양 세포)를 효과기 세포에 가깝게 한다. 일부 실시형태에서, 표적-세포 항원은 종양 항원이다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 종양-특이적 항원(TSA)이고, 종양 세포에 의해서만 발현된다. 일부 실시형태에서, 표적 세포 항원은 종양-연관 항원(TAA)이고, 종양 세포 및 1종 이상의 유형의 정상 세포 또는 비-종양 세포에 의해서 발현된다. 일부 경우에, TSA는 또한 1종 이상의 유형의 정상 세포 또는 비-종양 세포에 존재하지만, 종양 세포에 의해서 대부분 발현된다. 일부 예에서, 종양 항원(예를 들어, TSA 또는 TAA)은 하나의 암 유형에 존재한다. 일부 예에서, 종양 항원은 다수의 암 유형에 존재한다. 일 실시형태에서, 종양 항원은 혈액 암 세포 상에서 발현된다. 또 다른 실시형태에서, 종양 항원은 고형 종양의 세포 상에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 고형 종양은 교모세포종, 비소세포 폐암, 비소세포 폐암이 아닌 폐암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 간암, 결장암, 위암, 비장암, 피부암, 교모세포종이 아닌 뇌암, 신장암, 갑상선암 등이다. 보다 구체적인 실시형태에서, 종양 항원은 개체에서 종양 세포에 의해서 발현된다.
예시적인 종양 항원(예를 들어, TSA 또는 TAA)은 알파태아단백질(AFP), 암배아 항원(CEA), CA-125, 상피 종양 항원(ETA), 타이로시나제, CD10(네프릴리신, 막 메탈로-엔도펩티다제(MME), 중성 엔도펩티다제(NEP) 또는 공통 급성 림프아구성 백혈병 항원(CALLA)), CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, ras, p53, v-raf 뮤린 육종 바이러스성 종양유전자 동족체 Bl(BRAF), 조절 칼슘 결합 타이로신-(Y)-포스포릴화(calcium binding tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated: CABYR), 시스테인-풍부 분비 단백질 3(CRISP3), CSAG 패밀리, 멤버 2(CSAG2), 암/고환 항원 2(CTAG2), 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR), 페리틴, 중 폴리펩타이드 1; 고환-특이적 발현(FTHL17), G 항원 1(GAGE1), 락테이트 데하이드로게나제 C(LDHC), 흑색종 항원 패밀리 A(MAGEA) 1, MAGEA3, MAGEA4,(흑색종 항원 패밀리 B, 6) MAGEB6, 미토겐-활성화 단백질 카이나제 1(MAPK1), MHC 클래스 I 폴리펩타이드-관련 서열 A(MICA), 뮤신(MUC) 1, 세포 표면 연관(MUC1), MUC16, NLR 패밀리, 파이린 도메인 함유 4(NLRP4), 뉴욕 식도 편평 세포 암종 1(NY-ESO-1), PDZ 결합 카이나제 (PB), 우선적으로 발현되는 흑색종 내 항원(preferentially expressed antigen in melanoma: PRAME), 성별 결정 영역 Y-박스(SOX)-2, SOX10, SOX11, 핵과 연관된 정자 단백질, X-연결된 패밀리 멤버 Al(SPANXA1), 활액 육종, X(SSX) 중단점 2(SSX2), SSX4, SSX5, 고환 특이적, 10(TSGA10), 고환-특이적 세린 카이나제 6(TSSK6), 터비 유사 단백질(tubby like protein: TULP2), X 항원 패밀리, 멤버 2(XAGE2), 징크 핑거 단백질 165(ZNF165), 흑색종 2에서 부재(absent in melanoma 2: AIM2), BMI1 폴리콤브 환 핑거 종양유전자(종양유전자(polycomb ring finger oncogene: BMI1), 사이클로옥시게나제-2(COX-2), 타이로신 관련 단백질(TRP)-1, TRP-2, 당단백질 100(GP100), 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII), 제스테(zeste) 동족체 2의 향상제(EZH2), 인간 LI 세포 접착 분자(LICAM), 리빈(Livin), 다제 내성단백질 3(MRP-3), 네스틴, 올리고덴드로사이트 전사 인자(OLIG2), T 세포에 의해서 인식된 항원(ART)-1, ART4, T 세포에 의해서 인식된 편평 세포 암종 항원(SART)-1, SART2, SART3, B-사이클린, β-카테닌, 신경아교종-연관 종양유전자 동족체 1(Glil), 카베올린-1(Cav-1), 카텝신B, 분화 클러스터(CD)-74, 상피 칼슘-의존형 접착(E-카데린), EPH 수용체 A2(EphA2), EphA2/상피 카이나제(EphA2/Eck), fos-관련 항원 1(Fra-l/Fosl 1), 강글리오사이드/GD2, GD3, 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제-V(GnT-V, β1,6-Ν), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(Her2/Neu), 항체의 핵 증식-연관 항원 Ki67(Ki67), 인간 Ku 이종이량체 단백질 소단위(u70/80), 인터류킨-13 수용체 소단위 알파-2(IL-13Rα2), T 세포에 의해서 인식된 흑색종 항원(MART-1), 프로스페로 호메오박스 단백질 1(prospero homeobox protein: PROX1), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 서바이빈, 유로카이나제-유형 플라스미노겐 활성화인자 수용체(UPAR), 윌름스 종양 단백질 1(WT-1), 폴레이트 수용체 a, 글라이피칸(Glypican)-3, 5T4, 8H9, ανβ6 인테그린, B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CSPG4, EGP2, EGP40, EpCAM, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, FAP, FAR, FBP, 태아 AchR, HLA-AI, HLA-A2, IL-1Rα, KDR, 람다, 루이스-Y, MCSP, 메소텔린, NCAM, NKG2D 리간드, PSC1, PSMA, ROR1, TAG72, TEM1, TEM8, VEGRR2, HMW-MAA, VEGF, VEGF 수용체, P-당단백질, 에리쓰로포이에틴(EPO), 카데린, CD4, CD8, CD45, CD117(c-키트), CD133, HLA-A. HLA-B, HLA-C, 케모카인 수용체 5(CCR5), 줄기 세포 마커 ABCG2 수송인자, 면역글로불린, 인테그린, 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 수지상 세포-특이적 세포내 접착 분자 3-그래빙 논인테그린(grabbing nonintegrin)(DC-SIGN), 티로글로불린, 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 근원성 분화 촉진 인자-1(MyoD-1), Leu-7(CD57), LeuM-1, 단클론성 항체 Ki-67(Ki-67)에 의해서 정의된 세포 증식-연관 인간 핵 항원, 바이러스 엔벨로프 단백질, HIV gp120 및 트랜스페린 수용체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 다른 예시적인 종양 항원은 종양의 세포외 매트릭스, 예컨대, 피브로넥틴의 태아종양 변이체, 테나신 또는 종양의 괴사성 영역에 존재하는 항원이다.
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특정 실시형태에서, 인게이저 분자의 항원 인식 도메인은 종양-연관 항원(TAA) 또는 종양-특이적 항원(TSA)에 특이적으로 결합한다. 특정 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 TAA 또는 TSA에 대해서 특이적인 항체 또는 항체 단편 또는 항원-결합 단편 또는 이의 부분, 예컨대, 예를 들어, 단클론성 항체, Fv, scFv, Fab, 미니바디 또는 다이아바디를 포함한다. 특정 실시형태에서, 인게이저의 항원 인식 도메인은 TAA 또는 TSA에 대해서 특이적인 scFv이다. 구체적인 실시형태에서, TAA 또는 TSA는 암 세포 상에서 발현된다. 일 실시형태에서, TAA 또는 TSA는 혈액암 세포 상에서 발현된다. 또 다른 실시형태에서, TAA 또는 TSA는 고형 종양의 세포 상에서 발현된다. 보다 구체적인 실시형태에서, 고형 종양은 교모세포종, 비소세포 폐암, 비소세포 폐암이 아닌 폐암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 간암, 결장암, 위암, 비장암, 피부암, 교모세포종이 아닌 뇌암, 신장암, 갑상선암 등이다. 보다 구체적인 실시형태에서, TAA 또는 TSA는 개체에서 종양 세포에 의해서 발현된다. 일부 실시형태에서, 인게이저 분자의 항원-인식 도메인은 표 2에 제시된 1종 이상의 표적 세포 항원에 대해서 특이적이다.
EphA2
일부 실시형태에서, EphA2는 EPH 수용체 A2(에프린 유형-A 수용체 2; EPHA2; ARCC2; CTPA; CTPP1; 또는 ECK)라고 지칭되며, 이것은 인간에서 단백질-타이로신 카이나제 패밀리의 에프린 수용체 서브패밀리 내의 EPHA2 유전자에 의해서 암호화된 단백질이다. 이러한 서브패밀리 내의 수용체는 일반적으로 단일 카이나제 도메인 및 Cys-풍부 도메인 및 2 피브로넥틴 III형 반복부를 포함하는 세포외 영역을 포함하고; 본 개시내용의 항체의 실시형태는 이러한 도메인 중 임의의 것을 표적으로 한다. 예시적인 인간 EphA2 핵 서열은 젠뱅크(GenBank)(등록상표) 수탁 번호 NM_004431로 존재하고, 예시적인 인간 EphA2 폴리펩타이드 서열은 젠뱅크(등록상표) 수탁 번호 NP_004422로 존재하고, 이들 둘 모두는 이들의 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다. 예시적인 인간 EphA2 핵 서열은 젠뱅크(등록상표) 수탁 번호 NM_004448.2로 존재하고, 예시적인 인간 EphA2 폴리펩타이드 서열은 젠뱅크(등록상표) 수탁 번호 NP_004439로 존재하고, 이들 둘 모두는 이들의 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
타이로신 카이나제 수용체 패밀리 중에서 가장 마지막 군인, Eph 패밀리는 이의 서열 동족체 및 이의 리간드, 에프린(Eph 수용체 상호작용 단백질)에 대한 이의 결합 친화도에 따라서 분류된 수용체의 EphA(EphA1-10) 또는 EphB(EphB1-6) 서브클래스로 구성된다. 인간 EphA2 유전자는 염색체 1 상에 위치하고, 130kDa의 겉보기 분자량을 갖는 976개 아미노산의 수용체 타이로신 카이나제를 암호화하고, 마우스 EphA2와 90% 아미노산 서열 상동성을 갖는다. Eph 패밀리는 세포외 보존 N-말단 리간드-결합 도메인, 그 다음 표피 성장 인자-유사 모티프 및 2개의 피브로넥틴 유형-III 반복부를 갖는 시스테인-풍부 도메인을 함유한다. 세포외 모티프 이후에 막 스패닝 영역 및 막근접 영역, 타이로신 카이나제 도메인, 멸균 알파 모티프(SAM), 및 스냅 후부 도메인(디스크 거대 및 조나 오클루덴스 단백질(disc large and zona occludens protein: PDZ) 도메인-결합 모티프)을 포함하는 세포질 영역이 이어진다. EphA2는 다른 Eph 수용체와 25 내지 35% 서열 상동성을 나타내고, 타이로신 잔기는 막근접 및 카이나제 도메인 내에 보존된다.
EphA2 mRNA 발현은 피부, 골수, 흉선, 자궁, 고환, 전립선, 방광, 신장, 소장, 결장, 비장, 간, 폐 및 뇌에서 관찰된다. 결장, 피부, 신장 및 폐 내에서의 EphA2 발현은 골수에 비해서 10배를 초과한다. EphA2는 또한 외배엽 세포에서의 낭배 형성 발달 중인 후뇌에서의 초기 배발생 동안 발현된다. 피부에서, EphA2는 표피 및 모공의 각질세포에 존재하지만, 진피 세포(섬유아세포, 혈관 세포 및 염증성 세포)에는 존재하지 않는다. EphA2는 또한 사춘기에 암컷 마우스에서 증식성 유선에서 발현되고, 발정 사이클 동안 별개로 발현된다. 배아 및 정상 성인 조직에서의 이의 발현에 더하여, EphA2는 몇몇 암, 예컨대, 유방암, 위암, 흑색종, 난소암, 런치암(lunch cancer), 신경교종, 방광암, 전립선암, 식도암, 신장암, 결장암 및 외음부암에서 과발현된다. 특히, 높은 수준의 EphA2는 악성 암-유래 세포주 및 암의 후기 형태에서 검출된다. 다수의 상이한 유형의 암의 전임상 모델 및 임상 시편에서의 EphA2 과발현의 관점에서, EphA2 발현의 증가된 수준은 암 결과의 예측 및 암의 임상적 관리 둘 모두에서 유용한 정보이다. 암 세포와 비교할 때 정상 세포에서의 EphA2의 차별적 발현은 또한 치료 표적으로서의 그의 중요성을 의미한다.
HER2
일부 실시형태에서, HER2는 인간 표피 성장 인자 수용체 2(Neu, ErbB-2, CD340 또는 pi 85)라고 지칭되며, 이것은 인간에서 표피 성장 인자 수용체(EFR/ErbB) 패밀리에서 ERBB2 유전자에 의해서 암호화된 단백질이다. HER2는 세포외 리간드 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 다수의 신호전달 분자와 상호작용하는 세포내 도메인을 함유한다. HER2는 타이로신 카이나제 활성도를 갖는 표피 성장 인자 수용체 패밀리의 구성원이다. 수용체의 이량체화는 수용체의 세포질 도메인 내에서 타이로신 잔기의 자가포스포릴화를 초래하고, 세포 증식 및 종양발생으로 이어지는 다양한 신호전달 경로를 개시한다. HER2의 증폭 또는 과발현은 유방암의 대략적으로 15 내지 30%에서 발생하고, 위암/위식도암의 10 내지 30%에서 발생하고, 예후 및 예측 바이오마커로서 작용한다. HER2 과발현은 또한 다른 암, 예컨대, 난소, 자궁내막, 방광, 폐, 결장, 및 두경부에서 관찰된다. HER2는 침윤성 유방암의 15 내지 30%에서 과발현되고, 이것은 예후 및 예측 영향 둘 모두를 갖는다. IHC를 사용하여 결정된, HER2 단백질의 과발현은 23%에서 관찰되고, FISH를 사용하여 결정된 유전자의 과발현은 위암 연구에서 200개의 절제된 종양의 27%에서 관찰된다. HER2 과발현은 위암에서 더 불량한 결과와 직접적으로 상관관계가 있다. 260개의 위암의 연구에서, HER2 과발현은 독립적인 부정적인 예후 인자이고, HER2 염색 강도는 종양 크기, 장막 침윤 및 림프절 전이와 상관관계가 있다. 다른 연구는 또한 위암에서 HER2 과발현의 부정적인 영향을 확인해주었다. HER2 과발현은 식도암의 0 내지 83%에서 보고되며, 편평 세포 암종(0 내지 56%)과 비교할 때 선암(10 내지 83%)에서 더 높은 양의 비율인 경향성이 있다. HER2의 과발현은 난소암을 갖는 20 내지 30% 환자에서 관찰된다. 자궁내막 장액 암종에서, 보고된 HER2 과발현 비율은 14% 내지 80% 범위이고, HER2 증폭(동일계 혼성화에서의 형광[FISH]에 의해서)은 21% 내지 47% 범위이다. 본 개시내용의 항체의 실시형태는 세포외 리간드 결합 도메인을 표적으로 한다.
다이시알로강글리오사이드 GD2
다이시알로강글리오사이드 GD2는 세포 표면 상에서 주로 발현되는 시알산-함유 글리코스핑고리피드이다. 이러한 탄수화물 항원의 기능은 완전히 이해되지 않지만; 그것은 세포외 매트릭스 단백질에 대한 종양 세포의 부착에서 중요한 역할을 한다고 생각된다. 정상 태아 및 성인 조직에서의 GD2 발현은 중추 신경계, 말초 신경 및 피부 멜라닌세포에 주로 제한되지만, GD2 발현은 비장의 일부 정상 조직 및 백비수(white pulp)의 기질 성분에서 설명되어 있다. 악성 세포에서, GD2는 신경모세포종 및 대부분의 흑색종에서 균일하게 발현되고, 골 및 연조직 육종, 소세포 폐암 및 뇌종양을 비롯한 다양한 다른 종양에서 가면적인 정도로 발현된다. GD2는 세포 표면 상에 존재하고, 그곳에 농축되어 있으며, 원형질막에 내포된 세라마이드 모이어티의 2개의 탄화수소 쇄 및 세포외 표면 상에 위치된 올리고당을 가지며, 세포외 표면 상에서 이것은 이웃 세포의 세포외 분자 또는 표면에 대한 인식 지점을 제공한다. 세포 표면 상에서의 이의 존재와 조합된 비교적 종양-선택적인 발현으로 인해서, GD2는 종양-특이적 항체 요법을 위한 매력적인 표적이다. 본 개시내용의 항체의 실시형태는 세포외 도메인을 표적으로 한다.
치료 분자
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열 및 1종 이상의 치료 분자를 암호화하는 1종 이상의 추가적인 핵산 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료 분자"는 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스의 치료 효능을 향상시키는 분자를 지칭한다. 일반적으로, 본 명세서에 기술된 치료 분자는 단백질, 핵산 또는 이들의 조합물이다. 예시적인 치료 분자는 사이토카인, 케모카인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 프로테아제, RNA 폴리뉴클레오타이드 및 DNA 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 치료 분자는 세포 면역 반응을 자극 또는 활성화시킴으로써 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스의 치료 효능을 증가 또는 향상시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료 분자는 억제성 조절 면역 반응을 길항작용함으로써 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스의 치료 효능을 증가 또는 향상시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 억제성 면역 반응의 감소는 종양 미세환경에서 일어난다. 일부 예에서, 치료 분자에 의한 억제성 면역 반응의 감소는 본 명세서에 기술된 위형 종양용해성 바이러스의 종양용해성 효과를 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 치료 분자는 본 명세서에 기술된 위형 종양용해성 바이러스로 치료된 대상체에서 면역조절성 T 세포 활성도를 추가로 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 치료 분자는 핵산 수준 또는 단백질 수준에서 단백질의 생산 수준을 조정 또는 손상시키고, 단백질 기능을 파괴한다.
일부 실시형태에서, 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열 및 1종 이상의 치료 분자를 암호화하는 핵산 서열은 동일한 벡터 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열 및 1종 이상의 치료 분자를 암호화하는 핵산 서열은 상이한 벡터 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 예에서, 치료 분자는 폴리펩타이드 또는 핵산 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가적인 핵산 서열은 더 높은 발현 수준 및 치료 분자의 생산을 가능하게 하는 바이러스 벡터 내에 삽입된다.
일부 실시형태에서, 치료 분자는 폴리펩타이드이다. 일부 예에서, 폴리펩타이드는 면역 조정인자 폴리펩타이드이다. 일부 경우에, 면역 조정인자 폴리펩타이드는 사이토카인, 공자극성 도메인, T-세포 활성화의 음성 조절성 분자(예를 들어, 면역 관문 저해제)를 저해하는 도메인 또는 이들의 조합물이다.
일부 실시형태에서, 면역 조정인자 폴리펩타이드는 1종 이상의 세포 유형, 예컨대, 조절성 T 세포(Treg), 골수-유래 억제 세포(MDSC), 수지상 세포 및/또는 T 세포의 활성도를 조정한다. 예시적인 Treg 조정 폴리펩타이드는 CCR4, 헬리오스(Helios), TIGIT, GITR, 뉴로필린, 뉴리틴(neuritin), CD103, CTLA-4, ICOS 및 Swap70을 포함한다. 예시적인 MDSC 조정 폴리펩타이드는 TGF-βR1, GM-CSF, INFγ, 인터류킨, 예컨대, IL-β, IL-1F2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-6, IL-6Rα, IL-6/IL-6R 복합체, TGF-β1, M-CSF, 프로스타글란딘 E2/PGE2, 프로스타글란딘 E 합성효소 2, S100A8 및 VEGF를 포함한다. 예시적인 수지상-세포 안내된 조정 폴리펩타이드는 GM-CSF 및/또는 IL-13을 포함한다. 예시적인 T 세포-안내된 조정 폴리펩타이드는 IL-12, OX-40, GITR, CD28 또는 IL-28 또는 IL-12, OX-40, GITR, CD28 또는 IL-28을 포함하는 경로를 효능작용하는 항체를 포함한다.
다른 실시형태에서, 치료적 폴리펩타이드는 섬유증 기질을 조정한다. 예시적인 섬유증 기질 폴리펩타이드는 섬유아세포 활성화 단백질-알파(FAP)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료적 폴리펩타이드는 프로테아제이다. 특별한 실시형태에서, 프로테아제는 세포외 매트릭스, 특히 종양 미세환경 내의 세포외 매트릭스를 변경시킬 수 있다. 예시적인 프로테아제는 매트릭스메탈로프로테아제(MMP), 예컨대, MMP9, 콜라게나제 및 엘라스타제를 포함한다.
치료 분자로서의 사이토카인
일부 경우에, 면역 조정인자 폴리펩타이드는 사이토카인이다. 사이토카인은 세포 신호전달에 관여되는 약 5 내지 20kDa의 작은 단백질의 카테고리이고, 특히 케모카인, 인터페론(INF), 인터류킨(IL) 및 종양 괴사 인자(TNF)를 포함한다. 케모카인은 세포의 이동을 안내하기 위한 화학유인제로서 역할을 하고, 4개의 서브패밀리로 분류된다: CXC, CC, CX3C, 및 XC. 예시적인 케모카인은 CC 서브패밀리로부터의 케모카인, 예컨대, CCL1, CCL2(MCP-1), CCL3, CCL4, CCL5(RANTES), CCL6, CCL7, CCL8, CCL9(또는 CCL10), CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, 및 CCL28; CXC 서브패밀리, 예컨대, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, 및 CXCL17; XC 서브패밀리, 예컨대, XCL1 및 XCL2; 및 X3C 서브패밀리, 예컨대, CX3CL1을 포함한다.
인터페론(IFN)은 I형 IFN(예를 들어, IFN-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ 및 IFN-ω), II형 IFN(예를 들어, IFN-γ) 및 III형 IFN을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-α는 IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17 및 IFNA21을 비롯한 약 13종의 하위유형으로 추가로 분류된다.
인터류킨은 면역세포, 예컨대 T 세포 및 B 세포, 및 다른 조혈 세포의 발생 및 분화를 촉진시키는 사이토카인의 넓은 부류이다. 예시적인 인터류킨은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8(CXCL8), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35 및 IL-36을 포함한다.
종양 괴사 인자(TNF)는 아포토시스를 조정하는 사이토카인의 군이다. 일부 예에서, TNF 패밀리 내에는 약 19종의 구성원이 존재하고, 이것은 TNFα, 림포톡신-알파(LT-α), 림포톡신-베타(LT-β), T 세포 항원 gp39(CD40L), CD27L, CD30L, FASL, 4-1BBL, OX40L 및 TNF-관련 아포토시스 유도 리간드(TRAIL)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 인게이저를 암호화하는 핵산 서열 및 케모카인, 인터페론, 인터류킨 또는 종양 괴사 인자로부터 선택된 사이토카인을 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열 및 케모카인, 인터페론, 인터류킨 및/또는 종양 괴사 인자를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다.
치료 분자로서의 공자극성 도메인
일부 실시형태에서, 면역 조정인자 폴리펩타이드는 공자극성 도메인이다. 일부 경우에, 공자극성 도메인은 항원-특이적 세포독성을 향상시킨다. 일부 경우에, 공자극성 도메인은 사이토카인 생산을 추가로 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 공자극성 도메인은 CD27, CD28, CD70, CD80, CD83, CD86, CD134(OX-40), CD134L(OK-40L), CD137(41BB), CD137L(41BBL) 또는 CD224를 포함한다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 인게이저를 암호화하는 핵산 서열 및 공자극성 도메인을 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 인게이저를 암호화하는 핵산 서열 및 CD27, CD28, CD80, CD83, CD86, CD134, CD134L, CD137, CD137L 또는 CD224로부터 선택된 공자극성 도메인을 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다.
치료 분자로서의 면역 관문 저해제
일부 실시형태에서, 면역 조정인자 폴리펩타이드는 T-세포 활성화의 음성 조절성 분자를 저해하는 면역 관문 저해제 폴리펩타이드이다. 면역 관문 저해제는 CD4 및 CD8 T 세포의 세포 표면 상의 분자의 군인, 면역 관문 분자에 결합한다. 일부 예에서, 이러한 분자는 항-종양 면역 반응을 하향조정 또는 저해하기 위한 "브레이크"로서 작용한다. 면역 관문 저해제는 면역 관문 분자의 활성도를 조정 또는 저해하는 임의의 분자를 지칭한다. 일부 예에서, 면역 관문 저해제는 항체, 항체-유도체(예를 들어, Fab 단편, scFv, 모노바디, 다이아바디), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 압타머 또는 펩타이드를 포함한다.
예시적인 면역 관문 분자는 예정된 사멸-리간드 1(PDL1, B7-H1, CD274라고도 공지됨), 예정된 사멸 1(PD-1), PD-L2(B7-DC, CD273), LAG3, TIM3, 2B4, A2aR, B7H1, B7H3, B7H4, BTLA, CD2, CD16, CD27, CD28, CD30, CD40, CD70, CD80, CD86, CD137, CD160, CD226, CD276, DR3, GAL9, GITR, HAVCR2, HVEM, IDO1, IDO2, 유도성 T 세포 공자극성(ICOS), KIR, LAIR1, LIGHT, 콜라겐성 구조를 갖는 대식세포 수용체(MARCO), OX-40, 포스파티딜세린(PS), SLAM, TIGHT, VISTA 및 VTCN1을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 면역 관문 저해제는 PDL1, PD-1, CTLA-4, PD-L2, LAG3, TIM3, 2B4, A2aR, B7H1, B7H3, B7H4, BTLA, CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, CD70, CD80, CD86, CD137, CD160, CD226, CD276, DR3, GAL9, GITR, HAVCR2, HVEM, IDO1, IDO2, ICOS, KIR, LAIR1, LIGHT, MARCO, OX-40, PS, SLAM, TIGHT, VISTA 및 VTCN1 중 하나 이상을 저해한다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열 및 면역 관문 저해제를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 관문 저해제는 1종 이상의 면역 관문 분자의 발현 또는 활성도를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 면역 관문 저해제는 면역 관문 분자와 이의 리간드 간의 상호작용을 감소시킨다(예를 들어, PD-1과 PDL1 간의 상호작용을 감소시킴). 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 인게이저를 암호화하는 핵산 서열 및 PDL1, PD-1, CTLA-4, PD-L2, LAG3, TIM3, 2B4, A2aR, B7H1, B7H3, B7H4, BTLA, CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, CD70, CD80, CD86, CD137, CD160, CD226, CD276, DR3, GAL9, GITR, HAVCR2, HVEM, IDO1, IDO2, ICOS, KIR, LAIR1, LIGHT, MARCO, OX-40, PS, SLAM, TIGHT, VISTA 및 VTCN1 중 1종 이상을 저해하는 면역 관문 저해제를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 활성화 도메인 및 치료 분자 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 치료 분자 도메인은 면역 관문 저해제이다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 활성화 도메인 및 치료 분자 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 치료 분자 도메인은 PDL1, PD-1, CTLA-4, PD-L2, LAG3, TIM3, 2B4, A2aR, B7H1, B7H3, B7H4, BTLA, CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, CD70, CD80, CD86, CD137, CD160, CD226, CD276, DR3, GAL9, GITR, HAVCR2, HVEM, IDO1, IDO2, ICOS, KIR, LAIR1, LIGHT, MARCO, OX-40, PS, SLAM, TIGHT, VISTA 및 VTCN1 중 1종 이상을 저해하는 면역 관문 저해제이다.
a) PDL1 저해제
일부 실시형태에서, 면역 관문 저해제는 PDL1의 저해제이다. 일부 실시형태에서, 면역 관문 저해제는 PDL1에 대한 항체(예를 들어, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 인간화 또는 키메라 항체 또는 항원-결합 단편)이다. 일부 실시형태에서, PDL1의 저해제는 PDL1의 발현 또는 활성도를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, PDL1의 저해제는 PD-1과 PDL1 간의 상호작용을 감소시킨다. 예시적인 PDL1의 저해제는 항-PDL1 항체, RNAi 분자(예를 들어, 항-PDL1 RNAi), 안티센스 분자(예를 들어, 항-PDL1 안티센스 RNA) 또는 우성 음성(dominant negative) 단백질(예를 들어, 우성 음성 PDL1 단백질)을 포함한다. 예시적인 항-PDL1 항체는 클론 EH12; MPDL3280A(제넨테크(Genentech), RG7446); 항-마우스 PDL1 항체 클론 10F.9G2(바이오엑스셀(BioXcell), Cat # BE0101); 항-PDL1 단클론성 항체 MDX-1105(브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Meyers Squibb)으로부터의 BMS-936559 및 BMS-935559; MSB0010718C; 마우스 항-PDL1 클론 29E.2A3; 및 아스트라제네카(AstraZeneca)의 MEDI4736을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-PDL1 항체는 국제 PCT 공개 제WO 2013/079174호; WO 2010/036959호; 제WO 2013/056716호; 제WO 2007/005874호; WO 2010/089411호; 제WO 2010/077634호; 제WO 2004/004771호; 제WO 2006/133396호; 제WO 2013/09906호; 제WO 2012/145493호; 제WO 2013/181634호; 미국 특허 출원 공개 제20140294898호; 또는 중국 특허 출원 공개 제CN 101104640호에 개시된 항-PDL1 항체이다.
일부 실시형태에서, PDL1 저해제는 PDL1 발현의 핵산 저해제이다. 일부 실시형태에서, PDL1 저해제는 국제 PCT 공개 제WO 2011/127180호 또는 제WO 2011/000841호에 개시된 것이다. 일부 실시형태에서, PDL1 저해제는 라파마이신이다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 CD3(예를 들어, 항-CD3 scFv)에 결합하는 활성화 도메인 및 PDL1(예를 들어, 항-PDL1 scFv)에 결합하는 치료 분자 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 추가적인 치료 분자를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 활성화 도메인 및 PDL1에 결합하는 치료 분자 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 활성화 도메인 및 항원 인식 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열, 및 PDL1 저해제를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 인게이저를 암호화하는 핵산 서열 및 EH12, 제넨테크의 MPDL3280A(RG7446); 바이오엑스셀로부터의 항-마우스 PDL1 항체 클론 10F.9G2(Cat # BE0101); 브리스톨-마이어스 스큅으로부터의 항-PDL1 단클론성 항체 MDX-1105(BMS-936559) 및 BMS-935559; MSB0010718C; 마우스 항-PDL1 클론 29E.2A3; 및 아스트라제네카의 MEDI4736로부터 선택된 PDL1 저해제를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다.
b) PD-L2 저해제
일부 실시형태에서, 면역 관문 저해제는 PD-L2의 저해제이다. 일부 실시형태에서, PD-L2의 저해제는 PD-L2에 대한 항체(예를 들어, 단클론성 항체 또는 단편 또는 인간화 또는 키메라 항체 또는 이의 단편)이다. 일부 실시형태에서, PD-L2의 저해제는 PD-L2의 발현 또는 활성도를 감소시킨다. 다른 실시형태에서, PD-L2의 저해제는 PD-1과 PD-L2 간의 상호작용을 감소시킨다. PD-L2의 예시적인 저해제는 항체(예를 들어, 항-PD-L2 항체), RNAi 분자(예를 들어, 항-PD-L2 RNAi), 안티센스 분자(예를 들어, 항-PD-L2 안티센스 RNA) 또는 우성 음성 단백질(예를 들어, 우성 음성 PD-L2 단백질)을 포함한다.
일부 실시형태에서, PD-L2 저해제는 글락소스미쓰클라인(GlaxoSmithKline)의 AMP-224(앰플리뮨(Amplimmune))이다. 일부 실시형태에서, PD-L2 저해제는 rHIgM12B7이다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 활성화 도메인 및 항원 인식 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열, 및 PD-L2 저해제를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 인게이저를 암호화하는 핵산 서열 및 AMP-224(앰플리뮨) 또는 rHIgM12B7로부터 선택된 PD-L2 저해제를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 활성화 도메인 및 PDL2에 결합하는 치료 분자 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 CD3(예를 들어, 항-CD3 scFv)에 결합하는 활성화 도메인 및 PD-L2(예를 들어, 항-PDL2 scFv)에 결합하는 치료 분자 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 추가적인 치료 분자를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
c) PD-1 저해제
일부 실시형태에서, 면역 관문 저해제는 PD1의 저해제이다. 일부 실시형태에서, PDL1의 저해제는 PD-1에 대한 항체(예를 들어, 단클론성 항체 또는 단편 또는 인간화 또는 키메라 항체 또는 이의 단편)이다. PD-1에 대한 예시적인 항체는 바이오엑스셀로부터의 항-마우스 PD-1 항체 클론 J43(Cat # BE0033-2); 바이오엑스셀로부터의 항-마우스 PD-1 항체 클론 RMP1-14(Cat # BE0146); 마우스 항-PD-1 항체 클론 EH12; 머크(Merck)의 MK-3475 항-마우스 PD-1 항체(키트루다(Keytruda), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 람브롤리주맙(lambrolizumab)); 및 아납티스바이오(AnaptysBio)의 항-PD-1 항체, ANB011라고 공지됨; 항체 MDX-1 106(ONO-4538); 브리스톨-마이어스 스큅의 인간 IgG4 단클론성 항체 니볼루맙(nivolumab)(Opdivo(등록상표), BMS-936558, MDX1106); 아스트라제네카의 AMP-514, 및 AMP-224; 및 피딜리주맙(Pidilizumab)(CT-011), 큐어테크 엘티디.(CureTech Ltd.)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 활성화 도메인 및 항원 인식 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열, 및 ANB011; 항체 MDX-1 106(ONO-4538); 브리스톨-마이어스 스큅's 인간 IgG4 단클론성 항체 니볼루맙 (Opdivo(등록상표), BMS-936558, MDX1106); 아스트라제네카의 AMP-514, 및 AMP-224; 및 피딜리주맙(CT-011)으로부터 선택된 PD1 저해제를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 인게이저를 암호화하는 핵산 서열, 및 ANB011; 항체 MDX-1 106(ONO-4538); 브리스톨-마이어스 스큅's 인간 IgG4 단클론성 항체 니볼루맙(Opdivo(등록상표), BMS-936558, MDX1106); 아스트라제네카의 AMP-514, 및 AMP-224; 및 피딜리주맙(CT-011)으로부터 선택된 PD-1 저해제를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 활성화 도메인 및 항원 인식 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열, 및 PD-L2 저해제를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열 및 AMP-224(앰플리뮨) 또는 rHIgM12B7로부터 선택된 PD-L2 저해제를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 활성화 도메인 및 PD1에 결합하는 치료 분자 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 CD3(예를 들어, 항-CD3 scFv)에 결합하는 활성화 도메인 및 PD1(예를 들어, 항-PD1 scFv)에 결합하는 치료 분자 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 추가적인 치료 분자를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
d) CTLA-4 저해제
일부 실시형태에서, 면역 관문 저해제는 CTLA-4의 저해제이다. 일부 실시형태에서, CTLA-4의 저해제는 CTLA-4에 대한 항체(예를 들어, 단클론성 항체 또는 단편 또는 인간화 또는 키메라 항체 또는 이의 단편)이다. 일 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체는 항원 제시 세포 상에서 발현된 CD80(B7-1) 및/또는 CD86(B7-2)에 대한 CTLA-4의 결합을 차단한다. CTLA-4에 대한 예시적인 항체는 이필리무맙(ipilimumab)(Yervoy(등록상표)라고도 공지됨, MDX-010, BMS-734016 및 MDX-101, 브리스톨 마이어스 스큅); 밀리포어(Millipore)로부터의 항-CTLA4 항체 클론 9H10; 트레멜리무맙(tremelimumab)(CP-675,206, 티실리무맙, 파이저(Pfizer)); 및 압캄(Abcam)으로부터의 항-CTLA4 항체 클론 BNI3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체는 국제 PCT 공개 제WO 2001/014424호; 제WO 2004/035607호; 제WO 2003/086459호; 제WO 2012/120125호; 제WO 2000/037504호; 제WO 2009/100140호; 제WO 2006/09649호; 제WO 2005/092380호; 제WO 2007/123737호; 제WO 2006/029219호; 제WO 2010/0979597호; 제WO 2006/12168호; 제WO 1997/020574호, 미국 특허 출원 공개 제 2005/0201994호; 또는 유럽 특허 출원 공개 제EP 1212422호 중 임의의 것에 개시된 것이다. 추가적인 CTLA-4 항체는 미국 특허 제5,811,097호; 제5,855,887호; 제5,977,318호; 제6,051,227호; 제6,682,736호; 제6,984,720호; 제7,109,003호; 제7,132,281호; 국제 PCT 공개 제WO 01/14424호 및 제WO 00/37504; 및 미국 특허 출원 공개 제2002/0039581호 및 제 2002/086014에 기술되어 있다. 일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체는 국제 PCT 공개 제WO 1998/42752호; 미국 특허 제6,682,736호 및 제6,207,156호; 문헌[Hurwitz et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(17): 10067-10071 (1998); Camacho et al, J. Clin. Oncol., 22(145): Abstract No. 2505 (2004) (항체 CP-675206); Mokyr et al, Cancer Res., 58:5301-5304 (1998)] 중 임의의 것에 개시된 것이다.
일부 실시형태에서, CTLA-4 저해제는 국제 PCT 공개 제WO 1996/040915호에 개시된 바와 같은 CTLA-4 리간드이다.
일부 실시형태에서, CTLA-4 저해제는 CTLA-4 발현의 핵산 저해제, 예컨대, RNAi 분자이다. 일부 실시형태에서, 항-CTLA4 RNAi 분자는 국제 PCT 공개 제WO 1999/032619호 및 제WO 2001/029058; 미국 특허 출원 공개 제2003/0051263호, 제2003/0055020호, 제2003/0056235호, 제2004/265839호, 제2005/0100913호, 제2006/0024798호, 제2008/0050342호, 제2008/0081373호, 제2008/0248576호 및 제2008/055443; 및/또는 미국 특허 제6,506,559호; 제7,282,564호; 제7,538,095호; 및 제7,560,438호 중 임의의 것에 기술된 것의 형태를 갖는다. 일부 예에서, 항-CTLA4 RNAi 분자는 이중 가닥 RNAi 분자, 예컨대, 유럽 특허 제EP 1309726호에 개시된 것이다. 일부 예에서, 항-CTLA4 RNAi 분자는 이중 가닥 RNAi 분자, 예컨대, 미국 특허 제7,056,704호 및 제7,078,196호에 기술된 것이다. 일부 실시형태에서, CTLA4 저해제는 압타머, 예컨대, 국제 PCT 공개 제WO 2004/081021호에 기술된 것, 예컨대, Del 60 또는 M9-14 del 55이다. 추가로, 일부 실시형태에서, 본 발명의 항-CTLA4 RNAi 분자는 RNA 분자, 예컨대, 미국 특허 제5,898,031호, 제6,107,094호, 제7,432,249호, 및 제7,432,250호, 및 유럽 출원 제EP 0928290에 기술된 것이다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 활성화 도메인 및 항원 인식 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열, 및 CTLA-4 저해제를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열 및 이필리무맙(Yervoy(등록상표)라고도 공지됨, MDX-010, BMS-734016 및 MDX-101); 항-CTLA4 항체, 밀리포어로부터의 클론 9H10; 파이저의 트레멜리무맙(CP-675,206, 티실리무맙); 및 압캄으로부터의 항-CTLA4 항체 클론 BNI3으로부터 선택된 CTLA-4 저해제를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 활성화 도메인 및 CTLA-4에 결합하는 치료 분자 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 CD3(예를 들어, 항-CD3 scFv)에 결합하는 활성화 도메인 및 CTLA-4(예를 들어, 항-CTLA-4 scFv)에 결합하는 치료 분자 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 추가적인 치료 분자를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
e) LAG3 저해제
일부 실시형태에서, 면역 관문 저해제는 LAG3(CD223)의 저해제이다. 일부 실시형태에서, LAG3의 저해제는 LAG3에 대한 항체(예를 들어, 단클론성 항체 또는 단편 또는 인간화 또는 키메라 항체 또는 이의 단편)이다. 추가적인 실시형태에서, LAG3에 대한 항체는 LAG3과 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 II 분자의 상호작용을 차단한다. LAG3에 대한 예시적인 항체는 이바이오사이언스(eBioscience)로부터의 항-Lag-3 항체 클론 eBioC9B7W(C9B7W); 라이프스팬 바이오사이언시스즈(LifeSpan Biosciences)로부터의 항-Lag3 항체 LS-B2237; 이뮤텝(Immutep)으로부터의 IMP321(ImmuFact); 항-Lag3 항체 BMS-986016; 및 LAG-3 키메라 항체 A9H12를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-LAG3 항체는 국제 PCT 공개 제WO 2010/019570호; 제WO 2008/132601호; 또는 제WO 2004/078928호에 개시된 항-LAG3 항체이다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 활성화 도메인 및 항원 인식 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열, 및 LAG3 저해제를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열 및 이바이오사이언스로부터의 항-Lag-3 항체 클론 eBioC9B7W(C9B7W); 라이프스팬 바이오사이언시스즈로부터의 항-Lag3 항체 LS-B2237; 이뮤텝으로부터의 IMP321(ImmuFact); 항-Lag3 항체 BMS-986016; 및 LAG-3 키메라 항체 A9H12로부터 선택된 LAG3 저해제를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 활성화 도메인 및 LAG3에 결합하는 치료 분자 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 CD3(예를 들어, 항-CD3 scFv)에 결합하는 활성화 도메인 및 LAG3(예를 들어, 항-LAG3 scFv)에 결합하는 치료 분자 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 추가적인 치료 분자를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
f) TIM3 저해제
일부 실시형태에서, 면역 관문 저해제는 TIM3의 저해제이다. 일부 실시형태에서, TIM3의 저해제는 TIM3(HAVCR2라고도 공지됨)에 대한 항체(예를 들어, 단클론성 항체 또는 단편 또는 인간화 또는 키메라 항체 또는 이의 단편)이다. 추가적인 실시형태에서, TIM3에 대한 항체는 TIM3과 갈렉틴-9(Gal9)의 상호작용을 차단한다. 일부 실시형태에서, 항-TIM3 항체는 국제 PCT 공개 제WO 2013/006490호; 제WO 2011/55607호; 제WO 2011/159877호; 또는 제WO 2001/17057호에 개시된 항-TIM3 항체이다. 또 다른 실시형태에서, TIM3 저해제는 국제 PCT 공개 제WO 2009/052623호에 개시된 TIM3 저해제이다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 활성화 도메인 및 항원 인식 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열, 및 TIM3 저해제를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열 및 TIM3 저해제, 예컨대, TIM3과 갈렉틴-9(Gal9)의 상호작용을 차단하는 TIM3에 대한 항체를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 활성화 도메인 및 TIM3에 결합하는 치료 분자 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 CD3(예를 들어, 항-CD3 scFv)에 결합하는 활성화 도메인 및 LAG3(예를 들어, 항-TIM3 scFv)에 결합하는 치료 분자 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 추가적인 치료 분자를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
g) B7-H3 저해제
일부 실시형태에서, 면역 관문 저해제는 B7-H3의 저해제이다. 일부 실시형태에서, B7-H3의 저해제는 B7-H3에 대한 항체(예를 들어, 단클론성 항체 또는 단편 또는 인간화 또는 키메라 항체 또는 이의 단편)이다. 일부 실시형태에서, B7-H3의 저해제는 MGA271(마크로제닉스(MacroGenics))이다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 활성화 도메인 및 항원 인식 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열, 및 B7-H3 저해제를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 인게이저를 암호화하는 핵산 서열 및 B7-H3 저해제, 예컨대, MGA271을 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 활성화 도메인 및 B7-H3에 결합하는 치료 분자 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 CD3(예를 들어, 항-CD3 scFv)에 결합하는 활성화 도메인 및 B7-H3(예를 들어, 항-B7-H3 scFv)에 결합하는 치료 분자 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스는 추가적인 치료 분자를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
특정 다른 실시형태에서, 인게이저 분자는 1종 이상의 다른 도메인, 예를 들어, 사이토카인, 공자극성 도메인, T-세포 활성화의 음성 조절성 분자를 저해하는 도메인 또는 이들의 조합물 1종 이상을 추가적으로 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 인게이저는 위형 종양용해성 바이러스 내에 제공된 제1 폴리펩타이드와 1종 이상의 다른 도메인, 예를 들어, 사이토카인, 공자극성 도메인, T-세포 활성화의 음성 조절성 분자를 저해하는 도메인 또는 이들의 조합물 1종 이상을 갖는 제2 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 동일한 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터) 내에서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 상이한 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터) 내에서 암호화된다. 구체적인 실시형태에서, 사이토카인은 IL-15, IL-2 및/또는 IL-7이다. 다른 구체적인 실시형태에서, 공자극성 도메인은 CD27, CD80, CD83, CD86, CD134 또는 CD137이다. 다른 구체적인 실시형태에서, T-세포 활성화의 음성 조절성 분자를 저해하는 도메인은 PD-1, PDL1, CTLA4 또는 B7-H4이다.
치료 분자로서의 항-혈관형성 인자
일부 실시형태에서, 치료 분자는 폴리펩타이드 예컨대, 항-혈관형성 인자이다. 혈관형성 또는 신혈관형성은 확립된 혈관 네트워크로부터의 새로운 미세혈관의 형성이다. 일부 예에서, 혈관형성은 다수의 세포 유형, 예컨대, 내피 세포(EC) 및 혈관 내피 전구 세포, 주연세포, 혈관 평활근 세포, 기질 세포, 예컨대, 줄기세포 및 실질 세포로로부터의 소통을 포함한다. 이러한 소통 또는 상호작용은 분비된 인자, 예컨대, VEGF, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF) 또는 앤지오포이에틴을 통해서 일어난다. 일부 예에서, 항-혈관형성 인자는 세포 유형: 내피 세포(EC) 및 혈관 내피 전구 세포, 주연세포, 혈관 평활근 세포, 기질 세포, 예컨대, 줄기세포 및 실질 세포의 상호작용 중 1종 이상을 방해하는 폴리펩타이드이다. 일부 예에서, 항-혈관형성 인자는 분비된 인자, 예컨대, VEGF, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF) 또는 앤지오포이에틴의 상호작용 중 하나 이상을 방해하는 폴리펩타이드이다.
다른 실시형태에서, 조절성 T 세포를 조정하는 치료적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 위형 종양용해성 바이러스가 제공된다. 일부 예에서, 조절성 T 세포는 자기-항원에 대한 관용(tolerance)을 유지하고, 일부 예에서 자가면역을 폐지한다. 일부 경우에, Treg는 효과기 T 세포의 유도 및 증식을 억제 또는 하향조절한다. 예시적인 Treg 조정 폴리펩타이드는 CCR4, 헬리오스(Helios), TIGIT, GITR, 뉴로필린, 뉴리틴(neuritin), CD103, CTLA-4, ICOS 및 Swap70을 포함한다.
다른 실시형태에서, 골수-유래 억제 세포(MDSC)를 조정하는 치료적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 위형 종양용해성 바이러스가 제공된다. MDSC는 수지상 세포, 대식세포 및 호중구를 또한 포함하는 골수 계통(골수 줄기세포로부터 유래한 상이한 세포 유형의 클러스터)의 면역세포의 이종 집단이다. 일부 예에서, 골수 세포는 T 세포와 상호작용하여 T 세포의 기능을 조절한다. 예시적인 MDSC 조정 폴리펩타이드는 TGF-βR1, GM-CSF, IFN-γ, 인터류킨(예를 들어, IL-β, IL-1F2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-6, IL-6Rα, IL-6/IL-6R 복합체, TGF-β1, M-CSF, 프로스타글란딘 E2/PGE2, 프로스타글란딘 E 합성효소 2, S100A8 및 VEGF를 포함한다.
다른 실시형태에서, 섬유증 기질을 조정하는 치료적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 위형 종양용해성 바이러스가 제공된다. 일부 실시형태에서, 섬유증은 만성 또는 재발성인 염증에 반응하여 발생한다. 시간에 따라서, 염증의 반복적인 병치례는 조직을 자극하여 상처를 남겨서, 섬유성 조직의 증강을 유발한다. 일부 예에서, 충분한 섬유성 물질이 발생하면, 그것은 기질 섬유종으로 변한다. 예시적인 섬유증 기질 폴리펩타이드는 섬유아세포 활성화 단백질-알파(FAP)를 포함한다.
치료 분자로서의 핵산 중합체
일부 실시형태에서, 치료 분자는 핵산 중합체이다. 일부 예에서, 핵산 중합체는 RNA 중합체이다. 일부 예에서, RNA 중합체는 서열이 마이크로RNA(miRNA 또는 miR) 표적 서열에 상보적인 안티센스 중합체이다. 일부 예에서, RNA 중합체는 마이크로RNA 중합체이다. 일부 실시형태에서, RNA 중합체는 DNA-지향되는 RNAi(ddRNAi) 서열을 포함하는데, 이것은 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)의 생체내 생산을 가능하게 한다.
일부 실시형태에서, 마이크로RNA 중합체는 표적 유전자의 발현을 억제하는 상이한 조직 및 세포 유형에서 발현되는 짧은 비-암호 RNA이다. 예를 들어, miRNA는 캡핑된 및 폴리아데닐화된 1차 전사물(프리(pri)-miRNA)의 부분으로서 RNA 중합효소 II에 의해서 전사된다. 일부 예에서, 1차 전사물은 드로사(Drosha) 리보뉴클레아제 III 효소에 의해서 절단되어 대략적으로 70-nt의 스템-루프 전구체 miRNA(프레(pre)-miRNA)를 생산하는데, 이것은 세포질 다이서(Dicer) 리보뉴클레아제에 의해서 추가로 절단되어 성숙 miRNA 및 안티센스 miRNA 스타(miRNA*) 산물을 생성시킨다. 일부 예에서, 성숙 miRNA는 RNA-유도된 침묵 복합체(RISC) 내에 혼입되는데, 이것은 miRNA와의 불완전한 염기 짝지움을 통해서 표적 mRNA를 인식하고, 일부 예에서 표적 mRNA의 번역 저해 또는 탈안정화를 초래한다.
일부 예에서, 이상조절된(dysregulated) 마이크로RNA 발현은 1종 이상의 유형의 암과 상관관계가 있다. 일부 실시형태에서, 마이크로RNA는 oncomiR라 지칭된다. 일부 예에서, 이상조절된 마이크로RNA 발현은 상승된 발현이다. 일부 예에서, 마이크로RNA의 상승된 발현 수준은 1종 이상의 유형의 암과 상관관계가 있다. 예를 들어, 마이크로RNA-155(miR-155)의 과발현은 암, 예컨대, 버킷 림프종 또는 후두 편평 세포 암종(LSCC)에서 관찰되었고, 마이크로RNA-21(miR-21)의 과발현은 유방암에서 관찰되었다.
일부 실시형태에서, 상승된 발현 수준을 갖는 예시적인 마이크로RNA는 miR-10 패밀리(예를 들어, miR-10b), miR-17, miR-21, miR-106 패밀리(예를 들어, miR-106a), miR-125 패밀리(예를 들어, miR-125b), miR-145, miR-146 패밀리(예를 들어, miR-146a, miR-146b), miR-155, miR-96, miR-182, miR-183, miR-221, miR-222 및 miR-1247-5p를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 예에서, 핵산 중합체는 서열이 oncomiR의 보체인 안티센스 중합체이다. 일부 예에서, 핵산 중합체는 서열이 과발현을 특징으로 하는 oncomiR의 보체인 안티센스 중합체이다. 일부 예에서, 핵산 중합체는 서열이 마이크로RNA 표적 서열의 보체인 안티센스 중합체이다. 일부 예에서, 핵산 중합체는 서열이 과발현을 특징으로 하는 마이크로RNA 표적 서열의 보체인 안티센스 중합체이다. 일부 예에서, 치료 분자는 서열이 마이크로RNA 표적 서열의 보체인 안티센스 중합체이다. 일부 예에서, 치료 분자는 서열이 과발현을 특징으로 하는 마이크로RNA 표적 서열의 보체인 안티센스 중합체이다. 일부 예에서, 과발현 수준은 마이크로RNA의 내인성 발현 수준에 관련된다.
일부 예에서, 이상조절된 마이크로RNA 발현은 감소된 발현이다. 일부 예에서, 마이크로RNA의 감소된 발현 수준은 1종 이상의 유형의 암과 상관관계가 있다. 예를 들어, miR-31의 감손된 수준은 인간 및 마우스 전이성 유방암 세포주 둘 모두에서 관찰되었다.
일부 실시형태에서, 감소된 발현 수준을 갖는 예시적인 마이크로RNA는 miR-31, miR-34 패밀리(예를 들어, miR34a, miR-34b 및 miR-34c), miR-101, miR-126, miR-145, miR-196a, 및 miR-200 패밀리를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 예에서, 핵산 중합체는 oncomiR이다. 일부 예에서, oncomiR은 내인성 oncomiR과 동등하고, 여기서 내인성 oncomiR은 감소된 발현 수준을 특징으로 한다. 일부 예에서, 핵산 중합체는 마이크로RNA 중합체이다. 일부 예에서, 치료 분자는 마이크로RNA 중합체이다. 일부 예에서, 마이크로RNA는 내인성 마이크로RNA 중합체와 동등하고, 여기서 내인성 마이크로RNA는 감소된 발현 수준을 특징으로 한다.
상기에 기술된 바와 같이, 일부 예에서 RNA 중합체는 DNA-지향되는 RNAi(ddRNAi) 서열을 포함한다. 일부 예에서, shRNA를 암호화하는 ddRNAi 작제물은 바이러스 벡터 예컨대, 본 명세서에 기술된 위형 종양용해성 바이러스의 바이러스 벡터 내에 패키징된다. 일부 예에서 표적 세포(예를 들어, 종양 세포) 내로의 유입 시, 바이러스 게놈은 암호화된 shRNA를 생산하도록 가공된다. 이어서 shRNA는 내인성 숙주계에 의해서 가공되고, 목적하는 유전자 표적을 조정 및 침묵시키도록 RNAi 경로에 유입된다. 일부 예에서, 유전자 표적은 암 유형에서 과발현되는 유전자이다. 일부 예에서, 유전자 표적은 고형 종양에서 과발현되는 유전자이다. 일부 예에서, 유전자 표적은 혈액암에서 과발현되는 유전자이다. 암에서 과발현되는 예시적인 유전자는 TP53, 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2), 뮤신 1-세포 표면 연관(MUC1), 인간 뇌하수체 종양-형질전환 유전자 1(hPPTG1), 전립선 및 유방암 과발현 유전자 1 단백질(PBOV1) 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 예에서, 핵산 중합체는 ddRNAi 서열을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 중합체는 암에서 과발현되는 유전자를 표적으로 하는 ddRNAi 서열을 포함한다. 일부 예에서, 치료 분자는 ddRNAi 서열을 포함한다. 일부 예에서, 치료 분자는 암에서 과발현되는 유전자를 표적으로 하는 ddRNAi 서열을 포함한다.
예시적인 인게이저 분자
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 인게이저 분자는 활성화 도메인 및 항원 인식 도메인을 포함하는 이중특이적 항체 작제물을 포함하며, 여기서 활성화 도메인은 표 1에 제시된 효과기 세포 표면 수용체와 상호작용하거나 또는 이것에 결합하고; 항원 인식 도메인은 표 2에 제시된 표적-세포 항원과 상호작용하거나 또는 이것에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 인게이저 분자는 활성화 도메인 및 치료 분자 도메인을 포함하는 이중특이적 항체 작제물을 포함하며, 여기서 활성화 도메인은 표 1에 제시된 효과기 세포 표면 수용체와 상호작용하거나 또는 이것에 결합하고; 치료 분자 도메인은 표 2에 제시된 세포 표면 항원과 상호작용하거나 또는 이것에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 인게이저 분자는 활성화 도메인을 포함하며, 여기서 활성화 도메인은 항-CD3 scFv를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 scFv는 서열번호 20의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 단편 및 서열번호 22의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 scFv는 서열번호 20의 아미노산 서열과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 단편 및 서열번호 22의 아미노산 서열과 100% 동일한 중쇄 가변 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 scFv는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 단편 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 scFv는 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 단편 및 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 인게이저 분자는 활성화 도메인을 포함하며, 여기서 활성화 도메인은 항-CD3 scFv를 포함하고, 여기서, 항-CD3 scFv는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 가변 단편 핵산 및 서열번호 21의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 가변 단편 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 scFv는 서열번호 19의 핵산 서열과 100% 동일한 경쇄 가변 단편 핵산 및 서열번호 21의 아미노산 서열과 100% 동일한 중쇄 가변 단편 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 scFv는 서열번호 19를 포함하는 경쇄 가변 단편 핵산 서열 및 서열번호 21을 포함하는 중쇄 가변 단편 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 scFv는 서열번호 19로 이루어진 경쇄 가변 단편 핵산 서열 및 서열번호 21로 이루어진 중쇄 가변 단편 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 인게이저 분자는 항원 인식 도메인을 포함하며, 여기서 항원 인식 도메인은 항-CD19 scFv를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD19 scFv는 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 단편 및 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD19 scFv는 서열번호 16의 아미노산 서열과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 단편 및 서열번호 18의 아미노산 서열과 100% 동일한 중쇄 가변 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD19 scFv는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 단편 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD19 scFv는 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 단편 및 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 인게이저 분자는 항원 인식 도메인을 포함하며, 여기서 항원 인식 도메인은 항-CD19 scFv를 포함하고, 여기서, 항-CD19 scFv는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 가변 단편 핵산 및 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 가변 단편 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD19 scFv는 서열번호 15의 핵산 서열과 100% 동일한 경쇄 가변 단편 핵산 및 서열번호 17의 아미노산 서열과 100% 동일한 중쇄 가변 단편 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD19 scFv는 서열번호 15를 포함하는 경쇄 가변 단편 핵산 서열 및 서열번호 17을 포함하는 중쇄 가변 단편 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD19 scFv는 서열번호 15로 이루어진 경쇄 가변 단편 핵산 서열 및 서열번호 17로 이루어진 중쇄 가변 단편 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 인게이저 분자는 치료 분자 도메인을 포함하며, 치료 분자 도메인은 항-PDL1 scFv를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PDL1 scFv는 서열번호 36의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 단편 및 서열번호 38의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PDL1 scFv는 서열번호 36의 아미노산 서열과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 단편 및 서열번호 38의 아미노산 서열과 100% 동일한 중쇄 가변 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PDL1 scFv는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 단편 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PDL1 scFv는 서열번호 36의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 단편 및 서열번호 38의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 인게이저 분자는 치료 분자 도메인을 포함하며, 여기서 치료 분자 도메인은 항-PDL1 scFv를 포함하고, 여기서, 항-PDL1 scFv는 서열번호 35의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 가변 단편 핵산 및 서열번호 37의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 가변 단편 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PDL1 scFv는 서열번호 35의 핵산 서열과 100% 동일한 경쇄 가변 단편 핵산 및 서열번호 37의 아미노산 서열과 100% 동일한 중쇄 가변 단편 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PDL1 scFv는 서열번호 35를 포함하는 경쇄 가변 단편 핵산 서열 및 서열번호 37을 포함하는 중쇄 가변 단편 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PDL1 scFv는 서열번호 35로 이루어진 경쇄 가변 단편 핵산 서열 및 서열번호 37로 이루어진 중쇄 가변 단편 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 인게이저 분자는 치료 분자 도메인을 포함하며, 치료 분자 도메인은 SIRP1α 폴리펩타이드 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, SIRP1α 폴리펩타이드 단편은 서열번호 32의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SIRP1α 폴리펩타이드 단편은 서열번호 32의 아미노산 서열과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SIRP1α 폴리펩타이드 단편은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SIRP1α 폴리펩타이드 단편은 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 인게이저 분자는 치료 분자 도메인을 포함하고, 여기서 치료 분자 도메인은 SIRP1α 폴리펩타이드 단편을 포함하고, 여기서 SIRP1α 폴리펩타이드 단편은 서열번호 31의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SIRP1α 폴리펩타이드 단편은 서열번호 31의 핵산 서열과 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SIRP1α 폴리펩타이드 단편은 서열번호 31의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SIRP1α 폴리펩타이드 단편은 서열번호 31의 핵산 서열로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 인게이저 분자는 CD3에 결합하는 scFv를 포함하는 활성화 도메인 및 CD19에 결합하는 scFv를 포함하는 항원 인식 도메인을 포함한다(본 명세서에서 CD19-CD3 BiTE 또는 CD19 BiTE라 지칭됨). 예시적인 CD19-CD3 BiTE는 도 1(서열번호 44)에 도시되어 있다. 이러한 실시형태에서, 항-CD3 scFv 및 항-CD19 scFv은 G4S 링커(서열번호 6)에 의해서 함께 연결된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스는 이시스트론성 또는 다시스트론성 핵산 서열을 포함하는데, 여기서 제1 핵산 서열은 CD19-CD3 BiTE를 암호화하고, 제2 핵산 서열은 치료 분자, 예컨대, IL-15(도 2, 서열번호 53), IL-12(도 3, 서열번호 54) 또는 CXCL10(도 4, 서열번호 55)을 암호화한다. 이러한 실시형태에서, CD19-CD3 BiTE(예를 들어, 서열번호 44)는 T2A 자가-절단 펩타이드 링커(서열번호 14)에 의해서 치료 분자, 예를 들어, IL-15(서열번호 24), IL-12 p35(서열번호 28), IL-12 p40(서열번호 26), 및/또는 CXCL10(서열번호 30)에 연결된다.
일부 실시형태에서, 인게이저 분자는 CD3에 결합하는 scFv를 포함하는 활성화 도메인 및 CD47에 결합하는 SIRP1α 폴리펩타이드 단편을 포함하는 치료 분자 도메인(서열번호 32)을 포함한다(본 명세서 SIRP1α-CD3 BiTE 또는 SIRP1α BiTE라 지칭됨). 예시적인 SIRP1α-CD3 BiTE의 개략도가 도 5(SIRP1α-CD3 (SL), 서열번호 46) 및 도 6(SIRP1α-CD3(LL), 서열번호 48)에 도시되어 있다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 scFv 및 SIRP1α 펩타이드 단편은 단일 아미노산 링커 또는 "짧은 링커"(SL)(예를 들어, 도 5에 도시된 바와 같은 SIRP1α-CD3 (SL))에 의해서 함께 연결된다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 scFv 및 SIRP1α 펩타이드 단편은 G4S 링커 또는 "긴 링커"(LL)(예를 들어, 도 6에 도시된 바와 같은 SIRP1α-CD3 (LL))에 의해서 함께 연결된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스는 이시스트론성 또는 다시스트론성 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 SIRP1α-CD3 BiTE를 암호화하고, 제2 핵산 서열은 치료 분자, 예컨대, IL-15(도 7, 서열번호 56 및 도 8, 서열번호 57), IL-12(도 9, 서열번호 58 및 도 10, 서열번호 59) 또는 CXCL10(도 11, 서열번호 60 및 도 12, 서열번호 61)을 암호화한다. 이러한 실시형태에서, SIRP1α-CD3 BiTE(예를 들어, 서열번호 46 또는 서열번호 48)는 T2A 자가-절단 펩타이드 링커(서열번호 14)에 의해서 치료 분자, 예를 들어, IL-15(서열번호 24), IL-12 p35(서열번호 28), IL-12 p40(서열번호 26), 및/또는 CXCL10(서열번호 30)에 연결된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스는 이시스트론성 또는 다시스트론성 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 SIRP1α-CD3 BiTE를 암호화하고, 제2 핵산 서열은 치료 분자, 예컨대, MMP9(도 18A, 서열번호 65 및 도 18B, 서열번호 66)를 암호화한다. 이러한 실시형태에서, SIRP1α-CD3 BiTE(예를 들어, 서열번호 65 또는 66)는 T2A 자가-절단 펩타이드 링커(서열번호 14)에 의해서 MMP9 폴리펩타이드(서열번호 34)에 연결된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스는 이시스트론성 또는 다시스트론성 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 SIRP1α-CD3 BiTE를 암호화하고, 제2 핵산 서열은 IgG1 Fc 도메인에 연결된 항-PDL1 scFv를 포함하는 치료 분자(예를 들어, IgG1 CH2-CH3-힌지를 포함함, 서열번호 40), 예컨대, 도 37(서열번호 68)에 도시된 SIRP1α-CD3-PDL1-Fc(SL) 작제물 또는 도 38(서열번호 70)에 도시된 SIRP1α-CD3-PDL1-Fc(LL) 작제물을 암호화한다.
일부 실시형태에서, 인게이저 분자는 CD3에 결합하는 scFv를 포함하는 활성화 도메인 및 PDL1에 결합된 scFv를 포함하는 치료 분자 도메인을 포함한다(본 명세서에서 PDL1-CD3 BiTE 또는 PDL1 BiTE라 지칭됨). 예시적인 PDL1-CD3 BiTE는 도 13(서열번호 50)에 도시되어 있다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 scFv 및 항-PDL1 scFv는 G4S 링커(서열번호 6)에 의해서 함께 연결된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스는 이시스트론성 또는 다시스트론성 핵산 서열을 포함하는데, 여기서 제1 핵산 서열은 PDL1-CD3 BiTE를 암호화하고, 제2 핵산 서열은 치료 분자, 예컨대, IL-15(도 14, 서열번호 62), IL-12(도 15, 서열번호 63) 또는 CXCL10(도 16, 서열번호 64)을 암호화한다. 이러한 실시형태에서, SIRP1α-CD3 BiTE(예를 들어, 서열번호 50)는 T2A 자가-절단 펩타이드 링커(서열번호 14)에 의해서 치료 분자, 예를 들어, IL-15(서열번호 24), IL-12 p35(서열번호 28), IL-12 p40(서열번호 26), 및/또는 CXCL10(서열번호 30)에 연결된다.
일부 실시형태에서, 인게이저 분자는 삼분 인게이저 분자이고, CD3에 결합하는 scFv를 포함하는 활성화 도메인, PDL1에 결합하는 scFv를 포함하는 치료 분자 도메인, 및 IgG1 Fc 도메인을 포함하고 1종 이상의 FcγR에 결합할 수 있는 제3 도메인(예를 들어, IgG1 CH2-CH3-힌지를 포함함, 서열번호 40)을 포함하며, 본 명세서에서 PDL1-CD3-Fc 삼분 T 세포 인게이저 또는 TiTE 또는 PDL1 TiTE라 지칭된다. 예시적인 PDL1-CD3-Fc TiTE의 개략도가 도 17(서열번호 52)에 도시되어 있다.
예시적인 인게이저 분자 및 치료 분자의 아미노산 서열이 표 3에 도시되어 있다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
일부 실시형태에서, 본 발명은 인게이저 분자 및/또는 치료 분자를 암호화하는 재조합 핵산 서열을 제공한다. 예시적인 재조합 핵산 서열을 표 4에 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 치료 분자를 암호화하고, 치료 분자는 IL-15이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 IL-15 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 24의 아미노산 서열과 100% 동일한 IL-15 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 IL-15 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어진 IL-15 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 IL-15 치료 분자를 암호화하고, 서열번호 23의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 IL-15 치료 분자를 암호화하고, 서열번호 23의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 IL-15 치료 분자를 암호화하고, 서열번호 23의 핵산 서열로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 치료 분자를 암호화하고, 여기서 치료 분자는 IL-12(즉, IL-12 p35 및/또는 IL-12 p40)이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 26의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 IL-12 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 26의 아미노산 서열과 100% 동일한 IL-12 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 IL-12 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 26의 아미노산 서열로 이루어진 IL-12 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 IL-12 치료 분자를 암호화하고, 서열번호 25의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 IL-12 치료 분자를 암호화하고, 서열번호 25의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 IL-12 치료 분자를 암호화하고, 서열번호 25의 핵산 서열로 이루어진다.
일부 실시형태에서,본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 28의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 IL-12 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 28의 아미노산 서열과 100% 동일한 IL-12 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 IL-12 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 28의 아미노산 서열로 이루어진 IL-12 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 IL-12 치료 분자를 암호화하고, 서열번호 27의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 IL-12 치료 분자를 암호화하고, 서열번호 27의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 IL-12 치료 분자를 암호화하고, 서열번호 27의 핵산 서열로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 26 및 28의 아미노산 서열을 포함하는 IL-12 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 IL-12 치료 분자를 암호화하고, 서열번호 25 및 27의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 치료 분자를 암호화하고, 치료 분자는 CXCL10이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 30의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CXCL10 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 30의 아미노산 서열과 100% 동일한 CXCL10 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CXCL10 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 30의 아미노산 서열로 이루어진 CXCL10 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 CXCL10 치료 분자를 암호화하고, 서열번호 29의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 CXCL10 치료 분자를 암호화하고, 서열번호 29의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 CXCL10 치료 분자를 암호화하고, 서열번호 29의 핵산 서열로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 치료 분자를 암호화하고, 치료 분자는 MMP9이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 34의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 MMP9 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 34의 아미노산 서열과 100% 동일한 MMP9 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 MMP9 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 34의 아미노산 서열로 이루어진 MMP9 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 MMP9 치료 분자를 암호화하고, 서열번호 33의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 MMP9 치료 분자를 암호화하고, 서열번호 33의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 MMP9 치료 분자를 암호화하고, 서열번호 33의 핵산 서열로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 치료 분자를 암호화하고, 치료 분자는 항-PDL1 scFv를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 항-PDL1 scFv를 포함하는 치료 분자를 암호화하고, 여기서 항-PDL1 scFv는 서열번호 36의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 단편 및 서열번호 38의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 항-PDL1 scFv를 포함하는 치료 분자를 암호화하고, 여기서 항-PDL1 scFv는 서열번호 36의 아미노산 서열과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 단편 및 서열번호 38의 아미노산 서열과 100% 동일한 중쇄 가변 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 항-PDL1 scFv를 포함하는 치료 분자를 암호화하고, 여기서 항-PDL1 scFv는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 단편 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 항-PDL1 scFv를 포함하는 치료 분자를 암호화하고, 여기서 항-PDL1 scFv는 서열번호 36의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 단편 및 서열번호 38의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 항-PDL1 scFv를 포함하는 치료 분자를 암호화하고, 여기서 항-PDL1 scFv는 서열번호 35의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 가변 단편 핵산 서열 및 서열번호 37의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 가변 단편 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 항-PDL1 scFv를 포함하는 치료 분자를 암호화하고, 여기서 항-PDL1 scFv는 서열번호 35의 핵산 서열과 100% 동일한 경쇄 가변 단편 핵산 서열 및 서열번호 37의 아미노산 서열과 100% 동일한 중쇄 가변 단편 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 항-PDL1 scFv를 포함하는 치료 분자를 암호화하고, 여기서 항-PDL1 scFv는 서열번호 35를 포함하는 경쇄 가변 단편 핵산 서열 및 서열번호 37을 포함하는 중쇄 가변 단편 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 항-PDL1 scFv를 포함하는 치료 분자를 암호화하고, 여기서 항-PDL1 scFv는 서열번호 35로 이루어진 경쇄 가변 단편 핵산 서열 및 서열번호 37로 이루어진 중쇄 가변 단편 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 항-PDL1 scFv 및 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 항-PDL1 scFv 및 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 치료 분자를 암호화하고, 여기서 IgG1 Fc 도메인은 서열번호 40의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 항-PDL1 scFv 및 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 치료 분자를 암호화하고, 여기서 IgG1 Fc 도메인은 서열번호 40의 아미노산 서열과 100% 동일하다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 항-PDL1 scFv 및 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 치료 분자를 암호화하고, 여기서 IgG1 Fc 도메인은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 항-PDL1 scFv 및 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 치료 분자를 암호화하고, 여기서 IgG1 Fc 도메인은 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 항-PDL1 scFv 및 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 치료 분자를 암호화하고, 여기서 IgG1 Fc 도메인 핵산 서열은 서열번호 39의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 항-PDL1 scFv 및 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 치료 분자를 암호화하고, 여기서 IgG1 Fc 도메인 핵산 서열은 서열번호 39를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 항-PDL1 scFv 및 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 치료 분자를 암호화하고, 여기서 IgG1 Fc 도메인 핵산 서열은 서열번호 39를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 43, 45, 47, 49, 51, 67 및 69로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 43, 45, 47, 49, 51, 67 및 69로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 43, 45, 47, 49, 51, 67 및 69로부터 선택된 핵산 서열과 100% 동일하다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 43, 45, 47, 49, 51, 67 및 69로부터 선택된 핵산 서열로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 44, 46, 48, 50 및 52로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 치료 분자 및/또는 인게이저 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 44, 46, 48, 50 및 52로부터 선택된 아미노산 서열과 100% 동일한 인게이저 분자 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 44, 46, 48, 50 및 52로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인게이저 분자 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 서열번호 44, 46, 48, 50 및 52로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 인게이저 분자 단백질을 암호화한다.
일부 실시형태에서, 재조합 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 인게이저 분자 및 치료 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 인게이저 분자 및 치료 분자를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하며, 여기서 아미노산 서열은 서열번호 53 내지 66, 68 및 70로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도, 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 인게이저 분자 및 치료 분자를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하며, 아미노산 서열은 서열번호 53 내지 66, 68 및 70으로부터 선택된 아미노산 서열과 100% 동일하다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 인게이저 분자 및 치료 분자를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하며, 아미노산 서열은 서열번호 53 내지 66, 68 및 70으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
인게이저 분자의 추가적인 예시적인 실시형태는 항-CD3 scFv(예를 들어, 서열번호 20 및 22로 구성됨)를 포함하는 활성화 도메인 및 세포 표면 단백질, 예컨대, CTLA4, TIM3, LAG3, BTLA, KIR, TIGIT, OX40 또는 GITR에 결합하는 scFv를 포함하는 치료 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스는 이시스트론성 또는 다시스트론성 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 항-CD3 scFv(예를 들어, 서열번호 20 및 22로 구성됨)를 포함하는 활성화 도메인 및 세포 표면 단백질 예컨대, CTLA4, TIM3, LAG3, BTLA, KIR, TIGIT, OX40, CD47 또는 GITR에 결합하는 scFv를 포함하는 치료 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하고, 제2 핵산 서열은 치료 분자, 예컨대, IL-15(서열번호 24), IL-12(서열번호 26 및 28), CXCL10(서열번호 30) 또는 MMP9(서열번호 34)를 암호화한다. 이러한 실시형태에서, 인게이저 분자는 T2A 자가-절단 펩타이드 링커(서열번호 14)에 의해서 치료 분자 폴리펩타이드에 연결된다.
인게이저 분자의 추가적인 예시적인 실시형태는 항-CD3 scFv(예를 들어, 서열번호 20 및 22로 구성됨)를 포함하는 활성화 도메인 및 SLAMF7(CD319라고도 공지됨) 또는 CD27(CD27의 막 결합된 형태 또는 CD27의 가용성 형태)에 결합하는 scFv를 포함하는 항원 인식 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스는 이시스트론성 또는 다시스트론성 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 항-CD3 scFv(예를 들어, 서열번호 20 및 22로 구성됨)를 포함하는 활성화 도메인 및 표적 세포 항원, 예컨대, SLAMF7 또는 CD27에 결합하는 scFv를 포함하는 항원-인식 도메인을 포함하는 인게이저 분자를 암호화하고, 제2 핵산 서열은 치료 분자, 예컨대, IL-15(서열번호 24), IL-12(서열번호 26 및 28), CXCL10(서열번호 30) 또는 MMP9(서열번호 34)를 암호화한다. 이러한 실시형태에서, 인게이저 분자는 T2A 자가-절단 펩타이드 링커(서열번호 14)에 의해서 치료 분자 폴리펩타이드에 연결된다.
본 명세서에 기술된 인게이저 분자에 의한 표적화에 적합한 추가적인 세포 표면 단백질을 하기 표 5에 나타낸다. 치료 분자로서 사용하기에 적합한 추가적인 단백질을 하기 표 6에 나타낸다.
Figure pct00015
Figure pct00016
종양용해성 바이러스의 치료 용도
일부 실시형태에서, 본 발명은 암성 질환의 예방, 치료, 및/또는 개선을 위한 조성물 및 사용 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 유효량(예를 들어, 치료적 유효량)의 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 바이러스는 인게이저 분자 또는 인게이저 분자 및 치료 분자를 발현한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 미세 잔존 질환, 초기 고형 종양, 후기 고형 종양 및/또는 전이성 고형 종양을 비롯한 모든 병기 및 유형의 암에 유용하다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다수의 상이한 암과 연관된 다양한 고형 종양을 치료하는 데 사용된다. 용어 "고형 종양"은 재발 또는 난치성 종양뿐만 아니라 림프암에서 관찰되는 전이를 제외한 전이(어디에 존재하든)를 지칭한다.
예시적인 고형 종양은 뇌 및 다른 중추 신경계 종양(예를 들어, 뇌척수막, 뇌, 척수, 뇌신경 및 중추 신경계의 다른 부분의 종양, 예를 들어, 교모세포종 또는 수질 아세포종); 두부 및/또는 목암; 유방 종양; 순환계 종양(예를 들어, 심장, 종격 및 흉막, 및 다른 흉곽내 기관, 혈관 종양 및 종양-연관 혈관 조직); 배설계 종양(예를 들어, 신장, 신우, 요관, 방광, 특정 되지 않은 다른 비뇨기관); 위장관 종양(예를 들어, 식도, 위, 소장, 결장, 직장결장, 직장S상결장 경계부, 직장, 항문 및 항문관); 간 및 간내 담즙관, 담낭, 담도의 특정되지 않은 다른 부분, 췌장, 다른 소화기관 관련 종양); 두경부 관련 종양; 구강(입술, 혀, 잇몸, 구강저, 입천장, 및 입의 다른 부분, 귀밑샘, 및 다른 침샘 부분, 편도, 입인두, 코인두, 배모양굴, 후두인두, 및 입술의 다른 부위, 경구 및 인두) 관련 종양; 생식계 종양(예를 들어, 음문, 질, 자궁경, 자궁체, 자궁, 난소, 및 여성 생식기관과 관련된 다른 부위, 태반, 음경, 전립 선, 고환, 및 남성 생식기관과 관련된 다른 부위); 기도 종양(예를 들어, 비강 및 중이, 보조굴, 후두, 기관, 기관지 및 폐, 예를 들어 소세포 폐암 또는 비소세포 폐암); 골격계 종양(예를 들어, 사지 뼈관절 연골, 뼈관 절 연골 및 다른 부위); 피부 종양(예를 들어, 악성 흑색종, 비-흑색종 피부암, 기저세포 피부 암종, 편평 세포 피부 암종, 중피종, 카포시 육종); 및 말초 신경 및 자율 신경계, 결합 및 연조직, 복막뒤 및 복막, 눈 및 부속기, 갑상선, 부신 및 다른 내분비선 및 관련 구조, 림프절의 2차 및 특정되지 않은 악성 신생물, 호흡계 및 소화계의 2차 악성 신생물 및 다른 부위의 2차 악성 신생물을 비롯한 다른 조직과 관련된 종양, 핍돌기신경교종(oligodendroglioma), 핍지교성상세포종(oligoastrocytoma), 별아교세포종, 교모세포종 또는 수모세포종 또는 다른 고형 종양을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
특별한 실시형태에서, 고형 종양은 뇌종양이다. 일부 예에서, 뇌종양은 신경교종, 특히 뇌실막세포종, 핍돌기신경교종, 핍지교성상세포종, 별아교세포종, 교모세포종 또는 수모세포종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 혈액암을 치료하는 데 사용된다. 용어 "혈액암"은 본 명세서에서 혈액계의 암을 지칭하고, 재발 또는 난치성 혈액암뿐만 아니라 전이된 혈액암(어디에 위치하든)을 포함한다. 일부 예에서, 혈액암은 T-세포 악성종양 또는 B-세포 악성종양이다. 예시적인 T-세포 악성 종양은 달리 특정되지 않은 말초 T-세포 림프종(PTCL-NOS), 역형성 대세포 림프종, 혈관면역모세포성 림프종, 피부 T-세포 림프종, 성인 T-세포 백혈병/림프종(ATLL), 모세포성 NK-세포 림프종, 장병증-유형 T-세포 림프종, 혈액비장 감마-델타 T-세포 림프종, 림프모세포성 림프종, 코 NK/T-세포 림프종, 또는 치료 관련 T-세포 림프종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
예시적인 B-세포 악성 종양은 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소림프구성 림프종(SLL), 고위험 CLL, 비-CLL/SLL 림프종, 프로림프구성 백혈병(PLL), 여포성 림프종(FL), 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 다발성 골수종, 절외 변연부 B 세포 림프종, 절변연부 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 비버킷 고급 B 세포 림프종, 원발성 종격 B 세포 림프종(PMBL), 면역아세포성 거대 세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종, B 세포 프로림프구성 백혈병, 림프구형질세포 림프종, 비장 변연부 림프종, 혈장 세포 골수종, 형질세포종, 종격(흉선) 거대 B 세포 림프종, 혈관내 거대 B 세포 림프종, 원발성 삼출성림프종, 또는 림프종양 육아종증을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 경우에, 혈액암은 재발 또는 난치성 혈액암이다. 일부 경우에, 혈액암은 전이된 혈액암이다.
일부 실시형태에서, 종양용해성 바이러스는 감염 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24시간 이내에 또는 감염 2, 3, 4, 5 또는 6일 이내에 바이러스에 의해서-감염된 세포의 사멸 이전에 인게이저 분자 및/또는 치료적 폴리펩타이드의 높은 발현 수준을 생성시키도록 조작된다. 인게이저 분자 및/또는 치료적 폴리펩타이드의 발현은 특히 웨스턴 블롯, ELISA, 면역침전 또는 전기영동을 비롯한 관련 기술 분야에 공지된 방법에 의해서 결정될 수 있다. 일반적으로, 치료 분자에 대한 언급에서 "높은 발현 수준"은 종양용해성 바이러스로 감염되지 않은 세포 내의 상응하는 폴리펩타이드의 기저 발현 수준보다 더 높은 발현 수준을 지칭한다.
조성물 및 투여 경로
일부 실시형태에서, 치료적 유효량의 종양용해성 바이러스 또는 이의 조성물은 대상체에게 투여된다. 본 개시내용에 따라서, 용어 "약제학적 조성물"은 개체에게 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 명세서에 기술된 조성물의 투여는 국지 또는 전신일 수 있고, 예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내, 국소 또는 진피내 투여에 의해서 상이한 방식에 의해서 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 수단에 에 의해서 투여된다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 조성물은 대상체에게 정맥내로, 종양내로, 진피내로, 동맥내로, 복강내로, 병변내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 흉강내, 기관내로, 비내, 유리체내로, 질내로, 직장내로, 국소로, 종양내로, 근육내, 척추강내로, 피하로, 결막하, 소수포내로(intravesicularlly), 점막내로, 심낭내로, 탯줄내로, 안내로 경구로, 국지적으로, 흡입에 의해서, 주사에 의해서, 주입에 의해서, 연속 주입에 의해서, 국지화된 관류에 의해서, 카테터를 통해서, 세척(lavage)을 통해서, 크림으로 또는 지질 조성물로 투여될 수 있다. 특별한 실시형태에서, 조성물은 주입 또는 주사를 통해서 개체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 투여는 비경구, 예를 들어, 정맥내이다. 일부 실시형태에서, 종양용해성 바이러스 또는 이의 조성물은 예를 들어, 바이올리스틱 전달(biolistic delivery)에 의해서 내부 또는 외부 표적 부위에 또는 카테터에 의해서 동맥 내의 부위에, 표적 부위에 직접 투여된다. 특별한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조성물은 피하로 또는 정맥내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스 또는 이의 조성물은 정맥내로 또는 동맥내로 투여된다.
바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조성물은 비경구, 경피, 강내, 동맥내, 척추강내, 정맥내 투여 또는 암 내의 직접 주사를 위한 특정 투여 경로를 위해서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다. "약제학적으로 또는 약물학적으로 허용 가능한"은 본 명세서에서 적절한 경우 동물 또는 인간에게 투여되는 경우 알레르기 또는 다른 유사한 유해 반응을 생성하지 않는 분자 독립체 및 조성물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다. "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 완충액, 안정화 제형, 항박테리아제 및 항균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 적합한 약제학적 담체의 예는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 인산염 완충 염수 용액, 물, 에멀션, 예컨대, 유/수 에멀션, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 종래의 방법에 의해서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 보충 활성 성분이 또한 조성물 중에 혼입된다. 인간 투여를 위해서, 본 명세서에 기술된 조성물은 FDA 기관의 생물학 표준에 의해서 요구된 바와 같은 멸균성, 발열원성 및 일반적인 안정성 및 순도 표준을 충족한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조성물은 담체, 예컨대, 예를 들어, 이의 혼합물에 적합한 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 용매 또는 분산 매질 및 식물유를 함유하는 용매 또는 분산 매질을 포함한다. 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해서, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해서 그리고 계면활성제의 사용에 의해서 적절한 유체성이 유지된다. 미생물의 작용 예방은 관련 기술 분야에 공지된 다양한 항박테리아제 및 항균제에 의해서 제공된다. 다수의 경우에, 등장제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 일부 실시형태에서, 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 중에 사용함으로써 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스는 조성물 중에 중성 또는 염 형태로 제형화된다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 산 부가 염(단백질의 유리 아미노기로 형성됨)을 포함하고, 이것은 무기산, 예컨대, 예를 들어, 염산 또는 인산 또는 유기산, 예컨대, 아세트산, 옥살산, 타타르산, 만델산 등으로 형성된다. 유리 카복실기로 형성되는 염은 무기 염기, 예컨대, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 페릭 하이드록사이드, 및 유기 염기, 예컨대, 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된다.
주사 가능한 용도에 적합한 약제학적 형태는 멸균 수성 용액 또는 분산액; 참기름, 땅콩유 또는 수성 프로필렌 글리콜을 비롯한 제형; 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액을 위한 멸균 분말을 포함한다. 일부 경우에, 형태는 멸균성이고, 유체이다. 일부 경우에, 그것은 제조 및 특정 저장 파라미터(예를 들어, 냉장 및 냉동)의 조건 하에서 안정적이고, 미생물, 예컨대, 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해서 보존된다. 본 명세서에서 일부 실시형태의 수성 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 수성 매질 중에 용해 또는 분산된 유효량의 바이러스, 핵산, 치료 단백질, 펩타이드, 작제물, 자극제, 저해제 등을 포함한다. 상기 중 임의의 것을 발현하는 벡터의 수성 조성물이 또한 고려된다.
특정 실시형태에서, 생물학적 물질은 바람직하지 않은 소분자량 분자를 제거하기 위해서 상당히 투석되고/되거나 적절한 경우 바람직한 비히클 내에서 보다 준비된 제형을 위해서 동결건조된다. 일부 실시형태에서, 활성 화합물 또는 작제물은 비경구 투여를 위해서 제형화되고, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하, 병변내, 비내 또는 복강내 경로를 통해서 주사를 위해서 제형화된다. 대상체의 백신화 또는 부스트(boost)를 위해서 사용되는 임의의 경로가 사용된다. 활성 성분 또는 구성성분을 함유하는 수성 조성물의 제제는 본 개시내용에 비추어 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주사 가능한 것으로서 제조되고; 주사 이전에 액체의 첨가 시에 용액 또는 현탁액을 제조하는 데 사용하기에 적합한 고체 형태가 또한 제조되고; 제제는 또한 유화된다.
일부 예에서, 종양용해성 바이러스는 주사를 위한 약제학적으로 허용 가능한 제형 중에 분산된다. 일부 실시형태에서, 멸균 주사 용액은 활성 화합물 또는 작제물을 필요한 양으로 상기에 열거된 다른 성분 중 임의의 것과 함께 적절한 용매 중에 혼입하고, 필요한 경우 그 다음 멸균 여과함으로써 제조된다.
제형화 시, 본 명세서에 기술된 조성물은 치료하고자 하는 질환 및 투여 제형과 상용성인 방식으로 그리고 치료 유효량인 바와 같은 그러한 양으로 투여된다. 제형은 다양한 투여형, 예컨대, 상기에 기술된 주사 가능한 용액의 유형이지만, 지연 방출형 캡슐 또는 마이크로입자 및 마이크로구체 등으로서 쉽게 투여된다.
수성 용액 중의 비경구 투여를 위해서, 예를 들어, 용액은 필요한 경우 적합하게 완충되고, 액체 희석액은 먼저 충분한 염수 또는 글루코스와 등장성이 된다. 이러한 특정 수성 용액은 정맥내, 종양내, 근육내, 피하 및 복강내에 특히 적합하다. 본 맥락에서, 사용되는 멸균 수성 매질은 본 개시내용에 비추어 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 1회 투여량을 1㎖의 등장성 NaCl 용액 중에 용해시키고, 1000㎖의 피하주입(hypodermolysis) 유체에 첨가하거나 또는 제안된 주입 부위에서 주사한다.
비경구 투여, 예컨대, 정맥내, 종양내, 진피내 또는 근육내 주사를 위해서 제형화된 화합물에 더하여, 다른 약제학적으로 허용 가능한 형태는 예를 들어, 정제 또는 경구 투여를 위한 다른 고체; 리포솜 제형; 서방형 캡슐(time release capsule); 생물분해성 및 현재 사용되는 임의의 다른 형태를 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스는 캡슐화되어 면역인식을 저해하고, 종양의 부위에 위치된다.
일부 예에서, 비경구 투여를 위한 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀션을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 식물유, 예컨대, 올리브유, 및 주사 가능한 유기 에스터, 예컨대, 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 물, 알코올/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액, 예컨대, 염수 및 완충 매질을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거 및 고정 오일을 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충물, 전해질 보충물(예컨대 링거 덱스트로스에 기초한 것) 등을 포함한다. 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제가 또한 첨가될 수 있다. 또한, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 단백질성 담체, 예컨대, 예를 들어, 바람직하게는 인간 기원의 혈청 알부민 또는 면역글로불린을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 단백질성 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물 또는 이를 암호화하는 핵산 분자 또는 벡터(본 개시내용에 기술된 바와 같음)에 더하여, 약제학적 조성물의 의도되는 용도에 따라서, 추가로 생물학적 활성제를 포함할 수 있다고 고려된다.
일부 실시형태에서, 바이러스 종양용해 및 치료 유전자의 전달 효율을 증가시키기 위해서 연속적으로 벡터를 방출하는 종양-침윤성 바이러스-생산 세포는 종양 내에 직접 이식을 위해서 제형화된다.
비내 제형은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,476,116호, 제5,116,817호, 및 제6,391,452호에 기술되어 있다, 관련 기술 분야에 널리 공지된 이러한 기술 및 다른 기술에 따라서 제조된 제형은 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 플루오로카본 및/또는 관련 기술 분야에 공지된 다른 가용화제 또는 분산제를 사용하여, 염수 중에서 용액으로서 제조된다(예를 들어, 문헌[Ansel, H. C. et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Sixth Ed. (1995)] 참고). 바람직하게는 이러한 조성물 및 제형은 적합한 비독성의 약제학적으로 허용 가능한 성분을 사용하여 제조된다. 이들 성분은 비내 투여형의 제제에서 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 이들 중 일부는 관련 기술 분야의 표준 참조인 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st edition, 2005]에서 발견된다. 적합한 담체를 선택하는 것은 목적하는 비내 투여형, 예를 들어, 용액, 현탁액, 연고 또는 젤의 정확한 성질에 의하여 크게 좌우된다. 비내 투여형은 일반적으로 활성 성분에 더하여 다량의 물을 함유한다. 소량의 다른 성분, 예컨대, pH 조정제, 유화제 또는 분산화제, 보존제, 계면활성제, 겔화제 또는 완충화제 및 다른 안정화제 및 가용화제가 또한 존재할 수 있다. 비 투여형은 비 분비물과 등장성이다.
흡입에 의한 투여를 위해서, 본 명세서에 기술된 것은 에어로졸, 미스트 또는 분말 형태로 존재한다. 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물은 적합한 추진제, 예를 들어, 다이클로로디플루오로메탄, 트라이클로로플루오로메탄, 다이클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스를 사용하여 가압식 팩 또는 네불라이저로부터 에어로졸 분무 제시의 형태로 편리하게 전달된다. 가압식 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정된다. 본 명세서에 기술된 화합물 및 적합한 분말 베이스, 예컨대, 락토스 또는 전분의 분말 믹스를 함유하는, 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한, 예컨대, 단지 예의 방식으로서만, 젤라틴의 캡슐 및 카트리지가 제형화된다.
치료적 유효량 및 치료 치료요법
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스 및 이의 조성물은 치료적 유효량으로 대상체에게 투여된다. 치료적 유효량은 치료될 대상체, 대상체의 상태(예를 들어, 일반적인 건강, 목적하는 예방, 치료될 질환, 투여 경로 및/또는 바이러스의 특성에 좌우될 것이다. 일부 실시형태에서, 투여 책임이 있는 사람(예를 들어, 의사)은 개체에 적절한 용량을 결정할 것이다. 의학 분야에 널리 공지된 바와 같이, 임의의 하나의 환자를 위한 투여량은 환자의 체격, 체중, 신체 표면적, 연령, 성별 및 일반적인 건강, 투여될 특정 화합물, 치료될 특정 질환, 투여 시기 및 경로 및 동시에 투여되는 다른 약물을 비롯한 다수의 인자에 좌우된다. 따라서, 각각의 개별 환자의 경우, 바이러스가 큰 집단에 투여되더라도, 각각의 환자는 개인에 대해서 적절한 투여량에 대해서 모니터링되고, 환자를 모니터링하는 이러한 실시는 관련 기술 분야에서 일상적이라고 예상된다.
일부 실시형태에서, 치료적 유효량의 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스는 단일 용량으로 투여된다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스 또는 이의 조성물은 대상체에게 약 1x10+5pfu 내지 약 1x10+15pfu(플라크 형성 단위), 약 1x10+8pfu 내지 약 1x10+15pfu, 약 1x10+10pfu 내지 약 1x10+15pfu 또는 약 1x10+8pfu 내지 약 1x10+12pfu의 범위의 용량으로 투여된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스 또는 이의 조성물은 대상체에게 약 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 또는 1015pfu의 바이러스의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 용량은 조성물이 투여될 대상체의 연령에 좌우된다. 예를 들어, 대상체가 유아인 경우 더 낮은 용량이 필요할 수 있고, 대상체가 성인 인간 대상체인 경우 더 높은 용량이 필요할 수 있다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, 유아 대상체에게 약 1x10+8pfu 내지 약 1x10+10pfu가 제공되는 반면, 성인 인간 대상체에게 약 1x10+10pfu 내지 약 1x10+12pfu가 제공될 것이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량의 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스는 2회 이상의 용량의 과정을 통해서 투여된다. 일부 실시형태에서, 2회 이상의 용량이 동시에(예를 들어, 같은 날에 또는 짧은 시간 간격에 걸쳐서) 또는 적절한 간격으로, 예를 들어, 1일당 2회, 3회, 4회 또는 그 초과의 하위용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스 또는 이의 조성물은 대상체에게 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스 또는 이의 조성물은 대상체에게 1회 초과로 투여된다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 초과의 횟수로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 대상체에서 병원성 유기체 또는 병태(예를 들어, 암)에 대한 노출 또는 요구에 따라서, 시간 기간에 대해서 매일 또는 매주 기준으로 또는 매달, 격년 또는 매년 기준으로 투여될 수 있다. 특별한 실시형태에서, 종양용해성 바이러스 및 이의 조성물은, 이것이 연장된 시간 기간 동안 대상체에 의해서 유지되는 방식으로 제형화되고, 그러한 양 및/또는 빈도로 투여된다.
일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스 또는 이의 조성물은 치료 응용을 위해서 투여되거나 또는 유지 요법, 예컨대, 예를 들어, 차도가 있는 환자를 위해서 투여된다. 일부 실시형태에서, 위형 종양용해성 바이러스 또는 이의 조성물은 1개월에 1회, 2개월에 1회, 6개월에 1회, 1년에 1회, 1년에 2회, 1년에 3회, 2년에 1회, 3년에 1회 또는 5년에 1회 투여된다.
일부 실시형태에서 환자의 상태가 개선된 경우, 위형 종양용해성 바이러스 또는 이의 조성물은 의사의 판단에 따라서 계속적으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물의 용량은 일시적으로 감소되고/되거나 조성물의 투여는 특정 시간 길이(즉, "휴약기(drug holiday)") 동안 일시적으로 지연된다. 일부 실시형태에서, 휴약기의 길이는 예의 방식으로, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 15일, 20일, 28일, 35일, 50일, 70일, 100일, 120일, 150일, 180일, 200일, 250일, 280일, 300일, 320일, 350일 또는 365일을 비롯한, 2일 내지 1년 사이에서 달라진다. 휴약기 동안 용량 감소는 단지 예의 방식으로, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%를 비롯한, 10% 내지 100%이다.
일부 실시형태에서, 환자의 병태의 개선이 일어나면, 필요한 경우 유지 용량이 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물의 투여량 및/또는 투여 빈도는 증상의 함수로서, 개선된 질환, 장애 또는 병태가 유지되는 수준까지 감소된다. 일부 실시형태에서, 환자는 임의의 증상 재발에 따라서 장기간 기준으로 간헐적인 치료를 필요로 할 수 있다.
일부 실시형태에서, 이러한 치료 요법의 독성 및 치료 효능은 LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량)의 결정을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 절차에 의해서 결정된다. 독성 효과와 치료 효과 간의 용량비는 치료 지수이고, 그것은 LD50과 ED50 간의 비로서 표현된다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 세포 배양물 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터를 인간에서의 사용을 위한 용량 범위를 제형화하는 데 사용한다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 최소 독성을 갖는 ED50을 포함하는 순환 용량의 위 이내이다. 투여량은 사용되는 투여형 및 이용되는 투여 경로에 따라서 이러한 범위 내에서 달라진다.
일부 예에서, 종양 항원 발현 수준은 환자에서 치료 진행을 평가하기 위해서, 환자를 계층화하기 위해서, 그리고/또는 치료 요법을 조정하기 위해서 평가된다. 일부 예에서, 항원 발현 수준의 평가는 면역조직화학(IHC)(반정량적 또는 정량적 IHC) 또는 다른 항체-기반 검정(웨스턴 블롯, 형광 면역검정(FIA), 형광 동일계 혼성화(fluorescence in situ hybridization: FISH), 방사성면역검정(RIA), 방사성면역침전(RIP), 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA), 면역검정, 면역방사성 검정, 플루오로면역검정, 화학발광 검정, 생물발광 검정, 젤 전기영동 포함) 또는 간접적으로 이러한 유전자를 위한 전산물을 정량화하는 것(예를 들어, 동일계 혼성화, 뉴클레아제 보호, 노던 블롯, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 예컨대, 역전사효소 PCR(RT-PCR))을 사용하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 세포, 예를 들어, 림프구는, 항체를 사용한 파라핀 포매된 종양 절편 또는 FACs 기술을 사용함으로써 분석된다.
일부 예에서, 항체를 사용하여 기술, 예컨대, 면역조직화학, ELISA 및 웨스턴 블롯팅을 통해서 표적 세포의 단백질 함량을 특징규명한다. 일부 경우에, 이것은 예를 들어, 종양용해성 바이러스 요법에 바람직하게 반응할 가능성이 있는 대상체의 존재 및 부재 및/또는 종양용해성 바이러스와 함께 면역자극제를 공동 투여할 필요성에 대한 스크린을 제공한다.
일부 실시형태에서, 면역조직화학은 생검물로부터의 조직의 샘플 상에서 수행된다. 일부 경우에, 새로운 샘플 또는 동결된 샘플을 조사한다. 일부 예에서, 세포 중에 존재하는 항원에 대한 항체는 슬라이드 상의 샘플에 첨가되고, 항체는 항원이 존재하는 곳이면 어디든 결합한다. 일부 실시형태에서, 이어서 과량의 항체는 세척된다. 일부 경우에, 세포에 결합되어 유지된 항체는 현미경 하에서의 가시화를 위하여 2차 항체로 추가로 표지된다.
일부 실시형태에서, 시험 샘플은 대상체, 예컨대, 예를 들어, 조직(예를 들어, 종양 생검물), 뇌척수액(CSF), 림프, 혈액, 혈장, 혈청, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 림프액, 림프구, 활액 및 소변으로부터 입수된다. 특별한 실시형태에서, 시험 샘플은 CSF 또는 종양 조직으로부터 입수된다. 다른 특별한 실시형태에서, 시험 샘플은 종양 조직으로부터 입수되고, 예를 들어, 샘플 중의 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 상대적인 수를 결정하고/하거나 샘플 중의 1종 이상의 Th1 및/또는 Th2 사이토카인의 수준을 예를 들어, Th1 및/또는 Th2 사이토카인에 대한 항체를 샘플로부터의 고정된 및 투과된 세포의 면역형광 염색에 의해서 측정한다. 다른 특별한 실시형태에서, 시험 샘플은 혈액으로부터 입수되고, 예를 들어, 샘플 중의 1종 이상의 Th1 및/또는 Th2 사이토카인의 수준은 ELISA에 의해서 측정된다.
병용 요법
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바이러스, 발현 작제물, 핵산 분자 및/또는 벡터는 또 다른 치료제와 병용하여 투여된다. 일부 실시형태에서, 종양용해성 바이러스 및 추가적인 치료제는 동일한 조성물 중에 제형화된다. 이러한 실시형태에서, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양용해성 바이러스 및 추가적인 치료제는 별개의 조성물(예를 들어, 환자 또는 대상체에게 투여하기에 적합한 2종 이상의 조성물) 중에 제형화된다. 본 개시내용은 T-세포 요법을 비롯한, 면역 세포를 통해서 작용하는 것을 비롯한, 다른 암 요법, 예를 들어, 이중특이적 항체 작제물, 표적화 독소 또는 다른 화합물과의 공동-투여 프로토콜을 추가로 포함한다. 본 발명의 조성물(들)의 공동-투여를 위한 임상 치료요법은 다른 성분의 투여와 동시에, 투여 이전에 및/또는 투여 이후에 공동-투여를 포함한다. 특정 병용 요법은 화학요법, 방사선, 수술, 호르몬 요법, 및/또는 다른 유형의 면역요법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량의 위형 종양용해성 바이러스는 추가적인 치료제와 병용으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 예에서, 추가적인 치료제는 화학치료제, 스테로이드, 면역치료제, 표적화 요법 또는 이들의 조합물이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 아주반트 요법과 함께 투여된다. 예를 들어, 활성화 아주반트 치료제는 1종 이상의 투여(예를 들어, 위형 바이러스의 종양내 투여) 이전에, 투여와 동시에 또는 투여 이후에 투여된다. 예를 들어, 아주반트 요법은 톨-유사 수용체(TLR) 리간드의 조정, 예컨대, CpG 서열을 포함하는 DNA 분자에 의한 TLR9 활성화 또는 (예를 들어, RNA 리간드에 의한) TLR9 활성화를 포함한다. 다른 아주반트 치료제는 효능작용 항체 또는 다른 폴리펩타이드(예를 들어, 각각 CD40 리간드(CD40L) 또는 GITR 리간드(GITRL)에 의한 CD40 또는 GITR의 활성화)를 포함한다. 추가로, STING를 조정하는 환형 다이뉴클레오타이드(예를 들어, c-di-GMP)가 제공된다. 또 다른 활성화 아주반트는 인터류킨, 예컨대, IL-33을 포함한다.
일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 벤다무스틴, 보르테조밉, 레날리도마이드, 이델랄리십(GS-1101), 보리노스타트, 에버롤리무스, 파노비노스타트, 템시롤리무스, 로미뎁신, 보리노스타트, 플루다라빈, 사이클로포스파마이드, 미톡산트론, 펜토스타틴, 프레드니손, 에톱사이드, 프로카르바진, 및 탈리도마이드로부터 선택된 작용제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 다중-작용 치료 요법이다. 일부 실시형태에서 추가적인 치료제는 HyperCVAD 요법(사이클로포스파마이드, 빈크리스틴, 독소루비신, 메토트렉세이트와 교대 투여되는 덱사메타손 및 사이타라빈)을 포함한다. 일부 실시형태에서, HyperCVAD 치료요법은 리툭시맙과 병용하여 투여된다.
일부 실시형태에서 추가적인 치료제는 R-CHOP 요법(리툭시맙, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손)을 포함한다.
일부 실시형태에서 추가적인 치료제는 FCR 요법(FCR(플루다라빈, 사이클로포스파마이드, 리툭시맙)을 포함한다.
일부 실시형태에서 추가적인 치료제는 FCMR 치료요법(플루다라빈, 사이클로포스파마이드, 미톡산트론, 리툭시맙)을 포함한다.
일부 실시형태에서 추가적인 치료제는 FMR 치료요법(플루다라빈, 미톡산트론, 리툭시맙)을 포함한다.
일부 실시형태에서 추가적인 치료제는 PCR 치료요법(펜토스타틴, 사이클로포스파마이드, 리툭시맙)을 포함한다.
일부 실시형태에서 추가적인 치료제는 PEPC 치료요법(프레드니손, 에토포사이드, 프로카바진, 사이클로포스파마이드)을 포함한다.
일부 실시형태에서 추가적인 치료제는 90Y-이브리투모맙 티욱세탄 또는 131I-토시투모맙을 사용한 방사성면역요법을 포함한다.
일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 자가유래 줄기세포 이식편이다.
일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 하기로부터 선택된다: 질소 머스터드, 예컨대, 예를 들어 벤다무스틴, 클로람부실, 클로르메틴, 사이클로포스파마이드, 이포스파마이드, 멜팔란, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드; 알킬 설포네이트, 예컨대, 예를 들어, 부설판, 만노설판, 트레오설판; 에틸렌이민, 예컨대 카르보쿠온, 티오테파, 트라이아지쿠온; 나이트로소우레아, 예컨대, 예를 들어, 카르무스틴, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴, 세무스틴, 스트렙토조신; 에폭사이드, 예컨대 에토글루시드; 다른 알킬화제, 예컨대, 예를 들어, 다카르바진, 미토브로니톨, 피포브로만, 테모졸로마이드; 폴산 유사체, 예컨대, 예를 들어, 메토트렉세이트, 퍼메트렉세드, 프랄라트렉세이트, 랄티트렉세드; 퓨린 유사체, 예컨대, 예를 들어, 클라드리빈, 클로파라빈, 플루다라빈, 메르캅토퓨린, 넬라라빈, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대, 예를 들어, 아자시티딘, 카페시타빈, 카모푸르, 사이타라빈, 데시타빈, 플루오로우라실, 젬시타빈, 테가푸르; 빈카 알칼로이드, 예컨대, 예를 들어, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 빈플루닌, 비노렐빈; 포도필로톡신 유도체, 예컨대, 예를 들어, 에토포사이드, 테니포사이드; 콜히친 유도체, 예컨대, 예를 들어, 데메콜친; 탁산, 예컨대, 예를 들어, 도세탁셀, 파클리탁셀, 파클리탁셀 폴리글루멕스; 다른 식물성 알칼로이드 및 천연산물, 예컨대, 예를 들어, 트라벡테딘; 악티노마이신, 예컨대, 닥티노마이 신; 안트라사이클린, 예컨대, 예를 들어, 아클라루비신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 피라루비신, 발루비신, 조루비신; 다른 세포독성 항생제, 예컨대, 예를 들어, 블레오마이신, 익사베필론, 미토마이신, 플리카마이신; 백금 화합물, 예컨대, 예를 들어, 카르보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 사트라플라틴; 메틸하이드라진, 예컨대, 예를 들어, 프로카르바진; 감작제, 예컨대, 예를 들어, 아미노레불린산, 에파프록시랄, 메틸 아미노레불리네이트, 포르피머 나트륨, 테모포르핀; 단백질 카이나제 억제제, 예컨대 다사티닙, 에를로티닙, 에베로리무스, 제피티닙, 이마티닙, 라파티닙, 닐로티닙, 파조나닙, 소라페닙, 수니티닙, 템시로리무스; 다른 항신생물제, 예컨대, 예를 들어, 알리트레티노인, 알트레타민, 암자크린, 아나그렐라이드, 삼산화비소, 아스파라기나제, 벡사로텐, 보르테조밉, 셀레콕십, 데니류킨 디프티톡스, 에스트라무스틴, 하이드록시카바마이드, 이리노테칸, 로니다민, 마소프로콜, 밀테포세인, 미토구아존, 미토탄, 오블리메르센, 페가스파르가제, 펜토스타틴, 로미뎁신, 시티마젠 세라 데노벡, 티아조퓨린, 토포테칸, 트레티노인, 보리노스타트; 에스트로겐, 예컨대, 다이에틸스틸벤올, 에티닐에스 트라다이올, 포스페스트롤, 폴리에스트라다이올 포스페이트; 프로게스토겐, 예컨대, 예를 들어, 게스토노론, 메드록시프로게스테론, 메게스트롤; 고나도트로핀 방출 호르몬 유사체, 예컨대, 예를 들어, 예컨대 부세렐린, 고세렐린, 류프로렐린, 트립토렐린; 항에스트로겐, 예컨대 풀베스트란트, 타목시펜, 토레미펜; 항안드로겐, 예컨대, 예를 들어, 비칼루타마이드, 플루타마이드, 닐루타마이드, 효소억제제, 아미노글루테티마이드, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 포르메스탄, 레트로졸, 보로졸; 다른 호르몬 길항제, 예컨대 아바렐릭스, 데가렐릭스; 면역자극제, 예컨대, 히스타민 이염산염, 미파무르타이드, 피도티모드, 플레릭사포르, 로퀴니멕스, 티모펜틴; 면역억제제, 예컨대, 예를 들어, 에베로리무스, 구스페리무스, 레플루노마이드, 마이코페놀산, 시롤리무스; 칼시뉴린 저해제, 예컨대, 사이클로스포린, 타크로리무스; 다른 면역억제제, 예컨대, 예를 들어, 아자티오프린, 레날리도마이드, 메토트렉세이트, 탈리도마이드; 및 방사성 의약품, 예컨대, 예를 들어, 이오벤구안.
일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 인터페론, 인터류킨, 종양 괴사 인자, 성장 인자 등으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 하기로부터 선택된다: 안세스팀, 필그라스팀, 레노그라스팀, 몰그라모스팀, 페그필그라스팀, 사르그라모스팀; 인터페론, 예컨대, 예를 들어, IFNα 자연형, IFN α-2a, IFN α-2b, IFN 알파콘-1, IFN α-n1, IFN β 자연형, IFN β-1a, IFN β-1b, IFN γ, 페그인터페론 α-2a, 페그인터페론 α-2b; 인터류킨, 예컨대, 예를 들어, 알데스류킨, 오프렐베킨; 다른 면역자극제, 예컨대 BCG 백신, 글라티라머 아세테이트, 히스타민 이염산염, 이뮤노시아닌, 렌티난, 흑색종 백신, 미파무르타이드, 페가데마스, 피도티모드, 플레릭사포르, 폴리 I:C, 폴리 ICLC, 로퀴니멕스, 타소네르민, 티모펜틴; 면역억제제, 예컨대, 예를 들어, 아바나셉트, 아베티무스, 알레파셉트, 항림프구 면역글로불린(말), 항흉선세포 면역글로불린(토끼), 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 에 베로리무스, 구스페리무스, 레플루노마이드, 무로맙-CD3, 마이코페놀산, 나탈리주맙, 시롤리무스; TNFα 저해제, 예컨대, 예를 들어, 아달리무맙, 아펠리모맙, 세르톨리주맙 페골, 에타네르셉트, 골리무맙, 인플릭시맙; 인터류킨, 저해제 예컨대, 예를 들어, 아나킨라, 바실릭시맙, 카나키누맙, 닥클리주맙, 메폴리주맙, 릴로나셉트, 토실리주맙, 우스테키 누맙; 칼시뉴린 저해제, 예컨대, 예를 들어,사이클로스포린, 타크로리무스; 다른 면역억제제, 예컨대, 예를 들어, 아자티오프린, 레날리 도마이드, 메토트렉세이트, 탈리도마이드.
일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 하기로부터 선택된다: 아달리무맙, 알렘투주맙, 바실릭 시맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 세르톨리주맙 페골, 닥클리주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 젬투주맙, 이브리투모 맙 티욱세탄(이브리투모맙 티욱세탄), 인플릭시맙, 무로모납-CD3, 나탈리주맙, 파니투무맙, 라니비주맙, 리툭시 맙, 토시투모맙, 트라스투주맙 등 또는 이들의 조합물.
일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 하기로부터 선택된다: 단클론성 항체, 예컨대, 예를 들어, 알렘투주맙, 베바시주맙, 카투막소맙, 세툭시맙, 에드레콜로맙, 젬투주맙, 오파투무맙, 파니투무맙, 리툭시맙, 트라스투주맙, 면역억제제, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 무로맙-CD3, 나탈리주맙; TNF 알파 저해제, 예컨대, 예를 들어, 아달리무맙, 아펠리모맙, 세르톨리주맙 페골, 골리무맙, 인플릭시맙, 인터류킨 저해제, 바실릭시맙, 카나키누맙, 닥클리주맙, 메폴리주맙, 토실리주맙, 우스테키누맙, 방사성 의약품, 이브리투모맙 티욱세탄, 토시투모맙; 다른 단클론성 항체, 예컨대, 아바고보맙, 아데카투무맙, 알렘투주맙, 항-CD30 단클론성 항체 Xmab2513, 항-MET 단클론성 항체 MetMab, 아폴리주맙, 아포맙, 아르시투모맙, 바실릭시맙, 이중특이적 항체 2B1, 블리나투모맙, 브렌툭시맙 베도틴, 카프로맙 펜데타이드, 식수투무맙, 클라우딕시맙, 코나투무맙, 다세투주맙, 데노수맙, 에쿨리주맙, 에프 라투주맙, 에프라투주맙, 에르투막소맙, 에타라시주맙, 피기투무맙, 프레솔리무맙, 갈릭시맙, 가니투맙, 젬투주맙 오조가미신, 글렘바투무맙, 이브리투모맙, 이노투주맙 오조가미신, 이필리무맙, 렉사투무맙, 린투주맙, 린투주맙, 루카투무맙, 마파투무맙, 마투주맙, 밀라투주맙, 단클론성 항체 CC49, 넥시투무맙, 니모투주맙, 오파투무맙, 오레고보맙, 페르투주맙, 라마쿠리맙, 라니비주맙, 시플리주맙, 소넵시주맙, 타네주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 트레멜리무맙, 투코투주맙 셀모류킨, 벨투주맙, 비실리주맙, 볼로식시맙 및 잘루투무맙.
일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 종양 미세환경, 예컨대, 세포 신호전달 네트워크(예를 들어, 포스파티딜이노시톨 3-카이나제(PI3K) 신호전달 경로, B-세포 수용체 및 IgE 수용체로부터의 신호전달)에 영향을 주는 작용제로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 PI3K 신호전달 저해제 또는 syc 카이나제 저해제이다. 일 실시형태에서, syk 저해제는 R788이다. 또 다른 실시형태는 PKCγ 저해제, 예컨대, 단지 예의 방식으로, 엔자스타우린이다.
종양 미세환경에 영향을 주는 작용제의 예는 PI3K 신호전달 저해제, syc 카이나제 저해제, 단백질 카이나제 저해제, 예컨대, 예를 들어, 다사티닙, 에를로티닙, 에베로리무스, 제피티닙, 이마티닙, 라파디닙, 닐로티닙, 파조나닙, 소라페닙, 수니티닙, 템시롤리무스; 다른 혈관형성 저해제, 예컨대, 예를 들어, GT-111, JI-101, R1530; 다른 카이나제 저해제, 예컨대, 예를 들어, AC220, AC480, ACE-041, AMG 900, AP24534, Arry-614, AT7519, AT9283, AV-951, 악시티닙, AZD1152, AZD7762, AZD8055, AZD8931, 바페티닙, BAY 73-4506, BGJ398, BGT226, BI 811283, BI6727, BIBF 1120, BIBW 2992, BMS-690154, BMS-777607, BMS-863233, BSK-461364, CAL-101, CEP-11981, CYC116, DCC-2036, 디나시클립, 도비티닙 락테이트, E7050, EMD 1214063, ENMD-2076, 포스타마티닙 이나 트륨, GSK2256098, GSK690693, INCB18424, INNO-406, JNJ-26483327, JX-594, KX2-391, 리니파닙, LY2603618,MGCD265, MK-0457, MK1496,MLN8054,MLN8237, MP470, NMS-1116354, NMS-1286937, ON 01919.Na, OSI-027, OSI-930, Btk 저해제, PF-00562271, PF-02341066, PF-03814735, PF-04217903, PF-04554878, PF-04691502, PF-3758309, PHA-739358, PLC3397, 프로제니포이에틴, R547, R763, 라무시루맙, 레고라페닙, RO5185426, SAR103168, SCH 727965, SGI-1176, SGX523, SNS-314, TAK-593, TAK-901, TKI258, TLN-232, TTP607, XL147, XL228, XL281RO5126766, XL418, XL765를 포함한다.
일부 실시형태에서, 추가적인 치료제를 미토겐-활성화 단백질 카이나제 신호전달의 저해제, 예를 들어, U0126, PD98059, PD184352, PD0325901, ARRY-142886, SB239063, SP600125, BAY 43-9006, 워트만닌 또는 LY294002; Syk 저해제; mTOR 저해제; 및 항체(예를 들어, 리툭산)로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 하기로부터 선택된다: 20-에피-1,25 다이하이드록시비타민 D3; 5-에타인일우라실; 아비라테론; 아클라루비신; 아실풀벤; 아데시페놀; 아도젤레신; 알데스레우킨; ALL-TK 길항제; 알트레타민; 암바무스틴; 아미독스; 아미포스틴; 아미노레불린산; 암루비신; 암사크린; 아나그렐리드; 아나스트로졸; 안드로그라폴리드; 혈관형성 저해제; 길항제 D; 길항제 G; 안타렐릭스; 항-척추 발생 단백질-1; 항안드로겐, 전립선 암종; 항에스트로겐; 항네오플라스톤; 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 아피디콜린 글리시네이트; 아포토시스 유전자 조정인자; 아포토시스 조절인자; 아퓨린산; 아라-CDP-DL-PTBA; 아르기닌 데아미나제; 아술라크린; 아타메스탄; 아트리무스틴; 악시나스타틴 1; 악시나스타틴 2; 악시나스타틴 3; 아자세트론; 아자톡신; 아자타이로신; 바카틴 III 유도체; 발라놀; 바티마스타트; BCR/ABL 길항제; 벤조클로린; 벤조일스타우로스포린; 베타 락탐 유도체; 베타-알레틴; 베타클라마이신 B; 베툴린산; bFGF 저해제; 비칼루타마이드; 비산트렌; 비스아지리딘일스페르민; 비스나피드; 비스트라텐 A; 비젤레신; 브레플레이트; 브로피리민; 부도티탄; 부티오닌 설폭스이민; 칼시포트리올; 칼포스틴 C; 캄토테신 유도체; 카나리폭스 IL-2; 카페시타빈; 카복스아마이드-아미노-트라이아졸; 카복시아미도트라이아졸; CaRest M3; CARN 700; 연골조직 유래 저해제; 카르젤레신; 카제인 카이나제 저해제(ICOS); 카스타노스페르민; 세크로핀 B; 세트로렐릭스; 클로를른스; 클로로퀴녹살린 설폰아미드; 시카프로스트; 시스-포르피린; 클라드리빈; 클로미펜동족체; 클로트리마졸; 콜리스마이신 A; 콜리스마이신 B; 콤브레타스타틴 A4; 콤브레타스타틴 동족체; 코나제닌; 크람베시딘 816; 크리스나톨; 크립토피신 8; 크립토피신 A 유도체; 큐라신 A; 사이클로펜탄트라퀴논; 사이클로플라탐; 사이페마이신; 사이타라빈 옥포스페이트; 세포용해 인자; 사이토스타틴; 대클릭시맵; 데시타빈; 데하이드로디뎀닌 B; 데슬로렐린; 덱사메타손; 덱시포스파마이드; 덱스라족산; 덱스베라파밀; 디아지쿠온; 디뎀닌 B; 디독스; 다이에틸노르스페르민; 다이하이드로-5-아자시티딘; 다이하이드로탁솔, 9-다이옥사마이신; 다이페닐 스피로무스틴; 도세탁셀; 도코사놀; 돌라세트론; 독시플루리딘; 드롤록시펜; 드로나비놀; 듀오카마이신 SA; 엡셀렌; 에코무스틴; 에델포신; 에드레콜로맵; 에플로르니틴; 엘레멘; 에미테푸르; 에피루비신; 에프리스테리드; 에스트라무스틴 동족체; 에스트로겐 작용물질; 에스트로겐 길항물질; 에타니다졸; 에토포시드 포스페이트; 엑세메스탄; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 피나스테리드; 플라보피리돌; 플레젤라스틴; 플루아스테론; 플루다라빈; 플루오로다우노루니신 하이드로클로라이드; 포르페니멕스; 포르메스탄; 포스트리에신; 포테무스틴; 가돌리늄 텍사피린; 갈륨 나트레이트; 갈로시타빈; 가니렐릭스; 젤라티나제 저해제; 젬시타빈; 글루타티온 저해제; 헵술팜; 헤레굴린; 헥사메 틸렌 비스아세트아미드; 하이페리신; 이반드론산; 이다루비신; 이독시펜; 이드라만톤; 일모포신; 일로마스타트; 이미다조아크리돈; 이미퀴모드; 면역자극 펩타이드; 인슐린-예컨대, 예를 들어, 성장 인자-1 수용체 저해제; 인터페론 효능제; 인터페론; 인터류킨; 아이오벤구안; 아이오도독소루비신; 이포메아놀, 4-; 이로플락트; 이르소글라딘; 아이소벤가졸; 아이소호모할리콘드린 B; 이타세트론; 자스플라키노리드; 카할랄리드F; 라멜라린-N 트라이아세테이트; 란레오타이드; 레이나마이신; 레노그라스팀; 렌티난 설페이트; 렙톨스타틴; 레트로졸; 백혈병 저해인자; 백혈구 알파 인터페론; 류프롤리드 + 에스트로겐 + 프로게스테론; 류프로렐린; 레바미솔; 리아로졸; 선형 폴리아민 동족체; 친유성 다이사카라이드 펩타이드; 친유성 백금 화합물; 리소클린아마이드 7; 로바플라틴; 롬브리신; 로메트렉솔; 로니다민; 로속산트론; 로바스타틴; 록소리빈; 루르토테칸; 루테튬 텍사피린; 리소필린; 분해성 펩타이드; 마이탄신; 만노스타틴 A; 마리마스타트; 마소프로콜; 마스핀; 마트릴리신 억제제; 매트릭스 메탈로프로테이나제 저해제; 메노가릴; 메르바론; 메테렐린; 메티오니나제; 메토클로프라미드; MIF 저해제; 미페프리스톤; 밀테포신; 미리모스팀; 잘못 짝지워진 이중 가닥 RNA; 미토구아존; 미토락톨; 미토마이신 동족체; 미토나피드; 미토톡신 섬유아세포 성장 인자-사포린; 미톡산트론; 모파로텐; 몰그라모스팀; 단클론성 항체, 인간 융모막 고나도트로핀; 모노포스포릴 지질 A +마이오박테리움 세포벽 sk; 모피다몰; 다제 내성 유전자 저해제; 다중 종양 억제인자 1-기반 요법; 머스타드 항암제; 마이카페록사이드 B; 마이코박테리움 세포벽 추출물; 미리아포론; N-아세틸디날린; N-치환된 벤즈아미드; 나파렐린; 나그레스팁; 날록손 + 펜타조신; 나파빈; 나프테르핀; 나르토그라시팀; 네다플라틴; 네모루비신; 네리드론산; 중성 엔도펩티다제; 닐루타미드; 니사마이신; 산화 질소 조정인자; 나이트록사이드 산화방지제; 니트룰린; O6-벤질구아닌; 옥트레티드; 오키세논; 올리고뉴클레오타이드; 오나프리스톤; 온단세트론; 온단세트론; 오라신; 경구 사이토킨 유도인자; 오르마플라틴; 오사테론; 옥살리플라틴; 옥사유노마이신; 파클리탁셀; 파클리탁셀 동족체; 파클리탁셀 유도체; 팔라우아민; 팔미토일리족신; 파미드론산; 파낙시트리올; 파노미펜; 파라박틴; 파젤립틴; 페가스파르가제; 펠데신; 펜토산 폴리설페이트 나트륨; 펜토스타틴; 펜트로졸; 페르플루브론; 페르포스파마이드; 페릴릴 알코올; 페나지노마이신; 페닐아세테이트; 포스파타제 억제제; 피시바닐; 필로카르핀 하이드로클로라이드; 피라루비신; 피리트렉심; 플라세틴 A; 플라세틴 B; 플라스미노겐 활성인자 억제제; 백금 착체; 백금 화합물; 백금-트라이아민 착체; 포르피머 나트륨; 포르피로마이신; 프레드니손; 프로필 비스-아크리돈; 프로스타글란딘 J2; 프로테아솜 저해제; 단백질 A-기반 면역 조절제; 단백질 카이나제 C 저해제; 단백질 카이나제 C 저해제, 미크로알갈; 단백질 타이로신 포스파타제 저해제; 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 저해제; 푸르퓨린; 피라졸로아크리딘; 피리독실화된 헤모글로빈 폴리옥시에틸렌 공액물; raf 길항제; 랄티트렉시드; 라모세트론; ras 파르네실 단백질 트랜스퍼라제 저해제; ras 저해제; ras-GAP 저해제; 탈메틸화된 레텔립틴; 레늄Re 186 에티드로네이트; 리족신; 리보자임; RII 레티나미드; 로글레티미드; 로히투킨; 로무르티드; 로퀴니멕스; 루비기논 B1; 루복실; 사핑골; 사인토핀; SarCNU; 사르코피톨 A; 사르그라모스팀; Sdi 1 유사물질; 세무스틴; 노화 유래 저해제 1; 센스 올리고뉴클레오티드; 신호 전달 저해제; 신호전달 조절제; 단일 쇄 항원 결합 단백질; 시조피란; 소부족산; 나트륨 보로캅테이트; 나트륨 페닐아세테이트; 솔베롤; 소마토메딘 결합 단백질; 소네르민; 스파르포식산; 스피카마이신 D; 스피로무스틴; 스플레노펜틴; 스폰기스타틴 1; 스쿠알라민; 줄기 세포 저해제; 줄기-세포 분열 저해제; 스티피아마이드; 스트로멜리신 저해제; 설피노신; 과활성 혈관활성 장 펩타이드 길항제; 수라디스타; 수라민; 스와인소닌; 합성 글리코스아미노글리칸; 탈리무스틴; 타목시펜 메티오다이드; 타우로무스틴; 타자로텐; 테코갈란 나트륨; 테가푸르; 텔루라피릴륨; 텔로메라제 저해제; 테모포르핀; 테모졸로마이드; 테니포시드; 테트라클로로데카옥사이드; 테트라조민; 탈리블라스틴; 티오코랄린; 트롬보포이에틴; 트롬보포이에틴 유사물질; 티말파신; 티모포이에틴 수용체 효능제; 티모트리난; 갑상선 자극 호르몬; 주석 에틸 에티오푸르퓨린; 티라파자민; 티타노센 비클로라이드; 톱센틴; 토레미펜; 토티포텐트 줄기세포 인자; 번역 저해제; 트레티노인; 트라이아세틸유리딘; 트라이시리빈; 트리메트렉세이트; 트립토렐린; 트로피세트론; 투로스테라이드; 타이로신 카이나제 저해제; 트리포스틴; UBC 저해제; 유베니멕스; 비뇨생식기 강-유래된 성장 저해성 인자; 유로카이나제 수용체 길항제; 바프레오티드; 바리올린 B; 벡터 시스템, 적혈구 유전자 요법; 벨라레졸; 베라민; 베르딘스; 베르테포르핀; 비노렐빈; 빈크살틴; 비탁신; 보로졸; 자노테론; 제니플라틴; 질라스 코르브; 및 지노스타틴 스티말라머.
일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 알킬화제, 항대사물질, 자연 산물 또는 호르몬, 예를 들어, 질소 머스타드(예를 들어, 메클로로에타민, 사이클로포스파마이드, 클로람부실 등), 알킬 설포네이트(예를 들어, 부설판), 나이트로소우레아(예를 들어, 카무스틴, 로무스틴 등) 또는 트라이아젠(데카바진 등)으로부터 선택된다. 항대사물질의 예는 엽산 유사체(예를 들어, 메토트렉세이트) 또는 피리미딘 유사체(예를 들어, 사이타라빈), 퓨린 유사체(예를 들어, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 아주반트 요법과 함께 투여된다. 예를 들어, 활성화 아주반트 치료제는 1종 이상의 투여(예를 들어, 위형 바이러스의 종양내 투여) 이전에, 투여와 동시에 또는 투여 이후에 투여된다. 예를 들어, 아주반트 요법은 톨-유사 수용체(TLR) 리간드의 조정, 예컨대, CpG 서열을 포함하는 DNA 분자에 의한 TLR9 활성화 또는 (예를 들어, RNA 리간드에 의한) TLR9 활성화를 포함한다. 다른 아주반트 치료제는 효능작용 항체 또는 다른 폴리펩타이드(예를 들어, 각각 CD40 리간드(CD40L) 또는 GITR 리간드(GITRL)에 의한 CD40 또는 GITR의 활성화)를 포함한다. 추가로, STING를 조정하는 환형 다이뉴클레오타이드(예를 들어, c-di-GMP)가 제공된다. 또 다른 활성화 아주반트는 인터류킨, 예컨대, IL-33을 포함한다. 일부 예에서, 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물은 아주반트 요법과 함께 투여된다.
키트
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 1종 이상의 종양용해성 바이러스, 본 명세서에 기술된 바와 같은 핵산 서열, 본 명세서에 기술된 바와 같은 벡터, 및/또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 숙주 세포를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 키트는 상기 본 명세서에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물을 단독으로 또는 이를 필요로 하는 개체에게 투여될 추가 치료제와 조합하여 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 치료 방법에서의 약물로서 본 발명에 따른 벡터 및 바이러스-생산 세포를 사용하기 위한 키트를 제공한다. 특히, 본 발명의 일부 실시형태에 따른 벡터 및 바이러스 생산 세포는 대상체에서 고형 종양의 요법 또는 치료를 위해서 사용된다. 일부 실시형태에서, 치료 효과는 재조합 벡터 및 바이러스의 종양용해성 특성뿐만 아니라 치료 유전자의 사용에 의해서 유발된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 방법 및 조성물과 함께 사용하기 위한 키트를 제공한다. 일부 실시형태는 1종 이상의 고형 종양을 갖는 대상체의 발병을 감소시키거나 또는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 백신 조성물을 갖는 키트에 관한 것이다. 다른 실시형태는 본 명세서에 기술된 작제물을 제조 및 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 일부 예에서, 키트는 또한 적합한 용기, 예를 들어, 바이알, 튜브, 미니- 또는 마이크로퓨즈 튜브, 시험 튜브, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기를 포함한다. 추가적인 성분 또는 작용제가 제공되는 경우, 키트는 이러한 작용제 또는 성분이 놓인 1종 이상의 추가적인 용기를 함유한다. 키트는 본 명세서에서 또한 상업적 판매를 위해서 철저하게 밀폐된 작제물, 백신 조성물 및 임의의 다른 시약 용기를 함유하기 위한 수단을 포함한다. 이러한 용기는 목적하는 바이알이 보유된 주사 또는 취입 성형된 플라스틱 용기를 포함한다. 임의로, 1종 이상의 추가적인 작용제, 예컨대, 다른 항바이러스제, 항진균제 또는 항박테리아제는 기술된 조성물, 예를 들어, 백신으로서 사용하기 위한 조성물을 위해서 필요하다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함된 것으로 제시된 바와 같은 동일한 정도로 참고로 본 명세서에 포함된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 기술된 실시형태를 추가로 예시한다.
실시예 1: 위형 VSV-G의 제조
VSV-당단백질(VSV-GP)을 HIV1-gag 및 rev 단백질과 조합함으로써 예시적인 위형 VSV-G를 제조하도록 하기 프로토콜을 채택하였다.
세포 배양 및 형질주입: 하기 패키징 플라스미드의 DNA를 혼합하고, 293T 세포: HIV-1 GAG/POL을 발현하는 pMDLg/pRRE; HIV-1 REV를 발현하는 pRSV/REV; 및 pMD2.G 5 60 5.8 VSV 당단백질 내로의 형질주입을 위해서 준비하였다. DNA 믹스를 500㎕의 미리 가온된 옵티멤(Optimem) II 매질에 첨가하였다. 폴리프로필렌이민 형질주입 시약(PEI)의 작업 스톡을 1xPBS, pH 4.5 중에서 1㎍/㎕로 제조하고, 88㎕의 작업 스톡을 혼합물에 첨가하여, PEI:DNA의 4:1 v/w 비를 유지하였다. 혼합물을 간단하게 보텍싱하고, 실온에서 5 내지 10분 동안 정치시켜 PEI:DNA 형질주입 복합체를 형성하였다. 총 2.5 x 106개의 저 계대(P20 미만) 293T 세포를 10% 혈청 및 1% Pen/Strep이 보충된 15㎖ DMEM으로 15㎝ 접시당 시딩하였다. 형질주입 2시간 전에, 세포 배양 배지를 흡인시키고, 15㎖의 새로운 미리 가온된 성장 배지(GM)로 대체하였다. 이어서, 형질주입 복합체를 각각의 15㎝ 플레이트에 적가하고, 간단하게 스월링하여 혼합하고, 10% CO2, 35℃에서 8시간 동안 인큐베이션시켰다. 8시간 후에, 배지를 25mM HEPES 및 10% 혈청을 함유하는 새로운 성장 배지 10㎖로 대체하였다. 이어서 혼합물을 형질주입 후 48시간 동안 인큐베이션시켰다.
바이러스 수집: 각각의 접시로부터의 배지를 제거하고, 풀링시키고, 0.22㎛ 저 단백질 결합/신속 유동 필터 유닛을 통해서 여과하고, 4℃에서 저장하였다. 5㎖ 부피의 새로운 성장 배지를 각각의 접시에 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다(형질주입 후 60 내지 72시간). 각각의 접시로부터의 배지의 제2 로트를 이전 단계에서와 같이 수집하고, 이전 배지 수확물과 함께 풀링시켰다. DNASE-I(1mg/㎖ 스톡)로의 소화에 의해서 플라스미드 캐리-오버(carry-over)를 제거한다. 1㎕의 1M MgCl2가 보충된 1㎍/㎖ 용액의 바이러스 상청액을 실온에서 30분 동안, 그 다음 4℃에서 2 내지 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 여과된 상청액을 배양된 세포 상에서 직접 사용하거나, -80℃에서 분취 및 저장하였다. 위형 VSV-G 바이러스 상청액을 임의로 농축 및 정제하였다.
실시예 2: CD28-CA125 이중특이적 항체 인게이저 분자를 발현하는 위형 VSV-G의 작제
위형 VSV-G를 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하고, 항-CD28 분자를 포함하는 활성화 도메인 및 항-CA125 분자를 포함하는 항원 인식 도메인을 포함하는 인게이저 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 및 항-PD1 면역 조정 펩타이드를 암호화하는 핵산을 발현하도록 추가로 가공한다. 생성된 종양용해성 바이러스는 CD28-CA125 인게이저 분자 및 항-PD1 치료 분자(CD28-CA125-PD1 VSV-G)를 암호화하는 위형 종양용해성 VSV-G 바이러스이다.
실시예 3: CD28-CA125-PD1 VSV-G는 인간 T 세포를 활성화시키고, 항-종양 활성도를 나타낸다.
인간 T 세포를 위형 CD28-CA125-PD1 VSV-G 바이러스로 감염시킨다. 바이러스 감염 24시간 내지 48시간 후, T 세포 배양 배지를 수집하고, 염증전 사이토카인의 존재에 대해서 체크한다. 이러한 결과는, T 세포가 CD28-CA125-PD1 VSV-G 감염된 인간 T 세포의 세포 배양 상청액 중의 염증전 사이토카인, 예컨대, IFN-β 및 IL-2의 존재에 의해서 입증된 바와 같이, CD28-CA125-PD1 VSV-G에 의해서 활성화된다는 것을 나타낼 것이다.
KATO3 세포주로부터의 EphA2-과발현 위암 세포를 위형 CD28-CA125-PD1 VSV-G 또는 비-위형 CD28-CA125-PD1 VSV 바이러스로 감염시키고, 세포 증식을 평가한다. 이러한 결과는, 세포 증식이 비-위형 CD28-CA125-PD1 VSV 바이러스로 감염된 KATO3 세포와 비교할 때 위형 CD28-CA125-PD1 VSV-G로 감염된 세포 KATO3 세포에서 상당히 감소된 것을 나타낼 것이다.
실시예 4: CD19-CD3, SIRP1α-CD3, 및 PDL1-CD3-Fc 인게이저 분자는 CD3을 통해서 T-세포에 특이적으로 결합한다
T 세포에 대한 이분(CD19-CD3 및 SIRP1α-CD3) 및 삼분(PDL1-CD3-Fc) 인게이저 분자의 결합을 평가하였다. 간략하면, 25,000개의 T 세포를 200U/㎖ IL-2로 12일 동안 자극시켰다. 12일 후, T 세포를 다양한 농도의 인게이저 분자(CD19-CD3 및 SIRP1α-CD3의 경우 500, 1000 또는 2000ng/㎖; PDL1-CD3-Fc의 경우 니트 상청액)와 함께 20분 동안 실온에서 3회 반복물로 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 2회 세척하고, 500ng/㎖에서 추가적인 20분 동안 항-6XHis APC 항체로 염색하였다. 세포를 다시 세척하고, 프로피디움 아이오다이드(PI)로 처리하여 추가 분석으로부터 죽은 세포를 제외시켰다. 염색된 세포를 BD LSR 포테사 세포측정기(Fortesa cytometer) 상에서 유세포 분석법에 의해서 분석하고, 염색에 대해서 양성인 세포 집단의 백분율을 단지 2차 대조군의 2%로 설정하였다.
CD19-CD3(도 19A), SIRP1α-CD3(도 19B), 및 PDL1-CD3-Fc(도 19C)에 대한 결과는, 이들 분자 각각의 CD3 결합 모이어티가 2차 항체 단독과 비교할 때 인게이저 분자에 대해서 양성인 세포의 백분율의 증가에 의해서 나타난 바와 같이, CD3-발현 293F T 세포에 기능적으로 결합한다는 것을 나타낸다. 특히, % 양성 세포에서의 용량 의존형 증가가 CD19-CD3(도 19A)에 대해서 관찰되며, SIRP1α-CD3 작제물은 모든 농도에서 최대 결합을 나타내었다. 사용된 니트 PDL1-CD3-Fc 상청액의 양은 대부분의 T 세포에 대한 작제물의 결합을 초래하였다(도 19C).
이 실험 결과를 도 20에 정량한다. 특히, 작제물 모두는 인게이저 분자가 첨가되지 않은 샘플과 비교할 때 % 양성 T 세포의 상당한 증가를 나타내었다.
추가적인 실험은, CD19-CD3, SIRP1α-CD3 및 PDL1-CD3-Fc의 결합이 인게이저 분자의 항-CD3 도메인과 T 세포에 의해서 발현된 CD3의 상호작용에 의해서 매개되었다는 것을 나타내었다. T 세포를 인게이저 분자에 노출시키기 전에, T 세포를 항-CD3 단클론성 항체(OKT3)와 함께 인큐베이션시켰다. OKT3와의 사전인큐베이션은 CD19-CD3 인게이저의 결합을 저해하였고, PDL1-CD3-Fc 인게이저의 결합을 실질적으로 감소시켰다. OKT3와의 사전인큐베이션에 의한 SIRP1α-CD3 인게이저의 결합의 부족(도 21C)은 이러한 샘플에서 OKT3에 의한 CD3의 불완전한 저해로 인한 것일 것이다.
실시예 5: SIRP1α-CD3 작제물은 CD47에 특이적으로 결합한다.
SIRP1α-CD3 인게이저 작제물의 결합 특이성을 결정하기 위해서 실험을 수행하였다. Raji 세포를 SIRP1α-CD3 인게이저와 함께 20분 동안 RT에서 사전인큐베이션시켰다. 이어서 세포를 세척하고, 형광성 표지된 항-CD47 단클론성 항체와 함께 20분 동안 RT에서 인큐베이션시키고, 그 후 세포를 세척하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. SIRP1α-CD3 인게이저와 함께 사전인큐베이션시키지 않은 Raji 세포는 항-CD47 단클론성 항체의 상당한 결합을 나타내었다(도 22, IgG 대조군 히스토그램 대 항-CD47 히스토그램). Raji 세포와 SIRP1α-CD3 인게이저의 사전인큐베이션은 항-CD47 단클론성 항체의 결합을 차단하였다(도 22, 항-CD47 히스토그램 대 항-CD47 +SIRP1α-CD3 히스토그래프).
실시예 6: 표적 세포에 대한 SIRP1α-CD3 및 CD19-CD3 인게이저 분자의 결합
Raji(CD19+CD47+, 도 23), U2OS(CD19-CD47+, 도 24), GBM30-luc(CD19-CD47+, 도 25), 및 U251(CD19-CD47+, 도 26) 표적 세포 유형에 결합하는 SIRP1α-CD3 및 CD19-CD3 BiTE의 능력을 결정하기 위해서 실험을 수행하였다. 각각의 표적 세포 유형의 경우, 세포를 500 또는 1000ng/㎖의 (i) His-태그화된 가용성 SIRP1α; (ii) SIRP1α-CD3 BiTE; 또는 (iii) CD19-CD3 BiTE로 처리하였다. 이어서, 세포를 형광성 표지된 항-His 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다.
CD19+CD47+ Raji 세포에 대한 SIRP1α-CD3 및 CD19-CD3 결합의 결과를 도 23에 나타낸다. 음성 대조군 Ig(2° 단독)에 비해서, 가용성 SIRP1α, SIRP1α-CD3 BiTE, 및 CD19-CD3 BiTE는 IgG 대조군 히스토그램과 비교할 때 인게이저 히스토그램의 우향 이동에 의해서 나타난 바와 같이 Raji 세포에 결합할 수 있다(도 23A). BiTE 양성 세포의 백분율을 나타내는 결합 데이터의 정량을 도 23B에 나타낸다.
CD19-CD47+ U2OS 세포에 대한 SIRP1α-CD3 및 CD19-CD3 결합의 결과를 도 24에 나타낸다. 음성 대조군 Ig(2° 단독)에 비해서, 가용성 SIRP1α, SIRP1α-CD3 BiTE는 IgG 대조군 히스토그램과 비교할 때 인게이저 히스토그램의 우향 이동에 의해서 나타난 바와 같이, 사용된 모든 농도에서 U2OS 세포에 결합할 수 있다(도 24A). CD19-CD3 BiTE는 U2OS 세포에 결합할 수 없었으며, 이는 U2OS 세포에 의한 CD19 발현의 부족을 기초로 예측되었다. BiTE 양성 세포의 백분율을 나타내는 이러한 결합 데이터의 정량을 도 24B에 나타낸다.
CD19-CD47+ GBM30-luc세포에 대한 SIRP1α-CD3 및 CD19-CD3 결합의 결과를 도 25에 나타낸다. 음성 대조군 Ig(2° 단독)에 비해서, SIRP1α-CD3 BiTE는 IgG 대조군 히스토그램과 비교할 때 인게이저 히스토그램의 우향 이동에 의해서 나타난 바와 같이, 사용된 모든 농도에서 GBM30-luc 세포에 결합할 수 있다(도 25A). 이에 반해서, CD19-CD3 BiTE는 GBM30-luc 세포에 결합할 수 없었으며, 이는 GBM30-luc 세포에 의한 CD19 발현의 부족을 기초로 예측되었다. BiTE 양성 세포의 백분율을 나타내는 이러한 결합 데이터의 정량을 도 25B에 나타낸다.
CD19-CD47+ U251 세포에 대한 SIRP1α-CD3 및 CD19-CD3 결합의 결과를 도 26에 나타낸다. 음성 대조군 Ig(2° 단독)에 비해서, SIRP1α-CD3 BiTE는 IgG 대조군 히스토그램과 비교할 때 인게이저 히스토그램의 우향 이동에 의해서 나타난 바와 같이, 사용된 모든 농도에서 U251 세포에 결합할 수 있다(도 26A). 이에 반해서, CD19-CD3 BiTE는 U251 세포에 결합할 수 없었으며, 이는 U251 세포에 의한 CD19 발현의 부족을 기초로 예측되었다. BiTE 양성 세포의 백분율을 나타내는 이러한 결합 데이터의 정량을 도 26B에 나타낸다.
실시예 7: U251 세포에 대한 PDL1-CD3-Fc TiTE의 결합은 FcγR가 아니라 CD47에 의해서 매개된다.
PDL1-CD3-Fc TiTE 작제물이 표적 세포에 결합할 수 있는 2개 도메인(항-PDL1 및 Fc 도메인)을 포함하기 때문에 이들 작제물의 결합 특이성을 평가하기 위해서 실험을 수행하였다. CD19-CD47+ U251 세포를 2㎍/㎖의 형광성 표지된 항-PDL1 항체, 아이소폼 대조군 또는 PDL1-CD3-Fc 형질주입 상청액으로 처리하였다. 음성 대조군 Ig에 비해서, PDL1-CD3-Fc TiTE는 U251 세포에 결합하였다(도 27B). 이러한 관찰된 결합이 U251 세포에 의해서 발현된 FcγR 또는 CD47와의 상호작용으로 인한 것인지를 평가하기 위해서, U251 세포 상의 FcγR 발현을 결정하였다. 세포를 2㎍/㎖의 형광단-접합된 항-CD16/32(FcγRIII/FcγRII를 인식함) 또는 항-CD64(FcγRI을 인식함) mAb와 함께 20분 동안 RT에서 인큐베이션시켰다. 이어서 세포를 세척하고 BD LSR 포테사 세포측정기를 사용하여 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 도 27C에 나타난 바와 같이, U251 세포는 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII를 발현하지 않는데, 이는 PDL1-CD3-Fc 작제물의 결합이 FcγR이 아닌 CD47와의 상호작용에 의해서 매개되었다는 것을 나타낸다.
실시예 8: CD19-CD3, SIRP1α-CD3 및 PDL1-CD3-Fc 작제물은 표적 세포의 CD8 + T 세포-매개된 사멸을 자극한다.
표적 세포의 사멸을 매개하는 CD19-CD3, SIRP1α-CD3 및 PDL1-CD3-Fc 작제물의 능력을 결정하기 위해서 실험을 수행하였다. 간략하면, CD8+ T 세포를 200U/㎖의 IL-2 및 다이나비드(Dynabead)의 존재 하에서 8 내지 12일 동안 자극시켰다. 표적 세포와 함께 공배양하기 전에, 모든 다이아비드를 자석에 의해서 제거하고, 세포를 세척하여 IL-2를 제거하였다. Raji(도 28), THP1(도 29), U251(도 30) 및 293F(도 31) 표적 세포를 플레이팅 전에 형광막 염료 PKH67 그린으로 표지하였다. 이어서, CD8+ 효과기 T 세포를 1000ng/㎖의 CD19-CD3 BiTE, SIRP1α-CD3 BiTE 또는 PDL1-CD3-Fc 형질주입 상청액의 1:3 희석액과 함께 1:1의 효과기 대 표적비로 표적 세포와 함께 공배양하였다. 표적 및 효과기 세포의 공배양물을 18시간 동안 인큐베이션시키고, 그 후 이것을 7-AAD로 염색하고, BD LSR 포테사 세포측정기 상에서의 유세포 분석법에 의해서 생/사 분석을 수행하였다.
이들 실험의 결과는, CD19-CD3, SIRP1α-CD3 및 PDL1-CD3-Fc 인게이저 작제물이 모두 Raji 표적 세포의 효과기 세포-매개된 사멸을 유도할 수 있음을 나타낸다(도 28). Raji 세포에 대한 CD19-CD3, SIRP1α-CD3 및 PDL1-CD3-Fc 인게이저 분자 각각에 대한 EC50을 하기 표 7에 나타낸다.
Figure pct00017
이들 실험의 결과는 CD19-CD3 작제물이 아닌 PDL1-CD3-Fc 인게이저 작제물이 THP1 표적 세포의 효과기 세포-매개된 사멸을 유도할 수 있었음을 추가로 나타낸다(도 29). 이것은 THP1 세포에 의한 CD19의 결핍/비교적 낮은 발현으로 인한 것일 것이다.
추가로, PDL1-CD3-Fc 인게이저 작제물은 U251 표적 세포의 효과기 세포-매개된 사멸을 유도할 수 있었지만(도 30), CD19-CD3 작제물은 U251 세포에 의한 CD19 발현의 결핍으로 인해서 U251 세포의 효과기 세포-매개된 사멸을 유도하지 않았다. U251 세포에 대한 CD19-CD3 및 PDL1-CD3-Fc 작제물 각각에 대한 EC50을 하기 표 8에 나타낸다.
Figure pct00018
추가로, SIRP1α-CD3 인게이저 작제물은 대조군 오스테오폰틴-융합 단백질(OPN 1)과 비교할 때 SIRP1α-CD3 함유 배양물에서의 세포사 증가에 의해서 나타낸 바와 같이 293F 표적 세포의 효과기 세포-매개된 사멸을 유도할 수 있었다(도 31). 293F 세포에 대한 SIRP1α-CD3 인게이저 분자에 대한 EC50을 하기 표 9에 나타낸다.
Figure pct00019
실시예 9: PDL1-CD3-Fc BiTE는 U251 세포의 1차 NK 세포 사멸을 향상시킨다.
표적 세포의 NK 세포-매개된 사멸을 유도하는 PDL1-CD3-Fc 작제물의 능력을 평가하기 위해서 실험을 수행한다. 간략하면, U251 세포를 세포막 염료 PKH67 그린으로 표지하고, 이어서 시딩하고, 밤새 웰에 부착시켰다(도 32). 이어서 1차 NK 세포(스템 셀 테크놀로지스, 인크.(StemCell Technologies, Inc.))를 다양한 양의 바이러스에 의해서 생산된 PDL1-CD3-Fc 단백질과 함께, 1:1의 효과기 대 표적비로 각각의 웰에 첨가한다. 효과기/표적 세포 공배양물을 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션시킨 후, 7-AAD 염색에 의해서 생/사 분석을 수행하였다. 염색된 세포를 BD LSR 포테사 세포측정기 상에서 유세포 분석법에 의해서 분석한다.
이러한 결과는, 바이러스에 의해서 생산된 PDL1-CD3-Fc 화합물이 표적 세포, 예컨대, U251의 NK 세포-매개된 사멸을 자극할 수 있음을 나타낼 것이다.
실시예 10: oHSV-감염된 Vero 세포는 SIRP-1α-CD3 BiTE를 발현한다.
본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스가 인게이저 분자를 생산할 수 있는지를 입증하기 위해서, Vero 세포를 짧은 링커(SL)(ONCR-085; 2A5B SIRP1α-CD3(SL) BiTE) 또는 긴 링커(LL)(ONCR-087; 2A5B SIRP1α-CD3(LL) BiTE)를 갖는 SIRP1α-CD3 BiTE를 발현하는 oHSV(도 32) 또는 PDL1-CD3-Fc TiTE를 발현하는 oHSV로 감염시켰다(ONCR-089, 도 33). 세포를 3일 동안 감염시키고, 그 후 감염된 세포로부터의 상청액을 100K MWCO 한외여과막을 통과시켜 임의의 바이러스 입자를 제거하였다. 통과액을 10K MWCO 한외여과막으로 농축시켰다. 이어서, 바이러스 상청액 중의 인게이저 단백질의 양을 결정하기 위해서 농축된 바이러스 상청액 및 100ng, 50ng, 25ng 또는 12.5ng의 정제된 SIRP1α-CD3 또는 PDL1-CD3-Fc 단백질을 PAGE에 의해서, 그 다음 항-6xHis 검출 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해서 분석하였다.
결과는, ONCR-085 또는 ONCR-087로 감염된 세포가 각각 SIRP1α-CD3(SL) 및 SIRP1α-CD3(LL) 단백질을 생산하였음을 나타낸다(도 32). 추가로, ONCR-089로 감염된 세포는 PDL1-CD3-Fc 단백질을 생산하였다(도 33). 잔류하는 바이러스를 제거하는 100K 및 10K 아미콘 여과 및 농축 단계의 능력을 웨스턴 블롯에 의해서 평가하였다. 바이러스 상청액을 정화하는 작업흐름은 상청액의 저속 원심분리, 그 다음 0.8㎛ 필터막을 통한 여과를 포함한다. 이어서, 상청액 여과액을 아미콘 100kDa 필터에 통과시켜 바이러스를 비말동반시키고, 그 다음 아미콘 10kDa 필터를 통해서 여과액을 통과시켜 남아있는 단백질을 비말동반시켰다. 바이러스에 의해서-감염된 세포로부터의 상청액의 분취물을 아미콘 필터로의 가공 전 및 후에 취하고, HSV의 존재를 항-HSV 다클론성 항체로의 블롯팅에 의해서 결정하였다. 이러한 결과는, 인게이저 작제물을 정제하는 데 사용된 한외여과 단계가 바이러스를 효과적으로 제거하였음을 나타낸다(도 35). 따라서, 이러한 인게이저 작제물의 존재에서 관찰된 임의의 표적 세포 사멸은 표적 세포의 바이러스 감염의 결과로 인한 것이 아니라 인게이저 작제물 자체로 인한 것이다.
실시예 11: 바이러스에 의해서-생산된 SIRP1α-CD3 및 PDL1-CD3-Fc 인게이저 작제물은 표적 세포의 효과기-세포 매개된 사멸을 유도하였다.
표적 세포 사멸을 매개하는 바이러스에 의해서-생산된 인게이저 분자(SIRP1α-CD3 및 PDL1-CD3-Fc 작제물)의 능력을 평가하기 위해서 실험을 수행하였다. 간략하면, SIRP1α-CD3(SL), SIRP1α-CD3(LL) 및 PDL1-CD3-Fc 단백질을 실시예 10에 기술된 바와 같이 Vero 세포로부터 제조하였다. 50㎕의 생성된 SIRP1α-CD3(SL), SIRP1α-CD3(LL), 및 PDL1-CD3-Fc 인게이저 단백질 단백질 샘플을 20% FBS를 함유하는 조직 배양 배지 중에서 1:1로 희석하였다. 이어서, 희석된 인게이저 단백질을 형광성 표지된 U251 표적 세포와 함께 공배양된 활성화된 CD8+ 효과기 T 세포와 함께 1:1의 표적 대 효과기비로 18시간 동안 인큐베이션시켰다. U251 세포의 세포사를 BD LSR 포테사 세포측정기 상에서 유세포 분석법에 의해서 평가하였다.
본 실험의 결과는 바이러스에 의해서-생산된 인게이저 작제물은 U251 표적 세포의 T-세포 매개된 사멸을 유도함을 나타낸다(도 34A). 이 결과를 도 34B에 정량한다.
실시예 12: 293 T 세포로부터의 SIRP1α-CD3/PDL1-Fc 화합물의 발현
SIRP1α-CD3 인게이저 분자 및 PDL1-Fc 치료 분자를 암호화하는 2종의 발현 플라스미드를 생성하였다. 하나의 작제물은 His-태그화된 SIRP1α-CD3 BiTE를 암호화하는 제2 유전자에 연결된 HA-태그화된 PDL1-Fc를 암호화하는 제1 유전자를 포함하였다. SIRP1α 아미노산 서열을 단일 아미노산 링커(즉, 짧은 링커)에 의해서 항-CD3 scFv에 연결하였다(SIRP1α-CD3/PDL1-Fc(SL), 도 37). 다른 작제물은 SIRP1α-CD3 BiTE를 암호화하는 제2 유전자에 연결된 PDL1-Fc를 암호화하는 제1 유전자를 포함하였다. SIRP1α 아미노산 서열을 G4S 링커(즉, 긴 링커)에 의해서 항-CD3 scFv에 연결하였다(SIRP1α-CD3/PDL1-Fc(LL), 도 38). 작제물을 플라스미드(도 39) 내에 삽입하고, 생성된 SIRP1α-CD3/PDL1-Fc 발현 플라스미드를 293 프리 스타일(Free Style) T 세포 내에 형질주입하였다. 플라스미드 형질주입 4일 후, 배양물 상청액을 수집하였다.
항-PDL1-Fc 화합물을 HiTrap MabSelect SuRe 단백질 A 칼럼 HiTrap 칼럼(지이 헬쓰케어)을 사용하여 배양물 상청액으로부터 정제하였다. 간략하면, SIRP1α-CD3/PDL1-Fc(LL) 또는 SIRP1α-CD3/PDL1-Fc(LL) 발현 플라스미드로 형질주입된 293 T 세포로부터의 상청액을 칼럼 상에 적재하여 칼럼에 대한 HA-태그의 결합에 의해서 항-PDL1-Fc 화합물을 정제하였다. 항-His 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해서 통과액을 SIRP1α-CD3 BiTE 검출을 위해서 수집하였다(도 40B). 칼럼을 세척 완충액(20mM 인산나트륨, 150mM NaCl, pH 7.4)으로 세척하였다. 결합된 항-PDL1-Fc 단백질을 IgG 용리 완충액(pH 2.8, 피어스(Pierce))으로 용리시키고, 1M 트리스-HCl 완충액, pH 8으로 즉시 중화시켰다.
이어서 상이한 용리 분획의 항-PDL1-Fc 단백질 내용물을 쿠마시 염색에 의해서 가시화하였다. 간략하면, 용리 분획을 MOPS 완충액 중의 4% 내지 12% 비스-트리스 NuPAGE 젤 상에서 180볼트에서 1시간 동안 이동시켰다. 젤을 심플리 블루 세이프스테인(Simply Blue SafeStain) 중에서 1시간 동안 염색한 후 물로 탈색하였다. 각각의 용리 분획에 대한 항-PDL1-Fc 단백질 내용물을 도 40A에 나타낸다. 쿠마시 분석 후, 용리 분획을 합하고, PBS에 대해서 4℃에서 투석하였다. 이어서, 총 항-PDL1-Fc 단백질 농도를 BCA 검정에 의해서 결정하였다.
실시예 13: 단리된 PDL1-Fc 단백질은 표적 세포의 T 세포-매개된 사멸을 자극한다.
표적 세포의 효과기 세포-매개된 사멸을 유도하는 항-PDL1-Fc 단백질의 능력을 PD1/PDL1 차단 검정에 의해서 평가하였다. 검정의 일반적인 개략도를 도 41A 및 도 41B에 나타낸다. 간략하면, CD8+ T 세포를 PDL1-발현 표적 세포(CHO-K1 세포)와 함께 공배양하였다. 이어서 실시예 12에 기술된 바와 같이 단리된 다양한 농도의 항-PDL1-Fc 단백질을 배양물에 첨가하였다. 사용된 항-PDL1-Fc의 최고 농도는 50㎍/㎖였다. 이어서, 8개의 2.5배 연속 희석을 수행하여 나머지의 항-PDL1-Fc 농축액의 생성하였다. 세포사를 항-PDL1-Fc의 존재(도 41B) 및 부재(도 41A) 하에서 CytoTox-Glo(상표명) 세포독성 검정에 의해서 분석하였다. 결과를 도 41C에 정량한다. 항-PDL1-Fc의 EC50을 표 10에 나타낸다. 이러한 결과는, 본 명세서에 기술된 발현 작제물로부터 생산된 항-PDL1-Fc 치료 분자가 표적 세포의 효과기 세포-매개된 사멸을 매개할 수 있다는 것을 나타낸다.
Figure pct00020
실시예 13: oHSV-감염된 Vero 세포는 MMP9 및 항-PDL1-Fc 치료 분자를 발현한다.
실시예 10에 기술된 바와 같이 인게이저 분자를 생산하는 것에 더하여, 본 명세서에 기술된 종양용해성 바이러스가 MMP9 및 항-PDL1-Fc 치료 분자를 생산할 수 있는지를 입증하기 위해서 실험을 수행한다. Vero 세포를 SIRP1α-CD3/PDL1-Fc 작제물 BiTE를 발현하는 oHSV(도 37 및 도 38) 또는 SIRP1α-CD3/ MMP9 작제물을 발현하는 oHSV(도 18A 및 도 18B)로 감염시킨다. 세포를 3일 동안 감염시키고, 그 후 감염된 세포로부터의 상청액을 100K MWCO 한외여과막을 통과시켜 임의의 바이러스 입자를 제거한다. 통과액을 10K MWCO 한외여과막으로 농축시킨다. MMP9 및 항-PDL1-Fc를 실시예 11에 열거된 프로토콜에 따라서 여과되고 농축된 상청액으로부터 정제한다. 단백질 A-단리된 MMP9 및 항-PDL1 분획을 PAGE, 그 다음 쿠마시 염색에 의해서 분석한다. 단백질 A 통과액 중에 존재하는 SIRP1α-CD3 BiTE를 항-6x His 검출 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해서 분석한다.
결과는, SIRP1α-CD3/PDL1-Fc 작제물 또는 SIRP1α-CD3/ MMP9 작제물을 암호화하는 oHSV 벡터로 감염된 세포가 SIRP1α-CD3(SL) 및 SIRP1α-CD3(LL) BiTE 단백질, MMP9 및 항-PDL1-Fc를 생산함을 나타낼 것이다.
실시예 14: 바이러스에 의해서-생산된 SIRP1α-CD3/ MMP9 및 SIRP1α-CD3/PDL1-Fc 인게이저 작제물은 표적 세포의 효과기-세포 매개된 사멸을 유도한다.
표적 세포 사멸을 매개하는 바이러스에 의해서-생산된 인게이저 분자(SIRP1α-CD3) 및 치료 분자(MMP9 및 항-PDL1-Fc)의 능력을 평가하기 위해서 실험을 수행한다. 간략하면, SIRP1α-CD3(SL), SIRP1α-CD3(LL), MMP9, 및 항-PDL1-Fc 단백질을 실시예 13에 기술된 바와 같이 Vero 세포로부터 제조하였다. 50㎕의 생성된 단백질 단백질 샘플을 20% FBS를 함유하는 조직 배양 배지 중에 희석한다. 이어서, 희석된 단백질을 활성화된 CD8+ 효과기 T 세포 또는 NK 효과기 세포와 함께 인큐베이션시키고, 형광성 표지된 표적 세포와 함께 1:1의 표적 대 효과기비로 18시간 동안 공배양한다. 표적 세포의 세포사를 BD LSR 포테사 세포측정기 상에서 유세포 분석법에 의해서 평가한다.
이 실험의 결과는, 바이러스에 의해서-생산된 SIRP1α-CD3 인게이저 작제물 및 치료 분자 MMP9 및 항-PDL1-Fc가 표적 세포의 T-세포 및/또는 NK 세포 매개된 사멸을 유도할 수 있음을 나타낼 것이다.
본 발명의 바람직한 실시형태가 본 명세서에 제시되고 기술되어 있지만, 이러한 실시형태는 단지 예의 방식에 의해서 제공됨은, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 이제 다수의 변경, 변화 및 치환이 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 일어날 것이다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 실시형태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범주를 한정하고, 청구범위 및 이의 등가물의 범주 내의 방법 및 구조는 이에 의해서 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Oncorus, Inc. <120> PSEUDOTYPED ONCOLYTIC VIRAL DELIVERY OF THERAPEUTIC POLYPEPTIDES <130> WO/2018/006005 <140> PCT/US2017/040354 <141> 2017-06-30 <150> US 62/357,195 <151> 2016-06-30 <160> 70 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polynucleotide encoding signal peptide <400> 1 atggagttcg gcctgagctg ggtgttcctg gtggccctgt tcaggggcgt gcagtgc 57 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized signal peptide sequence <400> 2 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Asp 20 <210> 3 <400> 3 000 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized signal peptide sequence <400> 4 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Asp 20 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polynucleotide encoding GlySer linker peptide <400> 5 ggcggcggcg 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<400> 11 caccaccacc accaccac 18 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized 6-His tag sequence <400> 12 His His His His His His 1 5 <210> 13 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polynucleotide encoding T2A linker <400> 13 cgaagaaaac gcgaggggag gggctccctg ctcacctgtg gtgatgtcga agagaaccct 60 gggccg 66 <210> 14 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized T2A linker linker sequence <400> 14 Arg Arg Lys Arg Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 15 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polynucleotide encoding anti-CD19 light chain sequence <400> 15 gacatccagc tgacccagag ccccgccagc ctggccgtga gcctgggcca gagggccacc 60 atcagctgca aggccagcca gagcgtggac tacgacggcg acagctacct gaactggtac 120 cagcagatcc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacg acgccagcaa cctggtgagc 180 ggcatccccc ccaggttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaacatccac 240 cccgtggaga aggtggacgc cgccacctac cactgccagc agagcaccga ggacccctgg 300 accttcggcg gcggcaccaa gctggagatc aag 333 <210> 16 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized anti-CD19 light chain sequence <400> 16 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 17 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polynucleotide encoding anti-CD19 heavy chain sequence <400> 17 caggtgcagc tgcagcagag cggcgccgag ctggtgaggc ccggcagcag cgtgaagatc 60 agctgcaagg ccagcggcta cgccttcagc agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120 cccggccagg gcctggagtg gatcggccag atctggcccg gcgacggcga caccaactac 180 aacggcaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgccgacg agagcagcag caccgcctac 240 atgcagctga gcagcctggc cagcgaggac agcgccgtgt acttctgcgc caggagggag 300 accaccaccg tgggcaggta ctactacgcc atggactact ggggccaggg caccaccgtg 360 accgtgagca gc 372 <210> 18 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized anti-CD19 heavy chain sequence <400> 18 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 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acttcttag 489 <210> 24 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 85 90 95 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 100 105 110 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 115 120 125 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 130 135 140 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 145 150 155 160 Thr Ser <210> 25 <211> 987 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60 gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120 gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180 accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240 gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300 ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360 aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420 acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480 ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540 agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600 gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660 gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720 ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780 acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840 agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900 cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc 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ctcttccccg ttggccccat ccagtggttt 180 cgaggcgcag gaccaggacg agtgcttatt tacaatcaac gacagggccc attcccaaga 240 gtgacaacag tatccgatac caccaagcgc aataatatgg actttagcat tagaatcggc 300 aacataacac ccgctgacgc cggtacatac tattgtatta aatttcgaaa gggctcacca 360 gacgacgtgg aatttaagtc aggggccgga accgaactct cagttagagc aaaaccttct 420 gctagc 426 <210> 32 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys 20 25 30 Ser Val Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile 35 40 45 Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly 50 55 60 Pro Gly Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg 65 70 75 80 Val Thr Thr Val Ser Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser 85 90 95 Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 Ile Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly 115 120 125 Ala Gly Thr Glu Leu 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taccacggcc 780 aactacgaca ccgacgaccg gtttggcttc tgccccagcg agagactcta cacccgggac 840 ggcaatgctg atgggaaacc ctgccagttt ccattcatct tccaaggcca atcctactcc 900 gcctgcacca cggacggtcg ctccgacggc taccgctggt gcgccaccac cgccaactac 960 gaccgggaca agctcttcgg cttctgcccg acccgagctg actcgacggt gatggggggc 1020 aactcggcgg gggagctgtg cgtcttcccc ttcactttcc tgggtaagga gtactcgacc 1080 tgtaccagcg agggccgcgg agatgggcgc ctctggtgcg ctaccacctc gaactttgac 1140 agcgacaaga agtggggctt ctgcccggac caaggataca gtttgttcct cgtggcggcg 1200 catgagttcg gccacgcgct gggcttagat cattcctcag tgccggaggc gctcatgtac 1260 cctatgtacc gcttcactga ggggcccccc ttgcataagg acgacgtgaa tggcatccgg 1320 cacctctatg gtcctcgccc tgaacctgag ccacggcctc caaccaccac cacaccgcag 1380 cccacggctc ccccgacggt ctgccccacc ggacccccca ctgtccaccc ctcagagcgc 1440 cccacagctg gccccacagg tcccccctca gctggcccca caggtccccc cactgctggc 1500 ccttctacgg ccactactgt gcctttgagt ccggtggacg atgcctgcaa cgtgaacatc 1560 ttcgacgcca tcgcggagat tgggaaccag ctgtatttgt tcaaggatgg gaagtactgg 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encoding SIRP1alpha-CD3-LL bi-specific T-cell engager construct <400> 47 atggagaccg ataccctgct cttgtgggtt ttgcttcttt gggtgccagg atctacaggt 60 gatgaagaag aattgcagat catccaacca gacaaatccg tactcgtggc cgcaggagag 120 accgctaccc tcagatgtac catcacttct ctcttccccg ttggccccat ccagtggttt 180 cgaggcgcag gaccaggacg agtgcttatt tacaatcaac gacagggccc attcccaaga 240 gtgacaacag tatccgatac caccaagcgc aataatatgg actttagcat tagaatcggc 300 aacataacac ccgctgacgc cggtacatac tattgtatta aatttcgaaa gggctcacca 360 gacgacgtgg aatttaagtc aggggccgga accgaactct cagttagagc aaaaccttct 420 gctagcggcg gcggcggcag cgacatcaag ctgcagcaga gcggcgccga gctggccagg 480 cccggcgcca gcgtgaagat gagctgcaag accagcggct acaccttcac caggtacacc 540 atgcactggg tgaagcagag gcccggccag ggcctggagt ggatcggcta catcaacccc 600 agcaggggct acaccaacta caaccagaag ttcaaggaca aggccaccct gaccaccgac 660 aagagcagca gcaccgccta catgcagctg agcagcctga ccagcgagga cagcgccgtg 720 tactactgcg ccaggtacta cgacgaccac tactgcctgg actactgggg ccagggcacc 780 accctgaccg 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cgcctacatg 300 cagctgagca gcctgaccag cgaggacagc gccgtgtact actgcgccag gtactacgac 360 gaccactact gcctggacta ctggggccag ggcaccaccc tgaccgtgag cagcgtggag 420 ggcggcagcg gcggcagcgg cggcagcggc ggcagcggcg gcgtggacga catccagctg 480 acccagagcc ccgccatcat gagcgccagc cccggcgaga aggtgaccat gacctgcagg 540 gccagcagca gcgtgagcta catgaactgg taccagcaga agagcggcac cagccccaag 600 aggtggatct acgacaccag caaggtggcc agcggcgtgc cctacaggtt cagcggcagc 660 ggcagcggca ccagctacag cctgaccatc agcagcatgg aggccgagga cgccgccacc 720 tactactgcc agcagtggag cagcaacccc ctgaccttcg gcgccggcac caagctggag 780 ctgaagggcg gcggcggcag cgatatccag atgacacaga gcccatcatc tctgtctgca 840 agcgtaggag accgagtcac cattacatgc agagcctccc aagacgtttc cacagcagtg 900 gcctggtatc agcaaaaacc tggtaaggcg cccaagcttc tcatctattc agccagtttt 960 ctgtatagcg gcgttcccag ccgattctct ggctctggat ccggcacgga ctttactttg 1020 acaatttcct ctcttcagcc cgaagatttt gcaacctact actgtcagca atatctctac 1080 catccagcca cattcggaca gggcaccaaa gtcgaaatca aaagaggcgg cggcggcagt 1140 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tgactgtgag cgccgtagat gaagcaaaat cttgtgacaa aacccatacc 1560 tgcccaccat gcccagcccc agaacttctt ggcggaccct ctgtcttcct tttccctccg 1620 aagcccaagg ataccctgat gatcagccga accccggagg taacatgtgt ggtggtcgat 1680 gttagccatg aggatcctga agtcaaattt aactggtatg tagacggtgt tgaggtgcac 1740 aacgctaaaa ctaagcccag ggaggagcag tacaactcaa cctatcgcgt cgtatctgtg 1800 cttaccgtcc tgcatcaaga ctggctcaat ggtaaggaat ataaatgtaa agtgagtaac 1860 aaggcactgc cagcacctat cgaaaaaacc atctcaaagg cgaagggaca gcccagggaa 1920 ccccaggtct atactctgcc accttctcgg gatgaattga ccaagaacca agttagcctg 1980 acatgtctgg tgaaaggttt ctatccaagc gatatagctg tcgagtggga gtccaatggc 2040 caacctgaga acaattataa gaccacccca cccgttctgg acagcgacgg atcctttttc 2100 ctgtactcaa aactcactgt cgataaatca agatggcaac aaggcaacgt ttttagctgt 2160 agcgtgatgc acgaagcact tcataatcac tatacacaga agtcactctc tctttctcca 2220 ggacaccacc atcatcacca ctga 2244 <210> 52 <211> 747 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized PDL1-CD3-Fc bi-specific T-cell engager construct 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gaaatcaaaa gaggcggcgg cggcagtggc ggcgggggtt caggaggcgg gggttctgaa 480 gtgcaactcg ttgaaagcgt aggagggctt gtccaacctg gcgggtcact gcggttgagc 540 tgcgccgcaa gcggattcac cttctcagac tcttggatcc attgggtgcg ccaggctccc 600 ggaaaaggct tggaatgggt tgcttggatt tcaccgtatg gcggttccac atactacgct 660 gacagcgtta agggtcgatt caccatctct gcagatactt caaaaaacac agcctacctt 720 cagatgaata gtttgcgcgc cgaggacaca gcggtttatt attgtgccct aagacattgg 780 cccggcggtt tcgactactg ggggcaaggt acgttggtga ctgtgagcgc cgtagatgaa 840 gcaaaatctt gtgacaaaac ccatacctgc ccaccatgcc cagccccaga acttcttggc 900 gtaccctctg tcttcctttt ccctccgaag cccaaggata ccctgatgat cagccgaacc 960 ccggaggtaa catgtgtggt ggtcgatgtt agccatgagg atcctgaagt caaatttaac 1020 tggtatgtag acggtgttga ggtgcacaac gctaaaacta agcccaggga ggagcagtac 1080 aactcaacct atcgcgtcgt atctgtgctt accgtcctgc atcaagactg gctcaatggt 1140 aaggaatata aatgtaaagt gagtaacaag gcactgccag cacctatcga aaaaaccatc 1200 tcaaaggcga agggacagcc cagggaaccc caggtctata ctctgcaacc ttctcgggat 1260 gaattgacca agaaccaagt tagcctgaca tgtctggtga aaggtttcta tccaagcgat 1320 atagctgtcg agtgggagtc caatggccaa cctgagaaca attataagac caccccaccc 1380 gttctggaca gcgacggatc ctttttcctg tactcaaaac tcactgtcga taaatcaaga 1440 tggcaacaag gcaacgtttt tagctgtagc gtgatgcacg aagcacttca taatcactat 1500 acacagaagt cactctctct ttctccagga aaggttgacg aacagaaatt gatatccgag 1560 gaagatctca ataggaggaa gagagaaggc agggggagcc ttctcacttg cggcgatgtc 1620 gaggaaaatc cggggcctat ggagaccgat accctgctct tgtgggtttt gcttctttgg 1680 gtgccaggat ctacaggtga tgaagaagaa ttgcagatca tccaaccaga caaatccgta 1740 ctcgtggccg caggagagac cgctaccctc agatgtacca tcacttctct cttccccgtt 1800 ggccccatcc agtggtttcg aggcgcagga ccaggacgag tgcttattta caatcaacga 1860 cagggcccat tcccaagagt gacaacagta tccgatacca ccaagcgcaa taatatggac 1920 tttagcatta gaatcggcaa cataacaccc gctgacgccg gtacatacta ttgtattaaa 1980 tttcgaaagg gctcaccaga cgacgtggaa tttaagtcag gggccggaac cgaactctca 2040 gttagagcaa aaccttctgc tagcgacatc aagctgcagc agagcggcgc cgagctggcc 2100 aggcccggcg ccagcgtgaa gatgagctgc aagaccagcg gctacacctt caccaggtac 2160 accatgcact gggtgaagca gaggcccggc cagggcctgg agtggatcgg ctacatcaac 2220 cccagcaggg gctacaccaa ctacaaccag aagttcaagg acaaggccac cctgaccacc 2280 gacaagagca gcagcaccgc ctacatgcag ctgagcagcc tgaccagcga ggacagcgcc 2340 gtgtactact gcgccaggta ctacgacgac cactactgcc tggactactg gggccagggc 2400 accaccctga ccgtgagcag cgtggagggc ggcagcggcg gcagcggcgg cagcggcggc 2460 agcggcggcg tggacgacat ccagctgacc cagagccccg ccatcatgag cgccagcccc 2520 ggcgagaagg tgaccatgac ctgcagggcc agcagcagcg tgagctacat gaactggtac 2580 cagcagaaga gcggcaccag ccccaagagg tggatctacg acaccagcaa ggtggccagc 2640 ggcgtgccct acaggttcag cggcagcggc agcggcacca gctacagcct gaccatcagc 2700 agcatggagg ccgaggacgc cgccacctac tactgccagc agtggagcag caaccccctg 2760 acctccggcg ccggcaccaa gctggagctg aagcaccacc atcatcacca ctga 2814 <210> 68 <211> 937 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized SIRP1alpha-PDL1-CD3-Fc-SL bi-specific T-cell engager construct <400> 68 Met Glu Thr Asp Arg Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala 20 25 30 Gln Pro Ala Asp Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 35 40 45 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 50 55 60 Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 65 70 75 80 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 85 90 95 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 100 105 110 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu 115 120 125 Tyr His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 145 150 155 160 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 165 170 175 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp 180 185 190 Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 195 200 205 Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser 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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 420 425 430 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 435 440 445 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 450 455 460 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 465 470 475 480 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 485 490 495 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Val 500 505 510 Asp Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Arg Lys Arg 515 520 525 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 530 535 540 Gly Pro Met Glu Thr Asp Arg Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp 545 550 555 560 Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro 565 570 575 Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys 580 585 590 Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly 595 600 605 Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe 610 615 620 Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp 625 630 635 640 Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr 645 650 655 Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys 660 665 670 Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Ser 675 680 685 Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 690 695 700 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 705 710 715 720 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 725 730 735 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 740 745 750 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 755 760 765 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 770 775 780 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 785 790 795 800 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 805 810 815 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser 820 825 830 Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys 835 840 845 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser 850 855 860 Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 865 870 875 880 Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser 885 890 895 Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 900 905 910 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 915 920 925 Glu Leu Lys His His His His His His 930 935 <210> 69 <211> 2829 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polynucleotide encoding SIRP1alpha-PDL1-CD3-Fc-LL bi-specific T-cell engager construct <400> 69 atggaaaccg atacacttct gttgtgggtg ctgctgctgt gggtccctgg ttcaacaggc 60 gattatccct acgatgtgcc cgactacgca ggcgctcagc cagctgatga tatccagatg 120 acacagagcc catcatctct gtctgcaagc gtaggagacc gagtcaccat tacatgcaga 180 gcctcccaag acgtttccac agcagtggcc tggtatcagc aaaaacctgg taaggcgccc 240 aagcttctca tctattcagc cagttttctg tatagcggcg ttcccagccg attctctggc 300 tctggatccg gcacggactt tactttgaca atttcctctc ttcagcccga agattttgca 360 acctactact gtcagcaata tctctaccat ccagccacat tcggacaggg caccaaagtc 420 gaaatcaaaa gaggcggcgg cggcagtggc ggcgggggtt caggaggcgg gggttctgaa 480 gtgcaactcg ttgaaagcgt aggagggctt gtccaacctg gcgggtcact gcggttgagc 540 tgcgccgcaa gcggattcac cttctcagac tcttggatcc attgggtgcg ccaggctccc 600 ggaaaaggct tggaatgggt tgcttggatt tcaccgtatg gcggttccac atactacgct 660 gacagcgtta agggtcgatt caccatctct gcagatactt caaaaaacac agcctacctt 720 cagatgaata gtttgcgcgc cgaggacaca gcggtttatt attgtgccct aagacattgg 780 cccggcggtt tcgactactg ggggcaaggt acgttggtga ctgtgagcgc cgtagatgaa 840 gcaaaatctt gtgacaaaac ccatacctgc ccaccatgcc cagccccaga acttcttggc 900 gtaccctctg tcttcctttt ccctccgaag cccaaggata ccctgatgat cagccgaacc 960 ccggaggtaa catgtgtggt ggtcgatgtt agccatgagg atcctgaagt caaatttaac 1020 tggtatgtag acggtgttga ggtgcacaac gctaaaacta agcccaggga ggagcagtac 1080 aactcaacct atcgcgtcgt atctgtgctt accgtcctgc atcaagactg gctcaatggt 1140 aaggaatata aatgtaaagt gagtaacaag gcactgccag cacctatcga aaaaaccatc 1200 tcaaaggcga agggacagcc cagggaaccc caggtctata ctctgcaacc ttctcgggat 1260 gaattgacca agaaccaagt tagcctgaca tgtctggtga aaggtttcta tccaagcgat 1320 atagctgtcg agtgggagtc caatggccaa cctgagaaca attataagac caccccaccc 1380 gttctggaca gcgacggatc ctttttcctg tactcaaaac tcactgtcga taaatcaaga 1440 tggcaacaag gcaacgtttt tagctgtagc gtgatgcacg aagcacttca taatcactat 1500 acacagaagt cactctctct ttctccagga aaggttgacg aacagaaatt gatatccgag 1560 gaagatctca ataggaggaa gagagaaggc agggggagcc ttctcacttg cggcgatgtc 1620 gaggaaaatc cggggcctat ggagaccgat accctgctct tgtgggtttt gcttctttgg 1680 gtgccaggat ctacaggtga tgaagaagaa ttgcagatca tccaaccaga caaatccgta 1740 ctcgtggccg caggagagac cgctaccctc agatgtacca tcacttctct cttccccgtt 1800 ggccccatcc agtggtttcg aggcgcagga ccaggacgag tgcttattta caatcaacga 1860 cagggcccat tcccaagagt gacaacagta tccgatacca ccaagcgcaa taatatggac 1920 tttagcatta gaatcggcaa cataacaccc gctgacgccg gtacatacta ttgtattaaa 1980 tttcgaaagg gctcaccaga cgacgtggaa tttaagtcag gggccggaac cgaactctca 2040 gttagagcaa aaccttctgc tagcggcggc ggcggcagcg acatcaagct gcagcagagc 2100 ggcgccgagc tggccaggcc cggcgccagc gtgaagatga gctgcaagac cagcggctac 2160 accttcacca ggtacaccat gcactgggtg aagcagaggc ccggccaggg cctggagtgg 2220 atcggctaca tcaaccccag caggggctac accaactaca accagaagtt caaggacaag 2280 gccaccctga ccaccgacaa gagcagcagc accgcctaca tgcagctgag cagcctgacc 2340 agcgaggaca gcgccgtgta ctactgcgcc aggtactacg acgaccacta ctgcctggac 2400 tactggggcc agggcaccac cctgaccgtg agcagcgtgg agggcggcag cggcggcagc 2460 ggcggcagcg gcggcagcgg cggcgtggac gacatccagc tgacccagag ccccgccatc 2520 atgagcgcca gccccggcga gaaggtgacc atgacctgca gggccagcag cagcgtgagc 2580 tacatgaact ggtaccagca gaagagcggc accagcccca agaggtggat ctacgacacc 2640 agcaaggtgg ccagcggcgt gccctacagg ttcagcggca gcggcagcgg caccagctac 2700 agcctgacca tcagcagcat ggaggccgag gacgccgcca cctactactg ccagcagtgg 2760 agcagcaacc ccctgacctt cggcgccggc accaagctgg agctgaagca ccaccaccac 2820 caccactag 2829 <210> 70 <211> 942 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized SIRP1alpha-PDL1-CD3-Fc-LL bi-specific T-cell engager construct <400> 70 Met Glu Thr Asp Arg Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala 20 25 30 Gln Pro Ala Asp Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 35 40 45 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 50 55 60 Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 65 70 75 80 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 85 90 95 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 100 105 110 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu 115 120 125 Tyr His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 145 150 155 160 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 165 170 175 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp 180 185 190 Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 195 200 205 Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 210 215 220 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 225 230 235 240 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 245 250 255 Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 260 265 270 Val Thr Val Ser Ala Val Asp Glu Ala Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 275 280 285 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 290 295 300 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 305 310 315 320 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 325 330 335 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 340 345 350 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 355 360 365 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 370 375 380 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 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Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly 805 810 815 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile 820 825 830 Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys 835 840 845 Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp 850 855 860 Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr 865 870 875 880 Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 885 890 895 Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala 900 905 910 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly 915 920 925 Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His 930 935 940

Claims (77)

  1. 재조합 핵산을 포함하는 위형 종양용해성 바이러스(pseudotyped oncolytic virus)로서,
    i) 인게이저(engager) 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산 서열로서, 상기 인게이저 폴리펩타이드는 효과기 세포 상에서 발현된 항원에 대해서 특이적인 활성화 도메인 및 표적 세포 상에서 발현된 세포-표면 항원에 대해서 특이적인 항원 인식 도메인을 포함하는, 상기 제1 핵산 서열을 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항원 인식 도메인은 종양 항원에 특이적으로 결합하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  3. 제2항에 있어서, 종양 항원은 표 2로부터 선택되는, 위형 종양용해성 바이러스.
  4. 재조합 핵산을 포함하는 위형 종양용해성 바이러스로서,
    i) 인게이저 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산 서열로서, 상기 인게이저 폴리펩타이드는 효과기 세포 상에서 발현된 항원에 대해서 특이적인 활성화 도메인 및 세포 표면 상에서 발현된 저해성 항원에 결합하는 치료 분자 도메인(therapeutic molecule domain)을 포함하는, 상기 제1핵산 서열을 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  5. 제4항에 있어서, 상기 치료 분자 도메인은 PD1, PDL1 또는 CD47에 특이적으로 결합하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 핵산은 치료적 폴리펩타이드(therapeutic polypeptide)를 암호화하는 제2 핵산 서열을 더 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  7. 제6항에 있어서, 상기 재조합 핵산은 다시스트론성(multicistronic) 서열인, 위형 종양용해성 바이러스.
  8. 제7항에 있어서, 상기 다시스트론성 서열은 이시스트론성(bicistronic) 서열 또는 삼시스트론성(tricistronic) 서열인, 위형 종양용해성 바이러스.
  9. 제7항에 있어서, 상기 다시스트론성 서열은 피코나바이러스-2a-유사 서열을 포함하고, 그리고 상기 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 상기 재조합 핵산 내에 존재하는 단일 프로모터 서열로부터 발현되는, 위형 종양용해성 바이러스.
  10. 제6항에 있어서, 상기 치료적 폴리펩타이드는 면역 조정인자 폴리펩타이드인, 위형 종양용해성 바이러스.
  11. 제10항에 있어서, 상기 면역 조정인자 폴리펩타이드는 사이토카인, 공자극성 분자, 면역 관문 폴리펩타이드, 항-혈관형성 인자, 기질 메탈로프로테아제(MMP) 또는 핵산으로부터 선택되는, 위형 종양용해성 바이러스.
  12. 제11항에 있어서, 상기 면역 관문 폴리펩타이드는,
    i) PD-1, PDL-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, 뉴로필린 또는 CCR4의 저해제;
    ii) GITR, OX-40 또는 CD28의 효능제; 또는
    iii) i)과 ii)의 조합물을 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  13. 제11항에 있어서, 상기 MMP는 MMP9인, 위형 종양용해성 바이러스.
  14. 제11항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-15, IL-12 및 CXCL10으로부터 선택되는, 위형 종양용해성 바이러스.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효과기 세포는 T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 대식세포인, 위형 종양용해성 바이러스.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성화 도메인은 CD3, CD4, CD5, CD8, CD16, CD28, CD40, CD134, CD137 또는 NKG2D에 특이적으로 결합하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  17. 재조합 핵산을 포함하는 위형 종양용해성 바이러스로서,
    i) 인게이저 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산 서열로서, 상기 인게이저 폴리펩타이드는 효과기 세포 상에서 발현된 항원에 대해서 특이적인 활성화 도메인 및 표적 세포 상에서 발현된 종양 세포 항원에 대해서 특이적인 항원 인식 도메인을 포함하되, 상기 효과기 세포 상에서 발현된 상기 항원은 CD3이고, 그리고 상기 종양 세포 항원은 CD19인, 상기 제1 핵산 서열을 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  18. 제17항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 44와 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  19. 제17항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 43을 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  20. 제17항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은,
    ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열로서, 상기 치료 분자는 IL-12인, 상기 제2 핵산 서열을 더 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  21. 제20항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 54와 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  22. 제17항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은,
    ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열로서, 상기 치료 분자는 IL-15인, 상기 제2 핵산 서열을 더 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  23. 제22항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 53과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  24. 제17항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은,
    ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열로서, 상기 치료 분자는 CXCL10인, 상기 제2 핵산 서열을 더 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  25. 제24항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 55와 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  26. 제17항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은,
    ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열로서, 상기 치료 분자는 MMP9인, 상기 제2 핵산 서열을 더 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  27. 재조합 핵산을 포함하는 위형 종양용해성 바이러스로서,
    i) 인게이저 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산 서열로서, 상기 인게이저 폴리펩타이드는 효과기 세포 상에서 발현된 항원에 대해서 특이적인 활성화 도메인 및 저해성 항원에 대해서 특이적인 치료 분자 도메인을 포함하되, 상기 효과기 세포 상에서 발현된 상기 항원은 CD3이고, 그리고 상기 저해성 항원은 PDL1인, 상기 제1 핵산 서열을 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  28. 제27항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 50과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  29. 제27항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 49를 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  30. 제27항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은,
    ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열로서, 상기 치료 분자는 IL-12인, 상기 제2 핵산 서열을 더 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  31. 제30항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 63과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  32. 제27항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은,
    ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열로서, 상기 치료 분자는 IL-15인, 상기 제2 핵산 서열을 더 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  33. 제32항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 62와 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  34. 제27항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은,
    ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열로서, 상기 치료 분자는 CXCL10인, 상기 제2 핵산 서열을 더 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  35. 제34항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 64와 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  36. 제27항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은,
    ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열로서, 상기 치료 분자는 MMP9인, 상기 제2 핵산 서열을 더 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  37. 제27항에 있어서, 상기 인게이저 분자는 제3 결합 도메인을 더 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  38. 제37항에 있어서, 상기 제3 결합 도메인은 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  39. 제38항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 52와 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  40. 제39항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 51을 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  41. 재조합 핵산을 포함하는 위형 종양용해성 바이러스로서,
    i) 인게이저 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산 서열로서, 상기 인게이저 폴리펩타이드는 효과기 세포 상에서 발현된 항원에 대해서 특이적인 활성화 도메인 및 저해성 항원에 대해서 특이적인 치료 분자 도메인을 포함하되, 상기 효과기 세포 상에서 발현된 상기 항원은 CD3이고, 그리고 상기 저해성 항원은 SIRP1α인, 상기 제1 핵산 서열을 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  42. 제41항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 46 또는 48과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  43. 제41항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 45 또는 47을 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  44. 제41항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은,
    ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열로서, 상기 치료 분자는 IL-12인, 상기 제2 핵산 서열을 더 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  45. 제44항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 58 또는 59와 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  46. 제41항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은,
    ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열로서, 상기 치료 분자는 IL-15인, 상기 제2 핵산 서열을 더 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  47. 제46항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 56 또는 57과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  48. 제41항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은,
    ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열로서, 상기 치료 분자는 CXCL10인, 상기 제2 핵산 서열을 더 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  49. 제48항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 60 또는 61과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  50. 제41항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은,
    ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열로서, 상기 치료 분자는 MMP9인, 상기 제2 핵산 서열을 더 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  51. 제50항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 65 또는 66과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  52. 제41항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은,
    ii) 치료 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열로서, 상기 치료 분자는 IgG1 Fc 도메인에 연결된 항-PDL1 scFv인, 상기 제2 핵산 서열을 더 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  53. 제52항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 68 또는 70과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  54. 제52항에 있어서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 67 또는 69를 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위형 종양용해성 바이러스는 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스 1(HSV1), 점액종 바이러스, 레오바이러스, 폴리오바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 홍역 바이러스(MV), 라사 바이러스(LASV) 또는 뉴캐슬병 바이러스(NDV)로부터 선택되는, 위형 종양용해성 바이러스.
  56. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위형 종양용해성 바이러스는 참조 바이러스와 비교할 때 인간 대상체에서 감소된 향신경성 활성도 및/또는 신경독성 활성도를 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  57. 제56항에 있어서, 상기 참조 바이러스는 i) 비-위형 종양용해성 바이러스 또는 ii) 백시니아 바이러스인, 위형 종양용해성 바이러스.
  58. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위형 종양용해성 바이러스는 약화된 종양용해성 바이러스인, 위형 종양용해성 바이러스.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 재조합 핵산을 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  60. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 재조합 핵산을 포함하는, 위형 종양용해성 바이러스.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양용해성 바이러스는 표적 세포를 선택적으로 감염시키는, 위형 종양용해성 바이러스.
  62. 제61항에 있어서, 상기 표적 세포는 종양 세포이고, 그리고 상기 종양용해성 바이러스는 상기 종양 세포 내에서 선택적으로 복제될 수 있는, 위형 종양용해성 바이러스.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 백시니아 바이러스가 아닌, 위형 종양용해성 바이러스.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인게이저 폴리펩타이드는 이분(bipartite) 폴리펩타이드이고, 항체, 항체 도메인, 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인, 이중-가변-도메인 항체(DVD-Ig), Tandab, 다이아바디(diabody), 플렉시바디(flexibody), 독-앤-락(dock-and-lock) 항체, 스콜피온(Scorpion) 폴리펩타이드, 단일 쇄 가변 단편(scFv), BiTE, 듀오바디(DuoBody), Fc-조작된 IgG, Fcab, Mab2 또는 DART 폴리펩타이드로 구성된, 위형 종양용해성 바이러스.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 위형 종양용해성 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 상기 위형 종양용해성 바이러스는 면역 반응을 유도하는, 약제학적 조성물.
  67. 제66항에 있어서, 면역 반응은 표적 세포에 대해서 선택적으로 세포독성인, 약제학적 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 상기 표적 세포는 고형 종양 세포 또는 혈액암 세포인, 약제학적 조성물.
  69. 제68항에 있어서, 상기 표적 세포는 1종 이상의 종양 항원을 발현하는, 약제학적 조성물.
  70. 제69항에 있어서, 상기 1종 이상의 종양 항원은 표 2로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  71. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 종양용해성 바이러스 또는 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  72. 제71항에 있어서, 암의 치료를 필요로 하는 상기 대상체에게 1종 이상의 추가적인 요법을 더 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 1종 이상의 추가적인 요법은 수술, 방사선, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법 또는 이들의 조합물을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  74. 1종 이상의 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에서 1종 이상의 종양을 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 종양용해성 바이러스 또는 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 1종 이상의 종양은 종양 항원을 발현하는, 종양을 치료하는 방법.
  75. 하기 단계들을 포함하는, 치료를 위한 환자를 선택하는 방법:
    a) 상기 환자로부터 유래된 1종 이상의 종양 세포 상에서 종양 항원의 발현을 결정하는 단계; 및
    b) 상기 환자로부터 수득된 상기 종양 세포가 상기 1종 이상의 종양 항원을 발현하는 경우 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 종양용해성 바이러스 또는 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 상기 1종 이상의 종양 항원은 표 2로부터 선택되는, 치료를 위한 환자를 선택하는 방법.
  77. 인게이저 폴리펩타이드 및 치료적 폴리펩타이드를 종양 부위에 전달하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 종양용해성 바이러스 또는 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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