JP2022516318A - カプセル化ポリヌクレオチド及び使用方法 - Google Patents

カプセル化ポリヌクレオチド及び使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、腫瘍溶解性ウイルスをコードする組換えＲＮＡ分子に関する。本開示はさらに、組換えＲＮＡ分子のカプセル化、ならびにがんの治療及び予防のための組換えＲＮＡ分子及び／または粒子の使用に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１月４日に出願された米国仮出願第６２／７８８，５０４号、及び２０１９年９月３日に出願された米国仮出願第６２／８９５，１３５号の優先権を主張し、それらの内容はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの説明の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列表のコンピュータ可読フォーマットのコピー（ファイル名：ＯＮＣＲ－０１５＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録された日付：２０２０年１月２日、ファイルサイズ：２６５キロバイト）。
本開示は概して、免疫学、炎症、及びがん治療の分野に関する。より具体的には、本開示は、粒子をカプセル化したウイルスゲノムに関する。本開示はさらに、がんなどの増殖性障害の治療及び予防に関する。
腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に感染して溶解することができる溶解性ライフサイクルを備えた複製可能なウイルスである。直接的な腫瘍細胞溶解は、細胞死をもたらすだけでなく、局所的な抗原提示細胞によって取り込まれ提示される腫瘍抗原に指向する適応免疫応答の生成ももたらす。したがって、腫瘍溶解性ウイルスは、直接的な細胞溶解、及びウイルスクリアランス後の抗腫瘍応答を維持できる抗原特異的適応応答の促進の両方を通じて、腫瘍細胞成長に対抗する。
しかしながら、複製可能なウイルスの臨床使用は、いくつかの課題を提示する。一般に、ウイルス曝露は自然免疫経路を活性化し、幅広い非特異的な炎症応答を引き起こす。患者が以前にウイルスに曝露されていない場合、この最初の自然免疫応答は、適応性抗ウイルス応答の発生及び中和抗体の産生につながり得る。患者が以前にウイルスに曝露されている場合、既存の中和抗ウイルス抗体が、所望される溶解効果を妨げ得る。どちらの場合も、中和抗体の存在は、標的細胞のウイルス溶解を妨げるだけでなく、ウイルス治療の再投与を無効にする。これらの要因は、転移性がんの治療におけるウイルス治療の使用を制限し、かかるがんの治療に必要な繰り返し全身投与の有効性が、自然に発生する抗ウイルス応答によって妨げられるためである。かかる障害の非存在下でさえ、非疾患性細胞におけるその後のウイルス複製は、周囲の細胞及び組織への実質的な疾患外の付随的損傷をもたらし得る。
複製可能なウイルスの治療的使用に関連する組成物及び方法について、当技術分野において長い間感じられてきた満たされていない必要性が残存する。本開示は、かかる組成物及び方法などを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、腫瘍溶解性ウイルスをコードする合成ＲＮＡウイルスゲノムを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスが、ポジティブセンス（（＋）－センス）ｓｓＲＮＡウイルスである。いくつかの実施形態では、（＋）－センスｓｓＲＮＡウイルスが、表１に列挙されるものから選択される。いくつかの実施形態では、（＋）－センスｓｓＲＮＡウイルスが、ピコルナウイルスである。いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスが、Ｓｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルス（ＳＶＶ）またはＣｏｘｓａｃｋｉｅウイルスである。いくつかの実施形態では、ＳＶＶが、野生型ＳＶＶ－Ａ（配列番号１）、Ｓ１７７Ａ－ＳＶＶＡ変異体（配列番号２）、ＳＶＶ－ＩＲ２変異体（配列番号３）、及びＳＶＶ－ＩＲ２－Ｓ１７７Ａ変異体（配列番号４）から選択されるＳＶＶ－Ａである。いくつかの実施形態では、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルスが、ＣＶＢ３、ＣＶＡ２１、及びＣＶＡ９から選択される。いくつかの実施形態では、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルスが、配列番号２７を含む修飾ＣＶＡ２１ウイルスである。
いくつかの実施形態では、細胞へのＬＮＰの送達が、細胞によるウイルス粒子の産生をもたらし、ウイルス粒子が、感染性及び溶解性である。いくつかの実施形態では、コードされた腫瘍溶解性ウイルスが、対象へのＬＮＰ投与部位から遠隔である腫瘍のサイズを減少させることができる。
いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡウイルスゲノムが、外因性ペイロードタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、外因性ペイロードタンパク質をコードする組換えＲＮＡ分子をさらに含む。いくつかの実施形態では、外因性ペイロードタンパク質が、蛍光タンパク質、酵素タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体と結合することができる抗原結合分子、または細胞表面受容体のリガンドである。いくつかの実施形態では、サイトカインが、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、及びＩＬ－３６γから選択される。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体のリガンドが、Ｆｌｔ３リガンドまたはＴＮＦＳＦ１４である。いくつかの実施形態では、ケモカインが、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２１、及びＣＣＬ５から選択される。いくつかの実施形態では、抗原結合分子が、免疫チェックポイント受容体と結合して阻害することができる。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント受容体が、ＰＤ－１である。いくつかの実施形態では、抗原結合分子が、腫瘍抗原と結合することができる。いくつかの実施形態では、抗原結合分子が、二重特異性Ｔ細胞会合分子（ＢｉＴＥ）または二重特異性軽Ｔ細胞会合分子（ＬｉＴＥ）である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原が、ＤＬＬ３またはＥｐＣＡＭである。
いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡウイルスゲノム及び／または組換えＲＮＡ分子が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）カセットを含み、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２１９、ｍｉＲ－２１９ａ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－１３７、及びｍｉＲ－１２６から選択される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、カチオン性脂質、１つ以上のヘルパー脂質、及びリン脂質－ポリマー複合体を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質が、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＬＣ（旧名称：ＳＳ－１８／４ＰＥ－１３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ（旧名称：ＳＳ－３３／４ＰＥ－１５）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＰ、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ－３１９）、またはＮ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）から選択される。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びコレステロールから選択される。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、中性脂質は、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。
いくつかの実施形態では、リン脂質－ポリマー複合体が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＰＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、及び１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）から選択される。いくつかの実施形態では、リン脂質－ポリマー複合体が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－５０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、及び１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）から選択される。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質が、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣを含み、１つ以上のヘルパー脂質が、コレステロール（Ｃｈｏｌ）及びＤＳＰＣを含み、リン脂質－ポリマー複合体が、ＤＰＧ－ＰＥＧ２０００を含む。いくつかの実施形態では、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～２５％、Ｃ＝２０％～３０％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝２０％～２５％、Ｃ＝２５％～３０％、及びＤ＝０％～１％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約４９：２２：２８．５：０．５である。
いくつかの実施形態では、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２０％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２５％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５５％、Ｂ＝１０％～２０％、Ｃ＝３０％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝１０％～１５％、Ｃ＝３５％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、４９：１１：３８．５：１．５である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～６５％、Ｂ＝５％～２０％、Ｃ＝２０％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝５０％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１０％、Ｃ＝３０％～３５％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、５８：７：３３．５：１．５である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、表５から選択される脂質製剤を含む。
いくつかの実施形態では、ヒアルロナンが、ＬＮＰの表面と複合される。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の複数の脂質ナノ粒子を含む、治療用組成物を提供する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４００ｎｍ～約５００ｎｍ、約４２５ｎｍ～約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ～約５００ｎｍ、または約４７５ｎｍ～約５００ｎｍの平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約１２０ｎｍの平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、または約１２０ｎｍの平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約１００ｎｍの平均サイズを有する。
いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約４０ｍＶ～約－４０ｍＶ、約２０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約１０ｍＶ～約－１０ｍＶ、約５ｍＶ～約－５ｍＶ、または約２０ｍＶ～約－４０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約－２０ｍＶ未満、約－３０ｍＶ未満、約３５ｍＶ未満、または約－４０ｍＶ未満の平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約－５０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約－４０ｍＶ～約－２０ｍＶ、または約－３０ｍＶ～約－２０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約－３０ｍＶ、約－３１ｍＶ、約－３２ｍＶ、約－３３ｍＶ、約－３４ｍＶ、約－３５ｍＶ、約－３６ｍＶ、約－３７ｍＶ、約－３８ｍＶ、約－３９ｍＶ、または約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。
いくつかの実施形態では、治療用組成物を対象に投与すると、組換ＲＮＡポリヌクレオチドが対象の標的細胞に送達され、組換えＲＮＡポリヌクレオチドが、対象の標的細胞を溶解することができる感染性腫瘍溶解性ウイルスを産生する。いくつかの実施形態では、標的細胞が、がん性細胞である。
いくつかの実施形態では、組成物が、静脈内または腫瘍内送達のために製剤化される。
いくつかの実施形態では、本開示は、がん性腫瘍の成長を阻害することを必要とする対象において、がん性腫瘍の成長を阻害する方法であって、がん性腫瘍の成長を阻害することを必要とする対象に、本明細書に記載の治療用組成物を投与することを含み、組成物の投与が、腫瘍の成長を阻害する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、投与が、腫瘍内または静脈内である。いくつかの実施形態では、がんが、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、膀胱癌、またはメラノーマである。
いくつかの実施形態では、本開示は、腫瘍溶解性ウイルスをコードする合成ＲＮＡウイルスゲノムを含む組換えＲＮＡ分子を提供する。いくつかの実施形態では、コードされた腫瘍溶解性ウイルスが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである。いくつかの実施形態では、ｓｓＲＮＡウイルスが、ポジティブセンス（（＋）－センス）またはネガティブセンス（（－）－センス）ｓｓＲＮＡウイルスである。いくつかの実施形態では、（＋）－センスｓｓＲＮＡウイルスが、ピコルナウイルスである。いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスが、Ｓｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルス（ＳＶＶ）またはＣｏｘｓａｃｋｉｅウイルスである。いくつかの実施形態では、ＳＶＶが、野生型ＳＶＶ－Ａ（配列番号１）、Ｓ１７７Ａ－ＳＶＶＡ変異体（配列番号２）、ＳＶＶ－ＩＲ２変異体（配列番号３）、またはＳＶＶ－ＩＲ２－Ｓ１７７Ａ変異体（配列番号４）から選択されるＳＶＶ－Ａである。いくつかの実施形態では、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルスが、ＣＶＢ３、ＣＶＡ２１、及びＣＶＡ９から選択される。いくつかの実施形態では、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルスが、配列番号２７を含む修飾ＣＶＡ２１ウイルスである。
いくつかの実施形態では、組換えＲＮＡ分子が、腫瘍溶解性ウイルスをコードするポリヌクレオチド配列に挿入されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）カセットをさらに含み、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、細胞内の対応するｍｉＲＮＡのうちの１つ以上の発現が、細胞内のコードされたウイルスの複製を阻害する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２１９、ｍｉＲ－２１９ａ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－１３７、及びｍｉＲ－１２６から選択される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上の非必須遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の５’または３’に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、組換えＲＮＡ分子が、非ウイルス送達ビヒクルによって細胞に導入されると、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスを産生することができる。いくつかの実施形態では、細胞が、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞が、哺乳動物対象に存在する哺乳動物細胞である。
いくつかの実施形態では、複製可能なウイルスが、ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルス、ポリオウイルス、Ｓｅｎｅｃａ ｖａｌｌｅｙウイルス、ｌａｓｓａウイルス、マウス白血病ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、ｓｉｎｄｂｉｓウイルス、及びｍａｒａｂａウイルスからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、複製可能なウイルスが、表１に列挙されるものから選択される。
いくつかの実施形態では、組換えＲＮＡ分子が、核酸ベクターに挿入される。いくつかの実施形態では、核酸ベクターが、レプリコンである。
いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡウイルスゲノムが、外因性ペイロードタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、外因性ペイロードタンパク質が、蛍光タンパク質、酵素タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体と結合することができる抗原結合分子、または細胞表面受容体と結合することができるリガンドである。いくつかの実施形態では、サイトカインが、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、及びＩＬ－３６γから選択される。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体のリガンドが、Ｆｌｔ３リガンドまたはＴＮＦＳＦ１４である。いくつかの実施形態では、ケモカインが、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２１、及びＣＣＬ５から選択される。いくつかの実施形態では、抗原結合分子が、免疫チェックポイント受容体と結合して阻害することができる。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント受容体が、ＰＤ－１である。いくつかの実施形態では、抗原結合分子が、腫瘍抗原と結合することができる。いくつかの実施形態では、抗原結合分子が、二重特異性Ｔ細胞会合分子（ＢｉＴＥ）または二重特異性軽Ｔ細胞会合分子（ＬｉＴＥ）である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原が、ＤＬＬ３またはＥｐＣＡＭである。
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えＤＮＡ分子であって、５’から３’の、プロモーター配列、５’接合部切断配列、本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列、及び３’接合部切断配列を含む、組換えＤＮＡ分子を提供する。いくつかの実施形態では、プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列である。
いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列が、リボザイム配列であり、３’接合部切断配列が、リボザイム配列である。いくつかの実施形態では、５’リボザイム配列が、ハンマーヘッド型リボザイム配列であり、３’リボザイム配列が、デルタ肝炎ウイルスリボザイム配列である。いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列が、リボザイム配列であり、３’接合部切断配列が、制限酵素認識配列である。いくつかの実施形態では、５’リボザイム配列が、ハンマーヘッド型リボザイム配列、ピストル型リボザイム配列、または修飾ピストル型リボザイム配列である。いくつかの実施形態では、３’制限酵素認識配列が、ＩＩＳ型制限酵素認識配列である。いくつかの実施形態では、ＩＩＳ型認識配列が、ＳａｐＩ認識配列である。いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列が、ＲＮＡｓｅＨプライマー結合配列であり、３’接合部切断配列が、制限酵素認識配列である。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子を産生する方法であって、本明細書に記載のＤＮＡ分子のインビトロ転写と、得られる組換えＲＮＡ分子の精製と、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、組換えＲＮＡ分子は、合成ＲＮＡウイルスゲノムによってコードされる腫瘍溶解性ウイルスに対して天然である５’及び３’末端を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、哺乳動物対象への投与に好適な、有効量の本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子と、担体と、を含む、組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子を含む粒子を提供する。いくつかの実施形態では、粒子は、生分解性である。いくつかの実施形態では、粒子は、ナノ粒子、エクソソーム、リポソーム、及びリポプレックスからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、エクソソームは、無傷エクソソームまたは空のエクソソームに由来する修飾エクソソームである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、カチオン性脂質、１つ以上のヘルパー脂質、及びリン脂質－ポリマー複合体を含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質が、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＬＣ（旧名称：ＳＳ－１８／４ＰＥ－１３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ（旧名称：ＳＳ－３３／４ＰＥ－１５）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＰ、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ－３１９）、またはＮ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）から選択される。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びコレステロールから選択される。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、中性脂質が、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。
いくつかの実施形態では、リン脂質－ポリマー複合体が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＰＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、及び１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）から選択される。
いくつかの実施形態では、リン脂質－ポリマー複合体が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－５０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、及び１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）から選択される。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質が、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣを含み、１つ以上のヘルパー脂質が、コレステロール（Ｃｈｏｌ）及びＤＳＰＣを含み、リン脂質－ポリマー複合体が、ＤＰＧ－ＰＥＧ２０００を含む。いくつかの実施形態では、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～２５％、Ｃ＝２０％～３０％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝２０％～２５％、Ｃ＝２５％～３０％、及びＤ＝０％～１％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約４９：２２：２８．５：０．５である。
いくつかの実施形態では、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２０％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２５％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５５％、Ｂ＝１０％～２０％、Ｃ＝３０％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝１０％～１５％、Ｃ＝３５％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、４９：１１：３８．５：１．５である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、表５から選択される脂質製剤を含む。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、中性脂質が、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。いくつかの実施形態では、粒子が、リン脂質－ポリマー複合体をさらに含み、リン脂質－ポリマー複合体が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）である。
いくつかの実施形態では、ヒアルロナンが、ＬＮＰの表面と複合される。
いくつかの実施形態では、粒子が、ペイロード分子をコードする第２の組換えＲＮＡ分子をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の組換えＲＮＡ分子が、レプリコンである。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の複数の脂質ナノ粒子を含む、治療用組成物を提供する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４００ｎｍ～約５００ｎｍ、約４２５ｎｍ～約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ～約５００ｎｍ、または約４７５ｎｍ～約５００ｎｍの平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約１２０ｎｍの平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、または約１２０ｎｍの平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約１００ｎｍの平均サイズを有する。
いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約２０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約１０ｍＶ～約－１０ｍＶ、約５ｍＶ～約－５ｍＶ、または約２０ｍＶ～約－４０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約－２０ｍＶ未満、約－３０ｍＶ未満、約３５ｍＶ未満、または約－４０ｍＶ未満の平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約－５０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約－４０ｍＶ～約－２０ｍＶ、または約－３０ｍＶ～約－２０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約－３０ｍＶ、約－３１ｍＶ、約－３２ｍＶ、約－３３ｍＶ、約－３４ｍＶ、約－３５ｍＶ、約－３６ｍＶ、約－３７ｍＶ、約－３８ｍＶ、約－３９ｍＶ、または約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。
いくつかの実施形態では、対象への組成物の送達が、カプセル化組換えＲＮＡ分子を標的細胞に送達し、カプセル化組換えＲＮＡ分子が、標的細胞を溶解することができる感染性ウイルスを産生する。いくつかの実施形態では、組成物が、静脈内または腫瘍内送達のために製剤化される。いくつかの実施形態では、標的細胞が、がん性細胞である。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドを含む無機粒子を提供する。いくつかの実施形態では、無機粒子が、金ナノ粒子（ＧＮＰ）、金ナノロッド（ＧＮＲ）、磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）、磁気ナノチューブ（ＭＮＴ）、カーボンナノホーン（ＣＮＨ）、カーボンフラーレン、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ＣＰＮＰ）、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）、シリカナノチューブ（ＳＮＴ）、または星状中空シリカナノ粒子（ＳＨＮＰ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、無機粒子が、ペイロード分子をコードする第２の組換えＲＮＡ分子をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の組換えＲＮＡ分子が、レプリコンである。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の無機粒子を含む組成物であって、粒子の平均直径が、約５００ｎｍ未満である、約５０ｎｍ～５００ｎｍである、約２５０ｎｍ～約５００ｎｍであるか、または約３５０ｎｍである、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の無機粒子を含む組成物であって、粒子の平均直径が、約５０ｎｍ～１２０ｎｍである、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、粒子の平均直径が、約５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、または約１２０ｎｍである。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約１００ｎｍの平均サイズを有する。
いくつかの実施形態では、本開示は、がん性細胞を殺傷する方法であって、がん性細胞を、本明細書に記載の粒子、本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子、またはその組成物に、粒子を該がん性細胞に細胞内送達するのに十分な条件下で曝露することを含み、カプセル化ポリヌクレオチドによって産生される複製可能なウイルスが、がん性細胞の殺傷をもたらす、方法を提供する。いくつかの実施形態では、複製可能なウイルスが、非がん性細胞で産生されない。いくつかの実施形態では、方法が、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで実施される。
いくつかの実施形態では、本開示は、対象においてがんを治療する方法であって、がんに罹患している対象に、有効量の、本明細書に記載の粒子、本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子、またはその組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、粒子またはその組成物が、静脈内、鼻腔内、吸入剤として投与されるか、または腫瘍に直接的に注入される。いくつかの実施形態では、粒子またはその組成物が、対象に繰り返し投与される。いくつかの実施形態では、対象が、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、非ヒト霊長類、またはヒトである。
いくつかの実施形態では、がんが、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、精巣癌、大腸癌、結腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺癌、悪性神経膠腫、膠芽細胞腫、膀胱癌、メラノーマ、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、肉腫、及び辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）から選択される。いくつかの実施形態では、肺癌が、小細胞肺癌または非小細胞肺癌である。いくつかの実施形態では、肝臓癌が、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）である。いくつかの実施形態では、前立腺癌が、治療中に出現する神経内分泌前立腺癌である。いくつかの実施形態では、膀胱癌、膵臓癌、及び胃癌が、神経内分泌サブタイプである。
Ａ及びＢは、ゲノムを含むＲＮＡ分子の産生及びＳＶＶのウイルス溶解を示す。 ＳＶＶ＋ｓｓＲＮＡ／ＬＮＰを用いた処置後の成功したＲＮＡ送達及び機能性ウイルスの産生を示す。 脂質ナノ粒子組成物の変異が、ＲＮＡ捕捉の粒径及び／またはパーセンテージを変化させることを示す。 脂質ナノ粒子組成物の変異が、ＲＮＡ捕捉の粒径及び／またはパーセンテージを変化させることを示す。 脂質ナノ粒子組成物の変異が、ＲＮＡ捕捉の粒径及び／またはパーセンテージを変化させることを示す。 脂質ナノ粒子組成物の変異が、ＲＮＡ捕捉の粒径及び／またはパーセンテージを変化させることを示す。 Ｈ１２９９腫瘍モデルにおけるＳＶＶ＋ｓｓＲＮＡ／ＬＮＰの有効性を示す。ＰＢＳまたはＳＶＶ＋ｓｓＲＮＡ／ＬＮＰ（製剤番号７０００１－５．Ｃ）の静脈内投与後のＨ１２９９腫瘍担持マウスにおける腫瘍体積を示す。 Ｈ１２９９腫瘍モデルにおけるＳＶＶ＋ｓｓＲＮＡ／ＬＮＰの有効性を示す。ＰＢＳまたはＳＶＶ＋ｓｓＲＮＡ／ＬＮＰ（製剤番号７０００１－５．Ｃ）で静脈内処置した後のＨ１２９９腫瘍担持マウスにおける体重測定を示す。 ＳＶＶ＋ｓｓＲＮＡ／ＬＮＰの静脈内投与後の腫瘍からの感染性ＳＶＶの回復を示す。 ＳＶＶ＋ｓｓＲＮＡ／ＬＮＰの静脈内投与後の腫瘍からの感染性ＳＶＶの回復を示す。 Ｈ１２９９腫瘍モデルにおけるＳＶＶ／ＬＮＰ製剤７０００９－１．Ｃ、７０００９－２．Ｃ、及び７０００９－３．Ｃの有効性を示す。ＰＢＳ、ＳＶＶ－Ｎｅｇ／ＬＮＰ（製剤番号７０００９－１．Ｃ）、ＳＶＶ／ＬＮＰ（製剤番号７０００９－２．Ｃ）、またはＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ／ＬＮＰ（製剤番号７０００９－３．Ｃ）の静脈内投与後のＨ１２９９腫瘍担持マウスにおける腫瘍体積を示す。 Ｈ１２９９腫瘍モデルにおけるＳＶＶ／ＬＮＰ製剤７０００９－１．Ｃ、７０００９－２．Ｃ、及び７０００９－３．Ｃの有効性を示す。ＰＢＳ、ＳＶＶ－Ｎｅｇ／ＬＮＰ（製剤番号７０００９－１．Ｃ）、ＳＶＶ／ＬＮＰ（製剤番号７０００９－２．Ｃ）、またはＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ／ＬＮＰ（製剤番号７０００９－３．Ｃ）で静脈内処置した後のＨ１２９９腫瘍担持マウスにおける体重測定を示す。 Ｈ１２９９腫瘍モデルにおけるＳＶＶ／ＬＮＰ製剤７０００９－１．Ｃ、７０００９－２．Ｃ、及び７０００９－３．Ｃの有効性を示す。ＰＢＳ、ＳＶＶ－Ｎｅｇ／ＬＮＰ（製剤番号７０００９－１．Ｃ）、ＳＶＶ／ＬＮＰ（製剤番号７０００９－２．Ｃ）、またはＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ／ＬＮＰ（製剤番号７０００９－３．Ｃ）で処置したＨ１２９９腫瘍担持マウスから単離した腫瘍（図６Ｃ）または肝臓（図６Ｄ）組織におけるＳＶＶ複製を示す。 Ｈ１２９９腫瘍モデルにおけるＳＶＶ／ＬＮＰ製剤７０００９－１．Ｃ、７０００９－２．Ｃ、及び７０００９－３．Ｃの有効性を示す。ＰＢＳ、ＳＶＶ－Ｎｅｇ／ＬＮＰ（製剤番号７０００９－１．Ｃ）、ＳＶＶ／ＬＮＰ（製剤番号７０００９－２．Ｃ）、またはＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ／ＬＮＰ（製剤番号７０００９－３．Ｃ）で処置したＨ１２９９腫瘍担持マウスから単離した腫瘍（図６Ｃ）または肝臓（図６Ｄ）組織におけるＳＶＶ複製を示す。 ＰＢＳまたはＳＶＶ－ＷＴ ＲＮＡ脂質ナノ粒子（製剤番号７００５３－１－１．Ｃ、７００５３－２－２．Ｃ、７００５９－１－３．Ｃ、及び７００５９－２－４．Ｃ）の静脈内投与後のＨ１２９９腫瘍担持マウスにおける腫瘍体積を示す。 ＰＢＳまたはＳＶＶ－ＷＴ（製剤番号７００８７－１．Ｃ）ＲＮＡ脂質ナノ粒子の静脈内投与後、またはリポフェクタミンで製剤化したＳＶＶ－ＷＴの腫瘍内投与後のＨ８２腫瘍担持マウスにおける腫瘍体積を示す。 Ｈ１２９９腫瘍モデルにおけるＳＶＶ／ＬＮＰ製剤７００７７－３．Ｃ、７００７７－４．Ｃ、７００７７－８．Ｃ、７００７７－１０．Ｃ、及び７００７７－１１．Ｃの有効性を示す。ＰＢＳまたはＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ ＲＮＡ脂質ナノ粒子（製剤番号７００７７－３．Ｃ、７００７７－４．Ｃ、７００７７－８．Ｃ、７００７７－１０．Ｃ、及び７００７７－１１．Ｃ）の静脈内投与後のＨ１２９９腫瘍担持マウスにおける腫瘍体積を示す。 Ｈ１２９９腫瘍モデルにおけるＳＶＶ／ＬＮＰ製剤７００７７－３．Ｃ、７００７７－４．Ｃ、７００７７－８．Ｃ、７００７７－１０．Ｃ、及び７００７７－１１．Ｃの有効性を示す。ＰＢＳまたはＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ ＲＮＡ脂質ナノ粒子（製剤番号７００７７－３．Ｃ、７００７７－４．Ｃ、７００７７－８．Ｃ、７００７７－１０．Ｃ、及び７００７７－１１．Ｃ）で静脈内処置したＨ１２９９腫瘍担持マウスの体重測定を示す。 Ｈ１２９９腫瘍モデルにおけるＳＶＶ／ＬＮＰ製剤７００７７－３．Ｃ、７００７７－４．Ｃ、７００７７－８．Ｃ、７００７７－１０．Ｃ、及び７００７７－１１．Ｃの有効性を示す。ＰＢＳまたはＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ ＲＮＡ脂質ナノ粒子（製剤番号７００７７－３．Ｃ、７００７７－４．Ｃ、７００７７－８．Ｃ、７００７７－１０．Ｃ、及び７００７７－１１．Ｃ）で静脈内処置したＨ１２９９腫瘍担持マウスにおける血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）を示す。 Ｈ１２９９腫瘍モデルにおけるＳＶＶ／ＬＮＰ製剤７００７７－３．Ｃ、７００７７－４．Ｃ、７００７７－８．Ｃ、７００７７－１０．Ｃ、及び７００７７－１１．Ｃの有効性を示す。ＰＢＳまたはＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ ＲＮＡ脂質ナノ粒子（製剤番号７００７７－３．Ｃ、７００７７－４．Ｃ、７００７７－８．Ｃ、７００７７－１０．Ｃ、及び７００７７－１１．Ｃ）で静脈内処置したＨ１２９９腫瘍担持マウスから単離した腫瘍組織におけるＳＶＶ複製を示す。 ＰＢＳまたはＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ ＲＮＡ脂質ナノ粒子（製剤番号７００８７－１．Ｃ、７００８７－２．Ｃ、７００８７－３．Ｃ、及び７００８７－４．Ｃ）の静脈内投与後のＨ１２９９腫瘍担持マウスにおける腫瘍体積を示す。 ＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ ＲＮＡ脂質ナノ粒子（製剤番号８００１０－１．Ｃ、８００１０－２．Ｃ、８００１０－３．Ｃ、８００１０－４．Ｃ、及び８００１０－５．Ｃ）で静脈内処置したＨ１２９９腫瘍担持マウスから単離した腫瘍組織におけるＳＶＶ複製を示す。 ＰＢＳまたはＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ ＲＮＡ脂質ナノ粒子（製剤番号８００３３－１．Ｃ、８００３３－２．Ｃ、及び８００３３－３．Ｃ）の静脈内投与後のＨ１２９９腫瘍担持マウスにおける腫瘍体積を示す。 Ｈ４４６腫瘍モデルにおけるＳＶＶ／ＬＮＰ製剤８００５９－１．Ｃ及び８００５９－２．Ｃの有効性を示す。ＰＢＳ、ＳＶＶ－Ｎｅｇ ＬＮＰ（製剤番号８００５９－１．Ｃ）、またはＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ ＬＮＰ（製剤番号８００５９－２．Ｃ）の静脈内投与後のＨ４４６腫瘍担持マウスにおける腫瘍体積を示す。 Ｈ４４６腫瘍モデルにおけるＳＶＶ／ＬＮＰ製剤８００５９－１．Ｃ及び８００５９－２．Ｃの有効性を示す。ＰＢＳ、ＳＶＶ－Ｎｅｇ ＬＮＰ（製剤番号８００５９－１．Ｃ）、またはＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ ＬＮＰ（製剤番号８００５９－２．Ｃ）で静脈内処置したＨ４４６腫瘍担持マウスの体重測定を示す。 Ｈ４４６腫瘍モデルにおけるＳＶＶ／ＬＮＰ製剤８００５９－１．Ｃ及び８００５９－２．Ｃの有効性を示す。ＰＢＳ、ＳＶＶ－Ｎｅｇ ＬＮＰ（製剤番号８００５９－１．Ｃ）、またはＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ ＬＮＰ（製剤番号８００５９－２．Ｃ）で静脈内処置したＨ４４６腫瘍担持マウスから単離した腫瘍組織におけるＳＶＶ複製を示す。 ＰＢＳ、ＳＶＶ－ＷＴ ＬＮＰ（製剤番号８０１３０－１．Ｃ）、またはＳＶＶ－ＩＲ２ ＬＮＰ（製剤番号８０１３０－２．Ｃ）の静脈内投与後のＨ１２９９腫瘍担持マウスにおける腫瘍体積を示す。 ＰＢＳ、ＳＶＶ－ＷＴ ＬＮＰ（製剤番号８０１３０－１．Ｃ）、またはＳＶＶ－ＩＲ２ ＬＮＰ（製剤番号８０１３０－２．Ｃ）で静脈内処置したＮＩＥ－１１５腫瘍担持マウスから単離した腫瘍組織におけるＳＶＶ複製を示す。 Ａ及びＢは、抗ＳＶＶポリクローナル抗体での処置時のＳＶＶ媒介性Ｈ４４６細胞溶解の阻害を示す。 ＰＢＳ、ＳＶＶウイルス、またはＳＶＶ－ＷＴ ＬＮＰ（製剤番号８０１３９－１．Ｃ）の静脈内投与後、及びウサギ血清または抗ＳＶＶポリクローナル抗体の腹腔内投与後のＨ１２９９腫瘍担持マウスにおける腫瘍体積を示す。 ＰＢＳまたはＣＶＡ２１－ＷＴ ＬＮＰ（製剤番号７００３２－６Ｃ）の腫瘍内投与後、またはＣＶＡ２１－ＷＴ ＬＮＰの静脈内投与後のＳＫ－ＭＥＬ－２８腫瘍担持マウスにおける腫瘍体積を示す。 ３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位を使用してピコルナウイルスのために真正の３’末端を生成するためのインビトロ転写アプローチの概略図を示す。 ５’ＤＮＡプライマー及びＲＮａｓｅＨ酵素を使用してピコルナウイルスのために真正の５’末端を生成するためのＲＮａｓｅＨアプローチを示す。 ５’ＲＮａｓｅＨプライマー結合部位及び３’ＳａｐＩ制限部位を有する消化ＲＮＡのプライマー伸長分析を示す。 ピコルナウイルスのために真正の５’末端を生成するためのリボザイムアプローチを示す。 別個の５’末端の生成のためのハンマーヘッド型リボザイムを示す。矢印の５’末端でアニール及び切断する最小ハンマーヘッド型リボザイム（ＨＨＲ）の構造モデルを示す。矢印の５’末端の切断のための安定化ステムＩ（ＳＴＢＬ）を有するリボザイムの構造モデルを示す。 Ａ及びＢは、別個の５’末端の生成のためのピストル型リボザイムを示す野生型ピストル型リボザイム特性の概略図を示す。ｍＦＯＬＤによってモデル化されたＰ３鎖を融合するために添加されたテトラループを有するＰ．Ｐｏｌｙｍｙｘａからのピストル型リボザイムを示す。破線ボックスは、ウイルス配列の文脈においてリボザイムの折り畳みを保持するように変異された領域である。破線ボックスに示される「ＧＵＣ」配列を「ＵＣＡ」に変異させてピストル１を生成し、「ＧＵＣ」配列を「ＴＴＡ」に変異させてピストル２を生成した。 ピストル１リボザイムが、インビトロ転写プロセス中に完全な切断をもたらすことを実証する。 インビトロ転写プロセス中のすべてのリボザイムによるプライマー伸長分析を示す。 マイナス鎖ＲＮＡの検出を示し、ピストル１リボザイムが、５’ハンマーヘッド型リボザイムを使用する構築物と比較して、ＲＮＡ鋳型からのＳＶＶ複製のより速いキックオフをもたらすことを確認する。 ５’ハンマーヘッド型リボザイムで生成された構築物と比較して、５’ピストル１リボザイム及び３’ＳａｐＩ制限部位で生成された合成ＲＮＡ ＳＶＶゲノムの増加したインビボ有効性を示す。ＰＢＳ、ＳＶＶ－ＨＨＲ ＬＮＰ（製剤番号８０１３０－１．Ｃ）、またはＳＶＶ－ＰＲ ＬＮＰ（製剤番号８０１３０－３．Ｃ）の静脈内投与後のＨ１２９９腫瘍担持マウスの腫瘍体積。 Ａ及びＢは、修飾リボヌクレオチドを使用したＳＶＶ ＲＮＡのインビトロ転写（図２９Ａ）及び修飾ヌクレオチドを含むＳＶＶ ＲＮＡゲノムのウイルス複製（図２９Ｂ）を示す。 ＳＶＶ、及びＳＶＶウイルスゲノムからの様々なペイロード分子をコードするＳＶＶのウイルス複製（ＩＣ５０曲線）を示す。 Ｈ１２９９腫瘍モデルにおけるＩＬ－３６γをコードするＳＶＶ－ＲＮＡゲノムの有効性を示す。処置後の腫瘍成長を示す。 Ｈ１２９９腫瘍モデルにおけるＩＬ－３６γをコードするＳＶＶ－ＲＮＡゲノムの有効性を示す。腫瘍組織におけるＩＬ－３６γ発現を示す。 Ａ及びＢは、ＲＮＡポリヌクレオチドからの感染性ＣＶＡ２１ウイルスの産生を示す。ＲＮＡポリヌクレオチドからの感染性ＣＶＡ２１の産生における５’ＵＴＲ配列の効果を示す。配列番号２６の５’ＵＴＲを含むＲＮＡポリヌクレオチドからの感染性ＣＶＡ２１の産生を示す。 ＬＮＰ／ＳＶＶ ＲＮＡ組成物及び作用様式の概略図を示す。ＬＮＰ／ＳＶＶ－ＲＮＡを全身投与し、ＳＶＶ－ＲＮＡゲノムを、ＳＶＶ－ビリオンを複製及び産生する許容性腫瘍細胞に送達する。ＳＶＶ感染は、腫瘍溶解及び抗ウイルス免疫応答を引き起こす隣接腫瘍細胞に広がる。 ＳＶＶ－ＲＮＡ及びＮｅｇ－ＲＮＡのインビトロ転写プロセスを示す。５’及び３’リボザイム（Ｒｉｂ）によるＳＶＶ－ＲＮＡの自己触媒的切断は、複製に必要な別々の５’及び３’末端を有するＳＶＶ－ＲＮＡを生成する。対照的に、Ｎｅｇ－ＲＮＡ構築物は、リボザイム配列を欠き、複製及びビリオン産生ができない。 接合部切断配列を使用して、ウイルスの天然５’及び３’の別々の末端を維持するために、ゲノム転写産物から非ウイルスＲＮＡポリヌクレオチドを除去する一般的な概略図を示す。
当技術分野では、中和抗体の存在下で有効であり、繰り返し全身投与することができ、その複製が疾患性細胞に限定され、したがって正常な非がん性細胞への副次的な損傷を最小限に抑えながら、治療効果を最大化するウイルス療法が必要である。本開示は、これらの障害を克服し、脂質ナノ粒子、高分子ナノ粒子、またはエクソソームなどの非免疫原性粒子にカプセル化することができる複製可能なウイルスゲノムを提供する。いくつかの実施形態では、粒子が、ペイロード分子をコードするポリヌクレオチドをさらにカプセル化する。いくつかの実施形態では、本開示は、複製可能なウイルスゲノム、ならびに増殖性疾患及び障害（例えば、がん）の治療及び予防のための使用方法を提供する。本開示は、広範囲の増殖性障害（例えば、がん）を治療するのに好適な安全で有効な組換えポリヌクレオチドベクターの全身送達を可能にする。
本明細書で使用された項の見出しは、組織的な目的のためのものにすぎず、記載された主題を限定するものとして解釈されるものではない。特許、特許出願、記事、本、及び論文を含むがこれらに限定されない、本明細書で引用されるすべての文書または文書の一部は、その全体があらゆる目的のために参照により明示的に本明細書に組み込まれる。組み込まれた文書または文書の一部の１つ以上が、出願でのその用語の定義と矛盾する用語を定義している場合、本出願に表示される定義が制御される。しかしながら、本明細書で引用された任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、及び特許出願の言及は、それらが有効な先行技術を構成するか、または世界の任意の国における一般的知識の一部を形成するという認識、または示唆の任意の形態ではなく、そのように受け取られるべきではない。
Ａ．定義
本明細書では、任意の濃度範囲、割合範囲、比の範囲、または整数範囲は、別段示されない限り、記述された範囲内の任意の整数の値、及び適切な場合には、その分数（整数の１０分の１及び１００分の１など）を含むものと理解されたい。本明細書で使用される「ａ」及び「ａｎ」という用語は、別段示されない限り、列挙された構成要素の「１つ以上」を指すことを理解されたい。代替手段（例えば、「または」）の使用は、代替手段の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は同義語として使用される。本明細書で使用される場合、「複数」は、１つ以上の構成要素（例えば、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列）を指し得る。本出願では、「または」の使用は、別段示されない限り、「及び／または」を意味する。
本出願で使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は、等価物として使用される。本出願で使用される約／およそを伴うまたは伴わない任意の数字は、、関連技術分野の当業者によって認識される任意の通常の変動を網羅することを意味する。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別途記載のない限りまたは別途内容から明らかでない限り（かかる数が可能な値の１００％を超え得る場合を除く）、述べられた基準値のいずれかの方向（上回るまたは下回る）において、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下に含まれる値の範囲を指す。
「減少する」または「低減する」は、基準値と比較して、少なくとも５％、例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、または１００％の特定の値の減少または低減を指す。特定の値の減少または低減はまた、基準値と比較した値の倍数変化として表すことができ、例えば、基準値と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００倍以上の減少である。
「増加」は、基準値と比較して、少なくとも５％、例えば５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、１００、２００、３００、４００、５００％以上の特定の値の増加を指す。特定の値の増加はまた、基準値と比較した値の倍数変化として表すことができ、例えば、基準値のレベルと比較して、少なくとも１倍、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００倍以上の増加である。
「配列同一性」という用語は、同じであり、同じ相対位置にある２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の塩基またはアミノ酸のパーセンテージを指す。かかるものとして、１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して、特定のパーセンテージの配列同一性を有する。配列比較の場合、通常、１つの配列が基準配列として機能し、試験配列が比較される。「基準配列」という用語は、試験配列が比較される分子を指す。
「相補的」は、天然または非天然に存在する（例えば、上記のように修飾された）塩基（ヌクレオチド）またはその類似体を含む２つの配列間の、塩基スタッキング及び特異的水素結合を介した対形成の能力を指す。例えば、核酸のある位置の塩基が、標的の対応する位置の塩基と水素結合することができる場合、次に塩基は、その位置で互いに相補的であると見なされる。核酸は、普遍的な塩基、または水素結合に正または負の寄与を提供しない不活性な脱塩基スペーサーを含むことができる。塩基対には、標準的なワトソン－クリック塩基対及び非ワトソン－クリック塩基対（例えば、ゆらぎ塩基対とフーグスティーン塩基対）の両方が含まれ得る。相補的塩基対の場合、アデノシン型塩基（Ａ）はチミジン型塩基（Ｔ）またはウラシル型塩基（Ｕ）に相補的であり、シトシン型塩基（Ｃ）はグアノシン型塩基に相補的であることが理解され、３－ニトロピロールまたは５－ニトロインドールなどの普遍的な塩基は、任意のＡ、Ｃ、Ｕ、またはＴとハイブリダイズし、相補的であると見なされる。Ｎｉｃｈｏｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９４；３６９：４９２－４９３、及びＬｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９４；２２：４０３９－４０４３。イノシン（Ｉ）もまた、当技術分野において普遍的な塩基であると見なされており、任意のＡ、Ｃ、Ｕ、またはＴを相補的であると見なされている。Ｗａｔｋｉｎｓ ａｎｄ ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５；３３（１９）：６２５８－６２６７を参照されたい。
「発現カセット」または「発現構築物」は、プロモーターと作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列を指す。「作動可能に連結された」とは、そのように記載された構成要素が、それらが意図された方法で機能することを可能にする関係にある並置を指す。例えば、プロモーターがポリヌクレオチド配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターはポリヌクレオチド配列に作動可能に連結される。
「対象」という用語は、例えば、哺乳動物などの動物を含む。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、霊長類である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、畜牛、ヒツジ、ヤギ、乳牛、ブタなどの畜産動物、またはイヌ及びネコなどの飼い慣らされた動物である。いくつかの実施形態（例えば、特に研究の文脈において）では、対象は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、または近交系ブタなどのブタである。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用される。
「投与」は、本明細書では、薬剤または組成物を対象に導入することを指す。
本明細書で使用される「治療」は、生理学的結果に影響を与えるために、薬剤または組成物を対象に送達することを指す。いくつかの実施形態では、治療は、哺乳動物、例えば、ヒトにおける疾患の治療を指し、（ａ）疾患を阻害すること、すなわち疾患の発症を阻止すること、または疾患の進行を防止すること、（ｂ）疾患を軽減する、すなわち疾患の状態の退行をもたらすこと、（ｃ）疾患を治癒させることを含む。
「有効量」という用語は、特定の生理学的効果をもたらすのに必要な薬剤または組成物の最小量を指す（例えば、特定の生理学的効果を増加、活性化、及び／または増強するのに必要な量）。特定の薬剤の有効量は、質量／体積、細胞数／体積、粒子／体積、（薬剤の質量）／（対象の質量）、細胞数／（対象の質量）、または粒子／（対象の質量）などの薬剤の性質に基づいて、様々な方法で表され得る。特定の薬剤の有効量は、最大有効濃度の半分（ＥＣ５０）として表すこともでき、基準レベル及び最大応答レベルの中間にある特定の生理学的応答の程度をもたらす薬剤の濃度を指す。
細胞の「集団」は、１を超える任意の数の細胞を指すが、好ましくは、少なくとも１×１０３個の細胞、少なくとも１×１０４個の細胞、少なくとも１×１０５個の細胞、少なくとも１×１０６個の細胞、少なくとも１×１０７個の細胞、少なくとも１×１０８個の細胞、少なくとも１×１０９個の細胞、少なくとも１×１０１０個の細胞、またはそれ以上の細胞である。細胞の集団は、インビトロの集団（例えば、培養中の細胞の集団）またはインビボの集団（例えば、特定の組織に存在する細胞の集団）を指し得る。
「エフェクター機能」は、標的細胞または標的抗原に指向する免疫応答の生成、維持、及び／または増強に関連する免疫細胞の機能を指す。
「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」、及び「ｍｉＲ」という用語は、本明細書で互換的に使用され、分解または翻訳抑制のためにそれらの標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を指示することによって遺伝子発現を制御する、約２１～２５ヌクレオチドの長さの小さなノンコーディング内因性ＲＮＡを指す。
本明細書で使用される「組成物」という用語は、対象または細胞に投与または送達することができる、本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子または粒子カプセル化組換えＲＮＡ分子の製剤を指す。
本明細書で利用される「薬学的に許容される」という表現は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症のないヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに好適な、安全な医学的判断の範囲内にあり、妥当な利益／リスク比に見合う、化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指す。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤」には、これらに限定されないが、任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、染料／着色剤、風味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、及び／または乳化剤が含まれ、これは、米国食品医薬品局によって、ヒト及び／または家畜動物での使用が許容されるものとして承認されている。
「複製可能なウイルスゲノム」という用語は、ウイルス複製及び感染性ウイルス粒子の産生に必要なすべてのウイルス遺伝子をコードするウイルスゲノムを指す。
「腫瘍溶解性ウイルス」という用語は、がん細胞に優先的に感染するように修飾されているか、または自然に優先的に感染するウイルスを指す。
「ベクター」という用語は、別の核酸分子を輸送または運搬することができる核酸分子を指すために本明細書で使用される。
分子及び細胞生化学の一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ＆Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）、及びＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９８）などの標準的な教科書内で見つけることができ、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
合成ＲＮＡウイルスゲノム
いくつかの実施形態では、本開示は、腫瘍溶解性ウイルスをコードする組換えＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡゲノム）を提供する。かかる組換えＲＮＡ分子は、本明細書では、「合成ウイルスゲノム」または「合成ＲＮＡウイルスゲノム」と称される。かかる実施形態では、合成ＲＮＡウイルスゲノムは、非ウイルス送達ビヒクルによって細胞に導入されると、感染性の溶解性ウイルスを産生することができ、感染性ウイルスを複製及び産生するために、細胞内に存在する追加の外因性遺伝子またはタンパク質を必要としない。むしろ、宿主細胞内の内因性翻訳メカニズムは、合成ＲＮＡウイルスゲノムからのウイルスタンパク質の発現を媒介する。次いで、発現したウイルスタンパク質は、ウイルス複製を媒介し、かつＲＮＡウイルスゲノムを含む感染性ウイルス粒子（カプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、及び／または膜タンパク質を含み得る）に組み立てる。したがって、本明細書に記載のＲＮＡポリヌクレオチド（すなわち、合成ＲＮＡウイルスゲノム）は、宿主細胞に導入されると、別の宿主細胞に感染することができるウイルスを産生する。（図３３の概略図を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、合成ウイルスゲノムが、組換えリボ核酸（ＲＮＡ）として提供される（すなわち、合成ＲＮＡウイルスゲノム）。いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡウイルスゲノムは、１つ以上の核酸類似体を含む。核酸類似体の例としては、２’－Ｏ－メチル置換ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシ－エチル塩基、２’フルオロ塩基、ロック核酸（ＬＮＡ）、ロック解除核酸（ＵＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、モルホリノ、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡウイルスゲノムが、レプリコン、導入遺伝子をコードするＲＮＡウイルスゲノム、ｍＲＮＡ分子、または環状ＲＮＡ分子（ｃｉｒｃＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡウイルスゲノムが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスゲノムを含む。いくつかの実施形態では、一本鎖ゲノムは、ポジティブセンスまたはネガティブセンスゲノムであり得る。
いくつかの実施形態では、組換えＲＮＡ分子は、環状ＲＮＡ分子（ｃｉｒｃＲＮＡ）である。ＣｉｒｃＲＮＡ分子は、エキソヌクレアーゼ媒介分解に必要な遊離末端を欠き、したがって、ＲＮＡ分子の半減期を延長し、経時的により安定したタンパク質産生を可能にする（例えば、Ｗｅｓｓｅｌｈｏｅｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｒ ＲＮＡ ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．（２０１８）９：２６２９）を参照されたい。ＣｉｒｃＲＮＡ分子から機能性ＲＮＡウイルスを産生するためには、適切な３’及び５’天然末端を有する線状ＲＮＡゲノムを産生することができるように、細胞内に一度環状構築物を「開」にする必要がある。したがって、いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスをコードする組換えＲＮＡ分子は、ｃｉｒｃＲＮＡ分子として提供され、細胞内のｃｉｒｃＲＮＡ分子の線形化を促進する１つ以上の追加のＲＮＡ配列をさらに含む。かかる追加のＲＮＡ配列の例としては、ｓｉＲＮＡ標的部位、ｍｉＲＮＡ標的部位、及びガイドＲＮＡ標的部位が挙げられる。対応するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｇＲＮＡは、ｃｉｒｃＲＮＡ分子と共製剤化することができる。あるいは、ｍｉＲＮＡ標的部位は、ｃｉｒｃＲＮＡ分子の切断及びコードされた腫瘍溶解性ウイルスの初期発現が特定のｍｉＲＮＡを発現する標的細胞に限定されるように、標的細胞における同族ｍｉＲＮＡの発現に基づいて選択することができる。
本明細書に記載の合成ＲＮＡウイルスゲノムは、腫瘍溶解性ウイルスをコードする。当技術分野で既知である腫瘍溶解性ウイルスの例は、これらに限定されないが、ピコルナウイルス（例えば、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルス）、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、オルソミクソウイルス、及びｍａｒａｂａウイルスを含む。いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡウイルスゲノムによってコードされる腫瘍溶解性ウイルスは、ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルス、ポリオウイルス（ＰＶＳ－ＲＩＰＯなどのキメラポリオウイルス、及び他のキメラピコルナウイルス）、もしくはＳｅｎｅｃａ ｖａｌｌｅｙウイルスなどの科Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス、または任意の多数のピコルナウイルスからのキメラ起源の任意のウイルス、ｌａｓｓａウイルスなどのＡｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス、マウス白血病ウイルスなどのＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス、Ａ型インフルエンザウイルスなどのＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス、ニューカッスル病ウイルスもしくは麻疹ウイルスなどのＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス、哺乳動物オルソレオウイルスなどのＲｅｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス、ｓｉｎｄｂｉｓウイルスなどのＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス、または水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）もしくはｍａｒａｂａウイルスなどのＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスである。
ポジティブセンスの一本鎖ＲＮＡウイルス
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ＲＮＡウイルスゲノムは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスゲノムをコードする。いくつかの実施形態では、ｓｓＲＮＡウイルスは、ポジティブセンスのｓｓＲＮＡ（＋センスｓｓＲＮＡ）ウイルスである。例示的な＋センスｓｓＲＮＡウイルスには、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルス、ポリオウイルス、及びＳｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルス（ＳＶＶ）、ＳＶＶ－Ａを含む）、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＮＬ６３などのアルファコロナウイルス、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－ＯＣ３、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶなどのベータコロナウイルス）、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、マウス白血病ウイルス）、及びＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス）のメンバーが含まれる。ポジティブセンスのｓｓＲＮＡウイルスの追加の例示的な属及び種を以下の表１に示す。
Figure 2022516318000002
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子は、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルス、ポリウイルス、及びＳｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルス（ＳＶＶ）から選択されるピコルナウイルスをコードする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子は、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルスをコードする。この実施形態のいくつかの態様では、組換えＲＮＡ分子は、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルスであり、配列番号２６の５’ＵＴＲ配列を含む（例えば、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｃ Ａｒｅ Ｃｌｏｓｅｌｙ Ｒｅｌａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｏｎｃａｐｓｉｄ Ｃｏｄｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，（２００３）７７：１６，ｐ．８９７３－８９８４を参照されたい。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５４６７０２）。かかる実施形態では、配列番号２６の５’ＵＴＲ配列は、以前に記載された他の５’ＵＴＲ配列と比較して、機能性Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルスの産生を予期せず増加させる（例えば、Ｎｅｗｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃ－ｃｌｕｓｔｅｒ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｕｐ Ａ ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓｅｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００３），８４，３０４１－３０５０を参照されたい。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４６５５１５）。この実施形態のいくつかの態様では、組換えＲＮＡ分子は、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルスをコードし、配列番号２７の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ＲＮＡウイルスゲノムは、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルスをコードする。いくつかの実施形態では、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルスが、ＣＶＢ３、ＣＶＡ２１、及びＣＶＡ９から選択される。例示的なＣｏｘｓａｃｋｉｅウイルスの核酸配列を、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号Ｍ３３８５４．１（ＣＶＢ３）、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＫＴ１６１２６６．１（ＣＶＡ２１）、及びＧｅｎＢａｎｋ参照番号Ｄ００６２７．１（ＣＶＡ９）に提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ＲＮＡウイルスゲノムは、配列番号２７を含む修飾ＣＶＡ２１ウイルスをコードする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ＲＮＡウイルスゲノムは、Ｓｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルス（ＳＶＶ）をコードする。いくつかの実施形態では、ＳＶＶが、野生型ＳＶＶ（ＳＶＶ－Ａ、配列番号１、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＭＦ８９３２００．１など）または変異型ＳＶＶ（ＳＶＶ－１７７Ａ－配列番号２、ＳＶＶ－ＩＲ２－配列番号３、またはＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ－ＩＲ２－配列番号４など）から選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ＲＮＡウイルスゲノムは、キメラピコルナウイルスをコードする（例えば、第１のピコルナウイルスに由来するカプシドタンパク質またはＩＲＥＳなどの１つの部分、及び第１のピコルナウイルスに由来する別の部分、ならびに第２のピコルナウイルスに由来するプロテアーゼまたはポリメラーゼなどの非構造的遺伝子である別の部分を含むウイルスをコードする）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ＲＮＡウイルスゲノムは、キメラＳＶＶをコードする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ＲＮＡウイルスゲノムは、キメラＣｏｘｓａｃｋｉｅウイルスをコードする。
いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡウイルスゲノムが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）カセットを含み、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、細胞内の対応するｍｉＲＮＡのうちの１つ以上の発現が、細胞内のコードされた腫瘍溶解性ウイルスの複製を阻害する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２１９、ｍｉＲ－２１９ａ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－１３７、及びｍｉＲ－１２６から選択される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む。
いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡウイルスゲノムが、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに組み込まれる１つ以上のｍｉＲ－ＴＳカセットを含む。いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡウイルスゲノムが、１つ以上の非必須遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに組み込まれる１つ以上のｍｉＲ－ＴＳカセットを含む。いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡウイルスゲノムが、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の５’または３’に組み込まれる１つ以上のｍｉＲ－ＴＳカセットを含む。
いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡウイルスゲノムが、ペイロード分子をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。かかる実施形態では、合成ＲＮＡウイルスゲノムは、感染性腫瘍溶解性ウイルスの産生、ならびにペイロード分子の発現を駆動する。かかる実施形態では、ペイロード分子の発現は、腫瘍溶解性ウイルスの治療有効性を増加させることができる。いくつかの実施形態では、ペイロード分子は、ＩＬ－１２（例えば、配列番号８などのＩＬ－１２をコードするＳＶＶゲノム）、ＧＭ－ＣＳＦ（例えば、配列番号７などのＧＭＣＳＦをコードするＳＶＶゲノム）、ＣＸＣＬ１０（例えば、配列番号１０などのＣＸＣＬ１０をコードするＳＶＶゲノム）、ＩＬ－３６γ（例えば、配列番号１１などのＩＬ－３６γをコードするＳＶＶゲノム）、ＣＣＬ２１（例えば、ＣＣＬ２１をコードするＳＶＶゲノム）、ＩＬ－１８（例えば、ＩＬ－１８をコードするＳＶＶゲノム）、ＩＬ－２（例えば、ＩＬ－２をコードするＳＶＶゲノム）、ＣＣＬ４（例えば、ＣＣＬ４をコードするＳＶＶゲノム）、ＣＣＬ５（例えば、ＣＣＬ５をコードするＳＶＶゲノム）、抗ＣＤ３－抗ＢｉＴＥ（例えば、配列番号９などの抗ＣＤ３－抗ＦＡＰ ＢｉＴＥをコードするＳＶＶゲノム）、ＤＬＬ３に結合する抗原結合分子、またはＥｐＣＡＭに結合する抗原結合分子から選択される。実施例２３及び２４を参照されたい。これらの実施形態での使用に好適なペイロード分子の種類のさらなる説明を以下に提供する。
組換えＲＮＡウイルスゲノムを産生する方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ＲＮＡウイルスゲノムは、合成ＲＮＡウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクター鋳型を使用してインビトロで産生される。「ベクター」という用語は、別の核酸分子を輸送、コード、または運搬することができる核酸分子を指すために本明細書で使用される。輸送される核酸は、通常、ベクター核酸分子に挿入される。ベクターは、細胞内で自律複製を誘導する配列を含み得、及び／または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子は、１つ以上のウイルスベクターを使用して産生される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ＲＮＡウイルスゲノムは、好適な宿主細胞に対してインビトロで（例えば、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーションなどによる）、組換えＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを導入することによって産生される。好適な宿主細胞には、昆虫及び哺乳動物細胞株が含まれる。宿主細胞を適切な時間で培養すると、ポリヌクレオチドの発現及び合成ＲＮＡウイルスゲノムの産生が可能となる。次いで、合成ＲＮＡウイルスゲノムは、宿主細胞から単離され、治療的使用のために製剤化される（例えば、粒子にカプセル化される）。３’及び５’リボザイムを有するＲＮＡウイルスゲノムのインビトロ合成の概略図を図３４に示す。同じ概略図は、接合部切断配列の他の組み合わせを使用したＲＮＡウイルスゲノムの合成に適用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ＲＮＡウイルスゲノムを含む組換えＲＮＡ分子は、ウイルスに対して天然である別々の５’及び３’末端を必要とする。インビトロでＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによってまたは哺乳動物の５’及び３’ＵＴＲを含む哺乳動物のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩによって産生されるＲＮＡ転写産物は、感染性ＲＮＡウイルスの産生に必要な別々の天然末端を含まない。例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、転写を開始するために、鋳型ポリヌクレオチドの５’末端にグアノシン残基を必要とする。しかしながら、ＳＶＶは、その５’末端にウリジン残基で始まる。したがって、ＳＶＶ転写産物のインビトロ転写に必要なＴ７リーダー配列は、機能性感染性ＳＶＶの産生に必要な天然５’ＳＶＶ末端を生成するために除去されなければならない。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ＲＮＡウイルスゲノムの産生の使用に好適なポリヌクレオチドは、ウイルスに対して天然である別々の５’及び３’末端の生成を可能にする追加の非ウイルス５’及び３’配列を必要とする。かかる配列は、本明細書では接合部切断配列（ＪＣＳ）と称される。したがって、いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、ウイルスの内因性５’及び３’の別々の末端を維持するために、非ウイルスＲＮＡポリヌクレオチドが転写産物から除去されるように、ウイルスＲＮＡ及び哺乳動物ｍＲＮＡ配列の接合部でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはＰｏｌ ＩＩにコードされたＲＮＡ転写産物を切断するように作用する（図３５に示される概略図を参照されたい）。いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、合成ウイルスゲノムをコードするＤＮＡプラスミドの線形化中に適切な末端を生成するように作用する（例えば、３’制限酵素認識配列を使用して、プラスミド鋳型の線形化時に、及び合成ＲＮＡゲノムのインビトロ転写の前に、適切な３’末端を産生する）。
接合部切断配列の性質及びウイルスゲノム転写物からの非ウイルスＲＮＡの除去は、様々な方法によって達成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子の標的である。本明細書で使用される「ＲＮＡ干渉分子」は、内因性遺伝子サイレンシング経路（例えば、ダイサー及びＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ））を介して標的ｍＲＮＡ配列の分解を媒介するＲＮＡポリヌクレオチドを指す。例示的なＲＮＡ干渉剤には、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が含まれる。さらに、現在当技術分野で既知である、または将来定義される特定の部位でＲＮＡ転写物を切断するための任意の系を使用して、ウイルスに対して天然である別々の末端を生成することができる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、ｍｉＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列と少なくとも部分的に相補的である、約１８～２５ヌクレオチドの長さの天然に存在する小さなノンコーディングＲＮＡ分子を指す。動物では、ｍｉＲＮＡの遺伝子は、二本鎖であり、ステムループ構造を形成する、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）に転写される。次に、Ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、クラス２ ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ドローシャ及びマイクロプロセッササブユニット、ＤＣＧＲ８を含むマイクロプロセッサ複合体によって核内で切断され、７０～１００ヌクレオチドの前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）を形成する。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡはヘアピン構造を形成し、細胞質に輸送され、そこでＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素、ダイサーによってプロセシングされて約１８～２５ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ二本鎖となる。二本鎖のどちらの鎖も機能的なｍｉＲＮＡとして機能し得るが、通常、ｍｉＲＮＡの１つの鎖が分解され、１つの鎖のみがアルゴノート（ＡＧＯ）ヌクレアーゼに負荷されて、ｍｉＲＮＡ及びそのｍＲＮＡ標的が相互作用するエフェクターＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）が産生される（Ｗａｈｉｄ ｅｔ ａｌ．，１８０３：１１，２０１０，１２３１－１２４３）。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’接合部切断配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列である。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、Ｐｏｌ ＩＩ転写物に埋め込まれた合成ｍｉＲＮＡに由来する人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）である。（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２００８）３６：９；２８１１－２８３４、Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ（２００２），９；１３２７－１３３３、Ｆｅｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１３）５；１７０４－１７１３を参照されたい）。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’接合部切断配列は、ａｍｉＲＮＡ標的配列である。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、ｓｉＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、通常、約２１～２３ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ分子を指す。二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称される多タンパク質複合体と会合することにより細胞質でプロセシングされ、その間に「パッセンジャー」センス鎖が二本鎖から酵素的に切断される。次に、活性化ＲＩＳＣに含まれるアンチセンス「ガイド」鎖が、配列相補性によってＲＩＳＣを対応するｍＲＮＡに誘導し、ＡＧＯヌクレアーゼが、標的ｍＲＮＡを切断して、特定の遺伝子サイレンシングを引き起こす。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、ｓｈＲＮＡ分子に由来する。ｓｈＲＮＡは、ステムループ構造を形成する約５０～７０ヌクレオチドの長さの一本鎖人工ＲＮＡ分子である。細胞内でのｓｈＲＮＡの発現は、プラスミドまたはウイルスベクターによってｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを導入することによって達成される。次いで、ｓｈＲＮＡを、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのステムループ構造を模倣する生成物に転写し、核を搬出した後、ヘアピンは、ダイサーによってプロセシングされて二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を形成し、次いでＲＩＳＣによってプロセシングされて標的遺伝子のサイレンシングをさらに仲介する。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’接合部切断配列は、ｓｉＲＮＡ標的配列である。
いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列である。かかる実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮａｓｅ活性を有するＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ１３）を使用して設計及び導入され、正確な接合部位でのウイルスゲノム転写産物の切断を仲介することができる。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’接合部切断配列は、ｇＲＮＡ標的配列である。
いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡをコードする配列である。ウイルスゲノム（例えば、組換えＲＮＡ分子）をコードするポリヌクレオチドが転写されると、これらの配列は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡステムループ構造を形成し、これがドローシャによって核内で切断され、正確な接合部位で転写物が切断される。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’接合部切断配列は、ｐｒｉ－ｍＲＮＡ標的配列である。
いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、エンドリボヌクレアーゼＲＮＡｓｅＨによって切断を促進するプリマー結合配列である。かかる実施形態では、５’及び／または３’接合部切断配列にアニールするプライマーが、ＲＮＡｓｅＨ酵素と共にインビトロ反応に添加される。ＲＮＡｓｅＨは、ＤＮＡにハイブリダイズされるＲＮＡのホスホジエステル結合を特異的に加水分解するため、正確な接合部切断配列での合成ＲＮＡゲノム中間体の切断を可能にして、必要な５’及び３’天然末端を産生する。
いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、制限酵素認識部位であり、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたプラスミド鋳型流出ＲＮＡ合成の線形化中に、ウイルス転写物の別々の末端の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、ＩＩＳ型制限酵素認識部位である。ＩＩＳ型制限酵素は、非対称ＤＮＡ配列を認識し、認識配列の外側、通常は１～２０ヌクレオチド以内の規定距離で切断する特定の酵素群を含む。例示的なＩＩＳ型制限酵素としては、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、ＢａｅＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢｉ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｓｔＩ、ＣａｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏｌＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＬ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、及びＳｆａＮＩが挙げられる。これらのＩＩＳ型制限酵素の認識配列は、当技術分野で既知である。ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｔｏｏｌｓ－ａｎｄ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ－ｃｈａｒｔｓ／ｔｙｐｅ－ｉｉｓ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ－ｅｎｚｙｍｅｓにあるＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのウェブサイトを参照されたい。いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、ＳａｐＩ制限酵素認識部位である。
いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、リボザイムをコードする配列であり、合成ＲＮＡゲノム中間体の自己切断を媒介して、最終的な合成ウイルスＲＮＡゲノムに必要とされる天然の別々の５’及び３’末端を産生し、続いて、感染性ＲＮＡウイルスを産生する。例示的なリボザイムには、ハンマーヘッド型リボザイム（例えば、図２３に示されるハンマーヘッドリボザイム）、Ｖａｒｋｕｄサテライト（ＶＳ）リボザイム、ヘアピンリボザイム、ＧＩＲ１分岐リボザイム、ｇｌｍＳリボザイム、ツイスターリボザイム、ツイスターシスターリボザイム、ピストル型リボザイム（例えば、図２４に示されるピストル１及びピストル２）、ハチェットリボザイム、及びデルタ肝炎ウイルスリボザイムが含まれる。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’接合部切断配列は、リボザイムをコードする配列である。
いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、「アプタザイム」と称される、リガンド誘導性の自己切断リボザイムをコードする配列である。アプタザイムは、リガンドに特異的な組み込まれたアプタマードメインを含むリボザイム配列である。アプタマードメインと結合するリガンドは、リボザイムの酵素活性の活性化を誘発し、それによってＲＮＡ転写物の切断をもたらす。例示的なアプタザイムには、テオフィリン依存性アプタザイム（例えば、Ａｕｓｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ，ＢｉｏＳｙｓｔ．（２０１０）６，８０７－８１４に記載される、テオフィリン依存性アプタマーと連結したハンマーヘッド型リボザイム）、テトラサイクリン依存性アプタザイム（例えば、Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｅＬｉｆｅ ２０１６；５：ｅ１８８５８ ＤＯＩ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．１８８５８、Ｗｉｎ ａｎｄ Ｓｍｏｌｋｅ，ＰＮＡＳ（２００７）１０４；１４２８３－１４２８８、Ｗｈｉｔｔｍａｎｎ ａｎｄ Ｓｕｅｓｓ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｔ（２０１１）７；２４１９－２４２７、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ＆Ｂｉｏｌ（２００８）１５；１２５－１１３７、及びＢｅｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｎ Ｂｉｏｌ（２０１５）４；５２６－５３４に記載されるＴｅｔ依存性アプタマーと連結したハンマーヘッド型リボザイム）、及びグアニン依存性アプタザイム（例えば、Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ．，（２０１２）４８（５７）；７２１５－７２１７に記載されるグアニン依存性アプタマーと連結したハンマーヘッド型リボザイム）が含まれる。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’接合部切断配列は、アプタザイムをコードする配列である。
いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、ＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｈＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ａｍｉＲＮＡ分子）、またはｇＲＮＡ分子、またはＲＮＡｓｅＨプライマーの標的配列である。かかる実施形態では、接合部切断配列は、ＲＮＡｉ分子、ｇＲＮＡ分子、またはプライマー分子の配列と少なくとも部分的に相補的である。パーセント配列同一性及びパーセント相補性の比較ならびに決定のための配列アラインメントの方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似法の検索によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、手動調整及び目視検査（例えば、Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）によって、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０に記載のＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを含む当技術分野で既知のアルゴリズムを使用することによって、それぞれ、行うことができる。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センターを通じて公開されている。
いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列及び３’接合部切断配列は、同じ群に由来する（例えば、両方ともＲＮＡｉ標的配列、両方ともリボザイムをコードする配列などである）。例えば、いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、ＲＮＡｉ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ標的配列）であり、ウイルスゲノム（例えば、組換えＲＮＡ分子）をコードするポリヌクレオチドの５’及び３’末端に組み込まれる。かかる実施形態では、５’及び３’ＲＮＡｉ標的配列は、同じ（すなわち、同じｓｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡの標的）であり得るか、または異なり得る（すなわち、５’配列が１つのｓｉＲＮＡ、ｓｈｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡの標的であり、３’配列が別のｓｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡの標的である）。いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、ガイドＲＮＡ標的配列であり、ウイルスゲノム（例えば、組換えＲＮＡ分子）をコードするポリヌクレオチドの５’及び３’末端に組み込まれる。かかる実施形態では、５’及び３’ｇＲＮＡ標的配列は、同じ（すなわち、同じｇＲＮＡの標的）であり得るか、または異なり得る（すなわち、５’配列が１つのｇＲＮＡの標的であり、３’配列が別のｇＲＮＡの標的である）。いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、ｐｒｉ－ｍＲＮＡをコードする配列であり、ウイルスゲノム（例えば、組換えＲＮＡ分子）をコードするポリヌクレオチドの５’及び３’末端に組み込まれる。いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、リボザイムをコードする配列であり、ウイルスゲノム（例えば、組換えＲＮＡ分子）をコードするポリヌクレオチドの５’及び３’末端に直ちに組み込まれる。
いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列及び３’接合部切断配列は、同じ群に由来するが、異なるバリアントまたは種類である。例えば、いくつかの実施形態では、５’及び３’接合部切断配列は、ＲＮＡｉ分子の標的配列であり得、５’接合部切断配列は、ｓｉＲＮＡ標的配列であり、３’接合部切断配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列である（またはその逆である）。いくつかの実施形態では、５’及び３’接合部切断配列は、リボザイムをコードする配列であり得、５’接合部切断配列は、ハンマーヘッド型リボザイムをコードする配列であり、３’接合部切断配列は、デルタ肝炎ウイルスリボザイムをコードする配列である。
いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列及び３’接合部切断配列は、異なる種類である。例えば、いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列は、ＲＮＡｉ標的配列であり（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ標的配列）、３’接合部切断配列は、リボザイム配列、アプタザイム配列、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列、またはｇＲＮＡ標的配列である。いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列は、リボザイム配列であり、３’接合部切断配列は、ＲＮＡｉ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ標的配列）、アプタザイム配列、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡをコードする配列、またはｇＲＮＡ標的配列である。いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列は、アプタザイム配列であり、３’接合部切断配列は、ＲＮＡｉ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ標的配列）、リボザイム配列、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列、またはｇＲＮＡ標的配列である。いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列であり、３’接合部切断配列は、ＲＮＡｉ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ標的配列）、リボザイム配列、アプタザイム配列、またはｇＲＮＡ標的配列である。いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列は、ｇＲＮＡ標的配列であり、３’接合部切断配列は、ＲＮＡｉ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ標的配列）、リボザイム配列、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列、またはアプタザイム配列である。
合成ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドと比較した接合部切断配列の例示的な配置を、以下の表Ａ及びＢに示す。
Figure 2022516318000003
Figure 2022516318000004
Figure 2022516318000005
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ＲＮＡウイルスゲノムは、インビトロＲＮＡ転写によってインビトロで産生される（図３５の概略図を参照されたい）。次いで、合成ＲＮＡウイルスゲノムは、精製され、治療的使用のために製剤化される（例えば、脂質ナノ粒子にカプセル化される）。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’リボザイム配列、（ｉｉｉ）合成ＲＮＡウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’リボザイム配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ハンマーヘッド型リボザイム配列（例えば、図２３に提供されるものなどの野生型ＨＨＲまたは修飾ＨＨＲ）、（ｉｉｉ）合成ＲＮＡウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’デルタ肝炎ウイルスリボザイム配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ハンマーヘッド型リボザイム配列（例えば、図２３に提供されるものなどの野生型ＨＨＲまたは修飾ＨＨＲ）、（ｉｉｉ）野生型ＳＶＶ－Ａゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’デルタ肝炎ウイルスリボザイム配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１２を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ハンマーヘッド型リボザイム配列（例えば、図２３に提供されるものなどの野生型ＨＨＲまたは修飾ＨＨＲ）、（ｉｉｉ）ＳＶＶＡ－Ｓ１７７Ａゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’デルタ肝炎ウイルスリボザイム配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１３を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ハンマーヘッド型リボザイム配列（例えば、図２３に提供されるものなどの野生型ＨＨＲまたは修飾ＨＨＲ）、（ｉｉｉ）ＳＶＶＡ－ＩＲ２ゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’デルタ肝炎ウイルスリボザイム配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ハンマーヘッド型リボザイム配列（例えば、図２３に提供されるものなどの野生型ＨＨＲまたは修飾ＨＨＲ）、（ｉｉｉ）ＳＶＶＡ－ＩＲ２－Ｓ７７Ａゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’デルタ肝炎ウイルスリボザイム配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’リボザイム配列、（ｉｉｉ）合成ＲＮＡウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’制限酵素認識部位を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ハンマーヘッド型リボザイム配列（例えば、図２３に提供されるものなどの野生型ＨＨＲまたは修飾ＨＨＲ）、（ｉｉｉ）合成ＲＮＡウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ハンマーヘッド型リボザイム配列（例えば、図２３に提供されるものなどの野生型ＨＨＲまたは修飾ＨＨＲ）、（ｉｉｉ）野生型ＳＶＶＡゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１８を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ハンマーヘッド型リボザイム配列（例えば、図２３に提供されるものなどの野生型ＨＨＲまたは修飾ＨＨＲ）、（ｉｉｉ）ＳＶＶＡ－Ｓ１７７Ａゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ハンマーヘッド型リボザイム配列（例えば、図２３に提供されるものなどの野生型ＨＨＲまたは修飾ＨＨＲ）、（ｉｉｉ）ＳＶＶＡ－ＩＲ２ゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ハンマーヘッド型リボザイム配列（例えば、図２３に提供されるものなどの野生型ＨＨＲまたは修飾ＨＨＲ）、（ｉｉｉ）ＳＶＶＡ－Ｓ１７７Ａ－ＩＲ２ゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ピストル型リボザイム配列（例えば、図２４に示されるピストル１またはピストル２リボザイム配列）、（ｉｉｉ）合成ＲＮＡウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ピストル１リボザイム配列、（ｉｉｉ）野生型ＳＶＶゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１４を含むか、または配列番号１４からなる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ピストル２リボザイム配列、（ｉｉｉ）野生型ＳＶＶゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドが、配列番号１５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１５を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ピストル１リボザイム配列、（ｉｉｉ）ＳＶＶ－Ｓ１７７Ａゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ピストル１リボザイム配列、（ｉｉｉ）ＳＶＶ－ＩＲ２ゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドが、配列番号１６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドが、配列番号１６を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ピストル１リボザイム配列、（ｉｉｉ）ＳＶＶ－ＩＲ２－Ｓ１７７Ａゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドが、配列番号１７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１７を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ＲＮＡｓｅＨプライマー結合部位、（ｉｉｉ）合成ＲＮＡウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’制限酵素認識部位を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡベクターは、５’から３’の、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ＲＮＡｓｅＨプライマー結合部位、（ｉｉｉ）合成ＲＮＡウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｖ）３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位を含む。
合成ＲＮＡゲノムを含む粒子
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ＲＮＡゲノムは、「粒子」にカプセル化される。本明細書で使用される場合、粒子は、リポソーム、リポプレックス、ナノ粒子、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、エクソソーム、小胞などの物質の非組織由来組成物を指す。特定の実施形態では、粒子は、非タンパク質性及び非免疫原性である。かかる実施形態では、本明細書に記載の合成ＲＮＡゲノムのカプセル化は、全身性の抗ウイルス免疫応答を誘導することなくウイルスゲノムの送達を可能にし、抗ウイルス抗体を中和する効果を軽減する。さらに、本明細書に記載の合成ＲＮＡゲノムのカプセル化は、ゲノムを分解から保護し、標的宿主細胞への導入を容易にする。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の合成ＲＮＡゲノムを含むナノ粒子を提供する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子が、ペイロード分子をコードする第２のＲＮＡ分子をさらに含む。
いくつかの実施形態では、粒子は、対象において生分解性である。かかる実施形態では、粒子の複数の用量は、対象に粒子を蓄積することなく対象に投与することができる。好適な粒子の例には、ポリスチレン粒子、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）ＰＬＧＡ粒子、ポリペプチ系カチオン性ポリマー粒子、シクロデキストリン粒子、キトサン粒子、脂質系粒子、ポリ（β－アミノエステル）粒子、低分子－重量ポリエチレンイミン粒子、ポリホスホエステル粒子、ジスルフィド架橋ポリマー粒子、ポリアミドアミン粒子、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）粒子、及びＰＬＵＲＩＯＮＩＣＳ安定化ポリプロピレンスルフィド粒子が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、無機粒子にカプセル化される。いくつかの実施形態では、無機粒子は、金ナノ粒子（ＧＮＰ）、金ナノロッド（ＧＮＲ）、磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）、磁性ナノチューブ（ＭＮＴ）、カーボンナノホーン（ＣＮＨ）、カーボンフラーレン、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ＣＰＮＰ）、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）、シリカナノチューブ（ＳＮＴ）、または星状中空シリカナノ粒子（ＳＨＮＰ）である。
好ましくは、本明細書に記載の粒子は、溶解性を高め、インビボでの凝集によって引き起こされる可能性のある合併症を回避し、飲作用を促進するために、サイズがナノスコピックである。いくつかの実施形態では、粒子は、約１０００ｎｍ未満の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約５００ｎｍ未満の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約３０～約１００ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、または約７５～約１００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約３０～約７５ｎｍ、または約３０～約５０ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約１００～約５００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約２００～４００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約３５０ｎｍの平均サイズを有する。
エクソソーム
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ＲＮＡゲノムは、エクソソームにカプセル化される。エクソソームは、エンドサイトーシス起源の小さな膜小胞であり、多小胞体が親細胞（例えば、エクソソームが放出される細胞、本明細書ではドナー細胞とも称される）との融合に続いて細胞外環境に放出される。エクソソームの表面は、親細胞の細胞膜に由来する脂質二重層を含み、親細胞表面に発現される膜タンパク質をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、エクソソームは、親細胞からのサイトゾルをさらに含み得る。エクソソームは、上皮細胞、Ｂ及びＴリンパ球、肥満細胞（ＭＣ）、樹状細胞（ＤＣ）を含む多くの異なる細胞種によって産生され、血漿、尿、気管支肺胞洗浄液、腸上皮細胞、及び腫瘍組織で同定されている。エクソソームの組成は、それらが由来する親細胞種に依存するため、「エクソソーム特異的」タンパク質は存在しない。しかしながら、多くのエクソソームは、エクソソームが親細胞に由来する細胞内小胞に関連するタンパク質を含む（例えば、エンドソーム及びリソソームに関連する及び／またはそれらによって発現されるタンパク質）例えば、エクソソームは、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ及びＩＩ（ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩ）などの抗原提示分子、テトラスパニン（例えば、ＣＤ６３）、いくつかの熱ショックタンパク質、アクチン及びチューブリンなどの細胞骨格成分、細胞内膜融合に関与するタンパク質、細胞間相互作用分子（例えば、ＣＤ５４）、シグナル伝達タンパク質、及び細胞質内酵素で濃縮され得る。
エクソソームは、エクソソーム膜を標的細胞の原形質膜と融合させることにより、１つの細胞（例えば、親細胞）から標的またはレシピエント細胞への細胞タンパク質の移動を媒介し得る。したがって、エクソソームによってカプセル化される物質を修飾することにより、本明細書に記載のポリヌクレオチドなどの外因性薬剤を標的細胞に導入することができるメカニズムが提供される。１つ以上の外因性薬剤（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド）を含むように修飾されているエクソソームは、本明細書では「修飾エクソソーム」と称される。いくつかの実施形態では、修飾エクソソームは、外因性薬剤（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド）の導入によって産生され、親細胞に導入される。かかる実施形態では、外因性核酸は、外因性核酸自体、または外因性核酸の転写物が親細胞から産生される修飾エクソソームに組み込まれるように、親のエクソソーム産生細胞に導入される。外因性核酸は、当技術分野で既知である手段、例えば、外因性核酸の形質導入、トランスフェクション、形質転換、及び／またはマイクロインジェクションによって親細胞に導入することができる。
いくつかの実施形態では、修飾エクソソームは、本明細書に記載の合成ＲＮＡゲノムをエクソソームに直接的に導入することによって産生される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ＲＮＡゲノムは、無傷エクソソームに導入される。「無傷エクソソーム」とは、それらが産生される親細胞に由来するタンパク質及び／または遺伝物質を含むエクソソームを指す。無傷エクソソームを得るための方法は、当技術分野で既知である（例えば、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１ Ａｐｒ；２９（４）：３４－５、Ｏｈｎｏ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１３ Ｊａｎ；２１（ｌ）：１８５－９１、及びＥＰ特許公開第２０１０６６３号を参照されたい）。
特定の実施形態では、合成ＲＮＡゲノムは、空のエクソソームに導入される。「空のエクソソーム」とは、親細胞に由来するタンパク質及び／または遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を欠くエクソソームを指す。空のエクソソーム（例えば、親細胞由来の遺伝物質を欠く）を産生する方法は、当技術分野で既知であり、ＵＶ曝露、エクソソームへの核酸の負荷を媒介する内因性タンパク質の変異／欠失、ならびに内因性遺伝物質が開いた細孔を通ってエクソソームから出て行くように、エクソソーム膜の細孔を開くためのエレクトロポレーション及び化学的処理を含む。いくつかの実施形態では、空のエクソソームは、エクソソーム膜を得るために約９～約１４のｐＨを有する水溶液で処理することによってエクソソームを開き、小胞内成分を除去し（例えば、小胞内タンパク質及び／または核酸）、エクソソーム膜を再組み立てして空のエクソソームを形成することによって産生される。いくつかの実施形態では、小胞内成分（例えば、小胞内タンパク質及び／または核酸）は、超遠心分離または密度勾配超遠心分離によって除去される。いくつかの実施形態では、膜は、超音波処理、機械的振動、多孔質膜からの押し出し、電流、またはこれらの技術のうちの１つ以上の組み合わせによって再組み立てされる。特定の実施形態では、膜は、超音波処理によって再組み立てされる。
いくつかの実施形態では、修飾エクソソームを産生するための本明細書に記載の合成ＲＮＡゲノムによる無傷または空のエクソソームの負荷は、インビトロでの形質転換、トランスフェクション、及び／またはマイクロインジェクションなどの従来の分子生物学技術を使用して達成することができる。いくつかの実施形態では、外因性薬剤（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド）は、エレクトロポレーションによって無傷または空のエクソソームに直接的に導入される。いくつかの実施形態では、外因性薬剤（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド）は、リポフェクション（例えば、トランスフェクション）によって無傷または空のエクソソームに直接的に導入される。本開示によるエクソソームの産生に使用するのに好適なリポフェクションキットは、当技術分野で既知であり、市販されている（例えば、ＲｏｃｈｅからのＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００）。いくつかの実施形態では、外因性薬剤（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド）は、熱ショックを使用した形質転換によって無傷または空のエクソソームに直接的に導入される。かかる実施形態では、親細胞から単離したエクソソームは、エクソソーム膜を透過性にするために、Ｃａ２＋（ＣａＣｌ２中）などの二価カチオンの存在下で冷却される。次に、エクソソームを外因性核酸とインキュベートし、短時間熱ショックを与えることができる（例えば、４２℃で３０～１２０秒間インキュベート）。特定の実施形態では、外因性薬剤（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド）を有する空のエクソソームの負荷は、小胞内成分の除去後に薬剤をエクソソーム膜と混合または同時注入することによって達成することができる。したがって、エクソソーム膜から再組み立てされた修飾エクソソームは、外因性薬剤を小胞内空間に組み込むであろう。エクソソームカプセル化核酸を産生するための追加の方法は、当技術分野で既知である（例えば、米国特許第９，８８９，２１０号、同第９，６２９，９２９号、及び同第９，０８５，７７８号、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１６１０１０号及び同第ＷＯ２０１８／０３９１１９号を参照されたい）。
エクソソームは、細胞株、骨髄由来細胞、及び初代患者試料に由来する細胞を含む、多数の異なる親細胞から得ることができる。親細胞から放出されたエクソソームは、当技術分野で既知である手段によって親細胞培養物の上清から単離することができる。例えば、エクソソームの物理的特性を利用して、電荷（例えば、電気泳動分離）、サイズ（例えば、濾過、分子ふるいなど）、密度（例えば、通常または勾配遠心分離）、及びスベドベルグ定数（例えば、外力の有無による沈降など）に基づく分離を含む、培地または他の源からエクソソームを分離することができる。代替的または追加的に、単離は、１つ以上の生物学的特性に基づくことができ、表面マーカーを使用できる方法を含む（例えば、沈殿、固相への可逆的結合、ＦＡＣＳ分離、特異的リガンド結合、非特異的リガンド結合など）。エクソソーム表面タンパク質の分析は、ＣＤ６３などのエクソソーム関連タンパク質に対する蛍光標識抗体を使用したフローサイトメトリーによって決定できる。エクソソームを特徴付けするための追加のマーカーは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１６１０１０号に記載される。さらにさらに企図された方法では、エクソソームは、ＰＥＧ誘導融合及び／または超音波融合を含む化学的及び／または物理的方法を使用して融合することもできる。
いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーを利用して、エクソソームを単離することができる。いくつかの実施形態では、エクソソームは、当技術分野で一般的に既知であるように、遠心分離技術（１つ以上のクロマトグラフィー画分の）によるクロマトグラフィー分離後にさらに単離することができる。いくつかの実施形態では、エクソソームの単離は、前述のような分画遠心分離（例えば、Ｒａｐｏｓｏ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３，１１６１－１１７２（１９９６））、超遠心分離、サイズ系膜濾過、濃縮、及び／または比率ゾーン遠心分離を含むが、これらに限定されない、方法の組み合わせを伴い得る。
いくつかの実施形態では、エクソソーム膜は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、及びホスファチジルセリンのうちの１つ以上を含む。さらに、膜は、１つ以上のポリペプチド及び１つ以上の多糖、例えばグリカンを含むことができる。例示的なエクソソーム膜組成物及び１つ以上の膜成分の相対量を修飾するための方法は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／０３９１１９号に記載される。
いくつかの実施形態では、粒子は、エクソソームであり、約３０～約１００ｎｍ、約３０～約２００ｎｍ、または約３０～約５００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、エクソソームであり、約１０ｎｍ～約１００ｎｍ、約２０ｎｍ～約１００ｎｍ、約３０ｎｍ～約１００ｎｍ、約４０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約１５０ｎｍ、約１５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２５０ｎｍ、約２５０ｎｍ～約５００ｎｍ、または約１０ｎｍ～約１０００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、エクソソームであり、約２０ｎｍ～３００ｎｍ、約４０ｎｍ～２００ｎｍ、約２０ｎｍ～２５０ｎｍ、約３０ｎｍ～１５０ｎｍ、または約３０ｎｍ～１００ｎｍの直径を有する。
脂質ナノ粒子
特定の実施形態では、本明細書に記載の合成ＲＮＡウイルスゲノムは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル化される。特定の実施形態では、ＬＮＰは、トリグリセリド（例えば、トリステアリン）、ジグリセリド（例えば、グリセロールバヘネート）、モノグリセリド（例えば、グリセロールモノステアレート）、脂肪酸（例えば、ステアリン酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）、及びワックス（例えば、パルミチン酸セチル）などの１つ以上の脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上のカチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上のカチオン性脂質、コレステロール、及び１つ以上の中性脂質を含む。
カチオン性脂質は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を帯びる多くの脂質種のいずれかを指す。かかる脂質には、これらに限定されないが、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＭＡ）、ジステアリールジメチルアンモニウム（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－臭化ジメチルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、及びＮ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）が含まれる。例えば、生理学的ｐＨを下回る正電荷を有するカチオン性脂質には、これらに限定されないが、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、及びＤＭＤＭＡが含まれる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、Ｃ１８アルキル鎖、頭部基とアルキル鎖との間のエーテル結合、及び０～３の二重結合を含む。かかる脂質には、例えば、ＤＳＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、及びＤＯＤＭＡが含まれる。カチオン性脂質は、エーテル結合及びｐＨ滴定可能な頭部基を含み得る。かかる脂質には、例えば、ＤＯＤＭＡが含まれる。追加のカチオン性脂質は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７４５，６５１号、同第５，２０８，０３６号、同第５，２６４，６１８号、同第５，２７９，８３３号、同第５，２８３，１８５号、同第５，７５３，６１３号、及び同第５，７８５，９９２号に記載される。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、プロトン化可能な第三級アミン頭部基を含む。かかる脂質は、本明細書ではイオン化可能な脂質と称される。イオン化可能な脂質は、イオン化可能なアミン頭部基を含み、通常、約７未満のｐＫａを含む脂質種を指す。したがって、酸性ｐＨの環境では、イオン化可能なアミン頭部基は、イオン化可能な脂質が負に帯電した分子（例えば、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドなどの核酸）と優先的に相互作用するようにプロトン化され、したがってナノ粒子の組み立て及びカプセル化を促進する。したがって、いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、脂質ナノ粒子への核酸の負荷を増加させることができる。ｐＨが約７よりも大きい環境（例えば、生理学的
Figure 2022516318000006
 ）では、イオン化可能な脂質は、中性電荷を含む。イオン化可能な脂質を含む粒子がエンドソームの低ｐＨ環境（例えば、ｐＨ＜７）に取り込まれると、イオン化可能な脂質は再びプロトン化され、陰イオン性エンドソーム膜と結合して、粒子によってカプセル化された内容物の放出を促進する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン化可能な脂質、例えば、７．ＳＳ－切断可能であり、ｐＨ応答性の脂質様物質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳシリーズなど）を含む。本開示の製剤化及び方法に好適なカチオン性またはイオン化可能な脂質の追加の例は、例えば、ＷＯ２０１８０８９５４０Ａ１、ＷＯ２０１７０４９２４５Ａ２、ＵＳ２０１５０１７４２６１、ＵＳ２０１４３０８３０４、ＵＳ２０１５３７６１１５、ＷＯ２０１／１９９９５２、及びＷＯ２０１６／１７６３３０に記載される。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＬＣ（旧名称：ＳＳ－１８／４ＰＥ－１３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ（旧名称：ＳＳ－３３／４ＰＥ－１５）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＰ、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ－３１９）、またはＮ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）から選択されるイオン化可能な脂質である。いくつかの実施形態では、カチオン性イオン化可能な脂質は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）である。いくつかの実施形態では、カチオン性イオン化可能な脂質は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＬＣである。いくつかの実施形態では、カチオン性イオン化可能な脂質は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣである。いくつかの実施形態では、カチオン性イオン化可能な脂質は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣである。いくつかの実施形態では、カチオン性イオン化可能な脂質は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＰである。いくつかの実施形態では、カチオン性イオン化可能な脂質は、Ｌ－３１９である。いくつかの実施形態では、カチオン性イオン化可能な脂質は、ＤＯＴＡＰである。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上の非カチオン性ヘルパー脂質（中性脂質）を含む。例示的な中性ヘルパー脂質には、（１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）（ＤＬＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤｉＰＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（ｌ’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、セラミド、スフィンゴミエリン、及びコレステロールが含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のヘルパー脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びコレステロールから選択される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＳＰＣを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＰＣを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＬＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＰＥを含む。
本明細書に記載のリポソーム及び薬学的組成物におけるＮ－オクタノイル－スフィンゴシン－ｌ－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）－２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ－２０００）を含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質及び誘導体化セラミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）などの誘導体化脂質の使用ならびに包含は、好ましくは、本明細書に開示される化合物及び脂質のうちの１つ以上と組み合わせてさらに企図される。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１つ以上のＣ６－Ｃ２０アルキルを含む脂質と共有結合した最大５ｋＤａの長さのポリ（エチレング）グリコール鎖を含む１つ以上のＰＥＧ修飾脂質をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－５０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、及び１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）から選択されるＰＥＧ修飾脂質をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５Ｋをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＳＧ－ＰＥＧ２Ｋをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＳＧ－ＰＥＧ５Ｋをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＭＧ－ＰＥＧ５Ｋをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、脂質ナノ粒子の総脂質含有量の約０．１％～約１％で含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、脂質ナノ粒子の総脂質含有量の約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、または約１．０％、約１．５％、約２．０％、約２．５％、または約３．０％で含まれる。
いくつかの実施形態では、脂質は、切断可能なペグ脂質で修飾される。切断可能な結合を有するＰＥＧ誘導体の例としては、ペプチド結合（Ｋｕｌｋａｒｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｍｍｐ－９ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＰＥＧ ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｔｏ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １１：２３９０－９、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｄｒｕｇ／ｄｙｅ－ｌｏａｄｅｄ，ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｅｇ－ｃｈｉｔｏｓａｎ－ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ｍｅｔｈｏｔｒａｘａｔｅ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｅｌｆ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｄｕａｌ ｍｏｄｅｌ ｉｍａｇｉｎｇ．ＡＣＳ Ａｐｐｌ Ｍａｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ７：１１９０８－２０．）、ジスルフィドキー（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ（２０１４）．Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ ｔｈｅ ｇｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ－ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｃｈｉｎ Ｊ Ｐｏｌｙｍ Ｓｃｉ ３３：１１８－２７、Ｗｕ＆Ｙａｎ（２０１５）．Ｃｏｐｐｅｒ ｎａｎｏｐｏｗｄｅｒ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｃｒｏｓｓ－ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｄｉａｒｙｌ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ａｒｙｌ ｉｏｄｉｄｅｓ ｉｎ ＰＥＧ－４００．Ｓｙｎｌｅｔｔ ２６：５３７－４２）、ビニルエーテル結合、ヒドラゾン結合（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｐｒｏｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｏ ｅｘｐｌｏｉｔ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ １４：９２７８－８６．）、及びエステル結合（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｅｓｔｅｒａｓｅ－ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｄｅＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＨ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｃｌｅａｖａｂｌｅ ＰＥＧ－ｌｉｐｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １３０：２３８－４５）で修飾されたものが挙げられる。Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃｌｅａｖｅａｂｌｅ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ：ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｔｈｅ “ＰＥＧ ｄｉｌｅｍｍａ” ｉｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ２４：２，２２－３２も参照されたい。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、活性化ＰＥＧ脂質である。例示的な活性化ＰＥＧ脂質には、ＰＥＧ－ＮＨ２、ＰＥＧ－ＭＡＬ、ＰＥＧ－ＮＨＳ、及びＰＥＧ－ＡＬＤが含まれる。かかる官能化ＰＥＧ脂質は、（例えば、抗原結合分子、ペプチド、グリカンなどの付着によって）粒子を特定の標的細胞または組織に導くための脂質ナノ粒子への標的部分のコンジュゲーションに有用である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＬＣである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＰである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質は、Ｌ－３１９である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、１つ以上のヘルパー脂質は、コレステロールを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、１つ以上のヘルパー脂質は、ＤＬＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、１つ以上のヘルパー脂質は、ＤＳＰＣを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、１つ以上のヘルパー脂質は、ＤＯＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、１つ以上のヘルパー脂質は、ＤＯＰＣを含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び少なくとも２つのヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰであり、少なくとも２つのヘルパー脂質は、コレステロール及びＤＬＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び少なくとも２つのヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質は、ＭＣ３であり、少なくとも２つのヘルパー脂質は、コレステロール及びＤＳＰＣを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのヘルパー脂質は、コレステロール及びＤＯＰＥを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのヘルパー脂質は、コレステロール及びＤＳＰＣを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び少なくとも３つのヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰであり、少なくとも３つのヘルパー脂質は、コレステロール、ＤＬＰＥ、及びＤＳＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び少なくとも３つのヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質は、ＭＣ３であり、少なくとも３つのヘルパー脂質は、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＤＭＧを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも３つのヘルパー脂質は、コレステロール、ＤＯＰＥ、及びＤＳＰＥを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも３つのヘルパー脂質は、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＤＭＧを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール、及びＤＬＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＭＣ３、コレステロール、及びＤＳＰＣを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール、及びＤＯＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール、ＤＬＰＥ、及びＤＳＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＭＣ３、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＤＭＧを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール、ＤＬＰＥ、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＭＣ３、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＤＭＧ－ＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール、ＤＯＰＥ、及びＤＳＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール、ＤＯＰＥ、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＰＧ－ＰＥＧ（例えば、ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＬＰＥを含み、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ：ＤＬＰＥの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約５０：３５：１５である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＬＰＥを含み、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約５０：３５：１５である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ＤＬＰＥ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧを含み、ＤＯＴＰ：Ｃｈｏｌ：ＤＬＰＥの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約５０：３５：１５であり、粒子は、約０．２％のＤＳＰＥ－ＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＭＣ３、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ＤＳＰＣ、及びＤＭＧ－ＰＥＧを含み、ＭＣ３：Ｃｈｏｌ：ＤＳＰＣ：ＤＭＧ－ＰＥＧの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約４９：３８．５：１１：１．５である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋ）を含み、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～２５％、Ｃ＝２０％～３０％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝２０％～２５％、Ｃ＝２５％～３０％、及びＤ＝０％～１％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約４９：２２：２８．５：０．５である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２０％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２５％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５５％、Ｂ＝１０％～２０％、Ｃ＝３０％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝１０％～１５％、Ｃ＝３５％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、４９：１１：３８．５：１．５である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～６５％、Ｂ＝５％～２０％、Ｃ＝２０％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝５０％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１０％、Ｃ＝３０％～３５％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、５８：７：３３．５：１．５である。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、標的細胞によるナノ粒子の取り込みを調節または促進するために、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）でコーティングされる（図２）。ＧＡＧは、ヘパリン／ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、またはヒアルロン酸（ＨＡ）であり得る。特定の実施形態では、ナノ粒子の表面は、ＨＡでコーティングされ、腫瘍細胞による取り込みのための粒子を標的とする。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸トリペプチド（ＲＧＤペプチド）でコーティングされる（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４，２０１２，３７４７－３７５６、及びＢｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３２（１８），２０１１，４２０５－４２１０を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約５０ｎｍ～約５００ｎｍの平均サイズを有する。例えば、いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１５０ｎｍ、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４００ｎｍ～約５００ｎｍ、約４２５ｎｍ～約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ～約５００ｎｍ、または約４７５ｎｍ～約５００ｎｍの平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約１２０ｎｍの平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、または約１２０ｎｍの平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約１００ｎｍの平均サイズを有する。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、中性電荷（例えば、約０ｍＶ～１ｍＶの平均ゼータ電位）を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約４０ｍＶ～約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約４０ｍＶ～約０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約３５ｍＶ～約０ｍＶ、約３０ｍＶ～約０ｍＶ、約２５ｍＶ～約０ｍＶ、約２０ｍＶ～約０ｍＶ、約１５ｍＶ～約０ｍＶ、約１０ｍＶ～約０ｍＶ、または約５ｍＶ～約０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約２０ｍＶ～約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約２０ｍＶ～約－２０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約１０ｍＶ～約－２０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約１０ｍＶ～約－１０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約１０ｍＶ、約９ｍＶ、約８ｍＶ、約７ｍＶ、約６ｍＶ、約５ｍＶ、約４ｍＶ、約３ｍＶ、約２ｍＶ、約１ｍＶ、約０ｍＶ、約－１ｍＶ、約－２ｍＶ、約－３ｍＶ、約－４ｍＶ、約－５ｍＶ、約－６ｍＶ、約－７ｍＶ、約－８ｍＶ、約－９ｍＶ、約－１０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約０ｍＶ～約－２０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約－２０ｍＶ未満の平均ゼータ電位を有する。例えば、いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約－３０ｍＶ未満、約３５ｍＶ未満、または約－４０ｍＶ未満の平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約－５０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約－４０ｍＶ～約－２０ｍＶ、または約－３０ｍＶ～約－２０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約０ｍＶ、約－１ｍＶ、約－２ｍＶ、約－３ｍＶ、約－４ｍＶ、約－５ｍＶ、約－６ｍＶ、約－７ｍＶ、約－８ｍＶ、約－９ｍＶ、約－１０ｍＶ、約－１１ｍＶ、約－１２ｍＶ、約－１３ｍＶ、約－１４ｍＶ、約－１５ｍＶ、約－１６ｍＶ、約－１７ｍＶ、約－１８ｍＶ、約－１９ｍＶ、約－２０ｍＶ、約－２１ｍＶ、約－２２ｍＶ、約－２３ｍＶ、約－２４ｍＶ、約－２５ｍＶ、約－２６ｍＶ、約－２７ｍＶ、約－２８ｍＶ、約－２９ｍＶ、約－３０ｍＶ、約－３１ｍＶ、約－３２ｍＶ、約－３３ｍＶ、約－３４ｍＶ、約－３５ｍＶ、約－３６ｍＶ、約－３７ｍＶ、約－３８ｍＶ、約－３９ｍＶ、または約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の組換え核酸分子を含み、約３：１（Ｌ：Ｎ）の脂質（Ｌ）対核酸（Ｎ）の比率を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の組換え核酸分子を含み、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、または約１０：１のＬ：Ｎ比率を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の組換え核酸分子を含み、約７：１（Ｌ：Ｎ）の脂質（Ｌ）対核酸（Ｎ）の比率を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の組換え核酸分子を含み、約４．５：１、約４．６：１、約４．７：１、約４．８：１、約４．９：１、約５：１、約５．１：１、約５．２：１、約５．３：１、約５．４：１、または約５．５：１のＬ：Ｎ比率を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の組換え核酸分子を含み、約６．５：１、６．６：１、６．７：１、６．８：１、６．９：１、７：１、７．１：１、７．２：１、７．３：１、７．４：１、及び７．５：１のＬ：Ｎ比率を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、表５に列挙される製剤のうちの１つから選択される脂質製剤を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、腫瘍溶解性ウイルスをコードする合成ＲＮＡウイルスゲノムを含み、コードされた腫瘍溶解性ウイルスは、対象へのＬＮＰ投与部位から遠隔である腫瘍のサイズを減少させることができる。例えば、本明細書に提供される実施例で実証されるように、本明細書に記載のＬＮＰの静脈内投与は、腫瘍組織におけるウイルス複製及び腫瘍サイズの低減をもたらす。これらのデータは、本開示のＬＮＰが、ＬＮＰ投与部位から遠隔である腫瘍またはがん性組織に局在することができることを示す。かかる効果は、容易に入手できず、したがって治療の腫瘍内送達に好適ではない腫瘍の治療における本明細書に記載のＬＮＰカプセル化腫瘍溶解性ウイルスの使用を可能にする。
ペイロード分子
いくつかの実施形態では、粒子は、合成ＲＮＡウイルスゲノムを含み、ペイロード分子をコードする組換えＲＮＡポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、粒子は、脂質ナノ粒子であり、合成ＲＮＡウイルスゲノムを含み、ペイロード分子をコードする組換えＲＮＡポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、ペイロード分子をコードするＲＮＡポリヌクレオチドの３’または５’ＵＴＲに組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、ペイロード分子をコードするポリヌクレオチドに挿入される。かかる実施形態では、ペイロードの翻訳及びその後の発現は、対応するｍｉＲＮＡが発現される細胞では起こらないか、または実質的に減少する。いくつかの実施形態では、ペイロード分子をコードする組換えＲＮＡポリヌクレオチドは、レプリコンである。
いくつかの実施形態では、ペイロードは、細胞傷害性ペプチドである。本明細書で使用される場合、「細胞傷害性ペプチド」は、宿主細胞で発現された場合に細胞死を、及び／または宿主細胞によって分泌された場合に隣接細胞の細胞死を誘導することができるタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、細胞傷害性ペプチドは、カスパーゼ、ｐ５３、ジフテリア毒素（ＤＴ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ（ＰＥＡ）、Ｉ型リボザイム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）（例えば、サポリン及びジェロニン）、ＩＩ型ＲＩＰ（例えば、リシン）、志賀様毒素１（Ｓｌｔ１）、感光性活性酸素種（例えば、キラーレッド）である。特定の実施形態では、細胞傷害性ペプチドは、カスパーゼ遺伝子などのアポトーシスを介して細胞死をもたらす自殺遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態では、ペイロードは、免疫調節ペプチドである。本明細書で使用される場合、「免疫調節ペプチド」は、特定の免疫受容体及び／または経路を調節する（例えば、活性化または阻害する）ことができるペプチドである。いくつかの実施形態では、免疫調節ペプチドは、免疫細胞、組織細胞、及び間質細胞を含む任意の哺乳動物細胞に作用することができる。好ましい実施形態では、免疫調節ペプチドは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、好塩基球、肥満細胞、または好酸球などの免疫細胞に作用する。例示的な免疫調節ペプチドには、抗体またはその抗原結合断片などの抗原結合分子、サイトカイン、ケモカイン、可溶性受容体、細胞表面受容体リガンド、二分ペプチド、及び酵素が含まれる。
いくつかの実施形態では、ペイロードは、ＩＬ－１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－３６γ、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、またはＴＮＦＳＦ１４などのサイトカインである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ４、またはＣＣＬ５などのケモカインである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ニューロピリンリガンド、Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４７リガンド（例えば、ＳＩＲＰ１α）などの細胞表面受容体のリガンドである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、可溶性サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ－１３Ｒ、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＩＬ－３５Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－１２Ｒ、及びインターフェロン受容体）または可溶性自然免疫受容体（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体、補体受容体など）などの可溶性受容体である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、細胞内ＲＮＡ及び／またはＤＮＡセンシングに関与するタンパク質の優性アゴニスト変異体である（例えば、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－１、またはＭＤＡ－５の優性アゴニスト変異体）。
いくつかの実施形態では、ペイロードは、抗体またはその抗原結合断片などの抗原結合分子である（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）など）。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、免疫チェックポイント受容体（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＣＴＬＡ４）または細胞成長及び活性化に関与する追加の細胞表面受容体（例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ４７、ＣＳＦ１Ｒ、４１ＢＢ、ＣＤ４０、及びＮＫＧ２Ｄ）などの細胞表面受容体と特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ペイロード分子は、クロロトキシン、ＢｍＫｎ－２、ネオプラジン１、ネオプラジン２、及びマウリポリン（ｍａｕｒｉｐｏｒｉｎ）などのサソリポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ペイロード分子は、コントルトロスタチン、アポキシン－Ｉ、ボトロプストキシン－Ｉ、ＢＪｃｕＬ、ＯＨＡＰ－１、ロドストミン（ｒｈｏｄｏｓｔｏｍｉｎ）、ｄｒＣＴ－Ｉ、ＣＴＸ－ＩＩＩ、Ｂ１Ｌ、及びＡＣＴＸ－６などのヘビポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ペイロード分子は、ラタルシン及びヒアルロニダーゼなどのクモポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ペイロード分子は、メリチン及びアパミンなどのハチポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ペイロード分子は、ＰｓＴ－１、ＰｄＴ－１、及びＰｄＴ－２などのカエルポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、ペイロードは、酵素である。いくつかの実施形態では、酵素は、細胞外マトリックスを改変することによって腫瘍微小環境を調節することができる。かかる実施形態では、酵素は、これらに限定されないが、マトリックスメタロプロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ９）、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ゼラチナーゼ、またはエラスターゼを含み得る。いくつかの実施形態では、酵素は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、またはチトクロームＰ４５０などの遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（ＧＤＥＰＴ）システムの一部である。いくつかの実施形態では、酵素は、標的細胞において細胞死経路を誘導または活性化することができる（例えば、カスパーゼ）。いくつかの実施形態では、酵素は、細胞外代謝産物またはメッセージを分解することができる（例えば、アルギナーゼまたは１５－ヒドロキシプロスタグランジン脱水素酵素）。
いくつかの実施形態では、ペイロード分子は、二分ペプチドである。本明細書で使用される場合、「二分ペプチド」は、非がん性エフェクター細胞上で発現される細胞表面抗原と結合することができる第１のドメインと、標的細胞によって発現される細胞表面抗原と結合することができる第２のドメインと、からなる多量体タンパク質を指す（例えば、がん性細胞、腫瘍細胞、または異なる種類のエフェクター細胞）。いくつかの実施形態では、二分ポリペプチドの個々のポリペプチドドメインは、抗体またはその結合断片（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはＦ（ａｂ））、ナノボディ、ダイアボディ、フレキシボディ、ＤＯＣＫ－ＡＮＤ－ＬＯＣＫ（商標）抗体、またはモノクローナル抗イディオタイプ抗体（ｍＡｂ２）を含み得る。いくつかの実施形態では、二分ポリペプチドの構造は、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））、Ｔａｎｄａｂ（登録商標）、二重特異性Ｔ細胞会合（ＢｉＴＥ（商標））、ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）、または二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、二分ポリペプチドは、ＢｉＴＥであり、表３及び／または表４に示す抗原と特異的に結合するドメインを含む。例示的なＢｉＴＥを以下の表２に示す。
Figure 2022516318000007
いくつかの実施形態では、エフェクター細胞に発現される細胞表面抗原は、以下の表３から選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞またはエフェクター細胞に発現する細胞表面抗原は、以下の表４から選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞に発現する細胞表面抗原は、腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＥｐｈＡ２、ＭＣＳＰ、ＡＤＡＭ１７、ＰＳＣＡ、１７－Ａ１、ＮＫＧＤ２リガンド、ＣＳＦ１Ｒ、ＦＡＰ、ＧＤ２、ＤＬＬ３、またはニューロピリンから選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、表４に列挙されるものから選択される。
Figure 2022516318000008
Figure 2022516318000009
Figure 2022516318000010
治療用組成物及び使用方法
本開示の一態様は、本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子を含む治療用組成物、または本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子を含む粒子、及びがんの治療方法に関する。本明細書に記載の組成物は、所望の送達経路に適した任意の方法で製剤化することができる。典型的には、製剤には、誘導体またはプロドラッグ、溶媒和物、立体異性体、ラセミ体、またはそれらの互変異性体を含むすべての生理学的に許容される組成物と、任意の薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／または賦形剤が含まれる。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤」には、これらに限定されないが、任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、染料／着色剤、風味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、及び／または乳化剤が含まれ、これは、米国食品医薬品局によって、ヒト及び／または家畜動物での使用が許容されるものとして承認されている。例示的な薬学的に許容される担体には、これらに限定されないが、乳糖、ブドウ糖、及びショ糖などの糖；コーンスターチ及びジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロースなどのセルロースならびにその誘導体；トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバター、ワックス、動植物性脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、及び大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびに薬学的製剤に利用される任意の他の適合性物質が含まれる。
「製薬学的に許容可能な塩」には、酸基付加塩及び塩基付加塩の両方が含まれる。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が含まれ、これらは、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、ならびにこれらに限定されないが、酢酸、２，２－ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４－アセトアミド安息香酸、樟脳酸、樟脳－１０－スルホン酸、カプロン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン－１，２－ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２－オキソ－グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン－１，５－ジスルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、１－ヒドロキシ－２－ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロト酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４－アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐトルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸などの有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩などの無機塩基から誘導することができる。有機塩基に由来する塩には、これらに限定されないが、一級、二級、及び三級アミンの塩、アンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール、２－ジメチルアミノエタノール、２－ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベネタミン、ベンザチン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ－エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などの天然に存在する置換アミン、環状アミン、及び塩基性イオン交換樹脂を含む置換アミンが含まれる。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、及びカフェインである。
本開示は、がん性細胞への組成物の細胞内送達に十分な条件下で、本明細書に記載のＲＮＡポリヌクレオチドもしくは粒子、またはその組成物に細胞を曝露することを含む、がん性細胞または標的細胞を殺傷する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「がん性細胞」または「標的細胞」は、本明細書に記載のポリヌクレオチドもしくは粒子、または本明細書に記載のその組成物による治療または投与のために選択される哺乳動物細胞を指す。本明細書で使用される場合、「がん性細胞を殺傷する」とは、特に、アポトーシスまたはネクローシスによるがん性細胞の死を指す。がん性細胞の殺傷は、腫瘍サイズ測定、細胞数、ならびにアネキシンＶなどの細胞死マーカーの検出及びヨウ化プロピジウムの取り込みについてのフローサイトメトリーを含むがこれらに限定されない、当技術分野で既知である方法によって決定され得る。
本開示は、がんを治療または予防することを必要とする対象において、がんを治療または予防するための方法であって、有効量の本明細書に記載の治療用組成物が対象に投与される、方法をさらに提供する。投与経路は、当然、治療される疾患の位置及び性質によって異なり得、例えば、皮内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、真皮下、非経口、経鼻、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、気管内、腹腔内、腫瘍内、灌流、洗浄、直接的注入、及び経口投与を含み得る。本明細書に記載のカプセル化ポリヌクレオチド組成物は、転移性がんの治療において特に有用であり、全身投与は、組成物を複数の器官及び／または細胞種に送達するために必要であり得る。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、全身的に投与される。
本明細書で互換的に使用される「有効量」または「有効用量」は、疾患または状態の症状の改善または向上をもたらす、本明細書に記載の組成物の量及び／または用量を指す。改善とは、疾患もしくは状態、または疾患もしくは状態の症状の任意の改善または向上である。改善は、観察可能または測定可能な改善であるか、または対象が一般的に良好であると感じるような改善であり得る。したがって、当業者は、治療が疾患状態を改善する可能性があるが、疾患の完全な治癒ではない可能性があることを認識する。対象における改善には、これらに限定されないが、減少した腫瘍量、減少した腫瘍細胞増殖、増加した腫瘍細胞死、免疫経路の活性化、増加した腫瘍進行までの時間、減少したがん性疼痛、増加した生存、または生活の質の改善が含まれる。
いくつかの実施形態では、有効用量の投与は、本明細書に記載の組成物の単回用量の投与で達成され得る。本明細書で使用される場合、「用量」は、一度に送達される組成物の量を指す。いくつかの実施形態では、組換えＲＮＡ分子の用量は、５０％の組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）として測定される。いくつかの実施形態では、ＴＣＩＤ５０は、少なくとも約１０３～１０９ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、例えば少なくとも約１０３ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０４ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０５ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０７ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、または約１０９ ＴＣＩＤ５０／ｍＬである。いくつかの実施形態では、用量は、所与の体積中の粒子の数によって測定され得る（例えば、粒子／ｍＬ）。いくつかの実施形態では、用量は、各粒子に存在する本明細書に記載のＲＮＡポリヌクレオチドのゲノムコピー数によってさらに洗練され得る（例えば、各粒子が、ポリヌクレオチドの少なくとも１つのゲノムコピーを含む、粒子数／ｍＬ）。いくつかの実施形態では、有効量の送達は、本明細書に記載の組成物の複数回の投与を必要とし得る。したがって、有効用量の投与は、本明細書に記載の組成物の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、またはそれ以上の用量の投与を必要とし得る。
本明細書に記載の組成物の複数の用量が投与される実施形態では、各用量は、同じ人物によって及び／または同じ地理的位置で投与される必要はない。さらに、投薬は、所定のスケジュールに従って投与され得る。例えば、所定の投薬スケジュールは、本明細書に記載の組成物の用量を、毎日、隔日、毎週、隔週、毎月、隔月、毎年、半年ごとなどに投与することを含み得る。所定の投薬スケジュールは、所与の患者に対して必要に応じて調整することができる（例えば、投与される組成物の量は増加または減少させることができ、及び／または用量の頻度は増加または減少させることができ、及び／または投与される用量の総数は増加または減少させることができる）。
本明細書で使用される場合、「予防」または「予防法」は、疾患の症状の完全な予防、疾患の症状の発症の遅延、またはその後に発症する疾患の症状の重症度の軽減を意味し得る。
本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、本明細書に記載の組成物が本明細書に記載の方法に従って投与される任意の哺乳動物対象を意味すると解釈される。特定の実施形態では、本開示の方法は、ヒト対象を治療するために利用される。本開示の方法は、非ヒト霊長類（例えば、サル、ヒヒ、及びチンパンジー）、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、ウサギ、ヤギ、シカ、ヒツジ、フェレット、スナネズミ、モルモット、ハムスター、コウモリ、トリ（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル）、サカナ、及び爬虫類を治療するためにさらに利用され得る。
本明細書における「がん」は、典型的には、無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指すか、または説明する。がんの例には、これらに限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫（脂肪肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、平滑筋肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、横紋筋肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、及び軟骨肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍、中皮腫、滑膜肉腫、神経鞘腫、髄膜腫、腺癌、メラノーマ、及び白血病またはリンパ性悪性腫瘍が含まれる。かかるがんのより詳細な例には、扁平上皮癌（例えば、上皮扁平上皮癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌腫、及び肺扁平上皮癌腫を含む肺癌、小細胞肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化器癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ）または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ）、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道腫瘍、ユーイング腫瘍、基底細胞癌腫、腺癌腫、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌腫、嚢胞腺癌腫、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎細胞癌腫、肝細胞癌腫、胆管癌腫、絨毛癌腫、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫瘍、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、骨髄異形成症候群、重鎖疾患、神経内分泌腫瘍、神経鞘腫、及び他の癌腫、ならびに頭頸部癌が含まれる。いくつかの実施形態では、がんは、神経内分泌癌である。さらに、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、髄膜腫、神経鞘腫、神経線維腫症、ケロイド、筋腫、及び子宮筋腫などを含む、良性（すなわち、非癌性）の過剰増殖性疾患、障害、尾及び状態もまた、本明細書に開示される開示を使用して治療され得る。
さらに付番した実施形態
本発明のさらに付番した実施形態を以下の通り提供する：
実施形態１．腫瘍溶解性ウイルスをコードする合成ＲＮＡウイルスゲノムを含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）。
実施形態２．腫瘍溶解性ウイルスが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである、実施形態１に記載のＬＮＰ。
実施形態３．腫瘍溶解性ウイルスが、ポジティブセンス（（＋）－センス）ｓｓＲＮＡウイルスである、実施形態１に記載のＬＮＰ。
実施形態４．（＋）－センスｓｓＲＮＡウイルスが、ピコルナウイルスである、実施形態３に記載のＬＮＰ。
実施形態５．ピコルナウイルスが、Ｓｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルス（ＳＶＶ）またはＣｏｘｓａｃｋｉｅウイルスである、実施形態４に記載のＬＮＰ。
実施形態６．ＳＶＶが、野生型ＳＶＶ－Ａ（配列番号１）、Ｓ１７７Ａ－ＳＶＶＡ変異体（配列番号２）、ＳＶＶ－ＩＲ２変異体（配列番号３）、及びＳＶＶ－ＩＲ２－Ｓ１７７Ａ変異体（配列番号４）から選択されるＳＶＶ－Ａである、実施形態５に記載のＬＮＰ。
実施形態７．Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルスが、ＣＶＢ３、ＣＶＡ２１、及びＣＶＡ９から選択される、実施形態５に記載のＬＮＰ。
実施形態８．Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓが、配列番号２７を含む修飾ＣＶＡ ２１ウイルスである、実施形態５に記載のＬＮＰ。
実施形態９．ＬＮＰを細胞と接触させると、細胞によるウイルス粒子の産生がもたらされ、ウイルス粒子が、感染性及び溶解性である、実施形態１～８のいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態１０．合成ＲＮＡウイルスゲノムが、外因性ペイロードタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態１１．外因性ペイロードタンパク質をコードする組換えＲＮＡ分子をさらに含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態１２．外因性ペイロードタンパク質が、蛍光タンパク質、酵素タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体と結合することができる抗原結合分子、または細胞表面受容体のリガンドである、実施形態１０または１１に記載のＬＮＰ。
実施形態１３．サイトカインが、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、及びＩＬ－３６γから選択される、実施形態１２に記載のＬＮＰ。
実施形態１４．細胞表面受容体のリガンドが、Ｆｌｔ３リガンドまたはＴＮＦＳＦ１４である、実施形態１２に記載のＬＮＰ。
実施形態１５．ケモカインが、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４から選択される、実施形態１２に記載のＬＮＰ。
実施形態１６．抗原結合分子が、免疫チェックポイント受容体と結合して阻害することができる、実施形態１２に記載のＬＮＰ。
実施形態１７．免疫チェックポイント受容体が、ＰＤ－１である、実施形態１６に記載のＬＮＰ。
実施形態１８．抗原結合分子が、腫瘍抗原と結合することができる、実施形態１２に記載のＬＮＰ。
実施形態１９．抗原結合分子が、二重特異性Ｔ細胞会合分子（ＢｉＴＥ）または二重特異性軽Ｔ細胞会合分子（ＬｉＴＥ）である、実施形態１８に記載のＬＮＰ。
実施形態２０．腫瘍抗原が、ＤＬＬ３またはＥｐＣＡＭである、実施形態１８または１９に記載のＬＮＰ。
実施形態２１．合成ＲＮＡウイルスゲノム及び／または組換えＲＮＡ分子が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）カセットを含み、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態２２．１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２１９、ｍｉＲ－２１９ａ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－１３７、及びｍｉＲ－１２６から選択される、実施形態２１に記載のＬＮＰ。
実施形態２３．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態２２に記載のＬＮＰ。
実施形態２４．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態２２に記載のＬＮＰ。
実施形態２５．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態２２に記載のＬＮＰ。
実施形態２６．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態２２に記載のＬＮＰ。
実施形態２７．ＬＮＰが、カチオン性脂質、１つ以上のヘルパー脂質、及びリン脂質－ポリマー複合体を含む、実施形態１～２６のいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態２８．カチオン性脂質が、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＬＣ（旧名称：ＳＳ－１８／４ＰＥ－１３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ（旧名称：ＳＳ－３３／４ＰＥ－１５）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＰ、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ－３１９）、またはＮ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）から選択される、実施形態２７に記載のＬＮＰ。
実施形態２９．ヘルパー脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びコレステロールから選択される、実施形態２７または２８に記載のＬＮＰ。
実施形態３０．カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、中性脂質が、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、実施形態２７に記載のＬＮＰ。
実施形態３１．リン脂質－ポリマー複合体が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＰＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、及び１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）から選択される、実施形態２７～３０のいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態３２．リン脂質－ポリマー複合体が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－５０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、及び１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）から選択される、実施形態２７～３１のいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態３３．カチオン性脂質が、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣを含み、１つ以上のヘルパー脂質が、コレステロール（Ｃｈｏｌ）及びＤＳＰＣを含み、リン脂質－ポリマー複合体が、ＤＰＧ－ＰＥＧ２０００を含む、実施形態２７に記載のＬＮＰ。
実施形態３４．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～２５％、Ｃ＝２０％～３０％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態３３に記載のＬＮＰ。
実施形態３５．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝２０％～２５％、Ｃ＝２５％～３０％、及びＤ＝０％～１％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態３３に記載のＬＮＰ。
実施形態３６．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約４９：２２：２８．５：０．５である、実施形態３３に記載のＬＮＰ。
実施形態３７．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２０％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態３３に記載のＬＮＰ。
実施形態３７Ａ．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２５％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態３３に記載のＬＮＰ。
実施形態３７Ｂ．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５５％、Ｂ＝１０％～２０％、Ｃ＝３０％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態３３に記載のＬＮＰ。
実施形態３８．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝１０％～１５％、Ｃ＝３５％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態３３に記載のＬＮＰ。
実施形態３９．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、４９：１１：３８．５：１．５である、実施形態３３に記載のＬＮＰ。
実施形態３９Ａ．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～６５％、Ｂ＝５％～２０％、Ｃ＝２０％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態３３に記載のＬＮＰ。
実施形態３９Ｂ．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝５０％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態３３に記載のＬＮＰ。
実施形態３９Ｃ．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態３３に記載のＬＮＰ。
実施形態３９Ｄ．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１０％、Ｃ＝３０％～３５％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態３３に記載のＬＮＰ。
実施形態３９Ｅ．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、５８：７：３３．５：１．５である、実施形態３３に記載のＬＮＰ。
実施形態４０．ＬＮＰが、表５から選択される脂質製剤を含む、実施形態１～３９Ｅのいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態４１．ヒアルロナンが、ＬＮＰの表面と複合される、実施形態１～４０のいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態４２．実施形態１～４１のいずれか１つに記載の複数の脂質ナノ粒子を含む、治療用組成物。
実施形態４３．複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４００ｎｍ～約５００ｎｍ、約４２５ｎｍ～約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ～約５００ｎｍ、または約４７５ｎｍ～約５００ｎｍの平均サイズを有する、実施形態４２に記載の治療用組成物。
実施形態４３Ａ．複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約１２０ｎｍの平均サイズを有する、実施形態４２に記載の治療用組成物。
実施形態４３Ｂ．複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、または約１２０ｎｍの平均サイズを有する、実施形態４２に記載の治療用組成物。
実施形態４３Ｃ．複数のＬＮＰが、約１００ｎｍの平均サイズを有する、実施形態４２に記載の治療用組成物。
実施形態４４．複数のＬＮＰが、約４０ｍＶ～約－４０ｍＶ、約２０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約１０ｍＶ～約－１０ｍＶ、約５ｍＶ～約－５ｍＶ、または約２０ｍＶ～約－４０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する、実施形態４２～４３Ｃのいずれか１つに記載の治療用組成物。
実施形態４５．複数のＬＮＰが、約－２０ｍＶ未満、約－３０ｍＶ未満、約－３５ｍＶ未満、または約－４０ｍＶ未満の平均ゼータ電位を有する、実施形態４２～４３Ｃのいずれか１つに記載の治療用組成物。
実施形態４６．複数のＬＮＰが、約－５０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約－４０ｍＶ～約－２０ｍＶ、または約－３０ｍＶ～約－２０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する、実施形態４５に記載の治療用組成物。
実施形態４７．複数のＬＮＰが、約－３０ｍＶ、約－３１ｍＶ、約－３２ｍＶ、約－３３ｍＶ、約－３４ｍＶ、約－３５ｍＶ、約－３６ｍＶ、約－３７ｍＶ、約－３８ｍＶ、約－３９ｍＶ、または約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する、実施形態４５または４６に記載の治療用組成物。
実施形態４８．治療用組成物を対象に投与すると、組換えＲＮＡポリヌクレオチドが対象の標的細胞に送達され、組換えＲＮＡポリヌクレオチドが、対象の標的細胞を溶解することができる感染性腫瘍溶解性ウイルスを産生する、実施形態４２～４７のいずれか１つに記載の治療用組成物。
実施形態４９．組成物が、静脈内または腫瘍内送達のために製剤化される、実施形態４８に記載の治療用組成物。
実施形態５０．標的細胞が、がん性細胞である、実施形態４８に記載の治療用組成物。
実施形態５１．がん性腫瘍の成長を阻害することを必要とする対象において、がん性腫瘍の成長を阻害する方法であって、がん性腫瘍の成長を阻害することを必要とする対象に、実施形態４２～５０のいずれか１つに記載の治療用組成物を投与することを含み、組成物の投与が、腫瘍の成長を阻害する、方法。
実施形態５２．投与が、腫瘍内または静脈内である、実施形態５１に記載の方法。
実施形態５３．がんが、肺癌、肝臓癌、メラノーマ、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、髄質芽細胞腫、または膀胱癌である、実施形態５１または５２に記載の方法。
実施形態５３Ａ．がんが、神経内分泌癌である、実施形態５１～５３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５４．腫瘍溶解性ウイルスをコードする合成ＲＮＡウイルスゲノムを含む、組換えＲＮＡ分子。
実施形態５５．コードされた腫瘍溶解性ウイルスが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである、実施形態５４に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態５６．ｓｓＲＮＡウイルスが、ポジティブセンス（（＋）－センス）またはネガティブセンス（（－）－センス）ｓｓＲＮＡウイルスである、実施形態５５に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態５７．（＋）－センスｓｓＲＮＡウイルスが、ピコルナウイルスである、実施形態５６に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態５８．ピコルナウイルスが、Ｓｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルス（ＳＶＶ）またはＣｏｘｓａｃｋｉｅウイルスである、実施形態５７に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態５９．ＳＶＶが、野生型ＳＶＶ－Ａ（配列番号１）、Ｓ１７７Ａ－ＳＶＶＡ変異体（配列番号２）、ＳＶＶ－ＩＲ２変異体（配列番号３）、またはＳＶＶ－ＩＲ２－Ｓ１７７Ａ変異体（配列番号４）から選択されるＳＶＶ－Ａである、実施形態５８に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態６０．Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルスが、ＣＶＢ３、ＣＶＡ２１、及びＣＶＡ９から選択される、実施形態５８に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態６１．Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルスが、配列番号２７を含む修飾ＣＶＡ２１ウイルスである、実施形態５８に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態６２．組換えＲＮＡ分子が、非ウイルス送達ビヒクルによって細胞に導入されると、感染性の溶解性ウイルスを産生することができる、実施形態５４～６１のいずれか１つに記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態６３．腫瘍溶解性ウイルスをコードするポリヌクレオチド配列に挿入されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）カセットをさらに含み、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、細胞内の対応するｍｉＲＮＡのうちの１つ以上の発現が、細胞内のコードされたウイルスの複製を阻害する、実施形態５４～６２のいずれか１つに記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態６４．１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２１９、ｍｉＲ－２１９ａ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－１３７、及びｍｉＲ－１２６から選択される、実施形態６３に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態６５．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態６４に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態６６．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態６４に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態６７．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態６４に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態６８．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態６４に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態６９．組換えＲＮＡ分子が、非ウイルス送達ビヒクルによって細胞に導入されると、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスを産生することができる、実施形態５４～６８のいずれか１つに記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態７０．細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態６９に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態７１．細胞が、哺乳動物対象に存在する哺乳動物細胞である、実施形態７０に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態７２．複製可能なウイルスが、ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルス、ポリオウイルス、Ｓｅｎｅｃａ ｖａｌｌｅｙウイルス、ｌａｓｓａウイルス、マウス白血病ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、ｓｉｎｄｂｉｓウイルス、及びｍａｒａｂａウイルスからなる群から選択される、実施形態５４～７１のいずれか１つに記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態７２Ａ．複製可能なウイルスが、表１に列挙されるものから選択される、実施形態５４～７１のいずれか１つに記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態７３．１つ以上のｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに組み込まれる、実施形態６３に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態７４．１つ以上のｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上の非必須遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに組み込まれる、実施形態６３に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態７４Ａ．１つ以上のｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに組み込まれる、実施形態６３に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態７５．組換えＲＮＡ分子が、核酸ベクターに挿入される、実施形態５４～７４Ａのいずれか１つに記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態７６．核酸ベクターが、レプリコンである、実施形態７５に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態７７．合成ＲＮＡウイルスゲノムが、外因性ペイロードタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態５４～７６に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態７８．外因性ペイロードタンパク質が、蛍光タンパク質、酵素タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体と結合することができる抗原結合分子、または細胞表面受容体と結合することができるリガンドである、実施形態７７に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態７９．サイトカインが、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、及びＩＬ－３６γから選択される、実施形態７８に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態８０．細胞表面受容体のリガンドが、Ｆｌｔ３リガンドまたはＴＮＦＳＦ１４である、実施形態７８に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態８１．ケモカインが、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４から選択される、実施形態７８に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態８２．抗原結合分子が、免疫チェックポイント受容体と結合して阻害することができる、実施形態７８に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態８３．免疫チェックポイント受容体が、ＰＤ－１である、実施形態８２に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態８４．抗原結合分子が、腫瘍抗原と結合することができる、実施形態７８に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態８５．抗原結合分子が、二重特異性Ｔ細胞会合分子（ＢｉＴＥ）または二重特異性軽Ｔ細胞会合分子（ＬｉＴＥ）である、実施形態８４に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態８６．腫瘍抗原が、ＤＬＬ３またはＥｐＣＡＭである、実施形態８４または８５に記載の組換えＲＮＡ分子。
実施形態８７．組換えＤＮＡ分子であって、５’から３’の、プロモーター配列、５’接合部切断配列、実施形態５４～８６のいずれか１つに記載の組換えＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列、及び３’接合部切断配列を含む、組換えＤＮＡ分子。
実施形態８８．プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列である、実施形態８７に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態８９．５’接合部切断配列が、リボザイム配列であり、３’接合部切断配列が、リボザイム配列である、実施形態８７または８８に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態９０．５’リボザイム配列が、ハンマーヘッド型リボザイム配列であり、３’リボザイム配列が、デルタ肝炎ウイルスリボザイム配列である、実施形態８９に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態９１．５’接合部切断配列が、リボザイム配列であり、３’接合部切断配列が、制限酵素認識配列である、実施形態８７または８８に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態９２．５’リボザイム配列が、ハンマーヘッド型リボザイム配列、ピストル型リボザイム配列、または修飾ピストル型リボザイム配列である、実施形態９１に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態９３．３’制限酵素認識配列が、ＩＩＳ型制限酵素認識配列である、実施形態９１または９２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態９４．ＩＩＳ型認識配列が、ＳａｐＩ認識配列である、実施形態９３に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態９５．５’接合部切断配列が、リボザイム配列であり、３’接合部切断配列が、制限酵素認識配列である、実施形態８７または８８に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態９６．実施形態５４～８６のいずれか１つに記載の組換えＲＮＡ分子の産生方法であって、実施形態８７～９５のいずれか１つに記載のＤＮＡ分子のインビトロ転写と、得られる組換えＲＮＡ分子の精製と、を含む、方法。
実施形態９８．組換えＲＮＡ分子が、合成ＲＮＡウイルスゲノムによってコードされる腫瘍溶解性ウイルスに対して天然である５’及び３’末端を含む、実施形態９６に記載の方法。
実施形態９９．哺乳動物対象への投与に好適な、有効量の実施形態５４～８６のいずれか１つに記載の組換えＲＮＡ分子と、担体と、を含む、組成物。
実施形態１００．実施形態５４～８６のいずれか１つに記載の組換えＲＮＡ分子を含む、粒子。
実施形態１０１．粒子が、生分解性である、実施形態１００に記載の粒子。
実施形態１０２．粒子が、ナノ粒子、エクソソーム、リポソーム、及びリポプレックスからなる群から選択される、実施形態１０１に記載の粒子。
実施形態１０３．エクソソームが、無傷のエクソソームまたは空のエクソソームに由来する修飾エクソソームである、実施形態１０２に記載の粒子。
実施形態１０４．ナノ粒子が、カチオン性脂質、１つ以上のヘルパー脂質、及びリン脂質－ポリマー複合体を含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、実施形態１０２に記載の粒子。
実施形態１０５．カチオン性脂質が、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＬＣ（旧名称：ＳＳ－１８／４ＰＥ－１３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ（旧名称：ＳＳ－３３／４ＰＥ－１５）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＰ、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ－３１９）、またはＮ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）から選択される、実施形態１０４に記載の粒子。
実施形態１０６．ヘルパー脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びコレステロールから選択される、実施形態１０４または１０５に記載の粒子。
実施形態１０７．カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、中性脂質が、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、実施形態１０４に記載のＬＮＰ。
実施形態１０８．リン脂質－ポリマー複合体が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＰＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、及び１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）から選択される、実施形態１０４～１０６のいずれか１つの実施形態に記載の粒子。
実施形態１０９．リン脂質－ポリマー複合体が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－５０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、及び１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）から選択される、実施形態１０４～１０８のいずれか１つに記載の粒子。
実施形態１１０．カチオン性脂質が、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣを含み、１つ以上のヘルパー脂質が、コレステロール（Ｃｈｏｌ）及びＤＳＰＣを含み、リン脂質－ポリマー複合体が、ＤＰＧ－ＰＥＧ２０００を含む、実施形態１０４に記載の粒子。
実施形態１１１．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～２５％、Ｃ＝２０％～３０％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態１１０に記載の粒子。
実施形態１１２．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝２０％～２５％、Ｃ＝２５％～３０％、及びＤ＝０％～１％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態１１０に記載の粒子。
実施形態１１３．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約４９：２２：２８．５：０．５である、実施形態１１０に記載の粒子。
実施形態１１４．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２０％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態１１０に記載の粒子。
実施形態１１４Ａ．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２５％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態１１０に記載の粒子。
実施形態１１４Ｂ．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５５％、Ｂ＝１０％～２０％、Ｃ＝３０％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態１１０に記載の粒子。
実施形態１１５．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝１０％～１５％、Ｃ＝３５％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態１１０に記載の粒子。
実施形態１１６．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、４９：１１：３８．５：１．５である、実施形態１１０に記載の粒子。
実施形態１１６Ａ．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～６５％、Ｂ＝５％～２０％、Ｃ＝２０％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態１１０に記載の粒子。
実施形態１１６Ｂ．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝５０％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態１１０に記載の粒子。
実施形態１１６Ｃ．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態１１０に記載の粒子。
実施形態１１６Ｄ．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１０％、Ｃ＝３０％～３５％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態１１０に記載の粒子。
実施形態１１６Ｅ．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、５８：７：３３．５：１．５である、実施形態１１０に記載の粒子。
実施形態１１７．ＬＮＰが、表５から選択される脂質製剤を含む、実施形態１００～１１６Ｅのいずれか１つに記載の粒子。
実施形態１１８．カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、中性脂質が、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、実施形態１０４に記載の粒子。
実施形態１１９．リン脂質－ポリマー複合体をさらに含み、リン脂質－ポリマー複合体が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）である、実施形態１０４または１１８に記載の粒子。
実施形態１２０．ヒアルロナンが、ＬＮＰの表面と複合される、実施形態１０４～１１９のいずれか１つに記載の粒子。
実施形態１２１．ペイロード分子をコードする第２の組換えＲＮＡ分子をさらに含む、実施形態１０４～１１９のいずれか１つに記載の粒子。
実施形態１２２．第２の組換えＲＮＡ分子が、レプリコンである、実施形態１２１に記載の粒子。
実施形態１２３．第２の組換えＲＮＡ分子が、アルファウイルスレプリコンである、実施形態１２２に記載の粒子。
実施形態１２４．実施形態１０４～１２３のいずれか１つに記載の複数の脂質ナノ粒子を含む、治療用組成物。
実施形態１２５．複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４００ｎｍ～約５００ｎｍ、約４２５ｎｍ～約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ～約５００ｎｍ、または約４７５ｎｍ～約５００ｎｍの平均サイズを有する、実施形態１２４に記載の治療用組成物。
実施形態１２５Ａ．複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約１２０ｎｍの平均サイズを有する、実施形態１２４に記載の治療用組成物。
実施形態１２５Ｂ．複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、または約１２０ｎｍの平均サイズを有する、実施形態１２４に記載の治療用組成物。
実施形態１２５Ｃ．複数のＬＮＰが、約１００ｎｍの平均サイズを有する、実施形態１２４に記載の治療用組成物。
実施形態１２６．複数のＬＮＰが、約４０ｍＶ～約－４０ｍＶ、約２０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約１０ｍＶ～約－１０ｍＶ、約５ｍＶ～約－５ｍＶ、または約２０ｍＶ～約－４０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する、実施形態１２４～１２５Ｃのいずれか１つに記載の治療用組成物。
実施形態１２７．複数のＬＮＰが、約－２０ｍＶ未満、約－３０ｍＶ未満、約－３５ｍＶ未満、または約－４０ｍＶ未満の平均ゼータ電位を有する、実施形態１２４～１２５Ｃのいずれか１つに記載の治療用組成物。
実施形態１２８．複数のＬＮＰが、約－５０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約－４０ｍＶ～約－２０ｍＶ、または約－３０ｍＶ～約－２０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する、実施形態１２４～１２５Ｃのいずれか１つに記載の治療用組成物。
実施形態１２９．複数のＬＮＰが、約－３０ｍＶ、約－３１ｍＶ、約－３２ｍＶ、約－３３ｍＶ、約－３４ｍＶ、約－３５ｍＶ、約－３６ｍＶ、約－３７ｍＶ、約－３８ｍＶ、約－３９ｍＶ、または約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する、実施形態１２４～１２５Ｃのいずれか１つに記載の治療用組成物。
実施形態１３０．対象への組成物の送達が、カプセル化組換えＲＮＡ発現分子を標的細胞に送達し、カプセル化組換えＲＮＡ分子が、標的細胞を溶解することができる感染性ウイルスを産生する、実施形態１２４～１２９のいずれか１つに記載の治療用組成物。
実施形態１３１．組成物が、静脈内または腫瘍内送達のために製剤化される、実施形態１３０に記載の治療用組成物。
実施形態１３２．標的細胞が、がん性細胞である、実施形態１３１に記載の治療用組成物。
実施形態１３３．実施形態５４～８６のいずれか１つに記載の組換えポリヌクレオチドを含む、無機粒子。
実施形態１３４．無機粒子が、金ナノ粒子（ＧＮＰ）、金ナノロッド（ＧＮＲ）、磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）、磁気ナノチューブ（ＭＮＴ）、カーボンナノホーン（ＣＮＨ）、カーボンフラーレン、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ＣＰＮＰ）、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）、シリカナノチューブ（ＳＮＴ）、または星状中空シリカナノ粒子（ＳＨＮＰ）からなる群から選択される、実施形態１３３に記載の無機粒子。
実施形態１３５．ペイロード分子をコードする第２の組み換えＲＮＡ分子をさらに含む、実施形態１３３に記載の無機粒子。
実施形態１３６．第２の組換えＲＮＡ分子が、レプリコンである、実施形態１３５に記載の粒子。
実施形態１３７．実施形態１３３～１３６のいずれか１つに記載の無機粒子を含む組成物であって、粒子の平均直径が、約５００ｎｍ未満である、約５０ｎｍ～５００ｎｍである、約２５０ｎｍ～約５００ｎｍであるか、または約３５０ｎｍである、組成物。
実施形態１３８．がん性細胞を殺傷する方法であって、がん性細胞を、実施形態１～４１、１００～１２３、または１３３～１３６のいずれか１つに記載の粒子、実施形態５４～８６のいずれか１つに記載の組換えＲＮＡ分子またはその組成物に、粒子を当該がん性細胞に細胞内送達するのに十分な条件下で曝露することを含み、カプセル化ポリヌクレオチドによって産生される複製可能なウイルスが、がん性細胞の殺傷をもたらす、方法。
実施形態１３９．複製可能なウイルスが、非がん性細胞で産生されない、実施形態１３８に記載の方法。
実施形態１４０．方法が、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで実施される、実施形態１３８または１３９に記載の方法。
実施形態１４１．対象においてがんを治療する方法であって、がんに罹患している対象に、有効量の、実施形態１～４１、１００～１２３、または１３３～１３６のいずれか１つに記載の粒子、実施形態５４～８６のいずれか１つに記載の組換えＲＮＡ粒子、またはその組成物を投与することを含む、方法。
実施形態１４２．粒子またはその組成物が、静脈内、鼻腔内、吸入剤として投与されるか、または腫瘍に直接的に注入される、実施形態１４１に記載の方法。
実施形態１４３．粒子またはその組成物が、対象に繰り返し投与される、実施形態１４１または１４２に記載の方法。
実施形態１４４．対象が、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、非ヒト霊長類、またはヒトである、実施形態１４１～１４３のいずれかに記載の方法。
実施形態１４５．がんが、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、精巣癌、大腸癌、結腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺癌、悪性神経膠腫、神経膠芽腫、メラノーマ、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、肉腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、髄芽細胞腫、膀胱癌、及び辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）から選択される、実施形態１４１～１４４のいずれかに記載の方法。
実施形態１４６．肺癌が、小細胞肺癌または非小細胞肺癌である、実施形態１４５に記載の方法。
実施形態１４７．肝臓癌が、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）である、実施形態１４５に記載の方法。
実施形態１４８．前立腺癌が、治療中に出現する神経内分泌前立腺癌である、実施形態１４５に記載の方法。
実施形態１４８Ａ．がんが、神経内分泌癌である、実施形態１４１～１４８のいずれか１つに記載の方法。
以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を説明する目的で与えられており、いかなる方法でも本開示を限定することを意味するものではない。提示の実施例は、本明細書に記載の方法ともに、提示の好ましい実施形態を代表し、例示的であり、開示の範囲を制限することを意図したものではない。特許請求の範囲によって定義される開示の精神に包括されるその中の変更及び他の使用が、当業者に生じるであろう。
実施例１．組換えＲＮＡ分子からの感染性ピコルナウイルスウイルスの産生
組換えＲＮＡ分子から感染性ＳＶＶウイルスを産生する能力を評価するために、実験を実施した。簡単に説明すると、ＳＶＶウイルスゲノムを含むＲＮＡポリヌクレオチドを、Ｔ７転写によってインビトロで生成し、２９３Ｔ細胞に１μｇのＳＶＶ ＲＮＡ構築物をリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘで４時間トランスフェクトし、細胞を洗浄し、完全培地を各ウェルに添加した。トランスフェクトした２９３Ｔからの上清を７２時間後に収集し、０．４５μＭフィルターでシリンジ濾過し、ＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞に対して段階的に希釈した。４８時間後、上清をＮＣＩ－Ｈ１２９９培養物から除去し、細胞をクリスタルバイオレットで染色してウイルス感染力を評価した。図１Ｂに示すように、ＳＶＶ－ＷＴゲノムを含むＲＮＡ分子は、活性溶解ウイルスを産生した。
加えて、１μｇのＳＶＶ－ＷＴ ＲＮＡ脂質、ＳＶＶ－ＷＴプラスミドＤＮＡ、またはＳＶＶ陰性ｐＤＮＡ対照で処理したＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞の上清を７２時間後に収集し、感染していないＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞に対して段階的に希釈した。細胞生存率アッセイを、標準プロトコルに従って実施した。図２に示すように、ＳＶＶ－ＷＴ ＲＮＡ／ＬＮＰは、インビトロで腫瘍細胞溶解をもたらす感染性ウイルスを産生することができる。
実施例２．ＳＶＶをコードするＲＮＡの静脈内送達のための脂質ナノ粒子の製剤
ＳＶＶゲノムを含む組換えＲＮＡ分子を、インビボでのＲＮＡの送達のために脂質ナノ粒子に製剤化した。
脂質ナノ粒子の産生：以下の脂質を脂質ナノ粒子の製剤において使用した：
（ａ）Ｄ－Ｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、
（ｂ）Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）
（ｃ）ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＬＣ（旧名称：ＳＳ－１８／４ＰＥ－１３）、
（ｄ）ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ（旧名称：ＳＳ－３３／４ＰＥ－１５）、
（ｅ）ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣ、
（ｆ）ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＰ、
（ｇ）ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ－３１９）
（ｈ）コレステロール、
（ｉ）１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、
（ｊ）１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、
（ｋ）１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、
（ｌ）１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
（ｍ）１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－５０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５Ｋ）、
（ｎ）１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、
（ｏ）１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、及び
（ｐ）１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）。
脂質を、以下の表５に示される様々な比率でエタノール中で調製した。次いで、ＲＮＡ脂質ナノ粒子を、マイクロ流体マイクロ混合物（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）を使用して、２ｍＬ／分の合計流量で生成した（エタノール、脂質混合物の場合は０．５ｍＬ／分、水性緩衝液、ＤＮＡの場合は１．５ｍＬ／分）。得られた粒子を、Ｃａ及びＭｇを含むＰＢＳを用いたタンジェント流濾過によって洗浄した。例示的なＳＶＶ ＬＮＰ製剤を、表５に提供する。別途示されない限り、カプセル化されたＲＮＡゲノムのそれぞれを、５’ハンマーヘッド型リボザイム及び３’デルタ型肝炎型リボザイムを含むＩＶＴ鋳型から生成した。
Figure 2022516318000011
Figure 2022516318000012
Figure 2022516318000013
Figure 2022516318000014
Figure 2022516318000015
Figure 2022516318000016
Figure 2022516318000017
Figure 2022516318000018
Figure 2022516318000019
脂質ナノ粒子の物理的特性の分析：表５中の脂質ナノ粒子の物理的特性は、接線流濾過の前及び後に評価した。粒子サイズ分布及びゼータ電位の測定値を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ－ＺＳ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用した光散乱によって決定した。サイズ測定をｐＨ７．４のＨＢＳで実行し、ゼータ電位測定をｐＨ７．４の０．０１Ｍ ＨＢＳで実施した。ＲＮＡ捕捉のパーセンテージを、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイによって測定した。８０パーセントを超えるＲＮＡ捕捉を示した脂質ナノ粒子を、インビボで試験した。
種々の脂質ナノ粒子製剤の物理的特性を、以下の表６に示す。
Figure 2022516318000020
Figure 2022516318000021
Figure 2022516318000022
Figure 2022516318000023
Figure 2022516318000024
図３Ａ～図３Ｄ及び表６に示すように、脂質組成物及び脂質比の変動は、ナノ粒子サイズ及び／またはＲＮＡ捕捉を変化させる。８０％を超えるＲＮＡ捕捉を示した脂質ナノ粒子を、以下に記載の実施例４～１８においてインビボで試験した。
実施例３：ＳＶＶをコードするＲＮＡを含む脂質ナノ粒子は、感染性ウイルスを産生し、インビボでの腫瘍の成長を阻害する
マウスにおいて腫瘍の成長を阻害するために、ＳＶＶ－ＷＴ ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子がインビボで感染性ウイルスを産生する能力を判定するための実験を実施した。
ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の産生、製剤、及び物理的特性の分析を実施例３に記載されるように実施し、以下の表７に要約する。
Figure 2022516318000025
ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子が腫瘍の成長を阻害する能力を、Ｈ１２９９異種移植片モデルを使用して評価した。簡単に説明すると、５×１０６個のＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞を、０．１ｍＬの無血清ＤＰＢＳ及びＭａｔｒｉｇｅｌ（１：１の体積／体積）に懸濁し、８週齢の雌の胸腺欠損ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右側腹部に皮下接種した。マウスを、無作為に実験群に割り当て、中央腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ３（１２０～１８０ｍｍ３の範囲）に達したときに治療を開始した。
ＳＶＶ－ＷＴ ＲＮＡを含有する２用量の脂質ナノ粒子（５μｇ／用量）を、１日目及び８日目に静脈内投与した。腫瘍体積を、電子ノギスを使用して週に３回測定した。１６日目に、腫瘍を感染性ウイルスの評価のために採取した。
図４Ａに示すように、ＳＶＶ－ＷＴ脂質ナノ粒子で治療したマウスは、ＰＢＳで治療したマウスと比較して、腫瘍成長の有意な減少を示した（２方向ＲＭ ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０．００１）。さらに、図４Ｂに示すように、ＳＶＶ－ＷＴ脂質ナノ粒子での治療は、体重に影響を与えず、静脈内投与したときに脂質ナノ粒子が非毒性であることを示唆した。図５Ａ及び図５Ｂは、ＳＶＶ－ＷＴ脂質ナノ粒子の静脈内投与後の腫瘍からの感染性ＳＶＶの回復を示す。
実施例４：機能獲得型ＳＶＶをコードするＲＮＡ分子を含む粒子が、腫瘍の成長を阻害した
マウスにおいて腫瘍の成長を阻害するために、機能獲得変異を有するＳＶＶをコードするＲＮＡ分子（ＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ）を含む脂質ナノ粒子がインビボで感染性ウイルスを産生する能力を判定するための実験を実施した。
ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の産生、製剤、及び物理的特性の分析を、実施例３に記載したように実施し、以下の表８に要約する。
Figure 2022516318000026
ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子が腫瘍の成長を阻害する能力を、実施例３にさらに記載されるＨ１２９９異種移植片モデルを使用して評価した。簡単に説明すると、５×１０６個のＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞を、８週齢の雌の胸腺機能不全ヌードマウスの右側腹部に皮下接種した。マウスを、４つの実験群：（ｉ）ＰＢＳのみ、（ｉｉ）ＳＶＶ陰性（ＳＶＶ－Ｎｅｇ、製剤番号７０００９－１．Ｃ）、（ｉｉｉ）ＳＶＶ（野生型、製剤番号７０００９－２．Ｃ）、及び（ｉｖ）ＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ（製剤番号７０００９－３．Ｃ）に無作為に割り当てた。ＳＶＶ－Ｎｅｇ脂質ナノ粒子は、複製することができないが、ＳＶＶ－ＷＴ及びＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ ＲＮＡに類似するサイズのＲＮＡ分子で構成された。中央腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ３に達したときに、脂質ナノ粒子（５μｇ／用量）を１日目に静脈内投与し、続いて６日目、１１日目、及び１６日目に追加の治療を行った。腫瘍体積を、電子ノギスを使用して週に３回測定した。２２日目に、マウスを殺処分し、腫瘍及び肝臓組織を採取し、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用してマイナス鎖ＳＶＶ ＲＮＡ（ＳＶＶを複製するための代替マーカー）の存在を測定することによって、複製した感染性ウイルスの存在を決定した。
図６Ａに示すように、ＳＶＶ－ＷＴまたはＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ脂質ナノ粒子で治療したマウスは、ＳＶＶ－Ｎｅｇ脂質ナノ粒子またはＰＢＳで治療したマウスと比較して、腫瘍成長を有意に阻害した（ｐ＜０．０５、２方向ＡＮＯＶＡ）。ＳＶＶ脂質ナノ粒子の投与は、研究の過程を通じて体重への影響が最小限であり（図６Ｂ）、これは、ＳＶＶをコードするＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子が非毒性であり、十分に耐容性であることを示唆している。
ＳＶＶの活性複製を、ＳＶＶ－ＷＴまたはＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ ＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子で治療したマウスの腫瘍組織で検出した（図６Ｃ）。重要なことに、活性ウイルス複製は、腫瘍組織において感染性ウイルスを産生することができる脂質ナノ粒子を受けたマウスを含む、任意の治療群の肝臓組織では生じなかった（図６Ｄ）。
実施例５：ＳＶＶをコードするＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子は、腫瘍の成長を阻害する
ＳＶＶをコードするＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子がインビボで感染性ウイルスを産生し、腫瘍の成長を阻害する能力を判定するための実験を実施した。
ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の産生、製剤、及び物理的特性の分析は、実施例２及び以下の表９に記載される。
Figure 2022516318000027
ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子が腫瘍の成長を阻害する能力を、実施例４にさらに記載されるＨ１２９９異種移植片モデルを使用して評価した。簡単に説明すると、５×１０６個のＨ１２９９細胞を、胸腺機能不全ヌードマウスの右側腹部に皮下接種した。中央腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ３に達したときに、マウスに、２つの５μｇ用量の、ＭＣ－３、ＳＳ－ＬＣ、またはＳＳ－ＥＣイオン化可能な脂質（上の表９に示される製剤）を含むＳＶＶ脂質ナノ粒子を１日目及び６日目に静脈内投与した。腫瘍体積を、電子ノギスを使用して週に３回測定した。１２日目に、腫瘍組織を採取し、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用してマイナス鎖ＳＶＶ ＲＮＡ（ＳＶＶを複製するための代替マーカー）の存在について分析した。
図７に示すように、ＭＣ３ベースの脂質ナノ粒子で治療したマウス（製剤番号７００５３－１．Ｃ）は、ＰＢＳで治療したマウスと比較して、腫瘍成長の有意な阻害を示した（分散＊＊ｐ＜０．０１を比較するためのＦ検定）。しかしながら、ＳＳ－ＬＣベースまたはＳＳ－ＥＣベースの脂質ナノ粒子（製剤番号７００５３－２．Ｃ、７００５９－１．Ｃ、または７００５９－２．Ｃ）は、腫瘍成長に対する阻害効果を有しなかった。これらのデータは、ＭＣ３ベースの脂質ナノ粒子がＳＶＶをコードするＲＮＡ分子を腫瘍組織に送達し、インビボでの感染性ウイルスの産生及び腫瘍溶解をもたらすことを示唆する。
実施例６：小細胞肺癌におけるＳＶＶをコードするＲＮＡを含む脂質ナノ粒子のインビボ有効性
ＳＶＶをコードするＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子がインビボで感染性ウイルスを産生し、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の成長を阻害する能力を判定するための実験を実施した。
ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の産生、製剤、及び物理的特性の分析は、実施例２及び以下の表１０に記載される。
Figure 2022516318000028
ＳＣＬＣ上のＳＶＶをコードするＲＮＡ脂質ナノ粒子のインビボ有効性を、Ｈ８２異種移植モデルを使用して試験した。簡単に説明すると、ＮＣＩ－Ｈ８２細胞（無血清ＰＢＳ及びＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の１：１の混合物中の１×１０６個の細胞／０．１ｍＬ）を、８週齢の雌の胸腺不全ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右側腹部に皮下接種した。マウスは、中央腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ３（１２０～１８０ｍｍ３の範囲）に達したときに治療を開始し、１日目、６日目、１１日目、及び１６日目に、１０μｇのＳＶ－ＷＴ脂質ナノ粒子（製剤番号７００８７－１Ｃ）を静脈内投与したか、または１日目及び４日目に、１μｇのリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（陽性対照）で製剤化したＳＶＶ－ＷＴ ＲＮＡを腫瘍内投与した。腫瘍体積を、電子ノギスを使用して週に３回測定した。
図８に示すように、ＳＶＶ－ＷＴ脂質ナノ粒子またはリポフェクタミンで製剤化したＳＶＶ－ＷＴ ＲＮＡで治療したマウスは、ＰＢＳで治療したマウスと比較して、腫瘍成長の有意な阻害を示した（２方向ＡＮＯＶＡ ｐ＜０．０５）。これらの結果は、ＳＶＶをコードするＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子の静脈内投与、またはリポフェクタミンで製剤化したＳＶＶをコードするＲＮＡ分子の腫瘍内投与のいずれかが、腫瘍組織におけるウイルス複製を効果的に開始し、腫瘍細胞溶解をもたらすことを示す。
実施例７：脂質組成物の変異は、ＳＶＶをコードするＲＮＡナノ粒子の抗腫瘍活性を変化させることができる
ＳＶＶをコードするＲＮＡ分子を含むナノ粒子の脂質組成物がインビボでのウイルス複製及び抗腫瘍活性に影響を及ぼすかどうかを判定するための実験を実施した。
ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の産生、製剤、及び物理的特性の分析は、実施例２及び以下の表１１に記載される。
表１１．ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子製剤
Figure 2022516318000029
ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子が腫瘍の成長を阻害する能力を、実施例４にさらに記載されるＨ１２９９異種移植片モデルを使用して評価した。簡単に説明すると、５×１０６個のＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞を、胸腺機能不全ヌードマウスの右側腹部に皮下接種した。中央腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ３に達したときに、マウスに、５μｇの脂質ナノ粒子（上の表１１に示される製剤）を１日目及び６日目に静脈内投与した。腫瘍体積を、電子ノギスを使用して週に３回測定した。１２日目に、腫瘍組織を採取し、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用してマイナス鎖ＳＶＶ ＲＮＡ（ＳＶＶを複製するための代替マーカー）の存在について分析した。
図９Ａに示すように、ＭＣ３ベース及びＯＣベースの脂質ナノ粒子の両方で治療したマウス（製剤番号７００７７－３．Ｃ、７００７７－４．Ｃ、７００７７－８．Ｃ、７００７７－１０．Ｃ、及び７００７７－１１．Ｃ）は、ＰＢＳで治療したマウスと比較して、腫瘍の成長を有意に阻害した（２方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの多重比較試験、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ）。異なる脂質ナノ粒子製剤で治療したマウスからの腫瘍組織は、マイナス鎖ＳＶＶ ＲＮＡの存在を示し、ＳＶＶ－ＷＴ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の静脈内投与が腫瘍組織におけるウイルス複製を誘導したことを確認した（図９Ｄ）。ＭＣ３ベースの脂質ナノ粒子は、体重減少及び肝臓酵素ＡＳＴ及びＡＬＴの増加を引き起こしたが、ＯＣベースの脂質ナノ粒子は、これらのパラメータに影響を与えなかった（図９Ｂ及び図９Ｃ）。まとめて、これらのデータは、ＯＣベースの脂質ナノ粒子製剤が、腫瘍の成長を有意に阻害し、マウスにおいて良好に耐容性であったことを示した。
実施例８：ＰＥＧ組成物は、脂質ナノ粒子抗腫瘍活性を変化させる
ＳＶＶをコードするＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子のＰＥＧ組成物がインビボでのウイルス複製及び抗腫瘍活性に影響を及ぼすかどうかを判定するための実験を実施した。
ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の産生、製剤、及び物理的特性の分析は、実施例２及び以下の表１２に記載される。
Figure 2022516318000030
ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子が腫瘍の成長を阻害する能力を、実施例４にさらに記載されるＨ１２９９異種移植片モデルを使用して評価した。簡単に説明すると、５×１０６個のＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞を、胸腺機能不全ヌードマウスの右側腹部に皮下接種した。中央腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ３に達したときに、２回の用量の、ＳＶＶをコードするＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子（５μｇ／用量）を１日目、６日目、１１日目、及び１６日目にに静脈内投与した。腫瘍体積を、電子ノギスを使用して週に３回測定した。
図１０に示すように、製剤７００８７－１．Ｃ及び７００８７－４．Ｃ（表１２）で治療したマウスは、ＰＢＳで治療したマウスと比較して、腫瘍成長の有意な阻害を示した（２方向ＡＮＯＶＡ、テューキー多重比較検定、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１及び＊＊＊：ｐ＜０．００１対ＰＢＳ）。製剤７００８７－２．Ｃ及び７００８７－３．Ｃのみが、製剤で使用されるＰＥＧ化脂質のタイプにおいて７００８７－４．Ｃとは異なる（表１２）。これらの所見は、ＰＥＧ化脂質のタイプが、ＳＶＶをコードするＲＮＡナノ粒子の抗腫瘍活性に有意な影響を及ぼし得ることを示唆する。
実施例９：ＰＥＧ組成物は、ＯＣベースの脂質ナノ粒子抗腫瘍活性を変化させる
ＳＶＶをコードするＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子のＰＥＧ組成物がインビボでのウイルス複製及び抗腫瘍活性に影響を及ぼすかどうかを判定するための実験を実施した。
ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の産生、製剤、及び物理的特性の分析は、実施例２及び以下の表１３に記載される。
Figure 2022516318000031
ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子が腫瘍の成長を阻害する能力を、実施例４にさらに記載されるＨ１２９９異種移植片モデルを使用して評価した。簡単に説明すると、５×１０６個のＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞を、胸腺機能不全ヌードマウスの右側腹部に皮下投与した。中央腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ３に達したときに、マウスに、５μｇの、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５Ｋ、またはＤＰＧ－、ＤＭＧ－、もしくはＤＳＧ－ＰＥＧ２Ｋのいずれかを含むＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子（表１３に示される製剤）を静脈内投与した。治療から７２時間後にマウスから腫瘍組織を収集し、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用してマイナス鎖ＳＶＶ ＲＮＡ（ＳＶＶを複製するための代替マーカー）の存在について分析した。
図１１に示すように、製剤で使用されるＰＥＧ型は、ナノ粒子がＳＶＶゲノムを腫瘍組織に効率的に送達する能力を変更することができる。製剤８００１０－２．Ｃ、８００１０－３．Ｃ、及び８００１０－４．Ｃで治療したマウスの腫瘍は、より多くのＳＶＶマイナス（－）鎖またはＳＶＶ複製を示した。製剤８００１０－２．Ｃ、８００１０－３．Ｃ、８００１０－４．Ｃ、及び８００１０－５．Ｃのみが、製剤で使用される脂質－ＰＥＧのタイプ及びパーセンテージにおいて互いに異なる。これは、ＰＥＧ型の選択及び使用されたパーセンテージが、これらのナノ粒子の生物学的活性に有意な影響を及ぼし得ることを示した。
実施例１０：イオン化可能な脂質組成物は、脂質ナノ粒子抗腫瘍活性を変化させる
イオン化可能な脂質組成物がインビボでＳＶＶをコードするＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子の抗腫瘍活性に影響を与えるかどうかを判定するための実験を実施した。
脂質ナノ粒子の産生、製剤、及びＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の物理的特性の分析の説明は、実施例２及び以下の表１４に記載される。
Figure 2022516318000032
ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子のイオン化可能な脂質組成物が腫瘍の成長を阻害する能力を、実施例４にさらに記載されるＨ１２９９異種移植片モデルを使用して評価した。簡単に説明すると、５×１０６個のＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞を、胸腺機能不全ヌードマウスの右側腹部に皮下投与した。中央腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ３に達したときに、マウスに、１ｍｇ／ｋｇの、ＳＳ－ＯＣ（製剤番号８００３３－１．Ｃ）、ＳＳ－ＬＣ（製剤番号８００３３－２．Ｃ）、またはＳＳ－ＯＰ（製剤番号８００３３－３．Ｃ）のイオン化可能な脂質を含むＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ ＲＮＡ脂質ナノ粒子を、研究の１日目及び８日目に静脈内投与した。腫瘍体積を、電子ノギスを使用して週に３回測定した。
図１２に示すように、ＳＳ－ＯＣベースまたはＳＳ－ＯＰベースの脂質ナノ粒子で治療したマウスは、ＰＢＳまたはＳＳ－ＬＣベースの脂質ナノ粒子で治療したマウスと比較して、腫瘍成長の有意な阻害を示した（２方向ＡＮＯＶＡ、テューキー多重比較検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１対ＰＢＳ）。これらの結果は、イオン化可能な脂質組成物がインビボでＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の抗腫瘍活性に影響を及ぼすことを示す。
実施例１１：小細胞肺癌におけるＳＶＶをコードするＲＮＡを含む脂質ナノ粒子のインビボ有効性
ＳＶＶをコードするＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子がインビボで感染性ウイルスを産生し、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の成長を阻害する能力を判定するための実験を実施した。
ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の産生、製剤、及び物理的特性の分析は、実施例２及び以下の表１５に記載される。
Figure 2022516318000033
ＳＣＬＣ上のＳＶＶをコードするＲＮＡ脂質ナノ粒子のインビボ有効性を、Ｈ４４６異種移植モデルを使用して試験した。簡単に説明すると、ＮＣＩ－Ｈ８２細胞（無血清ＰＢＳ及びＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の１：１の混合物中の５×１０６個の細胞／０．１ｍＬ）を、８週齢の雌の胸腺不全ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右側腹部に皮下接種した。中央腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ３（１２０～１８０ｍｍ３の範囲）に達したときに、マウスに、１ｍｇ／ｋｇの、ＳＶＶ－Ｎｅｇ（製剤番号８００５９－１．Ｃ）またはＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ（製剤番号８００５９－２．Ｃ）のＲＮＡ脂質ナノ粒子またはＰＢＳを、１日目、８日目、及び１５日目に静脈内投与した。腫瘍体積を、電子ノギスを使用して週に３回測定した。２２日目に、腫瘍を採取し、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用してマイナス鎖ＳＶＶ ＲＮＡ（ＳＶＶを複製するための代替マーカー）の存在について分析した。
図１３Ａに示すように、ＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ脂質ナノ粒子で治療したマウスは、ＳＶＶ－Ｎｅｇ脂質ナノ粒子またはＰＢＳで治療したマウスと比較して、腫瘍成長の有意な阻害を示した（２方向ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０．００１）。重要なことに、ＳＶＶをコードするＲＮＡ脂質ナノ粒子の静脈内投与は、体重に影響を与えず、これらの薬剤が非毒性であり、十分に耐容性であることを示唆していた（図１３Ｂ）。ＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ ＲＮＡ脂質ナノ粒子製剤で治療したマウスからの腫瘍組織は、マイナス鎖ＳＶＶ ＲＮＡの存在を示し、ＳＶＶ－ＷＴ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の静脈内投与が腫瘍組織におけるウイルス複製を誘導したことを示した（図１３Ｃ）。これらの結果は、ＳＶＶ－Ｓ１７７Ａ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の全身投与がインビボでＳＶＶ複製及びＳＣＬＣ細胞の溶解をもたらすことを示す。
実施例１２：腫瘍成長に対するＳＶＶ－ＩＲＥＳ２ ＲＮＡ脂質ナノ粒子のインビボ有効性
ＳＶＶ－ＩＲＥＳ２ ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子がインビボで腫瘍の成長を阻害し得るかどうかを判定するための実験を実施した。
ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の産生、製剤、及び分析は、実施例２及び以下の表１６に記載される。
Figure 2022516318000034
ＳＶＶ－ＷＴ及びＳＶＶ－ＩＲＥＳ２脂質ナノ粒子が腫瘍の成長を阻害する能力を、実施例４にさらに記載されるＨ１２９９異種移植片モデルを使用して評価した。簡単に説明すると、５×１０６個のＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞を、胸腺機能不全ヌードマウスの右側腹部に皮下投与した。中央腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ３に達したときに、マウスに、０．２ｍｇ／ｋｇの、ＳＶＶ－ＷＴ（製剤番号８０１３０－１．Ｃ）またはＳＶＶ－ＩＲＥＳ２（製剤番号８０１３０－２．Ｃ）のＲＮＡ分子（１日目）を含む脂質ナノ粒子を静脈内投与した。その後の用量のＰＢＳまたは脂質ナノ粒子を、研究の８日目に投与した。腫瘍体積を、電子ノギスを使用して週に３回測定した。
図１４に示すように、ＳＶＶ－ＷＴ ＲＮＡまたはＳＶＶ－ＩＲＥＳ２ ＲＮＡ脂質ナノ粒子で治療したマウスは、ＰＢＳで治療したマウスと比較して、有意に低い腫瘍負荷を示した（２方向ＡＮＯＶＡ、テューキー多重比較検定、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。これらの結果は、ＳＶＶ－ＷＴまたはＳＶＶ－ＩＲＥＳ２ ＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子がインビボで抗腫瘍活性を示し、ＳＶＶ－ＩＲＥＳ２が最良の抗腫瘍効果を示すことを示す。
実施例１３：ＳＶＶ ＩＲＥＳ２をコードするＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子は、神経芽細胞腫瘍において複製することができる
ＳＶＶ－ＷＴ及びＳＶＶ－ＩＲＥＳ２ ＲＮＡ脂質ナノ粒子がインビボで複製する能力を判定するための実験を実施した。
ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の産生、製剤、及び分析は、実施例２及び以下の表１７に記載される。
Figure 2022516318000035
ＳＶＶ－ＷＴ及びＳＶＶ－ＩＲＥＳ２脂質ナノ粒子が腫瘍の成長を阻害する能力を、Ｎ１Ｅ－１１５異種移植片モデルを使用して評価した。簡単に説明すると、Ｎ１Ｅ－１１５細胞（無血清ＰＢＳ及びＭａｔｒｉｇｅｌの１：１の混合物中の５×１０５個の細胞／０．１ｍＬ）を、８週齢の雌のＡ／Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右側腹部に皮下接種した。中央腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ３（１２０～１８０ｍｍ３の範囲）に達したときに、マウスに、０．４ｍｇ／ｋｇの、ＳＶＶ－ＷＴ（製剤番号８０１３０－１．Ｃ）またはＳＶＶ－ＩＲＥＳ２（製剤番号８０１３０－２．Ｃ）のＲＮＡ脂質ナノ粒子（１日目）を静脈内投与した。脂質ナノ粒子の治療から９６時間後にマウスから腫瘍を採取し、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用してマイナス鎖ＳＶＶ ＲＮＡ（ＳＶＶを複製するための代替マーカー）の存在について分析した。
図１５に示すように、ＳＶＶ－ＷＴまたはＳＶＶ－ＩＲＥＳ２ ＲＮＡ脂質ナノ粒子を投与したマウスは、ＰＢＳ対照と比較して、マイナス鎖ＳＶＶ ＲＮＡの１０～１０００倍高いレベルを示した。特に、ＳＶＶ－ＩＲＥＳ２脂質ナノ粒子で治療したマウスからの腫瘍組織の大部分は、ＳＶＶ－ＷＴ ＲＮＡ脂質ナノ粒子を投与したマウスと比較して、より高いレベルのＳＶＶ複製を示した。これらの結果は、ＳＶＶ－ＷＴまたはＳＶＶ－ＩＲＥＳ２ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の全身投与がインビボで神経芽細胞腫瘍でＳＶＶ複製をもたらすことを示す。
実施例１４：ＳＶＶに対する中和ウサギポリクローナル抗体の生成
ウサギポリクローナル抗体は、ウサギにＳＶＶビリオンを免疫することによって生成された。免疫化ウサギの血清中の抗ＳＶＶ抗体の存在を、ＥＬＩＳＡによって確認した（データは示さず）。
抗ＳＶＶ抗体が細胞溶解を阻害し得るかどうかを判定するために、抗ＳＶＶ抗体のＳＶＶウイルス（１×１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）及び連続希釈液（１：２）を、Ｈ４４６細胞上でインキュベートした。Ｈ４４６細胞の溶解活性を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）によって計算した。図１６Ａは、ＳＶＶが最大１：３２０の希釈でウサギポリクローナル抗体によって中和されることを示す。
ウサギ抗ＳＶＶポリクローナル抗体の１：１００希釈の有効性を判定するために、異なる濃度のＳＶＶウイルス及び希釈ＳＶＶ抗体（１：１００）を、Ｈ４４６細胞上でインキュベートした。図１６Ｂに示すように、１０２～１０７ ＴＣＩＤ５０／ｍＬの範囲の試験したすべての用量のＳＶＶウイルスを、抗ＳＶＶ抗体の１：１００希釈によって中和した。１、２、及び３つの群は、抗体希釈物の生物学的複製物である。
実施例１５：ＳＶＶ－ＲＮＡ脂質ナノ粒子は、中和血清の存在下で抗腫瘍活性を示す
ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子を、インビボでＳＶＶ中和抗体の存在下で試験した。
抗ＳＶＶポリクローナル抗体の生成及び試験は、実施例１４に記載される。ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の産生、製剤、及び分析は、実施例２及び以下の表１８に記載される。
Figure 2022516318000036
抗ＳＶＶ抗体がＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子によって誘導される腫瘍細胞溶解を阻害する能力を、実施例４にさらに記載されるＨ１２９９異種移植片モデルを使用して評価した。簡単に説明すると、Ｈ１２９９腫瘍を担持するヌードマウス（ｎ＝８マウス／群）に、１００μＬのＳＶＶ－ＲＮＡ脂質ナノ粒子（製剤番号８０１３９－１．Ｃ）またはＳＶＶビリオンを静脈内投与し、ナイーブウサギ血清（陰性対照）または抗ＳＶＶポリクローナル抗体のいずれかを腹腔内注射した。腫瘍担持マウスは、０日目及び７日目に２回用量の抗体、ならびに研究の１日目及び８日目に２回用量のＳＶＶビリオンまたはＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子を受けた。腫瘍体積を、電子ノギスを使用して週に３回測定した。治療群を、以下の表１９に示す。
Figure 2022516318000037
図１７に示すように、ナイーブウサギ血清で免疫化されたＳＶＶビリオン治療マウスは、腫瘍成長の有意な阻害を示した（２方向ＡＮＯＶＡ、テューキー多重比較検定、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。対照的に、ＳＶＶビリオン治療マウスへのＳＶＶ中和抗体の投与は、ＳＶＶの抗腫瘍活性を完全に遮断した。ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子で治療したマウスへのＳＶＶ中和抗体（またはナイーブウサギ血清）の投与は、ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の抗腫瘍活性に影響を与えなかった。ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子治療は、ＳＶＶ中和血清で治療したマウスにおいて腫瘍成長を有意に阻害した（２方向ＡＮＯＶＡ、テューキー多重比較検定、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。したがって、ＳＶＶビリオンとは異なり、ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の抗腫瘍活性は、循環中の中和抗体の存在によって影響を受けない。
実施例１６：メラノーマにおけるＣＶＡ２１をコードするＲＮＡ脂質ナノ粒子のインビボ有効性
ＣＶＡ２１をコードするＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子がインビボで感染性ウイルスを産生し、メラノーマ腫瘍の成長を阻害する能力を判定するための実験を実施した。ＣＶＡ２１ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の産生、製剤、及び分析は、実施例２及び以下の表２０に記載される。
Figure 2022516318000038
ＣＶＡ２１ ＲＮＡ脂質ナノ粒子が腫瘍の成長を阻害する能力を、ＳＫ－ＭＥＬ２８異種移植片モデルを使用して評価した。簡単に説明すると、ＳＫ－ＭＥＬ２８細胞（無血清ＰＢＳ及びＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の１：１の混合物中の１×１０６個の細胞／０．１ｍＬ）を、８週齢の雌の胸腺不全ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右側腹部に皮下接種した。中央腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ３（１２０～１８０ｍｍ３の範囲）に達したときに、マウスに、ＰＢＳまたはＬｉｐｏａｆｅｃｔｉｍｅ ＲＮＡｉＭＡｘ（１μｇ）で製剤化したＣＶＡ２１をコードするＲＮＡのいずれかを静脈内投与したか、またはＣＶＡ２１をコードするＲＮＡ脂質ナノ粒子（製剤番号７００３２－６Ｃ、５μｇ）を静脈内投与した。マウスは、１日目及び５日目に腫瘍内治療、または１日目、６日目、１１日目、及び１６日目に静脈内治療を受けた。腫瘍体積を、電子ノギスを使用して週に３回測定した。
図１８に示すように、ＣＶＡ２１ ＲＮＡ分子を含むＬＮＰによる静脈内治療、またはリポフェクタミンで製剤化したＣＶＡ２１－ＲＮＡ分子の腫瘍内治療は、ＰＢＳで治療したマウスと比較して、腫瘍担持マウスにおける腫瘍成長を防止した（２方向ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０．００１）。まとめると、これらの結果は、ＣＶＡ２１ ＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子が、メラノーマの治療のための効果的な治療戦略であることを示唆する。
実施例１７：ＳＶＶの別々の３’末端の生成のための戦略
上述のように、本明細書に記載の合成ゲノムは、合成ゲノムから複製可能なウイルス及び感染性ウイルスを産生するために、ウイルスに対して天然である別々の３’及び５’末端を必要とする。インビトロでＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって産生されるＲＮＡ転写産物は、哺乳動物の５’及び３’ＵＴＲであり、したがって、感染性ｓｓＲＮＡウイルスの産生に必要な別々の天然末端は含まない。
感染性ＳＶＶに必要な別々の３’末端を生成するために、３’制限酵素認識配列を使用する戦略を用いた。ＳａｐＩ制限認識配列を、ＤＮＡ鋳型の３’末端に挿入した。ＳａｐＩは、その認識部位の５’を切断して、適切な長さのポリチミジンランを生成し、ウイルスに対して天然である別個のウイルスポリアデニル化部位を生成する。このプロセスを、図１９に示す。
実施例１８：ＳＶＶの別個の５’末端の生成のためのＲＮａｓｅＨ戦略
ＲＮＡｓｅＨ戦略を用いて、ＳＶＶに対して天然である別々の５’末端を生成した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、５’末端にグアノシン残基を必要とする。しかしながら、ＳＶＶの５’末端は、ウリジン残基で始まる。したがって、Ｔ７リーダーは、ウイルスの真正の末端を生成するために除去されなければならない。インビトロ転写（ＩＶＴ）及び５’リーダー処理アプローチの図を図２０に示す。ＩＶＴ鋳型を上部に示し、得られたＲＮＡ転写産物を中央に示す。次いで、このＳＶＶ＋ｓｓＲＮＡ転写産物を相補的ｄｓＤＮＡオリゴ（破線ボックス）にアニールし、その部分をＲＮａｓｅＨで加水分解する。正しい５’末端を有する最終ウイルスｓｓＲＮＡ生成物を、下部に示す。
ＲＮａｓｅＨ操作転写産物の正しい処理を、プライマー伸長分析によって評価した。ＲＮＡ転写産物をＲＮａｓｅＨで処理したか、または未消化のままにした。次いで、相補的な蛍光プライマーを添加し、消化試料及び未消化試料にアニールし、次いで、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ逆転写酵素によって伸長した。次いで、生成物をＴＢＥ ＵＲＥＡアクリルアミドゲル上で分解した。予想される帯は、以下の通りであった：未消化≧１５０ｂｐ及び消化＝１００ｂｐ。図２１に示すように、この戦略は、ＲＮａｓｅＨの存在下で消化された帯の増加によって示されるように、約９０％のＲＮＡを正しく処理することをもたらす。
この戦略は、実施例１９に記載の３’制限酵素戦略と組み合わせて、感染性ＳＶＶの産生に必要な別々の５’及び３’末端を有する最終的な合成ＳＶＶゲノムを産生する。
実施例１９：ＳＶＶの別個の５’末端の生成のためのリボザイム戦略
リボザイム戦略を用いて、ＳＶＶに対して天然である別々の５’末端を生成した。このアプローチの概略図を図２２に示し、ピコルナウイルスの５’末端で切断するリボザイムの設計を示す。描写される２つのリボザイムは、ハンマーヘッド型及びピストル型リボザイムであるが、複数の他のリボザイムは、この文脈において特異的に切断するように適合され得る。
この戦略の実施のためのハンマーヘッド型及びピストル型リボザイムの改変を、それぞれ、図２３及び図２４に示す。ＳＶＶの５’末端をアニールし、切断する最小ハンマーヘッド型リボザイム（ＨＨＲ）の構造モデルを図２３Ａに示す（このリボザイムは、矢印によって示される部位で５’末端を切断する）。ＳＶＶ ５’末端（ＳＴＢＬ）の切断のための安定化ステムＩを有するハンマーヘッド型リボザイムの構造モデルを図２３Ｂに示す（このリボザイムは、矢印によって示される部位で５’末端を切断する）。図２４Ａは、野生に見られるピストル型リボザイム特性（ピストルＷＴ）の概略図を示す。図２４Ｂは、Ｐ３鎖を融合するために添加されたテトラループを有するｍＦＯＬＤによってモデル化されたＰ．Ｐｏｌｙｍｙｘａからのピストル型リボザイムを示す。破線ボックス内の核酸は、ウイルス配列の文脈においてリボザイムの折り畳みを保持するように変異された。破線ボックス内に示されるＷＴ「ＧＵＣ」配列を「ＵＣＡ」に変異させてピストル１を生成し、「ＧＵＣ」配列を「ＴＴＡ」に変異させてピストル２を生成した。
ＩＶＴプロセス中に切断を媒介する４つのリボザイム（ＨＨＲ、ＳＴＢＬ、ピストル１、及びピストル２）のそれぞれの能力を評価した。ＩＶＴ鋳型をＨｐａＩで線形化して、切断されていない場合は１５０ｎｔの流出を得、リボザイム切断の場合は約９０ｎｔ及び約６０ｎｔの２つの切断断片を得て、ＩＶＴプロセスの後にリボザイム効率の読み出しを得た。図２５に示すように、リボザイム構築物とのすべての反応において３つの帯が存在した。２つのハンマーヘッド型リボザイムは、約４０～６０％の効率で切断する（ＳＴＢＬ－レーン３及びＨＨＲ－レーン４）。レーン５のピストル１リボザイムは、ゲル上に目に見える未切断生成物を有さなかった。レーン６のピストル２リボザイムは、ゲル上に約５％の未切断生成物を可視化した。プライマー伸長分析を使用して同様の結果を得た（図２６）。プライマー伸長生成物を、ＴＢＥ ＵＲＥＡアクリルアミドゲル上で分解した。予想される帯は、未消化≧１５０ｂｐ（１５０ｂｐでレーン７におけるＳＶＶ－Ｎｅｇの参照帯を参照されたい）であり、消化＝８０ｂｐであった。ピストル１は、レーン１０に上部帯が存在しないことによって証明される完全な切断をもたらす。
これらの結果は、リボザイムの４つすべてがＩＶＴ転写産物の切断を媒介することができることを示す。しかしながら、ピストル１及びピストル２リボザイムは、より効率的であり、ピストル１は、最も効率的であり、ＩＶＴプロセス中に完全な切断を媒介する。
実施例２０：５’リボザイム及び３’制限酵素操作されたＳＶＶゲノムのインビトロ機能
５’リボザイム配列及び３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位で操作されたＳＶＶゲノムの機能性を評価するためにインビトロアッセイを実施した。以下のＩＶＴ鋳型を使用して、合成ＳＶＶゲノムを生成した：
（ａ）５’ＨＨＲ配列及び３’ＳａｐＩ認識配列
（ｂ）５’ピストル１配列及び３’ＳａｐＩ認識配列
Ｈ１２９９細胞を、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、１ｕｇのＩＶＴ産生ＲＮＡでトランスフェクトした。全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎからの２５０ｕＬのＱＩＡｚｏｌ試薬を使用して、１２時間、２４時間、及び３６時間でＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞から抽出した。ｃＤＮＡを、このＲＮＡから産生し、マイナス鎖特異的Ｔａｑｍａｎアッセイで分析した。ＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞を、固定量の示されたＩＶＴ産生ＲＮＡでトランスフェクトした。絶対ｑＲＴ－ＰＣＲを、このＲＮＡから経時的に産生されたｃＤＮＡに対して行った。Ｈ１２９９細胞からのＳＶＶキックオフの初期動態は、ピストル１－ＳａｐＩ構築物において大幅に増強される（図２７）。
実施例２１：腫瘍成長に対するピストル／ＳａｐＩ ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子のインビボ有効性
ＳＶＶ－ピストル／ＳａｐＩ ＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子がインビボで腫瘍の成長を阻害し得るかどうかを判定するための実験を実施した。
ＳＶＶ ＲＮＡ脂質ナノ粒子の産生、製剤、及び分析は、実施例２及び以下の表２１に記載される。
Figure 2022516318000039
ＳＶＶ－ＨＨＲ－ＨＤＶ及びＳＶＶ－ピストル／ＳａｐＩ脂質ナノ粒子が腫瘍の成長を阻害する能力を、実施例４にさらに記載されるＨ１２９９異種移植片モデルを使用して評価した。簡単に説明すると、５×１０６個のＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞を、胸腺機能不全ヌードマウスの右側腹部に皮下投与した。中央腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ３に達したときに、マウスに、０．２ｍｇ／ｋｇの、ＳＶＶ－ＨＨＲ／ＨＤＶ（製剤番号８０１３０－１．Ｃ）またはＳＶＶ－ピストル／ＳａｐＩ（製剤番号８０１３０－３．Ｃ）のＲＮＡ分子（１日目）を含む脂質ナノ粒子を静脈内投与した。その後の用量のＰＢＳまたは脂質ナノ粒子を、研究の８日目に投与した。腫瘍体積を、電子ノギスを使用して週に３回測定した。
図２８に示すように、ＳＶＶ－ＨＨＲ－ＨＤＶ ＲＮＡまたはＳＶＶ－ピストル／ＳａｐＩ ＲＮＡ脂質ナノ粒子で治療したマウスは、ＰＢＳで治療したマウスと比較して、腫瘍成長を有意に阻害した（２方向ＡＮＯＶＡ、テューキー多重比較検定、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。さらに、ＳＶＶ－ピストル／ＳａｐＩ ＲＮＡ脂質ナノ粒子による治療は、ＳＶＶ－ＨＨＲ ＲＮＡ脂質ナノ粒子と比較して、腫瘍成長の阻害においてより効果的であった（２方向ＡＮＯＶＡ、テューキー多重比較検定、＃＃ｐ＜０．０１）。
実施例２２：修飾リボヌクレオチドを有するＳＶＶ－ＲＮＡのインビトロ合成
ＲＮＡの安定性を増強するために修飾リボヌクレオチドを用いてＳＶＶ－ＲＮＡをインビトロで合成する可能性を評価するための実験を実施した。ＭＣｈｅｒｒｙ（遺伝子発現及びウイルス複製のためのマーカー、ＳＶＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ）をコードするＳＶＶポジティブセンスのＲＮＡのインビトロ合成を、修飾リボヌクレオチドを用いずに、または修飾リボヌクレオチドを用いて行った（図２９Ａ）。インビトロで合成したＲＮＡを、ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で製剤化し、ＮＣＩ－Ｈ１２９９ヒト癌肺細胞に４時間トランスフェクトし、その後、細胞を洗浄し、新鮮な培地を７２時間添加した。赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙの存在（図２９Ｂ中により薄いシェーディングとして示される）を、ウイルス複製の代用として使用した。
図２９Ａに示すように、Ψ－ＵＴＰまたは５－ｍ－ＣＴＰを有するＳＶＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＲＮＡの合成は効率的であった。両方の修飾リボヌクレオチドを組み合わせた場合、ＲＮＡは、産生されなかった。これは、複数の修飾リボヌクレオチドの存在がＳＶＶ－ＲＮＡのＩＶＴを支持しなかったことを示した。ＳＶＶ－Ψ－ＵＴＰ ＲＮＡまたはＳＶＶ－５－ｍ－ＣＴＰ ＲＮＡのトランスフェクションは、ウイルス複製を示さなかった（図２９Ｂ）。ウイルスＲＮＡの二次構造は、ウイルス複製を支持するための鍵であり、ＳＶＶの場合、ＲＮＡの天然の二次構造を変更し、ウイルス複製を防止することができる修飾リボヌクレオチドの使用である。
実施例２３：ＳＶＶゲノムからのペイロード分子の発現
ペイロード分子をコードするポリヌクレオチドがＳＶＶウイルスゲノムから発現され得るかどうかを評価するための実験を実施した。ｍＣｈｅｒｒｙ、ナノルシフェラーゼ、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＦＡＰ－ＣＤ３ ＢｉＴＥの各々の発現カセットを、ＳＶＶゲノムをコードするプラスミドに挿入した。Ｈ１２９９細胞を、０．０１５ｐｍｏｌのプラスミドでトランスフェクトし、上清を回収し、濾過してウイルス粒子を収集した。濾過した上清を、Ｈ４４６培養物に移し、感染性を評価した。図３０に示すように、ペイロード操作ウイルスの各々は、様々な程度の有効性にもかかわらず、Ｈ４４６細胞に感染することができた。各構築物のＩＣ５０を、以下の表２２に提供する。これらのデータは、ＳＶＶが、ウイルスの治療有効性を高めるために様々なペイロード分子を発現するように操作され得ることを示す。
Figure 2022516318000040
実施例２４：腫瘍組織における腫瘍成長及びペイロード発現に対するペイロードＲＮＡ脂質ナノ粒子をコードするＳＶＶのインビボ有効性
ＳＶＶペイロードＲＮＡを含む脂質ナノ粒子がインビトロで腫瘍の成長を阻害し得るかどうかを判定し、腫瘍組織におけるペイロード発現を評価するための実験を実施した
ＳＶＶ－Ｎｅｇ、ＳＶＶ－ＷＴ、及びＳＶＶ－ＩＬ－３６γ ＲＮＡ（配列番号１１）脂質ナノ粒子の産生、製剤、及び分析は、実施例２ならびに以下の表２３及び２４に記載される。
Figure 2022516318000041
Figure 2022516318000042
ＳＶＶ－ＷＴ＋ＳＶＶ－Ｎｅｇ及びＳＶＶ－ＷＴ＋ＳＶＶ－ＩＬ－３６γ脂質ナノ粒子が腫瘍の成長を阻害する能力を、実施例４にさらに記載されるＨ１２９９異種移植片モデルを使用して評価した。簡単に説明すると、５×１０６個のＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞を、胸腺機能不全ヌードマウスの右側腹部に皮下投与した。中央腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ３に達したときに、マウスに、０．２ｍｇ／ｋｇの、ＳＶＶ－ＷＴ＋ＳＶＶ－Ｎｅｇ（製剤番号８０１１６－３．Ｃ＋８０１１６－４．Ｃ混合物（１：１の比率））、またはＳＶＶ－ＷＴ＋ＳＶＶ－ＩＬ－３６γ（製剤番号８０１１６－４．Ｃ＋８０１１６－５．Ｃ混合物（１：１の比率））のＲＮＡ分子（１日目）を含む脂質ナノ粒子を静脈内投与した。その後の用量のＰＢＳまたは脂質ナノ粒子を、研究の８日目に投与した。腫瘍体積を、電子ノギスを使用して週に３回測定した。１０日目に研究を終了し、腫瘍をペイロード発現分析のために収集した。
図３１Ａに示すように、ＳＶＶ－ＷＴ＋ＳＶＶ－ＮｅｇまたはＳＶＶ－ＷＴ＋ＳＶＶ－ＩＬ－３６γ ＲＮＡ脂質ナノ粒子で治療したマウスは、ＰＢＳで治療したマウスと比較して、有意に低い腫瘍負荷を示した（２方向ＡＮＯＶＡ、テューキー多重比較検定、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。これらの結果は、ＳＶＶ－ＷＴ＋ＳＶＶ－ＩＬ－３６γ ＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子がインビボで抗腫瘍活性を示すことを示す。
研究の終了時に収集した腫瘍組織を処理して、腫瘍溶解物を生成した。ＩＬ３６γレベルを、Ｅｌｉｓａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ，ＤＹ２３２０－０５）によって決定した。図３１Ｂに示すように、ヒトＩＬ－３６γを、ＳＶＶ－ＷＴ＋ＳＶＶ－ＩＬ３６γ ＲＮＡ脂質ナノ粒子で治療したマウスで検出した。これらの結果は、ＳＶＶ－ＩＬ－３６γ ＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子が、ウイルスゲノムにコードされる導入遺伝子の腫瘍組織における発現を支持することを示す。
実施例２５：ＣｏｘｓａｃｋｉｅウイルスをコードするＲＮＡ分子の最適化
組換えＲＮＡ分子から感染性ＣｏｘｓａｃｋｉｅウイルスＡ２１（ＣＶＡ２１）を産生する能力を評価するための実験を実施した。簡単に説明すると、ＣＶＡ２１ウイルスゲノムを含むＲＮＡポリヌクレオチドは、前述のＣＶＡ２１ゲノム配列に基づいて、インビトロでＴ７転写によって生成された（Ｎｅｗｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃ－ｃｌｕｓｔｅｒ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｕｐ Ａ ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓｅｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００３），８４，３０４１－３０５０を参照されたい。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４６５５１５）。ＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞に、１μｇのＣＶＡ２１ ＲＮＡ構築物をリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘで４時間トランスフェクトし、その時点でウェルを洗浄し、完全培地を各ウェルに添加した。４８時間後、上清をＳＫ－ＭＥＬ－２８培養物から除去し、細胞をクリスタルバイオレットで染色してウイルス感染力を評価した。図３２Ａ（左パネル）に示すように、Ｎｅｗｃｏｍｂｅ ＣＶＡ２１配列（ＣＶＡ２１ ＷＴ）を含むＲＮＡ分子は、活性溶解ウイルスを産生しなかった（未溶解ＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞のクリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌａｔｅ）染色によって示される）。
驚くべきことに、５’ＵＴＲへの改変は、組換えＲＮＡ分子からの感染性ＣＶＡ２１の産生に必要とされた。図３２Ａ（右パネル）に示すように、Ｎｅｗｃｏｍｂｅ（ＣＶＡ２１－Ｂｒｏｗｎ）によって記載されるＣＶＡ２１ゲノム配列へのＢｒｏｗｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，（２００３）７７：１６，ｐ．８９７３－８９８４．ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５４６７０２）によって記載される５’ＵＴＲ配列の組み込みは、感染性ＣＶＡ２１ウイルスの産生及びウイルス細胞溶解をもたらし、複数の独立したクローンにわたるクリスタルバイオレット染色の欠如によって示された。２つの異なるＣＶＡ２１－ＢｒｏｗｎクローンでトランスフェクトしたＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞からの上清を７２時間後に収集し、０．４５μＭフィルターでシリンジ濾過し、新たなＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞に対して段階的に希釈した。４８時間後、上清をＳＫ－ＭＥＬ－２８培養物から除去し、細胞をクリスタルバイオレットで染色してウイルス感染力を評価した。図３２Ｂに示すように、Ｂｒｏｗｎ ５’ＵＴＲ配列（ＵＴＲ配列－配列番号２６、修飾ＣＶＡ２１配列－配列番号２７）を含むＣＶＡ２１をコードするＲＮＡ分子は、トランスフェクトした細胞の上清への感染性ＣＶＡ２１の産生及び放出をもたらし、上清のみが細胞溶解を媒介する能力によって示された。
参照による組み込み
本明細書で引用されるすべての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、及び特許出願は、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。しかしながら、本明細書で引用された任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、及び特許出願の言及は、それらが有効な先行技術を構成するか、または世界の任意の国における一般的知識の一部を形成するという認識、または示唆の任意の形態ではなく、そのように受け取られるべきではない。
本開示の好適な実施形態が本明細書に示され記載されたが、そのような実施形態は、ほんの一例として提供されることが当業者に自明であろう。当業者は、多数の変化形、変更、及び置換を本開示から逸脱することなく想定するであろう。本明細書に記載される本開示の実施形態に対する種々の代替手段が、本開示の実施において採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲に含まれる方法及び構造、ならびにそれらの等価物が、それにより包含されることが意図される。

Claims (168)

  1. 腫瘍溶解性ウイルスをコードする合成ＲＮＡウイルスゲノムを含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）。
  2. 前記腫瘍溶解性ウイルスが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである、請求項１に記載のＬＮＰ。
  3. 前記腫瘍溶解性ウイルスが、ポジティブセンス（（＋）－センス）ｓｓＲＮＡウイルスである、請求項１に記載のＬＮＰ。
  4. 前記（＋）－センスｓｓＲＮＡウイルスが、表１に列挙されるものから選択される、請求項３に記載のＬＮＰ。
  5. 前記（＋）－センスｓｓＲＮＡウイルスが、ピコルナウイルスである、請求項３に記載のＬＮＰ。
  6. 前記ピコルナウイルスが、Ｓｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルス（ＳＶＶ）またはＣｏｘｓａｃｋｉｅウイルスである、請求項５に記載のＬＮＰ。
  7. 前記ＳＶＶが、野生型ＳＶＶ－Ａ（配列番号１）、Ｓ１７７Ａ－ＳＶＶＡ変異体（配列番号２）、ＳＶＶ－ＩＲ２変異体（配列番号３）、及びＳＶＶ－ＩＲ２－Ｓ１７７Ａ変異体（配列番号４）から選択されるＳＶＶ－Ａである、請求項６に記載のＬＮＰ。
  8. 前記Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルスが、ＣＶＢ３、ＣＶＡ２１、及びＣＶＡ９から選択される、請求項６に記載のＬＮＰ。
  9. 前記Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルスが、配列番号２７を含む修飾ＣＶＡ２１ウイルスである、請求項６に記載のＬＮＰ。
  10. 細胞への前記ＬＮＰの送達が、前記細胞によるウイルス粒子の産生をもたらし、前記ウイルス粒子が、感染性及び溶解性である、請求項１～９のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
  11. 合成ＲＮＡウイルスゲノムが、外因性ペイロードタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
  12. 外因性ペイロードタンパク質をコードする組換えＲＮＡ分子をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
  13. 前記外因性ペイロードタンパク質が、蛍光タンパク質、酵素タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体と結合することができる抗原結合分子、または細胞表面受容体のリガンドである、請求項１１または１２に記載のＬＮＰ。
  14. 前記サイトカインが、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、及びＩＬ－３６γから選択される、請求項１３に記載のＬＮＰ。
  15. 前記細胞表面受容体のリガンドが、Ｆｌｔ３リガンドまたはＴＮＦＳＦ１４である、請求項１３に記載のＬＮＰ。
  16. 前記ケモカインが、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２１、及びＣＣＬ５から選択される、請求項１３に記載のＬＮＰ。
  17. 前記抗原結合分子が、免疫チェックポイント受容体と結合して阻害することができる、請求項１３に記載のＬＮＰ。
  18. 前記免疫チェックポイント受容体が、ＰＤ－１である、請求項１７に記載のＬＮＰ。
  19. 前記抗原結合分子が、腫瘍抗原と結合することができる、請求項１３に記載のＬＮＰ。
  20. 前記抗原結合分子が、二重特異性Ｔ細胞会合分子（ＢｉＴＥ）または二重特異性軽Ｔ細胞会合分子（ＬｉＴＥ）である、請求項１９に記載のＬＮＰ。
  21. 前記腫瘍抗原が、ＤＬＬ３またはＥｐＣＡＭである、請求項１９または２０に記載のＬＮＰ。
  22. 前記合成ＲＮＡウイルスゲノム及び／または前記組換えＲＮＡ分子が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）カセットを含み、前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
  23. 前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２１９、ｍｉＲ－２１９ａ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－１３７、及びｍｉＲ－１２６から選択される、請求項２２に記載のＬＮＰ。
  24. 前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項２３に記載のＬＮＰ。
  25. 前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項２３に記載のＬＮＰ。
  26. 前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項２３に記載のＬＮＰ。
  27. 前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項２３に記載のＬＮＰ。
  28. 前記ＬＮＰが、カチオン性脂質、１つ以上のヘルパー脂質、及びリン脂質－ポリマー複合体を含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
  29. 前記カチオン性脂質が、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＬＣ（旧名称：ＳＳ－１８／４ＰＥ－１３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ（旧名称：ＳＳ－３３／４ＰＥ－１５）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＰ、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ－３１９）、またはＮ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）から選択される、請求項２８に記載のＬＮＰ。
  30. 前記ヘルパー脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びコレステロールから選択される、請求項２８または２９に記載のＬＮＰ。
  31. 前記カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、中性脂質が、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項２８に記載のＬＮＰ。
  32. 前記リン脂質－ポリマー複合体が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＰＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、及び１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）から選択される、請求項２８～３０のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
  33. 前記リン脂質－ポリマー複合体が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－５０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、及び１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）から選択される、請求項２８～３２のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
  34. 前記カチオン性脂質が、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣを含み、前記１つ以上のヘルパー脂質が、コレステロール（Ｃｈｏｌ）及びＤＳＰＣを含み、前記リン脂質－ポリマー複合体が、ＤＰＧ－ＰＥＧ２０００を含む、請求項２８に記載のＬＮＰ。
  35. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～２５％、Ｃ＝２０％～３０％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項３４に記載のＬＮＰ。
  36. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝２０％～２５％、Ｃ＝２５％～３０％、及びＤ＝０％～１％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項３４に記載のＬＮＰ。
  37. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約４９：２２：２８．５：０．５である、請求項３４に記載のＬＮＰ。
  38. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２０％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項３４に記載のＬＮＰ。
  39. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２５％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項３４に記載のＬＮＰ。
  40. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５５％、Ｂ＝１０％～２０％、Ｃ＝３０％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項３４に記載のＬＮＰ。
  41. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝１０％～１５％、Ｃ＝３５％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項３４に記載のＬＮＰ。
  42. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、４９：１１：３８．５：１．５である、請求項３４に記載のＬＮＰ。
  43. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～６５％、Ｂ＝５％～２０％、Ｃ＝２０％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項３４に記載のＬＮＰ。
  44. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝５０％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項３４に記載のＬＮＰ。
  45. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項３４に記載のＬＮＰ。
  46. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１０％、Ｃ＝３０％～３５％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項３４に記載のＬＮＰ。
  47. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、５８：７：３３．５：１．５である、請求項３４に記載のＬＮＰ。
  48. 前記ＬＮＰが、表５から選択される脂質製剤を含む、請求項１～４２のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
  49. ヒアルロナンが、前記ＬＮＰの表面と複合される、請求項１～４８のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
  50. 請求項１～４９のいずれか１項に記載の複数の脂質ナノ粒子を含む、治療用組成物。
  51. 前記複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４００ｎｍ～約５００ｎｍ、約４２５ｎｍ～約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ～約５００ｎｍ、または約４７５ｎｍ～約５００ｎｍの平均サイズを有する、請求項５０に記載の治療用組成物。
  52. 前記複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約１２０ｎｍの平均サイズを有する、請求項５０に記載の治療用組成物。
  53. 前記複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、または約１２０ｎｍの平均サイズを有する、請求項５０に記載の治療用組成物。
  54. 前記複数のＬＮＰが、約１００ｎｍの平均サイズを有する、請求項５０に記載の治療用組成物。
  55. 前記複数のＬＮＰが、約４０ｍＶ～約－４０ｍＶ、約２０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約１０ｍＶ～約－１０ｍＶ、約５ｍＶ～約－５ｍＶ、または約２０ｍＶ～約－４０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する、請求項５０～５４のいずれか１項に記載の治療用組成物。
  56. 前記複数のＬＮＰが、約－２０ｍＶ未満、約－３０ｍＶ未満、約－３５ｍＶ未満、または約－４０ｍＶ未満の平均ゼータ電位を有する、請求項５０～５４のいずれか１項に記載の治療用組成物。
  57. 前記複数のＬＮＰが、約－５０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約－４０ｍＶ～約－２０ｍＶ、または約－３０ｍＶ～約－２０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する、請求項５６に記載の治療用組成物。
  58. 前記複数のＬＮＰが、約－３０ｍＶ、約－３１ｍＶ、約－３２ｍＶ、約－３３ｍＶ、約－３４ｍＶ、約－３５ｍＶ、約－３６ｍＶ、約－３７ｍＶ、約－３８ｍＶ、約－３９ｍＶ、または約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する、請求項５６または５７に記載の治療用組成物。
  59. 前記治療用組成物を対象に投与すると、前記組換えＲＮＡポリヌクレオチドが前記対象の標的細胞に送達され、前記組換えＲＮＡポリヌクレオチドが、前記対象の前記標的細胞を溶解することができる感染性腫瘍溶解性ウイルスを産生する、請求項５０～５８のいずれか１項に記載の治療用組成物。
  60. 前記組成物が、静脈内または腫瘍内送達のために製剤化される、請求項５９に記載の治療用組成物。
  61. 前記標的細胞が、がん性細胞である、請求項５９に記載の治療用組成物。
  62. がん性腫瘍の成長を阻害することを必要とする対象において、がん性腫瘍の成長を阻害する方法であって、前記がん性腫瘍の成長を阻害することを必要とする対象に、請求項５０～６１のいずれか１項に記載の治療用組成物を投与することを含み、前記組成物の投与が、前記腫瘍の成長を阻害する、前記方法。
  63. 前記投与が、腫瘍内または静脈内である、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記がんが、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、乳癌、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、髄質芽細胞腫、またはメラノーマである、請求項６２または６３に記載の方法。
  65. 前記がんが、神経内分泌癌である、請求項６２～６４のいずれか１項に記載の方法。
  66. 腫瘍溶解性ウイルスをコードする合成ＲＮＡウイルスゲノムを含む、組換えＲＮＡ分子。
  67. 前記コードされた腫瘍溶解性ウイルスが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである、請求項６６に記載の組換えＲＮＡ分子。
  68. 前記ｓｓＲＮＡウイルスが、ポジティブセンス（（＋）－センス）またはネガティブセンス（（－）－センス）ｓｓＲＮＡウイルスである、請求項６７に記載の組換えＲＮＡ分子。
  69. 前記（＋）－センスｓｓＲＮＡウイルスが、ピコルナウイルスである、請求項６８に記載の組換えＲＮＡ分子。
  70. 前記ピコルナウイルスが、Ｓｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルス（ＳＶＶ）またはＣｏｘｓａｃｋｉｅウイルスである、請求項６９に記載の組換えＲＮＡ分子。
  71. 前記ＳＶＶが、野生型ＳＶＶ－Ａ（配列番号１）、Ｓ１７７Ａ－ＳＶＶＡ変異体（配列番号２）、ＳＶＶ－ＩＲ２変異体（配列番号３）、またはＳＶＶ－ＩＲ２－Ｓ１７７Ａ変異体（配列番号４）から選択されるＳＶＶ－Ａである、請求項７０に記載の組換えＲＮＡ分子。
  72. 前記Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルスが、ＣＶＢ３、ＣＶＡ２１、及びＣＶＡ９から選択される、請求項７０に記載の組換えＲＮＡ分子。
  73. 前記Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルスが、配列番号２７を含む修飾ＣＶＡ２１ウイルスである、請求項７０に記載の組換えＲＮＡ分子。
  74. 前記腫瘍溶解性ウイルスをコードするポリヌクレオチド配列に挿入されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）カセットをさらに含み、前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、細胞内の対応するｍｉＲＮＡのうちの１つ以上の発現が、前記細胞内の前記コードされたウイルスの複製を阻害する、請求項６６～７３のいずれか１項に記載の組換えＲＮＡ分子。
  75. 前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２１９、ｍｉＲ－２１９ａ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－１３７、及びｍｉＲ－１２６から選択される、請求項７４に記載の組換えＲＮＡ分子。
  76. 前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項７５に記載の組換えＲＮＡ分子。
  77. 前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項７５に記載の組換えＲＮＡ分子。
  78. 前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項７５に記載の組換えＲＮＡ分子。
  79. 前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項７５に記載の組換えＲＮＡ分子。
  80. 前記組換えＲＮＡ分子が、非ウイルス送達ビヒクルによって細胞に導入されると、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスを産生することができる、請求項６６～７９のいずれか１項に記載の組換えＲＮＡ分子。
  81. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項８０に記載の組換えＲＮＡ分子。
  82. 前記細胞が、哺乳動物対象に存在する哺乳動物細胞である、請求項８１に記載の組換えＲＮＡ分子。
  83. 複製可能なウイルスが、ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルス、ポリオウイルス、Ｓｅｎｅｃａ ｖａｌｌｅｙウイルス、ｌａｓｓａウイルス、マウス白血病ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、ｓｉｎｄｂｉｓウイルス、及びｍａｒａｂａウイルスからなる群から選択される、請求項６６～８２のいずれか１項に記載の組換えＲＮＡ分子。
  84. 前記１つ以上のｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに組み込まれる、請求項７４に記載の組換えＲＮＡ分子。
  85. 前記１つ以上のｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上の非必須遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに組み込まれる、請求項８４に記載の組換えＲＮＡ分子。
  86. 前記組換えＲＮＡ分子が、核酸ベクターに挿入される、請求項６６～８５のいずれかに記載の組換えＲＮＡ分子。
  87. 前記核酸ベクターが、レプリコンである、請求項１４１に記載の組換えＲＮＡ分子。
  88. 合成ＲＮＡウイルスゲノムが、外因性ペイロードタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項６６～８７に記載の組換えＲＮＡ分子。
  89. 前記外因性ペイロードタンパク質が、蛍光タンパク質、酵素タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体と結合することができる抗原結合分子、または細胞表面受容体と結合することができるリガンドである、請求項８８に記載の組換えＲＮＡ分子。
  90. 前記サイトカインが、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、及びＩＬ－３６γから選択される、請求項８９に記載の組換えＲＮＡ分子。
  91. 前記細胞表面受容体のリガンドが、Ｆｌｔ３リガンドまたはＴＮＦＳＦ１４である、請求項８９に記載の組換えＲＮＡ分子。
  92. 前記ケモカインが、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２１、及びＣＣＬ５から選択される、請求項８９に記載の組換えＲＮＡ分子。
  93. 前記抗原結合分子が、免疫チェックポイント受容体と結合して阻害することができる、請求項８９に記載の組換えＲＮＡ分子。
  94. 前記免疫チェックポイント受容体が、ＰＤ－１である、請求項９３に記載の組換えＲＮＡ分子。
  95. 前記抗原結合分子が、腫瘍抗原と結合することができる、請求項８９に記載の組換えＲＮＡ分子。
  96. 前記抗原結合分子が、二重特異性Ｔ細胞会合分子（ＢｉＴＥ）または二重特異性軽Ｔ細胞会合分子（ＬｉＴＥ）である、請求項９５に記載の組換えＲＮＡ分子。
  97. 前記腫瘍抗原が、ＤＬＬ３またはＥｐＣＡＭである、請求項９５または９６に記載の組換えＲＮＡ分子。
  98. 組換えＤＮＡ分子であって、５’から３’の、プロモーター配列、５’接合部切断配列、請求項６６～９７のいずれか１項に記載の組換えＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列、及び３’接合部切断配列を含む、前記組換えＤＮＡ分子。
  99. 前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列である、請求項９８に記載の組換えＤＮＡ分子。
  100. 前記５’接合部切断配列が、リボザイム配列であり、前記３’接合部切断配列が、リボザイム配列である、請求項９８または９９に記載の組換えＤＮＡ分子。
  101. 前記５’リボザイム配列が、ハンマーヘッド型リボザイム配列であり、前記３’リボザイム配列が、デルタ肝炎ウイルスリボザイム配列である、請求項１００に記載の組換えＤＮＡ分子。
  102. 前記５’接合部切断配列が、リボザイム配列であり、前記３’接合部切断配列が、制限酵素認識配列である、請求項９８または９９に記載の組換えＤＮＡ分子。
  103. 前記５’リボザイム配列が、ハンマーヘッド型リボザイム配列、ピストル型リボザイム配列、または修飾ピストル型リボザイム配列である、請求項１０２に記載の組換えＤＮＡ分子。
  104. ３’制限酵素認識配列が、ＩＩＳ型制限酵素認識配列である、請求項１０２または１０３に記載の組換えＤＮＡ分子。
  105. 前記ＩＩＳ型認識配列が、ＳａｐＩ認識配列である、請求項１０４に記載の組換えＤＮＡ分子。
  106. 前記５’接合部切断配列が、ＲＮＡｓｅＨプライマー結合配列であり、前記３’接合部切断配列が、制限酵素認識配列である、請求項９８または９９に記載の組換えＤＮＡ分子。
  107. 請求項６６～９７のいずれか１項に記載の組換えＲＮＡ分子を産生する方法であって、請求項９８～１０６のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子のインビトロ転写と、得られる組換えＲＮＡ分子の精製と、を含む、前記方法。
  108. 前記組換えＲＮＡ分子が、前記合成ＲＮＡウイルスゲノムによってコードされる前記腫瘍溶解性ウイルスに対して天然である５’及び３’末端を含む、請求項１０７に記載の方法。
  109. 哺乳動物対象への投与に好適な、有効量の請求項６６～９７のいずれか１項に記載の組換えＲＮＡ分子と、担体と、を含む、組成物。
  110. 請求項６６～９７のいずれか１項に記載の組換えＲＮＡ分子を含む、粒子。
  111. 前記粒子が、生分解性である、請求項１１０に記載の粒子。
  112. 前記粒子が、ナノ粒子、エクソソーム、リポソーム、及びリポプレックスからなる群から選択される、請求項１１１に記載の粒子。
  113. 前記エクソソームが、無傷エクソソームまたは空のエクソソームに由来する修飾エクソソームである、請求項１１２に記載の粒子。
  114. 前記ナノ粒子が、カチオン性脂質、１つ以上のヘルパー脂質、及びリン脂質－ポリマー複合体を含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項１１２に記載の粒子。
  115. 前記カチオン性脂質が、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＬＣ（旧名称：ＳＳ－１８／４ＰＥ－１３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ（旧名称：ＳＳ－３３／４ＰＥ－１５）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＰ、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ－３１９）、またはＮ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）から選択される、請求項１１４に記載の粒子。
  116. 前記ヘルパー脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びコレステロールから選択される、請求項１１４または１１５に記載の粒子。
  117. 前記カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、前記中性脂質が、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項１１４に記載の粒子。
  118. 前記リン脂質－ポリマー複合体が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＰＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、及び１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）から選択される、請求項１１４～１１６のいずれか１項に記載の粒子。
  119. 前記リン脂質－ポリマー複合体が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－５０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、及び１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）から選択される、請求項１１４～１１８のいずれか１項に記載の粒子。
  120. 前記カチオン性脂質が、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣを含み、前記１つ以上のヘルパー脂質が、コレステロール（Ｃｈｏｌ）及びＤＳＰＣを含み、前記リン脂質－ポリマー複合体が、ＤＰＧ－ＰＥＧ２０００を含む、請求項１１４に記載の粒子。
  121. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～２５％、Ｃ＝２０％～３０％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項１２０に記載の粒子。
  122. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝２０％～２５％、Ｃ＝２５％～３０％、及びＤ＝０％～１％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項１２０に記載の粒子。
  123. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約４９：２２：２８．５：０．５である、請求項１２０に記載の粒子。
  124. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２０％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項１２０に記載の粒子。
  125. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２５％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項１２０に記載の粒子。
  126. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５５％、Ｂ＝１０％～２０％、Ｃ＝３０％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項１２０に記載の粒子。
  127. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝１０％～１５％、Ｃ＝３５％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項１２０に記載の粒子。
  128. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、４９：１１：３８．５：１．５である、請求項１２０に記載の粒子。
  129. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝４５％～６５％、Ｂ＝５％～２０％、Ｃ＝２０％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項１２０に記載の粒子。
  130. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝５０％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４５％、及びＤ＝０％～３％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項１２０に記載の粒子。
  131. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４０％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項１２０に記載の粒子。
  132. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１０％、Ｃ＝３０％～３５％、及びＤ＝１％～２％であり、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項１２０に記載の粒子。
  133. 前記ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、５８：７：３３．５：１．５である、請求項１２０に記載の粒子。
  134. 前記ＬＮＰが、表５から選択される脂質製剤を含む、請求項１１０～１３３のいずれか１項に記載の粒子。
  135. 前記カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、前記中性脂質が、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項１１４に記載の粒子。
  136. リン脂質－ポリマー複合体をさらに含み、前記リン脂質－ポリマー複合体が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）である、請求項１１４または１３５に記載の粒子。
  137. ヒアルロナンが、前記ＬＮＰの表面と複合される、請求項１１０～１３６のいずれか１項に記載の粒子。
  138. ペイロード分子をコードする第２の組換えＲＮＡ分子をさらに含む、請求項１１０～１３６のいずれか１項に記載の粒子。
  139. 前記第２の組換えＲＮＡ分子が、レプリコンである、請求項１３８に記載の粒子。
  140. 請求項１１４～１３９のいずれか１項に記載の複数の脂質ナノ粒子を含む、治療用組成物。
  141. 前記複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４００ｎｍ～約５００ｎｍ、約４２５ｎｍ～約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ～約５００ｎｍ、または約４７５ｎｍ～約５００ｎｍの平均サイズを有する、請求項１４０に記載の治療用組成物。
  142. 前記複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約１２０ｎｍの平均サイズを有する、請求項１４０に記載の治療用組成物。
  143. 前記複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、または約１２０ｎｍの平均サイズを有する、請求項１４０に記載の治療用組成物。
  144. 前記複数のＬＮＰが、約１００ｎｍの平均サイズを有する、請求項１４０に記載の治療用組成物。
  145. 前記複数のＬＮＰが、約２０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約１０ｍＶ～約－１０ｍＶ、約５ｍＶ～約－５ｍＶ、または約２０ｍＶ～約－４０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する、請求項１４０～１４４のいずれか１項に記載の治療用組成物。
  146. 前記複数のＬＮＰが、約－２０ｍＶ未満、約－３０ｍＶ未満、約－３５ｍＶ未満、または約－４０ｍＶ未満の平均ゼータ電位を有する、請求項１４０～１４４のいずれか１項に記載の治療用組成物。
  147. 前記複数のＬＮＰが、約－５０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約－４０ｍＶ～約－２０ｍＶ、または約－３０ｍＶ～約－２０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する、請求項１４６に記載の治療用組成物。
  148. 前記複数のＬＮＰが、約－３０ｍＶ、約－３１ｍＶ、約－３２ｍＶ、約－３３ｍＶ、約－３４ｍＶ、約－３５ｍＶ、約－３６ｍＶ、約－３７ｍＶ、約－３８ｍＶ、約－３９ｍＶ、または約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する、請求項１４１または１４６に記載の治療用組成物。
  149. 対象への前記組成物の送達が、カプセル化組換えＲＮＡ分子を標的細胞に送達し、前記カプセル化組換えＲＮＡ分子が、前記標的細胞を溶解することができる感染性ウイルスを産生する、請求項１４０～１４８のいずれか１項に記載の治療組成物。
  150. 前記組成物が、静脈内または腫瘍内送達のために製剤化される、請求項１４９に記載の治療用組成物。
  151. 前記標的細胞が、がん性細胞である、請求項１５０に記載の治療用組成物。
  152. 請求項６６～９７のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、無機粒子。
  153. 前記無機粒子が、金ナノ粒子（ＧＮＰ）、金ナノロッド（ＧＮＲ）、磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）、磁気ナノチューブ（ＭＮＴ）、カーボンナノホーン（ＣＮＨ）、カーボンフラーレン、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ＣＰＮＰ）、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）、シリカナノチューブ（ＳＮＴ）、または星状中空シリカナノ粒子（ＳＨＮＰ）からなる群から選択される、請求項１５２に記載の無機粒子。
  154. ペイロード分子をコードする第２の組換えＲＮＡ分子をさらに含む、請求項１５０に記載の無機粒子。
  155. 前記第２の組換えＲＮＡ分子が、レプリコンである、請求項１５４に記載の粒子。
  156. 請求項１５２～１５５のいずれか１項に記載の無機粒子を含む組成物であって、前記粒子の平均直径が、約５００ｎｍ未満である、約５０ｎｍ～５００ｎｍである、約２５０ｎｍ～約５００ｎｍであるか、または約３５０ｎｍである、前記組成物。
  157. がん性細胞を殺傷する方法であって、前記がん性細胞を、請求項１～４９、１１０～１３９、または１５２～１５５のいずれか１項に記載の粒子、請求項６６～９７のいずれか１項に記載の組換えＲＮＡ分子またはその組成物に、前記粒子を前記がん性細胞に細胞内送達するのに十分な条件下で曝露することを含み、前記カプセル化ポリヌクレオチドによって産生される複製可能なウイルスが、前記がん性細胞の殺傷をもたらす、前記方法。
  158. 前記複製可能なウイルスが、非がん性細胞で産生されない、請求項１５７に記載の方法。
  159. 前記方法が、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで実施される、請求項１５７または１５８に記載の方法。
  160. 対象においてがんを治療する方法であって、前記がんに罹患している対象に、有効量の、請求項１～４９、１１０～１３９、または１５２～１５５のいずれか１項に記載の粒子、請求項６６～９７のいずれか１項に記載の組換えＲＮＡ粒子、またはその組成物を投与することを含む、前記方法。
  161. 前記粒子またはその組成物が、静脈内、鼻腔内、吸入剤として投与されるか、または腫瘍に直接的に注入される、請求項１６０に記載の方法。
  162. 前記粒子またはその組成物が、前記対象に繰り返し投与される、請求項１６０または１６１に記載の方法。
  163. 前記対象が、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、非ヒト霊長類、またはヒトである、請求項１６０～１６２のいずれかに記載の方法。
  164. 前記がんが、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、精巣癌、大腸癌、結腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺癌、悪性神経膠腫、神経膠芽腫、メラノーマ、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、肉腫、神経芽細胞腫、神経内分泌癌、横紋筋肉腫、髄芽細胞腫、膀胱癌、及び辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）から選択される、請求項１６０～１６３のいずれかに記載の方法。
  165. 前記肺癌が、小細胞肺癌または非小細胞肺癌である、請求項１６４に記載の方法。
  166. 前記肝臓癌が、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）である、請求項１６４に記載の方法。
  167. 前記前立腺癌が、治療中に出現する神経内分泌前立腺癌である、請求項１６４に記載の方法。
  168. 前記がんが、神経内分泌癌である、請求項１５０～１６７のいずれかに記載の方法。
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