JP2023528300A - 封入されたｒｎａレプリコンおよび使用方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、腫瘍崩壊ウイルス由来のレプリコンおよびそれらのキャプシド形成に関する。本開示はまた、ペイロード分子をコードする一つ以上の導入遺伝子のレプリコンへの組み込みに関する。本開示はさらに、腫瘍崩壊ウイルスをコードするレプリコンおよび／または組換えＲＮＡ分子の粒子へのカプセル封入、ならびにがんの治療および予防のための当該レプリコンおよび／または粒子の使用に関する。本開示は、ａ）ピコルナウイルスゲノムであって、一つ以上のタンパク質コード領域に欠失または切断を含むピコルナウイルスゲノム、およびｂ）異種ポリヌクレオチドを含む、組換えＲＮＡレプリコンを提供する。一部の実施形態では、ピコルナウイルスゲノムが、一つ以上のＶＰコード領域に欠失または切断を含む。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年５月２９日出願の米国仮出願第６３／０３２，０００号の優先権を主張し、当該仮出願の内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
配列表の参照による援用
ここで共に電子的に提出された以下のテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。配列表のコンピュータ可読形式の写し（ファイル名：ＯＮＣＲ＿０１９＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、作成日：２０２１年５月２８日、ファイルサイズ：約７７１キロバイト）。
本開示は、概して、免疫学、炎症、およびがん治療の分野に関する。より具体的には、本開示は、改善された搭載能力と、ペイロード分子をコードする異種ポリヌクレオチドとを有するウイルスレプリコン、ならびに粒子に封入されたウイルスレプリコンに関する。本開示はさらに、がん等の増殖性疾患の治療および予防に関する。
一つ以上の治療用分子に対する改善された搭載能力および／または機能性を含む、ウイルスおよび／またはウイルスレプリコンの治療的使用に関連する組成物および方法に対する当技術分野での長年にわたって要望されているニーズが依然として存在する。本開示は、このような組成物および方法、およびそれ以上を提供する。
本開示は、ａ）ピコルナウイルスゲノムであって、一つ以上のタンパク質コード領域に欠失または切断を含むピコルナウイルスゲノム、およびｂ）異種ポリヌクレオチドを含む、組換えＲＮＡレプリコンを提供する。一部の実施形態では、ピコルナウイルスゲノムが、一つ以上のＶＰコード領域に欠失または切断を含む。一部の実施形態では、ピコルナウイルスゲノムが、ＶＰ１コード領域、ＶＰ３コード領域およびＶＰ２コード領域のそれぞれに欠失または切断を含む。一部の実施形態では、ピコルナウイルスゲノムが、ＶＰ１コード領域およびＶＰ３コード領域の欠失ならびにＶＰ２コード領域の切断を含む。一部の実施形態では、ピコルナウイルスが、セネカウイルス（ｓｅｎｅｃａｖｉｒｕｓ）、カルジオウイルス、およびエンテロウイルスから選択される。一部の実施形態では、欠失または切断は、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、少なくとも２５００ｂｐ、または少なくとも３０００ｂｐを含む。一部の実施形態では、欠失または切断が、少なくとも２０００ｂｐを含む。一部の実施形態では、欠失の部位または切断の部位が、異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドが、２Ａコード領域と２Ｂコード領域との間に挿入される。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドが、３Ｄコード領域と３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との間に挿入される。一部の実施形態では、一つ以上の異種ポリヌクレオチドが、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、または少なくとも３０００ｂｐを含む。
本開示は、ａ）セネカバレーウイルス（ＳＶＶ（Ｓｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙ Ｖｉｒｕｓ））ゲノムであって、一つ以上のタンパク質コード領域に欠失または切断を含むセネカバレーウイルス（ＳＶＶ（Ｓｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙ Ｖｉｒｕｓ））ゲノムと、ｂ）異種ポリヌクレオチドとを含む、組換えＲＮＡレプリコンを提供する（すなわち、当該レプリコンがＳＶＶ由来のレプリコンである）。一部の実施形態では、欠失または切断が、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位および３４７７位のヌクレオチドの間の一つ以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、欠失または切断が、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位から３４７７位のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、欠失または切断が、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、または少なくとも２０００ｂｐを含む。一部の実施形態では、欠失または切断が、少なくとも２０００ｂｐを含む。一部の実施形態では、ＳＶＶゲノムが、５’リーダータンパク質コード配列を含む。一部の実施形態では、ＳＶＶゲノムが、ＶＰ４コード領域を含む。一部の実施形態では、ＳＶＶゲノムが、ＶＰ２コード領域またはその切断を含む。一部の実施形態では、ＳＶＶゲノムが、５’から３’方向に、５’リーダータンパク質コード配列、ＶＰ４コード領域、およびＶＰ２コード領域またはその切断を含む。一部の実施形態では、５’リーダータンパク質コード配列、ＶＰ４コード領域、およびＶＰ２コード領域またはその切断を含むＳＶＶゲノムの部分が、配列番号１の１～１２６０位のヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＳＶＶゲノムが、５’から３’方向に、５’リーダータンパク質コード配列、ＶＰ４コード領域、ＶＰ２コード領域またはその切断、および異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＳＶＶゲノムが、シス作用性複製エレメント（ＣＲＥ）を含む。一部の実施形態では、ＣＲＥが、１０～２００ｂｐを含む。一部の実施形態では、ＣＲＥが、配列番号１に従う１０００位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＣＲＥが、配列番号１に従う１１１７位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＣＲＥが、配列番号１４９に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＳＶＶゲノムが、２Ａコード領域をさらに含む。一部の実施形態では、２Ａコード領域が、ＶＰ２コード領域またはその切断と異種ポリヌクレオチドとの間に位置している。一部の実施形態では、ＳＶＶゲノムが、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、３Ｃｐｒｏコード領域、および３Ｄ（ＲｄＲｐ）コード領域のうちの一つ以上を含む。一部の実施形態では、ＳＶＶゲノムが、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、３Ｃｐｒｏコード領域、および３Ｄ（ＲｄＲｐ）コード領域を含む。一部の実施形態では、ＳＶＶゲノムが、５’から３’方向に、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、３Ｃｐｒｏコード領域、および３Ｄ（ＲｄＲｐ）コード領域を含む。一部の実施形態では、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、３Ｃｐｒｏコード領域、および３Ｄ（ＲｄＲｐ）コード領域を含むＳＶＶゲノムの部分が、配列番号１に従う３５０５位から７３１０位のヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＳＶＶゲノムが、５’から３’方向に、異種ポリヌクレオチドおよび２Ｂコード領域を含む。
本開示は、ａ）コクサッキーウイルスゲノムであって、一つ以上のタンパク質コード領域に欠失または切断を含むコクサッキーウイルスゲノム、およびｂ）異種ポリヌクレオチドを含む、組換えＲＮＡレプリコンを提供する（すなわち、当該レプリコンがコクサッキーウイルス由来のレプリコンである）。一部の実施形態では、欠失または切断が、配列番号３の番号付けに従って、上限下限を含めて、７１７位から３３３２位のヌクレオチドの間の一つ以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、欠失または切断が、配列番号３の番号付けに従って、上限下限を含めて、７１７位から３３３２位のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、欠失または切断が、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐまたは少なくとも２６００ｂｐを含む。一部の実施形態では、コクサッキーウイルスゲノムが、５’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲを含むコクサッキーウイルスゲノムの部分が、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、コクサッキーウイルスゲノムが、２Ａコード領域、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ＵＴＲのうちの一つ以上を含む。一部の実施形態では、コクサッキーウイルスゲノムが、２Ａコード領域、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、コクサッキーウイルスゲノムが、５’から３’方向に、２Ａコード領域、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、２Ａコード領域、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ＵＴＲを含むコクサッキーウイルスゲノムの部分が、配列番号３における３４９２位から７４３５位のヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、コクサッキーウイルスゲノムが、５’から３’方向に、５’ＵＴＲ、異種ポリヌクレオチドおよび２Ａコード領域を含む。
本開示は、ａ）脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ゲノムであって、一つ以上のタンパク質コード領域に欠失または切断を含む脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ゲノム、およびｂ）異種ポリヌクレオチドを含む、組換えＲＮＡレプリコンを提供する（すなわち、当該レプリコンがＥＭＣＶ由来のレプリコンである）。
一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンが、異種ポリヌクレオチドと２Ｂコード領域との間に挿入される内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ））を含む。
一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンの異種ポリヌクレオチドが、一つ以上のペイロード分子をコードする。一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンの異種ポリヌクレオチドが、二つ以上のペイロード分子をコードする。一部の実施形態では、二つ以上のペイロード分子が、一つ以上の開裂ポリペプチドによって動作可能に連結される。一部の実施形態では、当該開裂ポリペプチドが、２Ａファミリーの自己開裂ペプチド、３Ｃ開裂部位、フーリン部位、ＩＧＳＦ１ポリペプチド、またはＨＩＶプロテアーゼ部位を含む。一部の実施形態では、当該開裂ポリペプチドが、ＩＧＳＦ１ポリペプチドを含み、またＩＧＳＦ１ポリペプチドが、配列番号７５に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドが、ＨＩＶプロテアーゼ部位を含む。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドが、２Ａファミリーの自己開裂ペプチドを含む。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドが、フーリン部位を含む。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ’－ペイロード分子１－開裂ポリペプチド－ペイロード分子２－Ｃ’を含む二つ以上のペイロード分子と開裂ポリペプチドとを含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドが、ＨＩＶプロテアーゼをコードするコード領域をさらに含み、また異種ポリヌクレオチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ’－ペイロード分子１－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ＨＩＶプロテアーゼ－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ペイロード分子２－Ｃ’を含むポリペプチドをコードするコード領域を含む。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドが、第三のペイロードド分子をコードするコード領域をさらに含み、また異種ポリヌクレオチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ’－ペイロード分子１－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ＨＩＶプロテアーゼ－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ペイロード分子２－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ペイロード分子３－Ｃ’を含むポリペプチドをコードするコード領域を含む。一部の実施形態では、本開示の組換えＲＮＡレプリコンが、コードされたポリペプチドのＣ末端に開裂ポリペプチドをさらに含む。
一部の実施形態では、ペイロード分子が、蛍光タンパク質、酵素、サイトカイン、ケモカイン、抗原、細胞表面受容体に結合することができる抗原結合分子、および細胞表面受容体に対するリガンドから選択される。一部の実施形態では、ペイロード分子が、
ａ）ＩＦＮγ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、およびＩＬ－３６γを含む一つ以上のサイトカイン、
ｂ）ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、およびＣＣＬ２１を含む一つ以上のケモカイン、
ｃ）抗－ＰＤ１－ＶＨＨ－Ｆｃ抗体、抗－ＣＤ４７－ＶＨＨ－Ｆｃ抗体、および抗－ＴＧＦβ－ＶＨＨ（またはｓｃＦｖ）－Ｆｃ抗体を含む一つ以上の抗体、
ｄ）ＤＬＬ３およびエフェクター細胞標的抗原と結合する二部位ポリペプチドと、ＦＡＰおよびエフェクター細胞標的抗原と結合する二部位ポリペプチドと、ＥｐＣＡＭおよびエフェクター細胞標的抗原と結合する二部位ポリペプチドとを含む、一つ以上の二部位ポリペプチド、
ｅ）サバイビン、ＭＡＧＥファミリータンパク質、および表６に記載のすべての抗原を含む一つ以上の腫瘍関連抗原、
ｆ）一つ以上の腫瘍新生抗原、
ｇ）ＭＨＣ－ペプチド抗原複合体に結合する一つ以上の二部位ポリペプチド、
ｈ）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ） ＵＬ２７／糖タンパク質Ｂ／ｇＢ、ＨＳＶ ＵＬ５３／糖タンパク質Ｋ／ｇＫ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ） Ｆタンパク質、ＦＡＳＴｐ１５、ＶＳＶ－Ｇ、シンシチン（ｓｙｎｃｉｔｉｎ）－１（ヒト内在性レトロウイルス－Ｗ（ＨＥＲＶ－Ｗ）由来）またはシンシチン－２（ＨＥＲＶＦＲＤＥ１由来）、パラミクソウイルスＳＶ５－Ｆ、はしかウイルス－Ｈ、はしかウイルス－Ｆ、例えばテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、メーソン－ファイザーモンキーウイルス（ＭＰＭＶ）およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）等であり、任意でＲ膜貫通ペプチドが除去されている（Ｒ－バージョン）、レトロウイルスまたはレンチウイルス由来の糖タンパク質を含む一つ以上の膜融合性タンパク質、
ｉ）ＩＬ１５Ｒ、ＰＧＤＨ、ＡＤＡ、ＡＤＡ２、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＣＨＩＰＳ、ＭＬＫＬ（またはその４ＨＢドメインのみ）、ＧＳＤＭＤ（またはそのＬ１９２Ａ変異体、またはそのアミノ酸１～２３３断片、またはＬ１９２Ａ変異を有するそのアミノ酸１～２３３断片）、ＧＳＤＭＥ（またはそのアミノ酸１～２３７断片）、ＨＭＧＢ１（またはそのボックスＢドメインのみ）、メリチン（例えば、アルファ－メリチン）、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ（またはそのアミノ酸５６～２３９断片）、ヘビＬＡＡＯ、ヘビディスインテグリン、レプチン、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ガスダーミンＤまたはその切断、ガスダーミンＥまたはその切断、を含む一つ以上の他のペイロード分子、
ｊ）デングウイルス、チクングニヤウイルス、ヒト結核菌、ヒト免疫不全ウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、コロナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、トガウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、および動物ウイルス（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖｉｒｕｓ）を含む、病原体由来の一つ以上の抗原、または
ｋ）それらの任意の組み合わせ、から選択される。
一部の実施形態では、二つ以上のペイロード分子が、蛍光タンパク質、酵素、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体に結合することができる抗原結合分子、および細胞表面受容体に対するリガンドからなる群から選択される。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドが、
ＩＬ－２およびＩＬ－３６γ、
ＣＸＣＬ１０ならびにＦＡＰおよびＣＤ３に結合する抗原結合分子、
ＩＬ－２ならびにＤＬＬ３およびＣＤ３に結合する抗原結合分子、
ＩＬ－３６γならびにＤＬＬ３およびＣＤ３に結合する抗原結合分子、または
ＩＬ－２、ＩＬ－３６γならびにＤＬＬ３およびＣＤ３に結合する抗原結合分子、を含む二つ以上のペイロード分子をコードする。
一部の実施形態では、本開示の組換えＲＮＡレプリコンが、一つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含むマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）カセットをさらに含む。一部の実施形態では、一つ以上のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２１９、ｍｉＲ－２１９ａ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－１３７、およびｍｉＲ－１２６を含む。
本開示は、５’から３’方向に、プロモーター配列、５’結合部開裂配列、本開示の組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチド配列、および３’結合部開裂配列を含む、組換えＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列である。一部の実施形態では、５’結合部開裂配列がリボザイム配列であり、また３’結合部開裂配列がリボザイム配列である。一部の実施形態では、５’リボザイム配列が、ハンマーヘッド型リボザイム配列であり、また３’リボザイム配列が、デルタ型肝炎ウイルスリボザイム配列である。一部の実施形態では、５’結合部開裂配列がリボザイム配列であり、また３’結合部開裂配列が制限酵素認識配列である。一部の実施形態では、５’リボザイム配列が、ハンマーヘッド型リボザイム配列、ピストル型リボザイム配列、または改変されたピストル型リボザイム配列である。一部の実施形態では、３’制限酵素認識配列が、タイプＩＩＳ制限酵素認識配列である。一部の実施形態では、タイプＩＩＳ認識配列が、ＳａｐＩ認識配列である。一部の実施形態では、５’結合部開裂配列がＲＮＡｓｅＨプライマー結合配列であり、また３’結合部開裂配列が制限酵素認識配列である。
本開示は、本開示のＤＮＡ分子のインビトロ転写、および結果として生じる組換えＲＮＡレプリコンの精製を含む、組換えＲＮＡレプリコンを産生する方法を提供する。
本開示は、有効量の本開示の組換えＲＮＡレプリコンおよび哺乳類対象への投与に適した担体を含む組成物を提供する。
本開示は、本開示の組換えＲＮＡレプリコンを含むベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターがウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターが非ウイルスベクターである。
本開示は、本開示の組換えＲＮＡレプリコンを含む粒子を提供する。一部の実施形態では、当該粒子が、ナノ粒子、エクソソーム、リポソーム、およびリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ナノ粒子が、カチオン性脂質、一つ以上のヘルパー脂質、およびリン脂質－ポリマーコンジュゲートを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。一部の実施形態では、カチオン性脂質が、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＬＣ（旧名：ＳＳ－１８／４ＰＥ－１３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ（旧名：ＳＳ－３３／４ＰＥ－１５）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＰ、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオアート（Ｌ－３１９）、またはＮ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）から選択される。一部の実施形態では、ヘルパー脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびコレステロールから選択される。一部の実施形態では、カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、また中性脂質が、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。一部の実施形態では、リン脂質－ポリマーコンジュゲートが、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＰＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、および１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）から選択される。一部の実施形態では、リン脂質－ポリマーコンジュゲートが、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－５０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、および１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）から選択される。一部の実施形態では、カチオン性脂質が、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣを含むものであり、一つ以上のヘルパー脂質が、コレステロール（Ｃｈｏｌ）およびＤＳＰＣを含み、またリン脂質－ポリマーコンジュゲートが、ＤＰＧ－ＰＥＧ２０００を含む。一部の実施形態では、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、式中、
（ａ） Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～２５％、Ｃ＝２０％～３０％、およびＤ＝０％～３％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
（ｂ） Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝２０％～２５％、Ｃ＝２５％～３０％、およびＤ＝０％～１％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
（ｃ） Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２０％～４５％、およびＤ＝０％～３％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
（ｄ） Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２５％～４５％、およびＤ＝０％～３％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
（ｅ） Ａ＝４５％～５５％、Ｂ＝１０％～２０％、Ｃ＝３０％～４０％、およびＤ＝１％～２％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
（ｆ） Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝１０％～１５％、Ｃ＝３５％～４０％、およびＤ＝１％～２％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
（ｇ） Ａ＝４５％～６５％、Ｂ＝５％～２０％、Ｃ＝２０％～４５％、およびＤ＝０％～３％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
（ｈ） Ａ＝５０％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４５％、およびＤ＝０％～３％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
（ｉ） Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４０％、およびＤ＝１％～２％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、または
（ｊ） Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１０％、Ｃ＝３０％～３５％、およびＤ＝１％～２％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。
一部の実施形態では、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）が、約４９：２２：２８．５：０．５、約４９：１１：３８．５：１．５、または約５８：７：３３．５：１．５である。一部の実施形態では、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）が、約４９：２２：２８．５：０．５である。一部の実施形態では、カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、また中性脂質が、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。
一部の実施形態では、本開示の粒子が、リン脂質－ポリマーコンジュゲートをさらに含み、該リン脂質－ポリマーコンジュゲートは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）である。
一部の実施形態では、本開示の粒子が、腫瘍崩壊ウイルスをコードする第二の組換えＲＮＡ分子をさらに含む。一部の実施形態では、腫瘍崩壊ウイルスがピコルナウイルスである。一部の実施形態では、ピコルナウイルスが、セネカウイルス（ｓｅｎｅｃａｖｉｒｕｓ）、カルジオウイルス、およびエンテロウイルスから選択される。一部の実施形態では、ピコルナウイルスが、セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）である。一部の実施形態では、ピコルナウイルスが、コクサッキーウイルスである。一部の実施形態では、ピコルナウイルスが、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）である。
本開示は、本開示の複数の脂質ナノ粒子を含む治療用組成物を提供する。一部の実施形態では、複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約１２０ｎｍの平均サイズを有する。一部の実施形態では、複数のＬＮＰが、約１００ｎｍの平均サイズを有する。一部の実施形態では、複数のＬＮＰが、約２０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約１０ｍＶ～約－１０ｍＶ、約５ｍＶ～約－５ｍＶ、または約２０ｍＶ～約－４０ｍＶ、－５０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約－４０ｍＶ～約－２０ｍＶ、または約－３０ｍＶ～約－２０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。一部の実施形態では、複数のＬＮＰが、約－３０ｍＶ、約－３１ｍＶ、約－３２ｍＶ、約－３３ｍＶ、約－３４ｍＶ、約－３５ｍＶ、約－３６ｍＶ、約－３７ｍＶ、約－３８ｍＶ、約－３９ｍＶ、または約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。
本開示は、本開示の粒子、ベクター、組換えＲＮＡレプリコン、または組成物に対してがん性細胞を曝露することを含む、がん性細胞を死滅させる方法を提供する。一部の実施形態では、当該方法が、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで実施される。
本開示は、対象におけるがんを治療する方法を提供し、当該方法には、がんに罹患した対象に対して、治療有効量の本開示の粒子、ベクター、組換えＲＮＡレプリコンまたは組成物を投与することが含まれる。一部の実施形態では、組換え型ＲＮＡレプリコンまたはその組成物が、静脈内、鼻腔内、吸入剤として投与されるか、または腫瘍に直接注射される。一部の実施形態では、粒子、組換えＲＮＡレプリコン、またはその組成物が、対象に繰り返し投与される。一部の実施形態では、対象が、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、非ヒト霊長類、またはヒトである。
一部の実施形態では、がんが、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、前立腺がん（例えば、去勢抵抗性神経内分泌前立腺がん）、 精巣がん、結腸直腸がん、結腸がん、膵がん、肝がん、胃がん、頭頸部がん、甲状腺がん、悪性神経膠腫、膠芽腫、黒色腫、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、 肉腫、神経芽腫、神経内分泌がん、横紋筋肉腫、髄芽腫、膀胱がん、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、メルケル細胞がん、および腎細胞がんから選択される。一部の実施形態では、肺がんが、小細胞肺がんまたは非小細胞肺がんであり、肝がんが、肝細胞がん（ＨＣＣ）であり、および／または前立腺がんが、治療下で発現した神経内分泌前立腺がんである。一部の実施形態では、がんが、神経内分泌がんである。
本開示は、疾患に対して対象を免疫する方法を提供し、当該方法には、対象に、治療有効量の本開示の粒子、ベクター、組換えＲＮＡレプリコンまたは組成物を投与することが含まれる。一部の実施形態では、粒子、組換えＲＮＡレプリコンまたはその組成物が、静脈内に、筋肉内に、皮内に、鼻腔内に、または吸入剤として投与される。一部の実施形態では、粒子、組換えＲＮＡレプリコン、またはその組成物が、対象に繰り返し投与される。一部の実施形態では、疾患が、感染症である。一部の実施形態では、当該感染症が、デングウイルス、チクングニヤウイルス、ヒト結核菌、ヒト免疫不全ウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、コロナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、トガウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、および動物ウイルス（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖｉｒｕｓ）を含む病原体のうちのひとつに起因する。
本開示は、ピコルナウイルスゲノムおよび異種ポリヌクレオチドを含む組換えＲＮＡレプリコンを提供する。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドが、２Ａコード領域と２Ｂコード領域との間に挿入される。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドが、５’ＵＴＲと２Ａコード領域との間に挿入される。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドが、３Ｄコード領域と３’ＵＴＲとの間に挿入される。一部の実施形態では、ピコルナウイルスが、セネカウイルス（ｓｅｎｅｃａｖｉｒｕｓ）、カルジオウイルス、およびエンテロウイルスから選択される。
図１は、野生型ＳＶＶウイルスゲノムおよび例示的なＳＶＶ由来の組換えＲＮＡレプリコンを示す概略図である。
図２は、様々な長さの異種ポリヌクレオチドを含むＳＶＶのウイルス複製速度を示す一連のグラフである。
図３Ａは、ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子を有する様々なＳＶＶ由来の組換えＲＮＡレプリコン構築物を示す概略図である。図３Ｂは、レプリコンでトランスフェクトしたＨ１２９９細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す一連の撮像図である。 図３Ａは、ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子を有する様々なＳＶＶ由来の組換えＲＮＡレプリコン構築物を示す概略図である。図３Ｂは、レプリコンでトランスフェクトしたＨ１２９９細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す一連の撮像図である。
図４Ａは、Ｔｒｕｎｃ５レプリコンおよび／または野生型ＳＶＶウイルスゲノムでトランスフェクトしたＨ１２９９細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す一連の撮像図である。図４Ｂは、ウイルス力価を評価するためのＨ４４６細胞におけるＩＣ５０アッセイの結果を示すグラフを含む。 図４Ａは、Ｔｒｕｎｃ５レプリコンおよび／または野生型ＳＶＶウイルスゲノムでトランスフェクトしたＨ１２９９細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す一連の撮像図である。図４Ｂは、ウイルス力価を評価するためのＨ４４６細胞におけるＩＣ５０アッセイの結果を示すグラフを含む。
図５Ａは、ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子を有する様々なＳＶＶ由来の組換えＲＮＡレプリコン構築物を示す概略図である。図５Ｂは、インビトロでのＴ７ ＲＮＡ合成の結果を示すゲル画像である。図５Ｃは、各レプリコンでトランスフェクトした細胞のｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示す一連の撮像図である。 図５Ａは、ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子を有する様々なＳＶＶ由来の組換えＲＮＡレプリコン構築物を示す概略図である。図５Ｂは、インビトロでのＴ７ ＲＮＡ合成の結果を示すゲル画像である。図５Ｃは、各レプリコンでトランスフェクトした細胞のｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示す一連の撮像図である。 図５Ａは、ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子を有する様々なＳＶＶ由来の組換えＲＮＡレプリコン構築物を示す概略図である。図５Ｂは、インビトロでのＴ７ ＲＮＡ合成の結果を示すゲル画像である。図５Ｃは、各レプリコンでトランスフェクトした細胞のｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示す一連の撮像図である。
図６Ａは、野生型ＳＶＶウイルスゲノム、およびｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子を担持するＳＶＶ由来の組換えＲＮＡレプリコンを示す概略図である。図６Ｂは、異なるレポーター遺伝子を担持するＳＶＶ由来の組換えＲＮＡレプリコンＴｒｕｎｃ１０を示す概略図である。 図６Ａは、野生型ＳＶＶウイルスゲノム、およびｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子を担持するＳＶＶ由来の組換えＲＮＡレプリコンを示す概略図である。図６Ｂは、異なるレポーター遺伝子を担持するＳＶＶ由来の組換えＲＮＡレプリコンＴｒｕｎｃ１０を示す概略図である。
図７Ａは、マウスＩＬ－２ペイロードをコードする導入遺伝子を担持するＳＶＶ－レプリコンＴｒｕｎｃ１０を示す概略図である。図７Ｂは、ｍＩＬ－２発現の結果を示す二つのグラフを含む。図７Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図７Ａは、マウスＩＬ－２ペイロードをコードする導入遺伝子を担持するＳＶＶ－レプリコンＴｒｕｎｃ１０を示す概略図である。図７Ｂは、ｍＩＬ－２発現の結果を示す二つのグラフを含む。図７Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図７Ａは、マウスＩＬ－２ペイロードをコードする導入遺伝子を担持するＳＶＶ－レプリコンＴｒｕｎｃ１０を示す概略図である。図７Ｂは、ｍＩＬ－２発現の結果を示す二つのグラフを含む。図７Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。
図８Ａは、シグナル配列を有するおよびシグナル配列を有さない、単鎖ｍＩＬ－１２（ｓｃｍＩＬ－１２）をコードする導入遺伝子を担持するＳＶＶ－レプリコンＴｒｕｎｃ１０を示す概略図である。図８Ｂは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。図８Ｃは、マウスＩＬ－１２の発現を示す二つのグラフを含む。 図８Ａは、シグナル配列を有するおよびシグナル配列を有さない、単鎖ｍＩＬ－１２（ｓｃｍＩＬ－１２）をコードする導入遺伝子を担持するＳＶＶ－レプリコンＴｒｕｎｃ１０を示す概略図である。図８Ｂは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。図８Ｃは、マウスＩＬ－１２の発現を示す二つのグラフを含む。 図８Ａは、シグナル配列を有するおよびシグナル配列を有さない、単鎖ｍＩＬ－１２（ｓｃｍＩＬ－１２）をコードする導入遺伝子を担持するＳＶＶ－レプリコンＴｒｕｎｃ１０を示す概略図である。図８Ｂは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。図８Ｃは、マウスＩＬ－１２の発現を示す二つのグラフを含む。
図９Ａは、天然のシグナル配列を有するまたはＩＬ２シグナル配列を有する、ヒトＩＬ－３６γをコードする導入遺伝子を担持するＳＶＶ－レプリコンＴｒｕｎｃ１０を示す概略図である。図９Ｂは、トランスフェクションまたはトランスキャプシド形成後のｈＩＬ－３６γの分泌を示す二つのグラフを含む。図９Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示す二つのグラフを含む。 図９Ａは、天然のシグナル配列を有するまたはＩＬ２シグナル配列を有する、ヒトＩＬ－３６γをコードする導入遺伝子を担持するＳＶＶ－レプリコンＴｒｕｎｃ１０を示す概略図である。図９Ｂは、トランスフェクションまたはトランスキャプシド形成後のｈＩＬ－３６γの分泌を示す二つのグラフを含む。図９Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示す二つのグラフを含む。 図９Ａは、天然のシグナル配列を有するまたはＩＬ２シグナル配列を有する、ヒトＩＬ－３６γをコードする導入遺伝子を担持するＳＶＶ－レプリコンＴｒｕｎｃ１０を示す概略図である。図９Ｂは、トランスフェクションまたはトランスキャプシド形成後のｈＩＬ－３６γの分泌を示す二つのグラフを含む。図９Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示す二つのグラフを含む。
図１０Ａは、単一のペイロードの下流にある脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳが組み込まれたバイシストロニックなレプリコンを示す概略図である。図１０Ｂは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図１０Ａは、単一のペイロードの下流にある脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳが組み込まれたバイシストロニックなレプリコンを示す概略図である。図１０Ｂは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。
図１１Ａは、第一のペイロードと第二のペイロード（ｅＧＦＰ）との間のフーリン－Ｔ２Ａ部位によって分離された複数のペイロードの下流にある脳性心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳが組み込まれたジシストロニックな二重ペイロードレプリコンを示す概略図である。図１１Ｂは、感染２４時間後のｍＣｈｅｒｒｙおよびＧＦＰの発現を示す一連の画像である。 図１１Ａは、第一のペイロードと第二のペイロード（ｅＧＦＰ）との間のフーリン－Ｔ２Ａ部位によって分離された複数のペイロードの下流にある脳性心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳが組み込まれたジシストロニックな二重ペイロードレプリコンを示す概略図である。図１１Ｂは、感染２４時間後のｍＣｈｅｒｒｙおよびＧＦＰの発現を示す一連の画像である。
図１２Ａは、二重ペイロードレプリコンであって、ＲｄＲｐと３’ＵＴＲとの間の当該レプリコンの３’末端において第二のペイロードが組み込まれた二重ペイロードレプリコンを示す概略図である。図１２Ｂは、トランスフェクション後のｈＩＬ－３６γの分泌を示すグラフである。図１２Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図１２Ａは、二重ペイロードレプリコンであって、ＲｄＲｐと３’ＵＴＲとの間の当該レプリコンの３’末端において第二のペイロードが組み込まれた二重ペイロードレプリコンを示す概略図である。図１２Ｂは、トランスフェクション後のｈＩＬ－３６γの分泌を示すグラフである。図１２Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図１２Ａは、二重ペイロードレプリコンであって、ＲｄＲｐと３’ＵＴＲとの間の当該レプリコンの３’末端において第二のペイロードが組み込まれた二重ペイロードレプリコンを示す概略図である。図１２Ｂは、トランスフェクション後のｈＩＬ－３６γの分泌を示すグラフである。図１２Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。
図１３Ａは、ｈｉｓタグ付き１ＤＬＴ１７６－ＭＴＴ１０－ＤＬＬ３－ＶＨＨ－ＣＤ３ ＬｉＴＥの発現を分析する抗Ｈｉｓウェスタンブロットである。図１３Ｂは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図１３Ａは、ｈｉｓタグ付き１ＤＬＴ１７６－ＭＴＴ１０－ＤＬＬ３－ＶＨＨ－ＣＤ３ ＬｉＴＥの発現を分析する抗Ｈｉｓウェスタンブロットである。図１３Ｂは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。
図１４Ａは、ｈｉｓタグ付きｒＤＬＬ３－αＣＤ３－ＢｉＴＥの発現を分析する抗Ｈｉｓウェスタンブロットである。図１４Ｂは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図１４Ａは、ｈｉｓタグ付きｒＤＬＬ３－αＣＤ３－ＢｉＴＥの発現を分析する抗Ｈｉｓウェスタンブロットである。図１４Ｂは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。
図１５Ａは、ｈｉｓタグ付き抗ｍＦＡＰ ＢｉＴＥとＣＸＣＬ１０との間の代替的な開裂ペプチド（３Ｃ、またはフーリン－３Ｃ、またはフーリンＴ２Ａ）を含むＴｒｕｎｃ１０レプリコンを示す概略図である。図１５Ｂは、ＣＸＣＬ１０の発現の結果を示すグラフである。図１５Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図１５Ａは、ｈｉｓタグ付き抗ｍＦＡＰ ＢｉＴＥとＣＸＣＬ１０との間の代替的な開裂ペプチド（３Ｃ、またはフーリン－３Ｃ、またはフーリンＴ２Ａ）を含むＴｒｕｎｃ１０レプリコンを示す概略図である。図１５Ｂは、ＣＸＣＬ１０の発現の結果を示すグラフである。図１５Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図１５Ａは、ｈｉｓタグ付き抗ｍＦＡＰ ＢｉＴＥとＣＸＣＬ１０との間の代替的な開裂ペプチド（３Ｃ、またはフーリン－３Ｃ、またはフーリンＴ２Ａ）を含むＴｒｕｎｃ１０レプリコンを示す概略図である。図１５Ｂは、ＣＸＣＬ１０の発現の結果を示すグラフである。図１５Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。
図１６Ａは、ｈｉｓタグ付き抗ｍＦＡＰ ＢｉＴＥとＣＸＣＬ１０との間の代替的な開裂ペプチド（Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、またはＥ２Ａ）を含むＴｒｕｎｃ１０レプリコンを示す概略図である。図１６Ｂは、ＣＸＣＬ１０の発現の結果を示すグラフである。図１６Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図１６Ａは、ｈｉｓタグ付き抗ｍＦＡＰ ＢｉＴＥとＣＸＣＬ１０との間の代替的な開裂ペプチド（Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、またはＥ２Ａ）を含むＴｒｕｎｃ１０レプリコンを示す概略図である。図１６Ｂは、ＣＸＣＬ１０の発現の結果を示すグラフである。図１６Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図１６Ａは、ｈｉｓタグ付き抗ｍＦＡＰ ＢｉＴＥとＣＸＣＬ１０との間の代替的な開裂ペプチド（Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、またはＥ２Ａ）を含むＴｒｕｎｃ１０レプリコンを示す概略図である。図１６Ｂは、ＣＸＣＬ１０の発現の結果を示すグラフである。図１６Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。
図１７Ａは、ＩＧＳＦ１ポリペプチド（配列番号７５および７６）によって作動可能に連結された二重ペイロード分子をコードするレプリコンポリヌクレオチドの構成を示す概略図である。図１７Ｂは、ＩＬ－３６γの発現の結果を示すグラフである。図１７Ｃは、ＩＬ－２の発現の結果を示すグラフである。図１７Ｄは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図１７Ａは、ＩＧＳＦ１ポリペプチド（配列番号７５および７６）によって作動可能に連結された二重ペイロード分子をコードするレプリコンポリヌクレオチドの構成を示す概略図である。図１７Ｂは、ＩＬ－３６γの発現の結果を示すグラフである。図１７Ｃは、ＩＬ－２の発現の結果を示すグラフである。図１７Ｄは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図１７Ａは、ＩＧＳＦ１ポリペプチド（配列番号７５および７６）によって作動可能に連結された二重ペイロード分子をコードするレプリコンポリヌクレオチドの構成を示す概略図である。図１７Ｂは、ＩＬ－３６γの発現の結果を示すグラフである。図１７Ｃは、ＩＬ－２の発現の結果を示すグラフである。図１７Ｄは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図１７Ａは、ＩＧＳＦ１ポリペプチド（配列番号７５および７６）によって作動可能に連結された二重ペイロード分子をコードするレプリコンポリヌクレオチドの構成を示す概略図である。図１７Ｂは、ＩＬ－３６γの発現の結果を示すグラフである。図１７Ｃは、ＩＬ－２の発現の結果を示すグラフである。図１７Ｄは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。
図１８Ａは、同一のオープンリーディングフレームにおける分泌された二つのペイロードのＨＩＶ－１プロテアーゼ媒介処理の概略図を示す。図１８Ｂは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。図１８Ｃは、両方のペイロードの発現の結果を示す二つのグラフを含む。 図１８Ａは、同一のオープンリーディングフレームにおける分泌された二つのペイロードのＨＩＶ－１プロテアーゼ媒介処理の概略図を示す。図１８Ｂは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。図１８Ｃは、両方のペイロードの発現の結果を示す二つのグラフを含む。 図１８Ａは、同一のオープンリーディングフレームにおける分泌された二つのペイロードのＨＩＶ－１プロテアーゼ媒介処理の概略図を示す。図１８Ｂは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。図１８Ｃは、両方のペイロードの発現の結果を示す二つのグラフを含む。
図１９Ａは、ＢｉＴＥおよびｈＩＬ－３６γを含む二重ペイロードレプリコンを示す概略図である。図１９Ｂは、ｈＩＬ－３６γの発現の結果を示すグラフである。図１９Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図１９Ａは、ＢｉＴＥおよびｈＩＬ－３６γを含む二重ペイロードレプリコンを示す概略図である。図１９Ｂは、ｈＩＬ－３６γの発現の結果を示すグラフである。図１９Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図１９Ａは、ＢｉＴＥおよびｈＩＬ－３６γを含む二重ペイロードレプリコンを示す概略図である。図１９Ｂは、ｈＩＬ－３６γの発現の結果を示すグラフである。図１９Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。
図２０Ａは、三重ペイロードレプリコンＴ１０－ＢｉＴＥ－ＩＬ３ｇ６－ＩＬ２を示す概略図である。図２０Ｂは、ｈＩＬ－３６およびｍＩＬ－２の発現を示す二つのグラフを含む。図２０Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図２０Ａは、三重ペイロードレプリコンＴ１０－ＢｉＴＥ－ＩＬ３ｇ６－ＩＬ２を示す概略図である。図２０Ｂは、ｈＩＬ－３６およびｍＩＬ－２の発現を示す二つのグラフを含む。図２０Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図２０Ａは、三重ペイロードレプリコンＴ１０－ＢｉＴＥ－ＩＬ３ｇ６－ＩＬ２を示す概略図である。図２０Ｂは、ｈＩＬ－３６およびｍＩＬ－２の発現を示す二つのグラフを含む。図２０Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。
図２１Ａは、三重ペイロードレプリコンＴ１０－ｍＩＬ２－ＢｉＴＥ－ｈＩＬ－３６γの代替的な設計を示す概略図である。図２１Ｂは、ｈＩＬ－３６およびｍＩＬ－２の発現を示す二つのグラフを含む。図２１Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図２１Ａは、三重ペイロードレプリコンＴ１０－ｍＩＬ２－ＢｉＴＥ－ｈＩＬ－３６γの代替的な設計を示す概略図である。図２１Ｂは、ｈＩＬ－３６およびｍＩＬ－２の発現を示す二つのグラフを含む。図２１Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。 図２１Ａは、三重ペイロードレプリコンＴ１０－ｍＩＬ２－ＢｉＴＥ－ｈＩＬ－３６γの代替的な設計を示す概略図である。図２１Ｂは、ｈＩＬ－３６およびｍＩＬ－２の発現を示す二つのグラフを含む。図２１Ｃは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。
図２２Ａは、三重ペイロードレプリコンＴ１０－ｍＩＬ２－ｈＩＬ－３６γ－ＢｉＴＥの別の設計を示す概略図である。図２２Ｂは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。図２２Ｃは、上清および溶解物中のｈＩＬ－３６およびｍＩＬ－２の発現を示す一連のグラフである。 図２２Ａは、三重ペイロードレプリコンＴ１０－ｍＩＬ２－ｈＩＬ－３６γ－ＢｉＴＥの別の設計を示す概略図である。図２２Ｂは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。図２２Ｃは、上清および溶解物中のｈＩＬ－３６およびｍＩＬ－２の発現を示す一連のグラフである。 図２２Ａは、三重ペイロードレプリコンＴ１０－ｍＩＬ２－ｈＩＬ－３６γ－ＢｉＴＥの別の設計を示す概略図である。図２２Ｂは、ＴａｑＭａｎアッセイにより分析したＲＮＡコピー数の結果を示すグラフである。図２２Ｃは、上清および溶解物中のｈＩＬ－３６およびｍＩＬ－２の発現を示す一連のグラフである。
図２３Ａは、ＮＣＩ－Ｈ６９細胞由来のマウスモデルにおけるインビボでのｈＩＬ－３６γ発現の結果を示すグラフである。図２３Ｂは、ＮＣＩ－Ｈ４４６細胞由来のマウスモデルにおけるインビボでのｈＩＬ－３６γ発現の結果を示すグラフである。 図２３Ａは、ＮＣＩ－Ｈ６９細胞由来のマウスモデルにおけるインビボでのｈＩＬ－３６γ発現の結果を示すグラフである。図２３Ｂは、ＮＣＩ－Ｈ４４６細胞由来のマウスモデルにおけるインビボでのｈＩＬ－３６γ発現の結果を示すグラフである。
図２４は、野生型コクサッキーウイルスゲノム、およびｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子を担持する例示的なコクサッキーウイルス由来の組換えＲＮＡレプリコンを示す概略図である。
図２５Ａは、レプリコンおよび／または対照ベクターでトランスフェクトした細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙおよびＧＦＰの発現を示す一連の画像である。図２５Ｂは、野生型ウイルスゲノムとの同時トランスフェクションにおけるレプリコンのトランスキャプシド形成を実証する、ｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す二つの画像を含む。 図２５Ａは、レプリコンおよび／または対照ベクターでトランスフェクトした細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙおよびＧＦＰの発現を示す一連の画像である。図２５Ｂは、野生型ウイルスゲノムとの同時トランスフェクションにおけるレプリコンのトランスキャプシド形成を実証する、ｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す二つの画像を含む。
図２６は、ＳＶＶ由来のレプリコンおよびＮｅｇ－ＲＮＡに対するインビトロでの転写プロセスを示す図である。５’および３’のリボザイム（Ｒｉｂ）によるＳＶＶ由来レプリコンの自己触媒的開裂が、複製に必要な分離した５’末端および３’末端を有するＳＶＶ由来レプリコンを生成する。対照的に、Ｎｅｇ－ＲＮＡ構築物はリボザイム配列を欠いており、複製およびウイルス粒子産生をすることができない。
図２７は、レプリコンの天然の５’末端および３’末端の分離を維持するために、ゲノム転写物から非ウイルス性ＲＮＡポリヌクレオチドを除去する結合部開裂配列の使用を示す図である。
図２８Ａ～２８Ｂは、分離した５’末端を生成するためのハンマーヘッド型リボザイムを示す概略図である。図２８Ａは、矢印が示す５’末端でアニーリングおよび開裂する、最小のハンマーヘッド型リボザイム（ＨＨＲ）（配列番号１０８）の構造モデルを示す概略図である。図２８Ｂは、矢印が示す５’末端の開裂のための安定化されたステムＩ（ＳＴＢＬ）を有するリボザイム（配列番号１０９）の構造モデルを示す概略図である。
図２９Ａ～２９Ｂは、分離した５’末端を生成するためのピストル型リボザイムを示す概略図である。図２９Ａは、野生型のピストル型リボザイム（配列番号１１０、１１１）の特徴を示す概略図である。図２９Ｂは、ｍＦＯＬＤによりモデル化されたＰ３鎖を融合するように付加されたテトラループをもつ、パエニバシラス・ポリミキサ（Ｐ．Ｐｏｌｙｍｙｘａ）由来のピストル型リボザイム（配列番号１１２）を示す概略図である。破線の四角は、ウイルス配列との関連でリボザイムの折り畳みを保持するように変異された領域である。破線の四角で示される“ＧＵＣ”配列を“ＵＣＡ”に変異させて、ピストル型１を生成し、また“ＧＵＣ”配列を“ＴＴＡ”に変異させてピストル型２を生成した。 図２９Ａ～２９Ｂは、分離した５’末端を生成するためのピストル型リボザイムを示す概略図である。図２９Ａは、野生型のピストル型リボザイム（配列番号１１０、１１１）の特徴を示す概略図である。図２９Ｂは、ｍＦＯＬＤによりモデル化されたＰ３鎖を融合するように付加されたテトラループをもつ、パエニバシラス・ポリミキサ（Ｐ．Ｐｏｌｙｍｙｘａ）由来のピストル型リボザイム（配列番号１１２）を示す概略図である。破線の四角は、ウイルス配列との関連でリボザイムの折り畳みを保持するように変異された領域である。破線の四角で示される“ＧＵＣ”配列を“ＵＣＡ”に変異させて、ピストル型１を生成し、また“ＧＵＣ”配列を“ＴＴＡ”に変異させてピストル型２を生成した。
腫瘍崩壊ウイルスは、腫瘍細胞を感染および溶解することができる溶解のライフサイクルを有する複製可能なウイルスである。直接的な腫瘍細胞溶解により、細胞死だけでなく、局所抗原提示細胞によって取り込まれて提示される、腫瘍抗原に対する適応免疫応答の生成も結果として生じる。したがって、腫瘍崩壊ウイルスは、直接的な細胞溶解と、ウイルスクリアランス後に抗腫瘍応答を維持する能力を持つ抗原特異的適応応答を促進することとの両方を介して、腫瘍細胞の増殖を減少させようとする。
腫瘍崩壊ウイルスは、ペイロード分子を発現するように遺伝子操作することができるが、これは例えば所望のペイロードタンパク質をウイルスゲノムにコードする異種ポリヌクレオチドを組み込むことによる。しかしながら、ウイルスキャプシドタンパク質のパッケージング能力により、ウイルスの複製速度、封入、および／または機能を損なうことなく、限定された長さのポリヌクレオチドのみを完全なウイルスゲノムに組み込むことができる。さらに、単一の合成ウイルスゲノムまたはウイルスレプリコンからの複数の機能的ペイロード分子の発現は、困難であり得る。ペイロード分子の組み込みにおけるこれら制限により、転移性がんの治療の際にウイルス治療薬の使用が制限される。
当技術分野で、抗がん治療剤等の様々な治療剤に使用することができる、ペイロード分子をコードする異種ポリヌクレオチドの組み込みに関して向上した能力を含む、腫瘍崩壊ウイルス由来のレプリコンが要望されている。異種配列は、本明細書でペイロード分子と称され得る一つ以上の分子をコードすることができる。一部の実施形態では、本開示のペイロード配列およびペイロード分子は、ウイルス機能を媒介しない。一部の実施形態では、本開示のペイロード配列およびペイロード分子は、ペイロード配列またはペイロード分子の発現のためのウイルス複製の投与を意図する対象または細胞の種と合致するまたは相同である種から単離されてもよく、または当該種が由来であってもよい。異種配列は、コード核酸配列または非コード核酸配列、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、アミノ酸配列、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせのうちの一つ以上をコードすることができる。
本開示は、ペイロード分子をコードする異種ポリヌクレオチドの組み込みに関して向上した能力を有するピコルナウイルスゲノムに由来する組換えＲＮＡレプリコンを提供する。一部の実施形態では、本開示の組換えＲＮＡレプリコンは、同一レプリコンから二つ以上の機能性ペイロード分子を発現する。二つ以上のペイロード分子を発現するレプリコンの例示的な構成を記載している。本開示は、組換えＲＮＡレプリコンを含む粒子をさらに提供する。一部の実施形態では、粒子は、完全なウイルスゲノムをさらに含む。一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、完全なウイルスゲノムにより発現したキャプシドタンパク質によりトランスキャプシド形成され得る。一部の実施形態では、細胞を当該粒子と接触させることにより、一方が組換えＲＮＡレプリコンを含み、もう一方が完全なウイルスゲノムを含む、感染性ウイルス粒子の二つの群の産生が可能となる。一部の実施形態では、いずれの群のウイルス粒子も、一緒に細胞を感染させることが可能であり、これがインビボまたはインビトロのいずれでも、両群のウイルス粒子の継続的な産生を可能にする。一部の実施形態では、本開示は、増殖性疾患および障害（例えば、がん）の治療および予防のための組換えＲＮＡレプリコンおよび使用方法を提供する。本開示は、広範な増殖性疾患（例えば、がん）を治療するのに好適な有効な組換えＲＮＡレプリコンの全身送達を可能にする。
本明細書において使用されるセクション見出しは、単に構成的な目的のためであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事、書籍、および論文を含むがこれに限定されない、本明細書で引用するすべての文書または文書の部分は、任意の目的のためにその全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる。一つ以上の組み込まれた文書または文書の部分が、その用語の本願での定義と矛盾する用語を定義する場合、本願で登場した定義に従う。しかし、本明細書で引用されるあらゆる参考文献、記事、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、それらが有効な従来技術を構成している、または世界のどの国においても共通の常識の一部を形成していることの承認、または何らかの形の示唆としているのではないものであり、またそのように解釈するべきではない。
組換えＲＮＡレプリコン
ピコルナウイルスゲノムは、保存された４－３－４形式に従うものであり、当該形式では単一のポリタンパク質が、ウイルスがコードされたプロテアーゼによって、５’リーダータンパク質（一部の種でのみ存在する）、四つの構造タンパク質、および七つ（３＋４）の非構造タンパク質へと開裂される。ピコルナウイルスゲノムは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）で始まり、また内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。ＩＲＥＳに隣接して、５’リーダータンパク質は、翻訳されたピコルナウイルスポリタンパク質の５’末端に位置するプロテアーゼであるが、それはピコルナウイルス科のすべてのメンバーに存在するわけではない。これにポリタンパク質のＰ１領域が続くが、これは、カプシドタンパク質ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ１の順にそれぞれをコードする。これらタンパク質は、ＶＰ４コード領域、ＶＰ２コード領域、ＶＰ３コード領域、およびＶＰ１コード領域によってそれぞれコードされる（これら四つのコード領域を総称して、「ＶＰコード領域」と呼ぶ）。翻訳されたポリタンパク質のＰ２領域は、２Ａ、２Ｂおよび２Ｃからなる。ピコルナウイルス２Ａは、ピコルナウイルスゲノムにおいて、複数のコピー内に存在する場合もあれば、存在しない場合もあり得るタンパク質である。ピコルナウイルスポリタンパク質の最終セグメントは、３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄを含むＰ３である。ＶＰｇとしても知られる３Ｂは、ゲノムの５’末端と結合し、そしてゲノム複製において重要な役割を果たす低分子タンパク質である。３Ｃによりコードされたプロテアーゼが、ピコルナウイルスポリタンパク質のほとんどの開裂を行うだけでなく、宿主転写を阻害する。ピコルナウイルスタンパク質のうち最後のものは、３Ｄであり、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）である。ピコルナウイルスの３’ＵＴＲは、典型的にはポリＡ尾部を有する。
本開示は、ピコルナウイルスゲノムであって、一つ以上のコード領域に欠失および／または切断を含むピコルナウイルスゲノムを含む、組換えＲＮＡレプリコンを提供する。一部の実施形態では、コード領域は、構造タンパク質（ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ１）をコードする。一部の実施形態では、当該レプリコンのピコルナウイルスゲノムは、ＶＰコード領域の全ての欠失を含む。一部の実施形態では、当該レプリコンのピコルナウイルスゲノムは、ＶＰ１コード領域、ＶＰ３コード領域およびＶＰ２コード領域のそれぞれに欠失および／または切断を含む。一部の実施形態では、当該レプリコンのピコルナウイルスゲノムは、ＶＰ１コード領域およびＶＰ３コード領域の欠失ならびにＶＰ２コード領域の切断を含む。一部の実施形態では、ピコナウイルスゲノムのＶＰコード領域内の欠失および切断は、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、少なくとも２５００ｂｐ、または少なくとも３０００ｂｐを含む。一部の実施形態では、ピコルナウイルスゲノムのＶＰコード領域内の合計の欠失および切断は、少なくとも２０００ｂｐである。
一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、一つ以上の異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、欠失または切断の部位に挿入される。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドが、２Ａコード領域と２Ｂコード領域との間に挿入される。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、３Ｄ（ＲｄＲｐ）コード領域と３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との間に挿入される。一部の実施形態では、一つ以上の異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、または少なくとも３０００ｂｐを含む。
一部の実施形態では、ピコルナウイルスゲノムは、セネカウイルス（ｓｅｎｅｃａｖｉｒｕｓ）ゲノム、カルジオウイルスゲノム、エンテロウイルスゲノム、およびアフトウイルスゲノムから選択される。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、カルジオウイルス、コサウイルス、エンテロウイルス、ヘパトウイルス、コブウイルス、パレコウイルス、ロサウイルス、サリウイルス、パシウイルス、セネカウイルス、およびそれらのキメラウイルスゲノムから選択されるピコルナウイルスに由来する。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、ヒトライノウイルス、ＨＲＶ（配列番号５；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｋ０２１２１．１）、ポリオウイルス、ＰＶ（配列番号６；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１１１９８４．２）、コクサッキーウイルスＡ、ＣＶＡ（配列番号７；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ５４６７０２．１）、ウシエンテロウイルス、ＢＥＶ（配列番号８；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１８５９．１）、エンテロウイルス７１、ＥＶ７１（配列番号９；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＫＪ６８６３０８．１）、エコーウイルス、ＥＣＨＯ（配列番号１０；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０２９８５９．２）、口蹄ウイルス（Ｆｏｏｔ－ａｎｄ－Ｍｏｕｔｈ ｖｉｒｕｓ）、ＦＭＤＶ（配列番号１１；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＤＱ９８９３２３．１）、セネカバレーウイルス、ＳＶＶ（配列番号１２；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿０１１３４９．１）、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス、ＴＭＥＶ（配列番号１３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２０３０１．１）、メンゴウイルス、ＭＥＶ（配列番号１４；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２２０８９．１）、脳心筋炎、ＥＭＣＶ（配列番号１５；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７４３１２．１）－各ウイルスのＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、括弧内に示されている－、から選択されるピコルナウイルスに由来する。一部の実施形態では、ピコルナウイルスゲノムは、セネカバレーウイルスゲノムである。一部の実施形態では、ピコルナウイルスゲノムは、コクサッキーウイルスゲノムである。一部の実施形態では、ピコルナウイルスゲノムは、脳心筋炎ウイルスゲノムである。一部の実施形態では、ピコルナウイルスゲノムは、ポリオウイルスゲノム（例えばＰＶＳ－ＲＩＰＯ等のキメラポリオウイルスを含む）である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組換えＲＮＡレプリコンは、キメラピコルナウイルスゲノム（例えば、第一のピコルナウイルスに由来する、キャプシドタンパク質またはＩＲＥＳ等である一部分、および第二のピコルナウイルスに由来する非構造プロテアーゼまたはポリメラーゼコード領域等である別の部分を含むウイルスゲノム）を含む。
一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、プラス鎖および／またはマイナス鎖のＲＮＡ合成のための能力を保持する。一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンのプラス鎖および／またはマイナス鎖のＲＮＡ合成の速度は、対応する野生型ウイルスゲノムの合成速度の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％である。
一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、野生型ウイルスゲノムに匹敵するウイルス複製速度を保持する。一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンのウイルス複製速度は、対応する野生型ウイルスゲノムのウイルス複製速度の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％である。
一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、組換えリボ核酸（ＲＮＡ）として提供される。一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、一つ以上の核酸類似体を含む。核酸類似体の例としては、２’－Ｏ－メチル置換ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシ－エチル塩基、２’フルオロ塩基、ロック核酸（ＬＮＡ）、アンロック核酸（ＵＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、モルホリノ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、環状ＲＮＡ分子（ｃｉｒｃＲＮＡ）または一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である。一部の実施形態では、一本鎖ＲＮＡは、プラス鎖またはマイナス鎖である。
一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、環状ＲＮＡ分子（ｃｉｒｃＲＮＡ）である。ｃｉｒｃＲＮＡ分子は、エキソヌクレアーゼ媒介性の分解に必要な遊離末端を欠いているため、ＲＮＡ分子の半減期を延長し、また経時的により安定したタンパク質産生を可能にする。ｃｉｒｃＲＮＡ分子から機能性ＲＮＡレプリコンを産生するためには、細胞内で一度円形構築物を「開裂」することで、適切な天然の３’末端および５’末端を有する直線状ＲＮＡレプリコンを産生できるようにする必要がある。したがって、一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、ｃｉｒｃＲＮＡ分子として提供され、そして細胞内のｃｉｒｃＲＮＡ分子の直線化を促進する一つ以上の追加的なＲＮＡ配列をさらに含む。こうした追加的なＲＮＡ配列の例としては、ｓｉＲＮＡ標的部位、ｍｉＲＮＡ標的部位、およびガイドＲＮＡ標的部位が挙げられる。対応するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｇＲＮＡは、ｃｉｒｃＲＮＡ分子と共に製剤化することができる。あるいは、標的細胞における同族ｍｉＲＮＡの発現に基づいてｍｉＲＮＡ標的部位を選択することができ、それにより、ｃｉｒｃＲＮＡ分子の開裂およびレプリコンの複製が、特定のｍｉＲＮＡを発現する標的細胞に制限される。
組換えＳＶＶレプリコン
本開示は、セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）ウイルスゲノムであって、一つ以上のＳＶＶタンパク質コード領域に欠失または切断を含むセネカバレーウイルス（ＳＶＶ）ウイルスゲノムを含む、組換えＲＮＡレプリコンを提供する。一部の実施形態では、当該レプリコンは異種ポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ＳＶＶゲノムは、野生型ＳＶＶゲノム（例えばＳＶＶ－Ａ等、配列番号１）、または変異型ＳＶＶゲノム（例えばＳＶＶ－ＩＲ２等、配列番号２）から選択される。一部の実施形態では、本開示の組換えＲＮＡレプリコンは、キメラＳＶＶゲノムを含む。
ＳＶＶウイルスゲノムについては、ＶＰ４コード領域は、配列番号１に従う９０４位のヌクレオチド～１１１６位のヌクレオチドを包含する。ＶＰ２コード領域は、配列番号１に従う１１１７位のヌクレオチド～１９６８位のヌクレオチドを包含する。ＶＰ３コード領域は、配列番号１に従う１９６９位のヌクレオチド～２６８５位のヌクレオチドを包含する。ＶＰ１コード領域は、配列番号１に従う２６８６位のヌクレオチド～３４７７位のヌクレオチドを包含する。２Ａコード領域は、配列番号１に従う３４７８位のヌクレオチド～３５０４位のヌクレオチドを包含する。２Ｂコード領域は、配列番号１に従う３５０５位のヌクレオチド～３８８８位のヌクレオチドを包含する。
一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムは、一つ以上のＶＰコード領域に欠失および／または切断を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のレプリコンは、合成ウイルスゲノムと組み合わせて対象に投与される。いかなる特定の理論にも拘束されることを意図するものではないが、レプリコン中のＶＰコード領域を欠失および／または切断することで、１）ウイルス自体よりも大きなペイロードカセットの収容を容易にし、および／または２）レプリコンに対して単独で細胞間への拡散を不可能になるようにさせることとなる。
一部の実施形態では、ＶＰ４コード領域、ＶＰ２コード領域、ＶＰ３コード領域、およびＶＰ１コード領域のうちの一つまたは少なくとも一つが、欠失および／または切断される。一部の実施形態では、ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ１を含むＶＰコード領域のうちの二つまたは少なくとも二つが、欠失および／または切断される。一部の実施形態では、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ１を含むＶＰコード領域のうちの二つまたは少なくとも二つが、欠失および／または切断される。一部の実施形態では、ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ１を含むＶＰコード領域のうちの三つまたは少なくとも三つが、欠失および／または切断される。一部の実施形態では、ＶＰ４コード領域、ＶＰ２コード領域、ＶＰ３コード領域、およびＶＰ１コード領域のうちの全てが、欠失および／または切断される。一部の実施形態では、ＶＰ２コード領域が切断され、またＶＰ３コード領域およびＶＰ１コード領域のうちの一つが欠失または切断される。一部の実施形態では、ＶＰ２コード領域が切断され、またＶＰ３コード領域およびＶＰ１コード領域の両方が欠失および／または切断される。一部の実施形態では、当該レプリコンのＳＶＶゲノムは、ＶＰ１コード領域、ＶＰ３コード領域およびＶＰ２コード領域のそれぞれの欠失および／または切断を含む。一部の実施形態では、当該レプリコンのＳＶＶゲノムは、ＶＰ１コード領域およびＶＰ３コード領域の欠失ならびにＶＰ２コード領域の切断を含む。一部の実施形態では、当該レプリコンのＳＶＶゲノムは、以下の表１に列挙されたパターンのうちの一つに従って、ＶＰ２－ＶＰ３－ＶＰ１領域に一つ以上の欠失または切断を含む。
Figure 2023528300000002
 ＊＊“Ｄ”は欠失を示し、“Ｔ”は切断を示し、“Ｎ”は切断または欠失がないことを示す。
一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムは、配列番号１および図１に従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内におけるＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失もしくは切断を含む、本質的に当該ＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失もしくは切断からなる、または当該ＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失もしくは切断からなる。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムは、配列番号１に従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応するＳＶＶゲノム領域の欠失を含む。一部の実施形態では、レプリコンは、配列番号１に従って１４０７位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上の欠失または切断を含む。一部の実施形態では、レプリコンは、配列番号１に従って１５９９位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上の欠失または切断を含む。一部の実施形態では、レプリコンは、配列番号１に従って１６８３位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上の欠失または切断を含む。一部の実施形態では、レプリコンは、配列番号１に従って１９２４位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上の欠失または切断を含む。一部の実施形態では、レプリコンは、配列番号１に従って２４６７位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上の欠失または切断を含む。一部の実施形態では、レプリコンは、配列番号１に従って１２６１位のヌクレオチドから３３００位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上の欠失または切断を含む。一部の実施形態では、レプリコンは、配列番号１に従って１２６１位のヌクレオチドから３０００位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上の欠失または切断を含む。一部の実施形態では、レプリコンは、配列番号１に従って１２６１位のヌクレオチドから２７００位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上の欠失または切断を含む。一部の実施形態では、レプリコンは、配列番号１に従って１２６１位のヌクレオチドから２４００位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上の欠失または切断を含む。一部の実施形態では、レプリコンは、配列番号１に従って１２６１位のヌクレオチドから２１００位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上の欠失または切断を含む。すべての範囲は、上限下限を含める。
一部の実施形態では、欠失または切断の各々は、１以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、欠失または切断の各々は、１０以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、欠失または切断の各々は、５０以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、欠失または切断の各々は、１００以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、欠失または切断の各々は、５００以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、欠失または切断の各々は、１０００以上のヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、一つ以上の欠失または切断は、合計で、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、少なくとも２１００ｂｐ、または少なくとも２２００ｂｐのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、一つ以上の欠失または切断は、合計で、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、２０００ｂｐ、２１００ｂｐ、２２００ｂｐ、２３００ｂｐ、２４００ｂｐ、またはその間の任意の値のヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、一つ以上の欠失または切断は、合計で、５００～２４００ｂｐ、５００～２３００ｂｐ、５００～２２００ｂｐ、５００～２０００ｂｐ、５００～１５００ｂｐ、５００～１０００ｂｐ、１０００～２３００ｂｐ、１０００～２２００ｂｐ、１０００～２０００ｂｐ、１０００～１５００ｂｐ、１５００～２３００ｂｐ、１５００～２２００ｂｐ、１５００～２０００ｂｐ、２０００～２３００ｂｐ、または２０００～２２００ｂｐのヌクレオチドからなる。すべての範囲は、上限下限を含める。
一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムは、５’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムは、５’リーダータンパク質コード配列を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムは、非切断ＶＰ４コード領域を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムは、ＶＰ２コード領域またはその切断を含む。
一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムは、５’から３’方向に、５’リーダータンパク質コード配列、ＶＰ４コード領域、およびＶＰ２コード領域またはその切断を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ、５’リーダータンパク質コード配列、ＶＰ４コード領域、およびＶＰ２コード領域またはその切断を含む、レプリコンのＳＶＶゲノムの部分は、配列番号１または配列番号２の１位～１２６０位のヌクレオチドに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ、５’リーダータンパク質コード配列、ＶＰ４コード領域、およびＶＰ２コード領域またはその切断を含む、レプリコンのＳＶＶゲノムの部分は、配列番号１または配列番号２の１位～１２６０位のヌクレオチドに対して、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９３％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ、５’リーダータンパク質コード配列、ＶＰ４コード領域、およびＶＰ２コード領域またはその切断を含む、レプリコンのＳＶＶゲノムの部分は、配列番号１または配列番号２の１位～１２６０位のヌクレオチドに従って、最大で１、最大で５、最大で１０または最大で２０のヌクレオチド変異を有する。
一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムは、ＶＰ２コード領域の５’部分を含む。一部の実施形態では、内在性ＶＰ２コード領域の５’部分は、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１１０ｂｐ、少なくとも１２０ｂｐ、少なくとも１３０ｂｐ、少なくとも１４０ｂｐ、または少なくとも１４５ｂｐの長さである。一部の実施形態では、内在性ＶＰ２コード領域の５’部分は、約５０ｂｐ、約６０ｂｐ、約７０ｂｐ、約８０ｂｐ、約９０ｂｐ、約１００ｂｐ、約１１０ｂｐ、約１２０ｂｐ、約１３０ｂｐ、約１４０ｂｐ、約１４５ｂｐ、またはその間の任意の値を含む。一部の実施形態では、内在性ＶＰ２コード領域の５’部分は、５０ｂｐ未満、６０ｂｐ未満、７０ｂｐ未満、８０ｂｐ未満、９０ｂｐ未満、１００ｂｐ未満、１１０ｂｐ未満、１２０ｂｐ未満、１３０ｂｐ未満、１４０ｂｐ未満、または１４５ｂｐ未満の長さである。すべての範囲は、上限下限を含める。
一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムは、シス作用性複製エレメント（ＣＲＥ）を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムのＶＰ２コード領域またはその切断は、ＣＲＥを含む。一部の実施形態では、ＶＰ４コード領域およびＶＰ２コード領域またはその切断を含む、レプリコンのＳＶＶゲノムにおける領域は、ＣＲＥを含む。
一部の実施形態では、当該ＣＲＥは、約１０ｂｐ、約２０ｂｐ、約３０ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約６０ｂｐ、約７０ｂｐ、約８０ｂｐ、約９０ｂｐ、約１００ｂｐ、約１１０ｂｐ、約１２０ｂｐ、約１３０ｂｐ、約１４０ｂｐ、約１５０ｂｐ、約１６０ｂｐ、約１７０ｂｐ、約１８０ｂｐ、約１９０ｂｐ、約２００ｂｐ、またはその間の任意の値のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、当該ＣＲＥは、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１１０ｂｐ、少なくとも１２０ｂｐ、少なくとも１３０ｂｐ、少なくとも１４０ｂｐ、少なくとも１５０ｂｐ、少なくとも１６０ｂｐ、少なくとも１７０ｂｐ、少なくとも１８０ｂｐ、少なくとも１９０ｂｐ、または少なくとも２００ｂｐのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、当該ＣＲＥは、１０～２００ｂｐ、１０～１５０ｂｐ、１０～１００ｂｐ、１０～７５ｂｐ、１０～６０ｂｐ、１０～５０ｂｐ、２０～２００ｂｐ、２０～１５０ｂｐ、２０～１００ｂｐ、２０～７５ｂｐ、２０～６０ｂｐ、２０～５０ｂｐ、３０～２００ｂｐ、３０～１５０ｂｐ、３０～１００ｂｐ、３０～７５ｂｐ、３０～６０ｂｐ、３０～５０ｂｐ、４０～２００ｂｐ、４０～１５０ｂｐ、４０～１００ｂｐ、４０～７５ｂｐ、４０～６０ｂｐ、４０～５０ｂｐ、５０～２００ｂｐ、５０～１５０ｂｐ、５０～１００ｂｐ、５０～７５ｂｐ、または５０～６０ｂｐのヌクレオチドを含む。すべての範囲は、上限下限を含める。
一部の実施形態では、ＣＲＥが、配列番号１に従う１０００位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＣＲＥが、配列番号１に従う、１０００位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１０５０位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１１００位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１１５０位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１２００位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１０５０位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１１００位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１１５０位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１２００位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチドから１２００位のヌクレオチド、１０５０位のヌクレオチドから１２００位のヌクレオチド、１１００位のヌクレオチドから１２００位のヌクレオチド、１１５０位のヌクレオチドから１２００位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチドから１１５０位のヌクレオチド、１０５０位のヌクレオチドから１１５０位のヌクレオチド、１１００位のヌクレオチドから１１５０位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチドから１１００位のヌクレオチド、または１０５０位のヌクレオチドから１１００位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＣＲＥが、配列番号１に従う、１０００位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１０５０位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１１００位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１１５０位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１２００位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１０５０位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１１００位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１１５０位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１２００位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチドから１２００位のヌクレオチド、１０５０位のヌクレオチドから１２００位のヌクレオチド、１１００位のヌクレオチドから１２００位のヌクレオチド、１１５０位のヌクレオチドから１２００位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチドから１１５０位のヌクレオチド、１０５０位のヌクレオチドから１１５０位のヌクレオチド、１１００位のヌクレオチドから１１５０位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチドから１１００位のヌクレオチド、または１０５０位のヌクレオチドから１１００位のヌクレオチドに対応する領域内に配置される。すべての範囲は、上限下限を含める。
一部の実施形態では、ＣＲＥが、配列番号１に従う１０００位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＣＲＥが、配列番号１の、１０００位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１０５０位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１１００位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１１５０位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１２００位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１０５０位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１１００位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１１５０位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１２００位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチドから１２００位のヌクレオチド、１０５０位のヌクレオチドから１２００位のヌクレオチド、１１００位のヌクレオチドから１２００位のヌクレオチド、１１５０位のヌクレオチドから１２００位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチドから１１５０位のヌクレオチド、１０５０位のヌクレオチドから１１５０位のヌクレオチド、１１００位のヌクレオチドから１１５０位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチドから１１００位のヌクレオチド、または１０５０位のヌクレオチドから１１００位のヌクレオチドに対応するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＥが、配列番号１の、１０００位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１０５０位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１１００位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１１５０位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１２００位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１０５０位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１１００位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１１５０位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１２００位のヌクレオチドから１２５０位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチドから１２００位のヌクレオチド、１０５０位のヌクレオチドから１２００位のヌクレオチド、１１００位のヌクレオチドから１２００位のヌクレオチド、１１５０位のヌクレオチドから１２００位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチドから１１５０位のヌクレオチド、１０５０位のヌクレオチドから１１５０位のヌクレオチド、１１００位のヌクレオチドから１１５０位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチドから１１００位のヌクレオチド、または１０５０位のヌクレオチドから１１００位のヌクレオチドに対応するポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。すべての範囲は、上限下限を含める。
一部の実施形態では、ＣＲＥが、配列番号１に従う１１１７位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上のヌクレオチドを含む。このＣＲＥ領域のポリヌクレオチド配列は、配列番号１４９で表される。一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１４９に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１４９のうち連続した１０のヌクレオチドのあるセグメントに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１４９のうち連続した２０のヌクレオチドのあるセグメントに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１４９のうち連続した３０のヌクレオチドのあるセグメントに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１４９のうち連続した４０のヌクレオチドのあるセグメントに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１４９のうち連続した５０のヌクレオチドのあるセグメントに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１４９のうち連続した６０のヌクレオチドのあるセグメントに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１４９のうち連続した７０のヌクレオチドのあるセグメントに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１４９のうち連続した８０のヌクレオチドのあるセグメントに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１４９のうち連続した９０のヌクレオチドのあるセグメントに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１４９のうち連続した１００のヌクレオチドのあるセグメントに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１４９のうち連続した１１０のヌクレオチドのあるセグメントに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１４９のうち連続した１２０のヌクレオチドのあるセグメントに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１４９のうち連続した１３０のヌクレオチドのあるセグメントに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１４９のうち連続した１４０のヌクレオチドのあるセグメントに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内のＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失または切断を含むものであり、当該一つ以上の欠失または切断が、合計で少なくとも５００ｂｐを含み、また当該レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＣＲＥポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内のＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失または切断を含むものであり、当該一つ以上の欠失または切断が、合計で少なくとも６００ｂｐを含み、また当該レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＣＲＥポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内のＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失または切断を含むものであり、当該一つ以上の欠失または切断が、合計で少なくとも７００ｂｐを含み、また当該レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＣＲＥポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内のＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失または切断を含むものであり、当該一つ以上の欠失または切断が、合計で少なくとも８００ｂｐを含み、また当該レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＣＲＥポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内のＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失または切断を含むものであり、当該一つ以上の欠失または切断が、合計で少なくとも９００ｂｐを含み、また当該レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＣＲＥポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内のＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失または切断を含むものであり、当該一つ以上の欠失または切断が、合計で少なくとも１０００ｂｐを含み、また当該レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＣＲＥポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内のＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失または切断を含むものであり、当該一つ以上の欠失または切断が、合計で少なくとも１１００ｂｐを含み、また当該レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＣＲＥポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内のＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失または切断を含むものであり、当該一つ以上の欠失または切断が、合計で少なくとも１２００ｂｐを含み、また当該レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＣＲＥポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内のＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失または切断を含むものであり、当該一つ以上の欠失または切断が、合計で少なくとも１３００ｂｐを含み、また当該レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＣＲＥポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内のＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失または切断を含むものであり、当該一つ以上の欠失または切断が、合計で少なくとも１４００ｂｐを含み、また当該レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＣＲＥポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内のＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失または切断を含むものであり、当該一つ以上の欠失または切断が、合計で少なくとも１５００ｂｐを含み、また当該レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＣＲＥポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内のＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失または切断を含むものであり、当該一つ以上の欠失または切断が、合計で少なくとも１６００ｂｐを含み、また当該レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＣＲＥポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内のＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失または切断を含むものであり、当該一つ以上の欠失または切断が、合計で少なくとも１７００ｂｐを含み、また当該レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＣＲＥポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内のＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失または切断を含むものであり、当該一つ以上の欠失または切断が、合計で少なくとも１８００ｂｐを含み、また当該レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＣＲＥポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内のＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失または切断を含むものであり、当該一つ以上の欠失または切断が、合計で少なくとも１９００ｂｐを含み、また当該レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＣＲＥポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内のＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失または切断を含むものであり、当該一つ以上の欠失または切断が、合計で少なくとも２０００ｂｐを含み、また当該レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＣＲＥポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内のＳＶＶゲノムの一つ以上の欠失または切断を含むものであり、当該一つ以上の欠失または切断が、合計で少なくとも２１００ｂｐを含み、また当該レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＣＲＥポリヌクレオチド配列を含む。 一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位のヌクレオチドから３４７７位のヌクレオチドに対応する領域内のＳＶＶゲノムの一つ
以上の欠失または切断を含むものであり、当該一つ以上の欠失または切断が、合計で少なくとも２２００ｂｐを含み、また当該レプリコンのＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＣＲＥポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムは、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、３Ｃｐｒｏコード領域、および３Ｄ（ＲｄＲｐ）コード領域のうちの一つ以上を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムは、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、３Ｃｐｒｏコード領域、および３Ｄ（ＲｄＲｐ）コード領域を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムは、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、３Ｃｐｒｏコード領域、および３Ｄ（ＲｄＲｐ）コード領域を含む。一部の実施形態では、レプリコンのＳＶＶゲノムは、５’から３’方向に、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、３Ｃｐｒｏコード領域、および３Ｄ（ＲｄＲｐ）コード領域を含む。一部の実施形態では、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、３Ｃｐｒｏコード領域、および３Ｄ（ＲｄＲｐ）コード領域を含むレプリコンのＳＶＶゲノムの部分は、配列番号１に従って３５０５位から７３１０位のヌクレオチドに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、５’から３’方向に、５’リーダータンパク質コード配列、ＶＰ４コード領域、ＶＰ２コード領域またはその切断と、異種ポリヌクレオチドとを含む。一部の実施形態では、レプリコンは、５’から３’方向に、異種ポリヌクレオチドおよび２Ｂコード領域を含む。一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、５’から３’方向に、異種ポリヌクレオチド、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、３Ｃｐｒｏコード領域、および３Ｄ（ＲｄＲｐ）を含む。
一部の実施形態では、ＳＶＶゲノムは、２Ａコード領域を含む。一部の実施形態では、２Ａコード領域が、ＶＰ２コード領域またはその切断と異種ポリヌクレオチドとの間に位置している。一部の実施形態では、２Ａコード領域は、異種ポリヌクレオチドと２Ｂコード領域との間に位置している。
一部の実施形態では、ＳＶＶ由来のレプリコンは、一つ以上の異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、レプリコンの異種ポリヌクレオチドは、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、少なくとも２５００ｂｐ、または少なくとも３０００ｂｐを含む。一部の実施形態では、当該一つ以上の異種ポリヌクレオチドは、合計で、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、少なくとも２５００ｂｐ、または少なくとも３０００ｂｐを含む。
一部の実施形態では、ＳＶＶ由来のレプリコンは、配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８および６０のうちのいずれか一つに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、ＳＶＶ由来のレプリコンは、ＳＶＶゲノムおよび異種ポリヌクレオチドを含むものであり、当該ＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位から３４７７位のヌクレオチドの間に欠失を含み、当該欠失が全長で少なくとも５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、２０００ｂｐ、２１００ｂｐ、２２００ｂｐ、２３００ｂｐ、または２４００ｂｐであり、当該ＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むＣＲＥを含む。
一部の実施形態では、ＳＶＶ由来のレプリコンは、ＳＶＶゲノムおよび異種ポリヌクレオチドを含むものであり、当該ＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位から３４７７位のヌクレオチドの間に欠失を含み、当該欠失が全長で少なくとも５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、２０００ｂｐ、２１００ｂｐ、２２００ｂｐ、２３００ｂｐ、または２４００ｂｐであり、当該ＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して、少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むＣＲＥを含む。
一部の実施形態では、ＳＶＶ由来のレプリコンは、ＳＶＶゲノムおよび異種ポリヌクレオチドを含み、当該ＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位から３４７７位のヌクレオチドの間に欠失を含み、当該欠失が全長で少なくとも５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、２０００ｂｐ、２１００ｂｐ、２２００ｂｐ、２３００ｂｐ、または２４００ｂｐであり、当該ＳＶＶゲノムが、配列番号１に従って１位から１２６０位のヌクレオチドに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み、当該ＳＶＶゲノムが、配列番号１に従って３５０５位から７３１０位のヌクレオチドに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み、また当該ＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むＣＲＥを含む。
一部の実施形態では、ＳＶＶ由来のレプリコンは、ＳＶＶゲノムおよび異種ポリヌクレオチドを含むものであり、当該ＳＶＶゲノムが、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位から３４７７位のヌクレオチドの間に欠失を含み、当該欠失が全長で少なくとも５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、２０００ｂｐ、２１００ｂｐ、２２００ｂｐ、２３００ｂｐ、または２４００ｂｐであり、当該ＳＶＶゲノムが、配列番号１に従って１位から１２６０位のヌクレオチドに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み、当該ＳＶＶゲノムが、配列番号１に従って３５０５位から７３１０位のヌクレオチドに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み、また当該ＳＶＶゲノムが、配列番号１４９に対して、少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むＣＲＥを含む。
組換えコクサッキーウイルスレプリコン
本開示は、コクサッキーウイルスゲノムであって、一つ以上のコクサッキーウイルスタンパク質コード領域に欠失または切断を含むコクサッキーウイルスゲノムを含む、組換えＲＮＡレプリコンを提供する。一部の実施形態では、当該レプリコンは異種ポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、コクサッキーウイルスは、ＣＶＢ３、ＣＶＡ２１、およびＣＶＡ９から選択される。例示的なコクサッキーウイルスの核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号Ｍ３３８５４．１（ＣＶＢ３；配列番号１６）、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＫＴ１６１２６６．１（ＣＶＡ２１；配列番号１７）、およびＧｅｎＢａｎｋ参照番号Ｄ００６２７．１（ＣＶＡ９；配列番号１８）として提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載の組換えＲＮＡレプリコンは、キメラコクサッキーウイルスをコードする。
コクサッキーウイルスゲノムについては、ＶＰ４コード領域は、配列番号３に従う７１４位のヌクレオチドから９２０位のヌクレオチドを包含する。ＶＰ２コード領域は、配列番号３に従う９２１位のヌクレオチドから１７３６位のヌクレオチドを包含する。ＶＰ３コード領域は、配列番号３に従う１７３７位のヌクレオチドから２４５６位のヌクレオチドを包含する。ＶＰ１コード領域は、配列番号３に従う２４５７位のヌクレオチドから３３５０位のヌクレオチドを包含する。２Ａコード領域は、配列番号３に従う３３５１位のヌクレオチドから３７９７位のヌクレオチドを包含する。２Ｂコード領域は、配列番号３に従う３７９８位のヌクレオチドから４０８８位のヌクレオチドを包含する。
一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、配列番号４の５’ＵＴＲ配列を含むコクサッキーウイルスゲノムを含む。こうした実施形態では、配列番号４の５’ＵＴＲ配列は、以前に記載した他の５’ＵＴＲ配列と比較して、機能性コクサッキーウイルスの産生を予想外に増加させる。一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、配列番号３の配列に従う、改変されたＣＶＡ２１コクサッキーウイルスゲノムを含む。
一部の実施形態では、レプリコンのコクサッキーウイルスゲノムは、一つ以上のＶＰコード領域に欠失および／または切断を含む。一部の実施形態では、ＶＰ４コード領域、ＶＰ２コード領域、ＶＰ３コード領域、およびＶＰ１コード領域のうちの一つまたは少なくとも一つが、欠失および／または切断される。一部の実施形態では、ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ１を含むＶＰコード領域のうちの二つまたは少なくとも二つが、欠失および／または切断される。一部の実施形態では、ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ１を含むＶＰコード領域のうちの三つまたは少なくとも三つが、欠失および／または切断される。一部の実施形態では、ＶＰ４コード領域、ＶＰ２コード領域、ＶＰ３コード領域、およびＶＰ１コード領域のうちの全てが、欠失および／または切断される。
一部の実施形態では、レプリコンのコクサッキーウイルスゲノムは、配列番号３に従って、上限下限を含めて、７１４位のヌクレオチドから３３５０位のヌクレオチドに対応する領域内におけるコクサッキーウイルスゲノムの一つ以上の欠失もしくは切断を含む、本質的に当該コクサッキーウイルスゲノムの一つ以上の欠失もしくは切断からなる、または当該コクサッキーウイルスゲノムの一つ以上の欠失もしくは切断からなる。一部の実施形態では、レプリコンのコクサッキーウイルスゲノムは、配列番号３に従って、上限下限を含めて、７１４位のヌクレオチドから３３５０位のヌクレオチドに対応するコクサッキーウイルスゲノム領域の欠失を含む。一部の実施形態では、レプリコンは、配列番号３に従って１０００位のヌクレオチドから３３５０位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上の欠失または切断を含む。一部の実施形態では、当該レプリコンは、配列番号３に従って、上限下限を含めて、７１４位のヌクレオチド～３３５０位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチド～３３５０位のヌクレオチド、１５００位のヌクレオチド～３３５０位のヌクレオチド、２０００位のヌクレオチド～３３５０位のヌクレオチド、２５００位のヌクレオチド～３３５０位のヌクレオチド、７１４位のヌクレオチド～３０００位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチド～３０００位のヌクレオチド、１５００位のヌクレオチド～３０００位のヌクレオチド、２０００位のヌクレオチド～３０００位のヌクレオチド、２５００位のヌクレオチド～３０００位のヌクレオチド、７１４位のヌクレオチド～２５００位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチド～２５００位のヌクレオチド、１５００位のヌクレオチド～２５００位のヌクレオチド、２０００位のヌクレオチド～２５００位のヌクレオチド、７１４位のヌクレオチド～２０００位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチド～２０００位のヌクレオチド、１５００位のヌクレオチド～２０００位のヌクレオチド、７１４位のヌクレオチド～１５００位のヌクレオチド、または１０００位のヌクレオチド～１５００位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上の欠失または切断を含む。すべての範囲は、上限下限を含める。
一部の実施形態では、レプリコンのコクサッキーウイルスゲノムは、配列番号３に従って、上限下限を含めて、７１７位のヌクレオチドから３３３２位のヌクレオチドに対応する領域内におけるコクサッキーウイルスゲノムの一つ以上の欠失もしくは切断を含む、本質的に当該コクサッキーウイルスゲノムの一つ以上の欠失もしくは切断からなる、または当該コクサッキーウイルスゲノムの一つ以上の欠失もしくは切断からなる。一部の実施形態では、レプリコンのコクサッキーウイルスゲノムは、配列番号３に従って、上限下限を含めて、７１７位のヌクレオチドから３３３２位のヌクレオチドに対応するコクサッキーウイルスゲノム領域の欠失を含む。一部の実施形態では、レプリコンは、配列番号３に従って１０００位のヌクレオチドから３３３２位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上の欠失または切断を含む。一部の実施形態では、当該レプリコンは、配列番号３に従って、上限下限を含めて、７１７位のヌクレオチド～３３３２位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチド～３３３２位のヌクレオチド、１５００位のヌクレオチド～３３３２位のヌクレオチド、２０００位のヌクレオチド～３３３２位のヌクレオチド、２５００位のヌクレオチド～３３３２位のヌクレオチド、７１７位のヌクレオチド～３０００位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチド～３０００位のヌクレオチド、１５００位のヌクレオチド～３０００位のヌクレオチド、２０００位のヌクレオチド～３０００位のヌクレオチド、２５００位のヌクレオチド～３０００位のヌクレオチド、７１７位のヌクレオチド～２５００位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチド～２５００位のヌクレオチド、１５００位のヌクレオチド～２５００位のヌクレオチド、２０００位のヌクレオチド～２５００位のヌクレオチド、７１７位のヌクレオチド～２０００位のヌクレオチド、１０００位のヌクレオチド～２０００位のヌクレオチド、１５００位のヌクレオチド～２０００位のヌクレオチド、７１７位のヌクレオチド～１５００位のヌクレオチド、または１０００位のヌクレオチド～１５００位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上の欠失または切断を含む。すべての範囲は、上限下限を含める。
一部の実施形態では、欠失または切断の各々は、１以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、欠失または切断の各々は、１０以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、欠失または切断の各々は、５０以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、欠失または切断の各々は、１００以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、欠失または切断の各々は、５００以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、欠失または切断の各々は、１０００以上のヌクレオチドを含む。すべての範囲は、上限下限を含める。
一部の実施形態では、一つ以上の欠失または切断は、合計で、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、少なくとも２１００ｂｐ、少なくとも２２００ｂｐ、少なくとも２３００ｂｐ、少なくとも２４００ｂｐ、少なくとも２５００ｂｐ、少なくとも２６００ｂｐ、少なくとも２６１５ｂｐ、少なくとも２６３６ｂｐ、少なくとも２６５０ｂｐ、または少なくとも２７００ｂｐのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、一つ以上の欠失または切断は、合計で、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、２０００ｂｐ、２１００ｂｐ、２２００ｂｐ、２３００ｂｐ、２４００ｂｐ、２５００ｂｐ、２６００ｂｐ、２７００ｂｐまたはその間の任意の値のヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、一つ以上の欠失または切断は、合計で、５００～２７００ｂｐ、５００～２６００ｂｐ、５００～２３００ｂｐ、５００～２０００ｂｐ、５００～１５００ｂｐ、５００～１０００ｂｐ、１０００～２７００ｂｐ、１０００～２６００ｂｐ、１０００～２３００ｂｐ、１０００～２０００ｂｐ、１０００～１５００ｂｐ、１５００～２７００ｂｐ、１５００～２６００ｂｐ、１５００～２３００ｂｐ、１５００～２２００ｂｐ、１５００～２０００ｂｐ、２０００～２７００ｂｐ、２０００～２６００ｂｐ、２０００～２３００ｂｐ、または２０００～２２００ｂｐのヌクレオチドからなる。すべての範囲は、上限下限を含める。
一部の実施形態では、レプリコンのコクサッキーウイルスゲノムは、５’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲを含むレプリコンのコクサッキーウイルスゲノムの部分は、配列番号４に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、５’ＵＴＲを含むレプリコンのコクサッキーウイルスゲノムの部分は、配列番号４に対して、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９３％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、５’ＵＴＲを含むレプリコンのコクサッキーウイルスゲノムの部分は、配列番号４に従って、最大で１、最大で５、最大で１０または最大で２０のヌクレオチド変異を有する。
一部の実施形態では、レプリコンのコクサッキーウイルスゲノムは、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ＵＴＲのうちの一つ以上を含む。一部の実施形態では、レプリコンのコクサッキーウイルスゲノムは、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、レプリコンのコクサッキーウイルスゲノムは、５’から３’方向に、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ ＵＴＲを含むコクサッキーウイルスゲノムの部分は、配列番号３に従って３７９７位のヌクレオチドから７４３５位のヌクレオチドに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、レプリコンは、５’から３’方向に、５’ ＵＴＲおよび異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、レプリコンは、５’から３’方向に、異種ポリヌクレオチドおよび２Ｂコード領域を含む。一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、５’から３’方向に、異種ポリヌクレオチド、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ＵＴＲを含む。
一部の実施形態では、レプリコンは、２Ａコード領域をさらに含む。一部の実施形態では、２Ａコード領域は、５’ＵＴＲと異種ポリヌクレオチドとの間に位置している。一部の実施形態では、２Ａコード領域は、異種ポリヌクレオチドと２Ｂコード領域との間に位置している。一部の実施形態では、レプリコンは、５’から３’方向に、５’ ＵＴＲ、異種ポリヌクレオチドおよび２Ａコード領域を含む。一部の実施形態では、レプリコンのコクサッキーウイルスゲノムは、５’から３’方向に、異種ポリヌクレオチド、２Ａコード領域、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ＵＴＲを含む。
一部の実施形態では、レプリコンのコクサッキーウイルスゲノムは、５’から３’方向に、２Ａコード領域、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、２Ａコード領域、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ ＵＴＲを含むコクサッキーウイルスゲノムの部分は、配列番号３に従って３４９２位から７４３５位のヌクレオチドに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、コクサッキーウイルス由来のレプリコンは、一つ以上の異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、当該レプリコンの異種ポリヌクレオチドは、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、少なくとも２５００ｂｐ、または少なくとも３０００ｂｐの長さを有する。一部の実施形態では、当該一つ以上の異種ポリヌクレオチドは、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、少なくとも２５００ｂｐ、または少なくとも３０００ｂｐの全長を有する。すべての範囲は、上限下限を含める。
一部の実施形態では、コクサッキーウイルス由来のレプリコンは、配列番号６２に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
異種ポリヌクレオチドおよびペイロード分子
一部の実施形態では、レプリコンは、一つ以上のペイロード分子をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、当該異種ヌクレオチドは、レプリコンのウイルスゲノムの２Ａコード領域と２Ｂコード領域との間のウイルスゲノム位置に挿入される。一部の実施形態では、当該異種ヌクレオチドは、レプリコンのウイルスゲノムの２Ａコード領域に対して上流のウイルスゲノム位置に挿入される。一部の実施形態では、当該異種ヌクレオチドは、３Ｄ（ＲｄＲｐ）コード領域または３Ｄ ｐｏｌコード領域に対して下流のウイルスゲノム位置に挿入される。
一部の実施形態では、当該異種ヌクレオチドは、ＳＶＶウイルスゲノムを含むレプリコンに挿入される。一部の実施形態では、当該異種ヌクレオチドは、配列番号１の１１１７位から３４７９位のヌクレオチドに対応するウイルスゲノムの領域に挿入される。一部の実施形態では、当該異種ヌクレオチドは、配列番号１の３５０４位から３５０５位のヌクレオチドに対応するウイルスゲノムの領域に挿入される。一部の実施形態では、当該異種ヌクレオチドは、配列番号１の７２０９位から７２１０位のヌクレオチドに対応するウイルスゲノムの領域に挿入される。
一部の実施形態では、当該異種ヌクレオチドは、コクサッキーウイルスのウイルスゲノムを含むレプリコンに挿入される。一部の実施形態では、当該異種ヌクレオチドは、配列番号３の７１３位から３３５１位のヌクレオチドに対応するウイルスゲノムの領域に挿入される。一部の実施形態では、当該異種ヌクレオチドは、配列番号３の３７９７位から３７９８位のヌクレオチドに対応するウイルスゲノムの領域に挿入される。一部の実施形態では、当該異種ヌクレオチドは、配列番号３の７３３４位から７３３５位のヌクレオチドに対応するウイルスゲノムの領域に挿入される。
一部の実施形態では、一つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列が、ペイロード分子をコードする異種ポリヌクレオチドに挿入される。一部の実施形態では、一つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列が、ペイロード分子をコードする異種ポリヌクレオチドの３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲに組み込まれる。一部の実施形態では、一つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列が、ペイロード分子をコードする異種ポリヌクレオチドのコード領域に組み込まれる。こうした実施形態では、対応するｍｉＲＮＡが発現される細胞において、ペイロードの翻訳およびその後の発現は発生せず、または実質的に減少する。一部の実施形態では、ペイロード分子はタンパク質である。
一部の実施形態では、ペイロード分子は分泌タンパク質である。一部の実施形態では、分泌タンパク質は、シグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、分泌タンパク質は、外来性のシグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ペイロード分子の分泌を促進する。一部の実施形態では、分泌タンパク質は、シグナルペプチドを有していない。
一部の実施形態では、ペイロード分子をコードする異種ポリヌクレオチドは、ウイルスタンパク質コード領域のうちの一つ以上を有する連続オープンリーディングフレームを形成する。ここで、連続オープンリーディングフレームは、ある連続するポリペプチドに翻訳され得る特定のヌクレオチドのトリプレットの配列を指す。一部の実施形態では、ペイロード分子およびウイルスタンパク質は、開裂ポリペプチドによって連結される。一部の実施形態では、ウイルスタンパク質は２Ｂである。
一部の実施形態では、ペイロード分子は、細胞傷害性ペプチドである。本明細書で使用される場合、「細胞傷害性ペプチド」は、宿主細胞中に発現されたときに細胞死を誘発することができるタンパク質、および／または宿主細胞によって分泌されたときに隣接細胞の細胞死を誘発することができるタンパク質を指す。一部の実施形態では、細胞傷害性ペプチドは、カスパーゼ、ｐ５３、ジフテリア毒素（ＤＴ）、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥＡ）、Ｉ型リボザイム不活化タンパク質（ＲＩＰ）（例えば、サポリンおよびゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ））、ＩＩ型ＲＩＰ（例えば、リシン）、志賀毒素様毒素１（Ｓｌｔ１）、感光性活性酸素種（例えば、キラーレッド（ｋｉｌｌｅｒ－ｒｅｄ））である。特定の実施形態では、細胞傷害性ペプチドは、例えばカスパーゼ遺伝子等である自殺遺伝子によってコードされるが、自殺遺伝子は結果としてアポトーシスを介して細胞死を生じる。
一部の実施形態では、ペイロード分子は、免疫調節ペプチドである。本明細書で使用される場合、「免疫調節ペプチド」は、特定の免疫受容体および／または経路を調節（例えば、活性化または阻害）することができるペプチドである。一部の実施形態では、免疫調節ペプチドは、免疫細胞、組織細胞、および間質細胞を含む任意の哺乳類細胞に作用することができる。好ましい実施形態では、免疫調節ペプチドは、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、好塩基球、肥満細胞、または好酸球等である免疫細胞に作用する。例示的な免疫調節ペプチドとしては、例えば抗体またはその抗原結合断片等である抗原結合分子、サイトカイン、ケモカイン、可溶性受容体、細胞表面受容体リガンド、二部位ポリペプチド、および酵素が挙げられる。
一部の実施形態では、ペイロード分子は、例えばＩＦＮｇ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－３６γ、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、またはＴＮＦＳＦ１４等であるサイトカインである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、例えばＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ４またはＣＣＬ５等であるケモカインである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、例えばＮＫＧ２Ｄリガンド、ニューロピリンリガンド、Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４７リガンド（例えば、ＳＩＲＰ１α）等である細胞表面受容体に対するリガンドである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、例えば可溶性サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ－１３Ｒ、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＩＬ－３５Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－１２Ｒ、およびインターフェロン受容体）または可溶性自然免疫受容体（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体、補体受容体など）等である可溶性受容体である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、細胞内ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ感知に関与するタンパク質の優性アゴニスト性変異体（例えば、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－１、またはＭＤＡ－５の優性アゴニスト性変異体）である。
一部の実施形態では、ペイロード分子は、例えば抗体またはその抗原結合断片（例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）など）等である抗原結合分子である。一部の実施形態では、抗原結合分子は、細胞表面受容体に、例えば免疫チェックポイント受容体（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、およびＣＴＬＡ４）、または細胞増殖および活性化に関与するさらなる細胞表面受容体（例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ４７、ＣＳＦ１Ｒ、４１ＢＢ、ＣＤ４０、およびＮＫＧ２Ｄ）等に、特異的に結合する。一部の実施形態では、抗原結合分子は、表３および／または表４に示される抗原に特異的に結合する。
一部の実施形態では、ペイロード分子は、例えばクロロトキシン、ＢｍＫｎ－２、ネオプラジン１（ｎｅｏｐｌａｄｉｎｅ １）、ネオプラジン２（ｎｅｏｐｌａｄｉｎｅ ２）、およびマウリポリン（ｍａｕｒｉｐｏｒｉｎ）等であるサソリポリペプチドである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、例えばコントルトロスタチン（ｃｏｎｔｏｒｔｒｏｓｔａｔｉｎ）、アポキシン－Ｉ（ａｐｏｘｉｎ－Ｉ）、ボスロプストキシン－Ｉ（ｂｏｔｈｒｏｐｓｔｏｘｉｎ－Ｉ）、ＢＪｃｕＬ、ＯＨＡＰ－１、ロドストミン（ｒｈｏｄｏｓｔｏｍｉｎ）、ｄｒＣＴ－Ｉ、ＣＴＸ－ＩＩＩ、Ｂ１Ｌ、およびＡＣＴＸ－６等であるヘビポリペプチドである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、例えばラタルシン（ｌａｔａｒｃｉｎ）およびヒアルロニダーゼ等であるクモポリペプチドである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、例えばメリチンおよびアパミン等であるミツバチポリペプチドである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、例えばＰｓＴ－１、ＰｄＴ－１、およびＰｄＴ－２等であるカエルポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子は酵素である。一部の実施形態では、当該酵素は、細胞外基質を変化させることによって腫瘍内微小環境を調節することができる。こうした実施形態では、当該酵素としては、マトリクスメタロプロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ９）、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ゼラチナーゼ、またはエラスターゼが挙げられ得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、酵素は、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、またはチトクロムＰ４５０等である遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（ＧＤＥＰＴ）系の一部である。一部の実施形態では、酵素は、標的細胞中の細胞死経路を誘導または活性化することができる（例えば、カスパーゼ）。一部の実施形態では、酵素は、細胞外代謝物または細胞外メッセージを分解することができる（例えば、アルギナーゼまたは１５－ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ）。
一部の実施形態では、ペイロード分子は、二部位ポリペプチド（二部位抗原結合分子）である。本明細書で使用される場合、「二部位ポリペプチド（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、非がん性エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）上に発現される細胞表面抗原を結合することができる第一のドメインと、標的細胞（例えば、がん細胞、腫瘍細胞、または異なるタイプのエフェクター細胞）によって発現される細胞表面抗原を結合することができる第二のドメインとから構成される多量体タンパク質を指す。一部の実施形態では、二部位ポリペプチドの個々のポリペプチドドメインは、抗体またはその結合断片（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）もしくはＦ（ａｂ））、ナノボディ、二重特異性抗体、フレキシボディ（ｆｌｅｘｉｂｏｄｙ）、ＤＯＣＫ－ＡＮＤ－ＬＯＣＫ（商標）抗体、またはモノクローナル抗イディオタイプ抗体（ｍＡｂ２）を含み得る。一部の実施形態では、二部位ポリペプチドの構造は、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））、Ｔａｎｄａｂ（登録商標）、 二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（商標）、ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）、または二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）ポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、二部位ポリペプチドは、ＢｉＴＥであり、また表３および／または表４に示される抗原に特異的に結合するドメインを含む。例示的なＢｉＴＥを以下の表２に示す。
Figure 2023528300000003
一部の実施形態では、二部位ポリペプチドが結合する、エフェクター細胞上に発現される細胞表面抗原は、以下の表３から選択される。一部の実施形態では、二部位ポリペプチドは、ＣＤ３またはその成分のうちの一つに結合する。ＣＤ３は、Ｔ細胞多分子受容体（ＴＣＲ）の一部としてＴリンパ球上に発現されるタンパク質複合体およびＴ細胞共受容体である。これは、ＣＤ３γ受容体鎖、ＣＤ３δ受容体鎖、ＣＤ３ε受容体鎖、および／またはＣＤ３ξ受容体鎖を含む。一部の実施形態では、二部位ポリペプチドは、ＮＫｐ４６に結合する。ＮＫｐ４６は、ＣＤ３３５としても知られ、天然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）ファミリーに属し、また２つのＩｇ様ドメインおよび短い細胞質尾部を有する糖タンパク質である。一部の実施形態では、二部位ポリペプチドは、ＣＤ１６に結合する。ＣＤ１６は、ＦｃγＲＩＩＩとしても知られ、ナチュラルキラー細胞、好中球、単球、およびマクロファージの表面上に存在する分化分子のクラスターである。一部の実施形態では、二部位ポリペプチドは、ＳＩＲＰαに結合する。ＳＩＲＰαは、シグナル調節タンパク質αとしても知られ、主に骨髄系細胞によって発現され、また幹細胞またはニューロンによっても発現される、ＳＩＲＰファミリー由来の調節性膜糖タンパク質であり、膜貫通タンパク質ＣＤ４７と相互作用する。
一部の実施形態では、腫瘍細胞またはエフェクター細胞上で発現する細胞表面抗原は、以下の表４から選択される。一部の実施形態では、腫瘍細胞上に発現される細胞表面抗原は、腫瘍抗原である。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＥｐｈＡ２、ＭＣＳＰ、ＡＤＡＭ１７、ＰＳＣＡ、１７－Ａ１、ＮＫＧＤ２リガンド、ＣＳＦ１Ｒ、ＦＡＰ、ＧＤ２、ＤＬＬ３、またはニューロピリンから選択される。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、表４に列挙されるものから選択される。
一部の実施形態では、二部位ポリペプチドは、ＤＬＬ３およびエフェクター細胞標的抗原に結合する分子、ＦＡＰおよびエフェクター細胞標的抗原に結合する分子、ならびにＥｐＣＡＭおよびエフェクター細胞標的抗原に結合する分子から選択される。一部の実施形態では、エフェクター細胞標的抗原は、表３から選択される。一部の実施形態では、エフェクター細胞標的抗原は、Ｔ細胞標的抗原である。一部の実施形態では、エフェクター細胞標的抗原は、ＣＤ３である。一部の実施形態では、エフェクター細胞標的抗原は、ＣＤ３εである。
Figure 2023528300000004
Figure 2023528300000005
Figure 2023528300000006
一部の実施形態では、二部位ポリペプチドは、以下の表５に記載の“ｘ”とマークされる二つの抗原の組合せに特異的に結合する。同一抗原を有する表５で“ｘ”とマークした組合せは、二部位ポリペプチドが、同一抗原の二つの異なるエピトープに特異的に結合することを示す。一部の実施形態では、二部位ポリペプチドは、ＢｉＴＥである。
Figure 2023528300000007
Figure 2023528300000008
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Figure 2023528300000033
Figure 2023528300000034
一部の実施形態では、ペイロード分子は抗原である。一部の実施形態では、当該抗原は、表４に列挙されるものから選択されるタンパク質またはその部分である。一部の実施形態では、抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）またはその部分である。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面上に発現される。一部の実施形態では、抗原またはその部分の発現は、腫瘍細胞に対する免疫反応を誘発する。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＣＤ１９、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＥｐｈＡ２、ＭＣＳＰ、ＡＤＡＭ１７、ＰＳＣＡ、１７－Ａ１、ＮＫＧＤ２リガンド、ＣＳＦ１Ｒ、ＦＡＰ、ＧＤ２、ＤＬＬ３、ニューロピリン、サバイビン、またはＭＡＧＥファミリータンパク質から選択される。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原はサバイビンである。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＭＡＧＥ（メラノーマ抗原遺伝子）ファミリータンパク質である。ＭＡＧＥファミリータンパク質には、ＭＡＧＥ－Ｂ１、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＡ１１、ＭＡＧＥＡ１２、ＭＡＧＥＡ２Ｂ、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ８、ＭＡＧＥＡ９、ＭＡＧＥＢ１、ＭＡＧＥＢ１０、ＭＡＧＥＢ１６、ＭＡＧＥＢ１８、ＭＡＧＥＢ２、ＭＡＧＥＢ３、ＭＡＧＥＢ４、ＭＡＧＥＢ５、ＭＡＧＥＢ６、ＭＡＧＥＢ６Ｂ、ＭＡＧＥＣ１、ＭＡＧＥＣ２、ＭＡＧＥＣ３、ＭＡＧＥＤ１、ＭＡＧＥＤ２、ＭＡＧＥＤ４、ＭＡＧＥＥ１、ＭＡＧＥＥ２、ＭＡＧＥＦ１、ＭＡＧＥＨ１、ＭＡＧＥＬ２、ＮＤＮ、ＮＤＮＬ２またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、以下の表６の抗原から選択される。一部の実施形態では、レプリコンは、本開示の二、三、四、五、またはそれ以上の腫瘍関連抗原をコードする。
一部の実施形態では、ペイロード分子は、本開示の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の断片（すなわち、ペプチド断片）を含むか、または当該断片からなる。一部の実施形態では、ＴＡＡの断片は、約１０アミノ酸（ａａ）、約１５ａａ、約２０ａａ、約３０ａａ、約４０ａａ、約５０ａａ、約６０ａａ、約７０ａａ、約８０ａａ、約９０ａａ、約１００ａａ、またはその間の任意の値の長さを有する。一部の実施形態では、ＴＡＡの断片は、少なくとも１０ａａ、少なくとも１５ａａ、少なくとも２０ａａ、少なくとも３０ａａ、少なくとも４０ａａ、少なくとも５０ａａ、少なくとも６０ａａ、少なくとも７０ａａ、少なくとも８０ａａ、少なくとも９０ａａ、または少なくとも１００ａａの長さを有する。一部の実施形態では、レプリコンは、各々が異なるＴＡＡの断片を含むか、または当該断片からなる、二、三、四、五、またはそれ以上のペイロード分子を含む。一部の実施形態では、レプリコンは、各々が同一のＴＡＡの異なる断片を含むか、または当該断片からなる、二、三、四、五、またはそれ以上のペイロード分子を含む。一部の実施形態では、レプリコンは、各々が同一のＴＡＡの同一の断片を含むか、または当該断片からなる、ペイロード分子の二つのコピー、三つのコピー、四つのコピー、五つのコピー、またはそれ以上のコピーを含む。一部の実施形態では、ペイロード分子は、ＴＡＡの同一のペプチド断片のリピートを含むものであり、例えば同一のペプチド断片の２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、または１０回を超えるリピート等を含む。
Figure 2023528300000035
一部の実施形態では、ペイロード分子は、腫瘍新生抗原を含むか、または腫瘍新生抗原からなる。用語「腫瘍新生抗原」は、対象の腫瘍細胞または組織に存在するが、対象の対応する正常な細胞または組織には存在しない新生抗原を指す。腫瘍新生抗原は、ペプチドまたはタンパク質であり得る。一部の実施形態では、腫瘍新生抗原は、患者特異的または対象特異的である。一部の実施形態では、レプリコンは、腫瘍新生抗原を含む複数のペイロード分子を、例えば腫瘍新生抗原を含む２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、または１０個を超えるペイロード分子等を、コードする。一部の実施形態では、レプリコンは、同一の腫瘍新生抗原の複数のコピーをコードすることができる。
一部の実施形態では、ペイロード分子は、主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）－ペプチド抗原複合体に特異的に結合する、二部位ポリペプチドである。一部の実施形態では、二部位ポリペプチドは、ＭＨＣ－ペプチド抗原複合体に特異的に結合する。一部の実施形態では、ＭＨＣは、Ｉ型ＭＨＣである。一部の実施形態では、ペプチド抗原は、ＴＡＡまたは腫瘍新生抗原に由来する。一部の実施形態では、二部位ポリペプチドは、ＭＨＣ－ペプチド抗原複合体に特異的に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の断片（例えば、ＴＣＲの細胞外ドメイン）を含む。一部の実施形態では、二部位ポリペプチドはまた、表３に従うエフェクター細胞抗原のうちの一つにも結合する。一部の実施形態では、二部位ポリペプチドは、ＣＤ３に特異的に結合する。一部の実施形態では、二部位ポリペプチドは、ＣＤ３εに特異的に結合する。
一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、一つ以上のペイロード分子を含むものであり、当該ペイロード分子は、
ａ）ＩＦＮγ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、およびＩＬ－３６γを含む一つ以上のサイトカイン、
ｂ）ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、およびＣＣＬ２１を含む一つ以上のケモカイン、
ｃ）抗－ＰＤ１－ＶＨＨ－Ｆｃ抗体、抗－ＣＤ４７－ＶＨＨ－Ｆｃ抗体、および抗－ＴＧＦβ－ＶＨＨ（またはｓｃＦｖ）－Ｆｃ抗体を含む一つ以上の抗体、
ｄ）ＤＬＬ３およびエフェクター細胞標的抗原と結合する二部位ポリペプチドと、ＦＡＰおよびエフェクター細胞標的抗原と結合する二部位ポリペプチドと、ＥｐＣＡＭおよびエフェクター細胞標的抗原と結合する二部位ポリペプチドとを含む、一つ以上の二部位ポリペプチド、
ｅ）サバイビン、ＭＡＧＥファミリータンパク質、および表６に記載のすべての抗原を含む一つ以上の腫瘍関連抗原、
ｆ）一つ以上の腫瘍新生抗原、
ｇ）ＭＨＣ－ペプチド抗原複合体に結合する一つ以上の二部位ポリペプチド、
ｈ）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ） ＵＬ２７／糖タンパク質Ｂ／ｇＢ、ＨＳＶ ＵＬ５３／糖タンパク質Ｋ／ｇＫ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ） Ｆタンパク質、ＦＡＳＴｐ１５、ＶＳＶ－Ｇ、シンシチン（ｓｙｎｃｉｔｉｎ）－１（ヒト内在性レトロウイルス－Ｗ（ＨＥＲＶ－Ｗ）由来）またはシンシチン－２（ＨＥＲＶＦＲＤＥ１由来）、パラミクソウイルスＳＶ５－Ｆ、はしかウイルス－Ｈ、はしかウイルス－Ｆ、および例えばテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、メーソン－ファイザーモンキーウイルス（ＭＰＭＶ）およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）等であり、任意でＲ膜貫通ペプチドが除去されている（Ｒ－バージョン）、レトロウイルスまたはレンチウイルス由来の糖タンパク質を含む一つ以上の膜融合性タンパク質、
ｉ）ＩＬ１５Ｒ、ＰＧＤＨ、ＡＤＡ、ＡＤＡ２、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＣＨＩＰＳ、ＭＬＫＬ（またはその４ＨＢドメインのみ）、ＧＳＤＭＤ（またはそのＬ１９２Ａ変異体、またはそのアミノ酸１～２３３断片、またはＬ１９２Ａ変異を有するそのアミノ酸１～２３３断片）、ＧＳＤＭＥ（またはそのアミノ酸１～２３７断片）、ＨＭＧＢ１（またはそのボックスＢドメインのみ）、メリチン（例えば、アルファ－メリチン）、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ（またはそのアミノ酸５６～２３９断片）、ヘビＬＡＡＯ、ヘビディスインテグリン、レプチン、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ガスダーミンＤまたはその切断、およびガスダーミンＥまたはその切断、を含む一つ以上の他のペイロード分子、
ｊ）デングウイルス、チクングニヤウイルス、ヒト結核菌、ヒト免疫不全ウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、コロナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、トガウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、および動物ウイルス（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖｉｒｕｓ）を含む、病原体由来の一つ以上の抗原、または
ｋ）それらの任意の組み合わせ、を含む。
膜融合タンパク質は、細胞膜への細胞の融合を促進するタンパク質である。本開示のレプリコンによりコードされる、ペイロード分子またはペイロード分子のうちの少なくともひとつは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ） ＵＬ２７／糖タンパク質Ｂ／ｇＢ、ＨＳＶ ＵＬ５３／糖タンパク質Ｋ／ｇＫ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ） Ｆタンパク質、ＦＡＳＴｐ１５、ＶＳＶ－Ｇ、シンシチン（ｓｙｎｃｉｔｉｎ）－１（ヒト内在性レトロウイルス－Ｗ（ＨＥＲＶ－Ｗ）由来）またはシンシチン－２（ＨＥＲＶＦＲＤＥ１由来）、パラミクソウイルスＳＶ５－Ｆ、はしかウイルス－Ｈ、はしかウイルス－Ｆ、および例えばテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、メーソン－ファイザーモンキーウイルス（ＭＰＭＶ）およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）等であり、任意でＲ膜貫通ペプチドが除去されている（Ｒ－バージョン）、レトロウイルスまたはレンチウイルス由来の糖タンパク質を含む、膜融合性タンパク質であり得る。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＧＭ－ＣＳＦである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号８１に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＧＭ－ＣＳＦポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＩＬ－２である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号８２に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＩＬ－２ポリペプチドである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号８３に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＩＬ－２ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＩＬ－１２ベータサブユニットである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号８４に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＩＬ－１２ベータサブユニットポリペプチドである。一部の実施形態では、ペイロード分子はＩＬ－１２アルファサブユニットである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号８５に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＩＬ－１２アルファサブユニットポリペプチドである。一部の実施形態では、ペイロード分子はＩＬ－２３アルファサブユニットである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号８６に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＩＬ－２３アルファサブユニットポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＩＬ－１８である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号８７に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＩＬ－１８ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＩＬ－３６γである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号８８に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＩＬ－３６γポリペプチドである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号８９に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＩＬ－３６γポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＣＸＣＬ１０である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号９０に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＸＣＬ１０ポリペプチドである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号９１に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＸＣＬ１０ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＣＣＬ４である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号９２に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＣＬ４ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＣＣＬ５である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号９３に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＣＬ５ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＣＣＬ２１である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号９４に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＣＬ２１ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子は抗－ＰＤ１－ＶＨＨ－Ｆｃである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号９５に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する抗－ＰＤ１－ＶＨＨ－Ｆｃ（ｈＩｇＧ４）ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子は、抗－ＤＬＬ３二部位ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗－ＤＬＬ３二部位ポリペプチドは、抗－ＤＬＬ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。一部の実施形態では、抗－ＤＬＬ３二部位ポリペプチドまたは抗－ＤＬＬ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）は、エフェクター細胞の細胞表面抗原を結合することができる第一のドメインと、ＤＬＬ３に結合することができる第二のドメインとを含む。一部の実施形態では、第一のドメインは、ＣＤ３に結合する。一部の実施形態では、第二のドメイン（ＤＬＬ３に結合する）は、ｓｃＦｖまたはナノボディ（ＶＨＨ）である。一部の実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは、ＰＣＴ国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０３０８３６号に記載されるものから選択されるが、当該出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＤＬＬ３抗原は、配列番号９６に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、ペイロード分子は、抗ＦＡＰ重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号９７に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する抗ＦＡＰ重鎖可変領域ポリペプチドを含む。一部の実施形態において、ペイロード分子は、抗ＦＡＰ軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号９８に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する抗ＦＡＰ軽鎖可変領域ポリペプチドを含む。
一部の実施形態において、ペイロード分子は、抗－ＣＤ３重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号９９に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する抗－ＣＤ３重鎖可変領域ポリペプチドを含む。一部の実施形態において、ペイロード分子は、抗－ＣＤ３軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１００に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する抗－ＣＤ３軽鎖可変領域ポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、ペイロード分子はブリナツモマブである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１０１に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するブリナツモマブ様ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＭＴ１１０である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１０２に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＭＴ１１０様ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＰａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１０３に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＰａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ様ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＡＭＧ３３０である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１０４に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＡＭＧ３３０様ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＣＯＶＡ４２０重鎖である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１０５に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＯＶＡ４２０重鎖様ポリペプチドである。一部の実施形態では、ペイロード分子はＣＯＶＡ４２０軽鎖である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１０６に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＯＶＡ４２０軽鎖様ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はサバイビンである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１０７に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するサバイビンポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＩＦＮγである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１１３に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＩＦＮγポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＩＬ－１５である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１１４に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＩＬ－１５ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＩＬ１５Ｒである。一部の実施形態では、ＩＬ１５ＲはＩＬ１５ＲＡおよび／またはＩＬ１５ＲＢを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１５ＲＡは、配列番号１１５に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＩＬ１５ＲＢポリペプチドは、配列番号１１６に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＰＧＤＨである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１１７に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＰＧＤＨポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＡＤＡ２である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１１８に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＡＤＡ２ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＨＹＡＬ１である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１１９に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＨＹＡＬ１ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＨＹＡＬ２である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１２０に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＨＹＡＬ２ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＭＬＫＬである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１２１に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＭＬＫＬポリペプチドである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、ＭＬＫＬ ４ＨＢドメインを含むか、またはＭＬＫＬ ４ＨＢドメインからなる。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＧＳＤＭＤである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１２２に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＧＳＤＭＤポリペプチドである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、ＧＳＤＭＤの１～２３３断片および／またはＬ１９２Ａ変異体である。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＧＳＤＭＥである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１２３に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＧＳＤＭＥポリペプチドである。一部の実施形態では、ペイロード分子はＧＳＤＭＥの１～２３７断片である。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＨＭＧＢ１である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１２４に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＨＭＧＢ１ポリペプチドである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、ＨＭＧＢ１ボックスＢドメインを含むか、またはＨＭＧＢ１ボックスＢドメインからなる。
一部の実施形態では、ペイロード分子はメリチンである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１２５に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するメリチンポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１２６に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏポリペプチドである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏのアミノ酸５６～２３９断片を含むか、またはＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏのアミノ酸５６～２３９断片からなる。
一部の実施形態では、ペイロード分子はヘビＬＡＡＯである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１２７に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するヘビＬＡＡＯポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はレプチンである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１２８に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するレプチンポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＦＬＴ３Ｌである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１２９に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＦＬＴ３Ｌポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＴＲＡＩＬである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１３０に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＴＲＡＩＬポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＭＡＧＥＡ１である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１３１に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＭＡＧＥＡ１ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＭＡＧＥＡ３である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１３２に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＭＡＧＥＡ３ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＭＡＧＥＡ４である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１３３に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＭＡＧＥＡ４ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＭＡＧＥＡ１２である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１３４に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＭＡＧＥＡ１２ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＭＡＧＥＣ２である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１３５に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＭＡＧＥＣ２ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＢＡＧＥ１（Ｂ黒色腫抗原１）である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１３６に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＢＡＧＥ１（Ｂ黒色腫抗原１）ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＧＡＧＥ１（Ｇ抗原１）である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１３７に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＧＡＧＥ１（Ｇ抗原１）ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子は、ＸＡＧＥ１Ｂ（Ｘ抗原ファミリーメンバー１Ｂ）である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１３８に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＸＡＧＥ１Ｂ（Ｘ抗原ファミリーメンバー１Ｂ）ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＣＴＡＧ２（ＬＡＧＥ１）である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１３９に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＴＡＧ２（ＬＡＧＥ１）ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＣＴＡＧ１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１４０に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＴＡＧ１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＳＳＸ２（滑膜肉腫Ｘブレークポイント２）である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１４１に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＳＳＸ２（滑膜肉腫Ｘブレークポイント２）ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＫＫＬＣ１（Ｋｉｔａ－ｋｙｕｓｈｕ肺がん抗原１）である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１４２に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＫＫＬＣ１（Ｋｉｔａ－ｋｙｕｓｈｕ肺がん抗原１）ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＳＡＧＥ（肉腫抗原）である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１４３に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＳＡＧＥ（肉腫抗原）ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＳＰＡ１７（精子自己抗原タンパク質１７）である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１４４に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＳＰＡ１７（精子自己抗原タンパク質１７）ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はサイクリンＡである。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１４５に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するサイクリンＡポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＫＭＨＮ１（ＣＣＤＣ１１０）である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１４６に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＫＭＨＮ１（ＣＣＤＣ１１０）ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＬＭＰ－１である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１４７に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＬＭＰ－１ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子はＬＭＰ－２である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、配列番号１４８に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＬＭＰ－２ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ペイロード分子は、対象自身のゲノムによってコードされない抗原である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、病原性微生物によって発現される抗原である。病原性微生物は、細菌、ウイルス、寄生生物、および真菌類を含む。一部の実施形態では、ペイロード分子は、デングウイルス、チクングニヤウイルス、ヒト結核菌、ヒト免疫不全ウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、コロナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、トガウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、および動物ウイルス（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖｉｒｕｓ）を含む病原体のうちのひとつに由来する抗原である。
開裂ポリペプチド
一部の実施形態では、一つ以上の開裂ポリペプチドが、ペイロード分子に対して動作可能に連結される。かかる開裂ポリペプチドの存在により、ペイロード分子を、レプリコンによってコードされる残りのポリペプチドから分離させることが可能になる。一部の実施形態では、レプリコンは、一つ以上の開裂ポリペプチドに対して動作可能に連結された二つ以上のペイロード分子をコードする異種ポリヌクレオチドを含み、これによりペイロード分子の分離が可能になる。一部の実施形態では、追加的なペプチドリンカー（例えばグリシン－セリンリンカー等）が、ペイロード分子と開裂ポリペプチドとの間に存在してもよい。
開裂ポリペプチドは、２Ａファミリーの自己開裂ペプチド、３Ｃ開裂部位、フーリン部位、ＩＧＳＦ１、およびＨＩＶ－１プロテアーゼ部位を含む。複数の開裂ポリペプチドをペイロード分子に動作可能に連結することができ、また異なる開裂ポリペプチドを同一のレプリコン内で使用することができることに留意されたい。例えば、異なる開裂ポリペプチドを、ペイロード分子のＮ末端およびＣ末端に動作可能に連結することができる。さらに二つ以上の開裂ポリペプチドを、一緒に結合するか、または連続的に連結して、向上した開裂特性を有し得るより長い開裂ポリペプチドを形成することができる。
一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、２Ａファミリーの自己開裂ペプチドを含むまたは２Ａファミリーの自己開裂ペプチドからなる。自己開裂ペプチドは、ピコルナウイルス科のメンバーに存在するが、その中には、例えば口蹄ウイルス（ＦＭＤＶ（Ｆｏｏｔ－ａｎｄ－Ｍｏｕｔｈ ｖｉｒｕｓ））、馬鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）およびブタｔｅｓｃｈｏウイルス－１（ＰＴＶ－１）等のアフトウイルス（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｍ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８２，１０２７－１０１（２００１）；Ｒｙａｎ，Ｍ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，２７２７－２７３２（２００１））、ならびに例えばタイロウイルス（例えば、タイラーマウス脳脊髄炎）および脳心筋炎ウイルス等であるカルジオウイルスが含まれる。ＦＭＤＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ－１およびＴａＶに由来する２Ａペプチドは、本明細書では、それぞれ、“Ｆ２Ａ”、“Ｅ２Ａ”、“Ｐ２Ａ”および“Ｔ２Ａ”と呼称されることがある。アフトウイルス２Ａポリペプチドは、典型的には、Ｄｘ１Ｅｘ２ＮＰＧ（配列番号６３）モチーフを含有するものであり、式中ｘ１はしばしばバリンまたはイソロイシンである。いかなる特定の理論にも拘束されることを意図するものではないが、２Ａ配列は、プロリンとグリシンとの間の「リボソームスキッピング」を媒介し、下流の翻訳に影響を与えることなく、ＰとＧとの間の正常なペプチド結合形成を欠損させると考えられている。例示的な２Ａ自己開裂ペプチドは、以下の表７に見ることができる。さらなる例示的な２Ａ自己切断ペプチドを、米国特許第９，４９７，９４３号およびＳｏｕｚａ－Ｍｏｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．２０１８ Ａｕｇ １；１８（５）に見ることができるが、これらは参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、表７に記載の２Ａ自己切断ペプチドのうちのひとつを含む。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、表７の２Ａ自己開裂ペプチドのうちのひとつに従う、最大で１、最大で２、最大で３、または最大で４の変異からなるアミノ酸配列を含む。
Figure 2023528300000036
一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、ＳＶＶ ２Ａ自己開裂ペプチドを含むまたはＳＶＶ ２Ａ自己開裂ペプチドからなる。一部の実施形態では、ＳＶＶ ２Ａ自己開裂ペプチドは、ＳＧＤＩＥＴＮＰＧＰ（配列番号６８）のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＳＶＶ ２Ａ自己開裂ペプチドは、ＳＧＤＩＥＴＮＰＧＰ（配列番号６８）に従って、最大で１、最大で２、または最大で３の変異からなるアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、コクサッキーウイルス２Ａ開裂部位を含むまたはコクサッキーウイルス２Ａ開裂部位からなる。一部の実施形態では、コクサッキーウイルス２Ａ開裂部位は、ＧＦＧＨＱ（配列番号６９）のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、コクサッキーウイルス２Ａ開裂部位は、ＧＦＧＨＱ（配列番号６９）に従って、最大で１、最大で２、または最大で３の変異からなるアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、３Ｃ開裂部位を含むまたは３Ｃ開裂部位からなる。一部の実施形態では、３Ｃ開裂部位は、アミノ酸配列ＩＶＹＥＬＱＧＰ（配列番号７０）を有するＳＶＶ ３Ｃ開裂部位である。一部の実施形態では、３Ｃ開裂部位は、ＩＶＹＥＬＱＧＰ（配列番号７０）に従って、最大で１、最大で２、または最大で３の変異からなるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、フーリン部位および３Ｃ開裂部位を含む。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、ＲＲＫＲＩＶＹＥＬＱＧＰ（配列番号７１）のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、３Ｃ開裂部位は、ＲＲＫＲＩＶＹＥＬＱＧＰ（配列番号７１）に従って、最大で１、最大で２、最大で３、または最大で４の変異からなるアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、哺乳類細胞によって産生されるプロテアーゼによって開裂され得る一つ以上の開裂部位を含むか、または当該開裂部位からなる。一部の実施形態では、プロテアーゼは、フーリンプロテアーゼである。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、一のフーリン部位を含むまたは一のフーリン部位からなる。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、二つ以上のフーリン部位を含むまたは二つ以上のフーリン部位からなる。一部の実施形態では、フーリン部位は、コンセンサス配列Ａｒｇ－Ｘ－Ｘ－Ａｒｇ（配列番号７２）を有する。一部の実施形態では、フーリン部位は、コンセンサス配列Ａｒｇ－Ｘ－Ｌｙｓ／Ａｒｇ－Ａｒｇ（配列番号７３）を有する。一部の実施形態では、フーリン部位は、アミノ酸配列ＲＲＫＲ（配列番号７４）を有する。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、一つ以上のＧＳリンカー（アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）を含む。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、一つ以上のＧＳＧリンカー（アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ）を含む。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、「ＧＳＧリンカー－２Ａペプチド」の構成を採用する。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、「フーリン部位－２Ａペプチド」の構成を採用する。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、「フーリン部位－ＧＳＧリンカー－２Ａペプチド」の構成を採用する。
一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、ＩＧＳＦ１ポリペプチドを含むまたはＩＧＳＦ１ポリペプチドからなる。一部の実施形態では、ＩＧＳＦ１ポリペプチドは、アミノ酸配列ＮＥＡＩＲＬＳＬＩＭＱＬＶＡＬＬＬＶＶＬＷＩＲＷＫＣＲＲＬＲＩＲＥＡＷＬＬＧＴＡＱＧＶＴＭＬＦＩＶＴＡＬＬＣＣＧＬＣＮＧ（配列番号７５）を含むまたは当該アミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＩＧＳＦ１ポリペプチドは、配列番号７５に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、ＩＧＳＦ１ポリペプチドに加えて、一つ以上のフーリン部位を含む。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＳＲＲＫＲＧＳＲＲＫＲＧＳ（配列番号７６）を有するフーリン部位含有ペプチドを含むまたは当該フーリン部位含有ペプチドからなる。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＳＲＲＫＲＧＳＲＲＫＲＧＳＮＥＡＩＲＬＳＬＩＭＱＬＶＡＬＬＬＶＶＬＷＩＲＷＫＣＲＲＬＲＩＲＥＡＷＬＬＧＴＡＱＧＶＴＭＬＦＩＶＴＡＬＬＣＣＧＬＣＮＧ（配列番号７７）を含むまたは当該アミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、配列番号７７に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ペイロード分子のうちの二つが、ＩＧＳＦポリペプチドを含む開裂ポリペプチドに動作可能に連結されている。一部の実施形態では、ペイロード分子のうちの二つが、ＩＧＳＦポリペプチドおよび一つ以上のフーリン部位を含む開裂ポリペプチドに動作可能に連結されている。一部の実施形態では、ペイロード分子のうちの二つが、配列番号７７のアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる開裂ポリペプチドに動作可能に連結されている。
一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、非哺乳類プロテアーゼによって認識され得る一つ以上の開裂部位を含むまたは当該開裂部位からなる。一部の実施形態では、非哺乳類プロテアーゼは、ＨＩＶプロテアーゼである。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、ＨＩＶプロテアーゼ部位を含むまたはＨＩＶプロテアーゼ部位からなる。一部の実施形態では、ＨＩＶプロテアーゼ部位は、アミノ酸配列ＩＦＬＥＴＳ（配列番号７８）を有するＰＲ開裂配列を含むまたは当該ＰＲ開裂配列からなる。一部の実施形態では、ＨＩＶプロテアーゼ部位は、ＩＦＬＥＴＳ（配列番号７８）に従って、最大で一、最大で二、または最大で三の変異または保存的変異を有するＰＲ開裂配列を含むまたは当該ＰＲ開裂配列からなる。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、ＧＳリンカーおよびＰＲ開裂配列を含む。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＳＧＩＦＬＥＴＳ（配列番号７９）を含むまたは当該アミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、ＧＳＧＩＦＬＥＴＳ（配列番号７９）に従って、最大で一、最大で二、最大で三または最大で四の変異または保存的変異を有するアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる。
一部の実施形態では、異種核酸は、ＨＩＶプロテアーゼコード配列を含む。一部の実施形態では、当該ＨＩＶプロテアーゼは、以下の配列番号８０に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる：
ＱＩＴＬＷＱＲＰＬＶＴＩＫＩＧＧＱＬＫＥＡＬＬＤＴＧＡＤＤＴＶＬＥＥＭＳＬＰＧＲＷＫＰＫＭＩＧＧＩＧＧＦＩＫＶＲＱＹＤＱＩＬＩＥＩＣＧＨＫＡＩＧＴＶＬＶＧＰＴＰＶＮＩＩＧＲＮＬＬＴＱＩＧＣＴＬＮＦ（配列番号８０）。
一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、一つ以上の開裂ポリペプチドに動作可能に連結されたペイロード分子をコードするコード領域を含む。一部の実施形態では、ペイロード分子は、二つの開裂ポリペプチドに対して動作可能に連結される。一部の実施形態では、少なくとも一つの開裂ポリペプチドが、ペイロード分子のＮ末端に隣接する、および／または少なくとも一つの開裂ポリペプチドが、ペイロード分子のＣ末端に隣接する。一部の実施形態では、開裂ペプチドおよびペイロード分子は、
Ｎ’－開裂ポリペプチド１－ペイロード分子－開裂ポリペプチド２－Ｃ’の構成を採用する。
一部の実施形態では、追加的な開裂ポリペプチドが、この段落で上述した構成のＮ’末端および／またはＣ’末端に存在し得る。一部の実施形態では、当該追加的な開裂ポリペプチドは、２Ａ自己開裂ペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃ末端における開裂ポリペプチド２は、Ｔ２Ａ自己開裂ペプチドを含むまたは当該Ｔ２Ａ自己開裂ペプチドからなる。一部の実施形態では、Ｎ末端における開裂ポリペプチド１は、２Ａ自己開裂ペプチドを含むまたは当該２Ａ自己開裂ペプチドからなる。一部の実施形態では、追加的なペプチドリンカー（例えばグリシン－セリンリンカー等）が、ペイロード分子と開裂ポリペプチドとの間に存在してもよい。
複数のペイロード分子の共発現
一部の実施形態では、本開示は、二つ以上のペイロード分子をコードする異種ヌクレオチドを含む組換えＲＮＡレプリコンを提供する。一部の実施形態では、本開示の組換えＲＮＡレプリコンは、一つのレプリコンから二つ以上のペイロード分子を発現することを可能にする。
一部の実施形態では、二つ以上のペイロード分子は、連続的な異種ポリヌクレオチドによってコードされる。一部の実施形態では、ペイロード分子のうちの少なくとも一つは、第二の異種ポリヌクレオチドによってコードされる。一部の実施形態では、二つ以上の異種ポリヌクレオチドは、ウイルスゲノムの異なる位置に挿入される。
一部の実施形態では、ペイロード分子の少なくとも一つは分泌タンパク質である。一部の実施形態では、当該分泌タンパク質は、天然のシグナルペプチドまたは外来性のシグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、ペイロード分子のうちの二つは分泌タンパク質である。一部の実施形態では、ペイロード分子の少なくとも二つは分泌タンパク質である。一部の実施形態では、ペイロード分子のすべてが分泌タンパク質である。一部の実施形態では、ペイロード分子のうちの少なくとも一つは、分泌のための天然シグナルペプチド配列を含む分泌タンパク質である。一部の実施形態では、ペイロード分子のうちの少なくとも一つは、分泌のための外来性のシグナルペプチド配列を含む分泌タンパク質である。一部の実施形態では、ペイロード分子のうちの少なくとも一つは、シグナルペプチド配列を含まない分泌タンパク質である。
一部の実施形態では、ペイロード分子の各々は、そのＣ末端で開裂ポリペプチドに動作可能に連結される。一部の実施形態では、ペイロード分子の各々は、そのＮ末端およびそのＣ末端の両方において開裂ポリペプチドに動作可能に連結される。
一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、開裂ポリペプチドに動作可能に連結された二つ以上のペイロード分子をコードするコード領域を含む。一部の実施形態では、二つ以上のペイロード分子および開裂ポリペプチドは、
Ｎ’－ペイロード分子１－開裂ポリペプチド－ペイロード分子２－Ｃ’の構成を採用する。
一部の実施形態では、追加的な開裂ポリペプチドが、この段落で上述した構成のＮ’末端および／またはＣ’末端に存在し得る。一部の実施形態では、当該追加的な開裂ポリペプチドは、２Ａ自己開裂ペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｔ２Ａ自己開裂ペプチドは、ペイロード分子２のＣ末端に隣接する。一部の実施形態では、追加的なペプチドリンカー（例えばグリシン－セリンリンカー等）が、ペイロード分子と開裂ポリペプチドとの間に存在してもよい。
一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、ＩＧＳＦポリペプチドを含むまたはＩＧＳＦポリペプチドからなる開裂ポリペプチドに動作可能に連結された二つのペイロード分子をコードするコード領域を含む。一部の実施形態では、ＩＧＳＦ１ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＮＥＡＩＲＬＳＬＩＭＱＬＶＡＬＬＬＶＶＬＷＩＲＷＫＣＲＲＬＲＩＲＥＡＷＬＬＧＴＡＱＧＶＴＭＬＦＩＶＴＡＬＬＣＣＧＬＣＮＧ（配列番号７５）。
一部の実施形態では、ＩＧＳＦ１ポリペプチドは、配列番号７５に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有する。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＳＲＲＫＲＧＳＲＲＫＲＧＳ（配列番号７６）を有するフーリン部位含有ペプチドを含む。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、アミノ酸配列
ＧＳＲＲＫＲＧＳＲＲＫＲＧＳＮＥＡＩＲＬＳＬＩＭＱＬＶＡＬＬＬＶＶＬＷＩＲＷＫＣＲＲＬＲＩＲＥＡＷＬＬＧＴＡＱＧＶＴＭＬＦＩＶＴＡＬＬＣＣＧＬＣＮＧ（配列番号７７）を含むまたは当該アミノ酸配列からなる。
一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、配列番号７７に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる。
一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、一つ以上のＨＩＶプロテアーゼ部位を含むまたは一つ以上のＨＩＶプロテアーゼ部位からなる開裂ポリペプチドに動作可能に連結された二つのペイロード分子をコードするコード領域を含む。一部の実施形態では、ＨＩＶプロテアーゼ部位は、アミノ酸配列ＩＦＬＥＴＳ（配列番号７８）、またはＩＦＬＥＴＳ（配列番号７８）に従って最大で一、最大で二、もしくは最大で三の変異もしくは保存的変異を有するアミノ酸配列を有する、ＰＲ開裂配列を含むまたは当該ＰＲ開裂配列からなる。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、ＧＳリンカーおよびＰＲ開裂配列を含む。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＳＧＩＦＬＥＴＳ（配列番号７９）を含むまたは当該アミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、開裂ポリペプチドは、ＧＳＧＩＦＬＥＴＳ（配列番号７９）に従って、最大で一、最大で二、最大で三または最大で四の変異または保存的変異を有するアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる。
一部の実施形態では、異種核酸は、ＨＩＶプロテアーゼコード領域をさらに含む。一部の実施形態では、ＨＩＶプロテアーゼは、ＨＩＶプロテアーゼ部位を含むまたはＨＩＶプロテアーゼ部位からなる開裂ポリペプチドによって、一つ以上のペイロード分子に動作可能に連結される。一部の実施形態では、ＨＩＶプロテアーゼは、二つのペイロード分子の間に位置する。
一部の実施形態では、異種核酸は、二つのペイロード分子およびＨＩＶプロテアーゼをコードするコード領域を含む。一部の実施形態では、異種核酸は、
Ｎ’－ペイロード分子１－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ＨＩＶプロテアーゼ－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ペイロード分子２－Ｃ’の構成を採用するポリペプチドをコードするコード領域を含む。
一部の実施形態では、追加的な開裂ポリペプチドが、この段落で上述した構成のＮ’末端および／またはＣ’末端に存在し得る。一部の実施形態では、当該追加的な開裂ポリペプチドは、ＨＩＶプロテアーゼ部位を含む。一部の実施形態では、当該追加的な開裂ポリペプチドは、２Ａ自己開裂ペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｔ２Ａ自己開裂ペプチドは、ペイロード分子２のＣ末端に隣接する。一部の実施形態では、追加的なペプチドリンカー（例えばグリシン－セリンリンカー等）が、ペイロード分子とＨＩＶプロテアーゼ部位との間に存在してもよい。
一部の実施形態では、異種核酸は、三つのペイロード分子およびＨＩＶプロテアーゼをコードするコード領域を含む。一部の実施形態では、異種核酸は、
Ｎ’－ペイロード分子１－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ＨＩＶプロテアーゼ－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ペイロード分子２－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ペイロード分子３－Ｃ’の構成を採用するポリペプチドをコードするコード領域を含む。
一部の実施形態では、追加的な開裂ポリペプチドが、この段落で上述した構成のＮ’末端および／またはＣ’末端に存在し得る。一部の実施形態では、当該追加的な開裂ポリペプチドは、ＨＩＶプロテアーゼ部位を含む。一部の実施形態では、当該追加的な開裂ポリペプチドは、２Ａ自己開裂ペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｔ２Ａ自己開裂ペプチドは、ペイロード分子３のＣ末端に隣接する。一部の実施形態では、追加的なペプチドリンカー（例えばグリシン－セリンリンカー等）が、ペイロード分子とＨＩＶプロテアーゼ部位との間に存在してもよい。
一部の実施形態では、二つ以上のペイロード分子が、蛍光タンパク質、酵素、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体に結合することができる抗原結合分子、および細胞表面受容体に対するリガンドからなる群から選択される。一部の実施形態では、ペイロード分子の少なくとも一つは分泌タンパク質である。一部の実施形態では、二つ以上のペイロード分子は分泌タンパク質である。一部の実施形態では、ペイロード分子は、本開示の「異種ポリヌクレオチドおよびペイロード分子」のセクションに記載したペイロード分子から選択される。
一部の実施形態では、二つ以上のペイロード分子は、
ａ．ＩＬ－２およびＩＬ－３６γ、
ｂ．ＣＸＣＬ１０ならびにＦＡＰおよびＣＤ３に結合する抗原結合分子、
ｃ．ＩＬ－２ならびにＤＬＬ３およびＣＤ３に結合する抗原結合分子、
ｄ．ＩＬ－３６γならびにＤＬＬ３およびＣＤ３に結合する抗原結合分子、または
ｅ．ＩＬ－２、ＩＬ－３６γならびにＤＬＬ３およびＣＤ３に結合する抗原結合分子、を含む。
一部の実施形態では、二つ以上のペイロード分子は、抗－ＤＬＬ３二部位ポリペプチド、抗－ＦＡＰ二部位ポリペプチド、抗－ＰＤ１－ＶＨＨ－Ｆｃ抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６γ、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ１０、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、抗－ＤＬＬ３二部位ポリペプチドは、抗－ＤＬＬ３／抗－ＣＤ３二部位ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗－ＦＡＰ二部位ポリペプチドは、抗－ＦＡＰ／抗－ＣＤ３二部位ポリペプチドである。
一部の実施形態では、本開示のレプリコン、またはレプリコンの異種ポリヌクレオチドは、以下の表８に列挙されたペイロード分子の組合せのうちの一つに従う、二つまたは少なくとも二つのペイロード分子に対するコード領域を含む。一部の実施形態では、レプリコンはＳＶＶ由来のレプリコンである。一部の実施形態では、レプリコンはＣＶＡ２１由来のレプリコンである。二つのペイロード分子の各組合せは、以下の表８に従って“ｘ”とマークされる。同一のペイロード分子を有する表８の“ｘ”とマークしたそれら組合せは、レプリコンがペイロード分子の二つのコピーを含むことを示す。
Figure 2023528300000037
Figure 2023528300000038
Figure 2023528300000039
Figure 2023528300000040
Figure 2023528300000041
Figure 2023528300000042
Figure 2023528300000043
Figure 2023528300000044
Figure 2023528300000045
Figure 2023528300000046
Figure 2023528300000047
Figure 2023528300000048
Figure 2023528300000049
Figure 2023528300000050
Figure 2023528300000051
Figure 2023528300000052
一部の実施形態では、本開示のレプリコン、または該レプリコンの異種ポリヌクレオチドは、以下の表９に列挙されたペイロード分子の組み合わせのうちの一つに従う、三つまたは少なくとも三つのペイロード分子に対するコード領域を含む。一部の実施形態では、レプリコンはＳＶＶ由来のレプリコンである。一部の実施形態では、レプリコンはＣＶＡ２１由来のレプリコンである。
Figure 2023528300000053
Figure 2023528300000054
Figure 2023528300000055
Figure 2023528300000056
一部の実施形態では、表８または表９の抗－ＤＬＬ３二部位ポリペプチドは、ＤＬＬ３と、表３に列挙されたエフェクター細胞抗原のうちの一つとに結合する。一部の実施形態では、表８または表９の抗－ＤＬＬ３二部位ポリペプチドは、ＤＬＬ３と、ＣＤ３、ＮＫｐ４６およびＣＤ１６から選択されたエフェクター細胞抗原のうちの一つとに結合する。一部の実施形態では、表８または表９の抗－ＤＬＬ３二部位ポリペプチドは、ＢｉＴＥである。
一部の実施形態では、表８または表９の抗－ＦＡＰ二部位ポリペプチドは、ＦＡＰと、表３に列挙されたエフェクター細胞抗原のうちの一つとに結合する。一部の実施形態では、表８または表９の抗－ＦＡＰ二部位ポリペプチドは、ＦＡＰと、ＣＤ３、ＮＫｐ４６およびＣＤ１６から選択されたエフェクター細胞抗原のうちの一つとに結合する。一部の実施形態では、表８または表９の抗－ＦＡＰ二部位ポリペプチドは、ＢｉＴＥである。
一部の実施形態では、表８または表９の抗－ＥｐＣＡＭ二部位ポリペプチドは、ＥｐＣＡＭと、表３に列挙されたエフェクター細胞抗原のうちの一つとに結合する。一部の実施形態では、表８または表９の抗－ＥｐＣＡＭ二部位ポリペプチドは、ＥｐＣＡＭと、ＣＤ３、ＮＫｐ４６およびＣＤ１６から選択されたエフェクター細胞抗原のうちの一つとに結合する。一部の実施形態では、表８または表９の抗－ＥｐＣＡＭ二部位ポリペプチドは、ＢｉＴＥである。
一部の実施形態では、様々なセネカバレーウイルス（ＳＶＶ）由来の組換えＲＮＡレプリコンは、一つ以上の免疫調節タンパク質（例えば、抗－ＤＬＬ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ））をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＳＶＶ由来の組換えＲＮＡレプリコンは、一つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－３６γ）および／または一つ以上のケモカイン（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ４）に対するコード領域をさらに含む。一部の実施形態では、ＳＶＶ由来の組換えＲＮＡレプリコンは、以下の表１０に従う、二つ以上のペイロード分子のコード領域を含む。
Figure 2023528300000057
一部の実施形態では、コクサッキーウイルスＡ２１（ＣＶＡ２１）由来の組換えＲＮＡレプリコンは、一つ以上の免疫調節タンパク質（例えば、抗－ＤＬＬ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ））をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＣＶＡ２１由来の組換えＲＮＡレプリコンは、一つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－３６γ）および／または一つ以上のケモカイン（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ４）に対するコード領域をさらに含む。一部の実施形態では、ＣＶＡ２１由来の組換えＲＮＡレプリコンは、以下の表１１に従う、二つ以上のペイロード分子のコード領域を含む。
Figure 2023528300000058
 内部リボソーム進入部位
一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、５’ＵＴＲの外側にＩＲＥＳを含む。一部の実施形態では、ＩＲＥＳは、５’ＵＴＲと２Ｂコード領域の間に位置している。一部の実施形態では、ＩＲＥＳは、２Ａコード領域と２Ｂコード領域との間に位置している。一部の実施形態では、ＩＲＥＳは、ペイロード分子コード配列と２Ｂコード領域との間に位置している。一部の実施形態では、ＩＲＥＳは、ＣＲＥと２Ｂコード領域との間に位置している。一部の実施形態では、ＩＲＥＳは、５’ＵＴＲと異種ポリヌクレオチドとの間に位置している。一部の実施形態では、ＩＲＥＳは、ＣＲＥと異種ポリヌクレオチドとの間に位置している。一部の実施形態では、ＩＲＥＳは、ＶＰコード領域と異種ポリヌクレオチドとの間に位置している。一部の実施形態では、ＩＲＥＳは、２Ａコード領域と異種ポリヌクレオチドとの間に位置している。一部の実施形態では、ＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳである。一部の実施形態では、レプリコンはＳＶＶゲノムを含むレプリコンである。
トランスキャプシド形成
一部の実施形態では、本開示の組換えＲＮＡレプリコンは、腫瘍崩壊ウイルス（例えば、ＲＮＡウイルスゲノム）をコードする別の組換えＲＮＡ分子によってトランスキャプシド形成され得る。こうした組換えＲＮＡ分子は、ウイルスゲノム（例えば、合成ウイルスゲノム）を含んでもよい。一部の実施形態では、かかる組換えＲＮＡ分子またはＲＮＡウイルスゲノムは、非ウイルス送達ビヒクルによって細胞内に導入されたときに、感染性の溶解性ウイルスを産生する能力を有し、また感染性ウイルスを複製および産生するために、細胞中に存在するさらなる外因性遺伝子またはタンパク質を必要としない。一部の実施形態では、かかるＲＮＡウイルスゲノムは、すべてのＶＰコード領域を含む。次いで、発現されたウイルスタンパク質は、ウイルス複製を媒介し、そしてＲＮＡウイルスゲノムを含む感染性ウイルス粒子（キャプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、および／または膜タンパク質を含み得る）へと構築する。一部の実施形態では、本開示の組換えＲＮＡレプリコンは、こうしたＲＮＡウイルスゲノムにより発現したキャプシドタンパク質によりトランスキャプシド形成され得る。一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、組換えＲＮＡレプリコンおよびＲＮＡウイルスゲノムが、同一細胞中に存在するとき（例えば、それらを粒子を介して細胞内に送達することによって）、トランスキャプシド形成され得る。このように、本明細書に記載の組換えＲＮＡレプリコンおよびＲＮＡウイルスゲノムは、同一の宿主細胞に導入されたとき、ウイルス粒子の二つの群を産生することができるが、この一方の群は組換えＲＮＡレプリコンを含み、他方の群はＲＮＡウイルスゲノムを含み、その両方ともが別の宿主細胞を感染させることができる。
ｍｉＲＮＡ標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）カセット
一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、一つ以上のｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）カセットを含むものであり、当該ｍｉＲ－ＴＳカセットは、一つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、また細胞内の一つ以上の対応するｍｉＲＮＡの発現が、細胞内のレプリコンの複製を阻害する。一部の実施形態では、一つ以上のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２１９、ｍｉＲ－２１９ａ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－１３７、およびｍｉＲ－１２６から選択される。一部の実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットは、ｍｉＲ－１２４標的配列の一つ以上のコピー、ｍｉＲ－１標的配列の一つ以上のコピー、およびｍｉＲ－１４３標的配列の一つ以上のコピーを含む。一部の実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットは、ｍｉＲ－１２８標的配列の一つ以上のコピー、ｍｉＲ－２１９ａ標的配列の一つ以上のコピー、およびｍｉＲ－１２２標的配列の一つ以上のコピーを含む。一部の実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットは、ｍｉＲ－１２８標的配列の一つ以上のコピー、ｍｉＲ－２０４標的配列の一つ以上のコピー、およびｍｉＲ－２１９標的配列の一つ以上のコピーを含む。一部の実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットは、ｍｉＲ－２１７標的配列の一つ以上のコピー、ｍｉＲ－１３７標的配列の一つ以上のコピー、およびｍｉＲ－１２６標的配列の一つ以上のコピーを含む。
一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、一つ以上のｍｉＲ－ＴＳカセットを含み、これは一つ以上の必須ウイルス遺伝子（タンパク質コード領域）の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに組み込まれる。一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、一つ以上のｍｉＲ－ＴＳカセットを含み、これは一つ以上の非必須遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに組み込まれる。一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、一つ以上のｍｉＲ－ＴＳカセットを含み、これは一つ以上の必須ウイルス遺伝子の５’または３’に組み込まれる。
組換えＲＮＡレプリコンの産生方法
一部の実施形態では、本開示の組換えＲＮＡレプリコンは、組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチドを含む一つ以上のＤＮＡベクター鋳型を使用してインビトロで産生される。用語「ベクター」は、本明細書において、別の核酸分子を運ぶ、コードする、または輸送することができる核酸分子を指すために使用される。運ばれた核酸は、概してベクター核酸分子に挿入される。ベクターとしては、細胞内の自律的複製を誘導する配列を含み得、および／または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含み得る。一部の実施形態では、本開示の組換えＲＮＡレプリコンは、一つ以上のウイルスベクターを使用して産生される。
一部の実施形態では、本開示の組換えＲＮＡレプリコンは、組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチドをインビトロで好適な宿主細胞に導入することによって産生される（例えば、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション等によって）。適切な宿主細胞としては、昆虫および哺乳類細胞株が挙げられる。宿主細胞は、ポリヌクレオチドの発現および組換えＲＮＡレプリコンの産生を可能にするために、適切な長さの時間にわたって培養される。次いで、組換えＲＮＡレプリコンを宿主細胞から単離し、治療的使用のために製剤化する（例えば、粒子に封入される）。３’リボザイムおよび５’リボザイムをもつ組換えＲＮＡレプリコンのインビトロ合成の概略図を図２６に示す（ＳＶＶ由来のレプリコンを例として用いるが、他のレプリコンにも同様に適用する）。当該概略図は、結合部開裂配列の他の組み合わせを使用した組換えＲＮＡレプリコンの合成に適用される。
一部の実施形態では、本開示の組換えＲＮＡレプリコンの複製は、レプリコンのウイルスゲノムにとって天然である分離した５’末端および３’末端を必要とする。インビトロでのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたは哺乳類ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩによって産生されるＲＮＡ転写物は、哺乳類の５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含有するが、これは感染性ＲＮＡウイルスの産生に必要な分離した天然の末端を含有しない。例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、転写を開始するために、鋳型ポリヌクレオチドの５’末端におけるグアノシン残基を必要とする。しかしながら、ＳＶＶはその５’末端においてウリジン残基で開始される。したがってＴ７リーダー配列は、ＳＶＶウイルスゲノムを含むレプリコンのインビトロ転写に必要とされるが、これは機能的レプリコンの産生に必要である天然の５’ＳＶＶ末端を生成するために除去されなければならない。したがって、一部の実施形態では、本開示の組換えＲＮＡレプリコンの産生における使用に適したポリヌクレオチドは、ウイルスにとって天然である分離された５’末端および３’末端の生成を可能にする、さらなる非ウイルス性の５’配列および３’配列を必要とする。かかる配列は、本明細書では結合部開裂配列（ＪＣＳ（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ））と呼ばれる。一部の実施形態では、結合部開裂配列は、ウイルスゲノムの分離された内在性の５’末端および３’末端を維持するため、非ウイルスＲＮＡポリヌクレオチドが転写物から除去されるように、ウイルスＲＮＡおよび哺乳類ｍＲＮＡ配列の結合部において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはＰｏｌ ＩＩコードＲＮＡ転写物を開裂する働きをする（図２７に示す概略図を参照）。一部の実施形態では、結合部開裂配列は、組換えＲＮＡレプリコンをコードするＤＮＡプラスミドの直線化の間に適切な末端を生成するように作用する（例えば、プラスミド鋳型を直線化した上で、および組換えＲＮＡレプリコンのインビトロ転写の前に、適切な３’末端を産生するための３’制限酵素認識配列の使用）。
結合部開裂配列の性質、およびウイルスゲノム転写物からの非ウイルス性ＲＮＡの除去は、様々な方法によって達成することができる。例えば、一部の実施形態では、結合部開裂配列は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子の標的である。本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ干渉分子」は、内在性遺伝子サイレンシング経路（例えば、ＤｉｃｅｒおよびＲＩＳＣ（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体））を介して標的ｍＲＮＡ配列の分解を媒介するＲＮＡポリヌクレオチドを指す。例示的なＲＮＡ干渉剤としては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が挙げられる。さらに、当技術分野で現在公知または今後規定される、特定の部位においてＲＮＡ転写物を開裂するための任意の系を使用して、ウイルスに対して天然の分離された両末端を生成することができる。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ分子はｍｉＲＮＡである。ｍｉＲＮＡとは、標的ｍＲＮＡ配列に対して少なくとも部分的に相補的である長さ約１８～２５ヌクレオチドの天然由来の低分子である非コードＲＮＡ分子を指す。動物では、ｍｉＲＮＡに関する遺伝子は、二本鎖であり且つステムループ構造を形成する一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）に転写される。次いで、クラス２のＲＮａｓｅ ＩＩＩであるＤｒｏｓｈａ、およびマイクロプロセッサのサブユニットＤＣＧＲ８を含むマイクロプロセッサ複合体によって核内でｐｒｉ－ｍｉＲＮＡが開裂されて、７０～１００ヌクレオチドの前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）が形成される。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡはヘアピン構造を形成し、細胞質に輸送され、そこでＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素であるＤｉｃｅｒによって約１８～２５ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ二本鎖に処理される。二本鎖のうちいずれかの鎖が機能的ｍｉＲＮＡとして作用する可能性もあるが、典型的にはｍｉＲＮＡの一方の鎖が分解され、一方の鎖のみがアルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）（ＡＧＯ）ヌクレアーゼに搭載されて、ｍｉＲＮＡおよびそのｍＲＮＡ標的が相互作用するエフェクターＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）が産生される（Ｗａｈｉｄ ｅｔ ａｌ．，１８０３：１１，２０１０，１２３１－１２４３）。一部の実施形態では、５’結合部開裂配列および／または３’結合部開裂配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列である。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、Ｐｏｌ ＩＩ転写物に埋め込まれた合成ｍｉＲＮＡに由来する人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）である。（例えばＬｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２００８） ３６：９； ２８１１－２８３４；Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ（２００２），９； １３２７－１３３３；Ｆｅｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１３） ５； １７０４－１７１３を参照）。一部の実施形態では、５’結合部開裂配列および／または３’結合部開裂配列は、ａｍｉＲＮＡ標的配列である。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、ｓｉＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、典型的には約２１～２３ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ分子を指す。二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるマルチタンパク質複合体と結合することにより細胞質内で処理されるが、その間に、「パッセンジャー」センス鎖は二本鎖から酵素的に開裂される。次いで、活性化ＲＩＳＣに含まれるアンチセンス「ガイド」鎖は、配列相補性により、対応するｍＲＮＡにＲＩＳＣを誘導し、そしてＡＧＯヌクレアーゼが標的ｍＲＮＡを切断し、結果として特定の遺伝子サイレンシングをもたらす。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、ｓｈＲＮＡ分子に由来している。ｓｈＲＮＡは、ステムループ構造を形成する、長さ約５０～７０ヌクレオチドの一本鎖人工ＲＮＡ分子である。細胞におけるｓｈＲＮＡの発現は、プラスミドまたはウイルスベクターによってｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを導入することによって達成される。次いでｓｈＲＮＡは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのステムループ構造を模倣する産物に転写され、そして核外輸送後、ヘアピンがＤｉｃｅｒによって処理されて、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を形成するが、これはその後、ＲＩＳＣによってさらに処理されて標的遺伝子サイレンシングを媒介する。一部の実施形態では、５’結合部開裂配列および／または３’結合部開裂配列は、ｓｉＲＮＡ標的配列である。
一部の実施形態では、結合部開裂配列は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列である。こうした実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮａｓｅ活性（例えば、Ｃａｓ１３）を有するＣａｓエンドヌクレアーゼを用いて設計および導入されて、正確な接合部部位でウイルスゲノム転写物の開裂を媒介することができる。一部の実施形態では、５’結合部開裂配列および／または３’結合部開裂配列は、ｇＲＮＡ標的配列である。
一部の実施形態では、結合部開裂配列は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡコード配列である。ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド（例えば、組換えＲＮＡ分子）の転写の際に、これら結合部開裂配列は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡステムループ構造を形成するが、これはその後、Ｄｒｏｓｈａによって核内で開裂されて、正確な結合部位において転写物を開裂する。一部の実施形態では、５’結合部開裂配列および／または３’結合部開裂配列は、ｐｒｉ－ｍＲＮＡ標的配列である。
一部の実施形態では、当該結合部開裂配列は、エンドリボヌクレアーゼＲＮＡｓｅＨによる開裂を促進するプライマー結合配列である。こうした実施形態では、５’結合部開裂配列および／または３’結合部開裂配列に対してアニーリングするプライマーが、ＲＮＡｓｅＨ酵素と共にインビトロでの反応に付加される。ＲＮＡｓｅＨは、ＤＮＡにハイブリダイズされるＲＮＡのホスホジエステル結合を特異的に加水分解し、それゆえ、正確な結合部開裂配列における組換えＲＮＡレプリコン中間体の開裂を可能にして、必要な天然の５’末端および３’末端を産生する。
一部の実施形態では、結合部開裂配列は、制限酵素認識部位であり、またＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたプラスミド鋳型のランオフＲＮＡ合成の直線化の間に、結果としてウイルス転写物の分離した両末端を生成する。一部の実施形態では、結合部開裂配列は、タイプＩＩＳの制限酵素認識部位である。タイプＩＩＳの制限酵素は、非対称ＤＮＡ配列を認識し、そしてそれらの認識配列の外側で所定の距離において、通常は１～２０ヌクレオチド以内で開裂する酵素の特定の群を含む。例示的なＩＩＳ型制限酵素としては、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、ＢａｅＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢｉ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｓｔＩ、ＣａｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏｌＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＬ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、およびＳｆａＮＩが挙げられる。これらタイプＩＩＳの制限酵素に対する認識配列は、当技術分野で公知である。ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｔｏｏｌｓ－ａｎｄ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ－ｃｈａｒｔｓ／ｔｙｐｅ－ｉｉｓ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ－ｅｎｚｙｍｅｓを参照されたい。一部の実施形態では、結合部開裂配列は、ＳａｐＩ制限酵素認識部位である。
一部の実施形態では、結合部開裂配列は、リボザイムをコードする配列であり、また組換えＲＮＡレプリコン中間体の自己開裂を媒介して、最終的な組換えＲＮＡレプリコンおよびその後の感染性ＲＮＡウイルスの産生に必要な天然の分離した５’末端および３’末端を産生する。例示的なリボザイムとしては、ハンマーヘッド型リボザイム（例えば、図２８Ａ～２８Ｂに示すハンマーヘッド型リボザイム）、Ｖａｒｋｕｄサテライト（ＶＳ）型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、ＧＩＲ１分岐リボザイム、ｇｌｍＳリボザイム、ツイスター型リボザイム、ツイスターシスター型リボザイム、ピストル型リボザイム（例えば、図２９Ａ～２９Ｂに示すＰｉｓｔｏｌ １およびＰｉｓｔｏｌ ２）、ハチェット型リボザイム、およびデルタ型肝炎ウイルスリボザイムが挙げられる。一部の実施形態では、５’結合部開裂配列および／または３’結合部開裂配列は、リボザイムをコードする配列である。
一部の実施形態では、当該結合部開裂配列は、リガンド誘導性自己開裂リボザイムをコードする配列であり、「アプタザイム」と称される。アプタザイムは、リガンドに特異的な統合されたアプタマードメインを含有するリボザイム配列である。アパトマードメインに結合するリガンドが、リボザイムの酵素活性の活性化を誘発し、それによってＲＮＡ転写物の開裂をもたらす。例示的なアプタザイムとしては、テオフィリン依存性アプタザイム（例えば、テオフィリン依存性アパトマーと連結したハンマーヘッドリボザイム）、テトラサイクリン依存性アプタザイム（例えば、Ｔｅｔ依存性アプタマーと連結したハンマーヘッド型リボザイム）、グアニン依存性アプタザイム（例えば、グアニン依存性アプタマーと連結したハンマーヘッドリボザイム）が挙げられる。一部の実施形態では、５’結合部開裂配列および／または３’結合部開裂配列は、アプタザイムをコードする配列である。
一部の実施形態では、当該結合部開裂配列は、ＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、またはａｍｉＲＮＡ分子）、ｇＲＮＡ分子、またはＲＮＡｓｅＨプライマーに対する標的配列である。こうした実施形態では、結合部開裂配列は、ＲＮＡｉ分子、ｇＲＮＡ分子、またはプライマー分子の配列に対して少なくとも部分的に相補的である。パーセント配列同一性およびパーセント相補性の比較および決定のための配列アライメントの方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性探索方法によって、これらアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）の計算された実施によって、手動のアラインメントおよび目視検査（例えば、Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照）によって、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９７７） Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０にそれぞれ記載されるアルゴリズムＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０をはじめとする当技術分野で公知のアルゴリズムを使用することによって、実施され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通して公的に入手可能である。
一部の実施形態では、５’結合部開裂配列および３’結合部開裂配列は、同じ群に由来する（例えば、いずれもＲＮＡｉ標的配列である、いずれもリボザイムをコードする配列である等）。例えば、一部の実施形態では、結合部開裂配列は、ＲＮＡｉ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ標的配列）であり、また組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチドの５’末端および３’末端に組み込まれる。こうした実施形態では、５’および３’のＲＮＡｉ標的配列は、同一であってもよく（すなわち、同一のｓｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡに対する標的）、または異なっていてもよい（すなわち、５’配列は、一つのｓｉＲＮＡ、ｓｈｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡに対する標的であり、また３’配列は、別のｓｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡに対する標的である）。一部の実施形態では、当該結合部開裂配列は、ガイドＲＮＡ標的配列であり、また組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチドの５’末端および３’末端に組み込まれる。こうした実施形態では、５’および３’のｇＲＮＡ標的配列は、同一であってもよく（すなわち、同一のｇＲＮＡに対する標的）、または異なっていてもよい（すなわち、５’配列は、一つのｇＲＮＡに対する標的であり、また３’配列は、別のｇＲＮＡに対する標的である）。一部の実施形態では、結合部開裂配列は、ｐｒｉ－ｍＲＮＡをコードする配列であり、また組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチドの５’末端および３’末端に組み込まれる。一部の実施形態では、結合部開裂配列は、リボザイムをコードする配列であり、また組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチド配列の５’および３’の直近に組み込まれる。
一部の実施形態では、５’結合部開裂配列および３’結合部開裂配列は、同一の群に由来するが、異なるバリアントまたはタイプである。例えば、一部の実施形態では、５’結合部開裂配列および３’結合部開裂配列は、ＲＮＡｉ分子に対する標的配列であり得るものであり、当該５’結合部開裂配列は、ｓｉＲＮＡ標的配列であり、また当該３’結合部開裂配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列である（またはその逆）。一部の実施形態では、５’結合部開裂配列および３’結合部開裂配列は、リボザイムをコードする配列であり得るものであり、当該５’結合部開裂配列は、ハンマーヘッド型リボザイムをコードする配列であり、また当該３’結合部開裂配列は、デルタ型肝炎ウイルスリボザイムをコードする配列である。
一部の実施形態では、５’結合部開裂配列および３’結合部開裂配列は、異なるタイプである。例えば、一部の実施形態では、５’結合部開裂配列は、ＲＮＡｉ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ標的配列）であり、また３’結合部開裂配列は、リボザイム配列、アプタザイム配列、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列、またはｇＲＮＡ標的配列である。一部の実施形態では、５’結合部開裂配列は、リボザイム配列であり、また３’結合部開裂配列は、ＲＮＡｉ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ標的配列）、アプタザイム配列、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡをコードする配列、またはｇＲＮＡ標的配列である。一部の実施形態では、５’結合部開裂配列は、アプタザイム配列であり、また３’結合部開裂配列は、ＲＮＡｉ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ標的配列）、リボザイム配列、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列、またはｇＲＮＡ標的配列である。一部の実施形態では、５’結合部開裂配列は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列であり、また３’結合部開裂配列は、ＲＮＡｉ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ標的配列）、リボザイム配列、アプタザイム配列、またはｇＲＮＡ標的配列である。一部の実施形態では、５’結合部開裂配列は、ｇＲＮＡ標的配列であり、また３’結合部開裂配列は、ＲＮＡｉ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ標的配列）、リボザイム配列、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列、またはアプタザイム配列である。
組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチドに対する結合部開裂配列の例示的な配置を以下で表１２および表１３に示す。
Figure 2023528300000059
Figure 2023528300000060
Figure 2023528300000061
一部の実施形態では、本開示の組換えＲＮＡレプリコンは、インビトロでのＲＮＡ転写によってインビトロで産生される（図２７の概略図を参照）。次いで、組換えＲＮＡレプリコンを精製して、治療的使用のために製剤化する（例えば、脂質ナノ粒子に封入される）。一部の実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の方向に、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’リボザイム配列、（ｉｉｉ）組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチド、および（ｉｖ）３’リボザイム配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の方向に、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ハンマーヘッド型リボザイム配列（例えば、野生型ＨＨＲまたは例えば図２８Ａ～２８Ｂに示すような改変されたＨＨＲ）、（ｉｉｉ）組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチド、および（ｉｖ）３’デルタ型肝炎ウイルスリボザイム配列を含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の方向に、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ハンマーヘッド型リボザイム配列（例えば、野生型ＨＨＲまたは例えば図２８Ａ～２８Ｂに示すような改変されたＨＨＲ）、（ｉｉｉ）組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチド、および（ｉｖ）３’デルタ型肝炎ウイルスリボザイム配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の方向に、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ハンマーヘッド型リボザイム配列（例えば、野生型ＨＨＲまたは例えば図２８Ａ～２８Ｂに示すような改変されたＨＨＲ）、（ｉｉｉ）組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチド、および（ｉｖ）３’デルタ型肝炎ウイルスリボザイム配列を含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の方向に、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’リボザイム配列、（ｉｉｉ）組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチド、および（ｉｖ）３’制限酵素認識部位を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の方向に、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ハンマーヘッド型リボザイム配列（例えば、野生型ＨＨＲまたは例えば図２８Ａ～２８Ｂに示すような改変されたＨＨＲ）、（ｉｉｉ）組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチド、および（ｉｖ）３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位を含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の方向に、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ハンマーヘッド型リボザイム配列（例えば、野生型ＨＨＲまたは例えば図２８Ａ～２８Ｂに示すような改変されたＨＨＲ）、（ｉｉｉ）組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチド、および（ｉｖ）３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位を含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の方向に、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ピストル型リボザイム配列（例えば、図２９Ａ～２９Ｂに示すＰｉｓｔｏｌ １またはＰｉｓｔｏｌ ２リボザイム配列）、（ｉｉｉ）組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチド、および（ｉｖ）３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の方向に、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’Ｐｉｓｔｏｌ １リボザイム配列、（ｉｉｉ）組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチド、および（ｉｖ）３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の方向に、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’Ｐｉｓｔｏｌ ２リボザイム配列、（ｉｉｉ）野生型ＳＶＶゲノムをコードするポリヌクレオチド、および（ｉｖ）３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１５に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１５を含むまたは配列番号１５からなる。
一部の実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’の方向に、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ＲＮＡｓｅＨプライマー結合部位、（ｉｉｉ）組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチド、および（ｉｖ）３’制限酵素認識部位を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡベクターは、５’から３’の方向に、（ｉ）プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）、（ｉｉ）５’ＲＮＡｓｅＨプライマー結合部位、（ｉｉｉ）組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチド、および（ｉｖ）３’ＳａｐＩ制限酵素認識部位を含むポリヌクレオチドを含む。
組換えＲＮＡレプリコンを含む粒子
一部の実施形態では、本開示の組換えＲＮＡレプリコンは、「粒子」の中に封入される。本明細書で使用される場合、粒子は、例えばリポソーム、リポプレックス、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロ粒子、マイクロスフィア、脂質粒子、エクソソーム、ベシクル等の物質の非組織由来の組成物を指す。一部の実施形態では、当該粒子は、非タンパク質性および非免疫原性である。こうした実施形態では、本開示の組換えＲＮＡレプリコンの封入により、全身的な抗ウイルス性免疫反応の誘導を伴うことなくウイルスゲノムの送達を可能にし、そして抗ウイルス抗体を中和する影響を軽減する。さらに、本開示の組換えＲＮＡレプリコンの封入は、ゲノムを分解から保護し、標的宿主細胞への導入を促進する。一部の実施形態では、粒子はナノ粒子である。一部の実施形態では、粒子は脂質ナノ粒子である。一部の実施形態では、粒子はエクソソームである。
本開示は、本開示の組換えＲＮＡレプリコンを含む粒子を提供する。一部の実施形態では、粒子は脂質ナノ粒子である。一部の実施形態では、粒子は、腫瘍崩壊ウイルスをコードする第二の組換えＲＮＡ分子をさらに含む。一部の実施形態では、腫瘍崩壊ウイルスをコードする第二の組換えＲＮＡ分子は、ＲＮＡウイルスゲノム（例えば、腫瘍崩壊ウイルスのＲＮＡウイルスゲノム）を含む。一部の実施形態では、腫瘍崩壊ウイルスがピコルナウイルスである。一部の実施形態では、ピコルナウイルスが、セネカウイルス（ｓｅｎｅｃａｖｉｒｕｓ）、カルジオウイルス、およびエンテロウイルスから選択される。一部の実施形態では、ピコルナウイルスが、セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）である。一部の実施形態では、ピコルナウイルスが、コクサッキーウイルスである。一部の実施形態では、ピコルナウイルスは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡウイルスゲノムは、インタクトなＶＰ１コード領域、ＶＰ２コード領域、ＶＰ３コード領域、およびＶＰ４コード領域を含む。一部の実施形態では、インタクトなＶＰ１コード領域、ＶＰ２コード領域、ＶＰ３コード領域、およびＶＰ４コード領域を含むＲＮＡウイルスゲノムは、レプリコンのウイルスゲノムと同一のウイルス種または同一のウイルス属に属する。一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、インタクトなＶＰコード領域を含むＲＮＡウイルスゲノムより発現したキャプシドタンパク質によりトランスキャプシド形成され得る。一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、組換えＲＮＡレプリコンおよびＲＮＡウイルスゲノムが、同一細胞中に存在するとき（例えば、それらを粒子を介して細胞内に送達することによって）、トランスキャプシド形成され得る。
一部の実施形態では、粒子は、対象において生分解性である。こうした実施形態では、粒子の複数回用量を、対象に粒子を蓄積させることなく、対象に投与することができる。好適な粒子の例としては、ポリスチレン粒子、乳酸・グリコール酸共重合体ＰＬＧＡ粒子、ポリペプチド系カチオン性ポリマー粒子、シクロデキストリン粒子、キトサン粒子、脂質系粒子、ポリ（β－アミノエステル）粒子、低分子量ポリエチレンイミン粒子、ポリホスホエステル粒子、ジスルフィド架橋ポリマー粒子、ポリアミドアミン粒子、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）粒子、およびＰＬＵＲＩＯＮＩＣＳ安定化ポリプロピレンスルフィド粒子が挙げられる。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、無機粒子の中に封入される。一部の実施形態では、無機粒子は、金ナノ粒子（ＧＮＰ）、金ナノロッド（ＧＮＲ）、磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）、磁気ナノチューブ（ＭＮＴ）、カーボンナノホルン（ＣＮＨ）、カーボンフラーレン、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ＣＰＮＰ）、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）、シリカナノチューブ（ＳＮＴ）、または星型中空シリカナノ粒子（ＳＨＮＰ）である。
一部の実施形態では、本開示の粒子は、溶解性を増強し、インビボでの蓄積によって引き起こされる可能性のある合併症を回避し、かつ飲細胞作用を促進するために、ナノスケールサイズである。一部の実施形態では、粒子の平均直径は約１０００ｎｍ未満である。一部の実施形態では、粒子の平均直径は約５００ｎｍ未満である。一部の実施形態では、粒子の平均直径は約３０～約１００ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、または約７５～約１００ｎｍである。一部の実施形態では、粒子の平均直径は約３０～約７５ｎｍ、または約３０～約５０ｎｍである。一部の実施形態では、粒子の平均直径は約１００～約５００ｎｍである。一部の実施形態では、粒子の平均直径は約２００～約４００ｎｍである。一部の実施形態では、粒子の平均直径は約３５０ｎｍである。
エクソソーム
一部の実施形態では、本開示の組換えＲＮＡレプリコンは、「エクソソーム」の中に封入される。エクソソームは、エンドサイトーシス起源の小さな膜小胞であり、当該膜小胞は多小胞体が親細胞（例えば、エクソソームが放出される細胞、本明細書ではドナー細胞とも呼ぶ）の形質膜と融合した後に細胞外環境に放出される。エクソソームの表面は、親細胞の細胞膜に由来する脂質二重層を含み、また親細胞表面上に発現される膜タンパク質をさらに含み得る。一部の実施形態では、エクソソームはまた、親細胞由来のサイトゾルを含有してもよい。エクソソームは、上皮細胞、Ｂリンパ球およびＴリンパ球、肥満細胞（ＭＣ）、ならびに樹状細胞（ＤＣ）をはじめとする多数の様々な細胞型によって産生され、そして血漿、尿、気管支肺胞洗浄液、腸上皮細胞、および腫瘍組織において特定されている。エクソソームの組成は、それらの由来となる親細胞タイプに依存するため、「エクソソーム特異的」であるタンパク質は存在しない。しかしながら、多数のエクソソームは、エクソソームが親細胞において起源となった細胞内小胞に結合するタンパク質（例えば、エンドソームおよびリソソームと結合するタンパク質、ならびに／またはエンドソームおよびリソソームによって発現されるタンパク質）を含む。例えば、エクソソームは、例えば主要組織適合複合体ＩおよびＩＩ（ＭＨＣ－ＩおよびＭＨＣ－ＩＩ）、テトラスパニン（例えば、ＣＤ６３）、いくつかの熱ショックタンパク質、例えばアクチンおよびチューブリン等の細胞骨格成分、細胞内膜融合に関与するタンパク質、細胞間相互作用（例えば、ＣＤ５４）、シグナル伝達タンパク質、および細胞質酵素等の抗原提示分子中で富化することができる。
エクソソームは、エクソソーム膜と標的細胞の形質膜との融合によって、一つの細胞（例えば、親細胞）から標的細胞またはレシピエント細胞への細胞タンパク質の伝達を媒介し得る。このように、エクソソームにより封入される材料を改変することにより、本明細書に記載のポリヌクレオチド等の外因性因子を標的細胞に導入することができる機序が提供される。一つ以上の外因性因子（例えば、本明細書に記載されるポリヌクレオチド）を含有するように改変されたエクソソームは、本明細書では「改変エクソソーム」と称される。一部の実施形態では、改変エクソソームは、外因性因子（例えば、本明細書に記載されるポリヌクレオチド）の導入によって産生され、親細胞に導入される。こうした実施形態では、外因性核酸が、外因性核酸自体、または外因性核酸の転写物が親細胞から産生される改変エクソソームに組み込まれるように、親であるエクソソーム産生細胞に導入される。外因性核酸は、当技術分野で公知の手段、例えば、外因性核酸の形質導入、トランスフェクション、形質転換、および／またはマイクロインジェクションによって親細胞に導入することができる。
一部の実施形態では、改変されたエクソソームは、本開示の組換えＲＮＡレプリコンをエクソソームに直接導入することによって産生される。一部の実施形態では、本開示の組換えＲＮＡレプリコンは、インタクトなエクソソームに導入される。「インタクトなエクソソーム」とは、それらが産生される親細胞に由来するタンパク質および／または遺伝物質を含むエクソソームを指す。インタクトなエクソソームを取得するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１ Ａｐｒ； ２９（４）：３４－５；Ｏｈｎｏ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１３ Ｊａｎ； ２１（ｌ）：１８５－９１、および欧州特許公報第２０１０６６３号を参照）。
一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコンは、空のエクソソーム内に導入される。「空のエクソソーム」とは、親細胞に由来するタンパク質および／または遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を欠くエクソソームを指す。空のエクソソーム（例えば、親細胞由来の遺伝物質を欠いている）を産生する方法は当技術分野で公知であり、ＵＶ曝露、エクソソームへの核酸の装填を媒介する内在性タンパク質の変異／欠失、ならびに内在性遺伝物質が開口細孔を通ってエクソソームから抜け出るように、エクソソーム膜内に細孔を開けるための電気穿孔および化学的処理が挙げられる。一部の実施形態では、空のエクソソームは、ｐＨが約９～約１４である水溶液で処理することによってエクソソームを開き、エクソソーム膜を得て、小胞内成分（例えば、小胞内タンパク質および／または核酸）を除去し、エクソソーム膜を再構築して空のエクソソームを形成することによって産生される。一部の実施形態では、小胞内成分（例えば、小胞内タンパク質および／または核酸）は、超遠心分離または密度勾配超遠心分離によって除去される。一部の実施形態では、当該膜は、超音波処理、機械的振動、多孔性膜を通した押し出し加工、電流、またはこれら技術のうちの一つ以上の組み合わせによって再構築される。特定の実施形態では、当該膜は、超音波処理によって再構築される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組換えＲＮＡレプリコンをインタクトまたは空のエクソソームに装填して改変されたエクソソームを産生することは、例えばインビトロでの形質転換、トランスフェクション、および／またはマイクロインジェクション等である従来の分子生物学技術を使用して達成され得る。一部の実施形態では、外因性因子（例えば、本明細書に記載されるポリヌクレオチド）は、電気穿孔によってインタクトまたは空のエクソソームに直接導入される。一部の実施形態では、外因性因子（例えば、本明細書に記載されるポリヌクレオチド）は、リポフェクション（例えば、トランスフェクション）によってインタクトまたは空のエクソソームに直接導入される。本開示によるエクソソームの産生での使用に適したリポフェクションキットは、当技術分野で公知であり、また市販されている（例えば、Ｒｏｃｈｅ社からのＦｕＧＥＮＥ（登録商標） ＨＤトランスフェクション試薬、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社からのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標） ２０００）。一部の実施形態では、外因性因子（例えば、本明細書に記載されるポリヌクレオチド）は、熱ショックを用いた形質転換によってインタクトまたは空のエクソソームに直接導入される。こうした実施形態では、親細胞から単離されたエクソソームは、エクソソーム膜を透過処理するために、例えばＣａ２＋（ＣａＣｌ２中の）等の二価カチオンの存在下で冷却される。次いでエクソソームは、外因性核酸とインキュベートして、短時間熱ショック（例えば、４２℃で３０～１２０秒間インキュベートされる）を行うことができる。特定の実施形態では、外因性因子（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド）を空のエクソソームに装填することは、小胞内成分の除去後のエクソソーム膜を当該因子と混合または共インキュベートすることによって達成することができる。したがって、エクソソーム膜から再構築した改変されたエクソソームは、外因性因子を小胞内空間に組み込むこととなる。エクソソームに封入された核酸を産生するためのさらなる方法は当技術分野で公知である（例えば、米国特許第９，８８９，２１０号、第９，６２９，９２９号、および第９，０８５，７７８号、国際ＰＣＴ出願の国際公開第２０１７／１６１０１０号および国際公開第２０１８／０３９１１９号を参照）。
エクソソームは、細胞株、骨髄由来細胞、および一次患者サンプルに由来する細胞を含めた、多数の様々な親細胞から取得することができる。親細胞から放出されたエクソソームは、当技術分野で公知の手段により、親細胞培養物の上清から単離することができる。例えば、エクソソームの物理的特性を利用して、電荷（例えば、電気泳動的な分離）、サイズ（例えば、濾過、分子ふるい等）、密度（例えば、定型的な遠心分離または勾配遠心分離）、およびスベドベリ定数（例えば、外力を伴うまたは伴わない沈降など）に基づいて分離することを含む、媒体からのまたは他の源の材料からの分離を行うことができる。あるいは、または追加的に、単離は、一つ以上の生物学的特性に基づいてもよく、また表面マーカー（例えば沈殿、固相への可逆的結合、ＦＡＣＳ分離、特異的リガンド結合、非特異的リガンド結合等のための）を用いることができる方法を含む。エクソソーム表面タンパク質の分析は、例えばＣＤ６３等のエクソソーム結合タンパク質に対する蛍光標識される抗体を使用してフローサイトメトリーによって決定することができる。エクソソームを特徴解析するための追加的なマーカーは、国際ＰＣＴ出願の国際公開２０１７／１６１０１０号に記載されている。またさらに企図された方法では、ＰＥＧ誘導融合および／または超音波融合を含む化学的方法および／または物理的方法を使用して、エクソソームを融合することができる。
一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーを利用して、エクソソームを単離することができる。一部の実施形態では、当技術分野で一般的に知られているように、遠心分離技術によるクロマトグラフィー分離後に（一つ以上のクロマトグラフィー画分のうちの）エクソソームをさらに単離することができる。一部の実施形態では、エクソソームの単離は、限定されるものではないが、前述したような様々な遠心分離（Ｒａｐｏｓｏ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３，１１６１－１１７２（１９９６）を参照）、超遠心分離、サイズに基づく膜濾過、濃度、および／または速度ゾーン遠心分離を含む方法の組み合わせを伴い得る。
一部の実施形態では、エクソソーム膜は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、およびホスファチジルセリンのうちの一つ以上を含む。さらに、膜は、一つ以上のポリペプチドおよび一つ以上の多糖類、例えばグリカン等、を含むことができる。エクソソーム膜組成物および一つ以上の膜構成要素の相対量を改変する方法の例は、国際ＰＣＴ出願の国際公開第２０１８／０３９１１９号に記載される。
一部の実施形態では、粒子はエクソソームであり、直径は約３０～約１００ｎｍ、約３０～約２００ｎｍ、または約３０～約５００ｎｍである。一部の実施形態では、粒子は、エクソソームであり、直径は約１０ｎｍ～約１００ｎｍ、約２０ｎｍ～約１００ｎｍ、約３０ｎｍ～約１００ｎｍ、約４０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約１５０ｎｍ、約１５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２５０ｎｍ、約２５０ｎｍ～約５００ｎｍ、または約１０ｎｍ～約１０００ｎｍである。一部の実施形態では、粒子はエクソソームであり、直径は約２０ｎｍ～３００ｎｍ、約４０ｎｍ～２００ｎｍ、約２０ｎｍ～２５０ｎｍ、約３０ｎｍ～１５０ｎｍ、または約３０ｎｍ～１００ｎｍである。
脂質ナノ粒子
一部の実施形態では、本明細書に記載の組換えＲＮＡレプリコンは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の中に封入される。特定の実施形態では、ＬＮＰは、例えばトリグリセリド（例えば、トリステアリン）、ジグリセリド（例えば、バヘン酸グリセリル（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｂａｈｅｎａｔｅ））、モノグリセリド（例えば、モノステアリン酸グリセリル）、脂肪酸（例えば、ステアリン酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）、およびロウ（例えば、パルミチン酸セチル）等の一つ以上の脂質を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、一つ以上のカチオン性脂質および一つ以上のヘルパー脂質を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、一つ以上のカチオン性脂質、コレステロール、および一つ以上の中性脂質を含む。
カチオン性脂質は、例えば生理学的ｐＨ等である選択されたｐＨで正味の正電荷を担持するいくつかの脂質種のいずれかを指す。かかる脂質としては、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＭＡ）、ジステアリルジメチルアンモニウム（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、およびＮ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、生理学的ｐＨ未満で正電荷を有するカチオン性脂質としては、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、およびＤＭＤＭＡが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、Ｃ１８アルキル鎖、頭部基とアルキル鎖との間のエーテル結合、および０～３個の二重結合を含む。かかる脂質としては、例えば、ＤＳＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、およびＤＯＤＭＡが挙げられる。カチオン性脂質は、エーテル結合およびｐＨ滴定可能な頭部基を含み得る。かかる脂質としては、例えば、ＤＯＤＭＡが挙げられる。
一部の実施形態では、カチオン性脂質は、プロトン化可能な三級アミン頭部基を含む。かかる脂質は、本明細書ではイオン化可能な脂質と呼称される。イオン化可能な脂質とは、イオン化可能なアミン頭部基を含み且つ典型的には約７未満のｐＫａを含む、脂質種を指す。したがって、酸性ｐＨである環境において、イオン化可能なアミン頭部基は、イオン化可能な脂質が負に帯電した分子（例えば、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチド等の核酸）と優先的に相互作用し、それによってナノ粒子のアセンブリおよび封入を促進するようにプロトン化される。したがって、一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、脂質ナノ粒子内への核酸の装填を増加させることができる。ｐＨが約７より大きい環境（例えば、生理学的ｐＨ約７．４）では、イオン化可能な脂質は、中性電荷を含む。イオン化可能な脂質を含む粒子がエンドソームの低ｐＨ環境（例えば、ｐＨ＜７）に取り込まれると、イオン化可能な脂質は、再びプロトン化され、そしてアニオン性エンドソーム膜と結合し、粒子により封入した内容物の放出が促進される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、イオン化可能な脂質、例えば、７．ＳＳ－開裂可能かつｐＨ応答性の脂質様物質（例えば、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳシリーズ）を含む。
一部の実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＬＣ（旧名：ＳＳ－１８／４ＰＥ－１３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ（旧名：ＳＳ－３３／４ＰＥ－１５）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＰ、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオアート（Ｌ－３１９）、またはＮ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）から選択されるイオン化可能な脂質である。一部の実施形態では、カチオン性イオン化可能脂質は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）である。一部の実施形態では、カチオン性イオン化可能脂質は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＬＣである。一部の実施形態では、カチオン性イオン化可能脂質は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣである。一部の実施形態では、カチオン性イオン化可能脂質は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣである。一部の実施形態では、カチオン性イオン化可能脂質は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＰである。一部の実施形態では、カチオン性イオン化可能脂質は、Ｌ－３１９である。一部の実施形態では、カチオン性イオン化可能脂質は、ＤＯＴＡＰである。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、一つ以上の非カチオン性ヘルパー脂質（中性脂質）を含む。例示的な中性ヘルパー脂質としては、（１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）（ＤＬＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）（ＤｉＰＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、セラミド、スフィンゴミエリン、およびコレステロールが挙げられる。一部の実施形態では、一つ以上のヘルパー脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびコレステロールから選択される。一部の実施形態では、ＬＮＰはＤＳＰＣを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰはＤＯＰＣを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰはＤＬＰＥを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰはＤＯＰＥを含む。
本明細書に記載されるリポソーム組成物および医薬組成物中においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質および例えば誘導体化セラミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）等である誘導体化脂質、例えばＮ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）－２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ－２０００セラミド）が挙げられる、当該ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質および誘導体化脂質の使用および含有も企図され、好ましくは、本明細書に開示される化合物および脂質のうちの一つ以上と組み合わせられる。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、一つ以上のＣ６～Ｃ２０アルキルを含む脂質に共有結合した最大５ｋＤａの長さのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、一つ以上のＰＥＧ修飾脂質をさらに含み得る。一部の実施形態では、ＬＮＰは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）をさらに含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－５０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、および１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）から選択されるＰＥＧ修飾脂質をさらに含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５Ｋをさらに含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋをさらに含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＤＳＧ－ＰＥＧ２Ｋをさらに含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋをさらに含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＤＳＧ－ＰＥＧ５Ｋをさらに含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＤＭＧ－ＰＥＧ５Ｋをさらに含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、脂質ナノ粒子中の総脂質含量の約０．１％～約１％を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、脂質ナノ粒子中の総脂質含量の約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．５％、約２．０％、約２．５％、または約３．０％を含む。
一部の実施形態では、脂質は、開裂可能なＰＥＧ脂質で修飾される。開裂可能な結合を有するＰＥＧ誘導体の例としては、ペプチド結合（Ｋｕｌｋａｒｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｍｍｐ－９ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＰＥＧ ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｔｏ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １１：２３９０－９；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｄｒｕｇ／ｄｙｅ－ｌｏａｄｅｄ，ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｅｇ－ｃｈｉｔｏｓａｎ－ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ｍｅｔｈｏｔｒａｘａｔｅ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｅｌｆ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｄｕａｌ ｍｏｄｅｌ ｉｍａｇｉｎｇ．ＡＣＳ Ａｐｐｌ Ｍａｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ７：１１９０８－２０）、ジスルフィドキー（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ（２０１４）．Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ ｔｈｅ ｇｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ－ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｃｈｉｎ Ｊ Ｐｏｌｙｍ Ｓｃｉ ３３：１１８－２７；Ｗｕ ＆ Ｙａｎ（２０１５）．Ｃｏｐｐｅｒ ｎａｎｏｐｏｗｄｅｒ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｃｒｏｓｓ－ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｄｉａｒｙｌ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ａｒｙｌ ｉｏｄｉｄｅｓ ｉｎ ＰＥＧ－４００．Ｓｙｎｌｅｔｔ ２６：５３７－４２）、ビニルエーテル結合、ヒドラゾン結合（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｐｒｏｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｏ ｅｘｐｌｏｉｔ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ １４：９２７８－８６）、およびエステル結合（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｅｓｔｅｒａｓｅ－ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｄｅＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＨ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｃｌｅａｖａｂｌｅ ＰＥＧ－ｌｉｐｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １３０：２３８－４５）で修飾されたものが挙げられる。Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃｌｅａｖｅａｂｌｅ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ：ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｔｈｅ “ＰＥＧ ｄｉｌｅｍｍａ” ｉｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ２４：２，２２－３２も参照されたい。
一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、活性化されたＰＥＧ脂質である。例示的な活性化ＰＥＧ脂質としては、ＰＥＧ－ＮＨ２、ＰＥＧ－ＭＡＬ、ＰＥＧ－ＮＨＳ、およびＰＥＧ－ＡＬＤが挙げられる。かかる機能性化ＰＥＧ脂質は、特定の標的細胞または組織に粒子を向けるために、脂質ナノ粒子に対して標的化部分のコンジュゲーションで有用である（例えば、抗原結合分子、ペプチド、グリカン等の付着によって）。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質と一つ以上のヘルパー脂質を含むものであり、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである。一部の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質と一つ以上のヘルパー脂質を含むものであり、カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質と一つ以上のヘルパー脂質を含むものであり、カチオン性脂質は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標） ＳＳ－ＥＣである。一部の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質と一つ以上のヘルパー脂質を含むものであり、カチオン性脂質は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標） ＳＳ－ＬＣである。一部の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質と一つ以上のヘルパー脂質を含むものであり、カチオン性脂質は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標） ＳＳ－ＯＣである。一部の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質と一つ以上のヘルパー脂質を含むものであり、カチオン性脂質は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標） ＳＳ－ＯＰである。一部の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質と一つ以上のヘルパー脂質を含むものであり、カチオン性脂質は、Ｌ－３１９である。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質と一つ以上のヘルパー脂質を含むものであり、一つ以上のヘルパー脂質は、コレステロールを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質と一つ以上のヘルパー脂質を含むものであり、一つ以上のヘルパー脂質は、ＤＬＰＥを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質と一つ以上のヘルパー脂質を含むものであり、一つ以上のヘルパー脂質は、ＤＳＰＣを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質と一つ以上のヘルパー脂質を含むものであり、一つ以上のヘルパー脂質は、ＤＯＰＥを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質と一つ以上のヘルパー脂質を含むものであり、一つ以上のヘルパー脂質は、ＤＯＰＣを含む。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質と少なくとも二つのヘルパー脂質を含むものであり、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰであり、また少なくとも二つのヘルパー脂質は、コレステロールおよびＤＬＰＥを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質と少なくとも二つのヘルパー脂質を含むものであり、カチオン性脂質はＭＣ３であり、また少なくとも二つのヘルパー脂質は、コレステロールおよびＤＳＰＣを含む。一部の実施形態では、少なくとも二つのヘルパー脂質は、コレステロールおよびＤＯＰＥを含む。一部の実施形態では、少なくとも二つのヘルパー脂質は、コレステロールおよびＤＳＰＣを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質と少なくとも三つのヘルパー脂質を含むものであり、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰであり、また少なくとも三つのヘルパー脂質は、コレステロール、ＤＬＰＥおよびＤＳＰＥを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質と少なくとも三つのヘルパー脂質を含むものであり、カチオン性脂質はＭＣ３であり、また少なくとも三つのヘルパー脂質は、コレステロール、ＤＳＰＣおよびＤＭＧを含む。一部の実施形態では、少なくとも三つのヘルパー脂質は、コレステロール、ＤＯＰＥ、およびＤＳＰＥを含む。一部の実施形態では、少なくとも三つのヘルパー脂質は、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＤＭＧを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール、およびＤＬＰＥを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰはＭＣ３、コレステロール、およびＤＳＰＣを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール、およびＤＯＰＥを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール、ＤＬＰＥ、およびＤＳＰＥを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＭＣ３、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＤＭＧを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール、ＤＬＰＥ、およびＤＳＰＥ－ＰＥＧを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＭＣ３、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＤＭＧ－ＰＥＧを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール、ＤＯＰＥ、およびＤＳＰＥを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール、ＤＯＰＥ、およびＤＳＰＥ－ＰＥＧを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＤＰＧ－ＰＥＧ（例えば、ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋ）を含む。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、およびＤＬＰＥを含むものであり、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ：ＤＬＰＥの比（総脂質含量の百分率として）は、約５０：３５：１５である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、およびＤＬＰＥを含むものであり、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥの比（総脂質含量の百分率として）は、約５０：３５：１５である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ＤＬＰＥ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧを含むものであり、ＤＯＴＰ：Ｃｈｏｌ：ＤＬＰＥの比（総脂質含量の百分率として）は、約５０：３５：１５であり、粒子は、約０．２％のＤＳＰＥ－ＰＥＧを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＭＣ３、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ＤＳＰＣ、およびＤＭＧ－ＰＥＧを含み、ＭＣ３：Ｃｈｏｌ：ＤＳＰＣ：ＤＭＧ－ＰＥＧの比（総脂質含量の百分率として）は、約４９：３８．５：１１：１．５である。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、およびＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含むものであり、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）は、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、式中、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～２５％、Ｃ＝２０％～３０％、およびＤ＝０％～３％であり、且つＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、およびＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含むものであり、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）は、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、式中、Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝２０％～２５％、Ｃ＝２５％～３０％、およびＤ＝０％～１％であり、且つＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、およびＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含むものであり、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）は、約４９：２２：２８．５：０．５である。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、およびＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含むものであり、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）は、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、式中、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２０％～４５％、およびＤ＝０％～３％であり、且つＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、およびＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含むものであり、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）は、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、式中、Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２５％～４５％、およびＤ＝０％～３％であり、且つＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、およびＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含むものであり、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）は、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、式中、Ａ＝４５％～５５％、Ｂ＝１０％～２０％、Ｃ＝３０％～４０％、およびＤ＝１％～２％であり、且つＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、およびＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含むものであり、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）は、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、式中、Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝１０％～１５％、Ｃ＝３５％～４０％、およびＤ＝１％～２％であり、且つＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、およびＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含むものであり、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）は、約４９：１１：３８．５：１．５である。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、およびＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含むものであり、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）は、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、式中、Ａ＝４５％～６５％、Ｂ＝５％～２０％、Ｃ＝２０％～４５％、およびＤ＝０％～３％であり、且つＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、およびＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含むものであり、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）は、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、式中、Ａ＝５０％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４５％、およびＤ＝０％～３％であり、且つＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、およびＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含むものであり、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）は、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、式中、Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４０％、およびＤ＝１％～２％であり、且つＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、およびＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含むものであり、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）は、約Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、式中、Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１０％、Ｃ＝３０％～３５％、およびＤ＝１％～２％であり、且つＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＳＳ－ＯＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、およびＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋを含むものであり、ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）は、約５８：７：３３．５：１．５である。
一部の実施形態では、ナノ粒子は、標的細胞によるナノ粒子の取り込みを調節するか、または促進するために、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）で被覆される。ＧＡＧは、ヘパリン／ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸、ケラチン硫酸、またはヒアルロン酸（ＨＡ）であってもよい。特定の実施形態では、ナノ粒子の表面は、ＨＡで被覆され、また腫瘍細胞による取り込みのために粒子を標的とする。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸トリペプチド（ＲＧＤペプチド）で被覆される（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４，２０１２，３７４７－３７５６、およびＢｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３２（１８），２０１１，４２０５－４２１０を参照）。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、約５０ｎｍ～約５００ｎｍの平均サイズを有する。例えば、一部の実施形態では、ＬＮＰは、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１５０ｎｍ、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４００ｎｍ～約５００ｎｍ、約４２５ｎｍ～約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ～約５００ｎｍ、または約４７５ｎｍ～約５００ｎｍの平均サイズを有する。一部の実施形態では、複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約１２０ｎｍの平均サイズを有する。一部の実施形態では、複数のＬＮＰは、約５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、または約１２０ｎｍの平均サイズを有する。一部の実施形態では、複数のＬＮＰが、約１００ｎｍの平均サイズを有する。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、中性電荷（例えば、約０ｍＶ～１ｍＶの平均ゼータ電位）を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約４０ｍＶ～約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約４０ｍＶ～約０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約３５ｍＶ～約０ｍＶ、約３０ｍＶ～約０ｍＶ、約２５ｍＶ～約０ｍＶ、約２０ｍＶ～約０ｍＶ、約１５ｍＶ～約０ｍＶ、約１０ｍＶ～約０ｍＶ、または約５ｍＶ～約０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約２０ｍＶ～約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約２０ｍＶ～約－２０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約１０ｍＶ～約－２０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約１０ｍＶ～約－１０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約１０ｍＶ、約９ｍＶ、約８ｍＶ、約７ｍＶ、約６ｍＶ、約５ｍＶ、約４ｍＶ、約３ｍＶ、約２ｍＶ、約１ｍＶ、約０ｍＶ、約－１ｍＶ、約－２ｍＶ、約－３ｍＶ、約－４ｍＶ、約－５ｍＶ、約－６ｍＶ、約－７ｍＶ、約－８ｍＶ、約－９ｍＶ、約－９ｍＶ、または約－１０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、約０ｍＶ～約－２０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約－２０ｍＶ未満の平均ゼータ電位を有する。例えば、一部の実施形態では、ＬＮＰは、約－３０ｍＶ未満、約３５ｍＶ未満、または約－４０ｍＶ未満の平均ゼータ電位を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約－５０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約－４０ｍＶ～約－２０ｍＶ、または約－３０ｍＶ～約－２０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約０ｍＶ、約－１ｍＶ、約－２ｍＶ、約－３ｍＶ、約－４ｍＶ、約－５ｍＶ、約－６ｍＶ、約－７ｍＶ、約－８ｍＶ、約－９ｍＶ、約－１０ｍＶ、約－１１ｍＶ、約－１２ｍＶ、約－１３ｍＶ、約－１４ｍＶ、約－１５ｍＶ、約－１６ｍＶ、約－１７ｍＶ、約－１８ｍＶ、約－１９ｍＶ、約－２０ｍＶ、約－２１ｍＶ、約－２２ｍＶ、約－２３ｍＶ、約－２４ｍＶ、約－２５ｍＶ、約－２６ｍＶ、約－２７ｍＶ、約－２８ｍＶ、約－２９ｍＶ、約－３０ｍＶ、約－３１ｍＶ、約－３２ｍＶ、約－３３ｍＶ、約－３４ｍＶ、約－３５ｍＶ、約－３６ｍＶ、約－３７ｍＶ、約－３８ｍＶ、約－３９ｍＶ、または約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の組換え核酸分子を含み、また核酸（Ｎ）に対する脂質（Ｌ）の比が約３：１（Ｌ：Ｎ）である。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の組換え核酸分子を含み、またＬ：Ｎ比が約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、または約１０：１である。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の組換え核酸分子を含み、また核酸（Ｎ）に対する脂質（Ｌ）の比が約７：１である。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の組換え核酸分子を含み、またＬ：Ｎ比が約４．５：１、約４．６：１、約４．７：１、約４．８：１、約４．９：１、約５：１、約５．１：１、約５．２：１、約５．３：１、約５．４：１、または約５．５：１である。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の組換え核酸分子を含み、またＬ：Ｎ比が約６．５：１、６．６：１、６．７：１、６．８：１、６．９：１、７：１、７．１：１、７．２：１、７．３：１、７．４：１、および７．５：１である。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、表１４に列挙された製剤のうちの一つから選択される脂質製剤を含む。
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Figure 2023528300000063
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 治療用組成物および使用方法
本開示の一態様は、本明細書に記載の組換えＲＮＡレプリコンを含む治療組成物、または本明細書に記載の組換えＲＮＡレプリコンを含む粒子、およびがんの治療方法に関する。本明細書に記載される組成物は、所望の送達経路に好適な任意の方法で製剤化され得る。典型的には、製剤は、任意の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および／または賦形剤と共に、当該組成物の誘導体もしくはプロドラッグ、溶媒和物、立体異性体、ラセミ体、または互変異性体を含めて全ての生理学的に許容可能な組成物を含む。
一部の実施形態では、組換えＲＮＡレプリコン（および任意でＲＮＡウイルスゲノム）を含むＬＮＰは、対象に投与されたときに腫瘍崩壊ウイルスを産生することができるものであり、当該コードされた腫瘍崩壊ウイルスが、投与部位から離れた腫瘍のサイズを縮小することができる。例えば、ＬＮＰの静脈内投与により、腫瘍組織におけるレプリコン複製および腫瘍サイズの減少がもたらされ得る。一部の実施形態では、本開示のＬＮＰは、ＬＮＰ投与部位から離れた腫瘍またはがん組織に局在化することができる。こうした効果により、容易には到達できないことから治療の腫瘍内送達に適さない腫瘍の治療において、本開示のＬＮＰに封入されたレプリコンの使用が可能になる。
本明細書で使用される「薬学的に許容可能」という文言は、堅実な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触して使用することに適し、合理的な利益／リスク比に見合ったものである、それら化合物、物質、組成物および／または剤型を指すために用いる。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤」には、ヒトまたは家畜での使用に許容可能なものとして米国食品医薬品局によって承認されている、あらゆるアジュバント、担体、賦形剤、流動化剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、色素／着色剤、香味促進剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤が含まれるが、これらに限定されない。例示的な薬学的に許容可能な担体としては、例えば乳糖、グルコースおよびショ糖等の糖類、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン等のデンプン、セルロースおよび例えばカルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース等のセルロースの誘導体、トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、ココアバター、ロウ、動物油脂および植物油脂、パラフィン、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、 酸化亜鉛、例えば落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油等の油類、例えばプロピレングリコール等のグリコール類、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール等のポリオール類、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル等のエステル類、寒天、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤、アルギン酸、発熱因子なしの水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、リン酸緩衝液、ならびに医薬製剤に採用されるその他の適合した物質が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「薬学的に許容される塩」は、酸および塩基付加塩の両方を含む。薬学的に許容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含み、またこれは、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸と、ならびに例えば、限定されるものではないが、酢酸、２，２－ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４－アセトアミド安息香酸、ショウノウ酸、カンファー－１０－スルホン酸、カプリン酸、カプロ酸、カプリル酸、炭酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン－１，２－ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２－オキソ－グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、ナフタレン－１，５－ジスルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、１－ヒドロキシ－２－ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモン酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４－アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアニン酸、ｐトルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸等の有機酸と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩等である無機塩基に由来し得る。有機塩基に由来する塩としては、一級アミン、二級アミン、および三級アミン、天然に生じる置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、ならびに塩基性イオン交換樹脂の塩が挙げられ、例えばアンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール、２－ジメチルアミノエタノール、２－ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベネタミン、ベンザチン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ－エチルピペリジン、ポリアミン樹脂等が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、およびカフェインである。
本開示は、がん細胞または標的細胞を死滅させる方法であって、本明細書に記載されるＲＮＡポリヌクレオチドまたは粒子またはその組成物に対して、当該がん細胞への組成物の細胞内送達に十分な条件下で、当該細胞を曝露することを含む、がん細胞または標的細胞を死滅させる方法を提供する。本明細書で使用される場合、「がん細胞を死滅させること」は、アポトーシスまたは壊死によるがん細胞の死を指す。がん細胞の死滅は、腫瘍サイズ測定、細胞数、および例えばアネキシンＶ等の細胞死マーカーの検出のためのフローサイトメトリー、およびヨウ化プロピジウムの組み込みを含むがこれに限定されない当技術分野に公知の方法によって決定され得る。
本開示は、治療を必要とする対象においてがんを治療または予防するための方法であって、本明細書に記載の治療組成物の有効量が、該対象に投与されるものである当該方法をさらに提供する。投与経路は、治療される疾患の位置および性質によって、当然のことながら異なることとなり、例えば皮内、経皮、皮下、非経口、経鼻、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮的、気管内、腹腔内、腫瘍内、灌流、洗浄、直接注射、および経口の投与が挙げられ得る。本明細書に記載の封入されたポリヌクレオチド組成物は、転移性がんの治療に有用であり、全身投与は、組成物を複数の器官および／または細胞型に送達するために必要であり得る。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、全身的に投与される。
本開示は、疾患に対して対象を免疫化するための方法であって、本開示の治療組成物の有効量を、該対象に投与することを含む当該方法をさらに提供する。投与経路は、免疫化剤の位置および性質によって、当然のことながら異なることとなり、例えば皮内、経皮、皮下、非経口、経鼻、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮的、気管内、腹腔内、腫瘍内、灌流、洗浄、直接注射、および経口の投与が挙げられ得る。
本開示はさらに、薬剤として使用するための、本開示の粒子、本開示のベクター、本開示の組換えＲＮＡレプリコン、またはその組成物をさらに提供する。一部の実施形態では、薬剤はがん細胞を死滅させるためのものである。一部の実施形態では、薬剤はがんを治療するためのものである。一部の実施形態において、薬剤は、疾患に対する免疫化のためのものである。
本明細書で交換可能に使用される「有効量」または「有効用量」は、疾患または状態の症状の改善または回復をもたらす、本明細書に記載の組成物の量および／または用量を指す。改善は、疾患もしくは状態の、または疾患もしくは状態の症状のあらゆる改善または回復である。改善は、観察可能または測定可能な改善であるか、または対象の全身的な健康の感覚の改善であり得る。したがって、当業者は、治療は疾患状態を改善し得るが、疾患を完全に治癒することではない場合があることを認識する。対象における改善としては、腫瘍量の減少、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞死の増加、免疫経路の活性化、腫瘍進行までの時間の増加、がん疼痛の減少、生存率の増加、または生活の質の改善が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、特定の薬剤の有効量は、例えば質量／体積、細胞数／体積、粒子／体積、（薬剤の質量）／（対象の質量）、細胞数／（対象の質量）、または粒子／（対象の質量）等である、薬剤の性質に基づいて様々な方法で表され得る。特定の薬剤の有効量はまた、参照レベルと最大応答レベルとの中間である特定の生理学的応答の規模をもたらす薬剤の濃度を指す、半数効果濃度（ＥＣ５０）として表されてもよい。
一部の実施形態では、有効用量の投与は、本明細書に記載される組成物の単回用量の投与によって達成され得る。本明細書で使用される場合、「用量」は、一度に送達される組成物の量を指す。一部の実施形態では、組換えＲＮＡ分子の用量は、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）として測定される。一部の実施形態では、ＴＣＩＤ５０は、少なくとも約１０３～１０９ＴＣＩＤ５０／ｍＬであり、例えば少なくとも約１０３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０４ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０６ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０７ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０８ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、または約１０９ＴＣＩＤ５０／ｍＬである。一部の実施形態では、用量は、所与の体積中の粒子数（例えば、粒子／ｍＬ）によって測定されてもよい。一部の実施形態では、用量は、各粒子中に存在する、本明細書に記載されるＲＮＡポリヌクレオチドのゲノムコピー数（例えば、粒子数／ｍＬであり、各粒子がポリヌクレオチドの少なくとも一のゲノムコピーを含む）によってさらに精密化されてもよい。一部の実施形態では、有効用量の送達は、本明細書に記載される組成物の複数回用量の投与を必要とし得る。したがって、有効用量の投与は、本明細書に記載される組成物の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、またはそれ以上の用量の投与を必要とし得る。
本明細書に記載される組成物の複数回用量が投与される実施形態では、各用量は、同一の行為者によって、および／または同じ地理的位置で投与される必要はない。さらに投与は、所定のスケジュールに従って投与されてもよい。例えば、所定の投与スケジュールは、本明細書に記載される組成物の用量を、毎日、隔日、毎週、隔週、毎月、隔月、毎年、または半年ごと等で投与することを含み得る。所定の投与スケジュールは、所与の患者に対して必要に応じて調整され得る（例えば、投与される組成物の量は、増加または減少されてもよく、および／または投与頻度は増加または減少されてもよく、および／または投与される総回数は、増加または減少されてもよい）。
定義
本記載では、別段の示唆がない限り、任意の濃度範囲、百分率の範囲、比の範囲、または整数の範囲が、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合にはその分数（例えば、ある整数の１０分の１および１００分の１等）を含むと理解されるべきである。本明細書で使用されるとき、「ａ」および「ａｎ」の語は、別段の示唆がない限り、列挙された構成要素の「一つ以上」を意味することが理解されるべきである。代替語（例えば、「または」）の使用では、代替物の一方、両方、または任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は同義で使用される。本明細書で使用される場合、「複数の」は、一つ以上の構成要素（例えば、一つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列）を意味し得る。
本願で使用される場合、用語「約」および「およそ」は、同等であることとして使用される。約／およその有無に関わらず、本願で使用される任意の数字は、当業者によって認識される任意の正常な変動を網羅することを意味する。ある実施形態では、用語「およそ」または「約」は、別段の記載がない限り、または文脈から別途明らかでない限り、記載される参照値のいずれかの方向（より高い方またはより低い方）に向けて２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲内に当てはまる値の範囲を指す（当該数値が１００％を超える可能性がある場合を除く）。一部の実施形態では、用語「およそ」または「約」は、別段の記載がない限り、または文脈から別途明らかでない限り、記載される参照値のいずれかの方向（より高い方またはより低い方）に向けて１０％の範囲内に当てはまる値の範囲を指す（当該数値が１００％を超える可能性がある場合を除く）。
「減少する」または「軽減する」は、参照値と比較して、少なくとも５％、例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、または１００％の特定値の減少または低下を意味する。特定の値の減少または低下はまた、参照値と比較して値の倍率変化として表されてもよく、例えば参照値と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００倍またはそれ以上、減少する。
「増加する」は、参照値と比較して、少なくとも５％、例えば５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、１００、２００、３００、４００、５００％またはそれ以上の特定値の増加を意味する。特定の値の増加はまた、参照値と比較して値の倍率変化として表されてもよく、例えば参照値のレベルと比較して、少なくとも１倍、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００倍またはそれ以上、増加する。
用語「配列同一性」は、同一であり、同じ相対位置にある、二つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の間の塩基またはアミノ酸の百分率を指す。このように、一つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、別のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と比較して、ある一定の百分率の配列同一性を有する。配列比較については、典型的には、一つの配列が参照配列としての役割を果たし、これに対して試験配列を比較する。用語「参照配列」は、試験配列が比較される分子を指す。用語「変異」は、核酸またはアミノ酸の置換、欠失、または付加を指す。用語「保存的変異」は、ポリペプチド中の単一アミノ酸または少数のアミノ酸の置換を指すものであり、この新しいアミノ酸は、置換されたアミノ酸と類似した化学的特性および物理的特性（電荷、親水性等）を有する。
「相補性」は、塩基スタッキングおよび特定の水素結合を介して、天然または非天然（例えば、上述のように改変された）の塩基（ヌクレオチド）またはその類似体を含む二つの配列間での対形成能力を指す。例えば、核酸の一つの位置におけるある塩基が、標的の対応する位置における塩基と水素結合することができる場合、当該塩基は、その位置において互いに相補的であるとみなされる。核酸は、普遍的な塩基、または水素結合に対するポジティブまたはネガティブな寄与を全くもたらさない不活性な脱塩基スペーサーを含み得る。塩基対形成は、正規のワトソン・クリック塩基対形成および非ワトソン・クリック塩基対形成（例えば、ウォブル塩基対形成およびホグスティーン塩基対形成）の両方を含み得る。相補性塩基対形成については、アデノシン型塩基（Ａ）はチミジン型塩基（Ｔ）またはウラシル型塩基（Ｕ）に対して相補的であること、シトシン型塩基（Ｃ）はグアノシン型塩基（Ｇ）に対して相補的であること、また例えば３－ニトロピロールまたは５－ニトロインドール等の普遍的な塩基は、任意のＡ、Ｃ、Ｕ、またはＴにハイブリダイズすることができ、それらは任意のＡ、Ｃ、Ｕ、またはＴに対して相補的であるとみなされることを理解されたい。Ｎｉｃｈｏｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９４；３６９：４９２－４９３およびＬｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９４；２２：４０３９－４０４３。イノシン（Ｉ）はまた、当技術分野では、普遍的な塩基であると考えられており、任意のＡ、Ｃ、Ｕ、またはＴに対して相補的であるとみなされる。Ｗａｔｋｉｎｓ ａｎｄ ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５； ３３（１９）：６２５８－６２６７を参照されたい。
「発現カセット」または「発現構築物」は、プロモーターに動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列を指す。
「動作可能に連結された」とは、そのように記載される構成要素が、それらが意図された様式で機能することを許容する関係にある近接を意味する。例えば、プロモーターがポリヌクレオチド配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されており、開裂ポリペプチドが、特定の望ましい条件下でペイロード分子の分離（例えば、残りのポリペプチドからの）を許容する場合、開裂ポリペプチドはペイロード分子に動作可能に連結されている。
用語「対象」は、例えば哺乳類等である動物を含む。一部の実施形態では、哺乳類は霊長類である。一部の実施形態では、哺乳類はヒトである。一部の実施形態では、対象は、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ等の家畜、または例えばイヌやネコ等の飼いならされた動物である。一部の実施形態では（例えば、特に研究的な文脈で）、対象は、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、または近交系ブタ等のブタである。用語「対象」および「患者」は、本明細書では区別なく使用される。一部の実施形態では、本開示の方法は、ヒト対象を治療するために用いられる。本開示の方法はまた、非ヒト霊長類（例えば、サル、ヒヒ、およびチンパンジー）、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、ウサギ、ヤギ、シカ、ヒツジ、フェレット、スナネズミ、モルモット、ハムスター、コウモリ、鳥、およびは虫類を治療するために用いることもできる。
本明細書で使用される場合、「予防」または「予防処置」は、疾患の症状の完全な予防、疾患の症状の発症の遅延、またはその後に発症する疾患の症状の重症度の低下を意味する場合がある。
本明細書の「がん」は、典型的には非制御性細胞増殖によって特徴付けられる哺乳類の生理学的状態を指すか、または記述する。がんの例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫（脂肪肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、平滑筋肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、横紋筋肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、および軟骨肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍、中皮腫、滑膜腫、神経鞘腫、髄膜腫、腺がん、黒色腫、および白血病またはリンパ系腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。こうしたがんのより具体的な例としては、扁平上皮細胞がん（例えば、上皮扁平細胞がん）、小細胞肺がんを含む肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がんおよび肺の扁平上皮がん、小細胞肺がん、腹膜がん、肝細胞がん、消化管がんを含む胃部のがんまたは胃がん、膵がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、肝細胞がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がん、唾液腺がん、腎がんまたは腎臓がん（例えば、腎細胞がん）、神経内分泌がん、前立腺がん（例えば、去勢抵抗性神経内分泌前立腺がん）、外陰部がん、甲状腺がん、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、辺縁層リンパ腫（ＭＺＬ）、メルケル細胞がん、肝がん、肛門がん、陰茎がん、精巣がん、食道がん、胆道腫瘍、ユーイング腫瘍、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性肺がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性がん腫、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫（例えば、悪性神経膠腫）、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨髄異形成疾患、Ｈ鎖病、神経内分泌腫瘍、シュワン細胞腫、他の癌腫ならびに頭頸部がんが挙げられる。一部の実施形態では、がんが、神経内分泌がんである。さらに、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、髄膜腫、シュワン細胞腫、神経線維腫症、ケロイド、筋腫および子宮筋腫ならびにその他をはじめとする、良性（すなわち、非がん性）の過剰増殖性の疾患、障害および状態もまた、本明細書に開示される開示を使用して治療され得る。
「投与」とは、本明細書では、薬剤または組成物を対象に導入することを指す。
本明細書で使用される場合、「治療すること」とは、生理学的転帰に影響を及ぼすために、薬剤または組成物を対象に送達することを指す。一部の実施形態では、治療することとは、（ａ）疾患を阻害すること、すなわち疾患の発症を停止させるまたは疾患進行を予防すること、（ｂ）疾患を緩和すること、すなわち疾患状態の退行を引き起こすこと、および（ｃ）疾患を治癒することを含めて、哺乳類における、例えばヒトにおける、疾患の治療を指す。
細胞の「集団」は、１より大きい任意の数の細胞を指すが、好ましくは、少なくとも１×１０３細胞、少なくとも１×１０４細胞、少なくとも１×１０５細胞、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも１×１０７細胞、少なくとも１×１０８細胞、少なくとも１×１０９細胞、少なくとも１×１０１０細胞、またはそれ以上の細胞である。細胞集団は、インビトロ集団（例えば、培養中の細胞集団）またはインビボ集団（例えば、特定の組織内に存在する細胞集団）を指し得る。
「エフェクター機能」は、標的細胞または標的抗原に対する免疫反応の発生、維持、および／または増強に関連する免疫細胞の機能を意味する。
用語「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」、および「ｍｉＲ」は、本明細書において区別なく使用され、また分解または翻訳抑制のためにそれらの標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を方向付けることによって遺伝子発現を調節する、約２１～２５ヌクレオチドの長さの小さな非コード内在性ＲＮＡを指す。
本明細書で使用される場合、用語「組成物」は、対象または細胞に投与または送達することができる、本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子または粒子に封入された組換えＲＮＡ分子の製剤を指す。
用語「複製可能なウイルスゲノム」は、ウイルス複製および感染性ウイルス粒子の産生に必要なウイルス遺伝子のすべてをコードするウイルスゲノムを指す。
用語「腫瘍崩壊ウイルス」は、がん細胞に優先的に感染するように改変された、または自然に感染したウイルスを指す。
用語「ベクター」は、本明細書において、別の核酸分子を運ぶまたは輸送することができる核酸分子を指すために使用される。
用語「レプリコン」は、それ自体のコピーの生成を方向付けることができる核酸を指す。本明細書で使用される場合、用語「レプリコン」は、ＲＮＡならびにＤＮＡを含む。概して、ウイルスレプリコンは、ウイルスのゲノムの少なくとも一部を含有する。ウイルスレプリコンは、不完全なウイルスゲノムを含有していてもなお、それ自体のコピーの生成を方向付けることができる。
用語「上流」は、核酸に関連して使用される場合は、参照ヌクレオチド配列に関して５’方向に位置するヌクレオチド配列を指し、またポリペプチドに関連して使用される場合は、参照アミノ酸配列に関してＮ－末端方向に位置するアミノ酸配列を指す。用語「下流」は、核酸に関連して使用される場合は、参照ヌクレオチド配列に関して３’方向に位置するヌクレオチド配列を指し、またポリペプチドに関連して使用される場合は、参照アミノ酸配列に関してＣ－末端方向に位置するアミノ酸配列を指す。
用語「シス作用性複製エレメント」は、ＲＮＡウイルスまたはレプリコンのＲＮＡゲノムの一部を指し、これはシスで存在しなければならず、すなわち、複製に必要な状態として各ウイルス鎖の一部として存在する。一部の実施形態では、シス作用性複製エレメントは、ウイルスＲＮＡの一つ以上のセグメントから構成される。
アミノ酸または核酸の位置に関連して本明細書で使用される場合、用語「～に対応する」または「～に対応して」は、第一および参照のポリペプチド／ポリヌクレオチド配列が整列しているときの参照ポリペプチド／ポリヌクレオチド配列中の所与のアミノ酸／核酸と整列している第一のポリペプチド／ポリヌクレオチド配列内における位置を指す。アライメントは、当業者によって、この目的のために設計されたソフトウェア、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａバージョン１．２．４およびそのバージョンに対するデフォルトパラメータを使用して実施される。
分子および細胞生化学における全般的な方法は、分子クローニングでは、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）；Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ ＆ Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）；およびＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）、などの標準のテキストで確認することができ、これら開示は参照により本明細書に組み込まれる。

さらなる番号付けした実施形態
本開示のさらなる番号付けした実施形態が、以下のとおり提供される。
実施形態１．組換えＲＮＡレプリコンであって、
ピコルナウイルスゲノムであって、一つ以上のタンパク質コード領域に欠失または切断を含むピコルナウイルスゲノム、および
異種ポリヌクレオチドを含む、組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態２．ピコルナウイルスゲノムが、一つ以上のＶＰコード領域に欠失または切断を含む、実施形態１の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態３．ピコルナウイルスゲノムが、ＶＰ１コード領域、ＶＰ３コード領域およびＶＰ２コード領域のそれぞれに欠失または切断を含む、実施形態１または２の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態４．ピコルナウイルスゲノムが、ＶＰ１コード領域およびＶＰ３コード領域の欠失ならびにＶＰ２コード領域の切断を含む、実施形態１から３のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態５．ピコルナウイルスが、セネカウイルス（ｓｅｎｅｃａｖｉｒｕｓ）、カルジオウイルス、およびエンテロウイルスから選択される、実施形態１から４のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態６．欠失または切断は、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、少なくとも２５００ｂｐ、または少なくとも３０００ｂｐを含む、実施形態１から５のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態７．欠失または切断が、少なくとも２０００ｂｐを含む、実施形態６に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態８．欠失の部位または切断の部位が、異種ポリヌクレオチドを含む、実施形態１から７のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態９．異種ポリヌクレオチドが、２Ａコード領域と２Ｂコード領域との間に挿入される、実施形態１から７のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態１０．異種ポリヌクレオチドが、３Ｄコード領域と３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との間に挿入される、実施形態１から７のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態１１．異種ポリヌクレオチドが、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、または少なくとも３０００ｂｐを含む、実施形態１から１０のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態１２．ピコルナウイルスが、セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）である、実施形態１から１１のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態１３．欠失または切断が、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位および３４７７位のヌクレオチドの間の一つ以上のヌクレオチドを含む、実施形態１２に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態１４．欠失または切断が、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位から３４７７位のヌクレオチドを含む、実施形態１２に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態１５．欠失または切断が、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、または少なくとも２０００ｂｐを含む、実施形態１２または１３に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態１６．欠失または切断が、少なくとも２０００ｂｐを含む、実施形態１５に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態１７．ＳＶＶゲノムが、５’リーダータンパク質コード配列を含む、実施形態１２から１６のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態１８．ＳＶＶゲノムが、ＶＰ４コード領域を含む、実施形態１２から１７のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態１９．ＳＶＶゲノムが、ＶＰ２コード領域またはその切断を含む、実施形態１２から１８のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態２０．ＳＶＶゲノムが、５’から３’方向に、５’リーダータンパク質コード配列、ＶＰ４コード領域、およびＶＰ２コード領域またはその切断を含む、実施形態１９に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態２１．５’リーダータンパク質コード配列、ＶＰ４コード領域、およびＶＰ２コード領域またはその切断を含むＳＶＶゲノムの部分が、配列番号１の１～１２６０位のヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態２０に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態２２．ＳＶＶゲノムが、５’から３’方向に、５’リーダータンパク質コード配列、ＶＰ４コード領域、ＶＰ２コード領域またはその切断、および異種ポリヌクレオチドを含む、実施形態２０または２１に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態２３．ＳＶＶゲノムが、シス作用性複製エレメント（ＣＲＥ）を含む、実施形態１から２２のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態２４．ＣＲＥが、１０～２００ｂｐを含む、実施形態２３に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態２５．ＣＲＥが、配列番号１に従う１０００位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上のヌクレオチドを含む、実施形態２３または２４に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態２６．ＣＲＥが、配列番号１に従う１１１７位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上のヌクレオチドを含む、実施形態２３または２４に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態２７．ＣＲＥが、配列番号１４９に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、実施形態２３から２６のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態２８．ＳＶＶゲノムが、２Ａコード領域をさらに含む、実施形態１２から２７のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態２９．２Ａコード領域が、ＶＰ２コード領域またはその切断と異種ポリヌクレオチドとの間に位置している、実施形態２８に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態３０．ＳＶＶゲノムが、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、３Ｃｐｒｏコード領域、および３Ｄ（ＲｄＲｐ）コード領域のうちの一つ以上を含む、実施形態１２から２９のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態３１．ＳＶＶゲノムが、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、３Ｃｐｒｏコード領域、および３Ｄ（ＲｄＲｐ）コード領域を含む、実施形態１２から２９のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態３２．ＳＶＶゲノムが、５’から３’方向に、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、３Ｃｐｒｏコード領域、および３Ｄ（ＲｄＲｐ）コード領域を含む、実施形態３１に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態３３．２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、３Ｃｐｒｏコード領域、および３Ｄ（ＲｄＲｐ）コード領域を含むＳＶＶゲノムの部分が、配列番号１に従う３５０５位から７３１０位のヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態３２に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態３４．ＳＶＶゲノムが、５’から３’方向に、異種ポリヌクレオチドと２Ｂコード領域を含む、実施形態３０から３３のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態３５．ピコルナウイルスが、コクサッキーウイルスである、実施形態１から１１のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態３６．欠失または切断が、配列番号３の番号付けに従って、上限下限を含めて、７１７位から３３３２位のヌクレオチドの間の一つ以上のヌクレオチドを含む、実施形態３５に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態３７．欠失または切断が、配列番号３の番号付けに従って、上限下限を含めて、７１７位から３３３２位のヌクレオチドを含む、実施形態３５に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態３８．欠失または切断が、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐまたは少なくとも２６００ｂｐを含む、実施形態３５または３６に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態３９．コクサッキーウイルスゲノムが、５’ＵＴＲを含む、実施形態３５から３８のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態４０．５’ＵＴＲを含むコクサッキーウイルスゲノムの部分が、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態３５から３９のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態４１．コクサッキーウイルスゲノムが、２Ａコード領域、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ＵＴＲのうちの一つ以上を含む、実施形態３５から４０のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態４２．コクサッキーウイルスゲノムが、２Ａコード領域、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ＵＴＲを含む、実施形態３５から４０のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態４３．コクサッキーウイルスゲノムが、５’から３’方向に、２Ａコード領域、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ＵＴＲを含む、実施形態４２に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態４４．２Ａコード領域、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ＵＴＲを含むコクサッキーウイルスゲノムの部分が、配列番号３における３４９２位から７４３５位のヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態４２に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態４５．コクサッキーウイルスゲノムが、５’から３’方向に、５’ＵＴＲ、異種ポリヌクレオチドおよび２Ａコード領域を含む、実施形態４１から４４のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態４６．ピコルナウイルスが、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）である、実施形態１から１１のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態４７．組換えＲＮＡレプリコンが、異種ポリヌクレオチドと２Ｂコード領域との間に挿入される内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ））を含む、実施形態９および実施形態１１から４６のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態４８．異種ポリヌクレオチドが、一つ以上のペイロード分子をコードする、実施形態１から４７のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態４９．異種ポリヌクレオチドが、二つ以上のペイロード分子をコードする、実施形態１から４７のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態５０．二つ以上のペイロード分子が、一つ以上の開裂ポリペプチドによって動作可能に連結される、実施形態４９に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態５１．開裂ポリペプチドが、２Ａファミリーの自己開裂ペプチド、３Ｃ開裂部位、フーリン部位、ＩＧＳＦ１ポリペプチド、またはＨＩＶプロテアーゼ部位を含む、実施形態５０に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態５２．開裂ポリペプチドが、ＩＧＳＦ１ポリペプチドを含み、またＩＧＳＦ１ポリペプチドが、配列番号７５に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５１に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態５３．開裂ポリペプチドが、ＨＩＶプロテアーゼ部位を含む、実施形態５１に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態５４．開裂ポリペプチドが、２Ａファミリーの自己開裂ペプチドを含む、実施形態５１に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態５５．開裂ポリペプチドが、フーリン部位を含む、実施形態５０～５４のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態５６．異種ポリヌクレオチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ’－ペイロード分子１－開裂ポリペプチド－ペイロード分子２－Ｃ’を含む二つ以上のペイロード分子と開裂ポリペプチドとを含むポリペプチドをコードするものである、実施形態５０から５５のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態５７．異種ポリヌクレオチドが、ＨＩＶプロテアーゼをコードするコード領域をさらに含み、また異種ポリヌクレオチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ’－ペイロード分子１－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ＨＩＶプロテアーゼ－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ペイロード分子２－Ｃ’を含むポリペプチドをコードするコード領域を含む、実施形態５３に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態５８．異種ポリヌクレオチドが、第三のペイロード分子をコードするコード領域をさらに含み、また異種ポリヌクレオチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
Ｎ’－ペイロード分子１－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ＨＩＶプロテアーゼ－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ペイロード分子２－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ペイロード分子３－Ｃ’を含むポリペプチドをコードするコード領域を含む、実施形態５７に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態５９．コードされたポリペプチドのＣ末端に開裂ポリペプチドをさらに含む、実施形態５６から５８のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態６０．ペイロード分子が、蛍光タンパク質、酵素、サイトカイン、ケモカイン、抗原、細胞表面受容体に結合することができる抗原結合分子、および細胞表面受容体に対するリガンドから選択される、実施形態４８から５９のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態６１．ペイロード分子が、
ａ）ＩＦＮ□、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、およびＩＬ－３６γを含む一つ以上のサイトカイン、
ｂ）ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、およびＣＣＬ２１を含む一つ以上のケモカイン、
ｃ）抗－ＰＤ１－ＶＨＨ－Ｆｃ抗体、抗－ＣＤ４７－ＶＨＨ－Ｆｃ抗体、および抗－ＴＧＦβ－ＶＨＨ（またはｓｃＦｖ）－Ｆｃ抗体を含む一つ以上の抗体、
ｄ）ＤＬＬ３およびエフェクター細胞標的抗原と結合する二部位ポリペプチドと、ＦＡＰおよびエフェクター細胞標的抗原と結合する二部位ポリペプチドと、ＥｐＣＡＭおよびエフェクター細胞標的抗原と結合する二部位ポリペプチドとを含む、一つ以上の二部位ポリペプチド、
ｅ）サバイビン、ＭＡＧＥファミリータンパク質、および表６に記載のすべての抗原を含む一つ以上の腫瘍関連抗原、
ｆ）一つ以上の腫瘍新生抗原、
ｇ）ＭＨＣ－ペプチド抗原複合体に結合する一つ以上の二部位ポリペプチド、
ｈ）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ） ＵＬ２７／糖タンパク質Ｂ／ｇＢ、ＨＳＶ ＵＬ５３／糖タンパク質Ｋ／ｇＫ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ） Ｆタンパク質、ＦＡＳＴｐ１５、ＶＳＶ－Ｇ、シンシチン（ｓｙｎｃｉｔｉｎ）－１（ヒト内在性レトロウイルス－Ｗ（ＨＥＲＶ－Ｗ）由来）またはシンシチン－２（ＨＥＲＶＦＲＤＥ１由来）、パラミクソウイルスＳＶ５－Ｆ、はしかウイルス－Ｈ、はしかウイルス－Ｆ、および例えばテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、メーソン－ファイザーモンキーウイルス（ＭＰＭＶ）およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）等であり、任意でＲ膜貫通ペプチドが除去されている（Ｒ－バージョン）、レトロウイルスまたはレンチウイルス由来の糖タンパク質を含む一つ以上の膜融合性タンパク質、
ｉ）ＩＬ１５Ｒ、ＰＧＤＨ、ＡＤＡ、ＡＤＡ２、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＣＨＩＰＳ、ＭＬＫＬ（またはその４ＨＢドメインのみ）、ＧＳＤＭＤ（またはそのＬ１９２Ａ変異体、またはそのアミノ酸１～２３３断片、またはＬ１９２Ａ変異を有するそのアミノ酸１～２３３断片）、ＧＳＤＭＥ（またはそのアミノ酸１～２３７断片）、ＨＭＧＢ１（またはそのボックスＢドメインのみ）、メリチン（例えば、アルファ－メリチン）、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ（またはそのアミノ酸５６～２３９断片）、ヘビＬＡＡＯ、ヘビディスインテグリン、レプチン、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ガスダーミンＤまたはその切断、およびガスダーミンＥまたはその切断、を含む一つ以上の他のペイロード分子、
ｊ）デングウイルス、チクングニヤウイルス、ヒト結核菌、ヒト免疫不全ウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、コロナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、トガウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、および動物ウイルス（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖｉｒｕｓ）を含む、病原体由来の一つ以上の抗原、または
ｋ）それらの任意の組み合わせ、から選択される、実施形態４８から５９のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態６２．二つ以上のペイロード分子が、蛍光タンパク質、酵素、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体に結合することができる抗原結合分子、および細胞表面受容体に対するリガンドからなる群から選択される、実施形態４９から５９のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態６３．異種ポリヌクレオチドが、
ａ．ＩＬ－２およびＩＬ－３６γ、
ｂ．ＣＸＣＬ１０ならびにＦＡＰおよびＣＤ３に結合する抗原結合分子、
ｃ．ＩＬ－２ならびにＤＬＬ３およびＣＤ３に結合する抗原結合分子、
ｄ．ＩＬ－３６γならびにＤＬＬ３およびＣＤ３に結合する抗原結合分子、または
ｅ．ＩＬ－２、ＩＬ－３６γならびにＤＬＬ３およびＣＤ３に結合する抗原結合分子、を含む二つ以上のペイロード分子をコードする、実施形態４９から５９のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態６４．一つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含むマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）カセットをさらに含む、実施形態１から６３のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態６５．一つ以上のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２１９、ｍｉＲ－２１９ａ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－１３７、およびｍｉＲ－１２６を含む、実施形態６４に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態６６．５’から３’方向に、プロモーター配列、５’結合部開裂配列、実施形態１から６５のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチド配列、および３’結合部開裂配列を含む、組換えＤＮＡ分子。
実施形態６７．プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列である、実施形態６６に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態６８．５’結合部開裂配列がリボザイム配列であり、また３’結合部開裂配列がリボザイム配列である、実施形態６６または６７に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態６９．５’リボザイム配列が、ハンマーヘッド型リボザイム配列であり、また３’リボザイム配列が、デルタ型肝炎ウイルスリボザイム配列である、実施形態６８に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態７０．５’結合部開裂配列がリボザイム配列であり、また３’結合部開裂配列が制限酵素認識配列である、実施形態６６または６７に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態７１．５’リボザイム配列が、ハンマーヘッド型リボザイム配列、ピストル型リボザイム配列、または改変されたピストル型リボザイム配列である、実施形態７０に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態７２．３’制限酵素認識配列が、タイプＩＩＳ制限酵素認識配列である、実施形態７０または７１に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態７３．タイプＩＩＳ認識配列が、ＳａｐＩ認識配列である、実施形態７２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態７４．５’結合部開裂配列がＲＮＡｓｅＨプライマー結合配列であり、また３’結合部開裂配列が制限酵素認識配列である、実施形態６６または６７に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態７５．実施形態６６から７４のいずれか一つに記載のＤＮＡ分子のインビトロ転写、および結果として生じる組換えＲＮＡレプリコンの精製を含む、実施形態１から６５のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコンを産生する方法。
実施形態７６．有効量の実施形態１から６５のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコンおよび哺乳類対象への投与に適した担体を含む、組成物。
実施形態７７．実施形態１から６５のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコンを含む、ベクター。
実施形態７８．ベクターがウイルスベクターである、実施形態７７に記載のベクター。
実施形態７９．ベクターが非ウイルスベクターである、実施形態７７に記載のベクター。
実施形態８０．実施形態１から６５のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコンを含む、粒子。
実施形態８１．当該粒子が、ナノ粒子、エクソソーム、リポソーム、およびリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）からなる群から選択される、実施形態８０に記載の粒子。
実施形態８２．ナノ粒子が、カチオン性脂質、一つ以上のヘルパー脂質、およびリン脂質－ポリマーコンジュゲートを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、実施形態８１に記載の粒子。
実施形態８３．カチオン性脂質が、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＬＣ（旧名：ＳＳ－１８／４ＰＥ－１３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ（旧名：ＳＳ－３３／４ＰＥ－１５）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＰ、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオアート（Ｌ－３１９）、またはＮ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）から選択される、実施形態８２に記載の粒子。
実施形態８４．ヘルパー脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびコレステロールから選択される、実施形態８２または８３に記載の粒子。
実施形態８５．カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、また中性脂質が、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、実施形態８２に記載の粒子。
実施形態８６．ＰＥＧ脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＰＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、および１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）から選択される、実施形態８２から８５のいずれか一つに記載の粒子。
実施形態８７．ＰＥＧ脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－５０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、および１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）から選択される、実施形態８２から８６のいずれか一つに記載の粒子。
実施形態８８．カチオン性脂質が、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣを含むものであり、一つ以上のヘルパー脂質が、コレステロール（Ｃｈｏｌ）およびＤＳＰＣを含み、またリン脂質－ポリマーコンジュゲートが、ＤＰＧ－ＰＥＧ２０００を含む、実施形態８２に記載の粒子。
実施形態８９．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、式中、
ａ．Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～２５％、Ｃ＝２０％～３０％、およびＤ＝０％～３％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
ｂ．Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝２０％～２５％、Ｃ＝２５％～３０％、およびＤ＝０％～１％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
ｃ．Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２０％～４５％、およびＤ＝０％～３％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
ｄ．Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２５％～４５％、およびＤ＝０％～３％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
ｅ．Ａ＝４５％～５５％、Ｂ＝１０％～２０％、Ｃ＝３０％～４０％、およびＤ＝１％～２％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
ｆ．Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝１０％～１５％、Ｃ＝３５％～４０％、およびＤ＝１％～２％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
ｇ．Ａ＝４５％～６５％、Ｂ＝５％～２０％、Ｃ＝２０％～４５％、およびＤ＝０％～３％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
ｈ．Ａ＝５０％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４５％、およびＤ＝０％～３％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
ｉ．Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４０％、およびＤ＝１％～２％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
ｊ．Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１０％、Ｃ＝３０％～３５％、およびＤ＝１％～２％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、実施形態８８に記載の粒子。
実施形態９０．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）が、
ａ．約４９：２２：２８．５：０．５、
ｂ．約４９：１１：３８．５：１．５、または
ｃ．約５８：７：３３．５：１．５である、実施形態８８に記載の粒子。
実施形態９１．ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）が、約４９：２２：２８．５：０．５である、実施形態８８に記載の粒子。
実施形態９２．カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、また中性脂質が、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、実施形態８２に記載の粒子。
実施形態９３．ＰＥＧ脂質であって、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）であるＰＥＧ脂質をさらに含む、実施形態８２または９２に記載の粒子。
実施形態９４．腫瘍崩壊ウイルスをコードする第二の組換えＲＮＡ分子をさらに含む、実施形態８０から９３のいずれか一つに記載の粒子。
実施形態９５．腫瘍崩壊ウイルスがピコルナウイルスである、実施形態９４に記載の粒子。
実施形態９６．ピコルナウイルスが、セネカウイルス（ｓｅｎｅｃａｖｉｒｕｓ）、カルジオウイルス、およびエンテロウイルスから選択される、実施形態９５に記載の粒子。
実施形態９７．ピコルナウイルスが、セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）である、実施形態９５に記載の粒子。
実施形態９８．ピコルナウイルスが、コクサッキーウイルスである、実施形態９５に記載の粒子。
実施形態９９．ピコルナウイルスが、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）である、実施形態９５に記載の粒子。
実施形態１００．実施形態８２から９９のいずれか一つに記載の複数の脂質ナノ粒子を含む、治療組成物。
実施形態１０１．複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約１２０ｎｍの平均サイズを有する、実施形態１００に記載の治療組成物。
実施形態１０２．複数のＬＮＰが、約１００ｎｍの平均サイズを有する、実施形態１００に記載の治療組成物。
実施形態１０３．複数のＬＮＰが、約２０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約１０ｍＶ～約－１０ｍＶ、約５ｍＶ～約－５ｍＶ、または約２０ｍＶ～約－４０ｍＶ、－５０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約－４０ｍＶ～約－２０ｍＶ、または約－３０ｍＶ～約－２０ｍＶの平均ゼータ電位を有する、実施形態１００から１０２のいずれか一つに記載の治療組成物。
実施形態１０４．複数のＬＮＰが、約－３０ｍＶ、約－３１ｍＶ、約－３２ｍＶ、約－３３ｍＶ、約－３４ｍＶ、約－３５ｍＶ、約－３６ｍＶ、約－３７ｍＶ、約－３８ｍＶ、約－３９ｍＶ、または約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する、実施形態１０３に記載の治療組成物。
実施形態１０５．がん細胞を死滅させる方法であって、実施形態８０から９７のいずれか一つに記載の粒子、実施形態７７から７９のいずれか一つに記載のベクター、実施形態１から６５のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン、またはその組成物に、がん細胞を曝露することを含む、方法。
実施形態１０６．当該方法が、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで実施される、実施形態１０５に記載の方法。
実施形態１０７．対象においてがんを治療する方法であって、実施形態８０から９７のいずれか一つに記載の粒子、実施形態７７から７９のいずれか一つに記載のベクター、実施形態１から６５のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン、またはその組成物の有効量を、がんに罹患している対象に投与することを含む、方法。
実施形態１０８．粒子、組換え型ＲＮＡレプリコンまたはその組成物が、静脈内、鼻腔内、吸入剤として投与されるか、または腫瘍に直接注射される、実施形態１０７に記載の方法。
実施形態１０９．粒子、組換えＲＮＡレプリコン、またはその組成物が、対象に繰り返し投与される、実施形態１０７または１０８に記載の方法。
実施形態１１０．対象が、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、非ヒト霊長類、またはヒトである、実施形態１０７から１０９のいずれかに記載の方法。
実施形態１１１．がんが、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、前立腺がん、精巣がん、結腸直腸がん、結腸がん、膵がん（例えば、去勢抵抗性神経内分泌前立腺がん）、肝がん、胃がん、頭頸部がん、甲状腺がん、悪性神経膠腫、膠芽腫、黒色腫、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、肉腫、神経芽腫、神経内分泌がん、横紋筋肉腫、髄芽腫、膀胱がん、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、メルケル細胞がん、および腎細胞がんから選択される、実施形態１０７から１１０のいずれかに記載の方法。
実施形態１１２．実施形態１１１に記載の方法であって、
ａ．肺がんが、小細胞肺がんまたは非小細胞肺がんであり、
ｂ．肝がんが肝細胞がん（ＨＣＣ）であり、および／または
ｃ．前立腺がんが、治療下で発現した神経内分泌前立腺がんである、実施形態１１１に記載の方法。
実施形態１１３．がんが、神経内分泌がんである、実施形態１１１に記載の方法。
実施形態１１４．疾患に対して対象を免疫化する方法であって、実施形態８０から９７のいずれか一つに記載の粒子、実施形態７７から７９のいずれか一つに記載のベクター、実施形態１から６５のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン、またはその組成物の有効量を、対象に投与することを含む、方法。
実施形態１１５．粒子、組換えＲＮＡレプリコンまたはその組成物が、静脈内に、筋肉内に、皮内に、鼻腔内に、または吸入剤として投与される、実施形態１１４に記載の方法。
実施形態１１６．粒子、組換えＲＮＡレプリコン、またはその組成物が、対象に繰り返し投与される、実施形態１１４または１１５に記載の方法。
実施形態１１７．疾患が、感染症である、実施形態１１４から１１６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１１８．当該感染症が、デングウイルス、チクングニヤウイルス、ヒト結核菌、ヒト免疫不全ウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、コロナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、トガウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、および動物ウイルス（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖｉｒｕｓ）を含む病原体のうちのひとつに起因する、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１１９．ピコルナウイルスゲノムおよび異種ポリヌクレオチドを含む、組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態１２０．異種ポリヌクレオチドが、２Ａコード領域と２Ｂコード領域との間に挿入される、実施形態１１９に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態１２１．異種ポリヌクレオチドが、５’ＵＴＲと２Ａコード領域との間に挿入される、実施形態１１９に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態１２２．異種ポリヌクレオチドが、３Ｄコード領域と３’ＵＴＲとの間に挿入される、実施形態１１９に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
実施形態１２３．ピコルナウイルスが、セネカウイルス、カルジオウイルス、およびエンテロウイルスから選択される、実施形態１１９から１２２のいずれか一つに記載の組換えＲＮＡレプリコン。
以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を説明する目的で提供され、いかなる様式でも本開示を制限することを意図していない。本実施例は、本明細書に記載される方法と共に、現在好ましい実施形態を代表し、例示的であり、本開示の範囲に対する限定として意図されていない。その中の変更および特許請求の範囲で規定するとおりの本開示の趣旨に包含されるその他の使用は、当業者が想到するであろう。
実施例１：異種ポリヌクレオチドの挿入は、ＳＶＶウイルス複製を低下させる
様々な長さの異種ポリヌクレオチドをウイルスゲノム内に挿入したセネカバレーウイルス（ＳＶＶ）（表１５）のウイルス複製能力を評価するために、実験を実施した。簡潔に述べると、ＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞を、１日目に組換えＳＶＶウイルスゲノムをコードする０．０１５ｐｍｏｌのプラスミドでトランスフェクトした。４日目に、細胞を採取し、上清を濾過してウイルスを収集した。５日目に、ＮＣＩ－Ｈ４４６細胞を収集したウイルスに感染させ、ＣＴＧアッセイを実施してウイルス複製速度を推定した。結果を図２および表１５に示す。異種ポリヌクレオチドの挿入は、ウイルス複製速度の低下をもたらした。
Figure 2023528300000067
 実施例２：ＶＰ２領域内のＳＶＶシス作用性複製エレメント（ＣＲＥ）の特定
一つ以上のＶＰタンパク質をコードするウイルスゲノム領域内の欠失／切断がＳＶＶウイルス複製に影響を与えるかどうかを評価するために実験を実施した。ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子とＶＰタンパク質をコードする領域における欠失および／または切断とを含むＳＶＶ由来の組換えＲＮＡレプリコンを表１６および図３Ａに従って生成した。対応する組換えＲＮＡレプリコンを、インビトロＴ７転写を介して生成した。得られたＲＮＡでＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞をトランスフェクトし、ｍＣｈｅｒｒｙ発現をトランスフェクションの２４時間後に評価した。結果は、１５９９ｂｐ～３４７８ｂｐの間の欠失がＳＶＶウイルス複製に対して最小の影響である一方で、１１１６ｂｐ～１５９９ｂｐ（ＶＰ２コード領域内）の間のヌクレオチドの欠失がＳＶＶウイルス複製を大幅に低減させることを示した（図３Ｂ）。したがって、シス作用性複製エレメント（またはシス作用性複製エレメントの少なくとも一部）は、ＳＶＶウイルスゲノムの１１１６ｂｐ～１５９９ｂｐの間に存在する。
Figure 2023528300000068
 実施例３：Ｔｒｕｎｃ５レプリコンは、最小の効力喪失でＳＶＶ野生型（ＳＶＶｗｔ）によりトランスキャプシド形成される
野生型ＳＶＶによるトランスキャプシド形成後にＴｒｕｎｃ５レプリコンが効力を保持できるかどうかを評価して、野生型ＳＶＶに対する適応コストを決定するために実験を実施した。簡潔に述べると、Ｔｒｕｎｃ５レプリコンおよび／または野生型ＳＶＶウイルスゲノムを、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化し、そしてＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ社）でインビトロ転写（ＩＶＴ）した。ＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞を、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して、結果物であるＲＮＡ分子のそれぞれまたは両方の０．５ｕｇまたは１ｕｇで同時トランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、上清を収集し、０．４５ｕｍのフィルターを通して濾過した。濾過された上清の１００ｕｌを、Ｈ１２９９細胞の新鮮な単層の上に移し、感染後２４時間でｍＣｈｅｒｒｙの発現を観察した（図４Ａ）。ｍＣｈｅｒｒｙの発現は、ＳＶＶｗｔとの同時トランスフェクション後に検出されたが、レプリコン単独でのトランスフェクション後には検出されなかったため、Ｔｒｕｎｃ５がトランスキャプシド形成されたことが実証された。ＮＣＩ－Ｈ４４６細胞で実施されるＩＣ５０アッセイを使用して、ＳＶＶ野生型（ＳＶＶｗｔ）トランスフェクションからの濾過された上清のウイルス力価をＳＶＶｗｔおよびＴｒｕｎｃ５－ＳＶＶのレプリコンの同時トランスフェクションと比較した（図４Ｂ）。ＳＶＶｗｔとＴｒｕｎｃ５の同時トランスフェクションでは、ウイルス力価の低下が最小である。
実施例４：Ｔｒｕｎｃ１０はＣＲＥを維持し、ペイロード性能を最大化する
ＣＲＥの位置を絞り、ＳＶＶのＶＰコード領域内の許容可能な欠失の長さを分析するために、さらなる実験を実施した。ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子とＶＰタンパク質をコードする領域における欠失および／または切断とを含むＳＶＶ由来の組換えＲＮＡレプリコンを表１７および図５Ａに従って生成した。実験は、実施例２に記載されるプロトコルに従って実施した。図５Ｂは、インビトロＴ７ ＲＮＡ合成を介して生成されたＲＮＡ分子を示し、図５Ｃは、様々なレプリコンのｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示す。結果は、１２６０ｂｐ～３４７８ｂｐの間の欠失（Ｔｒｕｎｃ１０レプリコン）はＳＶＶウイルス複製に対する影響が最小であることを示した。
Figure 2023528300000069
 実施例５：単一のペイロードを含むＳＶＶレプリコンが、複製およびトランスキャプシド形成能力をもつ
インビトロおよびインビボでの能力試験のために、レプリコンを構築した（図６Ａ～６Ｂ）。様々なペイロード（ｍＣｈｅｒｒｙ、ナノ－ルシフェラーゼ、またはｅＧＦＰ）を図６Ｂに示すようにレプリコン内に挿入して、結果物のレプリコンを、実施例２～４のプロトコルに従って試験した。結果は、これらレプリコンはすべて、複製およびトランスキャプシド形成能力があることを示した。
実施例６：マウスＩＬ－２ペイロードを含むＳＶＶ－Ｔｒｕｎｃ１０レプリコン
ＳＶＶ－Ｔｒｕｎｃ１０レプリコンを介したマウスＩＬ－２ペイロードタンパク質の発現を試験するために、実験を実施した。図７Ａは、マウスＩＬ－２ペイロードをコードする導入遺伝子を担持するＳＶＶ－レプリコンＴｒｕｎｃ１０の構築物を示す。当該レプリコンおよびＳＶＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ鋳型を、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化し、そしてＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ社）でインビトロ転写（ＩＶＴ）した。Ｈ１２９９細胞を、１ｕｇのレプリコンＲＮＡ、または１ｕｇのＳＶＶｍＣｈｅｒｒｙを加えた１ｕｇのレプリコンＲＮＡと共に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、上清を収集し、０．４５ｕｍのフィルターを通して濾過し、そしてＲＮＡをＱＩＡｚｏｌ（Ｑｉａｇｅｎ社）中に収集した。濾過された上清の１００ｕｌを、Ｈ１２９９細胞の新鮮な単層の上に移し、感染後４８時間で上清を収集した。マウスＩＬ－２の発現が、ｍＩＬ－２のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ社）で検出された（図７Ｂ）。さらに、ウイルスＲＮＡを単離し、プラス鎖およびマイナス鎖に特異的なＴａｑＭａｎアッセイで分析した（図７Ｃ）。結果は、ＳＶＶ－Ｔｒｕｎｃ１０－ｍＩＬ－２レプリコンが、トランスフェクションおよびトランスキャプシド形成後にｍＩＬ－２を発現および分泌し、プラス鎖およびマイナス鎖のウイルスＲＮＡ合成の能力があることを示した。
実施例７：単鎖ｍＩＬ－１２ペイロードを含むＳＶＶ－Ｔｒｕｎｃ１０レプリコン
ＳＶＶ－Ｔｒｕｎｃ１０レプリコンを介した単鎖ｍＩＬ－１２（ｓｃｍＩＬ－１２）ペイロードタンパク質の発現を試験するために、実験を実施した。図８Ａは、シグナル配列を有するおよびシグナル配列を有さない単鎖ｍＩＬ－１２（ｓｃｍＩＬ－１２）をコードする導入遺伝子を担持するＳＶＶ－レプリコンＴｒｕｎｃ１０の構築物を示す。当該レプリコンおよびＳＶＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ鋳型を、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化し、そしてＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ社）でインビトロ転写（ＩＶＴ）した。Ｈ１２９９細胞を、１ｕｇのレプリコンＲＮＡ、または１ｕｇのＳＶＶｍＣｈｅｒｒｙを加えた１ｕｇのレプリコンＲＮＡと共に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、上清を収集し、０．４５ｕｍのフィルターを通して濾過し、そしてＲＮＡをＱＩＡｚｏｌ（Ｑｉａｇｅｎ社）中に収集した。濾過された上清の１００ｕｌを、Ｈ１２９９細胞の新鮮な単層の上に移し、感染後４８時間で上清を収集した。ＲＮＡを単離し、プラス鎖およびマイナス鎖特異的なＴａｑＭａｎアッセイ（図８Ｂ）により分析したが、これによりレプリコンがプラス鎖およびマイナス鎖のウイルスＲＮＡ合成の能力があることが示され、またペイロードの分泌は、プラスまたはマイナスのウイルスＲＮＡ合成と相関しないことが示された。マウスＩＬ－１２の発現が、ｍＩＬ－２のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ社）（図８Ｃ）で検出されたが、これによりＴｒｕｎｃ１０－ｓｃｍＩＬ－１２レプリコンが、トランスフェクションおよびトランスキャプシド形成後にｍＩＬ－１２を発現および分泌することが示された。シグナル配列の欠失によりＩＬ－１２の分泌が減少した。全体的に、結果は、Ｔｒｕｎｃ１０－ｓｃｍＩＬ－１２レプリコンおよびＴｒｕｎｃ１０－ｓｃｍＩＬ－１２Δｓｓレプリコンが、プラス鎖およびマイナス鎖のウイルスＲＮＡ合成の能力があることを示したが、インタクトなシグナル配列は、トランスフェクションおよびトランスキャプシド形成後のｍＩＬ－１２の発現および分泌を促進することを示した。
実施例８：ＳＶＶ－Ｔｒｕｎｃ１０－ｈＩＬ－３６γレプリコン
ＳＶＶ－Ｔｒｕｎｃ１０レプリコンを介したヒトＩＬ－３６γペイロードタンパク質の発現を試験するために、実験を実施した。図９Ａは、天然のシグナル配列を有するまたはＩＬ２シグナル配列を有する、ヒトＩＬ－３６γをコードする導入遺伝子を担持するＳＶＶ－レプリコンＴｒｕｎｃ１０の構築物を示す。当該レプリコンおよびＳＶＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ鋳型を、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化し、そしてＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ社）でインビトロ転写（ＩＶＴ）した。Ｈ１２９９細胞を、１ｕｇのレプリコンＲＮＡ、または１ｕｇのＳＶＶｍＣｈｅｒｒｙを加えた１ｕｇのレプリコンＲＮＡと共に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、上清を収集し、０．４５ｕｍのフィルターを通して濾過し、そしてＲＮＡをＱＩＡｚｏｌ試薬（Ｑｉａｇｅｎ社）中に収集した。濾過された上清の１００ｕｌを、Ｈ１２９９細胞の新鮮な単層の上に移し、感染後４８時間で上清を収集した。ｈＩＬ－３６γの発現が、ｈＩＬ－３６γのＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ社）で検出された。両レプリコンとも、トランスフェクションおよびトランスキャプシド形成後にｈＩＬ－３６γを発現および分泌し、そしてＩＬ－２シグナル配列の付加により発現または分泌は向上されない（図９Ｂ）。ＲＮＡを単離し、プラス鎖およびマイナス鎖に特異的なＴａｑＭａｎアッセイで分析した。結果（図９Ｃ）は、両レプリコンが、プラス鎖およびマイナス鎖のウイルスＲＮＡ合成の能力があることを示した。全体的に、結果は、ＳＶＶ－Ｔｒｕｎｃ１０－ｈＩＬ－３６γレプリコンおよびＳＶＶ－Ｔｒｕｎｃ１０－ＩＬ２ｓｓ－ｈＩＬ－３６γ－１８Ｓレプリコンが、トランスフェクションおよびトランスキャプシド形成後にｈＩＬ－３６γを発現および分泌し、プラス鎖およびマイナス鎖のウイルスＲＮＡ合成の能力があることを実証した。
実施例９：ジシストロニックレプリコンにおける第二のＩＲＥＳは、レプリコン機能を向上させない
図１０Ａは、単一ペイロードの下流に第二の脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳが組み込まれたジシストロニックなレプリコンの構築物を示す概略図である。レプリコン機能の改善に対する第二のＩＲＥＳの効果を試験した。当該レプリコンおよびＳＶＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ鋳型を、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化し、そしてＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ社）でインビトロ転写（ＩＶＴ）した。Ｈ１２９９細胞を、１ｕｇのレプリコンＲＮＡ、または１ｕｇのＳＶＶｍＣｈｅｒｒｙと共に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、ＱＩＡｚｏｌ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＲＮＡを収集した。ＲＮＡを単離し、プラス鎖およびマイナス鎖に特異的なＴａｑＭａｎアッセイで分析した（図１０Ｂ）。結果は、レプリコンのマイナス鎖合成が、第二のＥＣＭＶ ＩＲＥＳの付加によって損なわれ、そしてｈＤＬＬ３－ＢｉＴＥペイロードまたはｍＩＬ－２ペイロードの下流にある第二のＩＲＥＳの組み込みは、ウイルスＲＮＡ合成を向上させないことを示した。
実施例１０：複数のフーリンＴ２Ａ部位は、ジシストロニックな二重ペイロードレプリコンにおけるペイロード発現に有効ではない
図１１Ａは、第一のペイロードと第二のペイロード（ｅＧＦＰ）との間のフーリン－Ｔ２Ａ部位によって分離された複数のペイロードの下流に第二の脳性心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳが組み込まれたジシストロニックな二重ペイロードレプリコンの構築物を示す。当該レプリコンおよびＳＶＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ鋳型を、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化し、そしてＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ社）でインビトロ転写（ＩＶＴ）した。Ｈ１２９９細胞を、１ｕｇのレプリコンＲＮＡ、または１ｕｇのＳＶＶｍＣｈｅｒｒｙを加えた１ｕｇのレプリコンＲＮＡと共に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、ＧＦＰ発現に関して細胞を観察し、レプリコンおよびＳＶＶｍＣｈｅｒｒｙの同時トランスフェクションよりの上清を収集し、０．４５ｕｍのフィルターを通して濾過した。濾過された上清の１００ｕｌを、Ｈ１２９９細胞の新鮮な単層の上に移し、感染後２４時間でｍＣｈｅｒｒｙおよびＧＦＰの発現に関して細胞を調べた（図１１Ｂ）。Ｔｒｕｎｃ１０－ｈＤＬＬ３－ＢｉＴＥ－ＧＦＰ－ｅＩＲＥＳまたはＴｒｕｎｃ１０－ｍＩＬ２－ＧＦＰ－ｅＩＲＥＳのいずれかのトランスフェクション後、またはトランスキャプシド形成後に、ＧＦＰの最小の発現が検出されたが、このことは、ジシストロニックなレプリコンが第二のペイロードの発現を障害していたことを示す。
実施例１１：第二のペイロードをレプリコンの３’末端に組み込んだ二重ペイロードレプリコンは、複製に効果的ではない
図１２Ａは、ＲｄＲｐと３’ＵＴＲとの間のレプリコンの３’末端において第二のペイロードが組み込まれた二重ペイロードレプリコンの構築物を示す。当該レプリコンおよびＳＶＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ鋳型を、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化し、そしてＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ社）でインビトロ転写（ＩＶＴ）した。Ｈ１２９９細胞を、１ｕｇのレプリコンＲＮＡ、または１ｕｇのＳＶＶｍＣｈｅｒｒｙを加えた１ｕｇのレプリコンＲＮＡと共に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、上清を収集し、０．４５ｕｍのフィルターを通して濾過し、そしてＲＮＡをＱＩＡｚｏｌ試薬（Ｑｉａｇｅｎ社）中に収集した。濾過された上清の１００ｕｌを、Ｈ１２９９細胞の新鮮な単層の上に移し、感染後４８時間で上清を収集した。ｈＩＬ－３６γの発現が、ｈＩＬ－３６γのＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ社）で検出された。当該レプリコンは、トランスフェクション後に２ｐｇ／ｍＬ未満のｈＩＬ－３６を分泌したが、このｈＩＬ－３６の分泌は、トランスキャプシド形成後には検出不能であった（図１２Ｂ）。ＲＮＡを単離し、プラス鎖およびマイナス鎖特異的なＴａｑＭａｎアッセイで分析したが、これにより、レプリコンがプラス鎖およびマイナス鎖のウイルスＲＮＡ合成に関して不完全であることが示された（図１２Ｃ）。結果は、３’末端におけるペイロードの挿入は、トランスフェクション後のＩＬ－３６γの非常に低い発現をもたらし、トランスキャプシド形成を阻害し、そしてプラス鎖およびマイナス鎖合成を減少させることを実証した。
実施例１２：Ｔｒｕｎｃ１０レプリコンを使用した１ＤＬＴ１７６－ＭＴＴ１０－ＤＬＬ３－ＶＨＨ－ＣＤ３の発現
ｈｉｓタグ付き１ＤＬＴ１７６－ＭＴＴ１０－ＤＬＬ３－ＶＨＨ－ＣＤ３ ＬｉＴＥの発現のために単一ペイロードレプリコンを構築した。当該レプリコンおよびＳＶＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ鋳型を、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化し、そしてＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ社）でインビトロ転写（ＩＶＴ）した。Ｈ１２９９細胞を、１ｕｇのレプリコンＲＮＡ、または１ｕｇのＳＶＶｍＣｈｅｒｒｙを加えた１ｕｇのレプリコンＲＮＡと共に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、上清を収集し、０．４５ｕｍのフィルターを通して濾過し、そしてＲＮＡをＱＩＡｚｏｌ試薬（Ｑｉａｇｅｎ社）中に収集した。濾過された上清の１００ｕｌを、Ｈ１２９９細胞の新鮮な単層の上に移し、感染後４８時間で上清を収集した。抗Ｈｉｓウェスタンブロットを用いて、ｈｉｓタグ付き１ＤＬＴ１７６－ＭＴＴ１０－ＤＬＬ３－ＶＨＨ－ＣＤ３ ＬｉＴＥの発現を検出した。ＬｉＴＥの発現と相関した特定のバンドを矢印で示しているが、トランスフェクトおよびトランスキャプシド形成したサンプルの上清中で検出された（図１３Ａ）。ＲＮＡを単離し、プラス鎖およびマイナス鎖に特異的なＴａｑＭａｎアッセイで分析した（図１３Ｂ）。この結果から、Ｔｒｕｎｃ１０－１ＤＬＴ１７６－ＭＴＴ１０－ＤＬＬ３－ＶＨＨ－ＣＤ３レプリコンは、ＬｉＴＥペイロード発現、ならびにプラス鎖およびマイナス鎖のウイルスＲＮＡ合成の能力があることが示唆された。
実施例１３：Ｔｒｕｎｃ１０レプリコンを使用したｒＤＬＬ３－αＣＤ３－Ｈ／Ｌ－ＢｉＴＥおよびＴ１０－ｒＤＬＬ３－αＣＤ３－Ｌ／Ｈ－ＢｉＴＥの発現
ｈｉｓタグ付きｒＤＬＬ３－αＣＤ３－ＢｉＴＥの発現のために単一ペイロードレプリコンを構築した。Ｈ／Ｌは後に軽鎖が続く重鎖で配向され、一方で逆のことがＬ／Ｈに対して同様である。Ａ．レプリコンおよびＳＶＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ鋳型を、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化し、ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ社）でインビトロ転写（ＩＶＴ）した。Ｈ１２９９細胞を、１ｕｇのレプリコンＲＮＡ、または１ｕｇのＳＶＶｍＣｈｅｒｒｙを加えた１ｕｇのレプリコンＲＮＡと共に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、上清を収集し、０．４５ｕｍのフィルターを通して濾過し、そしてＲＮＡをＱＩＡｚｏｌ試薬（Ｑｉａｇｅｎ社）中に収集した。濾過された上清の１００ｕｌを、Ｈ１２９９細胞の新鮮な単層の上に移し、感染後４８時間で上清を収集した。抗Ｈｉｓウェスタンブロットで、ｈｉｓタグ付きｒＤＬＬ３－αＣＤ３－ＢｉＴＥの発現を検出した（図１４Ａ）。ＬｉＴＥの発現と相関した特定のバンドを矢印で示しているが、トランスフェクトおよびトランスキャプシド形成したサンプルの上清で検出された。ＲＮＡを単離し、プラス鎖およびマイナス鎖に特異的なＴａｑＭａｎアッセイで分析した（図１４Ｂ）。結果は、Ｔｒｕｎｃ１０－ｒＤＬＬ３－αＣＤ３ ＢｉＴＥを発現するレプリコンの両方が、ＢｉＴＥペイロードの発現、トランスキャプシド形成、ならびにプラス鎖およびマイナス鎖のウイルスＲＮＡ合成の能力があることを実証した。重鎖および軽鎖の配向は、レプリコン機能に影響を与えない。
実施例１４：Ｔｒｕｎｃ１０レプリコンを使用した複数のペイロードを発現する代替的な開裂ペプチド
ｈｉｓタグ付きｍＦＡＰとＣＸＣＬ１０との間の代替的な開裂ペプチド（３Ｃ、またはフーリン－３Ｃ、またはフーリンＴ２Ａ）を含むＴｒｕｎｃ１０レプリコンを、これら代替的な開裂ペプチドのいずれかが、単一のレプリコンからの複数のペイロードの効率的な発現を可能にするかどうかを検証するために構築した（図１５Ａおよび配列番号４０、４２、４４）。当該レプリコンの鋳型（配列番号３９、４１、４３）およびＳＶＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ鋳型を、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化し、そしてＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ社）でインビトロ転写（ＩＶＴ）した。Ｈ１２９９細胞を、１ｕｇのレプリコンＲＮＡ、または１ｕｇのＳＶＶｍＣｈｅｒｒｙを加えた１ｕｇのレプリコンＲＮＡと共に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、上清を収集し、０．４５ｕｍのフィルターを通して濾過し、そしてＲＮＡをＱＩＡｚｏｌ試薬（Ｑｉａｇｅｎ社）中に収集した。濾過された上清の１００ｕｌを、Ｈ１２９９細胞の新鮮な単層の上に移し、感染後４８時間で上清を収集した。ＣＸＣＬ１０の発現が、ＣＸＣＬ１０特異的なＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ社）で分析された。ＣＸＣＬ１０の発現は、トランスフェクションまたはトランスキャプシド形成後には検出されなかった（図１５Ｂ）。ＲＮＡを単離し、プラス鎖およびマイナス鎖に特異的なＴａｑＭａｎアッセイで分析したが（図１５Ｃ）、これにより、これらレプリコンがすべて、プラス鎖およびマイナス鎖のウイルスＲＮＡ合成に関して不完全であることが示された。したがって、元のフーリンＴ２Ａ部位と比較して、３Ｃ、ｆＴ２Ａおよびフーリン３Ｃの開裂部位は、二重ペイロードの発現またはマイナス鎖もしくはプラス鎖の合成を促進しない。
ｈｉｓタグ付きｍＦＡＰとＣＸＣＬ１０との間の代替的な開裂ペプチド（Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、またはＥ２Ａ）を含むＴｒｕｎｃ１０レプリコンを、これら代替的な開裂ペプチドのいずれかが、単一のレプリコンからの複数のペイロードの効率的な発現を可能にするかどうかを検証するために構築した（図１６Ａおよび配列番号４８、５０、５２、５４）。当該レプリコンの鋳型（配列番号４７、４９、５１、５３）およびＳＶＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ鋳型を、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化し、そしてＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ社）でインビトロ転写（ＩＶＴ）した。Ｈ１２９９細胞を、１ｕｇのレプリコンＲＮＡ、または１ｕｇのＳＶＶｍＣｈｅｒｒｙを加えた１ｕｇのレプリコンＲＮＡと共に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、上清を収集し、０．４５ｕｍのフィルターを通して濾過し、そしてＲＮＡをＱＩＡｚｏｌ試薬（Ｑｉａｇｅｎ社）において収集した。濾過された上清の１００ｕｌを、Ｈ１２９９細胞の新鮮な単層の上に移し、感染後４８時間で上清を収集した。ＣＸＣＬ１０の発現を、ＣＸＣＬ１０特異的なＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ社）で調べたが（図１６Ｂ）、ＣＸＣＬ１０の発現は、フーリン－Ｔ２Ａレプリコンと比較して、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、およびＥ２Ａレプリコンから増強されるが、トランスキャプシド形成後にはＣＸＣＬ１０の発現は検出されないことを示した。ＲＮＡを単離し、プラス鎖およびマイナス鎖に特異的なＴａｑＭａｎアッセイで分析したが（図１６Ｃ）、これにより、すべてのレプリコンが、プラス鎖およびマイナス鎖のウイルスＲＮＡ合成の能力があり、フーリンＴ２Ａレプリコンと比較して改善されることが示された。
実施例１５：Ｎ末端フーリン部位を有するＩＧＳＦ１内部ドメインリンカーが、単一のＯＲＦからの２つのポリペプチドの分泌を可能にする
Ｎ末端フーリン部位を有するＩＧＳＦ１内部ドメインリンカーを、単一のレプリコンからの複数のペイロードの発現のために開裂ポリペプチドとして試験した。宿主ＩＧＳＦ１媒介処理リンカーを、同一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からの２つのペイロードの発現および分泌を可能にするように設計した。ヒトＩＧＳＦ１タンパク質が、膜貫通ドメインとタンデムシグナル配列／シグナルペプチダーゼ部位を含有し、第二の分泌ペイロードの分泌を促進する。ＩＧＳＦ１リンカーのＮ末端に、両方のペプチドのＥＲ処理のために、およびＮ末端ペイロードの放出を確実にするために、２ｘのフーリン開裂部位が含まれた。この例では、Ｎ末端ペイロード分子はマウスＩＬ－１２であり、またＣ末端ペイロード分子はＯＲＦ内のＩＬ－３６ガンマである（図１７Ａおよび配列番号６０）。このＯＲＦを、試験のためにＴｒｕｎｃ１０レプリコンに挿入した。
当該レプリコンの鋳型（配列番号５９）およびＳＶＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ鋳型を、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化し、そしてＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ社）でインビトロ転写（ＩＶＴ）した。Ｈ１２９９細胞を、１ｕｇのレプリコンＲＮＡ、または１ｕｇのＳＶＶｍＣｈｅｒｒｙを加えた１ｕｇのレプリコンＲＮＡと共に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、上清を収集し、０．４５ｕｍのフィルターを通して濾過し、そしてＲＮＡをＱＩＡｚｏｌ試薬（Ｑｉａｇｅｎ社）中に収集した。濾過された上清の１００ｕｌを、Ｈ１２９９細胞の新鮮な単層の上に移し、感染後４８時間で上清を収集した。ヒトＩＬ－３６γおよびマウスＩＬ－２の発現は、ｈＩＬ－３６γおよびｍＩＬ－２のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ社）で検出される。両ペイロードの発現は、トランスフェクションおよびトランスキャプシド形成（ＴＥ）後に検出される（図１７Ｂ～１７Ｃ）。ＲＮＡを単離し、プラス鎖およびマイナス鎖に特異的なＴａｑＭａｎアッセイで分析したが（図１７Ｄ）、これにより、すべてのレプリコンが、プラス鎖およびマイナス鎖のウイルスＲＮＡ合成の能力があり、また単一のペイロードＧＦＰレプリコンと同等に複製することが示された。全体的に、結果は、単一のレプリコンからの両ペイロードの発現を可能にする、ＩＬ２およびＩＬ３６間で開裂するためにＩＧＳＦ１媒介性の処理を使用する戦略が成功したことを実証した。ＩＬ３６およびＩＬ２の両方が、トランスフェクションおよびトランスキャプシド形成後に発現された。プラス鎖およびマイナス鎖のＲＮＡ合成は、Ｔ１０－ｅＧＦＰレプリコンと同等である。
実施例１６：ＨＩＶプロテアーゼ媒介性の蛋白質分解が、二つのペイロードのペイロード発現を増強する
図１８Ａは、同一のオープンリーディングフレームにおける分泌された二つのペイロードのＨＩＶ－１プロテアーゼ媒介性処理の概略図を示す。二つのペイロードは、ＨＩＶ－１プロテアーゼの連結された二量体または単量体のいずれかと、隣接するＨＩＶプロテアーゼ開裂（ＰＲ）部位とによって分離される。この実施例では、Ｎ末端ペイロード分子はマウスＩＬ－１２であり、またＣ末端ペイロード分子はＯＲＦ内のＩＬ－３６γである。このＯＲＦを、試験のためにＴｒｕｎｃ１０レプリコンに挿入した（配列番号５６、５８）。当該レプリコンの鋳型（配列番号５５、５７）およびＳＶＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ鋳型を、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化し、そしてＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ社）でインビトロ転写（ＩＶＴ）した。Ｈ１２９９細胞を、１μｇのレプリコンＲＮＡ、または１μｇのＳＶＶｍＣｈｅｒｒｙを加えた１ｕｇのレプリコンＲＮＡと共に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、上清を収集し、０．４５ｕｍのフィルターを通して濾過し、そしてＲＮＡをＱＩＡｚｏｌ試薬（Ｑｉａｇｅｎ社）中に収集した。濾過された上清の１００ｕｌを、Ｈ１２９９細胞の新鮮な単層の上に移し、感染後４８時間で上清を収集する。ＲＮＡを単離し、プラス鎖およびマイナス鎖に特異的なＴａｑＭａｎアッセイで分析したが（図１８Ｂ）、これにより、すべてのレプリコンが、プラス鎖およびマイナス鎖のウイルスＲＮＡ合成の能力があり、また単一のペイロードＧＦＰレプリコンと同等に複製することが示された。ヒトＩＬ－３６γおよびマウスＩＬ－２の発現は、ｈＩＬ－３６γおよびｍＩＬ－２のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ社）で検出された。両ペイロードの発現は、トランスフェクションおよびトランスキャプシド形成後に検出された（図１８Ｃ）。全体的に、これら結果は、ＨＩＶプロテアーゼの単一のコピーが、単一レプリコンからの両ペイロードの効率的な発現を可能にし、またＩＬ－３６γおよびＩＬ２が、トランスフェクションおよびトランスキャプシド形成後に首尾よく発現されたことを実証した。プラス鎖およびマイナス鎖のＲＮＡ合成は、Ｔｒｕｎｃ１０－ｅＧＦＰレプリコンと同等である。全体的に、これら結果は、ＨＩＶプロテアーゼが単一のＯＲＦからの二重ペイロードを可能にすることを実証した。
図１９Ａは、単量体ＨＩＶ－１プロテアーゼと、ｈｉｓ－タグ付きｈＤＬＬ３－ＢｉＴＥおよびヒトＩＬ－３６γ間の隣接するプロテアーゼ開裂部位とを含む、二重ペイロードレプリコンＴ１０－ＢｉＴＥ－ｈＩＬ－３６γを示しているが、単一のＴｒｕｎｃ１０由来のレプリコンからの二つのペイロードの発現について試験した。当該レプリコンおよびＳＶＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ鋳型を、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化し、そしてＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ社）でインビトロ転写（ＩＶＴ）した。Ｈ１２９９細胞を、１μｇのレプリコンＲＮＡ、または１μｇのＳＶＶｍＣｈｅｒｒｙを加えた１μｇのレプリコンＲＮＡと共に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、上清を収集し、０．４５μｍのフィルターを通して濾過し、そしてＲＮＡをＱＩＡｚｏｌ試薬（Ｑｉａｇｅｎ社）において収集した。濾過された上清の１００ｕｌを、Ｈ１２９９細胞の新鮮な単層の上に移し、感染後４８時間で上清を収集した。ヒトＩＬ－３６γの発現を、ｈＩＬ－３６γのＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ社）で調べた。ｈＩＬ－３６γの発現は、トランスフェクションおよびトランスキャプシド形成の両方の後に検出された（図１９Ｂ）。ＲＮＡを単離し、プラス鎖およびマイナス鎖特異的なＴａｑＭａｎアッセイで分析したが（図１９Ｃ）、これにより、すべてのレプリコンがプラス鎖およびマイナス鎖のウイルスＲＮＡ合成の能力があることが示された。全体的に、これら結果は、ＨＩＶプロテアーゼの単一のコピーが、トランスフェクションおよびトランスキャプシド形成後に二重ペイロードレプリコンよりのｈＩＬ－３６発現を可能にすることを実証した。プラス鎖およびマイナス鎖のＲＮＡ合成は、Ｔ１０－ｅＧＦＰレプリコンと比較して減少する。
実施例１７：単一のレプリコンからの三重ペイロードのＨＩＶプロテアーゼ媒介性発現
図２０Ａは、単量体ＨＩＶ－１プロテアーゼと、ｈｉｓ－タグ付きｈＤＬＬ３－ＢｉＴＥ、ヒトＩＬ－３６γおよびマウスＩＬ－２の間の隣接するプロテアーゼ開裂部位とを含む、三重ペイロードレプリコンＴ１０－ＢｉＴＥ－ＩＬ３ｇ６－ＩＬ２を示しているが、単一のレプリコンＴｒｕｎｃ１０（Ｔ１０）からの三つのペイロードの発現について試験した。当該レプリコンおよびＳＶＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ鋳型を、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化し、そしてＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ社）でインビトロ転写（ＩＶＴ）した。Ｈ１２９９細胞を、１μｇのレプリコンＲＮＡ、または１ｕｇのＳＶＶｍＣｈｅｒｒｙを加えた１μｇのレプリコンＲＮＡと共に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、上清を収集し、０．４５ｕｍのフィルターを通して濾過し、そしてＲＮＡをＱＩＡｚｏｌ試薬（Ｑｉａｇｅｎ社）中に収集した。濾過された上清の１００μＬを、Ｈ１２９９細胞の新鮮な単層の上に移し、感染後４８時間で上清を収集した。ヒトＩＬ－３６γおよびマウスＩＬ－２の発現を、ｈＩＬ－３６γまたはｍＩＬ－２特異的なＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ社）で試験した。ｈＩＬ－３６の発現は、トランスフェクションおよびトランスキャプシド形成後に検出されず、またｍＩＬ－２の発現が低いことが、トランスフェクションおよびトランスキャプシド形成後に検出された（図 ２０Ｂ）。ＲＮＡを単離し、プラス鎖およびマイナス鎖に特異的なＴａｑＭａｎアッセイで分析したが（図２０Ｃ）、これにより、すべてのレプリコンが、プラス鎖およびマイナス鎖のウイルスＲＮＡ合成の能力があるが、当該能力は単一のペイロードレプリコンと比較して低い。
図２１Ａは、三重ペイロードレプリコンＴ１０－ｍＩＬ２－ＢｉＴＥ－ｈＩＬ－３６γの代替的な設計を示しているが、これはＩＬ－２コード領域を他の二つのペイロードコード領域の前に配置し、そして単量体ＨＩＶ－１プロテアーゼと、マウスＩＬ－２、ｈｉｓ－タグ付きｈＤＬＬ３－ＢｉＴＥおよびヒトＩＬ－３６γの間の隣接するプロテアーゼ開裂部位とを使用する。この構築物は、上記と同じプロトコルに従って、単一のレプリコンからの三つのペイロードの発現について試験された。ｈＩＬ－３６の発現は、トランスフェクション後に検出されたが、その発現レベルは、トランスキャプシド形成（ＴＥ）後に低下した。ｍＩＬ－２の発現が低いことが、トランスフェクションおよびトランスキャプシド形成後に溶解物中で検出されたが、上清内には分泌されなかった（図２１Ｂ）。ＲＮＡを単離し、プラス鎖およびマイナス鎖特異的なＴａｑＭａｎアッセイで分析したが（図２１Ｃ）、これにより、すべてのレプリコンがプラス鎖およびマイナス鎖のウイルスＲＮＡ合成の能力があることが示された。
図２２Ａは、三重ペイロードレプリコンＴ１０－ｍＩＬ２－ｈＩＬ－３６γ－ＢｉＴＥの別の設計を示しているが、これはｈＤＬＬ３－ＢｉＴＥを最後のペイロードとして配置し、そして単量体ＨＩＶ－１プロテアーゼと、マウスＩＬ－２、ヒトＩＬ－３６γ、およびｈｉｓ－タグ付きｈＤＬＬ３－ＢｉＴＥの間の隣接するプロテアーゼ開裂部位とを含む。この構築物は、上記と同じプロトコルに従って、単一のレプリコンからの三つのペイロードの発現について試験された。ＲＮＡを単離し、プラス鎖およびマイナス鎖特異的なＴａｑＭａｎアッセイで分析したが（図２２Ｂ）、これにより、すべてのレプリコンがプラス鎖およびマイナス鎖のウイルスＲＮＡ合成の能力があることが示された。ｈＩＬ－３６およびｍＩＬ－２の発現は、トランスフェクション後に検出されたが、トランスキャプシド形成後では検出されなかった。また上清と比較して、ｍＩＬ－２の発現がより高いことが、溶解物中で検出された（図２２Ｃ）。全体的に、結果は、三重ペイロードレプリコンＴ１０－ｍＩＬ２－ｈＩＬ３６－ＢｉＴＥ ＢｉＴＥから、ｈＩＬ－３６およびｍＩＬ－２の発現が、上清および溶解物中で低レベルでトランスフェクション後に検出することができたが、トランスキャププシド形成後には検出できず、またプラス鎖およびマイナス鎖の合成は、Ｔ１０－ｅＧＦＰよりもわずかに低いことを示した。
実施例１８：ＳＶＶ由来のＲＮＡレプリコンを使用したペイロード発現のインビボ試験
ＳＶＶ由来のレプリコンを使用したペイロード発現を、動物モデルで試験した。
胸腺欠損の雌ヌードマウスに、ＮＣＩ－Ｈ６９細胞（無血清ＰＢＳおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の１：１混合物中８×１０６細胞／０．１ｍＬ）を右脇腹の皮下に移植した。腫瘍サイズの中央値が約１５０ｍｍ３（１２０～１８０ｍｍ３の範囲）に達したとき、マウスは、治療群当たりマウス３匹の群のコホートに分けた。一治療群では、野生型ＳＶＶ ＲＮＡウイルスゲノム（ＳＶＶ－ＷＴ）またはＳＶＶ－Ｔｒｕｎｃ１０－ｈＩＬ－３６γ ＲＮＡレプリコン（実施例８に記載される通り）のいずれかを封入する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の混合物を用いて、腫瘍内投与を介してマウスを治療した。対照群では、野生型ＳＶＶ ＲＮＡウイルスゲノムおよびＳＶＶ陰性対照ＲＮＡ（ＳＶＶ－Ｎｅｇ）を封入するＬＮＰの混合物で、腫瘍内投与を介してマウスを治療した。腫瘍サンプルを、投与後４８時間後、７２時間後および６日後に収集し、サンプル組織を粉砕し、腫瘍溶解物を調製した。ＩＬ－３６γの発現レベルを、ＥＬＩＳＡにより決定した。結果を図２３Ａに示す。ヒトＩＬ－３６γの発現が、投与後４８時間後および７２時間後の腫瘍サンプルで検出された。
別の実験群では、胸腺欠損の雌ヌードマウスに、ＮＣＩ－Ｈ４４６細胞（無血清ＰＢＳおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の１：１混合物中５×１０６細胞／０．１ｍＬ）を右脇腹の皮下に移植した。腫瘍サイズの中央値が約１５０ｍｍ３（１２０～１８０ｍｍ３の範囲）に達したとき、マウスは、治療群当たりマウス３匹の群のコホートに分けた。一治療群では、野生型ＳＶＶ ＲＮＡウイルスゲノム（ＳＶＶ－ＷＴ）、およびヒトＩＬ－３６γ（Ｒ－ＩＬ３６ｇ）をコードするＳＶＶレプリコンＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の混合物を用いて、腫瘍内投与を介してマウスを治療した。対照群では、野生型ＳＶＶ ＲＮＡウイルスゲノムおよびＳＶＶ陰性対照ＲＮＡ（ＳＶＶ－Ｎｅｇ）を封入するＬＮＰの混合物で、腫瘍内投与を介してマウスを治療した。腫瘍サンプルを、投与後４８時間後、７２時間後および７日後に収集し、サンプル組織を粉砕し、腫瘍溶解物を調製した。ＩＬ－３６γの発現レベルを、ＥＬＩＳＡにより決定した。結果を図２３Ｂに示す。ヒトＩＬ－３６γの発現が、投与後４８時間後および７２時間後の腫瘍サンプルで検出された。
実施例１９：コクサッキーウイルスＡ２１レプリコンの構築と、それよりのペイロードの発現
図２４に示すように、ＣＶＡ２１－レプリコン（配列番号６２）を、ＶＰ構造タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の除去およびそれらを２Ａプロテアーゼ部位に隣接した蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ ＯＲＦで置換することによって作製した。当該レプリコンは、配列番号６１に従う、ＤＮＡベクター鋳型を用いて産生することができる。
ｍＣｈｅｒｒｙペイロードを含むＣＶＡ２１－レプリコンを、ペイロードの発現について試験した。６ウェルプレート中の１×１０＾５個のＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞を、ＣＶＡ２１－ＷＴ ＲＮＡ（対照２）と等しいモル比で、またはＣＶＡ２１－レプリコンＲＮＡと等しいモル比で、５００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡ（トランスフェクション対照）を単独で用いて、ＲＮＡｉＭＡｘ試薬でトランスフェクトした（図２５Ａ）。トランスフェクション対照が、Ｈ１２９９細胞の最大のトランスフェクション効率を示した。対照２は、ＣＶＡ２１－ｍＲＮＡを用いたトランスフェクションによってＧＦＰシグナルが部分的に阻害されたことを示した。ＣＶＡ２１－レプリコンは、全体にわたってｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示すが、これは非常に効率的なトランスフェクションおよび高発現を示すトランスフェクション対照のものと合致する。したがって、ＣＶＡ２１レプリコンＲＮＡは、ＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞においてペイロードタンパク質を発現することができる。
次に、ＷＴ ＣＶＡ２１ウイルスの存在下でＣＶＡ２１ ｍＣｈｅｒｒｙレプリコンをトランスキャプシド形成することができるかどうかを決定するために実験を行った。６ウェルプレート中の１ｘ１０＾５個のＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞を、ＣＶＡ２１－レプリコンＲＮＡ（陰性対照）を単独で５００ｎｇを用いて、または５００ｎｇのＣＶＡ２１－ＷＴ ＲＮＡを用いて、ＲＮＡｉＭＡｘ試薬でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、上清を収集し、遠心沈殿させ、４５μＭで濾過し、次いで１００μＬを用いて、（１ｘ１０＾５細胞の）Ｈ１２９９細胞の新しい１２ウェルプレートのウェルに感染させた。強力な感染およびｍＣｈｅｒｒｙシグナルがレプリコン：ＷＴウイルスの上清で感染させたウェルで確認されたが、これはＷＴ－ＲＮＡが産生したキャプシドによるｍＣｈｅｒｒｙレプリコンのキャプシド形成が成功した一方で、ＣＶＡ２１－ＷＴを欠いた陰性対照では、ｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示さなかったことを示唆した（図２５Ｂ）。全体として、これら結果は、ペイロードを担持するＣＶＡ２１レプリコンが、野生型ＣＶＡ２１ウイルスの存在下で首尾よくトランスキャプシド形成され得ることを実証した。
実施例２０：肺がん治療に関する、ＳＶＶ由来の組換えＲＮＡレプリコンとＳＶＶウイルスゲノムをコードするＲＮＡ分子とを含む脂質ナノ粒子のインビボでの有効性
様々なセネカバレーウイルス（ＳＶＶ）由来の組換えＲＮＡレプリコンを構築する。これら組換えＲＮＡレプリコンは、一つ以上の免疫調節タンパク質（例えば、抗－ＤＬＬ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ））をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。これら組換えＲＮＡレプリコンの一部は、一つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－３６γ）および／または一つ以上のケモカイン（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ４）に対するコード領域をさらに含む。ＳＶＶ由来のＲＮＡレプリコンの一部は、以下の表１８に従って、一つ以上のペイロード分子のコード領域を含む：
Figure 2023528300000070
ＳＶＶ由来レプリコンの各々について、ＳＶＶ由来のＲＮＡレプリコンとＳＶＶウイルスゲノムをコードするＲＮＡ分子とを含む脂質ナノ粒子を調製する。これら脂質ナノ粒子がもつインビボでの肺腫瘍増殖を阻害する能力を評価するために動物実験を行うが、これはＳＶＶウイルスゲノムをコードするがＲＮＡレプリコンを含まないＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子の能力と比較される。
簡潔に述べると、８週齢のＮＳＧマウスに、１、２および３日目にヒトＰＢＭＣを注射する。１０日目に、Ｈ１２９９－ＤＬＬ３細胞（無血清ＰＢＳおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の１：１混合物中５×１０６細胞／０．１ｍＬ）を、ＰＢＭＣヒト化マウスの右脇腹に皮下移植する。腫瘍サイズの中央値が約１５０ｍｍ３（１２０～１８０ｍｍ３の範囲）に達したとき、マウスは、治療群当たりマウス８～１０匹の群のコホートに分ける。マウスは、ＳＶＶウイルスゲノムをコードするＲＮＡ分子と特定のＳＶＶ由来のＲＮＡレプリコンとを含有するＬＮＰで治療される（静脈内投与および／または腫瘍内投与を介して）。対照群では、マウスを、ＳＶＶウイルスゲノムをコードするＲＮＡ分子を含有するＬＮＰで治療する。腫瘍体積は、各治療群の有効性を評価するために週に２回測定される。
実施例２１：黒色腫治療に関する、ＣＶＡ２１由来の組換えＲＮＡレプリコンとＣＶＡ２１ウイルスゲノムをコードするＲＮＡ分子とを含む脂質ナノ粒子のインビボでの有効性
様々なコクサッキーウイルスＡ２１（ＣＶＡ２１）由来の組換えＲＮＡレプリコンを構築する。これら組換えＲＮＡレプリコンは、一つ以上の免疫調節タンパク質（例えば、抗－ＤＬＬ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ））をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。これら組換えＲＮＡレプリコンの一部は、一つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－３６γ）および／または一つ以上のケモカイン（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ４）に対するコード領域をさらに含む。ＣＶＡ２１由来のＲＮＡレプリコンの一部は、以下の表１９に従って、一つ以上のペイロード分子のコード領域を含む：
Figure 2023528300000071
ＣＶＡ２１由来のレプリコンの各々について、ＣＶＡ２１由来のＲＮＡレプリコンとＣＶＡ２１ウイルスゲノムをコードするＲＮＡ分子とを含む脂質ナノ粒子を調製する。これら脂質ナノ粒子がもつインビボでの黒色腫増殖を阻害する能力を評価するために動物実験を行うが、これはＣＶＡ２１ウイルスゲノムをコードするがＲＮＡレプリコンを含まないＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子の能力と比較される。
簡潔に述べると、８週齢のＮＳＧマウスに、１、２および３日目にヒトＰＢＭＣを注射する。１０日目に、ＳＫ－ＭＥＬ－２８－ＥｐＣＡＭ細胞（無血清ＰＢＳおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の１：１混合物中５×１０６細胞／０．１ｍＬ）を、ＰＢＭＣヒト化マウスの右脇腹に皮下移植する。腫瘍サイズの中央値が約１５０ｍｍ３（１２０～１８０ｍｍ３の範囲）に達したとき、マウスは、治療群当たりマウス８～１０匹の群のコホートに分ける。マウスは、ＣＶＡ２１ウイルスゲノムをコードするＲＮＡ分子および特定のＣＶＡ２１由来のＲＮＡレプリコンを含有するＬＮＰで治療される（静脈内投与および／または腫瘍内投与を介して）。対照群では、マウスを、ＣＶＡ２１ウイルスゲノムをコードするＲＮＡ分子を含有するＬＮＰで治療する。腫瘍体積は、各治療群の有効性を評価するために週に２回測定される。
参照による援用
本明細書に引用されるすべての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開公報、および特許出願は、すべての目的のためにその全体が参照により援用される。しかし、本明細書に引用されるあらゆる参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開公報、および特許出願の言及は、それらが有効な従来技術を構成している、または世界中のどの国においても共通の一般知識の一部を形成していること承認、または何らかの形の示唆として解釈するものではなく、するべきではない。
本開示の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明してきたが、こうした実施形態が単に例示として提供されていることは、当業者には明らかであろう。今後、本開示から逸脱することなく、当業者には多数の変形、変更、および置換が想到されるであろう。当然のことながら、本明細書に記述された本開示の実施形態に対する様々な代替が、本開示の実践に用いられてもよい。本願の特許請求の範囲では、本開示の範囲、およびこれらの特許請求の範囲の中の方法および構造、ならびにそれらの均等物がそれによって包含されることを意図する。

Claims (123)

  1. ピコルナウイルスゲノムであって、一つ以上のタンパク質コード領域に欠失または切断を含むピコルナウイルスゲノム、および
    異種ポリヌクレオチドを含む、組換えＲＮＡレプリコン。
  2. 前記ピコルナウイルスゲノムが、一つ以上のＶＰコード領域に前記欠失または前記切断を含む、請求項１に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  3. 前記ピコルナウイルスゲノムが、ＶＰ１コード領域、ＶＰ３コード領域およびＶＰ２コード領域のそれぞれに欠失または切断を含む、請求項１または２に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  4. 前記ピコルナウイルスゲノムが、ＶＰ１コード領域およびＶＰ３コード領域の欠失ならびにＶＰ２コード領域の切断を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  5. 前記ピコルナウイルスが、セネカウイルス（ｓｅｎｅｃａｖｉｒｕｓ）、カルジオウイルス、およびエンテロウイルスから選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  6. 前記欠失または前記切断は、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、少なくとも２５００ｂｐ、または少なくとも３０００ｂｐを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  7. 前記欠失または前記切断が、少なくとも２０００ｂｐを含む、請求項６に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  8. 前記欠失の部位または前記切断の部位が、異種ポリヌクレオチドを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  9. 前記異種ポリヌクレオチドが、２Ａコード領域と２Ｂコード領域との間に挿入される、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  10. 前記異種ポリヌクレオチドが、３Ｄコード領域と３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との間に挿入される、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  11. 前記異種ポリヌクレオチドが、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、または少なくとも３０００ｂｐを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  12. 前記ピコルナウイルスが、セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  13. 前記欠失または前記切断が、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位および３４７７位のヌクレオチドの間の一つ以上のヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  14. 前記欠失または前記切断が、配列番号１の番号付けに従って、上限下限を含めて、１２６１位から３４７７位のヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  15. 前記欠失または前記切断が、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、または少なくとも２０００ｂｐを含む、請求項１２～１３に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  16. 前記欠失または前記切断が、少なくとも２０００ｂｐを含む、請求項１５に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  17. ＳＶＶゲノムが、５’リーダータンパク質コード配列を含む、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  18. ＳＶＶゲノムが、ＶＰ４コード領域を含む、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  19. ＳＶＶゲノムが、ＶＰ２コード領域またはその切断を含む、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  20. ＳＶＶゲノムが、５’から３’方向に、５’リーダータンパク質コード配列、ＶＰ４コード領域、およびＶＰ２コード領域またはその切断を含む、請求項１９に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  21. ５’リーダータンパク質コード配列、ＶＰ４コード領域、およびＶＰ２コード領域またはその切断を含むＳＶＶゲノムの部分が、配列番号１の１～１２６０位のヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項２０に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  22. ＳＶＶゲノムが、５’から３’方向に、５’リーダータンパク質コード配列、ＶＰ４コード領域、ＶＰ２コード領域またはその切断、および異種ポリヌクレオチドを含む、請求項２０または２１に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  23. ＳＶＶゲノムが、シス作用性複製エレメント（ＣＲＥ）を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  24. ＣＲＥが、１０～２００ｂｐを含む、請求項２３に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  25. ＣＲＥが、配列番号１に従う１０００位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上のヌクレオチドを含む、請求項２３または２４に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  26. ＣＲＥが、配列番号１に従う１１１７位のヌクレオチドから１２６０位のヌクレオチドに対応する領域内に一つ以上のヌクレオチドを含む、請求項２３または２４に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  27. ＣＲＥが、配列番号１４９に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  28. ＳＶＶゲノムが、２Ａコード領域をさらに含む、請求項１２～２７のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  29. ２Ａコード領域が、ＶＰ２コード領域またはその切断と異種ポリヌクレオチドとの間に位置している、請求項２８に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  30. ＳＶＶゲノムが、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、３Ｃｐｒｏコード領域、および３Ｄ（ＲｄＲｐ）コード領域のうちの一つ以上を含む、請求項１２～２９のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  31. ＳＶＶゲノムが、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、３Ｃｐｒｏコード領域、および３Ｄ（ＲｄＲｐ）コード領域を含む、請求項１２～２９のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  32. ＳＶＶゲノムが、５’から３’方向に、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、３Ｃｐｒｏコード領域、および３Ｄ（ＲｄＲｐ）コード領域を含む、請求項３１に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  33. ２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、３Ｃｐｒｏコード領域、および３Ｄ（ＲｄＲｐ）コード領域を含むＳＶＶゲノムの部分が、配列番号１に従う３５０５位から７３１０位のヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３２に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  34. ＳＶＶゲノムが、５’から３’方向に、異種ポリヌクレオチドと２Ｂコード領域を含む、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  35. ピコルナウイルスが、コクサッキーウイルスである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  36. 前記欠失または前記切断が、配列番号３の番号付けに従って、上限下限を含めて、７１７位から３３３２位のヌクレオチドの間の一つ以上のヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  37. 前記欠失または前記切断が、配列番号３の番号付けに従って、上限下限を含めて、７１７位から３３３２位のヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  38. 前記欠失または前記切断が、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、または少なくとも２６００ｂｐを含む、請求項３５または３６に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  39. コクサッキーウイルスゲノムが、５’ＵＴＲを含む、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  40. ５’ＵＴＲを含むコクサッキーウイルスゲノムの部分が、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  41. コクサッキーウイルスゲノムが、２Ａコード領域、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ＵＴＲのうちの一つ以上を含む、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  42. コクサッキーウイルスゲノムが、２Ａコード領域、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ＵＴＲを含む、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  43. コクサッキーウイルスゲノムが、５’から３’方向に、２Ａコード領域、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ＵＴＲを含む、請求項４２に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  44. ２Ａコード領域、２Ｂコード領域、２Ｃコード領域、３Ａコード領域、３Ｂコード領域、ＶＰｇコード領域、３Ｃコード領域、３Ｄ ｐｏｌコード領域、および３’ＵＴＲを含むコクサッキーウイルスゲノムの部分が、配列番号３における３４９２位から７４３５位のヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項４２に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  45. コクサッキーウイルスゲノムが、５’から３’方向に、５’ＵＴＲ、異種ポリヌクレオチドおよび２Ａコード領域を含む、請求項４１～４４のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  46. ピコルナウイルスが、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  47. 組換えＲＮＡレプリコンが、異種ポリヌクレオチドと２Ｂコード領域との間に挿入される内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ））を含む、請求項９および１１～４６のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  48. 異種ポリヌクレオチドが、一つ以上のペイロード分子をコードする、請求項１～４７のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  49. 異種ポリヌクレオチドが、二つ以上のペイロード分子をコードする、請求項１～４７のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  50. 二つ以上のペイロード分子が、一つ以上の開裂ポリペプチドによって動作可能に連結される、請求項４９に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  51. 開裂ポリペプチドが、２Ａファミリーの自己開裂ペプチド、３Ｃ開裂部位、フーリン部位、ＩＧＳＦ１ポリペプチド、またはＨＩＶプロテアーゼ部位を含む、請求項５０に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  52. 開裂ポリペプチドが、ＩＧＳＦ１ポリペプチドを含み、また該ＩＧＳＦ１ポリペプチドが、配列番号７５に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  53. 開裂ポリペプチドが、ＨＩＶプロテアーゼ部位を含む、請求項５１に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  54. 開裂ポリペプチドが、２Ａファミリーの自己開裂ペプチドを含む、請求項５１に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  55. 開裂ポリペプチドが、フーリン部位を含む、請求項５０～５４のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  56. 異種ポリヌクレオチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ’－ペイロード分子１－開裂ポリペプチド－ペイロード分子２－Ｃ’を含む二つ以上のペイロード分子と開裂ポリペプチドとを含むポリペプチドをコードするものである、請求項５０から５５のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  57. 異種ポリヌクレオチドが、ＨＩＶプロテアーゼをコードするコード領域をさらに含み、また異種ポリヌクレオチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ’－ペイロード分子１－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ＨＩＶプロテアーゼ－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ペイロード分子２－Ｃ’を含むポリペプチドをコードするコード領域を含む、請求項５３に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  58. 異種ポリヌクレオチドが、第三のペイロード分子をコードするコード領域をさらに含み、また異種ポリヌクレオチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
    Ｎ’－ペイロード分子１－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ＨＩＶプロテアーゼ－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ペイロード分子２－ＨＩＶプロテアーゼ部位－ペイロード分子３－Ｃ’を含むポリペプチドをコードするコード領域を含む、請求項５７に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  59. 当該コードされたポリペプチドのＣ末端に開裂ポリペプチドをさらに含む、請求項５６～５８のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  60. ペイロード分子が、蛍光タンパク質、酵素、サイトカイン、ケモカイン、抗原、細胞表面受容体に結合することができる抗原結合分子、および細胞表面受容体に対するリガンドから選択される、請求項４８～５９のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  61. 前記ペイロード分子が、
    ａ）ＩＦＮγ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、およびＩＬ－３６γを含む一つ以上のサイトカイン、
    ｂ）ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、およびＣＣＬ２１を含む一つ以上のケモカイン、
    ｃ）抗－ＰＤ１－ＶＨＨ－Ｆｃ抗体、抗－ＣＤ４７－ＶＨＨ－Ｆｃ抗体、および抗－ＴＧＦβ－ＶＨＨ（またはｓｃＦｖ）－Ｆｃ抗体を含む一つ以上の抗体、
    ｄ）ＤＬＬ３およびエフェクター細胞標的抗原と結合する二部位ポリペプチドと、ＦＡＰおよびエフェクター細胞標的抗原と結合する二部位ポリペプチドと、ＥｐＣＡＭおよびエフェクター細胞標的抗原と結合する二部位ポリペプチドとを含む、一つ以上の二部位ポリペプチド、
    ｅ）サバイビン、ＭＡＧＥファミリータンパク質、および表６に記載のすべての抗原を含む一つ以上の腫瘍関連抗原、
    ｆ）一つ以上の腫瘍新生抗原、
    ｇ）ＭＨＣ－ペプチド抗原複合体に結合する一つ以上の二部位ポリペプチド、
    ｈ）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＵＬ２７／糖タンパク質Ｂ／ｇＢ、ＨＳＶ ＵＬ５３／糖タンパク質Ｋ／ｇＫ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質、ＦＡＳＴｐ１５、ＶＳＶ－Ｇ、シンシチン（ｓｙｎｃｉｔｉｎ）－１（ヒト内在性レトロウイルス－Ｗ（ＨＥＲＶ－Ｗ）由来）またはシンシチン－２（ＨＥＲＶＦＲＤＥ１由来）、パラミクソウイルスＳＶ５－Ｆ、はしかウイルス－Ｈ、はしかウイルス－Ｆ、および例えばテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、メーソン－ファイザーモンキーウイルス（ＭＰＭＶ）およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）等であり、任意でＲ膜貫通ペプチドが除去されている（Ｒ－バージョン）、レトロウイルスまたはレンチウイルス由来の糖タンパク質を含む一つ以上の膜融合性タンパク質、
    ｉ）ＩＬ１５Ｒ、ＰＧＤＨ、ＡＤＡ、ＡＤＡ２、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＣＨＩＰＳ、ＭＬＫＬ（またはその４ＨＢドメインのみ）、ＧＳＤＭＤ（またはそのＬ１９２Ａ変異体、またはそのアミノ酸１～２３３断片、またはＬ１９２Ａ変異を有するそのアミノ酸１～２３３断片）、ＧＳＤＭＥ（またはそのアミノ酸１～２３７断片）、ＨＭＧＢ１（またはそのボックスＢドメインのみ）、メリチン（例えば、アルファ－メリチン）、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ（またはそのアミノ酸５６～２３９断片）、ヘビＬＡＡＯ、ヘビディスインテグリン、レプチン、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ガスダーミンＤまたはその切断、およびガスダーミンＥまたはその切断、を含む一つ以上の他のペイロード分子、
    ｊ）デングウイルス、チクングニヤウイルス、ヒト結核菌、ヒト免疫不全ウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、コロナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、トガウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、および動物ウイルス（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖｉｒｕｓ）を含む、病原体由来の一つ以上の抗原、または
    ｋ）それらの任意の組み合わせ、から選択される、請求項４８から５９のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  62. 二つ以上のペイロード分子が、蛍光タンパク質、酵素、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体に結合することができる抗原結合分子、および細胞表面受容体に対するリガンドからなる群から選択される、請求項４９～５９のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  63. 異種ポリヌクレオチドが、
    ａ．ＩＬ－２およびＩＬ－３６γ、
    ｂ．ＣＸＣＬ１０ならびにＦＡＰおよびＣＤ３に結合する抗原結合分子、
    ｃ．ＩＬ－２ならびにＤＬＬ３およびＣＤ３に結合する抗原結合分子、
    ｄ．ＩＬ－３６γならびにＤＬＬ３およびＣＤ３に結合する抗原結合分子、または
    ｅ．ＩＬ－２、ＩＬ－３６γならびにＤＬＬ３およびＣＤ３に結合する抗原結合分子、を含む二つ以上のペイロード分子をコードする、請求項４９から５９のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  64. 一つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含むマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）カセットをさらに含む、請求項１～６３のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  65. 一つ以上のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２１９、ｍｉＲ－２１９ａ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－１３７、およびｍｉＲ－１２６を含む、請求項６４に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  66. ５’から３’方向に、プロモーター配列、５’結合部開裂配列、請求項１～６５のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチド配列、および３’結合部開裂配列を含む、組換えＤＮＡ分子。
  67. プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列である、請求項６６に記載の組換えＤＮＡ分子。
  68. ５’結合部開裂配列がリボザイム配列であり、また３’結合部開裂配列がリボザイム配列である、請求項６６または６７に記載の組換えＤＮＡ分子。
  69. ５’リボザイム配列が、ハンマーヘッド型リボザイム配列であり、また３’リボザイム配列が、デルタ型肝炎ウイルスリボザイム配列である、請求項６８に記載の組換えＤＮＡ分子。
  70. ５’結合部開裂配列がリボザイム配列であり、また３’結合部開裂配列が制限酵素認識配列である、請求項６６または６７に記載の組換えＤＮＡ分子。
  71. ５’リボザイム配列が、ハンマーヘッド型リボザイム配列、ピストル型リボザイム配列、または改変されたピストル型リボザイム配列である、請求項７０に記載の組換えＤＮＡ分子。
  72. ３’制限酵素認識配列が、タイプＩＩＳ制限酵素認識配列である、請求項７０または７１に記載の組換えＤＮＡ分子。
  73. タイプＩＩＳ認識配列が、ＳａｐＩ認識配列である、請求項７２に記載の組換えＤＮＡ分子。
  74. ５’結合部開裂配列がＲＮＡｓｅＨプライマー結合配列であり、また３’結合部開裂配列が制限酵素認識配列である、請求項６６または６７に記載の組換えＤＮＡ分子。
  75. 請求項６６～７４のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子のインビトロ転写、および結果として生じる組換えＲＮＡレプリコンの精製を含む、請求項１～６５のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコンを産生する方法。
  76. 有効量の請求項１～６５のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコンおよび哺乳類対象への投与に適した担体を含む、組成物。
  77. 請求項１～６５のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコンを含む、ベクター。
  78. ベクターがウイルスベクターである、請求項７７に記載のベクター。
  79. ベクターが非ウイルスベクターである、請求項７７に記載のベクター。
  80. 請求項１～６５のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコンを含む、粒子。
  81. 当該粒子が、ナノ粒子、エクソソーム、リポソーム、およびリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）からなる群から選択される、請求項８０に記載の粒子。
  82. ナノ粒子が、カチオン性脂質、一つ以上のヘルパー脂質、およびリン脂質－ポリマーコンジュゲートを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項８１に記載の粒子。
  83. カチオン性脂質が、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＬＣ（旧名：ＳＳ－１８／４ＰＥ－１３）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ（旧名：ＳＳ－３３／４ＰＥ－１５）、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＰ、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオアート（Ｌ－３１９）、またはＮ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）から選択される、請求項８２に記載の粒子。
  84. ヘルパー脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびコレステロールから選択される、請求項８２または８３に記載の粒子。
  85. カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、また中性脂質が、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項８２に記載の粒子。
  86. ＰＥＧ脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＰＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、および１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）から選択される、請求項８２～８５のいずれか一項に記載の粒子。
  87. ＰＥＧ脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－５０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジパルミトイル－ｒａｃ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－５０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ５Ｋ）、および１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）から選択される、請求項８２～８６のいずれか一項に記載の粒子。
  88. カチオン性脂質が、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣを含むものであり、一つ以上のヘルパー脂質が、コレステロール（Ｃｈｏｌ）およびＤＳＰＣを含み、またリン脂質－ポリマーコンジュゲートが、ＤＰＧ－ＰＥＧ２０００を含む、請求項８２に記載の粒子。
  89. ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄであり、式中、
    ａ．Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～２５％、Ｃ＝２０％～３０％、およびＤ＝０％～３％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
    ｂ．Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝２０％～２５％、Ｃ＝２５％～３０％、およびＤ＝０％～１％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
    ｃ．Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２０％～４５％、およびＤ＝０％～３％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
    ｄ．Ａ＝４０％～６０％、Ｂ＝１０％～３０％、Ｃ＝２５％～４５％、およびＤ＝０％～３％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
    ｅ．Ａ＝４５％～５５％、Ｂ＝１０％～２０％、Ｃ＝３０％～４０％、およびＤ＝１％～２％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
    ｆ．Ａ＝４５％～５０％、Ｂ＝１０％～１５％、Ｃ＝３５％～４０％、およびＤ＝１％～２％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
    ｇ．Ａ＝４５％～６５％、Ｂ＝５％～２０％、Ｃ＝２０％～４５％、およびＤ＝０％～３％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
    ｈ．Ａ＝５０％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４５％、およびＤ＝０％～３％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
    ｉ． Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１５％、Ｃ＝３０％～４０％、およびＤ＝１％～２％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％、
    ｊ．Ａ＝５５％～６０％、Ｂ＝５％～１０％、Ｃ＝３０％～３５％、およびＤ＝１％～２％であり、且つ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である、請求項８８に記載の粒子。
  90. ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）が、
    ａ．約４９：２２：２８．５：０．５、
    ｂ．約４９：１１：３８．５：１．５、または
    ｃ．約５８：７：３３．５：１．５である、請求項８８に記載の粒子。
  91. ＳＳ－ＯＣ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＧ－ＰＥＧ２Ｋの比（総脂質含量の百分率として）が、約４９：２２：２８．５：０．５である、請求項８８に記載の粒子。
  92. カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、また中性脂質が、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項８２に記載の粒子。
  93. ＰＥＧ脂質であって、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）であるＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項８２または９２に記載の粒子。
  94. 腫瘍崩壊ウイルスをコードする第二の組換えＲＮＡ分子をさらに含む、請求項８０から９３のいずれか一項に記載の粒子。
  95. 腫瘍崩壊ウイルスがピコルナウイルスである、請求項９４に記載の粒子。
  96. ピコルナウイルスが、セネカウイルス（ｓｅｎｅｃａｖｉｒｕｓ）、カルジオウイルス、およびエンテロウイルスから選択される、請求項９５に記載の粒子。
  97. ピコルナウイルスが、セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）である、請求項９５に記載の粒子。
  98. ピコルナウイルスが、コクサッキーウイルスである、請求項９５に記載の粒子。
  99. ピコルナウイルスが、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）である、請求項９５に記載の粒子。
  100. 請求項８２～９９のいずれか一項に記載の複数の脂質ナノ粒子を含む、治療組成物。
  101. 複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約１２０ｎｍの平均サイズを有する、請求項１００に記載の治療組成物。
  102. 複数のＬＮＰが、約１００ｎｍの平均サイズを有する、請求項１００に記載の治療組成物。
  103. 複数のＬＮＰが、約２０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約１０ｍＶ～約－１０ｍＶ、約５ｍＶ～約－５ｍＶ、または約２０ｍＶ～約－４０ｍＶ、－５０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約－４０ｍＶ～約－２０ｍＶ、または約－３０ｍＶ～約－２０ｍＶの平均ゼータ電位を有する、請求項１００～１０２のいずれか一項に記載の治療組成物。
  104. 複数のＬＮＰが、約－３０ｍＶ、約－３１ｍＶ、約－３２ｍＶ、約－３３ｍＶ、約－３４ｍＶ、約－３５ｍＶ、約－３６ｍＶ、約－３７ｍＶ、約－３８ｍＶ、約－３９ｍＶ、または約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する、請求項１０３に記載の治療組成物。
  105. がん細胞を死滅させる方法であって、請求項８０～９７のいずれか一項に記載の粒子、請求項７７～７９のいずれか一項に記載のベクター、請求項１～６５のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン、またはその組成物に、がん細胞を曝露することを含む、方法。
  106. 当該方法が、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで実施される、請求項１０５に記載の方法。
  107. 対象においてがんを治療する方法であって、請求項８０～９７のいずれか一項に記載の粒子、請求項７７～７９のいずれか一項に記載のベクター、請求項１～６５のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン、またはその組成物の有効量を、前記がんに罹患している前記対象に投与することを含む、方法。
  108. 粒子、組換え型ＲＮＡレプリコンまたはその組成物が、静脈内、鼻腔内、吸入剤として投与されるか、または腫瘍に直接注射される、請求項１０７に記載の方法。
  109. 粒子、組換えＲＮＡレプリコン、またはその組成物が、前記対象に繰り返し投与される、請求項１０７または１０８に記載の方法。
  110. 前記対象が、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、非ヒト霊長類、またはヒトである、請求項１０７～１０９のいずれかに記載の方法。
  111. 前記がんが、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、前立腺がん、精巣がん、結腸直腸がん、結腸がん、膵がん（例えば、去勢抵抗性神経内分泌前立腺がん）、肝がん、胃がん、頭頸部がん、甲状腺がん、悪性神経膠腫、膠芽腫、黒色腫、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、肉腫、神経芽腫、神経内分泌がん、横紋筋肉腫、髄芽腫、膀胱がん、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、メルケル細胞がん、および腎細胞がんから選択される、請求項１０７～１１０のいずれか一項に記載の方法。

  112. ａ．前記肺がんが、小細胞肺がんまたは非小細胞肺がんであり、
    ｂ．肝がんが、肝細胞がん（ＨＣＣ）であり、および／または
    ｃ．前立腺がんが、治療下で発現した神経内分泌前立腺がんである、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記がんが、神経内分泌がんである、請求項１１１に記載の方法。
  114. 疾患に対して対象を免疫化する方法であって、請求項８０～９７のいずれか一項に記載の粒子、請求項７７～７９のいずれか一項に記載のベクター、請求項１～６５のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン、またはその組成物の有効量を、前記対象に投与することを含む、方法。
  115. 粒子、組換えＲＮＡレプリコンまたはその組成物が、静脈内に、筋肉内に、皮内に、鼻腔内に、または吸入剤として投与される、請求項１１４に記載の方法。
  116. 粒子、組換えＲＮＡレプリコン、またはその組成物が、前記対象に繰り返し投与される、請求項１１４または１１５に記載の方法。
  117. 前記疾患が、感染症である、請求項１１４から１１６のいずれか一項に記載の方法。
  118. 当該感染症が、デングウイルス、チクングニヤウイルス、ヒト結核菌、ヒト免疫不全ウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、コロナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、トガウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、および動物ウイルス（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖｉｒｕｓ）を含む病原体のうちのひとつに起因する、請求項１１７に記載の方法。
  119. ピコルナウイルスゲノムおよび異種ポリヌクレオチドを含む、組換えＲＮＡレプリコン。
  120. 前記異種ポリヌクレオチドが、２Ａコード領域と２Ｂコード領域との間に挿入される、請求項0に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  121. 異種ポリヌクレオチドが、５’ＵＴＲと２Ａコード領域との間に挿入される、請求項0に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  122. 異種ポリヌクレオチドが、３Ｄコード領域と３’ＵＴＲとの間に挿入される、請求項１１９に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
  123. 前記ピコルナウイルスが、セネカウイルス、カルジオウイルス、およびエンテロウイルスから選択される、請求項１１９～１２２のいずれか一項に記載の組換えＲＮＡレプリコン。
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