JP2022507269A - カプセル化ポリヌクレオチド及び使用方法 - Google Patents

カプセル化ポリヌクレオチド及び使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、複製可能なウイルスゲノムをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに関し、ポリヌクレオチドは、非ウイルス送達ビヒクルによって細胞に導入されると、複製可能なウイルスを産生することができる。本開示はさらに、ポリヌクレオチドのカプセル化、ならびにがんの治療及び予防のためのポリヌクレオチド及び／または粒子の使用に関する。本開示は、自己複製ポリヌクレオチドをコードするＤＮＡポリヌクレオチド、ならびに関連する組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、複製可能なウイルスゲノムをコードする核酸配列を含み、ポリヌクレオチドは、非ウイルス送達ビヒクルによって細胞に導入されると、複製可能なウイルスを産生することができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月１３日に出願された米国仮出願第６２／７６０，４２２号の優先権を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書への参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＯＮＣＲ＿０１４＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは２３ＫＢであり、２０１９年１１月１３日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
技術分野
本開示は概して、免疫学、炎症、及びがん治療の分野に関する。より詳細には、本開示は、複製可能なウイルスゲノムをコードする粒子をカプセル化したポリヌクレオチドに関する。本開示はさらに、がんなどの増殖性障害の治療及び予防に関する。
腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に感染して溶解することができる溶解性ライフサイクルを備えた複製可能なウイルスである。直接的な腫瘍細胞溶解は、細胞死をもたらすだけでなく、局所的な抗原提示細胞によって取り込まれ提示される腫瘍抗原に指向する適応免疫応答の生成ももたらす。したがって、腫瘍溶解性ウイルスは、直接的な細胞溶解、及びウイルスクリアランス後の抗腫瘍応答を維持できる抗原特異的適応応答の促進の両方を通じて、腫瘍細胞成長に対抗する。
しかしながら、複製可能なウイルスの臨床使用は、いくつかの課題を提示する。一般に、ウイルス曝露は自然免疫経路を活性化し、幅広い非特異的な炎症応答を引き起こす。患者が以前にウイルスに曝露されていない場合、この最初の自然免疫応答は、適応性抗ウイルス応答の発生及び中和抗体の産生につながり得る。患者が以前にウイルスに曝露されている場合、既存の中和抗ウイルス抗体が、所望される溶解効果を妨げ得る。どちらの場合も、中和抗体の存在は、標的細胞のウイルス溶解を妨げるだけでなく、ウイルス治療の再投与を無効にする。これらの要因は、転移性がんの治療におけるウイルス治療の使用を制限し、かかるがんの治療に必要な繰り返し全身投与の有効性が、自然に発生する抗ウイルス応答によって妨げられるためである。かかる障害の非存在下でさえ、非疾患性細胞におけるその後のウイルス複製は、周囲の細胞及び組織への実質的な疾患外の付随的損傷をもたらし得る。
複製可能なウイルスの治療的使用に関連する組成物及び方法について、当技術分野において長い間感じられてきた満たされていない必要性が残存する。本開示は、かかる組成物及び方法などを提供する。
本開示は、自己複製ポリヌクレオチドをコードするＤＮＡポリヌクレオチド、ならびに関連する組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、複製可能なウイルスゲノムをコードする核酸配列を含み、ポリヌクレオチドは、非ウイルス送達ビヒクルによって細胞に導入されると、複製可能なウイルスを産生することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であって、複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子を含み、ポリヌクレオチド配列が、哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）と結合できるプロモーター配列と作動可能に連結され、３’接合部切断配列及び５’接合部切断配列と隣接し、３’及び５’接合部切断配列が、異なる種類であり、複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドが、非ウイルスの起源である、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を提供する。
いくつかの実施形態では、３’接合部切断配列が、リボザイム配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される。いくつかの実施形態では、３’接合部切断配列が、リボザイム配列であり、５’接合部切断配列が、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列である。いくつかの実施形態では、３’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列であり、５’接合部切断配列が、リボザイム配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される。いくつかの実施形態では、３’接合部切断配列が、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、リボザイム配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される。いくつかの実施形態では、３’接合部切断配列が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、リボザイム配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される。いくつかの実施形態では、３’接合部切断配列が、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、リボザイム配列、及びアプタザイム配列から選択される。いくつかの実施形態では、３’接合部切断配列が、アプタザイム配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びリボザイム配列から選択される。
いくつかの実施形態では、複製可能なウイルスゲノムが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスが、ポジティブセンス（（＋）センス）またはネガティブセンス（（－）センス）ｓｓＲＮＡウイルスである。いくつかの実施形態では、複製可能なウイルスゲノムが、（＋）センスｓｓＲＮＡウイルスであり、（＋）センスｓｓＲＮＡウイルスが、ピコルナウイルスである。いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスが、Ｓｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルス（ＳＶＶ）またはＣｏｘｓａｃｋｉｅウイルスである。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰを細胞と接触させると、細胞によるウイルス粒子の産生がもたらされ、ウイルス粒子が、感染性及び溶解性である。
いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子が、外因性ペイロードタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、外因性ペイロードタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含む。
いくつかの実施形態では、外因性ペイロードタンパク質が、蛍光タンパク質、酵素タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体のリガンド、または細胞表面受容体と結合することができる抗原結合分子である。いくつかの実施形態では、サイトカインが、ＩＬ－１８、ＩＬ－３６γ、ＬＩＧＨＴ、及びＩＬ－２から選択される。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体のリガンドが、Ｆｌｔ３リガンドである。いくつかの実施形態では、ケモカインが、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４から選択される。
いくつかの実施形態では、抗原結合分子が、免疫チェックポイント受容体と結合して阻害することができる。一実施形態では、免疫チェックポイント受容体が、ＰＤ１である。いくつかの実施形態では、抗原結合分子が、ＤＬＬ３、ＥｐＣａｍ、及びＣＥＡから選択される腫瘍関連抗原と結合することができる。いくつかの実施形態では、抗原結合分子が、腫瘍抗原に特異的な第１のドメイン及びＴ細胞表面分子に特異的な第２のドメインを含む、二重特異性Ｔ細胞会合分子である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ３である。
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）カセットが、複製可能なウイルスゲノムをコードする核酸配列に挿入され、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、細胞内の対応するｍｉＲＮＡのうちの１つ以上の発現が、細胞内の複製可能なウイルスゲノムの複製を阻害する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２１９、ｍｉＲ－２１９ａ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－１３７、及びｍｉＲ－１２６から選択される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む。
いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子が、複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドである。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、カチオン性脂質、コレステロール、及び中性脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、中性脂質が、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、リン脂質－ポリマー複合体をさらに含み、リン脂質－ポリマー複合体が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）である。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質が、Ｄ－Ｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）であり、中性脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）のリン脂質－ポリマー複合体をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ヒアルロナンが、ＬＮＰの表面と複合される。いくつかの実施形態では、ＲＧＤペプチドが、ＬＮＰの表面と複合される。
いくつかの実施形態では、本開示は、請求項１～３７のいずれか１項に記載の複数の脂質ナノ粒子を含み、複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約５００ｎｍの平均サイズを有する、治療用組成物を提供する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４００ｎｍ～約５００ｎｍ、約４２５ｎｍ～約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ～約５００ｎｍ、または約４７５ｎｍ～約５００ｎｍの平均サイズを有する。
いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約－２０ｍＶ未満、約－３０ｍＶ未満、約３５ｍＶ未満、または約－４０ｍＶ未満の平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約－５０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約－４０ｍＶ～約－２０ｍＶ、または約－３０ｍＶ～約－２０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰが、約－３０ｍＶ、約－３１ｍＶ、約－３２ｍＶ、約－３３ｍＶ、約－３４ｍＶ、約－３５ｍＶ、約－３６ｍＶ、約－３７ｍＶ、約－３８ｍＶ、約－３９ｍＶ、または約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。
いくつかの実施形態では、治療用組成物を対象に投与すると、組換えＤＮＡポリヌクレオチドが対象の標的細胞に送達され、組換えＤＮＡポリヌクレオチドが、対象の標的細胞を溶解することができる感染性ウイルスを産生する。いくつかの実施形態では、組成物が、静脈内または腫瘍内に送達される。いくつかの実施形態では、標的細胞が、がん性細胞である。
いくつかの実施形態では、本開示は、がん性腫瘍の成長を阻害する方法であって、それを必要とする対象において、本明細書に記載の治療用組成物をそれを必要とする対象に投与することを含み、組成物の投与が、腫瘍の成長を阻害する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、投与が、腫瘍内または静脈内である。いくつかの実施形態では、がんが、肺癌または肝臓癌である。
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えＤＮＡ分子であって、複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ポリヌクレオチド配列が、哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）と結合できるプロモーター配列と作動可能に連結され、３’接合部切断配列及び５’接合部切断配列と隣接し、３’及び５’接合部切断配列が、異なる種類であり、複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドが、非ウイルスの起源である、組換えＤＮＡ分子を提供する。
いくつかの実施形態では、３’接合部切断配列が、リボザイム配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される。いくつかの実施形態では、３’接合部切断配列が、リボザイム配列であり、５’接合部切断配列が、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列である。いくつかの実施形態では、３’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列であり、５’接合部切断配列が、リボザイム配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される。いくつかの実施形態では、３’接合部切断配列が、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、リボザイム配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される。いくつかの実施形態では、３’接合部切断配列が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、リボザイム配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される。いくつかの実施形態では、３’接合部切断配列が、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、リボザイム配列、及びアプタザイム配列から選択される。いくつかの実施形態では、３’接合部切断配列が、アプタザイム配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びリボザイム配列から選択される。
いくつかの実施形態では、コードされたウイルスが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである。いくつかの実施形態では、ｓｓＲＮＡウイルスが、ポジティブセンス（（＋）センス）またはネガティブセンス（（－）センス）ｓｓＲＮＡウイルスである。いくつかの実施形態では、（＋）センスｓｓＲＮＡウイルスが、ピコルナウイルスである。いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスが、Ｓｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルス（ＳＶＶ）またはＣｏｘｓａｃｋｉｅウイルスである。
いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子が、非ウイルス送達ビヒクルによって細胞に導入されると、感染性の溶解性ウイルスを産生することができる。
いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子が、外因性ペイロードタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、外因性ペイロードタンパク質が、蛍光タンパク質、酵素タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体のリガンド、または細胞表面受容体と結合することができる抗原結合分子である。
いくつかの実施形態では、サイトカインが、ＩＬ－１８、ＩＬ－３６γ、ＬＩＧＨＴ、及びＩＬ－２である。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体のリガンドが、Ｆｌｔ３リガンドである。いくつかの実施形態では、ケモカインが、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４から選択される。いくつかの実施形態では、抗原結合分子が、免疫チェックポイント受容体と結合して阻害することができる。一実施形態では、免疫チェックポイント受容体が、ＰＤ１である。いくつかの実施形態では、抗原結合分子が、ＤＬＬ３、ＥｐＣａｍ、及びＣＥＡから選択される腫瘍関連抗原と結合することができる。いくつかの実施形態では、抗原結合分子が、腫瘍抗原に特異的な第１のドメイン及びＴ細胞表面分子に特異的な第２のドメインを含む、二重特異性Ｔ細胞会合分子である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ３である。
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）カセットが、複製可能なウイルスゲノムをコードする核酸配列に挿入され、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、細胞内の対応するｍｉＲＮＡのうちの１つ以上の発現が、細胞内のコードされたウイルスの複製を阻害する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２１９、ｍｉＲ－２１９ａ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－１３７、及びｍｉＲ－１２６から選択される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子が、複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドまたはＮａｎｏＶである。
ポリヌクレオチドゲノムが由来し得る多様な種類のＤＮＡまたはＲＮＡウイルスの例を示す。 自己複製ポリヌクレオチドがカプセル化されたグリコサミノグリカン（ＣＡＧ）ヒアルロナン（ＨＡ）でコーティングされた脂質系ナノ粒子の例を示す。 腫瘍を標的としたナノ粒子にカプセル化された自己複製ポリヌクレオチドによるがんの治療の例を示す。 トランスで発現されるＲｅｐ５２及びＲｅｐ７８を有する５’及び３’ＩＴＲを含む自己複製ウイルスゲノム（図４Ａ）、ならびに内部Ｒｅｐカセットを有する５’及び３’ＩＴＲを含む自己複製ウイルスゲノム（図４Ｂ）の増殖のための複製ＨＳＶベクターの例を示す。ｇＢ：ＮＴ＝ｇＢ遺伝子におけるウイルス侵入を増強する二重変異；ＢＡＣ＝ｌｏｘＰと隣接するクロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列；Δ接合＝ＩＣＰ４遺伝子の１つのコピーを含む完全な内部反復領域の欠失；ＩＴＲ＝ＡＡＶ由来の逆位末端配列；Ｐｏｌ ＩＩｐ＝構成的ＰｏｌＩＩプロモーター；Ｒｅｐカセット＝ＩＴＲと隣接するウイルスゲノムＤＮＡの複製のためのＡＡＶ Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ７８をコードするカセット；任意でｍｉＲＮＡ減衰が斜めに細切れにされたボックスで示される。 トランスで発現されるＲｅｐ５２及びＲｅｐ７８を有する５’及び３’ＩＴＲを含む自己複製ポリヌクレオチド（図５Ａ）、ならびに内部Ｒｅｐカセットを有する５’及び３’ＩＴＲを含む自己複製ウイルスゲノム（図５Ｂ）の増殖のための非複製ＨＳＶベクターの例を示す。ｇＢ：ＮＴ＝ｇＢ遺伝子におけるウイルス侵入を増強する二重変異；ＢＡＣ＝ｌｏｘＰと隣接するクロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列；Δ接合＝ＩＣＰ４遺伝子の１つのコピーを含む完全な内部反復領域の欠失；ＩＴＲ＝ＡＡＶ由来の逆位末端配列；Ｐｏｌ ＩＩｐ＝構成的ＰｏｌＩＩプロモーター；Ｒｅｐカセット＝ＩＴＲと隣接するウイルスゲノムＤＮＡの複製のためのＡＡＶ Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ７８をコードするカセット；任意でｍｉＲＮＡ減衰が斜めに細切れにされたボックスで示される。 ポジティブ鎖ＲＮＡポリオウイルスＩ型ゲノムをコードするポリヌクレオチドの図を示す。ポリヌクレオチドは、任意選択で、ＡＡＶ由来のＩＴＲが５’及び３’末端と隣接し得る（図６Ａ及び図６Ｂ）。ポリヌクレオチドは、任意選択で、ｍｉＲＮＡ減衰のための１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列カセット（ｍｉＲ－ＴＳカセット）を含み得る（図６Ｂ）。 ポリオウイルスＩ型ゲノムをコードする自己複製ポリヌクレオチドの生産のための複製ＨＳＶベクターの例を示す。ポリオウイルスのゲノムは、任意選択で、ｍｉＲＮＡ減衰のためのｍｉＲＮＡ標的部位を含み得る（斜めに細切れにされたボックスで示される）。図７Ｂは、ＡＡＶ由来のＩＴＲが５’及び３’末端と隣接するポリオウイルスＩ型ゲノムをコードする自己複製ポリヌクレオチドを産生するための複製ＨＳＶベクターを示す。ｇＢ：ＮＴ＝ｇＢ遺伝子におけるウイルス侵入を増強する二重変異；ＢＡＣ＝ｌｏｘＰと隣接するクロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列；ΔＵＬ１９＝主要なカプシドタンパク質であるＶＰ５をコードするＵＬ１９遺伝子の欠失；Δ接合＝ＩＣＰ４遺伝子の１つのコピーを含む完全な内部反復領域の欠失；Ｐｏｌ ＩＩｐ＝構成的ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロモーター；Ｒｅｐカセット＝ＩＴＲと隣接するウイルスゲノムＤＮＡの複製のためのＡＡＶ Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ７８をコードするカセット；ポリオウイルスゲノムカセット＝ＨＳＶゲノムの遺伝子間座位に挿入され、さらに転写によって産生される鎖ゲノム；任意でｍｉＲＮＡ減衰が斜めに細切れにされたボックスで示される。 非小細胞肺癌（図８Ａ）、肝細胞癌腫（図８Ｂ）、及び前立腺癌（図８Ｃ）などの特定のがんの治療のためのポリオウイルスＩ型ポリヌクレオチドゲノムの例を示す。 非小細胞肺癌（図８Ａ）、肝細胞癌腫（図８Ｂ）、及び前立腺癌（図８Ｃ）などの特定のがんの治療のためのポリオウイルスＩ型ポリヌクレオチドゲノムの例を示す。 非小細胞肺癌（図８Ａ）、肝細胞癌腫（図８Ｂ）、及び前立腺癌（図８Ｃ）などの特定のがんの治療のためのポリオウイルスＩ型ポリヌクレオチドゲノムの例を示す。 水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）ゲノムをコードする自己複製ポリヌクレオチドの例を示す。ポリヌクレオチドは、任意選択で、ＡＡＶ由来のＩＴＲが５’及び３’末端と隣接し得る（図９Ｂ）。ポリヌクレオチドは、任意選択で、ｍｉＲＮＡ減衰のための１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得、斜めに細切れにされたボックスで示される（図９Ｂ）。 ＶＳＶゲノムポリヌクレオチドゲノムの産生のための複製ＨＳＶベクターの例を示す。ＶＳＶゲノムは、任意選択で、ｍｉＲＮＡ減衰のためのｍｉＲＮＡ標的部位を含み得る（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。図１０Ｂは、ＡＡＶ由来のＩＴＲが５’及び３’末端と隣接するＶＳＶゲノムを産生するための複製ＨＳＶベクターを示す。ｇＢ：ＮＴ＝ｇＢ遺伝子におけるウイルス侵入を増強する二重変異；ＢＡＣ＝ｌｏｘＰと隣接するクロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列；Δ接合＝ＩＣＰ４遺伝子の１つのコピーを含む完全な内部反復領域の欠失；ΔＵＬ１９＝主要なカプシドタンパク質であるＶＰ５をコードするＵＬ１９遺伝子の欠失；ＶＳＶゲノムカセット＝ＨＳＶゲノムの遺伝子間座位に挿入されたネガティブ鎖ＶＳＶゲノム及び必須ＶＳＶ遺伝子の転写のための双方向性Ｐｏｌ ＩＩプロモーター（ＢＤ Ｐｏｌ ＩＩｐ）を有する必須ＶＳＶ遺伝子、Ｎ、Ｐ、及びＬをコードするアンチゲノム（ネガティブ鎖）ＶＳＶゲノム及び哺乳類発現カセット；任意でｍｉＲＮＡ減衰が斜めに細切れにされたボックスで示される；Ｒｅｐカセット＝ＩＴＲと隣接するウイルスゲノムＤＮＡの複製のためのＡＡＶ Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ７８をコードするカセット；Ｐｏｌ ＩＩｐ＝構成的ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロモーター。 肝細胞癌腫（図１１Ａ）、前立腺癌（図１１Ｂ）、及び非小細胞肺癌（図１１Ｃ）などの特定のがんの治療のためのＶＳＶポリヌクレオチドゲノムの例を示す。 肝細胞癌腫（図１１Ａ）、前立腺癌（図１１Ｂ）、及び非小細胞肺癌（図１１Ｃ）などの特定のがんの治療のためのＶＳＶポリヌクレオチドゲノムの例を示す。 肝細胞癌腫（図１１Ａ）、前立腺癌（図１１Ｂ）、及び非小細胞肺癌（図１１Ｃ）などの特定のがんの治療のためのＶＳＶポリヌクレオチドゲノムの例を示す。 アデノウイルスポリヌクレオチドゲノムの例を示す。ＡＡＶゲノムは、任意選択で、ｍｉＲＮＡ減衰のためのｍｉＲＮＡ標的部位を含み得、斜めに細切れにされたボックスで示される（図１２Ｂ）。 肝細胞癌腫（図１３Ａ）、前立腺癌（図１３Ｂ）、及び非小細胞肺癌（図１３Ｃ）などの特定のがんの治療のためのＡＡＶポリヌクレオチドゲノムの例を示す。 ＣＶＢ３ウイルスゲノムの概略図を示す。ＣＶＢ３は、ゲノムサイズが約７．４ｋｂの＋センスのｓｓＲＮＡピコルナウイルスである。 ＣｏｘｓａｃｋｉｅウイルスＡ２１構築物の概略図を示す。 Ｓｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルス（ＳＶＶ）構築物の概略図を示す。 ＩＴＲと隣接する腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）ＤＮＡカセット及びＲｅｐカセットを含む組換えＨＳＶ－１、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターを示す。 Ｒｅｐカセット及びＡ／Ｃヘテロ二量体、ＡＰ２１９６７によるＲｅｐ発現の制御を示す。 図１７に示したシステムによって産生されたＮａｎｏＶ構築物の単量体及び二量体を示す。ＮａｎｏＶ単量体及び二量体の構造ならびにサイズを示す。 図１７に示したシステムによって産生されたＮａｎｏＶ構築物の単量体及び二量体を示す。制限酵素消化後の予測される単量体及び二量体のゲル分析を示す。 図１７に示したシステムによって産生されたＮａｎｏＶ構築物の単量体及び二量体を示す。内部ＰＣＲプライマーの位置を含むＮａｎｏＶ構築物の概略図を示す。 図１７に示したシステムによって産生されたＮａｎｏＶ構築物の単量体及び二量体を示す。内部プライマーを使用したＮａｎｏＶのＰＣＲ増幅を示す。 予測される方向でのＮａｎｏＶコンカテマーの産生を示す。ＮａｎｏＶ単量体におけるＡｆｌＩＩ切断部位の位置を示す。 予測される方向でのＮａｎｏＶコンカテマーの産生を示す。ＡｆｌＩＩ切断産物の可能なコンカテマー方向及び予測されるサイズを示す。 予測される方向でのＮａｎｏＶコンカテマーの産生を示す。ＡｆｌＩＩで消化されたＮａｎｏＶ ＤＮＡのゲル分析を示す。 ＮａｎｏＶ ＤＮＡ構築物からのｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す。 ３’及び５’リボザイム配列を含むピコルナウイルス構築物の概略図を示す。 複製可能なＳｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルス（ＳＶＶ）をコードするポリヌクレオチドの設計及び培養プロトコルの概略図を示す。図２３Ａは、哺乳動物の５’及び３’ＵＴＲ配列、ハンマーヘッド型リボザイム、ならびにデルタ肝炎リボザイムを含む、キャップポリアデニル化転写物を示す。図２３Ｂは、感染性ＳＶＶを産生するための培養プロトコルの概略図を示す。 同上。 ＳＶＶ－リボザイム（ＷＴ）及びＳＶＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ－リボザイムをコードするｄｓＤＮＡをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から産生されたウイルスからの単層の溶解を示すクリスタルバイオレット染色を示す。 図２３に示されるＳＶＶ転写物からの３つの異なる外因性ペイロードの発現を示す。図２０Ａは、ｍＣｈｅｒｒｙについての明視野及び蛍光顕微鏡観察を示す。図２０Ｂは、ナノルシフェラーゼアッセイの結果を示す。図２５Ｃは、ＣＸＣＬ１０発現を示す。 同上。 同上。 ＳＶＶをコードするプラスミド構築物のｍｉＲＮＡ減衰を示す。図２６Ａは、ｍｉＲ－１２２及びｍｉＲ－１減衰化ＳＶＶ構築物の概略図を示す。図２６Ｂは、ｍｉＲ－１２２及び／またはｍｉＲ－１模倣物でトランスフェクトされ、図２６Ａに示されるＳＶＶ－ＷＴまたはＳＶＶ－ｍｉＲＴ構築物に感染したＨ１２９９細胞の溶解を示すクリスタルバイオレット染色を示す。 腫瘍内に送達されるＳＶＶをコードするＤＮＡプラスミドによるインビボでの感染性ウイルスの産生及び腫瘍成長の阻害を示す。ＳＶＶをコードするプラスミドの腫瘍内投与後の腫瘍成長の阻害を示す。 腫瘍内に送達されるＳＶＶをコードするＤＮＡプラスミドによるインビボでの感染性ウイルスの産生及び腫瘍成長の阻害を示す。図２７Ａに示される実験から採取された微粉砕した腫瘍からの生ウイルスの単離を示す。 腫瘍内に送達されるＳＶＶをコードするＤＮＡプラスミドによるインビボ発現外因性ペイロードを示す。図２８Ａは、プラスミドＤＮＡの腫瘍内注射後に腫瘍溶解物で検出された平均放射輝度を示す。図２８Ｂは、プラスミドＤＮＡの腫瘍内注射後に腫瘍溶解物で検出されたＣＸＣＬ１０レベルを示す。 静脈内送達後の腫瘍部位へのＳＶＶをコードするプラスミドの送達を示す。 ＬＮＰでカプセル化されたＳＶＶをコードするプラスミドＤＮＡの静脈内送達後の腫瘍成長の阻害を示す。 ＳＶＶをコードするプラスミドのマップを示す。 ＣＶＡ２１をコードするプラスミドのマップを示す。 別々の３’及び５’天然末端を有する＋センスｓｓＲＮＡウイルスゲノムを産生するためのシステムを示す。 別々の３’及び５’天然末端を有する＋センスｓｓＲＮＡウイルスゲノムを産生するためのシステムを示す。 別々の３’及び５’天然末端を有する＋センスｓｓＲＮＡウイルスゲノムを産生するための非対称末端システムを示す。 ５’及び３’リボザイムを有するＳＶＶ（ＳＶＶ ＷＴ－Ｒ）ならびに３’リボザイム及び５’ｓｉＲＮＡ標的配列（５ｓｉＲＮＡ）を有するＳＶＶによるＨ１２９９単層の溶解を示すクリスタルバイオレット染色を示す。 同上。 別々の３’及び５’天然末端を有する＋センスｓｓＲＮＡウイルスゲノムを産生するための非対称末端システムを示す。５’ｓｉＲＮＡ標的配列を標的とするＡｍｉ－ＲＮＡは、３’リボザイムの後、ｂＧＨポリＡターミネーターの前にコードされる。 ５’及び３’リボザイム（ＳＶＶ－ｗｔ）または非対称末端切断システム（３’リボザイム及び５’ａｍｉＲＮＡ標的配列（ａｍｉ－ＳＶＶ））を有するＬＮＰでカプセル化されたＳＶＶをコードするプラスミドＤＮＡの有効性を示す。ＬＮＰでカプセル化されたＳＶＶ－ｗｔまたはａｍｉ－ＳＶＶの腫瘍内投与後のＨ４４６腫瘍成長の阻害を示す。 ５’及び３’リボザイム（ＳＶＶ－ｗｔ）または非対称末端切断システム（３’リボザイム及び５’ａｍｉＲＮＡ標的配列（ａｍｉ－ＳＶＶ））を有するＬＮＰでカプセル化されたＳＶＶをコードするプラスミドＤＮＡの有効性を示す。ＬＮＰでカプセル化されたＳＶＶ－ｗｔまたはａｍｉ－ＳＶＶの腫瘍内投与後のＨ１２９９腫瘍成長の阻害を示す。 ＬＮＰでカプセル化されたＳＶＶをコードするプラスミドＤＮＡ（ＳＶＶ－陰性、ＳＶＶ－ｗｔ、またはＡｍｉ－ＳＶＶ）の静脈内送達後の腫瘍成長の阻害を示す。
当技術分野では、中和抗体の存在下で有効であり、繰り返し全身投与することができ、その複製が疾患性細胞に限定され、したがって正常な非がん性細胞への副次的な損傷を最小限に抑えながら、治療効果を最大化する自己複製ウイルス療法が必要である。本開示は、これらの障害を克服し、脂質ナノ粒子、高分子ナノ粒子、またはエクソソームなどの非免疫原性粒子にカプセル化できる複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、複製可能なウイルスをコードする組換えＤＮＡ分子、ならびに増殖性疾患及び障害（例えば、がん）の治療及び予防のための使用方法を提供する。特定の実施例では、組換えＤＮＡ分子は、治療用分子をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。本開示は、広範囲の増殖性障害（例えば、がん）を治療するのに好適な安全で有効な組換えポリヌクレオチドベクターの全身送達を可能にする。
本明細書で使用された項の見出しは、組織的な目的のためのものにすぎず、記載された主題を限定するものとして解釈されるものではない。特許、特許出願、記事、本、及び論文を含むがこれらに限定されない、本明細書で引用されるすべての文書または文書の一部は、その全体があらゆる目的のために参照により明示的に本明細書に組み込まれる。組み込まれた文書または文書の一部の１つ以上が、出願でのその用語の定義と矛盾する用語を定義している場合、本出願に表示される定義が制御される。しかしながら、本明細書で引用された任意の参考文献、記事、刊行物、特許、特許公開、及び特許出願の言及は、それらが有効な先行技術を構成するか、または世界の任意の国における一般的知識の一部を形成するという認識、または示唆の任意の形態ではなく、そのように受け取られるべきではない。
Ｉ．定義
本明細書では、任意の濃度範囲、割合範囲、比の範囲、または整数範囲は、別段示されない限り、記述された範囲内の任意の整数の値、及び適切な場合には、その分数（整数の１０分の１及び１００分の１など）を含むものと理解されたい。本明細書で使用される「ａ」及び「ａｎ」という用語は、別段示されない限り、列挙された構成要素の「１つ以上」を指すことを理解されたい。代替手段（例えば、「または」）の使用は、代替手段の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は同義語として使用される。本明細書で使用される場合、「複数」は、１つ以上の構成要素（例えば、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列）を指し得る。本出願では、「または」の使用は、別段示されない限り、「及び／または」を意味する。
本出願で使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は、等価物として使用される。本出願で使用される任意の数字は、約／およその有無にかかわらず、関連技術分野の技術者によって認識される任意の通常の変動をカバーすることを意図する。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別途記載のない限りまたは別途内容から明らかでない限り（かかる数が可能な値の１００％を超え得る場合を除く）、述べられた基準値のいずれかの方向（上回るまたは下回る）において、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下に含まれる値の範囲を指す。
「減少する」または「低減する」は、基準値と比較して、少なくとも５％、例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、または１００％の特定の値の減少または低減を指す。特定の値の減少または低減はまた、基準値と比較した値の倍数変化として表すことができ、例えば、基準値と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００倍以上の減少である。
「増加」は、基準値と比較して、少なくとも５％、例えば５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、１００、２００、３００、４００、５００％以上の特定の値の増加を指す。特定の値の増加はまた、基準値と比較した値の倍数変化として表すことができ、例えば、基準値のレベルと比較して、少なくとも１倍、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００倍以上の増加である。
「配列同一性」という用語は、同じであり、同じ相対位置にある２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の塩基またはアミノ酸のパーセンテージを指す。かかるものとして、１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して、特定のパーセンテージの配列同一性を有する。配列比較の場合、通常、１つの配列が基準配列として機能し、試験配列が比較される。「基準配列」という用語は、試験配列が比較される分子を指す。
「相補的」は、天然または非天然に存在する（例えば、上記のように修飾された）塩基（ヌクレオシド）またはその類似体を含む２つの配列間の、塩基スタッキング及び特異的水素結合を介した対形成の能力を指す。例えば、核酸のある位置の塩基が、標的の対応する位置の塩基と水素結合することができる場合、次に塩基は、その位置で互いに相補的であると見なされる。核酸は、普遍的な塩基、または水素結合に正または負の寄与を提供しない不活性な脱塩基スペーサーを含むことができる。塩基対には、標準的なワトソン－クリック塩基対及び非ワトソン－クリック塩基対（例えば、ゆらぎ塩基対とフーグスティーン塩基対）の両方が含まれ得る。相補的塩基対の場合、アデノシン型塩基（Ａ）はチミジン型塩基（Ｔ）またはウラシル型塩基（Ｕ）に相補的であり、シトシン型塩基（Ｃ）はグアノシン型塩基（Ｇ）に相補的であることが理解され、３－ニトロピロールまたは５－ニトロインドールなどの普遍的な塩基は、任意のＡ、Ｃ、Ｕ、またはＴとハイブリダイズし、相補的であると見なされる。Ｎｉｃｈｏｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９４；３６９：４９２－４９３、及びＬｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９４；２２：４０３９－４０４３。イノシン（Ｉ）もまた、当技術分野において普遍的な塩基であると見なされており、任意のＡ、Ｃ、Ｕ、またはＴを相補的であると見なされている。Ｗａｔｋｉｎｓ ａｎｄ ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５；３３ （１９）：６２５８－６２６７を参照されたい。
「発現カセット」または「発現構築物」は、プロモーターと作動可能に連結されたＤＮＡポリヌクレオチド配列を指す。「作動可能に連結された」とは、そのように記載された構成要素が、それらが意図された方法で機能することを可能にする関係にある並置を指す。例えば、プロモーターがポリヌクレオチド配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターはポリヌクレオチド配列に作動可能に連結される。
「対象」という用語は、例えば、哺乳動物などの動物を含む。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、霊長類である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施例では、畜牛、ヒツジ、ヤギ、乳牛、ブタなどの畜産動物、またはイヌ及びネコなどの飼い慣らされた動物である。いくつかの実施形態（例えば、特に研究の文脈において）では、対象は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、または近交系ブタなどのブタである。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用される。
「投与」は、本明細書において、薬剤または組成物を対象に導入することを指す。
本明細書で使用される「治療」は、生理学的結果に影響を与えるために、薬剤または組成物を対象に送達することを指す。いくつかの実施形態では、治療は、細胞の集団を対象に送達することを含む。いくつかの実施形態では、治療は、哺乳動物、例えば、ヒトにおける疾患の治療を指し、（ａ）疾患を阻害すること、すなわち疾患の発症を阻止すること、または疾患の進行を防止すること、（ｂ）疾患を軽減する、すなわち疾患の状態の退行をもたらすこと、（ｃ）疾患を治癒させることを含む。
「有効量」という用語は、特定の生理学的効果をもたらすのに必要な薬剤または組成物の最小量を指す（例えば、特定の生理学的効果を増加、活性化、及び／または増強するのに必要な量）。特定の薬剤の有効量は、質量／体積、細胞数／体積、粒子／体積、（薬剤の質量）／（対象の質量）、細胞数／（対象の質量）、または粒子／（対象の質量）などの薬剤の性質に基づいて、様々な方法で表され得る。特定の薬剤の有効量は、最大有効濃度の半分（ＥＣ５０）として表すこともでき、基準レベル及び最大応答レベルの中間にある特定の生理学的応答の程度をもたらす薬剤の濃度を指す。
細胞の「集団」は、１を超える任意の数の細胞を指すが、好ましくは、少なくとも１ｘ１０３個の細胞、少なくとも１ｘ１０４個の細胞、少なくとも１ｘ１０５個の細胞、少なくとも１ｘ１０６個の細胞、少なくとも１ｘ１０７個の細胞、少なくとも１×１０８個の細胞、少なくとも１×１０９個の細胞、少なくとも１×１０１０個の細胞、またはそれ以上の細胞である。細胞の集団は、インビトロの集団（例えば、培養中の細胞の集団）またはインビボの集団（例えば、特定の組織に存在する細胞の集団）を指し得る。
「エフェクター機能」は、標的細胞または標的抗原に指向する免疫応答の生成、維持、及び／または増強に関連する免疫細胞の機能を指す。
「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」、及び「ｍｉＲ」という用語は、本明細書で互換的に使用され、分解または翻訳抑制のためにそれらの標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を指示することによって遺伝子発現を制御する、約２１～２５ヌクレオチドの長さの小さなノンコーディング内因性ＲＮＡを指す。
本明細書で使用される「組成物」という用語は、対象もしくは細胞に投与または送達することができる、本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチドまたは粒子カプセル化自己複製ポリヌクレオチドの製剤を指す。
本明細書で利用される「薬学的に許容される」という表現は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症のないヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに好適な、安全な医学的判断の範囲内にあり、妥当な利益／リスク比に見合う、化合物、材料、組成物及び／または剤形を指す。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤」には、これらに限定されないが、任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、染料／着色剤、風味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、及び／または乳化剤が含まれ、これは、米国食品医薬品局によって、ヒト及び／または家畜動物での使用が許容されるものとして承認されている。
「自己複製ポリヌクレオチド」という用語は、追加の外因性ポリヌクレオチドまたは外因性ベクターの非存在下で宿主細胞内で複製することができる外因性ポリヌクレオチドを指す。
「複製可能なウイルスゲノム」という用語は、本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチドによってコードされるウイルスゲノムを指し、ウイルス複製及び感染性ウイルス粒子の産生に必要なすべてのウイルス遺伝子をコードする。
「腫瘍溶解性ウイルス」という用語は、がん細胞に優先的に感染するように修飾されているか、または自然に優先的に感染するウイルスを指す。
「ベクター」という用語は、別の核酸分子を輸送または運搬することができる核酸分子を指すために本明細書で使用される。
分子及び細胞生化学の一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ ＆ Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ （Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）、及びＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）などの標準的な教科書内で見つけることができ、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＩＩ．自己複製ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、非ウイルス送達ビヒクルによって細胞に導入されると、感染性の溶解性ウイルスを産生することができる複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を提供する。本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチドは、感染性ウイルスを複製及び産生するために、細胞内に存在する追加の外因性遺伝子またはタンパク質を必要としない。むしろ、宿主細胞内の内因性転写メカニズムは、自己複製ポリヌクレオチドの最初の第１の転写または翻訳を媒介して、複製可能なウイルスゲノムを産生する。自己複製ポリヌクレオチドによってコードされるウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの継続的な複製、及び複製可能なウイルスゲノムを含む感染性ウイルス粒子（カプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、及び／または膜タンパク質を含み得る）への組み立てに必要なウイルスタンパク質を発現することができる。したがって、本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチドによってコードされる複製可能なウイルスゲノムは、宿主細胞に感染することができるウイルスを産生することができる。
いくつかの実施形態では、組換え核酸分子は、複製可能なウイルスゲノムをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、レプリコン、プラスミド、コスミド、ファージミド、トランスポゾン、細菌人工染色体、または酵母人工染色体である。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、自己複製ポリヌクレオチドを含むプラスミドである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、自己複製ポリヌクレオチドの転写を駆動または調節するプロモーターなどの転写制御要素と作動可能に連結される自己複製ポリヌクレオチド（例えば、複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、転写制御要素は、哺乳動物プロモーター配列である。いくつかの実施形態では、哺乳動物プロモーター配列は、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼと結合することができる。例えば、いくつかの実施形態では、哺乳動物プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、哺乳動物プロモーターは、ＣＡＧ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、またはＰＧＫプロモーターなどの構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、転写制御要素は、Ｔ７プロモーターなどのファージ由来のプロモーター配列である。かかる実施形態では、Ｔ７プロモーターの制御下にあるポリヌクレオチドは、細胞のサイトゾルで転写される。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、テトラサイクリン誘導性プロモーター（例えば、ＴＲＥ－Ｔｉｇｈｔ）、ドキシクリン誘導性プロモーター、温度誘導性プロモーター（例えば、Ｈｓｐ７０またはＨｓｐ９０由来プロモーター）、ラクトース誘導性プロモーター（例えば、ｐＬａｃプロモーター）などの誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、転写を調節する１つ以上の転写エンハンサー要素を含む。例えば、いくつかの実施形態では、プロモーターは、１つ以上の低酸素応答要素または１つ以上の放射線応答要素を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、主にがん細胞において自己複製ポリヌクレオチドの転写を駆動する。例えば、いくつかの実施形態では、転写制御要素は、ｈＴＥＲＴ、ＨＥ４、ＣＥＡ、ＯＣ、ＡＲＦ、ＣｇＡ、ＧＲＰ７８、ＣＸＣＲ４、ＨＭＧＢ２、ＩＮＳＭ１、メソセリン、ＯＰＮ、ＲＡＤ５１、ＴＥＴＰ、Ｈ１９、ｕＰＡＲ、ＥＲＢＢ２、ＭＵＣ１、Ｆｒｚ１、ＩＧＦ２－Ｐ４、Ｍｙｃ、またはＥ２Ｆなどのがん細胞で発現が増加する遺伝子に由来するプロモーターである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、逆位末端（ＩＴＲ）配列によって５’及び３’末端と隣接する。本明細書において、「逆位末端配列」または「ＩＴＲ」という用語は、異種ポリヌクレオチド配列（例えば、複製可能なウイルスゲノムをコードする核酸配列）の３’及び／または５’末端に位置し、非パリンドローム配列の１つ以上のストレッチによって分離されたパリンドローム配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。「パリンドローム」配列は、両方が５’から３’方向に読み取られたときにその相補鎖と同一である核酸配列を指す。ＩＴＲのポリヌクレオチド配列は、パリンドローム配列間の相補的塩基対形成によってステムループ構造（例えば、ヘアピンループ）を形成する。ＩＴＲポリヌクレオチド配列は、その配列がステムループ構造を形成できる限り、任意の長さにすることができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、以下の構造を含む：
（ａ）５’－ＩＴＲ－センスウイルスゲノム－ＩＴＲ－３’、または
（ｂ）３’－ＩＴＲ－アンチセンスウイルスゲノム－ＩＴＲ－５’。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＩＴＲ配列は、ステムループ構造、Ｒｅｐ結合部位、及び末端分解部位を形成することができるパリンドローム配列を最小限に含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＩＴＲは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する。かかる実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶの任意の既知の血清型（例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）に由来し得る（例えば、米国特許第９，５９８，７０３号を参照のされたい）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＩＴＲは、パルボウイルスに由来し得る（例えば、米国特許第５，５８５，２５４号を参照されたい）。本開示での使用に好適な追加の逆位末端配列は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１５２１４９号及び同第ＷＯ２０１６／１７２００８号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１７－０３６２６０８号に記載される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、２つのＩＴＲと隣接するポリヌクレオチド分子を含み、第１の分子の５’ＩＴＲは、第２の分子の３’ＩＴＲと共有結合し、第１の分子の３’ＩＴＲは、第２の分子の５’ＩＴＲと共有結合する。かかる実施形態では、共有結合したＩＴＲ隣接ポリヌクレオチドは、末端閉鎖した、線状の二本鎖腫瘍溶解性ウイルス核酸分子を形成する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、（ｉ）ウイルスゲノムのセンス配列をコードするポリヌクレオチドを含む第１の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子と、（ｉｉ）ウイルスゲノムのアンチセンス配列をコードするポリヌクレオチドを含む第２のｓｓＤＮＡ分子と、を含み、第１及び第２のｓｓＤＮＡ分子の各々が、３’ＩＴＲ及び５’ＩＴＲを含み、第１のｓｓＤＮＡ分子の３’末端が、第２のｓｓＤＮＡ分子の５’末端と共有結合し、第１のｓｓＤＮＡ分子の５’末端が、第２のｓｓＤＮＡ分子の３’末端と共有結合し、本明細書で「ＮａｎｏＶ分子」と称される末端閉鎖線形二本鎖腫瘍溶解性ウイルス（Ｏｖ）ＤＮＡ分子を形成する。
いくつかの実施形態では、自己複製ポリヌクレオチドは、複製可能なＤＮＡまたはＲＮＡウイルスゲノムをコードする。いくつかの実施形態では、複製可能なウイルスゲノムは、一本鎖ゲノムである（例えば、ｓｓＲＮＡゲノムまたはｓｓＤＮＡゲノム）。かかる実施形態では、一本鎖ゲノムは、ポジティブセンスまたはネガティブセンスゲノムであり得る。いくつかの実施形態では、複製可能なウイルスゲノムは、二本鎖ゲノムである（例えば、ｄｓＲＮＡゲノムまたはｄｓＤＮＡゲノム）。いくつかの実施形態では、自己複製ポリヌクレオチドは、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスをコードする。本明細書で使用される場合、「腫瘍溶解性ウイルス」という用語は、がん細胞に優先的に感染するように修飾されているか、または自然に優先的に感染するウイルスを指す。当技術分野で即知である腫瘍溶解性ウイルスの例は、これらに限定されないが、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、水疱性口炎ウイルス、オルトミクソウイルス、パルボウイルス、ｍａｒａｂａウイルス、またはＣｏｘｓａｃｋｉｅウイルスを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドによって産生される複製可能なウイルスは、アデノウイルスなどのアデノウイルス科の任意のウイルス、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルス、ポリオウイルス、もしくはＳｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルスなどのピコルナウイルス科の任意のウイルス、ウマヘルペスウイルスもしくは単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）などのヘルペスウイルス科の任意のウイルス、ｌａｓｓａウイルスなどのアレナウイルス科の任意のウイルス、マウス白血病ウイルスなどのレトロウイルス科の任意のウイルス、Ａ型インフルエンザウイルスなどのオルトミクソウイルス科の任意のウイルス、ニューカッスル病ウイルスもしくは麻疹ウイルスなどのパラミクソウイルス科の任意のウイルス、パルボウイルス科の任意のウイルス、哺乳動物オルトレオウイルスなどのレオウイルス科の任意のウイルス、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルスなどのトガウイルス科の任意のウイルス、ワクシニアウイルスもしくは粘液腫ウイルスなどのポックスウイルス科の任意のウイルス、または水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）もしくはｍａｒａｂａウイルスなどのラブドウイルス科の任意のウイルスであり、その例を図１に示す。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドによって産生される複製可能なウイルスは、修飾ポリオウイルス（例えば、ＰＶＳ－ＲＩＰＯ）などのキメラウイルスである。
いくつかの実施形態では、組換え核酸分子が細胞に導入される場合に、本明細書に開示される組換え核酸分子は、細胞の内因性ポリメラーゼ（複数可）によって転写されて、感染性ウイルスに組み立てることができるウイルスゲノムを産生する。産生された感染性ウイルスの量は、標的細胞もしくは標的細胞の集団、培養で増殖した細胞の上清、または対象の組織に存在するウイルスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡの量を定量化することを含むが、これらに限定されない、当技術分野で即知である方法によって測定することができる。かかる実施形態では、全ＤＮＡまたはＲＮＡは、標的細胞から単離され得、ｑＰＣＲは、ウイルスゲノムに存在するＲＮＡまたはＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用して実行され得る。いくつかの実施形態では、組換え核酸の細胞の集団から産生されたウイルス粒子の数は、標的細胞の集団に導入されたものは（例えば、インビトロ試料またはインビボ腫瘍から単離された試料）、当技術分野で即知である方法によって定量化することができる。いくつかの実施形態では、本開示の製剤は、少なくとも約１０３－１０９ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、例えば少なくとも約１０３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０４ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０６ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０７ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０８ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、または約１０９ＴＣＩＤ５０／ｍＬの５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の製剤は、インビボでの腫瘍成長を有意に阻害する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組換え核酸分子は、配列番号１～２と少なくとも約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一のポリヌクレオチド配列を含む。
Ａ．一本鎖ＲＮＡウイルス
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスゲノムをコードする。いくつかの実施形態では、ｓｓＲＮＡウイルスは、ポジティブセンスのｓｓＲＮＡ（＋センスｓｓＲＮＡ）ウイルス、またはネガティブセンスのｓｓＲＮＡ（－センスｓｓＲＮＡ）ウイルスである。
１．ポジティブセンスの一本鎖ＲＮＡウイルス
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチドは、ポジティブセンスの一本鎖ＲＮＡ（＋センスｓｓＲＮＡ）ウイルスゲノムをコードする。例示的な＋センスｓｓＲＮＡウイルスには、ピコルナウイルス科（例えば、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルス、ポリオウイルス、及びＳｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルス（ＳＶＶ）、ＳＶＶ－Ａを含む）、コロナウイルス科（例えば、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＮＬ６３などのアルファコロナウイルス、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－ＯＣ３、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶなどのベータコロナウイルス）、レトロウイルス科（例えば、マウス白血病ウイルス）、及びトガウイルス科（例えば、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス）のメンバーが含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチドは、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルスをコードする。いくつかの実施形態では、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルスは、ＣＶＢ３、ＣＶＡ２１、及びＣＡ９から選択される。ポジティブセンスのｓｓＲＮＡウイルスの追加の例示的な属及び種を以下の表４に示す。
Figure 2022507269000002
＋センスｓｓＲＮＡウイルスのゲノムは、５’－３’方向のｓｓＲＮＡ分子を含み、宿主細胞によってウイルスタンパク質に直接的に翻訳され得る。したがって、＋センスｓｓＲＮＡウイルスをコードする自己複製ポリヌクレオチドは、感染性ウイルスを産生するための任意の追加のウイルス複製タンパク質の存在を必要としない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされる＋センスｓｓＲＮＡの複製可能なウイルスゲノムは、ウイルスに天然の別々の５’及び３’末端を必要とする。哺乳動物のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩによって産生されるｍＲＮＡ転写産物には、哺乳動物の５’及び３’ＵＴＲが含まれ、したがって感染性ｓｓＲＮＡウイルスの産生に必要な別々の天然末端は含まれない。したがって、いくつかの実施形態では、感染性＋センスｓｓＲＮＡウイルス（例えば、表５に示すウイルス）の産生は、ウイルスの内因性５’及び３’の別々の末端を維持するために、非ウイルスＲＮＡが転写産物から除去されるように、ウイルスｓｓＲＮＡ及び哺乳動物ｍＲＮＡ配列の接合部でＰｏｌ ＩＩにコードされたウイルスゲノム転写産物の切断を可能にする追加の５’及び３’配列が必要とされる。かかる配列は、本明細書では接合部切断配列（ＪＣＳ）と称される。例えば、いくつかの実施形態では、自己ポリヌクレオチドは、以下の構造を含む：
（ａ）５’－Ｐｏｌ ＩＩ－ＪＣＳ－センスウイルスゲノム－ＪＣＳ－３’、
（ｂ）５’－Ｐｏｌ ＩＩ－ＪＣＳ－アンチセンスウイルスゲノム－ＪＣＳ－３’。
いくつかの実施形態では、自己複製ポリヌクレオチドは、ウイルス転写物の天然の別々の末端を産生するための５’及び３’接合部切断配列を含み、５’及び３’ＩＴＲと隣接する。例えば、いくつかの実施形態では、自己ポリヌクレオチドは、以下の構造を含む：
（ａ）５’－ＩＴＲ－Ｐｏｌ ＩＩ－ＪＣＳ－センスウイルスゲノム－ＪＣＳ－ＩＴＲ－３’、または
（ｂ）５’－ＩＴＲ－Ｐｏｌ ＩＩ－ＪＣＳ－アンチセンスウイルスゲノム－ＪＣＳ－ＩＴＲ－３’。
接合部切断配列及びウイルスゲノム転写物からの非ウイルスＲＮＡの除去は、様々な方法によって達成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子の標的である。本明細書で使用される「ＲＮＡ干渉分子」は、内因性遺伝子サイレンシング経路（例えば、ダイサー及びＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ））を介して標的ｍＲＮＡ配列の分解を媒介するＲＮＡポリヌクレオチドを指す。例示的なＲＮＡ干渉剤には、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、人工ｍｉＲＮＡ（ＡｍｉＲ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が含まれる。例示的な構築物の設計は、図３２Ａ、図３２Ｂ、及び図３３に示される。さらに、現在当技術分野で即知である、または将来定義される特定の部位でＲＮＡ転写物を切断するための任意の系を使用して、本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチドによってコードされるウイルスに天然の別々の末端を産生することができる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、ｍｉＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列と少なくとも部分的に相補的である、約１８～２５ヌクレオチドの長さの天然に存在する小さなノンコーディングＲＮＡ分子を指す。動物では、ｍｉＲＮＡの遺伝子は、二本鎖であり、ステムループ構造を形成する、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）に転写される。次に、Ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、クラス２ ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ドローシャ及びマイクロプロセッササブユニット、ＤＣＧＲ８を含むマイクロプロセッサ複合体によって核内で切断され、７０～１００ヌクレオチドの前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）を形成する。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡはヘアピン構造を形成し、細胞質に輸送され、そこでＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素、ダイサーによってプロセシングされて約１８～２５ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ二本鎖となる。二本鎖のどちらの鎖も機能的なｍｉＲＮＡとして機能し得るが、通常、ｍｉＲＮＡの１つの鎖が分解され、１つの鎖のみがアルゴノート（ＡＧＯ）ヌクレアーゼに負荷されて、ｍｉＲＮＡ及びそのｍＲＮＡ標的が相互作用するエフェクターＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）が産生される（Ｗａｈｉｄ ｅｔ ａｌ．，１８０３：１１，２０１０，１２３１－１２４３）。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’接合部切断配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列である。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、ｍｉＲＮＡが埋め込まれたｓｈＲＮＡ（ｓｈｍｉＲＮＡ）構築物に由来する人工ｍｉＲＮＡ（ＡｍｉＲ）である（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２００８）３６：９；２８１１－２８３４、Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ（２００２），９；１３２７－１３３３、Ｆｅｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１３）５；１７０４－１７１３を参照されたい）。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’接合部切断配列は、ＡｍｉＲ標的配列である。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、ｓｉＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、通常、約２１～２３ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ分子を指す。二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称される多タンパク質複合体と会合することにより細胞質でプロセシングされ、その間に「パッセンジャー」センス鎖が二本鎖から酵素的に切断される。次に、活性化ＲＩＳＣに含まれるアンチセンス「ガイド」鎖が、配列相補性によってＲＩＳＣを対応するｍＲＮＡに誘導し、ＡＧＯヌクレアーゼが、標的ｍＲＮＡを切断して、特定の遺伝子サイレンシングを引き起こす。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、ｓｈＲＮＡ分子に由来する。ｓｈＲＮＡは、ステムループ構造を形成する約５０～７０ヌクレオチドの長さの一本鎖人工ＲＮＡ分子である。細胞内でのｓｈＲＮＡの発現は、プラスミドまたはウイルスベクターによってｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを導入することによって達成される。次に、ｓｈＲＮＡは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡのステムループ構造を模倣する産物に転写され、ドローシャによって核内で同様にプロセシングされて、ヘアピンループ構造を有する一本鎖ＲＮＡを形成する。ヘアピンＲＮＡを細胞質に搬出した後、ヘアピンは、ダイサーによってプロセシングされて二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を形成し、次いでＲＩＳＣによってプロセシングされて標的遺伝子のサイレンシングをさらに仲介する。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’接合部切断配列は、ｓｉＲＮＡ標的配列である。
いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列である。かかる実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮａｓｅ活性を有するＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ１３）を使用して設計及び導入され、正確な接合部位でのウイルスゲノム転写産物の切断を仲介することができる。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’接合部切断配列は、ｇＲＮＡ標的配列である。
いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡをコードする配列である。二次ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドが転写されると、これらの配列は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡステムループ構造を形成し、これがドローシャによって核内で切断され、正確な接合部位で転写物が切断される。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’接合部切断配列は、ｐｒｉ－ｍＲＮＡ標的配列である。
いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、リボザイムをコードする配列であり、ウイルス転写物の自己切断を媒介して、二次腫瘍溶解性ウイルスの天然の別々の末端を産生する。例示的なリボザイムには、ハンマーヘッドリボザイム、Ｖａｒｋｕｄサテライト（ＶＳ）リボザイム、ヘアピンリボザイム、ＧＩＲ１分岐リボザイム、ｇｌｍＳリボザイム、ツイスターリボザイム、ツイスターシスターリボザイム、ピストルリボザイム、ハチェットリボザイム、及びデルタ肝炎ウイルスリボザイムが含まれる。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’接合部切断配列は、リボザイムをコードする配列である。
いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、「アプタザイム」と称される、リガンド誘導性の自己切断リボザイムをコードする配列である。アプタザイムは、リガンドに特異的な組み込まれたアプタマードメインを含むリボザイム配列である。アプタマードメインと結合するリガンドは、リボザイムの酵素活性の活性化を誘発し、それによってＲＮＡ転写物の切断をもたらす。例示的なアプタザイムには、テオフィリン依存性アプタザイム（例えば、Ａｕｓｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ ＢｉｏＳｙｓｔ．（２０１０）６，８０７－８１４に記載されるテオフィリン依存性アプタマーと連結したハンマーヘッド型リボザイム）、テトラサイクリン依存性アプタザイム（例えば、（例えば、Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｅＬｉｆｅ ２０１６；５：ｅ１８８５８ＤＯＩ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．１８８５８、Ｗｉｎ ａｎｄ Ｓｍｏｌｋｅ，ＰＮＡＳ（２００７）１０４；１４２８３－１４２８８、Ｗｈｉｔｔｍａｎｎ ａｎｄ Ｓｕｅｓｓ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｔ（２０１１）７；２４１９－２４２７、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ ＆ Ｂｉｏｌ（２００８）１５；１２５－１１３７、及びＢｅｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｎ Ｂｉｏｌ（２０１５）４；５２６－５３４に記載されるＴｅｔ依存性アプタマーと連結したハンマーヘッド型リボザイム）、グアニン依存性アプタザイム（例えば、Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ．，（２０１２）４８（５７）；７２１５－７２１７に記載されるグアニン依存性アプタマーと連結したハンマーヘッド型リボザイム）が含まれる。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’接合部切断配列は、アプタザイムをコードする配列である。
いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ＡｍｉＲ分子、またはｇＲＮＡ分子の標的配列である。かかる実施形態では、標的ＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉまたはｇＲＮＡ分子のガイド配列と少なくとも部分的に相補的である。パーセント配列同一性及びパーセント相補性の比較ならびに決定のための配列アラインメントの方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似法の検索によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、手動調整及び目視検査（例えば、Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）によって、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０に記載のＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを含む当技術分野で即知のアルゴリズムを使用することによってのそれぞれで行うことができる。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センターを通じて公開されている。
いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列及び３’接合部切断配列は、同じ群に由来する（例えば、両方ともＲＮＡｉ標的配列、両方ともリボザイムをコードする配列などである）。例えば、いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、ＲＮＡｉ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ＡｍｉＲ、またはｍｉＲＮＡ標的配列）であり、二次腫瘍溶解性ウイルスをコードするポリヌクレオチドの５’及び３’末端に組み込まれる。かかる実施形態では、５’及び３’ＲＮＡｉ標的配列は、同じ（すなわち、同じｓｉＲＮＡ、ＡｍｉＲ、またはｍｉＲＮＡの標的）であるか、または異なり得る（すなわち、５’配列が１つのｓｉＲＮＡ、ｓｈｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡの標的であり、３’配列が別のｓｉＲＮＡ、ＡｍｉＲ、またはｍｉＲＮＡの標的である）。いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、ガイドＲＮＡ標的配列であり、二次腫瘍溶解性ウイルスをコードするポリヌクレオチドの５’及び３’末端に組み込まれる。かかる実施形態では、５’及び３’ｇＲＮＡ標的配列は、同じ（すなわち、同じｇＲＮＡの標的）であるか、または異なり得る（すなわち、５’配列が１つのｇＲＮＡの標的であり、３’配列が別のｇＲＮＡの標的である）。いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、ｐｒｉ－ｍＲＮＡをコードする配列であり、二次腫瘍溶解性ウイルスをコードするポリヌクレオチドの５’及び３’末端に組み込まれる。いくつかの実施形態では、接合部切断配列は、リボザイムをコードする配列であり、ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列の５’及び３’側のすぐに二次腫瘍溶解性ウイルスをコードするポリヌクレオチドに組み込まれる。
いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列及び３’接合部切断配列は、同じ群に由来するが、異なるバリアントまたは種類である。例えば、いくつかの実施形態では、５’及び３’接合部切断配列は、ＲＮＡｉ分子の標的配列であり得、５’接合部切断配列は、ｓｉＲＮＡ標的配列であり、３’接合部切断配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列である（またはその逆である）。いくつかの実施形態では、５’及び３’接合部切断配列は、リボザイムをコードする配列であり得、５’接合部切断配列は、ハンマーヘッド型リボザイムをコードする配列であり、３’接合部切断配列は、デルタ肝炎ウイルスリボザイムをコードする配列である。
いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列及び３’接合部切断配列は異なる種類である。例えば、いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列は、ＲＮＡｉ標的配列であり（例えば、ｓｉＲＮＡ、ＡｍｉＲ、またはｍｉＲＮＡ標的配列）、３’接合部切断配列は、リボザイム配列、アプタザイム配列、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列、またはｇＲＮＡ標的配列である。いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列は、リボザイム配列であり、３’接合部切断配列は、ＲＮＡｉ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ＡｍｉＲ、またはｍｉＲＮＡ標的配列）、アプタザイム配列、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡをコードする配列、またはｇＲＮＡ標的配列である。いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列は、アプタザイム配列であり、３’接合部切断配列は、ＲＮＡｉ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ＡｍｉＲ、またはｍｉＲＮＡ標的配列）、リボザイム配列、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列、またはｇＲＮＡ標的配列である。いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列であり、３’接合部切断配列は、ＲＮＡｉ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ＡｍｉＲ、またはｍｉＲＮＡ標的配列）、リボザイム配列、アプタザイム配列、またはｇＲＮＡ標的配列である。いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列は、ｇＲＮＡ標的配列であり、３’接合部切断配列は、ＲＮＡｉ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ＡｍｉＲ、またはｍｉＲＮＡ標的配列）、リボザイム配列、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列、またはアプタザイム配列である。
いくつかの実施形態では、５’接合部切断配列は、ＡｍｉＲ標的配列であり、３’接合部切断配列は、リボザイム配列である。
自己複製ポリヌクレオチドと比較した接合部切断配列の例示的な配置を、以下の表Ａ及びＢに示す。
Figure 2022507269000003
Figure 2022507269000004
Figure 2022507269000005
２．ネガティブセンスｓｓＲＮＡウイルス
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ネガティブセンスの一本鎖ＲＮＡ（－センスｓｓＲＮＡ）ウイルスゲノムをコードする。－センスｓｓＲＮＡウイルスのゲノムは、３’－５’方向のｓｓＲＮＡ分子を含み、タンパク質に直接的に翻訳することができない。むしろ、－センスｓｓＲＮＡウイルスのゲノムは、最初にＲＮＡポリメラーゼによって＋センスｍＲＮＡ分子に転写される必要がある。例示的な－センスｓｓＲＮＡウイルスには、パラミクソウイルス科（例えば、麻疹ウイルス及びニューカッスル病ウイルス）、ラブドウイルス科（例えば、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）及びｍａｒｂａウイルス）、アレナウイルス科（例えば、Ｌａｓｓａウイルス）、及びオルトミクソウイルス科（例えば、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、Ｃ型インフルエンザ、Ｄ型インフルエンザなどのインフルエンザウイルス）を含む。
いくつかの実施形態では、－センスｓｓＲＮＡウイルスゲノムをコードする自己複製ポリヌクレオチドは、－センスｓｓＲＮＡゲノムの複製に必要なウイルスタンパク質に直接的に翻訳できるｍＲＮＡ転写物をコードする第１のポリヌクレオチド配列、及びウイルスゲノムのアンチゲノム配列を含む第２のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリヌクレオチド配列は、真核細胞で発現することができるプロモーター、例えば、哺乳動物プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリヌクレオチド配列は、双方向性Ｐｏｌ ＩＩプロモーターなどの双方向性プロモーターに作動可能に連結される（例えば、図９、１０、及び１１を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、－センスｓｓＲＮＡゲノムの複製に必要なウイルス遺伝子は、同じ発現カセットから発現される。いくつかの実施形態では、－センスｓｓＲＮＡゲノムの複製に必要なウイルス遺伝子は、異なる発現カセット、例えば、２つまたは３つの発現カセット、例えば、各遺伝子の発現カセット、または３つの遺伝子のうち２つを有する１つの発現カセット、及び第３の遺伝子を有する別の発現カセットから発現される。－センスｓｓＲＮＡゲノムの複製に必要なウイルス遺伝子は、同じオープンリーディングフレームから、または２つもしくは３つの異なるオープンリーディングフレームから翻訳され得る。一実施形態では、－センスｓｓＲＮＡゲノムの複製に必要なウイルス遺伝子は、単一のオープンリーディングフレームから共翻訳的に発現され、翻訳後に成熟ポリペプチドにプロセシングされる。一実施形態では、－センスｓｓＲＮＡゲノムの複製に必要なウイルス遺伝子は、２Ａペプチド配列によって連結され、オープンリーディングフレームから個々のポリペプチドに翻訳されたポリペプチドの自己切断をもたらす。－センスｓｓＲＮＡゲノム遺伝子の複製に必要なウイルス遺伝子は、任意の順序で配置され得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、－センスｓｓＲＮＡゲノムの複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の機能的バリアントを含む。当業者は、特定の－センスｓｓＲＮＡウイルスに必要な遺伝的要素に従って、前述のシステムの適切なバリアントを操作する方法を認識するであろう。この操作は、複製に必須の追加の遺伝子を追加するという形態を取り得る。
いくつかの実施形態では、複製に必要なウイルスタンパク質に直接的に翻訳できるｍＲＮＡ転写物をコードする第１のポリヌクレオチド配列は、真核細胞で発現できるプロモーター、例えば、哺乳動物のＰｏｌ ＩＩプロモーターに作動可能に連結されており、さらにＴ７ポリメラーゼをコードする。かかる実施形態では、第２のポリヌクレオチド配列は、Ｔ７プロモーターに作動可能に連結される。例えば、いくつかの実施形態では、自己複製ポリヌクレオチドは、以下の構造を含む：
（ａ）５’－［複製に必要なウイルス遺伝子］－双方向性プロモーター－［アンチゲノムウイルスゲノム］－３’、
（ｂ）５’－Ｐｏｌ ＩＩ－［複製に必要なウイルス遺伝子＋Ｔ７ ｐｏｌ］－Ｔ７プロモーター－［アンチゲノムウイルスゲノム］－３’、
（ｃ）いくつかの実施形態では、－センスｓｓＲＮＡウイルスゲノムをコードする自己複製ポリヌクレオチドは、例えば、以下のようなＡＡＶ由来のＩＴＲによって５’及び３’末端に隣接される：
（ｄ）５’－ＩＴＲ－［複製に必要なウイルス遺伝子］－双方向性プロモーター－［アンチゲノムウイルスゲノム］－ＩＴＲ－３’、
（ｅ）５’－ＩＴＲ－Ｐｏｌ ＩＩ－［複製に必要なウイルス遺伝子＋Ｔ７ ｐｏｌ］－Ｔ７プロモーター－［アンチゲノムウイルスゲノム］－ＩＴＲ－３’、
Ｂ．二本鎖ＲＮＡウイルス
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチドは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ウイルスゲノムをコードする。例示的なｄｓＲＮＡウイルスには、アマルガウイルス（Ａｍａｌｇａｖｉｒｉｄａｅ）科、ビルナウイルス科、クリソウイルス（Ｃｈｒｙｓｏｖｉｒｉｄａｅ）科、シストウイルス科、エンドルナウイルス（Ｅｎｄｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科、ハイポウイルス（Ｈｙｐｏｖｉｒｉｄａｅ）科、メガビルナウイルス（Ｍｅｇａｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科、パルチチウイルス（Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｉｄａｅ）科、ピコビルナウイルス（Ｐｉｃｏｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科、クアドリウイルス（Ｑｕａｄｒｉｖｉｒｉｄａｅ）科、レオウイルス科、トティウイルス科のメンバーが含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡウイルスゲノムをコードする。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡウイルスゲノムは、ネガティブセンス（相補的）鎖の５’のポジティブセンス鎖としてコードされる。したがって、いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡウイルスゲノムは、ＤＮＡポリヌクレオチドの同じ鎖からの別のものに相補的である２つのＲＮＡ分子として転写される。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡウイルスゲノムの２つのＲＮＡ分子は、単一のＲＮＡとして転写され、これは、例えば、リボザイム、エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ系システムなどによって、ポジティブ及びネガティブセンス分子に切断される。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡウイルスゲノムは、共有ｄｓＤＮＡ鋳型に隣接するプロモーターに作動可能に連結された共有ｄｓＤＮＡ鋳型から転写される。一方のプロモーターが、ＤＮＡポリヌクレオチドのワトソン鎖からの転写を引き起こし、それによってｄｓＲＮＡゲノムのプラス鎖を生成する。他方のプロモーターが、ＤＮＡポリヌクレオチドのクリック鎖からの転写を引き起こし、それによってｄｓＲＮＡゲノムのネガティブ鎖を生成する。いくつかのｄｓＲＮＡウイルス、例えば、レオウイルスは、セグメント化ウイルスであり、それらのゲノムが複数のＲＮＡ分子、いくつかの事例ではｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの混合物で構成されることを意味する。本開示は、ＤＮＡポリヌクレオチドが各セグメントの転写ユニットを含む実施形態を提供する。いくつかの実施形態では、セグメントは、ＤＮＡポリヌクレオチドのワトソン及び／またはクリック鎖上のいくつかのプロモーターから転写される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡセグメントは、１つ以上のＲＮＡセグメントの転写後切断によって、例えば、リボザイム、エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ系システムなどによって生成される。いくつかの実施形態では、システムのプロモーターの１つ以上は、Ｔ７プロモーターであり、システムは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７システムの使用は、ｄｓＲＮＡウイルスゲノムの１つ以上のセグメントに天然の５’末端を生成する。いくつかの実施形態では、システムのプロモーターの１つ以上は、真核生物的に活性なプロモーター、例えば、哺乳動物プロモーターである。
Ｃ．一本鎖ＤＮＡウイルス
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスゲノムをコードする。例示的なｓｓＤＮＡウイルスには、パルボウイルス科（例えば、アデノ随伴ウイルス）、アネロウイルス科、ビドナウイルス（Ｂｉｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）科、サーコウイルス科、ジェミニウイルス科、ジェノモウイルス（Ｇｅｎｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）科、イノウイルス科、ミクロウイルス科、ナノウイルス科、スマコウイルス（Ｓｍａｃｏｖｉｒｉｄａｅ）科、及びスピラウイルス（Ｓｐｉｒａｖｉｒｉｄａｅ）科のメンバーが含まれる。一実施形態では、自己複製ポリヌクレオチドは、パルボウイルスをコードする。一実施形態では、自己複製ポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をコードする。
Ｄ．二本鎖ＤＮＡウイルス
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスゲノムをコードする。例示的なｄｓＤＮＡウイルスには、ミオウイルス科、ポドウイルス科、シホウイルス科、アロヘルペスウイルス科、ヘルペスウイルス科（例えば、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－１、ウマヘルペスウイルス）、ポックスウイルス科（例えば、ワクシニアウイルス及び粘液腫ウイルス）のメンバーが含まれる。一実施形態では、自己複製ポリヌクレオチドは、アデノウイルスをコードする。
Ｅ．ｍｉＲＮＡ減衰
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチドは、１つ以上の必須ウイルス遺伝子に挿入される１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列を含む複製可能なウイルスゲノムをコードする。ｍｉＲは、細胞増殖及びアポトーシスの制御に関与するものを含む、多数のタンパク質をコードする多くの転写産物を制御する。ｍｉＲによって制御される例示的なタンパク質には、従来のプロト腫瘍性タンパク質、ならびにＲａｓ、Ｍｙｃ、Ｂｃｌ２、ＰＴＥＮ、及びｐ５３などの腫瘍抑制因子が含まれる。
ｍｉＲＮＡは、正常な細胞プロセスと密接に関連しており、それらの調節不全は、がんを含む広範囲の疾患の一因となる。重要なことに、ｍｉＲＮＡは、正常な組織と比較してがん組織で差次的に発現し、広範な様々ながんの標的メカニズムとして機能することができる。発がん、悪性形質転換、または転移に関連するｍｉＲＮＡ（正または負のいずれかで）は、「腫瘍ｍｉＲ」として知られている。表２は、特定のがんにおける腫瘍ｍｉＲ及びそれらの相対的発現のリストを示す。
いくつかの態様では、特定のｍｉＲＮＡの発現は、特定のがん及び／または転移の発生または維持と正に関連する。かかるｍｉＲは、本明細書では「発がん性ｍｉＲＮＡ」または「腫瘍ｍｉＲ」と称される。いくつかの実施形態では、発がん性ｍｉＲＮＡの発現は、非がん性対照細胞（すなわち、正常または健康な対照）で観察される発現レベルと比較してがん性細胞もしくは組織で増加するか、または異なるがん種に由来するがん性細胞で観察される発現レベルと比較して増加する。例えば、がん性細胞における発がん性ｍｉＲＮＡの発現は、非がん性対照細胞または異なるがん種に由来するがん性細胞における発がん性ｍｉＲＮＡの発現と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％以上増加し得る。いくつかの態様では、がん性細胞は、非がん性対照細胞では発現されない発がん性ｍｉＲＮＡを発現し得る。
いくつかの態様では、特定の腫瘍ｍｉＲの発現は、特定のがん及び／または転移の発生または維持と負に関連する。かかる腫瘍ｍｉＲは、その発現ががんの発生を予防または抑制することから、本明細書において、「腫瘍抑制ｍｉＲＮＡ」または「腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡ」と称される。いくつかの実施形態では、腫瘍抑制ｍｉＲＮＡの発現は、非がん性対照細胞（すなわち、正常または健康な対照）で観察される発現レベルと比較してがん性細胞もしくは組織で減少するか、または異なるがん種に由来するがん性細胞で観察される腫瘍抑制ｍｉＲＮＡの発現レベルと比較して減少する。例えば、がん性細胞における腫瘍抑制ｍｉＲＮＡの発現は、非がん性対照細胞または異なるがん種に由来するがん性細胞における腫瘍抑制ｍｉＲＮＡの発現と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％減少し得る。いくつかの態様では、非がん性対照細胞は、がん性細胞では発現されない腫瘍抑制ｍｉＲＮＡを発現し得る。
通常、特定のｍｉＲＮＡの発がん性対腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡの指定は、がんの種類によって異なる。例えば、１つのｍｉＲＮＡの発現が特定のがんで増加し、そのがんの発生に関連し得、一方で同じｍｉＲＮＡの発現が別のがんで減少し、そのがんの発生の予防に関連し得る。しかしながら、いくつかのｍｉＲＮＡは、がんの種類に関係なく発がん性ｍｉＲＮＡとして機能し得る。例えば、いくつかのｍｉＲＮＡは、腫瘍抑制遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を分解の標的とし、それによって腫瘍抑制タンパク質の発現を低減させる。表２は、いくつかのがん及び各がん種で観察された対応する「上方制御された」ｍｉＲＮＡ及び「下方制御された」ｍｉＲＮＡのリストを示す。表２では、上方制御されたｍｉＲＮＡは、その特定のがんで発がん性である可能性が高いｍｉＲＮＡであり、下方制御されたｍｉＲＮＡは、その特定のがんで腫瘍抑制性である可能性が高い。追加の腫瘍抑制ｍｉＲＮＡのリストを表３に示す。表１は、１２個の選択した腫瘍ｍｉＲ（９個の腫瘍抑制因子及び３個の発がん性ｍｉＲＮＡ）及び多数のがんの関係を示す。
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドによって産生されるウイルスの複製は、ウイルスゲノムの１つ以上の位置に１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を組み込むことによって腫瘍細胞に制限される。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、複製可能なウイルスゲノムの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、必須ウイルス遺伝子の１つ以上の遺伝子座に組み込まれる。本明細書で使用される場合、「必須ウイルス遺伝子」は、ウイルス複製、ウイルス遺伝子産物の感染性粒子への組み立てに必要な、または組み立てられた感染性粒子の構造的完全性を維持するために必要とされるウイルス遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、必須ウイルス遺伝子は、ＵＬ１、ＵＬ５、ＵＬ６、ＵＬ７、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１４、ＵＬ１５、ＵＬ１７、ＵＬ１８、ＵＬ１９、ＵＬ２０、ＵＬ２２、ＵＬ２５、ＵＬ２６、ＵＬ２６．５、ＵＬ２７、ＵＬ２８、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ３１、ＵＬ３２、ＵＬ３３、ＵＬ３４、ＵＬ３５、ＵＬ３６、ＵＬ３７、ＵＬ３８、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４２、ＵＬ４８、ＵＬ４９、ＵＬ５０、ＵＬ５２、ＵＬ５３、ＵＬ５４、ＵＳ１、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ６、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ１２、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＰＢ、Ｆ、Ｂ５Ｒ、ＳＥＲＯ－１、Ｃａｐ、Ｒｅｖ、ＶＰ１－４、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、ポリメラーゼ（Ｌ）、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄを含む。
いくつかの実施形態では、必須ウイルス遺伝子の１つ以上の遺伝子座に挿入されたｍｉＲＮＡ標的配列は、正常な非がん性細胞によって発現され、がん性細胞において発現されないか、または低減した発現を示すｍｉＲＮＡに対応する。正常な（非がん性）細胞で発現するｍｉＲＮＡは、ポリヌクレオチドの対応する標的配列と結合し、ｍｉＲＮＡ標的配列を含むウイルス遺伝子の発現を抑制し、それによってウイルス複製及び／または感染性粒子への構造的組み立てを防ぐであろう。したがって、ｍｉＲＮＡ標的配列の挿入は、コードされたウイルスの溶解効果から正常細胞を保護する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、腫瘍抑制ｍｉＲＮＡ（例えば、表３に列挙されるｍｉＲＮＡ）の標的配列である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個の必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入されたｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または３’ＵＴＲに組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、ウイルスゲノムの非必須遺伝子の３’または５’ＵＴＲに組み込まれる（例えば、ガンマ３４．５）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に組み込まれるｍｉＲＮＡ標的配列を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチドは、１つ以上の必須ウイルス遺伝子に組み込まれる複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、複数（例えば、２つ以上）の必須ウイルス遺伝子に組み込まれるｍｉＲＮＡ標的配列を含む。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個以上の必須ウイルス遺伝子に挿入されるｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。かかる実施形態では、各必須ウイルス遺伝子は、１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含み、一方でポリヌクレオチドは全体として複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含むであろう。かかる実施形態では、複数のｍｉＲＮＡ標的配列は、同じｍｉＲＮＡに対応し得る。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個以上の必須ウイルス遺伝子に挿入される同じｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。かかる実施形態では、複数のｍｉＲＮＡ標的配列は、２つ以上の異なるｍｉＲＮＡに対応し得る。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、第１の必須ウイルス遺伝子に挿入される第１のｍｉＲＮＡに対応するｍｉＲＮＡ標的配列、第２の必須ウイルス遺伝子に挿入される第２のｍｉＲＮＡに対応するｍｉＲＮＡ標的配列、第３の必須ウイルス遺伝子に挿入される第３のｍｉＲＮＡに対応するｍｉＲＮＡ標的配列などを含み得る。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列の複数のコピーは、必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に組み込まれる。例えば、いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個以上のコピーが、必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入され得る。いくつかの実施形態では、必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される複数のｍｉＲＮＡ標的配列の各々は、同じｍｉＲＮＡに対応する。いくつかの実施形態では、必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される複数のｍｉＲＮＡ標的配列の各々は、異なるｍｉＲＮＡに対応する。例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個以上の異なるｍｉＲＮＡに対応するｍｉＲＮＡ標的配列が、必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入され得る。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列の複数のコピーが、複数の必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に組み込まれる。例えば、いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個以上のコピーが、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個以上の必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入され得る。いくつかの実施形態では、特定の必須ウイルス遺伝子に挿入される複数のｍｉＲＮＡ標的配列は、すべて同じｍｉＲＮＡに対応し得る。例えば、いくつかの実施形態では、第１の必須ウイルス遺伝子は、各々が第１のｍｉＲＮＡに対応する複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得、第２の必須ウイルス遺伝子は、各々が第２のｍｉＲＮＡに対応する複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。いくつかの実施形態では、自己複製ポリヌクレオチドは、各々がそれぞれ第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０のｍｉＲＮＡに対応する複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含む第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０の必須ウイルス遺伝子をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、異なるｍｉＲＮＡに対応する複数のｍｉＲＮＡ標的配列は、複数の必須ウイルス遺伝子座に挿入される。例えば、いくつかの実施形態では、第１の必須ウイルス遺伝子は、２つ以上の異なるｍｉＲＮＡに対応する複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得、第２の必須ウイルス遺伝子は、２つ以上の異なるｍｉＲＮＡに対応する複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。かかる実施形態では、第１の必須ウイルス遺伝子のｍｉＲＮＡ標的配列は、第２の必須ウイルス遺伝子のｍｉＲＮＡ標的配列と同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、自己複製ポリヌクレオチドは、各々が異なるｍｉＲＮＡに対応する複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含む第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０の必須ウイルス遺伝子をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０の必須ウイルス遺伝子のいずれか１つのｍｉＲＮＡ標的配列は、他の必須ウイルス遺伝子のいずれかのｍｉＲＮＡ標的配列と同じであり得る。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０の必須ウイルス遺伝子のいずれか１つのｍｉＲＮＡ標的配列は、他の必須ウイルス遺伝子のいずれかのｍｉＲＮＡ標的配列と異なり得る。
いくつかの実施形態では、複数のｍｉＲＮＡ標的配列は、１つ以上の必須のウイルス遺伝子の遺伝子座にタンデムに挿入され、リンカー配列またはスペーサー配列によって互いに分離される。いくつかの実施形態では、リンカーまたはスペーサー空間配列は、４つ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、リンカーまたはスペーサー空間配列は、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個以上のヌクレオチドを含む。一実施形態では、リンカー配列またはスペーサー配列は、少なくとも４つ～少なくとも６つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、以下のサブユニットの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個以上が、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の遺伝子座にタンデムに挿入される：（ａ）第１のｍｉＲＮＡの標的配列－リンカーもしくはスペーサー配列－第１のｍｉＲＮＡの標的配列、または（ｂ）第１のｍｉＲＮＡの標的配列－リンカーもしくはスペーサー配列－第２のｍｉＲＮＡのターゲット配列。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、表３に列挙されるｍｉＲＮＡのうちの１つ以上のいずれかの標的配列である。
Ｆ．ペイロード分子
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ペイロード分子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペイロード分子をコードする核酸は、複製可能なウイルスゲノムをコードする組換え核酸分子とは別の第２のポリヌクレオチドとして存在する。本明細書で使用される場合、「ペイロード分子」（「治療分子」とも称される）は、本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチドまたはその感染性粒子によってコードされるウイルスの治療効果をさらに高めることができる任意の分子を指す。本開示での使用に好適なペイロード分子には、細胞傷害性ペプチド、免疫調節ペプチドなどのタンパク質またはペプチドが含まれる（例えば、抗体またはその抗原結合断片などの抗原結合分子、サイトカイン、ケモカイン、可溶性受容体、細胞表面受容体リガンド、二分ペプチド、及び酵素。かかるペイロード分子は、核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンタゴミル、リボザイム、及びアパタマー）をさらに含み得る。ペイロード分子の性質は、疾患の種類及び所望される治療結果によって異なり得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、ペイロード分子をコードするポリヌクレオチド配列の３’または５’ＵＴＲに組み込まれる。かかる実施形態では、ペイロードの翻訳及びその後の発現は、対応するｍｉＲＮＡが発現される細胞では起こらないか、または実質的に減少する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の３’及び／または５’ＵＴＲに挿入される。
いくつかの実施形態では、治療用分子の発現は、非がん性細胞と比較してがん細胞における治療用分子の発現の増加を駆動する転写制御要素によってさらに制御され得る（例えば、ｈＴＥＲＴ、ＨＥ４、ＣＥＡ、ＯＣ、ＡＲＦ、ＣｇＡ、ＧＲＰ７８、ＣＸＣＲ４、ＨＭＧＢ２、ＩＮＳＭ１、メソセリン、ＯＰＮ、ＲＡＤ５１、ＴＥＴＰ、Ｈ１９、ｕＰＡＲ、ＥＲＢＢ２、ＭＵＣ１、Ｆｒｚ１、ＩＧＦ２－Ｐ４、または低酸素（ＨＲＥ）に由来するプロモスター及び放射線応答要素）。いくつかの実施形態では、ペイロード分子の発現は、自己複製ポリヌクレオチドと同じ転写制御要素の制御下にある。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、自己複製ポリヌクレオチドを含み、細胞傷害性ペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。本明細書で使用される場合、「細胞傷害性ペプチド」は、宿主細胞で発現された場合に細胞死を、及び／または宿主細胞によって分泌された場合に隣接細胞の細胞死を誘導することができるタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、細胞傷害性ペプチドは、カスパーゼ、ｐ５３、ジフテリア毒素（ＤＴ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ（ＰＥＡ）、Ｉ型リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）（例えば、サポリン及びジェロニン）、ＩＩ型ＲＩＰ（例えば、リシン）、志賀様毒素１（Ｓｌｔ１）、感光性活性酸素種（例えば、キラーレッド）である。特定の実施形態では、細胞傷害性ペプチドは、カスパーゼ遺伝子などのアポトーシスを介して細胞死をもたらす自殺遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態では、ペイロードは、免疫調節ペプチドである。本明細書で使用される場合、「免疫調節ペプチド」は、特定の免疫受容体及び／または経路を調節する（例えば、活性化または阻害する）ことができるペプチドである。いくつかの実施形態では、免疫調節ペプチドは、免疫細胞、組織細胞、及び間質細胞を含む任意の哺乳動物細胞に作用することができる。好ましい実施形態では、免疫調節ペプチドは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、好塩基球、肥満細胞、または好酸球などの免疫細胞に作用する。例示的な免疫調節ペプチドには、抗体またはその抗原結合断片などの抗原結合分子、サイトカイン、ケモカイン、可溶性受容体、細胞表面受容体リガンド、二分ペプチド、及び酵素が含まれる。
いくつかの実施形態では、ペイロードは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－３６、ＩＬ－３６γ、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４／ＣＤ２５８）、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、またはＩＦＮγなどのサイトカインである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ＩＬ－２、ＩＬ－１８、ＬＩＧＨＴ、及びＩＬ－３６γから選択されるサイトカインである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ４、またはＣＣＬ５などのケモカインをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ４、及びＣＣＬ５から選択されるケモカインである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ニューロピリンリガンド、Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４７リガンド（例えば、ＳＩＲＰ１α）などの細胞表面受容体のリガンドである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、可溶性サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ－１３Ｒ、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＩＬ－３５Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－１２Ｒ、及びインターフェロン受容体）または可溶性自然免疫受容体（例えば、ｔｏｌｌ様受容体、補体受容体など）などの可溶性受容体である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、細胞内ＲＮＡ及び／またはＤＮＡセンシングに関与するタンパク質の優性アゴニスト変異体である（例えば、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－１、またはＭＤＡ－５の優性アゴニスト変異体）。
いくつかの実施形態では、ペイロードは、抗体またはその抗原結合断片などの抗原結合分子である（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）など）。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、免疫チェックポイント受容体（例えば、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、及びＣＤ４７）または細胞成長及び活性化に関与する追加の細胞表面受容体（例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２００Ｒ、ＣＳＦ１Ｒ、４１ＢＢ、ＣＤ４０、及びＮＫＧ２Ｄ）などの細胞表面受容と特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ペイロード分子は、クロロトキシン、ＢｍＫｎ－２、ネオプラジン１、ネオプラジン２、及びマウリポリン（ｍａｕｒｉｐｏｒｉｎ）などのサソリポリペプチドである。いくつかの実施形態では、治療用分子は、コントルトロスタチン、アポキシンＩ、ボトロプストキシンＩ、ＢＪｃｕＬ、ＯＨＡＰ－１、ロドストミン（ｒｈｏｄｏｓｔｏｍｉｎ）、ｄｒＣＴ－Ｉ、ＣＴＸ－ＩＩＩ、Ｂ１Ｌ、及びＡＣＴＸ－６などのヘビポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ペイロード分子は、ラタルシン及びヒアルロニダーゼなどのクモポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ペイロード分子は、メリチン及びアパミンなどのハチポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ペイロード分子は、ＰｓＴ－１、ＰｄＴ－１、及びＰｄＴ－２などのカエルポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、ペイロードは、酵素である。いくつかの実施形態では、酵素は、細胞外マトリックスを改変することによって腫瘍微小環境を調節することができる。かかる実施形態では、酵素は、これらに限定されないが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（例えば、ＭＭＰ９）、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ゼラチナーゼ、またはエラスターゼを含み得る。いくつかの実施形態では、酵素は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、またはチトクロームＰ４５０などの遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（ＧＤＥＰＴ）システムの一部である。いくつかの実施形態では、酵素は、標的細胞において細胞死経路を誘導または活性化することができる（例えば、カスパーゼ）。
いくつかの実施形態では、ペイロード分子は、二分ペプチドである。本明細書で使用される場合、「二分ペプチド」は、非がん性エフェクター細胞上で発現される細胞表面抗原と結合することができる第１のドメインと、標的細胞によって発現される細胞表面抗原と結合することができる第２のドメインとからなる多量体タンパク質を指す（例えば、がん性細胞、腫瘍細胞、または異なる種類のエフェクター細胞）。いくつかの実施形態では、二分ポリペプチドの個々のポリペプチドドメインは、抗体またはその結合断片（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはＦ（ａｂ））、サソリポリペプチド、ダイアボディ、フレキシボディ、ＤＯＣＫ－ＡＮＤ－ＬＯＣＫ（商標）抗体、またはモノクローナル抗イディオタイプ抗体（ｍＡｂ２）を含み得る。いくつかの実施形態では、二分ポリペプチドの構造は、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））、Ｔａｎｄａｂ（登録商標）、二重特異性Ｔ細胞会合（ＢｉＴＥ（商標））、ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）、または二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、二分ポリペプチドは、ＢｉＴＥであり、表６及び／または表７に示す抗原と特異的に結合するドメインを含む。例示的なＢｉＴＥを以下の表５に示す。
Figure 2022507269000006
いくつかの実施形態では、エフェクター細胞に発現される細胞表面抗原は、以下の表６から選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞またはエフェクター細胞に発現する細胞表面抗原は、以下の表７から選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞に発現する細胞表面抗原は、腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＥｐｈＡ２、ＭＣＳＰ、ＡＤＡＭ１７、ＰＳＣＡ、１７－Ａ１、ＮＫＧＤ２リガンド、ＣＳＦ１Ｒ、ＦＡＰ、ＧＤ２、ＤＬＬ３、またはニューロピリンから選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＥｐＣａｍ、ＤＬＬ３、及びＣＥＡから選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、表７に列挙されるものから選択される。
Figure 2022507269000007
Figure 2022507269000008
Figure 2022507269000009
ＩＩＩ．自己複製ポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を産生する方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、１つ以上のベクターを使用してインビトロで産生される。「ベクター」という用語は、別の核酸分子を輸送または運搬することができる核酸分子を指すために本明細書で使用される。輸送される核酸は、通常、ベクター核酸分子に挿入される。ベクターは、細胞内で自律複製を誘導する配列を含み得、及び／または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチドをプラスミド骨格に挿入することによって産生される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、１つ以上のウイルスベクターを使用して産生される。ウイルスベクターは、時に、「組み換えウイルス」または「ウイルス」と称され得る。いくつかの実施形態では、２つのベクターシステムが使用される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ由来のＩＴＲと隣接する。次に、ＩＴＲ隣接ポリヌクレオチドを第１の発現ベクターに挿入し、ＩＴＲを媒介した複製に必要なＡＡＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）を第２の発現ベクターに挿入する。かかる実施形態では、第１及び第２のベクターは、細胞内で好適な宿主細胞（例えば、昆虫細胞株）に送達され（例えば、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーションなどによる）、ＩＴＲ隣接ポリヌクレオチドが宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれる細胞を産生する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のベクターは、ヘルペスウイルス発現ベクターである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のベクターは、バキュロウイルス発現ベクターである。かかる発現系は、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，８：８，２０１３に記載される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＩＴＲの非存在下で産生される量よりも多い量でＩＴＲ隣接自己複製ポリヌクレオチドを産生する。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ隣接導入遺伝子でトランスフェクトされた宿主細胞からのＩＴＲ隣接ウイルスゲノムＤＮＡは、ＩＴＲを含まない同様にトランスフェクトされた導入遺伝子よりも４～６０倍多くのＤＮＡを産生し得る（例えば、組換えバキュロウイルス感染を介して）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１３を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、単一のベクター発現システムを使用してインビトロで産生される。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチドを含む発現カセットは、ＵＬ３及びＵＬ４遺伝子の間に（例えば、遺伝子間遺伝子座に）または組換えＨＳＶゲノム骨格のＩＣＰ４遺伝子座（例えば、図４Ｂ及び図５Ｂを参照されたい）の間に挿入される。ＩＴＲを媒介した複製に必要なＡＡＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）を含む第２の発現カセットが、組換えＨＳＶ骨格のＩＣＰ０またはＩＣＰ４遺伝子座に挿入される。Ｒｅｐタンパク質の発現により、単一のベクターからＩＴＲ隣接ポリヌクレオチドを効率的に複製できる。いくつかの実施形態では、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、制御可能または誘導性プロモーターに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、好適な宿主細胞に対して細胞内で（例えば、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーションなどによる）、ＩＴＲ隣接自己複製ポリヌクレオチドを含む発現カセット及びＩＴＲを媒介した複製に必要なＡＡＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含むＨＳＶベクターによって産生される。好適な宿主細胞には、昆虫及び哺乳動物細胞株が含まれる。ＨＳＶベクターを含む宿主細胞を適切な時間で培養すると、挿入された発現カセットの発現及び組換えＤＮＡ分子の産生が可能となる。次に、組換えＤＮＡ分子は、宿主細胞ＤＮＡから単離され、治療的使用のために製剤化される（例えば、粒子にカプセル化される）。
いくつかの実施形態では、上記のＡＡＶ－ＩＴＲシステムによって産生された組換えＤＮＡ分子は、各末端で一緒に共有結合した２つの一本鎖ＤＮＡ分子の産生をもたらす。例えば、第１の分子の５’ＩＴＲは、第２のＤＮＡ分子の３’ＩＴＲと共有結合し、第１の分子の３’ＩＴＲは、第２のＤＮＡ分子の５’ＩＴＲと共有結合する。かかる実施形態では、共有結合したＩＴＲ隣接ポリヌクレオチドは、本明細書ではＮａｎｏＶ分子と称される、末端閉鎖した、線状の二本鎖腫瘍溶解性ウイルス核酸分子を形成する。いくつかの実施形態では、一本鎖ＤＮＡ分子の各々は、単一のＩＴＲ隣接ポリヌクレオチドを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＮａｎｏＶ分子は２つのｓｓＤＮＡ分子を含み、１つのｓｓＤＮＡ分子は、５’－ＩＴＲ－［自己複製ポリヌクレオチドのセンス配列］－ＩＴＲ－３’の構造を含み、１つのｓｓＤＮＡ分子は、３’－ＩＴＲ－［自己複製ポリヌクレオチドのアンチセンス配列］－ＩＴＲ－３’の構造を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖ＤＮＡ分子の各々は、２つ以上のＩＴＲ隣接ポリヌクレオチド（すなわち、ＩＴＲ隣接ポリヌクレオチドのコンカンタマー）を含む。ＩＴＲ隣接ポリヌクレオチドのコンカンタマーは、様々な方向を有することができる。例えば、いくつかの実施形態では、コンカンタマーは、ヘッドトゥーヘッド方向またはテイルトゥーテイル方向で形成される。
ＩＶ．自己複製ポリヌクレオチドを含む粒子
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、「粒子」にカプセル化される。本明細書で使用される場合、粒子は、リポソーム、リポプレックス、ナノ粒子、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、エクソソーム、小胞などの物質の非組織由来組成物を指す。特定の実施形態では、粒子は、非タンパク質性及び非免疫原性である。かかる実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドのカプセル化は、全身性の抗ウイルス免疫応答を誘導することなくウイルスペイロードの送達を可能にし、抗ウイルス抗体を中和する効果を軽減する。さらに、本明細書に記載のポリヌクレオチドのカプセル化は、ポリヌクレオチドを分解から保護し、標的宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入を容易にする。
いくつかの実施形態では、粒子は、対象において生分解性である。かかる実施形態では、粒子の複数の用量は、対象に粒子を蓄積することなく対象に投与することができる。好適な粒子の例には、ポリスチレン粒子、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）ＰＬＧＡ粒子、ポリペプチ系カチオン性ポリマー粒子、シクロデキストリン粒子、キトサン粒子、脂質系粒子、ポリ（β－アミノエステル）粒子、低分子－重量ポリエチレンイミン粒子、ポリホスホエステル粒子、ジスルフィド架橋ポリマー粒子、ポリアミドアミン粒子、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）粒子、及びＰＬＵＲＩＯＮＩＣＳ安定化ポリプロピレンスルフィド粒子が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、無機粒子にカプセル化される。いくつかの実施形態では、無機粒子は、金ナノ粒子（ＧＮＰ）、金ナノロッド（ＧＮＲ）、磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）、磁性ナノチューブ（ＭＮＴ）、カーボンナノホーン（ＣＮＨ）、カーボンフラーレン、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ＣＰＮＰ）、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）、シリカナノチューブ（ＳＮＴ）、または星状中空シリカナノ粒子（ＳＨＮＰ）である。
Ａ．エクソソーム
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、エクソソームにカプセル化される。エクソソームは、エンドサイトーシス起源の小さな膜小胞であり、多小胞体が親細胞（例えば、エクソソームが放出される細胞、本明細書ではドナー細胞とも称される）との融合に続いて細胞外環境に放出される。エクソソームの表面は、親細胞の細胞膜に由来する脂質二重層を含み、親細胞表面に発現される膜タンパク質をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、エクソソームは、親細胞からのサイトゾルをさらに含み得る。エクソソームは、上皮細胞、Ｂ及びＴリンパ球、肥満細胞（ＭＣ）、樹状細胞（ＤＣ）を含む多くの異なる細胞種によって産生され、血漿、尿、気管支肺胞洗浄液、腸上皮細胞、及び腫瘍組織で同定されている。エクソソームの組成は、それらが由来する親細胞種に依存するため、「エクソソーム特異的」タンパク質は存在しない。しかしながら、多くのエクソソームは、エクソソームが親細胞に由来する細胞内小胞に関連するタンパク質を含む（例えば、エンドソーム及びリソソームに関連する及び／またはそれらによって発現されるタンパク質）例えば、エクソソームは、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ及びＩＩ（ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩ）などの抗原提示分子、テトラスパニン（例えば、ＣＤ６３）、いくつかの熱ショックタンパク質、アクチン及びチューブリンなどの細胞骨格成分、細胞内膜融合に関与するタンパク質、細胞間相互作用分子（例えば、ＣＤ５４）、シグナル伝達タンパク質、及び細胞質ゾル酵素に濃縮され得る。
エクソソームは、エクソソーム膜を標的細胞の原形質膜と融合させることにより、１つの細胞（例えば、親細胞）から標的またはレシピエント細胞への細胞タンパク質の移動を媒介し得る。したがって、エクソソームによってカプセル化される物質を修飾することにより、本明細書に記載のポリヌクレオチドなどの外因性薬剤を標的細胞に導入することができるメカニズムが提供される。１つ以上の外因性薬剤（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド）を含むように修飾されているエクソソームは、本明細書では「修飾エクソソーム」と称される。いくつかの実施形態では、修飾エクソソームは、外因性薬剤（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド）の導入によって産生され、親細胞に導入される。かかる実施形態では、外因性核酸は、外因性核酸自体、または外因性核酸の転写物が親細胞から産生される修飾エクソソームに組み込まれるように、親のエクソソーム産生細胞に導入される。外因性核酸は、当技術分野で即知である手段、例えば、外因性核酸の形質導入、トランスフェクション、形質転換、及び／またはマイクロインジェクションによって親細胞に導入することができる。
いくつかの実施形態では、修飾エクソソームは、本明細書に記載のポリヌクレオチドをエクソソームに直接的に導入することによって産生される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、無傷エクソソームに導入される。「無傷エクソソーム」とは、それらが産生される親細胞に由来するタンパク質及び／または遺伝物質を含むエクソソームを指す。無傷エクソソームを得るための方法は当技術分野で即知である（例えば、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１ Ａｐｒ；２９（４）：３４－５、Ｏｈｎｏ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１３ Ｊａｎ；２１（ｌ）：１８５－９１、及びＥＰ特許公開第２０１０６６３号を参照されたい）。
特定の実施形態では、外因性薬剤（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド）は、空のエクソソームに導入される。「空のエクソソーム」とは、親細胞に由来するタンパク質及び／または遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を欠くエクソソームを指す。空のエクソソーム（例えば、親細胞由来の遺伝物質を欠く）を産生する方法は、当技術分野で即知であり、ＵＶ曝露、エクソソームへの核酸の負荷を媒介する内因性タンパク質の変異／欠失、ならびに内因性遺伝物質が開いた細孔を通ってエクソソームから出て行くように、エクソソーム膜の細孔を開くためのエレクトロポレーション及び化学的処理を含む。いくつかの実施形態では、空のエクソソームは、エクソソーム膜を得るために約９～約１４のｐＨを有する水溶液で処理することによってエクソソームを開き、小胞内成分を除去し（例えば、小胞内タンパク質及び／または核酸）、エクソソーム膜を再組み立てして空のエクソソームを形成することによって産生される。いくつかの実施形態では、小胞内成分（例えば、小胞内タンパク質及び／または核酸）は、超遠心分離または密度勾配超遠心分離によって除去される。いくつかの実施形態では、膜は、超音波処理、機械的振動、多孔質膜からの押し出し、電流、またはこれらの技術のうちの１つ以上の組み合わせによって再組み立てされる。特定の実施形態では、膜は、超音波処理によって再組み立てされる。
いくつかの実施形態では、修飾エクソソームを産生するための外因性薬剤（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド）による無傷または空のエクソソームの負荷は、インビトロでの形質転換、トランスフェクション、及び／またはマイクロインジェクションなどの従来の分子生物学技術を使用して達成することができる。いくつかの実施形態では、外因性薬剤（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド）は、エレクトロポレーションによって無傷または空のエクソソームに直接的に導入される。いくつかの実施形態では、外因性薬剤（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド）は、リポフェクション（例えば、トランスフェクション）によって無傷または空のエクソソームに直接的に導入される。本開示によるエクソソームの産生に使用するのに好適なリポフェクションキットは当技術分野で知られており、市販されている（例えば、ＲｏｃｈｅからのＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００）。いくつかの実施形態では、外因性薬剤（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド）は、熱ショックを使用した形質転換によって無傷または空のエクソソームに直接的に導入される。かかる実施形態では、親細胞から単離したエクソソームは、エクソソーム膜を透過性にするために、Ｃａ２＋（ＣａＣｌ２中）などの二価カチオンの存在下で冷却される。次に、エクソソームを外因性核酸とインキュベートし、短時間熱ショックを与えることができる（例えば、４２℃で３０～１２０秒間インキュベート）。特定の実施形態では、外因性核酸が環状ＤＮＡプラスミドである場合、熱ショック法を使用する無傷または空のエクソソームの形質転換が使用される。特定の実施形態では、外因性薬剤（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド）を有する空のエクソソームの負荷は、小胞内成分の除去後に薬剤をエクソソーム膜と混合または同時注入することによって達成することができる。したがって、エクソソーム膜から再組み立てされた修飾エクソソームは、外因性薬剤を小胞内空間に組み込むであろう。エクソソームカプセル化核酸を産生するための追加の方法は、当技術分野で即知である（例えば、米国特許第９，８８９，２１０号、同第９，６２９，９２９号、及び同第９，０８５，７７８号、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１６１０１０号及び同第ＷＯ２０１８／０３９１１９号を参照されたい）。
エクソソームは、細胞株、骨髄由来細胞、及び初代患者試料に由来する細胞を含む、多数の異なる親細胞から得ることができる。親細胞から放出されたエクソソームは、当技術分野で即知である手段によって親細胞培養物の上清から単離することができる。例えば、エクソソームの物理的特性を利用して、電荷（例えば、電気泳動分離）、サイズ（例えば、ろ過、分子ふるいなど）、密度（例えば、通常または勾配遠心分離）、及びスベドベルグ定数（例えば、外力の有無による沈降など）に基づく分離を含む、培地または他の源からエクソソームを分離することができる。代替的または追加的に、単離は、１つ以上の生物学的特性に基づくことができ、表面マーカーを使用できる方法を含む（例えば、沈殿、固相への可逆的結合、ＦＡＣＳ分離、特異的リガンド結合、非特異的リガンド結合など）。エクソソーム表面タンパク質の分析は、ＣＤ６３などのエクソソーム関連タンパク質に対する蛍光標識抗体を使用したフローサイトメトリーによって決定できる。エクソソームを特徴付けするための追加のマーカーは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１６１０１０に記載される。さらにさらに企図された方法では、エクソソームは、ＰＥＧ誘導融合及び／または超音波融合を含む化学的及び／または物理的方法を使用して融合することもできる。
いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーを利用して、エクソソームを単離することができる。いくつかの実施形態では、エクソソームは、当技術分野で一般的に知られているように、遠心分離技術（１つ以上のクロマトグラフィー画分の）によるクロマトグラフィー分離後にさらに単離することができる。いくつかの実施形態では、エクソソームの単離は、前述のような分画遠心分離（例えば、Ｒａｐｏｓｏ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３，１１６１－１１７２（１９９６））、超遠心分離、サイズ系膜濾過、濃縮、及び／または比率ゾーン遠心分離を含むがこれに限定されない方法の組み合わせを伴い得る。
いくつかの実施形態では、エクソソーム膜は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、及びホスファチジルセリンのうちの１つ以上を含む。さらに、膜は、１つ以上のポリペプチド及び１つ以上の多糖、例えばグリカンを含むことができる。例示的なエクソソーム膜組成物及び１つ以上の膜成分の相対量を修飾するための方法は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／０３９１１９号に記載される。
好ましくは、本明細書に記載の粒子は、溶解性を高め、インビボでの凝集によって引き起こされる可能性のある合併症を回避し、飲作用を促進するために、サイズがナノスコピックである。いくつかの実施形態では、粒子は、約１０００ｎｍ未満の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約５００ｎｍ未満の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約３０～約１００ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、または約７５～約１００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約３０～約７５ｎｍ、または約３０～約５０ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約１００～約５００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約２００～４００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約３５０ｎｍの平均サイズを有する。
いくつかの実施形態では、粒子はエクソソームであり、約３０～約１００ｎｍ、約３０～約２００ｎｍ、または約３０～約５００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子はエクソソームであり、約１０ｎｍ～約１００ｎｍ、約２０ｎｍ～約１００ｎｍ、約３０ｎｍ～約１００ｎｍ、約４０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約１５０ｎｍ、約１５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２５０ｎｍ、約２５０ｎｍ～約５００ｎｍ、または約１０ｎｍ～約１０００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子はエクソソームであり、約２０ｎｍ～３００ｎｍ、約４０ｎｍ～２００ｎｍ、約２０ｎｍ～２５０ｎｍ、約３０ｎｍ～１５０ｎｍ、または約３０ｎｍ～１００ｎｍの直径を有する。
Ｂ．脂質ナノ粒子
特定の実施形態では、本明細書に記載の組換えＤＮＡ分子は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル化される。特定の実施形態では、ＬＮＰは、トリグリセリド（例えば、トリステアリン）、ジグリセリド（例えば、グリセロールバヘネート）、モノグリセリド（例えば、グリセロールモノステアレート）、脂肪酸（例えば、ステアリン酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）、及びワックス（例えば、パルミチン酸セチル）などの１つ以上の脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上のカチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上のカチオン性脂質、コレステロール、及び１つ以上の中性脂質を含む。
カチオン性脂質は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を帯びる多くの脂質種のいずれかを指す。かかる脂質には、これらに限定されないが、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＭＡ）、ジステアリールジメチルアンモニウム（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－臭化ジメチルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、及びＮ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）が含まれる。例えば、生理学的ｐＨを下回る正電荷を有するカチオン性脂質には、これらに限定されないが、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、及びＤＭＤＭＡが含まれる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、Ｃ１８アルキル鎖、頭部とアルキル鎖との間のエーテル結合、及び０～３の二重結合を含む。かかる脂質には、例えば、ＤＳＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、及びＤＯＤＭＡが含まれる。カチオン性脂質は、エーテル結合及びｐＨ滴定可能な頭部を含み得る。かかる脂質には、例えば、ＤＯＤＭＡが含まれる。追加のカチオン性脂質は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７４５，６５１号、同第５，２６４，６１８号、同第５，２７９，８３３号、同第５，２８３，１８５号、同第５，７５３，６１３号、同第５，７８５，９９２号に記載される。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、プロトン化可能な第三級アミン頭部を含む。かかる脂質は、本明細書ではイオン化可能な脂質と称される。イオン化可能な脂質は、イオン化可能なアミン頭部を含み、通常、約７未満のｐＫａを含む脂質種を指す。したがって、酸性ｐＨの環境では、イオン化可能なアミン頭部は、イオン化可能な脂質が負に帯電した分子（例えば、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドなどの核酸）と優先的に相互作用するようにプロトン化され、したがってナノ粒子の組み立て及びカプセル化を促進する。したがって、いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、脂質ナノ粒子への核酸の負荷を増加させることができる。ｐＨが約７よりも大きい環境（例えば、生理学的ｐＨが約７．４）では、イオン化可能な脂質は中性電荷を含む。イオン化可能な脂質を含む粒子がエンドソームの低ｐＨ環境（例えば、ｐＨ＜７）に取り込まれると、イオン化可能な脂質は再びプロトン化され、陰イオン性エンドソーム膜と結合して、粒子によってカプセル化された内容物の放出を促進する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、及びＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡから選択されるイオン化可能な脂質である。いくつかの実施形態では、カチオン性イオン化可能脂質は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上の非カチオン性ヘルパー脂質（中性脂質）を含む。例示的な中性ヘルパー脂質には、（１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）（ＤＬＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤｉＰＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（ｌ’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、セラミド、スフィンゴミエリン、及びコレステロールが含まれる。
本明細書に記載のリポソーム及び薬学的組成物におけるＮ－オクタノイル－スフィンゴシン－ｌ－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）－２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ－２０００）を含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質及び誘導体化セラミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）などの誘導体化脂質の使用ならびに包含は、好ましくは、本明細書に開示される化合物及び脂質のうちの１つ以上と組み合わせてさらに企図される。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１つ以上のＣ６－Ｃ２０アルキルを含む脂質と共有結合した最大５ｋＤａの長さのポリ（エチレング）グリコール鎖を含む１つ以上のＰＥＧ修飾脂質をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、脂質ナノ粒子の総脂質含有量の約０．１％～約１％で含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、脂質ナノ粒子の総脂質含有量の約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、または約１．０％で含まれる。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質はＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、１つ以上のヘルパー脂質はコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、１つ以上のヘルパー脂質はＤＬＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、１つ以上のヘルパー脂質はＤＳＰＣを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、１つ以上のヘルパー脂質はＤＯＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び少なくとも２つのヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰであり、少なくとも２つのヘルパー脂質は、コレステロール及びＤＬＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び少なくとも２つのヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質はＭＣ３であり、少なくとも２つのヘルパー脂質は、コレステロール及びＤＳＰＣを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのヘルパー脂質は、コレステロール及びＤＯＰＥを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのヘルパー脂質は、コレステロール及びＤＳＰＣを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び少なくとも３つのヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰであり、少なくとも３つのヘルパー脂質は、コレステロール、ＤＬＰＥ、及びＤＳＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質及び少なくとも３つのヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質はＭＣ３であり、少なくとも３つのヘルパー脂質は、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＤＭＧを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも３つのヘルパー脂質は、コレステロール、ＤＯＰＥ、及びＤＳＰＥを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも３つのヘルパー脂質は、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＤＭＧを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール、及びＤＬＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＭＣ３、コレステロール、及びＤＳＰＣを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール、及びＤＯＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール、ＤＬＰＥ、及びＤＳＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＭＣ３、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＤＭＧを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール、ＤＬＰＥ、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＭＣ３、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＤＭＧ－ＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール、ＤＯＰＥ、及びＤＳＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール、ＤＯＰＥ、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧを含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＬＰＥを含み、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ：ＤＬＰＥの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約５０：３５：１５である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＤＬＰＥを含み、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約５０：３５：１５である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＴＡＰ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ＤＬＰＥ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧを含み、ＤＯＴＰ：Ｃｈｏｌ：ＤＬＰＥの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約５０：３５：１５であり、粒子は、約０．２％のＤＳＰＥ－ＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＭＣ３、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ＤＳＰＣ、及びＤＭＧ－ＰＥＧを含み、ＭＣ３：Ｃｈｏｌ：ＤＳＰＣ：ＤＭＧ－ＰＥＧの比率（総脂質含有量のパーセンテージとして）が、約４９：３８．５：１１：１．５である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン化可能な脂質、例えば、７．ＳＳ－切断可能であり、ｐＨ応答性の脂質様物質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳシリーズなど）を含む。本開示の製剤化及び方法に好適なカチオン性またはイオン化可能な脂質の追加の例は、例えば、ＷＯ２０１８０８９５４０Ａ１、ＷＯ２０１７０４９２４５Ａ２、ＵＳ２０１５０１７４２６１、ＵＳ２０１４３０８３０４、ＵＳ２０１５３７６１１５、ＷＯ２０１／１９９９５２、及びＷＯ２０１６／１７６３３０に記載される。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、標的細胞によるナノ粒子の取り込みを調節または促進するために、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）でコーティングされる（図２）。ＧＡＧは、ヘパリン／ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、またはヒアルロン酸（ＨＡ）であり得る。特定の実施形態では、ナノ粒子の表面は、ＨＡでコーティングされ、腫瘍細胞による取り込みのための粒子を標的とする。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸トリペプチド（ＲＧＤペプチド）でコーティングされる（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４，２０１２，３７４７－３７５６、及びＢｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３２（１８），２０１１，４２０５－４２１０を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約５０ｎｍ～約５００ｎｍの平均サイズを有する。例えば、いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１５０ｎｍ、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４００ｎｍ～約５００ｎｍ、約４２５ｎｍ～約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ～約５００ｎｍ、または約４７５ｎｍ～約５００ｎｍの平均サイズを有する。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約－２０ｍＶ未満の平均ゼータ電位を有する。例えば、いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約－３０ｍＶ未満、約３５ｍＶ未満、または約－４０ｍＶ未満の平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約－５０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約－４０ｍＶ～約－２０ｍＶ、または約－３０ｍＶ～約－２０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰが、約－３０ｍＶ、約－３１ｍＶ、約－３２ｍＶ、約－３３ｍＶ、約－３４ｍＶ、約－３５ｍＶ、約－３６ｍＶ、約－３７ｍＶ、約－３８ｍＶ、約－３９ｍＶ、または約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の組換え核酸分子を含み、約３：１（Ｌ：Ｎ）の脂質（Ｌ）対核酸（Ｎ）の比率を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の組換え核酸分子を含み、約４：１、約５：１、約６：１、または約７：１のＬ：Ｎ比率を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の組換え核酸分子を含み、約４．５：１、約４．６：１、約４．７：１、約４．８：１、約４．９：１、約５：１、約５．１：１、約５．２：１、約５．３：１、約５．４：１、または約５．５：１のＬ：Ｎ比率を含む。
Ｖ．治療用組成物及び使用方法
本開示の一態様は、本明細書に記載の組換え核酸分子を含む治療用組成物、または本明細書に記載の組換え核酸分子を含む粒子、及びがんの治療方法に関する。本明細書に記載の組成物は、所望の送達経路に適した任意の方法で製剤化することができる。典型的には、製剤には、誘導体またはプロドラッグ、溶媒和物、立体異性体、ラセミ体、またはそれらの互変異性体を含むすべての生理学的に許容される組成物と、任意の薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／または賦形剤が含まれる。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤」には、これらに限定されないが、任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、染料／着色剤、風味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤が含まれ、これは、米国食品医薬品局によって、ヒトまたは家畜動物での使用が許容されるものとして承認されている。例示的な薬学的に許容される担体には、これらに限定されないが、乳糖、ブドウ糖、ショ糖などの糖；コーンスターチ及びジャガイモデンプンなどの澱粉；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロースなどのセルロースならびにその誘導体；トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバター、ワックス、動植物性脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；カンテン；水酸化マグネシウムや水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびに薬学的製剤に利用される任意の他の適合性物質が含まれる。
「薬学的に許容される塩」には、酸及び塩基付加塩の両方が含まれる。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が含まれ、これらは、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、ならびにこれらに限定されないが酢酸、２，２－ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４－アセトアミド安息香酸、樟脳酸、樟脳－１０－スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン－１，２－ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２－オキソ－グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン－１，５－ジスルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、１－ヒドロキシ－２－ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロト酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４－アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐトルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸などの有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩などの無機塩基から誘導することができる。有機塩基に由来する塩には、これらに限定されないが、一級、二級、及び三級アミンの塩、アンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール、２－ジメチルアミノエタノール、２－ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベネタミン、ベンザチン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ－エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などの天然に存在する置換アミン、環状アミン、及び塩基性イオン交換樹脂を含む置換アミンが含まれる。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、及びカフェインである。
本開示は、がん性細胞への組成物の細胞内送達に十分な条件下で、本明細書に記載のポリヌクレオチドもしくは粒子、またはその組成物に細胞を曝露することを含む、がん性細胞または標的細胞を殺傷する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「がん性細胞」または「標的細胞」は、本明細書に記載のポリヌクレオチドもしくは粒子、または本明細書に記載のその組成物による治療または投与のために選択される哺乳動物細胞を指す。本明細書で使用される場合、「がん性細胞を殺傷する」とは、特に、アポトーシスまたはネクローシスによるがん性細胞の死を指す。がん性細胞の殺傷は、腫瘍サイズ測定、細胞数、ならびにアネキシンＶなどの細胞死マーカーの検出及びヨウ化プロピジウムの取り込みについてのフローサイトメトリーを含むがこれらに限定されない、当技術分野で即知である方法によって決定され得る。
本開示は、がんを治療または予防するための方法をそれを必要とする対象においてさらに提供し、有効量の本明細書に記載の治療用組成物が対象に投与される。投与経路は、当然、治療される疾患の位置及び性質によって異なり得、例えば、皮内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、真皮下、非経口、経鼻、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、気管内、腹腔内、腫瘍内、灌流、洗浄、直接的注入、及び経口投与を含み得る。本明細書に記載のカプセル化ポリヌクレオチド組成物は、転移性がんの治療において特に有用であり、全身投与は、組成物を複数の器官及び／または細胞種に送達するために必要であり得る。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、全身的に投与される。
本明細書で互換的に使用される「有効量」または「有効用量」は、疾患または状態の症状の改善または向上をもたらす、本明細書に記載の組成物の量及び／または用量を指す。改善とは、疾患もしくは状態、または疾患もしくは状態の症状の任意の改善または向上である。改善は、観察可能または測定可能な改善であるか、または対象が一般的に良好であると感じるような改善であり得る。したがって、当業者は、治療が疾患状態を改善する可能性があるが、疾患の完全な治癒ではない可能性があることを認識する。対象における改善には、これらに限定されないが、減少した腫瘍量、減少した腫瘍細胞増殖、増加した腫瘍細胞死、免疫経路の活性化、増加した腫瘍進行までの時間、減少したがん性疼痛、増加した生存、または生活の質の改善が含まれる。
いくつかの実施形態では、有効用量の投与は、本明細書に記載の組成物の単回用量の投与で達成され得る。本明細書で使用される場合、「用量」は、一度に送達される組成物の量を指す。いくつかの実施形態では、用量は、所与の体積中の粒子の数によって測定され得る（例えば、粒子／ｍＬ）。いくつかの実施形態では、用量は、各粒子に存在する本明細書に記載のポリヌクレオチドのゲノムコピー数によってさらに洗練され得る（例えば、各粒子が、ポリヌクレオチドの少なくとも１つのゲノムコピーを含む、粒子数／ｍＬ）。いくつかの実施形態では、有効量の送達は、本明細書に記載の組成物の複数回の投与を必要とし得る。したがって、有効用量の投与は、本明細書に記載の組成物の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、またはそれ以上の用量の投与を必要とし得る。
本明細書に記載の組成物の複数の用量が投与される実施形態では、各用量は、同じ人物によって及び／または同じ地理的位置で投与される必要はない。さらに、投薬は、所定のスケジュールに従って投与され得る。例えば、所定の投薬スケジュールは、本明細書に記載の組成物の用量を、毎日、隔日、毎週、隔週、毎月、隔月、毎年、半年ごとなどに投与することを含み得る。所定の投薬スケジュールは、所与の患者に対して必要に応じて調整することができる（例えば、投与される組成物の量は増加または減少させることができ、及び／または用量の頻度は増加または減少させることができ、及び／または投与される用量の総数は増加または減少させることができる）。
本明細書で使用される場合、「予防」または「予防法」は、疾患の症状の完全な予防、疾患の症状の発症の遅延、またはその後に発症する疾患の症状の重症度の軽減を意味し得る。
本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、本明細書に記載の組成物が本明細書に記載の方法に従って投与される任意の哺乳動物対象を意味すると解釈される。特定の実施形態では、本開示の方法は、ヒト対象を治療するために利用される。本開示の方法は、非ヒト霊長類（例えば、サル、ヒヒ、及びチンパンジー）、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、ウサギ、ヤギ、シカ、ヒツジ、フェレット、スナネズミ、モルモット、ハムスター、コウモリ、トリ（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル）、サカナ、及び爬虫類を治療するためにさらに利用され得る。
本明細書における「がん」は、典型的には、無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指すか、または説明する。がんの例には、これらに限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫（脂肪肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、平滑筋肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、横紋筋肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、軟骨肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍、中皮腫、滑膜肉腫、神経鞘腫、髄膜腫、腺癌、メラノーマ、及び白血病またはリンパ性悪性腫瘍が含まれる。かかるがんのより詳細な例には、扁平上皮癌（例えば、上皮扁平上皮癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌腫、及び肺扁平上皮癌腫を含む肺癌、小細胞肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化器癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ）または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ）、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道腫瘍、ユーイング腫瘍、基底細胞癌腫、腺癌腫、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌腫、嚢胞腺癌腫、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎細胞癌腫、肝細胞癌腫、胆管癌腫、絨毛癌腫、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫瘍、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、骨髄異形成症候群、重鎖疾患、神経内分泌腫瘍、神経鞘腫、及び他の癌腫、ならびに頭頸部癌が含まれる。さらに、良性（すなわち、非癌性）の過剰増殖性疾患、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、髄膜腫、神経鞘腫、神経線維腫症、ケロイド、筋腫及び子宮筋腫などを含む障害ならびに状態もまた、本明細書に開示される開示を使用して治療され得る。
ＶＩ．例示的な自己複製ポリヌクレオチド
当業者は、コードされたウイルスの性質が様々であり、治療される疾患の適応症に依存することを理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、ポリオウイルスは、特定のがんの治療に使用され得る。ポリオウイルスのゲノムは、単一のポリタンパク質をコードする一本鎖、ポジティブセンス極性ＲＮＡ分子を含む。５’非翻訳領域（ＵＴＲ）には、クローバー型及び内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の２つの機能ドメインを保有し、ウイルスタンパク質ＶＰｇと共有結合する。３’ＵＴＲは、ポリアデニル化される（例えば、図６Ａを参照されたい）。いくつかの実施形態では、ポリオウイルスゲノムは、ＡＡＶ由来のＩＴＲによって５’及び３’末端に隣接される（例えば、図６Ａを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、ウイルス遺伝子、例えば、必須ウイルス遺伝子と作動可能に連結される。例えば、ポリオウイルスゲノムは、これらに限定されないが、３Ｄｐｏｌ、その機能はウイルスＲＮＡゲノムの複数のコピーを作製することであるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；２Ａｐｒｏ及び３Ｃｐｒｏ／３ＣＤｐｒｏ、ウイルスポリペプチドＶＰｇ（３Ｂ）を切断するプロテアーゼ、ウイルスＲＮＡと結合し、ウイルスのポジティブ及びネガティブ鎖ＲＮＡの合成に必要なタンパク質；ウイルス複製に必要なタンパク質複合体を含む２ＢＣ、２Ｂ、２Ｃ（ＡＴＰａｓｅ）、３ＡＢ、３Ａ、３Ｂタンパク質、さらにＶＰ２及びＶＰ４、ＶＰ１及びＶＰ３に切断されるＶＰ０、ウイルスカプシドのタンパク質を含む、この目的に好適ないくつかの遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ減衰化ポリオウイルスゲノムは、ポリヌクレオチド複製及び核侵入を助けるために、ＡＡＶ由来のＩＴＲ配列によって隣接される（例えば、図６Ｂを参照されたい）。必要に応じて他の遺伝子を選択することもできる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、遺伝子座内の位置にｍｉＲＮＡ標的配列を挿入することにより、ウイルス遺伝子、例えば必須ウイルス遺伝子と機能的に連結され、機能的なポリペプチドをコードする遺伝子の能力を維持しながら、ｍｉＲＮＡ標的配列の転写をもたらす。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ウイルス遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列がインフレームであり、ポリペプチドの２つ以上の機能的タンパク質への翻訳及び翻訳後切断を可能にするように、例えば、２つのポリペプチドのコード配列の間などのオープンリーディングフレームに挿入される。例えば、ｍｉＲＮＡ標的配列は、２つの２Ａペプチド配列と、ｍｉＲＮＡ標的配列の挿入部位の下流（３’）のポリペプチド配列のリーディングフレームを保存するために必要に応じて追加される追加のヌクレオチドとの間に挿入され得る。
いくつかの実施形態では、野生型ポリオウイルスゲノムは、１つ以上の必須ポリオウイルス遺伝子を減衰するために、四量体ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－３４ａ、及びｌｅｔ７標的部位を含むｍｉＲＮＡ標的配列カセットを３’ＵＴＲに挿入することにより修飾される（図８Ａ）。いくつかの実施形態では、このｍｉＲＮＡ減衰化ポリオウイルスは、非小細胞肺癌の治療における使用に好適である（図８Ａ）。いくつかの実施形態では、野生型ＰＶゲノムは、四量体ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－３４ａ、及びｌｅｔ７標的部位を含むｍｉＲＮＡ標的配列カセットを１つ以上の必須ポリオウイルス遺伝子の３’ＵＴＲに挿入することにより修飾される（図８Ｂ）。いくつかの実施形態では、このｍｉＲＮＡ減衰化ポリオウイルスは、肝細胞癌腫の治療における使用に好適である（図８Ｂ）。いくつかの実施形態では、野生型ポリオウイルスゲノムは、１つ以上の必須ポリオウイルス遺伝子を減衰するために、四量体ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１４５、及びｌｅｔ７標的部位を含むｍｉＲＮＡ標的配列カセットを３’ＵＴＲに挿入することにより修飾される（図８Ｃ）。いくつかの実施形態では、このｍｉＲＮＡ減衰化ポリオウイルスは、前立腺癌の治療における使用に好適である（図８Ｃ）。
いくつかの実施形態では、ＶＳＶは、特定のがんの治療に使用され得る。ＶＳＶゲノムは、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、及びポリメラーゼ（Ｌ）の５つの主要なタンパク質をコードする一本鎖、ネガティブセンス極性ＲＮＡ分子を含む。５つのウイルスコードされたタンパク質の各々に１つのモノシストロン性ｍＲＮＡが存在する。ｍＲＮＡはキャップされ、メチル化され、ポリアデニル化される。ＶＳＶは細胞質のネガティブセンスＲＮＡウイルスであるため、ｍＲＮＡの合成及び修飾のための酵素は、ビリオンに封入される（図９Ａ）。いくつかの実施形態では、ＶＳＶゲノムは、ポリヌクレオチド複製及び核侵入を助けるために、ＡＡＶ由来のＩＴＲ配列によって隣接される（図９Ａ）。
いくつかの実施形態では、野生型ＶＳＶゲノムは、ＶＳＶゲノムの１つ以上の必須ウイルス遺伝子（例えば、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、またはＬ遺伝子のうちの１つ以上）の遺伝子座に挿入された１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含むｍｉＲＮＡ標的配列カセットの挿入によって修飾される（図９Ｂ）。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入される。いくつかの実施形態では、野生型ＶＳＶゲノムは、減衰するために、四量体ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－３４ａ、及びｌｅｔ７標的部位を含むｍｉＲＮＡ標的配列カセットを５つのウイルスコード転写物のうち４つ（例えば、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、またはＬ遺伝子のうちの４つ）の３’ＵＴＲに挿入することにより修飾される（図１１Ａ）。いくつかの実施形態では、このｍｉＲＮＡ減衰化ＶＳＶは、肝細胞癌腫の治療における使用に好適である（図１１Ａ）。いくつかの実施形態では、野生型ＶＳＶゲノムは、減衰するために、四量体ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１４５、及びｌｅｔ７標的部位を含むｍｉＲＮＡ標的配列カセットを５つのウイルスコード転写物のうち４つ（例えば、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、またはＬ遺伝子のうちの４つ）の３’ＵＴＲに挿入することにより修飾される（図１１Ｂ）。いくつかの実施形態では、このｍｉＲＮＡ減衰化ＶＳＶは、前立腺癌の治療における使用に好適である（図１１Ｂ）。いくつかの実施形態では、野生型ＶＳＶゲノムは、減衰するために、四量体ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－３４ａ、及びｌｅｔ７標的部位を含むｍｉＲＮＡ標的配列カセットを５つのウイルスコード転写物のうち４つ（例えば、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、またはＬ遺伝子のうちの４つ）の３’ＵＴＲに挿入することにより修飾される（図１１Ｃ）。いくつかの実施形態では、このｍｉＲＮＡ減衰化ＶＳＶは、非小細胞肺癌の治療における使用に好適である（図１１Ｃ）。
いくつかの実施形態では、アデノウイルスは、特定のがんの治療に使用され得る。ＡＡＶゲノムは、２４～３６個のタンパク質コーディング遺伝子をコードする二本鎖ＤＮＡ分子を含む。Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、及びＥ４転写ユニットは、ウイルスの増殖周期の初期に転写される（図１２Ａ）。これらの転写ユニット内の遺伝子によってコードされるタンパク質は、主にウイルス転写の制御、ウイルスＤＮＡの複製、及び感染に対する宿主の応答の抑制に関与する。いくつかの実施形態では、アデノウイルスゲノムは、ポリヌクレオチド複製及び核侵入を助けるために、ＡＡＶ由来のＩＴＲ配列によって隣接される（図１２Ａ）。
いくつかの実施形態では、野生型ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶゲノムの１つ以上の必須ウイルス遺伝子（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、またはＥ４のうちの１つ以上）に挿入された１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含むｍｉＲＮＡ標的配列カセットの挿入によって修飾される（図１２Ｂ）。いくつかの実施形態では、野生型ＡＡＶゲノムは、四量体ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－３４ａ、及びｌｅｔ７標的部位を含むｍｉＲＮＡ標的配列カセットを１つ以上の必須遺伝子（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、またはＥ４のうちの１つ以上）の３’ＵＴＲに挿入することにより修飾される（図１３Ａ）。いくつかの実施形態では、このｍｉＲＮＡ減衰化アデノウイルスは、肝細胞癌腫の治療における使用に好適である（図１３Ａ）。いくつかの実施形態では、野生型ＡＡＶゲノムは、四量体ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１４５、及びｌｅｔ７標的部位を含むｍｉＲＮＡ標的配列カセットを１つ以上の必須遺伝子（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、またはＥ４のうちの１つ以上）の３’ＵＴＲに挿入することにより修飾される（図１３Ｂ）。いくつかの実施形態では、このｍｉＲＮＡ減衰化アデノウイルスは、前立腺癌の治療における使用に好適である（図１３Ｂ）。いくつかの実施形態では、野生型ＡＡＶゲノムは、四量体ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－３４ａ、及びｌｅｔ７標的部位を含むｍｉＲＮＡ標的配列カセットを１つ以上の必須遺伝子（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、またはＥ４のうちの１つ以上）の３’ＵＴＲに挿入することにより修飾される（図１３Ｃ）。いくつかの実施形態では、このｍｉＲＮＡ減衰化アデノウイルスは、非小細胞肺癌の治療における使用に好適である（図１３Ｃ）。
以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を説明する目的で与えられており、いかなる方法でも本開示を限定することを意味するものではない。提示の実施例は、本明細書に記載の方法ともに、提示の好ましい実施形態を代表し、例示的であり、開示の範囲を制限することを意図したものではない。特許請求の範囲によって定義される開示の精神に包括されるその中の変更及び他の使用が、当業者に生じるであろう。
実施例１：複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド構築物の操作
本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチド構築物は、標準的な分子生物学及び遺伝学技術を使用して操作ならびに製造した。特定のウイルスをコードする例示的な構築物及びこれらの構築物による治療に対応するがんを、以下の表１３、１４、及び１５に記載した。しかしながら、適切なウイルスは、ウイルスの所望の特徴及び治療されるがんの特徴に基づいて選択することができる。同様に、ｍｉＲＮＡ標的配列カセット（ｍｉＲ ＴＳ）をウイルスゲノム中の１つ以上の位置に挿入して、正常な非がん細胞でコード化ウイルスゲノムの複製を制御しながら、がん性細胞での複製を可能にすることができる。例示的な構築物は、本開示を通して記載した。作製した構成を、以下の表８に要約した。
Figure 2022507269000010
自己複製ポリヌクレオチドの設計後、構築物は、プラスミド骨格への挿入によって、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する末端逆方向反復（ＩＴＲ）を追加することにより、送達されるように操作した。プロトコル及び方法を、これら２つの特定の種類の送達メカニズム、すなわちプラスミドゲノム構築物及びＩＴＲ隣接Ｎａｎｏウイルス（ＮａｎｏＶ）構築物の設計のために開発し、以下に記載した。
実施例２：複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド構築物を含むプラスミドの設計及び生産
ＳＶＶウイルスＤＮＡをＧｅｎｓｃｒｉｐｔで合成し、ポリ（Ａ）、５’ハンマーヘッド型リボザイム、及び３’デルタ型肝炎リボザイムを、融合ＰＣＲでギブソンアセンブリを用いてベースベクターに挿入して追加した。このベースベクターは２．４ｋｂの長さであり、最小限の複製起点、及び哺乳類細胞での使用に最適化されたカナマイシン耐性カセットが含まれる（図３１Ａ）。発現カセットは、配列番号１として開示した。Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルス（ＣＶＡ２１）について類似のベクターを構築し、図３１Ｂに示した。ＣＶＡ２１発現カセットは、配列番号２として開示した。
実施例３：ＩＴＲ隣接ＮａｎｏＶ構築物の設計及び産生
ＩＴＲ隣接ＮａｎｏＶ構築物の産生について、自己複製ポリヌクレオチド構築物を、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）応答性プロモーターの制御下でＡＡＶ由来のＩＴＲに隣接する発現カセットに挿入した。図１７は、モデルＮａｎｏＶ構築物の概略図を示す。テトラサイクリン応答性プロモーターであるＴＲＥ－ｔｉｇｈｔは、ｍＣｈｅｒｒｙの発現を駆動し、これは、代替物として使用され、適切なウイルスゲノム構築物に置き換えることができる（図１７にＯＶとして示した）。テトラサイクリン制御トランス活性化因子（ｔＴＡ）の発現は、構成的プロモーターによって制御され、図１７にＵｂＣＰとして示した。このＮａｎｏＶ構築物を、Ｇａｔｅｗａｙクローニングシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してＨＳＶ－１のＵＬ３／４遺伝子間領域に挿入し、これにより、様々なＮａｎｏＶカセットを迅速に挿入できる。培養培地にテトラサイクリンを追加すると、ＴｅｔがｔＴＡと結合し、ｍＣｈｅｒｒｙ構築物の発現が妨げられる。したがって、培養培地からＴｅｔを除去すると、誘導可能なｍＣｈｅｒｒｙ発現が可能になる。さらに、第２の構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶ）の制御下にあるｉＤｉｍｅｒｉｚｅカセット（Ｔａｋａｒａ）を、ＨＳＶ－１ ＢＡＣ内のＵＬ５０／５１遺伝子間遺伝子座に挿入した。ｉＤｉｍｅｒｉｚｅカセットは、ヘテロ二量体誘導性Ｒｅｐ７８／５２発現を制御する２つの異種二量体化ドメイン（ＤｍｒＡ及びＤｍｒＣ）を含む。Ａ／Ｃヘテロ二量体ＡＰ２１９６７を培養培地に追加すると、ｉＤｉｍｅｒｉｚｅカセットが活性化され、Ｒｅｐ７８／５２発現がもたらされ、ＩＴＲ隣接ＮａｎｏＶ構築物の複製が駆動される。
ｉＤｉｍｅｒｉｚｅカセットによるＲｅｐ７８／５２発現の制御を実証するために、ベロ細胞を、ＡＰ２１９６７の存在下で０．５ｎｍ、５ｎｍ、５０ｎｍ、または５００ｎｍでｉＤｉｍｅｒｉｚｅ－Ｒｅｐカセットでトランスフェクトした。Ｒｅｐタンパク質をコードするプラスミド（ｐＣＤＮＡ－Ｒｅｐ）を陽性対照として使用した。タンパク質をトランスフェクションの２４時間後に細胞から抽出し、α－Ｒｅｐまたはα－アクチン抗体を使用してＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット分析を行った。図１８に示すように、５０ｎＭ以上のヘテロ二量体濃度は、ｉＤｉｍｅｒｉｚｅカセットからのＲｅｐ７８／５２発現を誘導した一方で、ヘテロ二量体の追加は、ｐＣＤＮＡ－Ｒｅｐトランスフェクト細胞のＲｅｐ発現レベルに影響を与えなかった。
ＮａｎｏＶ構築物の産生を実証するために、Ｕ２ＯＳ細胞を図１７に示す組換えＨＳＶ－１ベクターに感染させた。感染後３日後、感染細胞を回収し、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを精製した。このシステムによって産生されると予想されるＮａｎｏＶ単量体及び二量体を図１９Ａに示す。抽出したＤＮＡを、ＨＳＶ ＤＮＡの遊離末端を露出するために、ＮｈｅＩ及びＥｘｏＩＩＩで消化したが、ＮａｎｏＶ ＤＮＡは露出せず、閉鎖末端を有しないＤＮＡを分解した。次に、消化したＤＮＡ断片をアガロースゲルで分析し、ＮａｎｏＶ単量体及び二量体の存在を確認した。図１９Ｂに示すように、バンドは、単量体及び二量体断片の両方について予想したサイズで現れた（それぞれ、３．７ｋｂ及び７．４ｋｂ）。ＤＮＡを３．７ｋｂ及び７．４ｋｂの両方のバンドから抽出し、内部ｍＣｈｅｒｒｙカセットに特異的な内部を使用したその後のＰＣＲ分析を実行した（図１９Ｃの概略図を参照されたい）。図１９Ｄに示すように、これらのＰＣＲ反応物は、３．７ｋｂ及び７．４ｋｂの両方のバンドから抽出したＤＮＡから１．９ｋｂのアンプリコンを産生し、ＩＴＲの内部のポリヌクレオチド配列が複製されたことを示す。
ＮａｎｏＶコンカテマーの方向を決定するために、３．７ｋｂ単量体及び７．４ｋｂ二量体の両方から抽出したＤＮＡをＡｆｌＩＩで消化し、非還元アガロースゲル電気泳動で分析した。図２０Ａに示すように、ＡｆｌＩＩの予想される切断部位はＵｂＣプロモーターにあり、それにより、単量体において１．２ｋｂ及び２．５ｋｂの予想されるサイズを有する切断産物を産生する。コンカテマーからの予想される生成物サイズは、二量体の方向によって異なる（例えば、図２０Ｂに示すように、ヘッドトゥーヘッド、テイルトゥーテイル、またはヘッドトゥーテイル）。図１８Ｂの３．７ｋｂフラグメントから抽出したＤＮＡのＡｆｌＩＩ切断は、予想した１．２ｋｂ及び２．５ｋｂ断片を生成した（図２０Ｃ、白いバーによって示されるバンドの存在）。図１９Ｂの７．４ｋｂ断片から抽出したＤＮＡのＡｆｌＩＩ切断は、コンカンタマーのテイルトゥーテイル方向を示す１．２ｋｂ及び５ｋｂ、及びコンカンタマーのヘッドトゥーヘッド方向を示す２．５ｋｂ及び２．４ｋｂのサイズの断片を生成した。
実施例４：３’及び５’リボザイムを必要とするプラスミドゲノムからの感染性ピコルナウイルスウイルスの産生
哺乳動物のＰｏｌ ＩＩプロモーターの制御下にあるＳＶＶをコードするポリヌクレオチドを含む、実施例２で生成したプラスミドから感染性ＳＶＶウイルスを産生する能力を評価するために実験を実施した。ＳＶＶ及びＣｏｘｓａｃｋｉｅウイルスなどのポジティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスは、適切に複製するために、ウイルスに天然の別々の５’及び３’末端を必要とし、これらは、哺乳動物の５’及び３’ＵＴＲを含む哺乳動物のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ転写産物によって産生されない。したがって、感染性＋センスｓｓＲＮＡウイルスの産生は、Ｐｏｌ ＩＩコード化ＳＶＶ転写産物からの非ウイルス性ＲＮＡの除去を触媒し、複製可能な感染性ＳＶＶの発現を可能にする５’及び３’リボザイム配列を含める必要があった（図２２及び２３Ａの全般的な概略図を参照されたい）。
簡単に説明すると、ＳＶＶウイルスゲノムをコードするＤＮＡポリヌクレオチドは、５’及び３’リボザイムをコードする配列の挿入を含む（ＳＶＶ ｗ／Ｒ）及び含まずに（ＳＶＶ ｗ／ｏ Ｒ）生成した（図２３Ａ）。これらの構築物を、実施例２に記載したようにＤＮＡプラスミドに挿入した。末端リボザイム配列を含む及び含まないＳＶＶをコードするプラスミドが、感染性ウイルスを産生する能力を試験するために、２９３Ｔ細胞を１ｘ１０６細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種した。播種の２４時間後、２９３Ｔ細胞に１μｇの上記のＳＶＶプラスミド構築物をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００で４時間トランスフェクトし、その時点で完全培地を各ウェルに追加した。トランスフェクトした２９３Ｔからの上清を７２時間後に収集し、０．４５μＭフィルターでシリンジ濾過し、Ｈ１２９９細胞に対して段階的に希釈した（図２３Ｂのプロトコル概略図を参照されたい）。４８時間後、上清をＨ１２９９培養物から除去し、細胞をクリスタルバイオレットで染色してウイルス感染力を評価した。図２４に示すように、活性溶解ＳＶＶは、クリスタルバイオレット染色における不透明度の減少によって示される、末端リボザイムを含む構築物からのみ産生された。したがって、これらのデータは、本明細書に記載のポリヌクレオチドへのリボザイムをコードする配列の組み込みが、感染性ＳＶＶウイルスの産生に必要であることを示す。
実施例５：インビトロでペイロードタンパク質を発現することができるＳＶＶをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡプラスミド
ＳＶＶをコードするポリヌクレオチドに組み込まれたペイロードをコードする配列からペイロードタンパク質を発現する、実施例２に記載のＳＶＶプラスミドの能力を評価するために実験を実施した。ｍＣｈｅｒｒｙレポーター、ナノルシフェラーゼタンパク質、及びＣＸＣＬ１０の３つのペイロードを試験した。末端リボザイム配列を含むＳＶＶをコードするプラスミドはｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を発現することができたが、末端リボザイム配列を含まないＳＶＶをコードするプラスミドは発現しなかった（図２５Ａ）。さらに、ＳＶＶをコードするプラスミドは、ナノルシフェラーゼを発現することができた（図２５Ｂ）。なおさらに、ＳＶＶをコードするプラスミドは、ＣＸＣＬ１０を発現することができた（図２５Ｃ）。これらのデータは、感染性ＳＶＶの産生に加えて、これらのプラスミド構築物が、蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙで例示した）、酵素タンパク質（ナノルシフェラーゼで例示した）、組換えケモカイン（ＣＸＣＬ１０で例示した）を含む、複数の異なる種類のペイロードタンパク質を発現できることを示す。
実施例６：ＳＶＶをコードする自己複製ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ減衰
実施例２に記載のＳＶＶをコードするポリヌクレオチドがｍｉＲＮＡ減衰できるかを決定するために実験を実施した。ｍｉＲ－１及びｍｉＲ－１２２標的配列を含むｍｉＲＮＡ標的カセット（ｍｉＲ－Ｔ）は、図２６に示すように、内在性ウイルス２Ａ及び合成Ｔ２Ａ配列の間にＳＶＶウイルスポリタンパク質を含んでインフレームに挿入した（図１６も参照されたい）。ｍｉＲ－１標的配列は、筋細胞におけるウイルス複製を制御すると予想され、ｍｉＲ－１２２標的配列は、肝臓細胞におけるウイルス複製を制御すると予想される。ｍｉＲＮＡ減衰化ＳＶＶ及びＷＴ（対照）ＳＶＶウイルスは、実施例４に記載されるように、ＳＶＶをコードするプラスミドでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の上清からウイルスを単離することによって産生した。このウイルスは、ｍｉＲ－１及びｍｉＲ－１２２模倣物を発現する許容Ｈ１２９９細胞に感染するために使用した。４８時間後、感染細胞の上清を回収し、細胞をクリスタルバイオレットで染色した。ＳＶＶ－ｍｉＲＴ複製はＳＶＶ ＷＴと同等であり、ｍｉＲＮＡ減衰はクリスタルバイオレット染色で見られるように有効であった（図２６Ｂ）。ＷＴ ＳＶＶと比較したＳＶＶ ｍｉＲ－Ｔ構築物のｍｉＲＮＡ減衰は、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイを用いたＨ４４６細胞に対する感染Ｈ１２９９細胞の上清のウイルス力価を評価することによって決定した。以下の表９の左の列に示すように、陰性対照模倣物、ｍｉＲ－１、及びｍｉＲ－１２２のＴＣＩＤ５０／ｍＬは同等であるため、同族のｍｉＲＮＡは、ＷＴウイルスの事例においてウイルス複製に影響を与えなかった。しかしながら、ＳＶＶ ｍｉＲ－Ｔ（右の列）のＩＣ５０は、ｍｉＲ－１またはｍｉＲ－１２２発現細胞のいずれかがＳＶＶ ｍｉＲ－Ｔ構築物に感染した場合、感染力価の複数の対数減少が観察されたため、標的細胞にｍｉＲ－１またはｍｉＲ－１２２模倣体をトランスフェクトした場合、ＳＶＶ ＷＴウイルス（左の列）と比較して大幅に低減した。これらのデータは、本明細書に記載の自己複製ポリヌクレオチドから産生されたウイルスが、複数の組織特異的ｍｉＲＮＡの挿入によって減衰化され得ることを示す。
Figure 2022507269000011
実施例７：インビトロで感染性ウイルスを産生するＳＶＶをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド
Ｈ１２９９異種移植モデルを使用して、インビトロで感染性ウイルスを産生するＳＶＶをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドの能力を決定するための実験を実施した。簡単に説明すると、５ｘ１０６個のＨ１２９９細胞を、８週齢の雌の胸腺欠損ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右側腹部に皮下接種した。腫瘍体積がおよそ１００ｍｍ３の体積に達したときに、マウスを無作為に２つの実験群に割り当て、以下に記載するように治療した。
図２２に例示したＳＶＶをコードするリボザイム対応発現カセット（ＳＶＶ ｗ／Ｒ）及び非リボザイム対応（ＳＶＶ ｗ／ｏ Ｒ）カセットを含むプラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を用いて製剤化した。簡単に説明すると、１４μｇの各構築物をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００と１：１の比率で調整し、ボルテックスし、次に注入前に１０分間インキュベートした。１４μｇ／用量でのプラスミドＤＮＡの２用量を、接種後１８日目及び２０日目に腫瘍内投与した。腫瘍体積を、電子ノギスを使用して週に３回測定した。２０、２２、及び２３日目に、腫瘍を感染性ウイルスの評価のために採取した。
図２７Ａに示すように、リボザイム対応のＳＶＶをコードするプラスミドで治療したマウスは、非リボザイム対応のＳＶＶをコードするプラスミドで治療したマウスと比較して、腫瘍成長の有意な阻害を示した。各群から採取した腫瘍からウイルスを単離し、Ｈ１２９９細胞に滴定し、ウイルス溶解をクリスタルバイオレット染色によって評価した。図２７Ｂに示すように、ＳＶＶ ｗ／Ｒプラスミドで治療したマウスに由来する腫瘍からの単離株は、活性な溶解性ウイルスを含み、ＳＶＶ ｗ／ｏ Ｒ群（左パネル、図２７Ｂ）から単離したウイルスと比較してクリスタルバイオレット染色（右パネル、図２７Ｂ）における減少した不透明度を示した。これらのデータは、ＳＶＶをコードするリボザイム対応ポリヌクレオチドを含むプラスミドが、インビボで感染性の溶解性ウイルスを産生し、腫瘍内に送達されると腫瘍の増殖を阻害することを示す。
実施例８：インビボでペイロードを発現するＳＶＶをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド
インビボで投与した場合に様々なペイロードを発現するＳＶＶをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドの能力を評価するための追加の実験を実施した。リボザイム対応プラスミドＤＮＡ構築物を製剤化し、実施例７に記載したようにＨ１２９９異種移植モデルに腫瘍内注入した。ＳＶＶをコードするポリヌクレオチド配列に加えて、ナンルシフェラーゼ（図２８Ａ）またはＣＸＣＬ１０（図２８Ｂ）をコードする配列をプラスミド挿入物に組み込んだ。２日目（ナンルシフェラーゼ）または６日目（ＣＸＣＬ１０）に腫瘍を採取し、それぞれのペイロードタンパク質の発現を評価した。図２８Ａ～図２８Ｂに示すように、ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むＳＶＶプラスミド、またはＣＸＣＬ１０をコードするポリヌクレオチドを含むＳＶＶプラスミドの腫瘍内投与は、単離した腫瘍において各ペイロードの検出をもたらした（図２８Ａは増強した発光を示し、図２８ＢはＣＸＣＬ１０の上昇したレベルを示す）。これらのデータは、感染性ウイルスの産生に加えて、ＳＶＶをコードするプラスミドがインビボで外因性の酵素及びサイトカインのペイロードを発現できることを示す。
実施例９：ＳＶＶをコードするプラスミドの静脈内送達のための脂質ナノ粒子の製剤
ＳＶＶをコードするプラスミドを、プラスミドの静脈内送達のために脂質ナノ粒子に製剤化した。
脂質ナノ粒子の産生：以下の脂質を脂質ナノ粒子の製剤において使用した：
（ａ）Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）；
（ｂ）コレステロール；
（ｃ）１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）；
（ｄ）１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）（ＰＥＧ－ＤＳＰＥアミン）
（ｅ）１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－（ポリエチレングリコール）（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）。
製剤：脂質をエタノール中で５０：３５：１５の比率（ＤＯＴＡＰ：コレステロール：ＤＬＰＥ）で調製した。いくつかの事例では、脂質ナノ粒子を０．２％ＰＥＧ－ＤＳＰＥまたはＰＥＧ－ＤＳＰＥアミンでさらに製剤化した。粒子は、マイクロ流体マイクロ混合物（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）を使用して、２ ｍＬ／分の合計流量で調製した（エタノール、脂質混合物の場合は０．５ ｍＬ／分、水性緩衝液、プラスミドＤＮＡの場合は１．５ｍＬ／分）。得られた粒子を、Ｃａ及びＭｇを含むＰＢＳを用いたタンジェント流濾過（ＴＦＦ）によって洗浄した。
ＨＡ複合手順：高分子量ヒアルロナン（ＨＡ）（７００ ＫＤａ（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ））を０．２Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ ５．５）に溶解し、最終濃度を５ｍｇ／ｍＬとした。ＨＡ混合物を、１：１：６のモル比率（ＨＡ：ＥＤＣ：スルホ－ＮＨＳ）で１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）で活性化した。活性化の３０分後、脂質粒子を追加し、ｐＨを７．４に調整した。溶液を室温で２時間インキュベートした。各カプセル化製剤について得られたパラメーターを以下の表１０に示した。
Figure 2022507269000012
粒子製剤の物理的特性の分析：表１０に記載した得られた粒子製剤の各々について、粒子サイズ分布及びゼータ電位の測定値を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ－ＺＳ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用した光散乱によって決定した。サイズ測定をｐＨ７．４のＨＢＳで実行し、ゼータ電位測定をｐＨ７．４の０．０１Ｍ ＨＢＳで実施した。製剤の特性は、ＨＡ複合の前ならびにＴＦＦの前及び後に評価した。これらの評価の結果を以下の表１１に示した。
Figure 2022507269000013
結果：プラスミドＤＮＡを細胞に正常に送達し、感染性ウイルスを産生する各製剤の能力を評価するために、Ｈ１２９９細胞に各製剤をトランスフェクトした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて製剤化したプラスミドＤＮＡを陽性対照として使用し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのみを陰性対照として使用した。トランスフェクションの３日後、上清を回収し、Ｈ４６６細胞への上清の滴定及びＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ生存アッセイにより、ＳＶＶ ＴＣＩＤ５０／ｍＬを計算した。
Figure 2022507269000014
表１２に示すように、プラスミドＤＮＡの脂質粒子製剤は、プラスミドＤＮＡを細胞に送達することができ、様々な製剤のＴＣＩＤ５０／ｍＬ値が感染性ウイルスの産生を示しているため、感染性ウイルスの産生をもたらした。
実施例１０：腫瘍部位への送達及び腫瘍成長の阻害をもたらすプラスミドＤＮＡの静脈内注入
ＳＶＶをコードするプラスミドＤＮＡの脂質粒子製剤を全身投与した場合に、ｐＤＮＡを腫瘍に送達できるかを決定するための実験を実施した。実施例９及び表１０に記載の製剤５２０２１－４Ｄを選択し、粒子を、約９５％の活性ＤＮＡ回収及び脂質カプシド形成効率を有するＰＢＳ中で製剤化した。腫瘍体積がおよそ１５０ｍｍ３の体積に達したときに、１００μＬ（およそ２７μｇのＤＮＡ）のＬＮＰを静脈内投与した。ＰＢＳをビヒクル対照として使用した。ＬＮＰまたはビヒクル対照の２回の追加用量を１日おきに合計３用量静脈内投与した。最終用量の４８時間後にマウスを犠牲にし、腫瘍組織を収集した。図２９に示すように、ＳＶＶプラスミドＤＮＡをＬＮＰで処理したマウスから採取した腫瘍で検出した。したがって、ＬＮＰは、プラスミドＤＮＡを腫瘍部位に送達することができる。
肺癌異種移植モデル：ＳＶＶをコードするプラスミドＤＮＡの脂質粒子製剤が、実施例７に記載のＨ１２９９異種移植モデルにおいて静脈内投与した場合に、腫瘍成長に影響を及ぼし得るかを決定するための追加の実験を実施した。標的部分であるヒアルロン酸が存在し、インビトロで機能するため、実施例９及び表１０に記載の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤５２０２１－２Ｄをさらなる分析のために選択し、粒子を、約９５％の活性ＤＮＡ回収及び脂質カプシド形成効率を有するＰＢＳで製剤化した。腫瘍体積がおよそ１５０ｍｍ３の体積に達したときに、１００μＬ（およそ２７μｇのＤＮＡ）のＬＮＰを静脈内投与した。ＰＢＳをビヒクル対照として使用した。ＬＮＰまたはビヒクル対照の３回の追加用量を１日おきに合計４用量静脈内投与した。腫瘍体積を、電子ノギスを使用して少なくとも週に２回測定した。
図３０に示すように、ＬＮＰで製剤化されたプラスミドＤＮＡの静脈内送達は、ＰＢＳ対照で観察した成長と比較して、経時的な腫瘍成長を有意に阻害した（図３０、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ補正を用いた２元配置分散分析）。これらの結果は、感染性ウイルスをコードするプラスミドＤＮＡを非ウイルス性ビヒクルで静脈内送達することができ、インビボで腫瘍成長を有意に阻害できることを示す。
肝細胞癌腫異種移植モデル：同様の実験を実施して、肝細胞癌腫のネズミ異種移植モデルにおける静脈内ＬＮＰ送達の有効性を評価する。簡単に説明すると、マウスに３ｘ１０６個のＨｅｐＧ２細胞を接種し、上記のように製剤化したＬＮＰを静脈内投与した。腫瘍成長を経時的に測定し、さらなる分析のために実験の最後に腫瘍を採取した。これらの実験は、肝細胞癌腫のモデルにおいて腫瘍成長を阻害する腫瘍溶解性ウイルスをコードするＬＮＰカプセル化構築物の静脈内での能力を実証することを期待する。追加の実験を実施して、Ｈ４４６異種移植モデル及びＮ１Ｅ－１１５同系神経芽細胞腫モデルを使用した小細胞肺癌のネズミモデルにおける静脈内ＬＮＰ送達の有効性を評価することができる。
実施例１１：ウイルスゲノムをコードするＬＮＰカプセル化自己複製ポリヌクレオチドを用いたがんに罹患する患者の治療
実験を実施して、がんに罹患する患者を治療するための本明細書に記載の自己複製ウイルスゲノムの能力を評価することができる。かかる実験では、ウイルスゲノムをコードする自己複製ポリヌクレオチドは、実施例１に概して記載したように操作される。
これらの自己複製ポリヌクレオチドは、プラスミド骨格に組み込むためにさらに操作することができる。代替的に、自己複製ポリヌクレオチドの大規模なインビトロ増殖のために、ＡＡＶ－ＩＴＲ配列を組み込んでウイルスゲノム全体に隣接させて、ポリヌクレオチド複製及び核侵入を助けるためのＮａｎｏＶ構築物を生成することができる。ＩＴＲ隣接ゲノム全体が、組換えＨＳＶゲノム骨格の遺伝子間遺伝子座（図４Ｂ、図７Ｂ）に挿入されるか、または代替的にＩＣＰ４遺伝子座に挿入される（図５Ｂ、図１０Ｂ、ＩＣＰ４補完細胞株に転じて提供されるＩＣＰ４）。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をＩＣＰ０に挿入し、ＩＴＲ隣接ウイルスゲノムＤＮＡの効率的な複製を可能にする（実施例３を参照されたい）。
プラスミドゲノムまたはＮａｎｏＶゲノムを、標準的な分子生物学技術を使用して培養物から精製し（例えば、マキシプレップ）、次いで凍結乾燥したヒアルロナン（ＨＡ）表面修飾脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル化した（実施例９を参照されたい）。非カプセル化ウイルスゲノムＤＮＡを超遠心分離によって除去し、ナノ粒子カプセル化ウイルスゲノムをｑＰＣＲによって定量化した。がんに罹患する患者へのインビボ投与のために、ＬＮＰを、薬学的に許容される安定剤と共にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で調製した。患者は、静脈内注入を介して、１０ｍＬ容量の薬学的に許容される担体中の１０１０ベクターゲノムで１日目に治療した。患者は、がんの存在について標準的な管理手順を使用してモニタリングした。これらの実験の潜在的な結果には、標準治療と比較した腫瘍成長の部分的または完全な阻害、腫瘍転移の阻害、延長した寛解期間、及び／または低減した再発率が含まれる。
実施例１２：ウイルスゲノムをコードするＬＮＰカプセル化自己複製ポリヌクレオチドを用いた肺癌に罹患する患者の治療
実施例１１に従って実験を実施して、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に罹患する患者または小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）に罹患する患者を治療するための本明細書に記載の自己複製ウイルスゲノムの能力を評価することができる。ＬＮＰにカプセル化され、ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣの治療に使用することができる例示的な自己複製ポリヌクレオチドを、以下の表１３に概説した。
Figure 2022507269000015
実施例１３：肝細胞癌腫に罹患する患者の治療。
実施例１１に従って実験を実施して、肝細胞癌腫に罹患する患者を治療するための本明細書に記載の自己複製ウイルスゲノムの能力を評価することができる。ＬＮＰにカプセル化され、肝細胞癌腫の治療に使用することができる例示的な自己複製ポリヌクレオチドを、以下の表１４に概説した。
Figure 2022507269000016
実施例１４：前立腺癌に罹患する患者の治療。
実施例１１に従って実験を実施して、前立腺癌に罹患する患者を治療するための本明細書に記載の自己複製ウイルスゲノムの能力を評価することができる。ＬＮＰにカプセル化され、前立腺癌の治療に使用することができる例示的な自己複製ポリヌクレオチドを、以下の表１５に概説した。
Figure 2022507269000017
実施例１５：３’リボザイム及び５’ｓｉＲＮＡ標的配列を有するプラスミドゲノムからの感染性ピコルナウイルスウイルスの産生
哺乳動物のＰｏｌ ＩＩプロモーターの制御下にあり、３’リボザイム配列及び５’ｓｉＲＮＡ標的配列を有し、ウイルスゲノムの天然３’及び５’末端を生成するＳＶＶをコードするポリヌクレオチドを含む、プラスミドから感染性ＳＶＶウイルスを産生する能力を評価するために実験を実施した。（図３３の全般的な概略図を参照されたい）。
簡単に説明すると、ＳＶＶウイルスゲノムをコードするＤＮＡポリヌクレオチドは、５’及び３’リボザイム（ＳＶＶ ＷＴ－Ｒ、実施例２及び４に記載される）ならびに３’リボザイム及び５’ｓｉＲＮＡ標的配列（５ｐ ｓｉＲＮＡ）を用いて生成した。これらの構築物を、実施例２に記載したようにＤＮＡプラスミドに挿入した。対称末端（３’及び５’リボザイム）及び非対称末端（３’リボザイム及び５’ｓｉＲＮＡ標的配列）を有するこれらのＳＶＶをコードするプラスミドが、感染性ウイルスを産生する能力を試験するために、２９３Ｔ細胞を１ｘ１０６細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種した。播種の２４時間後、２９３Ｔ細胞に１μｇの上記のＳＶＶプラスミド構築物をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００で４時間トランスフェクトし、その時点で完全培地を各ウェルに追加した。トランスフェクトした２９３Ｔからの上清を７２時間後に収集し、０．４５μＭフィルターでシリンジ濾過し、Ｈ１２９９細胞に対して段階的に希釈した（図２３Ｂのプロトコル概略図を参照されたい）。４８時間後、上清をＨ１２９９培養物から除去し、細胞をクリスタルバイオレットで染色してウイルス感染力を評価した。図３３に示すように、クリスタルバイオレット染色における不透明度の減少によって示される、非対称末端を含む構築物からの活性溶解ＳＶＶの産生の増加を観察した。同様の構築物を、５’末端に人工ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ標的配列を使用して作製した。
実施例１６：３’及び５’ＡｍｉＲ標的配列を有するプラスミドゲノムからの感染性ピコルナウイルスウイルスの産生
哺乳動物のＰｏｌ ＩＩプロモーターの制御下にあり、５’ａｍｉＲＮＡ標的配列を有し、ウイルスゲノムの５’末端及び３’ＨＤＶリボザイムを生成するＳＶＶをコードするポリヌクレオチドを含む、プラスミドから感染性ＳＶＶウイルスを産生する能力を評価するために実験を実施した。
簡単に説明すると、ＳＶＶウイルスゲノムをコードするＤＮＡポリヌクレオチドは、５’及び３’リボザイム（ＷＴ－Ｒ、実施例２及び４に記載される）ならびに５’及び３’ＡｍｉＲ標的配列（５ｐ３ｐ Ａｍｉ）を用いて生成した。これらの構築物を、実施例２に記載したようにＤＮＡプラスミドに挿入した。これらのＳＶＶをコードするプラスミドが、感染性ウイルスを産生する能力を試験するために、２９３Ｔ細胞を１ｘ１０６細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種した。播種の２４時間後、２９３Ｔ細胞に１μｇの上記のＳＶＶプラスミド構築物をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００で４時間トランスフェクトし、その時点で完全培地を各ウェルに追加した。トランスフェクトした２９３Ｔからの上清を７２時間後に収集し、０．４５μＭフィルターでシリンジ濾過し、Ｈ１２９９細胞に対して段階的に希釈した（図２３Ｂのプロトコル概略図を参照されたい）。４８時間後、上清をＨ１２９９培養物から除去し、細胞をクリスタルバイオレットで染色してウイルス感染力を評価した。
以下の表１６に示すように、５’及び３’リボザイムで観察した産生と比較して、５’ａｍｉＲＮＡ標的配列を含む構築物からの活性溶解性ＳＶＶの産生の増加を観察した。
Figure 2022507269000018
実施例１７：腫瘍成長の増強した阻害をもたらすプラスミドＡｍｉＲ－ＳＶＶ ＤＮＡの腫瘍内注入
図３５に記載の５’ＡｍｉＲ標的配列及び３’リボザイムを含むＳＶＶをコードするプラスミドＤＮＡの脂質粒子製剤を、Ｈ４４６異種移植モデルで腫瘍内投与した場合に、腫瘍成長に影響を与えるかを決定するために追加の実験を実施した。５’及び３’リボザイム配列を含むＳＶＶをコードするプラスミドＤＮＡをさらに投与し、ＰＢＳをビヒクル対照として使用した。ｐＤＮＡ構築物を図２７に記載されるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を用いて製剤化した。腫瘍体積がおよそ１５０ｍｍ３の体積に達したときに、２５μＬ（１μｇのＤＮＡ）のＬＮＰ－ｐＤＮＡを１日目及び４日目に腫瘍内投与した。腫瘍体積を、電子ノギスを使用して少なくとも週に２回測定した。図３６Ａに示すように、ａｍｉ－ＳＶＶプラスミドは、リボザイム構築物（ＳＶＶ－ＷＴ）及び陰性対照（ＰＢＳ）と比較して、腫瘍成長の増加した阻害を示した。同様の結果をＨ１２９９異種移植モデルで示した（図３６Ｂ）。
実施例１８：ＳＶＶをコードするプラスミドの静脈内送達のための脂質ナノ粒子の製剤
ＳＶＶ－陰性、ＳＶＶ－ＷＴ、及びＡｍｉ－ＳＶＶをコードするプラスミドを、静脈内送達のために脂質ナノ粒子に製剤化した。
脂質ナノ粒子の産生：以下の脂質を脂質ナノ粒子の製剤において使用した：
（ａ）Ｄ－Ｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）；
（ｂ）コレステロール；
（ｃ）１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；
（ｄ）１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）。
製剤：脂質をエタノール中で４９：３８．５：１１：１．５の比率（ＭＣ３：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）で調製した。粒子は、マイクロ流体マイクロ混合物（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）を使用して、２ ｍＬ／分の合計流量で調製した（エタノール、脂質混合物の場合は０．５ ｍＬ／分、水性緩衝液、プラスミドＤＮＡの場合は１．５ｍＬ／分）。得られた粒子を、Ｃａ及びＭｇを含むＰＢＳに対して４℃で１８時間分離した。
粒子製剤の物理的特性の分析：得られた粒子製剤の各々について、粒子サイズ分布及びゼータ電位の測定値を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ－ＺＳ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用した光散乱によって決定した。サイズ測定をｐＨ７．４のＨＢＳで実行し、ゼータ電位測定をｐＨ７．４の０．０１Ｍ ＨＢＳで実施した。製剤の特性は、分離の前及び後に評価した。これらの評価の結果を以下の表１７に示した。
Figure 2022507269000019
腫瘍部位への送達及び腫瘍成長の阻害をもたらすプラスミドＤＮＡの静脈内注入：ＳＶＶをコードするプラスミドＤＮＡ（ＳＶＶ－陰性、ＳＶＶ－ｗｔ、またはＡｍｉ－ＳＶＶ）の脂質粒子製剤を全身投与した場合に、ｐＤＮＡを腫瘍に送達できるかを決定するための実験を実施した。表１７に記載の製剤７０００９を、約９５％の活性ＤＮＡ回収及び脂質カプシド形成効率を有するＰＢＳ中で製剤化した。Ｈ１２９９腫瘍体積がおよそ１２５ｍｍ３の体積に達したときに、１００μＬ（およそ１５μｇのＤＮＡ）のＬＮＰを静脈内投与した。ＰＢＳをビヒクル対照として使用した。ＬＮＰまたはビヒクル対照の３回の追加用量を６日ごとに合計４用量静脈内投与した。腫瘍体積を最大３０日目まで測定した。腫瘍成長阻害をＳＶＶ－ｗｔ－ＬＮＰ－７０００９－１Ｃで治療したマウス（ＳＶＶ－陰性（７０００９－２Ｃ）と比較したＴＧＩ％５７、ｐ＝０．００５９、二元配置分散分析、Ｔｕｒｋｅｙ検定）及びＡｍｉ－ＳＶＶ－ＬＮＰ－７０００９－３Ｃ（ＳＶＶ－陰性（７０００９－２Ｃ）と比較したＴＧＩ％５７、ｐ＝０．００５６、二元配置分散分析、Ｔｕｒｋｅｙ検定）で治療したマウスで観察した。ＳＶＶ－陰性－ＬＮＰ－７０００９－３Ｃで治療したマウスは、ＰＢＳ対照群と比較して腫瘍成長を改変せず、観察した有効性がＳＶＶ活性構築物の産物であることを示す（ＳＶＶ－ｗｔ及びＡｍｉ－ＳＶＶ）。
さらに付番した実施形態
本開示のさらに付番した実施形態は以下の通りである：
実施形態１．脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であって、複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子を含み、ポリヌクレオチド配列が、哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）と結合できるプロモーター配列と作動可能に連結され、３’接合部切断配列及び５’接合部切断配列と隣接し、３’及び５’接合部切断配列が、異なる種類であり、複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドが、非ウイルスの起源である、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）。
実施形態２．３’接合部切断配列が、リボザイム配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される、実施形態１に記載のＬＮＰ。
実施形態３．３’接合部切断配列が、リボザイム配列であり、５’接合部切断配列が、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列である、実施形態２に記載のＬＮＰ。
実施形態４．３’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列であり、５’接合部切断配列が、リボザイム配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される、実施形態１に記載のＬＮＰ。
実施形態５．３’接合部切断配列が、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、リボザイム配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される、実施形態１に記載のＬＮＰ。
実施形態６．３’接合部切断配列が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、リボザイム配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される、実施形態１に記載のＬＮＰ。
実施形態７．３’接合部切断配列が、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、リボザイム配列、及びアプタザイム配列から選択される、実施形態１に記載のＬＮＰ。
実施形態８．３’接合部切断配列が、アプタザイム配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びリボザイム配列から選択される、実施形態１に記載のＬＮＰ。
実施形態９．複製可能なウイルスゲノムが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである、実施形態１～８のいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態１０．一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスが、ポジティブセンス（（＋）センス）またはネガティブセンス（（－）センス）ｓｓＲＮＡウイルスである、実施形態９に記載のＬＮＰ。
実施形態１１．複製可能なウイルスゲノムが、（＋）センスｓｓＲＮＡウイルスであり、（＋）センスｓｓＲＮＡウイルスが、ピコルナウイルスである、実施形態１０に記載のＬＮＰ。
実施形態１２．ピコルナウイルスが、Ｓｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルス（ＳＶＶ）またはＣｏｘｓａｃｋｉｅウイルスである、実施形態１１に記載のＬＮＰ。
実施形態１３．ＬＮＰを細胞と接触させると、細胞によるウイルス粒子の産生がもたらされ、ウイルス粒子が、感染性及び溶解性である、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態１４．組換えＤＮＡ分子が、外因性ペイロードタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態１５．ＬＮＰが、外因性ペイロードタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態１６．外因性ペイロードタンパク質が、蛍光タンパク質、酵素タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体のリガンド、または細胞表面受容体と結合することができる抗原結合分子である、実施形態１４または１５に記載のＬＮＰ。
実施形態１７．サイトカインが、Ｆｌｔ３リガンド、及びＩＬ－１８、ＩＬ－１８γ、及びＩＬ－２から選択される、実施形態１６に記載のＬＮＰ。
実施形態１７Ａ．細胞表面受容体のリガンドが、Ｆｌｔ３リガンドである、実施形態１６に記載のＬＮＰ。
実施形態１８．ケモカインが、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４から選択される、実施形態１６に記載のＬＮＰ。
実施形態１９．抗原結合分子が、免疫チェックポイント受容体と結合して阻害することができる、実施形態１６に記載のＬＮＰ。
実施形態２０．免疫チェックポイント受容体が、ＰＤ１である、実施形態１９に記載のＬＮＰ。
実施形態２１．抗原結合分子が、ＤＬＬ３、ＥｐＣａｍ、及びＣＥＡから選択される腫瘍関連抗原と結合することができる、実施形態１６に記載のＬＮＰ。
実施形態２１Ａ．抗原結合分子が、腫瘍抗原に特異的な第１のドメイン及びＴ細胞表面分子に特異的な第２のドメインを含む、二重特異性Ｔ細胞会合分子である、実施形態１６～２１のいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態２１Ｂ．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ３である、実施形態２１Ａに記載のＬＮＰ。
実施形態２２．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）カセットが、複製可能なウイルスゲノムをコードする核酸配列に挿入され、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、細胞内の対応するｍｉＲＮＡのうちの１つ以上の発現が、細胞内の複製可能なウイルスゲノムの複製を阻害する、実施形態１～２１のいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態２３．１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２１９、ｍｉＲ－２１９ａ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－１３７、及びｍｉＲ－１２６から選択される、実施形態２２に記載のＬＮＰ。
実施形態２４．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態２３に記載のＬＮＰ。
実施形態２５．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態２３に記載のＬＮＰ。
実施形態２６．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態２３に記載のＬＮＰ。
実施形態２７．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態２３に記載のＬＮＰ。
実施形態２８．組換えＤＮＡ分子が、複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドである、実施形態１～２７のいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態２９．ＬＮＰが、カチオン性脂質、コレステロール、及び中性脂質を含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態３０．カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、中性脂質が、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、実施形態２９に記載のＬＮＰ。
実施形態３１．リン脂質－ポリマー複合体をさらに含み、リン脂質－ポリマー複合体が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）である、実施形態２９または３０に記載のＬＮＰ。
実施形態３１Ａ．カチオン性脂質が、Ｄ－Ｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）であり、中性脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、実施形態２９に記載のＬＮＰ。
実施形態３１Ｂ．１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）のリン脂質－ポリマー複合体をさらに含む、実施形態３１Ａに記載のＬＮＰ。
実施形態３２．ヒアルロナンが、ＬＮＰの表面と複合される、実施形態１～３１Ｂのいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態３２Ａ．ＲＧＤペプチドが、ＬＮＰの表面と複合される、実施形態１～３１Ｂのいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態３３．実施形態１～３２のいずれか１つに記載の複数の脂質ナノ粒子を含み、複数のＬＮＰが、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍの平均サイズを有する、治療用組成物。
実施形態３４．複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４００ｎｍ～約５００ｎｍ、約４２５ｎｍ～約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ～約５００ｎｍ、または約４７５ｎｍ～約５００ｎｍの平均サイズを有する、実施形態３３に記載の治療用組成物。
実施形態３５．複数のＬＮＰが、約－２０ｍＶ未満、約－３０ｍＶ未満、約３５ｍＶ未満、または約－４０ｍＶ未満の平均ゼータ電位を有する、実施形態３３または３４に記載の治療用組成物。
実施形態３６．複数のＬＮＰが、約－５０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約－４０ｍＶ～約－２０ｍＶ、または約－３０ｍＶ～約－２０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する、実施形態３５に記載の治療用組成物。
実施形態３７．複数のＬＮＰが、約－３０ｍＶ、約－３１ｍＶ、約－３２ｍＶ、約－３３ｍＶ、約－３４ｍＶ、約－３５ｍＶ、約－３６ｍＶ、約－３７ｍＶ、約－３８ｍＶ、約－３９ｍＶ、または約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する、実施形態３５または３６に記載の治療用組成物。
実施形態３８．治療用組成物を対象に投与すると、組換えＤＮＡポリヌクレオチドが対象の標的細胞に送達され、組換えＤＮＡポリヌクレオチドが、対象の標的細胞を溶解することができる感染性ウイルスを産生する、実施形態３３～３７のいずれか１つに記載の治療用組成物。
実施形態３９．組成物が、静脈内または腫瘍内に送達される、実施形態３８に記載の治療用組成物。
実施形態４０．標的細胞が、がん性細胞である、実施形態３８に記載の治療用組成物。
実施形態４１．がん性腫瘍の成長を阻害する方法であって、それを必要とする対象において、実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の治療用組成物をそれを必要とする対象に投与することを含み、組成物の投与が、腫瘍の成長を阻害する、方法。
実施形態４２．投与が、腫瘍内または静脈内である、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４３．がんが、肺癌または肝臓癌である、実施形態４１または４２に記載の方法。
実施形態４４．組換えＤＮＡ分子であって、複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ポリヌクレオチド配列が、哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）と結合できるプロモーター配列と作動可能に連結され、３’接合部切断配列及び５’接合部切断配列と隣接し、３’及び５’接合部切断配列が、異なる種類であり、複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドが、非ウイルスの起源である、組換えＤＮＡ分子。
実施形態４５．３’接合部切断配列が、リボザイム配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される、実施形態４４に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態４６．３’接合部切断配列が、リボザイム配列であり、５’接合部切断配列が、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列である、実施形態４５に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態４７．３’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列であり、５’接合部切断配列が、リボザイム配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される、実施形態４４に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態４８．３’接合部切断配列が、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、リボザイム配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される、実施形態４４に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態４９．３’接合部切断配列が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、リボザイム配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される、実施形態４４に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態５０．３’接合部切断配列が、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、リボザイム配列、及びアプタザイム配列から選択される、実施形態４４に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態５１．３’接合部切断配列が、アプタザイム配列であり、５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びリボザイム配列から選択される、実施形態４４に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態５２．コードされたウイルスが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである、実施形態４４～５１のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態５３．ｓｓＲＮＡウイルスが、ポジティブセンス（（＋）センス）またはネガティブセンス（（－）センス）ｓｓＲＮＡウイルスである、実施形態５２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態５４．（＋）センスｓｓＲＮＡウイルスが、ピコルナウイルスである、実施形態５３に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態５５．ピコルナウイルスが、Ｓｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルス（ＳＶＶ）またはＣｏｘｓａｃｋｉｅウイルスである、実施形態５４に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態５６．組換えＤＮＡ分子が、非ウイルス送達ビヒクルによって細胞に導入されると、感染性の溶解性ウイルスを産生することができる、実施形態４４～５５のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態５７．組換えＤＮＡ分子が、外因性ペイロードタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態４４～５６のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態５８．外因性ペイロードタンパク質が、蛍光タンパク質、酵素タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、または細胞表面受容体と結合することができる抗原結合分子である、実施形態５７に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態５９．サイトカインが、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ－１８、ＩＬ－１８γ、及びＩＬ－２である、実施形態５８に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態６０．ケモカインが、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４から選択される、実施形態５８に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態６１．抗原結合分子が、免疫チェックポイント受容体と結合して阻害することができる、実施形態５８に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態６２．免疫チェックポイント受容体が、ＰＤ１である、実施形態６２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態６３．抗原結合分子が、ＤＬＬ３、ＥｐＣａｍ、及びＣＥＡから選択される腫瘍関連抗原と結合することができる、実施形態５８に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態６３Ａ．抗原結合分子が、腫瘍抗原に特異的な第１のドメイン及びＴ細胞表面分子に特異的な第２のドメインを含む、二重特異性Ｔ細胞会合分子である、実施形態５８または請求項６３に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態６３Ｂ．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ３である、実施形態６３Ａに記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態６４．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）カセットが、複製可能なウイルスゲノムをコードする核酸配列に挿入され、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、細胞内の対応するｍｉＲＮＡのうちの１つ以上の発現が、細胞内のコードされたウイルスの複製を阻害する、実施形態４４～６３のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態６５．１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２１９、ｍｉＲ－２１９ａ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－１３７、及びｍｉＲ－１２６から選択される、実施形態６４に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態６６．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態６４に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態６７．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態６４に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態６８．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態６４に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態６９．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態６４に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態７０．組換えＤＮＡ分子が、複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドまたはＮａｎｏＶである、実施形態４４～６９のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態７１．組換えＤＮＡ分子であって、複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含み、複製可能なウイルスをコードするポリヌクレオチド配列が、非ウイルスの起源であり、組換えＤＮＡ分子が、非ウイルス送達ビヒクルによって細胞に導入されると、複製可能なウイルスを産生することができる、組換えＤＮＡ分子。
実施形態７２．複製可能なウイルスゲノムが、ＤＮＡウイルスのゲノムまたはＲＮＡウイルスのゲノムである、実施形態７１に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態７３．ＤＮＡゲノムまたはＲＮＡゲノムが、二本鎖または一本鎖ウイルスである、実施形態５６７２の組換えＤＮＡ分子。
実施形態７４．一本鎖ゲノムが、ポジティブセンス（（＋）センス）またはネガティブセンス（（－）センス）ゲノムである、実施形態７３に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態７５．細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態７１に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態７６．細胞が、哺乳動物対象に存在する哺乳動物細胞である、実施形態７５に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態７７．複製可能なウイルスが、アデノウイルス、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルス、ポリオウイルス、Ｓｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルス、ウマヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）、ｌａｓｓａウイルス、マウス白血病ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス、ワクシニアウイルス、粘液腫ウイルス、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、ｍａｒａｂａウイルス、実施形態７１に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態７８．複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドに挿入される１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）カセットをさらに含み、ｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、細胞内の対応するｍｉＲＮＡのうちの１つ以上の発現が、細胞内のコードされたウイルスの複製を阻害する、実施形態７１～７７のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態７９．１つ以上のｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに組み込まれる、実施形態７８に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態８０．１つ以上の必須ウイルス遺伝子が、ＵＬ１、ＵＬ５、ＵＬ６、ＵＬ７、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１４、ＵＬ１５、ＵＬ１７、ＵＬ１８、ＵＬ１９、ＵＬ２０、ＵＬ２２、ＵＬ２５、ＵＬ２６、ＵＬ２６．５、ＵＬ２７、ＵＬ２８、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ３１、ＵＬ３２、ＵＬ３３、ＵＬ３４、ＵＬ３５、ＵＬ３６、ＵＬ３７、ＵＬ３８、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４２、ＵＬ４８、ＵＬ４９、ＵＬ５０、ＵＬ５２、ＵＬ５３、ＵＬ５４、ＵＳ１、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ６、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ１２、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＰＢ、Ｆ、Ｂ５Ｒ、ＳＥＲＯ－１、Ｃａｐ、Ｒｅｖ、ＶＰ１－４、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、ポリメラーゼ（Ｌ）、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ３、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄからなる群から選択される、実施形態７９に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態８１．１つ以上のｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上の非必須ウイルス遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに組み込まれる、実施形態７８に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態８２．ポリヌクレオチドが、レプリコン、プラスミド、コスミド、ファージミド、トランスポゾン、細菌人工染色体、酵母人工染色体、または末端閉鎖線形二本鎖腫瘍溶解性ウイルス（Ｏｖ）ＤＮＡ分子から選択される核酸ベクターに挿入される、実施形態７１～８１のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態８３．ポリヌクレオチドが、ＤＮＡポリヌクレオチドであり、複製可能なウイルスゲノムをコードする核酸配列の５’末端での第１のＡＡＶ由来の逆位末端配列（ＩＴＲ）、及び複製可能なウイルスゲノムをコードする核酸配列の３’末端での第２のＡＡＶ由来のＩＴＲをさらに含む、実施形態７１に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態８４．ポリヌクレオチドが、ＤＮＡポリヌクレオチドであり、複製可能なウイルスゲノムをコードする核酸配列の３’側すぐの第１のリボザイムコード配列、及び複製可能なウイルスゲノムをコードする核酸配列の５’側すぐの第２のリボザイムコード配列をさらに含む、実施形態７１に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態８５．配列をコードする第１及び第２のリボザイムが、ハンマーヘッド型リボザイムまたはデルタ肝炎ウイルスリボザイムをコードする、実施形態８４に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態８６．プロモーター配列が、真核生物のＲＮＡポリメラーゼと結合することができる、実施形態７１に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態８７．プロモーター配列が、哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼと結合することができる、実施形態７１に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態８８．ポリヌクレオチドがＤＮＡポリヌクレオチドであり、哺乳動物ポリメラーゼが、感染性の複製可能なＲＮＡウイルスの転写を駆動する、実施形態７１に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態８９．ポリヌクレオチドがＤＮＡポリヌクレオチドであり、哺乳動物ポリメラーゼが、感染性の複製可能なＤＮＡウイルスの転写を駆動する、実施形態７１に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態９０．プロモーター配列が、がん細胞においてポリヌクレオチドの転写を選択的に駆動する、実施形態７１に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態９１．プロモーター配列が、ｈＴＥＲＴ、ＨＥ４、ＣＥＡ、ＯＣ、ＡＲＦ、ＣｇＡ、ＧＲＰ７８、ＣＸＣＲ４、ＨＭＧＢ２、ＩＮＳＭ１、メソセリン、ＯＰＮ、ＲＡＤ５１、ＴＥＴＰ、Ｈ１９、ｕＰＡＲ、ＥＲＢＢ２、ＭＵＣ１、Ｆｒｚ１、またはＩＧＦ２－Ｐ４からなる群から選択される遺伝子に由来する、実施形態７１～９０のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態９２．細胞傷害性ポリペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗原結合分子、細胞表面受容体のリガンド、可溶性受容体、酵素、サソリポリペプチド、ヘビポリペプチド、クモポリペプチド、ハチポリペプチド、カエルポリペプチド、及び治療用核酸からなる群から選択されるペイロード分子をコードする核酸配列をさらに含む、実施形態７１～９１のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態９３．１つ以上のｍｉＲ－ＴＳカセットが、ペイロード分子をコードする核酸配列の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲ配列に組み込まれる、実施形態９２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態９４．細胞傷害性ポリペプチドが、ｐ５３、ジフテリア毒素（ＤＴ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ（ＰＥＡ）、Ｉ型リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）、ＩＩ型ＲＩＰ、または志賀様毒素１（Ｓｌｔ１）から選択される、実施形態９２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態９５．酵素が、メタロプロテイナーゼ、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、カスパーゼ、ゼラチナーゼ、または単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、またはチトクロームＰ４５０から選択される遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（ＧＤＥＰＴ）システムの一部である酵素から選択される、実施形態９２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態９６．ゼラチナーゼが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、実施形態９５に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態９７．メタロプロテイナーゼが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（例えば、ＭＭＰ９）またはＡＤＡＭ１７である、実施形態９５に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態９８．サイトカインが、オステオポンチン、ＩＬ－１３、ＴＧＦβ、ＩＬ－３５、ＩＬ－１８、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγからなる群から選択される、実施形態９２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態９９．ケモカインが、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、及びＣＣＬ２１から選択される、実施形態９２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１００．細胞表面受容体のリガンドが、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ニューロピリンリガンド、Ｆｌｔ３リガンド、またはＣＤ４７リガンドである、実施形態９２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１０１．抗原結合分子が、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＣＴＬＡ４、ＣＣＲ４、ＯＸ４０、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ４７、ＣＳＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１９、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＥＧＦＲ、ＣＤ２００、ＣＤ４０、ＨＥＲ２、ＤＬＬ３、４－１ＢＢ、１７－１Ａ、ＧＤ２、及び表７に列挙される腫瘍抗原のうちのいずれか１つ以上からなる群から選択される細胞表面抗原と結合する、実施形態９２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１０２．サソリポリペプチドが、クロロトキシン、ＢｍＫｎ－２、ネオプラジン１、ネオプラジン２、及びマウリポリン（ｍａｕｒｉｐｏｒｉｎ）からなる群から選択される、実施形態９２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１０３．ヘビポリペプチドが、コントルトロスタチン、アポキシンＩ、ボトロプストキシンＩ、ＢＪｃｕＬ、ＯＨＡＰ－１、ロドストミン（ｒｈｏｄｏｓｔｏｍｉｎ）、ｄｒＣＴ－Ｉ、ＣＴＸ－ＩＩＩ、Ｂ１Ｌ、及びＡＣＴＸ－６からなる群から選択される、実施形態９２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１０４．クモポリペプチドが、ラタルシン及びヒアルロニダーゼからなる群から選択される、実施形態９２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１０５．ハチポリペプチドが、メリチン及びアパミンからなる群から選択される、実施形態９２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１０６．カエルポリペプチドが、ＰｓＴ－１、ＰｄＴ－１、及びＰｄＴ－２からなる群から選択される、実施形態９２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１０７．ペイロードタンパク質が、免疫細胞に対して作用する、請求項９２～１０６のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１０８．免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、及び／または樹状細胞からなる群から選択される、実施形態１０７に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１０９．ペイロードポリペプチドが、ヒト細胞表面抗原と結合することができる第１ドメインと、ヒト腫瘍細胞抗原と結合することができる第２ドメインと、を含む二分ポリペプチドである、実施形態９２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１１０．二分ポリペプチドの一方または両方のドメインが、抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、ダイアボディ、フレキシボディ、ＤＯＣＫ－ＡＮＤ－ＬＯＣＫ（商標）抗体、及びモノクローナル抗イディオタイプ抗体（ｍＡｂ２）からなる群から選択される抗原結合分子である、実施形態１０９に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１１１．二分ポリペプチドが、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））、二重特異性Ｔ細胞会合（ＢｉＴＥ（商標））、ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）、二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）ポリペプチド、またはＴａｎｄａｂ（登録商標）である、実施形態１１０に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１１２．抗体が、操作されたＦｃドメインを有するＩｇＧ抗体である、実施形態１１０に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１１３．治療用核酸が、アンタゴミル、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、リボザイム、またはアプタマーである、実施形態９２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１１４．ポリヌクレオチドが、ｍｉＲ－ＴＳカセットに含まれるｍｉＲＮＡ標的配列と結合するｍｉＲＮＡを発現する細胞で複製されないか、または最小限に複製される、実施形態７２～１１３のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１１５．ｍｉＲＮＡが、表３から選択される、実施形態１１４に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１１６．１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２１９、ｍｉＲ－２１９ａ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－１３７、及びｍｉＲ－１２６から選択される、実施形態１１４に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１１７．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態１１６に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１１８．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態１１６に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１１９．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態１１６に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１２０．ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態１１６に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１２１．組換えＤＮＡ分子が、自己複製ポリヌクレオチドを含むプラスミドである、実施形態７１～１２０のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１２２．組換えＤＮＡ分子であって、（ｉ）ウイルスゲノムのセンス配列を含む第１の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子と、（ｉｉ）ウイルスゲノムのアンチセンス配列を含む第２のｓｓＤＮＡ分子と、を含み、第１及び第２のｓｓＤＮＡ分子の各々が、３’逆位末端配列及び５’逆位末端配列を含み、センスｓｓＤＮＡ分子の３’末端が、アンチセンスｓｓＤＮＡ分子の５’末端と共有結合され、センスｓｓＤＮＡ分子の５’末端が、アンチセンスｓｓＤＮＡ分子の３’末端と共有結合されて、末端閉鎖線形二本鎖腫瘍溶解性ウイルス（Ｏｖ）ＤＮＡ分子を形成する、組換えＤＮＡ分子。
実施形態１２３．コードされたウイルスが、ネガティブセンスまたはポジティブセンス一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡウイルスである、実施形態１２２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１２４．ポジティブセンスｓｓＲＮＡウイルスが、ポリオウイルス（ＰＶ）である、実施形態１２３に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１２５．ネガティブセンスｓｓＲＮＡウイルスが、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）ゲノムである、実施形態１２３に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１２６．第１及び第２のｓｓＤＮＡ分子の各々が、ウイルスゲノム配列の５’側すぐのリボザイムをコードする配列、及びウイルスゲノム配列の３’側すぐのリボザイムをコードする配列をさらに含む、実施形態１２２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１２７．ウイルスゲノムが、１つ以上の必須ウイルス遺伝子に挿入された１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列を含む、実施形態１２２～１２６のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１２８．１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列が、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または５’ＵＴＲに挿入される、実施形態１２７に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１２９．１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列が、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、またはそれ以上の必須ウイルス遺伝子に挿入される、実施形態１２７または１２８に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１３０．少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのｍｉＲＮＡ標的配列が、１つ以上の必須ウイルス遺伝子に挿入される、請求項１２７～１２９のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１３１．少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲＮＡ標的配列が、１つのｍｉＲＮＡの標的配列を含む、実施形態１３０に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１３２．少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのｍｉＲＮＡ標的配列が、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの異なるｍｉＲＮＡの標的配列を含む、実施形態１３０に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１３３．ウイルスゲノムが、ＶＳＶゲノムであり、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列が、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、及び／またはポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質をコードする遺伝子のうちの１つ以上に挿入される、実施形態１２２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１３４．ウイルスゲノムが、ＰＶゲノムであり、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列が、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ（ＶＰｇ）、３Ｃ、または３Ｄタンパク質をコードする遺伝子のうちの１つ以上に挿入される、実施形態１２２に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１３５．３’及び５’ＩＴＲが、ＡＡＶに由来する、実施形態１２２～１３４のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１３６．ＡＡＶが、ＡＡＶ２である、実施形態１３５に記載の組換えＤＮＡ分子。
実施形態１３７．有効量の実施形態４４～１３６のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ分子、及び哺乳動物対象への投与に好適な担体を含む、組成物。
実施形態１３８．実施形態４４～１３６のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ分子を含む、粒子。
実施形態１３９．粒子が、生分解性である、実施形態１３８に記載の粒子。
実施形態１４０．粒子が、ナノ粒子、エクソソーム、リポソーム、及びリポプレックスからなる群から選択される、実施形態１３９に記載の粒子。
実施形態１４１．エクソソームが、無傷のエクソソームまたは空のエクソソームに由来する修飾されたエクソソームである、実施形態１４０に記載の粒子。
実施形態１４２．ナノ粒子が、カチオン性脂質、コレステロール、及び中性脂質を含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、実施形態１４０に記載の粒子。
実施形態１４３．カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、中性脂質が、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、実施形態１４２に記載のＬＮＰ。
実施形態１４４．リン脂質－ポリマー複合体をさらに含み、リン脂質－ポリマー複合体が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）である、実施形態１４２または１４３に記載のＬＮＰ。
実施形態１４５．ヒアルロナンが、ＬＮＰの表面と複合される、実施形態１４２～１４４のいずれか１つに記載のＬＮＰ。
実施形態１４６．実施形態１４２～１４５のいずれか１つに記載の複数の脂質ナノ粒子を含み、複数のＬＮＰが、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍの平均サイズを有する、治療用組成物。
実施形態１４７．複数のＬＮＰの平均粒径が、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４００ｎｍ～約５００ｎｍ、約４２５ｎｍ～約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ～約５００ｎｍ、または約４７５ｎｍ～約５００ｎｍである、実施形態１４６に記載の治療用組成物。
実施形態１４８．複数のＬＮＰが、約－２０ｍＶ未満、約－３０ｍＶ未満、約３５ｍＶ未満、または約－４０ｍＶ未満の平均ゼータ電位を有する、実施形態１４６または１４７に記載の治療用組成物。
実施形態１４９．複数のＬＮＰが、約－５０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約－４０ｍＶ～約－２０ｍＶ、または約－３０ｍＶ～約－２０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する、実施形態１４８に記載の治療用組成物。
実施形態１５０．複数のＬＮＰが、約－３０ｍＶ、約－３１ｍＶ、約－３２ｍＶ、約－３３ｍＶ、約－３４ｍＶ、約－３５ｍＶ、約－３６ｍＶ、約－３７ｍＶ、約－３８ｍＶ、約－３９ｍＶ、または約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する、実施形態１４７または１４８に記載の治療用組成物。
実施形態１５１．対象への組成物の送達が、カプセル化ＤＮＡ発現カセットを標的細胞に送達し、カプセル化ＤＮＡ発現カセットが、標的細胞を溶解することができる感染性ウイルスを産生する、実施形態１４６～１５０のいずれか１つに記載の治療組成物。
実施形態１５２．組成物が、静脈内または腫瘍内に送達される、実施形態１５１に記載の治療用組成物。
実施形態１５３．標的細胞が、がん性細胞である、実施形態１５２に記載の治療用組成物。
実施形態１５４．実施形態４４～１３６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む、無機粒子。
実施形態１５５．無機粒子が、金ナノ粒子（ＧＮＰ）、金ナノロッド（ＧＮＲ）、磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）、磁性ナノチューブ（ＭＮＴ）、カーボンナノホーン（ＣＮＨ）、カーボンフラーレン、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ＣＰＮＰ）、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）、シリカナノチューブ（ＳＮＴ）、または星状中空シリカナノ粒子（ＳＨＳＮ）からなる群から選択される、実施形態１５４に記載の粒子。
実施形態１５６．実施形態１５４または１５５に記載の粒子を含み、粒子の平均直径が、約５００ｎｍ未満である、約２５０ｎｍ～約５００ｎｍである、または約３５０ｎｍである、組成物。
実施形態１５７．がん性細胞を殺傷する方法であって、がん性細胞を、実施形態１３７～１５６のいずれか１つに記載の粒子もしくは組成物、またはその組成物に、粒子を該がん性細胞に細胞内送達するのに十分な条件下で曝露することを含み、カプセル化ポリヌクレオチドによって産生される複製可能ウイルスが、がん性細胞の殺傷をもたらす、方法。
実施形態１５８．複製可能なウイルスが、非がん性細胞で産生されない、実施形態１５７に記載の方法。
実施形態１５９．方法が、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで実施される、実施形態１５７または１５８に記載の方法。
実施形態１６０．対象におけるがんを治療する方法であって、がんに罹患している対象に有効量の実施形態１３７～１５６のいずれか１つに記載の粒子もしくは組成物、またはその組成物を投与することを含む、方法。
実施形態１６１．粒子またはその組成物が、静脈内、鼻腔内、吸入剤として投与されるか、または腫瘍に直接的に注入される、実施形態１６０に記載の方法。
実施形態１６２．粒子またはその組成物が、対象に繰り返し投与される、実施形態１６０または１６１に記載の方法。
実施形態１６３．対象が、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、非ヒト霊長類、またはヒトである、実施形態１６０～１６２のいずれかに記載の方法。
実施形態１６４．がんが、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、精巣癌、大腸癌、結腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺癌、悪性神経膠腫、神経膠芽腫、メラノーマ、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、及び辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）から選択される、実施形態１６０～１６３のいずれかに記載の方法。
実施形態１６５．肺癌が、小細胞肺癌または非小細胞肺癌である、実施形態１６４に記載の方法。
実施形態１６６．肝臓癌が、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）である、実施形態１６４に記載の方法。
実施形態１６７．先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子を製造する方法であって、ａ．組換えＤＮＡ分子を第１のウイルス発現ベクターに挿入することであって、組換えＤＮＡ分子が、ポリヌクレオチドの５’アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来の逆位末端配列（ＩＴＲ）及び３’ＡＡＶ由来のＩＴＲ末端を含む、挿入することと、ｂ．ＩＴＲを媒介した複製に必要とされるＡＡＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドを第２のウイルス発現ベクターに挿入することと、ｃ．第１及び第２のウイルス発現ベクターを細胞に細胞内送達することと、を含み、組換えＤＮＡ分子が、ゲノムに安定的に組み込まれ、細胞が、ＩＴＲの非存在下で産生されるよりも多い量のＩＴＲ隣接ポリヌクレオチドを産生する、方法。
実施形態１６８．ウイルス発現ベクターが、ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、実施形態１６７に記載の方法。
参照による組み込み
本明細書で引用されるすべての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、及び特許出願は、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。しかしながら、本明細書で引用された任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、及び特許出願の言及は、それらが有効な先行技術を構成するか、または世界の任意の国における一般的知識の一部を形成するという認識、または示唆の任意の形態ではなく、そのように受け取られるべきではない。
本開示の好適な実施形態が本明細書に示され記載されたが、そのような実施形態は、ほんの一例として提供されることが当業者に自明であろう。当業者は、多数の変化形、変更、及び置換を本開示から逸脱することなく想定するであろう。本明細書に記載される本開示の実施形態に対する種々の代替手段が、本開示の実施において採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲に含まれる方法及び構造、ならびにそれらの等価物が、それにより包含されることが意図される。
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Claims (79)

  1. 脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であって、複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子を含み、前記ポリヌクレオチド配列が、哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）と結合できるプロモーター配列と作動可能に連結され、３’接合部切断配列及び５’接合部切断配列と隣接し、前記３’接合部切断配列及び前記５’接合部切断配列が、異なる種類であり、前記複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドが、非ウイルスの起源である、前記脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）。
  2. 前記３’接合部切断配列が、リボザイム配列であり、前記５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される、請求項１に記載のＬＮＰ。
  3. 前記３’接合部切断配列が、リボザイム配列であり、前記５’接合部切断配列が、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列である、請求項２に記載のＬＮＰ。
  4. 前記３’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列であり、前記５’接合部切断配列が、リボザイム配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される、請求項１に記載のＬＮＰ。
  5. 前記３’接合部切断配列が、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列であり、前記５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、リボザイム配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される、請求項１に記載のＬＮＰ。
  6. 前記３’接合部切断配列が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列であり、前記５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、リボザイム配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される、請求項１に記載のＬＮＰ。
  7. 前記３’接合部切断配列が、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列であり、前記５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、リボザイム配列、及びアプタザイム配列から選択される、請求項１に記載のＬＮＰ。
  8. 前記３’接合部切断配列が、アプタザイム配列であり、前記５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びリボザイム配列から選択される、請求項１に記載のＬＮＰ。
  9. 前記複製可能なウイルスゲノムが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである、請求項１～８のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
  10. 前記一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスが、ポジティブセンス（（＋）センス）またはネガティブセンス（（－）センス）ｓｓＲＮＡウイルスである、請求項９に記載のＬＮＰ。
  11. 前記複製可能なウイルスゲノムが、（＋）センスｓｓＲＮＡウイルスであり、前記（＋）センスｓｓＲＮＡウイルスが、ピコルナウイルスである、請求項１０に記載のＬＮＰ。
  12. 前記ピコルナウイルスが、Ｓｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルス（ＳＶＶ）またはＣｏｘｓａｃｋｉｅウイルスである、請求項１１に記載のＬＮＰ。
  13. 前記ＬＮＰを細胞と接触させると、前記細胞によるウイルス粒子の産生がもたらされ、前記ウイルス粒子が、感染性及び溶解性である、請求項１～１２のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
  14. 前記組換えＤＮＡ分子が、外因性ペイロードタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
  15. 前記ＬＮＰが、外因性ペイロードタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
  16. 前記外因性ペイロードタンパク質が、蛍光タンパク質、酵素タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体のリガンド、または細胞表面受容体と結合することができる抗原結合分子である、請求項１４または１５に記載のＬＮＰ。
  17. 前記サイトカインが、ＩＬ－１８、ＩＬ－３６γ、ＬＩＧＨＴ、及びＩＬ－２から選択される、請求項１６に記載のＬＮＰ。
  18. 前記細胞表面受容体のリガンドが、Ｆｌｔ３リガンドである、請求項１６に記載のＬＮＰ。
  19. 前記ケモカインが、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４から選択される、請求項１６に記載のＬＮＰ。
  20. 前記抗原結合分子が、免疫チェックポイント受容体と結合して阻害することができる、請求項１６に記載のＬＮＰ。
  21. 前記免疫チェックポイント受容体が、ＰＤ１である、請求項２０に記載のＬＮＰ。
  22. 前記抗原結合分子が、ＤＬＬ３、ＥｐＣａｍ、及びＣＥＡから選択される腫瘍関連抗原と結合することができる、請求項１６に記載のＬＮＰ。
  23. 前記抗原結合分子が、腫瘍抗原に特異的な第１のドメイン及びＴ細胞表面分子に特異的な第２のドメインを含む、二重特異性Ｔ細胞会合分子である、請求項１６～２２のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
  24. 前記Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ３である、請求項２３に記載のＬＮＰ。
  25. マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）カセットが、前記複製可能なウイルスゲノムをコードする核酸配列に挿入され、前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、細胞内の対応するｍｉＲＮＡのうちの１つ以上の発現が、前記細胞内の前記複製可能なウイルスゲノムの複製を阻害する、請求項１～２２のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
  26. 前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２１９、ｍｉＲ－２１９ａ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－１３７、及びｍｉＲ－１２６から選択される、請求項２５に記載のＬＮＰ。
  27. 前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項２６に記載のＬＮＰ。
  28. 前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項２６に記載のＬＮＰ。
  29. 前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項２６に記載のＬＮＰ。
  30. 前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項２６に記載のＬＮＰ。
  31. 前記組換えＤＮＡ分子が、複製可能なウイルスゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列を含むプラスミドである、請求項１～３０のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
  32. 前記ＬＮＰが、カチオン性脂質、コレステロール、及び中性脂質を含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
  33. 前記カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、前記中性脂質が、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項３２に記載のＬＮＰ。
  34. リン脂質－ポリマー複合体をさらに含み、前記リン脂質－ポリマー複合体が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン）である、請求項３２または３３に記載のＬＮＰ。
  35. 前記カチオン性脂質が、Ｄ－Ｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）であり、前記中性脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、請求項３２に記載のＬＮＰ。
  36. １，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）のリン脂質－ポリマー複合体をさらに含む、請求項３４に記載のＬＮＰ。
  37. ヒアルロナンが、前記ＬＮＰの表面と複合される、請求項１～３６のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
  38. ＲＧＤペプチドが、前記ＬＮＰの表面と複合される、請求項１～３６のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
  39. 請求項１～３７のいずれか１項に記載の複数の脂質ナノ粒子を含み、前記複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約５００ｎｍの平均サイズを有する、治療用組成物。
  40. 前記複数のＬＮＰが、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４００ｎｍ～約５００ｎｍ、約４２５ｎｍ～約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ～約５００ｎｍ、または約４７５ｎｍ～約５００ｎｍの平均サイズを有する、請求項３９に記載の治療用組成物。
  41. 前記複数のＬＮＰが、約－２０ｍＶ未満、約－３０ｍＶ未満、約３５ｍＶ未満、または約－４０ｍＶ未満の平均ゼータ電位を有する、請求項３９または４０に記載の治療用組成物。
  42. 前記複数のＬＮＰが、約－５０ｍＶ～約－２０ｍＶ、約－４０ｍＶ～約－２０ｍＶ、または約－３０ｍＶ～約－２０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する、請求項４１に記載の治療用組成物。
  43. 前記複数のＬＮＰが、約－３０ｍＶ、約－３１ｍＶ、約－３２ｍＶ、約－３３ｍＶ、約－３４ｍＶ、約－３５ｍＶ、約－３６ｍＶ、約－３７ｍＶ、約－３８ｍＶ、約－３９ｍＶ、または約－４０ｍＶの平均ゼータ電位を有する、請求項４１または４２に記載の治療用組成物。
  44. 前記治療用組成物を対象に投与すると、組換えＤＮＡポリヌクレオチドが前記対象の標的細胞に送達され、前記組換えＤＮＡポリヌクレオチドが、前記対象の前記標的細胞を溶解することができる感染性ウイルスを産生する、請求項３９～４３のいずれか１項に記載の治療用組成物。
  45. 前記組成物が、静脈内または腫瘍内に送達される、請求項４４に記載の治療用組成物。
  46. 前記標的細胞が、がん性細胞である、請求項４４に記載の治療用組成物。
  47. がん性腫瘍の成長を阻害する方法であって、それを必要とする対象において、請求項３９～４６のいずれか１項に記載の治療用組成物を前記それを必要とする対象に投与することを含み、前記組成物の投与が、前記腫瘍の成長を阻害する、前記方法。
  48. 前記投与が、腫瘍内または静脈内である、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記がんが、肺癌または肝臓癌である、請求項４７または４８に記載の方法。
  50. 組換えＤＮＡ分子であって、複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記ポリヌクレオチド配列が、哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）と結合できるプロモーター配列と作動可能に連結され、３’接合部切断配列及び５’接合部切断配列と隣接し、前記３’接合部切断配列及び前記５’接合部切断配列が、異なる種類であり、前記複製可能なウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドが、非ウイルスの起源である、前記組換えＤＮＡ分子。
  51. 前記３’接合部切断配列が、リボザイム配列であり、前記５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される、請求項５０に記載の組換えＤＮＡ分子。
  52. 前記３’接合部切断配列が、リボザイム配列であり、前記５’接合部切断配列が、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列である、請求項５１に記載の組換えＤＮＡ分子。
  53. 前記３’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列であり、前記５’接合部切断配列が、リボザイム配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される、請求項５０に記載の組換えＤＮＡ分子。
  54. 前記３’接合部切断配列が、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列であり、前記５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、リボザイム配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される、請求項５０に記載の組換えＤＮＡ分子。
  55. 前記３’接合部切断配列が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列であり、前記５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、リボザイム配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びアプタザイム配列から選択される、請求項５０に記載の組換えＤＮＡ分子。
  56. 前記３’接合部切断配列が、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列であり、前記５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、リボザイム配列、及びアプタザイム配列から選択される、請求項５０に記載の組換えＤＮＡ分子。
  57. 前記３’接合部切断配列が、アプタザイム配列であり、前記５’接合部切断配列が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列、人工ｍｉＲ（ＡｍｉＲ）標的配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、ｐｒｉ－ｍｉＲ配列、及びリボザイム配列から選択される、請求項５０に記載の組換えＤＮＡ分子。
  58. 前記コードされたウイルスが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである、請求項５０～５７のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。
  59. 前記ｓｓＲＮＡウイルスが、ポジティブセンス（（＋）センス）またはネガティブセンス（（－）センス）ｓｓＲＮＡウイルスである、請求項５８に記載の組換えＤＮＡ分子。
  60. 前記（＋）センスｓｓＲＮＡウイルスが、ピコルナウイルスである、請求項５９に記載の組換えＤＮＡ分子。
  61. 前記ピコルナウイルスが、Ｓｅｎｅｃａ Ｖａｌｌｅｙウイルス（ＳＶＶ）またはＣｏｘｓａｃｋｉｅウイルスである、請求項６０に記載の組換えＤＮＡ分子。
  62. 前記組換えＤＮＡ分子が、非ウイルス送達ビヒクルによって細胞に導入されると、感染性の溶解性ウイルスを産生することができる、請求項５０～６１のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。
  63. 前記組換えＤＮＡ分子が、外因性ペイロードタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５０～６２のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。
  64. 前記外因性ペイロードタンパク質が、蛍光タンパク質、酵素タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体のリガンド、または細胞表面受容体と結合することができる抗原結合分子である、請求項６３に記載の組換えＤＮＡ分子。
  65. 前記サイトカインが、ＩＬ－１８、ＩＬ－３６γ、ＬＩＧＨＴ、及びＩＬ－２である、請求項６４に記載の組換えＤＮＡ分子。
  66. 前記細胞表面受容体のリガンドが、Ｆｌｔ３リガンドである、請求項６４に記載の組換えＤＮＡ分子。
  67. 前記ケモカインが、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４から選択される、請求項６４に記載の組換えＤＮＡ分子。
  68. 前記抗原結合分子が、免疫チェックポイント受容体と結合して阻害することができる、請求項６４に記載の組換えＤＮＡ分子。
  69. 前記免疫チェックポイント受容体が、ＰＤ１である、請求項６８に記載の組換えＤＮＡ分子。
  70. 前記抗原結合分子が、ＤＬＬ３、ＥｐＣａｍ、及びＣＥＡから選択される腫瘍関連抗原と結合することができる、請求項６４に記載の組換えＤＮＡ分子。
  71. 前記抗原結合分子が、腫瘍抗原に特異的な第１のドメイン及びＴ細胞表面分子に特異的な第２のドメインを含む、二重特異性Ｔ細胞会合分子である、請求項６４または請求項７０に記載の組換えＤＮＡ分子。
  72. 前記Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ３である、請求項７１に記載の組換えＤＮＡ分子。
  73. マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）カセットが、前記複製可能なウイルスゲノムをコードする核酸配列に挿入され、前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、細胞内の対応するｍｉＲＮＡのうちの１つ以上の発現が、前記細胞内の前記コードされたウイルスの複製を阻害する、請求項５０～７２のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。
  74. 前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２１９、ｍｉＲ－２１９ａ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－１３７、及びｍｉＲ－１２６から選択される、請求項７３に記載の組換えＤＮＡ分子。
  75. 前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項７３に記載の組換えＤＮＡ分子。
  76. 前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項７３に記載の組換えＤＮＡ分子。
  77. 前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項７３に記載の組換えＤＮＡ分子。
  78. 前記ｍｉＲ－ＴＳカセットが、ｍｉＲ－２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ－１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ－１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項７３に記載の組換えＤＮＡ分子。
  79. 前記組換えＤＮＡ分子が、複製可能なウイルスゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列を含むプラスミドまたはＮａｎｏＶである、請求項５０～７８のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。
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