KR20060103890A - 세네카 밸리 바이러스에 기초한 조성물 및 질병의 치료방법 - Google Patents

세네카 밸리 바이러스에 기초한 조성물 및 질병의 치료방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20060103890A
KR20060103890A KR1020067008081A KR20067008081A KR20060103890A KR 20060103890 A KR20060103890 A KR 20060103890A KR 1020067008081 A KR1020067008081 A KR 1020067008081A KR 20067008081 A KR20067008081 A KR 20067008081A KR 20060103890 A KR20060103890 A KR 20060103890A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
virus
svv
cells
leu
mutant
Prior art date
Application number
KR1020067008081A
Other languages
English (en)
Inventor
폴 엘 할렌벡
칼 엠 헤이
샨티 게인쉬
세쉬다 레디 폴리스
링 슈
징핑 양
쳉 쳉
Original Assignee
노바르티스아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 노바르티스아게 filed Critical 노바르티스아게
Publication of KR20060103890A publication Critical patent/KR20060103890A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/768—Oncolytic viruses not provided for in groups A61K35/761 - A61K35/766
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/085—Picornaviridae, e.g. coxsackie virus, echovirus, enterovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32061—Methods of inactivation or attenuation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 세네카 밸리 바이러스("SVV")로 불리는 신규의 RNA 피코나바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 분리된 SVV 핵산 및 상기 핵산에 의해 코딩되는 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명은 SVV 단백질에 대하여 생성된 항체를 제공한다. SVV는 몇몇 유형의 종양을 선택적으로 사멸시키는 능력을 보유하기 때문에, 본 발명은 암을 치료하기 위해 SVV 및 SVV 폴리펩티드를 사용하는 방법을 제공한다. SVV는 특정 종양을 특이적으로 표적으로 하기 때문에, 본 발명은 암을 검출하기 위해 SVV 핵산 및 단백질을 사용하는 방법을 제공한다. 또한, SVV의 종양 특이적 기전에 의해 제공되는 정보에 기인하여, 본 발명은 새로운 암용해성 바이러스 유도체를 제조하는 방법 및 종양 특이적 향성을 갖도록 바이러스를 변경시키는 방법을 제공한다.

Description

세네카 밸리 바이러스에 기초한 조성물 및 질병의 치료 방법{SENECA VALLEY VIRUS BASED COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING DISEASE}
본 명세서는 저작권으로 보호되는 소재를 포함한다. 이 저작권의 저작권자는 미국ㆍ특허 상표청의 특허 파일 또는 기록에 개시된 바와 같은 특허 문헌 또는 특허 명세서를 타인이 팩스밀리로 복사하는 것에는 이의가 없지만, 그 밖의 다른 모든 저작권은 보유한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 출원, 공개 특허 출원, 등록 특허, 텍스트 및 참고 문헌은 본 발명이 속하는 기술 분야를 더욱 충분히 설명하기 위해 본원에 그 전체가 참고 문헌으로 포함된다.
이 출원은 2003년 9월 26일에 출원된 미국 출원 번호 제60/506,182호에 대해 우선권을 주장하며, 상기 출원은 그 전문이 본원에 포함된다.
바이러스 치료법은 암 치료를 위한 전도 유망한 방법이다. 천연 형태이건 조작된 형태이건 간에 암 세포에 특이적으로 결합하여 이를 사멸시키는 암용해성 바이러스는 화학요법 및 방사선과 같은 대체 치료법보다 효능이 더 뛰어나며 독성은 적을 수 있다. 게다가, 암용해성 바이러스 치료법은 약리학적으로 원하는 부위에서 치료제를 증폭시킬 수 있는 것으로 알려진 유일한 치료법이기도 하다.
암 치료법의 중요한 측면은 정상 세포에 대한 암 세포의 사멸률을 높이는 것이다. 이 목적을 달성하는 것은 연루된 광범위한 세포 유형, 전이에 기인한 암 세포의 전신 전파 및 정상 세포와 암 세포 간의 작은 생물학적 차이를 비롯하여 수 많은 이유로 인하여 어려운 문제였다. 진보하고 있긴 하지만 현행 암 치료법에는 개선해야 할 문제점이 여전히 많이 남아있다.
과거에는, 외과 의사들이 환자를 사실상 손상시키지 않고 종양을 외과 수술에 의해 제거하고자 하였다. 1차 종양을 완전히 제거하여도 생존을 보장하지는 못하는데, 그 이유는 체내의 미지 부위로의 조기 전이가 검출되지 않은 상태로 남아있기 때문이다. 또한, 몇몇 연구는 외과적 개입이 혈관형성 억제제를 생산하는 종양 세포의 제거로 인하여 원거리 전이의 성장을 강화시킬 수 있음을 제시하고 있다. 마지막으로, 많은 경우에 있어 종양은 수술적 제거 후에 원래의 위치에서 다시 성장하게 된다. 방사선은 다른 것을 희생시켜 가장 빨리 증식하는 세포를 선택적으로 파괴한다. 그러나 종양 세포는 치료 중에 내성이 되거나 비분열 상태로 있음으로써 방사선 치료를 회피할 수 있다. 게다가, 다수의 정상 세포는 활발히 분열하며 치료에 의해 사멸된다(위장관 세포, 모낭 등)는 점에서 방사선이 늘 선택적인 방법은 아니다.
방사선과 마찬가지로 화학요법은 완벽하게 선택적인 방법은 아니며, 따라서 다수의 정상 세포를 파괴하게 되며, 세포의 약물 내성 및/또는 분열 상태로 인하여 모든 종양 세포를 사멸시키지는 못한다. 따라서, 화학요법 및 방사선 요법은 정상 세포와 암 세포 사이에 존재하는 작은 감수성 차이만을 이용하여, 좁은 치료 지수 를 제공하게 된다. 작은 치료 지수는 암을 치료하기 위한 어떠한 양상에서도 바람직하지 않은 특성임이 분명하다. 따라서, 이러한 한계점을 극복하기 위한 신규의 암 치료 방법이 요구된다.
이러한 신규 치료법 중 하나가 암용해성 바이러스 치료법이다. 처음에는, 세포독성 이종 유전자를 보유하는 복제 결함성 바이러스의 사용을 암 치료에 시도하였다. 그러나 이 방법은 종양의 형질도입에 있어 비효율적이고 암에 대한 선택성이 부적절한 것으로 확인되었다. 이러한 한계점을 극복하기 위해, 바이러스를 종양 세포에서 선택적으로 복제하도록 변형시키거나 또는 본래의 종양 선택성을 가지는 바이러스를 발견하였다. 따라서 이러한 암용해성 바이러스는 바이러스를 국소 주입하거나 또는 바이러스를 전신에 송달함으로써 종양 덩어리를 통해 복제하고 확산하여 종양 세포를 선택적으로 사멸시키는 특성을 보유하였다(도 1).
이러한 새로이 정의된 부류의 항암 치료법의 조기 전망에도 불구하고, 암 치료법으로서의 그 사용을 제한할 수 있는 몇 가지 제약점이 여전히 존재한다. 그러므로, 암 치료법에 사용될 수 있는 신규한 암용해성 바이러스에 대한 요구가 여전히 존재한다.
발명의 개요
본래 특성이 몇몇 유형의 종양을 선택적으로 사멸시키는 능력을 포함하는 신규 RNA 피코나바이러스가 발견되었다[이하에서는 세네카 밸리 바이러스(Seneca Valley virus; "SVV")라 칭함]. 하기 실시예에서 입증된 바와 같이, SVV는 대부분의 경우에 정상 세포에 비하여 종양 세포를 50% 사멸시키는 데 필요한 바이러스의 양(즉, EC50 값)에 있어서 10,000배가 넘는 차이로 향신경성 특성을 갖는 종양 계통을 선택적으로 사멸시킨다. 이 결과는 또한 생체내에서도 이어지는데, 여기에서는 마우스 체내의 종양 외식편이 선택적으로 제거된다. 또한, 생체내 결과는, 전신에 투여된 최대 1 x 1014 vp/kg(킬로그램당 벡터 또는 바이러스 입자)이 면역 결핍성 또는 면역 적격성 마우스에서 사멸 및 시각적으로 확인되는 임상적 증상을 전혀 유발하지 않는다는 점에서 SVV가 정상 세포에 독성이 없음을 나타낸다.
SVV는 1 x 108 vp/kg만큼 낮은 용량에서도 효능을 발휘한다. 따라서, > 100,000의 매우 높은 치료 지수가 달성된다. 마우스 체내에 미리 확립된 대형 종양의 100%가 완전히 근절될 수 있다는 점에서 효능은 매우 우수하다(실시예 11 참조). 이러한 효능은 어떠한 보조 요법도 사용하지 않고 SVV의 단독 전신 주사에 의해 성립될 수 있다. 또한, SVV를 주사한 마우스는 주사한 후 적어도 200일 동안 임상적 증상이나 종양의 재발을 나타내지 않는다. 또한 SVV는 고역가로 정제될 수 있으며 허용성 세포주에서 세포당 > 200,000 바이러스 입자로 생성될 수 있다. 따라서 SVV 기초 바이러스 치료법은 특정 유형의 암 치료를 위한 안전하고 효율적이며 새로운 라인의 치료법으로서 매우 유망하다. 또한, SVV는 작고 조작이 용이한 게놈, 단순하고 빠른 생활주기 및 충분히 규명된 캡시드를 가지며, 따라서 변형이 용이하다. 이러한 특성들은, 적어도 부분적으로, 새로운 세포 또는 조직 특이적 향성을 가지는 변형된 SVV를 생성하는 방법을 가능케 하여, SVV 기초 치료법이 원래의 SVV 분리물에 의한 감염에 대해 내성이 있는 새로운 종양 유형에 적용될 수 있도록 한다.
따라서, 본 발명은 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 또는 뉴클레오티드 길이가 50개 이상인 상기 서열들 중 어느 하나의 연속된 일부분에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 가지는 핵산 서열, 또는 뉴클레오티드 길이가 10개, 15개 또는 20개 이상인 상기 서열들 중 어느 하나의 연속된 일부분과 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공한다. 본 발명의 분리된 핵산은 RNA 또는 DNA일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 또는 뉴클레오티드 길이가 50개 이상인 상기 서열들 중 어느 하나의 연속된 일부분에 대해 고 엄중도, 중간 엄중도 또는 저 엄중도 조건 하에 하이브리드화하는 분리된 핵산을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21에 대해, 또는 뉴클레오티드 길이가 50개 이상인 상기 서열들 중 어느 하나의 연속된 일부분에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 가지는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21을 포함하는 핵산 서열에 대해, 또는 뉴클레오티드 길이가 50개 이상인 상기 서열들 중 어느 하나의 연속된 일부분에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 가지는 핵산에 의해 코딩되는 분리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22에 대해, 또는 아미노산 길이가 10개 이상인 상기 서열들 중 어느 하나의 연속된 일부분에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22에 대해, 또는 아미노산 길이가 10개 이상인 상기 서열들 중 어느 하나의 연속된 일부분에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체를 제공한다. 분리된 항체는 서열 번호 2의 임의의 단백질 에피토프 또는 항원에 결합하도록 생성될 수 있다. 또한, 이 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 서열 번호 1에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 게놈 서열을 가지는 분리된 SVV 또는 이의 유도체 또는 이의 관련체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 미국 표준 균주 보존 기관(ATCC) 특허 기탁 번호 PTA-5343의 식별 특성 및 핵산 서열을 모두 가지는 분리된 바이러스를 제공한다. 본 발명의 바이러스 중 일부는 PTA-5343 분리물, 이 PTA-5343의 변이체, 동족체, 관련체, 유도체 및 돌연변이체와, 암용해 특성에 관여하는 것으로 확인된 SVV(야생형 및 돌연변이형 둘 다)의 서열에 대하여 변형된 기타 바이러스의 변이체, 동족체, 유도체 및 돌연변이체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하기의 특성들을 포함하는 분리된 SVV를 제공한다: ∼7.5 킬로염기(kb)의 단일 가닥 RNA 게놈(양성(+) 센스 가닥); ∼27 나노미터(nm)의 직경; 약 31 kDa, 36 kDa 및 27 kDa의 근사 분자량을 가지는 3종 이상의 단백질을 포함하는 캡시드; 염화세슘(CsCl) 구배 상에서의 약 1.34 g/mL의 부력 밀도; 및 종양 세포 내에서의 복제 적격성. 이러한 측면에서, 31 kDa의 캡시드 단백질(VP1)은 서열 번호 8에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 36 kDa 캡시드 단백질(VP2)은 서열 번호 4에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 27 kDa 캡시드 단백질(VP3)은 서열 번호 6에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기의 특성들을 포함하는 분리된 SVV 유도체 또는 관련체를 제공한다: 종양 세포 내에서의 복제 적격성, 종양 세포 향성 및 정상 세포 내에서의 세포 용해능의 결여. 또 다른 측면에서, 이 바이러스는 신경내분비 특성을 보유하는 종양 세포 유형에서 복제 적격성이다.
다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 본 발명 바이러스 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물; 본 발명 바이러스를 포함하는 세포; 본 발명 바이러스의 항원을 포함하는 바이러스 용해물; 및 본 발명 바이러스로부터 얻어진 분리 및 정제된 바이러스 항원을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포를 바이러스로 감염시키는 단계; 세포 용해물을 회수하는 단계; 세포 용해물로 1 순환 이상의 구배 원심분리를 실시하는 단계; 및 상기 구배로부터 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는, 본 발명 바이러스를 정제하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암을 치료하기 위해 유효량의 바이러스 또는 이의 유도체를 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공하는데, 이 때 상기 바이러스는 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21에 대해 또는 서열 번호 1의 일부분에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 게놈 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호 3, 5, 7 또는 이의 연속된 일부분에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 캡시드 코딩 영역을 포함하는 바이러스의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 서열 번호 4, 6, 8 또는 이의 연속된 일부분에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 캡시드를 포함하는 바이러스의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 암 세포를 바이러스 또는 이의 유도체와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 진행을 억제하는 방법을 제공하며, 이 때 상기 바이러스 또는 이의 유도체는 암 세포에 특이적으로 결합하며 상기 바이러스는 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 또는 21에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 게놈 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암 세포를 유효량의 바이러스 또는 이의 유도체와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포의 사멸 방법을 제공하며, 이 때 상기 바이러스는 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 또는 21에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 게놈 서열을 갖는다.
암에 적용되는 상기 치료 방법들에서, 바이러스는 피코나바이러스일 수 있다. 피코나바이러스는 카디오바이러스, 에르보바이러스, 아프토바이러스, 코부바이러스, 헤파토바이러스, 파레코바이러스, 테스코바이러스, 엔테로바이러스 또는 리노바이러스일 수 있다. 카디오바이러스는 빌유이스크(vilyuisk) 인간 뇌척수염 바이러스, 테일러(Theiler) 쥐 뇌척수염 바이러스, 뇌심근염 바이러스 및 SVV로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 뇌심근염 바이러스는 CA-131395, LA-97-1278, IL-92-48963, IA-89-47752, NJ-90-10324, MN-88-36695, 및 NC-88-23626으로 구성된 분리물의 군으로부터 선택될 수 있다. SVV는 ATCC 기탁 번호가 PTA-5343인 바이러스 또는 서열 번호 1 또는 이의 연속된 일부분에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 바이러스일 수 있다.
본 발명은 또한 세포를 본 발명 바이러스와 접촉시키는 것을 포함하는 비정상적으로 증식하는 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 비정상적으로 증식하는 세포는 종양 세포이다. 이 방법의 다양한 측면에서, 종양 세포는 인간 소세포 폐암, 인간 망막아세포종, 인간 신경아세포종, 인간 수아세포종, 마우스 신경아세포종, 윌름 종양 및 인간 비-소세포 폐암으로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명은 또한 유효량의 본 발명 바이러스를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 피험체의 신생물성 질환의 치료 방법을 제공한다. 한 측면에서, 신생물성 질환은 신경내분비암이다. 또 다른 측면에서, 피험체는 포유동물이다. 또 다른 측면에서 포유동물은 인간이다.
본 발명은 또한 바이러스에 감염된 세포를 바이러스의 복제를 가능하게 하는 조건 하에 배양하는 단계 및 세포 또는 상청액으로부터 바이러스를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명 바이러스의 생성 방법을 제공한다. 이러한 방법의 한 측면에서, 세포는 PER.C6 세포이다. 이 방법의 또 다른 측면에서, 세포는 H446 세포이다. 이 방법의 다양한 측면에서, 세포는 세포당 200,000개 이상의 바이러스 입자를 생성할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명 바이러스를 포함하는 것으로 추측되는 테스트 물질로부터 RNA를 분리하는 단계; 서열 번호 1의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드에 해당하는 RNA를 표지하는 단계; 테스트 물질을 표지된 RNA로 프로빙(probing)하는 단계; 및 테스트 물질로부터 분리된 RNA와 표지된 RNA의 결합을 검출하는 단계로서, 상기 결합은 바이러스의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하는, 본 발명 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호 1의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 프로브 또는 이의 상보서열을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) SVV 게놈 서열과 테스트 바이러스 게놈 서열을 비교하는 단계; (b) SVV 게놈 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 테스트 바이러스 게놈 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드 간의 적어도 첫 번째 아미노산 차이를 확인하는 단계; (c) 테스트 바이러스 게놈 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 SVV 게놈 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대해 적어도 하나 적은 아미노산 차이를 갖도록 테스트 바이러스 게놈 서열을 돌연변이시키는 단계; (d) 돌연변이된 테스트 바이러스 게놈 서열을 종양 세포에 형질감염(transfection)시키는 단계; 및 (e) 종양 세포가 돌연변이된 테스트 바이러스 게놈 서열에 의해 용해되어 감염되는지를 확인하는 단계를 포함하는, 암용해성 카디오바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 테스트 바이러스에서 돌연변이된 아미노산(들)은 구조 영역의 아미노산, 예컨대 캡시드 코딩 영역의 아미노산이다. 또 다른 측면에서, 테스트 바이러스에서 돌연변이된 아미노산은 비구조 영역의 아미노산이다.
암용해성 바이러스의 제조 방법의 한 측면에서, SVV 게놈 서열은 ATCC 기탁 번호가 PTA-5343인 분리된 SVV로부터 얻어지거나, 또는 서얼 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 또는 이의 연속된 일부분에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 바이러스로부터 얻어진다. 이 방법의 또 다른 측면에서, 테스트 바이러스 게놈 서열을 돌연변이시키는 단계는 테스트 바이러스 게놈 서열을 가지는 cDNA를 돌연변이시키는 것을 포함한다. 이 방법의 또 다른 측면에서, 돌연변이된 테스트 바이러스 게놈 서열을 형질감염시키는 단계는 RNA를 형질감염시키는 것을 포함하는데, 이 때 상기 RNA는 돌연변이된 테스트 바이러스 게놈 서열을 가지는 cDNA로부터 생성된 것이다.
암용해성 카디오바이러스의 제조 방법의 또 다른 측면에서, 테스트 바이러스는 피코나바이러스이다. 테스트 피코나바이러스는 테스코바이러스, 엔테로바이러스, 리노바이러스, 카디오바이러스, 에르보바이러스, 아프토바이러스, 코부바이러스, 헤파토바이러스, 파레코바이러스 또는 테스코바이러스일 수 있다. 또 다른 측면에서, 테스트 바이러스는 카디오바이러스이다. 또 다른 측면에서, 암용해성 바이러스의 제조 방법에서 확인된 아미노산 차이는 SVV 캡시드 단백질과 테스트 바이러스 캡시드 단백질 서열 간의 차이이다. 암용해성 바이러스의 제조를 위한 또 다른 측면에서, 테스트 바이러스 게놈 서열은 빌유이스크 인간 뇌척수염 바이러스, 테일러 쥐 뇌척수염 바이러스 및 뇌심근염 바이러스로 구성된 군에서 선택된다. 또 다른 측면에서, 테스트 바이러스 게놈 서열은 뇌심근염 바이러스로부터 선택된다. 뇌심근염 바이러스는 CA-131395, LA-97-1278, IL-92-48963, IA-89-47752, NJ-90-10324, MN-88-36695, 및 NC-88-23626으로 구성된 분리물의 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 측면에서, 뇌심근염 바이러스 또는 임의의 기타 테스트 바이러스는 ATCC 기탁 번호 PTA-5343의 SVV 또는 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 또는 이의 연속된 일부분에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열을 가지는 분리물로부터 선택될 수 있다.
암용해성 카디오바이러스의 제조 방법의 또 다른 측면에서, 테스트 바이러스와 SVV 간의 아미노산 차이는 SVV의 캡시드 단백질 영역에 있으며, 이 때 아미노산 차이는 SVV 서열 번호 4, 6 또는 8 내에서 정렬된다.
본 발명은 또한 (a) 다수의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 돌연변이체의 라이브러리를 생성하는 단계; (b) 바이러스 돌연변이체의 라이브러리를 허용성 세포에 형질감염시켜, 다수의 돌연변이 바이러스가 생성되도록 하는 단계; (c) 다수의 돌연변이 바이러스를 분리하는 단계; (d) 비허용성 세포를 분리된 다수의 돌연변이 바이러스와 함께 항온처리하는 단계; 및 (e) 비허용성 세포에서 생성된 돌연변이 바이러스를 회수함으로써, 향성이 변경된 돌연변이 바이러스를 제조하는 단계를 포함하는, 세포형 향성이 변경된 돌연변이 바이러스의 제조 방법을 제공한다. 한 측면에서, 이 방법은 (f) 회수된 돌연변이 바이러스를 비허용성 세포 내에서 항온처리하는 단계; 및 (g) 비허용성 세포에서 생성된 돌연변이 바이러스를 회수하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 측면에서, 이 방법은 단계 (f) 및 (g)를 반복하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 측면에서, 바이러스 돌연변이체의 라이브러리는 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 또는 이의 연속된 일부분을 포함하는 모 서열로부터 생성된다.
세포형 향성이 변경된 돌연변이체 바이러스의 제조 방법의 한 측면에서, 항온처리는 멀티-웰 고처리량 플랫폼(multi-well throughput platform)으로 수행하는데, 이 때 상기 플랫폼은 각 웰에 서로 다른 비허용성 세포 유형을 포함한다. 이러한 측면에서, 이 방법은 어느 웰이 세포를 사멸시키는 돌연변이 바이러스를 포함하는지를 확인하기 위해 플랫폼을 스크리닝하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 스크리닝은 각 웰의 흡광도를 분석함으로써 수행한다.
세포형 향성이 변경된 돌연변이 바이러스의 제조 방법의 또 다른 측면에서, 비허용성 세포는 종양 세포이다.
세포형 향성이 변경된 돌연변이 바이러스의 제조 방법의 또 다른 측면에서, 바이러스 돌연변이체의 라이브러리를 생성하는 단계는 (i) 바이러스의 게놈 서열의 일부분에 대해 동일한 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; (ii) 폴리뉴클레오티드를 돌연변이시켜 다수의 상이한 돌연변이 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계; (iii) 단계 (i)에서 폴리뉴클레오티드가 포함하는 바이러스의 게놈 서열의 일부분을 제외한 바이러스의 게놈 서열을 가지는 벡터로 다수의 돌연변이된 폴리뉴클레오티드를 결찰시킴으로써, 바이러스 돌연변이체의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 바이러스의 게놈 서열은 피코나바이러스이다. 또 다른 측면에서, 바이러스의 게놈 서열은 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 또는 이의 연속된 일부분에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 바이러스 돌연변이체의 라이브러리를 생성하는 단계에서, 단계 (ii)의 돌연변이 유발은 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드에 무작위 삽입하여 수행한다. 한 측면에서, 뉴클레오티드의 무작위 삽입은 트리뉴클레오티드-돌연변이 유발(trinucleotide-mutagenesis; TRIM)에 의해 수행한다. 또 다른 측면에서, 폴리뉴클레오티드에 삽입된 뉴클레오티드의 적어도 일부분은 에피토프 태그를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 바이러스 돌연변이체의 라이브러리를 생성하는 단계에서, 단계 (ii)의 돌연변이 유발은 폴리뉴클레오티드의 캡시드 코딩 영역에서 수행한다.
본 발명은 또한, 세포형 향성이 변경된 돌연변이 카디오바이러스를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 카디오바이러스의 돌연변이 폴리뉴클레오티드 서열의 라이브러리를 생성하는 단계로서, 상기 생성은 카디오바이러스의 캡시드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; 폴리뉴클레오티드를 돌연변이시켜서 폴리뉴클레오티드 서열을 코딩하는 다수의 상이한 돌연변이 캡시드를 생성하는 단계; 및 돌연변이된 캡시드 코딩 폴리뉴클레오티드를 캡시드 코딩 영역을 제외한 카디오바이러스의 게놈 서열을 가지는 벡터로 결찰시킴으로써, 카디오바이러스의 돌연변이 폴리뉴클레오티드 서열의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함하는 것인 단계; (b) 돌연변이 폴리뉴클레오티드 서열의 라이브러리를 허용성 세포에 형질감염시켜, 다수의 돌연변이 바이러스가 생성되도록 하는 단계; (c) 다수의 돌연변이 바이러스를 분리하는 단계; (d) 비허용성 세포와 다수의 분리된 돌연변이 바이러스를 함께 항온처리하는 단계; 및 (e) 비허용성 세포에서 생성된 돌연변이 바이러스를 회수함으로써, 향성이 변경된 돌연변이 카디오바이러스를 제조하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 이 방법은 (f) 회수된 돌연변이 바이러스를 비허용성 세포에서 항온처리하는 단계; 및 (g) 비허용성 세포에서 생성된 돌연변이 바이러스를 회수하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 측면에서, 이 방법은 단계 (f) 및 (g)를 반복하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 측면에서, 돌연변이 유발은 캡시드 코딩 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 무작위 삽입하여 수행한다. 또 다른 측면에서, 캡시드 코딩 폴리뉴클레오티드에 무작위 삽입된 뉴클레오티드의 적어도 일부분은 에피토프 태그를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 뉴클레오티드의 무작위 삽입은 TRIM에 의해 수행한다. 또 다른 측면에서, 다수의 상이한 돌연변이 캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 108 또는 109개를 초과하는 상이한 캡시드 코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 측면에서, 세포형 향성이 변경된 돌연변이 SVV를 제조하는 방법은 (a) SVV 돌연변이체의 cDNA 라이브러리를 생성하는 단계; (b) SVV 돌연변이체의 cDNA 라이브러리로부터 SVV RNA를 생성하는 단계; (c) SVV RNA를 허용성 세포에 형질감염시켜, 다수의 돌연변이 SVV가 생성되도록 하는 단계; (d) 다수의 돌연변이 SVV를 분리하는 단계; (e) 비허용성 종양 세포를 다수의 분리된 돌연변이 SVV와 함께 항온처리하는 단계; 및 (f) 비허용성 종양 세포를 용해하여(lytically) 감염시키는 돌연변이 SVV를 회수함으로써, 향성이 변경된 돌연변이 SVV를 제조하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 이 방법은 (g) 회수된 돌연변이 SVV를 비허용성 세포 내에서 항온처리하는 단계; 및 (h) 비허용성 종양 세포를 용해하여 감염시키는 돌연변이 SVV를 회수하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 측면에서, 이 방법은 단계 (g) 및 (h)를 반복하는 단계를 더 포함한다. 한 측면에서, 항온처리는 멀티-웰 고처리량 플랫폼으로 수행하는데, 이 때 상기 플랫폼은 각 웰에 서로 다른 비허용성 세포 유형을 포함한다. 또 다른 측면에서 이 방법은 어느 웰이 세포를 용해하여 감염시키는 돌연변이 SVV를 포함하는지를 확인하기 위해 플랫폼을 스크리닝하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 측면에서, 스크리닝은 각 웰의 흡광도를 분석함으로써 수행한다. 한 측면에서, SVV 돌연변이의 cDNA 라이브러리는 다수의 돌연변이 SVV 캡시드 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 다수의 돌연변이 SVV 캡시드 폴리뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드의 무작위 삽입에 의해 생성된다. 또 다른 측면에서, 무작위 삽입된 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분은 에피토프 태그를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 뉴클레오티드의 무작위 삽입은 TRIM에 의해 수행한다. 또 다른 측면에서, SVV 돌연변이체의 cDNA 라이브러리는 ATCC 기탁 번호가 PTA-5343인 SVV로부터 생성된다. 또 다른 측면에서, SVV 돌연변이체의 cDNA 라이브러리는 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 또는 21에 대해 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 또는 65%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하는 SVV로부터 생성된다. 또 다른 측면에서, 비허용성 종양 세포는 종양 세포주 또는 환자로부터 분리된 종양 세포 유형이다.
본 발명은 또한 생체내에서 종양 세포형 향성을 가지는 돌연변이 바이러스를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 다수의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 돌연변이체의 라이브러리를 생성하는 단계; (b) 바이러스 돌연변이체의 라이브러리를 허용성 세포에 형질감염시켜 다수의 돌연변이 바이러스가 생성되도록 하는 단계; (c) 다수의 돌연변이 바이러스를 분리하는 단계; (d) 분리된 다수의 돌연변이 바이러스를 종양을 가진 포유동물에게 투여하는 단계로서, 상기 포유동물은 돌연변이 바이러스의 비돌연변이형의 천연 숙주가 아닌 것인 단계; 및 (e) 종양 내에서 복제한 바이러스를 회수함으로써, 생체내에서 종양 세포형 향성을 가지는 돌연변이 바이러스를 제조하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 바이러스 돌연변이체의 라이브러리를 생성하는 단계는 바이러스의 캡시드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; 폴리뉴클레오티드를 돌연변이시켜 다수의 상이한 돌연변이 캡시드 코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계; 및 다수의 돌연변이된 캡시드 코딩 폴리뉴클레오티드를 캡시드 코딩 영역을 제외한 바이러스의 게놈 서열을 가지는 벡터로 결찰시킴으로써 바이러스 돌연변이체의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 단계 (e)에서 회수된 바이러스는 종양의 세포를 용해하여 감염시킨다. 생체내에서 종양 세포형 향성을 가지는 돌연변이 바이러스를 제조하는 방법의 또 다른 측면에서, 종양은 이종 이식편, 동계 종양, 동소성 종양 또는 이종유전자 종양이다. 또 다른 측면에서, 포유동물은 마우스이다.
본 발명의 모든 방법에 있어서, 바이러스는 피코나바이러스일 수 있다. 피코나바이러스는 카디오바이러스, 에르보바이러스, 아프토바이러스, 코부바이러스, 헤파토바이러스, 파레코바이러스, 테스코바이러스, 엔트로바이러스 또는 리노바이러스일 수 있다. 카디오바이러스는 SVV일 수 있다. SVV는 ATCC 특허 기탁 번호가 PTA-5343인 SVV 또는 서열 번호 1, 3, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 또는 이의 연속된 일부분에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 SVV일 수 있다. 또한, 카디오바이러스는 빌유이스크 인간 뇌척수염 바이러스, 테일러 쥐 뇌척수염 바이러스 및 뇌심근염 바이러스로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 한 측면에서, 뇌심근염 바이러스는 CA-131395, LA-97-1278, IL-92-48963, IA-89-47752, NJ-90-10324, MN-88-36695 및 NC-88-23626으로 구성된 분리물의 군에서 선택된다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 ATCC 기탁 번호 PTA-5343인 SVV 또는 서열 번호 1, 3, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 또는 이의 연속된 일부분에 대해 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 또는 65%의 서열 동일성을 갖는 분리물로부터 선택되거나 또는 서열 상동성에 의해 SVV와 관련이 있는 것으로 간주되는 임의의 바이러스를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 돌연변이 바이러스를 제조하는 방법 중 어느 한 방법에 의해 제조된 암용해성 바이러스를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 암용해성 바이러스로 환자를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 본원에 개시된 돌연변이 바이러스 제조 방법 중 어느 한 방법에 의해 제조된 암용해성 바이러스를, 암용해성 바이러스가 비감염성이 되도록 하고 암용해성 바이러스의 향성은 영향을 받지 않도록 불활성화시키는 단계; 및 (b) 방사선 조사된 암용해성 바이러스를 종양 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 환자의 치료 방법은 불활성화된 암용해성 바이러스에 독소를 부착시키는 단계를 더 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 종양을 가진 환자를 SVV로 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 바이러스가 비감염성이 되도록 하고 향성은 영향을 받지 않도록 SVV를 불활성화시키는 단계; 및 (b) 불활성화된 SVV를 종양 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 종양을 가진 환자를 SVV로 치료하는 방법은 독소를 불활성화된 SVV에 부착시키는 단계를 더 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 불활성화된 SVV를 포함하는 SVV 조성물을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 캡시드 영역에 통합된 에피토프 태그를 포함하는 SVV를 제공한다.
본 발명은 또한 종양을 가진 환자를 SVV로 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 캡시드 내에서 코딩된 에피토프 태그를 포함하는 돌연변이 SVV를 생성하는 단계; (b) 독소를 에피토프 태그에 부착시키는 단계; 및 (c) 독소가 부착되어 있는 돌연변이 SVV를 종양 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 생성 단계는 에피토프 태그를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 SVV의 캡시드 코딩 영역 폴리뉴클레오티드에 삽입하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 돌연변이 SVV는 세포형 향성이 변경되지 않는다. 또 다른 측면에서, 이 방법은 돌연변이 SVV가 비감염성이 되도록 돌연변이 SVV를 불활성화시키는 단계를 더 포함한다.
본 발명은 또한 (a) 환자로부터 종양 샘플을 분리하는 단계; (b) 종양 샘플을 에피토프 태그가 달린 SVV와 항온처리하는 단계; 및 (c) 에피토프 태그를 검출함으로써 결합된 SVV에 대하여 종양 샘플을 스크리닝하는 단계를 포함하는, 샘플 중의 종양 세포를 검출하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 에피토프 태그가 달린 불활성화된 SVV를 환자에게 투여하는 단계로서, 상기 에피토프 태그에 표지가 접합되는 것인 단계; 및 (b) 환자 체내의 표지를 검출하는 단계를 포함하는, 생체내 종양 세포를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 종양 세포의 검출 방법에서, SVV는 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 돌연변이 SVV일 수 있다.
또한, 신생물 질환을 치료하고, 신생물 질환을 검출하고, SVV를 생성하는 본 발명 방법은 야생형 SVV, 돌연변이체(변형된 것 또는 변이체를 포함함) SVV, SVV의 관련체 및 본 발명의 기타 종양 특이적 바이러스에 적용된다.
본 발명의 바이러스 및 이의 조성물은 본원에 기재된 질병의 치료를 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 바이러스 또는 이의 조성물은 본원에서 언급된 질병의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 측면에서, 본 발명은 암 치료 방법에 있어서 또는 암 치료용 의약의 제조에 있어서의 SVV(또는 이의 돌연변이체, 유도체, 관련체 및 조성물)의 용도를 제공한다.
기탁 정보
하기 물질들은 특허 절차상의 미생물 기탁에 관한 국제적 승인에 대한 부다페트스 조약 하에, 미국 20110-2209 버지니아주 매너사스 유니버시티 불바드 10801에 소재하는 미국 표준 균주 보존 기관(ATCC)에 기탁되었다. 기탁된 물질의 입수성에 대한 모든 제약은 특허 등록 시에 사라지며 이는 변경 불가능하다. 물질: 세네카 밸리 바이러스(SVV). ATCC 특허 기탁 번호: PTA-5343. 기탁일: 2003년 7월 25일.
도면의 간단한 설명
도 1은 암용해성 바이러스를 사용하는 바이러스 치료법의 개략도를 보여준다. 암용해성 바이러스는 바이러스를 국소 주사하거나 바이러스를 전신에 투여함으로써 종양 덩어리를 통해 복제하고 확산하여 종양 세포를 선택적으로 사멸시키는 특성을 보유한다.
도 2는 우라닐 아세테이트로 염색하여 투과 전자 현미경에 의해 관찰한 정제된 SVV를 보여준다. 구형 바이러스 입자는 직경이 약 27 nm이다.
도 3은 대형 결정질 봉입체 및 대형 소낭체를 보유하는 SVV에 감염된 PER.C6 세포의 전자 현미경 사진이다.
도 4A는 SVV RNA의 분석 결과를 보여준다. SVV 게놈 RNA는 Trizol(인비트로겐 코포레이션, 캘리포니아주 칼스배드)을 사용하는 구아니듐 티오시아네이트 및 페놀 추출법을 이용하여 추출한다. RNA는 1.25% 변성성 아가로스 겔을 통해 분해한다. 밴드는 에티듐 브로마이드(EtBr) 염색에 의해 가시화하여 사진을 찍었다. 레인 2에서, SVV 게놈 RNA의 주 밴드가 관찰되었으며, 이는 전체 길이 SVV 게놈의 크기가 약 7.5 kb임을 나타낸다[확인].
도 4B는 SVV를 포함하여 피코나바이러스의 폴리단백질 프로세싱으로부터 생성된 단백질 생성물 및 게놈 구조를 보여주는 개략도이다.
도 5A-5E는 SVV의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1) 및 코딩된 아미노산 서열(서열 번호 2)를 나타낸다. 종결 코돈은 5671-3 위치에 "*"로 표시하였다. 일반적으로, 정확한 뉴클레오티드가 확인되는 지점을 포함하는 서열 목록에서, 이들 위치는 "n"으로 나타내어진다. 그러므로, "n"을 보유하는 코돈에서, 해당 아미노산은 "x"로 표시된다.
도 6A-6D는 SVV의 전체 길이 게놈의 대부분의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)을 제시한다. 이 뉴클레오티드 서열은 ATCC 특허 기탁 번호: PTA-5343의 SVV 분리물로부터 유래되었다. 기탁일은 2003년 7월 25일이다.
도 7A-7B는 서열 번호 1에 의해 코딩되는 아미노산 서열(서열 번호 2)을 나타낸다.
도 8은 SVV의 부분적 1B 또는 VP2 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 3)을 나타낸다. 이 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 4-429와 동일하다.
도 9는 서열 번호 3에 의해 코딩되는 부분적 SVV VP2 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 4)을 나타낸다. 서열 번호 4에 제시된 서열은 서열 번호 2의 아미노산 2-143과 동일하다.
도 10은 SVV의 1C 또는 VP3 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 5)을 나타낸다. 이 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 430-1146과 동일하다.
도 11은 서열 번호 5에 의해 코딩되는 SVV VP3 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 6)을 나타낸다. 서열 번호 6에 제시된 서열은 서열 번호 2의 아미노산 144-382와 동일하다.
도 12는 SVV의 1D 또는 VP1 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 7)을 나타낸다. 이 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1147-1923과 동일하다.
도 13은 서열 번호 7에 의해 코딩되는 SVV의 VP1 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 8)을 나타낸다. 서열 번호 8에 제시된 서열은 서열 번호 2의 아미노산 383-641과 동일하다.
도 14는 SVV의 2A 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 9)을 나타낸다. 이 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1924-1965와 동일하다.
도 15는 서열 번호 9에 의해 코딩되는 SVV 2A 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 10)을 나타낸다. 서열 번호 10에 제시된 서열은 서열 번호 2의 아미노산 642-655와 동일하다.
도 16은 SVV의 2B 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 11)을 나타낸다. 이 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1966-2349와 동일하다.
도 17은 서열 번호 11에 의해 코딩되는 SVV 2B 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 12)을 나타낸다. 서열 번호 12에 제시된 서열은 서열 번호 2의 아미노산 656-783과 동일하다.
도 18은 SVV의 2C 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 13)을 나타낸다. 이 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 2350-3315와 동일하다.
도 19는 서열 번호 13에 의해 코딩되는 SVV 2C 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 14)을 나타낸다. 서열 번호 14에 제시된 서열은 서열 번호 2의 아미노산 784-1105와 동일하다.
도 20은 SVV의 3A 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 15)을 나타낸다. 이 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 3316-3585와 동일하다.
도 21은 서열 번호 15에 의해 코딩되는 SVV 3A 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 16)을 나타낸다. 서열 번호 16에 제시된 서열은 서열 번호 2의 아미노산 1106-1195와 동일하다.
도 22는 SVV의 3B 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 17)을 나타낸다. 이 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 3586-3651과 동일하다.
도 23은 서열 번호 17에 의해 코딩되는 SVV 3B 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 18)을 나타낸다. 서열 번호 18에 제시된 서열은 서열 번호 2의 아미노산 1196-1217과 동일하다.
도 24는 SVV의 3C 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 19)을 나타낸다. 이 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 3652-4284와 동일하다.
도 25는 서열 번호 19에 의해 코딩되는 SVV 3C 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 20)을 나타낸다. 서열 번호 20에 제시된 서열은 서열 번호 2의 아미노산 1218-1428과 동일하다.
도 26은 SVV의 3D 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 21)을 나타낸다. 이 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 4285-5673과 동일하다.
도 27은 서열 번호 21에 의해 코딩되는 SVV 3D 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 22)을 나타낸다. 서열 번호 22에 제시된 서열은 서열 번호 2의 아미노산 1429-1890과 동일하다.
도 28A-28H는 서열 번호 2의 SVV와, 뇌심근염 바이러스[EMCV; 뇌심근염 바이러스(Encephalomyocarditis virus) 종], 테일러 쥐 뇌심근염 바이러스[TMEV; 테일로바이러스(Theilovirus) 종], 래트 TMEV-유사 물질(TLV; 테일로바이러스 종), 및 빌유이스크 인간 뇌척수염 바이러스(VHEV; 테일로바이러스 종)와 같은 카디오바이러스(Cardiovirus) 속의 다양한 구성원 간의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. 다양한 카디오바이러스의 구체적인 서열은 서열 번호 23(EMCV-R), 서열 번호 24(EMCV-PV21), 서열 번호 25(EMCV-B), 서열 번호 26(EMCV-Da), 서열 번호 27(EMCV-Db), 서열 번호 28(EMCV-PV2), 서열 번호 29(EMCV-Mengo), 서열 번호 30(TMEV/DA), 서열 번호 31(TMEV/GDVII), 서열 번호 32(TMEV/BeAn8386), 서열 번호 33(TLV-NGS910) 및 서열 번호 34(VHEV/Siberia-55)에 제시되어 있다.
도 28에서 번호 위치는 서열 목록의 번호매김에 대응하지 않는다. "/" 기호는 폴리단백질이 최종 기능성 생성물로 절단되는 절단 위치를 나타낸다. 예를 들어, 1번 위치와 157번 위치 사이의 정렬은 1A(VP4) 영역에 있다. 159번 위치와 428번 위치 사이의 정렬은 1B(VP2) 영역에 있으며; 430번 위치와 668번 위치 사이의 정렬은 1C(VP3) 영역에 있으며, 670번 위치와 967번 위치 사이의 정렬은 1D(VP1) 영역에 있으며; 969번 위치와 1111번 위치 사이의 정렬은 2A 영역에 있으며; 1112번 위치와 1276번 위치 사이의 정렬은 2B 영역에 있으며; 1278번 위치와 1609번 위치 사이의 정렬은 2C 영역에 있으며; 1611번 위치와 1700번 위치 사이의 정렬은 3A 영역에 있으며; 1702번 위치와 1723번 위치 사이의 정렬은 3B 영역에 있으며; 1725번 위치와 1946번 위치 사이의 정렬은 3C 영역에 있으며; 1948번 위치와 2410번 위치 사이의 정렬은 3D 영역에 있다. 이 정렬은 또한 표준 서열 분석 프로그램에 의해 확인할 수 있는 바와 같이, 바이러스 서열 간의 잠재적 보존성 또는 유사성의 영역을 보여준다. 이 정렬은 BioEdit 5.0.9 및 Clustal W 1.81을 사용하여 생성하였다.
도 29는 SVV의 최종 폴리펩티드 생성물을 제시한다. 몇 개의 보존된 모티프는 진하게 표시하고 밑줄을 그었다: 2A/2B "절단" (NPGP); 2C ATP-결합(GxxGxGKS/T 및 hyhyhyxxD); 3B(VPg)/RNA 결합 잔기(Y); 3C(pro) 활성 부위 잔기(H, C, H); 3D (pol) 모티프(KDEL/IR, PSG, YGDD, FLKR).
도 30은 SVV와 이들 피코나바이러스 간의 계통발생학적 관계를 확인하기 위해 서열 분석에 사용된 피코나바이러스 종을 제시한다(실시예 4 참고).
도 31은 VP2 서열 분석의 관점에서 SVV(서열 번호 4)와 다른 피코나바이러스 간의 계통발생학적 관계를 보여준다. 이 도면은 부트스트랩 이웃 연결 트리를 보여준다(실시예 4 참고).
도 32는 SVV(서열 번호 6)와 다른 피코나바이러스 간의 VP3에 대한 부트스트랩 이웃 연결 트리를 보여준다(실시예 4 참고).
도 33은 SVV(서열 번호 8)와 다른 피코나바이러스 간의 VP1에 대한 부트스트랩 이웃 연결 트리를 보여준다(실시예 4 참고).
도 34는 SVV(즉, 부분적 P1 - 서열 번호 2의 아미노산 2-641)와 다른 피코나바이러스 간의 P1(즉, 1A, 1B, 1C 및 1D)에 대한 부트스트랩 이웃 연결 트리를 보여준다(실시예 4 참고).
도 35는 SVV(서열 번호 14)와 다른 피코나바이러스 간의 2C에 대한 부트스트랩 이웃 연결 트리를 보여준다(실시예 4 참고).
도 36은 SVV(서열 번호 20)와 다른 피코나바이러스 간의 3C(pro)에 대한 부트스트랩 이웃 연결 트리를 보여준다(실시예 4 참고).
도 37은 SVV(서열 번호 22)와 다른 피코나바이러스 간의 3D(pro)에 대한 부트스트랩 이웃 연결 트리를 보여준다(실시예 4 참고).
도 38은 SVV(서열 번호 4)와 다른 피코나바이러스 간의 VP2의 실제 아미노산 동일성 백분율(% 동일성)을 제시한다(실시예 4 참고).
도 39는 SVV(서열 번호 6)와 다른 피코나바이러스 간의 VP3의 실제 아미노산 동일성 백분율을 제시한다(실시예 4 참고).
도 40은 SVV(서열 번호 8)와 다른 피코나바이러스 간의 VP1의 실제 아미노산 동일성 백분율을 제시한다(실시예 4 참고).
도 41은 SVV(즉, 부분적 P1 - 서열 번호 2의 아미노산 2-641)와 다른 피코나바이러스 간의 P1의 실제 아미노산 서열 동일성을 제시한다(실시예 4 참고).
도 42는 SVV(서열 번호 14)와 다른 피코나바이러스 간의 2C의 실제 아미노산 동일성 백분율을 제시한다(실시예 4 참고).
도 43은 SVV(서열 번호 20)와 다른 피코나바이러스 간의 3C(pro)의 실제 아미노산 동일성 백분율을 제시한다(실시예 4 참고).
도 44는 SVV(서열 번호 22)와 다른 피코나바이러스 간의 3D(pol)의 실제 아미노산 동일성 백분율을 제시한다(실시예 4 참고).
도 45는 SDS-PAGE에 의해 분석되는 바와 같은 SVV의 VP2(∼36 kDa), VP1(∼31 kDa) 및 VP3(∼27 kDa) 단백질을 보여준다. 정제된 SVV로 SDS-PAGE를 실시하였고, 은 염색에 의해 가시화하였다. 레인 "MWt"는 분자량 마커이고; 레인 "SVV"는 SVV의 구조 단백질을 포함한다. 3종의 분자량 마커의 크기 및 바이러스 단백질의 명칭 역시 기재하였다.
도 46A-46B는 전신 투여 후의 혈액 및 종양 내의 SVV의 양을 나타낸다(실시예 7). H446 종양을 보유하는 누드 마우스를 꼬리 정맥 주사에 의해 1 x 1012 vp/kg의 양의 SVV로 처리하였다. 마우스는 주사한 지 0 시간, 1 시간, 3 시간, 6 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간 및 7일 후에 채혈하고, 채혈 직후 혈액으로부터 혈장을 분리하여 감염 배지에 희석하고, PER.C6 세포를 감염시키는 데 사용하였다. 주사한 지 6 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간 및 7일 후에 종양을 적출하였다. 이 종양을 작은 절편으로 절개하여 1 ml의 배지에 현탁시키고 CVL을 제조하였다.
도 46C-46D는 생체내 SVV 소거율과 관련된 데이터를 제시한다. 이 도면은 SVV가 유사한 용량의 i.v. 아데노바이러스와 비교하여 혈액 중에서 현저히 더 긴 체류 시간을 나타내며(실시예 7), 따라서 SVV는 생체내 아데노바이러스보다 더 느린 소거 속도를 나타낸다는 것을 보여준다. 1회 정맥(i.v.) 투여 후에, SVV는 최대 6 시간 동안 혈액 중에 잔존하는 반면(도 46C; 도 46C는 도 46D와의 비교를 위해 포함시킨 도 46A의 사본이다), 아데노바이러스는 약 1 시간 이내에 혈액으로부터 소거 또는 고갈된다(도 46D).
도 47은 H446 이종 이식편의 면역조직화학 분석 및 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 보여준다(실시예 7). H446 종양을 보유하는 누드 마우스의 꼬리 정맥에 1 x 1012 vp/kg의 용량의 행크(Hank) 평형 염 용액(HBSS) 또는 SVV를 주사하여 처리하였다. 이 마우스는 주사한 후 3일째 희생시키고 종양을 적출하였다. 종양 세포 내의 바이러스 단백질은 SVV-특이적 마우스 항체를 사용하여 면역조직화학 분석에 의해 가시화하였다(윗쪽 패널). HBSS 또는 SVV로 처리된 마우스로부터 적출된 H446 종양 세포의 대체적 형태는 H&E 염색에 의해 염색하였다(아랫쪽 패널).
도 48은 1차 인간 간세포에서의 SVV 매개 세포독성을 나타낸다(실시예 9). 콜라겐 코팅된 12웰 플레이트에 분주한 1차 인간 간세포를 세포당 1, 10 및 100, 1000개 입자(ppc)의 SVV로 감염시켰다. 감염 3일 후에, 세포에 회합된 락테이트 데히드로게나제(LDH)와 배양 상청액 중의 LDH를 별도로 측정하였다. 최대 세포내 LDH와 상청액 LDH를 합한 것에 대한 상청액 중의 LDH 단위의 비율로서 세포독성 백분율을 결정하였다.
도 49는 선택된 세포주에서 SVV에 의한 바이러스 생산율을 보여준다. SVV의 복제능을 평가하기 위해, 선택된 정상 세포 및 종양 세포를 세포 1개당 바이러스 입자 1개(ppc)의 양의 SVV로 감염시켰다(실시예 9). 72 시간 후, 세포를 회수하고 PER.C6 세포에 대한 역가에 대하여 CVL를 분석하였다. 각 세포주에 대하여, SVV 복제의 효율은 밀리리터당 플라크 형성 단위(pfu/ml)로서 표현하였다.
도 50은 누드 마우스 및 CD1 마우스에 있어서의 체중에 따른 독성을 보여준다(실시예 10). 각 처리군에 있어서의 마우스의 평균 체중은 바이러스 투여 후 며칠 동안 측정하였다. 마우스에게 1일째 단일 용량의 SVV 또는 PBS를 꼬리 정맥으로 주사하였다.
도 51은 H446 이종 이식편 모델에 있어서의 효능을 보여준다. H446 종양이 누드 마우스에서 확립되었으며, 이 마우스는 그룹별로 나누어(n = 10), HBSS 또는 6 가지의 상이한 용량의 SVV를 꼬리 정맥에 주사하여 처리하였다(실시예 11). 연구 20일째, 대형 종양(평균 종양 용적 = 2000 mm3)을 보유하는 HBSS 그룹으로부터의 5 마리의 마우스에게 1 x 1011 vp/kg의 양으로 주사하였다(화살표로 표시함). 데이터는 평균 종양 용적 + 표준 편차(SD)로서 표현하였다.
도 52는 미처리 또는 SVV로 처리한 H446 이종 이식편 누드 마우스의 사진을 보여준다(실시예 11). SVV의 효능은 미리 확립된 대형 종양의 100%가 완전히 근절된다는 점에서 효능이 매우 강하다. SVV로 처리된 마우스는 주사 후 적어도 200일 동안 임상적 증상이나 종양의 재발을 전혀 나타내지 않았다.
도 53은 시험관내 SVV 종양 특이성 및 효능에 관한 데이터를 제시한다(실시예 11). 이 그래프는 H446 인간 소세포 폐암(SCLC) 종양 세포(윗쪽 그래프) 또는 정상 H460 세포(아랫쪽 그래프)의 항온처리 후의 세포 생존율을 보여준다. SVV는 세포당 약 10-3개 입자의 EC50으로 종양 세포를 특이적으로 사멸시켰다. 이와는 달리, 정상 인간 세포는 어떠한 농도의 SVV에서도 사멸되지 않았다.
도 54는 SVV의 전체 게놈을 포함하는 대표적인 플라스미드를 도시한다(실시예 15). 벡터 상에 SVV 서열의 상류에 T7 프로모터가 존재함으로 인해 SVV 서열의 시험관내 전사가 가능해지며, 이로써 SVV RNA 분자가 생성될 수 있다.
도 55는 전체 길이 및 기능성 게놈 SVV 플라스미드의 구축 및 이어지는 SVV 바이러스 생산에 대한 개략도를 도시한다(실시예 16). 기능성 게놈 SVV 클론을 얻기 위해, SVV의 완전한 게놈을 T7 프로모터를 갖는 벡터로 클로닝할 수 있다. 이는 바이러스의 cDNA 클론을 제조하고, 이들의 서열을 결정하고, 연속된 단편들을 하나의 플라스미드에 클로닝하여, "pSVV"로 명명되는 플라스미드를 형성함으로써 수행할 수 있다. 그 후 SVV의 전체 게놈을 갖는 플라스미드를 역전사하여 SVV RNA를 생성할 수 있다. 그 후 SVV RNA를 허용성 포유동물 세포에 형질감염시키고, 그 후 SVV 바이러스 입자를 회수하고 정제할 수 있다.
도 56은 코딩 서열(즉, 1A-1D에 대한 코딩 영역)을 포함하는 벡터("pSVV 캡시드")의 구축에 대한 개략도를 도시한다. 그 후 pSVV 캡시드는 SVV 캡시드 돌연변이체의 라이브러리를 생성하는 데 이용될 수 있다.
도 57은 SVV 캡시드 돌연변이체의 라이브러리의 생성을 위해 SVV 캡시드를 돌연변이시키는 방법의 한 예를 보여준다(실시예 16). 이 도면은 플라스미드의 임의의 위치에 올리고뉴클레오티드 서열이 삽입된 것을 예시한다. 이 올리고뉴클레오티드는 무작위 올리고뉴클레오티드, 알고 있는 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드, 또는 에피토프 태그를 코딩하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 이 도면에서, 제한 효소 CviJI는 pSVV 캡시드 DNA를 무작위로 절단한다. 단일 부위에서 절단된 선형화된 pSVV 캡시드 DNA를 분리하고 겔로부터 정제하여 올리고뉴클레오티드와 결찰시킨다.
도 58은 캡시드 코딩 영역 내에 서열 돌연변이를 포함하는 전체 길이 SVV 돌연변이체의 라이브러리를 생성하기 위한 개략도를 제시한다(실시예 16). 예를 들어, pSVV 캡시드 돌연변이체 라이브러리(예를 들어 도 57에 도시된 개략도에 따라 생성함)로부터의 캡시드 코딩 영역은 제한 효소 분해 및 겔 정제에 의해 분리한다. 또한 전체 길이 SVV 서열을 포함하는 벡터를 분해하여 캡시드 코딩 영역을 절단해 낸다. 그 후 pSVV 캡시드 돌연변이 라이브러리로부터의 캡시드 코딩 영역을 야생형 캡시드 서열이 결여된 pSVV 벡터에 결찰시켜, 캡시드 코딩 영역에 다수의 돌연변이를 가지는 전체 길이 SVV 돌연변이체("pSVVFL" 벡터)의 라이브러리를 생성한다.
도 59는 캡시드 돌연변이의 라이브러리르 포함하는 SVV 바이러스 입자를 생산하는 일반적 방법을 제시한다(실시예 16). pSVVFL 벡터를 역전사하여 SVV RNA를 생성한다. SVV RNA를 허용성 세포에 형질감염시키는데, 이 때 SVV 돌연변이 바이러스 입자가 생성된다. 이 바이러스 입자는 세포를 용해시키며, 다수의 캡시드 변이체를 포함하는 SVV 바이러스 입자의 집합체, "SVV 캡시드 라이브러리"를 분리한다.
도 60은 종양 세포를 특이적으로 감염시킬 수 있는 반면, 비종양 세포는 감염시킬 수 없는 SVV 캡시드 돌연변이체를 스크리닝하는 일반적 방법을 제시한다. SVV 캡시드 라이브러리를 관심있는 종양 세포주 또는 조직과 항온처리한다. 초기 항온처리 기간 후에, 세포를 세척하여 세포 내로 진입할 수 없는 SVV 바이러스 입자를 제거한다. 그 후, 바이러스 용해가 관찰될 때까지 세포를 배양액 중에 유지한다. 그 후 배양 상청액을 수집하여, 종양 세포를 용해하여 감염시킬 수 있는 SVV 캡시드 돌연변이체를 분리한다. 그 후 이러한 바이러스는 공지의 허용성 세포주를 감염시킴으로써 생육시킨 뒤에, 역 스크린(counter-screen)을 실시한다. 역 스크린은 종양 세포를 감염시킬 수 있는 SVV 캡시드 돌연변이 바이러스를 정상 세포와 함께 항온처리함으로써 수행한다. 상청액 중에 비결합 상태로 남아있는 바이러스만을 수집함으로써, 종양 특이성을 가지는 돌연변이 SVV 바이러스를 분리한다. 이러한 과정은 SVV 종양 특이적 바이러스의 분리물을 추가 정제하기 위해 반복할 수 있다.
도 61은 바이러스 돌연변이체가 세포주에 결합하고/하거나 세포주를 감염시킬 수 있는지를 테스트하기 위한 전통적인 방법을 보여준다. 전통적 방법은 종종 세포주를 배양하기에 비효율적인 방법인 것, 즉 플라스크를 필요로 하여, 다수의 상이한 세포주와 관련한 바이러스 돌연변이체 라이브러리의 대량 스크린은 부담이 되게 된다.
도 62는 여러 세포주를 특이적으로 감염시키는 능력을 보유하는 바이러스 돌연변이체를 스크리닝하기 위한 본 발명의 고처리량 방법을 보여준다(실시예 16). 이 도면에서는, 다수의 상이한 종양 세포주를 384웰 플레이트에서 배양한다. 각 웰에, 바이러스 샘플을 첨가한다(예를 들어, SVV 캡시드 라이브러리의 샘플). 세포 변성 효과를 나타내는 웰로부터 배지를 수집하여, 플라스크 또는 대형 조직 배양 플레이트에서 배지 중의 모든 바이러스가 허용성 세포주(예를 들어 SVV의 경우 H446 또는 PER.C6)를 감염시킴에 의해 증폭될 수 있도록 한다. 바이러스를 생장시켜, RNA를 분리하고 그 서열을 분석하여 캡시드의 올리고뉴클레오티드 삽입 돌연변이 유발에 의해 삽입된 코딩된 펩티드 서열을 결정할 수 있다. 그 후 펩티드 자체가 종양 세포 유형에 특이적으로 결합할 수 있는지를 확인하기 위해 테스트할 수 있다.
도 63은 또 다른 고처리량 스크리닝 개략도를 보여준다(실시예 16). 종양 및 정상 세포주를 멀티-웰 플레이트에서 배양한다. 세포가 바이러스 매개 용해에 의해 사멸되는지를 테스트하기 위해 각 웰에 바이러스를 첨가한다. 각 웰의 흡광도를 판독하여 세포 변성 효과를 신속히 분석할 수 있다. 세포 변성 효과를 나타내는 웰로부터의 바이러스를 생장시켜 시험관내(종양 및 정상 세포주를 재테스트함)와 시험관내 모델에서(바이러스가 마우스 체내의 이식된 종양을 사멸시킬 수 있는지를 테스트함) 추가로 테스트한다.
도 64는 새로운 종양 특이적 향성을 가지는 SVV 캡시드 돌연변이체를 분석하여 종양 선택적 펩티드를 생성할 수 있음을 보여준다. 종양 세포주의 특이적 감염을 가능하게 하는 SVV 캡시드 돌연변이체를 서열 결정하여 올리고뉴클레오티드 삽입에 의해 코딩되는 펩티드를 확인한다. 이로써 성공적인 캡시드 돌연변이체로부터 아미노산 공통 서열을 결정할 수 있다. 그 후 공통 서열을 가지는 펩티드가 해당 종양 세포 유형에 특이적으로 결합할 수 있는지를 확인하기 위해 테스트할 수 있다. 그 후 종양 선택적 펩티드를 독소 또는 약물에 부착시켜 종양 특이적 표적화 수송체로서 사용할 수 있다.
도 65는 SVV 캡시드 라이브러리를 생체내에서 먼저 테스트할 수 있음을 예시한다. 마우스(정상, 무흉선, 누드, CD-1 형질전환 마우스 등을 포함함)에 특정 종양을 외식할 수 있다. 그 후 이들 마우스에 SVV 유도체 라이브러리, 예컨대 SVV 캡시드 라이브러리를 주사한다. 특정 시점에, 마우스로부터 종양 세포를 적출하여, 종양의 제거를 나타내는 마우스에서, 초기 종양 샘플로부터 바이러스를 분리하고 허용성 세포주에서 생장시킨다.
도 66은 본 발명의 SVV 유도체에 대한 임상적 테스트 프로그램을 보여준다.
도 67은 그 캡시드에서 에피토프 태그를 코딩하는 SVV 유도체(새로운 종양 향성을 가짐)가 다양한 목적에 사용될 수 있음을 예시한다. 이것들은 에피토프의 존재를 분석함으로써 특정 종양 세포가 조직 샘플에 존재하는지를 검출하기 위한 스크리닝 시약으로서 사용될 수 있다. 대안으로, 독소 또는 기타 치료제를 에피토프 태그에 부착시키고, 그 후 이 바이러스를 환자에게 투여할 수 있다. 또한, 야생형 또는 유도체 SVV에 방사선을 조사하거나 불활성화시켜, 바이러스 입자 자체를 치료 디바이스로서 사용할 수 있다. 둘 중 어느 바이러스 입자도 아폽토시스 유도성 펩티드의 존재로 인하여 세포의 아폽토시스를 유도하며 또는 입자는 독소 또는 부착된 다른 치료제를 보유함으로써 바이러스가 특이적 표적화 송달 디바이스로서 사용될 수 있다.
도 68은 피코나바이러스의 기본적인 생활 주기를 보여준다.
도 69는 다른 피코나바이러스와 SVV의 폴리펩티드 길이를 비교한 것을 보여준다.
도 70은 피코나바이러스 2A-유사 NPG/P 단백질의 아미노산을 비교한 것을 보여준다. SVV에 대한 서열은 서열 번호 2의 잔기 635-656에 제시된다.
도 71은 EMCV-R에 대한 아미노산 서열(서열 번호 23)을 제시한다.
도 72는 EMCV-PV21(수탁 번호 CAA52361)에 대한 아미노산 서열(서열 번호 24)을 제시한다.
도 73은 EMCV-B(수탁 번호 P17593)에 대한 아미노산 서열(서열 번호 25)을 제시한다.
도 74는 EMCV-Da(수탁 번호 P17594)에 대한 아미노산 서열(서열 번호 26)을 제시한다.
도 75는 EMCV-Db에 대한 아미노산 서열(서열 번호 27)을 제시한다.
도 76는 EMCV-PV2(수탁 번호 CAA60776)에 대한 아미노산 서열(서열 번호 28)을 제시한다.
도 77은 EMCV-mengo(수탁 번호 AAA46547)에 대한 아미노산 서열(서열 번호 29)을 제시한다.
도 78은 TMEV/DA(수탁 번호 AAA47928)에 대한 아미노산 서열(서열 번호 30)을 제시한다.
도 79는 TMEV/GDVII(수탁 번호 AAA47929)에 대한 아미노산 서열(서열 번호 31)을 제시한다.
도 80은 TMEV/BeAn8386(수탁 번호 AAA47930)에 대한 아미노산 서열(서열 번호 32)을 제시한다.
도 81은 TLV-NGS910(수탁 번호 BAC58035)에 대한 아미노산 서열(서열 번호 33)을 제시한다.
도 82는 VHEV/Siberia-55(수탁 번호 AAA47931)에 대한 아미노산 서열(서열 번호 34)을 제시한다.
발명의 상세한 설명
용어 "바이러스", "바이러스의 입자", "바이러스 입자", "벡터 입자", "바이러스 벡터 입자" 및 "비리온"은 상호 교환하여 사용되며, 예를 들어 본 발명의 바이러스 벡터가 감염성 입자의 생성을 위해 적절한 세포 또는 세포주에 형질도입 또는 형질감염될 경우 형성되는 감염성 바이러스 입자를 의미하는 것으로서 광범위하게 이해되어야 한다.
용어 "유도체", "돌연변이체", "변이체" 및 "변형체"는 일반적으로 유도체, 돌연변이체, 변이체 또는 변형체된 바이러스가 주형 바이러스 핵산 또는 아미노산 서열에 대하여 핵산 또는 아미노산 서열 차이를 가질 수 있음을 나타내는 것으로 상호 교환적으로 사용된다. 예를 들어, SVV 유도체, 돌연변이체, 변이체 또는 변형된 SVV는 ATCC 특허 기탁 번호 PTA-5343의 야생형 SVV 핵산 또는 아미노산 서열에 대하여 핵산 또는 아미노산 서열 차이를 가지는 SVV를 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "암", "암 세포", "신생물 세포", "신생물", "종양" 및 "종양 세포"는 상호 교환적으로 사용되며, 비교적 자발적 성장을 나타내는 세포를 의미하며, 따라서 이들은 세포 증식 조절능을 크게 상실한 것이 특징인 비정상적 성장 표현형을 나타낸다. 신생물 세포는 악성 또는 양성일 수 있다. 본 발명에 따르면, 바람직한 종양 세포의 한 가지 유형은 향신경성 특성을 가지는 것들이다.
2 이상의 핵산 또는 단백질 서열과 관련하여 사용되는 용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율이란 단백질-단백질 BLAST(Protein-Protein BLAST of GenBank databases (Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool. "J. Mol. Biol. 215: 403-410))와 같은 서열 비교 알고리즘을 이용하거나 시각적 조사에 의해 측정한 바와 같이, 최대 상응성에 대하여 비교 및 정렬하였을 때 동일하거나 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 특정 백분율로 가지는 2 이상의 서열 또는 부분 서열을 의미한다. BLAST 알고리즘에 대해서는 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410(1990)]에 기재되어 있으며, 공개 활용 BLAST 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 제공된다.
예를 들어, 본원에서 사용되는 용어 "∼에 대해 적어도 90% 동일한"이란 기준 폴리펩티드(또는 폴리뉴클레오티드)에 대한 90∼100의 동일성 백분율을 의미한다. 90% 이상의 수준의 동일성은 예시를 목적으로 아미노산 길이가 100개인 테스트 폴리펩티드와 기준 폴리펩티드를 비교한다고 가정할 경우, 테스트 폴리펩티드의 아미노산 중 10%(즉, 100개 중 10개) 이하가 기준 폴리펩티드의 것과 차이가 있다는 사실을 나타낸다. 유사한 비교가 테스트 폴리뉴클레오티드와 기준 폴리뉴클레오티드 간에도 적용될 수 있다. 그러한 차이는 아미노산 서열의 전체 길이에 대하여 무작위로 분포된 점 돌연변이로서 나타날 수 있거나 또는 그러한 차이는 최대 허용치, 즉 100개 아미노산 중 10개 아미노산의 차이(90% 동일성)까지의 다양한 길이의 하나 이상의 위치에 밀집할 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로서 정의된다. 약 85∼90% 이상의 동일성 수준에서, 그 결과는 프로그램 및 갭 파라미터 설정에 무관하여야 하며, 그러한 높은 수준의 동일성은 종종 소프트웨어에 의존하지 않고 용이하게 평가할 수 있다.
본 발명의 내용에서, 용어 "분리된"이란 사람의 손에 의해 그 천연 환경으로부터 분리되어 존재하는 핵산 분자, 폴리펩티드, 바이러스 또는 세포를 의미한다. 분리된 핵산 분자 또는 폴리펩티드는 정제된 형태로 존재할 수 있거나 또는 비-천연 환경에, 예를 들어 재조합 숙주 세포 내에 존재할 수 있다. 분리된 바이러스 또는 세포는 세포 배양액에서와 같이 정제된 형태로 존재할 수 있거나 또는 예를 들어 재조합 또는 이종성 유기체와 같이 비-천연 환경에 존재할 수 있다.
용어 "자연 발생" 또는 "야생형"은 사람에 의해 인공적으로 생성되는 것과는 다른, 자연에서 발견될 수 있는 실체를 나타내는 데 사용된다. 예를 들어, 자연의 공급원으로부터 분리할 수 있고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스를 포함함) 내에 존재하는 단백질 또는 뉴클레오티드 서열은 자연 발생 서열이다.
"고 엄중도", "중간 엄중도" 또는 "저 엄중도"의 개념은 핵산 하이브리드화 조건을 의미한다. 고 엄중도 조건은 어닐링 또는 하이브리드화가 표적과 프로브 간에 발생하도록 하기 위해 표적의 핵산 서열과 프로브의 핵산 서열 간에 더 큰 동일성을 요구하는 조건을 의미한다. 저 엄중도 조건은 어닐링 또는 하이브리드화가 표적과 프로브 간에 발생하도록 하기 위해 표적의 핵산 서열과 프로브의 핵산 서열 간에 더 적은 동일성을 요구하는 조건을 의미한다. 엄중도 조건은 하이브리드화가 수행되는 완충액의 염 농도에 의해 또는 온도에 의해 조절할 수 있으며, 이 때 더 높은 염 농도는 엄중도가 더 낮은 조건을 형성하며, 더 높은 온도는 엄중도가 더 높은 조건을 형성한다. 엄중도 조건은 하이브리드화가 일어나는 서열의 길이 및 핵산 구성에 따라 달라질 것이지만, 고 엄중도, 중간 엄중도 및 저 엄중도의 대표적인 조건을 하기의 예시적인 조건에 기재한다. 일반적으로 사용되는 하이브리드화 완충액은 0.3 M 시트르산삼나트륨 및 3 M Nacl에 해당하는 20X 스탁 농도를 갖는 SSC(염화나트륨/시트르산나트륨)이다. 고 엄중도 조건의 경우, SSC의 유효 농도는 65℃로 설정된 하이브리드화 온도에서 0.1X∼0.5X(1.5∼7.5 mM 시트르산삼나트륨, 15∼75 mM NaCl)일 수 있다. 중간 조건은 일반적으로 55∼62℃의 온도에서의 0.5X∼2X SSC 농도(7.5∼30 mM 시트르산삼나트륨, 75∼300 mM NaCl)일 수 있다. 저 엄중도 조건에서 수행되는 하이브리드화는 50∼55℃의 온도에서 2X∼5X SSC 농도(30∼75 mM 시트르산삼나트륨, 300∼750 mM NaCl)를 이용할 수 있다. 이러한 조건들은 단지 예로서 제시된 것이며, 제한적인 것으로 간주되어서는 안된다.
세네카 밸리 바이러스(SVV):
SVV는 이전에는 발견되지 않았던 새로운 RNA 바이러스이며, 피코나바이러스과의 카디오바이러스속의 구성원과 가장 밀접한 관계에 있다. 따라서, 본 발명에서는, SVV를 카디오바이러스속 및 피코나바이러스과의 구성원으로 간주한다. 카디오바이러스는 이들의 게놈 조직, 공통적인 병리학적 특성 및 0.1 M NaCl, pH 5∼7에서의 이들의 비리온의 해리성이라는 특수한 특징들에 의해 다른 피코나바이러스와는 구별된다(Scraba, D. et al., "Cardioviruses(Picornaviridae)," in Encyclopedia of Virology, 2nd Edition, R.G. Webseter and A. Granoff, Editors, 1999). SVV와 다른 카디오바이러스 간의 서열 분석의 결과는 이하에서 논의한다.
SVV의 게놈은 예상 크기가 약 7.5 kb인 하나의 단일 가닥 양성(+) 센스 가닥 RNA 분자로 구성된다(도 4A 참조). SVV는 피코나바이러스이기 때문에, 이것은 모든 피코나바이러스에서 보존되어 있는 다수의 특징들을 보유한다: (i) 게놈 RNA는 감염성이고, 따라서 세포에 형질감염되어 바이러스-수용체 결합 및 바이러스 생활 주기의 진입 단계를 우회할 수 있다; (ii) 게놈의 5' 말단에 긴(약 600∼1200 bp) 비번역 영역(UTR)이 존재하고 3' 말단에 짧은(약 50∼100 bp) 비번역 영역이 존재한다; (iii) 5' UTR은 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site; IRES)로서 알려진 클로버잎 모양의 2차 구조를 포함한다; (iv) 게놈의 나머지 부분은 단일 폴리단백질을 코딩한다; (v) 게놈의 양 말단이 변형되는데, 5' 말단은 공유 결합된 작은 염기성 단백질 "Vpg"에 의해 변형되고 3' 말단은 폴리아데닐화에 의해 변형된다.
본 발명은 분리된 SVV 바이러스(ATCC 특허 기탁 번호 PTA-5343) 및 그로부터의 SVV의 완전한 게놈 구성을 제공한다. 현재, 서열이 결정된 최대 SVV 게놈 단편은 PTA-5343 분리물로부터 유래된 분리된 SVV 핵산이며, 이것은 SVV 게놈 서열의 대부분을 포함하며, 본원에서 도 5A∼5E와 도 6A∼6D에 제시되어 있고, 서열 번호 1로서 표시된다. 이 뉴클레오티드 서열의 번역은 SVV의 단일 폴리단백질의 대부분이 서열 번호 1에 의해 코딩된다는 것을 보여준다. 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1∼5673에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 본원에 도 5A∼E와 도 7A∼7B에 제시되어 있고, 서열 번호 2로서 표시된다. 그러므로 본 발명은 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21을 포함하여, 서열 번호 1의 분리된 부분을 제공하는데, 이것은 서열 번호 1의 상기 부분들에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 분리될 수 있도록 발현 벡터에 서브클로닝할 수 있다. 또한, 고 엄중도, 중간 엄중도 또는 저 엄중도 조건 하에 서열 번호 1에 하이브리드화할 수 있는 분리된 핵산, 또는 이의 일부분도 본 발명에 포함된다.
본 발명은 또한 도 9에 제시된 서열 번호 4의 아미노산 서열(이것은 서열 번호 2의 아미노산 2-143에 해당함)을 가지는 분리된 부분적인 SVV VP2(1B) 단백질을 제공한다. 부분적 SVV VP2 단백질의 아미노산 서열은 도 8에 제시된 서열 번호 3의 핵산 서열(이것은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 4-429에 해당함)에 의해 코딩된다.
본 발명은 또한 도 11에 제시된 서열 번호 6의 아미노산 서열(이것은 서열 번호 2의 아미노산 144-382에 해당함)을 가지는 분리된 SVV VP3(1C) 단백질을 제공한다. SVV VP3 단백질의 아미노산 서열은 도 10에 제시된 서열 번호 5의 핵산 서열(이것은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 430-1146에 해당함)에 의해 코딩된다.
본 발명은 또한 도 13에 제시된 서열 번호 8의 아미노산 서열(이것은 서열 번호 2의 아미노산 383-641에 해당함)을 가지는 분리된 SVV VP1(1D) 단백질을 제공한다. SVV VP1 단백질의 아미노산 서열은 도 12에 제시된 서열 번호 7의 핵산 서열(이것은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1147-1923에 해당함)에 의해 코딩된다.
본 발명은 또한 도 15에 제시된 서열 번호 10의 아미노산 서열(이것은 서열 번호 2의 아미노산 642-655에 해당함)을 가지는 분리된 SVV 2A 단백질을 제공한다. SVV 2A 단백질의 아미노산 서열은 도 14에 제시된 서열 번호 9의 핵산 서열(이것은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1924-1965에 해당함)에 의해 코딩된다.
본 발명은 또한 도 17에 제시된 서열 번호 12의 아미노산 서열(이것은 서열 번호 2의 아미노산 656-783에 해당함)을 가지는 분리된 SVV 2B 단백질을 제공한다. SVV 2B 단백질의 아미노산 서열은 도 16에 제시된 서열 번호 11의 핵산 서열(이것은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1966-2349에 해당함)에 의해 코딩된다.
본 발명은 또한 도 19에 제시된 서열 번호 14의 아미노산 서열(이것은 서열 번호 2의 아미노산 784-1105에 해당함)을 가지는 분리된 SVV 2C 단백질을 제공한다. SVV 2B 단백질의 아미노산 서열은 도 18에 제시된 서열 번호 13의 핵산 서열(이것은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 2350-3315에 해당함)에 의해 코딩된다.
본 발명은 또한 도 21에 제시된 서열 번호 16의 아미노산 서열(이것은 서열 번호 2의 아미노산 1106-1195에 해당함)을 가지는 분리된 SVV 3A 단백질을 제공한다. SVV 3A 단백질의 아미노산 서열은 도 20에 제시된 서열 번호 15의 핵산 서열(이것은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 3316-3585에 해당함)에 의해 코딩된다.
본 발명은 또한 도 23에 제시된 서열 번호 18의 아미노산 서열(이것은 서열 번호 2의 아미노산 1196-1217에 해당함)을 가지는 분리된 SVV 3B(VPg) 단백질을 제공한다. SVV 3B 단백질의 아미노산 서열은 도 22에 제시된 서열 번호 17의 핵산 서열(이것은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 3586-3651에 해당함)에 의해 코딩된다.
본 발명은 또한 도 25에 제시된 서열 번호 20의 아미노산 서열(이것은 서열 번호 2의 아미노산 1218-1428에 해당함)을 가지는 분리된 SVV 3C("pro" 또는 "프로테아제") 단백질을 제공한다. SVV 3C 단백질의 아미노산 서열은 도 24에 제시된 서열 번호 19의 핵산 서열(이것은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 3652-4284에 해당함)에 의해 코딩된다.
본 발명은 또한 도 27에 제시된 서열 번호 22의 아미노산 서열(이것은 서열 번호 2의 아미노산 1429-1890에 해당함)을 가지는 분리된 SVV 3D("pol" 또는 "폴리머라제") 단백질을 제공한다. SVV 3C 단백질의 아미노산 서열은 도 24에 제시된 서열 번호 19의 핵산 서열(이것은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 4285-5673에 해당함; 뉴클레오티드 5671-5673, "tga"는 아미노산 서열 목록에서 별표 "*"로서 표시된 종결 코돈을 코드함)에 의해 코딩된다.
본 발명의 핵산은 RNA 형태와 DNA 형태 둘 다를 포함하며, 제시된 목록의 상보성 서열도 함축적으로 포함한다.
따라서, 서열 번호 1로 표시되는 분리된 SVV 핵산은 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 5,752개 길이의 뉴클레오티드를 갖는다. SVV 게놈 서열은 다양한 하류 "번역 생성물"로 절단되는 단일 폴리단백질로서 번역된다. 본 발명은 서열 번호 1의 모든 핵산 단편과 그러한 단편에 의해 코딩되는 모든 폴리펩티드를 포함한다.
전체 길이 SVV 폴리단백질 아미노산 서열의 대부분은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1-5673에 의해 코딩된다. 이 폴리단백질은 3개의 전구체 단백질, P1, P2 및 P3으로 절단된다(도 4B 참조). P1, P2 및 P3은 더 작은 생성물로 추가 절단된다. 구조 영역 P1(1ABCD; 또는 캡시드 영역)의 절단 생성물은 1ABC, VPO, VP4, VP2, VP3 및 VP1이다. 비구조 단백질 P2(2ABC)의 절단 생성물은 2A, 2BC, 2B 및2C이다. 비구조 영역 P3 폴리단백질(3ABCD)의 절단 생성물은 3AB, 3CD, 3A, 3C, 3D, 3C', 및 3D'이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 분리된 핵산을 제공한다: (i) 2ABC의 서열(서열 번호 1의 뉴클레오티드 1924-3315) 및 이로부터 코딩된 단백질; (ii) 2BC의 서열(서열 번호 1의 뉴클레오티드 1966-3315) 및 이로부터 코딩된 단백질; (iii) 3ABCD의 서열(서열 번호 1의 뉴클레오티드 3316-5673) 및 이로부터 코딩된 단백질; (iv) 3AB의 서열(서열 번호 1의 뉴클레오티드 3316-3651) 및 이로부터 코딩된 단백질; 및 (v) 3CD의 서열(서열 번호 1의 뉴클레오티드 3652-5673) 및 이로부터 코딩된 단백질.
피코나바이러스의 기본 캡시드 구조는 각각 4개의 폴리펩티드 VP1, VP2, VP3 및 VP4(이들 모두는 원래의 프로토머 VP0의 절단으로부터 유래됨)로 구성된, 60개의 프로토머의 조밀하게 패킹된 20면체 배열로 구성된다. SVV 바이러스 입자는 직경이 약 27 mm이며(도 2 참조), 이것은 직경이 약 27∼30 nm인 다른 피코나바이러스 입자의 크기와 일관성을 보인다.
피코나바이러스의 복제 속도는 빠르며, 그 주기는 약 5∼10 시간 내에 완료된다(일반적으로 약 8 시간)(피코나바이러스 복제 주기의 개략도는 도 68 참조). 게놈 RNA는 수용체에 결합한 후, 입자로부터 방출되어 세포질로 유입된다. 그 후 게놈 RNA는 폴리솜에 의해 직접 번역되지만, 감염 후 약 30분 내에, 세포내 단백질 합성은 급격히 감쇠하여 거의 0 수준이 된다. 이러한 현상은 "차단(shutoff)"이라 부르며, 세포 변성 효과(cytopathic effects; cpe)의 주된 원인이다. 차단은 번역 개시 과정에서 모든 진핵 mRNA의 5' 말단에서 m7G 캡 구조에 결합하는 데 관여하는 숙주 세포의 220 kDa 캡-결합 복합체(CBC)의 절단에 의한 것으로 보인다. CBC의 절단은 2A 프로테아제에 의해 유발되는 것으로 보인다.
5' UTR은 IRES를 포함한다. 정상적으로, 진핵 세포의 번역은 리보솜이 5' 메틸화 캡에 결합하고 그 후 mRNA를 따라 주사하면서 첫 번째 AUG 개시 코돈을 발견할 때 시작된다. IRES는 이 과정을 극복하여, 피코나바이러스 RNA가 CBC가 분해된 후에도 계속 번역될 수 있게 한다.
바이러스 폴리단백질은 처음에 2A 프로테아제에 의해 폴리단백질 P1, P2 및 P3으로 절단된다(도 4B 참조). 그 후, 피코나바이러스의 주요 프로테아제인 3C에 의해 추가적인 절단 사건이 수행된다. 3C에 의해 만들어진 절단 생성물 중 하나는 바이러스 RNA 의존적 RNA 폴리머라제(3D)이며, 이것은 게놈 RNA를 복사하여 음성(-) 센스 가닥을 생성한다. (-) 센스 가닥은 (+) 가닥 (게놈) RNA 합성을 위한 주형을 형성한다. (+) 가닥 중 일부는 번역되어 추가적인 바이러스 단백질을 생성하고, 일부 (+) 가닥은 캡시드로 패키징되어 새로운 바이러스 입자를 형성하게 된다.
(+) 가닥 RNA 게놈은 미리 형성된 캡시드로 패키징되는 것으로 생각되지만, 게놈과 캡시드 간의 분자적 상호작용은 분명하지 않다. 비어있는 캡시드가 모든 피코나바이러스 감염에 있어 공통적이다. 캡시드는 P1 폴리단백질 전구체의 절단에 의해 VPO, VP3, 및 VP1로 구성된 프로토머로 조립되며, 이들은 서로 결합하여 게놈을 밀봉한다. 바이러스 입자의 성숙 및 감염성은 VP0에서 VP2 및 VP4로의 내부 자가 촉매적 절단에 의존한다. 세포가 용해될 때 새로 형성된 바이러스 입자의 방출이 일어난다.
본 발명은 또한 ATCC 특허 기탁 번호 PTA-5343의 식별 특성 및 핵산 서열 전부를 보유하는 분리된 바이러스를 제공한다. 본 발명의 바이러스는 PTA-5343 분리물, PTA-5343 분리물의 변이체, 동족체, 유도체 및 돌연변이체와, 그 암용해 특성에 관여하는 것으로 확인된 SVV의 서열(본원에 개시된 야생형 및 돌연변이체 둘 다)에 대하여 변형된 다른 피코나바이러스의 변이체, 동족체, 유도체 및 돌연변이체에 관한 것일 수 있다.
본 발명은 또한 ATCC 특허 기탁 번호가 PTA-5343인 분리된 SVV 및 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 및 22의 아미노산 서열을 가지는 분리된 SVV 단백질로부터의 에피토프에 대해 특이적인 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 서열 번호 1의 단편 또는 일부분에 의해 코딩되는 단백질로부터의 에피토프에 대하여 특이적인 항체를 포함한다.
다양한 카디오바이러스 분리물로부터의 RNA 서열의 비교 분석에 의하면, 게놈들 간에 >45%의 뉴클레오티드 동일성이 있는 것으로 확인되었다. 카디오바이러스는 EMC 유사 바이러스("EMCV"- 예컨대, Mengo, B, R; 및 MM, ME, Columbia-SK), 테일러 유사 바이러스("TMEV" - 예컨대, BeAn, DA 및 GD VII 균주), 및 빌유이스크 바이러스로 세분될 수 있다.
다른 바이러스에 대하여 SVV 서열을 분석할 경우, SVV는 카디오바이러스인 것으로 생각된다(실시예 4 및 본원에 첨부된 도면 참조). EMCV 및 TMEV가 표준 카디오바이러스로서 간주된다면, SVV는 분명히 전형적 카디오바이러스는 아니다. 오히려 이들 두 바이러스는, 특히 5' UTR에서 차이가 있다(Pevear et al., 1987, J. Virol., 61: 1507-1516). 계통발생학적으로 SVV는 그 폴리단백질의 상당 부분에 있어서 EMCV 및 TMEV와 클러스터를 이루며(P1, 2C, 3Cpro 및 3DPol 영역; 도 31-37 참조), 이는 SVV가 카디오바이러스일 확률이 가장 크다는 것을 나타낸다.
암 치료 방법:
본 발명은 피코나바이러스, 이의 유도체, 변이체, 돌연변이체 또는 동족체를 비롯하여, SVV의 암용해 특성에 있어서 변형된 바이러스를 사용하는 암 치료법을 제공한다. 본 발명은 야생형 SVV(즉, ATTC 특허 기탁 번호 PTA-5343)가 몇몇 유형의 종양을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 보유한다는 것을 보여준다. 예를 들어, SVV는 소세포 폐암(SCLC) 및 신경아세포종을 비롯하여 향신경성 또는 신경내분비 특성을 보유하는 종양 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있다. 신경내분비 종양의 다른 예들은 부신의 크롬친화성세포종, 가스트리노마(졸링거-엘리슨 증후군을 유발함), 글루카곤종, 인슐린종, 골수 암종(골수 갑상선 암종을 포함함), 다발성 내분비 신생물 증후군, 췌장 내분비 종양, 부신경절종, VIPomas(혈관 작용성 장내 폴리펩티드 종양), 도세포 종양 및 크롬친화성세포종을 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 4 가지 유형의 신경내분비 폐 종양을 포함한다. 가장 중요한 유형인 소세포 폐암(SCLC)은 모든 암 중에서도 성장 및 확산 속도가 가장 빠르다. 대형 세포 신경내분비 암종은, 암을 형성하는 세포의 크기를 제외하고는 예후 판정 및 환자의 치료 방법에 있어서 SCLC와 매우 유사하며 희귀 암이다. 암양종으로도 알려진 암양종 종양은 2 가지 유형의 기타 폐 신경내분비 암을 포함한다. 이러한 두 가지 유형은 전형적 암양종 및 비전형적 암양종이다.
이론에 구속되는 것은 아니지만, SVV가 종양 세포를 특이적으로 사멸시키는 능력은 선택적 복제, 아폽토시스, 종양 선택적 세포 진입에 의한 용해, 종양 선택적 번역, 종양 선택적 단백질 분해, 종양 선택적 RNA 복제 및 이들의 조합을 포함할 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다.
SVV는 변형된 아데노바이러스를 비롯하여 다른 암용해성 바이러스에 비하여 많은 유리한 특성을 갖는다, 예를 들어 (i) SVV는 SCLC, 윌름 종양, 망막아세포종 및 신경아세포종을 비롯하여 신경계 특성을 가지는 암에 대하여 매우 높은 선택성을 갖는다 - 예를 들어, SVV는 신경내분비 종양 세포를 향한 선택성이 10,000배를 초과한다; (ii) SVV는 화학요법 치료보다 1,000배 더 우수한 세포 사멸 특이성을 갖는 것으로 확인되었다; (iii) SVV는 킬로그램당 1014 개 바이러스 입자만큼 많은 양으로 전신 투여 후에도 마우스에서 과도한 독성을 나타내지 않는다; (iv) SVV의 효능은, 종양 성장을 재발하지 않으면서 미리 확립된 대형 종양의 100%를 마우스로부터 근절할 수 있다는 점에서 효능이 매우 강하다; (v) SVV는 고역가로 정제될 수 있으며, 허용성 세포주에서 세포당 200,000개 입자보다 많은 양으로 생성될 수 있다; (vi) SVV는 크기가 작아서(SVV 바이러스 입자는 직경이 30 nm 미만임) 다른 암용해성 바이러스보다 종양으로의 투과성 및 확산성이 더 우수하다; (vii) SVV는 복제 속도가 빠르다(12 시간 미만); (viii) 특이적 항-종양제로서 사용하기 위해 SVV의 변형이 필요하지 않다.
또한, 초기 연구(실시예 6 참조)는 SVV가 암용해성 바이러스 치료법을 위한 유리한 도구가 되게 하는 몇 가지 추가적인 요인들을 제시한다: (i) 인간 혈청 샘플은 SVV에 대해 유도된 중화 항체를 포함하지 않는다; (ii) SVV는 보체에 의해 억제되지 않는다; (iii) SVV는 적혈구 응집에 의해 억제되지 않는다. 상기한 요인들 전부가, SVV가 다른 암용해성 바이러스보다 생체내 순환 시간이 더 길다는 사실에 기여한다(예로서, 실시예 7 참조).
본 발명은 바이러스가 세포 집단에서 신생물 세포를 형질변환시키고 복제하여 신생물 세포를 사멸시키는 조건 하에 세포 집단을 유효량의 SVV와 접촉시키는 것을 포함하는 세포 집단 내 신생물 세포를 선택적으로 사멸시키는 방법을 제공한다. SVV가 생체내에서 종양 세포를 사멸시키는 방법 이외에도, 본 방법은 (1) SVV로 감염시킨 경우 종양을 시험관내에서 배양할 수 있는 구체예; (2) 비종양 세포 존재 하에 종양을 배양할 수 있는 구체예; (3) 세포가 인간 세포인 경우를 비롯하여 포유동물 세포(종양 세포 및 비종양 세포 둘 다)인 구체예를 포함한다. 세포의 시험관내 배양 및 SVV에 의한 감염은 다양한 용도에 적용될 수 있다. 예를 들어, 시험관내 감염이 다량의 SVV를 생성하기 위한 방법으로서, 신생물 세포가 세포 집단 내에 존재하는지를 확인 또는 검출하기 위한 방법으로서, 또는 돌연변이 SVV가 다양한 종양 세포 또는 조직 유형을 특이적으로 표적화하여 사멸시킬 수 있는지를 스크리닝하는 방법으로서 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 암 치료를 위한 생체외 방법을 제공하는데, 이 방법에서는 인간 암 환자로부터 세포를 분리하고, 시험관내에서 배양하고, 암 세포를 선택적으로 사멸시키는 SVV로 감염시키고, 비종양 세포를 환자에게 다시 도입한다. 대안으로, 환자로부터 분리된 세포를 SVV로 감염시키고, 환자에게 SVV를 투여하기 위한 방법으로서 환자에게 즉시 재도입할 수 있다. 한 구체에에서, 암 세포는 조혈모 세포 유래의 세포이다. 경우에 따라, 환자는 배양된 세포가 환자에게 재도입되기 전에 생체내에서 환자의 종양 세포를 파괴하기 위한 치료(예, 화학요법 또는 방사선 요법)를 받을 수 있다. 한 구체예에서, 치료는 환자의 골수 세포를 파괴하기 위해 이용될 수 있다.
SVV는 신경계 특성을 갖는 종양 세포 유형에 대한 강력한 항종양 활성을 보유한다. SVV는 정상 인간, 래트, 마우스, 소 또는 양 세포주 또는 비신경계 종양 세포주에 대해서는 세포 용해 활성을 나타내지 않는다. 게다가 SVV는 1차 인간 간세포에 대해서는 세포 독성을 나타내지 않는다. 하기 표 1은 특정 종양 세포 유형에 대한 SVV의 시험관내 세포 용해 효능을 측정하기 위해 수행된 연구 결과를 요약한 것이다.
[표 1]
특정 종양 세포 유형에 대한 SVV 세포 용해 효능
세포주 세포 유형 EC50(VP/세포)
H446 인간 SCLC 0.0012
PER.C6 인간 배아 망막아세포종 0.02
H69AR SCLC-다제 내성 0.035
293 AD5 DNA 형질전환 인간 신장 0.036
Y79 인간 망막아세포종 0.00035
IMR32 인간 뇌 신경아세포종 0.035
D283 Med 인간 소뇌 수아세포종 0.25
SK-N-AS 인간 뇌 신경아세포종 0.474
N1E-115 마우스 신경아세포종 0.0028
BEKPCB3E1 Ad5E1로 형질전환시킨 소 배아 신장 세포 0.99
H1299 인간 비-SCLC 7.66
ST 돼지 고환 5.9
DMS153 인간 SCLC 9.2
BEK 소 배아 신장 17.55
M059K 인간 뇌 악성 신경교아세포종 1,061
PK15 돼지 신장 1,144
FBRC 태아 소 망막 10,170
HCN-1A 인간 뇌 23,708
H460 인간 LCLC > 30,000(불활성)
Neuro 2A 마우스 신경아세포종 > 30,000(불활성)
DMS79 인간 SCLC > 30,000(불활성)
H69 인간 SCLC > 30,000(불활성)
C8D30 마우스 뇌 > 30,000(불활성)
MRC-5 인간 태아 폐 섬유아세포 > 30,000(불활성)
HMVEC 신생아 혈관 내피 세포 > 30,000(불활성)
HMVEC 성인 혈관 내피 세포 > 30,000(불활성)
A375-S2 인간 흑색종 > 30,000(불활성)
SK-MEL-28 흑색종 > 30,000(불활성)
PC3 인간 전립선 암 > 30,000(불활성)
PC3M2AC6 인간 전립선 암 > 30,000(불활성)
LnCap 인간 전립선 암 > 30,000(불활성)
DU145 인간 전립선 암 > 30,000(불활성)
쥐를 이용한 연구(실시예 참조)는 SVV가 생체내에서 높은 효능 및 특이성으로 종양을 선택적으로 사멸시킬 수 있음을 보여준다. 이러한 생체내 연구는 SVV가 다른 암용해성 바이러스에 비해 많은 장점들을 갖는다는 것을 보여준다. 예를 들어, 확립된 종양을 근절할 수 있는 암용해성 종양 바이러스의 능력에 영향을 주는 중요한 요인 중 하나는 바이러스의 침투성이다. 아데노바이러스 벡터를 사용한 연구에서, Ad5에 기초한 벡터는 무흉선 마우스에서의 SCLC 종양 발달에 영향을 미치지 않는다. 면역조직화학적 결과에 기초하면, 아데노바이러스는 확립된 종양을 관통할 수 없는 것으로 나타났다. 이와는 대조적으로, SVV는 단일 전신 투여 후에 무흉선 누드 마우스에서 H446 SCLC 종양을 제거할 수 있었다. SVV는 크기가 작기 때문에(직경 < 30 mm), 다른 바이러스보다 종양 조직에서 침투성 및 확산성이 더 크며, 따라서, SVV의 작은 크기는 확립된 종양에 성공적으로 침투하여 근절할 수 있는 능력에 기여할 수 있다.
화학요법제에 대해 암세포가 나타내는 내성은 암 치료법의 한 방안으로서 화학요법을 받고 있는 모든 환자들이 직면하고 있는 주된 문제점이다. 화학요법제에 대해 내성을 나타내게 된 환자들은 늘 그런 것은 아니지만 종종 아주 불량한 예후를 나타내게 되며 대체 요법없이 방치될 수 있다. 화학요법제 내성의 주요 원인 중 하나는 다제 내성 단백질(Multiple Drug Resistant protein; MRP)이라 불리는 단백질 패밀리의 발현, 과발현 또는 증가된 활성이라는 점은 널리 알려져 있다. 본 출원인은 SVV에 대한 특정 종양 세포의 감수성은 암 세포의 화학요법제 내성 상태와 MRP 발현과도 상관성이 있다는 것을 발견하였다. H69는 시험관내에서 SVV에 대해 내성이 있는 화학요법제 감수성(아드리아마이신) 세포주인 반면, H69AR은 MRP를 과발현시키고 SVV에 감수성이 있는 화학요법제 내성 세포주이다(표 1 참조). MDR을 비롯하여 MRP의 과발현은 SVV 사멸에 대한 세포의 감수성과 상관성이 있음을 나타내는 증거들이 있다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 SVV가 MRP를 발현하는 세포를 사멸시키는 암 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 비정상적으로 증식하는 세포와 같은 비정상 세포에 의한 질병의 치료 방법을 제공한다. 이 방법은 비정상 세포의 일부 또는 전부가 파괴되도록 상기 비정상 세포를 SVV와 접촉시키는 것을 포함한다. SVV는 비정상 세포로 인해 발생된 다양한 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이러한 질병의 예로는, 종양 세포가 신경내분비 특징 및 신경섬유종증을 나타내는 암을 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다.
신경내분비 종양은 다양한 방법에 의해 확인할 수 있다. 예를 들어, 신경내분비 종양은 다수의 펩티드 호르몬 및 아민을 생성하고 분비한다. 이러한 물질들 중 일부는 특수한 임상적 증후군: 암양종, 졸링거-엘리슨, 고혈당증, 글루카곤종 및 WDHA 증후군을 유발한다. 이러한 증후군에 대한 특이적 마커는 뇨중 5-HIAA, 혈청 또는 혈장 가스트린, 인슐린, 글루카곤 및 혈관 작용성 장내 폴리펩티드 각각의 기본 수준 및/또는 자극된 수준이다. 몇몇 암양종 종양과, 내분비 췌장 종양의 약 1/3은 어떠한 임상적 증후군도 나타내지 않으므로 "비기능성" 종양이라 불린다. 그러므로, 크로모그라닌 A, 췌장 폴리펩티드, 혈청 뉴런-특이적 에놀라제 및 당단백질 호르몬의 서브유닛과 같은 일반적인 종양 마커는 호르몬과 관련된 뚜렷한 임상적 증상 없이 환자에게 스크리닝 목적으로 사용되어 왔다. 이러한 일반적 종양 마커 중에서도 크로모그라닌 A는, 그 정확한 기능은 아직 확립되지 않았지만, 다양한 유형의 신경내분비 종양에 대한 감도 및 특이성이 매우 높은 혈청 마커인 것으로 확인되었다. 이는 크로모그라닌 A가 기지 호르몬을 분비하지 않는 신경내분비 기원의 분화가 덜 된 여러 유형의 종양에서 그 양이 상승될 수 있기 때문이다. 한때, 크로모그라닌 A는 진단 및 치료적 평가 둘 다에 있어서 유용한, 일반적인 최적의 내분비 혈청 또는 혈장 마커인 것으로 간주되었으며, 다양한 신경내분비 종양을 가진 환자의 50∼100%에서 그 농도가 증가되어 있다. 크로모그라닌 A의 혈청 또는 혈장 수준은 종양 부하량을 반영하며, 이것은 중장 암양종 환자의 독립적 예후 판정 마커가 될 수 있다.
본 발명은 또한 SVV 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 약학적으로 허용되는 담체 중에 유효량의 SVV를 포함할 수 있는 이러한 조성물은 단위 제형, 멸균 비경구 액제 또는 현탁제, 멸균된 장관용 액제 또는 경구 액제 또는 현탁제, 수중유 또는 유중수 에멀션 등으로 개체에 국소 또는 전신 투여하는 데 적합하다. 비경구 및 장관용 약물 송달을 위한 제제는 당분야에 공지되어 있다. 조성물은 또한 SVV의 동결건조 및/또는 재구성 형태를 포함한다. 적합한 약학적 담체로는 예를 들어 염수 용액, 프로타민 설페이트(Elkins-Sinn, Inc., 뉴저지주 체리 힐), 물, 수성 완충액, 예컨대 인산염 완충액 및 Tris 완충액, 또는 폴리브렌(Polybrene)(Sigma Chemical, 미주리주 세인트 루이스) 및 인산염 완충 염수 및 수크로스가 있다. 적합한 약학적 담체의 선택은 본원에 포함된 기재 사항에 의하면 당업자에게는 명백하다. 이러한 용액들은 멸균 용액이며, 일반적으로 SVV 이외에 미립질을 포함하지 않는다. 이 조성물은 생리학적 조건에 근접하도록 하기 위해 필요한 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등을 포함할 수 있다. SVV에 의한 세포의 감염을 증강시키는 부형제도 포함될 수 있다.
SVV는 종양 세포에서의 바이러스의 복제를 통해 종양 세포의 성장을 억제하거나 예방하거나 파괴하는 데 유효한 양으로 숙주 또는 피험체에 투여한다. 암 치료를 위해 SVV를 이용하는 방법은 치료적으로 유용한 종양 세포의 파괴를 유발할 수 있는 안전하고 발달 가능하며 허용 가능한 양의 바이러스를 전신, 국부 또는 국소 투여하는 것을 포함한다. 전신 투여 후에도, SVV에 대한 치료 지수는 10 이상이며, 바람직하게는 100 이상 또는 더욱 바람직하게는 1000 이상이다. 일반적으로, SVV는 1 x 108∼1 x 1014 vp/kg의 양으로 투여된다. 투여되는 정확한 용량은 환자의 연령, 체중 및 성별과 치료되는 종양의 크기 및 심각성을 비롯하여 다양한 요인에 따라 달라진다. 바이러스는 1회 이상 투여할 수 있으며, 투여 회수는 숙주의 면역 반응 잠재력에 따라 달라질 수 있다. 조성물의 1회 또는 다회 투여는 치료의가 선택하는 용량 수준 및 패턴에 따라 수행할 수 있다. 필요하다면, 면역 반응은, 바이러스에 대한 면역 반응을 감소시킴으로써 반복 투여를 가능케 하고/하거나 복제를 증강시킬 수 있도록 다양한 면역억제제를 사용하여 감퇴시킬 수 있다. 본 발명의 항신생물 바이러스 요법은 다른 항신생물 프로토콜과 병행될 수 있다. 투여는 리포솜, 직접 주사, 카테터, 국소 적용, 흡입 등을 이용하는 다양한 방식으로 이루어질 수 있다. 또한, SVV 게놈 RNA의 DNA 카피, 또는 이의 일부분 역시 투여 방법이 될 수 있는데, 이 경우 DNA는 후에 세포에 의해 전사되어 SVV 바이러스 입자 또는 특정 SVV 폴리펩티드를 생성하게 된다.
치료적 유효량이란 환자의 증상을 완화시키거나 생존을 연장시킬 수 있는 바이러스의 양을 의미한다. 바이러스의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서, LD50(동물 또는 세포 집단의 50%에 대한 치사량; 바이러스의 경우 이 용량의 단위는 vp/kg임) 및 ED50(동물 또는 세포 집단의 50%에서 치료 효과를 보이는 양 - vp/kg임) 또는 EC50[동물 또는 세포 집단의 50%에서의 유효 농도 - vp/세포(예를 들어 하기 표 1 참조)]을 측정하기 위한 표준 절차에 의해 측정할 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 간의 용량비가 치료 지수이며, 이것은 LD50과 ED50 또는 EC50 간의 비로서 표현할 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 바이러스가 바람직하다. 이러한 세포 배양물 분석 및 동물 실험으로부터 얻어진 데이터는 인간에게 사용하기 위한 투여량 범위를 조율하는 데 이용될 수 있다. 바이러스의 투여량은 독성을 거의 또는 전혀 나타내지 않으면서 ED50 또는 EC50을 포함하는 일정 순환 농도 내에 속하는 것이 바람직하다. 투여량은 이용되는 제형 및 이용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 변화될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 유기체에 본 발명의 바이러스 조성물을 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 신생물 질환을 가진 숙주 유기체를 치료하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 신생물 조직은 비정상적으로 증식하는 조직이며, 신생물 조직은 악성 종양 조직일 수 있다. 바람직하게는, 바이러스는 종양 조직에서의 선택적 복제능으로 인하여 조직 또는 종양 덩어리 전반에 분포된다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 신생물 질환은 향신경성 특성을 가지는 질환들을 포함한다.
본 발명 바이러스의 제조 방법:
매우 높은 역가 및 수율로 본 발명 바이러스를 제조하는 방법은 본 발명의 추가적인 측면을 이룬다. 전술한 바와 같이, SVV는 고역가로 정제될 수 있으며, 허용성 세포주당 200,000개 입자를 초과하는 양으로 생성될 수 있다. 다량의 바이러스를 생성할 수 있는 세포는 PER.C6(Fallaux et al., Human Gene Therapy, 9: 1909-1917, 1998), H446(ATCC# HTB-171) 및 표 1에 기재된 다른 세포주(여기서 EC50 값은 0보다 작다)를 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니나,
예를 들어, 피코나바이러스의 배양은 하기와 같이 수행할 수 있다. 해당 바이러스는 1회 정제된 플라크이며, 제대로 분리된 플라크를 피킹하여 PER.C6과 같은 허용성 세포주에서 증폭시킨다. 감염된 세포로부터의 미정제 바이러스 용해물(CVL)은 여러 사이클의 동결-해동에 의해 제조하여 다수의 허용성 세포를 감염시키는 데 사용할 수 있다. 허용성 세포는 10% 소 태아 혈청(Biowhitaker, 매릴랜드주 워커스빌) 및 10 mM 염화마그네슘((Sigma, 미주리주 세인트 루이스)을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Invitrogen, 캘리포니아주 칼스배드)와 같은 다양한 배지를 사용하여, 다양한 조직 배양 플라스크, 예를 들어 50 x 150 cm2 플라스크에서 배양할 수 있다. 감염된 세포는 감염 24∼48 시간 후 또는 완전한 세포 변성 효과(CPE)가 확인될 때 회수하여, 4℃, 1500 rpm에서 10분간 원심분리하여 수집한다. 세포 펠릿을 세포 배양물 상청액에 재현탁시키고 여러 사이클의 동결-해동을 실시한다. 생성된 CVL은 4℃, 1500 rpm에서 10분간 원심분리하여 투명하게 만든다. 바이러스는 구배 원심분리에 의해 정제할 수 있다. 예를 들어, 2 순환의 CsCl 구배는 SVV를 정제하는 데 충분할 수 있다: 1-단계 구배(CsCl 밀도 1.24 g/ml 및 1.4 g/ml), 이어서 1 순환의 연속 구배 원심분리(CsCl 밀도 1.33 g/ml). 정제된 바이러스 농도는 분광광도계를 사용하여 측정하는데, 1 A260 = 9.5 x 1012 입자인 것으로 가정한다(Scraba D.G., and Palmenberg, A.C. 1999), Cardioviruses(Picornaviridae). In: Encyclopedia of Virology. Second edition, R.G. Webster and A Granoff Eds). PER.C6 세포를 사용한 표준 플라크 분석에 의해 정제된 바이러스의 역가 역시 측정한다. PER.C6 세포로부터의 SVV의 수율은 세포당 200,000 입자보다 많으며, 입자 대 PFU의 비는 약 100이다. 그 밖의 허용성 세포(H446-ATCC# HTB-171)로부터의 SVV의 수율은 적어도 이보다 같거나 더 높을 수 있다.
또한, SVV의 정제에, 상업적으로 유용한 대규모 굿 매뉴팩춰링 프로세스(Good Manufacturing Processes; GMP)에서의 여러 단계를 적용할 수 있다. 본 발명은 또한 아데노바이러스의 정제 방법에 기초한 SVV 정제 방법을 포함한다. 이 방법은 그 밀도를 기준으로 SVV를 분리하는 것을 포함하는데, 그 이유는 SVV는 아데노바이러스와 매우 유사한 밀도를 가지며 아데노바이러스와 동시에 정제될 수 있기 때문이다.
종양의 검출 및 조사 방법:
본 발명은 본 발명 바이러스를 사용하여 환자 체내의 종양 또는 신생물 세포를 검출하는 방법을 제공한다. 세포 샘플은 환자로부터 채취하여 에피토프 태그가 달린 SVV(또는 본 발명에 의해 제공되는 기타 종양 특이적 바이러스, 즉 종양 특이적 돌연변이 카디오바이러스)와 상기 샘플을 함께 항온처리하여 스크리닝한 다음, 에피토프 태그를 검출함으로써 결합된 SVV에 대하여 샘플을 스크리닝할 수 있다. 대안으로, 샘플은 SVV가 어떠한 세포 용해를 유발하는지를 검출함으로써 스크리닝할 수 있다. SVV가 세포 용해를 유발하거나 또는 SVV가 샘플 중의 세포에 특이적으로 결합할 수 있다면, 이는 샘플이 SVV에 결합되고/되거나 SVV에 의해 감염될 수 있는 것으로 알려진 신생물 또는 종양 세포를 함유하고 있을 가능성을 암시한다.
또한, SVV는 생체내 종양 세포를 검출하는 방법에 이용될 수 있다. 이러한 방법에서, 에피토프 태그가 달린 SVV는 먼저 SVV가 여전히 종양 세포에 특이적으로 결합할 수 있으나 복제는 할 수 없도록 불활성화시킬 수 있다. 결합된 SVV를 가지는 종양 세포는 에피토프 태그를 분석함으로써 검출할 수 있다. 에피토프 태그의 검출은 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 수행할 수 있는데, 이 때 항체는 표지된 것이거나(예를 들어 형광 표지) 또는 항체는 후에 표지된 2차 항체에 의해 검출될 수 있는 것이다.
본 발명의 검출 방법은 본 발명의 임의의 바이러스에 의해 특이적으로 표적화된 임의의 유형의 종양 또는 신생물 세포를 검출하는 것을 포함한다. 구체적인 종양 유형으로는, 예를 들어 신경내분비형 종양, 예컨대 망막아세포종, SCLC, 신경아세포종, 신경교아세포종 및 수아세포종을 포함한다.
본 발명은 또한 종양 세포를 연구하기 위한 도구로서의 SVV의 용도를 제공한다. SVV는 일부 종양 세포 유형을 선택적으로 파괴하고, 비종양 세포에 대한 독성 효과는, 있다고 해도, 아주 약간만 있다. 이러한 특성으로 인하여, SVV는 종양을 연구하고 가능하게는 새로운 종양 특이적 유전자 및/또는 경로를 발견하는 데 이용될 수 있다. 즉, 종양 세포의 특성 중에는 SVV의 복제를 허용하는 몇 가지 특성이 존재하는데, 이 때 정상 세포는 상기 특성을 나타내지 않는다. 새로운 종양 특이적 유전자 및/또는 경로를 확인한 후에, 치료적 항체 또는 소분자를 디자인 또는 스크리닝하여 이들 물질들이 항종양제인지를 확인할 수 있다.
본 발명은 또한 SVV에 반응하는 모든 유형의 암을 확인하기 위한 방법을 제공한다. 한 구체예에서, SVV 반응성 세포의 확인 방법은 세포를 입수하는 단계, 상기 세포를 SVV와 접촉시키는 단계 및 세포 사멸을 검출하거나 바이러스 복제를 검출하는 단계를 포함한다. 세포 사멸은 당업자에게 공지되어 있는 다양한 방법들을 이용하여 검출할 수 있다(예, MTS 분석, 본원의 고처리량 섹션 참조). 바이러스 복제를 검출하는 방법 역시 당업자에게 공지되어 있다(예, CPE의 관찰, 플라크 분석, DNA 정량법, 종양 세포 내의 바이러스량을 검출하기 위한 FACS, 바이러스 RNA를 검출하기 위한 RT-PCR 분석 등). 한 구체예에서, 세포는 암 세포이다. 암 세포의 예로는 확립된 종양 세포주 및 포유동물로부터 적출한 종양 세포를 들 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다. 한 구체예에서, 포유동물은 인간이다. 또 다른 구체예에서, 암은 인간 암 환자로부터 적출한 암 세포이다.
SVV 반응성 암 세포를 확인하는 방법은 SVV 복제를 허용하는 종양 세포주 또는 종양 조직을 발견하는 데 이용될 수 있다. 또한, 허용성 종양 세포의 특성을 확인함으로써, 세포가 SVV에 의해 선택적으로 사멸될 수 있도록 하는 종양 세포의 특성들을 확인할 수 있다. 이러한 특성들의 발견은 항암 약물에 대한 새로운 표적을 제시하였다. 또한, SVV 반응성 암 세포를 확인하는 방법은 SVV를 이용한 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 인간 암 환자를 위한 스크린으로서 사용될 수 있다.
SVV의 천연 숙주는 아직 확인되지 않았기 때문에, SVV를 검출하기 위한 분석에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 따라서, 본 발명은 SVV를 검출하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 검출 분석은 SVV 폴리펩티드 에피토프에 특이적인 항체에 기초한다. 또 다른 구체예에서, 검출 분석은 핵산의 하이브리드화에 기초한다. 한 구체예에서, RNA는 SVV로부터 분리하고, 표지하여(예를 들어, 방사능 표지, 화학발광 표지, 형광 표지 등) 프로브를 만든다. 그 후 RNA는 테스트 물질로부터 분리하고 니트로셀룰로스(또는 이와 유사하거나 기능적 등가인 기재)에 결합시키고, 표지된 SVV RNA로 프로빙하고, 결합된 프로브의 양을 검출한다. 또한, 바이러스의 RNA는 직접적 또는 간접적으로 서열을 결정하고 그 서열에 기초하여 PCR 분석을 진행한다. 한 구체예에서, PCR 분석은 실시간(real time) PCR 분석이다.
향성이 변경된 바이러스의 제조 방법:
본 발명은 SVV 돌연변이체(또는 변이체 또는 유도체)를 구성하는 방법을 제공하는데, 이 때 상기 돌연변이체는 세포형 향성이 변경된 것이다. 구체적으로, SVV 돌연변이체를 야생형 SVV 결합에 대해 내성이 있는 것으로 알려진 종양 또는 신생물 세포에 특이적으로 결합하고/하거나 사멸시키는 능력에 대해 선택한다.
천연 또는 야생형 SVV는 천연 바이러스의 변형이 다른 암 징후를 표적으로 할 수 있게 하는 단순한 게놈 및 구조를 갖고 있다. 이러한 새로운 유도체는 비-신경계 암에 대한 확장된 향성을 나타내며, 천연 SVV에서 발견되는 높은 치료 지수를 여전히 유지한다. 표적화 방법 중 가능한 한 가지는 바이러스 표면에 조직 특이적 에피토프 또는 리간드를 포함시키는 것이다.
암을 표적으로 하는 후보 바이러스를 선별하기 위해, 본 발명은 천연 SVV의 캡시드 영역에서 무작위 펩티드 서열을 코딩하는 유전자 삽입체를 갖는 암용해성 바이러스 라이브러리를 구성하고 스크리닝하는 방법을 제공한다. 108의 다양성을 갖는 무작위 펩티드 라이브러리면 충분한 것으로 생각되며, 바이러스를 종양 조직에 특이적으로 유도하는 펩티드를 생성하여야 한다.
종양 세포가 정상 세포와는 다른 특성들, 예를 들어 (1) 종양 세포는 투과성이 더 큰 세포막을 갖는다는 특성; (2) 종양은 세포형 특이적 수용체를 발현하는 것으로 이미 확인된 바 있는 혈관형성성 내피 세포와 같은 특수한 기질 세포를 보유한다는 특성; 및 (3) 종양 세포는 특정 수용체, 항원 및 세포외 기질 단백질을 차별적으로 발현한다는 특성을 나타낸다는 것이 다양한 연구에 의해 확인되었다(Arap, W. et al., Nat. Med., 2002, 8 (2): 121-127; Kolonin, M. et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2001, 5 (3): 308-313; St. Croix, B. et al., Science, 2000, 289 (5482): 1997-1202). 이러한 연구들은 종양 및 정상 조직이 분자 수준에서 구별되며 표적화된 약물 송달 및 암 치료가 가능할 수 있음을 입증하였다. 구체적으로, 마우스 모델에서 혈관을 향해 이동하는 것에 의해 선택된 몇몇 펩티드가 세포독성 약물(Arap, W. et al., Science, 1998, 279 (5349): 377-380), 향-아폽토시스 펩티드(Ellerby, H. M. et al., Nat. Med., 1999, 17(8): 768-774), 메탈로프로테아제 억제제(Koivunen, E. et al., Nat. Biotechnol, 1999, 17 (8): 768-774), 사이토카인(Curnis, F. et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18 (11): 1185-1190), 형광단(Hong. F.D. and Cayman, G.L., CancerRes., 2000, 60 (23): 6551-6556) 및 유전자(Trepel, M. et al., Hum. Gene Ther., 2000, 11 (14): 1971-1981)의 표적 송달에 사용되어 왔다. 종양 표적화 펩티드는 모 약물의 효능은 증가시키되 독성은 낮추는 것으로 입증되었다.
SVV 유도체의 라이브러리는 바이러스의 캡시드 영역에 무작위 펩티드 서열을 삽입하여 생성할 수 있다. 도 57에 도시된 바와 같이, SVV 캡시드 영역, 즉 "pSVV 캡시드"를 포함하는 벡터를 먼저 생성한다. 그 후 이 캡시드 벡터는, 예를 들어 아무 위치에서나 DNA를 절단하는 제한 효소, 즉 CviJI(평활 말단 절단 효소)로 벡터를 절단하여 돌연변이를 유발할 수 있다. 이 벡터는 여러 위치에서 절단되며, CviJI에 의해 단 한 번 절단된 DNA는 겔 정제에 의해 분리할 수 있다(도 57 참조). 이와 같이 분리된 DNA 집합체는 캡시드 영역의 여러 곳에서 절단된 복수의 종을 함유한다. 그 후 이러한 집합체는 올리고뉴클레오티드 및 리가제와 항온처리하여, 일정 비율의 올리고뉴클레오티드가 벡터의 캡시드 영역 내 다수의 상이한 위치로 결찰되도록 한다. 이와 같은 방식으로, 돌연변이 SVV 캡시드의 라이브러리를 생성할 수 있다.
캡시드 코딩 영역에 삽입된 올리고뉴클레오티드는 무작위 올리고뉴클레오티드, 비무작위 올리고뉴클레오티드(즉, 올리고뉴클레오티드의 서열이 이미 결정됨), 또는 반무작위 올리고뉴클레오티드(즉, 올리고뉴클레오티드의 일부분은 미리 결정되었고 일부분은 무작위 서열을 가짐)일 수 있다. 고려되는 올리고뉴클레오티드의 비무작위 양태는 에피토프 코딩 영역을 포함할 수 있다. 고려되는 에피토프는 c-myc - 인간 원발암 유전자 myc의 10개 아미노산 분절[EQKLISEEDL (서열 번호 35)]; HA - 인간 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터의 헤마글루티닌 단백질[YPYDVPDYA (서열 번호 36)]; 및 His6 - 6개의 연속된 히스티딘을 코딩하는 서열을 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다.
그 후 돌연변이 캡시드 폴리뉴클레오티드의 라이브러리(예, 도 57의 "pSVV 캡시드 라이브러리")를 단지 돌연변이 캡시드 코딩 영역만이 절단되도록 제한 효소로 분해할 수 있다. 그 후 상기 돌연변이 캡시드 코딩 영역은 캡시드 코딩 영역이 결여된 전체 길이 게놈 서열을 포함하는 벡터로 결찰시킨다(예를 들어 도 58 참조). 이러한 결찰에 의해 전체 길이 게놈 서열을 가지는 벡터가 생성되는데, 이 때 벡터의 집합체(또는 라이브러리)는 다수의 돌연변이 캡시드를 포함한다. 도 58에는, 여러 캡시드를 포함하는 SVV 돌연변이체의 이와 같은 라이브러리를 "pSVVFL 캡시드"로 표시된다. 그 후 pSVVFL 캡시드 벡터 라이브러리를 선형화하고 역전사하여 돌연변이 SVV RNA를 생성한다(도 59 참조). 그 후 이 돌연변이 SVV RNA는, 그 캡시드 내에 부적합한 돌연변이를 보유하지 않는 SVV 서열이 숙주 세포에 의해 번역되어 다수의 돌연변이 SVV 입자를 생성하도록 허용성 세포주로 형질감염시킨다. 도 59에는, 다수의 돌연변이 SVV 입자가 "SVV 캡시드 라이브러리"로 표시되어 있다.
캡시드 코딩 영역에 삽입된 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩되는 펩티드는 특정 바이러스 감염에 대한 표적화 부분으로서 작용할 수 있다. 특정 유형의 암을 표적으로 하는 바이러스는 그 펩티드에 대한 수용체를 보유하는 암 세포만을 선택적으로 감염시켜서, 그 세포에서 복제하여 그 세포를 사멸시키며 동종의 세포로만 확산한다. 이러한 방법에 의하면, 신규한 종양 표적화 펩티드 및 리간드, 종양 선택적 수용체, 치료용 SVV 유도체, 및 피코나바이러스 유도체를 비롯하여 기타 바이러스 유도체의 동정이 가능하다.
SVV 돌연변이체 라이브러리의 시험관내 및 생체내 스크리닝은 펩티드 비드 라이브러리 및 파지 디스플레이와 같은 다른 기법에 비해 몇 가지 장점을 갖는다. 이러한 다른 기법들과는 달리, 본원에서 바람직한 후보물질, 즉 암 세포에 선택적으로 결합하는 SVV 유도체는 계내에서(in situ) 복제할 것이다. 이와 같이 복제에 기초한 라이브러리 접근법은 파지 디스플레이와 같은 새로운 세포 결합 부분을 발견하기 위한 종래의 방법에 비해 수많은 장점을 갖는다. 첫째, SVV 라이브러리의 스크리닝은 복제에 기초한 것이다. 원하는 바이러스 유도체만이 표적 조직에서, 이 경우 특정 암 세포에서 복제할 수 있다. 스크리닝/선별 과정에 의하면 표적화 펩티드 부분을 가질 뿐만 아니라 암 치료제 자체가 될 수 있는 매우 특이적인 바이러스 후보물질이 얻어진다. 이와는 달리, 파지 디스플레이 스크린에 의하면 결합 사건이 초래되어 표적화 펩티드 후보물질만이 얻어진다. 따라서, SVV 라이브러리 스크리닝은 훨씬 더 빠르고 선택적인 방법을 제공한다. 둘째, 시험관내 또는 생체내 파지 스크리닝 과정 중에, 표적 세포로부터 회수된 파지는 박테리아에서 증폭할 수 있는 반면, SVV 유도체는 감염된 세포(또는 용해에 의해 감염된 세포의 배양 상청액)로부터 직접 회수하여 정제할 수 있다. 셋째, SVV는 조작이 더 용이한 더 작은 게놈을 보유하며, 따라서 최적화된 삽입을 확보하기 위해 캡시드 영역으로 유전 정보를 무작위로 상입하는 것이 가능하다. 따라서, SVV 라이브러리의 구성 및 스크리닝은 매우 효과적인 바이러스 유도체를 생성할 수 있는 가능성이 매우 높다. 이러한 유도체들은 비신경계 특성을 갖는 암을 특이적으로 감염시키도록 디자인하고 스크리닝한다.
캡시드 코딩 영역으로의 올리고뉴클레오티드의 삽입은 몇 가지 결함성 돌연변이체의 생성을 초래한다. 돌연변이체는 올리고뉴클레오티드 서열의 삽입이 종결 코돈을 생성시켜 바이러스 폴리단백질이 생성되지 못하도록 한다는 점에서 결함이 있는 것일 수 있다. 또한, 돌연변이체는 올리고뉴클레오티드 서열의 삽입이 캡시드 구조를 변경시켜 캡시드가 더 이상 조립될 수 없도록 한다는 점에서 결함이 있는 것일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 서열의 삽입이 종결 코돈을 생성하거나 유지할 수 없는 캡시드 구조를 생성할 가능성을 줄이기 위해, TRIM과 같은 방법을 이용하여 종결 코돈 또는 특정 아미노산을 코딩하지 않도록 무작위 올리고뉴클레오티드를 디자인할 수 있다.
캡시드 영역 내에 올리고뉴클레오티드를 위한 최적 삽입 지점이 있는지를 확인하기 위해, RGD-SVV 라이브러리를 생성할 수 있다(실시예 16 참조). SVV 캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 CviJI을 사용하여 무작위로 절단한다. 그 후 무작위로 절단된 캡시드 폴리뉴클레오티드는 적어도 RGD 아미노산 서열(아르기닌-글리신-아스파르트산)을 코딩하는 올리고뉴클레오티드에 결찰시킨다. 그 후 이러한 RGD-캡시드 서열은 캡시드 서열이 결실된 SVV 전체 길이 서열 벡터에 결찰시킨다. RGD-SVV 유도체 바이러스를 생성하고 이를 특정 인테그린 발현 세포주를 감염시켜 그 속에서 복제할 수 있는 능력에 대하여 테스트한다(RGD 펩티드는 물질을 인테그린 수용체로 표적화하는 것으로 확인되었기 때문에). 그 후, RGD 올리고뉴클레오티드에 대한 주요 삽입 부위가 있는지를 확인하기 위해 인테그린 발현 세포주를 감염시키는 데 성공적인 RGD-SVV 유도체를 분석한다. 그 후 이 부위를 무작위, 비무작위 또는 반무작위 올리고뉴클레오티드의 위치 지정 삽입에 사용할 수 있다.
또한, SVV와 다른 피코나바이러스 간의 캡시드 코딩 영역의 일부분을 비교하였을 때(도 28 참조), 바이러스 간에 서열 유사성이 최저 수준인, 박스를 치지 않은 영역이 여러 곳 존재한다. 이러한 영역들은 바이러스 간의 향성 차이에 중요하게 작용할 수 있다. 따라서, 이러한 영역들은 SVV 캡시드(및 다른 바이러스 캡시드)의 올리고뉴클레오티드 삽입 돌연변이 유발을 위한 후보 지점이 될 수 있다.
종양 특이적 치료제로서의 불활성화된 SVV:
SVV 및 SVV-캡시드 유도체는 특정 종양 세포 유형 및/또는 조직을 표적으로 할 수 있기 때문에, SVV 입자 자체가 치료제용 송달 수송체로서 사용될 수 있다. 이러한 방법에서는, SVV의 암용해능에 대한 요구가 선택 사항이 되는데, 그 이유는 송달된 치료제가 표적화된 종양 세포를 사멸시킬 수 있기 때문에다.
예를 들어, 야생형 SVV는 바이러스가 더 이상 감염된 세포를 용해시키지 않지만 바이러스가 표적화된 종양 세포 유형에 특이적으로 결합하여 세포 내로 진입할 수 있도록 불활성화시킬 수 있다. 바이러스의 복제 기능을 불활성화시킬 수 있는 것으로 당분야에 알려진 표준 방법은 다수가 있다. 예를 들어, 전체 바이러스 백신은 바이러스가 복제할 수 없도록 포르말린 또는 β-프로피오락톤으로 불활성화시킨다. 야생형 SVV 자체는 세포의 아폽토시스를 유발하는 펩티드를 포함할 수 있다. 대안으로, SVV에 방사선을 조사할 수 있다. 그러나, 방사선 조사된 바이러스는 먼저 이들이 종양 세포를 특이적으로 표적화할 수 있도록 확실히 하기 위해 테스트를 거쳐야 하는데, 왜냐하면 특정 방사선 조사 조건은 단백질 변성, 즉 캡시드 변성을 유발할 수 있기 때문이다. 또한 패키징 신호 서열이 결실된 돌연변이 SVV도 생성할 수 있다. 이러한 SVV 돌연변이체는 표적 세포에 특이적으로 결합하여 세포 내로 진입할 수 있으나 복제된 SVV 게놈 RNA는 패키징되어 캡시드로 조립되지 않는다. 그러나, 이러한 방법은, 이들 돌연변이 SVV의 초기 진입이 숙주 단백질 합성을 중단시켜 종양 세포 사멸이 여전히 일어나도록 하기 때문에 유용한 것으로 판단될 수 있다.
돌연변이 캡시드를 갖는 유도체 SVV 역시 불활성화시켜 암 세포를 사멸시키는 데 이용할 수 있다. 캡시드 영역으로 삽입된 에피토프 태그를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 갖는 유도체 SVV는 독소를 종양 세포로 송달하기 위한 수송체로서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 유도체 SVV는 무작위로 돌연변이키셔 종양 특이적 향성에 대하여 스크리닝할 수 있다. 독소는 에피토프 태그에 부착시켜, 바이러스가 독소를 종양 세포에 송달하게 할 수 있다. 대안으로, 바이러스가 치료용 항체를 종양 세포에 송달하도록, 에피토프 태그에 특이적으로 결합하는 치료용 항체를 사용할 수 있다.
고처리량 스크리닝:
본 발명은 다양한 세포주를 특이적으로 감염시킬 수 있는 능력을 보유하는 바이러스를 스크리닝하기 위한 고처리량 방법을 포함한다. 감염 특이성은 세포 변성 효과를 분석하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 고처리량 스크리닝에 적합한 멀티-웰 플레이트, 예를 들어 384웰 플레이트의 여러 웰에서 다수의 상이한 종양 세포주를 배양할 수 있다. 각 웰에, 세포가 바이러스 매개 용해에 의해 사멸되는지를 테스트하기 위해 바이러스 샘플을 첨가한다. 세포 변성 효과를 보이는 웰로부터 배지를 수집하여 그 배지 중의 임의의 바이러스가 플라스크 또는 대형 조직 배양 플레이트 중의 허용성 세포주를 감염시킴으로써 증폭할 수 있도록 한다. 바이러스를 성장시켜 RNA를 분리하고 바이러스에 종양 세포 유형 특이적 향성을 제공하는 데 관여할 수 있는 서열 돌연변이를 확인하기 위해 그 서열을 분석한다.
형광 염료계 분석, ATP계 분석, MTS 분석 및 LDH 분석을 비롯하여 다양한 비색 측정 및 형광 측정 방법은 세포 변성 효과를 신속하게 분석할 수 있다. 형광 염료계 분석은 사세포 집단을 검출하기 위한 핵산 염료를 포함할 수 있는데, 왜냐하면 세포 불투과성 핵산 염료는 사세포 집단을 특이적으로 검출할 수 있기 때문이다. 생세포 집단과 사세포 집단 둘 다를 동시에 검출하기를 원한다면, 생세포 집단을 검출하기 위해 핵산 염료를 세포내 에스테라제 기질, 원형질막 투과성 핵산 염료, 원형질막 전위 민감성 프로브, 세포소기관 프로브 또는 다른 세포 투과성 지시제와 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, Invitrogen(캘리포니아주 칼스배드)은 손상된 원형질막을 갖는 세포만을 투과하는 다양한 SYTOXTM 핵산 염료를 제공한다. 에티듐 브로마이드 및 프로피듐 요오다이드도 사세포 또는 죽어가는 세포를 검출하는 데 이용할 수 있다. 이러한 염료는 임의의 흡광도 판독기에 의해 검출될 수 있는 고친화성 핵산 염료이다.
예를 들어, 용해는 손상된 세포의 사이토졸로부터 상청액으로 방출되는 락테이트 데히드로게나제(lactate dehydrogenase; LDH) 활성의 측정값에 기초할 수 있다. 세포 배양물 생청액 중의 LDH의 존재를 검출하기 위해서는, LDH가 커플링 효소 반응에 의해 테트라졸륨염 INT를 포르마잔으로 환원시키도록 기질 혼합물을 첨가할 수 있다. 그 후 포르마잔 염료는 흡광도 판독기에 의해 검출할 수 있다. 대안으로, 전자 커플링 시약으로서 펜진 메토설페이트(phenzine methosulfate; PMS)를 사용하는 MTS 분석 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨, 내부염]을 이용하여 세포독성을 검출할 수도 있다. 프로메가(Promega)(위스콘신주 메디슨)는 CellTiter 96(등록상표) AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 키트를 제공하는데, 이 키트에서 용액 시약은 배양 웰에 직접 첨가하여 1∼4 시간 동안 항온처리하고 그 후 490 nm에서 흡광도를 판독한다. 490 nm 흡광도 양에 의해 측정된 포르마잔 생성물의 양은 배양물 중의 생세포의 수에 정비례한다.
흡광도를 판독하기 위한 고처리량 장치는 다수가 있다. 예를 들어, SpectraMax Plus 384 Absorbance Platereader(Molecular Devices)는 1 nm의 증분으로 190∼1000 nm의 파장을 검출할 수 있다. 이 장치는 초고속 샘플 처리량에 대하여 96웰 마이크로플레이트를 5초 이내에 판독할 수 있으며 384웰 마이크로플레이트를 16초 이내에 판독할 수 있다.
바이러스 복제는 또한 성공적인 감염의 지표로서 분석될 수 있는데, 이러한 검출 방법은 고처리량 방식으로 이용할 수 있다. 예를 들어, 실시간 RT-PCR 방법은 세포 배양물 상청액 중의 바이러스 전사체의 존재를 검출하는 데 이용될 수 있다. 바이러스 RNA에서 cDNA로 역전사가 일어나면, 이 cDNA는 이중 가닥 DNA 결합 염료를 사용하여 PCR에 의해 증폭 및 검출할 수 있다(예를 들어, SYBR(등록상표) Green, Qiagen GmbH, 독일). 그 후, PCR 생성물의 양은 형광광도계를 사용하여 측정할 수 있다.
세포 변성 효과를 보이는 웰로부터의 바이러스는 배양하여 시험관내(종양 및 정상 세포주를 재테스트함) 및 생체내 모델(바이러스가 마우스 체내에 외식된 종양을 사멸시킬 수 있는지를 테스트함)에서 추가로 테스트한다.
항체:
본 발명은 또한 바이러스의 단백질을 비롯하여 본 발명의 바이러스에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 자연 발생 항체뿐 아니라, 비-자연 발생 항체, 예를 들어 단일쇄 항체, 키메라 항체, 이작용성 항체 및 인간화 항체와, 이들의 항원 결합성 단편을 포함한다. 이러한 비-자연 발생 항체는 고체상 펩티드 합성을 이용하여 제조하거나 또는 재조합 기법에 의해 제조하거나, 또는 예를 들어 가변 중쇄 및 가변 경쇄로 구성된 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다(Huse et al., Science 246: 1275-1281, 1989). 예를 들어 키메라 항체, 인간화 항체, CDR-이식 항체, 단일쇄 항체 및 이작용성 항체를 제조하기 위한 이와 같은 방법들은 당업자에게 널리 알려져 있다(Winter and Harris, Immunol. Today 14: 243-246, 1993; Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989; Harlow and Lane, Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); Hilyard et al., Protein Engineering : A practical approach, IRL Press 1992; Borrabeck, Antibody Engineering, 2d ed., Oxford University Press 1995). 본 발명의 항체는 완전한 분자는 물론이고 본 발명의 폴리펩티드 내에 존재하는 에피토프 결정인자에 결합할 수 있는 이의 단편들, 예를 들어 Fab, F(ab')2 및 Fv를 포함한다.
항체 생성을 위한 면역원으로서 사용되는 본 발명의 SVV 폴리펩티드의 펩티드 일부분(즉, 서열 번호 2로부터의 임의의 펩티드 단편) 또는 본 발명의 다른 바이러스 폴리펩티드의 펩티드 일부분이 비면역원성인 경우, 이것은 합텐을 소 혈청 알부민(BSA) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 같은 캐리어 분자에 커플링시키거나 또는 펩티드 일부분을 융합 단백질로서 발현시킴으로써 면역원성으로 만들 수 있다. 합텐을 캐리어 분자에 커플링시키는 데 사용되는 다양한 기타 캐리어 분자 및 방법은 당분야에 잘 알려져 있다(참고 문헌: Harlow and Lane, supra, 1988). 예를 들어 토끼, 염소, 마우스 또는 기타 포유동물에서 폴리클로날 항체를 생성하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다(참고 문헌: Green et al., "Production of Polyclonal Antisera," in Immunochemical Protocols, Manson, ed., Humana Press 1992, pages 1-5; Coligan et al., "Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters," in Curr. Protocols Immunol. (1992), section 2.4.1).
당분야에 잘 알려져 있고 통상적인 방법을 이용하여 모노클로날 항체도 얻을 수 있다(Kohler and Milstein, Nature 256: 495, 1975; Coligan et al., supra, 1992, sections 2.5.1-2.6.7; Harlow and Lane, supra, 1988). 예를 들어, 바이러스, 바이러스 폴리펩티드 또는 이의 단편으로 면역화시킨 마우스로부터의 비장 세포를 적절한 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 생성할 수 있다. 클로닝된 하이브리도마 세포주는, 적절한 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 분비하는 클론을 동정하기 위해, 예를 들어 표지된 SVV 폴리펩티드를 사용하여 스크리닝하고, 바람직한 특이성 및 친화성을 갖는 항체를 발현하는 하이브리도마를 분리하여 항체의 연속 공급원으로서 이용할 수 있다. 마찬가지로, 예를 들어 면역화된 동물로부터 폴리클로날 항체를 분리할 수 있다. 그러한 항체들은, 본 발명의 방법을 수행하는 데 유용한 것 이외에도, 예를 들어 표준화된 키트를 제조하는 데 유용하다. 예를 들어 단일쇄 항체를 발현하는 재조합 파지 역시 표준화된 키트를 제조하는 데 이용될 수 있는 항체를 제공한다. 예를 들어 모노클로날 항체는, 단백질-A 세파로스 겔을 이용한 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 비롯하여 다양한 확립된 기법에 의해 하이브리도마 배양물로부터 분리 및 정제할 수 있다(Barnes et al., in Meth. Mol. Biol. 10: 79-104, Humana Press 1992); Coliganetal., supra, 1992, see sections 2.7. 1-2.7. 12 and sections 2.9.1-2.9.3).
항체의 항원 결합성 단편은 특정 항체의 단백질 분해성 가수분해에 의해, 또는 그 단편을 코딩하는 DNA의 발현에 의해 제조할 수 있다. 항체 단편은 통상적 방법에 의해 전체 항체의 펩신 또는 파파인 분해에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 항체를 펩신으로 효소적으로 분해하여 F(ab')2로 불리는 5S 단편을 얻을 수 있다. 이 단편은 티올 환원제 및 경우에 따라 이황화 결합의 절단으로부터 발생하는 설프히드릴기에 대한 차단기를 사용하여 추가 절단하여 3.5S Fab' 1가 단편을 생성할 수 있다. 대안으로, 펩신을 사용한 효소적 절단은 두 개의 1가 Fab' 단편 및 Fc 단편을 바로 생성한다(참고 문헌: Goldenberg, U.S. Pat. Nos. 4,036,945 and 4,331,647; Nisonhoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230. 1960; Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959; Edelman et al., Meth. Enzymol., 1: 422 (Academic Press 1967); Coligan et al., supra, 1992, see sections 2.8. 1-2.8. 10 and 2.10.1-2.10.4).
항체의 항원 결합성 단편의 또 다른 예는 단일 상보성 결정 영역(CDR)을 코딩하는 펩티드이다. CDR 펩티드는 해당 항체의 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 구성하여 얻을 수 있다. 그러한 폴리펩티드는, 예를 들어 항체 생산 세포로부터 얻은 RNA에 의해 코딩되는 가변 영역을 합성하기 위한 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 제조할 수 있다(참고 문헌: Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106, 1991).
본 발명의 항체는, 예를 들어 면역분석에 사용하기에 적합한데, 이 분석에서 본 발명의 항체는 액체상으로 이용될 수도 있고 고체상 캐리어에 결합될 수 있다. 또한, 이러한 면역분석에서의 항체는 다양한 방식으로 검출 가능하게 표지할 수 있다. 본 발명 항체를 이용할 수 있는 면역분석 유형의 예로는 직접적 또는 간접적 방식의 경쟁적 면역분석 및 비경쟁적 면역분석이 있다. 이러한 면역분석의 예로는 방사능 면역분석(RIA) 및 샌드위치(면역계량; immunometric) 분석이 있다. 본 발명 항체를 사용한 항원의 검출은 생리학적 샘플에 대한 면역조직화학적 분석을 비롯하여 전진, 후진 또는 동시 모드로 수행되는 면역분석을 이용하여 수행할 수 있다. 당업자라면 과도한 실험 없이 다른 면역분석 포맷을 이해하거나 또는 용이하게 구별할 수 있을 것이다.
당업자에게 공지된 항체를 표지하기 위한 다수의 다양한 표지와 표지 방법이 존재한다. 본 발명에 이용될 수 있는 표지 유형의 예로는 효소, 방사능 동위원소, 형광 화합물, 콜로이드성 금속, 화학발광 화합물, 인광 화합물 및 생물발광 화합물을 포함한다. 당업자라면 항체 또는 항원에 결합시키기에 적합한 그 밖의 표지도 알고 있거나 또는 통상의 실험에 의해 그를 확인할 수 있을 것이다.
전술한 바와 같은 본 발명의 범위 및 정신으로부터 벗어남이 없이 상기 방법 및 조성물에 다양한 변화가 이루어질 수 있기 때문에, 상기한 발명의 상세한 설명에 포함되거나 첨부하는 도면에 도시되어 있거나 또는 첨부하는 청구의 범위에 정의된 모든 주제는 제한적 의미로서가 아니라 대표예로서 해석되어야 한다.
하기에 기재된 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 제한하고자 포함시킨 것은 아니다.
실시예 1
바이러스의 증폭 및 정제
PER.C6 세포에서의 SVV의 배양: SVV는 1회 정제한 플라크이며, 제대로 분리한 플라크를 피킹하여, PER.C6 세포에서 증폭시킨다(Fallaux et al., 1998). SVV로 감염시킨 PER.C6 세포로부터의 미정제 바이러스 용해물(CVL)은 3 사이클의 동결-해동에 의해 준비하여 PER.C6 세포를 감염시키는 데 사용한다. PER.C6 세포는 10% 태아 소 혈청(Biowhitaker, 미국 매릴랜드주 워커스빌) 및 10 mM 염화마그네슘(Sigma, 미국 미주리주 세인트 루이스)을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스배드)를 사용하여 50 x 150 cm2 T.C. 플라스크에서 배양한다. 감염된 세포는 완전한 CPE가 확인되었을 때 감염시킨 지 30 시간째 회수하고 4℃, 1500 rpm에서 10분간 원심분리하여 수집한다. 세포 펠릿은 세포 배양물 상청액(30 ml)에 재현탁시키고 3 사이클의 동결-해동을 실시한다. 생성된 CVL은 4℃, 1500 rpm에서 10분간 원심분리하여 투명하게 만든다. 바이러스는 2 순환의 CsCl 구배에 의해 정제한다: 1-단계 구배(CsCl 밀도 1.24 g/ml 및 1.4 g/ml), 이어서 1 순환의 연속 구배 원심분리(CsCl 밀도 1.33 g/ml). 정제된 바이러스 농도는 분광광도계를 사용하여 측정하는데, 1 A260 = 9.5 x 1012 입자인 것으로 가정한다(Scraba D.G., and Palmenberg, A.C. 1999. Cardioviruses(Picornaviridae). In: Encyclopedia of Virology, Second edition, R.G. Webster and A Granoff Eds). 또한 정제된 바이러스의 역가를 PER.C6 세포를 사용한 표준 플라크 분석에 의해 측정한다. PER.C6 세포로부터의 SVV의 수율은 세포당 200,000개 입자보다 많으며, 입자 대 PFU의 비는 약 100이다. 다른 허용성 세포(H446-ATCC#; HTB-171)로부터의 SVV의 수율은 적어도 이와 같거나 더 높을 수 있다.
실시예 2
전자 현미경 관찰
SVV는 직접 도포법을 이용하여 포름바 카본이 코딩된 그리드에 마운팅하고, 우라닐 아세테이트를 사용하여 염색하여, 투과 전자 현미경으로 관찰한다. 바이러스의 대표 현미경 사진은 고배율에서 촬영한다. 투과 전자 현미경 관찰을 위해서는, SVV에 감염된 PER.C6 세포의 초박막 절편을 포매된 블록으로부터 절단하고 형성된 절편을 투과 전자 현미경으로 관찰한다.
정제된 SVV 입자는 구형이며 직경이 약 27 nm로서, 그리드 상에 하나씩 또는 작은 응집체로서 보인다. SVV의 대표 사진은 도 2에 도시되어 있다. 몇 곳에, 파괴된 바이러스 입자와 염료가 침투된 비어있는 캡시드 역시 관찰된다. 감염된 PER.C6 세포의 초미세 구조 분석에 의하면 세포질 내에 결정질 봉입체가 존재하는 것으로 나타났다. SVV에 감염된 PER.C6 세포의 대표 사진은 도 3에 도시되어 있다. 바이러 스 감염 세포는 몇 개의 대형 소포체(비어있는 소낭)를 나타내었다.
실시예 3
SVV의 핵산 분리
RNA 분리: SVV 게놈 RNA는 Trizol(Invitrogen)을 사용하는 구아니듐 티오시아네이트 및 페놀 추출법을 이용하여 추출하였다. 분리는 공급업자의 권장사항에 따라 수행하였다. 요약하면, 정제된 SVV 250 ㎕를 3배 부피의 TRIZOL 및 240 ㎕의 클로로포름과 혼합하였다. RNA를 함유하는 수성상은 600 ㎕의 이소프로판올로 침전시켰다. RNA 펠릿은 70% 에탄올로 2회 세척하고 건조시켜서 DEPC 처리수에 용해시켰다. 추출된 RNA의 양은 260 nm에서의 흡광도 측정에 의해 추정하였다. RNA의 분액을 1.25% 변성 아가로스 겔을 통해 분해하고(Cambrex Bio Sciences Rockland Inc., 미국 메인주 록클랜드), 밴드를 에티듐 브로마이드 염색에 의해 가시화하여 사진을 촬영하였다(도 4).
cDNA 합성: SVV 게놈의 cDNA는 RT-PCR에 의해 합성하였다. cDNA의 합성은 1 ㎍의 RNA, AMV 역전사효소 및 무작위 14량체 올리고뉴클레오티드 또는 올리고-dT를 사용하여 표준 조건 하에 수행하였다. cDNA의 단편을 증폭시키고 플라스미드로 클로닝하고 클론의 서열을 결정하였다.
실시예 4
SVV 서열 분석:
다른 바이러스와의 진화론적 관계를 확인하기 위해 SVV의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)을 분석하였다. 이 ORF에 대한 번역 생성물(서열 번호 2)은 피코나 바이러스와 유사하였으며, VP2의 중간에서부터 3D 폴리머라제의 말단에 있는 종결 코돈에까지 이르렀고, 그 길이는 1890개 아미노산이었다(도 5A∼5E 및 7A∼7B). 종결 코돈은 포함하되 폴리(A) 꼬리(이 중 18개 잔기는 표시됨)는 제외한 3' 비번역 영역(UTR), 즉 뉴클레오티드 5671∼5734는 뉴클레오티드(nt) 길이가 64개이며 OFR 다음에 위치한다(도 5E).
SVV의 3개의 부분 게놈 분절의 사전 비교(도시하지 않음)에 의해, SVV가 카디오바이러스속(피코나바이러스과)의 구성원과 가장 밀접한 관계에 있음을 확인하였다. SVV, 뇌심근염 바이러스(EMCV; 뇌심근염 바이러스종), 테일러 쥐 뇌척수염 바이러스(TMEV; 테일로바이러스종), 빌유이스크 인간 뇌척수염 바이러스(VHEV; 테일로바이러스종) 및 래트 TMEV-유사 물질(TLV; 테일로바이러스종)의 폴리단백질 서열의 정렬을 구성하였다(도 28). 이러한 정렬로부터 SVV 폴리단백질 프로세싱을, 카디오바이러스속의 가장 밀접한 관계에 있는 구성원의 폴리단백질 프로세싱과 비교하였다. 도 28에서 개개의 폴리펩티드 사이의 절단 부위는 "/" 기호로 분리한다.
피코나바이러스에서, 대부분의 폴리단백질 절단은 바이러스에 의해 코딩된 하나 이상의 프로테아제에 의해 이루어지지만, 카디오바이러스, 아프토바이러스, 에르보바이러스 및 테스코바이러스에서는 P1-2A와 2B 사이의 절단이, 2A 서열 자체와 관련되어 있고 서열 "NPG/P"(여기서, "/"는 2A와 2B 폴리펩티드 사이의 분리선을 나타낸다)를 필연적으로 수반하는, 충분히 규명되지 않은 cis-작용성 기전에 의해 이루어진다(Donnelly et al., 1997, J. Gen. Virol. 78: 13-21). 파레코바이러스 중 하나인 륜간 바이러스는 전형적 파레코바이러스 2A의 상류에 존재하는 상기 서열(NPGP)를 보유하며, 추가적인 2A이거나 P1 캡시드 영역의 C-말단부이다. 현재 파악된 9종의 피코나바이러스속 모두에서, 3Cpro는 거의 cis-작용성 자체 절단 반응을 수행한다(즉, 2A는 엔테로바이러스 및 리노바이러스의 N-말단에서 절단하며, L은 아프토바이러스 및 에르보바이러스의 C-말단에서 절단한다). 캡시드 폴리펩티드 VP0에서 VP4 및 VP2로의 조립후 절단은 3Cpro에 의해서가 아니라, 바이러스 RNA를 필요로 할 수 있는 미지의 기전에 의해 수행된다. VP0 절단은 파레코바이러스 및 코부바이러스에서는 일어나지 않는다. 정상 카디오바이러스 3Cpro 절단 부위는 -1번 위치에서 글루타민(Q) 또는 글루타메이트(E)를 보유하며, +1번 위치에서 글리신(G), 세린(S), 아데닌(A) 또는 아스파라긴(N)을 보유한다(표 2). SVV 폴리단백질의 절단은, 히스티딘(His)/세린(Ser)인 VP3/VP1 부위를 제외하고는, 이러한 패턴에 부합한다(표 2); 그러나, H/S는 말 리니티스 A 바이러스[ERAV; 아프토바이러스(Aphthovirus) 속]의 적어도 한 균주에서 3A와 3BVPg 사이의 절단 부위로서 존재할 가능성이 있다(Wutz et al., 1996, J. Gen. Virol. 77: 1719-1730).
[표 2]
SVV 및 카디오바이러스의 절단 부위
Figure 112006029330715-PCT00001
SVV의 1차적 절단(P1/P2 및 P2/P3): 서열 NPG/P를 이용하는 신규 기전 및 2BC와 P3 간의 3Cpro에 의한 전형적 절단 현상에 의한 2B로부터의 P1-2A의 분리를 포함하는 이러한 1차적 절단 현상은 카디오바이러스, 아프토바이러스, 에르보바이러스 및 테스코바이러스와 유사한 방식으로 일어나는 것으로 예측된다(포 2).
P1 절단: SVV P1 캡시드 코딩 영역 내의 절단은 EMCV 및 TMEV와의 서열 정렬에 의해 예측이 비교적 용이하였다(표 2).
P2 절단: 2C 단백질은 RNA 합성에 관여한다. SVV의 2C 폴리펩티드는 추정 헬리카제 및 모든 피코나바이러스 2C에 존재하는 NTP-결합성 모티프 GxxGxGKS/T(도메인 A) 및 hyhyhyxxD(여기서 hy는 임의의 소수성 잔기임; 도메인 B)를 포함한다(도 29).
P3 절단: P3 절단 부위의 예측 역시 비교적 용이하였다. 3A 폴리펩티드의 기능에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 그러나, 모든 피코나바이러스 3A 단백질은 추정되는 막관통 알파 나선을 포함한다. 이러한 단백질에서 SVV와 카디오바이러스 간의 1차 서열 동일성은 낮다(도 28 참조, 1612∼1701번 위치 사이).
게놈 결합형 폴리펩티드, VPg는 3B 영역에 의해 코딩되며, 다른 카디오바이러스와 공통으로 공유하는 아미노산이 거의 없지만, 세 번째 잔기는 티로신으로서 바이러스 게놈의 5' 말단에 대한 그 결합과 일치한다(Rothberg et al., 1978)(도 28 참조, 1703∼1724번 사이).
4종의 피코나바이러스 3C 시스테인 프로테아제의 3차원 구조를 해명하여, 활성 부위 잔기를 확인하였다(HAV, Allaire et al., 1994, Nature, 369: 72-76; Bergmann et al., 1997, J. Virol., 71: 2436-2448; PV-1, Mosimann et al., 1997, J. Mol. Biol., 273: 1032-1047; HRV-14, Matthews et al., 1994, Cell, 77: 761-771; and HRV-2, Matthews et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 11000-11007). 도 29에 진하게 표시된 시스테인은 친핵체인 반면, 진하게 표시된 첫 번째 히스티딘은 일반적 염기이며 글루타민 잔기에 대한 특이성은 진하게 표시된 두 번째 히스티딘에 의해 주로 정해진다; 3개 잔기 전부가 SVV 서열(도 29) 및 그 밖의 공지된 모든 피코나바이러스(도 28; 3C 서열 비교에 대해서는 1726∼1946번 사이를 참조)에서 보존되어 있다.
3D 폴리펩티드는 RNA 의존적 RNA 폴리머라제의 주요 성분이며, SVV는 피코나 유사 바이러스 RNA 의존적 RNA 폴리머라제에서 보존된 모티프, 즉 KDEL/IR, PSG, YGDD 및 FLKR을 포함한다(도 3; 도 28, 1948∼2410번 사이).
P1의 N-말단의 미리스토일화: 대부분의 피코나바이러스에서, P1 전구체 폴리 펩티드는 그 N-말단 글리신 잔기에 의해(존재할 경우 N-말단 메티오닌은 제거됨) 아미드 결합을 통해 미리스트산 분자에 공유 결합된다(Chow et al., 1987, Nature, 327: 482-486). 그 결과, P1 N-말단을 포함하는 절단 생성물 VPO 및 VP4 역시 미리스토일화된다. 이러한 미리스토일화는 글리신에서 시작하여 8개의 아미노산 신호를 인식하는 미리스토일 트랜스퍼라제에 의해 수행된다. 피코나바이러스에서는, 5개 잔기의 공통 서열 모티프 G-x-x-x-T/S가 확인되었다(Palmenberg, 1989, In Molecular Aspects of Picornavirus Infection and Detection, pp. 211-241, Ed. Semler & Ehrenfeld, Washington D.C., Amer. Soc. for Micro.). 파레코바이러스(인간 파레코바이러스 및 륜간 바이러스)에서는 VP0의 성숙 절단이 일어나지 않으며, 분명하게 미리스토일화되지 않지만, 이러한 바이러스에 대하여 VP0의 N-말단을 차단하는 몇 가지 유형의 분자가 존재하는 것으로 생각된다.
개개의 SVV 폴리펩티드와 공개 서열 데이터베이스의 비교
SVV 폴리펩티드 각각(서열 번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 및 22)을 유럽 생물정보학 연구소[European Bioinformatics Institute(EBI; http://www. ebi.ac.uk/)]의 FASTA 온라인 프로그램을 이용하여 공개 단백질 서열 데이터베이스와 비교하였다. 이러한 비교의 결과(최적 일치)를 표 3에 제시하였다. 2C, 3Cpro 및 3Dpol과 함께, 전체로서 간주된 폴리펩티드(VP2, VP3 및 VP1)는 카디오바이러스속의 구성원과 가장 밀접한 관계에 있었으나, 짧은 예상 2A 서열은 륜간 바이러스(파레코바이러스속)의 것과 더 가까웠다. 유사한 서열을 갖는 SVV 2A 뉴클레오티드 서열 의 보다 상세한 비교는 도 28에 도시하였다(2A 유사 NPG/P 단백질 비교에 대해서는 도 70 역시 참조).
[표 3]
세네카 밸리 바이러스의 개개의 예상 폴리펩티드의 데이터베이스 비교
Figure 112006029330715-PCT00002
SVV 2B와 우레아플라스마 우레아리티컴(Ureaplasma urealyticum) 다중 밴드 항원 또는 3A와 클로로븀 테피덤(Chlorobium tepidum) 에놀라제 2와의 일치(match)의 중요성은 분명하지 않다. 그러나, 이러한 관계는 더 연구해 볼 만한 가치가 있다.
SVV 폴리펩티드와 다른 피코바이러스의 계통발생학적 비교
카디오바이러스(VP2, VP3, VP1, 2C, 3C 및 3D)와 정렬할 수 있는 SVV 폴리펩티드를 각 피코나바이러스종의 대표 구성원의 동일한 단백질과 비교하였다(표 4). 프로그램 BioEdit v5.0.9(Hall, 1999, Nucl. Acids. Symp. Ser., 41: 95-98) 및 Clustal X v1.83(Thompson et al., 1997, Nucl. Acids Res., 25: 4876-4882)을 사용하여 이 정렬을 수행하고 Saitou 및 Nei의 알고리즘에 따라 거리 행렬 및 무루트 이웃 연결 트리(unrooted Neighbor-joining tree)를 구축하였다(Satiou and Nei, 1987, Mol. Biol. Evol., 4: 406-425). 분지도에 대한 신뢰 한계는 부트스트랩 리샘플링(1000 유사-복사체)에 의해 입수하였다. 트리는 TreeView 1.6.6(페이지, 1996)를 이용하여 작도한다(도 31∼37). 트리를 구축하는 데 이용된 거리 행렬은 다중 치환에 대해 보정된 값을 이용하였으며, 도 38∼44는 실제 아미노산 동일성 백분율을 보여준다. 도 4는 피코나바이러스과의 현재 분류법과 이러한 비교에 사용된 대표적인 바이러스 서열을 제시한다.
[표 4]
SVV와의 비교에 사용된 피코나바이러스의 분류학적 분류
속 종 대표 바이러스 약어 수탁 번호
엔테로바이러스 폴리오바이러스 폴리오바이러스 1 PV-1 V01149
인간 엔테로바이러스 A 콕사키바이러스 A16 CV-A16 U05876
인간 엔테로바이러스 B 콕사키바이러스 B5 CV-B5 X67706
인간 엔테로바이러스 C 콕사키바이러스 A21 CV-A21 D00538
인간 엔테로바이러스 D 엔테로바이러스 70 EV-70 D00820
원숭이 엔테로바이러스 A 원숭이 엔테로바이러스 A1 SEV-A AF201894
소 엔테로바이러스 소 엔테로바이러스 1 BEV-1 D00214
돼지 엔테로바이러스 B 돼지 엔테로바이러스 9 PEV-9 AF363453
새로운 속? 아직 지정되지 않음 원숭이 바이러스 2* SV2 AY064708
돼지 엔테로바이러스 A 돼지 엔테로바이러스 8* PEV-8 AF406813
리노바이러스 인간 리노바이러스 A 인간 리노바이러스 2 HRV-2 X02316
인간 리노바이러스 B 인간 리노바이러스 14 HRV-14 K02121
카디오바이러스 뇌심근염 바이러스 뇌심근염 바이러스 EMCV M81861
테일로바이러스 테일러 쥐 뇌척수염 바이러스 TMEV M20562
아프토바이러스 구제역 바이러스 구제역 바이러스 O FMDV-O X00871
말 리니티스 A 바이러스 말 리니티스 A 바이러스 ERAV X96870
헤파토바이러스 간염 A 바이러스 간염 A 바이러스 HAV M14707
조류 뇌척수염양 바이러스 조류 뇌척수염 바이러스 AEV AJ225173
파레코바이러스 인간 파레코바이러스 인간 파레코바이러스 1 HPeV-1 L02971
륜간 바이러스 륜간 바이러스 LV AF327920
코부바이러스 아이키 바이러스 아이키 바이러스 AiV AB040749
소 코부바이러스 소 코부바이러스 BKV AB084788
에르보바이러스 말 리니티스 B 바이러스 말 리니티스 B 바이러스 1 ERBV-1 X96871
테스코바이러스 돼지 테스코바이러스 돼지 테스코바이러스 1 PTV-1 AJ011380
* SV2 및 PEV-8의 현재의 분류학적 상태는 이들을 엔테로바이러스속에 위치시킨다. 하지만, 이들이 새로운 속으로 재분류될 수 있음이 제안된 바 있다(Krumbholz et al., 2002; Oberste et al., 2003).
개개의 캡시드 단백질의 트리(도 31∼33)는, 모든 트리 폴리펩티드로부터의 데이터를 조합할 때 생성된 트리의 모든 대표예는 아니다(도 34). 이것은 아마도, 특히 캡시드 폴리펩티드가 VP2의 경우에서와 같이 전체 길이가 아닌 경우, 캡시드 폴리펩티드를 정렬함에 있어서의 어려움에 의한 것일 수 있다(도 31). 그러나, P1, 2C, 3Cpro 및 3Dpol 트리는 모두 일치하며, 이것은 SVV가 EMCV 및 TMEV와 클러스터를 형성한다는 것을 보여준다.
카디오바이러스속의 구성원으로서의 세네카 밸리 바이러스
SVV의 3Dpol이 카디오바이러스와 관련이 있고, EMCV와 TMEV의 서로에 대한 관계만큼 가까운 관계에 있다는 것은 분명하다(도 37; 도 44). 피코나바이러스에서 상대적으로 보존되어 있다고 일반적으로 간주되는 다른 폴리펩티드 2C 및 3C에서도, SVV는 또한 카디오바이러스와 가장 밀접한 관계에 있으며, 다만 EMCV 및 TMEV가 서로에 대해 그러한 것만큼 EMCV 및 TMEV와 밀접한 관계에 있는 것은 아니다(각각 도 42 및 도 43). 외부 캡시드 단백질(전체적으로 보았을 때)에서는, SVV는 또한 카디오바이러스와 가장 밀접한 관계에 있으며, 2종의 아프토바이러스종, 즉 구제역 바이러스 및 말 리티티스 바이러스 A와 거의 동일한 관계를 갖는다(∼33%). SVV는 2B 및 3A 폴리펩티드에서 카디바이러스로부터 크게 분기하며 임의의 공지된 피코나바이러스와는 검출 가능한 관계를 갖지 않는다. 그러나, 이것은 전례가 없지 않은데; 조류 뇌척수염 바이러스는 간염 A 바이러스(HAV)와는 2A, 2B 및 3A에서 상당히 차이를 보이지만(Marvil et al., 1999, J. Gen. Virol., 80: 653-662), HAV와 함께 헤파토바이러스속 내에서 애매하게 분류된다.
EMCV 및 TMEV가 표준으로서 간주된다면, 세네카 밸리 바이러스는 전형적 카디오바이러스는 분명히 아니다. 심지어 이들 두 바이러스는 특히 5' UTR에서 그 차이를 보인다(Pevear et al., 1987, J. Gen. Virol., 61: 1507-1516). 그러나, 계통발생학적으로 SVV는 그 폴리펩티드(P1, 2C, 3Cpro 및 3Dpol 영역)에 상당 부분에서 EMCV 및 TMEV와 클러스터를 형성한다. 결국, 피코나바이러스 내에서의 SVV의 분류 학적 위치는 바이러스 분류학 국제 위원회(International Committee for the Taxonomy of Viruses; ICTV)의 행정 위원회(Executive Committee; EC)와 피코나바이러스 연구 그룹의 권장 및 지지하는 공개 자료에 의해 결정될 것이다. 여기에는 두 가지의 선택권이 있다: i) SVV를 카디오바이러스속의 새로운 종으로 포함시키는 것; 또는 ii) SVV를 새로운 속에 할당하는 것. 이 단계에서, 본 발명의 목적상 SVV를 카디와이러스속에 포함시킨다.
실시예 4
SVV 캡시드 단백질의 SDS-PAGE 및 N-말단 서열 분석
정제된 SVV로 NuPAGE 프리-캐스트 Bis-Tris 폴리아크릴아미드 미니-겔 전기영동 시스템(Novex, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)를 실시한다. 겔의 1/2을 은 염색으로 가시화하고, 나머지 1/2은 캡시드 단백질의 N-말단의 아미노산 서열 결정을 위한 샘플을 제조하는 데 사용한다. 단백질을 멤브레인에 이전하기 전에, 겔을 10 mM CAPS 완충액(pH 11)에 1 시간 동안 침지시키고, PVDF 멤브레인(Amersham)은 메탄올로 적신다. 단백질을 PVDF 멤브레인으로 이전한다. 이전 후, 아미도 블랙으로 약 1분간 염색하여 단백질을 가시화하고, 관심있는 밴드를 메스로 절개하여 공기 건조시킨다. 이 단백질로 펄스 상 서열 분석기를 사용하여 에드만 분해에 의해 자동화 N-말단 서열 결정을 실시한다.
정제된 SVV의 3개의 주요 구조 단백질이 도 45에 도시되어 있다(약 36 kDa, 31 kDa, 및 27 kDa).
실시예 5
인간 혈청 샘플 중의 SVV에 대한 중화 항체에 대한 분석
특정 바이러스 벡터에 대한 기존의 항체는 전이성 암의 치료와 같은 전신 송달 용도를 위한 그러한 벡터의 사용을 제한할 수 있는데, 그 이유는 기존의 항체는 전신에 송달된 벡터에 결합하여 벡터가 표적화 조직 또는 장기를 변환시킬 기회를 갖기도 전에 그들을 중화시킬 수 있기 때문이다. 그러므로, 인간이 전신 송달용으로 선택된 바이러스 벡터에 대한 중화 항체를 보유하지 않도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 인간 혈청 샘플이 SVV 특이적 중화 항체를 포함하고 있는지를 확인하기 위해, 무작위로 수집된 인간 혈청 샘플을 사용하여 중화 분석을 수행한다.
조직 배양물의 감염 용량 50: 실험 하루 전에, 1 x 104개의 세포를 포함하는 PER.C6 세포 현탁액 180 ㎕를 96웰 조직 배양 접시에 분주한다. SVV의 미정제 바이러스 용해물(CVL)을 DMEM 배지(둘베코 변형 이글 배지)에 10-0∼10-11의 log 단계로 희석하고 각 희석액 20 ㎕를 PER.C6 세포를 함유하는 팰콘 96웰 조직 배양 플레이트의 3개 웰로 이전한다. 이 플레이트를 5% CO2 중 37℃에서 항온처리하고 세포 변성 효과(CPE)의 현미경 검사를 위해 3일 동안 관찰하여, 조직 배양물 감염 농도 50(TCID50)을 계산한다.
중화 분석: 먼저, 배지 40 ㎕를 모든 웰에 첨가한 후에 열 불활성화된 혈청 40 ㎕를 첫 번째 웰에 첨가하여 피펫팅으로 혼합하여 스크리닝에 사용할 1:4 희석액을 제조한다. 그 후 40 ㎕를 그 옆쪽의 웰로 옮겨서 혈청 샘플을 2배 희석시킨 다. 100 TCID50을 함유하는 SVV 40 ㎕를 희석된 혈청 샘플을 함유하는 웰에 첨가한다. 플레이트는 37℃에서 1 시간 동안 항온처리한다. 혼합액 40 ㎕를 취하여 PER.C6 세포를 함유하는 플레이트(1 x 104 세포/160 ㎕/웰)로 이전한다. 이 플레이트를 37℃에서 3일 동안 항온처리한다. 이 후, 배양물의 CPE 여부를 현미경으로 관찰한다.
전술한 바와 같이 수행된 대표적인 중화 분석에서는, 미국, 유럽 및 일본으로부터 무작위로 수집한 22개의 인간 혈청 샘플을 SVV 특이적 중화 항체에 대해 조사하였다. 이 혈청 샘플을 연속 희석시켜서 100 TCID50을 함유하는 일정량의 SVV와 혼합한다. 그 후 혈청-바이러스 혼합물을 PER.C6 세포를 감염시키는 데 사용하였으며, 24 시간 동안 항온처리하였다. 중화 항체 역가는 CPE 형성을 차단할 수 있는 혈청의 최고 희석률의 역수로서 결정하였다. 이 실험에서는, 어떠한 혈청 희석액도 CPE 형성을 차단하지 않았는데, 이는 인간 혈청 샘플이 SVV 중화 항체를 포함하고 있지 않았음을 나타낸다.
PER.C6의 추가적인 SVV 감염은 인간 혈액과의 항온처리에 의해 억제되지 않았으며(실시예 6 참조), 이는 SVV 감염이 보체 또는 적혈구 응집에 의해 억제되지 않았음을 나타낸다. 그 결과, SVV는 다른 암용해성 바이러스보다 더 긴 생체내 순환 시간을 나타내는데, 이것은 암용해성 아데노바이러스의 사용과 관련된 중요한 문제이다.
실시예 6
인간 적혈구에 대한 SVV의 결합 및 적혈구 응집
다양한 바이러스 혈청형이 다양한 동물종의 혈액으로부터 분리된 적혈구의 시험관내 적혈구 응집을 유발하는 것으로 확인되었다. 적혈구 응집 또는 적혈구에의 결합은 생체내에서 독성을 유발할 수 있으며 생체내 체내분포 및 바이러스 벡터의 효능에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 전이성 암 치료를 위해 전신 투여를 목적으로 선택된 바이러스 벡터의 적혈구 응집반응 특성을 분석하는 것이 바람직하다.
적혈구 응집 분석: SVV가 인간 적혈구의 응집을 유발하는지를 확인하기 위해, U자형 96웰 플레이트에서 적혈구 응집반응 분석을 수행한다. 정제된 SVV를 25 ㎕의 PBS(인산염 완충 염수)에 2벌로 연속 희석하고 동부피의 1% 적혈구 현탁액을 각 웰에 첨가한다. 적혈구의 분리에 사용되는 혈액 샘플은 항응고제로서 헤파린을 사용하여 건강한 개체로부터 입수한다. 적혈구는 차가운 PBS에 혈액을 3회 세척하여 혈장 및 백혈구를 제거하여 준비한다. 마지막 세척 후에, 적혈구는 PBS에 현탁시켜 1%(V/V)의 세포 현탁액을 제조한다. 바이러스 및 적혈구를 살짝 혼합하고, 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 항온처리하여 적혈구 응집반응 패턴을 모니터한다.
전혈 불활성화 분석: 혈액 성분에 의한 SVV의 직접 불활성화를 배제하기 위해, 바이러스의 분액을, A, B, AB, O형에 속하는 헤파린 처리된 인간 혈액 또는 PBS와 함께 실온에서 30분 또는 1 시간 동안 항온처리한 뒤에, 혈장을 분리하고, 그 후 PER.C6 세포를 감염시키고 역가를 계산한다.
전술한 바와 같이 수행된 대표적인 분석에서는, 테스트한 어떤 SVV 희석률에서도 상이한 혈액형(A, B, AB 및 O)의 인간 적혈구의 적혈구 응집반응이 관찰되지 않았다. SVV를 인간 혈액 샘플과 혼합하고 30분 및 1 시간 동안 항온처리하였을 때 바이러스 역가에 약간의 증가가 관찰되었는데, 이는 바이러스가 혈액 성분에 의해 불활성화되는 것이 아니라 테스트한 조건 하에서 감염성이 더 커진다는 것을 나타낸다.
실시예 7
생체내 소거
혈액 순환 시간: 혈액 순환 시간 및 종양 내 바이러스의 양을 측정하기 위해, 1 x 1012 vp/kg 용량의 SVV를 꼬리 정맥에 주사하여 H446 종양을 보유하는 누드 마우스를 처리하였다. 주사한 지 0, 1, 3, 6, 24, 48, 72 시간 및 7일(189 시간) 후에 마우스의 혈액을 채혈하고 채혈 직후 혈액으로부터 혈장을 분리하여 감염 배지에 희석시켜 PER.C6 세포를 감염시키는 데 사용하였다. 주사된 마우스는 주사한 지 6, 24, 48, 72 시간 후와 7일 후에 희생시키고, 종양을 적출하였다. 종양은 작은 절편으로 절개하여 1 ml의 배지에 현탁시키고 3 사이클의 동결-해동을 실시하여, 감염된 세포로부터 바이러스를 방출시켰다. 상청액의 연속 log 희석을 실시하여 PER.C6 세포에 대하여 역가를 분석하였다. SVV 역가는 pfu/ml로서 표현하였다. 또한 종양 내 바이러스 캡시드 단백질을 검출하기 위해, 종양 절편을 H&E 염색으로 염색하고 조직화학적 분석을 실시하였다.
혈액 중의 바이러스 입자의 순환 농도는 마우스 체중의 7.3%가 혈액이라고 가정하여 측정한다. 사실상 전술한 바와 동일하게 수행된 대표적인 분석에서, 바이 러스를 투여한 지 6 시간 이내에, SVV의 순환 농도는 0개 입자로 감소하였고, SVV는 더 나중 시점에서는 검출할 수 없었다(도 46A). 이 종양 내에서 SVV는 주사한지 6 시간 후에 검출할 수 있었으며, 그 후 바이러스의 양은 2 log 단위로 꾸준히 증가하였다(도 46B). 주사한 지 7일 후에는 종양 내에서 바이러스를 검출할 수 있었다. 종양 절편으로 면역조직화학적 분석을 실시하였을 때 종양 세포 내에 SVV 단백질이 확인되었다(도 47, 윗쪽 패널). H&E에 의해 염색하였을 때, 종양 절편은 몇 개의 둥근형의 종양 세포를 나타내었다(도 47, 아랫쪽 패널).
SVV는 또한 유사량 용량의 i.v. 아데노바이러스와 비교하여 훨씬 더 긴 혈중 체류 시간을 나타낸다. 1회의 i.v. 투여 후, SVV는 최대 6 시간 동안 혈액 중에 잔류하는 반면(도 46C; 도 46C는 도 46D와의 비교를 목적으로 도 46A를 복사한 것이다), 아데노바이러스는 약 1 시간 이내에 혈액으로부터 소거된다.
실시예 8
종양 세포 선택성
SVV의 시험관내 세포 사멸 활성: 인간, 소, 돼지 및 마우스 세포의 감수성을 측정하기 위해, SVV에 감염된 다양한 공급원으로부터 정상 및 종양 세포를 입수하였다. 모든 세포 유형은 공급업자가 권장하는 배지와 조건 하에서 배양하였다. 1차 인간 간세포는 In Vitro Technologies(매릴랜드주 발티모어)로부터 구입하여, 간세포 배양 배지(Hepatocye Culture Media)(HCMTM, BioWhittaker/Clonetics Inc., 캘리포니아주 샌 디에고)에서 배양할 수 있다.
시험관내 세포 변성 분석: 어느 유형의 세포가 SVV 감염에 감수성이 있는지를 확인하기 위해, 증식중인 정상 세포 및 종양 세포의 단층을 정제된 SVV의 연속 희석액으로 감염시켰다. 세포는 CPE에 대해 모니터하여 비감염 세포와 비교하였다. 감염시킨 지 3일 후, MTS 세포독성 분석을 수행하고, 세포당 입자의 수로서 치사량-50%(LD50) 값을 계산한다. 하기 표 5 및 6 참조.
[표 5]
EC50 값이 100 미만인 세포주
EC 50 < 1인 세포주 EC 50 값
H446(인간 sclc) 0.001197
PERC6 0.01996
H69AR(sclc-다제 내성) 0.03477
293(ad5E1로 형질전환시킨 인간 신장) 0.03615
Y79(인간 망막아세포종) 0.0003505
IMR32(인간 뇌; 신경아세포종) 0.03509
D283med(인간 뇌; 소뇌; 수아세포종) 0.2503
SK-N-AS(인간 뇌; 신경아세포종) 0.474
N1E-115(마우스 신경아세포종) 0.002846
SK-NEP-1(신장, 윌름 종양, 흉막 삼출, 인간 0.03434
BEKPCB3E1(ad5E1로 형질전환시킨 소 태아 신장 세포 0.99
EC 50 < 10(1-10)인 세포주 EC 50 값
H1299(인간-비 sclc) 7.656
ST(돼지 고환) 5.929
DMS 153(인간 sclc) 9.233
EC 50 < 100(10-100)인 세포주 EC 50 값
BEK(소 배아 신장) 17.55
[표 6]
EC50 값이 1000보다 큰 세포주
M059K (인간 뇌; 악성 신경교아세포종) HUVEC (인간 정맥 내피 세포) CMT-64(마우스-sclc)
KK(인간 신경교아세포종) HAEC (인간 대동맥 내피 세포) LLC-1(마우스-LCLC)
U-118MG(인간 신경교아세포종) WI38(인간 폐 섬유아세포) RM-1(마우스-전립선)
DMS 79(인간 sclc) MRC-5(인간 폐 섬유아세포) RM-2(마우스-전립선)
H69(인간 sclc) IMR90(인간 폐 섬유아세포) RM-9(마우스-전립선)
DMS 114(인간 sclc) HMVEC(인간 미세혈관 내피 세포 - 성인) MLTC-1(마우스-고환)
DMS 53(인간 sclc) HMVEC(인간 미세혈관 내피 세포 - 신생아) KLN-205(마우스-sqcc)
H460(인간-LCLC) HCN-1A(인간 뇌) CMT-93(마우스-직장)
A375-S2(인간 흑색종) HRCE (인간 신장 피질 외피 세포) B16F0(마우스 흑색종)
SK-MEL-28(인간 흑색종) Neuro-2A (마우스 신경아세포종)
PC3(인간 전립선) C8D30(마우스 뇌)
PC3M2AC6(인간 전립선) PK15(돼지-신장)
LNCaP(인간 전립선) FBRC(태아 소 망막)
DU145(인간 전립선) MDBK(소 신장)
Hep3B(인간 간 암종) CSL 503 (ad5E1로 형질전환시킨 양 폐세포)
Hep2G(인간 간 암종) OFRC(양 태아 망막 세포)
SW620(인간 결장)
SW839(인간 신장)
5637(인간 방광)
HeLa S3
S8
MTS 분석은 제조업자의 설명서에 따라 수행하였다(CellTiter96(등록상표) AQueous 분석, Promega 공급, 위스콘신주 메디슨). CellTiter96(등록상표) AQueous 분석은 바람직하게는 테트라졸륨 화합물 (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨, 내부 염; MTS) 및 전자 커플링제, 페나진 메토설페이트(PMS)를 사용한다. 이 연구에서 평가된, 접촉이 억제된 정상 인간 세포는 HUVEC(인간 배꼽 정맥 내피 세포), HAEC(인간 대동맥 내피 세포, Clonetics/BioWhittaker # CC-2535), Wi38(정상 인간 태아 폐 섬유아세포, ATCC # CCL-75), IMR90(인간 정상 폐 섬유아세포, ATCC CCL-186), MRC-5(인간 정상 폐 섬유아세포, ATCC, # CCL-171) 및 HRCE(인간 신장 피질 외피 세포, Clonetics/BioWhittaker # CC-2554)를 포함한다.
SVV는 상기 접촉 억제 정상 세포 중 어느 것에서도 CPE를 유발하지 않는다. 하기의 인간 종양 세포주, 즉, Hep3B(ATCC # HB-8064), HepG2(인간 간세포 암종, ATCC # HB-8065), LNCaP(인간 전립선 암종, ATCC # CRL-10995), PC3M-2AC6, SW620(인간 결장직장 선암, ATCC # CCL-227), SW 839(인간 신장 선암, ATCC # HTB-49), 5637(인간 방광 암종, ATCC # HTB-9), DMS-114(소세포 폐암, ATCC # CRL-2066), DMS 153(인간 소세포 폐암, ATCC # CRL-2064), A549(인간 폐 암종, ATCC # CCL-185), HeLa S3(인간 자궁경부 선암, ATCC # CCL-2.2), NCI-H460(인간 대세포 폐암, ATCC # HTB-177), KK(신경교아세포종), 및 U-118 MG(인간 신경교아세포종, ATCC # HTB-15)에서는 바이러스에 의해 유도된 CPE가 전혀 관찰되지 않았다. 표 6에서 EC50 값이 1000보다 큰 세포주는 SVV 복제 및/또는 비리온 생성을 가장 허용하지 않는다는 점에 주목해야 한다. 다만, SVV가 이들 세포에 결합하여 세포 내로 진입할 수 있지만 SVV 복제가 세포 내부에서는 일어날 수 없기 때문에 CPE가 관찰되지 않거나 또는 복제가 발생하여도 몇 가지 다른 진입후 차단 현상(즉, 복제된 SVV 게놈이 비리온으로 패키징되지 않음)으로 인하여 CPE가 관찰되지 않을 가능성은 남아있다. 그러나, 이들 세포주에서의 CPE의 부재를 고려하면, 이들 세포주와, 가능 하게는 이들의 종양 유형은 어느 세포 및 종양 유형이 SVV 복제에 대하여 허용성인지 비허용성인지를 테스트하기 위한 좋은 후보가 된다. 야생형 SVV는 종양 특이적이며 소세포 폐암 및 신경아세포종을 비롯하여 신경내분비 종양을 표적으로 하는 것으로 확인되었지만, SVV가 신경내분비 종양의 형태에서는 허용되지 않도록 하는 병인의 유형을 갖는 개별 환자가 있을 수 있다. 그러므로, 본 발명은 종양이 야생형 SVV에 대해 비허용성인 개별 환자로부터 분리된 종양 세포형을 사멸시킬 수 있는 SVV 유도체를 생성하는 것을 고려하는데, 상기 개별 환자로부터 분리된 종양 유형은, 예를 들어 신경교아세포종, 림프종, 소세포 폐암. 대세포 폐암, 흑색종, 전립선암, 간암종, 결장암, 신장암, 결장암, 방광암, 직장암 및 편평상피세포 폐암을 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다.
1차 인간 간세포(In Vitro Technologies)에 대한 SVV 매개 세포독성은 LDH 방출 분석(CytoTox(등록상표) 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay, Promega, # G1780)에 의해 측정하였다. 콜라겐 코팅된 12웰 플레이트에 분주한 1차 인간 간세포를 세포당 1, 10, 100 및 1000개 입자(ppc)의 SVV로 감염시켰다. 감염 3 시간 후, 감염 배지를 2 ml의 배양 배지로 교환하고 CO2 배양기에서 3일 동안 배양하였다. 세포 회합형 락테이트 데히드로게나제(LDH) 및 배양 상청액 중의 LDH는 독립적으로 측정하였다. 세포독성 백분율은 최대 세포내 LDH + 상청액 LDH에 대한 상청액 중의 LDH 단위의 비로서 결정한다.
Figure 112006029330715-PCT00003
도 48에 도시된 데이터는 테스트된 다수의 모든 감염에서 SVV 매개 간독성이 없음을 보여준다.
실시예 10
바이러스 생성 분석
SVV의 복제능을 평가하기 위해, 접촉이 억제된 소정의 종양 세포 몇 종과 활발하게 분열중인 종양 세포를 1 바이러스 입자/세포(ppc)의 SVV로 감염시켰다. 72 시간 후, 세포 및 배지로 3 사이클의 동결-해동을 실시하고 원심분리를 수행하여 상청액을 수집하였다. 상청액의 연속 log 희석을 실시하고, PER.C6 세포에 대하여 역가를 분석하였다. 각 세포주에 대하여, SVV 복제의 효율은 pfu/ml로서 표현하였다(도 49).
실시예 10
독성
최대 허용량(Maximum Tolerated Dose; MTD)은 동물(예, 마우스)이 SVV 처리 후 용량 제한 독성(Dose Limiting Toxicity; DLT)을 나타내는 용량 직전의 용량으로서 정의된다. DLT는 동물이 전체 연구 기간 동안 SVV 투여에 기인한 체중, 증상 및 사망률의 감소를 나타내는 용량으로서 정의된다. SVV에 대한 중화 항체는 기준일, 15일 및 21일째 측정하였다. 중화 분석은 앞서 기재한 바와 같이 수행하였다.
할란 스프래그 돌리(Harlan Sprague Dawley; 인디애나폴리스, 미국 인디애나주)로부터 구입한, 면역 결핍 누드 마우스와 제왕절개 출산-1(caesarean derived-1; CD-1) 이종 교배 면역 적격성 마우스 둘 다에, 용량 수준당 10 마리의 마우스를 사용하여, SVV의 용량을 단계적으로 증가시키면서(1 x 108∼1 x 1014 vp/kg) 정맥 투여하여 MTD를 측정하였다. 이 바이러스는 테스트한 모든 용량 수준에서 충분히 허용 가능한 것이었으며, 어떠한 임상적 증상도 나타내지 않았고 체중 손실도 나타내지 않았다(도 50). 마우스는 15일 및 21일째 채혈하고, 중화 분석으로 SVV 특이적 중화 항체의 존재에 대하여 그 혈청을 모니터하였다. SVV를 주사한 CD1 마우스는 중화 항체를 생성하였으며, 그 역가는 1/1024∼1/4096이다.
면역적격성 마우스 계통(A/J)에 대하여 또 다른 독성 연구를 수행하였다. SVV는 N1E-115 세포에서 세포 사멸 활성과 복제능을 나타내는 것으로 입증되었다(표 1 참조). 쥐 세포주 N1E-115(신경아세포종 세포주, 즉 신경내분비 암)는 A/J 마우스 계통으로부터 유래된 것이다. 따라서, N1E-115 세포가 A/J 마우스의 피하에 이식되어 종양을 형성하는 동계 마우스 모델을 확립하고, 그 후 이 마우스를 SVV로 처리하여 그 효능 및 독성을 조사하였다.
A/J 연구에서는, 마우스에 SVV를 정맥 주사하여 A/J 마우스가 SVV의 전신 투여에 내성을 보일 수 있는지를 확인하였다. 독성의 징후를 관찰하기 위해 혈액학적 분석 결과를 입수하고 혈청 화학 분석 결과 역시 입수할 수 있다. 연구 계획은 하기 표 7에 제시하였다.
[표 7]
A/J 연구 계획
그룹 # 동물(암컷) 테스트 물질 용량 수준 (입자/kg) 용량 부피(mL/kg) 투여 방법 부검일
1 5 부형제 0 10 1일째 IV 15일째
2 5 SVV 108 10 1일째 IV 15일째
3 5 SVV 1011 10 1일째 IV 15일째
4 5 SVV 1014 10 1일째 IV 15일째
A/J 마우스는 잭슨 레보러토리즈(Jackson Laboratory; 메인주 바 하버)로부터 입수한 8∼10 주령의 암컷이었다. SVV는 분리된 비리온을 사용시까지 -80℃에 저장함으로써 준비하였다. SVV는 얼음 위에서 해동시키고 HBSS(행크 평형 염 용액)으로 희석시켜 새로 제조하였다. SVV를 그룹 2의 경우 107 입자/mL, 그룹 3의 경우 1010 입자/mL, 그룹 4의 경우 1013 입자/mL의 농도로 희석시켰다. HBSS는 그룹 1을 위한 부형제 대조군으로서 사용하였다. 모든 투여용 용액은 투여시까지 얼음 위에서 습윤 상태로 유지하였다.
SVV는 체중 1 kg당 10 mL의 용량 부피로 꼬리 정맥을 통해 동물에게 정맥 주사하여 투여하였다. 투여일에 동물의 체중을 재고, 투여량 부피를 체중을 기준으로 조정하였다(즉, 0.0200 kg의 마우스에게 투여용 용액 0.200 mL를 투여함). 마우스의 유병률 및 사망률을 1일 2회 모니터하였다. 마우스의 체중은 주 2회 측정한다. 빈사 상태의 동물 및 임의의 비정상적 증상(물리적 또는 거동상)을 보이는 동물에 관한 정보는 즉시 기록한다.
사후 관찰 및 측정은 표준 혈액학적 분석 및 혈청 화학분석(AST, ALT, BUN, CK, LDH)을 위해 마지막 희생 시의 모든 생존 동물로부터 혈액을 채혈하는 것을 수 반한다. 희생 시 하기의 장기들을 적출하였다: 뇌, 심장, 폐, 신장, 간 및 생식선. 각 장기 샘플의 절반은 드라이아이스로 바로 동결시키고, 나머지 절반은 포르말린에 담근다.
초기 혈액학적 분석 결과(CBC, 차등적)는 SVV를 주사한 지 2주 후에 얻었고, 그 결과는 하기 표 8에 요약하였다. 각 테스트 그룹으로부터 5 마리의 마우스를 테스트하였다(표 7 참조).
[표 8]
A/J 독성 결과 - 혈액학적 분석
Figure 112006029330715-PCT00004
Figure 112006029330715-PCT00005
이러한 결과들은 미처리 마우스로부터 얻은 혈액학적 분석 프로필과 비교하여 저용량, 중간 용량 및 고용량의 SVV로 처리한 마우스로부터 얻은 혈액학적 분석 프로필에 비정상성이 없음을 보여준다. 이러한 연구로부터, SVV의 전신 투여 후에 측정 가능한 어떠한 독성의 징후도 없다는 결론을 내릴 수 있으며, 이는 i.v. 주사 후에 A/J 마우스가 SVV에 대해 내성을 보인다는 것을 나타낸다.
실시예 11
효능
할란 스프래그 돌리(인디애나주 인디애나폴리스)로부터 구입한 6∼7 주령의 무흉선 암컷 누드 마우스(nu/nu)를 효능 조사에 사용하였다. 수동식 감금장치를 사용하여 마우스의 오른쪽 옆구리에 5 x 106 H446 세포를 피하 주사하였다. 종양 크기를 정기적으로 측정하고, 식 π/6 x W x L2 (식 중, L은 종양의 길이, W는 종양의 폭을 나타냄)를 이용하여 그 용적을 계산하였다. 종양의 크기가 약 100∼150 mm3에 달하였을 때, 마우스(n=10)를 무작위로 그룹별로 나누었다. 그 후 마우스에게 용량을 단계적으로 증가시키면서 10 ml/kg 용량 부피의 SVV를 꼬리 정맥에 주사하였다. 대조군 그룹의 마우스에는 동부피의 HBSS를 주사하였다. 용량은 체중 1 kg당 1 x 107에서 1 x 1013 입자로 단계적으로 증가시킨다. 항종양 효능은 SVV 투여 후 주 2회 종양 용적을 측정함으로써 확인하였다. 완전한 반응은 이종이식편의 완전한 소멸로서 정의하였고, 부분적 반응은 종양 용적이 50% 또는 그 이상만큼 퇴화하는 것으로 정의하였으며, 무반응은 대조군 그룹에서와 동일한 종양의 연속 성장으로서 정의하였다.
HBSS로 처리된 마우스로부터의 종양은 급속하게 성장하여 조사 20일째 2000 mm3보다 커졌다(도 51; ◇ 선 참조). 이와는 대조적으로, SVV를 1회 전신 주사한 마우스는 테스트한 모든 용량에서(최저 용량은 제외), 조사 2일째 종양이 사라졌다. 최저 용량 그룹에서는 조사 31일 경에 8 마리의 마우스에서 종양이 사라졌으며, 1 마리의 마우스는 매우 큰 종양을 가지고 있었고, 나머지는 촉진(觸診)할 수 있는 종양(25 mm3)을 보유하였다. 대형 종양에 대한 SVV의 항종양 활성을 평가하기 위해, > 2000 mm3의 종양을 보유하는 HBSS 그룹으로부터의 5 마리의 마우스에 조사 20일째 1 x 1011 vp/kg의 용량을 1회 전신 주사하였다. 추적 기간 동안(SVV를 주사한 지 11일째), 종양 용적의 급격한 퇴화가 관찰되었다(도 51).
도 52는 SVV로 "처리하지 않았거나"(즉, HBSS로 처리함) 또는 SVV로 "처리한" 마우스의 사진을 보여준다. 사진으로부터 확인할 수 있듯이, 미처리 마우스는 매우 큰 종양을 보유하고 있고, 처리된 마우스는 어떠한 가시적 종양 징후도 보이 지 않았다. 또한, SVV로 처리한 비희생 마우스의 경우, 200일의 조사 기간 동안 종양 재성장이 전혀 관찰되지 않았다.
특정 종양 세포주에 관한 SVV에 대한 시험관내 효능 데이터는 표 1 및 5에 기재되어 있다. 이 데이터는 SVV가 특정 종양 세포 유형을 특이적으로 감염시키고 정상 성체 세포는 감염시키지 않는다는 것을 보여주는데, 이는 다른 어떠한 공지의 암용해성 바이러스에 비해서도 두드러진 장점이다. SVV는 화학요법적 치료보다 세포 사멸 특이성이 1,000배 더 우수한 것으로 확인되었다(SVV에 대한 세포 사멸 특이성 값은 10,000보다 큰 것으로 확인된 반면, 화학요법에 대한 세포 사멸 특이성 값은 약 10이다).
SVV의 특이적 세포독성 활성은 H446 인간 SCLC 세포에서 입증되었다. SVV의 농도를 증가시키면서 2일간 항온처리한 후, 세포 생존율을 측정하였다. 결과는 도 53에 도시되어 있다. 도 53은 SVV와 H446 SCLC 종양 세포(윗쪽 그래프) 또는 정상 인간 H460 세포(아랫쪽 그래프)를 항온처리한 후의 세포 생존율을 보여준다. SVV는 약 10-3 입자/세포의 EC50으로 종양 세포를 특이적으로 사멸시켰다. 이와는 대조적으로, 정상 인간 세포는 어떤 농도의 SVV에서도 사멸되지 않았다. 또한, 표 1∼3에 요약된 바와 같이, SVV는 SCLC 다제 내성 종양 세포를 비롯하여 다수의 다른 종양 세포주에 대해서도 세포독성을 나타내었다. 다른 종양 세포주에 대한 SVV 세포독성에 대한 EC50 값은 세포당 10-3∼20,000 입자였다. SVV는 다양한 다른 비신경계 종양 및 정상 인간 조직에 대해서는 세포독성을 나타내지 않았다. 또한, SVV는 LDH 방출이 세포당 최대 1000개 입자로 측정되는 바와 같이, 1차 인간 간세포에 대해서는 독성을 나타내지 않았다(도 48 참조).
실시예 12
설치류에서의 생체내 분포 및 약동학적 연구
SVV의 약동학적 및 생체내 분포 연구는 정상 마우스와 H446 SCLC 종양을 보유하는 면역결함 무흉선 누드 마우스에서 수행한다. 이 연구는 정상 마우스와 면역결함 종양 보유 마우스 둘 다에 SVV를 1회 정맥 투여한 후의 SVV의 생체내 분포, 제거 및 지속성을 평가한다. 각 마우스 그룹에 단일 용량의 대조군 완충액을 정맥 주사하거나 3 가지 용량 중 하나(108, 1010, 또는 1012 vp/kg)의 SVV를 정맥 주사하고, 임상적 징후를 모니터한다. 투여 후 1 시간, 6 시간, 24 시간 및 48 시간째와 1주, 2주, 4주 및 12주째 5 마리의 마우스 그룹으로부터 혈액 샘플을 채혈한다. 용량 수준은 바이러스 제거의 선형성을 결정하기 위해 알고 있는 낮은 유효 용량과 더 높은 두 가지 용량 수준을 포함한다. 마우스 그룹은 투여 후 24 시간과 2주, 4주 및 12주째 희생시킨다. 간, 심장, 폐, 비장, 신장, 림프절, 골수, 뇌 및 척추 조직을 비롯하여 선택된 조직을 무균 상태로 적출하고 검증된 RT-PCR 분석을 이용하여 SVV RNA의 존재에 대해 테스트한다.
투여 후 24 시간 및 2주, 4주 및 12주째 마우스를 희생시켜 뇨 및 변 샘플을 채취하고 감염성 바이러스의 존재를 조사한다. 이 실시예에서의 실험 계획은 하기 표 9에 기재되어 있다.
[표 9]
CD-1 마우스 및 SCLC 종양을 보유하는 무흉선 누드 마우스 체내의 SVV의 분포
그룹 처리 용량 수준 (vp/kg) 경로 마우스 #/ 혈액 샘플링 시점 마우스 #/ PCR 조직 분포를 위한 시점
정상 CD-1 마우스
1 염수 0 i.v. 5 5
2 SVV 108 i.v. 5 5
3 SVV 1010 i.v. 5 5
4 SVV 1012 i.v. 5 5
무흉선 종양 보유 마우스
5 염수 0 i.v. 5 5
6 SVV 108 i.v. 5 5
7 SVV 1010 i.v. 5 5
8 SVV 1012 i.v. 5 5
정상 마우스와 H446 SCLC 종양을 보유하는 면역결함 무흉선 누드 마우스 둘 다에서 급성 i.v. 독성학 조사를 역시 수행하였다. 정상 마우스 및 SCLC 종양 보유 마우스에 대한 예비 i.v. 조사는 1014 vp/kg 이하의 용량에서 SVV가 안전성이 있음을 나타낸다. 어떠한 유해 임상적 징후도 관찰되지 않았으며, 1014 vp/kg의 1회 i.v. 투여 후 2주까지 체중 손실이 없었다.
실시예 13
정상 성체 마우스 및 임신한 마우스에서의 바이러스 전파 조사
이 실시예의 목적은 고농도의 SVV를 주사한 마우스와 비감염 정상 마우스의 공동서식 후에 SVV가 전파 가능한지를 확인하기 위한 것이다. SVV는 종양을 보유하지 않은 정상 마우스에서는 복제하지 못하기 때문에, 종양 보유 마우스에 고농도의 SVV를 주사한 후에 건강한 정상 마우스에 노출시켜 임상적 시나리오를 더 잘 모의하도록 할 수도 있다. 두 번째 목적은 감염된 암컷으로부터의 SVV가 임신중인 비감염 DAM으로 전파되어 후에 발생중인 태아에게 전파될 가능성을 평가하기 위한 것이다.
5 마리의 미처리 수컷 및 암컷 CD-1 마우스로 구성된 3개 그룹을 108, 1010 또는 1012 vp/kg으로 감염시킨 동일 성별의 1 마리 마우스에 노출시키고, 혈액 샘플링에 의해 SVV의 존재를 모니터한다.
유사하게, SVV에 노출된 암컷을 다수의 임신중인 암컷과 섞고, 바이러스가 감염된 암컷으로부터 비감염 임신 암컷으로 전파되어 후에 발생중인 태아에게 전파되는 능력을 측정한다.
실시예 14
비-인간 영장류 연구
SVV의 안전성, 독성 및 독성동태는 비-인간 영장류에서도 측정한다. 용량 범위 탐색 단계에, 개개의 원숭이에게 108 vp/kg의 SVV를 1회 i.v. 투여하고, 감염 또는 독성의 임상적 징후를 세밀히 모니터한다. 이 용량에 대해 내성을 보인다면, 추가의 동물들에게 1012 vp/kg의 용량이 될 때까지 더 많은 용량으로 i.v. 투여한다. 그 후, 주요 연구는 3 마리의 수컷 및 암컷 원숭이 그룹으로 구성되며, 각 원숭이에게 부형제 단독 또는 3 가지 용량의 SVV 중 하나로 6주 동안 매주 1회 투여하고, 독성의 징후를 모니터한다. 성별마다 두 마리씩 더해, 6주 동안 부형제만을 투여하거나 고용량의 SVV를 투여하고, 희생시키기 전에 4주간의 회복 기간을 더 준다.
1주와 6주 동안의 투여 후 혈액 샘플을 얻는다. 초기 투여 및 희생 전에 임상학적 병리학 분석 및 혈액학적 분석을 위해 혈액 샘플을 준비한다. 매 투여 후에, SVV에 대한 중화 항체의 존재를 평가하기 위해 추가의 혈액 샘플을 준비한다.
생존한 원숭이를 마취시켜 full gross 부검을 실시하고 주 연구 및 회복 원숭이로부터 전체 조직 리스트를 수집한다. 대조군 및 고용량 그룹으로부터 적출한 조직은 조직병리학적 분석으로 평가한다. 투여한 지 1주 및 6주째 뇨 및 변 샘플을 채집하고 감염성 SVV의 존재를 평가한다. 이 실시예의 전반적 계획은 하기 표 1에 기재되어 있다.
[표 10]
영장류에서의 SVV의 다회 투여 독성학 연구
Figure 112006029330715-PCT00006
실시예 15
전체 길이 및 기능성 게놈 SVV 플라스미드의 구성
현재, SVV의 5' 게놈 서열의 단지 약 1.5∼2 Kb만 서열 결정하면 되며, 이는 5' UTR, 1A(VP4) 및 1B의 일부(VP2)를 커버하는 뉴클레오티드 영역을 나타낸다. 추가의 SVV cDNA는 ATCC 기탁 번호 PTA-5343의 분리된 SVV로부터 준비한다. SVV 입자를 PER.C6과 같은 허용성 세포주로 감염시키고 바이러스를 분리한다. 그 후 바이러스 RNA를 바이러스 입자로부터 회수하여 그로부터 cDNA 카피를 제조한다. 개개의 cDNA 클론의 서열을 결정하여, 선택된 cDNA 클론을 SVV 서열의 5' 말단의 상류에 T7 프로모터를 갖는 플라스미드에서 하나의 전체 길이 클론으로 결합시킨다. 이 플라스미드로부터의 전체 길이 SVV를, T7 폴리머라제 및 시험관내 전사 시스템을 이용하여 역전사하여, 전체 길이 RNA를 생성한다(도 55 참조). 그 후 전체 길이 RNA 를 허용성 세포주에 형질감염시켜 전체 길이 클론의 감염성을 테스트한다(도 55 참조).
방법은 다음과 같다: RNA 분리: SVV 게놈 RNA는 Trizol(Invitrogen)을 사용하는 구아니듐 티오시아네이트 및 페놀 추출법을 이용하여 추출한다. 요약하면, 정제된 SVV 250 ㎕을 3배 부피의 Trizol 및 240 ㎕의 클로로포름과 혼합한다. RNA를 함유하는 수성상은 600 ㎕의 이소프로판올로 침전시킨다. RNA 펠릿은 70% 에탄올로 2회 세척하고, 건조시키고, DEPE-처리수에 용해시킨다. 추출된 RNA의 양은 260 nm에서의 흡광도 측정에 의해 추정한다. RNA 분액은 1.25% 변성 아가로스 겔을 통해 분해하고(Cambrex Bio Sciences Rockland Inc., 미국 메인주 로클랜드), 에티듐 브로마이드에 의해 밴드를 가시화하여 사진을 찍는다.
cDNA 합성: SVV 게놈의 cDNA는 RT-PCR에 의해 합성한다. cDNA의 합성은 1 ㎍의 RNA, AMV 역전사효소 및 무작위 14량체 올리고뉴클레오티드 또는 올리고-dT를 사용하여 표준 조건 하에 수행한다. cDNA의 단편을 증폭시키고, 플라스미드로 클로닝하고, 그 클론의 서열을 결정한다. 게놈의 5' 최말단의 서열을 결정하기 위해 더 광범위한 수단이 필요할 수 있다.
전체 길이 게놈의 클로닝: 일단 서열이 알려지면, 통상적인 분자 생물학 기법에 의해 T7 폴리머라제 프로모터의 하류에 SVV의 전체 길이 클론을 구성할 수 있다(예를 들어 도 54 참조).
SVV의 회수: SVV의 전체 길이 게놈을 갖는 플라스미드는 표준 프로토콜에 따라 역전사한다: 바이러스 RNA(100 ng)를, 천연 SVV에 대해 허용성인 것으로 알려진 세포주인 H446 세포를 형질감염시키는 데 사용하지만, 바이러스 RNA 형질감염에 가장 효율적인 세포주는 다양한 세포주 중에서 실험적으로 결정할 수 있다.
실시예 16
RGD를 표시하는 SVV 라이브러리의 구성
무작위 펩티드 서열을 코딩하는 올리고뉴클레오티드로 무작위로 생성한 SVV 캡시드 돌연변이체의 구성을 위한 최적의 삽입 위치를 찾기 위해서는, 간단한 모델 시스템(RGD)을 이용한다. RGD(아르기닌, 글리신, 아스파르트산)는 인테그린에 결합하는 짧은 펩티드 리간드이다. 성공적인 RGD-SVV 유도체는 하기의 특성들을 포함하여야 한다: (1) 유전자 삽입은 SVV 특유의 바람직한 특성들 중 어떠한 것도 변경하지 않아야 한다; (2) 성공적인 RGD 유도체 바이러스는 Vb5 인테그린 함유 세포를 향한 향성을 지녀야 한다.
단지 연속된 캡시드 영역을 함유하는 SVV 플라스미드는 아무 위치에서나 1회 절단될 것이며, RGD라 칭해지는 짧은 모델 펩티드 서열이 각 위치에 삽입될 것이다. 바이러스 SVV-RGD 라이브러리는 도 56 및 57에 기재된 일반적 기법을 이용하여 이러한 플라스미드 라이브러리로부터 구성한다.
캡시드 영역으로의 cRGD 올리고뉴클레오티드의 무작위 삽입을 수행한다. 요약하면, 단지 SVV의 연속된 2.1 Kb 캡시드 영역을 코딩하는 플라스미드를 구성한다(도 56 참조, "pSVV 캡시드"). 후술하는 CviJI 또는 엔도뉴클레아제 V 방법을 이용하여 플라스미드를 부분적으로 분해함으로써 pSVV 캡시드의 한 곳을 무작위로 절단한다. 1곳이 절단된 플라스미드를 분리한 후, RGD 올리고뉴클레오티드를 삽입하 여 pSVV 캡시드 RGD 라이브러리를 생성한다.
제한 효소 CviJI는 초음파 처리 또는 전단 처리와 같은 다른 무작위 절단 방법에 비해 몇 가지 장점을 갖는다. 첫째, CviJI는 평활 말단 절단 효소이기 때문에 수복이 필요하지 않다. 둘째, CviJI는 아무 위치나 절단하는 것으로 입증되어서, 절단 빈발 구역(hot spot)이 발생하지 않는다. 절차 역시 간단하고 신속하다. 요약하면, CviJI의 농도 및/또는 분해 시간은 절단된 DNA의 대부분이 선형화된 플라스미드, 즉 단일 절단이 될 때까지 점점 감소시킨다. 이것은 도 57에 도시된 바와 같은 표준 아가로스 겔 전기영동에 의해 관찰할 수 있다. 그 후 밴드를 분리하고 정제하여 RGD 올리고와 결찰시킨다.
DNA를 무작위로 절단하는 데 이용될 수 있는 또 다른 방법은 엔도뉴클레아제 V 방법이다(Kiyazaki, K., Nucleic Acids Res., 2002, 30 (24): e139). 엔도뉴클레아제 V는 우라실 위치의 3'쪽의 두 번째 또는 세 번째 포스포디에스테르 결합에서 우라실 함유 DNA에 흠을 낸다. 이 방법 역시 DNA를 무작위로 절단하는 것으로 예상되며, 그 빈도는 폴리머라제 연쇄 반응에서 dUTP의 농도를 조정함으로써 간단한 방식으로 결정한다. 절단 위치는 항상 티미딘(우라실로 치환) 위치의 하류의 2개 또는 3개 염기이지만, 이 방법은 다른 방법보다 절단 빈발 구역이나 절단 희박 구역(cold spot)을 훨씬 더 적게 생성하는 것으로 예상된다.
무작위로 선형화한 플라스미드는 cRGD 올리고뉴클레오티드와 결찰시킨다. 그 후 생성된 pSVV 캡시드 라이브러리는 증폭시켜, 무작위로 삽입된 cRGD 영역을 갖는 캡시드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 집합체를 정제할 수 있다(도 57 및 58 참조). 그 후 캡시드 폴리뉴클레오티드의 집합체를 캡시드 영역을 제외한 전체 길이 SVV 서열을 포함하는 벡터로 서브클로닝하여, 전체 길이 SVV 서열의 라이브러리를 생성한다(여기서, cRGD 서열은 무작위로 삽입되기 때문에 라이브러리는 캡시드 영역에서 서열 다양성을 나타낸다). 그 후 이 라이브러리는 RNA로 역전사하고, RNA는 허용성 세포주로 형질감염시켜, 다양한 캡시드를 갖는 SVV 입자의 집합체를 생성한다(도 59 참조). 바이러스 입자의 이러한 RGD-SVV의 집합체가 회수되면("RGD-SVV 라이브러리"), 다수의 라이브러리(즉 10개 이상)를 서열결정을 위해 무작위로 피킹하여, RGD 서열의 삽입 및 삽입 위치의 다양성을 확인한다.
RGD를 표시하는 SVV 라이브러리의 시험관내 선별: SVV-RGD 라이브러리를 스크리닝하여 어느 삽입 위치가 SVV의 확장된 향성을 나타내게 하였는지를 확인한다. RGD-SVV 라이브러리로 ανβ5 인테그린 발현 NSCLC 세포주(비-소세포 폐암 세포주, 즉, ανβ5를 발현하는 A549)로 감염시킨다. 기능성이 있고 적절히 표시된 RGD 모티프를 포함하는 SVV 유도체만이 이러한 세포를 감염시키고 복제할 수 있다.
액체의 취급, 20종의 세포주의 동시 배양 및 384웰 플레이트에서의 측정을 가능하게 하는 고처리량 자동화 시스템(TECAN)에 의해 시험관내 스크리닝을 수행한다(도 62 및 도 63 참조). 완전한 CPE가 관찰되었을 때 감염시킨 지 30 시간 후에 세포를 회수하고, 그 후 4℃, 1500 rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 수집한다. 그 후 세포 펠렛을 세포 배양물 상청액에 재현탁시키고, 3 사이클의 동결-해동을 실시한다. 생성된 현탁액을 4℃, 1500 rpm에서 10분간 원심분리하여 투명하게 만든 다. 2 순환의 CsCl 구배에 의해 바이러스를 정제한다: 1-단계 구배(CsCl 밀도 1.24 g/ml 및 1.4 g/ml), 이어서 1 순환의 연속 구배 원심분리(CsCl 밀도 1.33 g/ml). 정제된 바이러스 농도는 분광광도계를 사용하여 측정하는데, 1 A260 = 9.5 x 1012개 입자인 것으로 가정한다(Scraba D.G., and Palmenberg, A.C. 1999). 이 과정은 충분한 양의 바이러스가 ανβ5 세포로부터 회수될 때까지 반복할 수 있다.
회수된 RGD-SVV 유도체의 분석: 개개의 RGD를 표시하는 SVV 유도체(약 10∼50종의 상이한 유도체)의 작은 집합체를 분석한다. 바이러스 혼합물을 희석하고, 단일 바이러스 입자를 분석을 위해 증폭시킨다. 각 유도체를 이들이 ανβ5를 발현하는 세포를 효율적이고 특이적으로 감염시키는 능력을 얻었는지를 확인하기 위해 테스트한다. 그 후 이 특성을 가진 각 유도체의 캡시드 영역의 서열을 결정하여 RGD 삽입 위치를 확인한다. cRGD를 표시하는 회수된 SVV 유도체는 하기의 특성들을 보유하여야 한다: (1) 바이러스의 본래 특성들은 여전히 무결하다; (2) 유도체가 RGD에 결합하는 인테그린을 높은 수준으로 발현하는 세포를 감염시키는 능력을 획득하였다. 이 방법은 RGD 삽입에 의해 확장된 향성을 얻을 수 있는 하나 이상의 위치를 확인하여, 임의의 올리고뉴클레오티드가 이러한 위치에 삽입되어 향성이 변경된 SVV 유도체를 생성할 수 있도록 하기 위한 것이다.
서열 결정된 cRGD-SVV 유도체에 번호를 매겨 인테그린에 대한 그 결합능으로 등급을 매긴다. 결합 활성을 테스트하기 위해 재조합 β2 인테그린을 96웰 미량적정 플레이트 상에 PBS 중에서 고정화시키고, PBS로 2회 세척하고, PBS 중의 3% BSA로 차단한 후에, 독특한 RGD 표시 바이러스와 항온처리한다. 펩티드 삽입이 없는 천연 바이러스를 음성 대조군으로서 사용한다. 항온처리 1∼5 시간 후, PBS로 웰을 적어도 3회 세척한다. 그 후, 플레이트에 결합된 바이러스는 항-SVV 항체로 검출한다. RGD 펩티드, 또는 인테그린에 대한 항체는 인테그린이 결합된 플레이트에 대한 RGD-SVV 유도체의 결합과 경쟁할 수 있어야 한다.
인테그린에 대한 최대 결합력을 갖는 cRGD-SVV 유도체(20)를 분석하여 cRGD 올리고뉴클레오티드 삽입의 '성공적인' 위치(들)를 확인한다. 삽입 위치는 SVV의 향성을 간파할 수 있게 한다. 삽입 위치 및 다른 알고 있는 구조의 분석에 기초하여, 무작위 펩티드 라이브러리를 배치하기 위한 이상적인 위치를 결정할 수 있다(이 방법은 SVV 유도체를 생성하기 위한 대안의 방법이며, 여기서 올리고뉴클레오티드(기지 서열 또는 무작위 서열)이 캡시드 내의 아무 위치에나 삽입된다). 무작위 올리고뉴클레오티드 서열을 갖도록 생성된 SVV 유도체는, 두 가지의 추가적인 신규 방법을 제외하고는, RGD-SVV 라이브러리에 대하여 전술한 것과 실질적으로 동일한 방식으로 구성한다. 원하는 코딩 영역 내의 원치않는 종결 코돈과 불리한 아미노산 삽입(예, 시스테인 또는 프롤린)을 피하기 위해, Morphosys(독일 무니크)에 의해 개발된 TRIM(트리뉴클레오티드-돌연변이 유발) 기법을 이용하여 캡시드 삽입을 위한 무작위 올리고뉴클레오티드를 생성할 수 있다. TRIM은 원하는 위치에서만 아미노산을 코딩하는 트리뉴클레오티드를 이용한다(Virnekas, B. et al., Nucleic Acids Res, 1994, 22 (25): 5600-5607). 108의 다양성을 갖는 SVV를 표시하는 무작위 펩티드이면 충분할 것으로 생각되고 표적화된 종양 조직에 바이러스를 특이적으로 유도하는 펩티드를 생성할 것으로 예상된다. SVV를 표시하는 무작위 펩티드로는 전술한 바와 같이 시험관내 테스트를 실시하거나 또는 종양 보유 마우스를 사용하여 생체내 테스트를 실시한다.
SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG <120> SENECA VALLEY VIRUS BASED COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING DISEASE <130> 287037.127-WO <140> PCT/US2004/031504 <141> 2004-09-23 <150> 60/506,182 <151> 2003-09-26 <160> 167 <170> PatentIn Ver. 3.2 <210> 1 <211> 5752 <212> DNA <213> Seneca Valley Virus <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> a, t, c or g <400> 1 nntctagccc accatggcaa caagaagagc ttacaggagc tgaatgaaga acagtgggtg 60 gaaatgtctg acgattaccg gaccgggaaa aacatgcctt ttcagtctct tggcacatac 120 tatcggcccc ctaactggac ttggggtccc aatttcatca acccctatca agtaacggtt 180 ttcccacacc aaattctgaa cgcgagaacc tctacctcgg tagacataaa cgtcccatac 240 atcggggaga cccccacgca atcctcagag acacagaact cctggaccct cctcgttatg 300 gtgctcgttc ccctagacta taaggaagga gccacaactg acccagaaat tacattttct 360 gtaaggccta caagtcccta cttcaatggg cttcgcaacc gctacacggc cgggacggac 420 gaagaacagg ggcccattcc tacggcaccc agagaaaatt cgcttatgtt tctctcaacc 480 ctccctgacg acactgtccc tgcttacggg aatgtgcgta cccctcctgt caattacctc 540 cctggtgaaa taaccgacct tttgcaactg gcccgcatac ccactctcat ggcatttgag 600 cgggtgcctg aacccgtgcc tgcctcagac acatatgtgc cctacgttgc cgttcccacc 660 cagttcgatg acaggcctct catctccttc ccgatcaccc tttcagatcc cgtctatcag 720 aacaccctgg ttggcgccat cagttcaaat ttcgccaatt accgtgggtg tatccaaatc 780 actctgacat tttgtggacc catgatggcg agagggaaat tcctgctctc gtattctccc 840 ccaaatggaa cgcaaccaca gactctttcc gaagctatgc agtgcacata ctctatttgg 900 gacataggct tgaactctag ttggaccttc gtcgtcccct acatctcgcc cagtgactac 960 cgtgaaactc gagccattac caactcggtt tactccgctg atggttggtt tagcctgcac 1020 aagttgacca aaattactct accacctgac tgtccgcaaa gtccctgcat tctctttttc 1080 gcttctgctg gtgaggatta cactctccgt ctccccgttg attgtaatcc ttcctatgtg 1140 ttccactcca ccgacaacgc cgagaccggg gttattgagg cgggtaacac tgacaccgat 1200 ttctctggtg aactggcggc tcctggccct aaccacacta atgtcaagtt cctgtttgat 1260 cgatctcgat tattgaatgt aatcaaggta ctggagaagg acgccgtttt cccccgccct 1320 ttccctacac aagaaggtgc gcagcaggat gatggttact tttgtcttct gaccccccgc 1380 ccaacagtcg cttcccgacc cgccactcgt ttcggcctgt acgccaatcc gtccggcagt 1440 ggtgttcttg ctaacacttc actggacttc aatttttata gcttggcctg tttcacttac 1500 tttagatcgg accttgaggt tacggtggtc tcactagagc cggatctgga atttgctgta 1560 gggtggtttc cttctggcag tgaataccag gcttccagct ttgtctacga ccagctgcat 1620 gtgcccttcc actttactgg gcgcactccc cgcgctttcg ctagcaaggg tgggaaggta 1680 tctttcgtgc tcccttggaa ctctgtctcg tctgtgctcc ccgtgcgctg ggggggggct 1740 tccaagctct cttctgctac gcggggtcta ccggcgcatg ctgattgggg gactatttac 1800 gcctttgtcc cccgtcctaa tgagaagaaa agcaccgctg taaaacacgt ggccgtgtac 1860 attcggtaca agaacgcacg tgcctggtgc cccagcatgc ttccctttcg cagctacaag 1920 cagaagatgc tgatgcaatc tggcgatatc gagaccaatc ctggtcctgc ttctgacaac 1980 ccaattttgg agtttcttga agcagaaaat gatctagtca ctctggcctc tctctggaag 2040 atggtgcact ctgttcaaca gacctggaga aagtatgtga agaacgatga tttttggccc 2100 aatttactca gcgagctagt gggggaaggc tctgtcgcct tggccgccac gctatccaac 2160 caagcttcag taaaggctct tttgggcctg cactttctct ctcgggggct caattacact 2220 gacttttact ctttactgat agagaaatgc tctagtttct ttaccgtaga accacctcct 2280 ccaccagctg aaaacctgat gaccaagccc tcagtgaagt cgaaattccg aaaactgttt 2340 aagatgcaag gacccatgga caaagtcaaa gactggaacc aaatagctgc cggcttgaag 2400 aattttcaat ttgttcgtga cctagtcaaa gaggtggtcg attggctgca ggcctggatc 2460 aacaaagaga aagccagccc tgtcctccag taccagttgg agatgaagaa gctcgggcct 2520 gtggccttgg ctcatgacgc tttcatggct ggttccgggc cccctcttag cgacgaccag 2580 attgaatacc tccagaacct caaatctctt gccctaacac tggggaagac taatttggcc 2640 caaagtctca ccactatgat caatgccaaa caaagttcag cccaacgagt tgaacccgtt 2700 gtggtggtcc ttagaggcaa gccgggatgc ggcaagggct tggcctctac gttgattgcc 2760 caggctgtgt ccaagcgcct ctatggctcc caaagtgtat attctcttcc cccagatcca 2820 gatttcttcg atggatacaa aggacagttc gtgaccttga tggatgattt gggacaaaac 2880 ccggatggac aagatttccc caccttttgt cagatggtgt cgaccgccca atttctcccc 2940 aacatggcgg accttgcaga gaaagggcgt ccctttacct ccaatctcat cattgcaact 3000 acaaatctcc cccacttcag tcctgtcacc attgctgatc cttctgcagt ctctcgccgt 3060 atcaactacg atctgactct agaagtatct gaggcctaca agaaacacac acggctgaat 3120 tttgacttgg ctttcaggcg cacagacgcc ccccccattt atccttttgc tgcccatgtg 3180 ccctttgtgg acgtagctgt gcgcttcaaa aatggtcacc agaattttaa tctcctagag 3240 ttggtcgatt ccatttgtac agacattcga gccaagcaac aaggtgcccg aaacatgcag 3300 actctggttc tacagagccc caacgagaat gatgacaccc ccgtcgacga ggcgttgggt 3360 agagttctct cccccgctgc ggtcgatgag gcgcttgtcg acctcactcc agaggccgac 3420 ccggttggcc gtttggctat tcttgccaag ctaggtcttg ccctagctgc ggtcacccct 3480 ggtctgataa tcttggcagt gggactctac aggtacttct ctggctctga tgcagaccaa 3540 gaagaaacag aaagtgaggg atctgtcaag gcacccagga gcgaaaatgc ttatgacggc 3600 ccgaagaaaa actctaagcc ccctggagca ctctctctca tggaaatgca acagcccaac 3660 gtggacatgg gctttgaggc tgcggtcgct aagaaagtgg tcgtccccat taccttcatg 3720 gttcccaaca gaccttctgg gcttacacag tccgctcttc tggtgaccgg ccggaccttc 3780 ctaatcaatg aacatacatg gtccaatccc tcctggacca gcttcacaat ccgcggtgag 3840 gtacacactc gtgatgagcc cttccaaacg gttcatttca ctcaccacgg tattcccaca 3900 gatctgatga tggtacgtct cggaccgggc aattctttcc ctaacaatct agacaagttt 3960 ggacttgacc agatgccggc acgcaactcc cgtgtggttg gcgtttcgtc cagttacgga 4020 aacttcttct tctctggaaa tttcctcgga tttgttgatt ccgtcacctc tgaacaagga 4080 acttacgcaa gactctttag gtacagggtg acgacctaca aaggatggtg cggctcggcc 4140 ctggtctgtg aggccggtgg cgtccgacgc atcattggcc tgcattctgc tggcgccgcc 4200 ggtatcggcg ccgggaccta tatctcaaaa ttaggactaa tcaaagccct gaaacacctc 4260 ggtgaacctt tggccacaat gcaaggactg atgactgaat tagagcctgg aatcaccgta 4320 catgtacccc ggaaatccaa attgagaaag acgaccgcac acgcggtgta caaaccggag 4380 tttgagcctg ctgtgttgtc aaaatttgat cccagactga acaaggatgt tgacttggat 4440 gaagtaattt ggtctaaaca cactgccaat gtcccttacc aacctccttt gttctacaca 4500 tacatgtcag agtacgctca tcgagtcttc tccttcttgg ggaaagacaa tgacattctg 4560 accgtcaaag aagcaattct gggcatcccc ggactagacc ccatggatcc ccacacagct 4620 ccgggtctgc cttacgccat caacggcctt cgacgtactg atctcgtcga ttttgtgaac 4680 ggtacagtag atgcggcgct ggctgtacaa atccagaaat tcttagacgg tgactactct 4740 gaccatgtct tccaaacttt tctgaaagat gagatcagac cctcagagaa agtccgagcg 4800 ggaaaaaccc gcattgttga tgtgccctcc ctggcgcatt gcattgtggg cagaatgttg 4860 cttgggcgct ttgctgccaa gtttcaatcc catcctggct ttctcctcgg ctctgctatc 4920 gggtctgacc ctgatgtttt ctggaccgtc ataggggctc aactcgaggg gagaaagaac 4980 acgtatgacg tggactacag tgcctttgac tcttcacacg gcactggctc cttcgaggct 5040 ctcatctctc actttttcac cgtggacaat ggttttagcc ctgcgctggg accgtatctc 5100 agatccctgg ctgtctcggt gcacgcttac ggcgagcgtc gcatcaagat taccggtggc 5160 ctcccctccg gttgtgccgc gaccagcctg ctgaacacag tgctcaacaa tgtgatcatc 5220 aggactgctc tggcattgac ttacaaggaa tttgagtatg acacggttga tatcatcgcc 5280 tacggtgacg accttctggt tggcacggat tacgatctgg acttcaatga ggtggcacga 5340 cgcgctgcca agttggggta taagatgact cctgccaaca agggttctgt cttccctccg 5400 acttcctctc tttccgatgc tgtttttcta aagcgcaaat tcgtccaaaa caacgacggc 5460 ttatacaaac cagttatgga tttaaagaat ttggaagcca tgctctccta cttcaaacca 5520 ggaacactac tcgagaagct gcaatctgtt tctatgttgg ctcaacattc tggaaaagaa 5580 gaatatgata gattgatgca ccccttcgct gactacggtg ccgtaccgag tcacgagtac 5640 ctgcaggcaa gatggagggc cttgttcgac tgacccagat agcccaaggc gcttcggtgc 5700 tgccggcgat tctgggagaa ctcagtcgga acagaaaaaa aaaaaaaaaa aa 5752 <210> 2 <211> 1890 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> variable amino acid <400> 2 Xaa Leu Ala His His Gly Asn Lys Lys Ser Leu Gln Glu Leu Asn Glu 1 5 10 15 Glu Gln Trp Val Glu Met Ser Asp Asp Tyr Arg Thr Gly Lys Asn Met 20 25 30 Pro Phe Gln Ser Leu Gly Thr Tyr Tyr Arg Pro Pro Asn Trp Thr Trp 35 40 45 Gly Pro Asn Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Val Thr Val Phe Pro His Gln 50 55 60 Ile Leu Asn Ala Arg Thr Ser Thr Ser Val Asp Ile Asn Val Pro Tyr 65 70 75 80 Ile Gly Glu Thr Pro Thr Gln Ser Ser Glu Thr Gln Asn Ser Trp Thr 85 90 95 Leu Leu Val Met Val Leu Val Pro Leu Asp Tyr Lys Glu Gly Ala Thr 100 105 110 Thr Asp Pro Glu Ile Thr Phe Ser Val Arg Pro Thr Ser Pro Tyr Phe 115 120 125 Asn Gly Leu Arg Asn Arg Tyr Thr Ala Gly Thr Asp Glu Glu Gln Gly 130 135 140 Pro Ile Pro Thr Ala Pro Arg Glu Asn Ser Leu Met Phe Leu Ser Thr 145 150 155 160 Leu Pro Asp Asp Thr Val Pro Ala Tyr Gly Asn Val Arg Thr Pro Pro 165 170 175 Val Asn Tyr Leu Pro Gly Glu Ile Thr Asp Leu Leu Gln Leu Ala Arg 180 185 190 Ile Pro Thr Leu Met Ala Phe Glu Arg Val Pro Glu Pro Val Pro Ala 195 200 205 Ser Asp Thr Tyr Val Pro Tyr Val Ala Val Pro Thr Gln Phe Asp Asp 210 215 220 Arg Pro Leu Ile Ser Phe Pro Ile Thr Leu Ser Asp Pro Val Tyr Gln 225 230 235 240 Asn Thr Leu Val Gly Ala Ile Ser Ser Asn Phe Ala Asn Tyr Arg Gly 245 250 255 Cys Ile Gln Ile Thr Leu Thr Phe Cys Gly Pro Met Met Ala Arg Gly 260 265 270 Lys Phe Leu Leu Ser Tyr Ser Pro Pro Asn Gly Thr Gln Pro Gln Thr 275 280 285 Leu Ser Glu Ala Met Gln Cys Thr Tyr Ser Ile Trp Asp Ile Gly Leu 290 295 300 Asn Ser Ser Trp Thr Phe Val Val Pro Tyr Ile Ser Pro Ser Asp Tyr 305 310 315 320 Arg Glu Thr Arg Ala Ile Thr Asn Ser Val Tyr Ser Ala Asp Gly Trp 325 330 335 Phe Ser Leu His Lys Leu Thr Lys Ile Thr Leu Pro Pro Asp Cys Pro 340 345 350 Gln Ser Pro Cys Ile Leu Phe Phe Ala Ser Ala Gly Glu Asp Tyr Thr 355 360 365 Leu Arg Leu Pro Val Asp Cys Asn Pro Ser Tyr Val Phe His Ser Thr 370 375 380 Asp Asn Ala Glu Thr Gly Val Ile Glu Ala Gly Asn Thr Asp Thr Asp 385 390 395 400 Phe Ser Gly Glu Leu Ala Ala Pro Gly Pro Asn His Thr Asn Val Lys 405 410 415 Phe Leu Phe Asp Arg Ser Arg Leu Leu Asn Val Ile Lys Val Leu Glu 420 425 430 Lys Asp Ala Val Phe Pro Arg Pro Phe Pro Thr Gln Glu Gly Ala Gln 435 440 445 Gln Asp Asp Gly Tyr Phe Cys Leu Leu Thr Pro Arg Pro Thr Val Ala 450 455 460 Ser Arg Pro Ala Thr Arg Phe Gly Leu Tyr Ala Asn Pro Ser Gly Ser 465 470 475 480 Gly Val Leu Ala Asn Thr Ser Leu Asp Phe Asn Phe Tyr Ser Leu Ala 485 490 495 Cys Phe Thr Tyr Phe Arg Ser Asp Leu Glu Val Thr Val Val Ser Leu 500 505 510 Glu Pro Asp Leu Glu Phe Ala Val Gly Trp Phe Pro Ser Gly Ser Glu 515 520 525 Tyr Gln Ala Ser Ser Phe Val Tyr Asp Gln Leu His Val Pro Phe His 530 535 540 Phe Thr Gly Arg Thr Pro Arg Ala Phe Ala Ser Lys Gly Gly Lys Val 545 550 555 560 Ser Phe Val Leu Pro Trp Asn Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Val Arg 565 570 575 Trp Gly Gly Ala Ser Lys Leu Ser Ser Ala Thr Arg Gly Leu Pro Ala 580 585 590 His Ala Asp Trp Gly Thr Ile Tyr Ala Phe Val Pro Arg Pro Asn Glu 595 600 605 Lys Lys Ser Thr Ala Val Lys His Val Ala Val Tyr Ile Arg Tyr Lys 610 615 620 Asn Ala Arg Ala Trp Cys Pro Ser Met Leu Pro Phe Arg Ser Tyr Lys 625 630 635 640 Gln Lys Met Leu Met Gln Ser Gly Asp Ile Glu Thr Asn Pro Gly Pro 645 650 655 Ala Ser Asp Asn Pro Ile Leu Glu Phe Leu Glu Ala Glu Asn Asp Leu 660 665 670 Val Thr Leu Ala Ser Leu Trp Lys Met Val His Ser Val Gln Gln Thr 675 680 685 Trp Arg Lys Tyr Val Lys Asn Asp Asp Phe Trp Pro Asn Leu Leu Ser 690 695 700 Glu Leu Val Gly Glu Gly Ser Val Ala Leu Ala Ala Thr Leu Ser Asn 705 710 715 720 Gln Ala Ser Val Lys Ala Leu Leu Gly Leu His Phe Leu Ser Arg Gly 725 730 735 Leu Asn Tyr Thr Asp Phe Tyr Ser Leu Leu Ile Glu Lys Cys Ser Ser 740 745 750 Phe Phe Thr Val Glu Pro Pro Pro Pro Pro Ala Glu Asn Leu Met Thr 755 760 765 Lys Pro Ser Val Lys Ser Lys Phe Arg Lys Leu Phe Lys Met Gln Gly 770 775 780 Pro Met Asp Lys Val Lys Asp Trp Asn Gln Ile Ala Ala Gly Leu Lys 785 790 795 800 Asn Phe Gln Phe Val Arg Asp Leu Val Lys Glu Val Val Asp Trp Leu 805 810 815 Gln Ala Trp Ile Asn Lys Glu Lys Ala Ser Pro Val Leu Gln Tyr Gln 820 825 830 Leu Glu Met Lys Lys Leu Gly Pro Val Ala Leu Ala His Asp Ala Phe 835 840 845 Met Ala Gly Ser Gly Pro Pro Leu Ser Asp Asp Gln Ile Glu Tyr Leu 850 855 860 Gln Asn Leu Lys Ser Leu Ala Leu Thr Leu Gly Lys Thr Asn Leu Ala 865 870 875 880 Gln Ser Leu Thr Thr Met Ile Asn Ala Lys Gln Ser Ser Ala Gln Arg 885 890 895 Val Glu Pro Val Val Val Val Leu Arg Gly Lys Pro Gly Cys Gly Lys 900 905 910 Gly Leu Ala Ser Thr Leu Ile Ala Gln Ala Val Ser Lys Arg Leu Tyr 915 920 925 Gly Ser Gln Ser Val Tyr Ser Leu Pro Pro Asp Pro Asp Phe Phe Asp 930 935 940 Gly Tyr Lys Gly Gln Phe Val Thr Leu Met Asp Asp Leu Gly Gln Asn 945 950 955 960 Pro Asp Gly Gln Asp Phe Ser Thr Phe Cys Gln Met Val Ser Thr Ala 965 970 975 Gln Phe Leu Pro Asn Met Ala Asp Leu Ala Glu Lys Gly Arg Pro Phe 980 985 990 Thr Ser Asn Leu Ile Ile Ala Thr Thr Asn Leu Pro His Phe Ser Pro 995 1000 1005 Val Thr Ile Ala Asp Pro Ser Ala Val Ser Arg Arg Ile Asn Tyr Asp 1010 1015 1020 Leu Thr Leu Glu Val Ser Glu Ala Tyr Lys Lys His Thr Arg Leu Asn 1025 1030 1035 1040 Phe Asp Leu Ala Phe Arg Arg Thr Asp Ala Pro Pro Ile Tyr Pro Phe 1045 1050 1055 Ala Ala His Val Pro Phe Val Asp Val Ala Val Arg Phe Lys Asn Gly 1060 1065 1070 His Gln Asn Phe Asn Leu Leu Glu Leu Val Asp Ser Ile Cys Thr Asp 1075 1080 1085 Ile Arg Ala Lys Gln Gln Gly Ala Arg Asn Met Gln Thr Leu Val Leu 1090 1095 1100 Gln Ser Pro Asn Glu Asn Asp Asp Thr Pro Val Asp Glu Ala Leu Gly 1105 1110 1115 1120 Arg Val Leu Ser Pro Ala Ala Val Asp Glu Ala Leu Val Asp Leu Thr 1125 1130 1135 Pro Glu Ala Asp Pro Val Gly Arg Leu Ala Ile Leu Ala Lys Leu Gly 1140 1145 1150 Leu Ala Leu Ala Ala Val Thr Pro Gly Leu Ile Ile Leu Ala Val Gly 1155 1160 1165 Leu Tyr Arg Tyr Phe Ser Gly Ser Asp Ala Asp Gln Glu Glu Thr Glu 1170 1175 1180 Ser Glu Gly Ser Val Lys Ala Pro Arg Ser Glu Asn Ala Tyr Asp Gly 1185 1190 1195 1200 Pro Lys Lys Asn Ser Lys Pro Pro Gly Ala Leu Ser Leu Met Glu Met 1205 1210 1215 Gln Gln Pro Asn Val Asp Met Gly Phe Glu Ala Ala Val Ala Lys Lys 1220 1225 1230 Val Val Val Pro Ile Thr Phe Met Val Pro Asn Arg Pro Ser Gly Leu 1235 1240 1245 Thr Gln Ser Ala Leu Leu Val Thr Gly Arg Thr Phe Leu Ile Asn Glu 1250 1255 1260 His Thr Trp Ser Asn Pro Ser Trp Thr Ser Phe Thr Ile Arg Gly Glu 1265 1270 1275 1280 Val His Thr Arg Asp Glu Pro Phe Gln Thr Val His Phe Thr His His 1285 1290 1295 Gly Ile Pro Thr Asp Leu Met Met Val Arg Leu Gly Pro Gly Asn Ser 1300 1305 1310 Phe Pro Asn Asn Leu Asp Lys Phe Gly Leu Asp Gln Met Pro Ala Arg 1315 1320 1325 Asn Ser Arg Val Val Gly Val Ser Ser Ser Tyr Gly Asn Phe Phe Phe 1330 1335 1340 Ser Gly Asn Phe Leu Gly Phe Val Asp Ser Val Thr Ser Glu Gln Gly 1345 1350 1355 1360 Thr Tyr Ala Arg Leu Phe Arg Tyr Arg Val Thr Thr Tyr Lys Gly Trp 1365 1370 1375 Cys Gly Ser Ala Leu Val Cys Glu Ala Gly Gly Val Arg Arg Ile Ile 1380 1385 1390 Gly Leu His Ser Ala Gly Ala Ala Gly Ile Gly Ala Gly Thr Tyr Ile 1395 1400 1405 Ser Lys Leu Gly Leu Ile Lys Ala Leu Lys His Leu Gly Glu Pro Leu 1410 1415 1420 Ala Thr Met Gln Gly Leu Met Thr Glu Leu Glu Pro Gly Ile Thr Val 1425 1430 1435 1440 His Val Pro Arg Lys Ser Lys Leu Arg Lys Thr Thr Ala His Ala Val 1445 1450 1455 Tyr Lys Pro Glu Phe Glu Pro Ala Val Leu Ser Lys Phe Asp Pro Arg 1460 1465 1470 Leu Asn Lys Asp Val Asp Leu Asp Glu Val Ile Trp Ser Lys His Thr 1475 1480 1485 Ala Asn Val Pro Tyr Gln Pro Pro Leu Phe Tyr Thr Tyr Met Ser Glu 1490 1495 1500 Tyr Ala His Arg Val Phe Ser Phe Leu Gly Lys Asp Asn Asp Ile Leu 1505 1510 1515 1520 Thr Val Lys Glu Ala Ile Leu Gly Ile Pro Gly Leu Asp Pro Met Asp 1525 1530 1535 Pro His Thr Ala Pro Gly Leu Pro Tyr Ala Ile Asn Gly Leu Arg Arg 1540 1545 1550 Thr Asp Leu Val Asp Phe Val Asn Gly Thr Val Asp Ala Ala Leu Ala 1555 1560 1565 Val Gln Ile Gln Lys Phe Leu Asp Gly Asp Tyr Ser Asp His Val Phe 1570 1575 1580 Gln Thr Phe Leu Lys Asp Glu Ile Arg Pro Ser Glu Lys Val Arg Ala 1585 1590 1595 1600 Gly Lys Thr Arg Ile Val Asp Val Pro Ser Leu Ala His Cys Ile Val 1605 1610 1615 Gly Arg Met Leu Leu Gly Arg Phe Ala Ala Lys Phe Gln Ser His Pro 1620 1625 1630 Gly Phe Leu Leu Gly Ser Ala Ile Gly Ser Asp Pro Asp Val Phe Trp 1635 1640 1645 Thr Val Ile Gly Ala Gln Leu Glu Gly Arg Lys Asn Thr Tyr Asp Val 1650 1655 1660 Asp Tyr Ser Ala Phe Asp Ser Ser His Gly Thr Gly Ser Phe Glu Ala 1665 1670 1675 1680 Leu Ile Ser His Phe Phe Thr Val Asp Asn Gly Phe Ser Pro Ala Leu 1685 1690 1695 Gly Pro Tyr Leu Arg Ser Leu Ala Val Ser Val His Ala Tyr Gly Glu 1700 1705 1710 Arg Arg Ile Lys Ile Thr Gly Gly Leu Pro Ser Gly Cys Ala Ala Thr 1715 1720 1725 Ser Leu Leu Asn Thr Val Leu Asn Asn Val Ile Ile Arg Thr Ala Leu 1730 1735 1740 Ala Leu Thr Tyr Lys Glu Phe Glu Tyr Asp Thr Val Asp Ile Ile Ala 1745 1750 1755 1760 Tyr Gly Asp Asp Leu Leu Val Gly Thr Asp Tyr Asp Leu Asp Phe Asn 1765 1770 1775 Glu Val Ala Arg Arg Ala Ala Lys Leu Gly Tyr Lys Met Thr Pro Ala 1780 1785 1790 Asn Lys Gly Ser Val Phe Pro Pro Thr Ser Ser Leu Ser Asp Ala Val 1795 1800 1805 Phe Leu Lys Arg Lys Phe Val Gln Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Lys Pro 1810 1815 1820 Val Met Asp Leu Lys Asn Leu Glu Ala Met Leu Ser Tyr Phe Lys Pro 1825 1830 1835 1840 Gly Thr Leu Leu Glu Lys Leu Gln Ser Val Ser Met Leu Ala Gln His 1845 1850 1855 Ser Gly Lys Glu Glu Tyr Asp Arg Leu Met His Pro Phe Ala Asp Tyr 1860 1865 1870 Gly Ala Val Pro Ser His Glu Tyr Leu Gln Ala Arg Trp Arg Ala Leu 1875 1880 1885 Phe Asp 1890 <210> 3 <211> 426 <212> DNA <213> Seneca Valley Virus <400> 3 ctagcccacc atggcaacaa gaagagctta caggagctga atgaagaaca gtgggtggaa 60 atgtctgacg attaccggac cgggaaaaac atgccttttc agtctcttgg cacatactat 120 cggcccccta actggacttg gggtcccaat ttcatcaacc cctatcaagt aacggttttc 180 ccacaccaaa ttctgaacgc gagaacctct acctcggtag acataaacgt cccatacatc 240 ggggagaccc ccacgcaatc ctcagagaca cagaactcct ggaccctcct cgttatggtg 300 ctcgttcccc tagactataa ggaaggagcc acaactgacc cagaaattac attttctgta 360 aggcctacaa gtccctactt caatgggctt cgcaaccgct acacggccgg gacggacgaa 420 gaacag 426 <210> 4 <211> 142 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 4 Leu Ala His His Gly Asn Lys Lys Ser Leu Gln Glu Leu Asn Glu Glu 1 5 10 15 Gln Trp Val Glu Met Ser Asp Asp Tyr Arg Thr Gly Lys Asn Met Pro 20 25 30 Phe Gln Ser Leu Gly Thr Tyr Tyr Arg Pro Pro Asn Trp Thr Trp Gly 35 40 45 Pro Asn Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Val Thr Val Phe Pro His Gln Ile 50 55 60 Leu Asn Ala Arg Thr Ser Thr Ser Val Asp Ile Asn Val Pro Tyr Ile 65 70 75 80 Gly Glu Thr Pro Thr Gln Ser Ser Glu Thr Gln Asn Ser Trp Thr Leu 85 90 95 Leu Val Met Val Leu Val Pro Leu Asp Tyr Lys Glu Gly Ala Thr Thr 100 105 110 Asp Pro Glu Ile Thr Phe Ser Val Arg Pro Thr Ser Pro Tyr Phe Asn 115 120 125 Gly Leu Arg Asn Arg Tyr Thr Ala Gly Thr Asp Glu Glu Gln 130 135 140 <210> 5 <211> 717 <212> DNA <213> Seneca Valley Virus <400> 5 gggcccattc ctacggcacc cagagaaaat tcgcttatgt ttctctcaac cctccctgac 60 gacactgtcc ctgcttacgg gaatgtgcgt acccctcctg tcaattacct ccctggtgaa 120 ataaccgacc ttttgcaact ggcccgcata cccactctca tggcatttga gcgggtgcct 180 gaacccgtgc ctgcctcaga cacatatgtg ccctacgttg ccgttcccac ccagttcgat 240 gacaggcctc tcatctcctt cccgatcacc ctttcagatc ccgtctatca gaacaccctg 300 gttggcgcca tcagttcaaa tttcgccaat taccgtgggt gtatccaaat cactctgaca 360 ttttgtggac ccatgatggc gagagggaaa ttcctgctct cgtattctcc cccaaatgga 420 acgcaaccac agactctttc cgaagctatg cagtgcacat actctatttg ggacataggc 480 ttgaactcta gttggacctt cgtcgtcccc tacatctcgc ccagtgacta ccgtgaaact 540 cgagccatta ccaactcggt ttactccgct gatggttggt ttagcctgca caagttgacc 600 aaaattactc taccacctga ctgtccgcaa agtccctgca ttctcttttt cgcttctgct 660 ggtgaggatt acactctccg tctccccgtt gattgtaatc cttcctatgt gttccac 717 <210> 6 <211> 239 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 6 Gly Pro Ile Pro Thr Ala Pro Arg Glu Asn Ser Leu Met Phe Leu Ser 1 5 10 15 Thr Leu Pro Asp Asp Thr Val Pro Ala Tyr Gly Asn Val Arg Thr Pro 20 25 30 Pro Val Asn Tyr Leu Pro Gly Glu Ile Thr Asp Leu Leu Gln Leu Ala 35 40 45 Arg Ile Pro Thr Leu Met Ala Phe Glu Arg Val Pro Glu Pro Val Pro 50 55 60 Ala Ser Asp Thr Tyr Val Pro Tyr Val Ala Val Pro Thr Gln Phe Asp 65 70 75 80 Asp Arg Pro Leu Ile Ser Phe Pro Ile Thr Leu Ser Asp Pro Val Tyr 85 90 95 Gln Asn Thr Leu Val Gly Ala Ile Ser Ser Asn Phe Ala Asn Tyr Arg 100 105 110 Gly Cys Ile Gln Ile Thr Leu Thr Phe Cys Gly Pro Met Met Ala Arg 115 120 125 Gly Lys Phe Leu Leu Ser Tyr Ser Pro Pro Asn Gly Thr Gln Pro Gln 130 135 140 Thr Leu Ser Glu Ala Met Gln Cys Thr Tyr Ser Ile Trp Asp Ile Gly 145 150 155 160 Leu Asn Ser Ser Trp Thr Phe Val Val Pro Tyr Ile Ser Pro Ser Asp 165 170 175 Tyr Arg Glu Thr Arg Ala Ile Thr Asn Ser Val Tyr Ser Ala Asp Gly 180 185 190 Trp Phe Ser Leu His Lys Leu Thr Lys Ile Thr Leu Pro Pro Asp Cys 195 200 205 Pro Gln Ser Pro Cys Ile Leu Phe Phe Ala Ser Ala Gly Glu Asp Tyr 210 215 220 Thr Leu Arg Leu Pro Val Asp Cys Asn Pro Ser Tyr Val Phe His 225 230 235 <210> 7 <211> 777 <212> DNA <213> Seneca Valley Virus <400> 7 tccaccgaca acgccgagac cggggttatt gaggcgggta acactgacac cgatttctct 60 ggtgaactgg cggctcctgg ccctaaccac actaatgtca agttcctgtt tgatcgatct 120 cgattattga atgtaatcaa ggtactggag aaggacgccg ttttcccccg ccctttccct 180 acacaagaag gtgcgcagca ggatgatggt tacttttgtc ttctgacccc ccgcccaaca 240 gtcgcttccc gacccgccac tcgtttcggc ctgtacgcca atccgtccgg cagtggtgtt 300 cttgctaaca cttcactgga cttcaatttt tatagcttgg cctgtttcac ttactttaga 360 tcggaccttg aggttacggt ggtctcacta gagccggatc tggaatttgc tgtagggtgg 420 tttccttctg gcagtgaata ccaggcttcc agctttgtct acgaccagct gcatgtgccc 480 ttccacttta ctgggcgcac tccccgcgct ttcgctagca agggtgggaa ggtatctttc 540 gtgctccctt ggaactctgt ctcgtctgtg ctccccgtgc gctggggggg ggcttccaag 600 ctctcttctg ctacgcgggg tctaccggcg catgctgatt gggggactat ttacgccttt 660 gtcccccgtc ctaatgagaa gaaaagcacc gctgtaaaac acgtggccgt gtacattcgg 720 tacaagaacg cacgtgcctg gtgccccagc atgcttccct ttcgcagcta caagcag 777 <210> 8 <211> 259 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 8 Ser Thr Asp Asn Ala Glu Thr Gly Val Ile Glu Ala Gly Asn Thr Asp 1 5 10 15 Thr Asp Phe Ser Gly Glu Leu Ala Ala Pro Gly Pro Asn His Thr Asn 20 25 30 Val Lys Phe Leu Phe Asp Arg Ser Arg Leu Leu Asn Val Ile Lys Val 35 40 45 Leu Glu Lys Asp Ala Val Phe Pro Arg Pro Phe Pro Thr Gln Glu Gly 50 55 60 Ala Gln Gln Asp Asp Gly Tyr Phe Cys Leu Leu Thr Pro Arg Pro Thr 65 70 75 80 Val Ala Ser Arg Pro Ala Thr Arg Phe Gly Leu Tyr Ala Asn Pro Ser 85 90 95 Gly Ser Gly Val Leu Ala Asn Thr Ser Leu Asp Phe Asn Phe Tyr Ser 100 105 110 Leu Ala Cys Phe Thr Tyr Phe Arg Ser Asp Leu Glu Val Thr Val Val 115 120 125 Ser Leu Glu Pro Asp Leu Glu Phe Ala Val Gly Trp Phe Pro Ser Gly 130 135 140 Ser Glu Tyr Gln Ala Ser Ser Phe Val Tyr Asp Gln Leu His Val Pro 145 150 155 160 Phe His Phe Thr Gly Arg Thr Pro Arg Ala Phe Ala Ser Lys Gly Gly 165 170 175 Lys Val Ser Phe Val Leu Pro Trp Asn Ser Val Ser Ser Val Leu Pro 180 185 190 Val Arg Trp Gly Gly Ala Ser Lys Leu Ser Ser Ala Thr Arg Gly Leu 195 200 205 Pro Ala His Ala Asp Trp Gly Thr Ile Tyr Ala Phe Val Pro Arg Pro 210 215 220 Asn Glu Lys Lys Ser Thr Ala Val Lys His Val Ala Val Tyr Ile Arg 225 230 235 240 Tyr Lys Asn Ala Arg Ala Trp Cys Pro Ser Met Leu Pro Phe Arg Ser 245 250 255 Tyr Lys Gln <210> 9 <211> 42 <212> DNA <213> Seneca Valley Virus <400> 9 aagatgctga tgcaatctgg cgatatcgag accaatcctg gt 42 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 10 Lys Met Leu Met Gln Ser Gly Asp Ile Glu Thr Asn Pro Gly 1 5 10 <210> 11 <211> 384 <212> DNA <213> Seneca Valley Virus <400> 11 cctgcttctg acaacccaat tttggagttt cttgaagcag aaaatgatct agtcactctg 60 gcctctctct ggaagatggt gcactctgtt caacagacct ggagaaagta tgtgaagaac 120 gatgattttt ggcccaattt actcagcgag ctagtggggg aaggctctgt cgccttggcc 180 gccacgctat ccaaccaagc ttcagtaaag gctcttttgg gcctgcactt tctctctcgg 240 gggctcaatt acactgactt ttactcttta ctgatagaga aatgctctag tttctttacc 300 gtagaaccac ctcctccacc agctgaaaac ctgatgacca agccctcagt gaagtcgaaa 360 ttccgaaaac tgtttaagat gcaa 384 <210> 12 <211> 128 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 12 Pro Ala Ser Asp Asn Pro Ile Leu Glu Phe Leu Glu Ala Glu Asn Asp 1 5 10 15 Leu Val Thr Leu Ala Ser Leu Trp Lys Met Val His Ser Val Gln Gln 20 25 30 Thr Trp Arg Lys Tyr Val Lys Asn Asp Asp Phe Trp Pro Asn Leu Leu 35 40 45 Ser Glu Leu Val Gly Glu Gly Ser Val Ala Leu Ala Ala Thr Leu Ser 50 55 60 Asn Gln Ala Ser Val Lys Ala Leu Leu Gly Leu His Phe Leu Ser Arg 65 70 75 80 Gly Leu Asn Tyr Thr Asp Phe Tyr Ser Leu Leu Ile Glu Lys Cys Ser 85 90 95 Ser Phe Phe Thr Val Glu Pro Pro Pro Pro Pro Ala Glu Asn Leu Met 100 105 110 Thr Lys Pro Ser Val Lys Ser Lys Phe Arg Lys Leu Phe Lys Met Gln 115 120 125 <210> 13 <211> 966 <212> DNA <213> Seneca Valley Virus <400> 13 ggacccatgg acaaagtcaa agactggaac caaatagctg ccggcttgaa gaattttcaa 60 tttgttcgtg acctagtcaa agaggtggtc gattggctgc aggcctggat caacaaagag 120 aaagccagcc ctgtcctcca gtaccagttg gagatgaaga agctcgggcc tgtggccttg 180 gctcatgacg ctttcatggc tggttccggg ccccctctta gcgacgacca gattgaatac 240 ctccagaacc tcaaatctct tgccctaaca ctggggaaga ctaatttggc ccaaagtctc 300 accactatga tcaatgccaa acaaagttca gcccaacgag ttgaacccgt tgtggtggtc 360 cttagaggca agccgggatg cggcaagggc ttggcctcta cgttgattgc ccaggctgtg 420 tccaagcgcc tctatggctc ccaaagtgta tattctcttc ccccagatcc agatttcttc 480 gatggataca aaggacagtt cgtgaccttg atggatgatt tgggacaaaa cccggatgga 540 caagatttcc ccaccttttg tcagatggtg tcgaccgccc aatttctccc caacatggcg 600 gaccttgcag agaaagggcg tccctttacc tccaatctca tcattgcaac tacaaatctc 660 ccccacttca gtcctgtcac cattgctgat ccttctgcag tctctcgccg tatcaactac 720 gatctgactc tagaagtatc tgaggcctac aagaaacaca cacggctgaa ttttgacttg 780 gctttcaggc gcacagacgc cccccccatt tatccttttg ctgcccatgt gccctttgtg 840 gacgtagctg tgcgcttcaa aaatggtcac cagaatttta atctcctaga gttggtcgat 900 tccatttgta cagacattcg agccaagcaa caaggtgccc gaaacatgca gactctggtt 960 ctacag 966 <210> 14 <211> 322 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 14 Gly Pro Met Asp Lys Val Lys Asp Trp Asn Gln Ile Ala Ala Gly Leu 1 5 10 15 Lys Asn Phe Gln Phe Val Arg Asp Leu Val Lys Glu Val Val Asp Trp 20 25 30 Leu Gln Ala Trp Ile Asn Lys Glu Lys Ala Ser Pro Val Leu Gln Tyr 35 40 45 Gln Leu Glu Met Lys Lys Leu Gly Pro Val Ala Leu Ala His Asp Ala 50 55 60 Phe Met Ala Gly Ser Gly Pro Pro Leu Ser Asp Asp Gln Ile Glu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Asn Leu Lys Ser Leu Ala Leu Thr Leu Gly Lys Thr Asn Leu 85 90 95 Ala Gln Ser Leu Thr Thr Met Ile Asn Ala Lys Gln Ser Ser Ala Gln 100 105 110 Arg Val Glu Pro Val Val Val Val Leu Arg Gly Lys Pro Gly Cys Gly 115 120 125 Lys Gly Leu Ala Ser Thr Leu Ile Ala Gln Ala Val Ser Lys Arg Leu 130 135 140 Tyr Gly Ser Gln Ser Val Tyr Ser Leu Pro Pro Asp Pro Asp Phe Phe 145 150 155 160 Asp Gly Tyr Lys Gly Gln Phe Val Thr Leu Met Asp Asp Leu Gly Gln 165 170 175 Asn Pro Asp Gly Gln Asp Phe Ser Thr Phe Cys Gln Met Val Ser Thr 180 185 190 Ala Gln Phe Leu Pro Asn Met Ala Asp Leu Ala Glu Lys Gly Arg Pro 195 200 205 Phe Thr Ser Asn Leu Ile Ile Ala Thr Thr Asn Leu Pro His Phe Ser 210 215 220 Pro Val Thr Ile Ala Asp Pro Ser Ala Val Ser Arg Arg Ile Asn Tyr 225 230 235 240 Asp Leu Thr Leu Glu Val Ser Glu Ala Tyr Lys Lys His Thr Arg Leu 245 250 255 Asn Phe Asp Leu Ala Phe Arg Arg Thr Asp Ala Pro Pro Ile Tyr Pro 260 265 270 Phe Ala Ala His Val Pro Phe Val Asp Val Ala Val Arg Phe Lys Asn 275 280 285 Gly His Gln Asn Phe Asn Leu Leu Glu Leu Val Asp Ser Ile Cys Thr 290 295 300 Asp Ile Arg Ala Lys Gln Gln Gly Ala Arg Asn Met Gln Thr Leu Val 305 310 315 320 Leu Gln <210> 15 <211> 270 <212> DNA <213> Seneca Valley Virus <400> 15 agccccaacg agaatgatga cacccccgtc gacgaggcgt tgggtagagt tctctccccc 60 gctgcggtcg atgaggcgct tgtcgacctc actccagagg ccgacccggt tggccgtttg 120 gctattcttg ccaagctagg tcttgcccta gctgcggtca cccctggtct gataatcttg 180 gcagtgggac tctacaggta cttctctggc tctgatgcag accaagaaga aacagaaagt 240 gagggatctg tcaaggcacc caggagcgaa 270 <210> 16 <211> 90 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 16 Ser Pro Asn Glu Asn Asp Asp Thr Pro Val Asp Glu Ala Leu Gly Arg 1 5 10 15 Val Leu Ser Pro Ala Ala Val Asp Glu Ala Leu Val Asp Leu Thr Pro 20 25 30 Glu Ala Asp Pro Val Gly Arg Leu Ala Ile Leu Ala Lys Leu Gly Leu 35 40 45 Ala Leu Ala Ala Val Thr Pro Gly Leu Ile Ile Leu Ala Val Gly Leu 50 55 60 Tyr Arg Tyr Phe Ser Gly Ser Asp Ala Asp Gln Glu Glu Thr Glu Ser 65 70 75 80 Glu Gly Ser Val Lys Ala Pro Arg Ser Glu 85 90 <210> 17 <211> 66 <212> DNA <213> Seneca Valley Virus <400> 17 aatgcttatg acggcccgaa gaaaaactct aagccccctg gagcactctc tctcatggaa 60 atgcaa 66 <210> 18 <211> 22 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 18 Asn Ala Tyr Asp Gly Pro Lys Lys Asn Ser Lys Pro Pro Gly Ala Leu 1 5 10 15 Ser Leu Met Glu Met Gln 20 <210> 19 <211> 633 <212> DNA <213> Seneca Valley Virus <400> 19 cagcccaacg tggacatggg ctttgaggct gcggtcgcta agaaagtggt cgtccccatt 60 accttcatgg ttcccaacag accttctggg cttacacagt ccgctcttct ggtgaccggc 120 cggaccttcc taatcaatga acatacatgg tccaatccct cctggaccag cttcacaatc 180 cgcggtgagg tacacactcg tgatgagccc ttccaaacgg ttcatttcac tcaccacggt 240 attcccacag atctgatgat ggtacgtctc ggaccgggca attctttccc taacaatcta 300 gacaagtttg gacttgacca gatgccggca cgcaactccc gtgtggttgg cgtttcgtcc 360 agttacggaa acttcttctt ctctggaaat ttcctcggat ttgttgattc cgtcacctct 420 gaacaaggaa cttacgcaag actctttagg tacagggtga cgacctacaa aggatggtgc 480 ggctcggccc tggtctgtga ggccggtggc gtccgacgca tcattggcct gcattctgct 540 ggcgccgccg gtatcggcgc cgggacctat atctcaaaat taggactaat caaagccctg 600 aaacacctcg gtgaaccttt ggccacaatg caa 633 <210> 20 <211> 211 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 20 Gln Pro Asn Val Asp Met Gly Phe Glu Ala Ala Val Ala Lys Lys Val 1 5 10 15 Val Val Pro Ile Thr Phe Met Val Pro Asn Arg Pro Ser Gly Leu Thr 20 25 30 Gln Ser Ala Leu Leu Val Thr Gly Arg Thr Phe Leu Ile Asn Glu His 35 40 45 Thr Trp Ser Asn Pro Ser Trp Thr Ser Phe Thr Ile Arg Gly Glu Val 50 55 60 His Thr Arg Asp Glu Pro Phe Gln Thr Val His Phe Thr His His Gly 65 70 75 80 Ile Pro Thr Asp Leu Met Met Val Arg Leu Gly Pro Gly Asn Ser Phe 85 90 95 Pro Asn Asn Leu Asp Lys Phe Gly Leu Asp Gln Met Pro Ala Arg Asn 100 105 110 Ser Arg Val Val Gly Val Ser Ser Ser Tyr Gly Asn Phe Phe Phe Ser 115 120 125 Gly Asn Phe Leu Gly Phe Val Asp Ser Val Thr Ser Glu Gln Gly Thr 130 135 140 Tyr Ala Arg Leu Phe Arg Tyr Arg Val Thr Thr Tyr Lys Gly Trp Cys 145 150 155 160 Gly Ser Ala Leu Val Cys Glu Ala Gly Gly Val Arg Arg Ile Ile Gly 165 170 175 Leu His Ser Ala Gly Ala Ala Gly Ile Gly Ala Gly Thr Tyr Ile Ser 180 185 190 Lys Leu Gly Leu Ile Lys Ala Leu Lys His Leu Gly Glu Pro Leu Ala 195 200 205 Thr Met Gln 210 <210> 21 <211> 1389 <212> DNA <213> Seneca Valley Virus <400> 21 ggactgatga ctgaattaga gcctggaatc accgtacatg taccccggaa atccaaattg 60 agaaagacga ccgcacacgc ggtgtacaaa ccggagtttg agcctgctgt gttgtcaaaa 120 tttgatccca gactgaacaa ggatgttgac ttggatgaag taatttggtc taaacacact 180 gccaatgtcc cttaccaacc tcctttgttc tacacataca tgtcagagta cgctcatcga 240 gtcttctcct tcttggggaa agacaatgac attctgaccg tcaaagaagc aattctgggc 300 atccccggac tagaccccat ggatccccac acagctccgg gtctgcctta cgccatcaac 360 ggccttcgac gtactgatct cgtcgatttt gtgaacggta cagtagatgc ggcgctggct 420 gtacaaatcc agaaattctt agacggtgac tactctgacc atgtcttcca aacttttctg 480 aaagatgaga tcagaccctc agagaaagtc cgagcgggaa aaacccgcat tgttgatgtg 540 ccctccctgg cgcattgcat tgtgggcaga atgttgcttg ggcgctttgc tgccaagttt 600 caatcccatc ctggctttct cctcggctct gctatcgggt ctgaccctga tgttttctgg 660 accgtcatag gggctcaact cgaggggaga aagaacacgt atgacgtgga ctacagtgcc 720 tttgactctt cacacggcac tggctccttc gaggctctca tctctcactt tttcaccgtg 780 gacaatggtt ttagccctgc gctgggaccg tatctcagat ccctggctgt ctcggtgcac 840 gcttacggcg agcgtcgcat caagattacc ggtggcctcc cctccggttg tgccgcgacc 900 agcctgctga acacagtgct caacaatgtg atcatcagga ctgctctggc attgacttac 960 aaggaatttg agtatgacac ggttgatatc atcgcctacg gtgacgacct tctggttggc 1020 acggattacg atctggactt caatgaggtg gcacgacgcg ctgccaagtt ggggtataag 1080 atgactcctg ccaacaaggg ttctgtcttc cctccgactt cctctctttc cgatgctgtt 1140 tttctaaagc gcaaattcgt ccaaaacaac gacggcttat acaaaccagt tatggattta 1200 aagaatttgg aagccatgct ctcctacttc aaaccaggaa cactactcga gaagctgcaa 1260 tctgtttcta tgttggctca acattctgga aaagaagaat atgatagatt gatgcacccc 1320 ttcgctgact acggtgccgt accgagtcac gagtacctgc aggcaagatg gagggccttg 1380 ttcgactga 1389 <210> 22 <211> 462 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 22 Gly Leu Met Thr Glu Leu Glu Pro Gly Ile Thr Val His Val Pro Arg 1 5 10 15 Lys Ser Lys Leu Arg Lys Thr Thr Ala His Ala Val Tyr Lys Pro Glu 20 25 30 Phe Glu Pro Ala Val Leu Ser Lys Phe Asp Pro Arg Leu Asn Lys Asp 35 40 45 Val Asp Leu Asp Glu Val Ile Trp Ser Lys His Thr Ala Asn Val Pro 50 55 60 Tyr Gln Pro Pro Leu Phe Tyr Thr Tyr Met Ser Glu Tyr Ala His Arg 65 70 75 80 Val Phe Ser Phe Leu Gly Lys Asp Asn Asp Ile Leu Thr Val Lys Glu 85 90 95 Ala Ile Leu Gly Ile Pro Gly Leu Asp Pro Met Asp Pro His Thr Ala 100 105 110 Pro Gly Leu Pro Tyr Ala Ile Asn Gly Leu Arg Arg Thr Asp Leu Val 115 120 125 Asp Phe Val Asn Gly Thr Val Asp Ala Ala Leu Ala Val Gln Ile Gln 130 135 140 Lys Phe Leu Asp Gly Asp Tyr Ser Asp His Val Phe Gln Thr Phe Leu 145 150 155 160 Lys Asp Glu Ile Arg Pro Ser Glu Lys Val Arg Ala Gly Lys Thr Arg 165 170 175 Ile Val Asp Val Pro Ser Leu Ala His Cys Ile Val Gly Arg Met Leu 180 185 190 Leu Gly Arg Phe Ala Ala Lys Phe Gln Ser His Pro Gly Phe Leu Leu 195 200 205 Gly Ser Ala Ile Gly Ser Asp Pro Asp Val Phe Trp Thr Val Ile Gly 210 215 220 Ala Gln Leu Glu Gly Arg Lys Asn Thr Tyr Asp Val Asp Tyr Ser Ala 225 230 235 240 Phe Asp Ser Ser His Gly Thr Gly Ser Phe Glu Ala Leu Ile Ser His 245 250 255 Phe Phe Thr Val Asp Asn Gly Phe Ser Pro Ala Leu Gly Pro Tyr Leu 260 265 270 Arg Ser Leu Ala Val Ser Val His Ala Tyr Gly Glu Arg Arg Ile Lys 275 280 285 Ile Thr Gly Gly Leu Pro Ser Gly Cys Ala Ala Thr Ser Leu Leu Asn 290 295 300 Thr Val Leu Asn Asn Val Ile Ile Arg Thr Ala Leu Ala Leu Thr Tyr 305 310 315 320 Lys Glu Phe Glu Tyr Asp Thr Val Asp Ile Ile Ala Tyr Gly Asp Asp 325 330 335 Leu Leu Val Gly Thr Asp Tyr Asp Leu Asp Phe Asn Glu Val Ala Arg 340 345 350 Arg Ala Ala Lys Leu Gly Tyr Lys Met Thr Pro Ala Asn Lys Gly Ser 355 360 365 Val Phe Pro Pro Thr Ser Ser Leu Ser Asp Ala Val Phe Leu Lys Arg 370 375 380 Lys Phe Val Gln Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Lys Pro Val Met Asp Leu 385 390 395 400 Lys Asn Leu Glu Ala Met Leu Ser Tyr Phe Lys Pro Gly Thr Leu Leu 405 410 415 Glu Lys Leu Gln Ser Val Ser Met Leu Ala Gln His Ser Gly Lys Glu 420 425 430 Glu Tyr Asp Arg Leu Met His Pro Phe Ala Asp Tyr Gly Ala Val Pro 435 440 445 Ser His Glu Tyr Leu Gln Ala Arg Trp Arg Ala Leu Phe Asp 450 455 460 <210> 23 <211> 2292 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 23 Met Ala Thr Thr Met Glu Gln Glu Thr Cys Ala His Ser Leu Thr Phe 1 5 10 15 Glu Glu Cys Pro Lys Cys Ser Ala Leu Gln Tyr Arg Asn Gly Phe Tyr 20 25 30 Leu Leu Lys Tyr Asp Glu Glu Trp Tyr Pro Glu Glu Leu Leu Thr Asp 35 40 45 Gly Glu Asp Asp Val Phe Asp Pro Glu Leu Asp Met Glu Val Val Phe 50 55 60 Glu Leu Gln Gly Asn Ser Thr Ser Ser Asp Lys Asn Asn Ser Ser Ser 65 70 75 80 Glu Gly Asn Glu Gly Val Ile Ile Asn Asn Phe Tyr Ser Asn Gln Tyr 85 90 95 Gln Asn Ser Ile Asp Leu Ser Ala Asn Ala Ala Gly Ser Asp Pro Pro 100 105 110 Arg Thr Tyr Gly Gln Phe Ser Asn Leu Phe Ser Gly Ala Val Asn Ala 115 120 125 Phe Ser Asn Met Leu Pro Leu Leu Ala Asp Gln Asn Thr Glu Glu Met 130 135 140 Glu Asn Leu Ser Asp Arg Val Ser Gln Asp Thr Ala Gly Asn Thr Val 145 150 155 160 Thr Asn Thr Gln Ser Thr Val Gly Arg Leu Val Gly Tyr Gly Thr Val 165 170 175 His Asp Gly Glu His Pro Ala Ser Cys Ala Asp Thr Ala Ser Glu Lys 180 185 190 Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Tyr Thr Phe Lys Val Asn Asp Trp Thr 195 200 205 Ser Thr Gln Lys Pro Phe Glu Tyr Ile Arg Ile Pro Leu Pro His Val 210 215 220 Leu Ser Gly Glu Asp Gly Gly Val Phe Gly Ala Ala Leu Arg Arg His 225 230 235 240 Tyr Leu Val Lys Thr Gly Trp Arg Val Gln Val Gln Cys Asn Ala Ser 245 250 255 Gln Phe His Ala Gly Ser Leu Leu Val Phe Met Ala Pro Glu Tyr Pro 260 265 270 Thr Leu Asp Ala Phe Ala Met Asp Asn Arg Trp Ser Lys Asp Asn Leu 275 280 285 Pro Asn Gly Thr Arg Thr Gln Thr Asn Lys Lys Gly Pro Phe Ala Met 290 295 300 Asp His Gln Asn Phe Trp Gln Trp Thr Leu Tyr Pro His Gln Phe Leu 305 310 315 320 Asn Leu Arg Thr Asn Thr Thr Val Asp Leu Glu Val Pro Tyr Val Asn 325 330 335 Ile Ala Pro Thr Ser Ser Trp Thr Gln His Ala Ser Trp Thr Leu Val 340 345 350 Ile Ala Val Val Ala Pro Leu Thr Tyr Ser Thr Gly Ala Ser Thr Ser 355 360 365 Leu Asp Ile Thr Ala Ser Ile Gln Pro Val Arg Pro Val Phe Asn Gly 370 375 380 Leu Arg His Glu Thr Leu Ser Arg Gln Ser Pro Ile Pro Val Thr Ile 385 390 395 400 Arg Glu His Ala Gly Thr Trp Tyr Ser Thr Leu Pro Asp Ser Thr Val 405 410 415 Pro Ile Tyr Gly Lys Thr Pro Val Ala Pro Ser Asn Tyr Met Val Gly 420 425 430 Glu Tyr Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Gln Ile Pro Thr Phe Ile Gly 435 440 445 Asn Lys Ile Pro Asn Ala Val Pro Tyr Ile Glu Ala Ser Asn Thr Ala 450 455 460 Val Lys Thr Gln Pro Leu Ala Thr Tyr Gln Val Thr Leu Ser Cys Ser 465 470 475 480 Cys Leu Ala Asn Thr Phe Leu Ala Ala Leu Ser Arg Asn Phe Ala Gln 485 490 495 Tyr Arg Gly Ser Leu Val Tyr Thr Phe Val Phe Thr Gly Thr Ala Met 500 505 510 Met Lys Gly Lys Phe Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Ala Gly Lys 515 520 525 Pro Thr Ser Arg Asp Gln Ala Met Gln Ala Thr Tyr Ala Ile Trp Asp 530 535 540 Leu Gly Leu Asn Ser Ser Tyr Ser Phe Thr Val Pro Phe Ile Ser Pro 545 550 555 560 Thr His Phe Arg Met Val Gly Thr Asp Gln Val Asn Ile Thr Asn Ala 565 570 575 Asp Gly Trp Val Thr Val Trp Gln Leu Thr Pro Leu Thr Tyr Pro Pro 580 585 590 Gly Cys Pro Thr Ser Ala Lys Ile Leu Thr Met Val Ser Ala Gly Lys 595 600 605 Asp Phe Ser Leu Lys Met Pro Ile Ser Pro Ala Pro Trp Ser Pro Gln 610 615 620 Gly Val Glu Asn Ala Glu Lys Gly Val Thr Glu Asn Thr Asn Ala Thr 625 630 635 640 Ala Asp Phe Val Ala Gln Pro Val Tyr Leu Pro Glu Asn Gln Thr Lys 645 650 655 Val Ala Phe Phe Tyr Asn Arg Ser Ser Pro Ile Gly Ala Phe Thr Val 660 665 670 Lys Ser Gly Ser Leu Glu Ser Gly Phe Ala Pro Phe Ser Asn Gly Thr 675 680 685 Cys Pro Asn Ser Val Ile Leu Thr Pro Gly Pro Gln Phe Asp Pro Ala 690 695 700 Tyr Asp Gln Leu Arg Pro Gln Arg Leu Thr Glu Ile Trp Gly Asn Gly 705 710 715 720 Asn Glu Glu Thr Ser Lys Val Phe Pro Leu Lys Ser Lys Gln Asp Tyr 725 730 735 Ser Phe Cys Leu Phe Ser Pro Phe Val Tyr Tyr Lys Cys Asp Leu Glu 740 745 750 Val Thr Leu Ser Pro His Thr Ser Gly Asn His Gly Leu Leu Val Arg 755 760 765 Trp Cys Pro Thr Gly Thr Pro Thr Lys Pro Thr Thr Gln Val Leu His 770 775 780 Glu Val Ser Ser Leu Ser Glu Gly Arg Thr Pro Gln Val Tyr Ser Ala 785 790 795 800 Gly Pro Gly Ile Ser Asn Gln Ile Ser Phe Val Val Pro Tyr Asn Ser 805 810 815 Pro Leu Ser Val Leu Ser Ala Val Trp Tyr Asn Gly His Lys Arg Phe 820 825 830 Asp Asn Thr Gly Ser Leu Gly Ile Ala Pro Asn Ser Asp Phe Gly Thr 835 840 845 Leu Phe Phe Ala Gly Thr Lys Pro Asp Ile Lys Phe Thr Val Tyr Leu 850 855 860 Arg Tyr Lys Asn Lys Arg Val Phe Cys Pro Arg Pro Thr Val Phe Phe 865 870 875 880 Pro Trp Pro Thr Ser Gly Asp Lys Ile Asp Met Thr Pro Arg Ala Gly 885 890 895 Val Leu Met Leu Glu Ser Pro Asn Ala Leu Asp Ile Ser Arg Thr Tyr 900 905 910 Pro Thr Leu His Val Leu Ile Gln Phe Asn His Arg Gly Leu Glu Val 915 920 925 Arg Leu Phe Arg His Gly His Phe Trp Ala Glu Thr Arg Ala Asp Val 930 935 940 Ile Leu Arg Ser Lys Thr Lys Gln Val Ser Phe Leu Ser Asn Gly Asn 945 950 955 960 Tyr Pro Ser Met Asp Ser Arg Ala Pro Trp Asn Pro Trp Lys Asn Thr 965 970 975 Tyr Gln Ala Val Leu Arg Ala Glu Pro Cys Arg Val Thr Met Asp Ile 980 985 990 Tyr Tyr Lys Arg Val Arg Pro Phe Arg Leu Pro Leu Val Gln Lys Glu 995 1000 1005 Trp Pro Val Arg Glu Glu Asn Val Phe Gly Leu Tyr Arg Ile Phe Asn 1010 1015 1020 Ala His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ala Asp Leu Leu Ile His Asp Ile Glu 1025 1030 1035 1040 Thr Asn Pro Gly Pro Phe Met Phe Arg Pro Arg Lys Gln Val Phe Gln 1045 1050 1055 Thr Gln Gly Ala Ala Val Ser Ser Met Ala Gln Thr Leu Leu Pro Asn 1060 1065 1070 Asp Leu Ala Ser Lys Ala Met Gly Ser Ala Phe Thr Ala Leu Leu Asp 1075 1080 1085 Ala Asn Glu Asp Ala Gln Lys Ala Met Lys Ile Ile Lys Thr Leu Ser 1090 1095 1100 Ser Leu Ser Asp Ala Trp Glu Asn Val Lys Glu Thr Leu Asn Asn Pro 1105 1110 1115 1120 Glu Phe Trp Lys Gln Leu Leu Ser Arg Cys Val Gln Leu Ile Ala Gly 1125 1130 1135 Met Thr Ile Ala Val Met His Pro Asp Pro Leu Thr Leu Leu Cys Leu 1140 1145 1150 Gly Thr Leu Thr Ala Ala Glu Ile Thr Ser Gln Thr Ser Leu Cys Glu 1155 1160 1165 Glu Ile Ala Ala Lys Phe Lys Thr Ile Phe Ile Thr Pro Pro Pro Arg 1170 1175 1180 Phe Pro Thr Ile Ser Leu Phe Gln Gln Gln Ser Pro Leu Lys Gln Val 1185 1190 1195 1200 Asn Asp Ile Phe Ser Leu Ala Lys Asn Leu Asp Trp Ala Val Lys Thr 1205 1210 1215 Val Glu Lys Val Val Asp Trp Phe Gly Thr Trp Ile Val Gln Glu Glu 1220 1225 1230 Lys Glu Gln Thr Leu Asp Gln Leu Leu Gln Arg Phe Pro Glu His Ala 1235 1240 1245 Lys Arg Ile Ser Asp Leu Arg Asn Gly Met Ala Ala Tyr Val Glu Cys 1250 1255 1260 Lys Glu Ser Phe Asp Phe Phe Glu Lys Leu Tyr Asn Gln Ala Val Lys 1265 1270 1275 1280 Glu Lys Arg Thr Gly Ile Ala Ala Val Cys Glu Lys Phe Arg Gln Lys 1285 1290 1295 His Asp His Ala Thr Ala Arg Cys Glu Pro Val Val Ile Val Leu Arg 1300 1305 1310 Gly Asp Ala Gly Gln Gly Lys Ser Leu Ser Ser Gln Val Ile Ala Gln 1315 1320 1325 Ala Val Ser Lys Thr Ile Phe Gly Arg Gln Ser Val Tyr Ser Leu Pro 1330 1335 1340 Pro Asp Ser Asp Phe Phe Asp Gly Tyr Glu Asn Gln Phe Ala Ala Ile 1345 1350 1355 1360 Met Asp Asp Leu Gly Gln Asn Pro Asp Gly Ser Asp Phe Thr Thr Phe 1365 1370 1375 Cys Gln Met Val Ser Thr Thr Asn Phe Leu Pro Asn Met Ala Ser Leu 1380 1385 1390 Glu Arg Lys Gly Thr Pro Phe Thr Ser Gln Leu Val Val Ala Thr Thr 1395 1400 1405 Asn Leu Pro Glu Phe Arg Pro Val Thr Ile Ala His Tyr Pro Ala Val 1410 1415 1420 Glu Arg Arg Ile Thr Phe Asp Tyr Ser Val Ser Ala Gly Pro Val Cys 1425 1430 1435 1440 Ser Lys Thr Glu Ala Gly Tyr Lys Val Leu Asp Val Glu Arg Ala Phe 1445 1450 1455 Arg Pro Thr Gly Glu Ala Pro Leu Pro Cys Phe Gln Asn Asn Cys Leu 1460 1465 1470 Phe Leu Glu Lys Ala Gly Leu Gln Phe Arg Asp Asn Arg Thr Lys Glu 1475 1480 1485 Ile Ile Ser Leu Val Asp Val Ile Glu Arg Ala Val Ala Arg Ile Glu 1490 1495 1500 Arg Lys Lys Lys Val Leu Thr Thr Val Gln Thr Leu Val Ala Gln Gly 1505 1510 1515 1520 Pro Val Asp Glu Val Ser Phe His Ser Val Val Gln Gln Leu Lys Ala 1525 1530 1535 Arg Gln Gln Ala Thr Asp Glu Gln Leu Glu Glu Leu Gln Glu Ala Phe 1540 1545 1550 Ala Lys Val Gln Glu Arg Asn Ser Val Phe Ser Asp Trp Leu Lys Ile 1555 1560 1565 Ser Ala Met Leu Cys Ala Ala Thr Leu Ala Leu Ser Gln Val Val Lys 1570 1575 1580 Met Ala Lys Ala Val Lys Gln Met Val Lys Pro Asp Leu Val Arg Val 1585 1590 1595 1600 Gln Leu Asp Glu Gln Glu Gln Gly Pro Tyr Asn Glu Thr Ala Arg Val 1605 1610 1615 Lys Pro Lys Thr Leu Gln Leu Leu Asp Ile Gln Gly Pro Asn Pro Val 1620 1625 1630 Met Asp Phe Glu Lys Tyr Val Ala Lys His Val Thr Ala Pro Ile Gly 1635 1640 1645 Phe Val Tyr Pro Thr Gly Val Ser Thr Gln Thr Cys Leu Leu Val Arg 1650 1655 1660 Gly Arg Thr Leu Val Val Asn Arg His Met Ala Glu Ser Asp Trp Thr 1665 1670 1675 1680 Ser Ile Val Val Arg Gly Val Thr His Ala Arg Ser Thr Val Lys Ile 1685 1690 1695 Leu Ala Ile Ala Lys Ala Gly Lys Glu Thr Asp Val Ser Phe Ile Arg 1700 1705 1710 Leu Ser Ser Gly Pro Leu Phe Arg Asp Asn Thr Ser Lys Phe Val Lys 1715 1720 1725 Ala Gly Asp Val Leu Pro Thr Gly Ala Ala Pro Val Thr Gly Ile Met 1730 1735 1740 Asn Thr Asp Ile Pro Met Met Tyr Thr Gly Thr Phe Leu Lys Ala Gly 1745 1750 1755 1760 Val Ser Val Pro Val Glu Thr Gly Gln Thr Phe Asn His Cys Ile His 1765 1770 1775 Tyr Lys Ala Asn Thr Arg Lys Gly Trp Cys Gly Ser Ala Leu Leu Ala 1780 1785 1790 Asp Leu Gly Gly Ser Lys Lys Ile Leu Gly Ile His Ser Ala Gly Ser 1795 1800 1805 Met Gly Ile Ala Ala Ala Ser Ile Val Ser Gln Glu Met Ile Arg Ala 1810 1815 1820 Val Val Asn Ala Phe Glu Pro Gln Gly Ala Leu Glu Arg Leu Pro Asp 1825 1830 1835 1840 Gly Pro Arg Ile His Val Pro Arg Lys Thr Ala Leu Arg Pro Thr Val 1845 1850 1855 Ala Arg Gln Val Phe Gln Pro Ala Tyr Ala Pro Ala Val Leu Ser Lys 1860 1865 1870 Phe Asp Pro Arg Thr Glu Ala Asp Val Asp Glu Val Ala Phe Ser Lys 1875 1880 1885 His Thr Ser Asn Gln Glu Ser Leu Pro Pro Val Phe Arg Met Val Ala 1890 1895 1900 Lys Glu Tyr Ala Asn Arg Val Phe Thr Leu Leu Gly Lys Asp Asn Gly 1905 1910 1915 1920 Arg Leu Thr Val Lys Gln Ala Leu Glu Gly Leu Glu Gly Met Asp Pro 1925 1930 1935 Met Asp Arg Asn Thr Ser Pro Gly Leu Pro Tyr Thr Ala Leu Gly Met 1940 1945 1950 Arg Arg Thr Asp Val Val Asp Trp Glu Ser Ala Thr Leu Ile Pro Phe 1955 1960 1965 Ala Ala Glu Arg Leu Arg Lys Met Asn Glu Gly Asp Phe Ser Glu Val 1970 1975 1980 Val Tyr Gln Thr Phe Leu Lys Asp Glu Leu Arg Pro Ile Glu Lys Val 1985 1990 1995 2000 Gln Ala Ala Lys Thr Arg Ile Val Asp Val Pro Pro Phe Glu His Cys 2005 2010 2015 Ile Leu Gly Arg Gln Leu Leu Gly Lys Phe Ala Ser Lys Phe Gln Thr 2020 2025 2030 Gln Pro Gly Leu Glu Leu Gly Ser Ala Ile Gly Cys Asp Pro Asp Val 2035 2040 2045 His Trp Thr Ala Phe Gly Val Ala Met Gln Gly Phe Glu Arg Val Tyr 2050 2055 2060 Asp Val Asp Tyr Ser Asn Phe Asp Ser Thr His Ser Val Ala Met Phe 2065 2070 2075 2080 Arg Leu Leu Ala Glu Glu Phe Phe Thr Pro Glu Asn Gly Phe Asp Pro 2085 2090 2095 Leu Thr Arg Glu Tyr Leu Glu Ser Leu Ala Ile Ser Thr His Ala Phe 2100 2105 2110 Glu Glu Lys Arg Phe Leu Ile Thr Gly Gly Leu Pro Ser Gly Cys Ala 2115 2120 2125 Ala Thr Ser Met Leu Asn Thr Ile Met Asn Asn Ile Ile Ile Arg Ala 2130 2135 2140 Gly Leu Tyr Leu Thr Tyr Lys Asn Phe Glu Phe Asp Asp Val Lys Val 2145 2150 2155 2160 Leu Ser Tyr Gly Asp Asp Leu Leu Val Ala Thr Asn Tyr Gln Leu Asp 2165 2170 2175 Phe Asp Lys Val Arg Ala Ser Leu Ala Lys Thr Gly Tyr Lys Ile Thr 2180 2185 2190 Pro Ala Asn Lys Thr Ser Thr Phe Pro Leu Asn Ser Thr Leu Glu Asp 2195 2200 2205 Val Val Phe Leu Lys Arg Lys Phe Lys Lys Glu Gly Pro Leu Tyr Arg 2210 2215 2220 Pro Val Met Asn Arg Glu Ala Leu Glu Ala Met Leu Ser Tyr Tyr Arg 2225 2230 2235 2240 Pro Gly Thr Leu Ser Glu Lys Leu Thr Ser Ile Thr Met Leu Ala Val 2245 2250 2255 His Ser Gly Lys Gln Glu Tyr Asp Arg Leu Phe Ala Pro Phe Arg Glu 2260 2265 2270 Val Gly Val Val Val Pro Ser Phe Glu Ser Val Glu Tyr Arg Trp Arg 2275 2280 2285 Ser Leu Phe Trp 2290 <210> 24 <211> 2292 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 24 Met Ala Thr Thr Met Glu Gln Glu Thr Cys Ala His Ser Leu Thr Phe 1 5 10 15 Glu Glu Cys Pro Lys Cys Ser Ala Leu Gln Tyr Arg Asn Gly Phe Tyr 20 25 30 Leu Leu Lys Tyr Asp Glu Glu Trp Tyr Pro Glu Glu Leu Leu Thr Asp 35 40 45 Gly Glu Asp Asp Val Phe Asp Pro Glu Leu Asp Met Glu Val Val Phe 50 55 60 Glu Leu Gln Gly Asn Ser Thr Ser Ser Asp Lys Asn Asn Ser Ser Ser 65 70 75 80 Glu Gly Asn Glu Gly Val Ile Ile Asn Asn Phe Tyr Ser Asn Gln Tyr 85 90 95 Gln Asn Ser Ile Asp Leu Ser Ala Asn Ala Ala Gly Ser Asp Pro Pro 100 105 110 Arg Thr Tyr Gly Gln Phe Ser Asn Leu Phe Ser Gly Ala Val Asn Ala 115 120 125 Phe Ser Asn Met Leu Pro Leu Leu Ala Asp Gln Asn Thr Glu Glu Met 130 135 140 Glu Asn Leu Ser Asp Arg Val Ser Gln Asp Thr Ala Gly Asn Thr Val 145 150 155 160 Thr Asn Thr Gln Ser Thr Val Gly Arg Leu Val Gly Tyr Gly Thr Val 165 170 175 His Asp Gly Glu His Pro Ala Ser Cys Ala Asp Thr Ala Ser Glu Lys 180 185 190 Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Tyr Thr Phe Lys Val Asn Asp Trp Thr 195 200 205 Ser Thr Gln Lys Pro Phe Glu Tyr Ile Arg Ile Pro Leu Pro His Val 210 215 220 Leu Ser Gly Glu Asp Gly Gly Val Phe Gly Ala Ala Leu Arg Arg His 225 230 235 240 Tyr Leu Val Lys Thr Gly Trp Arg Val Gln Val Gln Cys Asn Ala Ser 245 250 255 Gln Phe His Ala Gly Ser Leu Leu Val Phe Met Ala Pro Glu Tyr Pro 260 265 270 Thr Leu Asp Thr Phe Val Met Asp Asn Arg Trp Ser Lys Asp Asn Leu 275 280 285 Pro Asn Gly Ala Arg Thr Gln Thr Asn Lys Lys Gly Pro Phe Ala Met 290 295 300 Asp His Gln Asn Phe Trp Gln Trp Thr Leu Tyr Pro His Gln Phe Leu 305 310 315 320 Asn Leu Arg Thr Asn Thr Thr Val Asp Leu Glu Val Pro Tyr Val Asn 325 330 335 Ile Ala Pro Thr Ser Ser Trp Thr Gln His Ala Ser Trp Thr Leu Val 340 345 350 Ile Ala Val Val Ala Pro Leu Thr Tyr Ser Thr Gly Ala Ser Thr Ser 355 360 365 Leu Asp Ile Thr Ala Ser Ile Gln Pro Val Arg Pro Val Phe Asn Gly 370 375 380 Leu Arg His Glu Thr Leu Ser Arg Gln Ser Pro Ile Pro Val Thr Ile 385 390 395 400 Arg Glu His Ala Gly Thr Trp Tyr Ser Thr Leu Pro Asp Ser Thr Val 405 410 415 Pro Ile Tyr Gly Lys Thr Pro Val Ala Pro Ser Asn Tyr Met Val Gly 420 425 430 Glu Tyr Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Gln Ile Pro Thr Phe Ile Gly 435 440 445 Asn Lys Ile Pro Asn Ala Val Pro Tyr Ile Glu Ala Ser Asn Thr Ala 450 455 460 Val Lys Thr Gln Pro Leu Ala Thr Tyr Gln Val Thr Leu Ser Cys Ser 465 470 475 480 Cys Leu Ala Asn Thr Phe Leu Ala Ala Leu Ser Arg Asn Phe Ala Gln 485 490 495 Tyr Arg Gly Ser Leu Val Tyr Thr Phe Val Phe Thr Gly Thr Ala Met 500 505 510 Met Lys Gly Lys Phe Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Ala Gly Lys 515 520 525 Pro Thr Ser Arg Asp Gln Ala Met Gln Ala Thr Tyr Ala Ile Trp Asp 530 535 540 Leu Gly Leu Asn Ser Ser Tyr Ser Phe Thr Val Pro Phe Ile Ser Pro 545 550 555 560 Thr His Phe Arg Met Val Gly Thr Asp Gln Val Asn Ile Thr Asn Ala 565 570 575 Asp Gly Trp Val Thr Val Trp Gln Leu Thr Pro Leu Thr Tyr Pro Pro 580 585 590 Gly Cys Pro Thr Ser Ala Lys Ile Leu Thr Met Val Ser Ala Gly Lys 595 600 605 Asp Phe Ser Leu Lys Met Pro Ile Ser Pro Ala Pro Trp Ser Pro Gln 610 615 620 Gly Val Glu Asn Ala Glu Lys Gly Val Thr Glu Asn Ala Asp Ala Thr 625 630 635 640 Ala Asp Phe Val Ala Gln Pro Val Tyr Leu Pro Glu Asn Gln Thr Lys 645 650 655 Val Ala Phe Phe Tyr Asp Arg Ser Ser Pro Ile Gly Ala Phe Thr Val 660 665 670 Gln Ser Gly Ser Leu Glu Ser Gly Phe Ala Pro Phe Ser Asn Lys Thr 675 680 685 Cys Pro Asn Ser Val Ile Leu Thr Pro Gly Pro Gln Phe Asp Pro Ala 690 695 700 Tyr Asp Gln Leu Arg Pro Gln Arg Leu Thr Glu Ile Trp Gly Asn Gly 705 710 715 720 Asn Glu Glu Thr Ser Lys Val Phe Pro Leu Lys Ser Lys Gln Asp Tyr 725 730 735 Ser Phe Cys Leu Phe Ser Pro Phe Val Tyr Tyr Lys Cys Asp Leu Glu 740 745 750 Val Thr Leu Ser Pro His Thr Ser Gly Asn His Gly Leu Leu Val Arg 755 760 765 Trp Cys Pro Thr Gly Thr Pro Thr Lys Pro Thr Thr Gln Val Leu His 770 775 780 Glu Val Ser Ser Leu Ser Glu Gly Arg Thr Pro Gln Val Tyr Ser Ala 785 790 795 800 Gly Pro Gly Ile Ser Asn Gln Ile Ser Phe Val Val Pro Tyr Asn Ser 805 810 815 Pro Leu Ser Val Leu Pro Ala Val Trp Tyr Asn Gly His Lys Arg Phe 820 825 830 Asp Asn Thr Gly Ser Leu Gly Ile Ala Pro Asn Ser Asp Phe Gly Thr 835 840 845 Leu Phe Phe Ala Gly Thr Lys Pro Asp Ile Lys Phe Thr Val Tyr Leu 850 855 860 Arg Tyr Lys Asn Met Arg Val Phe Cys Pro Arg Pro Thr Val Phe Phe 865 870 875 880 Pro Trp Pro Thr Ser Gly Asp Lys Ile Asp Met Thr Pro Arg Ala Gly 885 890 895 Val Leu Met Leu Glu Ser Pro Asn Ala Leu Asp Ile Ser Arg Thr Tyr 900 905 910 Pro Thr Leu His Val Leu Ile Gln Phe Asn His Arg Gly Leu Glu Val 915 920 925 Arg Leu Phe Arg His Gly Gln Phe Trp Ala Glu Thr Arg Ala Asp Val 930 935 940 Ile Leu Arg Ser Lys Thr Lys Gln Val Ser Phe Leu Ser Asn Gly Asn 945 950 955 960 Tyr Pro Ser Met Asp Ser Arg Ala Pro Trp Asn Pro Trp Lys Asn Thr 965 970 975 Tyr Gln Ala Val Leu Arg Ala Glu Pro Cys Arg Val Thr Met Asp Ile 980 985 990 Tyr Tyr Lys Arg Val Arg Pro Phe Arg Leu Pro Leu Val Gln Lys Glu 995 1000 1005 Trp Arg Val Arg Glu Glu Asn Val Phe Gly Leu Tyr Arg Ile Phe Asn 1010 1015 1020 Ala His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ala Asp Leu Leu Ile His Asp Ile Glu 1025 1030 1035 1040 Thr Asn Pro Gly Pro Phe Met Phe Arg Pro Arg Lys Gln Val Phe Gln 1045 1050 1055 Thr Gln Gly Ala Ala Val Ser Ser Met Ala Gln Thr Leu Leu Pro Asn 1060 1065 1070 Asp Leu Ala Ser Lys Ala Met Gly Ser Ala Phe Thr Ala Leu Leu Asp 1075 1080 1085 Ala Asn Glu Asp Ala Arg Lys Ala Met Lys Ile Ile Lys Thr Leu Ser 1090 1095 1100 Ser Leu Ser Asp Ala Trp Glu Asn Val Lys Glu Thr Leu Asn Asn Pro 1105 1110 1115 1120 Glu Phe Trp Lys Gln Leu Leu Ser Arg Cys Val Gln Leu Ile Ala Gly 1125 1130 1135 Met Thr Ile Ala Val Met His Pro Asp Pro Leu Thr Leu Leu Cys Leu 1140 1145 1150 Gly Thr Leu Thr Ala Ala Glu Ile Thr Ser Gln Thr Ser Leu Cys Glu 1155 1160 1165 Glu Ile Ala Ala Lys Phe Lys Thr Ile Phe Ile Thr Pro Pro Pro Arg 1170 1175 1180 Phe Pro Thr Ile Ser Leu Phe Gln Gln Gln Ser Pro Leu Lys Gln Val 1185 1190 1195 1200 Asn Asp Phe Phe Ser Leu Ala Lys Asn Leu Asp Trp Ala Val Lys Thr 1205 1210 1215 Val Glu Lys Val Val Asp Trp Phe Gly Thr Trp Ile Val Gln Glu Glu 1220 1225 1230 Lys Glu Gln Thr Leu Asp Gln Leu Leu Gln Arg Phe Pro Glu His Ala 1235 1240 1245 Lys Arg Ile Ser Asp Leu Arg Asn Gly Met Ala Ala Tyr Val Glu Cys 1250 1255 1260 Lys Glu Ser Phe Asp Phe Phe Glu Lys Leu Tyr Asn Gln Ala Val Lys 1265 1270 1275 1280 Glu Lys Arg Thr Gly Ile Ala Ala Val Cys Glu Lys Phe Arg Gln Lys 1285 1290 1295 His Asp His Ala Thr Ala Arg Cys Glu Pro Val Val Ile Val Leu Arg 1300 1305 1310 Gly Asp Ala Gly Gln Gly Lys Ser Leu Ser Ser Gln Val Ile Ala Gln 1315 1320 1325 Ala Val Ser Lys Thr Ile Phe Gly Arg Gln Ser Val Tyr Ser Leu Pro 1330 1335 1340 Pro Asp Ser Asp Phe Phe Asp Gly Tyr Glu Asn Gln Phe Ala Ala Ile 1345 1350 1355 1360 Met Asp Asp Leu Gly Gln Asn Pro Asp Gly Ser Asp Phe Thr Thr Phe 1365 1370 1375 Cys Gln Met Val Ser Thr Thr Asn Phe Leu Pro Asn Met Ala Ser Leu 1380 1385 1390 Glu Arg Lys Gly Thr Pro Phe Thr Ser Gln Leu Val Val Ala Thr Thr 1395 1400 1405 Asn Leu Pro Glu Phe Arg Pro Val Thr Ile Ala His Tyr Pro Ala Val 1410 1415 1420 Glu Arg Arg Ile Thr Phe Asp Tyr Ser Val Ser Ala Gly Pro Val Cys 1425 1430 1435 1440 Ser Lys Thr Glu Ala Gly Tyr Lys Val Leu Asp Val Glu Arg Ala Phe 1445 1450 1455 Arg Pro Thr Gly Glu Ala Pro Leu Pro Cys Phe Gln Asn Asn Cys Leu 1460 1465 1470 Phe Leu Glu Lys Ala Gly Leu Gln Phe Arg Asp Asn Arg Thr Lys Glu 1475 1480 1485 Ile Ile Ser Leu Val Asp Val Ile Glu Arg Ala Val Ala Arg Ile Glu 1490 1495 1500 Arg Lys Lys Lys Val Leu Thr Thr Val Gln Thr Leu Val Ala Gln Ala 1505 1510 1515 1520 Pro Val Asp Glu Val Ser Phe His Ser Val Val Gln Gln Leu Lys Ala 1525 1530 1535 Arg Gln Glu Ala Thr Asp Glu Gln Leu Glu Glu Leu Gln Glu Ala Phe 1540 1545 1550 Ala Lys Val Gln Glu Arg Asn Ser Val Phe Ser Asp Trp Leu Lys Ile 1555 1560 1565 Ser Ala Met Leu Cys Ala Ala Thr Leu Ala Leu Ser Gln Val Val Lys 1570 1575 1580 Met Ala Lys Ala Val Lys Gln Met Val Lys Pro Asp Leu Val Arg Val 1585 1590 1595 1600 Gln Leu Asp Glu Gln Glu Gln Gly Pro Tyr Asn Glu Thr Ala Arg Ala 1605 1610 1615 Lys Pro Lys Thr Leu Gln Leu Leu Asp Ile Gln Gly Pro Asn Pro Val 1620 1625 1630 Met Asp Phe Glu Lys Tyr Val Ala Lys His Val Thr Ala Pro Ile Asp 1635 1640 1645 Phe Val Tyr Pro Thr Gly Val Ser Thr Gln Thr Cys Leu Leu Val Arg 1650 1655 1660 Gly Arg Thr Leu Ala Val Asn Arg His Met Ala Glu Ser Asp Trp Thr 1665 1670 1675 1680 Ser Ile Val Val Arg Gly Val Thr His Ala Arg Ser Thr Val Lys Ile 1685 1690 1695 Leu Ala Ile Ala Lys Ala Gly Lys Glu Thr Asp Val Ser Phe Ile Arg 1700 1705 1710 Leu Ser Ser Gly Pro Leu Phe Arg Asp Asn Thr Ser Lys Phe Val Lys 1715 1720 1725 Ala Gly Asp Val Leu Pro Thr Gly Ala Ala Pro Val Thr Gly Ile Met 1730 1735 1740 Asn Thr Asp Ile Pro Met Met Tyr Thr Gly Thr Phe Leu Lys Ala Gly 1745 1750 1755 1760 Val Ser Val Pro Val Glu Thr Gly Gln Thr Phe Asn His Cys Ile His 1765 1770 1775 Tyr Lys Ala Asn Thr Arg Lys Gly Trp Cys Gly Ser Ala Leu Leu Ala 1780 1785 1790 Asp Leu Gly Gly Ser Lys Lys Ile Leu Gly Ile His Ser Ala Gly Ser 1795 1800 1805 Met Gly Ile Ala Ala Ala Ser Ile Val Ser Gln Glu Met Ile Arg Ala 1810 1815 1820 Val Val Asn Ala Phe Glu Pro Gln Gly Ala Leu Glu Arg Leu Pro Asp 1825 1830 1835 1840 Gly Pro Arg Ile His Val Pro Arg Lys Thr Ala Leu Arg Pro Thr Val 1845 1850 1855 Ala Arg Gln Val Phe Gln Pro Ala Tyr Ala Pro Ala Val Leu Ser Lys 1860 1865 1870 Phe Asp Pro Arg Thr Glu Ala Asp Val Asp Glu Val Ala Phe Ser Lys 1875 1880 1885 His Thr Ser Asn Gln Glu Ser Leu Pro Pro Val Phe Arg Met Val Ala 1890 1895 1900 Lys Glu Tyr Ala Asn Arg Val Phe Thr Leu Leu Gly Lys Asp Asn Gly 1905 1910 1915 1920 Arg Leu Thr Val Lys Gln Ala Leu Glu Gly Leu Glu Gly Met Asp Pro 1925 1930 1935 Met Asp Arg Asn Thr Ser Pro Gly Leu Pro Tyr Thr Ala Leu Gly Met 1940 1945 1950 Arg Arg Thr Asp Val Val Asp Trp Glu Ser Ala Thr Leu Ile Pro Phe 1955 1960 1965 Ala Ala Glu Arg Leu Arg Lys Met Asn Glu Gly Asp Phe Ser Glu Val 1970 1975 1980 Val Tyr Gln Thr Phe Leu Lys Asp Glu Leu Arg Pro Ile Glu Lys Val 1985 1990 1995 2000 Gln Ala Ala Lys Thr Arg Ile Val Asp Val Pro Pro Phe Glu His Cys 2005 2010 2015 Ile Leu Gly Arg Gln Leu Leu Gly Lys Phe Ala Ser Lys Phe Gln Thr 2020 2025 2030 Gln Pro Gly Leu Glu Leu Gly Ser Ala Ile Gly Cys Asp Pro Asp Val 2035 2040 2045 His Trp Thr Ala Phe Gly Val Ala Met Gln Gly Phe Glu Arg Val Tyr 2050 2055 2060 Asp Val Asp Tyr Ser Asn Phe Asp Ser Thr His Ser Val Ala Met Phe 2065 2070 2075 2080 Arg Leu Leu Ala Glu Glu Phe Phe Thr Pro Glu Asn Gly Phe Asp Pro 2085 2090 2095 Leu Thr Arg Glu Tyr Leu Glu Ser Leu Ala Ile Ser Thr His Ala Phe 2100 2105 2110 Glu Glu Lys Arg Phe Leu Ile Thr Gly Gly Leu Pro Ser Gly Cys Ala 2115 2120 2125 Ala Thr Ser Met Leu Asn Thr Ile Met Asn Asn Ile Ile Ile Arg Ala 2130 2135 2140 Gly Leu Tyr Leu Thr Tyr Lys Asn Phe Glu Phe Asp Asp Val Lys Val 2145 2150 2155 2160 Leu Ser Tyr Gly Asp Asp Leu Leu Val Ala Thr Asn Tyr Gln Leu Asp 2165 2170 2175 Phe Asp Lys Val Arg Ala Ser Leu Ala Lys Thr Gly Tyr Lys Ile Thr 2180 2185 2190 Pro Ala Asn Lys Thr Ser Thr Phe Pro Leu Asn Ser Thr Leu Glu Asp 2195 2200 2205 Val Val Phe Leu Lys Arg Lys Phe Lys Lys Glu Gly Pro Leu Tyr Arg 2210 2215 2220 Pro Val Met Asn Arg Glu Ala Leu Glu Ala Met Leu Ser Tyr Tyr Arg 2225 2230 2235 2240 Pro Gly Thr Leu Ser Glu Lys Leu Thr Ser Ile Thr Met Leu Ala Val 2245 2250 2255 His Ser Gly Lys Gln Glu Tyr Asp Arg Leu Phe Ala Pro Phe Arg Glu 2260 2265 2270 Val Gly Val Val Val Pro Ser Phe Glu Ser Val Glu Tyr Arg Trp Arg 2275 2280 2285 Ser Leu Phe Trp 2290 <210> 25 <211> 2292 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 25 Met Ala Thr Thr Met Glu Gln Glu Ile Cys Ala His Ser Leu Thr Leu 1 5 10 15 Lys Gly Cys Pro Lys Cys Ser Ala Leu Gln Tyr Arg Asn Gly Phe Tyr 20 25 30 Leu Leu Lys Tyr Asp Glu Glu Trp Tyr Pro Glu Glu Leu Leu Thr Asp 35 40 45 Gly Glu Asp Asp Val Phe Asp Pro Glu Leu Asp Met Glu Val Val Phe 50 55 60 Glu Leu Gln Gly Asn Ser Thr Ser Ser Asp Lys Asn Asn Ser Ser Ser 65 70 75 80 Asp Gly Asn Glu Gly Val Ile Ile Asn Asn Phe Tyr Ser Asn Gln Tyr 85 90 95 Gln Asn Ser Ile Asp Leu Ser Ala Asn Ala Thr Gly Ser Asp Pro Pro 100 105 110 Arg Thr Tyr Gly Gln Phe Ser Asn Leu Leu Ser Gly Ala Val Asn Ala 115 120 125 Phe Ser Asn Met Ile Pro Leu Leu Ala Asp Gln Asn Thr Glu Glu Met 130 135 140 Glu Asn Leu Ser Asp Arg Val Leu Gln Asp Thr Ala Gly Asn Thr Val 145 150 155 160 Thr Asn Thr Gln Ser Thr Val Gly Arg Leu Val Gly Tyr Gly Ala Val 165 170 175 His Asp Gly Glu His Pro Ala Ser Cys Ala Asp Thr Ala Ser Glu Lys 180 185 190 Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Tyr Thr Phe Lys Val Asn Asp Trp Thr 195 200 205 Ser Thr Gln Lys Pro Phe Glu Tyr Ile Arg Ile Pro Leu Pro His Val 210 215 220 Leu Ser Gly Glu Asp Gly Gly Val Phe Gly Ala Ala Leu Arg Arg His 225 230 235 240 Tyr Leu Val Lys Thr Gly Trp Arg Val Gln Val Gln Cys Asn Ala Ser 245 250 255 Gln Phe His Ala Gly Ser Leu Leu Val Phe Met Ala Pro Glu Tyr Pro 260 265 270 Thr Leu Asp Ala Phe Ala Met Asp Asn Arg Trp Ser Lys Asp Asn Leu 275 280 285 Pro Asn Gly Thr Lys Thr Gln Thr Asn Arg Lys Gly Pro Phe Ala Met 290 295 300 Asp His Gln Asn Phe Trp Gln Trp Thr Leu Tyr Pro His Gln Phe Leu 305 310 315 320 Asn Leu Arg Thr Asn Thr Thr Val Asp Leu Glu Val Pro Tyr Val Asn 325 330 335 Ile Ala Pro Thr Ser Ser Trp Thr Gln His Ala Ser Trp Thr Leu Val 340 345 350 Ile Ala Val Val Ala Pro Leu Thr Tyr Ser Thr Gly Ala Ser Thr Ser 355 360 365 Leu Asp Ile Thr Ala Ser Ile Gln Pro Val Arg Pro Val Phe Asn Gly 370 375 380 Leu Arg His Glu Thr Leu Ser Arg Gln Ser Pro Ile Pro Val Thr Ile 385 390 395 400 Arg Glu His Ala Gly Thr Trp Tyr Ser Thr Leu Pro Asp Ser Thr Val 405 410 415 Pro Ile Tyr Gly Lys Thr Pro Val Ala Pro Ala Asn Tyr Met Val Gly 420 425 430 Glu Tyr Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Gln Ile Pro Thr Phe Ile Gly 435 440 445 Asn Lys Ile Pro Asn Ala Val Pro Tyr Ile Glu Ala Ser Asn Thr Ala 450 455 460 Val Lys Thr Gln Pro Leu Ala Thr Tyr Gln Val Thr Leu Ser Cys Ser 465 470 475 480 Cys Leu Ala Asn Thr Phe Leu Ala Ala Leu Ser Arg Asn Phe Ala Gln 485 490 495 Tyr Arg Gly Ser Leu Val Tyr Thr Phe Val Phe Thr Gly Thr Ala Met 500 505 510 Met Lys Gly Lys Phe Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Ala Gly Lys 515 520 525 Pro Thr Ser Arg Asp Gln Ala Met Gln Ala Thr Tyr Ala Ile Trp Asp 530 535 540 Leu Gly Leu Asn Ser Ser Tyr Ser Phe Thr Val Pro Phe Ile Ser Pro 545 550 555 560 Thr His Phe Arg Met Val Gly Thr Asp Gln Val Asn Ile Thr Asn Val 565 570 575 Asp Gly Trp Val Thr Val Trp Gln Leu Thr Pro Leu Thr Tyr Pro Pro 580 585 590 Gly Cys Pro Thr Ser Ala Lys Ile Leu Thr Met Val Ser Ala Gly Lys 595 600 605 Asp Phe Ser Leu Lys Met Pro Ile Ser Pro Ala Pro Trp Ser Pro Gln 610 615 620 Gly Val Glu Asn Ala Glu Arg Gly Val Thr Glu Asp Thr Asp Ala Thr 625 630 635 640 Ala Asp Phe Val Ala Gln Pro Val Tyr Leu Pro Glu Asn Gln Thr Lys 645 650 655 Val Ala Phe Phe Tyr Asp Arg Ser Ser Pro Ile Gly Ala Phe Thr Val 660 665 670 Lys Ser Gly Ser Leu Glu Ser Gly Phe Thr Pro Phe Ser Asn Gln Thr 675 680 685 Cys Pro Asn Ser Val Ile Leu Thr Pro Gly Pro Gln Phe Asp Pro Ala 690 695 700 Tyr Asp Gln Leu Arg Pro Gln Arg Leu Thr Glu Ile Trp Gly Asn Gly 705 710 715 720 Asn Glu Glu Thr Ser Lys Val Phe Pro Leu Lys Ser Lys Gln Asp Tyr 725 730 735 Ser Phe Cys Leu Phe Ser Pro Phe Val Tyr Tyr Lys Cys Asp Leu Glu 740 745 750 Val Thr Leu Ser Pro His Thr Ser Gly Asn His Gly Leu Leu Val Arg 755 760 765 Trp Cys Pro Thr Gly Thr Pro Thr Lys Pro Thr Thr Gln Val Leu His 770 775 780 Glu Val Ser Ser Leu Ser Glu Gly Arg Thr Pro Gln Val Tyr Ser Ala 785 790 795 800 Gly Pro Gly Ile Thr Asn Gln Ile Ser Phe Val Val Pro Tyr Asn Ser 805 810 815 Pro Leu Ser Val Leu Pro Ala Val Trp Tyr Asn Gly His Lys Arg Phe 820 825 830 Asp Asn Thr Gly Ser Leu Gly Ile Ala Pro Asn Ser Asp Phe Gly Thr 835 840 845 Leu Phe Phe Ala Gly Thr Lys Pro Asp Ile Lys Phe Thr Val Tyr Leu 850 855 860 Arg Tyr Lys Asn Met Arg Val Phe Cys Pro Arg Pro Thr Val Phe Phe 865 870 875 880 Pro Trp Pro Ser Ser Gly Asp Lys Ile Asp Met Thr Pro Arg Ala Gly 885 890 895 Val Leu Met Leu Glu Ser Pro Asn Ala Leu Asp Ile Ser Arg Thr Tyr 900 905 910 Pro Thr Leu His Ile Leu Ile Gln Phe Asn His Gly Gly Leu Glu Ile 915 920 925 Arg Leu Phe Arg His Gly Met Phe Trp Ala Glu Ala His Ala Asp Val 930 935 940 Ile Leu Arg Ser Arg Thr Lys Gln Ile Ser Phe Leu Asn Asn Gly Ser 945 950 955 960 Phe Pro Ser Met Asp Ala Arg Ala Pro Trp Asn Pro Trp Lys Asn Thr 965 970 975 Tyr His Ala Val Leu Arg Ala Glu Pro Tyr Arg Val Thr Met Asp Val 980 985 990 Tyr His Lys Arg Ile Arg Pro Phe Arg Leu Pro Leu Val Gln Lys Glu 995 1000 1005 Trp Asn Val Arg Glu Glu Asn Val Phe Gly Leu Tyr Gly Ile Phe Asn 1010 1015 1020 Ala His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ala Asp Leu Leu Ile His Asp Ile Glu 1025 1030 1035 1040 Thr Asn Pro Gly Pro Phe Met Ala Lys Pro Lys Lys Gln Val Phe Gln 1045 1050 1055 Thr Gln Gly Ala Ala Val Ser Ser Met Ala Gln Thr Leu Leu Pro Asn 1060 1065 1070 Asp Leu Ala Ser Lys Val Met Gly Ser Ala Phe Thr Ala Leu Leu Asp 1075 1080 1085 Ala Asn Glu Asp Ala Gln Lys Ala Met Arg Ile Ile Lys Thr Leu Ser 1090 1095 1100 Ser Leu Ser Asp Ala Trp Glu Asn Val Lys Glu Thr Leu Asn Asn Pro 1105 1110 1115 1120 Glu Phe Trp Lys Gln Leu Leu Ser Arg Cys Val Gln Leu Ile Ala Gly 1125 1130 1135 Met Thr Ile Ala Val Met His Pro Asp Pro Leu Thr Leu Leu Cys Leu 1140 1145 1150 Gly Thr Leu Thr Ala Ala Glu Ile Thr Ser Gln Thr Ser Leu Cys Glu 1155 1160 1165 Glu Ile Val Ala Lys Phe Lys Lys Ile Phe Thr Thr Pro Pro Pro Arg 1170 1175 1180 Phe Pro Thr Ile Ser Leu Phe Gln Gln Gln Ser Pro Leu Lys Gln Val 1185 1190 1195 1200 Asn Asp Val Phe Ser Leu Ala Lys Asn Leu Asp Trp Ala Val Lys Thr 1205 1210 1215 Val Glu Lys Val Val Asp Trp Phe Gly Thr Trp Val Val Gln Glu Glu 1220 1225 1230 Lys Glu Gln Thr Leu Asp Gln Leu Leu Gln Arg Phe Pro Glu His Ala 1235 1240 1245 Lys Arg Ile Ser Asp Leu Arg Asn Gly Met Ser Ala Tyr Val Glu Cys 1250 1255 1260 Lys Glu Ser Phe Asp Phe Phe Glu Lys Leu Tyr Asn Gln Ala Val Lys 1265 1270 1275 1280 Glu Lys Arg Thr Gly Ile Ala Ala Val Cys Glu Lys Phe Arg Gln Lys 1285 1290 1295 His Asp His Ala Thr Ala Arg Cys Glu Pro Val Val Ile Val Leu Arg 1300 1305 1310 Gly Asp Ala Gly Gln Gly Lys Ser Leu Ser Ser Gln Val Ile Ala Gln 1315 1320 1325 Ala Val Ser Lys Thr Ile Phe Gly Arg Gln Ser Val Tyr Ser Leu Pro 1330 1335 1340 Pro Asp Ser Asp Phe Phe Asp Gly Tyr Glu Asn Gln Phe Ala Ala Ile 1345 1350 1355 1360 Met Asp Asp Leu Gly Gln Asn Pro Asp Gly Ser Asp Phe Thr Thr Phe 1365 1370 1375 Cys Gln Met Val Ser Thr Thr Asn Phe Leu Pro Asn Met Ala Ser Leu 1380 1385 1390 Glu Arg Asn Gly Thr Pro Phe Thr Ser Gln Ile Val Val Ala Thr Thr 1395 1400 1405 Asn Leu Pro Glu Phe Arg Pro Val Thr Ile Ala His Tyr Pro Ala Val 1410 1415 1420 Glu Arg Arg Ile Thr Phe Asp Tyr Ser Val Ser Ala Gly Pro Val Cys 1425 1430 1435 1440 Ser Lys Thr Glu Ala Gly Tyr Lys Val Leu Asp Val Glu Arg Ala Phe 1445 1450 1455 Arg Pro Thr Gly Asp Ala Pro Leu Pro Cys Phe Gln Asn Asn Cys Leu 1460 1465 1470 Phe Leu Glu Lys Ala Gly Leu Gln Phe Arg Asp Asn Arg Thr Lys Glu 1475 1480 1485 Ile Leu Ser Leu Val Asp Val Ile Glu Arg Ala Val Ala Arg Ile Glu 1490 1495 1500 Arg Lys Lys Lys Val Leu Thr Thr Val Gln Thr Leu Val Ala Gln Ala 1505 1510 1515 1520 Pro Val Asp Glu Val Ser Phe His Ser Val Val Gln Gln Leu Lys Ala 1525 1530 1535 Arg Gln Glu Ala Thr Asp Glu Gln Leu Glu Glu Leu Gln Glu Ala Phe 1540 1545 1550 Ala Lys Thr Gln Glu Arg Ser Ser Val Phe Ser Asp Trp Met Lys Ile 1555 1560 1565 Ser Ala Met Leu Cys Ala Ala Thr Leu Ala Leu Ser Gln Val Val Lys 1570 1575 1580 Met Ala Lys Thr Val Lys Gln Met Val Arg Pro Asp Leu Val Arg Val 1585 1590 1595 1600 Gln Leu Asp Glu Gln Glu Gln Gly Pro Tyr Asn Glu Ala Val Arg Ala 1605 1610 1615 Lys Pro Lys Thr Leu Gln Leu Leu Asp Ile Gln Gly Pro Asn Pro Val 1620 1625 1630 Met Asp Phe Glu Lys Tyr Val Ala Lys Phe Val Thr Ala Pro Ile Asp 1635 1640 1645 Phe Val Tyr Pro Thr Gly Val Ser Thr Gln Thr Cys Leu Leu Val Lys 1650 1655 1660 Gly Arg Thr Leu Ala Val Asn Arg His Met Ala Glu Ser Asp Trp Ser 1665 1670 1675 1680 Ser Ile Val Val Arg Gly Val Thr His Ala Arg Ser Thr Val Arg Ile 1685 1690 1695 Leu Ala Ile Ala Lys Ala Gly Lys Glu Thr Asp Val Ser Phe Ile Arg 1700 1705 1710 Leu Ser Ser Gly Pro Leu Phe Arg Asp Asn Thr Ser Lys Phe Val Lys 1715 1720 1725 Ala Asp Asp Val Leu Pro Ala Thr Ser Ala Pro Val Ile Gly Ile Met 1730 1735 1740 Asn Thr Asp Ile Pro Met Met Phe Thr Gly Thr Phe Leu Lys Ala Gly 1745 1750 1755 1760 Val Ser Val Pro Val Glu Thr Gly Gln Thr Phe Asn His Cys Ile His 1765 1770 1775 Tyr Lys Ala Asn Thr Arg Lys Gly Trp Cys Gly Ser Ala Leu Leu Ala 1780 1785 1790 Asp Leu Gly Gly Lys Lys Lys Ile Leu Gly Met His Ser Ala Gly Ser 1795 1800 1805 Met Gly Arg Thr Ala Ala Ser Ile Val Ser Gln Glu Met Ile Cys Ala 1810 1815 1820 Val Val Ser Ala Phe Glu Pro Gln Gly Ala Leu Glu Arg Leu Pro Asp 1825 1830 1835 1840 Gly Pro Arg Ile His Val Pro Arg Lys Thr Ala Leu Arg Pro Thr Val 1845 1850 1855 Ala Arg Arg Val Phe Gln Pro Ala Tyr Ala Pro Ala Val Leu Ser Lys 1860 1865 1870 Phe Asp Pro Arg Thr Glu Ala Asp Val Asp Glu Val Ala Phe Ser Lys 1875 1880 1885 His Thr Ser Asn Gln Glu Ser Leu Pro Pro Val Phe Arg Met Val Ala 1890 1895 1900 Lys Glu Tyr Ala Asn Arg Val Phe Thr Leu Leu Gly Arg Asp Asn Gly 1905 1910 1915 1920 Arg Leu Thr Val Lys Gln Ala Leu Glu Gly Leu Glu Gly Met Asp Pro 1925 1930 1935 Met Asp Lys Asn Thr Ser Pro Gly Leu Pro Tyr Thr Ala Leu Gly Met 1940 1945 1950 Arg Arg Thr Asp Val Val Asp Trp Glu Ser Ala Thr Leu Ile Pro Tyr 1955 1960 1965 Ala Ala Asp Arg Leu Lys Lys Met Asn Glu Gly Asp Phe Ser Asp Ile 1970 1975 1980 Val Tyr Gln Thr Phe Leu Lys Asp Glu Leu Arg Pro Val Glu Lys Val 1985 1990 1995 2000 Gln Ala Ala Lys Thr Arg Ile Val Asp Val Pro Pro Phe Glu His Cys 2005 2010 2015 Ile Leu Gly Arg Gln Leu Leu Gly Arg Phe Ala Ser Lys Phe Gln Thr 2020 2025 2030 Gln Pro Gly Leu Glu Leu Gly Ser Ala Ile Gly Cys Asp Pro Asp Val 2035 2040 2045 His Trp Thr Ala Phe Gly Val Ala Met Gln Gly Phe Glu Arg Val Tyr 2050 2055 2060 Asp Val Asp Tyr Ser Asn Phe Asp Ser Thr His Ser Val Ala Met Phe 2065 2070 2075 2080 Arg Leu Leu Ala Glu Glu Phe Phe Thr Pro Glu Asn Gly Phe Asp Pro 2085 2090 2095 Leu Val Lys Glu Tyr Leu Glu Ser Leu Ala Ile Ser Thr His Ala Phe 2100 2105 2110 Glu Glu Lys Arg Tyr Leu Ile Thr Gly Gly Leu Pro Ser Gly Cys Ala 2115 2120 2125 Ala Thr Ser Met Leu Asn Thr Ile Met Asn Asn Ile Ile Ile Arg Ala 2130 2135 2140 Gly Leu Tyr Leu Thr Tyr Lys Asn Phe Glu Phe Asp Asp Val Lys Val 2145 2150 2155 2160 Leu Ser Tyr Gly Asp Asp Leu Leu Val Ala Thr Asn Tyr Gln Leu Asn 2165 2170 2175 Phe Asp Lys Val Arg Ala Ser Leu Ala Lys Thr Gly Tyr Lys Ile Thr 2180 2185 2190 Pro Ala Asn Lys Thr Ser Thr Phe Pro Leu Asp Ser Thr Leu Glu Asp 2195 2200 2205 Val Val Phe Leu Lys Arg Lys Phe Lys Lys Glu Gly Pro Leu Tyr Arg 2210 2215 2220 Pro Val Met Asn Arg Glu Ala Leu Glu Ala Met Leu Ser Tyr Tyr Arg 2225 2230 2235 2240 Pro Gly Thr Leu Ser Glu Lys Leu Thr Ser Ile Thr Met Leu Ala Val 2245 2250 2255 His Ser Gly Lys Pro Glu Tyr Asp Arg Leu Phe Ala Pro Phe Arg Glu 2260 2265 2270 Val Gly Val Val Val Pro Ser Phe Glu Ser Val Glu Tyr Arg Trp Arg 2275 2280 2285 Ser Leu Phe Trp 2290 <210> 26 <211> 2292 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 26 Met Ala Thr Thr Met Glu Gln Glu Ile Cys Ala His Ser Leu Thr Phe 1 5 10 15 Lys Gly Cys Pro Lys Cys Ser Ala Leu Gln Tyr Arg Asn Gly Phe Tyr 20 25 30 Leu Leu Lys Tyr Asp Glu Glu Trp Tyr Pro Glu Glu Leu Leu Thr Asp 35 40 45 Gly Glu Asp Asp Val Phe Asp Pro Glu Leu Asp Met Glu Val Val Phe 50 55 60 Glu Leu Gln Gly Asn Ser Thr Ser Ser Asp Lys Asn Asn Ser Ser Ser 65 70 75 80 Asp Gly Asn Glu Gly Val Ile Ile Asn Asn Phe Tyr Ser Asn Gln Tyr 85 90 95 Gln Asn Ser Ile Asp Leu Ser Ala Asn Ala Thr Gly Ser Asp Pro Pro 100 105 110 Arg Thr Tyr Gly Gln Phe Ser Asn Leu Leu Ser Gly Ala Val Asn Ala 115 120 125 Phe Ser Asn Met Ile Pro Leu Leu Ala Asp Gln Asn Thr Glu Glu Met 130 135 140 Glu Asn Leu Ser Asp Arg Val Leu Gln Asp Thr Ala Gly Asn Thr Val 145 150 155 160 Thr Asn Thr Gln Ser Thr Val Gly Arg Leu Val Gly Tyr Gly Ala Val 165 170 175 His Asp Gly Glu His Pro Ala Ser Cys Ala Asp Thr Ala Ser Glu Lys 180 185 190 Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Tyr Thr Phe Lys Val Asn Asp Trp Thr 195 200 205 Ser Thr Gln Lys Pro Phe Glu Tyr Ile Arg Ile Pro Leu Pro His Val 210 215 220 Leu Ser Gly Glu Asp Gly Gly Val Phe Gly Ala Ala Leu Arg Arg His 225 230 235 240 Tyr Leu Val Lys Thr Gly Trp Arg Val Gln Val Gln Cys Asn Ala Ser 245 250 255 Gln Phe His Ala Gly Ser Leu Leu Val Phe Met Ala Pro Glu Tyr Pro 260 265 270 Thr Leu Asp Ala Phe Ala Met Asp Asn Arg Trp Ser Lys Asp Asn Leu 275 280 285 Pro Asn Gly Thr Lys Thr Gln Thr Asn Arg Lys Gly Pro Phe Ala Met 290 295 300 Asp His Gln Asn Phe Trp Gln Trp Thr Leu Tyr Pro His Gln Phe Leu 305 310 315 320 Asn Leu Arg Thr Asn Thr Thr Val Asp Leu Glu Val Pro Tyr Val Asn 325 330 335 Ile Ala Pro Thr Ser Ser Trp Thr Gln His Ala Ser Trp Thr Leu Val 340 345 350 Ile Ala Val Val Ala Pro Leu Thr Tyr Ser Thr Gly Ala Ser Thr Ser 355 360 365 Leu Asp Ile Thr Ala Ser Ile Gln Pro Val Arg Pro Val Phe Asn Gly 370 375 380 Leu Arg His Glu Thr Leu Ser Arg Gln Ser Pro Ile Pro Val Thr Ile 385 390 395 400 Arg Glu His Ala Gly Thr Trp Tyr Ser Thr Leu Pro Asp Ser Thr Val 405 410 415 Pro Ile Tyr Gly Lys Thr Pro Val Ala Pro Ala Asn Tyr Met Val Gly 420 425 430 Glu Tyr Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Gln Ile Pro Thr Phe Ile Gly 435 440 445 Asn Lys Ile Pro Asn Ala Val Pro Tyr Ile Glu Ala Ser Asn Thr Ala 450 455 460 Val Lys Thr Gln Pro Leu Ala Thr Tyr Gln Val Thr Leu Ser Cys Ser 465 470 475 480 Cys Leu Ala Asn Thr Phe Leu Ala Ala Leu Ser Arg Asn Phe Ala Gln 485 490 495 Tyr Arg Gly Ser Leu Val Tyr Thr Phe Val Phe Thr Gly Thr Ala Met 500 505 510 Met Lys Gly Lys Phe Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Ala Gly Lys 515 520 525 Pro Thr Ser Arg Asp Gln Ala Met Gln Ala Thr Tyr Ala Ile Trp Asp 530 535 540 Leu Gly Leu Asn Ser Ser Tyr Ser Phe Thr Val Pro Phe Ile Ser Pro 545 550 555 560 Thr His Phe Arg Met Val Gly Thr Asp Gln Val Asn Ile Thr Asn Val 565 570 575 Asp Gly Trp Val Thr Val Trp Gln Leu Thr Pro Leu Thr Tyr Pro Pro 580 585 590 Gly Cys Pro Thr Ser Ala Lys Ile Leu Thr Met Val Ser Ala Gly Lys 595 600 605 Asp Phe Ser Leu Lys Met Pro Ile Ser Pro Ala Pro Trp Ser Pro Gln 610 615 620 Gly Val Glu Asn Ala Glu Arg Gly Val Thr Glu Asp Thr Asp Ala Thr 625 630 635 640 Ala Asp Phe Val Ala Gln Pro Val Tyr Leu Pro Glu Asn Gln Thr Lys 645 650 655 Val Ala Phe Phe Tyr Asp Arg Ser Ser Pro Ile Gly Ala Phe Ala Val 660 665 670 Lys Ser Gly Ser Leu Glu Ser Gly Phe Ala Pro Phe Ser Asn Glu Thr 675 680 685 Cys Pro Asn Ser Val Ile Leu Thr Pro Gly Pro Gln Phe Asp Pro Ala 690 695 700 Tyr Asp Gln Leu Arg Pro Gln Arg Leu Thr Glu Ile Trp Gly Asn Gly 705 710 715 720 Asn Glu Glu Thr Ser Lys Val Phe Pro Leu Lys Ser Lys Gln Asp Tyr 725 730 735 Ser Phe Cys Leu Phe Ser Pro Phe Val Tyr Tyr Lys Cys Asp Leu Glu 740 745 750 Val Thr Leu Ser Pro His Thr Ser Gly Asn His Gly Leu Leu Val Arg 755 760 765 Trp Cys Pro Thr Gly Thr Pro Ala Lys Pro Thr Thr Gln Val Leu His 770 775 780 Glu Val Ser Ser Leu Ser Glu Gly Arg Thr Pro Gln Val Tyr Ser Ala 785 790 795 800 Gly Pro Gly Ile Ser Asn Gln Ile Ser Phe Val Val Pro Tyr Asn Ser 805 810 815 Pro Leu Ser Val Leu Pro Ala Val Trp Tyr Asn Gly His Lys Arg Phe 820 825 830 Asp Asn Thr Gly Ser Leu Gly Ile Ala Pro Asn Ser Asp Phe Gly Thr 835 840 845 Leu Phe Phe Ala Gly Thr Lys Pro Asp Ile Lys Phe Thr Val Tyr Leu 850 855 860 Arg Tyr Lys Asn Met Arg Val Phe Cys Pro Arg Pro Thr Val Phe Phe 865 870 875 880 Pro Trp Pro Ser Ser Gly Asp Lys Ile Asp Met Thr Pro Arg Ala Gly 885 890 895 Val Leu Met Leu Glu Ser Pro Asn Ala Leu Asp Ile Ser Arg Thr Tyr 900 905 910 Pro Thr Leu His Ile Leu Ile Gln Phe Asn His Gly Gly Leu Glu Ile 915 920 925 Arg Leu Phe Arg His Gly Met Phe Trp Ala Glu Ala His Ala Asp Val 930 935 940 Ile Leu Arg Ser Arg Thr Lys Gln Ile Ser Phe Leu Asn Asn Gly Ser 945 950 955 960 Phe Pro Ser Met Asp Ala Arg Ala Pro Trp Asn Pro Trp Lys Asn Thr 965 970 975 Tyr His Ala Val Leu Arg Ala Glu Pro Tyr Arg Val Thr Met Asp Val 980 985 990 Tyr His Lys Arg Ile Arg Pro Phe Arg Leu Pro Leu Val Gln Lys Glu 995 1000 1005 Trp Asn Val Arg Glu Glu Asn Val Phe Gly Leu Tyr Gly Ile Phe Asn 1010 1015 1020 Ala His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ala Asp Leu Leu Ile His Asp Ile Glu 1025 1030 1035 1040 Thr Asn Pro Gly Pro Phe Met Ala Lys Pro Lys Lys Gln Val Phe Gln 1045 1050 1055 Thr Gln Gly Ala Ala Val Ser Ser Met Ala Gln Thr Leu Leu Pro Asn 1060 1065 1070 Asp Leu Ala Ser Lys Val Met Gly Ser Ala Phe Thr Ala Leu Leu Asp 1075 1080 1085 Ala Asn Glu Asp Ala Gln Lys Ala Met Arg Ile Ile Lys Thr Leu Ser 1090 1095 1100 Ser Leu Ser Asp Ala Trp Glu Asn Val Lys Glu Thr Leu Asn Asn Pro 1105 1110 1115 1120 Glu Phe Trp Lys Gln Leu Leu Ser Arg Cys Val Gln Leu Ile Ala Gly 1125 1130 1135 Met Thr Ile Ala Val Met His Pro Asp Pro Leu Thr Leu Leu Cys Leu 1140 1145 1150 Gly Thr Leu Thr Ala Ala Glu Ile Thr Ser Gln Thr Ser Leu Cys Glu 1155 1160 1165 Glu Ile Val Ala Lys Phe Lys Lys Ile Phe Thr Thr Pro Pro Pro Arg 1170 1175 1180 Phe Pro Thr Ile Ser Leu Phe Gln Gln Gln Ser Pro Leu Lys Gln Val 1185 1190 1195 1200 Asn Asp Val Phe Ser Leu Ala Lys Asn Leu Asp Trp Ala Val Lys Thr 1205 1210 1215 Val Glu Lys Val Val Asp Trp Phe Gly Thr Trp Val Val Gln Glu Glu 1220 1225 1230 Lys Glu Gln Thr Leu Asp Gln Leu Leu Gln Arg Phe Pro Glu His Ala 1235 1240 1245 Lys Arg Ile Ser Asp Leu Arg Asn Gly Met Ser Ala Tyr Val Glu Cys 1250 1255 1260 Lys Glu Ser Phe Asp Phe Phe Glu Lys Leu Tyr Asn Gln Ala Val Lys 1265 1270 1275 1280 Glu Lys Arg Thr Gly Ile Ala Ala Val Cys Glu Lys Phe Arg Gln Lys 1285 1290 1295 His Asp His Ala Thr Ala Arg Cys Glu Pro Val Val Ile Val Leu Arg 1300 1305 1310 Gly Asp Ala Gly Gln Gly Lys Ser Leu Ser Ser Gln Val Ile Ala Gln 1315 1320 1325 Ala Val Ser Lys Thr Ile Phe Gly Arg Gln Ser Val Tyr Ser Leu Pro 1330 1335 1340 Pro Asp Ser Asp Phe Phe Asp Gly Tyr Glu Asn Gln Phe Ala Ala Ile 1345 1350 1355 1360 Met Asp Asp Leu Gly Gln Asn Pro Asp Gly Ser Asp Phe Thr Thr Phe 1365 1370 1375 Cys Gln Met Val Ser Thr Thr Asn Phe Leu Pro Asn Met Ala Ser Leu 1380 1385 1390 Glu Arg Asn Gly Thr Pro Phe Thr Ser Gln Ile Val Val Ala Thr Thr 1395 1400 1405 Asn Leu Pro Glu Phe Arg Pro Val Thr Ile Ala His Tyr Pro Ala Val 1410 1415 1420 Glu Arg Arg Ile Thr Phe Asp Tyr Ser Val Ser Ala Gly Pro Val Cys 1425 1430 1435 1440 Ser Lys Thr Glu Ala Gly Tyr Lys Val Leu Asp Val Glu Arg Ala Phe 1445 1450 1455 Arg Pro Thr Gly Asp Ala Pro Leu Pro Cys Phe Gln Asn Asn Cys Leu 1460 1465 1470 Phe Leu Glu Lys Ala Gly Leu Gln Phe Arg Asp Asn Arg Thr Lys Glu 1475 1480 1485 Ile Leu Ser Leu Val Asp Val Ile Glu Arg Ala Val Ala Arg Ile Glu 1490 1495 1500 Arg Lys Lys Lys Val Leu Thr Thr Val Gln Thr Leu Val Ala Gln Ala 1505 1510 1515 1520 Pro Val Ala Glu Val Ser Phe His Ser Val Val Gln Gln Leu Lys Ala 1525 1530 1535 Arg Gln Glu Ala Thr Asp Glu Gln Leu Glu Glu Leu Gln Glu Ala Phe 1540 1545 1550 Ala Lys Thr Gln Glu Arg Ser Ser Val Phe Ser Asp Trp Met Lys Ile 1555 1560 1565 Ser Ala Met Leu Cys Ala Ala Thr Leu Ala Leu Ser Gln Val Val Lys 1570 1575 1580 Met Ala Lys Thr Val Lys Gln Met Val Arg Pro Asp Leu Val Arg Val 1585 1590 1595 1600 Gln Leu Asp Glu Gln Glu Gln Gly Pro Tyr Asn Glu Ala Val Arg Ala 1605 1610 1615 Lys Pro Lys Thr Leu Gln Leu Leu Asp Ile Gln Gly Pro Asn Pro Val 1620 1625 1630 Met Asp Phe Glu Lys Tyr Val Ala Lys Phe Val Thr Ala Pro Ile Asp 1635 1640 1645 Phe Val Tyr Pro Thr Gly Val Ser Thr Gln Thr Cys Leu Leu Val Lys 1650 1655 1660 Gly Arg Thr Leu Ala Val Asn Arg His Met Ala Glu Ser Asp Trp Ser 1665 1670 1675 1680 Ser Ile Val Val Arg Gly Val Thr His Ala Arg Ser Thr Val Arg Ile 1685 1690 1695 Leu Ala Ile Ala Lys Ala Gly Lys Glu Thr Asp Val Ser Phe Ile Arg 1700 1705 1710 Leu Ser Ser Gly Pro Leu Phe Arg Asp Asn Thr Ser Lys Phe Val Lys 1715 1720 1725 Ala Asp Asp Val Leu Pro Ala Thr Ser Ala Pro Val Ile Gly Ile Met 1730 1735 1740 Asn Thr Asp Ile Pro Met Met Phe Thr Gly Thr Phe Leu Lys Ala Gly 1745 1750 1755 1760 Val Ser Val Pro Val Glu Thr Gly Gln Thr Phe Asn His Cys Ile His 1765 1770 1775 Tyr Lys Ala Asn Thr Arg Lys Gly Trp Cys Gly Ser Ala Leu Leu Ala 1780 1785 1790 Asp Leu Gly Gly Lys Lys Lys Ile Leu Gly Met His Ser Ala Gly Ser 1795 1800 1805 Met Gly Arg Thr Ala Ala Ser Ile Val Ser Gln Glu Met Ile Cys Ala 1810 1815 1820 Val Val Ser Ala Phe Glu Pro Gln Gly Ala Leu Glu Arg Leu Pro Asp 1825 1830 1835 1840 Gly Pro Arg Ile His Val Pro Arg Lys Thr Ala Leu Arg Pro Thr Val 1845 1850 1855 Ala Arg Arg Val Phe Gln Pro Ala Tyr Ala Pro Ala Val Leu Ser Lys 1860 1865 1870 Phe Asp Pro Arg Thr Glu Ala Asp Val Asp Glu Val Ala Phe Ser Lys 1875 1880 1885 His Thr Ser Asn Gln Glu Ser Leu Pro Pro Val Phe Arg Met Val Ala 1890 1895 1900 Lys Glu Tyr Ala Asn Arg Val Phe Thr Leu Leu Gly Arg Asp Asn Gly 1905 1910 1915 1920 Arg Leu Thr Val Lys Gln Ala Leu Glu Gly Leu Glu Gly Met Asp Pro 1925 1930 1935 Met Asp Lys Asn Thr Ser Pro Gly Leu Pro Tyr Thr Ala Leu Gly Met 1940 1945 1950 Arg Arg Thr Asp Val Val Asp Trp Glu Ser Ala Thr Leu Ile Pro Tyr 1955 1960 1965 Ala Ala Asp Arg Leu Lys Lys Met Asn Glu Gly Asp Phe Ser Asp Ile 1970 1975 1980 Val Tyr Gln Thr Phe Leu Lys Asp Glu Leu Arg Pro Val Glu Lys Val 1985 1990 1995 2000 Gln Ala Ala Lys Thr Arg Ile Val Asp Val Pro Pro Phe Glu His Cys 2005 2010 2015 Ile Leu Gly Arg Gln Leu Leu Gly Arg Phe Ala Ser Lys Phe Gln Thr 2020 2025 2030 Gln Pro Gly Leu Glu Leu Gly Ser Ala Ile Gly Cys Asp Pro Asp Val 2035 2040 2045 His Trp Thr Ala Phe Gly Val Ala Met Gln Gly Phe Glu Arg Val Tyr 2050 2055 2060 Asp Val Asp Tyr Ser Asn Phe Asp Ser Thr His Ser Val Ala Met Phe 2065 2070 2075 2080 Arg Leu Leu Ala Glu Glu Phe Phe Thr Pro Glu Asn Gly Phe Asp Pro 2085 2090 2095 Leu Val Lys Glu Tyr Leu Glu Ser Leu Ala Ile Ser Thr His Ala Phe 2100 2105 2110 Glu Glu Lys Arg Tyr Leu Ile Thr Gly Gly Leu Pro Ser Gly Cys Ala 2115 2120 2125 Ala Thr Ser Met Leu Asn Thr Ile Met Asn Asn Ile Ile Ile Arg Ala 2130 2135 2140 Gly Leu Tyr Leu Thr Tyr Lys Asn Phe Glu Phe Asp Asp Val Lys Val 2145 2150 2155 2160 Leu Ser Tyr Gly Asp Asp Leu Leu Val Ala Thr Asn Tyr Gln Leu Asn 2165 2170 2175 Phe Asp Lys Val Arg Ala Ser Leu Ala Lys Thr Gly Tyr Lys Ile Thr 2180 2185 2190 Pro Ala Asn Lys Thr Ser Thr Phe Pro Leu Asp Ser Thr Leu Glu Asp 2195 2200 2205 Val Val Phe Leu Lys Arg Lys Phe Lys Lys Glu Gly Pro Leu Tyr Arg 2210 2215 2220 Pro Val Met Asn Arg Glu Ala Leu Glu Ala Met Leu Ser Tyr Tyr Arg 2225 2230 2235 2240 Pro Gly Thr Leu Ser Glu Lys Leu Thr Ser Ile Thr Met Leu Ala Val 2245 2250 2255 His Ser Gly Lys Pro Glu Tyr Asp Arg Leu Phe Ala Pro Phe Arg Glu 2260 2265 2270 Val Gly Val Val Val Pro Ser Phe Glu Ser Val Glu Tyr Arg Trp Arg 2275 2280 2285 Ser Leu Phe Trp 2290 <210> 27 <211> 2292 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 27 Met Ala Thr Thr Met Glu Gln Glu Ile Cys Ala His Ser Leu Thr Phe 1 5 10 15 Lys Gly Cys Pro Lys Cys Ser Ala Leu Gln Tyr Arg Asn Gly Phe Tyr 20 25 30 Leu Leu Lys Tyr Asp Glu Glu Trp Tyr Pro Glu Glu Leu Leu Thr Asp 35 40 45 Gly Glu Asp Asp Val Phe Asp Pro Glu Leu Asp Met Glu Val Val Phe 50 55 60 Glu Leu Gln Gly Asn Ser Thr Ser Ser Asp Lys Asn Asn Ser Ser Ser 65 70 75 80 Asp Gly Asn Glu Gly Val Ile Ile Asn Asn Phe Tyr Ser Asn Gln Tyr 85 90 95 Gln Asn Ser Ile Asp Leu Ser Ala Asn Ala Thr Gly Ser Asp Pro Pro 100 105 110 Arg Thr Tyr Gly Gln Phe Ser Asn Leu Leu Ser Gly Ala Val Asn Ala 115 120 125 Phe Ser Asn Met Ile Pro Leu Leu Ala Asp Gln Asn Thr Glu Glu Met 130 135 140 Glu Asn Leu Ser Asp Arg Val Leu Gln Asp Thr Ala Gly Asn Thr Val 145 150 155 160 Thr Asn Thr Gln Ser Thr Val Gly Arg Leu Val Gly Tyr Gly Ala Val 165 170 175 His Asp Gly Glu His Pro Ala Ser Cys Ala Asp Thr Ala Ser Glu Lys 180 185 190 Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Tyr Thr Phe Lys Val Asn Asp Trp Thr 195 200 205 Ser Thr Gln Lys Pro Phe Glu Tyr Ile Arg Ile Pro Leu Pro His Val 210 215 220 Leu Ser Gly Glu Asp Gly Gly Val Phe Gly Ala Ala Leu Arg Arg His 225 230 235 240 Tyr Leu Val Lys Thr Gly Trp Pro Val Gln Val Gln Cys Asn Ala Ser 245 250 255 Gln Phe His Ala Gly Ser Leu Leu Val Phe Met Ala Pro Glu Tyr Pro 260 265 270 Thr Leu Asp Ala Phe Ala Met Asp Asn Arg Trp Ser Lys Asp Asn Leu 275 280 285 Pro Asn Gly Thr Lys Thr Gln Thr Asn Arg Lys Gly Pro Phe Ala Met 290 295 300 Asp His Gln Asn Phe Trp Gln Trp Thr Leu Tyr Pro His Gln Phe Leu 305 310 315 320 Asn Leu Arg Thr Asn Thr Thr Val Asp Leu Glu Val Pro Tyr Val Asn 325 330 335 Ile Ala Pro Thr Ser Ser Trp Thr Gln His Ala Ser Trp Thr Leu Val 340 345 350 Ile Ala Val Val Ala Pro Leu Thr Tyr Ser Thr Gly Ala Ser Thr Ser 355 360 365 Leu Asp Ile Thr Ala Ser Ile Gln Pro Val Arg Pro Val Phe Asn Gly 370 375 380 Leu Arg His Glu Thr Leu Ser Arg Gln Ser Pro Ile Pro Val Thr Ile 385 390 395 400 Arg Glu His Ala Gly Thr Trp Tyr Ser Thr Leu Pro Asp Ser Thr Val 405 410 415 Pro Ile Tyr Gly Lys Thr Pro Val Ala Pro Ala Asn Tyr Met Val Gly 420 425 430 Glu Tyr Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Gln Ile Pro Thr Phe Ile Gly 435 440 445 Asn Lys Ile Pro Asn Ala Val Pro Tyr Ile Glu Ala Ser Asn Thr Ala 450 455 460 Val Lys Thr Gln Pro Leu Ala Thr Tyr Gln Val Thr Leu Ser Cys Ser 465 470 475 480 Cys Leu Ala Asn Thr Phe Leu Ala Ala Leu Ser Arg Asn Phe Ala Gln 485 490 495 Tyr Arg Gly Ser Leu Val Tyr Thr Phe Val Phe Thr Gly Thr Ala Met 500 505 510 Met Lys Gly Lys Phe Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Ala Gly Lys 515 520 525 Pro Thr Ser Arg Asp Gln Ala Met Gln Ala Thr Tyr Ala Ile Trp Asp 530 535 540 Leu Gly Leu Asn Ser Ser Tyr Ser Phe Thr Val Pro Phe Ile Ser Pro 545 550 555 560 Thr His Phe Arg Met Val Gly Thr Asp Gln Val Asn Ile Thr Asn Val 565 570 575 Asp Gly Trp Val Thr Val Trp Gln Leu Thr Pro Leu Thr Tyr Pro Pro 580 585 590 Gly Cys Pro Thr Ser Ala Lys Ile Leu Thr Met Val Ser Ala Gly Lys 595 600 605 Asp Phe Ser Leu Lys Met Pro Ile Ser Pro Ala Pro Trp Ser Pro Gln 610 615 620 Gly Val Glu Asn Ala Glu Arg Gly Val Thr Glu Asp Thr Asp Ala Thr 625 630 635 640 Ala Asp Phe Val Ala Gln Pro Val Tyr Leu Pro Glu Asn Gln Thr Lys 645 650 655 Val Ala Phe Phe Tyr Asp Arg Ser Ser Pro Ile Gly Ala Phe Thr Val 660 665 670 Lys Ser Gly Ser Leu Glu Ser Gly Phe Ala Pro Phe Ser Asn Glu Thr 675 680 685 Cys Pro Asn Ser Val Ile Leu Thr Pro Gly Pro Gln Phe Asp Pro Ala 690 695 700 Tyr Asp Gln Leu Arg Pro Gln Arg Leu Thr Glu Ile Trp Gly Asn Gly 705 710 715 720 Asn Glu Glu Thr Ser Lys Val Phe Pro Leu Lys Ser Lys Gln Asp Tyr 725 730 735 Ser Phe Cys Leu Phe Ser Pro Phe Val Tyr Tyr Lys Cys Asp Leu Glu 740 745 750 Val Thr Leu Ser Pro His Thr Ser Gly Asn His Gly Leu Leu Val Arg 755 760 765 Trp Cys Pro Thr Gly Thr Pro Ala Lys Pro Thr Thr Gln Val Leu His 770 775 780 Glu Val Ser Ser Leu Ser Glu Gly Arg Thr Pro Gln Val Tyr Ser Ala 785 790 795 800 Gly Pro Gly Val Ser Asn Gln Ile Ser Phe Val Val Pro Tyr Asn Ser 805 810 815 Pro Leu Ser Val Leu Pro Ala Val Trp Tyr Asn Gly His Lys Arg Phe 820 825 830 Asp Asn Thr Gly Ser Leu Gly Ile Ala Pro Asn Ser Asp Phe Gly Thr 835 840 845 Leu Phe Phe Ala Gly Thr Lys Pro Asp Ile Lys Phe Thr Val Tyr Leu 850 855 860 Arg Tyr Lys Asn Met Arg Val Phe Cys Pro Arg Pro Thr Val Phe Phe 865 870 875 880 Pro Trp Pro Ser Ser Gly Asp Lys Ile Asp Met Thr Pro Arg Ala Gly 885 890 895 Val Leu Met Leu Glu Ser Pro Asn Ala Leu Asp Ile Ser Arg Thr Tyr 900 905 910 Pro Thr Leu His Ile Leu Ile Gln Phe Asn His Gly Gly Leu Glu Ile 915 920 925 Arg Leu Phe Arg His Val Gln Phe Trp Ala Glu Ala His Ala Asp Val 930 935 940 Ile Leu Arg Ser Arg Thr Lys Gln Ile Ser Phe Leu Asn Asn Gly Ser 945 950 955 960 Phe Pro Ser Met Asp Ala Arg Ala Pro Trp Asn Pro Trp Lys Asn Thr 965 970 975 Tyr His Ala Val Leu Arg Ala Glu Pro Tyr Arg Val Thr Met Asp Val 980 985 990 Tyr His Lys Arg Ile Arg Pro Phe Arg Leu Pro Leu Val Gln Lys Glu 995 1000 1005 Trp Asn Val Arg Glu Glu Asn Val Phe Gly Leu Tyr Gly Ile Phe Asn 1010 1015 1020 Ala His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ala Asp Leu Leu Ile His Asp Ile Glu 1025 1030 1035 1040 Thr Asn Pro Gly Pro Phe Met Ala Lys Pro Lys Lys Gln Val Phe Gln 1045 1050 1055 Thr Gln Gly Ala Ala Val Ser Ser Met Ala Gln Thr Leu Leu Pro Asn 1060 1065 1070 Asp Leu Ala Ser Lys Val Met Gly Ser Ala Phe Thr Ala Leu Leu Asp 1075 1080 1085 Ala Asn Glu Asp Ala Gln Lys Ala Met Arg Ile Ile Lys Thr Leu Ser 1090 1095 1100 Ser Leu Ser Asp Ala Trp Glu Asn Val Lys Glu Thr Leu Asn Asn Pro 1105 1110 1115 1120 Glu Phe Trp Lys Gln Leu Leu Ser Arg Cys Val Gln Leu Ile Ala Gly 1125 1130 1135 Met Thr Ile Ala Val Met His Pro Asp Pro Leu Thr Leu Leu Cys Leu 1140 1145 1150 Gly Thr Leu Thr Ala Ala Glu Ile Thr Ser Gln Thr Ser Leu Cys Glu 1155 1160 1165 Glu Ile Val Ala Lys Phe Lys Lys Ile Phe Thr Thr Pro Pro Pro Arg 1170 1175 1180 Phe Pro Thr Ile Ser Leu Phe Gln Gln Gln Ser Pro Leu Lys Gln Val 1185 1190 1195 1200 Asn Asp Val Phe Ser Leu Ala Lys Asn Leu Asp Trp Ala Val Lys Thr 1205 1210 1215 Val Glu Lys Val Val Asp Trp Phe Gly Thr Trp Val Val Gln Glu Glu 1220 1225 1230 Lys Glu Gln Thr Leu Asp Gln Leu Leu Gln Arg Phe Pro Glu His Ala 1235 1240 1245 Lys Arg Ile Ser Asp Leu Arg Asn Gly Met Ser Ala Tyr Val Glu Cys 1250 1255 1260 Lys Glu Ser Phe Asp Phe Phe Glu Lys Leu Tyr Asn Gln Ala Val Lys 1265 1270 1275 1280 Glu Lys Arg Thr Gly Ile Ala Ala Val Cys Glu Lys Phe Arg Gln Lys 1285 1290 1295 His Asp His Ala Thr Ala Arg Cys Glu Pro Val Val Ile Val Leu Arg 1300 1305 1310 Gly Asp Ala Gly Gln Gly Lys Ser Leu Ser Ser Gln Val Ile Ala Gln 1315 1320 1325 Ala Val Ser Lys Thr Ile Phe Gly Arg Gln Ser Val Tyr Ser Leu Pro 1330 1335 1340 Pro Asp Ser Asp Phe Phe Asp Gly Tyr Glu Asn Gln Phe Ala Ala Ile 1345 1350 1355 1360 Met Asp Asp Leu Gly Gln Asn Pro Asp Gly Ser Asp Phe Thr Thr Phe 1365 1370 1375 Cys Gln Met Val Ser Thr Thr Asn Phe Leu Pro Asn Met Ala Ser Leu 1380 1385 1390 Glu Arg Asn Gly Thr Pro Phe Thr Ser Gln Leu Val Val Ala Thr Thr 1395 1400 1405 Asn Leu Pro Glu Phe Arg Pro Val Thr Ile Ala His Tyr Pro Ala Val 1410 1415 1420 Glu Arg Arg Ile Thr Phe Asp Tyr Ser Val Ser Ala Gly Pro Val Cys 1425 1430 1435 1440 Ser Lys Thr Glu Ala Gly Tyr Lys Val Leu Asp Val Glu Arg Ala Phe 1445 1450 1455 Arg Pro Thr Gly Asp Ala Pro Leu Pro Cys Phe Gln Asn Asn Cys Leu 1460 1465 1470 Phe Leu Glu Lys Ala Gly Leu Gln Phe Arg Asp Asn Arg Thr Lys Glu 1475 1480 1485 Ile Leu Ser Leu Val Asp Val Ile Glu Arg Ala Val Ala Arg Ile Glu 1490 1495 1500 Arg Lys Lys Lys Val Leu Thr Thr Val Gln Thr Leu Val Ala Gln Ala 1505 1510 1515 1520 Pro Val Ala Glu Val Ser Phe His Ser Val Val Gln Gln Leu Lys Ala 1525 1530 1535 Arg Gln Glu Ala Thr Asp Glu Gln Leu Glu Glu Leu Gln Glu Ala Phe 1540 1545 1550 Ala Lys Thr Gln Glu Arg Ser Ser Val Phe Ser Asp Trp Met Lys Ile 1555 1560 1565 Ser Ala Met Leu Cys Ala Ala Thr Leu Ala Leu Thr Gln Val Val Lys 1570 1575 1580 Met Ala Lys Thr Val Lys Gln Met Val Arg Pro Asp Leu Val Arg Val 1585 1590 1595 1600 Gln Leu Asp Glu Gln Glu Gln Gly Pro Tyr Asn Glu Ala Val Arg Ala 1605 1610 1615 Lys Pro Lys Thr Leu Gln Leu Leu Asp Ile Gln Gly Pro Asn Pro Val 1620 1625 1630 Met Asp Phe Glu Lys Tyr Val Ala Lys Phe Val Thr Ala Pro Ile Asp 1635 1640 1645 Phe Val Tyr Pro Thr Gly Val Ser Thr Gln Thr Cys Leu Leu Val Lys 1650 1655 1660 Gly Arg Thr Leu Ala Val Asn Arg His Met Ala Glu Ser Asp Trp Ser 1665 1670 1675 1680 Ser Ile Val Val Arg Gly Val Thr His Ala Arg Ser Thr Val Arg Ile 1685 1690 1695 Leu Ala Ile Ala Lys Ala Gly Lys Glu Thr Asp Val Ser Phe Ile Arg 1700 1705 1710 Leu Ser Ser Gly Pro Leu Phe Arg Asp Asn Thr Ser Lys Phe Val Lys 1715 1720 1725 Ala Asp Asp Val Leu Pro Ala Thr Ser Ala Pro Val Ile Gly Ile Met 1730 1735 1740 Asn Thr Asp Ile Pro Met Met Phe Thr Gly Thr Phe Leu Lys Ala Gly 1745 1750 1755 1760 Val Ser Val Pro Val Glu Thr Gly Gln Thr Phe Asn His Cys Ile His 1765 1770 1775 Tyr Lys Ala Asn Thr Arg Lys Gly Trp Cys Gly Ser Ala Leu Leu Ala 1780 1785 1790 Asp Leu Gly Gly Lys Lys Lys Ile Leu Gly Met His Ser Ala Gly Ser 1795 1800 1805 Met Gly Val Ala Ala Ala Ser Ile Val Ser Gln Glu Met Ile Cys Ala 1810 1815 1820 Val Val Ser Ala Phe Glu Pro Gln Gly Ala Leu Glu Arg Leu Pro Asp 1825 1830 1835 1840 Gly Pro Arg Ile His Val Pro Arg Lys Thr Ala Leu Arg Pro Thr Val 1845 1850 1855 Ala Arg Gln Val Phe Gln Pro Ala Tyr Ala Pro Ala Val Leu Ser Lys 1860 1865 1870 Phe Asp Pro Arg Thr Glu Ala Asp Val Asp Glu Val Ala Phe Ser Lys 1875 1880 1885 His Thr Ser Asn Gln Glu Ser Leu Pro Pro Val Phe Arg Met Val Ala 1890 1895 1900 Lys Glu Tyr Ala Asn Arg Val Phe Thr Leu Leu Gly Arg Asp Asn Gly 1905 1910 1915 1920 Arg Leu Thr Val Lys Gln Ala Leu Glu Gly Leu Glu Gly Met Asp Pro 1925 1930 1935 Met Asp Lys Asn Thr Ser Pro Gly Leu Pro Tyr Thr Ala Leu Gly Met 1940 1945 1950 Arg Arg Thr Asp Val Val Asp Trp Glu Ser Ala Thr Leu Ile Pro Tyr 1955 1960 1965 Ala Ala Asp Arg Leu Lys Lys Met Asn Glu Gly Asp Phe Ser Asp Ile 1970 1975 1980 Val Tyr Gln Thr Phe Leu Lys Asp Glu Leu Arg Pro Val Glu Lys Val 1985 1990 1995 2000 Gln Ala Ala Lys Thr Arg Ile Val Asp Val Pro Pro Phe Glu His Cys 2005 2010 2015 Ile Leu Gly Arg Gln Leu Leu Gly Arg Phe Ala Ser Lys Phe Gln Thr 2020 2025 2030 Gln Pro Gly Leu Glu Leu Gly Ser Ala Ile Gly Cys Asp Pro Asp Val 2035 2040 2045 His Trp Thr Ala Phe Gly Val Ala Met Gln Gly Phe Glu Arg Val Tyr 2050 2055 2060 Asp Val Asp Tyr Ser Asn Phe Asp Ser Thr His Ser Val Ala Met Phe 2065 2070 2075 2080 Arg Leu Leu Ala Glu Glu Phe Phe Thr Pro Glu Asn Gly Phe Asp Pro 2085 2090 2095 Leu Val Lys Glu Tyr Leu Glu Ser Leu Ala Ile Ser Thr His Ala Phe 2100 2105 2110 Glu Glu Lys Arg Tyr Leu Ile Thr Gly Gly Leu Pro Ser Gly Cys Ala 2115 2120 2125 Ala Thr Ser Met Leu Asn Thr Ile Met Asn Asn Ile Ile Ile Arg Ala 2130 2135 2140 Gly Leu Tyr Leu Thr Tyr Lys Asn Phe Glu Phe Asp Asp Val Lys Val 2145 2150 2155 2160 Leu Ser Tyr Gly Asp Asp Leu Leu Val Ala Thr Asn Tyr Gln Leu Asn 2165 2170 2175 Phe Asp Lys Val Arg Ala Ser Leu Ala Lys Thr Gly Tyr Lys Ile Thr 2180 2185 2190 Pro Ala Asn Lys Thr Ser Thr Phe Pro Leu Asp Ser Thr Leu Glu Asp 2195 2200 2205 Val Val Phe Leu Lys Arg Lys Phe Lys Lys Glu Gly Pro Leu Tyr Arg 2210 2215 2220 Pro Val Met Asn Arg Glu Ala Leu Glu Ala Met Leu Ser Tyr Tyr Arg 2225 2230 2235 2240 Pro Gly Thr Leu Ser Glu Lys Leu Thr Ser Ile Thr Met Leu Ala Val 2245 2250 2255 His Ser Gly Lys Pro Glu Tyr Asp Arg Leu Phe Ala Pro Phe Arg Glu 2260 2265 2270 Val Gly Val Val Val Pro Ser Phe Glu Ser Val Glu Tyr Arg Trp Arg 2275 2280 2285 Ser Leu Phe Trp 2290 <210> 28 <211> 2292 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 28 Met Ala Thr Thr Met Glu Gln Glu Ile Cys Ala His Ser Leu Thr Phe 1 5 10 15 Lys Gly Cys Pro Lys Cys Ser Ala Leu Gln Tyr Arg Asn Gly Phe Tyr 20 25 30 Leu Leu Lys Tyr Asp Glu Glu Trp Tyr Pro Glu Glu Leu Leu Thr Asp 35 40 45 Gly Glu Asp Asp Val Phe Asp Pro Glu Leu Asp Met Glu Val Val Phe 50 55 60 Glu Leu Gln Gly Asn Ser Thr Ser Ser Asp Lys Asn Asn Ser Ser Ser 65 70 75 80 Asp Gly Asn Glu Gly Val Ile Ile Asn Asn Phe Tyr Ser Asn Gln Tyr 85 90 95 Gln Asn Ser Ile Asp Leu Ser Ala Asn Ala Thr Gly Ser Asp Pro Pro 100 105 110 Arg Thr Tyr Gly Gln Phe Ser Asn Leu Leu Ser Gly Ala Val Asn Ala 115 120 125 Phe Ser Asn Met Ile Pro Leu Leu Ala Asp Gln Asn Thr Glu Glu Met 130 135 140 Glu Asn Leu Ser Asp Arg Val Leu Gln Asp Thr Ala Gly Asn Thr Val 145 150 155 160 Thr Asn Thr Gln Ser Thr Val Gly Arg Leu Val Gly Tyr Gly Ala Val 165 170 175 His Asp Gly Glu His Pro Ala Ser Cys Ala Asp Thr Ala Ser Glu Lys 180 185 190 Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Tyr Thr Phe Lys Val Asn Asp Trp Thr 195 200 205 Ser Thr Gln Lys Pro Phe Glu Tyr Ile Arg Ile Pro Leu Pro His Val 210 215 220 Leu Ser Gly Glu Asp Gly Gly Val Phe Gly Ala Ala Leu Arg Arg His 225 230 235 240 Tyr Leu Val Lys Thr Gly Trp Arg Val Gln Val Gln Cys Asn Ala Ser 245 250 255 Gln Phe His Ala Gly Ser Leu Leu Val Phe Met Ala Pro Glu Tyr Pro 260 265 270 Thr Leu Asp Ala Phe Ala Met Asp Asn Arg Trp Ser Lys Asp Asn Leu 275 280 285 Pro Asn Gly Thr Lys Thr Gln Thr Asn Arg Lys Gly Pro Phe Ala Met 290 295 300 Asp His Gln Asn Phe Trp Gln Trp Thr Leu Tyr Pro His Gln Phe Leu 305 310 315 320 Asn Leu Arg Thr Asn Thr Thr Val Asp Leu Glu Val Pro Tyr Val Asn 325 330 335 Ile Ala Pro Thr Ser Ser Trp Thr Gln His Ala Ser Trp Thr Leu Val 340 345 350 Ile Ala Val Val Ala Pro Leu Thr Tyr Ser Thr Gly Ala Ser Thr Ser 355 360 365 Leu Asp Ile Thr Ala Ser Ile Gln Pro Val Arg Pro Val Phe Asn Gly 370 375 380 Leu Arg His Glu Thr Leu Ser Arg Gln Ser Pro Ile Pro Val Thr Ile 385 390 395 400 Arg Glu His Ala Gly Thr Trp Tyr Ser Thr Leu Pro Asp Ser Thr Val 405 410 415 Pro Ile Tyr Gly Lys Thr Pro Val Ala Pro Ala Asn Tyr Met Val Gly 420 425 430 Glu Tyr Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Gln Ile Pro Thr Phe Ile Gly 435 440 445 Asn Lys Ile Pro Asn Ala Val Pro Tyr Ile Glu Ala Ser Asn Thr Ala 450 455 460 Val Lys Thr Gln Pro Leu Ala Thr Tyr Gln Val Thr Leu Ser Cys Ser 465 470 475 480 Cys Leu Ala Asn Thr Phe Leu Ala Ala Leu Ser Arg Asn Phe Ala Gln 485 490 495 Tyr Arg Gly Ser Leu Val Tyr Thr Phe Val Phe Thr Gly Thr Ala Met 500 505 510 Met Lys Gly Lys Phe Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Ala Gly Lys 515 520 525 Pro Thr Ser Arg Asp Gln Ala Met Gln Ala Thr Tyr Ala Ile Trp Asp 530 535 540 Leu Gly Leu Asn Ser Ser Tyr Ser Phe Thr Val Pro Phe Ile Ser Pro 545 550 555 560 Thr His Phe Arg Met Val Gly Thr Asp Gln Val Asn Ile Thr Asn Val 565 570 575 Asp Gly Trp Val Thr Val Trp Gln Leu Thr Pro Leu Thr Tyr Pro Pro 580 585 590 Gly Cys Pro Thr Ser Ala Lys Ile Leu Thr Met Val Ser Ala Gly Lys 595 600 605 Asp Phe Ser Leu Lys Met Pro Ile Ser Pro Ala Pro Trp Ser Pro Gln 610 615 620 Gly Val Glu Asn Ala Glu Arg Gly Val Thr Glu Asp Thr Asp Ala Thr 625 630 635 640 Ala Asp Phe Val Ala Gln Pro Val Tyr Leu Pro Glu Asn Gln Thr Lys 645 650 655 Val Ala Phe Phe Tyr Asp Arg Ser Ser Pro Ile Gly Ala Phe Thr Val 660 665 670 Lys Ser Gly Ser Leu Glu Ser Gly Phe Ala Pro Phe Ser Asn Lys Thr 675 680 685 Cys Pro Asn Ser Val Ile Leu Thr Pro Gly Pro Gln Phe Asp Pro Ala 690 695 700 Tyr Asp Gln Leu Arg Pro Gln Arg Leu Thr Glu Ile Trp Gly Asn Arg 705 710 715 720 Asn Glu Glu Thr Ser Lys Val Phe Pro Leu Lys Ser Lys Gln Asp Tyr 725 730 735 Ser Phe Cys Leu Phe Ser Pro Phe Val Tyr Tyr Lys Cys Asp Leu Glu 740 745 750 Val Thr Leu Ser Pro His Thr Ser Gly Asn His Gly Leu Leu Val Arg 755 760 765 Trp Cys Pro Thr Gly Thr Pro Ala Lys Pro Thr Thr Gln Val Leu His 770 775 780 Glu Val Ser Ser Leu Ser Glu Gly Arg Thr Pro Gln Val Tyr Ser Ala 785 790 795 800 Gly Pro Gly Ile Ser Asn Gln Ile Ser Phe Val Val Pro Tyr Asn Ser 805 810 815 Pro Leu Ser Val Leu Pro Ala Val Trp Tyr Asn Gly His Lys Arg Phe 820 825 830 Asp Asn Thr Gly Ser Leu Gly Ile Ala Pro Asn Ser Asp Phe Gly Thr 835 840 845 Leu Phe Phe Ala Gly Thr Lys Pro Asp Ile Lys Phe Thr Val Tyr Leu 850 855 860 Arg Tyr Lys Asn Met Arg Val Phe Cys Pro Arg Pro Thr Val Phe Phe 865 870 875 880 Pro Trp Pro Ser Ser Gly Asp Lys Ile Asp Met Thr Pro Arg Ala Gly 885 890 895 Val Leu Met Leu Glu Ser Pro Asn Ala Leu Asp Ile Ser Arg Thr Tyr 900 905 910 Pro Thr Leu His Ile Leu Ile Gln Phe Asn His Gly Gly Leu Glu Ile 915 920 925 Arg Leu Phe Arg His Gly Gln Phe Trp Ala Glu Ala His Ala Asp Val 930 935 940 Ile Leu Arg Ser Arg Thr Lys Gln Ile Ser Phe Leu Asn Asn Gly Ser 945 950 955 960 Phe Pro Ser Met Asp Ala Arg Ala Pro Trp Asn Pro Trp Lys Asn Thr 965 970 975 Tyr His Ala Val Leu Arg Ala Glu Pro Tyr Arg Val Thr Met Asp Val 980 985 990 Tyr His Lys Arg Ile Arg Pro Phe Arg Leu Pro Leu Val Gln Lys Glu 995 1000 1005 Trp Asn Val Arg Glu Glu Asn Val Phe Gly Leu Tyr Ser Ile Phe Asn 1010 1015 1020 Ala His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ala Asp Leu Leu Ile His Asp Ile Glu 1025 1030 1035 1040 Thr Asn Pro Gly Pro Phe Met Ala Lys Pro Lys Lys Gln Val Phe Gln 1045 1050 1055 Thr Gln Gly Ala Ala Val Ser Ser Met Ala Gln Thr Leu Leu Pro Asn 1060 1065 1070 Asp Leu Ala Ser Lys Val Met Gly Ser Ala Phe Thr Ala Leu Leu Asp 1075 1080 1085 Ala Asn Glu Asp Ala Gln Lys Ala Met Arg Ile Ile Lys Thr Leu Ser 1090 1095 1100 Ser Leu Ser Asp Ala Trp Glu Asn Val Lys Glu Thr Leu Asn Asn Pro 1105 1110 1115 1120 Glu Phe Trp Lys Gln Leu Leu Ser Arg Cys Val Gln Leu Ile Ala Gly 1125 1130 1135 Met Thr Ile Ala Val Met His Pro Asp Pro Leu Thr Leu Leu Cys Leu 1140 1145 1150 Gly Thr Leu Thr Ala Ala Glu Ile Thr Ser Gln Thr Ser Leu Cys Glu 1155 1160 1165 Glu Ile Val Ala Lys Phe Lys Lys Ile Phe Thr Thr Pro Pro Pro Arg 1170 1175 1180 Phe Pro Thr Ile Ser Leu Phe Gln Gln Gln Ser Pro Leu Lys Gln Val 1185 1190 1195 1200 Asn Asp Val Phe Ser Leu Ala Lys Asn Leu Asp Trp Ala Val Lys Thr 1205 1210 1215 Val Glu Lys Val Val Asp Trp Phe Gly Thr Trp Val Val Gln Glu Glu 1220 1225 1230 Lys Glu Gln Thr Leu Asp Gln Leu Leu Gln Arg Phe Pro Glu His Ala 1235 1240 1245 Lys Arg Ile Ser Asp Leu Arg Asn Gly Met Ser Ala Tyr Val Glu Cys 1250 1255 1260 Lys Glu Ser Phe Asp Phe Phe Glu Lys Leu Tyr Asn Gln Ala Val Lys 1265 1270 1275 1280 Glu Lys Arg Thr Gly Ile Ala Ala Val Cys Glu Lys Phe Arg Gln Lys 1285 1290 1295 His Asp His Ala Thr Ala Arg Cys Glu Pro Val Val Ile Val Leu Arg 1300 1305 1310 Gly Asp Ala Gly Gln Gly Lys Ser Leu Ser Ser Gln Val Ile Ala Gln 1315 1320 1325 Ala Val Ser Lys Thr Ile Phe Gly Arg Gln Ser Val Tyr Ser Leu Pro 1330 1335 1340 Pro Asp Ser Asp Phe Phe Asp Gly Tyr Glu Asn Gln Phe Ala Ala Ile 1345 1350 1355 1360 Met Asp Asp Leu Gly Gln Asn Pro Asp Gly Ser Asp Phe Thr Thr Phe 1365 1370 1375 Cys Gln Met Val Ser Thr Thr Asn Phe Leu Pro Asn Met Ala Ser Leu 1380 1385 1390 Glu Arg Lys Gly Thr Pro Phe Thr Ser Gln Leu Val Val Ala Thr Thr 1395 1400 1405 Asn Leu Pro Glu Phe Arg Pro Val Thr Ile Ala His Tyr Pro Ala Val 1410 1415 1420 Glu Arg Arg Ile Thr Phe Asp Tyr Ser Val Ser Ala Gly Pro Val Cys 1425 1430 1435 1440 Ser Lys Thr Glu Ala Gly Tyr Lys Val Leu Asp Val Glu Arg Ala Phe 1445 1450 1455 Arg Pro Thr Gly Asp Ala Pro Leu Pro Cys Phe Gln Asn Asn Cys Leu 1460 1465 1470 Phe Leu Glu Lys Ala Gly Leu Gln Phe Arg Asp Asn Arg Thr Lys Glu 1475 1480 1485 Ile Leu Ser Leu Val Asp Val Ile Glu Arg Ala Val Ala Arg Ile Glu 1490 1495 1500 Arg Lys Lys Lys Val Leu Thr Thr Val Gln Thr Leu Val Ala Gln Ala 1505 1510 1515 1520 Pro Val Asp Glu Val Ser Phe His Ser Val Val Gln Gln Leu Lys Ala 1525 1530 1535 Arg Gln Glu Ala Thr Asp Glu Gln Leu Glu Glu Leu Gln Glu Ala Phe 1540 1545 1550 Ala Lys Thr Gln Glu Arg Ser Ser Val Phe Ser Asp Trp Met Lys Ile 1555 1560 1565 Ser Ala Met Leu Cys Ala Ala Thr Leu Ala Leu Thr Gln Val Val Lys 1570 1575 1580 Met Ala Lys Thr Val Lys Gln Met Val Arg Pro Asp Leu Val Arg Val 1585 1590 1595 1600 Gln Leu Asp Glu Gln Glu Gln Gly Pro Tyr Asn Glu Ala Val Arg Ala 1605 1610 1615 Lys Pro Lys Thr Leu Gln Leu Leu Asp Ile Gln Gly Pro Asn Pro Val 1620 1625 1630 Met Asp Phe Glu Lys Tyr Val Ala Lys Phe Val Thr Ala Pro Ile Asp 1635 1640 1645 Phe Val Tyr Pro Thr Gly Val Ser Thr Gln Thr Cys Leu Leu Val Lys 1650 1655 1660 Gly Arg Thr Leu Ala Val Asn Arg His Met Ala Glu Ser Asp Trp Ser 1665 1670 1675 1680 Ser Ile Val Val Arg Gly Val Thr His Ala Arg Ser Thr Val Arg Ile 1685 1690 1695 Leu Ala Ile Ala Lys Ala Gly Lys Glu Thr Asp Val Ser Phe Ile Arg 1700 1705 1710 Leu Ser Ser Gly Pro Leu Phe Arg Asp Asn Thr Ser Lys Phe Val Lys 1715 1720 1725 Ala Asp Asp Val Leu Pro Ala Thr Ser Ala Pro Val Ile Gly Ile Met 1730 1735 1740 Asn Thr Asp Ile Pro Met Met Phe Thr Gly Thr Phe Leu Lys Ala Gly 1745 1750 1755 1760 Val Ser Val Pro Val Glu Thr Gly Gln Thr Phe Asn His Cys Ile His 1765 1770 1775 Tyr Lys Ala Asn Thr Arg Lys Gly Trp Cys Gly Ser Ala Leu Leu Ala 1780 1785 1790 Asp Leu Gly Gly Lys Lys Lys Ile Leu Gly Met His Ser Ala Gly Ser 1795 1800 1805 Met Gly Arg Thr Ala Ala Ser Ile Val Ser Gln Glu Met Ile Cys Ala 1810 1815 1820 Val Val Ser Ala Phe Glu Pro Gln Gly Ala Leu Glu Arg Leu Pro Asp 1825 1830 1835 1840 Gly Pro Arg Ile His Val Pro Arg Lys Thr Ala Leu Arg Pro Thr Val 1845 1850 1855 Ala Arg Gln Val Phe Gln Pro Ala Tyr Ala Pro Ala Val Leu Ser Lys 1860 1865 1870 Phe Asp Pro Arg Thr Glu Ala Asp Val Asp Glu Val Ala Phe Ser Lys 1875 1880 1885 His Thr Ser Asn Gln Glu Ser Leu Pro Pro Val Phe Arg Met Val Ala 1890 1895 1900 Lys Glu Tyr Ala Asn Arg Val Phe Thr Leu Leu Gly Arg Asp Asn Gly 1905 1910 1915 1920 Arg Leu Thr Val Lys Gln Ala Leu Glu Gly Leu Glu Gly Met Asp Pro 1925 1930 1935 Met Asp Lys Asn Thr Ser Pro Gly Leu Pro Tyr Thr Ala Leu Gly Met 1940 1945 1950 Arg Arg Thr Asp Val Val Asp Trp Glu Ser Ala Thr Leu Ile Pro Tyr 1955 1960 1965 Ala Ala Asp Arg Leu Lys Lys Met Asn Glu Gly Asp Phe Ser Asp Ile 1970 1975 1980 Val Tyr Gln Thr Phe Leu Lys Asp Glu Leu Arg Pro Val Glu Lys Val 1985 1990 1995 2000 Gln Ala Ala Lys Thr Arg Ile Val Asp Val Pro Pro Phe Glu His Cys 2005 2010 2015 Ile Leu Gly Arg Gln Leu Leu Gly Arg Phe Ala Ser Lys Phe Gln Thr 2020 2025 2030 Gln Pro Gly Leu Glu Leu Gly Ser Ala Ile Gly Cys Asp Pro Asp Val 2035 2040 2045 His Trp Thr Ala Phe Gly Val Ala Met Gln Gly Phe Glu Arg Val Tyr 2050 2055 2060 Asp Val Asp Tyr Ser Asn Phe Asp Ser Thr His Ser Val Ala Met Phe 2065 2070 2075 2080 Arg Leu Leu Ala Glu Glu Phe Phe Thr Pro Glu Asn Gly Phe Asp Pro 2085 2090 2095 Leu Val Lys Glu Tyr Leu Glu Ser Leu Ala Ile Ser Thr His Ala Phe 2100 2105 2110 Glu Glu Lys Arg Tyr Leu Ile Thr Gly Gly Leu Pro Ser Gly Cys Ala 2115 2120 2125 Ala Thr Ser Met Leu Asn Thr Ile Met Asn Asn Ile Ile Ile Arg Ala 2130 2135 2140 Gly Leu Tyr Leu Thr Tyr Lys Asn Phe Glu Phe Asp Asp Val Lys Val 2145 2150 2155 2160 Leu Ser Tyr Gly Asp Asp Leu Leu Val Ala Thr Asn Tyr Gln Leu Asn 2165 2170 2175 Phe Asp Lys Val Arg Ala Ser Leu Ala Lys Thr Gly Tyr Lys Ile Thr 2180 2185 2190 Pro Ala Asn Lys Thr Ser Thr Phe Pro Leu Asp Ser Thr Leu Glu Asp 2195 2200 2205 Val Val Phe Leu Lys Arg Lys Phe Lys Lys Glu Gly Pro Leu Tyr Arg 2210 2215 2220 Pro Val Met Asn Arg Glu Ala Leu Glu Ala Met Leu Ser Tyr Tyr Arg 2225 2230 2235 2240 Pro Gly Thr Leu Ser Glu Lys Leu Thr Ser Ile Thr Met Leu Ala Val 2245 2250 2255 His Ser Gly Lys Pro Glu Tyr Asp Arg Leu Phe Ala Pro Phe Arg Glu 2260 2265 2270 Val Gly Val Val Val Pro Ser Phe Glu Ser Val Glu Tyr Arg Trp Arg 2275 2280 2285 Ser Leu Phe Trp 2290 <210> 29 <211> 2293 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 29 Met Ala Thr Thr Met Glu Gln Glu Ile Cys Ala His Ser Met Thr Phe 1 5 10 15 Glu Glu Cys Pro Lys Cys Ser Ala Leu Gln Tyr Arg Asn Gly Phe Tyr 20 25 30 Leu Leu Lys Tyr Asp Glu Glu Trp Tyr Pro Glu Glu Ser Leu Thr Asp 35 40 45 Gly Glu Asp Asp Val Phe Asp Pro Asp Leu Asp Met Glu Val Val Phe 50 55 60 Glu Thr Gln Gly Asn Ser Thr Ser Ser Asp Lys Asn Asn Ser Ser Ser 65 70 75 80 Glu Gly Asn Glu Gly Val Ile Ile Asn Asn Phe Tyr Ser Asn Gln Tyr 85 90 95 Gln Asn Ser Ile Asp Leu Ser Ala Asn Ala Thr Gly Ser Asp Pro Pro 100 105 110 Lys Thr Tyr Gly Gln Phe Ser Asn Leu Leu Ser Gly Ala Val Asn Ala 115 120 125 Phe Ser Asn Met Leu Pro Leu Leu Ala Asp Gln Asn Thr Glu Glu Met 130 135 140 Glu Asn Leu Ser Asp Arg Val Ser Gln Asp Thr Ala Gly Asn Thr Val 145 150 155 160 Thr Asn Thr Gln Ser Thr Val Gly Arg Leu Val Gly Tyr Gly Thr Val 165 170 175 His Asp Gly Glu His Pro Ala Ser Cys Ala Asp Thr Ala Ser Glu Lys 180 185 190 Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Tyr Thr Phe Lys Val Asn Asp Trp Thr 195 200 205 Ser Thr Gln Lys Pro Phe Glu Tyr Ile Arg Ile Pro Leu Pro His Val 210 215 220 Leu Ser Gly Glu Asp Gly Gly Val Phe Gly Ala Thr Leu Arg Arg His 225 230 235 240 Tyr Leu Val Lys Thr Gly Trp Arg Val Gln Val Gln Cys Asn Ala Ser 245 250 255 Gln Phe His Ala Gly Ser Leu Leu Val Phe Met Ala Pro Glu Tyr Pro 260 265 270 Thr Leu Asp Val Phe Ala Met Asp Asn Arg Trp Ser Lys Asp Asn Leu 275 280 285 Pro Asn Gly Thr Arg Thr Gln Thr Asn Arg Lys Gly Pro Phe Ala Met 290 295 300 Asp His Gln Asn Phe Trp Gln Trp Thr Leu Tyr Pro His Gln Phe Leu 305 310 315 320 Asn Leu Arg Thr Asn Thr Thr Val Asp Leu Glu Val Pro Tyr Val Asn 325 330 335 Ile Ala Pro Thr Ser Ser Trp Thr Gln His Ala Ser Trp Thr Leu Val 340 345 350 Ile Ala Val Val Ala Pro Leu Thr Tyr Ser Thr Gly Ala Ser Thr Ser 355 360 365 Leu Asp Ile Thr Ala Ser Ile Gln Pro Val Arg Pro Val Phe Asn Gly 370 375 380 Leu Arg His Glu Val Leu Ser Arg Gln Ser Pro Ile Pro Val Thr Ile 385 390 395 400 Arg Glu His Ala Gly Thr Trp Tyr Ser Thr Leu Pro Asp Ser Thr Val 405 410 415 Pro Ile Tyr Gly Lys Thr Pro Val Ala Pro Ala Asn Tyr Met Val Gly 420 425 430 Glu Tyr Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Gln Ile Pro Thr Phe Ile Gly 435 440 445 Asn Lys Val Pro Asn Ala Val Pro Tyr Ile Glu Ala Ser Asn Thr Ala 450 455 460 Val Lys Thr Gln Pro Leu Ala Val Tyr Gln Val Thr Leu Ser Cys Ser 465 470 475 480 Cys Leu Ala Asn Thr Phe Leu Ala Ala Leu Ser Arg Asn Phe Ala Gln 485 490 495 Tyr Arg Gly Ser Leu Val Tyr Thr Phe Val Phe Thr Gly Thr Ala Met 500 505 510 Met Lys Gly Lys Phe Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Ala Gly Lys 515 520 525 Pro Thr Ser Arg Asp Gln Ala Met Gln Ala Thr Tyr Ala Ile Trp Asp 530 535 540 Leu Gly Leu Asn Ser Ser Tyr Ser Phe Thr Val Pro Phe Ile Ser Pro 545 550 555 560 Thr His Phe Arg Met Val Gly Thr Asp Gln Ala Asn Ile Thr Asn Val 565 570 575 Asp Gly Trp Val Thr Val Trp Gln Leu Thr Pro Leu Thr Tyr Pro Pro 580 585 590 Gly Cys Pro Thr Ser Ala Lys Ile Leu Thr Met Val Ser Ala Gly Lys 595 600 605 Asp Phe Ser Leu Lys Met Pro Ile Ser Pro Ala Pro Trp Ser Pro Gln 610 615 620 Gly Val Glu Asn Ala Glu Lys Gly Val Thr Glu Asn Thr Asp Ala Thr 625 630 635 640 Ala Asp Phe Val Ala Gln Pro Val Tyr Leu Pro Glu Asn Gln Thr Lys 645 650 655 Val Ala Phe Phe Tyr Asp Arg Ser Ser Pro Ile Gly Ala Phe Ala Val 660 665 670 Lys Ser Gly Ser Leu Glu Ser Gly Phe Ala Pro Phe Ser Asn Lys Ala 675 680 685 Cys Pro Asn Ser Val Ile Leu Thr Pro Gly Pro Gln Phe Asp Pro Ala 690 695 700 Tyr Asp Gln Leu Arg Pro Gln Arg Leu Thr Glu Ile Trp Gly Asn Gly 705 710 715 720 Asn Glu Glu Thr Ser Glu Val Phe Pro Leu Lys Thr Lys Gln Asp Tyr 725 730 735 Ser Phe Cys Leu Phe Ser Pro Phe Val Tyr Tyr Lys Cys Asp Leu Glu 740 745 750 Val Thr Leu Ser Pro His Thr Ser Gly Ala His Gly Leu Leu Val Arg 755 760 765 Trp Cys Pro Thr Gly Thr Pro Thr Lys Pro Thr Thr Gln Val Leu His 770 775 780 Glu Val Ser Ser Leu Ser Glu Gly Arg Thr Pro Gln Val Tyr Ser Ala 785 790 795 800 Gly Pro Gly Thr Ser Asn Gln Ile Ser Phe Val Val Pro Tyr Asn Ser 805 810 815 Pro Leu Ser Val Leu Pro Ala Val Trp Tyr Asn Gly His Lys Arg Phe 820 825 830 Asp Asn Thr Gly Asp Leu Gly Ile Ala Pro Asn Ser Asp Phe Gly Thr 835 840 845 Leu Phe Phe Ala Gly Thr Lys Pro Asp Ile Lys Phe Thr Val Tyr Leu 850 855 860 Arg Tyr Lys Asn Met Arg Val Phe Cys Pro Arg Pro Thr Val Phe Phe 865 870 875 880 Pro Trp Pro Thr Ser Gly Asp Lys Ile Asp Met Thr Pro Arg Ala Gly 885 890 895 Val Leu Met Leu Glu Ser Pro Asn Pro Leu Asp Val Ser Lys Thr Tyr 900 905 910 Pro Thr Leu His Ile Leu Leu Gln Phe Asn His Arg Gly Leu Glu Ala 915 920 925 Arg Ile Phe Arg His Gly Gln Leu Trp Ala Glu Thr His Ala Glu Val 930 935 940 Val Leu Arg Ser Lys Thr Lys Gln Ile Ser Phe Leu Ser Asn Gly Ser 945 950 955 960 Tyr Pro Ser Met Asp Ala Thr Thr Pro Leu Asn Pro Trp Lys Ser Thr 965 970 975 Tyr Gln Ala Val Leu Arg Ala Glu Pro His Arg Val Thr Met Asp Val 980 985 990 Tyr His Lys Arg Ile Arg Pro Phe Arg Leu Pro Leu Val Gln Lys Glu 995 1000 1005 Trp Arg Thr Cys Glu Glu Asn Val Phe Gly Leu Tyr His Val Phe Glu 1010 1015 1020 Thr His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ser Asp Leu Leu Ile His Asp Val Glu 1025 1030 1035 1040 Thr Asn Pro Gly Pro Phe Thr Phe Lys Pro Arg Gln Arg Pro Val Phe 1045 1050 1055 Gln Thr Gln Gly Ala Ala Val Ser Ser Met Ala Gln Thr Leu Leu Pro 1060 1065 1070 Asn Asp Leu Ala Ser Lys Ala Met Gly Ser Ala Phe Thr Ala Leu Leu 1075 1080 1085 Asp Ala Asn Glu Asp Ala Gln Lys Ala Met Lys Ile Ile Lys Thr Leu 1090 1095 1100 Ser Ser Leu Ser Asp Ala Trp Glu Asn Val Lys Gly Thr Leu Asn Asn 1105 1110 1115 1120 Pro Glu Phe Trp Lys Gln Leu Leu Ser Arg Cys Val Gln Leu Ile Ala 1125 1130 1135 Gly Met Thr Ile Ala Val Met His Pro Asp Pro Leu Thr Leu Leu Cys 1140 1145 1150 Leu Gly Val Leu Thr Ala Ala Glu Ile Thr Ser Gln Thr Ser Leu Cys 1155 1160 1165 Glu Glu Ile Ala Ala Lys Phe Lys Thr Ile Phe Thr Thr Pro Pro Pro 1170 1175 1180 Arg Phe Pro Val Ile Ser Leu Phe Gln Gln Gln Ser Pro Leu Lys Gln 1185 1190 1195 1200 Val Asn Asp Val Phe Ser Leu Ala Lys Asn Leu Asp Trp Ala Val Lys 1205 1210 1215 Thr Val Glu Lys Val Val Asp Trp Phe Gly Thr Trp Val Ala Gln Glu 1220 1225 1230 Glu Arg Glu Gln Thr Leu Asp Gln Leu Leu Gln Arg Phe Pro Glu His 1235 1240 1245 Ala Lys Arg Ile Ser Asp Leu Arg Asn Gly Met Ala Ala Tyr Val Glu 1250 1255 1260 Cys Lys Glu Ser Phe Asp Phe Phe Glu Lys Leu Tyr Asn Gln Ala Val 1265 1270 1275 1280 Lys Glu Lys Arg Thr Gly Ile Ala Ala Val Cys Glu Lys Phe Arg Gln 1285 1290 1295 Lys His Asp His Ala Thr Ala Arg Cys Glu Pro Val Val Ile Val Leu 1300 1305 1310 Arg Gly Asp Ala Gly Gln Gly Lys Ser Leu Ser Ser Gln Ile Ile Ala 1315 1320 1325 Gln Ala Val Ser Lys Thr Ile Phe Gly Arg Gln Ser Val Tyr Ser Leu 1330 1335 1340 Pro Pro Asp Ser Asp Phe Phe Asp Gly Tyr Glu Asn Gln Phe Ala Ala 1345 1350 1355 1360 Ile Met Asp Asp Leu Gly Gln Asn Pro Asp Gly Ser Asp Phe Thr Thr 1365 1370 1375 Phe Cys Gln Met Val Ser Thr Thr Asn Leu Leu Pro Asn Met Ala Ser 1380 1385 1390 Leu Glu Arg Lys Gly Thr Pro Phe Thr Ser Gln Leu Val Val Ala Thr 1395 1400 1405 Thr Asn Leu Pro Glu Phe Arg Pro Val Thr Ile Ala His Tyr Pro Ala 1410 1415 1420 Val Glu Arg Arg Ile Thr Phe Asp Tyr Ser Val Ser Ala Gly Pro Val 1425 1430 1435 1440 Cys Ser Lys Thr Glu Ala Gly Cys Lys Val Leu Asp Val Glu Arg Ala 1445 1450 1455 Phe Arg Pro Thr Gly Asp Ala Pro Leu Pro Cys Phe Gln Asn Asn Cys 1460 1465 1470 Leu Phe Leu Glu Lys Ala Gly Leu Gln Phe Arg Asp Asn Arg Ser Lys 1475 1480 1485 Glu Ile Leu Ser Leu Val Asp Val Ile Glu Arg Ala Val Thr Arg Ile 1490 1495 1500 Glu Arg Lys Lys Lys Val Leu Thr Ala Val Gln Thr Leu Val Ala Gln 1505 1510 1515 1520 Gly Pro Val Asp Glu Val Ser Phe Tyr Ser Val Val Gln Gln Leu Lys 1525 1530 1535 Ala Arg Gln Glu Ala Thr Asp Glu Gln Leu Glu Glu Leu Gln Glu Ala 1540 1545 1550 Phe Ala Arg Val Gln Glu Arg Ser Ser Val Phe Ser Asp Trp Met Lys 1555 1560 1565 Ile Ser Ala Met Leu Cys Ala Ala Thr Leu Ala Leu Thr Gln Val Val 1570 1575 1580 Lys Met Ala Lys Ala Val Lys Gln Met Val Arg Pro Asp Leu Val Arg 1585 1590 1595 1600 Val Gln Leu Asp Glu Gln Glu Gln Gly Pro Tyr Asn Glu Thr Thr Arg 1605 1610 1615 Ile Lys Pro Lys Thr Leu Gln Leu Leu Asp Val Gln Gly Pro Asn Pro 1620 1625 1630 Thr Met Asp Phe Glu Lys Phe Val Ala Lys Phe Val Thr Ala Pro Ile 1635 1640 1645 Gly Phe Val Tyr Pro Thr Gly Val Ser Thr Gln Thr Cys Leu Leu Val 1650 1655 1660 Lys Gly Arg Thr Leu Ala Val Asn Arg His Met Ala Glu Ser Asp Trp 1665 1670 1675 1680 Thr Ser Ile Val Val Arg Gly Val Ser His Thr Arg Ser Ser Val Lys 1685 1690 1695 Ile Ile Ala Ile Ala Lys Ala Gly Lys Glu Thr Asp Val Ser Phe Ile 1700 1705 1710 Arg Leu Ser Ser Gly Pro Leu Phe Arg Asp Asn Thr Ser Lys Phe Val 1715 1720 1725 Lys Ala Ser Asp Val Leu Pro His Ser Ser Ser Pro Leu Ile Gly Ile 1730 1735 1740 Met Asn Val Asp Ile Pro Met Met Tyr Thr Gly Thr Phe Leu Lys Ala 1745 1750 1755 1760 Gly Val Ser Val Pro Val Glu Thr Gly Gln Thr Phe Asn His Cys Ile 1765 1770 1775 His Tyr Lys Ala Asn Thr Arg Lys Gly Trp Cys Gly Ser Ala Ile Leu 1780 1785 1790 Ala Asp Leu Gly Gly Ser Lys Lys Ile Leu Gly Phe His Ser Ala Gly 1795 1800 1805 Ser Met Gly Val Ala Ala Ala Ser Ile Ile Ser Gln Glu Met Ile Asp 1810 1815 1820 Ala Val Val Gln Ala Phe Glu Pro Gln Gly Ala Leu Glu Arg Leu Pro 1825 1830 1835 1840 Asp Gly Pro Arg Ile His Val Pro Arg Lys Thr Ala Leu Arg Pro Thr 1845 1850 1855 Val Ala Arg Gln Val Phe Gln Pro Ala Phe Ala Pro Ala Val Leu Ser 1860 1865 1870 Lys Phe Asp Pro Arg Thr Asp Ala Asp Val Asp Glu Val Ala Phe Ser 1875 1880 1885 Lys His Thr Ser Asn Gln Glu Thr Leu Pro Pro Val Phe Arg Met Val 1890 1895 1900 Ala Arg Glu Tyr Ala Asn Arg Val Phe Ala Leu Leu Gly Arg Asp Asn 1905 1910 1915 1920 Gly Arg Leu Ser Val Lys Gln Ala Leu Asp Gly Leu Glu Gly Met Asp 1925 1930 1935 Pro Met Asp Lys Asn Thr Ser Pro Gly Leu Pro Tyr Thr Thr Leu Gly 1940 1945 1950 Met Arg Arg Thr Asp Val Val Asp Trp Glu Thr Ala Thr Leu Ile Pro 1955 1960 1965 Phe Ala Ala Glu Arg Leu Glu Lys Met Asn Asn Lys Asp Phe Ser Asp 1970 1975 1980 Ile Val Tyr Gln Thr Phe Leu Lys Asp Glu Leu Arg Pro Ile Glu Lys 1985 1990 1995 2000 Val Gln Ala Ala Lys Thr Arg Ile Val Asp Val Pro Pro Phe Glu His 2005 2010 2015 Cys Ile Leu Gly Arg Gln Leu Leu Gly Lys Phe Ala Ser Lys Phe Gln 2020 2025 2030 Thr Gln Pro Gly Leu Glu Leu Gly Ser Ala Ile Gly Cys Asp Pro Asp 2035 2040 2045 Val His Trp Thr Ala Phe Gly Val Ala Met Gln Gly Phe Glu Arg Val 2050 2055 2060 Tyr Asp Val Asp Tyr Ser Asn Phe Asp Ser Thr His Ser Val Ala Ile 2065 2070 2075 2080 Phe Arg Leu Leu Ala Glu Glu Phe Phe Ser Glu Glu Asn Gly Phe Asp 2085 2090 2095 Pro Leu Val Lys Asp Tyr Leu Glu Ser Leu Ala Ile Ser Lys His Ala 2100 2105 2110 Tyr Glu Glu Lys Arg Tyr Leu Ile Thr Gly Gly Leu Pro Ser Gly Cys 2115 2120 2125 Ala Ala Thr Ser Met Leu Asn Thr Ile Met Asn Asn Ile Ile Ile Arg 2130 2135 2140 Ala Gly Leu Tyr Leu Thr Tyr Lys Asn Phe Glu Phe Asp Asp Val Lys 2145 2150 2155 2160 Val Leu Ser Tyr Gly Asp Asp Leu Leu Val Ala Thr Asn Tyr Gln Leu 2165 2170 2175 Asn Phe Asp Arg Val Arg Thr Ser Leu Ala Lys Thr Gly Tyr Lys Ile 2180 2185 2190 Thr Pro Ala Asn Lys Thr Ser Thr Phe Pro Leu Glu Ser Thr Leu Glu 2195 2200 2205 Asp Val Val Phe Leu Lys Arg Lys Phe Lys Lys Glu Gly Pro Leu Tyr 2210 2215 2220 Arg Pro Val Met Asn Arg Glu Ala Leu Glu Ala Met Leu Ser Tyr Tyr 2225 2230 2235 2240 Arg Pro Gly Thr Leu Ser Glu Lys Leu Thr Ser Ile Thr Met Leu Ala 2245 2250 2255 Val His Ser Gly Lys Gln Glu Tyr Asp Arg Leu Phe Ala Pro Phe Arg 2260 2265 2270 Glu Val Gly Val Ile Val Pro Thr Phe Glu Ser Val Glu Tyr Arg Trp 2275 2280 2285 Arg Ser Leu Phe Trp 2290 <210> 30 <211> 2301 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 30 Met Ala Cys Lys His Gly Tyr Pro Asp Val Cys Pro Ile Cys Thr Ala 1 5 10 15 Val Asp Val Thr Pro Gly Phe Glu Tyr Leu Leu Leu Ala Asp Gly Glu 20 25 30 Trp Phe Pro Thr Asp Leu Leu Cys Val Asp Leu Asp Asp Asp Val Phe 35 40 45 Trp Pro Ser Asn Ser Ser Asn Gln Ser Glu Thr Met Glu Trp Thr Asp 50 55 60 Leu Pro Leu Val Arg Asp Ile Val Met Glu Pro Gln Gly Asn Ala Ser 65 70 75 80 Ser Ser Asp Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ser Gly Asn Glu Gly Val Ile 85 90 95 Ile Asn Asn Phe Tyr Ser Asn Gln Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Leu Ser 100 105 110 Ala Ser Gly Gly Asn Ala Gly Asp Ala Pro Gln Asn Asn Gly Gln Leu 115 120 125 Ser Asn Ile Leu Gly Gly Ala Ala Asn Ala Phe Ala Thr Met Ala Pro 130 135 140 Leu Leu Leu Asp Gln Asn Thr Glu Glu Met Glu Asn Leu Ser Asp Arg 145 150 155 160 Val Ala Ser Asp Lys Ala Gly Asn Ser Ala Thr Asn Thr Gln Ser Thr 165 170 175 Val Gly Arg Leu Cys Gly Tyr Gly Glu Ala His His Gly Glu His Pro 180 185 190 Ala Ser Cys Ala Asp Thr Ala Thr Asp Lys Val Leu Ala Ala Glu Arg 195 200 205 Tyr Tyr Thr Ile Asp Leu Ala Ser Trp Thr Thr Thr Gln Glu Ala Phe 210 215 220 Ser His Ile Arg Ile Pro Leu Pro His Val Leu Ala Gly Glu Asp Gly 225 230 235 240 Gly Val Phe Gly Ala Thr Leu Arg Arg His Tyr Leu Cys Lys Thr Gly 245 250 255 Trp Arg Val Gln Val Gln Cys Asn Ala Ser Gln Phe His Ala Gly Ser 260 265 270 Leu Leu Val Phe Met Ala Pro Glu Phe Tyr Thr Gly Lys Gly Thr Lys 275 280 285 Thr Gly Asp Met Glu Pro Thr Asp Pro Phe Thr Met Asp Thr Thr Trp 290 295 300 Arg Ala Pro Gln Gly Ala Pro Thr Gly Tyr Arg Tyr Asp Ser Arg Thr 305 310 315 320 Gly Phe Phe Ala Met Asn His Gln Asn Gln Trp Gln Trp Thr Val Tyr 325 330 335 Pro His Gln Ile Leu Asn Leu Arg Thr Asn Thr Thr Val Asp Leu Glu 340 345 350 Val Pro Tyr Val Asn Ile Ala Pro Thr Ser Ser Trp Thr Gln His Ala 355 360 365 Asn Trp Thr Leu Val Val Ala Val Phe Ser Pro Leu Gln Tyr Ala Ser 370 375 380 Gly Ser Ser Ser Asp Val Gln Ile Thr Ala Ser Ile Gln Pro Val Asn 385 390 395 400 Pro Val Phe Asn Gly Leu Arg His Glu Thr Val Ile Ala Gln Ser Pro 405 410 415 Ile Ala Val Thr Val Arg Glu His Lys Gly Cys Phe Tyr Ser Thr Asn 420 425 430 Pro Asp Thr Thr Val Pro Ile Tyr Gly Lys Thr Ile Ser Thr Pro Asn 435 440 445 Asp Tyr Met Cys Gly Glu Phe Ser Asp Leu Leu Glu Leu Cys Lys Leu 450 455 460 Pro Thr Phe Leu Gly Asn Pro Asn Ser Asn Asn Lys Arg Tyr Pro Tyr 465 470 475 480 Phe Ser Ala Thr Asn Ser Val Pro Thr Thr Ser Leu Val Asp Tyr Gln 485 490 495 Val Ala Leu Ser Cys Ser Cys Met Cys Asn Ser Met Leu Ala Ala Val 500 505 510 Ala Arg Asn Phe Asn Gln Tyr Arg Gly Ser Leu Asn Phe Leu Phe Val 515 520 525 Phe Thr Gly Ala Ala Met Val Lys Gly Lys Phe Leu Ile Ala Tyr Thr 530 535 540 Pro Pro Gly Ala Gly Lys Pro Thr Thr Arg Asp Gln Ala Met Gln Ala 545 550 555 560 Thr Tyr Ala Ile Trp Asp Leu Gly Leu Asn Ser Ser Phe Val Phe Thr 565 570 575 Ala Pro Phe Ile Ser Pro Thr His Tyr Arg Gln Thr Ser Tyr Thr Ser 580 585 590 Ala Thr Ile Ala Ser Val Asp Gly Trp Val Thr Val Trp Gln Leu Thr 595 600 605 Pro Leu Thr Tyr Pro Ser Gly Ala Pro Val Asn Ser Asp Ile Leu Thr 610 615 620 Leu Val Ser Ala Gly Asp Asp Phe Thr Leu Arg Met Pro Ile Ser Pro 625 630 635 640 Thr Lys Trp Ala Pro Gln Gly Ser Asp Asn Ala Glu Lys Gly Lys Val 645 650 655 Ser Asn Asp Asp Ala Ser Val Asp Phe Val Ala Glu Pro Val Lys Leu 660 665 670 Pro Glu Asn Gln Thr Arg Val Ala Phe Phe Tyr Asp Arg Ala Val Pro 675 680 685 Ile Gly Met Leu Arg Pro Gly Gln Asn Ile Glu Ser Thr Phe Val Tyr 690 695 700 Gln Glu Asn Asp Leu Arg Leu Asn Cys Leu Leu Leu Thr Pro Leu Pro 705 710 715 720 Ser Phe Cys Pro Asp Ser Thr Ser Gly Pro Val Lys Thr Lys Ala Pro 725 730 735 Val Gln Trp Arg Trp Val Arg Ser Gly Gly Thr Thr Asn Phe Pro Leu 740 745 750 Met Thr Lys Gln Asp Tyr Ala Phe Leu Cys Phe Ser Pro Phe Thr Tyr 755 760 765 Tyr Lys Cys Asp Leu Glu Val Thr Val Ser Ala Leu Gly Thr Asp Thr 770 775 780 Val Ala Ser Val Leu Arg Trp Ala Pro Thr Gly Ala Pro Ala Asp Val 785 790 795 800 Thr Asp Gln Leu Ile Gly Tyr Thr Pro Ser Leu Gly Glu Thr Arg Asn 805 810 815 Pro His Met Trp Leu Val Gly Ala Gly Asn Thr Gln Ile Ser Phe Val 820 825 830 Val Pro Tyr Asn Ser Pro Leu Ser Val Leu Pro Ala Ala Trp Phe Asn 835 840 845 Gly Trp Ser Asp Phe Gly Asn Thr Lys Asp Phe Gly Val Ala Pro Asn 850 855 860 Ala Asp Phe Gly Arg Leu Trp Ile Gln Gly Asn Thr Ser Ala Ser Val 865 870 875 880 Arg Ile Arg Tyr Lys Lys Met Lys Val Phe Cys Pro Arg Pro Thr Leu 885 890 895 Phe Phe Pro Trp Pro Val Ser Thr Arg Ser Lys Ile Asn Ala Asp Asn 900 905 910 Pro Val Pro Ile Leu Glu Leu Glu Asn Pro Ala Ala Phe Tyr Arg Ile 915 920 925 Asp Leu Phe Ile Thr Phe Ile Asp Glu Phe Ile Thr Phe Asp Tyr Lys 930 935 940 Val His Gly Arg Pro Val Leu Thr Phe Arg Ile Pro Gly Phe Gly Leu 945 950 955 960 Thr Pro Ala Gly Arg Met Leu Val Cys Met Gly Glu Lys Pro Ala His 965 970 975 Gly Pro Phe Thr Ser Ser Arg Ser Leu Tyr His Val Ile Phe Thr Ala 980 985 990 Thr Cys Ser Ser Phe Ser Phe Ser Ile Tyr Lys Gly Arg Tyr Arg Ser 995 1000 1005 Trp Lys Lys Pro Ile His Asp Glu Leu Val Asp Arg Gly Tyr Thr Thr 1010 1015 1020 Phe Gly Glu Phe Phe Arg Ala Val Arg Ala Tyr His Ala Asp Tyr Tyr 1025 1030 1035 1040 Lys Gln Arg Leu Ile His Asp Val Glu Met Asn Pro Gly Pro Val Gln 1045 1050 1055 Ser Val Phe Gln Pro Gln Gly Ala Val Leu Thr Lys Ser Leu Ala Pro 1060 1065 1070 Gln Ala Gly Ile Gln Asn Leu Leu Leu Arg Leu Leu Gly Ile Asp Gly 1075 1080 1085 Asp Cys Ser Glu Val Ser Lys Ala Ile Thr Val Val Thr Asp Leu Phe 1090 1095 1100 Ala Ala Trp Glu Arg Ala Lys Thr Thr Leu Val Ser Pro Glu Phe Trp 1105 1110 1115 1120 Ser Lys Leu Ile Leu Lys Thr Thr Lys Phe Ile Ala Ala Ser Val Leu 1125 1130 1135 Tyr Leu His Asn Pro Asp Phe Thr Thr Thr Val Cys Leu Ser Leu Met 1140 1145 1150 Thr Gly Val Asp Leu Leu Thr Asn Asp Ser Val Phe Asp Trp Leu Lys 1155 1160 1165 Asn Lys Leu Ser Ser Phe Phe Arg Thr Pro Pro Pro Val Cys Pro Asn 1170 1175 1180 Val Leu Gln Pro Gln Gly Pro Leu Arg Glu Ala Asn Glu Gly Phe Thr 1185 1190 1195 1200 Phe Ala Lys Asn Ile Glu Trp Ala Met Lys Thr Ile Gln Ser Ile Val 1205 1210 1215 Asn Trp Leu Thr Ser Trp Phe Lys Gln Glu Glu Asp His Pro Gln Ser 1220 1225 1230 Lys Leu Asp Lys Phe Leu Met Glu Phe Pro Asp His Cys Arg Asn Ile 1235 1240 1245 Met Asp Met Arg Asn Gly Arg Lys Ala Tyr Cys Glu Cys Thr Ala Ser 1250 1255 1260 Phe Lys Tyr Phe Asp Glu Leu Tyr Asn Leu Ala Val Thr Cys Lys Arg 1265 1270 1275 1280 Ile Pro Leu Ala Ser Leu Cys Glu Lys Phe Lys Asn Arg His Asp His 1285 1290 1295 Ser Val Thr Arg Pro Glu Pro Val Val Val Val Leu Arg Gly Ala Ala 1300 1305 1310 Gly Gln Gly Lys Ser Val Thr Ser Gln Ile Ile Ala Gln Ser Val Ser 1315 1320 1325 Lys Met Ala Phe Gly Arg Gln Ser Val Tyr Ser Met Pro Pro Asp Ser 1330 1335 1340 Glu Tyr Phe Asp Gly Tyr Glu Asn Gln Phe Ser Val Ile Met Asp Asp 1345 1350 1355 1360 Leu Gly Gln Asn Pro Asp Gly Glu Asp Phe Thr Val Phe Cys Gln Met 1365 1370 1375 Val Ser Ser Thr Asn Phe Leu Pro Asn Met Ala His Leu Glu Arg Lys 1380 1385 1390 Gly Thr Pro Phe Thr Ser Ser Phe Ile Val Ala Thr Thr Asn Leu Pro 1395 1400 1405 Lys Phe Arg Pro Val Thr Val Ala His Tyr Pro Ala Val Asp Arg Arg 1410 1415 1420 Ile Thr Phe Asp Phe Thr Val Thr Ala Gly Pro His Cys Thr Thr Ser 1425 1430 1435 1440 Asn Gly Met Leu Asp Ile Glu Lys Ala Phe Asp Glu Ile Pro Gly Ser 1445 1450 1455 Lys Pro Gln Leu Ala Cys Phe Ser Ala Asp Cys Pro Leu Leu His Lys 1460 1465 1470 Arg Gly Val Met Phe Thr Cys Asn Arg Thr Lys Ala Val Tyr Asn Leu 1475 1480 1485 Gln Gln Val Val Lys Met Val Asn Asp Thr Ile Thr Arg Lys Thr Glu 1490 1495 1500 Asn Val Lys Lys Met Asn Ser Leu Val Ala Gln Ser Pro Pro Asp Trp 1505 1510 1515 1520 Glu His Phe Glu Asn Ile Leu Thr Cys Leu Arg Gln Asn Asn Ala Ala 1525 1530 1535 Leu Gln Asp Gln Leu Asp Glu Leu Gln Glu Ala Phe Ala Gln Ala Arg 1540 1545 1550 Glu Arg Ser Asp Phe Leu Ser Asp Trp Leu Lys Val Ser Ala Ile Ile 1555 1560 1565 Phe Ala Gly Ile Ala Ser Leu Ser Ala Val Ile Lys Leu Ala Ser Lys 1570 1575 1580 Phe Lys Glu Ser Ile Trp Pro Ser Pro Val Arg Val Glu Leu Ser Glu 1585 1590 1595 1600 Gly Glu Gln Ala Ala Tyr Ala Gly Arg Ala Arg Ala Gln Lys Gln Ala 1605 1610 1615 Leu Gln Val Leu Asp Ile Gln Gly Gly Gly Lys Val Leu Ala Gln Ala 1620 1625 1630 Gly Asn Pro Val Met Asp Phe Glu Leu Phe Cys Ala Lys Asn Met Val 1635 1640 1645 Ala Pro Ile Thr Phe Tyr Tyr Pro Asp Lys Ala Glu Val Thr Gln Ser 1650 1655 1660 Cys Leu Leu Leu Arg Ala His Leu Phe Val Val Asn Arg His Val Ala 1665 1670 1675 1680 Glu Thr Glu Trp Thr Ala Phe Lys Leu Lys Asp Val Arg His Glu Arg 1685 1690 1695 Asp Thr Val Val Thr Arg Ser Val Asn Arg Ser Gly Ala Glu Thr Asp 1700 1705 1710 Leu Thr Phe Ile Lys Val Thr Lys Gly Pro Leu Phe Lys Asp Asn Val 1715 1720 1725 Asn Lys Phe Cys Ser Asn Lys Asp Asp Phe Pro Ala Arg Asn Asp Ala 1730 1735 1740 Val Thr Gly Ile Met Asn Thr Gly Leu Ala Phe Val Tyr Ser Gly Asn 1745 1750 1755 1760 Phe Leu Ile Gly Asn Gln Pro Val Asn Thr Thr Thr Gly Ala Cys Phe 1765 1770 1775 Asn His Cys Leu His Tyr Arg Ala Gln Thr Arg Arg Gly Trp Cys Gly 1780 1785 1790 Ser Ala Val Ile Cys Asn Val Asn Gly Lys Lys Ala Val Tyr Gly Met 1795 1800 1805 His Ser Ala Gly Gly Gly Gly Leu Ala Ala Ala Thr Ile Ile Thr Arg 1810 1815 1820 Glu Leu Ile Glu Ala Ala Glu Lys Ser Met Leu Ala Leu Glu Pro Gln 1825 1830 1835 1840 Gly Ala Ile Val Asp Ile Ser Thr Gly Ser Val Val His Val Pro Arg 1845 1850 1855 Lys Thr Lys Leu Arg Arg Thr Val Ala His Asp Val Phe Gln Pro Lys 1860 1865 1870 Phe Glu Pro Ala Val Leu Ser Arg Tyr Asp Pro Arg Thr Asp Lys Asp 1875 1880 1885 Val Asp Val Val Ala Phe Ser Lys His Thr Thr Asn Met Glu Ser Leu 1890 1895 1900 Pro Pro Val Phe Asp Ile Val Cys Asp Glu Tyr Ala Asn Arg Val Phe 1905 1910 1915 1920 Thr Ile Leu Gly Lys Asp Asn Gly Leu Leu Thr Val Glu Gln Ala Val 1925 1930 1935 Leu Gly Leu Pro Gly Met Asp Pro Met Glu Lys Asp Thr Ser Pro Gly 1940 1945 1950 Leu Pro Tyr Thr Gln Gln Gly Leu Arg Arg Thr Asp Leu Leu Asn Phe 1955 1960 1965 Asn Thr Ala Lys Met Thr Pro Gln Leu Asp Tyr Ala His Ser Lys Leu 1970 1975 1980 Val Leu Gly Val Tyr Asp Asp Val Val Tyr Gln Ser Phe Leu Lys Asp 1985 1990 1995 2000 Glu Ile Arg Pro Leu Glu Lys Ile His Glu Ala Lys Thr Arg Ile Val 2005 2010 2015 Asp Val Pro Pro Phe Ala His Cys Ile Trp Gly Arg Gln Leu Leu Gly 2020 2025 2030 Arg Phe Ala Ser Lys Phe Gln Thr Lys Pro Gly Leu Glu Leu Gly Ser 2035 2040 2045 Ala Ile Gly Thr Asp Pro Asp Val Asp Trp Thr Pro Tyr Ala Ala Glu 2050 2055 2060 Leu Ser Gly Phe Asn Tyr Val Tyr Asp Val Asp Tyr Ser Asn Phe Asp 2065 2070 2075 2080 Ala Ser His Ser Thr Ala Met Phe Glu Cys Leu Ile Lys Asn Phe Phe 2085 2090 2095 Thr Glu Gln Asn Gly Phe Asp Arg Arg Ile Ala Glu Tyr Leu Arg Ser 2100 2105 2110 Leu Ala Val Ser Arg His Ala Tyr Glu Asp Arg Arg Val Leu Ile Arg 2115 2120 2125 Gly Gly Leu Leu Ser Gly Cys Ala Ala Thr Ser Met Leu Asn Thr Ile 2130 2135 2140 Met Asn Asn Val Ile Ile Arg Ala Ala Leu Tyr Leu Thr Tyr Ser Asn 2145 2150 2155 2160 Phe Glu Phe Asp Asp Ile Lys Val Leu Ser Tyr Gly Asp Asp Leu Leu 2165 2170 2175 Ile Gly Thr Asn Tyr Gln Ile Asp Phe Asn Leu Val Lys Glu Arg Leu 2180 2185 2190 Ala Pro Phe Gly Tyr Lys Ile Thr Pro Ala Asn Lys Thr Thr Thr Phe 2195 2200 2205 Pro Leu Thr Ser His Leu Gln Asp Val Thr Phe Leu Lys Arg Arg Phe 2210 2215 2220 Val Arg Phe Asn Ser Tyr Leu Phe Arg Pro Gln Met Asp Ala Val Asn 2225 2230 2235 2240 Leu Lys Ala Met Val Ser Tyr Cys Lys Pro Gly Thr Leu Lys Glu Lys 2245 2250 2255 Leu Met Ser Ile Ala Leu Leu Ala Val His Ser Gly Pro Asp Ile Tyr 2260 2265 2270 Asp Glu Ile Phe Leu Pro Phe Arg Asn Val Gly Ile Val Val Pro Thr 2275 2280 2285 Tyr Ser Ser Met Leu Tyr Arg Trp Leu Ser Leu Phe Arg 2290 2295 2300 <210> 31 <211> 2303 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 31 Met Ala Cys Lys His Gly Tyr Pro Asp Val Cys Pro Ile Cys Thr Ala 1 5 10 15 Val Asp Ala Thr Pro Asp Phe Glu Tyr Leu Leu Met Ala Asp Gly Glu 20 25 30 Trp Phe Pro Thr Asp Leu Leu Cys Val Asp Leu Asp Asp Asp Val Phe 35 40 45 Trp Pro Ser Asp Thr Ser Thr Gln Pro Gln Thr Met Glu Trp Thr Asp 50 55 60 Val Pro Leu Val Cys Asp Thr Val Met Glu Pro Gln Gly Asn Ala Ser 65 70 75 80 Ser Ser Asp Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ser Gly Asn Glu Gly Val Ile 85 90 95 Ile Asn Asn Phe Tyr Ser Asn Gln Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Leu Ser 100 105 110 Ala Ser Gly Gly Asn Ala Gly Asp Ala Pro Gln Asn Asn Gly Gln Leu 115 120 125 Ser Ser Ile Leu Gly Gly Ala Ala Asn Ala Phe Ala Thr Met Ala Pro 130 135 140 Leu Leu Met Asp Gln Asn Thr Glu Glu Met Glu Asn Leu Ser Asp Arg 145 150 155 160 Val Ala Ser Asp Lys Ala Gly Asn Ser Ala Thr Asn Thr Gln Ser Thr 165 170 175 Val Gly Arg Leu Cys Gly Tyr Gly Lys Ser His His Gly Glu His Pro 180 185 190 Thr Ser Cys Ala Asp Ala Ala Thr Asp Lys Val Leu Ala Ala Glu Arg 195 200 205 Tyr Tyr Thr Ile Asp Leu Ala Ser Trp Thr Thr Ser Gln Glu Ala Phe 210 215 220 Ser His Ile Arg Ile Pro Leu Pro His Val Leu Ala Gly Glu Asp Gly 225 230 235 240 Gly Val Phe Gly Ala Thr Leu Arg Arg His Tyr Leu Cys Lys Thr Gly 245 250 255 Trp Arg Val Gln Val Gln Cys Asn Ala Ser Gln Phe His Ala Gly Ser 260 265 270 Leu Leu Val Phe Met Ala Pro Glu Phe Tyr Thr Gly Lys Gly Thr Lys 275 280 285 Ser Gly Thr Met Glu Pro Ser Asp Pro Phe Thr Met Asp Thr Thr Trp 290 295 300 Arg Ser Pro Gln Ser Ala Pro Thr Gly Tyr Arg Tyr Asp Arg Gln Ala 305 310 315 320 Gly Phe Phe Ala Met Asn His Gln Asn Gln Trp Gln Trp Thr Val Tyr 325 330 335 Pro His Gln Ile Leu Asn Leu Arg Thr Asn Thr Thr Val Asp Leu Glu 340 345 350 Val Pro Tyr Val Asn Val Ala Pro Ser Ser Ser Trp Thr Gln His Ala 355 360 365 Asn Trp Thr Leu Val Val Ala Val Leu Ser Pro Leu Gln Tyr Ala Thr 370 375 380 Gly Ser Ser Pro Asp Val Gln Ile Thr Ala Ser Leu Gln Pro Val Asn 385 390 395 400 Pro Val Phe Asn Gly Leu Arg His Glu Thr Val Leu Ala Gln Ser Pro 405 410 415 Ile Pro Val Thr Val Arg Glu His Gln Gly Cys Phe Tyr Ser Thr Asn 420 425 430 Pro Asp Thr Thr Val Pro Ile Tyr Gly Lys Thr Ile Ser Thr Pro Ser 435 440 445 Asp Tyr Met Cys Gly Glu Phe Ser Asp Leu Leu Glu Leu Cys Lys Leu 450 455 460 Pro Thr Phe Leu Gly Asn Pro Ser Thr Asp Asn Lys Arg Tyr Pro Tyr 465 470 475 480 Phe Ser Ala Thr Asn Ser Val Pro Ala Thr Ser Leu Val Asp Tyr Gln 485 490 495 Val Ala Leu Ser Cys Ser Cys Thr Ala Asn Ser Met Leu Ala Ala Val 500 505 510 Ala Arg Asn Phe Asn Gln Tyr Arg Gly Ser Leu Asn Phe Leu Phe Val 515 520 525 Phe Thr Gly Ala Ala Met Val Lys Gly Lys Phe Arg Ile Ala Tyr Thr 530 535 540 Pro Pro Gly Ala Gly Lys Pro Thr Thr Arg Asp Gln Ala Met Gln Ala 545 550 555 560 Thr Tyr Ala Ile Trp Asp Leu Gly Leu Asn Ser Ser Phe Asn Phe Thr 565 570 575 Ala Pro Phe Ile Ser Pro Thr His Tyr Arg Gln Thr Ser Tyr Thr Ser 580 585 590 Pro Thr Ile Thr Ser Val Asp Gly Trp Val Thr Val Trp Gln Leu Thr 595 600 605 Pro Leu Thr Tyr Pro Ser Gly Thr Pro Thr His Ser Asp Ile Leu Thr 610 615 620 Leu Val Ser Ala Gly Asp Asp Phe Thr Leu Arg Met Pro Ile Ser Pro 625 630 635 640 Thr Lys Trp Val Pro Gln Gly Ile Asp Asn Ala Glu Lys Gly Lys Val 645 650 655 Ser Asn Asp Asp Ala Ser Val Asp Phe Val Ala Glu Pro Val Lys Leu 660 665 670 Pro Glu Asn Gln Thr Arg Val Ala Phe Phe Tyr Asp Arg Ala Val Pro 675 680 685 Ile Gly Met Leu Arg Pro Gly Gln Asn Met Glu Thr Thr Phe Ser Tyr 690 695 700 Gln Glu Asn Asp Phe Arg Leu Asn Cys Leu Leu Leu Thr Pro Leu Pro 705 710 715 720 Ser Tyr Cys Pro Asp Ser Ser Ser Gly Pro Val Arg Thr Lys Ala Pro 725 730 735 Val Gln Trp Arg Trp Val Arg Ser Gly Gly Ala Asn Gly Ala Asn Phe 740 745 750 Pro Leu Met Thr Lys Gln Asp Tyr Ala Phe Leu Cys Phe Ser Pro Phe 755 760 765 Thr Tyr Tyr Lys Cys Asp Leu Glu Val Thr Val Ser Ala Met Gly Ala 770 775 780 Gly Thr Val Ser Ser Val Leu Arg Trp Ala Pro Thr Gly Ala Pro Ala 785 790 795 800 Asp Val Thr Asp Gln Leu Ile Gly Tyr Thr Pro Ser Leu Gly Glu Thr 805 810 815 Arg Asn Pro His Met Trp Ile Val Gly Ser Gly Asn Ser Gln Ile Ser 820 825 830 Phe Val Val Pro Tyr Asn Ser Pro Leu Ser Val Leu Pro Ala Ala Trp 835 840 845 Phe Asn Gly Trp Ser Asp Phe Gly Asn Thr Lys Asp Phe Gly Val Ala 850 855 860 Pro Thr Ser Asp Phe Gly Arg Ile Trp Ile Gln Gly Asn Ser Ser Ala 865 870 875 880 Ser Val Arg Ile Arg Tyr Lys Lys Met Lys Val Phe Cys Pro Arg Pro 885 890 895 Thr Leu Phe Phe Pro Trp Pro Thr Pro Thr Thr Thr Lys Ile Asn Ala 900 905 910 Asp Asn Pro Val Pro Ile Leu Glu Leu Glu Asn Pro Ala Ser Leu Tyr 915 920 925 Arg Ile Asp Leu Phe Ile Thr Phe Thr Asp Glu Leu Ile Thr Phe Asp 930 935 940 Tyr Lys Val His Gly Arg Pro Val Leu Thr Phe Arg Ile Pro Gly Phe 945 950 955 960 Gly Leu Thr Pro Ala Gly Arg Met Leu Val Cys Met Gly Ala Lys Pro 965 970 975 Ala His Ser Pro Phe Thr Ser Ser Lys Ser Leu Tyr His Val Ile Phe 980 985 990 Thr Ser Thr Cys Asn Ser Phe Ser Phe Thr Ile Tyr Lys Gly Arg Tyr 995 1000 1005 Arg Ser Trp Lys Lys Pro Ile His Asp Glu Leu Val Asp Arg Gly Tyr 1010 1015 1020 Thr Thr Phe Arg Glu Phe Phe Lys Ala Val Arg Gly Tyr His Ala Asp 1025 1030 1035 1040 Tyr Tyr Lys Gln Arg Leu Ile His Asp Val Glu Met Asn Pro Gly Pro 1045 1050 1055 Val Gln Ser Val Phe Gln Pro Gln Gly Ala Val Leu Thr Lys Ser Leu 1060 1065 1070 Ala Pro Gln Ala Gly Ile Gln Asn Ile Leu Leu Arg Leu Leu Gly Ile 1075 1080 1085 Glu Gly Asp Cys Ser Glu Val Ser Lys Ala Ile Thr Val Val Thr Asp 1090 1095 1100 Leu Val Ala Ala Trp Glu Lys Ala Lys Thr Thr Leu Val Ser Pro Glu 1105 1110 1115 1120 Phe Trp Ser Glu Leu Ile Leu Lys Thr Thr Lys Phe Ile Ala Ala Ser 1125 1130 1135 Val Leu Tyr Leu His Asn Pro Asp Phe Thr Thr Thr Val Cys Leu Ser 1140 1145 1150 Leu Met Thr Gly Val Asp Leu Leu Thr Asn Asp Ser Val Phe Asp Trp 1155 1160 1165 Leu Lys Ser Lys Leu Ser Ser Phe Phe Arg Thr Pro Pro Pro Ala Cys 1170 1175 1180 Pro Asn Val Met Gln Pro Gln Gly Pro Leu Arg Glu Ala Asn Glu Gly 1185 1190 1195 1200 Phe Thr Phe Ala Lys Asn Ile Glu Trp Ala Thr Lys Thr Ile Gln Ser 1205 1210 1215 Ile Val Asn Trp Leu Thr Ser Trp Phe Lys Gln Glu Glu Asp His Pro 1220 1225 1230 Gln Ser Lys Leu Asp Lys Leu Leu Met Glu Phe Pro Asp His Cys Arg 1235 1240 1245 Asn Ile Met Asp Met Arg Asn Gly Arg Lys Ala Tyr Cys Glu Cys Thr 1250 1255 1260 Ala Ser Phe Lys Tyr Phe Asp Asp Leu Tyr Asn Leu Ala Val Thr Cys 1265 1270 1275 1280 Lys Arg Ile Pro Leu Ala Ser Leu Cys Glu Lys Phe Lys Asn Arg His 1285 1290 1295 Asp His Ser Val Thr Arg Pro Glu Pro Val Val Ala Val Leu Arg Gly 1300 1305 1310 Ala Ala Gly Gln Gly Lys Ser Val Thr Ser Gln Ile Ile Ala Gln Ser 1315 1320 1325 Val Ser Lys Met Ala Phe Gly Arg Gln Ser Val Tyr Ser Met Pro Pro 1330 1335 1340 Asp Ser Glu Tyr Phe Asp Gly Tyr Glu Asn Gln Phe Ser Val Ile Met 1345 1350 1355 1360 Asp Asp Leu Gly Gln Asn Pro Asp Gly Glu Asp Phe Thr Val Phe Cys 1365 1370 1375 Gln Met Val Ser Ser Thr Asn Phe Leu Pro Asn Met Ala His Leu Glu 1380 1385 1390 Arg Lys Gly Thr Pro Phe Thr Ser Ser Phe Ile Val Ala Thr Thr Asn 1395 1400 1405 Leu Pro Lys Phe Arg Pro Val Thr Val Ala His Tyr Pro Ala Val Asp 1410 1415 1420 Arg Arg Ile Thr Phe Asp Phe Thr Val Thr Ala Gly Pro His Cys Lys 1425 1430 1435 1440 Thr Pro Ala Gly Met Leu Asp Ile Glu Lys Ala Phe Asp Glu Ile Pro 1445 1450 1455 Gly Ser Lys Pro Gln Leu Ala Cys Phe Ser Ala Asp Cys Pro Leu Leu 1460 1465 1470 His Lys Arg Gly Val Met Phe Thr Cys Asn Arg Thr Lys Thr Val Tyr 1475 1480 1485 Asn Leu Gln Gln Val Val Lys Met Val Asn Asp Thr Ile Thr Arg Lys 1490 1495 1500 Thr Glu Asn Val Lys Lys Met Asn Ser Leu Val Ala Gln Ser Pro Pro 1505 1510 1515 1520 Asp Trp Gln His Phe Glu Asn Ile Leu Thr Cys Leu Arg Gln Asn Asn 1525 1530 1535 Ala Ala Leu Gln Asp Gln Val Asp Glu Leu Gln Glu Ala Phe Thr Gln 1540 1545 1550 Ala Arg Glu Arg Ser Asp Phe Leu Ser Asp Trp Leu Lys Val Ser Ala 1555 1560 1565 Ile Ile Phe Ala Gly Ile Val Ser Leu Ser Ala Val Ile Lys Leu Ala 1570 1575 1580 Ser Lys Phe Lys Glu Ser Ile Trp Pro Thr Pro Val Arg Val Glu Leu 1585 1590 1595 1600 Ser Glu Gly Glu Gln Ala Ala Tyr Ala Gly Arg Ala Arg Ala Gln Lys 1605 1610 1615 Gln Ala Leu Gln Val Leu Asp Ile Gln Gly Gly Gly Lys Val Leu Ala 1620 1625 1630 Gln Ala Gly Asn Pro Val Met Asp Phe Glu Leu Phe Cys Ala Lys Asn 1635 1640 1645 Met Val Ser Pro Ile Thr Phe Tyr Tyr Pro Asp Lys Ala Glu Val Thr 1650 1655 1660 Gln Ser Cys Leu Leu Leu Arg Ala His Leu Phe Val Val Asn Arg His 1665 1670 1675 1680 Val Ala Glu Thr Glu Trp Thr Ala Phe Lys Leu Arg Asp Val Arg His 1685 1690 1695 Glu Arg Asp Thr Val Val Met Arg Ser Val Asn Arg Ser Gly Ala Glu 1700 1705 1710 Thr Asp Leu Thr Phe Val Lys Val Thr Lys Gly Pro Leu Phe Lys Asp 1715 1720 1725 Asn Val Asn Lys Phe Cys Ser Asn Lys Asp Asp Phe Pro Ala Arg Asn 1730 1735 1740 Asp Thr Val Thr Gly Ile Met Asn Thr Gly Leu Ala Phe Val Tyr Ser 1745 1750 1755 1760 Gly Asn Phe Leu Ile Gly Asn Gln Pro Val Asn Thr Thr Thr Gly Ala 1765 1770 1775 Cys Phe Asn His Cys Leu His Tyr Arg Ala Gln Thr Arg Arg Gly Trp 1780 1785 1790 Cys Gly Ser Ala Ile Ile Cys Asn Val Asn Gly Lys Lys Ala Val Tyr 1795 1800 1805 Gly Met His Ser Ala Gly Gly Gly Gly Leu Ala Ala Ala Thr Ile Ile 1810 1815 1820 Thr Arg Glu Leu Ile Glu Ala Ala Glu Lys Ser Met Leu Ala Leu Glu 1825 1830 1835 1840 Pro Gln Gly Ala Ile Val Asp Ile Ser Thr Gly Ser Val Val His Val 1845 1850 1855 Pro Arg Lys Thr Lys Leu Arg Arg Thr Val Ala His Asp Val Phe Gln 1860 1865 1870 Pro Lys Phe Glu Pro Ala Val Leu Ser Arg Tyr Asp Pro Arg Thr Asp 1875 1880 1885 Lys Asp Val Asp Val Val Ala Phe Ser Lys His Thr Thr Asn Met Glu 1890 1895 1900 Ser Leu Pro Pro Ile Phe Asp Ile Val Cys Gly Glu Tyr Ala Asn Arg 1905 1910 1915 1920 Val Phe Thr Ile Leu Gly Lys Asp Asn Gly Leu Leu Thr Val Glu Gln 1925 1930 1935 Ala Val Leu Gly Leu Ser Gly Met Asp Pro Met Glu Lys Asp Thr Ser 1940 1945 1950 Pro Gly Leu Pro Tyr Thr Gln Gln Gly Leu Arg Arg Thr Asp Leu Leu 1955 1960 1965 Asp Phe Asn Thr Ala Lys Met Thr Pro Gln Leu Asp Tyr Ala His Ser 1970 1975 1980 Lys Leu Val Leu Gly Val Tyr Asp Asp Val Val Tyr Gln Ser Phe Leu 1985 1990 1995 2000 Lys Asp Glu Ile Arg Pro Leu Glu Lys Ile His Glu Ala Lys Thr Arg 2005 2010 2015 Ile Val Asp Val Pro Pro Phe Ala His Cys Ile Trp Gly Arg Gln Leu 2020 2025 2030 Leu Gly Arg Phe Ala Ser Lys Phe Gln Thr Lys Pro Gly Phe Glu Leu 2035 2040 2045 Gly Ser Ala Ile Gly Thr Asp Pro Asp Val Asp Trp Thr Arg Tyr Ala 2050 2055 2060 Ala Glu Leu Ser Gly Phe Asn Tyr Val Tyr Asp Val Asp Tyr Ser Asn 2065 2070 2075 2080 Phe Asp Ala Ser His Ser Thr Ala Met Phe Glu Cys Leu Ile Asn Asn 2085 2090 2095 Phe Phe Thr Glu Gln Asn Gly Phe Asp Arg Arg Ile Ala Glu Tyr Leu 2100 2105 2110 Arg Ser Leu Ala Val Ser Arg His Ala Tyr Glu Asp Arg Arg Val Leu 2115 2120 2125 Ile Arg Gly Gly Leu Pro Ser Gly Cys Ala Ala Thr Ser Met Leu Asn 2130 2135 2140 Thr Ile Met Asn Asn Val Ile Ile Arg Ala Ala Leu Tyr Leu Thr Tyr 2145 2150 2155 2160 Ser Asn Phe Glu Phe Asp Asp Ile Lys Val Leu Ser Tyr Gly Asp Asp 2165 2170 2175 Leu Leu Ile Gly Thr Asn Tyr Gln Ile Asp Phe Asn Leu Val Lys Glu 2180 2185 2190 Arg Leu Ala Pro Phe Gly Tyr Lys Ile Thr Pro Ala Asn Lys Thr Thr 2195 2200 2205 Thr Phe Pro Leu Thr Ser His Leu Gln Asp Val Thr Phe Leu Lys Arg 2210 2215 2220 Arg Phe Val Arg Phe Asn Ser Tyr Leu Phe Arg Pro Gln Met Asp Ala 2225 2230 2235 2240 Val Asn Leu Lys Ala Met Val Ser Tyr Cys Lys Pro Gly Thr Leu Lys 2245 2250 2255 Glu Lys Leu Met Ser Ile Ala Leu Leu Ala Val His Ser Gly Pro Asp 2260 2265 2270 Ile Tyr Asp Glu Ile Phe Leu Pro Phe Arg Asn Val Gly Ile Val Val 2275 2280 2285 Pro Thr Tyr Asp Ser Met Leu Tyr Arg Trp Leu Ser Leu Phe Arg 2290 2295 2300 <210> 32 <211> 2303 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 32 Met Ala Cys Lys His Gly Tyr Pro Asp Val Cys Pro Ile Cys Thr Ala 1 5 10 15 Val Asp Ala Thr Pro Gly Phe Glu Tyr Leu Leu Met Ala Asp Gly Glu 20 25 30 Trp Tyr Pro Thr Asp Leu Leu Cys Val Asp Leu Asp Asp Asp Val Phe 35 40 45 Trp Pro Ser Asp Thr Ser Asn Gln Ser Gln Thr Met Asp Trp Thr Asp 50 55 60 Val Pro Leu Ile Arg Asp Ile Val Met Glu Pro Gln Gly Asn Ser Ser 65 70 75 80 Ser Ser Asp Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ser Gly Asn Glu Gly Val Ile 85 90 95 Ile Asn Asn Phe Tyr Ser Asn Gln Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Leu Ser 100 105 110 Ala Ser Gly Gly Asn Ala Gly Asp Ala Pro Gln Thr Asn Gly Gln Leu 115 120 125 Ser Asn Ile Leu Gly Gly Ala Ala Asn Ala Phe Ala Thr Met Ala Pro 130 135 140 Leu Leu Leu Asp Gln Asn Thr Glu Glu Met Glu Asn Leu Ser Asp Arg 145 150 155 160 Val Ala Ser Asp Lys Ala Gly Asn Ser Ala Thr Asn Thr Gln Ser Thr 165 170 175 Val Gly Arg Leu Cys Gly Tyr Gly Lys Ser His His Gly Glu His Pro 180 185 190 Ala Ser Cys Ala Asp Thr Ala Thr Asp Lys Val Leu Ala Ala Glu Arg 195 200 205 Tyr Tyr Thr Ile Asp Leu Ala Ser Trp Thr Thr Ser Gln Glu Ala Phe 210 215 220 Ser His Ile Arg Ile Pro Leu Pro His Val Leu Ala Gly Glu Asp Gly 225 230 235 240 Gly Val Phe Gly Ala Thr Leu Arg Arg His Tyr Leu Cys Lys Thr Gly 245 250 255 Trp Arg Val Gln Val Gln Cys Asn Ala Ser Gln Phe His Ala Gly Ser 260 265 270 Leu Leu Val Phe Met Ala Pro Glu Phe Tyr Thr Gly Lys Gly Thr Lys 275 280 285 Thr Gly Thr Met Glu Pro Ser Asp Pro Phe Thr Met Asp Thr Glu Trp 290 295 300 Arg Ser Pro Gln Gly Ala Pro Thr Gly Tyr Arg Tyr Asp Ser Arg Thr 305 310 315 320 Gly Phe Phe Ala Thr Asn His Gln Asn Gln Trp Gln Trp Thr Val Tyr 325 330 335 Pro His Gln Ile Leu Asn Leu Arg Thr Asn Thr Thr Val Asp Leu Glu 340 345 350 Val Pro Tyr Val Asn Val Ala Pro Ser Ser Ser Trp Thr Gln His Ala 355 360 365 Asn Trp Thr Leu Val Val Ala Val Leu Ser Pro Leu Gln Tyr Ala Thr 370 375 380 Gly Ser Ser Pro Asp Val Gln Ile Thr Ala Ser Leu Gln Pro Val Asn 385 390 395 400 Pro Val Phe Asn Gly Leu Arg His Glu Thr Val Ile Ala Gln Ser Pro 405 410 415 Ile Pro Val Thr Val Arg Glu His Lys Gly Cys Phe Tyr Ser Thr Asn 420 425 430 Pro Asp Thr Thr Val Pro Ile Tyr Gly Lys Thr Ile Ser Thr Pro Ser 435 440 445 Asp Tyr Met Cys Gly Glu Phe Ser Asp Leu Leu Glu Leu Cys Lys Leu 450 455 460 Pro Thr Phe Leu Gly Asn Pro Asn Thr Asn Asn Lys Arg Tyr Pro Tyr 465 470 475 480 Phe Ser Ala Thr Asn Ser Val Pro Ala Thr Ser Met Val Asp Tyr Gln 485 490 495 Val Ala Leu Ser Cys Ser Cys Met Ala Asn Ser Met Leu Ala Ala Val 500 505 510 Ala Arg Asn Phe Asn Gln Tyr Arg Gly Ser Leu Asn Phe Leu Phe Val 515 520 525 Phe Thr Gly Ala Ala Met Val Lys Gly Lys Phe Leu Ile Ala Tyr Thr 530 535 540 Pro Pro Gly Ala Gly Lys Pro Thr Thr Arg Asp Gln Ala Met Gln Ser 545 550 555 560 Thr Tyr Ala Ile Trp Asp Leu Gly Leu Asn Ser Ser Phe Asn Phe Thr 565 570 575 Ala Pro Phe Ile Ser Pro Thr His Tyr Arg Gln Thr Ser Tyr Thr Ser 580 585 590 Pro Thr Ile Thr Ser Val Asp Gly Trp Val Thr Val Trp Lys Leu Thr 595 600 605 Pro Leu Thr Tyr Pro Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ser Asp Ile Leu Thr 610 615 620 Leu Val Ser Ala Gly Asp Asp Phe Thr Leu Arg Met Pro Ile Ser Pro 625 630 635 640 Thr Lys Trp Val Pro Gln Gly Val Asp Asn Ala Glu Lys Gly Lys Val 645 650 655 Ser Asn Asp Asp Ala Ser Val Asp Phe Val Ala Glu Pro Val Lys Leu 660 665 670 Pro Glu Asn Gln Thr Arg Val Ala Phe Phe Tyr Asp Arg Ala Val Pro 675 680 685 Ile Gly Met Leu Arg Pro Gly Gln Asn Met Glu Thr Thr Phe Asn Tyr 690 695 700 Gln Glu Asn Asp Tyr Arg Leu Asn Cys Leu Leu Leu Thr Pro Leu Pro 705 710 715 720 Ser Phe Cys Pro Asp Ser Ser Ser Gly Pro Gln Lys Thr Lys Ala Pro 725 730 735 Val Gln Trp Arg Trp Val Arg Ser Gly Gly Val Asn Gly Ala Asn Phe 740 745 750 Pro Leu Met Thr Lys Gln Asp Tyr Ala Phe Leu Cys Phe Ser Pro Phe 755 760 765 Thr Phe Tyr Lys Cys Asp Leu Glu Val Thr Val Ser Ala Leu Gly Met 770 775 780 Thr Arg Val Ala Ser Val Leu Arg Trp Ala Pro Thr Gly Ala Pro Ala 785 790 795 800 Asp Val Thr Asp Gln Leu Ile Gly Tyr Thr Pro Ser Leu Gly Glu Thr 805 810 815 Arg Asn Pro His Met Trp Leu Val Gly Ala Gly Asn Ser Gln Val Ser 820 825 830 Phe Val Val Pro Tyr Asn Ser Pro Leu Ser Val Leu Pro Ala Ala Trp 835 840 845 Phe Asn Gly Trp Ser Asp Phe Gly Asn Thr Lys Asp Phe Gly Val Ala 850 855 860 Pro Asn Ala Asp Phe Gly Arg Leu Trp Ile Gln Gly Asn Thr Ser Ala 865 870 875 880 Ser Val Arg Ile Arg Tyr Lys Lys Met Lys Val Phe Cys Pro Arg Pro 885 890 895 Thr Leu Phe Phe Pro Trp Pro Thr Pro Thr Thr Thr Lys Ile Asn Ala 900 905 910 Asp Asn Pro Val Pro Ile Leu Glu Leu Glu Asn Pro Ala Ala Leu Tyr 915 920 925 Arg Ile Asp Leu Phe Ile Thr Phe Thr Asp Glu Phe Ile Thr Phe Asp 930 935 940 Tyr Lys Val His Gly Arg Pro Val Leu Thr Phe Arg Ile Pro Gly Phe 945 950 955 960 Gly Leu Thr Pro Ala Gly Arg Met Leu Val Cys Met Gly Glu Gln Pro 965 970 975 Ala His Gly Pro Phe Thr Ser Ser Arg Ser Leu Tyr His Val Ile Phe 980 985 990 Thr Ala Thr Cys Ser Ser Phe Ser Phe Ser Ile Tyr Lys Gly Arg Tyr 995 1000 1005 Arg Ser Trp Lys Lys Pro Ile His Asp Glu Leu Val Asp Arg Gly Tyr 1010 1015 1020 Thr Thr Phe Gly Glu Phe Phe Lys Ala Val Arg Gly Tyr His Ala Asp 1025 1030 1035 1040 Tyr Tyr Arg Gln Arg Leu Ile His Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro 1045 1050 1055 Val Gln Ser Val Phe Gln Pro Gln Gly Ala Val Leu Thr Lys Ser Leu 1060 1065 1070 Ala Pro Gln Ala Gly Ile Gln Asn Leu Leu Leu Arg Leu Leu Gly Ile 1075 1080 1085 Asp Gly Asp Cys Ser Glu Val Ser Lys Ala Ile Thr Val Val Thr Asp 1090 1095 1100 Leu Val Ala Ala Trp Glu Lys Ala Lys Thr Thr Leu Val Ser Pro Glu 1105 1110 1115 1120 Phe Trp Ser Lys Leu Ile Leu Lys Thr Thr Lys Phe Ile Ala Ala Ser 1125 1130 1135 Val Leu Tyr Leu His Asn Pro Asp Phe Thr Thr Thr Val Cys Leu Ser 1140 1145 1150 Leu Met Thr Gly Val Asp Leu Leu Thr Asn Asp Ser Val Phe Asp Trp 1155 1160 1165 Leu Lys Gln Lys Leu Ser Ser Phe Phe Arg Thr Pro Pro Pro Ala Cys 1170 1175 1180 Pro Asn Val Met Gln Pro Gln Gly Pro Leu Arg Glu Ala Asn Glu Gly 1185 1190 1195 1200 Phe Thr Phe Ala Lys Asn Ile Glu Trp Ala Met Lys Thr Ile Gln Ser 1205 1210 1215 Val Val Asn Trp Leu Thr Ser Trp Phe Lys Gln Glu Glu Asp His Pro 1220 1225 1230 Gln Ser Lys Leu Asp Lys Leu Leu Met Glu Phe Pro Asp His Cys Arg 1235 1240 1245 Asn Ile Met Asp Met Arg Asn Gly Arg Lys Ala Tyr Cys Glu Cys Thr 1250 1255 1260 Ala Ser Phe Lys Tyr Phe Asp Glu Leu Tyr Asn Leu Ala Val Thr Cys 1265 1270 1275 1280 Lys Arg Ile Pro Leu Ala Ser Leu Cys Glu Lys Phe Lys Asn Arg His 1285 1290 1295 Asp His Ser Val Thr Arg Pro Glu Pro Val Val Val Val Leu Arg Gly 1300 1305 1310 Ala Ala Gly Gln Gly Lys Ser Val Thr Ser Gln Ile Ile Ala Gln Ser 1315 1320 1325 Val Ser Lys Met Ala Phe Gly Arg Gln Ser Val Tyr Ser Met Pro Pro 1330 1335 1340 Asp Ser Glu Tyr Phe Asp Gly Tyr Glu Asn Gln Phe Ser Val Ile Met 1345 1350 1355 1360 Asp Asp Leu Gly Gln Asn Pro Asp Gly Glu Asp Phe Thr Val Phe Cys 1365 1370 1375 Gln Met Val Ser Ser Thr Asn Phe Leu Pro Asn Met Ala His Leu Glu 1380 1385 1390 Arg Lys Gly Thr Pro Phe Thr Ser Ser Phe Ile Val Ala Thr Thr Asn 1395 1400 1405 Leu Pro Lys Phe Arg Pro Val Thr Val Ala His Tyr Pro Ala Val Asp 1410 1415 1420 Arg Arg Ile Thr Phe Asp Phe Thr Val Thr Ala Gly Pro His Cys Lys 1425 1430 1435 1440 Thr Pro Ala Gly Met Leu Asp Val Glu Lys Ala Phe Asp Glu Ile Pro 1445 1450 1455 Gly Ser Lys Pro Gln Leu Ala Cys Phe Ser Ala Asp Cys Pro Leu Leu 1460 1465 1470 His Lys Arg Gly Val Met Phe Thr Cys Asn Arg Thr Gln Thr Val Tyr 1475 1480 1485 Asn Leu Gln Gln Val Val Lys Met Val Asn Asp Thr Ile Thr Arg Lys 1490 1495 1500 Thr Glu Asn Val Lys Lys Met Asn Ser Leu Val Ala Gln Ser Pro Pro 1505 1510 1515 1520 Asp Trp Glu His Phe Glu Asn Ile Leu Thr Cys Leu Arg Gln Asn Asn 1525 1530 1535 Ala Ala Leu Gln Asp Gln Leu Asp Glu Leu Gln Glu Ala Phe Ala Gln 1540 1545 1550 Ala Arg Glu Arg Ser Asp Phe Leu Ser Asp Trp Leu Lys Val Ser Ala 1555 1560 1565 Ile Ile Phe Ala Gly Ile Ala Ser Leu Ser Ala Val Ile Lys Leu Ala 1570 1575 1580 Ser Lys Phe Lys Glu Ser Ile Trp Pro Thr Pro Val Arg Val Glu Leu 1585 1590 1595 1600 Ser Glu Gly Glu Gln Ala Ala Tyr Ala Gly Arg Ala Arg Ala Gln Lys 1605 1610 1615 Gln Ala Leu Gln Val Leu Asp Ile Gln Gly Gly Gly Lys Val Leu Ala 1620 1625 1630 Gln Ala Gly Asn Pro Val Met Asp Phe Glu Leu Phe Cys Ala Lys Asn 1635 1640 1645 Ile Val Ala Pro Ile Thr Phe Tyr Tyr Pro Asp Lys Ala Glu Val Thr 1650 1655 1660 Gln Ser Cys Leu Leu Leu Arg Ala His Leu Phe Val Val Asn Arg His 1665 1670 1675 1680 Val Ala Glu Thr Asp Trp Thr Ala Phe Lys Leu Lys Asp Val Arg His 1685 1690 1695 Glu Arg His Thr Val Ala Leu Arg Ser Val Asn Arg Ser Gly Ala Lys 1700 1705 1710 Thr Asp Leu Thr Phe Ile Lys Val Thr Lys Gly Pro Leu Phe Lys Asp 1715 1720 1725 Asn Val Asn Lys Phe Cys Ser Asn Lys Asp Asp Phe Pro Ala Arg Asn 1730 1735 1740 Asp Thr Val Thr Gly Ile Met Asn Thr Gly Leu Ala Phe Val Tyr Ser 1745 1750 1755 1760 Gly Asn Phe Leu Ile Gly Asn Gln Pro Val Asn Thr Thr Thr Gly Ala 1765 1770 1775 Cys Phe Asn His Cys Leu His Tyr Arg Ala Gln Thr Arg Arg Gly Trp 1780 1785 1790 Cys Gly Ser Ala Ile Ile Cys Asn Val Asn Gly Lys Lys Ala Val Tyr 1795 1800 1805 Gly Met His Ser Ala Gly Gly Gly Gly Leu Ala Ala Ala Thr Ile Ile 1810 1815 1820 Thr Lys Glu Leu Ile Glu Ala Ala Glu Lys Ser Met Leu Ala Leu Glu 1825 1830 1835 1840 Pro Gln Gly Ala Ile Val Asp Ile Ala Thr Gly Ser Val Val His Val 1845 1850 1855 Pro Arg Lys Thr Lys Leu Arg Arg Thr Val Ala His Asp Val Phe Gln 1860 1865 1870 Pro Lys Phe Glu Pro Ala Val Leu Ser Arg Tyr Asp Pro Arg Thr Asp 1875 1880 1885 Lys Asp Val Asp Val Val Ala Phe Ser Lys His Thr Thr Asn Met Glu 1890 1895 1900 Ser Leu Pro Pro Ile Phe Asp Val Val Cys Gly Glu Tyr Ala Asn Arg 1905 1910 1915 1920 Val Phe Thr Ile Leu Gly Lys Glu Asn Gly Leu Leu Thr Val Glu Gln 1925 1930 1935 Ala Val Leu Gly Leu Pro Gly Met Asp Pro Met Glu Lys Asp Thr Ser 1940 1945 1950 Pro Gly Leu Pro Tyr Thr Gln Gln Gly Leu Arg Arg Thr Asp Leu Leu 1955 1960 1965 Asn Phe Ile Thr Ala Lys Met Thr Pro Gln Leu Asp Tyr Ala His Ser 1970 1975 1980 Lys Leu Val Ile Gly Val Tyr Asp Asp Val Val Tyr Gln Ser Phe Leu 1985 1990 1995 2000 Lys Asp Glu Ile Arg Pro Ile Glu Lys Ile His Glu Ala Lys Thr Arg 2005 2010 2015 Ile Val Asp Val Pro Pro Phe Ala His Cys Ile Trp Gly Arg Gln Leu 2020 2025 2030 Leu Gly Arg Phe Ala Ser Lys Phe Gln Thr Lys Pro Gly Leu Glu Leu 2035 2040 2045 Gly Ser Ala Ile Gly Thr Asp Pro Asp Val Asp Trp Thr Arg Tyr Ala 2050 2055 2060 Val Glu Leu Ser Gly Phe Asn Tyr Val Tyr Asp Val Asp Tyr Ser Asn 2065 2070 2075 2080 Phe Asp Ala Ser His Ser Thr Ala Met Phe Glu Cys Leu Ile Asn Asn 2085 2090 2095 Phe Phe Thr Glu Gln Asn Gly Phe Asp Arg Arg Ile Ala Glu Tyr Leu 2100 2105 2110 Arg Ser Leu Ala Val Ser Arg His Ala Tyr Glu Asp Arg Arg Val Leu 2115 2120 2125 Ile Arg Gly Gly Leu Pro Ser Gly Cys Ala Ala Thr Ser Met Leu Asn 2130 2135 2140 Thr Ile Met Asn Asn Val Ile Ile Arg Ala Ala Leu Tyr Leu Thr Tyr 2145 2150 2155 2160 Ser Asn Phe Asp Phe Asp Asp Ile Lys Val Leu Ser Tyr Gly Asp Asp 2165 2170 2175 Leu Leu Ile Gly Thr Asn Tyr Gln Ile Asp Phe Asn Leu Val Lys Glu 2180 2185 2190 Arg Leu Ala Pro Phe Gly Tyr Lys Ile Thr Pro Ala Asn Lys Thr Thr 2195 2200 2205 Thr Phe Pro Leu Thr Ser His Leu Gln Asp Val Thr Phe Leu Lys Arg 2210 2215 2220 Arg Phe Val Arg Phe Asn Ser Tyr Leu Phe Arg Pro Gln Met Asp Ala 2225 2230 2235 2240 Val Asn Leu Lys Ala Met Val Ser Tyr Cys Lys Pro Gly Thr Leu Lys 2245 2250 2255 Glu Lys Leu Met Ser Ile Ala Leu Leu Ala Val His Ser Gly Pro Asp 2260 2265 2270 Ile Tyr Asp Glu Ile Phe Leu Pro Phe Arg Asn Val Gly Ile Val Val 2275 2280 2285 Pro Thr Tyr Ser Ser Met Leu Tyr Arg Trp Leu Ser Leu Phe Arg 2290 2295 2300 <210> 33 <211> 2307 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 33 Met Met Ala Cys Ile His Gly Tyr Pro Ser Val Cys Pro Ile Cys Thr 1 5 10 15 Ala Ile Asp Lys Ser Ser Asp Gly Met Tyr Leu Leu Leu Ala Asp Asn 20 25 30 Glu Trp Phe Pro Ala Asp Leu Leu Thr Met Asp Leu Asp Asp Asp Val 35 40 45 Phe Trp Pro Asn Asp Glu Ser Asp Val Ser Glu Thr Met Asp Trp Thr 50 55 60 Asp Leu Pro Phe Ile Leu Asp Thr Ile Met Glu Pro Gln Gly Asn Ser 65 70 75 80 Thr Ser Ser Asp Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ser Gly Asn Glu Gly Val 85 90 95 Ile Ile Asn Asn Phe Tyr Ser Asn Gln Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Leu 100 105 110 Ser Ala Asn Gly Gly Asn Ala Gly Gly Ala Pro Lys Thr Glu Gly Gln 115 120 125 Leu Gly Asn Ile Leu Gly Asn Ala Ala Asn Ala Phe Ser Thr Met Ala 130 135 140 Pro Leu Leu Leu Asp Gln Asn Thr Glu Glu Met Glu Asn Leu Ser Asp 145 150 155 160 Arg Val Asp Ser Asp Lys Ala Gly Asn Ser Ala Val Asn Thr Gln Ser 165 170 175 Ser Val Gly Arg Leu Cys Gly Tyr Gly Met His His Lys Gly Lys His 180 185 190 Pro Ala Ser Cys Ala Asp Thr Ala Thr Asp Lys Val Leu Ser Ala Glu 195 200 205 Arg Tyr Tyr Thr Ile Asp Leu Ala Thr Trp Thr Thr Thr Leu Gly Thr 210 215 220 Phe Ser His Ile Arg Ile Pro Leu Pro His Val Leu Ala Gly Glu Asp 225 230 235 240 Gly Gly Val Phe Gly Ser Thr Leu Arg Arg His Tyr Leu Cys Lys Cys 245 250 255 Gly Trp Arg Ile Gln Val Gln Cys Asn Ala Ser Gln Phe His Ala Gly 260 265 270 Ser Leu Leu Val Phe Met Ala Pro Glu Phe Tyr Thr Gly His Thr Pro 275 280 285 Val Thr Gly Thr Thr Glu Pro Ala Thr Pro Phe Thr Met Asp Ser Ser 290 295 300 Trp Gln Thr Pro Gln Gln Asn Pro Val Gly Phe Arg Tyr Asp Gly Arg 305 310 315 320 Thr Gly Tyr Phe Ala Leu Asn His Gln Asn Tyr Trp Gln Trp Met Val 325 330 335 Tyr Pro His Gln Ile Leu Asn Leu Arg Thr Asn Thr Ser Val Asp Leu 340 345 350 Glu Val Pro Phe Thr Asn Ile Ala Pro Thr Ser Ser Trp Thr Gln His 355 360 365 Ala Asn Trp Thr Leu Val Val Ala Val Leu Thr Pro Leu Gln Tyr Ala 370 375 380 Ala Gly Ser Ala Thr Asp Val Gln Ile Thr Ala Ser Ile Gln Pro Val 385 390 395 400 Lys Pro Val Phe Asn Gly Leu Arg His Glu Ala Val Val Pro Gln Ser 405 410 415 Pro Ile Pro Val Thr Val Arg Glu His Gln Gly Thr Phe Tyr Ser Thr 420 425 430 Asn Pro Asp Thr Thr Val Pro Ile Tyr Gly Lys Thr Ile Ala Thr Pro 435 440 445 Ser Asp Tyr Met Cys Gly Glu Phe Ser Asp Leu Val Glu Leu Cys Lys 450 455 460 Leu Pro Thr Phe Leu Gly Asn Pro Ala Asn Thr Ser Pro Ala Gly Gly 465 470 475 480 Arg Tyr Pro Tyr Phe Ser Ala Thr Asn Ser Val Pro Ala Thr Ala Leu 485 490 495 Ala Ser Tyr Gln Val Ala Leu Ser Cys Ser Cys Met Ser Asn Ser Met 500 505 510 Leu Ala Ala Val Ala Arg Asn Phe Asn Gln Tyr Arg Gly Ser Leu Asn 515 520 525 Phe Leu Phe Val Phe Thr Gly Thr Ala Met Thr Lys Gly Lys Phe Leu 530 535 540 Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Ala Gly Lys Pro Thr Thr Arg Glu Gln 545 550 555 560 Ala Met Gln Ala Thr Tyr Ala Ile Trp Asp Leu Gly Leu Asn Ser Ser 565 570 575 Tyr Asn Phe Thr Val Pro Phe Ile Ser Pro Thr His Tyr Arg Gln Thr 580 585 590 Ser Tyr Thr Ser Thr Ser Ile Thr Ser Val Asp Gly Trp Leu Thr Val 595 600 605 Trp Gln Leu Thr Pro Leu Thr Tyr Pro Ala Asn Thr Pro Pro Asn Ala 610 615 620 Asp Ile Leu Thr Leu Val Ser Ala Gly Asp Asp Phe Thr Leu Arg Met 625 630 635 640 Pro Ile Ser Pro Thr Lys Trp Ile Pro Gln Gly Val Asp Asn Ala Glu 645 650 655 Lys Gly Lys Val Ser Asn Asp Asp Ala Thr Val Asp Phe Val Ala Glu 660 665 670 Pro Val Lys Phe Pro Asp Asn Gln Thr Lys Val Ser Phe Phe Tyr Asp 675 680 685 Arg Ser Val Pro Leu Gly Leu Leu Arg Pro Ala Gln Gly Met Glu Gln 690 695 700 Asp Phe Ala Tyr Ala Ala Asn Asp Ser Arg Ala Asn Ser Ile Leu Leu 705 710 715 720 Thr Pro Leu Pro Ser Tyr Ala Pro Asp Ser Thr Thr Gly Pro Thr Glu 725 730 735 Thr Gln Ala Pro Ile Gln Trp Arg Trp Leu Arg Gly Thr Ser Asp Gly 740 745 750 Ser Thr Thr Phe Pro Leu Met Thr Lys Gln Asp Tyr Ala Phe Leu Leu 755 760 765 Phe Ser Pro Phe Thr Tyr Tyr Lys Ala Asp Leu Glu Val Thr Leu Ser 770 775 780 Ala Ile Ser Asn Ser Asn Asn Val Thr Val Val Arg Trp Ala Pro Thr 785 790 795 800 Gly Ala Pro Ala Asp Ile Ser Arg Gln Leu Ser Gly Tyr Thr Pro Ser 805 810 815 Ile Gly Asp Thr Arg Asp Pro His Leu Trp Phe Val Gly Ala Gly Asn 820 825 830 Ser Gln Thr Ser Phe Val Val Pro Tyr Asn Ser Pro Leu Ser Val Leu 835 840 845 Pro Ala Ala Trp Phe Asn Gly Trp Ser Asp Phe Gly Asn Thr Lys Asp 850 855 860 Phe Gly Val Ala Pro Asn Ala Asp Phe Gly Arg Leu Trp Ile Gln Gly 865 870 875 880 Asn Thr Ser Val Ala Val Arg Val Arg Tyr Lys Lys Met Lys Val Phe 885 890 895 Cys Pro Arg Pro Thr Leu Phe Leu Pro Trp Pro Ser Thr Thr Thr Thr 900 905 910 Arg Ile His Ala Asp Asn Pro Val Ser Val Met Glu Leu Gln Asn Pro 915 920 925 Phe Ser Phe Tyr Arg Val Asp Leu Phe Ile Thr Phe Thr Asp Glu Leu 930 935 940 Ile Thr Phe Asp Tyr Lys Val His Gly Arg Pro Val Leu Gln Tyr Gln 945 950 955 960 Val Pro Gly Leu Gly Leu Thr Cys Ala Gly Arg Met Leu Val Cys Met 965 970 975 Gly Gln Met Pro Asn His Ala Pro Phe Ser Thr Val Arg His Leu Tyr 980 985 990 His Val Val Phe Thr Gly Ser Arg Asn Ser Phe Gly Val Val Ile Tyr 995 1000 1005 Tyr Lys Arg His Arg Pro Trp Lys Lys Pro Leu His Glu Glu Leu His 1010 1015 1020 Asp Tyr Gly Phe Glu Cys Phe Ser Asp Phe Phe Lys His Val Arg Glu 1025 1030 1035 1040 Tyr His Ala Ala Tyr Tyr Lys Gln Arg Leu Met His Asp Val Glu Thr 1045 1050 1055 Asn Pro Gly Pro Pro Val Gln Ser Val Phe Arg Pro Gln Gly Gly Val 1060 1065 1070 Leu Thr Lys Ser Gln Ala Pro Met Ser Gly Ile Gln Asn Leu Phe Leu 1075 1080 1085 Arg Ala Leu Gly Ile Asp Ala Asp His Gly Glu Phe Thr Arg Ala Val 1090 1095 1100 Thr Met Ile Thr Asp Leu Cys Asn Thr Trp Glu Lys Ala Lys Asn Thr 1105 1110 1115 1120 Leu Val Ser Pro Glu Phe Trp Thr Val Leu Ile Met Lys Thr Val Lys 1125 1130 1135 Phe Ile Ala Ala Ser Val Leu Tyr Leu His Asn Pro Asp Leu Thr Ala 1140 1145 1150 Thr Ile Cys Leu Ser Leu Met Thr Gly Val Asp Val Leu Thr Asn Glu 1155 1160 1165 Ser Ile Phe Asn Trp Leu Ser Asn Lys Leu Ser Lys Leu Phe His Thr 1170 1175 1180 Pro Pro Pro Pro Thr Ser Pro Leu Leu Gln Ala Gln Ser Pro Leu Arg 1185 1190 1195 1200 Glu Ala Asn Asp Gly Phe Asn Leu Ala Lys Asn Ile Glu Trp Ala Ile 1205 1210 1215 Lys Thr Val Gln Lys Ile Val Asp Trp Leu Met Ser Trp Phe Lys Gln 1220 1225 1230 Glu Glu Ala His Pro Gln Ala Lys Leu Asp Lys Met Leu Ala Asp Phe 1235 1240 1245 Pro Glu His Cys Ala Ser Ile Leu Ala Met Arg Asn Gly Arg Lys Ala 1250 1255 1260 Tyr Thr Asp Cys Ala Gly Ala Phe Lys Tyr Phe Glu Asp Leu Tyr Asn 1265 1270 1275 1280 Leu Ala Val Gln Cys Lys Arg Ile Pro Leu Ala Thr Leu Cys Glu Lys 1285 1290 1295 Phe Lys Asn Lys His Asp His Ala Val Ala Arg Pro Glu Pro Val Val 1300 1305 1310 Val Val Leu Arg Gly Asn Ala Gly Gln Gly Lys Ser Val Thr Ser Gln 1315 1320 1325 Ile Ile Ala Gln Ala Val Ser Lys Leu Ala Phe Gly Arg Gln Ser Val 1330 1335 1340 Tyr Ser Ile Pro Pro Asp Ser Asp Tyr Leu Asp Gly Tyr Glu Asn Gln 1345 1350 1355 1360 Phe Ser Val Ile Met Asp Asp Leu Gly Gln Asn Pro Asp Gly Glu Asp 1365 1370 1375 Phe Lys Val Phe Cys Gln Met Val Ser Ser Thr Asn Phe Leu Pro Asn 1380 1385 1390 Met Ala His Leu Glu Lys Lys Gly Thr Pro Phe Thr Ser Asn Phe Ile 1395 1400 1405 Val Ala Thr Thr Asn Leu Pro Lys Phe Arg Pro Val Thr Val Ala His 1410 1415 1420 Tyr Pro Ala Val Asp Arg Arg Ile Thr Phe Asp Leu Thr Val Glu Ala 1425 1430 1435 1440 Gly Pro Ala Cys Lys Thr Pro Thr Gly Met Leu Asp Val Glu Lys Ala 1445 1450 1455 Phe Gln Glu Ile Pro Gly Glu Pro Gln Leu Asp Cys Phe Ser Ser Asp 1460 1465 1470 Cys Ala Leu Leu His Lys Arg Gly Val Gln Phe Ile Cys Asn Arg Thr 1475 1480 1485 Lys Lys Ile Tyr Asn Leu Gln Gln Ile Val Lys Met Val Lys Asp Thr 1490 1495 1500 Ile Asp Asn Lys Val Ala Asn Leu Lys Lys Met Asn Thr Leu Val Ala 1505 1510 1515 1520 Gln Ser Pro Asn Asn Gly Asn Asp Met Glu His Ile Ile Thr Cys Leu 1525 1530 1535 Arg Gln Asn Asn Ala Ala Leu Gln Asp Gln Ile Asp Glu Leu Gln Glu 1540 1545 1550 Ala Phe Ala Gln Ala Gln Glu Arg Gln Asn Phe Leu Ser Asp Trp Met 1555 1560 1565 Lys Val Ser Ala Ile Ile Phe Ala Gly Ile Ala Ser Leu Ser Ala Val 1570 1575 1580 Cys Lys Leu Val Gly Arg Leu Lys Asn Leu Ile Trp Pro Ser Pro Val 1585 1590 1595 1600 His Val Glu Leu Ser Glu Gly Glu Gln Ala Ala Tyr Ala Gly Ala Lys 1605 1610 1615 Arg Gly Ala Lys Gln Ala Leu Gln Val Leu Asp Leu Gln Gly Gly Gly 1620 1625 1630 Arg Ile Ile Ala Gln Ala Gly Asn Pro Val Met Asp Tyr Glu Val Cys 1635 1640 1645 Val Ala Lys Asn Met Val Ala Pro Ile Thr Phe Tyr Tyr Ala Asp Lys 1650 1655 1660 Ala Gln Val Thr Gln Ser Cys Leu Leu Val Lys Gly Arg Leu Phe Val 1665 1670 1675 1680 Val Asn Arg His Val Ala Glu Thr Asp Trp Val Ser Phe Glu Leu Arg 1685 1690 1695 Asp Val Arg His Glu Arg Asp Thr Val Thr Met Arg Ser Val Asn Arg 1700 1705 1710 Ser Gly Met Glu Val Asp Leu Thr Phe Ile Lys Val Thr Lys Gly Pro 1715 1720 1725 Leu Phe Lys Asp Asn Thr Lys Lys Phe Cys Ser Asn Lys Asp Asp Phe 1730 1735 1740 Pro Gln Lys Asn Glu Thr Val Thr Gly Ile Met Asn Thr Gly Leu Pro 1745 1750 1755 1760 Phe Val Phe Asn Gly Lys Phe Ile Ile Gly Asn His Pro Val Asn Thr 1765 1770 1775 Thr Thr Gly Ala Thr Phe Asn His Cys Leu His Tyr Arg Ala Asn Thr 1780 1785 1790 Arg Arg Gly Trp Cys Gly Ser Ala Val Ile Cys Gln Val Asn Gly Lys 1795 1800 1805 Lys Ala Val Tyr Gly Met His Ser Ala Gly Gly Gly Gly Leu Ala Ala 1810 1815 1820 Ala Thr Ile Ile Thr Gln Glu Leu Val Glu Ala Ala Glu Gln Asn Met 1825 1830 1835 1840 Asp Arg Leu Val Pro Gln Gly Ala Ile Met Glu Ile Gly Thr Gly Ser 1845 1850 1855 Val Val His Val Pro Arg Lys Thr Lys Leu Arg Arg Thr Val Ala His 1860 1865 1870 Glu Ile Phe Leu Pro Lys Phe Glu Pro Ala Val Leu Ser Arg Tyr Asp 1875 1880 1885 Pro Arg Thr Glu Lys Asp Val Asp Gln Val Ala Phe Ser Lys His Thr 1890 1895 1900 Thr Asn Met Glu Glu Leu Pro Ala Val Phe Ser Met Val Ala Lys Glu 1905 1910 1915 1920 Tyr Ala Asn Arg Val Phe Thr Lys Leu Gly Lys Glu Asn Gln Leu Leu 1925 1930 1935 Thr Thr Gln Gln Ala Ile Leu Gly Leu Pro Gly Met Asp Pro Met Glu 1940 1945 1950 Lys Asp Thr Ser Pro Gly Leu Pro Tyr Thr Gln Gln Gly Leu Arg Arg 1955 1960 1965 Thr Asp Leu Val Asn Phe Glu Thr Gly Lys Met Asp His Asn Leu Asp 1970 1975 1980 Tyr Ala His Ser Lys Leu Met Leu Gly His Tyr Glu Asp Val Val Tyr 1985 1990 1995 2000 Gln Ser Phe Leu Lys Asp Glu Ile Arg Pro Ile Glu Lys Ile His Glu 2005 2010 2015 Ala Lys Thr Arg Ile Val Asp Val Pro Pro Phe His His Cys Ile Trp 2020 2025 2030 Gly Arg Gln Leu Leu Gly Arg Phe Ala Ser Arg Phe Gln Thr Asn Pro 2035 2040 2045 Gly Leu Asp Leu Gly Ser Ala Ile Gly Thr Asp Pro Asp Val Asp Trp 2050 2055 2060 Thr Val Phe Ala His Gln Leu Ala Glu Phe Lys Tyr Ile Tyr Asp Val 2065 2070 2075 2080 Asp Tyr Ser Asn Phe Asp Ala Ser His Ser Thr Ala Ile Phe Glu Ile 2085 2090 2095 Leu Ile Gln Glu Phe Phe Thr Pro Gln Asn Gly Phe Asp Pro Arg Ile 2100 2105 2110 Gly Glu Tyr Leu Arg Ser Leu Ala Val Ser Arg His Ala Tyr Glu Asp 2115 2120 2125 Arg Arg Val Leu Ile Arg Gly Gly Leu Pro Ser Gly Cys Ala Ala Thr 2130 2135 2140 Ser Met Ile Asn Thr Ile Ile Asn Asn Ile Val Ile Arg Ala Ala Leu 2145 2150 2155 2160 Tyr Met Thr Tyr Ala Asn Phe Glu Phe Asp Asp Ile Lys Val Leu Ser 2165 2170 2175 Tyr Gly Asp Asp Leu Leu Ile Ala Thr Asn Tyr Glu Ile Asn Phe Asn 2180 2185 2190 Leu Val Lys Glu Arg Leu Ala Pro Phe Asn Tyr Lys Ile Thr Pro Ala 2195 2200 2205 Asn Lys Thr Ser Thr Phe Pro Gln Thr Ser His Leu Gln Asp Val Val 2210 2215 2220 Phe Leu Lys Arg Arg Phe Val Gln Phe Asn Ser Phe Leu Phe Arg Pro 2225 2230 2235 2240 Gln Met Glu Thr Glu Asn Leu Lys Ala Met Val Ser Tyr Cys Arg Pro 2245 2250 2255 Gly Val Leu Lys Glu Lys Leu Met Ser Ile Ala Leu Leu Ala Val His 2260 2265 2270 Ser Gly Pro Asp Val Tyr Asp Glu Ile Phe Met Pro Phe Arg Arg Ile 2275 2280 2285 Gly Val Val Val Pro Glu Tyr Ser Thr Met Leu Tyr Arg Trp Leu Asn 2290 2295 2300 Leu Phe Arg 2305 <210> 34 <211> 930 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <220> <221> MOD_RES <222> (557) <223> variable amino acid <400> 34 Met Ala Cys Lys His Gly Tyr Pro Asp Val Cys Pro Ile Cys Thr Ala 1 5 10 15 Ile Asp Val Thr Pro Gly Phe Glu Tyr Leu Leu Leu Ala Asp Gly Glu 20 25 30 Trp Phe Pro Thr Asp Leu Leu Cys Val Asp Leu Asp Asp Asp Val Phe 35 40 45 Trp Pro Ser Asp Ser Ser Asn Gln Ser Gln Thr Met Glu Trp Thr Asp 50 55 60 Ile Pro Leu Ile Cys Asp Thr Val Met Glu Pro Gln Gly Asn Ser Thr 65 70 75 80 Ser Ser Asp Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ser Gly Asn Glu Gly Val Ile 85 90 95 Ile Asn Asn Phe Tyr Ser Asn Gln Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Leu Ser 100 105 110 Ala Asn Gly Gly Asn Ala Gly Asp Gly Pro Lys Thr Glu Gly Gln Leu 115 120 125 Ser Asn Ile Leu Gly Gly Ala Ala Asn Ala Phe Ala Thr Met Ala Pro 130 135 140 Leu Leu Leu Asp Glu Asn Thr Glu Glu Met Glu Asn Leu Ser Asp Arg 145 150 155 160 Val Asp Ser Asp Lys Ala Gly Asn Ser Ala Thr Asn Thr Gln Ser Ser 165 170 175 Val Gly Arg Leu His Gly Tyr Gly Ala Thr His Arg Gly Asp His Pro 180 185 190 Ala Ser Cys Ala Asp Thr Ala Thr Asp Lys Val Leu Ala Ala Glu Arg 195 200 205 Tyr Tyr Thr Ile Asp Leu Ala Thr Trp Thr Thr Ala Gln Thr Thr Phe 210 215 220 Ser His Ile Arg Val Pro Leu Pro His Ala Leu Ala Gly Glu His Gly 225 230 235 240 Gly Val Phe Gly Ala Thr Leu Arg Arg His Tyr Leu Ala Lys Cys Gly 245 250 255 Trp Arg Val Gln Val Gln Cys Asn Ala Ser Gln Phe His Ala Gly Ser 260 265 270 Leu Leu Val Phe Leu Ala Pro Glu Phe Tyr Thr Gly Thr Gly Val Ala 275 280 285 Thr Ser Gly Gln Glu Pro Asn Lys Val Phe Leu Met Asp Thr Thr Trp 290 295 300 Gln Glu Pro Gln Ala Ala Pro Thr Gly Phe Arg Tyr Asp Gly Lys Asn 305 310 315 320 Gly Phe Phe Thr Leu Asn His Gln Asn Tyr Trp Gln Trp Thr Val Tyr 325 330 335 Pro His Gln Ile Leu Asn Leu Arg Thr Asn Thr Ser Val Asp Leu Glu 340 345 350 Val Pro Tyr Val Asn Val Ala Pro Thr Ser Ser Trp Thr Gln His Ala 355 360 365 Asn Trp Ala Leu Val Val Ala Val Leu Thr Pro Leu Gln Tyr Ser Thr 370 375 380 Gly Ala Ala Thr Asp Val Ala Ile Thr Val Ser Leu Gln Pro Val Asn 385 390 395 400 Pro Val Phe Asn Gly Leu Arg His Glu Ala Gln Val Pro Gln Ser Pro 405 410 415 Val Ala Val Thr Val Arg Glu His Gln Gly Ser Phe Tyr Ser Thr Asn 420 425 430 Pro Asp Thr Thr Val Pro Ile Tyr Gly Lys Thr Ile Val Thr Pro Ser 435 440 445 Asp Tyr Met Cys Gly Glu Phe Thr Asp Leu Leu Glu Leu Cys Lys Leu 450 455 460 Pro Thr Phe Leu Gly Asn Leu Ser Asn Asp Thr Arg Val Pro Phe Phe 465 470 475 480 Thr Ala Thr Asn Ser Val Pro Thr Glu Ser Leu Val Glu Tyr Gln Val 485 490 495 Thr Leu Ser Cys Ser Cys Met Ser Asn Ser Met Leu Ala Ser Val Ala 500 505 510 Arg Asn Phe Asn Gln Tyr Arg Gly Ser Leu Asn Phe Leu Phe Val Phe 515 520 525 Thr Gly Ser Ala Met Thr Lys Gly Lys Phe Leu Ile Ala Tyr Thr Pro 530 535 540 Pro Gly Ala Gly Lys Pro Thr Thr Arg Asp Gln Ala Xaa Gln Ser Thr 545 550 555 560 Tyr Ala Ile Trp Asp Leu Gly Leu Asn Ser Ser Tyr Asn Phe Thr Val 565 570 575 Pro Phe Ile Ser Pro Ser His Tyr Arg Gln Thr Ser Tyr Thr Ser Pro 580 585 590 Ser Ile Ala Ala Val Asp Gly Trp Leu Thr Val Trp Gln Leu Thr Pro 595 600 605 Leu Thr Phe Pro Ala Asn Val Pro Pro Ser Ser Asp Ile Leu Thr Leu 610 615 620 Val Ser Ala Gly Asn Asp Phe Thr Leu Arg Met Pro Ile Ser Pro Thr 625 630 635 640 Lys Trp Ile Pro Gln Gly Val Asp Asn Ala Glu Lys Gly Lys Val Ser 645 650 655 Asp Asp Asn Ala Ser Val Asp Phe Val Ala Glu Pro Ile Lys Leu Pro 660 665 670 Glu Asn Gln Thr Arg Val Asn Phe Phe Tyr Asp Arg Ser Ser Pro Ile 675 680 685 Gly Leu Leu Arg Pro Asn Gln Ala Ile Glu Ser Asn Phe Ser Tyr Ser 690 695 700 Ala Asp Ser Asn Gly Ala Thr Asn Cys Ala Leu Leu Thr Pro Leu Pro 705 710 715 720 Ser Tyr Ser Pro Asp Arg Pro Gly Gln Ser Pro Asp Thr Ser Lys Ala 725 730 735 Pro Ile Gln Trp Arg Trp Ile Ser Ala Val Thr Glu Ser Gly Thr Val 740 745 750 Ser Asn Thr Phe Pro Thr Arg Thr Arg Gln Asp Tyr Ala Phe Leu Leu 755 760 765 Phe Ser Pro Phe Thr Tyr Tyr Lys Cys Asp Leu Glu Val Thr Leu Ser 770 775 780 Ser Val Gly Asn Gly Val Val Ala Ser Leu Val Arg Trp Ala Pro Thr 785 790 795 800 Gly Ala Pro Ala Asp Ile Thr Thr Gln Leu Thr Thr Ser Thr Pro Ser 805 810 815 Ile Gly Asp Thr Arg Asp Pro His Met Trp Leu Val Gly Ala Gly Asn 820 825 830 Ser Gln Thr Ser Phe Val Ile Pro Tyr Asn Ser Pro Leu Ser Val Leu 835 840 845 Pro Ala Ala Trp Phe Asn Gly Trp Ser Asn Phe Ser Asn Thr Tyr Asp 850 855 860 Phe Gly Ile Ala Pro Cys Ser Asp Phe Gly Arg Leu Trp Ile Gln Gly 865 870 875 880 Asn Ala Pro Leu Ala Ile Arg Val Arg Tyr Lys Lys Met Arg Val Phe 885 890 895 Cys Pro Arg Pro Thr Leu Phe Phe Pro Trp Pro Thr Pro Thr Thr Thr 900 905 910 Lys Val Asn Ala Asp Asn Pro Val Pro Ile Leu Asp Leu Glu Asn Pro 915 920 925 Ala Ala 930 <210> 35 <211> 142 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 35 Leu Ala His His Gly Asn Lys Lys Ser Leu Gln Glu Leu Asn Glu Glu 1 5 10 15 Gln Trp Val Glu Met Ser Asp Asp Tyr Arg Thr Gly Lys Asn Met Pro 20 25 30 Phe Gln Ser Leu Gly Thr Tyr Tyr Arg Pro Pro Asn Trp Thr Trp Gly 35 40 45 Pro Asn Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Val Thr Val Phe Pro His Gln Ile 50 55 60 Leu Asn Ala Arg Thr Ser Thr Ser Val Asp Ile Asn Val Pro Tyr Ile 65 70 75 80 Gly Glu Thr Pro Thr Gln Ser Ser Glu Thr Gln Asn Ser Trp Thr Leu 85 90 95 Leu Val Met Val Leu Val Pro Leu Asp Tyr Lys Glu Gly Ala Thr Thr 100 105 110 Asp Pro Glu Ile Thr Phe Ser Val Arg Pro Thr Ser Pro Tyr Phe Asn 115 120 125 Gly Leu Arg Asn Arg Tyr Thr Ala Gly Thr Asp Glu Glu Gln 130 135 140 <210> 36 <211> 239 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 36 Gly Pro Ile Pro Thr Ala Pro Arg Glu Asn Ser Leu Met Phe Leu Ser 1 5 10 15 Thr Leu Pro Asp Asp Thr Val Pro Ala Tyr Gly Asn Val Arg Thr Pro 20 25 30 Pro Val Asn Tyr Leu Pro Gly Glu Ile Thr Asp Leu Leu Gln Leu Ala 35 40 45 Arg Ile Pro Thr Leu Met Ala Phe Glu Arg Val Pro Glu Pro Val Pro 50 55 60 Ala Ser Asp Thr Tyr Val Pro Tyr Val Ala Val Pro Thr Gln Phe Asp 65 70 75 80 Asp Arg Pro Leu Ile Ser Phe Pro Ile Thr Leu Ser Asp Pro Val Tyr 85 90 95 Gln Asn Thr Leu Val Gly Ala Ile Ser Ser Asn Phe Ala Asn Tyr Arg 100 105 110 Gly Cys Ile Gln Ile Thr Leu Thr Phe Cys Gly Pro Met Met Ala Arg 115 120 125 Gly Lys Phe Leu Leu Ser Tyr Ser Pro Pro Asn Gly Thr Gln Pro Gln 130 135 140 Thr Leu Ser Glu Ala Met Gln Cys Thr Tyr Ser Ile Trp Asp Ile Gly 145 150 155 160 Leu Asn Ser Ser Trp Thr Phe Val Val Pro Tyr Ile Ser Pro Ser Asp 165 170 175 Tyr Arg Glu Thr Arg Ala Ile Thr Asn Ser Val Tyr Ser Ala Asp Gly 180 185 190 Trp Phe Ser Leu His Lys Leu Thr Lys Ile Thr Leu Pro Pro Asp Cys 195 200 205 Pro Gln Ser Pro Cys Ile Leu Phe Phe Ala Ser Ala Gly Glu Asp Tyr 210 215 220 Thr Leu Arg Leu Pro Val Asp Cys Asn Pro Ser Tyr Val Phe His 225 230 235 <210> 37 <211> 259 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 37 Ser Thr Asp Asn Ala Glu Thr Gly Val Ile Glu Ala Gly Asn Thr Asp 1 5 10 15 Thr Asp Phe Ser Gly Glu Leu Ala Ala Pro Gly Pro Asn His Thr Asn 20 25 30 Val Lys Phe Leu Phe Asp Arg Ser Arg Leu Leu Asn Val Ile Lys Val 35 40 45 Leu Glu Lys Asp Ala Val Phe Pro Arg Pro Phe Pro Thr Gln Glu Gly 50 55 60 Ala Gln Gln Asp Asp Gly Tyr Phe Cys Leu Leu Thr Pro Arg Pro Thr 65 70 75 80 Val Ala Ser Arg Pro Ala Thr Arg Phe Gly Leu Tyr Ala Asn Pro Ser 85 90 95 Gly Ser Gly Val Leu Ala Asn Thr Ser Leu Asp Phe Asn Phe Tyr Ser 100 105 110 Leu Ala Cys Phe Thr Tyr Phe Arg Ser Asp Leu Glu Val Thr Val Val 115 120 125 Ser Leu Glu Pro Asp Leu Glu Phe Ala Val Gly Trp Phe Pro Ser Gly 130 135 140 Ser Glu Tyr Gln Ala Ser Ser Phe Val Tyr Asp Gln Leu His Val Pro 145 150 155 160 Phe His Phe Thr Gly Arg Thr Pro Arg Ala Phe Ala Ser Lys Gly Gly 165 170 175 Lys Val Ser Phe Val Leu Pro Trp Asn Ser Val Ser Ser Val Leu Pro 180 185 190 Val Arg Trp Gly Gly Ala Ser Lys Leu Ser Ser Ala Thr Arg Gly Leu 195 200 205 Pro Ala His Ala Asp Trp Gly Thr Ile Tyr Ala Phe Val Pro Arg Pro 210 215 220 Asn Glu Lys Lys Ser Thr Ala Val Lys His Val Ala Val Tyr Ile Arg 225 230 235 240 Tyr Lys Asn Ala Arg Ala Trp Cys Pro Ser Met Leu Pro Phe Arg Ser 245 250 255 Tyr Lys Gln <210> 38 <211> 14 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 38 Lys Met Leu Met Gln Ser Gly Asp Ile Glu Thr Asn Pro Gly 1 5 10 <210> 39 <211> 128 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 39 Pro Ala Ser Asp Asn Pro Ile Leu Glu Phe Leu Glu Ala Glu Asn Asp 1 5 10 15 Leu Val Thr Leu Ala Ser Leu Trp Lys Met Val His Ser Val Gln Gln 20 25 30 Thr Trp Arg Lys Tyr Val Lys Asn Asp Asp Phe Trp Pro Asn Leu Leu 35 40 45 Ser Glu Leu Val Gly Glu Gly Ser Val Ala Leu Ala Ala Thr Leu Ser 50 55 60 Asn Gln Ala Ser Val Lys Ala Leu Leu Gly Leu His Phe Leu Ser Arg 65 70 75 80 Gly Leu Asn Tyr Thr Asp Phe Tyr Ser Leu Leu Ile Glu Lys Cys Ser 85 90 95 Ser Phe Phe Thr Val Glu Pro Pro Pro Pro Pro Ala Glu Asn Leu Met 100 105 110 Thr Lys Pro Ser Val Lys Ser Lys Phe Arg Lys Leu Phe Lys Met Gln 115 120 125 <210> 40 <211> 322 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 40 Gly Pro Met Asp Lys Val Lys Asp Trp Asn Gln Ile Ala Ala Gly Leu 1 5 10 15 Lys Asn Phe Gln Phe Val Arg Asp Leu Val Lys Glu Val Val Asp Trp 20 25 30 Leu Gln Ala Trp Ile Asn Lys Glu Lys Ala Ser Pro Val Leu Gln Tyr 35 40 45 Gln Leu Glu Met Lys Lys Leu Gly Pro Val Ala Leu Ala His Asp Ala 50 55 60 Phe Met Ala Gly Ser Gly Pro Pro Leu Ser Asp Asp Gln Ile Glu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Asn Leu Lys Ser Leu Ala Leu Thr Leu Gly Lys Thr Asn Leu 85 90 95 Ala Gln Ser Leu Thr Thr Met Ile Asn Ala Lys Gln Ser Ser Ala Gln 100 105 110 Arg Val Glu Pro Val Val Val Val Leu Arg Gly Lys Pro Gly Cys Gly 115 120 125 Lys Gly Leu Ala Ser Thr Leu Ile Ala Gln Ala Val Ser Lys Arg Leu 130 135 140 Tyr Gly Ser Gln Ser Val Tyr Ser Leu Pro Pro Asp Pro Asp Phe Phe 145 150 155 160 Asp Gly Tyr Lys Gly Gln Phe Val Thr Leu Met Asp Asp Leu Gly Gln 165 170 175 Asn Pro Asp Gly Gln Asp Phe Ser Thr Phe Cys Gln Met Val Ser Thr 180 185 190 Ala Gln Phe Leu Pro Asn Met Ala Asp Leu Ala Glu Lys Gly Arg Pro 195 200 205 Phe Thr Ser Asn Leu Ile Ile Ala Thr Thr Asn Leu Pro His Phe Ser 210 215 220 Pro Val Thr Ile Ala Asp Pro Ser Ala Val Ser Arg Arg Ile Asn Tyr 225 230 235 240 Asp Leu Thr Leu Glu Val Ser Glu Ala Tyr Lys Lys His Thr Arg Leu 245 250 255 Asn Phe Asp Leu Ala Phe Arg Arg Thr Asp Ala Pro Pro Ile Tyr Pro 260 265 270 Phe Ala Ala His Val Pro Phe Val Asp Val Ala Val Arg Phe Lys Asn 275 280 285 Gly His Gln Asn Phe Asn Leu Leu Glu Leu Val Asp Ser Ile Cys Thr 290 295 300 Asp Ile Arg Ala Lys Gln Gln Gly Ala Arg Asn Met Gln Thr Leu Val 305 310 315 320 Leu Gln <210> 41 <211> 90 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 41 Ser Pro Asn Glu Asn Asp Asp Thr Pro Val Asp Glu Ala Leu Gly Arg 1 5 10 15 Val Leu Ser Pro Ala Ala Val Asp Glu Ala Leu Val Asp Leu Thr Pro 20 25 30 Glu Ala Asp Pro Val Gly Arg Leu Ala Ile Leu Ala Lys Leu Gly Leu 35 40 45 Ala Leu Ala Ala Val Thr Pro Gly Leu Ile Ile Leu Ala Val Gly Leu 50 55 60 Tyr Arg Tyr Phe Ser Gly Ser Asp Ala Asp Gln Glu Glu Thr Glu Ser 65 70 75 80 Glu Gly Ser Val Lys Ala Pro Arg Ser Glu 85 90 <210> 42 <211> 22 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 42 Asn Ala Tyr Asp Gly Pro Lys Lys Asn Ser Lys Pro Pro Gly Ala Leu 1 5 10 15 Ser Leu Met Glu Met Gln 20 <210> 43 <211> 211 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 43 Gln Pro Asn Val Asp Met Gly Phe Glu Ala Ala Val Ala Lys Lys Val 1 5 10 15 Val Val Pro Ile Thr Phe Met Val Pro Asn Arg Pro Ser Gly Leu Thr 20 25 30 Gln Ser Ala Leu Leu Val Thr Gly Arg Thr Phe Leu Ile Asn Glu His 35 40 45 Thr Trp Ser Asn Pro Ser Trp Thr Ser Phe Thr Ile Arg Gly Glu Val 50 55 60 His Thr Arg Asp Glu Pro Phe Gln Thr Val His Phe Thr His His Gly 65 70 75 80 Ile Pro Thr Asp Leu Met Met Val Arg Leu Gly Pro Gly Asn Ser Phe 85 90 95 Pro Asn Asn Leu Asp Lys Phe Gly Leu Asp Gln Met Pro Ala Arg Asn 100 105 110 Ser Arg Val Val Gly Val Ser Ser Ser Tyr Gly Asn Phe Phe Phe Ser 115 120 125 Gly Asn Phe Leu Gly Phe Val Asp Ser Val Thr Ser Glu Gln Gly Thr 130 135 140 Tyr Ala Arg Leu Phe Arg Tyr Arg Val Thr Thr Tyr Lys Gly Trp Cys 145 150 155 160 Gly Ser Ala Leu Val Cys Glu Ala Gly Gly Val Arg Arg Ile Ile Gly 165 170 175 Leu His Ser Ala Gly Ala Ala Gly Ile Gly Ala Gly Thr Tyr Ile Ser 180 185 190 Lys Leu Gly Leu Ile Lys Ala Leu Lys His Leu Gly Glu Pro Leu Ala 195 200 205 Thr Met Gln 210 <210> 44 <211> 462 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 44 Gly Leu Met Thr Glu Leu Glu Pro Gly Ile Thr Val His Val Pro Arg 1 5 10 15 Lys Ser Lys Leu Arg Lys Thr Thr Ala His Ala Val Tyr Lys Pro Glu 20 25 30 Phe Glu Pro Ala Val Leu Ser Lys Phe Asp Pro Arg Leu Asn Lys Asp 35 40 45 Val Asp Leu Asp Glu Val Ile Trp Ser Lys His Thr Ala Asn Val Pro 50 55 60 Tyr Gln Pro Pro Leu Phe Tyr Thr Tyr Met Ser Glu Tyr Ala His Arg 65 70 75 80 Val Phe Ser Phe Leu Gly Lys Asp Asn Asp Ile Leu Thr Val Lys Glu 85 90 95 Ala Ile Leu Gly Ile Pro Gly Leu Asp Pro Met Asp Pro His Thr Ala 100 105 110 Pro Gly Leu Pro Tyr Ala Ile Asn Gly Leu Arg Arg Thr Asp Leu Val 115 120 125 Asp Phe Val Asn Gly Thr Val Asp Ala Ala Leu Ala Val Gln Ile Gln 130 135 140 Lys Phe Leu Asp Gly Asp Tyr Ser Asp His Val Phe Gln Thr Phe Leu 145 150 155 160 Lys Asp Glu Ile Arg Pro Ser Glu Lys Val Arg Ala Gly Lys Thr Arg 165 170 175 Ile Val Asp Val Pro Ser Leu Ala His Cys Ile Val Gly Arg Met Leu 180 185 190 Leu Gly Arg Phe Ala Ala Lys Phe Gln Ser His Pro Gly Phe Leu Leu 195 200 205 Gly Ser Ala Ile Gly Ser Asp Pro Asp Val Phe Trp Thr Val Ile Gly 210 215 220 Ala Gln Leu Glu Gly Arg Lys Asn Thr Tyr Asp Val Asp Tyr Ser Ala 225 230 235 240 Phe Asp Ser Ser His Gly Thr Gly Ser Phe Glu Ala Leu Ile Ser His 245 250 255 Phe Phe Thr Val Asp Asn Gly Phe Ser Pro Ala Leu Gly Pro Tyr Leu 260 265 270 Arg Ser Leu Ala Val Ser Val His Ala Tyr Gly Glu Arg Arg Ile Lys 275 280 285 Ile Thr Gly Gly Leu Pro Ser Gly Cys Ala Ala Thr Ser Leu Leu Asn 290 295 300 Thr Val Leu Asn Asn Val Ile Ile Arg Thr Ala Leu Ala Leu Thr Tyr 305 310 315 320 Lys Glu Phe Glu Tyr Asp Thr Val Asp Ile Ile Ala Tyr Gly Asp Asp 325 330 335 Leu Leu Val Gly Thr Asp Tyr Asp Leu Asp Phe Asn Glu Val Ala Arg 340 345 350 Arg Ala Ala Lys Leu Gly Tyr Lys Met Thr Pro Ala Asn Lys Gly Ser 355 360 365 Val Phe Pro Pro Thr Ser Ser Leu Ser Asp Ala Val Phe Leu Lys Arg 370 375 380 Lys Phe Val Gln Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Lys Pro Val Met Asp Leu 385 390 395 400 Lys Asn Leu Glu Ala Met Leu Ser Tyr Phe Lys Pro Gly Thr Leu Leu 405 410 415 Glu Lys Leu Gln Ser Val Ser Met Leu Ala Gln His Ser Gly Lys Glu 420 425 430 Glu Tyr Asp Arg Leu Met His Pro Phe Ala Asp Tyr Gly Ala Val Pro 435 440 445 Ser His Glu Tyr Leu Gln Ala Arg Trp Arg Ala Leu Phe Asp 450 455 460 <210> 45 <211> 6 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 45 Ala Gly Phe Cys Thr Glu 1 5 <210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 46 Ala Gly Asp Cys Ala Glu 1 5 <210> 47 <211> 6 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 47 Thr Gly Phe Cys Ala Glu 1 5 <210> 48 <211> 6 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 48 Ala Gly Phe Cys Ala Glu 1 5 <210> 49 <211> 22 <212> PRT <213> Porcine teschovirus <400> 49 Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 50 <211> 22 <212> PRT <213> Porcine teschovirus <400> 50 Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 51 <211> 22 <212> PRT <213> Porcine teschovirus <400> 51 Gly Pro Gly Ala Ser Ser Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 52 <211> 22 <212> PRT <213> Porcine teschovirus <400> 52 Gly Pro Gly Ala Ser Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 53 <211> 22 <212> PRT <213> Porcine teschovirus <400> 53 Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 54 <211> 22 <212> PRT <213> Porcine teschovirus <400> 54 Gly Pro Gly Ala Ala Asn Phe Ser Leu Leu Arg Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 55 <211> 22 <212> PRT <213> Porcine teschovirus <400> 55 Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 56 <211> 22 <212> PRT <213> Porcine teschovirus <400> 56 Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 57 <211> 22 <212> PRT <213> Porcine teschovirus <400> 57 Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Ile 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 58 <211> 22 <212> PRT <213> Porcine teschovirus <400> 58 Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 59 <211> 22 <212> PRT <213> Porcine teschovirus <400> 59 Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 60 <211> 22 <212> PRT <213> Porcine teschovirus <400> 60 Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Arg Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 61 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 61 Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 62 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 62 Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 63 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 63 Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Gln Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 64 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 64 Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Pro Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 65 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 65 Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 66 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 66 Leu Ser Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 67 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 67 Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 68 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 68 Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 69 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 69 Ala Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 70 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 70 Val Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 71 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 71 Met Cys Ser Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 72 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 72 Leu Cys Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 73 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 73 Leu Cys Asn Phe Asp Leu Leu Met Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 74 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 74 Met Ala Asn Phe Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 75 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 75 Leu Ser Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 76 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 76 Leu Phe Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 77 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 77 Leu Cys Asn Cys Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 78 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 78 Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 79 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 79 Leu Cys Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 80 <211> 19 <212> PRT <213> Foot and mouth disease virus <400> 80 Met Cys Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 81 <211> 22 <212> PRT <213> Equine rhinitis virus <400> 81 Asn Lys Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 82 <211> 22 <212> PRT <213> Equine rhinitis virus <400> 82 Ser Glu Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Leu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 83 <211> 22 <212> PRT <213> Equine rhinitis virus <400> 83 Ser Gln Gly Ala Thr Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 84 <211> 22 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 84 Asn Ala His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ala Asp Leu Leu Ile His Asp Ile 1 5 10 15 Glu Thr Asn Pro Gly Pro 20 <210> 85 <211> 22 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 85 Asn Ala His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ala Asp Leu Leu Ile His Asp Ile 1 5 10 15 Glu Thr Asn Pro Gly Pro 20 <210> 86 <211> 22 <212> PRT <213> Mengo virus <400> 86 Glu Thr His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ser Asp Leu Leu Ile His Asp Val 1 5 10 15 Glu Thr Asn Pro Gly Pro 20 <210> 87 <211> 22 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 87 Pro Phe Arg Ser Tyr Lys Gln Lys Met Leu Met Gln Ser Gly Asp Ile 1 5 10 15 Glu Thr Asn Pro Gly Pro 20 <210> 88 <211> 22 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 88 Arg Gly Tyr His Ala Asp Tyr Tyr Arg Gln Arg Leu Ile His Asp Val 1 5 10 15 Glu Thr Asn Pro Gly Pro 20 <210> 89 <211> 22 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 89 Arg Gly Tyr His Ala Asp Tyr Tyr Lys Gln Arg Leu Ile His Asp Val 1 5 10 15 Glu Met Asn Pro Gly Pro 20 <210> 90 <211> 22 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 90 Arg Ala Tyr His Ala Asp Tyr Tyr Lys Gln Arg Leu Ile His Asp Val 1 5 10 15 Glu Met Asn Pro Gly Pro 20 <210> 91 <211> 22 <212> PRT <213> Rat theiler's like virus <400> 91 Arg Glu Tyr His Ala Ala Tyr Tyr Lys Gln Arg Leu Met His Asp Val 1 5 10 15 Glu Thr Asn Pro Gly Pro 20 <210> 92 <211> 22 <212> PRT <213> Ljungan virus <400> 92 Glu Met Asp Phe Ala Gly Gly Lys Phe Leu Asn Gln Cys Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Thr Asn Pro Gly Pro 20 <210> 93 <211> 22 <212> PRT <213> Ljungan virus <400> 93 Glu Met Asp Phe Ala Gly Gly Lys Leu Phe Asn Gln Cys Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Thr Asn Pro Gly Pro 20 <210> 94 <211> 22 <212> PRT <213> Ljungan virus <400> 94 Glu Met Asp Tyr Ser Gly Gly Lys Phe Leu Asn Gln Cys Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 95 <211> 22 <212> PRT <213> Ljungan virus <400> 95 Asp Met Asp Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Phe Asn Gln Cys Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Thr Asn Pro Gly Pro 20 <210> 96 <211> 22 <212> PRT <213> Trypanosoma brucei <400> 96 Ala Ile Ser Ser Ile Ile Arg Thr Lys Met Leu Leu Ser Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 97 <211> 22 <212> PRT <213> Trypanosoma cruzi <400> 97 Ala Val Cys Asp Ala Gln Arg Gln Lys Leu Leu Leu Ser Gly Asp Ile 1 5 10 15 Glu Gln Asn Pro Gly Pro 20 <210> 98 <211> 22 <212> PRT <213> Bovine rotavirus <400> 98 Ala Asn Ser Lys Phe Gln Ile Asp Arg Ile Leu Ile Ser Gly Asp Ile 1 5 10 15 Glu Leu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 99 <211> 22 <212> PRT <213> Human rotavirus <400> 99 Ala Asn Ser Lys Phe Gln Ile Asp Lys Ile Leu Ile Ser Gly Asp Ile 1 5 10 15 Glu Leu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 100 <211> 23 <212> PRT <213> Porcine rotavirus <400> 100 Ala Asn Ala Lys Phe Gly Gln Ile Asp Lys Ile Leu Ile Ser Gly Asp 1 5 10 15 Val Glu Leu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 101 <211> 22 <212> PRT <213> Drosophila C virus <400> 101 Lys Gln Glu Ala Ala Arg Gln Met Leu Leu Leu Leu Ser Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Thr Asn Pro Gly Pro 20 <210> 102 <211> 22 <212> PRT <213> Cricket paralysis virus <400> 102 Arg Ala Phe Leu Arg Lys Arg Thr Gln Leu Leu Met Ser Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 103 <211> 22 <212> PRT <213> Acute bee paralysis virus <400> 103 His Cys Gly Ser Trp Thr Asp Ile Leu Leu Leu Leu Ser Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Thr Asn Pro Gly Pro 20 <210> 104 <211> 22 <212> PRT <213> Cricket paralysis virus <400> 104 Thr Leu Thr Arg Ala Glu Ile Glu Asp Glu Leu Ile Arg Ala Gly Ile 1 5 10 15 Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 105 <211> 22 <212> PRT <213> Perina nuda picorna like virus <400> 105 Val Thr Ala Gln Gly Trp Val Pro Asp Leu Thr Val Asp Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 106 <211> 22 <212> PRT <213> Ectropis obliqua picorna like virus <400> 106 Val Thr Ala Gln Gly Trp Ala Pro Asp Leu Thr Gln Asp Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 107 <211> 22 <212> PRT <213> Perina nuda picorna like virus <400> 107 Asn Ile Ile Gly Gly Gly Gln Lys Asp Leu Thr Gln Asp Gly Asp Ile 1 5 10 15 Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 108 <211> 22 <212> PRT <213> Ectropis obliqua picorna like virus <400> 108 Asn Ile Ile Gly Gly Gly Gln Arg Asp Leu Thr Gln Asp Gly Asp Ile 1 5 10 15 Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 109 <211> 22 <212> PRT <213> Deformed wing virus <400> 109 Asn Leu Leu Gln Leu Ser Asn Pro Val Gln Ala Lys Pro Glu Met Asp 1 5 10 15 Asn Pro Asn Pro Gly Pro 20 <210> 110 <211> 22 <212> PRT <213> Kakugo virus <400> 110 Asn Leu Leu Gln Leu Ser Asn Pro Val Gln Ala Lys Pro Glu Met Asp 1 5 10 15 Asn Pro Asn Pro Gly Pro 20 <210> 111 <211> 4 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 111 Asn Pro Gly Pro 1 <210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Illustrative conserved motif <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(3) <223> variable residue <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> variable residue <400> 112 Gly Xaa Xaa Gly Xaa Gly Lys Ser Thr 1 5 <210> 113 <211> 6 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 113 Lys Asp Glu Leu Ile Arg 1 5 <210> 114 <211> 4 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 114 Tyr Gly Asp Asp 1 <210> 115 <211> 4 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 115 Phe Leu Lys Arg 1 <210> 116 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic 6-His tag peptide <400> 116 His His His His His His 1 5 <210> 117 <211> 4 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 117 Glu Gln Gly Pro 1 <210> 118 <211> 4 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 118 Phe His Ser Thr 1 <210> 119 <211> 4 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 119 Lys Gln Lys Met 1 <210> 120 <211> 4 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 120 Met Gln Gly Pro 1 <210> 121 <211> 4 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 121 Leu Gln Ser Pro 1 <210> 122 <211> 4 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 122 Ser Glu Asn Ala 1 <210> 123 <211> 4 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 123 Met Gln Gln Pro 1 <210> 124 <211> 4 <212> PRT <213> Seneca Valley Virus <400> 124 Met Gln Gly Leu 1 <210> 125 <211> 4 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 125 Leu Gln Gly Asn 1 <210> 126 <211> 4 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 126 Leu Ala Asp Gln 1 <210> 127 <211> 4 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 127 Arg Gln Ser Pro 1 <210> 128 <211> 4 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 128 Pro Gln Gly Val 1 <210> 129 <211> 4 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 129 Leu Glu Ser Pro 1 <210> 130 <211> 4 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 130 Asn Pro Gly Pro 1 <210> 131 <211> 4 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 131 Gln Gln Ser Pro 1 <210> 132 <211> 4 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 132 Ala Gln Gly Pro 1 <210> 133 <211> 4 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 133 Ala Gln Ala Pro 1 <210> 134 <211> 4 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 134 Glu Gln Gly Pro 1 <210> 135 <211> 4 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 135 Ile Gln Gly Pro 1 <210> 136 <211> 4 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 136 Val Gln Gly Pro 1 <210> 137 <211> 4 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 137 Pro Gln Gly Ala 1 <210> 138 <211> 4 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 138 Pro Gln Gly Asn 1 <210> 139 <211> 4 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 139 Leu Leu Asp Gln 1 <210> 140 <211> 4 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 140 Leu Met Asp Gln 1 <210> 141 <211> 4 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 141 Ala Gln Ser Pro 1 <210> 142 <211> 4 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 142 Pro Gln Gly Val 1 <210> 143 <211> 4 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 143 Pro Gln Gly Ile 1 <210> 144 <211> 4 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 144 Pro Gln Gly Ser 1 <210> 145 <211> 4 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 145 Leu Glu Asn Pro 1 <210> 146 <211> 4 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 146 Asn Pro Gly Pro 1 <210> 147 <211> 4 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 147 Pro Gln Gly Pro 1 <210> 148 <211> 4 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 148 Ala Gln Ser Pro 1 <210> 149 <211> 4 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 149 Glu Gln Ala Ala 1 <210> 150 <211> 4 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 150 Ile Gln Gly Gly 1 <210> 151 <211> 4 <212> PRT <213> Theiler's murine encephalomyelitis virus <400> 151 Pro Gln Gly Ala 1 <210> 152 <211> 4 <212> PRT <213> Rat Theilovirus <400> 152 Pro Gln Gly Asn 1 <210> 153 <211> 4 <212> PRT <213> Rat Theilovirus <400> 153 Leu Leu Asp Gln 1 <210> 154 <211> 4 <212> PRT <213> Rat Theilovirus <400> 154 Pro Gln Ser Pro 1 <210> 155 <211> 4 <212> PRT <213> Rat Theilovirus <400> 155 Pro Gln Gly Val 1 <210> 156 <211> 4 <212> PRT <213> Rat Theilovirus <400> 156 Leu Gln Asn Pro 1 <210> 157 <211> 4 <212> PRT <213> Rat Theilovirus <400> 157 Asn Pro Gly Pro 1 <210> 158 <211> 4 <212> PRT <213> Rat Theilovirus <400> 158 Ala Gln Ser Pro 1 <210> 159 <211> 4 <212> PRT <213> Rat Theilovirus <400> 159 Ala Gln Ser Pro 1 <210> 160 <211> 4 <212> PRT <213> Rat Theilovirus <400> 160 Glu Gln Ala Ala 1 <210> 161 <211> 4 <212> PRT <213> Rat Theilovirus <400> 161 Ile Gln Gly Gly 1 <210> 162 <211> 4 <212> PRT <213> Rat Theilovirus <400> 162 Pro Gln Gly Ala 1 <210> 163 <211> 4 <212> PRT <213> Vilyuisk human encephalomyelitis virus <400> 163 Pro Gln Gly Asn 1 <210> 164 <211> 4 <212> PRT <213> Vilyuisk human encephalomyelitis virus <400> 164 Leu Leu Asp Glu 1 <210> 165 <211> 4 <212> PRT <213> Vilyuisk human encephalomyelitis virus <400> 165 Pro Gln Ser Pro 1 <210> 166 <211> 4 <212> PRT <213> Vilyuisk human encephalomyelitis virus <400> 166 Pro Gln Gly Val 1 <210> 167 <211> 4 <212> PRT <213> Vilyuisk human encephalomyelitis virus <400> 167 Leu Glu Asn Pro 1 ?? ?? ?? ??

Claims (121)

  1. 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 핵산 서열, 또는 뉴클레오티드 길이가 20개 이상인 상기 서열들 중 어느 하나의 연속된 일부분을 포함하는 분리된 핵산.
  2. 고 엄중도 조건 하에 제1항의 핵산에 하이브리드화하는 분리된 핵산.
  3. 중간 엄중도 조건 하에 제1항의 핵산에 하이브리드화하는 분리된 핵산.
  4. 저 엄중도 조건 하에 제1항의 핵산에 하이브리드화하는 분리된 핵산.
  5. 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 핵산 서열, 또는 뉴클레오티드 길이가 20개 이상인 상기 서열들 중 어느 하나의 연속된 일부분을 포함하는 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 핵산이 RNA 또는 DNA인 분리된 핵산.
  7. 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21을 포함하는 핵산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 핵산, 또는 뉴클레오티드 길이가 10개 이상 인 상기 서열들 중 어느 하나의 연속된 일부분에 의해 코딩되는 분리된 폴리펩티드.
  8. 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열, 또는 아미노산 길이가 10개 이상인 상기 서열들 중 어느 하나의 연속된 일부분을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  9. 제8항의 폴리펩티드 또는 제11항의 분리된 바이러스에 특이적으로 결합하는 분리된 항체.
  10. 제9항에 있어서, 항체가 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 키메라 항체인 항체.
  11. ATCC 특허 기탁 번호 PTA-5343의 식별 특성을 포함하는, 분리된 세네카 밸리(Seneca Valley) 바이러스 또는 이의 유도체.
  12. 서열 번호 1과 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% 또는 65% 동일한 서열을 포함하는 게놈을 가지는, 분리된 세네카 밸리 바이러스 또는 이의 유도체 또는 관련체.
  13. 하기 (i) 내지 (v)의 특성들을 포함하는, 분리된 세네카 밸리 바이러스 또는 이의 유도체 또는 관련체:
    (i) 약 7.5 kb의 단일 가닥 RNA 게놈;
    (ii) ∼27 nm의 직경;
    (iii) 약 31 kDa, 약 36 kDa 및 약 27 kDa의 근사 분자량을 가지는 적어도 3종의 단백질을 포함하는 캡시드;
    (iv) CsCl 구배 상에서의 약 1.34 g/ml의 부력 밀도; 및
    (v) 종양 세포에서의 복제 적격성.
  14. 하기 (i) 내지 (iii)의 특성들을 포함하는, 분리된 세네카 밸리 바이러스 또는 이의 유도체 또는 관련체:
    (i) 종양 세포에서의 복제 적격성;
    (ii) 종양 세포 향성(tropism); 및
    (iii) 정상 세포에서의 세포 용해능 결여.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 바이러스는 신경내분비 특성을 가지는 종양 세포 유형에서 복제 적격성인 것인 바이러스.
  16. 제12항에 있어서, 31 kDa 단백질은 서열 번호 8과 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% 또는 65% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 바이러스.
  17. 제12항에 있어서, 36 kDa 단백질은 서열 번호 4와 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% 또는 65% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 바이러스.
  18. 제12항에 있어서, 27 kDa 단백질은 서열 번호 6과 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% 또는 65% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 바이러스.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항의 바이러스 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  20. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항의 바이러스를 포함하는 세포.
  21. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항의 바이러스의 항원을 포함하는 바이러스 용해물.
  22. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항의 바이러스로부터 얻어진 분리된 바이러스 항원.
  23. 암을 치료하기 위해 유효량의 바이러스 또는 이의 유도체를 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법으로서, 상기 바이러스는 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 또는 21과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 게놈 서열을 가지는 것인 치료 방법.
  24. 서열 번호 3, 5 또는 7과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 캡시드 코딩 영역을 가지는 바이러스의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법.
  25. 암 세포를 바이러스 또는 이의 유도체와 접촉시키는 것을 포함하는 암 진행을 억제하는 방법으로서, 상기 바이러스는 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 또는 21과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 게놈을 가지는 것인 방법.
  26. 암 세포를 유효량의 바이러스 또는 이의 유도체와 접촉시키는 것을 포함하는 암 세포를 사멸시키는 방법으로서, 상기 바이러스는 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 또는 21과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 게놈을 가지는 것인 방법.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스는 피코나바이러스인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 피코나바이러스는 카디오바이러스인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 카디오바이러스는 빌유이스크 인간 뇌척수염 바이러스, 테일러 쥐 뇌척수염 바이러스, 뇌심근염 바이러스 및 세네카 밸리 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 뇌심근염 바이러스는 CA-131395, LA-97-1278, IL-92-48963, IA-89-47752, NJ-90-10324, MN-88-36695 및 NC-88-23626으로 구성된 분리물의 군에서 선택되는 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 세네카 밸리 바이러스는 ATCC 기탁 번호가 PTA-5343인 방법.
  32. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항의 바이러스를 정제하는 방법으로서,
    a. 세포를 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항의 바이러스로 감염시키는 단계;
    b. 세포 용해물을 회수하는 단계;
    c. 세포 용해물로 1 순환 이상의 구배 원심분리를 실시하는 단계; 및
    d. 구배로부터 상기 바이러스를 분리하는 단계
    를 포함하는 방법.
  33. 세포를 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항의 바이러스와 접촉시키는 것을 포 함하는 비정상적으로 증식하는 세포를 사멸시키는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 비정상적으로 증식하는 세포는 종양 세포인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 종양 세포는 인간 소세포 폐암, 인간 망막아세포종, 인간 신경아세포종, 인간 수아세포종, 마우스 신경아세포종, 윌름 종양 및 인간 비-소세포 폐암으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  36. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항의 바이러스의 유효량을 피험체에게 투여하는 것을 포함하는, 피험체의 신생물 질환을 치료하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 신생물 질환은 신경내분비 암인 방법.
  38. 제36항에 있어서, 피험체는 인간인 방법.
  39. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항의 바이러스를 제조하는 방법으로서, 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항의 바이러스로 감염시킨 세포를, 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에 배양하는 단계 및 세포 또는 상청액으로부터 바이러스를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 세포는 PER.C6 세포인 방법.
  41. 제39항에 있어서, 세포는 H446 세포인 방법.
  42. 제39항에 있어서, 세포는 세포당 200,000개 이상의 바이러스 입자를 생성하는 것인 방법.
  43. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항의 바이러스를 검출하는 방법으로서, 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항의 바이러스를 포함하는 것으로 추측되는 테스트 물질로부터 RNA를 분리하는 단계; 서열 번호 1의 적어도 15개의 연속된 뉴클레오티드에 해당하는 RNA를 표지하는 단계; 테스트 물질을 상기 표지된 RNA로 프로빙(probing)하는 단계; 및 표지된 RNA와 테스트 물질로부터 분리된 RNA의 결합을 검출하는 단계로서, 결합은 바이러스의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하는 방법.
  44. 서열 번호 1의 적어도 15개의 연속된 뉴클레오티드에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 프로브.
  45. 암용해성 바이러스를 제조하는 방법으로서,
    (a) 세네카 밸리 바이러스 게놈 서열과 테스트 바이러스 게놈 서열을 비교하 는 단계;
    (b) 세네카 밸리 바이러스 게놈 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 테스트 바이러스 게놈 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드 간의 적어도 첫 번째 아미노산 차이를 확인하는 단계;
    (c) 테스트 바이러스 게놈 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 세네카 밸리 바이러스 게놈 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대해 적어도 하나 적은 아미노산 차이를 갖도록 테스트 바이러스 게놈 서열을 돌연변이시키는 단계;
    (d) 돌연변이된 테스트 바이러스 게놈 서열을 종양 세포에 형질감염시키는 단계; 및
    (e) 종양 세포가 돌연변이된 테스트 바이러스 게놈 서열에 의해 용해되어(lytically) 감염되는지를 확인하는 단계
    를 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 세네카 밸리 바이러스 게놈은 서열 번호 1과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 것인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 테스트 바이러스는 피코나바이러스인 방법.
  48. 제45항에 있어서, 테스트 바이러스는 카디오바이러스인 방법.
  49. 제45항에 있어서, 아미노산 차이는 세네카 밸리 바이러스 캡시드 단백질과 테스트 바이러스 캡시드 단백질 간의 차이인 방법.
  50. 제45항에 있어서, 테스트 바이러스 게놈 서열을 돌연변이시키는 단계는 테스트 바이러스 게놈 서열을 가지는 cDNA를 돌연변이시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  51. 제51항에 있어서, 돌연변이된 테스트 바이러스 게놈 서열을 형질감염시키는 단계는 RNA를 형질감염시키는 것을 포함하며, 이 때 상기 RNA는 돌연변이된 테스트 바이러스 게놈 서열을 가지는 cDNA로부터 생성되는 것인 방법.
  52. 제48항에 있어서, 카디오바이러스 게놈 서열은 빌유이스크 인간 뇌척수염 바이러스, 테일러 쥐 뇌척수염 바이러스 및 뇌심근염 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 카디오바이러스 게놈 서열은 뇌심근염 바이러스로부터 선택되는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 뇌심근염 바이러스는 CA-131395, LA-97-1278, IL-92-48963, IA-89-47752, NJ-90-10324, MN-88-36695 및 NC-88-23626으로 구성된 분리물의 군에서 선택되는 것인 방법.
  55. 제52항에 있어서, 카디오바이러스는 서열 번호 1과 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% 또는 65% 동일한 서열을 포함하는 게놈을 가지는 분리물로부터 선택되는 것인 방법.
  56. 제45항에 있어서, 아미노산 차이는 서열 번호 4, 6, 8과 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% 또는 65% 동일한 서열, 또는 아미노산 길이가 10개 이상인 상기 서열들 중 어느 하나의 연속된 일부분 내에서의 차이인 방법.
  57. 세포형 향성이 변경된 돌연변이 바이러스를 제조하는 방법으로서,
    (a) 다수의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 돌연변이체의 라이브러리를 생성하는 단계;
    (b) 바이러스 돌연변이체의 라이브러리를 허용성 세포에 형질감염시켜, 다수의 돌연변이 바이러스가 생성되도록 하는 단계;
    (c) 다수의 돌연변이 바이러스를 분리하는 단계;
    (d) 비허용성 세포를 분리된 다수의 돌연변이 바이러스와 항온처리하는 단계; 및
    (e) 비허용성 세포에서 생성된 돌연변이 바이러스를 회수함으로써, 향성이 변경된 돌연변이 바이러스를 제조하는 단계
    를 포함하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 바이러스 돌연변이체의 라이브러리는 서열 번호 1과 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% 또는 65% 동일한 서열을 포함하는 모 서열로부터 생성하는 것인 방법.
  59. 제57항에 있어서,
    (f) 회수된 돌연변이 바이러스를 비허용성 세포 내에서 항온처리하는 단계; 및
    (g) 비허용성 세포에서 생성된 돌연변이 바이러스를 회수하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 단계 (f) 및 (g)를 반복하는 단계를 더 포함하는 방법.
  61. 제57항 또는 제59항에 있어서, 항온처리는 멀티-웰 고처리량 플랫폼에서 수행하며, 상기 플랫폼은 각 웰에 상이한 비허용성 세포 유형을 포함하는 것인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 어느 웰이 세포를 사멸시키는 돌연변이 바이러스를 포함하는지를 확인하기 위해 플랫폼을 스크리닝하는 단계를 더 포함하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 스크리닝은 각 웰의 흡광도를 분석하여 수행하는 것인 방 법.
  64. 제57항에 있어서, 비허용성 세포는 종양 세포인 방법.
  65. 제57항에 있어서, 바이러스 돌연변이체의 라이브러리를 생성하는 단계는
    (i) 바이러스의 게놈 서열의 일부분과 동일한 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
    (ii) 폴리뉴클레오티드를 돌연변이시켜 다수의 상이한 돌연변이 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계;
    (iii) 단계 (i)에서의 폴리뉴클레오티드가 포함하는 바이러스의 게놈 서열의 일부분을 제외한 바이러스의 게놈 서열을 가지는 벡터로 다수의 돌연변이된 폴리뉴클레오티드를 결찰시킴으로써, 바이러스 돌연변이체의 라이브러리를 생성하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 바이러스의 게놈 서열은 피코나바이러스로부터 유래된 것인 방법.
  67. 제65항에 있어서, 바이러스의 게놈 서열은 서열 번호 1과 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% 또는 65% 동일한 서열을 포함하는 것인 방법.
  68. 제66항에 있어서, 피코나바이러스는 카디오바이러스인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 카디오바이러스는 빌유이스크 인간 뇌척수염 바이러스, 테일러 쥐 뇌척수염 바이러스, 뇌심근염 바이러스 및 SVV로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  70. 제69항에 있어서, 뇌심근염 바이러스는 CA-131395, LA-97-1278, IL-92-48963, IA-89-47752, NJ-90-10324, MN-88-36695 및 NC-88-23626으로 구성된 분리물의 군에서 선택되는 것인 방법.
  71. 제57항에 있어서, 단계 (ii)의 돌연변이 유발은 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 무작위로 삽입하여 수행하는 것인 방법.
  72. 제57항에 있어서, 단계 (ii)의 돌연변이 유발은 폴리뉴클레오티드의 캡시드 코딩 영역에서 수행하는 것인 방법.
  73. 제71항에 있어서, 뉴클레오티드의 무작위 삽입은 트리뉴클레오티드-돌연변이 유발(trinucleotide-mutagenesis; TRIM)에 의해 수행하는 것인 방법.
  74. 제71항에 있어서, 폴리뉴클레오티드에 삽입된 뉴클레오티드의 적어도 일부분 은 에피토프 태그를 코딩하는 것인 방법.
  75. 세포형 향성이 변경된 돌연변이 카디오바이러스를 제조하는 방법으로서,
    (a) 카디오바이러스의 돌연변이 폴리뉴클레오티드 서열의 라이브러리를 생성하는 단계로서, 생성은
    - 카디오바이러스의 캡시드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
    - 폴리뉴클레오티드를 돌연변이시켜 다수의 상이한 돌연변이 캡시드 코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계; 및
    - 다수의 돌연변이된 캡시드 코딩 폴리뉴클레오티드를 캡시드 코딩 영역을 제외한 카디오바이러스의 게놈 서열을 가지는 벡터로 결찰시킴으로써, 카디오바이러스의 돌연변이 폴리뉴클레오티드 서열의 라이브러리를 생성하는 단계
    를 포함하는 것인 단계;
    (b) 돌연변이 폴리뉴클레오티드 서열의 라이브러리를 허용성 세포에 형질감염시켜, 다수의 돌연변이 바이러스가 생성되도록 하는 단계;
    (c) 다수의 돌연변이 바이러스를 분리하는 단계;
    (d) 비허용성 세포를 분리된 다수의 돌연변이 바이러스와 항온처리하는 단계; 및
    (e) 비허용성 세포에서 생성된 돌연변이 바이러스를 회수함으로써, 향성이 변경된 돌연변이 카디오바이러스를 제조하는 단계
    를 포함하는 방법.
  76. 제75항에 있어서,
    (f) 회수된 돌연변이 바이러스를 비허용성 세포 내에서 항온처리하는 단계; 및
    (g) 비허용성 세포에서 생성된 돌연변이 바이러스를 회수하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  77. 제76항에 있어서, 단계 (f) 및 (g)를 반복하는 단계를 더 포함하는 방법.
  78. 제75항에 있어서, 카디오바이러스는 서열 번호 1과 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% 또는 65% 동일한 서열을 포함하는 게놈을 가지는 것인 방법.
  79. 제75항에 있어서, 돌연변이 유발은 캡시드 코딩 폴리뉴클레오티드로 뉴클레오티드를 무작위로 삽입하여 수행하는 것인 방법.
  80. 제80항에 있어서, 캡시드 코딩 폴리뉴클레오티드로 무작위로 삽입된 뉴클레오티드의 적어도 일부분은 에피토프 태그를 코딩하는 것인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 뉴클레오티드의 무작위 삽입은 트리뉴클레오티드-돌연변이 유발(TRIM)에 의해 수행하는 것인 방법.
  82. 제75항에 있어서, 다수의 상이한 돌연변이 캡시드 코딩 폴리뉴클레오티드 서열은 108개를 초과하는 상이한 캡시드 코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  83. 제75항에 있어서, 다수의 상이한 돌연변이 캡시드 코딩 폴리뉴클레오티드 서열은 109개를 초과하는 상이한 캡시드 코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  84. 세포형 향성이 변경된 돌연변이 세네카 밸리 바이러스를 제조하는 방법으로서,
    (a) 세네카 밸리 바이러스 돌연변이체의 cDNA 라이브러리를 생성하는 단계;
    (b) 세네카 밸리 바이러스 돌연변이체의 cDNA 라이브러리로부터 세네카 밸리 바이러스 RNA를 생성하는 단계;
    (c) 세네카 밸리 바이러스 RNA를 허용성 세포에 형질감염시켜, 다수의 돌연변이 세네카 밸리 바이러스가 생성되도록 하는 단계;
    (d) 다수의 돌연변이 세네카 밸리 바이러스를 분리하는 단계;
    (e) 비허용성 종양 세포를 분리된 다수의 돌연변이 세네카 밸리 바이러스와 항온처리하는 단계; 및
    (f) 비허용성 종양 세포를 용해하여 감염시키는 돌연변이 세네카 밸리 바이러스를 회수함으로써, 향성이 변경된 돌연변이 세네카 밸리 바이러스를 제조하는 단계
    를 포함하는 방법.
  85. 제84항에 있어서,
    (g) 회수된 돌연변이 세네카 밸리 바이러스를 비허용성 세포 내에서 항온처리하는 단계; 및
    (h) 비허용성 종양 세포를 용해하여 감염시키는 돌연변이 세네카 밸리 바이러스를 회수하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  86. 제85항에 있어서, 단계 (g) 및 (f)를 반복하는 단계를 더 포함하는 방법.
  87. 제85항에 있어서, 항온처리는 멀티-웰 고처리량 플랫폼에서 수행하며, 상기 플랫폼은 각 웰에 상이한 비허용성 세포 유형을 포함하는 것인 방법.
  88. 제87항에 있어서, 어느 웰이 세포를 용해하여 감염시키는 돌연변이 세네카 밸리 바이러스를 포함하는지를 확인하기 위해 플랫폼을 스크리닝하는 단계를 더 포 함하는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 스크리닝은 각 웰의 흡광도를 분석하여 수행하는 것인 방법.
  90. 제84항에 있어서, 세네카 밸리 바이러스 돌연변이체의 cDNA 라이브러리는 다수의 돌연변이 세네카 밸리 바이러스 캡시드 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  91. 제90항에 있어서, 다수의 돌연변이 세네카 밸리 바이러스 캡시드 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3, 5 또는 7과 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% 또는 65% 동일한 서열을 포함하는 캡시드 코딩 영역으로 뉴클레오티드를 무작위로 삽입하여 생성하는 것인 방법.
  92. 제91항에 있어서, 무작위로 삽입된 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분은 에피토프 태그를 코딩하는 것인 방법.
  93. 제91항에 있어서, 뉴클레오티드의 무작위 삽입은 트리뉴클레오티드-돌연변이 유발(TRIM)에 의해 수행하는 것은 방법.
  94. 제84항에 있어서, 세네카 밸리 바이러스 돌연변이체의 cDNA 라이브러리는 ATCC 기탁 번호가 PTA-5343인 세네카 밸리 바이러스, 또는 서열 번호 1과 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% 또는 65% 동일한 서열을 포함하는 게놈을 가지는 바이러스로부터 생성하는 것인 방법.
  95. 제84항에 있어서, 비허용성 종양 세포는 종양 세포주 또는 환자로부터 분리된 종양 세포 유형인 방법.
  96. 제95항에 있어서, 비허용성 종양 세포주는 M059K, KK, U118MG, DMS79, H69, DMS114, DMS53, H460, A375-S2, SK-MEL-28, PC3, PC3M2AC6, LNCaP, DU145, Hep3B, Hep2G, SW620, SW839, 5637, HeLaS3, S8, HUVEC, HAEC, W138, MRC-5, IMR90, HMVEC, HCN-1A, HRCE, CMT-64, LLC-1, RM-1, RM-2, RM-9, MLTC-1, KLN-205, CMT-93, B16FO, Neuro-2A, C8D30, PK15, FBRC, MDBK, CSL503 및 OFRC로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  97. 제95항에 있어서, 환자로부터 분리된 비허용성 종양 세포 유형은 신경교아세포종, 림프종, 소세포 폐암, 대세포 폐암, 흑색종, 전립선암, 간암종, 결장암, 신장암, 결장암, 방광암, 직장암 및 편평상피세포 폐암으로 구성된 암의 군에서 선택되는 것인 방법.
  98. 생체내에서 종양 세포형 향성을 가지는 돌연변이 바이러스를 제조하는 방법으로서,
    (a) 다수의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 돌연변이체의 라이브러리를 생성하는 단계;
    (b) 바이러스 돌연변이체의 라이브러리를 허용성 세포에 형질감염시켜, 다수의 돌연변이 바이러스가 생성되도록 하는 단계;
    (c) 다수의 돌연변이 바이러스를 분리하는 단계;
    (d) 분리된 다수의 돌연변이 바이러스를 종양을 가진 포유동물에게 투여하는 단계로서, 상기 포유동물은 돌연변이 바이러스의 비돌연변이형의 천연 숙주가 아닌 것인 단계; 및
    (e) 종양 내에서 복제된 바이러스를 회수함으로써, 생체내에서 종양 세포형 향성을 가지는 돌연변이 바이러스를 제조하는 단계
    를 포함하는 방법.
  99. 제98항에 있어서, 바이러스 돌연변이체의 라이브러리를 생성하는 단계는
    - 바이러스의 캡시드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
    - 폴리뉴클레오티드를 돌연변이시켜 다수의 상이한 돌연변이 캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계; 및
    - 캡시드 코딩 영역을 제외한 바이러스의 게놈 서열을 가지는 벡터로 다수의 돌연변이된 캡시드 코딩 폴리뉴클레오티드를 결찰시켜, 바이러스 돌연변이체의 라 이브러리를 생성하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  100. 제98항에 있어서, 단계 (e)에서 회수된 바이러스는 종양 세포를 용해하여 감염시키는 것인 방법.
  101. 제98항에 있어서, 종양은 이종이식편, 동계 종양, 동소성 종양 또는 이종유전자 종양인 방법.
  102. 제98항에 있어서, 포유동물은 마우스인 방법.
  103. 제98항에 있어서, 바이러스 돌연변이체는 피코나바이러스인 방법.
  104. 제98항에 있어서, 피코나바이러스는 카디오바이러스인 방법.
  105. 제104항에 있어서, 피코나바이러스는 세네카 밸리 바이러스 또는 이의 관련체 또는 유도체인 방법.
  106. 제109항에 있어서, 세네카 밸리 바이러스는 ATCC 기탁 번호가 PTA-5343인 세네카 밸리 바이러스이거나 또는 서열 번호 1과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 게놈 서열을 가지는 것인 방법.
  107. 제45항, 제57항, 제75항, 제84항 및 제98항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 암용해성 바이러스.
  108. 암용해성 바이러스로 환자를 치료하는 방법으로서,
    (a) 암용해성 바이러스가 비감염성이 되도록 하고 암용해성 바이러스의 향성에는 영향을 주지 않도록 제107항의 암용해성 바이러스를 불활성화시키는 단계; 및
    (b) 불활성화된 암용해성 바이러스를 종양을 가진 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  109. 제108항에 있어서, 불활성화된 암용해성 바이러스에 독소를 부착시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  110. 세네카 밸리 바이러스로 종양을 가진 환자를 치료하는 방법으로서,
    (a) 바이러스가 비감염성이 되도록 하고 바이러스의 향성에는 영향을 주지 않도록 세네카 밸리 바이러스를 불활성화시키는 단계; 및
    (b) 불활성화된 세네카 밸리 바이러스를 종양을 가진 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  111. 제110항에 있어서, 불활성화된 세네카 밸리 바이러스에 독소를 부착시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  112. 불활성화된 세네카 밸리 바이러스를 포함하는 세네카 밸리 바이러스 조성물.
  113. 캡시드 영역에 통합된 에피토프 태그를 포함하는 세네카 밸리 바이러스.
  114. 세네카 밸리 바이러스로 종양을 가진 피험체를 치료하는 방법으로서,
    (a) 캡시드 내에서 코딩되는 에피토프 태그를 포함하는 돌연변이 세네카 밸리 바이러스를 생성하는 단계;
    (b) 에피토프 태그에 독소를 부착하는 단계; 및
    (c) 부착된 독소를 가진 돌연변이 세네카 밸리 바이러스를 종양을 가진 피험체에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  115. 제114항에 있어서, 생성 단계는
    - 세네카 밸리 바이러스의 캡시드 코딩 영역 폴리뉴클레오티드로 에피토프 태그를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 삽입하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  116. 제115항에 있어서, 돌연변이 세네카 밸리 바이러스는 ATCC 기탁 번호가 PTA-5343인 세네카 밸리 바이러스와 비교하여 세포형 향성이 변경되지 않은 것인 방법.
  117. 제116항에 있어서, 돌연변이 세네카 밸리 바이러스가 비감염성이 되도록 돌연변이 세네카 밸리 바이러스를 불활성화시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  118. 샘플 중의 종양 세포를 검출하는 방법으로서,
    (a) 환자로부터 종양 샘플을 분리하는 단계;
    (b) 종양 샘플을 에피토프 태그가 달린 세네카 밸리 바이러스와 항온처리하는 단계; 및
    (c) 에피토프 태그를 검출함으로써 결합된 세네카 밸리 바이러스에 대하여 종양 샘플을 스크리닝하는 단계
    를 포함하는 방법.
  119. 생체내에서 종양 세포를 검출하는 방법으로서,
    (a) 방사선이 조사되고 에피토프 태그가 달린 세네카 밸리 바이러스를 환자에게 투여하는 단계로서, 상기 에피토프 태그에 표지가 접합되는 것인 단계; 및
    (b) 환자 체내의 표지를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  120. 제118항 또는 제119항에 있어서, 세네카 밸리 바이러스는 돌연변이체, 유도체 또는 관련체인 방법.
  121. SVV로 암을 치료하는 방법으로서,
    (a) 결실된 패키징 신호 서열을 포함하는 SVV 돌연변이체를 제조하는 단계; 및
    (b) 종양 세포를 SVV 돌연변이체로 감염시킴으로써, SVV 매개 숙주 세포 차단(shutoff)에 의해 종양 세포 사멸을 유발하는 단계
    를 포함하는 방법.
KR1020067008081A 2003-09-26 2004-09-23 세네카 밸리 바이러스에 기초한 조성물 및 질병의 치료방법 KR20060103890A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US50618203P 2003-09-26 2003-09-26
US60/506,182 2003-09-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20060103890A true KR20060103890A (ko) 2006-10-04

Family

ID=34393123

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067008081A KR20060103890A (ko) 2003-09-26 2004-09-23 세네카 밸리 바이러스에 기초한 조성물 및 질병의 치료방법

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP1668025B1 (ko)
JP (1) JP2007506434A (ko)
KR (1) KR20060103890A (ko)
CN (1) CN1875028B (ko)
AU (1) AU2004275832A1 (ko)
BR (1) BRPI0414810A (ko)
CA (1) CA2540177A1 (ko)
DK (1) DK1668025T3 (ko)
HK (1) HK1094583A1 (ko)
IL (1) IL174430A0 (ko)
MX (1) MXPA06003318A (ko)
SG (1) SG149069A1 (ko)
WO (1) WO2005030139A2 (ko)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPQ425699A0 (en) 1999-11-25 1999-12-23 University Of Newcastle Research Associates Limited, The A method of treating a malignancy in a subject and a pharmaceutical composition for use in same
AU2002953436A0 (en) 2002-12-18 2003-01-09 The University Of Newcastle Research Associates Limited A method of treating a malignancy in a subject via direct picornaviral-mediated oncolysis
US7638318B2 (en) 2003-09-26 2009-12-29 Norvartis Ag Seneca Valley virus based compositions and methods for treating disease
WO2007047256A2 (en) * 2005-10-13 2007-04-26 Neotropix, Inc. Svv-based animal vaccines and uses thereof
US10537599B2 (en) 2015-12-02 2020-01-21 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Seneca valley virus (SVV) cellular receptor targeted oncotherapy
CN105925728B (zh) * 2016-06-01 2019-09-20 华南农业大学 一种塞内加谷病毒实时荧光定量pcr检测引物及试剂盒
US10323069B2 (en) * 2016-08-23 2019-06-18 Regents Of The University Of Minnesota Senecavirus A antigens and methods of use
BR112020000839A2 (pt) * 2017-07-14 2020-07-21 Oncorus, Inc. polinucleotídeos encapsulados e métodos de uso
CN109627293B (zh) * 2017-08-13 2021-02-09 中牧实业股份有限公司 塞尼卡谷病毒结构蛋白抗原表位多肽及其应用
CN107513524B (zh) * 2017-09-30 2021-02-09 中牧实业股份有限公司 一株猪塞内加谷病毒毒株及其应用
CN108467904B (zh) * 2018-05-24 2021-11-19 华南农业大学 检测塞尼卡谷病毒的rt-lamp引物组、试剂盒及应用
CN109182278B (zh) * 2018-10-12 2021-08-06 河南省动物疫病预防控制中心 塞尼卡谷病毒毒株及其应用
BR112021009226A2 (pt) * 2018-11-13 2021-10-26 Oncorus, Inc. Polinucleotídeos encapsulados e métodos de uso
CN109234464A (zh) * 2018-11-23 2019-01-18 山东新希望六和集团有限公司 用于检测塞尼卡谷病毒的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用
CN111733144A (zh) * 2019-03-25 2020-10-02 金宇保灵生物药品有限公司 一种塞内卡病毒的纯化方法及病毒液的浓缩纯化方法
CN112225780B (zh) * 2019-06-24 2022-02-11 中国动物疫病预防控制中心(农业农村部屠宰技术中心) 检测塞内卡病毒抗体的多肽及其应用
AU2020315800A1 (en) * 2019-07-19 2022-03-03 Seneca Therapeutics, Inc. Second generation seneca valley virus oncolytic therapy: compositions and methods thereof
CN110923211A (zh) * 2019-12-25 2020-03-27 哈药集团生物疫苗有限公司 塞内卡病毒分离株、塞内卡病毒病灭活疫苗及其制备方法
CN111286491A (zh) * 2020-02-03 2020-06-16 河南省动物疫病预防控制中心 猪塞内卡病毒核酸标准物及其应用
CN111849925B (zh) * 2020-07-06 2022-06-03 马忠仁 一种抗结肠癌疫苗及其制法
CN111798712B (zh) * 2020-07-15 2021-10-29 周晓庆 噬菌体侵染细菌3d智能模拟方法
CN111944764A (zh) * 2020-08-31 2020-11-17 信阳农林学院 一种表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系、构建方法和应用
CN112390861A (zh) * 2020-09-30 2021-02-23 信阳农林学院 表达猪塞内加谷病毒vp1蛋白的细胞系、构建方法和应用
CN117487006B (zh) * 2023-12-29 2024-04-12 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 一种抗a型塞内卡病毒的单克隆抗体以及抗原表位及应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6110461A (en) * 1997-08-13 2000-08-29 Oncolytics Biotech Inc. Reovirus for the treatment of neoplasia

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005030139A2 (en) 2005-04-07
DK1668025T3 (da) 2014-08-25
BRPI0414810A (pt) 2006-11-14
CN1875028A (zh) 2006-12-06
EP1668025B1 (en) 2014-06-25
IL174430A0 (en) 2006-08-01
EP1668025A2 (en) 2006-06-14
MXPA06003318A (es) 2006-06-08
WO2005030139A3 (en) 2005-10-20
EP1668025A4 (en) 2007-05-16
AU2004275832A1 (en) 2005-04-07
HK1094583A1 (en) 2007-04-04
JP2007506434A (ja) 2007-03-22
SG149069A1 (en) 2009-01-29
CN1875028B (zh) 2012-07-04
CA2540177A1 (en) 2005-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7638318B2 (en) Seneca Valley virus based compositions and methods for treating disease
KR20060103890A (ko) 세네카 밸리 바이러스에 기초한 조성물 및 질병의 치료방법
US8114416B2 (en) Modified oncolytic viruses
US7854928B2 (en) Method for limiting the growth of cancer cells using an attenuated measles virus
US20220088098A1 (en) Optimized oncolytic viruses and uses thereof
CN101448526A (zh) 基于西尼加谷病毒的组合物和治疗疾病的方法
CN109276580A (zh) 一种用于治疗肿瘤的病毒
JP5085825B2 (ja) 処置対象中の悪性腫瘍の処置方法およびそのための医薬組成物
AU2004202292B2 (en) Method of Treating a Malignancy in a Subject
Poirier Preclinical and clinical studies of Seneca Valley Virus, a therapeutically promising oncolytic picornavirus with neuroendocrine tropism
Wollenberg Tweaking reovirus T3D to boost the oncolytic potency
AU2015230743A1 (en) A method of treating a malignancy in a subject and a pharmaceutical composition for use in same

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid