KR20210113260A - 캡슐화된 rna 폴리뉴클레오타이드 및 사용 방법 - Google Patents

캡슐화된 rna 폴리뉴클레오타이드 및 사용 방법 Download PDF

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KR20210113260A
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로레나 러너
에드워드 엠. 케네디
미첼 에이치. 피너
크리스토프 쿠에바
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온코루스, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 종양용해성 바이러스를 암호화하는 재조합 RNA 분자에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 재조합 RNA 분자의 캡슐화 및 암의 치료 및 예방을 위한 재조합 RNA 분자 및/또는 입자의 용도에 관한 것이다.

Description

캡슐화된 RNA 폴리뉴클레오타이드 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 1월 4일에 출원된 미국 가출원 번호 62/788,504 및 2019년 9월 3일에 출원된 62/895,135에 대한 우선권을 주장하며, 이들의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일에 대한 설명
본원과 함께 전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. 서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형식의 카피(파일명: ONCR-015_01WO_SeqList_ST25.txt, 기록 날짜: 2020년 1월 2일, 파일 크기: 265 킬로바이트).
분야
본 개시내용은 일반적으로 면역학, 염증 및 암 치료제 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 입자 캡슐화된 바이러스 게놈에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 암과 같은 증식성 장애의 치료 및 예방에 관한 것이다.
종양용해성 바이러스는 종양 세포를 감염 및 용해시킬 수 있는 용해 생활사를 갖는 복제-적격(replication-competent) 바이러스이다. 직접적인 종양 세포 용해는 세포사 뿐만 아니라 국소 항원 제시 세포에 의해 흡수 및 제시된 종양 항원에 대한 적응 면역 반응의 생성을 초래한다. 따라서, 종양용해성 바이러스는 직접 세포 용해를 통해, 그리고 바이러스 청소 후 항종양 반응을 유지할 수 있는 항원 특이적인 적응성 반응(adaptive response)을 촉진함으로써 종양 세포 성장과 싸운다.
그러나, 복제-적격 바이러스의 임상적 사용에는 몇 가지 문제가 있다. 일반적으로, 바이러스 노출은 선천적 면역 경로를 활성화하여 광범위하고 비특이적인 염증 반응을 초래한다. 환자가 이전에 그 바이러스에 노출된 적이 없다면, 이 초기 선천적 면역 반응은 적응성 항바이러스 반응의 발생 및 중화 항체의 생산을 야기할 수 있다. 환자가 이전에 그 바이러스에 노출된 적이 있다면, 존재하는 중화 항바이러스 항체가 원하는 용해 효과를 방해할 수 있다. 두 경우 모두 중화 항체의 존재는 표적 세포의 바이러스 용해를 방해할 뿐만 아니라 바이러스 치료제의 재투여를 비효과적이게 만든다. 이러한 요인들은 전이성 암 치료에 바이러스 치료제들의 사용을 제한하는데, 이는 그러한 암의 치료에 필요한 반복적인 전신 투여의 효능이 자연 발생의 항바이러스 반응에 의해 방해되기 때문이다. 이러한 장애물이 없는 경우에도 비질병 세포에서 후속적인 바이러스 복제는 주위 세포 및 조직에 실질적인 질병외(off-disease) 부수적인 손상을 초래할 수 있다.
복제-적격 바이러스의 치료적 사용과 관련된 조성물 및 방법에 대해 본 기술분야에서 오랫동안 느낀 충족되지 않은 요구는 여전히 남아있다. 본 개시내용은 이러한 조성물 및 방법 등을 제공한다.
개요
일부 구현예에서, 본 개시내용은 종양용해성 바이러스를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 지질 나노입자(lipid nanoparticle, LNP)를 제공한다. 일부 구현예에서, 종양용해성 바이러스는 단일 가닥 RNA(single-stranded RNA, ssRNA) 바이러스이다. 일부 구현예에서, 종양용해성 바이러스는 포지티브 센스[(+)-센스] ssRNA 바이러스이다. 일부 구현예에서, (+)-센스 ssRNA 바이러스는 표 1에 나열된 것들로부터 선택된다. 일부 구현예에서, (+)-센스 ssRNA 바이러스는 피코나바이러스이다. 일부 구현예에서, 피코나바이러스는 세네카 밸리 바이러스(Seneca Valley Virus, SVV) 또는 콕사키바이러스(Coxsackievirus)이다. 일부 구현예에서, SVV는 야생형 SVV-A(서열번호 1), S177A-SVVA 돌연변이체(서열번호 2), SVV-IR2 돌연변이체(서열번호 3) 및 SVV-IR2-S177A 돌연변이체(서열번호 4)로부터 선택되는 SVV-A이다. 일부 구현예에서, 콕사키바이러스는 CVB3, CVA21, 및 CVA9로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 콕사키바이러스는 서열번호 27을 포함하는 변형된 CVA21 바이러스이다.
일부 구현예에서, 세포로 LNP의 전달은 그 세포가 바이러스 입자를 생성하게 하고, 여기서 바이러스 입자는 감염성이고 용해성이다. 일부 구현예에서, 암호화된 종양용해성 바이러스는 대상체에 대한 LNP 투여 부위에서 떨어져 있는 종양의 크기를 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 외인성 페이로드(payload) 단백질을 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 외인성 페이로드 단백질을 암호화하는 재조합 RNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 페이로드 단백질은 형광 단백질, 효소 단백질, 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자, 또는 세포 표면 수용체에 대한 리간드이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-12, GM-CSF, IL-18, IL-2 및 IL-36γ로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포 표면 수용체에 대한 리간드는 Flt3 리간드 또는 TNFSF14이다. 일부 구현예에서, 케모카인은 CXCL10, CCL4, CCL21 및 CCL5로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 분자는 면역 관문(checkpoint) 수용체에 결합하고 이를 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 관문 수용체는 PD-1이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 분자는 종양 항원에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 분자는 이중특이적 T 세포 체결자 분자(bispecific T cell engager molecule, BiTE) 또는 이중특이적 경쇄 T 세포 체결자 분자(bispecific light T cell engager molecule, LiTE)이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 DLL3 또는 EpCAM이다.
일부 구현예에서, 합성 RNA 바이러스 게놈 및/또는 재조합 RNA 분자는 마이크로 RNA(miRNA) 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하고, 여기서 miR-TS 카세트는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 miRNA는 miR-124, miR-1, miR-143, miR-128, miR-219, miR-219a, miR-122, miR-204, miR-217, miR-137 및 miR-126으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, miR-TS 카세트는 miR-124 표적 서열의 하나 이상의 카피(copy), miR-1 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-143 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, miR-TS 카세트는 miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-219a 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-122 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, miR-TS 카세트는 miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-204 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-219 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, miR-TS 카세트는 miR-217 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-137 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-126 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질, 하나 이상의 헬퍼 지질 및 인지질-중합체 접합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 DLinDMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA(MC3), COATSOME® SS-LC(이전 명칭: SS-18/4PE-13), COATSOME® SS-EC(이전 명칭: SS-33/4PE-15), COATSOME® SS-OC, COATSOME® SS-OP, 디((Z)-논-2-엔-1-일)9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L-319), 또는 N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); 및 콜레스테롤로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)이고, 중성 지질은 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이다.
일부 구현예에서, 인지질-중합체 접합체는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)] (DSPE-PEG); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌글리콜 (DPG-PEG); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DSG-PEG); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DSG-PEG); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DMG-PEG); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DMG-PEG), 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG-아민)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 인지질-중합체 접합체는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-5000](DSPE-PEG5K); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DPG-PEG2K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DSG-PEG5K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DSG-PEG2K); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DMG-PEG5K); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DMG-PEG2K)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 COATSOME® SS-OC를 포함하고, 여기서 하나 이상의 헬퍼 지질은 콜레스테롤(Chol) 및 DSPC를 포함하고, 인지질-중합체 접합체는 DPG-PEG2000을 포함한다. 일부 구현예에서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-25%, C = 20%-30% 및 D = 0%-3%이고, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-50%, B = 20%-25%, C = 25%-30% 및 D = 0%-1%이고, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 약 49:22:28.5:0.5이다.
일부 구현예에서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-30%, C = 20%-45% 및 D = 0%-3%이고, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-30%, C = 25%-45% 및 D = 0%-3%이고, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-55%, B = 10%-20%, C = 30%-40% 및 D = 1%-2%이고, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-50%, B = 10%-15%, C = 35%-40% 및 D = 1%-2%이고, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 49:11:38.5:1.5이다.
일부 구현예에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하며, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-65%, B = 5%-20%, C = 20%-45% 및 D = 0%-3%이고 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤 (Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하고, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 50%-60%, B = 5%-15%, C = 30%-45% 및 D = 0%-3%이고, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하고, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 55%-60%, B = 5%-15%, C = 30%-40% 및 D = 1%-2%이고, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하고, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 55%-60%, B = 5%-10%, C = 30%-35% 및 D = 1%-2%이고, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하고, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)는 58:7:33.5:1.5이다.
일부 구현예에서, LNP는 표 5로부터 선택되는 지질 제형을 포함한다.
일부 구현예에서, 히알루로난은 LNP의 표면에 접합된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 50nm 내지 약 500nm, 약 150nm 내지 약 500nm, 약 200nm 내지 약 500nm, 약 300nm 내지 약 500nm, 약 350nm 내지 약 500nm, 약 400nm 내지 약 500nm, 약 425nm 내지 약 500nm, 약 450nm 내지 약 500nm, 또는 약 475nm 내지 약 500nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 50nm 내지 약 120nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 50nm, 60nm, 70nm, 80nm, 90nm, 100nm, 110nm, 또는 약 120nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 100nm의 평균 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 40mV 내지 약 -40mV, 약 20mV 내지 약 -20mV, 약 10mV 내지 약 -10mV, 약 5mV 내지 약 -5mV, 또는 약 20mV 내지 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 -20mV 미만, 약 -30mV 미만, 약 35mV 미만 또는 약 -40mV 미만의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 -50mV 내지 약 -20mV, 약 -40mV 내지 약 -20mV, 또는 약 -30mV 내지 약 -20mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 -30mV, 약 -31mV, 약 -32mV, 약 -33mV, 약 -34mV, 약 -35mV, 약 -36mV, 약 -37mV, 약 -38mV, 약 -39mV 또는 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는다.
일부 구현예에서, 대상체에 대한 치료학적 조성물의 투여는 재조합 RNA 폴리뉴클레오타이드를 대상체의 표적 세포로 전달하며, 여기서 재조합 RNA 폴리뉴클레오타이드는 대상체의 표적 세포를 용해시킬 수 있는 감염성 종양용해 바이러스를 생성한다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 암 세포이다.
일부 구현예에서, 조성물은 정맥내 또는 종양내 전달을 위해 제형화된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 치료학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상체의 암성 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공하며, 여기서 조성물의 투여는 종양의 성장을 억제한다. 일부 구현예에서, 투여는 종양내 또는 정맥내이다. 일부 구현예에서, 암은 폐암, 간암, 전립선암, 방광암 또는 흑색종이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 종양용해성 바이러스를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 재조합 RNA 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 암호화된 종양용해성 바이러스는 단일 가닥 RNA(ssRNA) 바이러스이다. 일부 구현예에서, ssRNA 바이러스는 포지티브 센스[(+)-센스] 또는 네거티브 센스[(-)-센스] ssRNA 바이러스이다. 일부 구현예에서, (+)-센스 ssRNA 바이러스는 피코나바이러스이다. 일부 구현예에서, 피코나바이러스는 세네카 밸리 바이러스(SVV) 또는 콕사키바이러스이다. 일부 구현예에서, SVV는 야생형 SVV-A(서열번호 1), S177A-SVVA 돌연변이체(서열번호 2), SVV-IR2 돌연변이체(서열번호 3), 또는 SVV-IR2-S177A(서열번호 4)로부터 선택되는 SVV-A이다. 일부 구현예에서, 콕사키바이러스는 CVB3, CVA21 및 CVA9로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 콕사키바이러스는 서열번호 27을 포함하는 변형된 CVA21 바이러스이다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 종양용해성 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 삽입된 마이크로RNA(miRNA) 표적 서열(miR-TS) 카세트를 추가로 포함하며, 여기서 miR-TS 카세트는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 여기서 세포에서 하나 이상의 상응하는 miRNA의 발현은 세포에서 암호화된 바이러스의 복제를 억제한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 miRNA는 miR-124, miR-1, miR-143, miR-128, miR-219, miR-219a, miR-122, miR-204, miR-217, miR-137 및 miR-126으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, miR-TS 카세트는 miR-124 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-1 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-143 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, miR-TS 카세트는 miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-219a 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-122 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, miR-TS 카세트는 miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-204 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-219 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, miR-TS 카세트는 miR-217 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-137 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-126 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 miR-TS 카세트는 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 5' 비해독 영역(UTR) 또는 3' UTR에 통합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 miR-TS 카세트는 하나 이상의 비필수 유전자의 5' 비해독 영역(UTR) 또는 3' UTR에 통합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 miR-TS 카세트는 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 5' 또는 3'에 통합된다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 비-바이러스 전달 비히클에 의해 세포 내로 도입된 경우, 복제-적격 종양용해성 바이러스를 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 포유류 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 포유류 대상체에 존재하는 포유류 세포이다.
일부 구현예에서, 복제-적격 바이러스는 콕사키바이러스, 폴리오 바이러스, 세네카 밸리 바이러스, 라사(lasa) 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 뉴캐슬병(Newcastle disease) 바이러스, 홍역 바이러스, 신드비스(sindbis) 바이러스, 및 마라바(maraba) 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 복제-적격 바이러스는 표 1에 나열된 것들로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 핵산 벡터에 삽입된다. 일부 구현예에서, 핵산 벡터는 레플리콘(replicon)이다.
일부 구현예에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 외인성 페이로드 단백질을 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 페이로드 단백질은 형광 단백질, 효소 단백질, 사이토카인, 케모카인, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자, 또는 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-12, GM-CSF, IL-18, IL-2 및 IL-36γ로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포 표면 수용체에 대한 리간드는 Flt3 리간드 또는 TNFSF14이다. 일부 구현예에서, 케모카인은 CXCL10, CCL4, CCL21 및 CCL5로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 분자는 면역 관문 수용체에 결합하고 이를 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 관문 수용체는 PD-1이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 분자는 종양 항원에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 분자는 이중특이적 T 세포 체결자 분자(BiTE) 또는 이중특이적 경쇄 T 세포 체결자 분자(LiTE)이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 DLL3 또는 EpCAM이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 5'에서 3'로, 프로모터 서열, 5' 접합부 절단(junctional cleavage) 서열, 본원에 기재된 재조합 RNA 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 3' 접합부 절단 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 프로모터 서열은 T7 프로모터 서열이다.
일부 구현예에서, 5' 접합부 절단 서열은 리보자임 서열이고 3' 접합부 절단 서열은 리보자임 서열이다. 일부 구현예에서, 5' 리보자임 서열은 해머헤드 리보자임 서열이고, 3' 리보자임 서열은 델타 간염 바이러스 리보자임 서열이다. 일부 구현예에서, 5' 접합부 절단 서열은 리보자임 서열이고 3' 접합부 절단 서열은 제한 효소 인식 서열이다. 일부 구현예에서, 5' 리보자임 서열은 해머헤드 리보자임 서열, 피스톨(Pistol) 리보자임 서열, 또는 변형된 피스톨 리보자임 서열이다. 일부 구현예에서, 3' 제한 효소 인식 서열은 IIS형 제한 효소 인식 서열이다. 일부 구현예에서, IIS형 인식 서열은 SapI 인식 서열이다. 일부 구현예에서, 5' 접합부 절단 서열은 RNAseH 프라이머 결합 서열이고 3' 접합부 절단 서열은 제한 효소 인식 서열이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 DNA 분자의 시험관내 전사 및 생성된 재조합 RNA 분자의 정제를 포함하는 본원에 기재된 재조합 RNA 분자를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 합성 RNA 바이러스 게놈에 의해 암호화된 종양용해성 바이러스에 고유한 5' 및 3' 단부(end)를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 재조합 RNA 분자의 유효량, 및 포유류 대상체에게 투여하기에 적합한 담체(carrier)를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 재조합 RNA 분자를 포함하는 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, 입자는 생분해성이다. 일부 구현예에서, 입자는 나노입자, 엑소좀(exosome), 리포좀(liposome) 및 리포플렉스(lipoplex)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 엑소좀은 온전한(intact) 엑소좀 또는 빈(empty) 엑소좀으로부터 유래되는 변형된 엑소좀이다. 일부 구현예에서, 나노입자는 양이온성 지질, 하나 이상의 헬퍼 지질 및 인지질-중합체 접합체를 포함하는 지질 나노입자(LNP)이다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 DLinDMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA (MC3), COATSOME® SS-LC (이전 명칭: SS-18/4PE-13), COATSOME®SS-EC (이전 명칭: SS-33/4PE-15), COATSOME® SS-OC, COATSOME® SS-OP, 디((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트 (L-319) 또는 N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); 및 콜레스테롤로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)이고, 여기서 중성 지질은 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이다.
일부 구현예에서, 인지질-중합체 접합체는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌글리콜 (DPG-PEG); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DSG-PEG); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DSG-PEG); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DMG-PEG); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DMG-PEG), 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG-아민)으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 인지질-중합체 접합체는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-5000](DSPE-PEG5K); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DPG-PEG2K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DSG-PEG5K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DSG-PEG2K); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DMG-PEG5K); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DMG-PEG2K)으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 COATSOME® SS-OC를 포함하고, 하나 이상의 헬퍼 지질은 콜레스테롤(Chol) 및 DSPC를 포함하고, 인지질-중합체 접합체는 DPG-PEG2000을 포함한다. 일부 구현예에서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-25%, C = 20%-30% 및 D = 0%-3%, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-50%, B = 20%-25%, C = 25%-30% 및 D = 0%-1%이며, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 약 49:22:28.5:0.5이다.
일부 구현예에서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-30%, C = 20%-45% 및 D = 0%-3%이고, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-30%, C = 25%-45% 및 D = 0%-3%이고, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-55%, B = 10%-20%, C = 30%-40% 및 D = 1%-2%이며, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-50%, B = 10%-15%, C = 35%-40% 및 D = 1%-2%이고, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 49:11:38.5:1.5이다. 일부 구현예에서, LNP는 표 5로부터 선택된 지질 제형을 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)이고, 중성 지질은 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이다. 일부 구현예에서, 입자는 인지질-중합체 접합체를 추가로 포함하고, 여기서 인지질-중합체 접합체는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리(에틸렌글리콜)(DSPE-PEG) 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG-아민)이다.
일부 구현예에서, 히알루로난은 LNP의 표면에 접합된다.
일부 구현예에서, 입자는 페이로드 분자를 암호화하는 제2 재조합 RNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 재조합 RNA 분자는 레플리콘이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 50nm 내지 약 500nm, 약 150nm 내지 약 500nm, 약 200nm 내지 약 500nm, 약 300nm 내지 약 500nm, 약 350nm 내지 약 500nm, 약 400nm 내지 약 500nm, 약 425nm 내지 약 500nm, 약 450nm 내지 약 500nm, 또는 약 475nm 내지 약 500nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 50nm 내지 약 120nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 50nm, 60nm, 70nm, 80nm, 90nm, 100nm, 110nm, 또는 약 120nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 100nm의 평균 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 20mV 내지 약 -20mV, 약 10mV 내지 약 -10mV, 약 5mV 내지 약 -5mV, 또는 약 20mV 내지 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 -20mV 미만, 약 -30mV 미만, 약 35mV 미만 또는 약 -40mV 미만의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 -50mV 내지 약 -20mV, 약 -40mV 내지 약 -20mV, 또는 약 -30mV 내지 약 -20mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 -30mV, 약 -31mV, 약 -32mV, 약 -33mV, 약 -34mV, 약 -35mV, 약 -36mV, 약 -37mV, 약 -38mV, 약 -39mV 또는 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는다.
일부 구현예에서, 대상체에 조성물의 전달은 캡슐화된 재조합 RNA 분자를 표적 세포로 전달하고, 캡슐화된 재조합 RNA 분자는 표적 세포를 용해시킬 수 있는 감염성 바이러스를 생산한다. 일부 구현예에서, 조성물은 정맥내 또는 종양내 전달을 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 암성 세포이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 무기 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, 무기 입자는 금 나노입자 (GNP), 금 나노막대(GNR), 자기 나노입자(MNP), 자기 나노튜브(MNT), 탄소 나노혼(carbon nanohorn, CNH), 탄소 풀러렌(fullerene), 탄소 나노튜브(CNT), 인산칼슘 나노입자(CPNP), 중간다공성 실리카 나노입자(MSN), 실리카 나노튜브(SNT) 또는 성상(starlike) 중공 실리카 나노입자(SHNP)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 무기 입자는 페이로드 분자를 암호화하는 제2 재조합 RNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 재조합 RNA 분자는 레플리콘(replicon)이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 무기 입자를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 입자의 평균 직경은 약 500nm 미만, 약 50nm 내지 500nm, 약 250nm 내지 약 500nm, 또는 약 350nm이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 입자의 평균 직경이 약 50nm 내지 약 120nm인 본원에 기재된 무기 입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 입자의 평균 직경은 약 50nm, 60nm, 70nm, 80nm, 90nm, 100nm, 110nm, 또는 약 120nm이다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 100nm의 평균 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 암성 세포에 입자를 세포내 전달하기에 충분한 조건하에, 본원에 기재된 입자, 본원에 기재된 재조합 RNA 분자 또는 이의 조성물에 암성 세포를 노출시키는 것을 포함하는 암성 세포를 사멸시키는 방법을 제공하며, 여기서 캡슐화된 폴리뉴클레오타이드에 의해 생산된 복제-적격 바이러스는 암성 세포의 사멸을 초래한다. 일부 구현예에서, 복제-적격 바이러스는 비암성 세포에서 생산되지 않는다. 일부 구현예에서, 이 방법은 생체내, 시험관내 또는 생체외에서 수행된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 입자, 본원에 기재된 재조합 RNA 분자 또는 이의 조성물의 유효량을 암을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체의 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 입자 또는 이의 조성물은 정맥내, 비강내, 흡입제로서 투여되거나, 또는 종양에 직접 주사된다. 일부 구현예에서, 입자 또는 이의 조성물은 대상체에게 반복적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 마우스, 랫트, 토끼, 고양이, 개, 말, 비인간 영장류, 또는 인간이다.
일부 구현예에서, 암은 폐암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암, 고환암, 결장직장암, 결장암, 췌장암, 간암, 위암, 두경부암, 갑상선암, 악성 신경교종, 교모세포종, 방광암, 흑색종, B 세포 만성 림프구성 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 육종 및 변연부 림프종(MZL)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 폐암은 소세포 폐암 또는 비소세포 폐암이다. 일부 구현예에서, 간암은 간세포 암종(HCC)이다. 일부 구현예에서, 전립선암은 치료-유발 신경내분비 전립선암이다. 일부 구현예에서, 방광암, 췌장암 및 위암은 신경내분비 아형이다.
도 1a 및 도 1b는 SVV 게놈 및 SVV의 바이러스 용해를 포함하는 RNA 분자의 생산을 보여준다.
도 2는 SVV+ssRNA/LNP로 처리 후 성공적인 RNA 전달 및 기능성 바이러스 생산을 보여준다.
도 3a 내지 도 3d는 지질 나노입자 조성의 변이가 입자 크기 및/또는 RNA 포획(entrapment) 백분율을 변경한다는 것을 보여준다.
도 4a 및 도 4b는 H1299 종양 모델에서 SVV+ssRNA/LNP의 효능을 보여준다. 도 4a는 PBS 또는 SVV+ssRNA/LNP(제형 ID: 70001-5.C)의 정맥내 투여 후 H1299 종양-보유 마우스에서의 종양 부피를 보여준다. 도 4b는 PBS 또는 SVV+ssRNA/LNP(제형 ID: 70001-5.C)로 정맥내 처리된 H1299 종양-보유 마우스의 체중 측정을 보여준다.
도 5a 및 도 5b는 SVV+ssRNA/LNP의 정맥내 투약 후 종양으로부터 감염성 SVV의 회복을 보여준다.
도 6a 내지 도 6d는 H1299 종양 모델에서 SVV/LNP 제형 70009-1.C, 70009-2.C 및 70009-3.C의 효능을 보여준다. 도 6a는 PBS, SVV-Neg/LNP(제형 ID: 70009-1.C), SVV/LNP(제형 ID: 70009-2.C), 또는 SVV-S177A/LNP(제형 ID: 70009-3.C)의 정맥내 투여 후 H1299 종양 보유 마우스의 종양 부피를 보여준다. 도 6b는 PBS, SVV-Neg/LNP(제형 ID: 70009-1.C), SVV/LNP(제형 ID: 70009-2.C) 또는 SVV-S177A/LNP(제형 ID: 70009-3.C)로 정맥내 처리된 H1299 종양 보유 마우스의 체중 측정을 보여준다. 도 6c 및 도 6d는 PBS, SVV-Neg/LNP(제형 ID: 70009-1.C), SVV/LNP(제형 ID: 70009-2.C) 또는 SVV-S177A/LNP(제형 ID: 70009-3.C)로 처리된 H1299 종양 보유 마우스로부터 분리된 종양(도 6c) 또는 간(도 6d) 조직에서의 SVV 복제를 보여준다.
도 7은 PBS 또는 SVV-WT RNA 지질 나노입자(제형 ID: 70053-1-1.C, 70053-2-2.C, 70059-1-3.C 및 70059-2-4.C)의 정맥내 투여 후 H1299 종양 보유 마우스에서의 종양 부피를 보여준다.
도 8은 PBS 또는 SVV-WT(제형 ID: 70087-1.C) RNA 지질 나노입자의 정맥내 투여, 또는 리포펙타민에 의해 제형화된 SVV-WT의 종양내 투여 후 H82 종양 보유 마우스에서의 종양 부피를 보여준다.
도 9a 내지 도 9d는 H1299 종양 모델에서 SVV/LNP 제형 70077-3.C, 70077-4.C, 70077-8.C, 70077-10.C 및 70077-11.C의 효능을 보여준다. 도 9a는 PBS 또는 SVV-S177A RNA 지질 나노입자(제형 ID: 70077-3.C, 70077-4.C, 70077-8.C, 70077-10.C 및 70077-11.C)의 정맥내 투여 후 H1299 종양 보유 마우스의 종양 부피를 보여준다. 도 9b는 PBS 또는 SVV-S177A RNA 지질 나노입자(제형 ID: 70077-3.C, 70077-4.C, 70077-8.C, 70077-10.C 및 70077-11.C)로 정맥내 처리된 H1299 종양 보유 마우스의 체중 측정을 보여준다. 도 9c는 PBS 또는 SVV-S177A RNA 지질 나노입자(제형 ID: 70077-3.C, 70077-4.C, 70077-8.C, 70077-10.C 및 70077-11.C)로 정맥내 처리된 H1299 종양 보유 마우스의 혈청 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)를 보여준다. 도 9d는 PBS 또는 SVV-S177A RNA 지질 나노입자(제형 ID: 70077-3.C, 70077-4.C, 70077-8.C, 70077-10.C 및 70077-11.C)로 정맥내 처리된 H1299 종양 보유 마우스로부터 분리된 종양 조직에서의 SVV 복제를 보여준다.
도 10은 PBS 또는 SVV-S177A RNA 지질 나노입자(제형 ID: 70087-1.C, 70087-2.C, 70087-3.C, 및 70087-4.C)의 정맥내 투여 후 H1299 종양-보유 마우스에서의 종양 부피를 보여준다.
도 11은 SVV-S177A RNA 지질 나노입자(제형 ID: 80010-1.C, 80010-2.C, 80010-3.C, 80010-4.C 및 80010-5.C)가 정맥내 처리된 H1299 종양 보유 마우스로부터 분리된 종양 조직에서의 SVV 복제를 보여준다.
도 12는 PBS 또는 SVV-S177A RNA 지질 나노입자(제형 ID: 80033-1.C, 80033-2.C 및 80033-3.C)의 정맥내 투여 후 H1299 종양 보유 마우스에서의 종양 부피를 보여준다.
도 13a 내지 도 13c는 H446 종양 모델에서 SVV/LNP 제형 80059-1.C 및 80059-2.C의 효능을 보여준다. 도 13a는 PBS, SVV-Neg LNP(제형 ID: 80059-1.C) 또는 SVV-S177A LNP(제형 ID: 80059-2.C)의 정맥내 투여 후 H446 종양 보유 마우스의 종양 부피를 보여준다. 도 13b는 PBS, SVV-Neg LNP(제형 ID: 80059-1.C) 또는 SVV-S177A LNP(제형 ID: 80059-2.C)로 정맥내 처리된 H446 종양 보유 마우스의 체중 측정을 보여준다. 도 13c는 PBS, SVV-Neg LNP(제형 ID: 80059-1.C) 또는 SVV-S177A LNP(제형 ID: 80059-2.C)로 정맥내 처리된 H446 종양 보유 마우스로부터 분리된 종양 조직에서의 SVV 복제를 보여준다.
도 14는 PBS, SVV-WT LNP(제형 ID: 80130-1.C) 또는 SVV-IR2 LNP(제형 ID: 80130-2.C)의 정맥내 투여 후 H1299 종양 보유 마우스의 종양 부피를 보여준다.
도 15는 PBS, SVV-WT LNP(제형 ID: 80130-1.C), 또는 SVV-IR2 LNP(제형 ID: 80130-2.C)로 정맥내 처리된 NIE-115 종양 보유 마우스로부터 분리된 종양 조직에서의 SVV 복제를 보여준다.
도 16a 및 도 16b는 항-SVV 다클론 항체로 처리 시의 SVV-매개 H446 세포 용해의 억제를 보여준다.
도 17은 PBS, SVV 바이러스 또는 SVV-WT LNP(제형 ID: 80139-1.C)의 정맥내 투여 및 토끼 혈청 또는 항-SVV 다클론 항체의 복강내 투여 후 H1299 종양-보유 마우스에서의 종양 부피를 보여준다.
도 18은 PBS 또는 CVA21-WT LNP(제형 ID: 70032-6C)의 종양내 투여 또는 CVA21-WT LNP의 정맥내 투여 후 SK-MEL-28 종양-보유 마우스에서의 종양 부피를 보여준다.
도 19는 3' SapI 제한 효소 인식 부위를 사용하여 피코나바이러스에 대한 진짜 3' 말단을 생성하기 위한 시험관내 전사 접근법의 개요를 보여준다.
도 20은 5' DNA 프라이머 및 RNaseH 효소를 사용하여 피코나바이러스에 대한 진짜 5' 말단을 생성하기 위한 RNaseH 접근법을 보여준다.
도 21은 5' RNaseH 프라이머 결합 부위 및 3' SapI 제한 부위를 갖는 분해된 RNA의 프라이머 연장 분석을 예시한다.
도 22는 피코나바이러스에 대한 진짜 5' 말단을 생성하기 위한 리보자임 접근법을 보여준다.
도 23a 및 도 23b는 별개의 5' 말단을 생성하기 위한 해머헤드 리보자임을 보여준다. 도 E-1은 화살표의 5' 말단에서 어닐링 및 절단하는 최소 해머헤드 리보자임(HHR)의 구조 모델을 보여준다. 도 E-2는 화살표에서 5' 말단을 절단하기 위한 안정화된 줄기 I(STBL)을 갖는 리보자임의 구조 모델을 보여준다.
도 24a 및 도 24b는 별개의 5' 말단을 생성하기 위한 피스톨(pistol) 리보자임을 보여준다. 도 F-1은 야생형 피스톨 리보자임 특성의 개략도를 보여준다. 도 F-2는 mFOLD에 의해 모델링된 P3 가닥을 융합시키기 위해 첨가된 테트라루프(tetraloop)를 갖는 P. 폴리믹사(P. Polymyxa)의 피스톨 리보자임을 보여준다. 파선 박스는 바이러스 서열의 상황에서 리보자임의 접힘(fold)을 보유하도록 돌연변이된 영역이다. 파선 박스에 표시된 "GUC" 서열은 "UCA"로 돌연변이되어 피스톨 1을 생성하였고 "GUC" 서열은 "TTA"로 돌연변이되어 피스톨 2를 생성했다.
도 25는 피스톨 1 리보자임이 시험관내 전사 과정 동안 완전한 절단을 초래 한다는 것을 입증한다.
도 26은 시험관내 전사 과정 동안 모든 리보자임을 사용한 프라이머 연장 분석을 예시한다.
도 27은 마이너스 가닥 RNA의 검출을 보여주며, 이는 피스톨 1 리보자임이 5' 해머헤드 리보자임을 사용한 작제물에 비해 RNA 주형으로부터 SVV 복제의 더 빠른 킥오프(kickoff)을 초래한다는 것을 확인시켜준다.
도 28은 5' 해머헤드 리보자임에 의해 생성된 작제물에 비해 5' 피스톨 1 리보자임 및 3' SapI 제한 부위에 의해 생성된 합성 RNA SVV 게놈의 증가된 생체내 효능을 보여준다. PBS, SVV-HHR LNP(제형 ID: 80130-1.C) 또는 SVV-PR LNP(제형 ID: 80130-3.C)의 정맥내 투여 후 H1299 종양 보유 마우스의 종양 부피.
도 29a 및 도 29b는 변형된 리보뉴클레오타이드를 사용한 SVV RNA의 시험관내 전사(도 29a) 및 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 SVV RNA 게놈의 바이러스 복제(도 29b)를 보여준다.
도 30은 SVV 및 SVV 바이러스 게놈으로부터 다양한 페이로드 분자를 암호화하는 SVV의 바이러스 복제를 보여준다(IC50 곡선).
도 31a 및 도 31b는 H1299 종양 모델에서 IL-36γ를 암호화하는 SVV-RNA 게놈의 효능을 보여준다. 도 31a는 처리 후 종양 성장을 보여준다. 도 31b는 종양 조직에서의 IL-36γ 발현을 보여준다.
도 32a 및 도 32b는 RNA 폴리뉴클레오타이드로부터 감염성 CVA21 바이러스의 생산을 보여준다. 도 32a는 RNA 폴리뉴클레오타이드로부터 감염성 CVA21의 생산에 대한 5' UTR 서열의 효과를 보여준다. 도 32b는 서열번호 26의 5' UTR을 포함하는 RNA 폴리뉴클레오타이드로부터 감염성 CVA21의 생산을 보여준다.
도 33은 LNP/SVV RNA 조성 및 작용 방식의 개략도를 보여준다. LNP/SVV-RNA는 전신 투여되며, SVV-RNA 게놈은 허용 종양 세포로 전달되어, 여기서 복제하여 SVV-비리온을 생성한다. SVV 감염은 종양용해 및 항바이러스 면역 반응을 유도해내는 인접 종양 세포로 확산한다.
도 34는 SVV-RNA 및 Neg-RNA에 대한 시험관내 전사 과정을 보여준다. 5' 및 3' 리보자임(Rib)에 의한 SVV-RNA의 자가촉매 절단(autocatalytic cleavage)은 복제에 필요한 별개의 5' 및 3' 단부를 가진 SVV-RNA를 생성한다. 이와 대조적으로, Neg-RNA 작제물은 리보자임 서열이 없고 복제 및 비리온 생산을 할 수 없다.
도 35는 바이러스의 천연 5' 및 3' 별개의 단부를 유지하기 위해 게놈 전사체로부터 비-바이러스 RNA 폴리뉴클레오타이드를 제거하도록 접합부 절단 서열을 사용하는 일반적인 개략도를 보여준다.
바이러스 치료법의 기술 분야에는 중화 항체의 존재 하에서 효과적이며, 반복적으로 전신 투여될 수 있고, 복제가 병든 세포에 제한되어 정상의 비암성 세포에 대한 부수적인 손상을 최소화하면서 치료 효능을 최대화하는 바이러스 요법이 요구된다. 본 개시내용은 이러한 장애를 극복하고, 지질 나노입자, 중합체 나노입자 또는 엑소좀과 같은 비면역원성 입자에 캡슐화될 수 있는 복제-적격 바이러스 게놈을 제공한다. 일부 구현예에서, 입자는 페이로드 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 복제-적격 바이러스 게놈 및 증식성 질환 및 장애(예를 들어, 암)의 치료 및 예방을 위한 사용 방법을 제공한다. 본 개시내용은 광범위한 증식성 장애(예를 들어, 암)를 치료하기에 적합한 안전하고 효과적인 재조합 폴리뉴클레오타이드 벡터의 전신 전달을 가능하게 한다.
본 명세서에 사용된 섹션 제목은 단지 구성 목적을 위한 것이며, 설명된 주제를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 특허, 특허 출원, 기사, 서적 및 논문을 포함하되 이에 제한되지 않는 본 명세서에 인용된 모든 문서 또는 문서의 일부는 임의의 목적을 위해 전체적으로 분명히 참조로 포함된다. 포함된 문서 중 하나 이상 또는 문서의 일부가 본 출원에서 해당 용어의 정의와 모순되는 용어를 정의하는 경우 이 출원에 나타나는 정의를 따른다. 그러나, 본 명세서에 인용된 임의의 참고문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 공보 및 특허 출원에 대한 언급은 이들이 타당한 선행 기술을 구성하거나 전세계의 모든 국가에서 공통된 일반 지식의 일부를 형성한다는 인정 또는 임의의 형태의 암시로서 간주된 것이 아니며, 그런 것으로서 간주되어서는 안된다.
정의
본 명세서에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 표시되지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수 값 및 적당한 경우에는 그 분율(예를 들어, 정수의 1/10 및 1/100)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어 "하나("a" 및 "an")은 달리 표시되지 않는 한, 열거된 구성 요소 중 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안의 사용(예를 들어, "또는")은 대안 중 하나, 둘 모두 또는 이들의 임의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어 "포함한다(include)" 및 "포함한다(comprise)"는 동의어로 사용된다. 본원에 사용된 "복수"는 하나 이상의 구성요소(예를 들어, 하나 이상의 miRNA 표적 서열)을 지칭할 수 있다. 본 출원에서 "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한, "및/또는"을 의미한다.
본 출원에 사용되는 용어 "약" 및 "대략"은 동의어로서 사용된다. 본 출원에서 약/대략의 유무 하에 사용된 임의의 숫자는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 임의의 정상적인 변동을 커버하는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되거나 그 상황(그러한 숫자가 100%의 가능한 값을 초과하는 경우는 제외)에서 달리 명백하지 않은 한, 언급된 기준 값의 어느 한 방향(초과 또는 미만)에서의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다.
"감소한다(decrease)" 또는 "축소한다(reduce)"는 기준 값과 비교하여 적어도 5%, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100%의 특정 값의 감소 또는 축소를 지칭한다. 특정 값의 감소 또는 축소는 또한 기준 값과 비교하여 값의 배수 변화, 예를 들어, 기준 값과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000배 이상의 감소로서 표현될 수도 있다.
"증가한다"는 기준 값과 비교하여 적어도 5%, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 200, 300, 400, 500% 이상의 특정 값의 증가를 지칭한다. 특정 값의 증가는 기준 값과 비교하여 값의 배수 변화, 예를 들어, 기준 값의 수준과 비교하여 적어도 1배, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000배 이상의 증가로서 표현될 수도 있다.
용어 "서열 동일성"은 동일하고 동일한 상대적 위치에 있는 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 사이의 염기 또는 아미노산의 백분율을 지칭한다. 이처럼, 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열은 다른 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열과 비교하여 특정 백분율의 서열 동일성을 갖는다. 서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 기준 서열로서 작용하고, 이에 대해 시험 서열이 비교된다. 용어 "기준 서열"은 시험 서열이 비교되는 분자를 지칭한다.
"상보적"은 천연 또는 비-천연 발생(예를 들어, 전술한 바와 같이 변형됨)의 염기(뉴클레오타이드) 또는 이의 유사체를 포함하는 두 서열 사이에 염기 적층 및 특정 수소 결합을 통한 페어링(paring) 능력을 지칭한다. 예를 들어, 핵산의 한 위치에 있는 염기가 표적의 상응하는 위치에 있는 염기와 수소 결합을 할 수 있는 경우, 그 염기들은 해당 위치에서 서로 상보적인 것으로 간주한다. 핵산은 범용 염기 또는 수소 결합에 긍정적이거나 부정적인 기여를 제공하지 않는 비활성 무염기성(abasic) 스페이서를 포함할 수 있다. 염기 페어링은 표준 Watson-Crick 염기 페어링 및 비 Watson-Crick 염기 페어링(예를 들어, Wobble 염기 페어링 및 Hoogsteen 염기 페어링)을 모두 포함할 수 있다. 상보적인 염기 페어링의 경우, 아데노신형 염기(A)는 티미딘형 염기(T) 또는 우라실형 염기(U)에 상보적이며, 사이토신형 염기(C)는 구아노신형 염기(G)에 상보적이며, 3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌과 같은 범용 염기는 임의의 A, C, U 또는 T에 혼성화할 수 있고 이에 대해 상보적인 것으로서 생각되는 것으로 이해한다. Nichols 등, Nature, 1994; 369:492-493 및 Loakes 등, Nucleic Acids Res., 1994; 22:4039-4043. 이노신(I)은 또한 본 기술분야에서 범용 염기로 생각되고 있고 임의의 A, C, U 또는 T에 상보적인 것으로 생각한다. Watkins 및 SantaLucia, Nucl. Acids Research, 2005; 33(19):6258-6267 참조.
"발현 카세트" 또는 "발현 작제물"은 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. "작동가능하게 연결된"은 이와 같이 기재된 구성요소가 의도된 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계에 있는 병치를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터가 폴리뉴클레오타이드 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 프로모터는 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된다.
용어 "대상체"는 동물, 예컨대, 예를 들어 포유류를 포함한다. 일부 구현예에서, 포유류는 영장류이다. 일부 구현예에서, 포유류는 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 소, 양, 염소, 암소, 돼지 등과 같은 가축; 또는 개 및 고양이와 같은 길들여진 동물이다. 일부 구현예(예를 들어, 특히 연구 상황에서)에서 대상체는 설치류(예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터), 토끼, 영장류 또는 돼지, 예컨대 근친교배된 돼지 등이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 호환적으로 사용된다.
본원에서 "투여"는 제제 또는 조성물을 대상체 내로 도입시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 "치료하는"은 생리학적 결과에 영향을 미치기 위해 제제 또는 조성물을 대상체에게 전달하는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료하는은 (a) 질병을 억제하는 것, 즉 질병 발달을 저지하거나 질병 진행을 방지하는 것; (b) 질병을 완화시키는 것, 즉 질병 상태의 퇴행을 유발하는 것; 및 (c) 질병을 치유하는 것을 포함하여, 포유류, 예를 들어 인간의 질병 치료를 지칭한다.
용어 "유효량"은 특정 생리학적 효과를 초래하는데 필요한 제제 또는 조성물의 최소량(예를 들어, 특정 생리학적 효과를 증가, 활성화 및/또는 향상시키는데 필요한 양)을 지칭한다. 특정 제제의 유효량은 제제의 성질에 기초하여 다양한 방식으로 표현될 수 있고, 예컨대, 질량/부피, 세포 수/부피, 입자/부피, (제제의 질량)/(대상체의 질량), 세포 수/(대상체의 질량) 또는 입자/(대상체의 질량)이다. 특정 제제의 유효량은 또한 최대 유효 농도의 절반(EC50)으로서 표현될 수 있으며, 이는 기준 수준과 최대 반응 수준 사이의 중간인 특정 생리학적 반응의 규모를 초래하는 제제의 농도를 지칭한다.
세포의 "집단"은 1보다 큰 임의의 수의 세포를 지칭하지만, 바람직하게는 적어도 1x103 세포, 적어도 1x104 세포, 적어도 1x105 세포, 적어도 1x106 세포, 적어도 1x107 세포, 적어도 1x108 세포, 적어도 1x109 세포, 적어도 1x1010 세포 또는 그 이상의 세포이다. 세포 집단은 시험관내 집단(예를 들어, 배양물 중의 세포 집단) 또는 생체내 집단(예를 들어, 특정 조직에 상주하는 세포 집단)을 지칭할 수 있다.
"이펙터(effector) 기능"은 표적 세포 또는 표적 항원에 대한 면역 반응의 생성, 유지 및/또는 향상과 관련된 면역 세포의 기능을 지칭한다.
용어 "마이크로RNA", "miRNA" 및 "miR"은 본원에서 호환적으로 사용되며, 분해 또는 해독 억제를 위해 이들의 표적 메신저 RNA(mRNA)를 유도함으로써 유전자 발현을 조절하는 약 21 내지 25개 뉴클레오타이드 길이의 작은 비암호 내인성 RNA를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "조성물"은 대상체 또는 세포로 투여 또는 전달될 수 있는 본원에 기재된 재조합 RNA 분자 또는 입자 캡슐화된 재조합 RNA 분자의 제형을 지칭한다.
"약제학적 허용성"이라는 어구는 건전한 의학적 판단 범위 내에서 인간 및 동물의 조직과 합리적인 유익/유해 비율에 비례하여 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭하는 것으로서 본원에 사용된다.
본원에 사용된 "약제학적 허용성 담체, 희석제 또는 부형제"는 인간 및/또는 가축용으로 허용되는 것으로서 미국식약청의 승인을 받은 임의의 보조제, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향미 증진제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정제, 등장제, 용매, 계면활성제 및/또는 유화제를 제한없이 포함한다.
용어 "복제-적격 바이러스 게놈"은 바이러스 복제 및 감염성 바이러스 입자의 생산에 필요한 모든 바이러스 유전자를 암호화하는 바이러스 게놈을 지칭한다.
용어 "종양용해성 바이러스"는 암 세포를 감염시키기 위해 변형되거나, 자연적으로, 우선적으로 감염시키기 위해 변형된 바이러스를 지칭한다.
용어 "벡터"는 다른 핵산 분자를 전달하거나 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로서 본원에 사용된다.
분자 및 세포 생화학의 일반적인 방법은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook 등, HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed.(Ausubel 등 eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag 등, John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner 등 eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)과 같은 표준 교과서에서 찾아볼 수 있고, 상기 문헌의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
합성 RNA 바이러스 게놈
일부 구현예에서, 본 개시내용은 종양용해성 바이러스(예를 들어, RNA 게놈)를 암호화하는 재조합 RNA 분자를 제공한다. 이러한 재조합 RNA 분자는 본원에서 "합성 바이러스 게놈" 또는 "합성 RNA 바이러스 게놈"으로 지칭된다. 이러한 구현예에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 비-바이러스 전달 비히클에 의해 세포 내로 도입되었을 때 감염 용해성 바이러스를 생산할 수 있으며, 복제하여 감염성 바이러스를 생산하기 위해 세포에 존재해야 하는 추가 외인성 유전자 또는 단백질을 필요로 하지 않는다. 오히려, 숙주 세포의 내인성 해독 메커니즘은 합성 RNA 바이러스 게놈으로부터 바이러스 단백질의 발현을 매개한다. 발현된 바이러스 단백질은 그 다음 바이러스 복제를 매개하고, RNA 바이러스 게놈을 포함하는 감염성 바이러스 입자(캡시드 단백질, 외피 단백질 및/또는 막 단백질을 포함할 수 있음)로 조립된다(assembly). 이와 같이, 본원에 기술된 RNA 폴리뉴클레오타이드(즉, 합성 RNA 바이러스 게놈)는 숙주 세포에 도입된 경우, 다른 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스를 생산한다. 도 33의 개략도 참조.
일부 구현예에서, 합성 바이러스 게놈은 재조합 리보핵산(RNA)(즉, 합성 RNA 바이러스 게놈)으로서 제공된다. 일부 구현예에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 하나 이상의 핵산 유사체를 포함한다. 핵산 유사체의 예는 2'-O-메틸-치환된 RNA, 2'-O-메톡시-에틸 염기, 2' 플루오로 염기, 잠금 핵산(locked nucleic acid, LNA), 잠금해제 핵산(unlocked nucleic acid, UNA), 가교 핵산(bridged nucleic acid, BNA), 모르폴리노(morpholino), 및 펩타이드 핵산(PNA)을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 레플리콘, 전이유전자(transgene)를 암호화하는 RNA 바이러스 게놈, mRNA 분자 또는 원형 RNA 분자(circRNA)이다. 일부 구현예에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 단일 가닥 RNA(ssRNA) 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 게놈은 포지티브 센스 또는 네거티브 센스 게놈일 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 원형 RNA 분자(circRNA)이다. circRNA 분자는 엑소뉴클레아제 매개 분해에 필요한 자유 말단이 없어, 그 RNA 분자의 반감기를 연장시키며 시간이 지남에 따라 더욱 안정적인 단백질 생산을 가능하게 한다(예를 들어, Wesselhoeft 등, Engineering circular RNA for potent and stable translation in eukaryotic cells. Nature Communications. (2018) 9:2629 참조). circRNA 분자로부터 기능성 RNA 바이러스를 생산하기 위해서는 적절한 3' 및 5' 천연 단부를 가진 선형 RNA 게놈이 생산될 수 있도록 원형 작제물을 일단 세포 내에서 "절단 개방(break open)"할 필요가 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 종양용해성 바이러스를 암호화하는 재조합 RNA 분자는 circRNA 분자로서 제공되고 세포 내에서 circRNA 분자의 선형화를 용이하게 하는 하나 이상의 추가 RNA 서열을 추가로 포함한다. 이러한 추가 RNA 서열의 예로는 siRNA 표적 부위, miRNA 표적 부위 및 가이드 RNA 표적 부위를 포함한다. 해당 siRNA, miRNA 또는 gRNA는 circRNA 분자와 함께 공동제형화될 수 있다. 대안적으로, miRNA 표적 부위는 표적 세포 중의 동족 miRNA의 발현에 기초하여 선택할 수 있어, circRNA 분자의 절단 및 암호화된 종양용해성 바이러스의 초기 발현이 특정 miRNA를 발현하는 표적 세포에 제한되도록 한다.
본원에 기재된 합성 RNA 바이러스 게놈은 종양용해성 바이러스를 암호화한다. 종양용해성 바이러스의 예는 본 기술분야에 공지되어 있고, 예컨대, 피코나바이러스(예를 들어, 콕사키바이러스), 폴리오 바이러스, 홍역 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 오르토믹소바이러스 및 마라바 바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 합성 RNA 바이러스 게놈에 의해 암호화된 종양용해성 바이러스는 피코나비리대(Picornaviridae) 과의 바이러스, 예컨대 콕사키바이러스, 폴리오 바이러스(예컨대, PVS-RIPO와 같은 키메라 폴리오 바이러스 및 기타 키메라 피코나바이러스를 포함함), 또는 세네카 밸리(Seneca valley) 바이러스, 또는 임의의 다수의 피코나바이러스에서 유래하는 키메라 기원의 임의의 바이러스, 아레나비리대(Arenaviridae) 과의 바이러스, 예컨대 라사(lassa) 바이러스, 레트로비리대(Retroviridae) 과의 바이러스, 예컨대 뮤린 백혈병 바이러스, 오르토믹소비리대 과의 바이러스, 예컨대 인플루엔자 A 바이러스, 파라믹소비리대 과의 바이러스, 예컨대 뉴캐슬병 바이러스 또는 홍역 바이러스, 레오비리대(Reoviridae) 과의 바이러스, 예컨대 포유류 오르토레오바이러스, 토가비리대(Togaviridae) 과의 바이러스, 예컨대 신드비스(sindbis) 바이러스, 또는 랍도비리대(Rhabdoviridae) 과의 바이러스, 예컨대 수포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 마라바(maraba) 바이러스이다.
포지티브 센스, 단일 가닥 RNA 바이러스
일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 RNA 바이러스 게놈은 단일 가닥 RNA (ssRNA) 바이러스 게놈을 암호화한다. 일부 구현예에서, ssRNA 바이러스는 포지티브-센스, ssRNA(+ 센스 ssRNA) 바이러스이다. 예시적인 + 센스 ssRNA 바이러스는 피코나비리대 과[예를 들어, 콕사키바이러스, 폴리오 바이러스, 및 SVV-A를 포함하는 세네카 밸리 바이러스(SVV)], 코로나비리대 과(예를 들어, HCoV-229E 및 HCoV-NL63과 같은 알파코로나바이러스, HCoV-HKU1, HCoV-OC3 및 MERS-CoV와 같은 베타코로나바이러스), 레트로비리대 과(예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스), 및 토가비리대 과(예를 들어, 신드비스 바이러스)의 구성원을 포함한다. 포지티브 센스 ssRNA 바이러스의 또 다른 예시적인 속 및 종은 아래 표 1에 제시된다.
[표 1]
Figure pct00001
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일부 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 RNA 분자는 콕사키바이러스, 폴리오 바이러스 및 세네카 밸리 바이러스(SVV)로부터 선택되는 피코나바이러스를 암호화한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 RNA 분자는 콕사키바이러스를 암호화한다. 이 구현예의 일부 측면에서, 재조합 RNA 분자는 콕사키바이러스를 암호화고 서열번호 26의 5' UTR 서열을 포함한다(예를 들어, Brown 등, Complete Genomic Sequencing Shows that Polioviruses and Members of Human Enterovirus Species C Are Closely Related in the Noncapsid Coding Region. Journal of Virology, (2003)77:16, p. 8973-8984. GenBank 수탁 번호 AF546702 참조). 이러한 구현예에서, 서열번호 26의 5' UTR 서열은 다른 이전에 기술된 5' UTR 서열(예를 들어, Newcombe 등, Cellular receptor interactions of C-cluster human group A coxsackieviruses Journal of General Virology(2003), 84, 3041-3050. GenBank 수탁번호 AF465515 참조)과 비교하여 기능성 콕사키바이러스의 생산을 예기치 않게 증가시킨다. 이 구현예의 일부 측면에서, 재조합 RNA 분자는 콕사키바이러스를 암호화하고 서열번호 27의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 RNA 바이러스 게놈은 콕사키바이러스를 암호화한다. 일부 구현예에서, 콕사키바이러스는 CVB3, CVA21 및 CVA9로부터 선택된다. 예시적인 콕사키바이러스의 핵산 서열은 GenBank 참조 번호 M33854.1 (CVB3), GenBank 참조 번호 KT161266.1(CVA21), 및 GenBank 참조 번호 D00627.1(CVA9)에 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호 27을 포함하는 변형된 CVA21 바이러스를 암호화한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 RNA 바이러스 게놈은 세네카 밸리 바이러스(SVV)를 암호화한다. 일부 구현예에서, SVV는 야생형 SVV(예컨대, SVV-A, 서열번호 1, GenBank 참조 번호 MF893200.1) 또는 돌연변이 SVV(예컨대, SVV-177A - 서열번호 2, SVV-IR2 - 서열번호 3, 또는 SVV-S177A-IR2 - 서열번호 4)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 RNA 바이러스 게놈은 키메라 피코나바이러스를 암호화한다(예를 들어, 제1 피코나바이러스 유래의 캡시드 단백질 또는 IRES와 같은 하나의 부위, 및 제1 피코나바이러스에서 유래되는 다른 부위, 및 제2 피코나바이러스 유래의 프로테아제 또는 중합효소와 같은 비구조 유전자인 다른 부위를 포함하는 바이러스를 암호화함). 일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 RNA 바이러스 게놈은 키메라 SVV를 암호화한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 RNA 바이러스 게놈은 키메라 콕사키바이러스를 암호화한다.
일부 구현예에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 마이크로RNA(miRNA) 표적 서열 (miR-TS) 카세트를 포함하고, 여기서 miR-TS 카세트는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 여기서 세포 중의 하나 이상의 상응하는 miRNA의 발현은 그 세포에서 암호화된 종양용해성 바이러스의 복제를 억제한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 miRNA는 miR-124, miR-1, miR-143, miR-128, miR-219, miR-219a, miR-122, miR-204, miR-217, miR-137 및 miR-126으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, miR-TS 카세트는 miR-124 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-1 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-143 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, miR-TS 카세트는 miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-219a 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-122 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, miR-TS 카세트는 miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-204 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-219 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, miR-TS 카세트는 miR-217 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-137 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-126 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다.
일부 구현예에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 5' 비해독 영역(UTR) 또는 3' UTR에 통합되는 하나 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 하나 이상의 비필수 유전자의 5' 비해독 영역(UTR) 또는 3' UTR에 통합되는 하나 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 5' 또는 3'에 통합되는 하나 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다.
일부 구현예에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 페이로드 분자를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 구현예에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 감염성 종양용해성 바이러스의 생산 뿐만 아니라 페이로드 분자의 발현을 유도한다. 이러한 구현예에서, 페이로드 분자의 발현은 종양용해성 바이러스의 치료 효능을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 페이로드 분자는 IL-12(예를 들어, IL-12를 암호화하는 SVV 게놈, 예컨대 서열번호 8), GM-CSF(예를 들어, GMCSF를 암호화하는 SVV 게놈, 예컨대 서열번호 7), CXCL10(예를 들어, CXCL10을 암호화하는 SVV 게놈, 예컨대 서열번호 10), IL-36γ(예를 들어, IL-36γ를 암호화하는 SVV 게놈, 예컨대 서열번호 11), CCL21(예를 들어, CCL21을 암호화하는 SVV 게놈), IL-18(예를 들어, IL-18을 암호화하는 SVV 게놈), IL-2(예를 들어, IL-2를 암호화하는 SVV 게놈), CCL4(예를 들어, CCL4를 암호화하는 SVV 게놈), CCL5(예를 들어, CCL5를 암호화하는 SVV 게놈), 항-CD3-항-FAP BiTE(예를 들어, 항-CD3-항-FAP BiTE를 암호화하는 SVV 게놈, 예컨대 서열번호 9), DLL3에 결합하는 항원 결합 분자, 또는 EpCAM에 결합하는 항원 결합 분자로부터 선택된다. 실시예 23 및 24를 참조한다. 이들 구현예에서 사용하기에 적합한 페이로드 분자의 유형에 대한 추가 설명은 아래에 제공된다.
재조합 RNA 바이러스 게놈을 생산하는 방법
일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 RNA 바이러스 게놈은 합성 RNA 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 DNA 벡터 주형을 사용하여 시험관내에서 생산한다. 용어 "벡터"는 다른 핵산 분자를 전달, 암호화 또는 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 본원에 사용된다. 전달된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 삽입된다. 벡터는 세포에서 자율 복제를 유도하는 서열을 포함할 수 있고, 및/또는 숙주 세포 DNA 내로 통합하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 종양용해성 바이러스를 암호화하는 재조합 RNA 분자는 하나 이상의 바이러스 벡터를 사용하여 생산한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 RNA 바이러스 게놈은 재조합 RNA 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 시험관내에서 적합한 숙주 세포 내로 도입(예를 들어, 형질감염, 형질도입, 전기천공 등에 의해)시켜 생산한다. 적합한 숙주 세포는 곤충 및 포유류 세포주를 포함한다. 숙주 세포는 폴리뉴클레오타이드의 발현 및 합성 RNA 바이러스 게놈의 생산을 허용하기에 적절한 양의 시간 동안 배양된다. 합성 RNA 바이러스 게놈은 그 다음 숙주 세포로부터 단리되고 치료용으로 제형화된다(예를 들어, 입자에 캡슐화됨). 3' 및 5' 리보자임을 이용한 RNA 바이러스 게놈의 시험관내 합성의 개략도는 도 34에 제시된다. 동일한 개략도는 다른 조합의 접합부 절단 서열을 사용하여 RNA 바이러스 게놈을 합성하는 데 적용된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 재조합 RNA 분자는 바이러스에 고유한 별개의 5'및 3' 말단을 필요로 한다. 시험관내 T7 RNA 중합효소 또는 포유류 RNA Pol II에 의해 생산된 RNA 전사체는 감염성 RNA 바이러스 생산에 필요한 별개의 고유 단부를 함유하지 않는 포유류 5' 및 3' UTR을 함유한다. 예를 들어, T7 RNA 중합효소는 전사를 개시하기 위해 주형 폴리뉴클레오타이드의 5' 단부에 구아노신 잔기를 필요로 한다. 그러나, SVV는 이의 5' 단부가 우리딘 잔기로 시작한다. 즉, 기능적인 감염성 SVV의 생산에 필요한 고유의 5' SVV 말단을 생성하기 위해서는 SVV 전사체의 시험관내 전사에 필요한 T7 리더(leader) 서열이 제거되어야 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 RNA 바이러스 게놈의 생산에 사용하기에 적합한 폴리뉴클레오타이드는 그 바이러스에 고유한 별개의 5' 및 3' 단부의 생성을 가능하게 하는 또 다른 비-바이러스성 5' 및 3' 서열을 필요로 한다. 이러한 서열은 본원에서 접합부 절단 서열(junctional cleavage sequence, JCS)로 지칭된다. 일부 구현예에서, 접합부 절단 서열은 바이러스 RNA와 포유류 mRNA 서열의 접합부에서 T7 RNA 중합효소 또는 Pol II-암호화된 RNA 전사체를 절단하는 작용을 하여, 그 전사체로부터 비-바이러스 RNA 폴리뉴클레오타이드를 제거하여 바이러스의 내인성 5' 및 3' 별개의 단부는 유지되도록 한다(도 35에 도시된 개략도 참조). 일부 구현예에서, 접합부 절단 서열은 합성 바이러스 게놈을 암호화하는 DNA 플라스미드의 선형화 동안 적절한 단부를 생성하는 작용을 한다(예를 들어, 플라스미드 주형의 선형화 시, 합성 RNA 게놈의 시험관내 전사 전에, 적절한 3' 단부를 생산하기 위한 3' 제한 효소 인식 서열의 사용).
접합부 절단 서열의 성질 및 바이러스 게놈 전사체로부터 비-바이러스 RNA의 제거는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 접합부 절단 서열은 RNA 간섭(RNAi) 분자에 대한 표적이다. 본원에 사용된 "RNA 간섭 분자"는 내인성 유전자 침묵 경로(예를 들어, Dicer 및 RNA 유도 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC))를 통해 표적 mRNA 서열의 분해를 매개하는 RNA 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 예시적인 RNA 간섭제는 마이크로RNA(miRNA), 인공 miRNA(amiRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 작은 간섭 RNA(siRNA)를 포함한다. 또한, 현재 본 기술분야에 공지되어 있거나 미래에 정의될 특정 부위에서 RNA 전사체를 절단하기 위한 임의의 시스템을 사용하여 바이러스 고유의 별개의 단부를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, RNAi 분자는 miRNA이다. miRNA는 표적 mRNA 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 약 18 내지 25개 길이의 뉴클레오타이드인 자연 발생의 작은 비암호(non-coding) RNA 분자를 지칭한다. 동물에서 miRNA를 위한 유전자는 일차 miRNA(pri-miRNA)로 전사되고, 이는 이중 가닥이며 줄기-루프 구조를 형성한다. pri-miRNA는 그 다음 클래스 2 RNase III, Drosha, 및 마이크로프로세서 서브유닛, DCGR8을 포함하는 마이크로프로세서 복합체에 의해 핵에서 절단되어, 70 내지 100개의 뉴클레오타이드 전구체(precusor) miRNA(pre-miRNA)를 형성한다. pre-miRNA는 헤어핀 구조를 형성하고, 세포질로 수송되어, 여기서 RNase III 효소인 Dicer에 의해 약 18 내지 25개 뉴클레오타이드의 miRNA 이중체(duplex)로 프로세싱된다. 이중체의 어느 한 가닥이 기능적인 miRNA로서 잠재적으로 작용할 수 있지만, 전형적으로 miRNA의 한 가닥은 분해되고 하나의 가닥만이 Argonaute(AGO) 뉴클레아제 상에 로드(load)되어 이펙터 RNA 유도된 침묵 복합체(RISC)를 생성하고, 여기서 miRNA와 이의 mRNA 표적은 상호작용한다(Wahid 등, 1803:11, 2010, 1231-1243). 일부 구현예에서, 5' 및/또는 3' 접합부 절단 서열은 miRNA 표적 서열이다.
일부 구현예에서, RNAi 분자는 Pol II 전사체에 내장된 합성 miRNA로부터 유래되는 인공 miRNA(amiRNA)이다(예를 들어, Liu 등, Nucleic Acids Res(2008) 36:9; 2811-2834; Zeng 등, Molecular Cell(2002), 9; 1327-1333; Fellman 등, Cell Reports(2013) 5; 1704-1713 참조). 일부 구현예에서, 5' 및/또는 3' 접합부 절단 서열은 amiRNA 표적 서열이다.
일부 구현예에서, RNAi 분자는 siRNA 분자이다. siRNA는 전형적으로 길이가 약 21 내지 23개의 뉴클레오타이드인 이중 가닥 RNA 분자를 지칭한다. 이중체 siRNA 분자는 RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)라고 불리는 다중 단백질 복합체와 결합하여 세포질에서 프로세싱되고, 그 동안 "패신저" 센스 가닥이 이중체로부터 효소적으로 절단된다. 활성화된 RISC에 함유된 안티센스 "가이드" 가닥은 그 다음 RISC를 서열 상보성에 의거하여 상응하는 mRNA로 유도하고, AGO 뉴클레아제는 표적 mRNA를 절단하여 특정 유전자 침묵을 초래한다. 일부 구현예에서, siRNA 분자는 shRNA 분자에서 유래된다. shRNA는 줄기-루프 구조를 형성하는 약 50 내지 70개의 뉴클레오타이드 길이의 단일 가닥 인공 RNA 분자이다. 세포에서 shRNA의 발현은 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 의해 shRNA를 암호화하는 DNA 폴리뉴클레오타이드를 도입시킴으로써 달성된다. shRNA는 그 다음 pre-miRNA의 줄기-루프 구조를 모방한 생성물로 전사되고, 핵 추출(export) 후 Dicer에 의해 헤어핀이 프로세싱되어 이중체 siRNA 분자를 형성하고, 이는 그 다음 RISC에 의해 추가 프로세싱되어 표적-유전자 침묵을 매개한다. 일부 구현예에서, 5' 및/또는 3' 접합부 절단 서열은 siRNA 표적 서열이다.
일부 구현예에서, 접합부 절단 서열은 가이드 RNA(gRNA) 표적 서열이다. 이러한 구현예에서, gRNA는 정확한 접합 부위에서 바이러스 게놈 전사체의 절단을 매개하기 위해 RNase 활성을 갖는 Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas13)에 의해 설계 및 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 및/또는 3' 접합부 절단 서열은 gRNA 표적 서열이다.
일부 구현예에서, 접합부 절단 서열은 pri-miRNA-암호화 서열이다. 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 재조합 RNA 분자)의 전사 시, 이 서열은 pri-miRNA 줄기-루프 구조를 형성하고, 이는 그 다음 정확한 접합부 부위에서 전사체를 절단하는 Drosha에 의해 핵에서 절단된다. 일부 구현예에서, 5' 및/또는 3' 접합부 절단 서열은 pri-mRNA 표적 서열이다.
일부 구현예에서, 접합부 절단 서열은 엔도리보뉴클레아제인 RNAseH에 의한 절단을 용이하게 하는 프라이머 결합 서열이다. 이러한 구현예에서, RNAseH 효소와 함께 5' 및/또는 3' 접합부 절단 서열에 어닐링하는 프라이머가 시험관내 반응에 첨가된다. RNAseH는 DNA에 혼성화하는 RNA의 포스포디에스테르 결합을 특이적으로 가수분해하여, 정확한 접합부 절단 서열에서 합성 RNA 게놈 중간체를 절단할 수 있어, 필요한 5' 및 3' 고유의 단부를 생산한다.
일부 구현예에서, 접합부 절단 서열은 제한 효소 인식 부위이고 T7 RNA 중합효소를 사용한 플라스미드 주형 유출(runoff) RNA 합성의 선형화 동안 바이러스 전사체의 별개의 단부를 생성시킨다. 일부 구현예에서, 접합부 절단 서열은 IIS형 제한 효소 인식 부위이다. IIS형 제한 효소는 비대칭 DNA 서열을 인식하여, 이러한 인식 서열 외측의 일정 거리, 일반적으로 1 내지 20개 뉴클레오타이드 내에서 절단하는 특정 효소 그룹을 포함한다. 예시적인 IIS형 제한 효소는 AcuI, AlwI, BaeI, BbsI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BsaXI, BseRI, BsgI, BsmAI, BsmBi, BsmFI, BsmBi, BsmFI, BspCNI, BspMI, BspQI, BsrDI, BsrI, BtgZI, BtsCI, BstI, CaspCI, EarI, EciI, Esp3I, FauI, FokI, HgaI, HphI, HpyAV, MbolI, MlyI, MmeI, MnlL, NmeAIII, PleI, SapI, 및 SfaNI를 포함한다. 이러한 IIS형 제한 효소에 대한 인식 서열은 본 기술분야에 공지되어 있다. neb.com/tools-and-resources/selection-charts/type-iis-restriction-enzymes에 있는 New England Biolabs 웹사이트를 참조한다. 일부 구현예에서, 접합부 절단 서열은 SapI 제한 효소 인식 부위이다.
일부 구현예에서, 접합부 절단 서열은 리보자임 암호화 서열이고 합성 RNA 게놈 중간체의 자가 절단을 매개하여 최종 합성 바이러스 RNA 게놈에 필요한 고유한 별개의 5' 및 3' 단부를 생산하고, 이어서 감염성 RNA 바이러스를 생산한다. 예시적인 리보자임은 해머헤드 리보자임(예를 들어, 도 23에 도시된 해머헤드 리보자임), Varkud 위성(VS) 리보자임, 헤어핀 리보자임, GIR1 분기성 리보자임, glmS 리보자임, 트위스터 리보자임, 트위스터 시스터 리보자임, 피스톨 리보자임(예를 들어, 도 24에 도시된 피스톨 1 및 피스톨 2), 도끼 리보자임(hatchet ribozyme) 및 델타 간염 바이러스 리보자임을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 및/또는 3' 접합부 절단 서열은 리보자임 암호화 서열이다.
일부 구현예에서, 접합부 절단 서열은 "압타자임(aptazyme)"으로 지칭되는 리간드-유도성 자가 절단 리보자임을 암호화하는 서열이다. 압타자임은 리간드에 특이적인 통합 압타머 도메인을 함유하는 리보자임 서열이다. 압타머 도메인에 대한 리간드 결합은 리보자임의 효소 활성의 활성화를 촉발하여 RNA 전사체를 절단시킨다. 예시적인 압타자임은 테오필린-의존성 압타자임(예를 들어, Auslander 등, Mol BioSyst. (2010) 6, 807-814에 기술된 테오필린-의존성 압타머에 연결된 해머헤드 리보자임), 테트라사이클린-의존성 압타자임(예를 들어, Zhong 등, eLife 2016; 5:e18858 DOI: 10.7554/eLife.18858; Win and Smolke, PNAS (2007) 104; 14283-14288; Whittmann and Suess, Mol Biosyt(2011) 7; 2419-2427; Xiao 등, Chem & Biol(2008) 15; 125-1137; 및 Beilstein 등, ACS Syn Biol(2015) 4; 526-534에 기술된 Tet-의존성 압타머에 연결된 해머헤드 리보자임), 구아닌-의존성 압타자임(예를 들어, Nomura 등, Chem Commun., (2012) 48(57); 7215-7217]에 기술된 구아닌 의존성 압타머에 연결된 해머헤드 리보자임)을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 및/또는 3' 접합부 절단 서열은 압타자임 암호화 서열이다.
일부 구현예에서, 접합부 절단 서열은 RNAi 분자(예를 들어, siRNA 분자, shRNA 분자, miRNA 분자 또는 amiRNA 분자), gRNA 분자, 또는 RNAseH 프라이머에 대한 표적 서열이다. 이러한 구현예에서, 접합부 절단 서열은 RNAi 분자, gRNA 분자, 또는 프라이머 분자의 서열에 적어도 부분적으로 상보적이다. 서열 동일성 백분율 및 상보성 백분율을 비교 및 결정하기 위한 서열 정렬 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은, 예를 들어, Needleman 및 Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson 및 Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 이러한 알고리즘의 컴퓨터 실행에 의해(위스콘신 매디슨 사이언스 드라이브 575에 소재하는 Genetics Computer Group의 위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 수동 정렬 및 육안 조사에 의해(예를 들어, Brent 등, (2003) Current Protocols in Molecular Biology 참조), Altschul 등,(1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; 및 Altschul 등, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410에 각각 기술된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘을 포함하는 본 기술분야에 알려진 알고리즘의 사용에 의해 수행될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information을 통해 공개적으로 입수용이하다.
일부 구현예에서, 5' 접합부 절단 서열 및 3' 접합부 절단 서열은 동일한 그룹으로부터 유래된다(예를 들어, 둘 모두 RNAi 표적 서열, 둘 모두 리보자임 암호화 서열 등). 예를 들어, 일부 구현예에서, 접합부 절단 서열은 RNAi 표적 서열 (예를 들어, siRNA, shRNA, amiRNA 또는 miRNA 표적 서열)이고 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 재조합 RNA 분자)의 5' 및 3' 말단에 통합된다. 이러한 구현예에서, 5' 및 3' RNAi 표적 서열은 동일(즉, 동일한 siRNA, amiRNA 또는 miRNA에 대한 표적)하거나 또는 상이(즉, 5' 서열은 하나의 siRNA, shmiRNA 또는 miRNA에 대한 표적이고, 3' 서열은 다른 siRNA, amiRNA 또는 miRNA의 표적임)하다. 일부 구현예에서, 접합부 절단 서열은 가이드 RNA 표적 서열이고 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 재조합 RNA 분자)의 5' 및 3' 단부에 통합된다. 이러한 구현예에서, 5' 및 3' gRNA 표적 서열은 동일(즉, 동일한 gRNA에 대한 표적)하거나, 또는 상이(즉, 5' 서열은 하나의 gRNA에 대한 표적이고 3' 서열은 다른 gRNA에 대한 표적임)할 수 있다. 일부 구현예에서, 접합부 절단 서열은 pri-mRNA-암호화 서열이고 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 재조합 RNA 분자)의 5' 및 3' 단부에 통합된다. 일부 구현예에서, 접합부 절단 서열은 리보자임 암호화 서열이고 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 재조합 RNA 분자)의 5' 및 3' 바로 옆에 통합된다.
일부 구현예에서, 5' 접합부 절단 서열 및 3' 접합부 절단 서열은 동일한 그룹에서 유래하지만 상이한 변이체 또는 유형이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 5' 및 3' 접합부 절단 서열은 RNAi 분자에 대한 표적 서열일 수 있으며, 여기서 5' 접합부 절단 서열은 siRNA 표적 서열이고 3' 접합부 절단 서열은 miRNA 표적 서열이다(또는 그 반대). 일부 구현예에서, 5' 및 3' 접합부 절단 서열은 리보자임 암호화 서열일 수 있으며, 여기서 5' 접합부 절단 서열은 해머헤드 리보자임 암호화 서열이고 3' 접합부 절단 서열은 델타 간염 바이러스 리보자임 암호화 서열이다.
일부 구현예에서, 5' 접합부 절단 서열 및 3' 접합부 절단 서열은 상이한 유형이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 5' 접합부 절단 서열은 RNAi 표적 서열(예를 들어, siRNA, amiRNA 또는 miRNA 표적 서열)이고 3' 접합부 절단 서열은 리보자임 서열, 압타자임 서열, pri-miRNA 서열 또는 gRNA 표적 서열이다. 일부 구현예에서, 5' 접합부 절단 서열은 리보자임 서열이고 3' 접합부 절단 서열은 RNAi 표적 서열(예를 들어, siRNA, amiRNA 또는 miRNA 표적 서열), 압타자임 서열, pri-miRNA-암호화 서열, 또는 gRNA 표적 서열이다. 일부 구현예에서, 5' 접합부 절단 서열은 압타자임 서열이고 3' 접합부 절단 서열은 RNAi 표적 서열(예를 들어, siRNA, amiRNA 또는 miRNA 표적 서열), 리보자임 서열, pri-miRNA 서열, 또는 gRNA 표적 서열이다. 일부 구현예에서, 5' 접합부 절단 서열은 pri-miRNA 서열이고 3' 접합부 절단 서열은 RNAi 표적 서열(예를 들어, siRNA, amiRNA 또는 miRNA 표적 서열), 리보자임 서열, 압타자임 서열, 또는 gRNA 표적 서열이다. 일부 구현예에서, 5' 접합부 절단 서열은 gRNA 표적 서열이고 3' 접합부 절단 서열은 RNAi 표적 서열(예를 들어, siRNA, amiRNA 또는 miRNA 표적 서열), 리보자임 서열, pri-miRNA 서열 또는 압타자임 서열이다.
합성 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 상대적인 접합부 절단 서열의 예시적인 배열은 하기 표 A 및 B에 제시된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 RNA 바이러스 게놈은 시험관내 RNA 전사에 의해 시험관내에서 생산된다(도 35의 개략도 참조). 합성 RNA 바이러스 게놈은 이후 정제되고 치료용으로 제형화된다(예를 들어, 지질 나노입자로 캡슐화됨). 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3'로 다음을 포함한다: (i) 프로모터 서열(예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 리보자임 서열; (iii) 합성 RNA 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3' 리보자임 서열. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3'로 다음을 포함한다: (i) 프로모터 서열(예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 해머헤드 리보자임 서열(예를 들어, 야생형 HHR 또는 변형된 HHR, 예컨대, 도 23에 제공된 것); (iii) 합성 RNA 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3' 델타 간염 바이러스 리보자임 서열.
일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3'로 다음을 포함한다: (i) 프로모터 서열(예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 해머헤드 리보자임 서열(예를 들어, 야생형 HHR 또는 변형된 HHR, 예컨대, 도 23에 제공된 것); (iii) 야생형 SVV-A 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3' 델타 간염 바이러스 리보자임 서열. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 12와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 12를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3'로 다음을 포함한다: (i) 프로모터 서열(예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 해머헤드 리보자임 서열(예를 들어, 야생형 HHR 또는 변형된 HHR, 예컨대, 도 23에 제공된 것); (iii) SVVA-S177A 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3' 델타 간염 바이러스 리보자임 서열. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 13과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 13을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3'로 다음을 포함한다: (i) 프로모터 서열(예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 해머헤드 리보자임 서열(예를 들어, 야생형 HHR 또는 변형된 HHR, 예컨대, 도 23에 제공된 것); (iii) SVVA-IR2 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3' 델타 간염 바이러스 리보자임 서열. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3'로 다음을 포함한다: (i) 프로모터 서열(예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 해머헤드 리보자임 서열(예를 들어, 야생형 HHR 또는 변형된 HHR, 예컨대, 도 23에 제공된 것); (iii) SVVA-IR2-S77A 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3'델타 간염 바이러스 리보자임 서열.
일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3'로 다음을 포함한다: (i) 프로모터 서열(예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 리보자임 서열; (iii) 합성 RNA 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3' 제한 효소 인식 부위. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3'로 다음을 포함한다: (i) 프로모터 서열(예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 해머헤드 리보자임 서열(예를 들어, 야생형 HHR 또는 변형된 HHR, 예컨대 도 23에 제공된 것); (iii) 합성 RNA 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3' SapI 제한 효소 인식 부위.
일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3'로 다음을 포함한다: (i) 프로모터 서열(예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 해머헤드 리보자임 서열 (예를 들어, 야생형 HHR 또는 변형된 HHR, 예컨대 도 23에 제공된 것); (iii) 야생형 SVVA 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3' SapI 제한 효소 인식 부위. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 18에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 18을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3'로 다음을 포함한다: (i) 프로모터 서열(예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 해머헤드 리보자임 서열(예를 들어, 야생형 HHR 또는 변형된 HHR, 예컨대 도 23에 제공된 것); (iii) SVVA-S177A 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3' SapI 제한 효소 인식 부위. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3'로 다음을 포함한다: (i) 프로모터 서열(예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 해머헤드 리보자임 서열(예를 들어, 야생형 HHR 또는 변형된 HHR, 예컨대 도 23에 제공된 것); (iii) SVVA-IR2 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3' SapI 제한 효소 인식 부위. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3'로 다음을 포함한다: (i) 프로모터 서열(예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 해머헤드 리보자임 서열(예를 들어, 야생형 HHR 또는 변형된 HHR, 예컨대 도 23에 제공된 것); (iii) SVVA-S177A-IR2 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3' SapI 제한 효소 인식 부위.
일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3'로 다음을 포함한다: (i) 프로모터 서열(예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 피스톨 리보자임 서열(예를 들어, 도 24에 도시된 피스톨 1 또는 피스톨 2 리보자임 서열); (iii) 합성 RNA 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3' SapI 제한 효소 인식 부위. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3'로 다음을 포함한다: (i) 프로모터 서열(예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 피스톨 1 리보자임 서열; (iii) 야생형 SVV 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3' SapI 제한 효소 인식 부위. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 14를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3'로 다음을 포함한다: (i) 프로모터 서열(예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 피스톨 2 리보자임 서열; (iii) 야생형 SVV 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3' SapI 제한 효소 인식 부위. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 15와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 15를 포함하거나 이로 구성된다.
일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3'로 다음을 포함한다: (i) 프로모터 서열(예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 피스톨 1 리보자임 서열; (iii) SVV-S177A 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3' SapI 제한 효소 인식 부위. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3'로 다음을 포함한다: (i) 프로모터 서열 (예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 피스톨 1 리보자임 서열; (iii) SVV-IR2 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3' SapI 제한 효소 인식 부위. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 16과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 16을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3'로 다음을 포함한다: (i) 프로모터 서열(예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 피스톨 1 리보자임 서열; (iii) SVV-IR2-S177A 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3' SapI 제한 효소 인식 부위. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 17과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 17을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 구현예에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3'로 다음을 포함한다: (i) 프로모터 서열(예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' RNAseH 프라이머 결합 부위; (iii) 합성 RNA 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3' 제한 효소 인식 부위. 일부 구현예에서, DNA 벡터는 5'에서 3'로 다음을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: (i) 프로모터 서열(예를 들어, T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' RNAseH 프라이머 결합 부위; (iii) 합성 RNA 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iv) 3' SapI 제한 효소 인식 부위.
합성 RNA 게놈을 포함하는 입자
일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 RNA 게놈은 "입자"에 캡슐화된다. 본원에 사용된 바와 같이, 입자는 리포좀, 리포플렉스, 나노입자, 나노캡슐, 마이크로입자, 마이크로스피어, 지질 입자, 엑소좀, 소포 등과 같은 물질의 비-조직 유래의 조성물을 지칭한다. 특정 구현예에서, 입자는 비-단백질성 및 비-면역원성이다. 이러한 구현예에서, 본원에 기술된 합성 RNA 게놈의 캡슐화는 전신 항바이러스 면역 반응의 유도없이 바이러스 게놈의 전달을 허용하고 항바이러스 항체를 중화시키는 효과를 완화시킨다. 또한, 본원에 기재된 합성 RNA 게놈의 캡슐화는 게놈을 분해로부터 보호하고 표적 숙주 세포로의 도입을 용이하게 한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 합성 RNA 게놈을 포함하는 나노입자를 제공한다. 일부 구현예에서, 나노입자는 지질 나노입자이다. 일부 구현예에서, 나노입자는 페이로드 분자를 암호화하는 제2 RNA 분자를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 입자는 대상체에서 생분해성이다. 이러한 구현예에서, 입자의 다회 용량은 대상체에 입자의 축적없이 대상체에게 투여될 수 있다. 적합한 입자의 예에는 폴리스티렌 입자, 폴리(락트-코-글리콜산) PLGA 입자, 폴리펩타이드계 양이온성 중합체 입자, 사이클로덱스트린 입자, 키토산 입자, 지질계 입자, 폴리(β-아미노 에스테르) 입자, 저분자량 폴리에틸렌이민 입자, 폴리포스포에스테르 입자, 이황화 가교 중합체 입자, 폴리아미도아민 입자, 폴리에틸렌이민(PEI) 입자 및 PLURIONICS 안정화된 폴리프로필렌 설파이드 입자를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 무기 입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 무기 입자는 금 나노입자(GNP), 금 나노막대(GNR), 자기 나노입자(MNP), 자기 나노튜브(MNT), 탄소 나노혼(CNH), 탄소 풀러렌, 탄소 나노튜브(CNT), 인산칼슘 나노입자(CPNP), 중간다공성(mesoporous) 실리카 나노입자(MSN), 실리카 나노튜브(SNT), 또는 성상의 중공 실리카 나노입자(SHNP)이다.
바람직하게는, 본원에 기재된 입자는 용해도를 향상시키고, 생체내 응집에 의해 야기되는 가능한 합병증을 방지하고, 세포흡수작용(pinocytosis)을 용이하게 하기 위해 나노스코픽(nanoscopic) 크기이다. 일부 구현예에서, 입자는 약 1000nm 미만의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 입자는 약 500nm 미만의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 입자는 약 30 내지 약 100nm, 약 50 내지 약 100nm, 또는 약 75 내지 약 100nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 입자는 약 30 내지 약 75nm 또는 약 30 내지 약 50nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 입자는 약 100 내지 약 500nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 입자는 약 200 내지 400nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 입자는 약 350nm의 평균 크기를 갖는다.
엑소좀
일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 RNA 게놈은 엑소좀에 캡슐화된다. 엑소좀은 다소포체와 모세포(parental cell)(예를 들어, 엑소좀이 방출되는 세포, 본원에서 공여자 세포라고도 지칭됨)의 원형질막과의 융합 후 세포외 환경으로 방출되는 식작용 기원의 작은 막 소포이다. 엑소좀의 표면은 모세포의 세포막에서 유래된 지질 이중층을 포함하고 모세포 표면에서 발현되는 막 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 엑소좀은 또한 모세포로부터의 세포기질(cytosol)을 함유할 수 있다. 엑소좀은 상피 세포, B 및 T 림프구, 비만 세포(MC), 및 수지상 세포(DC)를 포함한 많은 상이한 세포 유형에 의해 생성되며, 혈장, 소변, 기관지폐포 세척액, 장 상피 세포, 및 종양 조직에서 식별되었다. 엑소좀의 조성은 이들이 유래되는 모세포 유형에 의존적이기 때문에, "엑소좀 특이적" 단백질은 없다. 그러나, 많은 엑소좀은 모세포에서 엑소좀이 유래되는 세포내 소포와 결합된 단백질(예를 들어, 엔도좀 및 리소좀과 결합되고 및/또는 그에 의해 발현되는 단백질)을 포함한다. 예를 들어, 엑소좀은 주요 조직 적합성 복합체 I 및 II(MHC-I 및 MHC-II), 테트라스파닌(예를 들어, CD63), 여러 열 충격 단백질, 액틴 및 튜불린과 같은 세포골격 성분, 세포내 막 융합에 관여하는 단백질, 세포-세포 상호작용(예를 들어, CD54), 신호 형질도입 단백질, 및 세포기질 효소와 같은 항원 제시 분자가 풍부할 수 있다.
엑소좀은 엑소좀 막과 표적 세포의 원형질막의 융합에 의해 하나의 세포(예를 들어, 모세포)로부터 표적 또는 수용체 세포로 세포 단백질의 전달을 매개할 수 있다. 이와 같이, 엑소좀에 의해 캡슐화된 물질의 변형은 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드와 같은 외인성 제제가 표적 세포에 도입될 수 있는 메커니즘을 제공한다. 하나 이상의 외인성 제제(예를 들어, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드)를 함유하도록 변형된 엑소좀은 본원에서 "변형된 엑소좀"으로 지칭된다. 일부 구현예에서, 변형된 엑소좀은 모세포에 도입된 외인성 제제(예를 들어, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드)의 도입에 의해 생산된다. 이러한 구현예에서, 외인성 핵산은 엑소좀을 생산하는 모세포 내로 도입되어, 모세포로부터 생산된 변형된 엑소좀에 외인성 핵산 자체, 또는 외인성 핵산의 전사체가 통합되어 있다. 외인성 핵산은 본 기술분야에 공지된 수단, 예를 들어 외인성 핵산의 형질도입, 형질감염, 형질전환 및/또는 미세주입에 의해 모세포로 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 엑소좀은 본원에 기재된 합성 RNA 게놈을 엑소좀으로 직접 도입시켜 생산한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 RNA 게놈은 온전한 엑소좀으로 도입된다. "온전한 엑소좀"은 이것이 생산되는 모세포에서 유래되는 단백질 및/또는 유전자 물질을 포함하는 엑소좀을 지칭한다. 온전한 엑소좀을 얻는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, Alvarez-Erviti L. 등, Nat Biotechnol. 2011 Apr; 29(4):34-5; Ohno S, 등, Mol Ther 2013 Jan; 21(l):185-91; 및 EP 특허 공개 번호 2010663 참조).
특정 구현예에서, 합성 RNA 게놈은 빈(empty) 엑소좀으로 도입된다. "빈 엑소좀"은 모세포로부터 유래되는 단백질 및/또는 유전자 물질(예를 들어, DNA 또는 RNA)이 없는 엑소좀을 지칭한다. 빈 엑소좀(예를 들어, 모세포 유래 유전자 물질이 없음)을 생산하는 방법은 UV 노출, 엑소좀에 핵산의 로딩을 매개하는 내인성 단백질의 돌연변이/결실, 뿐만 아니라 엑소좀의 소공을 개방시켜 이 개방 소공을 통해 내인성 유전자 물질이 엑소좀 밖으로 빠져 나가도록 하는 전기천공 및 화학적 처리를 포함하는 것으로서, 본 기술분야에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 빈 엑소좀은 약 9 내지 약 14의 pH를 갖는 수용액으로 처리하여 엑소좀을 개방하여 엑소좀 막을 수득하고, 소포내 성분(예를 들어, 소포내 단백질 및/또는 핵산)을 제거하고,엑소좀 막을 재조립하여 빈 엑소좀을 형성시킴으로써 생산한다. 일부 구현예에서, 소포내 성분(예를 들어, 소포내 단백질 및/또는 핵산)은 초원심분리 또는 밀도 구배 초원심분리에 의해 제거한다. 일부 구현예에서, 막은 초음파 처리, 기계적 진동, 다공성 막을 통한 압출, 전류, 또는 이들 기술 중 하나 이상의 조합에 의해 재조립된다. 특정 구현예에서, 막은 초음파 처리에 의해 재조립된다.
일부 구현예에서, 변형된 엑소좀을 생성하기 위해 온전한 또는 빈 엑소좀에 본원에 기재된 합성 RNA 게놈의 로딩은 시험관내 형질전환, 형질감염 및/또는 미세주입과 같은 통상적인 분자생물학 기술을 사용하여 달성할 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 제제(예를 들어, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드)는 전기천공에 의해 온전한 또는 빈 엑소좀 내로 직접 도입된다. 일부 구현예에서, 외인성 제제(예를 들어, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드)는 리포펙션(예를 들어, 형질감염)에 의해 온전한 또는 빈 엑소좀 내로 직접 도입된다. 본 개시내용에 따른 엑소좀의 생산에 사용하기에 적합한 리포펙션 키트는 본 기술분야에 공지되어 있고 상업적으로 입수 가능하다(예를 들어, Roche의 FuGENE® HD 형질감염 시약 및 Invitrogen의 LIPOFECTAMINETM 2000). 일부 구현예에서, 외인성 제제(예를 들어, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드)는 열 충격을 사용한 형질전환에 의해 온전한 또는 빈 엑소좀 내로 직접 도입된다. 이러한 구현예에서, 모세포로부터 분리된 엑소좀은 엑소좀 막을 투과시키기 위해 Ca2+(CaCl2에서)와 같은 2가 양이온의 존재하에 냉각한다. 엑소좀은 그 다음 외인성 핵산과 함께 항온처리되고, 잠시 열 충격을 준다(예를 들어, 42℃에서 30 내지 120초 동안 항온처리). 특정 구현예에서, 빈 엑소좀에 외인성 제제(예를 들어, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드)의 로딩은 소포내 성분을 제거한 후, 외인성 막과 제제를 혼합 또는 공동항온처리함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 엑소좀 막으로부터 재조립된 변형된 엑소좀은 소포내 공간에 외인성 제제를 포함할 것이다. 엑소좀 캡슐화된 핵산을 생산하는 추가 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 9,889,210; 9,629,929; 및 9,085,778; 국제 PCT 공개 번호 WO 2017/161010 및 WO 2018/039119 참조).
엑소좀은 1차 환자 샘플에서 유래된 세포주, 골수 유래 세포, 및 세포를 포함하는 수많은 상이한 모세포로부터 수득할 수 있다. 모세포로부터 방출된 엑소좀은 본 기술분야에 공지된 수단에 의해 모세포 배양물의 상청액으로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 엑소좀의 물리적 특성은 배지 또는 다른 소스 물질로부터 분리하는데 이용될 수 있으며, 그 예로는 전하(예를 들어, 전기영동 분리), 크기(예를 들어, 여과, 분자 체질 등), 밀도(예를 들어, 정규 원심분리 또는 구배 원심분리), 및 Svedberg 상수(예를 들어, 외력의 존재 또는 부재 하의 침강 등)를 기반으로 한 분리가 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단리는 하나 이상의 생물학적 특성을 기반으로 할 수 있으며, 표면 마커(예를 들어, 침전, 고체 상에 대한 가역적 결합, FACS 분리, 특이적 리간드 결합, 비특이적 리간드 결합 등에 대한 것)를 이용할 수 있는 방법을 포함한다. 엑소좀 표면 단백질의 분석은 CD63과 같은 엑소좀 결합 단백질에 대한 형광 표지된 항체를 사용하는 유세포분석에 의해 결정될 수 있다. 엑소좀을 특성화하기 위한 추가 마커는 국제 PCT 공개 번호 WO 2017/161010에 기재되어 있다. 또 다른 고려된 방법에서, 엑소좀은 또한 PEG-유도 융합 및/또는 초음파 융합을 포함하는 화학적 및/또는 물리적 방법을 사용하여 융합될 수도 있다.
일부 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 엑소좀을 분리할 수 있다. 일부 구현예에서, 엑소좀은 크로마토그래피 분리 후에, 본 기술분야에 일반적으로 알려져 있는 바와 같이 원심분리 기술(하나 이상의 크로마토그래피 분획의)에 의해 추가로 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 엑소좀의 단리는 이전에 기재된 차등 원심분리(Raposo, G. 등, J. Exp. Med. 183, 1161-1172 (1996)), 초원심분리, 크기 기반의 막 여과, 농축, 및/또는 속도 침강 원심분리를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 방법의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 엑소좀 막은 인지질, 당지질, 지방산, 스핑고지질, 포스포글리세라이드, 스테롤, 콜레스테롤 및 포스파티딜세린 중 하나 이상을 포함한다. 또한, 막은 하나 이상의 폴리펩타이드 및 하나 이상의 다당류, 예컨대 글리칸을 포함할 수 있다. 예시적인 엑소좀의 막 조성 및 하나 이상의 막 성분의 상대적인 양을 변경시키는 방법은 국제 PCT 공개 번호 WO 2018/039119에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 입자는 엑소좀이고 약 30 내지 약 100nm, 약 30 내지 약 200nm, 또는 약 30 내지 약 500nm의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 입자는 엑소좀이고 약 10nm 내지 약 100nm, 약 20nm 내지 약 100nm, 약 30nm 내지 약 100nm, 약 40nm 내지 약 100nm, 약 50nm 내지 약 100nm, 약 60nm 내지 약 100nm, 약 70nm 내지 약 100nm, 약 80nm 내지 약 100nm, 약 90nm 내지 약 100nm, 약 100nm 내지 약 200nm, 약 100nm 내지 약 150nm, 약 150nm 내지 약 200nm, 약 100nm 내지 약 250nm, 약 250nm 내지 약 500nm, 또는 약 10nm 내지 약 1000nm의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 입자는 엑소좀이고 약 20nm 내지 300nm, 약 40nm 내지 200nm, 약 20nm 내지 250nm, 약 30nm 내지 150nm, 또는 약 30nm 내지 100nm의 직경을 갖는다.
지질 나노입자
특정 구현예에서, 본원에 기재된 합성 RNA 바이러스 게놈은 지질 나노입자 (LNP)에 캡슐화된다. 특정 구현예에서, LNP는 하나 이상의 지질, 예컨대, 트리글리세라이드(예를 들어, 트리스테아린), 디글리세라이드(예를 들어, 글리세롤 바헤네이트), 모노글리세라이드(예를 들어, 글리세롤 모노스테아레이트), 지방산(예를 들어, 스테아르산), 스테로이드(예를 들어, 콜레스테롤), 및 왁스(예를 들어, 세틸 팔미테이트)를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 하나 이상의 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 하나 이상의 양이온성 지질, 콜레스테롤 및 하나 이상의 중성 지질을 포함한다.
양이온성 지질은 생리학적 pH와 같은 선택된 pH에서 최종(net) 양전하를 운반하는 임의의 다수의 지질 종을 지칭한다. 이러한 지질은 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA), 디옥타데실디메틸암모늄(DODMA), 디스테아릴디메틸암모늄(DSDMA), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC); N-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB); N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP); 3-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일)콜레스테롤(DC-Chol), 및 N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 생리학적 pH 아래에서 양전하를 갖는 양이온성 지질은 DODAP, DODMA, 및 DMDMA를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 C18 알킬 사슬, 헤드 기와 알킬 사슬 사이에 에테르 결합, 및 0 내지 3개의 이중 결합을 포함한다. 이러한 지질은, 예를 들어, DSDMA, DLinDMA, DLenDMA, 및 DODMA를 포함한다. 양이온성 지질은 에테르 결합 및 pH 적정가능한 헤드 기를 포함할 수 있다. 이러한 지질은, 예를 들어, DODMA를 포함한다. 또 다른 양이온성 지질은 본원에 참고로 포함된, 미국 특허 7,745,651; 5,208,036; 5,264,618; 5,279,833; 5,283,185; 5,753,613; 및 5,785,992에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 양성자화가능한 3차 아민 헤드 기를 포함한다. 이러한 지질은 본원에서 이온화가능한 지질이라고 지칭된다. 이온화가능한 지질은 이온화가능한 아민 헤드 기를 포함하고 전형적으로 약 7 미만의 pKa를 포함하는 지질 종을 지칭한다. 따라서, 산성 pH 환경을 갖는 환경에서, 이온화가능한 아민 헤드 기는 양성자화되어, 이온화가능한 지질이 음전하를 띤 분자(예를 들어, 본원에 기재된 재조합 폴리뉴클레오타이드와 같은 핵산)와 우선적으로 상호작용하여, 나노입자 조립 및 캡슐화를 용이하게 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 지질 나노입자 내로 핵산 로딩을 증가시킬 수 있다. pH가 약 7보다 큰 환경(예를 들어, 약 7.4의 생리학적 pH)에서, 이온화가능한 지질은 중성 전하를 포함한다. 이온화가능한 지질을 포함하는 입자가 엔도솜의 낮은 pH 환경(예를 들어, pH < 7)에 흡수되면, 이온화가능한 지질은 다시 양성자화되고 음이온성 엔도 좀 막과 결합하여, 입자에 의해 캡슐화된 내용물의 방출을 촉진한다. 일부 구현예에서, LNP는 이온화가능한 지질, 예를 들어 7.SS-절단가능하고 pH-반응성인 지질 유사 물질(예를 들어, COATSOME® SS-시리즈)을 포함한다. 본 개시내용의 제형 및 방법에 적합한 양이온성 또는 이온화가능한 지질의 또 다른 예는, 예를 들어, WO2018089540A1, WO2017049245A2, US20150174261, US2014308304, US2015376115, WO201/199952 및 WO2016/176330에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 DLinDMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA(MC3), COATSOME® SS-LC(이전 명칭: SS-18/4PE-13), COATSOME® SS-EC(이전 명칭: SS-33/4PE-15), COATSOME® SS-OC, COATSOME® SS-OP, 디((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L-319) 또는 N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP)로부터 선택되는 이온화가능한 지질이다. 일부 구현예에서, 양이온성 이온화가능한 지질은 DLin-MC3-DMA(MC3)이다. 일부 구현예에서, 양이온성 이온화가능한 지질은 COATSOME® SS-LC이다. 일부 구현예에서, 양이온성 이온화가능한 지질은 COATSOME® SS-EC이다. 일부 구현예에서, 양이온성 이온화가능한 지질은 COATSOME® SS-OC이다. 일부 구현예에서, 양이온성 이온화가능한 지질은 COATSOME® SS-OP이다. 일부 구현예에서, 양이온성 이온화가능한 지질은 L-319이다. 일부 구현예에서, 양이온성 이온화가능한 지질은 DOTAP이다.
일부 구현예에서, LNP는 하나 이상의 비-양이온성 헬퍼 지질(중성 지질)을 포함한다. 예시적인 중성 헬퍼 지질은 (1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민)(DLPE), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DiPPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE), (1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)( DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 세라마이드, 스핑고미엘린 및 콜레스테롤을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 헬퍼 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); 및 콜레스테롤로부터 선택된다. 일부 구현예에서, LNP는 DSPC를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DOPC를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DLPE를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DOPE를 포함한다.
본원에 기재된 리포좀 조성물 및 약제학적 조성물에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-변형된 인지질 및 유도체화된 지질, 예컨대 유도체화된 세라마이드(PEG-CER), 예로서, N-옥타노일-스핑고신-l-[숙시닐(메톡시폴리에틸렌글리콜)-2000](C8 PEG-2000 세라마이드)의 사용 및 포함도 고려되며, 바람직하게는 본원에 개시된 하나 이상의 화합물 및 지질과의 조합도 고려된다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 C6-C20 알킬을 포함하는 지질에 공유 부착된 5kDa 이하의 길이인 폴리(에틸렌)글리콜 사슬을 포함하는 하나 이상의 PEG-변형된 지질을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, LNP는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리(에틸렌글리콜)(DSPE-PEG) 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)] (DSPE-PEG-아민)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-5000](DSPE-PEG5K); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DPG-PEG2K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DSG-PEG5K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DSG-PEG2K); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DMG-PEG5K); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DMG-PEG2K)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DSPE-PEG5K를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DPG-PEG2K를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DSG-PEG2K를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DMG-PEG2K를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DSG-PEG5K를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DMG-PEG5K를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, PEG-변형된 지질은 지질 나노입자 중 총 지질 함량의 약 0.1% 내지 약 1%를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG-변형된 지질은 지질 나노입자 중 총 지질 함량의 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1.0%, 약 1.5%, 약 2.0%, 약 2.5% 또는 약 3.0%를 포함한다.
일부 구현예에서, 지질은 절단가능한 PEG 지질에 의해 변형된다. 절단가능한 결합을 가진 PEG 유도체의 예에는 펩타이드 결합(Kulkarni 등 (2014). Mmp-9 responsive PEG cleavable nanovesicles for efficient delivery of chemotherapeutics to pancreatic cancer. Mol Pharmaceutics 11:2390-9; Lin　등 (2015).　Drug/dye-loaded, multifunctional peg-chitosan-iron oxide nanocomposites for methotraxate synergistically self-targeted cancer therapy and dual model imaging. ACS Appl Mater Interfaces 7:11908-20), 이황화물 핵심(Yan　등　(2014).　A method to accelerate the gelation of disulfide-crosslinked hydrogels. Chin J Polym Sci 33:118-27; Wu　& Yan　(2015).　Copper nanopowder catalyzed cross-coupling of diaryl disulfides with aryl iodides in PEG-400. Synlett 26:537-42), 비닐 에테르 결합, 하이드라존 결합(Kelly　등 (2016).　Polymeric prodrug combination to exploit the therapeutic potential of antimicrobial peptides against cancer cells. Org Biomol Chem 14:9278-86.), 및 에스테르 결합(Xu　등 (2008).　Esterase-catalyzed dePEGylation of pH-sensitive vesicles modified with cleavable PEG-lipid derivatives. J Control Release 130:238-45)에 의해 변형된 것을 포함한다. 또한, Fang 등, (2017)　Cleaveable PEGylation: a strategy for overcoming the "PEG dilemma" in efficient drug delivery. Drug Delivery 24:2, 22-32도 참조한다.
일부 구현예에서, PEG 지질은 활성화된 PEG 지질이다. 예시적인 활성화된 PEG 지질은 PEG-NH2, PEG-MAL, PEG-NHS 및 PEG-ALD를 포함한다. 이러한 작용기화된 PEG 지질은 입자를 특정 표적 세포 또는 조직으로 유도하는(예를 들어, 항원 결합 분자, 펩타이드, 글리칸 등의 부착에 의해) 지질 나노입자에 대한 표적화 모이어티의 접합에 유용하다.
일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하며, 여기서 양이온성 지질은 DOTAP이다. 일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하고, 여기서 양이온성 지질은 DLin-MC3-DMA(MC3)이다. 일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하고, 여기서 양이온성 지질은 COATSOME® SS-EC이다. 일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하고, 여기서 양이온성 지질은 COATSOME® SS-LC이다. 일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하고, 여기서 양이온성 지질은 COATSOME® SS-OC이다. 일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하고, 여기서 양이온성 지질은 COATSOME® SS-OP이다. 일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하며, 여기서 양이온성 지질은 L-319이다.
일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하고, 여기서 하나 이상의 헬퍼 지질은 콜레스테롤을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하고, 여기서 하나 이상의 헬퍼 지질은 DLPE를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하고, 여기서 하나 이상의 헬퍼 지질은 DSPC를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하고, 여기서 하나 이상의 헬퍼 지질은 DOPE를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하고, 여기서 하나 이상의 헬퍼 지질은 DOPC를 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질 및 적어도 2개의 헬퍼 지질을 포함하고, 여기서 양이온성 지질은 DOTAP이고, 적어도 2개의 헬퍼 지질은 콜레스테롤 및 DLPE를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질 및 적어도 2개의 헬퍼 지질을 포함하고, 여기서 양이온성 지질은 MC3이고, 적어도 2개의 헬퍼 지질은 콜레스테롤 및 DSPC를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 헬퍼 지질은 콜레스테롤 및 DOPE를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 헬퍼 지질은 콜레스테롤 및 DSPC를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질 및 적어도 3개의 헬퍼 지질을 포함하고, 여기서 양이온성 지질은 DOTAP이고, 적어도 3개의 헬퍼 지질은 콜레스테롤, DLPE 및 DSPE를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질 및 적어도 3개의 헬퍼 지질을 포함하고, 여기서 양이온성 지질은 MC3이고, 적어도 3개의 헬퍼 지질은 콜레스테롤, DSPC 및 DMG를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 3개의 헬퍼 지질은 콜레스테롤, DOPE 및 DSPE를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 3개의 헬퍼 지질은 콜레스테롤, DSPC 및 DMG를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DOTAP, 콜레스테롤 및 DLPE를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 MC3, 콜레스테롤 및 DSPC를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DOTAP, 콜레스테롤 및 DOPE를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DOTAP, 콜레스테롤, DLPE 및 DSPE를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 MC3, 콜레스테롤, DSPC 및 DMG를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DOTAP, 콜레스테롤, DLPE 및 DSPE-PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 MC3, 콜레스테롤, DSPC 및 DMG-PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DOTAP, 콜레스테롤, DOPE 및 DSPE를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DOTAP, 콜레스테롤, DOPE 및 DSPE-PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤 및 DPG-PEG(예를 들어, DPG-PEG2K)를 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 DOTAP, 콜레스테롤(Chol) 및 DLPE를 포함하고, 여기서 DOTAP:Chol:DLPE의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 약 50:35:15이다. 일부 구현예에서, LNP는 DOTAP, 콜레스테롤(Chol) 및 DLPE를 포함하고, 여기서 DOTAP:Chol:DOPE의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)는 약 50:35:15이다. 일부 구현예에서, LNP는 DOTAP, 콜레스테롤(Chol), DLPE, DSPE-PEG를 포함하고, 여기서 DOTP:Chol:DLPE의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 약 50:35:15이고, 여기서 입자는 약 0.2% DSPE-PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 MC3, 콜레스테롤(Chol), DSPC 및 DMG-PEG를 포함하고, 여기서 MC3:Chol:DSPC:DMG-PEG의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 약 49:38.5:11:1.5이다.
일부 구현예에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하고, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-25%, C = 20%-30% 및 D = 0%-3%이고, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤 (Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하고, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(총 지질 함량의 백분율로서)의 비율은 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-50%, B = 20%-25%, C = 25%-30% 및 D = 0%-1%이고, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하며, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 약 49:22:28.5:0.5이다.
일부 구현예에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하며, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-30%, C = 20%-45% 및 D = 0%-3%이고, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하고, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-30%, C = 25%-45% 및 D = 0%-3%이며, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하고, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-55%, B = 10%-20%, C = 30%-40% 및 D = 1%-2%이고, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하고, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-50%, B = 10%-15%, C = 35%-40% 및 D = 1%-2%이고, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤 (Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하고, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 49:11:38.5:1.5이다.
일부 구현예에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하고, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-65%, B = 5%-20%, C = 20%-45% 및 D = 0%-3%이고 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하고, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 50%-60%, B = 5%-15%, C = 30%-45% 및 D = 0%-3%이며, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하고, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)은 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 55%-60%, B = 5%-15%, C = 30%-40% 및 D = 1%-2%이며, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하고, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(총 지질 함량의 백분율로서)의 비율은 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 55%-60%, B = 5%-10%, C = 30%-35% 및 D = 1%-2%이며, 여기서 A+B+C+D = 100%이다. 일부 구현예에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤 (Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하고, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)는 58:7:33.5:1.5이다.
일부 구현예에서, 나노입자는 표적 세포에 의한 나노입자의 흡수를 조절하거나 촉진하기 위해 글리코사미노글리칸(GAG)으로 코팅한다(도 2). GAG는 헤파린/헤파린 설페이트, 콘드로이틴 설페이트/더마탄 설페이트, 케라틴 설페이트 또는 히알루론산(HA)일 수 있다. 특정 구현예에서, 나노입자의 표면은 HA로 코팅되고 종양 세포에 의한 흡수에 대해 입자를 표적화한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 아르기닌-글리신-아스파테이트 트리펩타이드(RGD 펩타이드)에 의해 코팅된다(Ruoslahti, Advanced Materials, 24, 2012, 3747-3756; 및 Bellis 등, Biomaterials, 32 (18), 2011, 4205-4210 참조).
일부 구현예에서, LNP는 약 50nm 내지 약 500nm의 평균 크기를 갖는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, LNP는 약 50nm 내지 약 200nm, 약 100nm 내지 약 200nm, 약 150nm 내지 약 200nm, 약 50nm 내지 약 150nm, 약 100nm 내지 약 150nm, 약 150nm 내지 약 500nm, 약 200nm 내지 약 500nm, 약 300nm 내지 약 500nm, 약 350nm 내지 약 500nm, 약 400nm 내지 약 500nm, 약 425nm 내지 약 500nm, 약 450nm 내지 약 500nm, 또는 약 475nm 내지 약 500nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 50nm 내지 약 120nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 50nm, 60nm, 70nm, 80nm, 90nm, 100nm, 110nm, 또는 약 120nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 100nm의 평균 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, LNP는 중성 전하(예를 들어, 약 0mV 내지 1mV의 평균 제타 전위)를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 40mV 내지 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 40mV 내지 약 0mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 35mV 내지 약 0mV, 약 30mV 내지 약 0mV, 약 25mV 내지 약 0mV, 약 20mV 내지 약 0mV, 약 15mV 내지 약 0mV, 약 10mV 내지 약 0mV, 또는 약 5mV 내지 약 0mV 사이의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 20mV 내지 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 20mV 내지 약 -20mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 10mV 내지 약 -20mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 10mV 내지 약 -10mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 10mV, 약 9mV, 약 8mV, 약 7mV, 약 6mV, 약 5mV, 약 4mV, 약 3mV, 약 2mV, 약 1mV, 약 0mV, 약 -1mV, 약 -2mV, 약 -3mV, 약 -4mV, 약 -5mV, 약 -6mV, 약 -7mV, 약 -8mV, 약 -9 mV, 약 -9mV 또는 약 -10mV의 평균 제타 전위를 갖는다.
일부 구현예에서, LNP는 약 0mV 내지 -20mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 -20 mV 미만의 평균 제타 전위를 갖는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, LNP는 약 -30 mV 미만, 약 35 mV 미만, 또는 약 -40 mV 미만의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 -50mV 내지 약 -20mV, 약 -40mV 내지 약 -20mV, 또는 약 -30mV 내지 약 -20mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 0mV, 약 -1mV, 약 -2mV, 약 -3mV, 약 -4mV, 약 -5mV, 약 -6mV, 약 -7mV, 약 -8mV, 약 -9mV, 약 -10mV, 약 -11mV, 약 -12mV, 약 -13mV, 약 -14mV, 약 -15mV, 약 -16mV, 약 -17 mV, 약 -18mV, 약 -19mV, 약 -20mV, 약 -21mV, 약 -22mV, 약 -23mV, 약 -24mV, 약 -25mV, 약 -26mV, 약 -27 mV, 약 -28mV, 약 -29mV, 약 -30mV, 약 -31mV, 약 -32mV, 약 -33mV, 약 -34mV, 약 -35mV, 약 -36mV, 약 -37 mV, 약 -38mV, 약 -39mV 또는 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 본원에 기재된 재조합 핵산 분자를 포함하고, 지질(L) 대 핵산(N)을 약 3:1(L:N)의 비율로 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 본원에 기재된 재조합 핵산 분자를 포함하고, 약 4:1, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1, 또는 약 10:1의 L:N 비율을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 본원에 기재된 재조합 핵산 분자를 포함하고 약 7:1의 지질(L) 대 핵산(N)의 비율을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 본원에 기재된 재조합 핵산 분자를 포함하고 약 4.5:1, 약 4.6:1, 약 4.7:1, 약 4.8:1, 약 4.9:1, 약 5:1, 약 5.1:1, 약 5.2:1, 약 5.3:1, 약 5.4:1 또는 약 5.5:1의 L:N 비율을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 본원에 기재된 재조합 핵산 분자를 포함하고 약 6.5:1, 6.6:1, 6.7:1, 6.8:1, 6.9:1, 7:1, 7.1:1, 7.2:1, 7.3:1, 7.4:1, 및 7.5:1의 L:N 비율을 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 표 5에 열거된 제형 중 하나로부터 선택되는 지질 제형을 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 종양용해성 바이러스를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하고, 여기서 암호화된 종양용해성 바이러스는 대상체에 대한 LNP 투여 부위로부터 떨어져 있는 종양의 크기를 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 실시예에서 입증된 바와 같이, 본원에 기재된 LNP의 정맥내 투여는 종양 조직에서 바이러스 복제 및 종양 크기 감소를 초래한다. 이들 데이터는 본 개시내용의 LNP가 LNP 투여 부위로부터 떨어져 있는 종양 또는 암성 조직에 국재화될 수 있음을 나타낸다. 이러한 효과는 쉽게 접근할 수 없어 종양내 전달 치료에 적합하지 않은 종양의 치료에 있어서, 본원에 기재된 LNP-캡슐화된 종양용해성 바이러스의 사용을 가능하게 한다.
페이로드 분자
일부 구현예에서, 입자는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하고, 추가로 페이로드 분자를 암호화하는 재조합 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 입자는 지질 나노입자이고 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하고, 추가로 페이로드 분자를 암호화하는 재조합 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 miRNA 표적 서열은 페이로드 분자를 암호화하는 RNA 폴리뉴클레오타이드의 3' 또는 5' UTR에 통합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 miRNA 표적 서열이 페이로드 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 삽입된다. 이러한 구현예에서, 페이로드의 해독 및 후속 발현은, 상응하는 miRNA가 발현되는 세포에서 발생하지 않거나 실질적으로 감소된다. 일부 구현예에서, 페이로드 분자를 암호화하는 재조합 RNA 폴리뉴클레오타이드는 레플리콘(replicon)이다.
일부 구현예에서, 페이로드는 세포독성 펩타이드이다. 본원에 사용된 바와 같이, "세포독성 펩타이드"는 숙주 세포에서 발현될 때 세포사 및/또는 숙주 세포에 의해 분비될 때 이웃 세포의 세포사를 유도할 수 있는 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 세포독성 펩타이드는 카스파제, p53, 디프테리아 독소(DT), 슈도모나스 외독소 A(PEA), I형 리보자임 불활성화 단백질(RIP)(예를 들어, 사포린 및 젤로닌), II형 RIP(예를 들어, 리신)이다, 시가(Shiga)-유사 독소 1(Slt1), 감광성 반응성 산소 종(예를 들어, 킬러-레드)이다. 특정 구현예에서, 세포독성 펩타이드는 카스파제 유전자와 같이, 아폽토시스를 통해 세포사를 초래하는 자살 유전자에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 페이로드는 면역 조절 펩타이드이다. 본원에 사용된 바와 같이, "면역 조절 펩타이드"는 특정 면역 수용체 및/또는 경로를 조절(예를 들어, 활성화 또는 억제)할 수 있는 펩타이드이다. 일부 구현예에서, 면역 조절 펩타이드는 면역 세포, 조직 세포 및 간질 세포를 포함하는 임의의 포유류 세포에 작용할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 면역 조절 펩타이드는 T 세포, NK 세포, NKT T 세포, B 세포, 수지상 세포, 대식세포, 호염기구, 비만 세포 또는 호산구와 같은 면역 세포에 작용한다. 예시적인 면역 조절 펩타이드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 항원 결합 분자, 사이토카인, 케모카인, 가용성 수용체, 세포 표면 수용체 리간드, 이분(bipartite) 펩타이드 및 효소를 포함한다.
일부 구현예에서, 페이로드는 IL-1, IL-12, IL-15, IL-18, IL-36γ, TNFα, IFNα, IFNβ, IFNγ, 또는 TNFSF14와 같은 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 페이로드는 CXCL10, CXCL9, CCL21, CCL4 또는 CCL5와 같은 케모카인이다. 일부 구현예에서, 페이로드는 NKG2D 리간드, 뉴로필린 리간드, Flt3 리간드, CD47 리간드(예를 들어, SIRP1α)와 같은 세포 표면 수용체에 대한 리간드이다. 일부 구현예에서, 페이로드는 가용성 수용체, 예컨대 가용성 사이토카인 수용체(예를 들어, IL-13R, TGFβR1, TGFβR2, IL-35R, IL-15R, IL-2R, IL-12R 및 인터페론 수용체) 또는 가용성 선천성 면역 수용체(예를 들어, Toll 유사 수용체, 보체 수용체 등)이다. 일부 구현예에서, 페이로드는 세포내 RNA 및/또는 DNA 감지에 관여하는 단백질의 우성 작용제 돌연변이체(예를 들어, STING, RIG-1, 또는 MDA-5의 우성 작용제 돌연변이체)이다.
일부 구현예에서, 페이로드는 항원 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 사슬 가변 단편(scFv), F(ab) 등)이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 분자는 세포 표면 수용체, 예컨대 면역 관문 수용체(예를 들어, PD-1, PD-L1 및 CTLA4) 또는 세포 성장 및 활성화에 관여하는 또 다른 세포 표면 수용체(예를 들어, OX40, CD200R, CD47, CSF1R, 41BB, CD40 및 NKG2D)에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 페이로드 분자는 클로로톡신, BmKn-2, 네오플라딘 1, 네오플라딘 2, 및 모리포린(mauriporin)과 같은 전갈 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 페이로드 분자는 콘토르트로스타틴(contortrostatin), 아폭신-I, 보스롭스톡신(bothropstoxin)-I, BJcuL, OHAP-1, 로도스토민, drCT-I, CTX-III, B1L 및 ACTX-6과 같은 뱀 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 페이로드 분자는 라타르신 및 히알루로니다제와 같은 거미 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 페이로드 분자는 멜리틴 및 아파민과 같은 벌 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 페이로드 분자는 PsT-1, PdT-1 및 PdT-2와 같은 개구리 폴리펩타이드이다.
일부 구현예에서, 페이로드 분자는 효소이다. 일부 구현예에서, 효소는 세포외 기질을 변경함으로써 종양 미세환경을 조절할 수 있다. 이러한 구현예에서, 효소는 기질 메탈로프로테아제(예를 들어, MMP9), 콜라게나아제, 히알루로니다아제, 젤라티나아제 또는 엘라스타아제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 효소는 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제, 사이토신 탈아미노효소, 니트로리덕타아제, 카복시펩티다제 G2, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 또는 사이토크롬 P450과 같은 유전자 지향 효소 전구약물 요법(GDEPT) 시스템의 일부이다. 일부 구현예에서, 효소는 표적 세포의 세포사 경로를 유도하거나 활성화할 수 있다(예를 들어, 카스파제). 일부 구현예에서, 효소는 세포외 대사산물 또는 메시지(message)를 분해할 수 있다(예를 들어, 아르기나제 또는 15-하이드록시프로스타글란딘 탈수소효소).
일부 구현예에서, 페이로드 분자는 이분 펩타이드이다. 본원에 사용된 "이분 펩타이드"는 비-암성 이펙터 세포에서 발현된 세포 표면 항원에 결합할 수 있는 제1 도메인 및 표적 세포(예를 들어, 암성 세포, 종양 세포, 또는 상이한 유형의 이펙터 세포)에 의해 발현된 세포 표면 항원에 결합할 수 있는 제2 도메인으로 구성된 다량체 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 이분 폴리펩타이드의 개별 폴리펩타이드 도메인은 항체 또는 이의 결합 단편[예를 들어, 단일 사슬 가변 단편(scFv) 또는 F(ab)], 나노바디, 디아바디, 플렉시바디, DOCK-AND-LOCKTM 항체 또는 단클론 항-유전자형 항체(mAb2)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이분 폴리펩타이드의 구조는 이중 가변 도메인 항체(DVD-IgTM), Tandab®, 이중특이적 T 세포 체결자(BiTETM), DuoBody® 또는 이중 친화성 재표적화(DART) 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 이분 폴리펩타이드는 BiTE이고 표 3 및/또는 4에 제시된 항원에 특이적으로 결합하는 도메인을 포함한다. 예시적인 BiTE는 하기 표 2에 제시되어 있다.
[표 2]
Figure pct00006
일부 구현예에서, 이펙터 세포 상에서 발현된 세포 표면 항원은 하기 표 3으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 세포 또는 이펙터 세포에서 발현되는 세포 표면 항원은 하기 표 4로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 세포에서 발현되는 세포 표면 항원은 종양 항원이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 CD19, EpCAM, CEA, PSMA, CD33, EGFR, Her2, EphA2, MCSP, ADAM17, PSCA, 17-A1, NKGD2 리간드, CSF1R, FAP, GD2, DLL3 또는 뉴로필린으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 표 4에 나열된 것들로부터 선택된다.
[표 3]
Figure pct00007
[표 4]
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
치료학적 조성물 및 사용 방법
본 개시내용의 일 측면은 본원에 기재된 재조합 RNA 분자, 또는 본원에 기재된 재조합 RNA 분자를 포함하는 입자를 포함하는 치료학적 조성물, 및 암 치료 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 조성물은 원하는 전달 경로에 적합한 임의의 방식으로 제형화될 수 있다. 전형적으로, 제형은 유도체, 전구약물, 용매화물, 입체이성질체, 라세미체, 또는 호변이성질체를 임의의 약제학적 허용성 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 포함하는 모든 생리학적 허용성 조성물을 포함한다.
본원에 사용된 "약제학적 허용성 담체, 희석제 또는 부형제"는 미국식약청(FDA)에서 인간 또는 가축에 사용하기에 허용되는 것으로서 승인된 임의의 보조제, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향미 증강제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정제, 등장제, 용매, 계면활성제 또는 유화제를 제한없이 포함한다. 예시적인 약제학적 허용성 담체는 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; 셀룰로오스 및 그 유도체, 예컨대 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 활석; 코코아 버터, 왁스, 동물 및 식물성 지방, 파라핀, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 산화아연; 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; 프로필렌글리콜과 같은 글리콜; 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리올; 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; 한천; 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄과 같은 완충제; 알긴산; 발열원이 없는 물; 등장 식염수; 링거액; 에틸 알코올; 인산염 완충액; 및 약제학적 제형에 이용되는 임의의 다른 화합성 물질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"약제학적 허용성 염"은 산 및 염기 부가 염을 모두 포함한다. 약제학적 허용성 염으로는 산 부가 염(단백질의 유리 아미노기에 의해 형성됨)을 포함하고, 이는 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기 산, 및 제한없이 아세트산, 2,2-디클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤젠술폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 캄포르산, 캄포-10-설폰산, 카프르산, 카프로 산, 카프릴산, 탄산, 신남산, 구연산, 시클라믹산, 도데실 황산, 에탄-1,2-디설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티스산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루탐산, 글루타르산, 2-옥소-글루타르산, 글리세로인산, 글리콜산, 히푸르산, 이소부티르산, 젖산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄설폰산, 뮤신산, 나프탈렌-1,5-디설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 1-하이드록시-2-나프토산, 니코틴산, 올레산, 오로틱산, 옥살산, 팔미트산, 파모인산, 프로피온산, 피로글루탐산, 피루브산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 세바스산, 스테아르산, 숙신산, 타르타르산, 티오시안산, p-톨루엔설 폰산, 트리플루오로아세트산, 운데실렌산 등과 같은 유기산에 의해 형성된다. 유리 카복실기에 의해 형성된 염은 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 염 등과 같은 무기 염기로부터 유래될 수 있다. 유기 염기로부터 유래된 염은 1차, 2차 및 3차 아민의 염, 자연 발생의 치환된 아민을 포함한 치환된 아민, 사이클릭 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예컨대, 암모니아, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 디에탄올아민, 에탄올아민, 데아놀, 2-디메틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 디사이클로헥실아민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 히드라바민, 콜린, 베타인, 베네타민, 벤자틴, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 트리에탄올아민, 트로메타민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 폴리아민 수지 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특히 바람직한 유기 염기는 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 트리메틸아민, 디사이클로헥실아민, 콜린 및 카페인이다.
본 개시내용은 암성 세포 또는 표적 세포를 본원에 기재된 RNA 폴리뉴클레오타이드 또는 입자, 또는 이의 조성물에, 이 조성물을 암성 세포로 세포내 전달하기에 충분한 조건 하에, 노출시키는 것을 포함하는, 암성 세포 또는 표적 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다. 본원에 사용된, "암성 세포" 또는 "표적 세포"는 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 입자, 또는 본원에 기재된 이의 조성물에 의한 치료 또는 투여를 위해 선택된 포유류 세포를 지칭한다. 본원에 사용된 "암성 세포를 사멸시키는 것"은 구체적으로 아폽토시스 또는 괴사에 의한 암성 세포의 사멸을 지칭한다. 암성 세포의 사멸은 종양 크기 측정, 세포 계수, 및 아넥신(Annexin) V와 같은 세포사 마커 및 요오드화프로피듐의 혼입을 검출하기 위한 유세포분석을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 본 기술분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 개시내용은 본원에 기재된 치료학적 조성물의 유효량이 대상체에게 투여되는, 이를 필요로 하는 대상체의 암을 치료 또는 예방하는 방법을 추가로 제공한다. 투여 경로는 치료할 질병의 위치 및 성질에 따라 당연히 달라질 것이며, 예를 들어 피내, 경피(transdermal), 피하, 비경구, 비강, 정맥내, 근육내, 비강내, 피하, 피부경유(percutaneous), 기관내, 복강내, 종양내, 관류, 세척, 직접 주사 및 경구 투여를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 캡슐화된 폴리뉴클레오타이드 조성물은 전이성 암의 치료에 특히 유용하며, 여기서 전신 투여는 다수의 기관 및/또는 세포 유형에 조성물을 전달하는 데 필요할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 전신 투여된다.
본원에서 호환적으로 사용되는 "유효량" 또는 "유효 용량"은 질환 또는 상태의 증상 개선 또는 복원을 초래하는 본원에 기재된 조성물의 양 및/또는 용량을 지칭한다. 개선은 질병 또는 상태, 또는 질병 또는 상태의 증상의 임의의 개선 또는 복원이다. 개선은 관찰가능하거나 측정가능한 개선이거나, 대상체의 전반적인 행복감의 개선일 수 있다. 따라서, 본 기술분야의 기술자는 치료가 질병 상태를 개선할 수 있지만, 질병에 대한 완전한 치유가 아닐 수 있음을 알고 있다. 대상체의 개선은 종양 부담 감소, 종양 세포 증식 감소, 종양 세포사 증가, 면역 경로 활성화, 종양 진행 시간 증가, 암 통증 감소, 생존 증가 또는 삶의 질 개선을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 유효 용량의 투여는 본원에 기재된 조성물의 단일 용량의 투여에 의해 달성될 수 있다. 본원에 사용된 "용량"은 한 번에 전달되는 조성물의 양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 분자의 용량은 50% 조직 배양 감염 용량(Tissue culture Infective Dose, TCID50)으로서 측정된다. 일부 구현예에서, TCID50은 적어도 약 103-109 TCID50/mL, 예를 들어, 적어도 약 103 TCID50/mL, 약 104 TCID50/mL, 약 105 TCID50/mL, 약 106 TCID50/mL, 약 107 TCID50/mL, 약 108 TCID50/mL, 또는 약 109 TCID50/mL이다. 일부 구현예에서, 용량은 주어진 부피 중의 입자의 수(예를 들어, 입자/mL)로서 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 용량은 각 입자에 존재하는 본원에 기재된 RNA 폴리뉴클레오타이드의 게놈 카피 수(예를 들어, 입자의 #/mL, 여기서 각 입자는 폴리뉴클레오타이드의 적어도 하나의 게놈 카피를 포함함)에 의해 추가로 개량될 수 있다. 일부 구현예에서, 유효 용량의 전달은 본원에 기재된 조성물의 다회 용량의 투여를 필요로 할 수 있다. 이와 같이, 유효 용량의 투여는 본원에 기재된 조성물의 적어도 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 20회, 30회, 40회, 50회 용량, 또는 그 이상의 투여를 필요로 할 수 있다.
본원에 기재된 조성물의 다회 용량이 투여되는 구현예에서, 각 용량은 동일한 행위자에 의해 및/또는 동일한 지리적 위치에 투여될 필요는 없다. 또한, 투약은 미리 결정된 일정에 따라 투여될 수 있다. 예를 들어, 미리 결정된 투약 일정은 매일, 격일, 매주, 격주, 매월, 격월, 매년, 반기 등으로 본원에 기재된 조성물의 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 소정의 투약 일정은 주어진 환자에 대해 필요에 따라 조정될 수 있다(예를 들어, 투여된 조성물의 양은 증가 또는 감소될 수 있고 및/또는 용량의 빈도가 증가 또는 감소될 수 있고, 및/또는 투여되는 용량의 총 수가 증가 또는 감소될 수 있다).
본원에 사용된 "방지" 또는 "예방"은 질병 증상의 완전한 방지, 질병 증상의 발병 지연, 또는 후속적으로 발생하는 질병 증상의 중증도 감소를 의미할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체" 또는 "환자"는 본원에 기재된 조성물이 본원에 기재된 방법에 따라 투여되는 임의의 포유류 대상체를 의미하는 것으로 간주된다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 인간 대상체를 치료하기 위해 사용된다. 본 개시내용의 방법은 또한 비-인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 개코 원숭이 및 침팬지), 마우스, 랫트, 소, 말, 고양이, 개, 돼지, 토끼, 염소, 사슴, 양, 흰족제비, 게르빌루스쥐, 기니피그, 햄스터, 박쥐, 새(예를 들어, 닭, 칠면조 및 오리), 물고기 및 파충류를 치료하는데 이용될 수 있다.
본원에서 "암"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류의 생리학적 상태를 지칭하거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종(지방육종, 골형성 육종, 혈관육종, 내피육종, 평활근육종, 척색종, 림프관육종, 림프관내피육종, 횡문근육종, 섬유육종, 점액육종, 및 연골육종을 포함함), 신경내분비 종양, 중피종, 활막종, 슈반세포종, 수막종, 선암종, 흑색종 및 백혈병 또는 림프성 악성종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 편평 세포 암(예를 들어, 상피 편평 세포 암), 폐암, 예컨대, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종, 소세포 폐 암종, 복막암, 간세포암, 위장암을 포함한 위(gastric) 또는 위(stomach) 암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 직장암, 결직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장(kidney) 또는 신장(renal) 암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 고환암, 식도암, 담도 종양, 유잉 종양, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선 암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신장 세포 암종, 간종양, 담관 암종, 융모막 암종, 정상피종, 배아 암종, 빌름스 종양, 고환 종양, 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 표피종, 송과선종, 혈관모세포종, 청각 신경종, 희소돌기교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 골수이형성 질환, 중쇄 질환, 신경내분비 종양, 슈반세포종, 및 기타 암종, 뿐만 아니라 두경부암을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 신경내분비 암이다. 또한, 양성(즉, 비암성) 과증식성 질환, 장애 및 상태, 예컨대, 양성 전립선 비대(BPH), 수막종, 슈반세포종, 신경섬유종증, 켈로이드, 근종 및 자궁 섬유종 등도 본원에 개시된 개시내용을 사용하여 치료할 수 있다.
추가 구현예
본 발명의 추가 넘버링된 구현예는 다음과 같이 제공된다:
구현예 1: 종양용해성 바이러스를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 지질 나노입자(LNP).
구현예 2: 구현예 1의 LNP로서, 종양용해성 바이러스가 단일 가닥 RNA(ssRNA) 바이러스인 LNP.
구현예 3: 구현예 1의 LNP로서, 종양용해성 바이러스가 포지티브 센스((+)-센스) ssRNA 바이러스인 LNP.
구현예 4: 구현예 3의 LNP로서, (+)-센스 ssRNA 바이러스가 피코나바이러스인 LNP.
구현예 5: 구현예 4의 LNP로서, 피코나바이러스는 세네카 밸리 바이러스(SVV) 또는 콕사키바이러스인 LNP.
구현예 6: 구현예 5의 LNP로서, SVV는 야생형 SVV-A(서열번호 1), S177A-SVVA 돌연변이체(서열번호 2), SVV-IR2 돌연변이체(서열번호 3) 및 SVV-IR2-S177A 돌연변이체(서열번호 4)로부터 선택되는 SVV-A인 LNP.
구현예 7: 구현예 5의 LNP로서, 콕사키바이러스는 CVB3, CVA21 및 CVA9로부터 선택되는 LNP.
구현예 8: 구현예 5의 LNP로서, 콕사키바이러스는 서열번호 27을 포함하는 변형된 CVA21 바이러스인 LNP.
구현예 9: 구현예 1 내지 8 중 어느 하나의 LNP로서, 세포와 LNP의 접촉은 그 세포에 의한 바이러스 입자의 생산을 초래하고, 그 바이러스 입자는 감염성 및 용해성인 LNP.
구현예 10: 구현예 1 내지 9 중 어느 하나의 LNP로서, 합성 RNA 바이러스 게놈이 외인성 페이로드 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, LNP.
구현예 11: 구현예 1 내지 9 중 어느 하나의 LNP로서, 외인성 페이로드 단백질을 암호화하는 재조합 RNA 분자를 추가로 포함하는, LNP.
구현예 12: 구현예 10 또는 11의 LNP로서, 외인성 페이로드 단백질은 형광 단백질, 효소 단백질, 사이토카인, 케모카인, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자, 또는 세포 표면 수용체에 대한 리간드인 LNP.
구현예 13: 구현예 12의 LNP로서, 사이토카인은 IL-12, GM-CSF, IL-18, IL-2 및 IL-36γ로부터 선택되는 LNP.
구현예 14: 구현예 12의 LNP로서, 세포 표면 수용체에 대한 리간드가 Flt3 리간드 또는 TNFSF14인 LNP.
구현예 15: 구현예 12의 LNP로서, 케모카인이 CXCL10, CCL4, CCL21 및 CCL5로부터 선택되는 LNP.
구현예 16: 구현예 12의 LNP로서, 항원 결합 분자가 면역 관문 수용체에 결합하고 이를 억제할 수 있는 것인 LNP.
구현예 17: 구현예 16의 LNP로서, 면역 관문 수용체가 PD-1인 LNP.
구현예 18: 구현예 12의 LNP로서, 항원 결합 분자가 종양 항원에 결합할 수 있는 LNP.
구현예 19: 구현예 18의 LNP로서, 항원 결합 분자가 이중특이적 T 세포 체결자 분자(BiTE) 또는 이중특이적 경쇄 T 세포 체결자 분자(LiTE)인 LNP.
구현예 20: 구현예 18 또는 19의 LNP로서, 종양 항원이 DLL3 또는 EpCAM인 LNP.
구현예 21: 구현예 1 내지 20 중 어느 하나의 LNP로서, 합성 RNA 바이러스 게놈 및/또는 재조합 RNA 분자가 마이크로 RNA(miRNA) 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하고, 여기서 miR-TS 카세트는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 LNP.
구현예 22: 구현예 21의 LNP로서, 하나 이상의 miRNA는 miR-124, miR-1, miR-143, miR-128, miR-219, miR-219a, miR-122, miR-204, miR-217, miR-137 및 miR-126으로부터 선택되는 LNP.
구현예 23: 구현예 22의 LNP로서, miR-TS 카세트가 miR-124 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-1 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-143 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 LNP.
구현예 24: 구현예 22의 LNP로서, miR-TS 카세트가 miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-219a 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 MiR-122 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 LNP.
구현예 25: 구현예 22의 LNP로서, miR-TS 카세트가 miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-204 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-219 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 LNP.
구현예 26: 구현예 22의 LNP로서, miR-TS 카세트가 miR-217 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-137 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-126 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 LNP.
구현예 27: 구현예 1 내지 26 중 어느 하나의 LNP로서, 양이온성 지질, 하나 이상의 헬퍼 지질, 및 인지질-중합체 접합체를 포함하는 LNP.
구현예 28: 구현예 27의 LNP로서, 양이온성 지질이 DLinDMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA(MC3), COATSOME® SS-LC(이전 명칭: SS-18/4PE-13), COATSOME® SS-EC(이전 명칭: SS-33/4PE-15), COATSOME® SS-OC, COATSOME® SS-OP, 디((Z)-논-2-엔-1-일)9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L-319), 또는 N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP)로부터 선택되는 LNP.
구현예 29: 구현예 27 또는 28의 LNP로서, 헬퍼 지질이 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); 및 콜레스테롤로부터 선택되는 LNP.
구현예 30: 구현예 27의 LNP로서, 양이온성 지질이 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)이고, 중성 지질이 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)인 LNP.
구현예 31: 구현예 27 내지 30 중 어느 하나의 LNP로서, 인지질-중합체 접합체가 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜(DPG-PEG); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DSG-PEG); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DSG-PEG); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DMG-PEG); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DMG-PEG), 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG-아민)으로부터 선택되는 LNP.
구현예 32: 구현예 27 내지 31 중 어느 하나의 LNP로서, 인지질-중합체 접합체가 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-5000](DSPE-PEG5K); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DPG-PEG2K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DSG-PEG5K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DSG-PEG2K); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DMG-PEG5K); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DMG-PEG2K)로부터 선택되는 LNP.
구현예 33: 구현예 27의 LNP로서, 양이온성 지질은 COATSOME® SS-OC를 포함하고, 하나 이상의 헬퍼 지질은 콜레스테롤(Chol) 및 DSPC를 포함하고, 인지질-중합체 접합체는 DPG-PEG2000을 포함하는 LNP.
구현예 34: 구현예 33의 LNP로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-25%, C = 20%-30%, 및 D = 0%-3%이고 A+B+C+D = 100%인 LNP.
구현예 35: 구현예 33의 LNP로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-50%, B = 20%-25%, C = 25%-30% 및 D = 0%-1%이고, A+B+C+D = 100%인 LNP.
구현예 36: 구현예 33의 LNP로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 49:22:28.5:0.5인 LNP.
구현예 37: 구현예 33의 LNP로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-30%, C = 20%-45% 및 D = 0%-3%이고 A+B+C+D = 100%인 LNP.
구현예 37A: 구현예 33의 LNP로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-30%, C = 25%-45% 및 D = 0%-3%이고 A+B+C+D = 100%인 LNP.
구현예 37B: 구현예 33의 LNP로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-55%, B = 10%-20%, C = 30%-40% 및 D = 1%-2%이고 A+B+C+D = 100%인 LNP.
구현예 38: 구현예 33의 LNP로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-50%, B = 10%-15%, C = 35%-40% 및 D = 1%-2%이고 A+B+C+D = 100%인 LNP.
구현예 39: 구현예 33의 LNP로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 49:11:38.5:1.5인 LNP.
구현예 39A: 구현예 33의 LNP로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-65%, B = 5%-20%, C = 20%-45% 및 D = 0%-3%이고 A+B+C+D = 100%인 LNP.
구현예 39B: 구현예 33의 LNP로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 50%-60%, B = 5%-15%, C = 30%-45% 및 D = 0%-3%이고 A+B+C+D = 100%인 LNP.
구현예 39C: 구현예 33의 LNP로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 55%-60%, B = 5%-15%, C = 30%-40% 및 D = 1%-2%이고 A+B+C+D = 100%인 LNP.
구현예 39D: 구현예 33의 LNP로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 55%-60%, B = 5%-10%, C = 30%-35% 및 D = 1%-2%이고 A+B+C+D = 100%인 LNP.
구현예 39E: 구현예 33의 LNP로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 58:7:33.5:1.5인 LNP.
구현예 40: 구현예 1 내지 39E 중 어느 하나의 LNP로서, 표 5로부터 선택되는 지질 제형을 포함하는 LNP.
구현예 41: 구현예 1 내지 40 중 어느 하나의 LNP로서, 히알루로난이 LNP의 표면에 접합되어 있는 LNP.
구현예 42: 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 따른 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료학적 조성물.
구현예 43: 구현예 42의 치료학적 조성물로서, 복수의 LNP는 약 50nm 내지 약 500nm, 약 150nm 내지 약 500nm, 약 200nm 내지 약 500nm, 약 300nm 내지 약 500nm, 약 350nm 내지 약 500nm, 약 400nm 내지 약 500nm, 약 425nm 내지 약 500nm, 약 450nm 내지 약 500nm, 또는 약 475nm 내지 약 500nm의 평균 크기를 갖는 치료학적 조성물.
구현예 43A: 구현예 42의 치료학적 조성물로서, 복수의 LNP는 약 50nm 내지 약 120nm의 평균 크기를 갖는 치료학적 조성물.
구현예 43B: 구현예 42의 치료학적 조성물로서, 복수의 LNP가 약 50nm, 60nm, 70nm, 80nm, 90nm, 100nm, 110nm, 또는 약 120nm의 평균 크기를 갖는 치료학적 조성물.
구현예 43C: 구현예 42의 치료학적 조성물로서, 복수의 LNP가 약 100nm의 평균 크기를 갖는, 치료학적 조성물.
구현예 44: 구현예 42 내지 43C 중 어느 하나의 치료학적 조성물로서, 복수의 LNP가 약 40mV 내지 약 -40mV, 20mV 내지 약 -20mV, 약 10mV 내지 약 -10mV, 약 5mV 내지 약 -5mV, 또는 약 20mV 내지 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는, 치료학적 조성물.
구현예 45: 구현예 42 내지 43C 중 어느 하나의 치료학적 조성물로서, 복수의 LNP가 약 -20 mV 미만, 약 -30 mV 미만, 약 -35 mV 미만, 또는 약 -40 mV 미만의 평균 제타 전위를 갖는 치료학적 조성물.
구현예 46: 구현예 45의 치료학적 조성물로서, 복수의 LNP가 약 -50mV 내지 약 -20mV, 약 -40mV 내지 약 -20mV, 또는 약 -30mV 내지 약 -20mV의 평균 제타 전위를 갖는 치료학적 조성물.
구현예 47: 구현예 45 또는 46의 치료학적 조성물로서, 복수의 LNP가 약 -30mV, 약 -31mV, 약 -32mV, 약 -33mV, 약 -34mV, 약 -35mV, 약 -36mV, 약 -37mV, 약 -38mV, 약 -39mV 또는 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는, 치료학적 조성물.
구현예 48: 구현예 42 내지 47 중 어느 하나의 치료학적 조성물로서, 대상체에게 치료학적 조성물의 투여가 대상체의 표적 세포로 재조합 RNA 폴리뉴클레오타이드를 전달하고, 여기서 재조합 RNA 폴리뉴클레오타이드는 대상체의 표적 세포를 용해시킬 수 있는 감염성 종양용해성 바이러스를 생산하는 치료학적 조성물.
구현예 49: 구현예 48의 치료학적 조성물로서, 조성물이 정맥내 또는 종양내 전달을 위해 제형화된, 치료학적 조성물.
구현예 50: 구현예 48의 치료학적 조성물로서, 표적 세포가 암성 세포인 치료학적 조성물.
구현예 51: 구현예 42 내지 50 중 어느 하나에 따른 치료학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상체에서 암성 종양의 성장을 억제하는 방법으로서, 상기 조성물의 투여가 종양의 성장을 억제하는 방법.
구현예 52: 구현예 51의 방법으로서, 투여가 종양내 또는 정맥내인 방법.
구현예 53: 구현예 51 또는 52의 방법으로서, 암이 폐암, 간암, 흑색종, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신경모세포종, 횡문근육종, 수모세포종 또는 방광암인, 방법.
구현예 53A: 구현예 51 내지 53 중 어느 하나의 방법으로서, 암이 신경내분비 암인 방법.
구현예 54: 종양용해성 바이러스를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 재조합 RNA 분자.
구현예 55: 구현예 54의 재조합 RNA 분자로서, 암호화된 종양용해성 바이러스가 단일 가닥 RNA(ssRNA) 바이러스인 재조합 RNA 분자.
구현예 56: 구현예 55의 재조합 RNA 분자로서, ssRNA 바이러스가 포지티브 센스((+)-센스) 또는 네거티브 센스((-)-센스) ssRNA 바이러스인 재조합 RNA 분자.
구현예 57: 구현예 56의 재조합 RNA 분자로서, (+)-센스 ssRNA 바이러스가 피코나바이러스인 재조합 RNA 분자.
구현예 58: 구현예 57의 재조합 RNA 분자로서, 피코나바이러스가 세네카 밸리 바이러스(SVV) 또는 콕사키바이러스인 재조합 RNA 분자.
구현예 59: 구현예 58의 재조합 RNA 분자로서, SVV가 야생형 SVV-A(서열번호 1), S177A-SVVA 돌연변이체(서열번호 2), SVV-IR2 돌연변이체(서열번호 3) 또는 SVV-IR2-S177A(서열번호 4)로부터 선택되는 SVV-A인 재조합 RNA 분자.
구현예 60: 구현예 58의 재조합 RNA 분자로서, 콕사키바이러스가 CVB3, CVA21 및 CVA9로부터 선택되는, 재조합 RNA 분자.
구현예 61: 구현예 58의 재조합 RNA 분자로서, 콕사키바이러스가 서열번호 27을 포함하는 변형된 CVA21 바이러스인 재조합 RNA 분자.
구현예 62: 구현예 54 내지 61 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자로서, 비-바이러스 전달 비히클에 의해 세포 내로 도입된 경우 감염 용해성 바이러스를 생산할 수 있는 재조합 RNA 분자.
구현예 63: 구현예 54 내지 62 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자로서, 종양용해성 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 삽입된 마이크로RNA(miRNA) 표적 서열(miR-TS) 카세트를 추가로 포함하고, 여기서 miR-TS 카세트는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 세포에서 하나 이상의 상응하는 miRNA의 발현이 그 세포에서 암호화된 바이러스의 복제를 억제하는 재조합 RNA 분자.
구현예 64: 구현예 63의 재조합 RNA 분자로서, 하나 이상의 miRNA가 miR-124, miR-1, miR-143, miR-128, miR-219, miR-219a, miR-122, miR-204, miR-217, miR-137 및 miR-126으로부터 선택되는 재조합 RNA 분자.
구현예 65: 구현예 64의 재조합 RNA 분자로서, miR-TS 카세트가 miR-124 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-1 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-143 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 재조합 RNA 분자.
구현예 66: 구현예 64의 재조합 RNA 분자로서, miR-TS 카세트가 miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-219a 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-122 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 재조합 RNA 분자.
구현예 67: 구현예 64의 재조합 RNA 분자로서, miR-TS 카세트가 miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-204 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-219 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 재조합 RNA 분자.
구현예 68: 구현예 64의 재조합 RNA 분자로서, miR-TS 카세트가 miR-217 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-137 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-126 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 재조합 RNA 분자.
구현예 69: 구현예 54 내지 68 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자로서, 비-바이러스 전달 비히클에 의해 세포 내로 도입된 경우, 복제-적격 종양용해성 바이러스를 생산할 수 있는 재조합 RNA 분자.
구현예 70: 구현예 69의 재조합 RNA 분자로서, 세포가 포유류 세포인 재조합 RNA 분자.
구현예 71: 구현예 70의 재조합 RNA 분자로서, 세포가 포유류 대상체에 존재하는 포유류 세포인 재조합 RNA 분자.
구현예 72: 구현예 54 내지 71 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자로서, 복제-적격 바이러스가 콕사키바이러스, 폴리오 바이러스, 세네카 밸리 바이러스, 라사 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 홍역 바이러스, 신드비스 바이러스 및 마라바 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 재조합 RNA 분자.
구현예 72A: 구현예 54 내지 71 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자로서, 복제-적격 바이러스가 표 1에 나열된 것들로부터 선택되는, 재조합 RNA 분자.
구현예 73: 구현예 63의 재조합 RNA 분자로서, 하나 이상의 miR-TS 카세트가 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 5' 비해독 영역(UTR) 또는 3' UTR에 통합된 재조합 RNA 분자.
구현예 74: 구현예 63의 재조합 RNA 분자로서, 하나 이상의 miR-TS 카세트가 하나 이상의 비필수 유전자의 5' 비해독 영역(UTR) 또는 3' UTR에 통합된 재조합 RNA 분자.
구현예 74A: 구현예 63의 재조합 RNA 분자로서, 하나 이상의 miR-TS 카세트가 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 5' 또는 3'에 통합된 재조합 RNA 분자.
구현예 75: 구현예 54 내지 74A 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자로서, 핵산 벡터에 삽입된 재조합 RNA 분자.
구현예 76: 구현예 75의 재조합 RNA 분자로서, 핵산 벡터가 레플리콘인 재조합 RNA 분자.
구현예 77: 구현예 54 내지 76의 재조합 RNA 분자로서, 합성 RNA 바이러스 게놈이 외인성 페이로드 단백질을 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 재조합 RNA 분자.
구현예 78: 구현예 77의 재조합 RNA 분자로서, 외인성 페이로드 단백질이 형광 단백질, 효소 단백질, 사이토카인, 케모카인, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자, 또는 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드인 재조합 RNA 분자.
구현예 79: 구현예 78의 재조합 RNA 분자로서, 사이토카인이 IL-12, GM-CSF, IL-18, IL-2, 및 IL-36으로부터 선택되는 재조합 RNA 분자.
구현예 80: 구현예 78의 재조합 RNA 분자로서, 세포 표면 수용체에 대한 리간드가 Flt3 리간드 또는 TNFSF14인 재조합 RNA 분자.
구현예 81: 구현예 78의 재조합 RNA 분자로서, 케모카인이 CXCL10, CCL4, CCL21 및 CCL5로부터 선택되는 재조합 RNA 분자.
구현예 82: 구현예 78의 재조합 RNA 분자로서, 항원 결합 분자가 면역 관문 수용체에 결합하고 이를 억제할 수 있는 재조합 RNA 분자.
구현예 83: 구현예 82의 재조합 RNA 분자로서, 면역 관문 수용체가 PD-1인 재조합 RNA 분자.
구현예 84: 구현예 78의 재조합 RNA 분자로서, 항원 결합 분자가 종양 항원에 결합할 수 있는 재조합 RNA 분자.
구현예 85: 구현예 84의 재조합 RNA 분자로서, 항원 결합 분자가 이중특이적 T 세포 체결자 분자(BiTE) 또는 이중특이적 경쇄 T 세포 체결자 분자(LiTE)인 재조합 RNA 분자.
구현예 86: 구현예 84 또는 85의 재조합 RNA 분자로서, 종양 항원이 DLL3 또는 EpCAM인 재조합 RNA 분자.
구현예 87: 5'에서 3'로, 프로모터 서열, 5' 접합부 절단 서열, 구현예 54 내지 86 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 3' 접합부 절단 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
구현예 88: 구현예 87의 재조합 DNA 분자로서, 프로모터 서열이 T7 프로모터 서열인 재조합 DNA 분자.
구현예 89: 구현예 87 또는 88의 재조합 DNA 분자로서, 5' 접합부 절단 서열이 리보자임 서열이고 3' 접합부 절단 서열이 리보자임 서열인 재조합 DNA 분자.
구현예 90: 구현예 89의 재조합 DNA 분자로서, 5' 리보자임 서열이 해머헤드 리보자임 서열이고 3' 리보자임 서열이 델타 간염 바이러스 리보자임 서열인 재조합 DNA 분자.
구현예 91: 구현예 87 또는 88의 재조합 DNA 분자로서, 5' 접합부 절단 서열이 리보자임 서열이고 3' 접합부 절단 서열이 제한 효소 인식 서열인 재조합 DNA 분자.
구현예 92: 구현예 91의 재조합 DNA 분자로서, 5' 리보자임 서열이 해머헤드 리보자임 서열, 피스톨 리보자임 서열 또는 변형된 피스톨 리보자임 서열인 재조합 DNA 분자.
구현예 93: 구현예 91 또는 92의 재조합 DNA 분자로서, 3' 제한 효소 인식 서열이 IIS형 제한 효소 인식 서열인 재조합 DNA 분자.
구현예 94: 구현예 93의 재조합 DNA 서열로서, IIS형 인식 서열이 SapI 인식 서열인 재조합 DNA 분자.
구현예 95: 구현예 87 또는 88의 재조합 DNA 분자로서, 5' 접합부 절단 서열이 RNAseH 프라이머 결합 서열이고 3' 접합부 절단 서열이 제한 효소 인식 서열인 재조합 DNA 분자.
구현예 96: 구현예 54 내지 86 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자를 생산하는 방법으로서, 구현예 87 내지 95 중 어느 하나의 DNA 분자의 시험관내 전사 및 생성된 재조합 RNA 분자의 정제를 포함하는, 방법.
구현예 98: 구현예 96의 방법으로서, 재조합 RNA 분자가 합성 RNA 바이러스 게놈에 의해 암호화된 종양용해성 바이러스에 고유한 5' 및 3' 단부를 포함하는 방법.
구현예 99: 구현예 54 내지 86 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자의 유효량, 및 포유류 대상체에게 투여하기에 적합한 담체를 포함하는 조성물.
구현예 100: 구현예 54 내지 86 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자를 포함하는 입자.
구현예 101: 구현예 100의 입자로서, 생분해성인 입자.
구현예 102: 구현예 101의 입자로서, 나노입자, 엑소좀, 리포좀 및 리포플렉스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 입자.
구현예 103: 구현예 102의 입자로서, 엑소좀이 온전한 엑소좀 또는 빈 엑소좀으로부터 유래되는 변형된 엑소좀인 입자.
구현예 104: 구현예 102의 입자로서, 나노입자가 양이온성 지질, 하나 이상의 헬퍼 지질 및 인지질-중합체 접합체를 포함하는 지질 나노입자(LNP)인 입자.
구현예 105: 구현예 104의 입자로서, 양이온성 지질이 DLinDMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA(MC3), COATSOME® SS-LC(이전 명칭: SS-18/4PE-13), COATSOME® SS-EC(이전 명칭: SS-33/4PE-15), COATSOME® SS-OC, COATSOME® SS-OP, 디((Z)-논-2-엔-1-일)9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L-319), 또는 N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP)로부터 선택되는 입자.
구현예 106: 구현예 104 또는 105의 입자로서, 헬퍼 지질이 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); 및 콜레스테롤로부터 선택되는 입자.
구현예 107: 구현예 104의 입자로서, 양이온성 지질이 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)이고, 중성 지질이 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)인 입자.
구현예 108: 구현예 104 내지 106 중 어느 하나의 입자로서, 인지질-중합체 접합체가 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌글리콜(DPG-PEG); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DSG-PEG); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DSG-PEG); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DMG-PEG); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DMG-PEG), 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG-아민)으로부터 선택되는 입자.
구현예 109: 구현예 104 내지 108 중 어느 하나의 입자로서, 인지질-중합체 접합체가 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-5000](DSPE-PEG5K); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DPG-PEG2K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DSG-PEG5K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DSG-PEG2K); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DMG-PEG5K); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DMG-PEG2K)으로부터 선택되는 것인 입자.
구현예 110: 구현예 104의 입자로서, 양이온성 지질이 COATSOME® SS-OC를 포함하고, 하나 이상의 헬퍼 지질이 콜레스테롤(Chol) 및 DSPC를 포함하고, 인지질-중합체 접합체가 DPG-PEG2000을 포함하는 것인 입자.
구현예 111: 구현예 110의 입자로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-25%, C = 20%-30% 및 D = 0%-3%이며, A+B+C+D = 100%인 입자.
구현예 112: 구현예 110의 입자로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-50%, B = 20%-25%, C = 25%-30% 및 D = 0%-1%이고 A+B+C+D = 100%인 입자.
구현예 113: 구현예 110의 입자로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 49:22:28.5:0.5인 입자.
구현예 114: 구현예 110의 입자로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-30%, C = 20%-45% 및 D = 0%-3%이고 A+B+C+D = 100%인 입자.
구현예 114A: 구현예 110의 입자로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-30%, C = 25%-45% 및 D = 0%-3%이고, A+B+C+D = 100%인 입자.
구현예 114B: 구현예 110의 입자로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-55%, B = 10%-20%, C = 30%-40% 및 D = 1%-2%이고, A+B+C+D = 100%인 입자.
구현예 115: 구현예 110의 입자로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-50%, B = 10%-15%, C = 35%-40% 및 D = 1%-2%이고, A+B+C+D = 100%인 입자.
구현예 116: 구현예 110의 입자로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 49:11:38.5:1.5인 입자.
구현예 116A: 구현예 110의 입자로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-65%, B = 5%-20%, C = 20%-45% 및 D = 0%-3%이고, A+B+C+D = 100%인 입자.
구현예 116B: 구현예 110의 입자로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 50%-60%, B = 5%-15%, C = 30%-45% 및 D = 0%-3%이고, A+B+C+D = 100%인 입자.
구현예 116C: 구현예 110의 입자로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 55%-60%, B = 5%-15%, C = 30%-40% 및 D = 1%-2%이고, A+B+C+D = 100%인 입자.
구현예 116D: 구현예 110의 입자로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 55%-60%, B = 5%-10%, C = 30%-35% 및 D = 1%-2%이고, A+B+C+D = 100%인 입자.
구현예 116E: 구현예 110의 입자로서, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 58:7:33.5:1.5인 입자.
구현예 117: 구현예 100 내지 116E 중 어느 하나의 입자로서, LNP는 표 5로부터 선택되는 지질 제형을 포함하는 입자.
구현예 118: 구현예 104의 입자로서, 양이온성 지질이 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)이고, 중성 지질이 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)인 입자.
구현예 119: 구현예 104 또는 118의 입자로서, 인지질-중합체 접합체를 추가로 포함하고, 인지질-중합체 접합체가 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리(에틸렌글리콜)(DSPE-PEG) 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG-아민)인 입자.
구현예 120: 구현예 104 내지 119 중 어느 하나의 입자로서, 히알루로난이 LNP의 표면에 접합되는 입자.
구현예 121: 구현예 104 내지 119 중 어느 하나의 입자로서, 페이로드 분자를 암호화하는 제2 재조합 RNA 분자를 추가로 포함하는 입자.
구현예 122: 구현예 121의 입자로서, 제2 재조합 RNA 분자가 레플리콘인 입자.
구현예 123: 구현예 122의 입자로서, 제2 재조합 RNA 분자가 알파바이러스 레플리콘인 입자.
구현예 124: 구현예 104 내지 123 중 어느 하나에 따른 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료학적 조성물.
구현예 125: 구현예 124의 치료학적 조성물로서, 복수의 LNP가 약 50nm 내지 약 500nm, 약 150nm 내지 약 500nm, 약 200nm 내지 약 500nm, 약 300nm 내지 약 500nm, 약 350nm 내지 약 500nm, 약 400nm 내지 약 500nm, 약 425nm 내지 약 500nm, 약 450nm 내지 약 500nm, 또는 약 475nm 내지 약 500nm의 평균 크기를 갖는, 치료학적 조성물.
구현예 125A: 구현예 124의 치료학적 조성물로서, 복수의 LNP가 약 50nm 내지 약 120nm의 평균 크기를 갖는 치료학적 조성물.
구현예 125B: 구현예 124의 치료학적 조성물로서, 복수의 LNP가 약 50nm, 60nm, 70nm, 80nm, 90nm, 100nm, 110nm, 또는 약 120nm의 평균 크기를 갖는 치료학적 조성물.
구현예 125C: 구현예 124의 치료학적 조성물로서, 복수의 LNP가 약 100nm의 평균 크기를 갖는 치료학적 조성물.
구현예 126: 구현예 124 내지 125C 중 어느 하나의 치료학적 조성물로서, 복수의 LNP가 약 40mV 내지 약 -40mV, 약 20mV 내지 약 -20mV, 약 10mV 내지 약 -10mV, 약 5mV 내지 약 -5mV, 또는 약 20mV 내지 약 -40mV 사이의 평균 제타 전위를 갖는 치료학적 조성물.
구현예 127: 구현예 124 내지 125C 중 어느 하나의 치료학적 조성물로서, 복수의 LNP가 약 -20mV 미만, 약 -30mV 미만, 약 -35mV 미만, 또는 약 -40mV 미만의 평균 제타 전위를 갖는 치료학적 조성물.
구현예 128: 구현예 124 내지 125C 중 어느 하나의 치료학적 조성물로서, 복수의 LNP가 약 -50mV 내지 약 -20mV, 약 -40mV 내지 약 -20mV, 또는 약 -30mV 내지약 -20mV 사이의 평균 제타 전위를 갖는, 치료학적 조성물.
구현예 129: 구현예 124 내지 125C 중 어느 하나의 치료학적 조성물로서, 복수의 LNP가 약 -30mV, 약 -31mV, 약 -32mV, 약 -33mV, 약 -34mV, 약 -35mV, 약 -36mV, 약 -37mV, 약 -38mV, 약 -39mV 또는 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는, 치료학적 조성물.
구현예 130: 구현예 124 내지 129 중 어느 하나의 치료학적 조성물로서, 대상체에게 조성물의 전달이 캡슐화된 재조합 RNA 분자를 표적 세포로 전달하고, 여기서 캡슐화된 재조합 RNA 분자는 표적 세포를 용해할 수 있는 감염성 바이러스를 생산하는 치료학적 조성물.
구현예 131: 구현예 130의 치료학적 조성물로서, 정맥내 또는 종양내 전달을 위해 제형화된 치료학적 조성물.
구현예 132: 구현예 131의 치료학적 조성물로서, 표적 세포가 암성 세포인 치료학적 조성물.
구현예 133: 구현예 54 내지 86 중 어느 하나의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 무기 입자.
구현예 134: 구현예 133의 무기 입자로서, 금 나노입자(GNP), 금 나노막대(GNR), 자기 나노입자(MNP), 자기 나노튜브(MNT), 탄소 나노혼(CNH), 탄소 풀러렌, 탄소 나노튜브(CNT), 인산 칼슘 나노입자(CPNP), 중간다공성 실리카 나노입자(MSN), 실리카 나노튜브(SNT), 또는 성상 중공 실리카 나노입자(SHNP)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 무기 입자.
구현예 135: 구현예 133의 무기 입자로서, 페이로드 분자를 암호화하는 제2 재조합 RNA 분자를 추가로 포함하는 무기 입자.
구현예 136: 구현예 135의 입자로서, 제2 재조합 RNA 분자가 레플리콘인 입자.
구현예 137: 구현예 133 내지 136 중 어느 하나의 무기 입자를 포함하는 조성물로서, 입자의 평균 직경이 약 500nm 미만, 약 50nm 내지 약 500nm 사이, 약 250nm 내지 약 500nm 사이, 또는 약 350nm인 조성물.
구현예 138: 구현예 1 내지 41, 100 내지 123 또는 133 내지 136 중 어느 하나의 입자, 구현예 54 내지 86 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자, 또는 이의 조성물에 암성 세포를, 이 암성 세포로 상기 입자의 세포내 전달에 충분한 조건하에, 노출시키는 것을 포함하는 암성 세포를 사멸시키는 방법으로서, 캡슐화된 폴리뉴클레오타이드에 의해 생산된 복제-적격 바이러스가 암성 세포의 사멸을 초래하는 방법.
구현예 139: 구현예 138의 방법으로서, 복제-적격 바이러스가 비암성 세포에서 생산되지 않는 방법.
구현예 140: 구현예 138 또는 139의 방법으로서, 생체내, 시험관내 또는 생체외에서 수행되는 방법.
구현예 141: 구현예 1 내지 41, 100 내지 123, 또는 133 내지 136 중 어느 하나의 입자, 구현예 54 내지 86 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자, 또는 이의 조성물의 유효량을 암을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체의 암을 치료하는 방법.
구현예 142: 구현예 141의 방법으로서, 입자 또는 이의 조성물이 정맥내, 비강내, 흡입제로서 투여되거나, 또는 종양 내로 직접 투여되는 방법.
구현예 143: 구현예 141 또는 142의 방법으로서, 입자 또는 이의 조성물이 대상체에게 반복적으로 투여되는 방법.
구현예 144: 구현예 141 내지 143 중 어느 하나의 방법으로서, 대상체가 마우스, 랫트, 토끼, 고양이, 개, 말, 비-인간 영장류 또는 인간인 방법.
구현예 145: 구현예 141 내지 144 중 어느 하나의 방법으로서, 암이 폐암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암, 고환암, 결장직장암, 결장암, 췌장암, 간암, 위암, 두경부암, 갑상선암, 악성 신경교종, 교모세포종, 흑색종, B 세포 만성 림프구성 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 육종, 신경모세포종, 횡문근육종, 수모세포종, 방광암, 및 변연부 림프종(MZL)으로부터 선택되는 방법.
구현예 146: 구현예 145의 방법으로서, 폐암이 소세포 폐암 또는 비-소세포 폐암인 방법.
구현예 147: 구현예 145의 방법으로서, 간암이 간세포 암종(HCC)인 방법.
구현예 148: 구현예 145의 방법으로서, 전립선암이 치료-유발 신경내분비 전립선암인 방법.
구현예 148A: 구현예 141 내지 148 중 어느 하나의 방법으로서, 암이 신경내분비 암인 방법.
실시예
다음 실시예는 본 개시내용의 다양한 구현예를 예시하기 위해 제공되며 어떠한 방식으로도 본 개시내용을 제한하려는 것이 아니다. 본 실시예는 본원에 기재된 방법과 함께 현재 바람직한 구현예를 대표하고; 예시적이며; 본 개시내용의 범위에 대한 제한으로서 간주되지 않는다. 본원의 변화 및 청구범위에 의해 한정되는 본 개시내용의 취지 내에 포함된 기타 용도는 본 기술분야의 기술자에게 생각나는 것일 것이다.
실시예 1: 재조합 RNA 분자로부터 감염성 피코나바이러스 바이러스의 생산
재조합 RNA 분자로부터 감염성 SVV 바이러스를 생산하는 능력을 평가하기 위해 실험을 수행했다. 간단히 말하면, SVV 바이러스 게놈을 포함하는 RNA 폴리뉴클레오타이드는 시험관내 T7 전사에 의해 생성했고, 293T 세포는 Lipofectamine RNAiMax 중 SVV RNA 작제물 1μg으로 4시간 동안 형질감염시켰고, 세포를 세척하고, 완전 배지를 각 웰에 첨가하였다. 형질감염된 293T로부터의 상청액은 72시간 후에 수집했고, 0.45 μM 필터로 주사기 여과하였고, NCI-H1299 세포 상에 연속 희석하였다. 48시간 후, NCI-H1299 배양물로부터 상청액을 제거하고 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 바이러스 감염성를 평가했다. 도 1b에 도시된 바와 같이, SVV-WT 게놈을 포함하는 RNA 분자는 활성 용해성 바이러스를 생산했다.
또한, 1μg의 SVV-WT RNA 지질, SVV-WT 플라스미드 DNA, 또는 SVV-음성 pDNA 대조군으로 처리된 NCI-H1299 세포의 상청액을 72시간 후에 수집했고 미감염된 NCI-H1299 세포 상에 연속 희석하였다. 세포 생존력 분석은 표준 프로토콜에 따라 수행했다. 도 2에 도시된 바와 같이, SVV-WT RNA/LNP는 시험관내에서 종양 세포 용해를 초래하는 감염성 바이러스를 생산할 수 있다.
실시예 2: SVV-암호화 RNA의 정맥내 전달을 위한 지질 나노입자의 제형
SVV 게놈을 포함하는 재조합 RNA 분자를 생체내 RNA 전달을 위한 지질 나노입자에 제형화했다.
지질 나노입자 생산 :
다음 지질을 지질 나노입자의 제형에 사용했다:
(a) D-Lin-MC3-DMA(MC3);
(b) N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP)
(c) COATSOME® SS-LC(이전 명칭: SS-18/4PE-13);
(d) COATSOME® SS-EC(이전 명칭: SS-33/4PE-15);
(e) COATSOME® SS-OC;
(f) COATSOME® SS-OP;
( g) 디((Z)-논-2-엔-1-일)9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L-319)
(h) 콜레스테롤;
(i) 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC);
(j) 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE);
(k) 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC);
(l) 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE);
(m) 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-5000](DSPE-PEG5K);
(n) 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DPG-PEG2K);
(o) 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DSG-PEG2K); 및
(p) 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DMG-PEG2K).
지질은 하기 표 5에 제시된 다양한 비율로 에탄올에서 제조했다. 그 다음, 미세유체 미세혼합물(Precision NanoSystems, 브리티시 콜롬비아주 밴쿠버)을 2 mL/min의 혼합 유속(에탄올, 지질 혼합물의 경우 0.5mL/min 및 수성 완충액, RNA의 경우 1.5 mL/min)으로 사용하여 RNA 지질 나노입자를 생성하였다. 생성된 입자를 Ca 및 Mg를 함유하는 PBS로 접선 유동 여과에 의해 세척하였다. 예시적인 SVV LNP 제형은 표 5에 제공된다. 달리 명시되지 않는 한, 캡슐화된 RNA 게놈은 각각 5' 해머헤드 리보자임 및 3' 델타 간염 리보자임을 포함하는 IVT 주형으로부터 생성하였다.
[표 5]
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
지질 나노입자의 물리적 특성의 분석 : 표 5의 지질 나노입자의 물리적 특성은 접선 유동 여과 전후에 평가했다. 입자 크기 분포 및 제타 전위 측정은 Malvern Nano-ZS Zetasizer(Malvern Instruments Ltd, 영국 우스터셔)를 사용하여 광 산란에 의해 결정했다. 크기 측정은 pH 7.4의 HBS에서 수행했고 제타 전위 측정은 pH 7.4의 0.01M HBS에서 수행했다. RNA 포획의 백분율은 Ribogreen 검정에 의해 측정하였다. 80% 초과의 RNA 포획을 보이는 지질 나노입자를 생체내에서 시험했다
다양한 지질 나노입자 제형의 물리적 특성은 하기 표 6에 제시된다.
[표 6]
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
도 3a 내지 도 3d 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 지질 조성 및 지질 비율의 변동은 나노입자 크기 및/또는 RNA 포획을 변경시킨다. 80% 초과의 RNA 포획을 나타낸 지질 나노입자는 하기 기재된 실시예 4 내지 18에서 생체내 시험하였다.
실시예 3: SVV-암호화 RNA를 포함하는 지질 나노입자는 감염성 바이러스를 생산하고 생체내 종양 성장을 억제한다
마우스에서 종양 성장을 억제하기 위해 생체내에서 감염성 바이러스를 생산하는 SVV-WT RNA를 포함하는 지질 나노입자의 능력을 결정하기 위해 실험을 수행하였다.
SVV RNA 지질 나노입자의 생산, 제형화 및 물리적 특성의 분석은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행했으며, 이하 표 7에 정리하였다.
[표 7]
Figure pct00020
종양 성장을 억제하는 SVV RNA 지질 나노입자의 능력은 H1299 이종이식편 모델을 사용하여 평가했다. 간단히 말하면, 5x106 NCI-H1299 세포를 0.1 mL의 무혈청 DPBS 및 Matrigel(1:1 v/v)에 현탁하고 8주령의 암컷 무흉선 누드 마우스(Charles River Laboratories)의 오른쪽 옆구리에 피하 접종했다. 마우스를 무작위로 실험 그룹에 할당하고 종양 크기 중앙값이 약 150mm3 (120 내지 180mm3 범위)에 도달할 때 치료를 시작했다.
SVV-WT RNA (5 μg/용량)를 함유하는 지질 나노입자 2회 용량을 1일 및 8일차에 정맥내 투여하였다. 전자 캘리퍼스를 사용하여 종양 부피를 주당 3회 측정하였다. 16일차에, 감염성 바이러스의 평가를 위해 종양을 수확하였다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, SVV-WT 지질 나노입자로 처리된 마우스는 PBS로 처리된 마우스와 비교하여 종양 성장의 유의적인 감소를 나타냈다(이원(two way) RM ANOVA, p <0.0.001). 또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, SVV-WT 지질 나노입자 처리는 체중에 영향을 미치지 않았으며, 이는 지질 나노입자가 정맥내 투여 시 무독성임을 시사한다. 도 5a 및 도 5b는 SVV-WT 지질 나노입자의 정맥내 투약 후 종양으로부터 감염성 SVV의 회수를 보여준다.
실시예 4: 기능 획득 SVV 암호화 RNA를 포함하는 입자는 종양 성장을 억제했다
마우스에서 종양 성장을 억제하기 위해 생체내에서 감염성 바이러스를 생산하는 기능 획득(gain-of-function) 돌연변이(SVV-S177A)를 갖는 SVV 암호화 RNA 분자를 포함하는 지질 나노입자의 능력을 결정하기 위해 실험을 수행하였다.
SVV RNA 지질 나노입자의 생산, 제형화 및 물리적 특성의 분석은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행했으며, 하기 표 8에 정리하였다.
[표 8]
Figure pct00021
종양 성장을 억제하는 SVV RNA 지질 나노입자의 능력은 실시예 3에 상세히 기재된 H1299 이종이식편 모델을 사용하여 평가했다. 간단히 말하면, 5x106 NCI-H1299 세포를 8주령의 암컷 무흉선 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하로 접종했다. 마우스를 무작위로 4개의 실험 그룹으로 할당했다: (i) PBS 단독, (ii) SVV-음성(SVV-Neg, 제형 ID: 70009-1.C), (iii) SVV(야생형, 제형 ID: 70009-2.C) 및 (iv) SVV-S177A(제형 ID: 70009-3.C). SVV-Neg 지질 나노입자는 복제할 수 없지만, SVV-WT 및 SVV-S177A RNA와 크기가 유사한 RNA 분자로 구성되었다. 종양 크기 중앙값이 약 150 mm3에 도달했을 때, 지질 나노입자(5 ㎍/용량)를 1일차에 정맥내 투여했고, 그 다음 6일, 11일 및 16일차에 추가 처리하였다. 종양 부피는 전자 캘리퍼스를 사용하여 주 3회 측정했다. 22일차에, 마우스를 희생시키고 종양 및 간 조직을 수확하여, qRT-PCR을 사용하여 마이너스 가닥 SVV RNA(복제성 SVV에 대한 대리 마커)의 존재를 측정함으로써 복제하는 감염성 바이러스의 존재를 결정했다.
도 6a에 나타낸 바와 같이, SVV-WT 또는 SVV-S177A 지질 나노입자로 처리된 마우스는 SVV-Neg 지질 나노입자 또는 PBS로 처리된 마우스에 비해 종양 성장을 유의적으로 억제하였다(p < 0.05, 이원 ANOVA). SVV 지질 나노입자의 투여는 연구 과정 전반에 걸쳐 체중에 최소한의 영향을 미쳤고(도 6b), 이는 SVV 암호화 RNA 분자를 포함하는 지질 나노입자가 무독성이고 내약성이 좋다는 것을 암시한다.
SVV-WT 또는 SVV-S177A RNA 분자를 포함하는 지질 나노입자로 처리된 마우스의 종양 조직에서는 SVV의 활성 복제가 검출되었다(도 6c). 중요한 것은, 종양 조직에서 감염성 바이러스를 생성할 수 있는 지질 나노입자를 투여받은 마우스를 포함한 임의의 치료 그룹의 간 조직에서는 활성 바이러스 복제가 발생하지 않았다는 것이다(도 6d).
실시예 5: SVV 암호화 RNA 분자를 포함하는 지질 나노입자는 종양 성장을 억제한다
감염성 바이러스를 생성하고 생체내에서 종양 성장을 억제하는 SVV-암호화 RNA 분자를 포함하는 지질 나노입자의 능력을 결정하기 위해 실험을 수행하였다.
SVV RNA 지질 나노입자 생산, 제형화 및 물리적 특성의 분석은 실시예 2 및 이하 표 9에 기재되어 있다.
[표 9]
Figure pct00022
종양 성장을 억제하는 SVV RNA 지질 나노입자의 능력은 실시예 4에 더 상세히 설명되어 있는 H1299 이종이식편 모델을 사용하여 평가하였다. 간단히 말하면, 5x106 H1299 세포를 무흉선 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 종양 크기 중앙값이 약 150mm3에 도달할 때, 1일 및 6일차에 MC-3, SS-LC 또는 SS-EC 이온화가능한 지질을 포함하는 SVV 지질 나노입자(상기 표 9에 제시된 제형) 5μg의 2회 용량을 마우스의 정맥내로 투여했다. 종양 부피는 전자 캘리퍼스를 사용하여 주 3회 측정하였다. 12일차에, 종양 조직을 수확하고 qRT-PCR을 사용하여 마이너스 가닥 SVV RNA(복제성 SVV에 대한 대리 마커)의 존재에 대해 분석했다.
도 7에 나타낸 바와 같이, MC3 기반 지질 나노입자(제형 ID: 70053-1.C)로 처리된 마우스는 PBS로 처리된 마우스와 비교하여 종양 성장의 유의적인 억제를 입증했다(분산을 비교하는 F 시험 **p<0.01). 그러나, SS-LC 기반 또는 SS-EC 기반의 지질 나노입자(제형 ID: 70053-2.C, 70059-1.C 또는 70059-2.C)는 종양 성장에 대한 억제 효과가 없었다. 이러한 데이터는 MC3 기반의 지질 나노입자는 SVV 암호화 RNA 분자를 종양 조직으로 전달하여 생체내에서 감염성 바이러스의 생산 및 종양용해를 초래한다는 것을 암시한다.
실시예 6: 소세포 폐암에서 SVV 암호화 RNA를 포함하는 지질 나노입자의 생체내 효능
생체내에서 감염성 바이러스를 생산하고 소세포 폐암(SCLC) 성장을 억제하는 SVV-암호화 RNA 분자를 포함하는 지질 나노입자의 능력을 결정하기 위해 실험을 수행했다.
SVV RNA 지질 나노입자 생산, 제형화 및 물리적 특성의 분석은 실시예 2 및 이하 표 10에 기재된다.
[표 10]
Figure pct00023
SCLC에 대한 SVV 암호화 RNA 지질 나노입자의 생체내 효능은 H82 이종이식편 모델을 사용하여 시험했다. 간단히 말하면, NCI-H82 세포(무혈청 PBS와 Matrigel®의 1:1 혼합물에 1x106 세포/0.1mL)를 8주령의 암컷 무흉선 누드 마우스(Charles River Laboratories)의 오른쪽 옆구리에 피하 접종했다. 마우스는 종양 크기 중앙값이 약 150mm3(120 내지 180mm3 범위)에 도달했을 때 치료를 시작했고, 1일, 6일, 11일 및 16일차에 10μg의 SVV-WT 지질 나노입자(제형 ID: 70087-1C)를 정맥내 투여하거나, 또는 1일 및 4일차에 Lipofectamine RNAiMax로 제형화된 SVV-WT RNA(양성 대조군) 1μg을 종양내 투여했다. 전자 캘리퍼스를 사용하여 주 3회 종양 부피를 측정했다.
도 8에 도시된 바와 같이, SVV-WT 지질 나노입자 또는 리포펙타민-제형화된 SVV-WT RNA로 처리된 마우스는 PBS로 처리된 마우스에 비해 종양 성장의 유의적인 억제를 나타냈다(이원 ANOVA p<0.05). 이러한 결과는 SVV 암호화 RNA 분자를 포함하는 지질 나노입자의 정맥내 투여 또는 리포펙타민 제형화된 SVV 암호화 RNA 분자의 종양내 투여가 종양 조직에서 바이러스 복제를 효과적으로 개시하여 종양 세포 용해를 초래한다는 것을 나타낸다.
실시예 7: 지질 조성의 변동은 SVV 암호화 RNA 나노입자의 항종양 활성을 변경시킬 수 있다.
SVV-암호화 RNA 분자를 포함하는 나노입자의 지질 조성이 생체내 바이러스 복제 및 항종양 활성에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 실험을 수행하였다.
SVV RNA 지질 나노입자 생산, 제형화 및 물리적 특성의 분석은 실시예 2 및 이하 표 11에 기재된다.
[표 11]
Figure pct00024
종양 성장을 억제하는 SVV RNA 지질 나노입자의 능력은 실시예 4에 상세히 설명되어 있는 H1299 이종이식편 모델을 사용하여 평가했다. 간단히 말하면, 5x106 NCI-H1299 세포를 무흉선 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 종양 크기 중앙값이 약 150mm3에 도달하면 1일 및 6일차에 5μg의 지질 나노입자(상기 표 11에 제시된 제형)를 정맥내로 투여했다. 종양 부피는 전자 캘리퍼스를 사용하여 주당 3회 측정했다. 12일차에, 종양 조직을 수확하고 qRT-PCR을 사용하여 마이너스 가닥 SVV RNA(복제성 SVV에 대한 대리 마커)의 존재에 대해 분석했다.
도 9a에 도시된 바와 같이, MC3 기반 및 OC 기반 지질 나노입자(제형 ID: 70077-3.C, 70077-4.C, 70077-8.C, 70077-10.C, 및 70077-11.C) 둘 모두로 처리된 마우스는 PBS로 처리된 마우스에 비해 종양 성장을 유의적으로 억제했다(이원 ANOVA, Tukey의 다중 비교 시험, ****: p<0.0001 대 PBS). 상이한 지질 나노입자 제형으로 처리된 마우스의 종양 조직은 마이너스 가닥 SVV RNA의 존재를 보여주었고, 이는 SVV-WT RNA 지질 나노입자의 정맥내 투여가 종양 조직에서 바이러스 복제를 유도했음을 확인시켜 주었다(도 9d). MC3 기반의 지질 나노입자는 체중 감소 및 간 효소 AST 및 ALT의 증가를 유발한 반면, OC 기반의 지질 나노입자는 이러한 매개 변수에 영향을 미치지 않았다(도 9b 및 도 9c). 종합적으로, 이러한 데이터는 OC 기반의 지질 나노입자 제형이 종양 성장을 유의적으로 억제했고 마우스에서 내약성이 좋았음을 나타냈다.
실시예 8: PEG 조성물은 지질 나노입자 항종양 활성을 변경시킨다
SVV 암호화 RNA 분자를 포함하는 지질 나노입자의 PEG 조성이 생체내 바이러스 복제 및 항종양 활성에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 실험을 수행하였다.
SVV RNA 지질 나노입자 생산, 제형화 및 물리적 특성의 분석은 실시예 2 및 이하 표 12에 기재된다.
[표 12]
Figure pct00025
종양 성장을 억제하는 SVV RNA 지질 나노입자의 능력은 실시예 4에 상세히 설명된 H1299 이종이식편 모델을 사용하여 평가했다. 간단히 말하면, 5x106 NCI-H1299 세포를 무흉선 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 종양 크기 중앙값이 약 150mm3에 도달하면 마우스에 SVV 암호화 RNA 분자를 함유하는 지질 나노입자(5 μg/용량) 2회 용량을 1일, 6일, 11일 및 16일차에 정맥내로 투여했다. 종양 부피는 전자 캘리퍼스를 사용하여 주 3회 측정했다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 제형 70087-1.C 및 70087-4.C(표 12)로 처리된 마우스는 PBS로 처리된 마우스와 비교하여 종양 성장의 유의적인 억제를 입증했다 (이원 ANOVA, Tukey의 다중 비교 시험, ****: p<0.0001 및 ***: p<0.001 대 PBS). 제형 70087-2.C 및 70087-3.C는 제형화에 사용된 PEG화된 지질의 유형에서만 70087-4.C와 상이하다(표 12). 이러한 발견은 PEG화된 지질의 유형이 SVV 암호화 RNA 나노입자의 항종양 활성에 유의적인 영향을 미칠 수 있음을 암시한다.
실시예 9: PEG 조성은 OC 기반의 지질 나노입자 항종양 활성을 변경시킨다
SVV 암호화 RNA 분자를 포함하는 지질 나노입자의 PEG 조성이 생체내 바이러스 복제 및 항종양 활성에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 실험을 수행하였다.
SVV RNA 지질 나노입자 생산, 제형화 및 물리적 특성의 분석은 실시예 2 및 이하 표 13에 기재된다.
[표 13]
Figure pct00026
종양 성장을 억제하는 SVV RNA 지질 나노입자의 능력은 실시예 4에 상세히 설명된 H1299 이종이식편 모델을 사용하여 평가했다. 간단히 말하면, 5x106 NCI-H1299 세포를 무흉선 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 투여하였다. 종양 크기 중앙값이 약 150mm3에 도달하면, 마우스에게 DSPE-PEG5K, 또는 DPG-, DMG- 또는 DSG-PEG2K를 함유하는 SVV RNA 지질 나노입자(표 13에 제시된 제형) 5μg을 정맥내 투여했다. 처리 72시간 후 마우스로부터 종양 조직을 수집하고 qRT-PCR을 사용하여 마이너스 가닥 SVV RNA(복제성 SVV에 대한 대리 마커)의 존재에 대해 분석했다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 제형에 사용된 PEG 유형은 SVV 게놈을 종양 조직에 효율적으로 전달하는 나노입자의 능력을 변경할 수 있다. 제형 80010-2.C, 80010-3.C 및 80010-4.C로 처리된 마우스의 종양은 더 많은 수의 SVV 마이너스(-) 가닥 또는 SVV 복제를 나타냈다. 제형 80010-2.C, 80010-3.C, 80010-4.C 및 80010-5.C는 제형에 사용된 지질-PEG의 유형 및 백분율만이 서로 다르다. 이것은 PEG 유형의 선택과 사용된 백분율이 이러한 나노입자의 생물학적 활성에 유의적인 영향을 미칠 수 있음을 입증했다.
실시예 10: 이온화가능한 지질 조성물은 지질 나노입자 항종양 활성을 변경한다
이온화가능한 지질 조성물이 생체내에서 SVV-암호화 RNA 분자를 포함하는 지질 나노입자의 항종양 활성에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 실험을 수행 하였다.
지질 나노입자 생산, 제형화 및 SVV RNA 지질 나노입자의 물리적 특성 분석에 대한 설명은 실시예 2 및 이하 표 14에 기재된다.
[표 14]
Figure pct00027
종양 성장을 억제하는 SVV RNA 나노입자의 이온화가능한 지질 조성의 능력은 실시예 4에 상세히 설명된 H1299 이종이식편 모델을 사용하여 평가했다. 간단히 말하면, 5x106 NCI-H1299 세포를 무흉선 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 투여했다. 종양 크기 중앙값이 약 150mm3에 도달하면, 마우스에게 SS-OC(제형 ID: 80033-1.C), SS-LC(제형 ID: 80033-2.C), 또는 SS-OP(제형 ID:80033-3.C) 이온화가능한 지질을 포함하는 SVV-S177A RNA 지질 나노입자 1 mg/kg을 연구 1일 및 8일차에 정맥내 투여했다. 종양 부피는 전자 캘리퍼스를 사용하여 주당 3회 측정했다.
도 12에 도시된 바와 같이, SS-OC 기반 또는 SS-OP 기반 지질 나노입자로 처리된 마우스는 PBS 또는 SS-LC 기반 지질 나노입자로 처리된 마우스에 비해 종양 성장의 유의적인 억제를 나타냈다(이원 ANOVA, Tukey의 다중 비교 시험, *p<0.05, **p<0.001 vs. PBS). 이러한 결과는 이온화가능한 지질 조성이 생체내 SVV RNA 지질 나노입자의 항종양 활성에 영향을 미친다는 것을 입증한다.
실시예 11: 소세포 폐암에서 SVV 암호화 RNA 분자를 포함하는 지질 나노입자의 생체내 효능
생체내에서 감염성 바이러스를 생산하고 소세포 폐암(SCLC) 성장을 억제하는 SVV-암호화 RNA 분자를 포함하는 지질 나노입자의 능력을 결정하기 위해 실험을 수행하였다.
SVV RNA 지질 나노입자 생산, 제형화 및 물리적 특성의 분석은 실시예 2 및 이하 표 15에 기재된다.
[표 15]
Figure pct00028
SCLC에 대한 SVV 암호화 RNA 지질 나노입자의 생체내 효능은 H446 이종이식편 모델을 사용하여 시험하였다. 간단히 말하면, NCI-H446 세포(무혈청 PBS 및 Matrigel®의 1:1 혼합물 중 5x106 세포/0.1 mL)를 8주령 암컷 무흉선 누드 마우스(Charles River Laboratories)의 오른쪽 옆구리에 피하 접종했다. 종양 크기 중앙값이 약 150mm3(120 내지 180mm3 범위)에 도달하면, 마우스에 1 mg/kg의 SVV-Neg (제형 ID: 80059-1.C) 또는 SVV-S177A(제형 ID: 80059-2.C) RNA 지질 나노입자 또는 PBS를 1일, 8일 및 15일차에 정맥내 투여했다. 종양 부피는 전자 캘리퍼스를 사용하여 주 3회 측정했다. 22일차에, 종양을 수확하고 qRT-PCR을 사용하여 마이너스 가닥 SVV RNA(복제성 SVV에 대한 대리 마커)의 존재에 대해 분석했다.
도 13a에 나타낸 바와 같이, SVV-S177A 지질 나노입자로 처리된 마우스는 SVV-Neg 지질 나노입자 또는 PBS로 처리된 마우스와 비교하여 종양 성장의 유의적인 억제를 입증했다(이원 ANOVA, p<0.0.001). 중요한 것으로, SVV-암호화 RNA 지질 나노입자의 정맥내 투여가 체중에 영향을 미치지 않았으며, 이는 이들 제제가 무독성이고 내약성이 좋다는 것을 암시한다(도 13b). SVV-S177A RNA 지질 나노입자로 처리된 마우스의 종양 조직은 마이너스 가닥 SVV RNA의 존재를 보여주었고, 이는 SVV-S177A RNA 지질 나노입자의 정맥내 투여가 종양 조직에서 바이러스 복제를 유도했음을 나타낸다(도 13c). 이러한 결과는 SVV-S177A RNA 지질 나노입자의 전신 투여가 생체내에서 SVV 복제 및 SCLC 세포의 용해를 유도한다는 것을 입증한다.
실시예 12: 종양 성장에 대한 SVV-IRES2 RNA 지질 나노입자의 생체내 효능
SVV-IRES2 RNA를 함유하는 지질 나노입자가 생체내에서 종양 성장을 억제할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 실험을 수행하였다.
SVV RNA 지질 나노입자 생산, 제형화 및 분석은 실시예 2 및 이하 표 16에 기재된다.
[표 16]
Figure pct00029
종양 성장을 억제하는 SVV-WT 및 SVV-IRES2 지질 나노입자의 능력은 실시예 4에 상세히 설명된 H1299 이종이식편 모델을 사용하여 평가했다. 간단히 말하면, 5x106 NCI-H1299 세포를 무흉선 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 투여했다. 종양 크기 중앙값이 약 150mm3에 도달하면, 마우스에게 SVV-WT(제형 ID: 80130-1.C) 또는 SVV-IRES2(제형 ID: 80130-2.C) RNA 분자를 함유하는 지질 나노입자 0.2 mg/kg을 정맥내 투여했다(1일). 연구 8일차에 PBS 또는 지질 나노입자의 후속 용량을 투여했다. 종양 부피는 전자 캘리퍼스를 사용하여 주 3회 측정했다.
도 14에 나타낸 바와 같이, SVV-WT RNA 또는 SVV-IRES2 RNA 지질 나노입자로 처리된 마우스는 PBS로 처리된 마우스에 비해 현저히 낮은 종양 부담을 나타냈다(이원 ANOVA, Tukey의 다중 비교 시험, ****p<0.0001). 이러한 결과는 SVV-WT 또는 SVV-IRES2 RNA 분자를 함유하는 지질 나노입자가 생체내에서 항종양 활성을 나타낸다는 것을 입증하고, SVV-IRES2가 최상의 항종양 효과를 입증한다.
실시예 13: SVV IRES2-암호화 RNA 분자를 함유하는 지질 나노입자는 신경모세포종 종양에서 복제할 수 있다
생체 내에서 복제하는 SVV-WT 및 SVV-IRES2 RNA 지질 나노입자의 능력을 결정하기 위해 실험을 수행하였다.
SVV RNA 지질 나노입자 생산, 제형화 및 분석은 실시예 2 및 이하 표 17에 기재된다.
[표 17]
Figure pct00030
종양 성장을 억제하는 SVV-WT 및 SVV-IRES2 지질 나노입자의 능력은 N1E-115 이종이식편 모델을 사용하여 평가했다. 간단히 말하면, N1E-115 세포(무혈청 DPBS와 Matrigel의 1:1 혼합물 중 5x105 세포/0.1mL)를 8주령 암컷 A/J 마우스(Charles River Laboratories)의 오른쪽 옆구리에 피하 접종했다. 종양 크기 중앙값이 약 150mm3(120 내지 180mm3 범위)에 도달하면, 마우스에게 0.4 mg/kg의 SVV-WT(제형 ID: 80130-1.C) 또는 SVV-IRES2(제형 ID: 80130-2.C) RNA 지질 나노입자를 정맥내 투여했다(1 일차). 지질 나노입자 처리 96시간 후 마우스로부터 종양을 수확하고 qRT-PCR을 사용하여 마이너스 가닥 SVV RNA(복제성 SVV에 대한 대리 마커)의 존재에 대해 분석했다.
도 15에 나타낸 바와 같이, SVV-WT 또는 SVV-IRES2 RNA 지질 나노입자를 투여받은 마우스는 PBS 대조군과 비교하여 10 내지 1000배 더 높은 수준의 마이너스 가닥 SVV RNA를 나타냈다. 특히, SVV-IRES2 지질 나노입자로 처리된 마우스의 종양 조직의 대부분은 SVV-WT RNA 지질 나노입자가 투여된 마우스에 비해 더 높은 수준의 SVV 복제를 나타냈다. 이러한 결과는 SVV-WT 또는 SVV-IRES2 RNA 지질 나노입자의 전신 투여가 생체내 신경모세포종 종양에서 SVV 복제를 유도한다는 것을 입증한다.
실시예 14: SVV에 대한 중화성 토끼 다클론 항체의 생성
토끼를 SVV 비리온으로 면역화하여 토끼 다클론 항체를 생성하였다. 면역화 된 토끼의 혈청에서 항-SVV 항체의 존재는 ELISA에 의해 확인했다(데이터는 제시되지 않음).
항-SVV 항체가 세포 용해를 억제할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, SVV 바이러스(1x106 TCID50/mL) 및 연속 희석(1:2)된 항-SVV 항체를 H446 세포에서 항온처리했다. H446 세포의 용해 활성은 CellTiter-Glo®에 의해 계산했다. 도 16a는 SVV가 최대 1:320 희석율의 토끼 다클론 항체에 의해 중화된다는 것을 보여준다.
토끼 항-SVV 다클론 항체의 1:100 희석물의 효과를 결정하기 위해, 상이한 농도의 SVV 바이러스 및 희석된 SVV 항체(1:100)를 H446 세포에서 항온처리하였다. 도 16b에 나타낸 바와 같이, 102 내지 107 TCID50/mL 범위의 시험된 모든 용량의 SVV 바이러스는 항-SVV 항체의 1:100 희석물에 의해 중화되었다. 1, 2 및 3 그룹은 항체 희석물의 생물학적 반복물이다.
실시예 15: SVV-RNA 지질 나노입자는 중화 혈청의 존재하에 항종양 활성을 나타낸다
SVV RNA 지질 나노입자는 생체내에서 SVV 중화 항체의 존재하에 시험하였다.
항-SVV 다클론 항체의 생성 및 시험은 실시예 14에 기재되어 있다. SVV RNA 지질 나노입자 생산, 제형화 및 분석은 실시예 2 및 이하 표 18에 기재된다.
[표 18]
Figure pct00031
SVV RNA 지질 나노입자에 의해 유도된 종양 세포 용해를 억제하는 항-SVV 항체의 능력은 실시예 4에 상세히 설명된 H1299 이종이식편 모델을 사용하여 평가했다. 간단히 말하면, H1299 종양을 보유한 누드 마우스(n = 8 마리 마우스/그룹)에게 100 μL의 SVV-RNA 지질 나노입자(제형 ID: 80139-1.C) 또는 SVV 비리온을 정맥내 투여했고 나이브 토끼 혈청(음성 대조군) 또는 항-SVV 다클론 항체는 복강내 주사했다. 종양 보유 마우스는 0일 및 7일차에 항체 2회 용량, 및 연구 1일 및 8일차에 SVV 비리온 또는 SVV RNA 지질 나노입자 2회 용량을 투여받았다. 종양 부피는 전자 캘리퍼스를 사용하여 주 3회 측정했다. 처리군은 이하 표 19에 제시된다.
[표 19]
Figure pct00032
도 17에 나타낸 바와 같이, 나이브 토끼 혈청으로 면역화된 SVV 비리온 처리된 마우스는 종양 성장의 유의적인 억제를 나타냈다(이원 ANOVA, Tukey의 다중 비교 시험, ****p<0.0001). 대조적으로, SVV 비리온 처리된 마우스에 SVV-중화 항체의 투여는 SVV의 항종양 활성을 완전하게 차단했다. SVV RNA 지질 나노입자로 처리된 마우스에 SVV 중화 항체(또는 나이브 토끼 혈청)의 투여는 SVV RNA 지질 나노입자의 항종양 활성에 영향을 미치지 않았다. SVV RNA 지질 나노입자 처리는 SVV 중화 혈청으로 처리된 마우스에서 종양 성장을 유의적으로 억제했다(이원 ANOVA, Tukey의 다중 비교 시험, ****p<0.0001). 따라서, SVV 비리온과 달리, SVV RNA 지질 나노입자의 항종양 활성은 혈행 중의 중화 항체의 존재에 의해 영향을 받지 않는다.
실시예 16: 흑색종에서 CVA21-암호화 RNA 지질 나노입자의 생체내 효능
생체내에서 감염성 바이러스를 생산하고 흑색종 종양 성장을 억제하는 CVA21-암호화 RNA 분자를 포함하는 지질 나노입자의 능력을 결정하기 위해 실험을 수행하였다. CVA21 RNA 지질 나노입자 생산, 제형화 및 분석은 실시예 2 및 이하 표 20에 기재한다.
[표 20]
Figure pct00033
종양 성장을 억제하는 CVA21 RNA 지질 나노입자의 능력은 SK-MEL28 이종이식편 모델을 사용하여 평가했다. 간단히 말하면, SK-MEL28 세포(무혈청 PBS와 Matrigel®의 1:1 혼합물 중 1x106 세포/0.1 mL)를 8주령 암컷 무흉선 누드 마우스 (Charles River Laboratories)의 오른쪽 옆구리에 피하 접종했다. 종양 크기 중앙값이 약 150mm3(120 내지 180mm3 범위)에 도달하면, 마우스에게 PBS 또는 Lipoafectime RNAiMAx로 제형화된 CVA21 암호화 RNA(1μg)를 종양내 투여하거나, 또는 CVA21 암호화 RNA 지질 나노입자(제형 ID: 70032-6C, 5μg)를 정맥내 투여했다. 마우스는 1일과 5일차에 종양내 처리를 받았거나, 1일, 6일, 11일 및 16일차에 정맥내 처리를 받았다. 종양 부피는 전자 캘리퍼스를 사용하여 주 3회 측정했다.
도 18에 도시된 바와 같이, CVA21 RNA 분자를 포함하는 LNP에 의한 정맥내 처리 또는 리포펙타민으로 제형화된 CVA21-RNA 분자의 종양내 처리는 PBS로 처리 된 마우스에 비해 종양 보유 마우스에서 종양 성장을 방지하였다(이원 ANOVA, p<0.0.001). 종합적으로, 이러한 결과는 CVA21 RNA 분자를 포함하는 지질 나노입자가 흑색종 치료에 효과적인 치료 전략임을 암시한다.
실시예 17: SVV의 별개의 3' 말단 생성 전략
전술한 바와 같이, 본원에 기술된 합성 게놈은 이 합성 게놈으로부터 복제 적격 및 감염성 바이러스를 생성하기 위해 바이러스 고유의 별개의 3' 및 5' 단부를 필요로 한다. 따라서, 시험관내 포유류 5' 및 3' UTR 존재하에 T7 RNA 중합효소에 의해 생산된 RNA 전사체는 감염성 ssRNA 바이러스의 생산에 필요한 별개의 고유한 단부를 함유하지 않는다.
3' 제한 효소 인식 서열을 사용하는 전략을 사용하여 감염성 SVV에 필요한 별개의 3'말단을 생성했다. DNA 주형의 3' 단부에 SapI 제한 인식 서열을 삽입했다. SapI은 인식 부위의 5'를 절단하여 적절한 길이의 폴리티미딘 런(run)을 생성하여 그 바이러스에 고유한 별개의 바이러스 폴리아데닐화 부위를 생성한다. 이 프로세스는 도 19에 예시된다.
실시예 18: SVV의 별개의 5' 말단 생성을 위한 RNaseH 전략
RNAseH 전략은 SVV에 고유한 별개의 5' 말단을 생성하기 위해 사용했다. T7 RNA 중합효소는 5' 단부에 구아노신 잔기를 필요로 한다. 그러나, SVV의 5' 말단은 우리딘 잔기로 시작한다. 따라서, T7 리더를 제거하여 바이러스를 위한 진정한 말단을 생성해야 한다. 도 20은 시험관내 전사(IVT) 및 5' 리더 프로세싱 접근법의 모식도이다. IVT 주형은 상단에 도시되고 생성된 RNA 전사체는 중간에 예시된다. 이 SVV +ssRNA 전사체는 그 다음 상보적인 dsDNA 올리고(파선 박스)에 어닐링되고 해당 부위는 RNaseH에 의해 가수분해된다. 정확한 5' 말단이 있는 최종 바이러스 ssRNA 생성물이 하단에 제시된다.
RNaseH 조작된 전사체의 정확한 프로세싱은 프라이머 연장 분석에 의해 평가했다. RNA 전사체는 RNaseH로 처리되거나 분해없이 방치했다. 그 다음, 상보적인 형광 프라이머를 첨가하고 상기 분해 및 미분해된 샘플에 어닐링한 다음, Superscript IV 역전사 효소로 연장시켰다. 그 다음 생성물을 TBE UREA 아크릴아미드 겔에서 분리하였다. 예상 밴드는 다음과 같았다: 미분해된 것 ≥ 150bp 및 분해된 것 = 100bp. 도 21에서 볼 수 있듯이, 이 전략은 RNaseH의 존재 하에서 분해된 밴드의 증가에 의해 예시되는 바와 같이 정확하게 프로세싱된 약 90%의 RNA를 초래한다.
이 전략은 실시예 19에 기재되는 3' 제한 효소 전략과 조합하여 감염성 SVV의 생산에 필요한 별개의 5' 및 3' 말단을 갖는 최종 합성 SVV 게놈을 생산한다.
실시예 19: SVV의 별개의 5' 말단을 생성하기 위한 리보자임 전략
리보자임 전략을 사용하여 SVV에 고유한 별개의 5' 말단을 생성했다. 이 접근법의 개략도는 도 22에 예시되며, 이는 피코나바이러스의 5' 말단에서 절단하는 리보자임의 설계를 보여준다. 도시된 2개의 리보자임은 해머헤드 리보자임 및 피스톨 리보자임이지만, 이 상황에서 특이적으로 절단하도록 다수의 다른 리보자임이 개조될 수 있다.
이 전략의 구현을 위한 해머헤드 및 피스톨 리보자임의 변형이 각각 도 23 및 도 24에 도시된다. SVV의 5' 단부를 어닐링하고 절단하는 최소 해머헤드 리보자임(HHR)의 구조 모델은 도 23a에 도시된다(이 리보자임은 화살표로 표시된 부위에서 5' 단부를 절단한다). SVV 5' 말단을 절단하기 위한 안정화된 줄기 I을 갖는 해머헤드 리보자임(STBL)의 구조 모델은 도 23b에 도시된다(이 리보자임은 화살표로 표시된 부위에서 5' 단부를 절단한다). 도 24a는 야생형(피스톨 WT)에서 발견되는 피스톨 리보자임 특성의 개략도를 보여준다. 도 24b는 P3 가닥을 융합하기 위해 첨가된 테트라루프를 이용하여 mFOLD에 의해 모델링된 P. 폴리믹사(P.Polymyxa)로부터의 피스톨 리보자임을 보여준다. 파선 박스 안의 핵산은 이 바이러스 서열의 상황에서 리보자임의 접힘을 유지하기 위해 돌연변이유발되었다. 파선 박스에 제시된 WT "GUC" 서열은 "UCA"로 돌연변이되어 피스톨 1을 생성하였고 "GUC" 서열은 "TTA"로 돌연변이되어 피스톨 2를 생성했다.
IVT 과정 동안 절단을 매개하는 4개 리보자임(HHR, STBL, 피스톨 1 및 피스톨 2) 각각의 능력을 평가하였다. IVT 주형은 HpaI로 선형화하여 미절단 케이스에서 150nt 유출을 산출했고, 리보자임 절단의 케이스에서는 약 90nt 및 약 60nt의 2개의 절단 단편을 산출하여 순차적으로 IVT 처리 이후 리보자임 효율의 판독값(readout)을 제공한다. 도 25에 나타낸 바와 같이, 리보자임 작제물이 있는 모든 반응에서는 3개의 밴드가 존재했다. 2개의 해머헤드 리보자임은 약 40 내지 60% 효율로 절단한다(STBL - 레인 3 및 HHR - 레인 4). 레인 5의 피스톨 1 리보자임은 미절단 생성물을 겔에서 볼 수 없었다. 레인 6의 피스톨 2 리보자임은 겔에서 볼 수 있는 약 5% 미절단 생성물을 나타냈다. 유사한 결과는 프라이머 연장 분석에서 수득되었다(도 26). 프라이머 연장 생성물은 TBE UREA 아크릴아미드 겔에서 분리되었다. 예상 밴드는 다음과 같았다: 미분해된 것 ≥150bp(150bp 레인 7에서 SVV-Neg의 기준 밴드 참조) 및 분해된 것 = 80bp. 피스톨 1은 레인 10에서 상부 밴드의 부재로 입증되는 완전한 절단을 초래한다.
이러한 결과는 4개의 리보자임 모두가 IVT 전사체의 절단을 매개할 수 있음을 입증한다. 그러나, 피스톨 1 및 피스톨 2 리보자임이 더 효율적이었으며, 피스톨 1이 가장 효율적이며 IVT 과정 동안 완전한 절단을 매개한다.
실시예 20: 5' 리보자임 및 3' 제한 효소 조작된 SVV 게놈의 시험관내 기능
5' 리보자임 서열 및 3' SapI 제한 효소 인식 부위에 의해 조작된 SVV 게놈의 기능을 평가하기 위해 시험관내 검정을 수행했다. 다음 IVT 주형을 사용하여 합성 SVV 게놈을 생성했다:
(a) 5’HHR 서열 및 3’SapI 인식 서열
(b) 5’피스톨 1 서열 및 3’SapI 인식 서열
H1299 세포는 1ug의 IVT 생성된 RNA와 함께 Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen)를 사용하여 형질감염시켰다. 총 RNA는 Qiagen의 QIAzol 시약 250uL을 사용하여 12 시간, 24 시간 및 36 시간째에 NCI-H1299 세포로부터 추출했다. 이 RNA로부터 cDNA를 생산하고 마이너스 가닥 특이적 Taqman 검정으로 분석했다. NCI-H1299 세포를 표시된 IVT 생성된 RNA의 고정된 양으로 형질감염시켰다. 시간이 지남에 따라 이 RNA로부터 생성된 cDNA에 대해 절대 qRT-PCR을 수행했다. H1299 세포로부터 SVV 킥오프의 초기 동역학은 Pistol1-SapI 작제물에서 크게 향상된다(도 27).
실시예 21: 종양 성장에 대한 피스톨/SapI SVV RNA 지질 나노입자의 생체내 효능
SVV-피스톨/SapI RNA 분자를 함유하는 지질 나노입자가 생체내에서 종양 성장을 억제할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 실험을 수행했다.
SVV RNA 지질 나노입자 생산, 제형화 및 분석은 실시예 2 및 이하 표 21에 기재된다.
[표 21]
Figure pct00034
종양 성장을 억제하는 SVV-HHR-HDV 및 SVV-피스톨/SapI 지질 나노입자의 능력은 실시예 4에 상세히 설명되는 H1299 이종이식편 모델을 사용하여 평가했다. 간단히 말하면, 5x106 NCI-H1299 세포를 무흉선 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 투여했다. 종양 크기 중앙값이 약 150mm3에 도달하면, 마우스에게 SVV-HHR/HDV(제형 ID: 80130-1.C) 또는 SVV-피스톨/SapI(제형 ID: 80130-3.C) RNA 분자를 함유하는 지질 나노입자 0.2 mg/kg을 정맥내 투여했다(1일). 연구 8일차에 PBS 또는 지질 나노입자의 후속 용량을 투여했다. 종양 부피는 전자 캘리퍼스를 사용하여 주 3회 측정했다.
도 28에 나타낸 바와 같이, SVV-HHR-HDV RNA 또는 SVV-피스톨/SapI RNA 지질 나노입자로 처리된 마우스는 PBS로 처리된 마우스에 비해 종양 성장을 유의적으로 억제하였다(이원 ANOVA, Tukey의 다중 비교 시험, ****p<0.0001). 또한, SVV-피스톨/SapI RNA 지질 나노입자로의 처리는 SVV-HHR RNA 지질 나노입자에 비해 종양 성장을 억제하는데 있어서 더욱 효과적이었다(이원 ANOVA, Tukey의 다중 비교 시험, ##p<0.01).
실시예 22: 변형된 리보뉴클레오타이드를 사용한 SVV-RNA의 시험관내 합성
RNA 안정성을 향상시키기 위해 변형된 리보뉴클레오타이드로 SVV-RNA를 시험관내 합성할 수 있는 가능성을 평가하기 위해 실험을 수행하였다. mCherry(유전자 발현 및 바이러스 복제에 대한 마커, SVV-mCherry)를 암호화하는 SVV 포지티브-센스 RNA의 시험관내 합성은 변형된 리보뉴클레오타이드 존재 또는 부재하에 수행했다(도 29a). 시험관내 합성된 RNA를 RNAiMax(Invitrogen, Thermo Fisher, 매사츄세츠 월텀)로 제형화하고 NCI-H1299 인간 암 폐세포에 4시간 동안 형질감염시킨 후, 세포를 세척하고 신선한 배지를 72 시간 동안 첨가했다. 적색 형광 단백질 mCherry(도 29b에서 더 밝은 음영으로 표시됨)의 존재는 바이러스 복제의 대리로서 사용되었다.
도 29a에 나타낸 바와 같이, Ψ-UTP 또는 5-m-CTP를 이용한 SVV-mCherry-RNA의 합성은 효율적이었다. 변형된 두 리보뉴클레오타이드가 조합된 경우에는 어떠한 RNA도 생성되지 않았다. 이것은 다중 변형된 리보뉴클레오타이드의 존재가 SVV-RNA의 IVT를 지원하지 않음을 시사했다. SVV-Ψ-UTP RNA 또는 SVV-5m-CTP RNA의 형질감염은 바이러스 복제를 일으키지 않았다(도 29b). 바이러스 RNA 이차 구조는 바이러스 복제를 지원하는 핵심이며, SVV의 케이스에서 RNA의 천연 이차 구조를 변경할 수 있는 변형된 리보뉴클레오타이드의 사용은 바이러스 복제를 방해한다.
실시예 23: SVV 게놈에서 페이로드 분자의 발현
페이로드 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 SVV 바이러스 게놈으로부터 발현될 수 있는지 여부를 평가하기 위해 실험을 수행했다. mCherry, 나노루시퍼라제(nanoLuciferase), CXCL10, IL-12, GM-CSF 및 FAP-CD3 BiTE 각각에 대한 발현 카세트를 SVV 게놈을 암호화하는 플라스미드에 삽입했다. H1299 세포를 0.015 pmol의 플라스미드로 형질감염시키고 상청액을 수확하고 여과하여 바이러스 입자를 수집했다. 여과된 상청액을 H446 배양물로 옮기고 감염성를 평가했다. 도 30에 나타낸 바와 같이, 각각의 페이로드 조작된 바이러스는 효능의 정도는 다양하지만 H446 세포를 감염시킬 수 있었다. 각 작제물에 대한 IC50은 아래 표 22에 제공된다. 이러한 데이터는 SVV가 바이러스의 치료 효능을 향상시키기 위해 다양한 페이로드 분자를 발현하도록 조작될 수 있음을 시사한다.
[표 22]
Figure pct00035
실시예 24: 종양 조직에서 종양 성장 및 페이로드 발현에 대한 페이로드 RNA 지질 나노입자를 암호화하는 SVV의 생체내 효능
SVV-페이로드 RNA를 함유하는 지질 나노입자가 생체내에서 종양 성장을 억제하고 종양 조직에서 페이로드 발현을 평가할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 실험을 수행했다.
SVV-Neg, SVV-WT 및 SVV-IL-36γ RNA(서열번호 11) 지질 나노입자 생산, 제형화 및 분석은 실시예 2 및 하기 표 23 및 24에 기재된다.
[표 23]
Figure pct00036
[표 24]
Figure pct00037
종양 성장을 억제하는 SVV-WT+SVV-Neg 및 SVV-WT+SVV-IL-36γ 지질 나노입자의 능력은 실시예 4에 상세히 설명된 H1299 이종이식편 모델을 사용하여 평가했다. 간단히 말하면, 5x106 NCI-H1299 세포를 무흉선 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 투여했다. 종양 크기 중앙값이 약 150 mm3에 도달하면, 마우스에게 SVV-WT + SVV-Neg(제형 ID: 80116-3.C + 80116-4.C 혼합 비율 1:1) 또는 SVV-WT + SVV-IL-36γ(제형 ID: 80116-4.C + 80116-5.C 혼합 비율 1:1) RNA 분자를 함유하는 지질 나노입자 0.2 mg/kg을 정맥내 투여했다(1일). 연구 8일차에 PBS 또는 지질 나노입자의 후속 용량을 투여했다. 종양 부피는 전자 캘리퍼스를 사용하여 주 3회 측정했다. 연구는 10일차에 종료했고 페이로드 발현 분석을 위해 종양을 수집했다.
도 31a에 도시된 바와 같이, SVV-WT + SVV-Neg 또는 SVV-WT + SVV-IL-36γ RNA 지질 나노입자로 처리된 마우스는 PBS로 처리된 마우스(이원 ANOVA, Tukey의 다중 비교 시험, ****p<0.0001)에 비해 현저히 낮은 종양 부담을 나타냈다. 이러한 결과는 SVV-WT + SVV-IL-36γ RNA 분자를 함유하는 지질 나노입자가 생체내에서 항종양 활성을 나타낸다는 것을 입증한다.
연구 종료시 수집된 종양 조직을 처리하여 종양 용해물을 생성했다. IL36γ 수준은 Elisa(R & D System, DY2320-05)에 의해 결정했다. 도 31b에 나타낸 바와 같이, 인간 IL-36γ는 SVV-WT + SVV-IL36γ RNA 지질 나노입자로 처리된 마우스에서 검출되었다. 이러한 결과는 SVV-IL-36γ RNA 분자를 함유하는 지질 나노입자가 바이러스 게놈에서 암호화된 전이유전자의 종양 조직에서 발현을 지원한다는 것을 입증한다.
실시예 25: 콕사키바이러스 암호화 RNA 분자의 최적화
재조합 RNA 분자로부터 감염성 콕사키 바이러스 A21(CVA21)을 생산하는 능력을 평가하기 위해 실험을 수행했다. 간단히 말하면, CVA21 바이러스 게놈을 포함하는 RNA 폴리뉴클레오타이드는 이전에 기술된 CVA21 게놈 서열에 기초하여 시험관내 T7 전사에 의해 생성했다(Newcombe 등, Cellular receptor interaction of C-cluster human group A coxsackieviruses Journal of General Virology (2003), 84, 3041-3050. GenBank 수탁 번호 AF465515). SK-MEL-28 세포를 리포펙타민 RNAiMax 중의 CVA21 RNA 작제물 1μg로 4시간 동안 형질감염시켰고, 이때 웰을 세척하고 완전 배지를 각 웰에 첨가했다. 48시간 후, SK-MEL-28 배양물에서 상청액을 제거하고 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 바이러스 감염성를 평가했다. 도 32a(왼쪽 패널)에 나타낸 바와 같이, NewcombeCVA21 서열을 포함하는 RNA 분자(CVA21WT)는 활성 용해성 바이러스를 생산하지 않았다(미용해된 SK-MEL-28 세포의 크리스탈 바이올엣 염색에 의해 표시됨).
놀랍게도, 재조합 RNA 분자로부터 감염성 CVA21의 생산을 위해 5' UTR로의 변경이 필요했다. 도 32a(오른쪽 패널)에 도시된 바와 같이, Newcombe에 의해 기술된 CVA21 게놈 서열(CVA21-Brown)에 Brown 등에 의해 기술된 5' UTR 서열(Journal of Virology, (2003)77:16, p.8973-8984. GenBank 수탁번호 AF546702)의 통합은 감염성 CVA21 바이러스의 생산 및 바이러스 세포 용해를 초래했고, 이는 다중 독립 클론을 따라 크리스탈 바이오렛 염색의 부족에 의해 시사되었다. 2개의 상이한 CVA21-Brown 클론에 의해 형질감염된 SK-MEL-28 세포로부터 72시간 후 상청액을 수집하였고, 0.45μM 필터로 주사기 여과하고, 새로운 SK-MEL-28 세포 상에 연속 희석하였다. 48시간 후, SK-MEL-28 배양물로부터 상청액을 제거하고, 세포는 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 바이러스 감염성을 평가하였다. 도 32b에 도시된 바와 같이, Brown 5' UTR 서열을 포함하는 CVA21 암호화 RNA 분자(UTR 서열 - 서열번호 26, 변형된 CVA21 서열 - 서열번호 27)는 형질감염된 세포의 상청액으로 감염성 CVA21의 생산 및 방출을 초래하였고, 이는 상청액 단독이 세포 용해를 매개하는 능력에 의해 시사되었다.
참조에 의한 포함
본원에 인용된 모든 참고문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 간행물 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 포함된다. 그러나, 본원에 인용된 임의의 참고문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 간행물 및 특허 출원에 대한 언급은 이들이 타당한 선행 기술을 구성하거나 또는 전세계적으로 공통된 일반 지식의 일부를 형성함을 인정하는 것이거나 또는 임의의 형태의 암시를 하는 것이 아니며 그런 것으로서 간주되지 않아야 한다.
본 개시내용의 바람직한 구현예가 본원에 제시되고 설명되었지만; 이러한 구현예는 단지 예로서 제공된 것임이 본 기술분야의 기술자에게 명백할 것이다. 이제 본 개시내용으로부터 벗어남이 없이 수많은 변형, 변화, 및 치환이 본 기술분야의 기술자에게 발견될 것이다. 본원에 설명된 개시내용의 구현예들에 대한 다양한 대안들은 본 개시내용을 실행하는데 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다음의 청구범위는 본 개시내용의 범위를 한정하며, 이로써 이러한 청구범위 내의 방법 및 구조 및 그 균등물이 포함되어야 하는 것으로 의도된 것이다.
<110> Oncorus, Inc. <120> ENCAPSULATED RNA POLYNUCLEOTIDES AND METHODS OF USE <130> ONCR-015/01WO 324865-2145 <150> 62/788,504 <151> 2019-01-04 <150> 62/895,135 <151> 2019-11-03 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7310 <212> RNA <213> Senecavirus A <400> 1 uuugaaaugg ggggcugggc ccugaugccc aguccuuccu uuccccuucc gggggguuaa 60 ccggcugugu uugcuagagg cacagagggg caacauccaa ccugcuuuug cggggaacgg 120 ugcggcuccg auuccugcgu cgccaaaggu guuagcgcac ccaaacggcg caccuaccaa 180 uguuauuggu guggucugcg aguucuagcc uacucguuuc ucccccgacc auucacucac 240 ccacgaaaag uguguuguaa ccauaagauu uaacccccgc acgggaugug cgauaaccgu 300 aagacuggcu caagcgcgga aagcgcugua accacaugcu guuagucccu uuauggcugc 360 aagauggcua cccaccucgg aucacugaac uggagcucga cccuccuuag uaagggaacc 420 gagaggccuu cgugcaacaa gcuccgacac agaguccacg ugacugcuac caccaugagu 480 acaugguucu ccccucucga cccaggacuu cuuuuugaau auccacggcu cgauccagag 540 gguggggcau gaccccuagc auagcgagcu acagcgggaa cuguagcuag gccuuagcgu 600 gccuuggaua cugccugaua 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cagcugcaug ugcccuucca cuuuacuggg 3180 cgcacucccc gcgcuuucgc uagcaagggu gggaagguau cuuucgugcu cccuuggaac 3240 ucugucucgu cugugcuccc cgugcgcugg gggggggcuu ccaagcucuc uucugcuacg 3300 cggggucuac cggcgcaugc ugauuggggg acuauuuacg ccuuuguccc ccguccuaau 3360 gagaagaaaa gcaccgcugu aaaacacgug gccguguaca uucgguacaa gaacgcacgu 3420 gccuggugcc ccagcaugcu ucccuuucgc agcuacaagc agaagaugcu gaugcaaucu 3480 ggcgauaucg agaccaaucc cgggccugcu ucugacaacc caauuuugga guuucuugaa 3540 gcagaaaaug aucuagucac ucuggccucu cucuggaaga uggugcacuc uguucaacag 3600 accuggagaa aguaugugaa gaacgaugau uuuuggccca auuuacucag cgagcuagug 3660 ggggaaggcu cugucgccuu ggccgccacg cuauccaacc aagcuucagu aaaggcucuu 3720 uugggccugc acuuucucuc ucgggggcuc aauuacacug acuuuuacuc uuuacugaua 3780 gagaaaugcu cuaguuucuu uaccguagaa ccaccuccuc caccagcuga aaaccugaug 3840 accaagcccu cagugaaguc gaaauuccga aaacuguuua agaugcaagg acccauggac 3900 aaagucaaag acuggaacca aauagcugcc ggcuugaaga auuuucaauu uguucgugac 3960 cuagucaaag agguggucga uuggcugcag 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Sequence <220> <223> Senecavirus A S177A mutant <400> 2 uuugaaaugg ggggcugggc ccugaugccc aguccuuccu uuccccuucc gggggguuaa 60 ccggcugugu uugcuagagg cacagagggg caacauccaa ccugcuuuug cggggaacgg 120 ugcggcuccg auuccugcgu cgccaaaggu guuagcgcac ccaaacggcg caccuaccaa 180 uguuauuggu guggucugcg aguucuagcc uacucguuuc ucccccgacc auucacucac 240 ccacgaaaag uguguuguaa ccauaagauu uaacccccgc acgggaugug cgauaaccgu 300 aagacuggcu caagcgcgga aagcgcugua accacaugcu guuagucccu uuauggcugc 360 aagauggcua cccaccucgg aucacugaac uggagcucga cccuccuuag uaagggaacc 420 gagaggccuu cgugcaacaa gcuccgacac agaguccacg ugacugcuac caccaugagu 480 acaugguucu ccccucucga cccaggacuu cuuuuugaau auccacggcu cgauccagag 540 gguggggcau gaccccuagc auagcgagcu acagcgggaa cuguagcuag gccuuagcgu 600 gccuuggaua cugccugaua gggcgacggc cuagucgugu cgguucuaua gguagcacau 660 acaaauaugc agaacucuca uuuuucuuuc gauacagccu cuggcaccuu ugaagaugua 720 accggaacaa aagucaagau cguugaauac cccagaucgg ugaacaaugg uguuuacgau 780 ucgucuacuc auuuggagau acugaaccua cagggugaaa uugaaauuuu aaggucuuuc 840 aaugaauacc aaauucgcgc cgccaaacaa caacucggac uggacaucgu guacgaacua 900 caggguaaug uucagacaac gucaaagaau gauuuugauu cccguggcaa uaaugguaac 960 augaccuuca auuacuacgc aaacacuuau cagaauucag uagacuucuc gaccuccucg 1020 ucggcgucag gcgccggacc ugggaacucu cggggcggau uagcgggucu ccucacaaau 1080 uucaguggaa ucuugaaccc ucuuggcuac cucaaagauc acaacaccga agaaauggaa 1140 aacucugcug aucgagucac aacgcaaacg gcgggcaaca cugccauaaa cacgcaauca 1200 ucauugggug uguugugugc cuacguugaa gacccgacca aaucugaucc uccguccagc 1260 agcacagauc aacccaccac cacuuucacu gccaucgaca ggugguacac uggacgucuc 1320 aauucuugga caaaagcugu aaaaaccuuc ucuuuucagg ccgucccgcu ucccggugcc 1380 uuucugucua ggcagggagg ccucaacgga ggggccuuca cagcuacccu acauagacac 1440 uuuuugauga agugcgggug gcaggugcag guccaaugua auuugacaca auuccaccaa 1500 ggcgcucuuc uuguugccau gguuccugaa accacccuug augucaagcc cgacgguaag 1560 gcaaagagcu uacaggagcu gaaugaagaa cagugggugg aaaugucuga cgauuaccgg 1620 accgggaaaa acaugccuuu ucaggcgcuu ggcacauacu aucggccccc uaacuggacu 1680 ugggguccca auuucaucaa ccccuaucaa guaacgguuu ucccacacca aauucugaac 1740 gcgagaaccu cuaccucggu agacauaaac gucccauaca ucggggagac ccccacgcaa 1800 uccucagaga cacagaacuc cuggacccuc cucguuaugg ugcucguucc ccuagacuau 1860 aaggaaggag ccacaacuga cccagaaauu acauuuucug uaaggccuac aagucccuac 1920 uucaaugggc uucgcaaccg cuacacggcc gggacggacg aagaacaggg gcccauuccu 1980 acggcaccca gagaaaauuc gcuuauguuu cucucaaccc ucccugacga cacugucccu 2040 gcuuacggga augugcguac cccuccuguc aauuaccucc cuggugaaau aaccgaccuu 2100 uugcaacugg cccgcauacc cacucucaug gcauuugagc gggugccuga acccgugccu 2160 gccucagaca cauaugugcc cuacguugcc guucccaccc aguucgauga caggccucuc 2220 aucuccuucc cgaucacccu uucagauccc gucuaucaga acacccuggu uggcgccauc 2280 aguucaaauu ucgccaauua ccgugggugu auccaaauca cucugacauu uuguggaccc 2340 augauggcga gagggaaauu ccugcucucg uauucucccc caaauggaac gcaaccacag 2400 acucuuuccg aagcuaugca gugcacauac ucuauuuggg acauaggcuu gaacucuagu 2460 uggaccuucg ucguccccua caucucgccc agugacuacc gugaaacucg agccauuacc 2520 aacucgguuu acuccgcuga ugguugguuu agccugcaca aguugaccaa aauuacucua 2580 ccaccugacu guccgcaaag ucccugcauu cucuuuuucg cuucugcugg ugaggauuac 2640 acucuccguc uccccguuga uuguaauccu uccuaugugu uccacuccac cgacaacgcc 2700 gagaccgggg uuauugaggc ggguaacacu gacaccgauu ucucugguga acuggcggcu 2760 ccuggcucua accacacuaa ugucaaguuc cuguuugauc gaucucgauu auugaaugua 2820 aucaagguac uggagaagga cgccguuuuc ccccgcccuu ucccuacaca agaaggugcg 2880 cagcaggaug augguuacuu uugucuucug accccccgcc caacagucgc uucccgaccc 2940 gccacucguu ucggccugua cgccaauccg uccggcagug guguucuugc uaacacuuca 3000 cuggacuuca auuuuuauag cuuggccugu uucacuuacu uuagaucgga ccuugagguu 3060 acgguggucu cacuagagcc ggaucuggaa uuugcuguag ggugguuucc uucuggcagu 3120 gaauaccagg cuuccagcuu ugucuacgac cagcugcaug ugcccuucca cuuuacuggg 3180 cgcacucccc gcgcuuucgc uagcaagggu gggaagguau cuuucgugcu cccuuggaac 3240 ucugucucgu cugugcuccc cgugcgcugg gggggggcuu ccaagcucuc uucugcuacg 3300 cggggucuac cggcgcaugc ugauuggggg acuauuuacg ccuuuguccc ccguccuaau 3360 gagaagaaaa gcaccgcugu aaaacacgug gccguguaca uucgguacaa gaacgcacgu 3420 gccuggugcc ccagcaugcu ucccuuucgc agcuacaagc agaagaugcu gaugcaaucu 3480 ggcgauaucg agaccaaucc cgggccugcu ucugacaacc caauuuugga guuucuugaa 3540 gcagaaaaug aucuagucac ucuggccucu cucuggaaga uggugcacuc uguucaacag 3600 accuggagaa aguaugugaa gaacgaugau uuuuggccca auuuacucag cgagcuagug 3660 ggggaaggcu cugucgccuu ggccgccacg cuauccaacc aagcuucagu aaaggcucuu 3720 uugggccugc acuuucucuc ucgggggcuc aauuacacug acuuuuacuc uuuacugaua 3780 gagaaaugcu cuaguuucuu uaccguagaa ccaccuccuc caccagcuga aaaccugaug 3840 accaagcccu cagugaaguc gaaauuccga aaacuguuua agaugcaagg acccauggac 3900 aaagucaaag acuggaacca aauagcugcc ggcuugaaga auuuucaauu uguucgugac 3960 cuagucaaag agguggucga uuggcugcag gccuggauca acaaagagaa agccagcccu 4020 guccuccagu accaguugga gaugaagaag cucgggccug uggccuuggc ucaugacgcu 4080 uucauggcug guuccgggcc cccucuuagc gacgaccaga uugaauaccu ccagaaccuc 4140 aaaucucuug cccuaacacu ggggaagacu aauuuggccc aaagucucac cacuaugauc 4200 aaugccaaac aaaguucagc ccaacgaguu gaacccguug uggugguccu uagaggcaag 4260 ccgggaugcg gcaagagcuu ggccucuacg uugauugccc aggcuguguc caagcgccuc 4320 uauggcuccc aaaguguaua uucucuuccc ccagauccag auuucuucga uggauacaaa 4380 ggacaguucg ugaccuugau ggaugauuug ggacaaaacc cggauggaca agauuucucc 4440 accuuuuguc agaugguguc gaccgcccaa uuucucccca acauggcgga ccuugcagag 4500 aaagggcguc ccuuuaccuc caaucucauc auugcaacua caaaucuccc ccacuucagu 4560 ccugucacca uugcugaucc uucugcaguc ucucgccgua ucaacuacga ucugacucua 4620 gaaguaucug aggccuacaa gaaacacaca cggcugaauu uugacuuggc uuucaggcgc 4680 acagacgccc cccccauuua uccuuuugcu gcccaugugc ccuuugugga cguagcugug 4740 cgcuucaaaa auggucacca gaauuuuaau cuccuagagu uggucgauuc cauuuguaca 4800 gacauucgag ccaagcaaca aggugcccga aacaugcaga cucugguucu acagagcccc 4860 aacgagaaug augacacccc cgucgacgag gcguugggua gaguucucuc ccccgcugcg 4920 gucgaugagg cgcuugucga ccucacucca gaggccgacc cgguuggccg uuuggcuauu 4980 cuugccaagc uaggucuugc ccuagcugcg gucaccccug gucugauaau cuuggcagug 5040 ggacucuaca gguacuucuc uggcucugau gcagaccaag aagaaacaga aagugaggga 5100 ucugucaagg cacccaggag cgaaaaugcu uaugacggcc cgaagaaaaa cucuaagccc 5160 ccuggagcac ucucucucau ggaaaugcaa cagcccaacg uggacauggg cuuugaggcu 5220 gcggucgcua agaaaguggu cguccccauu accuucaugg uucccaacag accuucuggg 5280 cuuacacagu ccgcucuucu ggugaccggc cggaccuucc uaaucaauga acauacaugg 5340 uccaaucccu ccuggaccag cuucacaauc cgcggugagg uacacacucg ugaugagccc 5400 uuccaaacgg uucauuucac ucaccacggu auucccacag aucugaugau gguacgucuc 5460 ggaccgggca auucuuuccc uaacaaucua gacaaguuug gacuugacca gaugccggca 5520 cgcaacuccc gugugguugg cguuucgucc aguuacggaa acuucuucuu cucuggaaau 5580 uuccucggau uuguugauuc caucaccucu gaacaaggaa cuuacgcaag acucuuuagg 5640 uacaggguga cgaccuacaa aggauggugc ggcucggccc uggucuguga ggccgguggc 5700 guccgacgca ucauuggccu gcauucugcu ggcgccgccg guaucggcgc cgggaccuau 5760 aucucaaaau uaggacuaau caaagcccug aaacaccucg gugaaccuuu ggccacaaug 5820 caaggacuga ugacugaauu agagccugga aucaccguac auguaccccg gaaauccaaa 5880 uugagaaaga cgaccgcaca cgcgguguac aaaccggagu uugagccugc uguguuguca 5940 aaauuugauc ccagacugaa caaggauguu gacuuggaug aaguaauuug gucuaaacac 6000 acugccaaug ucccuuacca accuccuuug uucuacacau acaugucaga guacgcucau 6060 cgagucuucu ccuucuuggg gaaagacaau gacauucuga ccgucaaaga agcaauucug 6120 ggcauccccg gacuagaccc cauggauccc cacacagcuc cgggucugcc uuacgccauc 6180 aacggccuuc gacguacuga ucucgucgau uuugugaacg guacaguaga ugcggcgcug 6240 gcuguacaaa uccagaaauu cuuagacggu gacuacucug accaugucuu ccaaacuuuu 6300 cugaaagaug agaucagacc cucagagaaa guccgagcgg gaaaaacccg cauuguugau 6360 gugcccuccc uggcgcauug cauugugggc agaauguugc uugggcgcuu ugcugccaag 6420 uuucaauccc auccuggcuu ucuccucggc ucugcuaucg ggucugaccc ugauguuuuc 6480 uggaccguca uaggggcuca acucgagggg agaaagaaca cguaugacgu ggacuacagu 6540 gccuuugacu cuucacacgg cacuggcucc uucgaggcuc ucaucucuca cuuuuucacc 6600 guggacaaug guuuuagccc ugcgcuggga ccguaucuca gaucccuggc ugucucggug 6660 cacgcuuacg gcgagcgucg caucaagauu accgguggcc uccccuccgg uugugccgcg 6720 accagccugc ugaacacagu gcucaacaau gugaucauca ggacugcucu ggcauugacu 6780 uacaaggaau uugaauauga caugguugau aucaucgccu acggugacga ccuucugguu 6840 ggcacggauu acgaucugga cuucaaugag guggcacgac gcgcugccaa guugggguau 6900 aagaugacuc cugccaacaa ggguucuguc uucccuccga cuuccucucu uuccgaugcu 6960 guuuuucuaa agcgcaaauu cguccaaaac aacgacggcu uauacaaacc aguuauggau 7020 uuaaagaauu uggaagccau gcucuccuac uucaaaccag gaacacuacu cgagaagcug 7080 caaucuguuu cuauguuggc ucaacauucu ggaaaagaag aauaugauag auugaugcac 7140 cccuucgcug acuacggugc cguaccgagu cacgaguacc ugcaggcaag auggagggcc 7200 uuguucgacu gacccagaua gcccaaggcg cuucggugcu gccggcgauu cugggagaac 7260 ucagucggaa cagaaaaggg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 7310 <210> 3 <211> 7312 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Senecavirus A IR2 mutant <400> 3 uuugaaaugg ggggcugggc ccugaugccc aguccuuccu uuccccuucc gggggguuaa 60 ccggcugugu uugcuagagg cacagaggag caacauccaa ccugcuuuug uggggaacgg 120 ugcggcucca auuccugcgu cgccaaaggu guuagcgcac ccaaacggcg caucuaccaa 180 ugcuauuggu guggucugcg aguucuagcc uacucguuuc uccccuauuc auucacucac 240 gcacaaaaag uguguuguaa cuacaagauu uagcccucac acgggaugug ugauaaccgc 300 aagacugacu caagcgcgga aagcgcugua accgcaugcu guuagucccu uuauggcugc 360 gagauggcua uccaccucgg aucacugaac uggagcucga cccuccuuag uaagggaacc 420 gagaggccuu cuugcaacaa gcuccgacac agaguccacg ugauugcuac caccaugagu 480 acaugguucu ccccucucga cccaggacuu cuuuuugaau auccacggcu cgauccagag 540 gguggggcau gaucccccua gcauagcgag cuacagcggg aacuguagcu aggccuuagc 600 gugccuugga uacugccuga uagggcgacg gccuagucgu gucgguucua uagguagcac 660 auacaaauau gcagaacucu cauuuuucuu ucgauacagc cucuggcacc uuugaagaug 720 uaaccggaac aaaagucaag aucguugaau accccagauc ggugaacaau gguguuuacg 780 auucgucuac ucauuuggag auacugaacc uacaggguga aauugaaauu uuaaggucuu 840 ucaaugaaua ccaaauucgc gccgccaaac aacaacucgg acuggacauc guguacgaac 900 uacaggguaa uguucagaca acgucaaaga augauuuuga uucccguggc aauaauggua 960 acaugaccuu caauuacuac gcaaacacuu aucagaauuc aguagacuuc ucgaccuccu 1020 cgucggcguc aggcgccgga ccugggaacu cucggggcgg auuagcgggu cuccucacaa 1080 auuucagugg aaucuugaac ccucuuggcu accucaaaga ucacaacacc gaagaaaugg 1140 aaaacucugc ugaucgaguc acaacgcaaa cggcgggcaa cacugccaua aacacgcaau 1200 caucauuggg uguguugugu gccuacguug aagacccgac caaaucugau ccuccgucca 1260 gcagcacaga ucaacccacc accacuuuca cugccaucga caggugguac acuggacguc 1320 ucaauucuug gacaaaagcu guaaaaaccu ucucuuuuca ggccgucccg cuucccggug 1380 ccuuucuguc uaggcaggga ggccucaacg gaggggccuu cacagcuacc cuacauagac 1440 acuuuuugau gaagugcggg uggcaggugc agguccaaug uaauuugaca caauuccacc 1500 aaggcgcucu ccuuguugcc augguuccug aaaccacccu ugaugucaag cccgacggua 1560 aggcaaagag cuuacaggag cugaaugaag aacagugggu ggaaaugucu gacgauuacc 1620 ggaccgggaa aaacaugccu uuucagucuc uuggcacaua cuaucggccc ccuaacugga 1680 cuuggggucc caauuucauc aaccccuauc aaguaacggu uuucccacac caaauucuga 1740 acgcgagaac cucuaccucg guagacauaa acgucccaua caucggggag acccccacgc 1800 aauccucaga gacacagaac uccuggaccc uccucguuau ggugcucguu ccccuagacu 1860 auaaggaagg agccacaacu gacccagaaa uuacauuuuc uguaaggccu acaagucccu 1920 acuucaaugg gcuucgcaac cgcuacacgg ccgggacgga cgaagaacag gggcccauuc 1980 cuacggcacc cagagaaaau ucgcuuaugu uucucucaac ccucccugac gacacugucc 2040 cugcuuacgg gaaugugcgu accccuccug ucaauuaccu cccuggugaa auaaccgacc 2100 uuuugcaacu ggcccgcaua cccacucuca uggcauuuga gcgggugccu gaacccgugc 2160 cugccucaga cacauaugug cccuacguug ccguucccac ccaguucgau gacaggccuc 2220 ucaucuccuu cccgaucacc cuuucagauc ccgucuauca gaacacccug guuggcgcca 2280 ucaguucaaa uuucgccaau uaccgugggu guauccaaau cacucugaca uuuuguggac 2340 ccaugauggc gagagggaaa uuccugcucu cguauucucc cccaaaugga acgcaaccac 2400 agacucuuuc cgaagcuaug cagugcacau acucuauuug ggacauaggc uugaacucua 2460 guuggaccuu cgucgucccc uacaucucgc ccagugacua ccgugaaacu cgagccauua 2520 ccaacucggu uuacuccgcu gaugguuggu uuagccugca caaguugacc aaaauuacuc 2580 uaccaccuga cuguccgcaa agucccugca uucucuuuuu cgcuucugcu ggugaggauu 2640 acacucuccg ucuccccguu gauuguaauc cuuccuaugu guuccacucc accgacaacg 2700 ccgagaccgg gguuauugag gcggguaaca cugacaccga uuucucuggu gaacuggcgg 2760 cuccuggcuc uaaccacacu aaugucaagu uccuguuuga ucgaucucga uuauugaaug 2820 uaaucaaggu acuggagaag gacgccguuu ucccccgccc uuucccuaca caagaaggug 2880 cgcagcagga ugaugguuac uuuugucuuc ugaccccccg cccaacaguc gcuucccgac 2940 ccgccacucg uuucggccug uacgccaauc cguccggcag ugguguucuu gcuaacacuu 3000 cacuggacuu caauuuuuau agcuuggccu guuucacuua cuuuagaucg gaccuugagg 3060 uuacgguggu cucacuagag ccggaucugg aauuugcugu agggugguuu ccuucuggca 3120 gugaauacca ggcuuccagc uuugucuacg accagcugca ugugcccuuc cacuuuacug 3180 ggcgcacucc ccgcgcuuuc gcuagcaagg gugggaaggu aucuuucgug cucccuugga 3240 acucugucuc gucugugcuc cccgugcgcu gggggggggc uuccaagcuc ucuucugcua 3300 cgcggggucu accggcgcau gcugauuggg ggacuauuua cgccuuuguc ccccguccua 3360 augagaagaa aagcaccgcu guaaaacacg uggccgugua cauucgguac aagaacgcac 3420 gugccuggug ccccagcaug cuucccuuuc gcagcuacaa gcagaagaug cugaugcaau 3480 cuggcgauau cgagaccaau cccgggccug cuucugacaa cccaauuuug gaguuucuug 3540 aagcagaaaa ugaucuaguc acucuggccu cucucuggaa gauggugcac ucuguucaac 3600 agaccuggag aaaguaugug aagaacgaug auuuuuggcc caauuuacuc agcgagcuag 3660 ugggggaagg cucugucgcc uuggccgcca cgcuauccaa ccaagcuuca guaaaggcuc 3720 uuuugggccu gcacuuucuc ucucgggggc ucaauuacac ugacuuuuac ucuuuacuga 3780 uagagaaaug cucuaguuuc uuuaccguag aaccaccucc uccaccagcu gaaaaccuga 3840 ugaccaagcc cucagugaag ucgaaauucc gaaaacuguu uaagaugcaa ggacccaugg 3900 acaaagucaa agacuggaac caaauagcug ccggcuugaa gaauuuucaa uuuguucgug 3960 accuagucaa agaggugguc gauuggcugc aggccuggau caacaaagag aaagccagcc 4020 cuguccucca guaccaguug gagaugaaga agcucgggcc uguggccuug gcucaugacg 4080 cuuucauggc ugguuccggg cccccucuua gcgacgacca gauugaauac cuccagaacc 4140 ucaaaucucu ugcccuaaca cuggggaaga cuaauuuggc ccaaagucuc accacuauga 4200 ucaaugccaa acaaaguuca gcccaacgag uugaacccgu uguggugguc cuuagaggca 4260 agccgggaug cggcaagagc uuggccucua cguugauugc ccaggcugug uccaagcgcc 4320 ucuauggcuc ccaaagugua uauucucuuc 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aacagcccaa cguggacaug ggcuuugagg 5220 cugcggucgc uaagaaagug gucgucccca uuaccuucau gguucccaac agaccuucug 5280 ggcuuacaca guccgcucuc cuggugaccg gccggaccuu ccuaaucaau gaacauacau 5340 gguccaaucc cuccuggacc agcuucacaa uccgcgguga gguacacacu cgugaugagc 5400 ccuuccaaac gguucauuuc acucaccacg guauucccac agaucugaug augguacguc 5460 ucggaccggg caauucuuuc ccuaacaauc uagacaaguu uggacuugac cagaugccgg 5520 cacgcaacuc ccgugugguu ggcguuucgu ccaguuacgg aaacuucuuc uucucuggaa 5580 auuuccucgg auuuguugau uccaucaccu cugaacaagg aacuuacgca agacucuuua 5640 gguacagggu gacgaccuac aaaggauggu gcggcucggc ccuggucugu gaggccggug 5700 gcguccgacg caucauuggc cugcauucug cuggcgccgc cgguaucggc gccgggaccu 5760 auaucucaaa auuaggacua aucaaagccc ugaaacaccu cggugaaccu uuggccacaa 5820 ugcaaggacu gaugacugaa uuagagccug gaaucaccgu acauguaccc cggaaaucca 5880 aauugagaaa gacgaccgca cacgcggugu acaaaccgga guuugagccu gcuguguugu 5940 caaaauuuga ucccagacug aacaaggaug uugacuugga ugaaguaauu uggucuaaac 6000 acacugccaa ugucccuuac caaccuccuu uguucuacac auacauguca gaguacgcuc 6060 aucgagucuu cuccuucuug gggaaagaca augacauucu gaccgucaaa gaagcaauuc 6120 ugggcauccc cggacuagac cccauggauc cccacacagc uccgggucug ccuuacgcca 6180 ucaacggccu ucgacguacu gaucucgucg auuuugugaa cgguacagua gaugcggcgc 6240 uggcuguaca aauccagaaa uucuuagacg gugacuacuc ugaccauguc uuccaaacuu 6300 uucugaaaga ugagaucaga cccucagaga aaguccgagc gggaaaaacc cgcauuguug 6360 augugcccuc ccuggcgcau ugcauugugg gcagaauguu gcuugggcgc uuugcugcca 6420 aguuucaauc ccauccuggc uuucuccucg gcucugcuau cgggucugac ccugauguuu 6480 ucuggaccgu cauaggggcu caacucgagg ggagaaagaa cacguaugac guggacuaca 6540 gugccuuuga cucuucacac ggcacuggcu ccuucgaggc ucucaucucu cacuuuuuca 6600 ccguggacaa ugguuuuagc ccugcgcugg gaccguaucu cagaucccug gcugucucgg 6660 ugcacgcuua cggcgagcgu cgcaucaaga uuaccggugg ccuccccucc gguugugccg 6720 cgaccagccu gcugaacaca gugcucaaca augugaucau caggacugcu cuggcauuga 6780 cuuacaagga auuugaauau gacaugguug auaucaucgc cuacggugac gaccuucugg 6840 uuggcacgga uuacgaucug gacuucaaug 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ucgcuuaugu uucucucaac ccucccugac gacacugucc 2040 cugcuuacgg gaaugugcgu accccuccug ucaauuaccu cccuggugaa auaaccgacc 2100 uuuugcaacu ggcccgcaua cccacucuca uggcauuuga gcgggugccu gaacccgugc 2160 cugccucaga cacauaugug cccuacguug ccguucccac ccaguucgau gacaggccuc 2220 ucaucuccuu cccgaucacc cuuucagauc ccgucuauca gaacacccug guuggcgcca 2280 ucaguucaaa uuucgccaau uaccgugggu guauccaaau cacucugaca uuuuguggac 2340 ccaugauggc gagagggaaa uuccugcucu cguauucucc cccaaaugga acgcaaccac 2400 agacucuuuc cgaagcuaug cagugcacau acucuauuug ggacauaggc uugaacucua 2460 guuggaccuu cgucgucccc uacaucucgc ccagugacua ccgugaaacu cgagccauua 2520 ccaacucggu uuacuccgcu gaugguuggu uuagccugca caaguugacc aaaauuacuc 2580 uaccaccuga cuguccgcaa agucccugca uucucuuuuu cgcuucugcu ggugaggauu 2640 acacucuccg ucuccccguu gauuguaauc cuuccuaugu guuccacucc accgacaacg 2700 ccgagaccgg gguuauugag gcggguaaca cugacaccga uuucucuggu gaacuggcgg 2760 cuccuggcuc uaaccacacu aaugucaagu uccuguuuga ucgaucucga uuauugaaug 2820 uaaucaaggu acuggagaag 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augcucuccu acuucaaacc aggaacacua cucgagaagc 7080 ugcaaucugu uucuauguug gcucaacauu cuggaaaaga agaauaugau agauugaugc 7140 accccuucgc ugacuacggu gccguaccga gucacgagua ccugcaggca agauggaggg 7200 ccuuguucga cugacccaga uagcccaagg cgcuucggug cugccggcga uucugggaga 7260 acucagucgg aacagaaaag ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 7313 <210> 5 <211> 8066 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVV-mCherry construct <400> 5 uuugaaaugg ggggcugggc ccugaugccc aguccuuccu uuccccuucc gggggguuaa 60 ccggcugugu uugcuagagg cacagagggg caacauccaa ccugcuuuug cggggaacgg 120 ugcggcuccg auuccugcgu cgccaaaggu guuagcgcac ccaaacggcg caccuaccaa 180 uguuauuggu guggucugcg aguucuagcc uacucguuuc ucccccgacc auucacucac 240 ccacgaaaag uguguuguaa ccauaagauu uaacccccgc acgggaugug cgauaaccgu 300 aagacuggcu caagcgcgga aagcgcugua accacaugcu guuagucccu uuauggcugc 360 aagauggcua cccaccucgg aucacugaac uggagcucga cccuccuuag uaagggaacc 420 gagaggccuu cgugcaacaa gcuccgacac agaguccacg ugacugcuac caccaugagu 480 acaugguucu 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aaaaaccuuc ucuuuucagg ccgucccgcu ucccggugcc 1380 uuucugucua ggcagggagg ccucaacgga ggggccuuca cagcuacccu acauagacac 1440 uuuuugauga agugcgggug gcaggugcag guccaaugua auuugacaca auuccaccaa 1500 ggcgcucuuc uuguugccau gguuccugaa accacccuug augucaagcc cgacgguaag 1560 gcaaagagcu uacaggagcu gaaugaagaa cagugggugg aaaugucuga cgauuaccgg 1620 accgggaaaa acaugccuuu ucagucucuu ggcacauacu aucggccccc uaacuggacu 1680 ugggguccca auuucaucaa ccccuaucaa guaacgguuu ucccacacca aauucugaac 1740 gcgagaaccu cuaccucggu agacauaaac gucccauaca ucggggagac ccccacgcaa 1800 uccucagaga cacagaacuc cuggacccuc cucguuaugg ugcucguucc ccuagacuau 1860 aaggaaggag ccacaacuga cccagaaauu acauuuucug uaaggccuac aagucccuac 1920 uucaaugggc uucgcaaccg cuacacggcc gggacggacg aagaacaggg gcccauuccu 1980 acggcaccca gagaaaauuc gcuuauguuu cucucaaccc ucccugacga cacugucccu 2040 gcuuacggga augugcguac cccuccuguc aauuaccucc cuggugaaau aaccgaccuu 2100 uugcaacugg cccgcauacc cacucucaug gcauuugagc gggugccuga acccgugccu 2160 gccucagaca cauaugugcc 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cuuggccugu uucacuuacu uuagaucgga ccuugagguu 3060 acgguggucu cacuagagcc ggaucuggaa uuugcuguag ggugguuucc uucuggcagu 3120 gaauaccagg cuuccagcuu ugucuacgac cagcugcaug ugcccuucca cuuuacuggg 3180 cgcacucccc gcgcuuucgc uagcaagggu gggaagguau cuuucgugcu cccuuggaac 3240 ucugucucgu cugugcuccc cgugcgcugg gggggggcuu ccaagcucuc uucugcuacg 3300 cggggucuac cggcgcaugc ugauuggggg acuauuuacg ccuuuguccc ccguccuaau 3360 gagaagaaaa gcaccgcugu aaaacacgug gccguguaca uucgguacaa gaacgcacgu 3420 gccuggugcc ccagcaugcu ucccuuucgc agcuacaagc agaagaugcu gaugcaaucu 3480 ggcgauaucg agaccaaucc cgggccgagc aagggcgagg aggauaacau ggccaucauc 3540 aaggaguuca ugcgcuucaa ggugcacaug gagggcuccg ugaacggcca cgaguucgag 3600 aucgagggcg agggcgaggg ccgccccuac gagggcaccc agaccgccaa gcugaaggug 3660 accaagggug gcccccugcc cuucgccugg gacauccugu ccccucaguu cauguacggc 3720 uccaaggccu acgugaagca ccccgccgac auccccgacu acuugaagcu guccuucccc 3780 gagggcuuca agugggagcg cgugaugaac uucgaggacg gcggcguggu gaccgugacc 3840 caggacuccu cccugcagga cggcgaguuc aucuacaagg ugaagcugcg cggcaccaac 3900 uuccccuccg acggccccgu aaugcagaag aagaccaugg gcugggaggc cuccuccgag 3960 cggauguacc ccgaggacgg cgcccugaag ggcgagauca agcagaggcu gaagcugaag 4020 gacggcggcc acuacgacgc ugaggucaag accaccuaca aggccaagaa gcccgugcag 4080 cugcccggcg ccuacaacgu caacaucaag uuggacauca ccucccacaa cgaggacuac 4140 accaucgugg aacaguacga acgcgccgag ggccgccacu ccaccggcgg cauggacgag 4200 cuguacaagg agggcagagg aagucugcua acaugcggug acgucgagga gaaucccggg 4260 ccugcuucug acaacccaau uuuggaguuu cuugaagcag aaaaugaucu agucacucug 4320 gccucucucu ggaagauggu gcacucuguu caacagaccu ggagaaagua ugugaagaac 4380 gaugauuuuu ggcccaauuu acucagcgag cuaguggggg aaggcucugu cgccuuggcc 4440 gccacgcuau ccaaccaagc uucaguaaag gcucuuuugg gccugcacuu ucucucucgg 4500 gggcucaauu acacugacuu uuacucuuua cugauagaga aaugcucuag uuucuuuacc 4560 guagaaccac cuccuccacc agcugaaaac cugaugacca agcccucagu gaagucgaaa 4620 uuccgaaaac uguuuaagau gcaaggaccc auggacaaag ucaaagacug gaaccaaaua 4680 gcugccggcu ugaagaauuu ucaauuuguu cgugaccuag ucaaagaggu ggucgauugg 4740 cugcaggccu ggaucaacaa agagaaagcc agcccugucc uccaguacca guuggagaug 4800 aagaagcucg ggccuguggc cuuggcucau gacgcuuuca uggcugguuc cgggcccccu 4860 cuuagcgacg accagauuga auaccuccag aaccucaaau cucuugcccu aacacugggg 4920 aagacuaauu uggcccaaag ucucaccacu augaucaaug ccaaacaaag uucagcccaa 4980 cgaguugaac ccguuguggu gguccuuaga ggcaagccgg gaugcggcaa gagcuuggcc 5040 ucuacguuga uugcccaggc uguguccaag cgccucuaug gcucccaaag uguauauucu 5100 cuucccccag auccagauuu cuucgaugga uacaaaggac aguucgugac cuugauggau 5160 gauuugggac aaaacccgga uggacaagau uucuccaccu uuugucagau ggugucgacc 5220 gcccaauuuc uccccaacau ggcggaccuu gcagagaaag ggcgucccuu uaccuccaau 5280 cucaucauug caacuacaaa ucucccccac uucaguccug ucaccauugc ugauccuucu 5340 gcagucucuc gccguaucaa cuacgaucug acucuagaag uaucugaggc cuacaagaaa 5400 cacacacggc ugaauuuuga cuuggcuuuc aggcgcacag acgccccccc cauuuauccu 5460 uuugcugccc augugcccuu uguggacgua gcugugcgcu ucaaaaaugg ucaccagaau 5520 uuuaaucucc uagaguuggu 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cgcaagacuc uuuagguaca gggugacgac cuacaaagga 6420 uggugcggcu cggcccuggu cugugaggcc gguggcgucc gacgcaucau uggccugcau 6480 ucugcuggcg ccgccgguau cggcgccggg accuauaucu caaaauuagg acuaaucaaa 6540 gcccugaaac accucgguga accuuuggcc acaaugcaag gacugaugac ugaauuagag 6600 ccuggaauca ccguacaugu accccggaaa uccaaauuga gaaagacgac cgcacacgcg 6660 guguacaaac cggaguuuga gccugcugug uugucaaaau uugaucccag acugaacaag 6720 gauguugacu uggaugaagu aauuuggucu aaacacacug ccaauguccc uuaccaaccu 6780 ccuuuguucu acacauacau gucagaguac gcucaucgag ucuucuccuu cuuggggaaa 6840 gacaaugaca uucugaccgu caaagaagca auucugggca uccccggacu agaccccaug 6900 gauccccaca cagcuccggg ucugccuuac gccaucaacg gccuucgacg uacugaucuc 6960 gucgauuuug ugaacgguac aguagaugcg gcgcuggcug uacaaaucca gaaauucuua 7020 gacggugacu acucugacca ugucuuccaa acuuuucuga aagaugagau cagacccuca 7080 gagaaagucc gagcgggaaa aacccgcauu guugaugugc ccucccuggc gcauugcauu 7140 gugggcagaa uguugcuugg gcgcuuugcu gccaaguuuc aaucccaucc uggcuuucuc 7200 cucggcucug cuaucggguc ugacccugau guuuucugga ccgucauagg ggcucaacuc 7260 gaggggagaa agaacacgua ugacguggac uacagugccu uugacucuuc acacggcacu 7320 ggcuccuucg aggcucucau cucucacuuu uucaccgugg acaaugguuu uagcccugcg 7380 cugggaccgu aucucagauc ccuggcuguc ucggugcacg cuuacggcga gcgucgcauc 7440 aagauuaccg guggccuccc cuccgguugu gccgcgacca gccugcugaa cacagugcuc 7500 aacaauguga ucaucaggac ugcucuggca uugacuuaca aggaauuuga auaugacaug 7560 guugauauca ucgccuacgg ugacgaccuu cugguuggca cggauuacga ucuggacuuc 7620 aaugaggugg cacgacgcgc ugccaaguug ggguauaaga ugacuccugc caacaagggu 7680 ucugucuucc cuccgacuuc cucucuuucc gaugcuguuu uucuaaagcg caaauucguc 7740 caaaacaacg acggcuuaua caaaccaguu auggauuuaa agaauuugga agccaugcuc 7800 uccuacuuca aaccaggaac acuacucgag aagcugcaau cuguuucuau guuggcucaa 7860 cauucuggaa aagaagaaua ugauagauug augcaccccu ucgcugacua cggugccgua 7920 ccgagucacg aguaccugca ggcaagaugg agggccuugu ucgacugacc cagauagccc 7980 aaggcgcuuc ggugcugccg gcgauucugg gagaacucag ucggaacaga aaagggaaaa 8040 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 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acaacaccga agaaauggaa 1140 aacucugcug aucgagucac aacgcaaacg gcgggcaaca cugccauaaa cacgcaauca 1200 ucauugggug uguugugugc cuacguugaa gacccgacca aaucugaucc uccguccagc 1260 agcacagauc aacccaccac cacuuucacu gccaucgaca ggugguacac uggacgucuc 1320 aauucuugga caaaagcugu aaaaaccuuc ucuuuucagg ccgucccgcu ucccggugcc 1380 uuucugucua ggcagggagg ccucaacgga ggggccuuca cagcuacccu acauagacac 1440 uuuuugauga agugcgggug gcaggugcag guccaaugua auuugacaca auuccaccaa 1500 ggcgcucuuc uuguugccau gguuccugaa accacccuug augucaagcc cgacgguaag 1560 gcaaagagcu uacaggagcu gaaugaagaa cagugggugg aaaugucuga cgauuaccgg 1620 accgggaaaa acaugccuuu ucagucucuu ggcacauacu aucggccccc uaacuggacu 1680 ugggguccca auuucaucaa ccccuaucaa guaacgguuu ucccacacca aauucugaac 1740 gcgagaaccu cuaccucggu agacauaaac gucccauaca ucggggagac ccccacgcaa 1800 uccucagaga cacagaacuc cuggacccuc cucguuaugg ugcucguucc ccuagacuau 1860 aaggaaggag ccacaacuga cccagaaauu acauuuucug uaaggccuac aagucccuac 1920 uucaaugggc uucgcaaccg cuacacggcc gggacggacg 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aaggucuuuc 840 aaugaauacc aaauucgcgc cgccaaacaa caacucggac uggacaucgu guacgaacua 900 caggguaaug uucagacaac gucaaagaau gauuuugauu cccguggcaa uaaugguaac 960 augaccuuca auuacuacgc aaacacuuau cagaauucag uagacuucuc gaccuccucg 1020 ucggcgucag gcgccggacc ugggaacucu cggggcggau uagcgggucu ccucacaaau 1080 uucaguggaa ucuugaaccc ucuuggcuac cucaaagauc acaacaccga agaaauggaa 1140 aacucugcug aucgagucac aacgcaaacg gcgggcaaca cugccauaaa cacgcaauca 1200 ucauugggug uguugugugc cuacguugaa gacccgacca aaucugaucc uccguccagc 1260 agcacagauc aacccaccac cacuuucacu gccaucgaca ggugguacac uggacgucuc 1320 aauucuugga caaaagcugu aaaaaccuuc ucuuuucagg ccgucccgcu ucccggugcc 1380 uuucugucua ggcagggagg ccucaacgga ggggccuuca cagcuacccu acauagacac 1440 uuuuugauga agugcgggug gcaggugcag guccaaugua auuugacaca auuccaccaa 1500 ggcgcucuuc uuguugccau gguuccugaa accacccuug augucaagcc cgacgguaag 1560 gcaaagagcu uacaggagcu gaaugaagaa cagugggugg aaaugucuga cgauuaccgg 1620 accgggaaaa acaugccuuu ucagucucuu ggcacauacu aucggccccc 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agaagcagac 5040 ccuuacagag ugaaaaugaa gcucugcauc cugcuucacg ccuucagcac ccgcgucgug 5100 accaucaaca gggugauggg cuaucugagc uccgccgagg gcagaggaag ucugcuaaca 5160 ugcggugacg ucgaggagaa ucccgggccu gcuucugaca acccaauuuu ggaguuucuu 5220 gaagcagaaa augaucuagu cacucuggcc ucucucugga agauggugca cucuguucaa 5280 cagaccugga gaaaguaugu gaagaacgau gauuuuuggc ccaauuuacu cagcgagcua 5340 gugggggaag gcucugucgc cuuggccgcc acgcuaucca accaagcuuc aguaaaggcu 5400 cuuuugggcc ugcacuuucu cucucggggg cucaauuaca cugacuuuua cucuuuacug 5460 auagagaaau gcucuaguuu cuuuaccgua gaaccaccuc cuccaccagc ugaaaaccug 5520 augaccaagc ccucagugaa gucgaaauuc cgaaaacugu uuaagaugca aggacccaug 5580 gacaaaguca aagacuggaa ccaaauagcu gccggcuuga agaauuuuca auuuguucgu 5640 gaccuaguca aagagguggu cgauuggcug caggccugga ucaacaaaga gaaagccagc 5700 ccuguccucc aguaccaguu ggagaugaag aagcucgggc cuguggccuu ggcucaugac 5760 gcuuucaugg cugguuccgg gcccccucuu agcgacgacc agauugaaua ccuccagaac 5820 cucaaaucuc uugcccuaac acuggggaag acuaauuugg cccaaagucu 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ccggaaaucc 7560 aaauugagaa agacgaccgc acacgcggug uacaaaccgg aguuugagcc ugcuguguug 7620 ucaaaauuug aucccagacu gaacaaggau guugacuugg augaaguaau uuggucuaaa 7680 cacacugcca augucccuua ccaaccuccu uuguucuaca cauacauguc agaguacgcu 7740 caucgagucu ucuccuucuu ggggaaagac aaugacauuc ugaccgucaa agaagcaauu 7800 cugggcaucc ccggacuaga ccccauggau ccccacacag cuccgggucu gccuuacgcc 7860 aucaacggcc uucgacguac ugaucucguc gauuuuguga acgguacagu agaugcggcg 7920 cuggcuguac aaauccagaa auucuuagac ggugacuacu cugaccaugu cuuccaaacu 7980 uuucugaaag augagaucag acccucagag aaaguccgag cgggaaaaac ccgcauuguu 8040 gaugugcccu cccuggcgca uugcauugug ggcagaaugu ugcuugggcg cuuugcugcc 8100 aaguuucaau cccauccugg cuuucuccuc ggcucugcua ucgggucuga cccugauguu 8160 uucuggaccg ucauaggggc ucaacucgag gggagaaaga acacguauga cguggacuac 8220 agugccuuug acucuucaca cggcacuggc uccuucgagg cucucaucuc ucacuuuuuc 8280 accguggaca augguuuuag cccugcgcug ggaccguauc ucagaucccu ggcugucucg 8340 gugcacgcuu acggcgagcg ucgcaucaag auuaccggug gccuccccuc 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ccccggacua gaccccaugg 7740 auccccacac agcuccgggu cugccuuacg ccaucaacgg ccuucgacgu acugaucucg 7800 ucgauuuugu gaacgguaca guagaugcgg cgcuggcugu acaaauccag aaauucuuag 7860 acggugacua cucugaccau gucuuccaaa cuuuucugaa agaugagauc agacccucag 7920 agaaaguccg agcgggaaaa acccgcauug uugaugugcc cucccuggcg cauugcauug 7980 ugggcagaau guugcuuggg cgcuuugcug ccaaguuuca aucccauccu ggcuuucucc 8040 ucggcucugc uaucgggucu gacccugaug uuuucuggac cgucauaggg gcucaacucg 8100 aggggagaaa gaacacguau gacguggacu acagugccuu ugacucuuca cacggcacug 8160 gcuccuucga ggcucucauc ucucacuuuu ucaccgugga caaugguuuu agcccugcgc 8220 ugggaccgua ucucagaucc cuggcugucu cggugcacgc uuacggcgag cgucgcauca 8280 agauuaccgg uggccucccc uccgguugug ccgcgaccag ccugcugaac acagugcuca 8340 acaaugugau caucaggacu gcucuggcau ugacuuacaa ggaauuugaa uaugacaugg 8400 uugauaucau cgccuacggu gacgaccuuc ugguuggcac ggauuacgau cuggacuuca 8460 augagguggc acgacgcgcu gccaaguugg gguauaagau gacuccugcc aacaaggguu 8520 cugucuuccc uccgacuucc ucucuuuccg augcuguuuu ucuaaagcgc aaauucgucc 8580 aaaacaacga cggcuuauac aaaccaguua uggauuuaaa gaauuuggaa gccaugcucu 8640 ccuacuucaa accaggaaca cuacucgaga agcugcaauc uguuucuaug uuggcucaac 8700 auucuggaaa agaagaauau gauagauuga ugcaccccuu cgcugacuac ggugccguac 8760 cgagucacga guaccugcag gcaagaugga gggccuuguu cgacugaccc agauagccca 8820 aggcgcuucg gugcugccgg cgauucuggg agaacucagu cggaacagaa aagggaaaaa 8880 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 8905 <210> 10 <211> 7658 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVV CXCL10 construct <400> 10 uuugaaaugg ggggcugggc ccugaugccc aguccuuccu uuccccuucc gggggguuaa 60 ccggcugugu uugcuagagg cacagagggg caacauccaa ccugcuuuug cggggaacgg 120 ugcggcuccg auuccugcgu cgccaaaggu guuagcgcac ccaaacggcg caccuaccaa 180 uguuauuggu guggucugcg aguucuagcc uacucguuuc ucccccgacc auucacucac 240 ccacgaaaag uguguuguaa ccauaagauu uaacccccgc acgggaugug cgauaaccgu 300 aagacuggcu caagcgcgga aagcgcugua accacaugcu guuagucccu uuauggcugc 360 aagauggcua cccaccucgg aucacugaac uggagcucga cccuccuuag uaagggaacc 420 gagaggccuu cgugcaacaa gcuccgacac agaguccacg ugacugcuac caccaugagu 480 acaugguucu ccccucucga cccaggacuu cuuuuugaau auccacggcu cgauccagag 540 gguggggcau gaccccuagc auagcgagcu acagcgggaa cuguagcuag gccuuagcgu 600 gccuuggaua cugccugaua gggcgacggc cuagucgugu cgguucuaua gguagcacau 660 acaaauaugc agaacucuca uuuuucuuuc gauacagccu cuggcaccuu ugaagaugua 720 accggaacaa aagucaagau cguugaauac cccagaucgg ugaacaaugg uguuuacgau 780 ucgucuacuc auuuggagau acugaaccua cagggugaaa uugaaauuuu aaggucuuuc 840 aaugaauacc aaauucgcgc cgccaaacaa caacucggac uggacaucgu guacgaacua 900 caggguaaug uucagacaac gucaaagaau gauuuugauu cccguggcaa uaaugguaac 960 augaccuuca auuacuacgc aaacacuuau cagaauucag uagacuucuc gaccuccucg 1020 ucggcgucag gcgccggacc ugggaacucu cggggcggau uagcgggucu ccucacaaau 1080 uucaguggaa ucuugaaccc ucuuggcuac cucaaagauc acaacaccga agaaauggaa 1140 aacucugcug aucgagucac aacgcaaacg gcgggcaaca cugccauaaa cacgcaauca 1200 ucauugggug uguugugugc cuacguugaa gacccgacca aaucugaucc uccguccagc 1260 agcacagauc aacccaccac cacuuucacu gccaucgaca ggugguacac uggacgucuc 1320 aauucuugga caaaagcugu aaaaaccuuc ucuuuucagg ccgucccgcu ucccggugcc 1380 uuucugucua ggcagggagg ccucaacgga ggggccuuca cagcuacccu acauagacac 1440 uuuuugauga agugcgggug gcaggugcag guccaaugua auuugacaca auuccaccaa 1500 ggcgcucuuc uuguugccau gguuccugaa accacccuug augucaagcc cgacgguaag 1560 gcaaagagcu uacaggagcu gaaugaagaa cagugggugg aaaugucuga cgauuaccgg 1620 accgggaaaa acaugccuuu ucagucucuu ggcacauacu aucggccccc uaacuggacu 1680 ugggguccca auuucaucaa ccccuaucaa guaacgguuu ucccacacca aauucugaac 1740 gcgagaaccu cuaccucggu agacauaaac gucccauaca ucggggagac ccccacgcaa 1800 uccucagaga cacagaacuc cuggacccuc cucguuaugg ugcucguucc ccuagacuau 1860 aaggaaggag ccacaacuga cccagaaauu acauuuucug uaaggccuac aagucccuac 1920 uucaaugggc uucgcaaccg cuacacggcc gggacggacg aagaacaggg gcccauuccu 1980 acggcaccca gagaaaauuc gcuuauguuu cucucaaccc ucccugacga cacugucccu 2040 gcuuacggga augugcguac cccuccuguc aauuaccucc cuggugaaau aaccgaccuu 2100 uugcaacugg cccgcauacc cacucucaug gcauuugagc gggugccuga acccgugccu 2160 gccucagaca cauaugugcc cuacguugcc guucccaccc aguucgauga caggccucuc 2220 aucuccuucc cgaucacccu uucagauccc gucuaucaga acacccuggu uggcgccauc 2280 aguucaaauu ucgccaauua ccgugggugu auccaaauca cucugacauu uuguggaccc 2340 augauggcga gagggaaauu ccugcucucg uauucucccc caaauggaac gcaaccacag 2400 acucuuuccg aagcuaugca gugcacauac ucuauuuggg acauaggcuu gaacucuagu 2460 uggaccuucg ucguccccua caucucgccc agugacuacc gugaaacucg agccauuacc 2520 aacucgguuu acuccgcuga ugguugguuu agccugcaca aguugaccaa aauuacucua 2580 ccaccugacu guccgcaaag ucccugcauu cucuuuuucg cuucugcugg ugaggauuac 2640 acucuccguc uccccguuga uuguaauccu uccuaugugu uccacuccac cgacaacgcc 2700 gagaccgggg uuauugaggc ggguaacacu gacaccgauu ucucugguga acuggcggcu 2760 ccuggcucua accacacuaa ugucaaguuc cuguuugauc gaucucgauu auugaaugua 2820 aucaagguac uggagaagga cgccguuuuc ccccgcccuu ucccuacaca agaaggugcg 2880 cagcaggaug augguuacuu uugucuucug accccccgcc caacagucgc uucccgaccc 2940 gccacucguu ucggccugua cgccaauccg uccggcagug guguucuugc uaacacuuca 3000 cuggacuuca auuuuuauag cuuggccugu uucacuuacu uuagaucgga ccuugagguu 3060 acgguggucu cacuagagcc ggaucuggaa uuugcuguag ggugguuucc uucuggcagu 3120 gaauaccagg cuuccagcuu ugucuacgac cagcugcaug ugcccuucca cuuuacuggg 3180 cgcacucccc gcgcuuucgc uagcaagggu gggaagguau cuuucgugcu cccuuggaac 3240 ucugucucgu cugugcuccc cgugcgcugg gggggggcuu ccaagcucuc uucugcuacg 3300 cggggucuac cggcgcaugc ugauuggggg acuauuuacg ccuuuguccc ccguccuaau 3360 gagaagaaaa gcaccgcugu aaaacacgug gccguguaca uucgguacaa gaacgcacgu 3420 gccuggugcc ccagcaugcu ucccuuucgc agcuacaagc agaagaugcu gaugcaaucu 3480 ggcgauaucg agaccaaucc cgggccgaug aacccaagug cugccgucau uuucugccuc 3540 auccugcugg gucugagugg gacucaaggg aucccucucg caaggacggu ccgcugcaac 3600 ugcauccaua ucgaugacgg gccagugaga augagggcca uagggaagcu ugaaaucauc 3660 ccugcgagcc uauccugccc acguguugag aucauugcca cgaugaaaaa gaaugaugag 3720 cagagauguc ugaauccgga aucuaagacc aucaagaauu uaaugaaagc guuuagccaa 3780 aaaaggucua aaagggcucc ugagggcaga ggaagucugc uaacaugcgg ugacgucgag 3840 gagaaucccg ggccugcuuc ugacaaccca auuuuggagu uucuugaagc agaaaaugau 3900 cuagucacuc uggccucucu cuggaagaug gugcacucug uucaacagac cuggagaaag 3960 uaugugaaga acgaugauuu uuggcccaau uuacucagcg agcuaguggg ggaaggcucu 4020 gucgccuugg ccgccacgcu auccaaccaa gcuucaguaa aggcucuuuu gggccugcac 4080 uuucucucuc gggggcucaa uuacacugac uuuuacucuu uacugauaga gaaaugcucu 4140 aguuucuuua ccguagaacc accuccucca ccagcugaaa accugaugac caagcccuca 4200 gugaagucga aauuccgaaa acuguuuaag augcaaggac ccauggacaa agucaaagac 4260 uggaaccaaa uagcugccgg cuugaagaau uuucaauuug uucgugaccu agucaaagag 4320 guggucgauu ggcugcaggc cuggaucaac aaagagaaag ccagcccugu ccuccaguac 4380 caguuggaga ugaagaagcu cgggccugug gccuuggcuc augacgcuuu cauggcuggu 4440 uccgggcccc cucuuagcga cgaccagauu gaauaccucc agaaccucaa aucucuugcc 4500 cuaacacugg ggaagacuaa uuuggcccaa agucucacca cuaugaucaa ugccaaacaa 4560 aguucagccc aacgaguuga acccguugug gugguccuua gaggcaagcc gggaugcggc 4620 aagagcuugg ccucuacguu gauugcccag gcugugucca agcgccucua uggcucccaa 4680 aguguauauu cucuuccccc agauccagau uucuucgaug gauacaaagg acaguucgug 4740 accuugaugg augauuuggg acaaaacccg gauggacaag auuucuccac cuuuugucag 4800 auggugucga ccgcccaauu ucuccccaac auggcggacc uugcagagaa agggcguccc 4860 uuuaccucca aucucaucau ugcaacuaca aaucuccccc acuucagucc ugucaccauu 4920 gcugauccuu cugcagucuc ucgccguauc aacuacgauc ugacucuaga aguaucugag 4980 gccuacaaga aacacacacg gcugaauuuu gacuuggcuu ucaggcgcac agacgccccc 5040 cccauuuauc cuuuugcugc ccaugugccc uuuguggacg uagcugugcg cuucaaaaau 5100 ggucaccaga auuuuaaucu ccuagaguug gucgauucca uuuguacaga cauucgagcc 5160 aagcaacaag gugcccgaaa caugcagacu cugguucuac agagccccaa cgagaaugau 5220 gacacccccg ucgacgaggc guuggguaga guucucuccc ccgcugcggu cgaugaggcg 5280 cuugucgacc ucacuccaga ggccgacccg guuggccguu uggcuauucu ugccaagcua 5340 ggucuugccc uagcugcggu caccccuggu cugauaaucu uggcaguggg acucuacagg 5400 uacuucucug gcucugaugc agaccaagaa gaaacagaaa gugagggauc ugucaaggca 5460 cccaggagcg aaaaugcuua ugacggcccg aagaaaaacu cuaagccccc uggagcacuc 5520 ucucucaugg aaaugcaaca gcccaacgug gacaugggcu uugaggcugc ggucgcuaag 5580 aaaguggucg uccccauuac cuucaugguu cccaacagac cuucugggcu uacacagucc 5640 gcucuucugg ugaccggccg gaccuuccua aucaaugaac auacaugguc caaucccucc 5700 uggaccagcu ucacaauccg cggugaggua cacacucgug augagcccuu ccaaacgguu 5760 cauuucacuc accacgguau ucccacagau cugaugaugg uacgucucgg accgggcaau 5820 ucuuucccua acaaucuaga caaguuugga cuugaccaga ugccggcacg caacucccgu 5880 gugguuggcg uuucguccag uuacggaaac uucuucuucu cuggaaauuu ccucggauuu 5940 guugauucca ucaccucuga acaaggaacu uacgcaagac ucuuuaggua cagggugacg 6000 accuacaaag gauggugcgg cucggcccug gucugugagg ccgguggcgu ccgacgcauc 6060 auuggccugc auucugcugg cgccgccggu aucggcgccg ggaccuauau cucaaaauua 6120 ggacuaauca aagcccugaa acaccucggu gaaccuuugg ccacaaugca aggacugaug 6180 acugaauuag agccuggaau caccguacau guaccccgga aauccaaauu gagaaagacg 6240 accgcacacg cgguguacaa accggaguuu gagccugcug uguugucaaa auuugauccc 6300 agacugaaca 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uguguuguaa ccauaagauu uaacccccgc acgggaugug cgauaaccgu 300 aagacuggcu caagcgcgga aagcgcugua accacaugcu guuagucccu uuauggcugc 360 aagauggcua cccaccucgg aucacugaac uggagcucga cccuccuuag uaagggaacc 420 gagaggccuu cgugcaacaa gcuccgacac agaguccacg ugacugcuac caccaugagu 480 acaugguucu ccccucucga cccaggacuu cuuuuugaau auccacggcu cgauccagag 540 gguggggcau gaccccuagc auagcgagcu acagcgggaa cuguagcuag gccuuagcgu 600 gccuuggaua cugccugaua gggcgacggc cuagucgugu cgguucuaua gguagcacau 660 acaaauaugc agaacucuca uuuuucuuuc gauacagccu cuggcaccuu ugaagaugua 720 accggaacaa aagucaagau cguugaauac cccagaucgg ugaacaaugg uguuuacgau 780 ucgucuacuc auuuggagau acugaaccua cagggugaaa uugaaauuuu aaggucuuuc 840 aaugaauacc aaauucgcgc cgccaaacaa caacucggac uggacaucgu guacgaacua 900 caggguaaug uucagacaac gucaaagaau gauuuugauu cccguggcaa uaaugguaac 960 augaccuuca auuacuacgc aaacacuuau cagaauucag uagacuucuc gaccuccucg 1020 ucggcgucag gcgccggacc ugggaacucu cggggcggau uagcgggucu ccucacaaau 1080 uucaguggaa ucuugaaccc ucuuggcuac cucaaagauc acaacaccga agaaauggaa 1140 aacucugcug aucgagucac aacgcaaacg gcgggcaaca cugccauaaa cacgcaauca 1200 ucauugggug uguugugugc cuacguugaa gacccgacca aaucugaucc uccguccagc 1260 agcacagauc aacccaccac cacuuucacu gccaucgaca ggugguacac uggacgucuc 1320 aauucuugga caaaagcugu aaaaaccuuc ucuuuucagg ccgucccgcu ucccggugcc 1380 uuucugucua ggcagggagg ccucaacgga ggggccuuca cagcuacccu acauagacac 1440 uuuuugauga agugcgggug gcaggugcag guccaaugua auuugacaca auuccaccaa 1500 ggcgcucuuc uuguugccau gguuccugaa accacccuug augucaagcc cgacgguaag 1560 gcaaagagcu uacaggagcu gaaugaagaa cagugggugg aaaugucuga cgauuaccgg 1620 accgggaaaa acaugccuuu ucagucucuu ggcacauacu aucggccccc uaacuggacu 1680 ugggguccca auuucaucaa ccccuaucaa guaacgguuu ucccacacca aauucugaac 1740 gcgagaaccu cuaccucggu agacauaaac gucccauaca ucggggagac ccccacgcaa 1800 uccucagaga cacagaacuc cuggacccuc cucguuaugg ugcucguucc ccuagacuau 1860 aaggaaggag ccacaacuga cccagaaauu acauuuucug uaaggccuac aagucccuac 1920 uucaaugggc uucgcaaccg cuacacggcc gggacggacg aagaacaggg gcccauuccu 1980 acggcaccca gagaaaauuc gcuuauguuu cucucaaccc ucccugacga cacugucccu 2040 gcuuacggga augugcguac cccuccuguc aauuaccucc cuggugaaau aaccgaccuu 2100 uugcaacugg cccgcauacc cacucucaug gcauuugagc gggugccuga acccgugccu 2160 gccucagaca cauaugugcc cuacguugcc guucccaccc aguucgauga caggccucuc 2220 aucuccuucc cgaucacccu uucagauccc gucuaucaga acacccuggu uggcgccauc 2280 aguucaaauu ucgccaauua ccgugggugu auccaaauca cucugacauu uuguggaccc 2340 augauggcga gagggaaauu ccugcucucg uauucucccc caaauggaac gcaaccacag 2400 acucuuuccg aagcuaugca gugcacauac ucuauuuggg acauaggcuu gaacucuagu 2460 uggaccuucg ucguccccua caucucgccc agugacuacc gugaaacucg agccauuacc 2520 aacucgguuu acuccgcuga ugguugguuu agccugcaca aguugaccaa aauuacucua 2580 ccaccugacu guccgcaaag ucccugcauu cucuuuuucg cuucugcugg ugaggauuac 2640 acucuccguc uccccguuga uuguaauccu uccuaugugu uccacuccac cgacaacgcc 2700 gagaccgggg uuauugaggc ggguaacacu gacaccgauu ucucugguga acuggcggcu 2760 ccuggcucua accacacuaa 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gggucagaac cuuguggcag uuccacgaag ugacagugug 3660 accccaguca cuguugcugu uaucacaugc aaguauccag aggcucuuga gcaaggcaga 3720 ggggauccca uuuauuuggg aauccagaau ccagaaaugu guuuguauug ugagaagguu 3780 ggagaacagc ccacauugca gcuaaaagag cagaagauca uggaucugua uggccaaccc 3840 gagcccguga aacccuuccu uuucuaccgu gccaagacug guaggaccuc cacccuugag 3900 ucuguggccu ucccggacug guucauugcc uccuccaaga gagaccagcc caucauucug 3960 acuucagaac uugggaaguc auacaacacu gccuuugaau uaaauauaaa ugacgagggc 4020 agaggaaguc ugcuaacaug cggugacguc gaggagaauc ccgggccugc uucugacaac 4080 ccaauuuugg aguuucuuga agcagaaaau gaucuaguca cucuggccuc ucucuggaag 4140 auggugcacu cuguucaaca gaccuggaga aaguauguga agaacgauga uuuuuggccc 4200 aauuuacuca gcgagcuagu gggggaaggc ucugucgccu uggccgccac gcuauccaac 4260 caagcuucag uaaaggcucu uuugggccug cacuuucucu cucgggggcu caauuacacu 4320 gacuuuuacu cuuuacugau agagaaaugc ucuaguuucu uuaccguaga accaccuccu 4380 ccaccagcug aaaaccugau gaccaagccc ucagugaagu cgaaauuccg aaaacuguuu 4440 aagaugcaag gacccaugga caaagucaaa gacuggaacc aaauagcugc cggcuugaag 4500 aauuuucaau uuguucguga ccuagucaaa gagguggucg auuggcugca ggccuggauc 4560 aacaaagaga aagccagccc uguccuccag uaccaguugg agaugaagaa gcucgggccu 4620 guggccuugg cucaugacgc uuucauggcu gguuccgggc ccccucuuag cgacgaccag 4680 auugaauacc uccagaaccu caaaucucuu gcccuaacac uggggaagac uaauuuggcc 4740 caaagucuca ccacuaugau caaugccaaa caaaguucag cccaacgagu ugaacccguu 4800 gugguggucc uuagaggcaa gccgggaugc ggcaagagcu uggccucuac guugauugcc 4860 caggcugugu ccaagcgccu cuauggcucc caaaguguau auucucuucc cccagaucca 4920 gauuucuucg auggauacaa aggacaguuc gugaccuuga uggaugauuu gggacaaaac 4980 ccggauggac aagauuucuc caccuuuugu cagauggugu cgaccgccca auuucucccc 5040 aacauggcgg accuugcaga gaaagggcgu cccuuuaccu ccaaucucau cauugcaacu 5100 acaaaucucc cccacuucag uccugucacc auugcugauc cuucugcagu cucucgccgu 5160 aucaacuacg aucugacucu agaaguaucu gaggccuaca agaaacacac acggcugaau 5220 uuugacuugg cuuucaggcg cacagacgcc ccccccauuu auccuuuugc ugcccaugug 5280 cccuuugugg acguagcugu 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gcagtgaata 3240 ccaggcttcc agctttgtct acgaccagct gcatgtgccc ttccacttta ctgggcgcac 3300 tccccgcgct ttcgctagca agggtgggaa ggtatctttc gtgctccctt ggaactctgt 3360 ctcgtctgtg ctccccgtgc gctggggggg ggcttccaag ctctcttctg ctacgcgggg 3420 tctaccggcg catgctgatt gggggactat ttacgccttt gtcccccgtc ctaatgagaa 3480 gaaaagcacc gctgtaaaac acgtggccgt gtacattcgg tacaagaacg cacgtgcctg 3540 gtgccccagc atgcttccct ttcgcagcta caagcagaag atgctgatgc aatctggcga 3600 tatcgagacc aatcccgggc ctgcttctga caacccaatt ttggagtttc ttgaagcaga 3660 aaatgatcta gtcactctgg cctctctctg gaagatggtg cactctgttc aacagacctg 3720 gagaaagtat gtgaagaacg atgatttttg gcccaattta ctcagcgagc tagtggggga 3780 aggctctgtc gccttggccg ccacgctatc caaccaagct tcagtaaagg ctcttttggg 3840 cctgcacttt ctctctcggg ggctcaatta cactgacttt tactctttac tgatagagaa 3900 atgctctagt ttctttaccg tagaaccacc tcctccacca gctgaaaacc tgatgaccaa 3960 gccctcagtg aagtcgaaat tccgaaaact gtttaagatg caaggaccca tggacaaagt 4020 caaagactgg aaccaaatag ctgccggctt gaagaatttt caatttgttc 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cttggggaaa gacaatgaca ttctgaccgt 6780 caaagaagca attctgggca tccccggact agaccccatg gatccccaca cagctccggg 6840 tctgccttac gccatcaacg gccttcgacg tactgatctc gtcgattttg tgaacggtac 6900 agtagatgcg gcgctggctg tacaaatcca gaaattctta gacggtgact actctgacca 6960 tgtcttccaa acttttctga aagatgagat cagaccctca gagaaagtcc gagcgggaaa 7020 aacccgcatt gttgatgtgc cctccctggc gcattgcatt gtgggcagaa tgttgcttgg 7080 gcgctttgct gccaagtttc aatcccatcc tggctttctc ctcggctctg ctatcgggtc 7140 tgaccctgat gttttctgga ccgtcatagg ggctcaactc gaggggagaa agaacacgta 7200 tgacgtggac tacagtgcct ttgactcttc acacggcact ggctccttcg aggctctcat 7260 ctctcacttt ttcaccgtgg acaatggttt tagccctgcg ctgggaccgt atctcagatc 7320 cctggctgtc tcggtgcacg cttacggcga gcgtcgcatc aagattaccg gtggcctccc 7380 ctccggttgt gccgcgacca gcctgctgaa cacagtgctc aacaatgtga tcatcaggac 7440 tgctctggca ttgacttaca aggaatttga atatgacatg gttgatatca tcgcctacgg 7500 tgacgacctt ctggttggca cggattacga tctggacttc aatgaggtgg cacgacgcgc 7560 tgccaagttg gggtataaga tgactcctgc caacaagggt tctgtcttcc ctccgacttc 7620 ctctctttcc gatgctgttt ttctaaagcg caaattcgtc caaaacaacg acggcttata 7680 caaaccagtt atggatttaa agaatttgga agccatgctc tcctacttca aaccaggaac 7740 actactcgag aagctgcaat ctgtttctat gttggctcaa cattctggaa aagaagaata 7800 tgatagattg atgcacccct tcgctgacta cggtgccgta ccgagtcacg agtacctgca 7860 ggcaagatgg agggccttgt tcgactgacc cagatagccc aaggcgcttc ggtgctgccg 7920 gcgattctgg gagaactcag tcggaacaga aaagggaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 7980 aaaaaaggcc ggcatggtcc cagcctcctc gctggcgccg gctgggcaac atgcttcggc 8040 atggcgaatg ggacgcggcc gctcgagtct agagggcccg tttaaacccg ctgatcagcc 8100 t 8101 <210> 26 <211> 713 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified CVA21 5' UTR <400> 26 ttaaaacagc tctggggttg ttcccacccc agaggcccac gtggcggcta gtactctggt 60 attacggtac ctttgtacgc ctgttttgta tcccttcccc cgtaacttta gaagcttatc 120 aaaagttcaa tagcaggggt acaaaccagt acctctacga acaagcactt ctgtttcccc 180 ggtgatatca catagactgt acccacggtc aaaagtgatt gatccgttat ccgcttgagt 240 acttcgagaa 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gcttctgata aacgactgag ccgcaccatg ttgggtgaaa 2040 tcctaaatta ttacacccat tggacggggt ccatcaggtt cacctttcta ttttgtggta 2100 gtatgatggc cactggtaaa ctgctcctca gctattcccc accgggagct aaaccaccaa 2160 ccaatcgcaa ggatgcaatg ctaggcacac acatcatctg ggacctaggg ttacaatcca 2220 gttgttccat ggttgcaccg tggatctcca acacagtgta cagacggtgt gcacgtgatg 2280 acttcactga gggcggattt ataacttgct tctatcaaac tagaattgtg gtacctgctt 2340 caacccctac cagtatgttc atgttaggct ttgttagtgc gtgtccagac ttcagtgtca 2400 gactgcttag ggacactccc catattagtc aatcgaaact aataggacgt acacaaggca 2460 ttgaagacct cattgacaca gcgataaaga atgccttaag agtgtcccaa ccaccctcga 2520 cccagtcaac tgaagcaact agtggagtga atagccagga ggtgccagct ctaactgctg 2580 tggaaacagg agcatctggt caagcaatcc ccagtgatgt ggtggaaact aggcacgtgg 2640 taaattacaa aaccaggtct gaatcgtgtc ttgagtcatt ctttgggaga gctgcgtgtg 2700 tcacaatcct atccttgacc aactcctcca agagcggaga ggagaaaaag catttcaaca 2760 tatggaatat tacatacacc gacactgtcc agttacgcag aaaattagag tttttcacgt 2820 attccaggtt tgatcttgaa atgacttttg tattcacaga gaactatcct agtacagcca 2880 gtggagaagt gcgaaaccag gtgtaccaga tcatgtatat tccaccaggg gcaccccgcc 2940 catcatcctg ggatgactac acatggcaat cctcttcaaa cccttccatc ttctacatgt 3000 atggaaatgc acctccacgg atgtcaattc cttacgtagg gattgccaat gcctattcac 3060 acttctacga tggctttgca cgggtgccac ttgagggtga gaacaccgat gctggcgaca 3120 cgttttacgg tttagtgtcc ataaatgatt ttggagtttt agcagttaga gcagtaaacc 3180 gcagtaatcc acatacaata cacacatctg tgagagtgta catgaaacca aaacacattc 3240 ggtgttggtg ccccagacct cctcgagctg tattatacag gggagaggga gtggacatga 3300 tatccagtgc aattctacct ctgaccaagg tagactcaat taccactttt gggtttggtc 3360 atcagaacaa agcagtgtac gttgccggtt acaagatttg caactaccac ctagcaaccc 3420 caagtgatca cttgaatgca attagtatgt tatgggacag ggatttaatg gtggtggaat 3480 ctagagccca gggaactgat accatcgcca gatgtagttg caggtgtgga gtttactatt 3540 gtgaatctag gaggaagtac taccctgtca cttttactgg cccaacgttt cgattcatgg 3600 aagcaaacga ctactatcca gcaagatacc agtctcacat gctgataggg tgcggatttg 3660 cagaacccgg ggactgcggt gggatactga ggtgcactca tggggtaatt ggtatcatta 3720 ctgcaggagg tgaaggggta gtagcctttg ctgacattag agacctctgg gtgtatgaag 3780 aggaggccat ggaacaggga ataacaagct acatcgaatc tctcggcaca gcctttggcg 3840 cagggttcac ccacacaatc agtgagaaag tgactgaatt gacaacaatg gttaccagca 3900 ctatcacaga aaaactactg aaaaacttgg tgaaaatagt gtcggctcta gtgattgttg 3960 tgagaaatta tgaggacact accacgatcc ttgcaacact agcactactc gggtgtgata 4020 tatctccttg gcaatggttg aagaagaagg catgtgactt actagagatt ccttatgtga 4080 tgcgccaagg tgatgggtgg atgaagaaat tcacagaggc gtgcaatgca gctaaaggct 4140 tagagtggat tagcaacaaa atttccaagt ttatagattg gttgaagtgt aaaattatcc 4200 cagacgctaa ggacaaggtg gaatttctca ccaagttgaa acagctagac atgttggaaa 4260 atcaaattgc aaccatccac caatcttgcc ccagccaaga acaacaagag attcttttca 4320 acaatgtgag atggctagca gtccagtccc gtcggtttgc accattatac gctgtggagg 4380 cacgccgaat taacaaaatg gagagcacaa taaacaatta tatacagttc aagagcaaac 4440 accgtattga accagtatgt atgctcattc atgggtcacc agggacgggt aaatctatag 4500 ctacttcatt aataggtaga 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aaaaaaccca atgtccctac tatcagagtc gctaaagtcc 5400 aggggccagg atttgactac gcagtggcaa tggcaaaaag aaacatagtt actgcaacca 5460 ccaccaaggg tgaatttacc atgctagggg tgcatgataa tgtagcaata ttgccaaccc 5520 atgccgctcc aggagaaacc attattattg atgggaaaga agtagagatc ctagatgcca 5580 gagccttaga agatcaagcg ggaaccaatc ttgagatcac cattattact ctaaaaagaa 5640 atgagaagtt tagagacatc agatcacata ttcccaccca aattactgaa actaacgatg 5700 gagtgttgat cgtgaacact agcaagtacc ccaatatgta tgtccccgtt ggtgctgtga 5760 ccgaacaggg atatcttaat ctcagtggac gtcaaactgc tcgcacttta atgtacaact 5820 ttccaacaag ggcaggccag tgcggaggaa tcatcacttg tactggcaaa gtcattggga 5880 tgcatgttgg cgggaacggt tcacatgggt ttgcagcagc cctcaagcga tcatacttca 5940 ctcaaaatca gggcgaaatc cagtggatga ggtcatcaaa agaagtgggg taccccatta 6000 taaatgcccc atccaagaca aagttagaac ccagtgcttt ccactatgtt tttgaaggtg 6060 ttaaggaacc agctgtactc actaagaatg accccagact aaaaacagat tttgaagaag 6120 ccatcttttc taaatatgtg gggaacaaaa ttactgaagt ggacgagtac atgaaagaag 6180 cagtggatca ctatgcagga 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gaaacagtca catgggagaa tgtaacattt ctgaaaagat 7080 ttttcagagc agatgagaag tatccattcc tggtgcatcc agtgatgcca atgaaagaaa 7140 ttcacgaatc aatcagatgg accaaggacc ctagaaacac acaggatcac gtacgctcgt 7200 tgtgcctatt agcttggcac aacggtgaag aagaatacaa taaattttta gctaaaatca 7260 gaagtgtgcc aatcggaaga gctttattgc tcccagagta ctctacattg taccgccgat 7320 ggctcgactc attttagtaa ccctacctca gtcggattgg attgggttat actgttgtag 7380 gggtaaattt ttctttaatt cggagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 7435

Claims (168)

  1. 종양용해성 바이러스를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 지질 나노입자(LNP).
  2. 제1항에 있어서, 상기 종양용해성 바이러스가 단일 가닥 RNA(ssRNA) 바이러스인 LNP.
  3. 제1항에 있어서, 상기 종양용해성 바이러스가 포지티브 센스((+)-센스) ssRNA 바이러스인 LNP.
  4. 제3항에 있어서, 상기 (+)-센스 ssRNA 바이러스가 표 1에 나열된 것들로부터 선택되는 LNP.
  5. 제3항에 있어서, 상기 (+)-센스 ssRNA 바이러스가 피코나바이러스인 LNP.
  6. 제5항에 있어서, 상기 피코나바이러스가 세네카 밸리 바이러스(SVV) 또는 콕사키바이러스인 LNP.
  7. 제6항에 있어서, 상기 SVV가 야생형 SVV-A(서열번호 1), S177A-SVVA 돌연변이체(서열번호 2), SVV-IR2 돌연변이체(서열번호 3) 및 SVV-IR2-S177A 돌연변이체(서열번호 4)로부터 선택되는 SVV-A인 LNP.
  8. 제6항에 있어서, 상기 콕사키바이러스가 CVB3, CVA21 및 CVA9로부터 선택되는 LNP.
  9. 제6항에 있어서, 상기 콕사키바이러스가 서열번호 27을 포함하는 변형된 CVA21 바이러스인 LNP.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에 상기 LNP의 전달은 상기 세포에 의한 바이러스 입자의 생산을 초래하고, 상기 바이러스 입자는 감염성 및 용해성인 LNP.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈이 외인성 페이로드 단백질을 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 LNP.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 페이로드 단백질을 암호화하는 재조합 RNA 분자를 추가로 포함하는 LNP.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 외인성 페이로드 단백질이 형광 단백질, 효소 단백질, 사이토카인, 케모카인, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자, 또는 세포 표면 수용체에 대한 리간드인 LNP.
  14. 제13항에 있어서, 상기 사이토카인이 IL-12, GM-CSF, IL-18, IL-2 및 IL-36γ로부터 선택되는 LNP.
  15. 제13항에 있어서, 상기 세포 표면 수용체에 대한 리간드가 Flt3 리간드 또는 TNFSF14인 LNP.
  16. 제13항에 있어서, 상기 케모카인이 CXCL10, CCL4, CCL21 및 CCL5로부터 선택되는 LNP.
  17. 제13항에 있어서, 상기 항원 결합 분자가 면역 관문 수용체에 결합하여 이를 억제할 수 있는 LNP.
  18. 제17항에 있어서, 상기 면역 관문 수용체가 PD-1인 LNP.
  19. 제13항에 있어서, 상기 항원 결합 분자가 종양 항원에 결합할 수 있는 LNP.
  20. 제19항에 있어서, 상기 항원 결합 분자가 이중특이적 T 세포 체결자 분자(BiTE) 또는 이중특이적 경쇄 T 세포 체결자 분자(LiTE)인 LNP.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 종양 항원이 DLL3 또는 EpCAM인 LNP.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈 및/또는 재조합 RNA 분자가 마이크로 RNA(miRNA) 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하고, 상기 miR-TS 카세트는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 LNP.
  23. 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 miRNA가 miR-124, miR-1, miR-143, miR-128, miR-219, miR-219a, miR-122, miR-204, miR-217, miR-137 및 miR-126으로부터 선택되는 LNP.
  24. 제23항에 있어서, 상기 miR-TS 카세트가 miR-124 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-1 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-143 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 LNP.
  25. 제23항에 있어서, 상기 miR-TS 카세트가 miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-219a 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-122 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 LNP.
  26. 제23항에 있어서, 상기 miR-TS 카세트가 miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-204 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-219 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 LNP.
  27. 제23항에 있어서, 상기 miR-TS 카세트가 miR-217 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-137 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-126 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 LNP.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 양이온성 지질, 하나 이상의 헬퍼 지질 및 인지질-중합체 접합체를 포함하는 LNP.
  29. 제28항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 DLinDMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA(MC3), COATSOME® SS-LC(이전 명칭: SS-18/4PE-13), COATSOME® SS-EC(이전 명칭: SS-33/4PE-15), COATSOME® SS-OC, COATSOME® SS-OP, 디((Z)-논-2-엔-1-일)9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L-319) 또는 N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP)로부터 선택되는 LNP.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 헬퍼 지질이 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); 및 콜레스테롤로부터 선택되는 LNP.
  31. 제28항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)이고, 상기 중성 지질이 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)인 LNP.
  32. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인지질-중합체 접합체가 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)] (DSPE-PEG); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌글리콜(DPG-PEG); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DSG-PEG); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DSG-PEG); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DMG-PEG); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DMG-PEG), 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG-아민)으로부터 선택되는 LNP.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인지질-중합체 접합체가 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-5000](DSPE-PEG5K); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DPG-PEG2K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DSG-PEG5K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DSG-PEG2K); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DMG-PEG5K); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DMG-PEG2K)으로부터 선택되는 LNP.
  34. 제28항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 COATSOME® SS-OC를 포함하고, 상기 하나 이상의 헬퍼 지질이 콜레스테롤(Chol) 및 DSPC를 포함하며, 상기 인지질-중합체 접합체가 DPG-PEG2000을 포함하는 LNP.
  35. 제34항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-25%, C = 20%-30%, 및 D = 0%-3%이고, A+B+C+D = 100%인 LNP.
  36. 제34항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-50%, B = 20%-25%, C = 25%-30%, 및 D = 0%-1%이고, A+B+C+D = 100%인 LNP.
  37. 제34항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 49:22:28.5:0.5인 LNP.
  38. 제34항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-30%, C = 20%-45%, 및 D = 0%-3%이고, A+B+C+D = 100%인 LNP.
  39. 제34항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-30%, C = 25%-45%, 및 D = 0%-3%이고, A+B+C+D = 100%인 LNP.
  40. 제34항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-55%, B = 10%-20%, C = 30%-40%, 및 D = 1%-2%이고, A+B+C+D = 100%인 LNP.
  41. 제34항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-50%, B = 10%-15%, C = 35%-40%, 및 D = 1%-2%이고, A+B+C+D = 100%인 LNP.
  42. 제34항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 49:11:38.5:1.5인 LNP.
  43. 제34항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-65%, B = 5%-20%, C = 20%-45%, 및 D = 0%-3%이고, A+B+C+D = 100%인 LNP.
  44. 제34항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 50%-60%, B = 5%-15%, C = 30%-45%, 및 D = 0%-3%이고, A+B+C+D = 100%인 LNP.
  45. 제34항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 55%-60%, B = 5%-15%, C = 30%-40% 및 D = 1%-2%이고, A+B+C+D = 100%인 LNP.
  46. 제34항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 55%-60%, B = 5%-10%, C = 30%-35%, 및 D = 1%-2%이고, A+B+C+D = 100%인 LNP.
  47. 제34항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 58:7:33.5:1.5인 LNP.
  48. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 표 5로부터 선택되는 지질 제형을 포함하는 LNP.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로난이 상기 LNP의 표면에 접합된 LNP.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료학적 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 상기 복수의 LNP가 약 50nm 내지 약 500nm, 약 150nm 내지 약 500nm, 약 200nm 내지 약 500nm, 약 300nm 내지 약 500nm, 약 350nm 내지 약 500nm, 약 400nm 내지 약 500nm, 약 425nm 내지 약 500nm, 약 450nm 내지 약 500nm, 또는 약 475nm 내지 약 500nm의 평균 크기를 갖는 치료학적 조성물.
  52. 제50항에 있어서, 상기 복수의 LNP가 약 50nm 내지 약 120nm의 평균 크기를 갖는 치료학적 조성물.
  53. 제50항에 있어서, 상기 복수의 LNP가 약 50nm, 60nm, 70nm, 80nm, 90nm, 100nm, 110nm, 또는 약 120nm의 평균 크기를 갖는 치료학적 조성물.
  54. 제50항에 있어서, 상기 복수의 LNP가 약 100nm의 평균 크기를 갖는 치료학적 조성물.
  55. 제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 LNP가 약 40mV 내지 약 -40mV, 약 20mV 내지 약 -20mV, 약 10mV 내지 약 -10mV, 약 5mV 내지 약 -5mV, 또는 약 20mV 내지 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는 치료학적 조성물.
  56. 제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 LNP가 약 -20mV 미만, 약 -30mV 미만, 약 -35mV 미만, 또는 약 -40mV 미만의 평균 제타 전위를 갖는 치료학적 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 상기 복수의 LNP가 약 -50mV 내지 약 -20mV, 약 -40mV 내지 약 -20mV, 또는 약 -30mV 내지 약 -20mV의 평균 제타 전위를 갖는 치료학적 조성물.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 복수의 LNP가 약 -30mV, 약 -31mV, 약 -32mV, 약 -33mV, 약 -34mV, 약 -35mV, 약 -36mV, 약 -37mV, 약 -38mV, 약 -39mV 또는 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는 치료학적 조성물.
  59. 제50항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 상기 치료학적 조성물의 투여는 상기 대상체의 표적 세포로 상기 재조합 RNA 폴리뉴클레오타이드를 전달하고, 상기 재조합 RNA 폴리뉴클레오타이드는 상기 대상체의 상기 표적 세포를 용해시킬 수 있는 감염성 종양용해성 바이러스를 생산하는 치료학적 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 상기 조성물이 정맥내 또는 종양내 전달용으로 제형화되는 치료학적 조성물.
  61. 제59항에 있어서, 상기 표적 세포가 암성 세포인 치료학적 조성물.
  62. 제50항 내지 제61항 중 어느 한 항에 따른 치료학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상체의 암성 종양의 성장을 억제하는 방법으로서, 상기 조성물의 투여가 상기 종양의 성장을 억제하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 투여가 종양내 또는 정맥내인 방법.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 암이 폐암, 간암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 위암, 유방암, 신경모세포종, 횡문근육종, 수모세포종, 또는 흑색종인 방법.
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 신경내분비암인 방법.
  66. 종양용해성 바이러스를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 재조합 RNA 분자.
  67. 제66항에 있어서, 상기 암호화된 종양용해성 바이러스가 단일 가닥 RNA(ssRNA) 바이러스인 재조합 RNA 분자.
  68. 제67항에 있어서, 상기 ssRNA 바이러스가 포지티브 센스((+)-센스) 또는 네거티브 센스((-)-센스) ssRNA 바이러스인 재조합 RNA 분자.
  69. 제68항에 있어서, 상기 (+)-센스 ssRNA 바이러스가 피코나바이러스인 재조합 RNA 분자.
  70. 제69항에 있어서, 상기 피코나바이러스가 세네카 밸리 바이러스(SVV) 또는 콕사키바이러스인 재조합 RNA 분자.
  71. 제70항에 있어서, 상기 SVV가 야생형 SVV-A(서열번호 1), S177A-SVVA 돌연변이체(서열번호 2), SVV-IR2 돌연변이체(서열번호 3), 또는 SVV-IR2-S177A(서열번호 4)로부터 선택되는 SVV-A인 재조합 RNA 분자.
  72. 제70항에 있어서, 상기 콕사키바이러스가 CVB3, CVA21 및 CVA9로부터 선택되는 재조합 RNA 분자.
  73. 제70항에 있어서, 상기 콕사키바이러스가 서열번호 27을 포함하는 변형된 CVA21 바이러스인 재조합 RNA 분자.
  74. 제66항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양용해성 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 삽입된 마이크로 RNA(miRNA) 표적 서열 (miR-TS) 카세트를 추가로 포함하고, 상기 miR-TS 카세트는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 세포에 있는 하나 이상의 상응하는 miRNA의 발현이 상기 세포에서 상기 암호화된 바이러스의 복제를 억제하는, 재조합 RNA 분자.
  75. 제74항에 있어서, 상기 하나 이상의 miRNA가 miR-124, miR-1, miR-143, miR-128, miR-219, miR-219a, miR-122, miR-204, miR-217, miR-137 및 miR-126으로부터 선택되는 재조합 RNA 분자.
  76. 제75항에 있어서, 상기 miR-TS 카세트가 miR-124 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-1 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-143 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 재조합 RNA 분자.
  77. 제75항에 있어서, 상기 miR-TS 카세트가 miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-219a 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-122 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 재조합 RNA 분자.
  78. 제75항에 있어서, 상기 miR-TS 카세트가 miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-204 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-219 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 재조합 RNA 분자.
  79. 제75항에 있어서, 상기 miR-TS 카세트가 miR-217 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-137 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 miR-126 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 재조합 RNA 분자.
  80. 제66항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 RNA 분자가 비-바이러스 전달 비히클에 의해 세포내로 도입된 경우, 복제-적격 종양용해성 바이러스를 생산할 수 있는 재조합 RNA 분자.
  81. 제80항에 있어서, 상기 세포가 포유류 세포인 재조합 RNA 분자.
  82. 제81항에 있어서, 상기 세포가 포유류 대상체에 존재하는 포유류 세포인 재조합 RNA 분자.
  83. 제66항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제-적격 바이러스가 콕사키바이러스, 폴리오 바이러스, 세네카 밸리 바이러스, 라사 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 홍역 바이러스, 신드비스 바이러스 및 마라바 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 재조합 RNA 분자.
  84. 제74항에 있어서, 상기 하나 이상의 miR-TS 카세트가 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 5' 비해독 영역(UTR) 또는 3' UTR에 통합되는 재조합 RNA 분자.
  85. 제84항에 있어서, 상기 하나 이상의 miR-TS 카세트가 하나 이상의 비필수 유전자의 5' 비해독 영역(UTR) 또는 3' UTR에 통합되는 재조합 RNA 분자.
  86. 제66항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 RNA 분자가 핵산 벡터에 삽입된 재조합 RNA 분자.
  87. 제141항에 있어서, 상기 핵산 벡터가 레플리콘인 재조합 RNA 분자.
  88. 제66항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈이 외인성 페이로드 단백질을 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 재조합 RNA 분자.
  89. 제88항에 있어서, 상기 외인성 페이로드 단백질이 형광 단백질, 효소 단백질, 사이토카인, 케모카인, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자, 또는 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드인 재조합 RNA 분자.
  90. 제89항에 있어서, 상기 사이토카인이 IL-12, GM-CSF, IL-18, IL-2 및 IL-36γ로부터 선택되는 재조합 RNA 분자.
  91. 제89항에 있어서, 상기 세포 표면 수용체에 대한 리간드가 Flt3 리간드 또는 TNFSF14인 재조합 RNA 분자.
  92. 제89항에 있어서, 상기 케모카인이 CXCL10, CCL4, CCL21 및 CCL5로부터 선택되는 재조합 RNA 분자.
  93. 제89항에 있어서, 상기 항원 결합 분자가 면역 관문 수용체에 결합하고 이를 억제할 수 있는 재조합 RNA 분자.
  94. 제93항에 있어서, 상기 면역 관문 수용체가 PD-1인 재조합 RNA 분자.
  95. 제89항에 있어서, 상기 항원 결합 분자가 종양 항원에 결합할 수 있는 재조합 RNA 분자.
  96. 제95항에 있어서, 상기 항원 결합 분자가 이중특이적 T 세포 체결자 분자(BiTE) 또는 이중특이적 경쇄 T 세포 체결자 분자(LiTE)인 재조합 RNA 분자.
  97. 제95항 또는 제96항에 있어서, 상기 종양 항원이 DLL3 또는 EpCAM인 재조합 RNA 분자.
  98. 프로모터 서열, 5' 접합부 절단 서열, 제66항 내지 제97항 중 어느 한 항의 재조합 RNA 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 3' 접합부 절단 서열을 5'에서 3'로 포함하는 재조합 DNA 분자.
  99. 제98항에 있어서, 상기 프로모터 서열이 T7 프로모터 서열인 재조합 DNA 분자.
  100. 제98항 또는 제99항에 있어서, 상기 5' 접합부 절단 서열이 리보자임 서열이고, 상기 3' 접합부 절단 서열이 리보자임 서열인 재조합 DNA 분자.
  101. 제100항에 있어서, 상기 5' 리보자임 서열이 해머헤드 리보자임 서열이고, 상기 3' 리보자임 서열이 델타 간염 바이러스 리보자임 서열인 재조합 DNA 분자.
  102. 제98항 또는 제99항에 있어서, 상기 5' 접합부 절단 서열이 리보자임 서열이고, 상기 3' 접합부 절단 서열이 제한 효소 인식 서열인 재조합 DNA 분자.
  103. 제102항에 있어서, 상기 5' 리보자임 서열이 해머헤드 리보자임 서열, 피스톨 리보자임 서열, 또는 변형된 피스톨 리보자임 서열인 재조합 DNA 분자.
  104. 제102항 또는 제103항에 있어서, 상기 3' 제한 효소 인식 서열이 IIS형 제한 효소 인식 서열인 재조합 DNA 분자.
  105. 제104항에 있어서, 상기 IIS형 인식 서열이 SapI 인식 서열인 재조합 DNA 분자.
  106. 제98항 또는 제99항에 있어서, 상기 5' 접합부 절단 서열이 RNAseH 프라이머 결합 서열이고 상기 3' 접합부 절단 서열이 제한 효소 인식 서열인 재조합 DNA 분자.
  107. 제98항 내지 제106항 중 어느 한 항의 DNA 분자를 시험관내 전사하는 단계 및 생성된 재조합 RNA 분자를 정제하는 단계를 포함하는, 제66항 내지 제97항 중 어느 한 항의 재조합 RNA 분자를 생산하는 방법.
  108. 제107항에 있어서, 상기 재조합 RNA 분자가 상기 합성 RNA 바이러스 게놈에 의해 암호화된 종양용해성 바이러스에 고유한 5' 및 3' 단부를 포함하는 방법.
  109. 제66항 내지 제97항 중 어느 한 항의 재조합 RNA 분자의 유효량, 및 포유류 대상체에게 투여하기에 적합한 담체를 포함하는 조성물.
  110. 제66항 내지 제97항 중 어느 한 항의 재조합 RNA 분자를 포함하는 입자.
  111. 제110항에 있어서, 상기 입자가 생분해성인 입자.
  112. 제111항에 있어서, 상기 입자가 나노입자, 엑소좀, 리포좀 및 리포플렉스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 입자.
  113. 제112항에 있어서, 상기 엑소좀이 온전한 엑소좀 또는 빈 엑소좀으로부터 유래된 변형된 엑소좀인 입자.
  114. 제112항에 있어서, 상기 나노입자가 양이온성 지질, 하나 이상의 헬퍼 지질 및 인지질-중합체 접합체를 포함하는 지질 나노입자(LNP)인 입자.
  115. 제114항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 DLinDMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA(MC3), COATSOME® SS-LC(이전 명칭: SS-18/4PE-13), COATSOME® SS-EC(이전 명칭: SS-33/4PE-15), COATSOME® SS-OC, COATSOME® SS-OP, 디((Z)-논-2-엔-1-일)9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L-319) 또는 N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP)로부터 선택되는 입자.
  116. 제114항 또는 제115항에 있어서, 상기 헬퍼 지질이 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); 및 콜레스테롤로부터 선택되는 입자.
  117. 제114항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)이고, 상기 중성 지질이 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)인 입자.
  118. 제114항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인지질-중합체 접합체가 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌글리콜(DPG-PEG); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DSG-PEG); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DSG-PEG); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DMG-PEG); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DMG-PEG), 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG-아민)으로부터 선택되는 입자.
  119. 제114항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인지질-중합체 접합체가 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-5000](DSPE-PEG5K); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DPG-PEG2K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DSG-PEG5K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DSG-PEG2K); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DMG-PEG5K); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DMG-PEG2K)로부터 선택되는 입자.
  120. 제114항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 COATSOME® SS-OC를 포함하고, 상기 하나 이상의 헬퍼 지질이 콜레스테롤(Chol) 및 DSPC를 포함하고, 상기 인지질-중합체 접합체가 DPG-PEG2000을 포함하는 입자.
  121. 제120항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-25%, C = 20%-30%, 및 D = 0%-3%이고, A+B+C+D = 100%인 입자.
  122. 제120항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-50%, B = 20%-25%, C = 25%-30%, 및 D = 0%-1%이고, A+B+C+D = 100%인 입자.
  123. 제120항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 49:22:28.5:0.5인 입자.
  124. 제120항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-30%, C = 20%-45%, 및 D = 0%-3%이고, A+B+C+D = 100%인 입자.
  125. 제120항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 40%-60%, B = 10%-30%, C = 25%-45%, 및 D = 0%-3%이고, A+B+C+D = 100%인 입자.
  126. 제120항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-55%, B = 10%-20%, C = 30%-40%, 및 D = 1%-2%이고, A+B+C+D = 100%인 입자.
  127. 제120항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-50%, B = 10%-15%, C = 35%-40%, 및 D = 1%-2%이고, A+B+C+D = 100%인 입자.
  128. 제120항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 49:11:38.5:1.5인 입자.
  129. 제120항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 45%-65%, B = 5%-20%, C = 20%-45%, 및 D = 0%-3%이고, A+B+C+D = 100%인 입자.
  130. 제120항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 50%-60%, B = 5%-15%, C = 30%-45%, 및 D = 0%-3%이고, A+B+C+D = 100%인 입자.
  131. 제120항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 55%-60%, B = 5%-15%, C = 30%-40% 및 D = 1%-2%이고, A+B+C+D = 100%인 입자.
  132. 제120항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 약 A:B:C:D이고, 여기서 A = 55%-60%, B = 5%-10%, C = 30%-35%, 및 D = 1%-2%이고, A+B+C+D = 100%인 입자.
  133. 제120항에 있어서, 상기 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율로서)이 58:7:33.5:1.5인 방법.
  134. 제110항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 표 5로부터 선택되는 지질 제형을 포함하는 입자.
  135. 제114항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로판(DOTAP)이고, 상기 중성 지질이 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)인 입자.
  136. 제114항 또는 제135항에 있어서, 추가로 인지질-중합체 접합체를 포함하고, 상기 인지질-중합체 접합체가 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리(에틸렌글리콜)(DSPE-PEG), 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG-아민)인 입자.
  137. 제110항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로난이 상기 LNP의 표면에 접합된 입자.
  138. 제110항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드 분자를 암호화하는 제2 재조합 RNA 분자를 추가로 포함하는 입자.
  139. 제138항에 있어서, 상기 제2 재조합 RNA 분자가 레플리콘인 입자.
  140. 제114항 내지 제139항 중 어느 한 항에 따른 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료학적 조성물.
  141. 제140항에 있어서, 상기 복수의 LNP가 약 50nm 내지 약 500nm, 약 150nm 내지 약 500nm, 약 200nm 내지 약 500nm, 약 300nm 내지 약 500nm, 약 350nm 내지 약 500nm, 약 400nm 내지 약 500nm, 약 425nm 내지 약 500nm, 약 450nm 내지 약 500nm, 또는 약 475nm 내지 약 500nm의 평균 크기를 갖는 치료학적 조성물.
  142. 제140항에 있어서, 상기 복수의 LNP가 약 50nm 내지 약 120nm의 평균 크기를 갖는 치료학적 조성물.
  143. 제140항에 있어서, 상기 복수의 LNP가 약 50nm, 60nm, 70nm, 80nm, 90nm, 100nm, 110nm, 또는 약 120nm의 평균 크기를 갖는 치료학적 조성물.
  144. 제140항에 있어서, 상기 복수의 LNP가 약 100nm의 평균 크기를 갖는 치료학적 조성물.
  145. 제140항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 LNP가 약 20mV 내지 약 -20mV, 약 10mV 내지 약 -10mV, 약 5mV 내지 약 -5mV, 또는 약 20mV 내지 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는 치료학적 조성물.
  146. 제140항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 LNP가 약 -20mV 미만, 약 -30mV 미만, 약 -35mV 미만, 또는 약 -40mV 미만의 평균 제타 전위를 갖는 치료학적 조성물.
  147. 제146항에 있어서, 상기 복수의 LNP가 약 -50mV 내지 약 -20mV, 약 -40mV 내지 약 -20mV, 또는 약 -30mV 내지 약 -20mV의 평균 제타 전위를 갖는 치료학적 조성물.
  148. 제141항 또는 제146항에 있어서, 상기 복수의 LNP가 약 -30mV, 약 -31mV, 약 -32mV, 약 -33mV, 약 -34mV, 약 -35mV, 약 -36mV, 약 -37mV, 약 -38mV, 약 -39mV 또는 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는 치료학적 조성물.
  149. 제140항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 상기 조성물의 전달이 상기 캡슐화된 재조합 RNA 분자를 표적 세포로 전달하고, 상기 캡슐화된 재조합 RNA 분자는 상기 표적 세포를 용해시킬 수 있는 감염성 바이러스를 생산하는 치료학적 조성물.
  150. 제149항에 있어서, 정맥내 또는 종양내 전달용으로 제형화된 치료학적 조성물.
  151. 제150항에 있어서, 상기 표적 세포가 암성 세포인 치료학적 조성물.
  152. 제66항 내지 제97항 중 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 무기 입자.
  153. 제152항에 있어서, 상기 무기 입자가 금 나노입자(GNP), 금 나노막대(GNR), 자기 나노입자(MNP), 자기 나노튜브(MNT), 탄소 나노혼(CNH), 탄소 풀러렌, 탄소 나노튜브(CNT), 인산 칼슘 나노입자(CPNP), 중간다공성 실리카 나노입자(MSN), 실리카 나노튜브(SNT), 또는 성상 중공 실리카 나노입자(SHNP)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 무기 입자.
  154. 제150항에 있어서, 페이로드 분자를 암호화하는 제2 재조합 RNA 분자를 추가로 포함하는 무기 입자.
  155. 제154항에 있어서, 상기 제2 재조합 RNA 분자가 레플리콘인 입자.
  156. 제152항 내지 제155항 중 어느 한 항의 무기 입자를 포함하는 조성물로서, 상기 입자의 평균 직경이 약 500nm 미만, 약 50nm 내지 500nm 사이, 약 250nm 내지 약 500nm 사이, 또는 약 350nm인 조성물.
  157. 제1항 내지 제49항, 제110항 내지 제139항 및 제152항 내지 제155항 중 어느 한 항의 입자, 제66항 내지 제97항 중 어느 한 항의 재조합 RNA 분자, 또는 이의 조성물에 암성 세포를, 상기 입자를 상기 암성 세포로 세포내 전달하기에 충분한 조건하에, 노출시키는 것을 포함하는 암성 세포를 사멸시키는 방법으로서, 상기 캡슐화된 폴리뉴클레오타이드에 의해 생산된 복제-적격 바이러스가 상기 암성 세포의 사멸을 초래하는 방법.
  158. 제157항에 있어서, 상기 복제-적격 바이러스가 비암성 세포에서 생산되지 않는 방법.
  159. 제157항 또는 제158항에 있어서, 생체내, 시험관내 또는 생체외에서 수행되는 방법.
  160. 제1항 내지 제49항, 제110항 내지 제139항, 및 제152항 내지 제155항 중 어느 한 항의 입자, 제66항 내지 제97항 중 어느 한 항의 재조합 RNA 분자, 또는 이의 조성물의 유효량을 암을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 암을 치료하는 방법.
  161. 제160항에 있어서, 상기 입자 또는 이의 조성물이 정맥내, 비강내, 흡입제로서 투여되거나, 또는 종양 내로 직접 투여되는 방법.
  162. 제160항 또는 제161항에 있어서, 상기 입자 또는 이의 조성물이 상기 대상체에게 반복적으로 투여되는 방법.
  163. 제160항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 마우스, 랫트, 토끼, 고양이, 개, 말, 비-인간 영장류 또는 인간인 방법.
  164. 제160항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 폐암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암, 고환암, 결장직장암, 결장암, 췌장암, 간암, 위암, 두경부암, 갑상선암, 악성 신경교종, 교모세포종, 흑색종, B 세포 만성 림프구성 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 육종, 신경모세포종, 신경내분비암, 횡문근육종, 수모세포종, 방광암, 및 변연부 림프종(MZL)으로부터 선택되는 방법.
  165. 제164항에 있어서, 상기 폐암이 소세포 폐암 또는 비소세포 폐암인 방법.
  166. 제164항에 있어서, 상기 간암이 간세포 암종(HCC)인 방법.
  167. 제164항에 있어서, 상기 전립선암이 치료-유발 신경내분비 전립선암인 방법.
  168. 제150항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 신경내분비 암인 방법.
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