JP6396891B2 - 遺伝子改変コクサッキーウイルス - Google Patents
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Description
本発明は、癌の処置に適用可能な、改変コクサッキーウイルスに関する。本発明は、腫瘍溶解性ウイルス療法の分野で有用である。
腫瘍溶解性ウイルス療法（癌ウイルス療法）とは、ウイルスを癌細胞に感染させ、癌組織内でウイルスを増殖させながらウイルスが有する腫瘍溶解性を利用して癌組織を破壊・死滅させる治療法である。DNAウイルスであるアデノウイルスや単純ヘルペスウイルスを利用した臨床研究が脳腫瘍や乳癌を対象として実施されており、安全性と有効性を示す結果が報告されつつある。
コクサッキーウイルスB群3型（CVB3）は（非特許文献1〜3）、1本鎖プラス鎖RNAゲノムを有し、細胞質内のみで増殖し、宿主細胞ゲノムに対する変異導入の可能性が低いために、腫瘍溶解性ウイルス療法において安全性が比較的高いと考えられている。また、CVB3はありふれたウイルスであり、多くの場合、感染しても不顕性感染に留まる。しかしながら、無菌性髄膜炎、ウイルス性心筋炎、膵炎との関連性に関する報告がある。また、CVB3に関しては、ヒト非小細胞肺癌に対する顕著な腫瘍溶解性が報告されている（非特許文献4）。
一方、腫瘍溶解性ウイルス療法への適用が期待されるウイルスの一つとして、コクサッキーウイルスA21(CVA21)が知られており（特許文献1）、ウイルスゲノムにmiRNAを組み込むことにより、組織特異的にウイルスを増殖させたとの報告がある（非特許文献5）。
Liu Z. et al. Virology. 265: 206-17 (1999)
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Henke A. et al. Int J Med Microbiol. 298: 127-34 (2008)
Miyamoto, S. et al. Cancer Res. 72 (10), 2609-21 (2012)
Russell, SJ. et al. Nat Med. 14 (11), 1278-83 (2008)
本発明者らの検討によると、野生型CVB3（CVB-WT）をin vivoで評価した際に、血清生化学検査においてはAMY、CK、ASTおよびALTの上昇が生じ、また組織診では、膵臓における外分泌組織の破壊、心筋における炎症性湿潤、肝臓における炎症性湿潤が観られた。これらの好ましくない作用は軽減されることが望ましい。
そこで、本発明者らはCVB3-WTのゲノム3'untranslated region（UTR）に組織特異的microRNA（miRNA）の標的配列を挿入することを試みた。これにより、miRNAが存在する組織においては、挿入した標的配列にmiRNAを含むRISC複合体が結合し、ウイルスタンパク質の翻訳が阻害されるため、組織特異的にウイルス増殖が抑制されることを期待した。その際、本発明者らは、これまで類似の目的での利用が一切検討されてこなかった２つのmiRNAに着目した。１つは膵臓特異的に発現しているといわれているmiR-217であり、もう1つは筋組織および正常細胞特異的に発現しているといわれているmiR-1であった。
一方、上述の特定のmiRNAの標的配列のゲノムへの挿入を検討する中で、3'UTR中であっても、挿入する位置によっては、ウイルスの複製が妨げられることが判明し、適切な挿入位置を見出す必要があることが分かった。
また本発明者らは、CVB3-WTでは腫瘍の完全治療が認められない事例に対しては、さらに腫瘍に対する効果を高めた改変ウイルスが必要であると考えた。
本発明は、以下を提供する。
[1]コクサッキーウイルスB3野生型(CVB3-WT)のゲノムに、組織特異的microRNA(miRNA)の標的配列からなるポリヌクレオチドが少なくとも一つ挿入された変異ゲノムを含む、組織特異的に増殖が抑制された改変コクサッキーウイルス。
[2]挿入される位置が、CVB3-WTゲノムの3'UTR領域内である、1に記載の改変コクサッキーウイルス。
[3]挿入される位置が、CVB3-WTゲノムの位置7344より上流または位置7345より下流（好ましくは位置7304と7305との間）である、1または2に記載の改変コクサッキーウイルス。
[4]組織特異的miRNAが、膵臓および／または心筋に発現しているものである、1〜3のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルス。
[5]組織特異的miRNAが、miR-1および／またはmiR-217である、1〜4のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルス。
[6]標的配列からなるポリヌクレオチドが複数個（例えば2〜6個）挿入された、1〜5のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルス。
[7]挿入されるポリヌクレオチドが、下記(a)若しくは(b)、または(a)若しくは(b)において1〜数個のヌクレオチドを欠失、置換若しくは付加した配列からなるポリヌクレオチドである、1〜6のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルス。
(a) ATA CAT ACT TCT TTA CAT TCC Acg atA TAC ATA CTT CTT TAC ATT CCA acc ggt TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TAt cac TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TA (配列番号1)
(b) TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TAc gat TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TAa ccg gtT CCA ATC AGT TCC TGA TGC AGT Atc acT CCA ATC AGT TCC TGA TGC AGT A(配列番号2)
[8]変異ゲノムがさらに、顆粒球単球コロニー刺激因子（GM-CSF)をコードする領域が発現可能に挿入されている、1〜7のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルス。
[9]変異ゲノムがさらに、GM-CSFをコードする領域とその下流に連結された2Aプロテアーゼ認識配列をコードする領域とを含むポリヌクレオチドが、翻訳開始地点のATGの下流でありかつVP4領域の上流である位置に、機能可能に挿入されている、1〜8のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルス。
[10]2Aプロテアーゼ認識配列が、ポリオウイルス由来の2Aプロテアーゼが認識可能な配列に改変したものである、9に記載の改変コクサッキーウイルス。
[11]CVB3-WTゲノムにおいて、GM-CSFをコードする領域が発現可能に挿入された変異ゲノムを含む、改変コクサッキーウイルス。
[12]CVB3-WTゲノムにおいて、GM-CSFをコードする領域とその下流に連結された2Aプロテアーゼ認識配列をコードする領域とを含むポリヌクレオチドが、翻訳開始地点のATGの下流でありかつVP4領域の上流である位置に、機能可能に挿入された変異ゲノムを含む、改変コクサッキーウイルス。
[13]2Aプロテアーゼ認識配列が、ポリオウイルス由来の2Aプロテアーゼが認識可能な配列に改変したものである、12に記載の改変コクサッキーウイルス。
[14]1〜13のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルスを含む医薬組成物。
[15]癌、好ましくは癌（好ましくは肺癌、より好ましくは非小細胞肺癌）またはその前癌状態の処置（予防または治療）のための、14に記載の医薬組成物。
[16]癌（好ましくは肺癌、より好ましくは非小細胞肺癌）またはその前癌状態の処置（予防または治療）において使用するための、1〜13のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルス。
[17]1〜13のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルス、または14若しくは15に記載の医薬組成物を用いる、癌（好ましくは肺癌、より好ましくは非小細胞肺癌）またはその前癌状態の処置（予防または治療）方法。
[18]1〜13のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルスの、力価測定または増殖のための、対応する組織特異的miRNA の発現量が高くない細胞(例えば、H1299細胞)の使用。
[19]局所用または全身投与用の製剤である、14または15に記載の医薬組成物。
[1]コクサッキーウイルスB3野生型(CVB3-WT)のゲノムに、組織特異的microRNA(miRNA)の標的配列からなるポリヌクレオチドが少なくとも一つ挿入された変異ゲノムを含む、組織特異的に増殖が抑制された改変コクサッキーウイルス。
[2]挿入される位置が、CVB3-WTゲノムの3'UTR領域内である、1に記載の改変コクサッキーウイルス。
[3]挿入される位置が、CVB3-WTゲノムの位置7344より上流または位置7345より下流（好ましくは位置7304と7305との間）である、1または2に記載の改変コクサッキーウイルス。
[4]組織特異的miRNAが、膵臓および／または心筋に発現しているものである、1〜3のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルス。
[5]組織特異的miRNAが、miR-1および／またはmiR-217である、1〜4のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルス。
[6]標的配列からなるポリヌクレオチドが複数個（例えば2〜6個）挿入された、1〜5のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルス。
[7]挿入されるポリヌクレオチドが、下記(a)若しくは(b)、または(a)若しくは(b)において1〜数個のヌクレオチドを欠失、置換若しくは付加した配列からなるポリヌクレオチドである、1〜6のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルス。
(a) ATA CAT ACT TCT TTA CAT TCC Acg atA TAC ATA CTT CTT TAC ATT CCA acc ggt TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TAt cac TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TA (配列番号1)
(b) TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TAc gat TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TAa ccg gtT CCA ATC AGT TCC TGA TGC AGT Atc acT CCA ATC AGT TCC TGA TGC AGT A(配列番号2)
[8]変異ゲノムがさらに、顆粒球単球コロニー刺激因子（GM-CSF)をコードする領域が発現可能に挿入されている、1〜7のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルス。
[9]変異ゲノムがさらに、GM-CSFをコードする領域とその下流に連結された2Aプロテアーゼ認識配列をコードする領域とを含むポリヌクレオチドが、翻訳開始地点のATGの下流でありかつVP4領域の上流である位置に、機能可能に挿入されている、1〜8のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルス。
[10]2Aプロテアーゼ認識配列が、ポリオウイルス由来の2Aプロテアーゼが認識可能な配列に改変したものである、9に記載の改変コクサッキーウイルス。
[11]CVB3-WTゲノムにおいて、GM-CSFをコードする領域が発現可能に挿入された変異ゲノムを含む、改変コクサッキーウイルス。
[12]CVB3-WTゲノムにおいて、GM-CSFをコードする領域とその下流に連結された2Aプロテアーゼ認識配列をコードする領域とを含むポリヌクレオチドが、翻訳開始地点のATGの下流でありかつVP4領域の上流である位置に、機能可能に挿入された変異ゲノムを含む、改変コクサッキーウイルス。
[13]2Aプロテアーゼ認識配列が、ポリオウイルス由来の2Aプロテアーゼが認識可能な配列に改変したものである、12に記載の改変コクサッキーウイルス。
[14]1〜13のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルスを含む医薬組成物。
[15]癌、好ましくは癌（好ましくは肺癌、より好ましくは非小細胞肺癌）またはその前癌状態の処置（予防または治療）のための、14に記載の医薬組成物。
[16]癌（好ましくは肺癌、より好ましくは非小細胞肺癌）またはその前癌状態の処置（予防または治療）において使用するための、1〜13のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルス。
[17]1〜13のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルス、または14若しくは15に記載の医薬組成物を用いる、癌（好ましくは肺癌、より好ましくは非小細胞肺癌）またはその前癌状態の処置（予防または治療）方法。
[18]1〜13のいずれか1項に記載の改変コクサッキーウイルスの、力価測定または増殖のための、対応する組織特異的miRNA の発現量が高くない細胞(例えば、H1299細胞)の使用。
[19]局所用または全身投与用の製剤である、14または15に記載の医薬組成物。
本発明によれば、エンテロウイルスを用いた医薬組成物の安全性と抗腫瘍効果をより高めることができる。
本発明に関し、数値範囲を「X〜Y」で表すときは、その範囲は両端の値XおよびYを含む。本発明に関し、「Aおよび／またはB」というときは、A、Bのうち、少なくとも一方を指す趣旨である。
[改変コクサッキーウイルス]
<miR標的配列挿入によるCVB3の安全性向上>
本発明によって提供される改変コクサッキーウイルスの一態様は、コクサッキーウイルスB3野生型(CVB3-WT)のゲノムに、組織特異的microRNA(miRNA)の標的配列からなるポリヌクレオチドが少なくとも一つ挿入された変異ゲノムを含む、改変コクサッキーウイルスである。このような改変コクサッキーウイルスは、組織特異的に増殖が抑制されうる。
<miR標的配列挿入によるCVB3の安全性向上>
本発明によって提供される改変コクサッキーウイルスの一態様は、コクサッキーウイルスB3野生型(CVB3-WT)のゲノムに、組織特異的microRNA(miRNA)の標的配列からなるポリヌクレオチドが少なくとも一つ挿入された変異ゲノムを含む、改変コクサッキーウイルスである。このような改変コクサッキーウイルスは、組織特異的に増殖が抑制されうる。
組織特異的miRNAの標的配列の挿入される位置は、CVB3-WTゲノムの3'UTR領域内であることが好ましい。また、本発明者らの検討によると、一般的なCVB3産生細胞であるHeLa細胞において7304-7305bpの間に標的配列を挿入した遺伝子改変CVB3は増殖を認めたが、7344-7345bpの間に挿入した遺伝子改変CVB3は増殖を認めなかった。また、miRNAの発現抑制を行ったHaLa細胞においても同様の現象が見られた。したがって、挿入される位置は、CVB3-WTゲノムの位置7344より上流または位置7345より下流であることがより好ましく、位置7304と7305との間であることがさらに好ましい。
用いる組織特異的miRNA（およびその標的配列）は、目的の効果を奏するものであれば、種々選択できるが、膵臓および／または心筋に発現しているmiRNA（およびその標的配列）であることが好ましい。組織特異的miRNAの特に好ましい例は、miR-1および／またはmiR-217である。組織特異的miRNA（およびその標的配列）は、一種類のみ用いてもよく、複数種類を組み合わせて用いてもよい。
挿入される組織特異的miRNAの標的配列の個数は、目的の効果を奏するものであれば、種々選択できるが、複数個、例えば2〜6個であることが好ましい。
特に好ましい態様においては、挿入されるポリヌクレオチドは、下記(a)または(b)である。あるいは、(a)または(b)において1〜数個のヌクレオチドを欠失、置換若しくは付加した配列からなるポリヌクレオチドであって、(a)または(b)と同様に機能することができるもの、すなわちCVB3-WTゲノムの3'UTR領域内に挿入され、改変コクサッキーウイルスを構成したときに、組織特異的に増殖を抑制することができるものである。あるいは、(a)または(b)に示したヌクレオチド配列と、少なくとも90％、好ましくは95%、より好ましくは98%、さらに好ましくは99%の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドであって、(a)または(b)と同様に機能することができるもの、すなわちCVB3-WTゲノムの3'UTR領域内に挿入され、改変コクサッキーウイルスを構成したときに、組織特異的に増殖を抑制することができるものである。
(a) ATA CAT ACT TCT TTA CAT TCC Acg atA TAC ATA CTT CTT TAC ATT CCA acc ggt TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TAt cac TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TA (配列番号1)
(b) TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TAc gat TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TAa ccg gtT CCA ATC AGT TCC TGA TGC AGT Atc acT CCA ATC AGT TCC TGA TGC AGT A(配列番号2)
(a) ATA CAT ACT TCT TTA CAT TCC Acg atA TAC ATA CTT CTT TAC ATT CCA acc ggt TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TAt cac TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TA (配列番号1)
(b) TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TAc gat TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TAa ccg gtT CCA ATC AGT TCC TGA TGC AGT Atc acT CCA ATC AGT TCC TGA TGC AGT A(配列番号2)
なお、あるヌクレオチド配列において1〜数個のヌクレオチドを欠失、置換若しくは付加した配列を有するポリヌクレオチドを得るための手法、およびヌクレオチド配列に関する配列同一性の計算方法（例えば、BLASTアルゴリズムを用いて計算することができる。）は、当業者にはよく知られている。
<GM-CSFの挿入による攻撃性向上>
本発明によって提供される改変コクサッキーウイルスの別の一態様では、CVB3-WTのゲノムに、顆粒球単球コロニー刺激因子（GM-CSF）をコードする領域が発現可能に挿入されている。GM-CSFをコードする領域を発現可能に挿入するためには、mGM-CSFの遊離方法、遺伝子の挿入部位、プロテアーゼ認識配列の改変について、考慮することができる。mGM-CSFの遊離方法の例としては、3Cプロテアーゼ認識配列の利用、2Aプロテーゼ認識配列の利用、IRESの利用、2Apeptideの利用が挙げられ、遺伝子の挿入部位の例としては、CVB3-WTのゲノムの翻訳開始地点ATG直下（VP4の上流）、2A遺伝子の上流、3'UTRが挙げられ、プロテアーゼ認識配列の改変としては、CVB3以外のウイルス由来配列への改変が挙げられる。
<GM-CSFの挿入による攻撃性向上>
本発明によって提供される改変コクサッキーウイルスの別の一態様では、CVB3-WTのゲノムに、顆粒球単球コロニー刺激因子（GM-CSF）をコードする領域が発現可能に挿入されている。GM-CSFをコードする領域を発現可能に挿入するためには、mGM-CSFの遊離方法、遺伝子の挿入部位、プロテアーゼ認識配列の改変について、考慮することができる。mGM-CSFの遊離方法の例としては、3Cプロテアーゼ認識配列の利用、2Aプロテーゼ認識配列の利用、IRESの利用、2Apeptideの利用が挙げられ、遺伝子の挿入部位の例としては、CVB3-WTのゲノムの翻訳開始地点ATG直下（VP4の上流）、2A遺伝子の上流、3'UTRが挙げられ、プロテアーゼ認識配列の改変としては、CVB3以外のウイルス由来配列への改変が挙げられる。
好ましい態様の一つは、翻訳開始地点のATGの下流でありかつVP4領域の上流である位置に、GM-CSFをコードする領域とその下流に連結された2Aプロテアーゼ認識配列をコードする領域とを含むポリヌクレオチドを機能可能に挿入することである。
CVB3-WTのゲノムの構造を下記に示す。
本発明の一態様においては、2Aプロテアーゼ（「2Apro」とあらわすこともある。）の認識配列は、CVB3由来のものを用いるより、ポリオウイルス由来の2Aプロテアーゼが認識可能な配列に改変したものであることが好ましい。
特に好ましい態様においては、挿入されるポリヌクレオチドは、配列番号4のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである。あるいは、配列番号3〜5のいずれか一の配列、好ましくは配列番号4の配列において1〜数個のヌクレオチドを欠失、置換若しくは付加した配列からなるポリヌクレオチドであって、配列番号4のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと同様に機能することができるもの、すなわちCVB3-WTゲノムに挿入され、改変コクサッキーウイルスを構成したときに、GM-CSFを発現し、かつ細胞変性効果（CPE）を発揮しうるものである。あるいは、配列番号3〜5のいずれか一の配列、好ましくは配列番号4の配列と、少なくとも90％、好ましくは95%、より好ましくは98%、さらに好ましくは99%の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドであって、配列番号4のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと同様に機能することができるもの、すなわちCVB3-WTゲノムに挿入され、改変コクサッキーウイルスを構成したときに、GM-CSFを発現し、かつ細胞変性効果（CPE）を発揮しうるものである。
このようなGM-CSFをコードするポリヌクレオチド等の挿入による癌に対する攻撃性を向上するための改変は、単独で行ってもよく、また上述のmiRNA標的配列の挿入と組み合わせて行ってもよい。本発明の特に好ましい態様の一つは、miRNA標的配列の挿入とGM-CSFをコードするポリヌクレオチド等の挿入とが組み合わせて実施されたものである。安全性が高く、かつ腫瘍溶解性も高いことが期待できるからである。
<改変ウイルスの調製、その他>
本発明の改変ウイルスは、WT-CVB3を遺伝子操作することにより調製できる。WT-CVB3は、検体等から既知のウイルス単離方法によって単離できる。ウイルス単離方法の例は、遠心分離、培養細胞によるウイルスの増殖等である。いったん改変コクサッキーウイルスが調製されれば、ウイルスの生産のための生物学的な種々の方法を用いて、当該改変コクサッキーウイルスを増やすことができる。
本発明の改変ウイルスは、WT-CVB3を遺伝子操作することにより調製できる。WT-CVB3は、検体等から既知のウイルス単離方法によって単離できる。ウイルス単離方法の例は、遠心分離、培養細胞によるウイルスの増殖等である。いったん改変コクサッキーウイルスが調製されれば、ウイルスの生産のための生物学的な種々の方法を用いて、当該改変コクサッキーウイルスを増やすことができる。
改変の元となるCVB3は、癌細胞への高い感染性を獲得するよう、天然に存在しているウイルスを、多数回の継代にわたって細胞株において培養することによって生物選抜してもよい。生物選抜に好適な細胞株の例は、CAR、DAF等を発現する癌細胞株である。
本発明にしたがって調製された改変コクサッキーウイルスの評価は、当業者にはよく知られたin vitroまたはin vivoの種々の手段により、安全性、効力、力価等の様々な側面について評価することできる。例えば、癌細胞に対する攻撃性（溶解性、傷害性）は、CVB3に暴露された癌細胞の細胞株の生存を試験することで確認することができる。細胞株の生存を試験する方法には、例えば、固定した細胞を染色液で染色して、染色された生細胞の数を定量する方法、クリスタルバイオレット法、アポトーシス特異的なマーカーを定量する方法等がある。これらの方法を用いて、CVB3とインキュベーションされた癌細胞の細胞株について、所定時間後に生存している癌細胞を定量することで、結果的に、CVB3の感染による細胞傷害性によって、死滅した癌細胞を定量することができる。
本発明者らが、改変CVB3（miRNA標的配列が挿入されたもの）の産生および力価の測定を、HeLa細胞および使用したmiRNAの発現が低かったH1299細胞を用いて行ったところ、本明細書の実施例の項に示した条件では、H1299細胞で産生した改変CVB3は、HeLa細胞で産生したものの5倍ものウイルス力価を呈した。また、HeLa細胞で産生した改変CVB3を用いて、H1299細胞およびHeLa細胞でウイルス力価の測定を行ったところ、H1299細胞でのウイルス力価はHeLa細胞でのウイルス力価よりも10倍以上高い値を示した。したがって、本発明の一態様においては、改変ウイルス産生およびウイルス力価測定には、H1299細胞が適切である。本発明により、改変コクサッキーウイルスの、力価測定または増殖のためには、対応する組織特異的miRNAの発現量が高くない細胞(例えば、H1299細胞)の使用が提案される。
[医薬組成物]
<適用疾患>
本発明によって提供される医薬組成物の一態様は、上述の改変CVB3を有効成分として含む。医薬組成物が処置の対象とする癌種は、特に限定されず、固形癌および液性癌を含む。CVB3は、固形癌および液性癌の癌細胞に対する細胞傷害性を有する。CVB3による癌細胞に対する細胞傷害性は、ウイルスが癌細胞に感染し、癌細胞の細胞質で複製することによる癌細胞の溶解によるか、ウイルスの感染に起因する癌細胞内のカスパーゼの活性化によるアポトーシスによる。CVB3は、細胞表面のCARを認識して、当該細胞に感染することができる。なお、本発明に関し、疾患または状態に関連して「処置（する）」というときは、予防および治療を含む。
<適用疾患>
本発明によって提供される医薬組成物の一態様は、上述の改変CVB3を有効成分として含む。医薬組成物が処置の対象とする癌種は、特に限定されず、固形癌および液性癌を含む。CVB3は、固形癌および液性癌の癌細胞に対する細胞傷害性を有する。CVB3による癌細胞に対する細胞傷害性は、ウイルスが癌細胞に感染し、癌細胞の細胞質で複製することによる癌細胞の溶解によるか、ウイルスの感染に起因する癌細胞内のカスパーゼの活性化によるアポトーシスによる。CVB3は、細胞表面のCARを認識して、当該細胞に感染することができる。なお、本発明に関し、疾患または状態に関連して「処置（する）」というときは、予防および治療を含む。
CVB3は、固形癌および液性癌の癌細胞に対する細胞傷害性を有するが、固形癌であって、特に強い細胞傷害性が誘導される癌細胞は、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、悪性中皮腫、大腸癌、結腸直腸癌、食道癌、下咽頭癌、ヒトBリンパ腫、乳癌および子宮頸癌からなる群から選択されるいずれかの癌の細胞である。したがって本実施の形態に係る医薬組成物は、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、悪性中皮腫、大腸癌、結腸直腸癌、食道癌、下咽頭癌、ヒトBリンパ腫、乳癌および子宮頸癌からなるぐんより選択されるいずれかを対象に適用されるのが好ましい。
肺癌は、罹患者数が上位の癌種である。本実施の形態に係る医薬組成物により、より多くの肺癌患者の治療に貢献できる。大腸癌、結腸直腸癌は、欧米型食生活の定着した日本において罹患率が増加しており、死亡率も増加している。本実施の形態に係る医薬組成物により、大腸癌、結腸直腸癌に対する治療薬の選択肢が増えることは患者にとって有益である。食道癌は、手術切除後の再発率が30〜50％と高く、既存の薬剤に対する感受性が低い。本実施の形態に係る医薬組成物によって食道癌の治療成績の向上が期待できる。
また、本実施の形態に係る医薬組成物は、CDDP抵抗性、ゲフィチニブ抵抗性またはオキサリプラチン抵抗性の癌の細胞に対して強い細胞傷害性を有する。このため、これらの抗癌剤に抵抗性を示す、いわゆる難治性癌に対する有効な治療を提供することができる。
また、本実施の形態に係る医薬組成物は、CVB3を含む場合、癌幹細胞に対しても強い細胞傷害性を示す。癌幹細胞は、癌再発の原因の1つと考えられており、癌の転移および再発の防止に有用である。
<剤形、用法、用量>
また、本実施の形態に係る医薬組成物は、種々の剤形とし、種々の投与経路を採ることができる。すなわち、本実施の形態に係る医薬組成物は、局所用の製剤とすることもでき、全身投与用の製剤とすることもできる。例えば、注射剤または点滴剤とし、癌種に応じて腫瘍内投与、静脈投与、胸腔内投与、腹腔内投与とすることができる。特に、食道癌、大腸癌等の消化器癌の多くは、内視鏡等で腫瘍組織を視認しながら、医薬組成物を腫瘍組織に直接注射できる。この場合、内視鏡等で注射した部位を確認できるため、出血しても対処しやすいという利点もある。他に、経口投与でもよいし、筋肉、皮下、直腸、膣 、鼻腔等を介して投与してもよい。
また、本実施の形態に係る医薬組成物は、種々の剤形とし、種々の投与経路を採ることができる。すなわち、本実施の形態に係る医薬組成物は、局所用の製剤とすることもでき、全身投与用の製剤とすることもできる。例えば、注射剤または点滴剤とし、癌種に応じて腫瘍内投与、静脈投与、胸腔内投与、腹腔内投与とすることができる。特に、食道癌、大腸癌等の消化器癌の多くは、内視鏡等で腫瘍組織を視認しながら、医薬組成物を腫瘍組織に直接注射できる。この場合、内視鏡等で注射した部位を確認できるため、出血しても対処しやすいという利点もある。他に、経口投与でもよいし、筋肉、皮下、直腸、膣 、鼻腔等を介して投与してもよい。
本実施の形態に係る医薬組成物は、改変CVB3に加えて、キャリア、希釈剤または補助剤等を含むようにしてもよい。キャリアとしては、例えば、リポソーム、ミセル等が好ましい。リポソームは、脂質と膜安定性に寄与するステロイドまたはステロイド前駆体との組み合わせを含む。この場合、脂質としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド、ガングリオシド等のホスファチジル化合物が挙げられる。リポソームまたはミセルで覆われたCVB3は、宿主の免疫応答を低下させることができる。
希釈剤としては、例えば、脱塩水、蒸留水および生理的食塩水等が挙げられる、また、補助剤としては、植物系オイル、セルロース誘導体、ポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル等が挙げられる。
経口投与の場合、当該医薬組成物は、甘味剤、崩壊剤、希釈剤、コーティング剤、保存剤等を含有してもよい。
本実施の形態に係る医薬組成物は、CVB3が、癌を治療するのに十分な量となるように投与される。投与量は、患者の体重、年齢、性別、腫瘍組織の大きさ等に基づいて決定される。例えば、当該医薬組成物を液剤とする場合、CVB3が液剤1mlに1×102〜1×1010 50%組織培養感染量(TCID50)含まれていればよい。好ましくは、CVB3が液剤1mlに1×105 TCID50以上含まれていればよい。当該医薬組成物は、単回で投与してもよいし、複数回で投与してもよい。また、当該医薬組成物は、徐放製剤として持続的に投与してもよい。
<他の製剤との併用>
本実施の形態に係る医薬組成物は、抗癌剤と併用してもよい。当該医薬組成物と異なる作用機序を有する抗癌剤を併用することで、抗腫瘍効果の向上が期待できる。抗癌剤は、特に限定されないが、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、悪性中皮腫、大腸癌、結腸直腸癌、食道癌、下咽頭癌、ヒトBリンパ腫、子宮頸癌および膵癌等の治療に用いられるものが望ましい。具体的には、抗癌剤は、CDDP（シスプラチン）、ゲフィチニブ、オキサリプラチンなどである。
[その他]
本実施の形態に係る医薬組成物は、抗癌剤と併用してもよい。当該医薬組成物と異なる作用機序を有する抗癌剤を併用することで、抗腫瘍効果の向上が期待できる。抗癌剤は、特に限定されないが、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、悪性中皮腫、大腸癌、結腸直腸癌、食道癌、下咽頭癌、ヒトBリンパ腫、子宮頸癌および膵癌等の治療に用いられるものが望ましい。具体的には、抗癌剤は、CDDP（シスプラチン）、ゲフィチニブ、オキサリプラチンなどである。
[その他]
本発明の実施の形態に係る医薬組成物は、癌細胞に感染可能な、CVB3（改変体を含む。以下同様。）に由来するポリヌクレオチドを有効成分として含んでいてもよい。CVB3に由来するポリヌクレオチドは、それぞれCVB3から直接単離されたウイルスRNA、合成RNA、単離されたウイルスRNAの塩基配列に対応するcDNAであってもよい。ウイルスRNAを単離するには、任意の方法を使用することができる。ウイルスRNAを単離する方法は、例えば、フェノール／クロロホルム抽出の使用に基づく方法等である。また、当該ポリヌクレオチドは、ウイルスを生じさせるためのポリヌクレオチドを組み込んだウイルスプラスミドや発現ベクターであってもよい。発現ベクターには、例えば、ウイルスを生じさせるために必要なウイルスタンパク質をコードするRNAを発現することができるプラスミドが含まれる。発現ベクターには、挿入されたポリヌクレオチドが機能的に連結された転写調節制御配列が含まれてもよい。ここでの転写調節制御配列は、例えば、転写を開始させるためのプロモーター、転写されたmRNAに対するリボソームの結合を可能にするための発現制御エレメント等である。
発現ベクターとしては、例えば、pSV2neo、pEF−PGk．puro 、pTk2、非複製アデノウイルスシャトルベクター、サイトメガロウイルスプロモータ等を用いることができる。ウイルスを生じさせるために必要なウイルスタンパク質をコードするcDNAは、ウイルスRNAまたはそのフラグメントを逆転写することによって調製することができる。
本実施の形態に係る医薬組成物は、癌細胞に感染可能な、CVB3に由来するポリヌクレオチドに加えて、例えば、リポソーム等のキャリアを含むようにしてもよい。CVB3に由来するポリヌクレオチドは、例えば配列番号1または2の配列からなるポリヌクレオチド、および／または配列番号3〜5のいずれか一の配列からなるポリヌクレオチドを含むものであってもよい。
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲は、実施例に限定されない。
I. miR標的配列挿入によるCVB3の安全性向上
本研究の目的は腫瘍溶解性野生型CVB3（CVB-WT）で見られた膵臓・心筋における副作用軽減である。CVB3-WTは膵臓に特に激しい炎症を引き起こし、血清生化学検査においてAMYの著しい上昇、H&E染色組織像において外分泌腺の破壊が確認される。これらの問題を克服するため、我々はCVB3-WTのゲノム3' untranslated region（UTR）に組織特異的microRNA（miRNA）の標的配列を挿入し、予想される副作用の軽減を目指した。挿入したmiRNAの標的配列に組織特異的なmiRNAを有したRISC複合体が結合しウイルスタンパク質の翻訳等を阻害するため、組織特異的な増殖抑制が可能となる。
本研究の目的は腫瘍溶解性野生型CVB3（CVB-WT）で見られた膵臓・心筋における副作用軽減である。CVB3-WTは膵臓に特に激しい炎症を引き起こし、血清生化学検査においてAMYの著しい上昇、H&E染色組織像において外分泌腺の破壊が確認される。これらの問題を克服するため、我々はCVB3-WTのゲノム3' untranslated region（UTR）に組織特異的microRNA（miRNA）の標的配列を挿入し、予想される副作用の軽減を目指した。挿入したmiRNAの標的配列に組織特異的なmiRNAを有したRISC複合体が結合しウイルスタンパク質の翻訳等を阻害するため、組織特異的な増殖抑制が可能となる。
I-1. 標的配列の挿入部位によるウイルス増殖の違い
我々は２つのmiRNAに着目し、１つは膵臓特異的に発現していると言われているmiR-217、もう1つは筋組織および正常細胞特異的に発現していると言われているmiR-1を組み合わせ、計4つmiRNA標的配列が連続している二種類のmiRNA標的配列（miR-1×2＆miR-217×2、miR-217×4）を作製した。二種類の標的配列をそれぞれCVB3ゲノムの7304-7305bpの間にoverlap extension PCR法を用いて挿入した。また、同時に概出の標的配列をCVB3ゲノムの7344-7345bpの間にoverlap extension PCR法にて挿入した（図1）。
我々は２つのmiRNAに着目し、１つは膵臓特異的に発現していると言われているmiR-217、もう1つは筋組織および正常細胞特異的に発現していると言われているmiR-1を組み合わせ、計4つmiRNA標的配列が連続している二種類のmiRNA標的配列（miR-1×2＆miR-217×2、miR-217×4）を作製した。二種類の標的配列をそれぞれCVB3ゲノムの7304-7305bpの間にoverlap extension PCR法を用いて挿入した。また、同時に概出の標的配列をCVB3ゲノムの7344-7345bpの間にoverlap extension PCR法にて挿入した（図1）。
7304-7305bpの間に挿入した遺伝子改変CVB3はどちらも（CVB3-miR-1&217T、CVB3-miR-217T）一般的なCVB3産生細胞であるHeLa細胞において増殖を認め、遺伝子改変CVB3の作製に成功した。しかしながら、7344-7345bpの間に挿入した遺伝子改変CVB3はどれもHeLa細胞において増殖を認めなかった（図2）。また、miRNAの発現抑制を行ったHaLa細胞においても同様の現象が見られたことから、3' UTRであってもmiRNA標的配列の挿入部位によってCVB3の複製が行われないことが明らかとなり、この40 bpがCVB3の複製に重要な配列ということが明らかとなった。
以前、RussellらがCVA21においてmiRNA標的配列を3'UTRに挿入し、組織特異的な増殖抑制が生じることを報告しているが、本研究はCVB3を用いたことやRussellらとは異なるmiRNAに着目したこと、またウイルスゲノムに挿入したと報告のない新規miRNAを用いていることが新しい。加えて3'UTRのどの部位に挿入したら良いという報告はRussellの報告にはなく、この7304-7305 bpに挿入したことによりCVB3の複製が正常行われたことも新しいと考えられる。
以降、遺伝子改変CVB3-miRTは7304-7305 bpに挿入したものを指す。また、特に記載した場合を除き、CVB3-miR-1&217Tとは、図1に示したmiR-1とmiR-217Tとを2つずつ(配列番号1のポリヌクレオチド)挿入したものを指し、またCVB3-miR-217Tとは、図1に示したmiR-217Tを4つ(配列番号2の配列のポリヌクレオチド)挿入したものを指す。
以降、遺伝子改変CVB3-miRTは7304-7305 bpに挿入したものを指す。また、特に記載した場合を除き、CVB3-miR-1&217Tとは、図1に示したmiR-1とmiR-217Tとを2つずつ(配列番号1のポリヌクレオチド)挿入したものを指し、またCVB3-miR-217Tとは、図1に示したmiR-217Tを4つ(配列番号2の配列のポリヌクレオチド)挿入したものを指す。
I-2. 挿入配列による増殖速度の違い、各細胞における内在性miRNAの発現量
次に、HeLa細胞を用いて遺伝子改変CVB3-miRTを作製した際、他の二種類（CVB3-WT、CVB3-miR-217T）と比較してCVB3-miR-1&217Tにおいてのみ増殖の遅延が認められた（図3）。
次に、HeLa細胞を用いて遺伝子改変CVB3-miRTを作製した際、他の二種類（CVB3-WT、CVB3-miR-217T）と比較してCVB3-miR-1&217Tにおいてのみ増殖の遅延が認められた（図3）。
このことから、HeLa細胞においてmiR-1が多く発現していることが予想されたため、HeLa細胞、正常気道上皮細胞であるBEAS-2B細胞、治療対象である肺癌細胞株（A549細胞、NCI-H1299細胞）、膵癌細胞株であるAsPC-1細胞、横紋筋肉腫細胞であるRD細胞における内在性miRNAの発現定量をreal-time PCR法にて行った。その結果、予想通りHeLa細胞はmiR-1の発現量が正常細胞であるBEAS-2B細胞より20倍以上も高いことが明らかとなり、横紋筋肉腫細胞株のRD細胞についで2番目の発現量であった。また、治療対象である肺癌細胞株2種においてはmiR-1およびmiR-217どちらも発現はほとんど認められなかった（図4）。
このことから、本遺伝改変CVB3-miRTのmiRNA特異的増殖抑制が見られている可能性が示唆されてきたので、次にmiR-1とmiR-217の発現が殆ど見られないNCI-H1299細胞にmiR-1およびmiR-217をトランスフェクションにより導入し、CVB3-miRTの増殖抑制が見られるか検討した。その結果、miR-1を導入したH1299細胞において、CVB3-miR-1&217TはCVB3-WTと比較して100倍のウイルス量を感染しても腫瘍溶解効果が見られないということが明らかとなった（図5A）。また、miR-217を導入したH1299細胞においては、CVB3-miR-1&217TおよびCVB3-miR217TはCVB3-WTと比較して10,000倍のウイルス量を感染しても腫瘍溶解効果が見られなかった（図5B）。以上のことから、本遺伝子改変CVB3は標的miRNA特異的にRNA干渉を引き起こし増殖抑制がかかっていることが明らかとなった。
I-3. 産生細胞、力価測定細胞による力価の違い
上記の結果を踏まえ、CVB3-miRTの適切な産生細胞を決定するため、HeLa細胞およびmiRNAの発現が低かったH1299細胞を用いてウイルス産生および力価の測定を行った。H1299細胞で産生したCVB3-miR-1&217TはHeLa細胞で産生したウイルスよりも5倍ものウイルス力価を呈した（図6）。また、HeLa細胞で産生したCVB3-miR-1&217Tを用いて、H1299細胞およびHeLa細胞でウイルス力価の測定を行ったところ、H1299細胞でのウイルス力価はHeLa細胞でのウイルス力価よりも10倍以上高い値を示した（図7）。これらのことから、CVB3-miRTのウイルス産生およびウイルス力価測定にはH1299細胞が適切であることが明らかとなった。
上記の結果を踏まえ、CVB3-miRTの適切な産生細胞を決定するため、HeLa細胞およびmiRNAの発現が低かったH1299細胞を用いてウイルス産生および力価の測定を行った。H1299細胞で産生したCVB3-miR-1&217TはHeLa細胞で産生したウイルスよりも5倍ものウイルス力価を呈した（図6）。また、HeLa細胞で産生したCVB3-miR-1&217Tを用いて、H1299細胞およびHeLa細胞でウイルス力価の測定を行ったところ、H1299細胞でのウイルス力価はHeLa細胞でのウイルス力価よりも10倍以上高い値を示した（図7）。これらのことから、CVB3-miRTのウイルス産生およびウイルス力価測定にはH1299細胞が適切であることが明らかとなった。
I-4. In vivo試験
遺伝子改変CVB3のin vivo抗腫瘍効果および毒性を検討した。0日目にヌードマウスの右側腹部に腫瘍（非小細胞肺癌、NCI-H1299細胞）を接種し、2日目より計5回、CVB3ウイルスを隔日で腫瘍内に投与（5×106 TCID50 / 回）した。
遺伝子改変CVB3のin vivo抗腫瘍効果および毒性を検討した。0日目にヌードマウスの右側腹部に腫瘍（非小細胞肺癌、NCI-H1299細胞）を接種し、2日目より計5回、CVB3ウイルスを隔日で腫瘍内に投与（5×106 TCID50 / 回）した。
その結果、CVB3-WTを投与した群およびCVB3-miRTを投与した群で、Tumor volume(mm3)が抑制され（また組織診では、膵臓における外分泌組織の破壊、心筋における炎症性湿潤、肝臓における炎症性湿潤が観られた。図8AおよびB）、また腫瘍接種後40日後には非処置群の生存率は0％であったのに対して、ウイルスを投与した群の生存率は100％であった（図8C）。
また血中のアミラーゼ（AMY）、クレアチンキナーゼ（CK）およびアスパラギン酸アミノ基転移酵素（AST）について測定したところ、CVB3-WTを投与した群ではやや高値であったが、CVB3-miRTを投与した群では非処置群と同程度であった（図9）。また、膵臓のH&E組織染色では、WTを投与した際に生じることがある外分泌組織の破壊は、特には観られなかった（図10）。これらのことからCVB3-miR-1&217Tは、膵臓、筋、肝臓に対する影響が少ないことが示唆された。
I-5. METHODS SUMMARY
以下のプロトコールにしたがって、本研究は行われた。
以下のプロトコールにしたがって、本研究は行われた。
[CVB3-miRT作製]
<ベクター構築>
(Materials & reagents)
・CVB3 Plasmid
・KOD -Plus-
・UltraPure
・Primer
CVB3-miR-Forward
caggtctttgaggggaacaa (20 pmol/μl)（配列番号6）
CVB3-miR-Reverse
attaatgcagctggcacgac (20 pmol/μl) （配列番号7）
miR-1&217T Forward
ttaATACATACTTCTTTACATTCCAcgatATACATACTTCTTTACATTCCAaccggtTCCAATCAGTTCCTGATGCAGTAtcacTCCAATCAGTTCCTGATGCAGTAgagacaatttgaaataatttag (20 pmol/μl) （配列番号8）
miR-1&217T Reverse
ctcTACTGCATCAGGAACTGATTGGAgtgaTACTGCATCAGGAACTGATTGGAaccggtTGGAATGTAAAGAAGTATGTATatcgTGGAATGTAAAGAAGTATGTATtaatctaaaaggagtccaacca (20 pmol/μl) （配列番号9）
miR-217T Forward
ttaTCCAATCAGTTCCTGATGCAGTAcgatTCCAATCAGTTCCTGATGCAGTAaccggtTCCAATCAGTTCCTGATGCAGTAtcacTCCAATCAGTTCCTGATGCAGTAgagacaatttgaaataatttag（配列番号10）
<ベクター構築>
(Materials & reagents)
・CVB3 Plasmid
・KOD -Plus-
・UltraPure
・Primer
CVB3-miR-Forward
caggtctttgaggggaacaa (20 pmol/μl)（配列番号6）
CVB3-miR-Reverse
attaatgcagctggcacgac (20 pmol/μl) （配列番号7）
miR-1&217T Forward
ttaATACATACTTCTTTACATTCCAcgatATACATACTTCTTTACATTCCAaccggtTCCAATCAGTTCCTGATGCAGTAtcacTCCAATCAGTTCCTGATGCAGTAgagacaatttgaaataatttag (20 pmol/μl) （配列番号8）
miR-1&217T Reverse
ctcTACTGCATCAGGAACTGATTGGAgtgaTACTGCATCAGGAACTGATTGGAaccggtTGGAATGTAAAGAAGTATGTATatcgTGGAATGTAAAGAAGTATGTATtaatctaaaaggagtccaacca (20 pmol/μl) （配列番号9）
miR-217T Forward
ttaTCCAATCAGTTCCTGATGCAGTAcgatTCCAATCAGTTCCTGATGCAGTAaccggtTCCAATCAGTTCCTGATGCAGTAtcacTCCAATCAGTTCCTGATGCAGTAgagacaatttgaaataatttag（配列番号10）
(Methods)
On iceで以下の順に0.2 ml PCR tubeに混合する。
On iceで以下の順に0.2 ml PCR tubeに混合する。
2．タッピングもしくは緩やかなピペッティングで攪拌し、軽くスピンダウンして溶液を集める。
Bio-Rad社のサーマルサイクラーで次のプログラムを実行する。
3．94℃ 2:00、94℃ 0:15、62℃ 0:15、68℃ 1:30（10 cycle）、72℃ 7:00
4．二つのPCR産物を用いてOverlap extension PCRを行う。
Bio-Rad社のサーマルサイクラーで次のプログラムを実行する。
3．94℃ 2:00、94℃ 0:15、62℃ 0:15、68℃ 1:30（10 cycle）、72℃ 7:00
4．二つのPCR産物を用いてOverlap extension PCRを行う。
5．この二つのPCR産物を1 μlずつチューブに入れ、これをテンプレートにし、CVB3-miR-Forward & CVB3-miR-Reverseプライマーを使用し、PCRを行う。プログラムは上記の通りに行い、サイクル数は30 cycle行う。
6．Overlap extension PCR産物を精製し、CVB3 plasmidも同時にSal IとBst IIで制限酵素処理する。
7．制限酵素処理産物を用いてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のバンドを切り出す。
8．ゲル精製後、制限酵素処理後CVB3 plasmidとOverlap extension PCR制限酵素処理産物をLgation Highを用いて、16℃、2 h反応させる。
9．Ligation産物をコンピテントセルに導入し、37℃で培養する。
10．翌日、コロニーを拾い、LB培地にて培養する。
11．培養物からプラスミドを回収し、miRNA標的配列の挿入の有無を確認する。
6．Overlap extension PCR産物を精製し、CVB3 plasmidも同時にSal IとBst IIで制限酵素処理する。
7．制限酵素処理産物を用いてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のバンドを切り出す。
8．ゲル精製後、制限酵素処理後CVB3 plasmidとOverlap extension PCR制限酵素処理産物をLgation Highを用いて、16℃、2 h反応させる。
9．Ligation産物をコンピテントセルに導入し、37℃で培養する。
10．翌日、コロニーを拾い、LB培地にて培養する。
11．培養物からプラスミドを回収し、miRNA標的配列の挿入の有無を確認する。
<ウイルスRNA作製>
(Materials & reagents)
・MEGAscript(登録商標)Kit Ambion Cat# AM1333 ＊Store at -20℃
・CVB3 plasmid（CVB3-WT、CVB3-miR-1&217T、CVB3-miR-217T）
・Phenol:Chloroform 5:1, Acid-equilibrated : pH 4.7 Sigma Cat# P1944-100ML Lot#010M1574
・Chloroform nacalai tesque Cat# 08402-55 Lot# V6K0595
・75% Ethanol（Nuclease-free water使用）
・10 mol/l-Ammonium Acetate Solution nacalai tesque Cat# 02432-74 Lot# L2B2291
・UltraPure
(Materials & reagents)
・MEGAscript(登録商標)Kit Ambion Cat# AM1333 ＊Store at -20℃
・CVB3 plasmid（CVB3-WT、CVB3-miR-1&217T、CVB3-miR-217T）
・Phenol:Chloroform 5:1, Acid-equilibrated : pH 4.7 Sigma Cat# P1944-100ML Lot#010M1574
・Chloroform nacalai tesque Cat# 08402-55 Lot# V6K0595
・75% Ethanol（Nuclease-free water使用）
・10 mol/l-Ammonium Acetate Solution nacalai tesque Cat# 02432-74 Lot# L2B2291
・UltraPure
(Methods)
1．室温で以下の順に0.2 ml PCRチューブに混合する。（Total 20 μl）
1．室温で以下の順に0.2 ml PCRチューブに混合する。（Total 20 μl）
2．サーマルサイクラーで37℃、3 h反応させる。（Bio-Rad社サーマルサイクラー使用）
3．3 h後、反応中のチューブにTURBO DNaseを1 μl加え、よく攪拌し、追加で37℃、15 min。
4．事前に1.5 mlチューブにUltraPure 114 μlと付属のAmmonium Acetate Stop Solutionを15 μlを混合した溶液を本数分×1.1倍作製しておく。
5．反応後、チューブに上記の混合液を129 μl加え、ピペッティング。
6．全量を0.7 mlチューブに移す。
7．そこに、150 μlのPhenol : Chloroformを加え、ピペッティング&転倒混和。
8．室温、10,000×g、2 min遠心。
9．上澄み（約150 μl）を別の新しい0.7 mlチューブに移す。
10．その水層にChloroformを150 μl加え、転倒混和。
21．室温、10,000×g、2 min遠心。
22．上澄み（約100 μl）を別の新しい0.7 mlチューブに移す。
23．冷5 M Ammonium acetateを、その水層に150 μl加え、ピペッティング。
24．On ice、10 min静置。
25．4℃、10,000×g、15 min遠心。
26．ピペットマンでゆっくり上清を除去する。
27．75% Ethanolを200 μl緩やかに加える。
28．4℃、10,000×g、10 min遠心。
29．ピペットマンでゆっくり上清をギリギリまで除去する。
30．ペレットにUltraPureを70 μl加え溶解。
3．3 h後、反応中のチューブにTURBO DNaseを1 μl加え、よく攪拌し、追加で37℃、15 min。
4．事前に1.5 mlチューブにUltraPure 114 μlと付属のAmmonium Acetate Stop Solutionを15 μlを混合した溶液を本数分×1.1倍作製しておく。
5．反応後、チューブに上記の混合液を129 μl加え、ピペッティング。
6．全量を0.7 mlチューブに移す。
7．そこに、150 μlのPhenol : Chloroformを加え、ピペッティング&転倒混和。
8．室温、10,000×g、2 min遠心。
9．上澄み（約150 μl）を別の新しい0.7 mlチューブに移す。
10．その水層にChloroformを150 μl加え、転倒混和。
21．室温、10,000×g、2 min遠心。
22．上澄み（約100 μl）を別の新しい0.7 mlチューブに移す。
23．冷5 M Ammonium acetateを、その水層に150 μl加え、ピペッティング。
24．On ice、10 min静置。
25．4℃、10,000×g、15 min遠心。
26．ピペットマンでゆっくり上清を除去する。
27．75% Ethanolを200 μl緩やかに加える。
28．4℃、10,000×g、10 min遠心。
29．ピペットマンでゆっくり上清をギリギリまで除去する。
30．ペレットにUltraPureを70 μl加え溶解。
<ウイルス作製>
(Materials & reagents)
・NCI-H1299 cells (1 ×107 cells/150 ml/dish)
・RPMI 1640 w/10% FBS (Growth medium)
・Opti-MEM（登録商標）I
・LipofectamineTM 2000 Reagent Invitrogen Cat# 11668-019
・In vitro transcription産物
(Materials & reagents)
・NCI-H1299 cells (1 ×107 cells/150 ml/dish)
・RPMI 1640 w/10% FBS (Growth medium)
・Opti-MEM（登録商標）I
・LipofectamineTM 2000 Reagent Invitrogen Cat# 11668-019
・In vitro transcription産物
(Methods)
1．分注したOpti-MEMにRNAを80 μgになるように液中に加え、もう別チューブに分注したOpti-MEMにLipofectamine 2000を120 μl液中に加える。
2．両者、室温、5 min静置。
3．両チューブを混合し、室温、20 min静置。
4．20 min後、混合液全量をNCI-H1299細胞に添加する。
5．4 h後、Growth mediumに置換する。
6．37℃、5% CO2、24 hインキュベート。
7．Transfectionから24 h後、培地を捨てないまま各NCI-H1299 cellsをセルスクレーパーで剥離する。
8．細胞ごと上清を50 mlチューブに回収する。
9．50 mlチューブをLiquid N2に浸けて凍結させる。
10．37℃ウォーターバスで解凍。
11．5〜6の凍結融解を2回繰り返す。 (計3回Freeze-Thaw)
12．4℃、3,000 rpm、15 min遠心。
13．上清を移すNCI-H1299 cellsの培地を新鮮な培地に置換する。（15 ml）
14．遠心後の上清全量をNCI-H1299 cellsに加える。
15．37℃、5% CO2、5〜6 hインキュベート
16．CPEが60〜70%以上確認された時点に、培養上清を除去。
17．Opti-MEM（登録商標）Iを2 ml加える。
18．セルスクレーパーで細胞を剥離。
19．細胞ごとOpti-MEM（登録商標）Iを全量、15 mlチューブに回収する。
20．この15 mlチューブをLiquid nitrogenに浸けて凍結させる。(約2 min)
21．37℃ウォーターバスで解凍。(約10 min)
22．5〜6の凍結融解を2回繰り返す (計3回Freeze-Thaw)
23．4℃、3,000 rpm、15 min遠心。
24．上清を-80℃で保存。
1．分注したOpti-MEMにRNAを80 μgになるように液中に加え、もう別チューブに分注したOpti-MEMにLipofectamine 2000を120 μl液中に加える。
2．両者、室温、5 min静置。
3．両チューブを混合し、室温、20 min静置。
4．20 min後、混合液全量をNCI-H1299細胞に添加する。
5．4 h後、Growth mediumに置換する。
6．37℃、5% CO2、24 hインキュベート。
7．Transfectionから24 h後、培地を捨てないまま各NCI-H1299 cellsをセルスクレーパーで剥離する。
8．細胞ごと上清を50 mlチューブに回収する。
9．50 mlチューブをLiquid N2に浸けて凍結させる。
10．37℃ウォーターバスで解凍。
11．5〜6の凍結融解を2回繰り返す。 (計3回Freeze-Thaw)
12．4℃、3,000 rpm、15 min遠心。
13．上清を移すNCI-H1299 cellsの培地を新鮮な培地に置換する。（15 ml）
14．遠心後の上清全量をNCI-H1299 cellsに加える。
15．37℃、5% CO2、5〜6 hインキュベート
16．CPEが60〜70%以上確認された時点に、培養上清を除去。
17．Opti-MEM（登録商標）Iを2 ml加える。
18．セルスクレーパーで細胞を剥離。
19．細胞ごとOpti-MEM（登録商標）Iを全量、15 mlチューブに回収する。
20．この15 mlチューブをLiquid nitrogenに浸けて凍結させる。(約2 min)
21．37℃ウォーターバスで解凍。(約10 min)
22．5〜6の凍結融解を2回繰り返す (計3回Freeze-Thaw)
23．4℃、3,000 rpm、15 min遠心。
24．上清を-80℃で保存。
<ウイルス力価測定>
(Materials & reagents)
・96 well plate（flat bottom）
・NCI-H1299 cells (5×103 cells/100 μl/well)
・RPMI1640 w/10%FBS (Growth medium)
・96 well plate（round bottom）
・Opti-MEM（登録商標）I
(Materials & reagents)
・96 well plate（flat bottom）
・NCI-H1299 cells (5×103 cells/100 μl/well)
・RPMI1640 w/10%FBS (Growth medium)
・96 well plate（round bottom）
・Opti-MEM（登録商標）I
(Methods)
1．NCI-H1299細胞を96 well Flat plateに5×103 cells/100 μl/wellで全wellに播種。
2．37℃、5% CO2、7 hインキュベート。
3．Opti-MEMを96 well Round plateに180 μlずつ、2列目から12最終列まで加える。
4．1列目のウイルス最濃列(通常10-2)の為、1.5 ml tubeにOpti-MEMを990 μl加え、そこにウイルス原液を10 μl添加、ピペッティングをしっかりし10-2液を調整。
5．ウイルス10-2液を96 well Round plateの1列目に120 μlずつ添加。
6．1列目のウイルス液を、電動8連ピペッターを使用して20 μlずつ2列目に移す。
7．そこで一度ピペッティングを行い、チップを変える。
8．直前に希釈した列から20 μlずつ取り、隣の列に移す。
9．一度ピペッティングを行い、チップを変える。
10．8.〜9.を11列まで繰り返す。
11．NCI-H1299細胞を播種したFlat plateをインキュベーターから取り出す。
12．8連ピペッターを用いて、Round plateの薄い12列目から順に、Flat PlateのNCI-H1299細胞に50 μlずつ加える。
13．37℃、5% CO2、120 h（5日間）インキュベート。
14．50% CPEが見られたwellをカウントする。以下の式を用いてTiterを算出する
Log10 (TCID50) = L + d (S - 0.5) + log10 (1/v)
1．NCI-H1299細胞を96 well Flat plateに5×103 cells/100 μl/wellで全wellに播種。
2．37℃、5% CO2、7 hインキュベート。
3．Opti-MEMを96 well Round plateに180 μlずつ、2列目から12最終列まで加える。
4．1列目のウイルス最濃列(通常10-2)の為、1.5 ml tubeにOpti-MEMを990 μl加え、そこにウイルス原液を10 μl添加、ピペッティングをしっかりし10-2液を調整。
5．ウイルス10-2液を96 well Round plateの1列目に120 μlずつ添加。
6．1列目のウイルス液を、電動8連ピペッターを使用して20 μlずつ2列目に移す。
7．そこで一度ピペッティングを行い、チップを変える。
8．直前に希釈した列から20 μlずつ取り、隣の列に移す。
9．一度ピペッティングを行い、チップを変える。
10．8.〜9.を11列まで繰り返す。
11．NCI-H1299細胞を播種したFlat plateをインキュベーターから取り出す。
12．8連ピペッターを用いて、Round plateの薄い12列目から順に、Flat PlateのNCI-H1299細胞に50 μlずつ加える。
13．37℃、5% CO2、120 h（5日間）インキュベート。
14．50% CPEが見られたwellをカウントする。以下の式を用いてTiterを算出する
Log10 (TCID50) = L + d (S - 0.5) + log10 (1/v)
[In vivo試験（抗癌効果、生化学検査、H&E染色）]
(Materials & reagents)
・150 mm dish
・NCI-H1299 cells (5 ×106 cells/100 μl PBS/mouse) (04/01 Thawing T175 2 passage)
・RPMI 1640 w/10% FBS (Growth medium)
・PBS
・18Gニードル Invitrogen Cat# 11668-019 Lot# 890730
・27Gニードル
・1 ml テルモシリンジ
・ウイルス
CVB3-WT (2.66×109 TCID50/ml : 約1.88 μl/mouse)
CVB3-miR-1&217T (3.55×108 TCID50/ml : 約14.1 μl/mouse)
CVB3-miR-217T (2.66×108 TCID50/ml : 約19 μl/mouse)
・1 ml テルモシリンジ (29G)
・Opti-MEM（登録商標）I
(Materials & reagents)
・150 mm dish
・NCI-H1299 cells (5 ×106 cells/100 μl PBS/mouse) (04/01 Thawing T175 2 passage)
・RPMI 1640 w/10% FBS (Growth medium)
・PBS
・18Gニードル Invitrogen Cat# 11668-019 Lot# 890730
・27Gニードル
・1 ml テルモシリンジ
・ウイルス
CVB3-WT (2.66×109 TCID50/ml : 約1.88 μl/mouse)
CVB3-miR-1&217T (3.55×108 TCID50/ml : 約14.1 μl/mouse)
CVB3-miR-217T (2.66×108 TCID50/ml : 約19 μl/mouse)
・1 ml テルモシリンジ (29G)
・Opti-MEM（登録商標）I
(Methods)
1．NCI-H2199 cellsを150 mm dish 16枚に播種。
2．4枚を剥がし50 mlチューブに回収。計4本の50mlチューブを遠心 (4℃、1,000 rpm、5 min)。
3．2本のペレットをPBS 20 mlに懸濁。これらを混ぜ合わせ計40 mlの懸濁液を作製。
4．4℃、1,000 rpm、5 min遠心。
5．NCI-H1299 cellsを5×107 cells/mlになるようにPBSで再懸濁。
6．BALB/c nu/nuの右側腹部に上記懸濁液を100 μl皮下注射する。
7．2日後、5×106 TCID50/50 μlになるようにOpti-MEMで希釈した各々のウイルスを腫瘍内投与する。
8．上記のウイルス投与は隔日で行い、計5回投与する。
9．隔日で腫瘍径（長径、短径）、体重を測定する。
1．NCI-H2199 cellsを150 mm dish 16枚に播種。
2．4枚を剥がし50 mlチューブに回収。計4本の50mlチューブを遠心 (4℃、1,000 rpm、5 min)。
3．2本のペレットをPBS 20 mlに懸濁。これらを混ぜ合わせ計40 mlの懸濁液を作製。
4．4℃、1,000 rpm、5 min遠心。
5．NCI-H1299 cellsを5×107 cells/mlになるようにPBSで再懸濁。
6．BALB/c nu/nuの右側腹部に上記懸濁液を100 μl皮下注射する。
7．2日後、5×106 TCID50/50 μlになるようにOpti-MEMで希釈した各々のウイルスを腫瘍内投与する。
8．上記のウイルス投与は隔日で行い、計5回投与する。
9．隔日で腫瘍径（長径、短径）、体重を測定する。
あるいは、上記8.および9.に代えて、下記を実施する。
8．更に2日後、マウスから血液および臓器を採取する。
9．血液は遠心分離後、上清を生化学検査に用いる。臓器はPFA固定後、脱水を行い、H&E染色を行う。
8．更に2日後、マウスから血液および臓器を採取する。
9．血液は遠心分離後、上清を生化学検査に用いる。臓器はPFA固定後、脱水を行い、H&E染色を行う。
II. GM-CSFの挿入による攻撃性向上
我々は野生型CVB3（CVB-WT）では腫瘍の完全治療が認められなかった事例に対して、更に腫瘍退縮効果を高める目的で、顆粒球単球コロニー刺激因子（GM-CSF）が挿入された遺伝子改変ウイルスの作製を試みた。
我々は野生型CVB3（CVB-WT）では腫瘍の完全治療が認められなかった事例に対して、更に腫瘍退縮効果を高める目的で、顆粒球単球コロニー刺激因子（GM-CSF）が挿入された遺伝子改変ウイルスの作製を試みた。
II-1. 結果
我々は以下の三点に注目して遺伝子改変の条件を検討した。１つ目はmGM-CSFの遊離方法（3Cpro、2Apro、IRES、2A peptide）。２つ目は遺伝子の挿入部位（CVB3-WTのゲノムの翻訳開始地点ATG直下、2A遺伝子前、もしくは3'UTR）。3つ目はプロテアーゼ認識配列の違い（他ウイルス由来配列との比較）。検討結果をまとめた表を示す。
我々は以下の三点に注目して遺伝子改変の条件を検討した。１つ目はmGM-CSFの遊離方法（3Cpro、2Apro、IRES、2A peptide）。２つ目は遺伝子の挿入部位（CVB3-WTのゲノムの翻訳開始地点ATG直下、2A遺伝子前、もしくは3'UTR）。3つ目はプロテアーゼ認識配列の違い（他ウイルス由来配列との比較）。検討結果をまとめた表を示す。
[3Cproの利用およびATG直下へのmGM-CSFの挿入(1st Generation、2nd Generation)]
まず、エンテロウイルス属の遺伝子改変で報告のある3Cproを利用しATG直下に挿入した。その結果、mGM-CSF遺伝子を挿入したCVB3は細胞変性効果（CPE）が見られなかった。しかしながら、対照として作製し確認できたEGFP挿入CVB3（CVB3-EGFP）は、既存の報告通りEGFPの発現が確認されCPEが見られた（図10）。このことから、mGM-CSFを挿入するには3Cproを利用しATG直下に挿入することは不適切である可能性が示唆された。なお、3rd Generationおよび4th Generationとして、IRESまたは2A peptideを利用し、3'UTR（STOPコドン上流または下流）に挿入することを試みたが、同様の結果であった。
まず、エンテロウイルス属の遺伝子改変で報告のある3Cproを利用しATG直下に挿入した。その結果、mGM-CSF遺伝子を挿入したCVB3は細胞変性効果（CPE）が見られなかった。しかしながら、対照として作製し確認できたEGFP挿入CVB3（CVB3-EGFP）は、既存の報告通りEGFPの発現が確認されCPEが見られた（図10）。このことから、mGM-CSFを挿入するには3Cproを利用しATG直下に挿入することは不適切である可能性が示唆された。なお、3rd Generationおよび4th Generationとして、IRESまたは2A peptideを利用し、3'UTR（STOPコドン上流または下流）に挿入することを試みたが、同様の結果であった。
[2Aproの利用および2A遺伝子直前へのmGM-CSFの挿入(5th Generation、6th Generation)]
上の結果を受け、蛋白質遊離方法として3Cpro、2Apro、IRES、2A peptideのどれがCPEを誘導しmGM-CSFの遊離ができるかを検討したところ、2Aproを利用し2A遺伝子前の直前にmGM-CSFを挿入したCVB3がCPEを誘導し、かつmGM-CSFの発現がELISA法によって確認できた。さらに、mGM-CSFと同時に挿入した2Apro認識配列の検討を行ったところ、CVB3由来2Apro認識配列を用いるより、Poliovirue由来2Apro認識配列を用いたものがCPEを誘導し（図12）、かつより高いウイルス力価のCVB3が得られることが判明した。しかしながら、2Aproを利用し2A遺伝子前の直前にmGM-CSFを挿入したCVB3においても、in vivo実験に適用可能なウイルス力価が得られなかった。
上の結果を受け、蛋白質遊離方法として3Cpro、2Apro、IRES、2A peptideのどれがCPEを誘導しmGM-CSFの遊離ができるかを検討したところ、2Aproを利用し2A遺伝子前の直前にmGM-CSFを挿入したCVB3がCPEを誘導し、かつmGM-CSFの発現がELISA法によって確認できた。さらに、mGM-CSFと同時に挿入した2Apro認識配列の検討を行ったところ、CVB3由来2Apro認識配列を用いるより、Poliovirue由来2Apro認識配列を用いたものがCPEを誘導し（図12）、かつより高いウイルス力価のCVB3が得られることが判明した。しかしながら、2Aproを利用し2A遺伝子前の直前にmGM-CSFを挿入したCVB3においても、in vivo実験に適用可能なウイルス力価が得られなかった。
[2Aproの利用およびATG直下へのmGM-CSFの挿入(8th Generation)]
上の結果を受け、in vivo実験に使用可能な高いウイルス力価を有するCVB3-EGFPの挿入部位であるATG直下に再び着目した。このATG直下に、2Aproを利用したCVB3-mGM-CSFを作製した。in vivo実験に使用可能な高力価のCVB3-mGM-CSFを得ることができた。なお、Poliovirue由来3Cpro利用およびATG直下へのmGM-CSFの挿入(7th Generation)では、十分なウイルス力価が期待できなかった。
上の結果を受け、in vivo実験に使用可能な高いウイルス力価を有するCVB3-EGFPの挿入部位であるATG直下に再び着目した。このATG直下に、2Aproを利用したCVB3-mGM-CSFを作製した。in vivo実験に使用可能な高力価のCVB3-mGM-CSFを得ることができた。なお、Poliovirue由来3Cpro利用およびATG直下へのmGM-CSFの挿入(7th Generation)では、十分なウイルス力価が期待できなかった。
[CVB3-GM-CSFのin vivo試験]
遺伝子改変CVB3-GM-CSF(挿入した配列は、上記の8th Generation CVB3-GM-CSF-LTTY。配列番号4のポリヌクレオチド。)のin vivo抗腫瘍効果を検討した。0日目にC57BL/6マウスの右側腹部に腫瘍（マウス肺癌、TC-1細胞）を接種し、4日目より計2回、CVB3-WTあるいはCVB3-GM-CSFを隔日で腫瘍内に投与（5×106 TCID50 / 回）した。その結果、遺伝子改変CVB3-GM-CSFにより、WTより高い腫瘍溶解性が奏された。
[小括]
本発明はmGM-CSFをエンテロウイルス属に挿入した初めて発明であり、他のウイルスでmGM-CSF挿入しているこれまでの報告とは全く違う方法でmGM-CSFを発現遊離している。エンテロウイルスの細胞変性効果を保持したまま外来性タンパク質を発現させるという考え方は病原性の研究が行われていたエンテロウイルスでは極めて異端であり、本研究の独自性および新規性は極めて高いものと考えられる。
遺伝子改変CVB3-GM-CSF(挿入した配列は、上記の8th Generation CVB3-GM-CSF-LTTY。配列番号4のポリヌクレオチド。)のin vivo抗腫瘍効果を検討した。0日目にC57BL/6マウスの右側腹部に腫瘍（マウス肺癌、TC-1細胞）を接種し、4日目より計2回、CVB3-WTあるいはCVB3-GM-CSFを隔日で腫瘍内に投与（5×106 TCID50 / 回）した。その結果、遺伝子改変CVB3-GM-CSFにより、WTより高い腫瘍溶解性が奏された。
[小括]
本発明はmGM-CSFをエンテロウイルス属に挿入した初めて発明であり、他のウイルスでmGM-CSF挿入しているこれまでの報告とは全く違う方法でmGM-CSFを発現遊離している。エンテロウイルスの細胞変性効果を保持したまま外来性タンパク質を発現させるという考え方は病原性の研究が行われていたエンテロウイルスでは極めて異端であり、本研究の独自性および新規性は極めて高いものと考えられる。
II-2. METHODS SUMMARY
以下のプロトコールにしたがって、本研究は行われた。
以下のプロトコールにしたがって、本研究は行われた。
[5th Generationの実験]
<1st Double Joint PCR>
(Materials & reagents)
・CVB3-WT Plasmid (1) (approx. 10 ng/μl)
・pMXs-eGFP (approx. 100 ng/μl) or
・KOD -Plus- Neo TOYOBO Cat# KOD-401
・UltraPure
・Primer (15 pmol/μl)
<1st Double Joint PCR>
(Materials & reagents)
・CVB3-WT Plasmid (1) (approx. 10 ng/μl)
・pMXs-eGFP (approx. 100 ng/μl) or
・KOD -Plus- Neo TOYOBO Cat# KOD-401
・UltraPure
・Primer (15 pmol/μl)
(Methods)
1．On iceで以下の順に0.2 ml PCR tubeに混合する。
1．On iceで以下の順に0.2 ml PCR tubeに混合する。
94℃ 2:00、98℃ 0:10、68℃ 2:00、（10 cycle）、72℃ 7:00
3つのPCR産物を用いてアガロース電気泳動を行い目的のバンドを切り出す。
切り出したゲルから、核酸を抽出する。
<2nd Double Joint PCR>
(Materials & reagents)
・1st joint PCR産物（VP1側 : EGFP : 2A側 = 1 : 3 : 1モル比）
VP1 PCRゲル抽出後産物（T、TG、MTNTの3種）
EGFP PCRゲル抽出後産物
2A PCRゲル抽出後産物（T、TG、MTNTの3種）
・KOD -Plus- Neo TOYOBO Cat# KOD-401
(Materials & reagents)
・1st joint PCR産物（VP1側 : EGFP : 2A側 = 1 : 3 : 1モル比）
VP1 PCRゲル抽出後産物（T、TG、MTNTの3種）
EGFP PCRゲル抽出後産物
2A PCRゲル抽出後産物（T、TG、MTNTの3種）
・KOD -Plus- Neo TOYOBO Cat# KOD-401
(Methods)
1. On iceで以下の順に0.2 ml PCR tubeに混合する。
1. On iceで以下の順に0.2 ml PCR tubeに混合する。
2．eppendorf社のMastercycler(登録商標)proで次のプログラムを実行する。
94℃ 2:00、98℃ 0:10、68℃ 4:00、（15 cycle）、72℃ 7:00
94℃ 2:00、98℃ 0:10、68℃ 4:00、（15 cycle）、72℃ 7:00
<3rd Double Joint PCR>
(Materials & reagents)
・2nd joint PCR産物（T、TG、MTNTの3種類）
・KOD -Plus- Neo TOYOBO Cat# KOD-401
・Primer (15 pmol/μl)
(Materials & reagents)
・2nd joint PCR産物（T、TG、MTNTの3種類）
・KOD -Plus- Neo TOYOBO Cat# KOD-401
・Primer (15 pmol/μl)
(Methods)
1．On iceで以下の順に0.2 ml PCR tubeに混合する。
1．On iceで以下の順に0.2 ml PCR tubeに混合する。
94℃ 2:00、98℃ 0:10、68℃ 2:00、（35 cycle）、72℃ 7:00
3．Double Joint PCR産物を精製し、CVB3 plasmidも同時にEcoR IとSpe Iで制限酵素処理する。
4．制限酵素処理産物を用いてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のバンドを切り出す。
5．ゲル精製後、制限酵素処理後CVB3 plasmidとOverlap extension PCR制限酵素処理産物をLgation Highを用いて、16℃、2 h反応させる。
6．Ligation産物をコンピテントセルに導入し、37℃で培養する。
7．翌日、コロニーを拾い、LB培地にて培養する。
8．培養物からプラスミドを回収し、目的配列の挿入の有無を確認する。
<ウイルスRNA作製〜ウイルス力価測定まで>
以降はCVB3-miRTのプロトコールと同一のため略。
[6th Generationの実験]
<Mutagenesis>
(Materials & reagents)
・CVB3-MTNT- Plasmid (1) (approx. 10 ng/μl)
・pMXs-eGFP (approx. 100 ng/μl) or
・KOD -Plus- Neo TOYOBO Cat# KOD-401
・UltraPure
・Primer (15 pmol/μl)
LTTY置換 Forward
CTTACAACGTACggcgcatttggacaacaatcag（配列番号23）
GQQ欠損 Forward
AAATGCGCCcgtatttgtca（配列番号24）
<Mutagenesis>
(Materials & reagents)
・CVB3-MTNT- Plasmid (1) (approx. 10 ng/μl)
・pMXs-eGFP (approx. 100 ng/μl) or
・KOD -Plus- Neo TOYOBO Cat# KOD-401
・UltraPure
・Primer (15 pmol/μl)
LTTY置換 Forward
CTTACAACGTACggcgcatttggacaacaatcag（配列番号23）
GQQ欠損 Forward
AAATGCGCCcgtatttgtca（配列番号24）
(Methods)
1．On iceで以下の順に0.2 ml PCR tubeに混合する。
1．On iceで以下の順に0.2 ml PCR tubeに混合する。
2．eppendorf社のMastercycler（登録商標）proで次のプログラムを実行する。
94℃ 2:00、98℃ 0:10、68℃ 12:00、（15 cycle）、72℃ 7:00
94℃ 2:00、98℃ 0:10、68℃ 12:00、（15 cycle）、72℃ 7:00
<Dpn I Digestion>
(Materials & reagents)
・Inverse PCR産物
・Dpn I (10U/μl) NEB Cat# R0176S
・Ligation high TOYOBO Cat# LGK-101
・T4 Polynucleotide Kinase (5U/μl) TOYOBO Cat# PNK-111
・UltraPure
(Materials & reagents)
・Inverse PCR産物
・Dpn I (10U/μl) NEB Cat# R0176S
・Ligation high TOYOBO Cat# LGK-101
・T4 Polynucleotide Kinase (5U/μl) TOYOBO Cat# PNK-111
・UltraPure
(Methods)
1．Inverse PCR産物全量(50 μl)にDpn Iを2 μl加え、良くピペッティングする。
2．37℃、2 h反応。
3．新しいPCRチューブに以下の順番で反応液を調製する。
1．Inverse PCR産物全量(50 μl)にDpn Iを2 μl加え、良くピペッティングする。
2．37℃、2 h反応。
3．新しいPCRチューブに以下の順番で反応液を調製する。
4．16℃、1 h反応。
5．反応液の一部（〜10 μl）を大腸菌の形質転換に供し、37℃で培養する。
6．翌日、コロニーを拾い、LB培地にて培養する。
7．培養物からプラスミドを回収し、変異の有無を確認する。
<ウイルスRNA作製〜ウイルス力価測定まで>
以降はCVB3-miRTのプロトコールと同一のため略。
5．反応液の一部（〜10 μl）を大腸菌の形質転換に供し、37℃で培養する。
6．翌日、コロニーを拾い、LB培地にて培養する。
7．培養物からプラスミドを回収し、変異の有無を確認する。
<ウイルスRNA作製〜ウイルス力価測定まで>
以降はCVB3-miRTのプロトコールと同一のため略。
[8th Generationの実験]
<ベクター構築>
(Materials & reagents)
・CVB3-WT Plasmid (approx. 10 ng/μl)
・pMXs-eGFP (approx. 100 ng/μl) or pORF9-mGMCSF (approx. 100 ng/μl)
・KOD -Plus- Neo TOYOBO Cat# KOD-401
・UltraPure
・Primer (15 pmol/μl)
<ベクター構築>
(Materials & reagents)
・CVB3-WT Plasmid (approx. 10 ng/μl)
・pMXs-eGFP (approx. 100 ng/μl) or pORF9-mGMCSF (approx. 100 ng/μl)
・KOD -Plus- Neo TOYOBO Cat# KOD-401
・UltraPure
・Primer (15 pmol/μl)
上記2種類（それぞれの表）の制限酵素配列挿入CVB3を作製し、挿入した制限酵素配列を利用してEGFPまたはmGM-CSFの配列を挿入する。以下は2種類に共通のプロトコールである。プライマー番号に従って同一の作業を行う。
(Methods)
1．On iceで以下の順に0.2 ml PCR tubeに混合する。
1．On iceで以下の順に0.2 ml PCR tubeに混合する。
2．タッピングもしくは緩やかなピペッティングで攪拌し、軽くスピンダウンして溶液を集める。
3．Bio-Rad社のサーマルサイクラーで次のプログラムを実行する。
94℃ 2:00、98℃ 0:10、62℃ 0:15、68℃ 1:30（20 cycle）、72℃ 7:00
4．二つのPCR産物を用いてOverlap extension PCRを行う。
5．この二つのPCR産物を1 μlずつチューブに入れ、これをテンプレートにし、CVB3-Forward & CVB3-Reverseプライマーを使用し、PCRを行う。プログラムは上記の通りに行い、サイクル数は30 cycle行う。
6．Overlap extension PCR産物を精製し、CVB3 plasmidも同時にBlp IとXma Iで制限酵素処理する。
7．酵素処理産物を用いてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のバンドを切り出す。
8．ゲル精製後、制限酵素処理後CVB3 plasmidとOverlap extension PCR制限酵素処理産物をLgation Highを用いて、16℃、2 h反応させる。
9．Ligation産物をコンピテントセルに導入し、37℃で培養する。
10．翌日、コロニーを拾い、LB培地にて培養する。
11．培養物からプラスミドを回収し、制限酵素配列の挿入の有無を確認する。
3．Bio-Rad社のサーマルサイクラーで次のプログラムを実行する。
94℃ 2:00、98℃ 0:10、62℃ 0:15、68℃ 1:30（20 cycle）、72℃ 7:00
4．二つのPCR産物を用いてOverlap extension PCRを行う。
5．この二つのPCR産物を1 μlずつチューブに入れ、これをテンプレートにし、CVB3-Forward & CVB3-Reverseプライマーを使用し、PCRを行う。プログラムは上記の通りに行い、サイクル数は30 cycle行う。
6．Overlap extension PCR産物を精製し、CVB3 plasmidも同時にBlp IとXma Iで制限酵素処理する。
7．酵素処理産物を用いてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のバンドを切り出す。
8．ゲル精製後、制限酵素処理後CVB3 plasmidとOverlap extension PCR制限酵素処理産物をLgation Highを用いて、16℃、2 h反応させる。
9．Ligation産物をコンピテントセルに導入し、37℃で培養する。
10．翌日、コロニーを拾い、LB培地にて培養する。
11．培養物からプラスミドを回収し、制限酵素配列の挿入の有無を確認する。
<Insert PCR>
(Methods)
１．On iceで以下の順に0.2 ml PCR tubeに混合する。
(Methods)
１．On iceで以下の順に0.2 ml PCR tubeに混合する。
2．eppendorf社のMastercycler（登録商標）proで次のプログラムを実行する。
94℃ 2:00、98℃ 0:15、68℃ 1:30、（35 cycle）、72℃ 7:00
3．PCR産物を精製し、制限酵素配列挿入CVB3 plasmidも同時にCla I & Sbf IまたはSfi Iで制限酵素処理する。
4．制限酵素処理産物を用いてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のバンドを切り出す。
5．ゲル精製後、制限酵素処理後CVB3 plasmidとPCR制限酵素処理産物をLgation Highを用いて、16℃、2 h反応させる。
6．Ligation産物をコンピテントセルに導入し、37℃で培養する。
7．翌日、コロニーを拾い、LB培地にて培養する。
8．培養物からプラスミドを回収し、EGFPまたはmGMCSF配列の挿入の有無を確認する。
94℃ 2:00、98℃ 0:15、68℃ 1:30、（35 cycle）、72℃ 7:00
3．PCR産物を精製し、制限酵素配列挿入CVB3 plasmidも同時にCla I & Sbf IまたはSfi Iで制限酵素処理する。
4．制限酵素処理産物を用いてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のバンドを切り出す。
5．ゲル精製後、制限酵素処理後CVB3 plasmidとPCR制限酵素処理産物をLgation Highを用いて、16℃、2 h反応させる。
6．Ligation産物をコンピテントセルに導入し、37℃で培養する。
7．翌日、コロニーを拾い、LB培地にて培養する。
8．培養物からプラスミドを回収し、EGFPまたはmGMCSF配列の挿入の有無を確認する。
<Mutagenesis PCR>
(Materials & reagents)
・CVB3-MTNT- Plasmid (1) (approx. 10 ng/μl)
・pMXs-eGFP (approx. 100 ng/μl) or
・KOD -Plus- Neo TOYOBO Cat# KOD-401
・UltraPure
・Primer (15 pmol/μl)
(Materials & reagents)
・CVB3-MTNT- Plasmid (1) (approx. 10 ng/μl)
・pMXs-eGFP (approx. 100 ng/μl) or
・KOD -Plus- Neo TOYOBO Cat# KOD-401
・UltraPure
・Primer (15 pmol/μl)
(Methods)
1．On iceで以下の順に0.2 ml PCR tubeに混合する。
1．On iceで以下の順に0.2 ml PCR tubeに混合する。
2．eppendorf社のMastercycler(登録商標)proで次のプログラムを実行する。
94℃ 2:00、98℃ 0:10、68℃ 12:00、（15 cycle）、72℃ 7:00
94℃ 2:00、98℃ 0:10、68℃ 12:00、（15 cycle）、72℃ 7:00
<Dpn I Digestion>
(Materials & reagents)
・Inverse PCR産物
・Dpn I (10U/μl) NEB Cat# R0176S
・Ligation high TOYOBO Cat# LGK-101
・T4 Polynucleotide Kinase (5U/μl) TOYOBO Cat# PNK-111
・UltraPure
(Materials & reagents)
・Inverse PCR産物
・Dpn I (10U/μl) NEB Cat# R0176S
・Ligation high TOYOBO Cat# LGK-101
・T4 Polynucleotide Kinase (5U/μl) TOYOBO Cat# PNK-111
・UltraPure
(Methods)
1．Inverse PCR産物全量(50 μl)にDpn Iを2 μl加え、良くピペッティングする。
2．37℃、2 h反応。
3．新しいPCRチューブに以下の順番で反応液を調製する。
1．Inverse PCR産物全量(50 μl)にDpn Iを2 μl加え、良くピペッティングする。
2．37℃、2 h反応。
3．新しいPCRチューブに以下の順番で反応液を調製する。
4．16℃、1 h反応。
5．反応液の一部（〜10 μl）を大腸菌の形質転換に供し、37℃で培養する。
6．翌日、コロニーを拾い、LB培地にて培養する。
7．培養物からプラスミドを回収し、変異の有無を確認する。
5．反応液の一部（〜10 μl）を大腸菌の形質転換に供し、37℃で培養する。
6．翌日、コロニーを拾い、LB培地にて培養する。
7．培養物からプラスミドを回収し、変異の有無を確認する。
<ウイルスRNA作製〜ウイルス力価測定まで>
以降はCVB3-miRTのプロトコールと同一のため略。
[ELISA (mGM-CSF 〜R&D〜)]
(Materials & reagents)
・Mouse GM-CSF Immunoassay R&D Systems Cat# PMGM00
・Milli-Q（600 mlオートクレーブ済）
・細胞上清
CVB3-mGMCSF感染NCI-H1299 cells
以降はCVB3-miRTのプロトコールと同一のため略。
[ELISA (mGM-CSF 〜R&D〜)]
(Materials & reagents)
・Mouse GM-CSF Immunoassay R&D Systems Cat# PMGM00
・Milli-Q（600 mlオートクレーブ済）
・細胞上清
CVB3-mGMCSF感染NCI-H1299 cells
(Methods)
1．Milli-Qを600 mlほどオートクレーブ滅菌。
2．冷めたら、Wash Buffer Concentrate（25×）を25 ml加えて全量625 ml（1×）に希釈する。
3．必要分の付属のmicroplate stripをプレートフレームにセットする。不要分はホイル内に戻す。
4．各wellにAssay Diluent RD1Wを50 μlずつ添加する。
5．スタンダードを薄い方から順に各well（Assay Diluent添加済）に50 μl添加。サンプルを同様に各well（Assay Diluent添加済）に50 μl添加し、フレームを緩やかに1 minタッピング。
6．カバーシールをしっかりとし、室温で2 hours静置。
7．各wellの液を吸引し、Wash Buffer（上記2.で作製済み）を400 μl添加する。
8．上記7の作業を計5回繰り返す。最後の時に清潔なキムタオルで水気を取る。
9．各wellにMouse GM-CSF Conjugateを100 μlずつ加える。
10．新しいカバーシールを張りつけ、室温で2 hours静置。
11．上記の洗浄作業を繰り返す。
12．各wellにSubstrate Solutionを100 μl添加する。
13．シールはせずに室温、暗所で30 min静置する。
14．各wellに100 μlのStop Solutionを添加する。
15．混ざるまで緩やかにプレートをタッピング。
16．30 min以内にプレートリーダーで450 nmにおける吸光度を測定する。
1．Milli-Qを600 mlほどオートクレーブ滅菌。
2．冷めたら、Wash Buffer Concentrate（25×）を25 ml加えて全量625 ml（1×）に希釈する。
3．必要分の付属のmicroplate stripをプレートフレームにセットする。不要分はホイル内に戻す。
4．各wellにAssay Diluent RD1Wを50 μlずつ添加する。
5．スタンダードを薄い方から順に各well（Assay Diluent添加済）に50 μl添加。サンプルを同様に各well（Assay Diluent添加済）に50 μl添加し、フレームを緩やかに1 minタッピング。
6．カバーシールをしっかりとし、室温で2 hours静置。
7．各wellの液を吸引し、Wash Buffer（上記2.で作製済み）を400 μl添加する。
8．上記7の作業を計5回繰り返す。最後の時に清潔なキムタオルで水気を取る。
9．各wellにMouse GM-CSF Conjugateを100 μlずつ加える。
10．新しいカバーシールを張りつけ、室温で2 hours静置。
11．上記の洗浄作業を繰り返す。
12．各wellにSubstrate Solutionを100 μl添加する。
13．シールはせずに室温、暗所で30 min静置する。
14．各wellに100 μlのStop Solutionを添加する。
15．混ざるまで緩やかにプレートをタッピング。
16．30 min以内にプレートリーダーで450 nmにおける吸光度を測定する。
[In vivo試験]
(Materials & reagents)
・150 mm dish
・TC-1 cells (1 ×106 cells/100 μl PBS/mouse) (03/20 Thawing T175 2 passage)
・RPMI 1640 w/10% FBS、1 mM sodium pyruvate (Growth medium)
・PBS
・18Gニードル Invitrogen Cat# 11668-019 Lot# 890730
・27Gニードル
・1 ml テルモシリンジ
・ウイルス
CVB3-WT (3.33×108 TCID50/ml : 約15 μl/mouse)
CVB3-mGM-CSF (1.12×108 TCID50/ml : 約45 μl/mouse)
・1 ml テルモシリンジ (29G)
・Opti-MEM（登録商標）I
(Materials & reagents)
・150 mm dish
・TC-1 cells (1 ×106 cells/100 μl PBS/mouse) (03/20 Thawing T175 2 passage)
・RPMI 1640 w/10% FBS、1 mM sodium pyruvate (Growth medium)
・PBS
・18Gニードル Invitrogen Cat# 11668-019 Lot# 890730
・27Gニードル
・1 ml テルモシリンジ
・ウイルス
CVB3-WT (3.33×108 TCID50/ml : 約15 μl/mouse)
CVB3-mGM-CSF (1.12×108 TCID50/ml : 約45 μl/mouse)
・1 ml テルモシリンジ (29G)
・Opti-MEM（登録商標）I
(Methods)
1．TC-1 cellsを150 mm dish に播種。
2．4枚を剥がし50 mlチューブに回収。計4本の50mlチューブを遠心 (4℃、1,000 rpm、5 min)。
3．2本のペレットをPBS 20 mlに懸濁。これらを混ぜ合わせ計40 mlの懸濁液を作製。
4．4℃、1,000 rpm、5 min遠心。
5．TC-1 cellsを1×107 cells/mlになるようにPBSで再懸濁。
6．C57BL/6の右側腹部に上記懸濁液を100 μl皮下注射する。
7．4日後、5×106 TCID50/50 μlになるようにOpti-MEMで希釈した各々のウイルスを腫瘍内投与する。
8．上記のウイルス投与は隔日で行い、計2回投与する。
9．隔日で腫瘍径（長径、短径）、体重を測定する。
1．TC-1 cellsを150 mm dish に播種。
2．4枚を剥がし50 mlチューブに回収。計4本の50mlチューブを遠心 (4℃、1,000 rpm、5 min)。
3．2本のペレットをPBS 20 mlに懸濁。これらを混ぜ合わせ計40 mlの懸濁液を作製。
4．4℃、1,000 rpm、5 min遠心。
5．TC-1 cellsを1×107 cells/mlになるようにPBSで再懸濁。
6．C57BL/6の右側腹部に上記懸濁液を100 μl皮下注射する。
7．4日後、5×106 TCID50/50 μlになるようにOpti-MEMで希釈した各々のウイルスを腫瘍内投与する。
8．上記のウイルス投与は隔日で行い、計2回投与する。
9．隔日で腫瘍径（長径、短径）、体重を測定する。
配列番号1: miR-1 & 217T (x2)
配列番号2: miR-217 (x4)
配列番号3: CVB3-GM-CSF-2A
配列番号4: CVB3-GM-CSF-LTTY
配列番号5: CVB3-GM-CSF-AVFQ
配列番号6: CVB3-miR-Forward primer
配列番号7: CVB3-miR-Reverse primer
配列番号8: miR-1&217T Forward primer
配列番号9: miR-1&217T Reverse primer
配列番号10: miR-217T Forward primer
配列番号11: CVB3-Forward primer
配列番号12: CVB3-Reverse primer
配列番号13: EGFP-Forward primer
配列番号14: EGFP-Forward primer
配列番号15: CVB3-G-EGFP-T-Fw primer
配列番号16: CVB3-G-EGFP-T-Rev primer
配列番号17: CVB3-TG-EGFP-TG-Fw primer
配列番号18: CVB3-TG-EGFP-TG-Rev primer
配列番号19: GAFGQQ-EGFP-MTNT-Fw primer
配列番号20: GAFGQQ-EGFP-MTNT-Rev primer
配列番号21: CVB3-Forward primer
配列番号22: CVB3-Reverse primer
配列番号23: LTTY substitution Forward primer
配列番号24: GQQ deletion Forward primer
配列番号25: CVB3-Forward primer
配列番号26: CVB3-Reverse primer
配列番号27: Cla&Sbf-Forward primer
配列番号28: Cla&Sbf-Reverse primer
配列番号29: Cla-EGFP-Forward primer
配列番号30: Cla-mGMCSF-Forward primer
配列番号31: CVB3-Forward primer
配列番号32: CVB3-Reverse primer
配列番号33: CVB3-Forward primer
配列番号34: CVB3-Reverse primer
配列番号35: Sfi-AVFQ-Forward primer
配列番号36: Sfi-AVFQ-Reverse primer
配列番号37: Sfi-EGFP-Forward primer
配列番号38: Sfi-EGFP-Reverse primer
配列番号39: Sfi-mGMCSF-Forward primer
配列番号40: Sfi-mGMCSF-Reverse primer
配列番号41: Inverse-2A-peptide-Fw primer
配列番号42: DLTTY-Fw primer
配列番号43: CCEFAGLRQAVFQ-Fw primer
配列番号44: Inverse-GMCSF-Rev primer
配列番号2: miR-217 (x4)
配列番号3: CVB3-GM-CSF-2A
配列番号4: CVB3-GM-CSF-LTTY
配列番号5: CVB3-GM-CSF-AVFQ
配列番号6: CVB3-miR-Forward primer
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配列番号11: CVB3-Forward primer
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配列番号13: EGFP-Forward primer
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配列番号15: CVB3-G-EGFP-T-Fw primer
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Claims (11)
- コクサッキーウイルスＢ３野生型（ＣＶＢ３−ＷＴ）のゲノムに、組織特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の標的配列からなるポリヌクレオチドが少なくとも一つ挿入された変異ゲノムを含む、組織特異的に増殖が抑制され、
前記ポリヌクレオチドが挿入される位置が、ＣＶＢ３−ＷＴゲノムの位置７３０４と位置７３０５との間であり、
前記組織特異的ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１および／またはｍｉＲ−２１７であると共に、
挿入されるポリヌクレオチドが、下記（ａ）若しくは（ｂ）、または（ａ）若しくは（ｂ）において１〜数個のヌクレオチドを欠失、置換若しくは付加した配列からなるポリヌクレオチドであり、
ＣＶＢ３−ＷＴが感染可能な癌細胞を標的細胞とする改変コクサッキーウイルス。
(a) ATA CAT ACT TCT TTA CAT TCC Acg atA TAC ATA CTT CTT TAC ATT CCA acc ggt TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TAt cac TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TA
(b)TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TAc gat TCC AAT CAG TTC CTG ATG CAG TAa ccg gtT CCA ATC AGT TCC TGA TGC AGT Atc acT CCA ATC AGT TCC TGA TGC AGT A - 標的細胞が、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、悪性中皮腫、大腸癌、結腸直腸癌、食道癌、下咽頭癌、ヒトＢリンパ腫、乳癌および子宮頸癌からなる群から選択されるいずれかの癌の細胞である、請求項１に記載の改変コクサッキーウイルス。
- 組織特異的ｍｉＲＮＡが、膵臓および／または心筋に発現しているものである、請求項１または２に記載の改変コクサッキーウイルス。
- 標的配列からなるポリヌクレオチドが複数個（例えば２〜６個）挿入された、請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変コクサッキーウイルス。
- 変異ゲノムがさらに、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする領域とその下流に連結された２Ａプロテアーゼ認識配列をコードする領域とを含むポリヌクレオチドが、翻訳開始地点のＡＴＧの直下に、機能可能に挿入されたものであり、
前記２Ａプロテアーゼ認識配列が、ポリオウイルス由来のＬＴＴＹで表されるアミノ酸配列である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変コクサッキーウイルス。 - ＣＶＢ３−ＷＴゲノムにおいて、ＧＭ−ＣＳＦをコードする領域とその下流に連結された２Ａプロテアーゼ認識配列をコードする領域とを含むポリヌクレオチドが、翻訳開始地点のＡＴＧの直下に、機能可能に挿入された変異ゲノムを含み、
前記２Ａプロテアーゼ認識配列が、ポリオウイルス由来のＬＴＴＹで表されるアミノ酸配列である、
改変コクサッキーウイルス。 - 請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変コクサッキーウイルスを含む医薬組成物。
- 癌またはその前癌状態の処置（予防または治療）のための、請求項７に記載の医薬組成物。
- 癌またはその前癌状態の処置（予防または治療）において使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変コクサッキーウイルス。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変コクサッキーウイルスの、力価測定または増殖のための、対応する組織特異的ｍｉＲＮＡの発現量が高くない細胞（例えば、Ｈ１２９９）細胞の使用。
- 局所用または全身投与用の製剤である、請求項７または８に記載の医薬組成物。
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| PCT/JP2014/060988 WO2014171526A1 (ja) | 2013-04-17 | 2014-04-17 | 遺伝子改変コクサッキーウイルス |
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|---|---|
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