CN110387353B - 一种用于治疗肿瘤的柯萨奇b组病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒领域和肿瘤治疗领域。具体而言，本发明涉及CVB1或其修饰形式，或包含CVB1或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的核酸分子，用于在受试者(例如，人)中治疗肿瘤的用途，以及在制备用于在受试者(例如，人)中治疗肿瘤的药物组合物中的用途。本发明还涉及一种治疗肿瘤的方法，其包括向有此需要的受试者施用CVB1或其修饰形式，或包含CVB1或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的核酸分子的步骤。

Description

一种用于治疗肿瘤的柯萨奇B组病毒
技术领域
本发明涉及病毒领域和肿瘤治疗领域。具体而言，本发明涉及CVB1或其修饰形式，或包含CVB1或其修饰形式的基因组核苷酸序列或其互补序列的核酸分子，用于在受试者(例如，人)中治疗肿瘤的用途，以及在制备用于在受试者(例如，人)中治疗肿瘤的药物中的用途。本发明还涉及一种治疗肿瘤的方法，其包括向有此需要的受试者施用CVB1或其修饰形式，或包含CVB1或其修饰形式的基因组核苷酸序列或其互补序列的核酸分子的步骤。
背景技术
目前恶性肿瘤的治疗手段主要包括手术治疗、化疗和放疗。这些传统疗法对于已转移的肿瘤治疗效果不尽如人意，并且还会对患者身体健康产生伤害巨大。相比之下，作为新型的治疗方式，利用溶瘤病毒对肿瘤的治疗方法具有特异性高、效果好、副作用小等特点，是一种目前被认为比较有前景的肿瘤治疗手段。
溶瘤病毒是一种能够在肿瘤细胞当中自我复制，从而杀死、溶解肿瘤细胞，或者使肿瘤细胞生长停滞的病毒。当进行体内治疗时，溶瘤病毒表现出对肿瘤细胞的选择特异性，能够直接诱导肿瘤细胞死亡，而对正常细胞影响较小或无影响；同时，溶瘤病毒也能通过激发免疫系统当中的细胞毒性T淋巴细胞反应，间接地杀伤肿瘤细胞。
目前已有报导的具有溶瘤活性的肠道病毒包括用于治疗恶性神经胶质瘤等人实体肿瘤的嵌合脊髓灰质炎病毒(Dobrikova等人，Mol Ther2008,16(11):1865-1872)；杀伤人胃癌和卵巢癌细胞的埃可病毒ECHO1(Shafren等人，Int J Cancer 2005,115(2):320-328；Haley等人，J Mol Med(Berl)2009,87(4):385-399)等等。然而获得兼具肿瘤特异性和肿瘤杀伤活性的病毒仍然是有必要的。
CVB1属于小核糖核酸病毒科(Picomaviridae)、肠道病毒属(Enterovirus)。研究发现，CVB1在感染人体后通常仅导致被感染者出现发热、打喷嚏、咳嗽等轻度症状，但也可能导致新生儿、婴幼儿以及免疫缺陷的成人出现严重的病毒性心肌炎、胰腺炎、肝炎、无菌性脑膜炎以及胰岛素依赖型糖尿病等慢性自身免疫性疾(Rinehart等人，J Virol 1997,71(5):3986–3991)。目前本领域尚未有任何CVB1具有溶瘤活性的报道。
发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、生物化学、细胞生物学、核酸化学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“CVB1(Coxsackivirus B1)”是指，小核糖核酸病毒科(Picomaviridae)、肠道病毒属(Enterovirus)、柯萨奇病毒(Coxsackivirus)B组中的一种，其基因组为单股正链RNA，由5’非编码区(5’UTR)、一个开放阅读框(ORF)、3’非编码区(3’UTR)和多聚腺苷酸尾巴组成；其ORF编码一个前体多聚蛋白，经过自身蛋白酶水解切割，可产生结构蛋白VP1～VP4和非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D；为了更加清楚地描述本发明，CVB1基因组中上述各蛋白所对应的核酸序列分别称为VP1基因、VP2基因、VP3基因、VP4基因、2A基因、2B基因、2C基因、3A基因、3B基因、3C基因和3D基因。在本发明中，表述“柯萨奇病毒B组1型(Coxsackivirus B1，CVB1)”意指野生型CVB1，其可从自然中的来源分离并且没有被人为有意地修饰，其实例包括但不限于原型株Conn-5，以及各种临床分离株(例如，本发明实施例1中所描述的临床分离株)。野生型CVB1的基因组序列或cDNA序列是本领域熟知的，并且可参见各种公共数据库(例如，GenBank数据库登录号：MG780414)。
如本文中所使用的，术语病毒的“修饰形式”是指，对野生型病毒进行修饰而获得的经修饰的病毒，其保留了野生型病毒的期望的活性(例如，溶瘤活性)。在本发明中，CVB1的“修饰形式”包括但不限于经修饰的CVB1病毒，其与野生型CVB1的基因组序列相比具有一个或多个核苷酸的替换、插入或删除，并且至少保留了CVB1的溶瘤活性。
如本文中所使用的，术语“溶瘤病毒”是指，能够感染肿瘤细胞，在肿瘤细胞中复制，引起肿瘤细胞死亡、裂解或阻止肿瘤细胞生长的病毒。优选地，该病毒对非肿瘤细胞具有最小的毒性效应。
如本文中所使用的，术语“肿瘤特异性”是指，选择性地在肿瘤细胞内展现出生物功能或活性。例如，在本发明中，当术语“肿瘤特异性”用于描述病毒的杀伤选择性时，意指该病毒能够选择性杀伤肿瘤细胞而不杀伤或基本上不杀伤非肿瘤细胞，或者，该病毒对肿瘤细胞的杀伤比对非肿瘤细胞的杀伤更为有效。
如本文中所使用的，术语“溶瘤活性”主要包括肿瘤杀伤活性。当描述病毒的溶瘤活性时，通常可以通过其病毒感染肿瘤细胞的能力、在肿瘤细胞内复制的能力和/或杀伤肿瘤细胞的能力等指标衡量该病毒的溶瘤活性。病毒的溶瘤活性可以采用本领域已知的任何方法进行测定。例如，病毒感染肿瘤细胞的能力可以通过测量感染给定百分率的肿瘤细胞(例如50％细胞)所需要的病毒剂量进行评价；在肿瘤细胞内复制的能力可以通过测量病毒在肿瘤细胞内的生长情况进行评价；杀伤肿瘤细胞的能力可以通过观察致细胞病变效应(CPE)或测量肿瘤细胞活性进行评价。
如本文中所使用的，表述“CVB1的cDNA序列”意指，该病毒基因组RNA序列的DNA表示形式，其与所述RNA序列相比差异仅在于所述RNA序列中的核糖核苷酸被对应的脱氧核糖核苷酸替代，例如尿嘧啶核糖核苷酸(UMP)由胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dTMP)替代。
如本文中所使用的，术语“外源核酸”是指，人工引入的核苷酸序列，其相对于原始序列而言是外来的。外源核酸包括但不限于，未在所述病毒基因组中发现的任何基因或核苷酸序列。然而，在本发明中，特别优选地，所述外源核酸由至多1500个，例如至多1200个，至多1000个核苷酸组成。在某些情况下，优选地，外源核酸编码具有抗肿瘤杀伤活性的蛋白或多肽，例如细胞因子、或抗肿瘤蛋白或多肽；或者，外源核酸包含微小RNA(microRNA，miRNA)的靶序列。在本发明中，所述微小RNA优选为那些在肿瘤细胞中的表达量显著低于正常细胞和/或具有明显的组织特异性的微小RNA，其实例包括但不限于，肝组织特异性表达的miR-122，miR-192，miR-483等；胰腺组织特异性表达的miR216a/b、miR217和miR-375；心脏特异性表达的miR-1，miR-133a/b，miR-208等；肾组织特异性表达的miR-192，miR-196a/b，miR-204，miR-215等；肌肉组织特异性表达的miR-133a/b，miR-206等；脑组织特异性表达的miR-124a，miR-125a/b，miR-128a/b，miR-138等；以及在肝肿瘤组织内低表达的miR-34，miR-122a，miR-26a；在胰腺肿瘤组织内低表达的miR-107、miR-96和miR-196；在肾肿瘤组织内低表达的miR-34；在膀胱肿瘤组织内低表达的miR-143，miR-133a/b；在肺肿瘤组织内低表达的miR-Let-7，miR-29，等等(参见，例如，Ruiz A J and Russell S J.MicroRNAs andoncolytic viruses.[J].Curr Opin Virol,2015,13:40–48；其全部通过引用并入本文)。
在本发明中，当经修饰的CVB1包含上述微小RNA的靶序列时，其在该microRNA高表达或特异性表达的细胞/组织中，受到该microRNA的调控，从而可使该溶瘤病毒的复制减弱、甚至丧失杀伤活性，而在该microRNA低表达或不表达的肿瘤细胞/组织中则正常复制、正常杀伤肿瘤细胞。
如本文中所使用的，术语“细胞因子”具有本领域技术人员公知的含义。然而，在本发明中，当使用本发明的溶瘤病毒来治疗肿瘤时，特别优选地，所述细胞因子为能够用于肿瘤治疗的细胞因子。“细胞因子”的实例包括但不限于，白介素(例如IL-2、IL-12和IL-15)、干扰素(例如IFNα、IFNβ、IFNγ)、肿瘤坏死因子(例如TNFα)、集落刺激因子(例如GM-CSF)，及其任何组合(参见例如，Ardolino M,Hsu J,Raulet D H.Cytokine treatment incancer immunotherapy[J].Oncotarget,2015,6(23):19346-19347)。
如本文中所使用的，术语“抗肿瘤蛋白或多肽”是指，具有治疗肿瘤活性的蛋白或多肽，其包括但不限于：(1)对细胞具有毒性、可抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡的蛋白或多肽，其实例包括但不限于胸苷激酶TK(TK/GCV)、TRAIL和FasL(参见例如，Candolfi M,KingG D,Muhammad A G,et al.Evaluation of proapototic transgenes to use incombination with Flt3L in an immune-stimulatory gene therapy approach forGlioblastoma multiforme(GBM)[J].FASEB J,2008,22:1077.13)；(2)具有免疫治疗作用的蛋白或多肽，其实例包括但不限于抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(anti-CTLA-4)、抗程序性死亡受体1(anti-PD-1)的单链抗体(scFv)和抗程序性死亡配体1(anti-PDL-1)的单链抗体(scFv)(参见例如，Nolan E,Savas P,Policheni A N,et al.Combined immunecheckpoint blockade as a therapeutic strategy for BRCA1-mutated breast cancer[J].Science Trans Med,2017,9:eaal4922；其全部通过引用并入本文)；(3)抑制肿瘤血管生成的蛋白或多肽，其实例包括但不限于抗血管内皮生长因子(anti-VEGF)的单链抗体(scFv)、VEGF来源多肽(例如D(LPR)、KSVRGKGKGQKRKRKKSRYK等)和ATN-161(参见例如，Rosca E V，Koskimaki J E，Rivera C G，et al.Anti-angiogenic peptides for cancertherapeutics[J].Curr Pharm Biotechnol，2011,12(8):1101–1116；其全部通过引用并入本文)。
如本文中所使用的，术语“scFv”是指，包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个蛋白/多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个蛋白/多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“内部核糖体进入位点(IRES)”是指，一段位于信使RNA(mRNA)序列中的核苷酸序列，其能够起始翻译而不依赖于5'帽结构。IRES通常位于5'非翻译区(5'UTR)中，但也可能位于在mRNA的其他位置。
如本文中所使用的，术语“人鼻病毒2(HRV2)”是指，小RNA病毒科的一种病毒，其基因组序列或cDNA序列是本领域公知的，可参见各种公共数据库(例如，GenBank数据库登录号X02316.1)。
如本文中所使用的，表述“包含CVB1或其修饰形式的基因组序列的核酸分子”或“核酸分子包含CVB1或其修饰形式的基因组序列”具有本领域技术人员通常理解的含义，即当所述核酸分子为DNA时，所述核酸分子包含CVB1或其修饰形式的基因组序列的DNA表示形式；当所述核酸分子为RNA时，所述核酸分子包含CVB1或其修饰形式的基因组序列。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指，在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，离子强度增强剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，稀释剂，佐剂，防腐剂，稳定剂等。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性(例如溶瘤活性)，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。
如本文中所使用的，术语“治疗”是指，治疗或治愈疾病(例如肿瘤)，延缓疾病(例如肿瘤)的症状的发作，和/或延缓疾病(例如肿瘤)的发展。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指，可以有效实现预期目的的量。例如，治疗有效量可以是有效地或足以治疗或治愈疾病(例如肿瘤)，延缓疾病(例如肿瘤)症状的发作和/或延缓疾病(例如肿瘤)发展的量。这样的有效量可以由本领域技术人员或医生容易地确定，并且可以与预期目的(例如治疗)、受试者的一般健康状况、年龄、性别、体重、待治疗的疾病的严重程度、并发症、施用方式等相关。这样的有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有肿瘤，或者，具有患有肿瘤的风险。
本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，出人意料地发现，CVB1具有广谱、显著的肿瘤细胞杀伤能力。基于这一发现，本发明人开发了新的用于治疗肿瘤的溶瘤病毒以及基于该病毒的肿瘤治疗方法。
因此，在第一方面，本发明提供了柯萨奇病毒B组1型(CVB1)或其修饰形式或一种核酸分子，用于在受试者中治疗肿瘤的用途，或者用于制备在受试者中治疗肿瘤的药物的用途；其中，所述核酸分子包含选自下列的序列：
(1)CVB1或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列；和
(2)所述基因组序列或cDNA序列的互补序列。
在某些优选的实施方案中，所述CVB1为野生型CVB1。在某些优选的实施方案中，所述CVB1可以是从感染柯萨奇病毒B组1型的个体中分离得到的临床分离毒株。
在某些优选的实施方案中，所述CVB1或其修饰形式的基因组序列与如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在某些优选的实施方案中，所述CVB1或其修饰形式的基因组序列为如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述CVB1或其修饰形式的cDNA序列与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在某些优选的实施方案中，所述CVB1或其修饰形式的cDNA序列为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述修饰形式为经修饰的CVB1，其与野生型CVB1相比在基因组中具有一个或多个核苷酸的替换、插入或删除。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1与野生型CVB1相比，具有一个或多个选自下列的修饰：
(1)位于非翻译区(例如5’UTR或3’UTR)的一个或多个突变；
(2)一个或多个外源核酸的插入；
(3)一个或多个内源基因的缺失或突变；和
(4)上述三项的任意组合。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1包括位于5’非翻译区(5’UTR)的一个或多个突变。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1的5’UTR序列经全部或部分替换。在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1的5’UTR中的内部核糖体进入位点(IRES)序列替换为外源IRES序列，例如人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列。在某些优选的实施方案中，所述人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列如SEQ ID NO：2所示。
人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列的使用在某些情况下是有利的，例如有益于提高溶瘤病毒的肿瘤特异性。之前已报道，在正常人神经细胞中，人鼻病毒2的内部核糖体进入位点序列会被宿主RNA结合蛋白(DRBP76和NF45)特异结合，从而阻止了elF4G等因子的招募(Merrill等人，J Virol 2006,80(7):3147-3156；Merrill和Gromeier，JVirol 2006,80(14):6936-6942；Neplioueva等人，PLoS One 2010,5(7):e11710)；同时，由于缺乏Raf/Erk1/2/MAPK等信号通路的支持，核糖体难以结合到人鼻病毒2的内部核糖体进入位点序列上，因此无法启动病毒蛋白翻译(Dobrikov等人，Mol Cell Biol 2011,31(14):2947-2959；Dobrikov等人，Mol Cell Biol 2013,33(5):937-946)。在人神经胶质瘤肿瘤细胞中，人鼻病毒2的内部核糖体进入位点却不受以上两个因素影响，可正常启动病毒蛋白转录与翻译。因此，在某些情况下，将CVB1的内部核糖体进入位点序列替换为人鼻病毒2的内部核糖体进入位点序列有益于避免或减轻本发明所述病毒对正常人神经细胞产生毒副作用，而不影响该病毒用于人神经胶质瘤的治疗。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1包含外源核酸。
在某些优选的实施方案中，所述外源核酸编码细胞因子(例如GM-CSF，优选为人GM-CSF)、或抗肿瘤蛋白或多肽(例如，抗PD-1或PD-L1的scFv，优选为抗人PD-1或PD-L1的scFv)。在某些优选的实施方案中，所述外源核酸的插入位点位于所述经修饰的CVB1基因组的5’UTR与VP4基因之间，或者位于VP1基因与2A基因之间。
在某些优选的实施方案中，所述外源核酸包含微小RNA(microRNA,miRNA)(例如miR-133或miR-206)的靶序列。在某些优选的实施方案中，所述微小RNA的靶序列的插入位点在所述经修饰的CVB1基因组的3’非翻译区(3’UTR)。
之前已报道，某些微小RNA在肿瘤细胞中的表达量显著低于正常细胞和/或具有明显的组织特异性，因此在某些情况下，本发明的经修饰的CVB1包含这类微小RNA的靶序列是有利的，因为在正常细胞或组织内高表达的这类微小RNA可以通过对应的靶序列减少甚至阻断经修饰的CVB1在该正常细胞或组织内的复制，从而减轻甚至避免经修饰的CVB1对非肿瘤细胞的毒副作用。这类微小RNA包括但不限于miR-133、miR-206、miR-1、miR-143、miR-145、miR-217、let-7、miR-15、miR-16等(参见例如，PCT国际申请WO2008103755A1，美国专利申请US20160143969A1，或Baohong Zhang等人，Developmental Biology，Volume 302,Issue 1,1February 2007,Pages 1–12；其全部通过引用并入本文)。
在某些优选的实施方案中，所述外源核酸包括一个或多个(例如2个，3个或4个)如上所述的微小RNA的靶序列。在某些优选的实施方案中，所述外源核酸包含miR-133和/或miR-206的靶序列。在某些优选的实施方案中，所述miR-133的靶序列如SEQ ID NO:3所示。在某些优选的实施方案中，所述miR-206的靶序列如SEQ ID NO:4所示。在某些情况下，miR-133和/或miR-206的靶序列的插入是有利的。这是由于miR-133和miR-206在肌肉组织中特异性表达，因此通过将miR-133和/或miR-206的靶序列插入所述经修饰的CVB1中的方式可以改变该溶瘤病毒的组织嗜性，以减小或避免对正常肌肉组织的杀伤。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1包含至少一种如上所述的外源核酸的插入和/或至少一种如上所述的位于非翻译区的突变。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1的基因组序列与选自下列的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQID NO：13-16所示的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1的基因组序列选自如SEQ ID NO：13-16任一项所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1的cDNA序列与选自下列的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQID NO：8-11所示的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1的cDNA序列选自如SEQ ID NO：8-11任一项所示的核苷酸序列。
本发明的经修饰的CVB1可以通过反向遗传学技术获得，所述反向遗传学技术是本领域已知的，例如可参见Yang L S，Li S X，Liu Y J，et al.Virus Res，2015,210:165-168；Hou W H,Yang L S，Li S X，et al.Virus Res，2015,205:41-44；其全部通过引用并入本文。在此类实施方案中，通常对野生型CVB1的cDNA进行修饰(例如，外源核酸的插入、内源基因的缺失或突变或位于非翻译区的突变)从而获得经修饰的CVB1。
本发明的CVB1或其修饰形式可以经预处理以减少或消除受试者对该病毒的免疫反应，其中所述预处理可以包括：将所述CVB1包装在脂质体或胶束中，和/或使用蛋白酶(例如，糜蛋白酶或胰蛋白酶)去除病毒的衣壳蛋白以减小宿主对病毒的体液和/或细胞免疫。
在本发明中，可以将如本文所述的CVB1或其修饰形式在肿瘤细胞内连续适应性传代。在某些优选的实施方案中，所述肿瘤细胞可以为本领域已知的肿瘤细胞系或肿瘤细胞株，也可以为从患有肿瘤的个体(例如，受试者)体内经手术切除或临床分离而得到的肿瘤细胞。在某些优选的实施方案中，将所述CVB1或其修饰形式在获得自患有肿瘤的个体(例如，受试者)体内的肿瘤细胞内连续适应性传代。在某些优选的实施方案中，所述肿瘤细胞从患有肿瘤的个体(例如，受试者)体内经手术切除或临床分离而得到。在某些优选的实施方案中，所述连续适应性传代的方法包括多个(例如至少5个，至少10个，至少15个，至少20个)由下述过程所构成的周期：1)将病毒感染靶肿瘤细胞；2)收获上清中的病毒；和3)将获得的病毒重新感染新鲜靶肿瘤细胞。
在某些优选的实施方案中，可以组合使用如上所述的CVB1和其修饰形式。因此，所述药物可以包括CVB1以及其修饰形式中的一种或数种。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子由如本文所述的CVB1或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列组成。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子具有如本文所述的CVB1或其修饰形式的基因组序列。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子为RNA。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子具有如SEQ IDNO:12-16任一项所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子为包含如本文所述的CVB1或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子为包含如本文所述的CVB1或其修饰形式的cDNA序列，或所述cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含CVB1或其修饰形式的基因组序列的互补序列。在某些优选的实施方案中，所述互补序列与选自下列的核苷酸序列互补：
(1)如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；
(2)与如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列；
(3)如SEQ ID NO：13-16任一项所示的核苷酸序列；和
(4)与如SEQ ID NO：13-16任一项所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含CVB1或其修饰形式的cDNA序列的互补序列。在某些优选的实施方案中，所述互补序列与选自下列的核苷酸序列互补：
(1)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
(2)与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列；
(3)如SEQ ID NO：8-11任一项所示的核苷酸序列；和
(4)与如SEQ ID NO：8-11任一项所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列。
本发明的核酸分子可以通过本领域已知的任何方式进行递送，例如，直接注射裸露的核酸分子(例如，裸RNA)，或利用非病毒递送系统(non-viral delivery system)。所述非病毒递送系统可通过本领域熟知的各种材料制备获得，其中所述材料包括但不限于详细描述于“Yin H,et al.Nat Rev Genet.2014Aug；15(8):541-55.”以及“Riley MK,Vermerris W.Nanomaterials(Basel).2017Apr 28；7(5).pii:E94.”中的各种材料，其全部通过引用并入本文，例如脂质体、无机纳米粒子(如金纳米颗粒)、多聚物(如PEG)等等。
在某些优选的实施方案中，所述药物包含治疗有效量的CVB1和/或其修饰形式，或治疗有效量的如本文所述的核酸分子。在某些优选的实施方案中，所述药物可以为医学领域已知的任何形式。例如，所述药物可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)等形式。在一些实施方案中，所述药物为注射液或冻干粉剂。
在某些优选的实施方案中，所述药物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。在某些优选的实施方案中，所述药物包含稳定剂。
在某些优选的实施方案中，所述药物任选地还包含另外的药学活性剂。在一个优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如另外的溶瘤病毒、化学治疗剂或免疫治疗剂。
在本发明中，所述另外的溶瘤病毒包括但不限于疱疹病毒、腺病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、麻疹病毒或其任意组合。所述化学治疗剂包括但不限于5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、甲氨蝶呤、羟基脲、环磷酰胺、达卡巴嗪、米托蒽醌、蒽环类(如表柔比星或多柔比星)、依托泊苷、铂类化合物(如卡铂或顺铂)、紫杉烷类(如紫杉醇或紫杉特尔)或其任意组合。所述免疫治疗剂包括但不限于免疫卡控点抑制剂(如PD-L1/PD-1抑制剂或CTLA-4抑制剂)、肿瘤特异性靶向抗体(如利妥昔单抗或赫赛汀)或其任意组合。
在某些优选的实施方案中，所述药物包含单位剂量的CVB1和/或其修饰形式，例如包含至少1x102pfu、至少1x103pfu、至少1x104pfu、1x105pfu、1x106pfu、至少1x107pfu、至少1x108pfu、至少1x109pfu、至少1x1010pfu、至少1x1011pfu、至少1x1012pfu、至少1x1013pfu、至少1x1014pfu或至少1x1016pfu的CVB1和/或其修饰形式。在某些优选的实施方案中，所述药物包含1x102pfu～1x1017pfu的CVB1和/或其修饰形式。
在某些优选的实施方案中，所述药物含有单位剂量的如本文所述的核酸分子，例如含有3×1010～3×1014病毒基因组拷贝数(virus genome copies)的所述核酸分子。
在某些优选的实施方案中，可以将所述药物与额外的疗法一起施用。这种额外的疗法可以是已知用于肿瘤的任何疗法，例如手术、化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗或基因治疗。这种额外的疗法可以在施用所述药物之前、同时或之后施用。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤选自结直肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、淋巴瘤、成骨肉瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、舌癌、鼻咽癌、鼻中隔鳞状细胞癌、咽鳞癌、颌下腺鳞癌、喉癌、甲状腺癌、甲状腺导管癌和膀胱癌。
在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
在第二方面，本发明提供了一种治疗肿瘤的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的CVB1或其修饰形式，或有效量的核酸分子的步骤；其中，所述核酸分子包含选自下列的序列：
(1)CVB1或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列；和
(2)所述基因组序列或cDNA序列的互补序列。
在某些优选的实施方案中，向所述受试者施用CVB1。在某些优选的实施方案中，所述CVB1为野生型CVB1。在某些优选的实施方案中，所述CVB1可以是从感染柯萨奇病毒B组1型的个体中分离得到的临床分离毒株。
在某些优选的实施方案中，所述CVB1或其修饰形式的基因组序列与如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在某些优选的实施方案中，所述CVB1或其修饰形式的基因组序列为如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述CVB1或其修饰形式的cDNA序列与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在某些优选的实施方案中，所述CVB1或其修饰形式的cDNA序列为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，向所述受试者施用CVB1的修饰形式。在某些优选的实施方案中，所述修饰形式为经修饰的CVB1，其与野生型CVB1相比在基因组中具有一个或多个核苷酸的替换、插入或删除。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1与野生型CVB1相比，具有一个或多个选自下列的修饰：
(1)位于非翻译区(例如，5’UTR或3’UTR)的一个或多个突变；
(2)一个或多个外源核酸的插入；
(3)一个或多个内源基因的缺失或突变；和
(4)上述三项的任意组合。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1包括位于5’非翻译区(5’UTR)的一个或多个突变。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1的5’UTR序列经全部或部分替换。在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1的5’UTR中的内部核糖体进入位点(IRES)序列替换为外源IRES序列，例如人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列。在某些优选的实施方案中，所述人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列如SEQ ID NO：2所示。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1包含外源核酸。
在某些优选的实施方案中，所述外源核酸编码细胞因子(例如GM-CSF，优选为人GM-CSF)、或抗肿瘤蛋白或多肽(例如抗PD-1或PD-L1的scFv，优选为抗人PD-1或PD-L1的scFv)。在某些优选的实施方案中，所述外源核酸的插入位点位于所述经修饰的CVB1基因组的5’UTR与VP4基因之间，或者位于VP1基因与2A基因之间。
在某些优选的实施方案中，所述外源核酸包含微小RNA(microRNA,miRNA)(例如miR-133或miR-206)的靶序列。在某些优选的实施方案中，所述微小RNA的靶序列的插入位点在所述经修饰的CVB1基因组的3’非翻译区(3’UTR)。
在某些优选的实施方案中，所述外源核酸包括一个或多个(例如2个，3个或4个)如上所述的微小RNA的靶序列。在某些优选的实施方案中，所述外源核酸包含miR-133和/或miR-206的靶序列。在某些优选的实施方案中，所述miR-133的靶序列如SEQ ID NO:3所示。在某些优选的实施方案中，所述miR-206的靶序列如SEQ ID NO:4所示。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1包含至少一种如上所述的外源核酸的插入和/或至少一种如上所述的位于非翻译区的突变。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1的基因组序列与选自下列的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQID NO：13-16所示的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1的基因组序列选自如SEQ ID NO：13-16任一项所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1的cDNA序列与选自下列的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQID NO：8-11所示的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1的cDNA序列选自如SEQ ID NO：8-11任一项所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，可以组合使用如上所述的CVB1和其修饰形式。因此，可以向受试者施用CVB1以及其修饰形式中的一种或多种。
在某些优选的实施方案中，向所述受试者施用如本文所述的核酸分子。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子由如本文所述的CVB1或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列组成。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子具有如本文所述的CVB1或其修饰形式的基因组序列。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子为RNA。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子具有如SEQ IDNO:12-16任一项所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子为包含如本文所述的CVB1或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子为包含如本文所述的CVB1或其修饰形式的cDNA序列，或所述cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含CVB1或其修饰形式的基因组序列的互补序列。在某些优选的实施方案中，所述互补序列与选自下列的核苷酸序列互补：
(1)如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；
(2)与如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列；
(3)如SEQ ID NO：13-16任一项所示的核苷酸序列；和
(4)与如SEQ ID NO：13-16任一项所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含CVB1或其修饰形式的cDNA序列的互补序列。在某些优选的实施方案中，所述互补序列与选自下列的核苷酸序列互补：
(1)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
(2)与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列；
(3)如SEQ ID NO：8-11任一项所示的核苷酸序列；和
(4)与如SEQ ID NO：8-11任一项所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列。
在本发明中，可以通过本领域已知的任何方式递送如本文所述的核酸分子，例如，直接注射裸露的核酸分子(例如，裸RNA)，或利用非病毒递送系统(non-viral deliverysystem)。所述非病毒递送系统可通过本领域熟知的各种材料制备获得，其中所述材料包括但不限于详细描述于“Yin H,et al.Nat Rev Genet.2014Aug；15(8):541-55.”以及“RileyMK,Vermerris W.Nanomaterials(Basel).2017Apr 28；7(5).pii:E94.”中的各种纳米材料，其全部通过引用并入本文，例如脂质体、无机纳米粒子(如金纳米颗粒)、多聚物(如PEG)等等。
在某些优选的实施方案中，可以将CVB1和/或其修饰形式，或如本文所述的核酸分子，作为药物组合物进行配制和施用。这样的药物组合物可包含治疗有效量的CVB1和/或其修饰形式，或治疗有效量的如本文所述的核酸分子。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物可以是医学领域已知的任何形式。例如，所述药物组合物可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)等形式。在一些实施方案中，所述药物组合物为注射液或冻干粉剂。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物包含稳定剂。
在本发明中可以通过各种合适的方式，向受试者施用CVB1和/或其修饰形式，或如本文所述的核酸分子。在某些情况下，CVB1和/或其修饰形式，或如本文所述的核酸分子的施用方式取决于肿瘤的位置和类型。例如，对于容易接近的实体肿瘤，任选地通过直接向肿瘤注射(例如，瘤内注射)来施用该病毒或核酸分子；对于造血系统的肿瘤，可以通过静脉内或其他血管内途径施用该病毒或核酸分子；对于体内不容易接近的肿瘤(例如转移瘤)，可以系统地施用该病毒或核酸分子以使其遍布全身并由此到达肿瘤(例如，静脉内或肌肉内注射)。任选地，可以经皮下、腹膜内、鞘内(例如对于脑部肿瘤)、局部(例如对于黑素瘤)、口服(例如对于口腔或食道癌)、经鼻或通过吸入喷雾(例如对于肺癌)等途径施用本发明的病毒或核酸分子。在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的CVB1和/或其修饰形式，或如本文所述的核酸分子。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括施用具有抗肿瘤活性的另外的药学活性剂。这种另外的药学活性剂可以在施用CVB1和/或其修饰形式，或如本文所述的核酸分子之前、同时或之后施用。
在某些优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂包括另外的溶瘤病毒、化学治疗剂或免疫治疗剂。
在本发明中，所述另外的溶瘤病毒包括但不限于疱疹病毒、腺病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、麻疹病毒或其任意组合。所述化学治疗剂包括但不限于5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、甲氨蝶呤、羟基脲、环磷酰胺、达卡巴嗪、米托蒽醌、蒽环类(如表柔比星或多柔比星)、依托泊苷、铂类化合物(如卡铂或顺铂)、紫杉烷类(如紫杉醇或紫杉特尔)或其任意组合。所述免疫治疗剂包括但不限于免疫卡控点抑制剂(如PD-L1/PD-1抑制剂或CTLA-4抑制剂)、肿瘤特异性靶向抗体(如利妥昔单抗或赫赛汀)或其任意组合。
在某些优选的实施方案中，可以以1～1x1015pfu/kg受试者体重的任何量施用CVB1和/或其修饰形式，例如以至少1x103pfu/kg、至少1x104pfu/kg、1x105pfu/kg、1x106pfu/kg、至少1x107pfu/kg、至少1x108pfu/kg、至少1x109pfu/kg、至少1x1010pfu/kg、至少1x1011pfu/kg或至少1x1012pfu/kg受试者体重的量施用CVB1和/或其修饰形式。在某些优选的实施方案中，可以以3×1010～3×1014病毒基因组拷贝数(virus genome copies)/kg受试者体重的任何量施用如本文所述的核酸分子。在某些优选的实施方案中，可以以每日3次、每日2次、每日1次、每两日1次或每周1次的方式施用CVB1和/或其修饰形式，或如本文所述的核酸分子，任选地酌情每周或每月重复如上所述的给药方案。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括施用额外的疗法。这种额外的疗法可以是已知用于肿瘤的任何疗法，例如手术、化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗或基因治疗。这种额外的疗法可以在施用如上所述的方法之前、同时或之后施用。
在某些优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤选自结直肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、淋巴瘤、成骨肉瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、舌癌、鼻咽癌、鼻中隔鳞状细胞癌、咽鳞癌、颌下腺鳞癌、喉癌、甲状腺癌、甲状腺导管癌和膀胱癌。
在第三方面，本发明还涉及一种药物组合物，其包含如在第一方面或第二方面中所定义的CVB1和/或其修饰形式，或如在第一方面或第二方面中所定义的核酸分子。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物可以为医学领域已知的任何形式。例如，所述药物组合物可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)等形式。在一些实施方案中，所述药物组合物为注射液或冻干粉剂。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物包含稳定剂。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物任选地还包含另外的药学活性剂。在一个优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如另外的溶瘤病毒、化学治疗剂或免疫治疗剂。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物用于在受试者中治疗肿瘤。
在某些优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤选自结直肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、淋巴瘤、成骨肉瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、舌癌、鼻咽癌、鼻中隔鳞状细胞癌、咽鳞癌、颌下腺鳞癌、喉癌、甲状腺癌、甲状腺导管癌和膀胱癌。
在第四方面，本发明还涉及如在第一方面或第二方面中所定义的CVB1和/或其修饰形式，或如在第一方面或第二方面中所定义的核酸分子，其用作药物。
在第五方面，本发明提供了一种经修饰的CVB1，其与野生型CVB1相比，5’UTR中的内部核糖体进入位点(IRES)序列替换为人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列。
在某些优选的实施方案中，所述人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列如SEQ ID NO：2所示。
在某些优选的实施方案中，所述野生型CVB1的基因组序列与如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在某些优选的实施方案中，所述野生型CVB1的基因组序列为如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述野生型CVB1的cDNA序列与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在某些优选的实施方案中，所述野生型CVB1的cDNA序列为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1还包含外源核酸。
在某些优选的实施方案中，所述外源核酸编码细胞因子(例如GM-CSF，优选为人GM-CSF)、或抗肿瘤蛋白或多肽(例如，抗PD-1或PD-L1的scFv，优选为抗人PD-1或PD-L1的scFv)。在某些优选的实施方案中，所述外源核酸的插入位点位于所述经修饰的CVB1基因组的5’UTR与VP4基因之间，或者位于VP1基因与2A基因之间。
在某些优选的实施方案中，所述外源核酸包含微小RNA(microRNA,miRNA)(例如miR-133或miR-206)的靶序列。在某些优选的实施方案中，所述微小RNA的靶序列的插入位点在所述经修饰的CVB1基因组的3’非翻译区(3’UTR)。
在某些优选的实施方案中，所述外源核酸包括一个或多个(例如2个，3个或4个)如上所述的微小RNA的靶序列。在某些优选的实施方案中，所述外源核酸包含miR-133和/或miR-206的靶序列。在某些优选的实施方案中，所述miR-133的靶序列如SEQ ID NO:3所示。在某些优选的实施方案中，所述miR-206的靶序列如SEQ ID NO:4所示。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1包含至少一种如上所述的外源核酸的插入。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1的基因组序列与如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1的基因组序列为如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1的cDNA序列与如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1的cDNA序列为如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的CVB1用于在受试者中治疗肿瘤，或者用于制备在受试者中治疗肿瘤的药物。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤选自结直肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、淋巴瘤、成骨肉瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、舌癌、鼻咽癌、鼻中隔鳞状细胞癌、咽鳞癌、颌下腺鳞癌、喉癌、甲状腺癌、甲状腺导管癌和膀胱癌。在某些优选的实施方案中，所述肿瘤为甲状腺癌。
在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
在第六方面，本发明提供了一种核酸分子，其包含选自下列的序列：
(1)如第五方面所述的经修饰的CVB1的基因组序列或cDNA序列；和
(2)所述基因组序列或cDNA序列的互补序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子由如上所述的经修饰的CVB1的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列组成。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子具有如上所述的经修饰的CVB1的基因组序列。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子为RNA。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子为包含如上所述的经修饰的CVB1的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子为包含如上所述的经修饰的CVB1的cDNA序列，或所述cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含如上所述的经修饰的CVB1的基因组序列的互补序列。在某些优选的实施方案中，所述互补序列与选自下列的核苷酸序列互补：
(1)如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；和
(2)与如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含如上所述的经修饰的CVB1的cDNA序列的互补序列。在某些优选的实施方案中，所述互补序列与选自下列的核苷酸序列互补：
(1)如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；和
(2)与如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子用于在受试者中治疗肿瘤，或者用于制备在受试者中治疗肿瘤的药物。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤选自结直肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、淋巴瘤、成骨肉瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、舌癌、鼻咽癌、鼻中隔鳞状细胞癌、咽鳞癌、颌下腺鳞癌、喉癌、甲状腺癌、甲状腺导管癌和膀胱癌。在某些优选的实施方案中，所述肿瘤为甲状腺癌。
在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
在第七方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含如第五方面所述的经修饰的CVB1，或如第六方面所述的核酸分子。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物可以为医学领域已知的任何形式。例如，所述药物组合物可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)等形式。在一些实施方案中，所述药物组合物为注射液或冻干粉剂。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物包含稳定剂。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物任选地还包含另外的药学活性剂。在一个优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如另外的溶瘤病毒、化学治疗剂或免疫治疗剂。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物用于在受试者中治疗肿瘤。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤选自结直肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、淋巴瘤、成骨肉瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、舌癌、鼻咽癌、鼻中隔鳞状细胞癌、咽鳞癌、颌下腺鳞癌、喉癌、甲状腺癌、甲状腺导管癌和膀胱癌。在某些优选的实施方案中，所述肿瘤为甲状腺癌。
在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
在第八方面，本发明还涉及如第五方面所述的经修饰的CVB1，或如第六方面所述的核酸分子，用于在受试者中治疗肿瘤的用途，或者用于制备在受试者中治疗肿瘤的药物的用途。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤选自结直肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、淋巴瘤、成骨肉瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、舌癌、鼻咽癌、鼻中隔鳞状细胞癌、咽鳞癌、颌下腺鳞癌、喉癌、甲状腺癌、甲状腺导管癌和膀胱癌。在某些优选的实施方案中，所述肿瘤为甲状腺癌。
在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
在第九方面，本发明还涉及一种治疗肿瘤的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的如第五方面所述的经修饰的CVB1，或有效量的如第六方面所述的核酸分子的步骤。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤选自结直肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、淋巴瘤、成骨肉瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、舌癌、鼻咽癌、鼻中隔鳞状细胞癌、咽鳞癌、颌下腺鳞癌、喉癌、甲状腺癌、甲状腺导管癌和膀胱癌。在某些优选的实施方案中，所述肿瘤为甲状腺癌。
在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
本发明还包含以下示例性实施方案：
1.柯萨奇病毒B组1型(CVB1)或其修饰形式或一种核酸分子，用于在受试者中治疗肿瘤的用途，或者用于制备在受试者中治疗肿瘤的药物的用途；其中，所述核酸分子包含选自下列的序列：
(1)CVB1或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列；和
(2)所述基因组序列或cDNA序列的互补序列。
2.项目1的用途，其中，所述CVB1为野生型CVB1；
优选地，所述CVB1是从感染柯萨奇病毒B组1型的个体中分离得到的临床分离毒株；
优选地，所述CVB1或其修饰形式的基因组序列与如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；更优选地，所述CVB1或其修饰形式的基因组序列为如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；
优选地，所述CVB1或其修饰形式的cDNA序列与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；更优选地，所述CVB1或其修饰形式的cDNA序列为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
3.项目1或2的用途，其中，所述修饰形式为经修饰的CVB1，其与野生型CVB1相比在基因组中具有一个或多个核苷酸的替换、插入或删除；
优选地，所述经修饰的CVB1与野生型CVB1相比，具有一个或多个选自下列的修饰：
(1)位于非翻译区(例如5’UTR或3’UTR)的一个或多个突变；
(2)一个或多个外源核酸的插入；
(3)一个或多个内源基因的缺失或突变；和
(4)上述三项的任意组合。
4.项目3的用途，其中，所述经修饰的CVB1包括位于5’非翻译区(5’UTR)的一个或多个突变；
优选地，所述经修饰的CVB1的5’UTR序列经全部或部分替换；
优选地，所述经修饰的CVB1的5’UTR中的内部核糖体进入位点(IRES)序列替换为外源IRES序列，例如人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列；
优选地，所述人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列如SEQ ID NO：2所示。
5.项目3或4的用途，其中，所述经修饰的CVB1包含外源核酸；
优选地，所述外源核酸编码细胞因子(例如GM-CSF，优选为人GM-CSF)、或抗肿瘤蛋白或多肽(例如，抗PD-1或PD-L1的scFv，优选为抗人PD-1或PD-L1的scFv)；
优选地，所述外源核酸的插入位点位于所述经修饰的CVB1基因组的5’UTR与VP4基因之间，或者位于VP1基因与2A基因之间；
优选地，所述外源核酸包含一个或多个(例如2个，3个或4个)微小RNA的靶序列；
优选地，所述微小RNA的靶序列的插入位点在所述经修饰的CVB1基因组的3’非翻译区(3’UTR)；
优选地，所述外源核酸包含miR-133和/或miR-206的靶序列；
优选地，所述miR-133的靶序列如SEQ ID NO:3所示；
优选地，所述miR-206的靶序列如SEQ ID NO:4所示。
6.项目3-5任一项的用途，其中，所述经修饰的CVB1包含至少一种如项目5中所定义的外源核酸的插入和/或至少一种如项目4中所定义的位于非翻译区的突变。
7.项目3-6任一项的用途，其中，所述经修饰的CVB1具有以下特征中的一项：
(1)所述经修饰的CVB1的基因组序列与选自下列的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQ ID NO：13-16所示的核苷酸序列；优选地，所述经修饰的CVB1的基因组序列选自如SEQ ID NO：13-16任一项所示的核苷酸序列；和
2)所述经修饰的CVB1的cDNA序列与选自下列的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQ ID NO：8-11所示的核苷酸序列；优选地，所述经修饰的CVB1的cDNA序列选自如SEQ ID NO：8-11任一项所示的核苷酸序列。
8.项目1-7任一项的用途，其中，所述药物包括CVB1以及其修饰形式中的一种或数种。
9.项目1-8任一项的用途，其中，所述核酸分子由所述CVB1或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列组成；
优选地，所述核酸分子具有所述CVB1或其修饰形式的基因组序列；
优选地，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:12-16任一项所示的核苷酸序列。
10.项目1-8任一项的用途，其中，所述核酸分子为包含所述CVB1或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)；
优选地，所述核酸分子为包含所述CVB1或其修饰形式的cDNA序列，或所述cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。
11.项目1-10任一项的用途，其中，所述药物包含治疗有效量的所述CVB1和/或其修饰形式，或治疗有效量的所述核酸分子。
12.项目1-11任一项的用途，其中，所述药物还包含具有抗肿瘤活性的另外的药学活性剂，例如另外的溶瘤病毒、化学治疗剂或免疫治疗剂；
优选地，所述另外的溶瘤病毒选自疱疹病毒、腺病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、麻疹病毒或其任意组合；
优选地，所述化学治疗剂选自5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、甲氨蝶呤、羟基脲、环磷酰胺、达卡巴嗪、米托蒽醌、蒽环类(如表柔比星或多柔比星)、依托泊苷、铂类化合物(如卡铂或顺铂)、紫杉烷类(如紫杉醇或紫杉特尔)或其任意组合；
优选地，所述免疫治疗剂选自免疫卡控点抑制剂(如PD-L1/PD-1抑制剂或CTLA-4抑制剂)、肿瘤特异性靶向抗体(如利妥昔单抗或赫赛汀)或其任意组合。
13.项目1-12任一项的用途，其中，所述肿瘤选自结直肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、淋巴瘤、成骨肉瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、舌癌、鼻咽癌、鼻中隔鳞状细胞癌、咽鳞癌、颌下腺鳞癌、喉癌、甲状腺癌、甲状腺导管癌和膀胱癌。
14.项目1-13任一项的用途，其中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
15.一种经修饰的CVB1，其与野生型CVB1相比，5’UTR中的内部核糖体进入位点(IRES)序列替换为人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列。
16.项目15的经修饰的CVB1，其中，所述经修饰的CVB1具有以下特征中的至少一项：
1)所述人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列如SEQ ID NO：2所示；
2)所述野生型CVB1的基因组序列与如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；优选地，所述野生型CVB1的基因组序列为如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；
3)所述野生型CVB1的cDNA序列与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；优选地，所述野生型CVB1的cDNA序列为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
17.项目15或16的经修饰的CVB1，其中，所述经修饰的CVB1还包含外源核酸；
优选地，所述外源核酸编码细胞因子(例如GM-CSF，优选为人GM-CSF)、或抗肿瘤蛋白或多肽(例如，抗PD-1或PD-L1的scFv，优选为抗人PD-1或PD-L1的scFv)；
优选地，所述外源核酸的插入位点位于所述经修饰的CVB1基因组的5’UTR与VP4基因之间，或者位于VP1基因与2A基因之间；
优选地，所述外源核酸包含一个或多个(例如2个，3个或4个)微小RNA的靶序列；
优选地，所述微小RNA的靶序列的插入位点在所述经修饰的CVB1基因组的3’非翻译区(3’UTR)；
优选地，所述外源核酸包含miR-133和/或miR-206的靶序列；
优选地，所述miR-133的靶序列如SEQ ID NO:3所示；
优选地，所述miR-206的靶序列如SEQ ID NO:4所示。
18.项目15-17任一项的经修饰的CVB1，其中，所述经修饰的CVB1具有以下特征中的一项：
1)所述经修饰的CVB1的基因组序列与如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；优选地，所述经修饰的CVB1的基因组序列为如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；
2)所述经修饰的CVB1的cDNA序列与如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；优选地，所述经修饰的CVB1的cDNA序列为如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
19.一种核酸分子，其包含选自下列的序列：
(1)项目15-18任一项所述的经修饰的CVB1的基因组序列或cDNA序列；和
(2)所述基因组序列或cDNA序列的互补序列。
20.项目19的核酸分子，其中，所述核酸分子由所述经修饰的CVB1的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列组成；
优选地，所述核酸分子具有所述经修饰的CVB1的基因组序列；
优选地，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
21.项目19的核酸分子，其中，所述核酸分子为包含所述经修饰的CVB1的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)；
优选地，所述核酸分子为包含所述经修饰的CVB1的cDNA序列，或所述cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。
发明的有益效果
与现有技术相比，本发明的技术方案至少具有以下有益效果：
本申请的发明人首次发现，CVB1具有广谱肿瘤杀伤活性。基于这一发现，本发明进一步提供了基于CVB1的溶瘤病毒，其具有更高的肿瘤杀伤活性以及肿瘤特异性，可单独用于肿瘤的治疗，亦可用作传统肿瘤治疗的辅助方法，或作为缺少其他治疗方法时的治疗手段。
本发明的CVB1或其修饰形式对正常细胞影响较小或无影响，可安全地施用给受试者(例如人)。因此，本发明的CVB1或其修饰形式具有重大的临床价值。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1A-1D分别显示了实施例2中野生型CVB1对人胰腺导管上皮细胞系hTERT-HPNE、人鼻咽癌细胞系CNE、人肝癌细胞系HepG2、人子宫内膜癌细胞系Ishikawa、人乳腺癌细胞系BT-474、人非小细胞肺癌细胞系EBC-1、人喉癌细胞系HEp-2、人舌癌细胞系SCC-25、人结直肠癌细胞系HT-29、人卵巢癌细胞系A2780、人胰腺癌细胞系AsPC-1和人前列腺癌细胞系DU145的体外杀伤实验结果的显微镜照片，其中，MOCK表示未感染病毒的细胞。结果显示，在感染复数(MOI)为1感染72小时后，CVB1对人肿瘤细胞系CNE、HepG2、Ishikawa、BT-474、EBC-1、HEp-2、SCC-25、HT-29、A2780、AsPC-1和DU145均有显著的溶瘤作用，但对人非肿瘤细胞的hTERT-HPNE无任何影响。
图2显示了实施例2中通过体外转录方法获得的1份野生型CVB1病毒基因组RNA样品的电泳图。
图3显示了实施例2中野生型CVB1病毒基因组RNA对人宫颈癌细胞系Hela的杀伤效果。结果显示，转染CVB1基因组RNA的Hela细胞在转染后48小时几乎全部裂解死亡。
图4A-4I分别显示了本发明实施例3中野生型CVB1对人乳腺癌细胞系BcaP37(A)、人非小细胞肺癌细胞系A549(B)和SPC-A-1(C)、人Burkitt's淋巴瘤细胞系Raji(D)、人子宫内膜癌细胞系Ishikawa(E)和HEC-1-B(F)、人宫颈癌细胞系Hela(G)和C-33A(H)，以及人神经胶质瘤细胞系GBM(I)的体内抗肿瘤实验结果。结果显示，在攻毒实验组中，每隔2天瘤内注射106TCID50/每瘤块的CVB1，共计5次后，分别皮下接种了BcaP37、A549、SPC-A-1、Raji、Ishikawa、HEC-1-B、Hela、C-33A或GBM细胞的SCID小鼠所形成的肿瘤的生长明显变慢、停滞，甚至裂解消失；相比之下，未经溶瘤病毒治疗的阴性组(CTRL)的肿瘤则保持正常生长，其肿瘤体积显著大于攻毒实验组。
图5显示了实施例3中CVB1-WT、CVB1-HRV2、CVB1-miR133&206T、CVB1-GM-CSF和CVB1-Anti-PD-1对人神经胶质瘤细胞系GBM的体内抗肿瘤实验结果。结果显示，在攻毒实验组中，每隔2天瘤内注射106TCID50/每瘤块的CVB1或其修饰形式，共5针，在处理10天后，皮下接种了GBM细胞的SCID小鼠所形成的肿瘤生长停滞至裂解消失；相比之下，未经溶瘤病毒治疗的阴性组(CTRL)肿瘤则保持正常生长，其肿瘤体积显著大于攻毒实验组。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
SEQ ID NO: 描述
1 野生型CVB1(CVB1-WT)的cDNA序列
2 人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列的RNA序列
3 miR-133靶序列的RNA序列
4 miR-206靶序列的RNA序列
5 miR-133靶序列与miR-206靶序列的串联序列的RNA序列
6 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因DNA序列
7 抗人程序性死亡受体1单链抗体(Anti-PD-1scFv)DNA序列
8 CVB1的修饰形式(CVB1-HRV2)的cDNA序列
9 CVB1的修饰形式(CVB1-miR133&206T)的cDNA序列
10 CVB1的修饰形式(CVB1-GM-CSF)的cDNA序列
11 CVB1的修饰形式(CVB1-Anti-PD1)的cDNA序列
12 野生型CVB1(CVB1-WT)的基因组序列
13 CVB1的修饰形式(CVB1-HRV2)的基因组序列
14 CVB1的修饰形式(CVB1-miR133&206T)的基因组序列
15 CVB1的修饰形式(CVB1-GM-CSF)的基因组序列
16 CVB1的修饰形式(CVB1-Anti-PD1)的基因组序列
17 miR-133靶序列的DNA序列
18 miR-206靶序列的DNA序列
19 miR-133靶序列与miR-206靶序列的串联序列的DNA序列
20 人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列的DNA序列
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1：CVB1及其修饰形式的获得及制备
1.1从患者临床标本中分离肠道病毒CVB1
(1)患者的咽拭子和肛拭子来源于中国，厦门市疾病预防与控制中心；非洲绿猴肾细胞(Vero细胞； Number:CCL-81TM)由中国，厦门大学，国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心保存，使用添加有10％胎牛血清、谷氨酰胺、青霉素和链霉素的MEM培养基进行培养。
(2)标本处理：将患者咽拭子和肛拭子在标本保存液中充分搅动，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，随后将标本保存液在4℃条件下4000rpm高速离心30min；
(3)接种与观察：
A.将Vero细胞铺24孔板，每孔细胞数量为1×105个，吸去生长液(MEM培养基，10％胎牛血清以及谷氨酰胺、青霉素和链霉素)，每孔换上1mL的维持液(MEM培养基，2％胎牛血清以及谷氨酰胺、青霉素和链霉素)，随后除了阴性对照孔，每孔接种50μL的标本上清液，37℃，5％CO2培养箱培养；
B.一周内每天在显微镜下观察细胞，记录接种孔内是否有特征性的细胞病变效应(CPE)的出现；
C.若7天内接种孔细胞出现肠道病毒特征性CPE时，收集细胞及上清至-80℃冻存；若7天后仍无CPE出现，将细胞进行盲传；
D.盲传6代内出现细胞CPE的，收集细胞及上清至-80℃冻存；盲传6代后仍未出现CPE的，判定为阴性；
(4)病毒的分离与克隆化：
使用RT-PCR(Hou等人，Virus Res 2015,205:41-44)与基于特异性抗体的酶联免疫斑点法(ELISPOT)(Yang等人.Clin Vaccine Immunol2014,21(3):312-320)鉴定从临床标本中分离获得的病毒，选取柯萨奇病毒B组1型阳性的培养物进行至少3次克隆化实验；对每一轮由有限稀释法获得的克隆毒株同样使用RT-PCR与ELISPOT鉴定，选取柯萨奇病毒B组1型阳性的克隆毒株后进行下一轮克隆化；挑选生长活力强的柯萨奇病毒B组1型单一毒株作为溶瘤病毒候选毒株。
1.2基于感染性克隆与反向遗传学技术获得CVB1及其修饰形式的拯救毒株
本实施例以野生型CVB1(SEQ ID NO:1)为示例，展示如何通过反向遗传学技术获得用于本发明的CVB1及其修饰形式，具体方法如下所述。
(1)病毒感染性克隆构建：野生型CVB1(命名为CVB1-WT)的cDNA序列见SEQ ID NO:1，其基因组RNA序列为SEQ ID NO:12；或者在野生型CVB1的cDNA(SEQ ID NO:1)的基础上做基因插入或替换改造，包括：
修饰形式1：将野生型CVB1的内部核糖体进入位点序列替换为人鼻病毒2的内部核糖体进入位点序列(其DNA序列见SEQ ID NO:20)，从而获得重组病毒(命名为CVB1-HRV2)的cDNA(SEQ ID NO:8)，其基因组RNA序列为SEQ ID NO:13；
修饰形式2：将miR-133靶序列(其DNA序列见SEQ ID NO:17)和miR-206靶序列(其DNA序列见SEQ ID NO:18)的串联序列(其DNA序列见SEQ ID NO:19)插入到野生型CVB1的cDNA(SEQ ID NO:1)的3’非翻译区7303-7304bp之间，从而获得重组病毒(命名为CVB1-miR133&206T)的cDNA(SEQ ID NO:9)，其基因组RNA序列为SEQ ID NO:14；
修饰形式3：将人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因(SEQ ID NO:6)插入到野生型CVB1的cDNA(SEQ ID NO:1)的VP1与2A基因之间，从而获得重组病毒(命名为CVB1-GM-CSF)的cDNA(SEQ ID NO:10)，其基因组RNA序列为SEQ ID NO:15；
修饰形式4：将编码抗人程序性死亡受体1单链抗体(Anti-PD-1scFv)的序列(SEQID NO:7)插入到野生型CVB1的cDNA(SEQ ID NO:1)的VP1与2A基因之间，从而获得该重组病毒(命名为CVB1-Anti-PD-1)的cDNA(SEQ ID NO:11)，其基因组RNA序列为SEQ ID NO:16。
然后将上述五种溶瘤病毒的cDNA序列(SEQ ID NO:1,8-11)送到基因合成公司(上海生工生物工程股份有限公司)进行全基因合成，并连接进入pSVA质粒(Hou等人，VirusRes 2015,205:41-44)，获得CVB1或其修饰形式(即，CVB1-WT、CVB1-HRV2、CVB1-miR133&206T、CVB1-GM-CSF和CVB1-Anti-PD-1)的感染性克隆质粒。
(2)质粒小提试剂盒和E coli.DH5α感受态购自北京天根生化科技有限公司；Hela细胞( Number:CCL-2TM)和人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞；/> Number:CCL-136TM)由中国，厦门大学，国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心保存，分别用DMEM和MEM培养基、加10％胎牛血清以及谷氨酰胺、青霉素和链霉素培养；转染试剂Lipofactamine2000和Opti-MEM购自Thermo Fisher Scientific公司。
(3)将分别包含上述五种溶瘤病毒cDNA序列的感染性克隆质粒转化进入Ecoli.DH5α感受态，待克隆长出后直接挑取单克隆菌株摇菌后用质粒小提试剂盒提取质粒，随后送公司(上海生工生物工程股份有限公司)进行测序分析；
(4)将测序正确的感染性克隆质粒与辅助质粒pAR3126共转染细胞拯救病毒(Hou等人，Virus Res 2015,205:41-44)。首先转染Hela细胞，具体操作方法参见转染试剂说明书；随后在显微镜下观察，当Hela细胞出现CPE时收获细胞及培养上清，并接种至RD细胞进行传代与培养，获得的拯救病毒可作为溶瘤病毒候选毒株。
实施例2：CVB1及其修饰形式的体外抗肿瘤实验
2.1所使用的病毒与细胞系
(1)病毒：本实施例使用实施例1所提供的CVB1-WT(SEQ ID NO:12)、CVB1-HRV2(SEQ ID NO:13)、CVB1-miR133&206T(SEQ ID NO:14)、CVB1-GM-CSF(SEQ ID NO:15)和CVB1-Anti-PD-1(SEQ ID NO:16)以及一株野生型柯萨奇病毒B组3型(以下简称：CVB3-WT；GenBank数据库登录号：KY286529.1)。
(2)细胞系：人横纹肌肉瘤细胞RD( Number:CCL-136TM)；人结直肠癌细胞系SW1116(/> Number:CCL-233TM)、SW480(/> Number:CCL-228TM)和HT-29(/> Number:HTB-38TM)；人胃癌细胞系AGS(/> Number:CRL-1739TM)、SGC7901(CCTCC保藏编号:GDC150)、BGC823(CCTCC保藏编号:GDC151)和NCI-N87(/>Number:CRL-5822TM)；人食管癌细胞系TE-1(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，编号:3131C0001000700089)；人小细胞肺癌细胞系DMS114(/> Number:CRL-2066TM)；人非小细胞肺癌细胞系SPC-A-1(CCTCC保藏编号:GDC050)、NCI-H1975(/>Number:CRL-5908TM)、NCI-H1299(/> Number:CRL-5803TM)、A549(/>Number:CCL-185TM)、NCI-H661(/> Number:HTB-183TM)、EBC-1(Thermo FisherScientific,Catalog#:11875101)和NCI-H1703(/> Number:CRL-5889TM)；人肝癌细胞系C3A(/> Number:CRL-10741TM)、HepG2(/> Number:HB-8065TM)、SMMC7721(购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，编号:3111C0001CCC000087)、BEL7402(CCTCC保藏编号:GDC035)、BEL7404(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，编号:3131C0001000700064)、Huh7(CCTCC保藏编号:GDC134)和PLC/PRF/5(/> Number:CRL-8024TM)；人卵巢癌细胞系SKOV3(/>Number:HTB-77TM)和Caov3(/> Number:HTB-75TM)；人子宫内膜癌细胞系HEC-1-A( Number:HTB-112TM)、HEC-1-B(/> Number:HTB-113TM)和Ishikawa(ECACC No.99040201)；人宫颈癌细胞系Hela(/> Number:CCL-2TM)、Caski(N umber:CRL-1550TM)和C-33A(/> Number:HTB-31TM)；人黑色素瘤细胞系SK-MEL-1(/> Number:HTB-67TM)和MeWo(/> Number:HTB-65TM)；人乳腺癌细胞系BcaP37(CCTCC保藏编号:GDC206)、BT-474(/> Number:HTB-20TM)和MDA-MB-231(/> Number:HTB-26TM)；人肾癌细胞系A-498(/> Number:HTB-44TM)和786-O(/> Number:CRL-1932TM)；人胰腺癌细胞系Capan-2(/>Number:HTB-80TM)、AsPC-1(/> Number:CRL-1682TM)、SW1990(/> Number:CRL-2172TM)、HPAF-2(/> Number:CRL-1997TM)和CFPAC-1(/> Number:CRL-1918TM)；人成骨肉瘤细胞系U2OS(/> Number:HTB-96TM)；人前列腺癌细胞系DU145( Number:HTB-81TM)和LNCap(/> Number:CRL-1740TM)；人神经胶质瘤细胞系GBM(病人肿瘤组织分离原代肿瘤细胞系)；人神经母瘤细胞系SH-SY5Y(/>Number:CRL-2266TM)；人舌鳞癌细胞系CAL27(/> Number:CRL-2095TM)和SCC-25( Number:CRL-1628TM)；人鼻咽癌细胞系CNE(购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，编号:3131C0001000700013)；人鼻中隔鳞状癌细胞系RPMI2650( Number:CCL-30TM)；人喉癌细胞系HEp-2(/> Number:CCL-23TM)；人甲状腺癌细胞系SW579(由国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心保存)和人甲状腺导管癌细胞系TT(/> Number:CRL-1803TM)；人膀胱癌细胞系J82(/> Number:HTB-1TM)和5637(/> Number:HTB-9TM)；人Burkitt's淋巴瘤细胞系Daudi( Number:CCL-213TM)和Raji(/> Number:CCL-86TM)；人正常细胞系包括：人胰腺导管上皮细胞系hTERT-HPNE(/> Number:CRL-4023TM)、人皮肤角化细胞系HaCat(CCTCC保藏编号:GDC106)、人胚肺成纤维细胞系MRC-5(/> Number:CCL-171TM)、人包皮成纤维细胞系HFF-1(/> Number:SCRC-1041TM)、人前列腺基质细胞系WPMY-1(/> Number:CRL-2854TM)、人脐静脉内皮细胞系HUVEC(Thermo FisherScientific,Catalog#:C01510C)以及分化后的人肝祖细胞系HepaRG(具原代肝细胞特征；Thermo Fisher Scientific,Catalog#:HPRGC10)。以上细胞均由中国，厦门大学，国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心保存。HepaRG细胞在WME培养基(添加1.5％DMSO)中培养；AGS和TT使用F-12K培养基；SH-SY5Y使用DMEM:F12(1:1)培养基；CFPAC-1使用IMDM培养基；RD、C-33A、EBC-1、SK-MEL-1、J82和DU145使用MEM培养基，Raji、Daudi、5637、786-O、TE-1、Caski、NCI-H1299、NCI-H1703、NCI-H1975、NCI-H661、SGC7901、BGC823、SW1116、HEp-2和LNCap使用RPMI-1640培养基，其他细胞都使用DMEM培养基，这些培养基均需添加10％的胎牛血清、谷氨酰胺与青霉素-链霉素双抗。以上所有细胞在37℃，5％CO2的标准条件下培养。
2.2病毒的培养
将RD细胞均匀铺于10厘米细胞培养板上，培养条件为含有10％胎牛血清以及谷氨酰胺、青霉素和链霉素的MEM培养基，37℃，5％CO2，饱和湿度；待细胞汇合度达到90％以上时，将细胞培养基更换为无血清的MEM培养基，每板接种107TCID50的CVB1-WT、CVB1-HRV2、CVB1-miR133&206T、CVB1-GM-CSF或CVB1-Anti-PD-1，继续培养24小时后，CVB1或其修饰形式在RD细胞内增殖并引起细胞出现CPE；当90％以上细胞出现收缩变圆、颗粒感增加以及脱落裂解时，收获细胞及其培养液上清；经3次反复冻融后，收集培养上清进行离心除去细胞碎片，离心条件为4000rpm，10min，4℃；最后，用0.22μm的一次性滤器(Millipore公司)过滤上清，除尽细胞碎片等杂质。
2.3病毒滴度的测定
将RD细胞铺于96孔板当中，细胞密度为104个/孔；待细胞贴壁之后，对实施例2.2中获得的病毒液用无血清MEM培养基进行10倍起始的10倍梯度稀释。加50μl稀释后的病毒到细胞孔当中，7天后观察并标记出现CPE的细胞孔，利用Karber法进行计算，计算公式为lgTCID50＝L-D(S-0.5)，L：最高稀释度的对数，D：稀释度对数之间的差，S：阳性孔比率总和。此时计算出来的TCID50单位为TCID50/50μl，需换算成TCID50/ml。
2.4病毒的体外抗肿瘤实验
将人肿瘤细胞与正常细胞按照104个/孔接种至96孔板；待细胞贴壁，每孔更换为无血清的对应细胞培养基，并且分别接种MOI为10、1、0.1和0.01的病毒；随后，每天在显微镜下观察细胞是否产生CPE。
其中，未感染病毒的人胰腺导管上皮细胞系hTERT-HPNE、人鼻咽癌细胞系CNE、人肝癌细胞系HepG2、人子宫内膜癌细胞系Ishikawa、人乳腺癌细胞系BT-474、人非小细胞肺癌细胞系EBC-1、人喉癌细胞系HEp-2、人舌癌细胞系SCC-25、人结直肠癌细胞系HT-29、人卵巢癌细胞系A2780、人胰腺癌细胞系AsPC-1和人前列腺癌细胞系DU145(阴性对照组，Mock)，以及使用MOI＝1CVB1-WT处理72小时后的上述细胞的显微镜照片如图1A-1D所示。结果显示，在感染复数(MOI)为1感染72小时后，病毒感染组的肿瘤细胞数量明显减少，且明显皱缩、破裂等现象；而经病毒感染的非肿瘤细胞与Mock组的非肿瘤细胞相比，其细胞形态几乎无变化。上述结果表明，CVB1对人鼻咽癌细胞系CNE、人肝癌细胞系HepG2和人子宫内膜癌细胞系Ishikawa、人乳腺癌细胞系BT-474、人非小细胞肺癌细胞系EBC-1、人喉癌细胞系HEp-2、人舌癌细胞系SCC-25、人结直肠癌细胞系HT-29、人卵巢癌细胞系A2780、人胰腺癌细胞系AsPC-1和人前列腺癌细胞系DU145均有显著的溶瘤作用，但对非肿瘤细胞人胰腺导管上皮细胞系hTERT-HPNE无任何影响。
在病毒感染培养72小时后使用Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒；上海碧云天生物技术有限公司)检测细胞存活率，具体方法如下：
在96孔细胞培养板中，贴壁细胞直接弃掉原培养基，悬浮细胞经离心后小心弃掉原培养基，随后更换为每孔100μl的新鲜无血清培养基；在接种细胞的孔中每孔加入10μlCCK-8溶液，同时在空白培养液中也加入等量的CCK-8溶液作为阴性对照；在细胞培养箱内37℃孵育0.5-3小时，在0.5、1、2、3小时分别利用酶标仪在吸光度为450nm进行一次检测，选取吸光度范围比较适宜的时间点作为细胞存活率的参考。CVB1-WT对各细胞的CCK-8检测结果参见表2，其中，“-”表示病毒处理后的细胞存活率与MOCK组相比无显著性差异；“+”表示病毒处理后的细胞数量减少但存活率仍大于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异；“++”表示病毒处理后的细胞存活率小于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异。
细胞存活率的计算方法为：
表2：CVB1-WT体外抗肿瘤实验结果
/>
/>
注：“-”表示病毒处理后的细胞存活率与MOCK组相比无显著性差异；“+”表示病毒处理后的细胞数量减少但存活率仍大于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异；“++”表示病毒处理后的细胞存活率小于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异。
由表2可知，CVB1-WT对大部分所检测的肿瘤细胞都有杀伤作用，特别的，该病毒对结直肠癌细胞系、胃癌细胞系、肺癌细胞系、肝癌细胞系、宫颈癌细胞系、子宫内膜癌细胞系、胰腺癌细胞系、前列腺癌细胞系、鼻咽癌细胞系、舌癌细胞系、喉癌细胞系、神经胶质瘤细胞系和神经母细胞瘤细胞系等杀伤十分显著。另一方面，该病毒除了对人正常胰腺导管上皮细胞系hTERT-HPNE和分化后的人肝祖细胞系HepaRG在MOI＝10时有一定毒性，对其他测试的非肿瘤细胞系包括人胚肺成纤维细胞系MRC-5、人包皮成纤维细胞系HFF-1、人皮肤角化细胞系HaCat、人前列腺基质细胞系WPMY-1和人脐静脉内皮细胞系HUVEC基本没有毒性。
特别值得注意的是，虽然CVB1-WT与已报道对特定肿瘤具有一定杀伤活性的野生型柯萨奇B组3型毒株(CVB3-WT；GenBank数据库登录号：KY286529.1)同属柯萨奇病毒，但两者之间的全基因组核苷酸同源性仅为72.8％，编码区核苷酸同源性仅为71％，是完全不同的两种病毒。特别地，本发明人通过平行比较CVB1-WT和CVB3-WT对不同类型肿瘤细胞的杀伤效力发现(表3)，CVB1具有比CVB3显著优越的肿瘤杀伤效果，其对大部分所检测的肿瘤细胞的杀伤活性相比于CVB3至少提高了几十倍、甚至几百倍。由此可见，本发明的CVB1能够以较低剂量产生更强的抗肿瘤活性，在保证疗效的同时大大增强了施用安全性，特别适用于抗肿瘤治疗。
表3：CVB1-WT与CVB3-WT的体外抗肿瘤实验结果对比
注：“-”表示病毒处理后的细胞存活率与MOCK组相比无显著性差异；“+”表示病毒处理后的细胞数量减少但存活率仍大于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异；“++”表示病毒处理后的细胞存活率小于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异；EC50，半数有效剂量，此处指处理后细胞存活率下降至50％的病毒MOI数值；效力倍数，此处指CVB1与CVB3对特定细胞的溶瘤效力倍数，即EC50比值。
另外，CVB1-miR133&206T、CVB1-GM-CSF和CVB1-Anti-PD-1的体外抗肿瘤实验结果显示，上述经修饰的CVB1均保留了母本毒株野生型CVB1对所检测肿瘤细胞的杀伤作用、以及对结直肠癌细胞系、胃癌细胞系、肺癌细胞系、肝癌细胞系、宫颈癌细胞系、子宫内膜癌细胞系、胰腺癌细胞系、前列腺癌细胞系、鼻咽癌细胞系、舌癌细胞系、喉癌细胞系、神经胶质瘤细胞系和神经母细胞瘤细胞系等的显著杀伤作用，其中对人结直肠癌细胞系SW480、人胃癌细胞系AGS、人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和人神经胶质瘤细胞系GBM的溶瘤活性的的CCK-8检测结果如表4所示。
特别值得注意的是，CVB1-HRV2对一些CVB1-WT杀伤较弱的肿瘤细胞却具有了明显的杀伤活性，带来了显著有利的技术效果，其中对人甲状腺癌细胞系SW579的溶瘤活性的CCK-8检测结果如表5所示。
表4：CVB1-miR133&206T、CVB1-GM-CSF和CVB1-Anti-PD-1的体外抗肿瘤实验结果
注：“-”表示病毒处理后的细胞存活率与MOCK组相比无显著性差异；“+”表示病毒处理后的细胞数量减少但存活率仍大于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异；“++”表示病毒处理后的细胞存活率小于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异。
表5：CVB1-WT与CVB1-HRV2对人甲状腺癌细胞系SW579的体外溶瘤实验结果比较
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注：“-”表示病毒处理后的细胞存活率与MOCK组相比无显著性差异；“+”表示病毒处理后的细胞数量减少但存活率仍大于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异；“++”表示病毒处理后的细胞存活率小于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异。
2.5 CVB1的连续适应性传代
在本实施例中，通过将CVB1在某一种肿瘤细胞内连续适应性传代以获得对该肿瘤细胞杀伤活性增强毒株。
将野生肠道病毒CVB1在其溶瘤作用效果不是非常显著的人成骨肉瘤细胞系U2OS、人甲状腺癌细胞系SW579和人膀胱癌细胞系J82中分别进行连续适应性传代，具体方法如下：
将以上肿瘤细胞其中一种均匀铺于10厘米细胞培养板上，培养条件为含有10％胎牛血清以及谷氨酰胺、青霉素和链霉素的对应细胞培养基，37℃，5％CO2，饱和湿度；待细胞汇合度达到90％以上时，将细胞培养基更换为无血清的细胞培养基，每板接种107TCID50的CVB1病毒，培养环境更换为33℃，5％CO2，饱和湿度；待CVB1在肿瘤细胞内增殖并引起细胞出现CPE时(感染最多3天后)，收获细胞及其培养液上清；经三次冻融后，4℃，4000rpm离心10min；取离心上清加入细胞汇合度达到90％以上的新的肿瘤细胞中，完成一次病毒传代。如此反复传代10次以上，每传代一次取出部分病毒液在RD细胞中进行病毒滴度检测，具体方法参照实施例2.3。通常病毒复制能力会随代次增加呈增强趋势，直至可在该肿瘤细胞中达到较高的感染性滴度且病毒复制稳定，即获得该肿瘤细胞的CVB1适应毒株。
随后，通过实施例2.4中所述的体外抗肿瘤实验的操作方法，将人肿瘤细胞U2OS、SW579或J82按照104个/孔接种至96孔板；待细胞贴壁，每孔更换为无血清的对应细胞培养基，37℃孵育30min，再分别接种MOI为10、1、0.1和0.01的每种细胞相对应的连续传代CVB1适应毒株(病毒滴度在RD细胞上检测)；随后每天在显微镜下观察细胞是否产生CPE，并在病毒感染培养72小时后使用CCK-8法检测细胞存活率。
结果如表6所示，野生型CVB1经过在其溶瘤作用效果不好的某一种肿瘤细胞中连续传代后，其对该肿瘤细胞的杀伤活性明显增强，表明可通过上述连续传代的方法获得对该肿瘤细胞溶瘤作用效果增强的CVB1适应毒株。
表6：通过在某肿瘤细胞内连续适应性传代后的CVB1对该肿瘤细胞的体外杀伤实验结果
注：“-”表示病毒处理后的细胞存活率与MOCK组相比无显著性差异；“+”表示病毒处理后的细胞数量减少但存活率仍大于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异；“++”表示病毒处理后的细胞存活率小于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异。
2.6 CVB1基因组RNA的溶瘤效果评价
在本实施例中，通过将纯化的CVB1基因组RNA转染某一种肿瘤细胞可产出大量具有感染性的CVB1活病毒并对肿瘤细胞造成杀伤。
首先通过体外转录的方法以获得病毒基因组RNA，该方法可参见例如Hadac E M,Kelly E J and Russell S J.Mol Ther，2011,19(6):1041–1047。具体而言，将实施例1中所获得的野生型CVB1的感染性克隆质粒线性化，以该线性化质粒为模板，使用试剂盒MEGAscriptTMT7 Transcription Kit(Thermo Fisher Scientific,AM1333)体外转录并大量生产病毒RNA，再使用MEGAclearTMTranscription Clean-Up Kit(Thermo FisherScientific,AM1908)纯化获得的病毒RNA待用，1份样品的RNA电泳图谱如图2所示。
随后，通过实施例2.4中所述的体外抗肿瘤实验的操作方法，将人宫颈癌细胞系Hela按照105个/孔接种至24孔板；待细胞贴壁，每孔更换为无血清的对应细胞培养基，37℃孵育30min，再使用转染试剂2000(Thermo Fisher Scientific,11668019)将纯化好的病毒RNA按照1μg每孔转染Hela细胞，阴性对照组转染无关RNA核酸分子，随后每天在显微镜下观察细胞是否产生CPE。
结果发现，转染CVB1基因组RNA的Hela细胞在转染后8小时左右开始出现CPE，随后细胞病变逐渐加剧，48小时后使用CCK8法检测存活率，Hela细胞已经几乎全部死亡裂解，Hela细胞感染0和48小时后的显微镜照片如图3所示；培养上清接种到新的Hela细胞中又可很快产生CPE。该结果表明，直接施用CVB1的核酸亦具有良好的杀伤活性，可用于治疗肿瘤。
实施例3：CVB1及其修饰形式的体内抗肿瘤实验
3.1病毒、细胞系与实验动物
(1)病毒：本实施例中使用实施例1所提供的CVB1-WT(SEQ ID NO:12)、CVB1-HRV2(SEQ ID NO:13)、CVB1-miR133&206T(SEQ ID NO:14)、CVB1-GM-CSF(SEQ ID NO:15)和CVB1-Anti-PD-1(SEQ ID NO:16)。病毒的培养与病毒滴度测定方法分别参见实施例2.2和2.3。
(2)细胞系：人乳腺癌细胞系BcaP37(CCTCC保藏编号:GDC206)、人非小细胞肺癌细胞系A549( Number:CCL-185TM)和SPC-A-1(CCTCC保藏编号:GDC050)、人Burkitt's淋巴瘤细胞系Raji(/> Number:CCL-86TM)、人子宫内膜癌细胞系Ishikawa(ECACC No.99040201)和HEC-1-B(/> Number:HTB-113TM)、人宫颈癌细胞系Hela(/> Number:CCL-2TM)和C-33A(/> Number:HTB-31TM)，以及人神经胶质瘤细胞系GBM(病人肿瘤组织分离原代肿瘤细胞系)。以上细胞除Raji使用RPMI-1640培养基，C-33A使用MEM培养基，其他细胞均使用DMEM培养基培养，并且上述培养基均添加入10％的胎牛血清、谷氨酰胺与青霉素-链霉素双抗。以上所有细胞均在37℃，5％CO2的标准条件下培养。
(3)实验动物：6-8周龄的雌性C.B17SCID小鼠来源于上海斯莱克实验动物有限责任公司；根据厦门大学实验动物中心与伦理委员会所批准的方案，将该小鼠在SPF条件下饲养。
3.2病毒的体内抗肿瘤实验
将用于SCID小鼠皮下成瘤的肿瘤细胞用0.01％胰蛋白酶消化后，再使用含10％的胎牛血清的细胞培养基重悬成单细胞悬液；计数悬液的细胞密度，1000g，3min离心沉淀细胞，再用适量体积的PBS重悬细胞，使达到约106-107个细胞/100μl PBS；按照106-107个细胞/100μl PBS/点在SCID小鼠背部皮下用注射器接种肿瘤细胞，待14-21天左右、肿瘤细胞在SCID小鼠皮下形成大约100mm3的瘤块的时候，将荷瘤SCID小鼠随机分为实验组(施用CVB1-WT、CVB1-HRV2、CVB1-miR133&206T、CVB1-GM-CSF或CVB1-Anti-PD-1)与阴性对照组，每组4只(n＝4)，用106TCID50/100μl无血清培养基/每瘤块的溶瘤病毒(CVB1-WT、CVB1-HRV2、CVB1-miR133&206T、CVB1-GM-CSF或CVB1-Anti-PD-1)或等量无血清培养基瘤内注射处理，每两天注射1次，共处理5次。每两天用游标卡尺测量并记录肿瘤大小变化，肿瘤大小的计算方法为：
肿瘤大小(mm3)＝肿瘤长度数值×(肿瘤宽度数值)2/2。
CVB1-WT对上述6种肿瘤的治疗结果分别如图4A-4I所示。结果显示，攻毒CVB1-WT后，所检测的BcaP37(A)、A549(B)、SPC-A-1(C)、Raji(D)、Ishikawa(E)、HEC-1-B(F)、Hela(G)、C-33A(H)和GBM(I)肿瘤生长均出现逐渐变慢和停滞，甚至裂解消失；相比之下，阴性组(CTRL)肿瘤则保持正常生长，其肿瘤大小显著大于实验组。
图5显示了CVB1-WT、CVB1-HRV2、CVB1-miR133&206T、CVB1-GM-CSF和CVB1-Anti-PD-1分别治疗GBM肿瘤模型10天后的结果。结果显示，与未经溶瘤病毒治疗的阴性对照组相比，CVB1-WT、CVB1-HRV2、CVB1-miR133&206T、CVB1-GM-CSF和CVB1-Anti-PD-1治疗后的肿瘤体积显著减小，甚至近乎消失，且5种溶瘤病毒处理后肿瘤体积减小幅度类似。上述结果表明CVB1-WT、CVB1-HRV2、CVB1-miR133&206T、CVB1-GM-CSF和CVB1-Anti-PD-1均展现出显著有利的体内抗肿瘤活性。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 厦门大学
北京万泰生物药业股份有限公司
<120> 一种用于治疗肿瘤的柯萨奇B组病毒
<130> IDC180021
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7371
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CVB1-WT的cDNA序列
<400> 1
tcctgtgggt tgatcccacc cacagggccc actgggcgct agcacactgg tattccggta 60
cctttgtgcg cctgttttat acacccttcc caagtgtaac ttagaagctt atcacacacg 120
gtcaacaggt gactcagtat gccaactggg tcttgatcaa gcacttctgt ttccccggac 180
tgagtatcaa taagctgctc acgcggctga aggagaaaac gttcgttaac cggccaatta 240
cttcgagaaa cctagtaaca ccatggaggt tgcgcagtgt ttcgctccac acaaccccag 300
tgtagatcag gccgatgagt caccgcactc ctcacgggcg accgtggcgg tggctgcgct 360
ggcggcctgc ccatgggata acccatggga cgcttcaata ctgacatggt gcgaagagtc 420
tattgagcta attggtagtc ctccggcccc tgaatgcggc taatcctaac tgcggagcag 480
atacccacac gccagtgggc agtctgtcgt aatgggcaac tctgcagcgg aaccgactac 540
tttgggtgtc cgtgtttcct tttattttta tactggctgc ttatggtgac aattgagaga 600
ttgttaccat atagctattg gattggccat ccagtgacaa acagagcgat tatttattta 660
tttgttggtt atatcccatt aagccaaaag gccctagtta ctctcaactt tatactattg 720
cttaatacaa cgaaatggga gctcaggtgt ctacacaaaa gacgggtgca catgagactg 780
gcttgaatgc cagcggcaat tctgtcatcc attacaccaa catcaattac tacaaggatg 840
ctgcatccaa ctccgcaaat aggcaagact tcacacaaga cccaggtaag ttcactgaac 900
ctgtaaagga catcatggtg aaaactatgc ctgcgttgaa ctcaccctct gctgaggaat 960
gcggctacag tgacagagtg cgttccatca cattaggtaa ttccactatc accacccaag 1020
agtgtgccaa cgtggtcgtc gggtacggag tgtggccaga gtatctaaaa gacaacgagg 1080
ccacagccga agatcagccc acacaacctg atgtggccac ctgccgcttc tatactttag 1140
aatcagtgca gtggatgaaa aattcggccg ggtggtggtg gaagctgcct gatgcactgt 1200
cacagatggg cttgtttggt caaaacatgc agtaccacta cttgggaaga acagggtata 1260
ctatacacgt acaatgcaat gcctcaaagt tccatcaagg atgcctgctt gtagtgtgtg 1320
tgcctgaagc tgagatgggg tgctctaact tgaacaacac gcccgaattc agtgagttat 1380
ccggaggaga cagtgccaga atgttcaccg atacacaggt cggggagtca aacgccaaga 1440
aagtacagac agcggtgtgg aacgccggaa tgggcgttgg agtgggtaat ctcactattt 1500
tccctcacca atggatcaac ctgaggacca acaacagtgc aacgctagtg atgccttaca 1560
taaacagcgt ccccatggat aacatgttca ggcacaataa cttaacacta atgattatcc 1620
catttgtacc gcttaattac agcgagggat cctcaccgta cgtgcccata acagtcacca 1680
tcgctcctat gtgtgcagag tacaacgggc tacggctggc cagcaaccag ggtctaccag 1740
ttatgacaac acctgggagc acgcaatttc taacttcaga tgacttccag tcaccgtcag 1800
cgatgccaca gtttgatgtc accccagaga tgcaaatacc aggccgcgta aataatttga 1860
tggagattgc cgaggtggac tcagtggtgc ctgtgaataa cacagaggac aacgtgagta 1920
gccttaaggc ataccagatt ccagtacagt ccaacagtga caatggtaag caggtttttg 1980
gttttccctt acaaccgggt gccaacaacg ttctgaatag aaccctcttg ggtgaaattc 2040
taaactatta cacccattgg agtggcagca taaaacttac attcatgttc tgtgggtctg 2100
ccatggccac tggcaagttc cttctggcat actcaccacc tggagcagga gtcccgaaaa 2160
accgaaaaga tgctatgctg ggcacccacg tcatatggga tgttgggtta caatcaagct 2220
gcgtgttgtg cgtaccgtgg attagccaaa cacactacag atacgtggtt gaggatgaat 2280
acacagcagc cggatatgtt acatgctggt atcaaacaaa tatcgtggtg ccagctgatg 2340
tgcaaagctc atgtgacatc ttgtgctttg tttcagcctg caacgatttc tctgtgcgga 2400
tgctgaaaga tacgcccttt ataagacagg acacatttta tcacggccca gtggaggagt 2460
ctgtggatcg tgcagtggca cgtgtggcgg acacgattag ttcacggccc actaactcgg 2520
agtcaattcc agcgctcacc gccgccgaga ctgggcatac ctcccaagtt gtgcctagcg 2580
acaccatgca aacaagacat gtgaaaaact accactcacg gtccgaatcg tccattgaaa 2640
atttcctatg ccggtctgcc tgtgtatact atgccacata caccaataac tcaaaaaaag 2700
aggggtttgc agagtgggtt atcaacacta gacaggtggc acagctaaga agaaagttgg 2760
agctcttcac atatctaagg tttgacttag aactaacatt tgttataacg agcgcacaac 2820
aacccagtac cgcctccagt gtagacgctc ccgtgcaaac ccatcagatt atgtatgtgc 2880
ctccaggtgg ccctgtacca acaaaggtta aagattatgc atggcaaact tccacaaacc 2940
ccagcgtttt ctggacagaa ggaaacgccc caccaaggat gtccatccca ttcattagca 3000
ttggtaatgc gtatagttgt ttttatgatg ggtggacgca gttttcaaga aacggggtct 3060
atggcatcaa taccctcaac aacatgggca cgttgtatat gaggcatgtc aatgaagcgg 3120
ggcagggtcc aatcaaaagt actgttagaa tatatttcaa acccaagcac gtgaaggcgt 3180
gggtgccacg tccgccaaga ttgtgtcaat atgagaagca gaaaaatgtc aattttagcc 3240
ctataggagt aaccacaagt agaacggaca ttataacaac aggcactttt ggtcagcagt 3300
ccggagcgat atatgtgggc aattacagga tagtcaatag gcacctggca acacactttg 3360
actggcaaaa ttgcatatgg gaggattaca acagggacct cctagtatgc actacaacgg 3420
cgcacggttg tgacaatatt gcaagatgcc agtgcacagc aggtgtgtat tattgtgctt 3480
ctaggaacaa gcattacccg gtgcattttg aaggaccagg cttggtggag gtccaggaaa 3540
gtgaatatta tccaaaaagg tatcaatcac acgtgcttct tgccgcaggg ttttctgagc 3600
cgggggattg tggtggtatt ctcaggtgtg aacatggtgt tataggcatc gtgaccatgg 3660
gtggtgaggg tgttgtcggc tttgccgatg tgcgcgatct cttatggctg gaagacgacg 3720
caatggaaca gggagtcagg gactacgtgg aacagcttgg aaacgccttt ggttctgggt 3780
ttaccaacca gatttgcgag caagtcaatc tgttaaaaga gtcactaata ggccaagact 3840
ccatcttgga aaaatcactc aaggcattag tgaaaatcat atcagcactg gttatcgtgg 3900
tgagaaacca cgatgacctc ataacagtca ctgccacctt agccctgatt ggctgtacca 3960
cttcaccgtg gcggtggcta aagaaaaaag tgactcaata ctatgggatt cccatggccg 4020
agagacagaa caatggctgg ctcaagaaat tcacagaaat gaccaatgca tgcaagggca 4080
tggaatggat cgccatcaaa atccaaaagt tcattgagtg gctcaaaatt aagatcttgc 4140
cagaagtaaa ggaaaaacac gagtttctta ccagacttaa gcaactccca ctcttagaaa 4200
gccaaattgc caccatcgag cagagtgcac catcacagag tgatcaggaa caactgttct 4260
ccaatataca gtacttcgcg cactattgca gaaagtacgc cccactgtac gcagctgagg 4320
caaaaagagt gttctctcta gaaaagaaaa tgagcaacta catacagttc aagtccaaat 4380
gccgtattga accagtctgt ttattgctcc atggtagccc tggagccgga aaatccgtgg 4440
ctaccaattt gattggacgc tcacttgcag agaagctcaa cagttcagtg tattcattgc 4500
caccagaccc agaccatttt gacggctata aacaacaagc tgtcgtaatc atggatgacc 4560
tgtgccagaa cccagatggg aaagacgtgt ccttgttctg ccagatggtt tcaagtgtag 4620
actttgttcc accaatggca gcacttgagg agaaaggcat actcttcaca tcgcctttcg 4680
tgctcgcctc taccaacgca ggttccatca acgctcccac tgtgtcagac agcagagccc 4740
ttgctagaag gttccacttc gacttgaaca ttgaggtcat ctcaatgtac agccagaatg 4800
gcaaaatcaa catgccaatg tcagtgaagg cttgtgatga tgagtgttgt ccagttaatt 4860
tcaagaggtg ttgtccatta gtgtgcggta aggccattca gttcattgac agaagaacac 4920
aaatgaggta ttcactagac atgcttgtaa ctgaaatgtt cagggagtac aaccacagac 4980
atagtgtggg ggcaacactc gaggcactct tccaaggccc acccgtgtac aaagagatca 5040
agatcagtgt tgcgccagaa acccctcccc caccggcaat agcagatctg ctgaaatctg 5100
tggacagtga agcagttaga gagtactgca aggaaaaggg atggttggtg cctgagatca 5160
attccactct acaaattgaa aagcacgtga gcagggcctt catttgcctg caagcgctca 5220
ccacgtttgt ttccgtggcg gggataattt acatcatata caaattgttt gctggcttcc 5280
agggggccta caccggtatg ccaaaccaaa aacctaaagt accaactttg aggcaggcta 5340
aggtgcaggg accggcattc gaattcgctg tggcaatgat gaaaagaaat gctagcacag 5400
tgaagaccga gtacggtgag ttcacaatgc ttggaatcta tgacaggtgg gcagtgctac 5460
ctcgtcacgc tagaccaggg cctaccatcc taatgaatga ccaggaagtg ggtgtggtgg 5520
atgccaagga gttagtggac aaggatggca ccaatttaga attaacactc ttgaagctca 5580
atagaaatga gaaattcaga gacatccgag gcttcttaac acgtgaggag gccgaagtca 5640
acgaggctgt gcttgctatt aacaccagca agttcccaaa tatgtacatt ccagttgggc 5700
aagtaacaga ttatggcttc ctcaacttgg gtggcacacc aactaagcgc atgctgatgt 5760
acaacttccc aacacgtgca ggccaatgtg ggggagttct aatgtctaca ggtaaagtgc 5820
tcggaataca cgtcggtggt aatggacacc aagggttttc ggcagccctg ttacgccact 5880
atttcaatga cgagcaggga gagattgagt tcatcgagag ctctaaggat gcaggctttc 5940
cagtcattaa cacacctagc aaaacaaagc tcgagcccag tgttttccat cacgtgtttg 6000
agggaaacaa agaaccagca gtgttgagga atggagaccc aagactgaaa gccaattttg 6060
aggaagccat tttctccaag tacatcggga atgtgaacac acatgtagac gagtacatga 6120
tggaagccgt cgaccattat gcaggacagt tagctacttt agatatcagt acagaaccta 6180
tgaagcttga ggatgctgtc tacggtactg agggcttgga agctctggac ttgaccacta 6240
gtgctgggta tccctatgtc gcccttggta taaaaaagag agacatctta tccaaaaagt 6300
ctaaggacct gtctaaactg agagagtgta tggacaagta tgggttaaac ctccctatgg 6360
tcacctatgt gaaggatgaa ttgaggtcag cagagaaagt ggctaagggc aaatccagac 6420
taatcgaggc gtccagttta aatgactcag tggcaatgag acagactttc ggtaacctgt 6480
ataagacatt ccatctgaac ccgggcatag tgactggcag tgcagttgga tgcgatcccg 6540
acttgttctg gagcaagatt ccagtcatgc tcgatggtca cctcatcgcc tttgactaca 6600
gtggatatga tgccagcctg agtccggtgt ggtttgcttg cttgaaactg ttgttggaaa 6660
agctggggta ctcacacaag gaaactaatt acatagatta cttgtgcaac tcccaccatt 6720
tgtacagaga caagcactac tttgtgaggg gaggaatgcc atccgggtgt tctggaacca 6780
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tgaaaagata cttcagagcg gatgagcaat atcccttcct cgttcaccca gtgatgccaa 7080
tgaaggacat tcatgagtca attaggtgga ctaaagaccc caaaaacacc caagatcacg 7140
tgcgatcctt gtgcttattg gcctggcaca atggagagca agaatatgag aattttgtat 7200
ccaaaatcag aagcgtccca gttgggcgct gcttgacatt gcctgcgttc tcgactctgc 7260
gcaggaagtg gttggattcc ttctaaaatt gaagtacaat gtgatttaac tcaattggct 7320
taaccctacc acacttaccg aactagataa cggtgtggta ggggtaaatt c 7371
<210> 2
<211> 507
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HRV2内部核糖体进入位点序列的RNA序列
<400> 2
aacuuagaag uuuuucacaa agaccaauag ccgguaauca gccagauuac ugaaggucaa 60
gcacuucugu uuccccgguc aauguugaua ugcuccaaca gggcaaaaac aacugcgauc 120
guuaaccgca aagcgccuac gcaaagcuua guagcaucuu ugaaaucguu uggcuggucg 180
auccgccauu uccccuggua gaccuggcag augaggcuag aaauacccca cuggcgacag 240
uguucuagcc ugcguggcug ccugcacacc cuaugggugu gaagccaaac aauggacaag 300
gugugaagag ccccgugugc ucgcuuugag uccuccggcc ccugaaugug gcuaaccuua 360
acccugcagc uagagcacgu aacccaaugu guaucuaguc guaaugagca auugcgggau 420
gggaccaacu acuuugggug uccguguuuc acuuuuuccu uuauauuugc uuauggugac 480
aauauauaca auauauauau uggcacc 507
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-133靶序列的RNA序列
<400> 3
acagcugguu gaaggggacc aa 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-206靶序列的RNA序列
<400> 4
ccacacacuu ccuuacauuc ca 22
<210> 5
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-133靶序列与miR-206靶序列的串联序列的RNA序列
<400> 5
acagcugguu gaaggggacc aacgauacag cugguugaag gggaccaaac cgguccacac 60
acuuccuuac auuccaucac ccacacacuu ccuuacauuc ca 102
<210> 6
<211> 435
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GM-CSF基因DNA序列
<400> 6
atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tgcacccgcc 60
cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg 120
cgtctcctga acctgagtag agacactgct gctgagatga atgaaacagt agaagtcatc 180
tcagaaatgt ttgacctcca ggagccgacc tgcctacaga cccgcctgga gctgtacaag 240
cagggcctgc ggggcagcct caccaagctc aagggcccct tgaccatgat ggccagccac 300
tacaagcagc actgccctcc aaccccggaa acttcctgtg caacccagat tatcaccttt 360
gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag 420
ccagtccagg agtga 435
<210> 7
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Anti-PD-1 scFv DNA序列
<400> 7
atgaagcacc tgtggttctt cctgctgctg gtggccgctc ctaggtgggt gctgtcccag 60
gtgcagctgg tgcagagcgg cgtggaggtg aagaagcccg gcgcttccgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcct ccggctacac cttcaccaac tactacatgt actgggtgag gcaggcccct 180
ggacagggac tggagtggat gggcggcatc aacccttcca acggcggcac caacttcaac 240
gagaagttca agaaccgggt gaccctgacc accgactcct ccaccaccac cgcctacatg 300
gagctgaagt ccctgcagtt tgacgacacc gccgtgtact actgcgccag gagggactac 360
cggttcgaca tgggcttcga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gtccagcgga 420
ggtggcggat ctggaggggg tggtagcggt ggaggcggga gtgagatcgt gctgacccag 480
tcccctgcta cactgtccct gtcccccggc gagagggcta cactgagctg cagggcctcc 540
aagggcgtgt ccacctccgg ctactcctac ctgcactggt accagcagaa gcctggacag 600
gctcccaggc tgctgatcta cctggcctcc tacctggagt ccggcgtgcc tgctaggttt 660
tccggcagcg gcagcggcac cgatttcacc ctgaccatct cctccctgga gcccgaggac 720
ttcgccgtgt actactgcca gcactccagg gatctgcctc tgaccttcgg cggcggcacc 780
aaggtggaga tcaag 795
<210> 8
<211> 7251
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CVB1-HRV2的cDNA序列
<400> 8
tcctgtgggt tgatcccacc cacagggccc actgggcgct agcacactgg tattccggta 60
cctttgtgcg cctgttttat acacccttcc caagtgtaac ttagaagaac ttagaagttt 120
ttcacaaaga ccaatagccg gtaatcagcc agattactga aggtcaagca cttctgtttc 180
cccggtcaat gttgatatgc tccaacaggg caaaaacaac tgcgatcgtt aaccgcaaag 240
cgcctacgca aagcttagta gcatctttga aatcgtttgg ctggtcgatc cgccatttcc 300
cctggtagac ctggcagatg aggctagaaa taccccactg gcgacagtgt tctagcctgc 360
gtggctgcct gcacacccta tgggtgtgaa gccaaacaat ggacaaggtg tgaagagccc 420
cgtgtgctcg ctttgagtcc tccggcccct gaatgtggct aaccttaacc ctgcagctag 480
agcacgtaac ccaatgtgta tctagtcgta atgagcaatt gcgggatggg accaactact 540
ttgggtgtcc gtgtttcact ttttccttta tatttgctta tggtgacaat atatacaata 600
tatatattgg caccatggga gctcaggtgt ctacacaaaa gacgggtgca catgagactg 660
gcttgaatgc cagcggcaat tctgtcatcc attacaccaa catcaattac tacaaggatg 720
ctgcatccaa ctccgcaaat aggcaagact tcacacaaga cccaggtaag ttcactgaac 780
ctgtaaagga catcatggtg aaaactatgc ctgcgttgaa ctcaccctct gctgaggaat 840
gcggctacag tgacagagtg cgttccatca cattaggtaa ttccactatc accacccaag 900
agtgtgccaa cgtggtcgtc gggtacggag tgtggccaga gtatctaaaa gacaacgagg 960
ccacagccga agatcagccc acacaacctg atgtggccac ctgccgcttc tatactttag 1020
aatcagtgca gtggatgaaa aattcggccg ggtggtggtg gaagctgcct gatgcactgt 1080
cacagatggg cttgtttggt caaaacatgc agtaccacta cttgggaaga acagggtata 1140
ctatacacgt acaatgcaat gcctcaaagt tccatcaagg atgcctgctt gtagtgtgtg 1200
tgcctgaagc tgagatgggg tgctctaact tgaacaacac gcccgaattc agtgagttat 1260
ccggaggaga cagtgccaga atgttcaccg atacacaggt cggggagtca aacgccaaga 1320
aagtacagac agcggtgtgg aacgccggaa tgggcgttgg agtgggtaat ctcactattt 1380
tccctcacca atggatcaac ctgaggacca acaacagtgc aacgctagtg atgccttaca 1440
taaacagcgt ccccatggat aacatgttca ggcacaataa cttaacacta atgattatcc 1500
catttgtacc gcttaattac agcgagggat cctcaccgta cgtgcccata acagtcacca 1560
tcgctcctat gtgtgcagag tacaacgggc tacggctggc cagcaaccag ggtctaccag 1620
ttatgacaac acctgggagc acgcaatttc taacttcaga tgacttccag tcaccgtcag 1680
cgatgccaca gtttgatgtc accccagaga tgcaaatacc aggccgcgta aataatttga 1740
tggagattgc cgaggtggac tcagtggtgc ctgtgaataa cacagaggac aacgtgagta 1800
gccttaaggc ataccagatt ccagtacagt ccaacagtga caatggtaag caggtttttg 1860
gttttccctt acaaccgggt gccaacaacg ttctgaatag aaccctcttg ggtgaaattc 1920
taaactatta cacccattgg agtggcagca taaaacttac attcatgttc tgtgggtctg 1980
ccatggccac tggcaagttc cttctggcat actcaccacc tggagcagga gtcccgaaaa 2040
accgaaaaga tgctatgctg ggcacccacg tcatatggga tgttgggtta caatcaagct 2100
gcgtgttgtg cgtaccgtgg attagccaaa cacactacag atacgtggtt gaggatgaat 2160
acacagcagc cggatatgtt acatgctggt atcaaacaaa tatcgtggtg ccagctgatg 2220
tgcaaagctc atgtgacatc ttgtgctttg tttcagcctg caacgatttc tctgtgcgga 2280
tgctgaaaga tacgcccttt ataagacagg acacatttta tcacggccca gtggaggagt 2340
ctgtggatcg tgcagtggca cgtgtggcgg acacgattag ttcacggccc actaactcgg 2400
agtcaattcc agcgctcacc gccgccgaga ctgggcatac ctcccaagtt gtgcctagcg 2460
acaccatgca aacaagacat gtgaaaaact accactcacg gtccgaatcg tccattgaaa 2520
atttcctatg ccggtctgcc tgtgtatact atgccacata caccaataac tcaaaaaaag 2580
aggggtttgc agagtgggtt atcaacacta gacaggtggc acagctaaga agaaagttgg 2640
agctcttcac atatctaagg tttgacttag aactaacatt tgttataacg agcgcacaac 2700
aacccagtac cgcctccagt gtagacgctc ccgtgcaaac ccatcagatt atgtatgtgc 2760
ctccaggtgg ccctgtacca acaaaggtta aagattatgc atggcaaact tccacaaacc 2820
ccagcgtttt ctggacagaa ggaaacgccc caccaaggat gtccatccca ttcattagca 2880
ttggtaatgc gtatagttgt ttttatgatg ggtggacgca gttttcaaga aacggggtct 2940
atggcatcaa taccctcaac aacatgggca cgttgtatat gaggcatgtc aatgaagcgg 3000
ggcagggtcc aatcaaaagt actgttagaa tatatttcaa acccaagcac gtgaaggcgt 3060
gggtgccacg tccgccaaga ttgtgtcaat atgagaagca gaaaaatgtc aattttagcc 3120
ctataggagt aaccacaagt agaacggaca ttataacaac aggcactttt ggtcagcagt 3180
ccggagcgat atatgtgggc aattacagga tagtcaatag gcacctggca acacactttg 3240
actggcaaaa ttgcatatgg gaggattaca acagggacct cctagtatgc actacaacgg 3300
cgcacggttg tgacaatatt gcaagatgcc agtgcacagc aggtgtgtat tattgtgctt 3360
ctaggaacaa gcattacccg gtgcattttg aaggaccagg cttggtggag gtccaggaaa 3420
gtgaatatta tccaaaaagg tatcaatcac acgtgcttct tgccgcaggg ttttctgagc 3480
cgggggattg tggtggtatt ctcaggtgtg aacatggtgt tataggcatc gtgaccatgg 3540
gtggtgaggg tgttgtcggc tttgccgatg tgcgcgatct cttatggctg gaagacgacg 3600
caatggaaca gggagtcagg gactacgtgg aacagcttgg aaacgccttt ggttctgggt 3660
ttaccaacca gatttgcgag caagtcaatc tgttaaaaga gtcactaata ggccaagact 3720
ccatcttgga aaaatcactc aaggcattag tgaaaatcat atcagcactg gttatcgtgg 3780
tgagaaacca cgatgacctc ataacagtca ctgccacctt agccctgatt ggctgtacca 3840
cttcaccgtg gcggtggcta aagaaaaaag tgactcaata ctatgggatt cccatggccg 3900
agagacagaa caatggctgg ctcaagaaat tcacagaaat gaccaatgca tgcaagggca 3960
tggaatggat cgccatcaaa atccaaaagt tcattgagtg gctcaaaatt aagatcttgc 4020
cagaagtaaa ggaaaaacac gagtttctta ccagacttaa gcaactccca ctcttagaaa 4080
gccaaattgc caccatcgag cagagtgcac catcacagag tgatcaggaa caactgttct 4140
ccaatataca gtacttcgcg cactattgca gaaagtacgc cccactgtac gcagctgagg 4200
caaaaagagt gttctctcta gaaaagaaaa tgagcaacta catacagttc aagtccaaat 4260
gccgtattga accagtctgt ttattgctcc atggtagccc tggagccgga aaatccgtgg 4320
ctaccaattt gattggacgc tcacttgcag agaagctcaa cagttcagtg tattcattgc 4380
caccagaccc agaccatttt gacggctata aacaacaagc tgtcgtaatc atggatgacc 4440
tgtgccagaa cccagatggg aaagacgtgt ccttgttctg ccagatggtt tcaagtgtag 4500
actttgttcc accaatggca gcacttgagg agaaaggcat actcttcaca tcgcctttcg 4560
tgctcgcctc taccaacgca ggttccatca acgctcccac tgtgtcagac agcagagccc 4620
ttgctagaag gttccacttc gacttgaaca ttgaggtcat ctcaatgtac agccagaatg 4680
gcaaaatcaa catgccaatg tcagtgaagg cttgtgatga tgagtgttgt ccagttaatt 4740
tcaagaggtg ttgtccatta gtgtgcggta aggccattca gttcattgac agaagaacac 4800
aaatgaggta ttcactagac atgcttgtaa ctgaaatgtt cagggagtac aaccacagac 4860
atagtgtggg ggcaacactc gaggcactct tccaaggccc acccgtgtac aaagagatca 4920
agatcagtgt tgcgccagaa acccctcccc caccggcaat agcagatctg ctgaaatctg 4980
tggacagtga agcagttaga gagtactgca aggaaaaggg atggttggtg cctgagatca 5040
attccactct acaaattgaa aagcacgtga gcagggcctt catttgcctg caagcgctca 5100
ccacgtttgt ttccgtggcg gggataattt acatcatata caaattgttt gctggcttcc 5160
agggggccta caccggtatg ccaaaccaaa aacctaaagt accaactttg aggcaggcta 5220
aggtgcaggg accggcattc gaattcgctg tggcaatgat gaaaagaaat gctagcacag 5280
tgaagaccga gtacggtgag ttcacaatgc ttggaatcta tgacaggtgg gcagtgctac 5340
ctcgtcacgc tagaccaggg cctaccatcc taatgaatga ccaggaagtg ggtgtggtgg 5400
atgccaagga gttagtggac aaggatggca ccaatttaga attaacactc ttgaagctca 5460
atagaaatga gaaattcaga gacatccgag gcttcttaac acgtgaggag gccgaagtca 5520
acgaggctgt gcttgctatt aacaccagca agttcccaaa tatgtacatt ccagttgggc 5580
aagtaacaga ttatggcttc ctcaacttgg gtggcacacc aactaagcgc atgctgatgt 5640
acaacttccc aacacgtgca ggccaatgtg ggggagttct aatgtctaca ggtaaagtgc 5700
tcggaataca cgtcggtggt aatggacacc aagggttttc ggcagccctg ttacgccact 5760
atttcaatga cgagcaggga gagattgagt tcatcgagag ctctaaggat gcaggctttc 5820
cagtcattaa cacacctagc aaaacaaagc tcgagcccag tgttttccat cacgtgtttg 5880
agggaaacaa agaaccagca gtgttgagga atggagaccc aagactgaaa gccaattttg 5940
aggaagccat tttctccaag tacatcggga atgtgaacac acatgtagac gagtacatga 6000
tggaagccgt cgaccattat gcaggacagt tagctacttt agatatcagt acagaaccta 6060
tgaagcttga ggatgctgtc tacggtactg agggcttgga agctctggac ttgaccacta 6120
gtgctgggta tccctatgtc gcccttggta taaaaaagag agacatctta tccaaaaagt 6180
ctaaggacct gtctaaactg agagagtgta tggacaagta tgggttaaac ctccctatgg 6240
tcacctatgt gaaggatgaa ttgaggtcag cagagaaagt ggctaagggc aaatccagac 6300
taatcgaggc gtccagttta aatgactcag tggcaatgag acagactttc ggtaacctgt 6360
ataagacatt ccatctgaac ccgggcatag tgactggcag tgcagttgga tgcgatcccg 6420
acttgttctg gagcaagatt ccagtcatgc tcgatggtca cctcatcgcc tttgactaca 6480
gtggatatga tgccagcctg agtccggtgt ggtttgcttg cttgaaactg ttgttggaaa 6540
agctggggta ctcacacaag gaaactaatt acatagatta cttgtgcaac tcccaccatt 6600
tgtacagaga caagcactac tttgtgaggg gaggaatgcc atccgggtgt tctggaacca 6660
gcattttcaa ttcaatgatt aataacataa tcatcagaac actgatgttg aaggtgtaca 6720
aagggataga tctagaccaa tttaggatga ttgcatatgg tgacgacgtc attgcttcgt 6780
acccgtatcc aattgatgcg tcattgctgg ctgaggctgg caaggggtat ggtctgatta 6840
tgacaccagc agacaaagga gagtgtttca atgaagtaac gtggaccaac gtcactttcc 6900
tgaaaagata cttcagagcg gatgagcaat atcccttcct cgttcaccca gtgatgccaa 6960
tgaaggacat tcatgagtca attaggtgga ctaaagaccc caaaaacacc caagatcacg 7020
tgcgatcctt gtgcttattg gcctggcaca atggagagca agaatatgag aattttgtat 7080
ccaaaatcag aagcgtccca gttgggcgct gcttgacatt gcctgcgttc tcgactctgc 7140
gcaggaagtg gttggattcc ttctaaaatt gaagtacaat gtgatttaac tcaattggct 7200
taaccctacc acacttaccg aactagataa cggtgtggta ggggtaaatt c 7251
<210> 9
<211> 7473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CVB1-miR133&206T的cDNA序列
<400> 9
tcctgtgggt tgatcccacc cacagggccc actgggcgct agcacactgg tattccggta 60
cctttgtgcg cctgttttat acacccttcc caagtgtaac ttagaagctt atcacacacg 120
gtcaacaggt gactcagtat gccaactggg tcttgatcaa gcacttctgt ttccccggac 180
tgagtatcaa taagctgctc acgcggctga aggagaaaac gttcgttaac cggccaatta 240
cttcgagaaa cctagtaaca ccatggaggt tgcgcagtgt ttcgctccac acaaccccag 300
tgtagatcag gccgatgagt caccgcactc ctcacgggcg accgtggcgg tggctgcgct 360
ggcggcctgc ccatgggata acccatggga cgcttcaata ctgacatggt gcgaagagtc 420
tattgagcta attggtagtc ctccggcccc tgaatgcggc taatcctaac tgcggagcag 480
atacccacac gccagtgggc agtctgtcgt aatgggcaac tctgcagcgg aaccgactac 540
tttgggtgtc cgtgtttcct tttattttta tactggctgc ttatggtgac aattgagaga 600
ttgttaccat atagctattg gattggccat ccagtgacaa acagagcgat tatttattta 660
tttgttggtt atatcccatt aagccaaaag gccctagtta ctctcaactt tatactattg 720
cttaatacaa cgaaatggga gctcaggtgt ctacacaaaa gacgggtgca catgagactg 780
gcttgaatgc cagcggcaat tctgtcatcc attacaccaa catcaattac tacaaggatg 840
ctgcatccaa ctccgcaaat aggcaagact tcacacaaga cccaggtaag ttcactgaac 900
ctgtaaagga catcatggtg aaaactatgc ctgcgttgaa ctcaccctct gctgaggaat 960
gcggctacag tgacagagtg cgttccatca cattaggtaa ttccactatc accacccaag 1020
agtgtgccaa cgtggtcgtc gggtacggag tgtggccaga gtatctaaaa gacaacgagg 1080
ccacagccga agatcagccc acacaacctg atgtggccac ctgccgcttc tatactttag 1140
aatcagtgca gtggatgaaa aattcggccg ggtggtggtg gaagctgcct gatgcactgt 1200
cacagatggg cttgtttggt caaaacatgc agtaccacta cttgggaaga acagggtata 1260
ctatacacgt acaatgcaat gcctcaaagt tccatcaagg atgcctgctt gtagtgtgtg 1320
tgcctgaagc tgagatgggg tgctctaact tgaacaacac gcccgaattc agtgagttat 1380
ccggaggaga cagtgccaga atgttcaccg atacacaggt cggggagtca aacgccaaga 1440
aagtacagac agcggtgtgg aacgccggaa tgggcgttgg agtgggtaat ctcactattt 1500
tccctcacca atggatcaac ctgaggacca acaacagtgc aacgctagtg atgccttaca 1560
taaacagcgt ccccatggat aacatgttca ggcacaataa cttaacacta atgattatcc 1620
catttgtacc gcttaattac agcgagggat cctcaccgta cgtgcccata acagtcacca 1680
tcgctcctat gtgtgcagag tacaacgggc tacggctggc cagcaaccag ggtctaccag 1740
ttatgacaac acctgggagc acgcaatttc taacttcaga tgacttccag tcaccgtcag 1800
cgatgccaca gtttgatgtc accccagaga tgcaaatacc aggccgcgta aataatttga 1860
tggagattgc cgaggtggac tcagtggtgc ctgtgaataa cacagaggac aacgtgagta 1920
gccttaaggc ataccagatt ccagtacagt ccaacagtga caatggtaag caggtttttg 1980
gttttccctt acaaccgggt gccaacaacg ttctgaatag aaccctcttg ggtgaaattc 2040
taaactatta cacccattgg agtggcagca taaaacttac attcatgttc tgtgggtctg 2100
ccatggccac tggcaagttc cttctggcat actcaccacc tggagcagga gtcccgaaaa 2160
accgaaaaga tgctatgctg ggcacccacg tcatatggga tgttgggtta caatcaagct 2220
gcgtgttgtg cgtaccgtgg attagccaaa cacactacag atacgtggtt gaggatgaat 2280
acacagcagc cggatatgtt acatgctggt atcaaacaaa tatcgtggtg ccagctgatg 2340
tgcaaagctc atgtgacatc ttgtgctttg tttcagcctg caacgatttc tctgtgcgga 2400
tgctgaaaga tacgcccttt ataagacagg acacatttta tcacggccca gtggaggagt 2460
ctgtggatcg tgcagtggca cgtgtggcgg acacgattag ttcacggccc actaactcgg 2520
agtcaattcc agcgctcacc gccgccgaga ctgggcatac ctcccaagtt gtgcctagcg 2580
acaccatgca aacaagacat gtgaaaaact accactcacg gtccgaatcg tccattgaaa 2640
atttcctatg ccggtctgcc tgtgtatact atgccacata caccaataac tcaaaaaaag 2700
aggggtttgc agagtgggtt atcaacacta gacaggtggc acagctaaga agaaagttgg 2760
agctcttcac atatctaagg tttgacttag aactaacatt tgttataacg agcgcacaac 2820
aacccagtac cgcctccagt gtagacgctc ccgtgcaaac ccatcagatt atgtatgtgc 2880
ctccaggtgg ccctgtacca acaaaggtta aagattatgc atggcaaact tccacaaacc 2940
ccagcgtttt ctggacagaa ggaaacgccc caccaaggat gtccatccca ttcattagca 3000
ttggtaatgc gtatagttgt ttttatgatg ggtggacgca gttttcaaga aacggggtct 3060
atggcatcaa taccctcaac aacatgggca cgttgtatat gaggcatgtc aatgaagcgg 3120
ggcagggtcc aatcaaaagt actgttagaa tatatttcaa acccaagcac gtgaaggcgt 3180
gggtgccacg tccgccaaga ttgtgtcaat atgagaagca gaaaaatgtc aattttagcc 3240
ctataggagt aaccacaagt agaacggaca ttataacaac aggcactttt ggtcagcagt 3300
ccggagcgat atatgtgggc aattacagga tagtcaatag gcacctggca acacactttg 3360
actggcaaaa ttgcatatgg gaggattaca acagggacct cctagtatgc actacaacgg 3420
cgcacggttg tgacaatatt gcaagatgcc agtgcacagc aggtgtgtat tattgtgctt 3480
ctaggaacaa gcattacccg gtgcattttg aaggaccagg cttggtggag gtccaggaaa 3540
gtgaatatta tccaaaaagg tatcaatcac acgtgcttct tgccgcaggg ttttctgagc 3600
cgggggattg tggtggtatt ctcaggtgtg aacatggtgt tataggcatc gtgaccatgg 3660
gtggtgaggg tgttgtcggc tttgccgatg tgcgcgatct cttatggctg gaagacgacg 3720
caatggaaca gggagtcagg gactacgtgg aacagcttgg aaacgccttt ggttctgggt 3780
ttaccaacca gatttgcgag caagtcaatc tgttaaaaga gtcactaata ggccaagact 3840
ccatcttgga aaaatcactc aaggcattag tgaaaatcat atcagcactg gttatcgtgg 3900
tgagaaacca cgatgacctc ataacagtca ctgccacctt agccctgatt ggctgtacca 3960
cttcaccgtg gcggtggcta aagaaaaaag tgactcaata ctatgggatt cccatggccg 4020
agagacagaa caatggctgg ctcaagaaat tcacagaaat gaccaatgca tgcaagggca 4080
tggaatggat cgccatcaaa atccaaaagt tcattgagtg gctcaaaatt aagatcttgc 4140
cagaagtaaa ggaaaaacac gagtttctta ccagacttaa gcaactccca ctcttagaaa 4200
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<220>
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<211> 8214
<212> DNA
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<223> CVB1-Anti-PD1的cDNA序列
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<210> 12
<211> 7371
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CVB1-WT的基因组序列
<400> 12
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<210> 13
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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gucaacaggu gacucaguau gccaacuggg ucuugaucaa gcacuucugu uuccccggac 180
ugaguaucaa uaagcugcuc acgcggcuga aggagaaaac guucguuaac cggccaauua 240
cuucgagaaa ccuaguaaca ccauggaggu ugcgcagugu uucgcuccac acaaccccag 300
uguagaucag gccgaugagu caccgcacuc cucacgggcg accguggcgg uggcugcgcu 360
ggcggccugc ccaugggaua acccauggga cgcuucaaua cugacauggu gcgaagaguc 420
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auacccacac gccagugggc agucugucgu aaugggcaac ucugcagcgg aaccgacuac 540
uuuggguguc cguguuuccu uuuauuuuua uacuggcugc uuauggugac aauugagaga 600
uuguuaccau auagcuauug gauuggccau ccagugacaa acagagcgau uauuuauuua 660
uuuguugguu auaucccauu aagccaaaag gcccuaguua cucucaacuu uauacuauug 720
cuuaauacaa cgaaauggga gcucaggugu cuacacaaaa gacgggugca caugagacug 780
gcuugaaugc cagcggcaau ucugucaucc auuacaccaa caucaauuac uacaaggaug 840
cugcauccaa cuccgcaaau aggcaagacu ucacacaaga cccagguaag uucacugaac 900
cuguaaagga caucauggug aaaacuaugc cugcguugaa cucacccucu gcugaggaau 960
gcggcuacag ugacagagug cguuccauca cauuagguaa uuccacuauc accacccaag 1020
agugugccaa cguggucguc ggguacggag uguggccaga guaucuaaaa gacaacgagg 1080
ccacagccga agaucagccc acacaaccug auguggccac cugccgcuuc uauacuuuag 1140
aaucagugca guggaugaaa aauucggccg ggugguggug gaagcugccu gaugcacugu 1200
cacagauggg cuuguuuggu caaaacaugc aguaccacua cuugggaaga acaggguaua 1260
cuauacacgu acaaugcaau gccucaaagu uccaucaagg augccugcuu guagugugug 1320
ugccugaagc ugagaugggg ugcucuaacu ugaacaacac gcccgaauuc agugaguuau 1380
ccggaggaga cagugccaga auguucaccg auacacaggu cggggaguca aacgccaaga 1440
aaguacagac agcggugugg aacgccggaa ugggcguugg aguggguaau cucacuauuu 1500
ucccucacca auggaucaac cugaggacca acaacagugc aacgcuagug augccuuaca 1560
uaaacagcgu ccccauggau aacauguuca ggcacaauaa cuuaacacua augauuaucc 1620
cauuuguacc gcuuaauuac agcgagggau ccucaccgua cgugcccaua acagucacca 1680
ucgcuccuau gugugcagag uacaacgggc uacggcuggc cagcaaccag ggucuaccag 1740
uuaugacaac accugggagc acgcaauuuc uaacuucaga ugacuuccag ucaccgucag 1800
cgaugccaca guuugauguc accccagaga ugcaaauacc aggccgcgua aauaauuuga 1860
uggagauugc cgagguggac ucaguggugc cugugaauaa cacagaggac aacgugagua 1920
gccuuaaggc auaccagauu ccaguacagu ccaacaguga caaugguaag cagguuuuug 1980
guuuucccuu acaaccgggu gccaacaacg uucugaauag aacccucuug ggugaaauuc 2040
uaaacuauua cacccauugg aguggcagca uaaaacuuac auucauguuc ugugggucug 2100
ccauggccac uggcaaguuc cuucuggcau acucaccacc uggagcagga gucccgaaaa 2160
accgaaaaga ugcuaugcug ggcacccacg ucauauggga uguuggguua caaucaagcu 2220
gcguguugug cguaccgugg auuagccaaa cacacuacag auacgugguu gaggaugaau 2280
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ugcaaagcuc augugacauc uugugcuuug uuucagccug caacgauuuc ucugugcgga 2400
ugcugaaaga uacgcccuuu auaagacagg acacauuuua ucacggccca guggaggagu 2460
cuguggaucg ugcaguggca cguguggcgg acacgauuag uucacggccc acuaacucgg 2520
agucaauucc agcgcucacc gccgccgaga cugggcauac cucccaaguu gugccuagcg 2580
acaccaugca aacaagacau gugaaaaacu accacucacg guccgaaucg uccauugaaa 2640
auuuccuaug ccggucugcc uguguauacu augccacaua caccaauaac ucaaaaaaag 2700
agggguuugc agaguggguu aucaacacua gacagguggc acagcuaaga agaaaguugg 2760
agcucuucac auaucuaagg uuugacuuag aacuaacauu uguuauaacg agcgcacaac 2820
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cuccaggugg cccuguacca acaaagguua aagauuaugc auggcaaacu uccacaaacc 2940
ccagcguuuu cuggacagaa ggaaacgccc caccaaggau guccauccca uucauuagca 3000
uugguaaugc guauaguugu uuuuaugaug gguggacgca guuuucaaga aacggggucu 3060
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ggcagggucc aaucaaaagu acuguuagaa uauauuucaa acccaagcac gugaaggcgu 3180
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cuauaggagu aaccacaagu agaacggaca uuauaacaac aggcacuuuu ggucagcagu 3300
ggcugcagag ccugcugcuc uugggcacug uggccugcag caucucugca cccgcccgcu 3360
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gccugcgggg cagccucacc aagcucaagg gccccuugac caugauggcc agccacuaca 3600
agcagcacug cccuccaacc ccggaaacuu ccugugcaac ccagauuauc accuuugaaa 3660
guuucaaaga gaaccugaag gacuuucugc uugucauccc cuuugacugc ugggagccag 3720
uccaggagac cacaaguaga acggacauua uaacaacagg cacuuuuggu cagcaguccg 3780
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acgguuguga caauauugca agaugccagu gcacagcagg uguguauuau ugugcuucua 3960
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aauauuaucc aaaaagguau caaucacacg ugcuucuugc cgcaggguuu ucugagccgg 4080
gggauugugg ugguauucuc aggugugaac augguguuau aggcaucgug accaugggug 4140
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uggaacaggg agucagggac uacguggaac agcuuggaaa cgccuuuggu ucuggguuua 4260
ccaaccagau uugcgagcaa gucaaucugu uaaaagaguc acuaauaggc caagacucca 4320
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caccguggcg guggcuaaag aaaaaaguga cucaauacua ugggauuccc auggccgaga 4500
gacagaacaa uggcuggcuc aagaaauuca cagaaaugac caaugcaugc aagggcaugg 4560
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ggaagugguu ggauuccuuc uaaaauugaa guacaaugug auuuaacuca auuggcuuaa 7800
cccuaccaca cuuaccgaac uagauaacgg ugugguaggg guaaauuc 7848
<210> 16
<211> 8214
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CVB1-Anti-PD1的基因组序列
<400> 16
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ccggaggaga cagugccaga auguucaccg auacacaggu cggggaguca aacgccaaga 1440
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ccacuucacc guggcggugg cuaaagaaaa aagugacuca auacuauggg auucccaugg 4860
ccgagagaca gaacaauggc uggcucaaga aauucacaga aaugaccaau gcaugcaagg 4920
gcauggaaug gaucgccauc aaaauccaaa aguucauuga guggcucaaa auuaagaucu 4980
ugccagaagu aaaggaaaaa cacgaguuuc uuaccagacu uaagcaacuc ccacucuuag 5040
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ucuccaauau acaguacuuc gcgcacuauu gcagaaagua cgccccacug uacgcagcug 5160
aggcaaaaag aguguucucu cuagaaaaga aaaugagcaa cuacauacag uucaagucca 5220
aaugccguau ugaaccaguc uguuuauugc uccaugguag cccuggagcc ggaaaauccg 5280
uggcuaccaa uuugauugga cgcucacuug cagagaagcu caacaguuca guguauucau 5340
ugccaccaga cccagaccau uuugacggcu auaaacaaca agcugucgua aucauggaug 5400
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cccuugcuag aagguuccac uucgacuuga acauugaggu caucucaaug uacagccaga 5640
auggcaaaau caacaugcca augucaguga aggcuuguga ugaugagugu uguccaguua 5700
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ucaccacguu uguuuccgug gcggggauaa uuuacaucau auacaaauug uuugcuggcu 6120
uccagggggc cuacaccggu augccaaacc aaaaaccuaa aguaccaacu uugaggcagg 6180
cuaaggugca gggaccggca uucgaauucg cuguggcaau gaugaaaaga aaugcuagca 6240
cagugaagac cgaguacggu gaguucacaa ugcuuggaau cuaugacagg ugggcagugc 6300
uaccucguca cgcuagacca gggccuacca uccuaaugaa ugaccaggaa gugggugugg 6360
uggaugccaa ggaguuagug gacaaggaug gcaccaauuu agaauuaaca cucuugaagc 6420
ucaauagaaa ugagaaauuc agagacaucc gaggcuucuu aacacgugag gaggccgaag 6480
ucaacgaggc ugugcuugcu auuaacacca gcaaguuccc aaauauguac auuccaguug 6540
ggcaaguaac agauuauggc uuccucaacu uggguggcac accaacuaag cgcaugcuga 6600
uguacaacuu cccaacacgu gcaggccaau gugggggagu ucuaaugucu acagguaaag 6660
ugcucggaau acacgucggu gguaauggac accaaggguu uucggcagcc cuguuacgcc 6720
acuauuucaa ugacgagcag ggagagauug aguucaucga gagcucuaag gaugcaggcu 6780
uuccagucau uaacacaccu agcaaaacaa agcucgagcc caguguuuuc caucacgugu 6840
uugagggaaa caaagaacca gcaguguuga ggaauggaga cccaagacug aaagccaauu 6900
uugaggaagc cauuuucucc aaguacaucg ggaaugugaa cacacaugua gacgaguaca 6960
ugauggaagc cgucgaccau uaugcaggac aguuagcuac uuuagauauc aguacagaac 7020
cuaugaagcu ugaggaugcu gucuacggua cugagggcuu ggaagcucug gacuugacca 7080
cuagugcugg guaucccuau gucgcccuug guauaaaaaa gagagacauc uuauccaaaa 7140
agucuaagga ccugucuaaa cugagagagu guauggacaa guauggguua aaccucccua 7200
uggucaccua ugugaaggau gaauugaggu cagcagagaa aguggcuaag ggcaaaucca 7260
gacuaaucga ggcguccagu uuaaaugacu caguggcaau gagacagacu uucgguaacc 7320
uguauaagac auuccaucug aacccgggca uagugacugg cagugcaguu ggaugcgauc 7380
ccgacuuguu cuggagcaag auuccaguca ugcucgaugg ucaccucauc gccuuugacu 7440
acaguggaua ugaugccagc cugaguccgg ugugguuugc uugcuugaaa cuguuguugg 7500
aaaagcuggg guacucacac aaggaaacua auuacauaga uuacuugugc aacucccacc 7560
auuuguacag agacaagcac uacuuuguga ggggaggaau gccauccggg uguucuggaa 7620
ccagcauuuu caauucaaug auuaauaaca uaaucaucag aacacugaug uugaaggugu 7680
acaaagggau agaucuagac caauuuagga ugauugcaua uggugacgac gucauugcuu 7740
cguacccgua uccaauugau gcgucauugc uggcugaggc uggcaagggg uauggucuga 7800
uuaugacacc agcagacaaa ggagaguguu ucaaugaagu aacguggacc aacgucacuu 7860
uccugaaaag auacuucaga gcggaugagc aauaucccuu ccucguucac ccagugaugc 7920
caaugaagga cauucaugag ucaauuaggu ggacuaaaga ccccaaaaac acccaagauc 7980
acgugcgauc cuugugcuua uuggccuggc acaauggaga gcaagaauau gagaauuuug 8040
uauccaaaau cagaagcguc ccaguugggc gcugcuugac auugccugcg uucucgacuc 8100
ugcgcaggaa gugguuggau uccuucuaaa auugaaguac aaugugauuu aacucaauug 8160
gcuuaacccu accacacuua ccgaacuaga uaacggugug guagggguaa auuc 8214
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-133靶序列的DNA序列
<400> 17
acagctggtt gaaggggacc aa 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-206靶序列的DNA序列
<400> 18
ccacacactt ccttacattc ca 22
<210> 19
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-133靶序列与miR-206靶序列的串联序列的DNA序列
<400> 19
acagctggtt gaaggggacc aacgatacag ctggttgaag gggaccaaac cggtccacac 60
acttccttac attccatcac ccacacactt ccttacattc ca 102
<210> 20
<211> 507
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HRV2内部核糖体进入位点序列的DNA序列
<400> 20
aacttagaag tttttcacaa agaccaatag ccggtaatca gccagattac tgaaggtcaa 60
gcacttctgt ttccccggtc aatgttgata tgctccaaca gggcaaaaac aactgcgatc 120
gttaaccgca aagcgcctac gcaaagctta gtagcatctt tgaaatcgtt tggctggtcg 180
atccgccatt tcccctggta gacctggcag atgaggctag aaatacccca ctggcgacag 240
tgttctagcc tgcgtggctg cctgcacacc ctatgggtgt gaagccaaac aatggacaag 300
gtgtgaagag ccccgtgtgc tcgctttgag tcctccggcc cctgaatgtg gctaacctta 360
accctgcagc tagagcacgt aacccaatgt gtatctagtc gtaatgagca attgcgggat 420
gggaccaact actttgggtg tccgtgtttc actttttcct ttatatttgc ttatggtgac 480
aatatataca atatatatat tggcacc 507

Claims (24)

1.野生型柯萨奇病毒B组1型(CVB1)或经修饰的CVB1或一种核酸分子用于制备在受试者中治疗肿瘤的药物的用途；
其中，(i)所述核酸分子由所述野生型CVB1或所述经修饰的CVB1的基因组序列或cDNA序列、或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列组成；或者(ii)所述核酸分子为包含所述野生型CVB1或所述经修饰的CVB1的基因组序列或cDNA序列、或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的载体；
其中，所述野生型CVB1的基因组序列如SEQ ID NO：12所示；和/或，所述野生型CVB1的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示；
并且，所述经修饰的CVB1与野生型CVB1相比，具有一个或多个选自下列的修饰：
(a)所述经修饰的CVB1的5’UTR中的内部核糖体进入位点(IRES)序列替换为人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列；
(b)外源核酸的插入，所述外源核酸选自编码细胞因子、或抗肿瘤蛋白或多肽的核酸序列、或一个或多个微小RNA的靶序列。
2.权利要求1的用途，其中，所述人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列如SEQID NO：2所示。
3.权利要求1的用途，其中，所述细胞因子为GM-CSF，和/或所述抗肿瘤蛋白或多肽为抗PD-1或PD-L1的scFv。
4.权利要求1的用途，其中，所述外源核酸的插入位点位于所述经修饰的CVB1基因组的5’UTR与VP4基因之间，或者位于VP1基因与2A基因之间。
5.权利要求1的用途，其中，所述微小RNA的靶序列的插入位点在所述经修饰的CVB1基因组的3’非翻译区(3’UTR)。
6.权利要求1的用途，其中，所述微小RNA的靶序列选自miR-133和/或miR-206的靶序列。
7.权利要求6的用途，其中，所述miR-133的靶序列如SEQ ID NO:3所示；和/或，所述miR-206的靶序列如SEQ ID NO:4所示。
8.权利要求1的用途，其中，所述经修饰的CVB1具有以下特征中的一项：
1)所述经修饰的CVB1的基因组序列选自如SEQ ID NO：13-16任一项所示的核苷酸序列；和
2)所述经修饰的CVB1的cDNA序列选自如SEQ ID NO：8-11任一项所示的核苷酸序列。
9.权利要求1-8任一项的用途，其中，所述药物包括所述野生型CVB1以及所述经修饰的CVB1中的一种或数种。
10.权利要求1-8任一项的用途，其中，所述药物还包含具有抗肿瘤活性的另外的药学活性剂。
11.权利要求10的用途，其中，所述另外的药学活性剂选自另外的溶瘤病毒、化学治疗剂或免疫治疗剂。
12.权利要求11的用途，其具备选自下列的特征：
(i)所述另外的溶瘤病毒选自疱疹病毒、腺病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、麻疹病毒或其任意组合；
(ii)所述化学治疗剂选自5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、甲氨蝶呤、羟基脲、环磷酰胺、达卡巴嗪、米托蒽醌、蒽环类、依托泊苷、铂类化合物、紫杉烷类或其任意组合；
(iii)所述免疫治疗剂选自免疫卡控点抑制剂、肿瘤特异性靶向抗体或其任意组合。
13.权利要求1-8任一项的用途，其中，所述肿瘤选自结直肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、淋巴瘤、成骨肉瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、舌癌、鼻咽癌、鼻中隔鳞状细胞癌、咽鳞癌、颌下腺鳞癌、喉癌、甲状腺癌、甲状腺导管癌和膀胱癌。
14.权利要求1-8任一项的用途，其中，所述受试者为人。
15.一种经修饰的CVB1，其与野生型CVB1相比，5’UTR中的内部核糖体进入位点(IRES)序列替换为人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列；其中，所述野生型CVB1的基因组序列如SEQ ID NO：12所示；和/或，所述野生型CVB1的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
16.权利要求15的经修饰的CVB1，其中，所述人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列如SEQ ID NO：2所示。
17.权利要求15的经修饰的CVB1，其中，所述经修饰的CVB1还包含外源核酸；所述外源核酸选自编码细胞因子、或抗肿瘤蛋白或多肽的核酸序列、或一个或多个微小RNA的靶序列。
18.权利要求17所述的经修饰的CVB1，其中，所述细胞因子为GM-CSF，和/或所述抗肿瘤蛋白或多肽为抗PD-1或PD-L1的scFv。
19.权利要求17所述的经修饰的CVB1，其中，所述外源核酸的插入位点位于所述经修饰的CVB1基因组的5’UTR与VP4基因之间，或者位于VP1基因与2A基因之间。
20.权利要求17所述的经修饰的CVB1，其中，所述微小RNA的靶序列的插入位点在所述经修饰的CVB1基因组的3’非翻译区(3’UTR)。
21.权利要求17所述的经修饰的CVB1，其中，所述微小RNA的靶序列选自miR-133和/或miR-206的靶序列。
22.权利要求21所述的经修饰的CVB1，其中，所述miR-133的靶序列如SEQ ID NO:3所示；和/或，所述miR-206的靶序列如SEQ ID NO:4所示。
23.权利要求15的经修饰的CVB1，其中，所述经修饰的CVB1具有以下特征中的一项：
1)所述经修饰的CVB1的基因组序列为如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；
2)所述经修饰的CVB1的cDNA序列为如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
24.一种核酸分子，其中，(i)所述核酸分子由权利要求15-23任一项所述的经修饰的CVB1的基因组序列或cDNA序列、或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列组成；或者，(ii)所述核酸分子为包含权利要求15-23任一项所述的经修饰的CVB1的基因组序列或cDNA序列、或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的载体。
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