CN103981152B - 一种柯萨奇病毒及其制备抗肿瘤药物之应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柯萨奇病毒，所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒B组3型变异株，其基因组2690位点为腺嘌呤且基因组3231位点为鸟嘌呤。所述柯萨奇病毒具有显著的溶细胞能力和选择特异性，能应用于抗肿瘤药物的制备，尤其是抗肺癌药物、抗肝癌药物、抗前列腺癌药物、抗黑色素瘤药物、抗乳腺癌药物、抗结肠癌药物及抗直肠癌药物。本发明提供的柯萨奇病毒应用于制备抗肿瘤药物，抗肿瘤效果好，安全性高。

Description

一种柯萨奇病毒及其制备抗肿瘤药物之应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物领域，更具体地，涉及一种柯萨奇病毒及其制备抗肿瘤药物之应用。 

背景技术

溶瘤病毒(oncolytic virus)，溶瘤病毒是指能够杀死、溶解肿瘤细胞，或阻碍肿瘤细胞生长的病毒。溶瘤病毒能在肿瘤细胞内复制，导致肿瘤细胞死亡，溶解，或使肿瘤细胞生长停滞。溶瘤病毒能特异性地在肿瘤细胞内复制并杀死肿瘤细胞，病毒对肿瘤细胞的杀伤力，肿瘤病人感染病毒后肿瘤消退。从1956年开始，研究者们就尝试着将病毒用于宫颈癌的治疗。 

柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)是小RNA病毒科肠道病毒属中的一类肠道病毒，常经呼吸道和消化道感染，感染后无症状或有发热、打喷嚏、咳嗽等感冒症状。柯萨奇病毒作为溶瘤病毒进行研究的肠道病毒，能有效的抗多种肿瘤细胞，但在动物实验中发现有些经CVA21治疗的小鼠死于致死性麻痹。 

柯萨奇病毒作为溶瘤病毒治疗目前还存在的问题是，柯萨奇病毒是消化道感染的常见病毒，那些已经被某些型别柯萨奇病毒感染过的患者体内具有病毒受体，如果采用与其抗原型别类似的柯萨奇病毒进行溶瘤治疗，效果可能相对较差。另外，很多经溶瘤病毒单独治疗的肿瘤并没有全部消失，如何促使溶瘤病毒在肿瘤内的扩散而提高其溶瘤效率，需要做进一步的探讨。 

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种柯萨奇病毒 CVB3变异株，其目的在于通过改变其结构蛋白，从而改变柯萨奇病毒的选择特异性，使柯萨奇病毒CVB3变异株仅对特定的肿瘤细胞具有溶细胞能力，由此解决目前柯萨奇病毒应用于抗肿瘤药物的制备损伤人体正常细胞副作用大的技术问题。 

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种柯萨奇病毒，其特征在于，所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒B组3型变异株，其基因组2690位点为腺嘌呤且基因组3231位点为鸟嘌呤。 

优选地，所述的柯萨奇病毒，其基因组1180位点为腺嘌呤。 

优选地，所述的柯萨奇病毒，其基因组4327位点为腺嘌呤，5088位点为胞嘧啶，且7192位点为腺嘌呤。 

优选地，所述的柯萨奇病毒，其基因组96位点为胞嘧啶。 

优选地，所述的柯萨奇病毒，其分类命名为小RNA病毒科肠道病毒属柯萨奇病毒B组3型CVB3-A株Coxsachievirus，于2014年3月21日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址为中国武汉武汉大学。保藏编号为CCTCC V201409。 

所述的柯萨奇病毒，可应用于抗肿瘤药物的制备。 

优选地，所述抗肿瘤药物为抗肺癌药物、抗肝癌药物、抗前列腺癌药物、抗黑色素瘤药物、抗乳腺癌药物、抗结肠癌药物或抗直肠癌药物。 

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果： 

(1)当所述柯萨奇病毒基因组2690位点突变为腺嘌呤且3231位点突变为鸟嘌呤后，其受体主要为CAR(Coxsackievirus-adenovirus receptor，柯萨奇病毒腺病毒受体)和DAF(decay accelerating factor，衰变加速因子)，由于受体的改变，使得本发明提供的柯萨奇病毒亲嗜CAR、DAF高表达的肿瘤细胞，而对人体正常细胞亲和力低，提高了柯萨奇病毒的选择特异性，从而提高了柯萨奇病毒用于制备抗肿瘤药物的安全性。 

（2）当所述柯萨奇病毒的基因组1180位点突变为腺嘌呤时，通过与黏附因子的作用增强了其与CAR的结合力，使得所述柯萨奇病毒与目标细胞的亲和力进一步加强。 

（3）当所述柯萨奇病毒的基因组4327位点突变为腺嘌呤，5088位点突变为胞嘧啶，且7192位点突变为腺嘌呤时，柯萨奇病毒聚合酶和调控蛋白的活性发生了改变，使得本发明提供的柯萨奇病毒具有更强的溶细胞能力，所述柯萨奇病毒用于制备抗肿瘤药物，抗肿瘤效果进一步提高。 

（4）当所述柯萨奇病毒基因组96位点突变为胞嘧啶时，由于5’UTR区域与病毒蛋白合成调控相关，因此可能通过高量表达病毒蛋白，使得病毒体合成数量增加，进一步提高了柯萨奇病毒的溶细胞能力，从而提高了其抗肿瘤效果。 

附图说明

图1是本发明提供的柯萨奇病毒Coxsackievirus CVB3-A电镜照片； 

图2是实施例1至实施例4提供的柯萨奇病毒CVB3变异株一步生长曲线； 

图3是实施例6体外抗肿瘤实验结果电镜照片； 

其中图3（1a）为A549正常细胞的光镜照片，3（1b）为CVB3-A感染的A549细胞的光镜照片（M0I=10）；图3（2a）为MCF-7正常细胞的光镜照片，图3（2b）为CVB3-A感染的MCF-7细胞的电镜照片（M0I=10）；图3（3a）为SUN-398正常细胞的电镜照片，图3（3b）为CVB3-A感染的SUN-398细胞电镜照片（M0I=10）；图3（4a）为人胚肾正常细胞的电镜照片，图3（4b）为CVB3-A感染的人胚肾细胞的电镜照片（M0I=1000）； 

图4为实施例7病毒体外抗肿瘤效果图。 

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体 实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。 

本发明提供了一种柯萨奇病毒，所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒B组3型变异株，其基因组2690位点为腺嘌呤且3231位点为鸟嘌呤。优选地，所述柯萨奇病毒的基因组1180位点为腺嘌呤。优选地，所述柯萨奇病毒的基因组4327位点为腺嘌呤，5088位点为胞嘧啶，且7192位点为腺嘌呤。优选地，所述柯萨奇病毒的基因组96位点为胞嘧啶。优选地，所述柯萨奇病毒，其分类命名为Coxsachievirus CVB3-A，于2014年3月21日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC V201409。 

所述柯萨奇按照如下方法获取： 

（1）检索野生型柯萨奇病毒B组3型Nancy株的基因组序列，其GeneBank NO.JX312064.1。 

（2）采用基因合成的方法，获得结构蛋白VP1重组的柯萨奇病毒CVB3变异株cDNA，并通过构建质粒转染细胞获得结构蛋白VP1重组的柯萨奇病毒CVB3变异株。所述cDNA其处于结构蛋白VP1基因编码区域的柯萨奇病毒基因组2690位点突变为腺嘌呤，3231位点突变为鸟嘌呤。 

（3）将步骤（2）中获得的结构蛋白VP1重组的柯萨奇病毒CVB3变异株，处于结构蛋白VP2基因编码区域的柯萨奇病毒基因组1180位点，突变为腺嘌呤，获得结构蛋白VP1/VP2重组的柯萨奇病毒CVB3变异株。 

（4）将步骤（2）和步骤（3）获得的结构蛋白VP1重组的柯萨奇病毒CVB3变异株和结构蛋白VP1/VP2重组的柯萨奇病毒CVB3变异株，处于调控蛋白2C、3A、3D基因编码区域的柯萨奇病毒基因组4327位点、5088位点、7192位点分别突变为腺嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤，获得结构蛋白VP1/调控蛋白重组的柯萨奇病毒CVB3变异株和结构蛋白VP1/VP2/调控蛋白重组的柯萨奇病毒CVB3变异株。 

（5）将步骤（2）、步骤（3）和步骤（4）获得的结构蛋白VP1重组的柯萨奇病毒CVB3变异株、结构蛋白VP1/VP2重组的柯萨奇病毒CVB3变异株、结构蛋白VP1/调控蛋白重组的柯萨奇病毒CVB3变异株、结构蛋白VP1/VP2/调控蛋白重组的柯萨奇病毒CVB3变异株，处于5’UTR区域的柯萨奇病毒基因组96位点，突变为胞嘧啶，获得结构蛋白VP1/5’UTR重组的柯萨奇病毒CVB3变异株、结构蛋白VP1/VP2/5’UTR重组的柯萨奇病毒CVB3变异株、结构蛋白VP1/调控蛋白/5’UTR重组的柯萨奇病毒CVB3变异株、结构蛋白VP1/VP2/调控蛋白/5’UTR重组的柯萨奇病毒CVB3变异株。 

（6）采用病毒一步生长曲线评价步骤（2）至步骤（4）中获得的所有柯萨奇病毒CVB3变异株的病毒复制能力即溶细胞能力； 

（8）保留具有明显溶细胞能力的柯萨奇病毒CVB变异株。 

所述野生型柯萨奇病毒B组3型Nancy株的基因组序列在GeneBank查阅，其编号为：JX312064.1 

所述基因定点突变的方法，可为核苷酸引物介导的定点突变、重叠延伸PCR定点突变、盒式突变、基因合成等。核苷酸引物介导的定点突变的具体方法参见Zoller MJ,Smith M.1982.Oligonucleotide-directted mutagenesis using M13-derived vectors:an efficient and general procedure for the production of point mutations in any fragment of DNA.Nucleic Acids Reserch,10(20):6487-6500。重叠延伸PCR定点突变的具体方法参见Davis GT,Bedzyk WD,et.al.Single chain antibody(SCA)encoding genes:one-step construction and expression in eukaryotic cells.Biotechnology.1991Feb;9(2):165-9.盒式突变的具体方法参见Wells JA,Vasser M,Powers DB.Cassette mutagenesis:an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.Gene.1985;34(2-3):315-23.基因合成的具体方法参见分子克隆实验指南（第三版）。 

所述一步生长曲线，按照如下方法制作： 

1）接种Hela细胞，形成单层后，用所述柯萨奇病毒感染，获得感染细胞； 

2）37℃、5%CO₂培养，不同时段，收集感染细胞并进行裂解，测定病毒滴度； 

3）根据步骤2）中获得的数据，绘制病毒滴度随培养时间的变化曲线，即一步生长曲线。 

CVB3为溶细胞病毒，在细胞培养上清中其子代病毒出现的越早，滴度上升越快，滴度越高，说明敏感细胞存活率越低，相应的柯萨奇病毒变异株溶细胞能力越高；柯萨奇病毒的溶细胞能力，是指其杀死并溶解目标细胞的能力。 

为评价本发明提供的柯萨奇病毒应用于抗肿瘤药物制备的药效和安全性，进行了病毒体外抗肿瘤实验、病毒体内抗肿瘤实验、病毒安全性实验。 

A、病毒体外抗肿瘤实验： 

（A1）将一定量的实验用肿瘤病毒接种至多孔板； 

（A2）将本发明提供的柯萨奇病毒分别感染步骤（A1）中的实验用肿瘤病毒； 

（A3）培养24小时和48小时候，在显微镜下观察肿瘤细胞病变，统计其存活率，存活率越低，抗肿瘤效果越好。 

B、病毒体内抗肿瘤实验： 

（B1）收集实验用肿瘤细胞，接种于裸鼠皮下，获得荷瘤小鼠； 

（B2）当肿瘤生长至7～8mm³时，将荷瘤小鼠随机分为阳性对照组、阴性对照组、病毒的高剂量组、病毒的中剂量组、病毒的低剂量组和病毒瘤内注射组。 

（B3）对于阳性对照组，注射相应肿瘤的一线抗肿瘤化药；对于阴性对照组，注射生理盐水；对于病毒的高剂量组，注射10⁹PFU（空斑形成单位）的本发明的柯萨奇病毒；对于病毒的中剂量组，注射10⁷PFU本发明提 供的柯萨奇病毒；对于病毒的低剂量组，注射10⁵PFU本发明提供的柯萨奇病毒；对于瘤内注射组，注射10⁹PFU本发明提供的柯萨奇病毒。除瘤内注射组外，其余组均为尾静脉注射。注射时间为隔天一次。 

（B4）观察小鼠生长情况，肿瘤生长情况，同时测量肿瘤体积，肿瘤体积=0.52×长×宽²。 

C、病毒安全性实验： 

（C1）将不同浓度的所述柯萨奇病毒的制剂，静脉注射到实验动物体内； 

（C2）测量给药前、给药后第1天（24小时）、第7天及第14天，实验动物的心电图、血液学、血液生化学、尿、粪指标及免疫学指标，观察给药后14天内动物的死亡情况及毒性反应； 

（C3）根据上述指标，综合评价所述柯萨奇病毒的安全性。 

按照上述方法，获取的柯萨奇病毒CVB3变异株，当所述柯萨奇病毒基因组2690位点突变为腺嘌呤且3231位点突变为鸟嘌呤后，其受体主要为CAR和DAF，由于受体的改变，使得本发明提供的柯萨奇病毒亲嗜CAR、DAF高表达的细胞，尤其是肺癌细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞、黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞和直肠癌细胞；当所述柯萨奇病毒的基因组1180位点突变为腺嘌呤时，通过与黏附因子的作用增强了其与CAR的结合力，使得所述柯萨奇病毒与目标细胞的亲和力进一步加强；当所述柯萨奇病毒的基因组4327位点突变为腺嘌呤，5088位点突变为胞嘧啶，且7192位点突变为腺嘌呤时，柯萨奇病毒聚合酶和调控蛋白的活性发生了改变，使得本发明提供的柯萨奇病毒具有更强的溶细胞能力；当所述柯萨奇病毒基因组96位点突变为胞嘧啶时，由于5’UTR区域与病毒蛋白合成调控相关，因此可能通过高量表达病毒蛋白，使得病毒体合成数量增加。上述位点之间存在协同作用，因此以Coxsackievirus CVB3-A的综合抗肿瘤效果及安全性最优。 

因此，所述柯萨奇病毒一方面由于与特异的受体具有高亲和力，因此其具有高度选择性，靶向性好，仅作用于高表达相应受体肿瘤细胞，而对正常细胞影响很小，其应用于制备抗癌药物具有较高安全性；另一方面，由于病毒在目标细胞内合成量大、溶细胞能力强，因此抗癌效果显著，能应用于抗肿瘤药物的制备；优选地，本发明提供的柯萨奇病毒，对于肺癌细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞、黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞和直肠癌细胞具有较高亲和力，因此所述抗肿瘤药物优选为抗肺癌药物、抗肝癌药物、抗前列腺癌药物、抗黑色素瘤药物、抗乳腺癌药物、抗结肠癌药物或抗直肠癌药物。 

以下为实施例：其仅以基因合成及核苷酸引物介导基因定点突变的方法为例获取相应基因重组的柯萨奇病毒CVB3变异株，然而获得点突变的方法不限于实施例中列举的方法，凡能获得相应突变的方法，均能获得具有相应溶细胞能力及安全性的柯萨奇病毒CVB3变异株。 

实施例1 

获取结构蛋白VP1重组的柯萨奇病毒CVB3变异株： 

1、病毒cDNA、细胞系、载体与菌株： 

病毒cDNA：在野生型柯萨奇病毒B组3型Nancy株的基因组cDNA序列上替换相应碱基位点，并在其5’端添加NotI酶切位点，3’端添加SalI酶切位点。然后此基因组cDNA送到基因合成公司（江苏金唯智生物技术有限公司）进行全基因合成 

克隆载体和酶：pVax1购自Invitrogen公司，NotI酶，SalI酶购自大连Takara公司 

菌株：Stbl3感受态细胞购自invitrogene公司； 

Hela细胞：华中科技大学同济医院妇科肿瘤研究所马丁教授惠赠。 

2、转染试剂： 

转染试剂：Lipofactamine2000及相应转染试剂Opti-MEM购自 invitrogene公司； 

3、实验步骤： 

（1）检索野生型柯萨奇病毒B组3型Nancy株的基因组序列。 

（2）采用基因合成的方法，获得结构蛋白VP1重组的柯萨奇病毒CVB3变异株cDNA，并通过构建质粒转染细胞获得结构蛋白VP1重组的柯萨奇病毒CVB3变异株。所述cDNA其处于结构蛋白VP1基因编码区域的柯萨奇病毒基因组2690位点突变为腺嘌呤，3231位点突变为鸟嘌呤。 

具体做法如下： 

（2-1）获得含有G2690A和A3231G两突变点的cDNA。 

采用基因合成技术，合成结构蛋白VP1重组的柯萨奇病毒CVB3变异株的cDNA。该变异株的2690位点为腺嘌呤，3231为鸟嘌呤位点，并且在基因合成过程中在结构蛋白VP1重组的柯萨奇病毒CVB3变异株的cDNA的5’端添加NotI酶切位点，3’端添加SalI酶切位点。苏州金唯智生物科技有限公司，完成该步骤。 

（2-2）根据基因合成公司提供的测序结果确定得到2690位点为腺嘌呤，3231为鸟嘌呤位点的结构蛋白VP1重组的柯萨奇病毒CVB3变异株的cDNA。 

（2-3）采用引物定点突变的方法将pVAX1真核表达质粒（购自Invitrogen公司）的多克隆位点处的ApaI酶切位点定点突变为SalI单酶切位点，获得pVAX1-SalI质粒。 

具体做法如下: 

首先，根据引物定点突变法（《分子克隆实验指南》第三版）设计上游引物pVAX-Apa-SalI-F和下游引物pVAX-Apa-SalI-R。 

pVAX-Apa-SalI-F:5’-GTCGACGTTTAAACCCGCTGATCAG-3’ 

pVAX-Apa-SalI-R:5’-GTTTAAACGTCGACTCTAGACTCGAGCGGCCG-3’ 

其次，利用高保真的DNA聚合酶扩增和所述上下游引物pVAX1载体，PCR反应条件为94℃变性2min，进行30个循环，循环温度为94℃30s，55℃30s，68℃3min，最后在68℃在延伸5min，1%琼脂糖凝胶后，DNA胶回收试剂盒（Axygen公司）回收pVAX1-SalI片段,DpnI(Fermentas公司）酶消化模板DNA2h后转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞（Invitrogen公司）。待克隆长出后直接挑取单克隆摇菌后用质粒抽提试剂盒（Axygen公司）提质粒后送到测序公司（苏州金唯智生物科技有限公司）进行测序，确定得到含有SalI单酶切位点的pVAX1-SalI真核表达质粒。 

（2-4）利用酶切连接的原理将基因合成得到的结构蛋白VP1重组的柯萨奇病毒CVB3变异株的cDNA连接到真核表达载体pVAX1-SalI质粒中，获得完整的真核表达质粒pVAX1-CBV3-VP1。 

具体做法如下： 

首先，将基因合成的含有结构蛋白VP1重组的柯萨奇病毒CVB3变异株的cDNA的质粒用NotI（fermentas公司）和SalI（fermentas公司）进行双酶切，37℃孵育2h，1%琼脂糖凝胶电泳跑胶后利用DNA胶回收试剂盒（Axygen公司）回收结构蛋白VP1重组的柯萨奇病毒CVB3变异株的cDNA片段（7400bp）。 

然后，将所述pVAX1-SalI质粒用NotI和SalI进行双酶切，37℃孵育2h，1%琼脂糖凝胶电泳跑胶后利用DNA胶回收试剂盒（Axygen公司）回收pVAX1载体片段（2999bp）。 

最后，将上述两个片段利用DNA连接试剂盒（TakaRa公司）在16℃连接1h后转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞（Invitrogen公司）。待转化子克隆长出后利用菌落PCR进行鉴定并基因测序，确保得到含有目标点突变G2690A和A3231G的pVAX1-CBV3-VP1质粒。 

（2-5）pVAX1-CBV3-VP1质粒转染细胞拯救病毒： 

接种Hela细胞至12孔板，用不含抗生素的10%小牛血清DMEM培养； 细胞单层密度达到90%后，用转染试剂进行pVAX1-CBV3-VP1质粒转染，具体操作方法，参见其说明书。 

（2-6）结构蛋白VP1重组的柯萨奇病毒CVB3变异株纯化： 

用无血清的DMEM培养基将病毒液做连续10倍稀释，分别加入6孔培养板上的单层Hela细胞中，每个稀释度做2个复孔，并设2个对照孔。37℃5%CO₂孵箱培养1h后，弃去病毒液，以无血清DMEM洗涤细胞2次，加入37℃含无血清DMEM的0.8%琼脂糖凝胶覆盖（2ml/孔），37℃5%CO₂孵箱培养30min后倒置培养板，培养72小时，0.05%中性红染色，置于避光暗盒孵育2h，观察空斑性状和数量，挑取单个空斑接种Hela细胞，当细胞病变效应（CPE）达到75%～100%时收获病毒液，反复冻融3次，4℃12000rpm离心15min,上清病毒液分装后储存在-80℃。 

实施例2 

获得结构蛋白VP1/VP2重组的柯萨奇病毒CVB3变异株： 

1、病毒、细胞系、载体与菌株： 

病毒：实施例1中获取的结构蛋白VP1重组的柯萨奇病毒CVB3变异株； 

载体、工具酶、菌株与细胞系：pVax1-SalI为实施例1中构建、NotI酶和SalI酶、Stbl3感受态细胞、Hela细胞来源同实施例1。 

2、转染试剂： 

转染试剂：Lipofactamine2000及相应转染试剂Opti-MEM购自invitrogene公司； 

3、实验步骤： 

采用核苷酸引物介导基因定点突变的方法，将实施例1中获得的结构蛋白VP1重组的柯萨奇病毒CVB3变异株，处于结构蛋白VP2基因编码区域的柯萨奇病毒基因组1180位点，突变为腺嘌呤，获得结构蛋白VP1/VP2重组的柯萨奇病毒CVB3变异株。 

具体方法如下： 

（3-1）根据引物定点突变法（《分子克隆实验指南》第三版），设计柯萨奇病毒基因组1180位点突变用上下游引物G1180A-R和G1180A-F序列，及连接用上下游引物CBV-(NotI)-F和CBV-(SalI)-R序列，并合成所述引物。 

G1180A-R:5’-CTTCCACCACCATCCTGGTGAGGTTTTCTGCCATT-3’ 

G1180A-F:5’-CCTCACCAGGATGGTGGTGGAAGCTGCCCGA-3’ 

（3-2）用高保真的DNA聚合酶pfx(invitrogen公司）以实施例1中得到pVAX1-CBV3-VP1质粒为模板并用引物CBV-(NotI)-F/G1180A-R扩增重组柯萨奇病毒CBV3基因组片段的1-1192片段且在5’端添加NotI酶切位点。PCR反应条件为94℃变性2min，然后进行30个循环，循环温度为94℃30s，55℃30s，68℃1min20s，最后在68℃在延伸5min，1%琼脂糖凝胶后，DNA胶回收试剂盒（Axygen公司）回收NotI-(1-1192)片段。 

（3-3）高保真的DNA聚合酶pfx(invitrogen公司）以实施例1中得到pVAX1-CBV3-VP1质粒为模板并用引物G1180A-F/CBV-(SalI)-R扩增重组柯萨奇病毒CBV3基因组片段的1170-7400片段且在3’端添加SalI酶切位点。PCR反应条件为94℃变性2min，然后进行30个循环，循环温度为94℃30s，55℃30s，68℃6min，最后在68℃在延伸10min，1%琼脂糖凝胶后，DNA胶回收试剂盒（Axygen公司）回收(1170-7400)-SalI片段。 

（3-4）利用同源重组的原理将PCR扩增得到的结构蛋白VP1/VP2重组的柯萨奇病毒CVB3变异株的cDNA的两个片段重组到真核表达载体pVAX1-SalI质粒中，获得完整的真核表达质粒pVAX1-CBV3-VP1/VP2。 

具体做法如下： 

首先，将实施例1中得到的pVAX1-SalI质粒用NotI和SalI进行双酶切，37℃孵育2h，1%琼脂糖凝胶电泳跑胶后利用DNA胶回收试剂盒（Axygen公司）回收pVAX1载体片段（2999bp）。 

然后，将（3-3）、（3-4）以及pVAX1载体片段利用GeneArt无缝连接试剂盒（invitrogen公司）进行同源重组，室温放置1h后转化E.coli Stbl3感受态细胞（Invitrogen公司）。待转化子克隆长出后利用菌落PCR进行鉴定并基因测序，确保得到含有目标点突变G1180A,G2690A和A3231G的pVAX1-CBV3-VP1/VP2质粒。 

（3-5）用pVAX1-CBV3-VP1/VP2质粒转染细胞拯救病毒，获得结构蛋白VP1/VP2重组的柯萨奇病毒CVB3变异株并纯化，具体步骤同实施例1。 

实施例3 

获得结构蛋白VP1/VP2/调控蛋白重组的柯萨奇病毒CVB3变异株： 

1、病毒cDNA、细胞系、载体与菌株： 

病毒cDNA：在野生型柯萨奇病毒B组3型Nancy株的基因组cDNA序列上替换相应碱基位点，并在其5’端添加NotI酶切位点，3’端添加SalI酶切位点。然后此基因组cDNA送到基因合成公司（江苏金唯智生物技术有限公司）进行全基因合成。 

克隆载体和酶：pVax1购自Invitrogen公司，NotI酶，SalI酶购自大连Takara公司 

菌株：Stbl3感受态细胞购自invitrogene公司； 

Hela细胞：华中科技大学同济医院妇科肿瘤研究所马丁教授惠赠。 

2、转染试剂： 

转染试剂：Lipofactamine2000及相应转染试剂Opti-MEM购自invitrogene公司； 

3、实验步骤： 

（1）检索野生型柯萨奇病毒B组3型Nancy株的基因组序列。 

（2）采用基因合成的方法，获得结构蛋白VP1/VP2/调控蛋白重组的柯萨奇病毒CVB3变异株cDNA，并通过构建质粒转染细胞获得结构蛋白 VP1/VP2/调控蛋白重组的柯萨奇病毒CVB3变异株。所述cDNA其处于结构蛋白VP1基因编码区域的柯萨奇病毒基因组2690位点突变为腺嘌呤，3231位点突变为鸟嘌呤，处于结构蛋白VP2基因编码区域的柯萨奇病毒基因组1180位点，突变为腺嘌呤，处于调控蛋白2C基因编码区域的柯萨奇病毒基因组4327位点突变为腺嘌呤，处于调控蛋白3A基因编码区域的柯萨奇病毒基因组5088位点突变为胞嘧啶，处于调控蛋白3D基因编码区域的柯萨奇病毒基因组7192位点突变为腺嘌呤。 

具体做法如下与实施例1类似，区别仅在于，采用基因合成技术合成变异株cDNA时，该变异株的2690位点为腺嘌呤，3231位点为鸟嘌呤位点，1180位点为腺嘌呤，4327位点为腺嘌呤，5088位点为胞嘧啶，7192位点为腺嘌呤。 

2690位点突变用上下游引物： 

G2690A-R:5’-CCTGAGTTTTTATACTCCGTAAAGTACACGCA-3’ 

G2690A-F:5’-CTTTACGGAGTATAAAAACTCAGGTGCCAAGCGGT-3’ 

3231位点突变用上下游引物： 

A3231G-R:5’-GAAGTTCACGCTCTTTGCCTTCTCGTATTGG-3’ 

A3231G-F:5’-GAAGGCAAAGAGCGTGAACTTCCAACCCAGCGGA-3’ 

1180位点突变用上下游引物： 

G1180A-R:5’-CTTCCACCACCATCCTGGTGAGGTTTTCTGCCATT-3’ 

G1180A-F:5’-CCTCACCAGGATGGTGGTGGAAGCTGCCCGA-3’ 

4327位点突变用上下游引物： 

G4327A-R:5’-CTTTGCTTCAGCTGCGTAGAGGGGAGCGTACTTT-3’ 

G4327A-F:5’-CCTCTACGCAGCTGAAGCAAAGAGGGTGTTCT-3’ 

5088位点突变用上下游引物： 

T5088C-R:5’-CCGCAATGGCGGGCGGTGGTGGTGTCTCTGGT-3’ 

T5088C-F:5’-CACCACCACCGCCCGCCATTGCGGACCTGCTCA-3’ 

7192位点突变用上下游引物： 

G7192A-R:5’-CATATTCGTGTTCCCCGTTATGCCAAGCTAAT-3’ 

G7192A-F:5’-CATAACGGGGAACACGAATATGAGGAGTTCATC-3’ 

实施例4 

获得结构蛋白VP1/VP2/调控蛋白/5’UTR重组的柯萨奇病毒CVB3变异株，Coxsackievirus CVB3-A： 

1、病毒、细胞系、载体与菌株： 

病毒：实施例3中获取的结构蛋白VP1/VP2/调控蛋白重组的柯萨奇病毒CVB3变异株； 

载体、工具酶、菌株与细胞系、：pVax1-SalI为实施例1中构建、NotI酶和SalI酶、Stbl3感受态细胞、Hela细胞来源同实施例1。 

2、转染试剂： 

转染试剂：Lipofactamine2000及相应转染试剂Opti-MEM购自invitrogene公司； 

3、实验步骤： 

采用核苷酸引物介导基因定点突变的方法，将实施例3中获得的结构蛋白VP1/VP2/调控蛋白重组的柯萨奇病毒CVB3变异株，处于5’UTR区域的柯萨奇病毒基因组96位点，突变为胞嘧啶，获得结构蛋白VP1/VP2/调控蛋白/5’UTR重组的柯萨奇病毒CVB3变异株。 

具体方法与实施例2类似，区别仅在于：设计柯萨奇病毒基因组96位点突变用上下游引物T96C-R和T96C-F序列，替代柯萨奇病毒基因组1180位点突变用上下游引物G1180A-R和G1180A-F序列；以实施例3中得到pVAX1-CBV3-VP1/VP2/调控蛋白质粒为模板，替代实施例1中得到pVAX1-CBV3-VP1质粒为模板。 

T96C-R:5’-GTTACAGTTGGGGGAGGGGGTATAAAACAGGCGC-3’ 

T96C-F:5’-ATACCCCCTCCCCCAACTGTAACTTAGAAGTA-3’ 

将获得的结构蛋白VP1/VP2/调控蛋白/5’UTR重组的柯萨奇病毒CVB3 变异株，命名为Coxsackievirus CVB3-A，于2014年3月21日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC V201409。 

实施例5 

柯萨奇病毒变异株筛选： 

1、病毒与细胞系： 

病毒：实施例1至实施例4中获得的结构蛋白VP1重组的柯萨奇病毒CVB3变异株、结构蛋白VP1/VP2重组的柯萨奇病毒CVB3变异株、结构蛋白VP1/VP2/调控蛋白重组的柯萨奇病毒CVB3变异株、结构蛋白VP1/VP2/调控蛋白/5’UTR重组的柯萨奇病毒CVB3变异株； 

细胞系：A549、H460、SUN398、MCF-7、正常人肾细胞、正常人胚肺成纤维细胞 

2、实验步骤： 

用病毒一步生长曲线实验评价所述柯萨奇病毒CVB3变异株的溶细胞能力： 

接种5×10⁵个/孔Hela细胞在6孔板上，待其长成单层时，以10MOI的CVB3-A感染Hela细胞，37℃、5%CO₂培养，分别在感染后2、4、6、8、10、12小时收集感染细胞（每个时间点设3个复孔），反复冻融3次，离心获取上清，用微量全细胞病变法检测病毒滴度，绘制病毒生长曲线。具体方法参见Kong WP,Ghadge GD,Roos RP.Involvement of cardiovirus leader in host cell-restricted virus expression.Proc Natl Acad Sci U S A.1994Mar1;91(5):1796-800. 

结果如图2所示。 

实施例1至实施例4获得的柯萨奇病毒CVB3变异均具有较强的溶细胞能力溶细胞能力，感染4小时内病毒数量均出现显著增长，其中实施例4提供的结构蛋白VP1/VP2/调控蛋白/5’UTR重组的柯萨奇病毒CVB3变异株Coxsackievirus CVB3-A溶细胞能力最优。 

实施例6 

病毒体外抗肿瘤实验： 

1、病毒与细胞系： 

病毒：实施例4提供的Coxsachievirus CVB3-A 

细胞系：A549、H460、MCF-7、Sun-398、人肺成纤维细胞、人胚肾细胞分别购自中科院上海细胞库和武汉原生原代生物医药科技有限公司 

2、实验步骤： 

（A1）将A549、H460、MCF-7、SUN-398、SKOV3、人肺成纤维细胞、人胚肾细胞等各5×10⁵个/孔接种至12孔板培养至形成细胞单层； 

（A2）分别感染Coxsachievirus CVB3-A，感染量为MOI（感染复数）为0.1～1000； 

（A3）逐日在显微镜下观察肿瘤细胞病变，在病毒感染培养72小时统计其存活率，结果如表1所示。电镜照片，如图3所示。 

表1Coxsachievirus CVB3-A体外抗肿瘤实验结果 

注:“-”表示无细胞病变效应；“+”表示15%的细胞出现病变效应；“+++”表示50%-75%的细胞出现病变效应；“++++”表示超过75%的细胞出现病变效应。 

由表3可知，Coxsachievirus CVB3-A对肺癌细胞株A549、H460，乳 腺癌细胞株MCF-7、肝癌细胞株SUN398有较好的杀细胞作用，而对人体正常细胞：卵巢癌细胞株SKOV3、人肺成纤维细胞、人胚肾细胞无杀灭作用，不影响正常细胞生长。 

实施例7 

病毒体内抗肿瘤实验： 

1、病毒、细胞系与实验动物： 

病毒：Coxsachievirus CVB3-A； 

细胞系：A549细胞购自中科院上海细胞库； 

实验动物：3周龄BALB/c裸鼠，体重15±3g。 

2、实验步骤： 

（B1）收集对数生长期的A549细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，接种于BALB/c裸鼠右腋皮下（1×10⁷个细胞/只），获得荷瘤小鼠； 

（B2）当肿瘤生长至7～8mm³时，将荷瘤小鼠随机分为阳性对照组、阴性对照组、病毒的高剂量组、病毒的中剂量组、病毒的低剂量组和病毒瘤内注射组。 

（B3）对于阳性对照组，注射相应肿瘤的一线抗肿瘤化药（多西他赛）；对于阴性对照组，注射生理盐水；对于病毒的高剂量组，注射10⁹PFU（空斑形成单位）本发明的柯萨奇病毒；对于病毒的中剂量组，注射10⁷PFU本发明提供的柯萨奇病毒；对于病毒的低剂量组，注射10⁵PFU本发明提供的柯萨奇病毒；对于瘤内注射组，注射10⁹PFU本发明提供的柯萨奇病毒。除瘤内注射组外，其余组均为尾静脉注射。注射时间为隔天一次。 

（B4）观察小鼠生长情况，肿瘤生长情况，同时测量肿瘤体积，肿瘤体积=0.52×长×宽²。 

肿瘤生长情况如图4所示。 

测量肿瘤体积如表2所示。 

实施例8 

病毒安全性实验： 

1、病毒与实验用动物： 

病毒：实施例1至实施例4获得的柯萨奇病毒CVB3变异株； 

实验用动物：年龄3～4岁，体重2.6～3.6kg的食蟹猴 

2、实验步骤： 

将病毒提供给药物安全性评估机构，按照如下方法进行病毒安全性实验： 

方法：本实验求无毒性反应和明显中毒剂量。对于每种病毒，做了3个剂量，即1×10⁸PFU/㎏、1×10⁹PFU/㎏、1×10¹⁰PFU/㎏剂量组，每组5只， ♀、兼用，静脉推注给药，给药容积为5ml/kg。测给药前、给药后24h(d1)、d7、d14分别检查心电图、血液学、血液生化学、尿、粪指标及免疫学指标，观察给药后14天内动物的死亡情况及毒性反应。 

实验结果：上述柯萨奇病毒变异株可能的毒性靶器官均为肝脏和心肌，但相关的天门冬氨酸氨基转换酶（AST）、丙氨酸氨基转换酶（ALT）、肌酸磷酸激酶（CK）的异常增高为一过性，均无器质性损伤。综合安全性评价：实施例3和实施例4提供的柯萨奇病毒变异株安全性相对较高，实施例1和实施例提供的柯萨奇病毒变异株亦较为安全，整体安全性明显强于现有的柯萨奇病毒。 

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (7)

1.一种柯萨奇病毒Coxsackievirus，其特征在于，所述柯萨奇病毒为基因组序列如GeneBank NO.JX312064.1所示的柯萨奇病毒B组3型Nancy株的变异株，所述变异株的基因组的第2690位点为腺嘌呤且基因组的第3231位点为鸟嘌呤。

2.如权利要求1所述的柯萨奇病毒，其特征在于，所述柯萨奇病毒的基因组的第1180位点为腺嘌呤。

3.如权利要求2所述的柯萨奇病毒，其特征在于，所述柯萨奇病毒的基因组的第4327位点为腺嘌呤，第5088位点为胞嘧啶，且第7192位点为腺嘌呤。

4.如权利要求3所述的柯萨奇病毒，其特征在于，所述柯萨奇病毒的基因组的第96位点为胞嘧啶。

5.如权利要求1至4任意一项所述的柯萨奇病毒，其特征在于，其分类命名为Coxsackievirus CVB3-A，于2014年3月21日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC V 201409。

6.一种如权利要求1至5任意一项所述的柯萨奇病毒的应用，其应用于制备抗肿瘤药物。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为抗肺癌药物、抗肝癌药物或抗乳腺癌药物。