CN108424881A - 一株肠道病毒68型及其在制备ev-d68型感染动物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株肠道病毒68型(enterovirus D‑68)EV‑D68、其构建方法及在制备肠道病毒68型感染动物中的用途。本发明的肠道病毒68型(enterovirus D‑68)EV‑D68是从KP240936.1全基因序列出发，将全基因序列转染至293T细胞，并通过感染RD细胞获得的病毒株。本发明的EV‑D68病毒P9可有效应用于1日龄Balb/C乳鼠建立EV‑D68的攻毒模型，呈现前肢和后肢麻痹症状，且攻毒后乳鼠全部死亡，满足动物模型的要求。
Description
【技术领域】
本发明涉及病毒学。特别地，本发明涉及一株肠道病毒68型，以及该病毒 在制备新型肠道病毒EV-D68型病毒感染动物模型中的应用。
【背景技术】
1962年美国首次从下呼吸道感染的病人中分离出新型肠道病毒EV-D68。 EV-D68的感染所引起的临床症状多表现为呼吸系统疾病(上呼吸道感染和下呼 吸道感染)，严重者可引起中枢神经系统性和脊髓灰质炎病毒感染类似的疾病症 状。目前，EV-D68已经成为全球范围内的传染性疾病。
EV-D68属于小RNA病毒科肠道病毒属。EV-D68的基因组为7.4kb左右单 股正链RNA，包括一个ORF和两端非编码区序列。ORF编码一个多聚蛋白，进 一步剪切翻译生成4个结构蛋白(VP4，VP2，VP3和VP1)和7个非结构蛋白 (2A，2B，2C，3A，3B，3C和3D)。其中2A蛋白酶和3C蛋白酶的功能与EV-71 和CV-A16类似，两者切割结构蛋白，使其包装形成直径约30nm的病毒颗粒， 而亚单位蛋白VP1区序列变异较大，常用来做基因分型。EV-D68可感染粒细胞、 单核细胞、T细胞、B细胞等淋巴细胞，并产生感染性病毒颗粒。EV-D68在淋 巴细胞的复制，可影响其免疫应答反应，进而导致疾病发生和发展，其中3Cpro 可能起到关键性作用。
动物模型是进行病原体致病机理和防治措施研究的重要工具，是评价疫苗有 效性的重要工具。目前，针对新型肠道病毒EV-D68的研究中，通过体外细胞培 养获得的病毒株接种乳鼠及小鼠后未见有完全死亡相关文献的报道。1962年 Schieble等应用Fermon,Franklin,Robinson和Rhyne 4株EV-D68分离的原型株， 通过腹腔和颅内途径传代接种乳鼠，传代继续接种乳鼠后未见乳鼠的死亡。 Alison等用NIH Swiss Webster小鼠建立EV-D68引起麻痹性脊髓炎模型，并且， 研究者应用2日龄乳鼠颅内注射的方式比较了5株2014年流行株(cladeA strain KY/14-18953；clade B strains IL/14-18952和CA/14-4231；clade B1strains MO/14-18947和CA/14-4232)以及2株原型株(Fermon和Rhyne)的神经毒力， 其中clade B1strains为2014年美国暴发中流行最为广泛毒株，但结果都未呈出 现合适的攻毒病毒株。
【发明内容】
本发明的目的是克服现有技术缺陷，通过遗传学手段制备出能够稳定复制和 遗传、能够有效感染乳鼠并致乳鼠死亡的新型肠道病毒毒株，使之能够适合后期 疫苗研究评价，为EV-D68疫苗的有效性评价提供指导意义。
为了实现上述目的，本发明提供一株肠道病毒-68型(enterovirus-D68) EV-D68，所述病毒于2018年2月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.15296。
本发明还提供上述肠道病毒-68型(enterovirus-D68)EV-D68的构建方法， 所述方法包括以下步骤：
(1)构建表达载体
合成肠道病毒68型病毒株KP240936.1的全基因序列，在空白原核表达载体pBluescript II SK上构建含有所述全基因序列的质粒pBluescript II SK-EV-D68；
(2)制备肠道病毒68型第1代
将步骤(1)得到的质粒pBluescript II SK-EV-D68与含有T7RNA聚合酶的 质粒共转染人肾上皮细胞中，细胞转染3-4天之后，弃去部分上清，重悬细胞， 液氮反复冻融三次，然后以转速8000rpm离心10分钟，再将上清全部加入到人 横纹肌瘤细胞，至人横纹肌瘤细胞病变80％-90％，收获病毒液，所得病毒液内 含有肠道病毒68型，所述病毒为第1代病毒；
(3)连续感染制备第n代病毒
以前述步骤获得的第1代病毒之后，取100μl含有第1代病毒的病毒液感 染人横纹肌瘤细胞，至人横纹肌瘤细胞病变80％-90％，获得含有第2代病毒的 病毒液；重复相同操作，依次获得含有第3-10代病毒的病毒液，并保存于-80℃；
(4)病毒确认
分别将步骤(2)和(3)所得的病毒液按以体积比计1：4加入蛋白变性缓 冲液，沸水加热10分钟，然后12000rpm离心10分钟，依据《分子克隆操作指 南》，确认所得特异性抗体为EV-D68VP1单克隆抗体，蛋白印迹结果显示出 EV-D68VP1特异性条带，其分子量为37kDa，确认所得第1-10代次病毒均为肠 道病毒68型，其中第9代次病毒命名为肠道病毒68型(enterovirus D-68)EV-D68， 即保藏编号为CGMCC No.15296的病毒株。
在本发明中，步骤(3)所述的各代次病毒的滴度为107.5～108TCID50/ml。
本发明还提供上述肠道病毒68型(enterovirus-D68)EV-D68在制备新型肠 道病毒EV-D68型感染动物中的用途。
优选地，所述动物是乳鼠。
特别优选地，所述动物是1日龄Balb/C鼠。
根据一种优选的实施方式，所述感染动物的脑内攻毒后的LD50为 2×106TCID50/ml。
根据另一种优选的实施方式，所述感染动物的腹腔内攻毒后的LD50为 2×107TCID50/ml。
本发明还涉及上述肠道病毒68型EV-D68在制备新型肠道病毒疫苗中的应 用。
本发明的肠道病毒68型EV-D68能够稳定复制和传代，通过对1日龄Balb/C 鼠进行脑内攻毒能够获得呈现前肢和后肢麻痹症状的乳鼠动物模型，通过腹腔内 攻毒能够获得呈现前肢麻痹症状的乳鼠动物模型，且攻毒后乳鼠全部死亡，满足 动物模型的要求，可用于相关疫苗研究，也为EV-D68疫苗的有效性评价提供指 导意义。
本发明的肠道病毒-68型(enterovirus-D68)EV-D68，所述病毒于2018年2 月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为 CGMCC No.15296。
【附图说明】
图1为EV-D68全基因序列合成图谱；
图2为EV-D68病毒感染RD细胞；
图3为EV-D68蛋白印迹检测VP1蛋白；
图4为P5代病毒分别脑内及腹腔攻击乳鼠病症(前肢麻痹)；
图5为本发明的EV-D68病毒分别脑内及腹腔攻击乳鼠病症；
图6为本发明的EV-D68病毒脑内攻击病毒LD50测定；
图7为本发明的EV-D68病毒腹腔攻击病毒LD50测定。
【具体实施方式】
以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。
在本发明中，如无特殊说明，用于解释浓度的“％”均为重量百分比，“：” 均为重量比，“份”均为重量份。
在本发明中，涉及以下培养基：
2％胎牛血清DMEM培养基：由赛默飞世尔科技(中国)有限公司提供。
实施例1肠道病毒68型EV-D68的构建及确认
选用genbank登录号KP240936.1的肠道病毒68型北京株的全基因序列，合 成获得全基因序列。并分别在KP240936.1全基因序列5′UTR和3′UTR引入 NotI(GCGGCCGC)和XhoI(CTCGAG)酶切位点，以及在5′UTR加入T7启动子 基因序列TAATACGACTCACTATAGGG(T7promoter)，在3′UTR加入 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(Poly A尾巴)； TAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG(T7terminator)。
以中泰美和公司提供的原核表达载体pBluescript II SK构建获得用于制备 EV-D68活病毒的全长pBluescript II SK-EV-D68质粒，该质粒含有基于 KP240936.1的全基因序列。
将含有EV-D68全基因序列的质粒pBluescript II SK-EV-D68与含有T7RNA 聚合酶的质粒共转染293T细胞于6孔板中，细胞转染3-4天之后，重悬细胞， 液氮反复冻融三次，连续传代感染RD细胞致细胞病变80％-90％(如图2所示)， 收获病毒液。
将收获的病毒液按以体积比计1：4加入蛋白变性缓冲液(Protein SDS PAGELoading Buffer，Takara)，沸水煮样品10分钟，12000rpm离心10分钟。具体实 验步骤依据《分子克隆操作指南》进行操作。结果显示其特异性抗体为EV-D68 VP1单克隆抗体，蛋白印迹结果显示出EV-D68VP1特异性条带，其分子量大约 为37kDa(如图3所示)，因此证明通过反向遗传学所制备的病毒为肠道病毒68 型，确认为EV-D68病毒第一代(并标记为P1)。
取100μl含有第1代病毒的病毒液感染人横纹肌瘤细胞，至人横纹肌瘤细 胞病变80％-90％，获得含有第2代病毒的病毒液；重复相同操作，依次获得含 有第3-10代病毒的病毒液，并保存于-80℃，分别标记为P2-P10。
实施例2EV-D68病毒的TCID50测定
为了比较传代之后各代病毒滴度的变化，将实施例1培养获得的P5至P10 代病毒，分别用含2％胎牛血清DMEM培养基10倍系列稀释之后分别加入到96 孔板的3-12列，每孔100μl，1-2列加入2％胎牛血清DMEM培养基100μl，同 时分别加入100μl 1×104细胞/孔的RD细胞33℃培养7天，应用Reed-Muench方 法计算不同病毒代次的TCID50。
表1不同代次病毒TCID50测定(实验重复三次)
结果显示：
P5-P10代病毒的滴度分别为107.8TCID50/ml；108TCID50/ml；107.9TCID50/ml；108TCID50/ml；108TCID50/ml；107.5TCID50/ml，P5-P10代病毒滴度之间无显著 性差异。
实施例3P5代病毒攻击不同品系的1日龄乳鼠
研究表明不同的病毒对于不同品系的乳鼠具有不同的敏感度，因此，本发明 选用不同品系的1日龄乳鼠，品系包括KM、NIH、C57、ICR和Balb/C，分别 通过脑内注射30μl和腹腔注射100μl P5代病毒(病毒原始滴度为 107.8TCID50/ml)，每天观察临床症状，最后记录病毒对不同品系乳鼠的敏感性。
表2P5代病毒不同方式攻击不同品系1日龄乳鼠(实验重复三次)
注：动物敏感等级；-：无临床症状；±：极弱的临床症状；+：弱的临床症 状；++：强的临床症状；
结果显示：KM乳鼠、NIH乳鼠分别在脑内和腹腔攻毒之后表现为无明显临 床症状；C57乳鼠在脑内和腹腔攻毒之后，呈现出极弱的临床症状，具体表现为 行动缓慢；ICR乳鼠在脑内和腹腔攻毒之后，呈现出行动缓慢及轻微的前肢麻痹； 而Balb/C乳鼠脑内攻毒之后呈现出前肢和后肢的麻痹，属强临床症状，而腹腔 攻毒之后呈现出前肢麻痹，如图4所示。通过不同品系乳鼠攻毒之后临床症状的 比较，确认Balb/C 1日龄乳鼠适合后续攻毒的实验研究。
实施例4 P5-P10代病毒攻击1日龄Balb/C乳鼠
基于实施例3的P5代病毒在不同品系乳鼠攻毒之后的实验后，对P5传代 至P10代的明度测定TCID50之后，分别采用脑内注射30μl和腹腔注射100μl的 方式攻毒1日龄Balb/C乳鼠，每天观察临床症状，并记录存活率，以确定不同 代病毒对乳鼠的致病性。
表3不同代次病毒脑内攻击1日龄Balb/C乳鼠
表4不同代次病毒腹腔攻击1日龄Balb/C乳鼠
结果显示，脑内注射病毒之后P5-P8代病毒乳鼠的存活率分别为83％，30％， 28％和17％，P9和P10代病毒攻毒之后乳鼠全部死亡。腹腔注射病毒之后P5-P8 代病毒乳鼠的存活率分别为83％，67％，60％和25％，P9和P10代病毒攻毒之 后乳鼠全部死亡。经过不同代次病毒对乳鼠共度之后致病性的研究，选用P9代 病毒作为乳鼠攻击模型病毒毒株。
实施例5P9代病毒攻击1日龄Balb/C乳鼠
为了确定P9代病毒毒株攻击Balb/C 1日龄乳鼠的LD50(半数致死剂量)， 对Balb/C1日龄乳鼠分别脑内注射30μl和腹腔注射100μl P9代病毒，每天观察 临床症状，并对临床症状进行了等级划分，同时记录存活率，并用Reed-Muench 方法分别计算出脑内和腹腔攻击P9代病毒之后的LD50(半数致死剂量)。
表5攻毒之后乳鼠临床症状等级的划分
结果显示：应用DMEM新鲜培养基依据体积比将病毒系列稀释为按体积比 1：4和1：8脑内注射1日龄乳鼠之后，乳鼠全部死亡，1：16，1：32和1：64 稀释病毒脑内注射之后，乳鼠的存活率为30％，40％和60％，用Reed-Muench 方法分别计算出脑内攻毒之后的LD50为2×106TCID50/ml。
原倍病毒腹腔注射1日龄乳鼠，乳鼠全部死亡，病毒按1：2，1：4和1：8 稀释腹腔注射1日龄乳鼠之后，乳鼠的存活率分别为20％，30％和60％，用 Reed-Muench方法分别计算出脑内攻毒之后的LD50为2×107TCID50/ml。经过传 代培养之后P9代病毒是可以作为EV-D68乳鼠攻击模型的攻毒株，此攻毒株的 建立为EV-D68疫苗后续的研究奠定基础，并提供一定的指导意义。
综上所述，本发明从KP240936.1全基因序列出发，并在5′UTR的5′端 引入T7启动子基因序列，将引入T7启动子的全基因序列构建到原核表达载体 pBluescript II SK，利用反向遗传学的操作方法，将全基因序列转染至293T细胞， 并通过感染RD细胞获得EV-D68的病毒株。
根据进一步实验证实，本发明的EV-D68病毒P9可有效应用于1日龄Balb/C 乳鼠建立EV-D68的攻毒模型，呈现前肢和后肢麻痹症状，且攻毒后乳鼠全部死 亡，满足动物模型的要求，可用于相关疫苗研究，也为EV-D68疫苗的有效性评 价提供指导意义。
Claims (9)
1.肠道病毒68型(enterovirus D-68)EV-D68，所述病毒于2018年2月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.15296。
2.权利要求1的肠道病毒68型(enterovirus D-68)EV-D68的构建方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建表达载体
合成肠道病毒68型病毒株KP240936.1的全基因序列，构建含有所述全基因序列的质粒pBluescript II SK-EV-D68；
(2)制备肠道病毒68型病毒第1代
将步骤(1)得到的质粒pBluescript II SK-EV-D68与含有T7RNA聚合酶的质粒共转染人肾上皮细胞中，细胞转染3-4天之后，弃去部分上清，重悬细胞，液氮反复冻融三次，然后以转速8000rpm离心10分钟，再将上清全部加入到人横纹肌瘤细胞，至人横纹肌瘤细胞病变80％-90％，收获病毒液，所得病毒液内含有肠道病毒68型，所述病毒为第1代病毒；
(3)连续感染制备第n代病毒
以前述步骤获得第1代病毒之后，取100μl含有第1代病毒的病毒液感染人横纹肌瘤细胞，至人横纹肌瘤细胞病变80％-90％，获得含有第2代病毒的病毒液；重复相同操作，依次获得含有第3-10代病毒的病毒液，并保存于-80℃；
(4)病毒确认
分别将步骤(2)和(3)所得的病毒液按以体积比计1：4加入蛋白变性缓冲液，沸水加热10分钟，然后12000rpm离心10分钟，依据《分子克隆操作指南》，确认所得特异性抗体为EV-D68VP1单克隆抗体，蛋白印迹结果显示出肠道病毒68型VP1特异性条带，其分子量为37kDa，确认所得第1-10代病毒均为肠道病毒68型病毒，其中第9代为病毒为权利要求1所述的肠道病毒68型(enterovirus D-68)EV-D68。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于步骤(3)所述的病毒的滴度为107.5～108TCID50/ml。
4.权利要求4的肠道病毒68型病毒(enterovirus-D68)EV-D68在制备肠道病毒68型感染动物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述动物是乳鼠。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述动物是1日龄Balb/C鼠。
7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述感染动物的脑内攻毒后的LD50为2×106TCID50/ml。
8.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述感染动物的腹腔内攻毒后的LD50为2×107TCID50/ml。
9.权利要求4的肠道病毒68型病毒(enterovirus-D68)EV-D68在制备新型肠道病毒疫苗中的应用。
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