CN105194681A - 一种基于ppv病毒样颗粒的纳米递药系统及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于PPV病毒样颗粒的纳米递药系统及其制备方法和应用。本发明的纳米递药系统由纳米载体材料和药物组成，所述的纳米载体材料为TK肽修饰的PPV病毒样颗粒，采用昆虫杆状病毒表达系统制备得到；所述的药物为小分子抗肿瘤药物；所述药物以包裹或共价连接的方式包载在纳米载体材料内。所述的TK肽为靶向多肽，其氨基酸序列为TWYKIAFQRNRK。TK肽采用基因工程方法与猪细小病毒(PPV)的衣壳蛋白VP2形成的病毒样颗粒(VLPs)连接在一起构建成纳米载体材料(TK-VLPs)，纳米载体材料包载药物形成主动靶向纳米递药系统，载药TK-VLPs纳米递药系统具有较好的肿瘤靶向性和较强的抗肿瘤生长作用，能更好地介导纳米递药系统靶向肿瘤组织，具有良好的研究和应用前景。

Description

一种基于PPV病毒样颗粒的纳米递药系统及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种基于PPV病毒样颗粒的纳米递药系统，具体涉及靶向多肽(TK肽)修饰的PPV衣壳蛋白VP2形成的病毒样颗粒所构成的主动靶向纳米递药系统及其制备方法，该主动靶向纳米递药系统包载小分子抗肿瘤药物后，可用于靶向治疗结肠癌。本发明属于多肽、生物技术和药剂学领域。

背景技术

中国肿瘤生物治疗协会2013肿瘤发展报告统计数据表明，恶性肿瘤占所有死亡人数的20％左右；每年肿瘤疾病的发病率和死亡率都在急剧增加着，《2012中国肿瘤登记年报》发布的最新统计数据表明，中国每年新发癌症病例约350万，因癌症死亡约250万，全国每6分钟就有1人被确诊为癌症，恶性肿瘤已经成为危害人类生命和健康的头号杀手。结直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在男性和女性恶性肿瘤中分别居第三位和第二位，2008年新发癌症患者超过120万，有60.87万癌症患者死于结直肠癌。在我国，结直肠癌死亡率已位于恶性肿瘤死亡率的第五位，严重危害人类健康。因此，如何有效治疗结直肠癌已成为全球健康领域亟待解决的难题。相关研究表明，靶向性给药可以增强药物在靶部位的活性并减少其在非靶部位的毒副作用，提高药物的治疗指数，给药系统是靶向治疗的关键。近年来本领域的研究重点之一是寻找与可特异性与肿瘤细胞或肿瘤新生血管结合的物质，以及将药物递送到肿瘤的新型递药系统。

病毒样颗粒(virus-likeparticles，VLPs)是含有某种病毒一个或多个结构蛋白的空心颗粒，因为VLPs不含有病毒核酸物质，不能自主复制，因此也不具有感染性。猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)是细小病毒科细小病毒属成员，PPV基因组编码两条结构多肽VP1和VP2，三条非结构多肽NS1、NS2和NS3。VP2分子质量为64ku，约占病毒衣壳蛋白总量的80％，在一定的环境下，VP2能自组装成VLPs，其形态与PPV相似。病毒样颗粒虽然是安全、有效的纳米载体，但是VLPs选择性相对较差，缺乏对肿瘤细胞的特异性。因此，通过靶向分子介导VLPs对肿瘤细胞的选择性，是一种有效的主动靶向方式。目前尚无靶向分子修饰的PPV-VLPs的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有抗癌化学药物的毒性及非特异性问题，提供一种新型的主动靶向纳米递药系统。

为了达到以上目的，本发明所采用的技术方案为：

一种基于PPV病毒样颗粒的纳米递药系统，其特征在于，是由纳米载体材料和药物组成，所述的纳米载体材料为TK肽修饰的PPV病毒样颗粒，采用昆虫杆状病毒表达系统制备得到；所述的药物为小分子抗肿瘤药物；所述药物以包裹或共价连接的方式包载在纳米载体材料内。

在本发明中，优选的，所述的TK肽为靶向多肽，其氨基酸序列为：TWYKIAFQRNRK；所述的PPV病毒样颗粒为PPV的衣壳蛋白VP2形成的病毒样颗粒；TK肽与PPV病毒样颗粒的摩尔比为1:1～20:1。

在本发明中通过控制Δvp2基因中TK肽的基因与VP2基因的拷贝数来调节TK肽与PPV病毒样颗粒的摩尔比。

在本发明中，优选的，所述的TK肽修饰的PPV病毒样颗粒通过以下方法制备得到：将TK肽的基因插入PPV的VP2基因中，得到Δvp2基因，克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHA中，所得的重组杆状病毒转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，得到重组杆粒，重组杆粒转染Sf9昆虫细胞，使其表达Δvp2蛋白并组装成TK肽修饰的PPV病毒样颗粒。

在本发明中，优选的，所述的方法包括以下步骤：

(1)以提取的PPVDNA为模板，利用扩增引物通过PCR扩增获得VP2基因，将VP2基因插入pMD18-T载体中，得到重组载体pMD18-T-vp2；

(2)以重组载体pMD18-T-vp2为模板，应用SOE-PCR扩增获得Δvp2基因，将Δvp2基因插入杆状病毒转移载体pFastBacHA中，得到pFD-Δvp2供体质粒；

(3)将pFD-Δvp2供体质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，与Bacmid进行重组，得到重组杆粒Bacmid-Δvp2；

(4)将重组杆粒Bacmid-Δvp2转染Sf9细胞，待细胞病变达到70％以上收集上清培养液，即第一代重组杆状病毒，连续传代后，以第三代重组杆状病毒作为种毒；

(5)将得到的第三代重组杆状病毒接种Sf9细胞，使其表达Δvp2蛋白并组装成TK肽修饰的PPV病毒样颗粒。

在本发明中，优选的，步骤(1)中所述的引物的核苷酸序列为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；步骤(2)中SOE-PCR扩增Δvp2基因的具体步骤为：第一轮扩增使用引物P1/P2，模板为pMD18-T-vp2，获得的目的片段命名P1-P2；引物P3/P4，模板为pMD18-T-vp2，获得的目的片段命名P3-P4；引物P5/P6，模板为pMD18-T-vp2，获得的目的片段命名P5-P6；第二轮扩增使用引物P1/P4，模板为P1-P2和P3-P4，获得目的基因片段P1-P4；使用引物P3/P6，模板为P3-P4和P5-P6，获得目的基因片段P3-P6；第三轮扩增使用引物P1/P6，模板为P1-P4和P3-P6，获得目的基因片段P1-P6，即Δvp2基因；引物P1-P6的核苷酸序列为SEQIDNO:3-SEQIDNO:8所示。

在本发明中，优选的，所述的纳米递药系统的平均粒径为10-100nm。

在本发明中，优选的，所述的小分子抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、喜树碱、羟基喜树碱、紫杉醇或多系紫杉醇中的一种。

进一步的，本发明提供了一种制备所述的纳米递药系统的方法，采用昆虫杆状病毒表达系统制备TK肽修饰的PPV病毒样颗粒，将小分子抗肿瘤药物通过包裹或共价连接的方式包载在TK肽修饰的PPV病毒样颗粒内。

在本发明中，优选的，采用昆虫杆状病毒表达系统制备TK肽修饰的PPV病毒样颗粒，将TK肽修饰的PPV病毒样颗粒、N-羟基丁二酰亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和小分子抗肿瘤药物按照质量比1:5:2:10～1:5:2:40的比例放入离心管中，4℃反应48h，反应后的样品装入透析膜中进行透析，透析液为pH7.4的磷酸盐缓冲液，4℃透析48h，期间每隔12h换液一次，即得。

更进一步的，本发明提供了所述的纳米递药系统在制备靶向治疗结肠癌细胞药物中的用途。

在本发明中，优选的，所述的结肠癌细胞为人结直肠腺癌HRT-18细胞或人结肠癌Cao-2细胞。

本发明同时还提供了所述TK肽的合成方法与亲和性评价，及其修饰的纳米递药系统的制备方法、靶向性评价及抑瘤效果等，其包括：

(1)合成TK肽

采用固相合成的方法合成TK肽(TWYKIAFQRNRK)，并进一步通过化学合成的方法获得荧光素标记的TK肽(FITC-TK)，HPLC及MS表征其结构。

(2)TK肽的亲和性评价

通过与受体蛋白结合能力及结肠癌肿瘤的结合能力两方面进行TK肽性质考察，采用表面等离子共振方法(SPR)测定TK肽与受体蛋白的结合常数Kd值。比较FITC与FITC-TK对结肠癌细胞的靶向性。

(3)TK-VLPs纳米载体的制备

通过提取PPV病毒基因组，进一步通过SOE-PCR扩增获得Δvp2基因，从而获得pFD-Δvp2供体质粒，进而构建重组杆状病毒Bacmid质粒，重组杆状病毒Bacmid质粒转染Sf9细胞，得到重组杆状病毒，重组杆状病毒接种Sf9细胞，制备TK肽修饰的PPV病毒样颗粒，用于TK-VLPs纳米载体的制备。

(4)载药TK-VLPs纳米递药系统的制备与表征

以阿霉素为模型药物，与一定比例的VLPs或TK-VLPs纳米载体通过化学反应，形成载药的TK-VLPs-DOX纳米递药系统。激光散射法测定粒径及粒径分布；负染色电镜法观察TK-VLPs-DOX的形态。

(4)载药TK-VLPs纳米递药系统的肿瘤靶向性评价

考察Cao-2及HRT-18细胞对VLPs-DOX和TK-VLPs-DOX纳米递药系统摄取情况，比较上述两种递药系统对肿瘤细胞的亲和能力。

(5)载药TK-VLPs纳米递药系统的抗肿瘤效果评价

以MTT法研究VLPs-DOX和TK-VLPs-DOX纳米递药系统对Cao-2及HRT-18细胞体外生长抑制效果。

实验结果表明，所述的TK肽与受体蛋白和肿瘤新生血管及结肠癌肿瘤均具有较高的亲和活性；与VLPs-DOX纳米递药系统相比，TK-VLPs-DOX纳米递药系统具有更好的肿瘤靶向性和更强的抗肿瘤生长作用；所述的TK-VLPs-DOX纳米递药系统，能更好地介导纳米递药系统靶向肿瘤组织，具有良好的应用前景。

本发明取得的有益效果：

本发明中，TK肽采用基因工程方法与猪细小病毒(PPV)的衣壳蛋白VP2形成的病毒样颗粒(VLPs)连接在一起构建成纳米载体材料(TK-VLPs)，纳米载体材料包载药物形成主动靶向纳米递药系统，载药TK-VLPs纳米递药系统具有较好的肿瘤靶向性和较强的抗肿瘤生长作用，能更好地介导纳米递药系统靶向肿瘤组织，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为TK及FITC-TK的HPLC及MS图谱；

图2为TK肽与受体蛋白结合的等离子共振分析图谱；

图3为TK肽对细胞的摄取图，其中，A图：FITC和TK-FITC与Cao-2、HRT-18、HUVEC及L929细胞作用后的激光共聚焦照片；B图：流式细胞仪检测Cao-2、HRT-18、HUVEC及L929细胞对FITC和TK-FITC的摄取情况；

图4为TK-VLPs表达及纯化图，其中，A图：直接免疫荧光结果，评价VP2与ΔVP2在昆虫细胞Sf9中的表达情况，绿色细胞为成功表达VP2(a)或ΔVP2(b)蛋白的细胞；B图：VP2与ΔVP2的SDS-PAGE分析，M(Maker)、纯化的VP2(1)、纯化的ΔVP2(2)、空载体(3和4)、未纯化的VP2(5)、未纯化的ΔVP2(6)；C图：VP2与ΔVP2的Westernblot分析，纯化的VP2与ΔVP2(2和3)，未纯化的VP2与ΔVP2(1和4)，空载体(5)；

图5为载药TK-VLPs的制备图，其中，左图：VLPs-DOX(1)，TK-VLPs-DOX(2)；右图：与左图相同，只是琼脂糖凝胶用考马斯亮蓝进一步染色；

图6为载药TK-VLPs的表征结果图，其中，A图：TK-VLPs-DOX粒径分布图；B图：TK-VLPs-DOX电镜图；

图7为Cao-2及HRT-18细胞对纳米递药系统的摄取图。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1TK肽及TK-FITC肽的合成、纯化和表征

采用固相合成的方法合成TK肽，具体步骤如下：将PAM-氨基酸-Boc树脂用三氟乙酸(TFA)脱保护1分钟，两次，将Boc保护氨基酸溶解在0.5M的HBTU(溶剂为DMF)中，室温反应15min，DMF洗涤，TFA脱除Boc保护，按照氨基酸序列依次反应，反应完成后，用20％的哌啶DMF溶液脱除CHO(含有W的氨基酸序列)保护基15分钟，两次。三氟乙酸脱Boc保护后，用氢氟酸将多肽从树脂上切割下来。TK肽的氨基酸序列为TWYKIAFQRNRK。进一步通过合成反应获得荧光素标记的TK肽(TK-FITC)。分别用HPLC和ESI-MS表征多肽纯度和分子量。HPLC和ESI-MS图谱如图1所示，两种多肽质谱计算所得分子量均与理论分子量相符。

实施例2TK肽亲和性评价

2.1SPR实验

使用Biacore技术进行SPR实验，采用表面等离子共振方法(SPR)测定TK肽与受体蛋白的结合常数Kd值。首先使用EDC/NHS溶液活化芯片表面的羧基，将整合素蛋白的醋酸钠溶液进样与CM5芯片偶联，然后将TK肽配制成一系列溶液，从低浓度到高浓度依次进样，流动相流速为30μL/min，获得的数据用Biacore软件计算TK肽与受体蛋白的结合常数Kd值。结果见附图2。使用Biacore技术分析TK肽与受体蛋白的结合能力，各曲线代表该浓度的多肽随时间与受体蛋白结合的动态曲线，使用Biacore分析软件计算多肽与蛋白结合的Kd值，TK肽与Integrinα₆β₁及Integrinα_vβ₃结合的Kd值分别是2.79×10^-5M和2.69×10^-5M，对照肽(TISWPPR肽)与Integrinα₆β₁及Integrinα_vβ₃结合的Kd值分别为9.49×10^-2M和1.01×10^-2M；结果表明，与对照肽相比，TK肽与Integrinα₆β₁及Integrinα_vβ₃结合能力更强。

2.2TK肽与靶向细胞的亲和性评价

将Cao-2、HRT-18、HUVEC及L929细胞按照2×10⁵cells/孔种植在6孔板上或共聚焦皿上，孵育24h后，弃去培液。在每孔细胞中各加入相同摩尔数FITC或TK-FITC溶液，培养一定时间，共聚焦显微镜观察或流式细胞记数。结果如图3所示，定性与定量结果均表明，与FITC相比，TK-FITC与肿瘤细胞具有更强的亲和能力。

实施例3VP2与ΔVP2在昆虫细胞Sf9中的表达

3.1病毒基因组的提取

将猪细小病毒同步接种至PK细胞中，37℃CO₂培养箱中培养3-5天，细胞培养物出现明显的细胞病变后，反复冻融3次收毒。对收获的病毒液进行DNA的提取，步骤见DNA提取试剂盒说明书。

3.2猪细小病毒(PPV)VP2和ΔVP2制备和序列的测定

参考GenBank(登录号：AY583318)中公布的PPV的VP2序列，根据序列两端保守区设计扩增引物见表1。靶向肽被插入VP2序列构建ΔVP2基因，设计6条引物用于ΔVP2制备，引物见表1。以提取的PPVDNA为模板，利用扩增引物通过PCR扩增获得VP2。将VP2连入pMD18-T载体中，得到质粒pMD18-T-vp2。经BamHI和SalI双酶切鉴定正确的质粒进一步测序鉴定。以鉴定正确的pMD18-T-vp2为模板，应用SOE-PCR扩增Δvp2基因，同样连入pMD18-T载体中得到质粒pMD18-T-Δvp2，经双酶切和测序鉴定。

SOE-PCR扩增Δvp2基因的具体方法如下：本实验使用KOD-Plus高保真DNA聚合酶(TOYOBO)试剂盒进行SOE-PCR扩增。使用50μL体系：KOD-Plus-(1.0U/μL)1μL，10×BufferforKOD-Plus-5μl；2mMdNTPs5μl；25mMMgSO₄2μl；10pmol/μl上游和下游引物各1.5μl；DNA模板25ng。PCR循环条件：9℃5min，94℃50s；56℃1min；72℃2min；30个循环，72℃10min。第一轮扩增使用引物P1和P2，模板为pMD18-T-vp2，获得的目的片段命名P1-P2；引物P3和P4，模板为pMD18-T-vp2，获得的目的片段命名P3-P4；引物P5和P6，模板为pMD18-T-vp2，获得的目的片段命名P5-P6；将上述目的基因分别进行胶回收纯化。第二轮扩增使用引物P1和P4，模板为P1-P2和P3-P4，获得目的基因片段P1-P4；使用引物P3和P6，模板为P3-P4和P5-P6，获得目的基因片段P3-P6；将上述目的基因分别进行胶回收纯化。第三轮扩增使用引物P1和P6，模板为P1-P4和P3-P6，获得目的基因片段P1-P6，即Δvp2。将Δvp2进行胶回收纯化后连接pMD18-T载体中得到质粒pMD18-T-Δvp2，经双酶切和测序鉴定。

表1质粒构建中的引物序列

注：加粗为BamHI位点，下划线为SalI位点.，斜体为插入的TK序列。

3.3供体质粒的构建

将高纯的pMD18-T-Δvp2质粒经BamHI和SalI双酶得到Δvp2基因，将其插入pFastBacHA中，得到pFD-Δvp2供体质粒。

3.4重组杆状病毒Bacmid质粒的构建

将供体质粒pFD-Δvp2转化DHl0Bac感受态，加入1mL无抗性LB培养基，37℃180rpm复苏4h，将复苏后的菌液进行10^-1、10^-2和10^-3倍稀释，份别取100uL至LB筛选平板中，37℃培养36-48h，待蓝白斑区分较为明显时，挑选大的白色单菌落，加入LB培养基(含有终浓度为50ug/mL卡那霉素、7ug/mL庆大霉素、10ug/mL四环霉素)中37℃180rpm摇12h，进行重组杆粒的提取，按照说明书进行。用M13引物进行PCR鉴定，鉴定正确的重组杆粒命名为Bacmid-Δvp2。

3.5PPV病毒样颗粒的制备

将Bacmid-Δvp2和和pFastBacHTA空载体分别转染Sf9细胞。按照转染试剂操作说明，在转染的前1天在六孔细胞培养板中铺Sf9单一层细胞，细胞密度达到70％-90％时，弃去孔中原有培养液，用无血洁的Grace培养液洗3遍，加入无血洁的Grace培养液，2mL/孔，27℃孵育。配转染复合物A、B液，A液/孔：250uL无血清Grace培养液加入5uL脂质体，混匀，静置5min；B液/孔：250uL无血清Grace培养液加入2ug重组杆粒DNA，混匀。将AB液混匀，静置20min后转染培养。70％以上细胞病变时，收集上清培养液，即P1代重组杆状病毒，收集第三代病毒用于重组蛋白的纯化。VLPs和TK-VLPs蛋白纯化根据已有报道，简要步骤如下，收集第三代病毒感染的Sf9昆虫细胞，在裂解液中重悬，冻融，然后通过离心移除碎片。上清液中加入0.5MNaCl和10％PEG-6000(w/v)后13,000g在40℃离心40分钟。沉淀重悬后蔗糖密度梯度离心。梯度分离后用SDS-PAGE和Western-blot进行鉴定。结果表明30％-40％的蔗糖层纯度较高，收集30％-40％的蔗糖层并透析过夜。透析后进一步通过CsCl缓冲液(25mMEDTA,0.6g/mLin50mMTris–HCl,pH7.8,0.5％TritonX-100)进行纯化。结果见图4，结果表明，VP2与ΔVP2被成功表达和纯化。

实施例4载药纳米递药系统TK-VLPs-DOX的制备与表征

按照质量比1:5:2:10～1:5:2:40的比例将VLPs或TK-VLPs，NHS(N-羟基丁二酰亚胺)，EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和阿霉素放入离心管中，4℃反应48h，反应后的样品装入透析膜中进行透析，透析液为pH7.4的磷酸盐缓冲液，4℃透析48h，其间每隔12h换液一次。阿霉素与VLPs或TK-VLPs交联结果见图5。非变性琼脂糖凝胶电泳评价阿霉素是否成功连接到VLPs或TK-VLPs纳米载体上，图5结果表明阿霉素被成功连接到纳米载体上。用动态光散射测定TK-VLPs-DOX纳米递药系统的粒径分布，用透射电镜观测其形态及大小，结果如图6所示。图6结果表明，TK-VLPs-DOX粒径在30nm左右。

实施例5TK-VLPs-DOX靶向性评价

将Cao-2及HRT-18细胞按照2×10⁵cells/孔种植在12孔板上，孵育24h后，弃去培液。在每孔细胞中各加入相同摩尔数DOX、VLPs-DOX或TK-VLPs-DOX溶液，培养一定时间后，荧光显微镜观察。结果如图7所示。Cao-2及HRT-18细胞与DOX，VLPs-DOX或TK-VLPs-DOX作用后，荧光显微镜结果表明，与VLPs-DOX相比，TK-VLPs-DOX与肿瘤细胞有更强的亲和能力。

实施例6TK-VLPs-DOX药效学评价

用含10％FBS的DMEM培养液，在二氧化碳培养箱内(37℃、5％CO₂、饱和湿度)培养Cao-2及HRT-18细胞，分别以7.5×10³cells/well接种于96孔板，24h后，将培养液吸出，加入一系列浓度的DOX//VLPs-DOX或TK-VLPs-DOX，共培养一定时间后吸出药液，PBS洗涤后加入含10％FBS的DMEM培养液，继续培养72h后，采用MTT法测定细胞存活率，计算细胞存活率，并进行显著性差异分析。结果见表2，结果表明，与VLPs-DOX相比，TK-VLPs-DOX能更好的抑制肿瘤细胞的增长。

表2DOX,VLPs-DOX和TK-VLP-DOX在HRT-18和Caco-2细胞上的IC50值

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种基于PPV病毒样颗粒的纳米递药系统，其特征在于，是由纳米载体材料和药物组成，所述的纳米载体材料为TK肽修饰的PPV病毒样颗粒，采用昆虫杆状病毒表达系统制备得到；所述的药物为小分子抗肿瘤药物；所述药物以包裹或共价连接的方式包载在纳米载体材料内。

2.根据权利要求1所述的纳米递药系统，其特征在于，所述的TK肽为靶向多肽，其氨基酸序列为：TWYKIAFQRNRK；所述的PPV病毒样颗粒为PPV的衣壳蛋白VP2形成的病毒样颗粒；TK肽与PPV病毒样颗粒的摩尔比为1:1～20:1。

3.根据权利要求1所述的纳米递药系统，其特征在于，所述的TK肽修饰的PPV病毒样颗粒通过以下方法制备得到：将TK肽的基因插入PPV的VP2基因中，得到△vp2基因，克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHA中，所得的重组杆状病毒转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，得到重组杆粒，重组杆粒转染Sf9昆虫细胞，使其表达△vp2蛋白并组装成TK肽修饰的PPV病毒样颗粒。

4.根据权利要求3所述的纳米递药系统，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

(1)以提取的PPVDNA为模板，利用扩增引物通过PCR扩增获得VP2基因，将VP2基因插入pMD18-T载体中，得到重组载体pMD18-T-vp2；

(2)以重组载体pMD18-T-vp2为模板，应用SOE-PCR扩增获得△vp2基因，将△vp2基因插入杆状病毒转移载体pFastBacHA中，得到pFD-△vp2供体质粒；

(3)将pFD-△vp2供体质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，与Bacmid进行重组，得到重组杆粒Bacmid-△vp2；

(4)将重组杆粒Bacmid-△vp2转染Sf9细胞，待细胞病变达到70％以上收集上清培养液，即第一代重组杆状病毒，连续传代后，以第三代重组杆状病毒作为种毒；

(5)将得到的第三代重组杆状病毒接种Sf9细胞，使其表达△vp2蛋白并组装成TK肽修饰的PPV病毒样颗粒。

5.根据权利要求4所述的纳米递药系统，其特征在于，步骤(1)中所述的引物的核苷酸序列为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；步骤(2)中SOE-PCR扩增△vp2基因的具体步骤为：第一轮扩增使用引物P1/P2，模板为pMD18-T-vp2，获得的目的片段命名P1-P2；引物P3/P4，模板为pMD18-T-vp2，获得的目的片段命名P3-P4；引物P5/P6，模板为pMD18-T-vp2，获得的目的片段命名P5-P6；第二轮扩增使用引物P1/P4，模板为P1-P2和P3-P4，获得目的基因片段P1-P4；使用引物P3/P6，模板为P3-P4和P5-P6，获得目的基因片段P3-P6；第三轮扩增使用引物P1/P6，模板为P1-P4和P3-P6，获得目的基因片段P1-P6，即Δvp2基因；引物P1-P6的核苷酸序列为SEQIDNO:3-SEQIDNO:8所示。

6.根据权利要求1所述的纳米递药系统，其特征在于，所述的纳米递药系统的平均粒径为10-100nm。

7.根据权利要求1所述的纳米递药系统，其特征在于，所述的小分子抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、喜树碱、羟基喜树碱、紫杉醇或多系紫杉醇中的一种。

8.一种制备权利要求1所述的纳米递药系统的方法，其特征在于，采用昆虫杆状病毒表达系统制备TK肽修饰的PPV病毒样颗粒，将小分子抗肿瘤药物通过包裹或共价连接的方式包载在TK肽修饰的PPV病毒样颗粒内。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，采用昆虫杆状病毒表达系统制备TK肽修饰的PPV病毒样颗粒，将TK肽修饰的PPV病毒样颗粒、N-羟基丁二酰亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和小分子抗肿瘤药物按照质量比1:5:2:10～1:5:2:40的比例放入离心管中，4℃反应48h，反应后的样品装入透析膜中进行透析，透析液为pH7.4的磷酸盐缓冲液，4℃透析48h，期间每隔12h换液一次，即得。

10.权利要求1所述的纳米递药系统在制备靶向治疗结肠癌细胞药物中的用途，优选的，所述的结肠癌细胞为人结直肠腺癌HRT-18细胞或人结肠癌Cao-2细胞。