RO117861B1 - Complex de acid nucleic si compozitie pentru introducerea acestuia in celulele eucariote superioare - Google Patents

Complex de acid nucleic si compozitie pentru introducerea acestuia in celulele eucariote superioare Download PDF

Info

Publication number
RO117861B1
RO117861B1 RO94-00499A RO9400499A RO117861B1 RO 117861 B1 RO117861 B1 RO 117861B1 RO 9400499 A RO9400499 A RO 9400499A RO 117861 B1 RO117861 B1 RO 117861B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
cells
gly
virus
ala
adenovirus
Prior art date
Application number
RO94-00499A
Other languages
English (en)
Inventor
David Curiel
Ernst Wagner
Matt Cotten
Kurt Zatloukal
Christian Plank
L Max Birnstiel
Bernd Oberhauser
Walter G M Schmidt
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Int filed Critical Boehringer Ingelheim Int
Publication of RO117861B1 publication Critical patent/RO117861B1/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
    • C12N2710/10251—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
    • C12N2710/10261—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10363—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/11011—Alpharetrovirus, e.g. avian leucosis virus
    • C12N2740/11022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32711—Rhinovirus
    • C12N2770/32722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32711—Rhinovirus
    • C12N2770/32761—Methods of inactivation or attenuation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Inventia se refera la un complex de acid nucleic, care cuprinde unul sau mai multi acizi nucleici, o prima substanta cu afinitate pentru acidul nucleic si un agent endozomolitic, care are el insusi un domeniu de legare la acidul nucleic sau este legat la o a doua substanta cu afinitate pentru acidul nucleic si care poate fi identica sau diferita de prima substanta si, eventual, un factor de internalizare, si la o compozitie pentru introducerea in celulele eucariote superioare a acestor complecsi de acizi nucleici.

Description

Invenția se referă la un complex de acid nucleic și la o compoziție cu acesta pentru introducerea de acizi nucleici în celulele eucariote superioare.
Necesitatea unui sistem eficient pentru introducerea de acid nucleic în celule vii există mai ales în cadrul genoterapiei. în acest caz se introduc gene în celule, pentru ca să se ajungă la sinteza in vivo a produselor de gene terapeutic active, de exemplu, pentru a înlocui gena care lipsește, în cazul unui defect genetic. Genoterapia “clasică” se bazează pe principiul de obținere a unei vindecări de durată printr-un singur tratament. Pe lângă aceasta, există însă necesitatea unor metode de tratare, în care ADN-ul terapeutic activ (sau și ARNm) să fie administrat în funcție de necesitate, o singură dată sau în mod repetat. Exemple de îmbolnăviri cauzate genetic, la care genoterapia reprezintă o aplicare care promite succes, sunt hemofilia, thalasemia și “Severe Combined Immune eficiency (SCID), un sindrom, care este provocat printr-o lipsă condiționată genetic din enzima adenozindeaminază. Posibilitățile de aplicare constau și în imunoreglare, în care prin administrarea de acizi nucleici funcționali, care codifică un antigen secretat de proteină sau pentru un antigen nesecretat de proteină, se ajunge prin intermediul unei vaccinări la o imunitate tumorală sau intracelulară. Alte exemple în care remedierea defectelor genetice se poate face prin administrare de acid nucleic care codifică gena defectă care poate fi administrată individual în cazul unei forme bine definite, sunt distrofia musculară (Dystrophin-Gen), fibroza cistică (“Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene”), hipercolesterolemia (LDL-Rezeptor-Gen). Metodele de tratament genoterapeutice mai sunt importante, când trebuie să se sintetizeze în organism hormoni, factori de creștere, sau proteine cu acțiune citotoxică sau imunomodulatoare.
Genoterapia prezintă și o aplicare cu succes și în tratamentul cancerului, fiind administrate așa-numitele “vaccinuri contra cancerului”. Pentru a mări imunogenicitatea celulelor tumorale, acestea se modifică, fie pentru a le face mai puternic antigene, fie pentru a le provoca să fabrice anumite substanțe imunomodulatoare, de exemplu, citocine, care declanșează apoi un răspuns imun. Pentru a obține acest lucru, celulele sunt transfectate cu un ADN care codifică o citochină, de exemplu, IL-2, IL-4, IFN-gama, TNF-alfa. Până acum s-au realizat transferuri de gene în celule tumorale autologe în principal, cu ajutorul vectorilor retrovirali.
Tehnologiile cele mai înaintate pentru implicarea acizilor nucleici în terapia genelor folosesc sisteme retrovirale pentru transferul de gene în celulă (Wilson șl colab., 2990, Kasid, 1990). Utilizarea de retrovirusuri este însă problematică, deoarece ea, aduce cu sine, chiar într-un procentaj scăzut, pericolul reacțiilor secundare cum ar fi, infecția cu virus (prin recombinare cu virusuri endogene sau contaminare cu virusuri ajutătoare urmată de o mutație posibilă la forma patogenă), sau formarea de celule canceroase. în afară de aceasta transformarea stabilă a celulelor somatice ale pacientului, așa cum se obține ea cu ajutorul retrovirusurilor, nu este de dorit în orice caz, deoarece prin aceasta tratamentul poate duce cu greu la starea normală și poate duce, de exemplu, la apariția de efecte secundare. în afară de aceasta, la această formă de terapie este greu să se obțină un titru destul de ridicat, pentru a infecta suficiente celule.
Acizii nucleici ca substanțe terapeutic active se mai folosesc în afară de aceasta, pentru a inhiba anumite funcțiuni ale celulei. De exemplu, acizii antisens ARN și ADN s-au dovedit a fi agenți eficienți pentru inhibarea selectivă a anumitor secvențe de gene. Modul lor de acțiune dă posibilitatea folosirii lor ca mijloace terapeutice pentru blocarea expresiei anumitor gene (cum ar fi, oncogene dereglate sau gene virale) in vivo. S-a arătat deja, că se pot introduce în celule antisens-oligonucleotide și acolo pot să-și exercite acțiunea lor inhibitoare (Zamecnik și colab., 1986), chiar dacă concentrația lor intracelulară, între altele din cauza preluării lor limitate prin membrana celulară este mică, din cauza încărcării puternic negative ale acizilor nucleici.
RO 117861 Β1
Pentru inhibarea selectivă a genelor o altă soluție constă în aplicarea de ribozime, și aici există necesitatea de a realiza o concentrație cât mai ridicată de ribozime active în celulă, motiv pentru care transportul în celule este unul din factorii limitativi.
Folosirea genoterapiei pentru obținerea unei imunități intracelulare cuprinde transducția de gene, care au o acțiune de protecție față de virusuri (așa-numitele gene 55 “proiective), de exemplu, mutații transdominante de gene, care codifică proteine virale, sau molecule ADN, care codifică așa-numitele “RNA decoys”.
De aceea, există necesitatea de a găsi metode, pentru a da posibilitatea expresiei de ADN în celulă.
S-au propus deja mai multe soluții, pentru a îmbunătăți transportul acizilor nucleici 60 în celule vii, care reprezintă unul din factorii limitativi al folosirii terapeutice a acestora.
Pentru transformarea genelor celulelor de mamifere in vitro se cunosc diferite metode tehnice, a căror aplicabilitate in vivo este totuși limitată (printre acestea se numără introducerea de ADN cu ajutroul lipozomilor, electroporației, microinjecției, fuziunii de celule, cu DEAE-Dextran sau metoda prin precipitare cu fosfat de calciu). 65
Mai demult s-au conceput vectori virali recombinanți, care realizează transferul de gene, folosindu-se mecanismele de intrare eficientă ale virusurilor lor de plecare. Această strategie s-a folosit la construirea vectorilor recombinanți, retrovirali și adenovirali, pentru a ajunge la un transfer de gene foarte eficient in vitro și in vivo (Berkner, 1988). Cu toată eficiența lor, acești vectori sunt supuși la limitări, și anume cu privire la mărimea și la 70 construcția ADN-urilor care trebuie transferate. în afară de aceasta, aceste substanțe aduc cu sine riscuri de securitate pe baza transferului de Co ale gen-elementelor virale capabile de viață ale virusului inițial
Pentru a evita aceste limitări, s-au elaborat strategii alternative pentru transferul de gene, la a căror bază stau mecanisme, de care se servește celula pentru transportul macro- 75 moleculelor. Un exemplu pentru aceasta este importul genelor în celulă printr-o cale foarte eficientă, endocitoza intermediată de receptor (Wu și Wu, 1987, Wagner și colab., 1990, și EP-A10388758). Această soluție folosește conjugate moleculare bifuncționale, care prezintă un domeniu de legătură a ADN și un domeniu cu specific de citire pentru un receptor de suprafață al celulei (Wu și Wu, 1987, Waqner și colab., 1990). Când domeniul de recu- 80 noaștere al receptorului de suprafață a celulei este recunoscut, se intemalizează conjugatul pe calea endocitozei mediate de receptor, ADN-ul legat de conjugat fiind transportat prin antrenare. Cu ajutorul acestei metode s-au putut obține șobolani cu transfer de gene, care erau cel puțin la fel de valoroși ca cei obținuți prin metodele de până atunci (Zenke și colab., 1990). 85
S-a putut arăta, că ADN transportat în celulă prin acest sistem este exprimat și că, în cazul utilizării acidului nucleic cu acțiune inhibitoare, acțiunea inhibitoare nu este prejudiciată de sistemul de transport.
Cererea de brevet PCT WO 91/17773 se referă la un sistem pentru transportul acizilor nucleici cu acțiune specifică pentru celule T. Acest sistem utilizează proteine celulare 90 de suprafață ale liniei de derivație a celulei T, de exemplu, CD4, receptor folosit de virusul HIV. Acidul nucleic care se introduce se complexează cu un conjugat proteină polikation, a cărui cotă parte de proteină are capacitatea de a se lega de proteina de suprafață a celulei T, de exemplu, CD4, și celulele care exprimă această proteină de suprafață, sunt aduse în contact cu complecșii obținuți de proteină-polikation/acid nucleic. S-a putut demonstra că 95 prin ajutorul acestui sistem, ADN-ul transportat se exprimă în celulă.
Problema, pe care o rezolvă invenția, este de a realiza un complex de acid nucleic și o compoziție cu acesta pentru introducerea acidului nucleic în celulele eucariote superioare.
RO 117861 Β1
Complexul de acid nucleic, conform invenției, cuprinde unul sau mai mulți acizi nucleici, o primă substanță cu afinitate pentru acid nucleic și un agent endozomolitic care are el însuși un domeniu de legare la acidul nucleic sau este legat la o a doua substanță cu afinitate pentru acidul nucleic și care poate fi identică sau diferită față de prima substanță eventual, un factor de internalizare care este legat la prima substanță cu afinitate pentru acidul nucleic, raportul molar factor de internalizare/substanța cu afinitate pentru acidul nucleic este, de la 10:1 la 1:10.
Compoziția pentru introducerea în celulele eucariote superioare a unor complecși ai acizilor nucleici, conform invenției, este constituită dintr-un complex de acid nucleic, definit în revendicarea 1, un agent endozomolitic care, ca parte componentă a complexului de acid nucleic sau per se, are capacitatea de a fi preluat de celulele eucariote și pune în libertate, în citoplasmă, conținutul endozomilor în care complexul este localizat după intrarea în celulă, raportul molar factor de internalizare/substanță cu afinitate pentru acidul nucleic, fiind de la 10:1 la 1:10.
Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avantaje:
- transfecția în prezența unui astfel de virus nu are drept urmare formarea de ADN virali în celule,
- se pot transporta constructe de gene foarte mari în celulă, neexistând limitări cu privire la secvență.
Invenția se referă la caracteristica de utilizare a funcțiunilor specifice ale celulei, pentru a da posibilitatea sau de a ușura introducerea acidului nucleic în celulă.
în ambele cazuri se desfășoară mecanismele de preluare cu ajutorul unor factori, care sunt denumiți în invenția de față “factori de internalizare”. Sub această denumire trebuie să se înțeleagă factorii, care, în sens mai îngust sau mai larg sunt specifici tipului de celulă, eventual cu co-acțiunea unor alți factori (de exemplu, proteine de la suprafața celulei), se leagă de suprafața celulei și sunt internalizați. (în cazul celor două invenții menționate mai sus factorul de internalizare este transferina, respectiv o proteină care se leagă la antigenul de suprafață a celulei T, de exemplu, un anticorp anti-CD4). Factorul de internalizare este conjugat cu o substanță cu caracter policationic, care pe baza afinității față de acizii nucleici duce la obținerea unui compus între factorul de internalizare și acidul nucleic. (Astfel de substanțe se denumesc în cele ce urmează “substanțe cu afinitate pentru acidul nucleic” sau, în legătură cu ADN-ul “Domenii de legătură ADN”. Când o astfel de substanță se obține ca parte componentă a conjugatului format dintr-un acid nucleic și un factor de internalizarea unui compus, ea este denumită în cele ce urmează “factor de legătură”.
în cursul acestei invenții s-a constatat că se poate obține un optim pentru preluarea de acid nucleic în celulă, când raportul conjugat: acid nucleic a fost astfel ales, încât complecșii factori de intemalizare-policație/acid nucleic au fost în mare măsură neutrii.
Pornind de la această observație, s-au îmbunătățit metodele, care folosesc complecși de factor de internalizare-factor de utilizare/factor de legătură pentru introducerea de acizi nucleici în celule eucariote superioare.
Wagnerși colab., 1991, au descris o metodă, cu ajutorul căreia se poate îmbunătăți eficiența sistemelor, la care are loc preluarea de acizi nucleici cu ajutorul factorilor de internalizare. Cantitatea de acid nucleic preluat în celulă nu se micșorează, când o parte din conjugatele transferinei-polication se înlocuiește cu polication necovalent legat; în anumite cazuri se poate ajunge chiar la o mărire considerabilă a preluării ADN. Cercetările asupra stării moleculare a complecșilor transferinei-polication - plasmidă-ADN, care au fost preparați în condiții considerente optime ADN/conjugat, au dat ca rezultat că plasmida-ADN în prezența conjugatelor duce la structuri toroide (asemănătoare cu “doughnuts” = gogoașă în formă de covrig) cu un diametru de circa 80-100 nm, dense.
RO 117861 Β1 încercările realizate cu proteine care se leagă de celule T, drept factor de internalizare au dus la rezultate asemănătoare. 150
Adaosul de substanțe cu afinitate față de acid nucleic duce și la o mărire a eficienței sistemului de import și atunci când se utilizează o altă substanță cu afinitate pentru acidul nucleic ca factor de legătură.
Complecșii descriși de Wagner și colab., 1991a, care se preiau cu ajutorul factorului de internalizare prin endocitoză în celule eucariote superioare, conțin acid nucleic, complexat 155 cu un conjugat de factor de internalizare-factor de legătură. în plus, complecșii mai conțin una sau mai multe substanțe cu afinitate pentru acidul nucleic, care eventual sunt identice cu factorul de legătură, în formă legată ne-covalent, în așa fel, încât intemalizarea obținută prin conjugat și/sau expresia acidului nucleic este mărită, ceea ce se poate explica în primul rând printr-un efect de condensare, dar, însă poate fi explicat și prin alte mecanisme. 160
Dacă și cu ajutorul acestei metode ratele de expresie ale acidului nucleic introdus pot fi mărite, aceasta este însă supusă la limitări. Posibilitatea de folosire a acestui sistem într-o legătură dată de condiții nu este determinată în mod exclusiv prin prezența receptorilor de suprafață a celulei relevante pentru sistem; limitările la care sunt supuse folosirile acestor sisteme, probabil sunt un rezultat al faptului că complecșii de conjugat-ADN intemalizați în 165 endozomi ajung în lizozomi, unde ei sunt distruși de enzime. Pentru a mări cota parte de acid nucleic care ajunge în nucleul celulei și acolo este exprimat conform destinației sale, s-a încercat în experiențe, care au precedat invenția de față, să se realizeze transfecția celulelor în prezență de substanțe, care inhibă activitatea enzimatică în lizozomi, așa-numitele substanțe lizozomatrope. Cu ajutorul acestor măsuri s-a putut ajunge la o expresie intensificată 170 a ADN-ului introdus; reacțiile obținute au fost însă foarte diferite în funcție de substanța utilizată - substanțele lizozomatrope alese au avut ca rezultat o intensificare a transferului de gene, pe când altele chiar l-au și inhibat. Astfel,s-a constatat.de exemplu, că importul eficient de ADN depinde de prezența bazei slabe ciorchină (Zenke și colab., 1990, Cotten și colab., 1990). Dar acest efect obținut prin ciorchină nu se explică altfel, ci doar exclusiv, prin faptul 175 că ciorchina mărește valoarea pH în lizozomi; cu ajutorul diferitelor experimente s-a constatat că alte substane, care prezintă ca și ciorchina capacitatea de modulare a valorii pH, cum ar fi, monesina, clorură de amoniu sau metilamină, nu au putut înlocui ciorchina, în diferitele experimentări unele din aceste substanțe au arătat chiar o acțiune inhibatoare. Apoi,s-a mai constatat că diferite celule asupra cărora s-a acționat au prezentat diferite reacții asupra 180 aceleiași substanțe cu acțiune lizozomatropă.
Deoarece, transferul de gene pe cale fiziologică, așa cum este reprezentat de endocitoza intermediată de receptor cu ajutorul complecșilor de acid nucleic, prezintă avantaje mari (mecanism netoxic al pătrunderii prin membrana celulară; posibilitatea administrării acizilor nucleici biologic activi, cum ar fi, gene, fragmente de gene sau acizi nucleici care 185 inhibează în mod specific funcțiuni ale celulei, pe bază de repetiție sau în mod continuu; posibilitatea de a ajunge exact la scopul propus pe celulă (Targeting); posibilitatea de obținere a conjugatelor în cantități mari), există necesitatea de a face acest sistem mai eficient.
Scopul invenției de față este îmbunătățirea importului acidului nucleic în celule eucariote superioare (Sub denumirea de “import”, respectiv, “transfer” se înțelege, în cadrul in- 190 venției de față, în afara intrării complecșilor de acid nucleic în celulă prin membrana celulară și localizarea complecșilor, respectiv, a acidului nucleic pus în libertate din aceștia în interiorul celulei, până la atingerea locului adecvat pentru expresia lui). Celulele eucariot superioare sunt cunoscute specialistului; drojdiile nu fac parte din acestea (Watson și colab., 1987).
195
RO 117861 Β1
O multitudine de virusuri realizează pătrunderea lor în gazda lor eucariotă prin mecanisme, care corespunde în principiu celor ale endocitozei mediată de receptor. O infecție de virus pe baza acestui mecanism începe, în general, cu legarea de particule de virus pe receptorii de pe membrana celulei. Imediat după aceasta are loc internalizarea virusului în celulă. Acest proces de internalizare urmează o cale comună, corespunzând intrării liganzilor fiziologici sau a macromoleculelor în celulă: Receptorii de pe suprafața celulei se ordonează mai întâi, în grupe, pentru a forma un așa-numit “coated pit” (adâncitură acoperită), apoi, membrana se răsfrânge spre interior și formează o vezică înconjurată de un înveliș. După ce această vezică s-a desprins de învelișul său are loc în interiorul ei o adăugare cu ajutorul unei pompe de protoni localizată în membrană. Prin aceasta se provoacă punerea în libertate a virusului din endozom. în mod dependent de acest fapt, dacă virusul prezintă un înveliș de lipide sau nu, s-au luat în considerare două feluri de punere în libertate a virusului din endozom: în cazul așa-numiților virusuri “goi” (de exemplu, Adenovirus, Poliovirus, Thinovirus), s-a propus, ca valoarea scăzută a pH să provoace modificări de conformație în proteinele virusului. Prin aceasta se pun în libertate domenii hidrofobe, care nu sunt accesibile la valoarea fiziologică a pH. Aceste domenii obțin prin aceasta capacitatea de a trece la acțiunea de schimb cu membrana endozomală și prin aceasta să provoace punerea în libertate a virusgenomului din enzodom în citoplasmă. Despre virusuri cu înveliș din lipide (de exemplu, Vesicular Stomatitis Virus, Semliki Forest Virus, influența Virus) se crede, că valoarea scăzută a pH-ului modifică structura sau conformația unora din proteinele virusului prin care se ajunge la fuziunea membranei virusului cu membrana endozomilor. Virusurile, care pătrund cu ajutorul acestui mecanism în celulă, prezintă anumite caracteristici moleculare speciale, care le dă posibilitatea să rupă membrana endozomului, pentru a-și permite intrarea în citoplasmă.
Alte virusuri, de exemplu, virusurile care prezintă un înveliș, Sendai, HIV și unele tulpini de virus de leucemie Moloney, sau virusurile SV40 care nu prezintă nici un înveliș, precum și Polyoma nu necesită pentru pătrunderea lor în celulă nici un mediu cu pH scăzut, ele pot, fie să cauzeze o fuziune direct la suprafața celulei cu membrana (virusul Sendai, poate HIV) sau ei pot declanșa mecanisme, pentru a rupe membrana celulei sau să treacă prin ea. Se consideră că și virusurile independente de valoare pH, pot folosi calea endocitozei (Mc Clure și colab., 1990).
La soluționarea problemei date s-a plecat de la gândirea de a folosi mecanismul utilizat de anumite virusuri la pătrunderea lor în celule eucariote, pentru a mări și a îmbunătăți importul complecșilor de acizi nucleici în celule și prin aceasta să se sporească expresia acestora.
S-a încercat deja să se intemalizeze în celulă proteine în comun cu virusuri(Otero și Carrasco, 1987). în acest caz s-a constatat că se folosește permeabilizarea celulei cu virus pentru introducerea de macromolecule. în procesele care se desfășoară în acest caz se pare că este vorba despre mecanisme în fază lichidă.
Cu ajutorul factorului de creștere epidermal (Epidermal Growth Factor, EFG), conjugat cu o toxină, s-a constatat, că acest ligand natural, care după legare la receptorul său este preluat în celulă prin endocitoză, în comun cu adenovirusul, care este, de asemenea, preluat de celulă prin endocitoză mediată de receptor, ajunge în același endozom și din acesta, de asemenea, în comun cu virusul, este eliberat în citozol (Fitz Gerald și colab., 1983).
S-a constatat în mod surprinzător, că prezența anumitor agenți (de exemplu, virusuri, componente de virusuri sau alte substanțe active), care prezintă în ceea ce privește mecanismul lor de intrare în celule eucariote proprietățile anumitor virusuri, are drept efect o mărire considerabilă a ratei expresiei unui acid nucleic important în celulă ca parte a unui complex. Această constatare a fost surprinzătoare mai ales deoarece complecșii de acid nucleic preluați în celulă sunt foarte mari.
RO 117861 Β1
Invenția de față se referă deci, la o compoziție pentru transfecția celulelor eucariote superioare cu un complex din acid nucleic și substanță cu afinitate pentru acidul nucleic, care este cuplată, eventual, cu un factor de internalizare pentru aceste celule. Compoziția este caracterizată prin aceea că. ea conține o substanță, care are capacitatea, per se sau 250 ca parte componentă a complexului de acid nucleic, să fie preluată de celulele care trebuie transificate și să pună în libertate în citoplasmă conținutul endozomilor, în care complexul este localizat după intrare în celulă.
Această substanță se denumește în cele ce urmează “agent endozomolitic”.
Capacitatea agenților endozomolitici, de a prelua celulele de transfectat și a pune în 255 libertate în citoplasmă conținutul endozomonWor, în care acești agenți sunt localizați după intrarea în celulă se denumește în cele ce urmează “în funcție de preluare”. Această funcție de preluare se compune din capacitatea activă de a se intemaliza în celulă prin mecanisme de endocitoză dependente de receptor sau pasivă, de a se internaliza în celulă prin faza lichidă, sau ca parte componentă a complexului de acid nucleic, și din capacitatea de a 260 sparge endozomii, care se denumește, în general, “activitate endozomolitică” sau “endozomoliză”.
într-una din formele de realizare ale invenției, agentul endosomolitic este un virus, într-o altă formă de realizare, agentul endosomolitic este o componentă de virus. Virusul, respectiv componenta de virus care se folosește în aceste forme de realizare ale invenției 265 de denumesc în cele ce urmează drept “virus liber” sau componentă liberă de virus.
în cadrul invenției de față acțiunea unei doze crescânde de adenovirusuri asupra capacității de transfer a genelor unei cantități constante de conjugat de transferină-polilizină s-a cercetat în celule HeLa, ca genă reporter fiind utilizată gena luciferază. Intensificarea transferului de gene obținută prin adenovirus a atins un maxim la 1 x 104 particule de virus 270 pe celulă, o cifră, care corespunde numărului aproximativ de receptori de adenovirus per celulă HeLa. Intensificarea de până la 2000 ori a expresiei luciferazei față de expresia, care se realizează numai cu conjugate de transferină-polilizină, a corespuns dozei mai ridicate de virus. într-un alt șir de cercetări s-a cercetat capacitatea unor cantități limitative de complecși de conjugat-ADN în prezența unei doze constante de adenovirus. S-a constatat că 275 preluarea de adenovirusuri în celule a intensificat transferul de gene mediat prin transferinăpolilizină printr-un interval larg de dozaje ADN. Intensitatea maximă a expresiei genelor, care s-a obținut prin complecșii de conjugat-ADN, a corespuns intensității, care a fost obținută cu de 100 ori mai puțin ADN, când s-au folosit adenovirusuri pentru intensificarea eficienței transfecției. 280
Acțiunea adenovirusului asupra transferului de gene a fost cercetată, atât pentru ADN necomplexați, cât și pentru ADN care au fost complexați cu polilizină sau cu conjugate de transferină-polilizină (fig.3A). Conform acestei analize, prezența adenovirusului în timpul transfecției a intensificat numai în mică măsură transferul de ADN goi, necomplexați. în compoziție puternică cu aceasta, transferul de ADN, complexat cu polilizină sau cu conju- 285 gate de transferină-polilizină, a fost intensificat prin adaos de adenovirus, acest efect apărând mult mai intens la conjugatele de transferină-polilizină. Dat fiind că cota parte de policații în conjugat nu folosește numai pentru a obține legătura dintre ADN și transferină, ci produce și modificări structurale evidente în structura ADN (compactare la structuri toroide; Wagner și colab., 1991 a), nu s-a putut remarca la început pe baza experimentărilor 290 vreo deosebire, dacă efectul observat este al unui transport intensificat al ADN condensat prin policație în faza lichidă sau se explică prin transportul intensificat prin virus al transportului de complex conjugat-ADN legat de receptor. Pentru a face deosebirea dintre aceste două posibilități, s-au realizat prin încercări succesive de legături (fig.3B). Legarea de transferină-polilizină sau complecși polilizină-ADN la temperatură scăzută fără internalizare 295
RO 117861 Β1 dă posibilitatea de a se îndepărta, înainte de tratare cu adenovirus, a complexului în exces în faza lichidă, (Fitz Gerald și colab., 1983), dacă s-a procedat în acest fel, s-a mărit în mod semnificativ transportul de complecși transferin-polilizin-ADN legate de receptor prin adaos de particule de adenovirus, ceea ce nu a fost valabil pentru complecșii de polilizină-ADN. Deci, intrarea ADN în celulă prin endocitoza mediată de receptor, este intensificată în mod specific.
Apoi, s-a cercetat care funcțiune specifică a adenovirusului este cea care provoacă o intensificare a transferului de gene mijlocită de receptor (fig.3C). Un tratament termic blând ale particulelor de virus nu modifică capacitatea lor de a se lega de membrana celulară a celulelor care trebuie tratate, însă influențează în rău posibilitatea acestor particule să rupă endozomii după intrarea lor în celulă (Defer și colab., 1990). Pe baza acestor date s-au putut cerceta separat diferitele efecte ale legării virusului și a intrării virusului în celulă. în cadrul încercărilor efectuate pentru invenția de față s-a constatat, că o activare la cald a anihilat complet capacitatea virusurilor de a intensifica transferul de gene care se desfășoară prin endocitoza mediată prin receptor.
Din aceasta s-a tras concluzia că intensificarea transferului de gene cu ajutorul conjugatelor de transferină-polilizină se explică în mod specific prin capacitatea adenovirusului, ca parte a funcțiunii sale de preluare, de a putea rupe endozomii. Faptul că o tulpină cu replicație defectă de virus ar putea produce o intensificare a expresiei genei, confirmă presupunerea că acest fenomen nu se explică prin funcția de replicație, ci prin funcția de preluare.
Pentru a exclude posibilitatea că intensificarea expresiei genei se explică printr-o eventuală transactivare a genei importate prin virus, s-au realizat încercări cu o linie de celule, care exprimă constitutiv gena RSV-LTR-luciferaza: adenovirusurile nu au arătat nici un efect în această linie de celule, pe când ei au provocat cu ajutorul conjugatelor de transferină-polilizină o intensificare clară a expresiei genei în linia de celule parenterale în care a fost introdusă. Această constatare a clarificat că adenovirusul este Influențat de fapte care au loc înainte de transcripție, că astfel acțiunea lor de intensificare asupra importului de gene are loc pe planul importului de gene și nu pe planul expresiei de gene (fig.5).
Apoi, s-a cercetat în cadrul invenției de față, ce acțiune este arătată asupra transferului de gene cu ajutorul conjugatelor de transferină-polilizină în linii selectate de celule. S-a constatat că prezența receptorilor de transferină pe celulele asupra cărora se dorește a se acționa este necesară, dar nu suficientă în toate cazurile, pentru a da posibilitatea transferului de gene cu ajutorul conjugatelor de transferină-polilizină. Anumiți factori specifici ai celulelor, care sunt în legătură cu destinația complecșilor de conjugat-ADN intemalizați în endozomi, par să joace un rol esențial pentru măsura transferului de gene, care poate fi obținut prin această cale. Din acest punct de vedere s-au studiat unele linii de celule selectate, atât cât privește transferul de gene cu ajutorul conjugatelor de transferină-polilizină, cât și în ce privește intensificarea transferului de gene prin adenovirusuri (fig.4). Celule ale unei linii de celule de fibroză cistică (CFT1) au arătat o expresie de gene de luciferază, potrivită numai după tratarea cu complecși de transferină-polilizină-ADN. Valoarea expresiei a fost mărită în mod semnificativ prin tratare cu adenovirusul d1312. în contradicție cu aceasta, celule de KB, care au fost tratate cu complecși de transferină-polilizină-ADN au arătat în ciuda prezentei de receptori de transferină o expresie a genei de luciferază, care a fost abia puțin mai ridicată decât nivelul de bază (Background). Totuși,un tratament cu adenovirus d1312 a avut ca efect la aceste celule activități clar demonstrabile de luciferază. în mod asemănător a acționat tratamentul cu adenovirusuri asupra celulelor HeLa, acest efect fiind totuși mult mai puternic la aceste celule, dat fiindcă și celulele HeLa și celulele KB au aproximativ același număr de receptori pentru adenovirus, deosebirea în intensificarea transferului
RO 117861 Β1 de gaze ar putea să reflecte numărul de receptori de transferină, care sunt caracteristici pentru un tip de celulă. Ca deosebire clară față de aceste rezultate, totuși, liniile de celule 345 WI-38 și HRC-5, despre care se cunoaște că în ele infecția cu adenovirus d 1312 are loc numai în mod slab, (Precious și Russel, 1985) au arătat numai o intensificare redusă a expresiei de gene, obținută numai prin complecșii de conjugat-ADN. Tratamentul cu adenovirusuri se pare că intensifică transferul de gene cu ajutorul complecșilor de conjugat-ADN în acele cazuri, în care transferul de gene este posibil prin endocitoză mediată prin receptor, 350 ca în cazul celulelor CFT1, precum și în unele cazuri, în care transferul de gene pe această cale decurge în mod ineficient, ca la celulele HeLa și celulele KB. Că măsura intensificării dintre diferitele celule care trebuie tratate variază în mod clar, ar putea să aibă cauza, în faptul că, acest efect este, atât o funcție a numărului de receptori de virusuri, de exemplu, a receptorilor de adenovirus al unui anumit tip de celule, precum și numărul de receptori de 355 transferină.
în cazul utilizării unui virus liber, substanța cu afinitate pentru acidul nucleic este, de preferință, o policație organică, care este, de preferință, conjugată cu un factor de intemalizare. Totuși, s-a constatat în cadrul invenției de față că, în anumite împrejurări se poate introduce în celulă, în prezența unui virus liber, ADN-ul care este completat numai cu o 360 substanță cu afinitate pentru acidul nucleic, deci fără un factor de internalizare. Apoi, s-a găsit că, la unele linii de celule, preluarea de complecși, constând din acid nucleic și substanță cu afinitate față de acidul nucleic, poate avea loc prin faza lichidă, dacă concentrația complecșilor este corespunzător de ridicată. Din încercările, care au fost efectuate în cadrul invenției de față și a invențiilor precedente, s-a dedus, că un element esențial pentru capa- 365 citatea de preluare a complecșilor de acizi nucleici este compactitatea lor, care se explică prin condensarea substanței cu afinitate față de acidul nucleic. Dacă substanța cu afinitate pentru acidul nucleic posedă, pe lângă capacitatea ei de a creea electroneutralitatea în mare măsură a complexului și de a îndesa acidul nucleic la o structură compactă, și o capacitate suficientă pentru legarea la suprafața celulei, pentru a pătrunde în comun cu virusul în 370 celulă, se poate renunța la mărirea capacității de preluare prin legarea covalentă a unui factor de internalizare la substanța cu afinitatea pentru acidul nucleic, pentru a forța complexul să intre în celulă prin endocitoză mediată de receptor. Unele celule prezintă o afinitate relativ ridicată față de anumite substanțe cu afinitate față de acidul nucleic, astfel, încât conjugatele din acid nucleic și factorul de legătură sunt preluați în celulă, fără ca să fie necesară 375 și acțiunea unui factor de internalizare. Acest lucru este valabil, de exemplu, la hepatocite, despre care s-a constatat în cadrul invenției de față că ele preiau complecși de ADNpolilizină.
într-o formă preferată de realizare a invenției, agentul endosomolitic este un virus, care este legat de substanța cu afinitate față de acidul nucleic și care are capacitatea, de 380 a pătrunde în celulă ca parte a complexului conjugat/acid nucleic și care pune în libertate în citoplasmă conținutul endozomilor, în care este localizat complexul după intrarea în celulă.
într-o altă formă preferată de realizare a invenției, agentul endosomolitic este o componentă de virus, care este legată la o substanță cu afinitate pentru acidul nucleic și care are capacitatea de a pătrunde în celulă ca parte a complexului conjugat/acid nucleic și să pună 385 în libertate conținutul endozomilor, în care complexul este localizat după intrarea în celulă, în citoplasmă.
Virusurile sau componentele de virusuri, care sunt legați la un domeniu de legătură al unui acid nucleic, se denumesc în cele ce urmează, independent de felul legăturii, “conjugate virale”.
390
RO 117861 Β1
Conjugatele virale, care constituie, de asemenea, obiectul invenției de față, conțin virusul sau componenta de virus ca parte componentă integrală a construcției lor funcționale și reunesc avantajele sistemului de vectori pe bază de conjugate de factor de internalizare cu avantajele, de a introduce virusurile în sistem.
în plus, conjugatele virale au conform acestor forme de realizare a invenției avantajul că, evită limitarea de bază care este inerentă sistemului de conjugat bifuncțional, cunoscut pentru transferul genelor prin endocitoză mediată prin receptor, dispunând de un mecanism propriu, care dă posibilitatea punerii lor în libertate din sistemul vezicular al celulei. Conjugatele virale, conform invenției, prezintă o deviere conceptuală de bază față de vectorii virali recombinanți, ADN-ul străin de transportat fiind purtat pe partea exterioară a virionului. Prin aceasta se pot transporta cu ajutorul conjugatelor, conform invenției, și constructe de gene foarte mari în celulă, neexistând limitări cu privire la secvență.
Caracteristica unui virus, care trebuie introdus ca virus (sau parte de virus), drept componentă de virus în cadrul invenției de față este definită prin funcția sa de preluare. Virusuri adecvate sunt pe de-o parte, acelea care posedă capacitatea de a produce, în timpul transfecției celulelor cu complexul de acid nucleic, pătrunderea în celulă prin endocitoza mediată de receptor și punerea lor în libertate - și prin aceasta punere în libertate a acidului nucleic - din endozom în citoplasmă. Fără a ne baza pe această teorie, acest mecanism al complecșilor de acid nucleic importați în celulă este benefic în măsura în care acești complecși, la internalizare, ajung în aceiași endozomi ca și virusurile, fiind transportați împreună cu virusurile din endozomi în citoplasmă. Dacă complecșii de acid nucleic conțin virusul sub formă legată, ei profită de activitatea endosomolitică a virusului și sunt transportați din endosomi în citoplasmă. în acest caz, se pare că se evită fuziunea dintre endozomi și lizozomi și cu aceasta se evită descompunerea enzimatică care are loc în mod normal în aceste organe mici ale celulei.
Exemple pentru virusuri și celule eucariot superioare, în care aceste virusuri pot pătrunde, se pot prelua.de exemplu, din Fields și Knipe, 1990. Caracterul primitor al unei linii este de celule pentru transformarea printr-un virus, care se folosește sub forma unui virus liber pentru înlesnirea intrării complecșilor de acid nucleic în celule, depinde de prezența și de numărul de receptori de suprafață pentru virus de pe celula asupra căreia se acționează. Cu privire la receptorii suprafeței celulei pentru adenovirus s-au descris metode pentru determinarea numărului lor pe celulele HeLa și KB de către Svensson, 1990 și Defer, 1990.
Virusurile adecvate pentru compoziția, conform invenției, și la care, la începutul infecției funcția de preluare de desfășoară prin endocitoză mediată prin receptor, sunt pe de-o parte virusurile fără înveliș de lipide, cum ar fi, Adenovirus, Poliovirus, Thinovirus, pe de altă parte virusuri cu înveliș cum ar fi, Vesicular Stomatitis, Semliki Forest, Influența-Virus; în afară de aceștia sunt adecvate tulpinile dependente de valoarea pH ale virusului Moloney. Virusurile deosebit de preferate pentru aplicarea invenției de față sunt Adenovirus, subgrupa C, tipul 5, Semliki Forest Virus, Vesicular Stomatitis Virus, Poliovirus, Rhinovirusuri și tulpinile de virusuri ai leucemiei Moloney.
Utilizarea de virusuri ARN, care nu au o transcriptază reversă, au pentru invenția de față avantajul, că o transfecție în prezența unui astfel de virus nu are drept urmare formarea de ADN virali în celulă. în cadrul invenției de față s-a arătat că Rhinovirusul HRV2, un reprezentant al grupei Picornavirus, mărește expresia unei gene reporter. Eficiența Rhinovirusului a fost dovedită atât sub formă liberă cât și sub formă de conjugate de virusuri.
în cadrul invenției de față, prin denumirea de virusuri se înțeleg - presupunând că ei sunt preluați în celulă și pun în libertate conținutul endozomilor, în care ajung - în afară de tipurile naturale și mutanții cărora le-a revenit, pe baza uneia sau mai multor mutații, funcțiuni ale tipului natural, care sunt deosebite față de funcțiunea de preluare, mai ales capacitatea de replicare.
RO 117861 Β1
Astfel de mutanți se obțin prin mutații, respectiv deleții în regiunile proteinei virusului, care sunt responsabile pentru funcțiile de replicație și care sunt dispensabile și care pot fi suplimentate prin linia de etanșare, cu ajutorul procedeelor tradiționale ale mutagenezei. Dintre acești mutanți fac parte, de exemplu, în cazul unui adenovirus, din mutanții ts (mutanți senzitivi la temperlatură), mutanți E1A și E1B, mutanți care prezintă mutații în genele acțio- 445 nate în MLP (Berkner, 1988) și mutanți care prezintă mutații în domeniile anumitor capsidproteine. Sunt adecvate și tulpinile de virusuri, care prezintă mutații corespunzătoare naturale. Capacitatea de replicare a virusurilor poate să fie cercetată, de exemplu, cu ajutorul unor Plaque-Assays cunoscute în literatură, la care culturile de celule sunt acoperite în straturi cu suspensii de concentrate diferite de virus și se stabilește numărul de celule lizate, 450 care sunt vizibile cu ajutroul plăcilor (plaques (Dulbecco, 1980).
Pentru folosirea în cadrul invenției de față sunt adecvate și așa-numitele virusuri defecte, acestea sunt virusuri, cărora le lipsește, în una sau mai multe gene, funcțiunea necesară pentru replicarea autonomă a virusului, pentru care, au nevoie de virusuri ajutătoare. Reprezentanți ai acestei grupe sunt particulele Dl (“defective interfering particles”), 455 care derivă din virusul standard infecțios, au aceeași structură de proteină ca virusul standard, prezintă mutații și au nevoie de virusul standard ca virus ajutător pentru replicarea lor (Huang, 1987; Olanda, 1990). Reprezentanți ai acestei grupe mai sunt, în afară de aceștia, virusurile satelit (Olanda 1990). O altă grupă este clasa parvovirusurilor, care se denumesc “adeno-associated virus” (Bems, 199). Dat fiind că, ciclurile de preluare a multor virusuri în 460 celulă nu sunt încă clarificate în totalitate, se presupune că mai există și alte virusuri, care prezintă activitatea endozomolitică, care este necesară pentru a se preta la folosirea în invenția de față.
Apoi, în cadrul invenției de față, sunt adecvate vaccinurile vii atenuate (Ginsberg, 1980) sau tulpinile de vaccinare. 465
Apoi, mai cad sub incidența noțiunii de virusuri în cadrul invenției de față, virusurile inactivate, de exemplu, prin tratament chimic, cum ar fi, tratamentul cu formaldehidă, prin iradiere UV, prin tratament chimic combinat cu iradiere UV, de exemplu, tratare cu psoralen/UV sau tratament cu bromdezoxiuridină/UV, prin iradiere gama sau prin bombardare cu neutroni, în vederea inactivării virusurilor. Virusurile inactivate, așa cum se utilizează, 470 de exemplu,și pentru vaccinuri, pot fi obținute cu ajutorul metodelor standard (Davis și Dulbecco, I980, Hearst și Thiry, 1977) și testate pentru folosirea și mărirea importului de complecși ADN. în cadrul invenției de față s-au făcut încercări în care s-au obținut preparate de adenovirus cu ajutorul unei lămpi de sterilizare tradiționale UV, respectiv, cu formaldehidă pentru inactivare și s-a constatat în mod surprizător, că măsura inactivării virusurilor era mult 475 mai mare decât scăderea efectului de transfer al genelor, care s-a obținut, când s-a adăugat adenovirus la mediul de transfecție. Și încercările care s-au făcut cu preparate de adenovirus biotinilat inactivat cu psoralan/UV, care adenovirus a fost conjugat cu polilizină cuplată cu streptavidină, au arătat că, drept urmare a inactivării titrul virusului a scăzut în mod considerabil mai puternic decât capacitatea de transfer a genelor. Aceasta este o indicație clară 480 asupra faptului, că mecanismele, care sunt în legătură la virusul activ cu mecanismul normal de infectare, pot fi distruse, fără ca efectul esențial pentru transferul de gene să fie distrus.
Prin noțiunea “componente de virus se înțeleg părți de virusuri, de exemplu, partea de proteină eliberată de acidul nucleic (capsida goală de virus, care poate fi obținută cu ajutorul metodelor recombinante, vezi,de exemplu, Ansardi și colab., 1991, Urakawn și 485 colab., 1989), proteine care se obțin la fracționare, sau peptide care posedă capacitatea endosomolitică esențială pentru funcțiunea de preluare a virusului intactivat. Aceste componente de virus pot fi obținute și în mod sintetic, în funcție de mărimea lor, fie cu ajutorul sintezei peptidelor, fie cu ajutorul metodelor recombinante. în cadrul invenției de față s-a putut
RO 117861 Β1 arăta, că proteinele de adenovirus, care sunt conjugate cu polilizină prin biotină/ streptavidină, pot intensifica transferul de gene. Exemple pentru fragmente de proteină de la alte virusuri ca adevirusuri, care sunt esențiali pentru internalizarea virusului, cuprind hemaglutinina virusului de influența (HA). Secvența N-terminală a hemaglutininei HA2-respectiv, această subunitate este răspunzătoare pentru punerea în libertate a virusului din endozom. S-a arătat că peptidele, care constau din 20 aminoacizi cu această secvență, fuzionează cu membranele lipidelor și le pot rupe/distruge parțial (Warton și colab., 1988). în invenția de față s-au folosit peptide de influența autentice și modificate cu succes în diferite forme de realizare. Un alt exemplu sunt proteinele de înveliș ale retrovirusurilor, de exemplu HIV gp41 (Rafalski și colab., 1990) respectiv, părți din aceste proteine de virus.
Utilizarea virusurilor, care au de la sine capacitatea de a pătrunde în celule, este numai un aspect al invenției de față.
Virusurile sau componentele de virusuri, care de la sine nu aduc cu sine capacitatea de a se lega de celulă și de a pătrunde în aceasta, se utilizează, de preferință, sub forma conjugatelor virale mai sus definite. Cuplarea la un domeniu de legătură ADN, de exemplu, o policație, realizează că virusul, respectiv, componenta de virus obține o afinitate puternică la moleculele de ADN, se complexează cu aceasta și este transportat în celulă ca parte componentă a complexului de ADN, care mai conține și un factor de internalizare/conjugat cu un domeniu de legare a ADN. în plus, față de efectul de transport realizat astfel, legarea virusului respectiv a componentei de virus la un domeniu de legătură a acidului nucleic poate avea ca urmare și o îmbunătățire a proprietăților sale de endozomolitice.
Prin alegerea altor factori de intemalizare, se poate transfeca practic, orice celulă eucariotă cu compoziția, conform invenției.
Faptul că un virus dat, respectiv, o componentă de virus este adecvată pentru o funcție de preluare în sensul invenției de față și astfel pentru utilizarea la intensificarea transferului de gene, poate fi constatat cu ajutorul unei simple încercări test Screeningassay. într-un astfel de test, de exemplu, pentru a testa un virus asupra posibilității sale de utilizare ca virus liber, celulele asupra cărora se acționează se aduc în contact cu un complex ADN în prezența sau în absența virusului. Cantitatea de complex ADN care se pune în libertate în citoplasmă, poate fi apoi determinată în mod simplu prin detectarea cu un produs de marcare, de exemplu, luciferază. Dacă prezența virusului are drept urmare că complexul ADN este preluat în măsură mai mare în celulă decât fără virus și este pus în libertate în citoplasmă, acest lucru poate fi explicat prin funcția de preluare a virusului. Mai este posibil, să se compare virusul de testare cu privire la funcția sa de preluare cu un virus, despre care se cunoaște că prezintă o funcție de preluare adecvată, de exemplu, cu adenovirus, subgrupa C, tipul 5. Țeste de acest fel pot fi aplicate și asupra unor conjugate virale, fiind supuși la astfel de teste și parametrii suplimentari, cum ar fi, conjugate de factori diferiți de intemalizare în diferite cantități. în plus, specialistul în materie poate să facă încercări de acest fel, eventual în legătură cu alte teste, ca, de exemplu, încercări de permeabilitate a lipozomilor (“Lipozomen Leakage Assays”), într-un mod simplu asupra unor componenți de virusuri sau alți agenți cu activitate endozomolitică potențială, pentru a-i cerceta asupra capacității lor de mărire a expresiei genelor.
în cazul utilizării de virusuri intacți, se examinează, eventual, paralel cu pre-încercările în care virusul este cercetat asupra capacității sale de intensificare a transferului de gene, și dacă virusul este capabil de replicare. Cercetarea asupra capacității de replicare se realizează în cazul virusurilor citopatici sau în cazul virusurului, care prejudiciază în mod vizibil creșterea celulelor gazdă, cu ajutorul plăcilor de testare (vezi ca mai sus). La alte virusuri se aplică metode de identificare speciale pentru virusul respectiv, de exemplu, testul de hamaglutionare sau metode chimico-fizice (electron-microscopice).
RO 117861 Β1 în cadrul invenției de față se preferă mai ales la utilizarea de virusuri libere, astfel de virusuri, care sunt obtenabili cu titru ridicat, care sunt stabile, care prezintă ca tip natural o 540 patogenitate scăzută și la care este posibilă o înlăturare intenționată a funcțiunilor de replicare, mai ales adenovirusuri. Dacă trebuie transfectată o anumită populație de celule, se preferă virusuri, care infectează această populație de celule în mod specific. Pentru cazul, în care prin transfecție trebuie cuprinse diferite tipuri de celule, se pot folosi virusuri, care sunt infecțioși pentru a domina măi larg de tipuri de celule. 545
Cerințele la prepararea virusurilor sunt în mod esențial de cea mai mare puritate posibilă precum și un tampon de stabilizare adaptat pentru virusul respectiv.
în fiecare caz se iau în considerare pentru aplicarea terapeutică a invenției de față in vivo numai acele virusuri, respectiv, componente de virusuri, la care riscurile de securitate, mai ales în ceea ce privește replicarea virusului în celulă precum și recombinarea virusului 550 ADN cu ADN-ul gazdei sunt cât mai mici.
în mod avantajos se pot aplica mecanismele de intrare ale virusului, care infectează alte animale decât oameni, pentru a intensifica preluarea și punerea în libertate a ADN în celule eucariote superioare, mai ales în celule umane, în măsura în care virusul prezintă în celule capacitatea de rupere a endozomilor. Membri ai familiei de adenovirus au fost izolați 555 din tipuri de păsări, din amfibii și din diferite alte păsări (vezi, de exemplu, Laver și colab., 1971; Bragg și colab., 1991; Akopian și colab., 1991; Takase și colab., 1990; Khang și Nagaraji, 1989, și Reece și colab., 1987). Virusuri de amfibieni, păsări, vite, câini, șoareci, oi, porci și maimuțe, precum și adenovirusuri umane se pot achiziționa din American Type Culture Collection, Rockville, Maryland (vezi, American Type Culture Collection Catalogue 560 of Animal Viruses and Antisera, Chlamydae and Rickettsiae, ediția 6, 1990, C.Buck și G.Paulino Hsg., pp. 1-17).
Avantajele posibile ale utilizării unui virus, de exemplu, a unui Adenovirus, al unei specii îndepărtate ar putea să fie o toxicitate micșorată în celulele asupra cărora se acționează (de exemplu, nu s-a așteptat de la adenovirusul de păsări de curte sau de broaște că 565 s-ar replica în celule de mamifere sau să inițieze în acestea expresia unor gene timpurii), un risc micșorat în comparație cu adenovirusul uman pentru cercetător, care obține acest virus al unei specii îndepărtate, și o pertubare micșorată prin anticorpi față de adenovirusul uman sau de șoarece. Lipsa unei perturbări prin anticorpii umani sau de șoarece este deosebit de importantă, când virusurile se utilizează pentru genoterapia la om sau la șoarece. 570
Adenovirusul de găini CELO (Chick Embryo Lethal Orphan Virus) nu arată nici o reactivitate cu anticorpii care recunosc epitopii grupelor principale ale adenovirusului, care infectează celulele mamiferelor. în afară de aceasta se pot cultiva virusuri CELO în ouă cu dezvoltare embrionară, pentru a obține cantități mari de virus (0,5 mg/ou; Laver și colab., 1971). Așa cum rezultă din exemple, conjugatele de CELO-polilizină intensifică transportul 575 ADN în celulele HeLa într-o măsură, care este comparabilă cu adenovirusul uman d1312. De aceea, utilizarea de conjugate cu CELO pentru intensificarea transportului ADN este foarte promițătoare pentru genoterapia umană.
S-au folosit virusuri din specii îndepărtate, de preferință, ca părți componente ale conjugatelor virale în complecși de combinații (conform definiției în cadrul invenției de față). 580 în conjugatele, conform invenției, care conțin un virus, se poate ca legătura virusului la domeniul de legătură al acidului nucleic să fie covalentă sau necovalentă, legăturile necovalente fiind o punte de biotină-streptavidină sau pentru cazul în care virusul prezintă pe proteinele de pe suprafața sa regiuni, care sunt acide și de aceea se pot lega de o policație, printr-o legătură ionică. 585 în încercările efectuate în cadrul invenției de față s-au format complecși în condiția ca acțiunea de schimb dintre adenovirus și polilizină să fie permisă înainte de complexarea
RO 117861 Β1 cu ADN. Drept încercare de control s-au făcut experiențe în condițiile în care polilizina a fost mai întâi neutralizată cu ADN și de aceea nu este liberă să se lege de adenovirus. în aceste încercări complecșii cu adenovirus legat ionic s-au dovedit a fi superioare.
Exemple pentru componente de virusuri în conjugatele, conform invenției, cu activitate endozomolitică sunt capsidele de virus goale sau peptidele virale. Legătura componentei de virus la domeniile de legătură a acidului nucleic poate fi covalentă, de exemplu, prin cuplare chimică a peptidei virale cu polilizină, sau necovalentă, de exemplu, ionică în cazul în care componenta de virus are radicali acizi, pentru a se lega de un polication.
Raportul dintre virus sau componenta de virus față de substanța cu afinitate față de acidul nucleic poate să varieze. în cazul conjugatului de polilizină-hemaglutininpeptida - influența s-a găsit în cadrul invenției de față că transferul de gene poate fi intensificat în măsură mai mare, când conținutul de peptidă virală din conjugat a fost mai ridicat.
Invenția de față se referă într-un alt aspect la metode pentru obținerea conjugatelor, conform invenției din virus (componente de virus), și substanță cu afinitate pentru acidul nucleic.
Conjugatele virale pot fi obținute (ca și conjugatele de factor de internalizare-policație) prin cuplarea componentelor sau, în cazul în care componenta de virus și policația sunt polipeptide, pe cale recombinantă, cu privire la metodele de obținere se face referire la dezvăluirea din EP 388758.
Cuplarea virusului, a proteinelor de virus sau a peptidelor de virus cu compuși poliaminici pe cale chimică poate avea loc în modul cunoscut pentru cuplarea peptidelor, caz în care, dacă este necesar, componentele individuale se prevăd înainte de reacția de cuplare cu substanțe de fixare (aceasă măsură este necesară atunci când la început nu există nici-o grupă funcțională adecvată pentru cuplare, de exemplu, o grupă mercapto sau de alcool. Prin substanțe de fixare se înțeleg compușii bifuncționali, care mai întâi sunt aduși la reacție cu grupe funcționale ale componentei individuale, după care se realizează cuplarea componentei individuale modificată).
Cuplarea poate avea loc prin:
a) Punți de disulfură, care pot fi scindate din nou în condiții reducătoare (de exemplu, la utilizarea de ditiopropionat de succinimidilpiridil) (Jung și colab., 1981);
b) prin compuși foarte stabili în condiții biologice (de exemplu, tioeter prin reacția linkerilor maleimido cu grupe de sulfhidril la linkerul legat de cea de-a doua componentă);
c) prin punți labile în condiții biologice, de exemplu, legături de esteri, sau legături de acetal sau cetal, instabili în condiții slab acide.
în cadrul invenției de față, prin încercările efectuate s-au cuplat hemoglutinin HA2peptide de influența cu polilizină pe cale chimică cu ajutorul ditiopropionatului de succinimidilpiridil (SPDF). S-a dovedit, că modificarea peptidei cu polilizină mărește activitatea endosomolitică. Experiențele de transfecție au arătat că eficiența transferului de gene mediată prin transferin-polilizină crește considerabil, când conjugatele de influența-peptid-polilizină există împreună cu transferin-polilizina în complexul ADN.
Apoi, s-a cuplat în cadrul invenției de față adenovirus cu ajutorul unor metode diferite la polilizină.
Un mod de cuplare la polilizină a avut loc în mod asemănător ca la obținerea de conjugate de transferin-polilizină (Wagner și colab., 1990) după modificarea adenovirusului d1312 defect cu ajutorul unui reactiv heterobifuncțional. Polilizina nelegată a fost separată prin centrifugare. Posibilitatea de legare ADN a fost demonstrată într-o experiență de legare cu ADN marcat radioactiv.
R0117861 Β1 în celulele K562 în absența clorochinei s-a putut găsi complecși constând din ADN, 635 adenovirus-polilizină și transferin-polilizină un transfer de gene mult mai ridicat decât cu adenovirus nemodificat, care nu este prezent și legat de ADN. Apoi, s-a găsit că în celule
HeLa a avut loc, cu ajutorul adenovirusului modificat cu polilizină o expresie clară de gene cu numai 0,0003 pg ADN în 5 x 105 celule HeLa.
în cazul în care virusul, respectiv componenta de virus prezintă lanțuri adecvate de 640 hidrați de carbon, ei pot fi legați de substanța cu afinitate pentru acidul nucleic prin unul sau mai multe lanțuri de hidrați de carbon ai glicoproteinei, unele cu altele.
O metodă adecvată pentru obținerea de conjugate de glicoproteină-policație este dezvăluită în brevetul german P 41150384; ea a fost descrisă recent de Wagner și colab., 1991b. 645
Un alt procedeu preferat pentru obținerea conjugatului, conform invenției, este cuplarea enzimatică a virusului respectiv a componentei de virus la o substanță cu afinitate pentru acidul nucleic, mai ales o poliamină, printr-o transglutaminazâ.
Grupa transglutaminazelor cuprinde mai multe enzime diferite, care se găsesc între altele în epidermă (transglutaminazâ epidermală), în sânge (factorul XIII) și în celulele unor 650 țesături diferite (transglutaminazâ de țesături) (Folk, 1985.)
Transglutaminazele catalizează în prezenta de Ca++ și prin scindare de NH3 cu formarea de legături de e-(y-glutamil)lizină. Premisa de la care se pleacă este ca să fie prezente și Uzine corespunzătoare în proteina care să poată fi transformate de către enzimă. Pe lângă grupele de ε-amino de Uzină, pot folosi ca substrat și (poli)amine, cum ar fi, etanol- 655 amina, putrezina, spermina sau spermidina (Clarke șl colab., 1959). în prezent nu s-a clarificat încă de care factori depinde, dacă se pot transforma o glutamină sau o Uzină a unei proteine sau o poliamină de către enzimă. Se cunoaște, că la un mare număr de proteine celulare, cum ar fi, citocheratine (Zatloukal și colab., 1989), tubulină, proteină de membrană celulară și chiar proteinele de suprafață de influentza virus (Iwanij, 1977) pot fi legate poli- 660 amine cu ajutorul transglutaminazei.
în cadrul invenției de față s-a putut arăta că polilizină poate fi cuplată cu ajutorul transglutaminazei de adenovirusuri. S-a constatat că, cuplarea se poate efectua în prezență de glicerină. Acest lucru oferă avantajul, că un preparat de virus, de exemplu, un preparat de adenovirus, care conține în tampon glicerină ca agent stabilizator, poate fi folosit direct 665 pentru cuplare.
Cu ajutorul conjugatelor de adenovirus-polilizină, care se completează în comun cu conjugate de transferin-polilizină cu plasmidă-ADN, s-a putut obține o expresie de gene cu un multiplu mai ridicată decât cu conjugate de transferin-polilizină în prezența de adenovirus necuplat cu polilizină. 670
O altă metodă preferată în cadrul invenției de față pentru obținerea conjugatelor conform invenției constă din acea că se cuplează virusul sau componenta de virus printr-o punte de biotină-proteină, de preferință, o punte de biotină-streptavidină la policație.
Asociația puternică cunoscută a biotinei cu streptavidină respectivă avidină (Wilchek și colab., 1988) a fost folosită pentru cuplarea adenovirusului la polilizină, adenovirusul fiind 675 modificat cu biotina și streptavidina s-a conjugat chimic cu polilizină în mod asemănător ca la obținerea de conjugate de transferină-polilizină (Wagner și colab., 1990). Complecșii constând din ADN și streptavidină-polilizinâ încă nelegată covaient, prezintă o eficiență de transfecție ridicată, chiar și la concentrații scăzute de ADN. Se obțin complecși deosebit de eficienți când virusul modificat cu biotină se leagă mai întâi de streptavidin-polilizină și abia 680 în a doua treaptă are loc legarea de ADN.
RO 117861 Β1
Eventual, legătura la biotină poate avea loc și prin avidină.
Apoi mai este posibil, să se efectueze legătura dintre virus (componenta de virus) și polilizină, biotinilând pe de-o parte virusul și pe de altă parte conjugând un anticorp antibiotină cu polilizină și efectuând legătura dintre virus și polilizină prin legătura biotină/anticorp, putând fi utilizați anticorpi policlonali sau monoclonali împotriva biotinei, din comerț.
Legătura dintre virus și polilizină mai poate fi efectuată, prin aceea că polilizină se cuplează cu o lectină, care are o afinitate față de o glicoproteină de suprafață a virusului, legătura într-un astfel de conjugat având loc prin legătura dintre lectină și glicoproteină. Dacă virusul nu prezintă de la sine lanțuri de hidrat de carbon laterale adecvate, el poate fi modificat corespunzător.
Un virus poate fi legat de o substanță cu afinitate față de acidul nucleic, fiind mai întâi modificat la suprafață cu un antigen străin față de virus (de exemplu, Digoxigenin DIG, fabricat de Boehringer Mannheim; sau cu biotină) și legătura dintre virusul modificat și substanța cu afinitate față de acidul nucleic se efectuează printr-un anticorp, care se leagă de acest antigen.
Alegerea metodei pentru obținerea conjugatelor, conform invenției, se orientează în funcție de diferite criterii. Astfel, de exemplu, cuplarea prin biotină este cea mai nespecifică și de aceea metoda cea mai larg utilizabilă, legătura mediată de biotină prezintă o legătură ne-covalentă foarte puternică. Reacția enzimatică cu transflutaminază prezintă avantajul, că ea este realizabilă și la scara cea mai mică. Cuplarea chimică se folosește, în general, atunci când trebuie sintetizate cantități mai mari de conjugat, această metodă este, în general, și cea mai adecvată, când trebuie cuplate proteine de virus sau peptide virus.
în cazul utilizării de virusuri inactivate, inactivarea se face, în general, înainte de cuplare, în măsura în care cuplarea nu este prejudiciată de inactivare.
Dacă un virus, de exemplu, adenovirus, sau o componentă endozomolitică a acestuia, prezintă domenii de legătură accesibile, de exemplu, domenii acide pentru legătură la o policație, legarea virusului respectiv, a componentei de virus la policație poate fi și ionică. în acest caz, încărcările pozitive ale policației, care este eventual conjugat cu un factor de intemalizare, este neutralizat parțial prin domeniile acide ale virusului (componentei de virus) restul de încărcări pozitive este neutralizat, în principal, de acidul nucleinic.
în cazul în care substanța cu afinitate față de acidul nucleic este o substanță de intercalare, ea este modificată cu un linker adecvat pentru cuplarea respectivă a virusului (componentei de virus), de exemplu, cuplarea cu transglutaminază cu spermină, sau cu o grupă bifuncțională, competentă pentru cuplarea chimică, de exemplu, cu un ester activ.
Raportul dintre virus (componenta de virus): substanța cu afinitate pentru acidul nucleic poate varia, el se determină de obicei în mod empiric, de exemplu, conducând la o cantitate constantă de virus (componentă de virus) cu diferite cantități de polilizină și se alege conjugatul optim pentru transfecție.
într-o altă formă de realizare a invenției, se poate modifica componenta de virus, de exemplu, o peptidă virală endozomolitică, pentru a se lega direct la ADN. în acest scop, peptidă însăși poate prezenta un domeniu de legătură ADN prin sinteză care este, prevăzută cu un fragment de aminoacizi încărcat pozitiv, de preferință, în prelungirea peptidei, deosebit de favorabil la capătul C terminalul.
într-o altă formă de realizare a invenției agentul enozomolitic este o peptidă nevirală, eventual sintetică. O peptidă de acest tip este conținută în compoziția, conform invenției de preferință, în așa fel încât, să fie legată ionic la substanța cu afinitate față de acidul nucleic, de exemplu, la polilizină în cazul complecșilor de ADN/factor de intemalizare - polilizină. în acest mod se realizează includerea peptidei endozomolitice în complecșii de acid nucleic, legând peptidă prin radicalii săi acizi de aminoacizi la domeniile de legătură ale acidului
RO 117861 Β1 nucleic încărcați pozitiv, de preferință la polilizină. în funcție de structura chimică a peptidei, mai ales cu privire la grupa sa terminală, legătura la polilizină poate avea loc și prin metodele descrise aici pentru legarea de peptide la polilizină. în acest scop, dacă se utilizează o peptidă care apare în natură, această peptidă poate fi modificată cu un aminoacid terminal adecvat ca “tijă pentru conjugare. 735
Un alt mod de a include peptide endozomolitice nevirale în complexele acidului nucleic, constă din aceea că ele se prevăd cu secvențe, care se leagă de ADN. Poziția unei astfel de secvențe trebuie să fie astfel, încât ea să nu perturbe activitatea endozomolitică a peptidei. Pentru aceasta, de exemplu peptidele, a căror capăt N terminal este responsabil pentru această activitate, se prelungește la capătul C terminal cu secvențe care se leagă la 740 ADN. Prelungiri de acest fel pot fi oligopeptide omoloage sau heterogene cationice, de exemplu, o coadă de oligolizină, sau un domeniu de legătură ADN natural, de exemplu, o peptidă ce provine de la un histon. De preferință, acestea cuprind o parte integrală a secvenței de legătură ADN care formează peptidă endozomolitică de 10 - 40 aminoacizi. Această formă de realizare a invenției oferă posibilitatea unui raport mai ridicat secvență 745 endozomolitică: secvență de legătură ADN decât în conjugatele de peptide, care conțin cantități mai ridicate de policationi, pentru a ajunge la o capacitate de eficiență mai mare a complecșilor.
Peptidele endozomolitice nevirale ar trebui să îndeplinească următoarele cerințe:
în privința activității endozomolitice permeabilitatea membranei de lipidă produsă de 750 peptidă, de preferință, ar trebui să fie mai ridicată la o valoare a pH-ului mai scăzută (5-6) decât la o valoare a pH-ului de 7. Apoi zonele de membrană rupte ar trebui să fie destul de mari, pentru a permite pătrunderea complecșilor ADN mari (porii mici nu sunt suficienți). Pentru a constata dacă o peptidă îndeplinește aceste cerințe, se pot realiza teste in vitro, în care peptidele se folosesc sub formă liberă sau legată și/sau incluse într-un complex ADN. 755 Astfel de teste pot cuprinde teste de permeabilitate pentru lipozomi sau eritrocite (“leakage assays”) și experiența de culturi de celule, în care se stabilește intensificarea expresiei de gene. Teste de acest fel sunt descrise în exemple. Cantitatea optimă de peptidă poate fi determinată prin titrări preliminare, determinând randamentul de transfer al genelor rezultate.
în acest caz, trebuie să se țină seama că randamentul diferitelor peptide și compoziția 760 optimă a complexului pot fi dependente de tipul de celulă.
Peptidele care rup membrana, conțin, în general, secvențe amfipatice și anume o parte hidrofobă, care poate intra în acțiune de schimb cu membrana de lipide, și o parte hidrofilă, care stabilizează faza apoasă în locul în care rupe membrana.
Există în natură câteva exemple de peptide, care rup membrana, de obicei peptide 765 mici sau domenii de peptide cu polipeptide mari. Astfel de peptide pot fi clasificate după funcțiunea lor în contextul natural, și anume în peptide care rup membranele (de exemplu, peptide de virusuri goale) și/sau peptide care fuzionează cu membranele (de exemplu, peptide de virusuri cu înveliș). Pentru ruperea endozomilor în legătură cu peptide sintetice ambele clase de secvențe de peptide pot fi de folos. Cele mai multe peptide naturale pot forma 770 alfa-helices amfipatice.
Prin includerea unor radicali acizi pe parte hidrofilă a unei alfa-Helix presupusă amfipatică în așa fel, încât helixul se poate forma numai la valoarea pH acidă, dar nu la valoarea pH neutră, la care respingerea încărcăturilor dintre radicalii acizi încărcați negativ împiedică formarea helixului, se poate ajunge la specificitatea pH. Această proprietate se găsește și 775 la secvențele care apar în mod natural (de exemplu, capătul N terminal N al peptidei de influentza HA2).
O peptidă amfipatică complet sintetică cu proprietăți specifice ale valorii pH pentru ruperea de membrane a fost descrisă de Subbarao și colab., 1987, și de Parente și colab.,
RO 117861 Β1
1990. Despre această peptidă s-a arătat, că ea formează în membrane numai pori mici, care permit punerea în libertate numai a unor compuși mici (Parente și colab., 1990).
în cadrul formei de realizare a invenției de față, care se servește de peptide nevirale, eventual sintetice, se întreprind în mod obișnuit următoarele trepte: din grupa de peptide care apar în mod natural sau sintetice se alege o secvență amfipatică de peptidă. Peptidele de acest fel aparțin de stadiul tehnic actual; o vedere de ansamblu asupra unor exemple se dă în tabelul 2. Dacă este necesar, se introduc radicali acizi (Glu, Asp) pentru a face activitatea valorii pH, în scopul activității peptidei de a rupe membranele să fie mai specifică (de exemplu, mutantul dublu acid al hemaglutinopeptidei cu semnal P50 corespunzător exemplului 37). Dacă este necesar, se mai poate introduce radicali acizi, pentru a ușura legarea peptidei la polilizină. O posibilitate, de a prevedea astfel de domenii de legătură de policații, poate consta din aceeea că se prevăd prelungiri acide cu capete C terminale, de exemplu, o coadă oligo-Glu.
Peptide endozomolitice adecvate pentru invenția de față pot să fie obținute și unind secvențe care apar în mod natural cu cele sintetice. în cursul invenției de față s-au efectuat exemple cu diferite peptide, derivate din peptidă sintetică GALA, descrisă de Parente și colab., 1990. S-au obținut unele derivate folosite în exemplele invenției de față, combinând peptidă GALA sau modificări ale acesteia cu secvențe ale peptidei de influentza sau modificări ale acesteia, de exemplu, peptidele cu marca EALA-inf șl EALA-P50 corespunzând exemplului 37.
Lungimea secvenței peptidei poate fi critică în privința helix-ului amfipatic; o mărire a stabilității unor domenii scurte, care sunt derivate din proteine naturale și cărora le lipsește contextul proteinei stabilizatoare, poate fi realizată prin prelungirea helix-ului.
Pentru a intensifica activitatea endozomolitică a peptidelor, se pot forma homodimere, heterodimere sau oligomere; în exemplele invenției de față s-a arătat că un dimer P50 prezintă o activitate mult mal ridicată decât monomerul.
Inventatorii au arătat acțiunea peptidelor sintetice asupra preluării pe ADN cu ajutorul conjugatelor transferină-polilizină. S-au sintetizat mai multe peptide diferite, s-a stabilit capacitatea lor de a face lipozomii și eritrocitele să fie permeabili, și s-a testat acțiunea lor asupra expresiei luciferazei în celule TIB 73 și în canale NIH 3T3.
într-o altă formă de realizare a invenției, agentul endozomolitic este o substanță amfipatică ne-peptidică. Cerințele pe care trebuie să le îndeplinească o astfel de substanță, pentru a se preta pentru aplicarea în cadrul invenției de față, sunt în esență aceleași ca pentru peptidele amfipatice, adică capacitatea, să se integreze în complexul de acid nucleic, specificitatea pH, etc.
Invenția se referă într-un alt aspect, la complecși, care sunt preluați în celule eucariotice superioare, conținând acid nucleic și un conjugat, care posedă capacitatea de a forma un complex împreună cu acidul nucleic, în vederea introducerii în celule eucariote superioare. Complecșii sunt caracterizați prin aceea că ei conțin un conjugat, care este format dintr-o substanță cu afinitate pentru acidul nucleic și dintr-un agent endozomolitic, care este legat de substanța cu afinitate pentru acidul nucleic și care posedă capacitatea, ca parte componentă a unui complex de conjugat/acid nucleic, să fie preluați în celulă și să pună în libertate în citoplasmă conținutul endozomilor, în care complexul este localizat după intrarea în celulă.
Complecșii de acid nucleic, care se utilizează în cadrul invenției de față sunt, de preferință, acei complecși, în care acidul nucleic este în așa fel complexat cu substanța având afinitate pentru acidul nucleic, încât complecșii să fie în esență electroneutrii.
într-o formă preferată de realizare a invenției agentul endozomolitic este un virus sau o componentă de virus, care se leagă covalent la o policație.
RO 117861 Β1 în cadrul invenției de față conjugatele endozomolitice cuprind în plus față de conjugatele, în care agenții endozomolitici sunt legați ionic la domeniile de legătură ADN-con- 830 form definiției și agenți endozomolitici, care se leagă diret la ADN, de exemplu, prin prelungirea lor bazică, deși “conjugatele” de acest fel în sens strict, nu au fost obținute prin legarea împreună a două componente. Funcția agenților endozomolitici de acest tip ca părți componente ale compoziției, conform invenției, este independentă de faptul dacă ei au fost sintetizați prin conjugarea unui agent endozomolitic și a unui domeniu de legătură ADN sau dacă 835 un domeniu de legătură ADN a fost prezent inițial în agentul endozomolitic.
într-o formă de realizare preferată a invenției, complecșii conțin în plus față de conjugatul endozomolitic încă un conjugat, în care este cuplată o substanță cu afinitate față de acidul nucleic, în cazul unui conjugat de policație endozomolitică, în general, aceleași ca cea a conjugatului, cu un factor de internalizare cu afinitate pentru celula asupra căreia se 840 acționează. Această formă de realizare a invenției de față se folosește mai ales atunci, când celula asupra căreia se acționează nu prezintă sau prezintă numai puțini receptori pentru virusul, care se folosește ca parte componentă a conjugatului endozomolitic. O altă folosire a acestei forme de aplicare este cea, la care se folosește componenta de virus, de exemplu o peptidă naturală, eventual modificată, o peptidă endozomolitică nevirală, eventual, sintetică 845 sau un virus al unei specii îndepărtate, care nu posedă capacitatea, de a pătrunde de la sine în celulele de transfecat. în prezența unui alt conjugat al unui factor de internalizare-factor de legătură, aceste conjugate endozomolitice profită de capacitatea de internalizare a celui de-al doilea conjugat, fiind complexate împreună cu acesta la acidul nucleic și care se denumesc în cele ce urmează ca parte componentă a complexului astfel format, drept “complex 850 de combinare” sau “complex ternar”, fiind preluate în acest fel în celulă. Fără a dori să fim legați de această teorie, complexele de combinare ale celulelor sunt preluate, fie prin legare la receptorul de suprafață specific pentru factorul de internalizare, fie, în cazul utilizării unui virus sau unei componente de virus, prin legare la receptorul de virus sau prin legare la ambii receptori pe cale endocitozei mediate de receptor. La punerea în libertate a agentului 855 endozomolitic din endozomi se pune în libertate și ADN conținut în complecși în citoplasmă și scapă astfel de descompunerea lizozomică.
în încercările invenției de față cu celule HeLa au putut fi transfecate aproape toate celulele cu adenovirus liber. Capacitatea hepatocitelor a putut să fie mărită și mai mult, când s-au folosit complecși ternari ADN, în care reporterul ADN este complexat cu conjugate de 860 polilizină-transferină și se leagă de adenovirus. Aici se garantează localizarea în comun a virusului endozomolitic și a complexului de ligand/receptor în endozom, ajungându-se pentru diferite celule, ca BNL, CL2 și celule HepG2, la o transfecție în practic toate celulele. O astfel de situație este similară pentru experimentările în care complecșii ternari, conținând transferină și-au găsit intrarea în celulele K562 mai curând prin receptorul de transferină decât prin 865 receptorul de adenovirus.
în mod surprinzător, complecșii ternari au transportat ADN chiar în cantități foarte mici. Astfel la o folosire de 30 pg ADN pe 3 x 105 celule s-au obținut 1,8 x 104 unități de lumină (rezultând din expresia unei secvențe care codifică pentru Luciferază, conținuți pe o plasmidă). La un astfel de Input ajung pe o celulă numai 60 molecule de ADN și 1 PFU de 870 virus (“Plaque Forming Unit”). Pentru comparație: prescripția de precipitat de calciu mai puțin eficientă utilizează 2 x 105 molecule de ADN pe celulă (Sambrook și colab., 1989). Invenția de față reprezintă de aceea un progres considerabil, deoarece ea permite transformarea mai eficientă a celulelor eucariotice superioare cu cantități foarte mici de ADN.
Prezența de virusuri, componente de virusuri sau agenți endozomolitici nevirali drept 875 componente ale conjugatelor endozomolitice ca părți componente de conjugate endozomolitice în complecși ADN are următoarele avantaje:
RO 117861 Β1
1) O posibilitate de folosire mai largă a tehnicii de transfer a genelsor cu complecși de acid nucleic, deoarece agentul endozomolitic însuși, mai ales pentru cazul, în care se folosește un virus sau o componentă de virus, poate reprezenta factorul de internalizare sau și în combinație cu un alt factor de internalizare (de exemplu, transferină sau asialofetuină, etc.) poate fi complexat pe ADN. Prin aceasta este posibil să se folosească efectul pozitiv al virusurilor și pentru celule, care nu posedă receptori pentru virusurile respective.
2) îmbunătățirea eficienței transferului de gene, deoarece prin legarea conjugatelor endozomolitice la ADN se garantează o preluare în comun în celule a acestora. Prin preluarea coordonată și prin punerea în libertate a virusurilor și a ADN, mai rezultă și posibilitatea unei reduceri a cantității de ADN și virusuri necesară pentru un transfer eficient de gene, ceea ce este de o importanță covârșitoare pentru aplicarea in vivo.
Prin factori de internalizare trebuie să se înțeleagă în cadrul invenției de față liganzi sau fragmente din aceștia, care sunt internalizați după legarea de celulă prin endocitoză, de preferință, prin endocitoză mediată prin receptor, sau factori, a căror legare/intemalizare are loc prin fuziune cu elemente ale membranei celulelor.
Printre factorii de internalizare adecvați se numără liganzii transferină (Klausner și colab., 1983), conalbumină (Sennett și colab., 1981), asialoglicoproteine (cum ar fi, asialotransferină, asialorosomucoidă sau asialofetuină), (Ashwall și colab., 1982), lectina (Goldstein și colab., 1980 și Shardon, 1987), respectiv substanțe care conțin galactoză și sunt intemalizate prin asialoglicoproteinreceptor; glicoproteina manosilirate (Stahl și colab., 1987), enzime lizomale (Sly și colab., 1982), LDL (Goldstein și colab., 1982), LDL modificat (Goldestein și colab., 1979), lipoproteine, care sunt primiți în celulă prin receptori (apo B100/LDL); proteine virale, cum ar fi proteina HIV gp120; anticorpi (Mellman și colab., 1984, Kuhn și colab., 1982, Abrahamson și colab., 1982) respectiv fragmente din acestea împotriva antigenelor suprafeței celulelor, de exemplu, anti-CD4, anto-CD7; citochine ca lnterleukin-1 (Mizei și colab., 1987), lnterleukin-2 (Smith și colab., 1985), TNF (Imamure și colab., 1987), Interferon (Anderson și colab., 1982); CSF (“Colony - stimulating Factor”) (Walker și colab., 1987), Factori de creștere ca insulina (Marschall, 1983), EGF (“Epitermal Growth Factor), (Carpenter, 1984); PDGF (Piatelet-derived Growt Factor”), (Heldin și colab., 1982), TGFB Transforming Growt Factor B”), (Massague și colab., 1986), Factorul de creștere a nervilor (Hosang și colab., 1987), factorul de creștere asemănător cu insulina I (“Insuline-like Growth Factor”), (Schlalch și colab., 1986), LH, PSH (Ascoli și colab., 1978), Hormonul de creștere (Hizuka și colab., 1981), Prolactin (Posner și colab., 1982), Glucagon (Asada-Kubota și colab., 1983, Hormoni de tiroidă (Cheng și colab., 1980), alfa-2-macroglobulin-protează (Kaplan și colab., 1979), precum și toxine dezarmate. Alte exemple sunt imunoglobulinele sau fragmente din acestea ca liganzi pentru receptorul Fc sau anticorpii de anti-imunoglobulină, care se leagă de Slgs (“Surface Immunoglobulins”) Liganzii pot fi de origine naturală sau sintetică (vezi, Trends Pharmacol. Sci., 1989 și referințele citate în acestea).
Esențiali pentru interpretarea unor astfel de factori de internalizare în cadrul invenției de față sunt:
a) că ei pot fi internalizați de tipul specific de celulă, în care acidul nucleic trebuie să fie introdus și capacitatea lor de internalizare nu este prejudiciată sau neprejudiciată esențial când ei se conjugă cu factorul de legătură, și
b) că ei sunt în situația, în cadrul acestei proprietăți, să ia cu sine în celulă acidul nucleic pe calea folosită de ei “huckepack.
în cercetările efectuate în cadrul invenției de față s-a arătat posibilitatea largă de folosire a invenției cu privire la factorul de internalizare, a unui factor de internalizare suplimentar în complecșii de combinație cu ajutorul conjugatelor de transferină-polilizină umană
RO 117861 Β1 și de șoarece, conjugatelor de asialofetuină-polilizină, conjugatelor de polilizină-galactoză, conjugatelor de glutinină-germene de grâu-pL, a conjugatelor specifice celulelor T, gp120-pL și anti CD7-pL, conjugatelor anti-lg-pL precum și cu ajutorul complecșilor de ADN-polilizină, care nu conțin un factor de intemalizare. în afară de acestea s-a arătat cu ajutorul corn- 930 plecșilor din ADN și virus conjugat cu polilizină (respectiv componentă de virus), care nu au conținut un conjugat suplimentar de factor de intemalizare-factor de legătură, capacitatea conjugatelor virale, conform invenției.
în amănunt se poate determina în încercări preliminare, dacă în cazul utilizării de virus liber ca agent endozomolitic, utilizarea unui factor de intemalizare, sau dacă pentru 935 cazul, că agentul endozomolitic este un virus sau o componentă de virus sau o peptidă nevirală ca parte a unui conjugat endozomolitic, un factor de legătură “suplimentar îmbunătățește sau dă posibilitatea primirii de complecși ai acidului nucleic. Astfel de teste cuprind transfecții paralele cu complecși de acid nucleic odată fără factor de intemalizare (suplimentar), de exemplu, în cazul de conjugate virale cu complecși constând din acid nucleic și 940 conjugat viral, și odată cu complecși, în care acidul nucleic este tratat cu un alt conjugat, conținând încă un factor de intemalizare, pentru care celulele asupra cărora se acționează au un receptor.
La utilizarea unui factor de intemalizare sau a unui factor suplimentar de internalizare, adică când se folosește un complex de combinații, acesta este mai înainte de toate 945 definit prin celulele asupra cărora se acționează, de exemplu, prin anumite antigene de suprafață sau receptori, care sunt specifici pentru tipul de celulă și astfel dau posibilitatea unui import direcționat al acidului nucleic în acest tip de celulă.
în cadrul invenției de față, substanțele cu afinitate pentru acizii nucleici, care sunt adecvate, sunt, de exemplu, policațiuni organice omologe cum ar fi, polilizină, poliarginina, 950 poliomitina sau policații heterogene cu doi sau mai mulți aminoacizi diferiți încărcați pozitiv, aceste policații putând să prezinte diferite lungimi de lanț, apoi policații sintetice nepeptidice cum ar fi, polietilenimina. Substanțe adecvate cu afinitate pentru acidul nucleic sunt apoi proteinele naturale care leagă ADN cu caracter policationici, cum ar fi, histonii sau protaminele respectiv analogi sau fragmente din aceștia, precum spermina sau spermidina. 955
Lungimea policației nu este critică, în măsura în care complecșii în ceea ce privește forma de realizare preferată sunt în esență electroneutri. Intervalul preferat de lungime a lanțului de polilizină este de la circa 20 până la circa 1000 monomeri de lizină. Totuși, pentru o lungime stabilită a ADN nu există nici o lungime critică pentru policație. Când ADN constă din 6000 bp și 12000 încărcături negative, cantitatea de policație per Mol de ADN poate fi 960 exemplu:
mol polilizină 200 sau mol polilizină 400 sau
120 mol polilizină 100, etc.
Specialistul mediu în materie poate alege cu ajutorul unor încercări de rutină simple 965 alte combinații de lungime a policației și cantității molare.
Alte substanțe ca afinitate față de acidul nucleic, adecvate ca părți componente al conjugatelor sunt substanțe de intercalare, cum ar fi, dimeri de stidiu, acridina sau peptide intercalabile, conținând triptofan și/sau tirozină și/sau fenilalanină.
Cu privire la compoziția calitativă a complecșilor de acid nucleic se stabilește mai 970 întâi, acidul nucleic ce se importă în celulă. Acidul nucleic se definește înainte de toate prin efectul biologic care se poate obține în celulă, în cazul aplicării în cadrul genoterapiei prin gena respectiv fragmentul de genă care trebuie adus în expresie, de exemplu, în scopul substituirii unei gene defecte, sau prin secvență-țintă a unei gene care trebuie inhibată. La acizii nucleici care trebuie transportați în celulă poate fi vorba despre ADN sau ARN, 975 neexistând limitări cu privire la secvența nucleotidelor.
RO 117861 Β1
Dacă invenția se folosește pentru celule tumorale, pentru a le folosi drept vaccinuri împotriva cancerului, celula care trebuie introdusă în ADN codifică,de preferință, pentru o substanță imunomodulatoare, de exemplu, o citocină cum ar fi, IL-2,1L-4, IFN-gamma, TNFalfa. Pot fi foarte folositoare combinații de ADN, care codifică pentru citocine, de exemplu, IL-2 și IFN-gamma. O altă genă, care este folositoare pentru introducerea în celulele tumorale este “Mulți Drug Reistance Gene” (mdr). în invenția de față s-au folosit cu succes conjugate de transferin-polilizină și conjugate de Low density-lipoprotein împreună cu conjugate de adenovirus pentru transfecția de celule tumorale (celule de melanom). în funcție de aplicarea specifică se poate determina în încercări preliminare, care ligand se pretează pentru cazul special de aplicare pentru celula tumorală respectivă.
Mai este posibil și să se introducă în celulă două sau mai multe secvențe diferite de acid nucleic, de exemplu, o plasmidă, conținând cADN, care codifică două proteine diferite, sub controlul unor secvențe adecvate de reglare, sau două constructe diferite de plasmidă, conținând diferite cADN.
Printre acizii nucleici inhibitori terapeutic activi, care sunt introduși în scopul inhibării secvențelor specifice de gene în celulă, se numără constructe de gene, dintre care se transcriu ARN-antisens sau ribozomi. Apoi, mai este posibil să se introducă oligonucleotide, de exemplu, antisenzoligonucleotide, în celulă. Antisenzoligonucleotidele cuprind de preferință 15 nucleotide sau mai multe. Eventual oligonucleotidele pot fi multimerizate. Ribozomii se introduc în celulă, de preferință, ca parte a unui construct de gene, care conține elemente de gene stabilizatoare, de exemplu, tARN. Constructe de gene de acest tip sunt dezvăluiți în brevetul EP A 0387775. Acizii nucleici inhibitori și mecanismele lor de acționare sunt cunoscute pentru specialistul în materie obișnuit; în legătură cu aceasta, a se vedea articolul de ansamblu al lui Helene și Toulme, 1990 și Takayama și Inouye, 1990 precum și referințele citate în acest articol.
în afara moleculelor de acid nucleic, care inhibă gene, de exemplu, virale, pe baza complementarității lor, se pot utiliza și gene cu altă acțiune inhibitoare. Exemple pentru acestea sunt gene care codifică proteine virale, care au așa-numitele mutații transdominante (Herskowitz, 1987). Expresia genelor în celulă furnizează proteine, care domină proteina naturală corespunzătoare și în acest fel protejează celula, care obține imunitatea celulară, împiedicând replicarea virusului. Se pretează mutațiile transdominante ale proteinelor virale, care sunt necesare pentru replicație și expresie, de exemplu, mutanții Gag, (Trono și colab., 1989; Green și colab., 1989; Mălin și colab., 1989).
Un alt mecanism pentru ajungerea la o imunitate intracelulară cuprinde expresia moleculelor ADN, care conțin locul de legătură pentru o proteină virală esențială, de exemplu, așa-numitele “TAR Decoys” (Sullenger și colab., 1990).
Exemple pentru gene aplicabile în cadrul genterapiei somatice, care pot fi introduse cu ajutorul invenției de față ca parte componentă a constructelor de gene în celulă, sunt factorul VIII (hemofilie A), (vezi, de exemplu, Wood și colab., 1984), Factor IX (hemofilie B) (vezi, de exemplu, Kurachi și colab., 1982), Adenosindeaminaza (SCID) (vezi, de exemplu, Valerio și colab., 1984), alfa-1-Antitripsina (enfizem pulmonar), (vezi, de exemplu, Ciliberto și colab., 1985) sau “Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene (vezi, de exemplu, Riordan și colab., 1989). Aceste exemple nu reprezintă nici un fel de limitare.
Cu privire la mărimea acizilor nucleici sunt posibile aplicații într-un domeniu larg; cu ajutorul invenției de față se pot transporta în celulă molecule de acid nucleic cu un ordin de mărime de circa 0,15 kb (în cazul unei gene tARN conținând o genă de ribozom) până la circa 50 kb și peste; molecule mai mici de acid nucleic se pot folosi ca oligonucleotide.
Este evident că tocmai pe baza faptului, că invenția de față nu este supusă la nici un fel de limitări cu privire la secvența genelor și că se pot transporta cu ajutorul invenției și constructe de gene foarte mari, această invenție oferă cele mai largi posbilități de aplicare.
RO 117861 Β1
Pornind de la acidul nucleic, se determină substanța cu afinitate fată de acidul nucleic, de preferință, o substanță organică policationică, care garantează complexarea acidului nucleic; complecșii obținuți sunt, de preferință, în esență electroneutrii. Când complecșii conțin pe lângă conjugatul endozomolitic un conjugat dintr-un factor de internalizare și o substanță cu afinitate pentru acidul nucleic, se ia în considerare partea de cationi a ambelor conjugate în privința electroneutralității.
în cursul unor invenții mai timpurii s-a constatat, că se poate obține un optim pentru importul de acid nucleic în celulă, când raportul conjugat: acid nucleic se alege în așa fel încât, factorul de intemalizare-policație/acid nucleic-complecși au fost neutrii. S-a constatat, că cantitatea de acid nucleic primit în celulă nu.se micșorează, când o parte din conjugatele de transferin-policație se înlocuiește cu o policație legată necovalent; în anumite cazuri se poate ajuge la o mărire considerabilă a primirii ADN(Wagner și colab., 1991a).
în acest caz s-a observat că în ADN din cadrul complecșilor există o structură toroidă cu un diametru de 80-100 nm sub formă compactată. Cantitatea de policație se alege în acest fel cu privire la ambii parametrii de electroneutralitate și obținerea unei structuri compacte, cantitatea de policație, care rezultă cu privire la obținerea unei neutralități electrice din încărcătura acidului nucleic, duce, în general, și la o compactare a ADN.
într-o altă formă de realizare a invenției, complecșii conțin în plus, substanțe care se leagă de acidul nucleic într-o formă de legare necovalentă, care pot fi identice sau diferite față de factorul de legătură, adică de substanța cu afinitate pentru acidul nucleic în conjugate. în cazul în care agentul endozomolitic este un virus liber, complecșii cuprind acid nucleic și conjugat de factor de internalizare. în cazul în care se folosește un conjugat endozomolitic, de exemplu, un conjugat viral, acidul nucleic este complexat cu acest conjugat, eventual împreună cu un conjugat al unui factor de internalizare suplimentar. Alegerea substanțelor cu afinitate pentru acidul nucleic, legate necovalent “libere după fel și cantitate se determină în afară de aceasta pe conjugat respectiv pe conjugate, trebuindsă se ia în seamă înainte de toate factorul de legătură conținut în conjugat: dacă factorul de legătură este, de exemplu, o substanță care nu prezintă sau prezintă o capacitate redusă de condensare ADN, este, în general, adecvat, cu privire la o internalizare mai eficientă a complecșilor în general, să se folosească astfel de substanțe eficiente cu afinitate față de ADN, care să posede această proprietate într-o măsură mai pregnantă. Dacă factorul de legătură însuși este o substanță care condensează acidul nucleic și se obține deja prin ea o compactare suficientă a acidului nucleic în vederea unei intemalizări eficiente, se folosește în mod adecvat o substanță cu afinitate pentru acidul nucleic, care acționează pe baza altor mecanisme asupra măririi expresiei.
Printre substanțele cu afinitate față de acidul nucleic adecvate în cadrul invenției de față dar nelegate covalent, se numără compușii capabili să condenseze acidul nucleic și/sau să le protejeze de descompunerea nedorită în celulă, mai ales substanțele deja menționate cu caracter policationic. O altă grupă de substanțe adecvate sunt acelea, care prin legarea de acidul nucleic cauzează o îmbunătățire a transcripției/expresiei acestora, prin aceea că ele îmbunătățesc accesibilitatea acidului nucleic pentru mecanismul de expresie al celulei. Un exemplu pentru o astfel de substanță este ne-histon-proteina cromozomală HMG1, despre care s-a constatat că posedă capacitatea de a compacta ADN și să-l aducă la expresie în celulă.
La determinarea rapoartelor molare de agent endozomolitic și/sau factor de internalizare/substanțe cu afinitate pentru acidul nucleic/acid(acizi)nucleic (nucleici) trebuie să se țină seama că complexarea acidului nucleic (acizilor nucleici) are loc și garantează că complexul format se leagă de celulă, se transmite în celulă și că el este pus în libertate fie de la sine, fie cu ajutorul agentului endozomolitic din endozomi.
1030
1035
1040
1045
1050
1055
1060
1065
1070
1075
RO 117861 Β1
Raportul ales respectiv factor de internalizare/factor de legătură/acid nucleic se orientează înainte de toate după mărimea moleculei de policație precum și de numărul și de divizarea grupărilor încărcate pozitiv, criterii, care se determină după mărimea și structura acidului nucleic (acizilor nucleici) de transportat. De preferință, raportul molar factor de internalizare/substanță cu afinitate față de acidul nucleic este de circa 10:1 până la circa 1:10.
După construcția și sinteza conjugatelor șl determinării rapoartelor optime pentru determinarea eficienței transfecției conjugatelor(e): ADN, se poate determina cu ajutorul titrărilor cantitatea părții de conjugat de factor de internalizare, care este eventual înlocuibil prin substanță liberă cu afinitate pentru acidul nucleic. în cazul utilizării de policații, atât ca factor de legătură, cât și ca substanță liberă cu afinitate față de acidul nucleic, policațiile pot fi identice sau diferite.
Pentru forma de realizare a invenției, la care se utilizează conjugatele virale, există o formă adecvată pentru determinarea raportului componentelor conținute în complecși, prin aceea că mai întâi se definește constructul de gene care trebuie importat în celulă, și așa cum s-a descris mai sus trebuie să se găsească un virus sau o componentă de virus, care, este adecvată pentru transfecția specială. Apoi virusul sau componenta de virus se leagă de policație și se complexează cu constructul de gene. Pornind de la o cantitate definită de conjugat viral, se pot realiza titrări, tratând celulele asupra cărora se acționează cu această cantitate (constantă) de conjugat și cu concentrații din ce în ce mai mici de ADN, sau Invers, în acest mod se determină raportul optim ADN: conjugat de virus. La utilizarea unui factor de internalizare suplimentar, se procedează, de exemplu, în așa fel, încât pornind de la o cantitate constantă de ADN, se determină prin titrare raportul optim dintre conjugatul de virus și conjugatul factorului de internalizare.
Complecșii se pot obține prin aceea că se amestecă componenții: i) acid nucleic ii) conjugat viral, eventual iii) conjugat de factor de intemalizare/conjugat de factor de legătură și eventual, iv) substanță cu afinitate pentru acidul nucleic legată necovalent, care există fiecare sub forma unor soluții diluate. în cazul utilizării de policații ca factor de legătură șl în același timp ca policații “libere este, în general, adecvat să se prepare mai întâi un amestec de conjugate cu policații libere și acest amestec să se unifice cu ADN. în acest caz se determină raportul optim de ADN față de conjugat(e) și policații prin experimente de titrare, adică într-un șir de experimente de transfecție cu cantitate constantă de ADN și cantități din ce în ce mai mari de amestecuri de conjugat(e)/policații. Raportul optim de conjugat(e); policații în amestec poate fi obținut cu ajutorul experimentelor de rutină, respectiv, din rapoartele optime ale amestecurilor introduse în experimentele de titrare.
Obținerea complecșilor ADN poate avea loc la concentrații fiziologice de sare. O altă posibilitate constă din folosirea concentrațiilor mari de sare (circa 2M NaCI) urmată de reglarea la condițiile fiziologice prin diluție înceată, respectiv, prin dializă.
Succesisunea cea mai adecvată pentru amestecarea componentelor acid nucleic, conjugat(e), substanță cu afinitate față de acidul nucleic, liberă, ne-covalent legată, se determină în detaliu prin încercări preliminare. în unele cazuri se poate dovedi ca adecvat să se complexeze mai întâi acidul nucleic cu conjugatul și abia după aceea să se adauge substanța cu afinitate pentru acidul nucleic, liberă, de exemplu, să se adauge policația, de exemplu, în cazul conjugatelor de transferină dimer de etidiu și polilizină.
într-o formă preferată de realizare a invenției factorul de internalizare (suplimentar) transferină și factorul de legătură este o policație. Sub denumirea de “transferină” se înțeleg, atâttransferinele naturale, cât și acele modificații de transferină, care sunt legate de receptor șl se transportă în celulă.
RO 117861 Β1
Primirea de acid nucleic are loc sub forma de complecși, în care conjugatele de factor de internalizare-policație sunt complexați cu acid nucleic. în cazul conținutului de substanță cu afinitate față de acid nucleic ne-covalent legată, aceasta este, de preferință, o policație, care este identică sau diferită față de policația conținută în conjugat.
în cazul complecșilor de combinații acidul nucleic se internalizează sub formă de complecși, în care, pe de-o parte sunt complexate conjugatele de factor de intemalizare ș,i pe altă parte conjugatele endozorriolitice cu acid nucleic.
Conjugatele de factor de intemalizare - policație, care se utilizează împreună cu virusul liber sau cu conjugate virale în complecșii de combinații, pot fi obținuți pe cale chimică sau, în cazul că policația este o polipeptidă, pe,cale recombinantă, cu privire la metodele de preparare se ia în considerare dezvăluirea din brevetul EP 0388758.
Conjugatele mai pot fi obținute prin legarea împreună a unei glicoproteine, de exemplu, transferină și a factorului de legătură prin una sau mai multe lanțuri de hidrați de carbon ai glicoproteinei unul cu altul. Astfel de conjugate sunt, spre deosebire de conjugatele obținute cu ajutorul procedeelor de cuplare tradiționale, libere de modificări, care provin de la substanțele utilizate de fixare (Linkeri). Aceste conjugate prezintă în cazul glicoproteinelor, care prezintă numai o grupă sau puține grupe de hidrat de carbon adecvate pentru cuplare, de exemplu, transferină, și avantajul, că ele sunt definite exact cu privire la locul lor de legătură glicoproteină/factor de legătură.
Cantitatea de agent endozomolltic folosit, respectiv, concentrația acestuia se orientează după transfecția efectuată detaliat. Este adecvat să se folosească cantitatea minimă de virus, respectiv, componentă de virus, care este necesară pentru a realiza intemalizarea virusului și complexului de acid nucleic și punerea în libertate din endozomi. Cantitatea de virus (conjugat) se determină în funcție de tipul de celulă, respectiv, în acest caz trebuie înainte de toate, să se țină seama de caracterul infecțios al virusului pentru acest tip de celulă. Un alt criteriu este conjugatul respectiv de factor de intemalizare - factor de legătură, mai ales cu privire la factorul de intemalizare, pentru care celula asupra căreia se acționează prezintă un număr definit de receptori. în afară de aceasta cantitatea de virus (conjugat) se orientează în funcție de cantitatea de ADN care trebuie importat. Pentru o transfecție stabilă, pentru care este necesară numai o cantitate redusă de ADN, este suficientă, în general, o cantitate mică de virus, pe când pentru o transfecție transientă, pentru care sunt necesare cantități mai mari de ADN, cantitatea de virus folosită este mai mare. Pentru o aplicare specială se determină în încercări preliminare cu celulele asupra cărora se acționează prevăzute pentru transfecție, eventual, cu o populație amestecată de celule, și cu sistemul de vectori prevăzuți pentru transfecție, prin titrare, concentrația optimă de virusuri, folosindu-se în mod adecvat ca ADN un construct de gene, care cu privire la mărime corespunde în mare măsură cu acela prevăzut pentru folosirea concretă și care, în scopul unei măsurători mai simple a eficienței transferului de gene conține o genă reporter. în cadrul invenției de față s-au dovedit a fi adecvate ca gene de reporter gena luciferazei și a beta-galactozidazei.
Invenția se referă într-un alt aspect la un procedeu pentru introducerea de complecși din acid nucleic, dintr-o substanță care leagă acidul nucleic și eventual.dintr-un factor de intemalizare, în celule eucariotice superioare. Procedeul este caracterizat prin aceea că, celulele se aduc în contact cu un agent, care prezintă capacitatea, de a fi primit în celule, fie de la sine, fie ca parte componentă a unui complex de acid nucleic și să pună în libertate în citoplasmă conținutul endozomilor, în care complecșii de acid nucleic sunt localizați după intrarea în celulă.
în general, se preferă o administrare concomitentă a agentului endozomolitic cu complexul de acid nucleic, administrarea poate însă să decurgă și unul după altul, în cazul aplicării separate ordinea de administrare nefiind critică, dacă administrarea are loc la timp scurt
1125
1130
1135
1140
1145
1150
1155
1160
1165
1170
RO 117861 Β1 una după alta, pentru a reliza un contact, cât mai concomitent al celulei cu componentele, în cazul utilizării de virus liber într-un preparat separat, administrarea concomitentă a preparatului de virus cu complecșii poate fi realizată prin aceea că preparatul de virus este parte componentă a mediului de transfecție, care conține complexul de acid nucleic. în cazul administrării concomitente a virusului liber, se amestecă înainte de aplicare complecșii de acid nucleic și preparatele de virus.
într-o formă preferată de realizare a procedeului,conform invenției, se folosește agentul endozomolitic ca parte componentă a unui complex de combinație.
Pentru a intensifica expresia genei, compozițiile, conform invenției, pot fi aplicate, în mod repetat.
într-o formă preferată de realizare celulele sunt celule tumorale primare. într-o formă deosebit de preferată, acidul nucleic este un ADN, care conține una sau mai multe secvențe, care codifică o substanță imunomodulatoare, de preferință, o citochină.
într-o altă formă de realizare celulele sunt mioblaste, de preferință, mioblaste primare.
într-o altă formă de realizare celulele sunt fibroblaste, de preferință, fibroblaste primare.
într-o altă formă de realizare celulele sunt hepatocite, de preferință, hepatocite primare.
într-o altă formă de realizare celulele sunt celule endotelice primare.
într-o altă formă de realizare celulele sunt celule primare epiteliale ale căilor respiratorii.
într-o altă formă de realizare celulele sunt celule T. într-o altă formă de realizare celulele sunt celule B.
Tabelul 1 arată transfecția cu succes cu ajutorul invenției de față, luând ca exemple diferite tipuri de celule.
Compoziția, conform invenției, a fost cercetată și la transfecția fibroblastelor hemofiliei B la câini. Atât luciferaza, cât și beta-glactozidaza au putut să fie exprimate cu succes în aceste cazuri. în afară de aceasta s-a utilizat sistemul, pentru a introduce în aceste fibroblaste factorul IX cADN la câini 1,4. Factorul IX a putut să fie detectat 24 h, după transfecție cu ajutorul sandwich-ELISA.
în anumite cazuri este adecvat, să se utilizeze în plus față de agentul endozomolitic o substanță lizozomatropă, de exemplu, când agentul endozomolitic este un conjugat de peptidă sau un retrovirus, a cărui activitate endozomolitică nu este strict dependentă de valoarea pH.
Se cunoaște că substanțele lizozomatrope frânează activitatea proteazelor și nucleazelor și cu aceasta pot inhiba descompunerea acizilor nucleici (Luthmann și Magnusson, 1983). Dintre aceste substanțe fac parte clorochina, monensina, nigericina și metilamină. S-a putut demonstra că monensina provoacă o mărire a expresiei genei reporter în cazul aplicării de Virus Moloney. S-a putut arăta că prezența clorochinei în practic 100% din celulele K562 duce la expresia unei gene reporter, care a fost introdusă în celule prin transfer de ADN mediat prin transferină. Hepatocitele DNL.CL2 sau HepG2 nu reacționează atât de bine asupra clorochinei ca celulele K562, au putut însă să fie transficate într-o cantitate, de 5 până la 10%, dacă s-au folosit proprietățile endozomolitice ale adenovirusului adăugat, defect din punct de vedere al replicației sau inactivat chimic.
Cu ajutorul invenției de față se intensifică avantajele vectorilor biologici. Pe baza repartiției receptorilor există un tropism, atât pentru factorul de internalizare, cât și pentru virus. Prin armonizarea acestor două componente asupra populației respective de celule se poate ajunge la o selectivitate mărită, care se poate folosi înainte de toate la aplicarea
RO 117861 Β1 terapeutică a invenției de față. Acest aspect are o importanță deosebită la aplicarea terapeutica a invenției de față la plămân, deoarece populațiile diferite de celule prezintă în plămân diferiți receptori, ceea ce poate necesita construcție de vectori cu afinitate de legare ridicată pentru o anumită populație a celulelor, de exemplu, pentru celulele respiratorii cu perișori ale căilor. Ca liganzi se pot folosi, de exemplu, lectine. Construcția unor astfel de conjugate necesită între altele confirmarea proprietăților de legătură ale unui candidat de ligand în conformația conjugatului. Această confirmare poate, de exemplu, să fie realizată cu anticorpi, împotriva liganzilor, cu ajutorul metodelor de colorare imunohistochimie în țesut, în care trebuie să aibă loc aplicarea terapeutică.
Invenția de față mai prevede într-un alt aspect compoziții farmaceutice, care conțin ca parte componentă activă un complex al unui acid nucleic terapeutic activ, de preferință, ca parte a unui construct de gene, precum și un agent endozomolitic, care este eventual conjugat și eventual un factor de internalizare. Se poate folosi oricare substanță purtătoare farmaceutic inertă, de exemplu, soluție de sare de bucătărie sau soluție de fosfat tampon cu sare de bucătărie sau oricare substanță purtătoare, în care complecșii ADN au proprietăți de șolubilitate adecvată, pentru a putea fi utilizate în cadrul invenției de față. Cu privire la metodele pentru formularea preparatelor farmaceutice se face referire la Remington’s Pharmaceutical Sdences, 1980.
Invenția de față oferă avantajul, unei flexibilități cât mai mari, la aplicare, între altele ca preparat farmaceutic. Compoziția, conform invenției, poate să existe ca liofilizat sau întrun tampon adecvat în stare congelată. Ea poate fi oferită și ca reactiv finit pentru întrebuințare, în soluție, de preferință, răcită, transportată și depozitată. Eventual, componentele necesare pentru transfecție, și anume ADN, agenții endozomolitici, eventual conjugați sau preparați pentru conjugare cu un partener separat de conjugare, substanța care leagă ADN, eventual conjugată cu un factor de internalizare, eventual policația liberă se află separate într-un tampon adecvat sau parțial separate ca părți componente ale unui kit de transfecție, care este, de asemenea, un obiect al invenției de față. Kitul de transfecție al invenției de față cuprinde o substanță purtătoare, care conține unul sau mai multe recipiente sau altele asemănătoare, care conțin materialele necesare pentru transfecția celulei eucariotice superioare corespunzând invenției de față; aceste recipiente pot fi, tuburi capilare, sticluțe sau altele asemănătoare.
într-un astfel de kit de transfecție un prim recipient poate conține unul sau mai multe ADN-uri diferite, de exemplu, care codifică diferite antigene. într-un al doilea recipient pot fi conținute unul sau mai multe conjugate diferite de factori de internalizare, aplicarea kitului de transfecție fiind posibilă sub forma unei construcții asamblate din elemente tipizate. Dacă părțile componente sunt prezente ca preparat gata de folosire sau separate, pentru a fi amestecate direct înainte de utilizare, depinde, atât de aplicarea specifică cât, și de stabilitatea complecșilor, care poate fi cercetată prin teste de rutină în teste de atabilitate. într-o formă de realizare preferată se găsește într-unul din recipientele unui kit, un conjugat de adenovirus-polilizină cuplat cu transglutaminază, care s-a dovedit a fi stabil la depozitare, într-o altă formă de realizare preferată se găsesc în recipiente separate adenovirus biotinilirat și streptavidină-polilizină și se amestecă înainte de aplicare. Prin utilizarea flexibilității invenției, specialistul mediu poate elabora o multitudine de kituri diferite de transfecție.
Aplicarea terapeutică a compoziției, conform invenției, drept preparat farmaceutic poate decurge sistemic, în acest caz se preferă calea intravenoasă. Organele asupra cărora se acționează pentru această formă de aplicare sunt, de exemplu, ficatul, splina, plămânul, măduva osoasă precum și tumorile.
1225
1230
1235
1240
1245
1250
1255
1260
1265
RO 117861 Β1
Exemple pentru aplicarea locală sunt țesutul pulmonar (aplicarea compoziției, conform invenției, ca lichid pentru instilare sau ca aerosol pentru inhalație). Pe lângă o specificitate mai ridicată a liganzilor, pentru celulele diferențiate ale plămânilor, mai poate fi necesar ca măsură întovărășitoare, să se influențeze diferiți factori, care sunt prezenți în vecinătatea țesutului plămânilor și care ar putea prejudicia transferul de gene (de exemplu, paralizie mișcării perișorilor, dizolvarea mucozității bronhiale, aplicarea de inhibitori de protează). Preparatele farmaceutice, conform invenției, mai pot fi administrate prin injecție direct în ficat, în țesutul muscular sau într-o tumoră, sau să fie administrate prin aplicare locală în tractul intestinal. O altă metodă pentru administrarea compoziției farmaceutice este aplicarea prin căile biliare. Această metodă de aplicare permite accesul direct la membranele de hepatocite la canalele fierei, acțiunea de schimb a compoziției cu componentele sângelui, fiind evitate.
Recent s-a prezentat posibilitatea de a utiliza mioblaste (celule musculare imature), pentru a introduce gene în fibrele musculare ale șoarecilor. Dat fiind că s-a găsit că mioblastele secenează produsul de gene în sânge, această metodă poate avea o aplicare mai largă decât tratamentul defectelor genetice ale celulelor musculare, ca, de exemplu, defectul în legătură cu distrofia musculară. Astfel, mioblastele manipulate pot fi folosite pentru a furniza produse de gene, care acționează, fie în sânge, fie sunt transportate de sânge. Experimentele invenției de față au arătat că, atât culturile de mioblaste, cât și culturile de miotuburi, chiar primare, pot fi transfecate cu eficiență ridicată. Mediile de transfecție, care au arătat rezultatele cele mai bune au conținut complecși de combinații de adenovirus biotinilat, transferină-polilizină și streptavidină-polilizină. în afara produselor de gene reporter luciferază și beta-galactozidază s-a exprimat în celulele musculare factorul VIII. în afara acestora s-a utilizat adenovirusul de găină CELO în complecșii de combinație, care au conținut glutinina de germene de grâu ca factor de internalizare suplimentar.
Aplicarea terapeutică poate avea loc și ex vivo, celulele tratate, de exemplu, celulele de măduvă de oase, hepatocite sau mioblaste se returnează în corp, de exemplu, Ponder și colab., 1991, Dhawen și colab., 1991.0 altă aplicare ex vivo a invenției de față se referă la așa-numitele vaccine de cancer. Principiul acestei folosiri terapeutice, constă în aceea că se izolează celule tumorale de la un pacient și celulele cu un ADN care codifică pentru o citochină se transfecă. într-o treaptă următoare celulele eventual se dezactivează, de exemplu prin iradiere, și anume în așa fel, încât ele să nu se mai înmulțească, dar să mai exprime încă citochina. Apoi, celulele modificate genetic se administrează pacientului, de la care s-au preluat, ca vaccin. în jurul locului de vaccinare, citochinele secenate activează citochinele sistemului imunitar, între altele prin aceea că activează celulele T. Aceste celule pot să-și exercite eficiența lor în alte părți ale corpului și atacă și celulele tumorale netratate. în acest mod se micșorează riscul recidivelor tumorale și dezvoltarea metastazei. O prescripție adecvată pentru aplicarea vaccinurilor de cancer pentru genoterapie a fost descrisă de Rosenberg și colab., 1992. în locul vectorilor retrovirali propuși de Rosenberg se poate folosi sistemul de transfer de gene al invenției de față. în încercările invenției de față s-au transficat cu succes celule primare de melanom cu un gen reporter, care a fost conținut în complexe de combinație din adenovirus cuplat cu polilizină și transferin-polilizină sau LDL-polilizină.
Invenția de față mai poate fi utilizată în încercări, pentru a determina răspunsul imun la un antigen dat. Limfocite T (CTL) antigen-specifice, care omoară celule infectate, joacă un rol important la apărarea împotriva infecțiilor virale sau a tumorilor prin gazdă. Acțiunea de schimb dintre celulele T și celulele care prezintă antigen (APC) este limitată HLA (“Human Lymphocytic antigens” = MHC, “Major Histocompatibility Molecules”). Pentru a constata omorârea de celule care exprimă un antigen, prin CTLs într-un “CTL Killing ASSAY in vitro, trebuie ca antigenul să fie prezentat în XTLs într-un context HLA just, ceea ce înseamnă obișnuit pe celula autologă asupra căreia se acționează. Un “CTL Killing Assay
RO 117861 Β1 poate fi realizat după cum urmează: APCs se transfecă cu un construct ADN, care conține o secvență care codifică pentru un antigen. Antigenepitopi se leagă la molecule clasa IMHC și se prezintă la suprafața celulei ca țintă pentru un răspuns CTL specific. După o incubare cu o probă de ser de la pacient se lizează APCs de prezența CTLs specifici. Liza celulei se poate măsura, de exemplu, prin urmărirea punerii în libertate a cromului radioactiv, care a fost introdus în APCs înainte de adaosul de ser. Prescripții stabilite (Walker și colab., 1989) utilizează B-DCLs (linii de celule limfoblastoide B) care au fost induse prin transfecție cu virusuri de vaccin recombinați la expresia de antigene. Totuși, celulele mor, care exprimă antigenul circa o zi în mod eficient, pe baza acțiunii litice ale vaccinurior. Aceste dificultăți pot fi învinse cu ajutorul “CTL Killing Assays”, care utilizează sistemul de transfer de teme al invenției de față, pentru a introduce ADN care codifică pentru antigeni în celulă, de exemplu, pentru a introduce constructe, care codifică pentru antigene HIV sau de tumori, în fibroblaste, pentru a lăsa ca antigenul să fie exprimat de acestea. Fibroblaste primare pot fi obținute ușor din biopsii, sunt ușor de cultivat și s-au dovedit a fi deosebit de eficiente (circa 50 până la circa70%) cu ajutorul invenției de față putând fi transfecabile. Astfel de încercări (Assays) sunt utile pentru ca să identifice cu privire la dezvoltarea de vaccinuri, epitopi, care sunt recunoscute de celule Killer. în afară de aceasta, ele pot fi utilizate în mod avantajos, pentru a determina un răspuns imun limitat la HLA a unei persoane împotriva unui anumit antigen.
Pe baza cantității mari, în care genele transportate cu ajutorul invenției de față sunt exprimate practic în toate celulele, invenția se poate utiliza și pentru a produce proteine recombinante. Și în acest caz nu există limitări sau numai puține limitări cu privire la secvența, respectiv, la mărimea ADN transferate, apoi există un spectru larg de tipuri de celule, care sunt transfecabile cu compoziția conform invenției. Se poate de aceea utiliza aproape orice tip de celulă pentru obținerea proteinelor recombinate, care garantează că proteina recombinată este produsă în mod specific naturii și într-o formă procesată posttranslațională complet modificată, care asigură activitatea biologică a produsului.
Transferul de gene în celule poate fi obținut, așa cum se arată în exemplele prezentate, cu ajutorul luciferazei și IFN-alfa, se poate transporta practic orice construct de gene, care duce la formarea unui produs de proteină dorit. Produsul de proteină dorit poate fi obținut 24 h până la o săptămână sau mai mult după transfecția înainte de cultura de celule (fie din supranatantul celulelor, fie dintr-un omogenizat de celule adecvat, corespunzător prescripției pentru produsul de proteină respectiv).
Utilizarea sistemului de transfer de gene, conform invenției de față, asupra obținerii proteinelor recombinate are următoarele avantaje.
1) Pe baza eficienței de transfecție ridicate (mai mult decât 90% din celulele transfectate pot exprima gena în cantități mari) nu este necesară o preselecție a celulelor transfectate; apoi nu este necesar să se stabilească linii de celule stabile. O cultură de celule la scară mică poate fi suficientă pentru a obține cantitățile necesare de proteină.
2) Se pot transporta constructe mari de gene; se pot transporta cu succes 48 kb.
3) Expresia de gene poate avea loc în celule, care garantează, că are loc procesarea translațională și modificarea respectivă (de exemplu, carboxilarea care depinde de vitamina K și de factorii de coagulare, vezi, Armentano și colab., 1990, sau glicozilarea specifică tipului de celulă.
4) Prin sistemul, conform invenției, devine disponibilă o varietate mai mare de celule asupra cărora se poate acționa pentru expresia de gene.
în exemplele care urmează, care ilustrează invenția de față, au fost utilizate următoarele materiale și metode:
1320
1325
1330
1335
1340
1345
1350
1355
1360
RO 117861 Β1
a) Conjugate de transformă umană-polilizină
S-a utilizat metoda descrisă de Wagner și colab., 1991 b, la care are loc cuplarea de polilizină la lanțurile laterale de hidrați de carbon ale transferinei.
O soluție de 280 mg (3,5 μίτιοΙ) de transferină umană (lipsită de fier, Sigma) în 6 ml 30 mM tampon de acetat de sodiu, pH=5, s-a răcit la 0°C și s-a adăugat la aceasta 750 μΙ 30 mM tampon de acetat de sodiu, pH=5, conținând 11 mg (51 μίτιοΙ) de periodat de sodiu. Amestecul s-a lăsat să stea în baie de gheață, timp de 90 min. Pentru îndepărtarea produselor cu moleculă redusă, s-a realizat o filtrare de gel (Sephadex G-25, Pharmacia), din care a rezultat o soluție cu un conținut de circa 250 mg transferină oxidată (Măsurare prin testul ninhidrinei). (Pentru a dovedi prezența formei oxidate, care conține aldehidă și care la colorare cu anisaldehidă dă o reacție de colorare, s-au picurat probele pe o placă de gel de silice în strat subțire, s-au uscat și plăcile s-au cufundat în p-anisaldehidă/acid sulfuric/etanol (1/1/18), s-au uscat și s-au încălzit). Soluția de transferină modificată s-a adăugat rapid (intervalul a 10 până la 15 min) la o soluție, conținând 1,5 μίτιοΙ poli(L) lizină marcată prin fluorescență cu o lungime medie a lanțului de 190 monomeri de lizină în 4,5 ml 100 mM acetat de sodiu, pH=5. Valoarea pH a soluției a fost reglată prin adaos de carbonat de sodiu tampon 1M la pH= 7,5. S-au adăugat la amestec, la intervale de câte o oră, 4 porțiuni de câte 28,5 mg (450 μΓηοΙ) cianborhidrură de sodiu. După 17 h s-au adăugat 2 ml de clorură de soldiu 5 M, pentru a aduce soluția la o concentrație totală de circa 0,75 M. Amestecul de reacție s-a aplicat pe o coloană de schimb de cationi (Pharmacia Mono S HR 10/10) și s-a fracționat cu un gradient de sare de 0,75 M până la 2,5 M clorură de sodiu cu un conținut constant de 25 mM HEPES, pH=7,3. Concentrația ridicată de sare la încărcarea coloanei și de la începutul gradientului a fost esențială pentru obținerea conjugatelor de policație. Debitul a fost eluat cu puțină transferină (circa 30%) împreună cu o activitate slabă de fluorescență; cantitatea cea mai mare de conjugat marcată prin fluorescență a eluat la o concentrație a sării, între 1,35 M și 1,9 M și a fost împărțită în 3 fracțiuni. Aceste fracțiuni au dat (în ordinea lor de eluție) după o dializă de două ori cu circa 2 I de 25 mM HEPES, pH=7,3 o fracțiune A (TfpL190A) cu un conținut de 45 mg (0,56 μΐηοΙ) transferină, modificată cu 366 nmol polilizină, o fracțiune B (TfpL190B) cu un conținut de 72 mg (0,90 μπιοΙ) transferină, modificată cu 557 nmol polilizină și o fracțiune C (TfpL190C), conținând 7 mg (85 nmol) transferină, modificată cu 225 nmol de polilizină. Conjugatele de transferină, în măsura în care nu au fost utilizate imediat, au fost depozitate după congelare rapidă în azot lichid la -20°C sub formă lipsită de fier. înainte de introducerea fierului s-au adus probe (0,5 până la 1 mg) cu clorură de sodiu la concentrația serului fiziologic (150 mM). Introducerea fierului s-a făcut prin adăugarea de 4 μΙ 10 mM citrat de fier tamponat (III) (conținând 200 mM citrat, în care s-a adăugat carbonat de sodiu, iar valoarea pH-ului s-a reglat la 7,8 per mg de conținut de transferină). Conjugatele cu conținut de fier au fost separate în părți alicote mici înainte de utilizarea lor pentru formarea de complex de ADN, au fost congelate prin șoc în azot lichid sau gheață uscâtă/etanol și s-au păstrat la - 20°C. (Această măsură s-a dovedit a fi adecvată, după ce s-a dovedit că dezghețarea de mai multe ori și înghețarea au avut ca efect stricarea conjugatelor).
b) Conjugate de transferină-polilizină de șoarece
S-a procedat analog ca la transferină umană, cu aceeași metodă indicată, prin lanțuri laterale de hidrați de carbon. Din 4,1 mg (51 nmol) transferină de șoarece și 2,1 mg (34 nmol) PL 290 s-au obținut conjugate din 15,5 nmol transferină de șoarece și 13 nmol pL290.
Plasmidă-ADN
a) pRSVL-ADN μg de plasmidă ADN pRSVL (conținând gena luciferazei Photinus pyralis sub controlul lui Rous Sarcoma Virus LTR Enhancer/Promoter (Uchida și colab., 1977, De Wet și colab., 1987), obținută prin metoda Standard Triton X Lyse (Maniatis) se centrifughează
RO 117861 Β1 la densitatea de echilibru CsCI/EtBr, se decolorează cu butanol-1 și se dializează față de 10 mM Tris/HCI, pH=7,5,1 mM EDTA) în 350 μΙ HBS (150 mM NaCI, 20 nM HEPES, pH=7,3 s-au amestecat 30 min, înainte de adăugarea celulei cu 12 pg conjugat de transferinăpolilizină în 150 μΙ HBS.
b) pCMV-ADN
Plasmida pCMV se obține prin îndepărtarea insertului de BamHI al plasmidei pSTCX556 (Severne și colab., 1988), apoi se tratează plasmida cu fragment Klenow și se folosește Hindlll/Sspl, precum și fragmentul tratat Klenow din plasmida pRSVL, care conține secvența care codifică luciferaza, respectiv, cea care codifică beta-galactozidază (Macgregor și Caskey, 1989). Formarea complexului se realizează în mod analog cu pRSVL.
Obținerea de preparate de virusuri
a) Preparate de adenovirus
Se utilizează tulpina de adenovirus d1312 descris de Jones și Shenk, 1979, care posedă o deleție în regiunea Ela. înmulțirea virusului se realizează îh linia de celule 293 transcomplementară Ela, obținerea efectuându-se la scară mare, așa cum s-a descris de Davidson și Hassel, 1987. Virusul purificat se preia în tamponul de depozitare (100 mM Tris, pH=8,0,100 mM NaCI, 0,1% BSA, 50% glicerină) sau în HBS/40% glicerină și se păstrează alicote la -70°C, determinarea concentrației virionilor se efectuează cu ajutorul analizei spectrofotometrice cu a virusului ADN genomic extras [Formula: o unitate optică de densitate (OD, A260) corespunde la 1012 particule de virus/ml; (Chardonnet și Dales, 1978)].
b) Preparate de retrovirus
Retrovirusul de leucemie de șoarece Moloney N2 se împachetează într-o linie de împachetare ecotropică (Keller și colab., 1985, Armentano și colab., 1987). Se colectează linii de celule exprimând virusul, se congelează sub șoc de azot lichid și se depozitează la 20°C. Proeminențele folosite în exemple, au un titru de circa 106 cfu/ml, măsurat cu celule NIH3T3 prin intermediul formării de colonii cu rezistență față de neomicină. Pentru experimentele de concentrare a virusului proeminențele sunt trecute sub atmosferă de azot printrun filtru cu membrană de 300 Kb (FILTRON) într-un concentrator de agitare a celulelor AMICON. Prin acesta proeminențele pot fi concentrate în mod normal, de la 10 - 30 ml la de 10 ori mai mult.
Celule și medii
Celule HeLa se cultivă în mediu DMEM, completat cu 5% ser fetal de vițel inactivat la cald 5% (FCS), penicilină la 1001.E./ml, streptomicină până la 100 μg/ml și 2 mM glutamină. Celule WI-38, MRC-5 și celule KB sunt cultivate în mediu EMEM (Eagle’s modified essential medium), completat cu 10% FCS activat la cald, antibiotice cum ar fi, mediu DMEM 10 mM, aminoacizi neesențiali și 2 mM glutamină. S-a cultivat CFT1 în mediu F12-7X (Willumsan și colab., 1989). CFT1 este o linie de celule de epiteliul de fibroză cistică respiratorie (obținută după metoda descrisă de lankaskas și colab., 1991; linia celulară CFT1 este caracterizată prin aceea că, ea este homozigotă pentru deleția mutației ÂF508 CF). Pentru încercările de transfer de gene celulele se cultivă pe plăci de cultură de celule de 6 cm, până când ele sunt confluente la circa 50% (5 x 10s celule). Mediul se îndepărtează și se adăugă 1 ml mediu DMEM- sau EMEM/2% FCS. Apoi, se adaugă complexele de conjugat ADN, imediat după aceea adenovirusurile d1312 (0,05 - 3,2 x 104 particule/celulă) sau un volum comparabil de tampon de depozitare a virusului (1 - 80 μΙ). Plăcile sunt puse, timp de o oră în incubator (5% CO2,37°C), apoi se adaugă 3 ml de mediu de completare. După alte 24 h de incubare se culeg celulele, pentru a determina expresia genelor luciferazei. în cazul celulelor CFT1, celulele sunt cultivate înainte de experimentările de transfer de gene, 4 h în mediu F12-7X fără transferină umană.
1420
1425
1430
1435
1440
1445
1450
1455
1460
RO 117861 Β1
Următoarele linii de celule sunt stabilite din ATCC, care pot fi obținute prin numerele de catalog indicate: celule HeLa: CCL 2, celule K562; CCL 243, celule HepG2: HB 8065, Celule IB-73: TIB 73 (BNL CL.2), celule NIH3T3: CRL 1658, celule 293: CRL 1573, celule KB: CCL 17, celule WI-38: CCL 75, celule MRC-5: CCL 171. Celule H9: sunt din AIDS research and Reference Reagent Program, U.S. Department of Health and Human Service, Catalog nr.87.
Limfocitele sunt obținute prin preluarea unei probe de 25 ml din sângele din cordonul ombilical în capilare de probe conținute în EDTA. Părți alicote sunt puse sub 4,5 ml Ficollhypaque (Pharmacia) și se centrifughează la 2500 rot/min. Se scoate stratul maroniu dintre stratul superior de plasmă și stratul limpede de fiooll (circa 10 ml). Se suplimentează cu 40 ml IMDM plus 10% FCS, proba se centrifughează, timp de 15 min la 1200 rot/min și peletul celular se preia în 50 ml IMDM proaspăt plus 10% FCS (densitatea celulară a fost de circa 2 x 10® celule/ml). Se suplimentează cu 250 μ\ parte alicotă de fitohemaglutinină (PHA P, DIFCO), cultura se incubează 48 h, la 37°C și 5% CO2, apoi se adaugă IL-2 (BMB) recombinantă (concentrația 20 unități/ml). Apoi, celulele se divizează cu IMDM/20% FCS, 2 unități/ml IL-2 1:3. Părți alicote ale celulelor se congelează în azot lichid în FCS plus 5% DMSO. înainte de utilizare celulele se cultivă în IMDM plus 20% FCS plus 2 unități/ml IL-2.
Pentru cercetările secvențiale de legătură celulele HeLa au fost echilibrate la 4°C în 1 ml DMEM, completat cu 2% FCS. Complexele de conjugat de ADN sunt adăugate ca la celelalte încercări și plăcile se Incubează două ore, la 4°C. Apoi.plăcile se spală mult cu DMEM rece ca gheața/2% FCS, apoi se adaugă 2 ml din acest mediu. Apoi, se dă adenovirus d1312 respectiv tampon de virus, celulele se lasă să se încălzească încet, înainte de a fi încărcate pentru încă 24 h în incubator. După această incubare celulele se culeg și se cercetează asupra expresiei de gene luciferazei.
Verificarea expresiei luciferază
Obținerea de extracte de celule, standardizarea conținutului de proteină precum și determinarea activității luciferazei se realizează, așa cum se descrie de Zenks și colab., 1990, Cotten și colab., 1990, respectiv în EP 0388758.
în continuare se dau 40 de exemple de realizare a invenției în legătură cu figurile care reprezintă:
- fig.1, acțiunea infecției cu adenovirus asupra transferului de gene cu ajutorul conjugatelor de transferină-polilizină;
- fig.2, efectul dozei de complex conjugat-ADN;
- fig.3, intensificarea transferului de gene mediat prin transferină-polilizină prin adenoviruși are loc prin endocitază mediată de receptor:
A) Acțiunea asupra ADN complexat;
B) Acțiunea asupra ADN legat de receptor;
C) Acțiunea asupra transferului de gene cu ajutorul conjugatelor de transferină-polilizină.
- fig.4, acțiunea infecției cu adenovirus asupra transferului de gene cu ajutorul conjugatelor de transferină-polilizină în linii de celule alese;
- fig.5, cercetare, dacă intensificarea expresiei genelor se bazează pe planul transportului de gene sau pe cel al transactivării;
- fig.6, conjugatul de tetra-galactoză-peptidă-polilizină;
- fig.7, transfecția de celule HepG2 cu complecși pRSVL-ADN în prezență de adenovirus;
- fig.8, transfecția de celule HepG2 cu complecși pCMVL-ADN în prezență de adeno- virus;
RO 117861 Β1
- fig.9, transfecția de celule TIB73 cu complecși de pCMVL-ADN
A) Valori de comparație cu clorochină;
B) în prezență de adenovirus.
- fig. 10, import de pCMVL-ADN în celule T în prezență de adenovirus:
A) Celule H9;
B) Limfocite primare.
- fig. 11, inactivarea UV de adenovirusuri;
A) Intensificarea efectului de transfer de gene în celule HeLa prin virusuri inactivați UV;
B) Comparația inactivării UV cu efectul transferului de gene.
- fig. 12, inactivarea de adenovirusuri prin formaldehidă;
- fig. 13, transfecția de celule NIH3T3 cu complecși de transferină-polilizină-ADN în prezența virusului Moloney;
- fig. 14, cercetare, dacă efectul de transfer al genelor la transfecția de celule NIH3T3 cu complecși de transferină-polilizină-ADN se explică prin virusul Moloney;
- fig. 15, interacțiuni dintre transferină și receptorul său au o importanță pentru efectul de transfer de gene ale virusului Moloney;
- fig. 16, influența valorii pH asupra efectului de transfer de gene la retrovirusuri;
- fig. 17, peptidă hemaglutinină-influentza; Testul Leakage pentru liposimi;
- fig. 18, transfecția celulelor K562 cu conjugate de transferină-polilizină în prezența conjugatului de peptidă de influentza-polilizină;
- fig. 19, transfecția de celule HeLa cu conjugate de transferină-polilizină în prezența conjugatului de peptidă de influentza-polilizină;
- fig.20, identificarea in situ a expresiei beta-galactozidazei după transfecția celulelor HeLa cu transferină-polilizină-pCMV-Peta-gal-ADN în prezență de adenovirus;
- fig.21, expresia Peta-galactozidazei in situ în celule HeLa în prezență de adenovirus;
- fig.22, transfecția de celule cu un cosmid 48 kb în prezență de adenovirus, A: celule HeLa; B: celule de neuroblastom.
- fig.23, obținerea de adenovirus-polilizină prin cuplare chimică;
- fig.24, transfecția de celule K562 cu conjugate de adenovirus cuplate;
- fig.25, transfecția de celule HeLa cu conjugate de adenovirus conjugat;
- fig.26, legarea polilizinei de adenovirus cu ajutorul transglutaminazei;
- fig.27, transfecția de hepatocite de șoarece cu ajutorul conjugatelor de adenoviruspolilizină cuplate cu transglutaminază;
- fig.28, intensificarea eficienței transfecției prin conjugate de adenovirus-polilizină cuplate prin transflutaminază în comparație cu virus necuplat;
- fig.29, transfecția de celule HeLa cu conjugate de adenovirus cuplate cu biotinăstreptavidină;
- fig.30, transfecția celulelor K562 cu conjugate de adenovirus cuplate cu biotinăstreptavidină;
- fig.31, transfecția celulelor de neuroblastom cu o cosmidă 48 kb cuplat cu conjugate de adenovirus prin intermediul biotinei-streptavidinei;
- fig.32, transfecția de hepatocite în prezența clorochinei sau de adenovirus,
- fig.33, transfecția de celule K562 în prezența unor agenți endozomolitici diferiți;
- fig.34, comparația protocoalelor de transfecție pe plan celular cu beta-galactozidază ca genă reporter în prezența diferitelor substanțe endosomolitice;
- fig.35, expresia luciferazei pe termen lung în hepatocite confluente, care nu se divizează;
1515
1520
1525
1530
1535
1540
1545
1550
1555
RO 117861 Β1
- fig.36, expresia în celule HeLa, transfectate în prezența virusului CELO liber și legat de polilizină prin intermediul biotinei-streptavidinei;
- fig.37, transfecția de mioblaste și miotuburi în prezență de adenovirus liber și legat de polilizină prin intermediul biotinei-streptavidinei;
- fig.38, transfecția culturilor de mioblaste și miotuburi primare;
- fig.39, comparația dintre adenovirus d1312 și CELO-virus la transfecția de celule HeLa și mioblaste C2C12;
- fig.40, îmbunătățirea transfecției cu CELO-virus prin utilizarea unui ligand de lecitină;
- fig.41, expresia unui factor VIII cADN în culturi de mioblaste C2C12 și culturi de miotuburi;
- fig.42, intensificarea transportului ADN prin proteine de adenovirus;
A: celule HeLa; B: fibroblaste.
- fig.43, conjugate de galactoză-peptidă de influență pentru transportul ADN în hepatocite;
- fig.44, conjugate de galactoză-adenovirus pentru transportul ADN în hepatocite;
- fig.45, transfer de gene în celule b, B-limfoblastoide;
- fig.46, transfer de ADN cu transferină-polilizină în prezență de rinovirus. A: rinovirus liber; B: rinovirus conjugat;
- fig.47, transfecție de celule primare umane de melanom cu complecși de combinație conținând conjugate de transferină și adenovirus;
- fig.48, transfecție de celule de melanom umane primare cu complecși de combinație conținând conjugate de LDL și adenovirus;
- fig.49, transfer de gene în celule epiteliale ale căilor respiratorii de șobolani in vivo;
- fig.50, testul Leakage al lipozimilor cu peptide amfipatice;
- fig.51, testul Leakage al eritrocitelor cu peptide amfipatice;
- fig.52, transfecția de celule BNL CI.2 în prezența peptidelor amfipatice;
- fig.53, transfecția de celule NIH3T în prezență de peptide amfipatice;
- fig.54, expresia de IFN-alfa în celule HeLa, transfectate în prezența de diferiți agenți endozomolitici.
Exemplul 1. Determinarea acțiunii tratamentului cu adenovirus asupra transferului de gene prin conjugate de transferină-polilizină
La început s-a cercetat acțiunea unei doze crescânde de virus asupra unei capacități a unei cantități definite de complex conjugat - ADN, pentru a provoca transfer de gene.
Pentru aceasta, pentru formarea de complex s-au amestecat pentru formarea complexului din 6 pg plasmida pRSVL cu 12 pg de conjugat de transferină umană-polilizlnă (hTfpL190B). Se adaugă la celulele HeLa, complexul de conjugat-ADN plus cantități diferite de adenovirus d1312 (0,05 - 3,2 x 104 particule de virus/celulă). Rezultatul acestei analize este reprezentat în fig.1. Activitatea luciferazei este exprimată în unități de lumină per 50 pg proteină de celulă totală. Conform acestei analize, cantități crescânde de adenovirus adăugat dau creșteri corespunzătoare ale transferului de gene. în figură sunt arătate valori medii ale 2 - 4 experimente separate; grinzile arată devierea de la standard.
Exemplul 2. Efectul dozei complexului conjugat-ADN
Se adaugă la celule HeLa diluții logaritmice de complecși de conjugat-ADN, obținuți ca în exemplul 1, și sau fără adaosul unui dozaj constant de adenovirus d1312 (1 x 104 particule de virus/celulă). Activitatea luciferazei se determină așa cum se indică în exemplul
1. Rezultatele sunt reprezentate în fig.2.
RO 117861 Β1
Exemplul 3. Intensificarea transferului de gene rezultat prin transferină-polilizină prin adenovirus are loc prin endocitoză mediată prin receptor
a) Acțiunea tratamentului cu adenovirus asupra transferului de ADN complexați
Pentru transfecție s-au folosit următoarele componente:
pg pRSVL-ADN fără conjugat de transferină-polilizină (ADN); 6 pg pRSVL-ADN plus 6 pg polilizină 270 neconjugate (ADN + pL); 6 pg pRSVL-ADN plus 12 pg din conjugatele folosite în exemplele precedente de transferină-polilizină (ADN + hTfpL190B). Aceste materiale de transfecție se adaugă la celulele HeLa cu sau fără adenovirus d1312 (d1312) (1 χ 104 particule de virus/celulă). Obținerea de extracte de celule, standardizarea după proteina totală și determinarea activității luciferazei are loc ca_în exemplele precedente. Rezultatul încercărilor efectuate este reprezentat în fig.3A.
b) Acțiunea tratamentului cu adenovirus asupra transferului ADN legat de receptor Complecșii de conjugat-ADN (ADN + hTfpL190B) sau complecșii de ADN-polilizină (ADN + pL) sunt legați la celule HeLa, fără să fie intemalizate, incubându-se, la 4°C. Complexul nelegat se îndepărtează înainte de adăugarea adenovirusului d1312 (1 χ 104 particule de virus/celulă) sau a unui volum de tampon comparabil. Incubarea care a urmat se realizează la 37eC, pentru a da posibilitatea intemalizării complexelor ADN legate și a adenovirusurilor. Determinarea activității luciferazei are loc așa cum s-a indicat (fig.3B).
c) Acțiunea tratării cu adenovirus asupra transferului de gene prin conjugate de transferină-polilizină
Se adaugă la celule HeLa complexe de conjugat-ADN, conținând 6 pg pRSVL-ADN plus 12 pg transferină-polilizină (ADN + hTfpL190B) la o concentrație de 1 χ 104 particule de adenovirus (d1312/celulă sau la o cantitate comparabilă de adenovirus d1312 inactivată la cald (d1312 h.i.). Inactiva rea se face prin incubare, timp de 30 min, la 45°C (Defer și colab., 1990).
Exemplul 4. Acțiunea tratamentului cu adenovirus asupra transferului de gene prin conjugate de transferină-polilizină în linii de celule selectate
Complecșii de conjugat-ADN (6 pg pRSVL + 12 pg hTfpL190B) se adaugă la celule din linia de celule CFT1, KB, HeLa, WI38 și MRC5 cu sau fără adenovirus d1312 (1 χ 104 particule de virus/celulă). Eficiența transferului de gene pentru diferitele linii de celule se determină ca în exemplele precedente cu ajutorul încercării cu luciferază (fig.4).
Exemplul 5. Intensificarea expresiei de gene de luciferază funcționează pe planul transportului de gene și nu asupra transactivării
Se obține mai întâi o linie de celule care exprimă constitutiv o luciferază cu denumirea K562 10/6, celulele fiind transificate cu o plasmidă, care a conținut un fragment de genă ESP-luciferază (un fragment Apal/Pvul de pRSVL (De Wet și colab., 1987) donat în locul Clal a pUC μ-Locus (Collis și colab., 1990). Această plasmidă este complexată cu un conjugat de transferină-polilizină complexat și celule K562 transificate cu acești complecși, procedându-se conform metodei descrise de von Cotten și colab., 1990. Deoarece, locusul plasmidă pUC p conține o genă de rezistență de neomidnă, se poate selecționa done care exprimă luciferază pe baza rezistenței la neomicină. Pentru celelalte încercări se alege o clonă cu denumirea K562 10/6.
Se tratează părți de alicote ale liniei de celule paranterale K562 (în 200 p\ RPM11640 plus 2% FCS; 500000 celule/probă),fie cu 12 pg TfpL plus 6 pg pRSVL sau cu 4 Mg pL90 plus 6 pg pRSVL, în câte 500 p\ HBS. Cantitățile indicate de adenovirus d1312 (fig.5) sunt lăsate să acționeze, timp de 1,5 h, la 37°C asupra celulelor, după care se adaugă 2 ml RPMI și 10% FCS. Apoi, se continuă incubarea la 37°C, încă 24 h și apoi, se pregătesc celulele pentru determinarea activității luciferazei. Se observă că incubarea cu adenovirus are ca
1610
1615
1620
1625
1630
1635
1640
1645
1650
RO 117861 Β1 efect o creștere importantă a activității luciferazei (fig.5A). Acest lucru este valabil, atât pentru complecșii TfpL (200 unități de lumină față de 25000 unități de lumină), cât și pentru complecșii pL90 (O față de 1,9 x 106 unități de lumină), din aceasta rezultă că linia de celule K562 are capacitatea, de a internaliza complecșii de pRSVL/polilizină și că această internalizare măsurată prin expresia luciferazei, este crescută considerabil prin prezența de adenovirus.
. încercări analoge se fac cu celulele K562 10/6, care exprimă constitutiv gena de luciferază RSVL, fiind folosite cantități asemănătoare de adenovirus d1312. Se incubează părți de alicote de 500000 celule (în 200 μΙ RPMI plus 2% FCS) cu cantitățile indicate în fig.5B de adenovirus d1312, timp de 1,5 h, la 37°C. Apoi, se adaugă ca la linia de celule paranterală RPMI plus 10% FCS, se incubează încă 24 h și se determină activitatea luciferazei. Așa cum se poate vedea din fig.5B, tratarea acestor celule cu adenovirus nu are un efect doveditor asupra activității luciferazei; valorile de control sunt în același interval ca valorile pentru probele tratate cu virus.
Exemplul 6. Transfecția de celule de ficat cu conjugate de asialofetuin-polilizină (AfpL) respectiv cu conjugate de tetragalactozăpeptid-pL ((gal)4pL) în prezență de adenovirus
a) Obținerea de peptidă lactosililată
3,5 mg (1,92 Mmol) de peptidă ramificată Lys-(Ny-Lys)Lys-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-GlyGly-Ser-Gly-Gly-Cys, obținută cu ajutorul metodei Fmoc cu utilizarea unui Applied Biosystem 431A Peptid-synthetizer, conținând o grupă de ditiopiridină pentru Cys, se tratează cu o soluție de 7,85 mg lactoză în 40 μ\ 10mM acetat de sodiu apos, pH=5, la 37°C. La soluție se adaugă 4 porțiuni de 0,6 mg (10 Mmol) de cianborohidrură de sodiu în intervale de circa 10 h. După un total de 64 h, la 37°C se adaugă 0,5 ml HEPES, pH=7,3 și 15 mg ditiotreitol (DTT). Fracționarea cu ajutorul filtrării de gel (Sephadex G-10,12 x 130 mm, eluant 20mM NaCI) sub argon a dat 3,6 ml soluție de peptidă lactosililată sub forma liberă mercapto (1,73 Mmol, corespunzând testului Ellmann; Randament 84%). Probele peptidei modificate au arătat o reacție de culoare cu anisaldehidă, dar nici o reacție de culoare cu ninhidrină; acest lucru a confirmat presupunerea că toate grupele amino N-terminale sunt lactosililate. Conjugatul tetra-galactozppeptid-polilizină este reprezentat în fig.6.
b) Obținerea polilizinei modificate cu 3-ditiopiridinpropionat
La o soluție filtrată de gel de 0,60 ^mol poli-L-lizină cu o lungime medie de lanț de 290 monomeri de lizină (pL290, hidrobromură, sigma) în 1,2 ml 100 mM HEPES pH= 7,9 se adaugă sub amestecare intensă 400 μ\ dintr-o soluție etanolică 15 mM de SPDP (6,0 Mmol). O oră mai târziu se adaugă 500 μ\ acetat de sodiu 1 M, pH=5; după filtrarea de gel (Dephadex G-25) cu 100 mM acetat de sodiu soluția conține 0,56 Mmol pL290 cu 5,77 Mmol substanță de fixare de ditiopiridină (Linker).
c) Conjugarea peptidei cu polilizină
Se obține conjugate amestecând 1,5 Mmol de peptidă lactosililată obținută în a) în 3 ml 20 mM NaCI cu 0,146 Mmol din pL290 modificată obținută din b) în 620 μ) 100 mM acetat de sodiu tamponat sub atmosferă de argon. După adăugare de 100 m> 2M HEPES, pH=7,9,amestecul de reacție se lasă 18 h.la temperatura camerei. Prin adăugarea de NaCI concentrația de sare se aduce la 0,66 M, și conjugatele se izolează prin cromatografie de schimb de cationi (Pharmacia Mono S Coloana HR 5/5; eluarea de gradiente tampon A: 50 mM HEPES pH=7,3; tampon B: tampon A plus 3 M NaCI). Fracțiunile de produs au eluat la concentrațiile de sare de circa 1,2 M -1,8 M și au fost separate în două fracțiuni de conjugat; fracțiunile de conjugat au fost marcate cu (gal)4pL1 și (gal)4pL2. Dializa față de 25 mM HEPES, pH=7,3 a dat fracțiunile de conjugat (gal)4pL1, conținând 24 nmol pL 290 modificat și (gal)4pL2, conținând 24,5 nmol pL 290 modificat.
RO 117861 Β1
1705
d) Obținerea de conjugate de asialofetuină
Conjugatele se obțin după același principiu ca și conjugatele de transferină; un procedeu asemănător pentru obținerea conjugatelor de asialoorosomucoid-polilizină a fost descris de Wu și Wu, 1988.
Cuplarea asialofetuinei la polilizină se face prin legarea punții disulfurice după modificarea cu reactivul bifuncțional SPDP (Pharmacia). O soluție de 100 mg 82,2 μΓποΙ) asialofetuină (sigma) în 2 mM HEPES, pH=7,9 se supune unei filtrări pe gel pe o coloană Sephadex G-25. La cei 4 ml soluție obținute din aceasta se adaugă 330 μ\ dintr-o soluție etanolică 15 mM de SPDP (5,0 pmol) sub agitare puternică. După o oră, la temperatura mediului înconjurător se efectuează purificarea pe încă o filtrare pe gel (Sephadex G-25); după această filtrare au rezultat 5 ml dintr-o soluție de 1,4 pmol de asialofetuină, modificată cu 2,25 Mmol de linker de ditiopiridină.
Se obțin conjugate amestecând 1,4 μΐηοΙ asialofetuină în 5 ml 100 mM HEPES, pH=7,9 cu 0,33 μ mol; pL190 modificat (conținând 1,07 μηιοΙ grupe de mercaptopropionat; se procedează în același fel ca pentru obținerea conjugatelor de transferină) în 6,5 ml 200 mM HEPES, pH=7,6 sub atmosferă de argon. Amestecul de reacție se lasă, timp de 24 h, la temperatura mediului înconjurător. Conjugatele se izolează din amestecul de reacție prin cromatografie de schimb de cationi (Pharmacia Mono-coloană B HR 10/10; eluție de gradienți, tampon A, 50 mM HEPES, pH=7,9; tampon B: Tampon A plus clorură de sodiu 3M) și se adaugă clorură de sodiu, până la o concentrație finală de 0,6 M înainte de încărcarea coloanei. Fracțiunea de produs se eluează la o concentrație de sare de circa 1,5 M. Dializa față de HBS de conjugate, conținând 0,52 μηιοΙ asialofetuină, modificată cu 0,24 pmol pL190.
e) Transfecția de celule HepG2 cu complecși pRSVL-ADN
Celule HepG2 se cultivă în mediu DMEM plus 10% FCS 100 I.E./ml penicilină, 100 Mg/ml streptomicină și 2 mM glutaminâ în flacoane T25. Transfecțiile se efectuează, la o densitate de 400000 celule/flacon. înainte de transfecție, celulele se spală cu 4 ml mediu proaspăt, conținând 10% FCS. Chiar înainte de transfecție se adaugă ciorchină (sigma), astfel, încât concentrația finală în suspensia de celule (plus soluția de ADN) să fie de 100 μΜ.
pg pRSVL-ADN în 330 μΙ HBS se amestecă cu cantitățile indicate în fig.7 de conjugat de TfpL190B (TfpL), cu conjugat de asialofetuină-pL90 (AfpL), polilizină 290 (pL) sau conjugat de tetragalactoză-peptid-polilizină (gal)4pL în 170 μΙ HBS. în experimentele de competiție se adaugă după 30 min. 240 pg asialofetuină ((gal) 4pL + Af) sau 30 pg peptidă lactozililată ((gal)4pL + (gal)4). Amestecul se adaugă la celule; celulele sunt incubate, timp de 4 h, la 37°C, apoi mediul de transfecție este înlocuit cu 4 ml mediu proaspăt de DMEM plus 10% FCS. După 24 h, celulele sunt culese pentru încercarea cu luciferază. Valorile reprezentate în fig .7 reprezintă activitatea totală a luciferazei a celulelor transificate. Așa cum rezultă din figură, pL și TfpL arată activități de luciferază reduse: (gal)4pL arată valori asemănător de ridicate ca AfpL; adaosul de (gal)4 sau AF concurează cu receptorul de asialoglicoproteină și coboară valorile, așa cum era de așteptat.
f) Transfecția de celule HepG2 cu complecși pCMVL-ADN
Celule HepG2 sunt cultivate în plăci de 6 cm până la o densitate de celule de 300000 celule/placă, așa cum s-a indicat în e). înainte de transfecție, celulele sunt spălate cu 1 ml mediu proaspăt, conținând 2% FCS.
pg pCMVL-ADN în HBS se amestecă cu cantitățile indicate în flg.8 de conjugat
TfpL190B (TfpL), conjugat de asialofetuină-pL (AfpL), polilizină 290 (pLys290), (gal)4L1 sau (gal)4pL2 în 170 pl HBS. După 30 min se adaugă fiecărui complex de conjugat de ADN 1 ml
DMEM, conținând 2% FCS și 50 pl soluție de tulpină de adenovirus d1312. în experimentările de competiție se adaugă, așa cum s-a indicat, 30 pg peptidă lactosililată (gal)4pL1 +
1710
1715
1720
1725
1730
1735
1740
1745
1750
RO 117861 Β1 (gal)4, respectiv, (gal)4pL2 + (gal)4). Amestecul se adaugă peste celule; celulele sunt incubate, timp de două ore, la 37’C, apoi se adaugă 1,5 ml mediu, conținând 10% FCS. Două ore mai târziu mediul de transfecție este înlocuit prin 4 ml de mediu DMEM proaspăt plus 10% FCS. După 24 h, celulele sunt recoltate pentru încercarea cu luciferază; valorile din fig .8 reprezintă activitatea totală a luciferazei a celulelor transificate. pLys290 arată un efect, (gal)4pL arată un efect mai puternic; adaosul de (gal)4, care concurează cu receptorul de asialoglicoproteină, reduce valorile lavaloarea obținută pentru polilizină.
g) Transfecția de celule TIB73 cu complecși pCMVL-ADN
Celule ale liniei de celule de ficat ale șoarecelui embrionic ATCC TIB73 (BNL CL.2; Patek și colab., 1978) sunt cultivate la 37°C în 5% atmosferă de CO2 în DMEM “high glucose” (0,4% glucoză), completată cu 10% FCS inactivată, conținând 100 I.E./ml penicilină, 100 pg/ml streptomicină și 2 mM glutamină, în plăci de 6 cm.
Transfecția se efectuează la o densitate de celule de 300000 celule/placă. înainte de transfecție celulele se spală cu 1 ml mediu proaspăt plus 2% FCS.
pg pCMVL-ADN în 300 μΙ HBS se amestecă cu cantitățile date de conjugat de transferină de șoarece-polilizină 290 (mTfpL), conjugate de asialofetuină pL (AfpL), polilizină 290 (pLys290), (gal)4pL1 sau (gal)4pL2 în 170 μΙ HBS. După 30 min se adaugă fiecărui complex de conjugat de ADN 1 ml DMEM, conținând 2% FCS și 50 μΙ soluție de tulpină de adenovirus d1312C. Amestecul se adaugă la celule, celulele sunt incubate la 37°C, timp de 2 h, apoi se adaugă 1,5 ml mediu, conținând 10% FCS. Două ore mai târziu mediul de transfecție este înlocuit cu 4 ml mediu proaspăt. După 14 h celulele sunt recoltate pentru testul luciferazei; valorile arătate în fig.9A prezintă activitatea totală a luciferazei celulelor transificate.
Pentru comparație se procedează la o transfecție fără adenovirus în prezență de colorohină; transfecțiile sunt realizate la o densitate a celulelor de 300000 celule/placă. înainte de transfecție celulele sunt spălate cu 1 ml mediu proaspăt, conținând 2% FCS. Cu puțin timp înainte de transfecție se adaugă ciorchină (Sigma), astfel că concentrațiile finale în suspensia de celule (plus soluția ADN) este de 100 μΜ. 6 pg pCMVL-ADN în 330 pl HBS se amestecă cu cantitățile indicate mTfpL, AfpL, pLys290, (gal)4pL1 sau (gal)4pL2 în 170 μΙ HBS. După 30 min complexele de ADN sunt adăugate la celule. Celulele sunt incubate la 37°C, timp de două ore, apoi se adaugă 1,5 ml mediu, conținând 10% FCS și 100 μΜ ciorchină. Două ore mai târziu mediul de transfecție este înlocuit cu 4 ml mediu proaspăt. După 24 h celulele sunt recoltate pentru determinarea luciferazei. Valorile obținute pentru activitatea luciferazei sunt reprezentate în fig.9B.
Exemplul 7. Import de ADN în celule T
a) Obținerea conjugatelor de anti CD7-polilizină 190
O soluție de 1,3 mg anti CD7-anticorpi (Immunotech) în 50 mM HEPES, pH=7,9 se tratează cu 49 pl soluție etanolică 1 mM de SPDP (Pharmacia). După o oră la temperatura camerei se filtrează pe o coloană de gel Sephadex G-25 (eluent tampon HEPES 50 mM pH=7,9), obținându-se 1,19 mg (7,5 nmol) anti CD7, modificat cu 33 nmol resturi de piridilditiopropionat, poli(L)lizină 190, marcate cu ajutorul fluorescenței FITC, se modifică cu analog de SPDP și prin tratare cu ditiotreitol și urmată de filtrare pe gel se duce la forma modificată cu grupe mercapto libere.
O soluție de 11 nmol polilizină 190, modificată cu 35 nmol grupe mercapto în 0,2 ml tampon de acetat de sodiu 30 mM se amestecă prin excluderea de oxigen cu anti CD7 modificat (în 0,5 ml HEPES 300 mM, pH=7,9) și se lasă peste noapte să stea la temperatura mediului ambiant. Amestecul de reacție se aduce prin adăugare de NaCI 5 N la un conținut de circa 0,6 M. Izolarea conjugatelor are loc prin cromatografie de schimb ionic (Mono S, Pharmacia, 50 mM HEPES, pH=7,3, gradient de sare 0,6 M până la 3 M NaCI); după dializă față de 10 mM HEPES, pH=7,3 se obțin conjugate corespunzătoare, constând din 0,51 mg (3,2 nmol) anti CD7-anticorpi, modificați cu 6,2 nmol polilizină 190.
RO 117861 Β1
b) Obținerea de conjugate gp120-polilizină 190
Cuplarea are loc în mod analog cu metodele cunoscute din literatură prin conexiune cu tioeter după modificarea cu N-hidroxi-succinimidester de acid 6-maleimidocapronic (EMOS, Sigma) (Fujuwara, și colab., 1981).
Conjugate gp120-polilizină190 conexate cu tioeter
O soluție de 2 mg gp120 recombinantă în 0,45 ml 100 mM HEPES, pH=7,9 este tratată cu 17 μΙ dintr-o soluție 10 mM de EMCS în dimetilformamidă. După o oră, la temperatura mediului ambiant se filtrează printr-ο coloană de gel Sephadex G-25 (eluant 100 mM tampon HEPES, pH=7,9). Soluția de produs (1,2 ml) este imediat lăsată să reacționeze prin excluderea oxigenului cu o soluție de 9,3 nmol polilizină 190, marcată prin fluorescență și modificată cu 30 nmol grupe mercapto (în 90 μΙ acetat de sodiu 30 mM,pH=5,0), și se lasă să stea peste noapte, la temperatura camerei. Amestecul de reacție se aduce prin adaos de 5 M NaCI, la un conținut de circa 0,6 M. Izolarea conjugatelor are loc prin cromatografie de schimb ionic (Mono, S, Pharmacia, 50 mM HEPES,pH=7,3, gradientul de sare 0,6 M până la 3 M NaCI); după fracționare și dializă față de 25 nM HEPES, pH=7,3 se obțin 3 fracțiuni de conjugat, A, B și C, constând din 0,40 mg rgp120 modificate cu 1,9 nmol polilizină 190 (în cazul fracțiunii A), respectiv, 0,25 mg rgp 120 modificat cu 2,5 nmol polilizină 190 (fracțiunea B), respectiv, 0,1 mg rgp 120 modificat cu 1,6 nmol polilizină 190 (fracțiunea C).
PCMVL-ADN (6 Mg/probă) este complexat cu cantitățile indicate de polilizină 90 sau cu conjugatele de polilizină menționate în 500 μΙ HBS. între timp se prepară alicote de celule H9 (10® celule în 5 ml RPMI cu 2% FCS) sau limfocite umane primare (3 x 10® celule în mediul Dulbecco modificat de Iscove (IMDM) plus 2% FCS). Complecșii pdllizină-ADN sunt adăugați la fiecare probă de celulă. 5 min mai târziu se adaugă cantitatea indicată de adenovirus d1312. Apoi, celulele sunt incubate la 37’C, 1,5 h, apoi se adaugă RPMI (în cazul celulelor H9) sau IMDM (în cazul limfocitelor primare) plus 20% FCS din fiecare probă. Celulele sunt incubate la 37°C, timp de 24 h, recoltate și tratate pentru determinarea activității luciferazei ca în exemplele celelalte. Rezultatul este reprezentat pentru încercările efectuate în fig.lOA (celule H9) respectiv fig.lOB (limfocite primare): în celulele H9 conjugatul anti CD7 (fig. 10A, coloana 7-9) și conjugatul gp120 (coloanele 10-12) cele mai bune rezultate cu privire la transferul de gene obținut cu adenovirus, conjugatul gp120 obținând și în absența adenovirusului deja o expresie clară a genei luciferazei. Este demn de remarcat, că în încercările efectuate numai conjugatul gp120 este în situația de a introduce ADN în limfocite primare și aceasta numai în prezența de adenovirus defect (fig.lOB, coloanele 7 și 8).
Exemplul 8. Inactivarea de adenovirusuri
a) Inactivarea UV
Un preparat de adenovirus d1312, obținut și depozitat, așa cum este descris în introducerea din exemple, se introduce în adânciturile de 2 cm ale unei plăci de cultură de celule (300 μΙ/adâncitură) pe gheață la o distanță de 8 cm față de lămpi UV (Philips TUV15 (G15 T8). Virusul este expus iradierii UV pentru o durată corespunzând timpilor indicați în fig.11A și părții de alicote din fiecare preparat se examinează asupra titrului de virus precum și asupra capacității lor, dacă și în ce măsură ele sunt în situația de a intensifica transferul de gene cu conjugate de polilizină-transferină în celule HeLa.
Cultivarea celulelor și transfecția se efectuează în esență, așa cum s-a indicat mai sus sub “Celule și medii”; componentele utilizate pentru transfecție sunt vizibile din fig. 11 A.
Complecșii din pCMVL-ADN și 12 μρ TfpL sunt obținuți în 500 μΙ HBS și se adaugă 3x10® celule HeLa (în 1 ml DMEM plus 2% FCS). După circa 5 min, mai târziu se adaugă 54 μΙ din fiecare preparat de virus la fiecare cultură și cultura este incubată la 37°C, o oră și jumătate până la două ore. în plus se adaugă o parte de alicotă de 5 ml DMEM plus 10% FCS la
1805
1810
1815
1820
1825
1830
1835
1840
1845
1850
RO 117861 Β1 fiecare cultură, incubarea se continuă la 37°C, timp de 24 h și culturile se recoltează pentru a fi cercetate cu privire la activitatea luciferazei. Cantitatea de 54 pl de virus neiradiat nu se află în domeniul de saturare, adică testul este sensibil la o cantitate de virus de cel puțin de ori mai ridicată. Valorile de virus pentru expresia luciferazei sunt reprezentate în fig.11B (pătratele închise).
Titrul de virus pentru fiecare preparat se determină prin utilizarea liniei de celule 293 complementată cu E1A. Mai întâi se obțin diluări în serie ale probelor de virus iradiate și neiradiate în DMEM plus 2% FCS. Paralel cu aceasta se obțin probe de 5 x 104 celule 293 (într-o adâncitură de 2 cm) și se introduc în 200 pl DMEM plus 2% FCS. O parte de alicotă de 5 pl din fiecare diluare se introduce pentru comparație în câte o a doua adâncitură. Pentru a realiza legarea virusului la celule, se incubează o oră și jumătate, la 37°C, apoi se adaugă 2 ml DMEM plus 10% FCS în fiecare adâncitură. 48 h mal târziu se numără culturile, pentru a determina efectul citopatic. Acea diluție de virus, deasupra căreia mai puțin de 50% din Celulele din cultură arată după 48 h un efect citopatic evident, arată cantitatea relativă de virus infecțios în fiecare preparat de virus. Valorile obținute sunt reprezentate în fig.11B (pătrate deschise). Rezultatul încercărilor rezultate în acest exemplu arată, că o scădere de zecimi în titrul virusului prin Iradiere UV duce numai la o reducere de 20 de ori a transferului de gene a luciferazei. Acest lucru arată, că mecanisme, care sunt hotărâtoare pentru caracterul infecțios al virusului, pot fi distruse, fără ca să prejudicieze capacitatea virusului de a intensifica transferul de gene.
Se observă, că la doze scăzute de virus, intensificarea transferului de gene scade în mod neesențial (fig.11a, col. 3-6) și că acest efect apare mai clar la doze ridicate (coloanele 7-10).
b) Inactivarea adenovirusurilor cu formaldehidă ml de preparat de adenovirus se trece peste o coloană de 10 ml G25 (Pharmacia PD 10 G, 25 M) preechilibrată cu 150 mM NaCI, 25 mM HEPES, pH=7,9,10% glicerină, și colectate într-un volum de 2,5 ml. Părți de alicote de preparate de virus filtrat sunt incubate 20 h, pe gheață având 0,0% (O), 0,01%, 0,1% sau 1% formaldehidă. Apoi.se adaugă Tris, pH=7,4 la o concentrație de 100 mM, apoi probele se dializează mai întâi două ore, față de 1 1150 mM NaCI, 50 mM, Tris, pH=7,4 și 50% glicerină și apoi peste noapte față de 2 x 1 1150 mM NaCI, 20 mM HEPES, pH= 7,9 și 50% glicerină.
Părți de alicote ale virusului sunt apoi cercetate pe 293 celule asupra titrului lor (cercetarea CPE-punct final sau Plaque-Assay, Precious and Russel, 1985). Apoi, se determină acțiunea virusurilor tratate cu formaldehidă asupra transferului de gene în celule HeLa (300000), ca în exemplele precedente, măsurând activitatea luciferazei. 90 pl din preparatul de virus au provocat un transfer de ADN, care a corespuns la mai mult decât 10® unități de lumină. Tratamentul virusului cu 0,01% sau cu 0,1% formaldehidă duce la o scădere neînsemnată a activității de transfer a genelor (circa o scădere de 10 ori la 0,1%). Deși tratamentul cu 1% formaldehidă cauzează o pierdere frapantă a activității transferului de gene, 90 pl din virus tot mai provoacă încă o expresie de gene corespunzând la 104 unități de lumină. La o tratare cu 0,1% formaldehidă există o reducere a titrului virusului la 105 PFU (Plaque forming units) cu o reducere a activității luciferazei cu numai 10%. Rezultatul încercărilor realizate este reprezentat în fig.12A.
c) Inactivarea de adenovirus cu UV/8-metoxipsoriali cu unde lungi
Părți de alicote de preparate de virus purificat sunt dizolvați la o concentrație de
0,33 /zg/ml 8-metoxipsoriali (concentrația inițială 33 ^g/ml 8-metoxipsoriali dizolvați în DMSO) și expuși la o sursă de lumină UV 365 nm (UVP model TL-33), pe gheață la o distanță de cm de filtrul de lampă. Durata iluminării, între 15 până la 30 min, așa cum se poate vedea din fig.12B. Probele de virus sunt apoi trecute printr-o coloană Sephadex G-25 (Pharmacia,
RO 117861 Β1
PD-10) echilibrată cu HBS + 40% glicerină și sunt depozitate la -70°C. Preparatele de virus sunt cercetate, pe de-o parte asupra capacității lor de a intensifica transferul de gene cu ajutorul complecșilor pCMVL/hTfpL în celule HeLa, (reprezentate ca unități de lumină, axa dreaptă din fig.12B), pe de altă parte asupra capacității lor de a se replica în celule 293 (titrul de virus, axa din stânga din fig.12B).
Exemplul 9. Transfecția de celule NIH3T3 cu virus Moloney în acest exemplu și în cele care urmează, care arată intensificarea internalizării de complecși de transferină-polilizină-ADN cu ajutorul retrovirusurilor, se folosesc, în măsura în care nu se indică altfel, următoarele materiale și metode:
Conjugatele de transferină-polilizină 190 și complecșii de conjugat-ADN sunt obținuți asemănător cu exemplele precedente, cu deosebirea, că reacția de formare a complexului se realizează într-un volum de 500 μΙ mM NaCI, 20mM HEPES, pH=7,4.
> Celulele NIH3T3 sunt cultivate în mediu DMEM cu un adaos de 10% FCS, 1001.E./ml penicilină, 100 /zg/ml streptomicină și 2 mM glutamină. Pentru transfecții, se curăță 5 - 7 x 10® celule per flacon T25 18, până la 24 h. Chiar înainte de transfecție celulele se introduc în mediu proaspăt și diferitele componente utilizate pentru transfecție se adaugă în următoarea ordine: Ciorchină (100 μΜ, acolo unde este indicat), complex de polilizină-transferinăADN, preparat de retrovirus. Apoi, celulele sunt incubate 4 h, la 37°C, apoi se schimbă mediul și celulele se recoltează 24 h mai târziu. Se obțin extracte, folosindu-se trei cicluri de congelare/dezghețare; cote de alicote din extract, standardizate în ce privește conținutul de proteină, sunt cercetate cu privire la activitatea luciferazei, așa cum este indicat pentru exemplele precedente.
în condițiile date se realizează transfecții de 106 celule NIH3T3 cu complecși TfpLADN în prezență de 100 μΜ ciorchină sau fără ciorchină, așa cum se indică în fig. 13. Se constată că fără ciorchină se ajunge la activitatea luciferazei numai pentru nivelul inferior (background niveau) (coloana 1) pe când în prezența ciorchinei se poate măsura o expresie înaltă a genei reporter pRSVL (coloana 2). Cantități crescânde ale virusului de leucemie Moloney, care se adaugă concomitent cu complecșii ADN în celule, pot să cauzeze o creștere din ce în ce mai mare a expresiei genei luciferazei (Cantitățile indicate în fig. 13 sunt în mililitri).
Exemplul 10. Cercetare, dacă mărirea transferului de gene se explică prin retrovirus Preparatul de virus folosit în exemplul 9 este un rest brut, nefracționat de celule care exprimă retrovirus. Pentru a obține dovada, că mărirea importului de ADN, care este obținut cu acest preparat de virus, se explică într-adevăr prin prezența virusului, restul se supune la dializă/purificare și concentrare, restul de retrovirus (indicat în figură cu RVS) este concentrat cu un factor 10. în cazul în care retrovirusul este responsabil pentru intensificare, ar trebui ca activitatea găsită în reziduul membranei, în afară de inactivarea posibilă a retrovirusului foarte labil, să aibe loc în timpul treptei de concentrare, aproximativ de 10 ori cantitatea restului inițial. Ca în exemplul anterior, s-au transferat 10® celule NIH3T3 în condițiile indicate în fig. 14.
Din fig. 14 se poate vedea, că transferul de gene are un efect de intensificare în reziduul membranei (s-au utilizat 20 - 600 μΙ, urme 3 - 6. în afară de aceasta se arată că 200 și 600 μ\ a preparatului concentrat de 10 ori sunt pe jumătate așa de active, ca 2 sau 6 ml ale preparatului de retrovirus inițial, neconcentrat (Urmele 7 și 8).
în paralel cu aceasta, se fac încercări cu celule umane K662, care nu prezintă un receptor pentru retrovirusul de șoarece ecotrop. Așa cum era de așteptat, nu se obține nici o intensificare a expresiei de gene.
1905
1910
1915
1920
1925
1930
1935
1940
1945
RO 117861 Β1
Exemplul 11. La efectul de transfer de gene al virusului Moloney, au un ml important efectele de schimb dintre transferină și receptorul său
Pentru a exclude posibilitatea, că transferul de complecși TfpL/pRSVL în celule se explică prin legarea nespecifică a polilizinei la retrovirus și pentru a clarifica mecanismul de intrare într-o măsură mai mare, se cercetează retrovirusul asupra capacității sale de a trimite plasmida-ADN în celulă, care este complexată numai cu polilizină. Cantitatea de polilizină utilizată corespunde cantității optime de mai înainte, care este determinată pentru a produce condensarea completă a plasmidei-ADN și este asemănătoare cantității de polilizină, care este utilizată cu conjugatul de polilizină-transferină (Wagner și colab., 1991a). încercările, al căror rezultat este reprezentat în fig. 15, au duș la rezultatul, că gena răspunzătoare de lipsa ciorchinei nu se exprimă nici sub forma de complecși de pL-pRSVL, nici sub forma de TfpL-pRSVL (coloanele 1 și 2). Dimpotrivă, în prezența de retrovirus sunt exprimate ADNreporter aplicate drept complex TfpL, totuși nu sub formă de complex pL-ADN (a se compara coloanele 3 și 4 cu coloanele 5 și 6). Mai departe, încercările efectuate au dus la rezultatul, că prezența de transferină liberă în exces a cauzat o micșorare a importului de ADN înlesnit de retrovirus (coloanele 7 și 8). și aceste rezultate au sprijinit concepția, că efectele de schimb dintre transferină și receptorul ei joacă un rol important pentru intensificarea primirii ADN, care este cauzată prin retrovirus.
Exemplul 12. Influența valoni pH asupra efectului de transfer de gene al retrovirusurilor
Experiențele realizate în cadrul acestui exemplu au avut drept scop cercetarea influenței valorii pH asupra capacității retrovirusurilor, de a intensifica transferul de gene.
încercările de transfecție sunt efectuate ca în exemplele precedente. Pentru a constata, dacă o valoare pH scăzută este importantă pentru efectul de transfer de gene, sau utilizat ambii inhibitori caracteristici pentru scăderea endosomală a valorii pH, monensina și clorură de amoniu. S-a plecat de la premisa că aceste două substanțe ar prejudicia transferul de gene, dacă retrovirusul are nevoie de o valoare mai mică a pH-ului pentru efectul de transfer de gene. Dacă dimpotrivă alte mecanisme sunt răspunzătoare pentru acest efect, și anume fuziunea directă pe suprafața citoplasmei, asemănător ca la mecanismul de intrare la HIV, atunci aceste substanțe, fie că nu au efect negativ, ci eventual chiar un efect de intensificare, când ele modifică calea complecșilor TfpL-ADN. Rezultatele experimentale, care sunt reprezentate în fig.16, sprijină mai mult ultima ipoteză. S-a cercetat acțiunea ambelor substanțe asupra transferului TfpL-ADN și s-a găsit că niciuna din cele două substanțe nu poate înlocui funcțional ciorchina, deși o creștere mică a expresiei de gene a luciferazei s-a constatat la concentrații mai ridicate de clorură de amoniu (coloanele 1-5). Retrovirusul singur arată intensificarea ușoră observată deja în exemplele precedente a transportului ADN (urma 6). S-a observat o creștere importantă când retrovirusul este folosit în prezență de 1 μΜ monensină (urma 7). Un efect mai puțin puternic este observat la o concentrație mai ridicată de monensină (urma 8), precum și în prezență de clorură de amoniu (urmele 9 și 10).
Exemplul 13. Intensificarea transferului de gene obținute prin conjugate de transferină prin peptida endosomolitică cu N-terminal al hemaglutininei de influența HA2
a) Sinteza peptidei
Peptida cu secvența (SECV ID NR:1) Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-lle-Ala-Gly-Phe-lle-GluAsn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-lle-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys este sintetizată cu ajutorul metodei Fmoc (Fluorenilmetoxicarbonil) (Atherton și colab., 1979), utilizânduse un Applied biosystems 431
Peptidsynthetizer, Grupele de protecție pentru lanțurile laterale sunt t-butil pentru Cys, Glu și Asp și tritil pentru Asn. După reacția de cuplare s-a realizat un test de ninhidrină, care a
RO 117861 Β1 arătat un grad de cuplare de 98% pentru fiecare treaptă. începând cu A-19 sunt efectuate cuplări duble. Grupa Fmoc cu N-terminal este îndepărtată de o parte din rășina de peptidă cu 20% piperidină în NMP (N-metilpirolidonă). Apoi, fracțiunile protejate cu Fmoc și fracțiunile neprotejate sunt spălate cu DOM (diclormetan) și uscate sub vid înaintat. Cantitățile obținute sunt 293,6 mg rășină de peptidă liberă de Fmoc respectiv 366,5 mg rășină de peptidă protejată de Fmoc.
111,1 mg din rășina de peptidă liberă de Fmoc este supusă 1,5 h, la o scindare cu acid trifluoracetic, utilizându-se un amestec de 10 ml TFA, 0,75 g fenol, 300 μ\ EDT (etanditiol) 250 μ\ Et-S-Me (etilmetilsulfură) și 500 μ\ apă. Peptidă este filtrată de rășină printr-un filtru Nutsche din sticlă. Rășina este spălată cu DCM și adăugată la filtrat. Filtratul este concentrat la cca 2 ml și apoi adăugat picătură cu picătură sub agitare la 40 ml eter. Precipitatul de peptidă este centrifugat și supematantul de eter este îndepărtat. Precipitatul este spălat de 3 ori cu 40 ml eter și uscat în vid înaintat. Produsul brut obținut de 58 mg este dizolvat în 3,5 ml NH4HCO3 20 mM, conținând 300 μ\ NH3 25%/1. Soluția este filtrată pe gel cu utilizarea aceluiași tampon pe o coloană Sephadex G-25 preambalate (Pharmacia PD10). întreg materialul este încărcat pe o coloană Mono Q (Pharmacia 100 x 14 mm) (gradient: 0-10 min 100% a, 10-100 min 0-100% B. A: 20 mM NH4HCO3 + 300 μ\ NH3/1. B: A + 3 M NaCI. Măsurare la 280 mM, verificare Trp-fluorescență la 354 nm. Debitul 1 ml/min). Produsul eluiază cu 1 M NaCI. Fracțiunea principală a coloanei Mono-Q este purificată prin Deverse Phase HPLC printr-o coloană RP-304 BIORAD-Hi-Pore (250 x 10 ml) (gradient: 50 100% tampon B în 12,5 min, 12,5 - 25 min 100% B. A: 20 mM NH4HCO3 + 300 μ\ NH3/1, B: A în 98% metanol. Debit 3 ml/min. Măsurare la 237 nm). Produsul a eluat la 100% b. Fracțiunile de produs sunt evaporate pe un Speedvac, se dizolvă din nou în tamponul A și la sfârșit este liofilizat. Cantitatea obținută este de 8,4 mg din produsul purificat HPLC sub forma protejată cu cisteină (peptidă este notată cu “P16)). Pentru a obține această peptidă sub forma liberă mercapto, substanța protejată cu /-butii se tratează cu tioanisol/etanditiol/acid trifluoracetic/acid trifluormetansulfonic (2/1/40/3; acidul trifluormetansulfonic se adaugă în raportul indicat după celelalte componente. Tratamentul se efectuează la temperatura mediului înconjurător, timp de 30 min. Peptidă este izolată prin precipitare cu eter și filtrare pe gel (Sephadex G-25) cu tamponul indicat mai sus A sub atmosferă de argon.
b) Cuplarea peptidei de influența cu polilizină b1) Legătură directă prin SPDP (Succinimidilpiridilditiopropionat)
19,8 mg hidrobromură de polilizin(pL)300 (Sigma) este filtrată pe gel pe o coloană Sephadex G-25 (Pharmacia PD-10) în acetat de sodiu, pentru a îndepărta fracțiunile cu moleculă mică. Pe baza testului cu ninhidrină concentrația pL după filtrare pe gel este de 3,16 mg/ml. Valoarea pH a soluției este reglată cu NaOH 1M la 7 - 8. La 2,6 ml din soluția pL (7,9 mg pL = 0,13 pmol) se adaugă 0,64 μηηοΙ SPDP (Pharmacia: 40 mM soluție în EtOH absolut). Aceasta corespunde la un raport molar de SPDP.pL de 5:1. Amestecul este lăsat să reacționeze peste noapte și se filtrează pe gel în 20 mM NH4HCO3, pH=8,2 pe o coloană G25. După reducerea unei cote de alicote de filtrat cu DTT (ditiotreitol) măsurarea de tiopiridonă a arătat că reacția a decurs complet. 0,3 ^mol pL-SPDP (față de pmol SPDP) în 2,212 ml este lăsată să reacționeze cu 0,35 pmol peptidă sub formă de tiol. Un precipitat alb, care a apărut la amestecarea de peptidă și pL, s-a dizolvat, reglând soluția la cu clorhidrat de guanidină 2 M, reacția având loc peste noapte. Măsurarea fotometrică de tiopiridonă în amestecul de reacție a confirmat din nou caracterul complet al reacției. Apoi, amestecul este dializat 2x2 față de 2120 mM HEPES/0,5 M clorhidrat de guanidină. Soluția obținută este încărcată pe o coloană Mono-S (0,7 x 6 cm, Pharmacia( )gradient: 0-20 min 100% A, 20-140 min 0-100% B. A: 20 mM HEPES, pH=7,3/0,5 clorhidrat de guanidină, B: 20 mM HEPES,
2000
2005
2010
2015
2020
2025
2030
2035
2040
2045
RO 117861 Β1 pH=7,3/3 M clorhidrat de guanidină, 0,3 ml/min. Confirmare la 280 nm și confirmare prin fluorescență la 354 nm, excitație la 280 nm). Fracțiunea de produs, care a eluat cu 1,5 M clorhidrat de guanidină, este dializată cu 2 x 21HBS. Determinarea care a urmat a concentrației pL prin testul cu ninhidrină arată o concentrație de circa 1,14 mg/ml. Cantitatea de peptidă în soluția conjugatului este calculată din absorbția sa la 280 nm); din aceasta a rezultat un raport molar de peptidă: pL de 4:1.
b2) Legarea printr-un linker de polietilenglicol
14,6 mg pL 300 hidrobromură (Sigma) este filtrată pe gel ca la b1). Pe baza testului de ninhidrină concentrația pL după filtrarea pe gel este de 4,93 mg/ml. Valoarea pH a soluției este reglată cu 1M NaOH, la 7 - 8. La 2,7 soluție pL (13,3 mg pL = 0,22 Mmol) se adaugă 4,33 pmol SPFP (Pharmacia; 30 nM soluție în EtOH absolut). Aceasta corespunde unui raport molar SPDP: pL de 20:1. După 1,5 h amestecul de reacție este filtrat pe gel pe o coloană Sephadex G-25 în 0,1 M acetat de sodiu/3M clorhidrat de guanidină. După reducerea unei cote de alicote a filtratului cu DTT este realizată o determinare a tiopiridonei, care a arătat un conținut de 3,62 pmol SPDP în fracțiunea de producție. pL modificat cu SPDP este redus prin adaos de 79 mg DTT la soluție. După două h de reducere soluția este filtrată din nou pe G 25 în condițiile indicate. Determinarea tiolului cu ajutorul testului Ellmann a arătat o concentrație a tiolului de 3,15 pmol în 2,224 ml.
17,62 mg = 5 pmol POE (polioxietilen-bis(6-aminohexil), Sigma) sunt dizolvați în 500 pl 20 mM NaHCO3/3M clorhidrat de guanidină, pH=7-8 și este lăsat să reacționeze cu
13,8 mg EMCS N-hidroxisuccinimidester al acidului ε-maleimidocapronic) (sigma) (=
44,7 pmol) dizolvat în 300 pl DMF (dimetilformamidă). După 30 min soluția este filtrată pe gel pe G25 (20 mM NaHCO3/3M clorhidrat de guanidină). Determinarea fotometrică a grupei maleimido la 300 nm arată o concentrație de 6,36 pmol de EMCS reacționat în 2 ml soluție.
La 1,049 ml din această soluție (corespunzând la 3,34 pmol EMCS) se adaugă 1,39 pmol din peptidă sub formă de tiol (în 2,5 ml 20 mM NaHCO3/3 M clorhidrat de guanidină) picătură cu picătură sub amestecare intensă cu ajutorul Vortex-ului într-un curent de argon. După 15 min nu s-au mai putut detecta cu testul Ellmann grupe libere de tiol.
Soluția de pL redus modificat cu SPDP este adusă o valoare pH de 7 - 8 prin adaos de 1M NaOH. 1,373 ml din această soluție sunt adăugate la amestecarea intensivă cu Vortex la amestecul de reacție de mai sus. Acest lucru dă raport molar de peptidă-SH: POEEMCS: pL-SH de 1:2,4:1,4 (față de EMCS, respectiv, SH). După 2,5 h de reacție nu s-au mai putut detecta, cu testul Ellmann grupe de tiol. Materialul este dializat peste noapte cu 2 I 20 mM HEPES pH=7,3/0,6M NaCI și apoi, este încărcat pe o mono S-coloană (gradient: 020 min 22% A, 20-150 min 22-100% B. A: 20 mM HEPES, pH=7,3, B: A - 3M NaCI. Debit: 0,3 ml/min. Măsurarea este realizată la 280 nm și măsurarea la fluorescență la 354 nm). Produsul care a eluat cu 1,5 -1,6M NaCI, este dializat cu 21 HBS. Determinarea concentrației pL cu ajutorul testului cu ninhidrină și determinarea fotometrică a concentrației de peptidă la 280 nm dă un raport calculat de peptidă: pL de 12:1 la o concentrație pL de 0,49 mg/ml într-un volum total de 4,5 ml.
c) Prepararea de lipozomi
Cu ajutorul metodei REV (“reverse-phase evaporation) se obține liposomi (Szoka și Papahadjopoulos, 1978; Strauhinger și Papahadjopoulos, 1983): Faza apoasă 10 mM HEPES, pH=7,3,100 mM calceină 150 mM NaCI; faza organică: o soluție de 300 pmol Lalfa-lecitină (din gălbenuș de ou, în principal palmitoiloleilfosfatidilcolină; Avânți Polar Lipids) în 260 pl cloroform este concentrat prin evaporare prin utilizarea unui evaporator rotativ. Materialul este apoi uscat în vid înaintat și după aceea, este din nou dizolvat în 3 ml de dietil eter. 1 ml din faza apoasă este bine amestecat cu faza de eter cu ajutorul Vortex-ului și este tratat 5 min, la 0’C într-un sonicator (tip baie) cu ultrasunete. După 30 min pe gheață mate
RO 117861 Β1 rialul este din nou tratat cu ultrasunete, timp de 10 min. Emulsia stabilă rezultată este concentrată prin evaporare pe un evaporator rotativ. După îndepărtarea dietileterului la 100 mbar se adaugă 0,75 ml din faza apoasă. Urmele reziduale de eter sunt îndepărtate prin evaporare în continuare la 50 mbar, timp de 30 min. Emulsia obținută (1,7 ml) este centrifugată la 500 rot/min și apoi, extrudată printr-o membrană de policarbonat Nucleopore (0,1 μΓη), ceea ce a dus la un volum final de 0,7 ml soluție de lipozomi. Lipozomii sunt separați de materialul neîncorporat prin filtrare pe gel (Sephadex mediu G-50, Pharmacia; 23 ml voi. de gel, 10 mM HEPES, pH=7,3/150 mM NaCI). Sunt colectate șase fracțiuni de 500 μΙ. Lipidfosforul este determinat prin metoda lui Bartlett, 1959, cu 2 mM.
d) încercarea de punere în libertate adipozotnilar. _ _--------------
Punerea în libertate a conținutului de lipozomi (“Leakage) este măsurată cu ajutorul ieșirii calceinei închise și a diluării rezultate din aceasta, care cauzează o încetare a autostingerii a fluorescenței (Bondeson și colab., 1984). Fluorescența calceinei este măsurată cu un Kontron SMF 25, fluorimetru spectral (excitație la 490 nm, emisie la 515 nm). în acest scop este diluat 100 μΙ - alicote din soluția de lipozomi de mai sus de 100 ori cu acetat de sodiu 0,1 M sau 10 mM HEPES/150 mM tampon de NaCI cu valoarea pH corespunzătoare (4,3,4,5, 5,0,6,0,7,3), pentru a obține un volum de 1 ml. La aceste soluții se adaugă 2,5pg de peptidă (forma protejată prin /-butii; 1 pg/μΙ soluție în HBS) în cuvete sub amestecare cu un curent blând de argon (concentrație finală 400 nM peptidă). Fluorescența calceinei este măsurată la diferite momente în timp după adaosul peptidei. Valorile pentru 100% Leakage sunt determinate prin ados de 2 μΙ Triton X-100 (Fluka).
Același mod de a proceda este folosit, pentru a măsura fluorescența calceinei după adaos de conjugate de peptidă-pL la soluția de lipozomi. Se adaugă 2,5 pg din conjugat (1 pg/μΙ, concentrație față de numai cantitatea de pL) la 1 ml soluție de lipozomi (concentrație finală 20 nM peptidă modificată). în mod analog este supus încercării de “leakage”
2,5 pg conjugat de peptidă-polilizină după incubare cu 5 pg ADN (15 min).
S-a găsit, că peptida cauzează numai în mediu acid punerea în libertate a conținutului de lipozomi (fig. 17). Conjugatul de peptidă este activ la valori pH, mult mai scăzute, găsindu-se o activitate puternică și la valoarea neutră a pH, care este intensificată și mai mult la scăderea valorii pH.
Complexarea conjugatului cu ADN a eliminat activitatea la valoarea neutră a pH, pe când la o valoare acidă a pH, este prezentă o activitate clară.
e) Transfecția celulelor K562
Celule K562 sunt cultivate în suspensie în RPMI mediul 1640 (Gibco BRL plus 2 g bicarbonat de sodiu/1) plus 10% FCS, 100 unități/ml penicilină, 100 pi/μΙ streptomicină și 2 mM glutamină până la o densitate de 500000 celule/ml. 12 până la 20 h înainte de transfecție celulele sunt introduse în mediu proaspăt, care a conținut 50/pM desferioxamină (această măsură s-a luat, pentru a se ajunge la o mărire a cifrei de receptor de transferină). în dimineața transfecției se culeg celulele, se suspendă în mediu proaspăt, conținând 10% FCS plus 50 μΜ desferioxamină (250000 celule/ml) și câte 2 ml se pun într-o capsulă cu 24 adâncituri.
Se amestecă 6 pg pCHVL-ADN în 160 μΙ HBS cu cantitățile indicate în fig. 18 de conjugat TfpL sau cu pL300 în 160 μΙ HBS, după 15 min se adaugă cantitățile indicate de conjugat de peptidă influența-pL (“P16pL), după alte 15 min se adaugă amestecul la celulele
K562. Celulele sunt incubate la 37°C, timp de 24 h și apoi, sunt recoltate pentru încercarea cu luciferază. Activitatea luciferazei se determină așa cum este indicat în exemplele anterioare. Valorile indicate în fig. 18 reprezintă activitate totală a luciferazei pentru celulele transiflcate.
2100
2105
2110
2115
2120
2125
2130
2135
2140
RO 117861 Β1
f) Transfecția celulelor HeLa
Celule HeLa sunt cultivate în capsule de cultură de 6 cm, așa cum s-a indicat la “Celule și medii”. Transfecțiile sunt realizate la o densitate de 300000 celule/placă. înainte de transfecție, celulele sunt incubate cu 1 ml mediu proaspăt, conținând 2% FCS.
Se amestecă 6 pCMVL-ADN în 160 μΙ HBS cu cantitățile indicate în fig. 19 de conjugat de TfpL sau cu pL300 sau cu un amestec din ambele în 160 μΙ. După 15 min se adaugă cantitățile indicate de conjugate de peptidă de influența-pL (“P16pL”) și după încă 15 min se adaugă amestecul la celule. Celulele sunt incubate, timp de 2 h, la 37°C, apoi se adaugă 2,5 ml mediu proaspăt cu un adaos de 10% FCS. Celulele sunt incubate la 37°C, timp de 24 h și apoi, sunt recoltate pentru activitatea luciferazei. Activitatea luciferazei este determinată așa cum s-a indicat în exemplele precedente. Valorile indicate în fig. 19 reprezintă activitatea totală a luciferazei a celulelor transificate.
Exemplul 14. Intensificarea unui transfer de gene cauzate de conjugate de transferină cu ajutorul unei alte peptide endosomolitice HA2-influenza-hemaglutinină
Peptidă cu secvența (SECV. ID NR:2) Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-lle-Ala-Gly-Phe-lle-GluAsn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-lle-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys cu notația P41) este sintetizată în mod analog ca cea din exemplul 13a). Cuplarea peptidei la polilizină (pL300) este realizată ca în exemplul 13 b1) prin legarea prin SPDP. în acest caz sunt obținute conjugate cu un raport molar peptidă: polilizină de 4:1.
b) Transfecția celulelor HeLa cu conjugate de peptidă de influență
Celule HeLa sunt, așa cum este indicat, cultivate în capsule de 6 cm, transfecțiile sunt realizate la o densitate de 300000 celule/capsulă. înainte de transfecție, celulele sunt incubate cu 1,5 ml mediu proaspăt, conținând 2% FCS. Se adaugă 6 pg pCMVL-ADN în 160 μΙ HBS (150 mM NaCI, 20 mM HEPES, pH=7,3) cu 6 pg din conjugatul TfpL19CB în 160 μΙ HBS, după 15 min se adaugă 10 pg conjugat de peptidă de influența-polilizină P41pL, sau, pentru comparație, 18 pg conjugat de peptidă de influența-polilizină P16pL (vezi exemplul 13) (fig.20); cantitățile indicate pentru ambele conjugate de peptidă sunt testate în așa fel, încât să reprezinte cantitățile optime pentru intensificarea transferului de gene. După alte 15 min, amestecul este adăugat la celule. După 24 h celulele sunt recoltate pentru restul de luciferază. Valorile arătate în fig.20a prezintă activitatea totală a luciferazei din celulele transificate.
Comparația conjugatelor de peptide arată o intensificare mai mare de 3,5 ori mai mare a transferului de gene prin conjugatul de peptidă P41pL.
q) Transfecția celulelor BNL CI.2 cu conjugate de peptide de influență
Celule BHL CI.2 sunt cultivate, așa cum este descris în exemplul 6. Peptidă de influență P41 este conjugată cu polilizină 300 la rapoarte molare peptidă: polilizină de 1:1, 3:1 și 8:1. Se adaugă celulelor complecși din 6 pg pCMVL-ADN și 20 pg din conjugate. Pentru comparație, se folosesc 20 pg pL300 sau 20 pg conjugate P16-polilizină obținute ca în exemplul 13. Celulele sunt incubate la 37°C, 4 h, apoi se adaugă 2 ml mediu, conținând 18% FCS. După 24 h celulele sunt recoltate pentru testul cu luciferază, a cărui rezultate sunt reprezentate în fig. 20B. în Leakage Assay pentru lipozomi (fig.20C) care este realizat ca în exemplu, activitatea conjugatelor a crescut (corespunzând la 2,5 pg polilizină, valoarea pH=5) cu conținutul lor în peptidă (în fig.P41 este notat cu “influ2).
Exemplul 15. Transfecția de celule HeLa cu un construct de genă reporter de betagalactozidază și dovedirea in situ a expresiei beta-galactozidazei
a) Cultivarea și transfecția celulelor
Pentru transfecție, se cultivă celule HeLa în mediu DMEM, conținând 5% FCS, penicilină, streptomicină și glutamină, așa cum este indicat în exemplele precedente, în capsule de cultură de 3 cm pe lamele (3 x 104 celule/capsulă).
RO 117861 Β1
Pentru transfecție este complexat 6 pg de construct de gene reporter (pCMV-betagal) în 160 p\ HBS cu 12 pg TfpL190B în 160 p\ HBS și este incubat 30 min, la temperatura mediului înconjurător.
într-o altă experimentare este incubat 6 pg pCMV-beta-gal în 160 p\ HBS cu 6 pg TfpL190B în 80 p\ HBS, 15 min, la temperatura mediului înconjurător. Apoi, se adaugă 12 pg de conjugat de peptidă de influența obținută în exemplul 13 (P16pL) în 80 p\ HBS și amestecul s-a incubat alte 15 min. Acești complecși ADN-policație sunt apoi amestecați cu 1 ml DMEM plus 2% FCS, antibiotice și glutamină, așa cum s-a indicat mai sus. Pentru a arăta efectul ciorchinei și adenovirusului asupra capacității de transfecție, se mai adaugă în alte experimentări ciorchină la o concentrație finală de 100 pM sau 50 p\ a soluției de bază de adenovirus d13120 în plus la mediul, care conține complecșii de ADN-policație.
Pentru transfecții este îndepărtat de pe celule mediul de cultură inițial și este adăugat 1 ml mediu, conținând complecși de ADN cu sau fără ciorchină sau virus. După un timp de incubare de două ore, la 37°C se adaugă celulelor 1 ml DMEM, conținând 10% FCS, antibiotice și glutamină, și este continuată incubarea, încă două ore. Apoi, este îndepărtat mediul în totalitate și celulele se cultivă pe 3 ml DMEM proaspăt, plus 10% FCS, antibiotice și glutamină.
b) încercarea cu beta-galactozidază h după transfecție mediul este îndepărtat, celulele se spală cu soluție de sare de bucătărie (PBS) tamponată cu fosfat și se fixează cu 0,5% glutardialdehidă în PBS 5 min, la temperatura mediului înconjurător. Apoi, agentul de fixare este îndepărtat și celulele se spală odată cu PBS. Apoi, este incubat cu soluția de colorare (10 nM tampon de fosfat pH 7,0,150 mM NaCI, 1mM MgCI2,3,3 mM ^FeiCN^HjO, 3,3 mM KjFe(CN^ și 0,2% 5-brom4-clor-3-indolil-beta-galactopiranozidă), la 37°C, 20 min până la 3 h (Lim și Chae, 1989). Apoi, lamelele sunt clătite cu PBS, apă și 96% etanol, se usucă și se acoperă în Mowiol pe platani. Pentru analiză este folosit un microscop Axiophot Zeiss.
Fig. 21 arată imagini ale măririlor microscopice (112 x). A: celule HeLa, transificate cu 6 pg pCMV-beta-gal, complexate cu 12 pg TfpL190B. Reacția de colorare pentru betagalactozidază este realizată, timp de 3 h. Figura arată că foarte puține celule (55 celule; grupa de celule colorate este indicată cu o săgeată), exprimă gena de beta-galactozidază. B: celule HeLa, transificate cu 6 pg pCMV-beta-galaxidază, complexată cu 6 pg TfpL190B și 12 pg P16pL. Reacția de colorare: 3 h. Puține celule (250 celule) exprimă gena de betagalactozidază. Reacția celulelor este totuși mai puternică decât în A. O: celule HeLa, transificate cu 6 pg pCMV-beta-galactozidază, complexată cu 6 pg TfpL190B și 12 pg P16pL în prezență de 100 μΜ de ciorchină. Reacția de colorare: 3 h. Multe grupe de celule arată o reacție puternic pozitivă (peste 1000 celule). D: celule HeLa, transificate cu 6 pg pCMV-betagal, complexate cu 12 pg TfpL190B în prezență de Adenovirus d1312. Reacția de colorare: 20 min. Aproape toate celulele (peste 90%) arată o reacție pozitivă E: celule HeLa netransificate (control pentru specificitatea reacției beta-galactozidazei). Reacția de colorare: 3 h.
Exemplul 16. Transfecție de celule HeLa cu un cosmid 48 kb în prezență de Adenovirus liber
a) Obținerea unui cosmid, conținând secvența care codifică pentru luciferază
Un fragment Sall 3,0 kb, conținând o singură secvență care codifică luciferaza în
F.pyralis. Luciferază sub controlul promotorului RSV, este legată de plasmida p22HSVLucalfa și în singura poziție Sall a clonei cosmidei Cl-7al, pentru a forma concatamere. (Cl-7al conține un fragment Sau3A 37 kb uman genomic ADN (digerare parțială), codificând pentru nici o genă vădită, donată în poziția BamHI a vectorului cosmidei pW15 (Stratagenă)). Produsul de reacție al țigării este apoi ambalat in vitro și o parte de alicotă a particulei de genă este infectată în E.coli MN544 și este placată pe plăci. Recombinanții sunt screenați cu
2195
2200
2205
2210
2215
2220
2225
2230
2235
2240
RO 117861 Β1 ajutorul hibridizării în colonii cu utilizarea fragmentului 3,0 kb Sall (marcat 32-P prin priming randomizat) și o parte din pozitivi sunt analizate prin cartare de restricție. Un construct de cosmid (CosLuc), conținând o singură copie de insert Sall, este cultivată și purificată pe un gradient de cesiu (mărimea totală: 48 kb).
Se obține un mic cosmid de control pWELuc /12 kb) prin digerare de CosLuc cu Not I, religare, transformare de bacterii și izolarea plasmidei corecte. Aceasta duce la obținerea unei molecule ADN de 12 kb căreia îi lipsea o parte din insertul ADN uman și o parte din polylinkerul lui CosLuc. Plasmida pSPNeoLuc (8kb) este plasmida descrisă în exemplul 5, care este un fragment de genă de luciferază RSV un fragment Apa1/pvul de pRSVL, donat în locul Clal al locusului pUC μ).
b) Transportul cosmidei în celulele HeLa
Celule HeLa (3 x 104 celule per capsulă de 6 cm) acoperite cu 1 ml DMEM + 2% FCS sunt incubate cu TfpL/complecși ADN, obținuți ca în introducerea din exemple, conținând cantitățile indicate de hTfpL, polilizină liberă și ADN. în plus, amestecurile de incubare au conținut fie 100 μΜ ciorchină (coloanele 1 și 2), fie 10 μΙ adenovirus d 1313, conținând 5 x 1011 particule per ml (coloanele 3-12). După o incubare de două ore, la 37°C se adaugă în fiecare capsulă 4 ml DMEM + 10% FCS. 24 h mai târziu se recoltează celulele și este măsurată activitatea luciferazei. Rezultatele sunt arătate în fig.22A.
c) Transportul cosmidei în celule de neuroblastom
Celule dintr-o linie de celule de neuroblastom cu notația GI-ME-N (Donti și colab., 1998) 1 x 10® celule per capsulă de 6 cm) acoperite cu 1 ml DMEM + 2% FCS sunt incubate cu complecși TfpL/ADN, obținuți așa cum este descris, conținând cantitățile indicate de hTfpL, polilizină și ADN. în plus, este introdus în amestecurile de incubare, fie 100 μΜ ciorchină (coloanele 3 și 4) fie 10 μΙ adenovirus d1312 conținând 5 x 1011 particule per ml (coloanele 5 și 6). După o incubare de două ore,la 37°C se adaugă în fiecare celulă 4 ml DMEM + 10% FCS. 24 h mai târziu celulele sunt recoltate și este măsurată activitatea luciferazei. Rezultatele sunt arătate în fig.22B.
Exemplul 17. Transfer de gene cu ajutorul conjugatelor cuplate de adenoviruspolilizină
a) Obținerea de conjugate de adenovirus-polilizină cu ajutroul cuplării chimice
2,35 ml dintr-o soluție filtrată pe gel (Sephadex G-25 PD10, Pharmacia) de adenovirus d1312 (cca 1011 particule) în 150 mM NaCI/25 mM HEPES, pH 7,9/10% glicerină este tratat cu 10 μΙ (10 nmol) dintr-o soluție 1 mM de SPDP (Pharmacia). După 3,5,h la temperatura mediului înconjurător, virusul modificat este separat prin filtrare pe gel (ca mai sus) de reactivul de exces. Soluția (2,5 ml) este spălată cu argon și sub excludere de oxigen și cu argon este lăsată să reacționeze cu 42 μΙ dintr-o soluție de polilizină (1 nmol) marcată FITC, modificată cu 2,3 nmol grupe de mercaptopropionat (obținută ca în EP 388758). După 18 h, la temperatura mediului înconjurător este trecută jumătate din soluție într-un tub capilar de centrifugă, este pus cu grijă sub un strat de 1 ml de clorură de cesiu (densitate 1,33 g/ml și este centrifugat două ore, la 35000 rot/min (SW60 Rotor), la temperatura mediului înconjurător. Banda de virus este colectată sub forma unei fracțiuni de 200 μΙ de clorură de cesiu și diluată cu MBS/50% glicerină la 1 ml.
O încercare de legătură cu ADN este realizată cu 200 μΙ de virus modificat; soluția de virus este diluată cu 1 ml HBS și tratată cu 100 μΙ de soluție dintr-un ADN marcat cu 35S (15 ng pRSVL, obținut prin translație Nick). Pentru control experiența este efectuată cu aceeași cantitate de virus nemodificat d1312 în paralel. După 30 min, probele sunt trecute în capilare de centrifugă, sunt puse cu grijă sub 1 ml dintr-o soluție de clorură de cesiu (densitate 1,33 g/ml) și sunt centrifugate două ore,la 35000 rot/min (rotor SW), la temperatura mediului ambiant. Gradientul este repartizat în câte 5 fracțiuni; fracțiunea 1,1 ml; fracțiunea
RO 117861 Β1
2, 0,6 ml; fracțiunea 3-5, câte 200 μ\. Este determinată radioactivitatea pentru câte 200 μ\ din fracțiuni și este redat în fig.23. în acest caz se găsește în fracțiunile cu conținut de virus (3-5) în principiul în fracțiunea 3,0 radioactivitate evident mai ridicată decât în experiența de control; acest lucru se explică prin asocierea specifică a adenovirusului modificat cu polilizină cu ADN marcat.
b) Transfecția de celule K562
Celule K562 (ATCC CCL 243) sunt cultivate în suspensie în mediu RPM11640 (Gibco BRL plus 2 g bicarbonat de sodiu) plus 10% FCS, 100 unități/ml penicilină, 100 μΙ/μΙ streptomicină și 2 mM glutamină până la o densitate de 500000 celule/ml. 12 până la 20 h înainte de transfecție celulele sunt puse în mediu proaspăt, care a conținut 50 μΜ desferioxamină (această măsură este luată pentru a ajunge la o mărire a cifrei receptorului de transferină). în dimineața transfecției celulele sunt colectate, suspendate în mediu proaspăt, conținând 10% FCS plus 50 μΜ desferioxamină, (250000 celule/ml) și introduse câte 2 ml într-o capsulă cu 24 de cavități. Cantitățile date în pCMVL-ADN (6, 0,6, 0,06 μς) în 100 μΙ HBS sunt amestecate cu 50 μΙ polilizină-adenovirus (pLAdeno) respectiv cu cantități corespunzătoare /35 μΙ) de adenovirus de control d1312. După 20 min sunt adăugate cantitățile corespunzătoare (12,1,2,0,12 μ$) de conjugat de TfpL190B în 150 μΙ HBS. După alte 20 minse adaugă amestecul la celulele K562. Celulele sunt incubate la 37°C, timp de 24 h și apoi, sunt recoltate pentru încercarea cu luciferază. Activitatea luciferazei este determinată așa cum este indicat în exemplele anterioare. Valorile indicate în fig.24 reprezintă activitatea totală a luciferazei a celulelor transificate.
c) Transfecția celulelor HeLa
O metodă de verificare a activității unui conjugat polilizină-virus este verificarea conjugatului asupra capacității sale, de a transporta cantități foarte mici de ADB (mai puțin decât μg). S-a așteptat o capacitate ridicată de transfer a ADN, când adenovirus este legat direct la ADN condensat pe polilizină, deoarece factorii de internalizare (transferină și fibre de proteină-adenovirus) sunt asociați direct cu ADN de transportat. Pentru a verifica justețea acestei presupuneri, este complexată o cantitate constantă din conjugatul de polilizinăadenovirus (2,5 μΙ, cca 5 x 107 particule de virus) cu cantități diferite (3 pq până la 0,0003 μς) de plasmidă reporter în 475 μΙ HBS. După 15 min de incubare, la temperatura mediului înconjurător, se adaugă fiecărei probe o cantitate corespunzătoare masei de ADN de transferină-polilizină (această cantitate de TfpL este aleasă pentru că realizează o electroneutralitate “packing” completă de 50% a plasmidei-ADN și în același timp realizează un spațiu liber de legătură pentru conjugatul de virus-polilizină. După un adaos de TfpL, amestecurile sunt incubate, timp de 15 min, apoi, fiecare amestec este introdus într-o capsulă de cultură, conținând 300000 celule HeLa în 1 ml DMEM/2% FCS. Apoi, celulele sunt incubate 1,5 h, la 37°C, apoi, se adaugă 4 ml DMEM/10% FCS. Paralel cu aceasta cantități echivalente de ADN sunt complexate cu un exces dublu în masă de TfpL (cantitatea pentru condensarea completă a ADN) și sunt utilizate pentru transferul de gene în celule HeLa (odată singure, odată în prezența de 25 μΙ din preparatul de adenovirus d1312 necuplat cu polilizină). După 24 h celulele sunt recoltate, se prepară extracte și se examinează cote de alicote asupra activității luciferazei. Rezultatul acestor încercări este reprezentat în fig.25. Lipsa de adenovirus nu se poate dovedi nici o activitate de luciferază la o cantitate de ADN sub 0,3 μg. Atât adenovirus cuplat cu polilizină, cât și adenovirus necuplat cum au funcționat bine la cantități mari de ADN (3 μρ și 0,3 μρ). La un adenovirus necuplat este observată totuși o scădere de aproape de 100 ori a activității la 0,03 μρ și o activitate neglijabilă sub această cantitate de ADN. în opoziție cu aceasta, virusul cuplat cu polilizină reține capacitatea sa de transfer de gene,atât la 0,003, cât șl la 0,0003 μ ADN. Această cantitate de ADN corespunde la circa 100 molecule de ADN/celulă șl circa 1 particulă de virus/moleculă ADN.
2295
2300
2305
2310
2315
2320
2325
2330
2335
2340
RO 117861 Β1
Exemplul 18. Transfer de gene cu ajutorul adenovirusurilor cuplați enzimatic de polilizină
a) Reacția enzimei ml de preparat de adenovirus (tulpina d1312; 5x1010 PFG/ml) este încărcat pe o coloană de filtrare pe gel Sephadex G-25 (Pharmacia) care este echilibrată cu 25 ml tampon de reacție (0,1 M Tris-HCI; pH=8,0, 2 mM DTT, 30% glicerină). Eluția are loc cu 3,6 ml tampon de reacție. Șarja pentru reacție pentru cuplarea enzimatică constă din 1150 μΙ din fracțiunea de eluție a virusului, 0,5 nmol transglutacinază de ficat de cobai (TG) (Sigma), 2 nmol, respectiv, 20 nmol polilizină 290,10 mM CaCI2 și tampon de reacție într-un volum final de 1500 p\. Reacția este realizată la 37°C, timp de o oră și după aceea, prin adaos de 30 p\ 0,5 M EDTA oprită. Pentru controlul specificității cuplării sunt realizate și șarje de reacție fără transglutaminazâ. Polilizină neîncorporată este separată de viruși prin centrifugare printr-un gradient de CaCI2 (densitatea 1,33 g/ml; 170000 x g, două ore). Fracțiunea, care,conține virusurile este scoasă, și tratată cu același volum de glicerină și congelată în azot lichid și păstrată la -70°C.
b) Demonstrarea legării de polilizină la adenoviruși
Reacția este realizată cu polilizină, care este marcată cu 125j cu ajutorul reactivului Bolton-Hunter (Amersham), așa cum s-a descris mai sus. După centrifugarea cu gradienți de CsCI este scoasă fracțiunea de virus și se separă printr-un alt gradient de OSCI. Apoi, gradientul este fracționat și radioactivitatea este determinată în toate fracțiunile cu un contor de scintilații. Așa cum se arată în fig.26, s-a dovedit în acest caz că la șarja de reacție cu TG (d1312/TG-pL) în fracțiunea de virus (virus) este îmbogățită polilizină radioactivă. în șarja de control fără TG (d1312/pL) nu s-a găsit nici o îmbogățire de polilizină radioactivă în fracțiunea de virus.
c) Testarea fracțiunilor de adenovirus modificate cu polilizină cu privire la efectul lor asupra eficienței transfecției
i) Celule și medii
Pentru transfecție sunt semănat 5x10® celule (hepatocite de șoarece; ATCC nr.; TIB 73) în DMEM cu 10% serfetal de vițel inactivat la cald (FCS), 2 mM glutamină, 100 I.E./ml penicilină și 100 Mg/ml streptomicină în capsule de cultură, de 6 cm.
ii) Formarea de complecși de virus-ADN-transferină μΙ din fracțiunea de virus modificată cu polilizină se amestecată cu 6 pg de plasmidă ADN pCMVL în 10 μ HBS și este incubată la temperatura mediului înconjurător. Apoi, este adăugată amestecului 8 pg transferină de șoarece-polilizină 290B (mTfpL) și este incubată încă 10 min.
iii) Transfecția hepatocitelor de șoarece
Complecșii de virus-ADN-transferină sunt amestecați cu 1,5 ml mediu (DMEM cu 2% FCS, 2 nM glutamină și antibiotice) și sunt adăugați la celule, după ce mediul vechi este îndepărtat. După o incubare de două ore, la 37°C se adaugă celulelor 2 ml de DMEM cu 10% FCS, glutamină și antibiotice. După o altă fază de cultivare de două ore este îndepărtat întregul mediu și este adăugat celulelor 4 ml de DMEM proaspăt cu 10% FCS, glutamină și antibiotice.
iv) Determinarea expresiei luciferazei h după transfecție, celulele sunt recoltate și este realizată încercarea pentru luciferază, așa cum s-a descris mai sus.
Așa cum se poate vedea din fig.27, preparatul de virus, la care adenovirusurile sunt tratate cu TG și 20 nmol polilizină, (d1312/TG-20 nmol pL) dau expresia cea mai puternică (153540000 unități de lumină). Preparatul de virus cu TG și 2 nm polilizină (d1312/TG-2nmol pL) este ceva mai puțin activ (57880000 unități de lumină). Fracțiunea de control la care
R0117861 Β1 adenovirusurile sunt tratate cu 20 nmol polilizină, dar fără TG, sunt aproape cu de 500 ori mai puțin activă. Pentru comparare sunt tratate mai departe pentru transfecție complecși, cu preparate inițiale de adenovirusuri, care nu sunt tratați nici cu TG, nici cu polilizină (d1312). Acest preparat a dat 4403000 unități luminoase.
d) Mărirea eficienței transfecției prin adenovirusuri modificate cu polilizină în comparație cu adenovirusuri nemodificați, mai ales la cantități reduse de ADN
Transfecția este realizată așa cum este descris în exemplul 30), pentru formarea de complex este utilizat 50 μ\ de fracțiunea de adenovirus d1312/TG-20nmol pL și 6 gg pCMVL/8 pg mTfpL, 0,6 pg pCMV-Luc/0,8 pg mTfpL sau 0,06 pg pCM VL/0,08 pg mTfpL. Pentru comparare s-au mai realizată și transfecții cu 6 pg, 0,6 pg, 0,06 pg pCMVL complecși de mTIpL și adenovirusuri nemodificați (d1312). S-a dovedit că complecșii cu adenovirusuri modificați cu polilizină au dat și la cantități reduse de ADN încă valori ridicate de expresie, pe când la adenovirusurii nemodificați expresia este puternic micșorată (fig.28).
Exemplul 19. Transfer de gene cu conjugate, în care legătură dintre adenovirus și polilizină are loc printr-o punte de biotină-streptavidină
A) Biotiniliare de adenovirus d1312
2,4 ml dintr-o soluție filtrată prin gel (Sephadex G-25 FD10, Pharmacia) de adenovirus d1312 (circa 1011 particule) în 150 mM NaCI/5 mM HEPES, pH=7,9/10% glicerină este tratată cu 10 p\ (10 nmol) dintr-o soluție 1 mM de NHS-LC-biotină (P*erce 21335). După 3 h, la temperatura mediului ambiant virusul modificat cu biotină este separat prin filtrare pe gel (ca mai sus) de reactivul în exces. Soluția este adusă prin adaos de glicerină la o concentrație de glicerină de 40% (volum total 3,2 ml) și este depozitată la - 25°C. Biotinilarea virusului poate să fie detectată prin dovedire calitativă după picurarea de diferite diluții pe membrana cu nitrat de celuloză: după uscare la 80°C/2 creând dulapul de uscare sub vid, blocarea cu BSA, incubarea cu fosfatază alcalină conjugată cu streptavidină (BRL), spălare și incubare, timp de o oră, cu soluția de developare NBT/ X-foșfat (sare de nitroalbastrutetrazoliu/5-brom-4-clor-3-indolilfosfasare de toluidină; Boehringer Mannheim) s-a găsit o reacție de colorare pozitivă.
b) Obținerea de conjugare de streptavidin-polilizină
Cuplarea de streptavidină cu polilizină este realizată conform metodei lui Wagner și colab., 1990, și descrisă în EP-A1 388758.
nmol (4,7 mg) streptavidină în 1 ml 200 mM HEPES, pH=7,9 și 300 mM NaCI sunt tratate cu o soluție etanolică 15 mM de SPDP /236 nmol). După 1,5 h, la temperatura mediului înconjurător proteina modificată este filtrată pe gel printr-o coloană Sephadex G-25, obținându-se 75 nmol streptavidină, modificată cu 196 nmol ditiopiridin linker (substanță de fixare pe bază de ditiopiridină). Proteina modificată este lăsată să reacționeze cu polilizină modificată cu 3-mercaptopropionat (75 nmol, lungimea medie a lanțului 290 monomeri de lizină modificată cu 190 nmol linker de mercaptopropionat) în 2,6 ml 100 mM HEPES, pH=7,9,150 mM NaCI sub atmosferă de argon. Conjugatele sunt izolate cu ajutorul cromatografiei de schimb de cationi pe o coloană Mono S HRS (Pharmacia). (Gradient: 20 -100% tampon. Tampon A: 50 mM HEPES pH=7,9; tampon B: tampon A plus 3M clorură de sodiu. Fracțiunea de produs a eluat la o soluție de sare, între 1,2 M și 1,7 M. Dializă față de HBS (20 mM HEPES pH=7,3, 150 mM NaCI) a dat un conjugat, constând din 45 nmol streptavidină și 53 nmol polilizină.
c) Transfecția de celule HeLa
Celule HeLa sunt cultivate în capsule de cultură de 6 cm, așa cum s-a descris în exemplul 1. Transfecțiile sunt realizate la o densitate de 300000 celule/placă. înainte de transfecție celulele sunt incubate cu 1 ml de mediu proaspăt, conținând 2% FCS.
2390
2395
2400
2405
2410
2415
2420
2425
2430
2435
RO 117861 Β1 pg pCEVL-ADN în 100 pl HBS sunt amestecate cu 0,8 pg streptavidină-polilizină în 170 pl HBS. După 20 min se adaugă 3 pl polilizină pL300 în 170 pl HBS. După încă 20 min se adaugă 65 pl adenovirus biotinilirat sau drept control cantități corespunzătoare de adenovirus d1312 (30 pl, virus inițial pentru modificare). Amestecul de complecți (“biotină AdV/complex A” resp. “Control ADV”, vezi fig.29) sunt lăsate să stea încă 20 min.
O formare alternativă de complecși este realizată, prin aceea că mai întâi se amestecă 65 pl adenovirus biotinilirat cu 0,8 pg streptavidină-polilizină în 50 pl HBS, după 20 min se adaugă 6 pg pCMVL-ADN în 170 pl HBS, și după alte 20 min se adaugă prin amestecare 3 pl polilizină pL300 în 200 pl HBS. (Amestec de complecși “biotin ADV/complex B”).
0,6 pg pCMVL-ADN în 67 pl HBS sunt amestecate cu 0,3 pg streptavidin-polilizină în 33 pl HBS. După 20 min se adaugă 65 pl adenovirus biotinilirat sau drept control cantități corespunzătoare de adenovirus d1312 (30 μΙ, virus inițial pentru modificare). Amestecul de complecși (“biotinAdV/complex A” respectiv “control Adv”, vezi fig.29) se lasă să stea încă 20 min și apoi sunt diluați cu HBS la 500 pl. Formarea alternativă de complex este realizată amestecând 65 pl adenovirus biotinilizat mai întâi cu 0,3 pg streptavidin-polilizină în 50 pl HBS, după 20 min adăugând 0,6 pg pCMVL-ADN în 50 pl HBS- Amestecul de complecși (“biotinAdV/complex B) este lăsată să stea alte 20 min și apoi, este diluat cu HBS la 500 pl.
Amestecurile sunt adăugate la celule. Celulele sunt incubate, timp de doză ore, la 27’C, apoi se adaugă 2,5 ml mediu proaspăt cu adaos de 10% FCS. Celulele sunt incubate, timp de 24 h, la 37°C și apoi, sunt recoltate pentru încercarea cu luciferază. Activitatea luciferazei se determină, așa cum se indică în exemplele anterioare. Valorile indicate în fig.29 reprezintă activitatea totală a luciferazei pentru celulele transificate.
Paralel cu aceasta se realizează transfecții de celule HeLa, folosind drept componentă de virus a conjugatului un virus biotinilirat care este inactivat printr-un tratament UV/psoral. Inactivarea este efectuată după cum urmează: Câte 200 pl preparat de virus biotinilirat se introduce în cavitățile unei plăci de cultură din țesătură de 1,6 cm. La fiecare probă se introduce 2 pl (33 mg/ml) 8-metoxipsoralen (în DMSO), capsula se pune pe gheață) și este iradiată 10 min cu o lampă UV (365 nm; UVP TL-33), distanța probei de filtru fiind de 4 cm. După iradiere cele două probe se unifică și se filtrează pe gel (G50, coloană Nick, Pharmacia), coloana fiind echilibrată în prealabil cu 40% glicerină în HBS. Cote de alicote de câte 75 pl este complexată cu 0,8 pg streptavidină-polilizină și este utilizată pentru transfecția celulelor HeLa, așa cum este descris mai sus.
Cu ajutorul încercării punctului citopatic final s-a constatat, că titrul virusului a scăzut cu ajutorul inactivării cu un factor de peste 104, pe când capacitatea de transfer a scăzut la capacități ridicate cu mai puțin de 50% și la concentrații scăzute cu un factor 5.
d) Transfecția de celule K562
Celule K562 sunt cultivate în suspensie în mediu RPM11640 (Gibco BRL, plus 2 g bicarbonat de sodiu per litru) + 10% FCS, 100 unități/ml penicilină, 100 ^g/ml streptomicină și 2 mM glutamină până la o densitate de celule de 500000 celule/ml. 16 h înainte de transfecție celulele sunt introduse în mediu proaspăt, conținând 50 μΜ deferioxamină (Sigma). Dimineața după transfecție celulele sunt preluate a câte 250000 celule/ml în mediu proaspăt, conținând 10% FCS + 50 μΜ deferioxamină și se introduc câte 2 ml per cavitate într-o placă cu 24 cavități.
Se obține trei feluri diferite de complecși ADN:
a) O soluție de 6 pg de pCMVL-ADN în 160 μ| HBS (150 mM NaCI, 20 mM HEPES pH=7,3) este amestecat cu 12 pg de conjugat TfpL190B în 160 pl HBS, după 30 min este adăugat 20 pl preparat de adenovirus d1212 și amestecul este adăugat la celule.
RO 117861 Β1
b) O soluție de 800 ng streptavidină-polilizină în 160 μΙ HBS este amestecat cu 20 μΙ adenovirus biotinilirat, obținut ca la a), după 30 min se adaugă o soluție de 6 μο pCMVLADN în 160 μΙ HBS și după alte 30 min,soluția este amestecată cu 10 μg din conjugatul TfpL190B în 160 μΙ HBS. După 30 min amestecul se adaugă la celule.
c) Complecșii ADN sunt obținuți ca în b), cu deosebirea, că în loc de TfpL190B se adaugă o soluție de 3,5 μg poli(L) Uzină p(Lys)190. Celulele sunt incubate 24 h, la 37μΟ și apoi recoltate pentru încercarea cu luciferază. Valorile reprezentate în fig.30 reprezintă activitatea totală a luciferazei pentru celulele transificate.
Exemplul 20. Transfer de gene în celule primare de măduvă osoasă
a) Izolarea de celule de măduvă osoasă
Celule primare de măduvă osoasă sunt recoltate de la șoareci, mediul de cultură (IMDM, conținând 10% FCS, 5 x 105M, beta-mercaptoetanol, 1% mediu condiționat cu IL-3 și antibiotice) fiind spălat cu un ac de injecție (0,4 mm sau 0,5 mm diametru) legat cu o fiolă de 1 ml, prin oasele coapsei și fluerului piciorului. Celulele sunt apoi 1 X spălate în mediu de cultură prin centrifugare la 100 x g 8 min. Apoi, celulele sunt resuspendate la o concentrație de 107 celule/ml și recoltate în sticle de cultură T25. După 4 h celulele neaderente sunt trecuteîntr-o nouă sticlă de cultură T25 și cultivate peste noapte în prezența a 50 μΜ deferioxamină.
b) Formarea de complecși de adenovirus-transferină-polilizină/ADN
Pentru formarea de complecși sunt incubate 50 μΙ adenovirus biotinilirat cu 400 ng polilizină modificată cu streptavidină în 20 μΙ HBS, timp de 20 min. Apoi, se adaugă 20 μΙ HBS conținând 6 μ9 pCMVL. După un timp de incubare de 20 min se adaugă 7 μ9 conjugat de transferină de șoarece-polilizină (mTfpL) în 160 μΙ HBS și tot amestecul este incubat, încă 20 min.
c) Transfecția
Pentru transfecție, celulele de măduvă osoasă sunt obținute din mediul de cultură prin centrifugare, timp de 8 min,la 100 x g. Precipitatul de celule este cultivat în 3 ml mediu de cultură, conținând 2% FCS și 250 μΙ din complecșii de adenovirus-transferină-polilizină/ADN, în care este preluat introducându-se într-o nouă sticlă T25, cultivarea având loc, timp de 3 h, la 37°C. Apoi se adaugă 3 ml de mediu de cultură și după două ore alți 6 ml mediu de cultură, conținând 10% FCS.
d) Determinarea expresiei luciferazei h după transfecție celulele sunt recoltate și este cercetat ca în celelalte exemple asupra expresiei luciferazei. Transfecția duce la o activitate a luciferazei corespunzând la 310 x 103 unități de lumină/100 Mg proteină celulară totală.
Exemplul 21. Transfecția de celule de neuroblastom cu o cosmidă de 48 kb în prezență de adenovirus liber și de conjugate de adenovirus-polilizină
Celulele din linia de celule cu notația GI-NE-N sunt transificate, așa cum s-a descris în exemplul 16, cu cosmida 48 kb cu cantitățile indicate de hTfpL, polilizină liberă și ADN. în plus amestecurile de incubare au conținut fie 100 μΜ ciorchină (coloanele 3 și 4) fie 10 μΙ adenovirus d1312, conținând 5 x 1011 particule per ml (coloanele 5 și 6). Ultimile două probe (coloanele 7 și 8, StpL) au conținut 15 μΙ adenovirus biotinilirat d1312 (1 x 1011 particule), incubate cu streptavidină-polilizină (0,8 μg, obținute ca în exemplul 19) în 150 μΙ HBS. Apoi, este adaugat probei 6 μς ADN în 150 μΙ HBS, se lasă să stea 30 min,la temperatura mediului înconjurător, după care este adăugat 150 μΙ HBS, conținând 6 μg hTfpL + 1 μg pL liber. După alte 30 min de incubare la temperatura mediului înconjurător, amestecul este adaugat la celule. După o incubare de două ore, la 37°C se adaugă în fiecare capsulă 4 ml DMEM + 10% FCS. 24 ore mai târziu celulele sunt recoltate și este măsurată activitatea luciferazei. Rezultatele sunt arătate în fig.31.
2490
2495
2500
2505
2510
2515
2520
2525
2530
RO 117861 Β1
Exemplul 22. Transfer de gene în celule epiteliale primare ale căilor respiratorii încercări preliminarii cu privire la corecția genetică a fibrozei cistice au arătat că liniile de celule imortalizate, derivate din epiteliul căilor respiratorii sunt accesibile metodei de transfer a invenției. Pentru a exclude posibilitatea că acest fenomen se explică prin modificările epiteliului căilor respiratorii, care sunt induse prin imortalizare, încercările sunt realizate cu conjugate de transferină-polilizină și în celulele epiteliului căilor respiratorii (ΓΑΕ).
Celulele ΓΑΕ sunt obținute din probe de polipi nazali de la pacienți, așa cum s-a descris de Yankaskas și colab., 1987. Țesuturile nu sunt spălate în soluție sterilă de sare de bucătărie, apoi transportate la 4°C în laborator, înainte de transportul în laborator sunt introduse în Joklil’S Einimum Resential Medium (MEM).plus antibiotice (penicilină 50 E/ml, streptomicină 50 /xg/ml, gentamicină 40 Mg/ml). Se separă cartilagiile și țesutul submucos în exces și straturile epiteliale sunt incubate în soluție de protează (Sigma, tip 14, 0,1 mg/dl) în MEM, la 4°C, timp de 16 până la 48 h. Se adaugă 10% FBS (ser de vită fetală) pentru neutralizarea proteazei și celulele se desprind prin mișcare ușoară. Suspensia obținută este filtrată printr-o rețea de Nylon de 10 Mm, pentru îndepărtarea resturilor de celule, este centrifugată (150 x g 5 min) și se spală în F12 + 10% FBS.
Celulele sunt apoi tratate cu conjugate de transferină-polilizină (hTfpL) și cu o plasmidă care codifică pentru luciferază (pRSVL) ca genă reporter. La această cercetare celulele primare nu au arătat o receptivitate pentru acești complecși ca liniile de celule imortalizate corespunzătoare (stratul de bază = 429 unități de lumină; cu adaos de conjugate: 543 unități de lumină) ceea ce a arătat, că celulele ΓΑΕ sunt relativ sărace în receptori de transferină.
Pentru a folosi un receptor alternativ pe celule, se utilizează adenovlrușuri biotinilirați (a se compara exemplul 19). Celulele tratate cu acest conjugat au arătat o expresie semnificativ mai puternică, decât valorile de bază (adaos de conjugate 2585753 ± 453585 unități de lumină). în afară de aceasta și celule epiteliale primare de la alte specii s-au dovedit a fi accesibile pentru această metodă de transfer de gene (șoarece = 3230244 ± 343153; maimuță = 53498880 ± 869481 unități de lunmină).
Exemplul 23. Transfer de gene în hepatocite și în celule ale sângelui în aceste experiențe ale acestui exemplu se folosesc următoarele materiale și metode:
Transfecția de celule de cultură din țesuturi: se cultivă celule din linia de celule BNL CL.2, așa cum s-a descris în exemplul 6. Celule HeLa și hepatocite sunt cultivate în capsule Petri de 6 cm. Transfecția este realizată la o densitate de celule de circa 3 x 10® celule per capsulă. înainte de transfecție mediul de cultură standard este înlocuit cu 1 ml mediu proaspăt cu 2% FCS.
Formarea de complexe binare: adenovirusuri biotinilați (circa 109 PFUS, vezi exemplul 19 a) și 19 b)) sunt lăsați să reacționeze cu 800 ng polilizină streptavidinilizate în 50 mI HBS. După 30 min, la temperatura mediului ambiant se adaugă 6 m9 pCMVL-ADN în 170 mI HBS, este incubat 30 min și apoi se adaugă 3 Mg pL300 în 200 μ\ HBS și după alte 30 min soluția este utilizată pentru încercări de transfecție.
Formarea de complecși ternari: adenovirusuri biotinilirați (circa 109 PFUs)) sunt lăsați să reacționeze cu 800 ng polilizină streptavidinilirată în 50 μΙ HBB. După 30 min, la temperatura mediului înconjurător se adaugă 6 Mg pCMVL-ADN în 170 μΙ HBS, este incubat 30 min și apoi, se adaugă 10 Mg TfpL190E în 200 μ\ HBS și după alte 30 min soluția este utilizată pentru încercări de transfecție.
încercarea cu beta-galactozidază: Celule BNL CL.2 sunt semănate pe lamele și timp de 24 h, celulele sunt transificate cu plasmida reporter pCMV-beta gal (Lim și Chae, 1989).
h mai târziu este realizat testul de beta-galaxidază așa cum este indicat în exemplul 15.
RO 117861 Β1
2585
a) Legătura dintre condensatele de ADN și adenovirus intensifică expresia de genă de reporter a luciferazei în mare măsură
Rezultatul transferului de ADN în hepatocite cu ajutorul complecșilor binari și ternari de ADN este reprezentat în fig.32. Efectul de transfer de gene este intensificat în prezență de adenovirus liber. Coloanele pLAdenov/tfpL arată rezultatele transfecțiilor cu adenovirus, care este conjugat cu ajutorul transglutaminazei cu polizină și apoi este lăsat să reacționeze cu ADN, care a neutralizat o parte din încărcăturile negative. Mai târziu se adaugă transferina-polilizina, care neutralizează încărcările negative reziduale. în acest mod este format un complex ternar adenovirus-polilizină/transferină-polilizină/ADN. Așa cum se poate vedea din figură, se obține o valoare deosebit de ridicată de 1,5 x 109 unități de lumină (corespunzător la circa 5000 unități de lumină pro celulă). Pentru încercarea reprezentată în coloana Adenov + pL + TfpL este amestecat adenovirus și polilizină ca pentru tratarea cu transglutaminază. Pentru a arăta specificitatea legăturii polilizinei la virus cauzată de transglutaminază, este omisă însă enzima. Apoi preparatul de virus este complexat cu aceeași cantitate de ADN și TfpL ca în pLAdeno/TfpL. în acest caz transfecția este moderată ca și cu AdenoV + TfpL, deoarece în ambele experiențe localizarea comună a virusului și a complexului de virus și ADN/transferină-polilizină este un fenomen întâmplător, în opoziție cu experimentul arătat în coloana pLAdenov/TfpL, în care localizarea comună prin legarea virusului și ADN în complexul recoltat furnizează o cantitate mare de infecție cu transferină (transfecție cu transferină).
b) Transfecția de celule k562 arată proprietățile endosomolitice ale adenovirusului
Celule ale liniei de celule K562 ale eritroleucemiei conțin circa 150000 receptori de transferină (Klausner și colab., 1983 b). în prezența ciorchinei aceste celule pot fi transificate și în absența de adenovirus în mare măsură cu complecși de TfpL/reporter ADN (fig.33, TfpL), așa cum s-a raportat deja de Cotten și colab., 1990. Aceeași complecși furnizează în prezența de adenovirus liber, dar în absența de ciorchină, expresii relativ slabe de gen reporter (AdenoV/TfpL), probabil pentru că celulele K562 ca și alte celule de sânge (Silver și colab., 1988; Horvath și colab., 1988) prezintă un număr mic de receptori de adenovirus. Când adenovirusul este legat printr-o punte de biotină/streptavidină de polilizină și ADNreporter este condensat în întregime prin adaos de mai multă polilizină, pentru a completa complexul binar (pLAdenov/pl), transfecția sprijinită de adenovirus atinge valori medii, probabil pentru că receptorii puțini de adenovirus sunt utilizați în mod eficient. Totuși, dacă ADNul complecsat cu adenovirus-polilizină condensează în întregime și sunt neutralizați prin adaos de transferină polilizină cu formarea unui complex ternar (pLadenov/TfpL) și numărul mare de receptori de transferină celulară intră în acțiune, eficiența transfecției se ridică cu, cel puțin două ordine de mărime, atât datorită legăturii eficiente de transferină, cât și datorită proprietăților endosomolitice ale virusului (fig. 33).
c) Complexe ternare de ADN duc la expresia de gen reporter în aproape 100% din hepatocite
Pentru a testa eficiența sistemului de transport în hepatocite de șoarece BNL CL.2, celulele sunt transfecate cu gena de reporter beta-galactozidază. Fig.34 arată încercarea cu beta-galactozidază după a) transfecția în prezență de ciorchină, b) transfecția în prezența de adenovirus d1312 și c) transfecția cu complecși de adenovirus ternar (d1312)-polilizinătransferină-ADN. în absență de adenovirus după transfecția standard numai puține celule exprimă gena reporter. Procentajul transfecției este de mai puțin de 0,1% dacă se utilizează și ciorchina, procentul crește la circa 0,2% (fig.34A). Cu adenovirus liber circa 5-10% din celule exprimă gena reporter (fig.34B), pe când complexele ternare cu virus modificat prin transglutaminază duce la expresia în majoritatea celulelor, dacă nu în toate celulele (fig.34C). Deoarece, complecșii ternari se pot utiliza la o diluție ridicată, nu apare, în mod
2590
2595
2600
2605
2610
2615
2620
2625
2630
RO 117861 Β1 obișnuit efectul toxic observat la doze ridicate de adenovirus liber (inactivat). Totuși, trebuie să se păstreze atenția, că la utilizarea de complecși ternari în concentrații ridicate, pentru a ajunge la 100% din celulele de cultură ale țesutului, devine observabil un efect toxic asemănător. Acțiunile toxice își pot avea originea în activitatea genelor virale reziduale, sau în proprietățile endosomolitice ale virusului adăugat, sau ele sunt pur și simplu o urmare a expresiei foarte ridicate a genei transificate.
d) Expresia unei gene reporter transificate este tranzitorie, dar nu durează săptămâni în hepatocite care nu se divizează
Se obțin complecși ternari de transport (pLAdenoV/TfpL) cu polilizină-adenovirus și cu adenovirus modificat, care este făcut și mai inactivat prin reacție cu psoralen. O cultură de celule de hepatocite confluentă 2/3 este transificată ca în exemplul reprezentatfniig.34B cu plasmidă de gen reporter pCMVL și activitatea de luciferază este măsurată la diferite puncte în timp. Așa cum se poate vedea din fig.35, activitatea luciferazei a fost cea mai ridicată după 3 zile, când cultura de celule de hepatocite a devenit confluentă și celulele au încetat să se dividă. Expresia genei reporter este menținută în cultura de celule care nu este divizată, fără ca să se fi aplicat o selecție asupra menținerii genei și a durat cel puțin 6 săptămâni, mai ales când s-a utilizat un adenovirus psoral inactivat pentru formarea complecșilor ternari.
Exemplul 24. Utilizarea de adenovirus CELO pentru intensificarea transportului ADN în celule umane în acest exemplu s-a testat adenovirusul CELO de găini asupra caracteristicii sale de a intensifica transferul ADN în celule HeLa umane în mod analog cu exemplele precedente, care au utilizat tipul de adenovirus uman 5.
Se utilizează adenovirusul de găini CELO (tulpina Phelps, serotip FAV-1,7, pasajul de celulă de rinichi al găinilor). Virusul (2 ml) este trecut printr-o coloană de filtrare cu gel PD-10, echilibrată cu 20 mM HEPES, pH=7,3,150 mM NaCI + 10% glicerină, și ml din eluat este lăsat să reacționeze cu 20 μΙ 1mM NHS-LC-Biotină (Pierce) 3 h, la temperatura camerei. Virusul biotinilirat este apoi dializat cu 3 x 300 ml HBS + 40% glicerină la 4°C și depozitat în cote de alicote la -70°C.
Celule HeLa (5 x 105 celule per capsulă de 6 cm) sunt complexate în 2 ml DMEM + 2% PCS cu 6 Mg de plasmidă pCMVL și sunt incubate cu amestecuri de polilizină (pLys) sau transferin-polilizină (TfpL) în 500 μΙ HBS (complecșii sunt preincubați 30 min. la temperatura mediului înconjurător). Apoi, probele sunt adăugate celulelor în prezența cantităților de virusuri indicate în fig.36. La probele, care au conținut virus CELO biotinilirat, cantitatea indicată de virus este preincubată la temperatura mediului înconjurător cu cantitatea indicată de streptavidină-polilizină (StrpL) în 200 μΙ HBS, timp de 30 min înainte ca să se adauge 6 Mg din plasmida pCMVL în 100 μΙ HBS. După o incubare de 30 min, la temperatura mediului înconjurător s-a dat cantitatea indicată de material TfpL la 37°C la celule. Două ore mai târziu este adaugă la celule 5 ml DMEM + 10% FCS și 24 h mai târziu celulele sunt recoltate și pregătite pentru încercarea cu luciferază.
Așa cum rezultă din fig.36, virusul CELO a intensificat sub formă liberă transportul ADN în celule HeLa (coloanele 1-6). Dacă totuși virusul CELO este modificat cu biotină și este conținut într-un complex cu streptavidină, s-a dovedit, că virusul, atât cu cât și fără transferină-polilizină suplimentară a intensificat transferul de ADN într-o măsură comparabilă cu cea atinsă de adenovirusul uman d1312. Linia specială de celule HeLa arată o capacitate ridicată de legătură pentru complecși de polilizină/ADN în absența transferinei (a se compara activitatea luciferazei probelor 1 și 4 din fig.36). De aceea este suficientă includerea virusului CELO într-un complex polilizină-ADN, pentru a cauza primirea complexului.
RO 117861 Β1
Exemplul 25. Transfecția de mioblaste
a) Transfecția de mioblaste și miotuburi cu complecși de ADNAransferină-polilizină în prezența de adenovirus liber și în prezența de adenovirus cuplat cu biotină/streptavidină
Mioblaste C2C12 (Blau și colab., 1985; ATCC nr.: CRL 1772) și mioblaste G8 (ATCC nr.: CRL 1456) sunt introduse în “high glucose DMEM” + 10% FCS culturi de mioblaste și transificate la subconfluența cu circa 5 χ 105 celule per capsulă de 6 cm. Culturile din miotuburi sunt obținute prin aceea că mioblastele sunt curățate în capsule de 6 cm (circa 5 χ 105 celule per capsulă) și mediul este înlocuit cu “high glucose DMEM” + 2% ser de cal, când celulele au ajuns la confluență (Barr și Leiden, 1991; Dhawan și colab., 1991). Transfecțiile miotuburilor sunt realizate 5 până la 7 zile mai târziu. Complecșii de transfecție sunt obținuți, așa cum este descris în exemplul 19, utilizându-se cantitățile indicate de TfpL, StrpL și adenovirus d1312 biotinilirat. Celulele sunt recoltate 20 h după transfecție și se măsoară activitatea luciferazei. Activitatea luciferazei indicată în fig. 37 se referă la întreaga probă de celule. S-a dovedit că, atât culturile de mioblaste, cât și culturile de miotuburi au putut fi transificate. După diferențiere la miotuburi eficiența transfecției este mai mică decât 1 log (C2C12) și nu a arătat o scădere semnificativă (G8). Formarea de miotuburi s-a petrecut la linia de celule G8 la o frecvență mai mică, ceea ce s-ar datora poate lipsei unei productivități scăzute care s-ar putea dovedi în cultura diferențiată. Rolul acțiunii de schimb dintre transferină și receptorul de transferină la transportul ADN în acest tip de celulă nu este esențial. în toate cele patru preparate de celulă are loc numai un transport slab de ADN cu utilizarea de complecși TfpL/ADN în prezența de adenovirus d1312 liber (coloanele 1,4, 7, 10). La utilizarea virusului cuplat s-a intensificat eficiența transfecției (coloanele 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12). La compararea cu complecși de combinații conținând numai virus și polilizină/StrpL, transferul de gene a ajuns la rezultatele care sunt obținute care cuprind transferină-polilizină, rezultând o creștere a eficienței de mai puțin decât 1 log (a se compara de exemplu, urma 2, fără transferină cu urma 3, transferină). Transfecția redusă cu virus liber și transfecția puternică cu complecși de virus cuplaj, atât în prezența, cât și în absența de transferină-polilizină lasă să se presupună că, adenovirusul folosește la aceste celule ca ligand și că, fără cuplare deși virusul liber poate pătrunde în celule, totuși complexul TfpL/ADN nu intră într-o cantitate productivă (pCMVL-ADN utilizat în acest exemplu este notat în figură cu pCLuc).
b) Analiză histochimică a frecvenței transfecției în miotuburi
Culturile de miotuburi C2C12 (ca în cazul mioblastelor, însămânțate în capsule de 6 cm, 5 x 10® celule, diferențiate în miotuburi) se obțin așa cum este descris în a). La probele cu virus liber este complexat pCMV-beta-gal ADN (6 pg) cu 8 pg TfpL în prezența de 500 p\ HBS și celulele sunt suplimentate în prezență de de 18 μΙ adenovirus d1312 (1 χ 1012 particule de virus per ml) în 2 ml DMEM/2% FCS. Probele cu virus cuplat se obțin cu pCmVLacz ADN (6 pg) complexat cu 7 pg TfpL și 800 ng StrpL + 18 μΙ adenovirus d1312 biotinilirat (1 χ 1012 virusuri/ml) în 500 μΙ HBS și se adaugă la celule în 2 ml DMEM/2% FCS. Așa cum este descris în exemplul 15, după o incubare de 24 h celulele sunt colorate pentru determinarea activității beta-galactozidazei.
Modelul de colorare a beta-galactozidazei este în conformitate cu rezultatele transfecțiilor, la care s-a utilizat luciferaza ca produs de genă reporter (vezi a)). în culturi de miotuburi se obține expresii de gene foarte scăzute, când s-a utilizat virus liber, pe când legătura dintre virus și ADN dă un nivel ridicat de expresie de gene. Prezența tuburilor colorate în albastru cu multe miezuri a arătat transferul cu succes al unei gene în aceste celule diferențiate în prezența de adenovirus liber.
2685
2690
2695
2700
2705
2710
2715
2720
2725
RO 117861 Β1
c) Transfer de ADN în culturi de mioblaste de șoarece și culturi de miotuburi de șoarece
Mușchii mari ai scheletului ambelor picioare dinapoi al unui șoarece de 4 săptămâni C57B1/6 sunt izolați steril în PBS și mărunțiți în bucăți de circa 5 mm. Țesutul este suspendat în 20 ml PBS, se lasă să decanteze circa 2 min și partea rămasă este absorbită. Această spălare este repetată de 3 ori. Țesutul este apoi amestecat cu 3,5 ml PBS plus C,5 ml tripsină/EDTA, 0,5 ml 1% (gr./vol.) colagenază, tip 2 Sigma și 0,5 ml 1% BSA (fracțiunea V în 4 mM CaCI2) și lăsat la incubare, la 37°C, timp de 30 min sub agitare continuă cu grijă. La sfârșitul incubării de 30 min țesutul rezidual este lăsat să decanteze, partea rămasă este îndepărtată și este amestecată cu 5 ml DMEM <+ 20% FCS. Incubarea cu protează este repetată de 3 - 4 ori, până când țesutul este complet dispersat. Suspensia de celule este apoi trecută printr-o sită celulară (Falcon) pentru a îndepărta agregate și fragmente de țesuturi, și este centrifugată la 500 x g 15 min. Peleta de celule este resuspendată în 10 ml DMEM + 20% FCS și fibroblastele sunt îndepărtate celulele fiind placate, timp de 60 min, pe o capsulă de cultură de țesut cu un diametru de 15 cm. Celulele neaderente sunt apoi îndepărtate cu grijă și placate pe cinci capsule de cultură de țesuturi de 10 cm acoperite cu laminină cu 15 ml DMEM + 20% FCS per capsulă. După atingerea confluenței (circa o săptămână mai târziu) celulele sunt tripsinate și replacate la circa 1 x 10® celule per capsulă pe capsule de 6 cm acoperite cu laminină. Pentru a forma culturi de miotuburi, circa 5 zile mai târziu (când celulele au ajuns la confluență) mediul este înlocuit cu DMEM + 2% ser de cal, și o săptămână mai târziu au realizat transfecții. Transfecția culturilor de mioblaste este făcută în capsule de 6 cm la circa 80% confluență. Plăcile de cultură de celule acoperite cu laminină se obțin după cum urmează: Capsulele de cultură de celule sunt acoperite cu 0,025 mg/ml polilizină (MG 30000 - 70000, sigma) în apă sterilă,timp de 30 min, la temperatura camerei. Plăcile sunt spălate de 3 ori cu apă sterilă șl uscate la ser. Apoi,plăcile sunt acoperite cu 8 ^g/ml laminină (EHS, Sigma) în apă peste noapte la temperatura mediului înconjurător. Plăcile sunt apoi spălate de 3 ori înainte de scoaterea germenilor din celule.
Complecșii de ADN utilizați pentru transfecție sunt obținuți prin aceea că cantitatea indicată de psoralen/adenovirus d1312 biotinilirat UV-inactivat (obținut ca în exemplul 19) se diluează în 150 μΙ HBS, se adaugă 1 pg StrpL în 150 μΙ HBS și apoi, se incubează 30 min,la temperatura camerei. Apoi, la fiecare probă se adaugă HBS (100 μΙ) conținând 6 pg pCMVL (în figură marcat cu pCLUc), și se incubează încă 30 min,la temperatura mediului înconjurător. Apoi, se adaugă fiecărei probe 7 pg TfpL în 100 μΙ HBS, sunt incubate 30 min,la temperatura camerei și apoi, se adaugă, fie culturii de mioblaste, fie la culturile de miotuburi în capsule de 6 cm, conținând 2 ml DMEM + 2% FCS. După o oră de incubare mediul este înlocuit cu 5 ml DMEM + 20% FCS (mioblaste) respectiv DMEM + 2% ser de cal (miotuban) și celulele sunt recoltate 48 h mai târziu pentru analiza luciferazei. Activitatea luciferazei probei totale de celule este reprezentată în fig.38.
Exemplul 26. îmbunătățirea transferului cu ajutorul virusului CELO în mioblaste cu utilizarea unui ligand de lecitină
a) Analiza comparativă a adenovirusului d1312 și a virusului CELO în celule HeLa și mioblaste C2C12
Probe, fie de la celule HeLa sau, fie de la mioblaste C2C12 (5 x 105 celule per capsulă de 6 cm) sunt complexate cu 1 pg StrpL/7 pg TfpL plus 5 μΙ adenovirus d1312 biotinilirat (vezi, exemplul 19,1 X1012 particule per ml), sau 18 pl virus CELO biotintilirat (vezi, exemplul 24,0,3 x 1012 particule per ml) și sunt transificate. După o incubare de 20 h celulele sunt recoltate șl sunt pregătite pentru măsurarea activității luciferazei. Fig. 39 arată activitatea luciferazei obținută de la fiecare probă totală de celule.
RO 117861 Β1
Transfecția celulelor HeLa este realizată cu eficiență comparabilă cu utilizarea de complecși adenovirus uman d1312/StrpL/TfpL/ADN, care pot intra în celulă, fie prin receptorul de adenovirus, fie prin receptorul de transferină, sau cu utilizarea de complecși CELO-Virus/StrpL/TfpL/ADN. Totuși, pe când transferul de ADN în mioblastele C2C12 cu complecși de adenovirus d1312 au putut să fie realizați în mod eficient, complecșii cu virus CELO au funcționat prost în aceste celule. Exemplele precedente au arătat, că receptorul de transferină joacă numai un rol mic la transportul complecșilor de combinație în aceste celule; probabil receptorul de adenovirus este locul de intrare principal. Activitatea slabă a virusului CELO în mioblaste s-ar putea deci explica printr-o legătură slabă, atât a virusului CELO, cât și a transferului la mioblastele C2C/I2.
b) îmbunătățirea transfecției mioblastelor C2C12 cu virus CELO cu utilizarea de aglutinină de germeni de grâu cu ligand
Pe baza transportului slab care este obținut în a), este ales noul ligand cu înlocuitor pentru transferină, și anume aglutinină de germene de grâu biotinilirat (2 - 4 Mol biotină pro Mol proteină; Boehringer Mannheim). CELO-virusul biotintilirat este obținut așa cum este descris mai înainte. Complecșii, conținând 6 pg pCMVL plus cantitățile indicate de StrpL, TfpL, aglutinină de germen de grâu biotinilirat (WGA-B) și virusul CELO sunt obținuți după cum urmează: virusul și WGA sunt diluați împreună în 150 μΙ HBS. StrpL este, de asemenea, diluat în 150 μΙ HBS, ambele soluții sunt amestecate și sunt incubate 30 min,la temperatura mediului înconjurător. ADN, diluat în 100 μΙ HBS, se adaugă la soluția StrpL/Virus/WGA, urmată de încă o incubare de 30 min,la temperatura mediului înconjurător. Apoi, TfpL se adaugă în 100 μΙ HBS la amestec și proba este incubată din nou 30 min, la temperatura mediului înconjurător. Complecșii sunt adăugați la mioblastele C2C12 (5 x 105 celule per capsulă de 6 cm) în 2 ml DMEM + 2% FCS. O oră mai târziu se adaugă celulelor 5 ml DMEM +10% FCS și 20 h mai târziu celulele sunt preparate pentru măsurarea activității luciferazei. Activitatea (unități de lumină) în fiecare probă totală de celulă este reprezentată în fig .40 (ADN utilizat în acest exemplu este pCMVL, care este notat în figură cu CLUc).
în lipsa virusului este obținut un transfer de ADN foarte slab, atât cu WGA cât și fără WGA (coloanele 1, 6). Un transfer moderat este obținut cu CELO-virusul cuplat (urma 2), cu care s-a obținut totuși o creștere de 16 ori, când este conținut în complex WGA-B. Mărirea cantității WGA în complex (de la 1 pg la 5 μg) a dat o ușoară scădere a transferului (a se compara coloanele 3 și 4) pe când mărirea conținutului de StrpL în complex (de la 1 pg la 2 pg) a mărit ușor transferul. Aceste rezultate arată clar, că WGA-B ca ligand intensifică transportul ADN în celulele C2C12 cu ajutorul virusurilor CELO.
d) Expresia factorului VIII în culturi de C2C12-mioblaste și miotuburi
Culturile de mioblaste și miotuburi sunt obținute așa cum s-a descris mai sus. Transfecțiile sunt realizate cu utilizarea de 6 pg a unei plasmide, conținând “full length Faktor VIII cDNA” (Wood și colab., 1984; Eaton și colab., 1986 și complexată, conform prescripției obișnuite de formare a complexului cu 5 sau 16 μΙ adenovirus biotinilirat (așa cum s-a indicat) plus 0,5 sau 1 μg StrpL și 7 sau 6 pg TfpL.
Complecșii de virus ADN sunt aplicați pe celule în 2% FCS/DMEM. După o incubație de 4 h, la 37°C se adaugă în fiecare capsulă 3 ml DMEM proaspăt + 10% FCS. 18 h mai târziu mediul este recoltat și cu ajutorul unui COATEST (KABI, Pharmacia), a unui sistem de testare, un standard internațional ca referință pentru a cerceta prezența factorului VIII. Cantitățile de factor VIII sunt notate ca mUnits, formate în 24 h per 1 x 10® celule (fig.41).
Exemplul 27. Utilizarea de proteină de adenovirus pentru transportul ADN
Adenovirus (tipul natural 300) purificat este cultivat în celule HeLa, așa cum s-a descris pentru adenovirusul d1312 biotinilirat. 1,2 ml de virus sunt dializați față de 3 x 300 ml mM MES (acid 2-(N-morfolino)etansulfonic), 1 mM EDTA, pH=6,25, la 4°C, timp de 18 h.
2780
2785
2790
2795
2800
2805
2810
2815
2820
RO 117861 Β1
Materialul este apoi centrifugat 30 min la 27 K într-un rotor SW60. Lichidul este îndepărtat cu grijă, peleții sunt resuspendați în HBS/40% glicerină. La lichid se adaugă HEPES, pH=7,4 și NaCI în cantități de 20 mM și 150 mM și, atât peleții (conținând core-proteina virală și cantitatea principală de hexonkapsids; în fig.42 “core”) cât și fracțiunile de lichid (conținând Vertices; în fig.42 “vertices”) sunt cercetați asupra activității de transport ADN în Mov13 fibroblaste de șoarece (Strauss și Jaenisch, 1992) sau celule HeLa.
Formarea de complex cu ADN este realizată după cum urmează: cantitățile indicate din fiecare fracțiune, virus rupt înainte de centrifugare sau virus intact (exprimat ca pg proteină, așa cum s-a determinat cu un Bradford-Assay) sunt diluate în 300 pl HBS. La acestea se adaugă streptavidină-polilizină (3 pg în 50 p\ HBS) urmat de o incubare de 30 min, la temperatura camerei. 6 pg pCMVL, în figură notat cu “pLuc, sunt diluați în 100 p\ HBS și sunt adaugați la prima soluție pentru o incubare de 30 min. Apoi, se adaugă 2 pg TfpL în 100 pl HBS, urmată de încă o incubare de 30 min. în probele, care sunt obținute numai cu TfpL, se amestecă 8 pg TfpL în 170 pl HBS cu 6 pg pCMVL în 330 μΙ HBS, 30 min, la temperatura mediului înconjurător. Cantitățile indicate de proteină de virus sunt diluate în 300 pl HBS și apoi, adăugate la complecșii TfpL/ADN. Toate probele sunt apoi introduse pentru o oră la 5x10® celule într-o capsulă de 6 cm, conținând 2 ml DMEM/10% FCS (fie celule HeLa, fie fibroblaste Mov13). Apoi, se adaugă 5 ml mediu proaspăt, conținând 10% FCS și celulele sunt preparate 20 h mai târziu, pentru determinarea activității luciferazei. Activitatea luciferazei obținută (în unități de lumină) este reprezentată în fig.42, atât pentru celule HeLa (tabelul 1) cât și pentru fibroblaste Mov13 (tabelul B).
La ambele tipuri de celule are loc o creștere depinzând de doza activității de transfer a ADN în legătură cu fracțiunea de Vertex (probele 4-6 dinambele tabele). Când aceeași cantitate de proteină de virus biotinilirat este conținută în complecșii TfpL/ADN fără streptavidină/polizină, se observă un transport ADN aproape de valorile inferioare (proba 3 de pe fiecare tabel).
Exemplul 28. Transfer de gene intensificat la utilizarea complecșilor ternari de ADN, conținând un conjugat de liganzi-galactoză
a) Complecși ternari, conținând un conjugat de peptidă de influență
Exemplele 13 și 14 au arătat că peptidele conjugate cu polilizină, care conțin secvențe, derivate de N-terminalul sub-unității virusului de influența-hemaglutinin HA-2, cresc în mod considerabil transferul de gene în complecșii de ADN/transferină-polilizină cu ajutorul transferinei-polilizinei.
Se obțin complecși de combinații ADN asemănătoare, conținând conjugatul de galactoză-ligand-polilizină tetra-antenar și peptidă de influența modificată cu polilizină (obținută ca în exemplul 6 respectiv 13), adăugând conjugatul de polilizină-liganzi la plasmida ADN pCMVL, pentru a neutraliza jumătate din încărcătura de ADN, și restul încărcăturii fiind utilizată pentru a încărca complecșii cu conjugat de peptidă de influență-polilizină. Transportul acestor complecși de ADNm care au conținut liganzii sintetici (gal)4 spre BNL CI.2 hepatocite (transfecțiile sunt realizate așa cum s-a descris în exemplul 6 g) a dat o expresie de luciferază (fig.43), care era în mod semnificativ mai ridicată decât expresia obținută cu transferină ca ligand expresie obținută. Expresia este mai mult decât de 500 ori mai ridicată decât expresia care este obținută în experiențele de centrul cu complecși de ADN fără peptide de influența, dar cu aceeași cantitate de polilizină (fig.43). Activitatea obținută cu complecși de combinație cu ADN este de asemenea de circa 30 ori mai ridicată decât cu complecși de ADN/(gal)4pL-complecși, cu care celulele sunt incubate în prezență de ciorchină.
RO 117861 Β1
b) Complecși ternari, conținând conjugat de adenovirus
Complecșii sunt obținuți după cum urmează:
Adenovirus d 1312 biotinilirat (obținut în exemplu 19; 2 pl, 6 pl sau 18 pl; 1012 particule pe ml) în 50 pl HBS este amestecat cu streptavidină-polilizină (100 ng, 160 ng sau 480 ng) în 100 pl HBS. După o incubare de 30 minse adaugă o soluție de 6 pg pCMVL în 200 pl HBS și după alte 30 min o soluție de 3,8 pg (gal)4pL (obținută ca în exemplul 6) sau 7 pg TfpL în 150 pl HBS. Soluțiile complexe de ADN sunt adăugate la câte 300000 celule (ATCC TIB73, ATCCTIB 74, ATCC TIB75, ATCC TIB76), cultivate în capsule de 6 cm în “high glucose DMEM” + 2% FCS, treptele de procedeu pentru cultura celulelor care au urmat și Încercările pentru luciferază sunt efectuate, așa cum este descris în exemplele precedente, și s-au obținut valorile de expresie a genelor arătate în fig.44 (după 24 h).
Exemplul 29. Transferul de gene în celule B, B-limfoblastoide
Conjugatele human-lg și anti-human-lg-polllizină sunt obținute după cum urmează, cuplarea efectuându-se în mod analog cu metode cunsocute în literatură prin introducerea de punți de disulfură după modificarea cu succinimidil-piridilditio-propionat (SPDP, Jung și colab., 1981):
a) Obținerea de conjugate de anti-human-lg-polilizin 300
O soluție de 2 mg de anti-human de capră Tsouthem Biotechnology Associates, Inc., Birmingam, al, USA) în HBS (150 M NaCI, 20 mM HEPES, pH=7,8) este tratată cu 14 pl 5 mM soluție etanolică de SPDP (Pharmacia). După 10 h, la temperatura mediului înconjurător este filtrată peste o coloană de gel Sephadex G 25 (eluant 100 mM tampon HEPES pH=7,3), obținându-se 1,3 mg anti-human-lg, modificat cu 30 nMol resturi de piridilditiopropionat. Poli (L) lizină 300 (grad de polimerizare mediu de 300 resturi de lizină (Sigma)) sunt modificate în mod analog cu SPDP și prin tratare cu ditiotreitol și urmată de filtrare pe gel este trecută în forma modificată cu grupe mercapto libere. O soluție de 12nMol polilizină 300, modificată cu 29 nMol grupe mercapto, în 0,3 ml HBS este amestecată cu excludere de oxigen cu antl-human-lg modificat sus-menționat și lăsat să stea peste noapte, la temperatura mediului înconjurător. Amestecul de reacție este adus prin adaos de 5 M NaCI la un conținut de 0,6 M NaCI. Izolarea conjugatelor are loc prin cromatografie de schimb de ioni (Pharmacia, Mono S HR 5/5); după dializă față de 25 mM HEPES pH=7,3 se obțin conjugate corespunzătoare, constând din 0,33 mg anti-human-lg, modificat cu 5 nMol polilizină 300 (raport molar 1:1).
b) Obținerea de conjugate human-lgG-polilizină 300
O soluție de 19,5 mg (122 nMol) anticorpi (Sigma I-4506) în 2 ml HBS este tratată cu 39 μΙ soluție etanolică 10 mM de succinimidil-piridilditio-propionat (SPDP, Pharmacia). După 2,5 h, la temperatura camerei este filtrat peste o coloană de gel Sephadex G 25 (eluant 100 mM tampon HEPES, pH=7,9), obținându-se 19 mg (119 nMol) human IgG, modificat cu 252 nMol resturi de piridilditiopropionat. Poli(L)lizină 300 (grad de polimerizare mediu de 300 resturi de lizină; Sigma) este modificată în mod analog cu SPDP și prin tratare cu ditiotreitol urmată de filtrarea pe gel a dus la forma modificată cu grupe libere de mercapto. O soluție de 119 nMol polilizină 300, modificată cu 282 nMol grupe mercapto, în 1 ml HBS este amestecată sub excludere de oxigen cu human-lgG modificat menționat mai sus și lăsat să stea, la temperatura mediului înconjurător. Amestecul de reacție este adus prin adaos de 5 M NaCI la un conținut de circa 0,6 M NaCI. Izolarea conjugatelor are loc prin cromatografie cu schimb de ioni (Mono S, Pharmacia, 50 mM HEPES, pH=7,3, gradient de sare 0,6 M până la 3 M NaCI); după dializă față de HBS, pH=7,3 se obține conjugate corespunzătoare, constând din 9 mg (57 nMol) anticorpi, modificate cu 90 nMol polilizină 300 (raport molar 1:1,6).
2875
2880
2885
2890
2895
2900
2905
2910
2915
RO 117861 Β1
c) Formarea de complecși și transfecție
Complecșii sunt obținuți după cum urmează: adenovirus d1312 biotintilirat (30 μΙ; 1012 particule per ml) în 50 μΙ HBS este amestecă cu streptavidină-polilizină (800 ng) în 100 μΙ HBS; după o incubare de 30 min, se adaugă o soluție de 9 μς pCMVL în 200 μΙ HBS. După alte 30 min.se adaugă o soluție de 5,1 pg polilizină (Lys450), 10,2 μg TfpL, 12 pg conjugat de human -IgG-Polilizină sau 10 μg conjugat de anti-human-lg-polilizin în 150 μΙ HBS. Complecșii ADN sunt adăugați la câte 10® celule B-limfoblastoide (celulele sunt obținute din celule de sânge uman mononuclear periferic prin imortalizare cu virus Epstein Barr, așa cum s-a descris de Walls și Crawford, 1989 și cultivate în plăci cu 24 de cavități în 1 mi HPMI 1640 + 2% FCS). Operația următoare a culturii de celule și încercările pentru luciferază sunt realizate așa cum este descris în exemplele anterioare. Valorile de expresie a genelor (activitatea luciferazei în unități de lumină) sunt reprezentate în fig.45.
Exemplul 30. Transportul ADN cu transferină-polilizină în prezența de rinovirus liber și conjugat
a) Preparate de rinovirus HRV-2
Rinovirusul HRV-2 este obținut și purificat așa cum este descris de Skern și colab., 1984.
O soluție de 400 μΙ de rinovirus (circa 30 pg) în HBS (150 mM NaCI/ 5 mM HEPES, pH=7,9)/10% glicerină este tratată cu 10 nMol NHS-LC-biotină (Pierce 21335). După o incubare de 3 h, la temperatura mediului înconjurător, virusul este separat de biotina neinclusă prin dializă prelungită față de HBS/40% glicerină, la 4°C.
Rinovirus sensibil la lumină, obținut prin cultivarea virusului în prezență de orange de acridină, este inactivat, așa cum este descris de Madshus și colab., 1984.
b) Obținerea de complecși de ADN și a transfecțiilor
i) Complecșii de transferină-polilizină/ADN sunt obținuți prin aceea că o soluție de 6 pg plasmidă-ADN pCMVL în 330 μΙ HBS (150 mM NaCI, 20 mM HEPES, pH=7,3) este amestecată cu o soluție de 8 pg TfpL.290 în 170 p\ HBS. Complecșii ADN sunt amestecați cu 1,5 ml mediu (DMEM + 2% FCS) și cu 0,14 pg până la 3,5 pg rinovirus HRV-2 (sau HRV2 inactivat). Amestecul este aplicat pe celule NIH 3T3 (300000 celule pe capsula de 6 cm). 4 h mai târziu mediul de transfecție este înlocuit prin 4 ml mediu proaspăt (DMEM + 10% FCS). Celulele sunt recoltate după 24 h și cercetate asupra activității luciferazei, așa cum s-a descris mai înainte (fig.46A).
ii) Complecși de combinații ADN, conținând conjugate de transferină-polilizină și conjugate de rinovirus-polilizină sunt obținuți după cum urmează: o soluție de 100 μΙ de rinovirus biotinilirat HRV-2 (3,5 pg) în HBS este amestecată cu 1 pg StrpL în 100 p\ HBS (celelalte concentrații de virus sunt amestecate cu cotele părți corespunzătoare).
După 30 min,la temperatura camerei, soluția este amestecată cu 6 pg plasmidă-ADN în 150 μ| HBS, după alte 30 min este incubată, la temperatura mediului înconjurător și apoi, este amestecată cu 6 pg TfpL290 în 150 p\ HBS. Complecșii ADN sunt amestecați cu 1,5 ml mediu (DMEM + 2% FCS) și adăugați la celulele 3T3 NIH (300000 celule per capsule de 6 cm). Tratamentul mai departe al culturilor și încercarea de determinare a luciferazei sunt efectuate așa cum s-a descris în i) (fig.46B).
Exemplul 31. Transfecție de celule HeLa cu complecși de combinație, care conțin adenovirus legat ionic
Formarea de complex a):
Complecșii ADN sunt obținuți, amestecând mai întâi 30 pl adenovirus d1312 (circa
109 PFUS) cu 1 pg polilizină pLys450 (lungimea medie a lanțului 450 monomeri) în 170 pl
HBS și apoi, după 30 min. Sunt tratați, la temperatura mediului înconjurător cu 6 pg pCMVLADN în 170 pl HBS. După o incubare care a durat, încă 30 min, complecșii sunt amestecați
RO 117861 Β1
2970 cu 9 pg TfpL190 în 170 μΙ HBS. O parte de alicotă din amestecul de complex (10% = 50 μΙ soluție, 600 ng ADN; sau 1% = 5 μΙ soluție, 60 ng ADN) este diluată în 1,5 ml DMEM + 2% FCS și adăugată la 300000 celule HeLa. După 4 h se adaugă 2 ml DMEM + 20% FCS. Recoltarea celulelor după 24 h și încercarea pentru activitatea luciferazei sunt efectuate ca de obicei. Activitatea luciferazei corespunzând extractului total este de 29115000 unități de lumină (în cazul a 600 ng ADN) și 1990000 unități de lumină (în cazul a 60 ng ADN).
Formarea de complex b) (experiență de control):
Complecșii ADN se obține amestecâd întâi 6 pg pCMVL-ADN în 170 p\ HBS cu 1 pg polilizină pLys50 în 170 p\ HBS și, după 30 min,la temperatura mediului înconjurător, se amestecă apoi cu 9 pg TfpL190 în 170 p\ HBS., După o incubare, timp de alte 30 min, complecșii se tratează cu 30 pl adenovirus d1312 (circa 109 PFUs). O parte de alicotă din amestecul de complecși (10% = 50 pl soluție, 600 ng ADN; sau 1% = 5 pl soluție, 60 ng ADN) se diluează în 1,5 ml DMEM + 2% FCS și se adaugă la 300000 celule HeLa. După 4 h se adaugă 2 ml DMEM + 20% FCS. Recolta de celule și încercarea cu luciferază se efectuează ca de obicei. Activitatea cu luciferază este de 405000 unități de lumină (în cazul a 600 ng ADN) și 200 unități de lumină (în cazul a 60 ng ADN).
Exemplul 32. Administrarea locală de complecși de ADN / adenovirus/ transferinpolilizin în ficatul de șobolani
a) Injecție directă
Complecșii ADN sunt obținuți, așa cum se descrie în exemplul 19. Ei au conținut 200 μΙ adenovirus d1312,6,4 pg streptavidină-polilizină, 48 pg pCMVL și 48 pg TfpL290 întrun volum total de 2000 pl HBS. Un șobolan mascul Sprague-Dawley (greutatea corpului 240 g) este anesteziat cu avertin și se realizează o laparatomie lungă de 4 cm. Injecția complecșilor are loc într-un, timp de două minute în lobul lateral din stânga al ficatului. Apoi, rana laparatomică este închisă în straturi. Șobolanul este omorât la 48 h, după injecția complecșilor prin anestezie cu eter și i s-a măsurat expresia luciferazei în diferite probe ale ficatului.
S-a dovedit o activitate a luciferazei de 5615 unități de lumină/mg conținut de proteină a homogenatului de ficat în zona locului de injecție; activitatea totală este de 370600 unități de lumină. în locurile din ficat îndepărtate de locul injecției nu s-a putut măsura nici o activitate a luciferazei.
b) Administrarea complecșilor prin sistemul căilor biliare în ficat
Complecșii sunt obținuți după cum urmează: 200 pl adenovirus d1312 biotinilirat, diluat cu 200 μΙ HBS, este incubat cu 6,4 pg polilizină modificată cu streptavidină în 400 pl HBS, timp de 30 min,la temperatura mediului înconjurător. Apoi, se adaugă 48 pg pCMVL în 800 pl HBS. După 30 min de incubare se adaugă 48 pg TfpL în 900 pl HBS. Pentru folosirea complecșilor sunt anesteziați cu avertin șobolani masculi Sprague-Dawley (greutatea corpului 250 g) și burta se deschide prin secțiunea mediană. Intestinul este pus pe partea stângă a corpului și se introduce în calea biliară un ac 27 G, care este legat cu un furtun și cu o seringă de 1 ml. Injecția complecșilor a durat 4 min. Apoi, acul este scos din calea biliară și locul de injecție este sigilat cu o lipitură de fibrină (Immuno). Rana abdomenului este închisă cu cusături și agrafe metalice. După 30 h șobolanul este omorât și diferiții lobi ai ficatului sunt examinați pentru a determina expresia luciferazei. Valoarea de vârf a activității luciferazei este de 19000 unități de lumină per mg proteină; expresia totală calculată în întregul ficat este în intervalul de 2,7 x 10® unități de lumină.
Exemplul 33. Administrarea complecșilor de ADN/adenovirus/TfpL în vana de coadă barată a șoarecilor
Complecșii sunt obținuți așa cum s-a descris în exemplul 19. Ei au constat din 45 pl adenovirus d1312, 0,8 pg streptavidină-polilizină, 6 pg p CMVL și 24 pg mTfpL290 într-un volum total de 150 pl HBS. Complecșii sunt injectați în vana cozii unui șoarece mascul
2975
2980
2985
2990
2995
3000
3005
3010
3015
RO 117861 Β1
C3H/He (vârsta: 2 luni) sub anestezia cu avertin. Chiar la sfârșitul injecției vena cozii este comprimată la capătul proximal și distal al cozii, astfel, încât soluția de complex este reținută în timpul comprimării (25 min) în segmentul de venă a cozii injectat și nu a putut să fie spălată cu sânge. 48 h după injecție șoarecele este omorât prin dislocare cervicală și vena de coadă injectată este preparată. S-a măsurat expresia luciferazei în homogenatul segmentului de venă al cozii. A rezultat în acest caz o activitate a luciferazei de 2600 unități de lumină/3 cm venă a cozii.
Exemplul 34. Transfecția celulelor de melanom umane primare
a) Transfecția cu complecși de combinații de adenovirus-polilizină/transferinăpolilizină
Celule primare de melanom sunt izolate dintr-un melanom îndepărtat pe cale chirurgicală de la un pacient. Pentru aceasta tumora este desfăcută mecanic în mediu de cultură RPM11640 cu 5% FCS 2mM glutamină și adaos de antibiotice, și fragmentele de țesut sunt presate printr-o sită din oțel. Apoi, celulele de cultură sunt spălate prin centrifugare și resuspensie de mai multe ori și însămânțate în sticle de cultură a celulelor T25.24 h după izolarea celulelor tumorale are loc transfecția cu complexe ternare constând din: 3 μΙ, 9 μΙ sau 27 μΙ adenovirus d1312 biotinilirat (1 x 1012/ml), 0,5 pg streptavidină-polilizină, 6 μρ pCMVL și 7 pg TfpL290 (în șarjă cu 27 p\ adenovirus: 1 pg streptavidină-polilizină și 6 pg TfpL290) într-un volum total de 500 pl HBS. 36 h după transfecție sunt recoltate celulele și se măsoară activitatea luciferazei (unități de lumină) (vezi, fig.47; grinda de sus arată rezultatele cu celulele în suspensie, cea de jos cu celulele aderente).
b) Transfecția cu complecși de adenovirus-polilizină/combinații de lipoproteină de densitate redusă-polilizină
i) Obținerea de conjugate de LDL-polilizină
O soluție de 10 mg (14,3 nmol) LDL (Low Density Lipoprotein, Sigma, L-2139, greutatea moleculară 3500000, diametrul particulelor circa 26 nm) în 2 ml HBS este tratată cu 143 pl dintr-o soluție etanolică 10 mM de SPDP (1,43 μηηοΙ; Pharmacia) și se lasă să reacționeze două ore, la temperatura mediului înconjurător. Filtrarea pe gel peste o coloană Sephadex G25 (14 x 140 mm) cu HBS a dat 3,2 ml dintr-o soluție de cca 10 mg LDL, modificată cu 0,70 μΓηοΙ resturi de piridilditiopropionat. Soluția este apoi tratată cu 1,2 ml NaCI 5 M, pentru ca, la adăugarea care urmează de polilizinâ, să se împiedice formarea precipitatului care apare altfel. Poli(L) lizina cu o lungime medie a lanțului de 300 monomeri este modificată așa cum este descris cu SPDP și prin tratare cu ditiotreitol urmată de filtrare pe gel și se obține forma modificată cu grupe de mercapto. Soluția modificată descrisă mai sus de LDL este amestecată cu soluția de 0,33 μΓηοΙ polilizinâ 300 modificată cu 0,76 μΓηοΙ grupe mercapto, în 4 ml NaCI 2 M, 0,5 M HEPES, pH=7,9, sub argon și lăsată să stea 48 h, la temperatura mediului înconjurător. Soluția de reacție este diluată cu apă sterilă la 32 ml (concentrația NaCI circa 0,5 M) și separată prin cromatografie de schimb ionic (Biograd Macroprep S, 10 x 100 mm, 20 mM HEPES, pH=7,3, gradient de 0,2 - 3 M NaCI). Fracțiunile de produs la o concentrație de sare de 1,8 M - 2,2 M și sunt separate. După dializă cu HBS se obțin conjugate, constând din 2,35 mg (3,4 nMol) LDL modificat cu 190 nmol polilizinâ (corespunde la 7,5 mg din forma de bază de polilizinâ). Aceasta corespunde la o modificare în medie a particulelor LDL cu circa 55 lanțuri de polilizinâ.
ii) Formarea de complex și transfecție:
Un preparat de 18 pl adenovirus d1312 biotinilirat este diluat cu HBS la 100 pl în volum. 1,2 pg streptavidină-polizină este reglat cu HBS la 100 μΙ în volum și este amestecat cu cei 100 ml de preparat de adenovirus. După 30 min se amestecă la aceasta 150 pl HBS cu 6 pg pCMVL. După alte 30 min se adaugă 300 pl HBS cu 4 pg LDLpL (conținut de polilizinâ 20 pg). Această soluție preparată se amestecă cu 1,5 ml DMEM (10% FCS) și se
RO 117861 Β1 adaugă la 3 x 103 celule de melanom (obținute ca sub a) și notate HMM1 și HMM4), care se găseau într-o capsulă de cultură de celule cu diametrul de 6 mm. Celelalte lucrări de cultură de celule și măsurători de luciferază sunt realizate, așa cum s-a descris la a). Expresia genelor se ia din fig.48; A) arată rezultatele cu celulele de melanom HMM1; toate încercările sunt realizate cu conjugate AdpL, care nu sunt indicate separat în figură. B) arată încercările cu celulele de melanom HMM4; toate încercările sunt realizate cu conjugate AdpL, acestea sunt menționate separat numai în ultima coloană (notația d 1312/16 se referă la preparatul special de virus). în încercarea reprezentată în coloana 2 se adaugă LDL într-un exces de 25 ori, ceea ce a rezultat pe baza competiției față de receptorul LDL într-o eficiență mai redusă de transfer de gene.
Exemplul 35. Transfecția fibroblastelor umane primare
Biopsii ale pielii umane sunt puse pe o placă Petri, conținând DMEM, 2mM glutamină, 20% FCS și antibiotice. Apoi, biopsiile sunt mărunțite cu un cuțit chirurgical și sunt cultivate în prezență de 3 ml mediu timp de 5 zile. Apoi, celulele se spală cu mediu proaspăt (a se vedea mai sus) și se cultivă alte 7 zile. După această durată de timp celulele sunt tripsinizate și subcultivate în noi plăci Petri. Când celulele sunt aproape confluente, ele sunt din nou tripsinizate și depozitate până la transfecție, depozitarea făcându-se în stare congelată. Pentru transfecție celulele sunt dezghețate, însămânțate în plăci Petri de 6 cm și cultivate în DMEM, conținând 2 mM glutamină, 10% FCS și antibiotice. Conjugatele pentru transfecție sunt obținute după cum urmează: 3 μΙ, 10 μΙ, 20 μΙ și 30 μΙ adenovirus d1312 sunt incubate cu 0,1 μρ, 0,3 pg, 0,5 pg și 0,8 pg streptavidină modificată cu polizină în 150 μΙ HBS 30 min, la temperatura camerei. Apoi, se adaugă 6 pg din plasmida pCMVbeta-gal în 170 μΙ HBS și amestecul este incubat încă 30 min. în ultima treaptă se adaugă 7,8 pg TfpL pentru conjugatele cu 3 p\ d1312, 7 pg TfpL pentru 10 p\ d1312 și 6 pg TfpL pentru conjugatele cu 20 p\ și cu 30 μΙ d1312 în 170 μg HBS. După o durată de incubare de 30 min conjugatele sunt aplicate pe celule în 2 ml DMEM, conținând 2 mM glutamină, 2% FCS și antibiotice și celulele sunt incubate 4 h, la 37°C. Apoi, mediul este îndepărtat și cultura este continuată, la 37°C cu DMEM, conținând 2 mM glutamină, 10% FCS și antibiotice. După 48 h este determinată expresia beta-galactozidazei, așa cum s-a descris în exemplele precedente.
La transfecția cu 3 μΙ d1312, 14% din celule au arătat o producție de beta-galactozidază, la 10 μΙ d1312 se obține 32% celule pozitive, cu 20 pl d1312 au fost 39% pozitive și cu 30 pl d1312 64% din celule sunt pozitive.
Exemplul 36. Transferul de gene în celulele epiteliale ale căilor respiratorii ale șobolanilor in vivo cu ajutorul complecșilor de combinații
a) Obținerea de complecși de combinații TfpL/AdpL
Complecși de transferină umană-polilizină-ADN (hTfpL) sunt obținuți prin combinația a 8 pg transferină-polilizină (Serva Biochemical) în 150 pl HBS (150 mM NaCI/20 mM HEPES, pH=7,3) cu 6 pg pCMVL-ADN în 350 pl HBS și se incubează la temperatura mediului înconjurător. Conjugatele de adenovirus-polilizină se obțin, așa cum este descris în exemplul 190); se utilizează psoralen/adenovirus inactivat UV. Complecșii de combinație hTfpL/AdpL sunt obținuți,conform prescripției din exemplul 23 c).
b) Administrarea complecșilor in vivo printr-o cale intratraheală
Pentru aceste încercări este utilizat șobolanul Sigmodon hidpidus (“Cotton Raf), despre care s-a dovedit că el reprezintă un mod adecvat de animal pentru îmbolnăviri de plămâni adenovirale umane (Pacini și colab., 1984). Animalele sunt anesteziate cu metoxifluran. După o tăietură verticală în latura centrală a gâtului s-a preparat traheea prin retezare. Complecșii (250 până la 300 μΙ; 3 pg ADN-plasmidă) se injectează vizibil direct în trahee în animalul așezat oblic, într-un unghi de 45°. La punctele în timp indicate în fig.49 după injecție, animalele sunt ucise cu CO2 și traheea și plămânul sunt recoltate în bloc după
3070
3075
3080
3085
3090
3095
3100
3105
3110
3115
RO 117861 Β1 spălarea in situ cu soluție de sare de bucătărie tamponată cu fosfat rece (PBS). Pentru testul de luciferază, țesutul plămânului este omogenizat în tamponul de extracție, lizatele sunt standardizate pe conținutul total de proteină și expresia luciferazei este măsurat așa cum s-a descris. Unitățile de lumină se referă la 1250 pg proteină totală, obținută din lizatele de plămân. Experiențele sunt realizate de câte 3 - 4 ori, rezultatele sunt reprezentate ca valori medii ± SEM.
Exemplul 37. Transferul de gene cu utilizarea unui agent endosomolitic neviral
a) Sinteza de peptide care rup membrana
i) Sinteza peptidelor
Peptidele sunt obținute pe un Synthiziser automat (ABI) 431 A) cu ajutorul metodei fazei solide cu utilizarea rășinei p-alcoxi-benzil-alcoolice (0,97 nMo/g) ca fază solidă și aminoacizi protejați Fmoc. Aminoacidul carboxiterminal este legat de rășină prin anhidrida simetrică. Următorii aminoacizi sunt cuplați cu ajutorul metodei 1-hidroxi-benzotriazol-diciclohexilcarbodiimidei. Se utilizează următoarele grupe de protecție cu lanțuri laterale: (Trt)Asn, (Trt)Cys/(t-Bu)Cys în cazul EALA și G1F/, (t-Bu)Glu, (Trt)His, (t-Bu)Ser.
Peptidele au prezentat următoarele secvențe: EALA: (SECV ID NR:5) Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys GLF (SECV ID NR:6) Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys GLF-II (SECV ID NR: 7) Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys GLF-delta (SECV ID NR:8) Gly Leu Phe Glu Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys EALA-lnf (SECV ID NR:9) Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Aln Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys EALA-P50 (SECV ID NR:10) Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys P50 (SECV ID NR:11) Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys
Peptidele sunt scindate de rășină și grupele de protecție-lanțurile laterale, cu excepția lui (t-Bu)Cys, sunt îndepărtate prin tratarea fazei solide încărcate cu 100 mg peptidă cu 3 ml dintr-un amestec de fenol/etandition/tioanisol/apă/acid trifluoracetic 0,75:0,25:0,5:0,5:10, timp de 1,5 h, la temperatura mediului înconjurător. Peptidele brute sunt precipitate în eter și spălate de 2 ori. Peptidele EALA șl GLF protejate S-t-Bu sunt dizolvate într-un volum mic de bicarbonat de trietilamoniu 1M (TEAB), pH=8, sunt diluate la 100 mM TEAB și apoi sunt purificate prin Reverse Phase HPLC pe o coloană de Nucleosil 500-50% (gradient 0,1% TFA/acetonitril) ambele peptide au eluat la circa 50% acetonitril. Se obține forma liberă CysSH a peptidei, îndepărtând grupele de protecție din peptidele Trt-Cys la fel cum s-a descris mai sus. Peptidele brute (5 mg) sunt dizolvate în 100 p\ 100 mM TEAB, pH=8, conținând 1 p\ beta-merkapto-etanol și peptidele sunt purificate prin filtrare prin gel (Sephadex G-25,100 mM TEAB, 0,5 mM EDTA) și uscate prin congelare sau cromatografie de schimb ionic (Mono Q Pharmacia, 20 mM HEPES, pH=7,3, gradient 0 până la 3 M NaCI; peptidă eluează la 1,5 M NaCI).
RO 117861 Β1 ii) Modificare cu N-(hidroxietil)maleimidă
Grupa SH a capătului C-terminală a a peptidei GLF-delta, GLF-II, EALA-inf, EALAP50, P50 este blocată după filtrarea pe gel (Sephadex G-25, 20 mM HEPES, pH=7,3, 0,5 mM EDTA) de forma SH liberă prin reacție cu un exces molar, de 1,3 până la de 10 ori de n-(hidroxietil)maleimidă (o oră, la temperatura mediului înconjurător). Maleimida în exces este îndepărtată prin filtrare pe gel (Sephadex G-25, 100 mM TEAB, pH=8) și peptidele (GLF-delta-ori, GLF-ll-ori, EALA-Inf-ori, EALA P50-ori, P50-ori) se obțin după uscare prin congelare ca sare de trietilamoniu.
iii) Modificația cu 2,2'-ditiobispiridină
Peptidele SH libere sunt lăsate să reacționeze cu 10 echivalenți de 2,2'-ditiobispiridină (20 mM HEPES, pH=7,9, 0,5 mM EDTA) peste noapte, la temperatura mediului înconjurător. Reactivul în exces este îndepărtat prin filtrare pe gel (Sephadex G-25,100 mM TEAB, pH=8) sau prin cromatografie de schimb ionic (Mono Q Pharmacia, 20 mM HEPES, pH=7,3, gradient 0 până la 3 M NaCI; peptida eluează la 1,5 M NaCI), pentru a obține peptidele (2-piridiltio)-Cys, (GLF-delta-SSPY, GLF-ll-SSPy, EALA-P50-SSPy, P50-SSPy).
iv) Dimerizarea peptidelor
Homodimerul din P50 (P50 dim) este obținut, lăsând să reacționeze cantități echimolare de P50-Cys-(2-piridiltio) și P50-Cys-SH în 20 mM HEPES, pH=7,3,3 zile la temperatura mediului înconjurător. Amestecul de reacție este separat pe o coloană Mono Q /HR-5/5 Pharmacia, 20 mM HEPES, pH=7,3, grandient 0,09 M până la 3 M NaCI; dimerul P50 eluează la 1,1 NaCI). Heterodimerul GIF-SS-P50 este obținut în mod analog prin reacția peptidei P50 (formă mercapto liberă) cu peptida GLF piridiltio-mod'ificată.
b) Testul Leakage Assay pentru lipozomi
Capacitatea peptidelor sintetice de a rupe lipozomi, este măsurată cu ajutorul ieșirii de substanță prin fluorescență din lipozomi, care sunt încărcați cu o concentrație de autostingere de calceină. Lipozomii sunt obținuți cu ajutorul metodei REV (“reverse phase evaporation) (Szoka și Ppahadjopoulos, 1978) cu o fază apoasă de 100 mM calceină, 375 mM Na+, 50 mM NaCI, pH=7,3 și sunt extrudați printr-un filtru de policarbonat (MacDonald și colab., 1991), pentru a obține o divizare uniformă a mărimilor. Lipozomii sunt separați prin filtrare pe gel pe Sephadex G-25 cu un tampon izo-osmotic (200 mM NaCI, 25 mM HEPES, pH=7,3) de materialul neîncorporat. Pentru testul Leakage la diferite valori pH, soluția de bază (6 μΙ/ml) se diluează în 2 x tampon de încercare (400 mM NaCI, 40 mM citrat de Na). O parte de alicotă de 100 μΙ este adăugată în câte 80 μΙ dintr-o diluție în serie a peptidei în apă într-o placă de microtitrare cu 96 de godeuri (concentrația finală în lipidă: 25 μΜ) și la 600 nm (excitație la 490 nm) pe un fotometru de fluorescență cu plăci de microtitrare se cercetează fluorescență calcelnei după 30 min de incubare, la temperatura camerei. Valoarea pentru 100% Leakage este obținută prin adaos de 1 μΙ dintr-o soluție 10% Triton X-100. Unitățile de leakage sunt calculate ca valoare reciprocă a concentrației de peptidă, la care s-a observat 50% Leakage (adică volumul în μΙ soluție de lipozomi, care sunt Uzați la 50% pro pg peptidă). Valorile sub 20 unități sunt extrapolate. Rezultatele Leakage Assays pentru lipozomi sunt reprezentate în fig.50. GFL și EALA au arătat activitatea specifică pH cea mai ridicată.
c) Testul Lyze pentru eritrocite
Eritrocite umane proaspete sunt spălate de mai multe ori cu HBS și resuspendate în 2 x tampon de test cu valoarea adecvată de pH (300 mM NaCI, 30 mM citrat de sodiu) la o concentrație de 6,6 x 107/ml. O parte de alicotă de 75 μΙ este introdusă, după o diluție în serie de câte 75 pl a peptidei în apă într-o placă de microtitrare cu 96 de godeuri (de tip con)
3170
3175
3180
3185
3190
3195
3200
3205
3210
RO 117861 Β1 și este incubată o oră, la 37°C sub agitare constantă. După îndepărtarea eritrocitelor nelizate prin centrifugare (1000 ref, 5 min) este trecut 100 pl din ce a rămas într-o placă de microtitrare și se determină absorbția de hemoglobină la 450 nm (corectura substratului la 750 nm). 100% liză se determină prin adaos de 1 pl dintr-o soluție 10% Triton X-100 înainte de centrifugare. Unitățile hemolitice se calculează ca valoare reciprocă a concentrației de peptidă la care s-a observat 50% Leakage (adică volumul în pl a soluției de eritrocite, care este lizată la 50% pro pg peptidă). Valorile sub 3 unități hemolitice sunt extrapolate. Valorile sunt redate în fig.51. Din aceasta se poate vedea că P50 și EALA-P50 prezintă valoarea cea mai ridicată specifică de pH cu privire la liză a celulelor și/sau a punerii în libertate a moleculelor mai mari cum ar fi hemoglobina. Monomerii P50 P50x și P50 SS-Py au o activitate mai scăzută. Metilina a arată activitatea cea mai ridicată, care totuși nu a fost specifică pentru valoarea acidă a pH.
d) Obținerea de complecși de combinație ADN
Complecșii ADN sunt obținuți mai întâi prin amestecarea a 6 pg pCMVL-ADN în 150 pl HBS cu 4 pg TfpL290 în 150 pl HBS și apoi,după 30 min,prin tratarea la temperatura mediului înconjurător cu 4 până la 20 pg Poly(L)Lysin290 în 100 pl HBS. După alte 30 min de incubare, la temperatura mediului înconjurător se adaugă 0,3 până la 30 pg peptidă în 100 pl HBS și este incubat.încă 30 min. Cantitatea optimă de agent endosomolitic este determinată în pretitrări, măsurând eficiența transferului de gene (vezi tabelul 3: transfer de gene în celule BNL CL.2). S-a dovedit că adaosul concomitent de polilizină și agent endoosomolitic ca și utilizarea unor volume mai ridicate pentru obținerea complecșilor 81,5 ml volum final) a dus la o eficiență de transfecție comparabilă (sau mai bună). în aceste încercări s-a mai dovedit că și substanțe nepeptidice amfipatice, acidul dezoxicolic și acidul oleic au intensificat transferul ADN.
e) Transfecția de celule
Linii de celule aderente (BNL CL.2 hepatocite respectiv celule NIH 3Tc) sunt cultivate 1 până la 2 zile înainte de transfecție în capsule pentru cultura de celule de 6 cm (mediu DMEM cu 10% FCS; 300000 celule/capsulă). Mediul este îndepărtat și se adaugă 1,5 ml DMEM + 2% FCS și 500 pl complecși de ADN. în mod alternativ se utilizează 0,5 ml DMEM + 6% FCS și 1,5 ml complecși de ADN. După o incubare de 4 h se adaugă 2 pl DMEM (18% FCS) (S-a constatat că în mod alternativ mediul poate fi înlocuit cu 4 ml DMEM cu 10% FCS), recolta de celule și încercările cu luciferază se fac la 24 h după transfecție, așa cum s-a descris. Valorile arătate pentru unitățile de lumină reprezintă activitatea luciferazei celulelor transificate. Transfecția hepatocitelor BNL CL.2 este reprezentată în fig.52.
Fig.52A: Complecșii ADN sunt obținuți, mai întâi prin amestecarea a 6 pg pCMVLADN în 250 pl HBS cu 4 pg TfpL290 în 250 pl HBS și apoi după 30 min, la temperatura mediului înconjurător se tratează cu 20 pg Poly(L) lyzin 290 în 750 pl HBS. După alte 30 min de incubare, la temperatura mediului înconjurător se adaugă cantitățile indicate în peptide în 250 pl HBS. După o incubare de încă 30 min complecșii sunt tratați cu 0,5 ml DMEM + 6% FCS și se adaugă la 450000 celule.
Fig.52b: Complecșii ADN sunt obținuți, amestecând mai întâi 6 pg pCMVL-ADN în
500 pl HBS cu 4 pg TfpL290 în 250 pl HBS și se lasă să stea 30 min,la temperatura camerei. O soluție de 500 pl de 20 pg Poly(L)lizină 290 în HBS este tratată cu cantitățile indicate de peptide în 250 pl HBS și imediat este adăugată la amestec TfpL/ADN. După alte 30 min de incubare, la temperatura mediului înconjurător complecșii sunt tratați cu 0,5 ml DMEM +
6% FCS și adăugați la 450000 celule, recolta de celule 24 h după transfecție și încercările cu luciferază sunt realizate așa cum s-a descris.
RO 117861 Β1
Experiențele realizate cu celulele NIH 3T3 sunt reprezentate în fig.53. Obținerea complecșilor A) și B) sunt aceleași ca pentru transfecția celulelor BNL CL.2.
în experiențele de cultură de celule peptidele P50 și EALA-P50 au arătat activitatea cea mai ridicată. EALA și Glf au avut o activitate medie, pe când monomerii P50 și Melittina au avut o activitate scăzută.
Exemplul 38. Transferul de gene la utilizarea unei peptide nevirale sintetice cu o prelungire de oligozină la terminalul C
O peptidă cu secvența (SECV ID NR:4) Met Ala Gin Asp lle lle Ser Thr lle Gly Asp Leu Val Lys Trp lle lle Asp Thr Val Asn Lys The Thr Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys este sintetizată și purificată după metoda descrisă în exemplul de mai înainte.
Această peptidă derivă din Staphylococcus aureus δ-toxin (SECV ID NR:3) Met Ala Gin Asp lle lle Ser Thr lle Gly Asp
Leu Val Lys Trp lle Asp Thr Val Asn Lys The Thr Lys
Lys, despre care se cunoaște, că prezintă specificitatea de rupere a membranelor la valoarea acidă a pH, este prelungită cu 10 lizine suplimentare.
Complecșii ADN sunt obținuți mai întâi prin amestecarea a 6 pg pCMVL-ADN în 170 p\ HBS cu 4 pg TfpL290 în 170 μΙ HBS și apoi, după 30 min sunt tratați, la temperatura mediului înconjurător cu circa 3 pg peptidă în 170 p\ HBS. După alte 30 min de incubare, la temperatura mediului înconjurător complecșii sunt amestecați cu 1,5 ml DMMEM + 2% FCS și se adaugă 450000 hepatocite BNL CL.2. După 2 h se adaugă 2 ml DMEM + 20% FCS, recoltarea celulelor 24 h după transfecție și măsurarea activității de luciferază este realizată ca în exemplele precedente. Activitatea luciferazei corespunzătoare extractului total este de 481000 unități de lumină.
Exemplul 39. Transfecția de hepatocite în prezența de peptide de melitină cu o coadă de oligolizină la capătul C terminal
Peptidă cu secvența (Direcția: capătul N terminal către capătul C terminal) (SECV ID NR:12)
Gly lle Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu lle Ser Trp lle Lys Arg Lys Arg Gin Gin Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys (notate cu mei I) și (SECV ID NR:13) Gly lle Gly Ala Val Leu Glu Val Leu Glu Thr Gly Leu Pro Ala Leu lle Ser Trp lle Lys Arg Lys Arg Gin Gin Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys (mutanți acizi, notați cu mei 2) sunt sintetizate, așa cum s-a descris în exemplul 38.
Complecșii ADN sunt obținuți, amestecând, mai întâi 6 pg PCMVL-ADN în 170 p\ HBS cu 4 pg TfpL290 în 170 p\ HBS și apoi, după 30 min, la temperatura mediului înconjurător se amestecă cu circa 3 pg peptidă mei 1 sau 5 pg mei 2 în 170 p\ HBS. După o incubare de alte 30 min complecșii sunt amestecați cu 1,5 ml DMEM + 2% FCS și adăugați la 450000 molecule BNL CL.2, care sunt cultivate ca în exemplul 38. Recolta de celule la 24 h după transfecție și testul de luciferază sunt realizate ca mai sus. Activitatea luciferazei, față de extractul total, este de 9200 unități de lumină (în cazul mei 1) și 9400 unități de lumină (în cazul mei 2).
Exemplul 40. Expresia interferonului alfa în celule HeLa
Celule HeLa (5 x 105 celule pro capsulă de 6 cm) sunt transificate cu plasmida pADCMV1-IFN, care codifică interferonul alfa2c sub controlul secvenței CMV Enhancer/Promotor (plasmida este descrisă în DE 4021917 A. pAD-CMVI-IFN este obținut reclonând HindlllXbal IFN-alfa20-lnsert în pAD-CMVL). Probe de 5 pg ADN în 330 μΙ HBS sunt amestecate
3265
3270
3275
3280
3285
3290
3295
3300
3305
RO 117861 Β1 cu 8 μρ TfpL în 330 μΙ HBS și lăsate să stea, timp de 30 min, la temperatura camerei. Probele 6 -10 au conținut numai 4 μς TfpL și după primele 30 min de incubare se adaugă probelor 6 și 7 câte o cotă de alicotă de P16pL (20 pg) în 160 p\ HBS și probelor 8, 9 și 10 o cotă de alicotă de pLys 290 (20 pg). După alte 30 min de incubare au fost adăugate cote de alicote de 160 HBS, conținând 10 p\ (proba 8) sau 50 p\ (proba 9 și 10) de P16 liber (pentru sinteza P16 și P16pL, vezi exemplul 13). După alte 30 min de incubare probele sunt aplicate pe celule HeLa în 2 ml DMEM/2% FCS în prezența următoarelor componente suplimentare: probele 2, 7 și 10 au conținut 100 μΜ ciorchină, probele 3 și 4 au conținut 5 și 15 μΙ adenovirus d1312 (1 x 1012 particule/ml), proba 5 a conținut 15 p\ din același virus psoraleninactivat. (I) drept control pentru stimularea producției endogene de interferon prin adenovirus, probele 11,12 și 13 s-au tratat cu cote de alicote de virus așa cum s-au tratat în exemplele 3, 4 și 5). Două ore după transfecție se adaugă celulelor 5 ml de mediu proaspăt DMEM + 10% FCS. 48 h după transfecție mediul este îndepărtat și înlocuit cu 2 ml de DMEM proaspăt + 10% FCS. Acest mediu este recoltat 72 h după transfecție și s-a efectuat un test ELISA pentru determinarea de IFN-alfa, așa cum este descris în DE 4021917 A. Cantitățile de IFN-alfa (în ng/ml) sunt reprezentate în fig.54.
în concordanță cu observațiile făcute mai înainte, care sunt făcute la utilizarea de gene-reporter de luciferază- sau beta- galactozidază, TfpL a funcționat numai slab la transferul genelor IFN în aceste celule. Prezența ciorchinei a produs un semnal demonstrabil (circa 7 ng/ml, proba 2), în schimb adenovirus d1312 a stimulat transferul de ADN într-un mod care a depins de doza respectivă (probele 3 și 4). Tratamentul acestor celule cu cantități comparabile de virus în absența complecșilor IFN-ADN nu a dus la nici un semnal demonstrabil IFN (probele 11 și 12). Transfecția cu peptida P16 endosomolitică derivată de peptida de influență (vezi, exemplul 13) ca conjugat (probele 6 și 7) sau ca peptidă legată ionic de suprafața complecșilor TfpL/ADN (probele 8,9 și 10, pentru legarea peptidelor (vezi, exemplul 37) a produs o producție demonstrabilă de interferon, care este intensificată cu conjugatul de peptidă în prezență de ciorchină (proba 7).
m o o ui o uo o m
co uo uo sO SO r*> r-
co co co co CO co co co co
co co co CO CO co 00 co co
I I + +
I +
I
+ -4. + + +
co <3> ΓΟΟ
σ>
*· V
Xi
(0 xi
Q ra
o o O o
σ> o
a> cn
V r— Z </>
ra a 2 <D o
Έ 5 Ie 5 ra S x:
RO 117861 Β1
io IO IO io b- Γ- Γ- IO IO IO IO r>-
II II II II II II II II II II II ||
I X X X X X X X X X X I
o. Q. Q. Q. Q. Q. CL Q. Q. Q. o. Q.
îi o o>
UI
<D ra φ n ra έ
o 'E '> 2 ra tr
>
£ c LU
O m o m o IA
00 co σ> o O
cn cn cn cn
co cn cn cn cn cn
co co h*
o m O m o
CN CM co CO
Si- si- sT
CO CO CO co co co
xi ra 8 ’co*
c ω
m c
T“ 0) <0 7
CD E V 0)
□ 0)
ϋ> c v
c 2 uT
□ “5 'co* l·· '«« Φ (0 CO UI
(0
□ V“
o <0 0)
θ' X m 0>
c IO ¢0 r σ>
x> <Q τ~
CM Φ 8 'Ξ. φ
0) X Ο)
0) O) «θ' <0
□ >. C
«* o Φ
xi I <n ΰ>
(0 1— a
O </> E 2
o Φ φ □
<0* φ Q £
*dî Ό • -
S Q V· V“
X) O O σ> σ> σ> ο
CQ m τ“ τ~
1? bII bII ιο II
X X X X
ο. Q. Q. CL
•2
Ε ui φ X
c c
CM « Q.
Φ Ό >» o X a
‘Ε E E
o <o ra
& X co
i .£ φ g «o □ E o ra a)
Φ c Ș n
u. δ
ιο 00 ΙΟ m
ο 00 00
τ- σ> σ> τ-
ο C ο ο ο Ο)
φ C C Ο)
<0 φ ra
co <0 CL -
£ ϋ xi co
'5> <7> '«θ’ ο
ν> <0 ο ω <0 ο
Φ ο Φ Ο
’6> C E? 'ro ΧΖ
< < < <
οο οο σ> r-
xi
(0
V Ο
σ> ο σ>
σ> (θ’ σ>
V
C
λ*· Φ ο ι_ <υ
<0 <0
<0 (0 (Λ
LU Σ LU
χ: χ: χ: χ: χ: ΧΖ «Μ χ: A χ: χ
ο. ο. ο. ο. ο. Ο. CL C ο. ο.
Ε Ε Ε Ε ε φ Ε Ε ρ ε Ε
<0 (0 ro ro 4-· <0 42 (0 co Ε φ φ
,χ X .>$ X '□ X χ Ψ X σ χ Ό
φ φ φ - 3 Φ Μ Φ ω φ =â 42 φ ο φ φ Ό φ
X 1 X I X 1 χ >ro χ >2 X X φ X « X <α
42 £ 42 42 ό 42 g 1 ro s= φ S a= ο 42 3 Ό □ Ό
<0 ro ro <0 ο. <0 ο. co φ φ φ C φ C
ί ί co ιο
CN CXI
φ Ό ‘C >
ο ιη O
<r uo
co <n co
o m
LH SD \O
•4· sr
co co co
RO 117861 Β1
Tabelul 3
3470
Transfecție de celule BNL CL.2 (6 pg pCM-L ADN, 4 μ TfpL29O)
pLys O/zg 0,3 pg 1 P9 3 Mg 10/zg 20 Mg 30 Mg
0m9 P50 dim GLF Melitin 160 330 490 0 540 290 0 300 340 0 70 425
4 pg P50 dim GLF EALA 3100 670 3140 200 600 150 430 170 560 180 410
10 pg P50 dim GLF EALA 5700 1950 2120 16600 16800 217000 179300 760 215000 181700 1330 1980 76360 3424800
20 pg P50 dim GLF EALA Melitin 3200 23300 418400 191000 6545 185100 320600 181000 7054800 294200 273600 9344000
Desoxychoic acid 6730 34700 16000
Oleic acid 12200 11900 4100
LISTA SECVENȚELOR
3475
3480
3485
3490 (ii) TITLUL INVENȚIEI:
Compoziție pentru introducerea complecșilor de acid nucleic în celule eucariotice superioare (iii) NUMĂRUL SECVENȚELOR: 13 (iv) COMPUTER READABLE FORM:
(A) MEDIUM ΤΥΡΕ: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patent In Release # 1,0, Version # 1,25 (EPO) (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV ID NR: 1:
(i) CARACTERIZAREA SECVENȚEI (A) LUNGIME: 23 aminoacizi (B) TIP: Aminoacid (C) FORMA LINIEI: linie individuală (D) TOPOLOGIE: ambele (ii) FELUL MOLECULEI: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID NR:1:
Gly Leu Phe Glu Ala lle Ala Gly Phe lle Glu Asn Gly Trp
5 10
Glu Gly Met lle Asp Gly Gly Gly Cys
20
3495
3500
3505
3510
RO 117861 Β1
(2) (i) INFORMAȚIE PENTRU SECV ID NR:2: CARACTERIZAREA SECVENȚEI (A) LUNGIME: 23 aminoacizi (B) TIP: Aminoacid (C) FORMA LINIEI: linie individuală (D) TOPOLOGIE: ambele
(ii) FELUL MOLECULEI: peptidă'
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID NR:2:
Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp 1 5 10
Glu Gly Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys
15 20
(2) (i) INFORMAȚIE PENTRU SECV ID NR:3 CARACTERIZAREA SECVENȚEI (A) LUNGIME: 26 aminoacizi (B) TIP: Aminoacid (C) FORMA LINIEI: linie individuală (D) TOPOLOGIE: ambele
(ii) FELUL MOLECULEI: peptidă
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID NR:3: Met Ala Gin Asp Ile Ile Ser Thr Ile Gly Asp Leu Val Lys 1 5 10
Trp Ile Ile Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys
15 20 25
(2) (i) INFORMAȚIE PENTRU SECV ID NR:4: CARACTERIZAREA SECVENȚEI (A) LUNGIME: 36 aminoacizi (B) TIP: Aminoacid (C) FORMA LINIEI: linie individuală (D) TOPOLOGIE: ambele
(ii) FELUL MOLECULEI: peptidă
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID NR:4:
Met Ala Gin Asp Ile Ile Ser Thr Ile Gly Asp Leu Val Lys 1 510
Trp Ile Ile Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys Lys Lys 15 2025
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
3035
(2) (0 INFORMAȚIE PENTRU SECV ID NR:5: CARACTERIZAREA SECVENȚEI (A) LUNGIME: 34 aminoacizi (B) TIP: Aminoacid (C) FORMA LINIEI: linie individuală (D) TOPOLOGIE: ambele
(ii) FELUL MOLECULEI: peptidă
RO 117861 Β1 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID NR:5:
Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala 1 5 10
Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu 15 20 25
Ala Ala Gly Gly Ser Cys 30 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV ID NR:6:
(1) CARACTERIZAREA SECVENȚEI (A) LUNGIME: 35 aminoacizi (B) TIP: Aminoacid (C) FORMA LINIEI: linie individuală (D) TOPOLOGIE: ambele (ii) FELUL MOLECULEI: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID NR:6:
Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu 1 510
Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala 15 2025
Leu Ala ala Gly Gly Ser Cys
3035 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV ID NR:7:
(1) CARACTERIZAREA SECVENȚEI (A) LUNGIME: 35 aminoacizi (B) TIP: Aminoacid (C) FORMA LINIEI: linie individuală (D) TOPOLOGIE: ambele (ii) FELUL MOLECULEI: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID NR:7:
Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu 1 510
Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala 15 2025
Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys
3035 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV ID NR:8:
(i) CARACTERIZAREA SECVENȚEI (A) LUNGIME: 34 aminoacizi (B) TIP: Aminoacid (C) FORMA LINIEI: linie individuală (D) TOPOLOGIE: ambele (ii) FELUL MOLECULEI: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID NR:8:
Gly Leu Phe Glu Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala
5 10
Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu
20 25
Ala Ala Gly Gly Ser Cys
3565
3570
3575
3580
3585
3590
3595
3600
3605
3610
RO 117861 Β1 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV ID NR:9:
(1) CARACTERIZAREA SECVENȚEI (A) LUNGIME: 34 aminoacizi (B) TIP: Aminoacid (C) FORMA LINIEI: linie individuală (D) TOPOLOGIE: ambele (ii) FELUL MOLECULEI: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID NR:9:
Gly Leu Phe Gly Ala lle Ala Gly Phe lle Glu Asn Gly Trp 1 5 10
Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu 15 20 25
Ala Ala Gly Gly Ser Cys (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV ID NR:10:
(1) CARACTERIZAREA SECVENȚEI (A) LUNGIME: 34 aminoacizi (B) TIP: Aminoacid (C) FORMA LINIEI: linie Individuală (D) TOPOLOGIE: ambele (îi) FELUL MOLECULEI: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI; SECV ID NR:10:
Gly Leu Phe Glu Ala lle Glu Gly Phe lle Glu Asn Gly Trp 1 5 10
Gly Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu 15 20 25
Ala Ala Gly Gly Ser Cys (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV ID NR:11:
(1) CARACTERIZAREA SECVENȚEI (A) LUNGIME: 23 aminoacizi (B) TIP: Aminoacid (C) FORMA LINIEI: linie individuală (D) TOPOLOGIE: ambele (ii) FELUL MOLECULEI: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID NR:11:
Gly Leu Phe Glu Ala lle Glu Gly Phe lle Glu Asn Gly Trp 1 5 10
Glu Gly Met lle Asp Gly Gly Gly Cys
20 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV IDNR: 12:
(i) CARACTERIZAREA SECVENȚEI (A) LUNGIME: 36 aminoacizi (B) TIP: Aminoacid (C) FORMA LINIEI: linie individuală (D) TOPOLOGIE: ambele
RO 117861 Β1 (ii) FELUL MOLECULEI: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID NR:12:
Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Gly Leu Pro
510
Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gin Gin Lys Lys
2025
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
3035 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV ID NR:13:
(i) CARACTERIZAREA SECVENȚEI (A) LUNGIME: 36 aminoacizi (B) TIP: Aminoacid (C) FORMA LINIEI: linie individuală (D) TOPOLOGIE: ambele (ii) FELUL MOLECULEI: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID NR:13: Gly Ile Gly Ala Val Leu Glu Val Leu Glu Thr Gly Leu Pro 1 510
Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gin Gin Lys Lys
2025
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys

Claims (111)

  1. Revendicări
    1. Complex de acid nucleic, caracterizat prin aceea că, cuprinde unul sau mai mulți acizi nucleici, o primă substanță cu afinitate pentru acid nucleic și un agent endozomolitic care are el însuși un domeniu de legare la acidul nucleic sau este legat la o a doua substanță cu afinitate pentru acidul nucleic și care poate fi identică sau diferită față de prima substanță, eventual, un factor de internalizare care este legat la prima substanță cu afinitate pentru acidul nucleic, raportul molar factor de internalizare/substanța cu afinitate pentru acidul nucleic este de la 10:1 la 1:10.
  2. 2. Complex, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, cuprinde un acid nucleic activ terapeutic.
  3. 3. Complex, conform revendicării 2, caracterizat prin aceea că, acidul nucleic cuprinde una sau mai multe molecule de ADN eficiente în genoterapie.
  4. 4. Complex, conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că, molcula de ADN codifică Factorul VIII a cărui lipsă duce la apariția hemofiliei A.
  5. 5. Complex, conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că, moleculele de ADN codifică citochine.
  6. 6. Complex, conform revendicării 2, caracterizat prin aceea că se folosește în preparatele farmaceutice împreună cu un purtător acceptabil farmaceutic.
  7. 7. Complex, conform revendicării 2, caracterizat prin aceea că, acidul nucleic cuprinde o secvență de nucleotidă de la care se pot transcrie molecule de ARN, care inhibă în mod specific funcțiile celulare.
  8. 8. Complex, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, substanța cu afinitate pentru acidul nucleic este un polication organic.
    3665
    3670
    3675
    3680
    3685
    3690
    3695
    3700
    3705
    3710
    RO 117861 Β1
  9. 9. Complex, conform revendicării 8, caracterizat prin aceea că, policationul este polilizină.
  10. 10. Complex, conform revendicării 9, caracterizat prin aceea că, policationul este polietilenimina.
  11. 11. Complex, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, agentul endozomolitic și factorul de internalizare sunt ambele legate la aceeași substanță cu afinitate pentru acidul nucleic.
  12. 12. Complex, conform revendicării 9, caracterizat prin aceea că, agentul endozomolitic și factorul de internalizare sunt legați la polilizină.
  13. 13. Complex,conform revendicării 12, caracterizat prin aceea că, polilizină este legată covalent.
  14. 14. Complex, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, cuprinde un conjugat care constă dintr-un agent endozomolitic și o substanță cu afinitate pentru acidul nucleic.
  15. 15. Complex, conform revendicării 14, caracterizat prin aceea că, agentul endozomolitic nu este el însuși un factor de internalizare pentru celula care va fi transfectată.
  16. 16. Complex, conform revendicării 15, caracterizat prin aceea că, agentul endozomolitic este un virus care nu este un factor de internalizare pentru o celulă umană.
  17. 17. Complex,conform revendicării 14, caracterizat prin aceea că, conjugatul este constituit dintr-un virus sau un agent endozomolitic polipeptidic și o poliamină care sunt legate enzimatic în prezența unei transglutaminaze.
  18. 18. Complex, conform revendicării 14, caracterizat prin aceea că, conjugatul este constituit dintr-un virus sau un agent endozomolitic polipeptidic și o poliamină legate chimic.
  19. 19. Complex, conform revendicării 14, caracterizat prin aceea că, conjugatul este constituit dintr-un virus modificat cu biotin care este legat la o poliamină cuplată la streptavidină.
  20. 20. Complex, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, agentul endozomolitic este un virus sau o componentă de virus.
  21. 21. Complex, conform revendicării 20, caracterizat prin aceea că, agentul endozomolitic este un adenovirus.
  22. 22. Complex, conform revendicării 21, caracterizat prin aceea că, adenovirusul este o mutantă.
  23. 23. Complex, conform revendicării 22, caracterizat prin aceea că, adenovirusul este o mutantă incompetentă la replicație.
  24. 24. Complex, conform revendicării 22, caracterizat prin aceea că, adenovirusul prezintă una sau mai multe mutații și/sau deleții în regiunea E1A.
  25. 25. Complex, conform revendicării 21, caracterizat prin aceea că, adenovirusul este inactivat.
  26. 26. Complex, conform revendicării 25, caracterizat prin aceea că, adenovirusul este inactivat prin UV cu unde scurte.
  27. 27. Complex, conform revendicării 25, caracterizat prin aceea că, adenovirusul este inactivat prin UV/psoralen.
  28. 28. Complex, conform revendicării 25, caracterizat prin aceea că, adenovirusul este inactivat cu formaldehidă.
  29. 29. Complex, conform revendicării 20, caracterizat prin aceea că, virusul este un virus picoma.
  30. 30. Complex, conform revendicării 29, caracterizat prin aceea că, virusul picoma este un rinovirus opțional inactivat.
    RO 117861 Β1
    3760
  31. 31. Complex, conform revendicărilor 1 și 20, caracterizat prin aceea că, agentul endozomolitic este un virus care produce infecție pentru o specie diferită de cea umană.
  32. 32. Complex, conform revendicării 31, caracterizat prin aceea că, virusul este un adenovirus de pasăre.
  33. 33. Complex, conform revendicării 32, caracterizat prin aceea că, adenovirusul este virusul Chick Embryo Lethal Orphan.
  34. 34. Complex, conform revendicării 20, caracterizat prin aceea că, agentul endozomolitic este o peptidă virală endozomolitică opțional modificată.
  35. 35. Complex, conform revendicării 34, caracterizat prin aceea că, peptida endozomolitică este o peptidă HA2 influența-hemaglutinină.
  36. 36. Complex, conform revendicării 35, caracterizat prin aceea că, peptida are secvențaGly-Leu-Phe-Glu-Ala-lle-Ala-Gly-Phe-lle-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-lle-Asp-GlyGly-Gly-Cys.
  37. 37. Complex, conform revendicării 35, caracterizat prin aceea că, peptida are secvențaGly-Leu-Phe-Gly-Ala-lle-Ala-Gly-Phe-lle-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-lle-Asp-GlyGly-Gly-Cys.
  38. 38. Complex, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, agentul endozomolitic este o peptidă naturală sau sintetică nevirală, opțional modificată, care are capacitatea de rupere a membranelor celulare, această capacitate fiind determinată prin proba de curgere a lipozomului sau proba de liză a eritocitei.
  39. 39. Complex, conform revendicării 38, caracterizat prin aceea că, peptida are secvențaGly-Leu-Phe-Glu-Ala-lle-Glu-Gly-Phe-lle-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-lle-Asp-GlyGly-Gly-Cys.
  40. 40. Complex, conform revendicării 38, caracterizat prin aceea că, peptida este un homo- sau un heterodimer al peptidei Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-lle-Glu-Gly-Phe-lle-Glu-Asn-GlyTrp-Glu-Gly-Met-lle-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
  41. 41. Complex, conform revendicării 38, caracterizat prin aceea că, peptida are secvența Trp-Glu-Ala-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-His-Leu-Ala-GluAla-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys.
  42. 42. Complex, conform revendicării 38, caracterizat prin aceea că, peptida are secvența Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-His-Leu-AlaGlu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Gly-Ser-Cys.
  43. 43. Complex, conform revendicării 34, caracterizat prin aceea că, peptida prezintă un domeniu de legare la acidul nucleic.
  44. 44. Complex, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, peptida prezintă un domeniu de legare la acidul nucleic.
  45. 45. Complex, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, factorul de internalizare este transferina.
  46. 46. Complex, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, factorul de internalizare este un ligand pentru celule T.
  47. 47. Complex, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, factorul de internalizare este un ligand pentru celule B.
  48. 48. Complex, conform revendicării 47, caracterizat prin aceea că, factorul de internalizare este o imunoglobulină.
  49. 49. Complex, conform revendicării 46, caracterizat prin aceea că, ligandul este o anti-imunoglobulină.
  50. 50. Complex, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, factorul de internalizare este un ligand pentru hepatocite.
    3765
    3770
    3775
    3780
    3785
    3790
    3795
    3800
    3805
    RO 117861 Β1
  51. 51. Complex, conform revendicării 50, caracterizat prin aceea că, factorul de internalizare este un ligand pentru receptorul de asialglicoproteină.
  52. 52. Complex, conform revendicării 51, caracterizat prin aceea că, factorul de internalizare este o tetra-galactoză-polilizină.
  53. 53. Complex, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, factorul de internalizare este o lectină.
  54. 54. Complex, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, factorul de internalizare este o lipoproteină de mică densitate.
  55. 55. Compoziție pentru introducerea în celule eucariote superioare de complecși ai acizilor nucleici,caracterizată prin aceea că este constituită dintr-un complex de acid nucleic, definit în revendicarea 1, un agent endozomolitic care, ca parte componentă a complexului de acid nucleic sau per se, are capacitate de a fi preluat de celulele eucariote și pune în libertate, în citoplasmă, conținutul endozomilor în care complexul este localizat după intrarea în celulă, raportul molar factor de internalizare/substanța cu afinitate pentru acidul nucleic fiind de la 10:1 la 1:10.
  56. 56. Compoziție, conform revendicării 55, caracterizată prin aceea că, agentul endozomolitic este un virus care, el însuși, este un factor de internalizare pentru celulele eucariote superioare.
  57. 57. Compoziție, conform revendicării 55, caracterizată prin aceea că, agentul endozomolitic are el însuși un domeniu de legare la acidul nucleic sau este legat de o substanță cu afinitate pentru acidul nucleic și are capacitatea de a fi intemalizat în celule drept componentă a complexului de nucleic, complexul putând eventual, conține în plus un factor de internalizare pentru celulele respective.
  58. 58. Compoziție, conform revendicării 57, caracterizată prin aceea că, agentul endozomolitic este legat covalent de o substanță cu afinitate pentru acidul nucleic.
  59. 59. Compoziție, conform revendicării 57, caracterizată prin aceea că, agentul endozomolitic este legat necovalent de o substanță cu afinitate pentru acidul nucleic.
  60. 60. Compoziție,conform revendicării 59, caracterizată prin aceea că, legătura are loc printr-o punte biotină-streptavidină.
  61. 61. Compoziție, conform revendicării 59, caracterizată prin aceea că, legătura este ionică.
  62. 62. Compoziție, conform revendicării 56, caracterizată prin aceea că, agentul endozomolitic este un virus sau o componentă de virus.
  63. 63. Compoziție, conform revendicării 62, caracterizată prin aceea că, agentul endozomolitic este un adenovirus.
  64. 64. Compoziție, conform revendicării 63, caracterizată prin aceea că, adenovirusul este o mutantă.
  65. 65. Compozite, conform revendicării 64, caracterizată prin aceea că, adenovirusul este o mutantă incompetentă la replicație.
  66. 66. Compoziție, conform revendicării 64, caracterizată prin aceea că, adenovirusul prezintă una sau mai multe mutații și/sau deleții în regiunea E1A.
  67. 67. Compoziție, conform revendicării 63, caracterizată prin aceea că, adenovirusul este inactivat.
  68. 68. Compoziție, conform revendicării 67, caracterizată prin aceea că, adenovirusul este inactivat prin UV cu unde scurte.
  69. 69. Compoziție, conform revendicării 67, caracterizată prin aceea că, adenovirusul este inactivat prin UV/psoralen.
  70. 70. Compoziție, conform revendicării 67, caracterizată prin aceea că, adenovirusul este inactivat cu formaldehidă.
    RO 117861 Β1
  71. 71. Compoziție, conform revendicării 56, caracterizată prin aceea că, virusul este un virus picoma.
  72. 72. Compoziție, conform revendicării 71, caracterizată prin aceea că, virusul picoma este un rinovirus opțional inactivat.
  73. 73. Compoziție, conform revendicării 56, caracterizată prin aceea că, agentul endozomolitic este un virus care produce infecție pentru o specie diferită de cea umană.
  74. 74. Compoziție, conform revendicării 73, caracterizată prin aceea că, virusul este un adenovirus de pasăre.
  75. 75. Compoziție, conform revendicării 74, caracterizată prin aceea că, adenovirusul este virusul Chick Embryo Lethal Orphan.
  76. 76. Compoziție, conform revendicării 57, caracterizată prin aceea că, agentul endozomolitic este o peptidă virală endozomolitică opțional modificată.
  77. 77. Compoziție, conform revendicării 76, caracterizată prin aceea că, peptida endozomolitică este o peptidă HA2 influența-hemaglutinină.
  78. 78. Compoziție, conform revendicării 77, caracterizată prin aceea că, peptida are secvențaGly-Leu-Phe-Glu-Ala-lle-Ala-Gly-Phe-lle-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-lle-Asp-GlyGly-GÎy-Cys.
  79. 79. Compoziție, conform revendicării 77, caracterizată prin aceea că, peptida are secvențaGly-Leu-Phe-Gly-Ala-lle-Ala-Gly-Phe-lle-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-lle-Asp-GlyGly-Gly-Cys.
  80. 80. Compoziție, conform revendicării 55, caracterizată prin aceea că, agentul endozomolitic este o peptidă naturală sau sintetică nevirală, opțional modificată, care are capacitatea de rupere a membranelor celulare, această capacitate fiind determinată prin proba de curgere a lipozomului sau proba de liză a eritocitei.
  81. 81. Compoziție, conform revendicării 80, caracterizată prin aceea că, peptida are secvențaGly-Leu-Phe-Glu-Ala-lle-Glu-Gly-Phe-lle-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-lle-Asp-GlyGly-Gly-Cys.
  82. 82. Compoziție, conform revendicării 80, caracterizată prin aceea că, peptida este un homo- sau un heterodimer al peptidei Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-lle-Glu-Gly-Phe-lle-Glu-AsnGly-Trp-Glu-Gly-Met-lle-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
  83. 83. Compoziție, conform revendicării 80, caracterizată prin aceea că, peptida are secvența Trp-Glu-Ala-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-His-Leu-Ala-GluAla-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys.
  84. 84. Compoziție, conform revendicării 80, caracterizată prin aceea că, peptida are secvența Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-His-Leu-AlaGlu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Gly-Ser-Cys.
  85. 85. Compoziție, conform revendicării 76, caracterizată prin aceea că, peptida prezintă un domeniu de legare la acidul nucleic.
  86. 86. Compoziție, conform revendicării 85, caracterizată prin aceea că, peptida prezintă o prelungire de oligolizină.
  87. 87. Compoziție, conform revendicării 57, caracterizată prin aceea că, factorul de internalizare este transferina.
  88. 88. Compoziție, conform revendicării 57, caracterizată prin aceea că, factorul de internalizare este un ligand pentru celule T.
  89. 89. Compoziție, conform revendicării 57, caracterizată prin aceea că, factorul de internalizare este un ligand pentru celule B.
  90. 90. Compoziție, conform revendicării 89, caracterizată prin aceea că, factorul de internalizare este o imunoglobulină.
    3860
    3865
    3870
    3875
    3880
    3885
    3890
    3895
    3900
    RO 117861 Β1
  91. 91. Compoziție, conform revendicării 88, caracterizată prin aceea că, ligandul este o anti-imunoglobulină.
  92. 92. Compoziție, conform revendicării 57, caracterizată prin aceea că, factorul de intemalizare este un ligand pentru hepatocite.
  93. 93. Compoziție, conform revendicării 92, caracterizată prin aceea că, factorul de intemalizare este un ligand pentru receptorul de asialglicoproteină.
  94. 94. Compoziție, conform revendicării 93, caracterizată prin aceea că, factorul de intemalizare este o tetra-galactoză-polilizină.
  95. 95. Compoziție, conform revendicării 57, caracterizata prin aceea că, factorul de intemalizare este o lectină.
  96. 96. Compoziție, conform revendicării 57, caracterizată prin aceea că, factorul de intemalizare este o lipoproteină de mică densitate.
  97. 97. Compoziție, conform revendicării 55, caracterizată prin aceea că, se introduce în celulele eucariote superioare in vitro sau ex vivo.
  98. 98. Compoziție, conform revendicării 97, caracterizată prin aceea că, celulele sunt celule de măduvă osoasă.
  99. 99. Compoziție, conform revendicării 97, caracterizată prin aceea că, celulele sunt celule umane.
  100. 100. Compoziție, conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că, celulele sunt celule tumorale.
  101. 101. Compoziție, conform revendicării 99, caracterizată prin aceea că, celulele sungt mioblaste.
  102. 102. Compoziție, conform revendicării 99, caracterizată prin aceea că, celulele sunt fibroblaste.
  103. 103. Compoziție, conform revendicării 99, caracterizată prin aceea că, celulele sunt hepatocite.
  104. 104. Compoziție, conform revendicării 99, caracterizată prin aceea că, celulele sunt celule endoteliale.
  105. 105. Compoziție, conform revendicării 99, caracterizată prin aceea că, celulele sunt celule ale căilor respiratorii.
  106. 106. Compoziție, conform revendicării 105, caracterizată prin aceea că, celulele tumorale sunt tratate ex vivo, iar ADN-ul codifică una sau mai multe substanțe imunomodulare, preferabil, citochine.
  107. 107. Compoziție, conform revendicării 55, caracterizată prin aceea că se utilizează sub forma unei truse de transfecție constituită dintr-un,prim recipient conținând o substanță cu afinitate pentru acidul nucleic care este opțional cuplată la un factor de intemalizare pentru o celulă eucariotă superioară și,un al doilea recipient care conține un virus capabil să pătrundă el însuși în celulele eucariote superioare și să elibereze conținutul ribozomilor în citoplasmă.
  108. 108. Compoziție, conform revendicării 107, caracterizată prin aceea că, al doilea recipient care conține un virus este capabil să pătrundă el însuși în celulele eucariote superioare ca un component al complexului de acid nucleic și să elibereze conținutul ribozomilor în citoplasmă.
  109. 109. Compoziție, conform revendicării 108, caracterizată prin aceea că se folosește sub forma unei truse de transfecție care conține, într-un prim recipient un conjugat adenovirus polilizină cuplat la transglutaminază.
    RO 117861 Β1
  110. 110. Compoziție, conform revendicării 55, caracterizată prin aceea că se folosește sub forma unei truse de transfecție care conține, într-un prim recipient un agent endozomolitic de biotin modificat și, un al doilea recipient care conține o substanță cu afinitate pentru acidul nucleic de tip streptovidină modificată.
  111. 111. Compoziție, conform revendicării 110, caracterizată prin aceea că se folosește sub forma unei truse de transfecție, având un prim recipient care conține un adenovirus biotinilat și, un al doilea recipient care conține polilizină-streptovidină.
RO94-00499A 1991-09-30 1992-09-28 Complex de acid nucleic si compozitie pentru introducerea acestuia in celulele eucariote superioare RO117861B1 (ro)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US76778891A 1991-09-30 1991-09-30
US76803991A 1991-09-30 1991-09-30
US82710292A 1992-01-30 1992-01-30
US82710392A 1992-01-30 1992-01-30
US86475992A 1992-04-07 1992-04-07
US93778892A 1992-09-02 1992-09-02
PCT/EP1992/002234 WO1993007283A1 (de) 1991-09-30 1992-09-28 Zusammensetzung für das einbringen von nukleinsäure-komplexen in höhere eukaryotische zellen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RO117861B1 true RO117861B1 (ro) 2002-08-30

Family

ID=27560281

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RO94-00499A RO117861B1 (ro) 1991-09-30 1992-09-28 Complex de acid nucleic si compozitie pentru introducerea acestuia in celulele eucariote superioare

Country Status (28)

Country Link
US (4) US5547932A (ro)
EP (2) EP0545016A1 (ro)
JP (1) JPH10506001A (ro)
CN (1) CN1059705C (ro)
AT (1) ATE215990T1 (ro)
AU (1) AU671084B2 (ro)
BG (1) BG62740B1 (ro)
BR (1) BR9206559A (ro)
CA (1) CA2118816C (ro)
CZ (1) CZ293141B6 (ro)
DE (1) DE59209951D1 (ro)
DK (1) DK0607206T3 (ro)
EE (1) EE03195B1 (ro)
ES (1) ES2173083T3 (ro)
FI (1) FI941474A0 (ro)
HK (1) HK1013104A1 (ro)
HU (2) HU218846B (ro)
IL (1) IL103171A (ro)
MX (1) MX9205543A (ro)
NO (1) NO316744B1 (ro)
NZ (1) NZ244306A (ro)
PL (1) PL180304B1 (ro)
PT (1) PT607206E (ro)
RO (1) RO117861B1 (ro)
SG (1) SG44680A1 (ro)
SI (1) SI9200236B (ro)
SK (1) SK281682B6 (ro)
WO (1) WO1993007283A1 (ro)

Families Citing this family (416)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5981273A (en) * 1991-09-30 1999-11-09 Boehringer Ingelheim Int'l. Gmbh Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
NZ244306A (en) * 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
CA2131620A1 (en) * 1992-03-20 1993-09-30 Louis C. Smith A dna transporter system and method of use
ES2221920T3 (es) * 1992-04-03 2005-01-16 The Regents Of The University Of California Sistema de liberacion de polinucleotidos de autoensamblaje que comprende un peptido cationico anfipatico.
WO1994006923A1 (en) * 1992-09-24 1994-03-31 The University Of Connecticut Modification of a virus to redirect infectivity and enhance targeted delivery of polynucleotides to cells
HUT73383A (en) * 1993-03-19 1996-07-29 Boehringer Sohn Ingelheim Process for preparing cancer vaccines
DE4311651A1 (de) * 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
WO1995002698A1 (en) * 1993-07-12 1995-01-26 Life Technologies, Inc. Composition and methods for transfecting eukaryotic cells
DE4335025A1 (de) * 1993-10-14 1995-04-20 Boehringer Ingelheim Int Endosomolytisch wirksame Partikel
EP0648493A1 (en) * 1993-10-19 1995-04-19 Tadatsugu Prof. Dr. Taniguchi A method to reverse the phenotype of transformed cells by the transcription factor IRF-1
US5928944A (en) * 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection
MX9603866A (es) * 1994-03-18 1997-03-29 Boehringer Ingelheim Int Procedimiento para el tratamiento de celulas eucarioticas.
AU2194895A (en) * 1994-03-25 1995-10-17 Uab Research Foundation, The Composition and methods for creating syngeneic recombinant virus-producing cells
US5670347A (en) 1994-05-11 1997-09-23 Amba Biosciences Llc Peptide-mediated gene transfer
US6284880B1 (en) 1994-05-30 2001-09-04 Boehringer Ingelheim International Gmbh Chicken embryo lethal orphan (CELO) virus GAM-1
DE4418965A1 (de) * 1994-05-31 1995-12-07 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
DE4426429A1 (de) * 1994-07-26 1996-02-01 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum Einführen von DNA in höhere eukaryotische Zellen
US6468981B1 (en) 1994-07-29 2002-10-22 Emory University Compositions and methods for targeting pharmaceutically active materials to cells containing androgen receptors
US5525606A (en) 1994-08-01 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Substituted 06-benzylguanines and 6(4)-benzyloxypyrimidines
US5965541A (en) * 1995-11-28 1999-10-12 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5962311A (en) * 1994-09-08 1999-10-05 Genvec, Inc. Short-shafted adenoviral fiber and its use
US5846782A (en) 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
US6465253B1 (en) 1994-09-08 2002-10-15 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5559099A (en) * 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
US5837533A (en) * 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
EP0785276A4 (en) * 1994-09-29 2002-01-09 Ajinomoto Kk MODIFICATION OF A PEPTIDE AND A PROTEIN
US6221959B1 (en) 1994-11-18 2001-04-24 Supratek Pharma, Inc. Polynucleotide compositions
US6359054B1 (en) 1994-11-18 2002-03-19 Supratek Pharma Inc. Polynucleotide compositions for intramuscular administration
US6008202A (en) * 1995-01-23 1999-12-28 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5795587A (en) * 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US6127525A (en) * 1995-02-21 2000-10-03 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same
US5770442A (en) 1995-02-21 1998-06-23 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same
AU5103996A (en) * 1995-03-09 1996-10-02 Bavarian Nordic Research Institute A/S Vectors carrying therapeutic genes encoding antimicrobial peptides for gene therapy
WO1996029423A1 (en) * 1995-03-20 1996-09-26 Baylor College Of Medicine Compositions and methods for inducing infection by retroviral vectors outside of their host range
DE19510344C1 (de) * 1995-03-22 1996-11-07 Boehringer Ingelheim Int Verwendung einer Tumorvakzine
US6420549B1 (en) 1995-06-06 2002-07-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide analogs having modified dimers
AU705035B2 (en) * 1995-06-07 1999-05-13 Baylor College Of Medicine Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
US6051429A (en) * 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US20030069173A1 (en) * 1998-03-16 2003-04-10 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced transfections
AU5979296A (en) * 1995-06-07 1996-12-30 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US6783980B2 (en) * 1995-06-15 2004-08-31 Crucell Holland B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
ATE278794T1 (de) * 1995-06-15 2004-10-15 Crucell Holland Bv Verpackungssysteme für humane, menschliche adenoviren, zur verwendung in die gentherapie
US5908777A (en) * 1995-06-23 1999-06-01 University Of Pittsburgh Lipidic vector for nucleic acid delivery
GB9515356D0 (en) * 1995-07-26 1995-09-20 Medical Res Council Improvements in or relating to delivery of nucleic acid
US5770720A (en) * 1995-08-30 1998-06-23 Barnes-Jewish Hospital Ubiquitin conjugating enzymes having transcriptional repressor activity
IL115199A (en) 1995-09-07 2005-05-17 Opperbas Holding Bv Composition comprising a polynucleic acid molecule in a liposome and method using said composition
CA2190304A1 (en) * 1995-12-15 1997-06-16 Elazar Rabbani Property effecting and/or property exhibiting compositions for therapeutic and diagnostic uses
AU2112697A (en) * 1996-02-09 1997-08-28 Pi-Wan Cheng Receptor ligand-facilitated delivery of biologically active molecules
DE19605548A1 (de) * 1996-02-15 1997-09-04 Boehringer Ingelheim Int Zusammensetzung für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen
CA2248538A1 (en) 1996-03-14 1997-09-18 The Immune Response Corporation Targeted delivery of genes encoding interferon
DE19615803A1 (de) 1996-04-20 1997-10-23 Boehringer Ingelheim Int CELO-Virus
US7812149B2 (en) 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US9096636B2 (en) 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
DE69725878T2 (de) 1996-08-13 2004-07-29 Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville Zusammensetzungen zur polynukleotidabgabe
DE19632532A1 (de) * 1996-08-13 1998-02-19 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur Herstellung von Säugetieren mit definierten genetischen Eigenschaften
US5948681A (en) * 1996-08-14 1999-09-07 Children's Hospital Of Philadelphia Non-viral vehicles for use in gene transfer
CN1181422A (zh) * 1996-10-31 1998-05-13 上海市肿瘤研究所 与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体
US6544523B1 (en) 1996-11-13 2003-04-08 Chiron Corporation Mutant forms of Fas ligand and uses thereof
US5965441A (en) * 1996-11-13 1999-10-12 The General Hospital Coporation HSV/AAV hybrid amplicon vectors
US20060002949A1 (en) 1996-11-14 2006-01-05 Army Govt. Of The Usa, As Rep. By Secretary Of The Office Of The Command Judge Advocate, Hq Usamrmc. Transcutaneous immunization without heterologous adjuvant
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
US6797276B1 (en) 1996-11-14 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Use of penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response
US6153596A (en) * 1996-12-18 2000-11-28 Emory University Polycationic oligomers
JP4289687B2 (ja) * 1997-03-14 2009-07-01 ザ チルドレンズ ホスピタル オブ フィラデルフィア 血友病の治療のための遺伝子治療で使用する方法と組成物
US20040009166A1 (en) * 1997-04-30 2004-01-15 Filpula David R. Single chain antigen-binding polypeptides for polymer conjugation
CA2288992C (en) * 1997-04-30 2012-06-12 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
US6635623B1 (en) 1997-06-13 2003-10-21 Baylor College Of Medicine Lipoproteins as nucleic acid vectors
US20050096288A1 (en) * 1997-06-13 2005-05-05 Aragene, Inc. Lipoproteins as nucleic acid vectors
DE19726186A1 (de) * 1997-06-20 1998-12-24 Boehringer Ingelheim Int Komplexe für den Transport von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
US6172211B1 (en) 1997-07-11 2001-01-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Nucleic acid encoding tag7 polypeptide
EP1007099A4 (en) * 1997-07-11 2004-11-24 Univ Brandeis METHOD FOR INDUCING APOPTOSE BY LOWERING THE THIAMINE MIRROR
US7923250B2 (en) 1997-07-30 2011-04-12 Warsaw Orthopedic, Inc. Methods of expressing LIM mineralization protein in non-osseous cells
DE69840361D1 (de) 1997-07-30 2009-01-29 Univ Emory Neue knochenmineralisierungsproteine, dna, vektoren, expressionssysteme
WO1999007723A1 (en) * 1997-08-07 1999-02-18 University Of Maryland, Baltimore Nucleic acid uptake and release vehicle
US20030125278A1 (en) * 1997-08-13 2003-07-03 Tang De-Chu C. Immunization of animals by topical applications of a salmonella-based vector
US6706693B1 (en) 1997-08-13 2004-03-16 The Uab Research Foundation Vaccination by topical application of genetic vectors
US6197332B1 (en) 1997-08-13 2001-03-06 Chiron Corporation Lipid-conjugated polyamide compounds and related compositions and methods thereof
US20030045492A1 (en) * 1997-08-13 2003-03-06 Tang De-Chu C. Vaccination by topical application of recombinant vectors
US6716823B1 (en) 1997-08-13 2004-04-06 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof
US6348450B1 (en) 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
US5998386A (en) 1997-09-19 1999-12-07 Feldman; Arthur M. Pharmaceutical compositions and method of using same for the treatment of failing myocardial tissue
WO1999019500A1 (en) * 1997-10-10 1999-04-22 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Healt H And Human Services Complex of biotinylated viral vector and ligand for targeted gene delivery
US6914131B1 (en) 1998-10-09 2005-07-05 Chiron S.R.L. Neisserial antigens
CA2671261A1 (en) 1997-11-06 1999-05-20 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Neisserial antigens
US6734338B1 (en) 1997-11-14 2004-05-11 Cedars-Sinai Medical Center Transfection, storage and transfer of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies
US7294755B1 (en) 1997-11-14 2007-11-13 Cedars-Sinai Medical Center Genetic modification of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies
JP2001523468A (ja) * 1997-11-14 2001-11-27 セダーシナイ メディカル センター トランスジェニック種の産生のための雄性生殖細胞のトランスフェクションおよび移入
EP0945138A1 (en) * 1997-12-04 1999-09-29 Université Louis Pasteur de Strasbourg Transfection particles
CA2317549C (en) * 1998-01-05 2006-04-11 University Of Washington Composition for enhancing transport through lipid-containing membranes, and uses thereof
BR9906927A (pt) 1998-01-14 2001-11-20 Chiron Spa Proteìnas de neisseria meningitidis
AU4070499A (en) 1998-04-30 1999-11-16 Cornell Research Foundation Inc. Adenoviral vectors with tandem fiber proteins
NZ541361A (en) 1998-05-01 2008-04-30 Inst Genomic Research Neisseria meningitidis antigens and compositions relating to SEQ ID Nos:2916, 2918 and 2920
US7244714B1 (en) * 1998-06-12 2007-07-17 Aradigm Corporation Methods of delivering aerosolized polynucleotides to the respiratory tract
US6509323B1 (en) 1998-07-01 2003-01-21 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
US7091192B1 (en) 1998-07-01 2006-08-15 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
US6245427B1 (en) 1998-07-06 2001-06-12 DüZGüNES NEJAT Non-ligand polypeptide and liposome complexes as intracellular delivery vehicles
US20040043489A1 (en) * 1998-07-08 2004-03-04 Menzo Havenga Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for dendritic cells and methods of use
US20030017138A1 (en) * 1998-07-08 2003-01-23 Menzo Havenga Chimeric adenoviruses
US7396919B1 (en) * 1998-07-17 2008-07-08 Mirus Bio Corporation Charge reversal of polyion complexes
WO2000011019A1 (en) * 1998-08-21 2000-03-02 Felix Frey Conjugates of dna interacting groups with steroid hormones for use as nucleic acid transfection agent
US6455314B1 (en) 1998-09-11 2002-09-24 Genvec, Inc. Alternatively targeted adenovirus
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
EP1953229A3 (en) 1998-10-15 2008-12-24 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Metastatic breast and colon cancer regulated genes
US6333396B1 (en) 1998-10-20 2001-12-25 Enzon, Inc. Method for targeted delivery of nucleic acids
US7166745B1 (en) 1998-11-12 2007-01-23 Invitrogen Corporation Transfection reagents
US20050063950A1 (en) * 1998-11-19 2005-03-24 Georgetown University Systemic viral/ligand gene delivery system and gene therapy
DE69942837D1 (de) 1998-11-19 2010-11-18 Univ Georgetown Systemisches virus/ligand genabgabemittel und gentherapie
US6929946B1 (en) * 1998-11-20 2005-08-16 Crucell Holland B.V. Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells
DK1141331T3 (da) 1998-12-16 2009-01-05 Novartis Vaccines & Diagnostic Human cyclinafhængig kinase (hPNQALRE)
US7098192B2 (en) 1999-04-08 2006-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of STAT3 expression
GB9908195D0 (en) 1999-04-09 1999-06-02 Microbiological Res Authority Treatment of intracellular infection
US6514762B1 (en) 1999-04-23 2003-02-04 New Mexico State University Technology Transfer Corporation Delivery of nucleotides by electrochemical release
DE19918446A1 (de) * 1999-04-23 2000-11-23 Univ Eberhard Karls Verwendung von Coxsackievirus B3 zur Verbesserung der Transfektion von Zellen
MXPA01010924A (es) 1999-04-30 2002-05-06 Chiron Spa Antigenos de neisseria conservados.
US20040009936A1 (en) * 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
US6913922B1 (en) 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
US6492169B1 (en) 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
US20050232900A1 (en) * 1999-05-18 2005-10-20 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
US6696272B1 (en) 1999-06-02 2004-02-24 Hsc Research & Development Limited Partnership Products and methods for gaucher disease therapy
DK1102785T3 (da) * 1999-06-07 2013-05-13 Arrowhead Res Corp Sammensætninger til lægemiddeltilførsel ved anvendelse af pH-følsomme molekyler
US20080281041A1 (en) * 1999-06-07 2008-11-13 Rozema David B Reversibly Masked Polymers
US8541548B2 (en) * 1999-06-07 2013-09-24 Arrowhead Madison Inc. Compounds and methods for reversible modification of biologically active molecules
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
ES2183752T3 (es) * 1999-09-17 2005-07-16 Tgt Laboratories, S.A. De C.V. Vectores adenovirales recombinantes y su utilizacion en el tratamiento de la cirrosis de higado.
EP2275553B1 (en) 1999-10-29 2015-05-13 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Neisserial antigenic peptides
CA2395636A1 (en) * 1999-12-30 2001-07-12 Novartis Ag Novel colloid synthetic vectors for gene therapy
AU2764801A (en) 2000-01-07 2001-07-24 University Of Washington Enhanced transport of agents using membrane disruptive agents
ES2507100T3 (es) 2000-01-17 2014-10-14 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Vacuna OMV suplementada contra meningococo
US6261840B1 (en) 2000-01-18 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US20020055479A1 (en) 2000-01-18 2002-05-09 Cowsert Lex M. Antisense modulation of PTP1B expression
BR0108711A (pt) 2000-02-28 2004-06-22 Chiron Spa Expressão heteróloga de proteìnas de neisseria
US6680172B1 (en) 2000-05-16 2004-01-20 Regents Of The University Of Michigan Treatments and markers for cancers of the central nervous system
EP1157999A1 (en) * 2000-05-24 2001-11-28 Introgene B.V. Methods and means for enhancing skin transplantation using gene delivery vehicles having tropism for primary fibroblasts, as well as other uses thereof
JP2003534806A (ja) * 2000-05-31 2003-11-25 ジェンベク、インコーポレイティッド アデノウイルスベクターのターゲティングの方法および組成物
EP1950297A2 (en) 2000-05-31 2008-07-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Compositions and methods for treating neoplastic disease using chemotherapy and radiation sensitizers
JP2004501657A (ja) 2000-06-28 2004-01-22 マックス−デルブルック−セントラム　フュール　モレクラーレ　メディツィン トランスフェクション効率の改良方法
US20040058856A1 (en) * 2000-07-26 2004-03-25 Soo-Young Choi Oligolysine transducing domain, oligolysine-cargo molecule complex and uses thereof
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
US20040033605A1 (en) * 2000-09-20 2004-02-19 Menzo Havenga Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for dendritic cells
US7235233B2 (en) * 2000-09-26 2007-06-26 Crucell Holland B.V. Serotype 5 adenoviral vectors with chimeric fibers for gene delivery in skeletal muscle cells or myoblasts
EP1191104A1 (en) * 2000-09-26 2002-03-27 Introgene B.V. Gene delivery vehicles and use thereof in the preparation of a medicament and/or vaccine
DE10049010A1 (de) * 2000-10-04 2002-04-18 Boehringer Ingelheim Int Transferrin-Polykation/DNS-Komplexe für die systemische Therapie von Tumorerkrankungen mit zytotoxischen Proteinen
NZ560966A (en) 2000-10-27 2010-06-25 Novartis Vaccines & Diagnostic Nucleic acids and proteins from streptococcus groups A & B
US20020086849A1 (en) * 2000-10-27 2002-07-04 Gulilat Gebeyehu Method for introducing antisense oligonucleotides into eucaryotic cells
US6892140B1 (en) 2000-11-27 2005-05-10 Enteron, Inc. Immunogenic cancer peptides and uses thereof
MXPA00011713A (es) * 2000-11-28 2002-05-31 Tgt Lab S A De C V Vectores recombinantes virales y no virales conteniendo el gen humano del activador de plasminogeno derivado de urocinasa y su utilidad en el tratamiento de diversos tipos de fibrosis hepatica, renal, pulmonar, pancreatica, cardiaca y cicatrices hipe
US7635571B2 (en) * 2000-12-07 2009-12-22 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Amplified signal in binding assays
US6635466B2 (en) * 2001-01-09 2003-10-21 University Of Iowa Research Foundation Adenovirus serotype 30 (Ad30)
US20030170826A1 (en) * 2001-02-02 2003-09-11 Peter Rabinovich Peptides for facilitating composite receptor expression and translocation of macromolecules
ES2310201T3 (es) 2001-02-13 2009-01-01 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Army Vacuna para inmunizacion transcutanea contra la diarrea de los viajeros.
US20020150566A1 (en) * 2001-03-23 2002-10-17 Kun-Liang Guan Method of inhibiting cancerous cell proliferation using Ras mutants of GDP-bound conformation
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
US20020193295A1 (en) * 2001-05-04 2002-12-19 Emanuel Calenoff Immunogenic peptides and uses thereof
EP1383480A4 (en) * 2001-04-30 2006-05-24 Targeted Genetics Corp Lipid-Containing Drug Delivery Complexes and Method of Producing the Same
WO2002089586A1 (en) * 2001-05-10 2002-11-14 St. Jude Children's Research Hospital Lung epithelial cell line for propagating viruses
US20060159657A1 (en) * 2001-06-14 2006-07-20 Macromed, Incorporated Formulations of lymphokines and method of use thereof for local or both local and systemic control of proliferative cell disorders
US20030003074A1 (en) * 2001-06-14 2003-01-02 Macromed, Inc. Formulations of lymphokines and method of use thereof for local or both local and systemic control of proliferative cell disorders
US7803915B2 (en) 2001-06-20 2010-09-28 Genentech, Inc. Antibody compositions for the diagnosis and treatment of tumor
WO2003000113A2 (en) 2001-06-20 2003-01-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
EP2270024B1 (en) 2001-06-21 2018-10-24 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US6964950B2 (en) 2001-07-25 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of C-reactive protein expression
US20030096772A1 (en) 2001-07-30 2003-05-22 Crooke Rosanne M. Antisense modulation of acyl CoA cholesterol acyltransferase-2 expression
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7227014B2 (en) 2001-08-07 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein (a) expression
GB0120022D0 (en) 2001-08-16 2001-10-10 Photobiotics Ltd Conjugate
JP2005536439A (ja) 2001-09-18 2005-12-02 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍の診断及び治療のための組成物と方法
WO2003052117A2 (en) * 2001-09-19 2003-06-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to non-viral transfection
US6750019B2 (en) 2001-10-09 2004-06-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression
NZ577565A (en) 2001-10-09 2010-10-29 Isis Pharmaceuticals Inc Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expressions
US7745418B2 (en) * 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
WO2003088808A2 (en) 2002-04-16 2003-10-30 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
JP2005527639A (ja) 2001-11-02 2005-09-15 インサート セラピューティクス インコーポレイテッド Ｒｎａ干渉の治療的利用のための方法及び組成物
US20030138407A1 (en) * 2001-11-02 2003-07-24 Patrick Lu Therapeutic methods for nucleic acid delivery vehicles
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
KR100982204B1 (ko) 2001-12-12 2010-09-14 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 에스.알.엘. 클라미디아 트라코마티스에 대한 면역화
NZ556415A (en) 2002-01-02 2009-02-28 Genentech Inc Compositions and methods for the diagnosis and treatment of glioma tumor
US8138383B2 (en) * 2002-03-11 2012-03-20 Arrowhead Madison Inc. Membrane active heteropolymers
US8008355B2 (en) * 2002-03-11 2011-08-30 Roche Madison Inc. Endosomolytic poly(vinyl ether) polymers
US20030186916A1 (en) * 2002-03-12 2003-10-02 Lei Yu Vector for transfection of eukaryotic cells
AU2003225793A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-29 Baxter Healthcare S.A. Methods and compositions for directing cells to target organs
US20030180712A1 (en) 2002-03-20 2003-09-25 Biostratum Ab Inhibition of the beta3 subunit of L-type Ca2+ channels
ATE447037T1 (de) * 2002-04-25 2009-11-15 Crucell Holland Bv Mittel und verfahren zur herstellung von adenovirusvektoren
US20040142450A1 (en) * 2002-05-10 2004-07-22 Seo Sang Heui Lung epithelial cell line for propagating viruses
US7199107B2 (en) 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
US20050233993A1 (en) * 2002-06-05 2005-10-20 Kadonaga James T Methods for promoting homologous recombination
PT2332582E (pt) 2002-06-19 2014-01-28 Apeiron Biologics Ag Activação de ace2 para o tratamento de doença cardíaca, pulmonar e renal e de hipertensão
US20060003316A1 (en) * 2002-07-15 2006-01-05 John Simard Immunogenic compositions derived from poxviruses and methods of using same
PT1534340E (pt) 2002-09-06 2012-03-13 Cerulean Pharma Inc Polímeros à base de ciclodextrina para a administração de medicamentos ligados por ligação covalente
CN1820078A (zh) * 2002-09-09 2006-08-16 田纳西大学研究基金会 弹状病毒的重组突变体及其应用方法
MXPA05002791A (es) 2002-09-13 2005-12-05 Replicor Inc Oligonucleotidos antivirales complementarios sin secuencia.
AU2003278957A1 (en) 2002-09-26 2004-04-23 Amgen, Inc. Modulation of forkhead box o1a expression
MXPA05003843A (es) * 2002-10-10 2006-02-17 Us Dept Veterans Affairs Deteccion, localizacion y determicnacion de fases de tumores usando linfocitos activados rotulados dirigidos a un epitope especifico.
AU2003295387A1 (en) 2002-11-05 2004-06-03 Isis Parmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
EP1560839A4 (en) 2002-11-05 2008-04-23 Isis Pharmaceuticals Inc CHIMERIC OLIGOMER COMPOUNDS AND THEIR USE IN GENE MODULATION
US20080026077A1 (en) * 2002-11-12 2008-01-31 John Hilfinger Methods and compositions of gene delivery agents for systemic and local therapy
US20050026859A1 (en) * 2002-11-12 2005-02-03 John Hilfinger Methods and compositions of gene delivery agents for systemic and local therapy
ES2420914T3 (es) 2002-11-13 2013-08-27 Genzyme Corporation Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B
CA2505801A1 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Rosanne Crooke Antisense modulation of apolipoprotein b expression
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
US7468356B2 (en) 2003-02-11 2008-12-23 Antisense Therapeutics Ltd. Modulation of insulin like growth factor I receptor expression
US7803781B2 (en) 2003-02-28 2010-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
US20040185559A1 (en) 2003-03-21 2004-09-23 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 1 expression
US7217566B2 (en) * 2003-03-24 2007-05-15 Invitrogen Corporation Attached cell lines
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
EP1620112A4 (en) * 2003-04-17 2007-04-25 Univ Columbia DESMOGLEIN 4 IS A NEW GENUS INVOLVED IN HAIR GROWTH
US7399853B2 (en) 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
US20040220085A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Jasbir Sandhu Compositions for nucleic acid delivery
US20040220084A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Jasbir Sandhu Methods for nucleic acid delivery
BRPI0410886A (pt) 2003-06-03 2006-07-04 Isis Pharmaceuticals Inc composto de filamento duplo, composição farmacêutica, sal farmaceuticamente aceitável, métodos de modificação do ácido nucleico que codifica a survivina humana, de inibição da expressão da suvivina em células ou tecidos, e de tratamento de uma condição associada com a expressão ou superexpressão da suvivina, e, oligonucleotìdeo de rnai de filamento único
CA2528094A1 (en) * 2003-06-09 2005-01-13 Corixa Corporation Expression vectors for stimulating an immune response to cancer antigens
US7883720B2 (en) * 2003-07-09 2011-02-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Charge-dynamic polymers and delivery of anionic compounds
WO2005013901A2 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
NZ576775A (en) 2003-09-18 2010-12-24 Isis Pharmaceuticals Inc Modulation of eIF4E expression
NZ546272A (en) 2003-10-10 2009-05-31 Alchemia Oncology Pty Ltd The modulation of hyaluronan synthesis and degradation in the treatment of disease
KR20060116825A (ko) * 2003-10-23 2006-11-15 일루미겐 바이오사이언시스, 인코포레이티드 바이러스 감염에 대한 저항성과 관련된 유전자인ｏａｓ1에서의 돌연변이의 검출
US8062891B2 (en) 2003-10-24 2011-11-22 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to plants
US8507277B2 (en) 2003-10-24 2013-08-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides
US20090123468A1 (en) 2003-10-24 2009-05-14 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US20090208478A1 (en) * 2003-10-24 2009-08-20 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US8133733B2 (en) 2003-10-24 2012-03-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues
EP2418281B1 (en) 2003-10-24 2016-06-01 Gencia Corporation Methods and compositions for delivering polynucleotides
US20050191653A1 (en) 2003-11-03 2005-09-01 Freier Susan M. Modulation of SGLT2 expression
CA2747871C (en) 2003-11-17 2018-04-10 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
WO2005054438A2 (en) 2003-12-01 2005-06-16 Invitrogen Corporation Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same
US20050265956A1 (en) * 2004-01-12 2005-12-01 Ye Liu Polyalkyleneimine-graft-biodegradable polymers for delivery of bioactive agents
US20050164271A1 (en) 2004-01-20 2005-07-28 Sanjay Bhanot Modulation of glucocorticoid receptor expression
US7468431B2 (en) 2004-01-22 2008-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E-BP2 expression
WO2005069987A2 (en) * 2004-01-23 2005-08-04 City Of Hope Amplifying interfering rna (rnai) expression and effects
US8569474B2 (en) 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
US20050203047A1 (en) * 2004-03-10 2005-09-15 Ulrich Thomann Delivery vectors for short interfering RNA, micro-RNA and antisense RNA
EP2700720A3 (en) 2004-03-15 2015-01-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for optimizing cleavage of RNA by RNASE H
WO2005097207A2 (en) * 2004-03-26 2005-10-20 Curis, Inc. Rna interference modulators of hedgehog signaling and uses thereof
DK1736541T3 (da) 2004-03-29 2013-05-06 Galpharma Co Ltd Nyt modificeret galectin 9-protein og anvendelse heraf
US20050244869A1 (en) 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
US7884086B2 (en) 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
US8697139B2 (en) 2004-09-21 2014-04-15 Frank M. Phillips Method of intervertebral disc treatment using articular chondrocyte cells
US9315862B2 (en) 2004-10-05 2016-04-19 California Institute Of Technology Aptamer regulated nucleic acids and uses thereof
CA2582353A1 (en) 2004-10-06 2006-04-20 University Of Rochester Treatment of pulmonary hypertension using an agent that inhibits a tissue factor pathway
US7833513B2 (en) 2004-12-03 2010-11-16 Rhode Island Hospital Treatment of Alzheimer's Disease
EP2110667A1 (en) 2005-01-20 2009-10-21 University Of Rochester Thoredoxin interacting protein (TXNIP) as regulator of vascular function
ES2852549T3 (es) 2005-02-09 2021-09-13 Sarepta Therapeutics Inc Composición antisentido para tratamiento de la atrofia muscular
JP2008531581A (ja) * 2005-02-23 2008-08-14 ユーエービー リサーチ ファウンデーション アルキル−グリコシドで増強されたワクチン接種
CN101175769A (zh) 2005-03-10 2008-05-07 健泰科生物技术公司 用于调控血管完整性的方法和组合物
AU2006230436B2 (en) 2005-03-31 2011-11-24 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
US8734851B2 (en) * 2005-04-29 2014-05-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Localized delivery of nucleic acid by polyelectrolyte assemblies
UA95446C2 (ru) 2005-05-04 2011-08-10 Іллюміджен Байосайєнсіз, Інк. Мутаци в генах oas1
DE102005023993A1 (de) * 2005-05-20 2006-11-23 TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH Nicht virales Vektorsystem zum Transport von Nukleinsäure in die Lunge
AU2006318194B2 (en) 2005-11-21 2012-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eiF4E-BP2 expression
US20090317802A1 (en) * 2005-12-09 2009-12-24 Bhatia Sangeeta N Compositions and Methods to Monitor RNA Delivery to Cells
CA2566267A1 (en) * 2005-12-09 2007-06-09 University Health Network Thymidylate kinase mutants and uses thereof
US20090068158A1 (en) * 2005-12-09 2009-03-12 Medin Jeffrey A Thymidylate kinase mutants and uses thereof
WO2007089584A2 (en) 2006-01-26 2007-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to huntingtin
CA2638915A1 (en) * 2006-02-10 2007-08-23 The Regents Of The University Of California Transducible delivery of sirna by dsrna binding domain fusions to ptd/cpps
EP2502999A3 (en) 2006-03-03 2013-01-23 Amorfix Life Sciences Ltd. Methods and compositions to treat and detect misfolded-SOD1 mediated diseases
US7718193B2 (en) * 2006-03-16 2010-05-18 University Of Washington Temperature- and pH-responsive polymer compositions
EP2614839A3 (en) 2006-04-05 2015-01-28 Genentech, Inc. Method for using BOC/CDO to modulate hedgehog signaling
MX2008014005A (es) 2006-05-03 2009-01-27 Baltic Technology Dev Ltd Agentes antisentido que combinan un oligonucleotido modificado con base fuertemente unida y nucleasa artificial.
EP2035035A2 (en) 2006-06-09 2009-03-18 Novartis AG Immunogenic compositions for streptococcus agalactiae
JP6125741B2 (ja) * 2006-07-12 2017-05-17 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 可逆的なホスホトリエステル電荷中和保護基による核酸の形質導入可能な送達
WO2008011473A2 (en) 2006-07-19 2008-01-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to hbxip
CN102614528B (zh) * 2006-08-18 2014-02-26 箭头研究公司 用于体内递送多核苷酸的多缀合物
US8017109B2 (en) * 2006-08-18 2011-09-13 Roche Madison Inc. Endosomolytic poly(acrylate) polymers
KR20090066289A (ko) 2006-09-08 2009-06-23 로드아일랜드하스피틀 알코올 유발성 뇌 질환의 치료, 예방 및 역행
EP2061484B1 (en) 2006-09-08 2012-11-07 Rhode Island Hospital Treatment, prevention, and reversal of alcohol-induced liver disease
WO2008058291A2 (en) 2006-11-09 2008-05-15 California Institute Of Technology Modular aptamer-regulated ribozymes
AU2007333225B2 (en) * 2006-12-08 2014-06-12 Massachusetts Institute Of Technology Delivery of nanoparticles and/or agents to cells
US8048998B2 (en) * 2007-01-19 2011-11-01 Exiqon A/S Mediated cellular delivery of LNA oligonucleotides
US8834918B2 (en) * 2007-01-22 2014-09-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Modified multilayered film
JP2010516625A (ja) 2007-01-24 2010-05-20 インサート セラピューティクス， インコーポレイテッド 制御された薬物送達のためのテザー基を有するポリマー−薬物コンジュゲート
EP2114981B1 (en) 2007-01-29 2013-05-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating protein expression
JP5761915B2 (ja) 2007-02-22 2015-08-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 炎症性腸疾患の検出方法
US7981688B2 (en) 2007-03-08 2011-07-19 University Of Washington Stimuli-responsive magnetic nanoparticles and related methods
EP2139447A2 (en) 2007-03-20 2010-01-06 Harold Brem Gm-csf cosmeceutical compositions and methods of use thereof
CA2584494A1 (en) * 2007-03-27 2008-09-27 Jeffrey A. Medin Vector encoding therapeutic polypeptide and safety elements to clear transduced cells
ES2654303T3 (es) 2007-05-04 2018-02-13 University Health Network Inmunoterapia de IL-12 contra el cáncer
US20090082217A1 (en) * 2007-07-16 2009-03-26 California Institute Of Technology Selection of nucleic acid-based sensor domains within nucleic acid switch platform
US20120165387A1 (en) 2007-08-28 2012-06-28 Smolke Christina D General composition framework for ligand-controlled RNA regulatory systems
US8367815B2 (en) * 2007-08-28 2013-02-05 California Institute Of Technology Modular polynucleotides for ligand-controlled regulatory systems
US8865667B2 (en) * 2007-09-12 2014-10-21 California Institute Of Technology Higher-order cellular information processing devices
AU2008307482B2 (en) 2007-10-02 2012-07-12 Amgen Inc. Increasing erythropoietin using nucleic acids hybridizable to micro-RNA and precursors thereof
US20090105375A1 (en) * 2007-10-09 2009-04-23 Lynn David M Ultrathin Multilayered Films for Controlled Release of Anionic Reagents
US9029524B2 (en) * 2007-12-10 2015-05-12 California Institute Of Technology Signal activated RNA interference
EP2077119A1 (de) * 2007-12-21 2009-07-08 Apeiron Biologics Forschungs- und Entwicklungsgesellschaft M.B.H. Behandlung von Fibrosen und Lebererkrankungen
US8344116B2 (en) * 2008-03-17 2013-01-01 Case Western Reserve University Polymers and complexes for delivery of nucleic acids to intracellular targets
US8568709B2 (en) 2008-03-20 2013-10-29 University Health Network Thymidylate kinase fusions and uses thereof
CN102037123A (zh) 2008-04-04 2011-04-27 卡兰多制药股份有限公司 Epas1抑制剂的组合物和用途
GB2459436A (en) * 2008-04-08 2009-10-28 Henderson Morley Plc Vaccine adjuvant
US8324333B2 (en) 2008-06-05 2012-12-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Anionic charge-dynamic polymers for release of cationic agents
US8815818B2 (en) 2008-07-18 2014-08-26 Rxi Pharmaceuticals Corporation Phagocytic cell delivery of RNAI
CN103429270B (zh) 2008-08-25 2016-11-23 埃克斯雷德制药有限公司 阻止结缔组织生长因子的反义核苷酸及其用途
CA2746527A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna interference in skin indications
CA2745811C (en) 2008-12-04 2021-07-13 Joseph Collard Treatment of tumor suppressor gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to the gene
JP6091752B2 (ja) 2008-12-04 2017-03-08 クルナ・インコーポレーテッド Ｅｐｏに対する天然アンチセンス転写物の抑制によるエリスロポエチン（ｅｐｏ）関連疾患の治療
MX366774B (es) 2008-12-04 2019-07-24 Curna Inc Uso de oligonucleótidos antisentido en la inhibición de transcrito antisentido natural para sirtuina 1.
US9493774B2 (en) 2009-01-05 2016-11-15 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of PCSK9 through RNAi
JP6066035B2 (ja) 2009-02-12 2017-01-25 クルナ・インコーポレーテッド グリア細胞由来神経栄養因子（ｇｄｎｆ）関連疾病の、ｇｄｎｆに対する天然アンチセンス転写物の抑制による治療
US9074210B2 (en) 2009-02-12 2015-07-07 Curna, Inc. Treatment of brain derived neurotrophic factor (BDNF) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to BDNF
US8329882B2 (en) 2009-02-18 2012-12-11 California Institute Of Technology Genetic control of mammalian cells with synthetic RNA regulatory systems
EP2963116B1 (en) 2009-03-04 2020-11-11 CuRNA, Inc. Treatment of sirtuin 1 (sirt1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to sirt 1
US9464287B2 (en) 2009-03-16 2016-10-11 Curna, Inc. Treatment of nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (NRF2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to NRF2
MX2011009752A (es) 2009-03-17 2011-09-29 Opko Curna Llc Tratamiento de enfermedades relacionadas a homologo tipo delta 1(dlk1) por inhibicion de transcrito antisentido natural a homologo tipo delta (dlk1).
US8772238B2 (en) 2009-03-18 2014-07-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of ixolaris, a tissue factor inhibitor, for the treatment of cancer
US9145555B2 (en) 2009-04-02 2015-09-29 California Institute Of Technology Integrated—ligand-responsive microRNAs
EP3248618A1 (en) 2009-04-22 2017-11-29 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules
CN102639151B (zh) 2009-05-01 2017-03-22 库尔纳公司 通过针对hbf/hbg的天然反义转录物的抑制治疗血红蛋白（hbf/hbg）相关疾病
WO2010129746A2 (en) 2009-05-06 2010-11-11 Curna, Inc. Treatment of tristetraproline (ttp) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ttp
JP5883782B2 (ja) 2009-05-06 2016-03-15 クルナ・インコーポレーテッド 脂質輸送代謝遺伝子に対する天然アンチセンス転写物の抑制による脂質輸送代謝遺伝子関連疾患の治療
CA2762369C (en) 2009-05-18 2021-12-28 Joseph Collard Treatment of reprogramming factor related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a reprogramming factor
EP2432882B1 (en) 2009-05-22 2019-12-25 CuRNA, Inc. TREATMENT OF TRANSCRIPTION FACTOR E3 (TFE3) and INSULIN RECEPTOR SUBSTRATE 2 (IRS2) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO TFE3
CN103221541B (zh) 2009-05-28 2017-03-01 库尔纳公司 通过抑制抗病毒基因的天然反义转录物来治疗抗病毒基因相关疾病
EP2440234A4 (en) 2009-06-10 2013-11-06 Univ New York IMMUNOLOGICAL TARGETING OF PATHOLOGICAL TAU PROTEINS
US8426214B2 (en) * 2009-06-12 2013-04-23 University Of Washington System and method for magnetically concentrating and detecting biomarkers
CA2765700C (en) 2009-06-16 2021-01-05 Opko Curna, Llc Treatment of collagen gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a collagen gene
ES2629339T3 (es) 2009-06-16 2017-08-08 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con la paraoxonasa 1 (pon1) por inhibición de transcrito antisentido natural a pon1
US8859515B2 (en) 2009-06-24 2014-10-14 Curna, Inc. Treatment of tumor necrosis factor receptor 2 (TNFR2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to TNFR2
CN102482672B (zh) 2009-06-26 2016-11-09 库尔纳公司 通过抑制唐氏综合征基因的天然反义转录物治疗唐氏综合征基因相关疾病
US9234199B2 (en) 2009-08-05 2016-01-12 Curna, Inc. Treatment of insulin gene (INS) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an insulin gene (INS)
CA2771172C (en) 2009-08-25 2021-11-30 Opko Curna, Llc Treatment of 'iq motif containing gtpase activating protein' (iqgap) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to iqgap
JP5887270B2 (ja) 2009-09-02 2016-03-16 ジェネンテック， インコーポレイテッド 突然変異体ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄおよびその使用方法
US20130079382A1 (en) 2009-10-12 2013-03-28 Larry J. Smith Methods and Compositions for Modulating Gene Expression Using Oligonucleotide Based Drugs Administered in vivo or in vitro
WO2011050194A1 (en) 2009-10-22 2011-04-28 Genentech, Inc. Methods and compositions for modulating hepsin activation of macrophage-stimulating protein
WO2011052804A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Tokyo University Of Science Educational Foundation Administrative Organization Method of delivering agent into target cell
US20120244169A1 (en) 2009-11-06 2012-09-27 Fibrogen, Inc. Treatment for Radiation-Induced Disorders
US9080933B2 (en) 2009-11-09 2015-07-14 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Stimuli-responsive polymer diagnostic assay comprising magnetic nanoparticles and capture conjugates
US20110117668A1 (en) * 2009-11-09 2011-05-19 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Self-powered smart diagnostic devices
JP6220126B2 (ja) * 2009-11-23 2017-10-25 セルリアン・ファーマ・インコーポレイテッド 治療的送達のためのシクロデキストリンに基づく重合体
MX2012006072A (es) 2009-11-30 2012-07-23 Genentech Inc Composiciones y metodos para el diagnostico y el tratamiento de tumores.
AU2010329847A1 (en) 2009-12-11 2012-07-26 Genecode As Methods of facilitating neural cell survival using GDNF family ligand (GFL) mimetics or RET signaling pathway activators
JP6025567B2 (ja) 2009-12-16 2016-11-16 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド 膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ｍｂｔｐｓ１）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｍｂｔｐｓ１関連性疾患の治療
WO2011079263A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Curna, Inc. Treatment of uncoupling protein 2 (ucp2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ucp2
US8940708B2 (en) 2009-12-23 2015-01-27 Curna, Inc. Treatment of hepatocyte growth factor (HGF) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to HGF
RU2611186C2 (ru) 2009-12-29 2017-02-21 Курна, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ОПУХОЛЕВЫМ БЕЛКОМ 63 (р63), ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К р63
RU2615450C2 (ru) 2009-12-29 2017-04-04 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с ядерным респираторным фактором 1(nrf1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к nrf1
US8946181B2 (en) 2010-01-04 2015-02-03 Curna, Inc. Treatment of interferon regulatory factor 8 (IRF8) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IRF8
WO2011085066A2 (en) 2010-01-06 2011-07-14 Curna, Inc. Treatment of pancreatic developmental gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a pancreatic developmental gene
CA2786535C (en) 2010-01-11 2019-03-26 Curna, Inc. Treatment of sex hormone binding globulin (shbg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to shbg
WO2011090971A2 (en) 2010-01-19 2011-07-28 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for male reproductive disorders
RU2611192C2 (ru) 2010-01-25 2017-02-21 Курна, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С РНКазой Н1, ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К РНКазе Н1
EP2539452B1 (en) 2010-02-22 2016-07-27 CuRNA, Inc. Treatment of pyrroline-5-carboxylate reductase 1 (pycr1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to pycr1
KR20130004579A (ko) 2010-02-23 2013-01-11 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법
SI2539451T1 (sl) 2010-02-24 2016-04-29 Arrowhead Research Corporation Sestavki za ciljano dostavo sirna
EP2556160A4 (en) 2010-04-09 2013-08-21 Curna Inc TREATMENT OF ILLNESSES ASSOCIATED WITH FIBROBLASTIC GROWTH FACTOR 21 (FGF21) BY INHIBITION OF THE NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT AGAINST FGF21
US8362207B2 (en) 2010-04-16 2013-01-29 Wake Forest University Health Sciences Multi-level specific targeting of cancer cells with IL-13
DK2563920T3 (en) 2010-04-29 2017-05-22 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulation of transthyretin expression
BR112012028010A2 (pt) 2010-05-03 2017-09-26 Genentech Inc anticorpo isolado, célula, ácido nucleíco isolado, método de identificação de um primeiro anticorpo que se liga a um epítopo antigênico tat425 ligado or um anticorpo, métodos de inibir o crescimento de uma célula, de tratamento terapêutico de determinação da presença de uma proteína de tat425 e de diagnóstico da presença de um tumor em um mamífero
RU2018110642A (ru) 2010-05-03 2019-02-27 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с сиртуином (sirt), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к сиртуину (sirt)
EP2569430B1 (en) 2010-05-12 2018-10-17 The Trustees of Columbia University in the City of New York Methods for producing enteroendocrine cells that make and secrete insulin
TWI531370B (zh) 2010-05-14 2016-05-01 可娜公司 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病
EP3299464B1 (en) 2010-05-26 2019-10-02 CuRNA, Inc. Treatment of atonal homolog 1 (atoh1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to atoh1
US9057067B2 (en) 2010-07-10 2015-06-16 Kinki University Method for transfecting nucleic acid to cell and nucleic acid complex
NO2593547T3 (ro) 2010-07-14 2018-04-14
DK2625197T3 (en) 2010-10-05 2016-10-03 Genentech Inc Smoothened MUTANT AND METHODS OF USING THE SAME
CA2813901C (en) 2010-10-06 2019-11-12 Curna, Inc. Treatment of sialidase 4 (neu4) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to neu4
US9222088B2 (en) 2010-10-22 2015-12-29 Curna, Inc. Treatment of alpha-L-iduronidase (IDUA) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IDUA
DK2633052T3 (en) 2010-10-27 2018-07-16 Curna Inc TREATMENT OF INTERFERON-RELATED DEVELOPMENT REGULATOR 1 (IFRD1) -RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENCE TRANSCRIPT TO IFRD1
WO2012061811A2 (en) 2010-11-05 2012-05-10 Fibrogen, Inc. Treatment method for lung remodeling diseases
WO2012065067A2 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Georgetown University Immortalization of epithelial cells and methods of use
CN103459599B (zh) 2010-11-23 2017-06-16 库尔纳公司 通过抑制nanog的天然反义转录物而治疗nanog相关疾病
WO2012092341A1 (en) 2010-12-28 2012-07-05 University Of Rochester Methods of modifying insulin signaling using biliverdin reductase (bvr) and bvr derived peptides
SI2670411T1 (sl) 2011-02-02 2019-06-28 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Protismiselne spojine, ki so usmerjene na rastni faktor veznega tkiva (CTGF), za uporabo v postopku zdravljenja keloidov ali hipertrofnih brazgotin
WO2012109495A1 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Metabolic Solutions Development Company, Llc Cellular targets of thiazolidinediones
WO2012124688A1 (ja) 2011-03-14 2012-09-20 国立大学法人北海道大学 肺送達のためのベクター、導入剤及び使用
US8658783B2 (en) 2011-04-13 2014-02-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
RU2620980C2 (ru) 2011-06-09 2017-05-30 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с фратаксином (fxn), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта fxn
AU2012271357A1 (en) 2011-06-16 2013-05-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of fibroblast growth factor receptor 4 expression
EP2753346B1 (en) 2011-09-07 2020-04-22 Mount Sinai School Of Medicine Ceramidase and cell differentiation
AU2012312433B2 (en) 2011-09-20 2017-07-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of GCGR expression
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
EP2771463A4 (en) 2011-10-25 2015-09-09 Isis Pharmaceuticals Inc ANTISENSE MODULATION OF GCCR EXPRESSION
JP2015511494A (ja) 2012-03-15 2015-04-20 キュアナ，インク． 脳由来神経栄養因子（ｂｄｎｆ）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｂｄｎｆ関連の疾患の処置
US9950001B2 (en) 2012-08-20 2018-04-24 The Regents Of The University Of California Polynucleotides having bioreversible groups
EP2943194A1 (en) 2012-09-17 2015-11-18 Chemedest Ltd. Treatment of peripheral neuropathy using gfr(alpha)3 type receptor agonists
WO2014055493A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
US9694050B2 (en) 2012-10-21 2017-07-04 University Of Rochester THY1 (CD90) as a novel therapy to control adipose tissue accumulation
US10415024B2 (en) 2012-11-16 2019-09-17 Poseida Therapeutics, Inc. Site-specific enzymes and methods of use
US10052364B2 (en) 2013-03-15 2018-08-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for cognitive disorders
US9822418B2 (en) 2013-04-22 2017-11-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Mutations in PDGFRB and NOTCH3 as causes of autosomal dominant infantile myofibromatosis
WO2014197938A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Antisense Therapeutics Ltd Combination therapy
AU2014317961B2 (en) 2013-09-05 2020-07-30 Murdoch University Antisense-induced exon2 inclusion in acid alpha-glucosidase
EP3047023B1 (en) 2013-09-19 2019-09-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions and methods for inhibiting jc virus (jcv)
US9975942B2 (en) 2013-11-11 2018-05-22 Wake Forest University Health Services EPHA3 And multi-valent targeting of tumors
WO2015116902A1 (en) 2014-01-31 2015-08-06 Genentech, Inc. G-protein coupled receptors in hedgehog signaling
WO2015120075A2 (en) 2014-02-04 2015-08-13 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2015171918A2 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Compositions and uses for treatment thereof
KR102589295B1 (ko) 2014-05-14 2023-10-13 타르그이뮨 테라퓨틱스 아게 개선된 폴리에틸렌이민 폴리에틸렌글리콜 벡터
EP3145550B1 (en) * 2014-05-19 2019-03-27 BioNTech AG Particles comprising protamine and rna in combination with endosome destabilizing agents
US10487314B2 (en) 2014-06-26 2019-11-26 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Inhibition of serotonin expression in gut enteroendocrine cells results in conversion to insulin-positive cells
CN106572974B (zh) 2014-07-15 2021-04-23 生命技术公司 用于将分子有效递送到细胞的具有脂质聚集体的组合物和方法
WO2016033424A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Genzyme Corporation Methods for the prevention and treatment of major adverse cardiovascular events using compounds that modulate apolipoprotein b
EP3226889A4 (en) 2014-11-19 2018-11-21 The Trustees of Columbia University in the City of New York Osteocalcin as a treatment for frailty associated with aging
JP2018504380A (ja) 2014-12-18 2018-02-15 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｒｅｖｅｒｓｉｒ（商標）化合物
MA41795A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
EP3302497A4 (en) 2015-06-01 2019-01-16 Sarepta Therapeutics, Inc. EXCLUSION OF EXON INDUCED PAT TECHNOLOGY ANTISENSE IN COLLAGEN TYPE VII
DK3310909T3 (da) 2015-06-17 2021-09-13 Poseida Therapeutics Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til at føre proteiner til specifikke loci i genomet
US10954300B2 (en) 2015-09-28 2021-03-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Use of pentoxifylline with immune checkpoint-blockade therapies for the treatment of melanoma
EP3359668A4 (en) 2015-10-09 2019-06-05 Sarepta Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING DUCHENNE MUSCLE DYSTROPHY AND ASSOCIATED ILLNESSES THEREOF
US11273151B2 (en) 2015-11-04 2022-03-15 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods of treating tumors and cancer, and identifying candidate subjects for such treatment
EP3370734B1 (en) 2015-11-05 2023-01-04 Children's Hospital Los Angeles Antisense oligo for use in treating acute myeloid leukemia
EP3411396A1 (en) 2016-02-04 2018-12-12 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
EP3445405A4 (en) 2016-04-18 2019-12-18 Sarepta Therapeutics, Inc. ANTISENSE OLIGOMERS AND METHOD FOR USE THEREOF TO TREAT DISEASES RELATING TO THE ACID ALPHA GLUCOSIDASE GENE
WO2017189730A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Treatment of hippo pathway mutant tumors and methods of identifying subjects as candidates for treatment
JP2019532027A (ja) 2016-08-17 2019-11-07 ソルスティス バイオロジクス，リミティッド ポリヌクレオチド構築物
US10994025B2 (en) 2017-05-12 2021-05-04 Massachusetts Institute Of Technology Argonaute protein-double stranded RNA complexes and uses related thereto
WO2019006455A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Solstice Biologics, Ltd. AUXILIARIES OF CHIRAL PHOSPHORAMIDITIS AND METHODS OF USE THEREOF
US11555189B2 (en) 2017-10-18 2023-01-17 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense oligomer compounds
WO2019126578A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
AU2019247490A1 (en) 2018-04-06 2020-10-22 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for somatic cell reprogramming and modulating imprinting
JP2024516168A (ja) 2021-04-22 2024-04-12 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド がんを治療するための組成物および方法

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IN165717B (ro) * 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US5166320A (en) * 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
US5428132A (en) * 1987-10-11 1995-06-27 United States Of America Conjugate and method for integration of foreign DNA into cells
US5192553A (en) * 1987-11-12 1993-03-09 Biocyte Corporation Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use
US5149782A (en) * 1988-08-19 1992-09-22 Tanox Biosystems, Inc. Molecular conjugates containing cell membrane-blending agents
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5108921A (en) * 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5240846A (en) * 1989-08-22 1993-08-31 The Regents Of The University Of Michigan Gene therapy vector for cystic fibrosis
JPH03127622A (ja) * 1989-10-09 1991-05-30 Green Cross Corp:The ｐＨ感受性リポソーム
ES2078521T3 (es) * 1990-05-18 1995-12-16 Boehringer Ingelheim Int Nuevos conjugados de proteina-polication.
AU660629B2 (en) * 1990-10-01 1995-07-06 University Of Connecticut, The Targeting viruses and cells for selective internalization by cells
WO1992019749A1 (en) * 1991-05-03 1992-11-12 The Board Of Regents Acting For And On Behalf Of The University Of Michigan Targeted delivery of genes encoding cell surface receptors
JPH06510524A (ja) * 1991-05-14 1994-11-24 ユニバーシティ オブ コネチカット 免疫原性タンパク質をコードする遺伝子の標的への配達
DE69231385T2 (de) * 1991-06-05 2001-04-12 Univ Connecticut Storrs Zielgerichtete freisetzung von genen, die sekretorische proteine kodieren
EP0666923A1 (en) * 1991-09-05 1995-08-16 The University Of Connecticut Targeted delivery of poly- or oligonucleotides to cells
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5521291A (en) * 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
US5981273A (en) 1991-09-30 1999-11-09 Boehringer Ingelheim Int'l. Gmbh Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
US5225182A (en) * 1991-10-31 1993-07-06 Sharma Yash P Vectored drug delivery system using a cephaloplastin linking agent and a methed of using the system
US5922859A (en) 1992-02-01 1999-07-13 Boehringer Ingelheim International Gmbh Complexes containing nucleic acid which can be taken-up by endocytosis into higher eukaryotic cells
US5583020A (en) * 1992-11-24 1996-12-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides
WO1994017832A1 (en) 1993-02-09 1994-08-18 The Scripps Research Institute Targeting and delivery of genes and antiviral agents into cells by the adenovirus penton
DE4311651A1 (de) 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
DE4335025A1 (de) 1993-10-14 1995-04-20 Boehringer Ingelheim Int Endosomolytisch wirksame Partikel
US5928944A (en) 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection

Also Published As

Publication number Publication date
HU211925A9 (en) 1996-01-29
IL103171A (en) 2003-04-10
ES2173083T3 (es) 2002-10-16
MX9205543A (es) 1993-05-01
EE03195B1 (ro) 1999-06-15
CZ293141B6 (cs) 2004-02-18
FI941474A (fi) 1994-03-30
BR9206559A (pt) 1994-11-08
NO316744B1 (no) 2004-04-26
HU9400898D0 (en) 1994-06-28
PL180304B1 (pl) 2001-01-31
NO941154L (no) 1994-03-29
HK1013104A1 (en) 1999-08-13
CZ74694A3 (en) 1995-05-17
ATE215990T1 (de) 2002-04-15
HU218846B (hu) 2000-12-28
CN1059705C (zh) 2000-12-20
NO941154D0 (no) 1994-03-29
SG44680A1 (en) 1997-12-19
US5547932A (en) 1996-08-20
AU671084B2 (en) 1996-08-15
HUT71312A (en) 1995-11-28
US6274322B1 (en) 2001-08-14
BG62740B1 (bg) 2000-06-30
US6022735A (en) 2000-02-08
CA2118816A1 (en) 1993-03-31
SK36894A3 (en) 1994-08-10
NZ244306A (en) 1995-07-26
DK0607206T3 (da) 2002-08-05
IL103171A0 (en) 1993-02-21
WO1993007283A1 (de) 1993-04-15
BG98718A (bg) 1995-02-28
AU2652692A (en) 1993-05-03
CN1070946A (zh) 1993-04-14
SK281682B6 (sk) 2001-06-11
US6077663A (en) 2000-06-20
SI9200236B (sl) 2002-10-31
CA2118816C (en) 2003-06-17
EP0607206A1 (de) 1994-07-27
DE59209951D1 (de) 2002-05-16
EP0545016A1 (de) 1993-06-09
FI941474A0 (fi) 1994-03-30
JPH10506001A (ja) 1998-06-16
PT607206E (pt) 2002-07-31
EP0607206B1 (de) 2002-04-10
SI9200236A (en) 1993-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RO117861B1 (ro) Complex de acid nucleic si compozitie pentru introducerea acestuia in celulele eucariote superioare
US5981273A (en) Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
CA2222550A1 (en) Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
JPH08507921A (ja) 癌ワクチンの調製方法
JPH07500009A (ja) 高等真核細胞に核酸を導入するための新規結合体
CA2331384A1 (en) Nucleic acid transfer phage
US20060166924A1 (en) Gene therapeutics
KR100241685B1 (ko) 핵산 복합체를 고등 진핵세포내로 도입시키기 위한 조성물
CA2481399A1 (en) Peptides and pharmaceutical compositions comprising said peptides for treating cancer
RU2138553C1 (ru) Трансфекционная композиция для высших эукариотных клеток, комплекс нуклеиновой кислоты, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, конъюгат, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, эндосомолитический пептид, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции
CN109836491A (zh) 一种靶向tipe3的t细胞受体、t细胞受体基因修饰t细胞及其制备方法和应用
HRP920602A2 (hr) Sastav za uvođenje kompleksa nukleinskih kiselina u više eukariotične stanice
US20020028498A1 (en) Recombinant MVA virus expressing the E2 gene of Bovine papillomavirus and its use in the therapy of tumors generated by papillomaviruses
CN112430577A (zh) 靶向EGFRvⅢ并干扰IL-6表达的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用
CN109836489A (zh) 一种靶向ny-eso-1的t细胞受体、t细胞受体基因修饰t细胞及其制备方法和应用
WO2002031139A1 (fr) Vecteur d&#39;expression de transporteur compulsif pour infection organique
CA2241040A1 (en) Improved pharmaceutical compositions