HU218846B - Készítmények nukleinsavkomplexek magasabbrendű eukarióta sejtekbe való bevitelére és eljárás az előállításukra - Google Patents

Készítmények nukleinsavkomplexek magasabbrendű eukarióta sejtekbe való bevitelére és eljárás az előállításukra Download PDF

Info

Publication number
HU218846B
HU218846B HU9400898A HU9400898A HU218846B HU 218846 B HU218846 B HU 218846B HU 9400898 A HU9400898 A HU 9400898A HU 9400898 A HU9400898 A HU 9400898A HU 218846 B HU218846 B HU 218846B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cells
gly
ala
glu
conjugate
Prior art date
Application number
HU9400898A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9400898D0 (en
HUT71312A (en
Inventor
Max L. Birnstiel
Matt Cotten
David Curiel
Bernd Oberhauser
Christian Plank
Walter Schmidt
Ernst Wagner
Kurt Zatloukal
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International Gmbh.
The University Of North Carolina
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim International Gmbh., The University Of North Carolina filed Critical Boehringer Ingelheim International Gmbh.
Publication of HU9400898D0 publication Critical patent/HU9400898D0/hu
Publication of HUT71312A publication Critical patent/HUT71312A/hu
Publication of HU218846B publication Critical patent/HU218846B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
    • C12N2710/10251—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
    • C12N2710/10261—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10363—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/11011—Alpharetrovirus, e.g. avian leucosis virus
    • C12N2740/11022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32711—Rhinovirus
    • C12N2770/32722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32711—Rhinovirus
    • C12N2770/32761—Methods of inactivation or attenuation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

A találmány tárgyát nukleinsavaknak magasabb rendű eukariótasejtekbe történő bevitelére szolgáló készítmények képezik.
A génterápia homlokterében mindenekelőtt a nukleinsavnak az élő sejtekbe történő bevezetésére szolgáló hatékony rendszer iránti igény áll. A géneket bejuttatják a sejtekbe annak érdekében, hogy terápiásán hatásos géntermékek in vivő szintézisét érjék el, például egy genetikai hiba esetében pótolják a hiányzó gént. A „klasszikus” génterápia azon az elven nyugszik, hogy egy egyszeri kezelés által tartós gyógyulást érjenek el. Emellett fennáll az igény olyan kezelési módszerek iránt is, amelyeknél a terápiásán hatásos DNS-t (vagy akár mRNS-t) mint egy gyógyszert („génterapeutikum”) igény szerint egyszer vagy ismételten adják be. Olyan genetikai eredetű megbetegedésekre, amelyeknél a génterápia egy sikert ígérő kezdeményezést mutat fel, példa a hemofília, béta-talasszémia és a súlyos összetett immunhiány (Severe Combined Immuné Deficiency=SCID) egy szindróma, amely az adenozindezamináz enzim genetikai eredetű hiányában nyilvánul meg. Alkalmazási lehetőségeket jelent továbbá az immunszabályozás, ahol egy szekretált antigénfehérjét vagy egy nem szekretált antigénfehérjét kódoló, működőképes nukleinsav oltással történő beadása révén Immorális vagy intracelluláris immunitást érnek el. További példák a genetikai hibákra, amelyeknél a kódolónukleinsav a hibás gén helyett például egyéni igény által meghatározott formában beadható, az izomdisztrófia (Dystrophin gén), cisztikus fibrózis (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gén), hiperkoleszterinémia (LDL-receptor-gén). A génterápiás kezelési módoknak továbbá akkor lehet jelentőségük, amikor hormonokat, növekedési faktorokat vagy citotoxikus vagy immunszabályozó hatással rendelkező fehérjéket kell szintetizálni az élőlényben.
A génterápia a rák kezelésében is egy sikert ígérő kezdeményezést jelent, amikor úgynevezett „rákvakcinát” adnak be. A daganatsejtek immunogenitásának növelése céljából megváltoztatják azokat, hogy vagy erősebben antigén jellegűvé tegyék, vagy arra ösztönözzék őket, hogy meghatározott immunszabályozó anyagokat termeljenek, például citokint, amelyek azután immunválaszt váltanak ki. Ahhoz, hogy ezt megvalósítsák, a sejteket olyan DNS-sel transzformálják, amely egy citokint, például IL-2-t, IL-4-et, IFN-gammát, TNF-alfát kódol. Eddig az autológ daganatsejtekben főleg retrovirális vektorok segítségével végezték el a géntranszfert.
A génterápia keretem belül a nukleinsavak felhasználásában eddig legelőrehaladottabb technológiák retrovirális rendszereket használnak géneknek a sejtekbe történő bevitelére [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 439-443 (1990)]. A retrovírusok felhasználása azonban problematikus, mivel ezek, legalábbis egy csekély százalékban, olyan mellékhatások veszélyét hordozzák magukban, mint a vírusfertőzés (endogén vírusokkal való rekombinálódás vagy helpervírusokkal való szenynyeződés és patogén formává való ezt követő lehetséges mutáció révén) vagy rák kialakulása. Ezenkívül nem minden esetben kívánatos a beteg szomatikus sejtjeinek stabil transzformációja, mint ahogyan azt retrovírusok segítségével elérik, mivel ezáltal, például mellékhatások fellépése esetén, a kezelés csak nagy nehézségek árán fordítható vissza. Ezenkívül a terápiának ennél a formájánál nehéz elegendően magas titert elérni ahhoz, hogy elegendő sejtet fertőzzünk.
Ezenkívül a nukleinsavak mint terápiásán hatásos anyagok alkalmazásra kerülnek meghatározott sejtfunkciók gátlásában, például antiszensz RNS-ek és DNS-ek meghatározott génszekvenciák szelektív gátlásában hatásos szereknek bizonyultak. Hatásmódjuk lehetővé teszi terapeutikumként való alkalmazásukat meghatározott gének (mint szabályozatlan onkogének vagy virális gének) kifejeződésének in vivő blokkolására. Bemutatták már, hogy rövid antiszensz oligonukleotidok bejuttathatok a sejtekbe, és ott kifejthetik gátlóhatásukat [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4143-4146 (1986)], bár sejten belüli koncentrációjuk csekély a nukleinsavak erős negatív töltése miatt a sejtmembránon keresztüli korlátozott átjutásuk következtében.
Egy további adalék a gének szelektív gátlásához a ribozimok alkalmazása. Itt is fennáll az igény az aktív ribozimok egy lehetőség szerinti magas koncentrációjának biztosítására a sejtben, amelynek egyik limitálótényezője a sejtbe történő bevitel.
A génterápiának intracelluláris immunitás elérése céljából történő alkalmazása magában foglalja olyan gének transzdukcióját, amelyek vírusokkal szemben védőhatással rendelkeznek (úgynevezett protektív gének), például olyan gének transzdomináns mutációit, amelyek vírusfehérjéket kódolnak, vagy úgynevezett „RNS decoy”-okat kódoló DNS-molekulákat. Ezért van szükség olyan módszerekre, amelyek lehetővé teszik a DNS kifejeződését a sejtben.
Már eddig is több megoldást javasoltak nukleinsavak élő sejtekbe történő bevitelének javítására, amely ezek terápiás alkalmazásában egyike a limitálótényezőknek.
Az emlősök sejtjeinek in vitro géntranszformációjára különböző technikák ismeretesek, amelyeknek in vivő használhatósága mégis korlátozott (idetartozik a DNS bevitele liposzómák, elektroporáció, mikroinjektálás, sejtfúzió, DEAE-dextrán vagy a kalcium-foszfátprecipitációs eljárás segítségével).
A legutóbbi időben olyan rekombináns vírusvektorokat fejlesztettek ki, amelyek megvalósítják gének átvitelét, miközben a vírusvektor hatásos belépési mechanizmusát használják ki. Ezt a stratégiát alkalmazzák rekombináns retrovírus- és adenovírus-vektorok összeállításánál, hogy nagy hatásfokú in vitro és in vivő géntranszfert éljenek el [BioTechniques 6,616-629 (1988)]. Minden hatásosságuk mellett e vektorok, figyelembe véve a szállítandó DNS nagyságát és szerkezetét, korlátoknak vannak alárendelve. Ezenkívül ezek az anyagok, az eredeti vírus életképes virálisgén-elemeinek kotranszferei miatt, biztonsági kockázatokat hordoznak.
Ezeknek a korlátoknak a kiküszöbölésére alternatív stratégiákat fejlesztettek ki a géntranszfer számára, amely mechanizmusoknak az szolgál alapul, hogy a sejtmakromolekulák transzportját veszi igénybe. Egy példa erre gének bevitele a sejtbe a leghatékonyabb
HU 218 846 Β úton, receptor közvetítette endocitózissal [J. Bioi. Chem. 262, 4429-4432 (1987); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3410-3414 (1990); EP-A1 0388 758 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés]. Ez a kezdeményezés bifunkciós molekuláris konjugátumokat vesz igénybe, amelyek egy DNS-kötő doménnel és egy sejtfelszíni receptorra specifikus doménnel rendelkeznek [J. Bioi. Chem. 262, 4429-4432 (1987); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87; 3410-3414 (1990)]. Amikor az ismertetőjelet magán viselő domént a sejtfelszíni receptor felismeri, a konjugátum a receptor közvetítette endocitózis útján intemalizálódik, aminek következtében a konjugátumhoz kapcsolt DNS-t magával viszi. Ennek az eljárásnak a segítségével részleges géntranszfereket tudtak elérni, amelyek az eddigi eljárásokkal legalábbis egyenértékűek voltak [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3655-3659 (1990)].
Ki tudták mutatni, hogy ennek a rendszernek a közvetítésével a sejtbe bevitt DNS kifejeződik, és gátlóhatású nukleinsavak alkalmazása esetén a transzportrendszer a gátlóhatást nem korlátozza.
A WO 91/17773 közzétételi számú nemzetközi bejelentés olyan nukleinsavak transzportjának rendszerére vonatkozik, amelyek T-sejtekre nézve specifikus hatásúak. Ez a rendszer felhasználja a T-sejt-eredővonal sejtfelületi fehérjéit, például a CD4-et, a HÍV által használt receptort. A bejuttatandó nukleinsavat egy fehérjepolikation konjugátummal komplexbe viszik, amelynek a fehérjerésze egy olyan fehérje, amely rendelkezik a T-sejt felületi fehérjéjéhez, például CD4-hez való kötődés képességével, és olyan sejteket, amelyek ezt a sejtfelületi fehérjét kifejezik, a kapott fehérjepolikation/nukleinsav komplexekkel érintkezésbe hozzuk. Be tudták bizonyítani, hogy ennek a rendszernek a segítségével sejtbe bevitt DNS kifejeződik.
Mindkét találmánynak közös jellemzője, hogy a nukleinsav sejtbe történő bevitelének lehetővé tételére vagy megkönnyítésére specifikus sejtfunkciókat használ fel. A felvételi mechanizmus mindkét esetben olyan faktorok részvételével megy végbe, amelyeket a jelen találmány „intemalizálófaktorok” elnevezéssel jelöl. Ezalatt olyan faktorokat kell érteni, amelyek szűkebb vagy tágabb értelemben sejttípus-specifikusak, adott esetben további faktorokkal együtt hatva (például sejtfelületi fehérjék) a sejt felületéhez kötődnek és intemalizálódnak. (A fent említett két találmány esetében az intemalizálófaktor transzferrin, illetve egy, a T-sejt egy felületi antigénjéhez kötődő fehéqe, például egy antiCD4-antitest.) Az intemalizálófaktort egy olyan polikaTjionkarakterű anyaggal konjugálják, amely nukleinsavak iránti affinitása alapján az intemalizálófaktor és a nukleinsav között kötést hoz létre. (Ilyen típusú anyagokat a következőkben „nukleinsavaffin anyagok” vagy a DNS-sel való összefüggésre utalva „DNS-kötő domének” elnevezésekkel illetjük. Amennyiben egy ilyen anyag mint a konjugátum része a nukleinsav és egy intemalizálófaktor között kötést létesít, a következőkben „kötőfaktor”-ként jelöljük.)
E két találmány vonatkozásában megállapítást nyert, hogy nukleinsavak sejtekbe történő felvételénél optimumot érhetünk el, ha a konjugátum: nukleinsav arányt úgy választottuk meg, hogy az intemalizálófaktor-polikation/nukleinsav komplexek messzemenően elektroneutrálisak voltak. Ebből a megfigyelésből kiindulva javítottuk azokat a módszereket, amelyek nukleinsavak magasabb rendű eukariótasejtekbe történő bevitelére intemalizálófaktor/kötőfaktor/nukleinsav komplexeket használnak fel.
Wagner és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4255-4259 (1991)] leírtak egy módszert, amelynek a segítségével javítható azoknak a rendszereknek a hatékonysága, amelyeknél a nukleinsavak felvétele intemalizálófaktorok segítségével történik. A sejtbe felvett nukleinsav mennyisége nem csökken, ha a transzferrin-polikation konjugátumok egy részét nem kovalensen kötött polikationon keresztül visszük be; sőt bizonyos esetekben a DNS-felvétel jelentős emelkedését érhetjük el. A transzferrin-polikation-plazmid-DNS komplexek - amelyeket optimálisnak talált DNS/konjugátum arány szerint állítottunk elő - molekuláris állapotára vonatkozó vizsgálatok azt mutatták, hogy a plazmid-DNS a konjugátum jelenlétében körülbelül 80-100 nm átmérőjű, toroidális szerkezetekbe (fánkhoz hasonló) sűrítve található.
A T-sejtekhez kötődő fehérjékkel mint intemalizálófaktorokkal végzett kísérletek hasonló eredményekre vezettek.
Szabad nukleinsavaffin anyag(ok) hozzáadása akkor is a beviteli rendszer hatékonyságának növelését eredményezi, ha egy másik nukleinsavaffin anyagot kötőfaktorként alkalmazunk.
A Wagner és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4255-4259 (1991)] által leírt komplexek, amelyeket intemalizálófaktor közvetítette endocitózison keresztül felvesznek magasabb rendű eukariótasejtek, olyan nukleinsavat tartalmaznak, amely egy internalizálófaktor-kötőfaktor konjugátummal van komplexben. A komplexek kiegészítésként egy vagy több nukleinsavaffin anyagot tartalmaznak - amelyek adott esetben azonosak a kötőfaktorral - nem kovalens kötésben oly módon, hogy a konjugátum révén elért intemalizáció és/vagy a nukleinsavkifejeződés növekszik, amely első közelítésben egy kondenzálóhatásra, lehetséges azonban, hogy más mechanizmusra vezethető vissza.
Noha ennek a módszernek a segítségével növelhetnénk a bevitt nukleinsavkifejeződés arányait, ez mégis korlátokba ütközik. Ennek a rendszernek a használhatóságát egy adott összefüggésben nem kizárólag a mindenkori, a rendszer számára meghatározó sejtfelszíni receptorok határozzák meg; azok a korlátok, amelyek ennek a rendszernek a használhatóságát meghiúsítják, valószínűleg abból következnek, hogy az endoszómákba internalizált konjugátum-DNS komplexek átjutnak a lizoszómákba, ahol enzimesen lebomlanak. A sejtmagba bejutott és ott rendeltetésének megfelelően kifejeződött nukleinsavak arányának megnövelésére irányuló kísérletekben - amelyek megelőzték a jelen találmányt - megpróbálták a sejtek transzfekcióját olyan anyagok jelenlétében véghez vinni, amelyek gátolják a lizoszómákban az
HU 218 846 Β enzimaktivitást, úgynevezett lizoszómatrop anyagok. Ennek az intézkedésnek a segítségével a bevitt DNSnek egy megnövelt kifejeződését tudták elérni; az elért reakciók azonban az alkalmazott anyagoktól függően meglehetősen különböztek egymástól - a kiválasztott lizoszómatrop anyagok egy része a géntranszfer megerősítését eredményezte, míg mások ezt még gátolták is. Ily módon állapították meg például, hogy a DNS hatásos bevitele a gyenge bázis klorokin jelenlététől függ [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3655-3659 (1990); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4033-4037(1990)]. Ezt a klorokin által elért hatást azonban nem szabad, illetve nem kizárólag arra visszavezetni, hogy a klorokin megemeli a lizoszómákban a pH értékét; különböző kísérletek során megállapítást nyert, hogy más anyagok, amelyek a klorokinhez hasonlóan a pH módosításának képességével rendelkeznek, mint monenzin, ammóniumklorid vagy metil-amin, nem tudják a klorokint helyettesíteni, a különböző kísérletekben ezeknek az anyagoknak némelyike még gátlóhatást is mutatott. Továbbá megállapítást nyert, hogy a különböző célsejtek ugyanarra a lizoszómatrop hatású anyagra különbözőképpen reagálnak.
Mivel a fiziológiai úton történő géntranszfer, mint azt a receptor közvetítette endocitózis nukleinsavkomplexekkel mutatja, nagy előnyökkel rendelkezik (a sejtmembránon való átlépés nem toxikus mechanizmussal; biológiailag aktív nukleinsavak, mint gének, géndarabok vagy sejtfunkciókat specifikusan gátló nukleinsavak ismételt vagy folyamatos beadásának lehetősége; a sejtspecifikus célba juttatás lehetősége; a konjugátumok nagy mennyiségben történő előállíthatósága), szükség van e rendszer hatásosabbá tételére.
A jelen találmány feladatának tekintettük nukleinsavak magasabb rendű eukariótasejtekbe történő bevitelének megjavítását. (A „bevitel”, illetve „transzfer” kifejezésekbe a jelen találmány keretei között beleértjük a nukleinsavkomplexnek a sejtmembránon keresztül történő sejtbe való belépésén kívül a komplex, illetve az abból szabaddá váló nukleinsav sejten belüli lokalizációját egy, a kifejeződésüknek megfelelő hely eléréséig.) A magasabb rendű eukariótasejtek a szakemberek számára közismertek; az élesztőket nem soroljuk ide [Mól. Bioi. of the Gene, Benjamin/Cummings Publ. Company Inc., 676-677 (1987)].
A vírusok nagy része az eukarióta-gazdasejtbe történő behatoláshoz felhasználja azokat a mechanizmusokat, amelyek a receptor közvetítette endocitózis elvének felelnek meg. E mechanizmus alapján egy vírusfertőzés általában a víruspartikuláknak a sejtmembrán receptoraihoz való kötődésével kezdődik. Ehhez kapcsolódóan következik a vírus intemalizációja a sejtbe. Az intemalizáció lefolyása egy sajátságos utat követ fiziológiás ligandumok vagy makromolekulák sejtbe való belépésének megfelelően. A receptorok a sejt felszínén mindenekelőtt csoportokba rendeződnek, hogy egy úgynevezett „ragadós üreget” (coated pit) képezzenek, ennek alapján türemkedik be a sejtmembrán, és egy burokkal körülvett vezikulumot képez. Miután ez a vezikulum a Clathrin-burkától megszabadult, a belsejében egy, a membránban elhelyezkedő protonpumpa segítségével kiváltott savasodás indul meg. Ez előidézi a vírus szabaddá válását az endoszómából. Attól függően, hogy a vírus rendelkezik-e lipidburokkal vagy sem, a vírus endoszómából történő szabaddá válásának két módját veszik figyelembe. Az úgynevezett „meztelen” vírusok esetében (például adenovírus, poliovírus, rhinovírus) azt feltételezik, hogy az alacsony pH-érték konformációváltozásokat okoz a vírusfehérjében. Ennek következtében hidrofób domének válnak szabaddá, amelyek fiziológiás pH-értéknél nem hozzáférhetőek. Ezáltal ezek a domének megszerzik az endoszómamembránnal való kölcsönhatásba lépés és ezzel a vírusgenom endoszómából a citoplazmába történő szabaddá válása megvalósításának képességét. A burokkal rendelkező vírusokról (például vesicular stomatitis vírus, semliki forest vírus, influenzavírus) azt tartják, hogy az alacsony pH-érték néhány vírusfehérjének a szerkezetét vagy a konformációját módosítja, ami által létrejön a vírusmembrán és az endoszómamembrán fúziója. Azok a vírusok, amelyek ezen mechanizmus segítségével hatolnak be a sejtbe, meghatározott molekuláris különlegességekkel rendelkeznek, amely lehetővé teszi számukra az endoszómamembrán felszakítását ahhoz, hogy beléphessenek a citoplazmába.
Más vírusoknak, például a burokkal rendelkező Sendai-, HÍV- és néhány Moloney-leukémiavírus-törzsnek vagy a burokkal nem rendelkező SV40- és Polyoma-vírusoknak nincs szükségük alacsony pH-értékre a sejtbe történő behatoláshoz, közvetlenül a sejtfelszínen elő tudnak idézni a membránnal egy fúziót (Sendaivírus, lehetőség szerint a HÍV), vagy pedig olyan mechanizmust képesek kifejteni, hogy felszakítsák a sejtmembránt vagy átjussanak rajta. Azt feltételezik, hogy a pH-értéktől független vírusok is igénybe tudják venni az endocitózis útját [J. General Virol. 71, Ί61-1Τ3 (1990)].
Az adott feladat megoldásánál abból a meggondolásból indultunk ki, hogy bizonyos vírusoknak az eukariótasejtekbe történő behatolásánál alkalmazott mechanizmusát használjuk ki a nukleinsavkomplexek sejtbe történő bevitelének javítására, és ezáltal a kifejeződés növelésére.
Már megpróbáltak fehérjéket vírusokkal együtt a sejtbe intemalizálni [Virology 160, 75-80 (1987)]. Megállapították, hogy a makromolekulák bejuttatásánál a vírusnak a sejtet permeabilizáló hatását használják ki. Az itt lejátszódó folyamatoknál folyadékfázismechanizmusokról lehet szó.
A hámeredetű növekedési faktor (Epidermal Growth Factor, EGF) segítségével konjugált toxinról megállapították, hogy ez a természetes ligandum, amely a receptorához való kötődés után endocitózissal bekerül a sejtbe az adenovírussal együtt, amelyet a sejt szintén receptor közvetítette endocitózissal vesz fel, ugyanabba az endoszómába kerül, és abból, szintén a vírussal együtt, szabadul ki a citoszolba [Cell 32, 607-617 (1983)].
Meglepő módon azt találtuk, hogy bizonyos ágensek (például vírusok, víruskomponensek vagy más ható4
HU 218 846 Β anyagok) - amelyek az eukariótasejtekbe történő belépési mechanizmusuk tekintetében meghatározott vírusok sajátságaival rendelkeznek - jelenléte egy komplex részeként, a sejtbe bevitt nukleinsav kifejeződésének mértékében jelentős emelkedést okoz. Ez a tapasztalat mindenekelőtt azért volt meglepő, mert a sejtek által felvett nukleinsavkomplexek nagyon nagy méretűek.
A jelen találmány tárgya tehát egy készítmény, magasabb rendű eukariótasejteknek olyan nukleinsavból és nukleinsavaffin anyagból álló komplexszel történő transzfekciójához, amely adott esetben ezekhez a sejtekhez egy intemalizálófaktorral kapcsolódik. A készítmény azzal jellemezhető, hogy olyan anyagot tartalmaz, amely vagy a) mint a nukleinsavkomplex alkotórésze vagy b) per se rendelkezik a transzfekcióra kiszemelt sejtbe való felvétel és az endoszómák tartalmának - amelyben a komplex a sejtbe lépés után lokalizálva van - a citoplazmába történő kiengedése képességével. Ezt az anyagot a következőkben „endoszomalitikus anyag” névvel jelöljük.
Az endoszomalitikus anyagok azon képességét, hogy a transzfekcióra kiszemelt sejtbe bekerüljenek, és az endoszómák tartalmát - amelyekben a sejtbe lépés után lokalizálva vannak - a citoplazmába kiengedjék, „felvételi funkció”-nak nevezzük. Ez a felvételi funkció az aktív, receptorfuggő endocitózismechanizmusok révén vagy a passzív, folyadékfázison keresztüli, vagy a nukleinsavkomplexek alkotórészeként a sejtbe történő intemalizálódás képességéből és az endoszómák felszakításának képességéből - amelyet általában „endoszomalitikus aktivitás” vagy „endoszomalízis” elnevezéssel jelölünk - tevődik össze.
A találmány egy megvalósítási formájában az endoszomalitikus anyag egy vírus. Egy másik megvalósítási formájában az endoszomalitikus anyag egy víruskomponens. A találmánynak ezekbe a megvalósítási formáiba beültetett vírust, illetve víruskomponenseket a következőkben „szabad vírus(komponens)”-ként jelöljük.
A jelen találmány keretei között megvizsgáltuk növekvő mennyiségű adenovírus hatását állandó mennyiségű transzferrin-polilizin konjugátum géntranszferére HeLa-sejtekben, ahol riportergénként a luciferázgént használtuk. A géntranszfer adenovírus által okozott felerősödése sejtenként 1 χ 104 vírusrészecske esetén ért el maximumot, amely a HeLa-sejtek adenovírus-receptorai hozzávetőleges számának felel meg. A luciferázkifejeződés körülbelül 2000-szeres felerősödése, szemben az egyedül transzferrin-polilizin konjugátummal elért kifejeződéssel, megfelelt a nagyobb vírusmennyiségnek. Egy további kísérletsorozatban megvizsgáltuk korlátozott mennyiségű konjugátum-DNS komplexek kapacitását állandó adenovírus-mennyiség jelenlétében. Megállapítottuk, hogy az adenovírus felvétele a sejtekbe a transzferrin-polilizin közvetítette géntranszfert a DNS-adagolás széles tartományában felerősítette. A konjugátum-DNS komplexek révén elért génkifejeződés maximális erőssége megfelelt annak az erősségnek, amelyet 100-szor kevesebb DNS-sel értünk el adenovírusoknak a transzfekció hatásosságát felerősítő alkalmazásával.
Az adenovírus géntranszferre gyakorolt hatását megvizsgáltuk mind nem komplexben levő, mind polilizinnel vagy transzferrin-polilizin konjugátummal komplexben levő DNS esetében (3A. ábra). Ezen analízis szerint adenovírus jelenléte a transzfekciónál a meztelen, nem komplexben levő DNS transzferét csak csekély mértékben erősítette. Ezzel ellentétben olyan DNS-ek transzferét, amelyek polilizinnel vagy transzferrin-polilizin konjugátumokkal komplexben voltak, az adenovírus kiegészítés felerősítette, ahol ez a hatás a transzferrin-polilizin konjugátumok esetében lényegesen erősebben lépett föl. Mivel a polikation alkotórész a konjugátumban nem csak arra szolgál, hogy a DNS és a transzferrin között kötést hozzon létre, hanem a DNS szerkezetében nyilvánvaló szerkezeti változásokat is okoz [összesűrítés toroidális struktúrákba; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4255-4259 (1991)], a kísérletek alapján nem tudtunk különbséget találni, vajon a megfigyelt hatás a polikationon keresztül kondenzált DNSnek a folyadékfázisba történő felerősített transzportjára vagy a receptorhoz kötött konjugátum-DNS komplex transzportjának a vírus által okozott fokozódására vezethető-e vissza. Ahhoz, hogy e két lehetőség között különbséget tegyünk, szekvenciális kötési próbákat végeztünk (3B. ábra). A transzferrin-polilizin-DNS vagy polilizin-DNS komplexek kötése alacsonyabb hőmérsékleten intemalizálás nélkül lehetővé teszi, hogy az adenovírussal való kezelés előtt a folyadékfázisban fölöslegben levő komplexet eltávolítsuk [Cell 32, 607-617 (1983)]. Ha így jártunk el, a receptorhoz kötött transzferrin-polilizin-DNS komplexek transzportja adenovírus-partikulák hozzáadásával jelentősen megnövekedett, amely a polilizin-DNS komplexek esetében nem érvényesült. Ezért tehát a DNS-nek receptor közvetítette endocitózissal történő belépése a sejtbe az, amely specifikusan felerősödik.
Továbbá megvizsgáltuk, hogy az adenovírusnak melyik az a specifikus funkciója, amely a receptor közvetítette géntranszfert befolyásolja (3C. ábra). A víruspartikulák enyhe hővel való kezelése nem változtatja meg a célsejtek membránjához való kötődési képességét, korlátozza azonban a sejtbe történő belépésük után az endoszómák felszakításának képességét [J. Virol. 64, 3661-3673 (1990)]. Ezen adottság alapján tudtuk a vírus kötődésének és a vírus sejtbe való belépésének eltérő hatásait egymástól elválasztva vizsgálni. A jelen találmány keretei között elvégzett kísérleteknél megállapítottuk, hogy hővel történő inaktiválás a vírusnak a receptor közvetítette endocitózison keresztül lezajló, géntranszfert felerősítő képességét teljes mértékben megszüntette. Ebből vontuk le azt a végső következtetést, hogy a transzferrin-polilizin konjugátumok segítségével történő géntranszfer felerősítése az adenovírusnak specifikusan arra a képességére vezethető vissza, hogy felvételi funkciójának részeként képes az endoszómákat felszakítani. Az a tény, hogy egy replikációs mechanizmusában sérült vírustörzs a génkifejeződés felerősítésére volt képes, megerősíti azt a feltevést, hogy ez a jelenség nem a replikációs funkcióra, hanem a virionfelvételi funkciójára vezethető vissza.
HU 218 846 Β
Annak a lehetőségnek a kizárására, hogy a génkifejeződés felerősödése a bevitt gén vírus okozta esetleges transzaktiválására vezethető vissza, vizsgálatokat végeztünk egy olyan sejtvonallal, amely az RSV-LTRluciferáz gént szerkezetéből adódóan (konstitutíve) kifejezi : az adenovírusok ebben a sejtvonalban semmilyen hatást nem mutattak, miközben a szülői sejtvonalban, amelybe a gént transzferrin-polilizin konjugátumokkal vittük be, a génkifejeződés egyértelmű felerősödését idézték elő. Ez a tapasztalat világossá tette, hogy az adenovírus azokat a folyamatokat befolyásolja, amelyek a transzkripció előtt zajlanak le, hogy a génbevitelre gyakorolt felerősítőhatása tehát a génbejuttatás és nem a génkifejeződés terén érvényesül (5. ábra).
A jelen találmány keretei között továbbá megvizsgáltuk, hogy az adenovírusok milyen kihatással vannak a transzferrin-polilizin konjugátumok segítségével történő géntranszferre kiválasztott sejtvonalakban. Megállapítottuk, hogy transzferrinreceptorok előfordulása a célsejteken szükséges, de nem minden esetben elégséges a transzferrin-polilizin konjugátumok segítségével történő géntranszfer lehetővé tételéhez. Úgy tűnik, hogy olyan sejtspecifikus faktorok, amelyek az endoszómákba intemalizált konjugátum-DNS komplexek sorsával összefüggésben vannak, az ezen az úton végzett géntranszfer mértékében lényeges szerepet játszanak. Erre való tekintettel néhány kiválasztott sejtvonalat mind a transzferrin-polilizin konjugátumok segítségével végzett géntranszferre, mind az adenovírusok által felerősített géntranszferre megvizsgáltunk (4. ábra). Egy cisztikusfibrózis-sejtvonal sejtjei (CFT1) közepes luciferázgén-kifejeződést mutattak transzferrin-polilizinDNS komplexekkel való egyedüli kezelés után. A génkifejeződés mértéke dl312 adenovírussal történt kezelés után jelentősen megnőtt. Egyértelmű ellentétben ezzel KB-sejtek, amelyeket transzferrin-polilizin-DNS komplexekkel kezeltünk, a transzferrinreceptorok megléte ellenére olyan luciferázgén-kifejeződést mutattak, amely alig haladta meg a háttérszintet. A dl312 adenovírussal való kezelés azonban ezeknél a sejteknél egyértelműen kimutatható luciferázaktivitást eredményezett. Hasonlóan hatott az adenovírusokkal való kezelés a HeLa-sejtekre, ez a hatás ezeknél a sejteknél azonban még erősebb volt. Mivel a HeLa- és KB-sejtek körülbelül ugyanannyi adenovírus-receptorral rendelkeznek, a géntranszfer felerősítésében mutatkozó eltérés visszatükrözhetné a transzferrinreceptorok számát, amely egy sejttípusra nézve jellemző érték. Ezektől az eredményektől azonban egyértelműen eltérően a WI-38 és MRC-5 sejtvonalak, amelyekről ismert, hogy adenovírussal való fertőzhetőségük gyenge [Virology, ed. Mahy, B. W. I, IRL Press, Oxford, Washington, DC, 193-205 (1985)], a konjugátum-DNS komplexekkel egyedül elért génkifejeződésnek csak egy nagyon gyenge felerősödése érhető el dl 312 adenovírussal. Az adenovírussal történő kezelés a konjugátum-DNS komplexek segítségével történő géntranszfert tehát azokban az esetekben erősítheti fel, amelyekben a géntranszfer receptor közvetítette endocitózissal lehetséges, mint a CFT1-sejtek esetében, valamint egyes olyan esetekben, amelyekben a géntranszfer ezen az úton nem megy hatásosan, mint HeLa- és KB-sejteknél. Annak az oka, hogy a felerősítés mértéke különböző célsejteknél egyértelműen különbözik, az lehet, hogy ez a hatás mind egy bizonyos sejttípus vírusreceptorainak, például adenovírus-receptorainak számában, mind transzferrinreceptorainak számában rejlik.
Szabad vírus alkalmazása esetén a nukleinsavaffin anyag előnyösen egy szerves polikation, amely előnyösen egy intemalizálófaktorral van konjugálva. A jelen találmány keretei között azonban megállapítottuk, hogy bizonyos körülmények között az olyan DNS, amely csak nukleinsavaffin anyaggal van komplexben, tehát intemalizálófaktor nélkül, szabad vírus jelenlétében bevihető a sejtbe. Továbbá azt találtuk, hogy néhány sejtvonalnál a komplexek - amelyek nukleinsavból és nukleinsavaffin anyagból állnak - felvétele a folyadékfázison keresztül történhet, amennyiben a komplexek koncentrációja megfelelően magas. Azokból a kísérletekből, amelyeket a jelen és a megelőző találmányok keretében végeztünk, azt vezettük le, hogy a nukleinsavkomplexek felvételi képességének egy lényeges eleme azok kompakt mivolta, amely a nukleinsavnak a nukleinsavaffin anyag révén történő kondenzálására vezethető vissza. Ha a nukleinsavaffin anyag azon képessége mellett, hogy a komplexek messzemenő elektroneutralitását előidézze és a nukleinsavat egy kompakt struktúrába sűrítse, elegendő képességgel rendelkezik a sejtfelszínhez való kötődéshez, hogy a vírussal együtt a sejtbe behatoljon, lemondhatunk arról, hogy a felvételi kapacitást megnöveljük egy intemalizálófaktomak kovelensen a nukleinsavaffin anyaghoz történő kötése révén, a komplexnek receptor közvetítette endocitózissal való sejtbe szállítására. Némelyik sejt relatív magas affinitást mutat meghatározott nukleinsavaffin anyaggal szemben olyannyira, hogy a nukleinsavból és kötőfaktorból álló konjugátumokat felveszi a sejt anélkül, hogy egy intemalizálófaktor közreműködésére szükség lenne. Ez a helyzet például a hepatocitáknál, amelyekről a jelen találmány keretei között megállapítottuk, hogy azok DNS-polilizin komplexeket felvesznek.
A találmánynak egy előnyben részesített megvalósítási formájában az endoszomalitikus anyag egy vírus, amely a nukleinsavaffin anyaghoz kötődik és rendelkezik a konjugátum/nukleinsav komplexek sejtbe történő behatolásának és az endoszómák tartalmának - amelyekben a komplex a sejtbe történő belépés után lokalizálva van - a citoplazmába való kiengedése képességével.
Egy további előnyben részesített megvalósítási formában az endoszomalitikus anyag egy víruskomponens, amely egy nukleinsavaffin anyaghoz kötődik és rendelkezik a konjugátum/nukleinsav komplexek sejtbe történő behatolásának és az endoszómák tartalmának - amelyekben a komplex a sejtbe történő belépés után lokalizálva van - a citoplazmába való kiengedése képességével.
Az olyan vírusokat vagy víruskomponenseket, amelyek egy nukleinsavkötő doménhez kötődnek, a következőkben a kötés módjától függetlenül „virális konjugátumok” elnevezéssel jelöljük.
HU 218 846 Β
A virális konjugátumok, amelyek szintén tárgyát képezik a jelen találmánynak, működőképes szerkezeteik szerves alkotórészeként tartalmazzák a vírust vagy a víruskomponenseket, és egyesítik az intemalizálófaktor/konjugátumokon alapuló vektorrendszerek előnyeit a vírusok által a rendszerbe bevitt előnyökkel.
Ezenfelül a virális konjugátumok a találmánynak e megvalósítási formái szerint azzal az előnnyel rendelkeznek, hogy elkerülik azt az alapvető korlátot, amely a receptor közvetítette endocitózissal történő géntranszfer ismert bifunkciós konjugátumrendszerének velejárója azáltal, hogy egy olyan specifikus mechanizmussal rendelkeznek, amely lehetővé teszi szabaddá válásukat a sejt-vezikulum rendszerből. A találmány szerinti virális konjugátumok egy alapvető koncepciózus elfordulást jelentenek a rekombináns vírusvektoroktól azáltal, hogy a szállítandó idegen DNS-t a virion a felszínén hordozza. Ezáltal a találmány szerinti konjugátumok segítségével egészen nagy génszerkezetek is bevihetők a sejtbe, ahol a szekvenciára nézve semmiféle korlátozás nem áll fenn.
Egy vírus alkalmasságát a jelen találmány keretei közötti beépíthetőségre, mint szabad vagy kötött vírus (rész), mint víruskomponens, felvételi funkciója által definiáljuk. Az alkalmas vírusok egyrészt olyanok, amelyek rendelkeznek a sejteknek a nukleinsavkomplexszel történő transzfekciója alatt receptor közvetítette endocitózissal a sejtbe való behatolás képességével, és hogy kiszabadulásukat - és ezzel együtt a nukleinsav szabaddá tételét - az endoszómából a citoplazmába előidézzék. Anélkül, hogy ezt az elméletet rögzíteni akarnánk, ez a mechanizmus annyiban kedvező lehetne a sejtbe bejuttatott nukleinsavkomplexeknek - amennyiben ezek az intemalizálás során ugyanabba az endoszómába jutnak, mint a vírusok -, hogy a vírusokkal együtt az endoszómából a citoplazmába szállítódnak. Ha a nukleinsavkomplexek a vírust kötött formában tartalmazzák, hasznot húznak a vírus endoszomalitikus aktivitásából, és az endoszómákból a citoplazmába kerülnek. Emellett az endoszómák és lizoszómák fúziója és ezáltal az ezekben a sejtalkotókban normális körülmények között végbemenő enzimes lebontás elkerülhető lenne.
Vírusokra és magasabb rendű eukariótasejtekre, amelyekbe ezek behatolni képesek, Fields és Knipe írtak le példákat [Virology 2nd edition, Raven Press Ltd., New York (1990)]. Egy adott sejtvonal fogékonysága a transzformációra egy vírus által - amelyet szabad vírus formájában nukleinsavkomplexek sejtbe történő belépésének elősegítésére építünk be - a célsejt vírus számára megfelelő felületi receptorainak előfordulásától és számától függ. Módszereket sejtfelületi adenovírus-receptorok számának meghatározására HeLa- és KB-sejtekre Svensson és Defer [J. Virol., 55, 442-449 (1985); J. Virol., 64,3661-3673 (1990)] írtak le.
Azokhoz a vírusokhoz - amelyek a találmány szerinti készítménynek megfelelnek és amelyeknél a fertőzés kezdetekor receptor közvetítette endocitózissal lezajló felvételi funkció végbemegy - tartoznak egyrészt a lipidburok nélküli vírusok, mint adenovírus, poliovírus, rhinovírus, másrészt a burokkal rendelkező vesicular stomatitis vírus, semliki forest vírus, influenzavírus; ezenkívül megfelelnek a Moloney-vírus pH-értéktől függő törzsei. A jelen találmány alkalmazására különösen előnyös vírusok közé tartoznak az adenovírus C alcsoport, 5 típus, semliki forest vírus, vesicular stomatitis vírus, poliovírus, rhinovírusok és Moloney-leukémiavírus-törzsek.
Jelen találmány számára olyan RNS-vírusok alkalmazása, amelyeknek nincs reverz transzkriptáz enzimjük, azzal az előnnyel jár, hogy a transzfekciót egy ilyen vírus jelenlétében nem követi vírus-DNS képződése a sejtben. A jelen találmány keretei között megmutattuk, hogy a rhinovírus HRV2 a picomavírus-csoportnak egy képviselője, amely egy riportergén kifejeződését megnöveli. A rhinovírus teljesítőképességét mind szabad, mind víruskonjugátum formában megmutattuk.
A jelen találmány keretei között vírus fogalom alatt értjük - feltéve, hogy a sejtbe bekerülnek, és az endoszómák tartalmát, amelyekbe bejutottak, szabaddá teszik - a vad típusokon kívül a mutánsokat is, amelyek a vad típusoknak a felvételi funkciótól különböző működéseit, különösen a replikáció képességét, egyszeri vagy többszöri mutációval elvesztették.
Ilyen mutánsokat mutagén kezeléssel állítunk elő, illetve delécióval azon vírusfehérje-régiókban, amelyek a replikációs funkciókért felelősek és a felvételi funkció számára nélkülözhetők, és a bevonathatáron keresztül komplementálhatók. Idetartoznak például az adenovírus esetében a ts-mutánsok (temperatursensitive=hőmérsékletre érzékeny), El A- és ElB-mutánsok, az MLP-hajtó génekben mutációt szenvedett mutánsok [BioTechniques 6, 616-629 (1988)] és a bizonyos kapszidfehéijék terén mutációval rendelkező mutánsok. Továbbá alkalmasak olyan vírustörzsek, amelyek megfelelő spontán mutációt szenvedtek. A vírusok replikációs képességét például az irodalomból ismert plakkmeghatározással vizsgálhatjuk, amelynél különböző víruskoncentrációjú szuszpenziókat rétegezőnk sejtkultúrákra, és a lizált sejtek számát, amelyek a plakkok révén láthatóak, állapítjuk meg [Microbiology, 3. edition, ed. Davis, B. D. et al., Harper and Row, The Natúré of Viruses, 853-884 (1980)].
A jelen találmány keretei között történő felhasználásra alkalmasak ezenkívül úgynevezett hibás vírusok, amelyeknek az önálló vírusreplikációhoz szükséges funkcióhoz hiányzó egy vagy több gén erejéig helper (segítő)-vírusokra van szükségük. Ennek a csoportnak a képviselői Dl-partikulák („defective interfering particles”), amelyek fertőző standard vírusból származnak, a standard vírussal azonos szerkezeti fehérjékkel rendelkeznek, mutációt szenvedtek, és a standard vírusra mint helpervírusra van szükségük replikációjukhoz [The Molecular Basis of Viral Replication, ed. Bercoff, R. P., Plenum Press New York and London, The Role of Defective Interfering (Dl) Particles in Viral Infection, 191-194 (1987); Virology, 2. edition, ed. Fields, Β. N., Knipe, D. M. et al. Raven Press Ltd., New York, Defective Viral Genomes, 151-165 (1990)]. Ennek a csoportnak a képviselői ezenkívül a szatellitavírusok
HU 218 846 Β [Virology 2nd edition, Raven Press Ltd., New York, Defective Viral Genomes, 151-165 (1990)]. Egy másik csoport a parvovírusok osztálya, amelyet adenoszatellitaként („adeno-associated vírus”) jellemeznek [Virology, 2. edition, ed. Fields, Β. N., Knipe, D. M. et al. Raven Press Ltd., New York, 1743-1759 (1990)]. Mivel sok vírusnak a sejtbe történő felvételi ciklusa még nem teljesen tisztázott, feltételezzük, hogy vannak még más vírusok, amelyek endoszomalitikus aktivitással rendelkeznek, amely alkalmasságukhoz szükséges a jelen találmányban történő felhasználásukra.
A jelen találmány keretei között megfelelőek továbbá legyengített élő vakcinák [Microbiology, 3. edition, ed. Davis, B. D. et al., Harper and Row, Picomaviruses, 1095-1117 (1980)] vagy oltóanyagok.
Vírus fogalom alá tartoznak továbbá a jelen találmány keretei között az inaktivált vírusok, például kémiai kezeléssel, így formaldehides kezeléssel, UV besugárzással, kémiai kezelés és UV besugárzás kombinációjával, például psoralen/UV vagy bróm-dezoxi-uridin/UV kezeléssel, gamma-besugárzással vagy neutronbombával inaktivált vírusok.
Inaktivált vírusokat, ahogyan például vakcinának használják azokat, az irodalomból ismert standard eljárások [Microbiology, 3. edition, ed. Davis, B. D. et al., Harper and Row, Sterilization and Disinfection, 1264-1274 (1980); Nucl. Acids Rés. 4, 1339-1347 (1977)] szerint állíthatunk elő, és a DNS-komplexek bevitelének megnövelésére szolgáló beépítésük szempontjából vizsgáljuk. A jelen találmány keretei között végzett kísérletekben adenovírus-preparátumokat készítettünk egy szokásos UV-sterilező lámpa vagy formaldehid segítségével, és meglepő módon azt állapítottuk meg, hogy a vírusok inaktiválódásának mértéke jóval nagyobb volt, mint a géntranszferhatás csökkenése, amelyet akkor értünk el, ha az adenovírust hozzáadtuk a transzfekciós táptalajhoz. Azok a kísérletek is, amelyeket psoralen/UV inaktivált, biotinezett, sztreptavidinhez kapcsolt polilizinnel konjugált adenovírus-készítményekkel végeztünk el, azt mutatták, hogy az inaktiválás következményeként a virustiter sokkal erősebben visszaesett, mint a géntranszfer-kapacitás. Ez egyértelműen arra utal, hogy azok a mechanizmusok, amelyek az aktív vírusoknál a normális fertőzési mechanizmussal vannak összefüggésben, tönkretehetők anélkül, hogy a géntranszfer számára lényeges hatás eltűnne.
„Víruskomponensek” fogalom alatt a vírusoknak olyan részeit értjük, például a nukleinsavtól megszabadított fehérjerészt [az üres víruskapszidot, amelyet rekombináns módszerek segítségével állíthatunk elő, lásd például J. Virology 65, 2088-2092 (1991); 1 Gén. Virol. 70, 1453-1463 (1989)], fehérjéket, amelyeket a frakcionálásnál kapunk vagy peptideket, amelyek rendelkeznek az intakt vírusnak a felvételi funkció számára lényeges endoszomalitikus képességével. Ezeket a víruskomponenseket szintetikusan is előállíthatjuk, nagyságuktól függően vagy peptidszintézissel, vagy rekombináns módszerekkel. A jelen találmány keretei között meg tudtuk mutatni, hogy azok az adenovírus-fehérjék, amelyek biotin/sztreptavidinen keresztül polilizinnel konjugálva vannak, a géntranszfert fel tudják erősíteni. A példák adenovírusoktól különböző más vírusok fehéijefragmentumaira, amelyek a vírus intemalizálása számára lényegesek, magukban foglalják az influenzavírus-hemagglutinint (HA). Az influenzavírus-hemagglutinin HA-2 alegységének N-terminális szekvenciája felelős a vírusnak az endoszómából történő szabaddá tételéért. Kimutattuk, hogy olyan peptidek, amelyek ennek a szekvenciának 20 aminosavjából állnak, a lipidmembránt fuzionálni tudják és részben felszakíthatják/tönkretehetik [J. Gén. Virol. 69, 1847-1857 (1988)]. A jelen találmányban autentikus és módosított influenzapeptideket sikeresen alkalmaztunk különböző megvalósítási formákban. Egy további példa a retrovírusok burokfehérjéi, például HÍV gp41 [Biochemistry 29, 7917-7922 (1990)], illetve e vírusfehérjék részei.
Olyan vírusoknak az alkalmazása, amelyek magukban hordozzák a sejtekbe való behatolás képességét, csak egy vonatkozása a jelen találmánynak.
Azokat a vírusokat vagy víruskomponenseket, amelyek nem hordozzák magukban a sejthez kötődés és behatolás képességét, előnyösen a fent definiált virális konjugátumok formájában alkalmazzuk. A kapcsolódás egy DNS-kötő doménhez, például egy polikationhoz garantálja, hogy a vírus, illetve víruskomponens a DNS-molekulához egy erős affinitást kap, amely által komplexbe kerül, és mint a DNS-komplex alkotórésze - amely szintén tartalmaz egy internalizálófaktor/DNS-kötő dómén konjugátumot - bejut a sejtbe. Ráadásul az így elért transzporthatáshoz, a vírus, illetve víruskomponens kötődése egy nukleinsavkötő doménhez endoszomalitikus tulajdonságaiban is javulást eredményez.
Más internalizálófaktorok megválasztása révén gyakorlatilag minden magasabb rendű eukariótasejt transzfekciója megoldható a találmány szerinti készítményekkel.
Azt, hogy egy adott vírus, illetve egy víruskomponens rendelkezik-e a jelen találmány értelmében vett felvételi funkcióval, és ennek következményeképpen alkalmazható-e a géntranszfer felerősítésére, egy egyszerű screening meghatározással eldönthető. Egy ilyen meghatározás során, például hogy egy vírust szabad vírusként történő felhasználására nézve teszteljünk, a célsejteket a vírus jelenlétében vagy távollétében hozzuk érintkezésbe egy DNS-komplexszel. A citoplazmába kiszabaduló DNS-komplex mennyiségét azután egyszerűen egy markerezett géntermék, például luciferáz kimutatásával határozzuk meg. Ha a vírus jelenléte azt eredményezi, hogy a DNS-komplex nagyobb mértékben kerül be a sejtbe és szabadul ki a citoplazmába, mint vírus nélkül, ez a vírus felvételi funkciójára vezethető vissza. Eljárhatunk úgy is, hogy a tesztvírust felvételi funkciójára nézve egy olyan vírussal hasonlítjuk össze, amelyről ismert, hogy megfelelő felvételi funkcióval rendelkezik, például 5 típus C alcsoportba tartozó adenovírussal. Az ilyen jellegű teszteknél virális konjugátumokat is alkalmazhatunk, ahol kiegészítőparaméterek, mint különböző intemalizálófaktor/konjugátumok, különböző mennyiségben alávethetők ilyen vizs8
HU 218 846 Β gálatoknak. Ebből kiindulva az átlagszakember alkalmazhat ilyen jellegű meghatározásokat - adott esetben más tesztekkel összekötve, mint például liposzómaáteresztőképesség-meghatározásokkal („Liposomes Leakage Assays”) - egyszerűen víruskomponensek vagy más, várhatóan endoszómalitikus aktivitással rendelkező anyagok felhasználásával, hogy ezek génkifejeződést növelő képességét megvizsgálja.
Intakt vírusok alkalmazása esetén, célszerűen párhuzamosan az előkísérletekkel, amelyekben a vírus géntranszfert felerősítő képességét vizsgáljuk, megnézzük, vajon a vírus képes-e replikációra. A replikációs képesség vizsgálatát sejtpatogén vírusok esetében vagy olyan vírusoknál, amelyek a gazdasejt növekedését észrevehetően korlátozzák, tarfoltmódszer (plaque assay) segítségével végezzük (lásd fentebb). Más vírusoknál a mindenkori vírusra speciális kimutatási módszereket alkalmazunk, például a hemagglutinációs tesztet vagy kémiai-fizikai módszereket (elektronmikroszkópia).
A jelen találmány keretei között olyan vírusokat részesítünk előnyben, amelyek magas titerrel állíthatók elő, stabilak, vad típusaik csekély patogenitást mutatnak, és amelyeknél lehetséges a replikációs funkció célzott kikapcsolása, különösen adenovírusokat. Amikor egy meghatározott sejtpopulációt kell transzformálni, azokat a vírusokat részesítjük előnyben, amelyek specifikusan ezt a sejtpopulációt fertőzik. Abban az esetben, ha a transzfekciónak különböző sejttípusokra kell kiterjednie, olyan vírusokat alkalmazunk, amelyek a sejttípusok széles körére nézve fertőzőek.
A víruskészítmények előállításával szemben támasztott követelmények lényegében a lehető legnagyobb tisztaság, valamint a mindenkori vírusra meghatározott stabilizálópuffer.
A jelen találmány in vivő terápiás alkalmazása szempontjából minden esetben csak olyan vírusok vagy víruskomponensek jönnek szóba, amelyeknél a biztonsági kockázatokat, különösen a vírusnak a sejtben való replikálódását illetően, mint a vírus DNS rekombinációját a gazdasejt DNS-sel, messzemenően lecsökkentjük.
Előnyös módon felhasználhatjuk azoknak a vírusoknak a belépési mechanizmusát, amelyek az embertől eltérő állatokat fertőznek, DNS bevitelének és szabaddá tételének felerősítésére magasabb rendű eukariótasejtekben, különösen emberi sejtekben, amennyiben a vírus a sejtekben az endoszómák felszakítására képesnek bizonyul. Az adenovírus-család tagjait izoláltuk madárfajtákból, kétéltűekből és különböző más állatokból [Virology 45, 598-614 (1971); Onderstepoort J. Vet. Rés. 58, 309-310 (1991); Nucl. Acids Rés. 19, 424 (1991); Nippon Juigaki Zasshi 52, 207-215 (1990); Am. J. Vet. Rés. 50, 1466-1470 (1989) és Aust. Vet. J. 64, 365-367 (1987)]. Kétéltűek, madarak, szarvasmarhák, kutyák, egerek, birkák, disznók és majmok adenovírusai ugyanúgy, mint emberi adenovírusok, beszerezhetők az amerikai törzsgyűjteményből (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland) [lásd American Type Culture Collection Catalogue of Animál Viruses and Antisera, Chlamydae and Rickettsiae, 6,1-17 (1990)].
Egy távoli faj vírusának, például adenovírusának alkalmazása olyan lehetséges előnyökkel jár, hogy csökkent toxicitású a célsejtben (például csirke vagy béka adenovírusától nem várnánk, hogy emlősök sejtjeiben replikálódjon vagy korai gének kifejeződését serkentse), a humán adenovírussal összehasonlítva csökkent kockázatot jelent a kutató számára, aki e távoli faj vírusát előkészíti, és csökkent zavarást okoz az antitestek révén, ellentétben a humán vagy egér-adenovírussal. A humán vagy egérantitestek révén fellépő zavarás elmaradása nagyon fontos, ha a vírusokat emberben vagy egérben használjuk génterápia számára.
A csirke-adenovírus CELO (Chick Embryo Lethal Orphan Vírus=csirkeembriót elölő vírus) nem mutat reaktivitást azokkal az antitestekkel, amelyek olyan adenovírusok főcsoportepi topjait ismerik fel, amelyek emlősállatok sejtjeit fertőzik. Ezenkívül CELO-vírusok tenyészthetők embrionált tojásokban nagy vírusmennyiségek előállítása céljából [0,5 mg/tojás; Virology 45, 598-614 (1971)]. Mint a kísérletekből következik, CELO-polilizin konjugátumok olyan mértékben erősítik fel a DNS transzportját HeLa-sejtekben, amely a humán dl312 adenovírussal összemérhető. Ennélfogva CELO-konjugátumok felhasználása a DNSbevitel felerősítésére a humán génterápia számára igen sokat ígérő.
Távoli fajok vírusait előnyben részesítjük virális konjugátumok alkotórészeiként kombinációs komplexekbe (a jelen találmány keretei közötti definíció szerint) történő beépítésre.
A találmány szerinti konjugátumokban, amelyek egy vírust tartalmaznak, a vírus kötődése a nukleinsavkötő doménhez lehet kovalens vagy nem kovalens, az utóbbi egy biotin/sztreptavidin hídon keresztül, vagy abban az esetben, ha a vírus a felületi fehérjéiben olyan régiókkal rendelkezik, amelyek savasak és ezáltal egy polikationt kötni tudnak, ionos kötéssel.
A jelen találmány keretein belül elvégzett kísérletekben komplexeket képeztünk olyan körülmények között, amelyek az ionos kölcsönhatást az adenovírus és a polilizin között a DNS-sel való komplexképzés előtt lehetővé tették. Kontrollként olyan körülmények között végeztünk kísérleteket, amelyekben a polilizint először DNS-sel semlegesítettük, és ezáltal nem tudott az adenovírushoz kötődni. Ezekben a kísérletekben az ionosán kötött adenovírust tartalmazó komplexek bizonyultak erősebbnek.
A találmány szerinti, endoszómalitikus aktivitással rendelkező konjugátumokban példák víruskomponensekre az üres víruskapszidok vagy virális peptidek. A víruskomponenseknek a nukleinsavkötő doménhoz való kötődése lehet kovalens, például a peptid kémiai kapcsolódása a polilizinnel, vagy nem kovalens, például ionos abban az esetben, ha a víruskomponens rendelkezik savas maradékokkal a polikationhoz való kötődéshez.
A vírus vagy víruskomponens és a nukleinsavaffin anyag aránya változó lehet. A jelen találmány keretei között az influenzahemagglutinin-peptid/polilizin konjugátum esetében azt találtuk, hogy a géntranszfer na9
HU 218 846 Β gyobb mértékben erősíthető fel, ha a virálispeptid-tartalom a konjugátumokban magasabb.
A jelen találmány tárgyát egy további vonatkozásban a találmány szerinti, vírusból (komponensekből) és nukleinsavaffin anyagból álló konjugátumok előállítására irányuló módszerek képezik.
A virális konjugátumok (mint az intemalizálófaktor-polikation konjugátumok) előállíthatók a komponensek összekapcsolásával, vagy ha a víruskomponens és a polikation polipeptid, akkor rekombináns úton, az előállítási módokat illetően az EP 388 758 számú európai szabadalmi leírás közzétételére hivatkozunk.
A vírus, vírusfehétjék vagy víruspeptidek összekapcsolása poliaminvegyületekkel kémiai úton, a peptidek egymással való kapcsolódásának ismert módja szerint történhet, ahol amennyiben szükséges, az egyes komponenseket a kapcsolási reakció előtt kapcsoló (linker)anyagokkal látjuk el (erre a műveletre akkor van szükség, ha eleve nem áll rendelkezésre a kapcsoláshoz megfelelő funkciós csoport, például egy merkaptovagy alkoholcsoport). A kapcsolóanyagoknál olyan bifunkciós vegyületek jönnek szóba, amelyeket mindenekelőtt az egyes komponensek funkciós csoportjaival léptetünk reakcióba, amelyet követően a módosított komponensek kapcsolását végezzük el.
A kapcsolás történhet:
a) Diszulfidhidakon keresztül, amelyek redukált körülmények között újra szétválhatnak (például szukcinimidil-piridil-ditiopropionát felhasználásával; Biochem. Rés. Commun. 101, 599 (1981).
b) Biológiai közegben messzemenően stabil vegyületeken keresztül (például a második komponenshez szulfhidrilcsoportokkal kötődő linkerek maleimidolinkerekkel való reakciója révén keletkezett tioéter).
c) Biológiai közegben labilis hidakon keresztül, például észterkötések vagy gyenge savas közegben instabil acetál- vagy ketálkötések.
A jelen találmány keretei között elvégzett kísérletekben endoszomalitikus influenzahemagglutinin HA-2 peptideket kapcsoltunk össze polilizinnel szukcinimidil-piridil-ditiopropionát (SPDP) segítségével kémiai úton. Kimutattuk, hogy a peptidnek polilizinnel való módosítása megemeli az endoszomalitikus aktivitást. Transzfekciós kísérletek azt mutatták, hogy a transzferrin-polilizin közvetítette géntranszfer hatékonysága jelentősen megnő, ha az influenzapeptid/polilizin konjugátumok a transzferrin-polilizinnel együtt állnak rendelkezésre a DNS-komplexben.
A jelen találmány keretei között továbbá különböző módszerek segítségével a polilizinhez kapcsoltuk az adenovírust. A polilizinhez való kapcsolásnak egy módja hasonló a hibás, dl312 adenovírusnak egy heterobifünkciós reagenssel való módosítását követő transzferrin-polilizin konjugátumok [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)] előállításához. A nem kötődött polilizint centrifugálással választottuk el. A DNSkötő képességét egy kötési kísérletben radioaktív jelzett DNS segítségével bizonyítottuk.
K562-sejtekben, klorokin nélkül olyan komplexekkel, amelyek DNS-ből, adenovírus-polilizinből és transzferrin-polilizinből állnak, lényegesen magasabb géntranszfert tapasztaltunk, mint módosítatlan adenovírus esetében, amely nem a DNS-hez kötötten áll rendelkezésre. Továbbá azt találtuk, hogy HeLa-sejtekben polilizin/módosított adenovírus segítségével csupán 0,0003 pg DNS felhasználásával 5 χ 105 HeLa-sejtben egyértelmű génkifejeződés jött létre.
Abban az esetben, ha a vírus, illetve víruskomponens megfelelő szénhidrátláncokkal rendelkezik, összekapcsolódhat a nukleinsavaffin anyaggal a glikoprotein egy vagy több szénhidrátláncán keresztül.
Glikoprotein-polikation konjugátumok előállítására egy megfelelő eljárás található a P 41 15 038.4 számú német szabadalmi bejelentésben; ezt röviden Wagner és munkatársai [Bioconjugate Chemistry 2, 226-231 (1991)] írták le.
Egy további előnyben részesített eljárás a találmány szerinti konjugátumok előállítására a vírus, illetve víruskomponens enzimes kapcsolása egy nukleinsavaffin anyaghoz, különösen egy poliaminhoz egy transzglutaminázon keresztül.
A transzglutaminázok csoportja több olyan különböző enzimet foglal magában, amelyek többek között a hámrétegben (epidermális transzglutamináz), a vérben (XIII. faktor) és a különböző szövetek sejtjeiben (szöveti transzglutamináz) fordulnak elő [Methods Enzymol. 113, 358-375 (1985)]. A transzglutaminázok Ca+ + jelenlétében és NH3 keletkezése mellett katalizálják az e-(7-glutamil)-lizin-kötéseket. Ennek az a feltétele, hogy a fehérjének megfelelő glutamin és lizin forduljon elő, amelyeket az enzim át tud alakítani. A lizin εaminocsoportja mellett (poli)aminok, mint etanolamin, putreszcin, spermin vagy spermidin is szolgálhatnak szubsztrátként [Arch. Biochem. Biophys. 79, 338-354 (1959)]. Eddig még nem tisztázott, milyen faktoroktól függ, hogy egy fehérjéből egy glutamint vagy lizint, vagy egy poliamint tud átalakítani az enzim. Ismert, hogy számtalan sejtfehérjéhez, mint a citokeratinhoz [Láb. Invest. 61, 603-608 (1989)], tubulinhoz, sejtmembránfehérjékhez és az influenzavírusok sejtfelszíni fehérjéihez [Eur. J. Biochem. 80, 359-368 (1977)] transzglutamináz segítségével poliaminok hozzáköthetők.
A jelen találmány keretei között meg tudtuk mutatni, hogy a polilizin transzglutamináz segítségével adenovírusokhoz kapcsolható. Megállapítottuk, hogy a kapcsolás glicerin jelenlétében végezhető el. Ez azzal az előnnyel jár, hogy egy olyan víruskészítmény, például adenovírus-készítmény, amely a pufferben stabilizálóágensként glicerint tartalmaz, közvetlen felhasználható a kapcsoláshoz. Olyan adenovírus-polilizin-konjugátumok segítségével, amelyek transzferrin-polilizin konjugátumokkal együtt plazmid-DNS-sel komplexben vannak, a génkifejeződésnek többszörösét tudtuk elérni, mint transzferrin-polilizin konjugátumokkal polilizinhez nem kapcsolt adenovírus jelenlétében.
Egy további, a jelen találmány keretei között előnyben részesített eljárás a találmány szerinti konjugátumok előállítására abban áll, hogy a vírus vagy víruskomponens egy biotin-fehérje hídon keresztül, előnyö10
HU 218 846 Β sen egy biotin-sztreptavidin hídon keresztül kapcsolódik a polikationhoz.
A biotin és a sztreptavidin ismerten erős kapcsolatát [Anal. Biochem. 171, 1 (1988)] használjuk ki az adenovírusnak a polilizinhez való kötésére azáltal, hogy az adenovírust biotinnal módosítjuk, és a sztreptavidint a transzferrin-polilizin konjugátumok előállításához hasonló módon [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)] kémiailag polilizinnel konjugáljuk. A DNS-ből és a biotinnal módosított vírushoz kötött sztreptavidin-polilizinből álló komplex és adott esetben még nem kovalensen kötött polilizin nagyon magas transzfekciós hatékonyságot mutatnak alacsony DNSkoncentrációknál is. Különösen nagy hatékonyságú komplexek képződnek, ha a biotinnal módosított vírust először a sztreptavidin-polilizinhez kötjük, és csak a második lépcsőben következik a DNS megkötése.
Adott esetben történhet a biotinhoz való kötés avidinen keresztül is.
Továbbá előállíthatjuk a vírus(komponensek) és a polilizin közötti kötést azáltal, hogy egyrészt a vírust biotinilezzük, másrészt egy antibiotin-antitestet polilizinnel konjugálunk és a vírus és polilizin közötti kötést a biotin/antitest kötésen keresztül állítjuk elő, ahol kézenfekvőén poliklonális vagy monoklonális antitesteket viszünk be a biotinnal szemben.
A vírus és a polilizin közötti kötést úgy is előállíthatjuk, hogy a polilizint egy olyan lektinnel kapcsoljuk össze, amelynek egy vírusfelületi glikoproteinhez affinitása van, ahol a kötés egy ilyen konjugátumban a lektin és a glikoprotein között jön létre. Amennyiben a vírus eleve nem rendelkezik megfelelő szénhidrátoldalláncokkal, megfelelően módosítható.
Vírust köthetünk egy nukleinsavaffm anyaghoz is azáltal, hogy először módosítjuk a felületét egy vírusidegen antigénnel (például digoxigeninnel, DIG, kapható a Boehringer Mannheim cégnél; vagy biotinnal), és a módosított vírus és a nukleinsavaffm anyag közötti összeköttetést egy olyan antitesten keresztül valósítjuk meg, amely ehhez az antigénhez kötődik.
Az, hogy melyik eljárást alkalmazzuk a találmány szerinti konjugátumok előállítására, különböző kritériumok függvénye. így például a biotinen keresztül történő kapcsolás a legkevésbé specifikus, és ebből következően a legszélesebb körben alkalmazható módszer, a biotin közvetítette kötés egy nagyon erős, nem kovalens kötést képvisel. Az enzimes reakció transzglutaminázzal azzal az előnnyel jár, hogy a legkisebb mennyiségnél is elvégezhető. A kémiai kapcsolás általában akkor jön számításba, ha nagyobb mennyiségű konjugátumot kell szintetizálni, ez a módszer általában a legcélszerűbb akkor is, ha vírusfehérjéket vagy -peptideket kell kapcsolni.
Inaktív vírusok alkalmazása esetén az inaktiválást általában a kapcsolás előtt végezzük el, amennyiben az inaktiválás nem akadályozza a kapcsolás létrejöttét.
Ha egy vírus, például adenovírus vagy annak egy endoszomalitikus komponense hozzáférhető kötődoménekkel rendelkezik, például polikation kötéséhez savas doménekkel, a vírus, illetve víruskomponens kötődése a polikationhoz ionos is lehet. Ebben az esetben az intemalizálófaktorral konjugált polikation pozitív töltéseit a vírus(komponens) savas doménjei részben semlegesítik, a maradék pozitív töltéseket pedig lényegében a nukleinsav semlegesíti.
Amennyiben nukleinsavaffm anyagként egy közbenső anyagot viszünk be, módosítjuk a mindenkori víruskapcsoláshoz megfelelő linkerrel, például transzglutaminázzal való kapcsoláshoz sperminnel vagy egy bifunkciós, a kémiai kapcsoláshoz megfelelő csoporttal, például egy aktív észterrel.
A vírus(komponens): nukleinsavaffm anyag aránya változhat, általában empirikusan állapítjuk meg, például úgy, hogy állandó mennyiségű vírus(komponens)t különböző mennyiségű polilizinnel konjugálunk és a transzfekcióhoz optimális konjugátumot kiválasztjuk.
A találmánynak egy további megvalósítási formájában a víruskomponenst, például egy endoszomalitikus virális pepiidet, módosíthatjuk, hogy a DNS-hez közvetlenül hozzáköthessük. E célból a peptid maga rendelkezhet egy DNS-kötő doménnel, amelyet úgy kaphatunk, hogy a pepiidet peptidszintézis segítségével állítjuk elő, ahol egy szakaszt pozitív töltésű aminosavakkal tervezünk meg, előnyösen a peptid meghosszabbításával, különösen előnyben részesítve a C-terminálist.
A találmánynak egy további megvalósítási formájában az endoszomalitikus anyag egy nem virális, adott esetben szintetikus peptid. A találmány szerinti készítmény egy ilyen típusú peptidet előnyösen oly módon tartalmaz, hogy az ionosán kötődik a nukleinsavaffm anyaghoz, például DNS/intemalizálófaktor/polilizinkomplexek esetén polilizinhez. így történik az endoszomalitikus peptid beépítése a nukleinsavkomplexbe azáltal, hogy a peptid a savas aminosavmaradékai révén a pozitív töltésű nukleinsavkötő doménhez, előnyösen polilizinhez kapcsolódik. A peptid kémiai szerkezetétől függően, különösen végcsoportjaira vonatkozóan, a polilizinhez való kötődés történhet a peptidek polilizinhez való kötődésének itt leírt módszerei szerint is. E célból ha egy, a természetben előforduló peptidet viszünk be, ezt a peptidet egy megfelelő terminális aminosawal, mint „szárral” módosíthatjuk a konjugációhoz.
Egy másik mód nem virális endoszomalitikus peptidek nukleinsavkomplexekbe történő beépítésére abból áll, hogy olyan szekvenciákkal látjuk el azokat, amelyek a DNS-hez kötődnek. Egy ilyen szekvencia helyzete olyan kell legyen, hogy a peptid endoszomalitikus aktivitását ne zavarja. Ezért például az olyan peptideket, amelyeknek N-terminálisa felelős ezért az aktivitásért, a C-terminálison hosszabbítjuk meg DNS-kötő szekvenciákkal. Az ilyen módon történő meghosszabbítások homológ vagy heterológ kationos oligopeptidek lehetnek, például egy oligolizinfarok vagy egy természetes DNSkötő dómén, például egy hisztonból levezetett peptid. Ezek az endoszomalitikus peptid szerves részét képező DNS-kötő szekvenciák előnyösen körülbelül 10-40 aminosavat foglalnak magukban. A találmánynak ez a megvalósítási formája lehetőséget ad az endoszomalitikus szekvencia: DNS-kötő szekvencia nagyobb arányára, mint a peptidkonjugátumokban, amelyek na11
HU 218 846 Β gyobb részben tartalmaznak polikationokat a komplexek nagyobb teljesítőképességének elérésére.
A nem-virális endoszomalitikus peptideknek a következő követelményeknek kell eleget tenniük.
Az endoszomalitikus aktivitásra való tekintettel a lipadmembránok peptid okozta áteresztőképességének alacsonyabb pH-értéknél (5-6) magasabbnak kell lennie, mint 7-es pH-értéknél. Továbbá a felszakított membránterületeknek elég nagyoknak kell lenniük ahhoz, hogy nagyobb DNS-komplexek átlépését lehetővé tegyék (kis pórusok nem elegendőek). Annak megállapítására, hogy egy peptid megfelel-e ezeknek a követelményeknek, in vitro teszteket végezhetünk, amelyekben a peptideket szabad vagy kötött formában és/vagy egy DNS-komplexbe beépítve alkalmazzuk. Ilyen tesztek magukban foglalhatják liposzómák vagy eritrociták áteresztő-képességének vizsgálatát („leakage assays”) és olyan sejtkultúra-kisérleteket, amelyekben meghatározzuk a génkifejeződés felerősödését. Ilyenfajta kísérleteket a példák ismertetésénél írunk le. Az optimális peptidmenynyiséget előzetes titrálásokkal állapíthatjuk meg, az eredményezett géntranszfer teljesítőképességének meghatározásával. Ezeknél arra kell ügyelni, hogy a különböző peptidek teljesítőképessége és a komplex optimális összetétele függhet a sejttípustól.
Azok a peptidek, amelyek felszakítják a membránokat, általában kétféle viselkedésű (amfipátiás) szekvenciákat tartalmaznak, nevezetesen egy hidrofób oldalt, amely a lipidmembránnal kölcsönhatásba tud lépni, és egy hidrofil oldalt, amely a membrán felszakadási helyén a vizes fázist stabilizálja.
A természetben van néhány példa olyan peptidekre, amelyek membránokat szakítanak fel, általában kis peptidek vagy nagyobb polipeptidek peptiddoménjei. Az ilyen peptidek a természetes környezetben betöltött funkciójuk szerint osztályozhatók, vagy membránokat felszakító peptidek (például meztelen vírusok peptidjei) és/vagy membránokat egyesítő peptidek (például burokkal rendelkező vírusok peptidjei). Az endoszómák felszakításában a szintetikus peptidekkel összhangban a peptidszekvenciák mindkét válfaja kihasználható. A legtöbb természetes peptid tud amfipátiás a-hélixeket képezni.
Egy feltehetően amfipátiás α-hélix hidrofil oldalára savas maradékok oly módon történő beépítése révén érhetünk el pH-specificitást, hogy a hélix csak savas pH-értéknél képződhessen, de semleges pH-nál ne, ahol a töltésből adódó taszítás a negatív töltésű savas maradékok között a hélixképzést megakadályozza. Ez a sajátság a természetben előforduló szekvenciáknál is megtalálható (például az influenza-HA-2 peptidek N-terminálisa).
Egy teljes egészében szintetikus amfipátiás pepiidet, amely pH-érték-specifikus sajátságokkal rendelkezik, írnak le Subbarao és Parente membránok felszakítására [Biochemistry 26, 2964-2972 (1987); Biochemistry 29, 8720-8728 (1990)]. Erről a pepiidről (szabad formában) bebizonyítottuk, hogy membránokban csak olyan kis pórusokat képez, amelyek csak kisméretű készítmények szabaddá tételét teszik lehetővé [Biochemistry 29, 8720-8728 (1990)].
A jelen találmány megvalósítási formájának keretei között, amely nem virális, adott esetben szintetikus peptideket használ fel, általában a következő lépéseket tesszük. A természetben előforduló vagy mesterséges peptidek csoportjából egy amfipátiás peptidszekvenciát választunk ki. Az ilyen típusú peptidek hozzátartoznak a technika állásához; a 2. táblázatban példákról adunk egy áttekintést. Ha szükséges, savas maradékokat (Glu, Asp) viszünk be annak érdekében, hogy a peptidek aktivitását membránok felszakítására jobban pH-érték-specifikussá tegyük (például az influenza hemagglutininpeptidek kétszeresen savanyú, P50 jelű mutánsai a 37. példának megfelelően). Ha szükséges, bevezethetünk savas maradékokat a peptid polilizinhez való kötődésének megkönnyítésére is. Egy lehetőség ilyen polikationkötő dómén megtervezésére állhat abból, hogy a Cterminálisra savas meghosszabbításokat, például egy oligo-Glu-farkot tervezünk.
A jelen találmány számára megfelelő endoszomalitikus peptideket úgy is kaphatunk, hogy természetben előforduló és mesterséges szekvenciákat egyesítünk. A jelen találmány vonatkozásában példákat végeztünk a Parente és munkatársai [Biochemistry 29, 8720-8728 (1990)] által leírt, szintetikus GALA peptidből levezetett különböző peptidekkel. Néhány, a jelen találmány példáiban felhasznált származékot oly módon állítottunk elő, hogy a GALA peptidet vagy módosításait az influenzapeptiddel vagy annak módosított szekvenciáival kombináltuk, például az EALA-Inf és EALA-P50 peptideket, a 37. példának megfelelően.
A peptidszekvencia hossza az amfipátiás hélixre nézve kritikus lehet; rövid domének - amelyeket természetes fehérjékből vezetünk le, és amelyeknél hiányzik a stabilizálandó fehérje összefüggése - stabilitásának megnövelését elérhetjük a hélix meghosszabbításával.
A peptid endoszomalitikus aktivitásának megerősítésére homodimereket, heterodimereket vagy oligomereket képezhetünk; a jelen találmány példáiban megmutattuk, hogy egy P50 dimer sokkal magasabb aktivitással rendelkezik, mint a monomer.
Bemutattuk szintetikus peptidek hatását a transzferrin-polilizin konjugátumok közvetítette DNS-felvételre. Több különböző peptidet szintetizáltunk, meghatároztuk képességüket a liposzómák és az eritrociták áteresztővé tételére, és teszteltük hatásukat a luciferázkifejeződésre TIB 73-sejtekben és NIH 3T3-sejtekben.
A találmánynak egy további megvalósítási formájában az endoszomalitikus anyag egy nem peptid amfipátiás vegyület. Azok a követelmények, amelyeket egy ilyen anyagnak teljesítenie kell ahhoz, hogy a jelen találmány keretein belül megfeleljen, lényegében ugyanazok, mint az amfipátiás peptidekre vonatkozók, nevezetesen a nukleinsavkomplexbe való beépülés, pH-specificitás stb. képessége.
A találmány tárgyát egy további vonatkozásban olyan komplexek képezik, amelyeket magasabb rendű eukariótasejtek felvesznek, nukleinsavat és egy olyan konjugátumot tartalmaznak, amely rendelkezik a nukleinsavval való komplexképzés képességével a magasabb rendű eukariótasejtekbe történő bevezetéshez.
HU 218 846 Β
A komplexek azzal jellemezhetők, hogy egy nukleinsavaffin anyagból és egy ahhoz hozzákötött endoszomalitikus anyagból álló konjugátumot tartalmaznak, amely egy konjugátum/nukleinsav komplex alkotórészeként rendelkezik a sejtbe való bejutás és az endoszómák tartalmának - amelyekben a komplex a sejtbe lépés után lokalizálva van - a citoplazmába történő kiengedése képességével.
A jelen találmány keretein belül alkalmazásra kerülő nukleinsavkomplexek előnyösen olyanok, amelyekben a nukleinsav egy nukleinsavaffin anyaggal oly módon van komplexben, hogy a komplexek lényegében elektroneutrálisak.
A találmánynak egy előnyben részesített megvalósítása formájában az endoszomalitikus anyag egy vírus vagy egy víruskomponens, amely kovalensen kötődik egy polikationhoz.
A jelen találmány keretein belül az endoszomalitikus konjugátumok magukban foglalják - kiegészítésként azon konjugátumok mellett, amelyekben az endoszomalitikus anyag ionosán kötődik egy DNS-kötő doménhez - definíciószerűen azokat az endoszomalitikus anyagokat is, amelyek közvetlenül a DNS-hez kötődnek, például bázikus meghosszabbításukon keresztül, jóllehet az ilyenfajta „konjugátumokat” szigorúan véve nem konjugáció révén, azaz két komponens egymással való kötődésével kaptuk. A találmány szerinti összetétel alkotórészeit képező ilyen típusú endoszomalitikus anyagok funkciója független attól, hogy egy endoszomalitikus anyag és egy DNS-kötő dómén konjugációjával szintetizáltuk azokat vagy az endoszomalitikus anyag eredetileg rendelkezett egy DNS-kötődoménnel.
A találmánynak egy előnyben részesített megvalósítási formájában az endoszomalitikus konjugátum mellett a komplexek kiegészítésként egy további konjugátumot tartalmaznak, amelyben egy nukleinsavaffin anyag - endoszomalitikus polikationkonjugátum esetében általában ugyanaz, mint a konjugátumé - egy, a célsejtre affinintemalizáló faktorhoz kapcsolódik. A jelen találmánynak ezt a megvalósítási formáját mindenekelőtt akkor használjuk, ha a célsejt nem vagy csak kevés receptorral rendelkezik arra a vírusra, amely mint az endoszomalitikus konjugátum alkotórésze, alkalmazásra kerül. E megvalósítási formának egy további alkalmazása, amikor egy víruskomponenst, például egy természetben előforduló, adott esetben módosított peptidet, egy nem virális, adott esetben szintetikus endoszomalitikus peptidet vagy egy távoli faj vírusát építjük be, amelyek maguktól nem képesek a transzfekcióra kiszemelt sejtekbe behatolni. Egy további intemalizálófaktor/kötőfaktor konjugátum jelenlétében ezek az endoszomalitikus konjugátumok kihasználják a második konjugátum intemalizálóképességét azáltal, hogy azzal együtt komplexbe kerülnek, és az így keletkezett komplex - a következőkben „kombinációs komplexének vagy „hármas komplex”-nek nevezve alkotórészeként bejutnak a sejtbe. Anélkül, hogy ezt az elméletet rögzíteni akarnánk, a kombinációs komplexeket a sejtek vagy az intemalizálófaktorra specifikus felületi receptorhoz történő kötés révén, vagy vírus vagy egy víruskomponens alkalmazása esetén a vírusreceptorhoz vagy mindkét receptorhoz történő kötés révén, receptor közvetítette endocitózis útján veszik föl. Az endoszomalitikus anyag szabaddá válásakor az endoszómákból a komplexekben levő DNS is kikerül, és ezáltal megmenekül a lizoszomális lebontástól.
A jelen találmány során HeLa-sejtekkel végzett kísérletekben szabad adenovírussal csaknem minden sejtet meg tudtunk fertőzni. Hepatocitáknál még tovább tudtuk növelni a teljesítőképességet, amikor hármas DNS-komplexeket alkalmaztunk, amelyekben a riporter-DNS polilizin-transzferrin konjugátumokkal van komplexben, és adenovírushoz kapcsolódik. Ebben az esetben szavatoljuk az endoszomalitikus vírus és a ligandum/receptor komplex együttes lokalizációját az endoszómában, ahol különböző sejteknél, mint BNL.CL2- és HepG2-sejteknél, gyakorlatilag minden sejtre kiterjedő transzfekciót értünk el. Egy ilyen helyzetet közelíthetünk meg olyan kísérleteknél, amelyekben hármas, transzferrint tartalmazó komplexek inkább transzferin receptorokon keresztül, mint adenovírus-receptorokon keresztül történő belépését tapasztaltuk K562-sejtekben.
Meglepő módon hármas komplexek nagyon kis mennyiségű DNS-t is átvittek. 30 pg DNS 3 χ 105 sejtre történő bevitelénél 1,8 χ 104 fényegységet (egy plazmádon található, luciferázt kódoló szekvencia kifejeződése eredményeként) mértünk. Egy ilyen bevitelnél egy sejtre mindössze 60 DNS-molekula és 1 PFU („plaque forming unit”=tarfoltegység) vírus jut. Összehasonlításképpen: a kevésbé hatékony kalciumprecipitációs módszer sejtenként 2χ 105 DNS-molekulát ír elő [Molecular Cloning, 2nd edition 3, 1639-1640 (1989)]. Ennélfogva a jelen találmány egy jelentős előrelépést képvisel, mivel magasabb rendű eukariótasejtek hatékony transzformációját nagyon kis mennyiségű DNS-sel teszi lehetővé.
Vírusok, víruskomponensek vagy nem virális endoszomalitikus anyagok jelenléte endoszomalitikus konjugátumok alkotórészeként DNS-komplexekben a következő előnyökkel jár.
1) A géntranszfertechnika szélesebb körű alkalmazhatósága nukleinsavkomplexekkel, mivel maga az endoszomalitikus anyag - különösen abban az esetben, ha egy vírust vagy víruskomponenst viszünk be - képviselheti az intemalizálófaktort, vagy akár kombinációban egy további intemalizálófaktorral (például transzferrinnel vagy aszialo-fetuinnal stb.) a DNS-hez kötve komplexbe vihető. Ezáltal válik lehetővé a vírusok kedvező hatásának kihasználása olyan sejteknél is, amelyek nem rendelkeznek az illető vírushoz receptorral.
2) A géntranszfer hatásfokának javulása, mivel az endoszomalitikus konjugátum DNS-hez történő kötődése által biztosítva van a sejtbe történő együttes felvételük. A vírusok és DNS-ek összehangolt felvétele és kiszabadulása révén lehetővé válik továbbá a hatásos géntranszferhez szükséges vírus és DNS-mennyiség csökkentése, ami különösen in vivő alkalmazásnál lényeges jelentőségű.
HU 218 846 Β
A jelen találmány keretei között intemalizálófaktor alatt olyan ligandumok vagy azok fragmentumai értendők, amelyek a sejthez való kötődést követően endocitózissal, előnyösen receptor közvetítette endocitózissal intemalizálódnak, vagy olyan faktorok, amelyeknek kötődése/intemalizálódása a sejtmembrán elemeivel történő fúzióval következik be. A megfelelő intemalizálófaktorok közé tartoznak a transzferrinligandumok [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 2263-2266 (1983)], konalbumin [Annu. Rév. Biochem., 50, 1053-1086 (1981)], aszialo-glikoproteinek (mint aszialo-transzferrin, aszialo-rozomukoid vagy aszialo-fetuin) [Annu. Rév. Biochem., 57, 531-554 (1982)], lektinek [Clin. Rés., 30, 417-426 (1982)], illetve olyan anyagok, amelyek galaktózt tartalmaznak, és az aszialo-glikoproteinreceptoron keresztül intemalizálódnak; mannóztartalmú glikoproteinek [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1399-1403 (1987)], lizoszóma enzimek [J. Cell Biochem., 18, 67-85 (1982)], LDL [Clin. Rés., 30, 4Π-Χ26 (1982)], módosított LDL [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 333-337 (1979)], olyan lipoproteinek, amelyeket a sejt a receptorokon keresztül vesz föl (apó B100/LDL); vírusfehéqék, mint a gpl20 HIV-fehérje; antitestek [J. Cell Biok, 98,1170-1177 (1984); Trends Biochem. Sci., 7, 299-302 (1982); J. Cell Biok, 97, 270-280 (1982)], illetve azok sejtfelszíni antigének elleni fragmentumai, például anti-CD4, anti-CD7; citokinek, mint interleukin-1 [J. Immunok, 138, 2906-2912 (1987)], interleukin-2 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 864-867 (1985)], TNF [J. Immunok, 139, 2989-2992 (1987)], interferonok [J. Biok Chem., 257, 11 301-11 304 (1982)]; CSF („Colony stimulating Factor”=kolóniastimuláló faktor) [J. Cell Physiok, 130, 255-261 (1987)], faktorok és növekedési faktorok, mint inzulin [J. Biok Chem., 250, 4133-4144 (1985)], EGF („Epitermal Growth Factor”=hámeredetű növekedési faktor) [Cell, 37, 357-358 (1984)]; PDGF („Plateletderived Growth Factor”=vérlemezke-eredetű növekedési faktor)[J. Biok Chem., 257,4216-4221 (1982)], TGFp („Transforming Growth FactorP”=transzformáló β növekedési faktor) [J. Cell Physiok, 128, 216-222 (1986)], idegnövekedési faktor [EMBO J. 6, 1197-1202 (1987)], inzulinhoz hasonló növekedési faktor I („Insulin-like Growth Factor”) [Endocrinology, 118, 1590-1597 (1986)], LH, FSH [J. Biok Chem., 253, 7832-7838 (1978)], növekedési hormon [J. Biok Chem., 256,4591-4597 (1981)], prolaktin [J. Cell Biok, 93,560-567 (1982)], glukagon [Exp. Pathol., 23,95-10' (1983)], tiroidhormonok [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3425-3429 (1980)], α-2-makroglobulin-proteáz [J. Biok Chem., 254,7323-7328 (1979)], valamint a hatástalanított toxinok. További példák az immunglobulinok vagy fragmentumaik, mint az Fc-receptor ligandumai, vagy antiimmunglobulin-antitestek, amelyek az Slgkhez („Surface Immunglobulins”=sejtfelszíni immunglobulinok) kötődnek. A ligandumok természetes vagy szintetikus eredetűek lehetnek [lásd Trends Pharmacol. Sci. (1989) és az abban található hivatkozásokat],
A jelen találmány keretei között az ilyen intemalizálófaktorok alkalmassága szempontjából lényegesek,
a) hogy specifikus sejttípus által, amelyikbe a nukleinsavat be kell vinni, intemalizálhatók legyenek, és internalizálóképességüket ne vagy lényegesen ne korlátozza, amikor a kötőfaktorral konjugáljuk őket, és
b) hogy ezen tulajdonságuk keretein belül abban a helyzetben vannak, hogy a nukleinsavat az általuk használt útvonalon keresztül a sejtbe „huckepack” bevigyék.
A jelen találmány keretei között elvégzett kísérletekben megmutattuk a találmány széles körű felhasználhatóságát tekintettel a kombinációs komplexekben levő intemalizálófaktorra, illetve egy kiegészítő internalizálófaktorra humán és egértranszferrin-polilizin konjugátumok, aszialo-fetuin-polilizin konjugátumok, galaktóz-polilizin konjugátumok, búzacsíra-agglutinin-pL konjugátumok, a T-sejt-specifikus gpl20-pL és anti-CD7-pL konjugátum, LDL-pL-konjugátum, Ig-pL- és anti-Ig-pL konjugátum segítségével, valamint DNS-polilizin komplexekkel, amelyek nem tartalmaztak internalizálófaktort. Ezenkívül bemutattuk DNS-ből és polilizinnel konjugált vírusból (illetve víruskomponensből) álló komplexek - amelyek nem tartalmaztak kiegészítő intemalizálófaktor/kötőfaktor konjugátumot - segítségével a találmány szerinti virális konjugátum teljesítőképességét.
Előkísérletekben egyenként meghatározhatjuk, hogy szabad vírusnak endoszomalitikus anyagként történő felhasználása esetén egy intemalizálófaktor alkalmazása vagy - abban az esetben, ha az endoszomalitikus anyag egy, az endoszomalitikus konjugátum részét képező vírus vagy víruskomponens vagy egy nem virális peptid egy kiegészítő kötőfaktor lehetővé teszi-e vagy megjavítja-e a nukleinsavkomplexek felvételét. Az ilyen vizsgálat párhuzamos transzfekciókat foglal magában nukleinsavkomplexekkel, egyszer intemalizálófaktor (kiegészítő) nélkül, például virális konjugátumok esetén, amelyek nukleinsavból és virális konjugátumból állnak, és egyszer olyan komplexekkel, amelyekben a nukleinsav egy további, internalizálófaktort magában foglaló konjugátumot tartalmaz, amelyre a célsejtek receptorral rendelkeznek.
Intemalizálófaktor vagy egy kiegészítő intemalizálófaktor, azaz egy kombinációs komplex alkalmazása esetén ezt mindenekelőtt a célsejtek által definiáljuk, például bizonyos sejtfelszíni antigének vagy receptorok által, amelyek egy sejttípusra nézve specifikusak, következésképp lehetővé teszik a nukleinsav irányított bevitelét ebbe a sejttípusba.
A jelen találmány keretei között megfelelő nukleinsavaffin anyagok például a homológ szerves polikationok, mint polilizin, poliarginin, poliomitin vagy heterológ, két vagy több különböző, pozitív töltésű aminosavat tartalmazó polikationok, amelyek különböző lánchosszúságúak lehetnek, továbbá nem peptid jellegű szintetikus polikationok, mint a poli(etilén-imin). Alkalmas nukleinsavaffin anyagok továbbá a természetes, polikationkarakterű DNS-kötő fehérjék, mint a pisztonok vagy protaminok, illetve ezek analógjai vagy fragmentumai, valamint a spermin vagy spermidin.
A polikation hossza nem döntő jelentőségű, amennyiben a komplexek - tekintettel az előnyben részesített ki14
HU 218 846 Β vitelezési formára - lényegében elektroneutrálisak. A polilizinlánchossz előnyben részesített tartománya körülbelül 20 és 1000 lizinmonomer között van. Egy előre megadott DNS-hosszúsághoz azonban nem tartozik kritikus polikation-lánchossz. Ha a DNS 6000 bázispárból áll, és 12 000 negatív töltése van, a polikation mennyisége DNS-mólonként például mól polilizin 200 monomer vagy 30 mól polilizin 400 monomer, vagy 120 mól polilizin 100 monomer stb. lehet.
Az átlagszakember egyszerű rutinkísérletek segítségével kiválaszthat más polikationhossz- és molárismennyiség-kombinációkat.
A konjugátumok alkotórészét képező további megfelelő nukleinsavaffm anyagok közbenső vegyületek, mint az etidiumdimerek, akridin vagy közbenső peptidek, amelyek triptofánt és/vagy tirozint, és/vagy fenilalanint tartalmaznak.
Tekintettel a nukleinsavkomplex minőségi összetételére, általában legelőször a sejtbe bejuttatandó nukleinsavat határozzuk meg. A nukleinsavat mindenekelőtt a sejtben elérendő biológiai hatás által definiáljuk, a génterápia keretei közötti felhasználás esetében a kifejezésre juttatandó gén, illetve géndarab - például egy hibás gén helyettesítése céljából - vagy egy gátolandó gén célszekvenciája által. A sejtbe szállítandó nukleinsavaknál DNS-ről vagy RNS-ről lehet szó, ahol a nukleotidszekvenciára nézve nem állnak fenn korlátozások.
Ha a találmányt daganatsejteknél alkalmazzuk, mint rákvakcina bevetését, a sejtbe bevezetendő DNS előnyösen egy immunmoduláló anyagot, például egy citokint - mint IL-2, IL-4, IFN-gamma, TNF-α kódol. Különösen hasznos lehet citokineket - például IL-2-t és IFN-gammát - kódoló DNS-ek kombinációja. Egy további, a daganatsejtekbe történő génbevitelnél hasznos gén, a „Multi Drug Resistance Gene” (mdr). A jelen találmányban eredményesen alkalmaztunk transzferrin-polilizin és low density-lipoprotein konjugátumokat adenovírus-konjugátumokkal együtt daganatsejtek (melanómasejtek) transzfekciójára. A specifikus alkalmazástól függően előkísérletekben kideríthetjük, hogy az illető daganatsejttípus számára speciális felhasználás esetében melyik ligandum megfelelő.
A sejtbe két vagy több különböző nukleinsavszekvenciát is be lehet vinni, például két különböző fehérjét kódoló cDNS-t tartalmazó plazmidot megfelelő regulátorszekvenciák kontrollja alatt, vagy két, különböző cDNS-eket tartalmazó plazmidszerkezetet.
A sejtbe specifikus génszekvenciák gátlása céljából bevezetett, terápiásán hatásos inhibiálónukleinsavak közé tartoznak olyan génszerkezetek, amelyekből antiszensz RNS vagy ribozim íródik át. Továbbá oligonukleotidok, például antiszensz oligonukleotidok sejtbe történő bevitele is lehetséges. Antiszensz oligonukleotidok előnyösen 15 vagy több nukleotidot tartalmaznak. Adott esetben az oligonukleotidok multimerek is lehetnek. Ribozimokat előnyösen egy olyan génszerkezet részeként vihetünk be a sejtbe, amely stabilizáló génelemeket, például tRNS-génelemeket tartalmaz. Ilyen típusú génszerkezeteket az EP-A0 387 775 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés ismertet. Gátlóhatású nukleinsavak és ezek hatásmechanizmusa közismert az átlagszakember számára; erre vonatkozóan a következő áttekintő cikkekre és azokban idézett referenciákra utalunk [Biochem. Biophys. Acta 1049, 99-125 (1990); Critical Reviews in Biochem. and Mól. Bioi. 25, 155-184(1990)].
A nukleinsavmolekulákon kívül, amelyek géneket, például virális géneket komplementaritásuk alapján gátolnak, más gátlóhatással rendelkező géneket is használhatunk. Erre példák az olyan gének, amelyek olyan virális fehérjéket kódolnak, melyek úgynevezett transzdomináns mutációt szenvedtek [Natúré 329, 219 (1987)]. A gének kifejeződése a sejtben olyan fehérjéket szolgáltat, amelyek a megfelelő vad típusú fehérjét elnyomják, és ily módon védik a sejtet, amely celluláris immunitást szerez, miközben a vírusreplikációt megakadályozzák. Alkalmasak olyan transzdomináns mutáns vírusfehérjék, amelyek a replikációhoz és a kifejeződéshez szükségesek - például Gag-, Tat- és Rev-mutánsok - amelyekről kimutatták, hogy gátolják a HIV-replikációt [Cell 59, 113-120 (1989); Cell 58, 215-223 (1989); Cell 58, 205-214 (1989)].
Az intracelluláris immunitás megszerzésének egy másik mechanizmusa magában foglalja olyan RNS-molekulák kifejeződését, amelyek egy nélkülözhetetlen virális fehérje számára kötőhelyet tartalmaznak, például úgynevezett „TAR Decoys” [Cell 63, 601-608 (1990)].
A szomatikus génterápia keretei között felhasználható génekre - amelyek a jelen találmány segítségével, mint génszerkezetek alkotórészei a sejtbe juttathatók példák a VIII. faktor (hemofília A) [Natúré, 312, 330-337 (1984)], IX. faktor (hemofília B) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6461-6464 (1982)], adenozin-dezamináz (SCID) [Gene, 31, 147-153 (1984)], a-1 antitripszin (tüdőemfizéma)[Cell, 41, 531-540 (1985)] vagy a cisztikus fibrózis (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gén) [Science, 245, 1066-1073 (1989)]. Ezek a példák nem jelentenek semmiféle korlátozást.
A nukleinsavak nagyságára vonatkozóan a felhasználás igen széles területen lehetséges; a jelen találmány segítségével körülbelül 0,15 kb (egy ribozimgént tartalmazó tRNS-gén esetében) és 50 kb közötti nagyságrendben és e fölött vihetők be nukleinsavmolekulák a sejtbe; kisebb nukleinsavmolekulákat oligonukleotidként alkalmazhatunk.
Nyilvánvaló, hogy éppen azon tény alapján, mely szerint a jelen találmány a génszekvenciákra nézve semmiféle korlátozást nem ír elő, és a találmány segítségével egészen nagy génszerkezetek is átvihetők, adottak a legszélesebb felhasználási lehetőségek.
A nukleinsavból kiindulva meghatározzuk a nukleinsavaffin anyagot, előnyösen egy szerves polikationvegyületet, amely biztosítja a nukleinsav komplexbe vitelét és a kapott komplexek előnyösen, lényegében véve elektroneutrálisak. Ha a komplexek az endoszomalitikus konjugátum mellett egy intemalizálófaktorból és
HU 218 846 Β egy nukleinsavaffin anyagból álló konjugátumot tartalmaznak, mindkét konjugátum kationrészét az elektroneutralitásra való tekintettel vesszük figyelembe.
Korábbi találmányok során megállapítást nyert, hogy a nukleinsav sejtbe történő bevitelére egy optimum érhető el, amennyiben a konjugátum:nukleinsav arányt úgy választottuk meg, hogy az intemalizálófaktor-polikation/nukleinsav komplexek messzemenően elektroneutrálisak voltak. Megállapítást nyert, hogy a sejtbe felvett nukleinsav mennyiségét nem csökkenti, ha a transzferrin-polikation konjugátum egy részét nem kovalensen kötött polikationon keresztül visszük be, sőt bizonyos esetekben a DNS-felvétel jelentős megnövekedését érhetjük el [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4255-4259 (1991)]. Emellett megfigyeltük, hogy a DNS a komplex belsejében toroidális szerkezetben található, 80-100 nm átmérőjű, tömörített formában. A polikation mennyiségét tehát a két paraméterre - elektroneutralitás és egy kompakt szerkezet elérésére - való tekintettel választjuk ki, ahol a polikation mennyisége, tekintettel a jelen találmány keretei között előnyben részesített, messzemenően elektroneutrális komplexek elérésére, a nukleinsavak töltéséből adódik, és általában a DNS tömörítését is szavatolja.
Adott esetben tehát a jelen találmánynak egy további megvalósítási formájában a komplexek kiegészítésképpen nukleinsavkötő anyagokat tartalmaznak nem kovalensen kötött formában, amelyek azonosak vagy különböznek a kötőfaktortól, tehát a konjugátumokban nukleinsavaffin anyagokként szerepelhetnek. Abban az esetben, amikor az endoszomalitikus anyag szabad vírus, a komplexek nukleinsavat és intemalizálófaktor/konjugátumot foglalnak magukban. Abban az esetben, amikor egy endoszomalitikus, például egy virális konjugátumot alkalmazunk, a nukleinsav ezzel a konjugátummal komplexben van, adott esetben egy kiegészítő intemalizálófaktor konjugátumával együtt. A nem kovalensen kötött, „szabad” nukleinsavaffin anyagok fajta és mennyiség szerinti kiválasztását ezenkívül a konjugátummal, illetve konjugátumokkal hangoljuk össze, ahol mindenekelőtt a konjugátumban található kötőfaktort kell figyelembe venni: amennyiben a kötőfaktor például egy olyan anyag, amely nem vagy csak csekély képességet mutat a DNS kondenzálására, a komplex hatékony intemalizálása szempontjából általában célszerű olyan DNS-affin anyagokat bevinni, amelyek ezzel a tulajdonsággal erősebben kifejezett mértékben rendelkeznek. Amennyiben maga a kötőfaktor egy nukleinsavat kondenzáló anyag, és általa már elérjük a nukleinsavnak a hatékony intemalizálás szempontjából kielégítő tömörítését, célszerűen egy olyan nukleinsavaffin anyagot alkalmazunk, amely más mechanizmusok szerint fokozza a génkifejeződést.
A jelen találmány keretei között megfelelő, nem kovalensen kötött nukleinsavaffin anyagok közé tartoznak olyan vegyületek, amelyek képesek a nukleinsavak kondenzálására és/vagy ezek nemkívánatos sejten belüli lebomlásának kivédésére, különösen a már említett polikationkarakterű anyagok. A megfelelő anyagok egy további csoportját képezik azok, amelyek a nukleinsavhoz való kötődésük révén annak átírásában/kifejeződésében javulást okoznak azáltal, hogy javítják a nukleinsav hozzáférését a génkifejeződési gépezethez a sejtben. Egy ilyen anyagra példa a kromoszomális nemhiszton fehérje HMG1, amelyről megállapítottuk, hogy rendelkezik a DNS tömörítésének és a sejtben való kifejeződéshez juttatásának a képességével.
Az endoszomalitikus anyag és/vagy intemalizálófaktor/nukleinsavaffin anyag/nukleinsav(ak) moláris arányainak a meghatározásánál figyelembe kell venni, hogy a nukleinsav(ak) komplexbe vitele történik és biztosított, hogy a képződött komplex a sejthez kötődve bekerül a sejtbe, és hogy vagy magától, vagy az endoszomalitikus anyag segítségével kiszabadul az endoszomákból.
A mindenkori kiválasztott intemalizálófaktor/kötőfaktor/nukleinsav arány mindenekelőtt a polikationmolekula nagyságához, valamint a pozitív töltésű csoportok számához és eloszlásához igazodik, ezek azok a kritériumok, amelyeket összehangolunk a bejuttatandó nukleinsav(ak) nagyságával és szerkezetével. Az internalizálófaktor: nukleinsavaffin anyag moláris aránya előnyösen körülbelül 10:1 és 1:10 között mozog.
A konjugátumok megszerkesztése és szintetizálása és a transzfekció hatékonysága szempontjából optimális konjugátum(ok):DNS arány meghatározása után titrálás segítségével határozhatjuk meg az intemalizálófaktor/konjugátum rész mennyiségét, amely adott esetben szabad nukleinsavaffin anyaggal pótolható. A polikationok mind kötőfaktorként, mind szabad nukleinsavaffin anyagként történő felhasználásuk esetén azonosak vagy különbözőek lehetnek.
A találmánynak olyan megvalósítási formájában, amelynél virális konjugátumokat használunk, a komplexben található komponensek arányainak meghatározására szolgáló megfelelő módszer abból áll, hogy először a sejtbe bejuttatandó génszerkezetet definiáljuk, és amint azt már fent leírtuk, egy olyan vírust vagy víruskomponenst kell találnunk, amely alkalmas a speciális transzfekcióra. Ezután a vírust vagy víruskomponenst hozzákötjük a polikationhoz, és komplexbe visszük a génszerkezettel. Definiált mennyiségű virális konjugátumból kiindulva titrálásokat végezhetünk úgy, hogy a célsejteket ezzel a (konstans) konjugátummennyiséggel és növekvő DNS-koncentrációval kezeljük, vagy fordítva. Ezen a módon állapítjuk meg az optimális DNS:víruskonjugátum arányt. Kiegészítő intemalizálófaktor alkalmazásánál például úgy járunk el, hogy állandó DNSmennyiségből kiindulva titrálások segítségével határozzuk meg a víruskonjugátum és az intemalizálófaktor/konjugátum közötti optimális arányt.
A komplexeket előállíthatjuk a mindig hígított oldatok formájában rendelkezésre álló komponensek, i) nukleinsav, ii) virális konjugátum, iii) intemalizálófaktor/kötőfaktor konjugátum és adott esetben iv) nemkovalensen kötött nukleinsavaffin anyag összekeverésével. Polikationok kötőfaktorként és egyidejűleg „szabad” polikationokként történő alkalmazása esetén általában célszerű először a konjugátumokból és szabad polikationokból egy keveréket készíteni, és ezt a keve16
HU 218 846 Β réket egyesíteni a DNS-sel. A DNS-nek a konjugátum(ok)hoz és a polikationokhoz való optimális arányát titrálási kísérletekkel határozzuk meg, azaz állandó mennyiségű DNS-sel és növekvő mennyiségű konjugátom(ok)/polikation keverékkel végzett transzfekciós kísérletek sorozatával. A konjugátum(ok): polikationok optimális arányát a keverékben megkaphatjuk rutinkísérletek segítségével, illetve a titrálási kísérletekben alkalmazott keverékek optimális arányainak összevetésével.
A DNS-komplexek előállítása fiziológiás sóoldatokban történhet. Egy további lehetőség töményebb sóoldatok (körülbelül 2M NaCl) alkalmazása és ehhez kapcsolódóan a fiziológiás körülmények beállítása fokozatos hígítással, illetve dialízissel.
A komponensek - nukleinsav, konjugátum(ok), adott esetben nem kovalensen kötött szabad nukleinsavaffin anyag - összekeverésének mindenkori legalkalmasabb sorrendjét előkísérletekben határozzuk meg. Bizonyos esetekben célszerűnek bizonyulhat első lépésben a nukleinsavat a konjugátummal, és a nukleinsavaffin anyagot csak ezután komplexbe vinni, például transzferrin/etidiumdimer konjugátumok és polilizin esetében.
A találmánynak egy előnyben részesített megvalósítási formájában a (kiegészítő) intemalizálófaktor transzferrin és a kötőfaktor egy polikation. „Transzferrin” alatt kell érteni mind a természetes transzferrineket, mind azokat a transzferrinmódosulatokat, amelyeket a receptorok megkötnek, és amelyek bejutnak a sejtbe. A nukleinsav felvétele komplexek formájában történik, amelyekben intemalizálófaktor/polikation konjugátumok vannak a nukleinsavval komplexben. Nem kovalensen kötött nukleinsavaffin anyag esetén ez előnyösen egy olyan polikation, amely a konjugátumban található polikationnal azonos vagy különböző.
Kombinációs komplexek esetén a nukleinsavat olyan komplexek formájában intemalizáljuk, amelyekben egyrészt az intemalizálófaktor/konjugátumok, másrészt az endoszomalitikus anyagok vannak komplexben nukleinsavval.
A szabad vírussal vagy a virális konjugátumokkal kombinációs komplexekben felhasználásra kerülő internalizálófaktor/polikation konjugátumokat előállíthatjuk kémiai úton, vagy abban az esetben, ha a polikation egy polipeptid, rekombináns úton. Az előállítási módszereket illetően az EP 388 758 számú európai szabadalmi leírásra hivatkozunk.
Konjugátumokat úgy is előállíthatunk, hogy egy glikoproteint, például transzferrint és a kötőfaktort a glikoprotein egy vagy több szénhidrátláncán keresztül összekötjük egymással. Az ilyen konjugátumok, ellentétben a szokásos kapcsolási eljárásokkal előállított konjugátumokkal, mentesek az alkalmazott linkervegyületektől eredő módosításoktól. Ezek a konjugátumok olyan glikoproteinek esetén, amelyeknek a kapcsoláshoz csak egy vagy kevés megfelelő szénhidrátcsoportjuk van, például transzferrin, azzal az előnnyel is rendelkeznek, hogy glikoprotein/kötőfaktor kötőhelyük szempontjából pontosan definiáltak.
A bevitt endoszomalitikus anyag mennyisége, illetve koncentrációja az egyedileg elvégzendő transzfekcióhoz igazodik. Célszerű a vírusnak, illetve víruskomponensnek olyan legkisebb mennyiségét bevinni, amely a vírus és a nukleinsavkomplex intemalizációjának és az endoszómákból való szabaddá válásának biztosításához szükséges. A vírus(konjugátum) mennyiségét a mindenkori sejttípusra határozzuk meg, ahol mindenekelőtt ennek a sejttípusnak a vírussal való fertőzhetőségét kell figyelembe venni. Egy további fontos tényező az intemalizálófaktor/kötőfaktor konjugátum, különös tekintettel az intemalizálófaktorra, amelyre a célsejtek meghatározott számú receptorral rendelkeznek. A vírus(konjugátum) mennyisége ezenkívül igazodik a bejuttatandó DNS mennyiségéhez. Egy olyan stabil transzfekcióhoz, amelyhez csekély mennyiségű DNS szükséges, általában elegendő kis mennyiségű vírus, miközben a nagyobb mennyiségű DNS-t igénylő tranziens transzfekciónál nagyobb az alkalmazott vírusmennyiség. Speciális felhasználáshoz előkísérletekben határozzuk meg az optimális víruskoncentrációt a mindenkori, a transzfekcióra kiszemelt sejtekkel, adott esetben sejtpopulációval és a transzfekcióhoz kiválasztott vektorrendszerrel titrálás segítségével, ahol DNS-ként célszerűen olyan génszerkezetet viszünk be, amely nagyságára nézve a konkrét felhasználásra kiszemelttel messzemenően összehangolt, és a géntranszfer hatékonyságának egyszerűbb mérése céljából egy riportergént tartalmaz. A jelen találmány keretei között a luciferáz- és a β-galaktozidázgének ilyen típusú kísérletekhez riportergénként való alkalmasságát mutattuk meg.
A találmány tárgyát egy további vonatkozásban nukleinsavból, nukleinsavkötő anyagból és adott esetben intemalizálófaktorból álló komplexek magasabb rendű eukariótasejtekbe történő bevitelére szolgáló eljárás képezi. Az eljárás azzal jellemezhető, hogy a sejteket olyan anyaggal hozza érintkezésbe, amely, önmagában vagy a nukleinsavkomplexek alkotórészeként, rendelkezik a sejtekbe történő felvétel és az endoszómák tartalmának amelyekben a nukleinsavkomplexek a sejtbe lépés után lokalizálva vannak - a citoplazmába történő kiengedése képességével.
Általában előnyben részesítjük az endoszomalitikus anyag és a nukleinsavkomplex egyidejű beadását, bár ez egymást követően is történhet, ahol a külön történő alkalmazás esetében a sorrendiség nem döntő tényező - addig, amíg a beadás gyors egymásutánban következik - hogy a sejtnek a komponensekkel lehetőség szerint egyidejű érintkezését szavatoljuk. Szabad vírusnak egy elkülönített készítményben való alkalmazása esetén azáltal biztosíthatjuk a víruspreparátumnak a komplexekkel egyidejű beadását, hogy a víruspreparátum a nukleinsavkomplexet tartalmazó transzfekciós táptalaj alkotórészét képezi. Szabad vírus egyidejű beadása esetén a nukleinsavkomplexeket és a víruskészítményt alkalmazás előtt összekeverjük.
A találmány szerinti eljárásnak egy előnyben részesített megvalósításában az endoszomalitikus anyagot egy kombinációs komplex alkotórészeként építjük be.
HU 218 846 Β
A génkifejeződés felerősítésére a találmány szerinti készítményeket ismételve is alkalmazhatjuk.
Egy előnyben részesített megvalósítási formában a sejtek primer daganatsejtek. Egy különösen előnyben részesített megvalósítási formában a nukleinsav egy DNS, amely egy vagy több olyan szekvenciát tartalmaz, amelyek egy immunszabályozó anyagot, előnyösen citokint kódolnak.
Egy további megvalósítási formában a sejtek mioblasztok, előnyösen primer mioblasztok.
Egy további megvalósítási formában a sejtek fibroblasztok, előnyösen primer fíbroblasztok.
Egy további megvalósítási formában a sejtek hepatociták, előnyösen primer hepatociták.
Egy további megvalósítási formában a sejtek primer endothelsejtek.
Egy további megvalósítási formában a sejtek primer légúti hámsejtek.
Egy további megvalósítási formában a sejtek Tsejtek.
Egy további megvalósítási formában a sejtek Bsejtek.
Az 1. táblázat a jelen találmány segítségével végzett sikeres transzfekciókat mutat be különböző sejttípusok példáján.
A találmány szerinti készítményt kutyahemofíliaB-fibroblasztok transzfekciójánál is megvizsgáltuk. Mind a luciferázt, mind a β-galaktozidázt sikeresen ki tudtuk fejezni ezekben az esetekben. Ezenkívül alkalmaztuk a rendszert az 1,4-es IX. kutyafaktor-cDNSnek ezekbe a fibroblasztokba történő bevitelére. Szendvics-ELISA segítségével ki tudtuk mutatni a IX. faktort 24 órával a transzfekció után.
Meghatározott esetekben célszerű az endoszomalitikus anyaghoz kiegészítésként egy lizoszómatrop anyagot alkalmazni, például ha az endoszomalitikus anyag egy peptidkonjugátum vagy egy retrovírus, amelyeknek az endoszomalitikus aktivitása nem szigorúan pH-érték-függő.
Ismert, hogy a lizoszómatrop anyagok gátolják a proteázok és nukleázok aktivitását, és ezáltal gátolhatják nukleinsavak lebomlását [Nucl. Acids Rés. 11, 1295-1308 (1983)]. Ezekhez az anyagokhoz tartoznak a klorokin, monenzin, nigericin és metil-amin. Meg tudtuk mutatni, hogy a monenzin Moloney-vírus alkalmazása esetén a riportergén-kifejeződés emelkedését idézte elő. Meg tudtuk mutatni, hogy klorokin jelenléte K562-sejtek gyakorlatilag 100%-ánál egy olyan riportergén-kifejeződéséhez vezetett, amelyet transzferrin közvetítette DNS-transzferrel vittünk be a sejtekbe. BNL.CL2 vagy HepG2-hepatociták nem reagáltak ilyen jól a klorokinre, mint a K562-sejtek, mégis 5-10%-ban tudtunk transzfekciót elérni, amikor hozzáadott replikációhibás vagy kémiailag inaktivált adenovírus endoszomalitikus tulajdonságait használtuk ki.
A jelen találmány segítségével felerősítjük a biológiai vektorok előnyeit. A receptorok eloszlása alapján mind az intemalizálófaktorra, mind a vírusra nézve tropizmus áll fenn. E két komponens összehangolása révén a mindenkori sejtpopulációra nézve megnövelt szelektivitás érhető el, amely mindenekelőtt a jelen találmány terápiás felhasználásánál jön kapóra. Ez a vonatkozás különleges jelentőségű a jelen találmánynak a tüdőben való terápiás alkalmazásánál, mivel a tüdőben a különböző sejtpopulációk különböző receptorokkal rendelkeznek, amely megkövetelheti egy bizonyos sejtpopulációra, például a csillószőrös légúti sejtekre magas kötési affinitású vektorok összeállítását. Ligandumként például lektinek jönnek számításba. Ilyen konjugátumok összeállítása többek között megköveteli egy ligandumjelölt kötési tulajdonságainak meghatározását a konjugátumkonformációban. Ezt a meghatározást elvégezhetjük például a ligandumokkal szembeni antitestekkel immunhisztokémiai színezési eljárások segítségével abban a szövetben, amelyben a terápiás beavatkozásra sor kerül.
A jelen találmány tárgyát egy további vonatkozásban olyan gyógyászati készítmények képezik, amelyek aktív alkotórészként egy terápiásán hatásos, előnyösen egy génszerkezet részét képező nukleinsav komplexét, valamint egy endoszomalitikus anyagot, amely adott esetben konjugálva van, és adott esetben egy intemalizálófaktor/konjugátumot tartalmaznak. Bármilyen inért, gyógyászatilag elfogadható hordozót alkalmazhatunk, például konyhasóoldatot vagy foszfátpufferrel készített konyhasóoldatot vagy bármi olyan hordozót, amelyben a DNS-komplexek megfelelően oldhatók ahhoz, hogy a jelen találmány keretei között felhasználhatók legyenek. A gyógyászati készítmény formulázási módszereit illetően a Remington’s Pharmaceutical Sciences 1980 (Mack Publ. Co., Easton, PA, Osol ed.) kiadványára hivatkozunk.
A jelen találmány a lehető legnagyobb rugalmasság előnyét nyújtja többek között gyógyászati készítményként történő felhasználásnál. A találmány szerinti összetétel liofilizátumként vagy megfelelő pufferben, mélyfagyasztott állapotban állhat rendelkezésre. Szállítható, tárolható és rendelkezésre bocsátható előnyösen lehűtve, felhasználásra kész reagensként oldatban is. Adott esetben a transzfekcióhoz szükséges komponensek - nevezetesen a DNS, az endoszomalitikus anyag, adott esetben konjugálva vagy egy különálló konjugációs partnerrel konjugációra készen, a DNS-kötő anyag, adott esetben egy intemalizálófaktorral konjugálva, adott esetben a szabad polikation megfelelő pufferben külön vagy részben elkülönítve egy transzfekciós kit alkotórészeként állnak rendelkezésre, amely szintén a jelen találmány tárgyát képezi. A jelen találmány tárgyát képező transzfekciós kit magában foglal egy hordozót, amely egy vagy több tartályt - mint csövecskék, üvegcsék vagy hasonlók - tartalmaz, amelyek a magasabb rendű eukarióta sejtek transzfekciójához a jelen találmánynak megfelelően szükséges anyagokat tartalmazzák. Egy ilyen transzfekciós kit első tartálya egy vagy több különböző, például különböző antigéneket kódoló DNS-t tartalmazhat. Egy második tartály tartalmazhat egy vagy több különböző intemalizáló faktor-konjugátumot, amelyek által építőkocka-rendszer szerint válik lehetségessé a transzfekciós kit alkalmazása. Az, hogy az alkotórészek felhasználásra kész készítményként
HU 218 846 Β vagy egymástól elválasztva - hogy közvetlenül felhasználás előtt keverjük össze - állnak rendelkezésre, a specifikus felhasználás mellett a komplexek stabilitásától függ, amelyet rutinszerű stabilitási teszttel vizsgálhatunk. Egy előnyben részesített kivitelezési formában transzglutaminázhoz kapcsolt adenovírus-polilizin konjugátum található, amely egy kit tartályában stabilan tárolhatónak bizonyult. Egy további előnyben részesített kivitelezési formában biotinezett adenovírus és sztreptavidin-polilizin egymástól elválasztott tartályokban állnak rendelkezésre, és felhasználás előtt keverjük össze azokat. A találmány rugalmassága folytán az átlagszakember számtalan különböző transzfekciós kitet fejleszthet ki.
A találmány szerinti összetétel gyógyászati készítményként való terápiás alkalmazása tervszerűen történik, ennél az intravénás útvonalat részesítjük előnyben. Ennek az alkalmazási formának a célszervei például a máj, lép, tüdő, csontvelő, valamint a daganatok. Példák a helyi alkalmazásra a tüdőszövet (a találmány szerinti összetétel folyadékként történő alkalmazása becseppentéshez vagy aeroszolként belélegzésre). A ligandumoknak a differenciált tüdősejtekre nézve magas specificitása mellett még szükség lehet kísérőintézkedésként különböző, a tüdőszövet környezetében előforduló és a géntranszfert esetleg korlátozni képes faktoroknak a befolyásolására (például a csillószőrmozgás bénítására, a hörgőnyálka feloldására, proteázinhibitorok alkalmazására). A találmány szerinti gyógyászati készítmények továbbá beadhatók közvetlen injektálással a májba, az izomszövetbe vagy egy daganatba, vagy helyileg alkalmazhatók a gyomor- és bélrendszerben. Egy további módja a gyógyászati készítmény beadásának az epevezeték-rendszerben történő felhasználás. Ez a felhasználási mód megengedi a közvetlen hozzáférést az epecsatomácskákon található hepatocitamembránokhoz, miközben elkerüljük a kölcsönhatást a vér alkotórészeivel.
Nemrég adódott a lehetőség mioblasztok (éretlen izomsejtek) alkalmazására, gének egerek izomrostjaiba való bevitelére. Mivel a mioblasztokról kimutattuk, hogy a génterméket a véráramba kiválasztják, ez a módszer szélesebb alkalmazásra találhat az izomsejtek genetikai hibáinak a kezelésénél, mint például az izomdisztrófiával összefüggő hibánál. Tehát a manipulált mioblasztokat felhasználhatjuk olyan géntermékek szállítására, amelyek vagy a vérben hatnak, vagy a vér szállítja azokat. A jelen találmány kísérletei azt mutatták, hogy mind mioblaszt-, mind miotubekultúrák, sőt primerek magas hatásfokkal vethetők alá transzfekciónak. Azok a transzfekciós táptalajok, amelyek a legjobb eredményeket mutatták, biotinezett adenovírusból, transzferrin-polilizinből és sztreptavidin-polilizinből álló kombinációs komplexeket tartalmaztak. Luciferáz és β-galaktozidáz riportergéntermékeken kívül a VIII. faktort is kifejeztük izomsejtekben. Ezenkívül beépítettük a csirke-adenovírust, a CELO-t olyan kombinációs komplexekbe, amelyek kiegészítő intemalizálófaktorként búzacsíra-agglutinint tartalmaztak.
A gyógyászati alkalmazás ex vivő is végbemehet, ahol a kezelt sejteket - például csontvelősejteket, hepatocitákat vagy mioblasztokat - visszavezetjük a testbe [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1217-1221 (1991); Science 254,1509-1512 (1991)]. A jelen találmánynak egy további ex vivő alkalmazása az úgynevezett rákvakcinát érinti. Ennek a gyógyászati lehetőségnek az elve abban áll, hogy a betegből daganatsejteket izolálunk, és a sejtekbe egy citokint kódoló DNS-t viszünk be. Egy következő lépésben, adandó alkalommal oly módon aktiváljuk a sejteket - például sugárzással -, hogy már nem szaporodnak, de a citokint még mindig kifejezik. Ezek után a genetikailag megváltoztatott sejteket vakcinaként beadjuk annak a betegnek, akiből a sejteket levettük. Az oltás helyének környezetében a kiválasztott citokinek aktiválják az immunrendszert, többek között azáltal, hogy a sejtölő T-sejteket aktiválják. Ezek az aktivált sejtek a test más részein is kifejthetik hatásukat, és nem kezelt daganatsejteket is megtámadhatnak. Ilyen módon lecsökken a tumormaradványoknak és metasztázis kialakulásának a kockázata. A rákvakcinák génterápiában történő alkalmazására egy megfelelő előírást készítettek Rosenberg és munkatársai [Humán Gene Therapy 3, 75-90 (1992)]. A Rosenberg által ajánlott retrovirális vektorok helyett lehet a jelen találmány géntranszferrendszerét alkalmazni. A jelen találmány kísérletei során sikeresen vittünk be primer melanómasejtekbe egy riportergént, amelyet polilizinhez kapcsolt adenovírusból és transzferrin-polilizinből vagy LDL-polilizinből álló kombinációs komplexek tartalmaztak.
A jelen találmányt felhasználhatjuk immunoassay jellegű elemzéseknél egy adott antigénre adott immunválasz meghatározására. Az antigénspecifikus sejtölő T-limfociták (CTL=Cytotoxic T-lymphocytes), amelyek megölik a fertőzött sejteket, fontos szerepet játszanak a gazdaszervezet vírusos fertőzésekkel vagy daganatokkal szembeni védekezésében. A T-sejtek és az antigént bemutató sejtek (APC=Antigén Presenting Cells) kölcsönhatása HLA-korlátozás alatt áll (HLA=Humán Lymphocytic Antigens=MHC=Major Histocompatibilty Complex). Antigént kifejező sejtek CTL-ek általi elpusztításának in vitro, „CTL Killing Assay”-vel történő megállapításához az antigént a CTL-ek számára a megfelelő HLA-kömyezetben kell bemutatni, amely az autológ célsejtekre nézve a megszokottat jelenti. Egy „CTL Killing Assay” a következőképpen végezhető el: az APC-ket egy olyan DNS-szerkezettel vetjük alá transzfekciónak, amely egy antigént kódoló szekvenciát tartalmaz. Az antigénepitópokat MHC I. osztályú molekulákhoz kötjük, és a sejt felszínén egy specifikus CTLválasz számára célként megjelenítjük. Egy betegből származó szérumpróbával történt inkubálás után, specifikus CTL-ek előfordulásától függően, bekövetkezik az APC-k lízise. A sejtek lízisét például, a szérum hozzáadása előtt az APC-kbe bevitt, radioaktív króm szabaddá válásának nyomon követésével mérhetjük. Megalapozott előírások [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9514-9518 (1989)] B-limfoblasztoid sejtvonalakat (B-LCL=B-Lymphoblastoid Cell Lines) alkalmaznak, amelyekben rekombináns vakciniavírusok transzfekciója révén antigéngének kifejeződését váltják ki. Az antigént körülbelül egy napon át hatékonyan kifejező sej19
HU 218 846 Β tek mégis elpusztulnak a vakciniavírus litikus hatása következtében. Ezeket a nehézségeket elkerülhetjük a „CTL Killing Assay”-k segítségével, amelyek a jelen találmány géntranszferrendszerét használják antigént kódoló DNS-nek a sejtbe történő bevezetésére, például HÍV- vagy daganatantigéneket kódoló szerkezetek bevitelét fibroblasztokba, hogy ezeket az antigén kifejezésére késztessék. Primer fibroblasztok könnyen nyerhetők biopsziával, könnyen tenyészthetők, és a jelen találmány segítségével különösen hatékony (körülbelül 50-70%) transzfekcióra való hajlamot mutattak. Az ilyen elemzések hasznosak vakcinák kifejlesztése szempontjából olyan epitópok azonosítására, amelyeket az ölősejtek felismernek. Ezenkívül előnyösen használhatók egy személy meghatározott antigénnel szembeni HLA-korlátozott immunválaszának meghatározására.
Az alkalmazási lehetőségek nagy száma alapján, amelyekben a jelen találmány segítségével átvitt gének gyakorlatilag minden sejtben kifejeződnek, a találmányt rekombináns fehérjék előállítására is felhasználhatjuk. Ebben az esetben sincs, vagy csak csekély korlátozás áll fenn a szállítandó DNS szekvenciájára, illetve nagyságára vonatkozóan, továbbá a sejttípusok széles spektruma alkalmas a találmány szerinti készítménnyel való transzfekcióra. Ennélfogva majdnem minden sejttípus felhasználható rekombináns fehérjék előállítására, amely szavatolja, hogy a rekombináns fehéije természetes és teljesen módosított poszttranszlációs fejlődési formában képződjön, amely biztosítja a termék magas biológiai aktivitását.
A géntranszfert a sejtekben úgy érhetjük el, ahogyan a jelen példákban luciferáz és IFN-α segítségével megmutatjuk, gyakorlatilag minden egyes, egy kívánt fehérjetermék képződéséhez vezető génszerkezet transzportálható. A kívánt fehérjetermék a transzfekció után 24 órától 1 hétig terjedő időszakban vagy tovább kinyerhető a sejtkultúrából (a mindenkori fehérjetermékre vonatkozó előírásnak megfelelően vagy a túlélő sejtekből, vagy egy megfelelő sejthomogenizátumból).
A géntranszferrendszer jelen találmány szerinti alkalmazása rekombináns fehérjék előállítására a következő előnyökkel jár:
1. A magas transzfekciós hatékonyság alapján (a transzfekción átesett sejtek több mint 90%-a tudja a gént nagy mennyiségben kifejezni) nincs szükség a transzfekcióra kiszemelt sejtek előzetes szelekciójára; továbbá nem szükséges stabil sejtvonalakat hitelesíteni. Egy sejtkultúra kis mennyiségben elegendő lehet használható mennyiségű fehérje kinyeréséhez.
2. Bevihetők nagy génszerkezetek; 48 kb méretűt tudtunk eredményesen transzportálni.
3. A génkifejeződés olyan sejtekben mehet végbe, amelyek szavatolják, hogy a megfelelő poszttranszlációs fejlődés és módosulás megtörténik, például K-vitamin-függő alvadási faktorok karboxilálása [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6141-6145 (1990)] vagy sejttípusspecifikus glikozilálás.
4. A találmány szerinti rendszer révén a célsejteknek nagyobb választéka áll majd a génkifejeződés rendelkezésére.
Az ábrák áttekintése
1. ábra: adenovírus-fertőzés hatása a transzferrin-polilizin konjugátumokkal történő géntranszferre;
2. ábra: konjugátum-DNS komplex dózishatás;
3. ábra: a transzferrin-polilizin közvetítette géntranszfer adenovírusokkal való felerősítése receptor közvetítette endocitózis eredménye:
A) hatás a komplexben levő DNS-re,
B) hatás a receptorhoz kötött DNS-re,
C) hatás a transzferrin-polilizin konjugátumokkal történő géntranszferre;
4. ábra: adenovírus-fertőzés hatása a transzferrin-polilizin konjugátumokkal történő géntranszferre kiválasztott sejtvonalakban;
5. ábra: annak vizsgálata, vajon a génkifejeződés felerősödése a géntranszport vagy a transzaktiválódás működésében rejlik;
6. ábra: tetragalaktózpeptid-polilizin konjugátum;
7. ábra: HepG2-sejtek transzfekciója pRSVL-DNS komplexekkel adenovírus jelenlétében;
8. ábra: HepG2-sejtek transzfekciója pCMVL-DNS komplexekkel adenovírus jelenlétében;
9. ábra: TIB73-sejtek transzfekciója pCMVL-DNS komplexekkel:
A) összehasonlító értékek klorokinnal,
B) adenovírus jelenlétében;
10. ábra: pCMVL-DNS bevitele T-sejtekbe adenovírus jelenlétében:
A) H9-sejtek,
B) primer limfociták;
11. ábra: adenovírusok UV-inaktiválása
A) a géntranszferhatás felerősítése HeLa-sejtekben UV-inaktivált vírusok segítségével,
B) az UV-inaktiválás összevetése a géntranszferhatással;
12. ábra: adenovírusok inaktiválása formaldehiddel;
13. ábra: NIH3T3-sejtek transzfekciója transzfemn-polilizin-DNS komplexekkel Moloney-vírus jelenlétében;
14. ábra: annak vizsgálata, vajon a NIH3T3-sejtek transzferrin-polilizin-DNS komplexekkel történő transzfekciójánál a géntranszferhatás a Moloney-vírusra vezethető-e vissza;
15. ábra: a transzferrin és receptora közötti kölcsönhatások szerepet játszanak a Moloney-vírus géntranszferhatásában;
16. ábra: a pH-érték befolyása retrovírusok géntranszferhatására;
17. ábra: influenzahemagglutinin-peptid; liposzómák felszakadásának meghatározása (Liposomes Leakage Assay);
18. ábra: K562-sejtek transzfekciója transzferrin-polilizin konjugátumokkal influenzapeptid-polilizin konjugátum jelenlétében;
19. ábra: HeLa-sejtek transzfekciója transzferrin-polilizin konjugátumokkal influenzapeptid-polilizin konjugátum jelenlétében;
20. ábra: a β-galaktozidáz kifejeződésének in situ kimutatása HeLa-sejtek transzferrin-polilizin20 ί
HU 218 846 Β pCMV-p-gal-DNS-sel adenovírus jelenlétében történő transzfekcióját követően;
21. ábra: in situ β-galaktozidáz-kifejeződés HeLa-sejtekben adenovírus jelenlétében;
22. ábra: sejtek transzfekciója egy 48 kb kozmiddal adenovírus jelenlétében:
A) HeLa-sejtek,
B) neuroblasztómasejtek;
23. ábra: adenovírus-polilizin előállítása kémiai kapcsolással;
24. ábra: K562-sejtek transzfekciója kémiailag kapcsolt adenovírus-konjugátumokkal;
25. ábra: HeLa-sejtek transzfekciója kémiailag kapcsolt adenovírus-konjugátumokkal;
26. ábra: polilizin adenovírushoz kötése transzglutaminázzal;
27. ábra: egérhepatociták transzfekciója transzglutaminázzal kapcsolt adenovírus-polilizin konjugátumokkal;
28. ábra: a transzfekció hatékonyságának felerősítése transzglutaminázzal kapcsolt adenovírus-polilizin konjugátumokkal, összehasonlítva a nem kapcsolt vírussal;
29. ábra: HeLa-sejtek transzfekciója biotin-sztreptavidinnel kapcsolt adenovírus-konjugátumokkal
30. ábra: K562-sejtek transzfekciója biotin-sztreptavidinnel kapcsolt adenovírus-konjugátumokkal;
31. ábra: neuroblasztómasejtek transzfekciója egy kb kozmiddal biotin-sztreptavidinnel kapcsolt adenovírus-konjugátumok segítségével;
32. ábra: hepatociták transzfekciója klorokin vagy adenovírus jelenlétében;
33. ábra: K562-sejtek transzfekciója különböző endoszomalitikus anyagok jelenlétében;
34. ábra: a β-galaktozidáz riportergénnel celluláris síkon folyó transzfekció összevetése különböző endoszomalitikus anyagok jelenlétében;
35. ábra: hosszan tartó luciferázkifejeződés összefüggő réteget alkotó, nem szaporodó hepatocitákban;
36. ábra: kifejeződés HeLa-sejtekben, amelyeknek a transzfekciója szabad és biotin-sztreptavidinnel polilizinhez kötött CELO-vírus jelenlétében történt;
37. ábra: mioblasztok és miotubok transzfekciója szabad és biotin-sztreptavidinnel polilizinhez kötött adenovírus jelenlétében;
38. ábra: primer mioblaszt- és miotubkultúrák transzfekciója;
39. ábra: dl312 adenovírus és CELO-vírus összehasonlítása HeLa-sejtek és C2C12 mioblasztok transzfekciójánál;
40. ábra: a CELO-vírussal végzett transzfekció javítása egy lektinligandum alkalmazásával;
41. ábra: VIII. faktor cDNS-kifejeződése C2C12 mioblaszt- és miotubkultúrákban;
42. ábra: a DNS-transzport felerősítése adenovírus-fehérj ékkel:
A) HeLa-sejtek,
B) fibroblasztok;
43. ábra: galaktóz-influenzapeptid konjugátumok a hepatocitákba történő DNS-transzporthoz;
44. ábra: galaktóz-adenovírus konjugátumok a hepatocitákba történő DNS-transzporthoz;
45. ábra: géntranszfer B-limfoblasztoid B-sejtekbe;
46. ábra: DNS-transzfer transzferrin-polilizinnel rhinovírus jelenlétében:
A) szabad rhinovírus,
B) konjugált rhinovírus;
47. ábra: primer humán melanómasejtek transzfekciója transzferrin- és adenovírus-konjugátumokat tartalmazó kombinációs komplexekkel;
48. ábra: primer humán melanómasejtek transzfekciója
LDL- és adenovírus-konjugátumokat tartalmazó kombinációs komplexekkel;
49. ábra: géntranszfer patkányok légúti hámsejtjeibe in vivő;
50. ábra: liposzómák áteresztőképességének meghatározása (Liposomes Leakage Assay) amfipátiás peptidekkel;
51. ábra: eritrociták áteresztőképességének meghatározása (Erithrozyten Leakage Assay) amfipátiás peptidekkel;
52. ábra: BNL CL.2 sejtek transzfekciója amfipátiás peptidek jelenlétében;
53. ábra: NIH3T3-sejtek transzfekciója amfipátiás peptidek jelenlétében;
54. ábra: IFN-α kifejeződése különböző endoszomalitikus anyagok jelenlétében transzfekciónak alávetett HeLa-sejtekben;
A jelen találmányt szemléltető következő példákban, ha nem adjuk meg másképp, a következő anyagokat és módszereket alkalmaztuk.
Transzferrin-polilizin/DNS komplexek előállítása
a) Humán transzferrin-polilizin konjugátumok
A Wagner és munkatársai által leírt módszert [Bioconjugate Chemistry 2, 226-231 (1991)] alkalmaztuk, amelynél a polilizin kapcsolása a transzferrin szénhidrátoldalláncain keresztül történik.
280 mg (3,5 pmol) humántranszferrin-oldatot (vasmentes, Sigma) 6 ml 30 mM nátrium-acetát-pufferben, pH=5, 0 °C-ra lehűtöttünk és 11 mg (51 μιηοΐ) nátrium-peqodátot tartalmazó, 750 μΐ 30 mM nátrium-acetát-puffert, pH=5, adtunk hozzá. A keveréket 90 percig jégfürdőben, sötétben állni hagytuk. A kis molekulájú termékek eltávolítása céljából gélszűrést végeztünk (Sephadex G-25, Pharmacia), amely körülbelül 250 mg oxidált transzferrint (mérése ninhidrines meghatározással) tartalmazó oldatot eredményezett. [Az aldehidet tartalmazó és ánizsaldehiddel színreakciót adó oxidált forma bizonyítására a próbákat szilikagél vékonyréteg-lemezre csepegtettük fel, megszárítottuk, és a lemezeket p-ánizsaldehid/kénsav/etanol (1/1/18) elegybe merítettük, majd szárítottuk és hevítettük.] A módosított transzferrinoldatot gyorsan (10-15 percen belül) hozzáadtuk egy 1,5 μιηοΐ fluoreszcens jelölésű, átlagosan 190 lizinmonomer lánchosszúságú poli(L)-lizint - 4,5 ml 100 mM nátrium-acetátban, pH=5 - tartalmazó oldathoz. Az oldat pH-ját 1 M nátrium-bikarbonát-puffer hozzáadásával 7,5-re állítottuk be. A keverékhez hozzá21
HU 218 846 Β adtunk szakaszosan, óránként 4 adagban, egyenként
28.5 mg (450 pmol) nátrium-ciano-bór-hidridet. 17 óra után 2 ml 5 M nátrium-kloridot adtunk hozzá, hogy az oldat összkoncentrációját körülbelül 0,75 M-ra állítsuk be. A reakciókeveréket kationcserélő oszlopra vittük fel (Pharmacia Mono S HR 10/10), és állandó mennyiségű 25 mM HEPES-t (pH=7,3) tartalmazó, 0,75-2,5 M nátrium-klorid-só-gradiens mellett ffakcionáltuk. A magas sókoncentráció az oszlop töltésénél és a gradiens kezdeténél lényeges volt a polikationkonjugátumok kinyeréséhez. Valamennyi transzferrin (körülbelül 30%) eluált gyenge fluoreszcens aktivitással keresztáramban; a fluoreszcens jelölésű konjugátum zöme 1,35 M és 1,9 M közötti sókoncentrációnál eluált, és 3 frakcióban gyűjtöttük össze. Ezek a frakciók (elúciójuk sorrendjében) 2 125 mM HEPES-sel (pH=7,3) szemben dializálva egy 45 mg (0,56 pmol), 366 nmol polilizinnel módosított transzferrintartalmú A frakciót (TfpL190A), egy 72 mg (0,90 pmol), 557 nmol polilizinnel módosított transzferrintartalmú B frakciót (TfpL190B) és egy 7 mg (85 nmol), 225 nmol polilizinnel módosított transzferrintartalmú C frakciót (TfpL190C) eredményeztek. A transzferrinkonjugátumokat, amennyiben nem kerültek azonnal felhasználásra, hirtelen lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, majd -20 °C-on vasmentes állapotban tároltuk. A vas beépítése előtt próbákat (0,5-1 mg) állítottunk be nátrium-kloriddal fiziológiássó-koncentrációra (150 mM). A vas beépítését transzferrin mg-onként 4 pl 10 mM vas(III)-citrát puffer (amely 200 mM citrátot tartalmazott, és a pH-ját nátrium-bikarbonáttal 7,8-re állítottuk be) hozzáadásával végeztük el. A vastartalmú konjugátumokat DNS-komplex képzésére való felhasználásuk előtt kis részletekre osztottuk, hirtelen lefagyasztottuk folyékony nitrogénben vagy szárazjég/etanolban, és -20 °C-on tároltuk. (Ez a művelet célszerűnek bizonyult, miután megmutatkozott, hogy többszöri felengedés és lefagyasztás a konjugátumok tönkremenéséhez vezet.)
b) Egértranszferrin-polilizin konjugátumok
A humán transzferrinnél megadott módszerekhez hasonlóan jártunk el, midőn a szénhidrátoldalláncokon keresztül történő kapcsolást végeztük el. 4,1 mg (51 nmol) egértranszferrinből és 2,1 mg (34 nmol) pL290ből kiindulva olyan konjugátumokat kaptunk, amelyek
15.5 nmol egértranszferrint és 13 nmol pL290-et tartalmaztak.
Plazmid-DNS
a) pRSVL-DNS
A pRSVL DNS-plazmid 6 pg-ját - a pRSVL a Photinus pyralis luciferázgénjét tartalmazza, a Rous Sarcoma Vírus LTR Enhancer/Promoters kontrollja alatt [J. Biochem. 82, 1425-1433 (1977); Mól. Cell. Bioi. 7, 725-737 (1987)], Triton-X Lyse Standard módszer szerint előállítva [Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 474 (1982)], amelyet CsCl/EtBr egyensúlyiréteggradiens-centrifugálás, butanolos színtelenítés és 10 mM Tris/HCl pH 7,5 + 1 mM EDTA-t tartalmazó 350 pl HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,3) oldattal szembeni dialízis követ - a sejtekhez történő hozzáadás előtt 30 perccel 12 pg transzferrin-polilizin konjugátummal kevertük össze 150 pl HBS-ben.
b) pCMV-DNS
A pCMV-plazmidot oly módon állítottuk elő, hogy a pSTCX556 plazmid BamHI-inszertjét [EMBO J. 7, 2503-2508 (1988)] eltávolítottuk, a plazmidot Klenowfragmentummal kezeltük, és a HindlII/SspI valamint a pRSVL-plazmidból Klenow-kezelt fragmentumot - amelyik a luciferázt, illetve a β-galaktozidázt kódoló szekvenciákat tartalmazza [Nucleic Acids Rés. 17,2365 (1989)] - beültettük. A komplexképzés a pRSVL-hez hasonlóan történt.
Víruskészítmények előállítása
a) Adenovírus-készítmények
A dl312 adenovírustörzset [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3665-3669 (1979)] alkalmaztuk, amely az Ela-régióban egy törléssel rendelkezik. A vírus szaporítását az Ela-transzkomplementálandó 293-as sejtvonalban végeztük el, ahol nagy mennyiségben állítottuk elő a vírust, mint azt Davidson és Hassell [J. Virol. 61, 1226-1239 (1987)] leírják. A tisztított vírust tárolópufferben (100 mM Tris, pH=8,0,100 mM NaCl, 0,1% BSA, 50% glicerin) vagy HBS/40% glicerinben vettük fel, és részletekben, -70 °C-on tároltuk. A virionkoncentráció meghatározását az extrahált genomiális vírusDNS UV-spektrofotometriás analízisével végeztük el [egy optikaidenzitás-egység (OD, A260) megfelel mlenként 1012 víruspartikulának; Virology, 40, 462-477 (1970)].
b) Retrovírus-készítmények
Az N2 Moloney-egérleukémia-retrovirust egy ekotropiás befoglalóvonalban fogtuk meg [Natúré 318, 149-154 (1985); J. Virol. 61, 1647-1650 (1987)]. A vírust kifejező túlélő sejtvonalakat összegyűjtöttük, hirtelen lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, és -20 °C-on tároltuk. A példákban alkalmazott túlélők titere körülbelül 106 cfu/ml (cfu=colonie forming unit=telepképző egység) volt, amelyet neomicinrezisztens kolóniaképzés segítségével, NIH3T3-sejtekkel mértünk meg. A túlélőket a víruskoncentráló kísérletekhez nitrogénatmoszférában egy 300 kb membránszűrőn (FILTRON) átszűrtük, és egy AMICON keverőkoncentrátorba juttattuk. Ily módon tudtuk a normális körülmények közötti 10-30 ml túlélőt 10-szeresére koncentrálni.
Sejtek és táptalajok
HeLa-sejteket 5%, hővel inaktivált magzatiborjúszérummal (FCS), 1001. E. penicillin/100 pg/ml sztreptomicinnel és 2 mM glutaminnal kiegészített DMEMtáptalajban tenyésztettünk. WI-38, MRC-5 és KBsejteket 10%, hővel inaktivált FCS-sel, a DMEM-nél leírt antibiotikumokkal, 10 mM nem esszenciális aminosavakkal és 2 mM glutaminnal kiegészített EMEM-táptalajban (Eagle’s Modified Essential Médium) tenyésztettünk. CFTl-et, egy respirációs, cisztikus fibrózishámsejtvonalat (Yankaskas módszere szerint előállítva [Am. Rév. Respir. Dis. 143, A139 (1991)]; a CFT1sejtvonal azzal jellemezhető, hogy a AF508-törlés CFmutációra nézve homozigóta) F12-7X táptalajon tenyésztettünk [Am. J. Physiol. 256, (Cell Physiol. 25,)
HU 218 846 Β
1033-1044 (1989)]. A géntranszferkísérletekhez a sejteket 6 cm-es sejtkultúralemezeken tenyésztettük addig, amíg körülbelül 50%-ban egybefolytak (5xl05 sejt). A táptalajt eltávolítottuk, és 1 ml DMEM vagy EMEM/2% FCS táptalajt adtunk hozzá. Ezek után adtuk hozzá a konjugátum-DNS komplexeket, közvetlenül utána a dl312 adenovírust (0,05-3,2 χ 104 partikula/sejt) vagy a vírustároló pufferből egy összevethető mennyiséget (1-80 pl). A lemezeket egy órára visszatettük a termosztátba (5% CO2, 37 °C), utána 3 ml komplett táptalajt adtunk hozzájuk. További 24 órás inkubálás után kinyertük a sejteket a luciferázgén kifejeződésének meghatározása céljából. CFTl-sejtek esetében a géntranszferkísérletek előtt a sejteket 4 órán át F12-7X táptalajon, humán transzferrin nélkül tenyésztettük.
A következő sejtvonalakat az ATCC-től - hozzáférhető a megadott katalógusszámok alatt - szereztük be: HeLa-sejtek: CCL2, K562-sejtek: CCL 243, HepG2sejtek: HB 8065, ΤΙΒ-73-sejtek: TIB 73 (BNL CL.2), NlH3T3-sejtek: CRL 1658, 293-sejtek: CRL 1573, KB-sejtek: CCL 17, WI-38-sejtek: CCL 75, MRC5-sejtek: CCL 171. A H9-sejteket az AIDS Research and Reference Reagent Program, U.S. Department of Health and Humán Services intézettől, 87. katalógusszámon szereztük be.
Primer limfocitákat kaptunk úgy, hogy köldökzsinórvérből egy 25 ml-es próbát EDTA-t tartalmazó próbacsövecskében vettünk fel. Kis részleteket 4,5 ml Ficollhypaque-val (Pharmacia) alárétegeztünk, és 15 percig 2500 rpm mellett centrifugáltuk. A felső plazmaréteg és a tiszta Ficoll-réteg közötti barnás réteget (körülbelül 10 ml) eltávolítottuk. 40 ml IMDM+10% FCS keverékét adtuk hozzá, a próbát 15 percig 1200 rpm mellett centrifugáltuk, és a sejtpelletet 50 ml friss IMDM+10% FCS keverékében vettük fel (a sejtsűrűség körülbelül 2xl06 sejt/ml volt). Fito-hemagglutinin (PHA P, DIFCO) egy 250 μΐ-es részletét adtuk hozzá, a kultúrát 48 órán át 37 °C-on és 5% CO2 mellett inkubáltuk, végül rekombináns IL-2-t (BMB) adtunk hozzá (koncentráció: 20 egység/ml). Ezek után a sejteket IMDM/20% FCS, 2 egység/ml IL-2 segítségével 1:3 arányban megosztottuk. A sejtek egy részét FCS+5% DMSO keverékében, folyékony nitrogénben mélyfagyasztottuk. Felhasználás előtt a sejteket IMDM+20% FCS+2 egység/ml IL-2 keverékében tenyésztettük.
A szekvenciáliskötés-vizsgálatokhoz a HeLa-sejteket 4 °C-on, 2% FCS-sel kiegészített 1 ml DMEM-ben ekvilibráltuk. A konjugátum-DNS komplexeket ugyanúgy adtuk hozzá, mint a többi kísérlemél, és a lemezeket 2 órán át 4 °C-on inkubáltuk. Ezek után a lemezeket alaposan mostuk jéghideg DMEM/2% FCS-sel, végül ennek a táptalajnak 2 ml-ét adtuk hozzá. Ezt követően tettük rá a dl 312 adenovírust, illetve víruspuffert, a sejteket hagytuk lassan felmelegedni, mielőtt további 24 órára a termosztátba tettük azokat. Az inkubáció után kinyertük és luciferázgén-kifejeződésre vizsgáltuk a sejteket. Luciferázmeghatározás
A sejtkivonatok előállítását, a fehérjetartalom standardizálását, valamint a luciferázaktivitás meghatározását az alábbi hivatkozások szerint végeztük el [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3655-3659 (1990); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4033-4037 (1990), illetve az EP 388 758 számú európai szabadalmi leírás].
1. példa
Adenovírus-kezelés transzferrin-polilizin konjugátumokkal történő géntranszferre gyakorolt hatásának meghatározása
Mindenekelőtt emelkedő vírusdózis hatását vizsgáltuk meghatározott mennyiségű konjugátum-DNS komplex géntranszfert eredményező képességére. A komplexképzéshez 6 pg pRSVL-plazmidot 12 pg humán transzferrin-polilizin konjugátummal (hTfpL190B) kevertünk össze. A konjugátum-DNS komplexet a dl312 adenovírus különböző mennyiségeivel (0,05-3,2 χ 104 víruspartikula/sejt) adtuk HeLa-sejtekhez. Ennek az analízisnek az eredményét az 1. ábrán mutatjuk meg. A luciferázaktivitást fényegység/50 pg sejtfehérje mértékegységben fejeztük ki. Ezen analízis szerint a hozzáadott adenovírus emelkedő mennyiségei a géntranszferben megfelelő növekedést eredményeztek. Az ábrán 2-4 különálló kísérlet eredményeinek átlagértékeit mutatjuk meg; a vízszintes vonalak a standard szórást mutatják.
2. példa
Konjugátum-DNS komplex dózishatása
Az 1. példában leírtak szerinti konjugátum-DNS komplexek logaritmikus hígítmányait készítettük el, ezeket HeLa-sejtekhez adtuk dl 312 adenovírus nélkül vagy állandó mennyiségű dl 312 adenovírus (1 χ 104 víruspartikula/sejt) adagolása mellett. A luciferázaktivitást úgy határoztuk meg, ahogyan azt az 1. példában megadtuk. Az eredmények a 2. ábrán láthatók.
3. példa
Transzferrin-polilizin általi, adenovírusok okozta, receptor közvetítette endocitózissal történő géntranszfer felerősítése
a) Az adenovírus-kezelés hatása a komplexben levő
DNS transzferére
A transzfekcióhoz a következő komponenseket raktuk össze: 6 pg pRSVL-DNS transzferrin-polilizin-konjugátum nélkül (DNS); 6 pg pRSVL-DNS+6 pg nem konjugált polilizin270 (DNS+pL); 6 pg pRSVLDNS+12 pg az előző példákban alkalmazott transzferrin-polilizin konjugátum (DNS+hTfpL190B). Ezeket a transzfekciós anyagokat HeLa-sejtekhez adtuk dl312 adenovírus (dl312) nélkül vagy azzal együtt (lxlO4 víruspartikula/sejt). A sejtkivonatok előállítását, az összfehérje standardizálását, valamint a luciferázaktivitás meghatározását az előző példákhoz hasonlóan végeztük el. Az elvégzett kísérletek eredménye a 3A. ábrán látható.
b) Az adenovírus-kezelés hatása a receptorhoz kötött
DNS transzferére
Konjugátum-DNS komplexeket (DNS+hTlpL190B) vagy polilizin-DNS komplexeket (DNS+pL) kötöttünk HeLa-sejtekhez, anélkül hogy intemalizáltuk volna azáltal, hogy 4 °C-on inkubáltuk. A nem kötött komp23
HU 218 846 Β lexeket a dl312 adenovírus (lxlO4 víruspartikula/sejt) vagy összevethető mennyiségű puffer hozzáadása előtt eltávolítottuk. Az ezt követő inkubációt 37 °C-on végeztük, hogy lehetővé tegyük a kötött DNS-komplexek és az adenovírusok intemalizációját. A luciferázaktivitás meghatározása a már megadottak szerint történt (3B. ábra).
c) Az adenovírus-kezelés hatása a transzferrin-polilizin konjugátumok általi géntranszferre 6 pg pRSVL-DNS+12 pg transzferrin-polilizin konjugátumtartalmú (DNS+hTfpL190B) konjugátumDNS komplexeket adtunk lxlO4 adenovírus-partikula (dl312)/sejt vagy összevethető mennyiségű, hővel inaktivált dl312 adenovírus (dl312 h. i.) mellett HeLa-sejtekhez. A hőinaktiválást 45 °C-on történő 30 perces inkubációval oldottuk meg [J. Virol. 64, 3661-3673 (1990)].
4. példa
Az adenovírus-kezelés hatása a transzferrin-polilizinkonjugátumok általi géntranszferre kiválasztott sejtvonalakban
Konjugátum-DNS komplexeket (6 pg pRSVL+ + 12 pg hTfpL190B) adtunk a CFT1-, KB-, HeLa-, WI-38- és MRC-5-sejtvonalak sejtjeihez dl312 adenovírussal együtt (1 χ 104 víruspartikula/sejt) vagy a nélkül. A géntranszfer hatékonyságát a különböző sejtvonalakra az előző példákhoz hasonlóan luciferázméréssel határoztuk meg (4. ábra).
5. példa
A luciferázgén-kifejeződés felerősödése a géntranszporton alapul, nem pedig transzaktiváláson
Mindenekelőtt egy, a luciferázt konstitutívan (szerkezetéből adódóan) kifejező sejtvonalat - K562 10/6 jelzéssel állítottunk elő úgy, hogy a sejteket egy olyan plazmiddal fertőztük, amely egy RSV-luciferázgénfragmentumot (a pRSVL-nek egy Apal/Pvul fragmentuma [Mól. Cell. Bioi. 7, 725-737 (1987)] klónozva a pUCp-Locus Clal-helyére [EMBO J. 9, 233-240 (1990)] tartalmazott. Ezt a plazmidot vittük komplexbe egy transzferrin-polilizin konjugátummal és ezzel a komplexszel fertőztünk K562-sejteket, amelynek során az alábbi hivatkozásban található módszer szerint jártunk el [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4033-4037 (1990)]. Mivel a pUCp-Locus plazmid egy neomicinrezisztencia-gént tartalmaz, a neomicinrezisztencia alapján ki tudtuk válogatni a luciferázt kifejező kiónokat. További vizsgálatokhoz a K562 10/6 jelű kiónt választottuk ki.
A K562 szülői sejtvonalának részleteit (200 pl RPMI 1640+2% FCS keverékében; 500 000 sejt/próba) vagy 12 pg TfpL + 6 pg pRSVL, vagy 4 pg pL90+6 pg pRSVL keverékével, mindegyiket 500 pl HBS-ben kezeltük. A dl312 adenovírus megadott mennyiségeit (5. ábra) 1,5 órán át 37 °C-on hagytuk a sejtekre hatni, majd 2 ml RPMI+10% FCS keverékét adtuk hozzá. Ezek után folytattuk az inkubálást 37 °Con további 24 óráig, és végül a sejteket előkészítettük a luciferázaktivitás méréséhez. Azt találtuk, hogy az adenovírussal történő inkubálás a luciferázaktivitásban nyilvánvaló emelkedést okoz (5A. ábra). Ez érvényes mind a TfpL-komplexekre (200 fényegység 25 000 fényegységgel szemben), mind a pL90-komplexekre (0 szemben 1,9 xlO5 6 fényegységgel). Ebből adódik, hogy a K562-sejtvonal rendelkezik a pRSVL/polilizin komplexek intemalizálásának képességével, és hogy ez a luciferázkifejeződéssel mért intemalizáció a vírus jelenléte folytán jelentősen emelkedik.
Hasonló kísérleteket végeztünk az RSVL-luciferázgént konstitutíven kifejező K562 10/6 sejtekkel, ahol hasonló mennyiségű dl312 adenovírust vittünk be. 500 000 sejt kis részleteit (200 pl RPMI+2% FCS keverékében) az 5B. ábrán megadott mennyiségű dl 312 adenovírussal 1,5 órán át 37 °C-on inkubáltuk. Ezek után ugyanúgy, mint a szülői sejteknél, RPMI+10% FCS keverékét adtuk hozzá, 24 órán át tovább inkubáltuk, és meghatároztuk a luciferázaktivitást. Ahogyan az az 5B. ábrából látható, ezeknél a sejteknél az adenovírussal való kezelés nem hatott észrevehetően a luciferázaktivitásra; a kontrollértékek ugyanott találhatók, ahol a vírussal kezelt próbák értékei.
6. példa
Májsejtek transzfekciója aszialo-fetuin/polilizin konjugátumokkal (AFpL), illetve tetragalaktózpeptid/pL konjugátumokkal (gal4pL) adenovírus jelenlétében
a) A laktozilált peptid előállítása
A Lys-(Ne-Lys)Lys-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-GlyGly-Ser-Gly-Gly-Cys, elágazó peptid - Fmoc-módszer segítségével előállítva, egy Applied Biosystem 431A peptidszintetizáló alkalmazásával, amely a Cys számára egy ditio-piridin-csoportot tartalmazott - 3,5 mg-ját (1,92 pmol) egy, 7,85 mg laktózt 40 pl 10 mM vizes nátrium-acetátban (pH=5) tartalmazó oldattal kezeltük 37 °C-on. Az oldathoz 4 részletben 0,6 mg (10 pmol) nátrium-ciano-bór-hidridet adtunk körülbelül 10 órás időközökben. Összesen 64 óra 37 °C-on tartás után 0,5 ml HEPES-t (pH=7, 3) és 15 mg ditio-treitolt (DTT) adtunk hozzá. Az argon alatti gélszűréssel (Sephadex G-10,12x130 mm, eluens: 20 mM NaCl) történt ffakcionálás 3,6 ml laktozilált peptidoldatot eredményezett a szabad merkapto-formában (az Ellmanntesztnek megfelelően 1,73 pmol; 84% hozam). A módosított peptidpróbák ánizs-aldehiddel adtak színreakciót, ninhidrinnel viszont nem; ez egyezik azzal a feltevéssel, hogy minden 4 N-terminális aminocsoport laktozilálva van. A tetragalaktózpeptid/polilizin konjugátumot a 6. ábrán mutatjuk be.
b) A 3-ditiopiridin-propionáttal módosított polilizin előállítása
0,60 pmol, 290 lizinmonomer átlagos lánchosszúságú poli(L)-lizin (pL290, Hydrobromid, Sigma) gélszűrt oldatához 1,2 ml 100 mM HEPES-ben (pH=7,9) intenzív keverés mellett SPDP 15 mM (6,0 pmol) etanolos oldatának 400 pl-jét adtuk. 1 órával később hozzáadtunk 500 pl 1 M nátrium-acetátot (pH=5); 100 mM nátrium-acetáttal való gélszűrés (Sephadex G-25) után az oldat 0,56 pmol pL290-et tartalmazott 5,77 pmol ditio-piridin-linkerrel.
HU 218 846 Β
c) A pepiid konjugációja polilizinnel
Konjugátumokat úgy állítottunk elő, hogy az a) pont szerint előállított laktozilált peptid 1,5 pmol-ját 3 ml 20 mM NaCl-ban a b) pont szerint kapott módosított pL290 0,146 pmol-jával 620 μΐ 100 mM nátriumacetát-pufferben argonatmoszférában összekevertük. 100 μΐ 2 M HEPES (pH=7,9) hozzáadása után a reakciókeveréket 18 órán át szobahőmérsékleten állni hagytuk. NaCl hozzáadása révén megemeltük a sókoncentrációt 0,66 M-ra és a konjugátumokat kationcserélő kromatográfiával (Pharmacia Mono S oszlop HR 5/5; gradienselúció, A puffer: 50 mM HEPES, pH=7,3; B puffer: A puffer+3 M NaCl) elválasztottuk. A körülbelül 1,2-1,8 M sókoncentrációnál eluált termékfrakciókat 2 konjugátumfrakcióba gyűjtöttük; a konjugátumfrakciókat (gal)4pLl és (gal)4pL2 jelöléssel láttuk el. 25 mM HEPES-sel (pH=7,3) szembeni dialízis a következő konjugátumfrakciókat eredményezte, 24 nmol módosított pL290-et tartalmazó (gal)4pLl és 24,5 nmol módosított pL290-et tartalmazó (gal)4pL2.
d) Aszialo-fetuin/konjugátumok előállítása
A konjugátumokat ugyanazon elv alapján állítottuk elő, mint a transzferrinkonjugátumokat; egy hasonló eljárást aszialo-rozomukoid/polilizin konjugátumok előállítására Wu és Wu [J. Bioi. Chem. 263,14 621-14 624 (1988)] írtak le.
Az aszialo-fetuin polilizinhez történő kötését a bifunkciós SPDP-reagenssel való (Pharmacia) módosítás után diszulfidhidakon keresztül végeztük el. 100 mg (2,2 pmol) aszialo-fetuint (Sigma) 2 ml 100 mM HEPES-ben (pH=7,9) oldva, Sephadex G-25 oszlopon gélszűrésnek vetettük alá. Az így kapott 4 ml oldatot 330 μΐ (5,0 mól) SPDP 15 mM etanolos oldatához adtuk hozzá erőteljes keverés mellett. 1 órás szobahőfokon tartás után további gélszűréssel (Sephadex G-25) tisztítottuk; így adódott 5 ml, 2,25 pmol ditio-piridinlinkerrel módosított 1,4 pmol aszialo-fetuin-oldat.
Konjugátumokat állítottunk elő azáltal, hogy 5 ml 100 mM HEPES-ben (pH=7,9) oldott 1,4 pmol módosított aszialo-fetuint 6,5 ml 200 mM HEPES-ben (pH = 7,6) oldott 0,33 pmol módosított pL190-nel (amely 1,07 pmol merkapto-propionát-csoportot tartalmazott; ennél ugyanúgy jártunk el, mint a transzferrinkonjugátumok előállításánál) kevertünk össze argonatmoszférában. A reakciókeveréket 24 órán át szobahőmérsékleten állni hagytuk. A konjugátumokat a reakciókeverékből kationcserélő kromatográfiával (Pharmacia Mono S oszlop HR10/10; gradienselúció, A puffer: 50 mM HEPES pH=7, 9; B puffer: A puffer+3 M NaCl) választottuk el, és az oszlophoz a feltöltést megelőzően 0,6 M végső koncentráció eléréséig nátriumkloridot adtunk. A termékfrakció körülbelül 1,5 M sókoncentrációnál eluált. A HBS-sel szembeni dialízis olyan konjugátumokat eredményezett, amelyek 0,24 pmol pLl 90-nel módosított 0,52 pmol aszialofetuint tartalmaztak.
e) HepG2-sejtek transzfekciója pRSVL-DNS komplexekkel
A HepG2-sejteket 10% FCS+100 I. E./ml penicillin, 100 pg/ml sztreptomicin+2 mM glutamintartalmú
DMEM-táptalajban, T25-palackokban tenyésztettük. A transzfekciókat 400 000 sejt/palack sejtsűrűségnél végeztük. A transzfekció előtt a sejteket 4 ml, 10% FCS-tartalmú friss táptalajjal mostuk. Közvetlenül a transzfekció előtt klorokint (Sigma) adtunk hozzá úgy, hogy a sejtszuszpenzióban (+DNS-oldat) a végső koncentráció 100 μΜ-t tett ki.
330 pl HBS-ben oldott 10 pg pRSVL-DNS-t a
7. ábrán megadott mennyiségű, 170 pl HBS-ben oldott TfpL190B-konjugátummal (TfpL), aszialo-fetuin-pL90 konjugátummal (AfpL), polilizin290-nel (pL) vagy tetragalaktózpeptid-polilizin konjugátummal [(gal)4pL] kevertünk össze. A kompetíciós kísérletekben 30 perc után 240 pg aszialo-fetuint [(gal)4pL+Af] vagy 30 pg laktozilált pepiidet [(gal)4pL+(gal)4] adtunk hozzá. A keveréket hozzáadtuk a sejtekhez; a sejteket 4 órán át 37 °C-on inkubáltuk, utána a transzfekciós táptalajt kiegészítettük 4 ml, 10% FCS-tartalmú friss táptalajjal. 24 óra elteltével a sejteket kinyertük a luciferázmeghatározáshoz. A 7. ábrán bemutatott értékek a transzfekción átesett sejtek össz-luciferázaktivitását mutatják. Ahogyan az az ábrából látható, pL és TfpL csekély luciferázaktivitást mutatnak; a (gal)4pL hasonlóan magas értékeket mutat, mint az AfpL; (gal)4 vagy Af hozzáadásakor ezek versengenek az aszialo-glikoprotein-receptorért, és mint ahogyan az várható, csökkentik az értékeket.
f) HepG2-sejtek transzfekciója pCMVL-DNS komplexekkel
HepG2-sejteket tenyésztettünk 6 cm-es lemezeken 300 000 sejt/lemez sejtsűrűség eléréséig, az e) pontban leírtak szerint. A transzfekció előtt a sejteket 1 ml, 2% FCS-tartalmú friss táptalajjal mostuk.
HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t a 8. ábrán megadott mennyiségű, 170 pl HBS-ben oldott TfpL190B-konjugátummal (TfpL), aszialo-fetuin/pL konjugátummal (AFpL), polilizin290-nel (pLys290), (gal)4pLl-gyel vagy (gal)4pL2-vel kevertünk össze. 30 perc múlva minden DNS-konjugátum-komplexhez 1 ml, 2% FCS és 50 pl adenovírus-törzsoldat dl312Ctartalmú DMEM-et adtunk. A kompetíciós kísérletekben, ahogyan megadtuk, 30 pg laktozilált peptidet (gal)4pL [(gal)4pLl+(gal)4, illetve (gal)4pL2+(gal)4] adtunk hozzá. A keveréket hozzáadtuk a sejtekhez; a sejteket 2 órán át 37 °C-on inkubáltuk, utána 1,5 ml, 10% FCS-tartalmú táptalajt adtunk hozzá. 2 órával később a transzfekciós táptalajt 4 ml friss DMEM-táptalajjal+10% FCS-sel pótoltuk. 24 óra elteltével a sejteket kinyertük a luciferázaktivitás meghatározásához; a
8. ábrán bemutatott értékek a transzfekción átesett sejtek össz-luciferázaktivitását mutatják. Hatást mutat a pLys290, a (gal)4pL egy erősebb hatást mutat; (gal)4 hozzáadása, amely verseng az aszialo-glikoprotein-receptorért, az értékeket lecsökkenti a polilizinnel kapott értékre.
g) TIB73-sejtek transzfekciója pCMVL-DNS komplexekkel
Az embrionális egérmájsejtvonal ATCC TIB73 [BNL CL.2; Natúré 276, 510-511 (1978)] sejtjeit 37 °C-on 5% CO2-atmoszférában 10% FCS+100
HU 218 846 Β
I. E./ml penicillin, 100 pg/ml sztreptomicin+2 mM glutamin tartalmú „magas glükóz” DMEM-ben (0,4% glükóz) tenyésztettük 6 cm-es lemezeken.
A transzfekciókat 300 000 sejt/lemez sejtsűrűségnél végeztük. A transzfekció előtt a sejteket 1 ml friss táptalaj+2% FCS keverékével mostuk.
300 μΐ HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t, 170 pl HBS-ben oldott, megadott mennyiségű egértranszferrin-polilizin290 konjugátummal (mTfpL), aszialo-fetuin/pL konjugátumokkal (AFpL), polilizin290-nel (pLys290), (gal)4pLl-gyel vagy (gal)4pL2vel kevertünk össze. 30 perc elteltével minden DNSkonjugátumkomplexhez 1 ml, 2% FCS+50 μΐ dl312C adenovírustörzsoldat-tartalmú DMEM-et adtunk. A keveréket hozzáadtuk a sejtekhez, a sejteket 2 órán át 37 °C-on inkubáltuk, utána 1,5 ml, 10% FCS-tartalmú táptalajt adtunk hozzá. 2 órával később a transzfekciós táptalajt 4 ml friss táptalajjal pótoltuk. 24 óra elteltével a sejteket kinyertük a luciferázaktivitás meghatározásához; a 9A. ábrán bemutatott értékek a transzfekción átesett sejtek össz-luciferázaktivitását mutatják.
Összehasonlításképpen adenovírus nélkül, klorokin jelenlétében hajtottunk végre transzfekciót. A transzfekciókat 300 000 sejt/lemez sejtsűrűségnél végeztük el. A transzfekció előtt a sejteket 1 ml, 2% FCS-tartalmú friss táptalajjal mostuk. Közvetlenül a transzfekció előtt klorokint (Sigma) adtunk hozzá úgy, hogy a sejtszuszpenzióban (+DNS-oldat) a végső koncentráció 100 μΜ lett. 330 μΐ HBS-ben oldott 6 pg pCMVLDNS-t, 170 pl HBS-ben oldott, megadott mennyiségű mTfpL-lel, AFpL-lel, pLys290-nel, (gal)4pLl-gyel vagy (gal)4pL2-vel kevertük össze. 30 perc múlva a DNS-komplexeket hozzáadtuk a sejtekhez. A sejteket 2 órán át 37 °C-on inkubáltuk, utána 1,5 ml, 10% FCS+100 μΜ klorokintartalmú táptalajt adtunk hozzá. 2 órával később a transzfekciós táptalajt 4 ml friss táptalajjal pótoltuk. 24 óra elteltével a sejteket kinyertük a luciferázaktivitás meghatározásához. A luciferázaktivitásra kapott értékeket a 9B. ábrán mutatjuk meg.
7. példa
DNS bevitele T-sejtekbe
a) Anti-CD7-polilizinl90 konjugátumok előállítása mM HEPES-ben (pH=7,9) oldott 1,3 mg anti-CD7-antitestet. (Immunotech) elegyítettünk 49 pl 1 mM SPDP (Pharmacia) etanolos oldatával. 1 órás szobahőfokon tartás után Sephadex G-25 gélt tartalmazó oszlopon szűrtük át (az eluens 50 mM HEPES-puffer pH=7,9 volt), ahol 1,19 mg (7,5 nmol), 33 nmol piridil-ditio-propionát-maradékokkal módosított antiCD7-et kaptunk. FITC-vel fluoreszcens jelölésű polilizinl90-et az SPDP-hez hasonlóan módosítottunk, és ditio-treitollal való kezelés és azt követő gélszűrés révén szabad merkaptocsoportokat tartalmazó, módosított formába hoztuk.
nmol merkaptocsoporttal módosított 11 nmol polilizinl90 0,2 ml 30 mM nátrium-acetát-pufferben készült oldatát oxigén kizárása mellett módosított anti-CD7-tel (0,5 ml 300 mM HEPES-ben, pH=7,9) kevertük össze, és egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagytuk. A reakciókeveréket 5 M NaCl hozzáadásával körülbelül 0,6 M-ra állítottuk be. A konjugátumok elválasztása ioncserélő kromatográfiával (Mono S, Pharmacia, 50 mM HEPES, pH=7,3, sógradiens 0,6-3 M NaCl) történt; a megfelelő, 6,2 nmol polilizin 190-nel módosított, 0,51 mg (3,2 nmol) anti-CD7-antitestből álló konjugátumokat 10 mM HEPES-sel (pH=7,3) szemben végzett dialízissel nyertük.
b) Gpl20-polilizinl90 konjugátumok előállítása
A kapcsolás az irodalomból ismert módszerekhez hasonlóan, 6-maleimido-kapronsav-N-hidroxi-szukcinimid-észterrel (EMCS, Sigma) való módosítást követően tioéterkötéssel történt [J. Immunoi. Meth. 45, 195 (1981)].
Tioéterrel kapcsolt gpl20-polilizinl90 konjugátumok:
0,45 ml 100 mM HEPES-ben (pH=7,9) oldott 2 mg rekombináns gpl20-at 10 mM EMCS-oldat 17 μΐ-ével dimetil-formamidban elegyítettünk. 1 óra szobahőfokon tartás után Sephadex G-25 gélt tartalmazó oszlopon szűrtük át (az eluens 100 mM HEPES-puffer pH=7,9 volt). A termékoldatot (1,2 ml) azon nyomban oxigén kizárásával fluoreszcens jelölésű, 30 nmol merkaptocsoporttal módosított 9,3 nmol polilizinl90 oldatába (90 μΐ 30 mM nátrium-acetátban, pH=5,0) helyeztük át, és egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagytuk. A reakciókeveréket 5 M NaCl hozzáadásával körülbelül 0,6 M-ra állítottuk be. A konjugátumok elválasztása ioncserélő kromatográfiával (Mono S, Pharmacia, 50 mM HEPES, pH=7,3, sógradiens 0,6-3 M NaCl) történt; a frakcionálás és 25 mM HEPES-sel (pH=7,3) szemben végzett dialízis után három, A, B és C konjugátumfrakciót kaptunk, amelyek rendre 1,9 nmol polilizinl90nel módosított 0,40 mg rgpl20 (A frakció), 2,5 nmol polilizinl90-nel módosított 0,25 mg rgpl20 (B frakció), illetve 1,6 nmol polilizin 190-nel módosított 0,1 mg rgpl20 (C frakció) voltak.
pCMVL-DNS-t (6 pg/próba) vittünk komplexbe megadott mennyiségű polilizin90-nel vagy polilizinkonjugátumokkal 500 μΐ HBS-ben. Közben H9-sejtek (106 sejt 5 ml, 2% FCS-tartalmú RPMI-ben) vagy primer humán limfociták (3xl06 sejt Iscove’s módosított Dulbecco’s táptalajban [(IMDM)+2% FCS] kis mennyiségét állítottuk elő. A polilizin-DNS komplexeket minden sejtpróbához hozzáadtuk. 5 perccel később hozzáadtuk a megadott mennyiségű dl 312 adenovírust. Ezek után a sejteket 37 °C-on 1,5 órát inkubáltuk, majd 15 ml RPMI-t (H9-sejtek esetében) vagy IMDM-et (primer limfociták esetében) +2% FCS-t adtunk minden próbához. A sejteket 37 °C-on 24 órán keresztül tenyésztettük, kinyertük és a többi kísérlethez hasonlóan kezeltük a luciferázaktivitás meghatározása céljából. Az elvégzett kísérletek eredményeit a 10A. (H9-sejtek), illetve 10B. (primer limfociták) ábrákon mutatjuk be: H9-sejteknél az anti-CD7-konjugátum (10A. ábra, 7-9. hasábok) és a gpl20-konjugátum (10-12. hasábok) mutatta a legjobb eredményeket az adenovírussal elért géntranszfert illetően, amelynél a gpl20-konjugátum már adenovírus nélkül is nyilvánvaló luciferázgén-kifejeződést eredményezett. Figyelemre méltó, hogy az elvégzett kísérletekben
HU 218 846 Β csak a gpl20-konjugátum volt képes a DNS-t primer limfocitákba bevinni, és ezt is csak a hibás adenovírus jelenlétében (10B. ábra, 7-8. hasáb).
8. példa
Adenovírusok inaktiválása
a) Inaktiválás UV besugárzással
Egy dl 312 adenovírus-készitményt, amelynek az előállítását és tárolását a példák előtti bevezetőben írtuk le, egy jégre és két UV-lámpától [Philips TUV15 (G15 T8) lámpák] 8 cm távolságban elhelyezett sejtkultúralemez 2 cm-es mélyedéseibe (300 μΐ/mélyedés) adagoltuk. A vírust a 11 A. ábrán megadott időtartamú UV-besugárzásoknak vetettük alá, és minden készítményből megvizsgáltunk egy kis mennyiséget a vírustiter meghatározására, valamint arra, hogy képes-e és milyen mértékben a polilizin-transzferrin konjugátumokkal történő géntranszfert HeLa-sejtekbe felerősíteni.
A sejtek tenyésztése és a transzfekció lényegében úgy történt, ahogyan azt fent a „Sejtek és táptalajok” címszó alatt megadtuk; a transzfekcióhoz felhasznált komponensek a 11 A. ábrán láthatók. A pCMVL-DNSből és 12 pg TfpL-ből álló komplexeket 500 ul HBSben állítottuk elő, és 3xl05 HeLa-sejthez (1 ml DMEM+2% FCS-ben) adtuk hozzá. Körülbelül 5 perc múlva minden kultúrához minden víruspreparátumból 54 μΐ-t adtunk, és a kultúrákat 37 °C-on 1,5-2 órán át inkubáltuk. Ezek után 5 ml DMEM+10% FCS részleteket adtunk minden kultúrához, folytattuk az inkubálást 37 °C-on 24 órán keresztül, majd kinyertük a kultúrákat, és luciferázaktivitásra vizsgáltuk azokat. A be nem sugárzott vírus 54 μΐ-es mennyisége nincs a telítési zónában, azaz a teszt legalább 3-szoros vírusmennyiségre érzékeny. A luciferázkifejeződésre kapott értékeket a 11B. ábrán mutatjuk be (zárt négyszögek).
Minden készítmény vírustiterét az El A komplementáló 293-sejtvonal felhasználásával határoztuk meg. Először hígítási sorozatokat készítettünk a besugárzott és be nem sugárzott víruspróbákból DMEM+2% FCSben. Ezzel párhuzamosan 5xl04 293-sejtet tartalmazó próbákat készítettünk (2 cm-es bemélyedésbe), és 200 μΐ DMEM+2% FCS-hez adtuk hozzá. Minden hígítmánynak egy 5 μΐ-es részletét mértük be összehasonlítás céljából egy-egy második bemélyedésbe. A vírus sejtekhez való kötődésének létrehozására 1,5 óráig 37 °C-on termosztáltuk, azután minden bemélyedésbe 2 ml DMEM+10% FCS-t mértünk be. 48 órával később megszámoltuk a kultúrákat a citopátiás hatás megállapítása céljából. Az a vírushígítmány, amely fölött a kultúrában 48 óra után a sejteknek kevesebb mint 50%-a mutat nyilvánvaló citopátiás hatást, minden víruskészítményben a fertőzőképes vírusok relatív mennyiségét mutatja. A kapott értékeket a 11B. ábrán (nyitott négyszögek) mutatjuk be. Az ebben a példában elvégzett kísérletek eredménye azt mutatja, hogy a vírustitemek UV besugárzás következtében tíz 4. hatványával való visszaesése a luciferázgén transzferében csak 20-szoros csökkenést okoz. Ez azt mutatja, hogy azok a mechanizmusok, amelyek a vírus fertőzőképességéért felelősek, tönkretehetők anélkül, hogy a vírusnak a géntranszfert felerősítő képességét korlátoznák. Megfigyeltük, hogy alacsony vírusdózisoknál a géntranszfer vírus általi felerősítése csekély mértékben esett vissza (11 A. ábra, 3-6. hasábok), és hogy ez a hatás magasabb dózisoknál erőteljesebben lépett föl.
b) Adenovírusok inaktiválása formaldehiddel ml adenovírus-készitményt előekvilibráltunk egy 10 ml-es G-25 oszlopon (Pharmacia PD 10 G, 25 M) 150 mM NaCl, 25 mM HEPES (pH=7,9), 10% glicerin keverékével áthajtva és 2,5 ml térfogatban felfogva. A gélszűrt víruskészítmény kis részleteit 20 órán át jégen, formaldehid nélkül (0), 0,01,0,1% vagy 1% formaldehiddel inkubáltuk. Ezt követően 100 mM koncentrációban Tris pH=7,4 puffért adtunk hozzájuk, majd a próbákat először 2 órán át 1 1 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH=7,4 és 50% glicerin elegyével, végül egy éjszakán át 2x1 1 150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH=7,9 és 50% glicerin elegyével szemben dializáltuk. A vírusrészleteket ezt követően 293-sejtekre vittük titerük meghatározása céljából (CPE-végpont-meghatározással vagy tarfoltmódszerrel) [Virology, ed. Mahy, B. W. J., IRL Press, Oxford, Washington, DC, 193-205 (1985)]. Ezután az előző példákhoz hasonlóan - a luciferázaktivitás mérésével - meghatároztuk a formaldehiddel kezelt vírusok hatását a géntranszferre HeLa-sejtekben (300 000). A víruskészítmény 90 μΐ-e eredményezett egy géntranszfert, amely több mint 108 fényegységnek felelt meg. A vírus 0,01 vagy 0,1% formaldehides kezelése a géntranszfer-aktivitás csekély mértékű csökkenését eredményezte (körülbelül 10-szeres csökkenés 0,1%-nál). Jóllehet az 1% formaldehides kezelés a géntranszfer-aktivitás feltűnő veszteségét okozza, a vírus 90 μΐ-e még így is 104 fényegységnek megfelelő génkifejeződést eredményezett. A 0,1% formaldehides kezelésnél a vírustiter 105 PFU-ra (plaque forming unit=tarfolt egység) esett vissza a luciferázaktivitás mindössze 10%os csökkenésével párosulva. Az elvégzett kísérletek eredményét a 12A. ábrán mutatjuk be.
c) Az adenovírus inaktiválása hosszúhullámú UV/8metoxi-psoralennel
A tisztított víruspreparátum kis részleteit 0,33 pg/ml 8-metoxi-psoralen (33 pg/ml 8-metoxi-psoralen törzskoncentráció DMSO-ban oldva) koncentrációra állítottuk be és egy 365 nm UV fény-forrásnak (UVP Modell TL-33) tettük ki jégre helyezve, 4 cm távolságra a lámpa szűrőjétől. A megvilágítás időtartama 15-30 perc volt, mint az a 12B. ábrából látható. A víruspróbákat ezután egy Sephadex G-25 oszlopon (Pharmacia, PD-10) ekvilibráltuk HBS+40% glicerinnel áthajtva, és -70 °C-on tároltuk. A víruskészítményeket egyrészt a pCMVL/hTfpL komplexek segítségével HeLa-sejtekbe történő géntranszfert felerősítő képességükre (fényegységekben bemutatva, jobb oldali tengely a 12B. ábrán), másrészt 293-sejtekben való replikálódási képességükre (vírustiter, bal oldali tengely a 12B. ábrán) vizsgáltuk.
9. példa
NIH3T3-sejtek transzfekciója Moloney-vírussal
Ebben és a következő példákban, amelyek a transzferrinpolilizin-DNS komplexek intemalizációjának ret27
HU 218 846 Β rovírusok segítségével történő felerősítését mutatják be, hacsak másképpen nem adtuk meg, a következő anyagokat és módszereket használtuk.
A transzferrin-polilizinl90 konjugátumokat és a konjugátum-DNS komplexeket az előző példákhoz hasonlóan állítottuk elő azzal a különbséggel, hogy a komplexképzési reakciót 500 pl térfogatú, 20 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH=7,4) keverékében végeztük el.
A NIH3T3-sejteket 10% FCS+100 I. E./ml penicillin, 100 pg/ml sztreptomicin+2 mM glutamintartalmú DMEM-táptalajban tenyésztettük. A transzfekciókhoz T25 palackonként 5-7 χ 105 sejtet szélesztettünk ki a transzfekciót megelőzően 18-24 órával. Közvetlenül a transzfekció előtt friss táptalajba tettük a sejteket, és a különböző, a transzfekcióhoz felhasznált komponenseket a következő sorrendben adtuk hozzá: klorokin (100 pM, ahol megadtuk), polilizin-transzferrin-DNS komplex, retrovírus-készítmény. A sejteket ezt követően 4 óra hosszat 37 °C-on inkubáltuk, majd kicseréltük a táptalajt, és a sejteket 24 órával később kinyertük. Kivonatokat állítottunk elő úgy, hogy három fagyasztás/felengedés ciklust alkalmaztunk; a kivonatok kis, fehérjetartalmukra standardizált részleteit luciferázaktivitásra vizsgáltuk, mint ahogyan az előző példákban megadtuk.
A megadott körülmények között 106 NIH3T3-sejt transzfekcióját végeztük el TfpL-DNS komplexekkel 100 pM klorokin jelenlétében vagy klorokin nélkül, ahogyan azt a 13. ábrán megadtuk. Megállapítottuk, hogy klorokin nélkül a luciferázaktivitás értékei csak a háttémívót érték el (1. hasáb), miközben klorokin jelenlétében a pRSVL-riportergén magas kifejeződését tudtuk mérni (2. hasáb). A Moloney-leukémiavírus emelkedő mennyiségei, amelyeket a DNS-komplexekkel egyidejűleg adtunk a sejtekhez, egyre emelkedő luciferázgén-kifejeződést tudtak előidézni. (A 13. ábrán megadott mennyiségek ml-t jelentenek.)
10. példa
Annak vizsgálata, hogy a géntranszfer erősödése vajon a retrovírusra vezethető-e vissza
A 9. példában alkalmazott víruskészítmény retrovírust kifejező sejtek nyers, nem frakcionált maradéka volt. Ahhoz, hogy bizonyítékot kapjunk arra nézve, hogy az ezzel a preparátummal elért DNS-bevitel-fokozódás ténylegesen a vírusra vezethető vissza, a maradékot a fent leírt dialízis/koncentrálás/tisztításnak vetettük alá, ahol a retrovírus-maradékot (az ábrán RSV-ként megadva) 10-szeresére koncentráltuk. Abban az esetben, ha a retrovírus felelős az erősödésért, a membránmaradékban talált aktivitás - eltekintve a rendkívül labilis retrovírusnak a koncentrálási lépések alatt bekövetkező esetleges inaktiválódásától - az eredeti maradékban mértnek körülbelül 10-szerese kell legyen. Ugyanúgy, mint az előző példában, 106 NIH3T3-sejtet vetettünk alá transzfekciónak a 14. ábrán megadott körülmények között. A 14. ábrából látható, hogy a géntranszfert felerősítő hatás a membrán-maradékban fordul elő (20-600 pl-t alkalmaztunk, 3-6. nyomvonalak; azonkívül megmutatkozott, hogy a 10-szeresen koncentrált preparátumok 200 és 600 pl-es mennyiségei körülbelül fele olyan aktívak, mint 2 vagy 6 ml az eredeti, nem koncentrált retrovírus-preparátumból (7. és 8. nyomvonal).
Ezzel párhuzamosan humán K562-sejtekkel végeztünk kísérleteket, amelyek nem rendelkeznek receptorral az ekotrop egérretrovírusra. Mint vártuk, nem értük el a génkifejeződés felerősödését.
11. példa
A Moloney-vírus géntranszferre gyakorolt hatásánál a transzferrin és receptora közötti kölcsönhatások játszanak szerepet
Annak a lehetőségnek a kizárására, hogy a TfpL/pRSVL komplexek transzferé a sejtekbe a polilizinnek a retrovírushoz való nem specifikus kötődésére vezethető vissza, és a belépési mechanizmus további tisztázására, megvizsgáltuk a retrovírusnak a csak polilizinnel komplexben levő plazmid-DNS-t sejtbe szállító képességét. Az alkalmazott polilizinmennyiség megfelel a korábban közölt optimumnak, amely a plazmidDNS teljes mértékű kondenzációját eredményezi, és hasonló ahhoz a polilizinmennyiséghez, amely a polilizintranszferrin konjugátumnál kerül felhasználásra [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4255-4259 (1991)]. Azok a kísérletek, amelyeknek az eredményét a 15. ábrán mutatjuk meg, azt eredményezték, hogy a riportergén klorokin hiányában sem TfpL-pRSVL komplexek, sem pL-pRSVL komplexek formájában nem fejeződik ki (1. és 2. hasáb). Ezzel szemben retrovírus jelenlétében a TfpL-komplexként elkészített riporter-DNS kifejeződik, viszont pL-DNS komplex formájában nem (vesd össze a 3. és 4. hasábot az 5. és 6. hasábbal). Az elvégzett kísérletek továbbá azt eredményezték, hogy feleslegben levő szabad transzferrin jelenléte a retrovírus által megkönnyített DNS-bevitelben csökkenést okozott (7. és 8. hasáb). Ezek az eredmények is alátámasztják azt a feltételezést, hogy a transzferrin és receptora közötti kölcsönhatások a DNS-felvétel retrovírus által okozott felerősítésében lényeges szerepet játszanak.
12. példa
A pH-érték befolyása a retrovírusok géntranszferre gyakorolt hatására
E példa keretei között elvégzett kísérletek célja az volt, hogy megvizsgáljuk a pH-érték befolyását a retrovírusok géntranszfert felerősítő képességére. A transzfekciós kísérleteket az előző példákban leírtakkal azonos módon végeztük el. Annak megállapítására, hogy vajon egy alacsonyabb pH-érték a géntranszferhatás számára lényeges-e, felhasználtuk mindkét jól ismert endoszomális pH-érték-csökkenést gátló szert, a monenzint és ammónium-kloridot. Abból a megfontolásból indultunk ki, hogy mindkét anyag korlátozni fogja a géntranszfert, amennyiben a retrovírusnak a géntranszferhatáshoz az endoszómák alacsonyabb pH-értékére van szüksége. Ha ezzel szemben e hatás számára más mechanizmusok jönnek szóba, nevezetesen közvetlen fúzió a citoplazma felületén a HÍV belépési mechanizmusához hasonlóan, akkor ezek az anyagok nem
HU 218 846 Β gyakorolhatnak negatív hatást, hanem adott esetben még felerősítőhatásuk is lehet, ha a TfjpL-DNS komplexek útját megváltoztatják. A 16. ábrán bemutatott kísérleti eredmények inkább az utóbbi hipotézist támasztják alá. Mindkét anyag hatását megvizsgáltuk a TfpLDNS transzferre, és azt találtuk, hogy a két anyag egyike sem helyettesítheti a klorokint funkcionálisan, bár a luciferázgén kifejeződésének csekély emelkedését állapítottuk meg magasabb ammónium-klorid-koncentrációknál (1-5. hasábok). A retrovírus önmagában mutat az előző példákban már megfigyelt enyhe felerősödést a DNS-transzportban (6. nyomvonal). Egy erős emelkedést figyeltünk meg, ha a retrovírust 1 μΜ monenzin jelenlétében alkalmaztuk (7. nyomvonal). Kevésbé erős hatást figyeltünk meg magasabb monenzinkoncentrációnál (8. nyomvonal), valamint ammónium-klorid jelenlétében (9. és 10. nyomvonal).
13. példa
Transzferrinkonjugátumokkal elért géntranszfer felerősítése az influenzahemagglutinin HA-2 N-terminális endoszomalitikus peptidje révén
a) A peptid szintézise
A peptidet, amely az 1. számú szekvenciavázlat szerint a következő: Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Ala-GlyPhe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-GlyGly-Gly-Cys, Fmoc (fluorenil-metoxi-karbonil)-módszer segítségével [Bioorg. Chem. 8, 351 (1979)] szintetizáltuk, ahol egy Applied Biosystems 431A peptidszintetizálót alkalmaztunk. Az oldalláncok védőcsoportjai t-butil a Cys számára, Glu és Asp és tritil az Asn számára. A kapcsolási reakció után ninhidrintesztet végeztünk, amely minden lépésre 98%-nál nagyobb kapcsolási fokot mutatott. Α-19-cel kezdődően kétszeres kapcsolásokat végeztünk. Az N-terminális Fmoc-csoportot NMP-ben (N-metil-pirrolidon) oldott 20% piperidinnel távolítottuk el a peptidgyanta egy részéből. Ezek után az Fmoc-védett és nem védett frakciókat DCM-mel (diklór-metán) mostuk és vákuum alatt szárítottuk. A hozam 293,6 mg Fmoc-mentes peptidgyanta, illetve 366,5 mg Fmoc-védett peptidgyanta. Az Fmoc-mentes peptidgyanta 111,1 mg-ját 1,5 órán keresztül trifluorecetsavas hasításnak vetettük alá, ahol 10 ml TFA, 0,75 g fenol, 300 μΐ EDT (etán-ditiol), 250 μΐ Et-S-Me (etil-metil-szulfid) és 500 μΐ víz keverékét használtuk fel. A peptidet a gyantától egy üvegnuccson szűrtük át. A gyantát DCM-mel mostuk, és hozzáadtuk a szűrlethez. A szűrletet körülbelül 2 ml-re pároltuk be, és azután cseppenként, rázás közben 40 ml éterhez adtuk hozzá. A peptidcsapadékot lecentrifugáltuk, és az étermaradékot kidobtuk. A csapadékot 3-szor mostuk 40 ml éterrel, és magas vákuumban szárítottuk. A kapott 58 mg nyersterméket 300 μΐ 25% NH3/1 tartalmú, 3,5 ml 20 mM NH4HCO3-ban oldottuk. Az oldatot ugyanazon puffer alkalmazásával egy előkészített Sephadex G-25 oszlopon (Pharmacia, PD-10) gélszűrtük. Az egész anyagot felvittük egy Mono Q oszlopra (Pharmacia, 100x14 mm). (Gradiens: 0-10 perc 100% A, 10-100perc0-100%B. A: 20mMNH4HC03+300 μΐ NH3/1. B: A+3 M NaCl. Mérés 280 mM, Trp-fluoreszcencia-kimutatásnál 354 nm-en. Folyadékáram ml/perc.) A termék 1 M NaCl-dal eluál. A Mono faoszlop főfrakcióját reverz fázisú HPLC-vel, egy BIORAD-Hi-Pore RP-304 oszlop (250x10 ml) alkalmazásával tovább tisztítottuk. (Gradiens: 12,5 perc 50-100% A puffer, 12,5-25 perc 100% B. A: 20 mM NH4HC03+300 μΐ NH3/1. B: A puffer 98% metanolban. Folyadékáram 3 ml/perc. Mérés 237 nm-en.) A termék 100 B-nél eluál. A termékffakciót egy Speedvac készülékben bepároltuk, majd A pufferben újra feloldottuk, végül liofilizáltuk. A ciszteinnel (Cys) védett formában levő, HPLC-vel tisztított termék hozama 8,4 mg (a peptidet „Pl6” jelöléssel illettük). Ahhoz, hogy a peptidet a szabad merkapto formában kapjuk meg, a tbutil-védett anyagot tioanizol/etánditiol/trifluor-ecetsav/trifluor-metánszulfonsav (2/1/40/3) keverékével (a trifluor-metánszulfonsavat a megadott arányban a többi komponens után adtuk az elegyhez) 30 percen keresztül kezeltük szobahőmérsékleten. A peptidet éteres kicsapással és azt követően a fent megadott A pufferrel gélszűrve (Sephadex G-25) argonatmoszférában választottuk el.
b) Az influenzapeptid összekapcsolása polilizinnel bl) Közvetlen kötés SPDP-n (szukcinimidil-piridilditio-propionát) keresztül
19,8 mg polilizin(pL)300-hidrobromidot (Sigma) Sephadex G-25 oszlopon (Pharmacia PD-10) nátrium-acetátban (pH=5) gélszűrtünk a kis molekulájú frakciók eltávolítása végett. A ninhidrinteszt alapján a pL-koncentráció a gélszűrés után 3,16 mg/ml lett. Az oldat pH-értékét 1 M NaOH-val 7-8-ra állítottuk be. A pL-oldat 2,5 ml-éhez (7,9 mg pL=0,13 pmol) 0,64 μιηοΐ SPDP-t (Pharmacia: 40 mM oldat abszolút etanolban) adtunk. Ez az SPDP :pL 5:1 moláris arányának felel meg. A keveréket egy éjszakán át reagáltattuk, és 20 mM NH4HCO3-ban (pH=8,2) G-25 oszlopon gélszűrtük. A szűrlet egy kis részletének DTT-vel (ditio-treitol) történő redukciója után a tiopiridon mérése azt mutatta, hogy a reakció teljesen lejátszódott. 2,212 ml 0,3 μιηοΐ pL-SPDP-t (mól SPDP-re vonatkoztatva) 0,35 mól, tiol formában levő peptiddel hagytunk reagálni. A peptid és a pL összekeverésekor megjelent fehér csapadékot feloldottuk azáltal, hogy az oldatot
M guanidin-hidrokloridra állítottuk be, ahol a reakció az éjszaka folyamán lejátszódott. A tiopiridon fotometriás mérése a reakciókeverékben újból megerősítette a reakció befejezettségét. Ezek után a keveréket 2 1 20 mM HEPES/0,5 M guanidin-hidroklorid elegyével szemben kétszer dializáltuk. A kapott oldatot egy Mono S oszlopra (0,7x6 cm, Pharmacia) vittük föl. (Gradiens: 0-20 perc 100% A, 20-140 perc 0-100% B. A: 20 mM HEPES pH=7,3/0,5 M guanidin-hidroklorid, B: 20 mM HEPES pH=7,3/3 M guanidin-hidroklorid, 0,3 ml/perc. Kimutatás 280 nm-nél és fluoreszcencia-kimutatás 354 nm-nél, gerjesztés 280 nm-nél.) A termékfrakciót, amely 1,5 M guanidin-hidrokloriddal eluált, 2x21 HBS-sel szemben dializáltuk. A pL-koncentráció ehhez kapcsolódó meghatározása ninhidrinteszttel körülbelül 1,14 mg/ml koncentrációt mutatott. A konjugátum oldatában levő peptidmennyiséget
HU 218 846 Β
280 nm-nél mért abszorpciójából számoltuk; ez a peptid:pL 4:1 moláris arányt adta.
b2) Kötés polietilénglikol linkeren keresztül
14,6 mg pL300-hidrobromidot (Sigma) gélszűrtünk a bl)-ben megadottak szerint. A ninhidrinteszt alapján a pL-koncentráció a gélszűrés után 4,93 mg/ml lett. Az oldat pH-értékét 1 M NaOH-dal 7-8-ra állítottuk be. A pL-oldat 2,7 ml-éhez (13,3 mg pL=0,22 pmol)
4.33 pmol SPDP-t (Pharmacia: 30 mM oldat abszolút etanolban) adtunk. Ez az SPDP:pL 20:1 moláris arányának felel meg. 1,5 óra után a reakciókeveréket Sephadex G25 oszlopon 0,1 M nátrium-acetát/3 M guanidin-hidroklorid keverékében gélszűrtük. A szűrlet egy kis részletének DTT-vel történő redukciója után tiopiridont határoztunk meg, amely a termékfrakcióban 3,62 pmol SPDP-t mutatott. Az SPDP-vel módosított pL-t redukáltuk 79 mg DTT-nek az oldathoz történő hozzáadása révén. 2 órás redukció után az oldatot újból G-25 oszlopon, a megadott körülmények között gélszűrtük. A tiolmeghatározás Ellmann-teszt segítségével 2,224 ml-ben 3,15 pmol tiolkoncentrációt mutatott.
17,62 mg=5 pmol POE-t [polioxi-etilén-bisz(6amino-hexil), Sigma] oldottunk fel 500 pl 20 mM NaHCO3/3 M guanidin-hidroklorid (pH 7-8) keverékében és 300 pl DMF-ben (dimetil-formamid) oldott 13,8 mg EMCS-sel (ε-maleimido-kapronsav-N-hidroxi-szukcinimid-észter) (Sigma) (=44,7 pmol) reagáltattuk. 30 perc után az oldatot G-25 oszlopon gélszűrtük (20 mM NaHCO3/3 M guanidin-hidroklorid). A maleimidocsoport fotometriás meghatározása 300 nm-nél 6,36 pmol reagált EMCS-t mutatott 2 ml oldatban.
Ennek az oldatnak 1,049 ml-éhez (megfelel
3.34 mól EMCS-nek) 1,39 pmol tiol formában (2,5 ml 20 mM NaHCO3/3 M guanidin-hidroklorid keverékben) levő peptidet adtunk cseppenként, Vortex segítségével intenzív átkeverés mellett, argonáramban. 15 perc múlva az Ellmann-teszttel már nem volt kimutatható szabad tiolcsoport.
A redukált, SPDP-vel módosított pL oldatát 1 M NaOH hozzáadásával 7-8 pH-értékre állítottuk be. Ennek az oldatnak 1,373 ml-ét Vortex segítségével intenzív átkeverés mellett a fenti reakciókeverékhez adtuk. Ez a peptid-SH:POE-EMCS:pL-SH 1:2,4:1,4 (EMCS-re, illetve SH-ra vonatkoztatva) moláris arányát eredményezte. 2,5 órás reakció után az Ellmannteszttel már nem voltak kimutatható szabad tiol-csoportok. Az anyagot egy éjszakán keresztül 2 1 20 mM HEPES, pH=7,3/0,6 M NaCl keverékével szemben dializáltuk, és azt követően egy Mono S oszlopra vittük föl. (Gradiens: 0-20 perc 22% A, 20-150 perc 22-100% B. A: 20 mM HEPES, pH=7,3, Β: A+3 M NaCl. Folyadékáram 0,3 ml/perc. A mérést 280 nmnél, a fluoreszcenciamérést 354 nm-nél végeztük.) A terméket, amely 1,5-1,6 M NaCl-dal eluált, 2 1 HBS-sel szemben dializáltuk. A ninhidrinteszt segítségével végzett pL-koncentráció-meghatározás és a peptidkoncentráció fotometriás meghatározása 280 nm-nél egy számított peptid'.pL 12:1 arányt adott
0,49 mg/ml pL-koncentrációnál, 4,5 ml össztérfogatban.
c) Liposzómakészítmény
A liposzómákat REV-módszerrel („reverse-phase evaporation”=reverz fázisú bepárlás) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 4194-4198 (1978); Meth. Enzymol. 101, 512-527 (1983)] állítottuk elő. A vizes fázis 10 mM HEPES (pH=7,3), 100 mM kalcein 150 mM NaCl; szerves fázis: 300 pmol L-a-lecitint (tojássárgájából, főleg palmitoil-oleoil-foszfatidil-kolin; Avanti Polar Lipids) 260 pl kloroformban rotációs bepárló segítségével bepároltuk. Ezt követően az anyagot magas vákuumban szárítottuk, és azután újraoldottuk 3 ml dietil-éterben. A vizes fázis 1 ml-ét az éterfázissal alaposan összekevertük Vortex segítségével, és 5 percig 0 °C-on Sonicatorban (Badtyp) ultrahanggal kezeltük. 30 perces jégen tartás után az anyagot még egyszer kezeltük ultrahanggal 10 percig. Az eredményül kapott stabil emulziót lassan bepároltuk rotációs bepárlóban. A dietil-éter eltávolítása után 100 mbar-nál a vizes fázis 0,75 ml-ét adtuk hozzá. A maradék étemyomokat további bepárlással távolítottuk el 50 mbar-nál 30 perc alatt. A kapott emulziót (1,7 ml) 500 rpm mellett centrifugáltuk, és ezt követően egy nukleopórusos polikationmembránon (0,1 pm) keresztül extrudáltuk, amely 0,7 ml végtérfogatú liposzómaoldatot eredményezett. A liposzómákat a be nem épült anyagoktól gélszűréssel (Sephadex G-50 médium, Pharmacia; 23 ml géltérfogat, 10 mM HEPES, pH=7,3/150 mM NaCl) választottuk el. 500 pl térfogatban hat frakciót gyűjtöttünk. 2 mM mennyiséggel lipidfoszfort határoztunk meg Bartlett módszere szerint [J. Bioi. Chem. 234, 466 (1959)].
d) A liposzómák áteresztőképességének meghatározása (Liposomes Leakage Assay)
A liposzómák tartalmának szabaddá válását („leakage”) a bezárt kalcein kilépése alapján és az ebből következő hígulásból, amely a fluoreszcencia kikapcsolódásának felfüggesztését okozza [Biochim. Biophys. Acta 777, 21-27 (1984)], mértük meg. A kalceinfluoreszcenciát egy Kontron SMF 25 spektrálfluoriméterrel (gerjesztés 490 nm-nél, emisszió 515 nm-nél) mértük. E célra a fenti liposzómaoldat 100 pl-es részleteit 0,1 M nátrium-acetát vagy 10 mM HEPES/150 mM NaCl-pufferrel - a megfelelő pH-értékkel (4,3, 4,5, 5,0,6,0, 7,3) -100-szorosára hígítottuk 1 ml térfogat eléréséhez. Ezekhez az oldatokhoz 2,5 pg peptidet (tbutil-védett formában; 1 pg/pl oldat HBS-ben) adtunk küvettákban, gyenge argonárammal (végső koncentráció 400 nM peptid) való keverés közben. A kalceinfluoreszcenciát különböző időpontokban a peptid hozzáadása után mértük. A 100%-os felszakításra jellemző értékeket 2 pl Triton X-100 (Fluka) hozzáadása révén határoztuk meg.
Ugyanezt az eljárást alkalmaztuk a kalceinfluoreszcencia mérésére a liposzómaoldathoz adott peptid-pL konjugátumok esetében. A konjugátum 2,5 ug-ját (1 pg/pl koncentráció egyedül a pL-mennyiségre vonatkoztatva) adtuk 1 ml liposzómaoldathoz (végső koncentráció 20 nM módosított peptid). Ehhez hasonlóan vetettünk alá 2,5 pg peptid-polilizin konjugátumot 5 pg
HU 218 846 Β
DNS-sel történő 15 perces inkubálás után a liposzómaáteresztő képesség meghatározásának.
Azt találtuk, hogy a peptid csak savas közegben okozza a liposzómák tartalmának szabaddá tételét (17. ábra). A peptidkonjugátum lényegesen alacsonyabb pH-értéknél volt aktív, ennél semleges pH-értéknél is erős aktivitást tapasztaltunk, amely a pH-érték csökkenésével még felerősödik. A konjugátum komplexbe vitele DNS-sel eltüntette az aktivitást semleges pH-értéknél, miközben savas pH-értéknél nyilvánvaló aktivitás mutatkozott.
e) K562-sejtek transzfekciója
K562-sejteket szuszpenzióban tenyésztettünk RPMI 1640 táptalaj (Gibco BRL+2 g nátrium-bikarbonát/l)+10% FCS, 100 egység/ml penicillin, 100 pl/pl sztreptomicin és 2 mM glutamin keverékében 500 000 sejt/ml sejtsűrűségig. 12-20 órával a transzfekció előtt a sejteket friss táptalajba tettük, amely 50 μΜ desz-ferri-oxamint tartalmazott (erre azért volt szükség, hogy a transzfemnreceptorok számában növekedést éljünk el). A transzfekció reggelén a sejteket öszszegyűjtöttük, friss táptalajban, amely 10% FCS+50 μΜ desz-ferri-oxamint tartalmazott, szuszpendáltuk (250 000 sejt/ml), és 2-2 ml-t adagoltunk 24 bemélyedést tartalmazó lemezre.
160 μΐ HBS-ben oldott 6 μg pCMVL-DNS-t a 18. ábrán megadott mennyiségű, 160 μΐ HBS-ben oldott TfpL-konjugátummal vagy pL300-zal kevertük össze, 15 perc múlva hozzáadtuk az influenzapeptid-pL konjugátum („P16pL”) megadott mennyiségeit, további 15 perc elteltével a keveréket K562-sejtekhez adtuk hozzá. A sejteket 37 °C-on 24 óráig inkubáltuk és utána kinyertük a luciferázaktivitáshoz. A luciferázaktivitást úgy határoztuk meg, ahogyan azt az előző példákban megadtuk. A 18. ábrán megadott értékek a transzfekción átesett sejtek össz-luciferázaktivitását mutatják.
f) HeLa-sejtek transzfekciója
HeLa-sejteket 6 cm-es szaporítócsészékben tenyésztettünk úgy, ahogyan azt a „Sejtek és táptalajok” fejezetben megadtuk. A transzfekciókat 300 000 sejt/lemez sűrűségnél végeztük el. A transzfekció előtt a sejteket 1 ml, 2% FCS-tartalmú friss táptalajban inkubáltuk.
160 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t a 19. ábrán megadott mennyiségű, 160 μΐ HBS-ben oldott TfpL-konjugátummal vagy pL300-zal, vagy a kettő keverékével kevertük össze. 15 perc múlva hozzáadtuk az influenzapeptid-pL konjugátum („P16pL”) megadott mennyiségeit, és további 15 perc elteltével a keveréket hozzáadtuk a sejtekhez. A sejteket 37 °C-on 2 óráig inkubáltuk, utána 2,5 ml, 10% FCS-sel kiegészített friss táptalajt adtunk hozzájuk. A sejteket 37 °C-on 24 óráig inkubáltuk, és azután kinyertük a luciferázaktivitáshoz. A luciferázaktivitást úgy határoztuk meg, ahogyan azt az előző példákban megadtuk. A 19. ábrán megadott értékek a transzfekción átesett sejtek össz-luciferázaktivitását mutatják.
14. példa
A transzferrinkonjugátumok okozta géntranszfer felerősítése egy további N-terminális endoszomalitikus influenzahemagglutinin ΗΑ-2-peptid segítségével
a) Peptid-polilizin konjugátumok előállítása
A P41 jelölésű, a 2. számú szekvenciavázlat szerint : Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-GluAsn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys peptidet a 13. példa a) pontja szerinti pepiidhez hasonlóan szintetizáltuk. A peptid kapcsolását polilizinhez (pL300) a 13. példa bl) pontja szerint SPDP-n keresztüli kötéssel végeztük el. Ily módon olyan konjugátumokat kaptunk, amelyekben a peptid:polilizin mólaránya 4:1.
b) HeLa-sejtek transzfekciója influenzapeptid-konjugátumokkal
HeLa-sejteket 6 cm-es csészékben tenyésztettünk, mint ahogyan megadtuk, a transzfekciókat 300 000 sejt/lemez sűrűségnél végeztük el. A transzfekció előtt a sejteket 1,5 ml, 2% FCS-tartalmú friss táptalajjal inkubáltuk. 160 pl HBS-ben (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH=7,3) oldott 6 pg pCMVL-DNS-t 160 pl HBS-ben oldott 6 pg TfpL190B-konjugátummal kevertük öszsze, 15 perc után 10 pg P41pL influenzapeptid-polilizin konjugátumot vagy összehasonlítás céljából 18 pg P16pL influenzapeptid-polilizin konjugátumot (lásd a 13. példában) adtunk hozzá (20. ábra); a megadott mennyiségeket mindkét peptidkonjugátum esetében teszteltük arra nézve, hogy a géntranszfer felerősítésére az optimális mennyiséget képviseljék. További 15 perc elteltével a keveréket hozzáadtuk a sejtekhez. 24 óra múlva a sejteket kinyertük a luciferázteszthez. A 20A. ábrán bemutatott értékek a transzfekción átesett sejtek összluciferázaktivitását mutatják. A két peptidkonjugátummal végzett kísérletek összehasonlítása a géntranszfemek több mint 3,5-szeresen magasabb felerősítését mutatja a P41pL peptidkonjugátummal.
c) BNL CL.2 sejtek transzfekciója influenzapeptidkonjugátumokkal
A BNL CL.2 sejteket a 6. példában leírtak szerint tenyésztettük. A P41 influenzapeptidet polilizin300-zal a peptid: polilizin 1:1, 3:1 és 8:1 moláris arányokkal konjugáltuk. 6 pg pCMVL-DNS és 20 pg konjugátum komplexét adtuk a sejtekhez. Összehasonlítás céljából 20 pg pL300-at vagy 20 pg P16-polilizin konjugátumot, a 13. példában leírtak szerint előállítva, alkalmaztunk. A sejteket 37 °C-on 4 óráig inkubáltuk, utána hozzáadtunk 2 ml, 18% FCS-tartalmú táptalajt. 24 óra elteltével a sejteket kinyertük a luciferázteszthez, amelynek eredményeit a 20B. ábrán mutatjuk be. A liposzómaáteresztő képesség meghatározásában (Liposomes Leakage Assay) (20C. ábra), amelyet úgy végeztünk el, mint a 13. példában, a konjugátumok (2,5 pg polilizinnek megfelelő, pH=5) aktivitása peptidtartalmukkal együtt nőtt (az ábrán a P41 „influ2”-ként van jelölve).
75. példa
HeLa-sejtek transzfekciója egy β-galaktozidáz riportergén-szerkezettel és a β-galaktozidáz-kifejeződés in situ kimutatása
a) A sejtek tenyésztése és transzfekciója
A transzfekcióhoz a HeLa-sejteket 5% FCS-, penicillin-, sztreptomicin- és glutamintartalmú DMEMtáptalajban tenyésztettük az előző példákban megadot31
HU 218 846 Β tak szerint, 3 cm-es kultúrlemezen, fedőüvegeken (3 χ 104 sejt/lemez). A transzfekcióhoz a β-galaktozidáz riportergén-szerkezet (pCMV-P-gal) 160 pl HBSben oldott 6 pg-ját 160 pl HBS-ben 12 pg TfpL190Bvel komplexbe vittük, és 30 percig szobahőfokon inkubáltuk.
Egy további kísérletben 160 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMV-P-gal-t 80 pl HBS-ben 6 pg TfpL190B-vel 15 percig szobahőmérsékleten inkubáltunk. Ezután a 13. példában előállított influenzapeptid-konjugátum (P16pL) 80 pl HBS-ben oldott 12 ug-ját adtuk hozzá, és a keveréket további 15 percig inkubáltuk. Ezt a DNS-polikation komplexet azután 1 ml DMEM+2% FCS, antibiotikum és glutamin keverékével vegyítettük a fent megadottak szerint. Abból a célból, hogy a klorokinnak és az adenovírusnak a transzfekció teljesítőképességére kifejtett hatását megmutassuk, további kísérletekben a DNS-polikation komplexeket tartalmazó táptalajhoz kiegészítésként 100 pM végkoncentrációban klorokint vagy 50 pl dl312 adenovírus-törzsoldatot adtunk.
A transzfekcióhoz az eredeti szaporító táptalajt eltávolítottuk a sejtekről és 1 ml, a DNS-komplexeket klorokinnal vagy a nélkül, illetve vírussal vagy a nélkül tartalmazó táptalajt adtunk hozzájuk. 37 °C-on történő 2 órás inkubálás után 1 ml, 10% FCS-, antibiotikum- és glutamintartalmú táptalajt adtunk a sejtekhez, és folytattuk az inkubálást még 2 óráig. Ezután az egész táptalajt eltávolítottuk, és a sejteket 3 ml friss DMEM+10% FCS, antibiotikum és glutamin táptalajban tenyésztettük,
b) β-galaktozidázmeghatározás
A transzfekció után 48 órával eltávolítottuk a táptalajt, a sejteket 1-szer mostuk foszfátpufferben készített konyhasóoldattal (PBS) és PBS-ben oldott 0,5% glutáraldehiddel 5 percig fixáltuk szobahőfokon. Ezután a fixálószert eltávolítottuk, és a sejteket 1-szer PBS-sel mostuk. Ezt követően a színezőoldattal (10 mM foszfátpuffer, pH=7,0, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3,3 mM K4Fe(CN)6.3H2O, 3,3 mM K3Fe(CN)6 és 0,2% 5bróm-4-klór-3-indol^-gaIaktopiranozid) 37 °C-on 20 perctől 3 óráig inkubáltuk [BioTechniques 7, 576-579 (1989)]. Ezután a fedőüvegeket PBS-ben, vízben és alkoholban leöblítettük, megszárítottuk és a tárgyasztalon Mowiolban befedtük. Az analízishez egy Zeiss Axiophot mikroszkópot használtunk.
A 21. ábra a mikroszkopikus nagyítások (112 x) képeit mutatja. A: HeLa-sejtek, transzfekció 6 pg pCMVβ-gal-lal, komplexben 12 pg TfpL190B-vel. A β-galaktozidázt kimutató színreakció 3 óra alatt készült el. Az ábra azt mutatja, hogy nagyon kevés sejt (55 sejt; a megfestődött sejtek csoportját nyíllal jelöltük) fejezi ki a βgalaktozidázgént. B: HeLa-sejtek, transzfekció 6 pg pCMV^-gal-lal, komplexben 6 pg TfpL190B-vel és 12 pg P16pL-lel. Színreakció: 3 óra. Kevés sejt (250 sejt) fejezi ki a β-galaktozidázgént. A sejtek reakciója azonban erősebb, mint az A esetben. C: HeLasejtek, transzfekció 6 pg pCMV^-gal-lal, komplexben 6 pg TfpL190B-vel és 12 pg P16pL-lel 100 pM klorokin jelenlétében. Színreakció: 3 óra. A sejtek sok csoportja mutat erős pozitív reakciót (több mint
1000 sejt). D: HeLa-sejtek, transzfekció 6 pg pCMVβ-gal-lal, komplexben 12 pg TfpL190B-vel dl 312 adenovírus jelenlétében. Színreakció 20 perc. Majdnem minden sejt (több mint 90%) mutat pozitív reakciót. E: nem fertőzött HeLa-sejtek (kontroll a β-galaktozidázreakció specificitásához). Színreakció: 3 óra.
16. példa
HeLa-sejtek transzfekciója egy 48 kb kozmiddal szabad adenovírus jelenlétében
a) Egy, a luciferázt kódoló szekvenciát tartalmazó kozmid előállítása
Az egyetlen - a P. pyralis luciferázt kódoló - szekvenciát az RSV promoter kontrollja alatt tartalmazó 3,0 kb Sall-fragmentumot a p22RSVLuca plazmidból a Cl-7al kozmidklón egyetlen Sall-helyére ligáltuk, konkatamerek képzése céljából. [A Cl-7al egy olyan, nyilvánvaló gént nem kódoló 37 kb humán genomiális DNS Sau3A-fragmentet (részleges emésztés) tartalmaz, amely a pW15 kozmidvektor BamHI-helyére van klónozva (stratagén)]. A ligációs reakció termékét ezután in vitro becsomagoltuk, és a kapott fágpartikula egy részével E. coli MN544 törzset fertőztünk, és LB amp lemezekre szélesztettük. A rekombinánsokat kolónia-hibridizációval a 3,0 kb Sall-fragmentum (véletlenszerű feltöltéssel 32~P jelölésű) mint hibridizációs szonda felhasználásával screeneltük és a pozitívak egy részét restrikciós térképezés segítségével analizáltuk. A Sall-inszertum egyetlen másolatát tartalmazó kozmidszerkezetet (CosLuc) tenyésztettük és céziumgradiensen tisztítottuk (teljes nagyság: 48 kb). Előállítottunk egy kicsi, pWELuc (12 kb) kontrollkozmidot a CosLuc Notl-vel való emésztésével, religálással, baktériumok transzformálásával és a megfelelő plazmid izolálásával. Ez egy olyan 12 kb molekulát eredményezett, amelyből hiányzott a humán DNS inszertum egy része és a CosLuc polilinkerének egy része. A pSPNeoLuc (8 kb) az 5. példában leírt plazmid, amely egy RSV-luciferáz-gén fragmentuma (a pRSVLnek egy Apal/Pvul fragmentuma, amely a pUCp-Locus Clal-helyére van klónozva).
b) A kozmid bevitele HeLa-sejtekbe ml DMEM+2% FCS-sel befedett HeLa-sejteket (3xl04 sejt/6 cm-es lemez) TfpL/DNS komplexekkel - amelyeket a példák előtti bevezetőben leírtak szerint állítottunk elő, és a megadott mennyiségű hTfpL-t, szabad polilizint és DNS-t tartalmazták - inkubáltunk. Az inkubációs keverékek kiegészítésként vagy 100 pM klorokint (1. és 2. hasáb) vagy 10 pl, 5xl0H partikula/ml koncentrációjú dl 312 adenovírust (3-12. hasábok) tartalmaztak. 2 órás, 37 °C-on történő inkubáció után minden lemezhez 4 ml DMEM+10% FCS-t adtunk. 24 órával később a sejteket kinyertük, és megmértük a luciferázaktivitást. Az eredményeket a 22A. ábrán mutatjuk meg.
c) A kozmid bevitele neuroblasztómasejtekbe ml DMEM+2% FCS-sel befedett, GI-ME-N jelölésű neuroblasztóma-sejtvonal sejtjeit [Cancer Gént. Cytogenet. 30, 225-231 (1988)] (1 χ 106 sejt/6 cm-es lemez) TfpL/DNS komplexekkel - amelyeket a leírtak szerint
HU 218 846 Β állítottunk elő és a megadott mennyiségű hTfpL-t, szabad polilizint és DNS-t tartalmazták - inkubáltunk. Az inkubációs keverékek kiegészítésként vagy 100 μΜ klorokint (3. és 4. hasáb), vagy 10 μΐ, 5xl0u partikula/ml koncentrációjú dl312 adenovírust (5. és 6. hasáb) tartalmaztak. 2 órás, 37 °C-on történő inkubáció után minden lemezhez 4 ml DMEM+10% FCS-t adtunk. 24 órával később a sejteket kinyertük, és megmértük a luciferázaktivitást. Az eredményeket a 22B. ábrán mutatjuk meg.
17. példa
Géntranszfer kémiailag kapcsolt adenovírus-polilizin konjugátumokkal
a) Adenovírus-polilizin konjugátumok előállítása kémiai kapcsolással
150 mM NaCl/25 mM HEPES (pH=7,9)/10% glicerin keverékben levő dl312 adenovírus gélszűrt (Sephadex G-25 PD-10, Pharmacia) oldatának 2,35 ml-ét (körülbelül 1011 partikula) 1 mM SPDP- (Pharmacia)oldat 10 μΐ-ével (10 nmol) elegyítettük. 3,5 óra múlva szobahőmérsékleten a módosított vírust gélszűréssel (mint fent) elválasztottuk a reagensfölöslegtől. Az oldatot (2,5 ml) átmostuk argonnal, és oxigén kizárása mellett, argon alatt, FITC-jelölésű, 2,3 nmol merkapto-propionát-csoportokkal módosított polilizin (l.nmol) (az EP 388 758 európai szabadalmi leírás szerint előállítva) oldatának 42 μΐ-ével reagáltattuk. 18 órás szobahőfokon tartás után az oldat felét centrifugacsőbe töltöttük, 1 ml cézium-klorid-oldattal (sűrűség 1,33 g/ml) óvatosan alárétegeztük, és 2 órán keresztül 35 000 rpm (SW60 rotor) mellett szobahőmérsékleten centrifugáltuk. A vírusszegélyt 200 μΐ cézium-klorid-frakcióként gyűjtöttük össze, és HBS/50% glicerin oldatával 1 ml-re hígítottuk. Egy DNS-kötés-meghatározást végeztünk a módosított vírus 300 μΐ-ével: a vírusoldatot 1 ml HBS-sel meghígítottuk és 35 S-jelzésű DNS (15 ng pRSVL, Nick-transzlációval előállítva) 100 μΐ oldatával elegyítettük. Kontrollként párhuzamos kísérletet végeztünk ugyanolyan mennyiségű, nem módosított dl312 vírussal. 30 perc után a próbákat centrifugacsövekbe töltöttük, 1 ml cézium-klorid-oldattal (sűrűség: 1,33 g/ml) óvatosan alárétegeztük, és 2 órán keresztül 35 000 rpm (SW60 rotor) mellett szobahőmérsékleten centrifugáltuk. A gradienst egyenként 5 frakcióba osztottuk; 1. frakció, 1 ml; 2. frakció, 0,6 ml; 3-5. frakciók egyenként 200 μΐ. Megmértük a 200 μΐ-es frakciók radioaktivitását, és a 23. ábrán mutatjuk be. A vírustartalmú (3-5.) frakciókban, főleg a 3. frakcióban nyilvánvalóan magasabb a radioaktivitás, mint a kontrollkísérletben; ez a polilizin/módosított adenovírus és a jelzett DNS-specifíkus összekapcsolódására vezethető vissza.
b) K562-sejtek transzfekciója
K562-sejteket (ATCC CCL 243) szuszpenzióban tenyésztettünk RPMI 1640 táptalaj (Gibco BRL+2 g nátrium-bikarbonát/1) +10% FCS, 100 egység/ml penicillin, 100 μΐ/μΐ sztreptomicin és 2 mM glutamin keverékében 500 000 sejt/ml sejtsűrűségig. 12-20 órával a transzfekció előtt a sejteket friss táptalajba tettük, amely 50 μΜ desz-ferri-oxamint tartalmazott (erre azért volt szükség, hogy a transzferrinreceptorok számában növekedést éljünk el). A transzfekció reggelén a sejteket összegyűjtöttük, friss táptalajban, amely 10% FCS+50 μΜ desz-ferri-oxamint tartalmazott, szuszpendáltuk (250 000 sejt/ml), és 2-2 ml-t adagoltunk 24 bemélyedést tartalmazó lemezre. A pCMVL-DNS megadott mennyiségeit (6, 0,6, 0,06 pg) 100 μΐ HBS-ben 50 μΐ polilizin-adenovírus (pLAdeno), illetve a kontroll-dl312 adenovírus megfelelő mennyiségével (35 μΐ) kevertük össze. 20 perc múlva mindig a megfelelő mennyiségű (12, 1,2, 0,12 pg) TfpL190B-konjugátumot 150 pl HBS-hez adtuk hozzá. További 20 perc elteltével a keveréket K562-sejtekhez adtuk. A sejteket 37 °C-on 24 óráig inkubáltuk, és utána kinyertük azokat a luciferázmeghatározáshoz. A luciferázaktivitás az előző példákban megadottak szerint történt. A 24. ábrán szereplő értékek a transzfekción átesett sejtek össz-luciferázaktivitását mutatják.
c) HeLa-sejtek transzfekciója
Egy polilizin-vírus konjugátum aktivitásának ellenőrzésére egy módszer a konjugátum azon képességének felülvizsgálata, hogy nagyon kis DNS-mennyiségeket (kevesebb mint pg) tud-e szállítani. Megnövekedett DNS-transzfer-kapacitást vártunk, amikor az adenovírus közvetlenül a polilizin által kondenzált DNS-hez van kötve, mivel az intemalizálófaktorok (transzferrin és adenovírus fiberfehéije) közvetlenül a szállítandó DNS-hez vannak kapcsolva. Ennek a feltevésnek a helyességét vizsgálandó konstans mennyiségű polilizinadenovírus konjugátumot (2,5 pl, körülbelül 5x10 víruspartikula) a riporterplazmid különböző mennyiségeivel (3-0,0003 pg) 475 pl HBS-ben komplexbe vittük. 15 perc szobahőfokon történő inkubálás után a DNS tömegének megfelelő mennyiségű transzferrin-polilizint adtunk minden próbához (ezt a mennyiséget TfpL-re választottuk meg, mivel ez a plazmid-DNS 50%-ának teljes mértékű elektroneutralitását garantálja, és egyidejűleg a vírus-polilizin konjugátum számára kötési szabad teret biztosít). TfpL hozzáadása után a keverékeket 15 percig inkubáltuk, majd minden keveréket egy-egy 6 cm-es szaporítócsészéhez adtunk, amelyek 300 000 HeLa-sejtet tartalmaztak 1 ml DMEM/2% FCS-ben. Ezután a sejteket 1,5 óráig 37 °C-on inkubáltuk, majd 4 ml DMEM/10 FCS-t adtunk hozzájuk. Ezzel párhuzamosan ekvivalens mennyiségű DNS-t 2-szeres fölöslegben levő TlpL-lel (a teljes mértékű DNSkondenzációhoz szükséges mennyiség) vittünk komplexbe és HeLa-sejtek géntranszferére használtuk fel (egyszer önmagában, egyszer 25 pl polilizinhez nem kapcsolt dl 312 adenovírus-készítmény jelenlétében). 24 óra után kinyertük a sejteket, kivonatokat készítettünk, és részleteit luciferázaktivitásra vizsgáltuk. Ezeknek a kísérleteknek az eredményeit a 25. ábrán mutatjuk be: adenovírus hiányában 0,3 pg DNS-mennyiség alatt nem mutatható ki luciferázaktivitás. Mind a polilizinhez kötött, mind a nem kötött adenovírus jól működött nagy DNS-mennyiségeknél (3 pg és 0,3 pg). A nem kötött adenovírussal azonban 0,03 pg-nál egy csaknem 100-szoros aktivitáscsökkenést és ez alatt a DNS-mennyiség alatt elhanyagolható aktivitást figyel33
HU 218 846 Β tünk meg. Ezzel ellentétben a polilizinhez kapcsolt vírus megtartja géntranszfer-kapacitását mind 0,003, mind 0,0003 pg DNS-mennyiségnél. Ez a DNSmennyiség megfelel körülbelül 100 DNS-molekula/sejt és körülbelül 1 víruspartikula/DNS-molekula koncentrációknak.
18. példa
Géntranszfer a polilizinhez enzimesen kapcsolt adenovírusokkal
a) Enzimreakció ml adenovírus készítményt (dl312 törzs; 5x 10'°
PFU/ml) vittünk föl egy Sephadex G-25 gélszűrő oszlopra (Pharmacia), amelyet előzőleg 25 ml reakciós pufferrel (0,1 M Tris-HCl; pH=8,0, 2 mM DTT, 30% glicerin) ekvilibráltunk. Az elúció 3,5 ml reakciós pufferrel történt. A reakciós kiindulási elegy az enzimes kapcsoláshoz 1150 pl víruselúciós frakcióból, 0,5 nmol tengerimalacmáj-glutaminázból (TG) (Sigma), 2 nmol, illetve 20 nmol polilizin290-ből, 10 mM CaCl2-ból és 1500 pl végtérfogatú reakciós pufferből áll. A reakciót 37 °C-on 1 óráig végeztük, majd 30 pl 0,5 M EDTA hozzáadásával leállítottuk. A kapcsolás specifícitásának kontrolljaként transzglutamináz nélküli reakciós összeállításokat is készítettünk. A be nem épült polilizint a vírusoktól centrifugálással választottuk el, CsClgradiens segítségével (sűrűség 1,33 g/ml; 170 000 g, 2 óra). A vírusokat tartalmazó frakciót leválasztottuk, azonos térfogatú glicerinnel elegyítettük, folyékony nitrogénben lefagyasztottuk és -70 °C-ra állítottuk be.
b) A polilizin adenovírusokhoz való kötésének bemutatása
A reakciót olyan polilizinnel végeztük a fent leírtak szerint, amelyet előzőleg Bolton-Hunter-reagens (Amersham) segítségével 125J-vel jelöltünk. A CsClgradiens-centrifúgálás után a vírusfrakciót leválasztottuk, és egy további CsCl-gradienssel szétválasztottuk. Ezután a gradienst ffakcionáltuk, és szcintillációs számláló segítségével minden frakcióban meghatároztuk a radioaktivitást. Mint ahogyan a 26. ábrán látható, megmutatkozott, hogy a TG-t tartalmazó reakció-összetételnél (dl312/TG-pL) a radioaktív polilizin feldúsult a vírusfrakcióban (vírus). A kontrollösszetételnél TG nélkül (dl312/pL) nem dúsult fel a radioaktív polilizin a vírusfrakcióban.
c) Polilizinnel módosított adenovírus-frakciók tesztelése a transzfekciós hatékonyságra gyakorolt hatásukat illetően
i) Sejtek és táptalajok
A transzfekcióhoz 5 χ 105 sejtet (egérhepatociták;
ATCC No.: TIB73) tenyésztettünk 10% hővel inaktivált magzatiborjú-szérum (FCS)-, 2 mM glutamin-, 100 I. E./ml penicillin és 100 pg/ml sztreptomicintartalmú DMEM táptalajban, 6 cm-es szaporítócsészékben.
ii) Vírus-DNS-transzferrin komplexek képzése
A mindenkori polilizinnel módosított vírusfrakció pl-ét 10 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL DNS-plazmiddal kevertük össze, és 20 percig szobahőfokon inkubáltuk. Ezután a keveréket hozzáadtuk 8 pg egértranszferrin-polilizin290B-hez, és további 10 percig inkubáltuk.
iii) Egérhepatociták transzfekciója
A vírus-DNS-transzferrin komplexeket 1,5 ml táptalajjal (DMEM+2% FCS, 2 mM glutamin és antibiotikumok) kevertük össze, és miután eltávolítottuk a régi táptalajt, a sejtekhez adtuk. 2 órás 37 °C-on történő inkubálás után a sejtekhez 2 ml, 10% FCS-, glutaminés antibiotikumtartalmú DMEM-et adtunk. További órás tenyésztés után az egész táptalajt eltávolítottuk és a sejtekhez 4 ml, 10% FCS-, glutamin- és antibiotikumtartalmú DMEM-et adtuk.
iv) A luciferázkifejeződés meghatározása órával a transzfekció után kinyertük a sejteket, és a fent leírtak szerint elvégeztük a luciferázmeghatározást. Amint az a 27. ábrából látható, a legerősebb kifejeződést (153 540 000 fényegység) az a víruskészítmény adta, amelynél az adenovírusokat TG-vel és 20 nmol polilizinnel kezeltük (dl312/TG-20 nmol pL). A TGvel és 2 nmol polilizinnel kezelt (dl312/TG-2 nmol pL) víruskészítmény valamivel kevésbé volt aktív (57 880 000 fényegység). A kontrollfrakció, amelynél az adenovírusokat 20 nmol polilizinnel kezeltük, de TG nélkül, csaknem 500-szor kevésbé volt hatásos. Összehasonlítás céljából további komplexeket használtunk transzfekcióhoz adenovírusokból kiindulva, amelyek sem TG-vel, sem polilizinnel nem voltak kezelve (dl 312). Ez a készítmény 4 403 000 fényegységet eredményezett.
d) A transzfekciós hatékonyság emelése polilizinnel módosított adenovírusok révén, összevetve nem módosított adenovírusokkal, különösen alacsony DNSmennyiségeknél
A transzfekciót a 3. c) példában leírtak szerint végeztük el, ahol a komplexképzéshez 50 pl dl312/TG-20 nmol pL adenovírus frakciót és 6 pg pCMVL/8 pg mTfpL, 0,6 pg pCMV-Luc/0,8 pg mTfpL vagy 0,06 pg pCMV-Luc/0,08 pg mTfpL-komplexeket alkalmaztunk. Összehasonlítás céljából 6 pg, 0,6 pg, 0,06 pg pCMVL/mTfpL komplexekkel és nem módosított adenovírusokkal (dl312) is végeztünk transzfekciókat. Azt találtuk, hogy a polilizinnel módosított adenovírusok komplexei alacsony DNS-mennyiségeknél is még magas kifejeződési értékeket adtak, ugyanakkor a nem módosított adenovírusoknál a kifejeződés erősen csökkent volt (28. ábra).
19. példa
Géntranszfer olyan konjugátumokkal, amelyekben az adenovírus és a polilizin között egy biotin-sztreptavidin hídon keresztül történik a kötés
a) A dl312 adenovírus biotinilálása
150 mM NaCl/5 mM HEPES (pH=7,9)/10% glicerin keverékben levő dl 312 adenovírus gélszűrt (Sephadex G-25 PD-10, Pharmacia) oldatának 2,4 ml-ét (körülbelül 10·1 partikula) 1 mM NH-LC-biotin (Pierce 21335) oldatának 10 pl-ével (10 nmol) elegyítettük.
órás szobahőfokon tartás után a biotinnal módosított vírust a fölöslegben levő reagenstől gélszűréssel (mint fenn) választottuk el. Az oldatot glicerin hozzáadásával
HU 218 846 Β
40% glicerinkoncentrációra állítottuk be (össztérfogat 3,2 ml) és -25 °C-on tároltuk. A vírus biotineződését a különböző hígítások cellulóz-nitrát-membránra történő csepegtetésével, kvalitatívan tudtuk kimutatni : 80 °C-on 2 óráig vákuum-szárítószekrényben történő szárítás után BSA-val blokkolás, inkubálás sztreptavidinnel konjugált alkalikus foszfatázzal (BRL), mosás és 1 órás inkubálás az NBT/X-foszfáttal (nitroblau-tetrazóliumsó/5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfát, toluidinsó; Boehringer Mannheim) pozitív színreakciót eredményezett.
b) Sztreptavidin-polilizin konjugátumok előállítása
A sztreptavidin polilizinnel történő kapcsolását
Wagner és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)] és az EP-A1 388 758 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés által leírt módszer szerint végeztük el.
ml, 200 mM HEPES (pH=7,9) és 300 mM NaCl keverékében oldott 79 nmol (4,7 mg) sztreptavidint SPDP 15 mM etanolos oldatával (236 nmol) kezeltünk. 1,5 óra szobahőmérsékleten tartás után a módosított fehérjét egy Sephadex G-25 oszlopon gélszűrtük, ahol 196 nmol ditio-piridin-linkerrel módosított 75 nmol sztreptavidint kaptunk. A módosított fehérjét 2,6 ml, 100 mM HEPES (pH=7,9) és 150 mM NaCl keverékében oldott, 3-merkapto-propionáttal módosított polilizinnel (75 nmol, átlagos lánchosszúság 290 lizinmonomer, 190 nmol merkapto-propionát-linkerrel módosítva) argonatmoszférában reagáltattuk. A konjugátumokat kationcserélő kromatográfíával választottuk el egy Mono S HR5 oszlopon (Pharmacia). (Gradiens: 20-100% puffer. A puffer: 50 mM HEPES pH=7,9; B puffer: A+3 M NaCl). A termékfrakció 1,2 M és 1,7 M sókoncentráció között eluált. A HBS-sel (20 mM HEPES pH=7,3, 150 mM NaCl) szemben végrehajtott dialízis egy 45 nmol sztreptavidinből és 53 nmol polilizinből álló konjugátumot eredményezett.
c) HeLa-sejtek transzfekciója
HeLa-sejteket tenyésztettünk 6 cm-es szaporítócsészékben, amint azt az 1. példában megadtuk. A transzfekciókat 300 000 sejt/lemez sűrűségnél végeztük. A transzfekció előtt a sejteket 1 ml, 2% FCS-tartalmú friss táptalajjal inkubáltuk.
100 pl HBS-ben oldott 6 μg pCMVL-DNS-t 170 μΐ HBS-ben oldott 0,8 μg sztreptavidin-polilizinnel kevertünk össze. 20 perc után 170 μΐ HBS-ben oldott 3 μΐ polilizin pL300-at kevertünk hozzá. További 20 perc elteltével 65 μΐ biotinilezett adenovírust vagy kontrollként dl312 adenovírus megfelelő mennyiségét (30 μΐ kiindulási vírus a módosításhoz) adtunk hozzá. A komplexkeverékeket („biotinAdV/komplex A”, illetve „kontroll-AdV”, lásd 29. ábra) további 20 percig állni hagytuk.
Egy alternatív komplexképzést végeztünk úgy, hogy 65 μΐ biotinilezett adenovírust először 50 μΐ HBSben levő 0,8 pg sztreptavidin-polilizinnel kevertünk össze, 20 perc után 170 μΐ HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t adtunk hozzá, és további 20 perc elteltével 200 pl HBS-ben oldott 3 pl polilizin pL300-at kevertünk hozzá („biotinAdV/komplex B” komplexkeverék).
pl HBS-ben oldott 0,6 pg pCMVL-DNS-t 33 pl HBS-ben oldott 0,3 pg sztreptavidin-polilizinnel kevertünk össze. 20 perc elteltével 65 pl biotinilezett adenovírust vagy kontrollként dl312 adenovírus megfelelő mennyiségét (30 pl kiindulási vírus a módosításhoz) adtunk hozzá. A komplexkeverékeket („biotinAdV/komplex A”, illetve „kontroll-AdV”, lásd 29. ábra) további 20 percig állni hagytuk, és azután HBS-sel 500 μΐ-re hígítottuk. Elvégeztük az alternatív komplexképzést úgy, hogy 65 pl biotinilezett adenovírust először 50 pl HBSben levő 0,3 pg sztreptavidin-polilizinnel kevertünk össze, 20 perc után 50 pl HBS-ben oldott 0,6 pg pCMVL-DNS-t adtunk hozzá. A komplexkeveréket („biotinAdV/komplex B”) további 20 percig állni hagytuk, és azután HBS-sel 500 μΐ-re hígítottuk.
A keverékeket hozzáadtuk a sejtekhez. A sejteket 2 órán keresztül 37 °C-on inkubáltuk, majd 2,5 ml, 10% FCS-sel kiegészített friss táptalajt adtunk hozzájuk. A sejteket 24 órán keresztül 37 °C-on inkubáltuk és kinyertük a luciferázmeghatározáshoz. A luciferázaktivitást úgy határoztuk meg, ahogyan azt az előző példákban megadtuk. A 29. ábrán megadott értékek a transzfekción átesett sejtek össz-luciferázaktivitását szemléltetik.
Ezzel párhuzamosan HeLa-sejtek olyan transzfekcióit végeztük el, ahol a konjugátum víruskomponenseként egy olyan biotinilezett vírust használtunk fel, amelyet előzőleg psoralen/UV kezeléssel inaktiváltunk. Az inaktiválás a következőképpen történt. Egy 1,6 cm-es szövetkultúra-lemez két bemélyedésébe 200-200 pl biotinilezett víruskészítményt adtunk. Minden próbához 2 pl (33 mg/ml) 8-metoxi-psoralent (DMSO-ban) adtunk, a csészét jégre helyeztük, és 10 percig UVlámpával (365 nm; UVP TL-33 lámpa) sugároztuk be, ahol a próba távolsága a szűrőtől 4 cm-re volt. A besugárzás után egyesítettük a két próbát, és gélszűrésnek vetettük alá (G50, Nick-oszlop, Pharmacia), ahol az oszlopot előzőleg 40% glicerintartalmú HBS-sel ekvilibráltuk. 75 μΐ-es részleteket komplexbe vittünk 0,8 pg sztreptavidin-polilizinnel és HeLa-sejtek transzfekciójához használtuk fel a fent leírtak szerint.
Citopátiásvégpont-meghatározással megállapítottuk, hogy az inaktiválás következtében több mint 104nel csökkent a vírustiter, mialatt a transzfekciós kapacitás magas koncentrációknál kevesebb mint 50%-kal, és alacsonyabb koncentrációknál 5-szörösen csökkent,
d) K562-sejtek transzfekciója
K562-sejteket szuszpenzióban tenyésztettünk RPMI 1640 táptalaj (Gibco BRL+2 g nátrium-bikarbonát/l) + 10% FCS, 100 egység/ml penicillin, 100 pg/ml sztreptomicin és 2 mM glutamin keverékében 500. 000 sejt/ml sejtsűrűségig. A transzfekció előtt 16 órával a sejteket 50 μΜ desz-ferri-oxamin- (Sigma) tartalmú, friss táptalajhoz adtuk. A transzfekció reggelén a sejteket 250 000 sejt/ml koncentrációig felvettük friss táptalajban, amely 10% FCS+50 μΜ desz-ferrioxamint tartalmazott, és bemélyedésenként 2-2 ml-t adagoltunk 24 bemélyedést tartalmazó lemezre.
Három különböző típusú DNS-komplexet állítottunk elő.
HU 218 846 Β
a) 160 μΐ HBS-ben (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH=7,3) oldott 6 pg pCMVL-DNS-t 160 μΐ HBS-ben oldott 12 pg TfpL190B konjugátummal kevertünk össze, 30 perc múlva 20 pl dl312 adenovírus-készítményt adtunk hozzá, és a keveréket a sejtekhez adtuk.
b) 160 pl HBS-ben oldott 800 ng sztreptavidin-polilizint 20 pl biotinilezett adenovírussal hoztunk össze, mint az a)-ban, kevertük, 30 perc után 160 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t adtunk hozzá, és további 30 perc elteltével az oldatot összekevertük 160 pl HBS-ben oldott 10 pg TfpL190B konjugátummal. 30 perc múlva a sejtekhez adtuk a keveréket.
c) A DNS-komplexeket b) szerint állítottuk elő azzal a különbséggel, hogy TfpL190B helyett poli(L)-lizin p(Lys)290 3,5 pg oldatát adtuk hozzá. A sejteket 24 óráig 37 °C-on inkubáltuk, majd kinyertük a luciferázmeghatározáshoz. A 30. ábrán bemutatott értékek a transzfekción átesett sejtek össz-luciferázaktivitását szemléltetik.
20. példa
Géntranszfer primer csontvelősejtekbe
a) Csontvelősejtek izolálása
Primer csontvelősejteket nyertünk ki egerekből azáltal, hogy szaporító táptalajt (10% FCS-t, 5 χ 10~5 Μ βmerkapto-etanolt, 1% IL-3-mal kondicionált táptalajt és antibiotikumokat tartalmazó IMDM) 1 ml-es ampullával összekötött injekciós tűvel (0,4 mm vagy 0,5 mm átmérőjű) izolált felsőcombcsonton és sípcsonton húztunk keresztül. A sejteket 100 xg mellett 8 percig tartó centrifugálással mostuk 1-szer a szaporító táptalajban. Ezután a sejteket 107 sejt/ml koncentrációnál reszuszpendáltuk, és T25 szaporítópalackokba kiszélesztettük. 4 óra elteltével a meg nem tapadt sejteket egy új T25 szaporítópalackba tettük át, és egy éjszakán keresztül 50 μΜ desz-ferri-oxamin jelenlétében tenyésztettük.
b) Adenovírus-transzferrin-polilizin/DNS komplexek képzése
A komplexképzéshez 50 pl biotinilezett adenovírust 400 ng, 20 pl HBS-ben oldott sztreptavidinnel módosított polilizinnel inkubáltunk 20 percig. Ezután 6 pg pCMVL-t tartalmazó 20 pl HBS-t adtunk hozzá. 20 perces inkubációs idő után 160 pl HBS-ben oldott 7 pg egértranszferrin-polilizin konjugátumot (mTfpL) adtunk hozzá, és az egész keveréket további 20 percig inkubáltuk.
c) Transzfekció
A csontvelősejteket a transzfekcióhoz 100xg mellett 8 percig tartó centrifugálással elválasztottuk a táptalajtól. A sejtüledéket 3 ml, 2% FCS-tartalmú és az adenovirus-transzferrin-polilizin/DNS komplexek 250 μΐ-ét tartalmazó szaporító táptalajban vettük fel, és egy új T25 palackban 37 °C-on tenyésztettük 3 órán keresztül. Ezután 3 ml és további 2 óra elteltével 6 ml szaporító táptalajt adtunk hozzá, amely 10% FCS-t tartalmazott.
d) A luciferázkifejeződés meghatározása
A transzfekció után 48 órával kinyertük a sejteket, és mint a többi példában, luciferázaktivitásra vizsgáltuk azokat. A transzfekció 310 χ 103 fényegység/100 pg összsejtfehérjének megfelelő luciferázaktivitáshoz vezetett.
21. példa
Neuroblasztómasejtek transzfekciója egy 48 kb kozmiddal szabad adenovírus és adenovírus-polilizin konjugátumok jelenlétében
A GI-ME-N jelölésű sejtvonal sejtjeit, ahogyan a 16. példában leírtuk, a 48 kb kozmiddal a megadott mennyiségű hTfpL-lel, szabad polilizinnel és DNS-sel transzfekciónak vetettük alá. Az inkubációs keverékek kiegészítésként vagy 100 pM klorokint (3. és 4. hasáb) vagy 10 pl, 5χ 1011 partikula/ml dl312 adenovírust (5. és 6. hasáb) tartalmaztak. Az utolsó két próba (7. és 8. hasáb, StpL/biotin) 30 percig sztreptavidin-polilizinnel (0,8 pg, a 19. példa szerint előállítva) 150 pl HBS-ben inkubált 15 pl biotinilezett dl312 adenovírust (1 χ 1011 partikula) tartalmazott. A próbához ezután 150 pl HBS-ben 6 pg DNS-t adtunk, 30 percig szobahőfokon állni hagytuk, amelyhez azután 150 pl HBS-ben 6 pg hTfpL+1 pg szabad pL keverékét adtuk. További 30 perc szobahőmérsékleten történő inkubálás után a keveréket a sejtekhez adtuk. 2 órás 37 °C-on történő inkubálás után minden csészéhez 4 ml DMEM+10% FCS-t adtunk. 24 órával később kinyertük a sejteket, és megmértük a luciferázaktivitást. Az eredményeket a
31. ábra mutatja.
22. példa
Géntranszfer primer légúti hámsejtekbe
A cisztikus fibrózis genetikai javítására irányuló előkísérletek azt mutatták, hogy a légúti hámból származtatott, el nem pusztuló sejtvonalak a találmány szerinti géntranszferelj árások számára hozzáférhetőek. Annak a lehetőségnek a kizárására, hogy ez a jelenség a légúti hám változásaira vezethető vissza, amelyeket a halhatatlanság vált ki, a transzferrin-polilizin konjugátumokkal végzett kísérleteket primer légúti hámsejtekben (1 °AE) is elvégeztük.
°AE-sejteket orrpolippróbákböl nyertünk ki [Genetics and Epithelial Cell Dysfúnction in Cystic Fibrosis, Alán R. Liss, Inc., 139-149 (1987)]. A szövetet steril konyhasóoldatban mostuk, utána antibiotikumokkal kiegészített (penicillin 50 E/ml, sztreptomicin 50 pg/ml, gentamicin 40 ug/ml) Joklik’s féle MEM-táptalajban (Minimum Essential Médium=minimális létfenntartó táptalaj) 4 °C-on a laboratóriumba szállítottuk. A porc- és fölöslegben levő szubmukózus szövetet eltávolítottuk, és az epiteliális rétegeket proteázoldatban (Sigma, Typ 14, 0,1 mg/dl) MEM-ben 4 °C-on 16-48 órát inkubáltuk. A proteáz semlegesítésére 10% FBS-t (magzatimarha-szérum) adtunk hozzá és a sejteket enyhe mozgatással feloldottuk. A kapott szuszpenziót 10 pm-es nejlonrácson szűrtük keresztül a sejttörmelék eltávolítása céljából, centrifugáltuk (150xg, 5 perc) és F12 +10% FBS keverékében mostuk.
A sejteket ezután transzferrin-polilizin konjugátumokkal (hTfpL) és egy, a luciferáz kódolásáért felelős plazmiddal (pRSVL) mint riportergénnel kezeltük. Ennél a vizsgálatnál a primer sejtek ezekre a komple36
HU 218 846 Β xekre nem mutatták azt a fogékonyságot, mint a megfelelő halhatatlan sejtvonalak (alapérték=429 fényegység; konjugátumokkal való kiegészítéssel: 543 fényegység), amely azt bizonyítja, hogy az 1 °AE-sejtek viszonylag kevés transzferrinreceptorral rendelkeznek.
A sejtek felületén egy alternatív receptor használatára biotinilezett adenovírusokat (vesd össze a 19. példával) alkalmaztunk. Ezzel a konjugátummal kezelt sejtek az alapértéknél szignifikánsan erősebb kifejeződést mutattak (konjugátumkiegészítés: 2 585 753±453 585 fényegység). Ezenkívül más fajok primer légúti hámsejtjei is hozzáférhetőnek bizonyultak a géntranszfer számára ezzel a módszerrel (egér=3 230 244±343 153; majom=53 498 880±869 481 fényegység).
23. példa
Géntranszfer hepatocitákba és vértestekbe
Ennek a példának a kísérleteinél a következő anyagokat és módszereket alkalmaztuk.
Szövettenyészet sejtjeinek transzfekciója. A BNL CL.2 sejtvonal sejtjeit úgy tenyésztettük, ahogyan azt a
6. példában leírtuk. A HeLa-sejteket és a hepatocitákat 6 cm-es Petri-csészékben tenyésztettük. A transzfekciót körülbelül 3χ 105 sejt/csésze sejtsűrűségnél végeztük. A transzfekció előtt a standard táptalajt 1 ml, 2% FCS-tartalmú friss táptalajjal pótoltuk.
Kettős komplexek képzése. Biotinilezett adenovírusokat reagáltattunk [körülbelül 109 PFU, lásd 19. a) és 19. b)] 50 pl HBS-ben 800 ng sztreptavidinnel módosított polilizinnel. 30 perces szobahőmérsékleten tartás után 170 μΐ HBS-ben oldott 6 μg pCMVL-DNS-t adtunk hozzá, 30 percig inkubáltuk, és azután 200 μΐ HBS-ben oldott 3 pg pL300-at adtunk hozzá, és további 30 perc elteltével az oldatot felhasználtuk a transzfekcióhoz.
Hármas komplexek képzése. Biotinilezett adenovírusokat reagáltattunk (körülbelül 109 PFU) 50 μΐ HBSben 800 ng sztreptavidinnel módosított polilizinnel. 30 perces szobahőmérsékleten tartás után 170 μΐ HBSben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t adtunk hozzá, 30 percig inkubáltuk, és azután 200 pl HBS-ben oldott 10 pg TfpL190B-t adtunk hozzá, és további 30 perc elteltével az oldatot felhasználtuk a transzfekcióhoz.
β-galaktozidázmeghatározás: BNL CL.2 sejteket fedőlemezekre szélesztettünk ki, és 24 óra múlva a sejteket a pCMV^-gal riporterplazmiddal [BioTechniques
7, 576-579 (1989)] transzfekciónak vetettük alá. 48 órával később elvégeztük a β-galaktozidáztesztet, mint ahogyan azt a 15. példában megadtuk.
a) A DNS-kondenzátum és az adenovírus összekötése nagymértékben felerősíti a luciferáz-riportergén kifejeződését
A hepatocitákba irányuló kettős és hármas DNSkomplexekkel történő DNS-transzfer eredményét a
32. ábrán szemléltetjük. A géntranszferhatás szabad adenovírus jelenlétében felerősödött. A pLAdenoV/TfpL hasábok az adenovírussal végzett transzfekciók eredményeit mutatják, amelyeket először transzglutamináz segítségével polilizinnel konjugáltunk, majd DNS-sel reagáltattunk, amely a negatív töltések egy részét semlegesítette. Később transzferrin-polilizint adtunk hozzá, amely a maradék negatív töltéseket semlegesítette. Ily módon egy hármas komplex, adenovírus-polilizin/transzferrin-polilizin/DNS képződött. Mint az az ábrából világosan látható, kivételesen magas értéket, 1,5 χ 109 fényegységet értünk el (ez körülbelül 5000 fényegységnek felel meg sejtenként). Az AdenoV+pL+TfpL hasáb szemléltette kísérletekhez az adenovírust és a polilizint úgy kevertük össze, mint a transzglutaminázzal való kezeléshez. Az enzimet azonban elhagytuk, hogy kimutassuk a polilizin adenovírushoz való kötődésének transzglutamináz okozta specificitását. A víruskészítményt ugyanazzal a DNSés TfpL-mennyiséggel vittük komplexbe, mint a pLAdenoV/TfpL-nél. Ebben az esetben ugyanolyan csekély transzfekciót értünk el, mint AdenoV+TfpL esetében, mivel mindkét kísérlemél sztochasztikus lefolyású volt az adenovírus és a DNS/transzferrin-polilizin komplex együttes lokalizációja, ellentétben a pLAdenoV/TfpL hasáb mutatta kísérlettel, ahol a vírusnak és a DNS-nek a hármas komplexen keresztül való kötődése révén létrejött együttes lokalizáció a transzferrininfekció (transzfekció transzferrinnel) nagy mértékéhez vezetett.
b) K562-sejtek transzfekciója mutatja az adenovírus endoszomalitikus tulajdonságait
A humán eritroleukémia K562-sejtvonal sejtjei körülbelül 150 000 transzferrinreceptorral rendelkeznek [Proc. Natl. Acad. Sci USA 80, 2263-2266 (1983)]. Ezekben a sejtekben klorokin jelenlétében adenovírus nélkül is nagymértékű transzfekciót lehet elérni TfpL/riporter-DNS komplexekkel (33. ábra, TfpL), mint ahogyan erről már Cotten és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4033-4037 (1990)] is hírt adtak. Ugyanezek a komplexek szabad vírus jelenlétében (AdenoV/TfpL), de klorokin nélkül viszonylag gyenge riportergén-kifejeződést adnak vélhetően azért, mert a K562-sejtek más vérsejtekhez hasonlóan kevés számú adenovírus-receptorral renlelkeznek [Virology 165, 377-387 (1988); J. Virol. 62, 341-345 (1988)]. Ha az adenovírust egy biotin-sztreptavidin hídon keresztül polilizinhez kötjük, és a riporter-DNS-t több polilizin hozzáadásával teljesen kondenzáljuk, hogy a kettős komplexet teljessé tegyük (pLAdenoV/pL), az adenovírussal támogatott transzfekció közepes értékeket ér el, vélhetően mivel hatásosan használjuk ki a kevés számú adenovírus-receptort. Ha azonban az adenovíruspolilizinnel komplexbe vitt DNS-t teljesen kondenzáljuk, és transzferrin-polilizin hozzáadásával egy hármas komplex (pL AdenoV/TfpL) keletkezése közben semlegesítjük, és a számtalan sejtfelületi transzferrinreceptor játékteret kap, a transzfekciós hatékonyság - mind a hatékony transzferrinkötődésnek, mind a vírus endoszomalitikus aktivitásának köszönhetően - legalább két további nagyságrenddel emelkedik (33. ábra).
c) Hármas DNS-komplexek a hepatociták közel
100%-ánál riportergén-kifejeződéshez vezetnek
A transzportrendszer hatékonyságának tesztelésére BNL CL.2 egérhepatocitákban a sejteket β-galaktozidáz riportergénnel fertőztük. A 34. ábra mutatja a β37
HU 218 846 Β galaktozidáz meghatározását a) transzferrinfekciónál klorokin jelenlétében, b) transzferrinfekciónál szabad dl312 adenovirus jelenlétében és c) adenovírus (dl312)polilizin-transzferrin-DNS hármas komplexekkel végzett transzfekciónál. Adenovírus hiányában a standard transzferrinfekciót követően csak kevés sejt fejezi ki a riportergént. A transzfekció százalékos aránya kevesebb mint 0,1%. Ha klorokint használunk, a százalékos arány körülbelül 0,2%-ra nő (34A. ábra). Szabad adenovírus jelenlétében a sejteknek körülbelül 5-10%-a fejezi ki a riportergént (34B. ábra), mialatt a hármas komplexek transzglutaminázzal módosított vírussal a legtöbb, ha nem az összes sejtnél génkifejeződéshez vezetnek (34C. ábra). Mivel a hármas komplexeket nagy hígításokban alkalmazhatjuk, általában nem következik be a szabad (inaktivált) adenovírus nagy adagjainál megfigyelt toxikus hatás. Azt azonban figyelembe kell venni, hogy a hármas komplexeknek - a szövetkultúrasejtek 100%-ának elérése céljából - nagy koncentrációban történő alkalmazásánál egy hasonló toxikus hatás észlelhető. A toxikus hatások oka a maradék virális génaktivitásban vagy a hozzáadott vírus endoszomalitikus tulajdonságaiban rejtőzhet, vagy lehet egyszerűen a bevitt gén magas kifejeződésének következménye,
d) Egy transzfekcióval bevitt riportergén hatása átmeneti, de nem szaporodó hepatocitákban hetekig eltartó
Hármas komplexeket (pLAdenoV/TfpL) állítottunk elő polilizin-adenovírussal és olyan módosított adenovírussal, amely még psoralennel is inaktiválva volt. Egy 2/3 részben egybefüggő hepatocitasejt-kultúrát a 34B. ábrán bemutatott kísérlethez hasonlóan, a pCMVL luciferáz riporterplazmiddal transzfekciónak vetettünk alá, és különböző időpontokban mértük a luciferázaktivitást. Amint az a 35. ábrából látható, a luciferázaktivitás 3 nap után - amikor a hepatocita-sejtkultúra egybefüggő lett, és a sejtek abbahagyták a szaporodást - lett a legmagasabb. A riportergén-kifejeződés fennmaradt a nem szaporodó sejtkultúrában, anélkül hogy a gén hordozására nézve szelekciót végeztünk volna, és legalább 6 hétig eltartott, különösen abban az esetben, amikor a hármas komplexben psoralennel inaktivált adenovírust alkalmaztunk.
24. példa
Csirke-adenovírus CELO alkalmazása a humán sejtekbe történő DNS-transzport felerősítésére
Ebben a példában a CELO csirke-adenovírust teszteltük az előző példákhoz hasonlóan, amelyekben a humán adenovírus 5 típust vizsgáltuk, hogy alkalmas-e humán HeLa-sejtekbe történő DNS-transzfer felerősítésére.
Csirke-adenovírust, CELO-t (Phelps törzs, FAV-l,7-szerotípus, csirkevesesejt-passzázs) használtunk. A vírust (2 ml) 20 mM HEPES (pH=7,3), 150 mM NaCl (HBS)+10% glicerin keverékével ekvilibrált, PD-10 gélszűrő oszlopon hajtottuk át, az eluátum 2 miét 20 μΐ 1 mM NHS-LC-biotinnal (Pierce) szobahőmérsékleten 3 óráig reagáltattuk. A biotinilezett vírust ezután 3x300 ml HBS+40% glicerin keverékével szemben 4 °C-on dializáltuk, és részletekben -70 °C-on tároltuk.
HeLa-sejteket (5xlO5 sejt/6 cm-es csésze) 2 ml
DMEM+2% FCS keverékében a polilizin- (pLys) vagy transzferrin-polilizin (TfpL) keverékekkel komplexbe vitt pCMVL plazmid 6 pg-jával 500 μΐ HBS-ben inkubáltunk (a komplexeket szobahőfokon 30 percig előinkubáltuk). A próbákat ezután a 36. ábrán megadott vírusmennyiségek jelenlétében a sejtekhez adtuk. Azoknál a próbáknál, amelyek a biotinilezett CELO-vírust tartalmazták, a megadott vírusmennyiséget a megadott mennyiségű sztreptavidin-polilizinnel (StrpL) 200 μΐ HBS-ben 30 percig szobahőfokon előinkubáltuk, mielőtt a pCMVL plazmid 6 pg-ját 100 μΐ HBS-ben hozzáadtuk. 30 perces szobahőmérsékleten történő inkubálás után a TipL-anyag megadott mennyiségét adtuk a sejtekhez 37 °C-on. 2 órával később 5 ml DMEM+10% FCS-t adtunk a sejtekhez, 24 óra múlva kinyertük a sejteket és előkészítettük a luciferázmeghatározáshoz.
Mint ahogyan a 36. ábra mutatja, a CELO-vírus szabad formában felerősítette a DNS-transzportot HeLasejtekbe (16. hasábok). Ha azonban a CELO-vírust biotinnal módosítottuk és sztreptavidinnel komplexbe vittük, azt találtuk, hogy a vírus mind transzferrin-polilizin kiegészítéssel, mind a nélkül a humán dl312 adenovírussal elérttel összehasonlítható mértékben erősíti fel a DNS-transzfert. HeLa-sejtek speciális sejtvonala magas kötési kapacitást mutat polilizin/DNS komplexekkel transzferrin nélkül (vesd össze a 36. ábra 1. és 4. próbáinak luciferázaktivitásait). Tehát a komplex felvételéhez elegendő a CELO-vírus bezárása egy polilizin-DNS komplexbe.
25. példa
Mioblasztok transzfekciója
a) Mioblasztok és miotubok transzfekciója DNS/transzferrin-polilizin komplexekkel szabad adenovírus és biotin-sztreptavidinen keresztül kapcsolt adenovírus jelenlétében
C2C12 mioblasztokat (ATCC Nr.: CRL 1772) [Science 230, 758-766 (1985)] és G8 mioblasztokat (ATCC Nr.: CRL 1456) „magas glükóztartalmú DMEM”+10% FCS táptalajban tenyésztettünk. A mioblasztkultúrákat körülbelül 5xl05 sejt/csésze összefüggő sejtrétegnél vetettük alá transzfekciónak. Miotubok tenyészetét állítottuk elő azáltal, hogy mioblasztokat 6 cm-es csészékbe kiszélesztettünk (körülbelül 5χ105 sejt/csésze), és amikor a sejtek összefüggő réteget alkottak, a táptalajt „magas glükóztartalmú DMEM”+2% lószérum keverékével cseréltük ki [Science 254, 1507-1509 (1991); Science 254, 1509-1512 (1991)]. A miotubok transzfekcióját 5-7 nappal később végeztük el. A transzfekciós komplexeket úgy állítottuk elő, ahogyan azt a 19. példában leírtuk, miközben a TfpL, StrpL és biotinilezett dl312 adenovírus megadott menynyiségeit alkalmaztuk. A sejteket a transzfekció után 20 órával kinyertük, és megmértük a luciferázaktivitást. A 37. ábrán megadott luciferázaktivitás az összes sejtpróbára vonatkozik. Megmutatkozott, hogy mind a mioblaszt-, mind a miotubkultúráknál magas transzfek38
HU 218 846 Β ciós hatékonyságot tudtunk elérni. A miotubok differenciálása után a transzfekciós hatékonyság kevesebb mint lóg értékre esett vissza (C2C12) vagy nem mutatott szignifikáns csökkenést (G8). A miotubok képződése a G8-sejtvonalnál kisebb frekvenciánál következik be, amely részben felelős lehet a kimutatható teljesítőképesség-csökkenés hiányáért a differenciált tenyészetben. A transzferrin és a transzferrinreceptor közötti kölcsönhatás szerepe a DNS-transzportban ennél a sejttípusnál nem volt lényeges. Mind a négy sejtkészítménynél csak gyenge DNS-transzport ment végbe TfpL/DNS komplexek szabad dl 312 adenovírus jelenlétében történő alkalmazásakor (1., 4., 7. és 10. hasábok). Kapcsolt vírus alkalmazásakor a transzfekció teljesítőképessége felerősödött (2., 3., 5., 6., 8., 9., 11. és 12. hasábok). Összehasonlítva a csak polilizin/StrpL-t és vírust tartalmazó, kombinációs komplexekkel elért géntranszfert olyan komplexek eredményeivel, amelyek a transzferrin-polilízint magukba záiják, a teljesítőképességnek kisebb mint 1 lóg növekedése adódott (vesd össze például a 2. nyomvonalat, ahol transzferrin nélkül, a 3.-kai, ahol transzferrin jelenlétében történt transzfekció). A csekély transzfekció szabad vírussal és az erős transzfekció kapcsolt vírus-komplexekkel mind transzferrin-polilizin jelenlétében, mind a nélkül azt sejteti, hogy ezeknél a sejteknél az adenovírus ligandumként szolgál, és kapcsolás nélkül a szabad vírus alig tud behatolni a sejtekbe, nem a produktív mennyiségben azonban a TfpL/DNS komplex belép (az ebben a példában alkalmazott pCMVL-DNS-t az ábrán pCLuc jelöléssel illetjük).
b) A transzfekciós gyakoriság hisztokémiai analízise miotubokban
C2C12 miotubkultúrákat állítottunk elő (5 χ 105 mioblasztsejtet 6 cm-es csészékbe kiszélesztettünk, miotubokra differenciáltuk), mint azt az a)-ban leírtuk. A szabad vírussal végzett próbáknál pCMVp-gal DNS-t (6 pg) 8 pg TfpL-lel 500 pl HBS jelenlétében komplexbe vittünk, és 2 ml DMEM/2% FCS-ben 18 pl dl 312 adenovírus (1 χ 1012 víruspartikula/ml) jelenlétében a sejtekhez adtuk. A kapcsolt vírussal végzett próbáknál komplexbe vittünk pCMVLacz DNS-t (6 pg) 500 pl HBS-ben 7 pg TfpL+800 ng StrpL+18 pl biotinilezett dl312 adenovírus (lxlO12 vírus/ml) keverékével, és ml DMEM/2% FCS-ben a sejtekhez adtuk. 24 órás inkubáció után a sejteket, mint azt a 15. példában leírtuk, megfestettük a β-galaktozidáz-aktivitás meghatározásához.
A β-galaktozidáz színmintái egybeestek azoknak a transzfekcióknak az eredményeivel, amelyeknél riportergén termékként luciferázt [lásd a)] alkalmaztunk. A miotubkultúrákban nagyon alacsony génkifejeződést kaptunk szabad vírus alkalmazása esetén, miközben a vírus DNS-hez való kötése magas génkifejeződési nívót eredményez. A négymagvú, kék színű Tubuli előfordulása mutatta egy gén sikeres transzferét ezekbe a differenciált sejtekbe szabad adenovírus jelenlétében.
c) DNS-transzfer primer egérmioblaszt- és egérmiotub-kultúrákba
Egy 4 hetes hím C57B1/6 egér két hátsó lábának nagy vázizomzatát sterilen, PBS-ben izoláltuk, és körülbelül 5 mm-es darabokra aprítottuk. A szövetet 20 ml PBS-ben szuszpendáltuk, körülbelül 2 percig hagytuk leülepedni, és a maradékot leszívtuk. Ezt a mosási műveletet 3-szor ismételtük. A szövetet ezután 3,5 ml PBS+0,5 ml tripszin/EDTA, 0,5 ml 1%-os (tömeg/térfogat) kollagenáz (2 Typ, Sigma) és 0,5 ml 1%>-os BSA (V frakció 4 mM CaCl2-ban) keverékével összekevertük, és 37 °C-on 30 percig gyakori óvatos rázogatás mellett inkubáltuk. A 30 perces inkubálás végén a maradék szövetet hagytuk leülepedni, a maradékot eltávolítottuk, és 5 ml DMEM+20% FCS-sel kevertük össze. A proteázzal történő inkubálást 3-4-szer ismételtük, amíg a szövet teljesen diszpergált állapotú nem lett. A sejtszuszpenziót ezután egy sejtszitán (Falcon) szűrtük át aggregátumok és szövetdarabkák eltávolítása céljából, és 500 xg mellett 15 percig centrifugáltuk. A sejtpelletet 10 ml DMEM + 20% FCS-ben reszuszpendáltuk, és eltávolítottuk a fibroblasztokat úgy, hogy a sejteket 60 perc időtartamra egy 15 cm átmérőjű, fedetlen szaporítócsészére szélesztettük ki. A meg nem tapadt sejteket azután óvatosan eltávolítottuk, és öt, lamininnal rétegzett 10 cm-es szövettenyésztő csészére, csészénként 15 ml DMEM+20% FCS keverékében szélesztettük. Az összefüggő sejtréteg elérése után (körülbelül 1 héttel később) a sejteket tripszinnel kezeltük, és csészénként körülbelül 1 χ 106 sejtet lamininnal rétegzett 6 cm-es csészére újraszélesztettünk. Miotubkultúrák képzése céljából körülbelül 5 nappal később (amikor a sejtek összefüggő réteget képeztek) a táptalajt DMEM+2%) lószérumra cseréltük ki, és egy héttel később transzfekciókat végeztünk. A mioblasztkultúrák transzfekcióját 6 cm-es csészékben körülbelül 80%-os összefüggő sejtrétegnél végeztük el. A lamininnal rétegzett sejtkultúralemezeket a következőképpen állítottuk elő: sejtkultúralemezeket steril vízben oldott 0,025 mg/ml polilizinnel (móltömeg: 30 000-70 000, Sigma) rétegeztünk szobahőmérsékleten 30 percig. A lemezeket 3-szor mostuk steril vízzel, és levegőn szárítottuk. Ezután a lemezeket 8 pg/ml laminin (EHS, Sigma) vizes oldatával egy éjszakán át rétegeztük. A lemezeket azután a sejtek kiszélesztése előtt 3-szor mostuk.
A transzfekcióhoz felhasznált DNS-komplexeket úgy állítottuk elő, hogy a psoralen/UV inaktivált, biotinilezett dl 312 adenovírus (a 19. példa szerint előállítva) megadott mennyiségét 150 pl HBS-ben meghígítottuk, 150 p HBS-ben oldott 1 pg StrpL-t adtunk hozzá, és végül szobahőfokon 30 percig inkubáltuk. Ezután minden próbához 6 pg pCMVL-t (az ábrán pCLuc-ként jelölve) tartalmazó 100 pl HBS-t adtunk, és további 30 percig szobahőfokon inkubáltuk. Lezárásként minden próbához 100 pl HBS-ben 7 pg TfpL-t adtunk, 30 percig szobahőfokon inkubáltuk, és azután a 6 cmes csészékben, 2 ml DMEM + 20% FCS-tartalmú mioblaszt- vagy miotubkultúrákhoz adtuk hozzá. 1 órás inkubálás után a táptalajt 5 ml DMEM+20% FCS-sel (mioblasztok), illetve DMEM+2% lószérummal (miotubok) pótoltuk, és a sejteket 48 órával később kinyertük a luciferázanalízishez. Az összes sejtpróba luciferázaktivitás-értékeit a 38. ábrán szemléltetjük.
HU 218 846 Β
26. példa
A mioblasztokba CELO-vírussal történő transzfer javítása lektinligandum alkalmazásával
a) dl 312 adenovírus és CELO-vírus összehasonlító analízise HeLa-sejtekben és C2C12 mioblasztokban HeLa-sejtek vagy C2C12 mioblasztok próbáit (5 χ 105 sejt/6 cm-es csésze) fertőztük 6 pg pCMVL-lel (az ábrán pCLuc-ként jelölve), amelyet előzőleg 1 pg StrpL/7 pg TfpL+5 pl biotinilezett dl312 adenovírus (lásd a 19. példát, 1 χ 1012 víruspartikula/ml) vagy 18 pl biotinilezett CELO-vírus (lásd a 24. példát 0,3 χ 1012 víruspartikula/ml) keverékével vittünk komplexbe. 20 órás inkubáció után kinyertük a sejteket, és előkészítettük a luciferázmeghatározáshoz. A 39. ábra mutatja minden összesített sejtpróba luciferázaktivitását.
HeLa-sejtek transzfekcióját összevethető hatékonysággal végeztük el humán dl312 adenovírus/StrpL/ /TfpL/DNS komplexek alkalmazásával, amelyek a sejtekbe vagy adenovírus-receptoron, vagy transzferrinreceptoron keresztül léphetnek be, vagy CELO-vírus/StrpL/TípL/DNS komplexekkel, amelyek a transzferrinreceptoron keresztül léphetnek be. Miközben azonban a DNS-transzfer C2C12 mioblasztokba dl312 adenovírus-komplexekkel hatékonyan elvégezhető volt, a CELO-vírus-komplexek ezekben a sejtekben rosszul működtek. Korábbi példák mutatták, hogy a transzferrinreceptor a kombinációs komplexek transzportjánál ezekben a sejtekben csak csekély szerepet játszik; vélhetően az adenovírus-receptor a fő belépési hely. A CELO-vírus gyenge aktivitását mioblasztokban tehát mind a CELO-vírusnak, mind a transzferrinnek a C2C12 mioblasztokon való gyenge kötődésére kellene visszavezetnünk.
b) C2C12 mioblasztok CELO-vírussal történő transzfekciójának javítása búzacsíra-agglutinin ligandumként való felhasználásával
Az a) szerint kapott gyenge transzport alapján egy új ligandumot választottunk ki a transzferrin helyettesítésére, nevezetesen a biotinilezett búzacsíra-agglutinint (2-4 mól biotin/mol fehérje; Boehringer Mannheim). Biotinilezett CELO-vírust állítottunk elő, mint ahogyan már leírtuk. 6 pg pCMVL+a megadott mennyiségű StrpL, TfpL, biotinilezett búzacsíra-agglutinin (biotinyliertes weizenkeimagglutinin=WGA-B) és CELOvírus-tartalmú komplexeket állítottunk elő a következők szerint. A vírust és a búzacsíra-agglutinint együtt hígítottuk meg 150 pl HBS-ben. Az StrpL-t ugyanígy 150 pl HBS-ben hígítottuk meg, a két oldatot összekevertük, és 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A 100 pl HBS-ben hígított DNS-t hozzáadtuk a StrpL/vírus/WGA oldathoz, ezt követte egy további 30 perces inkubálás szobahőfokon. Végül a TfpL-t 100 pl HBS-ben hozzáadtuk a keverékhez, és a próbát szobahőfokon újból 30 percig inkubáltuk. A komplexeket 2 ml DMEM+2% FCS-ben levő C2C12 mioblasztokhoz (5xl05 sejt/6 cm-es csésze) adtuk hozzá. Egy órával később 5 ml DMEM+10% FCS-t adtunk a sejtekhez, és 20 órával később előkészítettük a sejteket a lucíferáz aktivitás méréséhez. Minden összesített sejtpróba luciferázaktivitását (fényegységben) a 40. ábrán mutatjuk be (az ebben a kísérletben alkalmazott DNS pCMVL volt, amit az ábrán pCLuc-ként jelöltünk).
Vírus nélkül nagyon gyenge DNS-transzfert kaptunk mind búzacsíra-agglutininnel, mind nélküle (1. és 6. hasáb). Kiterjedtebb transzportot értünk el kapcsolt CELO-vírussal (2. hasáb), 16-szoros növekményt értünk el azonban, amikor a komplex WGA-B-t tartalmazott. A WGA mennyiségének növelése a komplexben (1 pg-ról 5 pg-ra) egy gyenge csökkenést okozott a transzferben (vesd össze a 3. és 4. hasábot), ugyanakkor a StrpL-tartalom növelése a komplexben (1 pg-ról 2 pg-ra) a transzfert kissé erősítette. Ezek az eredmények világosan mutatják, hogy a WGA-B mint ligandum a CELO-vírusokkal történő DNS-transzportot C2C12 mioblasztokban felerősíti.
d) A VIII. faktor kifejeződése C2C12 mioblaszt- és miotubkultúrákban
A mioblaszt- és miotubkultúrákat a fentiek szerint állítottuk elő. Transzfekciókat végeztünk egy plazmid 6 pg-jának felhasználásával, amely egy VIII. faktor (full length factor) cDNS-t tartalmazott [Natúré 312, 330-337 (1984); Biochemistry 25, 8343-8347 (1986)] és a szokásos komplexképzési előírás szerint vittük komplexbe 5 vagy 15 pl biotinilezett adenovírussal (mint megadtuk)+0,5 vagy 1 pg StrpL-lel és 7 vagy 6 pg TfpL-lel.
A DNS/vírus komplexeket 2% FCS/DMEM-ben vittük fel a sejtekre. 4 órás 37 °C-on történő inkubálás után minden csészéhez 3 ml friss DMEM+10% FCS-t adtunk. 18 órával később leszedtük a táptalajt a sejtekről és egy COATEST (KABI; Pharmacia) alkalmazásával, amely egy tesztrendszer nemzetközi standarddal mint referenciával a VIII. faktor meglétét vizsgáltuk. A VIII. faktor mennyiségeit 24 óra/1 χ 106 sejtben képződött egységekben megadva vittük fel a 41. ábrára.
27. példa
Adenovírus-fehéqe felhasználása a DNS-transzporthoz
Adenovírust (vad típus 300) szaporítottunk HeLasejtekben, tisztítottuk és mint a dl312 adenovírusnál leírtuk, biotinileztük. A vírus 1,2 ml-ét dializáltuk 3x300 ml, 5 mM MES (2-N-morfolino-etánszulfonsav) és 1 mM EDTA (pH=6,25) keverékével 4 °C-on 18 órán keresztül. Az anyagot ezután 30 percig 27 K mellett SW60 rotorban centrifugáltuk. A maradékot óvatosan eltávolítottuk, a pelletet HBS/40% glicerinben reszuszpendáltuk. A maradékhoz 20 mM HEPES-t (pH=7,4) és 150 mM NaCl-ot adtunk, és mind a pelletfrakciók (tartalmazzák a virális core-fehérjéket és a hexonkapszid fő mennyiségét; a 42. ábrán „core”), mind a maradék frakciók (tartalmazzák a vertexet; a 42. ábrán „vertex”) DNS-transzport-aktivitását megvizsgáltuk Movl3 egérfibroblasztokban [EMBO J. 11, 417-422 (1992)] vagy HeLa-sejtekben.
A komplexképzést a DNS-sel a következők szerint végeztük el: minden frakció megadott mennyiségét - a felszakított vírust centrifugálás előtt vagy az intakt vírust (pg fehérjében kifejezve, ahogyan a Bradford-féle méréssel meghatároztuk - 300 pl HBS-ben meghígítottuk. Sztreptavidin-polilizint (3 pg 50 pl HBS-ben) ad40
HU 218 846 Β tünk hozzá, amelyet egy 30 perces inkubálás követett szobahőmérsékleten. 6 pg pCMVL-t (az ábrán pCLucként jelölve) hígítottunk 100 pl HBS-ben, és 30 perces inkubációra az első oldathoz adtuk. Végül 100 pl HBSben oldott 2 pg TfpL-t adtunk hozzá, amelyet további 30 perces inkubáció követett. Azokban a próbákban, amelyeket csak TfpL-lel állítottunk elő, 170 pl HBSben oldott 8 pg TfpL-t 330 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-lel kevertünk össze 30 percig szobahőfokon. A megadott mennyiségű vírusfehérjét 300 pl HBS-ben hígítottuk és azután a TfpL/DNS komplexekhez adtuk. Ezután minden próbát 1 óra hosszára 5xl05 sejt/csésze, 2 ml DMEM/10% FCS-tartalmú sejtkultúrákhoz (vagy HeLa-sejtekhez, vagy Movl3 fibroblasztokhoz) adtuk. Ezután 5 ml, 10% FCS-tartalmú friss táptalajt adtunk hozzá, és 20 órával később a sejteket előkészítettük a luciferázaktivitás-méréshez. A kapott luciferázaktivitást (fényegységben) mind HeLa-sejtekre (A tábla), mind Movl3 fibroblasztokra (B tábla) a 42. ábra szemlélteti.
Mindkét sejttípusnál a DNS-transzfer-aktivitásnak egy dózisfüggő növekedése következett be a vertexffakcióval összeköttetésben (4-6. próbák mindkét táblán). Ha a TfpL/DNS komplexek a biotinilezett vírusfehérje ugyanazon mennyiségét tartalmazták sztreptavidin-polilizin nélkül, egy alapértékekhez közeli DNStranszportot (3. próba mindkét táblán) figyelhettünk meg.
28. példa
Felerősített géntranszfer galaktóz-ligandum konjugátumot tartalmazó hármas DNS-komplexek alkalmazásával
a) Influenzapeptid-konjugátumot tartalmazó hármas komplexek
A 13. és 14. példa megmutatta, hogy azok a polilizinnel konjugált peptidek, amelyek az influenzavírushemagglutinin ΗΑ-2-alegységének N-terminálisából levezetett szekvenciákat tartalmaztak DNS/transzferrin-polilizin komplexekben, a transzferrin-polilizin közvetítette géntranszfert lényegesen felerősítették.
Hasonló, a négyfogú galaktózligandum-polilizin konjugátumot és a polilizinnel módosított influenzapeptidet tartalmazó DNS-kombinációs komplexeket állítottunk elő oly módon, hogy a ligandum-polilizin konjugátumot a pCMVL DNS-plazmidhoz adtuk a DNS töltései felének semlegesítése céljából, és a maradék töltéseket arra használtuk, hogy a komplexeket influenzapeptid-polilizin konjugátummal töltsük fel. Ezeknek a DNS-komplexeknek a transzportja - amelyek a (gal)4 szintetikus ligandumot tartalmazták - BNL CL.2 hepatocitákba (a transzfekciókat a 6. g) példában leírtak szerint végeztük el) olyan luciferázgén-kifejeződést eredményezett (43. ábra), amely szignifikánsan magasabb volt, mint a transzferrinnel mint ligandummal kapott kifejeződés. A génkifejeződés több mint 500-szor magasabb volt annál a kifejeződésnél, amelyet a kontrollkísérletekben influenzapeptid nélküli DNS-komplexekkel, de azonos mennyiségű polilizinnel (43. ábra) kaptunk. A DNS-kombinációs komplexekkel kapott aktivitás is körülbelül 30-szor magasabb volt, mint a DNS/(gal)4pL komplexekkel, amelyekkel a sejteket klorokin jelenlétében inkubáltuk.
b) Adenovírus-konjugátumot tartalmazó hármas komplexek
A komplexeket a következők szerint állítottuk elő: 50 pl HBS-ben oldott biotinilezett dl 312 adenovírust (a 19. példa szerint előállítva; 2 pl, 6 pl vagy 18 pl; 1012 partikula/ml) 100 pl HBS-ben oldott sztreptavidin-polilizinnel (100 ng, 160 ng vagy 480 ng) kevertünk össze. 30 perces inkubálás után 200 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-t és további 30 perc után 150 pl HBS-ben 3,8 pg (gal)4pL-t (a 6. példa szerint előállítva) vagy 7 pg TfpL-t adtunk hozzá. A DNS-komplexoldatokat „magas glükóztartalmú” DMEM+2% FCS táptalajban szaporított, egyenként 300 000 sejt/6 cm-es csésze sűrűségű sejtkultúrákhoz (ATCC TIB73, ATCC TIB74, ATCC TIB75, ATCC TIB76) adtuk. Az ezt követő sejtkultúra-kezelési lépéseket és a luciferázmeghatározást úgy végeztük el, ahogyan azt az előző példákban leírtuk. A 44. ábrán látható génkifejeződési értékeket kaptuk (24 óra után).
29. példa
Géntranszfer B-limfoblasztoid B-sejtekbe
Humán lg- és antihumán Ig-polilizin konjugátumokat állítottunk elő a következők szerint, ahol a kapcsolást az irodalomból ismert módszerekhez hasonlóan diszulfidhidak bevezetésével, szukcinimidil-piridil-ditiopropionáttal történő módosítás (SPDP) [Biochem. Rés. Commun. 101, 599 (1981)] után végeztük el.
a) Anti-humán Ig-polilizin300 konjugátumok előállítása mg kecske-antihumán lg (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL, USA) HBSben készült oldatát (150 M NaCl, 20 mM HEPES, pH=7,8) 14 pl SPDP (Pharmacia) 5 mM etanolos oldatával elegyítettük. 10 órás szobahőmérsékleten való tárolás után egy Sephadex G 25 oszlopon gélszűrtűk (eluens: 100 mM HEPES, pH=7,3), ahol 30 nmol piridil-ditio-propionát-maradékokkal módosított 1,3 mg antihumán Ig-t kaptunk. Poli(L)-lizin300-at [átlagos polimerizációs fok 300 lizinmaradék (Sigma)] hasonlóan SPDP-vel módosítottunk, és ditio-treitollal való kezelés és azt követő gélszűrés után a szabad merkaptocsoportokkal módosított formába hoztuk. 0,3 ml HBS-ben oldott, 29 nmol merkaptocsoporttal módosított 12 nmol polilizin300 oldatát oxigén kizárása mellett a fent bevezetett módosított anti-humán Ig-vel összekevertük, és egy éjszakán át szobahőfokon állni hagytuk. A reakciókeveréket 5 M NaCl hozzáadása révén 0,6 M NaCl-tartalomra állítottuk be. A konjugátumok elválasztása ioncserélő kromatográfiával történt (Pharmacia, Mono S HR 5/5); 25 mM HEPES-sel (pH=7,3), szemben dializálva megfelelő, 4 nmol polilizin300-zal módosított 0,33 mg antihumán Ig-t (mólarány 2:1) tartalmazó konjugátumokat kaptuk.
b) Humán IgG-polilizin300 konjugátumok előállítása ml HBS-ben oldott 19,5 mg (122 nmol) antitest (Sigma 1-4506) oldatát 39 pl szukcinimidil-piridil-ditio41
HU 218 846 Β propionát (SPDP, Pharmacia) 10 mM etanolos oldatával elegyítettük. 2,5 órás szobahőfokon tartás után egy Sephadex G 25 oszlopon gélszűrtük (eluens: 100 mM HEPES, pH=7,9), ahol 252 nmol piridil-ditio-propionátmaradékokkal módosított 19 mg (119 nmol) humán IgG-t kaptunk. Poli(L)-lizin300-at [átlagos polimerizációs fok 300 lizinmaradék (Sigma)] hasonlóan SPDP-vel módosítottunk és ditio-treitollal való kezelés és azt követő gélszűrés után a szabad merkaptocsoportokkal módosított formába hoztuk. 1 ml HBS-ben oldott, 282 nmol merkaptocsoporttal módosított 119 nmol polilizin300 oldatát oxigén kizárása mellett a fent bevezetett módosított humán IgG-vel összekevertük, és egy éjszakán át szobahőfokon állni hagytuk. A reakciókeveréket 5 M NaCl hozzáadása révén körülbelül 0,6 M NaCl-ra állítottuk be. A konjugátumok elválasztása ioncserélő kromatográfiával történt (Mono S, Pharmacia, 50 mM HEPES, pH=7,3, sógradiens 0,6-3 M NaCl); HBS-sel (pH=7,3) szemben dializálva a megfelelő, 90 nmol polilizin300zal módosított 9 mg (57 nmol) antitestet (mólarány 1,6:1) tartalmazó konjugátumokat kaptuk.
c) Komplexképzés és transzfekció
A komplexeket a következők szerint állítottuk elő: 50 pl HBS-ben oldott biotinilezett dl312 adenovírust (30 pl; 1012 partikula/ml) 100 μΐ HBS-ben oldott sztreptavidin-polilizinnel (800 ng) kevertünk össze; 30 perces inkubálás után 200 μΐ HBS-ben oldott 9 pg pCMVL-t adtunk hozzá. További 30 perc után 5,1 pg polilizin (pLys450), 10,2 pg TfpL, 12 pg humán IgGpolilizin konjugátum vagy 10 pg antihumán Ig-polilizin-konjugátum 150 pl HBS-ben készült oldatát adtuk hozzá. A DNS-komplexeket egyenként 106 B-limfoblasztoid-sejthez adtuk {a sejteket humán perifériás mononukleáris vérsejtekből Epstein-Barr-vírussal való halhatatlanná tétel révén [Lymphocytes, a Practical Approach, G. G. B. Klaus, Ed., IRL Press Oxford, 149-162 (1989)] nyertük, és 24 bemélyedést tartalmazó lemezeken 1 ml RPMI 1640+2% FCS táptalajon tenyésztettük}. A sejtkultúra további menete és a luciferázmeghatározás az előző példákban leírtakhoz hasonlóan történt. A kapott génkifejeződés-értékeket (luciferázaktivitás fényegységben) a 45. ábrán mutatjuk be.
30. példa
DNS-transzport transzferrin-polilizinnel szabad és konjugált rhinovírus jelenlétében
a) HRV-2 rhinovírus készítése
HRV-2 rhinovírust Skem és munkatársainak leírása alapján állítottunk elő, és tisztítottuk [Virology 136, 125-132(1984)].
Rhinovírus 400 pl-es oldatát (körülbelül 30 pg) HBS (150 mM NaCl/ 5 mM HEPES, pH=7,9)/10% glicerinben 10 nmol NHS-LC-biotinnal (Pierce 21335) kezeltük. 3 órás szobahőfokon történő inkubációt követően a vírust HBS/40% glicerinnel szemben végzett megnyújtott dialízissel 4 °C-on elválasztottuk a be nem épült biotintól.
Fényérzékeny rhinovírust, amelyet akridin-narancs jelenlétében tenyésztve állítottunk elő [Virology 139, 346-357 (1984)], inaktiváltunk.
b) A DNS-komplexek előállítása és transzfekciók
i) Transzferrin-polilizin/DNS komplexeket állítottunk elő úgy, hogy 330 pl HBS-ben (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH=7,3) oldott 6 pg pCMVL plazmidDNS-t 170 pl HBS-ben oldott 8 pg TfpL290-nel kevertünk össze. A DNS-komplexeket 1,5 ml táptalajjal (DMEM+2% FCS) és 0,14-3,5 pg HRV-2 rhinovírussal (vagy inaktivált HRV-2-vel) kevertük össze. A keveréket NIH3T3-sejtekre vittük (300 000 sejt/6 cmes csésze). 4 órával később a transzfekciós táptalajt 4 ml friss táptalajjal (DMEM+10% FCS) egészítettük ki. A sejteket 24 óra múlva kinyertük, és luciferázaktivitásra vizsgáltuk azokat, mint ahogyan korábban már leírtuk (46A. ábra).
ii) Transzferrin-polilizin és rhinovírus-polilizin konjugátumokat tartalmazó DNS-kombinációs komplexeket állítottunk elő a következők szerint. Biotinilezett HRV-2 rhinovírus (3, 5 pg) 100 pl HBS-ben készített oldatát 100 pl HBS-ben oldott 1 pg StrpL-lel kevertük össze (más víruskoncentrációkat a megfelelő részekkel kevertünk). 30 perces szobahőfokon tartás után az oldatot 150 pl HBS-ben oldott 6 pg plazmidDNS-sel kevertük össze, és további 30 percig szobahőfokon inkubáltuk, és azután 150 pl HBS-ben oldott 6 pg TfpL290-nel kevertük. A DNS-komplexeket 1,5 ml táptalajjal (DMEM+2% FCS) kevertük össze, és NIH3T3-sejtekhez (300 000 sejt/6 cm-es csésze) adtuk. A kultúrák további kezelését és a luciferázmeghatározást az i)-ben leírtak szerint végeztük el (46B. ábra).
31. példa
HeLa-sejtek transzfekciója ionosán kötött adenovírust tartalmazó kombinációs komplexekkel
Komplexképzés A). A DNS-komplexeket úgy állítottuk elő, hogy először 30 pl dl312 adenovírust (körülbelül 109 PFU) 1 pg polilizinnel (pLys450; átlagos lánchossz 450 lizinmonomer) 170 pl HBS-ben kevertünk össze, és azután 30 perces szobahőfokon tartás után 170 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-sel elegyítettük. További 30 perces inkubálás után a komplexeket 170 pl HBS-ben oldott 9 pg TfpL190-nel kevertük össze. A komplexkeverék egy részletét (10%=50 pl oldat, 600 ng DNS; vagy 1%=5 pl oldat, 60 ng DNS) 1,5 ml DMEM + 2% FCS-sel meghígítottuk, és 300 000 HeLa-sejthez adtuk. 4 óra elteltével 2 ml DMEM+20% FCS-t adtunk hozzá. A 24 óra utáni sejtkinyerés és luciferázmeghatározás a szokásos módon történt. Az összkivonatnak megfelelő luciferázaktivitás 29 115 000 fényegységet (600 ng DNS esetén) és 1 090 000 fényegységet tett ki (60 ng DNS esetén).
Komplexképzés B) (kontrollkísérlet). A DNS-komplexeket úgy állítottuk elő, hogy először 170 pl HBSben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t 170 pl HBS-ben oldott 1 pg polilizinnel (pLys450) és 30 perces szobahőmérsékleten tartás után végül 170 pl HBS-ben oldott 9 pg TfpL190-nel kevertünk össze. További 30 perces inkubálás után a komplexeket 30 pl dl 312 adenovírussal (körülbelül 109 PFU) elegyítettük. A komplexkeverék egy részletét (10% = 50 pl oldat, 600 ng DNS; vagy 1%=5 pl oldat, 60 ng DNS) 1,5 ml DMEM+2%
HU 218 846 Β
FCS-sel meghígítottuk, és 300 000 HeLa-sejthez adtuk. 4 óra elteltével 2 ml DMEM+20% FCS-t adtunk hozzá. A 24 óra utáni sejtkinyerés és luciferázmeghatározás a szokásos módon történt. Az összkivonatnak megfelelő luciferázaktivitás 405 000 fényegységet (600 ng DNS esetén) és 200 fényegységet tett ki (60 ng DNS esetén).
32. példa
DNS/adenovírus/transzferrin-polilizin komplexek helyi beadása patkányok májába
a) Közvetlen injektálás
A DNS-komplexeket a 19. példában leírtak szerint állítottuk elő. A komplexek 200 pl dl312 adenovírust, 6,4 pg sztreptavidin-polilizint, 48 pg pCMVL-t és 48 pg TfpL290-et tartalmaztak 20 000 pl össztérfogatú HBS-ben. Egy hím Sprague-Dawley-patkányt (testtömeg: 240 g) avertinnel elaltattunk, és egy 4 cm hosszú laparotómiát végeztünk. A komplexek injektálása 2 perces időközökben történt a bal oldali májlebenybe. Ezután a laparotómiás sebet rétegenként összezártuk. A patkányt 48 órával a komplexek injektálása után éteranesztéziában leöltük és a máj különböző mintáiból luciferázkifejeződést mértünk. Az injektálás területéből készült májhomogenizátum 5615 fényegység/mg fehérjetartalom-értéknek adódott; az ossz aktivitás 370 600 fényegységet tett ki. Az injektálás helyétől távol eső májrészekben nem volt mérhető luciferázaktivitás.
b) A komplexek beadása a májba az epevezeték-rendszeren keresztül
A komplexeket a következők szerint állítottuk elő: 200 pl HBS-sel hígított 200 pl biotinilezett dl312 adenovírust 400 pl HBS-ben 6,4 pg sztreptavidinnel módosított polilizinnel 30 percig szobahőfokon inkubáltunk. Utána 800 pl HBS-ben 48 pg pCMVL-t adtunk hozzá. 30 perces inkubálás után 900 pl HBS-ben 48 pg TfpL-t adtunk hozzá. A komplexek felhasználásához egy hím Sprague-Dawley-patkányt (testtömeg: 250 g) avertinnel elaltattunk, és a hasat egy mediánvágással megnyitottuk. A belet a test bal oldalára helyeztük, és 1 ml-es fecskendővel és tömlővel ellátott 27 G tűt vezettünk be az epevezetékbe. A komplexek injektálása 4 percig tartott. Ezután a tűt kihúztuk az epe vezetékből, és az injektálás helyét egy fibrinragasztóval (Immuno) pecsételtük meg. A hasi sebet varrással és fémkapcsokkal zártuk le. 30 óra elteltével leöltük a patkányt, és a különböző májlebenyekből vett mintákat luciferázkifejeződésre vizsgáltuk. A luciferázaktivitás csúcsértéke 19 000 fényegység/mg fehérje volt; a számított összkifejeződés a máj egészében 2,7 χ 106 fényegység közelében volt.
33. példa
DNS/adenovírus/TfpL komplexek beadása egerek felduzzasztott farokvénájába
A komplexeket úgy készítettük el, ahogyan azt a 19. példában leírtuk. A komplexek 45 pl dl312 adenovírust, 0,8 pg sztreptavidin-polilizint, 6 pg pCMVL-t és 24 pg mTfpL290-et tartalmaztak 150 pl HBS-össztérfogatban. A komplexeket egy avertinnel elaltatott hím C3H/He egér farokvénájába (kor: 2 hónap) injektáltuk. Közvetlenül az injekció végén a farokvénát a proximális és disztális farokvégeken összenyomtuk úgy, hogy a komplexoldatot a komprimálás alatt (25 perc) a beoltott farokrészben visszatartsuk, és ne tudjon a vérrel kisodródni. 48 órával az oltás után az egeret a nyak kitekerésével leöltük, és az injektált farokvénát kipreparáltuk. A luciferázkifejeződést a farokrészlet homogenizátumában mértük. Ez 2600 fényegység/3 cm farokvéna luciferázaktivitásnak adódott.
34. példa
Primer humán melanómasejtek transzfekciója
a) Transzfekció adenovírus-polilizin/transzferrin-polilizin kombinációs komplexekkel
Primer melanómasejteket izoláltunk egy beteg sebészetileg eltávolított melanómájából. A daganatot mechanikailag aprítottuk RPMI 1640 sejtkultúra-táptalajban 5% FCS, 2 mM glutamin és antibiotikumok kiegészítésével, és a szövetdarabkákat egy acélszitán nyomtuk keresztül. Ezután többszöri centrifugálással és reszuszpendálással mostuk a daganatsejteket, és T25 tenyésztőpalackokba szélesztettük. A daganatsejtek izolálása után 24 órával következett a transzfekció hármas komplexekkel, amelyek a következőkből álltak: 3 pl, 9 pl vagy 27 pl biotinilezett dl312 adenovírus (1 χ 1012/ml), 0,5 pg sztreptavidin-polilizin, 6 pg pCMVL és 7 pg TfpL290 (27 pl adenovírus esetében: 1 pg sztreptavidin-polilizin és 6 pg TfpL290) 500 pl HBS össztérfogatban. A transzfekció után 36 órával kinyertük a sejteket, és megmértük a luciferázaktivitást (fényegységben) (lásd a 47. ábrát; a felső oszlop mutatja a szuszpenzió sejtjeivel kapott eredményeket, az alsó a megtapadt sejtek eredményeit).
b) Transzfekció adenovírus-polilizin/low density lipoprotein-polilizin kombinációs komplexekkel
i) Az LDL-polilizin konjugátumok előállítása: 10 mg (14,3 nmol) LDL (Low Density Lipoprotein, Sigma, L-2139, molekulatömeg 3 500 000, részecskeátmérő körülbelül 26 nm) 2 ml HBS-ben készített oldatát 143 pl SPDP (1,43 mól; Pharmacia) 10 mM etanolos oldatával elegyítettük, és 2 órán át reagáltattuk szobahőmérsékleten. Sephadex G25 oszlopon (14x140 mm) HBS-sel gélszűrve körülbelül 10 mg, 0,70 pmol piridilditio-propionát-maradékokkal módosított LDL 3,2 ml oldatát kaptuk. Az oldatot 1,2 ml 5 M NaCl-dal elegyítettük, hogy elkerüljük az ezután következő polilizin hozzáadásakor egyébként bekövetkező precipitációt. A 300 monomer átlagos lánchosszúságú poli(L)-lizint, mint már leírtuk, SPDP-vel módosítottuk és ditiotreitollal való kezelés és azt követő gélszűrés segítségével a merkaptocsoportokkal módosított formába hoztuk. A fent leírt módosított LDL-oldatot 4 ml 2 M NaCl+0,5 M HEPES (pH=7,9) keverékében oldott, 0,76 pmol merkaptocsoporttal módosított 0,33 pmol polilizin300-zal kevertük össze argonatmoszférában, és 48 óráig állni hagytuk szobahőfokon. A reakcióoldatot steril vízzel 32 ml-re hígítottuk [NaCl-koncentráció körülbelül 0,5 M) és ioncserélő kromatográfiával (Biorad Macroprep S, 10 x 100 mm, 20 mM HEPES (pH=7,3),
HU 218 846 Β gradiens 0,2-3 M NaCl] bontottuk fel. A termékfrakciókat, amelyek 1,8 M és 2,2 M sókoncentráció között eluáltak, összegyűjtöttük. HBS-sel szemben dializálva 190 nmol polilizinnel (megfelel a szabad polilizinbázis-forma 7,5 mg-jának) módosított 2,35 mg (3,4 nmol) LDL-ből álló konjugátumokat kaptunk. Ez az LDL-részecskék egy átlagos módosításának felel meg körülbelül 55 polilizinlánccal.
ii) Komplexképzés és transzfekció: 18 pl biotinilezett dl312 adenovírus-készítményt HBS-sel 100 pl-re hígítottunk. 1,2 pg sztreptavidin-polilizint HBS-sel 100 pl-re állítottunk be, és összekevertük a 100 pl víruskészítménnyel. 30 perc eltelte után 150 pl, 6 pg pCMVL-t tartalmazó HBS-sel kevertük össze. További 30 perc után 300 pl HBS-ben 4 pg LDLpL-t (polilizintartalom: 20 pg) adtunk hozzá. Az így előállított oldatot 1,5 ml DMEM-mel (10% FCS) kevertük, és 3 χ 105 primer melanómasejthez adtuk [az a)-ban leírtak szerint előállítva és HMM1 és HMM4 jelöléssel ellátva], amelyek egy 6 cm átmérőjű sejttenyésztő csészében voltak. A további sejtkultúra-kezeléseket és luciferázméréseket úgy végeztük el, ahogyan azt az a) alatt leírtuk. A génkifejeződés a 48. ábrán látható: A) mutatja a HMM1 melanómasejtekkel kapott eredményeket; valamennyi kísérletet AdpL-konjugátumokkal végeztük el, amelyet az ábrán külön nem említünk. B) mutatja a HMM4 melanómasejtekkel kapott eredményeket; valamennyi kísérletet AdpL-konjugátumokkal végeztük el, de ezt csak az utolsó hasábnál említjük külön (a dl 312/16 jelölés a speciális víruspreparátumra vonatkozik). A 2. hasáb szemléltette kísérletben az LDL-t 25szörös fölöslegben vittük be, amely az LDL-receptorok körüli versengés miatt lecsökkent géntranszfer-hatékonyságot eredményezett.
35. példa
Primer humán fibroblasztok transzfekciója
Humán bőrbiopsziákat tettünk DMEM-et, 2 mM glutamint, 20% FCS-t és antibiotikumokat tartalmazó táptalajra 6 cm-es Petri-csészébe. Ezután a biopsziákat sebészkéssel alaposan felaprítottuk, és 3 ml táptalaj jelenlétében 5 napig tenyésztettük. Ezután a sejteket friss táptalajjal (vesd össze fent) mostuk, és további 7 napig tenyésztettük. A tenyésztési idő lejárta után a sejteket tripszinnel kezeltük, és új Petri-csészében elkülönítve tenyésztettük. Amint a sejtek majdnem összefüggő réteget alkottak, újból tripszinnel kezeltük, és lefagyasztva tároltuk a transzfekcióig. A transzfekcióhoz a sejteket felengedtük, 6 cm-es Petri-csészékbe kiszélesztettük, és 2 mM glutamint, 10% FCS-t és antibiotikumokat tartalmazó DMEM-ben tenyésztettük. A konjugátumokat a transzfekcióhoz a következőképpen állítottuk elő: 3 pl, 10 pl, 20 pl és 30 pl biotinilezett dl312 adenovírust 0,1 pg, 0,3 pg, 0,5 pg és 0,8 pg sztreptavidin-polilizinnel 150 pl HBS-ben 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Ezután 170 pl HBS-ben oldott pCMVP-gal plazmid 6 ug-ját adtuk hozzá, és a keveréket további 30 percig inkubáltuk. Utolsó lépésként a 3 pl dl 312 adenovírust tartalmazó konjugátumokhoz 7,8 pg TfpL-t, a 10 pl dl312-t tartalmazókhoz 7 pg TfpL-t, a 20 pl és 30 pl dl 312-t tartalmanó konjugátumokhoz pedig 6 pg TfpL-t adtunk 170 pl HBS-ben. 30 perces inkubációs idő után a konjugátumokat 2 ml, 2 mM glutamin-, 2% FCS- és antibiotikumtartalmú DMEM-ben fölvittük a sejtekre, és 4 órát inkubáltuk 37 °C-on. Ezután eltávolítottuk a táptalajt, és a szaporítást 37 °C-on 2 mM glutamint, 10% FCS-t és antibiotikumokat tartalmazó DMEM-ben folytattuk. 48 óra után meghatároztuk a β-galaktozidáz-kifejeződést, mint ahogyan az előző példákban leírtuk.
A 3 pl dl312-tartalmú konjugátumokkal történő transzfekciónál a sejtek 14%-a mutatott β-galaktozidáztermelést, 10 pl dl312-nél 32%, 20 pl dl312-nél 39% és 30 pl dl312-nél 64% pozitív sejtet kaptunk.
36. példa
Géntranszfer patkányok légúti hámsejtjeibe in vivő kombinációs komplexek segítségével
a) TfpL/AdpL kombinációs komplexek előállítása
Humán transzferrin-polilizin-DNS komplexeket (hTfpL) állítottunk elő 150 pl HBS-ben (150 mM NaCl/20 mM HEPES, pH=7,3) oldott 8 pg transzferrinpolilizin (Serva Biochemical) és 350 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS kombinációjával, és 30 percig inkubáltuk szobahőfokon. Adenovírus-polilizin konjugátumokat állítottunk elő, mint ahogyan a 19. c) példában leírtuk; psoralen/UV inaktivált adenovírust használtunk fel. A hTfpL/AdpL kombinációs komplexeket a 23. c) példában található előírás szerint készítettük el.
b) A komplexek in vivő beadása a légcsövön keresztül
Ezekhez a kísérletekhez a Sigmodon hispidus („Cotton Rat”) patkányfajt használtuk, amelyről bebizonyosodott, hogy a humán adenovírus okozta tüdőbetegségek szemléltetésére alkalmas állatmodell [J. Infect. Dis. 150, 92-97 (1984)]. Az állatokat metoxi-fluránnal altattuk el. A nyak hasi oldalán ejtett függőleges vágással a légcsövet csonkolva kipreparáltuk. A komplexeket (250-300 pl; 3 pg plazmid-DNS) a ferdén 45°-os szögben lefektetett állatoknak láthatatlanul, közvetlenül a légcsövébe injektáltuk. A beadást követően a 49. ábrán megadott időpontokban az állatokat CO2-dal megöltük, és a légcsövet és a tüdőt en bloc kinyertük, miután in situ hideg foszfátpufferrel készült konyhasóoldattal (PBS) átmostuk. A luciferázteszthez a tüdőszövetet extrakciós pufferben homogenizáltuk, a lizátumot összfehéijetartalomra standardizáltuk és a luciferázgén-kifejeződést a leírtak szerint mértük. A megadott fényegységek a tüdőlizátumokból kapott 1250 pg összfehérjére vonatkoznak. A kísérleteket egyenként 3-4-szer végeztük el, az eredményeket középértékek±SEM-ként mutatjuk be.
37. példa
Géntranszfer nem virális endoszomalitikus anyag alkalmazásával
a) Membránt felszakító peptidek szintézise
i) Peptidszintézis. A peptidet egy automatikus szintetizálón (ABI 431 A) rögzített fázisú eljárással p-alkoxi-benzil-alkohol-gyanta (0,97 mmol/g) mint rögzített fázis és Fmoc-védett aminosavak felhasználásával
HU 218 846 Β állítottuk elő. A karboxiterminális aminosavat a szimmetrikus anhidriden keresztül kötöttük a gyantához. A következő aminosavakat az 1-hidroxi-benzotriazol-diciklohexil-karbodiimid-módszerrel kapcsoltuk. A következő oldalláncvédő csoportokat alkalmaztuk: (Trt)Asn, (Trt)Cys [EALA és GLF esetében (tBu)Cys], (t-Bu) Glu, (Trt)His, (T-Bu)Ser.
A peptidek szekvenciái a következők voltak:
EALA (5. számú szekvencia): Trp-Glu-Ala-Ala-LeuAla-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-His-LeuAla-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-Leu-AlaAla-Gly-Gly-Ser-Cys
GLF (6. számú szekvencia): Gly-Leu-Phe-Gly-AlaLeu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-HisLeu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-AlaLeu-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys
GLF-II (7. számú szekvencia): Gly-Leu-Phe-Gly-AlaLeu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-AlaLeu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-AlaLeu-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys
GLF-delta (8. számú szekvencia): Gly-Leu-Phe-GluLeu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-AlaLeu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-AlaLeu-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys
EALA-Inf (9. számú szekvencia): Gly-Leu-Phe-GlyAla-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-GlyLeu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-AlaLeu-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys
EALA-P50 (10. számú szekvencia): Gly-Leu-PheGlu-Ala-Ile-Glu-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-GluGly-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-GluAla-Leu-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys
P50 (11. számú szekvencia): Gly-Leu-Phe-Glu-AlaIle-Glu-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-MetIle-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys
A peptideket elválasztottuk a gyantától, és az oldalláncvédő csoportokat a (t-Bu)Cys kivételével a 100 mg peptiddel feltöltött szilárd fázisnak 3 ml, fenol/etánditiol/tioanizol/víz/trifluor-ecetsav 0,75:0,25:0,5: :0,5:10 keverékkel 1,5 óráig szobahőfokon történő kezelése révén távolítottuk el. A nyerspeptideket éterben kicsapattuk, és 2-szer mostuk. Az St-Bu-val védett EALA és GLF peptideket kis mennyiségű 1 M trietilammónium-bikarbonátban (TEAB), pH=8, oldottuk 100 mM TEAB-ra meghígítottuk és a továbbiakban reverz fázisú HPLC-vel egy Nucleosil 500-5C4 oszlopon tisztítottuk (0,1% TFA/acetonitril gradiens), mindkét peptid körülbelül 50% acetonitrilnél eluált. A peptidek szabad Cys-SH formáját úgy kaptuk meg, hogy a Trt-Cys-peptidekről ugyanúgy távolítottuk el a védőcsoportokat, mint ahogyan fent leírtuk. A nyerspeptideket (5 mg) 1 μΐ β-merkapto-etanolt tartalmazó 100 μΐ, 100 mM TEAB (pH=8) oldatában oldottuk, és gélszűréssel (Sephadex G-25, 100 mM TEAB, 0,5 mM EDTA), majd fagyasztva szárítással vagy ioncserélő kromatográfiával (Mono Q Pharmacia, 20 mM HEPES, pH=7,3, gradiens 0-3 M NaCl; a peptid 1,5 M NaClnál eluál) tisztítottuk.
ii) Módosítás N-(hidroxi-etil)-maleimiddel. A GLFdelta, GLF-II, EALA-Inf, EALA-P50 és P50 peptidek
C-terminális SH-csoportját a gélszűrés (Sephadex G-25, 20 mM HEPES, pH=7,3, 0,5 mM EDTA) utáni szabad SH formából N-(hidroxi-etil)-maleimid 1,3-10-szeres moláris fölöslegével történő reakció révén (1 óra szobahőfokon) blokkoltuk. A fölösleges maleimidet gélszűréssel (Sephadex G-25, 100 mM TEAB, pH=8) távolítottuk el, és a módosított peptideket (GLFdelta-mal, GLF-II-mal, EALA-Inf-mal, EALA-P50-mal és P50-mal) fagyasztva szárítás után trietil-ammóniumsók formájában kaptuk meg.
iii) Módosítás 2,2’-ditio-bisz-piridinnel. A szabad
SH-peptideket 10 ekvivalens 2,2’-ditio-bisz-piridinnel (20 mM HEPES, pH=7,9, 0,5 mM EDTA) egy éjszakán át szobahőfokon reagáltattuk. A fölösleges reagenst gélszűréssel (Sephadex G-25, 100 mM TEAB, pH = 8) vagy ioncserélő kromatográfiával (Mono Q Pharmacia, 20 mM HEPES, pH=7,3, gradiens 0-3 M NaCl; a peptid 1,5 M NaCl-nál eluál) távolítottuk el, hogy megkapjuk a (2-piridil-tio-)-Cys-peptideket (GLF-delta-SSPy, GLF-II-SSPy, EALA-Inf-SSPy, EALA-P50-SSPy és P50-SSPy).
iv) A peptidek dimerizálása. A P50 homodimeijét (P50 dim) állítottuk elő azáltal, hogy a P50-Cys-(2piridil-tio) és P50-Cys-SH ekvimoláris mennyiségeit 20 mM HEPES-ben (pH=7,3) 3 napig szobahőmérsékleten reagáltattuk. A reakciókeveréket egy Mono Q oszlopon választottuk el (HR-5/5 Pharmacia, 20 mM HEPES (pH=7,3), gradiens 0,09-3 M NaCl; a P50dimer 1,1 M NaCl-nál eluált).
b) A liposzómák áteresztőképességének meghatározása (Liposomes Leakage Assay)
A szintetikus peptideknek azon tulajdonságát, hogy képesek a liposzómák felszakítására, olyan fluoreszcens színanyagnak a liposzómából való kilépése segítségével mértük, amely kalceinnek önkioltó koncentrációjával van telítve. A liposzómákat REV-módszerrel (reverz fázisú bepárlás) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 4194-4198 (1978)] állítottuk elő 100 mM kalcein, 375 mM Na+, 50 mM NaCl, pH=7,3 vizes fázist alkalmazva és egy 100 nm-es polikarbonátszűrőn [Biochim. Biophys. Acta 1061, 297-303 (1991)] keresztül extrudáltuk egységes nagyságeloszlás elérése céljából. A liposzómákat Sephadex G-25 oszlopon, izoozmotikus puffer (200 mM NaCl, 25 mM HEPES, pH=7,3) segítségével gélszűréssel választottuk el a be nem épült anyagoktól. Az áteresztőképesség méréséhez (leakage assay) a törzsoldatot (6 μΐ/ml) különböző pH-értékeknél hígítottuk 2x assay-pufferben (400 mM NaCl, 40 mM Na-citrát). Egy 100 μΐ-es részletet adtunk a peptid egy vizes sorozathígítmányának 80 μΐ-éhez 96 bemélyedést tartalmazó mikrotiterlemezen (a lipid végső koncentrációja: 25 μΜ) és 30 perces szobahőfokon történő inkubálás után 600 nm-en (gerjesztés 490 nm-nél) vizsgáltuk a kalceinfluoreszcenciát egy mikrotiterlemez-fluoreszcens fotométerrel. A 100%-os felszakításnak megfelelő értéket 1 μΐ 10%-os Triton X-100 oldat hozzáadásával kaptuk meg. A „leakage” egységeket a peptidkoncentráció reciprokaként vettük számításba, amelynél 50%-os felszakítást vettünk figyelembe (azaz azt a térfogatot a liposzómaoldat μΐ-ében,
HU 218 846 Β amely pg peptidre vonatkoztatva 50%-ban lízist szenved). A 20 egység alatti értékeket extrapoláltuk. A liposzómák felszakítására irányuló meghatározások eredményeit az 50. ábrán mutatjuk be. A legmagasabb pHspecifikus aktivitást GLF és EALA peptidek mutatták.
c) Az eritrociták lízisének meghatározása (Erythrocytes Lyse Assay)
Friss humán eritrocitákat többször mostunk HBSsel és megfelelő pH-értékű 2x assay-pufferben (300 mM NaCl, 30 mM Na-citrát) 6,6 χ 107/ml koncentrációnál reszuszpendáltuk. Egy 75 pl-es részletet adtunk a peptid egy vizes sorozathígítmányának 75 pléhez 96 bemélyedést tartalmazó mikrotiterlemezen (Konus-típus), és 1 órán keresztül 37 °C-on állandó rázás közben inkubáltuk. A nem lizált eritrociták centrifugálással (1000 rcf, 5 perc) történő eltávolítása után a maradék 100 pl-ét egy új mikrotiterlemezre vittük át, és 450 nm-en (alapvonal-kiigazítás 750 nm-en) meghatároztuk a hemoglobinabszorpciót. 100-os lízist 1 pl 10%-os Triton X-100 oldat centrifugálás előtti hozzáadásával határoztunk meg. A hemolitikus egységeket a peptidkoncentráció reciprokaként vettük számításba, amelynél 50%-os lízist vettünk figyelembe (azaz azt a térfogatot az eritrocitaoldat pl-ében, amely pg peptidre vontkoztatva 50%-ban lízist szenved). A 3 hemolitikus egység alatti értékeket extrapoláltuk. Az értékeket az 51. ábrán szemléltetjük. Látható, hogy a P50 dim és az EALA-P50 peptidek rendelkeztek a legmagasabb pHspecifikus aktivitással, a sejtek lízise és/vagy nagyobb molekulák, mint a hemoglobin kiengedése tekintetében. A P50-mal és P50-SSPy P50 monomerek aktivitása alacsonyabb volt. Melittin mutatta a legmagasabb aktivitást, ez azonban nem specifikus a savas pH-értékre.
d) DNS kombinációs komplexek előállítása
DNS-komplexeket úgy állítottunk elő, hogy először
150 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t 150 pl HBS-ben oldott 4 pg TípL290-nel kevertünk össze, és végül 30 perces szobahőmérsékleten tartás után 100 pl HBS-ben oldott 4-20 pg poli(L)-lizin290-nel elegyítettük. További 30 perces szobahőfokon történő inkubálás után 0,3-30 pg, 100 pl HBS-ben oldott peptidet adtunk hozzá, és további 30 percig inkubáltuk. Az endoszomalitikus anyag optimális mennyiségét előzetes titrálással állapítottuk meg, ahol megmértük a kapott géntranszfer-teljesítő képességet (lásd a 3. táblázatot: géntranszfer BNL CL.2 sejtekbe). Azt találtuk, hogy a polilizin és az endoszomalitikus anyag egyidejű hozzáadása ugyanúgy, mint nagyobb térfogatok alkalmazása a komplexek előállításához (1,5 ml végtérfogat), összehasonlítható (vagy jobb) transzfekciós hatékonyságot eredményezett. Ezekből a kísérletekből az is kiderült, hogy a nem peptid amfipátiás anyagok, mint a dezoxikolsav és olajsav a DNS transzferét felerősítik.
e) A sejtek transzfekciója
Adherens sejtvonalakat (BNL CL.2 hepatocitákat, illetve NIH3T3-sejteket) tenyésztettünk a transzfekció előtt 1-2 napig 6 cm-es csészékben (DMEM táptalaj 10% FCS-sel; 300 000 sejt/csésze). A táptalajt eltávolítottak, és 1, 5 ml DMEM+2% FCS és 500 pl DNSkomplex keverékét adtuk a sejtekhez. Egy alternatíva
0, 5 ml DMEM+6% FCS és 1,5 ml DNS-komplex keverékének az alkalmazása. 4 órás inkubáció után 2 pl DMEM-et (18% FCS) adtunk hozzá. (Megállapítottuk, hogy egy másik lehetőség szerint 4 ml, 10% FCS-sel kiegészített DMEM-et adhatunk hozzá.) A sejtkinyerés és a luciferázmeghatározások 24 órával a transzfekciót követően történtek, mint azt korábban leírtuk. A bemutatott fényegységértékek a transzfekción átesett sejtek össz-luciferázaktivitását szemléltetik. A BNL CL.2 hepatociták transzfekcióját az 52. ábrán mutatjuk be.
52A. ábra: a DNS-komplexeket úgy állítottuk elő, hogy először 250 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVLDNS-t 250 pl HBS-ben oldott 4 pg TfpL290-nel kevertünk össze, és végül 30 perces szobahőmérsékleten tartás után 750 pl HBS-ben oldott 20 pg poli(L)-lizin290nel elegyítettük. További 30 perces szobahőfokon történő inkubálás után hozzáadtuk a megadott mennyiségű peptidet 250 pl HBS-ben oldva. További 30 perces inkubálás után a komplexeket 0,5 ml DMEM+6% FCS-sel elegyítettük, és 450 000 sejthez adtuk.
52B. ábra: a DNS-komplexeket úgy állítottuk elő, hogy először 500 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVLDNS-t 250 pl HBS-ben oldott 4 pg TfpL290-nel kevertünk össze, és 30 percig szobahőfokon állni hagytuk. 500 pl HBS-ben oldott 20 pg poli(L)-lizin290-et 250 pl HBS-ben oldott megadott mennyiségű peptiddel elegyítettünk és azonnal a TfpL/DNS keverékhez adtuk. További szobahőfokon történő 30 perces inkubálás után a komplexeket 0,5 ml DMEM+6% FCS keverékével elegyítettük, és 450 000 sejthez adtuk.
A sejtkinyerés és luciferázmeghatározások a leírtak szerint történtek.
Az 53. ábrán a NIH3T3-sejtekkel végzett kísérleteket mutatjuk meg. A komplexek A) és B) szerinti előállításai ugyanúgy történtek, mint a BNL CL.2 sejteknél.
A sejtkultúra-kísérletekben a P50 dim és EALA-P50 peptidek mutatták a legmagasabb aktivitást, az EALA és GLF peptidek közepes aktivitásúak, miközben a P50 monomerek és a melittin alacsony aktivitásúak voltak.
38. példa
Géntranszfer egy, a C-terminálison oligolizinmeghoszszabbítással rendelkező, nem virális szintetikus peptid alkalmazásával
A következő szekvenciával (4. számú szekvencia) rendelkező peptidet állítottuk elő és tisztítottuk az előző példában leírt módszer szerint: Met-Ala-Gln-AspIle-Ile-Ser-Thr-Ile-Gly-Asp-Leu-Val-Lys-Trp-Ile-IleAsp-Thr-Val-Asn-Lys-Phe-Thr-Lys-Lys-Lys-LysLys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys. Ez a Staphylococcus aureus δ-toxinjából (3. számú szekvencia): MetAla-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Thr-Ile-Gly-Asp-Leu-ValLys-Trp-Ile-Ile-Asp-Thr-V al-Asn-Lys-Phe-Thr-LysLys, levezetett peptid, amelyről ismert, hogy savas pH-értéknél specificitással rendelkezik a membránok felszakításában - amelyet oly módon származtattunk, hogy ezt a peptidet 10 kiegészítő Lys egységgel meghosszabbítottuk.
A DNS-komplexeket úgy állítottuk elő, hogy először 170 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t
HU 218 846 Β
170 μΐ HBS-ben oldott 4 pg TípL290-nel kevertünk össze és végül 30 perces szobahőmérsékleten tartás után 170 pl HBS-ben oldott 3 pg peptiddel elegyítettük. További 30 perces szobahőfokon történő inkubálás után a komplexeket 1,5 ml DMEM+2% FCS-sel kever- 5 tűk össze, és 450 000 BNL CL.2 hepatocitához adtuk.
óra múlva 2 ml DMEM+20% FCS-t adtunk hozzá.
A transzfekció után 24 órával a sejtkinyerést és a luciferázaktivitás-méréseket az előző példákban leírtak szerint végeztük el. Az összkivonatnak megfelelő lucife- 10 rázaktivitás 481 000 fényegység volt.
39. példa
Hepatociták transzfekciója a C-terminálison oligolizinfarokkal rendelkező melittinpeptidek jelenlétében A következő szekvenciáknak megfelelő peptideket szintetizáltuk (N-től a C-terminális irányába) (12. számú szekvencia): Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-ValLeu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-IleLys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys- 20 Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (mell jelzéssel) és (13. számú szekvencia): Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Glu-Val-LeuGlu-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-LysArg-Lys-Arg-Gln-Gln-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-LysLys-Lys-Lys-Lys (savas mutáns mel2 jelzéssel) a 38. 25 példában leírtak szerint.
A DNS-komplexeket úgy állítottuk elő, hogy először 170 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t 170 pl HBS-ben oldott 4 pg TfpL290-nel kevertünk össze, és végül 30 perces szobahőmérsékleten tartás 30 után 170 pl HBS-ben oldott körülbelül 3 pg mell vagy 5 pg mel2 peptiddel elegyítettük. További 30 perces szobahőfokon történő inkubálás után a komplexeket 1,5 ml DMEM + 2% FCS-sel kevertük össze, és 450 000 BNL CL.2 sejthez adtuk, amelyeket a 38. pél- 35 dában leírtak szerint tenyésztettünk. A transzfekció után 24 órával a sejtkinyerést és a luciferázaktivitás-méréseket az előző példákban leírtak szerint végeztük el.
Az összkivonatnak megfelelő luciferázaktivitás mell esetében 9200, mel2 esetében 9400 fényegység volt. 40
40. példa
Interferon-α kifejeződése HeLa-sejtekben
HeLa-sejteket (5xl05 sejt/6 cm-es csésze) fertőztünk pAD-CMVl-IFN plazmiddal, amely a humán al- 45 fa2c interferont kódolja a CMV enhancer/promoter szekvencia kontrollja alatt. (A plazmidot a DE 40 21 917 A számú német szabadalmi leírás úja le. A pAD-CMVIIFN plazmidot úgy kaptuk meg, hogy a HindlII-Xbal IFN-a2c-inszertumot a pAD-CMVl-be újra klónoztuk.) 330 pl HBS-ben oldott 6 pg DNS-mintákat elegyítettünk 330 pl HBS-ben oldott 8 pg TfpL-lel, és 30 percig állni hagytuk szobahőmérsékleten. A 6-10. minták csak 4 pg TfpL-t tartalmaztak, és az első 30 perces inkubálást követően a 6. és 7. mintához egy-egy részlet 160 pl HBS-ben oldott P16pL-t (20 pg), és a 8., 9. és 10. próbákhoz egyegy részlet pLys290-et (20 pg) adtunk. További 30 perces inkubálás után 160 pl HBS-ben oldott 10 pl (8. próba) vagy 50 pl (9. és 10. próba) szabad P16-részleteket adtunk hozzájuk (a P16 és P16pL szintézisére lásd a 13. példát). További 30 perc elteltével a próbákat HeLasejtekre vittük fel 2 ml DMEM/2% FCS-ben, amely a kö15 vetkező kiegészítőkomponenseket tartalmazta: a 2., 7. és 10. próbák 100 pM klorokint, a 3. és 4. próbák 5 pl és 15 pl dl 312 adenovírust (1 χ 1012 partikula/ml) tartalmaztak, az 5. próba ugyanezen vírus psoralennel inaktivált formájának 15 Npl-ét tartalmazta. (Az endogén interferontermelés adenovírus révén történő stimulálására kontrollként all.,12. és 13. próbákat a vírus kis részleteivel kezeltük, mint a 3., 4. és 5. példákban.) A transzfekció után 2 órával 5 ml friss DMEM+10% FCS-táptalajt adtunk a sejtekhez. 48 órával a transzfekció után a táptalajt eltávolítottuk, és 2 ml friss DMEM+10% FCS-sel pótoltuk. Ebből a táptalajból 72 órával a transzfekció után kinyertük a sejteket, és az IFN-α meghatározására elvégeztük az ELISA-tesztet a DE 40 21 917 A számú német szabadalmi leírás szerint. Az IFN-a-mennyiségeket (ng/ml-ben) az 54. ábrán mutatjuk meg.
A korábban luciferáz- vagy β-galaktozidáz riportergénekkel tett megfigyelésekkel összhangban, a TfpL csak gyengén működött az IFN-gén transzferénél ezekben a sejtekben. Klorokin jelenléte kimutatható jelet eredményezett (körülbelül 7 ng/ml 2. próba) ezzel szemben a dl312 adenovírus dózisfüggő módon stimulálta a DNS-transzfert (3. és 4. próba). Ezeknek a sejteknek összehasonlítható mennyiségű vírussal való kezelése IFN-DNS komplexek nélkül nem adott kimutatható IFN-jelet (11. és 12. próba). Az influenzapeptidből levezetett szintetikus endoszomalitikus P16 peptiddel (lásd 13. példa) mint konjugátummal (6. és 7. próba) vagy a TfpL/DNS komplexek felületéhez ionosán kötött peptiddel végzett transzfekció (8., 9. és 10. próba; a peptid kötéséhez lásd a 37. példát) kimutatható interferontermelést eredményezett, amelyet a peptidkonjugátum klorokin jelenlétében (7. próba) felerősített.
1. táblázat (1A.) Transzfekciós módszerek
SEJTTÍPUS TfpL TfpL+klorokin TfpL+szabad AdenoV TfpL+kötött AdenoV TfpL+Influ-pLys
Komplex (A) (A) (B) (E) (F)
Hepatociták
HepG2 - +/- + + +
BNL.CL2 - +/- + + + + + + + + + + + +
primer - - - + +
HU 218 846 Β
1. táblázat (1A.) (folytatás)
SEJTTÍPUS TfpL TfpL+klorokin TfpL+szabad AdenoV TfpL+kötött AdenoV TfpL+Influ-pLys
Komplex (A) (A) (B) (E) (F)
Mioblasztok/miotubok
C2C12 +/- +/- + + + + +
G8 +/- +/- + + + + +
primer + + +
Fibroblasztok
3T3 + + + + + + + + + + + + +
Mov-13 +/- +/- + + + + + +
egér-L-sejtek +/- + + + + + + + + +
primer + + + +
Endothelsejtek
sertésaorta +/- + + + + +/-
Humán neuroblasztóma-
sejtvonal
GI-ME-N +/- +/- + + + + + + +
HeLa-sejtek + + + + + + + + + + + + + + +
1. táblázat (1B.) Transzfekciós módszerek
SEJTTÍPUS TfpL TfpL+klorokin TfpL+szabad AdenoV TfpL+kötött AdenoV TfpL+Influ-pLys
Komplex (A) (A) (B) (E) (F)
Egér-ES-sejtek
CCE +/- + + +
Bruce 4 +/- + + + + +
Eritroidsejtek
K562 - + + + + + + + + + + +
csirke-HD3 + + T + -4- + + + + + + + + +
Csontvelő
egér - - + +
csirke +/- + + + +
EBV-transzformált
humán B-sejtek - - - + + + +
egérplazma-sejtvonalak (MPC11.SP2/0) + + + + + +
+/- luciferázaktivitás 1 000-10 000 fényegység/10« sejt
+ 10 000-10« fényegység
+ + 1- 5x10« fényegység
+ + + 5- 50x10« fényegység
+ + + + 50-100x10« fényegység
+ + + + + >100x10« fényegység
TfpL transzferrin-polilizin
AdenoV rcplikációra képtelen dl 312 adenovírus
Influ-pLys influenza HA-2 N-terminális peptid-polilizin
HU 218 846 Β
2. táblázat (2A.) Membránaktív fehérjék
Virális fúziós fehérjék
N-terminális fúziós szekvencia Burokkal rendelkező vírusok
Influenzavírus Myxoviridae HA 2 pH 5 White, 1990; Takahashi, 1990
VSV Rhabdoviridae G pH 5 Hoekstra, 1990
Vacciniavírus 14 kDa pH 5 Gong et al., 1990
Sendai-vírus Parainfluenzavírus FI pH 7 Hoekstra, 1990; Gething et al., 1978
Masemvírus Parainfluenzavírus F pH 7 Takahashi, 1990
HÍV Retroviridae gp41 pH 7 Slepushkin et al., 1992
SIV Retroviridae gp41 pH 7 Ruysschaert u., 1991;
Vandenbranden Burok nélküli vírusok Franchini, 1989
Poliovírus Enteroviridae vpl pH 5 Fricks und Hogle, 1990
Coxackievírus Enteroviridae vpl pH 5 Gething et al., 1978
Rhinovírus vpl pH 5
Internális fúziós szekvencia
Burokkal rendelkező vírusok
Semliki Forest v. Togaviridae El pH 5 White, 1990
Sindbisvírus White, 1990
Burok nélküli vírusok
Rhesus rotavírus vp5 Mackow et al., 1988
A 2. táblázatban szereplő szerzők szerinti irodalmi hivatkozások részletezve megtalálhatók az irodalomjegyzékben
2. táblázat (2B.) Membránaktív fehérjék
Mikroorganizmusokból származó toxinok Sztreptolizin O Streptococcus 69 kDa pH 7 Kehoe et al., 1987
szulfhidrilaktivált, koleszterinhez kötött 20-80mer, 15 nm-es pórusok
Liszteriolizin O L. monoeytogenes 60 kDa pH 5 Geoffroy et al., 1987
szulfhidrilaktivált, koleszterinhez kötött C9-cel és sztreptolizin O-val rokon
α-toxin Staphylococcus 34 kDa pH 7
amfipátiás felület β-lapszerkezet hexamer léziók,, 2 nm-es pórusok
Hemolizin E. coli 416 kDa pH 7 Oropeza-Werkerle et al., 1992
8 amfipátiás hélix Hemolizin Trypanosoma cruzi 75 kDa pH 5 Andrews et al., 1990
perforinekhez hasonló, C9-cel rokon Gerincesek immunrendszere Perforál Ojcius und Jung, 1991
Ca2+-fuggő membráninszerció Komplement C9 (MAC C5b 8,914) Bhakdi und Tranum-Jensen, 1991; Esser, 1991
Hohler-fehérjehenger 10 nm-es csatorna
jól szabályozott aktivitás Spermium-tojás-fúziós fehérje PH30 pH 7 Blobel et al., 1992
a felületi fehérjék a-alegysége internális fúziós szekvencia
HU 218 846 Β
2. táblázat (2C.) Membránaktív fehérjék
Védelmi toxinok
Blondelle u. Houghten,
Melittin méhméreg 26AA amf. a-helix, csavarodott 1991; Dempsey et al., 1991;
Ikura u. Inagaki, 1991
Bombolitin 17AA amf. a-hélix Argiolas u. Pisano, 1985
poszméhméreg Mastoparan 14AA amf. a-hélix Argiolas u. Pisano, 1985
darázsméreg
Crabrolin 13AA amf. a-hélix Argiolas u. Pisano, 1985
lódarázsméreg
Pardaxin 33AA amf. α-hélix, csavarodott Shai et al., 1990
„moses sole” hal
Antibakteriális peptidek Sarcotoxin IA „húslégy” Cecropins 37AA amf. α-hélix, csavarodott Esser, 1991
rovarok (humorális immunrendszer, selyemmoly)
Maganin 23 AA amf. a-hélix Marion et al., 1988
bőr Xenopus laevis Alameticin 15-24 A A amf. a-hélix Esser, 1991
gomba (Trichoderma viride) a-amino-vajsav
Baktériumtoxinok
δ-toxin 26AA amf. α-hélix savas közegben Thiaudiere et al., 1991;
Staphylococcus aureus Alouf et al., 1989
Amoebapor 25AA amf. α-hélix savas közegben Leippe et al., 1991
En tamoeba histolytica
Gerincesek immunrendszere
Defenzin 29-34A A β-lapszerkezet (SS-híd) Lehrer et al., 1991
négymagvú neutrofil
3. táblázat
BNL CL.2 sejtek transzfekciója (6 pg pCMVL-DNS, 4 pg TfpL290)
pLys Opg 0.3 pg 1 pg 3 Pg 10 Pg 20 pg 30 pg
opg P50 dim GLF melittin 160 330 490 0 540 290 0 300 340 0 70 425
4 Pg P50 dim GLF EALA 3 100 670 3 140 200 600 150 430 170 560 180 410
10 pg P50 dim GLF EALA 5 700 1 950 2 120 16 600 16 800 217 000 179 300 760 215 000 181 700 1 330 1 980 76 360 3 424 800
20 Pg P50 dim GLF EALA mellittin 3 200 23 300 418 400 191 000 6 545 185 100 320 600 181 000 7 054 800 294 200 273 600 9 344 000
dezoxi- kólsav 6 730 34 700 16 000
olaj sav 12 200 11 900 4 100
HU 218 846 Β
Abrahamson, D. R. et al., 1981, J. Cell Bioi., 91, 270-280.
Akopian, T. A. et al., 1991, Nucl. Acids Rés. 19,424. Alouf, J. E., Dufourcq J., Siffert O., Thiaudiere E. und
Geoffroy Ch., 1989, Eur. J. Biochem. 183, 381-390.
Anderson, P, et al., 1982, J. Bioi. Chem., 257, 11301-11304.
Andrews, N. W., Abrams C. K., Slatin S. L. und Griffiths G„ 1990, Cell 61,1277-87.
Ansardi, D. C. et al., 1991, J. Virology 65, 2088-2092. Argiolas, A. und Pisano J. J., 1985, J. Bioi. Chem. 260,
1437-1444.
Armentano, D., Yu, S., Kantoff, P., von Rüden, T., Anderson, W. F. und Gilboa, E., 1987, J. Virol. 61, 1647-1650.
Armentano, D. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87,6141-6145.
Asada-Kubota, M. et al., 1983, Exp. Pathol., 23,95-101. Ascoli, M. et al., 1978, J. Bioi. Chem., 253, 7832-7838. Ashwell, G. et al., 1982, Annu. Rév. Biochem. 51,
531-554.
Atherton, E., Gait, M. J., Sheppard, R. C. und Williams, B. J., 1979, Bioorg. Chem. 8, 351.
Barr, E. und Leiden, J., 1991, Science 254, 1507-1509. Bartlett, G. R., 1959, J. Bioi. Chem. 234,466.
Berkner, K. L., 1988, BioTechniques 6, 616-629.
Bems, K. I., 1990, Virology, 2nd edition, ed. by Fields,
Β. N., Knipe, D. M. et al., Raven Press Ltd., New York, 1743-1759.
Bhakdi, S. und Tranum-Jensen I, 1991, Immunology today 12, 318-320.
Blau, H. et al., 1985, Science 230, 758-766.
Blobel, C. P., Wolfsberg T. G., Tűrnek C. W., Myles
D. G., Primakoff P. und White J. M., 1992, Natúré 356,248-252.
Blondelle, S. E. und Houghten R. A., 1991, Biochemistry 30,4671-4678.
Bondeson, J., Wijkander, J. und Sundler, R., 1984, Biochim. Biophys. Acta 777,21-27.
Boulanger, P. A. und Puvion, F., 1973, Eur. J. Biochem. 39, 37-42.
Bragg, R. R. et al., 1991, Onderstepoort J. Vet. Rés. 58, 309-310.
Carpenter, G., 1984, Cell, 37,357-358.
Chardonnet, Y. und Dales, S., 1970, Viology 40, 462-477.
Cheng, S-Y. et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3425-3429.
Ciliberto, G., Dente, L., Cortese, R., 1985, Cell 41, 531-540.
Clarké, D. D., Mycek, Μ. I, Neidle, A. und Waelsch, H., 1959, Arch. Biochem. Biophys. 79, 338-354.
Collis, P., Antoniou, M. und Grosveld, F., 1990, EMBO J. 9,233-240.
Cotten, M., Laengle-Rouault, F., Kirlappos., H., Wagner,
E. , Mechtler, K., Zenke, M., Beug, H., und Bimstiel, M. L., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4033-4037.
Davidson, D. und Hassell, J. A., 1987, J. Virol. 61, 1226-1239.
Davis, B. D. und Dulbecco, R., 1980, Microbiology, 3rd edition, ed. by Davis, B. D. et al., Harper & Row, Sterilization and Disinfection, 1263-1274.
Defer, C., Belin, M., Caillet-Boudin, M. und Boulanger, P., 1990, J. Virol. 64, 3661-3673.
Dempsey, C. E., Bazzo R., Harvey T. S., Syperek I., Boheim G. und Campbell 1. D., 1991, FEBS Lett. 281, 240-244.
De Wet, J., Wood, K., DeLuca, M., Helinski, D. und Subramani, S., 1987, Mól. Cell. Bioi. 7, 725-737.
Dhawan, J. et al., 1991, Science 254,1509-1512.
Dönti, E. et al., 1988, Cancer Génét. Cytogenet. 30,
225-231.
Dulbecco, R., 1980, Microbiology, 3rd edition, ed. by Davis, B. D. et al., Harper & Row, The Natúré of Viruses, 853-884.
Eaton, D. L. et al., 1986, Biochemistry 25, 8343-8347. Esser A. F., 1991, Immunology today 12, 316-318. Fields, Β. N. und Knipe, D. M., 1990, Virology, 2nd edition, Raven Press, Ltd., New York.
FitzGerald, D., Padmanabhan, R., Pastan, I. und Willingham, M., 1983, Cell 32, 607-617.
Főik, J. E., 1985, Methods Enzymol. 113, 358-375. Franchini, G., 1989, Science 244, 694-697.
Fricks, C. E. und Hogle J. M., 1990, J. Virol. 64,
1934-1945.
Fujiwara, et al., 1981, J. Immunoi. Meth. 45,195. Geoffroy, C., Gaillard J. L., Alouf J. E. und Berche P.,
1987, Infection and Immunity 55,1641-1646.
Gething, Μ. I, White J. M. und Waterfield M. D., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75,2737-2740.
Ginsberg, H. S., 1980, Microbiology, 3rd edition, ed. by Davis, B. D. et al., Harper & Row, Picomaviruses, 1095-1117.
Goldmacher, V. S., Bláttler, W. A., Lambert, J. M., Mclntyre, G. und Steward, J., 1989, Molecular Pharmacology 36, 818-822.
Goldstein, J. L, et al., 1982, Clin. Rés., 30,417-426. Goldstein, J. L. et al., 1979, Proc. Natl Acad. Sci. USA,
76, 333-337.
Goldstein, L. J. et al., 1980, Natúré 285, 66.
Gong, S., Lai C. und Esteban M., 1990, Virology 178,
81-91.
Green, M. et al., 1989, Cell 58,215-223.
Hearst, J. E. und Thiry, L., 1977, Nucl. Acids Rés. 4, 1339-1347.
Heldin, C-H. et al., 1982, J. Bioi. Chem., 257, 4216-4221.
Héléne, C. und Toulme J. J., 1990, Biochem. Biophys. Acta 1049, 99-125.
Herskowitz, I., 1987, Natúré 329,219.
Hizuka, N. et al., 1981, J. Bioi. Chem., 256, 4591-4597. Hoekstra, D., 1990, J. Bioenerg. Biomembr. 22,
121-155.
Holland, J. J., 1990, Virology, 2nd edition, ed. by Fields, Β. N., Knipe, D. M. et al., Raven Press Ltd., New York, Defective Viral Genomes, 151-165.
Horváth, J. et al., 1988, J. Virol. 62, 341-345.
Horwitz, M. S., 1990, Virology, 2nd edition, ed. by
Fields, Β. N., Knipe, D. M. et al., Raven Press Ltd.,
HU 218 846 Β
New York, Adenoviridae and their replication, 1679-1721.
Hosang, M. et al., 1987, EMBO J., 6,1197-1202.
Huang, A. S., 1987, The Molecular Basis of Viral Replication, ed. by Bercoff, R. P., Plenum Press New York and London, The Role of Defective Interfering (Dl) Particles in Viral Infection, 191-194.
Ikura, T., Go N. und Inagaki F., 1991, Proteins 9, 81-89. Imamura, K. et al., 1987, J. Immunoi., 139, 2989-2992. Iwanij, V., 1977, Eur. J. Biochem. 80, 359-368.
Jones, N. und Shenk, T., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 76, 3665-3669.
Jung, et al., 1981, Biochem. Rés. Commun. 101, 599. Káplán, J. et al., 1979, J. Bioi. Chem., 254, 7323-7328. Kasid, A., Morecki, S., Aebersold, P., Cometta, K., Culver, K, Freeman, S., Director, E., Lotze, Μ. T., Blaese, R. M., Anderson, W. F. und Rosenberg, S. A., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 473-477.
Kehoe, M. A., Miller L., Walker J. A. und Boulnois
G. J., 1987, Infect. Immun. 55, 3228-3232.
Keller, G., Paige, C., Gilboa, E. und Wagner, E. F., 1985, Natúré 318,149-154.
Khang, C. und Nagaraji. K. V., 1989, Am. J. Vet. Rés. 50,1466-1470.
Klausner, R. D. et al., 1983; J. Bioi. Chem., 258, 4715-4724.
Klausner, R. D. et al., 1983; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2263-2266.
Kuhn, L. C. et al., 1982, Trends Biochem. Sci., 7, 299-302.
Kurachi, K, Davie, E. W., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci USA 79, 6461-6464.
Laver, W. G. et al., 1971, Virology 45, 598-614.
Lehrer, R. I., Ganz T. und Selsted Μ. E., 1991, Cell 64,
229-230.
Leippe, M., Ebei S., Schoenberger O. L., Horstmann R. D. und Müller-Eberhard H. J., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7659-7663.
Lim, K. und Chae, C. B., 1989, BioTechniques 7, 576-579.
Luthmann, H. und Magnusson, G., 1983, Nucl. Acids Rés. 11, 1295-1308.
MacDonald, R. C. et al., 1991, Biochim. Biophys. Acta 1061,297-303.
Macgregor, G. und Caskey, C. T., 1989, Nucl. Acids Rés. 17,2365.
Mackow, E. R., Shaw R. D., Matsui S. M., Vo P. T., Dang Μ. N. und Greenberg Η. B., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 645-649.
Madshus, I. H., Olsnes, S. und Sandvig, K., 1984, Virology 139, 346-357.
Malim, M. et al., 1989, Cell 58, 205-214.
Maniatis, T., Fritsch, E. F. und Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 474.
Marion, D., Zasloff M. und Bax A., 1988, FEB 227, 21. Marshall, S., 1985, J. Bioi. Chem., 250,4133-4144. Massague, J. et al., 1986, J. Cell. Physiol., 128,
216-222.
McClure, Μ. O., Sommerteit, M. A., Marsh, M. und Weiss, R. A., 1990, J. General Virol. 71, 767-773.
Mellman, I. S. et al., 1984, J. Cell Bioi., 98,1170-1177. Mizel, S. B. et al., 1987, J. Immunoi., 138, 2906-2912. Ojcius, D. M. und Young J. D., 1991, TIBS 16,
225-229.
Oropeza-Werkerle, R. L., Muller S., Briand J. P., Benz R., Schmid A. und Goebel W., 1992, Mól. Microbiol. 6,115-121.
Otero, M. J. und Carrasco, L., 1987, Virology 160, 75-80.
Pacini, D. L. et al., 1984, J. Infect. Dis. 150, 92-97. Parente, R. A. et al., 1990, Biochemistry 29, 8720-8728. Patek, P. Q., Collins, J. L. und Cohn, M. 1978, Natúré
276,510-511.
Ponder, J. P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 1217-1221.
Posner, Β. I. et al., 1982, J. Cell Bioi., 93, 560-567. Precious, B. und Russell, W. C., 1985, Virology, ed.
Mahy, B. W. J., IRL Press, Oxford, Washington, DC, 193-205.
Rafalski, M., Lear, J. D. und DeGrado, W. F., 1990, Biochemistry 29, 7917-7922.
Reece, R. L. et al, 1987, Aust. Vet. J. 64, 365-367. Riordan, J. R. et al., 1989, Science, 245,1066-1073. Rosenberg, St. A. et al., 1992, Humán Gene Therapy 3,
75-90.
Ruysschaert, J. M. und Vandenbranden M., 1991, Biochem. Biophys. Rés. Commun. 175, 872-879. Sambrook, J. et al. (Eds.), 1989, Molecular Cloning, 2nd edition, Vol. 3,1639-1640.
Schalch, D. S. et al., 1986, Endocrinology, 118, 1590-1597.
Sennett, C. et al., 1981, Annu. Rév. Biochem., 50, 1053-1086.
Seth, P., FitzGerald, D., Ginsberg, H., Willingham, M. und Pastan, I., 1984, Mól. Cell. Bioi. 4, 1528-1533.
Seveme, Y., Wieland, S., Schaffner, W. und Rusconi, S., 1988, EMBO J. 7,2503-2508.
Shai, Y., Bach D. und Yanovsky A., 1990, JBS 265, 20 202-20 209.
Sharon, N., 1987, Cell Separation: Methods and Selected Applications, Vol. 5, Academic Press Inc., pp. 13-44.
Silver, L. et al., 1988, Virology 165,377-387.
Sipe, D. M. et al., 1991, J. Bioi. Chem. 256, 3469-3474. Skem, T. et al., 1984, Virology 136,125-132. Slepushkin, V. A., Andreev S. M., Siderova Μ. V.,
Melikyan G. B., Grigoriev V. B., Chumakov V. M., Grinfeldt A. E., Manukyan R. A. und Karamov Ε. V., 1992, AIDS Rés. Humán Retroviruses 8, 9-18.
Sly, W. et al., 1982, J. Cell Biochem., 18, 67-85.
Smith, K. A. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,
864-867.
Stahl, P. D. et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1399-1403.
Straubinger, R. M. und Papahadjopoulos, D., 1983, Meth. Enzymol. 101, 512-527.
Strauss, W. und Jaenisch, R., 1992, EMBO J. 11, 417-422.
HU 218 846 Β
Subbarao, N. K. et al., 1987, Biochemistry 26, 2964-2972.
Sullenger, B. A. et al., 1990, Cell 63, 601-608.
Svensson, U., 1985, J. Virol., 55,442-449.
Szoka, F. und Papahadjopoulos, D., 1978, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 75,4194-4198.
Takahashi, S., 1990, Biochemistry 29, 6257-6264. Takayama, K. M. und Inouye, M., 1990, Critical reviews in Biochem. and Mól. Bioi. 25,155-184.
Takese, K. et al., 1990, Nippon Juigaki Zasshi 52, 207-215.
Thiaudiere, E., Siffert O., Talbot J. C., Bolard J., Alouf J. E. und Dufourcq J., 1991, Eur. J. Biochem. 195, 203-213.
Trono, D. et al., 1989, Cell 59,113-120.
Uchida, Y., Tsukada, U. und Sugimori, T., 1977, J. Biochem. 82,1425-1433.
Urakawa, T., et al., 1989, J. Gén. Virol. 70, 1453-1463. Valerio, D., Mclvor, R. S., Williams, S. R,, Duyvesteyn,
M. G. C., Van Ormondt, H., Van dér Eb, A. J., Martin, D. W. Jr, 1984, Gene, 31,147-153.
van Oostrum, J. und Bumett, R. M., 1985, J. Virol. 56, 439-448.
Wagner, E., Zenke, M., Cotten, M., Beug, H. und Bimstiel, M. L., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414.
Wagner, E., Cotten, M., Foisner, R. und Bimstiel, M. L., 1991a, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,4255-4259. Wagner, E., Cotten, M., Mechtler, K., Kirlappos, H. und
Bimstiel, M. L., 1991b, Bioconjugate Chemistry 2, 226-231.
Walker, F. et al., 1987, J. Cell Physiol., 130, 255-261. Walker, R. D. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86,9514-9518.
Walls, Ε. V. und Crawford, D. H., 1989, Lymphocytes, a practical approach, G. G. B. Klaus, Ed., IRL press Oxford, 149-162.
Watson, J. D., et al., 1987, Mól. Bioi. of the Gene, Benjamin/Cummings Publ. Company Inc., 676-677.
Wharton, S. A., Martin, S. R., Ruigrok, R. W. H., Skehel, J. J. und Wiley, D. C., 1988, J. Gén. Virol. 69,
1847-1857.
White, J. M., 1990, Annu. Rév. Physiol 52, 675-697. Wilchek, M. et al., 1988, Anal. Biochem. 171,1.
Gly Leu 1 Phe Glu Al a 5 Ile Al a
Glu Gly 15 Me t Ile Asp Gly 20 Gly
2. számú szekvencia vázlat A szekvencia hossza: 23 aminosav A szekvencia típusa: aminosav
Gly Leu 1 Phe Gly Al a 5 I 1 e Al a
Glu Gly 15 Me t Ile Asp Gly 20 Gly
Wilson, J. M., Dános, O., Grossman, M., Raulét, D. H. und Mulligan, R. C., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,439-443.
Willumsen, N. J., Davis, C. W. und Boucher, R. C., 1989, Am. J. Physiol. 256 (Cell Physiol. 25), 1033-1044.
Wood, W. I., Capon, D. J., Simonsen, C. C., Eaton, D. L., Gitschier, J., Keyt, B., Seeburg, P. H., Smith, D. H., Hollinshead, P., Wion, K. L., Delwart, E., Tuddenham, E. G. D., Vehar, G. A., Lawn, R. M., 1984, Natúré, 312, 330-337.
Wu, R., Yankaskas, J. R., Cheng, E., Knowles, M. R. und Boucher, R., 1985, Am. Rév. Respir. Dis. 132, 311-320.
Wu, G. Y. und Wu, C. H., 1987, J. Bioi. Chem. 262, 4429-4432.
Wu, G. Y. und Wu, C. H., 1988, J. Bioi. Chem. 263, 14 621-14 624.
Yankaskas, J. R., Stutts, M. J., Cotton, C. U. Knowles, M. R., Gatzy, J. T. und Boucher, R. C., 1987, Genetics and Epithelial Cell Dysfunction in Cystic Fibrosis, Alán R. Liss, Inc., pp. 139-149.
Yankaskas, J. R., Haizlip, J. E., Conrad, M., Kovái, D., Schlegel, R. und Boucher, R. C., 1991, Am. Rév. Respir. Dis. 143, A139.
Zamecnik, P. C., Goodchild, J., Taguchi, Y. und Sárin, P. S., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143-4146.
Zatloukal, K., Denk, H., Lackinger, E. und Rainer, I., 1989, Láb. Invest. 61, 603-608.
Zenke, M., Steinlein, P., Wagner, E., Cotten, M., Beug,
H. und Bimstiel, M. L., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3655-3659.
Zon, G., 1988, Pharmaceut. Research 5, No. 9, 539-549. Remington’s Pharmaceutical Sciences, 1980, Mack Publ. Co., Easton, PA, Osol (ed.).
Trends Pharmacol. Sci. 10,1989,458-462.
SZEKVENCIALISTÁK
I. számú szekvenciavázlat
A szekvencia hossza: 23 aminosav A szekvencia típusa: aminosav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid y Phe Ile Glu Asn Gly Trp 10
Υ Cys
A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid y Phe Ile Glu Asn Gly Trp 10 y Cys
HU 218 846 Β
3. számú szekvenciavázlat A szekvencia száltípusa: egyszálú
A szekvencia hossza: 26 aminosav Topológia: mindkettő
A szekvencia típusa: aminosav A molekula típusa: peptid
Met Alá Gin Asp 1 Ile Ile 5 Ser Thr Ile Gly Asp Leu Val Lys 10
Trp Ile Ile Asp 15 Thr Val 20 As n Ly s Phe Thr Lys Lys 25
4. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 36 aminosav A szekvencia típusa: aminosav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Met Alá Gin Asp 1 Ile Ile 5 Ser Thr Ile Gly Asp Leu Val Lys 10
Trp Ile Ile Asp 15 Thr Va 1 As n 20 Ly s Phe Thr Lys Lys Lys Lys 25
Lys Lys Lys Lys 30 Ly s Ly s Ly s Ly s 35
5. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 34 aminosav A szekvencia típusa: aminosav 25 A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Trp Glu Alá Alá 1 Leu Al a 5 Glu Al a Leu Alá Glu Alá Leu Alá 10
Glu His Leu Alá 15 Glu Al a Leu 20 Al a Glu Alá Leu Glu Alá Leu 25
Alá Alá Gly Gly 30 Ser Cy s
6. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 35 aminosav A szekvencia típusa: aminosav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Gly Leu Phe Gly 1 Al a Leu 5 Al a Glu Alá Leu Alá Glu Alá Leu 10
Alá Glu His Leu 15 Al a Glu Al a 20 Leu Alá Glu Alá Leu Glu Alá 25
Leu Alá Alá Gly 30 Gly Ser Cy s 35
7. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 35 aminosav A szekvencia típusa: aminosav 50 A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Gly Leu Phe Gly 1 Al a Leu 5 Al a Glu Alá Leu Alá Glu Alá Leu 10
Alá Glu Alá Leu Al a Glu Al a Le u Alá Glu Alá Leu Glu Alá
20 25
HU 218 846 Β
Leu Alá Alá Gly 30 Gly Ser Cy s 35
8. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 34 aminosav A szekvencia típusa: aminosav 5 A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Gly Leu Phe Glu 1 Leu 5 Alá Glu A1 a Leu Alá Glu Alá Leu Alá 10
Glu Alá Leu Alá 15 Glu A1 a 20 Leu A1 a Glu Alá Leu Glu Alá Leu 25
Alá Alá Gly Gly 30 Ser Cy s
9. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 34 aminosav A szekvencia típusa: aminosav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Gly Leu Phe Gly 1 A1 a 5 Ile A1 a G1 y Phe Ile Glu Asn Gly Trp 10
Glu Gly Leu Alá 15 Glu A1 a 20 Le u A1 a Glu Alá Leu Glu Alá Leu 25
Alá Alá Gly Gly 30 Ser Cys
10. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 34 aminosav A szekvencia típusa: aminosav 30 A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Gly Leu Phe Glu 1 A1 a 5 Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp 10
Glu Gly Leu Alá 15 Glu A1 a 20 Leu A1 a Glu Alá Leu Glu Alá Leu 25
Alá Alá Gly Gly 30 Ser Cy s
11. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 23 aminosav A szekvencia típusa: aminosav 45 A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Gly Leu Phe Glu 1 A1 a 5 Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp 10
Glu Gly Me t Ile 15 As p Gly 20 Gly Gly Cy s
12. számú szekvenciaváziat A szekvencia hossza: 36 aminosav A szekvencia típusa: aminosav 55 A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Gly Ile Gly Alá 1 Va 1 5 Leu Ly s Va 1 Leu Thr Thr Gly Leu Pro 10
HU 218 846 Β
Al a 15 Leu Ile Ser Trp Ile 20 Ly s
Ly s Lys Lys Ly s Ly s Ly s Ly s
30 35
g Lys Arg Gin Gin Lys Lys 25 s
13. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 36 aminosav A szekvencia típusa: aminosav
A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Gly 1 Ile Gly Al a Val 5 Leu Glu
Al a Leu Ile Ser Trp Ile Ly s
15 20
Ly s Lys Lys Lys Lys Ly s Ly s
30 35
Leu Glu 10 Th r Gly Leu Pro
Lys Arg Gin 25 Gin Ly s Ly s
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (109)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Magasabb rendű eukariótasejtek transzfekciójára szolgáló készítmény, amely tartalmaz egy komplexet, melyben az említett eukarióta sejtekben kifejezendő nukleinsav komplexet képez egy nukleinsavaffin anyaggal, amely adott esetben egy, az említett sejtek számára intemalizáló faktorként szolgáló anyaggal konjugált, azzal jellemezve, hogy tartalmaz továbbá egy endoszomalitikus anyagot, amely képes a sejtekbe internalizálódni és az endoszóma tartalmát - melybe a nukleinsavkomplex a sejtbe történő bejutás után lokalizálódott - a citoplazmába felszabadítani, ahol
    a) az endoszomalitikus anyag a fenti komplex alkotórészeként egy saját nukleinsavkötő doménen vagy egy nukleinsavaffin anyagon keresztül, amelyhez kötődik, a nukleinsavval komplexet képez; vagy
    b) az endoszomalitikus anyag egy vírus vagy víruskomponens, amely képes per se a transzferálandó sejtekbe bejutni, és a fenti komplexen kívül helyezkedik el.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti a) készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszomalitikus anyag kovalensen kötődik a nukleinsavaffin anyaghoz.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti a) készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszomalitikus anyag nem kovalensen kötődik a nukleinsavaffin anyaghoz.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a kötés egy biotin-sztreptavidin hídon keresztül történik.
  5. 5. A 3. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a kötés ionosán történik.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti a) készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszomalitikus anyag vírus vagy víruskomponens.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti b) vagy 6. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszomalitikus anyag adenovírus.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adenovírus egy mutáns.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti készítmény, azzaljellemezve, hogy az adenovírus replikációra képtelen mutáns.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adenovírus egy vagy több mutációt és/vagy az ElA-régióban deléciót hordozó mutáns.
  11. 11. A 7. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adenovírus inaktivált.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adenovírus UV-vel inaktivált.
  13. 13. A 11. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adenovírus UV/psoralennel inaktivált.
  14. 14. A 11. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adenovírus formaldehiddel inaktivált.
  15. 15. A 6. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a víruskomponens egy vagy több vírusból áll.
  16. 16. Az 1. igénypont szerinti b) vagy 6. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a vírus picomavírus.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a picomavírus adott esetben inaktivált rhino vírus.
  18. 18. Az 1. igénypont szerinti a) készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszomalitikus anyag olyan vírus, amely az embertől eltérő fajra fertőző.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a vírus egy adenovírus.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adenovírus egy madár-adenovírus.
  21. 21. A 20. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adenovírus a Chick Embryo Lethal Orphan (csirkeembriót elölő) vírus.
  22. 22. Az 1. igénypont szerinti a) készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszomalitikus anyag egy, adott esetben módosított endoszomalitikus virális peptid.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszomalitikus peptid influenzahemagglutinin HA-2 peptid.
    HU 218 846 Β
  24. 24. A 23. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid szekvenciája: Gly-Leu-Phe-GluAla-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-GlyMet-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
  25. 25. A 23. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid szekvenciája: Gly-Leu-Phe-GlyAla-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-GlyMet-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
  26. 26. Az 1. igénypont szerinti a) készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszomalitikus anyag nem virális, adott esetben módosított természetes vagy szintetikus peptid, amely képes széttörni a sejtmembránt.
  27. 27. A 26. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid szekvenciája: Gly-Leu-Phe-GluAla-Ile-Glu-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-GlyMet-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
  28. 28. A 26. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid a 27. igénypontban definiált peptid homo- vagy heterodimerje.
  29. 29. A 28. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid egy homodimer.
  30. 30. A 28. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid egy heterodimer, amelynek szekvenciája: Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Glu-Gly-Phe-IleGlu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu- AlaGlu-Ala-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys.
  31. 31. A 26. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid szekvenciája: Trp-Glu-Ala-AlaLeu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-HisLeu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-AlaLeu-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys.
  32. 32. A 26. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid szekvenciája: Gly-Leu-Phe-GlyAla-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-GluHis-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-AlaLeu-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys.
  33. 33. A 22. vagy 26. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid egy nukleinsavkötő doménnel rendelkezik.
  34. 34. A 33. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a nukleinsavkötő dómén egy oligolizinmeghosszabbítás.
  35. 35. Az 1. igénypont szerinti a) készítmény, azzal jellemezve, hogy az intemalizáló faktor transzferrin.
  36. 36. Az 1. igénypont szerinti a) készítmény, azzal jellemezve, hogy az intemalizáló faktor ligandum a Tsejtek számára.
  37. 37. Az 1. igénypont szerinti a) készítmény, azzal jellemezve, hogy az intemalizáló faktor ligandum a Bsejtek számára.
  38. 38. A 37. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az intemalizáló faktor immunglobulin.
  39. 39. A 37. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a ligandum antiimmunglobulin.
  40. 40. Az 1, igénypont szerinti a) készítmény, azzal jellemezve, hogy az intemalizáló faktor ligandum a hepatociták számára.
  41. 41. A 40. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az intemalizáló faktor ligandum az aszialo-glikoprotein receptor számára.
  42. 42. A 41. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az intemalizáló faktor tetragalaktóz-polilizin.
  43. 43. Az 1. igénypont szerinti a) készítmény, azzal jellemezve, hogy az intemalizáló faktor lektin.
  44. 44. Az 1. igénypont szerinti a) készítmény, azzal jellemezve, hogy az intemalizálófaktor kis sűrűségű (low density) lipoprotein.
  45. 45. Az 1-44. igénypont szerinti készítmény alkotórészét képező komplex, azzal jellemezve, hogy az alábbiakat tartalmazza:
    - egy vagy több, a magasabb rendű eukarióta sejtekben kifejezendő nukleinsavat,
    - egy endoszomalitikus anyagot, amely a nukleinsavkötő doménjén keresztül vagy egy nukleinsavaffin anyaghoz kötődve a nukleinsawal komplexet alkot, és
    - egy nukleinsavaffin anyagot, mely a nukleinsawal komplexben van és adott esetben egy, a magasabb rendű eukarióta sejtek számára intemalizáló faktorként szolgáló anyaggal konjugált.
  46. 46. A 45. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy terápiásán aktív nukleinsavat tartalmaz.
  47. 47. A 46. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav egy vagy több génterápiásán hatásos DNS-molekulából áll.
  48. 48. A 47. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy a DNS-molekulák citokineket kódolnak.
  49. 49. A 47. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy a DNS-molekula a VIII. faktort kódolja.
  50. 50. A 47. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav olyan nukleotidszekvenciát tartalmaz, amelyről sejtműködést gátló RNS-molekulák íródnak át.
  51. 51. A 45. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy a nukleinsavaffin anyag egy szerves polikation.
  52. 52. Az 51. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy a polikation polilizin.
  53. 53. Az 51. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy a polikation poli(etilén-imin).
  54. 54. A 45. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy az endoszomalitikus anyag és az internalizáló faktor ugyanahhoz a nukleinsavaffin anyaghoz kötődik.
  55. 55. Az 54. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy a nukleinsavaffin anyag polilizin.
  56. 56. Az 55. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy nem kovalensen kötött polilizint is tartalmaz.
  57. 57. A 45-56. igénypontok bármelyike szerinti komplex alkotórészét képező konjugátum, azzal jellemezve, hogy egy endoszomalitikus anyagból és egy nukleinsavaffin anyagból áll.
  58. 58. Az 57. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az endoszomalitikus anyag kovalensen kötődik a nukleinsavaffin anyaghoz.
  59. 59. Az 57. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az endoszomalitikus anyag nem kovalensen kötődik a nukleinsavaffin anyaghoz.
    HU 218 846 Β
  60. 60. Az 59. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a kötés egy biotin-sztreptavidin hídon keresztül valósul meg.
  61. 61. Az 59. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a kötés iononosan történik.
  62. 62. Az 57. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az endoszomalitikus anyag vírus vagy víruskomponens.
  63. 63. A 62. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az endoszomalitikus anyag adenovírus.
  64. 64. A 63. igénypont szerinti konjugátum, azzaljellemezve, hogy az adenovírus egy mutáns.
  65. 65. A 64. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az adenovírus replikációra képtelen mutáns.
  66. 66. A 65. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az adenovírus egy vagy több mutációt és/vagy az ElA-régióban deléciót hordozó mutáns.
  67. 67. A 63. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az adenovírus inaktivált.
  68. 68. A 67. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az adenovírus UV-vel inaktivált.
  69. 69. A 67. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az adenovírus UV/psoralennel inaktivált.
  70. 70. A 67. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az adenovírus formaldehiddel inaktivált.
  71. 71. A 62. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a víruskomponens egy vagy több adenovírus-fehéqéből áll.
  72. 72. A 62. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a vírus picomavírus.
  73. 73. A 72. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a vírus adott esetben inaktivált rhinovírus.
  74. 74. Az 57. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az endoszomalitikus anyag olyan vírus, amely az embertől eltérő fajra fertőző.
  75. 75. A 74. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a vírus egy adenovírus.
  76. 76. A 75. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az adenovírus egy madár-adenovírus.
  77. 77. A 76. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az adenovírus a Chick Embryo Lethal Orphan (csirkeembriót elölő) vírus.
  78. 78. Az 57. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az endoszomalitikus anyag egy, adott esetben módosított endoszomalitikus virális peptid.
  79. 79. A 78. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az endoszomalitikus peptid influenzahemagglutinin HA-2 peptid.
  80. 80. A 79. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a peptid szekvenciája: Gly-Leu-Phe-GluAla-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-GlyMet-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
  81. 81. A 79. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a peptid szekvenciája: Gly-Leu-Phe-GlyAla-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-GlyMet-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
  82. 82. Az 57. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az endoszomalitikus anyag nem virális, adott esetben módosított természetes vagy szintetikus peptid, amely képes széttörni a sejtmembránt.
  83. 83. A 82. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a peptid szekvenciája: Gly-Leu-Phe-GluAla-Ile-Glu-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
  84. 84. A 82. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a peptid a 83. igénypontban definiált peptid homo- vagy heterodimeije.
  85. 85. A 84. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a peptid egy homodimer.
  86. 86. A 84. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a peptid egy heterodimer, amelynek szék venciája: Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Glu-Gly-Phe Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Leu-Ala-Glu-Ala-LeuAla-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Gly-Gly-SerCys.
  87. 87. A 82. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a peptid szekvenciája: Trp-Glu-Ala-AlaLeu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-His Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-LeuAla-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys.
  88. 88. A 82. igénypont szerinti konjugátum, azzaljellemezve, hogy a peptid szekvenciája: Gly-Leu-Phe-GlyAla-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-GluHis-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu Ala-Leu-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys.
  89. 89. A 82. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a peptid egy nukleinsavkötő doménnel rendelkezik.
  90. 90. A 89. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a nukleinsavkötő dómén egy oligolizinmeghosszabbítás.
  91. 91. A 33. igénypont szerinti készítmény alkotórészeként alkalmas endoszomalitikus peptid, azzal jellemezve, hogy endoszomalitikus doménnel és egy mester ségesen bevezetett nukleinsavkötő doménnel rendelkezik.
  92. 92. A 91. igénypont szerinti endoszomalitikus peptid, azzal jellemezve, hogy a nukleinsavkötő dómén egyoligolizinmeghosszabbítás.
  93. 93. Eljárás az 57. igénypont szerinti konjugátum elő állítására, azzal jellemezve, hogy egy endoszomalitikus anyagot és egy nukleinsavaffin anyagot összekapcsolunk.
  94. 94. A 93. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vírus vagy egy (poli)peptid endoszomalitikus anyagot és egy poliamint transzglutamináz jelenlétében enzimesen kapcsolunk össze.
  95. 95. A 93. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vírust vagy egy (poli)peptid endoszomalitikus anyagot és egy poliamint kémiailag összekapcsolunk.
  96. 96. Eljárás az 57. vagy 58. igénypont szerinti konjugátum előállítására, azzal jellemezve, hogy egy vírust vagy víruskomponenst biotinnal módosítunk, és a módosított vírust vagy víruskomponenst sztreptavidinnel kapcsolt poliaminhoz kötjük.
  97. 97. Eljárás nukleinsavak bevitelére magasabb rendű eukarióta sejtekbe, azzal jellemezve, hogy a sejteket az
    HU 218 846 Β
    144. igénypontok bármelyike szerinti készítménnyel ex vivő vagy in vitro érintkezésbe hozzuk.
  98. 98. A 97. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek humán sejtek.
  99. 99. A 98. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek daganatsejtek.
  100. 100. A 98. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek mioblasztok.
  101. 101. A 98. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek fíbroblasztok.
  102. 102. A 98. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek hepatociták.
  103. 103. A 98. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek hámsejtek.
  104. 104. A 98. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek légúti sejtek.
  105. 105. A 97-104. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítményben a nukleinsav génterápiásán hatásos.
  106. 106. A 99. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a daganatsejteket a készítménnyel ex vivő érintkeztetjük, és a nukleinsav egy vagy több immunszabályozó anyagot, előnyösen citokint kódol.
  107. 107. Eljárás heterológ fehérje előállítására magasabb rendű eukarióta sejtekben, azzal jellemezve, hogy a sejteket az 1. igénypont szerinti készítménnyel, amelyben a nukleinsav a kívánt fehérjét kódoló DNS-szekvenciát tartalmazza, transzfektáljuk, a sejteket a fehérje kifejeződéséhez alkalmas körülmények között tenyésztjük, és a kifejeződött fehérjét izoláljuk.
  108. 108. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy egy 1 -44. igénypontok bármelyike szerinti készítményt, amelyben a nukleinsav terápiásán aktív és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
  109. 109. Eljárás az 1-44. igénypontok bármelyike szerinti készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy nukleinsavból és egy nukleinsavaffin anyagból, melyet adott esetben egy intemalizáló faktorral konjugálunk, komplexet képzünk és
    a) egy endoszomalitikus anyagot a saját nukleinsavkötő doménjén keresztül vagy egy nukleinsavaffin anyaghoz konjugálva a nukleinsavval komplexbe viszünk; vagy
    b) endoszomalitikus anyagként egy vírust vagy víruskomponenst adunk a fenti nukleinsavkomplexhez.
HU9400898A 1991-09-30 1992-09-28 Készítmények nukleinsavkomplexek magasabbrendű eukarióta sejtekbe való bevitelére és eljárás az előállításukra HU218846B (hu)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US76778891A 1991-09-30 1991-09-30
US76803991A 1991-09-30 1991-09-30
US82710292A 1992-01-30 1992-01-30
US82710392A 1992-01-30 1992-01-30
US86475992A 1992-04-07 1992-04-07
US93778892A 1992-09-02 1992-09-02

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9400898D0 HU9400898D0 (en) 1994-06-28
HUT71312A HUT71312A (en) 1995-11-28
HU218846B true HU218846B (hu) 2000-12-28

Family

ID=27560281

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9400898A HU218846B (hu) 1991-09-30 1992-09-28 Készítmények nukleinsavkomplexek magasabbrendű eukarióta sejtekbe való bevitelére és eljárás az előállításukra
HU95P/P00694P HU211925A9 (en) 1991-09-30 1995-06-30 Composition for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU95P/P00694P HU211925A9 (en) 1991-09-30 1995-06-30 Composition for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells

Country Status (28)

Country Link
US (4) US5547932A (hu)
EP (2) EP0545016A1 (hu)
JP (1) JPH10506001A (hu)
CN (1) CN1059705C (hu)
AT (1) ATE215990T1 (hu)
AU (1) AU671084B2 (hu)
BG (1) BG62740B1 (hu)
BR (1) BR9206559A (hu)
CA (1) CA2118816C (hu)
CZ (1) CZ293141B6 (hu)
DE (1) DE59209951D1 (hu)
DK (1) DK0607206T3 (hu)
EE (1) EE03195B1 (hu)
ES (1) ES2173083T3 (hu)
FI (1) FI941474A0 (hu)
HK (1) HK1013104A1 (hu)
HU (2) HU218846B (hu)
IL (1) IL103171A (hu)
MX (1) MX9205543A (hu)
NO (1) NO316744B1 (hu)
NZ (1) NZ244306A (hu)
PL (1) PL180304B1 (hu)
PT (1) PT607206E (hu)
RO (1) RO117861B1 (hu)
SG (1) SG44680A1 (hu)
SI (1) SI9200236B (hu)
SK (1) SK281682B6 (hu)
WO (1) WO1993007283A1 (hu)

Families Citing this family (416)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5981273A (en) * 1991-09-30 1999-11-09 Boehringer Ingelheim Int'l. Gmbh Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
NZ244306A (en) * 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
CA2131620A1 (en) * 1992-03-20 1993-09-30 Louis C. Smith A dna transporter system and method of use
ES2221920T3 (es) * 1992-04-03 2005-01-16 The Regents Of The University Of California Sistema de liberacion de polinucleotidos de autoensamblaje que comprende un peptido cationico anfipatico.
WO1994006923A1 (en) * 1992-09-24 1994-03-31 The University Of Connecticut Modification of a virus to redirect infectivity and enhance targeted delivery of polynucleotides to cells
HUT73383A (en) * 1993-03-19 1996-07-29 Boehringer Sohn Ingelheim Process for preparing cancer vaccines
DE4311651A1 (de) * 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
WO1995002698A1 (en) * 1993-07-12 1995-01-26 Life Technologies, Inc. Composition and methods for transfecting eukaryotic cells
DE4335025A1 (de) * 1993-10-14 1995-04-20 Boehringer Ingelheim Int Endosomolytisch wirksame Partikel
EP0648493A1 (en) * 1993-10-19 1995-04-19 Tadatsugu Prof. Dr. Taniguchi A method to reverse the phenotype of transformed cells by the transcription factor IRF-1
US5928944A (en) * 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection
MX9603866A (es) * 1994-03-18 1997-03-29 Boehringer Ingelheim Int Procedimiento para el tratamiento de celulas eucarioticas.
AU2194895A (en) * 1994-03-25 1995-10-17 Uab Research Foundation, The Composition and methods for creating syngeneic recombinant virus-producing cells
US5670347A (en) 1994-05-11 1997-09-23 Amba Biosciences Llc Peptide-mediated gene transfer
US6284880B1 (en) 1994-05-30 2001-09-04 Boehringer Ingelheim International Gmbh Chicken embryo lethal orphan (CELO) virus GAM-1
DE4418965A1 (de) * 1994-05-31 1995-12-07 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
DE4426429A1 (de) * 1994-07-26 1996-02-01 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum Einführen von DNA in höhere eukaryotische Zellen
US6468981B1 (en) 1994-07-29 2002-10-22 Emory University Compositions and methods for targeting pharmaceutically active materials to cells containing androgen receptors
US5525606A (en) 1994-08-01 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Substituted 06-benzylguanines and 6(4)-benzyloxypyrimidines
US5965541A (en) * 1995-11-28 1999-10-12 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5962311A (en) * 1994-09-08 1999-10-05 Genvec, Inc. Short-shafted adenoviral fiber and its use
US5846782A (en) 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
US6465253B1 (en) 1994-09-08 2002-10-15 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5559099A (en) * 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
US5837533A (en) * 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
EP0785276A4 (en) * 1994-09-29 2002-01-09 Ajinomoto Kk MODIFICATION OF A PEPTIDE AND A PROTEIN
US6221959B1 (en) 1994-11-18 2001-04-24 Supratek Pharma, Inc. Polynucleotide compositions
US6359054B1 (en) 1994-11-18 2002-03-19 Supratek Pharma Inc. Polynucleotide compositions for intramuscular administration
US6008202A (en) * 1995-01-23 1999-12-28 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5795587A (en) * 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US6127525A (en) * 1995-02-21 2000-10-03 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same
US5770442A (en) 1995-02-21 1998-06-23 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same
AU5103996A (en) * 1995-03-09 1996-10-02 Bavarian Nordic Research Institute A/S Vectors carrying therapeutic genes encoding antimicrobial peptides for gene therapy
WO1996029423A1 (en) * 1995-03-20 1996-09-26 Baylor College Of Medicine Compositions and methods for inducing infection by retroviral vectors outside of their host range
DE19510344C1 (de) * 1995-03-22 1996-11-07 Boehringer Ingelheim Int Verwendung einer Tumorvakzine
US6420549B1 (en) 1995-06-06 2002-07-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide analogs having modified dimers
AU705035B2 (en) * 1995-06-07 1999-05-13 Baylor College Of Medicine Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
US6051429A (en) * 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US20030069173A1 (en) * 1998-03-16 2003-04-10 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced transfections
AU5979296A (en) * 1995-06-07 1996-12-30 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US6783980B2 (en) * 1995-06-15 2004-08-31 Crucell Holland B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
ATE278794T1 (de) * 1995-06-15 2004-10-15 Crucell Holland Bv Verpackungssysteme für humane, menschliche adenoviren, zur verwendung in die gentherapie
US5908777A (en) * 1995-06-23 1999-06-01 University Of Pittsburgh Lipidic vector for nucleic acid delivery
GB9515356D0 (en) * 1995-07-26 1995-09-20 Medical Res Council Improvements in or relating to delivery of nucleic acid
US5770720A (en) * 1995-08-30 1998-06-23 Barnes-Jewish Hospital Ubiquitin conjugating enzymes having transcriptional repressor activity
IL115199A (en) 1995-09-07 2005-05-17 Opperbas Holding Bv Composition comprising a polynucleic acid molecule in a liposome and method using said composition
CA2190304A1 (en) * 1995-12-15 1997-06-16 Elazar Rabbani Property effecting and/or property exhibiting compositions for therapeutic and diagnostic uses
AU2112697A (en) * 1996-02-09 1997-08-28 Pi-Wan Cheng Receptor ligand-facilitated delivery of biologically active molecules
DE19605548A1 (de) * 1996-02-15 1997-09-04 Boehringer Ingelheim Int Zusammensetzung für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen
CA2248538A1 (en) 1996-03-14 1997-09-18 The Immune Response Corporation Targeted delivery of genes encoding interferon
DE19615803A1 (de) 1996-04-20 1997-10-23 Boehringer Ingelheim Int CELO-Virus
US7812149B2 (en) 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US9096636B2 (en) 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
DE69725878T2 (de) 1996-08-13 2004-07-29 Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville Zusammensetzungen zur polynukleotidabgabe
DE19632532A1 (de) * 1996-08-13 1998-02-19 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur Herstellung von Säugetieren mit definierten genetischen Eigenschaften
US5948681A (en) * 1996-08-14 1999-09-07 Children's Hospital Of Philadelphia Non-viral vehicles for use in gene transfer
CN1181422A (zh) * 1996-10-31 1998-05-13 上海市肿瘤研究所 与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体
US6544523B1 (en) 1996-11-13 2003-04-08 Chiron Corporation Mutant forms of Fas ligand and uses thereof
US5965441A (en) * 1996-11-13 1999-10-12 The General Hospital Coporation HSV/AAV hybrid amplicon vectors
US20060002949A1 (en) 1996-11-14 2006-01-05 Army Govt. Of The Usa, As Rep. By Secretary Of The Office Of The Command Judge Advocate, Hq Usamrmc. Transcutaneous immunization without heterologous adjuvant
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
US6797276B1 (en) 1996-11-14 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Use of penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response
US6153596A (en) * 1996-12-18 2000-11-28 Emory University Polycationic oligomers
JP4289687B2 (ja) * 1997-03-14 2009-07-01 ザ チルドレンズ ホスピタル オブ フィラデルフィア 血友病の治療のための遺伝子治療で使用する方法と組成物
US20040009166A1 (en) * 1997-04-30 2004-01-15 Filpula David R. Single chain antigen-binding polypeptides for polymer conjugation
CA2288992C (en) * 1997-04-30 2012-06-12 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
US6635623B1 (en) 1997-06-13 2003-10-21 Baylor College Of Medicine Lipoproteins as nucleic acid vectors
US20050096288A1 (en) * 1997-06-13 2005-05-05 Aragene, Inc. Lipoproteins as nucleic acid vectors
DE19726186A1 (de) * 1997-06-20 1998-12-24 Boehringer Ingelheim Int Komplexe für den Transport von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
US6172211B1 (en) 1997-07-11 2001-01-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Nucleic acid encoding tag7 polypeptide
EP1007099A4 (en) * 1997-07-11 2004-11-24 Univ Brandeis METHOD FOR INDUCING APOPTOSE BY LOWERING THE THIAMINE MIRROR
US7923250B2 (en) 1997-07-30 2011-04-12 Warsaw Orthopedic, Inc. Methods of expressing LIM mineralization protein in non-osseous cells
DE69840361D1 (de) 1997-07-30 2009-01-29 Univ Emory Neue knochenmineralisierungsproteine, dna, vektoren, expressionssysteme
WO1999007723A1 (en) * 1997-08-07 1999-02-18 University Of Maryland, Baltimore Nucleic acid uptake and release vehicle
US20030125278A1 (en) * 1997-08-13 2003-07-03 Tang De-Chu C. Immunization of animals by topical applications of a salmonella-based vector
US6706693B1 (en) 1997-08-13 2004-03-16 The Uab Research Foundation Vaccination by topical application of genetic vectors
US6197332B1 (en) 1997-08-13 2001-03-06 Chiron Corporation Lipid-conjugated polyamide compounds and related compositions and methods thereof
US20030045492A1 (en) * 1997-08-13 2003-03-06 Tang De-Chu C. Vaccination by topical application of recombinant vectors
US6716823B1 (en) 1997-08-13 2004-04-06 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof
US6348450B1 (en) 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
US5998386A (en) 1997-09-19 1999-12-07 Feldman; Arthur M. Pharmaceutical compositions and method of using same for the treatment of failing myocardial tissue
WO1999019500A1 (en) * 1997-10-10 1999-04-22 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Healt H And Human Services Complex of biotinylated viral vector and ligand for targeted gene delivery
US6914131B1 (en) 1998-10-09 2005-07-05 Chiron S.R.L. Neisserial antigens
CA2671261A1 (en) 1997-11-06 1999-05-20 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Neisserial antigens
US6734338B1 (en) 1997-11-14 2004-05-11 Cedars-Sinai Medical Center Transfection, storage and transfer of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies
US7294755B1 (en) 1997-11-14 2007-11-13 Cedars-Sinai Medical Center Genetic modification of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies
JP2001523468A (ja) * 1997-11-14 2001-11-27 セダーシナイ メディカル センター トランスジェニック種の産生のための雄性生殖細胞のトランスフェクションおよび移入
EP0945138A1 (en) * 1997-12-04 1999-09-29 Université Louis Pasteur de Strasbourg Transfection particles
CA2317549C (en) * 1998-01-05 2006-04-11 University Of Washington Composition for enhancing transport through lipid-containing membranes, and uses thereof
BR9906927A (pt) 1998-01-14 2001-11-20 Chiron Spa Proteìnas de neisseria meningitidis
AU4070499A (en) 1998-04-30 1999-11-16 Cornell Research Foundation Inc. Adenoviral vectors with tandem fiber proteins
NZ541361A (en) 1998-05-01 2008-04-30 Inst Genomic Research Neisseria meningitidis antigens and compositions relating to SEQ ID Nos:2916, 2918 and 2920
US7244714B1 (en) * 1998-06-12 2007-07-17 Aradigm Corporation Methods of delivering aerosolized polynucleotides to the respiratory tract
US6509323B1 (en) 1998-07-01 2003-01-21 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
US7091192B1 (en) 1998-07-01 2006-08-15 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
US6245427B1 (en) 1998-07-06 2001-06-12 DüZGüNES NEJAT Non-ligand polypeptide and liposome complexes as intracellular delivery vehicles
US20040043489A1 (en) * 1998-07-08 2004-03-04 Menzo Havenga Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for dendritic cells and methods of use
US20030017138A1 (en) * 1998-07-08 2003-01-23 Menzo Havenga Chimeric adenoviruses
US7396919B1 (en) * 1998-07-17 2008-07-08 Mirus Bio Corporation Charge reversal of polyion complexes
WO2000011019A1 (en) * 1998-08-21 2000-03-02 Felix Frey Conjugates of dna interacting groups with steroid hormones for use as nucleic acid transfection agent
US6455314B1 (en) 1998-09-11 2002-09-24 Genvec, Inc. Alternatively targeted adenovirus
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
EP1953229A3 (en) 1998-10-15 2008-12-24 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Metastatic breast and colon cancer regulated genes
US6333396B1 (en) 1998-10-20 2001-12-25 Enzon, Inc. Method for targeted delivery of nucleic acids
US7166745B1 (en) 1998-11-12 2007-01-23 Invitrogen Corporation Transfection reagents
US20050063950A1 (en) * 1998-11-19 2005-03-24 Georgetown University Systemic viral/ligand gene delivery system and gene therapy
DE69942837D1 (de) 1998-11-19 2010-11-18 Univ Georgetown Systemisches virus/ligand genabgabemittel und gentherapie
US6929946B1 (en) * 1998-11-20 2005-08-16 Crucell Holland B.V. Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells
DK1141331T3 (da) 1998-12-16 2009-01-05 Novartis Vaccines & Diagnostic Human cyclinafhængig kinase (hPNQALRE)
US7098192B2 (en) 1999-04-08 2006-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of STAT3 expression
GB9908195D0 (en) 1999-04-09 1999-06-02 Microbiological Res Authority Treatment of intracellular infection
US6514762B1 (en) 1999-04-23 2003-02-04 New Mexico State University Technology Transfer Corporation Delivery of nucleotides by electrochemical release
DE19918446A1 (de) * 1999-04-23 2000-11-23 Univ Eberhard Karls Verwendung von Coxsackievirus B3 zur Verbesserung der Transfektion von Zellen
MXPA01010924A (es) 1999-04-30 2002-05-06 Chiron Spa Antigenos de neisseria conservados.
US20040009936A1 (en) * 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
US6913922B1 (en) 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
US6492169B1 (en) 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
US20050232900A1 (en) * 1999-05-18 2005-10-20 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
US6696272B1 (en) 1999-06-02 2004-02-24 Hsc Research & Development Limited Partnership Products and methods for gaucher disease therapy
DK1102785T3 (da) * 1999-06-07 2013-05-13 Arrowhead Res Corp Sammensætninger til lægemiddeltilførsel ved anvendelse af pH-følsomme molekyler
US20080281041A1 (en) * 1999-06-07 2008-11-13 Rozema David B Reversibly Masked Polymers
US8541548B2 (en) * 1999-06-07 2013-09-24 Arrowhead Madison Inc. Compounds and methods for reversible modification of biologically active molecules
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
ES2183752T3 (es) * 1999-09-17 2005-07-16 Tgt Laboratories, S.A. De C.V. Vectores adenovirales recombinantes y su utilizacion en el tratamiento de la cirrosis de higado.
EP2275553B1 (en) 1999-10-29 2015-05-13 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Neisserial antigenic peptides
CA2395636A1 (en) * 1999-12-30 2001-07-12 Novartis Ag Novel colloid synthetic vectors for gene therapy
AU2764801A (en) 2000-01-07 2001-07-24 University Of Washington Enhanced transport of agents using membrane disruptive agents
ES2507100T3 (es) 2000-01-17 2014-10-14 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Vacuna OMV suplementada contra meningococo
US6261840B1 (en) 2000-01-18 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US20020055479A1 (en) 2000-01-18 2002-05-09 Cowsert Lex M. Antisense modulation of PTP1B expression
BR0108711A (pt) 2000-02-28 2004-06-22 Chiron Spa Expressão heteróloga de proteìnas de neisseria
US6680172B1 (en) 2000-05-16 2004-01-20 Regents Of The University Of Michigan Treatments and markers for cancers of the central nervous system
EP1157999A1 (en) * 2000-05-24 2001-11-28 Introgene B.V. Methods and means for enhancing skin transplantation using gene delivery vehicles having tropism for primary fibroblasts, as well as other uses thereof
JP2003534806A (ja) * 2000-05-31 2003-11-25 ジェンベク、インコーポレイティッド アデノウイルスベクターのターゲティングの方法および組成物
EP1950297A2 (en) 2000-05-31 2008-07-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Compositions and methods for treating neoplastic disease using chemotherapy and radiation sensitizers
JP2004501657A (ja) 2000-06-28 2004-01-22 マックス−デルブルック−セントラム　フュール　モレクラーレ　メディツィン トランスフェクション効率の改良方法
US20040058856A1 (en) * 2000-07-26 2004-03-25 Soo-Young Choi Oligolysine transducing domain, oligolysine-cargo molecule complex and uses thereof
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
US20040033605A1 (en) * 2000-09-20 2004-02-19 Menzo Havenga Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for dendritic cells
US7235233B2 (en) * 2000-09-26 2007-06-26 Crucell Holland B.V. Serotype 5 adenoviral vectors with chimeric fibers for gene delivery in skeletal muscle cells or myoblasts
EP1191104A1 (en) * 2000-09-26 2002-03-27 Introgene B.V. Gene delivery vehicles and use thereof in the preparation of a medicament and/or vaccine
DE10049010A1 (de) * 2000-10-04 2002-04-18 Boehringer Ingelheim Int Transferrin-Polykation/DNS-Komplexe für die systemische Therapie von Tumorerkrankungen mit zytotoxischen Proteinen
NZ560966A (en) 2000-10-27 2010-06-25 Novartis Vaccines & Diagnostic Nucleic acids and proteins from streptococcus groups A & B
US20020086849A1 (en) * 2000-10-27 2002-07-04 Gulilat Gebeyehu Method for introducing antisense oligonucleotides into eucaryotic cells
US6892140B1 (en) 2000-11-27 2005-05-10 Enteron, Inc. Immunogenic cancer peptides and uses thereof
MXPA00011713A (es) * 2000-11-28 2002-05-31 Tgt Lab S A De C V Vectores recombinantes virales y no virales conteniendo el gen humano del activador de plasminogeno derivado de urocinasa y su utilidad en el tratamiento de diversos tipos de fibrosis hepatica, renal, pulmonar, pancreatica, cardiaca y cicatrices hipe
US7635571B2 (en) * 2000-12-07 2009-12-22 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Amplified signal in binding assays
US6635466B2 (en) * 2001-01-09 2003-10-21 University Of Iowa Research Foundation Adenovirus serotype 30 (Ad30)
US20030170826A1 (en) * 2001-02-02 2003-09-11 Peter Rabinovich Peptides for facilitating composite receptor expression and translocation of macromolecules
ES2310201T3 (es) 2001-02-13 2009-01-01 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Army Vacuna para inmunizacion transcutanea contra la diarrea de los viajeros.
US20020150566A1 (en) * 2001-03-23 2002-10-17 Kun-Liang Guan Method of inhibiting cancerous cell proliferation using Ras mutants of GDP-bound conformation
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
US20020193295A1 (en) * 2001-05-04 2002-12-19 Emanuel Calenoff Immunogenic peptides and uses thereof
EP1383480A4 (en) * 2001-04-30 2006-05-24 Targeted Genetics Corp Lipid-Containing Drug Delivery Complexes and Method of Producing the Same
WO2002089586A1 (en) * 2001-05-10 2002-11-14 St. Jude Children's Research Hospital Lung epithelial cell line for propagating viruses
US20060159657A1 (en) * 2001-06-14 2006-07-20 Macromed, Incorporated Formulations of lymphokines and method of use thereof for local or both local and systemic control of proliferative cell disorders
US20030003074A1 (en) * 2001-06-14 2003-01-02 Macromed, Inc. Formulations of lymphokines and method of use thereof for local or both local and systemic control of proliferative cell disorders
US7803915B2 (en) 2001-06-20 2010-09-28 Genentech, Inc. Antibody compositions for the diagnosis and treatment of tumor
WO2003000113A2 (en) 2001-06-20 2003-01-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
EP2270024B1 (en) 2001-06-21 2018-10-24 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US6964950B2 (en) 2001-07-25 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of C-reactive protein expression
US20030096772A1 (en) 2001-07-30 2003-05-22 Crooke Rosanne M. Antisense modulation of acyl CoA cholesterol acyltransferase-2 expression
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7227014B2 (en) 2001-08-07 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein (a) expression
GB0120022D0 (en) 2001-08-16 2001-10-10 Photobiotics Ltd Conjugate
JP2005536439A (ja) 2001-09-18 2005-12-02 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍の診断及び治療のための組成物と方法
WO2003052117A2 (en) * 2001-09-19 2003-06-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to non-viral transfection
US6750019B2 (en) 2001-10-09 2004-06-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression
NZ577565A (en) 2001-10-09 2010-10-29 Isis Pharmaceuticals Inc Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expressions
US7745418B2 (en) * 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
WO2003088808A2 (en) 2002-04-16 2003-10-30 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
JP2005527639A (ja) 2001-11-02 2005-09-15 インサート セラピューティクス インコーポレイテッド Ｒｎａ干渉の治療的利用のための方法及び組成物
US20030138407A1 (en) * 2001-11-02 2003-07-24 Patrick Lu Therapeutic methods for nucleic acid delivery vehicles
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
KR100982204B1 (ko) 2001-12-12 2010-09-14 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 에스.알.엘. 클라미디아 트라코마티스에 대한 면역화
NZ556415A (en) 2002-01-02 2009-02-28 Genentech Inc Compositions and methods for the diagnosis and treatment of glioma tumor
US8138383B2 (en) * 2002-03-11 2012-03-20 Arrowhead Madison Inc. Membrane active heteropolymers
US8008355B2 (en) * 2002-03-11 2011-08-30 Roche Madison Inc. Endosomolytic poly(vinyl ether) polymers
US20030186916A1 (en) * 2002-03-12 2003-10-02 Lei Yu Vector for transfection of eukaryotic cells
AU2003225793A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-29 Baxter Healthcare S.A. Methods and compositions for directing cells to target organs
US20030180712A1 (en) 2002-03-20 2003-09-25 Biostratum Ab Inhibition of the beta3 subunit of L-type Ca2+ channels
ATE447037T1 (de) * 2002-04-25 2009-11-15 Crucell Holland Bv Mittel und verfahren zur herstellung von adenovirusvektoren
US20040142450A1 (en) * 2002-05-10 2004-07-22 Seo Sang Heui Lung epithelial cell line for propagating viruses
US7199107B2 (en) 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
US20050233993A1 (en) * 2002-06-05 2005-10-20 Kadonaga James T Methods for promoting homologous recombination
PT2332582E (pt) 2002-06-19 2014-01-28 Apeiron Biologics Ag Activação de ace2 para o tratamento de doença cardíaca, pulmonar e renal e de hipertensão
US20060003316A1 (en) * 2002-07-15 2006-01-05 John Simard Immunogenic compositions derived from poxviruses and methods of using same
PT1534340E (pt) 2002-09-06 2012-03-13 Cerulean Pharma Inc Polímeros à base de ciclodextrina para a administração de medicamentos ligados por ligação covalente
CN1820078A (zh) * 2002-09-09 2006-08-16 田纳西大学研究基金会 弹状病毒的重组突变体及其应用方法
MXPA05002791A (es) 2002-09-13 2005-12-05 Replicor Inc Oligonucleotidos antivirales complementarios sin secuencia.
AU2003278957A1 (en) 2002-09-26 2004-04-23 Amgen, Inc. Modulation of forkhead box o1a expression
MXPA05003843A (es) * 2002-10-10 2006-02-17 Us Dept Veterans Affairs Deteccion, localizacion y determicnacion de fases de tumores usando linfocitos activados rotulados dirigidos a un epitope especifico.
AU2003295387A1 (en) 2002-11-05 2004-06-03 Isis Parmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
EP1560839A4 (en) 2002-11-05 2008-04-23 Isis Pharmaceuticals Inc CHIMERIC OLIGOMER COMPOUNDS AND THEIR USE IN GENE MODULATION
US20080026077A1 (en) * 2002-11-12 2008-01-31 John Hilfinger Methods and compositions of gene delivery agents for systemic and local therapy
US20050026859A1 (en) * 2002-11-12 2005-02-03 John Hilfinger Methods and compositions of gene delivery agents for systemic and local therapy
ES2420914T3 (es) 2002-11-13 2013-08-27 Genzyme Corporation Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B
CA2505801A1 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Rosanne Crooke Antisense modulation of apolipoprotein b expression
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
US7468356B2 (en) 2003-02-11 2008-12-23 Antisense Therapeutics Ltd. Modulation of insulin like growth factor I receptor expression
US7803781B2 (en) 2003-02-28 2010-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
US20040185559A1 (en) 2003-03-21 2004-09-23 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 1 expression
US7217566B2 (en) * 2003-03-24 2007-05-15 Invitrogen Corporation Attached cell lines
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
EP1620112A4 (en) * 2003-04-17 2007-04-25 Univ Columbia DESMOGLEIN 4 IS A NEW GENUS INVOLVED IN HAIR GROWTH
US7399853B2 (en) 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
US20040220085A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Jasbir Sandhu Compositions for nucleic acid delivery
US20040220084A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Jasbir Sandhu Methods for nucleic acid delivery
BRPI0410886A (pt) 2003-06-03 2006-07-04 Isis Pharmaceuticals Inc composto de filamento duplo, composição farmacêutica, sal farmaceuticamente aceitável, métodos de modificação do ácido nucleico que codifica a survivina humana, de inibição da expressão da suvivina em células ou tecidos, e de tratamento de uma condição associada com a expressão ou superexpressão da suvivina, e, oligonucleotìdeo de rnai de filamento único
CA2528094A1 (en) * 2003-06-09 2005-01-13 Corixa Corporation Expression vectors for stimulating an immune response to cancer antigens
US7883720B2 (en) * 2003-07-09 2011-02-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Charge-dynamic polymers and delivery of anionic compounds
WO2005013901A2 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
NZ576775A (en) 2003-09-18 2010-12-24 Isis Pharmaceuticals Inc Modulation of eIF4E expression
NZ546272A (en) 2003-10-10 2009-05-31 Alchemia Oncology Pty Ltd The modulation of hyaluronan synthesis and degradation in the treatment of disease
KR20060116825A (ko) * 2003-10-23 2006-11-15 일루미겐 바이오사이언시스, 인코포레이티드 바이러스 감염에 대한 저항성과 관련된 유전자인ｏａｓ1에서의 돌연변이의 검출
US8062891B2 (en) 2003-10-24 2011-11-22 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to plants
US8507277B2 (en) 2003-10-24 2013-08-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides
US20090123468A1 (en) 2003-10-24 2009-05-14 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US20090208478A1 (en) * 2003-10-24 2009-08-20 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US8133733B2 (en) 2003-10-24 2012-03-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues
EP2418281B1 (en) 2003-10-24 2016-06-01 Gencia Corporation Methods and compositions for delivering polynucleotides
US20050191653A1 (en) 2003-11-03 2005-09-01 Freier Susan M. Modulation of SGLT2 expression
CA2747871C (en) 2003-11-17 2018-04-10 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
WO2005054438A2 (en) 2003-12-01 2005-06-16 Invitrogen Corporation Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same
US20050265956A1 (en) * 2004-01-12 2005-12-01 Ye Liu Polyalkyleneimine-graft-biodegradable polymers for delivery of bioactive agents
US20050164271A1 (en) 2004-01-20 2005-07-28 Sanjay Bhanot Modulation of glucocorticoid receptor expression
US7468431B2 (en) 2004-01-22 2008-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E-BP2 expression
WO2005069987A2 (en) * 2004-01-23 2005-08-04 City Of Hope Amplifying interfering rna (rnai) expression and effects
US8569474B2 (en) 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
US20050203047A1 (en) * 2004-03-10 2005-09-15 Ulrich Thomann Delivery vectors for short interfering RNA, micro-RNA and antisense RNA
EP2700720A3 (en) 2004-03-15 2015-01-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for optimizing cleavage of RNA by RNASE H
WO2005097207A2 (en) * 2004-03-26 2005-10-20 Curis, Inc. Rna interference modulators of hedgehog signaling and uses thereof
DK1736541T3 (da) 2004-03-29 2013-05-06 Galpharma Co Ltd Nyt modificeret galectin 9-protein og anvendelse heraf
US20050244869A1 (en) 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
US7884086B2 (en) 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
US8697139B2 (en) 2004-09-21 2014-04-15 Frank M. Phillips Method of intervertebral disc treatment using articular chondrocyte cells
US9315862B2 (en) 2004-10-05 2016-04-19 California Institute Of Technology Aptamer regulated nucleic acids and uses thereof
CA2582353A1 (en) 2004-10-06 2006-04-20 University Of Rochester Treatment of pulmonary hypertension using an agent that inhibits a tissue factor pathway
US7833513B2 (en) 2004-12-03 2010-11-16 Rhode Island Hospital Treatment of Alzheimer's Disease
EP2110667A1 (en) 2005-01-20 2009-10-21 University Of Rochester Thoredoxin interacting protein (TXNIP) as regulator of vascular function
ES2852549T3 (es) 2005-02-09 2021-09-13 Sarepta Therapeutics Inc Composición antisentido para tratamiento de la atrofia muscular
JP2008531581A (ja) * 2005-02-23 2008-08-14 ユーエービー リサーチ ファウンデーション アルキル−グリコシドで増強されたワクチン接種
CN101175769A (zh) 2005-03-10 2008-05-07 健泰科生物技术公司 用于调控血管完整性的方法和组合物
AU2006230436B2 (en) 2005-03-31 2011-11-24 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
US8734851B2 (en) * 2005-04-29 2014-05-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Localized delivery of nucleic acid by polyelectrolyte assemblies
UA95446C2 (ru) 2005-05-04 2011-08-10 Іллюміджен Байосайєнсіз, Інк. Мутаци в генах oas1
DE102005023993A1 (de) * 2005-05-20 2006-11-23 TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH Nicht virales Vektorsystem zum Transport von Nukleinsäure in die Lunge
AU2006318194B2 (en) 2005-11-21 2012-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eiF4E-BP2 expression
US20090317802A1 (en) * 2005-12-09 2009-12-24 Bhatia Sangeeta N Compositions and Methods to Monitor RNA Delivery to Cells
CA2566267A1 (en) * 2005-12-09 2007-06-09 University Health Network Thymidylate kinase mutants and uses thereof
US20090068158A1 (en) * 2005-12-09 2009-03-12 Medin Jeffrey A Thymidylate kinase mutants and uses thereof
WO2007089584A2 (en) 2006-01-26 2007-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to huntingtin
CA2638915A1 (en) * 2006-02-10 2007-08-23 The Regents Of The University Of California Transducible delivery of sirna by dsrna binding domain fusions to ptd/cpps
EP2502999A3 (en) 2006-03-03 2013-01-23 Amorfix Life Sciences Ltd. Methods and compositions to treat and detect misfolded-SOD1 mediated diseases
US7718193B2 (en) * 2006-03-16 2010-05-18 University Of Washington Temperature- and pH-responsive polymer compositions
EP2614839A3 (en) 2006-04-05 2015-01-28 Genentech, Inc. Method for using BOC/CDO to modulate hedgehog signaling
MX2008014005A (es) 2006-05-03 2009-01-27 Baltic Technology Dev Ltd Agentes antisentido que combinan un oligonucleotido modificado con base fuertemente unida y nucleasa artificial.
EP2035035A2 (en) 2006-06-09 2009-03-18 Novartis AG Immunogenic compositions for streptococcus agalactiae
JP6125741B2 (ja) * 2006-07-12 2017-05-17 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 可逆的なホスホトリエステル電荷中和保護基による核酸の形質導入可能な送達
WO2008011473A2 (en) 2006-07-19 2008-01-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to hbxip
CN102614528B (zh) * 2006-08-18 2014-02-26 箭头研究公司 用于体内递送多核苷酸的多缀合物
US8017109B2 (en) * 2006-08-18 2011-09-13 Roche Madison Inc. Endosomolytic poly(acrylate) polymers
KR20090066289A (ko) 2006-09-08 2009-06-23 로드아일랜드하스피틀 알코올 유발성 뇌 질환의 치료, 예방 및 역행
EP2061484B1 (en) 2006-09-08 2012-11-07 Rhode Island Hospital Treatment, prevention, and reversal of alcohol-induced liver disease
WO2008058291A2 (en) 2006-11-09 2008-05-15 California Institute Of Technology Modular aptamer-regulated ribozymes
AU2007333225B2 (en) * 2006-12-08 2014-06-12 Massachusetts Institute Of Technology Delivery of nanoparticles and/or agents to cells
US8048998B2 (en) * 2007-01-19 2011-11-01 Exiqon A/S Mediated cellular delivery of LNA oligonucleotides
US8834918B2 (en) * 2007-01-22 2014-09-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Modified multilayered film
JP2010516625A (ja) 2007-01-24 2010-05-20 インサート セラピューティクス， インコーポレイテッド 制御された薬物送達のためのテザー基を有するポリマー−薬物コンジュゲート
EP2114981B1 (en) 2007-01-29 2013-05-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating protein expression
JP5761915B2 (ja) 2007-02-22 2015-08-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 炎症性腸疾患の検出方法
US7981688B2 (en) 2007-03-08 2011-07-19 University Of Washington Stimuli-responsive magnetic nanoparticles and related methods
EP2139447A2 (en) 2007-03-20 2010-01-06 Harold Brem Gm-csf cosmeceutical compositions and methods of use thereof
CA2584494A1 (en) * 2007-03-27 2008-09-27 Jeffrey A. Medin Vector encoding therapeutic polypeptide and safety elements to clear transduced cells
ES2654303T3 (es) 2007-05-04 2018-02-13 University Health Network Inmunoterapia de IL-12 contra el cáncer
US20090082217A1 (en) * 2007-07-16 2009-03-26 California Institute Of Technology Selection of nucleic acid-based sensor domains within nucleic acid switch platform
US20120165387A1 (en) 2007-08-28 2012-06-28 Smolke Christina D General composition framework for ligand-controlled RNA regulatory systems
US8367815B2 (en) * 2007-08-28 2013-02-05 California Institute Of Technology Modular polynucleotides for ligand-controlled regulatory systems
US8865667B2 (en) * 2007-09-12 2014-10-21 California Institute Of Technology Higher-order cellular information processing devices
AU2008307482B2 (en) 2007-10-02 2012-07-12 Amgen Inc. Increasing erythropoietin using nucleic acids hybridizable to micro-RNA and precursors thereof
US20090105375A1 (en) * 2007-10-09 2009-04-23 Lynn David M Ultrathin Multilayered Films for Controlled Release of Anionic Reagents
US9029524B2 (en) * 2007-12-10 2015-05-12 California Institute Of Technology Signal activated RNA interference
EP2077119A1 (de) * 2007-12-21 2009-07-08 Apeiron Biologics Forschungs- und Entwicklungsgesellschaft M.B.H. Behandlung von Fibrosen und Lebererkrankungen
US8344116B2 (en) * 2008-03-17 2013-01-01 Case Western Reserve University Polymers and complexes for delivery of nucleic acids to intracellular targets
US8568709B2 (en) 2008-03-20 2013-10-29 University Health Network Thymidylate kinase fusions and uses thereof
CN102037123A (zh) 2008-04-04 2011-04-27 卡兰多制药股份有限公司 Epas1抑制剂的组合物和用途
GB2459436A (en) * 2008-04-08 2009-10-28 Henderson Morley Plc Vaccine adjuvant
US8324333B2 (en) 2008-06-05 2012-12-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Anionic charge-dynamic polymers for release of cationic agents
US8815818B2 (en) 2008-07-18 2014-08-26 Rxi Pharmaceuticals Corporation Phagocytic cell delivery of RNAI
CN103429270B (zh) 2008-08-25 2016-11-23 埃克斯雷德制药有限公司 阻止结缔组织生长因子的反义核苷酸及其用途
CA2746527A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna interference in skin indications
CA2745811C (en) 2008-12-04 2021-07-13 Joseph Collard Treatment of tumor suppressor gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to the gene
JP6091752B2 (ja) 2008-12-04 2017-03-08 クルナ・インコーポレーテッド Ｅｐｏに対する天然アンチセンス転写物の抑制によるエリスロポエチン（ｅｐｏ）関連疾患の治療
MX366774B (es) 2008-12-04 2019-07-24 Curna Inc Uso de oligonucleótidos antisentido en la inhibición de transcrito antisentido natural para sirtuina 1.
US9493774B2 (en) 2009-01-05 2016-11-15 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of PCSK9 through RNAi
JP6066035B2 (ja) 2009-02-12 2017-01-25 クルナ・インコーポレーテッド グリア細胞由来神経栄養因子（ｇｄｎｆ）関連疾病の、ｇｄｎｆに対する天然アンチセンス転写物の抑制による治療
US9074210B2 (en) 2009-02-12 2015-07-07 Curna, Inc. Treatment of brain derived neurotrophic factor (BDNF) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to BDNF
US8329882B2 (en) 2009-02-18 2012-12-11 California Institute Of Technology Genetic control of mammalian cells with synthetic RNA regulatory systems
EP2963116B1 (en) 2009-03-04 2020-11-11 CuRNA, Inc. Treatment of sirtuin 1 (sirt1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to sirt 1
US9464287B2 (en) 2009-03-16 2016-10-11 Curna, Inc. Treatment of nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (NRF2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to NRF2
MX2011009752A (es) 2009-03-17 2011-09-29 Opko Curna Llc Tratamiento de enfermedades relacionadas a homologo tipo delta 1(dlk1) por inhibicion de transcrito antisentido natural a homologo tipo delta (dlk1).
US8772238B2 (en) 2009-03-18 2014-07-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of ixolaris, a tissue factor inhibitor, for the treatment of cancer
US9145555B2 (en) 2009-04-02 2015-09-29 California Institute Of Technology Integrated—ligand-responsive microRNAs
EP3248618A1 (en) 2009-04-22 2017-11-29 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules
CN102639151B (zh) 2009-05-01 2017-03-22 库尔纳公司 通过针对hbf/hbg的天然反义转录物的抑制治疗血红蛋白（hbf/hbg）相关疾病
WO2010129746A2 (en) 2009-05-06 2010-11-11 Curna, Inc. Treatment of tristetraproline (ttp) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ttp
JP5883782B2 (ja) 2009-05-06 2016-03-15 クルナ・インコーポレーテッド 脂質輸送代謝遺伝子に対する天然アンチセンス転写物の抑制による脂質輸送代謝遺伝子関連疾患の治療
CA2762369C (en) 2009-05-18 2021-12-28 Joseph Collard Treatment of reprogramming factor related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a reprogramming factor
EP2432882B1 (en) 2009-05-22 2019-12-25 CuRNA, Inc. TREATMENT OF TRANSCRIPTION FACTOR E3 (TFE3) and INSULIN RECEPTOR SUBSTRATE 2 (IRS2) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO TFE3
CN103221541B (zh) 2009-05-28 2017-03-01 库尔纳公司 通过抑制抗病毒基因的天然反义转录物来治疗抗病毒基因相关疾病
EP2440234A4 (en) 2009-06-10 2013-11-06 Univ New York IMMUNOLOGICAL TARGETING OF PATHOLOGICAL TAU PROTEINS
US8426214B2 (en) * 2009-06-12 2013-04-23 University Of Washington System and method for magnetically concentrating and detecting biomarkers
CA2765700C (en) 2009-06-16 2021-01-05 Opko Curna, Llc Treatment of collagen gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a collagen gene
ES2629339T3 (es) 2009-06-16 2017-08-08 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con la paraoxonasa 1 (pon1) por inhibición de transcrito antisentido natural a pon1
US8859515B2 (en) 2009-06-24 2014-10-14 Curna, Inc. Treatment of tumor necrosis factor receptor 2 (TNFR2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to TNFR2
CN102482672B (zh) 2009-06-26 2016-11-09 库尔纳公司 通过抑制唐氏综合征基因的天然反义转录物治疗唐氏综合征基因相关疾病
US9234199B2 (en) 2009-08-05 2016-01-12 Curna, Inc. Treatment of insulin gene (INS) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an insulin gene (INS)
CA2771172C (en) 2009-08-25 2021-11-30 Opko Curna, Llc Treatment of 'iq motif containing gtpase activating protein' (iqgap) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to iqgap
JP5887270B2 (ja) 2009-09-02 2016-03-16 ジェネンテック， インコーポレイテッド 突然変異体ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄおよびその使用方法
US20130079382A1 (en) 2009-10-12 2013-03-28 Larry J. Smith Methods and Compositions for Modulating Gene Expression Using Oligonucleotide Based Drugs Administered in vivo or in vitro
WO2011050194A1 (en) 2009-10-22 2011-04-28 Genentech, Inc. Methods and compositions for modulating hepsin activation of macrophage-stimulating protein
WO2011052804A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Tokyo University Of Science Educational Foundation Administrative Organization Method of delivering agent into target cell
US20120244169A1 (en) 2009-11-06 2012-09-27 Fibrogen, Inc. Treatment for Radiation-Induced Disorders
US9080933B2 (en) 2009-11-09 2015-07-14 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Stimuli-responsive polymer diagnostic assay comprising magnetic nanoparticles and capture conjugates
US20110117668A1 (en) * 2009-11-09 2011-05-19 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Self-powered smart diagnostic devices
JP6220126B2 (ja) * 2009-11-23 2017-10-25 セルリアン・ファーマ・インコーポレイテッド 治療的送達のためのシクロデキストリンに基づく重合体
MX2012006072A (es) 2009-11-30 2012-07-23 Genentech Inc Composiciones y metodos para el diagnostico y el tratamiento de tumores.
AU2010329847A1 (en) 2009-12-11 2012-07-26 Genecode As Methods of facilitating neural cell survival using GDNF family ligand (GFL) mimetics or RET signaling pathway activators
JP6025567B2 (ja) 2009-12-16 2016-11-16 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド 膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ｍｂｔｐｓ１）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｍｂｔｐｓ１関連性疾患の治療
WO2011079263A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Curna, Inc. Treatment of uncoupling protein 2 (ucp2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ucp2
US8940708B2 (en) 2009-12-23 2015-01-27 Curna, Inc. Treatment of hepatocyte growth factor (HGF) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to HGF
RU2611186C2 (ru) 2009-12-29 2017-02-21 Курна, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ОПУХОЛЕВЫМ БЕЛКОМ 63 (р63), ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К р63
RU2615450C2 (ru) 2009-12-29 2017-04-04 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с ядерным респираторным фактором 1(nrf1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к nrf1
US8946181B2 (en) 2010-01-04 2015-02-03 Curna, Inc. Treatment of interferon regulatory factor 8 (IRF8) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IRF8
WO2011085066A2 (en) 2010-01-06 2011-07-14 Curna, Inc. Treatment of pancreatic developmental gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a pancreatic developmental gene
CA2786535C (en) 2010-01-11 2019-03-26 Curna, Inc. Treatment of sex hormone binding globulin (shbg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to shbg
WO2011090971A2 (en) 2010-01-19 2011-07-28 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for male reproductive disorders
RU2611192C2 (ru) 2010-01-25 2017-02-21 Курна, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С РНКазой Н1, ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К РНКазе Н1
EP2539452B1 (en) 2010-02-22 2016-07-27 CuRNA, Inc. Treatment of pyrroline-5-carboxylate reductase 1 (pycr1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to pycr1
KR20130004579A (ko) 2010-02-23 2013-01-11 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법
SI2539451T1 (sl) 2010-02-24 2016-04-29 Arrowhead Research Corporation Sestavki za ciljano dostavo sirna
EP2556160A4 (en) 2010-04-09 2013-08-21 Curna Inc TREATMENT OF ILLNESSES ASSOCIATED WITH FIBROBLASTIC GROWTH FACTOR 21 (FGF21) BY INHIBITION OF THE NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT AGAINST FGF21
US8362207B2 (en) 2010-04-16 2013-01-29 Wake Forest University Health Sciences Multi-level specific targeting of cancer cells with IL-13
DK2563920T3 (en) 2010-04-29 2017-05-22 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulation of transthyretin expression
BR112012028010A2 (pt) 2010-05-03 2017-09-26 Genentech Inc anticorpo isolado, célula, ácido nucleíco isolado, método de identificação de um primeiro anticorpo que se liga a um epítopo antigênico tat425 ligado or um anticorpo, métodos de inibir o crescimento de uma célula, de tratamento terapêutico de determinação da presença de uma proteína de tat425 e de diagnóstico da presença de um tumor em um mamífero
RU2018110642A (ru) 2010-05-03 2019-02-27 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с сиртуином (sirt), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к сиртуину (sirt)
EP2569430B1 (en) 2010-05-12 2018-10-17 The Trustees of Columbia University in the City of New York Methods for producing enteroendocrine cells that make and secrete insulin
TWI531370B (zh) 2010-05-14 2016-05-01 可娜公司 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病
EP3299464B1 (en) 2010-05-26 2019-10-02 CuRNA, Inc. Treatment of atonal homolog 1 (atoh1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to atoh1
US9057067B2 (en) 2010-07-10 2015-06-16 Kinki University Method for transfecting nucleic acid to cell and nucleic acid complex
NO2593547T3 (hu) 2010-07-14 2018-04-14
DK2625197T3 (en) 2010-10-05 2016-10-03 Genentech Inc Smoothened MUTANT AND METHODS OF USING THE SAME
CA2813901C (en) 2010-10-06 2019-11-12 Curna, Inc. Treatment of sialidase 4 (neu4) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to neu4
US9222088B2 (en) 2010-10-22 2015-12-29 Curna, Inc. Treatment of alpha-L-iduronidase (IDUA) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IDUA
DK2633052T3 (en) 2010-10-27 2018-07-16 Curna Inc TREATMENT OF INTERFERON-RELATED DEVELOPMENT REGULATOR 1 (IFRD1) -RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENCE TRANSCRIPT TO IFRD1
WO2012061811A2 (en) 2010-11-05 2012-05-10 Fibrogen, Inc. Treatment method for lung remodeling diseases
WO2012065067A2 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Georgetown University Immortalization of epithelial cells and methods of use
CN103459599B (zh) 2010-11-23 2017-06-16 库尔纳公司 通过抑制nanog的天然反义转录物而治疗nanog相关疾病
WO2012092341A1 (en) 2010-12-28 2012-07-05 University Of Rochester Methods of modifying insulin signaling using biliverdin reductase (bvr) and bvr derived peptides
SI2670411T1 (sl) 2011-02-02 2019-06-28 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Protismiselne spojine, ki so usmerjene na rastni faktor veznega tkiva (CTGF), za uporabo v postopku zdravljenja keloidov ali hipertrofnih brazgotin
WO2012109495A1 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Metabolic Solutions Development Company, Llc Cellular targets of thiazolidinediones
WO2012124688A1 (ja) 2011-03-14 2012-09-20 国立大学法人北海道大学 肺送達のためのベクター、導入剤及び使用
US8658783B2 (en) 2011-04-13 2014-02-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
RU2620980C2 (ru) 2011-06-09 2017-05-30 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с фратаксином (fxn), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта fxn
AU2012271357A1 (en) 2011-06-16 2013-05-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of fibroblast growth factor receptor 4 expression
EP2753346B1 (en) 2011-09-07 2020-04-22 Mount Sinai School Of Medicine Ceramidase and cell differentiation
AU2012312433B2 (en) 2011-09-20 2017-07-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of GCGR expression
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
EP2771463A4 (en) 2011-10-25 2015-09-09 Isis Pharmaceuticals Inc ANTISENSE MODULATION OF GCCR EXPRESSION
JP2015511494A (ja) 2012-03-15 2015-04-20 キュアナ，インク． 脳由来神経栄養因子（ｂｄｎｆ）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｂｄｎｆ関連の疾患の処置
US9950001B2 (en) 2012-08-20 2018-04-24 The Regents Of The University Of California Polynucleotides having bioreversible groups
EP2943194A1 (en) 2012-09-17 2015-11-18 Chemedest Ltd. Treatment of peripheral neuropathy using gfr(alpha)3 type receptor agonists
WO2014055493A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
US9694050B2 (en) 2012-10-21 2017-07-04 University Of Rochester THY1 (CD90) as a novel therapy to control adipose tissue accumulation
US10415024B2 (en) 2012-11-16 2019-09-17 Poseida Therapeutics, Inc. Site-specific enzymes and methods of use
US10052364B2 (en) 2013-03-15 2018-08-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for cognitive disorders
US9822418B2 (en) 2013-04-22 2017-11-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Mutations in PDGFRB and NOTCH3 as causes of autosomal dominant infantile myofibromatosis
WO2014197938A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Antisense Therapeutics Ltd Combination therapy
AU2014317961B2 (en) 2013-09-05 2020-07-30 Murdoch University Antisense-induced exon2 inclusion in acid alpha-glucosidase
EP3047023B1 (en) 2013-09-19 2019-09-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions and methods for inhibiting jc virus (jcv)
US9975942B2 (en) 2013-11-11 2018-05-22 Wake Forest University Health Services EPHA3 And multi-valent targeting of tumors
WO2015116902A1 (en) 2014-01-31 2015-08-06 Genentech, Inc. G-protein coupled receptors in hedgehog signaling
WO2015120075A2 (en) 2014-02-04 2015-08-13 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2015171918A2 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Compositions and uses for treatment thereof
KR102589295B1 (ko) 2014-05-14 2023-10-13 타르그이뮨 테라퓨틱스 아게 개선된 폴리에틸렌이민 폴리에틸렌글리콜 벡터
EP3145550B1 (en) * 2014-05-19 2019-03-27 BioNTech AG Particles comprising protamine and rna in combination with endosome destabilizing agents
US10487314B2 (en) 2014-06-26 2019-11-26 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Inhibition of serotonin expression in gut enteroendocrine cells results in conversion to insulin-positive cells
CN106572974B (zh) 2014-07-15 2021-04-23 生命技术公司 用于将分子有效递送到细胞的具有脂质聚集体的组合物和方法
WO2016033424A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Genzyme Corporation Methods for the prevention and treatment of major adverse cardiovascular events using compounds that modulate apolipoprotein b
EP3226889A4 (en) 2014-11-19 2018-11-21 The Trustees of Columbia University in the City of New York Osteocalcin as a treatment for frailty associated with aging
JP2018504380A (ja) 2014-12-18 2018-02-15 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｒｅｖｅｒｓｉｒ（商標）化合物
MA41795A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
EP3302497A4 (en) 2015-06-01 2019-01-16 Sarepta Therapeutics, Inc. EXCLUSION OF EXON INDUCED PAT TECHNOLOGY ANTISENSE IN COLLAGEN TYPE VII
DK3310909T3 (da) 2015-06-17 2021-09-13 Poseida Therapeutics Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til at føre proteiner til specifikke loci i genomet
US10954300B2 (en) 2015-09-28 2021-03-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Use of pentoxifylline with immune checkpoint-blockade therapies for the treatment of melanoma
EP3359668A4 (en) 2015-10-09 2019-06-05 Sarepta Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING DUCHENNE MUSCLE DYSTROPHY AND ASSOCIATED ILLNESSES THEREOF
US11273151B2 (en) 2015-11-04 2022-03-15 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods of treating tumors and cancer, and identifying candidate subjects for such treatment
EP3370734B1 (en) 2015-11-05 2023-01-04 Children's Hospital Los Angeles Antisense oligo for use in treating acute myeloid leukemia
EP3411396A1 (en) 2016-02-04 2018-12-12 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
EP3445405A4 (en) 2016-04-18 2019-12-18 Sarepta Therapeutics, Inc. ANTISENSE OLIGOMERS AND METHOD FOR USE THEREOF TO TREAT DISEASES RELATING TO THE ACID ALPHA GLUCOSIDASE GENE
WO2017189730A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Treatment of hippo pathway mutant tumors and methods of identifying subjects as candidates for treatment
JP2019532027A (ja) 2016-08-17 2019-11-07 ソルスティス バイオロジクス，リミティッド ポリヌクレオチド構築物
US10994025B2 (en) 2017-05-12 2021-05-04 Massachusetts Institute Of Technology Argonaute protein-double stranded RNA complexes and uses related thereto
WO2019006455A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Solstice Biologics, Ltd. AUXILIARIES OF CHIRAL PHOSPHORAMIDITIS AND METHODS OF USE THEREOF
US11555189B2 (en) 2017-10-18 2023-01-17 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense oligomer compounds
WO2019126578A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
AU2019247490A1 (en) 2018-04-06 2020-10-22 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for somatic cell reprogramming and modulating imprinting
JP2024516168A (ja) 2021-04-22 2024-04-12 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド がんを治療するための組成物および方法

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IN165717B (hu) * 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US5166320A (en) * 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
US5428132A (en) * 1987-10-11 1995-06-27 United States Of America Conjugate and method for integration of foreign DNA into cells
US5192553A (en) * 1987-11-12 1993-03-09 Biocyte Corporation Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use
US5149782A (en) * 1988-08-19 1992-09-22 Tanox Biosystems, Inc. Molecular conjugates containing cell membrane-blending agents
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5108921A (en) * 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5240846A (en) * 1989-08-22 1993-08-31 The Regents Of The University Of Michigan Gene therapy vector for cystic fibrosis
JPH03127622A (ja) * 1989-10-09 1991-05-30 Green Cross Corp:The ｐＨ感受性リポソーム
ES2078521T3 (es) * 1990-05-18 1995-12-16 Boehringer Ingelheim Int Nuevos conjugados de proteina-polication.
AU660629B2 (en) * 1990-10-01 1995-07-06 University Of Connecticut, The Targeting viruses and cells for selective internalization by cells
WO1992019749A1 (en) * 1991-05-03 1992-11-12 The Board Of Regents Acting For And On Behalf Of The University Of Michigan Targeted delivery of genes encoding cell surface receptors
JPH06510524A (ja) * 1991-05-14 1994-11-24 ユニバーシティ オブ コネチカット 免疫原性タンパク質をコードする遺伝子の標的への配達
DE69231385T2 (de) * 1991-06-05 2001-04-12 Univ Connecticut Storrs Zielgerichtete freisetzung von genen, die sekretorische proteine kodieren
EP0666923A1 (en) * 1991-09-05 1995-08-16 The University Of Connecticut Targeted delivery of poly- or oligonucleotides to cells
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5521291A (en) * 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
US5981273A (en) 1991-09-30 1999-11-09 Boehringer Ingelheim Int'l. Gmbh Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
US5225182A (en) * 1991-10-31 1993-07-06 Sharma Yash P Vectored drug delivery system using a cephaloplastin linking agent and a methed of using the system
US5922859A (en) 1992-02-01 1999-07-13 Boehringer Ingelheim International Gmbh Complexes containing nucleic acid which can be taken-up by endocytosis into higher eukaryotic cells
US5583020A (en) * 1992-11-24 1996-12-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides
WO1994017832A1 (en) 1993-02-09 1994-08-18 The Scripps Research Institute Targeting and delivery of genes and antiviral agents into cells by the adenovirus penton
DE4311651A1 (de) 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
DE4335025A1 (de) 1993-10-14 1995-04-20 Boehringer Ingelheim Int Endosomolytisch wirksame Partikel
US5928944A (en) 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection

Also Published As

Publication number Publication date
HU211925A9 (en) 1996-01-29
IL103171A (en) 2003-04-10
ES2173083T3 (es) 2002-10-16
MX9205543A (es) 1993-05-01
EE03195B1 (hu) 1999-06-15
CZ293141B6 (cs) 2004-02-18
FI941474A (fi) 1994-03-30
BR9206559A (pt) 1994-11-08
NO316744B1 (no) 2004-04-26
HU9400898D0 (en) 1994-06-28
PL180304B1 (pl) 2001-01-31
NO941154L (no) 1994-03-29
HK1013104A1 (en) 1999-08-13
CZ74694A3 (en) 1995-05-17
ATE215990T1 (de) 2002-04-15
CN1059705C (zh) 2000-12-20
NO941154D0 (no) 1994-03-29
SG44680A1 (en) 1997-12-19
US5547932A (en) 1996-08-20
AU671084B2 (en) 1996-08-15
HUT71312A (en) 1995-11-28
US6274322B1 (en) 2001-08-14
BG62740B1 (bg) 2000-06-30
US6022735A (en) 2000-02-08
CA2118816A1 (en) 1993-03-31
SK36894A3 (en) 1994-08-10
NZ244306A (en) 1995-07-26
DK0607206T3 (da) 2002-08-05
IL103171A0 (en) 1993-02-21
RO117861B1 (ro) 2002-08-30
WO1993007283A1 (de) 1993-04-15
BG98718A (bg) 1995-02-28
AU2652692A (en) 1993-05-03
CN1070946A (zh) 1993-04-14
SK281682B6 (sk) 2001-06-11
US6077663A (en) 2000-06-20
SI9200236B (sl) 2002-10-31
CA2118816C (en) 2003-06-17
EP0607206A1 (de) 1994-07-27
DE59209951D1 (de) 2002-05-16
EP0545016A1 (de) 1993-06-09
FI941474A0 (fi) 1994-03-30
JPH10506001A (ja) 1998-06-16
PT607206E (pt) 2002-07-31
EP0607206B1 (de) 2002-04-10
SI9200236A (en) 1993-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6022735A (en) Composition for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
US5981273A (en) Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
US5521291A (en) Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
JP3479298B2 (ja) 高等真核細胞に核酸を導入するための新規結合体
US20050215499A1 (en) Lipoproteins as nucleic acid vectors
WO1994017832A1 (en) Targeting and delivery of genes and antiviral agents into cells by the adenovirus penton
CA2222550A1 (en) Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
JP2002514892A (ja) 遺伝子治療における合成ウイルス様粒子の使用
US5830852A (en) Compositions for insulin-receptor mediated nucleic acid delivery
KR100241685B1 (ko) 핵산 복합체를 고등 진핵세포내로 도입시키기 위한 조성물
EP1007549B1 (en) Compositions and methods for highly efficient transfection
US6479464B1 (en) Compositions and methods for highly efficient transfection
RU2138553C1 (ru) Трансфекционная композиция для высших эукариотных клеток, комплекс нуклеиновой кислоты, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, конъюгат, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, эндосомолитический пептид, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции
HRP920602A2 (hr) Sastav za uvođenje kompleksa nukleinskih kiselina u više eukariotične stanice
US20030100496A1 (en) Compositions and methods for highly efficient transfection
Zhang Enhancement of targeted gene expression by incorporation of Listeriolysin O into protein-DNA complexes
CA2241040A1 (en) Improved pharmaceutical compositions

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees