NO316744B1 - Sammensetning for innforing av nukleinsyrekomplekser i hoyere eukaryotiske celler, kompleks, endosomolytisk peptid, fremgangsmater og transfeksjonssett - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører sammensetning for innføring av nukleinsyrekomplekser

i høyere eukaryotiske celler, kompleks, endosomolytisk peptid, fremgangsmåter og transfeksj onssett.

Behovet for et effektivt system for innføring av nukleinsyre i levende celler finnes fremfor alt innenfor rammen av genterapien. Derved blir gener sluset inn i celler for in vivo å oppnå syntesen av terapeutisk virksomme genprodukter, f.eks. for i tilfelle av en genetisk defekt å erstatte det defekte gen. Den "klassiske" genterapi beror på prinsippet å oppnå en varig helbredelse ved en engangsbehandling. Dessuten finnes det imidlertid behov for behandlingsmetoder, hvorved det terapeutisk virksomme DNA (eller også mRNA) blir administrert som et medikament ("genterapeutikum") én eller flere ganger, alt etter behov. Eksempler på genetisk betingede sykdommer, hvor genterapien representerer et resultatlovende utgangspunkt, er hemofili, beta-thalassemi og "Severe Combined Immune Deficiency" (SCID), et syndrom som fremkalles ved en genetisk betinget mangel på enzymet adenosindeaminase. Anvendelsesmuligheter finnes videre ved immunreguleringen, hvorved det ved administrering av funksjonell nukleinsyre som koder for et utskilt protein-antigen eller for et ikke utskilt protein-antigen, ved hjelp av en vaksinering blir oppnådd en humoral eller intracellulær immunitet. Ytterligere eksempler på genetiske defekter hvor en administrering av nukleinsyre som koder for det defekte gen og f.eks. kan administreres i individuell form tilpasset behovet, er muskeldystrofi (dystrofi-gen), cystisk fibrose ("Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene"), hyperkolesterolemi (LDL-reseptorgen). Genterapeutiske behandlingsmetoder er videre potensielt av betydning når hormoner, vekst-faktorer eller proteiner som virker cytotoksisk eller immunmodulerende, skal syntetiseres i organismen.

Genterapien er også et resultatlovende utgangspunkt for behandlingen av kreft, hvorved det sågar administreres "kreftvaksine". For å øke immunogeniteten av tumorceller blir disse forandret, enten for å gjøre dem sterkere antigene, eller for å få dem til å frembringe bestemte immunmodulerende substanser, f.eks. zytokiner, som deretter utløser en immunrespons. For å bevirke dette blir cellene transfisert med DNA som koder for et zytokin, f.eks. IL-2, IL-4, IFN-gamma, TNF-a. Tidligere ble genoverføring til autologe tumorceller hoved-sakelig gjennomført ved hjelp av retrovirusvektorer.

De hittil lengst utviklede teknologier for anvendelse av nukleinsyrer innenfor rammen av genterapien benytter retrovirussystemer for transfør av gener inn i cellen (Wilson et al., 1990, Kasid et al., 1990). Anvendelsen av retrovirus er imidlertid problematisk, fordi den, i alle fall i liten prosentsats, innebærer fare for bivirkninger som infeksjon med viruset (ved rekombinasjon med endogene virus eller forurensning med hjelpevirus og mulig påfølgende mutasjon til den patogene form) eller utvikling av kreft. Dessuten er den stabile transformasjon av pasientens somatiske celler, slik som den oppnås ved hjelp av retrovirus, ikke i alle fall ønskelig, fordi behandlingen derved, f.eks. ved at det opptrer bivirkninger, bare kan gjøres enda mer reversibel. Dessuten er det ved denne terapiform vanskelig å oppnå en tilstrekkelig høy titer til å infisere tilstrekkelige celler.

Nukleinsyrer som terapeutisk virksomme substanser kommer dessuten til anvendelse for å inhibere bestemte cellefunksjoner, f.eks. har antisens-RNA og -DNA vist seg som virksomme midler for den selektive inhibering av bestemte gensekvenser. Deres virknings-måte muliggjør deres anvendelse som terapeutika til blokkering av ekspresjonen av bestemte gener (som deregulerte onkogener eller virusgen) in vivo. Det er allerede vist at korte antisens oligonukleotider blir importert i celler og der kan utøve sin inhiberende virkning (Zamecknik et al., 1986), selvom deres intracellulære konsentrasjon, blant annet på grunn av deres begrensede opptak gjennom cellemembranen på grunn av nukleinsyrenes sterke negative ladning, er lav.

Et ytterligere utgangspunkt for selektiv inhibering av gener består i anvendelsen av ribozymer. Også her består behovet for å sikre den høyest mulige konsentrasjon av aktivt ribozym i cellen, for transporten av dette inn i cellen er én av de begrensende faktorer.

Anvendelsen av genterapien for å oppnå en intracellulær immunitet omfatter transduksjon av gener som har beskyttelsesvirkning mot virus (såkalte "protective genes"), f.eks. transdominante mutasjoner av gener som koder for virusproteiner, eller DNA-molekyler som koder for såkalte "RNA decoys". Det er derfor et behov for metoder til å muliggjøre ekspresjonen av DNA i cellen.

Det er allerede foreslått flere løsninger til å forbedre transporten av nukleinsyrer inn i levende celler, som ved deres terapeutiske anvendelse er én av de begrensende faktorer.

For gentransformasjon av pattedyrceller in vitro er det kjent forskjellige teknikker som imidlertid er begrenset anvendbare in vivo (dertil hører innføring av DNA ved hjelp av Hposomer, elektroporasjon, mikroinjeksjon, cellefusjon, DEAE-dekstran eller kalsiumfosfat-utfellingsmetoden).

I senere tid er det utviklet rekombinante virusvektorer som utfører overføring av gener idet de betjener seg av de effektive inntredelsesmekanismer for sine utgangsvirus. Denne strategi ble anvendt ved konstruksjonen av rekombinante retrovirus- og adenovirus-vektorer for å oppnå en svært virksom genoverføring in vitro og in vivo (Berkner, 1988).

Ved all sin virksomhet er disse vektorer underkastet begrensninger, og særlig med hensyn til størrelsen og konstruksjonen av det DNA som skal transfereres. Dessuten medfører disse midler sikkerhetsrisiki på grunn av kotransfør av livsdyktige virale genelementer hos opprinnelsesviruset.

For å omgå disse begrensninger ble det utviklet alternative strategier for genover-føring som berør på mekanismer som cellen betjener seg av for transporten av makromolekyler. Et eksempel på dette er importen av gener til cellen over den ytterst ytelses-dyktige vei for reseptorformidlet endozytose (Wu og Wu, 1987, Wagner et al., 1990, og EP-AI 0388 758). Denne publikasjon benytter seg av bifunksjonelle molekylare konjugater som har et DNA-bindingsdomene og et domene med spesifisitet for en celleoverflatereseptor (Wu og Wu, 1987, Wagner et al., 1990). Når gjenkjennelsesdomenet blir gjenkjent av celleoverflatereseptoren, blir konjugatet internalisert over veien for den reseptorformidlede endozytose, hvorved DNA bundet til konjugatet blir medtransportert. Ved hjelp av denne metode kunne det oppnås genoverføirngrater som i alle fall var jevnbyrdige med de vanlige metoder (Zenke et al., 1990).

Det kunne vises at DNA som transporteres inn i cellen ved hjelp av dette system blir uttrykt, og at i tilfelle anvendelse av nukleinsyre som virker inhiberende, blir den inhiberende virkning ikke skadet av transportsystemet.

PCT-søknad W091/17773 vedrører et system for transport av nukleinsyrer med spesifikk virkning for T-celler. Dette system gjør bruk av celleoverflateproteiner fra T-celle-avstamningslinjen, f.eks. CD4, den reseptor som benyttes av HIV-virus. Den nukleinsyre som skal importeres blir kompleksert med et protein polykationkonjugat, hvis proteinandel er et protein med evne til å binde seg til T-celle overflateproteinet, f.eks. CD4, og til celler som uttrykker dette overflateprotein, bragt i berøring med de oppnådde protein polykation/ nukleinsyrekomplekser. Det kunne påvises at DNA transportert inn i cellen ved hjelp av dette system blir uttrykt i cellen.

Felles for begge disse oppfinnelser er kjennetegnet at de benytter spesifikke cellefunksjoner for å muliggjøre eller å lette importen av nukleinsyren til cellen.

I begge tilfeller foregår opptaksmekanismen under deltakelse av faktorer som innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse betegnes som "internaliseirngsfaktorer". Derunder skal forstås faktorer som i engere eller bredere forståelse binder seg celletype-spesifikt, eventuelt under medvirkning av ytterligere faktorer (f.eks. celleoverflateproteiner), til celleoverflaten og blir internalisert (i tilfelle begge de ovenfor nevnte oppfinnelser er internaliseringsfaktoren transferm henholdsvis et protein som binder seg til et T-celle overflateantigen, f.eks. et anti-CD4-antistoff). Internaliseringsfaktoren er konjugert med en substans av polykationkarakter, som på grunn av sin affinitet til nukleinsyrer fremstiller en forbindelse mellom internaliseringsfaktoren og nukleinsyrene (slike substanser betegnes i det følgende som "nukleinsyreaffine substanser" eller i sammenheng med DNA, "DNA-bindingsdomener". Når en slik substans som bestanddel av konjugatet mellom nukleinsyren og en internaliseringsfaktor fremstiller en forbindelse, blir den i det følgende betegnet som "forbindelsesfaktor").

I begge disse oppfinnelser ble det fastslått at det kan oppnås et optimum for opptaket av nukleinsyre i cellen når forholdet konjugat:nukleinsyre velges slik at internaliseringsfaktor-polykation/nukleinsyrekompleksene var i høy grad elektronøytrale. Med utgangspunkt i denne betraktning ble de metoder forbedret som benytter internaliseringsfaktor-forbindelsesfaktor/nukleinsyrekomplekser for importen av nukleinsyrer til høyere eukaryotiske celler.

Av Wagner et al.} 1991a, ble det beskrevet en fremgangsmåte, ved hjelp av hvilken effektiviteten av systemer, hvorved opptaket av nukleinsyrer foregår ved hjelp av internaliseringsfaktorer, kan forbedres. Mengden av den nukleinsyre som opptas i cellen blir ikke nedsatt, når en del av transferin-polykation-konjugatene blir erstattet med ikke kovalent bundet polykation; i bestemte tilfeller kan det til og med oppnås en betydelig økning av DNA-opptaket. Undersøkelser av den molekylære tilstand av transferin-polykationplasmid-DNA-komplekser som var fremstilt med som optimalt oppnådde DNA/konj ugatforhold, hadde vist at plasmid-DNA i nærvær av konjugatene foreligger fortettet til toroide strukturer (som ligner "smultringer") med en diameter på ca. 80-100 nm.

De forsøk som ble gjennomført med proteiner som binder seg til T-celler som internaliseirngsfaktor ga lignende resultater.

Tilsetningen av frie nukleinsyreaffine substanser bevirker også da en økning av effektiviteten av importsystemet, når det anvendes en annen nukleinsyreaffin substans som forbindelsesfaktor.

De komplekser som er beskrevet av Wagner et al., 1991a, og som ble opptatt ved hjelp av internaliseringsfaktor over endozytose i høyere eukaryotiske celler, inneholder nukleinsyre kompleksert med et internaliseirngsfaktor-forbindelsesfaktor-konjugat. Dessuten inneholder kompleksene én eller flere nukleinsyreaffine substanser, som eventuelt er identiske med forbindelsesfaktoren i ikke kovalent bundet form av en slik art at internaliseringen og/eller ekspresjonen av nukleinsyren oppnådd gjennom konjugatet blir øket, hvilket i første rekke kanskje kunne skyldes en kondenserende virkning, men muligens også andre mekanismer.

Selv om ekspresjonsratene for den importerte nukleinsyre ved hjelp av denne metode kunne økes, så er de allikevel underlagt begrensninger. Brukbarheten av dette system i en gitt sammenheng blir ikke utelukkende bestemt ved tilstedeværelsen av den celleoverflatereseptor som eventuelt er relevant for systemet; begrensningene som ligger til grunn for anvendelsen av dette system er antagelig en følge av at konjugat DNA-kompleksene internalisert i endosomer kommer inn i lysosomene, hvor de nedbrytes enzymatisk. For å øke den andel av nukleinsyre som kommer inn i cellekjernen og der blir uttrykt ifølge sin bestemmelse, ble det i eksperimenter som er gått foran den foreliggende oppfinnelse, forsøkt å gjennomføre transfeksjonen av cellene i nærvær av substanser som inhiberer den enzymatiske aktivitet i lysosomene, såkalte lysosomatrope substanser. Ved hjelp av denne forholdsregel kunne det oppnås en forsterket ekspresjon av den importerte DNA; de oppnådde reaksjoner var imidlertid i avhengighet av den anvendte substans sterkt forskjellige - utvalgte lysosomatrope substanser bevirker en forsterkning av genoverføringen, mens andre sågar inhiberer denne. Således ble det f.eks. fastslått at den effektive import av DNA er avhengig av tilstedeværelsen av den svake base klorokin (Zenke et al., 1990, Cotten et al., 1990). Denne ved klorokin oppnådde effekt behøver imidlertid ikke, henholdsvis ikke utelukkende, å skyldes at klorokin forhøyer pH-verdien i lysosomene; ved hjelp av forskjellige eksperimenter ble det fastslått at andre substanser som i likhet med klorokin har evne til modulasjon av pH-verdien, som monensin, ammoniumklorid eller metylamin, ikke kunne erstatte klorokin, i forskjellige eksperimenter viste noen av disse substanser sågar en inhiberende virkning. Videre ble det fastslått at forskjellige målceller viser forskjellige reaksjoner på den samme lysosomatropt virkende substans.

Da genoverføring på fysiologisk vei, slik som den reseptorformidlede endozytose ved hjelp av nukleinsyrekomplekser fremstiller den, har store fordeler (ikke-toksisk mekanisme for gjennomgangen gjennom cellemembranen; mulighet for administrering av biologisk aktive nukleinsyrer, som gener, genavsnitt eller nukleinsyrer som spesifikt inhiberer cellefunksjoner, på repetitiv eller kontinuerlig basis; mulighet for cellespesifikk targeting; fremstillbarhet av konjugatene i store mengder) finnes det et behov for å gjøre dette system mer effektivt.

Grunnen til den foreliggende oppfinnelse var den oppgave å forbedre importen av nukleinsyre til høyere eukaryotiske celler (med "import", henholdsvis "overføring" forstås innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse i tillegg til innføringen av nukleinsyrekompleksene i cellen gjennom cellemembranen også lokaliseringen av kompleksene, henholdsvis den derav frigjorte nukleinsyre innenfor cellen inntil det er oppnådd et egnet sted for deres ekspresjon). Fagmannen er fortrolig med de høyere eukaryotiske celler; gjærceller blir ikke medregnet hertil (Watson et al., 1987).

Et flertall av virus iverksetter sin inntrengning i den eukaryotiske vert via mekanismer som i prinsippet tilsvarer mekanismene for den reseptorformidlede endozytose. En virusinfeksjon på basis av denne mekanisme begynner vanligvis med bindingen av viruspartikler til reseptorer på cellemembranen. I tilslutning dertil følger internaliseringen av viruset i cellen. Dette internaliseringsforløp følger en felles rute, tilsvarende innføringen av fysiologiske ligander eller av makromolekyler i cellen: reseptorene på celleoverflaten ordner seg først i grupper for å danne en såkalt "coated pit", derpå vrenger membranen seg innover og danner en vesikel omgitt av et hylster. Etter at denne vesikel har frigjort seg fra sitt Clathrin-hylster, foregår i dens indre en surgjøring ved hjelp av en protonpumpe lokalisert i membranen. Derved fremkalles frigjøringen av viruset fra endosomet. I avhengighet av om viruset har en lipidkappe eller ikke, ble det tatt i betraktning to arter av frigjøringen av viruset fra endosomet, i tilfelle såkalte "nakne" virus (f.eks. adenovirus, poliovirus, rhinovirus) ble det foreslått at den lave pH-verdi fremkaller konformasjonsendringer i virusproteiner. Derved frilegges hydrofobe domener som ved fysiologisk pH-verdi ikke er tilgjengelige. Disse domener far derved evne til å trå i vekselvirkning med endosommembranen og derved bevirke frigjøringen av virusgenomet fra endosomet til cytoplasma. Om virus med lipidhylster (f.eks. vesikulær stomatitis-virus, Semliki Forest-virus, influensavirus) blir det antatt at den lave pH-verdi vil modifisere strukturen eller konformasjonen av noen virusproteiner, hvorved fusjonen av virusmembranen med endosommembranen blir befordret. Virus som ved hjelp av denne mekanisme trenger inn i cellen, har bestemte molekylære detaljer som gjør det mulig for dem å sprenge endosommembranen for å skaffe seg adgang til cytoplasma.

Andre virus, f.eks. de virus som har en kappe, Sendai, HIV og noen Moloney leukemivirusstammer, eller de virus som ikke har noen kappe, SV40 og polyoma, trenger for sin inntrengning i cellen intet lavt pH-miljø, men kan enten direkte på celleoverflaten bevirke en fusjon med membranen (Sendai-virus, muligens HIV) eller de formår å utløse mekanismer for å sprenge cellemembranen eller passere denne. Det blir antatt at også de pH-uavhengige virus kan benytte endocytoseveien (McClure et al., 1990).

Ved løsningen av den stilte oppgave ble det gått ut fira den overveielse å utnytte den mekanisme som benyttes av bestemte virus ved deres inntrengning i eukaryotiske celler, for å forbedre importen av nukleinsyrekomplekser til cellen og derved øke ekspresjonen.

Det er allerede forsøkt å internalisere proteiner sammen med virus i cellen (Otero og Carrasco, 1987). Derved ble det fastslått at permeabiliseringen av cellen med viruset for innslusingen av makromolekyler blir utnyttet. Ved de derved foregående prosesser kan det dreie seg om mekanismer i flytende fase.

Ved hjelp av den epidermale vekstfaktor (Epidermal Growth Factor, EGF) konjugert til et toksin, ble det fastslått at denne naturlige ligand, som etter binding til sin reseptor ved endocytose blir opptatt i cellen sammen med adenoviruset, som likeså blir opptatt i cellen via reseptorformidlet endocytose, havner i det samme endosom og blir frigjort fra dette likeså sammen med viruset til cytosolen (Fitzgerald et al., 1983).

Det ble overraskende fastslått at tilstedeværelsen av bestemte agenser (f.eks. virus, viruskomponenter eller andre virkestoffer), som med hensyn til sin inntredelsesmekanisme i eukaryotiske celler har egenskapene til bestemte virus, bevirker en betydelig økning av ekspresjonsraten til nukleinsyren importert til cellen som del av et kompleks. Dette funn var derfor fremfor alt overraskende, fordi nukleinsyrekompleksene opptatt i cellen er svært store.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således en sammensetning for transfeksjon av høyere eukaryotiske celler inneholdende et kompleks hvor nukleinsyren er kompleksbundet med en substans som har affinitet for nukleinsyre, kjennetegnet ved at sammensetningen også inneholder et endosomolytisk middel, som er tilstede som en komponent av komplekset ved å være kompleksbundet med nukleinsyren via et nukleinsyrebindende domene spesifikt for nevnte middel eller via en substans som har affinitet for nukleinsyren som den er bundet til.

Det er videre beskrevet sammensetning for transfeksjon av høyere eukaryotiske celler inneholdende et kompleks hvor nukleinsyren er kompleksbundet med en substans som har affinitet for nukleinsyre, kjennetegnet ved at sammensetningen også inneholder et endosomolytisk middel, valgt fra et virus eller en viruskomponent med evne til å penetrere per se inn i cellen som skal transfekteres og som er tilstede utenfor nevnte kompleks hvor en substans som har affinitet for nukleinsyren, er kompleksbundet med nukleinsyren.

Det er videre beskrevet kompleks som en bestanddel av en sammensetning ifølge et

av kravene 1 og kravene 3-44, kjennetegnet ved at det inneholder én eller flere nukleinsyrer hvormed et endosomolytisk middel er kompleksbundet via en nukleinsyrebindende domene som er særegen for nevnte middel eller via en substans som har affinitet for nukleinsyren, som den er bundet til, og ved at det eventuelt inneholder en internaliseringsfaktor som er også kompleksbundet med nukleinsyren via en substans som har affinitet for nukleinsyren som det er konjugert til.

Oppfinnelsen beskriver også konjugat som en bestanddel av ovennevnte kompleks, kjennetegnet ved at konjugatet består av et endosomolytisk middel og en substans med affinitet for nukleinsyren.

Det er også beskrevet endosomolytisk peptid egnet som en bestanddel i ovennevnte sammensetningen, kjennetegnet ved at det har en endosomolytisk domene og en kunstig innført nukleinsyrebindende domene.

Dette middel betegnes i det følgende som "endosomolytisk middel".

De endosomolytiske midlers evne til å bli opptatt i de celler som skal transfiseres og frigjøre innholdet av endosomene hvor de er lokalisert etter innføring i cellen, til cytoplasma, . blir i det følgende betegnet som "opptaksfunksjon". Denne opptaksfunksjon sammensetter seg av evnen til, aktivt via reseptoravhengige endocytosemekanismer, eller passivt via den flytende fase, eller som bestanddel av nukleinsyrekomplekset, å bli internalisert i cellen, og evnen til å bryte opp endosomer som vanligvis blir betegnet som "endosomolytisk aktivitet" eller "endosomolyse".

I én utførelsesform av oppfinnelsen er det endosomolytiske middel et virus. I en annen utførelsesform er det endosomolytiske middel en viruskomponent. Viruset, henholdsvis viruskomponenten, som blir anvendt i denne utførelsesform av oppfinnelsen,

blir i det følgende betegnet som "fritt virus" eller "frie viruskomponenter".

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig videre fremgangsmåte for innføring av nukleinsyre inn i høyre eukaryotiske celler in vitro eller eks vivo, kjennetegnet ved at cellene blir behandlet med en sammensetning ifølge hvilket som helst av kravene 1-47.

Innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse ble undersøkt virkningen av en tiltagende dose av adenovirus på genoverføringkapasiteten av en konstant mengde transferin-polylysinkonjugat i HeLa-celler, hvorved luciferasegenet ble anvendt som reportergen. Forsterkningen av genoverføringen bevirket ved adenoviruset, nådde et maksimum ved lx IO4 viruspartikler pr. celle, et tall som tilsvarer det omtrentlige antall av adenovirusreseptorer pr. HeLa-celle. Forsterkningen på inntil 2000 ganger av luciferase-ekspresjonen sammenlignet med den ekspresjon som blir oppnådd med transferinpolylysinkonjugatene alene, tilsvarte den høyere virusdose. I en ytterligere forsøksrekke ble kapasiteten av limiterende mengder av konjugat DNA-komplekser undersøkt i nærvær av en konstant adenovirusdose. Det ble fastslått at opptaket av adenovirus i cellene forsterket genoverføringen formidlet ved transferinpolylysin over et bredt område av DNA-doseringer. Den maksimale styrke av genekspresjonen som blir oppnådd ved konjugat DNA-kompleksene, tilsvarte den styrke som ble oppnådd med 100 ganger mindre DNA, når adenovirus ble anvendt til forsterkning av transfeksjonseffektiviteten.

Virkningen av adenoviruset på genoverføring ble undersøkt både for ikke-kompleksert og for DNA som var blitt kompleksert med polylysin eller med transferinpolylysin-konjugater (fig. 3A). Ifølge denne analyse forsterket tilstedeværelsen av adenovirus under transfeksjonen overføring av naken ikke-kompleksert DNA bare i mindre grad. I sterk motsetning dertil ble overføring av DNA, kompleksert med polylysin eller med transferin-polylysinkonjugater, forsterket ved adenovirustilsetning, hvorved denne effekt opptrådte vesentlig sterkere ved transferrinpolylysinkonjugatene. Da polykationandelen i konjugatet ikke bare tjener til å få istand forbindelsen mellom DNA og transferrin, men også bevirker tydelige strukturelle forandringer i DNA-strukturen (kompaktering til toroide strukturer; Wagner et al., 1991a), kunne man på grunn av eksperimentene først ikke klart holde fra hverandre om den betraktede effekt er å tilbakeføre på en forsterket transport av DNA kondensert ved polykationet i den flytende fase, eller på en økning av transporten av reseptorbundet konjugat DNA-kompleks bevirket av viruset. For å skjelne mellom begge disse muligheter ble det gjennomført bindingsforsøk i rekkefølge (fig. 3B). Bindingen av transferrin-polylysin-DNA eller polylysin DNA-komplekser ved lav temperatur uten internalisering gjør det mulig før behandlingen med adenoviruset å fjerne overskudd av kompleks i den flytende fase (FitzGerald et al., 1983). Ved denne fremgangsmåte ble transporten av de reseptorbundede transferirn-polylysin-DNA-komplekser signifikant øket ved tilsetning av adenoviruspartikler, hvilket ikke skjedde for polylysin-DNA-kompleksene. Det er derfor innføringen av DNA i cellen via reseptorformidlet endocytose som blir spesifikt forsterket.

Videre ble det undersøkt hvilken bestemt funksjon av adenoviruset det er som bevirker en forsterkning av den reseptorformidlede genoverføring (fig. 3C). Mild varme-behandling av viruspartikkelen forandrer intet på dens evne til å binde seg til cellemembranen i målcellene, men påvirker imidlertid dens evne, etter innføring i cellen, til å bryte opp endosomene (Defer et al., 1990). På grunn av denne kjennsgjerning kunne de forskjellige effekter av virusbindingen og av innføringen av virus i cellen undersøkes adskilt. Ved forsøkene gjennomført innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse ble det fastslått at en varmeinaktivering fullstendig kunne fjerne virusets evne til å forsterke den genoverføring som foregår via reseptorformidlet endocytose. Derav ble trukket den slutning at forsterkningen av genoverføring ved hjelp av transferrin-polylysin-konjugater spesifikt må tilbakeføres på adenovirusets evne, som del av dets opptaksfunksjoner, til å kunne bryte opp endosomer. Den kjennsgjerning at en replikasjonsdefekt virusstamme kunne forårsake en forsterkning av genekspresjonen, bekrefter den antagelse at dette fenomen ikke kan tilbakeføres på replikasjonsfunksjonen, men snarere på virionets opptaksfunksjon.

For å utelukke den mulighet at forsterkningen av genekspresjonen kunne føres tilbake på en eventuell transaktivering av det importerte gen gjennom viruset, ble det gjennomført forsøk med en cellelinje som uttrykker RSV-LTR-luciferasegenet konstitutivt: adenovirus viste i denne cellelinje ingen effekt, mens de i den parentale cellelinje, hvori genet var blitt innført ved hjelp av transferrin-polylysin-konjugater, fremkalte en tydelig forsterkning av genekspresjonen. Dette funn gjorde det tydelig at adenoviruset har innflytelse på begiven-heter som finner sted før transkripsjonen, at deres forsterkende virkning på genimporten således virker innenfor området for genimporten, og ikke innenfor området for genekspresjonen (fig. 5).

Videre ble det innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse undersøkt hvilken virkning adenovirus har på genoverføring ved hjelp av transferrin-polylysin-konjugater i utvalgte cellelinjer. Det ble fastslått at tilstedeværelsen av transferrin-reseptorer på målcellene er nødvendig, men ikke i alle tilfeller tilstrekkelig, for å muliggjøre genoverføring ved hjelp av transferrin-polylysin-konjugater. Cellespesifikke faktorer som står i sammenheng med skjebnen til konjugat DNA-kompleksene internalisert i endosomene, synes å spille en vesentlig rolle for den grad av genoverføring som kan oppnås via denne vei. Med hensyn til dette ble det undersøkt noen utvalgte cellelinjer såvel på genoverføring ved hjelp av transferrin-polylysin-konjugater som også på en forsterkning av genoverføring ved adenovirus (fig. 4). Celler i en cystisk fibrose-cellelinje (CFT1) viste middels luciferase genekspresjon etter behandling med transferrin-polylysin-DNA-kompIekser alene. Graden av ekspresjonen ble signifikant øket ved behandling av adenoviruset dl 312.1 tydelig motsetning dertil viste KB-celler som ble behandlet med transferirn-polylysin-DNA-kompleksene, til tross for tilstedeværelsen av transferrin-reseptorer, en luciferase genekspresjon som knapt lå over bakgrunnsnivået. En behandling med adenovirus dl312 bevirket imidlertid for disse celler tydelig påvisbare luciferase-aktiviteter. På lignende måte virket behandlingen med adenovirus på HeLa-celler, hvorved denne effekt for disse celler imidlertid var enda vesentlig sterkere. Da HeLa-celler og KB-celler har omtrent det samme antall reseptorer for adenoviruset, kunne forskjellen i forsterkningen av genoverføring gjenspeile det antall transferrin-reseptorer som er karakteristisk for en celletype. Til tydelig forskjell fra disse resultater viste imidlertid cellelinjene WI-38 og MRC-5, for hvilke det er kjent at infeksjonen i disse med adenovirus foregår bare svakt (Precious og Russel, 1985), med dl 312 bare en svært liten forsterkning av den genekspresjon som ble oppnådd ved konjugat DNA-kompleksene alene. Behandlingen med adenovirus kunne således forsterke genoverføring ved hjelp av konjugat DNA-komplekser i slike tilfeller hvor genoverføring er mulig via reseptorformidlet endocytose, slik som i tilfellet CFT1 -cellene, samt i noen tilfeller hvor genoverføring foregår ineffektivt via denne vei, som ved HeLa- og KB-celler. At graden av forsterkningen mellom forskjellige målceller varierer tydelig kunne ha sin årsak deri, at denne effekt er både en funksjon av antallet virusreseptorer, f.eks. adenovirusreseptorer, av en bestemt celletype samt antallet av transferrinreseptorer.

I tilfelle anvendelsen av det frie virus er den nukleinsyreaffine substans fortrinnsvis et organisk polykation som fortrinnsvis er konjugert med en internaliseirngsfaktor. Det ble imidlertid fastslått innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse at DNA som er

kompleksert bare med nukleinsyreaffine substans, under bestemte forutsetninger, også uten internaliseirngsfaktor, kan bringes inn i cellen i nærvær av fritt virus. Videre ble det funnet at opptaket av kompleksene, bestående av nukleinsyre og nukleinsyreaffine substans, ved noen cellelinjer kan foregå via den flytende fase, når konsentrasjonen av kompleksene er tilsvarende høy. Av disse forsøk som ble gjennomført innenfor rammen av den foreliggende og den foregående oppfinnelse, ble det avledet at et vesentlig element for opptaksevnen til nukleinsyrekompleksene er deres kompakthet som kan føres tilbake på kondenseringen av

nukleinsyren ved hjelp av den nukleinsyreaffine substans. Når den nukleinsyreaffine substans i tillegg til sin evne til å frembringe den vidtgående elektronøytralitet av kompleksene og til å fortette nukleinsyren til en kompakt struktur, har en tilstrekkelig evne til å binde seg til celleoverflaten for sammen med viruset å trenge inn i cellen, kan det renonseres på å øke opptaks-kapasiteten ved at en internaliseirngsfaktor blir bundet kovalent til den nukleinsyreaffine

substans for å befordre komplekset via reseptorformidlet endocytose i cellen. Mange celler har en relativt høy affinitet til bestemte nukleinsyreaffine substanser, slik at konjugatene av nukleinsyre og bindingsfaktor blir opptatt i cellen uten at medvirkningen av en internaliseringsfaktor er nødvendig. Dette inntreffer f.eks. på hepatocytter, for hvilke det ble fastslått innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse at de opptar DNA polylysinkomplekser.

I en foretrukket utførelsesform av denne oppfinnelse er det endosomolytiske middel et virus som er bundet til den nukleinsyreaffine substans og som har evnen til å trenge inn i cellen som del av konjugat/nukleinsyre-komplekset og frigjøre til cytoplasma innholdet av endosomene, hvori komplekset er lokalisert etter innføringen i cellen.

Det endosomolytiske middel er følgelig en viruskomponent som er bundet til en nukleinsyreaffin substans og som har evne til å trenge inn i cellen som del av konjugat/ nukleinsyrekomplekset og frigjøre til cytoplasma innholdet av endosomene, hvori komplekset er lokalisert etter innføringen i cellen.

Virus eller viruskomponenter som er bundet til et nukleinsyrebindingsdomene blir i det følgende uansett bindingens art betegnet som "viruskonjugater".

Vimskonjugatene inneholder viruset eller viruskomponenten som integral bestanddel av sin funksjonelle konstruksjon og forener fordelene med vektorsystemer på basis av internaliseringsfaktorkonjugater med de fordeler som virus bringer inn i systemet.

Viruskonjugatene omgår den grunnleggende begrensning som hører sammen med det kjente bifunksjonelle konjugatsystem for genoverføring via reseptorformidlet endocytose,

idet de disponerer over en spesifikk mekanisme som muliggjør deres frigjøring fra celle-vesikelsystemet. Viruskonjugatene fremstiller et grunnleggende konseptuelt avvik fra de rekombinante virusvektorer, idet det fremmed-DNA som skal transporteres blir båret på utsiden av virionet. Derved kan ved hjelp av konjugatene ifølge oppfinnelsen også svært store genkonstruksjoner transporteres inn i cellen, hvorved det ikke består noen begrensninger med hensyn til sekvensen.

Egnetheten til et virus som skal innsettes som fritt eller bundet virus(del) som viruskomponent innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse, blir definert ved sin opptaksfunksjon. Egnede virus er på den ene side slike som under transfeksjonen av cellene med nukleinsyrekomplekset har evne til å trenge inn i cellen via reseptorformidlet endocytose og gjennomføre sin frigjøring - og dermed frigjøringen av nukleinsyren - fra endosomet til cytoplasma. Uten at man ønsker å være fastlagt på denne teori, kunne denne mekanisme forsåvidt komme de i cellen importerte nukleinsyrekomplekser tilgode, ettersom disse, såfrem de ved internaliseringen kommer inn i de samme endosomer som viruset, blir befordret sammen med viruset fra endosomene til cytoplasma. Når nukleinsyrekompleksene inneholder viruset i bundet form, profiterer de på den endosomolytiske aktivitet til viruset og blir befordret ut av endosomene til cytoplasma. Derved skulle fusjonen mellom endosomer og lysosomer og dermed den enzymatiske nedbrytning som vanligvis finner sted i disse celleorganeller, kunne unngås.

Eksempler på virus og høyere eukaryotiske celler som de kan trenge inn i, kan hentes f.eks. fra Fields og Knipe, 1990. Mottageligheten til en gitt cellelinje for transformasjonen ved et virus som i form av et fritt virus blir innsatt for å lette innføringen av nukleinsyrekomplekser i celler, avhenger av tilstedeværelsen og antallet av overflatereseptorer for viruset på målcellen. Med hensyn til celleoverflatereseptoren for adenovirus, er det beskrevet fremgangsmåter til bestemmelse av dens antall på HeLa- og KB-celler av Svensson, 1990, og Defer, 1990.

Til virus som er egnet for sammensetningen ifølge oppfinnelsen og ved begynnelsen av infeksjonen følger sin for seg gående opptaksfunksjon via reseptorformidlet endocytose, hører på den ene side virus uten lipidkappe som adenovirus, poliovirus, rhinovirus, på den annen side kappevirus som vesikulært stomatitis-virus, Semlike Forest-virus, influensavirus; dessuten egner seg pH-avhengige stammer av Moloney-virus. Til særlig foretrukne virus for anvendelse av den foreliggende oppfinnelse hører adenovirus, undergruppe C, type 5,

Semliki Forest-virus, vesikulært stomatitis-virus, poliovirus, rhinovirus og Moloney leukemi-virusstammer.

Anvendelsen av RNA-virus, som ikke har noen revers transkriptase for den foreliggende oppfinnelse har den foreliggende oppfinnelse har den fordel at en transfeksjon i nærvær av et slikt virus ikke fører til dannelsen av virus-DNA i cellen. Innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse ble det vist at rhinovirus HRV2, en representant for Picornavirus-gruppen, forhøyer ekspresjonen av et reportergen. Rhinovirusets yteevne ble vist såvel i fri form som også i form av viruskonjugater.

Innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse forstås med virus - forutsatt at de blir opptatt i cellen og frigjør innholdet av endosomene som de kommer inn i - i tillegg til villtypene også mutanter, som på grunn av én eller flere mutasjoner har mistet funksjoner hos villtypen som er forskjellige fra opptaksfunksjonen, særlig replikasjonsevnen.

Slike mutanter fremstilles ved mutasjoner, henholdsvis delesjoner, i virusprotein-regioner som er ansvarlige for replikasjonsfunksjoner og som kan unnværes for opptaksfunksjonen og som kan komplementeres gjennom forpakningslinjen, ved hjelp av vanlige mutagenesefremgangsmåter. Dertil hører f.eks. i tilfelle adenovirus, ts-mutanter (temperatur-sensitive mutanter), EIA- og ElB-mutanter, mutanter som har mutasjoner i MLP-drevne gener (Berkner, 1988) og mutanter som har mutasjoner i områder med bestemte kapsid-proteiner. Egnet er videre virusstammer som har tilsvarende naturlige mutasjoner. Virusets replikasjonsevne kan undersøkes f.eks. ved hjelp av plaque-assays kjent fra litteraturen, hvorved cellekulturer blir beskiktet med suspensjoner av forskjellig viruskonsentrasjon, og antallet lyserte celler som er synlige ved hjelp av plaquer blir bestemt (Dulbecco, 1980).

For anvendelsen innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse egner seg dessuten såkalte defekte virus, det er virus som i ett eller flere gen mangler den funksjon som er nødvendig for den autonome virusreplikasjon, og som de trenger hjelpevirus for. Representant for denne gruppe er DI-partikler ("defective interfering particles"), som avledes fra standard infeksjonsvirus, har de samme strukturproteiner som standardviruset, har mutasjoner og trenger standardviruset som hjelpevirus for sin replikasjon (Huang, 1987; Holland, 1990). Representant for denne gruppe er dessuten satelittvirus (Holland, 1990). En annen gruppe er parvovirusgruppen, som betegnes som "adeno-associated virus" (Berns, 1990). Da opptakscyklene for mange virus i cellen enda ikke er fullstendig oppklart, må det antas at det finnes ytterligere andre virus som har den endosomolytiske aktivitet som er nødvendig for deres egnethet til anvendelse i den foreliggende oppfinnelse.

Ytterligere innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse egner seg svekkede levendevaksine (Ginsbert, 1980) eller vaksinasjonsstammer.

Videre faller inn under begrepet virus innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse inaktiverte virus, f.eks. ved kjemisk behandling som formaldehydbehandling, ved UV-bestråling, ved kjemisk behandling kombinert med UV-bestråling, f.eks. psoral-UV-eller bromdesoksyuridin/UV-behandling, ved gamma-stråling eller ved neutronbeskytning av inaktiverte virus. Inaktiverte virus, slik som de f.eks. anvendes også for vaksine, kan fremstilles ved hjelp av standard metoder kjent fra litteraturen (Davis og Dulbecco, 1980, Hearst og Thiry, 1977) og testes for anvendelse til å øke importen av DNA-komplekser. I forsøkene som ble gjennomført innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse ble adenovirus-preparater inaktivert ved hjelp av en vanlig UV-steriliseringslampe, henholdsvis med formaldehyd, og det ble overraskende fastslått at graden av inaktivering av virus var vesentlig større enn den nedsettelse av genoverføringeffekt som ble oppnådd når adenovirus ble tilsatt transfeksjonsmediet. Også forsøk som ble gjennomført med preparater av psoral/ UV-inaktivert biotinylert adenovirus som var konjugert med streptavidin-koblet polylysin, viste at som følge av inaktiveringen sank virustiteren betraktelig sterkere enn genoverføring-kapasiteten. Dette er en tydelig hentydning til at mekanismer som ved det aktive virus står i sammenheng med den normale infeksjonsmekanisme, kan ødelegges uten at den vesentlige effekt for genoverføring blir ødelagt.

Under begrepet "viruskomponenter" forstås deler av virus, f.eks. den proteinandel som er befridd for nukleinsyre (det tomme viruskapsid som kan fremstilles ved hjelp av rekombinante metoder, se f.eks. Ansardi et al., 1991, Urakawa et al., 1989), proteiner som oppnås ved fraksjoneringen, eller peptider som har den for opptaksfunksjonen vesentlige endosomolytiske evne til det intakte virus. Disse viruskomponenter kan også fremstilles syntetisk i avhengighet av sin størrelse enten ved hjelp av peptidsyntese eller ved hjelp av rekombinante metoder. Innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse kunne det vises at adenovirusproteiner som er konjugert via biotin/streptavidin med polylysin, kunne forsterke genoverføring. Eksempler på proteinfragmenter fra andre virus enn adenovirus som er vesentlige for internaliseringen av virus, omfatter influensavirus-hemagglutinih (HA). Den N-terminale sekvens i influensavirus-hemagglutinin HA2-underenheten er ansvarlig for frigjøringen av virus fra endosomet. Det ble vist at peptider som består av 20 aminosyrer fra denne sekvens, fusjonerer og delvis kan bryte opp/ødelegge lipidmembraner (Wharton et al., 1988). I den foreliggende oppfinnelse ble autentiske og modifiserte influensapeptider med hell innsatt i forskjellige utførelsesformer. Et ytterligere eksempel er kappeproteiner fra retrovirus, f.eks. HIV pg41 (Rafalski et al., 1990) henholdsvis deler av disse virusproteiner.

Anvendelsen av virus som i seg selv har evnen til å trenge inn i celler, er bare ett aspekt ved den foreliggende oppfinnelse.

Virus eller viruskomponenter som i seg selv ikke bringer med seg evnen til å binde seg til cellen og trenge inn i denne, anvendes fortrinnsvis i form av de ovenfor definerte viruskonjugater. Koblingen til et DNA-bindingsdomene, f.eks. et polykation, garanterer at viruset henholdsvis viruskomponenten, får en sterk affinitet til DNA-molekyler, komplekserer dermed og som bestanddel av DNA-komplekset, som også inneholder et internaliseringsfaktor/DNA-bindingsdomene-konjugat, blir transportert inn i cellen. I tillegg til den dermed oppnådde transporteffekt kan bindingen av viruset henholdsvis viruskomponenten til et nukleinsyrebindingsdomene også føre til en forbedring av deres endosomolytiske egenskaper.

Gjennom utvalget av andre intemaliseringsfaktorer kan praktisk talt enhver høyere eukaryotisk celle transfiseres med sammensetningen ifølge oppfinnelsen.

Om et gitt virus henholdsvis en viruskomponent er egnet for en opptaksfunksjon i betydningen av den foreliggende oppfinnelse og således for anvendelse ved forsterkningen av genoverføring, kan fastslås ved hjelp av en enkel screeningassay. I en slik assay, f.eks. for å teste et virus på sin anvendbarhet som fritt virus, bringes målcellene i berøring med et DNA-kompleks i nærvær eller i fråvær av viruset. Mengden av DNA-kompleks som fri-gjøres til cytoplasma kan deretter enkelt bestemmes ved påvisning av et markørgenprodukt, f.eks. luciferase. Når tilstedeværelsen av viruset fører til at DNA-komplekset blir opptatt i cellen og frigjort til cytoplasma i større utstrekning enn uten virus, kan dette tilbakeføres på opptaksfunksjonen til viruset. Det er også mulig å sammenligne testviruset med hensyn til dets opptaksfunksjon med et virus som er kjent for at det har en egnet opptaksfunksjon, f.eks. med adenovirus, undergruppe C, type 5. Tester av denne art kan også anvendes på viruskonjugater, hvorved ytterligere parametre, som forskjellige internaliseringsfaktorkonjugater, i forskjellige mengder kan underkastes slike tester. Derutover kan gjennomsnittsfagmannen anvende undersøkelser av denne art, eventuelt i forbindelse med andre tester, som f.eks. liposomgjennomtrengelighetsassays ("Liposomen Leakage Assays"), på enkel måte på viruskomponenter eller andre midler med potensiell endosomolytisk aktivitet for å undersøke dem på sin evne til økning av genekspresjonen.

I tilfelle anvendelsen av intakt virus blir det prøvet, hensiktsmessig vis parallelt med forforsøkene, hvori viruset blir undersøkt på sin evne til forsterkning av genoverføring, om viruset er replikasjonsdyktig. Undersøkelsen på replikasjonsevne gjennomføres i tilfelle cytopatiske virus eller i tilfelle virus som merkbart påvirker veksten av vertscellene, ved hjelp av plaque-assays (sammenlign ovenfor). Ved andre virus anvendes påvisningsmetoder spesielle for det aktive virus, f.eks. hemagglutineringstesten eller fysikals-kjemiske metoder (elektronmikroskopisk).

Det blir innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse, særlig ved anvendelse av frie virus, foretrukket slike virus som lar seg fremstille med høy titer, som er stabile, som har liten patogenitet som villtype, og hvorved en målrettet utsjalting av replikasjonsfunksjonen er mulig, særlig adenovirus. Når en bestemt cellepopulasjon skal transfiseres, blir det foretrukket slike virus som spesifikt infiserer denne cellepopulasjon. For det tilfelle at forskjellige celletyper skal omfattes av transfeksjonen, kan det anvendes virus som er infeksiøse for et bredt område av celletyper.

Kravene til viruspreparatene er i det vesentlige høyest mulig renhet samt en stabiliserende buffer avstemt til den aktuelle virus.

I hvert tilfelle kommer for den terapeutiske anvendelse av den foreliggende oppfinnelse in vivo bare slike virus henholdsvis viruskomponenter i betraktning, hvorved sikkerhetsrisikoer, særlig med hensyn til replikasjonen i cellen samt rekombinasjonen av virus-DNA med verts-DNA i høyest mulig grad er minimert.

Fordelaktig vis kan anvendes innføringsmekanismen for virus som infiserer andre dyr som mennesker, for å forsterke opptaket og frigjøringen av DNA i høyere eukaryotiske celler særlig menneskelige celler, såfremt viruset i cellene har evne til å bryte opp endosomer. Medlemmer av adenovirusfamilien ble isolert fra fuglearter, fra amfibier og forskjellige andre dyr (se f.eks. Laver et al., 1971; Bragg et al., 1991; Akopian et al., 1991; Takase et al., 1990; Khang og Nagaraji, 1989, og Reece et al., 1987). Amfibie-, fugle-, storfe-, hunde-, muse-, saue-, svine- og ape-adenovirus, samt også humane adenovirus, kan leveres fra The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland (se American Type Culture Collection Catalogue of Animal Vimses and Antisera, Chlamydae and Rickettsiae, 6. opplag, 1990, C. Buck og G. Paulino utg., s. 1-17).

Mulige fordeler ved anvendelsen av et virus, f.eks. av et adenovirus av en fjern art, kunne være nedsatt toksisitet i målcellene (f.eks. kunne det ikke ventes av hønse- eller frosk-adenovirus at det replikerer i pattedyrceller eller initierer ekspresjonen av tidligere gener), enn i sammenligning med humant adenovirus nedsatt risiko for den forsker som fremstiller dette virus av en fjern art, og en nedsatt forstyrrelse ved antistoffer mot det humane eller mus-adenoviruset. Fraværet av en forstyrrelse ved de humane eller mus-antistoffer er særlig viktig når disse virus anvendes for genterapi i mennesker eller i mus.

Hønse-adenoviruset CELO (Chick Embryo Lethal Orphan Virus) har ingen reaktivitet med antistoffer som gjenkjenner hovedgruppe-epitopene av de adenovirus som infiserer pattedyrceller. Dessuten kan CELO-virus dyrkes i egg med embryoutvikling for å oppnå store mengder virus (0,5 mg/egg; Laver et al., 1971). Som det fremgår av eksemplene forsterker CELO-polylysin-konjugater DNA-transporten i HeLa-celler i en utstrekning som er sammenlignbar med det humane adenovirus dl 312. Anvendelsen av CELO-konjugater til forsterkning av DNA-transporten er derfor svært meget lovende for den humane genterapi.

Virus av fjerne arter innsettes fortrinnsvis som bestanddeler av viruskonjugater i kombinasjonskomplekser (ifølge definisjonen innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse).

I konjugatene ifølge oppfinnelsen som inneholder et virus kan bindingen av viruset til nukleinsyrebindingsdomenet være kovalent eller ikke-kovalent, sistnevnte f.eks. via en biotin-streptavidinbro eller, i det tilfelle at viruset på sine overflateproteiner har regioner som er sure og derfor kan binde seg til et polykation via en ionebinding.

I forsøk innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse ble det dannet komplekser under betingelser som tillater ionevekselvirkning mellom adenovirus og polylysin før komplekseringen med DNA. Som kontroll ble det gjennomført forsøk under betingelser hvorunder polylysin først ble nøytralisert med DNA og derfor ikke er fritt til å binde seg til adenoviruset. I disse forsøk viste det seg at kompleksene med ionebundet adenovirus var overlegne. Eksempler på viruskomponenter i konjugatene ifølge oppfinnelsen med endosomolytisk aktivitet er de tomme viruskapsider eller viruspeptider. Bindingen av viruskomponentene til nukleinsyrebindingsdomenet kan være kovalent, f.eks. ved kjemisk kobling av viruspeptidet med polylysin, eller ikke-kovalent, f.eks. ionisk i tilfelle viruskomponenten har sure rester, for å binde seg til et polykation.

Forholdet mellom virus eller viruskomponent og nukleinsyreaffinsubstans kan varieres. I tilfelle influensa-hemagglutininpeptid-polylysin-konjugat ble det innenfor.rammen av den foreliggende oppfinnelse funnet at genoverføring i større utstrekning kan forsterkes når innholdet av viruspeptid i konjugatene var høyere.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig videre fremgangsmåte for fremstilling av et heterologt protein i en høyere eukaryot celle, kjennetegnet ved at cellene blir behandlet med en sammensetning ifølge krav 1, idet nukleinsyren inneholder en DNA-sekvens som koder for ønsket protein, blir cellene dyrket under egnende betingelser for ekspresjon av proteinet, og proteinet blir isolert.

I et videre aspekt vedrører den foreliggende oppfinnelse følgelig fremgangsmåter til fremstilling av konjugatene ifølge oppfinnelsen fra viruskomponent og nukleinaffinsubstans.

Viruskonjugatene kan (i likhet med internaliseringsfaktor-polykatiion-konjugatene) fremstilles ved kobling av komponentene eller dersom viruskomponenten og polykationet er polypeptider, på rekombinant måte, med hensyn til fremstillingsmetodene refereres til kunn-gjøringen i EP 388 758.

Koblingen av virus, virusproteiner eller -peptider med polyaminforbindelser på kjemisk måte kan foregå på i og for seg kjent måte for kobling av peptider, hvorved enkeltkomponentene om nødvendig før koblingsreaksjonen blir utstyrt med linkersubstanser (denne forholdsregel er nødvendig når det fra tidligere ikke er til disposisjon noen funksjonell gruppe som egner seg for koblingen, f.eks. en merkapto- eller alkoholgruppe). Ved linkersubstansene dreier det seg om bifunksjonelle forbindelser som først bringes til reaksjon med funksjonelle grupper av enkeltkomponentene, hvorpå koblingen av de modifiserte enkeltkomponenter blir gjennomført.

Koblingen kan foregå via

a) disulfidbroer, som under reduserte betingelser kan spaltes igjen (f.eks. ved anvendelse av suksinimidylpyridylditiopropionat (Jung et al., 1981)), b) under biologiske betingelser vidtgående stabile forbindelser (f.eks. tioeter ved omsetning av maleimido-linkere med sulfhydrylgrupper på linkere bundet til den

andre komponent),

c) under biologiske betingelser labile broer, f.eks. esterbindinger, eller under svakt sure betingelser, ustabile acetal- eller ketalbindinger.

I forsøkene gjennomført innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse ble endosomolytiske influensa-hemagglutinin-HA2-peptider koblet sammen med polylysin på kjemisk måte ved hjelp av suksinimidylpyridylditiopropionat (SPDP). Det ble vist at modifikasjonen av peptidet med polylysin forhøyer den endosomolytiske aktivitet. Transfeksjonseksperimenter viste at effektiviteten av genoverføring formidlet med transferrin-polylysin blir øket betydelig når influensapeptid-polylysin-konjugatene foreligger sammen med transferrin-polylysin i DNA-komplekset.

Videre ble, innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse, adenovirus koblet til polylysin ved hjelp av forskjellige fremgangsmåter. En art av koblingen til polylysin foregikk på lignende måte som ved fremstillingen av transferrin-polylysin-konjugater (Wagner et al., 1990) etter modifisering av det defekte adenovirus dl312 ved hjelp av et heterobifunksjonelt reagens. Ubundet polylysin ble fraskilt ved sentrifugering. DNA-bindingsevnen ble påvist i et bindingseksperiment med radioaktivt merket DNA.

I K562-celler i fravær av klorokin kunne med komplekser bestående av DNA, adenovirus-polylysin og transferrin-polylysin finnes en vesentlig høyere genoverføring enn med ikke-modifisert adenovirus, som ikke foreligger bundet til DNA. Videre ble det funnet at det i HeLa-celler ved hjelp av polylysin-modiflsert adenovirus foregikk en tydelig genekspresjon med bare 0,0003 ug DNA i 5xl0<5> HeLa-celler.

Dersom viruset, henholdsvis viruskomponenten, har egnede karbohydratkjeder, kan de bindes sammen med den nukleinsyre-affine substans over én eller flere karbohydratkjeder i glykoproteinet.

En egnet fremgangsmåte til fremstilling av glykoprotein-polykation-konjugater er åpenbart i den tyske patentsøknad P 41 15 038.4; den er kort beskrevet av Wagner et al., 1991b.

En ytterligere foretrukket fremgangsmåte til fremstilling av konjugatene ifølge oppfinnelsen er den enzymatiske kobling av viruset, henholdsvis viruskomponenten, til en nukleinsyreaffin substans, spesielt et polyamin, ved en transglutaminase.

Gruppen av transglutaminase omfatter flere forskjellige enzymer som blant annet forekommer i epidermis (epidermal transglutaminase) i blod (faktor XIII) og i cellene i forskjellige vev (vevstransglutaminase) (Folk, 1985). Transglutaminaser katalyserer i nærvær av Ca++ og under avspalting av NH3 dannelsen av E-(y-glutamyl)lysinbindinger. Forutset-ningen for dette er at det på proteiner er tilstede tilsvarende glutaminer og Iysiner som kan omsettes av enzymet. Ved siden av E-aminogruppen i lysin kan også polyaminer som etanolamin, putreszin, spermin eller spermidin tjene som substrat (Clarke et al., 1959). For tiden er det enda uklart hvilke faktorer det avhenger av om et glutamin eller lysin i et protein eller et polyamin kan omsettes av enzymet. Det er kjent at polyaminer ved hjelp av transglutaminase kan bindes til tallrike celleproteiner som cytokeratiner (Zatloukal et al., 1989), Tubulin, cellemembranproteiner og også overflateproteiner på influensavirus (Iwanij, 1977).

Innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse kunne det vises at polylysin ved hjelp av transglutaminase kan kobles til adenovirus. Det ble fastslått at koblingen kan gjennomføres i nærvær av glycerol. Dette har den fordel at et viruspreparat, f.eks. et adenoviruspreparat, som inneholder glycerol i bufferen som stabiliserende middel, kan anvendes direkte for koblingen. Ved hjelp av adenovirus polylysinkonjugater som sammen med transferrin-polylysin-konjugater ble kompleksert med plasmid-DNA, kunne det oppnås en genekspresjon mange ganger høyere enn med transferrin-polylysin-konjugater i nærvær av ikke-polylysinkoblet adenovirus.

Ytterligere en foretrukket fremgangsmåte til fremstilling av konjugatene ifølge oppfinnelsen består i å koble viruset eller viruskomponenten over en biotin-proteinbro, fortrinnsvis en biotin-streptavidinbro, til polykationet.

Den bekjent sterke sammenbinding av biotin med streptavidin henholdsvis avidin (Wilchek et al., 1988) ble utnyttet til kobling av adenovirus til polylysin, idet adenovirus ble modifisert med biotin, og streptavidin på lignende måte som ved fremstillingen av transferrin-polylysinkonjugater (Wagner et al., 1990) ble konjugert kjemisk med polylysin. Komplekser bestående av DNA og streptavidin-polylysin som biotinmodifisert virus er bundet til, og eventuelt også ikke-kovalent bundet polylysin, fremviser en svært høy transfeksjonseffektivitet, også ved lavere DNA-konsentrasjoner. Det blir dannet svært effektive komplekser når det biotin-modifiserte virus først blir bundet til streptavidin-polylysin og bindingen til DNA foregår først i andre trinn.

Eventuelt kan bindingen til biotin også foregå over avidin.

Videre er det mulig å fremstille bindingen mellom viruskomponenten og polylysin, idet på den ene side viruset blir biotinylert og på den annen side et antibiotin-antistoff blir konjugert med polylysin og bindingen mellom virus og polylysin blir fremstilt over biotin/antistoff-bindingen, hvorved handelsvanlige polyklonale eller monoklonale antistoffer kan anvendes mot biotin.

Bindingen mellom viruset og polylysin kan også fremstilles idet polylysin blir koblet med et lektin som har affinitet til et virus overflateglykoprotein, hvorved bindingen foregår i et slikt konjugat over bindingen mellom lektinet og glykoproteinet. Dersom viruset i seg selv ikke har egnede karbohydratsidekjeder, kan det modifiseres tilsvarende.

Et virus kan også bindes til en nukleinsyreaffin substans, idet det først blir modifisert på overflaten med et virusfremmed antigen (f.eks. digoksigenin DIG, som kan skaffes fra Boehringer Mannheim; eller med biotin) og forbindelsen mellom det modifiserte virus og den nukleinsyreaffine substans blir fremstilt over et antistoff som binder seg til dette antigen. Hvilken fremgangsmåte som anvendes til fremstilling av konjugatene ifølge oppfinnelsen, retter seg etter forskjellige kriterier. Således er f.eks. koblingen over biotin den mest uspesifikke og følgelig den bredest anvendbare fremgangsmåte; den biotinformidlede binding fremstiller en svært sterk ikke-kovalent binding. Den enzymatiske reaksjon med transglutaminase har den fordel at den også lar seg gjennomføre i den minste målestokk. Den kjemiske kobling kommer vanligvis til anvendelse når større konjugatmengder skal syntetiseres, denne fremgangsmåte er vanligvis også den mest hensiktsmessige når virusproteiner eller -peptider skal sammenkobles. I tilfelle anvendelse av inaktiverte virus, blir inaktiveringen vanligvis foretatt før koblingen, såfremt koblingen ikke blir skadet ved inaktiveringen.

Når et virus, f.eks. adenovirus eller en endosomolytisk komponent derav, har tilgjengelige bindingsdomener, f.eks. sure domener for binding til et polykation, kan bindingen av viruset, henholdsvis av viruskomponenten til polykationet også være ionisk. I dette tilfelle er de positive ladninger på polykationet, som eventuelt er konjugert med en internaliseringsfaktor, delvis nøytralisert ved de sure domener på viruskomponenten, resten av positive ladninger nøytraliseres i alt vesentlig av nukleinsyren.

Dersom det som nukleinsyreaffin substans anvendes en interkalerende substans, er den modifisert med en linker som egner seg for den aktuelle kobling av viruskomponent, f.eks. for koblingen med transglutaminase med spermin, eller med en bifunksjonell gruppe kompetent for den kjemiske kobling, f.eks. en aktiv ester.

Forholdet av viruskomponent:nukleinsyreaffin substans kan variere, det fremskaffes vanligvis empirisk, f.eks. ved at en konstant mengde viruskomponent konjugeres med forskjellige mengder polylysin, og det optimale konjugat for transfeksjonen blir utvalgt.

Viruskomponenten, f.eks. et endosomolytisk viruspeptid, kan modifiseres for å binde seg direkte til DNA. For dette formål kan peptidet selv ha et DNA-bindingsdomene som kan oppnås idet peptidet blir fremstilt ved hjelp av peptidsyntese, hvorved det fremskaffes et avsnitt med positivt ladede aminosyrer, fortrinnsvis ved forlengelse av peptidet, særlig foretrukket i C-terminus.

Det endosomolytiske middel kan være et ikke-viralt, eventuelt syntetisk peptid. Et peptid av denne type inneholdes fortrinnsvis i sammensetningen ifølge oppfinnelsen på den måte at det er bundet ionisk til den nukleinsyreaffine substans, f.eks. til polylysin i tilfelle DNA/internaliseringsfaktor-polylysinkomplekser. På denne måte bevirkes innbygningen av det endosomolytiske peptid i nukleinsyrekompleksene, idet peptidet blir bundet via sine sure aminosyrerester til de positivt ladede nukleinsyrebindingsdomener, fortrinnsvis polylysin. I avhengighet av peptidets kjemiske struktur, særlig med hensyn til dets endegruppe, kan bindingen til polylysin også foregå ved de her beskrevne fremgangsmåter for bindingen av peptider til polylysin. For dette formål kan, når det anvendes et peptid som forekommer i naturen, dette peptid modifiseres med en egnet terminal aminosyre som "skaft" for konjugasjonen.

En annen måte til å bygge inn ikke-virale endosomolytiske peptider i nukleinsyrekompleksene består i å forsyne dem med sekvenser som binder seg til DNA. Tilstanden til en slik sekvens må være slik at den ikke forstyrrer peptidets endosomolytiske aktivitet. Derfor blir f.eks. peptider som har en N-terminus som er ansvarlig for denne aktivitet, forlenget i C-terminus med DNA-bindende sekvenser. Forlengelser av denne art kan være homologe eller heterologe kationiske oligopeptider, f.eks. en oligolysinhale, eller et naturlig DNA bindingsdomene, f.eks. et peptid avledet fra et histon. Fortrinnsvis omfatter disse en integrerende del av de ca. 10-40 aminosyrer i det endosomolytiske peptid som danner DNA-bindings-sekvenser. Denne utførelsesform tilbyr muligheten for et høyere forhold endosomolytisk sekvens:DNA-bindingssekvens enn i peptidkonjugater som inneholder høyere andeler av polykationer, for å oppnå en større ytelsesevne for kompleksene.

De ikke-virale endosomolytiske peptider bør tilfredsstille følgende krav:

Med hensyn til den endosomolytiske aktivitet bør gjennomtrengeligheten av lipidmembraner som bevirkes av peptidet ved lav pH-verdi (5-6) fortrinnsvis være høyere enn ved pH-verdi 7. Videre bør de oppbrudte membranområder være store nok til å tillate gjennomgang av store DNA-komplekser (små porer er ikke tilstrekkelige). For å fastslå om et peptid fyller disse krav, kan det gjennomføres tester in vitro, hvor peptidene blir anvendet i fri eller bundet form og/eller innebygget i et DNA-kompleks. Slike tester kan omfatte Hposom- eller erytrocyttgjennomtrengelighetstester ("leakage assays") og cellekultur-eksperimenter hvor forsterkningen av genekspresjonen blir bestemt. Tester av denne karakter er beskrevet i eksemplene. Den optimale peptidmengde kan fastlegges i forutgående titreringer hvor ytelsesevnen av den resulterende genoverføring blir bestemt. Derved skal bemerkes at ytelsesevnen av forskjellige peptider og den optimale sammensetningen av komplekset kan være avhengig av celletypen.

Peptider som bryter opp membraner inneholder vanligvis amfipatiske sekvenser, nemlig en hydrofob side som kan trå i vekselvirkning med lipidmembranen, og en hydrofil side som stabiliserer den vandige fase på det sted hvor membranen bryter opp.

I naturen finnes noen eksempler på peptider som bryter opp membraner, på vanlige små peptider eller små peptiddomener i større polypeptider. Slike peptider kan ifølge sin funksjon klassifiseres i sin naturlige kontekst, nemlig enten i peptider som bryter opp membraner (f.eks. peptider i nakne virus) og/eller peptider som fusjonerer membraner (f.eks. peptider i virus med kappe). For oppbryting av endosomer i sammenheng med syntetiske peptider kan begge grupper av peptidsekvenser være til nytte. De fleste naturlige peptider kan danne amfipatiske a-helikser.

Ved innbygging av sure rester på den hydrofile side av en sannsynlig amfipatisk a-heliks av denne type, som heliksen kan danne seg bare ved sur pH-verdi, ikke en gang ved nøytral pH-verdi, hvorved Iadningsfrastøtningen mellom de negativt lade sure rester forhindrer heliksdannelsen, kan det oppnås pH-spesifitet. Denne egenskap forekommer også ved naturlig forekommende sekvenser (f.eks. N-terminus i influensa-HA2-peptidet).

Et fullstendig syntetisk amfipatisk peptid me<*>d pH-verdispesifikke egenskaper til oppbryting av membraner er beskrevet av Subbarao et al., 1987, og av Parente et al., 1990. For dette peptid (i fri form) ble det vist at i membraner bare danner små porer som tillater frigjøring av bare små forbindelser (Parente et al., 1990).

Innenfor rammen av utførelsesformen av den foreliggende oppfinnelse som benytter seg av ikke-virale, eventuelt syntetiske peptider, blir det vanligvis foretatt følgende skritt: Fra gruppen av naturlig forekommende eller kunstige peptider velges ut en amfipatisk peptid-sekvens. Peptider av denne art hører til teknikkens stand; en oversikt over eksempler er gitt i tabell 2. Om nødvendig innføres sure rester (Glu, Asp) for å gjøre peptidets aktivitet til å bryte opp membraner mer pH-verdispesifikk (f.eks. de dobbéltsure mutanter av influensa-hemagglutininpeptidet med betegnelsen P50 tilsvarende eksempel 37). Om nødvendig kan sure rester også innføres for å lette bindingen av peptidet til polylysin. En mulighet til å forutse et slikt polykation bindingsdomene kan bestå i å forutse C-terminale sure forlengelser f.eks. en oligo-Glu-hale.

Endosomolytiske peptider som egner seg for den foreliggende oppfinnelse kan også tilveiebringes ved at naturlig forekommende og kunstige sekvenser blir forenet. I løpet av den foreliggende oppfinnelse ble det gjennomført eksempler med forskjellige peptider avledet fra det syntetiske peptid GALA beskrevet av Parente et al., 1990. Noen av derivatene som anvendes i eksemplene i den foreliggende oppfinnelse ble fremstilt ved at peptidet GALA eller modifikasjoner derav ble kombinert med sekvenser av influensapeptidet eller modifikasjoner derav, f.eks. peptidene med betegnelsen EALA-Inf og EALA-P50 tilsvarende eksempel 37.

Lengden av peptidsekvensen kan være kritisk med hensyn til den amfipatiske heliks; en økning av stabiliteten av korte domener som er avledet fra naturlige proteiner og som mangler konteksten til det stabiliserende protein, kan oppnås ved forlengelse av heliksen.

For å forsterke peptidenes endosomolytiske aktivitet kan det dannes homodimere, heterodimere eller oligodimere; i eksemplene i den foreliggende oppfinnelse ble det vist at en P50-dimer har en langt høyere aktivitet enn monomeren.

Oppfinneren har vist virkningen av syntetiske peptider på DNA-opptaket ved hjelp av transferrin-polylysin-konjugater. Det ble syntetisert flere forskjellige peptider, deres evne til å gjøre liposomer og erytrocytter gjennomtrengelige ble bestemt, og deres virkning på luciferase-ekspresjonen i TIB 73-celler og i NIH 3T3-celler ble testet.

Det endosomolytiske middel kan være en ikke-peptidisk amfipatisk substans. De krav som en slik substans må tilfredsstille for å være egnet for anvendelse innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse, er i alt vesentlig de samme som for de amfipatiske peptider, nemlig evnen til å bli integrert i nukleinsyrekompleksene, pH-spesifisitet osv.

Oppfinnelsen angår i et ytterligere aspekt komplekser som blir opptatt i høyere eukaryotiske celler inneholdende nukleinsyre og et konjugat som har evnen til å danne et kompleks med nukleinsyre for innføring av nukleinsyre i høyere eukaryotiske celler. Kompleksene inneholder et konjugat som består av en nukleinsyreaffin substans og et endosomolytisk middel som er bundet til den nukleinsyreaffine substans og har evne til å bli opptatt som bestanddel av et konjugat/nukleinsyrekompleks i cellen og frigjøre innholdet av endosomene, hvori komplekset er lokalisert etter innføring i cellen, til cytoplasma.

Nukleinsyrekompleksene som kommer til anvendelse innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse, er fortrinnsvis slike hvori nukleinsyren er kompleksert med en nukleinsyreaffin substans på en slik måte at kompleksene i alt vesentlig er elektronøytrale.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er det endosomolytiske middel et virus eller en viruskomponent som er bundet kovalent til et polykation.

Innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse omfatter de endosomolytiske konjugater - i tillegg til konjugater hvori endosomolytiske midler er bundet ionisk til et DNA-bindingsdomene - definisjonsmessig også endosomolytiske midler som binder seg direkte til DNA, f.eks. via sin basiske forlengelse, skjønt "konjugater" av denne art strengt tatt ikke oppnås ved konjugering, dvs. ved sammenbinding av to komponenter med hverandre. Funksjonen av endosomolytiske midler av denne type som bestanddeler av sammensetningen ifølge oppfinnelsen er uavhengig av om de blir syntetisert ved konjugering av et endosomolytisk middel og et DNA-bindingsdomene, eller om et DNA-bindingsdomene opprinnelig var tilstede i det endosomolytiske middel.

Kompleksene kan i tillegg til det endosomolytiske konjugat inneholde et ytterligere konjugat, hvori en nukleinsyreaffin substans, i tilfelle et endosomolytisk polykationkonjugat . vanligvis den samme som den i konjugatet, er koblet sammen med en internaliseringsfaktor med affinitet for målcellen. Disse anvendes fremfor alt når målcellen har ingen eller bare få reseptorer for det virus som kommer til anvendelse som bestanddel av det endosomolytiske konjugat. En ytterligere anvendelse av denne utførelsesform er den hvorved det anvendes en viruskomponent, f.eks. et naturlig forekommende, eventuelt modifisert peptid, et ikke-viralt, eventuelt syntetisk endosomolytisk peptid eller et virus av en fjern art, som ikke har evnen til av seg selv å trenge inn i de celler som skal transfiseres. I nærvær av et ytterligere intemaliseringsfaktor-sammenbindingsfaktor-konjugat profiterer disse endosomolytiske konjugater på internaliseringsevnen til det andre konjugat, idet de sammen med dette blir kompleksert til nukleinsyre og som bestanddel av det således oppståtte kompleks, i det følgende betegnet som "kombinasjonskompleks" eller "ternært kompleks" blir opptatt i cellen. Uten å ville være fastlagt på denne teori blir kombinasjonskompleksene opptatt av celler enten ved binding til den for internaliseringsfaktoren spesifikke overflatereseptor eller,

i tilfelle anvendelsen av et virus eller en viruskomponent ved binding til virusreseptoren eller ved binding til begge reseptorer via veien for reseptorformidlet endocytose. Ved frigjøringen av det endosomolytiske middel fra endosomene frigjøres også det i kompleksene inneholdte DNA til cytoplasma og unnslipper derved den lysosomale nedbrytning.

I forsøkene i den foreliggende oppfinnelse med HeLa-celler kunne nesten alle celler transfiseres med fritt adenovirus. Ytelsesevnen for hepatocytter kunne økes enda ytterligere, når det ble anvendt ternære DNA-komplekser, hvori reporter-DNA er kompleksert med polylysin-transferrin-konjugater og blir bundet til adenovirus. Her garanteres den felles lokalisering av det endosomolytiske virus og av ligand/reseptor-komplekset i endosomene, hvorved det for forskjellige celler, som BNL-CL2- og HepG2-celler, ble oppnådd en transfeksjon i praktisk talt alle celler. En slik situasjon kan man nærme seg for de eksperimenter hvori ternære, transferirn-holdige komplekser heller lot seg føre inn i K562-celler via transferrin-reseptoren enn over adenovirusreseptoren.

Det var overraskende at ternære komplekser transporterte DNA sågar i svært små mengder. Således ble ved anvendelse av 30 pg DNA pr. 3xl0<5> celler oppnådd l,8xl0<4 >lysenheter (oppnådd ved ekspresjonen av en sekvens som inneholdes på et plasmid og som koder for luciferase). Ved en slik input kommer det på én celle bare 60 DNA-molekyler og én PFU av virus ("Plaque Forming Unit"). Til sammenligning: den mindre effektive kalsium-utfellingsforskrift anvender 2x10<5> DNA-molekyler pr. celler (Sambrook et al., 1989). Den foreliggende oppfinnelse representerer følgelig et betydelig fremskritt, fordi den tillater effektiv transformasjon av høyere eukaryotiske celler med svært små DNA-mengder.

Tilstedeværelsen av virus, viruskomponenter eller ikke-virale endosomolytiske midler som bestanddeler av endosomolytiske konjugater i DNA-kompleksene har følgende fordeler: 1) Bredere anvendbarhet av genoverføringteknikken med nukleinsyrekomplekser, fordi det endosomolytiske middel selv, særlig i det tilfelle at det anvendes et virus eller en viruskomponent som kan fremstille internaliseringsfaktoren eller også kan komplekseres i kombinasjon med en ytterligere internaliseringsfaktor (f.eks. transferrin eller asialofetuin osv.) til DNA. Dermed er det mulig å utnytte den positive effekt av viruset også for celler som ikke har noen reseptor for de aktuelle

virus.

2) Forbedring av genoverføringeffektiviteten da det ved bindingen av de endosomolytiske konjugater til DNA er garantert et felles opptak i cellene. Ved det koordinerte opptak og frigjøring av virus og DNA finnes videre mulighet for en reduksjon av den mengde DNA og virus som er nødvendig for en effektiv genover-føring, hvilket særlig for anvendelse in vivo er av essensiell betydning.

Ved internaliseringsfaktor skal innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse forstås ligander eller fragmenter derav, som internaliseres etter binding til cellen via endocytose, fortrinnsvis reseptorformidlet endocytose, eller faktorer hvis binding/internalisering foregår via fusjon med cellemembranelementer. Til egnede internaliseringsfaktorer hører ligandene transferrin (Klausner et el., 1983), conalbumin (Sennett et al., 1981), asialoglyko-proteiner (som asialotransferrin, asialorosomucoid eller asialofetuin), (Ashwell et al., 1982), lectiner (Goldstein et al., 1980 og Shardon, 1987), henholdsvis substanser som inneholder \ galaktose og som internaliseres via asialoglykoproteinreseptoren; mannosylerte glykoproteiner (Stahl et al., 1987), lysosomale enzymer (Sly et al., 1982), LDL (Goldstein et al., 1982), modifisert LDL (Goldstein et al., 1979), lipoproteiner som opptas i cellen via reseptorer (apo B100/LDL); virusproteiner som HIV-proteinet gpl20; antistoffer (Mellman et al., 1984, Kuhn et al., 1982, Abrahamson et al., 1982) henholdsvis fragmenter derav mot celleoverflateantigener, f.eks. anti-CD4, anti-CD7; cytokiner som interleukin-1 (Mizel et al., 1987), interleukin-2 (Smith et al., 1985), TNF (Imamure et al., 1987), interferoner (Anderson et al., 1982); CSF ("Colony-stimulating Factor"), (Walker et al., 1987), faktorer og vekst-faktorer som insulin (Marshall, 1985), EGF ("Epidermal Growth Factor"), (Carpenter, 1984); PDGF ("Platelet-derived Growth Factor"), (Heldin et al., 1982), TGFfi ("Transforming Growth Factor B"), (Massague et al., 1986), nervevekstfaktor (Hosang et al., 1987), insulinlignende vekstfaktor I ("Insulin-like Growth Factor"), (Schalch et al., 1986), LH, FSH (Ascoli et al., 1978), veksthormon (Hizuka et al., 1981), prolactin (Posner et al., 1982), glukagon (Asada-Kubota et al., 1983), thyroidhormoner (Cheng et al., 1980), a-2-makro-globulinprotease (Kaplan et al., 1979), samt "avvæpnede" toksiner. Ytterligere eksempler er immunglobuliner eller fragmenter derav som ligander for Fc-reseptorcn eller anti-immunglobulin-antistoffer som binder seg til Sigs ("Surface Immunoglobulins"). Ligandene kan være av naturlig eller syntetisk opprinnelse (se Trends Pharmacol. Sei., 1989, og de deri siterte referanser).

Vesentlig for egnetheten av slike internaliseringsfaktorer innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse er: a) at de kan internaliseres av den spesifikke celletype, som nukleinsyren skal innføres i, og at deres internaliseringsevne ikke eller ikke vesentlig blir påvirket når de

konjugeres med sammenbindingsfaktoren, og

b) at de innenfor rammen av denne egenskap er istand til å ta med seg nukleinsyre "som en ryggsekk" inn i cellen på den vei som de benytter seg av.

I de forsøk som er gjennomført innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse, ble vist den brede anvendbarhet av oppfinnelsen med hensyn til internaliseringsfaktoren, henholdsvis en ytterligere internaliseringsfaktor i kombinasjonskompleksene ved hjelp av human- og mus-transferrin-polylysin-konjugater, asialofetuin-polylysin-konjugater, galaktose-polylysin-konjugater, hvetekimagglutinin-pL-konjugater, T-celle-spesifikke gpl20-pL og anti-CD7-pL-konjugater, ved hjelp av LDL-pL-konjugater, Ig-pL- og anti-Ig-pL-konjugater, samt ved hjelp av DNA-poIylysin-komplekser som ikke inneholder noen internaliseringsfaktor. Dessuten ble ved hjelp av komplekser av DNA og polylysin-konjugert virus (henholdsvis viruskomponent) som ikke inneholdt noe ytterligere internaliseringsfaktor sammenbindingsfaktorkonjugat, vist ytelsesevnen til viruskonjugater ifølge oppfinnelsen.

I forforsøk kan det enkeltvis bestemmes, i tilfelle anvendelsen av fritt virus som endosomolytisk middel, om anvendelsen av en internaliseringsfaktor, eller om i det tilfelle at det endosomolytiske middel er et virus eller en viruskomponent eller et ikke-viralt peptid som del av et endosomolytisk konjugat, en "ytterligere" sammenbindingsfaktor vil mulig-gjøre eller forbedre opptaket av nukleinsyrekomplekser. En slik test omfatter parallell transfeksjon med nukleinsyrekomplekser en gang uten (ytterligere) internaliseringsfaktor, f.eks. i tilfelle viruskonjugater med komplekser bestående av nukleinsyre og konjugat, og en annen gang med komplekser, hvori nukleinsyren er kompleksert med et ytterligere konjugat, inneholdende en ytterligere internaliseringsfaktor som målcellene har en reseptor for.

Ved anvendelse av en internaliseringsfaktor eller en ytterligere internaliseirngsfaktor, dvs. når et kombinasjonskompleks kommer til anvendelse, defineres dette fremfor alt ved målcellene, f.eks. ved bestemte overflateantigener eller reseptorer som er spesifikke for en celletype og således muliggjør en rettet import av nukleinsyre til denne celletype.

Nukleinsyreaffine substanser som egner seg innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse er f.eks. homologe organiske polykationer som polylysin, polyarginin, polyomitin eller heterologe polykationer med to eller flere forskjellige positivt ladede aminosyrer, hvorved disse polykationer kan ha forskjellig kjedelengde, videre ikke-peptidiske syntetiske polykationer som polyetylenimin. Egnede nukleinsyreaffine substanser er videre naturlige DNA-bindende proteiner av polykationkarakter som histoner eller protaminer, henholdsvis analoger eller fragmenter derav, samt spermin eller spermidiner.

Lengden av polykationet er ikke kritisk såfremt kompleksene med hensyn til den foretrukne utførelsesform er i alt vesentlig elektronøytrale. Det foretrukne område for poly-lysinkjedelengden ligger i området fra ca. 20 inntil ca. 1 000 lysinmonomerer. Det finnes imidlertid for en bestemt DNA-lengde ingen kritisk lengde for polykationet. Når DNA består av 6 000 bp og 12 000 negative ladninger, kan mengden av polykation pr. mol DNA f.eks. være:

60 mol polylysin 200 eller

30 mol polylysin 400 eller

120 mol polylysin 100, osv.

Gjennomsnittsfagmannen kan ved hjelp av enkle rutineforsøk velge ut andre kombinasjoner av polykationlengde og molar mengde.

Ytterligere egnede nukleinsyreaffine substanser som bestanddel av konjugatene er interkalerende substanser som etidiumdimere, akridin eller interkalerende peptider, inneholdende tryptofan og/eller tyrosin og/eller fenylalanin.

Med hensyn til den kvalitative sammensetning av nukleinsyrekompleksene blir vanligvis først bestemt den nukleinsyre som skal importeres til cellen. Nukleinsyren defineres fremfor alt ved den biologiske effekt som skal oppnås i cellen, i tilfelle anvendelse innenfor rammen av genterapi ved det gen, henholdsvis det genavsnitt, som skal bringes til ekspresjon, f.eks. med formålet substitusjon av et defekt gen, eller ved målsekvensen for et gen som skal inhiberes. Ved nukleinsyrene som skal transporteres inn i cellen kan det dreie seg om DNA eller RNA, hvorved det med hensyn til nukleotidsekvensen ikke består noen begrensning.

Når oppfinnelsen anvendes på tumorceller for å anvende disse som kreftvaksine, koder det DNA som skal føres inn i cellen, fortrinnsvis for en immunmodulerende substans, f.eks. et cytokin som IL-2, IL-4, IFN-gamma, TNF-a. Av særlig nytte kan være kombinasjoner av DNA som koder for cytokiner, f.eks. IL-2 og IFN-gamma. Et ytterligere gen som er nyttig for innføring i tumorceller er "Multi Drug Resistance Gene" (mdr). I den foreliggende oppfinnelse ble transferrin-polylysin- og Low Density-Lipoprotein-konjugater sammen med adenoviruskonjugater med hell innsatt for transfeksjon av tumorceller (melanomceller). I avhengighet av den spesifikke anvendelse kan det i forforsøk bringes på det rene hvilken ligand som egner seg for det bestemte anvendelsestilfelle for den aktuelle tumorcelletype.

Det er også mulig å bringe inn i cellen to eller flere forskjellige nukleinsyresekvenser, f.eks. et plasmid inneholdende cDNA som koder for to forskjellige proteiner, under kontroll av egnede regulatoriske sekvenser, eller to forskjellige plasmidkonstrukter inneholdende forskjellige cDNA.

Til terapeutisk virksomme inhiberende nukleinsyrer som innføres for det formål å inhibere bestemte gensekvenser i cellen, hører genkonstrukter, hvorifra det blir transkribert antisens RNA eller ribosymer.. Videre er det også mulig å bringe oligonukleotider, f.eks. antisensoligonukleotider inn i cellen. Antisens-oligonukleotider omfatter fortrinnsvis 15 nukleotider eller mer. Eventuelt kan oligonukleotidene være multimerisert. Ribosymer innføres i cellen fortrinnsvis som del av et genkonstrukt som inneholder stabiliserende genelementer, f.eks. tRNA-genelementer. Genkonstrukter av denne type er beskrevet i EP A 0 387 775. Gjennomsnittsfagmannen er fortrolig med inhiberende nukleinsyrer og deres virke-mekanismer; med hensyn hertil henvises til oversiktartiklene av Helene og Toulme, 1990, og Takayama og Inouye, 1990, samt de deri siterte referanser.

I tillegg til nukleinsyremolekyler som inhiberer gener, f.eks. virusgener, på grunn av sin komplementaritet, kan det også anvendes gener med annen inhiberende virkning. Eksempler på dette er gener som koder for virusproteiner som har såkalte transdominante mutasjoner (Herskowitz, 1987). Ekspresjon av genene i cellen gir proteiner som dominerer det tilsvarende villtypeprotein og på denne måte beskytter cellen som erhverver cellulær immunitet idet de forhindrer virusreplikasjonen. Egnet er transdominante mutasjoner av

. virusproteiner som er nødvendige for replikasjonen og ekspresjonen, f.eks. Gag-, Tat- og Rev-mutanter, for hvilke det ble vist at de inhiberer Hiv-replikasjonen (Trono et al., 1989; Green et al, 1989; Malim et al., 1989). *

En annen mekanisme til å oppnå intracellulær immunitet omfatter ekspresjon av RNA-molekyler som inneholder bindingsstedet for et essensielt virusprotein, f.eks. såkalt "TAR Decoys" (Sullenger et al., 1990).

Eksempler på gener som lar seg anvende innenfor rammen av den somatiske genterapi, og som ved hjelp av den foreliggende oppfinnelse kan sluses inn i cellen som bestanddel av genkonstrukter, er faktor VIII (Hemofili A), (se f.eks. Wood et al, 1984), faktor IX (hemofili B), (se f.eks. Kurachi et al, 1982), adenosindeaminase (SCID), (se f.eks. Valerio et al, 1984), a-1 antitrypsin (lungeemfysem), (se f.eks. Ciliberto et al, 1985), eller det "Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene" (se f.eks. Riordan et al, 1989). Disse eksempler representerer ingen som helst begrensning.

Med hensyn til størrelsen av nukleinsyrene er anvendelser mulige innenfor et bredt område; ved hjelp av den foreliggende oppfinnelse kan nukleinsyremolekyler av en størrelses-orden på ca. 0,15 kb (i tilfelle et tRNA-gen som inneholder et ribosymgen) inntil ca. 50 kb og derover befordres inn i cellen; midre nukleinsyremolekyler kan anvendes som oligonukleotider.

Det er åpenbart at nettopp på grunn av det faktum at den foreliggende oppfinnelse med hensyn til gensekvensen ikke underligger noen som helst begrensninger, og at ved hjelp av oppfinnelsen også svært store genkonstrukter kan transporteres, at de bredeste anvendelsesmuligheter er gitt.

Med utgangspunkt i nukleinsyren bestemmes den nukleinsyreaffine substans, fortrinnsvis en organisk polykationisk substans, som sikrer komplekseringen av nukleinsyren, de oppnådde komplekser er fortrinnsvis i alt vesentlig elektronøytrale. Når kompleksene ved siden av det endosomolytiske konjugat inneholder et konjugat av en internaliseringsfaktor og en nukleinsyreaffin substans, blir kationandelen av begge konjugater med hensyn til elektronøytralitetsaspektet tatt i betraktning.

I tidligere oppfinnelser var det fastslått at det kan oppnås et optimum for importen av nukleinsyre inn i cellen når forholdet konjugat:nukleinsyre ble valgt slik at intemaliseringsfaktor-polykation/nukleinsyrekompleksene var vidtgående elektronøytrale. Det ble fastslått at mengden av nukleinsyre opptatt i cellen ikke blir nedsatt når en del av transferrin-polykation-konjugatene blir erstattet med ikke-kovalent bundet polykation; i bestemte tilfeller kan det sågar oppnås en betraktelig økning av DNA-opptaket (Wagner et al, 1991a). Derved ble det observert at DNA innenfor kompleksene foreligger i fortettet form til toroide strukturer med en diameter på 80 til 100 nm. Mengden av polykation velges således med hensyn til begge parametrene elektronøytralitet og oppnåelse av en kompakt struktur, hvorved den mengde polykation som gir seg med hensyn til å oppnå elektronøytralitet fra nukleinsyrenes ladning, vanligvis også sikrer en kompaktering av DNA.

Kompleksene kan således eventuelt inneholde ytterligere nukleinsyrebindende substanser i ikke-kovalent bundet form som kan være like eller forskjellige fra sammenbindingsfaktoren, også den nukleinsyreaffine substans i konjugatene. For det tilfelle at det endosomolytiske middel er fritt virus, omfatter kompleksene nukleinsyre og internaliserings-faktorkonjugat. For det tilfelle at det anvendes et endosomolytisk konjugat, f.eks. et viruskonjugat, er nukleinsyren kompleksert med dette konjugat, eventuelt sammen med et konjugat av en ytterligere internaliseringsfaktor. Utvalget av ikke-kovalent bundede "frie" nukleinsyreaffine substanser etter art og mengde blir dessuten avstemt etter konjugatet henholdsvis konjugatene, hvorved det fremfor alt må tas hensyn til den sammenbindingsfaktor som inneholdes i konjugatet: er sammenbindingsfaktoren f.eks. en substans som har ingen eller bare liten evne til DNA-kondensasjon, er det med hensyn til en effektiv internalisering av kompleksene vanligvis hensiktsmessig å innsette slike DNA-affine substanser som har denne egenskap i sterkere utpreget målestokk. Er sammenbindingsfaktoren selv en nukleinsyrekondenserende substans og bevirkes allerede ved denne en med hensyn til effektiv internalisering tilfredsstillende kompaktering av nukleinsyren, anvendes hensiktsmessig en nukleinsyreaffin substans som på grunn av andre mekanismer bevirker en økning av ekspresjonen.

Til de innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse egnede ikke-kovalent bundne nukleinsyreaffine substanser hører forbindelser med evne til å kondensere nukleinsyre og/eller beskytte denne mot uønsket nedbrytning i cellen, særlig de allerede angitte substanser av polykationkarakter. En ytterligere gruppe av egnede substanser er slike som ved binding til nukleinsyre bevirker en forbedring av dens transkripsjon/ekspresjon, idet de forbedrer tilgjengeligheten av nukleinsyren for cellens ekspresjonsmaskineri. Et eksempel på en slik substans er det kromosomale ikke-histonprotein HMG1, for hvilket det ble fastslått at det har evne til å kompaktere DNA og bringe dette til ekspresjon i cellen.

Ved bestemmelse av molforholdet av endosomolytisk middel og/eller intemaliseringsfaktor/nukleinsyreaffin substans/nukleinsyre(r) må det tas hensyn til at kompleksering av nukleinsyre(ne) finner sted, og at det er sikret at det dannede kompleks blir bundet til cellen, befordret inn i cellen og at det enten av seg selv eller ved hjelp av det endosomolytiske . middel blir frigjort fra endosomene.

Det hver gang valgte forhold internaliseringsfaktor/sammenbindingsfaktor/nukleinsyre retter seg fremfor alt etter størrelsen av polykationmolekylene samt etter antallet og fordelingen av de positivt ladede grupperinger, kriterier som avstemmes etter størrelse og struktur av den nukleinsyre som skal transporteres. Fortrinnsvis er molforholdet internalise-ringsfaktonnukleinsyreaffin substans ca. 10:1 til ca. 1:10.

Etter konstruksjon og syntese av konjugatene og bestemmelse av det for transfeksjonens effektivitet optimale forhold konjugat(er):DNA kan ved hjelp av titrering bestemmes den mengde internaliseringsfaktor-konjugatandel som eventuelt lar seg erstatte med fri nukleinsyreaffin substans. I tilfelle anvendelse av polykationer både som sammenbindingsfaktor og som fri nukleinsyreaffin substans kan polykationene være like eller forskjellige.

For den utførelsesform av oppfinnelsen hvor viruskonjugater kommer til anvendelse, finnes det en egnet fremgangsmåte til bestemmelse av forholdet mellom komponentene som inneholdes i kompleksene ved først å definere det genkonstrukt som skal importeres inn i cellen og, som beskrevet ovenfor, å finne et virus eller en viruskomponent som er egnet for den spesielle transfeksjon. Deretter blir viruset eller viruskomponenten bundet til polykationet og kompleksert med genkonstruktet. Med utgangspunkt i en definert mengde viruskonjugat, kan det gjennomføres titreringer hvor målcellene blir behandlet med denne konstante konjugatmengde og avtagende DNA-konsentrasjoner, eller omvendt. På denne måte finnes det optimale forhold DNA:viruskonjugat. Ved anvendelse av en ytterligere internaliseirngsfaktor går man frem f.eks. slik at med utgangspunkt i en konstant DNA-mengde bestemmes ved titrering det optimale forhold mellom viruskonjugat og internalise-ringsfaktorkonjugat.

Kompleksene kan fremstilles ved å blande sammen komponentene i) nukleinsyre, ii) viruskonjugat, eventuelt iii) internalisermgsfaktor/sammenbindingsfaktorkonjugat og eventuelt iv) ikke-kovalent bundet nukleinsyreaffin substans som alltid foreligger i form av fortynnede løsninger. I tilfelle anvendelse av polykationer som sammenbindingsfaktor og samtidig som "frie" polykationer er det vanligvis hensiktsmessig først å fremstille en blanding av konjugater med frie polykationer og bringe denne blanding sammen med DNA. Derved bestemmes det optimale forhold av DNA til konjugat(er) og polykationer ved titreringseksperimenter, dvs. i en rekke transfeksjonseksperimenter med konstant DNA-mengde og økende mengde konjugat(er)/polykationblanding. Det optimale forhold konjugat(er):polykationer i blandingen kan oppnås ved hjelp av nitineeksperimenter henholdsvis ved sammenligning av de optimale forhold mellom blandingene anvendt i titreringseksperimentene.

Fremstillingen av DNA-kompleksene kan foregå ved fysiologiske saltkonsentrasjoner. En ytterligere mulighet består i anvendelse av høye saltkonsentrasjoner (ca. 2 molar NaCl) og påfølgende innstilling på fysiologiske betingelser ved langsom fortynning, henholdsvis dialyse.

Den hver gang best egnede rekkefølge for blandingen av komponentene nukleinsyre, konjugat(er), eventuelt ikke-kovalent bundet fri nukleinsyreaffin substans bestemmes detaljert i forforsøk. Eventuelt kan det vise seg formålstjenlig først å kompleksere nukleinsyren med konjugatet og først deretter tilføye den frie nukleinsyreaffine substans, f.eks. polykationet, f.eks. i tilfelle transferrin-etidiumdimer-konjugater og polylysin.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er den ytterligere internaliseringsfaktor transferrin og sammenbindingsfaktoren et polykation. Med "transferrin" skal forstås både de naturlige transferriner samt de transferrin-modifikasjoner som bindes av reseptoren og transporteres inn i cellen. Opptaket av nukleinsyre foregår i form av komplekser hvor internaliseirngsfaktor-polykation-konjugater er kompleksert med nukleinsyre. I tilfelle innholdet av ikke-kovalent bundet nukleinsyreaffin substans er denne fortrinnsvis et polykation som er likt med eller forskjellig fra det kation som inneholdes i konjugatet.

I tilfelle kombinasjonskomplekser blir nukleinsyren internalisert i form av komplekser hvori på den ene side internaliseringsfaktorkonjugatene og på den annen side de endosomolytiske er kompleksert med nukleinsyre.

Internaliseirngsfaktor-polykation-konjugatene som kommer til anvendelse sammen med fritt virus eller med viruskonjugatene i kombinasjonskompleksene kan fremstilles på kjemisk eller, i tilfelle polykationet er et polypeptid, på rekombinant måte, med hensyn til fremstillingsmetodene henvises til beskrivelsen i EP 388 758.

Konjugatene kan også fremstilles idet et glykoprotein, f.eks. transferrin, og sammenbindingsfaktoren blir bundet sammen med hverandre via én eller flere karbohydratkjeder av glykoproteinet. Slike konjugater er i motsetning til de konjugater som fremstilles ved hjelp av vanlige koblingsfremgangsmåter, fri for modifikasjoner som stammer fra den anvendte linkersubstans. Disse konjugater har i tilfelle glykoproteiner, som bare har én eller noen få karbohydratgrupper som egner seg for koblingen, f.eks. transferrin, ytterligere den fordel at de med hensyn til sitt bindingssted glykoprotein/sammenbindingsfaktor er nøyaktig definert.

Mengden av anvendt endosomolytisk middel, henholdsvis dettes konsentrasjon, retter seg etter den individuelt utførte transfeksjon. Det er hensiktsmessig å anvende den minste mengde virus, henholdsvis viruskomponenter, som er nødvendig for å sikre internaliseringen av virus og nukleinsyrekompleks og frigjøringen fra endosomene. Mengden av viruskonjugat blir avstemt etter den aktuelle celletype, derved må det fremfor alt tas hensyn til virusets infeksjonsevne for denne celletype. Et ytterligere kriterium er det aktuelle internaliseringsfaktor/sammenbindingsfaktorkonjugat, særlig med hensyn til internaliseirngsfaktoren, som målcellen har et definert antall reseptorer for. Dessuten retter mengden av viruskonjugat seg etter den mengde DNA som skal importeres. For en stabil transfeksjon som krever bare en liten DNA-mengde, er det vanligvis tilstrekkelig med en liten mengde virus, mens det for en transient transfeksjon som krever større DNA-mengder, anvendes en større virusmengde. For en spesiell anvendelse tilveiebringes i forforsøk med de målceller som hele tiden er forutsatt for transfeksjonen, eventuelt med en blandet cellepopulasjon, og det vektorsystem som er forutsett for transfeksjonen, den optimale viruskonsentrasjon ved titrering, hvorved det hensiktsmessig anvendes som DNA ét genkonstrukt som med hensyn til størrelsen vidtgående stemmer overens med det som er forutsett for den konkrete anvendelse, og som for enkel måling av genoverføring-effektiviteten inneholder et reportergen. Innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse ble påvist egnetheten av luciferase- og av B-galaktosidase-genet som reportergen for den slags forsøk.

Oppfinnelsen angår følgelig i et ytterligere aspekt en fremgangsmåte til innføring av komplekser av nukleinsyre, en nukleinsyrebindende substans og eventuelt en internaliseringsfaktor i høyere eukaryotiske celler. Cellene bringes i kontakt med et middel som har evne til, enten i seg selv eller som bestanddel av nukleinsyrekompleksene, å bli opptatt i cellene og frigjøre innholdet av endosomene, hvori nukleinsyrekompleksene er lokalisert etter innføring i cellen, til cytoplasma.

Vanligvis foretrekkes en samtidig administrering av endosomolytisk middel og nukleinsyrekompleks; administreringen kan imidlertid også foregå i rekkefølge, hvorved i

tilfelle den adskilte anvendelse rekkefølgen ikke er kritisk, så lenge administreringene følger kort etter hverandre for å sikre en mest mulig samtidig kontakt mellom cellen og komponentene. I tilfelle anvendelse av fritt virus i et eget preparat, kan den samtidige administrering av viruspreparatet med kompleksene sikres på den måte at viruspreparatet er en bestanddel av

transfeksjonsmediet som inneholder nukleinsyrekomplekset I tilfelle samtidig administrering av fritt virus blir nukleinsyrekompleksene og viruspreparatet blandet før anvendelsen.

I en foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes det endosomolytiske middel som bestanddel av et kombinasjonskompleks.

For å forsterke genekspresjonen kan sammensetningen ifølge oppfinnelsen også anvendes gjentatte ganger.

I en foretrukket utførelsesform er cellene primære tumorceller. I en særlig foretrukket utførelsesform er nukleinsyren et DNA som inneholder én eller flere sekvenser som koder for en immunmodulerende substans, fortrinnsvis et cytokin.

I en ytterligere utførelsesform er cellene myoblaster, fortrinnsvis primære myoblaster.

I en ytterligere utførelsesform er cellene fibroblaster, fortrinnsvis primære fibroblaster.

I en ytterligere utførelsesform er cellene hepatocytter, fortrinnsvis primære hepatocytter.

I en ytterligere utførelsesform er cellene primære endotelceller.

I en ytterligere utførelsesform er cellene primære luftveisepitelceller.

I en ytterligere utførelsesform er cellene T-celler.

I en ytterligere utførelsesform er cellene B-celler.

Tabell 1 viser den heldige transfeksjon ved hjelp av den foreliggende oppfinnelse med eksempel fra forskjellige celletyper.

Sammensetningen ifølge oppfinnelsen ble også undersøkt ved transfeksjon av hunde-hemofili B-fibroblaster. Såvel luciferase som fi-galaktosidase kunne i disse tilfeller ekspri-meres med hell. Dessuten ble systemet anvendt til å bringe inn 1.4 hundefaktoren IX cDNA i disse fibroblaster. Ved hjelp av sandwich-ELISA kunne faktor IX påvises 24 timer etter transfeksjonen.

I bestemte tilfeller er det formålstjenlig i tillegg til endosomolytiske midler å anvende en lysosomatrop substans, f.eks. når det endosomolytiske middel er et peptidkonjugat eller et retrovirus, hvis endosomolytiske aktivitet ikke er stringent pH-avhengig.

Det er kjent at lysosomatrope substanser hemmer aktiviteten av proteaser og nukleaser, og således kan inhibere nedbrytningen av nukleinsyrer (Luthmann og Magnusson, 1983). Til disse substanser hører klorokin, monensin, nigericin og metylamin. Det kunne vises at monensin frembringer en økning av reportergenekspresjonen i tilfelle anvendelse av moloneyvirus. Det kunne vises at tilstedeværelsen av klorokin i praktisk 100% av K562-celler fører til ekspresjon av et reportergen som ble bragt inn i cellene ved transferrin-formidlet DNA-transfør. BNL.CL2 eller HepG2-hepatocytter reagerte ikke så godt på klorokin som K562-cellene, men kunne imidlertid transfiseres i en utstrekning på 5-10% når de endosomolytiske egenskaper av tilsatt replikasjonsdefekt eller kjemisk inaktivert adenovirus ble utnyttet.

Ved hjelp av den foreliggende oppfinnelse forsterkes fordelene ved de biologiske vektorer. På grunn av fordelingen av reseptorene finnes det en tropisme både for internaliseringsfaktor og for viruset. Ved avstemning av begge disse komponenter til den aktuelle cellepopulasjon er det mulig å oppnå en forhøyet selektivitet som fremfor alt kommer til utførelse ved den terapeutiske anvendelse av den foreliggende oppfinnelse. Dette aspekt får særlig betydning ved den terapeutiske anvendelse av den foreliggende oppfinnelse i lungene, fordi de forskjellige cellepopulasjoner i lungene har forskjellige reseptorer, hvilket kan kreve konstruksjon av vektorer med høyere bindmgsaffinitet for en bestemt cellepopulasjon, f.eks. for flimmercellene i luftveiene. Som ligander kommer f.eks. lektiner i betraktning. Konstruksjon av slike konjugater fordrer blant annet bekreftelse av bindingsegenskapene til . en ligand kandidat i konjugatkonformasjonen. Denne bekreftelse kan gjennomføres f.eks. med antistoffer mot ligandene ved hjelp av immunhistokjemiske fargemetoder i det vev hvor den terapeutiske anvendelse skal foregå.

Den foreliggende oppfinnelse angår i et ytterligere aspekt farmasøytiske preparater, kjennetegnet ved at de inneholder, som aktivt ingrediens, en sammensetning ifølge et av kravene 1 til 47, inneholdende en terapeutisk aktiv nukleinsyre og en farmasøytisk akseptabel bærer. Enhver inert farmasøytisk antagbar bærer kan anvendes, f.eks. koksalt-løsning eller fosfatbuffret koksaltløsning, eller enhver bærer hvori DNA-kompleksene har egnede løslighetsegenskaper for anvendelse innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse. Med hensyn til fremgangsmåter til formulering av farmasøytiske preparater henvises til Remingtons Pharmaceutical Sciences, 1980.

Det er videre beskrevet transfeksjonssett, kjennetegnet ved at det inneholder en bærerenhet hvor det er to eller flere beholdere, en første beholder inneholdende en substans med en affinitet for nukleinsyren som er eventuelt koblet til en internaliseringsfaktor for en høyere eukaryot celle og en andre beholder inneholdende et endosomolytisk middel som er et virus eller en viruskomponent som har evne til å penetrere per se inn i cellen som skal bli transfektert.

Det er også beskrevet transfeksjonssett, kjennetegnet ved at det inneholder en bærerenhet hvor det er to eller flere beholdere, en første beholder inneholdende en substans med en affinitet for nukleinsyren som er konjugert med en internaliseringsfaktor for en høyere eukaryot celle og en andre beholder inneholdende en substans med en affinitet for nukleinsyren som er bundet til et endosomolytisk middel.

Den foreliggende oppfinnelse har fordelen av høyest mulig fleksibilitet ved anvendelsen, blant annet som farmasøytisk preparat. Sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan foregå som lyofilisat eller i en egnet buffer i dypfrosset tilstand. Den kan også ferdigstilles som bruksferdig reagens i løsning, transportert og lagret fortrinnsvis nedkjølt. Eventuelt foreligger komponentene som er nødvendige for transfeksjonen, nemlig DNA, endosomolytisk middel, eventuelt konjugert eller forberedt for konjugasjonen med en separat konjugasjonspartner, DNA-bindende substans, eventuelt konjugert med en internaliseringsfaktor, eventuelt fritt polykation, i en egnet buffer adskilt eller delvis adskilt som bestanddel av en transfeksjonssett som likeså er gjenstand for den foreliggende oppfinnelse. I et slikt transfeksjonssett som angitt ovenfor kan en første beholder inneholde ett eller flere forskjellige DNA som koder f.eks. for forskjellige antigener. Andre beholder kan inneholde ett eller flere forskjellige internaliseringsfaktorkonjugater, hvorved anvendelsen av transfeksjonssettet muliggjøres i form av et byggekloss-system. Om bestanddelene foreligger som bruksferdig preparat, eller adskilt for å blandes sammen umiddelbart før anvendelsen, avhenger ved siden av den spesifikke anvendelse av kompleksenes stabilitet som kan undersøkes rutinemessig i stabilitetstester. I en foretrukket utførelsesform finnes et transglutaminase-koblet adenovirus-polylysin-konjugat som har vist seg som lagringsstabilt, i én av beholderene i settet. I en ytterligere foretrukket utførelsesform foreligger biotinylert adenovirus og streptavidin-polylysin i adskilte beholdere og blir blandet før anvendelsen. Under utnyttelse av oppfinnelsens fleksibilitet kan gjennomsnittsfagmannen utvikle tallrike forskjellige transfeksjonssett.

Den terapeutiske anvendelse av sammensetningen ifølge oppfinnelsen som farmasøytisk preparat kan foregå systemisk, derved foretrekkes den intravenøse vei. Målorganer for denne anvendelsesform er f.eks. leveren, milten, lungene, benmargen samt tumorer.

Eksempler på den lokale anvendelse er lungevevet (anvendelse av sammensetningen ifølge oppfinnelsen som væske for instillasjon eller som aerosol for inhalering). Ved siden av en høy spesifisitet av liganden for de differensierte lungeceller, kan det derved være nødvendig som ytterligere forholdsregel å påvirke forskjellige faktorer som er tilstede i lungevevets omgivelser og som kunne påvirke genoverføringen (f.eks. lammelse av flimmerbevegelsen, oppløsning av bronkialmucus, anvendelse av proteaseinhibitorer). Videre kan de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen administreres ved direkte injeksjon i leveren, i muskelvevet eller i en tumor, eller ved lokal anvendelse i mage/tarm-kanalen. En ytterligere fremgangsmåte til administrering av den farmasøytiske sammensetning er anvendelsen via gallegangsystemet. Denne anvendelsesfremgangsmåte tillater direkte tilgang til hepatocyttmembranene på de små gallekanalene, hvorved vekselvirkningen av sammensetningen med blodbestanddelene blir unngått.. 1 korthet ble muligheten påvist til å anvende myoblaster (umodne muskelceller) til å bringe inn gener i muskelfibrene hos mus. Da det ble vist for myoblaster at de skiller ut genproduktet i blodet, kan denne fremgangsmåte finne bredere anvendelse enn til behandling av genetiske defekter i muskelceller, som f.eks. defekten i sammenheng med muskeldystrofi. De manipulerte myoblaster kunne således anvendes til å levere genprodukter som enten virker i blodet eller blir transportert av blodet. Eksperimentene i den foreliggende oppfinnelse har vist at både myoblast- og også myotub-kulturer, sågar primære, kan transfiseres med høyere effektivitet. De transfeksjonsmedier som viste de beste resultater, inneholdt kombinasjonskomplekser av biotinylert adenovirus, transferrin-polylysin og streptavidin-polylysin. I tillegg til reportergen-produktene luciferase og fi-galaktosidase ble faktor VIII uttrykt i muskelcellene. Dessuten ble hønseadenoviruset CELO innsatt i ' kombinasjonskomplekser som inneholdt hvetekimagglutinin som ytterligere internaliseringsfaktor.

Den terapeutiske anvendelse kan også foregå eks vivo, hvorved de behandlede celler, f.eks. benmargsceller, hepatocytter eller myoblaster blir tilbakeført til kroppen, f.eks. Ponder et al, 1991, Dhawan et al, 1991. En ytterligere eks vivo-anvendelse av den foreliggende oppfinnelse vedrører såkalt kreftvaksine. Prinsippet for denne terapeutiske sammensetning består deri å isolere tumorceller fra en pasient og transfisere cellene med et DNA som koder for et cytokin. I et neste skritt blir cellene eventuelt inaktivert, f.eks. ved stråling, og sågar av en slik art at de ikke lenger formerer seg men allikevel uttrykker cytokinet. Deretter blir de genetisk forandrede celler administrert som vaksine til den pasient som de ble tatt fra. I omgivelsene omkring vaksineringsstedet vil de utskilte cytokiner aktivere immunsystemet blant annet ved å aktivere cytotoksiske T-celler. Disse aktiverte celler kan utøve sin virkning i andre deler av kroppen og angriper også ikke-behandlede tumorceller. På denne måte nedsettes risikoen for tumorresidier og metastaseutvikling. En forskrift som egner seg for anvendelsen av kreftvaksiner for genterapien ble beskrevet av Rosenberg et al, 1992. Istedenfor retrovirus-vektorene foreslått av Rosenberg kan anvendes genoverføirngsystemet ifølge den foreliggende oppfinnelse. I forsøkene ifølge den foreliggende oppfinnelse ble primære melanomceller transfisert med hell med et reportergen som fantes i kombinasjonskomplekser av polylysinkoblet adenovirus og transferrin-polylysin eller LDL-polylysin.

Den foreliggende oppfinnelse kan også anvendes ved undersøkelser til å bestemme

immunresponsen på et gitt antigen. Antigenspesifikke cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) som dreper infiserte celler, spiller en viktig rolle ved forsvaret mot virusinfeksjoner eller tumorer gjennom verten. Vekselvirkningen mellom T-celler og antigenpresenterende celler (APC) er HLÅ-begrenset ("Human Lymphocytic Antigens" = MHC, "Magor Histocompatibility Molecules"). For å fastlegge drepingen av celler som uttrykker et antigen, ved CTL i en in

vitro "CTL Killing Assay", må antigenet presenteres for CTL'ene i riktig HLA-kontekst, hvilket vanligvis betyr på den autologe målcelle. En "CTL Killing Assay" kan gjennomføres som følger: APCer blir transfisert med et DNA-konstrukt som inneholder en sekvens som koder for et antigen. Antigenepitoper blir bundet til MHC klasse I-molekyler og presentert på celleoverflaten som mål for en spesifikk CTL-respons. Etter inkubasjon med en prøve av pasientserum blir APCene lysert i avhengighet av tilstedeværelsen av spesifikke CTL'er. Cellelysen kan måles f.eks. ved å forfølge frigjøringen av radioaktivt krom som ble innført i APCene før tilsetning av serumet. Etablerte forskrifter (Walker et al, 1989) anvender B-LCL'er (B-lymfoblastoide cellelinjer) som ble indusert ved transfeksjon med rekombinante vacciniavirus for ekspresjon av antigen-gener. Imidlertid dør de celler som uttrykker antigenet effektivt ca. 1 dag, på grunn av lysevirkningen av vaccinia. Disse vanskeligheter kan overvinnes ved hjelp av "CTL Killing Assays", som anvender genoverføring-systemet ifølge den foreliggende oppfinnelse for innføring i cellen av DNA som koder for antigener, f.eks. for innføring i fibroblaster av konstrukter som koder for HIV eller tumorantigener for å la disse uttrykke antigenet. Primære fibroblaster kan lett fremskaffes fra biopsier, er lett å dyrke og har vist seg som svært effektivt transfiserbare (ca. 50 til ca. 70%) ved hjelp av den foreliggende oppfinnelse. Slike assays er nyttige for, med hensyn til utviklingen av vaksiner, å identifisere epitoper som gjenkjennes av dreperceller. Dessuten kan de fordelaktig anvendes for å bestemme den HLA-begrensede immunrespons hos en person mot et bestemt antigen.

På grunn av den store mengde hvori genene som transporteres ved hjelp av den foreliggende oppfinnelse, blir eksprimert i praktisk talt alle celler, kan oppfinnelsen også

anvendes til å produsere rekombinante proteiner. Også i dette tilfelle finnes det ingen eller bare små begrensninger med hensyn til sekvensen, henholdsvis størrelsen av det transferene DNA, videre finnes det et bredt spektrum av celletyper som lar seg transfisere med sammensetningen ifølge denne oppfinnelse. Det kan derfor anvendes nesten enhver celletype for fremstillingen av rekombinante proteiner som sikrer at det rekombinante protein blir fremstilt på naturtro og i fullstendig modifisert posttranslasjonal bearbeidet form som sikrer den høye biologiske aktivitet av produktet!

Genoverføringen til cellene kan oppnås, som vist i de foreliggende eksempler, ved hjelp av luciferase og av IFN-a, det kan transporteres praktisk talt ethvert genkonstrukt som fører til dannelse av et ønsket proteinprodukt. Det ønskede proteinprodukt kan utvinnes fra cellekulturen 24 timer inntil 1 uke eller lengre etter transfeksjonen (enten fra celle-supernatanten eller fra et egnet cellehomogenisat tilsvarende forskriften for det aktuelle proteinprodukt).

Anvendelsen av genoverføirngsystemet ifølge den foreliggende oppfinnelse på fremstillingen av rekombinante proteiner har følgende fordeler: 1) På grunn av den høye transfeksjonseffektivitet (mer enn 90% av de transfiserte celler kan uttrykke genet i store mengder) er det unødvendig med en forseleksjon av transfiserte celler; videre er det ikke nødvendig å etablere stabile cellelinjer. En cellekultur i liten målestokk kan være tilstrekkelig til å oppnå brukbare mengder av

protein.

2) Store genkonstrukter kan transporteres; det kan med hell transporteres 48 kb.

3) Genekspresjonen kan finne sted i celler som sikrer at den tilsvarende post-translasjonale bearbeiding og modifikasjon finner sted (f.eks. vitamin K-avhengig karboksylering av koaguleringsfaktorer, se Armentano et al, 1990, eller celle-typespesifikk glykosylering. 4) Gjennom systemet ifølge oppfinnelsen blir et større utvalg av målceller disponible for genekspresjonen.

Figuroversikt:

Fig. 1: Virkning av adenovirus-infeksjon på genoverføring ved hjelp, av

transferrinpolylysinkonjugater

Fig. 2: Konjugat-DNA-kompleks-doseeffekt

Fig. 3: Forsterkning av transferrin-polylysin-formidlet genoverføring ved adenovirus foregår via reseptorformidlet endocytose:

A) Virkning på kompleksert DNA

B) Virkning på reseptorbundet DNA

C) Virkning på genoverføring ved hjelp av transferrinpolylysinkonjugater Fig. 4: Virkning av adenovirus-infeksjon på genoverføring ved hjelp av transferrin-polylysinkonjugater i utvalgte cellelinjer Fig. 5: Undersøkelse om forsterkningen av genekspresjonen beror på gentransport-nivået eller på transaktivering

Fig. 6: Tetragalaktose-peptid-polylysin-konjugat

Fig. 7: Transfeksjon av HepG2-celler med pRSVL-DNA-komplekser i nærvær av

adenovirus

Fig. 8: Transfeksjon av HepG2-celler med PCMVL-DNA-komplekser i nærvær av

adenovirus

Fig. 9: Transfeksjon av TIB73-celler med pCMVL-DNA-komplekser:

A) Sammenligningsverdier med klorokin

B) I nærvær av adenovirus

Fig. 10: Import av pCMVL-DNA i T-celler i nærvær av adenovirus:

A) H9-celler

B) Primære lymfocytter

Fig. 11: UV-inaktivering av adenovirus:

A) Forsterkning av genoverføring-effekten i HeLa-celler ved UV-inaktivert virus B) Sammenligning av UV-inaktiveringen med genoverføring-effekten

Fig. 12: Inaktivering av adenovirus med formaldehyd

Fig. 13: Transfeksjonav NIH3T3-celler med transferirn-polylysin-DNA-komplekser i

nærvær av Moloney-virus

Fig. 14: Undersøkelse om genoverføirngeffekten ved transfeksjonen av NIH3T3-celler

med transferirnpolylysin-DNA-komplekser kan tilbakeføres på Moloney-virus Fig. 15: Vekselvirkninger mellom transferrin og dens reseptor spiller en rolle for gen-overføringeffekten av Moloney-virus

Fig. 16: Innflytelse av pH-verdien på genoverføring-effekten av retrovirus

Fig. 17: Influensa-hemagglutinin-peptid; liposom-leakage-assay

Fig. 18: Transfeksjon av K562-celler med transferrin-polylysin-konjugater i nærvær

av influensapeptid-polylysinkonjugat

Fig. 19: Transfeksjon av HeLa-celler med transferrin-polylysin-konjugater i nærvær av

influensapeptid-polylysin-konj ugat

Fig. 20: In situ-påvirkning av fi-galaktosidase-ekspresjon etter transfeksjon av HeLa-celler med transferirn-polylysin-pCMV-if-gal-DNA i nærvær av adenovirus

Fig. 21: In situ B-galaktosidase-ekspresjon i HeLa-celler i nærvær av adenovirus

Fig. 22: Transfeksjon av celler med et 48 kb kosmid i nærvær av adenovirus.

A: HeLa-celler.

B: Neuroblastomceller

Fig. 23: Fremstilling av adenovirus-polylysin ved kjemisk kobling

Fig. 24: Transfeksjon av K562-celler med kjemisk koblede adenovirus-konjugater Fig. 25: Transfeksjon av HeLa-celler med kjemisk koblede adenovirus-konjugater

Fig. 26: Binding av polylysin til adenovirus ved hjelp av transglutaminase

Fig. 27: Transfeksjon av muse-hepatocytter ved hjelp av transglutaminase-koblede

adenovirus-polylysinkonjugater

Fig. 28: Forsterkning av transfeksjonseffektiviteten med transglutaminase-koblede

adenovirus-polylysinkonjugater i sammenligning med ikke-koblet virus

Fig. 29: Transfeksjon av HeLa-celler med biotin-streptavidin-koblede adenovirus- konjugater Fig. 30: Transfeksjon av K562-celler med biotin-streptavidin-koblede adenovirus- konjugater Fig. 31: Transfeksjon av neuroblastomceller med et 48 kb kosmid ved hjelp av biotin-streptavidin-koblede adenoviruskonj ugater

Fig. 32: Transfeksjon av hepatocytter i nærvær av klorodn eller adenovirus

Fig. 33: Transfeksjon av K562-celler i nærvær av forskjellige endosomolytiske midler Fig. 34: Sammenligning av transfeksjonsprotokollene på cellulært nivå med B-galakto sidase som reportergen i nærvær av forskjellige endosomolytiske midler Fig. 35: Langtids luciferase-ekspresjon i konfluente hepatocytter som ikke deler seg Fig. 36: Ekspresjon i HeLa-celler, transfisert i nærvær av fritt CELO-virus og CELO- virus bundet via biotin-streptavidin-polylysin Fig. 37: Transfeksjon av myoblaster og myotuber i nærvær av fritt adenovirus og

adenovirus bundet via biotin-streptavidin til polylysin

Fig. 38: Transfeksjon av primære myoblast- og myotubkulturer

Fig. 39: Sammenligning av adenovirus d 1312 og CELO-virus ved transfeksjon av

HeLa-celler og C2C12-myoblaster

Fig. 40: Forbedring av transfeksjonen med CELO-virus ved anvendelse av en lectin- ligand Fig. 41: Ekspresjon av et faktor VIII cDNA i C2C12-myoblast- og myotubkulturer

Fig. 42: Forsterkning av DNA-transporten ved adenovirusproteiner.

A: HeLa-celler.

B: Fibroblaster

Fig. 43: Galaktose-influensapeptid-konjugater for DNA-transporten i hepatocytter

Fig. 44: Galaktose-adenovirus-konjugater for DNA-transporten i hepatocytter

Fig. 45: Genoverføring i B-lymfoblastoide B-celler

Fig. 46: DNA-transfør med transferrin-polylysin i nærvær av rhinovirus.

A: fritt rhinovirus.

B: konjugert rhinovirus

Fig. 47: Transfeksjon av primære humane melanomceller med kombinasjons komplekser inneholdende transferrin- og adenovirus-konjugater Fig. 48: Transfeksjon av primære humane melanomceller med kombinasjonskomplekser inneholdende LDL- og adenovirus-konjugater

Fig. 49: Genoverføring i luftveisepitelceller hos rotter in vivo

Fig. 50: Liposom-leakage-assay med amfipatiske peptider

Fig. 51: Eytrocytt-leakage-assay med amfipatiske peptider

Fig. 52: Transfeksjon av BNL CL.2-celler i nærvær av amfipatiske peptider

Fig. 53: Transfeksjon av NIH3T-celler i nærvær av amfipatiske peptider

Fig. 54: Ekspresjon av IFN-a i HeLa-celler, transfisert i nærvær av forskjellige endosomolytiske midler

I de følgende eksempler som illustrerer den foreliggende oppfinnelse, ble det, såfremt intet annet er angitt, anvendt følgende materialer og metoder:

Fremstilling av transferirn-polylysin-DNA-kompIekser

a) Humantransferrin-polylysin-konjugater

Det ble anvendt fremgangsmåten beskrevet av Wagner et al, 1991b, hvorved

koblingen av polylysin foregår til karbohydratsidekjeden i transferrinet.

. En løsning av 280 mg (3,5 umol) humant transferrin Oernfritt, Sigma) i 6 ml 30 mM natriumacetatbuffer, pH 5, ble avkjølt til 0°C og tilsatt 750 ul 30 mM natriumacetatbuffer pH 5, inneholdende 11 mg (51 umol) natriumperjodat. Blandingen fikk bli stående i isbad 90 minutter i mørke. For å fjerne de lavmolekylære produkter ble det gjennomført en gelfiltrering (Sephadex G-25, Pharmacia), som ga en løsning med et innhold av ca. 250 mg oksydert transferrin (måling ved Ninhydrinassay). (For å påvise den oksyderte form som inneholder aldehyder og ved farging av anisaldehyd gir en fargereaksjon, ble prøvene dryppen på en silikagel tynnsjiktplate, tørket og platene neddykket i p-anisaldehyd/svovel-syre/etanol (1:1:18), tørket og oppvarmet). Den modifiserte transferrinløsning ble raskt (i løpet av 10-15 min) tilsatt til en løsning inneholdende 1,5 umol fluorescensmerket poly(L)lysin med en gjennomsnittlig kjedelengde på 190 lysinmonomerer i 4,5 ml 100 mM natriumacetat pH 5. Løsningens pH-verdi ble innstilt ved tilsetning av 1 M natriumhydrogen-karbonatbuffer på pH 7,5. Til blandingen ble i avstander på 1 time tilsatt fire porsjoner av 28,5 mg (450 umol) natriumcyanoborhydrid. Etter 17 timer ble tilsatt 2 ml 5 M natriumklorid for å bringe løsningen til en totalkonsentrasjon på ca. 0,75 M. Reaksjonsblandingen ble påsatt på en kationbyttersøyle (Pharmacia Mono S HR 10/10) og fraksjoner med et saltgradient på 0,75 M til 2,5 M natriumklorid med et konstant innhold av 25 mM HEPES pH 7,3. Den høye salt konsentrasjon ved påsettingen av søylen og fra begynnelsen av gradienten var vesentlig for utbyttet av polykationkonjugater. Noe transferrin (ca. 30%) sammen med en svak fluorescens-aktivtet eluerte i gjennomløpet; hovedmengden av fluorescensmarkert konjugat eluerte ved en saltkonsentrasjon mellom 1,35 M og 1,9 M og ble samlet i tre fraksjoner. Disse fraksjoner ga (i elueringsrekkefølge) etter to gangers dialyse mot 2125 mM HEPES pH 7,3 en fraksjon A (TfpL190A) med et innhold på 45 mg (0,56 umol) transferrin, modifisert med 366 nmol polylysin, en fraksjon B (TfpL190B) med et innhold på 72 mg (0,90 umol) transferrin, modifisert med 557 nmol polylysin, og en fraksjon C (TfpL190C), inneholdende 7 mg (85 nmol) transferrin, modifisert med 225 nm polylysin. Transferrin-konjugatene ble, såfremt de ikke straks ble anvendt, etter sjokkfrysing lagret i flytende nitrogen ved -20°C i jernfri form. Før innbyggingen av jern ble prøver (0,5-1 mg) bragt opp til en fysiologisk saltkonsentrasjon (150 mM) med natriumklorid.

Innbyggingen av jern ble foretatt ved tilsetning av 4 fil 10 mM jern(III)citratbuffer (inneholdende 200 mM citrat, ved tilsetning av natriumhydrogenkarbonat innstilt på en pH-verdi på 7,8) pr. mg transferrin-innhold. De jernholdige konjugater ble oppdelt før sin anvendelse for DNA-kompleksdannelsen i små alikvoter, sjokknedfrosset i flytende nitrogen eller tørris/etanol og oppbevart ved -20°C (denne forholdsregel viste seg som formålstjenlig etter at den hadde vist at flere gangers tining og innfrysing førte til ødeleggelse av konjugatene).

b) Mus-transferrin-polylysin-konjugater

Det ble gått frem tilsvarende fremgangsmåten angitt for humantransferrin, idet

koblingen via karbohydratsidekjedene ble foretatt. Ut i fra 4,1 mg (51 nmol) mustransferrin og 2,1 mg (34 nmol) pL290 ble det fremstilt konjugater av 15,5 nmol mustransferrin og 12 nmol pL290.

Plasmid- DNA

a) pRSVL-DNA

6 ug av DNA-plasmidet pRSVL (inneholdende Photinus pyralis luciferasegenet

under kontroll av Rous Sarcoma-virus LTR-enhancer/promotor (Uchida et al, 1977, De Wet et al, 1987), fremstilt ved hjelp av Triton-X lyse standardmetode (Maniatis), etterfulgt av CsCl/Etfir likevektstetthetsgradient-sentrifugering, avfarging med butanol-1 og dialyse mot 10 mM Tris-HCl, pH 7,5,1 mM EDTA) i 350 ul HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,3) ble 30 minutter før tilsetning til cellene blandet med 12 ug transferrin-polylysinkonjugat i 150 ul HBS.

b) pCMV-DNA

Plasmidet pCMV ble fremstilt idet BamHI-innskuddet av plasmid pSTCX556

(Severne et al, 1988) ble fjernet, plasmidet behandlet med Klenow-fragment og Hindlll/Sspl samt det Klenow-behandlede fragment fra plasmidet pRSVL, som inneholder sekvensen som koder for luciferase, henholdsvis den for B-galaktosidase (Maggregor og Caskey, 1989) ble innsatt. Kompleksdannelsen ble foretatt analogt med pRSVL.

Fremstilling av virus-preparater

a) Adenovirus-preparater

Det ble anvendt adenovirusstammen dl312 beskrevet av Jones og Shenk, 1979, som

har en delesjon i Ela-regionen. Formeringen av viruset ble gjennomført i den Ela-transkom-plementerende cellelinje 293, hvorved fremstillingen ble gjennomført i stor målestokk som beskrevet av Davidson og Hassel, 1987. Det rensede virus ble opptatt i lagerbuffer (100 mM Tris, pH 8,0,100 mM NACI, 0,1% BSA, 50% glycerol) eller i HBS/40% glycerol og alikvoter oppbevart ved -70°C. Bestemmelsen av virionkonsentrasjonen ble gjennomført ved hjelp av UV-spektrofotometrisk analyse av det ekstraherte genomiske virus-DNA (formel: én enhet av optisk tetthet (OD, A260) tilsvarer 10^ viruspartikler/ml; (Chardonnet og Dales, 1970)).

b) Retrovirus-prcparatcr

Moloney-museleukemi-retroviruset N2 ble pakket i en ekotropisk forpakningslinje

(Keller et al, 1985, Armentano et al, 1987). Supernatanter av viruseksprimerende cellelinjer ble samlet, sjokkfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -20°C. Supernatantene som ble anvendt i eksemplene hadde en titer på ca. 10<*>> cfu/ml, som ble målt ved hjelp av neomycin-resistenskolonidannelse med NIH3T3-celler. For viruskonsentreringseksperimentene ble supernatantene sendt gjennom et 300 kb membranfilter (FILTRON) under nitrogentrykk i en AMICON-rørecellekonsentrator. Derved kunne 10-30 ml supernatant normalt konsentreres 10 ganger.

Celler op medier

HeLa-celler ble dyrket i DMEM-medium, komplettert med 5% varmeinaktivert føtalt kalveserum (FCS), penicillin til 100 LE. pr. ml, streptomycin til 100 ug/ml og 2 mM glutamin. WI-38, MRC-5 og KB-celler ble dyrket i EMEM-medium (Eagles modified essential medium), komplettert med 10% varmeinaktivert FCS, antibiotika som DMEM-medium 10 mM ikke-essensielle aminosyrer og 2 mM glutamin. CFT1, en respiratorisk cystisk fibrose epitelcellelinje (fremstilt etter fremgangsmåten beskrevet av Yankaskas et al, 1991; CFT1 -cellelinjen er karakterisert ved at den er homozygot for ØF508-delesjon CF-mutasjonen) ble dyrket i F12-7X-medium (Willumsen et al, 1989). For genoverføring-forsøkene ble cellene dyrket i 6 cm cellekulturplater inntil de var til ca. 50% konfluente (5xl0<5> celler). Mediet ble fjernet og 1 ml DMEM- eller EMEM/2% FCS-medium ble tilsatt. Deretter ble konjugat-DNA-kompleksene tilsatt, umiddelbart deretter adenoviruset dl312 (0,05-3,2x10^ partikler/celle) eller et sammenlignbart volum av viruslagerbuffer (1-80 ul). Platene ble bragt tilbake i kulturskapet i 1 time (5% CO2, 37°C), deretter ble tilsatt 3 ml komplett medium. Etter ytterligere 24 timers inkubering ble cellene høstet for å bestemme luciferasegenekspresjonen. I tilfelle CFT1-cellene ble cellene dyrket før genoverføring-eksperimentene i 4 timer i F12-7X-medium uten human transferrin.

Følgende cellelinjer ble skaffet fra ATCC, under de angitte katalognummere: HeLa-celler: CCL 2, K562-celler: CCL 243, HepG2-celler: HB 8065, TlB-73-celler: TIB 73 (BNL CL.2),NIH3T3-celler: CRL 1658,293-celler: CRL 1573, KB-celler: CCL 17, WI-38-celler: CCL 75, MRC-5-celler: CCL 171. H9-celler: ble skaffet fra AIDS Research and Reference Reagent Program, U.S. Department of Health and Human Services, katalog nr. 87.

Primære lymfocytter ble skaffet, idet en 25 ml prøve av navlesnorblod ble opptatt i små prøverør inneholdende EDTA. Alikvoter ble forsynt med 4,5 ml Ficoll-hypaque (Pharmacia) og sentrifugert i 15 min ved 2 500 Upm. Det brunlige sjikt mellom det øvre plasmasjikt og det klare Ficollsjikt ble fjernet (ca. 10 ml). 40 ml IMCM pluss 10% FCS ble tilsatt, prøven sentrifugert i 15 min ved 1200 Upm og cellepelleten opptatt i 50 ml frisk IMDM pluss 10% FCS (celletettheten var ca. 2xl0<6> celler/ml). En 250 ul alikvot fytohemag-glutinin (PHA P, DIFCO) ble tilsatt, kulturen inkubert 48 timer ved 37°C og 5% CO2, deretter ble rekombinant IL-2 (BMB) tilsatt (konsentrasjon: 20 enheter/ml). Deretter ble cellene delt med IMDM/20% FCS, 2 enheter/ml IL-2 1:3. Alikvoter av cellene ble dypfrosset i flytende nitrogen i FCS pluss 5% DMSO. Før anvendelse ble cellene dyrket i IMDM pluss 20% FCS pluss 2 enheter/ml IL-2.

For de sekvensielle bindingsundersøkelser ble HeLa-cellene ekvilibrert ved 4°C i

1 ml DMIM, komplettert med 2% FCS. Konjugat-DNA-kompleksene ble tilsatt som ved de andre forsøk, og platene ble inkubert 2 timer ved 4°C. Deretter ble platene inngående vasket med iskald DMEM/2% FCS, deretter tilsatt 2 ml av dette medium. Deretter ble tilsatt adenovirus dl 312, henholdsvis virusbuffer, og cellene fikk varme seg opp langsomt før de ble plassert i kulturskapet i ytterligere 24 timer. Etter denne inkubering ble cellene høstet og undersøkt på luciferasegenekspresjon.

Luciferase-assav

Fremstillingen av celle-ekstrakter, standardisering av proteininnholdet samt bestemmelse av luciferase-aktiviteten ble gjennomført som beskrevet av Zenke et al, 1990, Cotten et al, 1990, henholdsvis i EP 388 758.

Eksempel 1

Bestemmelse av virkningen av adenovirus-behandlingen på genoverføringen ved transferrin-polyly sin-konj ugater

Først ble undersøkt virkningen av en økende virusdose på evnen til en definert mengde konjugat-DNA-kompleks til å oppnå genoverføring. Dertil ble for kompleksdannelsen blandet 6 ug av plasmidet pRSVL med 12 ug humantransferrin-polylysin-konjugat (hTfpL190B). Konjugat-DNA-komplekset pluss forskjellige mengder av adenoviruset dl312 (0,05-3,2x10<4> viruspartikler/celle) ble tilsatt til HeLa-cellene. Resultatet av denne analyse er gjengitt i fig. 1. Luciferase-aktiviteten er uttrykt i lysenheter pr. 50 ug totalcelleprotein. Ifølge denne analyse ga stigende mengder av tilsatt adenovirus en tilsvarende økning av genoverføring. I figuren er vist gjennomsnittsverdier av 2-4 adskilte eksperimenter; bjelkene viser standard avvik.

Eksempel 2

Konj ugat-DN A-kompleks-doseeffekt

Logaritmiske fortynninger av konj ugat-DNA-komplekser, fremstilt som i eksempel 1, ble tilsatt til HeLa-celler, med eller uten tilsetning av en konstant dosering av adenovirus dl312 (lxl0^ viruspartikler/celle). Luciferaseaktiviteten ble bestemt som angitt i eksempel 1. Resultatene er gjengitt i fig. 2.

Eksempel 3

Forsterkningen av genoverføring med adenovirus bevirket med transferrin-polylysin foregår via reseptorformidlet endocytose

a) Virkningen av adenovirus-behandling på transfør av kompleksert DNA

For transfeksjonen ble anvendt følgende komponenter: 6 ug pRSVL-DNA uten

tiansferrin-polylysin-konjugat (DNA); 6 ug pRSVL-DNA pluss 6 ug ikke-konjugert polylysin270 (DNA + pL); 6 ug pRSVL-DNA pluss 12 ug av transferrin-polylysin-konjugatene (DNA + hTfpL190B) anvendt i de forrige eksempler. Disse transfeksjons-materialer ble tilsatt til HeLa-cellene med eller uten adenovirus dl312 (dl312) (lxlO<4 >viruspartikler/celle). Fremstillingen av celleekstraktene, standardiseringen etter totalprotein og bestemmelsen av luciferase-aktiviteten foregikk som i de foregående eksempler. Resultatet av de gjennomførte forsøk er gjengitt i fig. 3a.

b) Virkningen av adenovirus-behandling på transfør av reseptorbundet DNA

Konjugat-DNA-komplekser (DNA + hTfpL190B) eller polylysin-DNA-komplekser

(DNA + pL) ble bundet til HeLa-celler uten å bli internalisert, idet inkuberihgen foregikk ved 4°C. Ikke-bundet kompleks ble fjernet før tilsetningen av adenovirus dl312 (1 xlO4 viruspartikler/celle) eller at et sammenlignbart buffervolum. Deri påfølgende inkubering ble gjennomført ved 37°C for å muliggjøre internaliseringen av de bundede DNA-komplekser og adenovirus. Bestemmelsen av luciferaseaktiviten foregikk som angitt (fig. 3B).

c) Virkningen av adenovirus-behandling på genoverføring ved transferrin-polylysin-konjugater

Konjugat-DNA-komplekser, inneholdende 6 ug pRSVL-DNA pluss 12 ug transferrin-polylysin (DNA + hTfpL190B) ble tilsatt til HeLa-cellene ved en konsentrasjon på lxlO4 adenoviruspartikler (dl312/celle eller en sammenlignbar mengde av varmeinaktivert adenovirus dl312 (dl312 h.i.). Varmeinaktivering ble foretatt ved 30 minutters inkubering ved 45°C (Defer et al, 1990).

Eksempel 4

Virkningen av adenovirus-behandling på genoverføring ved transferrin-polylysin-konjugater i utvalgte cellelinjer

Konjugat-DNA-komplekser (6 ug pRSVL + 12 ug hTfpL190B) ble tilsatt til celler av cellelinjene CFT1, KB, HeLa, WI38 og MRC5 med eller uten adenovirus dl312 (IxlO<4 >viruspartikler/celle). Effektiviteten av genoverføring for de forskjellige cellelinjer ble bestemt som i de foregående eksempler ved hjelp av luciferase-assay (fig. 4).

Eksempel 5

Forsterkning av luciferasegenekspresjonen fungerer på gentransportnivå og ikke på transaktivering

Det ble først fremstilt en cellelinje med betegnelsen K562 10/6 som konstitutivt uttrykker en luciferase, idet celler ble transfisert med et plasmid som inneholder et RSV-luciferase-genfragment (et Apal/PvuI-fragment av pRSVL (De Wet et al, 1987), klonet inn i Clal-stedet i pUCu.-Locus (Collis et al, 1990). Dette plasmid ble kompleksert med et transferrin-polylysin-konjugat og K562-celler transfisert med disse komplekser, hvorved det ble gett frem etter metoden beskrevet av Cotten et al, 1990. Da pUCu-lokus-plasmidet inneholder et neomycin resistensgen, kunne det på grunn av neomycinresistensen seleksjoneres kloner som uttrykker seg på luciferase. For de ytterligere forsøk ble det valgt ut en klon med betegnelsen K562 10/6.

Alikvoter av den parentale cellelinje K562 (i 200 ul RPMI1640 pluss 2& FCS; 500 000 celler/prøve) ble behandlet enten med 12 ag TfpL pluss 6 ug pRSVL eller med 4 ug pL90 pluss 6 ug pRSVL, hver gang i 500 ul HBS. De angitte mengder av adenovirus dl312 (fig. 5) fikk virke på cellene i 1,5 timer ved 37°C, hvoretter 2 ml RPMI og 10% FSC ble tilsatt. Deretter ble inkuberingen fortsatt ved 37°C i ytterligere 24 timer, og cellene ble deretter forberedt for luciferaseaktivitetsbestemmelsen. Det ble funnet at inkuberingen med adenovirus bevirker en tydelig økning i luciferase-aktiviten (fig. 5 A). Dette gjelder såvel for TfpL-kompleksene (200 lysenheter mot 25 000 lysenheter) som også for pL90-kompleksene (0 mot 1,9x10^ lysenheter). Derav kan sluttes at K562-cellelinjen har evne til å internalisere pRSVL/polylysin-komplekser, og at denne internalisering, målt via luciferaseekspresjonen, blir øket betydelig gjennom tilstedeværelsen av adenovirus.

Analoge forsøk ble gjennomført med K562 10/6-cellene som konstitutivt uttrykker RSVL-luciferasegenet, hvorved det ble anvendt lignende mengder av adenovirus dl312. Alikvoter på 500 000 celler (i 200 ul RPMI pluss 2% FCS) ble inkubert med de i fig. 5B angitte mengder av adenovirus dl 312 i 1,5 timer ved 37°C. Deretter ble som ved den parentale cellelinje tilsatt RPMI pluss 10% FCS, videre inkubert i 24 timer og luciferase-aktiviteten bestemt. Som det fremgår av fig. 5B, var behandlingen av disse celler med adenoviruset ikke påvisbar på luciferaseaktiviteten; kontrollverdiene ligger i det samme område som verdiene for de virusbehandlede prøver.

Eksempel 6

Transfeksjon av leverceller med asialofetuin-polylysin-konjugater (AFpL), henholdsvis med tetra-galaktosepeptid-pL-konjugater ((gal)4pL) i nærvær av adenovirus

a) Fremstilling av laktosylert peptid

3,5 mg (1,92 umol) av det forgrenede peptid Lys-(NE-Lys)Lys-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Cys, fremstilt ved hjelp av Fmoc-metoden for anvendelse av en

Applied Biosystems 431A peptid-synthesizer, inneholdende en ditiopyridin-gruppe for Cys, ble behandlet med en løsning av 7,85 mg laktose i 40 ul 10 mM vandig natriumacetat pH 5 ved 37°C. Til løsningen ble tilsatt 4 porsjoner 0,6 mg (10 umol) natriumcyanoborhydrid i intervaller på ca. 10 timer. Etter tilsammen 64 timer ved 37°C ble tilsatt 0,5 ml HEPES pH 7,3 og 15 mg ditiotreitol (DTT). Fraksjonering ved hjelp av gelfiltrering (Sephadex G-10,12 x 130 mm, eluens: 20 mM NaCl) under argon ga 3,6 ml løsning av laktosylert peptid i fri merkaptoform (1,73 umol, tilsvarende Ellmannstesten; 84% utbytte). Prøvene av det modifiserte peptid viste en fargereaksjon med anisaldehyd, men ingen fargereaksjon med ninhydrin; dette stemmer overens med den antagelse at alle 4 N-terminale aminogrupper er laktosylert. Tetra-galaktosepeptid-polylysin-konjugatet er gjengitt i fig. 6.

b) Fremstilling av 3-ditiopyridinpropionat-modifisert polylysin

Til en gelfiltrert løsning av 0,60 umol poly-L-lysin med en gjennomsnittlig kjedelengde på 290 lysinmonomerer (pL290, hydrobromid, Sigma) i 1,2 ml 100 mM HEPES pH 7,9 ble under intensiv blanding tilsatt 400 ul av en 15 mM etanolisk løsning av SPDP (6,0 umol). 1 time senere ble tilsatt 500 ul 1 M natriumacetat pH 5; etter gelfiltrering (Sephadex G-25) med 100 mM natriumacetat inneholdt løsningen 0,56 umol pL290 med 5,77 umol ditiopyridin-Iinker.

c) Konjugasjon av peptidet med polylysin

Konjugater ble fremstilt, idet 1,5 umol av det laktosylerte peptid fremstilt i a) i 3 ml 20 mM NaCl ble blandet sammen med 0,146 umol av det modifiserte pL290 oppnådd fra b) i 620 ul 100 mM natriumacetatbuffer under argonatmosfære. Etter tilsetning av 100 ul 2 M HEPES pH 7,9 fikk reaksjonsblandingen bli stående i 18 timer ved romtemperatur. Etter tilsetning av NaCl ble saltkonsentrasjonen bragt til 0,66 M, og konjgatene ble isolert ved kationbytterkromatografi (Pharmacia Mono S-kolonne HR 5/5; gradienteluering buffer A: 50 mM HEPES pH 7,3; buffer B: buffer A pluss 3 M NaCl). Produktfraksjonene eluerte ved saltkonsentrasjoner på ca. 1,2 M til 1,8 M og ble samlet i to konjugatfraksjoner; konjugatfraksjonene ble betegnet med (gal)4pLl og (gal)4pL2. Dialyse mot 25 mM HEPES pH 7,3 ga konjugatfraksjonene (gal)4pLl, inneholdende 24 nmol modifisert pL290 og (gal)4pL2, inneholdende 24,5 nmol modifisert pL290.

d) Fremstilling av asialofetuinkonjugater

Konjugatene ble fremstilt ifølge det samme prinsipp som transferrin-konjugatene; en

lignende fremgangsmåte for fremstillingen av asialoorosomukoid-polylysin-konjugater er beskrevet av Wu og Wu, 1988.

Koblingen av asialofetuin til polylysin ble gjennomført ved forbindelse over disulfidbroer etter modifikasjon med det bifunksjonelle reagens SPDP (Pharmacia). En løsning av 100 mg (2,2 umol) asialofetuin (Sigma) i 2 ml 100 mM HEPES pH 7,9 ble underkastet en gelfiltrering på en Sephadex G-25-kolonne. Til den derav oppnådde 4 ml løsning ble tilsatt 330 ul av en IS mM etanolisk løsning av SPDP (5,9 umol) under kraftig omrøring. Etter 1 time ved romtemperatur ble det renset ved en ytterligere gelfiltrering (Sephadex G-25); derav fikk man 5 ml av en løsning av 1,4 umol asialofetuin, modifisert med 2,25 umol ditio-pyridinlinker.

Konjugater ble fremstilt, idet 1,4 umol modifisert asialofetuin i 5 ml 100 mM HEPES pH 7,9 ble blandet sammen med 0,33 umol modifisert pL190 (inneholdende 1,07 umol merkaptopropionatgrupper; derved gikk man frem nøyaktig som for fremstillingen av Ixansferrin-konjugatene) i 6,5 ml 200 mM HEPES pH 7,6 under argonatmosfære. Reaksjonsblandingen fikk stå i 24 timer ved romtemperatur. Konjugatene ble isolert fra reaksjonsblandingen ved kationbytterkromato grafi (Pharmacia Mono S-kolonne HR 10/10; gradienteluering buffer A: 50 mM HEPES pH 7,9; buffer B: buffer A pluss 3 M natriumklorid) og natriumklorid tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,6 M før påsettingen på søylen. Produktfraksjonen eluerte ved en saltkonsentrasjon på ca. 1,5 M. Dialyse mot HBS ga konjugater, inneholdende 0,52 umol asialofetuin, modifisert med 0,24 umol pL190.

e) Transfeksjon av HepG2-celler med pRSVL-DNA-komplekser

HepG2-celler ble dyrket i DMEM-medium pluss 10% FCS 1001.E/ml penicillin, 100

Hg/ml streptomycin og 2 mM glutamin i T25-flasker. Transfeksjonen ble gjennomført ved en tetthet på 400 000 celler/flaske. Før transfeksjonen ble cellene vasket med 4 ml friskt medium inneholdende 10% FCS. Umiddelbart før transfeksjonen ble tilsatt klorokin (Sigma), slik at sluttkonsentrasjonen i cellesuspensjonen (pluss DNA-løsning) var 100 uM.

10 ug pRSVL-DNA i 330 ul HBS ble blandet med de i fig. 7 angitte mengder TfpL190B-konjugat (TfpL), asialofetuin-pL90-konjugat (AfpL), polylysin290 (pL) eller tetra-galaktose-peptid-polylysin-konjugat (gal)4pL i 170 (il HBS. I konkurranseeksperimentene ble etter 30 minutter tilsatt 240 ug asialofetuin (((gal)4pL + Af) eller 30 ug

laktosylert peptid ((gal)4pL + (gal)4). Blandingen ble tilsatt til cellene; cellene ble inkubert i 4 timer ved 37°C, deretter ble transfeksjonsmediet erstattet med 4 ml friskt DMEM-medium pluss 10% FCS. Etter 24 timer ble cellene høstet for luciferase-assay. Verdiene gjengitt i fig. 7 fremstiller den samlede luciferase-aktivitet av de transfiserte celler. Som det fremgår av figuren viser pL og TfpL lave luciferaseaktiviteter; (gal)4pL viser like høye verdier som AfpL; tilsetning av (gal)4 eller Af konkurrerer om asialoglykoproteinreseptoren og nedsetter, som ventet, verdiene.

f) Transfeksjon av HepG2-celler med pCMVL-DNA-komplekser

HepG2-celler ble dyrket i 6 cm plater til en celletetthet på 300 000 celler/plate, som

angitt i e). Før transfeksjonen ble cellene vasket med 1 ml friskt medium, inneholdende 2%

FCS.

6 ug pCMVL-DNA i HBS ble blandet sammen med de i fig. 8 angitte mengder TfpL190B-konjugat (TfpL), asialofetuin-pL-konjugat (AFpL), polylysin290 (pLys290), (gal)4pLl eller (gal)4pL2 i 170 ul HBS. Etter 30 minutter ble tilsatt til hvert DNA-konjugatkompleks 1 ml DMEM, inneholdende 2% FCS og 50 ul adenovirus stamløsning dl312C. I konkurranseeksperimentene ble, som angitt, tilsatt 30 ug laktosylert peptid (gal)4pL ((gal)4pLl + (gal)4 henholdsvis (gal)4pL2 + (gal)4). Blandingen ble tilsatt til cellene; cellene ble inkubert i 2 timer ved 37°C, deretter ble tilsatt 1,5 ml medium inneholdende 10% FCS. 2 timer senere ble transfeksjonsmediet erstattet med 4 ml friskt DMEM-medium + 10% FCS. Etter 24 timer ble cellene høstet for luciferase-assay; verdiene i fig. 8 fremstiller den samlede luciferase-aktivitet av de transfiserte celler. pLys290 viser ingen effekt, (gal)4pL viser en sterkere effekt; tilsetning av (gal)4 som konkurrerer om asialoglykoprotein-reseptoren, reduserer verdien til den verdi som ble oppnådd for polylysin.

g) Transfeksjon av TIB73-celler med pCMVL-DNA-komplekser

Celler fra den embryoniske mus-levercellelinje ATCC TIB73 (BNL CL.2; Patek et al,

1978) ble dyrket ved 37°C i 5% C02-atmosfaere i "high glucose" DMEM (0,4% glukose), komplettert med 10% varmeinaktivert FCS, inneholdende 1001.E./ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin og 2 mM glutamin, i 6 cm plater.

Transfeksjonene ble gjennomført ved en celletetthet på 300 000 celler/plate. Før transfeksjonene ble cellene vasket med 1 ml friskt medium pluss 2% FCS. 6 ug pCMVL-DNA i 300 ul HBS ble blandet sammen med de angitte mengder mustransferrin-polylysin290-konjugat (mTfpL), asialofetuin-pL-konjugater (AFpL), polylysin290 (pLys290), (gal)4pLl eller (gal)4pL2 i 170 ul HBS. Etter 30 minutter ble hvert DNA konjugatkompleks tilsatt 1 ml DMEM inneholdende 2% FCS og 50 ul adenovirus stamløsning dl312C. Blandingen ble tilsatt til cellene, cellene ble inkubert ved 37°C i 2 timer, deretter ble tilsatt 1,5 ml medium inneholdende 10% FCS. 2 timer senere ble transfeksjonsmediet erstattet med 4 ml friskt medium. Etter 24 timer ble cellene høstet for luciferase-assay; de i fig. 9A viste verdier gjengir den samlede luciferaseaktivitet av de transfiserte celler.

Til sammenligning ble det foretatt en transfeksjon uten adenovirus i nærvær av klorokin: transfeksjonen ble gjennomført ved en celletetthet på 300 000 celler/plate. Før transfeksjonen ble cellene vasket med 1 ml friskt medium inneholdende 2% FCS. Umiddelbart før transfeksjonen ble tilsatt klorokin (Sigma), slik at sluttkonsentrasjonen i cellesuspensjonen (+ DNA-løsning) var 100 uM. 6 ug pCMVL-DNA i 330 ul HBS ble blandet sammen med de angitte mengder mTfpL, AFpL, pLys290, (gal)4pLl eller (gal)4pL2 i 170 ul HBS. Etter 30 minutter ble DNA-kompleksene tilsatt til cellene. Cellene ble inkubert ved 37°C i 2 timer, deretter ble tilsatt 1,5 ml medium inneholdende 10% FCS og 100 uM klorokin. 2 timer senere ble transfeksjonsmediet erstattet med 4 ml friskt medium. Etter 24 timer ble cellene høstet for luciferase-bestemmelse. De verdier som ble oppnådd for luciferaseaktiviteten er gjengitt i fig. 9B.

Eksempel 7

Import av DNA i T-celler

a) Fremstilling av antiCD7-polylysinl90-konjugater

En løsning av 1,3 mg antiCD7-antistoff (Immunotech) i 50 mM HEPES pH 7,9 ble

tilsatt 49 ul 1 mM etanolisk løsning av SPDP (Pharmacia). Etter 1 time ved romtemperatur ble det filtrert over en gelkolonne Sephadex G-25 (elueringsmiddel 50 mM HEPES-buffer pH 7,9), hvorved det ble oppnådd 1,19 mg (7,5 nmol) antiCD7, modifisert med 33 nmol pyridylditiopropionat-rester. Poly(L)lysinl90, fluorescensmarkering ved hjelp av FITC, ble modifisert analogt med SPDP og ved behandling med ditiotreitol og etterfølgende gelfiltrering bragt i en form modifisert med frie merkaptogrupper.

En løsning av 11 nmol polylysin 190, modifisert med 35 nmol merkaptogrupper, i 0,2 ml 30 mM natriumacetatbuffer ble blandet sammen med modifisert antiCD7 (i 0,5 ml 300 mM HEPES pH 7,9) under utelukkelse av oksygen, og fikk stå over natten ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble bragt opp til en konsentrasjon på ca. 0,6 M ved tilsetning av 5 M NaCl. Isoleringen av konjugatene foregirt ved ionebytterkromatografi (Mono S, Pharmacia, 50 mM HEPES pH 7,3, saltgradient 0,6 M til 3 M NaCl); etter dialyse mot 10 mM HEPES pH 7,3 ble det oppnådd tilsvarende konjugater, bestående av 0,51 mg (3,2 nmol) antiCD7-antistoff, modifisert med 6,2 nmol polylysinl90.

b) Fremstilling av gp 120-polylysin 190-konjugater

Koblingen foregikk analogt med litteraturkjente fremgangsmåter ved tioetersammen-kobling etter modifisering med 6-maleimidokapronsyre-N-hydroksysuksinimidester (EMCS, Sigma) (Fujiwara et al, 1981).

Tioeter- sammenkoblede gpl 20- polylysin 190- konjugater;

En løsning av 2 mg rekombinant gpl 20 i 0,45 ml 100 mM HEPES pH 7,9 ble tilsatt 17 ul av en 10 mM løsning av EMCS i dimetylformamid. Etter 1 time ved romtemperatur ble det filtrert over en gelsøyle Sephadex G-25 (elueringsmiddel 100'mM HEPES-buffer 7,9). Produktløsningen (1,2 ml) ble straks omsatt under utelukkelse av oksygen med en løsning av 9,3 nmol polylysin 190, fluorescensmarkert og modifisert med 30 nmol merkaptogrupper (i 90 ul 30 mM natriumacetat pH 5,0), og fikk stå over natten ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen bragtes opp på en konsentrasjon på ca. 0,6 M ved tilsetning av 5 M NaCl. Isoleringen av konjugatene foregikk ved ionebytterkromatografi (Mono S Pharmacia, 50 mM HEPES pH 7,3, saltgradient 0,6 M til 3 M NaCl); etter fraksjonering og dialyse mot 25 mM HEPES pH 7,3 ble det fremstilt tre konjugatfraksjoner A, B og C, bestående av 0,40 mg rpgl20 modifisert med 1,9 nmol polylysin 190 (i tilfelle fraksjon A), henholdsvis 0,25 mg rgp 120 modifisert med 2,5 nm polylysin 190 (fraksjon B), henholdsvis 0,1 mg rgp 120 modifisert med 1,6 nmol polylysin 190 (fraksjon C).

pCMVL-DNA (6 ug/prøve) ble kompleksert med de angitte mengder polylysin90 eller de angitte polylysin-konjugater i 500 ul HBS. I mellomtiden ble det fremstilt alikvoter av H9-celler (IO<6> celler i 5 ml RPMI med 2% FCS) eller av primære humane lymfocytter (3xl0<6> celler i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM) pluss 2% FCS). Polylysin-DNA-kompleksene ble tilsatt til hver celleprøve. 5 minutter senere ble tilsatt den angitte mengde adenovirus dl312. Cellene ble deretter inkubert ved 37°C i 1,5 timer, deretter ble tilsatt 15 ml RPMI (i tilfelle H9-cellene) eller IMDM (i tilfelle de primære lymfocytter) pluss 20% FCS til hver prøve. Cellene ble inkubert ved 37°C i 24 timer, høstet og behandlet for bestemmelse av luciferase-aktiviteten som i de øvrige eksempler. Resultatet av de gjennom-førte forsøk er gjengitt i fig. 10A (H9-celler) henholdsvis fig. 10B (primære lymfocytter): I H9-celler viste angiCD7-konjugatet (fig. 10A, kolonnene 7-9) og gpl20-konjugatet (kolonnene 10-12) de beste resultater med hensyn til genoverføring oppnådd med adenovirus, hvorved gpl20-konjugatet også i fravær av adenovirus allerede oppnådde en tydelig ekspresjon av luciferasegenet. Det er bemerkelsesverdig at i de gjennomførte forsøk var bare gpl20-konjugatet istand til å bringe DNA inn i primære lymfocytter, og dette bare i nærvær av det defekte adenovirus (fig. 10B, kolonnene 7 og 8).

Eksempel 8

Inaktivering av adenovirus

a) UV-inaktivering

Et adenovirus dl312-preparat, fremstilt og lagret som beskrevet i innledningen til

eksemplene, ble plassert i fordypningene på 2 cm i en cellekulturplate (300 ul/fordypning) på is i 8 cm avstand fra 2 UV-lamper (Philips TUV 15 (Gl 5 T8)-lamper). Viruset ble utsatt for UV-bestrålingen i en varighet av de tider som er angitt i fig. 1 IA, og alikvoter av hvert preparat ble undersøkt på sin virustiter samt på sin evne til, om og i hvilket omfant de er istand til å forsterke gen-transfør med polylysin-transferrin-konjugater til HeLa-celler.

Dyrkingen av cellene og transfeksjonen ble i alt vesentlig foretatt som angitt ovenfor under "celler og medier"; komponentene som ble anvendt for transfeksjonen kan sees av fig.

1 IA. Kompleksene av pCMVL-DNA og 12 ug TfpL ble fremstilt i 500 ul HBS og tilsatt 3xl0<5> HeLa-celler (i 1 ml DMEM pluss 2% FCS). Ca. 5 minutter senere ble 55 ul av hvert viruspreparat tilsatt hver kultur, og kulturen inkubert ved 37°C i 1,5-2 timer. Deretter ble tilsatt en 5 ml alikvot DMEM pluss 10% FCS til hver kultur, inkuberingen fortsatt ved 37°C

i 24 timer og kulturene høstet og undersøkt på luciferase-aktivitet. Mengden på 54 ul av ikke-bestrålt virus ligger ikke i metningsområdet, dvs. at testen er følsom for en minst tre

ganger høyere virusmengde. De oppnådde verdier for luciferaseekspresjonen er gjengitt i fig.

1 IB (fylte firkanter).

Virustiteren for hvert preparat ble bestemt under anvendelse av den El A-kompIe-menterende cellelinje 293. Først ble det fremstilt seriefortynninger av de ubestrålte og de bestrålte virusprøver i DMEM pluss 2% FCS. Parallelt dermed ble det fremstilt prøver med 5xl0<4> 293-celler (i en 2 cm fordypning) og tilsatt til 200 ul DMEM pluss 2% FCS. En 5 ul alikvot av hver fortynning ble til sammenligning tilsatt hver gang til en andre fordypning. For å bevirke bindingen av virus til cellene, ble det inkubert i 1,5 timer ved 37°C, deretter ble tilsatt 2 ml DMEM pluss 10% FCS i hver fordypning. 48 timer senere ble kulturene tellet for å bestemme den cytopatiske effekt. Den virusfortynning over hvilken mindre enn 50% av cellene i kulturen etter 48 timer viser en tydelig cytopatisk effekt, angir den relative mengde av infeksiøs virus i hvert viruspreparat. De oppgitte verdier er gjengitt i fig. 1 IB (åpne firkanter). Resultatet av forsøkene gjennomført i dette eksempel viser at en nedsettelse på 4 tierpotenser i virustiteren ved UV-bestråling bevirker bare en 20 gangers reduksjon av luciferasegenoverføring. Dette viser at mekanismer som er bestemmende for virusets infeksjonsevne kan ødelegges uten å påvirke virusets evne til forsterkning av genoverføring.

Det ble bemerket at forsterkningen av genoverføring gjennom viruset ved lave virusdoser avtok bare lite (fig. 1 IA, kolonnene 3-6) og at denne effekt opptrådte tydeligere ved de høye doser (spaltene 7-10).

b) Inaktivering av adenovirus med formaldeh<y>d

2 ml adenoviruspreparat ble påsatt på en 10 ml G25-kolonne (Pharmacia PD 10 G, 25

M), forekvilibrert med 150 mMNaCl, 25 mM HEPES pH 7,9,10% glycerol, og fanget opp i et volum på 2,5 ml. Alikvoter av det gelfiltrerte viruspreparat ble inkubert uten (0), med 0,01%, 0,1% eller 1% formaldehyd i 20 timer på is. Deretter ble tilsatt Tris pH 7,4 til en konsentrasjon på 100 mM, deretter ble prøvene dialysert først 2 timer mot 1 liter 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,4 og 50% glycerol, og deretter over natten mot 2 x 1 liter 150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,9 og 50% glycerol.

Alikvoter av viruset ble deretter undersøkt på 293-celler på sin titer (CPE-sIuttpunkt-assay eller Plaque-assay, Precious og Russel, 1985). Deretter ble bestemt virkningen av de. formaldehyd-behandlede virus på genoverføring i HeLa-celler (300 000) som i de foregående eksempler, idet luciferase-aktiviteten ble målt. 90 ul av viruspreparatet bevirket en DNA-transfør som tilsvarte mer enn 10& lysenheter. Behandling av viruset med 0,01% eller med 0,1% formaldehyd førte til en ubetydelig nedsettelse av genoverføring-aktiviteten (ca. 10 gangers nedsettelse ved 0,1%). Skjønt behandlingen med 1% formaldehyd bevirker et påfallende tap av genoverføringaktivitet, kunne 90 ul av viruset fremdeles forårsake en genekspresjon tilsvarende IO<4> lysenheter.

Ved behandlingen med 0,1% formaldehyd var en nedsettelse av virustiteren til 10^ PFU ("Plaque forming units") koblet sammen med en nedsettelse av luciferase-aktiviteten på bare 10%. Resultatene av de gjennomførte forsøk er gjengitt i fig. 12A.

c) Inaktivering av adenovirus med langbøleet UV/ 8 metoksvpsoralen

Alikvoter av renset viruspreparat ble bragt til en konsentrasjon på 0,33 ug/ml 8-metoksypsoralen (stamkonsentrasjon 33 ug/ml 8-metoksypsoralen løst i DMSO) og utsatt for en 365 nm UV-lyskilde (UVP-modell TL-33) på is i en avstand av 4 cm fra lampefilteret. Varigheten av belysningen var 15-30 minutter som det fremgår fra fig. 12B. Virusprøvene ble deretter påsatt på en Sephadex G-25-kolonne (Pharmacia, PD-10) ekvilibrert med HBS + 40% glycerol og lagret ved -70°C. Viruspreparatene ble undersøkt på den ene side på sin evne til å forsterke genoverføring ved hjelp av pCMVL/hTfpL-komplekser i HeLa-celler (fremstilt som lysenheter, den høyre akse i fig. 12B), på den annen side på sin evne til å replikere i 293-celler (virustiter, venstre akse i fig. 12B).

Eksempel 9

Transfeksjon av NIH3T3- celler med Moloney- virus

I disse og i de følgende eksempler, som viser forsterkningen av internaliseringen av transferirn-polylysin-DNA-komplekser ved hjelp av retrovirus, ble anvendt følgende materialer og metoder, såfremt intet annet er angitt: Transferirn-polylysin 190-konjugater og konjugat-DNA-komplekser ble fremstilt analogt med de foregående eksempler, med den forskjell at kompleksdannelsesreaksjonen ble gjennomført i et volum på 500 ul 1 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,4.

NIH3T3-celler ble dyrket i DMEM-medium med tilsetning av 10% FCS, 1001.E./ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin og 2 mM glutamin. For transfeksjonen ble utplatet 5-7x10 <5> celler pr. T25-flaske 18-24 timer før transfeksjonen. Umiddelbart før transfeksjonen ble cellene overført til friskt medium og de forskjellige komponenter anvendt for transfeksjonen tilsatt i følgende rekkefølge: Klorokin (100 uM, hvor angitt), polylysin-transferrin-DNA-kompleks, retroviruspreparat. Cellene ble deretter inkubert 4 timer ved 37°C, deretter ble mediet utskiftet og cellene høstet 24 timer senere. Det ble fremstilt ekstrakter idet det ble anvendt tre fryse/tine-cykler; alikvoter av ekstraktene, standardisert på proteininnhold ble undersøkt på luciferaseaktivitet som angitt for de foregående eksempler.

Under de angitte betingelser ble det gjennomført transfeksjoner av 10^ NIH3T3-celler med TfpL-DNA-komplekser i nærvær av 100 uM klorokin eller uten klorokin, som vist i fig. 13. Det ble fastslått at verdiene for luciferase-aktiviteten uten klorokin bare nådde bakgrunnsnivå (kolonne 1), mens det i nærvær av klorokin kunne måles en høy ekspresjon av pRSVL-reportergenet (kolonne 2). Stigende mengder av Moloneyleukemiviruset som ble tilsatt til cellene samtidig med DNA-kompleksene kunne bevirke en tiltagende økning av luciferasegenekspresjonen (de mengder som er angitt i fig. 13 er ml).

Eksempel 10

Undersøkelse om økningen av genoverføring kan tilbakeføres til retroviruset

Det viruspreparat som ble anvendt i eksempel 9 var en rå, ikke-fraksjonert supernatant av celler som uttrykker retrovirus. For å få bevis for at økningen av DNA-importen som ble oppnådd med dette viruspreparat, virkelig kunne tilbakeføres på viruset, ble supernatanten underkastet den ovenfor beskrevne dialyse/konsentrasjonsrensing, hvorved retrovirussupernatanten (i figuren angitt med RBS) ble konsentrert med en faktor 10. Dersom retroviruset er ansvarlig for forsterkningen, skulle aktiviteten funnet i membranresten, bortsett fra en mulig inaktivering av det ytterst labile retrovirus under konsentrasjonstrinnet, være omlag den tidobbelte av den opprinnelige supernatant. Som i det foregående eksempel ble IO<6> NTH3T3-celler transfisert under betingelsene angitt i fig. 14. Fra fig. 14 kan man se at den effekt som forsterker genoverføring er tilstede i membranresten (det ble anvendt 20-600 ul, kolonnene 3-6). Dessuten viste det seg at 200 og 600 ul av det ti ganger konsentrerte preparat er bare ca. halvt så aktivt som 2 eller 6 ml av det opprinnelige ikke-konsentrerte retroviruspreparat (kolonnene 7 og 8). Parallelt dermed ble det gjennomført forsøk med humane K562-celler som ikke har noen reseptor for det ekotrope muse-retrovirus. Som ventet ble det ikke oppnådd noen forsterkning av genekspresjonen.

Eksempel 11

Ved eenoverføringeffekten av Molonev- virus spiller vekselvirkningen mellom transferrin og dens reseptor en rolle

For å utelukke den mulighet at transfør av TfpL/pRSVL-komplekser i cellene kan tilbakeføres til uspesifikk binding av polylysin til retroviruset, og for å oppklare innførings-mekanismen ytterligere, ble retroviruset undersøkt på sin evne til å befordre plasmid-DNA inn i en celle som er kompleksert bare med polylysin. Den anvendte polylysin-mengde tilsvarer det tidligere frembragte optimum som bevirker fullstendig kondensasjon av plasmid-DNA, og er lik den polylysinmengde som kommer til anvendelse med polylysin-transferrin-konjugatet (Wagner et al, 1991a). Forsøkene, hvis resultat er <g>jengitt i fig. 15, viste at reportergenet ved fravær av klorokin blir uttrykt hverken i form av TpfL-pRSVL-komplekser eller i form av pL-pRSVL-komplekser (kolonnene 1 og 2). I nærvær av retroviruset ble derimot uttrykt det reporter-DNA som ble anvendt som TfpL-kompleks, imidlertid ikke i form av pL-DNA-komplekset (sammenlign kolonnene 3 og 4 med kolonnene 5 og 6). Videre viste de gjennomførte forsøk at tilstedeværelsen av overskudd av fritt transferrin bevirket en nedsettelse av DNA-importen lettet ved hjelp av retroviruset (kolonnene 7 og 8). Også disse resultater støtter den forestilling at vekselvirkning mellom transferrin og dens reseptor spiller en vesentlig rolle for den forsterkning av DNA-opptaket som bevirkes ved retroviruset.

Eksempel 12

Innflytelse av pH- verdien på genoverføring- effekten av retrovirus

De innenfor rammen av dette eksempel gjennomførte eksperimenter ble gjennomført for å undersøke innflytelsen av pH-verdien på evnen til retrovirus til å forsterke denne gen-overføring. Transfeksjonsforsøkene ble foretatt som i de fore-gående eksempler. For å fastslå om en lav pH-verdi er vesentlig for genoverføring-effekten ble det anvendt begge de godt karakteriserte inhibitorer for den endosomale pH-verdisenkning, monensin og ammoniumklorid. Det ble gått ut i fra den overlegning at begge disse substanser ville påvirke gen-overføringen når retroviruset for genoverføringeffekten har behov for den lave pH-verdi av endosomet. Når derimot andre mekanismer for denne effekt kommer til utførelse, nemlig den direkte fusjon på cytoplasmaoverflaten, på samme måte som ved HIV-innførings-mekanismen, da skulle disse substanser enten ikke ha noen negativ effekt, men sågar eventuelt en forsterkende effekt, når de forandrer veien for TfpL-DNA-kompleksene. De eksperimentelle resultater som er gjengitt i fig. 16 støtter snarere den sistnevnte hypotese. Virkningen av begge substansene på TfpL-DNA-transfør ble undersøkt, og det ble funnet at ingen av de begge substanser funksjonelt kan erstatte klorokin. Alikevel ble det fastslått en liten økning av luciferasegenekspresjonen ved høyere ammoniumkloridkonsentrasjoner (kolonnene 1-5). Retroviruset alene viste den svake forsterkning av DNA-transporten observert allerede i de foregående eksempler (kolonne 6). En sterk økning ble observert når retroviruset ble anvendt i nærvær av 1 uM monensin (kolonne 7). En mindre sterk effekt ble observert ved en høyere monensin-konsentrasjon (kolonne 8), samt i nærvær av ammoniumklorid (kolonnene 9 og 10).

Eksempel 13

Forsterknin<g> av <g>enoverførin<g> oppnådd ved transferrin- konjugater gjennom det N- terminale endosomolytiske peptid av influensahema<g>glutininet HA2

a) Syntese av peptidet

Peptidet med sekvensen (SEQ ID nr. 1) Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Ala-GIy-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys ble syntetisert ved hjelp av Fmoc (fiuorenylmetoksykarbonyl)-metoden (Atherton et al, 1979), hvorved det ble anvendt en Applied Biosystems 43IA peptidsynthesizer. Sidekjedebeskyttelsesgruppene var t-butyl for Cys, Glu og Asp, og trityl for Asn. Etter koblingsreaksjonen ble det gjennomført en ninhydrintest som viste en koblingsgrad på >98% for hvert trinn. Begynnende med A-19 ble det gjennomført dobbeltkoblinger. Den N-terminale Fmoc-gruppe ble fjernet med 20% piperidin i NMP (N-metylpyrrolidon) fra en del av peptidharpiksen. Deretter ble de Fmoc-beskyttede og de ubeskyttede fraksjoner vasket med DCM (diklormetan) og tørket under høyvakuum. Utbyttene var 293,6 mg Fmoc-fri peptidharpiks henholdsvis 366,5 mg Fmoc-beskyttet peptidharpiks. 111,1 mg av den Fmoc-frie peptidharpiks ble i 1,5 timer underkastet en trifluoreddiksyre-spalting, hvorved det ble anvendt en blanding av 10 ml TF A, 0,75 g fenol, 300 ul EDT (etanditiol), 250 ul Et-S-Me (etylmetylsulfid) og 500 ul vann. Peptidet ble filtrert fra harpiksen gjennom en glass-sintertrakt. Harpiksen ble vasket med DCM og tilføyet til filtratet. Filtratet ble inndampet til ca. 2 ml og deretter dråpevis tilsatt under omrøring til 40 ml eter. Peptidbunnfallet ble frasentrifugert og etersupernatanten kastet. Bunnfallet ble vasket tre ganger med 40 ml eter og tørket under høyvakuum. De oppnådde 58 mg råprodukt ble løst i 3,5 ml 20 mM NH4HCO3, inneholdende 300 ul 25% NH3Æ. Løsningen ble gelfiltrert under anvendelse av den samme buffer på en forpakket Sephadex G-25-kolonne (Pharmacia PD-10). Det samlede materiale ble påsatt på en Mono Q-kolonne (Pharmacia 100 x 14 mm) (gradient: 0-10 min 100% A, 10-100 min 0-100% B. A: 20 mM Na4HCC>3 + 300 ul NH3/I. B: A + 3 M NaCl. Måling ved 280 mM, Trp-fluorescenspåvisning ved 354 nm. Strømningshastighet 1 ml/min). Produktet elueres med 1 M NaCl. Hovedfraksjonen fra Mono-Q-kolonnen ble ytterligere renset ved reversfase HPLC under anvendelse av en BIORAD Hi-Pore RP-304-kolonne (250 x 10 ml) (gradient: 50-100% buffer B i 12,5 min, 12,5-25 min 100% B. A: 20 mM Na4HCC«3 + 300 ul NH3/I, B: A i 98% metanol. Strømningshastighet: 3 ml/min. Måling ved 237 nm). Produktet eluerer ved 100% B. Produktfraksjonen ble inndampet på en Speedvac, løst igjen i buffer A og tilslutt lyofilisert. Utbyttet var 8,4 mg av det HPLC-rensede produkt i den cysteinbeskyttede form (peptidet ble betegnet med "Pl6"). For å oppnå peptidet i den frie merkaptoform ble den t-butyl-beskyttede substans behandlet i 30 min ved romtemperatur med tioanisol/etanditiol/trifluoreddiksyre/trifluormetansulfonsyre (2:1:40:3; trifluormetansulfonsyre ble tilsatt i det angitte forhold etter de andre komponenter). Peptidet ble isolert ved eterfelling og påfølgende gelfiltrering (Sephadex G-25) med den ovenfor angitte buffer A under argonatmosfære.

b) Kobling av influensa- peptidet med polylysin

bl) Direkte binding via SPDP ( suksinimidvlpvridvlditiopropionaf)

19,8 mg polylysin(pL)300-hydrobromid (Sigma) ble gelfiltrert på en Sephadex G-25-kolonne (Pharmacia PD-10) i natriumacetat pH 5 for å fjerne de lavmolekylære fraksjoner. På grunn av ninhydrintesten var pL-konsentrasjonen etter gelfiltreringen 3,16 mg/ml. Løsningens pH-verdi ble innstilt med 1 M NaOH på 7-8. Til 2,5 ml av pL-løsningen (7,9 mg pL = 0,13 umol) ble tilsatt 0,64 umol SPDP (Pharmacia: 40 mM løsning i absolutt EtOH). Dette tilsvarer et molforhold av SPDP:pL på 5:1. Blandingen fikk reagere over natten og ble gelfiltrert i 20 mM NH4HCO3 pH 8,2 på en G-25-kolonne. Etter reduksjon av en alikvot av filtratet med DTT (ditiotreitol) viste målingen av tiopyridon at omsetningen var fullstendig. 0,3 uM pL-SPDP (i forhold til uM SPDP) i 2,212 ml fikk reagere med 0,35 mM peptid i tiolform. Et hvitt bunnfall som fremkom ved blanding av peptid og pL ble løst, idet løsningen ble innstilt på 2 M guanidinhydroklorid, hvorved reaksjonen fant sted over natten. Fotometrisk måling av tiopyridon i reaksjonsblandingen bekreftet på nytt reaksjonens

fullstendighet. Deretter ble blandingen dialysert 2 ganger mot 2120 mM HEPES/0,5 M guanidinhydroklorid. Den fremstilte løsning ble påsatt på en Mono S-kolonne (0,7 x 6 cm, Pharmacia (gradient: 0-20 min 100% A, 20-140 min 0-100% B. A: 20 mM HEPES pH 7,3/- 0,5 M guanidinhydroklorid, B: 20 mM HEPES pH 7,3/3 M guanidinhydroklorid, 0,3 ml/min. Påvisning ved 280 nm og fluorescenspåvisning ved 354 nm, eksitering ved 280 nm). Produktfraksjonene som eluerte med 1,5 M guanidinhydroklorid ble dialysert med 2x21 HBS. Den påfølgende bestemmelse av pL-konsentrasjonen ved ninhydrintesten viste en konsentrasjon på ca. 1,14 mg/ml. Peptidmengden i løsningen av konjugatet ble beregnet ut i fra dens absorpsjon ved 280 nm; denne ga et molforhold av peptid:pL på 4:1.

b2) Bineing over en polvetvlenglvkol- linker

14,6 mg pL 300 hydrobromid (Sigma) ble gelfiltrert som angitt under bl). På grunn av ninhydrintesten var pL-konsentrasjonen etter gelfiltreringen 4,93 mg/ml. Løsningens pH-verdi ble innstilt med 1 M NaOH på 7-8. Til 2,7 ml pL-løsning (13,3 mg pL = 0,22 umol) ble tilsatt 4,33 umol SPDP (Pharmacia; 30 mM løsning i absolutt EtOH). Dette tilsvarer et molforhold av SPDP:pL på 20:1. Etter 1,5 timer ble reaksjonsblandingen gelfiltrert på en Sephadex G-25-kolonne i 0,1 M natriumacetat/3 M guanidinhydroklorid. Etter reduksjon av en alikvot av filtratet med DTT ble det gjennomført et bestemmelse av tiopyridon som viste et innhold på 3,62 umol SPDP i produktfraksjonen. Det SPDP-modifiserte pL ble redusert ved tilsetning av 79 mg DTT til løsningen. Etter 2 timer reduksjon ble løsningen på nytt filtrert på G25 under de angitte betingelser. Tiolbestemmelsen ved hjelp av Ellmann-test viste en tiolkonsentrasjon på 3,15 umol i 2,224 ml.

17,62 mg = 5 umol POE (polyoksyetylen-bis(6-aminoheksyl), Sigma) ble løst i 500 ul 20 mM NaHC03/3 M guanidinhydroklorid pH 7,8 og fikk reagere med 13,8 mg EMCS

(! -maleimidokapronsyre-N-hydroksysuksinimidester) (Sigma) (=44,7 umol), løst i 300 ul DMF (dimetylformamid). Etter 30 minutter ble løsningen gelfiltrert på G25 (20 mM NaHCO 3/3 M guanidinhydroklorid). Den fotometriske bestemmelse av maleimidogruppen ved 300 nm viste en konsentrasjon på 6,36 umol reagert EMCS i 2 ml løsning.

Til 1J049 ml av denne løsning (tilsvarende 3,34 umol EMCS) ble tilsatt 1,39 umol av peptidet i tiolform (i 2,5 ml 20 mM NaHC03/3 M guanidinhydroklorid) dråpevis ved intensiv omrøring ved hjelp av Vortex i en argonstrøm. Etter 15 min var det med Ellmann-testen ikke lenger mulig å påvise frie tiolgrupper.

Løsningen av det reduserte SPDP-modifiserte pL ble ved tilsetning av 1 M NaOH bragt opp til en pH-verdi på 7-8. 1,373 ml av denne løsning ble tilsatt ved intensiv omrøring ved hjelp av Vortex til den øvrige reaksjonsblanding. Dette ga et molforhold av peptid-SH:POE-EMCS:pL-SH på 1:2,4:1,4 (i forhold til EMCS henholdsvis SH). Etter 2,5 timers reaksjon var ingen frie tiolgrupper mer påvisbare med Ellmann-testen. Materialet ble dialysert over natten mot 2 120 mM HEPES pH 7,3/0,6 M NaCl og deretter påsatt på en. MONO S-kolonne (gradient: 0-20 min 22% A, 20-150 min 22-100% B. A: 20 mM HEPES pH 7,3, B: A + 3 M NaCl. Strømningshastighet 0,3 ml/min. Målingen ble gjennomført ved 280 nm og fluorescensmålingen ved 354 nm). Produktet som eluerte med 1,5-1,6 M NaCl ble dialysert med 21 HBS. Bestemmelsen av pL-konsentrasjonen ved hjelp av ninhydrintesten og den fotometriske bestemmelse av peptidkonsentrasjonen ved 280 nm ga et beregnet peptid:pL-forhold på 12:1 ved en pL-konsentrasjon poå 0,49 mg/ml i et totalvolum på 4,5 ml.

c) Liposom- fremstilling

Ved hjelp av REV-metoden ("reverse-phase evaporation") ble det fremstilt liposomer

(Szoka og Papahadjopoulos, 1978; Straubinger og Papahadjopoulos, 1983): Vandig fase 10 mM HEPES pH 7,3,100 mM kalsein, 150 mM NaCl; organisk fase: en løsning av 300 umol L-ci-lecitin (fra Eidotter, hovedsakelig palmitoyloleoylfosfatidylkolin; Avanti Polar Lipids) i 260 [il kloroform ble inndampet under anvendelse av en rotasjonsfordamper. Materialet ble deretter tørket i høyvakuum og deretter igjen løst i 3 ml dietyleter. 1 ml av den vandige fase ble grundig blandet med eterfasen ved hjelp av Vortex og ultralydbehandlet i 5 min ved 0°C i en sonikator (badtype). Etter 30 min på is ble materialet atter ultralydbehandlet i 10 min. Den resulterende stabile emulsjon ble langsomt inndampet på en rotasjonsfordamper. Etter fjerning av dietyleteren ved 100 mbar ble tilsatt 0,75 ml av den vandige fase. Restspor av eter ble fjernet ved videre fordampning ved 50 mbar i løpet av 30 min. Den oppnådde emulsjon (1,7 ml) ble sentrifugert ved 500 opm og deretter ekstrudert gjennom en nukleopore polykarbonatmembran (0,1 um), hvilket ga et sluttvolum på 0,7 ml liposom-løsning. Liposomene ble adskilt fra ikke-inkorporert materiale ved gelfiltrering (Sephadex G-50 medium, Pharmacia; 23 ml gel-volum, 10 mM HEPES pH 7,3/150 mM NaCl). Det ble samlet opp seks fraksjoner på 500 ul. Lipidfosfor ble bestemt etter fremgangsmåten til Bartlett, 1959, med 2 mM.

d) Liposom leakaee- assay

Frigjøringen av liposominnholdet ("leakage") ble målt ved hjelp av frigjøringen av

det innesluttede kalsein og den derav resulterende fortynning som bevirker en oppheving av selvutslukkingen av fluorescensen (Bondeson et al, 1984). Kalseinfluorescensen ble målt med et kontron SMF 25 spektralfluorimeter (eksitasjon ved 490 nm, emisjon ved 515 nm). For dette formål ble 100 ul alikvoter av liposomløsningen ovenfor fortynnet 100 ganger med 0,1 M natriumacetat eller 10 mM HEPES/150 mM NaCl-buffer med den tilsvarende pH-verdi (4,3,4,5, 5,0,6,0,7,3) for å fa et volum på 1 ml. Til disse løsninger ble tilsatt 2,5 ug av peptidet (t-butylbeskyttet form; 1 ug/ml løsning i HBS) i kuverter under blanding med en forsiktig argonstrøm (sluttkonsentrasjon 400 nM peptid). Kalseinfluorescensen ble målt på forskjellige tidspunkter etter tilsetning av peptidet. Verdiene for 100% leakage ble bestemt ved tilsetning av 2 ul Triton X-100 (Flukal.

Denne fremgangsmåte ble anvendt for å måle kalseinfluorescensen etter tilsetning av peptid-pL-konjugater til liposomløsningen. 2,5 ug av konjugatet (1 ug/ul, konsentrasjon i forhold til pL-mengden alene) ble tilsatt 1 ml liposomløsning (sluttkonsentrasjon 20 nM modifisert peptid). Analogt ble 2, 5 ug peptid-polylysin-konjugat etter inkubasjon med 5 ug DNA (15 min) underkastet leakage-assay.

Det ble funnet at peptidet bare i det sure område bevirker frigjøring av liposominnholdet (fig. 17). Peptidkonjugatet var aktivt ved vesentlig lavere pH-verdi, hvorved det også ved nøytral pH-verdi ble funnet en sterk aktivitet, som ved nedsettelse av pH-verdien forsterkes enda mer. Komplekseringen av konjugatet med DNA eliminerte aktiviteten ved nøytral pH-verdi, mens det ved sur pH-verdi var tilstede en tydelig aktivitet.

e) Transfeksjon av K562- celler

K562-celler ble dyrket i suspensjon i RPMI 1640-medium (Gibco BRL pluss 2 g

natriumhydrogenkarbonat/1) pluss 10% FCS, 100 enheter/ml penicillin, 100 ul/ul streptomycin og 2 mM glutamin inntil en tetthet på 500 000 celler/ml. 12-20 timer før transfeksjonen ble cellene tilsatt til friskt medium, som inneholdt 50 uM desferrioksamin (denne forholdsregel ble truffet for å oppnå en forhøyelse av transferrin-reseptortallet). Om morgenen før transfeksjonen ble cellene samlet, suspendert i friskt medium inneholdende 10% FSC pluss 50 uM desferrioksamin (250 000 celler/ml) og plassert i en skål med 2 ml i hver av 24 fordypninger. 6 jig pCMVL-DNA i 160 ul HBS ble blandet med mengdene av TfpL-konjugat angitt i fig. 18 eller med pL300 i 160 ul HBS, etter 15 min ble tilsatt de angitte mengder influensa-peptid-pL-konjugat ("P16pL"), etter ytterligere 15 min ble blandingen tilsatt til K562-cellene. Cellene ble inkubert ved 37°C i 24 timer og deretter høstet for luciferase-assay. Luciferase-aktiviteten ble bestemt som angitt i de foregående eksempler. Verdiene angitt i fig. 18 fremstiller den samlede luciferase-aktivitet av de transfiserte celler.

f) Transfeksjon av HeLa- celler

HeLa-celler ble dyrket i 6 cm kulturskåler som angitt under "celler og medier".

Transfeksjonen ble gjennomført ved en tetthet på 300 000 celler/plate. Før transfeksjonen ble cellene inkubert med 1 ml friskt medium inneholdende 2% FCS. 6 jig pCMVL-DNA i 160 ul HBS ble blandet med mengdene av TfpL-konjugat angitt i fig. 19 eller med pL300 eller en blanding av begge i 160 ul HBS. Etter 15 min ble de angitte mengder influensapeptid-pL-konjugat ("P16pL") tilsatt, og etter ytterligere 15 min ble blandingen tilsatt cellene. Cellene ble inkubert i 2 timer ved 37°C, deretter ble tilsatt 2,5 ml friskt medium med en tilsetning av 10% FCS. Cellene ble inkubert ved 37°C i 24 timer og deretter høstet for luciferase-assay. Luciferase-aktiviteten ble bestemt som angitt i de foregående eksempler. Verdiene angitt i fig. 19 fremstiller den samlede luciferase-aktivitet av de transfiserte celler.

Eksempel 14

a) Fremstilling av peptid- polylvsin- konjugater.

Forsterkningen av genoverføring bevirket ved transferrin-konjugater ved hjelp av et ytterligere N-terminalt endosomolytisk influensa-hemagglutinin-HA2-peptid.

Peptidet med sekvensen (SEQ ID nr. 2) Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cus med betegnelsen P41) ble syntetisert på tilsvarende måte som peptidet beskrevet i eksempel 13a). Koblingen av peptidet til polylysin (pL300) ble gjennomført som i eksempel 13bl) ved binding via SPDP. Derved ble det oppnådd konjugater med et molforhold peptid:polylysin på 4:1.

b) Transfeksjon av HeLa- celler med influensapeptidkonju<g>ater

HeLa-celler ble som angitt dyrket i 6 cm skåler, transfeksjonen ble gjennomført ved

en tetthet på 300 000 celler/skål. Før transfeksjonen ble cellene inkubert med 1,5 ml friskt medium inneholdende 2% FCS. 6 ug pCMVL-DNA i 160 ul HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,3) ble tilsatt 6 fig av konjugatet TfpL190B i 160 ul HBS, etter 15 min ble tilsatt 10 ug influensapeptid-polylysinkonjugat P41pL eller, til sammenligning, 18 ug influensa-peptid-polylysinkonjugat P16pL (se eksempel 13) (fig. 20); de angitte mengder for begge peptidkonjugater var blitt testet på at de representerer de optimale mengder for forsterkningen av genoverføring. Etter ytterligere 15 min ble blandingen tilsatt til cellene. Etter 24 timer ble cellene høstet for luciferase-testen. Verdiene vist i fig. 20A fremstiller den samlede luciferase-aktivitet av de transfiserte celler.

Sammenligningen av eksperimentene med begge peptidkonjugatene viser en mer enn 3,5 ganger høyere forsterkning av genoverføring ved peptidkonjugatet P41pL.

c) Transfeksjon av BNL C1. 2- celler med influensapeptidkonjugater

BNL CL.2-celler ble dyrket som beskrevet i eksempel 6. Influensapeptidet P41 ble

konjugert med polylysin300 ved molforhold peptid:polylysin på 1:1,3:1 og 8:1. Komplekser av 6 ug pCMVL-DNA og 20 ug av konjugatene ble tilsatt til cellene. For sammenligning ble det anvendt 20 ug pL300 eller 20 ug P16-polylysin-konjugater, fremstilt som beskrevet i eksempel 13. Cellene ble inkubert ved 37°C i 4 timer, deretter ble tilsatt 2 ml medium inneholdende 18% FCS. Etter 24 timer ble cellene høstet for luciferasetesten med resultater som gjengitt i fig. 20B. I liposom-leakage-assay (fig. 20C) som ble gjennomført som i eksempel 13, steg aktiviteten av konjugatene (tilsvarende 2,5 ug polylysin, pH-verdi 5) med deres innhold av peptid (i fig. er P41 betegnet som "influ2").

Eksempel 15

Transfeksjon av HeLa-celler med et B-galaktosidase-reportergenkonstrukt og in situ påvisning av B-galaktosidaseekspresjonen

a) Dyrking og transfeksjon av cellene

For transfeksjonen ble HeLa-celler dyrket i DMEM-medium, inneholdende 5% FCS,

penicillin, streptomycin og glutamin, som angitt i de foregående eksempler, i 3 cm kulturskåler på dekkglass (3xl0<4> celler/skål).

For transfeksjonen ble 6 ug av B-galaktosidase-reportergenkonstruktet (pCMV-B-gal) kompleksert i 160 ul HBS med 12 ug TfpL190B i 160 ul HBS og inkubert i 30 min ved romtemperatur.

I et ytterligere eksperiment ble 6 ug pCMV-B-gal i 160 ul HBS inkubert med 6 ug TfpL 190B i 80 ul HBS i 15 min ved romtemperatur. Deretter ble 12 fig av influensa-peptidkonjugatet (P16pL) fremstilt i eksempel 13 tilsatt i 80 ul HBS og blandingen videre inkubert i 15 min. Disse DNA-polykation-komplekser ble deretter blandet med 1 ml DMEM pluss 2% FCS, antibiotika og glutamin som angitt ovenfor. For å vise effekten av klorokin og adenovirus på transfeksjonens ytelsesevne, ble i ytterligere eksperimenter tilsatt klorokin ved en sluttkonsentrasjon på 100 uM eller 50 ul av adenovirus stamløsning d!312C i tillegg til det medium som inneholder DNA polykationkompleksene.

For transfeksjonen ble det opprinnelige kulturmedium fjernet fra cellene og tilsatt

1 ml medium inneholdende DNA-kompleksene med eller uten klorokin eller virus. Etter en inkubasjonstid på 2 timer ved 37°C ble 1 ml DMEM inneholdende 10% FCS, antibiotika og glutamin, tilsatt til cellene og inkubasjonen fortsatt i ytterligere 2 timer. Deretter ble det samlede medium fjernet, og cellene ble dyrket i 3 ml frisk DMEM pluss 10% FCS, antibiotika og glutamin.

b) B- galaktosidase- assav

48 timer etter transfeksjonen ble mediet fjernet, cellene ble vasket én gang med

fosfatbuffret koksaltløsning (PBS) og fiksert med 0,5% glutardialdehyd i PBS i 5 min ved romtemperatur. Deretter ble fiksermiddelet fjernet og cellene vasket én gang med PBS. Deretter ble det inkubert med fargeløsningen (10 mM fosfatbuffer pH 7,0,150 mM NaCl, 1 mM MgCl2,3,3 mM I^FefCNtø^O, 3,3 mM K3Fe(CN)6 og 0,2% 5-brom-4-klor-3-indolyl-B-galaktopyranosid) ved 37°C i 20 min til 3 timer (Lim og Chae, 1989). Deretter ble dekkglassene spylt i PBS, vann og 96% etanol, tørket og inndekket i Mowiol på objekt-bærere. Til analyse ble det anvendt et Zeiss Axiophot mikroskop.

Fig. 21 viser avbildninger av de mikroskopiske forstørrelser (112 ganger). A: HeLa-celler, transfisert med 6 ug pCMV-B-gal, kompleksert med 12 ug TpfL190B. Fargereaksjonen for B-galaktosidase ble gjennomført i løpet av 3 timer. Figuren viser at svært få celler (55 celler; gruppen av fargede celler er angitt med en pil) uttrykker B-galaktosidasegenet. B: HeLa-celler, transfisert med 6 ug pCMV-B-gal, kompleksert med 6 ug TfpL190B og 12 (ig P16pL. Fargereaksjon: 3 timer. Få celler (250 celler) uttrykker B-galaktosidasegen. Cellenes reaksjon er imidlertid sterkere enn i A. C: HeLa-celler, transfisert med 6 ug pCMV-B-gal, kompleksert med 6 ug TfpL190B og 12 ug P16pL i nærvær av 100 uM klorokin. Fargereaksjon: 3 timer. Flere grupper av celler viser en sterkt positiv reaksjon (mer enn 1000 celler). D: HeLa-celler, transfisert med 6 ug pCMV-B-gal, kompleksert med 12 ug TfpL190B i nærvær av adenovirus dl312. Fargereaksjon: 20 min. Nesten alle celler (mer enn 90%) viser en positiv reaksjon. E: Ikke-transfiserte HeLa-celler (kontroller for spesifisiteten av fi-galaktosidase-reaksjonen). Fargereaksjon: 3 timer.

Eksempel 16

Transfeksjon av HeLa-celler med et 48 kb kosmid i nærvær av fritt adenovirus

a) Fremstilling av et kosmid inneholdende sekvensen som koder for luciferase

Et 3,0 kb Sall-fragment, inneholdende en enkelt sekvens som koder for P. pyralis-luciferase under kontroll av RSV-promotoren, ble tatt ut av plasmidet p22RSVLuca og ligert inn i det foretrukne Sall-sted i kosmidklonen Cl-7al for å danne konkatamerer (Cl-7al inneholder et 37 kb humant genomisk DNA Sau3 A-fragment (delspalting) som ikke koder for noen åpenbare gener, klonet inn i BamHI-stedet i kosmidvektoren pWIS (Stratagene)). Ligeringsreaksjonsproduktet ble derpå innpakket in vitro, og en alikvot av den oppnådde fagpartikkel infisert i E. coli MN544 og platet ut på LB amp-plater. Rekombinantene ble screenet ved hjelp av kolonihybridisering under anvendelse av 3,0 kb Sall-fragmentet (<32>p. merket ved randomisert priming) som hybridiseringssonde, og et antall positiver analysert ved restriksjonskartlegging. Et kosmidkonstmkt (CosLuc) inneholdende en enkelt kopi av Sall-innskuddet ble dyrket og renset på cesiumgradient (samlet størrelse: 48 kb). Et lite kontrollkosmid pWÉLuc (12 kb) ble fremstilt ved spalting av CosLuc med Not I, religering, transformering av bakterier og isolering av det riktige plasmid. Dette ga et 12 kb DNA-molekyl som manglet et den av det humane DNA-innskudd og en del av polylinkeren fra CosLuc. Plasmidet pSPNeoLuc (8 kb) er plasmidet beskrevet i eksempel 5 som inneholder et RSV-luciferase-genfragment (et Apal/PvuI-fragment fra pRSVL, klonet inn i Clal-stedet i pUCu-lokus).

b) Transport av kosmidet i HeLa- celler

HeLa-celler 3x10<4> celler pr. 6 cm skål) bedekket med 1 ml DMEM + 2% FCS ble

inkubert med FfpL/DNA-kompIekser, fremstilt som beskrevet i innledningen til eksemplene, inneholdende de angitte mengder hTfpL, fritt polylysin og DNA. Dessuten inneholdt inkubasjonsblandingene enten 100 uM klorokin (kolonnene I og 2) eller 10 ul adenovirus dl312 inneholdende SxlO<1*> partikler pr. ml (kolonnene 3-12). Etter 2 timers inkubasjon ved 37°C ble hver skål tilsatt 4 ml DMEM pluss 10% FCS. 24 timer senere ble cellene høstet og luciferaseaktiviteten målt. Resultatene er vist i fig. 22A.

c) Transport av kosmidet i neuroblastomceller

Celler med en neuroblastomcellelinje med betegnelsen GI-ME-N (Donti et al, 1989)

(lxlO<6> celler pr. 6 cm skål) bedekket med 1 ml DMEM pluss 2% FCS ble inkubert med

TfpL/DNA-komplekser, fremstilt som beskrevet, inneholdende de angitte mengder av hTfpL, fritt polylysin og ONA. I tillegg inneholdt inkubasjonsblandingen enten 100 uM klorokin (kolonnene 3 og 4) eller 10 ul adenovirus dl312, inneholdende 5X10<11> partikler/ml (kolonnene 5 og 6). Etter 2 timers inkubasjon ved 37°C ble hver skål tilsatt 4 ml DMEM pluss 10% FCS. 24 timer senere ble cellene høstet og luciferase-aktiviteten målt. Resultatene er vist i fig. 22B.

Eksempel 17

Genoverføring ved hjelp av kjemisk koblede adenovirus-polylysin-konjugater

a) Fremstilling av adenovirus- polvlvsin- koniueater ved hjelp av kjemisk koblin<g>

2,35 ml av en gelfiltrert (Sephadex G-25 PD10, Pharmacia) løsning av adenovirus

dI312 (ca. 10<11> partikler) i 150 mM NaCl/25 mM HEPES, pH 7,9/10% glycerol, ble tilsatt 10 ul (10 nmol) av en 1 mM løsning SPDP (Pharmacia). Etter 3,5 timer ved romtemperatur ble det modifiserte virus fraskilt fra det overskytende reagens ved gelfiltrering (som ovenfor). Løsningen (2,5 ml) ble spylt med argon og fikk reagere under oksygenutelukkelse og argon med 42 ul av en løsning av FITC-markert polylysin (1 nmol), modifisert med 2,3 nmol merkaptopropionatgrupper (fremstilt som beskrevet i EP 388 758). Etter 18 timer ved romtemperatur ble halvparten av løsningen overført til et lite sentrifugerar, forsiktig underskiktet med 1 ml av en cesiumkloridløsning (tetthet 1,33 g/ml) og sentrifugert 2 timer ved 35 000 opm (SW60 rotor) ved romtemperatur. Virusbåndene ble samlet som 200 ul cesiumkloird-fraksjon og fortynnet med HBS/50% glycerol til 1 ml. En DNA-bindingsassay ble gjennomført med 300 ul av det modifiserte virus: virusløsningen ble fortynnet med 1 ml HBS og tilsatt 100 ul løsning av <35>S-merket DNA (15 ng pRSVL, fremstilt ved Nick-translasjon). For kontroll ble eksperimentet gjennomført parallelt med en like stor mengde ikke-modifisert virus dl 312. Etter 30 min ble prøvene overført til små sentrifugerar, forsiktig underskiktet med 1 ml av en cesiumkloridløsning (tetthet 1,33 g/ml) og sentrifugert 2 timer ved 35 000 opm (SW60 rotor) ved romtemperatur. Gradienten ble oppdelt i fem fraksjoner; fraksjon 1,1 ml; fraksjon 2, 0,6 ml; fraksjon 3-5, hver 200 ul. Radioaktiviteten av hver 200 ul av fraksjonene ble bestemt og er gjengitt i fig. 23. Derved finner man i de virusholdige fraksjoner (3-5), hovedsakelig fraksjon 3, en tydelig høyere radioaktivitet enn i kontroll-eksperimentet; dette er å tilbakeføre på spesifikk assosiasjon av polylysin-modifisert adenovirus med det merkede DNA.

b) Transfeksjon av K562- celler

K562-celIer (ATCC CCL 243) ble dyrket i suspensjon i RPMI 1640-medium (Gibco

BRL pluss 2 g natriumbikarbonat/1) pluss 10% FCS, 100 enheter/ml penicillin, 100 ul/ul streptomycin og 2 mM glutamin inntil en tetthet på 500 000 celler/ml. 12-20 timer før transfeksjonen ble cellene overført til friskt medium som inneholdt 50 uM desferrioksamin (denne forholdsregel ble truffet for å oppnå en forhøyelse av transferrin-reseptortallet). Om morgenen før transfeksjonen ble cellene samlet, suspendert i friskt medium inneholdende

10% FCS pluss 50 uM desferrioksamin (250 000 celler/ml) og hver 2 ml overført til en skål med 24 fordypninger. Angitte mengder av pCMVL-DNA (6, 0,6, 0,06 ug) i 100 ul HBS ble blandet med 50 ul polylysin-adenovirus (pLAdeno) henholdsvis tilsvarende mengder (35 ul) kontrolladenovirus dl312. Etter 20 min ble hver gang tilsatt tilsvarende mengder (12,1,2, 0,12 ug) TfpL190B-konjugat i 150 ul HBS. Etter ytterligere 20 min ble blandingen tilsatt til K562-cellene. Cellene ble inkubert ved 37°C i 24 timer og deretter høstet for luciferase-assay. Luciferase-aktiviteten ble bestemt som angitt i de foregående eksempler. Verdiene angitt i fig. 24 fremstiller den samlede luciferase-aktivitet av de transfiserte celler.

c) Transfeksjon av HeLa- celler

En fremgangsmåte til overprøving av aktiviten av et polylysin-viruskonjugat er

overprøvingen av konjugatets evne til å transportere svært små DNA-mengder (mindre enn ug). Det ble forventet en øket DNA-transførkapasitet når adenoviruset er direkte bundet til det polylysin-kondenserte DNA, fordi intemaliseringsfaktoren (transferrin og adenovirus fiberprotein) er direkte forbundet med det DNA som skal transporteres. For å overprøve riktigheten av denne antagelse ble en konstant mengde polylysin-adenovirus-konjugatet (2,5 ul, ca. 5x10<?> viruspartikler) kompleksert med forskjellige mengder (3 ug til 0,0003 ug) av reporterplasmid i 475 ul HBS. Etter 15 min inkubering ved romtemperatur ble en mengde transferrin-polylysin tilsvarende DNA-massen tilsatt til hver prøve (denne mengde av TfpL ble valgt fordi den sikrer fullstendig "packaging" (elektronøytralitet) av 50% av plasmid-DNA og samtidig sikrer fritt bindingsrom for virus-polylysinkonjugatet). Etter tilsetning av TfpL ble blandingene inkubert i 15 min, deretter ble hver blanding fylt i en 6 cm kulturskål, inneholdende 300 000 HeLa-celler i 1 ml DMEM/2% FCS. Derpå ble cellene inkubert i 1,5 timer ved 37°C, deretter ble tilsatt 4 ml DMEM/10% FCS. Parallelt dermed ble ekvivalente mengder DNA kompleksert med det dobbelte masseoverskudd TfpL (mengden for fullstendig DNA-kondensasjon) og anvendt for genoverføring i HeLa-Celler (én gang alene, én gang i nærvær av 25 ul av det ikke-polylysinkoblede adenovirus dl312-preparat). Etter 24 timer ble cellene høstet, ekstrakter fremstilt og alikvoter undersøkt på luciferase-aktivitet. Resultatet av disse forsøk er gjengitt i fig. 25: når adenovirus ikke er tilstede, er det ved en DNA-mengde under 0,3 ug ikke mulig å påvise noen luciferase-aktivitet. Såvel polylysinkoblet som også ikke-koblet adenovirus funksjonerte godt ved store DNA-mengder (3 ug og 0,3 ug). Med det ikke-koblede adenovirus ble det imidlertid observert en nesten 100 gangers aktivitetreduksjon ved 0,03 ug, og en neglisjerbar aktivitet under denne DNA-mengde. I

motsetning til dette beholder det polylysinkoblede virus sin genoverføringkapasitet såvel ved 0,003 som også ved 0,0003 fig DNA. Denne DNA-mengde tilsvarer ca. 100 DNA-molekyler pr. celle og ca. 1 viruspartikkel pr. DNA-molekyl.

Eksempel 18 Genoverføring ved hjelp av adenovirus koblet enzymatisk til polylysin

a) Enzymreaksjon

2 ml av adenoviruspreparatet (stamme dl312; 5xl0'<0> PFU/ml) ble påsatt på en

Sephadex G-2S gelfiltreirngskolonne (Pharmacia) som ble ekvilibrert med 25 ml reaksjonsbuffer (0,1 M Tris-HCl; pH 8,0,2 mM DTT, 30% glycerol). Elueringen foregikk med 3,5 ml reaksjonsbuffer. Reaksjonsblandingen for enzymatisk kobling består av 1150 ul av virus-elueringsfraksjonen, 0,5 nmol marsvinungelever-transglutaminase (TG) (Sigma), 2 nmol henholdsvis 20 nmol polylysin290,10 mM CaCl2 og reaksjonsbuffer i et sluttvolum på 1500 ul. Reaksjonen ble gjennomført ved 37°C i løpet av 1 time og deretter stanset ved tilsetning av 30 ul 0,5 M EDTA. For kontroll av koblingens spesifisitet ble det ogse gjennomfVrt reaksjonsblandinger uten transglutaminase. Ikke-inkorporert polylysin ble fraskilt fra virus ved sentrifugering over en CsCl-gradient (tetthet 1,33 g/ml; 170 000 x g, 2 timer). Den fraksjon som inneholder virus ble trukket av og tilsatt et like stort volum glycerol og frosset inn i flytende nitrogen og oppbevart ved -70°C.

b) Demonstrasjon av bindingen av polylysin til adenovirus

Reaksjonen ble gjennomført med polylysin som ble merker met <125>j ved hjelp av

Bolton-Hunter-reagens (Amersham) som beskrevet ovenfor. Etter CsCl-gradient-sentrifugeringen ble virusfraksjonen trukket av og separert over en ytterligere CsCl-gradient. Deretter ble gradienten fraksjonert og radioaktiviteten bestemt i alle fraksjoner med en scintillasjonsteller. Som gjengitt i fig. 26 viste det seg at ved reaksjonsblandingen med TG (dl312/TG-pL) var radioaktivt polylysin anriket i virusfraksjonen (virus). I kontroll-blandingen uten TG (dl312/pL) fantes ingen anrikning av radioaktivt polylysin i virusfraksjonen.

c) Testing av de polylysin- modifiserte adenovirusfraksioner med hensyn til deres effekt på transfeksjonseffektiviteten

i) Celler og medier

For transfeksjon ble 5x10^ celler (musehepatocytter; ATCC nr.: TIB 73) utsådd i DMEM med 10% varmeinaktivert føtalt kalveserum (FSC, 2 mM glutamin, 1001.E./ml penicillin og 100 fig/ml streptomycin i 6 cm kulturskåler.

ii) Dannelse av virus-DNA-transferrin-kompleksene

50 ul av den aktuelle polylysin-modifiserte virusfraksjon ble blandet med 6 ug av DNA-plasmidet pCMVL i 10 fil HBS og inkubert i 20 min ved romtemperatur. Deretter ble tilsatt til blandingen 8 ug musetransferrin-polylysin290 B (mTfpL) og inkubert i ytterligere 10 min.

iii) Transfeksjon av musehepatocyttene

Vims-DNA-transferrin-kompleksene ble blandet med 1,5 ml medium (DMEM med 2% FCS, 2 mM glutamin og antibiotika) og tilsatt til cellene etter at det gamle medium var fjernet. Etter en inkubasjon på 2 timer ved 37°C ble cellene tilsatt 2 ml DMEM med 10% FCS, glutamin og antibiotika. Etter en ytterligere kultiveringsfase på 2 timer ble det samlede medium fjernet og cellene tilsatt 4 ml frisk DMEM med 10% FCS, glutamin og antibiotika.

iv) Bestemmelse av luciferase-ekspresjonen

24 timer etter transfeksjonen ble cellene høstet og luciferase-assay gjennomført som beskrevet ovenfor.

Som det fremgår av fig. 27 ga det viruspreparat hvor adenovirus ble behandlet med TG og 20 nmol polylysin (dl312/TG-20 nm pL) den sterkeste ekspresjon (153540000 lysenheter). Viruspreparatet med TG og 2 nmol polylysin (dl312/TG-2 nmol pL) var noe mindre aktivt (57880000 lysenheter). Kontrollfraksjonen hvor adenovirus var behandlet med 20 nmol polylysin, imidlertid uten TG, var nesten 500 ganger mindre virksom. For sammenligning ble det videre anvendt komplekser for transfeksjon med utgangspreparatene av adenovirus, som hverken ble behandlet med TG eller med polylysin (dl 312). Disse preparater ga 4403000 lysenheter.

d) Øknin<g> av transfeksjons- effektiviteten ved polvlvsin- modifisert adenovirus sammenlignet med ikke- modifisert adenovirus. særlig ved lave DNA- mengder

Transfeksjonen ble gjennomført som beskrevet i eksempel 3c), hvorved det til komplekseringen ble anvendt 50 ul av adenovirusfraksjonen dl312/TG-20 nm pL og 6 fig pCMVL/8 fig mTfpL, 0,6 fig pCMV-Luc/0,8 ug mTfpL eller 0,06 fig pCMVL/0,08 fig mTfpL. For sammenligning ble det også gjennomført transfeksjoner med 6 fig, 0,6 fig, 0,06 fig pCMVL/mTfpL-komplekser og ikke-modifisert adenovirus (dl312). Det viste seg at kompleksene med polylysin-modifisert adenovirus også ved lave DNA-mengder fremdeles ga høye ekspresjonsverdier, mens ekspresjonen ved ikke-modifisert adenovirus var sterkt redusert (fig. 28).

Eksempel 19

Genoverføring med konjugater hvori bindingen mellom adenovirus og polylysin foregår over en biotin-streptavidin-bro

a) Biotinylerine av adenovirus dl312

2,4 ml av en gelfiltrert (Sephadex G-25 PD10, Pharmacia) løsning av adenovirus

dl312 (ca. 10<11> partikler) i 150 mM NaCl/5 mM HEPES, pH 7,9/10% glycerol, ble tilsatt 10 ul (10 nmol) av en 1 mM løsning av NHS-LC-biotin (Pierce 21335). Etter 3 timer ved romtemperatur ble det biotinmodifiserte virus fraskilt ved gelfiltrering (som ovenfor) fra

overskudd av reagens. Løsningen ble ved tilsetning av glycerol bragt opp i en glycerol-konsentrasjon på 40% (samlet volum 3,2 ml) og lagret ved -25°C. Biotinyleringen av viruset kunne påvises kvalitativt etter pådrypping av forskjellige fortynninger på cellulosenitrat-membran etter tørking ved 80°C/2 timer i vakuumtørkeskap, blokkering med BSA, inkubering med streptavidinkonjugert alkalisk fosfatase (BRL), vasking og 1 times inkubering med fremkallingsløsningen NBT/X-fosfat (nitroblått tetrazoliumsalt/5-brom-4-klor-3-indolylfosfat, toluidinsalt; Boehringer Mannheim) ble det funnet en positiv fargereaksjon.

b) Fremstillin<g> av streptavidin- polvlvsin- koniugater

Koblingen av streptavidin med polylysin ble gjennomført etter fremgangsmåten

beskrevet av Wagner et al, 1990, og i EP-A1 388 758.

79 nmol (4,7 mg) streptavidin i 1 ml 200 mM HEPES pH 7,9 og 300 mM NaCl ble behandlet med en 15 mM etanolisk løsning av SPDP (236 nmol). Etter 1,5 timer ved romtemperatur ble det modifiserte protein gelfiltrert over en Sephadex G-25-kolonne, hvorved det ble oppnådd 75 nmol streptavidin, modifisert med 196 nmol ditiopyridin-linker. Det modifiserte protein fikk reagere med 3-merkaptopropionat-modifisert polylysin (75 nmol, gjennomsnittlig kjedelengde 290 lysinmonomerer, modifisert med 190 nmol merkaptopropionat-linker) i 2,6 ml 100 mM HEPES pH 7,9,150 mM NaCl under argonatmosfære. Konjugater ble isolert ved hjelp av kationbytterkromatografi på en Mono S HR5-kolonne (Pharmacia). (Gradient: 20-100% buffer. Buffer A: 50 mM HEPES pH 7,9; buffer B: Buffer A pluss 3 M natriumklorid). Produktfraksjonen eluerte ved en saltkonsentrasjon mellom 1,2 M og 1,7 M. Dialyse mot HBS (20 mM HEPES pH 7,3,150 mM NaCl) ga et konjugat bestående av 45 nmol streptavidin og 53 nmol polylysin.

c) Transfeksjon av HeLa- celler

HeLa-celler ble dyrket i 6 cm kulturskåler som angitt i eksempel 1. Transfeksjonen

ble gjennomført ved en tetthet på 300 000 celler/plate. Før transfeksjonen ble cellene inkubert med 1 ml friskt medium inneholdende 2% FCS. 6 jig pCMVL-DNA i 100 ul HBS ble blandet med 0,8 ug streptavidin-polylysin i 170 ul HBS. Etter 20 min ble tilblandet 3 ul polylysin pL300 i 170 ul HBS. Etter ytterligere 20 min ble tilsatt 65 ul biotinylert adenovirus eller som kontroll tilsvarende mengder adenovirus dl312 (30 ul, utgangsvirus for modifiseringen). Kompleksblandingen ("biotinAdV/complex A" henholdsvis "control AdV", se fig. 29) fikk bli stående i ytterligere 20 min.

En alternativ kompleksdannelse ble gjennomført idet 65 ul biotinylert adenovirus først ble blandet med 0,8 fig streptavidinpolylysin i 50 ul HBS, etter 20 min ble tilsatt 6 ug pCMVL-DNA i 170 ul HBS, og etter ytterligere 20 min ble tilblandet 3 ul polylysin pL300 i 200 ul HBS (kompleksblanding "biotinAdV/complex B").

0,6 ug pCMVL-DNA i 67 ul HBS ble blandet med 0,3 ug streptavidin-polylysin i 33 ul HBS. Etter 20 min ble tilsatt 65 ul biotinylert adenovirus eller som kontroll tilsvarende mengder adenovirus dl312 (30 ul, utgangsvirus for modifiseringen). Kompleksblandingen ("biotinAdV/complex A", henholdsvis "control AdV", se fig. 29) fikk stå i ytterligere 20 min og ble deretter fortynnet med HBS til 500 ul. Den alternative kompleksdannelse ble gjennomført idet 65 ul biotinylert adenovirus først ble blandet med 0,3 ug streptavidin-polylysin i 50 ul HBS, etter 20 min ble tilsatt 0,6 ug pCMVL-DNA i 50 ul HBS. Kompleksblandingen ("biotinAdV/complex B") fikk stå i ytterligere 20 min og ble deretter fortynnet med HBS til 500 ul.

Blandingene ble tilsatt til cellene. Cellene ble inkubert i 2 timer ved 37°C, deretter ble tilsatt 2,5 ml friskt medium med en tilsetning av 10% FCS. Cellene ble inkubert i 24 timer ved 37°C og deretter høstet for luciferase-assay. Luciferase-aktiviteten ble bestemt som angitt i de foregående eksempler. Verdiene angitt i fig. 29 fremstiller den samlede luciferase-aktivitet av de transfiserte celler.

Parallelt med dette ble det gjennomført transfeksjoner av HeLa-celler, hvorved det som viruskomponent av konjugatet ble anvendt et biotinylert virus som var inaktivert ved

hjelp av psoralen/UV-behandling. Inaktiveringen ble foretatt som følger: 200 ul biotinylert . viruspreparat ble fylt i hver av 2 fordypninger i en 1,6 cm vevskulturplate. Til hver prøve ble tilsatt 2 ul (33 mg/ml) 8-metoksypsoralen (i DMSO), skålen ble plassert på is og bestrålt i 10 min med en UV-lampe (365 nm; UVP TL-33-lampe), hvorved prøvens avstand fra filteret

var 4 cm. Etter bestrålingen ble de to prøvene slått sammen og gelfiltrert (G50, Nick-kolonne, Pharmacia), hvorved kolonnen på forhånd var ekvilibrert med 40% glycerol i HBS. Alikvoter på hver 75 ul ble kompleksert med 0,8 fig streptavidin-polylysin og anvendt for transfeksjon av HeLa-celler som beskrevet ovenfor.

Ved hjelp av cytopatisk sluttpunkt-assay ble det fastslått at virustiteren ved inaktiveringen avtok med en faktor på mer enn 10^, mens transførkapasiteten ved høye konsentrasjoner avtok mindre enn 50% og ved lave konsentrasjoner med en faktor 5.

d) Transfeksjon av K562- celler

K562-celler ble dyrket i suspensjon i RPMI 1640-medium (Gibco BRL, pluss 2 g

. natriumhydrogenkarbonat pr. liter) + 10% FCS, 100 enheter/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin og 2 mM glutamin, inntil en celletetthet på 500 000 celler/ml. 16 timer før transfeksjonen ble cellene tilsatt til friskt medium inneholdende 50 um deferrioksamin (Sigma). Om morgenen etter transfeksjonen ble cellene med 250 000 celler/ml opptatt i friskt medium, inneholdende 10% FCS +50 uM deferrioksamin, og 2 ml pr. fordypning fylt i en plate med 24 fordypninger.

Det ble fremstilt tre forskjellige typer DNA-komplekser:

a) En løsning av 6 ug pCMVL-DNA i 160 ul HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,3) ble blandet med 12 ug av konjugatet TfpL190B i 160 ul HBS, etter 30 min ble tilsatt 20

fil adenovirus dl312-preparat og blandingen tilsatt til cellene.

b) En løsning av 800 ng streptavidin-polylysin i 160 ul HBS ble blandet med 20 ul biotinylert adenovirus, fremstilt som i a), etter 30 min ble tilsatt en løsning av 6 ug pCMVL-DNA i 160 fil HBS og etter ytterligere 30 min ble løsningen blandet med 10 ug av konjugatet TfpL190B i 160 fil HBS. Etter 30 min ble blandingen tilsatt til cellene. c) DNA-kompleksene ble fremstilt som i b), med den forskjell at det isteden for TfpL190B ble tilsatt en løsning av 3,5 ug Poly(L)lysin p(Lys)290. Cellene ble inkubert i 24

timer ved 37°C og deretter høstet for luciferase-assay. Verdiene gjengitt i fig. 30 fremstiller den samlede luciferase-aktivitet av de transfiserte celler.

Eksempel 20

Genoverføring i primære benmargceller

a) Isolering av benmargceller

Primære benmargceller ble høstet fra mus, idet kulturmedium (IMDM, inneholdende

10% FCS, 5x10"<5>m fi-merkaptoetanol, 1% IL-3-kondisjonert medium og antibiotika) ble spylt med en injeksjonsnål (0,4 mm eller 0,5 mm diameter) forbundet med en 1 ml ampulle, gjennom isolerte lår- og skinnebenknokler. Cellene ble deretter vasket én gang i kulturmedium ved sentrifugering ved 800 x g i 8 min. Deretter ble cellene slemmet opp igjen ved en konsentrasjon på 10<?> celler/ml og sådd ut i T25 kulturflasker. Etter 4 timer ble de ikke-fastklebende celler overført i en ny T25 kulturflaske og dyrket over natten i nærvær av 50 uM deferrioksamin.

b) Dannelse av adenovirus- transferrin- polylysin/ DNAkomplekser

For kompleksdannelsen ble 50 ul biotinylert adenovirus inkubert med 400 ng

streptavidin-modifisert polylysin i 20 ul HBS i 20 min. Deretter ble tilsatt 20 ul HBS inneholdende 6 fig pCMVL. Etter en inkubasjonstid på 20 min ble tilsatt 7 fig mus-transferrin-polylysin-konjugat (mTfpL) i 160 ul HBS, og hele blandingen ble videre inkubert i 20 min.

c) Transfeksjon

For transfeksjonen ble benmargcellene utvunnet ved 8 min sentrifugering ved 100 x g

fra kulturmediet. Cellebunnfallet ble tatt opp i 3 ml kulturmedium inneholdende 2% FCS og 250 ul av adenovirus-transferrin-polylysin/DNA-kompleksene, og dyrket i en ny T25 flaske i 3 timer ved 37°C. Deretter ble tilsatt 3 ml og etter 2 timer ytterligere 6 ml kulturmedium inneholdende 10% FCS.

d) Bestemmelse av luciferase- ekspresionen

48 timer etter transfeksjonen ble cellene høstet og undersøkt som i de andre

eksempler på tuciferase-ekspresjon. Transfeksjonen førte til en luciferase-aktivitet tilsvarende 310 x 10^ lysenheter pr. 100 ug totalcelleprotein.

Eksempel 21

Transfeksjon av neuroblastom-celler med et 48 kb kosmid i nærvær av fritt adenovirus og av adenovirus-poly lysin-konj ugater

Celler fra cellelinjen med betegnelsen GI-ME-N ble, som beskrevet i eksempel 16, transfisert med 48 kb kosmidet med de angitte mengder av hTfpL, fritt polylysin og DNA. Dessuten inneholdt inkubasjonsblandingen enten 100 uM klorokin (kolonnene 3 og 4) eller 10 fil adenovirus dl312, inneholdende 5x10^ partikler pr. ml (kolonnene 5 og 6). Begge de siste prøver (kolonnene 7 og 8, StpL/biotin) inneholdt 1S ul biotinylert adenovirus dl312 (lxlOl 1 partikler), inkubert i 30 min med streptavidin-polylysin (0,8 fig, fremstilt som i eksempel 19) i 150 ul HBS. Deretter ble tilsatt 6 ug DNA i 150 ul HBS til prøven som fikk stå i 30 min i romtemperatur, hvorpå det ble tilsatt 150 fil HBS inneholdende 6 fig hTfpL + 1 fig fritt pL. Etter ytterligere 30 min inkubasjon ved romtemperatur ble blandingen tilsatt til cellene. Etter 2 timer inkubering ved 37°C ble hver skål tilsatt 4 ml DMEM + 10% FCS. 24 timer senere ble cellene høstet og luciferase-aktiviteten målt. Resultatene er vist i fig. 31.

Eksempel 22

Genoverføring i primære luftveisepitelceller

Forforsøk med tanke på en genetisk korrektur av cystisk fibrose hadde vist at immortaliserte cellelinjer, avledet fra luftveisepitelet, er tilgjengelig for genoverføring-metoden ifølge den foreliggende oppfinnelse. For å utelukke den mulighet at dette fenomen kan føres tilbake til forandringer av luftveisepitelet som er indusert ved immortaliseringen, ble forsøkene med transferrin-polylysin-konjugater gjennomført også i primære luftveisepitelceller (Atemwegsepithelzellen 1°AE).

1° AE-celler ble fremskaffet fra prøver av pasientens nesepolypper, som beskrevet av Yankaskas et al., 1987. Vevene ble vasket i steril koksaltløsning, deretter transportert til laboratoriet i Jokliks Minimum Essential Me■dium (MEM) pluss antibiotika (penicillin 50 E/ml, streptomycin 50 ug/ml, gentamicin 40 fig/ml) ved 4°C. Bruskvev og overskytende submukøst vev ble frilagt, og epitelsjiktene i proteaseløsning (Sigma type 14,0,1 mg/dl) inkubert i MEM ved 4°C i 16-48 timer. Det ble tilsatt 10% FBS (føtalt storfeserum) for nøytralisering av proteasen, og cellene ble frigjørt ved svak bevegelse. Den oppnådde

suspensjon ble filtrert gjennom et 10 um nylongitter for å fjerne cellerestene, sentrifugert (150 x g 5 min) og vasket i F12 + 10% FBS.

Cellene ble derpå behandlet med transferrin-polylysin-konjugater (hTfpL) og et plasmid (pRSVL) som koder for luciferase, som reportergen. Ved denne undersøkelse viste de primære celler ikke den mottagelighet for disse komplekser som de tilsvarende immortaliserte cellelinjer (grunnlag = 429 lysenheter; med tilsetning av konjugater: 543 lysenheter), hvilket tydet på at de primære AE-celler er relativt fattige på transferrin-reseptorer.

For å benytte en alternativ reseptor på cellene ble det anvendt biotinylerte adenovirus (sammenlign eksempel 19). Cellene behandlet med dette konjugat viste en signifikant sterkere ekspresjon som grunnlagsverdi (tilsetning av konjugater 2 585 753 ± 4533 585 lysenheter). Dessuten viste seg også primære luftveisepitelceller fra andre arter som tilgjengelig for denne fremgangsmåte for genoverføring (mus = 3 230 244 ± 343 153; ape = 53 498 880 ± 869 481 lysenheter).

Eksempel 23

Genoverføring i heptatocytter og i blodceller

I eksperimentene i dette eksempel ble anvendt følgende materialer og metoder: Transfeksjon av vevskulturceller: Celler fra cellelinjen BNL CL.2 ble dyrket som beskrevet i eksempel 6. HeLa-celler og hepatocytter ble dyrket i 6 cm petriskåler. Transfeksjonen ble gjennomført ved en celletetthet på ca. 3x10^ celler/skål. Før transfeksjonen ble standardkulturmediet erstattet med 1 ml friskt medium med 2% FCS.

Dannelse av binære komplekser: Biotinylert adenovirus (ca. 10^ FPU, se eksempel 19a) og 19b)) fikk reagere med 800 ng streptavidinylert polylysin i 50 ul HBS. Etter 30 min ved romtemperatur ble tilsatt 6 ug pCMVL-DNA i 170 fil HBS, inkubert i 30 min og derpå tilsatt 3 fig pL300 i 200 fil HBS, og etter ytterligere 30 min ble løsningen anvendt til transfeksjonsforsøkene.

Dannelse av ternære komplekser: Biotinylert adenovirus (ca. 10^ FPU) fikk reagere med 80 ng streptavidinylert polylysin i 50 fil HBS. Etter 30 min ved romtemperatur ble tilsatt 6 ug pCMVL-DNA i 170 ul HBS, inkubert i 30 min og deretter tilsatt 10 ug TfpL190B i 200 fil HBS, og etter ytterligere 30 min ble løsningen anvendt til transfeksjonsforsøkene.

B-galaktosidase-assay: BNL CL.2-celler ble sådd ut på dekkglass og i løpet av 24 timer ble cellene transfisert ved reporterplasmidet pCMV-B gal (Lim og Chae, 1989). 48 timer senere ble B-galaktosidasetesten gjennomført som angitt i eksempel 15.

a) Forbindelsen mellom DNA-kondensater og adenovirus forsterker luciferase-reportergenekspresjonen i sterk grad

Resultatet av transfør av DNA i hepatocytter ved hjelp av binære og ternære DNA-komplekser er gjengitt i fig. 32: Genoverføringeffekten ble forsterket i nærvær av fritt adenovirus. Kolonnene pLAdenoV/TfpL viser resultatene av transfeksjoner med adenovirus som ble konjugert med polylysin ved hjelp av transglutaminase og deretter fikk reagere med DNA som nøytraliserte endel av de negative ladninger. Senere ble tilsatt transferrin-polylysin som nøytraliserte resten av de negative ladninger. På denne måte ble det dannet et ternært kompleks adenovinis-polylysin/transferrin-polylysin/DNA. Som det fremgår av figuren ble det oppnådd en usedvanlig høy verdi på 1,5x10^ lysenheter (tilsvarende ca. 5 000 lysenheter/ celle). For forsøket gjengitt i kolonnen AdenoV-pL-TfpL ble adenovirus og polylysin blandet som for behandlingen med transglutaminase. For å vise spesifisiteten av bindingen av polylysin til viruset som bevirkes ved transglutaminasen, ble enzymet allikevel utelatt. Deretter ble viruspreparatet kompleksert med den samme mengde DNA og TfpL som i pLAdeno/TfpL. I dette tilfelle var transfeksjonen moderat som med AdenoV+TfpL, fordi den felles lokalisering av virus og DNA/transferrin-polylysin-kompleks i begge eksperimenter var en stokastisk prosess, i motsetning til eksperimentet vist i kolonne pLAdenoV/TfpL, hvorved den felles lokalisering gjennom forbindelsen av virus og DNA i det ternære kompleks gir en høy grad av transferirnfeksjon (transferrin med transferrin).

b) Transfeksjon av K562-celler viser de endosomolytiske egenskaper av adenovirus

Celler av den humane erytroleukemi-cellelinje K562 inneholder ca. 150 000

transferrin-reseptorer (Klausner et al., 1983b). I nærvær av klorokin kan disse celler også i fravær av adenovirus transfiseres i sterk grad med TfpL/reporter-DNA-komplekser (fig. 33. TfpL), som allerede berettet av Cotten et al., 1990). De samme komplekser gir i nærvær av fritt adenovirus, men i fravær av klorokin, relativ svak reportergen-ekspresjon (AdenoV/TfpL), sannsynligvis fordi K562-celler som andre blodceller (Silver et al., 1988; Horvath et al., 1988) har et lite antall adenovirus-reseptorer. Når adenovirus blir bundet til polylysin over en biotin/streptavidin-bro og reporter-DNA ved tilsetning av mer polylysin blir fullstendig kondensert for å komplettere det binære kompleks (pLAdenoV/pL), oppnår transfeksjonen understøttet av adenovirus middelverdier, sannsynligvis fordi de fa adenovirus-reseptorer blir utnyttet effektivt. Når imidlertid DNA kompleksert med adenovirus-polylysin blir fullstendig kondensert og ved tilsetning av transferrin-polylysin under dannelse av et ternært kompleks (pLAdenoV/TfpL) blir nøytralisert og de tallrike cellulære transferrin-reseptorer kommer i aksjon, blir transfeksjonseffektiviteten - såvel takket være den effektive transferrin-binding som også virusets endosomolytiske egenskaper

- øket med minst to ytterligere størrelsesordener (fig. 33).

c) Ternære DNA-komplekser fører til ekspresjon av reportergenet i nesten 100% av hepatocyttene

For å teste effektiviteten av transportsystemet i mushepatocytter BNL CL.2, ble cellene transfisert med 6-galaktosidase-reportergenet. Fig. 34 viser iJ-galaktosidase-assay ifølge a) transferrinfeksjon i nærvær av klorokin, b) transferrinfeksjon i nærvær av fritt adenovirus dl312 og c) transfeksjon med ternære adenovirus dl312 polylysin-transferrin-DNA-komplekser. I fravær av adenovirus er det bare få celler som uttrykker reportergenet etter standard transferrinfeksjon. Prosentsatsen av transfeksjonen er mindre enn 0,1%. Når det også anvendes klorokin, blir prosentsatsen øket til ca. 0,2% (fig. 34A). Med fritt adenovirus vil ca. 5-10% av cellene uttrykke reportergenet (fig. 34B), mens de temære komplekser med transglutaminase-modifisert virus fører til ekspresjon i de fleste, om ikke i alle celler (fig. 34C). Da de ternære komplekser kan anvendes ved høyere fortynning, oppstår den toksiske effekt observert ved høye doser av fritt (inaktivert) adenovirus vanligvis ikke. Det skal imidlertid bemerkes at ved anvendelse av de ternære komplekser i høy konsentrasjon for å oppnå 100% av vevskulturcellene, kan det observeres en lignende toksisk effekt. De toksiske virkninger kan ha sin årsak i gjenværende virusgenaktivitet eller i de endosomolytiske egenskaper hos det tilsatte virus, eller de er ganske enkelt en følge av den svært høye ekspresjon av det transfiserte gen.

d) Ekspresjonen av et transfisert reportergen er transient, men fortsetter i ukevis i ikke-, delende hepatocytter

Ternære transportkomplekser (pLAdenoV/TfpL) ble fremstilt med polylysin-adenovirus og med modifisert adenovirus, som ved reaksjon med psoralen var blitt ytterligere inaktivert. En til 2/3 konfluent hepatocytt-cellekultur ble som i eksperimentet fremstilt 1 fig. 34B transfisert med luciferase-reportergen-plasmidet pCMVL og luciferase-aktiviteten målt på forskjellige tidspunkter. Som det fremgår av fig. 35 var luciferase-aktiviteten på det høyeste etter 3 dager, da hepatocyttcellekulturen ble konfluent og cellene opphørte å dele seg. Ekspresjonen av reportergenet fortsatte i cellekulturen som ikke delte seg, uten at det ble anvendt en seleksjon for bevaring av genet, og varte i minst 6 uker, særlig når psoralen-inaktivert adenovirus ble anvendt for dannelsen av de ternære komplekser.

Eksempel 24

Anvendelse av hønseadenovirus CELO til forsterkning av DNA-transporten i humane celler

I dette eksempel ble hønseadenoviruset CELO testet for sin egnethet til forsterkning av DNA-transfør i humane HeLa-celler analogt med de foregående eksempler, som anvendte det humane adenovirus type 5.

Det ble anvendt hønseadenoviruset CELO (Phelps-stammen, serotype FA V-1,7, hønsenyrecellepassasje). Viruset (2 ml) fikk reagere gjennom en PD-10 gelfiltrerings-kolonne, ekvilibrert med 20 mM HEPES pH 7,3,150 mM NaCl (HBS) + 10% glycerol, og 2 ml av eluatet fikk reagere med 20 ul 1 mM NHS-LC-biotin (Pierce) i 3 timer ved romtemperatur. Det biotinylerte virus ble derpå dialysert mot 3x300 ml HBS + 40% glycerol ved 4°C og lagret i alikvoter ved -70°C.

HeLa-celler (5xl0<5> celler pr. 6 cm skål) ble inkubert i 2 ml DMEM + 2% FCS med 6 Hg av plasmidet pCMVL, kompleksert med polylysin(pLys)- eller transferrin-polylysin-

(TfpL)-blandinger i 500 ul HBS (kompleksene ble på forhånd inkubert i 30 min ved romtemperatur). Prøvene ble deretter i nærvær av virusmengdene angitt i fig. 36 tilsatt til cellene. Ved de prøver som inneholdt biotinylert CELO-virus ble den angitte virusmengde forinkubert med den angitte mengde streptavidin-polylysin (StrpL) i 200 ul HBS i 30 min ved romtemperatur, før 6 ug av plasmidet pCMVL i 100 ul HBS ble tilsatt. Etter 30 min inkubering ved romtemperatur ble den angitte mengde TfpL-materiale tilsatt til cellene ved 37°C. 2 timer senere ble 5 ml DMEM + 10% FCS tilsatt til cellene, og 24 timer senere ble cellene høstet og forberedt på luciferase-assay.

Som det fremgår av fig. 36 forsterket CELO-viruset i fri form DNA-transporten i HeLa-celler (kolonnene 1-6). Når CELO-viruset imidlertid var modifisert med biotin og ble inneholdt i et kompleks med streptavidin, viste det seg at viruset såvel med som også uten ytterligere transferrin-polylysin forsterker DNA-transfør i en utstrekning som kan sammen-lignes med den som oppnås ved hjelp av humant adenovirus dl 312. Den spesielle linje i HeLa-celler viser høy bindingskapasitet for polylysin-DNA-komplekser i fravær av transferrin (sammenlign luciferase-aktiviteten av prøvene 1 og 4 i fig. 36). Inneslutningen av CELO-viruset i et polylysin-DNA-kompleks er derfor tilstrekkelig til å bevirke opptaket av komplekset.

Eksempel 25

Transfeksjon av myoblaster

a) Transfeksjon av myoblaster og myotuber med DNA/transferrin-polylysin-komplekser i nærvær av fritt adenovirus og i nærvær av biotin-streptavidin-koblet adenovirus

C2C12-myoblaster (Blau et al., 1985; ATCC nr.: CRL 1772) og G8-myoblaster (ATCC nr.: CRL 1456) ble transfisert i "high glucose DMEM" + 10% FCS myoblastkultur ved subkonfluens med ca. 5x10^ celler pr. 6 cm skål. Det ble fremstilt myotubkulturer idet myoblaster ble platet ut i 6 cm skåler (ca. 5x10^ celler/skål) og mediet ble byttet ut mot "high glukose DMEM" + 2% hesteserum ettersom cellene oppnådde konfluens (Barr og Leiden, 1991; Dhawan et al., 1991). Transfeksjonen av myotubene ble gjennomført 5-7 dager senere. Transfeksjonskompleksene ble fremstilt som beskrevet i eksempel 19, hvorved de angitte mengder av TfpL, StrpL og biotinylert adenovirus dl312 ble anvendt. Cellene ble høstet 20 timer etter transfeksjonen og luciferaseaktiviteten målt. Luciferase-aktiviteten angitt i fig. 37 gjelder den samlede celleprøve. Det viste seg at såvel myoblast- som også myotubkulturer kunne transfiseres med høy virkningsgrad. Etter differensiering til myotuber falt transfeksjonseffektiviteten mindre enn 1 log (C2C12) eller viste ingen signifikant reduksjon (G8). Dannelsen av myotuber foregikk ved G8-cellelinjen ved en lavere frekvens, hvilket delvis kunne være grunnen til at det ikke var noen påvisbar reduksjon av ytelsesevnen i den differensierte kultur. Rollen til vekselvirkningen mellom transferrin og transferrin-reseptoren i DNA-transporten i denne celletype var ikke vesentlig. I alle fire cellepreparater foregikk bare svak DNA-transport under anvendelse av dTfpL/DNA-komplekser i nærvær av fritt adenovirus dl312 (kolonnene 1,4, 7,10). Ved anvendelse av det koblede virus ble transfeksjonens ytelsesevne forsterket (kolonnene 2,3, 5,6, 8,9, 11, 12). Ved sammenligning av genoverføring oppnådd med kombinasjonskomplekser som inneholdt bare virus og polylysin/StrpL, med de resultater som ble oppnådd med komplekser som inneslutter transferrin-polylysin, fikk man en økning av ytelsesevnen med mindre enn 1 log (sammenlign f.eks. spor 2, intet transferrin, med spor 3, transferrin). Den svake transfeksjon med fritt virus og den sterke transfeksjon med koblede viruskomplekser såvel i nærvær som også i fravær av transferrin-polylysin lar oss anta at adenoviruset ved disse celler tjener som ligand og at det frie virus til og med uten kobling kan trenge inn i cellene, selv om TfpL/DNA-komplekset ikke trenger inn i produktiv utstrekning (det pCMVL-DNA som anvendes i dette eksempel er i figuren betegnet med pCLuc).

b) Histokjemisk analyse av transfeksjonshyppigheten i myotuber

C2C12-myotubkulturer (i likhet med myoblastene utsådd i 6 cm skåler, 5x10^ celler,

differensiert i myotuber) ble fremstilt som beskrevet i a). Ved prøvene med fritt virus ble pCMVB-gal DNA (6 ug) kompleksert med 8 ug TfpL i nærvær av 500 ul HBS og tilsatt til cellene i nærvær av 18 ul adenovirus dl312 (1x10<*2> viruspartikler pr. ml) i 2 ml DMEM/2% FCS. Prøvene med koblet virus ble fremstilt med pCMVLacz DNA (6 ug), kompleksert med 7 ug TfpL og 800 ng StrpL + 18 ul biotinylert adenovirus dl312 (lxlO<12> virus/ml) i 500 fil HBS og tilsatt til cellene i 2 ml DMEM/2% FCS. Etter inkubering i 24 timer ble cellene, som beskrevet i eksempel 15, farget for bestemmelse av fi-galaktosidaseaktiviteten.

B-galaktosidasefargemønsteret var i samsvar med resultatene av transfeksjonen hvor luciferase ble anvendt som reportergenprodukt (se a)). I myotubkulturer ble det oppnådd svært lav genekspresjon når dét ble anvendt fritt virus, mens forbindelsen mellom virus og DNA gir et høyt genekspresjonsnivå. Tilstedeværelsen av blåfargede flerkjernede tubuli viser den vellykkede transfør av et gen i disse differensierte celler i nærvær av fritt adenovirus.

c) Transfør av DNA i primære mus-myoblast- og mus-myotubkulturer

De store skjelettmuskler fra begge bakben hos en 4 uker gammel C57B1/6 hannmus

ble isolert sterilt i PBS og oppdelt i ca. 5 ml biter. Vevet ble suspendert i 20 ml PBS, fikk sedimentere i ca. 2 min og supernatanten suget av. Denne vasking ble gjentatt tre ganger. Vevet ble derpå blandet med 3,5 ml PBS pluss 0,5 ml trypsin/EDTA, 0,5 ml 1% (vekt/ volum) kollagenase, type 2 Sigma og 0,5 ml 1% BSA (fraksjon V i 4 mM CaCl2) og fikk inkuberes ved 37°C i 30 min under hyppig forsiktig omrøring. Ved slutten av den 30 min lange inkubering fikk restvevet sedimentere, supernatanten ble fjernet og blandet med 5 ml DMEM + 20% FCS. Inkuberingen med protease ble gjentatt 3-4 ganger inntil vevet var fullstendig dispergert. Cellesuspensjonen ble derpå sendt gjennom en cellesil (Falcon) for å fjerne aggregater og vevsfragmenter og sentrifugert ved 500 x g i 15 min. Cellepelleten ble

slemmet opp igjen i 10 ml DMEM + 20% FCS, og fibroblastene ble fjernet, idet cellene ble utplatet i 60 min på en udekket vevskulturskål med 15 cm diameter. De ikke-fastklebende celler ble så forsiktig fjernet og platet ut på S laminin-beskiktede 10 cm vevskulturskåler med 15 ml DMEM + 20% FCS pr. skål. Etter at det var oppnådd konfluens (ca. 1 uke senere) ble cellene trypsinert og med ca. lxlO<6> celler/skål platet ut igjen på lamimn-beskiktede 6 cm skåler. For å danne myotubkulturer ble mediet ca. 5 dager senere (da cellene hadde oppnådd konfluens) byttet ut mot DMEM + 2% hesteserum, og 1 uke senere ble transfeksjonen gjennomført. Transfeksjonen av myoblastkulturene ble foretatt i 6 cm skåler ved ca. 80% konfluens. De laminin-beskiktede cellekulturplater ble fremstilt som følger: Cellekulturskåler ble beskiktet med 0,025 mg/ml polylysin (molekylvekt 30 000-70 000, Sigma) i sterilt vann i 30 min ved romtemperatur. Platene ble spylt tre ganger med sterilt vann og lufttørket. Deretter ble platene beskiktet med 8 ug/ml laminin (EHS, Sigma) i vann over natten ved romtemperatur. Platene ble så vasket tre ganger før cellene ble sådd ut.

DNA-kompleksene som ble anvendt for transfeksjonen ble fremstilt idet den angitte mengde psoralen/UV-inaktivert biotinylert adenovirus dl 312 (fremstilt som i eksempel 19)

ble fortynnet i 150 ul HBS, tilsatt 1 ug StrpL i 150 fil HBS og deretter inkubert i 30 min ved romtemperatur. Derpå ble det til hver prøve tilsatt HBS (100 fil) inneholdende 6 fig pCMVL (i figuren betegnet pCLuc) og videre inkubert i 30 min ved romtemperatur. Til slutt ble hver prøve tilsatt 7 fig TfpL i 100 fil HBS, inkubert i 30 min ved romtemperatur og deretter tilsatt enten til myoblast- eller myotubkultufene i 6 cm skåler, inneholdende 2 ml DMEM + 2% FCS. Etter 1 times inkubering ble mediet erstattet med 5 ml DMEM + 20% FCS (myoblaster) henholdsvis DMEM + 2% hesteserum (myotuber), og cellene ble høstet 48 timer senere for luciferase-analysen. Luciferaseaktiviteten av den samlede celleprøve er gjengitt i fig. 38.

Eksempel 26

Forbedring av transfør ved hjelp av CELO-virus i myoblaster under anvendelse av en lektin-ligand

a) Sammenlignende analyse av adenovuris dl 312 og CELO-virus i HeLa-celler og C2C12-myobIaster

Prøver av enten HeLa-celler eller C2C12-myoblaster (5x10^ celler pr. 6 cm skål) ble transfisert med 6 ug pCMVL (i figuren betegnet med pCLuc), kompleksert med 1 ug StrpL/7 fig TfpL + 5 fil biotinylert adenovirus dl312 (se eksempel 19, lxlO<12> partikler/ml), eller 18 fil biotinylert CELO-virus (se eksempel 14,0,3xl012 partikler/ml). Etter 20 timers inkubering ble cellene høstet og forberedt for luciferase-aktivitetsmålingen. Fig. 39 viser den oppnådde luciferase-aktivitet av hver samlet celleprøve.

Transfeksjonen i HeLa-celler ble gjennomført under anvendelse av humant adenovirus dl312/StrpL/TfpL/DNA-komplekser, som kan komme inn i cellene enten via adenovirus-reseptoren eller transferrin-reseptoren, eller av CELO-virus/StrpDTfpL/DNA-komplekser som kan komme inn via transferrin-reseptoren med sammenlignbar effektivitet. Mens transfør av ONA i C2C12-myoblaster imidlertid kunne gjennomføres effektivt med adenovirus dl312-komplekser, funksjonerte komplekser med CELO-virus dårlig i disse celler. Tidligere eksempler har vist at transferrin-reseptoren ved transport av kombinasjonskomplekser i disse celler spiller bare en liten rolle; formodentlig er det adenovirus-reseptoren som er hovedinngangsstedet. Den svake aktivitet av CELO-viruset i myoblaster kunne også skyldes en svak binding såvel av CELO-viruset som også av transferrin til C2C12-myoblastene. b) Forbedring av transfeksjonen av C2C12-myoblaster med CELO-virus under anvendelse av hvetekimagglutinin som ligand

På grunn av den svake transport som ble oppnådd i a), ble det valgt ut en ny ligand som erstatning for transferrin, nemlig biotinylert hvetekimagglutinin (2-4 mol biotin pr. mol protein; Boehringer Mannheim). Biotinylert CELO-virus ble fremstilt som allerede beskrevet. Komplekser inneholdende 6 usdg pCMVL pluss de angitte mengder StrpL, TfpL, biotinylert hvetekimagglutinin (WGA-B) og CELO-virus ble fremstilt som følger: Virus og WGA ble sammen fortynnet i 150 fil HBS. StrpL ble likeså fortynnet i 150 ul HBS, begge løsningene ble blandet sammen og inkubert i 30 min ved romtemperatur. DNA, fortynnet i 100 ul HBS, ble tilsatt til StrpL/virus/WGA-løsningen, etterfulgt av en ytterligere 30 min inkubering ved romtemperatur. Avslutningsvis ble TfpL i 100 ^1 HBS tilsatt til blandingen, og prøven ble på nytt inkubert i 30 min ved romtemperatur. Kompleksene ble tilsatt til C2C12-myoblastene (5x10<5> celler pr. 6 cm skål) i 2 ml DMEM + 2% FCS. 1 time senere ble 5 ml DMEM + 10% FCS tilsatt til cellene, og 20 timer senere ble cellene preparert for Iuciferaseaktivitetsmålingen. Aktiviteten (lysenheter) i hver totalcelleprøve er gjengitt i fig.

40 (det anvendte DNA i dette eksempel var pCMVL, i figuren betegnet pCLuc).

I fråvær av virus ble det oppnådd svært svak DNA-transfør såvel med som også uten WGA (kolonnene 1, 6). Moderat transfør ble oppnådd med koblet CELO-virus (spor 2), det ble imidlertid oppnådd en 16 gangers økning når komplekset inneholdt WGA-B. Økningen av WGA-mengden i komplekset (fra 1 ug til 5 ug) ga en svak reduksjon i transfør (sammenlign kolonnene 3 og 4), mens hevingen av innholdet av StrpL i komplekset (fra 1 ug til 2 ug) førte til en svak økning av transfør. Disse resultater viser tydelig at WGA-B som ligand forsterker transporten av DNA i C2C12-celler ved hjelp av CELO-virus.

d) Ekspresjon av faktor VIII i C2C 12-myoblast- og myotubkulturer

Myoblast- og myotubkulturene ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Transfeksjoner

ble gjennomført under anvendelse av 6 ug av et plasmid inneholdende en full lengde faktor VIII cDNA (Wood et al., 1984; Eaton et al., 1986) og kompleksert ifølge den vanlige

kompleksdannelsesforskrift med 5 eller 15 ul biotinylert adenovirus (som angitt) pluss 0,5 eller 1 ug StrpL og 7 eller 6 fig TfpL.

DNA/viruskompleksene ble anbragt på cellene i 2% FCS/DMEM. Etter 4 timers inkubering ved 37°C ble 3 ml frisk DMEM + 10% FCS tilsatt til hver skål. 18 timer senere ble mediet høstet, og under anvendelse av et COATEST (KABI, Pharmacia) testsystem under-søkt med en internasjonal standard som referanse på tilstedeværelsen av faktor VIII. Faktor Vlll-mengdene ble gjengitt som m-enheter, dannet på 24 timer pr. 1x10^ celler (fig.41).

Eksempel 27

Anvendelse av adenovirus-protein for DNA-transporten

Adenovirus (villtype 300) ble dyrket i HeLa-celler, renset og biotinylert som beskrevet for adenovirus dl 312.1,2 ml av viruset ble dialysert mot 3x300 ml 5 mM MES (2-(N-morfolino)etansulfonsyre), 1 mM EDTA pH 6,25, i 18 timer ved 4°C. Materialet ble derpå sentrifugert i 30 min ved 27 K i en SV60-rotor. Supernatanten ble fjernet forsiktig, og pelleten ble slemmet opp igjen i HBS/40% glycerol. HEPES, pH 7,4 og NaCl ble tilsatt til supernatanten til 20 mM og 150 mM, og både pelletfraksjonen (inneholdende de virale Core-proteiner og hovedmengden av. heksonkapsidet; i fig. 42 "core) som også supernatant-fraksjonen (inneholdende Vertices; i fig. 42 "vertices") undesøkt på sin DNA-transport-aktivitet i Movl3 musfibroblaster (Strauss og Jaenisch, 1992) eller i HeLa-celler.

Kompleksdannelsen med DNA ble gjennomført som følger: De angitte mengder av hver fraksjon, sprengt virus før sentrifugeringen eller intakt virus (uttrykt som fig protein,

bestemt med en Bradford-assay) ble fortynnet i 300 fil HBS. Streptavidin-polylysin (3 fig i 50 fil HBS) ble derpå tilsatt, etterfulgt av 30 min inkubering ved romtemperatur. 6 ug pCMVL, i figuren betegnet "pCLuc", ble fortynnet i 100 fil HBS og tilføyet til den første løsning for en 30 min inkubering. Til slutt ble tilsatt 2 fig TfpL i 100 fil HBS, etterfulgt av en ytterligere 30 min inkubering. I de prøver som ble fremstilt bare med TfpL, ble 8 ug TfpL i 170 ul HBS

blandet med 6 ug pCMVL i 130 ul HBS i 30 min ved romtemperatur. De angitte mengder virusprotein ble fortynnet i 300 fil HBS og deretter tilsatt til TfpL/DNA-kompleksene. Alle prøver ble så tilsatt i 1 time til 5x10^ celler i en 6 cm skål, inneholdende 2 ml DMEM/10% FCS (enten HeLa-celler eller Movl3-fibroblaster). Deretter ble tilsatt 5 ml friskt medium, . inneholdende 10% FCS, og cellene forberedt 20 timer senere for luciferase-aktiviteten. Den oppnådde luciferaseaktivitet (i lysenheter) er gjengitt i fig. 42 både for HeLa-celler (diagram A) og for Movl3-fibroblaster (diagram B).

Ved begge celletyper foregikk en doseavhengig økning av DNA-transføraktiviteten i forbindelse med vertexfraksjonen (prøvene 4-6 i begge diagrammer). Når den samme mengde av biotinylert virusprotein var tilstede i TfpL/DNA-komplekser uten streptavidin-polylysin, ble det observert en DNA-transport som var nær bakgrunnsverdien (prøve 3 i hvert diagram).

Eksempel 28

Forsterket genoverføring ved anvendelse av ternære DNA-komplekser, inneholdende et galaktose-ligandkonj ugat

a) Ternære komplekser inneholdende et influensa-peptid-konjugat

Eksemplene 13 og 14 har vist at polylysin-konjugerte peptider som inneholder

sekvenser avledet fra N-terminus i influensavirus-hemagglutinin HA-2-underenheten, vesentlig øker genoverføring ved hjelp av transferrin-polylysin i DNA/transferrin-polylysin-komplekser.

Det ble fremstilt lignende DNA-kombinasjonskomplekser, inneholdende det tetra-antennære galaktose-ligand-polylysin-konjugat og det polylysin-modifiserte influensapeptid (fremstilt som i eksempel 6 henholdsvis 13), idet ligand-polylysinkonjugatet ble tilsatt til plasmid-DNA pCMVL for å nøytralisere halvparten av DNA-ladningen, og resten av ladningen ble anvendt til å gi ladning til kompleksene med influensapeptid-polylysin-konjugat. Transporten av disse DNA-komplekser som inneholdt de syntetiske ligander (gal)4 til BNL CL.2 hepatocytter (transfeksjonene ble gjennomført som beskrevet i eksempel 6g)) ga en luciferase-genekspresjon (fig. 43) som var signifikant høyere enn ekspresjonen oppnådd med transferrin som ligand. Ekspresjonen var mer enn 500 ganger høyere enn den ekspresjon som ble oppnådd i kontrolleksperimenter med DNA-komplekser uten influensapeptider, men med den samme mengde polylysin (fig. 43). Aktiviteten oppnådd med DNA-kombinasjonskompleksene var også ca. 30 ganger høyere enn med DNA/(gal)4pL-komplekser, som cellene ble inkubert med i nærvær av klorokin.

b) Ternære komplekser inneholdende adenovirus-konjugat

Kompleksene ble fremstilt som følger: Biotinylert adenovirus dl 312 (fremstilt som i

eksempel 19; 2 fil, 6 ul eler 18 fil; IO<12> partikler/ml) i 50 ul HBS ble blandet med streptavidin-polylysin (100 ng, 160 ng eller 480 ng) i 100 ul HBS. Etter inkubering i 30 min ble en løsning av 6 ug pCMVL i 200 fil HBS og etter ytterligere 30 min en løsning av 3,8 ug (gal)4pL (fremstilt som i eksempel 6) eller 7 ug TfpL tilsatt i 150 ul HBS. DNA-kompleks-løsningene ble tilsatt hver gang til 300 000 celler (ATCC TIB73, ATCC TIB74, ATCC TIB75, ATCC TIB76), dyrket i 6 cm skåler i "high glucose DMEM" + 2% FCS. Følgende cellekulturprosesstrinn og luciferase-analyser ble gjennomført som beskrevet i de foregående eksempler, det ble oppnådd genekspresjonsverdier (etter 24 timer) vist i fig. 44.

Eksempel 29

Genoverføring i B-lymfoblastoide B-celler

Human-Ig- og anti-human-Ig-polylysinkonjugater ble fremstilt som følger, hvorved koblingen ble gjennomført tilsvarende litteraturkjente metoder ved innføring av disulfidbroer etter modifisering med suksinimidylpyridylditio-propionat (SPDP, Jung et al., 1981):

a) Fremstilling av anti-human-Ig-polylysin 300-konjugater

En løsning av 2 mg geit-anti-human-Ig (Southern Biotechnology Associates, Inc.,

Birmingham, AL, USA) i HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,8) ble tilsatt 14 fil 5 mM etanolisk løsning av SPDP (Pharmacia). Etter 10 timer ved romtemperatur ble det filtrert over en gelkoFonne Sephadex G-25 (elueringsmiddel 100 mM HEPES buffer, pH 7,3), hvorved det ble oppnådd 1,3 mg anti-human-Ig, modifisert med 30 nmol pyridylditiopropionatrester. Poly(L)lysin 300 (gjennomsnittlig polymeriseringsgrad på 300 lysinrester (Sigma) ble modifisert analogt med SPDP og ved behandling med ditiotreitol og påfølgende gelfiltrering bragt i en form modifisert med frie merkaptogrupper. En løsning av 12 nmol polylysin 300, modifisert med 29 nmol merkaptogrupper, i 0,3 ml HBS ble under utelukkelse av oksygen blandet med ovenfor angitte modifiserte anti-human-Ig og fikk stå over natten ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble bragt opp til en konsentrasjon på 0,6 M NaCl ved tilsetning av 5 M NaCl. Isoleringen av konjugatene foregikk ved ionebytterkromatografi (Pharmacia, Mono S HR 5/5); etter dialyse mot 25 mM HEPES pH 7,3 ble oppnådd tilsvarende konjugater bestående av 0,33 mg anti-human-Ig, modifisert med 4 nmol polylysin 300 (molforhold 1:2).

b) Fremstilling av human-IgG-polylysin 300-konjugater

En løsning av 19,5 mg (122 nmol) antistoff (Sigma 1-4506) i 2 ml HBS ble tilsatt 39

ul 10 mM etanolisk løsning av suksinimidylpyridylditio-propionat (SPDP, Pharmacia). Etter 2,5 timer ved romtemperatur ble det filtrert over en gelkolonne Sephadex G-25 (elueringsmiddel 100 mM HEPES-buffer pH 7,9), hvorved det ble oppnådd 19 mg (119 nmol) human-IgG, modifisert med 252 nmol pyridylditiopropionat-rester. Poly(L)lysin 300 (gjennomsnittlig polymeriseringsgrad på 300 lysinrester; Sigma) ble modifisert analogt med SPDP og ved behandling med ditiotreitol og påfølgende gelfiltrering bragt over i en form modifisert med frie merkaptogrupper. En løsning av 119 nmol polylysin 300, modifisert med 282 nmol merkaptogrupper i 1 ml HBS ble blandet under oksygenutelukkelse med ovenfor angitte modifiserte human-IgG og fikk ble stående over natten ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble bragt opp i en konsentrasjon på ca. 0,6 M NaCl ved tilsetning av 5 M NaCl. Isoleringen av konjugatene foregikk ved ionebytterkromatografi (Mono S, Pharmacia, 50 mM HEPES pH 7,3, saltgradient 0,6 M til 3 M NaCl); etter dialyse mot HBS pH 7,3 ble oppnådd tilsvarende konjugater, bestående av 9 mg (57 nmol) antistoff, modifisert med 90 nmol polylysin 300 (molforhold 1:1,6).

c) Kompleksdannelse og transfeksjon

Kompleksene ble fremstilt som følger: Biotinylert adenovirus dl312 (30 ul; 10<*2>

partikler pr. ml) i 50 ul HBS ble blandet med streptavidin-polylysin (800 ng) i 100 ul HBS; etter 30 min inkubering ble det tilsatt en løsning av 9 ug pCMVL i 200 ul HBS. Etter ytterligere 30 min ble tilsatt en løsning av 5,1 ug polylysin (pLys450), 10,2 ug TfpL, 12 ug

human-IgG-polylysinkonjugat eller 10 ug anti-human-Ig-polylysinkonjugat i 150 fil HBS. DNA-kompleksene ble hver gang tilsatt til 10^ B-lymfoblastoidceller (cellene ble fremskaffet fra humane perifere mononukleære blodceller ved immortalisering med Epstein Barr-virus, som beskrevet av Walls og Crawford, 1989, og dyrket i plater med 24 fordypninger i 1 ml RPMI 1640 + 2% FCS). Den videre prosess for cellekulturen og luciferaseanalysene ble gjennomført som beskrevet for de foregående eksempler. De oppnådde genekspresjonsverdier (luciferaseaktivitet i lysenheter) er gjengitt i fig. 45.

Eksempel 30

DNA-transport med transferrin-polylysin i nærvær av fritt og konjugert rhinovirus

a) Rhinovirus HRV-2-preparater

Rhinovirus HRV-2 ble fremstilt og renset som beskrevet av Skem et al., 1984.

En 400 ul løsning av rhinovirus (ca. 30 ug) i HBS (150 mM NaCl/5 mM HEPES pH 7,9V10% glycerol ble behandlet med 10 nmol NHYS-LC-biotin (Pierce 21335). Etter 3 timers inkubering ved romtemperatur ble viruset fråskilt ved utvidet dialyse mot HBS/40% glycerol ved 4°C fra ikke-innbygget biotin.

Lysømfintlig rhinovirus, fremstilt ved dyrking av viruset i nærvær av akridinoransje, ble inaktivert som beskrevet av Madshus et al., 1984.

b) Fremstilling av DNA-komplekser og transfeksjoner

i) Transferirn-polylysin-DNA-komplekser ble fremstilt idet en løsning av 6 fig plasmid-DNA pCMVL i 330 ul HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,3) ble blandet med en løsning av 8 fig TfpL290 i 170 fil HBS. DNA-kompleksene ble blandet med 1,5 ml medium (DMEM + 2% FCS) og med 0,14 ug til 3,5 fig rhinovirus HRV-2 (eller inaktivert HRV-2). Blandingen ble innført på NIH 3T3-celler (300 000 celler/6 cm skål). 4 timer senere ble transfeksjonsmediet erstattet med 4 ml friskt medium (DMEM + 10% FCS). Cellene ble høstet etter 24 timer og undersøkt på luciferase-aktivitet som tidligere beskrevet (fig. 46A).

ii) DNA-kombinasjonskomplekser, inneholdende transferrin-polylysin- og rhinovirus-polylysin-konjugater ble fremstilt som følger: En 100 ul løsning av biotinylert rhinovirus HRV-2 (3,5 ug) i HBS ble blandet med 1 fig StrpL i 100 ul HBS (de andre virus-konsentrasjoner ble blandet med tilsvarende andeler). Etter 30 min ved romtemperatur ble løsningen blandet med 6 ug plasmid DNA i 150 fil HBS, videre inkubert i 30 min ved romtemperatur og deretter blandet med 6 ug TfpL290 i 150 fil HBS. DNA-kompleksene ble blandet med 1,5 ml medium (DMEM + 2% FCS) og tilsatt til NIH 3T3-cellene (300 000 celler/6 cm skål). Videre behandling av kulturene og luciferase-analysen ble gjennomført som beskrevet i i) (fig. 46B).

Eksempel 31

Transfeksjon av HeLa-celler med kombinasjonskomplekser som inneholder ionisk bundet adenovirus

Kompleksdannelse A): DNA-kompleksene ble fremstilt idet først 30 ul adenovirus dl 312 (ca. 10^ PFU) ble blandet med 1 fig polylyhsin pLys450 (gjennomsnittlig kjedelengde 450 monomerer) i 170 ul HBS, og derpå etter 30 min ved romtemperatur ble tilsatt 6 fig pCMVL-DNA i 170 fil HBS. Etter inkubering i ytterligere 30 min ble kompleksene blandet med 9 ug TfpL190 i 170 ul HBS. En alikvot av kompleksblandingen (10% = 50 fil løsning, 60 ng DNA; eller 1% = 5 fil løsning, 60 ng DNA) ble fortynnet i 1,5 ml DMEM + 2% FCS og tilsatt 300 000 HeLa-celler. Etter 4 timer ble 2 ml DMEM + 20% FCS tilsatt. Celle-høsting etter 24 timer og luciferase-assay ble gjennomført som vanlig. Luciferase-aktiviteten tilsvarende det samlede ekstrakt var 29 115 000 lysenheter (i tilfelle 600 ng DNA) og 1 090 000 lysenheter (i tilfelle 60 ng DNA).

Kompleksdannelse B) (kontrolleksperiment): DNA-kompleksene ble fremstilt idet først 6 fig pCMVL-DNA i 170 fil HBS ble blandet med 1 fig polylysin pLys450 i 170 fil HBS og, etter 30 min ved romtemperatur, deretter med 9 ug TfpL190 i 170 fil HBS. Etter en inkubering i ytterligere 30 min ble kompleksene tilsatt 30 fil adenovirus dl 312 (ca. 10^ PFU). En alikvot av kompleksblandingen (10% = 50 fil løsning, 600 ng DNA; eller 1% = 5 fil løsning, 60 ng DNA) ble fortynnet i 1,5 ml DMEM + 2% FCS og tilsatt 300 000 HeLa-celler. Etter 4 timer ble 2 ml DMEM + 20% FCS tilsatt. Cellehøsting etter 24 timer og luciferase-assay ble gjennomført som vanlig. Luciferaseaktiviteten tilsvarende det samlede ekstrakt var 405 000 lysenheter (i tilfelle 600 ng DNA) og 200 lysenheter (i tilfelle 60 ng

DNA).

Eksempel 32

Lokal administrasjon av DNA/adenovirus/transferrin-polylysin-komplekser i leveren hos rotter

a) Direkte-injeksjon

DNA-kompleksene ble fremstilt som beskrevet i eksempel 19. De inneholdt 200 ul

adenovirus dl312,6,4 ug streptavidin-polylysin, 48 fig pCMVL og 48 fig TfpL290 i et totalvolum på 2 000 ul HBS. En Sprague-Dawley hannrotte (kroppsvekt 240 g) ble anestetisert med avertin og en 4 cm lang laparotomi gjennomført. Injeksjonen av kompleksene foregikk over et tidsrom på 2 min i den venstresidige leverlapp. Deretter ble laparotomisåret lukket sjiktvis. Rotten ble avlivet i eteranestesi 48 timer etter injeksjon av kompleksene og luciferase-ekspresjonen målt i forskjellige prøver av leveren. Det viste seg en luciferase-aktivitet på 5 615 lysenheter/mg protein-innhold av leverhomogenatet i området for injeksjonsstedet; totalaktiviteten var 370 600 lysenheter. I leverdelene lengre borte fra injeksjonsstedet var det ikke mulig å måle noen luciferase-aktivitet.

b) Administrering av kompleksene via gallegangsystemet i leveren

Kompleksene ble fremstilt som følger: 200 ul biotinylert adenovirus dl312, fortynnet

med 200 ul HBS, ble inkubert med 6,4 ug streptavidin-modifisert polylysin i 400 ul HBS i 30 min ved romtemperatur. Deretter ble tilsatt 48 ug pCMVL i 800 ul HBS. Etter 30 min inkubering ble tilsatt 48 ug TfpL i 900 ul HBS. For anvendelsen av kompleksene ble Sprague-Dawley hannrotter (250 g kroppsvekt) anestetisert med avertin, og buken ble åpnet med et mediansnitt. Tarmen ble lagt på kroppens venstre side, og en 27 G nål, som var forbundet med en slange og en 1 ml sprøyte, ble ført inn i gallegangen. Injeksjonen av kompleksene varte i 4 min. Deretter ble nålen trukket tilbake fra gallegangen, og injeksjonsstedet ble forseglet med en fibrinkleber (Immuno). Buksåret ble lukket med sting og metall-klammere. Etter 30 timer ble rotten avlivet, og prøver fra forskjellige leverlapper ble under-søkt på luciferase-ekspresjon. Toppverdien av luciferase-aktiviteten var 19 000 lysenheter/ mg protein; den beregnede totalekspresjon i hele leveren lå i området 2,7x10^ lysenheter.

Eksempel 33

Administrering av DNA/adenovirus/TfpL-komplekser i den sammenstuede halevene hos mus

Kompleksene ble dannet som beskrevet i eksempel 19. De besto av 45 ul adenovirus dl 312,0,8 ug streptavidin-polylysin, 6 ug pCMVL og 24 ug mTfpL290 i et totalvolum på 150 ul HBS. Kompleksene ble injisert i halevenen til en C3H/He hannmus (alder: 2 måneer) under anestesi med avertin. Umiddelbart ved slutten av injeksjonen ble halevenen kompri-mert i den proksimale og distale hakende, slik at kompleksløsningen i løpet av tiden for komprimeringen (25 min) ble holdt tilbake i det injiserte haleveneavsnitt og ikke kunne spyles ut med blodet. 48 timer etter injeksjonen ble musen avlivet ved servikal dislokasjon, og den injiserte halevene ble preparert. Ekspresjonen av luciferase ble målt i homogenatet av haleveneavsnittet. Derved fant man en luciferase-aktivitet på 2 600 lysenheter/3 cm halevene

Eksempel 34

Transfeksjon av primære humane melanomceller

a) Transfeksjon med adenovims-polylysin/transferrin-polylysin-kombinasjonskomplekser

Primære melanomceller ble isolert fra et kirurgisk fjernet melanom fra en pasient.

Dertil ble tumoren mekanisk oppdelt i RPMI 1640 cellekulturmedium med 5% FCS 2 mM glutamin og antibiotikatilsetning, og vevsfragmentene ble trykket gjennom en stålsil. Deretter ble tumorcellene vasket flere ganger ved sentrifugering og gjenoppslemming og utsådd i T25 cellekulturflasker. 24 timer etter isoleringen av tumorcellene foregikk transfeksjonen med ternære komplekser bestående av: 3 ul, 9 ul eller 27 ul biotinylert adenovirus dl312 (\ x\ 0^/ m\), o,5 ug streptavidin-polylysin, 6 ug pCMVL og 7 ug TfpL290 (i blanding med 27 ul adenovirus: 1 fig streptavidin-polylysin og 6 ug TfpL290) i et totalvolum på 500 ul HBS. 36 timer etter transfeksjonen ble cellene høstet, og luciferase-aktiviteten (lysenheter) ble målt (se fig. 47; den øvre bjelke viser resultatene med cellene i suspensjon, den nedre med de sammenklebende celler).

b) Transfeksjon med adenovirus-polylysin/lavtetthets lipoprotein-polylysin-kombinasjonskomplekser

i) Fremstilling av LDL-polylysin-konjugater

En løsning av 10 mg (14,3 nmol) LDL (Low Density Lipoprotein, Sigma, L-2139, molekylvekt 3 500 000, partikkeldiameter ca. 26 nm) i 2 ml HBS ble tilsatt 143 ul av en 10 mM etanolisk løsning av SPDP (1,43 umol, Pharmacia) og fikk reagere 2 timer ved romtemperatur. Gelfiltrering over en Sephadex G-25 kolonne (14 x 140 mm) med HBS ga 3,2 ml av en løsning av ca. 10 mg LDL, modifisert med 0,70 umol pyridylditiopropionatrester. Løsningen ble tilsatt 1,2 ml 5 M NaCl for ved den derpå følgende tilsetning av polylysin å forhindre den ellers opptredende utfelling. Poly(L)lysin med gjennomsnittlig kjedelengde på 300 monomerer ble modifisert med SPDP som beskrevet og ved behandling med ditiotreitol og derpå følgende gelfiltrering bragt i en form modifisert med merkaptogrupper. Den ovenfor beskrevne modifiserte LDL-løsning ble blandet med løsningen av 0,33 umol polylysin 300, modifisert med 0,76 umol merkaptogrupper, i 4 ml 2 M NaCl, 0,5 M HEPES pH 7,9, under argon, og fikk stå i 48 timer ved romtemperatur. Reaksjonsløsningen ble fortynnet med sterilt vann til 32 ml (NaCl-konsentrasjon ca. 0,5 M) og separert ved ionebytterkromatografi (Biorad Macroprep S, 10x100 mm, 20 mM HEPES, pH 7,3, gradient på 0,2-3 M NaCl). Produktfraksjonene eluerte ved en saltkonsentrasjon på 1,8 M - 2,2 M og ble samlet sammen. Etter dialyse mot HBS ble det oppnådd konjugater, bestående av 2,35 mg (3,4 nmol) LDL modifisert med 190 nmol polylysin (tilsvarer 7,5 mg av den frie polylysin baseform). Dette tilsvarer en gjennomsnittlig modifisering av LDL-partikkelen med ca. 55 polylysinkjeder.

ii) Kompleksdannelse og transfeksjon:

18 ul biotinylert adenovirus dl312-preparat ble fortynnet med HBS til 100 ul volum. 1,2 fig streptavidin-polylysin ble innstilt med HBS til 100 ul volum og blandet med adenovirus-preparatet på 100 ul. Etter 30 min ble 150 ul HBS med 6 ug pCMVL tilblandet dertil. Etter ytterligere 30 min ble 300 ul HBS med 4 ug LDLpL (polylysin-innhold 20 ug) tilsatt dertil. Denne fremstilte løsning ble blandet med 1,5 ml DMEM (10% FCS) og tilsatt til 3x105 primære melanomceller (fremstilt som beskrevet under a) og betegnet som HMM1 og HMM4), som befant seg i en cellekulturskål med 6 mm diameter. De videre cellekultur-arbeider og luciferasemålinger ble gjennomført som beskrevet under a). Genekspresjonen kan tas ut av fig. 48; A) viser resultatene med melanimcellene HMM1; samtlige forsøk ble gjennomført med AdpL-konjugater, som i figuren ikke er angitt separat. B) viser forsøkene med melanimcellene HMM4; samtlige forsøkt ble gjennomført med AdpL-konjugater, disse i

er bare i den siste kolonne angitt separat (betegnelsen d 1312/16 gjelder de spesielle virus-preparater). I forsøket gjengitt i kolonne 2 ble LDL tilsatt i 25 gangers overskudd, hvilket på grunn av konkurransen om LDL-reseptorene førte til en nedsatt genoverføringeffektivitet.

Eksempel 35

Transfeksjon av primære human fibroblaster

Humane hudbiopsier blir tilsatt i en 6 cm petriskål inneholdende DMEM, 2 mM glutamin, 20% FCS og antibiotika. Deretter ble biopsiene grundig oppdelt med en kirurgisk kniv og i nærvær av 3 ml medium dyrket i 5 døgn. Derpå ble cellene vasket med friskt medium (sammenlign ovenfor) og dyrket ytterligere i 7 døgn. Etter dette tidsrom ble cellene trypsinisert og subkultivert i nye petriskåler. Når cellene var nesten konfluente, ble de igjen trypsinisert og lagret frosne inntil transfeksjonen. For transfeksjonene.ble cellene tint opp, sådd ut i 6 cm petriskåler og dyrket i DMEM, inneholdende 2 mM glutamin, 10% FCS og . antibiotika. Konjugatene for transfeksjonen ble fremstilt som følger: 3 ul, 10 ul, 20 fil og 30 fil biotinylert adenovirus dl312 ble inkubert med 0,1 ug, 0,3 ug, 0,5 ug og 0,8 ug polylysin-modifisert streptavidin i 150 ul HBS i 30 min ved romtemperatur. Deretter ble tilsatt 6 ug av plasmidet pCMVB-gal i 170 ul HBS, og blandingen ble inkubert videre i 30 min. I det siste trinn ble tilsatt 7,8 ug TfpL for konjugatene med 3 ul dl312, 7 ug TfpL for 10 ul dl312 og 6 jig TfpL for konjugatene med 20 ul og med 30 ul dl 312 i 170 ul HBS. Etter en inkuberings-varighet på 30 min ble konjugatene innført i cellene i 2 ml DMEM inneholdende 2 mM glutamin, 2% FCS og antibiotika, og cellene ble inkubert i 4 timer ved 37°C. Deretter ble mediet fjernet og kulturen fortsatt ved 37°C med DMEM inneholdende 2 mM glutamin, 10% FCS og antibiotika. Etter 48 timer ble ekspresjonenn av B-galaktosidase bestemt, som beskrevet i de foregående eksempler.

Ved transfeksjonen med 3 ul dl 312 viste 14% av cellene li-galaktosidaseproduksjon, ved 10 fil dl312 ble det oppnådd 32% positive celler, med 20 ul dl312 var 39% og med 30 ul d 1312 var 64% av cellene positive.

Eksempel 36

Genoverføring i luftbeisepitelceller hos rotter in vivo ved hjelp av kombinasjonskomplekser

a) Fremstilling av TfpL/AdpL-kombinasjonskomplekser

Humantransferrin-polylysin-DNA-komplekser (hTfpL) ble fremstilt ved kombinasjon

av 8 Hg transferrin-polylysin (Serva Biochemical) i 150 ul HBS (150 NaCl/20 mM HEPES pH 7,3) med 6 fig pCMVL-DNA i 350 ul HBS, og inkubert i 30 min ved romtemperatur. Adenovirus-polylysin-konjugater ble fremstilt som beskrevet i eksempel 19c); det ble

anvendt psoralen/UV-inaktivert adenovirus. Kombinasjonskompleksene hTfpL/AdpL ble fremstilt ifølge forskriften i eksempel 23c).

b) Administrasjon av kompleksene in vivo via den intratrakeale vei

For disse forsøk ble det anvendt rotten Sigmodon hispidus ("Cotton Rat"), for hvilken

det har vist seg at den er en egnet dyremodell for humane adenovirale lungesykdommer (Pacini et al., 1984). Dyrene ble anestetisert med metoksyfluran. Etter et vertikalsnitt i den ventrale side av halsen ble luftrøret preparert stumt. Kompleksene (250-300 ul; 3 ug plasmid-DNA) ble injisert under sikt direkte i luftrøret hos dyrene som var lagt skrått i en vinkel på 45 grader. Til tidspunktene etter injeksjonen angitt i fig. 49 ble dyrene avlivet med CC*2) og luftrøret og lungen ble høsten en bloc etter in situ-spyling med kald fosfatbuffret koksaltløsning (TBS). For luciferase-testen ble lungevevet homogenisert i ekstraksjons-buffer, ly satene standardisert på total proteininnhold og luciferasegenekspresjonen målt som beskrevet. De angitte lysenheter gjelder 1 250 fig totalt protein, oppnådd fra lungelysatene. Eksperimentene ble alle gjennomført 3-4 ganger, resultatene er gjengitt som middelverdi ±

SEM.

i

Eksempel 37

Genoverføring under anvendelse av ikke-virale endosomolytiske midler

a) Syntese av membransprengende peptider

i) Peptidsyntese:-

Peptidene ble fremstilt på en automatisk Syntheziser (ABI43 IA) ved hjelp av fastfasemetoden under anvendelse av p-alkoksybenzylalkoholharpiks (0,97 mmol/g) som fast fase og Fmoc-beskyttede aminosyrer. Den karboksyterminale aminosyre ble bundet til harpiksen via det symmetriske anhydrid. Følgende aminosyrer ble koblet ved hjelp av 1-hydroksybenzotriazol-dicykloheksylkarbodiimid-metoden. Det ble anvendt følgende side-kjedebeskyttelsesgrupper: (Trt)Asn, (Trt)Cys [(t-Bu)Cys i tilfelle EALA og GLF], (t-Bu)Glu, (Trt)His, (t-Bu)Ser.

Peptidene hadde følgende sekvenser:

Peptidene ble spaltet av fra harpiksen og sidekjedebeskyttelsesgruppene, med unntak av (t-Bu)Cys, fjernet ved behandling av 100 mg peptidbelagt fastfase med 3 ml av en

blanding av fenol/etanditiol/tioanisol/vann/trifluoreddiksyre 0,75:0,25:0,5:0,5:10 i løpet av 1,5 timer ved romtemperatur. De rå peptider ble utfelt i eter og vasket to ganger. De S-t-Bu-beskyttede peptider EALA og GLF ble løst i et lite volum 1 M trietylammoniumhydrogen-karbonat (TEAB) pH 8, fortynnet til 100 mM TEAB og ytterligere renset ved revers fase HPLC på en nukleosil 500-5C4-kolonne (0,1% TFA/acetonitril-gradient), begge peptider

eluerer ved ca. 50% acetonitril. Den frie Cys-SH-form av peptidene ble fremstilt idet beskyttelsesgruppene ble fjernet fra TRT-Cys-peptidene nøyaktig slik som beskrevet ovenfor. De rå peptider (5 mg) ble løst i 100 [il 100 mM TEAB, pH 8, inneholdende 1 ul JJ-merkaptoetanol, og renset ved gelfiltrering (Sephadex G-25,100 mM TEAB, 0,5 mM EDTA) og frysetørking eller ionebytterkromatografi (Mono Q Pharmacia, 20 mM HEPES pH 7,3, gradient 0-3 M NaCl; peptidet eluerte ved 1,5 M NaCl).

ii) Modifikasjon med N-(hydroksyetyl)maleimid

Den C-terminale SH-gruppe av peptidene GLF-delta, GLF-II, EALA-Inf, EALA-P50, P50 ble blokkert etter gelfiltreringen (Sephadex G-25,20 mM HEPES, pH 7,3, 0,5 mM EDTA) fra den frie SH-form ved reaksjon med et 1,3 til 10-dobbelt molart overskudd av N-(hydroksyetyl)maleimid (1 time ved romtemperatur). Overskudd av maleimid ble fjernet ved gelfiltrering (Sephadex G-25, 100 mM TEAB, pH 8) og peptidene (GLF-delta-mal, GLF-II-mal, EALA-Inf-mal, EALA-P50-mal, P50-mal) ble oppnådd etter frysetørking som trietyl-ammoniumsalt.

iii) Modifikasjon med 2,2'-ditiobispyridin

De frie SH-peptider fikk reagere med 10 ekvivalenter av 2,2'-ditiobispyridin (20 mM HEPES, pH 7,9,0,5 mM EDTA) over natten ved romtemperatur. Overskudd av reagens ble fjernet ved gelfiltrering (Sephadex G-25,100 mM TEAB, pH 8) eller ionebytterkromatografi (Mono Q Pharmacia, 20 mM HEPES, pH 7,3, gradient 0-3 molar NaCl; peptidet eluerer ved 1,5 NaCl), for å oppnå (2-pyridyltio)-Cys-peptidene (GLF-delta-SSPy, GLF-II-SSPy, EALA-Inf-SSPy, EALA-P50-SSPy, P50-SSPy).

iv) Dimerisering av peptidene

Homodimeren av P50 (P50 dim) ble fremstilt idet ekvimolare mengder av P50-Cys-(2-pyridyltio) og P50-Cys-SH i 20 mM HEPES, pH 7,3, fikk reagere i 3 døgn ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble separert på en Mono Q-kolonne (HR-5/5 Pharmacia, 20 mM HEPES pH 7,3, gradient 0,09 M til 3 M NaCl; P50-dimeren eluerte ved 1,1 M NaCl). Heterodimeren GLF-SS-P50 ble fremstilt analogt ved reaksjon av peptidet P50 (fri merkaptoform) med pyridyltiomodifisert peptid GLF.

b) Liposom-leakage-assay

Det syntetiske peptidets evne til å sprenge liposomer ble målt ved hjelp av uttredelsen

av fluorescensfargestoff fra liposomer som er belesset med en selvutslukkende konsentrasjon av kalsein. Liposomene ble fremstilt av REV-metoden ("reverse phase evaporation") (Szoka og Papahadjopoulos, 1978) med en vandig fase av 100 mM kalsein, 375 mM Na<+>, 50 mM

NaCl, pH 7,3, og ekstrudert gjennom et 100 nm polykarbonatfilter (MacDonald et al., 1991), for å oppnå en enhetlig størrelsesfordeling. Liposomene ble adskilt ved gelfiltrering på Sephadex G-25 med en isoosmotisk buffer (200 mM NaCl, 25 mM HEPES pH 7,3) fra ikke-innbygget materiale. For leakage-assay ved forskjellige pH-verdier ble stamløsningen (6 ul/ml) fortynnet i 2 x assaybuffer (400 mM NaCl, 40 mM Na-citrat). En alikvot på 100 ul ble tilsatt til 80 (il av en serie fortynning av peptidet i vann i en mikrotiterplate med 96 fordypninger (sluttkonsentrasjon av lipid: 25 uM) og undersøkt ved 600 nm (eksitasjon ved 490 nm) på et mikrotiterplate-fluorescensfotometer etter 30 min inkubering ved romtemperatur på kalseinfluorescens. Verdien for 100% leakage ble oppnådd ved tilsetning av 1 ul av en 10 prosentig Triton X-100-løsning. Leakage-enhetene ble beregnet som invers-verdi av den peptidkonsentrasjon hvor det ble observert 50% leakage (dvs. det volum i ul liposomlysning som blir lyset til 50% pr. ug peptid). Verdiene under 20 enheter ble ekstrapolert. Resultatene av liposom-leakage-assay er gjengitt i fig. 50. GLF og EALA hadde den høyeste pH-spesifikke aktivitet.

c) Erytrocyttlyse-assay

Friske humanerytrocytter ble vasket flere ganger med HBS og slemmet opp igjen i

2 x assaybuffer av egnet pH-verdi (300 mM NaCl, 30 mM Na-citrat) ved en konsentrasjon på 6,6x10^/ml. En alikvot på 75 ul ble tilsatt til 75 ul av en seriefortynning av peptidet i vann i en mikrotiterplate med 96 fordypninger (konustype) og inkubert i 1 time ved 37°C under konstant rysting. Etter fjerning av de ikke-lyserte erytrocytter ved sentrifugering (1 000 ref, 5 min) ble 100 ul av supernatanten overført til en ny mikrotiterplate og hemogglobinabsorp-sjonen bestemt ved 450 nm (bakgrunnskorrekter ved 750 nm). 100% lyse ble bestemt ved tilsetning av 1 ul av en 10%-ig Tritox X-100-løsning før sentrifugeringen. De hemolytiske enheter ble beregnet som invers verdi av den peptidkonsentrasjon hvor det ble observert 50% leakage (dvs. det volum i ul av erytrocyttløsningen som ble lysert til 50% pr. ug peptid). Verdiene under hemolyttiske enheter ble ekstrapolert. Verdiene er gjengitt i fig. 51. Derav fremgår det at P50 dim og EALA-P50 hadde den høyeste pH-spesifikke aktivitet med hensyn til lyse av celler og/eller til frigjøring av større molekyler som hemoglobin. P50-monomerene P50mal og P50 SS-Py hadde lavere aktivitet. Melittin hadde den høyeste aktivitet som imidlertid ikke var spesifikk for sur pH-verdi.

d) Fremstilling av DNA-kombinasjonskomplekser

DNA-kompleksene ble fremstilt idet først 6 ug pCMVL-DNA i 150 jxl HBS ble

blandet med 4 ug TfpL290 i 150 fil HBS, og deretter etter 30 min ved romtemperatur ble tilsatt 4-20 ug Poly(L)lysin290 i 100 ul HBS. Etter ytterligere 30 min inkubering ved

romtemperatur ble tilsatt 0,3-30 ug peptid i 100 ul HBS og inkubert videre i 30 min.

Den optimale mengde av endosomolytisk middel ble bestemt i fortitrering, hvorved den oppnådde ytelsesevne av genoverføring ble målt (se tabell 3: Genoverføring i BNL CL.2-celler). Det viste seg at den samtidige tilsetning av polylysin og endosomolytisk middel likesom anvendelsen av større volumer for kompleksfremstillingen (1,5 ml sluttvolum) ga sammen-lignbar (eller bedre) transfeksjonseffektivitet. I disse forsøk viste det seg også at også de ikke-peptidiske amfipatiske substanser desoksykolsyre og oljesyre forsterker transfør av DNA.

e) Transfeksjon av celler

Adherente cellelinjer (BNL CL.2 hepatocytter henholdsvis NIH 3T3-celler) ble

dyrket 1-2 døgn før transfeksjonen i 6 cm skåler (DMEM-medium med 10% FCS; 300 000 celler/skål). Mediet ble fjernet og 1,5 ml DMEM + 2% FCS og 500 ul DNA-kompleks ble tilsatt. Alternativt ble det anvendt 0,5 ml DMEM + 6% FCS og 1,5 ml DNA-komplekser. Etter 4 timers inkubering ble tilsatt 2 ul DMEM (18% FCS) (det ble fastslått at alternativt kan mediet erstattes med 4 ml DMEM med 10% FCS). Cellehøsting og luciferaseassay ble foretatt 24 timer etter transfeksjonen, som beskrevet. De viste verdier for lysenhetene representerer totalluciferase-aktiviteten av de transfiserte celler. Transfeksjonen av BNL CL.2-hepatocytter er fremstilt i fig. 52: Fig. 52A: DNA-kompleksene ble fremstilt idet først 6 ug pCMVL-DNA i 250 ul HBS ble blandet med 4 ug TfpL290 i 250 ul HBS og derpå etter 30 min ved romtemperatur ble tilsatt 20 ug poly(L)lysin290 i 750 ul HBS. Etter ytterligere 30 min inkubering ved romtemperatur ble tilsatt de angitte mengder av peptider i 250 ul HBS. Etter en inkubering på ytterligere 30 min ble kompleksene tilsatt 0,5 ml DMEM + 6% FCS og 450 000 celler tilføyet.

Fig. 52B: DNA-kompleksene ble fremstilt idet først 6 ug pCMVL-DNA i 500 ul HBS ble blandet med 4 ug TfpL290 i 250 ul HBS og fikk stå i 30 min ved romtemperatur. En 500 ul løsning av 20 ug poly(L)lysin290 i HBS ble tilsatt de angitte mengder av peptider i 250 ul HBS og umiddelbart tilsatt til TfpL/DNA-blandingen. Etter ytterligere 30 min inkubering ved romtemperatur ble kompleksene tilsatt 0,5 ml DMEM + 6% FCS og tilføyet til 450 000 celler. Cellehøstingen 24 timer etter transfeksjonen og luciferase-assay ble gjennomført som beskrevet.

Eksperimentene gjennomført med NIH 3T3-celler er gjengitt i fig. 53. Fremstillingen av kompleksene A) og B) var den samme som for transfeksjonen av BNL CL.2-celler.

I cellekultureksperimentene viste peptidene P50 dim og EALA-P50 den høyeste aktivitet, EALA og GLF hadde midlere aktivitet, mens P50-monomere og melittin hadde lav aktivitet.

Eksempel 38

Genoverføring under anvendelse av et syntetisk ikke-viralt peptid med en oligolysin-forlengelse på C-terminus

Et peptid med sekvensen (SEQ ID nr. 4) Met Ala Gin Asp Ile Ile Ser Thr Ile Gly Asp Leu Val Lys Trp Ile Ile Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys ble syntetisert og renset etter metoden beskrevet i det forrige eksempel. Dette peptid er avledet fra Staphylococcus aureus 5-toksinet (SEQ ID nr. 3) Met Ala Gin Asp Ile Ile Ser Thr Ile Gly Asp Leu Val Lys Trp Ile Ile Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys, som er kjent for at det har spesifisitet for å sprenge membraner ved sur pH-verdi, idet dette peptid ble forlenget med 10 ytterligere lysiner.

DNA-kompleksene ble fremstilt idet først 6 ug pCMVL-DNA i 170 ul HBS ble blandet med 4 ug TfpL290 i 170 ul HBS og derpå etter 30 min ved romtemperatur ble tilsatt ca. 3 ug peptid i 170 ul HBS. Etter ytterligere 30 min inkubering ved romtemperatur ble kompleksene blandet med 1,5 ml DMEM + 2% FCS og 450 000 BNL CL.2-hepatocytter tilføyet. Etter 2 timer ble tilsatt 2 ml DMEM + 20% FCS. Cellehøstingen 24 timer etter transfeksjonen og målingen av luciferase-aktiviteten ble gjennomført som i de foregående eksempler. Luciferaseaktiviteten tilsvarende totalekstraktet var 481 000 lysenheter.

Eksempel 39

Transfeksjon av hepatocytter i nærvær av melittinpeptider med en oligolysinhale i C-terminus

Peptider med sekvensene (retning: N- til C-terminus) (SEQ ID nr. 12) Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gin Gin Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys (betegnet som mel 1) og (SEQ ID nr. 13) Gly Ile Gly Ala Val Leu Glu Val Leu Glu Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gin Gin Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys (sure mutanter, betegnet som mel 2) ble syntetisert som beskrevet i eksempel 38.

DNA-kompleksene ble fremstilt idet først 6 ug pCMVL-DNA i 170 ul HBS ble blandet med 4 ug TfpL290 i 170 ul HBS og derpå etter 30 min ved romtemperatur ble tilsatt ca. 3 Hg peptid meil eller 5 ug mel2 i 170 ul HBS. Etter en inkubering på ytterligere 30 min ble kompleksene blandet med 1,5 ml DMEM + 2% FCS og tilføyet 450 000 BNL CL.2-celler, som var dyrket som i eksempel 38. Cellehøstingen 24 timer etter transfeksjonen og luciferasetesten ble gjennomført som beskrevet. Luciferase-aktiviteten, med hensyn til totalekstraktet, var 9 200 lysenheter (i tilfelle mel I) og 9 400 lysenheter (i tilfelle mel2).

Eksempel 40

Ekspresjon av interferon-alfa i HeLa-celler

HeLa-celler (5x10^ celler/6 cm skål) ble transfisert med plasmidet pAD-CMVl-IFN, som koder for humant interferon alfa2c under kontroll av CMV Enhancer/promotor-sekvensen (plasmidet er beskrevet i DE 40 21 917 A. pAD-CMVl-IFN ble fremstilt idet Hindlll-Xbal IFN-a2c-innskuddet ble klonet inn på nytt i pAD-CMVl. Prøver på 6 ug DNA i 330 ul HBS ble tilsatt 8 ug TfpL i 330 ul HBS og fikk stå i 30 min ved romtemperatur. Prøvene 6-10 inneholdt bare 4 ug TfpL, og etter de første 30 min inkubering ble det tilføyet til hver av prøvene 6 og 7 en alikvot av P16pL (20 ug) i 160 ul HBS og til prøvene 8,9 og 10 en alikvot av pLys 290 (20 ug). Etter ytterligere 30 min inkubering ble tilsatt alikvoter på 160 ul HBS, inneholdende 10 ul (prøve 8) eller 50 ul (prøve 9 og 10) fritt P16 (for syntese av P16 og P16pL se eksempel 13). Etter ytterligere 30 min inkubering ble prøvene innført på HeLa-celler i 2 ml DMEM/2% FCS i nærvær av følgende ytterligere komponenter: Prøvene

2,7 og 10 inneholdt 100 uM klorokin, prøvene 3 og 4 inneholdt 5 og 15 11 adenovirus dl312 (1x10<*2> partikler/ml), prøve 5 inneholdt 15 ul av det samme psoralen-inaktiverte virus (som kontroll for stimuleringen av endogen inter fer on-produksj on ved adenovirus ble prøvene 11, 12 og 13 behandlet med alikvoter av virus som i eksemplene 3,4 og 5). 2 timer etter transfeksjonen ble 5 ml friskt medium DMEM + 10% FCS tilsatt til cellene. 48 timer etter transfeksjonen ble mediet fjernet og tilsatt 2 ml friskt DMEM + 10% FCS. Dette medium ble høstet 72 timer etter transfeksjonen, og det ble gjennomført en ELISA-test til bestemmelse av IFN-a, som beskrevet i DE 40 21 917 A. IFN-a-mengdene (i ng/ml) er gjengitt i fig. 54.

I overensstemmelse med observasjonene gjort tidligere, og som ble gjort ved anvendelse av luciferase- eller fi-galaktosidase-reportergener, fungerte TfpL bare svakt ved transfør av IFN-genet til disse celler. Tilstedeværelsen av klorokin frembragte et påvisbart signal (ca. 7 ng/ml, prøve 2), adenovirus dl312 stimulerte derimot DNA-transfør på doseavhengig måte (prøvene 3 og 4). Behandlingen av disse celler med sammenlignbare mengder av virus i fravær av IFN-DNA-komplekser ga intet påvisbart IFN-signal (prøvene 11 og 12). Transfeksjonen med det syntetiske endosomolytiske peptid P16 avledet fra influensapeptidet (se eksempel 13) som konjugat (prøvene 6 og 7) eller som ionisk peptid bundet til overflaten av TfpL/DNA-komplekser (prøvene 8, 9 og 10, for binding av peptidene se eksempel 37) frembragte påvisbar interferonproduksjon som ble forsterket med peptidkonjugatet i nærvær av klorokin (prøve 7).

Litteratur:

Abrahamson, D.R. et al., 1981, J. Cell Biol., 91, 270-280.

Akopiari, T.A. et «1., 1991, Nucl. Aclds Res. 19, 424. Alouf, J.E., Dufourcq J., Siffert 0., Thiaudlere E. und

Geoffroy Ch., 1989, Eur. J. Biochem. 183, 381-390-Anderson, P. et al., 1982, J. Biol, Chem., 257, 11301-11304.

Andrews, N.W., Abrams C.K., Slatin S.L. und Griffiths

G., 1990, Cell 61, 1277-87.

Ansardl, D.C. et «1., 1991, J. Virology 65, 2088-2092. Argiolas, A. und Pisano J.J,, 1985, J. Biol. Chem. 260,

1437-1444.

Armentano, D.r Yu, S., Kantoff, P., von ftfiden, T.,

Anderson, W.F. und Gilboa, E», 1987, J. Virol. 61,

1647-1650.

Armentano, D. et al., 1990, Proe. Nati. Acad. Sel. USA,

87, 6141-6145.

Asada-Kubota, M. et al., 1983, Exp. Pathol., 23, 95-101.

Ascoli, M. et al., 1978, J. Biol. Chem., 253, 7832-7838.

Ashwell, G. et al., 1982, Annu. Rev. Biochem.-, 51, 531-554.

Atherton, E., Galt, M.J., Sheppard, R.C. und Williams,

B.J., 1979, Bioorg. Chem. 8, 351.

Barr, E. und Leiden, J., 1991, Science 254, 1507-1509. Bettlett, G.R., 1959, J. Biol. Chem. 234, 466.

Berkner, k.Ii., 1988, SioTechniques 6, 616-629.

Berns, K.I., 1990, Virology, 2nd Edition, Ed- by

Fields, B.N., Knipe, D.M. et al.. Raven Press

Ltd., New York, 1743-1759.

Bhakdi, S. und Tranum-Jensen J., 1991, Immunology today

12, 316-320.

Blau, K, et al., 1985, Science.230, 758-766.

Blobel, C.P., Wolfsberg T.G., Turuck C.W., Myles D.G.,

Primakoff P. und White J.M., 1992, Nature 356,

248-252.

Blondelle, S.E. und Houghten R.A., 1991, Biochemistry

30, 4671-4678.

Bondeson, J., Wijkander, J. und Sundler, R., 1984,

Biochim. Biophys. Acta 777, 21-27..

Boulanger, P.A. und Puvion, F., 1973, Eur. J. Biochem.

39, 37-42.

Bragg, R.R. et al., 1991, Onderstepoort J. Vet. Res.

58, 309-310.

Carpenter, G., 1984, Cell, 37, 357-358.

Chardormet, Y. und Dales, S., 1970, Viology 40, 462-477.

Cheng, S-Y. et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. USA,

77, 3425-3429.

Ciliberto, G., Dente, L., Cortese, R., 1985, Cell 41,

531-540.

Clarke, D.D., Mycek, M.J., Neidle, A. und Waelsch, H.,

1959, Arch. Biochem. Biophys. 79, 338-354. Collis, P., Antoniou, M. und Grosveld, F., 1990, EMBO

J. 9, 233-240.

Cotten, M., Laengle-Rouault, F., Kirlappos., H.,

Wagner, E., Mechtler, K., Zenke, M., Beug, H., und Birnstiel, M.L., 1990, Proe.Nati.Acad.Sei. USA 87,

4033-4037.

Davidson, D. und Hassell, J.A., 1987, J. Virol. 61,

1226-1239.

Davis, B.D. und Dulbecco, R., 1980, Microbiology, 3rd Edition, Ed. by Davis, B.D. et al.. Harper & Row,

Sterilization and Disinfection, 1263-1274.

Defer, C, Belin, M., Caillet-Boudin, M. und Boulanger,

P., 1990, J. Virol. 64, 3661-3673.

Dempsey, C.E., Bazzo R., Harvey T.S., Syperek 1.,

Boheim G. und Campbell I.D., 1991, FEBS Lett. 281, 240-244.

De Wet, J-, Wood, K., DeLuca, M., Helinski, D. und

Subramani, S., 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 725-737. Dhawan, J. et al., 1991, Science 254, 1509-1512.

Donti, E. et al., 1988, Cancer Genet. Cytogenet. 30,

225-231.

Dulbecco, R., 1980, Microbiology, 3rd Edition, Ed. by Davis, B.D. et al., Harper & Ro w. The Nature of

Viruses, 853-884.

Eaton, D.L. et al., 1986, Biocheraistry 25, 8343-8347. Esser, A.F., 1991, Immunology today 12, 316-318. Fields, B.N. und Knipe, D.M., 1990, Virology, 2nd

edition, Raven Press, Ltd., New York.

FitzGerald, D., Padmanabhan, R., Pastan, 1. und

Willingham, M., 1983, Cell 32, 607-617.

Folk, J.E., 1985, Methods Enzymol. 113, 358-375. Franchini, G., 1989, Science 244, 694-697. Fricks, CE. und Hogle J.M., 1990, J. Virol. 64, 1934-1945.

Fujiwara, et al., 1981, J. Immunol. Meth. 45, 195. Geoffroy, C., Gaillard J.-L., Alouf J.E. und Berche P.,

1987, Infection and Immunity 55, 1641-1646. Gething, M.J., White J.M. und Waterfield M.D., 1978,

Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 2737-2740. Ginsberg, H.S., 1980, Microbiology, 3rd Edition, Ed. by Davis, B.D. et al.. Harper & Row, Picornaviruses,

1095-1117.

Goldmacher, V.S., Blattler, w.A., Lambert, J.M.,

Mclntyre, G. und Steward, J., 1989, Molecular

Pharmacology 36, 818-822.

Goldstein, J.L. et al., 1982, Clin. Res., 30, 417-426. Goldstein, J.L. et al., 1979, Proe. Nati Acad. Sei.

USA, 76, 333-337.

Goldstein, L.J. et al., 1980, Nature 285, 66

Gong, S., Lai C. und Esteban M., 1990, Virology 178,

81-91.

Green, M. et al., 1989, Cell 58, 215-223.

Hearst, J. E. und Thiry, L., 1977, Nucl. Acids Res. 4,

1339-1347.

Heldin, C-H. et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 4216-4221.

Helene, C. und Toulme J.-J., 1990, Biochem. Biophys.

Acta 1049, 99-125.

Herskowitz, I., 1987, Nature 329, 219.

Hizuka, N. et al., 1981, J. Biol. Chem., 256, 4591-4597. Hoekstra, D., 1990, J. Bioenerg. Bioraembr. 22, 121-155. Holland, J.J., 1990, Virology,2nd Edition, Ed. by Fields, B.N., Knipe, D.M. et al., Raven Press

Ltd., New York, Defective Viral Genomes, 151-165. Horvath, J. et al., 1988, J. Virol. 62, 341-345. Horwitz, M.S., 1990, Virology, 2nd Edition, Ed. by Fields, B.N., Knipe, D.M. et al., Raven Press Ltd., New York, Adenoviridae and their

replication, 1679-1721.

Hosang, M. et al., 1987, EMBO J-, 6, 1197-1202.

Huang, A-S., 1987, The Molecular Basis of Vlral Replication, Ed. by Bercoff, R.P., Plenum Press New York and London, The Role of Defective Interfering (Dl) Particles in Viral Infection,

191-194.

Ikura, T., Go N. und Inagaki F., 1991, Proteins 9, 81-89.

Imaraura, K. et al., 1987, J. Immunol., 139, 2989-2992. Iwanij, V., 1977, Eur. J. Biochem. 80, 359-368.

Jones, N. und Shenk, T., 1979, Proe.Nati.Acad.Sei. USA

76, 3665-3669.

Jung, et al., 1981, Biochem. Res. Commun. 101, 599. Kaplan, J. et al., 1979, J. Biol. Chem., 254, 7323-7328.

Kasid, A., Morecki, S., Aebersold, P., Cornetta, X.,

Culver, K., Freeman, S., Director, E., Lotze,

. M.T., Blaese, R.M., Anderson, W.F. und Rosenberg,

S.A., 1990, Proe.Nati.Acad.Sei. USA 87, 473-477.

Kehoe, M.A., Miller L., Walker J.A. und Boulnols G.J.,

1987, Infect. Immun. 55,.3228-3232.

Keller, G., Paige, C, Gilboa, E. und Wagner, E.F.,

1985, Nature 318, 149-154.

Khang, C. und Nagaraji. K.V., 1989, Am. J. Vet. Res.

50, 1466-1470.

Klausner, R.D. et al., 1983, J. Biol. Chem., 258, 4715-4724.

Klausner, R.D. et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. USA

80, 2263-2266.

Kunn, L.C. et al., 1982, Trends Biochem. Sei., 7, 299-302.

Kurachi, K., Davie, E.W., 1982, Proe. Nati. Acad. Sei

USA 79, 6461-6464.

Laver, W.G. et al., 1971, Virology 45, 598-614.

Lehrer, R.I., Ganz T. und Selsted M.E., 1991, Cell 64,

229-230.

Leippe, M., Ebel S., Schoenberger O.L., Horstmann R.D.

und Muller-Eberhard H.J., 1991, Proe. Nati. Acad.

Sei. USA 88, 7659-7663.

Lim, K. und Chae, C.B., 1989, BioTechnigues 7, 576-579. Luthmann, H. und Magnusson, G., 1983, Nucl. Acids Res.

11, 1295-1308. MacDonald, R.C. et al., 1991, Biochim. Biophys. Acta

1061, 297-303.

Macgregor, G. und Caskey, C.T., 1989, Nucl. Acids Res.

17, 2365.

Mackow, E.R., Shaw R.D., Matsui S.M., Vo P.T., Dang M.N. und Greenberg H.B., 1988, Proe. Nati. Acad.

Sei. USA 85, 645-649.

Madshus, I.H., Olsnes, S. und Sandvig, K., 1984,

Virology 139, 346-357.

Malim, M. et al., 1989, Cell 58, 205-214.

Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrook, J. (1982)

Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 474.

Marion, D., Zasloff M. und Bax A-, 1988, FEB 227, 21. Marshall, S., 1985, J Biol. Chem-, 250, 4133-4144. Massague, J. et al., 1986, J. Cell. Physiol., 128, 216-222.

McClure, M.D., Sommerfelt, M.A., Marsh, M. und Weiss,

R.A.. 1990, J. General Virol. 71, 767-773. Mellman, l.S. et sl., 1984, j. Cell Biol., 98, 1170-1177.

Mizel, S.B. et al., 1987, 1987, J. Immunol., 138, 2906-2912.

Ojcius. D.M. und Young J.D., 1991, T1BS 16, 225-229. Oropeza-Werkerle, R.L., Muller S-, Briand J.P., Benz R., Schmid A. und Goebel W., 1992, Mol. Microbiol.

6, 115-121.

Otero, M.J. und Carrasco, L., 1987, Virology 160, 75-80.

Pacini, D.L. et al., 1984, J. Infect. Dis. 150, 92-97. Parente, R.A. et al., 1990, Biochemistry 29, B720-672B. Patek, P.Q., Collins, J.L. und Cohn, M. 1978, Nature

276, 510-511.

Ponder, J.P. et al., Proe. Nati. Acad. Sel. USA, 1991.

88, 1217-1221.

Posner, B.l. et al., 1982, J. Cell Biol., 93,- 560-567. Precious, B. und Russell, W.C., 1985, Virology, ed.

Mahy, B.W.J., IRL Press, Oxford, Washington, DC,

193-205.

Rafalski, M., Lear, J.D. und DeGrado, W.F., 1990,

Biochemistry 29, 7917-7922.

Reece, R.L. et al, 1987, Aust. Vet. J. 64, 365-367. Riordan, J.R. et al., 1989, Science, 245, 1066-1073. Rosenberg, St.A. et al., 1992, Human Gene Therapy 3,

75-90*

Ruysschaert, J.-M. und Vendenbranden M,, 1991, Biochem.

Biophys. Res. Commun. 175, 872-879.

Sambrook, J. et al. (Eds.), 1989, Molecular Cloning,

2nd Edition, Vol. 3, 16.39-16.40.

Schalch, D.S. et al., 1936, Endocrinology. 118, 1590-1597.

Sennett, C. et al., 1981, Annu- Rev. Biochem., 50,

1053-1086.

Setn, P., FitzGerald, D., Ginsberg, H., Willingham, M.

und Pastan, I., 1984, Mol. Cell. Biol. 4, 1528-1533.

Seveme, Y., Wieland, S., Schafffner, W. und Rusconi,

S-, 1988, EMBO J. 7, 2503-2508.

Shai, Y., Bach D. und Yanovsky A., 1990, JBS 265,

20202-20209.

Sharon, N., 1987, Cell Separation: Methods and Selected Applications, Vol. 5, Academic Press Inc., pp.13-44.

Silver, L. et al., 1988, Virology 165, 377-387.

Sipe, D.M. et al., 1991, J. Biol. Chem. 256, 3469-3474. Skern, T. et al., 1984, Virology 136, 125-132. Slepushkin, V.A., Andreev S.M., Siderova M.V., Melikyan G.B., Grigoriev V.B., Chumakov V.M., Grinfeldt A.E., Manukyan R.A. und Karamov E.V., 1992, AIDS

Res. Human Retroviruses 8, 9-18.

Sly, W. et al., 1982, J. Cell Biochem., 18, 67-85. Smith, K.A. et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. USA,

82, 864-867.

Stahl, P.D. et al., 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. USA,

75, 1399-1403.

Straubinger, R.M. und Papahadjopoulos, D., 1983, Meth.

Enzyraol. 101, 512-527.

Strauss, W. und Jaenisch, R., 1992, EMBO J. 11, 417-422.

Subbarao, N.K. et al., 1987, Biochemistry 26, 2964-2972.

Sullenger, B-A. et al., 1990, Cell 63, 601-608. Svensson, U., 1985, J.Virol., 55, 442-449.

Szoka, F. und Papahadjopoulos, D., 1978,

Proe.Nati.Acad.Sei. USA 75, 4194-4198.

Takahashi, S., 1990, Biochemistry 29, 6257-6264. Takayama, K.M. und Inouye, M., 1990, Critical reviews in Biochem. and Mol.Biol. 25, 155-184.

Takese, K. e-t al., 1990, Nippon Julgakl Zasshl 52, 207-215.

Thiaudiere, E., Siffert 0., Talbot J.-C., Bolard J.,

Alouf J.E. und Dufourcq J., 1991, Eur. J. Biochem.

195, 203-213.

Trono, D. et al., 1989, Cell 59, 113-120.

Uchida, Y., Tsukada, U. und Sugimori, T., 1977, J.

Biochem. 82, 1425-1433.

Urakawa, T., et al., 1989, J. Gen. Virol. 70, 1453-1463.

Valerio, D., Mclvor, R.S., Williams, S.R., Duyvesteyn, M.G.C., Van Ormondt, H., Van der Eb, A.J., Martin, D.W. Jr, 1984, Gene, 31, 147-153.

van Oostrum, J. und Burnett, R.M., 1985, J. Virol. 56,

439-448.

Wagner, E., Zenke, M., Cotten, M., Beug, H. und Bimstiel, M.L., 1990, Proe.Nati.Acad.Sei. USA 87,

3410-3414.

Wagner, E., Cotten, M., Foisner, R. und Bimstiel,

M.L., 1991a, Proe.Nati.Acad.Sei. USA 88,- 4255-4259.

Wagner, E., Cotten, M., Mechtler, K., Kirlappos, H. und Bimstiel, M.L., 1991b, Biooonjugate Chemistry 2,

226-231.

Walker, F. et al., 1987, J. Cell Physiol., 130, 255-261.

Walker, R.D. et al., 1989, Proe.Nati.Acad.Sei. USA 86,

9514-9518.

Walls, E.V. und Crawford, D.H., 1989, Lymphocytes, a practical approach, G.G.B. Klaus, Ed., IRL press

Oxford, 149-162

Watson, J.D., et al., 1987, Mol. Biol. of the Gene,

Benjamln/Cummings Publ. Company Inc., 676-677. Wharton, S.A., Martin, S.R., Ruigrok, R.W.H., Skehel,

J.J. und Wiley, D.C., 1988, J. Gen. Virol. 69, 1847-1857.

White, J.M., 1990, Annu. Rev. Physiol 52, 675-697 Wilchek, M. et al., 1988, Anal. Biochem. 171, 1. Wilson, J.K», oanos, O., Grossman, H., Raulet, D.H. und Mulligan, R.C., 1990, Proe.Nati.Acad.Sei. USA 87,

439-443.

Willumsen, N.J., Davis, C.W. und Boucher, R.C., 1989,

Am. J. Physiol. 256 (Cell Physiol. 25), 1033-1044. Wood, W.i., Capon, D.J., Simonsen, CC, Eaton, D.L.,

Gitschier, J., Keyt, B., Seeburg, P.H., Smith, D.H., Hollinshead, P., Wion, K.L., Delwart, E., Tuddenham, E.G.D., Venar, G.A., Lawn, R.M., 1984,

Nature, 312, 330-337.

Wu, R., Yankaskas, J.R., Cheng, E., Krvowles, M.R. und Boucher, R., 19B5, Atn.Rev.Respir.Dis. 132, 311-320.

Wu, G.Y. und Wu, C.H., 1987, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432.

Wu, G.Y. und Wu, C.H., 19B8, J. Biol. Chem. 263, 14621-14624.

Yankaskas, J.R., Stutts, M.J., Cotton, CU., -Knowles,

M.R., Gstzy, J.T. und Boucher, R.C., 1987, - Genetics and Epithelial Cell Dysfunction in Cystic

Fibrosis, Alan R. Liss, Inc., pp. 139-149. Yankaskas, J.R., Haizlip, J.E., Conrad, M., Koval, D..

Schlegel, R. und Boucher, R.C., 1991, Am, Rev.

Resplr. Dis. 143, A139.

Zamecnik, P.C., Goodchild, J., Taguchi, Y. und Sarin,

P.S., 1986, Proe.Nati.Acad.Sei. USA 83, 4143-4146. Zatloukal, K., Denk, H., Lackinger, E. und Ralner, I.,

1989, Lab. Invest. 61, 603-608.

2enke. Ni., Steinlein, P., Wagner, E., Cotten, M., Beug,

H. und Bimstiei, M.L., 1990, Proe.Nati.Acad.Sei-USA 87, 3655-3659.

Zon, G., 1988, Pharmaceut. Research 5, No.9, 539-549. Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980, Mack Publ.

Co., Easton, PA, Osol (ed.).

Trends Pharmacol. Sei. 10, 1989, 458-462.

Claims (74)

1. Sammensetning for transfeksjon av høyere eukaryotiske celler inneholdende et kompleks hvor nukleinsyren er kompleksbundet med en substans som har affinitet for nukleinsyre, karakterisert ved at sammensetningen også inneholder et endosomolytisk middel, som er tilstede som en komponent av komplekset ved å være kompleksbundet med nukleinsyren via et nukleinsyrebindende domene spesifikt for nevnte middel eller via en substans som har affinitet for nukleinsyren som den er bundet til.

2. Sammensetning for transfeksjon av høyere eukaryotiske celler inneholdende et kompleks hvor nukleinsyren er kompleksbundet med en substans som har affinitet for nukleinsyre, karakterisert ved at sammensetningen også inneholder et endosomolytisk middel, valgt fra et virus eller en viruskomponent med evne til å penetrere per se inn i cellen som skal transfekteres og som er tilstede utenfor nevnte kompleks hvor en substans som har affinitet for nukleinsyren, er kompleksbundet med nukleinsyren.

3. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at komplekset også inneholder en internaliseringsfaktor som også er kompleksbundet med nukleinsyren via en substans som har affinitet for nukleinsyren til hvilket det er konjugert.

4. Sammensetning ifølge krav 2, karakterisert ved at substansen som har affinitet for nukleinsyren er konjugert med en internaliseringsfaktor.

5. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at det endosomolytiske midlet er kovalent bundet til en forbindelse som har affinitet for nukleinsyren.

6 Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at det endosomolytiske midlet er ikke-kovalent bundet til en substans som har affinitet for nukleinsyren.

7. Sammensetning ifølge krav 6, karakterisert ved at bindingen blir oppnådd via en biotin-streptavidin-bro.

8. Sammensetning ifølge krav 6, karakterisert ved at bindingen blir oppnådd ionisk.

9. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at det endosomolytiske middel er et virus eller en viruskomponent.

10. Sammensetning ifølge krav 1,2 eller 9, karakterisert ved at i en sammensetning ifølge krav 1 eller krav 2 er det endosomolytiske middel et adenovirus.

11. Sammensetning ifølge krav 10, karakterisert ved at adenoviruset er en mutant.

12. Sammensetning ifølge krav 11, karakterisert ved at adenoviruset er en mutant uten evne til replikasjon.

13 Sammensetning ifølge krav 12, karakterisert ved at adenoviruset har én eller flere mutasjoner og/eller delesjoner i ElA-regionen.

14. Sammensetning ifølge krav 10, karakterisert ved at adenoviruset er inaktivert.

15. Sammensetning ifølge krav 14, karakterisert ved at adenoviruset er inaktivert av kortbølget UV.

16. Sammensetning ifølge krav 14, karakterisert ved at adenoviruset er inaktivert av UV/psoralen.

17. Sammensetning ifølge krav 14, karakterisert ved at adenoviruset er inaktivert ved formaldehyd.

18. Sammensetning ifølge krav 9, karakterisert ved at viruskomponenten består av én eller flere adenovirusproteiner.

19. Sammensetning ifølge krav 1,2 eller 9, karakterisert ved at i en sammensetning ifølge krav 1 eller krav 2 er det endosomolytiske midlet et picomavirus.

20. Sammensetning ifølge krav 19, karakterisert ved at picornaviruset er et eventuelt inaktivert rhinovirus.

21. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at det endosomolytiske middel i en sammensetning ifølge krav 1 er et virus som er infeksiøst for en art forskjellig fra menneske.

22. Sammensetning ifølge krav 21, karakterisert ved at viruset er et adenovirus.

23. Sammensetning ifølge krav 22, karakterisert ved at adenoviruset er et avianadenovirus.

24. Sammensetning ifølge krav 23, karakterisert ved at adenoviruset er Chick Embryo Le thai Orphan-virus.

25. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at det endosomolytiske midlet i en sammensetning ifølge a) er et eventuelt modifisert endosomolytisk viralt peptid.

26. Sammensetning ifølge krav 25, karakterisert ved at det endosomolytiske peptidet er et influensa-hemagglutinin Ha2-peptid.

27. Sammensetning ifølge krav 26, karakterisert ved at peptidet har sekvens SEKV.ID NR. 1.

28. Sammensetning ifølge krav 26, karakterisert ved at peptidet har sekvens SEKV.ID NR. 2.

29. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at det endosomolytiske midlet i en sammensetning ifølge krav 1 er et ikke-viralt, eventuelt modifisert, naturlig eller syntetisk peptid som har evne til å bryte opp cellemembraner, som kan bli detektert ved liposompermeabilitetstest og/eller erytrocyttlyseringstest.

30. Sammensetning ifølge krav 29, karakterisert ved at peptidet har sekvens SEKV.ID NR. 11.

31. Sammensetning ifølge krav 29, karakterisert ved at peptidet er en homo-eller heterodimer av peptidet definert i krav 27.

32. Sammensetning ifølge krav 31, karakterisert ved at peptidet er en homodimer.

33. Sammensetning ifølge krav 31, karakterisert ved at peptidet er en heterodimer som inneholder sekvens SEKV.ID NR. 10.

34. Sammensetning ifølge krav 29, karakterisert ved at peptidet har sekvensen Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.

35. Sammensetning ifølge krav 29, karakterisert ved at peptidet har sekvens SEKV.ID NR. 6.

36. Sammensetning ifølge krav 25 eller 29, karakterisert ved at peptidet har en nukleinsyrebindende domene.

37. Sammensetning ifølge krav 36, karakterisert ved at peptidet har en oligoly sinekstensj on.

38. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at internaliseringsfaktoren er transferrin.

39. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at internaliseringsfaktoren er en ligand for T-celler.

40. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at internaliseringsfaktoren er en ligand for B-celler.

41. Sammensetning ifølge krav 40, karakterisert ved at internaliseringsfaktoren er et immunglobulin.

42. Sammensetning ifølge krav 40, karakterisert ved at liganden er et anti-immunglobulin.

43. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at internaliseringsfaktoren er en ligand for hepatocyter.

44. Sammesetning ifølge krav 43, karakterisert ved at internaliseringsfaktoren er en ligand for asialoglykoproteinreseptoren.

45. Sammensetning ifølge krav 44, karakterisert ved at internaliseringsfaktoren er en tetra-galaktose-polylysin.

46. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at internaliseringsfaktoren er en lecitin.

47. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at internaliseringsfaktoren er et lav-tetthet-lipoprotein.

48. Kompleks som en bestanddel av en sammensetning ifølge et av kravene 1 og 3- 44, karakterisert ved at det inneholder én eller flere nukleinsyrer hvormed et endosomolytisk middel er kompleksbundet via en nukleinsyrebindende domene som er særegen for nevnte middel eller via en substans som har affinitet for nukleinsyren, som den er bundet til, og ved at det eventuelt inneholder en internaliseringsfaktor som er også kompleksbundet med nukleinsyren via en substans som har affinitet for nukleinsyren som det er konjugert til.

49. Kompleks ifølge krav 48, karakterisert ved at det inneholder en terapeutisk aktiv nukleinsyre..

50. Kompleks ifølge krav 49, karakterisert ved at nukleinsyren består av én eller flere DNA-molekyler som er aktive i genterapi.

51. Kompleks ifølge krav 50, karakterisert ved at DNA-molekylet koder for et cytokin.

52. Kompleks ifølge krav 50, karakterisert ved at DNA-molekylet koder for faktor VIII.

53. Kompleks ifølge krav 49, karakterisert ved at nukleinsyren inneholder en nukleotidsekvens hvor det fra RNA-molekyler som spesifikt inhiberer cellefunksjoner kan bli transkribert.

54. Kompleks ifølge krav 48, karakterisert ved at substansen med affinitet for nukleinsyren er et organisk polykation.

55. Kompleks ifølge krav 54, karakterisert ved at polykationet er polylysin.

56. Kompleks ifølge krav 54, karakterisert ved at polykationet er polyetylenimin.

57. Kompleks ifølge krav 48, karakterisert ved at det inneholder en internaliseirngsfaktor som er bundet til samme substans som har affinitet for nukleinsyren som det endosomolytiske midlet.

58. Kompleks ifølge krav 57, karakterisert ved at substansen med affinitet for nukleinsyren er polylysin.

59. Kompleks ifølge krav 58, karakterisert ved at det videre omfatter ikke-kovalent bundet polylysin.

60. Konjugat som en bestanddel av et kompleks ifølge et av kravene 48-59, karakterisert ved at konjugatet består av et endosomolytisk middel og en substans med affinitet for nukleinsyren.

61. Endosomolytisk peptid egnet som en bestanddel av sammensetningen ifølge krav 36, karakterisert ved at det har en endosomolytisk domene og en kunstig innført nukleinsyrebindende domene.

62. Peptid ifølge krav 61, karakterisert ved at den nukleinsyrebindende domenen er en oligolysinekstensjon.

63. Fremgangsmåte for innføring av nukleinsyre inn i høyre eukaryotiske celler in vitro eller eks vivo, karakterisert ved at cellene blir behandlet med en sammensetning ifølge hvilket som helst av kravene 1-47.

64. Fremgangsmåte ifølge krav 63, karakterisert ved at cellene er humane celler.

65. Fremgangsmåte ifølge krav 64, karakterisert ved at cellene er tumorceller.

66. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 64 og 65, karakterisert ved at nukleinsyren i sammensetningen er aktivi genterapi.

67. Fremgangsmåte ifølge krav 65 eller 66, karakterisert ved at tumorcellene blir behandlet med sammensetningen eks vivo og at DNAet koder for én eller flere immunmodulerende forbindelser, fortrinnsvis cytokiner.

68. Fremgangsmåte for fremstilling av et heterologt protein i en høyere eukaryot celle, karakterisert ved at cellene blir behandlet med en sammensetning ifølge krav 1, idet nukleinsyren inneholder en DNA-sekvens som koder for ønsket protein, blir cellene dyrket under egnende betingelser for ekspresjon av proteinet, og proteinet blir isolert.

69. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det inneholder, som aktiv ingrediens, en sammensetning ifølge et av kravene 1 til 47, inneholdende en terapeutisk aktiv nukleinsyre og en farmasøytisk akseptabel bærer.

70. Transfeksjonssett, karakterisert ved at det inneholder en bærereimet hvor det er to eller flere beholdere, en første beholder inneholdende en substans med en affinitet for nukleinsyren som er eventuelt koblet til en internaliseringsfaktor for en høyere eukaryot celle og en andre beholder inneholdende et endosomolytisk middel som er et virus eller en viruskomponent som har evne til å penetrere per se inn i cellen som skal bli transfektert.

71. Transfeksjonssett, karakterisert ved at det inneholder en bærereimet hvor det er to eller flere beholdere, en første beholder inneholdende en substans med en affinitet for nukleinsyren som er konjugert med en internaliseringsfaktor for én høyere eukaryot celle og en andre beholder inneholdende en substans med en affinitet for nukleinsyren som er bundet til et endosomolytisk middel.

72. Transfeksjonssett ifølge krav 71, karakterisert ved at det inneholder i den andre beholderen transglutaminase-koblet adenovirus-polylysinkonjugat.

73. Transfeksjonssett, karakterisert ved at det innholder en bærerenhet hvor det er to eller flere beholdere, en første beholder inneholdende et biotin-modifisert endosomolytisk middel og en andre beholder inneholdende en streptavidin-modifisert substans med en affinitet for nukleinsyren.

74. Transfeksjonssett ifølge krav 73, karakterisert ved at den første beholderen inneholder biotinylert adenovirus og en andre beholder inneholder streptavidin-polylysin.