SK281682B6 - Kompozícia na transfekciu buniek, komplex ako súčasť kompozície, konjugát ako súčasť komplexu, endozomolytický peptid, spôsob tvorby konjugátu, spôsob vnášania nukleových kyselín do buniek, farmaceutický prípravok s jeho obsahom a transfekčná súprava - Google Patents

Kompozícia na transfekciu buniek, komplex ako súčasť kompozície, konjugát ako súčasť komplexu, endozomolytický peptid, spôsob tvorby konjugátu, spôsob vnášania nukleových kyselín do buniek, farmaceutický prípravok s jeho obsahom a transfekčná súprava Download PDF

Info

Publication number
SK281682B6
SK281682B6 SK368-94A SK36894A SK281682B6 SK 281682 B6 SK281682 B6 SK 281682B6 SK 36894 A SK36894 A SK 36894A SK 281682 B6 SK281682 B6 SK 281682B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
cells
conjugate
composition
nucleic acid
gly
Prior art date
Application number
SK368-94A
Other languages
English (en)
Other versions
SK36894A3 (en
Inventor
David Curiel
Ernst Wagner
Matt Cotten
Kurt Zatloukal
Christian Plank
Max L. Birnstiel
Bernd Oberhauser
Walter G. Schmidt
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International Gmbh
The University Of North Carolina
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim International Gmbh, The University Of North Carolina filed Critical Boehringer Ingelheim International Gmbh
Publication of SK36894A3 publication Critical patent/SK36894A3/sk
Publication of SK281682B6 publication Critical patent/SK281682B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
    • C12N2710/10251—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
    • C12N2710/10261—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10363—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/11011—Alpharetrovirus, e.g. avian leucosis virus
    • C12N2740/11022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32711—Rhinovirus
    • C12N2770/32722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32711—Rhinovirus
    • C12N2770/32761—Methods of inactivation or attenuation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Kompozícia na transfekciu vyšších eukaryotických buniek je tvorená komplexom z nukleovej kyseliny a substancie s afinitou ku nukleovej kyseline, ktorá je prípadne konjugovaná s internalizačným faktorom na tieto bunky. Kompozícia obsahuje endozomolytický prostriedok, ktorý je buď voľný alebo viazaný vírus alebo vírusový komponent, alebo vírusový alebo nevírusový peptid s endozomolytickými vlastnosťami.ŕ

Description

Vynález sa týka zavádzania nukleových kyselín do vyšších eukaryotických buniek.
Doterajší stav techniky
Potreba účinného systému na zavádzanie nukleovej kyseliny do živých buniek existuje najmä v rámci génovej terapie. Pritom sa gény vložia do buniek, aby sa docielila in vivo syntéza terapeuticky účinných génových produktov, napríklad v prípade genetického defektu sa dá nahradiť chýbajúci gén. „Klasická“ génová terapia spočíva na princípe docielenia trvalého vyliečenia jednorazovým ošetrením. Popri tom však existuje potreba takých liečebných metód, pri ktorých by sa terapeuticky účinná DNA (alebo aj mRNA) podávala ako liek („génové terapeutikum) podľa potreby jednorázovo alebo opakovane. Príkladom na geneticky podmienené ochorenia, pri ktorých predstavuje nasadenie génovej terapie nádej na úspech, sú hemofília, beta-talasemia a „Severe Combined Immune Defíciency“ (SCID), syndróm, vyvolaný geneticky podmieneným nedostatkom enzýmu adenozindeaminázy. Možnosti aplikácie ďalej spočívajú pri regulácii imunity, pričom sa docieli humorálna alebo intracelulárna imunita formou očkovania podaním funkčnej nukleovej kyseliny, ktorá kóduje sekretovaný proteín-antigén alebo nesecernujúci protein-antigén. Ďalšie príklady na genetické defekty, pri ktorých jc možne podávať nukleovú kyselinu, kódovanú za defektný gén, napríklad v individuálnej, podľa potreby odsúhlasenej forme, sú svalová dystrofia (Dystrophin-Gen), cystická fibróza („Cystic fíbrosis transmembrane conductance regulátor gene“), hypercholesterolemia (LDL-receptorový gén). Liečebné metódy génovej terapie majú vtedy potenciálne význam, ak sa majú syntetizovať v organizme hormóny, rastové faktory alebo cytotoxické bielkoviny alebo účinné proteíny modulujúce imunitu.
Génovú terapiu je možné aj sľubne nasadiť pri liečbe rakoviny, keď je možné podávať tzv. „rakovinové vakcíny“. Aby sa zvýšila imunogenicita tumorových buniek, tieto sa pozmenia, aby sa buď antigénne posilnili alebo sa podporili v tvorbe istých substancií modulujúcich imunitu, napríklad cytokinov, ktoré potom spustia imunitnú odpoveď. Aby k tomu došlo, sú bunky transfikované s DNA, kódovanými pre cytokin, napríklad IL-2,IL-4, IFN-gamma, TNF-α. Doteraz sa prenos génov do autologových tumorových buniek vykonával prostredníctvom retrovirusových vektorov.
Doteraz najpokročilejšie technológie využívania nukleových kyselín v rámci génovej terapie používajú retrovirálne systémy na transfer génov do buniek (Wilson et al., 1990, Kasid et al., 1990). Používanie retrovirov je však problematické, pretože, prinajmenšom v obmedzenom percente, prináša so sebou riziko vedľajších účinkov, napríklad nákazy vírusom (rekombináciou s endogénnymi vírusmi alebo kontamináciou pomocnými vírusmi a možnú následnú mutáciu na patogénnu formu) alebo vyvolanie rakoviny. Okrem toho je stabilná transfekcia somatických buniek pacienta, ako je docielená pomocou retrovírusov, nie vždy žiaduca, pretože liečba, napríklad pri výskyte vedľajších účinkov, sa dá iba veľmi ťažko zvrátiť. Okrem toho je ťažké pri tejto forme terapie získať dostatočne vysoký titer, aby bolo možné infikovať dostatočne veľa buniek.
Nukleové kyseliny ako terapeuticky účinné substancie sa okrem toho používajú vtedy, ak je potrebné inhibovať isté funkcie buniek, tak napríklad antisensy RNA a DNA sa ukázali ako účinne prostriedky pre selektívnu inhibíciu istých génových sekvencií. Spôsob, akým účinkujú, umožňuje ich použitie ako terapeutika na blokovanie expresie istých génov (ako deregulované onkogény alebo vírusové gény) in vivo. Ukázalo sa už, že krátke antisenseoligonukleotidyje možné importovať do buniek, kde môžu vykonávať svoje inhibičné pôsobenie (Zamecnik et al., 1986), pričom ich intracelulárna koncentrácia je veľmi malá, čo je okrem iného spôsobené obmedzeným prestupom cez bunkovú membránu z dôvodu silného negatívneho náboja nukleových kyselín.
Ďalším prínosom k selektívnej inhibícii génov je použitie ribozómov. Aj tu existuje požiadavka dosiahnuť čo najvyššiu koncentráciu aktívnych ribozómov v bunke, pričom jedným z limitujúcich faktorov je prenos do bunky.
Použitie génovej terapie na docielenie intracelulárnej imunity zahŕňa transdukciu génov, ktorá má ochranný účinok proti vírusom (tzv. „protective genes“, ochranné gény), napríklad transdominantná mutácia génov, ktoré kódujú vírusové proteíny, alebo molekuly DNA, ktoré kódujú tzv. „RNA decoys“.
Sú potrebné metódy, ktoré by umožnili expresiu DNA v bunke.
Už boli navrhnuté viaceré riešenia, ako zlepšiť prenos nukleových kyselín do živých buniek, nakoľko pri ich terapeutickom používaní prenos predstavuje limitujúci faktor.
Pri transfekcii génov cicavcov in vitro sú známe rôzne techniky, ktorých používanie in vivo je však obmedzené (k tým patria prenos DNA pomocou lipozómov, elektroporácia, mikroinjekcie, fúzia buniek, DEAE-Dextran alebo precipitačná metóda fosforečnanom vápenatým).
Najnovšie boli vyvinuté rekombinantné vírusové vektory, ktoré zabezpečujú transfer génov tak, že si poslúžia účinnými vstupnými mechanizmami východiskových vírusov. Táto stratégia bola použitá pri konštrukcii rekombinantných retrovirusových a adenovírusoyých vektorov, aby sa docielil vysoko účinný génový prenos in vitro a in vivo (Berkner, 1988). Pri všetkej svojej účinnosti podliehajú tieto vektory obmedzeniam, a to vzhľadom na veľkosť a konštrukciu DNA, ktoré treba prenášať. Okrem toho tieto prostriedky sú riskantné z dôvodu ko-transferov životaschopných vírusových génových elementov pôvodných vírusov.
Aby sa obišli tieto obmedzenia, boli vyvinuté alternatívne stratégie na prenos génov, ktorých základom sú mechanizmy, ktoré slúžia bunke na transport makromolekúl. Príkladom je import génov do bunky nanajvýš efektívnou cestou receptorom sprostredkovanej endocytózy (Wu und Wu, 1987, Wagner et al., 1990, a EP-A1 0388 758). Tento spôsob používa bifunkcionálne molekulárne konjugáty, ktoré majú oblasť (doménu) viazania DNA a doménu so špecifikami pre povrchové receptory bunky. Keď je rozpoznaná spoznávacia doména povrchového receptora bunky, konjugát sa cestou receptormi sprostredkovanej endocytózy internalizuje, pričom sa spoluprenesie na konjugát naviazaná DNA. Pomocou tejto metódy mohli byť docielené také hodnoty génových prenosov, ktoré boli prinajmenšom rovnocenné s obvyklými metódami (Zenke et al., 1990).
Bolo možné ukázať, že DNA, transportovaná pomocou tohto systému do bunky, exprimuje a že v prípade použitia nukleovej kyseliny s inhibičným účinkom sa inhibičný účinok prenosom neobmedzí.
Zverejnená PCT- prihláška W091/17773 sa vzťahuje na systém prenosu nukleových kyselín so špecifickým účinkom na T-bunky. Tento systém používa povrchové proteíny
T-bunky pôvodnej línie napríklad CD4, receptorom, ktorý je využívaný vírusom HIV. Nukleová kyselina, ktorú treba vložiť do bunky, vytvorí komplex s konjugátom proteín-polykatión, ktorého proteínová časť je proteín, ktorý má schopnosť viazať sa na povrch T-bunky, napríklad na CD4, a bunky, ktoré exprimujú tento povrchový proteín, prídu do styku s komplexami proteín-polykatión/nukleové kyseliny. Bolo možné dokázať, že pomocou tohto systému do bunky vnesená DNA v bunke exprimuje.
Pre obidva tieto vynálezy je príznačné to, že používajú špecifické funkcie bunky, aby bolo možné importovať do bunky nukleovú kyselinu alebo to uľahčiť.
V obidvoch prípadoch prebiehajú prijímacie mechanizmy za spolupôsobenia faktorov, ktoré budú v rámci predkladaného vynálezu označované ako „intemalizujúce faktory“. Pod tým treba rozumieť také faktory, ktoré v užšom alebo širšom zmysle sú špecifické pre typ bunky, v danom prípade za spolupôsobenia ďalších faktorov (napríklad proteínov povrchu bunky), viažu na povrch bunky a sú intemalizované. (V prípade oboch uvedených vynálezov je intemalizujúcim faktorom transferín, prípadne proteín viažuci sa na povrchový antigén T-bunky, napríklad anti-CD4-protilátka.) Intemalizujúci faktor sa konjuguje so substanciu polykationického charakteru, ktorá z dôvodu svojej afinity k nukleovým kyselinám vytvorí spojenie medzi internalizujúcim faktorom a nukleovou kyselinou. (Substancie tohto druhu sa v nasledujúcom texte budú nazývať „substancie s afinitou k nukleovej kyseline“ alebo, v súvislosti s DNA, „doména viazania DNA“. Ak takáto substancia ako súčasť konjugátu vytvorí spojenie medzi nukleovou kyselinou a intemalizujúcim faktorom, je v nasledujúcom texte označovaná ako viažuci faktor).
Počas práce na obidvoch vynálezoch bolo zistené, že optimum pre príjem nukleových kyselín do bunky sa môže docieliť tak, že sa pomer konjugát: nukleová kyselina vyberie tak, že komplexy intemalizujúci faktor - polykatión/nukleová kyselina boli čo najviac elektroneutrálne. Na základe tohto pozorovania sa zlepšili metódy, ktoré využívajú na import nukleových kyselín do vyšších eukaryotických buniek komplexy intemalizujúci faktor viažuci faktor/nukleová kyselina.
Wagner et al., 1991a opísal metódu, pomocou ktorej je možné zlepšiť účinnosť systémov, pri ktorých sa deje prijímanie nukleových kyselín prostredníctvom intemalizujúcich faktorov. Množstvo nukleovej kyseliny, prijímanej bunkou, sa nezmenší, keď časť konjugátu transferrinpolykation sa nahradí nekovalentne viazaným polykationom; v niektorých prípadoch sa dokonca podarilo docieliť pozoruhodné zvýšenie prijatej kyseliny DNA. Skúmania molekulárneho stavu komplexov transferrin-polykation-plazmid-DNA, ktoré boli vytvorené ako optimálne pre vzťah odovzdávania DNA/konjugátu, ukázali, že plazmidová DNA za prítomnosti konjugátov bola zhustená do toroidných štruktúr (podobné „doughnuts“ (šišky)) s priemerom približne 80 až 100 nm.
Pokusy s proteínami viažucimi sa na T-bunky ako intemalizujúcimi faktormi priniesli podobné výsledky.
Pridanie voľných substancií s afinitou k nukleovej kyseline spôsobuje tiež zvýšenie účinnosti importných systémov, ak bola iná substancia s afinitou k nukleovej kyseline použitá ako viažuci faktor.
Wagnerom et al, 1991a, opísané komplexy, ktoré sú prijímané prostredníctvom intemalizujúceho faktora endocytózou do vyšších eukaryotických buniek, obsahujú nukleové kyseliny, v komplexe s konjugátom intemalizujúci faktor-viažuci faktor. K tomu obsahujú komplexy jeden alebo viac substancií s afinitou k nukleovej kyseline, ktoré sú v danom prípade identické s viažucim faktorom, v takej nekovalentnej viazanej forme, ktorá vystupňuje konjugátom docielenú intemalizáciu a/alebo expresiu nukleovej kyseliny, čo sa dá pripísať v prvom rade kondenzačnému účinku, možno ale aj iným mechanizmom.
Keď aj pomocou tejto metódy mohli byť hodnoty expresie importovaných nukleových kyselín zvýšené, predsa len podlieha obmedzeniam. Použiteľnosť tohto systému v daných súvislostiach nie je určovaná iba výlučne prítomnosťou pre daný systém relevantných receptorov povrchu bunky; obmedzenia, ktorým podlieha použitie tohto systému, sú pravdepodobne dôsledkom toho, že v endzomoch intemalizované komplexy konjugát- DNA skončia v lyzozómoch, kde sa enzymaticky odbúrajú. Aby sa zvýšil podiel nukleovej kyseliny, ktorá skončí v jadre bunky a tam exprimuje a splní tak svoj účel, robili sa pokusy, ktoré predchádzali predkladanému vynálezu, keď sa skúšala vykonať transfekcia buniek za prítomnosti substancií, ktoré mali inhibovať enzymatickú funkciu v lyzozómoch, tzv. lyzozomatropných substancií. S pomocou týchto opatrení sa docielila zosilnená expresia importovanej DNA: docielené reakcie však boli v závislosti od použitej substancie silne odlišné · vybrané lyzozomatropné substancie spôsobili zosilnený génový transfer, pokým iné ho dokonca inhibovali. Tak sa napríklad prišlo na to, že účinný import DNA je závislý od prítomnosti slabej bázy chloroquinu (Zenke et al., 1990, Cotten et al., 1990). Tento účinok dosiahnutý chloroquinom nespočíva, respektíve nespočíva iba výhradne v tom, že chloroquin zvyšuje hodnotu pH v lyzozómoch; pri rôznych pokusoch sa zistilo, že iné substancie, ktoré rovnako ako chloroquin modulujú hodnotu pH, ako monensin, chlorid amónny alebo metylamín, nemohli nahradiť chloroquin a v niektorých prípadoch mali dokonca inhibujúci účinok. Ďalej sa zistilo, že rôzne cieľové bunky vykazujú rozličnú reakciu na tú istú lyzozomatropnú substanciu.
Nakoľko génový transfer fyziologickou cestou, akou je endocytóza sprostredkovaná receptormi prostredníctvom komplexov nukleových kyselín, vykazuje veľké výhody (netoxický mechanizmus prenikania bunkovou membránou; možnosť podávania biologicky aktívnych nukleových kyselín, ako sú gény, časť génov alebo nukleové kyseliny špecificky inhibujúce funkciu buniek, na repetitívnej alebo kontinuálnej báze; možnosti cielenia podľa typu buniek; vytváranie konjugátu vo veľkých množstvách), existuje potreba zefektívniť tento systém.
Predkladaný vynález si kladie za úlohu zlepšiť import nukleových kyselín do vyšších eukaryotických buniek. (Pod pojmami „import“, pripadne „prenos“ sa v rámci predkladaného vynálezu okrem vstupu komplexov nukleových kyselín do bunky bunkovou membránou chápe aj lokalizácia komplexov, pripadne z nich uvoľnenej nukleovej kyseliny, vnútri bunky až po príchod na miesto vhodné na jeho expresiu.) Vyššie eukaryotické bunky sú odborníkom známe; Kvasinky sa k nim nerátajú (Watson et al., 1987).
Množstvo vírusov realizuje svoj prienik do eukaryotických hostiteľov mechanizmami, ktoré zodpovedajú princípom receptormi sprostredkovanej endocytózy. Vírusová infekcia na báze týchto mechanizmov začína vo všeobecnosti tak, že časti vírusov sa naviažu na receptory na bunkovej membráne. Na záver potom nasleduje intemalizácia vírusu do bunky. Tento intemalizačný proces sleduje spoločnú trasu, zodpovedajúcu vstupu fyziologických ligandov alebo makromolekúl do bunky: povrchové receptory bunky ich najprv usporiadajú do skupín, aby sa vytvoril tzv. „coated pit“, nato sa membrána vyhne dovnútra a vytvorí vezikulu obklopenú obalom. Po tom, čo sa vezikula zbaví svojho clatrinového obalu, v jej vnútri sa začne okyslovanie za pomoci v membráne lokalizovanej protónovej pumpy. Tým konjugátov DNA sa výrazne zvýšil pridaním častíc adenovírusu, čo sa však nestalo pri komplexoch polylyzín-DNA. Je to teda vstup DNA do bunky receptormi sprostredkovanej endocytózy, ktorý je takto špecificky zosilnený.
Ďalej sa zisťovalo, ktorá špecifická funkcia adenovírusu to je, čo spôsobuje zosilnenie génového prenosu receptormi sprostredkovanej endocytózy (obr. 3C). Mierne zahrievanie častíc vírusu nič nemení na ich schopnosti viazať sa na bunkovú membránu cieľových buniek, ovplyvňuje však schopnosť úniku z endozomu po vstupe do bunky (Defer et al., 1990). Na základe tejto danosti bolo možné oddelené skúmanie rôznych účinkov viazania vírusu a vstupu vírusu do bunky. Pri pokusoch vykonaných v rámci tohto vynálezu sa zistilo, že účinkami zahrievania sa úplne odstránila schopnosť vírusov zosilňovať prebiehajúci génový prenos receptormi sprostredkovanej endocytózy. Z toho sa vyvodil záver, že zosilnenie génového prenosu prostredníctvom konjugátov transferín-polylyzín sa dá pripísať schopnosti adenovírusu uniknúť z endozomu ako súčasti funkcie prijímania. Skutočnosť, že replikačne defektný vírusový kmeň dokázal prispieť k zosilneniu génovej expresie, potvrdzuje predpoklad, že tento fenomén je dôsledkom nie replikačnej funkcie, ale prijímacej funkcie viriónu.
Aby sa vylúčila možnosť, že zosilnenie génovej expresie je dôsledkom eventuálnej transaktivácie importovaných génov vírusom, robili sa pokusy s jednou líniou buniek, ktorá konštitutívne exprimuje gén RSV-LTR-luciferázy; adenovírusy nemali žiaden účinok na túto líniu buniek, zatiaľ čo v rodičovskej línii buniek, do ktorých bol gén zavedený prostredníctvom konjugátov transferín-polylyzín bolo vyvolané výrazné zosilnenie génovej expresie. Toto zistenie vyjasnilo, že adenovírus má vplyv na udalosti, ktoré sa dejú pred transkripciou, a že jeho zosilňujúci účinok na import génov pôsobí na úrovni importu génov a nie na úrovni génovej expresie (obr. 5).
Ďalej sa zisťovalo v rámci predkladaného vynálezu, aké účinky majú adenovírusy na prenos génov prostredníctvom konjugátov transferín-polylyzín v zvolených líniách buniek. Zistilo sa, že existencia transferínových receptorov na cieľových bunkách je nevyhnutná, nie však vo všetkých prípadoch postačujúca na umožnenie prenosu génov prostredníctvom konjugátov transferín-polylyzín. Zdá sa, že faktory špecifické pre bunku, ktoré majú súvis s osudom v endozómoch intemalizovaných komplexov konjugátov DNA, hrajú podstatnú úlohu pre rozsah génového prenosu, ktorý sa deje touto cestou. Vzhľadom na toto boli niektoré vybrané línie buniek skúmané tak na prenos génov prostredníctvom konjugátov transferín-polylyzín ako aj na zosilnenie prenosu génov prostredníctvom adenovírusov (obr. 4).
Bunky línie buniek cystickej fibrózy (CFT1) vykázali masívnu génovú expresiu luciferázy po ošetrení samotnými komplexami polylyzín-DNA. Rozsah expresie sa významne zvýšil ošetrením adenovírusom dl312. Vo výraznom rozpore k tomuto vykázali KB-bunky ošetrené komplexami transferín-polylyzín-DNA, napriek tomu, že boli k dispozícii transferínové receptory, lucifcrázovú génovú expresiu, ktorá sotva presahovala úroveň pozadia. Ošetrenie adenovírusom dl 312 však spôsobilo pri týchto bunkách jasne preukázateľné luciferázové aktivity. Podobne zaberalo ošetrenie adenovírusmi na HeLa-bunky, pričom pri týchto bunkách bol účinok ešte výraznejšie zosilnený. Nakoľko HcLa-bunky aj KB-bunky majú približne rovnaký počet receptorov na adenovírusy, mohol rozdiel v zosilnení génového prenosu ukázať počet transferínových receptorov, typických pre typ bunky. Jasný kontrast k týmto výsledkom ukázali bunkové línie WI-38 a MRC-5, o ktorých je známe, že sa iba ťažko infikujú adenovírusom (Precious a Russel,
1985), s dl312 sa docielilo iba obmedzené zosilnenie génovej expresie docielenej samotnými komplexami konjugátov DNA. Ošetrením adenovírusmi teda by mohol zosilniť génový prenos v takých prípadoch, pri ktorých je možný prenos receptormi sprostredkovanej endocytózy, ako je tomu v prípade buniek CTF1, ako aj v niektorých prípadoch, v ktorých génový prenos týmto spôsobom prebieha neúčinne, ako pri bunkách HeLa a KB. Nakoľko miera zosilnenia výrazne varíruje podľa cieľových buniek, môže to mať tú príčinu, že tento efekt je tak funkciou počtu vírusových receptorov, napríklad receptorov adenovírusu istého typu bunky ako aj počtu transferínových receptorov.
V prípade použitia voľného vírusu je preferovanou substanciou s afinitou k nukleovej kyseline organický polykation, ktorý sa prednostne konjuguje s intemalizujúcim faktorom. Aj tak sa však v rámci predkladaného vynálezu zistilo, že za istých okolností DNA, ktorá komplexuje iba so substanciou s afinitou k nukleovej kyseline, teda aj bez intemalizačného faktora, môže byť vnesená do bunky za prítomnosti voľného vírusu. Ďalej sa zistilo, že na niektoré línie buniek sa príjem komplexov, pozostávajúcich z nukleovej kyseliny a substancie s afinitou k nukleovej kyseline, do bunky môže udiať cez tekutú fázu, ak je koncentrácia komplexu dostatočne vysoká. Z pokusov, vykonaných v rámci tohto a predchádzajúceho vynálezu, sa odvodilo, že podstatným elementom pre schopnosť prijímania komplexov nukleových kyselín je ich kompaktnosť, odvodená z kondenzovania nukleovej kyseliny prostredníctvom substancie s afinitou k nukleovej kyseline. Ak substancia s afinitou k nukleovej kyseline vedľa svojej schopnosti vytvoriť elektroneutralitu komplexu a zhustiť nukleovú kyselinu do kompaktnej štruktúry má aj dostatočnú schopnosť viazať sa na povrch bunky, aby vnikla spolu s vírusom do bunky, je možné sa vzdať zvyšovania kapacity príjmu takým spôsobom, že sa intemalizačný faktor viaže kovalentne na substanciu s afinitou k nukleovej kyseline, aby sa vynútil vstup komplexu receptormi sprostredkovanej endocytózy do bunky. Niektoré bunky vykazujú relatívne vysokú afinitu k substanciám s afinitou k nukleovej kyseline, takže konjugáty z nukleovej kyseliny a viažuceho faktora sú prijímané do bunky bez toho, aby bola nutná spoluúčasť internalizačného faktora. To sa týka napríklad hepatocytov, o ktorých sa v rámci predkladaného vynálezu zistilo, že prijímajú komplexy DNA-polylyzín.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je endozomolytickým prostriedkom vírus, naviazaný na substanciu s afinitou k nukleovej kyseline, ktorý má tú schopnosť, že vnikne do bunky ako časť komplexu konjugátu/nukleová kyselina a uvoľňuje do cytoplazmy obsah endozomu, v ktorom je lokalizovaný komplex po vstupe do bunky.
V ďalšom výhodnom uskutočnení podľa vynálezu je endozomolytickým prostriedkom vírusový komponent, naviazaný na substanciu s afinitou k nukleovej kyseline, ktorý má tú vlastnosť, že vniká do bunky ako časť komplexu/konjugátu nukleových kyselín a uvoľňuje do cytoplazmy obsah endozomu, v ktorom je lokalizovaný komplex po vstupe do bunky.
Vírusy alebo vírusové komponenty, naviazané na väzobnú doménu nukleových kyselín, budú v ďalšom texte bez ohľadu na spôsob väzby nazývané „vírusové konjugáty“·
Vírusové konjugáty, ktoré takisto sú predmetom predkladaného vynálezu, obsahujú vírus alebo komponenty vírusu ako integrálnu súčasť svojej funkčnej konštrukcie a zjednocujú prednosti vektorových systémov na báze konjugátov internalizačných faktorov s prednosťami, aké prinášajú do systému vírusy.
SK 281682 Β6 nukleovej kyseliny (prázdne víruskapsidy, ktoré je možné vyrobiť pomocou rekombinantných metód, pozri napríklad Ansardi et al., 1991, Urakawa et al., 1989), proteíny, ktoré sa získali pri frakcionácii, alebo peptidy, ktoré majú na prijímaciu funkciu podstatnú endozomolytickú schopnosť. Tieto vírusové komponenty je možné vytvoriť aj synteticky v závislosti od ich veľkosti buď syntézou peptidov alebo pomocou rekombinantných metód. V rámci predkladaného vynálezu bolo možné ukázať, že proteíny adenovírusu, konjugované s polylyzínom cez biotín/streptavidín, môžu zosilniť génový prenos. Príkladom na fragmenty proteínov iných vírusov ako adenovírusov, ktoré sú podstatné na internalizáciu vírusu, zahŕňajú influenzavírus-hemoglutín (HA). N-koncová sekvencia podjednotky influenzavirus-hemaglutinínu HA2 je zodpovedná za uvoľnenie vírusu z endozómu. Ukázalo sa, že peptidy, ktoré pozostávajú z 20 aminokyselín tejto sekvencie, fúzujú lipidové membrány a môžu ich čiastočne zničiť alebo ich porušiť (Wharton et al., 1988). V predkladanom vynáleze sa použili autentické a modifikované influenzapeptidy v rôznych vykonávacích formách. Ďalším príkladom sú proteíny obalu retrovírusov, napríklad HIV gp41 (Raflski et al., 1990), prípadne časti týchto vírusových proteínov.
Využitie vírusov, ktoré samé majú schopnosť vniknúť do bunky, je len jedným aspektom predkladaného vynálezu.
Vírusy alebo vírusové komponenty, ktoré samé nemajú tú schopnosť viazať sa na bunku a vniknúť do nej, sa prednostne používajú vo forme definovaných vírusových konjugátov. Pripojenie sa na väzobnú doménu DNA, napríklad polykatión, zaručuje, že vírus, prípadne vírusový komponent, získa silnú afinitu k molekulám DNA, sa s nimi komplexuje a ako súčasť komplexu DNA, ktorý obsahuje aj intemalizačný faktor/konjugát s väzobnou doménou DNA, je prenesený do bunky. Dodatočne k takto dosiahnutému prenosovému efektu je možné viazať vírus, prípadne vírusové komponenty na väzobnú doménu nukleovej kyseliny, čo má tiež za následok zlepšenie jeho endozomolytických schopností.
Vzhľadom na množstvo iných internalizačných faktorov je možné transfikovať prakticky každú vyššiu eukaryotickú bunku s použitím postupu podľa vynálezu.
To, či daný vírus alebo vírusový komponent má prijímaciu funkciu v zmysle predkladaného vynálezu, a tým je schopný prispievať k zosilneniu génového prenosu, sa dá zistiť prostredníctvom jednoduchej skríningovej skúšky. V takejto analýze, napríklad s cieľom testovať použiteľnosť vírusu ako voľného vírusu, sa cieľové bunky stretnú s komplexom DNA za alebo bez prítomnosti vírusu. Množstvo komplexu DNA, ktorý sa uvoľní do cytoplazmy, sa dá potom určiť dokázaním markergénového produktu, napríklad luciferázy. Ak prítomnosť vírusu mala za následok to, že sa komplex DNA vo väčšej miere prijal do bunky a uvoľnil sa do cytoplazmy ako bez vírusu, je to možné pripísať prijímacej schopnosti vírusu. Je tiež možné porovnávať testovaný vírus na jeho prijímaciu ľunkciu s takým vírusom, o ktorom sa vie, že má vhodnú prijímaciu funkciu, napríklad s adenovírusom, podskupina C, typ 5. Testovanie tohto druhu je možné aplikovať aj na vírusové konjugáty, pričom dodatočným parametrom je to, aké konjugáty s intcmalizačnými faktormi a v akých množstvách sa testujú. Navyše priemerný odborník môže používať skúšky tohto druhu, v danom prípade v spojení s inými testami, ako napríklad analýzou priepustnosti lipozómov („Liposomen Leakage Assays“) jednoduchým spôsobom na vírusové komponenty alebo iné prostriedky s potenciálnou endozomoly tickou aktivitou, aby zistil, či majú schopnosť zosilňovať génovú expresiu.
V prípade použitia intaktných vírusov, účelovo paralelne k predchádzajúcim pokusom, v ktorých vírusy boli testované na svoju schopnosť zosilňovať génový prenos, sa skúma, či majú vírusy replikačnú schopnosť. Skúmania, či vírusy majú replikačnú schopnosť, sa v prípade cytopatických vírusov alebo vírusov, ktoré výrazne ovplyvňujú rast hostiteľskej bunky, vykonávajú za pomoci Plague-assay (analýz) (porovnaj). Pri iných vírusoch sa dôkazové metódy používajú špeciálne pre každý vírus, napríklad hemaglutinačný test alebo chemicko-fýzikálne metódy (elektrónovým mikroskopom).
V rámci predkladaného vynálezu, osobitne pri použití voľných vírusov, sú uprednostňované také vírusy, ktoré možno pripraviť s vysokým titrom, ktoré sú stabilné, ktoré ako divoký typ vykazujú malú patogenitu a pri ktorých je možné cielené vypnutie replikačných funkcií, zvlášť adenovírusy. Ak sa má transfikovať určitá populácia buniek, preferujú sa vírusy, ktoré túto bunkovú populáciu špecificky infikujú. Pre prípad, že transfekcia sa týka rôznych typov buniek, je možné použiť vírusy, ktoré sú infekčné pre široký okruh typov buniek.
Požiadavkou na preparáty vírusu je ich čo najväčšia čistota ako aj pre každý vírus prispôsobený stabilizačný pufer.
V každom prípade pripadajú do úvahy na terapetické použitie podľa predkladaného vynálezu in vivo iba také vírusy alebo vírusové komponenty, pri ktorých riziko bezpečnosti, zvlášť čo sa týka replikácie vírusu v bunke, ako_aj rekombinácie DNA vírusu s DNA hostiteľa, je čo najviac minimalizované.
Výhodne je možné použiť vstupné mechanizmy vínisov, ktoré infikujú iné zvieratá ako ľudí, aby zosilnelo prijímanie a uvoľňovanie DNA vo vyšších eukaryotických bunkách, osobitne v humánnych, pokiaľ vírus v bunke vykáže schopnosť dostať sa von z endozómu. Členovia adenovírusovej rodiny sa izolovali z rôznych vtáčích druhov, amfíbií a rôznych iných zvierat (pozri napríklad Laver et al., 1971; Bragg et al., 1991; Akopian et al., 1991; Takase et al., 1990; Khang a Nagaraji, 1989 a Reece et al., 1987). Adenovírusy z amfíbií, vtákov, hovädzieho dobytka, psov, myší, oviec, prasiat a opíc, ako aj humánne adenovírusy, je možné kúpiť od Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland (pozri Američan Type Culture Collection Catalogue of Animal Viruses and Antisera, Chlamydae and Rickettsiae, 6. vyd., 1990, C. Buck a G. Paulino Hsg., str. 1 -17).
Možnými prednosťami použitia vírusu, napríklad adenovírusu vzdialeného druhu, by mohla byť znížená toxicita v cieľových bunkách (napríklad by sa nečakalo, že slepačí alebo žabí adenovírus sa bude replikovať v bunkách cicavcov alebo že sa skôr vyvolá expresia génov), čo v porovnaní k humánnym adenovírusom znižuje riziko vedca, aké tento vírus vzdialeného druhu predstavuje, a spôsobuje znížené rušenie protilátkami oproti humánnemu alebo myšaciemu adenovírusu. Absencia rušivých vplyvov humánnymi alebo myšacími protilátkami je mimoriadne dôležitá, ak sa vírusy využijú na génovú terapiu v človeku alebo myši.
Slepačí adenovírus CELO (Chick Embryo Lethal Orphan Vírus) nevykazuje žiadnu reaktivitu s protilátkami, ktoré rozpoznajú epitopy hlavnej skupiny adenovírusov, infikujúcich bunky cicavcov. Okrem toho môžu CELO-vírusy byť pestované vo vajíčkach s embryonálnym vývojom, aby sa získal vírus vo veľkých množstvách (0,5 mg/vajíčko; Laver et al., 1971). Ako vyplýva z uvedených príkladov, zosilujú konjugáty CELO-polylyzín prenos
DNA do lleLa buniek v takej miere, aká je porovnateľná s humánnym adenovírusom dl312. Použitie CELO-konjugátu na zosilnenie transportu DNA je preto pre humánnu génovú terapiu veľmi sľubné.
Vírusy vzdialených druhov sú výhodné pre nasadenie ako súčasti vírusových konjugátov v kombinačných komplexoch (podľa definície v rámci predkladaného vynálezu).
Podľa vynálezu v konjugátoch, ktoré obsahujú vírus, môže byť väzba vírusu na väzobnú doménu nukleovej kyseliny kovalentná alebo nekovalentná, nekovalentná napríklad cez mostík biotín/streptavidín, alebo v prípade, že vírus vykazuje na svojich povrchových proteínoch oblasti, ktoré sú kyslé, a preto sa môžu viazať na polykation tonovou väzbou.
V pokusoch boli vytvorené komplexy za takých podmienok, ktoré povoľujú vzájomné ionové pôsobenie medzi adenovírusom a polylyzínom pred komplexovaním s DNA. Ako kontrola boli vykonané pokusy za podmienok, za ktorých najprv bol polylyzín neutralizovaný s DNA, a tým už nebol voľný, aby sa mohol viazať na adenovírus. V týchto pokusoch sa preukázali ako schopnejšie komplexy s ionovo viazaným adenovírusom.
Príkladom vírusových komponentov podľa zistených konjugátov s endozomolytickou činnosťou sú prázdne víruskapsidy alebo vírusové peptidy. Väzba vírusových komponentov na väzbové domény nukleových kyselín môže byť kovalentná, napríklad chemickým spojením vírusových peptidov s polylyzínom, alebo nekovalentná, napríklad iónová v prípade, že vírusové komponenty majú kyslé zvyšky, aby mohli viazať polykatióny.
Vzťah vírusov alebo vírusových komponentov k substanciám s afinitou k nukleovej kyseline môže byť rôzny. V prípade konjugátu influenzavirus-hemaglutininpeptid-polylyzín sa v rámci predkladaného vynálezu zistilo, že je možné do veľkej miery zosilniť génový prenos, ak bol vyšší obsah peptidov v konjugátoch.
Predkladaný vynález sa týka v ďalšom aspekte metód tvorby konjugátov podľa vynálezu z vírusov (vírusových komponentov) a substancie s afinitou k nukleovej kyseline.
Vírusové konjugáty môžu (ako aj konjugáty internalizaený faktor-polykation) byť vytvorené spojením komponentov alebo, ak vírusové komponenty a polykation sú polypeptidy, rekombináciou, čo sa týka metód tvorby treba brať do úvahy vynález EP 388 758.
Spájanie vírusov, vírusových proteínov alebo peptidov polyaminovými väzbami chemickou cestou sa môže diať známym spôsobom na spájanie peptidov, pričom, pokiaľ treba, sa vybavia jednotlivé komponenty spájacou (linker) substanciou (toto opatrenie je nutné vtedy, ak nie je k dispozícii žiadna na spojenie vhodná funkčná skupina, napríklad mercapto- alebo alkoholová skupina. Pri spájacích substanciách sa jedná o bifunkčné zlúčeniny, ktoré najprv reagujú s funkčnými skupinami jednotlivých komponentov, a potom nasleduje spojenie jednotlivých modifikovaných komponentov.
Spájanie sa môže diať prostredníctvom
a) disulfidových mostíkov, ktoré môžu byť za redukujúcich podmienok znovu rozštiepené (napríklad pri použití sukcinimidylpyridylditiopropionátu (Jung et al., 1981).
b) silne stabilných spojení v biologických podmienkach (napríklad Tioether reakciou Maleimido-linkerov (spájačov) so sulfohydrylovými skupinami linkerov naviazaných na druhé komponenty).
c) labilných mostíkov za biologických podmienok, napríklad esterové väzby, alebo za slabo kyslých podmienok nestabilné acetalové alebo ketalové väzby.
V pokusoch vykonaných v rámci predkladaného vynálezu sa spájali endozomolytické influenza-hemaglutinin HA2-peptidy s polylyzínom chemickou cestou prostredníctvom sukcinimidylpyridyldithiopropionátu (SPDP). Ukázalo sa, že modifikácia peptidov s polylyzínom zvýšila endozomolytickú činnosť. Transfekčné experimenty ukázali, že transferín - polylyzínom sa účinnosť génových prenosov významne zvýšila, ak konjugáty influenzapeptid polylyzín boli spolu s transferín - polylyzínom v komplexoch DNA.
Ďalej sa v pokusoch vykonaných v rámci predkladaného vynálezu spájali pomocou rozličných metód adenovírusy s polylyzínom.
Jeden spôsob spojenia s polylyzínom sa udial podobne ako pri tvorbe konjugátov transferín-polylyzín (Wagner et al., 1990) po modifikácii defektného adenovírusu dl312 prostredníctvom heterobifunkčných reagensov. Nenaviazaný polylyzín sa oddelil centrifúgáciou. Schopnosť viazať DNA sa dokázala vo väzobnom pokuse s rádioaktívne označenou DNA.
V bunkách K562 za neprítomnosti chloroquinu sa zistil podstatne zvýšený génový prenos s komplexami, ktoré pozostávali z DNA, adenovírus-polylyzínu a transferín-polylyzínu, ako s nemodifikovaným adenovírusom, ktorý nebol naviazaný na DNA. Ďalej sa zistilo, že v HeLa-bunkách sa pomocou polylyzínom modifikovaného adenovírusu udiala výrazná génová expresia s iba 0,0003 pg DNA v 5 x 105 HeLa-bunkách.
Ak vírus alebo vírusový komponent obsahuje vhodné reťazce uhľovodíkov, je možné ich s pomocou substancie s afinitou k nukleovej kyseline navzájom spájať cez jeden alebo viacej uhľovodíkových reťazcov glykoproteínu.
Vhodnou metódou na tvorbu konjugátov glykoproteínpolykatión je metóda zverejnená v nemeckom patente P 41 15 038.4; bola stručne opísaná Wagnerom et al., 1991b.
Ďalším výhodným procesom ako vytvoriť konjugáty podľa vynálezu, je enzymatické spájanie vírusu alebo vírusového komponentu so substanciou s afinitou k nukleovej kyseline, osobitne s polyamínom, prostredníctvom transglutaminázy.
Skupina transglutamináz zahŕňa viaceré rôzne enzýmy, ktoré sa nachádzajú v pokožke (epidermálne transglutaminázy), v krvi (faktor XIII) a v bunkách rozličných tkanív (tkanivové transglutaminázy) (Folk, 1985). Transglutaminázy katalyzujú v prítomnosti Ca++ a za odštiepenia NH, vytvorenie epsilon- (gama-glutamyl) lyzinových väzieb. Podmienkou tu je, že sú k dispozícii vhodné glutamíny a lyzíny na proteínoch, ktoré môžu byť z enzýmom premenené. Vedľa epsilon-amino skupiny lyzínu môžu ako substrát slúžiť (poly)aminy ako etanolamín, putrescín, spermín alebo spermidín (Čiarke et al., 1959). Nateraz nie je ešte jasné, od akých faktorov závisí, či glutamín alebo lyzín proteínu alebo polyamín môžu byť premenené enzýmom. Je známe, že mnohé bunkové proteíny ako cytokeratín (Zatloukal et al, 1989), tubulín, proteíny bunkovej membrány a aj povrchové proteíny influenzavírusov (Iwanij, 1977) môžu prostredníctvom transglutaminázy viazať polyamíny.
V rámci predkladaného vynálezu bolo možné ukázať, že sa polylyzín prostredníctvom transglutaminázy môže pripájať na adenovírusy. Zistilo sa, že možné realizovať spojenie za prítomnosti glycerínu. Toto ponúka tú výhodu, že vírusový preparát, napríklad preparát adenovírusu, ktorý v pufri obsahuje ako stabilizujúci agens glycerol, môže byť priamo použitý na spájanie. Za pomoci konjugátov adenovírus-polylyzín, ktoré spolu s konjugátmi transferín-polylyzín sú komplexované s plazmidovou DNA, sa mohli docieliť mnohonásobne vyššie génové expresie ako s konjugátmi transferín-polylyzín za prítomnosti adenovírusu spojeného nie s polylyzínom.
Ďalšia v rámci predkladaného vynálezu preferovaná metóda tvorby konjugátov podľa vynálezu spočíva v tom, že vírus alebo vírusové komponenty sa pripájajú prostredníctvom biotín - proteínového mostíka, prednostne biotín -
- streptavidínového mostíka, na polykatión.
Známe silné spojenie biotínu so streptavidínom prípadne avidínom (Wilchek et al., 1988) sa využilo na pripojenie adenovírusu k polylyzínu, pričom adenovirus bol modifikovaný biotínom, a streptavidín, podobne ako pri tvorbe konjugátov transferín - polylyzín, bol chemicky konjugovaný s polylyzínom. Komplexy, pozostávajúce z DNA a streptavidín - polylyzínu, na ktorý je naviazaný biotínom modifikovaný vírus, a v danom prípade ešte nekovalentne naviazaný polylyzín, vykazujú veľmi vysokú účinnosť transfekcie, aj pri nízkych koncentráciách DNA. Zvlášť účinné komplexy sa získali, keď biotínom modifikovaný vírus bol najprv naviazaný na streptavidin-polylyzín a len ako druhý stupeň nasleduje väzba DNA.
V danom prípade je možné vykonať väzbu na biotín aj cez avidín.
Ďalej je možné vytvoriť väzbu medzi vírusom (vírusovým komponentom) a polylyzinom tak, že na jednej strane sa biotinyluje vírus a na druhej sa konjugujú antibiotinové -
- protilátky s polylyzínom a väzba medzi vírusom a polylyzínom vznikne cez biotin/protilátkovú väzbu, pričom sú proti biotínu nasadené zvyčajné polyklonové alebo monoklonové protilátky.
Väzbu medzi vírusom a polylyzínom je možné vytvoriť aj tak, že sa spojí polylyzín s lektínom, ktorý má afinitu k vírusovému povrchovému glykoproteínu, pričom väzba v takomto konjugáte prebieha cez väzbu medzi lektínom a glykoproteínom. Ak samotný vírus nemá žiadne vhodné bočné uhľovodíkové reťazce, je možné ho príslušným spôsobom modifikovať.
Vírus je tiež možné viazať na substanciu s afinitou k nukleovej kyseline tak, že najprv je na povrchu modifikovaný vírusu cudzím antigénom (napríklad Digoxigenin DIG, ktorý sa dá získať od fy Boehringer Mannheim; alebo biotínom) a spojenie medzi modifikovaným vírusom a substanciou s afinitou k nukleovej kyseline sa deje pomocou protilátky, ktorá sa viaže na tento antigén. To, ktorá metóda na tvorbu konjugátov podľa vynálezu sa použije, sa riadi rozličnými kritériami. Tak napríklad spájanie cez biotín je najmenej špecifickou, a teda najširšie použiteľnou metódou, biotínom sprostredkovaná väzba predstavuje veľmi silnú nekovalentnú väzbu. Enzymatické reakcie s transglutaminázou majú tú výhodu, že je možné ich vykonávať aj v najmenšej miere. Chemické spojenie sa používa všeobecne vtedy, keď sa majú syntetizovať väčšie množstvá konjugátov, táto metóda je vtedy najúčelnejšia, keď sa majú spájať vírusové proteíny alebo vírusové peptidy. V prípade použitia inaktivovaných vírusov sa všeobecne inaktivuje pred spájaním, aby nebolo spájanie inaktiváciou ovplyvňované.
Ak vírus, napríklad adenovirus alebo jeho endozomolytické komponenty, majú prístupnú väzobnú doménu, napríklad kyslú doménu na viazanie sa na polykatión, môže byť väzba vírusu (vírusového komponentu) aj ionová. V takom prípade sa pozitívne náboje polykationu, ktorý je v danom prípade konjugovaný s internalizačným faktorom, čiastočne neutralizujú kyslou doménou vírusu (vírusového komponentu), zvyšok pozitívnych nábojov sa v podstate neutralizuje nukleovou kyselinou.
V prípade, že ako substancia s afinitou k nukleovej kyseline je nasadená interkalačná substancia, je modifikovaná vhodným linkerom na toto spájanie vírusu (vírusového komponentu), napríklad na spájanie sa s transglutaminázou so spermínom, alebo bifiinkčnou, na chemické spájanie kompetentnou skupinou, napríklad aktívnym esterom.
Vzťah vírus (vírusový komponent): substancia s afinitou k nukleovej kyseline sa môže meniť, obyčajne sa sprostredkúva empiricky, napríklad tak, že konštantné množstvo vírusu (vírusového komponentu) sa konjuguje s rôznymi množstvami polylyzínu, a tak sa vyberá optimálny konjugát na transfekciu.
V jednej z ďalších vykonávacích foriem vynálezu je možné vírusový komponent, napríklad endozomolytický vírusový peptid, modifikovať, aby sa dal priamo viazať na DNA. Na tento účel má samotný peptid vykázať väzobnú doménu pre DNA, ktorá sa dá získať tak, že sa peptid vytvorí peptidosyntézou, pričom vykukne úsek pozitívne nabitých aminokyselín, prednostne predĺžením peptidu, osobitne najlepšie na C-konci.
V ďalšom uskutočnení podľa vynálezu je endozomolytickým prostriedkom nevirusový, v danom prípade syntetický peptid. Peptid tohto typu je výhodne obsiahnutý; v procesoch podľa vynálezu tak, že je iónovo viazaný na substanciu s afinitou k nukleovej kyseline napríklad na polylyzín v prípade komplexov DNA/internalizačný faktor-polylyzín. Zabudovanie endozomolytického peptidu do komplexu nukleovej kyseliny sa uskutoční tak, že peptid cez svoje kyslé zvyšky aminokyselín sa naviaže na pozitívne nabitú väzobnú doménu nukleovej kyseliny, prednostne na polylyzín. V závislosti od chemickej štruktúry peptidu, hlavne jeho koncovej skupiny, je väzba na polylyzín možná aj metódami opísanými pre väzbu peptidov na polylyzín. Na tento účel je možné, ak sa použije v prírode sa vyskytujúci peptid, tento peptid modifikovať na konjugáciu, s vhodnou koncovou aminokyselinou ako „Stiel (držadlo)“.
Iný spôsob ako zabudovať nevírusové endozomolytické peptidy do komplexu nukleovej kyseliny, spočíva v tom,.že sa vybavia sekvenciami, ktoré viažu DNA. Poloha takejto sekvencie musí byť taká, že nenaruší endozomolytickú činnosť peptidu. Preto budú napríklad peptidy, ktorých N-koniec je zodpovedný za túto činnosť, predĺžené na C-konci o sekvencie viažuce DNA. Predĺženia tohto druhu môžu byť homolické alebo heterologické kationové oligopeptidy, napríklad oligolyzínový chvostík alebo prirodzená väzobná doména DNA, napríklad peptid odvodený z histonu. Prednostne zahŕňajú tieto sekvencie viažuce DNA, vytvárajúce integrálnu časť endozomolytických peptidov asi 10 až 40 aminokyselín. Táto vykonávacia forma vynálezu ponúka možnosť vyššieho pomeru endozomolytickú sekvencia : sekvencia viažuca DNA ako v konjugátoch peptidov, ktoré obsahujú väčšie podiely polykatiónov, aby sa dosiahla vyššia výkonnosť komplexov.
Nevírusové endzomolytické peptidy by mali spĺňať nasledujúce požiadavky:
Vzhľadom na endozomolytickú činnosť by mala byť peptidom spôsobená priepustnosť lipidovej membrány prednostne pri nižšej hodnote pH (5 až 6) vyššia ako pri hodnote pH 7. Ďalej by mali byť narušené oblasti membrány také veľké, aby umožnili prienik veľkých komplexov DNA (malé póry nepostačujú). Aby sa zistilo, či peptid spĺňa tieto požiadavky, je možné vykonať pokusy in vitro, v ktorých sa použijú peptidy vo voľnej alebo viazanej forme a/alebo zabudované v komplexe DNA. Takéto testy môžu zahŕňať lipozomové a erytrocytové testy priepust nosti („leakage assays“) a pokusy s bunkovými kultúrami, v ktorých sa stanoví zosilnenie génovej expresie. Testy tohto druhu sú opísané v príkladoch. Optimálne množstvo peptidov je možné určiť z predchádzajúcich titrácií tak, že sa stanoví výkonnosť výsledného génového transferu. Pritom treba zohľadniť to, že výkonnosť rôznych peptidov a optimálna skladba komplexov môže byť závislá od typu bunky.
Peptidy, ktoré prerazia membránu, obsahujú vo všeobecnosti amfipatické sekvencie, menovite hydrofóbnú stranu, ktorá môže interaktívne pôsobiť na lipidovú membránu, hydrofilnú stranu, ktorá stabilizuje vodnú fázu na mieste, kde sa pretrhne membrána.
V prírode existuje niekoľko príkladov peptidov, ktoré pretrhnú membránu na obyčajne malé peptidy alebo peptidové domény veľkých polypeptidov. Takéto peptidy môžu byť klasifikované podľa prirodzeného kontextu buď ako peptidy narušujúce membránu, (napríklad peptidy „holých“ vírusov) a/alebo peptidy fúzujúce s membránou (napríklad peptidy vírusov s obalom). Na únik z endozómov v súvislosti so syntetickými peptidami sa môžu využiť obe triedy peptidových sekvencií. Väčšina prirodzených peptidov môže vytvárať amfipatické a-helixy.
Zabudovaním kyslých zvyškov na hydrofilnej strane predpokladaného amfipatického α-helixu je možné dosiahnuť špecifickosť pH tak, že helix sa môže vytvoriť iba pri kyslej pH-hodnote, ale nie pri neutrálnej hodnote pH, pri ktorej odpor nábojov medzi záporne nabitými kyslými zvyškami bráni tvorbe helixu. Táto vlastnosť sa nachádza aj pri prirodzených sekvenciách (napríklad N-koniec peptidu iníluenza-HA2).
Úplne syntetický amfipatický peptid so špecifickými pH-vlastnosťami pre narušenie membrány bol opísaný Surbaom et al., 1987, a Parentem et al., 1990. O tomto peptide (vo voľnej forme) sa ukázalo, že vytvára na membráne iba malé póry, ktoré dovoľujú uvoľnenie iba malých zlúčenín (Parente et al., 1990).
V rámci vykonávacej formy predkladaného vynálezu, ktorá používa nevírusové, v danom prípade syntetické peptidy, sa obyčajne podniknú nasledujúce kroky: zo skupiny v prírode sa vyskytujúcich alebo umelých peptidov sa vyberie amfipatická peptidová sekvencia. Peptidy tohto druhu patria do stavu techniky; prehľad príkladov je daný v tabuľke 2. Ak je to potrebné, zavedú sa kyslé zvyšky (Glu, Asp), aby sa aktivita peptidu, pretrhnutie membrány, spravila viac pH-špecifickou (napríklad dvojito kyslé mutanty influenza - hemaglutininpeptid označenia P50 podľa príkladu 37). Keď je to potrebné, je možné tiež vniesť kyslé zvyšky, aby sa uľahčila väzba peptidov na polylyzín. Jedna možnosť, ako zabezpečiť takúto polykatiónovú väzobnú doménu, spočíva v obstaraní kyslého predĺženia na C-konci, napríklad oligo-Glu-chvostík.
Na predkladaný vynález vhodné endozomolytické peptidy sa dajú získať aj tak, že sa zjednotia v prírode sa vyskytujúce a umelé sekvencie. V priebehu prác na predkladanom vynáleze boli vykonané príklady s rôznymi peptidmi, odvodené od Parentem et al., 1990 opísaného syntetického peptidu GALA. Niektoré v príkladoch podľa vynálezu použité deriváty sa získali tak, že peptid GALA alebo jeho moodifikácie so sekvenciami influenzapeptidov sa skombinovali, napríklad peptidy s označením EALA-inf a EALA-P50, ako je v príklade 37.
Dĺžka peptidových sekvencií môže byť s ohľadom na amfipatické helixy kritická; predĺžením helixu je možné docieliť zvýšenie stability krátkych domén, odvodených od prirodzených proteínov, ktorým chýba kontext stabilizujúceho proteínu.
Aby sa zvýšila endozomolytická aktivita činnosti peptidov, je možné vytvoriť homodiméry, heterodiméry alebo oligoméry; v príkladoch sa ukázalo, že diméry P50 vykazujú oveľa vyššiu činnosť ako monomér.
Zistil sa účinok syntetických peptidov na prijímanie DNA prostredníctvom konjugátov transferín-polylyzín. Boli syntetizované viaceré rôzne peptidy, určená ich schopnosť spriepustniť lipozómy a erytrocyty a boli testované ich účinky na luciferázovú expresiu v bunkách TIB 73 a NIH 3T3.
V ďalších vykonávacích formách vynálezu je endozomolytický prostriedok nepeptická amfipatická substancia. Požiadavky, aké musí substancia spĺňať, aby bola vhodná na použitie podľa vynálezu, sú v podstate tie isté ako pre peptickú amfipatickú substanciu, hlavne sa jedná o schopnosť integrovať sa do komplexov nukleových kyselín, pH-špecifičnosť, atď.
Vynález sa v svojom ďalšom aspekte týka komplexov, prijímaných do vyšších eukaryotických buniek, ktoré obsahujú nukleovú kyselinu a konjugát, ktorý má schopnosť tvoriť komplex s nukleovou kyselinou na prienik do vyšších eukaryotických buniek. Komplexy sa vyznačujú tým, že obsahujú konjugát, skladajúci sa zo substancie s afinitou k nukleovej kyseline a endozomolytického prostriedku, ktorý je naviazaný na substanciu s afinitou k nukleovej kyseline a má tú schopnosť, že je ako súčasť komplexu konjugát/nukleová kyselina prijímaný do bunky a uvoľňuje obsah endozómu, v ktorom je po vstupe do bunky lokalizovaný, do cytoplazmy.
Komplexy nukleových kyselín, ktoré sa používajú v rámci predkladaného vynálezu, sú predovšetkým také, v ktorých je nukleová kyselina komplexovaná so substanciou s afinitou k nukleovej kyseline takým spôsobom, že komplexy sú v podstate elektroneutrálne.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je endozomolytickým prostriedkom vírus alebo vírusový komponent, ktorý, prípadne ktoré sú kovalentné naviazané na polykatión.
V rámci predkladaného vynálezu zahŕňajú endozomolytické konjugáty - dodatočne ku konjugátom, v ktorých je endozomolytický prostriedok iónovo viazaný na väzobnú doménu DNA - podľa definície aj endozomolytické prostriedky, ktoré priamo viažu DNA, napríklad cez svoje bázické predĺženie, hoci „konjugáty“ tohto druhu prísne vzaté nevznikli kojugáciou, t. j. vzájomným naviazaním sa dvoch komponentov. Funkcia endozomolytického prostriedku tohto druhu ako súčasti zisteného zloženia je nezávislá od toho, či boli syntetizované konjugáciou endozomolytického prostriedku a väzobnej domény DNA alebo či bola v endozomolytickom prostriedku k dispozícii väzobná doména DNA.
Vo výhodnom uskutočnení podľa vynálezu obsahujú komplexy okrem endozomolytického konjugátu aj ďalší konjugát, v ktorom substancia s afinitou k nukleovej kyseline v prípade endozomolytického polykationového konjugátu vo všeobecnosti tá istá ako v konjugáte, je spojená s internalizačným faktorom s afinitou k cieľovej bunke.
Táto vykonávacia forma predkladaného vynálezu sa používa predovšetkým vtedy, keď cieľová bunka nemá alebo má málo receptorov na vírus, ktorý je súčasťou endozomolytického konjugátu. Ďalšie využitie tejto vykonávacej formy je to, pri ktorej sa nasadí vírusový komponent, napríklad prirodzene sa vyskytujúci alebo prípadne modifikovaný peptid, nevírusový, prípadne syntetický endozomolytický peptid alebo vírus vzdialeného druhu, ktorý nemá schopnosť sám o sebe preniknúť do transfikovanej bunky. Za prítomnosti ďalšieho konjugátu intemalizačný faktor/viažuci faktor profitujú tieto endozomolytické konju
SK 281682 Β6 gáty z intemalizačnej schopnosti druhého konjugátu tak, že sú spolu s ním komlexované s nukleovou kyselinou a sú ako súčasť takto vzniknutého komplexu, naďalej nazývaného „kombinačný komplex“ alebo „trojitý' komplex“, prijaté do bunky. Bez toho, že by sme sa chceli nasilu držať tejto teórie, sú kombinačné komplexy prijaté do bunky buď väzbou na povrchové receptory špecifické pre intemalizačný faktor alebo v prípade použitia vírusu, alebo vírusového komponentu väzbou na vírusové receptory, alebo väzbou na oba receptory cestou receptormi sprostredkovanej endocytózy. Pri uvoľňovaní endozomolytického prostriedku z cndozómu sa uvoľní aj v komlexoch obsiahnutá DNA do cytoplazmy a unikne tak lyzozomálnemu odbúraniu.
Pri pokusoch podľa vynálezu s HeLa-bunkami mohli byť takmer všetky bunky transfikované voľným adenovírusom. Výkonnosť hepatocytov mohla byť ďalej stupňovaná, ak sa použili trojité komplexy DNA, v ktorých je reportérová-DNA komplexovaná s konjugátmi polylyzín-transferín a naviaže sa na adenovírus. Tu bola dosiahnutá spoločná lokalizácia endozomolytického vírusu a komplexu ligand/receptor v endozómoch, pričom pre rôzne bunky, ako BNL.CL2- a HepG2- bunky bola docielená transfekcia prakticky všetkých buniek. Takejto situácii je možné sa priblížiť v pokusoch, v ktorých trojité, transferín obsahujúce komplexy nájdu cestu do buniek cez transferínové receptory skôr ako cez receptory adenovírusu v K562 - bunkách.
Na prekvapenie prenášali trojité komplexy DNA dokonca aj vo veľmi nízkych množstvách. Tak pri nasadení 30 pg DNA na 3 x 105 buniek sa získalo 1,8 x 104 svetelných jednotiek (vyplývajúcich z expresie sekvencie kódujúcej luciferázu obsiahnutej v plazmide). Pri takomto vstupe pripadne na jednu bunku iba 60 molekúl DNA a 1 PFU na vírus („Plague Forming Unit“). Na porovnanie: menej účinný precipitačný predpis vápnikom používa 2 x 105 molekúl DNA na bunku (Sambrook et al., 1989). Predkladaný vynález teda predstavuje významný pokrok preto, že povoľuje účinnú transfekciu vyšších eukaryotických buniek s veľmi malými množstvami DNA.
Prítomnosť vírusov, vírusových komponentov alebo nevírusových endozomolytickým prostriedkov ako súčastí endozomolytických konjugátov v komplexoch DNA má nasledujúce výhody:
1) širšiu aplikovateľnosť techniky génového prenosu s komplexami nukleových kyselín, pretože endozomolytický prostriedok samotný, osobitne v takom prípade, keď sú nasadené vírusy alebo vírusové komponenty môže predstavovať intemalizačný faktor alebo aj v kombinácii s ďalším intemalizačným faktorom (napríklad transferínom alebo asialofetuínom a podobne) sa môže komplexovať s DNA. Preto je možné využiť pozitívny účinok vírusov aj pre také bunky, ktoré nemajú receptory pre príslušný vírus.
2) zlepšenie účinnosti génového prenosu, pretože naviazaním sa endozomolytických konjugátov na DNA sa docieli spoločné prijatie do bunky. Koordinovaným príjmom a uvoľnením vírusov a DNA sa otvára možnosť redukcie množstva DNA a vírusov na účinný génový prenos, čo má podstatný význam na použitie in vivo.
Pod intemalizačným faktorom sa v rámci predkladaného vynálezu chápu ligandy alebo ich fragmenty, ktoré naviazaním sa na bunku prostredníctvom endocytózy, predovšetkým receptorom sprostredkovanou endocytózou, sú internalizované, alebo faktory, ktorých väzba/intemalizácia sa deje fúziou s elementárni bunkovej membrány.
Ku vhodným intemalizačným faktorom sa počítajú ligandy transferín (Klausner et al., 1983), conalbumin (Sennet et al., 1981), azialoglykoproteíny (ako azialotransferín, asialorosomucoid alebo asialofetuin) (Ashwell et al., 1982), Lectiny (Goldstein et al., 1980 a Shardon, 1987), prípadne substancie, obsahujúce galaktózu a sú internalizované cez receptor azialolykoproteínu; manozylované glykoproteíny (Stahl et al., 1987), lyzozomové enzýmy (Sly et al., 1982), LD1 (Goldstein et al., 1982), modifikované LDL (Goldstein et al., 1979), lipoproteíny, ktoré sú prijímané do bunky receptormi (apo B100/LDL); vírusové proteíny, ako HIV-proteín gpl20; protilátky (Mellman et al., 1984, Kuhn et al., 1982, Abrahamson et al., 1982) pripadne ich fragmenty proti antigénom bunkového povrchu, napríklad anti-CD4, anti-CD7; cytokíny ako interleukin-1 (Mizel et al., 1987), interleukin-2 (Smith et al., 1987), TFN (Imamure et al., 1987), interferóny (Anderson et al., 1982; CSF („Colonystimulated Factor“), (Walker et al., 1987), faktory a rastové faktory ako inzulín (Marshall, 1985), EGF („Epitermal Growth Factor“), (Carpenter, 1984); PDGF („Plateletderived Growth Factor“), (Heldin et al., 1982), TGFB (Transforming Growth Factor), (Massague et al., 1986), nervový rastový faktor (Hosang et ak, 1987), inzulínu podobný rastový faktor I („Insulin-like Growth Factor“), (Schalch et al., 1986), LH, FSH (Ascoli et al., 1978), rastový hormon (Hizuka et al., 1981), prolactín (Posner et al., 1982), glucagon (Asada-Kubota et al., 1983), tyriodálne hormóny (Cheng et al., 1980), α-2-makroglobulín-proteáza (Kaplan et al., 1979), ako aj „odzbrojené“ toxíny. Ďalším príkladom sú imunoglobulíny alebo ich fragmenty ako. ligandy pre Fc-receptor alebo anti-imunoglobulínové protilátky, ktoré sa viažu na Slgs („Surface Immunoglobulins“). Ligandy môžu byť prirodzeného alebo umelého pôvodu (pozri Trends Pharmavol. Sci., 1989, a v nich citované referencie).
Podstatné pre vhodnosť takýchto internalizačných fak« torov v rámci predkladaného vynálezu je,
a) že môžu byť internalizované špecifickým typom bunky,, do ktorej majú vniesť nukleovú kyselinu, a ich internalizačná schopnosť nie je významne ovplyvnená, ak sú konjugované s viažucim faktorom, a
b) že v rámci týchto schopností sú v stave vniesť na nimi používanej ceste „na chrbte“ do bunky so sebou nukleovú kyselinu.
V pokusoch, vykonaných v rámci predkladaného vynálezu, sa ukázala široká aplikovateľnosť vynálezu vzhľadom na intemalizačný faktor, prípadne dodatočné internalizačné faktory v kombinačných komplexoch na základe humánnych a myšacích konjugátov transferín - polylyzín, azialofetuín - polylyzín konjugátov, konjugátov galaktóza -
- polylyzín, konjugátov aglutinínu z pšeničných klíčkov -
- pL, konjugátov z pre T-bunky špecifických gpl20-pL a anti CD7-pL, konjugátov LDL - pL, konjugátov Ig-pL a anti- Ig-pL ako aj na základe komplexov DNA-polylyzinu, ktoré neobsahujú žiaden intemalizačný faktor. Okrem toho sa pomocou komplexov z DNA a s polylyzínom konjugovaného vírusu (vírusového komponentu), ktoré neobsahujú žiaden dodatočný konjugát intemalizačný faktor-viažuci faktor, ukázala výkonnosť zistených vírusových konjugátov.
Jednotlivo sa dá v predbežných pokusoch určiť pri použití intemalizačného faktora, či v prípade, ak sa použije ako endozomolytický prostriedok voľný vírus alebo vírusový komponent alebo nevírusový peptid ako súčasť endozomolytického konjugátu, „dodatočný“ viažuci faktor zlepšuje alebo umožňuje prijatie komplexu nukleovej kyseliny. Takéto testy zahŕňajú paralelné transfekcie s komplexami nukleových kyselín raz bez (dodatočného) intemalizačného faktora, napríklad v prípade vírusových konjugátov s komplexami, pozostávajúcimi z nukleovej kyseliny a vírusové
SK 281682 Β6 ho konjugátu, a raz s komplexami, v ktorých nukleová kyselina s ďalším konjugátom, ktorý obsahuje ďalší internalizačný faktor, pre ktorý majú cieľové bunky receptor.
Pri použití intemalizačného faktora alebo dodatočného internalizačného faktora, t. j. keď sa použije kombinačný komplex, je tento definovaný najmä cieľovými bunkami, napríklad istými povrchovými antigénmi alebo receptormi, ktoré sú špecifické pre daný typ bunky a tak umožňujú riadený import nukleovej kyseliny do tohto typu bunky.
Substancie s afinitou k nukleovej kyseline vhodné na použitie v rámci predkladaného vynálezu sú napríklad homologické organické polykatióny ako polylyzín, polyarginín, polyornitín alebo heterogénne polykatióny s dvoma alebo viacerými rozdielnymi kladne nabitými aminokyselinami, pričom tieto polykatióny môžu mať rôznu dĺžku reťazcov, ďalej nepeptidové syntetické polykatióny ako polyetylénimín. Vhodnými substanciami s afinitou k nukleovej kyseline sú ďalej prirodzené proteíny viažuce DNA polykationického charakteru ako históny alebo protamíny prípadne analógy alebo fragmenty obidvoch, ako spermín a spermidín.
Dĺžka polykatiónu nie je kritická, nakoľko komplexy vzhľadom na preferovanú vykonávaciu formu sú v podstate elektroneutrálne. Uprednostňovaný rozsah dĺžky polylyzínového reťazca je ca. od 20 po 1000 lyzinových monomérov. Avšak pre istú predkladanú dĺžku DNA neexistuje kritická dĺžka pre polykatión. Ak DNA pozostáva z 6000 bp a 12 000 negatívnych nábojov, množstvo polykatiónu na mol DNA môže byť napríklad 60 mol polylyzínu 200 alebo 30 mol polylyzínu 400 alebo 120 mol polylyzínu 100, atď.
Priemerný odborník môže prostredníctvom jednoduchých rutinných pokusov vybrať iné kombinácie dĺžky polykatiónu a molámych množstiev.
Ďalšími vhodnými substanciami s afinitou k nukleovej kyseline, ako súčasti konjugátov, sú ďalej interkalačné substancie ako etidiumdiméry, akridín alebo interkalačné peptidy, obsahujúce tryptofán a/alebo tyrozín a/alebo fenylalanín.
Vzhľadom na kvalitatívne zloženie komplexov nukleových kyselín je všeobecne najskôr stanovovaná nukleová kyselina, ktorú treba importovať do bunky. Nukleová kyselina je definovaná predovšetkým biologickým účinkom, aký sa má docieliť v bunke, v prípade použitia v rámci génovej terapie génom alebo génovým úsekom vedúcim k expresii, napríklad nahradením defektného génu alebo cieľovou sekvenciou génu, ktorý treba inhibovať. Pri nukleových kyselinách, ktoré treba transportovať do bunky, sa môže jednať o DNA alebo RNA, pričom vzhľadom na nukleotidovú sekvenciu nejestvujú obmedzenia.
Ak sa vynález využije pri tumorových bunkách, aby sa tu využili ako rakovinová vakcína, kóduje v bunke, do ktorej sa zavádza, predovšetkým substanciu modulujúcu imunitu, napríklad cytokín ako 1L-12, IL-4, IFN-gama, TNF-a. Mimoriadne užitočné môžu byť kombinácie DNA, kódujúce cytokíny, napríklad 1L-2 a IFN-gamma. Ďalším génom, pre ktorý je prienik do tumorových buniek užitočný, je „Multi Drug Restistance Gene“ (mdr). V predkladanom vynáleze boli úspešne nasadené na transfekciu tumorových buniek (melanómové bunky) konjugáty transferín-polylyzín a konjugáty lipoproteínov s nízkou hustotou spolu s konjugátmi adenovírusu. V závislosti od špecifických použití sa zistilo v predchádzajúcich pokusoch, ktoré ligandy sú vhodné na špeciálne použitie pre určité tumorové bunky.
Je možné vniesť aj dve alebo viac rôznych sekvencií nukleovej kyseliny do bunky, napríklad plazmid, obsahujú ci cDNA, kódujúci dva rôzne proteíny, pod kontrolou vhodných regulačných sekvencií, alebo dve rôzne plazmidové konštrukcie, obsahujúce rôzne cDNA.
K terapeuticky účinným inhibujúcim nukleovým kyselinám, ktoré sa vnášajú do bunky s cieľom inhibovať špecifické génové sekvencie, patria génové konštrukcie, z ktorých sa transkribujú antisense-RNA alebo ribozómy. Ďalej je tiež možné vnášať do bunky oligonukleotidy, napríklad antisenseoligonukleotidy. Antisenseoligonukleotidy zahŕňajú najčastejšie 15 nukleotidov alebo viac. V danom prípade môžu byť oligonukleotidy multimerizované. Ribozómy sa do bunky zavádzajú ako časti génovej konštrukcie, ktorá obsahuje stabilizujúce génové elementy, napríklad tRNA- génové elementy. Génové konštrukcie tohto typu sú zverejnené v EP A O 387 775. Inhibujúce nukleové kyseliny a ich mechanizmy účinku sú priemernému odborníkovi známe; vzhľadom na to sa odvolávame na prehľadný článok od Helene a Tolme, 1990, a Takayama a Inouye, 1990, ako aj na v nich citované odvolávky.
Okrem molekúl nukleových kyselín, ktoré inhibujú gény, napríklad vírusové gény, na základe ich komplementarity, môžu byť použité aj gény s iným inhibujúcim účinkom. Príkladom pre toto sú gény, ktoré kódujú vírusové proteíny, ktoré majú tzv. transdominantné mutácie (Herskowitz, 1987). Expresiou génov v bunke vzniknú proteíny, ktoré ovládnu príslušný divoký typ proteínu, a tak chránia bunku, ktorá získa bunkovú imunitu tým, že zabraňujú replikácii vírusu. Vhodné sú transdominantné mutácie vírusových proteínov, nutných na replikáciu a expresiu, napríklad gag-, tat-, a rev-mutanty, o ktorých sa zistilo, že inhibujú replikáciu HIV (Trono et al., 1989; Green et al., 1989; Málim et al., 1989).
Iný mechanizmus na dosiahnutie vnútrobunkovej imunity zahŕňa expresiu molekúl RNA, ktoré obsahujú väzobné miesto pre esenciálny vírusový proteín, napríklad tzv. „TAR Decoys“ (Sullenger et al., 1990).
Príkladom v rámci somatickej génovej terapie použiteľných génov, ktoré s pomocou predkladaného vynálezu môžu byť ako súčasť génových konštrukcií prijaté do bunky, sú faktor VIII (hemofília A), (pozri napríklad Wood et al., 1984), faktor IX (hemofília B), pozri napríklad Kuchári et al., 1982), adenozindeamináza (SCID), (pozri Valerio et al., 1984), a-1 antitrypsín (pľúcny emfyzém), pozri napríklad Ciliberto et al., 1985), alebo „Cystic fíbrosis transmembrane conductance regulátor gene“ (pozri napríklad Riordan et al., 1989). Tieto príklady nepredstavujú žiadne obmedzenie.
Vzhľadom na veľkosť nukleových kyselín je možné široké použitie; s pomocou predkladaného vynálezu je možné dostať do bunky molekuly nukleových kyselín rádovo veľkých ca 0,5 kb (v prípade tRNA-génu obsahujúceho ribozomový gén) po ca. 50 kb a viac; menšie molekuly nukleových kyselín sa môžu použiť ako oligonukleotidy.
Je zjavné, že práve na základe skutočnosti, že predkladaný vynález nemá žiadne obmedzenia vzhľadom na génové sekvencie a že s pomocou vynálezu je možné do bunky transportovať aj veľmi veľké génové konštrukcie, sú dané najširšie možnosti využitia.
Vychádzajúc z nukleovej kyseliny sa určuje substancia s afinitou k nukleovej kyseline, prednostne organická polykationová substancia, ktorá zaručí komplexovanie nukleovej kyseliny, takto získané komplexy sú prednostne v podstate elektroneutrálne. Ak komplexy popri endozomolytickom konjugáte obsahujú konjugát z intemalizačného faktora a substancie s afinitou k nukleovej kyseline, berie sa do úvahy kationový podiel obidvoch konjugátov vzhľadom na aspekt elektroneutrality.
V priebehu predchádzajúcich vynálezov sa zistilo, že optimum importu nukleových kyselín sa môže docieliť, keď sa pomer konjugát:nukleová kyselina zvolí tak, že komplexy intemalizačný faktor-polykatión/nukleová kyselina sú čo najviac elektroneutrálne. Zistilo sa, že sa množstvo nukleovej kyseliny prijatej do bunky nezmenší, ak sa časť konjugátu transferín-polykatión nahradí nekovalentne viazaným polykatiónom; v istých prípadoch sa dokonca docielilo zvýšenie príjmu DNA (Wagner et al., 1991a). Pritom sa pozorovalo, že DNA sa v rámci komplexu zhustila do toroidných štruktúr s priemerom 80 - 100 nm. Množstvo polykatiónu sa tak zvolí vzhľadom na obidva parametre elektroneutrality a docielenia kompaktnej štruktúry, pričom množstvo polykatiónu, ktoré vyplynie z ohľadu na docielenie elektroneutrality z náboja nukleovej kyseliny, vo všeobecnosti zaručí aj zhusťovanie DNA.
V danom prípade tak v ďalšej vykonávacej forme vynálezu obsahujú komplexy navyše substancie viažuce nukleovú kyselinu vo forme nekovalentnej väzby, ktoré môžu byť rovnaké alebo odlišné od viažuceho faktora, teda substancie s afinitou k nukleovej kyseline v konjugátoch. Pre prípad, že endozomolytickým prostriedkom je voľný vírus, zahŕňajú komplexy nukleovú kyselinu a konjugát intemalizačného faktora. Pre prípad, že sa použije endozomolytický napríklad vírusový konjugát, nukleová kyselina sa komplexuje s konjugátom, v danom prípade spoločne s konjugátom dodatočného intemalizačného faktora. Výber nekovalentne viazanej „voľnej“ substancie s afinitou k nukleovej kyseline čo do druhu a množstva je okrem toho prispôsobený konjugátu alebo konjugátom, pričom sa zohľadňuje hlavne viažuci faktor v konjugáte: ak je viažuci faktor napríklad substancia, ktorá nemá alebo má obmedzenú schopnosť kondenzácie DNA, je vzhľadom na efektívnu intemalizáciu komplexu účelné, nasadiť takú substanciu s afinitou k DNA, ktoré majú túto vlastnosť v silne vyvinutej miere. Ak je viažucim faktorom samotná substancia kondenzujúca nukleovú kyselinu a je ním spôsobené dostatočné zhustenie nukleovej kyseliny vzhľadom na účinnú internalizáciu, použije sa účelovo substancia s afinitou k nukleovej kyseline, ktorá spôsobí inými mechanizmami zvýšenie expresie.
V rámci predkladaného vynálezu ku vhodným nekovalentne viazaným substanciám s afinitou k nukleovej kyseline patria zlúčeniny so schopnosťou kondenzovať nukleové kyseliny a/alebo ich chrániť pred nežiaducim odbúravaním v bunke, osobitne už zavedené substancie polykatiónového charakteru. Ďalšou skupinou vhodných substancií sú také, ktoré naviazaním sa na nukleovú kyselinu spôsobia zlepšenie transkripcie/expresie tak, že zlepšia v bunke prístupnosť nukleovej kyseliny mašinérii na expresiu. Príkladom takejto substancie je chromozómový nehistónový proteín HMG1, o ktorom sa zistilo, že má schopnosť zhusťovať DNA a docieliť jej expresiu v bunke.
Pri určovaní molámeho pomeru endozomolytický prostriedok a/alebo intemalizačný faktor/substancia s afinitou k nukleovej kyseline/nukleová kyselina(y) treba zohľadniť, že sa uskutoční komplexovanie nukleovej kyseliny(ín) a je zaručené, že vytvorený komplex sa naviaže na bunku, prenikne do bunky a že sám alebo s pomocou endozomolytického prostriedku bude uvoľnený z endozómu.
Vybraný pomer intemalizačný faktor/viažuci faktor/ nukleová kyselina sa riadi predovšetkým veľkosťou polykatiónovej molekuly ako aj počtom a rozdelením pozitívne nabitých zoskupení, kritériami, ktoré sú v súlade s veľkosťou a štruktúrou nukleových kyselín, ktoré treba preniesť. Výhodne má molárny pomer intemalizačný faktor: sub stancia s afinitou k nukleovej kyseline hodnoty približne 10 : 1 až 1 : 10.
Podľa konštrukcie a syntézy konjugátov a určenia optimálneho pomeru konjugát(ov) : DNA pre účinnosť transfekcie je možné stanoviť za pomoci titrovania množstvo podielu konjugátu intemalizačného faktora, ktorý je v danom prípade možné nahradiť voľnou substanciou s afinitou k nukleovej kyseline. V prípade použitia polykatiónov môžu byť polykatióny rovnaké alebo rozdielne pre viažuci faktor ako aj pre substanciu s afinitou k nukleovej kyseline.
Pre vykonávaciu formu vynálezu, pri ktorej sa používajú vírusové konjugáty, existuje vhodná metóda na stanovenie pomeru v komplexe sa nachádzajúcich komponentov tak, že sa najprv definuje génová konštrukcia, ktorá sa má importovať do bunky, a ako je opísané nájde sa vírus alebo vírusové komponenty vhodné na tú konkrétnu transfekciu. Potom sa vírus alebo vírusové komponenty naviažu na polykatión a skomplexujú sa s génovou konštrukciou. Vychádzajúc z definovaných množstiev vírusového konjugátu je možné vykonať titrácie tak, že sa cieľové bunky budú ošetrovať s týmto (konštantným) množstvom konjugátu a so znižujúcou sa koncentráciou DNA alebo naopak. Tak sa zisti optimálny pomer DNA/vírusový konjugát. Pri použití dodatočného intemalizačného faktora sa postupuje napríklad tak, že sa vyjde z konštantného množstva DNA a titráciou sa stanoví optimálny pomer medzi vírusovým konjugátom a konjugátom intemalizačného faktora.
Komplexy sa vytvárajú tak, že sa zmiešajú komponenty i) nukleová kyselina, ii) vírusový konjugát, prípadne iii) konjugát intemalizačný faktor/viažuci faktor a prípadne iv) nekovalentne viazaná substancia s afinitou k nukleovej kyseline, ktoré sú každý vo forme zriedených roztokov. V prípade použitia polykatiónov ako viažucich faktorov a súčasne ako „voľné“ polykatióny je vo všeobecnosti účelný aby sa najprv zmiešali konjugáty s voľnými polykatiónmi a túto zmes potom spojiť s DNA. Pritom sa optimálny pomer medzi DNA ku konjugátom a polykatiónom určuje titračnými pokusmi, t. j. v rade transfekčných experimentov s konštantným množstvom DNA a zvyšujúcim sa množstvom zmesi konjugát(ov)/polykationov. Optimálny pomer konjugát(ov): polykatiónov v zmesi sa určí za pomoci rutinných pokusov prípadne z porovnania optimálnych pomerov zmesí použitých v titračných pokusoch.
Tvorba komplexov DNA sa môže diať pri fyziologických koncentráciách soli. Ďalšou možnosťou je použitie vysokých koncentrácií soli (asi 2M NaCl) a následné nastavenie na fyziologické podmienky pomalým zrieďovaním, prípadne dialýzou.
Najvhodnejšie poradie pre zmiešanie komponentov nukleovej kyseliny, konjugátov, pripadne nekovalentne viazaných voľných substancii s afinitou k nukleovej kyseline sa stanovuje vždy v predbežných pokusoch. Niekedy sa ukáže ako účelné komplexovať najprv nukleovú kyselinu s konjugátom a len potom pridať voľnú substanciu s afinitou k nukleovej kyseline, napríklad polykatión, napríklad v prípade konjugátu transferín-etidiumdimer a polylyzínu.
V preferovanej vykonávacej forme vynálezu je (dodatočným) internalizačným faktorom transferín a viažucim faktorom polykatión. Pod pojmom „transferín“ sa chápu tak prirodzené transferíny ako aj tie modifikácie transferinu, ktoré sú receptorom naviazané a vnesené do bunky.
Prijatie nukleovej kyseliny do bunky sa deje vo forme komplexov, v ktorých je konjugát intemalizačný faktor-polykatión komplexovaný s nukleovou kyselinou. V prípade väzby na nekovalentne viazanú substanciu s afinitou k nukleovej kyseline, je touto prednostne polykatión, ktorý je rovnaký alebo rôzny od polykatiónu obsiahnutého v konjugáte.
V prípade kombinačného komplexu je nukleová kyselina intemalizovaná vo forme komplexov, v ktorých sú komplexované na jednej strane konjugáty internalizačného faktora a na druhej strane endozomolytické konjugáty s nukleovou kyselinou.
Konjugáty internalizačný faktor-polykatión, ktoré sa používajú spoločne s voľným vírusom alebo vírusovým konjugátom v kombinačných komplexoch, sa môžu vytvoriť chemickou cestou alebo, ak je polykatiónom polypeptid, aj rekombinačnou cestou, čo sa týka metód tvorby, berie sa do úvahy, čo bolo zverejnené v EP 388 758.
Konjugáty sa dajú vytvoriť aj tak, že sa navzájom previažu glykoproteín, napríklad transferín, a viažuci faktor prostredníctvom jedného alebo viacerých uhľovodíkových reťazcov glykoproteínu. Také konjugáty sú oproti prostredníctvom obyčajného spájacieho procesu vzniknutému konjugátu prosté modifikácií, vznikajúcich z použitých spájacích substancií. Tieto konjugáty majú v prípade glykoproteínov, ktoré majú iba jednu alebo málo uhľovodíkových skupín vhodných na spojenie, napríklad transferínu, okrem toho tú výhodu, že ich miesto väzby glykoproteín/viažuci faktor je presne definované.
Množstvo použitého endozomolytického prostriedku prípadne jeho koncentrácia, sa riadi podľa jednotlivých transfekcií. Je účelné, použiť najmenšie množstvá vírusu, prípadne vírusového komponentu, potrebné na zabezpečenie intemalizácie vírusu a komplexu nukleovej kyseliny a na uvoľnenie z endozómu. Množstvo vírusu (konjugátu) sa prispôsobí pre príslušný typ bunky, pričom predovšetkým sa berie ohľad na infekčnosť vírusu pre tento typ bunky. Ďalším kritériom je konjugát internalizačný faktor-viažuci faktor, hlavne čo sa týka internalizačného faktora, pre ktorý má cieľová bunka definovaný počet receptorov. Okrem toho sa riadi množstvo vírusu (konjugátu) podľa množstva DNA, ktorú treba importovať. Na stabilnú transfekciu, na ktorú je potrebné len malé množstvo DNA, je obyčajne dostatočné malé množstvo vírusu, zatiaľ čo pre transientnú transfekciu, pre ktorú sú potrebné veľké množstvá DNA, je použité väčšie množstvo vírusu. Na špeciálne použitie sa stanoví túrovaním optimálna koncentrácia vírusu v predbežných pokusoch vždy na transfekciu vybraných cieľových buniek, prípadne so zmiešanou bunkovou populáciou, a na transfekciu vybraným vektorovým systémom, pričom sa účelne nasadí ako DNA génová konštrukcia, ktorá je, čo sa týka veľkosti, zhodná s tou, ktorá je plánovaná na konkrétne použitie a ktorá obsahuje kvôli jednoduchému meraniu účinnosti génového prenosu reportérový gén.
V rámci predkladaného vynálezu sa ukázala vhodnosť génov luciferázy a β-galaktozidázy ako reportérových génov na takéto pokusy.
Vynález sa v ďalšom aspekte týka procesu vnášania komplexov nukleovej kyseliny, substancie viažucej nukleovú kyselinu, a prípadne internalizačného faktora do vyšších eukaryotických buniek. Proces je poznačený tým, že bunky prídu do kontaktu s prostriedkom, ktorý má schopnosť buď sám alebo ako súčasť komplexu nukleovej kyseliny byť prijatý do bunky a uvoľniť do cytoplazmy obsah endozómov. v ktorých je komplex nukleovej kyseliny po vstupe do bunky lokalizovaný.
Vo všeobecnosti sa uprednostňuje súčasné podávanie endozomolytického prostriedku a komplexu nukleovej kyseliny, podávanie však môže nasledovať aj postupne, pričom v prípade oddeleného použitia poradie nie je kritické, pokiaľ podávanie nasleduje po sebe, aby sa zaručil pokiaľ možno súčasný kontakt bunky s komponentami. V prípade použitia voľného vírusu pri oddelenej príprave je možné zaručiť súčasné podávanie vírusového prípravku s komplexami tak, že vírusový prípravok je súčasťou transfekčného média, ktoré obsahuje komplex nukleovej kyseliny. V prípade súčasného podávania voľného vírusu sa komplexy nukleovej kyseliny a vírusový prípravok zmiešajú pri použití.
Vo výhodnom prevedení spôsobu podľa vynálezu sa použije endozomolytický prostriedok ako súčasť kombinačného komplexu.
Aby sa zosilnila génová expresia, je možné aj opakovane použiť tieto zloženia.
V preferovanej vykonávacej forme sú bunky primáme tumorové bunky. V jednej mimoriadne výhodnej vykonávacej forme je nukleovou kyselinou DNA, ktorá ma jednu alebo viacej sekvencií, ktorá kóduje substanciu modulujúcu imunitu, výhodne cytokín.
V ďalšej vykonávacej forme sú bunky myoblasty, výhodne primárne myoblasty.
V ďalšej vykonávacej forme sú bunky fibroblasty, výhodne primáme fibroblasty.
V ďalšej vykonávacej forme sú bunky hepatocyty, výhodne primáme hepatocyty.
V ďalšej vykonávacej forme sú bunky primárne endotelové bunky.
V ďalšej vykonávacej forme sú bunky primárne epitelové bunky dýchacích ciest.
V ďalšej vykonávacej forme sú bunky T-bunky.
V ďalšej vykonávacej forme sú bunky B-bunky.
Tabuľka 1 znázorňuje úspešné transfekcie za pomoci predkladaného vynálezu na príkladoch rôznych typov buniek.
Zloženie sa skúmalo aj pri transfekcií psích hemofilických B-fibroblastov. V týchto prípadoch sa mohli luciferáza ako aj β-galaktozidáza úspešne exprimovať. Okrem toho sa tento systém použil aj pri vnášaní 1.4 psieho faktora IXc DNA do týchto fibroblastov. Prostredníctvom SandwichELISA sa mohol faktor IX po 24 hodinách po transfekcií dokázať.
V istých prípadoch je účelné okrem endozomolytického prostriedku použiť lyzozomatickú substanciu, napríklad keď endozomolytickým prostriedkom bol konjugát peptidu alebo retrovírus, ktorého endozomolytická aktivita nie je prísne závislá na hodnote pH.
Je známe, že lyzozomatropné substancie brzdia aktivitu proteáz a nukleáz, a tým môžu inhibovať odbúravanie nukleových kyselín (Luthmann a Magnusson, 1983). K týmto substanciám patria chloroquin, monensín, nigericín a metylamín. Bolo možné ukázať, že monensín vyvolal zvýšenie expresie génového reportéra v prípade použitia Moloney-vírusu. Bolo možné ukázať, že prítomnosť chloroquinu viedla prakticky v 100 % bunkách K562 k expresii génového reportéru, ktorý bol do bunky vnesený transferínom sprostredkovaným transferom DNA. Hepatocyty BNL.CL2 alebo HepG2 nereagovali tak dobre na chloroquin ako bunky K562, hoci ich bolo možné transfikovať v rozsahu 5 - 10 %, ak sa využili endozomolytické vlastnosti pridaného adenovírusu s replikačným defektom alebo chemicky inaktivovaného adenovírusu.
Pomocou vynálezu sa zväčšujú výhody biologických vektorov. Na základe rozdelenia receptorov existuje tropizmus tak pre internalizačný faktor ako aj pre vírus. Prispôsobením oboch týchto komponentov pre danú populáciu buniek sa dá docieliť zvýšená selektívnosť, ktorá bude prínosom najmä pri terapeutickom použití predkladaného vynálezu.
Tento aspekt má osobitý význam pri terapeutickom použití v pľúcach, pretože rôzne bunky v pľúcach majú rôzne receptory, čo môže vynútiť konštrukciu vektorov s vyššou väzobnou afinitou na určitú populáciu buniek, napríklad na riasinkové bunky dýchacích ciest. Z ligandov prichádzajú do úvahy napríklad lektíny. Konštrukcia takýchto konjugátov vyžaduje okrem iného potvrdenie schopnosti viazať ligandového kandidáta do konformácie konjugátu. Potvrdiť je to možné napríklad protilátkami proti ligandom za pomoci imunohistochemických farbiacich metód v tkanive, v ktorom má dôjsť k terapeutickému použitiu.
Predkladaný vynález sa týka v ďalšom aspekte farmaceutického zloženia, ktoré ako aktívnu súčasť obsahujú komplex terapeuticky účinnej nukleovej kyseliny, prednostne ako súčasť génovej konštrukcie, ako aj endozomolytický prostriedok, ktorý je prípadne konjugovaný, a prípadne konjugát internalizačného faktora. Je možné použiť každý inertný farmaceutický prípustný nosič, napríklad roztok kuchynskej soli alebo roztok kuchynskej soli vo fosfátovom tlmivom roztoku, alebo hocijaký nosič, v ktorom majú komplexy DNA vhodné rozpustné vlastnosti, aby mohli byť použité v rámci predkladaného vynálezu. Čo sa týka metód pre formuláciu farmaceutických príprav sa berie do úvahy Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980.
Predkladaný vynález ponúka výhodu najvyššej možnej flexibility pri použití, okrem iného ako farmaceutického prípravku. Vynájdené zloženie môže existovať ako lyofilizát alebo hlboko zmrazené vo vhodnom tlmivom roztoku. Môže byť aj pripravené, prenášané a skladované ako reagens pripravený na použitie v roztoku, najlepšie chladený. V danom prípade komponenty nutné na transfekciu, menovite DNA, endozomolytický prostriedok, prípadne konjugované alebo pripravené na konjugáciu s oddeleným konjugačným partnerom, substancia s afinitou k nukleovej kyseline, prípadne konjugovaná s intemalizačným faktorom, prípadne voľný polykatión, sú vo vhodnom tlmivom roztoku oddelené alebo čiastočne oddelené ako súčasti transfekčnej súpravy, ktorá takisto patrí ku predkladanému vynálezu. Transfekčná súprava v predkladanom vynáleze zahŕňa nosič, skladajúci sa z jednej alebo viacerých nádob, ako sú skúmavky, fľaštičky alebo podobné veci, ktoré podľa predkladaného vynálezu obsahujú nutné materiály k transfekcii vyššej eukaryotickej bunky. V jednej takej transfekčnej súprave môže prvá nádoba obsahovať jednu alebo viaceré DNA, napríklad kódujúce rôzne antigény. Druhá nádoba môže obsahovať jeden alebo viaceré konjugáty intemalizačného faktora, pričom je možné použitie transfekčnej súpravy vo forme stavebnicového systému. Či súčasti sú ako prípravky pripravené na použitie alebo oddelené, aby sa zmiešali tesne pred použitím, závisí popri špecifičnosti použitia aj od stabilnosti komplexov, ktoré môžu byť rutinne skúmané v testoch stability. V jednej preferovanej vykonávacej forme sa nachádza konjugát adenovírus-polylyzin spojený s trnsglutaminázou s polylyzínom, ktorý sa preukázal ako dostatočne stabilný na skladovanie v jednom z kontajnerov súpravy. V inej preferovanej vykonávacej forme sú biotinylovaný adenovírus a streptavidín-polylyzín uložené v oddelených nádobách a zmiešavajú sa pred použitím. Pri využití flexibility vynálezu môže priemerný odborník vyvinúť početné rôzne súpravy.
Systematicky môže nasledovať terapeutické používanie vynájdených zložení ako farmaceutických prípravkov, pričom sa prednostne využíva intravenózna cesta. Cieľovými orgánmi sú pri tejto forme použitia pečeň, slezina, pľúca, kostná dreň ako aj tumory. Príkladom lokálneho využitia je tkanivo pľúc (použitie vynájdenej zlúčeniny ako tekutiny na instiláciu alebo ako aerosól na inhaláciu). Okrem vyso kej špecifičnosti ligandov pre diferencované pľúcne bunky sa môže ukázať ako nutné sprievodné vybavenie ovplyvňovanie rôznych faktorov, ktoré sa vyskytujú v okolí pľúcneho tkaniva a môžu ovplyvniť génový prenos(napriklad ochromenie pohybu riasiniek, rozpustenie bronchiálneho hlienu, použitie proteázových inhibítorov). Ďalej je možné podávanie vynájdených farmaceutických prípravkov priamou injekciou do pečene, svalového tkaniva alebo do tumoru, alebo aj lokálne podávanie do gastrointestinálneho traktu. Ďalšou metódou podávania farmaceutického prípravku je aplikácia cez systém žlčovodu. Táto metóda použitia dovoľuje priamy prístup k membránam hepatocytov na žlčových kanálikoch, pričom sa zabráni vzájomnému pôsobeniu zlúčeniny s krvnými časticami.
Nedávno sa ukázala možnosť použitia myoblastov (nezrelých svalových buniek) na vnášanie génov do svalových vlákien myší. Nakoľko sa o myoblastoch dokázalo, že secernujú génový produkt do krvi, môže táto metóda nájsť široké uplatnenie pri liečení genetických defektov svalových buniek, napríklad defektu v súvislosti so svalovou dystrofiou. Je možné manipulovať myoblasty, aby dodávali génové produkty, ktoré buď pôsobia v krvi alebo sú krvou prenášané. Experimenty predkladaného vynálezu ukázali, že kultúry myoblastov ako aj myotubov, dokonca primárne, je možné transfikovať s vysokou účinnosťou. Transfekčné médiá, ktoré ukázali najlepšie výsledky, obsahovali kombinačné komplexy biotinylovaného adenovírusu, transferín-polylyzinu a streptavidín-polylyzínu. Okrem reportér-génového produktu luciferázy a β-galaktozidázy sa exprimoval v svalových bunkách faktor Vili. Okrem toho sa použil slepačí adenovírus CELO v kombinačnom komplexe, ktorý obsahoval ako dodatočný internalizačný faktor aglutinín z pšeničných klíčkov.
Terapeutické použitie sa môže vykonávať aj ex vivo, pričom ošetrené bunky, napríklad bunky kostnej drene, ήβpatocyty alebo myoblasty sa znovu zavedú do tela, napríklad Ponder et al., 1991, Dhavan et al., 1991. Ďalšie použitie predkladaného vynálezu ex vivo je tzv. rakovinová vakcína. Princíp použitia tejto terapie spočíva v tom, že sa izolujú tumorové bunky pacienta a bunky sa transfikqjú DNA kódujúcou cytokín. V ďalšom kroku sa bunky prípadne inaktivujú, napríklad žiarením, a to tak, že sa už potom nedokážu rozmnožovať, ale ešte stále exprimujú cytokín. Potom sa geneticky pozmenené bunky podávajú pacientovi, ktorému boli odobrané, ako vakcína. V okolí očkovaného miesta secemované cytokiny aktivizujú imunitný systém, okrem iného tak, že aktivujú cytotoxické T-bunky. Tieto aktivované bunky môžu pôsobiť v iných častiach tela a napádajú neošetrené tumorové bunky. Takto sa zníži riziko recidívy tumoru a rozvoja metastáz. Jeden vhodný predpis na použitie rakovinovej vakcíny bol opísaný Rosenbergom et al., 1992. Namiesto Rosenbergom navrhovaného retrovirálného vektora sa dá použiť systém génového prenosu, ktorý je použitý v predkladanom vynáleze. V pokusoch predkladaného vynálezu sa úspešne transfikovali bunky primárneho melanómu reportér-génom, ktorý bol obsiahnutý v kombinačnom komplexe adenovírusu spojeného s polylyzínom a transferínpoiylyzínu alebo a LDL-polylyzínu.
Predkladaný vynález je možné využiť aj na pokusy stanovovania imunitnej odpovede na daný antigén. Antigénšpeciftcké cytotoxické T-lymfocyty (CTL), ktoré usmrcujú infikované bunky, hrajú dôležitú úlohu pri obrane hostiteľa proti vírusovým infekciám alebo tumorom. Vzájomné pôsobenie T-buniek a buniek prezentujúcich antigén (APC) je obmedzené HLA („Human Lymphocytic Antigens“ = MHC, „Major Histocompability Molecules“) (pozn prekl.
SK 281682 Β6 asi zle v originále, nakoľko skratky sú práve opačné). Aby sa zistilo usmrcovanie buniek, ktoré exprimujú antigén, prostredníctvom CTL in vitro testom „CTL Killing Assay“, musí byť antigén CTL prezentovaný v správnom HLA kontexte, čo obyčajne znamená na autologovej cieľovej bunke. „CTL Killing Assay“ sa dá vykonať nasledovne: APCs sa transfikujú konštrukciou DNA, ktorá obsahuje jednu sekvenciu kódujúcu antigén. Antigénové epitopy sa naviažu na molekuly MHC triedy I a budú prezentované ako cieľ na povrchu bunky pre špecifickú CTL-odpoveď. Po inkubácii so vzorkou pacientovho séra sa v závislosti od špecifických CTL, ktoré sú k dispozícii, APC lyžujú. Bunková lýza sa dá merať napríklad sledovaním uvoľňovania rádioaktívneho chrómu, ktorý sa do APC vniesol pred pridaním séra. Etablované predpisy (Walker et al., 1989) používajú B-LCL (B-lymfoblastoidné línie buniek), ktoré sa indukujú transfekciou s rekombinantnými vakcínovými vírusmi kvôli expresii antigénových génov. Ale bunky, ktoré približne jeden celý deň účinne exprimovali antigén odumierajú na základe lytického účinku vakcíny. Tieto ťažkosti možno prekonať za pomoci „CTL Killing Assays“, ktoré používajú systém prenosu génov podľa predkladaného vynálezu, aby vniesli do bunky DNA ktorá kóduje antigény, napríklad aby sa vniesli do fibroblastov konštrukcie, ktoré kódujú antigény HIV alebo tumorové antigény, aby sa v nich antigén exprimoval. Primáme fibroplasty sa dajú ľahko pestovať z biopsií a ukázali sa ako zvlášť účinne (približne 50 - 70 %) transfikovateľné za pomoci predkladaného vynálezu. Takéto analýzy sú užitočné, s ohľadom na vývoj vakcín, na identifikáciu epitopov, ktoré boli spoznané killer-bunkami. Okrem toho ich možno výhodne použiť na určenie HLA-obmedzenej imunitnej odpovede osoby proti určitému antigénu.
Na základe veľkých množstiev, v akých je možné pomocou predkladaného vynálezu prenesené gény exprimovať prakticky vo všetkých bunkách, je možné vynález využiť na tvorbu rekombinantných proteínov. Aj v tomto prípade neexistujú žiadne alebo sú iba malé obmedzenia, týkajúce sa sekvencií respektíve veľkosti transferovanej DNA, ďalej existuje široké spektrum typov buniek, ktoré je možné vynájdenými zloženiami transfikovať. Na tvorbu rekombinantných proteínov je teda možné využiť takmer každý typ bunky , ktorý zaručuje, že rekombinantný protein sa vytvorí v prírodnej forme a v úplne modifikovanej posttranslačne vytvorenej forme, ktorá zaručí vysokú biologickú aktivitu produktu.
Génový prenos do buniek sa dá docieliť tak, ako je ukázané v predložených príkladoch pomocou luciferázy a IFN-α, je možné preniesť prakticky každú génovú konštrukciu, ktorá vedie ku vzniku žiadaného proteínového produktu. Požadovaný proteínový produkt je možné získať 24 hod. až 1 týždeň aj dlhšie po transfekcii z bunkových kultúr (buď z bunkového supematantu alebo z vhodného bunkového homogenizátu, podľa predpisu na každý proteínový produkt).
Použitie systému génového prenosu podľa predloženého vynálezu na tvorbu rekombinantných proteínov má nasledujúce výhody:
1. Na základe vysokej účinnosti transfekcie (viac ako 90 % transfikovaných buniek dokáže gén vo veľkých množstvách exprimovať) nie je potrebná žiadna predbežná selekcia transfikovaných buniek; ďalej nie je nutné etablovať stabilné línie buniek. Bunková kultúra v malom rozsahu môže stačiť, aby sa získali upotrebiteľné množstvá proteinu.
2. Je možné prenášať veľké génové konštrukcie; bolo možné preniesť úspešne 48 kb.
3. Génová expresia sa uskutoční v bunkách, ktoré zaručujú, že sa udeje zodpovedajúci posttranslačný proces a modifikácia (napríklad karboxylovanie faktorov zrážanlivosti závislých na vitamíne K, pozri Armentano et al., 1990, alebo glykozylovanie špecifické pre typ bunky).
4. Prostredníctvom vynájdeného systému bude k dispozícii väčší výber cieľových buniek na génovú expresiu.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1: Účinok adenovírusovej infekcie na génový prenos prostredníctvom konjugátov transferín - polylyzín Obr. 2: Dávkovací účinok konjugátu komplexu DNA Obr. 3: Zosilnenie génového prenosu sprostredkovaného transferín - polylyzínom adenovírusmi sa deje receptormi sprostredkovanou endocytózou:
A. účinok na komplexovanú DNA
B. účinok na DNA viazanú receptorom
C. účinok na génový prenos prostredníctvom konjugátov transferín-polylyzín
Obr. 4: Účinok adenovírusovej infekcie na génový prenos prostredníctvom konjugátov transferín-polylyzín vo vybraných líniách buniek
Obr. 5: Skúmanie, či zosilnenie génovej expresie spočíva na úrovni génového prenosu alebo transaktivácie
Obr. 6: Konjugát tetra-galaktózopeptid-polylyzín
Obr. 7: Transfekcia buniek HepG2 komplexami pRSVL-DNA za prítomnosti adenovírusu
Obr. 8: Transfekcia buniek HepG2 komplexami pCMVL-DNA za prítomnosti adenovírusu
Obr. 9: Transfekcia buniek TIB73 komplexami pCMVL-DNA:
A. porovnávacie hodnoty s chloroquinom
B. za prítomnosti adenovírusu
Obr. 10: Import pCMVL-DNA do T-buniek za prítomnosti adenovírusu:
A. bunky H9
B. primárne lymfocyty
Obr. 11: Inaktivácia adenovírusov pomocou UV-žiarenia:
A. zosilnenie účinku génového prenosu v HeLa - bunkách pomocou vírusov inaktivovaných UV-žiarením
B. porovnanie inaktivácie UV-žiarením s účinkom génového prenosu
Obr. 12: Inaktivácia adenovírusov formaldehydom
Obr. 13: Transfekcia NIH3T3-buniek komplexami transferínpolylyzín-DNA za prítomnosti Moloney-vírusu
Obr. 14: Skúmanie, či účinnosť génového prenosu pri transfekcii NIH3T3-buniek komplexami transferínpolylyzín-DNA sa dá pripísať prítomnosti Moloney-vírusu
Obr. 15: Vzájomné pôsobenie medzi transferínom a jeho receptorom zaváži pri génovom prenose Moloney-vírusu
Obr. 16: Vplyv hodnoty pH na účinok génového prenosu retrovírusov
Obr. 17: Influenza-hemaglutinin-peptid; pokus priepustnosti lipozómov (Liposomen Leakage Assay)
Obr. 18: Transfekcia buniek K562 konjugátom transferínpolylyzín za prítomnosti konjugátu influenzapeptid polylyzín
Obr. 19: Transfekcia HeLa-buniek konjugátom transferínpolylyzín za prítomnosti konjugátu influenzapeptid polylyzín
Obr. 20: In situ dôkaz B-galaktozidázovej expresie po transfekcii HeLa-buniek s transferín-polylyzín-pCVM-B-gal-DNA za prítomnosti adenovírusu
Obr. 21: In situ B-galaktozidázová expresia v HeLa-bunkách za prítomnosti adenovírusu
Obr. 22: Transfekcia buniek so 48 kb cosmidom za prítomnosti adenovírusu, A: HeLa bunky, B: neuroblastómové bunky
Obr. 23: Tvorba adenovírus-polylyzínu chemickým spojením
Obr. 24: Transfekcia buniek K562 konjugátom adenovírusu vzniknutého chemickým spojením
Obr. 25: Transfekcia HeLa-buniek konjugátom adenovírusu vzniknutého chemickým spojením
Obr. 26: Viazanie polylyzínu na adenovírus prostredníctvom transglutaminázy
Obr. 27: Transfekcia myšacích hepatocytov prostredníctvom transglutaminázou spojeného konjugátu adcnovíruspolylyzín
Obr. 28: Zosilnenie účinnosti transfekcie prostredníctvom transglutaminázou spojeného konjugátu adenovíruspolylyzín v porovnaní s nespojeným vírusom
Obr. 29: Transfekcia HeLa-buniek konjugátom adenovírusu spojeného biotín-streptavidínom
Obr. 30: Transfekcia buniek K562 konjugátom adenovírusu spojeného biotín-streptavidínom
Obr. 31: Transfekcia neuroblastomových buniek 48 kb cosmidom prostredníctvom konjugátu adenovírusu spojeného biotín-streptavidínom
Obr. 32: Transfekcia hepatocytov za prítomnosti chloroquinu alebo adenovírusu
Obr. 33: Transfekcia buniek K562 za prítomnosti rôznych endozomolytických prostriedkov
Obr. 34: Porovnanie transfekčných protokolov na bunkovej úrovni s β-galaktozidázou ako reportér-génom za prítomnosti rôznych endozomolytických prostriedkov
Obr. 35: Dlhodobá expresia luciferázy v konfluentných nedeliacich sa hepatocytoch
Obr. 36: Expresia v HeLa-bunkách, transfikovaných za prítomnosti voľného a cez biotín-streptavidín na polylyzín viazaného CELO-vírusu
Obr. 37: Transfekcia myoblastov a myotubov za prítomnosti voľného a cez biotín-streptavidín na polylyzín viazaného adenovírusu
Obr. 38: Transfekcia primárnych myoblastových a myotubových kultúr
Obr. 39 : Porovnanie adenovírusu dl312 a CELO-vírusu pri transfekcii HeLa-buniek a C2C12-myoblastov
Obr. 40: Zlepšenie transfekcie CELO-vírusom použitím lectínového ligandu
Obr. 41: Expresia faktora VIII cDNA v C2C12-myoblastových a myotubových kultúrach
Obr. 42: Zosilnenie prenosou DNA adenovirusovými proteínmi; A: HeLa-bunky, B: fibroblasty
Obr. 43: Konjugáty galaktóza-influenzapeptid na prenos DNA do hepatocytov
Obr. 44: Konjugáty galaktóza-adenovírus na prenos DNA do hepatocytov
Obr. 45: Génový prenos do B-lymfoblastoidných B-buniek Obr. 46: Prenos DNA s transferín-polylyzínom za prítomnosti rinovírusu; A: voľný rinovírus, B: konjugovaný rinovírus
Obr. 47: Transfekcia primárnych humánnych melanómových buniek kombinačným komplexom obsahujúcim konjugáty transferínu a adenovírusové konjugáty
Obr. 48: Transfekcia primárnych humánnych melanómových buniek kombinačnými komplexami obsahujúcimi konjugáty LDL a adenovírusové konjugáty
Obr. 49: Génový prenos v epitelových bunkách dýchacích ciest krýs in vivo
Obr. 50: Leakage Assay lipozómov s amfipatickými peptidmi
Obr. 51: Leakage Assay erytrocytov s amfipatickými peptidmi
Obr. 52: Transfekcia BNL CL.2-buniek za prítomnosti amfipatických peptidov
Obr. 53: Transfekcia NlH3T-buniek za prítomnosti amfipatických peptidov
Obr. 54: Expresia IFN-α v HeLa-bunkách transfikovaných za prítomnosti rôznych endozomolytických prostriedkov
Príklady uskutočnenia vynálezu
V nasledujúcich príkladoch, ktoré ilustrujú predkladaný vynález, boli, ak nebolo uvedené nič iné, použité nasledujúce materiály a metódy:
Tvorba komlexov transferín-polylyzin/DNA
a) konjugáty humánny transferín-polylyzín
Bola použitá metóda opísaná Wagnerom et al., 1991b, pri ktorej sa spojí polylyzín s bočnými uhľovodíkovými reťazcami transferínu.
Roztok 280 mg (3,5 pmol) humánneho transferínu (bez železa, Sigma) v 6 ml 30 mM tlmivého roztoku octanu sodného , pH 5, sa ochladil na 0 °C a pridalo sa 750 pl 30 mM tlmivého roztoku octanu sodného pH 5, obsahujúceho 11 mg (51 pmol) jodistanu sodného. Zmes sa nechala v ľadovom kúpeli v tme stáť 90 min. Na odstránenie nízkomolekulámych produktov sa vykonala gélová filtrácia (Sephadex G-25, Pharmacia), ktorou sa získal roztok s obsahom približne 250 mg oxidovaného transferínu (meranie ninhydrínovou metódou). (Na dôkaz oxidovanej formy, ktorá obsahuje aldehyd a pri farbení anisaldehydom dá farebnú reakciu, nakvapkali sa vzorky na silikageíovú tenkovrstvovú platničku, usušili sa a platničky sa ponorili do p-anisaldehydu/kyseliny sírovej/etanolu (1/1/18), usušili sa a zahriali. Modifikovaný roztok transferínu sa rýchle (v priebehu 10 až 15 min.) pridal do roztoku, obsahujúceho
1.5 pmol poly(L)lyzínu fluorescenčné značeného s priemernou dĺžkou reťazca 190 lyzínových monomérov v
4.5 ml 100 mM octanu sodného pH 5. pH hodnota roztoku sa pridaním 1 M tlmivého roztoku hydrouhličitanu sodného nastavila na pH 7,5. Ku zmesi sa pridávali v odstupoch vždy po 1 h 4 dávky vždy po 28,5 mg (450 pmol) kyanobórhydridu sodného. Po 17 h sa pridali 2 ml 5 M chloridu sodného, aby sa roztok upravil na celkovú koncentráciu približne 0,75 M. Reakčná zmes bola privedená na kolónu katiónového ionomeniča (Pharmacia Mono S HR 10/10) a frakcionované soľným gradientom od 0,75 M po 2,5 M chloridu sodného s konštantným obsahom 25 mM HEPES pH 7,3. Vysoká koncentrácia pri napĺňaní kolóny a od počiatku gradientu bola podstatná na získanie polykatiónových konjugátov. Trocha transferínu (približne 30 %) spolu so slabou fluorescenčnou aktivitou sa prietokom eluovalo; hlavné množstvo fluorescenčné značeného konjugátu eluovalo pri koncentrácii soli medzi 1,35 M a 1,9 M a bolo poolované do troch frakcií. Tieto frakcie dalifpodľa poradia ich elúcie) po dvojitej dialýze proti 2 1 25 mM HEPES pH 7,3 frakciu A(TfpL190A) s obsahom 45 mg (0,56 pmol) transferínu, modifikovaného s 366 nmol polylyzínu, frakciu B(TfpL190B) s obsahom 72 mg (0,90 pmol) transferínu, modifikovaného s 557 nmol polylyzínu a frakciu C(TfpL190C) s obsahom 7 mg (85 nmol) transferínu, modifikovaného s 225 nmol polylyzínu. Transferínové konjugáty boli, pokiaľ sa hneď nepoužili, po zmrazení šokom uskladnené v tekutom dusíku -20 °C vo forme bez železa.
Pred zabudovaním železa sa vzorky (0,5 až 1 mg) s chloridom sodným priviedli na fyziologickú koncentráciu soli (150 mM). Zabudovávanie železa sa spravilo pridaním 4 μΐ 10 mM tlmivého roztoku citranu železitého (III) (obsahujúceho 200 mM citranu, pridaním hydrouhličitanu sodného nastaveného na pH 7,8) na mg obsahu transferínu. Konjugáty obsahujúce železo boli pred použitím na tvorbu komplexov DNA rozdelené na malé alikvotné časti, zmrazené šokom v tekutom dusíku alebo v suchom ľade/etanole a uchované pri -20 °C. Tieto opatrenia sa ukázali ako účelné potom, čo sa ukázalo, že viacnásobné roztápanie a zmrazovanie viedlo ku znehodnoteniu konjugátu.
b) konjugáty myšací transferín-polylyzin
Postupovalo sa analogicky k metóde použitej na humánny transferín, v ktorom sa spojenie uskutočnilo cez bočné uhľovodíkové reťazce. Zo 4,1 mg (51 nmol) myšacieho transferínu a 2,1 mg (34 nmol) pL290 sa získali konjugáty z 15,5 nmol myšacieho transferínu a 13 nmol pL290.
Plazmidová DNA
a) pRSVL - DNA pg plazmidovej DNA pRSVL (obsahujúcich Photinus pyralis luciferázový gén pod kontrolou Rous Sarcoma vírusu LTR Enhancer/Promotcrs (Uchida ct al., 1977, De Wct et al., 1987), vytvorených štandardnou metódou prostredníctvom lýzy Tritonom X (Maniatis), nasledovanou centrifugáciou v rovnovážnom CsCl/EtBr hustom gradiente, odfarbené butanolom-1 a dialyzované proti 10 mM Tris/HCl pH 7,5 I mM EDTA) v 350 μΐ HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,3) boli 30 min. pred pridaním k bunkám zmiešané s 12 pg konjugátu transferin-polylyzín v 150 μΐ HBS.
b) pCMV-DNA
Plazmid pCMV sa vytvoril tak, že sa odstránil Bam-HI-Insert plazmidu pSTCX556 (Severne et al., 1988) plazmid ošetrený fragmentom Klenowov a HindlII/SspI ako aj Klenowom ošetrený fragment z plazmidu pRSVL, obsahujúci sekvenciu kódujúcu luciferázu, prípadne B-galaktozidázu (Macgregor a Caskey, 1989). Komplexovanie sa uskutočnilo analogicky podľa pRSVL.
Vytváranie vírusových preparácii
a) adcnovírusové preparácie
Použil sa adenovírusový kmeň d 1312, opísaný Jonesom a Shenkom, 1979, ktorý má deléciu v Ela-oblasti. Rozmnožovanie vírusu sa vykonalo v Ela-trans-komplementujúcej línii buniek 293, pričom sa vykonala tvorba vo veľkej miere, ako bolo opísané Davidsonom a Hasselom 1987. Vyčistený vírus bol umiestnený do uskladňovacieho tlmivého roztoku (100 mM Tris, pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 % BSA, 50 % glycerol) alebo do HBS/40 % glycerolu a alikvoty boli uchovávané pri -70 °C. Stanovenie viriónovej koncentrácie sa vykonalo prostredníctvom UV-spektrofotomctrickej analýzy extrahovaných genomových vírusových DNA (vzorec: jedna optická jednotka hustoty (OD, A260) zodpovedá 1012 vírusovým časticiam/ml; (Chardonet a Dales, 1970)).
b) retrovírusovc preparácie
Moloney-retrovírus myšacej leukémie N2 sa zabalil do ekotropickej baliacej línie (Keller et al., 1985, Armentano et al., 1987). Supematanty vírusom exprimovaných bunkových línií sa pozbierali, zmrazili šokom v kvapalnom dusíku a uskladnili pri -20 °C. Supematanty použité v príkladoch mali titer asi 106 cfu/ml, ktorý bol zmeraný prostredníctvom neomycín-rezistentnej tvorby kolónií s NIH3T3-bunkami. Na pokusy s koncentráciou vírusov boli supernatanty pod tlakom dusíka pretlačené cez 300 Kb membránový filter (FILTRON) do koncentrátora AMICON-miešacieho bunky. Tým mohol byť normálne 10 - 30 ml supernatant desaťnásobne koncentrovaný.
Bunky a médiá
HeLa-bunky sa pestovali v médiu DMEM, doplnenom 5 % teplom inaktivovaným fetálnym teľacím sérom (FCS), penicilínom 100I.E./ml, streptomycínom 100 pg/ml a 2 mM glutamínom. WI-38, MRC-5 a KB-bunky sa pestovali v EMEM-médiu (Eagle's modified essential médium), doplnenom 10 % teplom aktivovaným FCS, antibiotikami v ako DMEM-médiu 10 mM neesenciálnych aminokyselín a 2 mM glutamínom. CFT1, bunková línia epitelu respiračnej cystickej fibrózy (vytvorená podľa metódy opísanej Yankaskasom et al., 1991; bunková línia CFT1 je charakteristická tým, že je pre deltaF508-deléciovú CF-mutáciu homozygotná), bola vypestovaná v F12-7X-médiu (Willumsen et al., 1989). Na pokusy génového prenosu sa bunky pestovali na 6 cm platničkách bunkových kultúr, kým neboli asi z 50 % konfluentné (5 x 105 buniek). Médium sa odstránilo a pridal sa 1 ml DMEM/2 % FCS-média. Na to sa pridali komplexy konjugátov DNA, bezprostredne potom adenovírus d 1312 (0,05 až 3,2 x 104 častíc/bunku) alebo porovnateľný objem vírusového uskladňovacieho tlmivého roztoku (1 až 80 μΐ). Platničky sa dali na hodinu naspäť do inkubátora (5 % CO2, 37 °C), potom sa pridali 3 ml kompletovacieho média. Po ďalších 24 h inkubácie sa bunky pozbierali, aby sa určila lucifcrázová génová expresia. V prípade CFTl-buniek sa bunky pestovali pred pokusom s génovým transferom 4 hodiny v F12-7X-médiu bez humánneho transferínu.
Nasledujúce bunkové línie sa kupujú od ATCC, dajú sa získať pod udanými katalógovými číslami:
HeLa-bunky: CCL 2, K562-bunky: CCL 243, HepG2-bunky: HB 8065, ΤΙΒ-73-bunky: TIB 73 (BNL CL.2), NIH3T3-bunky: CRL 1658, 293-bunky: CRL 1573, KB-bunky: CCL 17, WI-38-bunky: CCL 75, MRC-5-bunky: CCL 171. H9-bunky: boli kupované z AIDS Research and Reference Reagent Program, U. S. Department of Health and Human Services, Katalog-Nr. 87.
Primárne lymfocyty sa získali tak, že sa odobrala 25 ml vzorka krvi z pupočnej šnúry do skúmavky obsahujúcej EDTA. Alikvoty sa dali na podklad 4,5 ml Ficoll - hypaque (Pharmacia) a 15 minút sa centrifugovali pri 2,500 Upm. Odobrala sa hnedastá vrstva medzi vrchnou vrstvou plazmy a čírou ficollovou vrstvou (asi 10 ml). Pridalo sa 40 ml 1MDM plus 10 % FCS, vzorka bola centrifúgovaná 15 minút pri 1,200 Upm a bunkový pelet bol umiestnený do 50 ml čerstvého IMDM plus 10 % FCS (hustota buniek bola približne 2 x 106 buniek/ml). Pridalo sa 250 μΐ alikvotu fytohemaglutininu (PHA P, DIFCO), kultúra bola inkubovaná 48 h pri 37 °C a 5 % CO2, a na záver sa pridal rekombinantný IL-2 (BMB) (koncentrácia: 20 jednotiek/ml). Potom boli bunky rozdelené s IMDM/20 % FCS, 2 jednotkami/ml IL-2 v pomere 1 : 3. Alikvoty buniek boli
SK 281682 Β6 hlboko zmrazené v tekutom dusíku v FCS plus 5 % DMSO. Pred použitím sa bunky pestovali v IMDM plus 20 % FCS plus 2 jednotkách/ml IL-2.
Na sekvenčné väzobné pokusy sa HeLa bunky ekvilibrovali pri 4 °C v 1 ml DMEM, doplnenom s 2 % FCS. Komplexy konjugátov DNA sa pridali ako pri ostatných pokusoch a platničky sa inkubovali 2 h pri 4 °C. Potom boli platničky výdatne premyté s ľadovochladným DMEM/2 % FCS, nakoniec sa pridali 2 ml tohto média. Potom sa na to pridal adenovírus dl312 pripadne vírusový tlmivý roztok, bunky sa nechali pomaly zohriať predtým, ako sa dali na ďalších 24 h do inkubátora. Po tejto inkubácii sa bunky pozbierali a vyšetrovali sa na luciferázový génový prenos.
Luciferázový test
Tvorba bunkových extraktov, štandardizácia obsahu proteínov ako aj stanovenie luciferázovej aktivity sa vykonalo tak, ako je opísané Zenke et al., 1990, Cotten et al., prípadne v EP 388 758.
Príklad 1
Určenie účinku pôsobenia adenovírusom na génový prenos pomocou konjugátov transferín-polylyzín
Najprv sa skúmal účinok zvyšovaných dávok vírusu na schopnosť definovaného množstva komplexu konjugátu DNA docieliť génový prenos. Na tento účel sa zmiešalo na tvorbu komplexu 6 pg plazmidu pRSVL s 12 pg konjugátu humánny transferín-polylyzín (hTfpL190B). Komplex konjugátu DNA plus rôzne množstvá adenovírusu dl312 (0,05 až 3,2 x 104 vírusových častíc na bunku) sa pridávali k HeLa-bunkám. Výsledok tejto analýzy je prezentovaný na obr. 1. Luciferázová aktivita je vyjadrená v svetelných jednotkách na 50 pg celkového bunkového proteínu. Podľa tejto analýzy sa získali so stúpajúcim množstvom pridávaného adenovírusu zodpovedajúce prírastky génového prenosu. Na obrázku sú znázornené priemerné hodnoty 2 až 4 oddelených pokusov; vodorovné čiarky ukazujú štandardnú odchýlku.
Príklad 2
Účinok dávkovania komplexu konjugátu DNA
Logaritmické zriedenia komplexov konjugátu DNA, vytvoreného tak ako v príklade 1, sa pridávali kHeLa-bunkám, a to s pridaním alebo bez pridania konštantnej dávky adenovírusu dl312 (1 x IO4 vírusových častíc na bunku). Luciferázová aktivita sa stanoví tak, ako je uvedené v príklade L Výsledky sú zobrazené na obr. 2.
Príklad 3
Zvýšenie génového transferu účinkom transferín-polylyzínu prostredníctvom adenovírusov sa deje receptormi sprostredkovanou endocytózou
a) účinok ošetrenia adenovírusom na prenos komplexovanej DNA
Na transfekciu sa použili nasledovné komponenty: 6 pg pRSVL-DNA bez konjugátu transferín-polylyzín (DNA); 6 pg pRSVL - DNA plus 6 pg nekonjugovaného polylyzínu - 270 (DNA/pL); 6 pg pRSVL - DNA plus 12 pg v predchádzajúcich príkladoch použitého konjugátu transferín - polylyzín (DNA + hTfpL190B). Tieto transfekčné látky sa pridávali k HeLa-bunkám s alebo bez adenovírusu dl312 (dl312) (1 x 104 vírusových častíc na bunku). Tvorba bunkového extraktu, štandardizácia podľa celkového proteínu a stanovenie luciferázovej aktivity sa udialo ako v predchádzajúcich príkladoch. Výsledok vykonaného pokusu je zobrazený na obr. 3 A.
b) účinok ošetrenia adenovírusom na prenos DNA viazanej na receptory
Komplexy konjugátu DNA (DNA + hTfpL190B) alebo komplexy polylyzín-DNA (DNA + pL) sa viazali na HeLa-bunky bez toho, že by sa internalizovali, tak, že boli inkubované pri 4 °C. Nenaviazaný komplex sa odstránil pred pridaním adenovírusu d!312 (1 x IO4 vírusových častíc na bunku) alebo porovnateľného množstva objemu tlmivého roztoku. Za tým nasledujúca inkubácia sa vykonala pri 37 °C, aby sa umožnila intemalizácia naviazaných DNA-komplexov a adenovírusov. Stanovenie luciferázovej aktivity sa udialo, ako je uvedené (obr. 3B).
c) Účinok ošetrenia adenovírusom na génový prenos prostredníctvom konjugátov transferín-polylyzín
Komplexy konjugátu DNA, obsahujúce 6 pg pRSVL-DNA plus 12 pg transferín-polylyzín (DNA + hTfpLl 90B) sa pridávali k HeLa-bunkám v koncentrácii vírusu 1 x IO4 adenovírusových (dl312) častíc na bunku alebo porovnateľného množstva teplom aktivovaného adenovírusu dl312 (dl312 h.i.j.Inaktivácia teplom sa vykonala 30 minútovou inkubáciou pri 45 °C (Defer et al., 1990).
Príklad 4
c) Účinok ošetrenia adenovírusom na génový prenos prostredníctvom konjugátu transferín-polylyzín na vybraných bunkových líniách
Komplexy konjugátu DNA (6 pg pRSVL plus 12 pg hTfpL190B) sa pridávali k bunkovým líniám CFT1, KB, HeLa, WI38 a MRC5 s adenovírusom alebo bez adenovírusu dl312 (1 x 104 vírusových častíc na bunku). Účinnosť génového prenosu na rôzne bunkové línie sa určovala tak ako v predchádzajúcich príkladoch pomocou luciferázového testu (obr. 4).
Príklad 5
Zosilnenie luciferázovej génovej expresie funguje na úrovni génového prenosu a nie na transaktivácii
Najprv sa vytvorila luciferázu konštitutívne exprimujúca bunková línia s označením K562 10/6 tak, že bunky boli transfikované plazmidom, ktorý obsahoval RSV-luciferázový génový fragment (Apal/Pvul-fragment z pRSVL (De Wet et al., 1987)), klonovaný v mieste Clal pUCp locusu (Collis et al., 1990). Tento plazmid bol skomplexovaný s konjugátom transferín-polylyzín a bunky K562 boli transfikované týmto komplexom, pričom sa postupovalo podľa metódy opísanej Cottenom et al., 1990. Nakoľko pUCp-locus-plazmid obsahuje gén rezistencie na neomycín, bolo možné na základe rezistencie na neomycín povyberať klony exprimujúce luciferázu. Na ďalšie pokusy sa vybral kloň s označením K562 10/6.
Alikvoty rodičovskej línie buniek K562 (v 200 pl
RPMI 1640 plus 2 % FCS; 500.000 buniek/vzorku) sa ošet19 rili buď 4 gg pL90 plus 12 gg TfpL plus 6 gg pRSVL alebo 4 gg pL90 plus, 6 gg pRSVL vždy v 500 gl HBS. Udávané množstvá adenovírusu d 1312 (obr. 5) sa nechali 1,5 h pôsobiť na bunky pri teplote 37 °C, na čo sa pridalo 2 ml RPMI a 10 % FCS. Potom sa pokračovalo ďalších 24 h v inkubácii pri 37 °C a na záver sa pripravili bunky na stanovenie luciferázovej aktivity. Zistilo sa, že inkubáciou s adenovírusom sa dosiahol výrazný prírastok luciferázovej aktivity (obr. 5A). Toto platí tak pre komplexy TfpL (200 svetelných jednotiek oproti 25.000 svetelným jednotkám), ako aj pre pL90-komplexy (0 oproti 1,9 x 106 svetelným jednotkám). Z toho vychádza, žc línia buniek K562 vykazuje schopnosť internalizovať komplexy pRSVL/polylyzín a že tieto internalizácie, merané luciferázovou expresiou, sú výrazne zvyšované prítomnosťou adenovírusu.
Analogické pokusy sa vykonali s K562 10/6 bunkami konštitutívne exprimujúcimi RSVL-luciferázový gén, pričom boli použité podobné množstvá adenovírusu dl312. Alikvoty 500.000 buniek (v 200 gl RPMI plus 2 % FCS) sa s na obr. 5B udanými množstvami adenovírusu dl312 inkubovali 1,5 h pri teplote 37 °C. Potom boli ako pri rodičovských bunkových líniách pridané RPMI plus 10 % FCS, 24 h boli ďalej inkubované a bola stanovená luciferázová aktivita. Ako je vidieť z obr. 5B, nie je účinok ošetrenia týchto buniek adenovírusom na luciferázovú aktivitu preukázateľný; kontrolné hodnoty ležia v tom istom rozsahu ako hodnoty pre vzorky ošetrované vírusom.
Príklad 6
Transfekcia pečeňových buniek konjugátmi asialofetuin - polylyzin (AFpL) prípadne tetra-galaktózo-peptid-pL ((gal)4pL) za prítomnosti adenovírusu
a) príprava laktózovaných peptidov
3,5 mg (1,92 gmol rozvetveného peptidu Lys-(N epsilon-Lys)Lys-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Cys, vytvoreného pomocou Fmoc-metódy s použitím syntetizéru Applied Biosystems 431A Peptid-Synthetizer, obsahujúceho ditiopyridinovú skupinu pre Cys, sa ošetrovali roztokom 7,85 mg laktózy v 40 gl 10 mM vodného roztoku octanu sodného pH 5 pri 37 °C. Do roztoku boli pridané postupne 4 dávky 0,6 mg (10 gmol) kyanobórhydridu sodného v intervaloch približne 10 h. Spolu po 64 h pri 37 °C sa pridalo 0,5 ml HEPES pH 7,3 a 15 mg ditiotreitolu (DTT). Frakcionáciou prostredníctvom gélovej filtrácie (Sephadex G-10, 12 x 130 mm, eluens: 20 mM NaCl) pod argónom sa získalo 3,6 ml roztoku laktozovaného peptidu vo voľnej merkaptoforme (1,73 gmol podľa Ellmannovho testu; 84 % výťažok). Vzorky modifikovaného peptidu javili farebnú reakciu s anízaldehydom, ale neukázali farebnú reakciu s ninhydrínom; toto je v súlade s predpokladom, že všetky 4 N-koncové aminoskupiny sú laktózované. Konjugát tetra-galaktózapeptid-polylyzín je znázornený na obr. 6.
b) vytvorenie polylyzínu modifikovaného 3-ditiopyridin-propionátom
K roztoku 0,60 gmol poly-L-lyzínu získanom gélovou filtráciou s priemernou dĺžkou reťazca 290 lyzínových monomérov (pL290, Hydrobromid, Sigma) v 1,2 ml 100 mM HEPES pH 7,9 za intenzívneho miešania bolo pridané 400 gl 15 mM etanolového roztoku zo SPDP (6,0 gmol). O hodinu neskôr sa pridalo 500 gl 1M octanu sodného pH 5; po gélovej filtrácii (Sephadex G-25) s 100 mM octanom sodným sa získal roztok 0,56 gmol pL290 s 5,77 gmol ditiopyridínového linkera.
c) konjugácia peptidu s polylyzínom
Konjugáty sa vytvorili tak, že sa zmiešalo 1,5 gmol v a) vytvorených laktozylovaných peptidov v 3 ml 20 mM NaCl s 0,146 gmol v b) získaných modifikovaných pL290 v 620 gl tlmivého roztoku octanu sodného v argónovej atmosfére. Po pridaní 100 pl 2 M HEPES pH 7,9 sa reakčná zmes nechala 18 h stáť pri izbovej teplote. Pridaním NaCl sa upravila koncentrácia soli na 0,66 M, a konjugáty sa izolovali chromatografiou na vymieňači iónov (katex) (Pharmacia Mono S kolóna HR 5/5; elúcia gradientu, pufer A: 50 mM HEPSE pH 7,3; pufer B: pufer A plus 3 M NaCl). Frakcie produktu boli eluované pri koncentrácii soli približne 1,2 M až 1,8 M a boli poolované v dvoch konjugátových frakciách; konjugátové frakcie boli označené ako (gal)4pLl a (gal)4pL2. Dialýzou proti 25 mM HEPES pH 3 sa získali konjugátové frakcie (gal)4pLl, obsahujúce 24 nmol modifikovaného pL290, a (gal)4pL2, obsahujúce
24.5 nmol modifikovaného pL290.
d) tvorba konjugátov asialofetuínu
Konjugáty sa vytvorili podľa toho istého princípu ako transferínové konjugáty; podobný proces tvorby konjugátov asialoorosomukoid-polylyzín bol opísaný Wu a WU, 1988.
Pripojenie asialofetuínu k polylyzínu sa vykonalo väzbou cez disulfidové mostíky podľa modifikácie s bifunkčným reagensom SPDP (Pharmacia). Roztok 100 mg (2,2 gmol) asialofetuínu (Sigma) v 2 ml 100 mM HEPES pH 7,9 sa podrobilo gélovej filtrácii na kolóne Sephadex-G-25. K takto získaným 4 ml roztoku sa pridalo 330 gl 15 mM etanolového roztoku SPDP (5,0 gmol) za silného miešania. Po 1 h pri izbovej teplote bol roztok prečistený ďalšou gélovou filtráciou (Sephadex G-25); z toho sa získalo 5 ml roztoku 1,4 gmol asialofetuínu, modifikovaného 2,25 gmol ditiopyridínovým linkerom.
Konjugáty sa vytvorili tak, že sa zmiešalo 1,4 gmol asialofetuínu v 5 ml 100 mM HEPES pH 7,9 s 0,33 gmol modifikovaného pl.190 (obsahujúceho 1,07 gmol merkaptopropionátových skupín; pritom sa postupovalo presne rovnako ako pri tvorbe transferinových konjugátov) v
6.5 ml 200 mM HEPES pH 7,6 v argónovej atmosfére. Reakčná zmes sa nechala 24 h stáť pri izbovej teplote. Konjugáty sa v reakčnej zmesi izolovali chromatografiou na vymieňači iónov (katex) (Pharmacia Mono S kolóna HR 10/10; elúcia gradientov, pufer A: 50 mM HEPSE pH 7,9; pufer B: pufer A plus 3 M NaCl) a pridával sa chlorid sodný až do konečnej koncentrácie 0,6 M pred naložením kolóny. Frakcia produktu bola eluovaná pri koncentrácii soli približne 1,5 M. Dialýzou proti HBS sa získali konjugáty, obsahujúce 0,52 gmol asialofetuínu, modifikovaného 0,24 gmol pL290.
e) transfekcie HepG2-buniek komplexami pRSVL-DNA
HepG2-bunky sa pestovali v DMEM-mediu plus 10 % FCS 100I.E./ml penicilínu, 100 gg /ml streptomycínu a 2 mM glutamínu vo fľašiach T-25. Transfekcie sa vykonali pri hustote 400.000 buniek/fľašu. Pred transfekciou sa premyli bunky so 4 ml čerstvého média, obsahujúcom 10 % FCS. Bezprostredne pred transfekciou sa pridal chloroquin (Sigma), aby sa docielila konečná koncentrácia 100 gM bunkovej suspenzie (plus roztok DNA).
pg pRSVL-DNA v 330 μΐ HBS sa zmiešalo s na obr. 7 udanými množstvami TfpL190B-konjugátu (TfpL), konjugátu asialofetuín- pL90 (AfpL), polylyzínom 290 (pL) alebo konjugátom tetragalaktózo-peptid-polylyzín (gal)4pL v 170 μΐ HBS. V kompetitívnych experimentoch sa pridalo po 30 min. 240 pg asialofetuínu ((gal)4pL + Af) alebo 30 pg laktózovaného peptidu ((gal)4pL + (gal)4). Zmes sa pridala k bunkám; bunky boli 4 h inkubované pri teplote 37 °C, potom bolo transfekčné médium nahradené 4 ml čerstvého DMEM-média plus 10 % FCS. Po 24 h boli zbierané bunky na luciferázovú skúšku. Hodnoty na obr. 7 predstavujú celkovú luciferázovú aktivitu transfikovaných buniek. Ako vidno z obrázku, majú pL a TfpL malé luciferázové aktivity; (gal)4pL vykazuje podobne vysoké hodnoty ako AfpL; pridaním (gal)4 alebo Af konkurujú si vzájomne o receptory a znižujú, ako sa aj čakalo, hodnoty.
f) transfekcia HepG2-bunick komplexami pCMVL-DNA
HepG2-bunky boli na 6 cm platničkách pestované až do bunkovej hustoty 300.000 buniek na platničku, ako bolo uvedené v e). Pred transfekciou boli bunky premyté s 1 ml čerstvého média, obsahujúceho 2 % FCS.
pg pCMVL-DNA v HBS bolo zmiešaných s na obr. 8 uvedenými množstvami konjugátu TfpL190B(TfpL) konjugátu asialofetuín-pL (AfpL), polylyzínom 290 (pLys290) (gal)4pLl alebo (gal)4pL2 v 170 μΐ HBS. Po 30 min. sa každému komplexu konjugátu DNA pridal 1 ml DMEM, obsahujúci 2 % FCS a 50 μΐ adenovírusového kmeňového roztoku d 1312C. V kompetitívnych experimentoch sa pridalo, ako bolo uvedené, 30 pg laktózovaného peptidu ((gal)4pL ((gal)4pLl + (gal)4, prípadne ((gal)4pL2 + + (gal)4)). Zmes sa pridala k bunkám; bunky boli 2 h inkubované pri teplote 37 °C, potom sa pridalo 1,5 ml média, obsahujúceho 10 % FCS. Po 2 h bolo transfekčné médium nahradené 4 ml čerstvého DMEM-média plus 10 % FCS. Po 24 h boli zbierané bunky na luciferázovú skúšku. Hodnoty na obr. 8 predstavujú celkovú luciferázovú aktivitu transfikovaných buniek. pLys 290 vykazuje účinok, (gal)4pL vykazuje silnejší účinok; prídavok (gal)4, ktorá konkuruje o asialoglykoproteínový receptor, redukuje hodnoty získané pre polylyzín.
g) transfekcia TIB73-buniek komplexami pCMVL-DNA
Bunky línie myšacích pečeňových embryonálnych buniek ATCC TIB73 (BNL CL.2; Patek et al., 1978) sa pestovali pri 37 °C v 5 % atmosfére CO2 vo „high glucose“ DMEM (0,4 % glukóza) doplnené 10 % teplom inaktivovaným FCS, ktorý obsahuje 100 I.E./penicilínu, 100 pg/ml streptomycínu a 2 mM glutamínu, na 6 cm platničke.
Transfekcie sa vykonávali pri hustote 300.000 buniek/platničku. Pred transfekciou sa bunky premyli s 1 ml čerstvého média plus 2 % FCS.
pg pCMVL v 300 μΙ HBS sa zmiešalo s udanými množstvami konjugátu myšacieho transferín-polylyzínu 290 (mTfpL), konjugátu asialofetuín-pL (AfpL), polylyzínom 290 (pLys290), (gal)4pLl alebo (gal)4pL2 v 170 μΐ HBS. Po 30 min, sa každému komplexu konjugátu DNA pridal 1 ml DMEM, obsahujúci 2 % FCS a 50 μΐ adenovírusového kmeňového roztoku dl312C. Zmes sa pridala k bunkám, bunky boli 2 h inkubované pri 37 °C, potom sa pridalo 1,5 ml média, obsahujúceho 10 % FCS. Po 2 h bolo transfekčné médium nahradené 4 ml čerstvého média. Po 24 h boli zbierané bunky na luciferázovú skúšku; hodnoty na obr. 9A predstavujú celkovú luciferázovú aktivitu transfikovaných buniek.
Na porovnanie sa robila transfekcia bez adenovírusu za prítomnosti chloroquinu:
Transfekcie sa vykonávali pri hustote 300.000 buniek/platničku. Pred transfekciou sa bunky premyli s 1 ml čerstvého média obsahujúceho 2 % FCS. Bezprostredne pred transfekciou sa pridal chloroquin (Sigma) tak, aby konečná koncentrácia v bunkovej suspenzii (plus roztok DNA) bola 100 μΜ. 6 pg pCMVL v 330 μΐ HBS sa zmiešalo s udanými množstvami mTfpL, AfpL, pLys290, (gal)4pLl alebo (gal)4pL2 v 170 μΐ HBS. Po 30 min. sa k bunkám pridali komlexy DNA, Bunky boli 2 h inkubované pri 37 °C, potom sa pridalo 1,5 ml média, obsahujúceho 10 % FCS a 100 μΜ chloroquinu. Po 2 h bolo transfekčné médium nahradené 4 ml čerstvého média. Po 24 h boli zbierané bunky na stanovenie luciferázy; získané hodnoty na obr. 9B predstavujú luciferázovú aktivitu.
Príklad 7
Import DNA do T-buniek
a) tvorba konjugátov AntiCD7-polylyzínl90
Roztok 1,3 mg antiCD7-protilátok (Immunotech) v 50 mM HEPES pH 7,9 sa zmiešal so 49 μΐ 1 mM etanolického roztoku SPCD (Pharmacia). Po 1 h pri izbovej teplote sa filtrovalo cez gélovú kolónu Sephadex G-25 (Eluens 50 mM HEPES-tlmivý roztok pH 7,9) pričom sa získalo 1,19 mg (7,5 nmol) antiCD7, modifikovaného s 33 nmol pyridylditiopropionátových zvyškov. Poly-L-lyzínl90, fluorescenčné značenie prostredníctvom FITC, sa modifikoval analogicky so SPDP a ošetrením ditiotreitolom a následnou gélovou fdtráciou sa upravil do formy modifikovanej' s voľnými merkaptoskupinami.
Roztok 11 nmol polylyzín 190, modifikovaného s 35 nmol merkaptoskupín, v 0,2 ml 30 mM tlmivého roztoku octanu sodného sa zmiešalo v neprítomnosti kyslíka s modifikovaným antiCD7 (v 0,5 ml 300 mM HEPÉS pH 7,9) a cez noc sa nechalo stáť pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa upravila pridaním 5M NaCl na obsah asi 0,6 M. Izolácia konjugátov sa udiala chromatografiou na vymieňačoch iónov (Mono S, Pharmacia, 50 mM HEPES pH 7,3, gradientu soli 0,6 M do 3 M NaCl); po dialýze proti 10 mM HEPES pH 7,3 sa získali zodpovedajúce konjugáty, pozostávajúce z 0,51 mg (3,2 nmol) antiCD7 - protilátok, modifikovaných so 6,2 nmol polylyzínu 190.
b) tvorba konjugátov gpl20-polylyzín 190
Spojenie sa udialo analogicky z literatúry známymi metódami prepojením tioéterom podľa modifikácie so 6-maleimidocapronovou kyselinou-N-hydroxysukcinimidesterom (EMCS, Sigma) (Fujiwara et al., 1981).
Tioéterom spojené konjugáty gp!20-polylyzín 190
Roztok 2 mg rekombinantného gpl20 v 0,45 ml 100 mM HEPES pH 7,9 sa zmiešalo s 17 μΙ 10 mM roztoku EMCS vo dimetylformamide. Po 1 h pri izbovej teplote sa filtrovalo cez gélovú kolónu Sephadex G-25 (Eluens 100 mM HEPES - tlmivý roztok 7,9). Roztok produktu (1,2 ml) sa v neprítomnosti kyslíka pomiešal roztokom 9,3 nmol polylyzínu 190, fluorescenčné značeného a modifikovaného 30 nmol mercaptoskupinami (v 90 μΐ 30 mM octanu sodného pH 5,0), a nechal sa stáť cez noc pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa upravila pridaním 5 M NaCl na obsah približne 0,6 M. Izolácia konjugátov sa udiala chromatografiou na vymieňačoch ionov (Mono S, Pharmacia, 50 mM HEPES pH 7,3, gradientu soli 0,6 M do 3 M NaCl); po frakcionácii a dialýze proti 25 mM HEPES pH 7,3 sa získali 3 frakcie A, B a C, pozostávajúce z 0,40 mg rpg 120 modifikovaného s 1,9 nmol polylyzínu 190 (v prípade frakcie A), prípadne 0,25 mg rpg 120 modifikovaného
2,5 nmol polylyzínu 190 (frakcia B), prípadne 0,1 mg rpg 120 modifikovaného s 1,6 nmol polylyzínu 190 (frakcia C).
pCMVL-DNA (6 pg/vzorku) sa komplcxovalo s udanými množstvami polylyzínu 190 alebo udanými konjugátmi polylyzínu v 500 μΐ HBS. Medzi tým sa vytvorili alikvoty H9-buniek (106 buniek v 5 ml RPM1 s 2 % FCS) alebo primárnych humánnych lymfocytov (3 x 106 buniek v Iscovom modifikovanom Dulbeccovom médiu (ÍMDM) plus 2 % FCS). Ku každej vzorke buniek sa pridal komplex polylyzín-DNA. 0,5 min. neskôr sa pridalo udané množstvo adenovírusu dl312. Bunky sa potom 1,5 h inkubovali pri 37 °C, a potom sa pridalo ku každej vzorke 15 ml RPMI ( v prípade H9-buniek) alebo IMDM (v prípade primárnych lymfocytov) plus 20 % FCS . Bunky sa inkubovali 24 h pri 37 °C, pozbierali sa a boli pripravené na stanovenie luciferázovej aktivity ako v ostatných príkladoch. Výsledok vykonaných pokusov je znázornený na obr. 10A (H9-bunky) prípadne 10B (primárne lymfocyty). H9-bunky vykázali antiCD7-konjugát (obr. 10A, stĺpce 7 až 9) a gpl20-konjugát (stĺpce 10 až 12) najlepšie výsledky čo sa týka génového transferu docieleného adenovírusom, pričom gpl 20-konjugát aj pri absencii adenovírusu vykázal výraznú expresiu luciferázového génu. Je pozoruhodné, že vo vykonaných pokusoch bol iba gpl20-konjugát schopný vniesť DNA do primárnych lymfocytov, a to iba za prítomnosti defektného adenovírusu (obr. 10B, stĺpce 7 a 8).
Príklad 8
Inaktivácia adenovírusov
a) UV-inaktivácia
Preparát adenovírusu d 13212, vytvorený a uskladnený, ako je opísané v úvode k príkladom, bol umiestnený v 2 cm jamkách na platničke bunkovej kultúry (300 μΐ/jamku) na ľade v 8 cm odstupe od dvoch UV-Iámp (lampy Philips TUV15 (G15 T8)). Vírus bol vystavený UV-žiareniu v čase trvania, ako je uvedené na obr. 11A, a alikvoty každého preparátu boli skúmané na ich titre, či a v akom rozsahu majú schopnosť zosilniť génový prenos konjugátmi polylyzín-transferín do HeLa-buniek.
Pri pestovaní buniek a transfekcii sa v podstate postupovalo tak, ako bolo uvedené pod „bunky a médiá“; na transfekciu použité komponenty sú viditeľné z obr. 11A. Komplexy z pCMVL-DNA a 12 pg TfpL boli vytvorené v 500 μΐ HBS a pridalo sa 3 x 105 HeLa-buniek (v 1 ml DMEM plus 2 % FCS). Približne o 5 min. neskôr sa pridalo 54 μΐ každého vírusového preparátu ku každej kultúre a kultúry sa jeden a pol - 2h inkubovali pri 37 °C. Potom sa pridalo 5 μΐ alikvotu DMEM plus 10 % FCS ku každej kultúre, inkubácia pokračovala pri 37 °C ďalších 24 h a kultúry sa zbierali a vyšetrovali sa na luciferázovú aktivitu. Množstvo 54 μΐ neožiarených vírusov neleží v oblasti nasýtenia, t. j. test je citlivý na najmenej trikrát vyššie vírusové množstvo. Získané hodnoty luciferázovej expresie sú zobrazené na obr. 1 IB (uzavretý štvoruholník). Vírusový titer každého preparátu sa stanovil s použitím E1A komplementačnej línie buniek 293. Najprv sa vytvorili sériové zriedenia neožiarenej a ožiarenej vzorky vírusu v DMEM plus 2 % FCS. Paralelne k tomu sa pripravili vzorky 5 x 104 buniek 293 (v jednej 2 cm jamke) a pridalo sa 200 μΐ DMEM plus 2 %. 5 ml alikvotu každého zriedenia sa pridalo na porovnanie do vždy druhej jamky. Aby sa spôsobila väzba vírusu na bunky, jeden a pol hodiny sa inkubovali pri 37 °C, a potom sa do každej jamky pridali 2 ml DMEM plus 10 % FCS. Po 48 h sa kultúry spočítali, aby sa zistil cytopatický účinok. Tie zriedenia vírusu, v ktorých menej ako 50 % buniek v kultúre po 48 h vykazovalo výrazný cytopatický účinok, vykazovali relatívne množstvo infekčného vírusu v každom preparáte. Získané hodnoty sú znázornené na obr. 11B (otvorené štvoruholníky). Výsledok pokusu vykonaného v tomto príklade ukazuje, že pokles o 4 rády vo vírusovom titri prostredníctvom UV-žiarenia spôsobuje iba 20-násobnú redukciu prenosu luciferázového génu. To ukazuje, že mechanizmy, udávajúce mieru infekčnosti vírusu, je možné zničiť bez ovplyvnenia schopnosti vírusu zosilniť génový prenos.
Zistilo sa, že sa pri nízkych dávkach vírusu zosilnenie génového prenosu vírusom nepatrne znižovalo (obr. 11 A, stĺpce 7 až 10) a tento účinok sa zvýraznil pri vysokých dávkach (stĺpce 7 až 10).
b) inaktivácia adenovírusu formaldehydom ml adenovírusového preparátu sa poslalo cez 10 ml kolónu G25 (Pharmacia PD 10 G, 25 M), predekvilibrovanú s 10 mM NaCl, 25 mM HEPES pH 7,9, 10 % glycerolom a zachytilo sa v objeme 2,5 ml. Alikvoty gélom filtrovaného vírusového preparátu sa bez (0), s 0,01 %, 0,1 % alebo 1 % formaldehydom inkubovali 20 h na ľade. Potom sa pridal Tris pH 7,4 do koncentrácie 100 mM, potom sa vzorky dialyzovali najprv 2 h proti 1 1 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,4 a 50 % glycerolom a nakoniec cez noc proti 2 x 1 1 150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,9 a 50 % glycerolu.
Alikvoty vírusu sa skúmali potom na bunkách na ich titer (CPE-end point-assay alebo plaque-assay, Precious a Russel, 1985). Potom sa stanovoval účinok formaldehydom ošetrených vírusov na génový prenos v HeLa-bunkách (300.000) ako v predchádzajúcich príkladoch, tak, že sa merala luciferázovú aktivita. 90 μΐ vírusovej preparácie spôsobilo prenos DNA, ktorý zodpovedal viac ako 108 svetelným jednotkám. Ošetrovanie vírusu s 0,01 % alebo s 0,1 % formaldehydom sa prejavilo v nepatrnom úbytku aktivity génového prenosu (asi 10-násobný úbytok pri 0,1 %). Hoci ošetrenie s 1 % formaldehydom spôsobil nápadnú stratu aktivity génového prenosu, 90 μΐ vírusu vyvolalo ešte stále génový prenos zodpovedajúci 104 svetelným jednotkám.
Pri ošetrení s 0,1 % formaldehydom bol spojený úbytok vírusového titru na 105 PFU („Plague forming units“) s 10 % úbytkom luciferázovej aktivity. Výsledok vykonaného pokusu je zobrazený na obr. 12A.
c) Inaktivácia adenovírusu dlhovlnovým UV/8 - metoxypsoralenom
Alikvoty vyčisteného vírusového preparátu sa upravili na koncentráciu 0,33 pg/ml 8-metoxypsoralenu (kmeňová koncentrácia 33 pg/ml 8-metoxypsoralenu rozpustená v DMSO) a boli vystavené 365 nm UV-svetelnému zdroju (UVP model TL-33), na ľade v odstupe 4 cm od filtra lampy. Ožarovanie trvalo 15 až 30 min., ako je vidno obr. 12B. Vírusové vzorky boli poslané cez kolónu Sephadex G-25 (Pharmacia, PD-10) ekvilibrované s HBS plus 40 % glycerol a uskladnené pri -70 °C. Vírusové preparáty sa na jednej strane skúmali na schopnosť zosilniť génový prenos pros tredníctvom komplexov pCMVL/hTfpL v HeLa-bunkách (predstavovanú ako svetelné jednotky, pravá os na obr. 12B), na druhej strane na schopnosť replikovať sa v bunkách 293 vírusový titer, ľavá os na obr. 12B).
Príklad 9
TransfekciaNIH3T3-buniek Moloney- vírusom
V tomto a v nasledujúcich príkladoch, ktoré ukazujú zosilnenie intemalizácie komplexov transferín-polylyzín-DNA prostredníctvom retrovírusov, boli, pokiaľ nie je uvedené inak, použité nasledujúce látky a metódy : konjugáty transferín-polylyzín 190 a komplexy konjugátov DNA boli vytvorené analogicky ako v predchádzajúcich príkladoch, s tým rozdielom, že reakcia tvorby komplexov sa vykonávala v objeme 500 μί mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,4.
NIH3T3-bunky boli pestované v médiu DMEM s prídavkom 10 % FCS, 100I.E./ml penicilínu, 100 pg/ml streptomycínu a 2 mM glutamínu. Na transfekciu sa nasadilo 5 až 7 x 105 buniek na T25-fľašu 18 až 24 h pred transfekciou. Bezprostredne pred transfekciou sa bunky dali do čerstvého média a rôzne komponenty používané na transfekciu sa pridávali v nasledujúcom poradí: chloroquin (100 μΜ, kde je udaný), komplex polylyzín-transferínDNA, retrovírusový preparát. Nato sa bunky inkubovali 4 h pri 37 °C, potom sa vymenilo médium, a po 24 h sa bunky zbierali. Extrakty sa vytvorili tak, že sa aplikovali 3 cykly zmrazovania a rozmrazovania; alikvoty extraktu, štandardizované čo sa týka obsahu proteínu, sa vyšetrovali na luciferázovú aktivitu, ako bolo uvedené v ostatných príkladoch.
Za uvedených podmienok sa vykonala transfekcia 106 buniek NIH3T3 komplexami TfpL-DNA za prítomnosti 100 μΜ chloroquinu alebo bez chloroquinu, ako je uvedené na obr. 13. Zistilo sa, že bez chloroquinu hodnoty luciferázovej aktivity dosiahli iba úroveň pozadia (stĺpec 1), pokým za prítomnosti chloroquinu bolo možné namerať vysokú expresiu pRSVL-reportérového génu. Zvyšujúce sa množstvá Moloney-vírusu leukémie, ktoré boli súčasne s DNA-komplexami pridávané k bunkám, mohli spôsobiť zvýšenie génovej expresie luciferázy. (Množstvá uvedené na obr. 13 sú v ml).
Príklad 10
Vyšetrovanie, či zvýšenie prenosu génov je možné pripísať retrovírusu
Vírusový preparát použitý v príklade 9 bol surový, nefrakcionovaný supematant retrovírusom exprimovaných buniek. Aby sa získal dôkaz o tom, že zvýšenie importu DNA, ktorá je obsiahnutá v tomto preparáte, je skutočne spôsobené vírusom, supematant retrovírusu bol podrobený opísanej dialýze/koncentračnému čisteniu, pričom supernatant retrovírusu (ako je uvedené na obr. s RVS) bol lOx koncentrovanejší. Ak je za zosilnenie zodpovedný retrovirus, mala by aktivita zistená v pozostatkoch membrány, odhliadnuc od prípadnej inaktivácie nanajvýš labilného retrovírusu počas kroku koncentrácie, dosahovať približne desaťnásobok pôvodného supernatantu. Ako v predchádzajúcom príklade sa transfikovalo IO6 buniek NIH3T3 za podmienok uvedených na obr. 14. Z obr. 14 je zjavné, že zosilňujúci účinok génového prenosu v zvyškoch membrány existuje, (použilo sa 20 až 600 μ!, stopy 3 - 6). Okrem toho sa ukázalo, že 200 až 600 μί desaťnásobne koncentrovanejšieho preparátu bolo približne polovičné aktívnych, ako 2 až 6 ml pôvodného, nekoncentrovaného retrovírusového preparátu (stopy 7 a 8).
Paralelne s týmto sa vykonali pokusy s humánnymi K562 - bunkami, ktoré nemajú receptor pre ekotropný myšací retrovírus. Ako sa očakávalo, nedocielilo sa žiadne zosilnenie génovej expresie.
Príklad 11
Pri účinku génového prenosu Moloney-virusom hrá rolu vzájomné pôsobenie transferínu a jeho receptora
Aby sa vylúčila možnosť, že prenos komplexov TfpL/pRSVL do buniek je spôsobený nešpecifickou väzbou polylyzínu na retrovírus, a aby sa mechanizmus vstupu lepšie objasnil, skúmala sa schopnosť retrovírusu vložiť do bunky plazmidovú DNA, komplexovanú iba s polylyzínom. Použité množstvo polylyzínu zodpovedá už predtým zistenému optimu, ktoré spôsobuje úplnú kondenzáciu plazmidovej DNA a je podobné množstvu polylyzínu, aké sa používa v konjugátoch polylyzín - transferín (Wagner et al., 1991a) Pokusmi, ktorých výsledok je zobrazený na obr. 15, sa zistilo, že reportér - gén pri absencii chloroquinu sa neexprimoval ani vo forme komplexov TfpL-pRSVL, ani vo forme komplexov pL-pRSVL (sĺpce 1 a 2). Za prítomnosti retrovírusu oproti tomu reportér-DNA aplikovaná ako TfpL-komplex exprimovala, ale nie v komplexe pL-DNA (porovnaj sĺpce 3 a 4 so stĺpcami 5 a 6). Ďalej sa vykonanými pokusmi zistilo, že prítomnosť nadbytku voľného transferínu spôsobila úbytok importu DNA, ktorý bol uľahr čený retrovírusom (sĺpce 7 a 8). Aj tieto výsledky podporujú predstavu, že vzájomné pôsobenie medzi transferínom a jeho receptorom hrá podstatnú rolu pre zosilnenie prijímania DNA, spôsobeného retrovírusom.
Príklad 12
Vplyv pH-hodnoty na účinnosť génového prenosu retrovírusov
Experimenty vykonané v rámci tohto príkladu sa robili preto, aby sa preskúmal vplyv hodnoty pH na schopnosť retrovírusov zosilniť génový prenos. Pokusy s transfekciou sa vykonali ako v predchádzajúcich príkladoch. Aby sa zistilo, či je pre génový prenos podstatná nízka hodnota pH, použili sa oba inhibítory endozomálneho znižovania pH s vhodnými vlastnosťami, monenzín a chlorid amónny. Vyšlo sa z úvahy, že obidve tieto substancie vtedy znížia génový prenos, ak retrovírus na efekt génového prenosu použije nižšiu pH-hodnotu endozómu. Ak sa naopak použijú na tento efekt iné mechanizmy, menovite priama fúzia na povrchu cytoplazmy, podobne ako pri mechanizme vstupu HIV, tak by tieto substancie nemali mať žiaden negatívny účinok, ale eventuálne dokonca zosilňovací účinok, ak zmenia cestu komplexov TfpL-DNA. Výsledky pokusu, ako sú zobrazené na obr. 16, podporujú skôr neskoršie menovanú hypotézu. Skúmali sa účinky obidvoch substancií na prenos TfpL-DNA, a prišlo sa na to, že žiadna z týchto substancií nedokáže nahradiť chloroquin. Aj keď sa zistil obmedzený prírastok génovej expresie pri použití vyšších koncentrácií chloridu amónneho (sĺpce I až 5). Retrovírus samotný vykazuje už v predchádzajúcich pokusoch pozorované ľahké zosilnenie prenosu DNA (stopa 6). Silný prírastok bol spozorovaný, keď sa použil retrovírus za prítomnosti 1 μΜ monenzínu (stopa 7). Menej silný účinok sa pozoroval pri vyšších koncentráciách monenzínu (stopa 8), ako aj za prítomnosti chloridu amónneho (stopy 9 a 10).
Príklad 13
Zosilnenie génového prenosu dosahovaného konjugátmi transferínu pomocou N-koncového endozomolytického peptidu influenza-hemaglutininu HA2
a) syntéza peptidu
Peptid so sekvenciou (SEQ ID NO:1) Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys sa syntetizoval za pomoci Fmoc (fluorenylmetoxykarbonylovej) metódy (Atherton et al., 1979), pričom sa použil Applied Biosystems 431A Peptidsyntetizer. Ochranné skupiny bočných reťazcov boli t-butyl pre Cys, Glu a Asp a trityl pre Asn. Po spájacej reakcii sa vykonal ninhydrinový test, ktorý ukázal stupeň spojenia > 98 % na jeden krok. Počnúc od A-19 sa vykonávali dvojité spojenia. N-koncová Fmoc-skupina sa odstránila 20 % piperidínom v NMP (N-metylpyrolidon) z časti peptidovej živice. Potom sa frakcie s Fmoc-ochranou a nechránené frakcie premyli s DCM (dichlórmetánom) a usušili sa za vysokého vákua. Výnos bol 293,6 mg peptidovej živice bez Fmoc, prípadne 366,5 mg živice s Fmoc-ochranou. 111,1 mg peptidovej živice bez Fmoc sa na
1,5 h podrobilo štiepeniu trifluoroctovou kyselinou, pričom sa použila zmes 10 ml TFA, 0,75 g fenolu, 300 μί EDT (etanditiol) 250 μί Et-S-Me(etylmetylsulfid) a 500 μί vody. Peptid bol od živice odfiltrovaný cez sklenený odsávací filter. Živica sa premyla s DCM, čo sa pridalo k filtrátu. Filtrát sa zahustil na približne 2 ml a po kvapkách sa za miešania pridal do 40 ml éteru. Peptidová zrazenina sa odstredila a éterový supematant sa vyhodil. Zrazenina sa 3x premyla so 40 ml éteru a usušila sa za vysokého vákua. Získaných 58 mg surového produktu sa rozpustilo v 3,5 ml 20 mM NH4HCO3, ktorý obsahoval 300 μί 25 % NH3/1. Roztok sa s použitím toho istého tlmivého roztoku filtroval cez predplnenú kolónu Sephadex G-25 (Pharmacia, PD-10). Celý materiál sa preniesol na kolónu Mono-Q (Pharmacia 100 x x 14 mm) (gradiento: 0-10 min. 100 % A, 10 - 100 min. 0 - 100 % B, A: 20 mM NH4HCO3 + + 300 μί NH3 /1. B: A + 3 M NaCI. Meranie pri 280 mM, dôkaz Trp-fluorescencie pri 354 nm. Prietok 1 ml/min.). Produkt je eluovaný s 1 M NaCI. Hlavná frakcia Mono-Q-kolóny sa ďalej prečisťovala reverznou fázou HPLC s použitím kolóny BIORAD-Hi-Pore RP-304 (250 x 10 ml) (gradient: 50 - 100 % tlmivý roztok B za 12,5 min., 12,5 až 25 min. 100 % B. A: 20 mM NH4HCO3 + 300 pl NH3/I, B: A v 98 % metanole, prietok 3 ml/min., meranie pri 237 nm). Produkt eluuje pri 100 % B. Frakcie produktu sa odparili na speedvacu, rozpustili sa znova v tlmivom roztoku A a na záver sa lyoftlyzovali. Výťažok bol 8,4 mg produktu vyčisteného HPLC v cystein chránenej forme (peptid bol označený ako „P 16“). Aby sa získal peptid 1 vo voľnej merkaptoforme, t-butyl-chránená substancia sa 30 min. ošetrovala pri izbovej teplote s tioanizol/etaneditiol/kyselina trifluórooctová/kyselina trifluórmetánsulfónová (2/1/40/3; kyselina trifluórmetánsulfónová sa v uvedenom pomere pridala po ostatných komponentoch). Peptid sa po vyzrážaní éterom a následnou gélovou filtráciou (Sephadex G-25) izoloval s uvedeným tlmivým roztokom A v argónovej atmosfére.
b) Spájanie influenza-peptidov s polylyzínom bl) priama väzba cez SPDP (sukcinimidylpyridylditiopropionát)
19,8 mg polylyzínu (pL) 300-hydrobromidu (Sigma) sa na kolóne Sephadex G-25 (Pharmacia, PD-10) podrobilo gélovej filtrácii v octane sodnom pH 5, aby sa odstránili nízkomolekulárne frakcie. Ninhydrinové testy ukázali koncentráciu pL po gélovej filtrácii 3,16 mg/ml. Hodnota pH roztoku bola pomocou 1 M NaOH nastavená na 7 až 8. Ku
2,5 ml roztoku pL (7,9 mg pL = 0,13 pmol) sa pridalo 0,64 SPDP (Pharmacia: 40 mM roztok v absolútnom EtOH).Toto zodpovedá molárnemu pomeru SPDP : pL 5 : : 1. Zmes sa nechala cez noc reagovať a podrobila sa gélovej filtrácii v 20 mM NH4HCO3 pH 8,2 na kolóne Sephadex G-25 (Pharmacia, PD-10). Po redukcii jedného alikvotu filtrátu s DTT (ditiotreitol) ukázali merania thiopyridonu, že reakcia úplne prebehla. 0,3 pmol (vzťahuje sa na pmol SPDP) pL-SPDP v 2,212 ml sa nechalo reagovať s 0,35 pmol peptidu v tiolovej forme. Biela zrazenina, ktorá sa objavila pri miešaní peptidu a pL, sa rozpustila tak, že roztok sa nastavil na 2 M guanidinhydrochlorid, pričom reakcia sa udiala cez noc. Fotometrické merania tiopyridonu v reakčnej zmesi potvrdili znova úplnosť reakcie. Potom sa zmes 2 x dialyzovala proti 2 I 20 mM HEPES/0,5 M guanidinhydrochlorid. Získaný roztok sa preniesol na mono-S-kolónu (0,7 x 6 cm, Pharmacia) (gradient: 0 až 20 min. 100 % A, 20 až 140 min. 0 až 100 % B. A: 20 mM HEPES pH 7,3/0,5 M guanidinhydrochloridu B: 20 mM HEPES pH 7,3/3M guanidinhydrochloridu, 0,3 ml/min. Dôkaz pri 280 nm a dôkaz fluorescencie pri 354 nm, vzbudenie pri 280 nm). Frakcia produktu, eluovaná s 1,5 M guanidinhydrochloridom, sa dialyzovala proti 2x21 HBS. Záverečné stanovenie koncentrácie pL ninhydrmovým testom vykázalo koncentráciu približne 1,14 mg/ml. Množstvo peptidu v roztoku konjugátu sa vyrátalo z jeho absorpcie pri 280 nm; tak sa získal molámy pomer peptidu:pL 4:1.
b2) viazanie cez polyetylenglykolový linker (viazač)
14,6 mg pL 300 hydrobromid (Sigma) sa podrobil gélovej filtrácii, ako bolo opísané v bl. Na základe ninhydrinového testu sa po gélovej filtrácii stanovila koncentrácia pL 4,93 mg/ml. pH-hodnota roztoku bola pomocou 1 M NaOH nastavená na 7 až 8. Ku 2,7 ml roztoku pL (13,3 mg pL= 0,22 pmol) sa pridalo 4,33 pmol SPDP (Pharmacia; 30 mM roztoku v absolútnom EtOH). Toto zodpovedá molárnemu pomeru SPDP : pL 20 : 1. Po 1,5 h sa reakčná zmes prefiltrovala gélom na kolóne Sephadex G-25 (Pharmacia, PD-10) v 0,1 M roztoku octanu sodného/3 M guanidinhydrochloridu. Po redukcii jedného alikvotu filtrátu s DTT (ditiotreitol) sa vykonalo meranie tiopyridonu, ktoré vykázalo obsah 3,62 pmol SPDP vo frakcii produktu. pL modifikovaný SPDP sa redukoval pridaním 79 mg DTT ku roztoku. Po 2 h redukcie sa roztok znova filtroval za uvedených podmienok na G-25. Stanovenie tiolu prostredníctvom Ellmannovho testu ukázalo koncentráciu tiolu 3,15 pmol v 2,224 ml.
17,62 mg = 5 pmol POE (polyoxyetylén-bis (6-aminohexyl), Sigma) sa rozpustilo v 500 pl 20 mM NaHCO3 /3 M guanidinhydrochloridu pH 7 - 8 a nechalo sa reagovať s 13,8 mg EMCS (epsilomaleidomidokapronová kyselina -N-hydroxysukcininmidester) (Sigma) (= 44,7 pmol) rozpustenými v 300 μί DMF (dimetylformamid). Po 30 min. sa roztok nechal na G-25 filtrovať gélom (20 mM NaHCO3/3 M guanidinhydrochloridu). Fotometrické stanovenie maleimidoskupiny pri 300 nm vykázalo koncentráciu 6,36 pmol zreagovanej EMCS v 2 ml roztoku.
K 1,049 ml tohto roztoku (zodpovedá 3,34 pmol
EMCS) sa pridalo 1,39 pmol peptidu v tiolovej forme (v
2,5 ml 20 mM NaHCO3/3 M guanidinhydrochloridu po
SK 281682 Β6 kvapkách za intenzívneho miešania vortexom v argónovej atmosfére. Po 15 min. už Ellmannovým testom neboli preukázateľné žiadne voľné tiolové skupiny.
Roztok redukovaného pL modi fikovaného SPDP sa pridaním 1 M NaOH upravil na pH-hodnotu 7 až 8. 1,373 ml tohto roztoku za intenzívneho miešania vortexom sa pridal k uvedenej reakčnej zmesi. Tak sa získal molámy pomer peptid-SH ; POE-EMCS : pL-SH 1: 2,4 : 1,4 (vzťahuje sa na EMCS príp SH). Po 2,5 h reakcii už Ellmannovým testom neboli preukázateľné žiadne voľné tiolové skupiny. Materiál sa cez noc nechal dialyzovať proti 2 1 20 mM HEPES pH 7,3/0,6 M NaCl a nakoniec sa preniesol na Mono-S-kolónu (gradient: 0 až 20 min. 22 % A, 20 až 150 min. 22 až 100 % B. A: 20 mM HEPES pH 7,3 B: A + + 3 M NaCl. Prietok 0,3 ml/min. Meranie sa robilo pri 280 nm a meranie fluorescencie pri 354 nm. Produkt, eluovaný s 1,5 až 1,6 M NaCl, sa dialyzoval proti 2 1 HBS. Stanovenie koncentrácie pL ninhydrinovým testom a fotometrické stanovovanie peptidovej koncentrácie pri 280 nm dalo vyrátaný pomer peptidu:pL 12 : 1 pri pL koncentrácii 0,49 mg/ml v celkovom objeme 4,5 ml.
c) lipozomové preparáty
Pomocou metódy REV („reverse-phase evaporation) sa vytvorili lipozómy (Szoka a Papahadjopoulos, 1978; Straubinger a Papahadjopoulos, 1983): vodná fáza 10 mM HEPES pH 7,3, 100 mM kalceín 150 mM NaCl, organická fáza: roztok 300 pmol L-a-lecitínu (z vaječných žĺtkov, hlavne palmitoyloleoylfosfatidylcholin; Avanti Polar Lipids) v 260 pl chloroformu sa odparil s použitím rotačnej odparovačky materiál sa nakoniec vysuší za vysokého vákua a potom sa rozpustil v 3 ml dietyléteru. 1 ml vodnej fázy sa poriadne zamiešal s éterovou fázou prostredníctvom vortexu a 5 min. sa pri 0 °C v sonicatore (typ kúpeľa) pôsobilo ultrazvukom. Po 30 min. na ľade na materiál znova 10 min. pôsobil ultrazvuk. Výsledná stabilná emulzia sa pomaly na rotačnej odparovačke odparila. Po odstránení dietyléteru pri 100 mbar sa pridalo 0,75 ml vodnej fázy. Zvyšné stopy éteru sa odstránili ďalším odparovaním pri 5.10' Pa, počas 30 min. Získaná emulzia (1,7 ml) sa centrifugovala pri 500 Upm a na záver sa extrudovala cez nukleoporéznu polykarbonátovú membránu (0,1 pm), čím sa získal konečný objem 0,7 ml lipozómového roztoku. Lipozómy sa oddelili od neinkorporovaného materiálu gélovou filtráciou na kolóne (Sephadex G-50 médium (Pharmacia, PD-10) 23 ml objemu gélu, 10 mM HEPES pH 7,3/150 mM NaCl). Pozbieralo sa šesť frakcií s objemom 500 pl. Lipidový fosfor sa stanovil Bartlettovou metódou, 1959, s 2 mM.
d) Lipozómový test priepustnosti (Liposomen Leakeage Assay)
Uvoľnenie obsahu lipozómu („leakage“) sa zmeralo pomocou výstupu uzavretého kalceínu a z toho vyplývajúceho zriedenia, ktoré spôsobuje zvýšenie samozhášania fluorescencie (Bondeson et al., 1984). Fluorescencia kalceínu sa merala na spektrálnom fluorimetri Kontron SMF 25 (vzbudenie pri 490 nm, emisia pri 515 nm). S týmto cieľom sa 100 pl alikvoty uvedeného lipozómového roztoku zriedili 100 krát 0,1 M octanom sodným alebo tlmivým roztokom 10 mM HEPES/150 mM NaCl) s príslušnou hodnotou pH (4,3, 4,5, 5,0, 6,0, 7,3), aby sa získal objem 1 ml. K týmto roztokom sa pridalo 2,5 pg peptidov(vo forme chránenej t-butylom; 1 pg/pl roztoku v HBS) v kyvetách za miešania s jemným argónovým prúdom (konečná koncentrácia 400 nM peptidov). Fluorescencia kalceínu sa merala po pridaní peptidov v rôznych časových bodoch. Hodnoty pre 100 % leakage sa stanovili pridaním 2 pl Tritonu X-100 (Fluka).
Ten istý postup bol použitý na meranie fluorescencie kalceínu po pridaní konjugátov peptid-pL ku lipozómovému roztoku. 2,5 pg konjugátu (1 pg/pl, koncentrácia sa týka samotného množstva pL) sa pridalo k 1 ml lipozómového roztoku (konečná koncentrácia 20 nM modifikovaného peptidu). Analogicky sa podrobilo aj 2,5 pg konjugátu peptid- polylyzín po inkubácii s 5 pg DNA (15 min.) leakage testu.
Zistilo sa, že peptid spôsobuje uvoľňovanie obsahu lipozómov iba v kyslom prostredí (obr. 17). Konjugát peptidu bol aktívny pri podstatne nižších pH-hodnotách, pričom sa zistila aj vysoká aktivita pri neutrálnom pH, ktorá sa pri poklese pH hodnoty ešte zvýšila.
Komplexovanie konjugátu s DNA eliminovalo aktivitu pri neutrálnej pH-hodnote, zatiaľ čo pri kyslej hodnote pH bola aktivita výrazná.
a) transfekcia K562-buniek
Bunky K562 sa pestovali v suspenzii v RPMI 1640-médiu (Gibco BRL plus 2 g hydrouhličitanu sodného/1) plus 10 % FCS, 100 jednotiek na ml penicilínu, 100 μΐ/μΐ streptomycínu a 2 mM glutamínu až do hustoty 500.000 buniek/ml. 12 až 20 h pred transfekciou sa dali bunky do čerstvého média, obsahujúceho 50 μΜ desferioxamínu (toto opatrenie sa urobilo na docielenie zvýšenia počtu transferínových receptorov). V to ráno, keď sa mala robiť transfekcia, sa bunky pozbierali, suspendovali v čerstvom médiu, obsahujúcom 10 % FCS plus 50 μΜ desferioxamínu (250.000 buniek /ml) a vždy sa dali 2 ml do jednej misky, s 24 jamkami.
pg pCMVL-DNA v 160 μΐ HBS sa zmiešalo s udanými množstvami TfpL-konjugátu alebo pL300 v 160 μΙ HBS, uvedenými na obr. 18, po 15 min. sa pridali udané množstvá konjugátu influenzapeptid-pL („P16pL“), po ďalších 15 min. sa pridala zmes k bunkám K562. Bunky sa inkubovali pri 37 °C 24 h a potom sa zbierali na luciferázový test. Luciferázová aktivita sa stanovila tak, ako je uvedené v predchádzajúcich príkladoch. Hodnoty udané na obr. 18 predstavujú celkovú luciferázová aktivitu transfikovaných buniek.
f) transfekcia HeLa-buniek
HeLa bunky sa pestovali v 6 cm kultivačných miskách, tak, ako je opísané v „bunky a médiá“. Transfekcia sa vykonala pri hustote 300.000 buniek na platničku. Pred transfekciou sa inkubovali bunky s 1 ml čerstvého média, obsahujúcim 2 % FCS.
pg pCMVL-DNA v 160 μΙ HBS sa zmiešalo s udanými množstvami TfpL-konjugátu alebo pL300, uvedenými na obr. 19, alebo so zmesou oboch v 160 μΐ HBS. Po 15 min. sa pridali udané množstvá konjugátu influenzapeptid-pL („P16pL“), po ďalších 15 min. sa pridala zmes k HeLa-bunkám. Bunky sa inkubovali pri 37 °C 2 h, potom sa pridalo 2,5 ml čerstvého média s prídavkom 10 % FCS. Bunky sa inkubovali pri 37 °C 24 h a potom sa zbierali na luciferázový test. Luciferázová aktivita sa stanovila tak, ako je uvedené v predchádzajúcich príkladoch. Hodnoty udané na obr. 19 predstavujú celkovú luciferázový aktivitu transfikovaných buniek.
Príklad 14
Zosilnenie génového prenosu spôsobeného transferinovými konjugátmi za pomoci ďalších N-koncových endozomolytických influenza-hemaglutinín-HA2-peptidov
a) Spôsob výroby konjugátov peptid-polylyzín
Peptid sekvencie (SEQ ID NO:2) Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys s označením P41 sa syntetizovali podobne ako peptid v príklade 13 a). Spojenie peptidu na polylyzín (pL300) sa vykonalo tak, ako v príklade 13 bl) väzbou cez SPDP. Pri tom sa získali konjugáty s molámym pomerom peptid : polylyzín 4:1.
b) transfekcia HcLa buniek konjugátmi influcnza-peptidu
HeLa bunky sa, ako už bolo udané, pestovali v 6 cm kultivačných miskách, transfekcie sa vykonali pri hustote 300.000 buniek/misku. Pred transfekciou sa inkubovali bunky s 1,5 ml čerstvého média, obsahujúceho 2 % FCS. 6 pg pCMVL-DNA v 160 pl HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,3) sa zmiešalo s 6 pg TfpL190B-konjugátu v 160 pl HBS, po 15 min. sa pridalo 10 pg konjugátu influenzapeptid-pL P41pL, alebo na porovnanie, 18 pg konjugátu influenzapeptid-pL P16pL, pozri príklad 13 (obr. 20); uvedené množstvá pre obidva peptidové konjugáty sa testovali, aby predstavovali optimálne množstvá na zosilnenie génového prenosu. Po ďalších 15 min. sa pridala zmes k bunkám. Po 24 h sa bunky zbierali na luciferázový test. Hodnoty udané na obr. 20A predstavujú celkovú luciferázovú aktivitu transfikovaných buniek.
Porovnanie pokusov sa oboma peptidovými konjugátmi ukázalo viacej ako 3,5 násobne zvýšenie génového prenosu peptidovým konjugátom P41pL.
c) transfekcia buniek BNL CL.2 konjugátmi influenzapeptidov
Bunky BNL CL.2 sa pestovali tak, ako je opísané v príklade 6. Influenzapeptid P41 sa konjugoval s polylyzínom 300 pri molámych pomeroch peptid:polylyzín 1 : 1, 3 : 1 a 8 : 1. Komplexy zo 6 pg pCMVL-DNA a 20 pg konjugátov sa pridali k bunkám. Na porovnanie sa použilo 20 pg pL300 alebo 20 pg konjugátu P16-polylyzín, vytvoreného tak, ako je opísané v príklade 13. Bunky sa inkubovali pri 37 °C 4 h, potom sa pridali 2 ml média, obsahujúceho 18 % FCS. Po 24 h sa zbierali bunky na luciferázový test, ktorého výsledky sú zobrazené na obr. 20B. V lipozómovom leakage assay (obr. 20C) , ktorý sa vykonal tak, ako bolo uvedené v príklade 13, stúpla aktivita konjugátov (zodpovedajúc 2,5 pg polylyzín, pH-hodnota 5) so svojím obsahom peptidov (na obr. je P41 označené ako influ2).
Príklad 15
Transfekcia HeLa-buniek s B-galaktozidázovou reportérgénovou konštrukciou a in situ dôkaz B-galaktozidázovej expresie
a) pestovanie a transfekcia buniek
Na transfekciu sa pestovali HeLa-bunky v DMEM-médiu, obsahujúcom 5 % FCS, penicilín, streptomycín a glutamín, ako bolo uvedené v predchádzajúcich príkladoch, v cm kultivačných miskách na viečkach (3 x 104 buniek/misku).
Na transfekciu sa komplexovalo 6 pg B-galaktozidázovej reportérgénovej konštrukcie (pCMV-B-gal) v 160 pl HBS s 12 pg TfpL190B v 160 pl HBS a inkubovala sa 30 min. pri izbovej teplote.
V ďalšom pokuse sa 6 pg pCMV-B-gal v 160 pl HBS inkubovalo s 6 pg TfpL190B v 80 pl HBS 15 min. pri izbovej teplote. Potom sa pridalo 12 pg konjugátu influenzapeptidov (P16pL), vyrobeného v príklade 13, v 80 pl HBS a zmes sa inkubovala ďalších 15 min. pri izbovej teplote. Tieto DNA-polykationové komplexy sa potom zmiešali s 1 ml DMEM plus 2 % FCS, antibiotikami a glutamínom, ako bolo uvedené. Aby sa preukázal účinok chloroquinu a adenovírusu na schopnosť zvýšiť transfekciu, pridával sa v ďalších pokusoch chloroquin pri konečnej koncentrácii 100 pM alebo 50 pl adenovírusového kmeňového roztoku dl312 ešte navyše k médiu, ktoré obsahovalo DNA-polykatiónové komplexy.
Na transfekcie sa pôvodné kultivačné médium z buniek odstránilo a pridal sa 1 ml média, obsahujúceho DNA-komplexy s alebo bez chloroquinu alebo vírusu. Po inkubačnom čase 2 hodín pri 37 °C sa pridal 1 ml DMEM, obsahujúceho 10 % FCS, antibiotiká a glutamín a inkubácia pokračovala ďalšie 2 h. Potom sa celé médium odstránilo a bunky sa pestovali v 3 ml čerstvého DMEM plus 10 % FCS, antibiotiká a glutamín.
b) B-galaktozidázový test h po transfekcii sa médium odstránilo, bunky sa lx premyli v roztoku kuchynskej soli pufrovanom fosfátovým tlmivým roztokom (PBS) a fixovali sa 0,5 % glutardialdehydom v PBS 5 min. pri izbovej teplote. Potom sa fixovací prostriedok odstránil a bunky sa premyli lx s PBS. Nakoniec sa inkubovalo pri 37 °C 20 min. až 3 h s farebným roztokom (10 mM fosfátový tlmivý roztok pH 7,0,150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3,3 mM K4Fe(CN)63H2O, 3,3 mM K3Fe(CN)Ď a 0,2 % 5-bróm-4-chlór-3-indolyl-B-galaktopyranosid) (Li a Chae, 1989). Potom sa viečka opláchli v PBS, vode a 96 % etanole, usušili sa a pokryli sa Mowiolom na objektovom nosiči. Na analýzu sa použil Zeiss Axiophot mikroskop.
Na obr. 21 sú zobrazenia mikroskopických zväčšenín (112 x). A: HeLa-bunky, transfikované so 6 pg pCMV-B-gal, komplexované s 12 pg TfpL190B. V priebehu 3 hodín prebehla farebná reakcia pre B-galaktozidázu. Obr. ukazuje, že veľmi málo buniek (55 buniek; skupina zafarbených buniek je označená šípkou) exprimovalo B-galaktozidázový gén. B: HeLa-bunky, transfikovanč so 6 pg pCMV-B-gal, komplexované so 6 pg TfpL190B a 12 pg P16pL. Farebná reakcia: 3 h. Málo buniek (250 buniek) exprimovalo B-galaktozidázu. Reakcia buniek je však predsa len lepšia ako v A. C: HeLa-bunky, transfikované so 6 pg pCMV-B-gal, komplexované so 6 pg TfpL190B a a 12 pg P16pL za prítomnosti 100 pM chloroquinu. Farebná reakcia: 3 h. Veľa skupín buniek vykázalo silne pozitívnu reakciu (viacej ako 1000 buniek). D: HeLa-bunky, transfikované so 6 pg pCMV-B-gal, komplexované s 12 pg TfpL190B za prítomnosti adenovírusu dl312. Farebná reakcia: 20 min. Takmer všetky bunky (viac ako 90 %) vykázali pozitívnu reakciu. E: Netransfikované HeLa-bunky (kontrola na špecifičnosť B-galaktozidázovej reakcie). Farebná reakcia: 3 h.
Príklad 16
Transfekcia HeLa buniek so 48 kb kosmidom za prítomnosti voľného adenovírusu
a) vytvorenie kosmidu, obsahujúceho sekvenciu kódujúcu luciferázu
Aby sa vytvorili konkataméry, 3,0 kb Sall-fragment, obsahujúci jedinú P. pyralis luciferázu kódujúcu sekvenciu za kontroly RSV-promotora, sa ligoval z plazmidu p22RSVLuca a do jediného miesta Sali kosmidového klonu Cl-7al. (Cl-7al obsahuje 37 kb humánnej genomovej DNA Sau3A-fragment (čiastočne natráveného), nekódujúceho nijaké zjavné gény, klonovaného v mieste BamHI kosmidového vektora pW15 (stratagény). Produkt ligačnej reakcie bol in vitro zabalený a alikvot získanej fagovej častice v E. coli MN544 infikovaný a bol umiestnený na LB amp platničkách. Rekombinanty boli prostredníctvom hybridácie kolónií s použitím 3,0 kb Sall-fragmentu sledované (32-P-značený randomizovaným primingom) ako hybridizujúcou sondou a istý počet pozitívnych sa analyzoval reštrikčným skartovaním. Kosmidová konštrukcia (CosLuc) obsahujúca jedinú kópiu Sall-insertu, sa pestovala a čistila na céziovom gradiente (celková veľkosť: 48 kb).
Malý kontrolný kosmid pWELuc (12 kb) sa vytvoril spracovaním CosLuc s Not I, religovaním, transfekciou z baktérií a izoláciou správneho plazmidu. Takto sa získalo 12 kb DNA molekula, ktorej chýbala časť humánneho DNA-insertu a časť polylinkera CosLuc-u. Plazmid pSPNeoLuc (8 kb) je v príklade 5 opísaný plazmid, ktorý klonuje RSV - luciferázový génový fragment (Apal/Pvul-fragment z pRSVL, klonovaný v mieste C lal pUCp-I.ocus-u).
b) transport kosmidu do HeLa-buniek
HeLa bunky (3 x 104 buniek na každú 6 cm misku), pokrytú s 1 ml DMEM + 2 % FCS sa inkubovali s TipL/DNA - komplexami, vytvorenými tak, ako je opísané v úvode k príkladom, ktoré obsahovali uvedené množstvá hTfpL, voľného polylyzínu a DNA. K tomu dostali inkubačné zmesi buď 100 μΜ chloroquinu (sĺpce 1 a 2) alebo 10 μΐ adenovírusu dl312, obsahujúceho 5 x 10 častíc na ml (sĺpce 3 až 12). Po dvojhodinovej inkubácii pri 37 °C sa do každej misky pridali 4 ml DMEM + 10 % FCS. O 24 neskôr sa zbierali bunky a merala sa luciferázová aktivita. Výsledky sú zobrazené na obr. 22A.
c) prenos kosmidu do neuroblastómových buniek
Bunky neuroblastómovej línie buniek s označením GI-ME-N (Donti et al., 1998) (1 x 106 buniek na každú 6 cm misku, pokrytú s 1 ml DMEM + 2 % FCS sa inkubovali s TfpL/DNA-komplexami, vytvorenými tak, ako je opísané, ktoré obsahovali uvedené množstvá hTfpL, voľného polylyzínu a DNA. K tomu dostali inkubačné zmesi buď 100 μΜ chloroquinu (sĺpce 3 a 4) alebo 10 μΐ adenovírusu dl312, obsahujúceho 5 x 10 častíc na ml (sĺpce 5 až 6). Po dvojhodinovej inkubácii pri 37 °C sa do každej misky pridali 4 ml DMEM + 10 % FCS. O 24 neskôr sa zbierali bunky a merala sa luciferázová aktivita. Výsledky sú zobrazené na obr. 22B.
Príklad 17
Génový prenos prostredníctvom chemicky spojeného konjugátu adenovírus-polylyzín
a) vytvorenie konjugátov adenovírus-polylyzín prostredníctvom chemického spojenia
Gélovou filtráciou (Sephadex G-25 PD 10, Pharmacia) získaných 2,35 ml roztoku adenovírusu d 1312 (približne 10 častíc) v 150 mM NaCl/25 mM HEPES, pH 7,9/10 % glycerol, sa pomiešalo s 10 μΙ (10 nmol) 1 mM roztoku SPDP (pharmacia). Po 3,5 h pri izbovej teplote sa modifikovaný vírus gélovou filtráciou oddelil od nadbytočného reagensu. Roztok (2,5 ml) sa opláchol argónom a s vylúčením kyslíka a pod argónom sa nechal reagovať so 42 μΐ roztoku FITC-značeného polylyzínu (1 nmol), modifikovaného s 2,3 nmol merkaptopropionátových skupín (vytvorených ako je opísané v EP 388 758). Po 18 h pri izbovej teplote sa polovica roztoku naliala do centrifugačnej skúmavky, opatrne podvrstvenej s 1 ml roztoku chloridu cézneho (hustota 1,33 mg/ml) a 2 h sa centrifugovalo pri 35000 rpm (rotor SW60 ) pri izbovej teplote. Skupina vírusu sa zbierala ako 200 μΐ frakcia chloridu cézneho a bola zriedená s HBS/50 % glycerolom na 1 ml. Test väzby DNA sa spravil s 300 μΐ modifikovaného vírusu: vírusový roztok sa zriedil so 1 ml HBS a pomiešal sa 100 μΐ roztoku 35S-značenej DNA (15 ng pRSVL, vytvoreného Nick-transláciou). Na kontrolu sa paralelne vykonal pokus s rovnakým množstvom nemodifikovaného vírusu dl312. Po 30 min. sa vzorky previedli do centrifugačných skúmaviek, opatrne sa podvrstvili s 1 ml roztoku chloridu cézneho (hustota 1,33 mg/ml) a 2 h sa centrifugovalo pri 35 000 rpm (rotor SW60) pri izbovej teplote. Gradient bol rozdelený na 5 frakcií; frakcia 1, 1 ml; frakcia 2, 0,6 ml; frakcia 3 až15 každá 200 μΐ. Stanovila sa rádioaktivita každých 200 jil frakcií aje zobrazená na obr. 23. Pritom sa vo frakciách, obsahujúcich vírus (3 až 5), hlavne frakcia 3, zistila podstatne vyššia rádioaktivita ako v kontrolnom pokuse; to sa dá pripísať špecifickej asociácii polylyzínom modifikovaného adenovírusu so značenou DNA.
b) transfekcia buniek K562
Bunky K562 (ATCC CCL 243) sa pestovali v suspenzii v RPMI 1640 - médiu (Gibco BRL plus 2 g hydrouhličitanu sodného/1) plus 10 % FCS, 100 jednotiek na ml penicilínu, 100 μΐ/μΐ streptomycínu a 2 mM glutamínu až do hustoty 500.000 buniek/ml. 12 až 20 h pred transfekciou sa dali bunky do čerstvého média, obsahujúceho 50 μΜ desferioxamínu (toto opatrenie sa urobilo na docielenie zvýšenia počtu transferínových receptorov). V to ráno, keď sa mala robiť transfekcia, sa bunky pozbierali, suspendovali v čerstvom médiu, obsahujúcom 10 % FCS plus 50 μΜ desferioxamínu (250.000 buniek/ml) a vždy sa dali 2 ml do jednej misky s 24 jamkami. Uvcdcnc množstvá pCMVL-DNA (6,0.6, 0,06 μg) v 100 μΙ HBS sa zmiešali s 50 μΐ polylyzínadenovírusu (pLAdeno), príp. zodpovedajúcimi množstvami (35 μΙ) kontrolného adenovírusu dl312. Po 20 min. sa pridali zodpovedajúce množstvá (12, 1,2, 0,12 pg) konjugátu TfpL190B v 150 μΙ HBS. Po ďalších 20 min. sa zmes pridala k bunkám K562. Bunky sa inkubovali 24 h pri 37 °C a potom sa zbierali na luciferázový test. Luciferázová aktivita sa stanovila tak, ako bolo uvedené v predchádzajúcich príkladoch. Hodnoty na obr. 24 predstavujú celkovú luciferázovú aktivitu transfikovaných buniek.
SK 281682 Β6
c) transfekcia HeLa buniek
Metódou preskúšania aktivity polylyzín - vírusového konjugátu je preskúšanie konjugátu na jeho schopnosť prenášať veľmi malé množstvá DNA (menej ako pg). Očakávalo sa zvýšenie kapacity prenosu DNA, ak adcnovírus jc priamo viazaný na polylyzínom kondenzovanú DNA, pretože internalizačné faktory (transferín a adenovírusový vláknitý proteín) sú priamo asociované spolu s prenášanou DNA. Aby sa preskúšala správnosť tohto predpokladu, komlexovalo sa konštantné množstvo konjugátu polylyzin-adenovírus (2,5 μί, približne 5 x 107 vírusových častíc) s rôznymi množstvami (3 pg až 0,0003 pg) reportérplazmidov v 475 pl HBS. Po 15 min. inkubácie pri izbovej teplote sa ku každej vzorke pridalo množstvo transferínpolylyzínu zodpovedajúce mase DNA (toto množstvo TfpL sa zvolilo, pretože zaručuje úplné „pakovanie“ (elektroneutralitu) 50 % plazmidovej DNA a súčasne dáva voľný priestor väzbe konjugátu vírus-polylyzín. Po pridaní TfpL sa zmesi inkubovali 15 min., potom sa každá zmes pridala do 6 cm kultivačnej misky, ktorá obsahovala 300.000 HeLa buniek v 1 ml DMEM/2 % FCS. Potom sa bunky inkubovali pri 37 °C 1,5 h, načo sa pridalo 4 mlDMEM/10 % FCS. Paralelne s tým sa ekvivalentné množstvá DNA komplexovali s dvojnásobným prebytkom TfpL (množstvo pre úplnú kondenzáciu DNA) a použili sa na génový prenos do HeLa buniek (raz samé a raz za prítomnosti 25 pl adenovírusového dl312 preparátu spojeného nie polylyzínom). Po 24 h sa bunky pozbierali, vytvorili sa extrakty a alikvoty sa vyšetrili na luciferázovú aktivitu. Výsledok týchto pokusov je znázornený na obr. 25: pri absencii adenovírusu nie je pri množstvách DNA pod 0,3 pg preukázaná akákoľvek luciferázová aktivita. Adenovírus spojený s polylyzínom ako aj nespojený s polylyzínom fungovali dobre pri veľkých množstvách DNA (3 pg a 0,3 pg). S neprepojeným adenovírusom však bol pozorovaný takmer 100-násobný úbytok aktivity pri 0,03 pg a zanedbateľná aktivita pri tomto množstve DNA. Naproti tomu s polylyzínom spojený vírus si udržal svoju kapacitu génového prenosu pri 0,003 ako aj pri 0,0003 pg DNA. Toto množstvo DNA zodpovedá približne 100 molekulám DNA/bunku a približne 1 vírusovej častici na molekulu DNA.
Príklad 18
Génový prenos pomocou adenovírusu enzymatícky viazaného na polylyzín
a) enzýmová reakcia ml adenovírusového preparátu (kmeň dl312; 5 x 1010 PFU/ml) sa nanieslo na gélovú filtračnú kolónu Sephadex G-25 (Pharmacia), ktorá sa ekvilibrovala s 25 ml reakčného tlmivého roztoku (0,1 M tris-HCl; pH 8,0, 2 mM DTT, 30 % glycerol). Nasledovala elúcia s 3,5 ml reakčného tlmivého roztoku. Reakčnou násadou na enzymatické spojenie je 1150 pl frakcie vírusovej elúcie, 0,5 nmol transglutaminázy z pečene morského prasiatka (TG) (Sigma), 2 nmol pripadne 20 nmol polylyzínu 290, 10 mM CaCl2 a reakčný tlmivý roztoku v konečnom objeme 1500 pl. Reakcia sa vykonávala pri 37 °C viac ako hodinu a potom sa zastavila pridaním 30 pl 0,5 M EDTA. Na kontrolu špecifickosti prepojenia sa robili aj reakčné násady bez transglutaminázy. Neinkorporovaný polylyzín sa od vírusov oddelil centrifugáciou cez CsCI - gradient (hustota 1,33 g/ml; 170 000 x g, 2 h). Frakcia, obsahujúca vírusy, bola odob ratá a pomiešaná s rovnakým objemom glycerolu a zmrazená v tekutom dusíku a uchovaná pri -70 °C.
b) demonštrácia väzby polylyzínu na adenovírusy
Reakcia sa vykonala, ako bolo opísané, s polylyzínom, značeným so l25J prostredníctvom Bolton-Hunterovho reagensu (Amersham). Po CsCI gradientovej centrifugácii bola vírusová frakcia odobratá a oddelená cez ďalší gradient CsCI. Potom sa gradient frakcionoval a stanovila sa rádioaktivita vo všetkých frakciách scintilačným počítačom. Ako je znázornené na obr. 26, ukázalo sa pritom, že pri reakčnej násade s TG (dl312(TG-pL) rádioaktívny polylyzín vo vírusových frakciách (vírus) bol koncentrovaný. V kontrolnej násade bez TG (dl312/pL) sa vo vírusových frakciách žiadna koncentrácia rádioaktívneho polylyzínu nenašla.
c) testovanie polylyzínom modifikovaných adenovírusových frakcií čo do ich účinku na efektívnosť transfekcie
i) bunky a médiá
K transfekcii sa vysialo 5 x 105 buniek (myšacie hepatocyty; ATCC No.: TIB 73) v DMEM s 10 % fetálnym, teplom inaktivovaným teľacím sérom (FSC), 2 mM glutamínu, penicilínom 100I.E./ml, streptomycínom 100 pg/ml v 6 cm kultivačných miskách.
ii) tvorba komplexov vírus-DNA-transferín pl polylyzínom modifikovanej vírusovej frakcie sa zmiešalo so 6 pg plazmidovej DNA pCMVL v 10 pl HBS a 20 minút sa inkubovalo pri izbovej teplote. Potom sa pridalo ku zmesi 8 pg myšacieho transferín - polylyzínu 290B (mTfpL) a inkubovalo sa ďalších 10 minút.
iii) transfekcia myšacích hepatocytov
Komplexy vírus - DNA - transferín sa zmiešali s 1,5 ml média (DMEM s 2 % FCS, 2 mM glutamín, a antibiotiká) a pridali sa k bunkám potom, čo bolo odstránené staré médium. Po dvojhodinovej inkubácii pri 37 °C sa pridalo k bunkám 2 ml DMEM s 10 % FCS, glutamínom a antibiotikami. Po ďalšej 2 h kultivačnej fáze sa celé médium odstránilo a k bunkám sa pridali 4 ml čerstvého DMEM s 10 % FCS, glutamínom a antibiotikami.
iv) stanovenie luciferázovej expresie hodín po transfekcii sa zbierali bunky a vykonal sa luciferázový assy, ako bolo opísané.
Ako je vidno z obr. 27, získala sa z vírusového preparátu, v ktorom boli ošetrované adenovírusy s TG a 20 nmol polylyzínu (dl312/TG-20 nmol pL) najsilnejšia expresia (153 540 000 svetelných jednotiek). Vírusový preparát s TG a 2 nmol polylyzínu (dl312/TG-2nmol pL) bol o niečo menej aktívny (57 880 000 svetelných jednotiek). Kontrolná frakcia, pri ktorej boli ošetrované adenovírusy s 20 nmol polylyzínu, avšak bez TG, boli takmer 500-krát menej účinné. Na ďalšie porovnanie sa použili na transfekciu komplexy s východiskovým preparátom adenovírusov, ktoré neboli ošetrované ani s TG ani s polylyzínom (dl312). Tieto preparáty docielili 44 030 00 svetelných jednotiek.
SK 281682 Β6
d) Zvýšenie účinnosti transfekcie adenovírusmi modifikovanými polylyzínom v porovnaní s nemodifikovanými adenovírusmi, osobitne pri nízkych množstvách DNA.
Vykonala sa transfekcia ako v prípade 3c), pričom sa ku tvorbe komplexu použila adenovírusová frakcia dl312(TG-20 nmol pL a 6 pg pCVML/8 pg mTfpL, 0,06 pg pCVM-Luc/0,8 pg mTfpL alebo 0,06 pg pCVML/0,08 pg mTfpL. Na porovnanie sa vykonali aj transfekcie s komplexami 6 pg , 0,6 pg a 0,06 pg pCVML/mTfpL a nemodifikovanými adenovírusmi (dl312). Ukázalo sa, že komplexy s polylyzínom modifikovanými adenovírusmi docielili aj pri nízkych množstvách DNA vysoké hodnoty expresie, zatiaľ čo pri nemodifikovaných adenovírusoch bola expresia silne znížená (obr. 28).
Príklad 19
Génový prenos konjugátmi, v ktorých sa väzba medzi adenovírusom a polylyzínom deje cez biotín-streptavidínový mostík
a) biotinylovanie adenovírusu dl312
2,4 ml roztoku adenovírusu dl312 získaného gélovou filtráciou (Sephadex G-25, PD-10, Pharmacia), (približne 10 častíc) v 150 mM NaCl/5 mM HEPES, pH 7,9/10 % glycerol, sa pomiešalo s 10 pl (10 nmol) 1 mM roztoku NHS-LC-biotínu (Pierce 21335). Po 3 h pri izbovej teplote sa biotínom modifikovaný vírus oddelil gélovou filtráciou od prebytočného reagensu. Roztok sa upravil pridaním glycerolu na 40 % koncentráciu glycerolu (celkový objem 3,2 ml) a pri -25 °C sa uskladnil. Biotinylovanie vírusu mohlo byť dokázané kvalitatívnym dôkazom po kvapkaní rôznych zriedení na celulózo-nitrátovú membránu: po vysušení pri 80 °C/2 h vo vákuovej sušičke, blokovaní s BSA, inkubácii so streptavidínom - konjugovanou alkalickou fosfatázou (BRL), vymytí a 1 h inkubácii s vyvíjači roztokom NBT/X-fosfát (nitro - tetrazoliová modrá soľ/5-brom-4-chlor-3-indolylfosfát, toluidinová soľ; Boeringer Mannheim) sa zistila pozitívna farebná reakcia.
b) tvorba konjugátov streptavidín-polylyzín
Spojenie streptavidínu s polylyzínom sa uskutočnilo metódou Wagnera et al., 1990, a opísanou v EP Al 388 758. 79 nmol (4,7 mg) streptavidínu v 1 ml 200 mM HEPES pH 7,9 a 300 mM NaCl sa ošetrilo s 15 mM etanolovým roztokom SPDP (236 nmol). Po 1,5 h pri izbovej teplote sa modifikovaný proteín filtroval gélom cez kolónu Sephadex G-25, pričom sa získalo 75 nmol streptavidínu, modifikovaného so 196 nmol ditiopyridinového linkera. Modifikovaný proteín sa nechal reagovať v argónovej atmosfére s 3-merkaptopropionátom modifikovaným polylyzínom (75 nmol, priemerná dĺžka reťazce 290 lyzínových monomérov, modifikovaného s 190 nmol merkaptopropionátového linkera) v 2,6 ml 100 mM HEPES pH 7,9, 150 mM NaCl za argónovej atmosféry. Konjugáty sa prostredníctvom chromatografie na meničoch katiónov izolovali na kolóne Mono S HR5(Pharmacia). (Gradient: 20 až 100 % tlmivý roztok. Tlmivý roztok A: 50 mM HEPES pH 7,9; Tlmivý roztok B: A + 3 M chlorid sodný. Frakcie produktu eluovali pri koncentrácii soli medzi 1,2 M a 1,7 M. Dialýzou proti HBS (20 mM HEPES pH 7,3, 150 mM NaCl) sa získal konjugát, pozostávajúci z 45 nmol streptavidínu a 53 nmol polylyzínu.
c) transfekcia HeLa-buniek
HeLa-bunky sa pestovali v 6 cm kultivačných miskách, ako bolo uvedené v príklade 1. Transfekcie sa vykonávali pri hustote 300 000 buniek/platničku. Pred transfekciou sa bunky inkubovali s 1 ml čerstvého média, obsahujúceho 2% FCS.
pg pCMVL v 100 pl HBS sa zmiešalo s 0,8 pg streptavidín - polylyzínu v 170 pl HBS. Po 20 min. sa primiešali 3 pl polylyzínu pL300 v 170 pl HBS. Po ďalších 20 min. sa pridalo 65 pl biotinylovaného adenovírusu alebo ako kontrola zodpovedajúce množstvo adenovírus dl312 (30 pl východiskový vírus na modifikáciu). Komplexná zmes („biotín Adv/complex A“ prípadne „control AdV“, pozri obr. 29) sa nechalo stáť ďalších 20 min.
Alternatívna tvorba komplexu sa vykonala tak, že 65 pl pCMVL biotinylovaného adenovírusu sa zmiešalo s 0,8 pg streptavidín - polylyzínu v 50 pl HBS, po 20 min. sa pridalo 6 pg pCMVL-DNA v 170 pl HBS, po ďalších 20 min. sa primiešali 3 pl polylyzínu pL300 v 200 pl HBS. (komplexná zmes „biotín Adv/complex B“).
0,6 pg pCMVL v 67 pl HBS sa zmiešalo s 0,3 pg streptavidín - polylyzínu v 33 pl HBS. Po 20 min. sa primiešalo 65 pl biotinylovaného adenovírusu alebo ako kontrola zodpovedajúce množstvo adenovírusu dl312 (30 pl, východiskový vírus na modifikáciu. Komplexná zmes „biotín Adv/complex A“ prípadne „control AdV“, pozri obr. 29) sa nechalo stáť ďalších 20 min. a potom sa zriedilo s HBS na 500 pl. Alternatívna tvorba komplexu sa vykonala tak, že 65 pl biotinylovaného adenovírusu sa najprv zmiešalo s 0,3 pg streptavidín-polylyzínu v 50 pl HBS, po 20 min. sa pridalo 0,6 pg pCMVL-DNA v 50 pl HBS. Komplexná zmes („biotín Adv/complex B“) sa nechalo stáť ďalších 20 min. a potom sa zriedilo s HBS na 500 pl.
Zmesi sa pridali k bunkám. Bunky sa nechali 2 h inlčubovať pri 37 °C, potom sa pridalo 2,5 ml čerstvého média,s prídavkom 10 % FCS. Bunky sa inkubovali 24 h pri 37 °C a potom sa zbierali na luciferázový test. Luciferázová aktivita sa stanovila tak ako v predchádzajúcich príkladoch. Na obr. 29 uvedené hodnoty predstavujú celkovú luciferázovú aktivitu transfikovaných buniek.
Paralelne k tomu sa vykonali transfekcie HeLa-buniek, pričom ako vírusový komponent konjugátu sa použil biotinylovaný vírus, ktorý bol inaktivovaný prostredníctvom psoralen/UV-žiarenia. Inaktivácia sa vykonala nasledovne: vždy 200 pl biotinylovaného vírusového preparátu sa dalo do dvoch jamôk 1,6 cm platničky s tkanivovou kultúrou. Ku každej vzorke sa pridali 2 pl (33 mg/ml) 8-metoxy-psoralenu (v DMSO), miska sa dala na ľad a 10 min. sa ožarovala UV-lampou (365 nm; lampa UVP TL-33), pričom odstup vzoriek od filtra bol 4 cm. Po ožiarení sa obe vzorky spojili a filtrovali gélom (G50, Nick-kolóna, Pharmacia), pričom sa kolóna predekvilibrovala so 40 % glycerolom v HBS. Alikvoty vždy po 75 pl sa komplexovali s 0,8 pg streptavidín - polylyzínu a použili sa na transfekciu HeLa buniek, ako bolo opísané.
Pomocou cytopatického endpointtestu sa zistilo, že vírusový titer sa inaktiváciou zmenšil o faktor viac ako 104, zatiaľ čo kapacita transfekcie pri vyšších koncentráciách sa zmenšila o menej ako 50 % a pri nízkych koncentráciách o faktor 5.
d) transfekcia buniek K562
Bunky K562 sa pestovali v suspenzii v RPMI 1640-médiu (Gibco BRL plus 2 g hydrouhličitanu sodného/1) plus 10 % FCS, 100 jednotiek na ml penicilínu, 100 pg/ml streptomycínu a 2 mM glutamínu až do hustoty 500.000 buniek/ml. 16 h pred transfekciou sa dali bunky do čerstvého média, obsahujúceho 50 μΜ desferioxamínu (Sigma). Ráno po transfekcii sa pridali bunky s hustotou 250.000 buniek/ml do čerstvého média obsahujúceho 10 % FCS a 50 μΜ deferioxamínu a dali sa vždy po 2 ml do jamky na platničke s 24 jamkami.
Vytvorili sa tri rôzne druhy DNA-komplexov:
a) roztok 6 pg pCMVL-DNA v 160 μί HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,3) sa zmiešal s 12 pg konjugátu TfpL190B v 160 pl HBS, po 30 min. sa pridalo 20 pl adenovírusového preparátu d 1312 a zmes sa pridala k bunkám.
b) roztok 800 ng streptavidín-polylyzínu v 160 pl HBS sa zmiešal s 20 pl biotinylovaného adenovírusu vytvoreného ako v a), po 30 min. sa pridal roztok 6 pg pCMVL-DNA v 160 pl HBS a po ďalších 30 min. sa primiešal roztok 10 pg konjugátu TfpL190B v 160 pl HBS. PO 30 min. sa zmes pridala k bunkám.
c) komplexy DNA sa vytvorili ako v b), s tým rozdielom, že namiesto TfpL190B sa pridal roztok 3,5 pg poly-L-lyzín p(Lys)290. Bunky sa inkubovali 24 h pri 37 °C a potom sa zbierali na luciferázový test. Hodnoty uvedené na obr. 30 predstavujú celkovú Iuciferázovú aktivitu transfikovaných buniek.
Príklad 20
Génový prenos v primárnych bunkách kostnej drene
a) izolácia buniek kostnej drene
Primárne bunky kostnej drene sa získali z myší tak, že kultivačné médium (IMDM, obsahujúce 10 % FCS 5 x x 105 M B-merkaptoetanolu, 1 % IL-3 kondicionovaného média a antibiotiká) s injekčnou ihlou (priemer 0,4 mm alebo 0,5 mm), spojené s 1 ml ampulou sa prepláchlo cez izolovanú stehennú kosť a holennú kosť. Bunky sa 1 x premyli v kultivačnom médiu centrifugovanim pri 100 x g 8 min. Potom sa bunky pri koncentrácii 107/ml resuspendovali a vysiali v T25-kultivačných fľašiach. Po 4 h sa bunky, ktoré nedržali, previedli do inej T25-kultivačncj fľašky a cez noc sa pestovali za prítomnosti 50 pM deferioxamínu.
b) tvorba komplexov adenovírus-transferín-polylyzín/DNA
Na tvorbu komplexov sa 20 min. inkubovalo 50 pl biotinylovaného adenovírusu s 400 ng polylyzinu modifikovaného streptavidínom v 20 pl HBS. Potom sa pridalo 20 pl HBS obsahujúceho 6 pg pCMVL. Po inkubačnom čase 20 min. sa pridalo 7 pg konjugátu myšacieho transferinu - polylyzinu (mTfpL) v 160 pl HBS a celá zmes sa inkubovala ďalších 20 min.
c) transfekcia
Na transfekciu sa získali bunky kostnej drene z kultivačného média 8 minútovou centrifugáciou pri 100 x g. Bunkový sediment sa preniesol do 3 ml kultivačného média, obsahujúceho 2 % FCS a 250 pl komplexov adenovirus - transferin - polylyzín/DNA a pestovala sa v novej T25-kultivačnej fľaške 3 h pri 37 °C. Potom sa pridali 3 ml a po dvoch hodinách ďalších 6 ml kultivačného média, obsahujúceho 10 % FCS.
d) stanovenie luciferázovej aktivity h po transfekcii sa bunky zbierali a ako v iných príkladoch sa vyšetrovala expresia luciferázy. Transfekcia viedla k luciferázovej aktivite zodpovedajúcej 310 x 103 svetelných jednotiek/100 pg celkového bunkového proteinu.
Príklad 21
Transfekcia nueroblastomových buniek 48 kb kozmidom za prítomnosti voľného adenovírusu a konjugátov adenovíruspolylyzínu
Bunky bunkovej línie s označením GI-ME-N boli transftkované tak, ako je opísané v príklade 16, 48 kb kozmidom s uvedenými množstvami hTfpL, voľným polylyzínom a DNA. K tomu sa pridali do inkubačnej zmesi buď 100 pM chloroquinu (sĺpce 3 a 4) alebo 10 pl adenovírus dl 312, ktorý obsahoval 5 x 10 častíc na ml (sĺpce 5 a 6). Posledné dve vzorky (sĺpce 7 a 8, StpL (biotin) dostali 15 pl biotinylovaného adenovírusu dl312 (1 x 1011 častíc), 30 min. sa inkubovali so streptavidín-polylyzínom (0,8 pg , vytvoreného ako v príklade 19) v 150 pl HBS. Potom sa ku vzorke pridalo 6 pg DNA v 150 pl HBS, 30 min. sa nechala stáť pri izbovej teplote, na čo sa pridalo 150 pl HBS, obsahujúceho 6 pg hTfpL + 1 pg voľného pL. Po ďalších 30 min. inkubácie pri izbovej teplote sa zmes pridala k bunkám. Po 2 h inkubácii pri 37 °C pridalo do každej misky 4 ml DMEM + 10 % FCS. O 24 h neskôr sa bunky zbierali a merala sa luciferázová aktivita. Výsledky sú ukázané na obr. 31.
Príklad 22
Génový prenos do primárnych epitelových buniek dýchacích ciest
Predbežné pokusy vzhľadom na genetickú korektúru cystickej fibrózy ukázali, že imortalizované bunkové línie, odvodené od epitelu dýchacích ciest sú prístupné objavenej metóde génového prenosu. Aby sa vylúčila možnosť, že tento fenomén je spôsobený zmenami v epitele dýchacích ciest, indukovanými imortalizáciou buniek, vykonali sa pokusy s konjugátmi transferin-polylyzín aj na primárnych epitelových bunkách dýchacích ciest. (1 AE).
Bunky I AE sa získali tak, ako je opísané Yankaskasom et al., 1987, zo vzoriek nosných polypov pacientov. Tkanivá sa vymyli v sterilnom roztoku kuchynskej soli, potom sa v Joklikovom minimálnom základnom médiu (MEM) plus antibiotiká (penicilín 50E/ml, streptomycín 50 pg/ml, gentamicín 40 pg/ml) pri 4 °C transportovali do laboratória. Chrupavka a nadbytočné submukózne tkanivo sa uvoľnili a epitelové vrstvy sa inkubovali v proteázovom roztoku (Sigma, typ 14, 0,1 mg/dl) v MEM pri 4 °C 16 až 48 h. Aby sa neutralizovala proteáza, pridalo sa 10 % FBS (fetálne hovädzie sérum) a bunky sa uvoľnili ľahkým pohybom. Získaná suspenzia sa filtrovala cez 10 pm nylonovú sieťku a bunková drvina sa oddelila centrifugovanim (150 g x 5 min.) a bola premytá v F12 + 10% FCS.
Bunky sa potom ošetrovali konjugátmi transferin - polylyzín (hTfpL) a luciferázu plazmidom (pRSVL) kódujúcim luciferázu ako reportérgénom. Pri tomto skúmaní nevykázali primáme bunky citlivosť na tieto komplexy ako príslušne imortalizované línie buniek (pozadie = 429 svetelných jednotiek, s prídavkom konjugátov 543 svetelných jednotiek), čo ukazovalo na to, že bunky 1 AE majú relatívne málo transferínových receptorov.
Aby sa využil alternatívny receptor na bunkách, použili sa biotinylované adenovírusy (porovnaj príklad 19). Bunky ošetrované týmto konjugátom vykázali výrazne silnejšiu expresiu ako hodnoty pozadia (pridanie konjugátov 2585753 ±453585 svetelných jednotiek). Okrem toho sa aj primáme epitelové bunky dýchacích ciest iných druhov ukázali ako prístupné tejto metóde génového prenosu (myš = 3230244 ±43153; opica = 53498880 ±869481 svetelných jednotiek).
Príklad 23
Génový prenos do hepatocytov a do krvných buniek
V pokusoch tohto príkladu sa použili nasledujúce materiály a metódy:
Transfekcia buniek tkanivových kultúr: pestovali sa bunky bunkovej línie BNL CL.2, ako je opísané v príklade 6. HeLa bunky a hepatocyty sa pestovali v 6 cm Petriho miskách. Transfekcia sa vykonávala pri hustote buniek približne 3 x 105 buniek na misku. Pred transfekciou sa štandardné kultivačné médium nahradilo 1 ml čerstvého média s 2 % FCS.
Tvorba binárnych komplexov: biotinylované adenovírusy (približne 109 PFUs, pozri príklad 19 a) a 19 b) sa nechali reagovať s 800 ng streptavidínovaného polylyzínu v 50 μί HBS. Po 30 min. v izbovej teplote sa pridalo 6 pg pCMVL-DNA v 170 μί HBS, 30 min. sa inkubovalo a potom sa pridalo 3 pg pL300 v 200 μί HBS a po ďalších 30 min. sa roztok použil na transfekčné pokusy.
Tvorba trojitých komplexov: biotinylované adenovírusy (približne 10’ PFUs) sa nechali reagovať s 800 ng streptavidínovaného polylyzínu v 50 μί HBS. Po 30 min. pri izbovej teplote sa pridalo 6 pg pCMVL-DNA v 170 μί HBS, 30 min. sa inkubovalo a potom sa pridalo 10 pg TípL190B v 200 pl HBS a po ďalších 30 min. sa roztok použil na transfekčné pokusy.
β-galaktozidázový test: bunky BNL CL.2 sa vysiali na sklených viečkach a 24 h sa transfikovali plazmidovým reportérom pCMV-B-gal (Lim a Chae, 1989). O 48 h neskôr sa vykonal β - galaktozidázový test ako bolo uvedené v príklade 15.
a) Spojenie medzi kondenzátmi DNA a adenovirusom zosilňuje luciferázovú reportérgénovú expresiu v silnej miere
Výsledok prenosu DNA do hepatocytov prostredníctvom dvojitých a trojitých komplexov DNA je znázornený na obr. 32: účinok génového prenosu bol za prítomnosti voľného adenovírusu zosilnený. Stĺpce pLAdenoV/TfpL ukazujú výsledky transfekcie adenovirusom, ktorý bol konjugovaný prostredníctvom transglutaminázy s polylyzínom a potom sa nechal reagovať s DNA, ktorá neutralizovala časť negatívnych nábojov. Neskôr sa pridal transferín-polylyzín, ktorý neutralizoval zvyšné negatívne náboje. Týmto spôsobom sa vytvoril trojitý komplex adenovíruspolylyzín/transferín-polylyzín/DNA. Ako je vidno z obr., získala sa mimoriadne vysoká hodnota 1,5 x 109 svetelných jednotiek (čo zodpovedá 5000 svetelným jednotkám na bunku). Pre pokus znázornený v stĺpci Adenov+pL+TfpL sa zmiešal adenovírus a polylyzín ako na ošetrenie s transglutaminázou. Aby sa ukázala špecifickosť transglutaminázou spôsobenej väzby polylyzínu na vírus, vynechal sa enzým. Potom sa vírusový preparát komplexoval ako v pLAdeno/TfpL. V tomto prípade bola transfekcia mohutná ako pri AdenoV+TípL, pretože v obidvoch pokusoch spoločné umiestnenie vírusu a komplexu DNA/transferín-polylyzín bol stochastický proces, na rozdiel od pokusu ukázaného v stĺpci pLAdenoV/TfpL, pri ktorom sa spoločné umiestnenie deje vo vysokej miere transferínfekciou (transfekciou s transferínom) spojením vírusu a DNA v trojitom komplexe.
b) transfekcia buniek K.562 dokazuje endozomolytické vlastnosti adenovírusu
Bunky humánnej erytroleukémiovej bunkovej línie K562 obsahujú asi 150 000 transferínových receptorov (Klausner et al., 1983 b). Za prítomnosti chloroquinu môžu tieto bunky aj pri absencii adenovírusu byť v značnej miere transfikované komplexami TfpL/reportér-DNA (obr. 33, TfpL), ako o tom písal Cotten et al., 1990. Tie isté komplexy vykazujú pri abcencii chloroquinu relatívne slabú reportérgénovú expresiu (AdenoV/TfpL), pravdepodobne preto, že bunky K562 ako iné krvné bunky (Silver et al., 1988; Horvath et al., 1988) majú obmedzený počet adenovírusových receptorov. Ak sa adenovírus viaže cez biotín/ /streptavidinový mostík na polylyzín, reportérova DNA sa pridaním viacej polylyzínu dokonale kondenzuje, aby sa kompletoval binárny komplex (pLAdenoV/pL), dosiahne transfekcia podporovaná adenovirusom stredné hodnoty, pravdepodobne preto, že sa efektívne využili tie nemnohé adenovírusové receptory. Ak sa však DNA komlexovaná s adenovírus - polylyzínom dokonale kondenzuje (pLAdenoV/TfpL) a pridaním transferín - polylyzínu sa neutralizuje vytvorením trojitého komplexu PlAdenoV/TípL a do hry vstúpia početné bunkové transferínové receptory, účinnosť transfekcie sa zväčší najmenej o dva veľkostné rády (obr. 33) vďaka efektívnej transferínovej väzbe ako aj endozymolytickým vlastnostiam vírusu.
c) trojité komplexy DNA vedú k expresii reportérového génu v takmer 100 % hepatocytov
S cieľom testovať účinnosť prenosového systému do myšacích hepatocytov BNL CL.2, boli bunky transfikované β-galaktozidázovým reportérovým génom. Obr. 34 ukazuje β-galaktozidázový test po a) transferinfekcii za prítomnosti chloroquinu, b) transferinfekcii za prítomnosti voľného adenovírusu dl312 a c) transfekcii trojitými komplexami adenovírus (d 1312) - polylyzín - transferín- DNA. Pri absencii adenovírusu exprimuje po štandardnej transferinfekcii reportérový gén iba málo buniek. Percento transfekcie je menšie ako 0,1 %. Ak sa k tomu použije chloroquin, percento sa zvýši na približne 0,2 % (obr. 34 a). S voľným adenovirusom exprimuje 5 až 10 % buniek reportérový gén (obr. 34b), zatiaľ čo trojité komplexy s transglutaminázou modifikovaným vírusom vedú k expresii vo väčšine, ak nie vo všetkých bunkách (obr. 34c). Nakoľko trojité komplexy môžu byť použité vo vysokých zriedeniach, neobjavuje sa toxický efekt pozorovaný pri vysokých dávkach voľného (inaktivovaného) adenovírusu. Bolo však možné pozorovať podobný toxický efekt pri použití trojitého komplexu vo vysokých koncentráciách s cieľom exprimovať v 100 % buniek tkanivovej kultúry. Toxické účinky môžu mať príčinu vo zvyškoch vírusovej génovej aktivity alebo v endozomolytických vlastnostiach pridaného vírusu, alebo sú jednoducho dôsledkom príliš vysokej expresie transfikovaného génu.
d) Expresia transfikovaného reportérového génu je transientná, ale pretrváva v nedeliacich sa hepytocytoch dlhé týždne.
Trojité prenosové komplexy (pLAdenoV/TfpL) sa vytvorili s polylyzin - adenovírusom a s modifikovaným adenovírusom, ktorý bol reakciou so psoralenom ďalej inaktivovaný. Z 2/3 konfluentná hepatocytová bunková kultúra bola v pokuse transfikovaná, ako je znázornené na obr. 34b, luciferázovým reportérgénovým plazmidom pCMVL a luciferázová aktivita sa merala v rôznych časových bodoch. Ako je vidno z obr. 35, bola luciferázová aktivita najvyššia po troch dňoch odvtedy, ako sa hepatocytová kultúra stala konfluentnou a bunky sa prestali deliť. Expresia reportérových génov pokračovala v nedeliacich sa bunkách bez toho, že by bola použitá selekcia na zachovanie génu a trvala najmenej 6 týždňov, osobitne, ak sa použil na tvorbu trojitého komplexu adenovírus inaktivovaný psoralenom.
Príklad 24
Použitie slepačieho adenovírusu CELO na zosilnenie prenosu DNA do humánnych buniek
V tomto príklade sa testovali schopnosti slepačieho adenovírusu CELO zosilňovať prenos DNA do humánnych HeLa buniek analogicky s predchádzajúcimi príkladmi, ktoré použili humánny adenovírus typu 5.
Použil sa slepačí adenovírus CELO (kmeň Phelps, Serotyp FAV-I, 7, bunky z pasáže slepačích obličiek. Vírus (2 ml) sa nechal filtrovať cez gélovú filtračnú kolónu PD-10. ekvilibrovanú s 20 mM HEPES pH 7,3, 150 mM NaCl (HBS) + 10 % glycerolom, a 2 ml eluátu sa nechalo zreagovať s 20 μΙ 1 mM NHS-LS-biotín (Pierce) 3 h pri izbovej teplote. Biotinylovaný vírus sa potom dialyzoval proti 3 x 300 ml HBS + 40 % glycerolu pri 4 °C a uskladnil sa v alikvotoch pri -70 °C.
HeLa bunky (5 x 105 buniek na 6 cm misku) boli v 2 ml DMEM + 2 % FCS so 6 pg plazmidu pCMVL komplexované s polylyzínovými (pLys) alebo transferín - polylyzínovými (TfpL) zmesami v 500 μί HBS inkubované (komplexy sa predinkubovali 30 minút pri izbovej teplote). Vzorky sa potom za prítomnosti na obr. 36 udaných množstiev vírusu pridali k bunkám. Pri vzorkách, ktoré obsahovali biotinylované CELO-vírusy, sa uvedené množstvo vírusu predinkubovalo s uvedenými množstvami streptavidín - polylyzínu (StrpL) v 200 μί HBS 30 min. pri izbovej teplote pred tým, ako sa pridalo 6 pg plazmidu pCMVL v 100 pl HBS. Po 30 min. inkubácii pri izbovej teplote sa k bunkám pridalo uvedené množstvo TfpL-materiálu pri 37 °C. Po dvoch hodinách sa k bunkám pridalo 5 ml DMEM + 10 % FCS a po 24 h sa bunky zbierali a pripravili na luciferázový test.
Ako je vidno z obrázku 36, zosilnil CELO-vírus vo voľnej forme prenos DNA do HeLa buniek (stĺpce 1 až 6). Ak však bol CELO-vírus modifikovaný biotínom a obsiahnutý v komplexe so streptavidínom, ukázalo sa, že prenos DNA bol zosilnený vírusom za prítomnosti transferín - polylyzínu ako aj bez neho, porovnateľne s mierou, aká sa dosiahla prostredníctvom humánneho adenovírusu dl312. Špeciálna línia HeLa buniek vykazuje vysokú väzobnú kapacitu komplexov polylyzín/DNA pri absencii transferínu (porovnaj luciferázovú aktivitu vzoriek 1 a 4 na obr. 36). Je preto zahrnutie CELO-vírusu do komplexu polylyzín-DNA dostačujúce, aby spôsobilo prijatie komplexu.
Príklad 25
Transfekcie myoblastov
a) transfekcia myoblastov a myotubov a komplexami DNA/transferín-polylyzín za prítomnosti voľného adenovírusu a za prítomnosti adenovírusu spojeného biotín/streptavidínom
C2C12 myoblasty (Blau et al., 1985; ATCC Nr.: CRL 1772) a G8-myoblasty (ATCC Nr.: CRL 1456) boli transfikované v „high glucose DMEM“ + 10 % FCS myoblastových kultúr pri subkonfluencii s približne 5 x 105 bunkami na 6 cm misku. Myotubové kultúry sa vytvorili tak, že myoblasty sa vysadili na 6 cm miske (približne 5 x 105 buniek na miske) a médium sa vymenilo za „high glucose DMEM“ + 2 % konského séra, keď dosiahli bunky konfluenciu (Barr a Leiden, 1991; Dhawan et al., 1991). Transfekcie myotubov sa vykonali o 5 až 7 dní neskôr. Transfekčné komplexy sa vytvorili tak, ako je opísané v príklade 19, pričom sa použili uvedené množstvá TfpL, StrpL a biotinylovaného adenovírusu dl312. Bunky sa 20 h po transfekcii zbierali a merala sa luciferázová aktivita. Na obr. 37 uvedená luciferázová aktivita sa vzťahuje na celú bunkovú vzorku. Ukázalo sa, že tak myoblasty ako aj myotubové kultúry je možné s vysokou účinnosťou transfikovať. Po diferenciácii na myotuby poklesla účinnosť transfekcie menej ako 1 log (C2C12) alebo sa neprejavil výzamný úbytok (G8). Tvorba myotubov sa diala v bunkovej línii G8 obmedzenou frekvenciou, čomu je treba čiastočne pripísať absenciu preukázateľného úbytku výkonnosti v diferencovaných kultúrach. Úloha vzájomného pôsobenia medzi transferínom atransferínovým receptorom v prenose DNA pri tomto type buniek nebola podstatná. Vo všetkých štyroch bunkových preparátoch sa konal iba slabý prenos DNA s použitím komplexov TfpL/DNA za prítomnosti voľného adenovírusu dl312 (stĺpce 1, 4, 7, 10). S použitím spojeného vírusu sa výkonnosť zvýšila (stĺpce 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12). Pri porovnaní výsledkov génového prenosu, dosiahnutého s kombinačnými komplexami, obsahujúcimi iba vírus a polylyzín/StrpL, s výsledkami dosiahnutými s komplexami, ktoré obsahujú transferín - polylyzin, získal sa prírastok výkonnosti menej ako 1 log (porovnaj napríklad stopu 2, bez transferínu, so stopou 3, transferín). Obmedzená transfekcia voľným vírusom a silná transfekcia spojenými vírusovými komplexami tak v prítomnosti transferín - polylyzínu ako bez neho viedli k predpokladu, že adenovírus pri týchto bunkách slúži ako ligand a že bez spojenia voľný vírus možno prenikne do bunky, ale komplex TfpL/DNA sa neprejaví v produktívnej miere (v tomto príklade použitá pCMVL-DNA je na obrázku označená ako pCLuc).
b) histochemická analýza početnosti výskytu transfekcie myotubov
Myotubové kultúry C2C12 (ako myoblasty vysiate v 6 cm miskách, 5 x 105 buniek, diferencované na myotuby) sa vytvorili, ako bolo opísané v a). Pri vzorkách s voľným vírusom sa komplexovala pCMVB-gal DNA (6 pg) s 8 pg TfpL za prítomnosti 500 pl HBS a pridala sa k bunkám za prítomnosti 18 pl adenovírusu dl312 (1 x 1012 vírusových častíc na ml) v 2 ml DMEM/2 % FCS. Vzorky so spojeným vírusom boli vytvorené s pCMVLacz DNA (6 pg) komplexovanou so 7 pg TfpL a 800 ng StrpL + 18 pl biotinylovaného adenovírusu dl312 (1 x 1012 vírusov na ml) v 500 pl HBS a pridali sa bunkám v 2 ml DMEM/2 % FCS. Po 2432
-hodinvej inkubácii sa bunky tak, ako je v príklade 15, farbili na stanovenie β-galaktozidázovej aktivity.
β-galaktozidázové farebné vzory boli v súlade s výsledkami transfekcii, pri ktorých sa použila luciferáza ako produkt reportér - génu (pozri a). V myotubových kultúrach sa získala veľmi nízka génová expresia, ak sa použil voľný vírus, zatiaľčo väzba vírusu a DNA docielili vysokú úroveň génovej expresie. Prítomnosť modro sfarbených mnohojadrových tubúl ukazovala na úspešný prenos génu do diferencovaných buniek za prítomnosti voľného adenovírusu.
c) Prenos DNA do primárnych myšacích myoblastov a myšacích myotubových kultúr
Veľké kostrové svaly oboch zadných nôh zo 4 týždňového samčeka myši C57B1/6 sa sterilné izolovali do PBS a rozdrobili sa na asi 5 mm kúsky. Tkanivo sa suspendovalo v 20 ml PBS ca 2 min. sa nechalo usadiť a supematant bol odsatý. Toto premývanie sa 3x opakovalo. Tkanivo sa potom zmiešalo s 3.5 ml PBS plus 0.5 ml trypsin/EDTA, 0,5 ml 1 % (hmotnosť/objem) kolagenázy, typ 2 Sigma a 0,5 ml 1 % BSA (frakcia V v 4 mM CaCl2) a nechalo sa inkubovať pri 37 °C 30 min. za častého opatrného miešania. Na záver 30 minútovej inkubácie sa nechalo zvyšné tkanivo usadiť, supematant sa odstránil a tkanivo sa zmiešalo s 5 ml DMEM + 20 % FCS. Inkubácia s proteázou sa 3 až 4 krát opakovala, kým nebolo tkanivo úplne dispergované. Bunková suspenzia sa potom prefiltrovala cez bunkové sito (Falcon), aby sa odstránili agregáty a fragmenty tkaniva, a centrifúgovala sa pri 500 x g 15 min. Bunkový pelet sa resuspendoval v 10 ml DMEM + 20 % FCS a fibroblasty sa odstránili tak, že bunky sa 60 min. nechali v nezakrytej tkanivovej kultivačnej miske s priemerom 15 cm navrstviť. Bunky, ktoré nedržali, sa opatrne odstránili a dali sa navrstviť do piatich laminínom pokrytých 10 cm tkanivových kultivačných misiek s 15 ml DMEM + 20 % FCS na misku. Po dosiahnutí konfluencie (približne za 1 týždeň) sa bunky trypsinovali a znova sa navrstvili na laminínom pokryté 6 cm misky v množstve asi 1 x 106 buniek na misku. Aby sa vytvorili myotubové kultúry, vymenilo sa približne o 5 dní neskôr (keď bunky dosiahli konfluenciu) médium za DMEM + 2 % konské sérum a o týždeň neskôr sa vykonali transfekcie. Transfekcia myoblastových kultúr sa vykonala v 6 cm miskách pri približne 80 % konfluencii. Laminínom pokryté 6 cm tkanivové kultivačné misky sa vyrobia takto: tkanivové kultivačné misky sa pokryjú s 0,025 mg/ml polylyzínu (MG 30.000 - 70.000, Sigma) v sterilnej vode 30 min. pri izbovej teplote. Platničky sa 3 x opláchnu v sterilnej vode a nechajú sa usušiť vzduchom. Potom sa platničky pokryjú s 8 pg/ml laminínu (EHS, Sigma) vo vode cez noc pri izbovej teplote. Platničky sa potom 3 x umyjú pred vysiatím buniek.
Na transfekciu požívané komplexy DNA sa vytvorili tak, že uvedené množstvo psoralen/UV-inaktivovaného adenovírusu dl312 (vytvoreného ako v príklade 19) sa zriedilo v 150 μί HBS, pridal sa 1 pg StrpL v 150 μί HBS, a nakoniec sa nechalo inkubovať 30 min. pri izbovej teplote. Potom sa pridalo ku každej vzorke HBS (100 μί), obsahujúce 6 pg pCMVL (na obr. označeného ako pCLuc) a nechalo sa inkubovať ďalších 30 min. pri izbovej teplote. Potom sa pridalo ku každej vzorke 7 pg TfpL v 100 pl HBS, nechalo sa inkubovať 30 min. pri izbovej teplote, a pridalo sa k myoblastovým alebo k myotubovým kultúram v 6 cm miskách, ktoré obsahovali 2 ml DMEM + 2 % FCS. Po hodine inkubovania sa nahradilo médium za 5 ml DMEM + 20 % FCS (myoblasty) alebo za 5 ml DMEM + + 2 % konské sérum (myotuby) a po 48 h sa bunky zbierali na luciferázovú analýzu. Obr. 38 znázorňuje luciferázovú aktivitu celkovej bunkovej vzorky.
Príklad 26
Zlepšenie prenosu pomocou CELO-vírusu do myoblastov s použitím lectínového ligandu.
a) porovnávacia anylýza adenovírusu d 1312 a CELO-vírusu v HeLa bunkách a myoblastoch C2CI2
Vzorky HeLa buniek alebo myoblastov C2C12 (5 x ItF na 6 cm misku) boli transfikované s 6 pg pCMVL (označeného na obr. pCLuc) komlexovaným s 1 pg StrpL/7 pg TfpL plus 5 pl biotinylovaného adenovírusu dl312 (pozri príklad 19, 1 x 1012 častíc na ml) alebo 18 pl biotinylovaného CELO-vírusu(pozri príklad 24, 0,3 x 1012 častíc na ml). Po 20 h inkubácii sa bunky zbierali a pripravili na meranie luciferázovej aktivity. Obr. 39 predstavuje získanú luciferázovú aktivitu každej celkovej bunkovej vzorky.
Transfekcia do HeLa buniek sa vykonala s použitím komplexov humánneho adenovírusu dl312 (StrpL/TfpL/DNA, ktoré do bunky môžu vstúpiť buď cez adenovírusové receptory alebo transferínové receptory, s porovnateľnou účinnosťou ako s použitím komplexov CELO-vírusu (StrpL/TfpL/DNA, ktoré do bunky môžu vstúpiť cez transferínové receptory. Zatiaľ čo však prenos DNA do myoblastov C2C12 s adenovírusovými komplexami (dl312) sa vykonal efektívne, komplexy CELO-vírusov fungovali v týchto bunkách zle. Predchádzajúce pokusy ukázali, že transferínové receptory pri prenose kombinačných komplexov pri týchto bunkách hrajú len obmedzenú úlohu; pravdepodobne adenovírusový receptor je hlavným miestom vstupu. Slabá aktivita CELO-vírusu pri myoblastoch má pravdepodobne príčinu v slabej väzbe CELO-Virusu ako aj transferínu na myoblasty C2C12.
b) zlepšenie transfekcie myoblastov C2C12 CELO-vírusom s použitím aglutinínu z pšeničných klíčkov ako ligandu
Z dôvodu slabého prenosu, ktorý sa dosiahol v a), bol vybratý nový ligand ako náhrada za transferín, a to biotinylovaný aglutinín z pšeničných klíčkov (2 až 4 Mol biotínu na mol proteínu; Boehringer Mannheim). Biotinylovaný CELO-vírus sa vytvoril tak, že ako bolo už opísané. Komplexy, obsahujúce 6 pg pCMVL plus uvedené množstvá StrpL, TfpL, a biotinylovaného aglutinínu z pšeničných klíčkov (WGA-B) a CELO-vírus boli vytvorené nasledovne: vírus a WGA boli spolu zriedené v 150 pl HBS. StrpL bolo takisto zriedený v 150 pl HBS, obidva roztoky sa zmiešali a nechali sa inkubovať 30 min. pri izbovej teplote. DNA, zriedená v 100 pl HBS, sa pridala k roztoku StrpL/vírus/WGA, nasledovala ďalšia inkubácia 30 min. pri izbovej teplote. Potom sa pridalo TfpL v 100 pl HBS k zmesi a vzorka sa inkubovala opäť 30 min. pri izbovej teplote. Komplexy sa pridali k myoblastom C2C12 (5 x 105 na 6 cm misku) v 2 ml DMEM + 2 % FCS. O hodinu neskôr sa pridalo 5 ml DMEM + 10 % FCS a po 20 h sa bunky preparovali na meranie luciferázovej aktivity. Aktivita (v svetelných jednotkách) na každú celkovú bunkovú vzorku je znázornená na obr. 40 (v tomto príklade použitá DNA bola pCMVL, na obr. označená ako pCLuc).
Pri absencii vírusu sa dosiahol iba veľmi slabý prenos
DNA tak s WGA ako bez neho (stĺpce 1,6). Silnejší prenos sa dosiahol so spojeným CELO vírusom (stopa 2). avšak
16-násobný nárast nastal, ak súčasťou komplexu bolo
WGA-B. Zvýšením množstva WGA v komplexe (z 1 pg na
SK 281682 Β6 pg) nastal mierny pokles v prenose (porovnaj stĺpce 3 a 4), pokým zvýšenie obsahu StrpL v komplexe (z 1 pg na 2 pg) prenos mierne zvýšilo. Tieto výsledky ukazujú zjavne, že WGA-B ako ligand zvyšuje prenos DNA do buniek C2C12 prostredníctvom CERO-vírusu.
d) expresia faktoru Vili v myoblastových C2C12 a v myotubových kultúrach
Myoblastové a myotubové kultúry sa vytvorili tak, ako je opísané. Transfekcie sa vykonali s použitím 6 pg plazmidu, ktorý obsahoval full length (v plnej dĺžke) faktor VIII cDNA (Wood et al., 1984; Eaton et al., 1986) a komplexovaného podľa zvyčajného predpisu na tvorbu komplexov s 5 alebo 15 pl biotinylovaného adenovírusu (ako bolo uvedené) plus 0,5 alebo 1 pg StrpL a 7 alebo 6 pg TfpL.
Komplexy DNA/vírus sa pridali k bunkám v 2 % FCS/DMEM. Po 4-hodinovej inkubácii pri 37 °C sa pridali do každej misky 3 ml čerstvého DMEM + 10 % FCS. Po 18 h sa pozbieralo médium a bolo vyšetrené s použitím testovacieho systému COATEST (KABI, Pharmacia) s medzinárodným štandardom ako referenciou na skúmanie sa skúmala prítomnosť faktora VIII. Množstvá faktora VIII sa uvádzali v jednotkách mU, vytvorených za 24 h na 106 buniek (obr. 41).
Príklad 27
Použitie adenovírusového proteínu na prenos DNA
Adenovirus (divoký typ 300) bol pestovaný v HeLa-bunkách, prečistený a bol biotinylovaný ako bolo opísané pre adenovirus dl312. 1,2 ml vírusu sa dialyzovalo 18 h proti 3 x 300 ml 5 mM MES (2-(N-Morpholino)etansulfonová kyselina), 1 mM EDTA pH 6,25, pri 4 °C, 18 h. Materiál sa potom centrifugoval 30 min. pri 27 K v rotore SW60. Supematant sa opatrne odstránil, pelet sa resuspendoval v HBS/40 % glycerol. HEPES, pH 7,4 a NaCl sa pridali k supematantu do 20 mM a 150 mM a pelet (obsahujúci vírusové jadrové proteíny a hlavné množstvo hexonkapsidu, na obr. 42 „core“) aj frakcie supertnatantu (obsahujúce verticie; na obr. 42 „vertices“) sa testovali na ich aktivitu prenosu DNA do Movl3 myšacích fibroblastov (Strauss a Jaenisch, 1992) alebo do HeLa buniek.
Tvorba komplexov s DNA sa vykonala nasledovne: uvedené množstvá každej frakcie, narušený vírus pred centrifúgáciou alebo intaktný vírus (vyjadrené v pg proteínov, ako bolo stanovené v Bradfordovom teste) sa zriedili s 300 pl HBS. Pridal sa streptavidín-polylyzín (3 pg v 50 pl HBS) a potom nasledovala 30 min. inkubácia pri izbovej teplote. 6 pg pCMVL, na obr. označené „pCLuc“, sa zriedilo v 100 pl HBS a po 30 min. inkubácii sa pridalo k prvému roztoku. Nakoniec sa pridali 2 pg TfpL v 100 ml HBS, nasledovala ďalšia 30 min. inkubácia. Vo vzorkách vytvorených iba s TfpL, sa miešalo 8 pg TfpL v 170 pl HBS so 6 pg pCMVL v 330 pl HBS počas 30 min. pri izbovej teplote. Uvedené množstvá vírusového proteínu sa zriedili v 300 pl HBS a potom sa pridali ku komplexom TfpL/DNA. Všetky vzorky sa potom na hodinu pridali k 5 x 105 bunkám do 6 cm misky, obsahujúcej 2 ml DMEM/10 % FCS, (buď HeLa-bunky alebo Movl3-fibroblasty). Potom sa k bunkám pridalo 5 ml čerstvého média, obsahujúceho 10 % FCS, a po 20 h sa bunky preparovali na meranie liiciferázovej aktivity. Získaná aktivita (v svetelných jednotkách) je znázornená na obr. 42, tak pre HeLa-bunky (tabuľka A) ako aj pre Movl3-fibroblasty (tabuľka B).
Pri obidvoch typoch buniek sa konal prírastok prenosovej aktivity DNA, závislý na dávkach, v spojení s vrchnou frakciou (vzorky 4 až 6 v obidvoch tabuľkách). Keď bolo v komplexoch TfpL/DNA obsiahnuté to isté množstvo biotinylovaného vírusového proteínu bez streptavidín-polylyzínu, bol pozorovaný prenos DNA blízky základným hodnotám (vzorka 3 na každej tabuľke).
Príklad 28
Zosilnený génový prenos pri použití trojitých komplexov DNA, obsahujúcich konjugát s galaktózovým ligandom
a) trojité komplexy, obsahujúce influenzapeptidový konjugát
Príklady 13 a 14 ukázali, že peptidy konjugované polylyzínom, ktoré obsahujú sekvencie, odvodené od N-konca podjednotky influenzavírus-hemaglutininu-HA-2, podstatne zvyšujú v komplexoch DNA/transferín-polylyzín génový prenos prostredníctvom transferín-polylyzínu.
Boli vytvorené dva podobné kombinačné komplexy DNA, obsahujúce polylyzínový konjugát s tetra-antenárnym galaktózovým ligandom a polylyzínom modifikovaný influenzapeptid (vytvorený ako v príklade 6, prípadne 13), tak, že konjugát ligand-polylyzín bol pridaný k plazmidovej DNA pCMVL, aby sa neutralizovala polovica náboja DNA, a zvšok náboja sa použil, aby sa nabili komplexy s konjugátom influenzapeptid - polylyzín. Prenosom takýchto komplexov DNA, ktoré obsahujú syntetické ligandy (gal) 4, do BNL CL.2 hepatocytov (transfekcie sa vykonali, ako bolo opísané v príklade 6 g) sa získala expresia luciferázového génu (obr. 43), ktorá bola výrazne vyššia ako expresia docielená s transferínom ako ligandom. Expresia bola viac ako 500-násobná ako expresia, získaná v kontrolných pokusoch s komplexami DNA bez influenzapeptidu, ale s takým istým množstvom polylyzínu (obr. 43). Aktivita docielená s DNA-kombinačnými komplexami bola tiež približne 30-krát vyššia ako s DNA/(gal) 4pL - komplexami, s ktorými sa bunky inkubovali za prítomnosti chloroquinu.
b) trojité komplexy, obsahujúce adenovírusový konjugát
Komplexy sa vytvorili nasledovne: biotinylovaný adenovirus d 1312, vytvorený ako v príklade 19; 2 pl, 6 μΐ alebo 18 pl; 1012 častíc na ml v 50 μΐ HBS sa zmiešalo s streptavidín-polylyzínom (100 ng,160 ng,480 ng) v 100 μΐ HBS. Po 30 min. inkubácii sa pridal roztok 6 pg pCMVL v 200 μΐ HBS a po ďalších 30 min. roztok 3,8 pg (gal)4pL (vytvoreného ako v príklade 6) alebo 7 pg TfpL v 150 pl HBS. Roztoky komplexu DNA sa pridali do 300.000 buniek (ATCC TIB73, ATCC TIB74, ATCC TIB75, ATCC TIB76) pestovaných v 6 cm miskách v „high glucose DMEM“ + 2 % FCS. Nasledujúce kroky bunkového kultivačného procesu a luciferázový test sa vykonali tak, ako je opísané v predchádzajúcich príkladoch a po 24 h sa získali hodnoty génovej expresie zobrazené na obr. 44.
Príklad 29
Génový prenos do B-lymfoblastoidných B-buniek
Konjugáty humánny-Ig-polylyzín a konjugáty anti-human-Ig-polylyzín sa vytvorili nasledovne, pričom spojenie sa vykonalo analogicky podľa metód známych z literatúry zavedením disulfidových mostíkov po modifikácii so
SK 281682 Β6 sukcinimidylpyridylditio-propionátom (SPDP, Jung et al., 1981):
a) vytvorenie konjugátov anti-human-Ig-polylyzin 300
Roztok 2 mg kozieho anti-human-lg(Southem Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL, USA) vHBS (150 M NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,8) sa pomiešalo so 14 μί 5 mM etanolového roztoku SPDP (Pharmacia). Po 10 h pri izbovej teplote sa filtrovalo cez gélovú kolónu Sephadex G 25 (eluens 100 mM HEPES-tlmivý roztok pH 7,3), pričom sa získalo 1,3 mg anti-human-Ig, modifikovaného s 30 nmol pyridylditiopropionátových zvyškov. Poly(L) lyzín 300 (priemerného stupňa polymerizácie z 300 lyzínových zvyškov (Sigma)) sa analogicky modifikoval s SPDP a ošetrením s ditiotreitolom a následnou gólovou filtráciou bol zmenený do formy modifikovanej voľnými merkapto-skupinami. Roztok 12 nmol polylyzínu 300, modifikovaného 29 nmol merkapto-skupinami, v 0,3 ml HBS sa pri absencii kyslíka zmiešalo so spomenutým modifikovaným anti-human-Ig a nechalo sa stáť cez noc pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa pridaním 5 M NaCl upravila na obsah 0,6 M NaCl. Izolácia konjugátov sa udiala chromatografiou na meničoch iónov (Pharmacia, Mono S HR 5/5); po dialýze proti 25 mM HEPES pH 7,3 sa získali príslušné konjugáty, pozostávajúce z 0,33 mg anti-human-Ig, modifikované so 4 nmol polylyzínu 300 (molámy pomer 1 :2).
b) vytvorenie konjugátov human-IgG-polylyzínu 300
Roztok 19,5 mg (122 nmol) protilátok (Sigma 1-4506) v 2 ml HBS sa zmiešal s 39 μί 10mM etanolového roztoku sukcinimidylpyridylditiopropionátu (SPDP, Pharmacia). Po
2,5 h pri izbovej teplote sa filtroval cez gélovú kolónu Sephadex g 25 (eluens 100 mM HEPES - tlmivý roztok pH 7,9), pričom sa získalo 19 mg (119 nmol) human-lgG, modifikovaného s 252 nmol pyridylditiopropionátových zvyškov. Poly(L) lyzín 300 (priemerný stupeň polymerizácie z 300 lyzínových zvyškov (Sigma)) sa analogicky modifikoval s SPDP a ošetrením s ditiotreitolom a následnou gólovou filtráciou bol zmenený do formy modifikovanej voľnými merkaptoskupinami. Roztok 119 nmol polylyzínu 300, modifikovaného 282 nmol merkaptoskupinami, v 1 ml HBS sa pri absencii kyslíka zmiešalo so spomenutým modifikovaným human-lgG a nechalo sa stáť cez noc pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa pridaním 5 M NaCl upravila na objem 0,6 M NaCl. Izolácia konjugátov sa udiala chromatografiou na meničoch ionov (Mono S, Pharmacia, 50 mM HEPES pH 7,3, gradient soli 0,6 M až 3 M NaCl); po dialýze proti HEPES pH 7,3 sa získali príslušné konjugáty, pozostávajúce z 9 mg (57 nmol) protilátok, modifikovaných s 90 nmol polylyzínu 300 (molámy pomer 1 : 1,6).
c) komplexovanie a transfekcia
Komplexy sa vytvorili nasledovne:
Biotinylovaný adenovírus dl312 (30 pl; 1012 častíc na ml) v 50 μί HBS sa zmiešal so streptavidín-polylyzínom (800 ng) v 100 μί HBS; po 30 min. inkubácie sa pridal roztok 9 pg pCMVL v 200 μί HBS. Po ďalších 30 min. inkubácie sa pridal roztok 5,1 pg polylyzínu (pLys450), 10,2 pg TfpL, 12 pg konjugátu human - IgG - polylyzínu alebo konjugátu 10 pg anti - human -Ig-polylyzínu v 150 pl HBS. Komplexy DNA sa pridali vždy k 106 B-lymfoblastoidným bunkám (bunky sa získali z humánnych periferných mononukleámych krvných buniek imortalizovanim s vírusom Epstein Barr, ako bolo opísané Walsom a Crawfordom, 1989, a pestovali sa v platniach s 24 jamkami v 1 ml RPMI 1640 + 2 % FCS). Ďalší postup s bunkovými kultúrami a luciferázový test sa vykonali tak, ako bolo opísané v predchádzajúcich príkladoch. Získané hodnoty génovej expresie (luciferázová aktivita v svetelných jednotkách) sú zobrazené na obr. 45.
Príklad 30
Prenos DNA s transferín-polylyzínom za prítomnosti voľného a konjugovaného rinovírusu
a) preparáty rinovírusu HRV-2
Rinovírus HRV-2 sa vytvoril a prečistil tak, ako opísal Skem et al., 1984.
400 pl roztoku rinovírusu (približne 30 pg ) v HBS (150 mM NaCl/5 mM HEPES pH 7,9)/10 % glycerol sa ošetrovalo s 10 nmol NHS -LC- biotínom (Pierce 21335). Po 3 h inkubácie pri izbovej teplote sa vírus oddelil od nezabudovaného biotínu rozsiahlou dialýzou proti HBS/40 % glycerol pri 4 °C.
Rinovírus, citlivý na svetlo, vytvorený pestovaním vírusu za prítomnosti akridinorange, sa inaktivoval tak. ako opísal Madshus et al., 1984.
b) vytvorenie komplexov DNA a transfekcie
i) Komplexy transferín - polylyzín/DNA sa vytvorili tak, že sa zmiešal roztok 6 pg plazmidovej - DNA pCMVL v 330 pl HBS (150 mM NaCl/20 mM HEPES pH 7,3) s roztokom 8 pg TfpL290 v 170 pl HBS. Komplexy DNA sa zmiešali s 1,5 ml média (DMEM + 2 % FCS) a s 0,14 pgaž
3,5 pg rinovírusu HRV-2 (alebo inaktivovaného HRV-2). Zmes sa naniesla na NIH 3T3-bunky (300.000 buniek, na 6 cm miske). Po 4 h sa transfekčné médium nahradilo 4 inl čerstvého média (DMEM + 10 % FCS). Bunky sa po 24 h zbierali a vyšetrovala sa luciferázová aktivita, ako bolo už skôr opísané (obr. 46A).
ii) Kombinačné komplexy DNA, obsahujúce transferín/polylyzín a konjugáty rinovírus/polylyzín sa vytvorili nasledovne: 100 pl biotinylovaného rinovírusu HRV-2 (3,5 pg) v HBS sa zmiešalo s 1 pg StrpL v 100 pl HBS (ostatné koncentrácie vírusu sa zmiešali so zodpovedajúcimi podielmi). Po 30 min. pri izbovej teplote sa roztok zmiešal s 6 pg plazmidovej-DNA v 150 pl HBS. Ďalších 30 min. sa inkuboval pri izbovej teplote a potom sa zmiešal s 6 pg TfpL290 v 150 pl HBS. Komplexy DNA sa zmiešali s 1,5 ml média (DMEM + 2 % FCS) a pridali sa k NIH 31'3-bunkám (300.000 buniek na 6 cm miske). Ďalšie ošetrenie kultúr a luciferázový test sa vykonali, ako bolo opísané v i) (obr. 46B).
Príklad 31
Transfekcia HeLa buniek kombinačnými komplexami, ktoré obsahujú ionovo viazaný adenovírus
Tvorba komplexu A: Komplexy DNA sa vytvorili tak, že najprv sa zmiešalo 30 pl adenovírusu dl312 (približne
10’PFU) s 1 pg polylyzínu pLys 450 (priemerná dĺžka reťazca 450 monomérov) v 170 pl HBS a potom sa po min. pri izbovej teplote primiešalo so 6 pg pCMVL-DNA v 170 pl HBS. Po ďalších 30 min. inkubácie sa komplexy zmiešali s 9 pg TfpL 190 v 170 pl HBS. Alikvot komplexnej zmesi (10 % = 50 μί roztoku, 600 ng DNA; alebo 1 % = 5 μί roztoku, 60 ng DNA) sa zriedil v 1,5 ml DMEM + 2 % FCS a pridal sa ku 300.000 HeLa buniek. Po 4 h sa pridali 2 ml DMEM + 20 % FCS. Zber buniek po 24 h a luciferázový test sa vykonali ako zvyčajne. Luciferázová aktivita, zodpovedajúca celkovému extraktu, obnášala 29,115.000 svetelných jednotiek (v prípade 600 ng DNA) a 1,090.000 svetelných jednotiek (v prípade 60 ng DNA).
Tvorba komplexu B (kontrolný pokus): Komplexy DNA sa vytvorili tak, že sa najprv zmiešalo 6 gg pCMVL-DNA v 170 gl HBS s 1 gg polylyzínu pLys 450 v 170 gl HBS a po 30 min. pri izbovej teplote sa primiešalo 9 gg TfpL 190 v 170 gl HBS. Po inkubácii dlhej ďalších 30 min. sa komplexy zmiešali s 30 gl adenovírusu dl312 (približne 109 PFU). Alikvot komplexnej zmesi (10 % = 50 gl roztoku, 600 ng DNA; alebo 1 % = 5 gl roztoku, 60 ng DNA) sa zriedil v 1,5 ml DMEM + 2 % FCS a pridal sa ku 300.000 HeLa buniek. Po 4 h sa pridali 2 ml DMEM + 20 % FCS. Zber buniek po 24 h a luciferázový test sa vykonali ako zvyčajne. Luciferázová aktivita, zodpovedajúca celkovému extraktu, bola 405.000 svetelných jednotiek (v prípade 600 ng DNA) a 200.000 svetelných jednotiek (v prípade 60 ngDNA).
Príklad 32
Lokálne podávanie komplexov DNA/adenovírus/transferín - polylyzínu do pečene krýs
a) priama injekcia
Komplexy DNA sa vytvorili tak, ako bolo opísané v príklade 19. Obsahovali 200 gl adenovírusu dl312, 6,4 gg streptavidín- polylyzínu, 48 gg pCMVL, a 48 gg TfpL290 v celkovom objeme 2000 gl HBS. Samček krysy Sprague-Dawley (telesná hmotnosť 240 g) sa podrobil anestéze s Avertinom a vykonala sa 4 cm dlhá laparotómia. Injekcia komplexu sa v časovom rozpätí 2 min. podala do ľavého bočného pečeňového laloka. Potom sa rana po laparotómii po vrstvách uzavrela. Krysa bola 48 h po injekcii komplexu usmrtená éterovou anestéziou a merala sa luciferázová expresia v rôznych vzorkách pečene. Zistila sa luciferázová aktivita 5.615 svetelných jednotiek/mg obsahu proteínov pečeňového homogenátu v oblasti miesta injekcie; celková aktivita bola 370.000 svetelných jednotiek. V častiach pečene vzdialených od miesta injekcie sa nedala merať žiadna luciferázová aktivita.
b) podávanie komplexov do pečene prostredníctvom žlčovodov
Komplexy sa vytvorili nasledovne:
200 gl biotinylovaného adenovírusu dl312, zriedeného s 200 gl HBS, sa inkubovalo s 6,4 gg streptavidínom modifikovaného polylyzínu v 400 gl HBS 30 min. pri izbovej teplote. Potom sa pridalo 48 gg pCMVL v 800 gl HBS. Po 30 min. inkubácii sa pridalo 48 gg TfpL v 900 gl HBS. Na aplikáciu komplexov sa samčekovia krysy Sprague - Dawley (telesná hmotnosť 250 g) podrobili anestéze s Avertinom a otvorilo sa im brucho mcdiánovým rezom. Črevo sa položilo na ľavú stranu tela a do žlčovodov sa zaviedla 27 G ihla, spojená hadičkou s 1 ml striekačkou. Injekcia komplexov trvala 4 min. Potom sa ihla zo žlčovodu vytiahla a miesto vpichu sa uzavrelo fibrinovým lepidlom (Immuno). Brušná rana sa zatvorila stehmi a kovovými svorkami. Po 30 h sa krysy usmrtili a vzorky rôznych peče ňových lalokov sa skúmali na luciferázovú aktivitu. Najvyššia hodnota bola 19.000 svetelných jednotiek na mg proteínu; vypočítaná celková expresia v celej pečeni bola v oblasti 2,7 x 106 svetelných jednotiek.
Príklad 33
Podávanie komplexov DNA/adenovírus/TfpL do podviazanej vény chvosta myší
Komplexy DNA sa vytvorili tak, ako bolo opísané v príklade 19. Pozostávali z 45 gl adenovírusu dl312, 0,8 gg streptavidín - polylyzínu, 6 gg pCMVL, a 24 gg mTfpL 290 v celkovom objeme 150 gl HBS. Komplexy sa injektovali do chvostovej vény samčeka myši C3H/He (vek: 2 mesiace) pod anestézou Avertinom. Bezprostredne po konci injekcie sa chvostová véna na proximálnom a distálnom konci komprimovala tak, že sa komplexný roztok počas komprimácie (25 min.) zadržal v injektovanom úseku chvostovej vény a nevyplavil sa krvou. 48 h po injekcii sa myš usmrtila cervikálnou dislokláciou a injektovaná chvostová véna sa preparovala. Expresia luciferázy sa merala v homogenáte rezu chvostovej vény. Získala sa hodnota luciferázovej aktivity 2.600 svetelných jednotiek/3 cm chvostovej vény.
Príklad 34
Transfekcia primárnych humánnych malanomových buniek
a) transfekcia kombinačnými komplexami adenovírus - polylyzín/transferín - polylyzín
Primárne melanomové bunky sa izolovali z chirurgicky odstráneného melanómu pacienta. K tomu bol tumor mechanicky rozdrvený v bunkovom kultivačnom médiu RPMI 1640 s 5 % FCS, 2 mM glutamínom s prídavkom antibiotík a fragmenty tkaniva sa pretlačili cez oceľové sitko. Potom sa tumorové bunky viackrát premyli centrifugáciou a resuspendovaním a boli vysiate do fliaš T25. 24 h po izolácii tumorových buniek nasledovala transfekcia trojitými komplexami, skladajúcimi sa z: 3 gl, 9 gl alebo 27 gl biotinylovaného adenovírusu d1312(1 x 10l2/ml), 0,5 gg streptavidín - polylyzínu, 6 gg pCMVL a 7 gg TfpL290 (v spojení s 27 gl adenovírusu : 1 gg streptavidín-polylyzínu a 6 gg TfpL290) v celkovom objeme 500 gl HBS. 36 h po transfekcii sa bunky zbierali a merala sa luciferázová aktivita (v svetelných jednotkách) (pozri obr. 47; horné vodorovné značky vyznačujú výsledky s bunkami v suspenzii, spodné značky bunky, ktoré sa udržali).
b) transfekcia kombinančnými komplexami adenovírus - polylyzín/lipoproteín s nízkou hustotou polylyzín
i) vytvorenie konjugátu LDL-polylyzín
Roztok 10 mg (14,3 nmol) LDL (Low Density Lipoproteín, Sigma, L-2139, molekulová hmotnosť 3,500.000, priemer častíc približne 26 nm) v 2 ml HBS sa zmiešal so 143 gl 10 mM etanolového roztoku SPDP (1,43 gmol; Pharmacia) a 2 h sa nechal reagovať pri izbovej teplote. Gélovou filtráciou cez kolónu Sephadex G 25 (14 x x 140 mm) s HBS sa získalo 3,2 ml roztoku približne 10 mg LDL, modifikovaného s 0,70 gmol pyridylditiopropionátovými zvyškami. Roztok sa zmiešal s 1,2 ml 5 M NaCl, aby sa zabránilo precipitácii, ktorá sa objavuje normálne ako dôsledok pridania polylyzínu. Poly(L) lyzín s priemernou dĺžkou reťazca 300 monomérov sa, ako bolo opísané, modifikoval so SPDP a ošetrením s ditiotreitolom a za ním nasledujúcou gélovou filtráciou sa dostal do formy modifikovanej merkaptoskupinami. Opísaný modifikovaný roztok LDL sa zmiešal s roztokom 0,33 pmol polylyzínu 300, modifikovaného s 0,76 pmol merkaptových skupín, v 4 ml 2 M NaCl, 0,5 M HEPES, pH 7,9, v argonovej atmosfére a nechal sa 48 h stáť pri izbovej teplote. Reakčný roztok sa zriedil sterilnou vodou na 32 ml (koncentrácia NaCl približne 0,5 M) a rozdelil sa chromatografiou na meničoch ionov (Biorad Macroprep S, 10 x 100 mm, 20 mM HEPES pH 7,3, gradient 0,2 až 3 M NaCl). Frakcie produktu eluovali pri koncentrácii soli 1,8 M až 2,2 M a boli poolované. Po dialýze proti HBS sa získali konjugáty, pozostávajúce z 2,35 mg (3,4 nmol) LDL modifikovaného so 190 nm polylyzínu(zodpovedá 7,5 mg voľnej bázovej polylyzínovej formy). Toto zodpovedá priemernej modifikácii častíc LDL s približne 55 polylyzínovými reťazcami.
ii) tvorba komplexov a transfekcia:
pl preparátu biotinylovaného adenovírusu dl312 sa zriedilo s HBS na objem 100 pl. 1,2 pg streptavidín-polylyzínu sa upravilo s HBS na objem 100 pl a zmiešalo sa so 100 pl adenovírusového preparátu. Po 30 min. sa primiešalo 150 pl HBS - 129 - so 6 pg pCMVL. Po ďalších 30 min. sa pridalo 300 pl HBS so 4 pg LDLpL (obsah polylyzínu 20 pg). Tento vytvorený roztok sa zmiešal s 1,5 ml DMEM (10 % FCS) a pridal sa ku 3 x 105 primárnych melanómových buniek (vytvorených ako bolo v a), opísaných a označených HMM1 a HMM4), ktoré sa nachádzali v bunkovej kultivačnej miske s priemerom 6 mm. Ďalšie kultivačné práce a merania luciferázy sa vykonali, ako je opísané pod a). Génovú expresiu vidno na obr. 48; A ukazuje výsledky s melanobunkami HMM1; všetky pokusy sa vykonali s konjugátmi AdpL, ktoré nie sú na obr. zvlášť uvedené. B ukazuje pokusy s melanobunkami HMM4; všetky pokusy sa vykonali s konjugátmi AdpL, ktoré sú uvedené iba v poslednom stĺpci (označenie dl312/16 sa vzťahuje na špeciálny vírusový preparát). V pokuse znázornenom v stĺpci 2 sa pridal LDL v 25-násobnom prebytku, čo sa v dôsledku kompetitície o receptory LDL prejavilo zníženou účinnosťou génového prenosu.
Príklad 35
Transfekcia primárnych humánnych fibroblastov
Humánne kožné biopsie sa dali do Petriho misiek s priemerom 6 cm, ktoré obsahovali DMEM, 2 mM glutamín, 20 % FCS a antibiotiká. Potom sa biopsie riadne rozdrobili s chirurgickým nožom a za prítomnosti 3 ml média sa pestovali 5 dní. Potom sa bunky premyli 3 ml čerstvého média (porovnaj) a pestovali sa ďalších 7 dni. Po tomto čase sa bunky trypsinovali a uložili sa zmrazené až do transfekcie. Na transfekciu sa bunky rozmrazili, vysiali sa do 6 cm Petriho misiek a pestovali sa v DMEM, ktorý obsahoval 2 mM glutaminu, 10 % FCS a antibiotiká. Konjugáty Na transfekciu sa vytvorili nasledovne: 3 pl, 10 pl, 20 pl, 30 μΐ biotinylovaného adenovírusu dl312 sa inkubovalo s 0,1 pg, 0,3 μg, 0,5 pg, 0,8 polylyzinom modifikovaného streptavidínu v 150 μί HBS 30 min. pri izbovej teplote. Potom sa pridalo 6 pg pCMVB-gal v 170 μί HBS a zmes sa inkubovala ďalších 30 min. V poslednom kroku sa pridalo 7,8 pg TfpL pre konjugáty s 3 pl d 1312, 7 pg TfpL pre konjugáty s 10 μί d 1312, 6 pg TfpL pre konjugáty s 20 pl a s 30 pl dl312 v 170 pl (pozn. prekl. v orig. zrejme omylom pg) HBS. Po inkubácii v dĺžke trvania 30 min. sa konjugáty pridali na bunky v 2 ml DMEM, obsahujúcim 2 mM glutamínu, 2 % FCS a antibiotiká, a bunky sa 4 h inkubovali pri 37 °C. Potom sa médium odstránilo a kultivácia pokračovala pri 37 °C s DMEM, obsahujúcom 2 mM glutaminu, 10 % FCS a antibiotiká. Po 48 h sa stanovila expresia B-galaktozidázy, ako bolo opísané v predchádzajúcich príkladoch. Pri transfekcii s 3 pl <11312 vykázalo 14 % buniek produkciu B-galaktozidázy, pri 10 pl d 1312 sa získalo 32 % pozitívnych buniek, pri 20 pl dl312 bolo pozitívnych 39 % buniek, apri 30 pl dl312 bolo pozitívnych 64 %buniek.
Príklad 36
Génový prenos do buniek epitelu dýchacích ciest krýs in vivo pomocou kombinačných komplexov
a) vytvorenie kombinačných komplexov TfpL/AdpL
Komplexy humánny transferín - polylyzín-DNA (hTfpL) sa vytvorili kombináciou 8 pg transferín - polylyzínu (Serva Biochemical) v 150 pl HBS (150 mM NaCl/20 mM HEPES pH 7.3) so 6 pg pCMVL-DNA v 350 pl HBS a inkubovali sa 30 min. pri izbovej teplote. Konjugáty adenovírus-polylyzín sa vytvorili, ako bolo opísané v príklade 19 c); použil sa adenovírus inaktivovaný psoralenom/UV. Kombinačné komplexy TfpL/AdpL sa vytvorili podľa predpisu v príklade 23 c).
a) podávanie komplexov in vivo intratracheálnou cestou
Na tieto pokusy sa použila krysa Sigdomon hispidus („Cotton Rat“), o ktorej sa zistilo, že je vhodným zvieracím modelom na humánne adenovírusové pľúcne ochorenia (Pacini et al., 1984). Zvieratá boli podrobené anestéze míetoxyfluranom. Po vertikálnom reze na ventrálnej strajje hrdla sa tupo preparoval hrtan. Komplexy (250 až 300 pl; 3 pg plazmidovej DNA) sa viditeľne injektovali priamo do hrtana zvieraťa ležiaceho šikmo pod uhlom 45. V časových bodoch zobrazených na obr. 49, sa zvieratá usmrcovali CO2 a hrtan a pľúca en block sa vybrali po výplachu in situ studeným roztokom kuchynskej soli vo fosfátovom tlmivom roztoku (PBS). Tkanivo pľúc sa v extrakčnom tlmivom roztoku homogenizovalo kvôli luciferázovému testu, lyzáty sa štandardizovali na celkový obsah proteínu a expresia luciferázového génu sa merala a opisovala, ako bolo opísané. Uvedené svetelné jednotky sa vzťahujú na 1,250 pg celkového proteínu, obsiahnutého v pľúcnych lyzátoch. Pokusy sa vykonali 3- až 4-krát, výsledky sú zobrazené ako stredné hodnoty ±SEM.
Príklad 37
Génový prenos s použitím nevírusových endozomolytických prostriedkov
a) syntéza peptidov, narušujúcich membránu
i) syntéza peptidov
Peptidy sa vytvorili na automatickom syntetizéri (ABI
431 A) prostredníctvom metódy pevnej fázy pri použití p-alkoxybenylalkoholovej živice (0,97 mmol/g) ako pevnej fázy a Fmoc - chránených aminokyselín. Karboxy - koncová aminokyselina sa naviazala cez symetrický anhydrid na živicu. Nasledujúce aminokyseliny sa spojili prostredníctvom 1 - hydroxybenzotriazol - dicyklohexylcarbodiimido37 vej metódy. Použili sa tieto ochranné skupiny bočných reťazcov: (Trt) Asn, (Trt)Cys [(t-Bu)Cys v prípade EALA a GLF], (t-Bu)Glu, (Trt)His, (t-Bu)Ser.
Petidy vykazujú nasledujúce sekvencie: EALA: (SEQ ID NO:5) Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys GLF (SEQ ID NO:6) Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys
GLF-Π (SEQ ID NO:7) Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys
GLF-delta (SEQ ID NO:8) Gly Leu Phe Glu Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys
EALA-Inf (SEQ ID N0:9) Gly Leu Phe Gly Ala íle Ala Gly Phe Íle Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys EALA-P50 (SEQ ID NO: 10) Gly Leu Phe Glu Ala íle Glu Gly Phe II e Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys
P50 (SEQ ID NO:11) Gly Leu Phe Glu Ala Íle Glu Gly Phe Íle Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met íle Asp Gly Gly Gly Cys
Peptidy sa odštiepili od živice a odstránili sa ochranné skupiny bočných reťazcov, s výnimkou (t-Bu) Cys, ošetrením so 100 mg pevnej fázy nabitej peptidom s 3 ml zmesi fenol/etanditiol/tioanizol/voda/kyselina trifluoroctová 0,75 : : 0,25 : 0,5 : 0,5 : 10 počas 1,5 h pri izbovej teplote. Surové peptidy sa vyzrážali v éteri a 2 x sa premyli. S-t-Bu-chránené peptidy EALA a GLF sa rozpustili v malom množstve 1 M hydrouhličitanu trietylamónneho (TEAB) pH 8, zriedili sa na 100 mM TEAB a ďalej sa čistili metódou HPLC s reverznou fázou na kolóne Nuclcosil 500-5C4 (0,1 % TFA/acetonitrilový gradient), obidva peptidy eluovali pri približne 50 % acetonitrile. Voľná forma peptidov Cys-SH sa udržala tak, že z Trt-Cys-peptidov sa odstránili ochranné skupiny takisto, ako bolo opísané. Surové peptidy (5 mg) sa rozpustili v 100 μΐ 100 mM TEAB, pH 8, obsahujúcom 1 μΐ β-merkaptoetanolu, a prečistili sa gélovou filtráciou (Sephadex G-25, 100 mM TEAB, 0,5 mM EDTA) a lyofilizáciou mrazom alebo chromatografiou na meničoch iónov (Mono Q Pharmacia, 20 mM HEPES pH 7,3, gradient 0 až 3MNaCI; peptid eluuje pri 1,5 M NaCl).
ii) Modifikácie s N-(hydroxyetyl) maleimidom
C-koncová SH-skupina peptidov GLF-delta, GLF-II, EALA-Inf, EALA-P50, P50 bola blokovaná po gélovej filtrácii, (Sephadex G-25, 20mM HEPES, pH 7,3, 0,5 mM EDTA) od voľnej SH-formy reakciou s 1,3 až 10-násobným prebytkom N-(hydroxyetyl) maleimidu (1 h pri izbovej teplote). Nadbytočný maleimid sa odstránil gélovou filtráciou (Sephadex G-25, 100 mM TEAB, pH 8) a získali sa peptidy (GLF-delta-mal, GLF-II-mal, EALA-Inf-mal, EALA-P50-mal, P50-mal) po usušení mrazom ako trietylamoniová soľ.
iii) modifikácie s 2,2' -ditiobispyridínom
Voľné SH-peptidy sa nechali reagovať cez noc s 10 ekvivalentami 2,2'-ditiobispyridínu (20 mM HEPES, pH 7,9, 0,5 mM EDTA) pri izbovej teplote. Nadbytočný reagens sa odstránil gélovou filtráciou (Sephadex G-25, 100 mM TEAB, pH 8) alebo chromatografiou na meničoch iónov (Mono Q Pharmacia, 20 mM HEPES pH 7,3, gradient 0 až 3 M NaCl; peptid eluuje pri 1,5 M NaCl) a získali sa (2-pyridyltio)-Cys peptidy (GLF-delta-SSPy, GLF-II-SSPy, EALA-Inf-SSPy, EALA-P50-SSPy, P50-SSPy).
iv) dimenzovanie peptidov
Homodimér P50 (P50 dim) sa vytvoril tak, že sa nechali 3 dni reagovať ekvimoláme množstvá P50-Cys-(2-pyridyltio) a P50-Cys-SH v 20 mM HEPES pH 7,3 pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa rozdelila na Mono Q kolóne (HR-5/5 Pharmacia, 20 mM HEPES pH 7,3 p, gradient 0,09 až 3 M NaCl; dimér P50 eluoval pri 1,1 M NaCl). Heterodimér GLF-SS-P50 sa vytvoril analogicky reakciou peptidov P50 (voľná merkaptoforma) s pyridyltio - modifikovaným peptidom GLF.
b) lipozomový leakeage assay
Schopnosť syntetických peptidov rozbiť lipozómy sa merala pomocou úniku fluorescenčného farbiva z lipozómov, ktoré boli nabité samozhášacou koncentráciou kalceinu. Lipozómy sa vytvorili prostredníctvom metódy REV („reverse phase evaporation“) (Szoka a Papahadjopoulos, 1978) s vodnou fázou 100 mM kalceínu, 375 mM Na+, 50 mM NaCl, pH 7,3 a boli extrudované cez lOOnm polykarbonátový filter (MacDonald et al., 1991), aby sa udržalo jednotné rozdelenie veľkostí. Lipozómy sa oddelili gélovou filtráciou na Sephadex G-25 s izoosmotickým tlmivým roztokom (200 mM NaCl, 25 mM HEPES, pH 7,3) od nezabudovaného materiálu. Pre leakage assay pri rôznych pH hodnotách sa zriedil kmeňový roztok (6 μΐ/ml) v 2 x assayovom tlmivom roztoku (400 mM NaCl, 40 mM citran sodný. Alikvot 100 μΐ sa pridal k 80 μΐ sériového zriedenia peptidov vo vode na mikrotitračnej platničke s 96 jamkami (konečná koncentrácia Jipidu: 25 μΜ) a pri 600 nm (vzbudenie pri 490nm) sa po 30 min. inkubácie pri izbovej teplote sa merala fluorescencia kalceínu na fluorescenčnom fotometri na mikrotitračnú platničku. Hodnota pre 100 % leakage sa získala pridaním 1 μΐ 10 % roztoku Tritonu X-100. Jednotky leakage sa vyrátali ako recipročné hodnoty na koncentráciu peptidov, pri ktorej sa pozorovala 50 % leakage (t. j. objem v μΙ lipozómového roztoku, ktorý z 50 % lýzoval na pg peptidu). Hodnoty pod 20 jednotiek sa extrapolovali. Výsledky lipozómového leakage test sú zobrazené na obr. 50. GLF a EALA ukázali najvyššiu pH-špecifickú aktivitu.
c) test erytrocytovej lýzy
Čerstvé humánne erytrocyty sa viackrát premyli v HBS a resuspendovali sa v 2 x testovacom tlmivom roztoku s vhodnou hodnotou pH (300 mM NaCl, 30 mM citran sodný) pri koncentrácii 6,6 x 107/ml. Alikvot 75 μΐ sa pridal k 75 μΐ sériového zriedenia peptidov vo vode na mikrotitračnej platničke s 96 jamkami(kónusového typu) a I h sa inkubovali pri 37 °C za stáleho trasenia. Po odstránení nelýzovaných erytrocytov centrifúgovanim (1000 ref, 5 min.) sa 100 μΐ supematantu previedlo na novú mikrotitračnú platničku a stanovila sa absorpcia hemoglobínu pri 450 nm ko38 rektúra pozedia pri 750 nm). 100 % lýza sa stanovila pridaním 1 pl roztoku 10 % Tritonu X-100 pred centrifugovaním. Hemolytické jednotky sa vyrátali ako recipročné hodnoty koncentrácie peptidov, pri ktorej sa pozorovala 50 % leakage (t. j. objem v pl erytrocytového roztoku, ktorý lýzoval z 50 % na pg peptidu). Hodnoty pod 3 hemolytické jednotky sa extrapolovali. Hodnoty sú zobrazené na obr. 51. Z nich jc vidno, že P50 dim a EALA-P50 vykazujú najvyššiu pH - špecifickú aktivitu, čo sa týka lýzy buniek a/alebo uvoľňovania vyšších molekúl ako hemoglobín. P50 - monoméry P50mal a P50 SS - Py mali nižšiu aktivitu. Melittin vykázal najvyššiu aktivitu, ktorá však nebola špecifická pre kyslé hodnoty pH.
d) vytvorenie kombinačných komplexov DNA
Komplexy DNA sa vytvorili tak, že sa najprv zmiešalo 6 pg pCMVL-DNA v 150 pl HBS so 4 pg TfpL290 v 150 pl HBS apo 30 min. pri izbovej teplote sa primiešalo 4 až 20 pg poly(L) lyzínu290 v 100 pl HBS. Po ďalších 30 min. inkubácie pri izbovej teplote sa pridalo 0,3 až 30 pg peptidov v 100 pl HBS a znova sa inkubovalo 30 min. Optimálne množstvo endozomolytického prostriedku sa stanovilo v predtitráciach, pričom sa merala získaná výkonnosť génového prenosu (pozri tab. 3: génový prenos do buniek BNL CL.2). Ukázalo sa, že súčasné pridávanie polylyzínu a endozomolytického prostriedku takisto ako použitie väčšieho objemu na tvorbu komplexov (1,5 ml konečného objemu) boli porovnateľné (alebo lepšie) čo do efektívnosti transfekcie. V týchto pokusoch sa ukázalo tiež, že aj nepeptidické amfipatické substancie kyselina desoxycholová a olejová zosilňujú prenos DNA.
e) transfekcia buniek
Adherentné línie buniek (BNL CL.2 hepatocyty prípadne bunky NIH3T3) sa pestovali 1 až 2 dni pred transfekciou v 6 cm miskách (médium DMEM s 10 % FCS; 300.000 buniek/misku). Médium sa odstránilo a pridalo sa
1,5 ml DMEM + 2 % FCS a 500 pl komplexov DNA. Alternatívne sa použilo 0,5 ml DMEM + 6 % FCS a 1,5 ml komplexov DNA. Po 4 h inkubácie sa pridalo 2 pl DMEM (18 % FCS). (Zistilo sa, že alternatívne je možné nahradiť médium 4 ml DMEM s 10 % FCS). Zber buniek a luciferázový test sa robili 24 h po transfekcii, ako bolo opísané. Vykázané hodnoty svetelných jednotiek predstavujú celkovú luciferázovú aktivitu transfikovaných buniek. Transfekcia hepatocytov BNL CL.2 je znázornená na obr. 52.
Obr. 52A: Komplexy DNA sa vytvorili tak, že sa najprv zmiešalo 6 pg pCMVL-DNA v 250 pl HBS so 4 pg TfpL290 v 250 pl HBS a po 30 min. pri izbovej teplote sa primiešalo 20 pg poly(L)lyzínu 290 v 750 pl HBS. Po ďalších 30 min. inkubácie sa pridali udané množstvá peptidov v 250 pl HBS a po ďalších 30 min. inkubovania sa primiešali komplexy s 0,5 ml DMEM + 6 % FCS a 450.000 buniek.
Obr. 52B: Komplexy DNA sa vytvorili tak, že sa najprv zmiešalo 6 pg pCMVL-DNA v 500 pl HBS so 4 pg TípL290 v 250 pl HBS a nechali sa stáť 30 min. pri izbovej teplote. 500 pl roztoku s 20 pg poly(L) lyzínu 290 v HBS sa zmiešalo s udanými množstvami peptidov v 250 pl HBS a hneď sa pridalo ku zmesi TípL/DNA. Po ďalších 30 min, inkubácie pri izbovej teplote sa primiešali komplexy s 0,5 ml DMEM + 6 % FCS a pridali sa k 450.000 buniek. Zber buniek a luciferázové testy sa robili 24 h po transfekcii, ako bolo opísané.
Experimenty, vykonané s bunkami NIH 3T3 sú znázornené na obr. 53. Tvorba komplexov A a B bola rovnaká na transfekciu buniek BNL CL.2.
V pokusoch s bunkovými kultúrami vykázali peptidy P50 dim a EALA-P50 najvyššiu aktivitu, EALA a GLF mali strednú hodnotu, pokým P50-monomér a Melittin mali nízku aktivitu.
Príklad 38
Génový prenos s použitím nevirusového syntetického peptidu s oligolyzínovým predĺžením na C-konci
Peptid sekvencie (SEQ ID NO: 4) Met Ala Gin Asp Íle íle Ser Thr íle Gly Asp Leu Val Lys Trp íle íle Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys sa metódou opísanou v predchádzajúcom príklade syntetizoval a vyčistil. Tento peptid je odvodený od Staphylococus aureus δ-toxin (SEQ ID NO: 3) Met Ala Gin Asp íle íle Ser Thr Íle Gly Asp Leu Val Lys Trp íle íle Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys , o ktorom je známe, že vykazuje špecifičnosť pre narušenie membrány pri kyslej hodnote pH tak, že tento peptid predĺži o 10 dodatočných lyzínov.
Komplexy DNA sa vytvorili tak, že sa najprv zmiešalo 6 pg pCMVL-DNA v 170 pl HBS so 4 pg TfpL290 v 170 pl HBS a nechali sa stáť 30 min. pri izbovej teplote a potom sa primiešali ca 3 pg peptidu v 170 pl HBS. Po ďalších 30 min. inkubácie pri izbovej teplote sa primiešali komplexy s 1,5 ml DMEM + 2 % FCS a pridali sa k 450.000 buniek BNL CL.2 hepatocytov. Po 2 h sa pridali 2 ml DMEM + 20 % FCS. Zber buniek a merania luciferázovej aktivity sa vykonali 24 h po transfekcii, ako v predchádzajúcich príkladoch. Luciferázová aktivita, zodpovedajúca celému extraktu, bola 481.000 svetelných jednotiek.
Príklad 39
Transfekcia hepatocytov za prítomnosti melittinových peptidov s oligolyzínovým chvostíkom na C-konci
Peptidy sekvencie (smer: N k C-koncu) (SEQ ID NO: 12) Gly íle Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu íle Ser Trp íle Lys Arg Lys Arg Gin Gin Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys (označené ako mel 1) a (SEQ ID NO: 13) Gly íle Gly Ala Val Leu Glu Val Leu Glu Thr Gly Leu Pro Ala Leu íle Ser Trp íle Lys Arg Lys Arg Gin Gin Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys (kyslé mutanty, označené ako 2) boli syntetizované, ako bolo opísané v príklade 38.
Komplexy DNA sa vytvorili tak, že sa najprv zmiešalo 6 pg pCMVL-DNA v 170 pl HBS so 4 pg TfpL290 v 170 pl HBS a nechali sa stáť 30 min. pri izbovej teplote a potom sa primiešali ca 3 pg peptidu mel 1 alebo 5 pg mel 2 v 170 pl HBS. Po ďalších 30 min. inkubácie pri izbovej teplote sa primiešali komplexy s 1,5 ml DMEM + 2 % FCS a pridali sa k 450.000 buniek BNL CL.2, ktoré boli vypestované, ako je opísané v príklade 38. Zber buniek sa vykonal 24 h po transfekcii a luciferázový test sa spravil, ako bolo opísané. Luciferázová aktivita, vzťahujúca sa na celý extrakt, bola 9.200 svetelných jednotiek (v prípade mel 1) a 9.400 svetelných jednotiek (v prípade mel 2).
Príklad 40
Expresia interferónu alfa v HeLa bunkách
HeLa bunky (5 x 105 na 6 cm misku) sa transfikovali plazmidom pAD-CMVl-IFN, kódujúcou intreferón alfa2c pod kontrolou sekvencie CMV enhancer/promótor (plazmid je opísaný v DE 40 21 917 A. pAD-CMVl-IFN sa získal, keď sa reklonoval HindlII-Xbal IFN-a2c-insert v pAD CMVl). Vzorky 6 pg DNA v 330 pl HBS sa pomiešali s 8 pg TfpL v 330 pl HBS a nechali sa stáť 30 min. pri izbovej teplote. Vzorky 6 až 10 dostali iba 4 pg TfpL a po prvých 30 min. inkubácie sa ku vzorkám 6 a 7 pridal alikvot PlôpL (20 pg) v 160 pl HBS a ku vzorkám 8, 9 a 10 alikvot pLys 290 (20 pg). Po ďalších 30 min. inkubácie sa pridali alikvoty 160 pl HBS, obsahujúce 10 pl (vzorka 8) alebo 50 pl (vzorka 9 a 10) voľného P16 (na syntézu P16 a P16pL pozri v príklade 13). Po ďalších 30 min. inkubácie sa dali vzorky na HeLa bunky v 2 ml DMEM/2 % FCS za prítomnosti nasledujúcich dodatočných komponentov: Vzorky 2,7 a 10 dostali 100 μΜ chloroquinu, vzorky 3 a 4 dostali 5 a 15 pl adenovírus dl312 (1 x 1012 častíc/ml), vzorka 5 dostala 15 pl toho istého, psoralenom inaktivovaného vírusu (ako kontrolu na stimuláciu endogénnej produkcie interferónu adenovírusom boli vzorky 11,12 a 13 ošetrené alikvotami vírusu ako v príkladoch 3, 4 a 5.) 2 h po transfekcii sa primiešalo k bunkám 5 ml čerstvého média DMEM + 10 % FCS. Toto médium sa 48 h po transfekcii odstránilo a nehradilo sa 2 ml čerstvého DMEM + 10 % FCS. Toto médium sa 72 h po transfekcii zbieralo a vykonal sa ELISA - test na stanovenie IFN-α, ako je opísané v DE 40 21 917 A. Množstvá IFN-α (v ng/ml) sú zobrazené na obr. 54.
V súlade s predchádzajúcimi pozorovaniami pri použití luciferázového alebo β-galaktozidázového reportér-génu fungoval TfpL pri prenose génu IFN do týchto buniek iba slabo. Prítomnosť chloroquinu vytvorila preukázateľný signál (približne 7 ng/ml, vzorka 2), adenovírus dl312 stimuloval naopak prenos DNA spôsobom závislým od dávkovania (vzorky 3 a 4). Ošetrovanie týchto buniek porovnateľnými množstvami vírusu pri absencii komplexov IFNDNA nevyvolalo žiaden preukázateľný signál IFN (vzorky 11 a 12). Transfekcia so syntetickým, od influenzapeptidu odvodeným endozomolytickým peptidom P16 (pozri príklad 13) ako konjugátom (vzorky 6 a 7) alebo ako ionovo viazaný peptid na povrch komplexov TfpL/DNA (vzorky 8, 9, 10 k väzbe peptidov pozri príklad 37) vytvorili preukázateľnú interferonovú produkciu, ktorá sa zosilnila konjugátom peptidu za prítomnosti chloroquinu (vzorka 7).

Claims (114)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Kompozícia na transfekciu vyšších eukaryotických buniek, v ktorej je nukleová kyselina v komplexe s látkou, ktorá má afinitu k nukleovej kyseline, pričom látka je prípadne konjugovaná s intemalizačným faktorom pre tieto bunky, vyznačujúca sa tým, že navyše obsahuje endozomolytický prostriedok, je v komplexe s nukleovou kyselinou prostredníctvom svojej nukleovo kyselinovej väzobnej domény alebo sa viaže na látku s afinitou k nukleovej kyseline, pričom komplex prípadne ďalej ob sahuje intemalizačný faktor konjugovaný s látkou s afinitou k nukleovej kyseline, ktorá je tiež v komplexe s nukleovou kyselinou; alebo
    b) je vírus alebo vírusová zložka, ktorá má schopnosť per se vstúpiť do bunky, ktorá má byť transfekovaná a je mimo komplexu, v ktorom jc látka s afinitou k nukleovej kyseline konjugovaná s nukleovou kyselinou, pričom látka s afinitou k nukleovej kyseline je prípadne konjugovaná s intemalizačným faktorom.
  2. 2. Kompozícia podľa nároku 1,vyznačujúca sa t ý m , že endozomolytický prostriedok podľa bodu a) je kovalentne viazaný na substanciu s afinitou k nukleovej kyseline.
  3. 3. Kompozícia podľa nároku 1,vyznačujúca sa t ý m , že endozomolytický prostriedok podľa bodu a) nie je kovalentne viazaný na substanciu s afinitou k nukleovej kyseline.
  4. 4. Kompozícia podľa nároku 3, vyznačujúca sa t ý m , že väzba sa deje cez biotín-streptavidínový mostík.
  5. 5. Kompozícia podľa nároku 3, vyznačujúca sa t ý m , že väzba sa deje iónovo,
  6. 6. Kompozícia podľa nároku 1,vyznačujúca sa t ý m , že endozomolytickým prostriedkom podľa bodu a) je vírus alebo vírusový komponent.
  7. 7. Kompozícia podľa nároku 1 alebo 6, v y z n a čujúca sa tým, že endozomolytickým prostriedkom podľa bodu a) alebo b) je adenovírus.
  8. 8. Kompozícia podľa nároku 7, vyznačujúca sa t ý m , že adenovírus je mutant.
  9. 9. Kompozícia podľa nároku 8, vyznačujúca sa t ý m , že adenovírus je mutant schopný replikácie.
  10. 10. Kompozícia podľa nároku 9, vyznačujúca sa t ý m , že adenovírus vykazuje jednu alebo viacej mutácií a/alebo delécií v ElA-regióne.
  11. 11. Kompozícia podľa nároku 7, vyznačujúca sa t ý m , že adenovírus je inaktivovaný.
  12. 12. Kompozícia podľa nároku 11,vyznačujúca sa tým, že adenovírus je inaktivovaný krátkovlnným UV-žiarením.
  13. 13. Kompozícia podľa nároku 11,vyznačujúca sa tým, že adenovírus je inaktivovaný UV/psoralenom.
  14. 14. Kompozícia podľa nároku 11,vyznačujúca sa tým, že adenovírus je inaktivovaný formaldehydom.
  15. 15. Kompozícia podľa nároku 6, vyznačujúca sa t ý m , že vírusové komponenty pozostávajú z jedného alebo viacerých adenovírusových proteínov.
  16. 16. Kompozícia podľa nároku 1 alebo 6, vyznačujúca sa tým, že endozomolytickým prostriedkom podľa bodu a) alebo b) je pikomavírus.
  17. 17. Kompozícia podľa nároku 16, vyznačujúca sa tým, že pikomavírus je rinovírus, príp. inaktivovaný.
  18. 18. Kompozícia podľa nároku i,vyznačuj úca sa t ý m , že endozomolytickým prostriedkom podľa bodu a) je vírus infekčný pre iné druhy ako pre človeka.
  19. 19. Kompozícia podľa nároku 18, vyznačujúca sa t ý m , že vírusom je adenovírus.
  20. 20. Kompozícia podľa nároku 19, vyznačujúca sa tým, že adenovírusom je vtáčí adenovírus.
  21. 21. Kompozícia podľa nároku 20, vyznačujúca sa tým, že adenovírusom je Chick Embryo Lethal Orphan vírus.
  22. 22. Kompozícia podľa nároku 1,vyznačuj úca sa t ý m , že endozomolytickým prostriedkom podľa bodu a) je endozomolytický vírusový peptid, prípadne modifikovaný.
  23. 23. Kompozícia podľa nároku 22, vyznačujúca sa tým, že endozomolytickým peptidom je influenza - hemaglutininový HA2-peptid.
  24. 24. Kompozícia podľa nároku 23, vyznačujúca sa tým,že peptid má sekvenciu Gly Leu Phe Glu Aia íle Ala Gly Phe íle Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met íle Asp Gly Gly Gly Cys.
  25. 25. Kompozícia podľa nároku 23,vyznačujúca sa tým, že peptidom má sekvenciu Gly Leu Phe Gly Ala íle Ala Gly Phe íle Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met íle Asp Gly Gly Gly Cys.
  26. 26. Kompozícia podľa nároku 1,vyznačuj úca sa t ý m , že endozomolytickým prostriedkom podľa bodu a) je nevirusový, pripadne modifikovaný, prírodný alebo syntetický peptid, ktorý má schopnosť narušiť bunkové membrány, čo je možné stanoviť testom priesaku lipozómov alebo erytrocytovým lyzačným testom.
  27. 27. Kompozícia podľa nároku 26, vyznačujúca sa tým, že peptid má sekvenciu Gly Leu Phe Glu Ala íle Glu Gly Phe íle Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met ile Asp Gly Gly Gly Cys.
  28. 28. Kompozícia podľa nároku 26, vyznačujúca sa tým, že peptid je homo alebo heterodimér peptidu definovaného v nároku 27.
  29. 29. Kompozícia podľa nároku 26, vyznačujúca sa t ý m , že peptid je homodimér.
  30. 30. Kompozícia podľa nároku 28, vyznačujúca sa tým, že peptid je heterodimér so sekvenciou Gly Leu Phe Glu Ala íle Glu Gly Phe íle Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.
  31. 31. Kompozícia podľa nároku 26, vyznačujúca sa tým, že peptid má sekvenciu Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys
  32. 32. Kompozícia podľa nároku 26, vyznačujúca sa tým, že peptid má sekvenciu Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys
  33. 33. Kompozícia podľa nároku 22 alebo 26, vyznačujúca sa tým, že peptid má väzobnú doménu na nukleovú kyselinu.
  34. 34. Kompozícia podľa nároku 33, vyznačujúca sa tým, že peptid má oligolyzínové predĺženie.
  35. 35. Kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa t ý m , že internalizačným faktorom je transferin.
  36. 36. Kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa t ý m , že internalizačným faktorom je ligand pre T-bunky.
  37. 37. Kompozícia podľa nároku 1,vyznačujúca sa t ý m , že internalizačným faktorom je ligand pre B-bunky.
  38. 38. Kompozícia podľa nároku 37, vyznačujúca sa tým, že internalizačným faktorom je imunoglobulín.
  39. 39. Kompozícia podľa nároku 37, vyznačujúca sa tým, že ligandom je anti-imunoglobulin.
  40. 40. Kompozícia podľa nároku 1,vyznačujúca sa t ý m , že internalizačným faktorom je ligand pre hepatocyty.
  41. 41. Kompozícia podľa nároku 40, vyznačujúca sa tým, že internalizačným faktorom je ligand pre asialoglykoproteínový receptor.
  42. 42. Kompozícia podľa nároku 41, vyznačujúca sa tým, že internalizačným faktorom je tetragalaktózový polylyzín.
  43. 43. Kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa t ý m , že internalizačným faktorom je lektín.
  44. 44. Kompozícia podľa nároku 1,vyznačujúca sa t ý m , že internalizačným faktorom je lipoproteín s nízkou hustotou (LDL).
  45. 45. Komplex ako súčasť kompozície podľa nárokov 1 až 44, vyznačujúci sa tým, že má jednu alebo viaceré nukleové kyseliny v komplexe s endozomolytickým prostriedkom, prostredníctvom svojej nukleovo kyselinovej väzobnej domény, alebo sa viaže na látku s afinitou k nukleovej kyseline, pričom komplex pripadne ďalej obsahuje intemalizačný faktor konjugovaný s látkou s afinitou k nukleovej kyseline, ktorá je tiež v komplexe s nukleovou kyselinou.
  46. 46. Komplex podľa nároku 45, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje terapeuticky aktívnu nukleovú kyselinu.
  47. 47. Komplex podľa nároku 46, vyznačujúci sa t ý m , že nukleová kyselina sa skladá z jednej alebo viacerých génovo terapeuticky účinných molekúl DNA.
  48. 48. Komplex podľa nároku 47, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje molekuly DNA kódujúce cytokíny.
  49. 49. Komplex podľa nároku 47, vyznačujúci sa t ý m , že DNA molekula kóduje Faktor VIII.
  50. 50. Komplex podľa nároku 46, vyznačujúci sa t ý m , že nukleová kyselina obsahuje sekvenciu nukleotidov, z ktorej budú transkribované RNA-molekuly, ktoré inhibujú špecifické funkcie bunky.
  51. 51. Komplex podľa nároku 45, vyznačujúci sa t ý m , žc substanciou s afinitou ku nukleovej kyseline je organický polykatión.
  52. 52. Komplex podľa nároku 51, vyznačujúci sa t ý m , že polykatiónom je polylyzín.
  53. 53. Komplex podľa nároku 51, vyznačujúci sa t ý m , že polykatiónom je polyetylénimín.
  54. 54. Komplex podľa nároku 45, vyznačujúci sa t ý m , že endozomolytický prostriedok a intemalizačný faktor sú viazané na tú istú substanciu s afinitou ku nukleovej kyseline.
  55. 55. Komplex podľa nároku 54, vyznačujúci sa t ý m , že endozomolytický prostriedok a intemalizačný faktor sú viazané na polylyzín.
  56. 56. Komplex podľa nároku 55, vyznačujúci sa t ý m , že okrem toho obsahuje nekovalentne viazaný polylyzín.
  57. 57. Konjugát ako súčasť komplexu podľa nárokov 45 až 56, vyznačujúci sa tým, že konjugát pozostáva z endozomolytického prostriedku a substancie s afinitou ku nukleovej kyseline.
  58. 58. Konjugát podľa nároku 57, vyznačujúci sa t ý m , že endozomolytický prostriedok je kovalentne viazaný na substanciu s afinitou ku nukleovej kyseline.
  59. 59. Konjugát podľa nároku 57, vyznačujúci sa t ý m , že endozomolytický prostriedok je nekovalentne viazaný na substanciu s afinitou ku nukleovej kyseline.
  60. 60. Konjugát podľa nároku 59, vyznačujúci sa t ý m , že väzba sa deje prostredníctvom biotin - streptavidínového mostíka.
  61. 61. Konjugát podľa nároku 59, vyznačujúci sa t ý m , že väzba je iónová.
    SK 281682 Β6
  62. 62. Konjugát podľa nároku 57, vyznačujúci sa t ý m , že endozomolytický prostriedok je vírus alebo vírusový komponent.
  63. 63. Konjugát podľa nároku 62, vyznačujúci sa t ý m , že endozomolytickým prostriedkom je adenovírus.
  64. 64. Konjugát podľa nároku 63, vyznačujúci sa t ý m , že adenovirus je mutant.
  65. 65. Konjugát podľa nároku 64, vyznačujúci sa t ý m , že adenovirus je mutant schopný replikácie.
  66. 66. Konjugát podľa nároku 65, vyznačujúci sa t ý m , že adenovirus vykazuje jednu alebo viacej mutácií a/alebo delécií v ElA-regióne.
  67. 67. Konjugát podľa nároku 63, vyznačujúci sa t ý m , že adenovirus je inaktivovaný.
  68. 68. Konjugát podľa nároku 67, vyznačujúci sa t ý m , že adenovirus je inaktivovaný krátkovlnným UV žiarením.
  69. 69. Konjugát podľa nároku 67, vyznačujúci sa t ý m , že adenovirus je inaktivovaný UV/psoralenom.
  70. 70. Konjugát podľa nároku 67, vyznačujúci sa t ý m , že adenovirus je inaktivovaný formaldehydom.
  71. 71. Konjugát podľa nároku 62, vyznačujúci sa t ý m , že vírusové komponenty pozostávajú z jedného alebo viacerých adenovírusových proteínov.
  72. 72. Konjugát podľa nároku 62, vyznačujúci sa t ý m , že vírus je pikomavirus.
  73. 73. Konjugát podľa nároku 72, vyznačujúci sa t ý m , že pikomavirus je rinovírus, prip. inaktivovaný.
  74. 74. Konjugát podľa nároku 57, vyznačujúci sa t ý m , že endozomolytický prostriedok sám nie je intemalizačným faktorom pre transflkované bunky.
  75. 75. Konjugát podľa nároku 74, vyznačujúci sa t ý m , že endozomolytickým prostriedkom je vírus alebo vírusový komponent, ktorý sám nie je intemalizačným faktorom pre humánne bunky.
  76. 76. Konjugát podľa nároku 75, vyznačujúci sa t ý m , že endozomolytickým prostriedkom je vírus infekčný pre druhy iné ako človek.
  77. 77. Konjugát podľa nároku 76, vyznačujúci sa t ý m , že vírusom je adenovirus.
  78. 78. Konjugát podľa nároku 77, vyznačujúci sa t ý m , že adenovírusomje vtáčí adenovirus.
  79. 79. Konjugát podľa nároku 78, vyznačujúci sa t ý m , že adenovírusom je Chick Embryo Lethal Orphan vírus.
  80. 80. Konjugát podľa nároku 74, vyznačujúci sa t ý m , že endozomolytickým prostriedkom je endozomolytický vírusový peptid, prípadne modifikovaný.
  81. 81. Konjugát podľa nároku 80, vyznačujúci sa t ý m , že endozomolytickým peptidom je influenzahemaglutininový HA2-peptid.
  82. 82. Konjugát podľa nároku 81, vyznačujúci sa t ý m , že peptid má sekvenciu Gly Leu Phe Glu Ala íle Ala Gly Phe íle Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Íle Asp Gly Gly Gly Cys.
  83. 83. Konjugát podľa nároku 81, vyznačujúci sa t ý m , že peptid má sekvenciu Gly Leu Phe Gly Ala íle Ala Gly Phe íle Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met íle Asp Gly Gly Gly Cys.
  84. 84. Konjugát podľa nároku 74, vyznačujúci sa t ý m , že endozomolytickým prostriedkom je nevírusový, prípadne modifikovaný, prírodný alebo syntetický peptid.
  85. 85. Konjugát podľa nároku 84, vyznačujúci sa t ý m , že peptid má sekvenciu Gly Leu Phe Glu Ala íle Glu Gly Phe íle Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met íle Asp Gly Gly Gly Cys.
  86. 86. Konjugát podľa nároku 84, vyznačujúci sa t ý m , že peptid je homo- alebo heterodimér peptidu definovaného v nároku 85.
  87. 87. Konjugát podľa nároku 86, vyznačujúci sa t ý m , že peptid je homodimér.
  88. 88. Konjugát podľa nároku 86, vyznačujúci sa t ý m , že peptid je heterodimér so sekvenciou Gly Leu Phe Glu Ala íle Glu Gly Phe íle Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.
  89. 89. Konjugát podľa nároku 84, vyznačujúci sa t ý m , že peptid má sekvenciu Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu I lis Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.
  90. 90. Konjugát podľa nároku 84, vyznačujúci sa t ý m , že peptid má sekvenciu Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.
  91. 91. Konjugát podľa nároku 84, vyznačujúci sa t ý m , že peptid má väzbovú doménu na nukleovú kyselinu.
  92. 92. Konjugát podľa nároku 91, vyznačujúci sa t ý m , že peptid má oligolyzínové predĺženie.
  93. 93. Endozomolytický peptid, vhodný ako súčasť kompozície podľa nároku 33, ktorý má endozomolytickú doménu a umelo zavedenú nukleovo kyselinovú väzobnú doménu.
  94. 94. Peptid podľa nároku 93, vyznačujúci sa t ý m , že väzbová doména na nukleovú kyselinu je oligplyzínové predĺženie.
  95. 95. Spôsob tvorby konjugátu podľa nároku 58, v y značujúci sa tým, že vírus alebo polypeptidový alebo peptidový endozomolytický prostriedok a polyamín sú enzymaticky spojené za prítomnosti transglutaminázy.
  96. 96. Spôsob tvorby konjugátu podľa nároku 58, v y značujúci sa tým, že vírus alebo polypeptidový alebo peptidový endozomolytický prostriedok a polyamín sú chemicky spojené.
  97. 97. Spôsob tvorby konjugátu podľa nároku 59, v y značujúci sa tým, že vírus alebo vírusový komponent je modifikovaný biotínom aje viazaný na polyamín spojený so streptavidínom.
  98. 98. Spôsob vnášania nukleovej kyseliny do vyšších eukaryotických buniek, vyznačujúci sa tým, že bunky sú in vitro a ex vivo ošetrené kompozíciou podľa nároku 1 až 44.
  99. 99. Spôsob podľa nároku 98, vyznačujúci sa t ý m , že bunky sú humánne bunky.
  100. 100. Spôsob podľa nároku 99, vyznačujúci sa t ý m , že bunky sú tumorové bunky.
  101. 101. Spôsob podľa nároku 99, vyznačujúci sa t ý m , že bunky sú myoblasty.
  102. 102. Spôsob podľa nároku 99, vyznačujúci sa t ý m , že bunky sú fibroblasty.
  103. 103. Spôsob podľa nároku 99, vyznačujúci sa t ý m , že bunky sú hepatocyty.
  104. 104. Spôsob podľa nároku 99, vyznačujúci sa t ý m , že bunky sú endotelové bunky.
  105. 105. Spôsob podľa nároku 104, vyznačujúci sa t ý m , že bunky sú bunky z dýchacích ciest.
    SK 281682 Β6
  106. 106. Spôsob podľa nároku 98 až 105, vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina v zložení je génovo terapeuticky účinná.
  107. 107. Spôsob podľa nároku 100 až 106, vyznačujúci sa tým, že tumorové bunky sú ošetrované zložením ex vivo a že DNA kóduje jednu alebo viacej substancií modulujúcich imunitu, prednostne cytokíny.
  108. 108. Spôsob vytvárania heterogénneho proteínu vo vyššej eukaryotickej bunke, vyznačujúci sa t ý m , že sa bunky ošetrujú zložením podľa nároku 1, pričom nukleová kyselina má takú sekvenciu DNA, ktorá kóduje želaný proteín, bunky sú kultivované za podmienok vhodných na expresiu proteínu a proteín sa izoluje.
  109. 109. Farmaceutický prípravok vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje kompozíciu podľa nároku 1 až 44, obsahujúcu terapeuticky aktívnu nukleovú kyselinu a farmaceutický prijateľný nosič.
  110. 110. Transfekčná súprava, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje nosičovú jednotku, v ktorej sa nachádzajú dva alebo viaceré kontajnery, pričom prvý kontajner obsahuje substanciu s afinitou k nukleovej kyseline, prípadne spojenú s internalizačným faktorom pre vyššie eukaryotické bunky, a druhý kontajner obsahuje prostriedok, ktorý má schopnosť sám vniknúť do vyšších eukaryotických buniek a uvoľniť obsah endozómu do cytoplazmy.
  111. 111. Transfekčná súprava, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje nosičovú jednotku, v ktorej sa nachádzajú dva alebo viaceré kontajnery, pričom prvý kontajner obsahuje substanciu s afinitou k nukleovej kyseline, prípadne spojenú s internalizačným faktorom pre vyššie eukaryotické bunky, a druhý kontajner obsahuje substanciu s afinitou k nukleovej kyseline spojenú s prostriedkom, ktorý má schopnosť ako súčasť komplexu nukleovej kyseliny preniknúť do vyšších eukaryotických buniek a uvoľniť obsah endozómu do cytoplazmy.
  112. 112. Transfekčná súprava podľa nároku 111, vyznačujúca sa tým, že v prvom kontajneri obsahuje konjugát transglutaminázou spojeného adenovírus-polylyzínu.
  113. 113. Transfekčná súprava, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje nosičovú jednotku, v ktorej sa nachádzajú dva alebo viaceré kontajnery, pričom prvý kontajner obsahuje biotínom modifikovaný endozomolytický prostriedok a druhý kontajner obsahuje substanciu s afinitou k nukleovej kyseline modifikovanú streptavidínom.
  114. 114. Transfekčná súprava podľa nároku 113, v y značujúca sa tým, že v prvom kontajneri obsahuje biotinylovaný adenovírus a druhý kontajner obsahuje streptavidín - polylyzín.
SK368-94A 1991-09-30 1992-09-28 Kompozícia na transfekciu buniek, komplex ako súčasť kompozície, konjugát ako súčasť komplexu, endozomolytický peptid, spôsob tvorby konjugátu, spôsob vnášania nukleových kyselín do buniek, farmaceutický prípravok s jeho obsahom a transfekčná súprava SK281682B6 (sk)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US76778891A 1991-09-30 1991-09-30
US76803991A 1991-09-30 1991-09-30
US82710292A 1992-01-30 1992-01-30
US82710392A 1992-01-30 1992-01-30
US86475992A 1992-04-07 1992-04-07
US93778892A 1992-09-02 1992-09-02
PCT/EP1992/002234 WO1993007283A1 (de) 1991-09-30 1992-09-28 Zusammensetzung für das einbringen von nukleinsäure-komplexen in höhere eukaryotische zellen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK36894A3 SK36894A3 (en) 1994-08-10
SK281682B6 true SK281682B6 (sk) 2001-06-11

Family

ID=27560281

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK368-94A SK281682B6 (sk) 1991-09-30 1992-09-28 Kompozícia na transfekciu buniek, komplex ako súčasť kompozície, konjugát ako súčasť komplexu, endozomolytický peptid, spôsob tvorby konjugátu, spôsob vnášania nukleových kyselín do buniek, farmaceutický prípravok s jeho obsahom a transfekčná súprava

Country Status (28)

Country Link
US (4) US5547932A (sk)
EP (2) EP0545016A1 (sk)
JP (1) JPH10506001A (sk)
CN (1) CN1059705C (sk)
AT (1) ATE215990T1 (sk)
AU (1) AU671084B2 (sk)
BG (1) BG62740B1 (sk)
BR (1) BR9206559A (sk)
CA (1) CA2118816C (sk)
CZ (1) CZ293141B6 (sk)
DE (1) DE59209951D1 (sk)
DK (1) DK0607206T3 (sk)
EE (1) EE03195B1 (sk)
ES (1) ES2173083T3 (sk)
FI (1) FI941474A0 (sk)
HK (1) HK1013104A1 (sk)
HU (2) HU218846B (sk)
IL (1) IL103171A (sk)
MX (1) MX9205543A (sk)
NO (1) NO316744B1 (sk)
NZ (1) NZ244306A (sk)
PL (1) PL180304B1 (sk)
PT (1) PT607206E (sk)
RO (1) RO117861B1 (sk)
SG (1) SG44680A1 (sk)
SI (1) SI9200236B (sk)
SK (1) SK281682B6 (sk)
WO (1) WO1993007283A1 (sk)

Families Citing this family (416)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5981273A (en) * 1991-09-30 1999-11-09 Boehringer Ingelheim Int'l. Gmbh Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
NZ244306A (en) * 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
CA2131620A1 (en) * 1992-03-20 1993-09-30 Louis C. Smith A dna transporter system and method of use
ES2221920T3 (es) * 1992-04-03 2005-01-16 The Regents Of The University Of California Sistema de liberacion de polinucleotidos de autoensamblaje que comprende un peptido cationico anfipatico.
WO1994006923A1 (en) * 1992-09-24 1994-03-31 The University Of Connecticut Modification of a virus to redirect infectivity and enhance targeted delivery of polynucleotides to cells
HUT73383A (en) * 1993-03-19 1996-07-29 Boehringer Sohn Ingelheim Process for preparing cancer vaccines
DE4311651A1 (de) * 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
WO1995002698A1 (en) * 1993-07-12 1995-01-26 Life Technologies, Inc. Composition and methods for transfecting eukaryotic cells
DE4335025A1 (de) * 1993-10-14 1995-04-20 Boehringer Ingelheim Int Endosomolytisch wirksame Partikel
EP0648493A1 (en) * 1993-10-19 1995-04-19 Tadatsugu Prof. Dr. Taniguchi A method to reverse the phenotype of transformed cells by the transcription factor IRF-1
US5928944A (en) * 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection
MX9603866A (es) * 1994-03-18 1997-03-29 Boehringer Ingelheim Int Procedimiento para el tratamiento de celulas eucarioticas.
AU2194895A (en) * 1994-03-25 1995-10-17 Uab Research Foundation, The Composition and methods for creating syngeneic recombinant virus-producing cells
US5670347A (en) 1994-05-11 1997-09-23 Amba Biosciences Llc Peptide-mediated gene transfer
US6284880B1 (en) 1994-05-30 2001-09-04 Boehringer Ingelheim International Gmbh Chicken embryo lethal orphan (CELO) virus GAM-1
DE4418965A1 (de) * 1994-05-31 1995-12-07 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
DE4426429A1 (de) * 1994-07-26 1996-02-01 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum Einführen von DNA in höhere eukaryotische Zellen
US6468981B1 (en) 1994-07-29 2002-10-22 Emory University Compositions and methods for targeting pharmaceutically active materials to cells containing androgen receptors
US5525606A (en) 1994-08-01 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Substituted 06-benzylguanines and 6(4)-benzyloxypyrimidines
US5965541A (en) * 1995-11-28 1999-10-12 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5962311A (en) * 1994-09-08 1999-10-05 Genvec, Inc. Short-shafted adenoviral fiber and its use
US5846782A (en) 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
US6465253B1 (en) 1994-09-08 2002-10-15 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5559099A (en) * 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
US5837533A (en) * 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
EP0785276A4 (en) * 1994-09-29 2002-01-09 Ajinomoto Kk MODIFICATION OF A PEPTIDE AND A PROTEIN
US6221959B1 (en) 1994-11-18 2001-04-24 Supratek Pharma, Inc. Polynucleotide compositions
US6359054B1 (en) 1994-11-18 2002-03-19 Supratek Pharma Inc. Polynucleotide compositions for intramuscular administration
US6008202A (en) * 1995-01-23 1999-12-28 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5795587A (en) * 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US6127525A (en) * 1995-02-21 2000-10-03 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same
US5770442A (en) 1995-02-21 1998-06-23 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same
AU5103996A (en) * 1995-03-09 1996-10-02 Bavarian Nordic Research Institute A/S Vectors carrying therapeutic genes encoding antimicrobial peptides for gene therapy
WO1996029423A1 (en) * 1995-03-20 1996-09-26 Baylor College Of Medicine Compositions and methods for inducing infection by retroviral vectors outside of their host range
DE19510344C1 (de) * 1995-03-22 1996-11-07 Boehringer Ingelheim Int Verwendung einer Tumorvakzine
US6420549B1 (en) 1995-06-06 2002-07-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide analogs having modified dimers
AU705035B2 (en) * 1995-06-07 1999-05-13 Baylor College Of Medicine Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
US6051429A (en) * 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US20030069173A1 (en) * 1998-03-16 2003-04-10 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced transfections
AU5979296A (en) * 1995-06-07 1996-12-30 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US6783980B2 (en) * 1995-06-15 2004-08-31 Crucell Holland B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
ATE278794T1 (de) * 1995-06-15 2004-10-15 Crucell Holland Bv Verpackungssysteme für humane, menschliche adenoviren, zur verwendung in die gentherapie
US5908777A (en) * 1995-06-23 1999-06-01 University Of Pittsburgh Lipidic vector for nucleic acid delivery
GB9515356D0 (en) * 1995-07-26 1995-09-20 Medical Res Council Improvements in or relating to delivery of nucleic acid
US5770720A (en) * 1995-08-30 1998-06-23 Barnes-Jewish Hospital Ubiquitin conjugating enzymes having transcriptional repressor activity
IL115199A (en) 1995-09-07 2005-05-17 Opperbas Holding Bv Composition comprising a polynucleic acid molecule in a liposome and method using said composition
CA2190304A1 (en) * 1995-12-15 1997-06-16 Elazar Rabbani Property effecting and/or property exhibiting compositions for therapeutic and diagnostic uses
AU2112697A (en) * 1996-02-09 1997-08-28 Pi-Wan Cheng Receptor ligand-facilitated delivery of biologically active molecules
DE19605548A1 (de) * 1996-02-15 1997-09-04 Boehringer Ingelheim Int Zusammensetzung für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen
CA2248538A1 (en) 1996-03-14 1997-09-18 The Immune Response Corporation Targeted delivery of genes encoding interferon
DE19615803A1 (de) 1996-04-20 1997-10-23 Boehringer Ingelheim Int CELO-Virus
US7812149B2 (en) 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US9096636B2 (en) 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
DE69725878T2 (de) 1996-08-13 2004-07-29 Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville Zusammensetzungen zur polynukleotidabgabe
DE19632532A1 (de) * 1996-08-13 1998-02-19 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur Herstellung von Säugetieren mit definierten genetischen Eigenschaften
US5948681A (en) * 1996-08-14 1999-09-07 Children's Hospital Of Philadelphia Non-viral vehicles for use in gene transfer
CN1181422A (zh) * 1996-10-31 1998-05-13 上海市肿瘤研究所 与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体
US6544523B1 (en) 1996-11-13 2003-04-08 Chiron Corporation Mutant forms of Fas ligand and uses thereof
US5965441A (en) * 1996-11-13 1999-10-12 The General Hospital Coporation HSV/AAV hybrid amplicon vectors
US20060002949A1 (en) 1996-11-14 2006-01-05 Army Govt. Of The Usa, As Rep. By Secretary Of The Office Of The Command Judge Advocate, Hq Usamrmc. Transcutaneous immunization without heterologous adjuvant
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
US6797276B1 (en) 1996-11-14 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Use of penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response
US6153596A (en) * 1996-12-18 2000-11-28 Emory University Polycationic oligomers
JP4289687B2 (ja) * 1997-03-14 2009-07-01 ザ チルドレンズ ホスピタル オブ フィラデルフィア 血友病の治療のための遺伝子治療で使用する方法と組成物
US20040009166A1 (en) * 1997-04-30 2004-01-15 Filpula David R. Single chain antigen-binding polypeptides for polymer conjugation
CA2288992C (en) * 1997-04-30 2012-06-12 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
US6635623B1 (en) 1997-06-13 2003-10-21 Baylor College Of Medicine Lipoproteins as nucleic acid vectors
US20050096288A1 (en) * 1997-06-13 2005-05-05 Aragene, Inc. Lipoproteins as nucleic acid vectors
DE19726186A1 (de) * 1997-06-20 1998-12-24 Boehringer Ingelheim Int Komplexe für den Transport von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
US6172211B1 (en) 1997-07-11 2001-01-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Nucleic acid encoding tag7 polypeptide
EP1007099A4 (en) * 1997-07-11 2004-11-24 Univ Brandeis METHOD FOR INDUCING APOPTOSE BY LOWERING THE THIAMINE MIRROR
US7923250B2 (en) 1997-07-30 2011-04-12 Warsaw Orthopedic, Inc. Methods of expressing LIM mineralization protein in non-osseous cells
DE69840361D1 (de) 1997-07-30 2009-01-29 Univ Emory Neue knochenmineralisierungsproteine, dna, vektoren, expressionssysteme
WO1999007723A1 (en) * 1997-08-07 1999-02-18 University Of Maryland, Baltimore Nucleic acid uptake and release vehicle
US20030125278A1 (en) * 1997-08-13 2003-07-03 Tang De-Chu C. Immunization of animals by topical applications of a salmonella-based vector
US6706693B1 (en) 1997-08-13 2004-03-16 The Uab Research Foundation Vaccination by topical application of genetic vectors
US6197332B1 (en) 1997-08-13 2001-03-06 Chiron Corporation Lipid-conjugated polyamide compounds and related compositions and methods thereof
US20030045492A1 (en) * 1997-08-13 2003-03-06 Tang De-Chu C. Vaccination by topical application of recombinant vectors
US6716823B1 (en) 1997-08-13 2004-04-06 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof
US6348450B1 (en) 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
US5998386A (en) 1997-09-19 1999-12-07 Feldman; Arthur M. Pharmaceutical compositions and method of using same for the treatment of failing myocardial tissue
WO1999019500A1 (en) * 1997-10-10 1999-04-22 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Healt H And Human Services Complex of biotinylated viral vector and ligand for targeted gene delivery
US6914131B1 (en) 1998-10-09 2005-07-05 Chiron S.R.L. Neisserial antigens
CA2671261A1 (en) 1997-11-06 1999-05-20 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Neisserial antigens
US6734338B1 (en) 1997-11-14 2004-05-11 Cedars-Sinai Medical Center Transfection, storage and transfer of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies
US7294755B1 (en) 1997-11-14 2007-11-13 Cedars-Sinai Medical Center Genetic modification of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies
JP2001523468A (ja) * 1997-11-14 2001-11-27 セダーシナイ メディカル センター トランスジェニック種の産生のための雄性生殖細胞のトランスフェクションおよび移入
EP0945138A1 (en) * 1997-12-04 1999-09-29 Université Louis Pasteur de Strasbourg Transfection particles
CA2317549C (en) * 1998-01-05 2006-04-11 University Of Washington Composition for enhancing transport through lipid-containing membranes, and uses thereof
BR9906927A (pt) 1998-01-14 2001-11-20 Chiron Spa Proteìnas de neisseria meningitidis
AU4070499A (en) 1998-04-30 1999-11-16 Cornell Research Foundation Inc. Adenoviral vectors with tandem fiber proteins
NZ541361A (en) 1998-05-01 2008-04-30 Inst Genomic Research Neisseria meningitidis antigens and compositions relating to SEQ ID Nos:2916, 2918 and 2920
US7244714B1 (en) * 1998-06-12 2007-07-17 Aradigm Corporation Methods of delivering aerosolized polynucleotides to the respiratory tract
US6509323B1 (en) 1998-07-01 2003-01-21 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
US7091192B1 (en) 1998-07-01 2006-08-15 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
US6245427B1 (en) 1998-07-06 2001-06-12 DüZGüNES NEJAT Non-ligand polypeptide and liposome complexes as intracellular delivery vehicles
US20040043489A1 (en) * 1998-07-08 2004-03-04 Menzo Havenga Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for dendritic cells and methods of use
US20030017138A1 (en) * 1998-07-08 2003-01-23 Menzo Havenga Chimeric adenoviruses
US7396919B1 (en) * 1998-07-17 2008-07-08 Mirus Bio Corporation Charge reversal of polyion complexes
WO2000011019A1 (en) * 1998-08-21 2000-03-02 Felix Frey Conjugates of dna interacting groups with steroid hormones for use as nucleic acid transfection agent
US6455314B1 (en) 1998-09-11 2002-09-24 Genvec, Inc. Alternatively targeted adenovirus
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
EP1953229A3 (en) 1998-10-15 2008-12-24 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Metastatic breast and colon cancer regulated genes
US6333396B1 (en) 1998-10-20 2001-12-25 Enzon, Inc. Method for targeted delivery of nucleic acids
US7166745B1 (en) 1998-11-12 2007-01-23 Invitrogen Corporation Transfection reagents
US20050063950A1 (en) * 1998-11-19 2005-03-24 Georgetown University Systemic viral/ligand gene delivery system and gene therapy
DE69942837D1 (de) 1998-11-19 2010-11-18 Univ Georgetown Systemisches virus/ligand genabgabemittel und gentherapie
US6929946B1 (en) * 1998-11-20 2005-08-16 Crucell Holland B.V. Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells
DK1141331T3 (da) 1998-12-16 2009-01-05 Novartis Vaccines & Diagnostic Human cyclinafhængig kinase (hPNQALRE)
US7098192B2 (en) 1999-04-08 2006-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of STAT3 expression
GB9908195D0 (en) 1999-04-09 1999-06-02 Microbiological Res Authority Treatment of intracellular infection
US6514762B1 (en) 1999-04-23 2003-02-04 New Mexico State University Technology Transfer Corporation Delivery of nucleotides by electrochemical release
DE19918446A1 (de) * 1999-04-23 2000-11-23 Univ Eberhard Karls Verwendung von Coxsackievirus B3 zur Verbesserung der Transfektion von Zellen
MXPA01010924A (es) 1999-04-30 2002-05-06 Chiron Spa Antigenos de neisseria conservados.
US20040009936A1 (en) * 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
US6913922B1 (en) 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
US6492169B1 (en) 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
US20050232900A1 (en) * 1999-05-18 2005-10-20 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
US6696272B1 (en) 1999-06-02 2004-02-24 Hsc Research & Development Limited Partnership Products and methods for gaucher disease therapy
DK1102785T3 (da) * 1999-06-07 2013-05-13 Arrowhead Res Corp Sammensætninger til lægemiddeltilførsel ved anvendelse af pH-følsomme molekyler
US20080281041A1 (en) * 1999-06-07 2008-11-13 Rozema David B Reversibly Masked Polymers
US8541548B2 (en) * 1999-06-07 2013-09-24 Arrowhead Madison Inc. Compounds and methods for reversible modification of biologically active molecules
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
ES2183752T3 (es) * 1999-09-17 2005-07-16 Tgt Laboratories, S.A. De C.V. Vectores adenovirales recombinantes y su utilizacion en el tratamiento de la cirrosis de higado.
EP2275553B1 (en) 1999-10-29 2015-05-13 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Neisserial antigenic peptides
CA2395636A1 (en) * 1999-12-30 2001-07-12 Novartis Ag Novel colloid synthetic vectors for gene therapy
AU2764801A (en) 2000-01-07 2001-07-24 University Of Washington Enhanced transport of agents using membrane disruptive agents
ES2507100T3 (es) 2000-01-17 2014-10-14 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Vacuna OMV suplementada contra meningococo
US6261840B1 (en) 2000-01-18 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US20020055479A1 (en) 2000-01-18 2002-05-09 Cowsert Lex M. Antisense modulation of PTP1B expression
BR0108711A (pt) 2000-02-28 2004-06-22 Chiron Spa Expressão heteróloga de proteìnas de neisseria
US6680172B1 (en) 2000-05-16 2004-01-20 Regents Of The University Of Michigan Treatments and markers for cancers of the central nervous system
EP1157999A1 (en) * 2000-05-24 2001-11-28 Introgene B.V. Methods and means for enhancing skin transplantation using gene delivery vehicles having tropism for primary fibroblasts, as well as other uses thereof
JP2003534806A (ja) * 2000-05-31 2003-11-25 ジェンベク、インコーポレイティッド アデノウイルスベクターのターゲティングの方法および組成物
EP1950297A2 (en) 2000-05-31 2008-07-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Compositions and methods for treating neoplastic disease using chemotherapy and radiation sensitizers
JP2004501657A (ja) 2000-06-28 2004-01-22 マックス−デルブルック−セントラム　フュール　モレクラーレ　メディツィン トランスフェクション効率の改良方法
US20040058856A1 (en) * 2000-07-26 2004-03-25 Soo-Young Choi Oligolysine transducing domain, oligolysine-cargo molecule complex and uses thereof
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
US20040033605A1 (en) * 2000-09-20 2004-02-19 Menzo Havenga Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for dendritic cells
US7235233B2 (en) * 2000-09-26 2007-06-26 Crucell Holland B.V. Serotype 5 adenoviral vectors with chimeric fibers for gene delivery in skeletal muscle cells or myoblasts
EP1191104A1 (en) * 2000-09-26 2002-03-27 Introgene B.V. Gene delivery vehicles and use thereof in the preparation of a medicament and/or vaccine
DE10049010A1 (de) * 2000-10-04 2002-04-18 Boehringer Ingelheim Int Transferrin-Polykation/DNS-Komplexe für die systemische Therapie von Tumorerkrankungen mit zytotoxischen Proteinen
NZ560966A (en) 2000-10-27 2010-06-25 Novartis Vaccines & Diagnostic Nucleic acids and proteins from streptococcus groups A & B
US20020086849A1 (en) * 2000-10-27 2002-07-04 Gulilat Gebeyehu Method for introducing antisense oligonucleotides into eucaryotic cells
US6892140B1 (en) 2000-11-27 2005-05-10 Enteron, Inc. Immunogenic cancer peptides and uses thereof
MXPA00011713A (es) * 2000-11-28 2002-05-31 Tgt Lab S A De C V Vectores recombinantes virales y no virales conteniendo el gen humano del activador de plasminogeno derivado de urocinasa y su utilidad en el tratamiento de diversos tipos de fibrosis hepatica, renal, pulmonar, pancreatica, cardiaca y cicatrices hipe
US7635571B2 (en) * 2000-12-07 2009-12-22 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Amplified signal in binding assays
US6635466B2 (en) * 2001-01-09 2003-10-21 University Of Iowa Research Foundation Adenovirus serotype 30 (Ad30)
US20030170826A1 (en) * 2001-02-02 2003-09-11 Peter Rabinovich Peptides for facilitating composite receptor expression and translocation of macromolecules
ES2310201T3 (es) 2001-02-13 2009-01-01 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Army Vacuna para inmunizacion transcutanea contra la diarrea de los viajeros.
US20020150566A1 (en) * 2001-03-23 2002-10-17 Kun-Liang Guan Method of inhibiting cancerous cell proliferation using Ras mutants of GDP-bound conformation
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
US20020193295A1 (en) * 2001-05-04 2002-12-19 Emanuel Calenoff Immunogenic peptides and uses thereof
EP1383480A4 (en) * 2001-04-30 2006-05-24 Targeted Genetics Corp Lipid-Containing Drug Delivery Complexes and Method of Producing the Same
WO2002089586A1 (en) * 2001-05-10 2002-11-14 St. Jude Children's Research Hospital Lung epithelial cell line for propagating viruses
US20060159657A1 (en) * 2001-06-14 2006-07-20 Macromed, Incorporated Formulations of lymphokines and method of use thereof for local or both local and systemic control of proliferative cell disorders
US20030003074A1 (en) * 2001-06-14 2003-01-02 Macromed, Inc. Formulations of lymphokines and method of use thereof for local or both local and systemic control of proliferative cell disorders
US7803915B2 (en) 2001-06-20 2010-09-28 Genentech, Inc. Antibody compositions for the diagnosis and treatment of tumor
WO2003000113A2 (en) 2001-06-20 2003-01-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
EP2270024B1 (en) 2001-06-21 2018-10-24 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US6964950B2 (en) 2001-07-25 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of C-reactive protein expression
US20030096772A1 (en) 2001-07-30 2003-05-22 Crooke Rosanne M. Antisense modulation of acyl CoA cholesterol acyltransferase-2 expression
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7227014B2 (en) 2001-08-07 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein (a) expression
GB0120022D0 (en) 2001-08-16 2001-10-10 Photobiotics Ltd Conjugate
JP2005536439A (ja) 2001-09-18 2005-12-02 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍の診断及び治療のための組成物と方法
WO2003052117A2 (en) * 2001-09-19 2003-06-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to non-viral transfection
US6750019B2 (en) 2001-10-09 2004-06-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression
NZ577565A (en) 2001-10-09 2010-10-29 Isis Pharmaceuticals Inc Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expressions
US7745418B2 (en) * 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
WO2003088808A2 (en) 2002-04-16 2003-10-30 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
JP2005527639A (ja) 2001-11-02 2005-09-15 インサート セラピューティクス インコーポレイテッド Ｒｎａ干渉の治療的利用のための方法及び組成物
US20030138407A1 (en) * 2001-11-02 2003-07-24 Patrick Lu Therapeutic methods for nucleic acid delivery vehicles
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
KR100982204B1 (ko) 2001-12-12 2010-09-14 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 에스.알.엘. 클라미디아 트라코마티스에 대한 면역화
NZ556415A (en) 2002-01-02 2009-02-28 Genentech Inc Compositions and methods for the diagnosis and treatment of glioma tumor
US8138383B2 (en) * 2002-03-11 2012-03-20 Arrowhead Madison Inc. Membrane active heteropolymers
US8008355B2 (en) * 2002-03-11 2011-08-30 Roche Madison Inc. Endosomolytic poly(vinyl ether) polymers
US20030186916A1 (en) * 2002-03-12 2003-10-02 Lei Yu Vector for transfection of eukaryotic cells
AU2003225793A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-29 Baxter Healthcare S.A. Methods and compositions for directing cells to target organs
US20030180712A1 (en) 2002-03-20 2003-09-25 Biostratum Ab Inhibition of the beta3 subunit of L-type Ca2+ channels
ATE447037T1 (de) * 2002-04-25 2009-11-15 Crucell Holland Bv Mittel und verfahren zur herstellung von adenovirusvektoren
US20040142450A1 (en) * 2002-05-10 2004-07-22 Seo Sang Heui Lung epithelial cell line for propagating viruses
US7199107B2 (en) 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
US20050233993A1 (en) * 2002-06-05 2005-10-20 Kadonaga James T Methods for promoting homologous recombination
PT2332582E (pt) 2002-06-19 2014-01-28 Apeiron Biologics Ag Activação de ace2 para o tratamento de doença cardíaca, pulmonar e renal e de hipertensão
US20060003316A1 (en) * 2002-07-15 2006-01-05 John Simard Immunogenic compositions derived from poxviruses and methods of using same
PT1534340E (pt) 2002-09-06 2012-03-13 Cerulean Pharma Inc Polímeros à base de ciclodextrina para a administração de medicamentos ligados por ligação covalente
CN1820078A (zh) * 2002-09-09 2006-08-16 田纳西大学研究基金会 弹状病毒的重组突变体及其应用方法
MXPA05002791A (es) 2002-09-13 2005-12-05 Replicor Inc Oligonucleotidos antivirales complementarios sin secuencia.
AU2003278957A1 (en) 2002-09-26 2004-04-23 Amgen, Inc. Modulation of forkhead box o1a expression
MXPA05003843A (es) * 2002-10-10 2006-02-17 Us Dept Veterans Affairs Deteccion, localizacion y determicnacion de fases de tumores usando linfocitos activados rotulados dirigidos a un epitope especifico.
AU2003295387A1 (en) 2002-11-05 2004-06-03 Isis Parmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
EP1560839A4 (en) 2002-11-05 2008-04-23 Isis Pharmaceuticals Inc CHIMERIC OLIGOMER COMPOUNDS AND THEIR USE IN GENE MODULATION
US20080026077A1 (en) * 2002-11-12 2008-01-31 John Hilfinger Methods and compositions of gene delivery agents for systemic and local therapy
US20050026859A1 (en) * 2002-11-12 2005-02-03 John Hilfinger Methods and compositions of gene delivery agents for systemic and local therapy
ES2420914T3 (es) 2002-11-13 2013-08-27 Genzyme Corporation Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B
CA2505801A1 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Rosanne Crooke Antisense modulation of apolipoprotein b expression
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
US7468356B2 (en) 2003-02-11 2008-12-23 Antisense Therapeutics Ltd. Modulation of insulin like growth factor I receptor expression
US7803781B2 (en) 2003-02-28 2010-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
US20040185559A1 (en) 2003-03-21 2004-09-23 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 1 expression
US7217566B2 (en) * 2003-03-24 2007-05-15 Invitrogen Corporation Attached cell lines
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
EP1620112A4 (en) * 2003-04-17 2007-04-25 Univ Columbia DESMOGLEIN 4 IS A NEW GENUS INVOLVED IN HAIR GROWTH
US7399853B2 (en) 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
US20040220085A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Jasbir Sandhu Compositions for nucleic acid delivery
US20040220084A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Jasbir Sandhu Methods for nucleic acid delivery
BRPI0410886A (pt) 2003-06-03 2006-07-04 Isis Pharmaceuticals Inc composto de filamento duplo, composição farmacêutica, sal farmaceuticamente aceitável, métodos de modificação do ácido nucleico que codifica a survivina humana, de inibição da expressão da suvivina em células ou tecidos, e de tratamento de uma condição associada com a expressão ou superexpressão da suvivina, e, oligonucleotìdeo de rnai de filamento único
CA2528094A1 (en) * 2003-06-09 2005-01-13 Corixa Corporation Expression vectors for stimulating an immune response to cancer antigens
US7883720B2 (en) * 2003-07-09 2011-02-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Charge-dynamic polymers and delivery of anionic compounds
WO2005013901A2 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
NZ576775A (en) 2003-09-18 2010-12-24 Isis Pharmaceuticals Inc Modulation of eIF4E expression
NZ546272A (en) 2003-10-10 2009-05-31 Alchemia Oncology Pty Ltd The modulation of hyaluronan synthesis and degradation in the treatment of disease
KR20060116825A (ko) * 2003-10-23 2006-11-15 일루미겐 바이오사이언시스, 인코포레이티드 바이러스 감염에 대한 저항성과 관련된 유전자인ｏａｓ1에서의 돌연변이의 검출
US8062891B2 (en) 2003-10-24 2011-11-22 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to plants
US8507277B2 (en) 2003-10-24 2013-08-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides
US20090123468A1 (en) 2003-10-24 2009-05-14 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US20090208478A1 (en) * 2003-10-24 2009-08-20 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US8133733B2 (en) 2003-10-24 2012-03-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues
EP2418281B1 (en) 2003-10-24 2016-06-01 Gencia Corporation Methods and compositions for delivering polynucleotides
US20050191653A1 (en) 2003-11-03 2005-09-01 Freier Susan M. Modulation of SGLT2 expression
CA2747871C (en) 2003-11-17 2018-04-10 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
WO2005054438A2 (en) 2003-12-01 2005-06-16 Invitrogen Corporation Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same
US20050265956A1 (en) * 2004-01-12 2005-12-01 Ye Liu Polyalkyleneimine-graft-biodegradable polymers for delivery of bioactive agents
US20050164271A1 (en) 2004-01-20 2005-07-28 Sanjay Bhanot Modulation of glucocorticoid receptor expression
US7468431B2 (en) 2004-01-22 2008-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E-BP2 expression
WO2005069987A2 (en) * 2004-01-23 2005-08-04 City Of Hope Amplifying interfering rna (rnai) expression and effects
US8569474B2 (en) 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
US20050203047A1 (en) * 2004-03-10 2005-09-15 Ulrich Thomann Delivery vectors for short interfering RNA, micro-RNA and antisense RNA
EP2700720A3 (en) 2004-03-15 2015-01-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for optimizing cleavage of RNA by RNASE H
WO2005097207A2 (en) * 2004-03-26 2005-10-20 Curis, Inc. Rna interference modulators of hedgehog signaling and uses thereof
DK1736541T3 (da) 2004-03-29 2013-05-06 Galpharma Co Ltd Nyt modificeret galectin 9-protein og anvendelse heraf
US20050244869A1 (en) 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
US7884086B2 (en) 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
US8697139B2 (en) 2004-09-21 2014-04-15 Frank M. Phillips Method of intervertebral disc treatment using articular chondrocyte cells
US9315862B2 (en) 2004-10-05 2016-04-19 California Institute Of Technology Aptamer regulated nucleic acids and uses thereof
CA2582353A1 (en) 2004-10-06 2006-04-20 University Of Rochester Treatment of pulmonary hypertension using an agent that inhibits a tissue factor pathway
US7833513B2 (en) 2004-12-03 2010-11-16 Rhode Island Hospital Treatment of Alzheimer's Disease
EP2110667A1 (en) 2005-01-20 2009-10-21 University Of Rochester Thoredoxin interacting protein (TXNIP) as regulator of vascular function
ES2852549T3 (es) 2005-02-09 2021-09-13 Sarepta Therapeutics Inc Composición antisentido para tratamiento de la atrofia muscular
JP2008531581A (ja) * 2005-02-23 2008-08-14 ユーエービー リサーチ ファウンデーション アルキル−グリコシドで増強されたワクチン接種
CN101175769A (zh) 2005-03-10 2008-05-07 健泰科生物技术公司 用于调控血管完整性的方法和组合物
AU2006230436B2 (en) 2005-03-31 2011-11-24 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
US8734851B2 (en) * 2005-04-29 2014-05-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Localized delivery of nucleic acid by polyelectrolyte assemblies
UA95446C2 (ru) 2005-05-04 2011-08-10 Іллюміджен Байосайєнсіз, Інк. Мутаци в генах oas1
DE102005023993A1 (de) * 2005-05-20 2006-11-23 TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH Nicht virales Vektorsystem zum Transport von Nukleinsäure in die Lunge
AU2006318194B2 (en) 2005-11-21 2012-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eiF4E-BP2 expression
US20090317802A1 (en) * 2005-12-09 2009-12-24 Bhatia Sangeeta N Compositions and Methods to Monitor RNA Delivery to Cells
CA2566267A1 (en) * 2005-12-09 2007-06-09 University Health Network Thymidylate kinase mutants and uses thereof
US20090068158A1 (en) * 2005-12-09 2009-03-12 Medin Jeffrey A Thymidylate kinase mutants and uses thereof
WO2007089584A2 (en) 2006-01-26 2007-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to huntingtin
CA2638915A1 (en) * 2006-02-10 2007-08-23 The Regents Of The University Of California Transducible delivery of sirna by dsrna binding domain fusions to ptd/cpps
EP2502999A3 (en) 2006-03-03 2013-01-23 Amorfix Life Sciences Ltd. Methods and compositions to treat and detect misfolded-SOD1 mediated diseases
US7718193B2 (en) * 2006-03-16 2010-05-18 University Of Washington Temperature- and pH-responsive polymer compositions
EP2614839A3 (en) 2006-04-05 2015-01-28 Genentech, Inc. Method for using BOC/CDO to modulate hedgehog signaling
MX2008014005A (es) 2006-05-03 2009-01-27 Baltic Technology Dev Ltd Agentes antisentido que combinan un oligonucleotido modificado con base fuertemente unida y nucleasa artificial.
EP2035035A2 (en) 2006-06-09 2009-03-18 Novartis AG Immunogenic compositions for streptococcus agalactiae
JP6125741B2 (ja) * 2006-07-12 2017-05-17 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 可逆的なホスホトリエステル電荷中和保護基による核酸の形質導入可能な送達
WO2008011473A2 (en) 2006-07-19 2008-01-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to hbxip
CN102614528B (zh) * 2006-08-18 2014-02-26 箭头研究公司 用于体内递送多核苷酸的多缀合物
US8017109B2 (en) * 2006-08-18 2011-09-13 Roche Madison Inc. Endosomolytic poly(acrylate) polymers
KR20090066289A (ko) 2006-09-08 2009-06-23 로드아일랜드하스피틀 알코올 유발성 뇌 질환의 치료, 예방 및 역행
EP2061484B1 (en) 2006-09-08 2012-11-07 Rhode Island Hospital Treatment, prevention, and reversal of alcohol-induced liver disease
WO2008058291A2 (en) 2006-11-09 2008-05-15 California Institute Of Technology Modular aptamer-regulated ribozymes
AU2007333225B2 (en) * 2006-12-08 2014-06-12 Massachusetts Institute Of Technology Delivery of nanoparticles and/or agents to cells
US8048998B2 (en) * 2007-01-19 2011-11-01 Exiqon A/S Mediated cellular delivery of LNA oligonucleotides
US8834918B2 (en) * 2007-01-22 2014-09-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Modified multilayered film
JP2010516625A (ja) 2007-01-24 2010-05-20 インサート セラピューティクス， インコーポレイテッド 制御された薬物送達のためのテザー基を有するポリマー−薬物コンジュゲート
EP2114981B1 (en) 2007-01-29 2013-05-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating protein expression
JP5761915B2 (ja) 2007-02-22 2015-08-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 炎症性腸疾患の検出方法
US7981688B2 (en) 2007-03-08 2011-07-19 University Of Washington Stimuli-responsive magnetic nanoparticles and related methods
EP2139447A2 (en) 2007-03-20 2010-01-06 Harold Brem Gm-csf cosmeceutical compositions and methods of use thereof
CA2584494A1 (en) * 2007-03-27 2008-09-27 Jeffrey A. Medin Vector encoding therapeutic polypeptide and safety elements to clear transduced cells
ES2654303T3 (es) 2007-05-04 2018-02-13 University Health Network Inmunoterapia de IL-12 contra el cáncer
US20090082217A1 (en) * 2007-07-16 2009-03-26 California Institute Of Technology Selection of nucleic acid-based sensor domains within nucleic acid switch platform
US20120165387A1 (en) 2007-08-28 2012-06-28 Smolke Christina D General composition framework for ligand-controlled RNA regulatory systems
US8367815B2 (en) * 2007-08-28 2013-02-05 California Institute Of Technology Modular polynucleotides for ligand-controlled regulatory systems
US8865667B2 (en) * 2007-09-12 2014-10-21 California Institute Of Technology Higher-order cellular information processing devices
AU2008307482B2 (en) 2007-10-02 2012-07-12 Amgen Inc. Increasing erythropoietin using nucleic acids hybridizable to micro-RNA and precursors thereof
US20090105375A1 (en) * 2007-10-09 2009-04-23 Lynn David M Ultrathin Multilayered Films for Controlled Release of Anionic Reagents
US9029524B2 (en) * 2007-12-10 2015-05-12 California Institute Of Technology Signal activated RNA interference
EP2077119A1 (de) * 2007-12-21 2009-07-08 Apeiron Biologics Forschungs- und Entwicklungsgesellschaft M.B.H. Behandlung von Fibrosen und Lebererkrankungen
US8344116B2 (en) * 2008-03-17 2013-01-01 Case Western Reserve University Polymers and complexes for delivery of nucleic acids to intracellular targets
US8568709B2 (en) 2008-03-20 2013-10-29 University Health Network Thymidylate kinase fusions and uses thereof
CN102037123A (zh) 2008-04-04 2011-04-27 卡兰多制药股份有限公司 Epas1抑制剂的组合物和用途
GB2459436A (en) * 2008-04-08 2009-10-28 Henderson Morley Plc Vaccine adjuvant
US8324333B2 (en) 2008-06-05 2012-12-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Anionic charge-dynamic polymers for release of cationic agents
US8815818B2 (en) 2008-07-18 2014-08-26 Rxi Pharmaceuticals Corporation Phagocytic cell delivery of RNAI
CN103429270B (zh) 2008-08-25 2016-11-23 埃克斯雷德制药有限公司 阻止结缔组织生长因子的反义核苷酸及其用途
CA2746527A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna interference in skin indications
CA2745811C (en) 2008-12-04 2021-07-13 Joseph Collard Treatment of tumor suppressor gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to the gene
JP6091752B2 (ja) 2008-12-04 2017-03-08 クルナ・インコーポレーテッド Ｅｐｏに対する天然アンチセンス転写物の抑制によるエリスロポエチン（ｅｐｏ）関連疾患の治療
MX366774B (es) 2008-12-04 2019-07-24 Curna Inc Uso de oligonucleótidos antisentido en la inhibición de transcrito antisentido natural para sirtuina 1.
US9493774B2 (en) 2009-01-05 2016-11-15 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of PCSK9 through RNAi
JP6066035B2 (ja) 2009-02-12 2017-01-25 クルナ・インコーポレーテッド グリア細胞由来神経栄養因子（ｇｄｎｆ）関連疾病の、ｇｄｎｆに対する天然アンチセンス転写物の抑制による治療
US9074210B2 (en) 2009-02-12 2015-07-07 Curna, Inc. Treatment of brain derived neurotrophic factor (BDNF) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to BDNF
US8329882B2 (en) 2009-02-18 2012-12-11 California Institute Of Technology Genetic control of mammalian cells with synthetic RNA regulatory systems
EP2963116B1 (en) 2009-03-04 2020-11-11 CuRNA, Inc. Treatment of sirtuin 1 (sirt1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to sirt 1
US9464287B2 (en) 2009-03-16 2016-10-11 Curna, Inc. Treatment of nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (NRF2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to NRF2
MX2011009752A (es) 2009-03-17 2011-09-29 Opko Curna Llc Tratamiento de enfermedades relacionadas a homologo tipo delta 1(dlk1) por inhibicion de transcrito antisentido natural a homologo tipo delta (dlk1).
US8772238B2 (en) 2009-03-18 2014-07-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of ixolaris, a tissue factor inhibitor, for the treatment of cancer
US9145555B2 (en) 2009-04-02 2015-09-29 California Institute Of Technology Integrated—ligand-responsive microRNAs
EP3248618A1 (en) 2009-04-22 2017-11-29 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules
CN102639151B (zh) 2009-05-01 2017-03-22 库尔纳公司 通过针对hbf/hbg的天然反义转录物的抑制治疗血红蛋白（hbf/hbg）相关疾病
WO2010129746A2 (en) 2009-05-06 2010-11-11 Curna, Inc. Treatment of tristetraproline (ttp) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ttp
JP5883782B2 (ja) 2009-05-06 2016-03-15 クルナ・インコーポレーテッド 脂質輸送代謝遺伝子に対する天然アンチセンス転写物の抑制による脂質輸送代謝遺伝子関連疾患の治療
CA2762369C (en) 2009-05-18 2021-12-28 Joseph Collard Treatment of reprogramming factor related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a reprogramming factor
EP2432882B1 (en) 2009-05-22 2019-12-25 CuRNA, Inc. TREATMENT OF TRANSCRIPTION FACTOR E3 (TFE3) and INSULIN RECEPTOR SUBSTRATE 2 (IRS2) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO TFE3
CN103221541B (zh) 2009-05-28 2017-03-01 库尔纳公司 通过抑制抗病毒基因的天然反义转录物来治疗抗病毒基因相关疾病
EP2440234A4 (en) 2009-06-10 2013-11-06 Univ New York IMMUNOLOGICAL TARGETING OF PATHOLOGICAL TAU PROTEINS
US8426214B2 (en) * 2009-06-12 2013-04-23 University Of Washington System and method for magnetically concentrating and detecting biomarkers
CA2765700C (en) 2009-06-16 2021-01-05 Opko Curna, Llc Treatment of collagen gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a collagen gene
ES2629339T3 (es) 2009-06-16 2017-08-08 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con la paraoxonasa 1 (pon1) por inhibición de transcrito antisentido natural a pon1
US8859515B2 (en) 2009-06-24 2014-10-14 Curna, Inc. Treatment of tumor necrosis factor receptor 2 (TNFR2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to TNFR2
CN102482672B (zh) 2009-06-26 2016-11-09 库尔纳公司 通过抑制唐氏综合征基因的天然反义转录物治疗唐氏综合征基因相关疾病
US9234199B2 (en) 2009-08-05 2016-01-12 Curna, Inc. Treatment of insulin gene (INS) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an insulin gene (INS)
CA2771172C (en) 2009-08-25 2021-11-30 Opko Curna, Llc Treatment of 'iq motif containing gtpase activating protein' (iqgap) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to iqgap
JP5887270B2 (ja) 2009-09-02 2016-03-16 ジェネンテック， インコーポレイテッド 突然変異体ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄおよびその使用方法
US20130079382A1 (en) 2009-10-12 2013-03-28 Larry J. Smith Methods and Compositions for Modulating Gene Expression Using Oligonucleotide Based Drugs Administered in vivo or in vitro
WO2011050194A1 (en) 2009-10-22 2011-04-28 Genentech, Inc. Methods and compositions for modulating hepsin activation of macrophage-stimulating protein
WO2011052804A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Tokyo University Of Science Educational Foundation Administrative Organization Method of delivering agent into target cell
US20120244169A1 (en) 2009-11-06 2012-09-27 Fibrogen, Inc. Treatment for Radiation-Induced Disorders
US9080933B2 (en) 2009-11-09 2015-07-14 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Stimuli-responsive polymer diagnostic assay comprising magnetic nanoparticles and capture conjugates
US20110117668A1 (en) * 2009-11-09 2011-05-19 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Self-powered smart diagnostic devices
JP6220126B2 (ja) * 2009-11-23 2017-10-25 セルリアン・ファーマ・インコーポレイテッド 治療的送達のためのシクロデキストリンに基づく重合体
MX2012006072A (es) 2009-11-30 2012-07-23 Genentech Inc Composiciones y metodos para el diagnostico y el tratamiento de tumores.
AU2010329847A1 (en) 2009-12-11 2012-07-26 Genecode As Methods of facilitating neural cell survival using GDNF family ligand (GFL) mimetics or RET signaling pathway activators
JP6025567B2 (ja) 2009-12-16 2016-11-16 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド 膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ｍｂｔｐｓ１）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｍｂｔｐｓ１関連性疾患の治療
WO2011079263A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Curna, Inc. Treatment of uncoupling protein 2 (ucp2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ucp2
US8940708B2 (en) 2009-12-23 2015-01-27 Curna, Inc. Treatment of hepatocyte growth factor (HGF) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to HGF
RU2611186C2 (ru) 2009-12-29 2017-02-21 Курна, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ОПУХОЛЕВЫМ БЕЛКОМ 63 (р63), ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К р63
RU2615450C2 (ru) 2009-12-29 2017-04-04 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с ядерным респираторным фактором 1(nrf1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к nrf1
US8946181B2 (en) 2010-01-04 2015-02-03 Curna, Inc. Treatment of interferon regulatory factor 8 (IRF8) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IRF8
WO2011085066A2 (en) 2010-01-06 2011-07-14 Curna, Inc. Treatment of pancreatic developmental gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a pancreatic developmental gene
CA2786535C (en) 2010-01-11 2019-03-26 Curna, Inc. Treatment of sex hormone binding globulin (shbg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to shbg
WO2011090971A2 (en) 2010-01-19 2011-07-28 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for male reproductive disorders
RU2611192C2 (ru) 2010-01-25 2017-02-21 Курна, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С РНКазой Н1, ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К РНКазе Н1
EP2539452B1 (en) 2010-02-22 2016-07-27 CuRNA, Inc. Treatment of pyrroline-5-carboxylate reductase 1 (pycr1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to pycr1
KR20130004579A (ko) 2010-02-23 2013-01-11 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법
SI2539451T1 (sl) 2010-02-24 2016-04-29 Arrowhead Research Corporation Sestavki za ciljano dostavo sirna
EP2556160A4 (en) 2010-04-09 2013-08-21 Curna Inc TREATMENT OF ILLNESSES ASSOCIATED WITH FIBROBLASTIC GROWTH FACTOR 21 (FGF21) BY INHIBITION OF THE NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT AGAINST FGF21
US8362207B2 (en) 2010-04-16 2013-01-29 Wake Forest University Health Sciences Multi-level specific targeting of cancer cells with IL-13
DK2563920T3 (en) 2010-04-29 2017-05-22 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulation of transthyretin expression
BR112012028010A2 (pt) 2010-05-03 2017-09-26 Genentech Inc anticorpo isolado, célula, ácido nucleíco isolado, método de identificação de um primeiro anticorpo que se liga a um epítopo antigênico tat425 ligado or um anticorpo, métodos de inibir o crescimento de uma célula, de tratamento terapêutico de determinação da presença de uma proteína de tat425 e de diagnóstico da presença de um tumor em um mamífero
RU2018110642A (ru) 2010-05-03 2019-02-27 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с сиртуином (sirt), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к сиртуину (sirt)
EP2569430B1 (en) 2010-05-12 2018-10-17 The Trustees of Columbia University in the City of New York Methods for producing enteroendocrine cells that make and secrete insulin
TWI531370B (zh) 2010-05-14 2016-05-01 可娜公司 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病
EP3299464B1 (en) 2010-05-26 2019-10-02 CuRNA, Inc. Treatment of atonal homolog 1 (atoh1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to atoh1
US9057067B2 (en) 2010-07-10 2015-06-16 Kinki University Method for transfecting nucleic acid to cell and nucleic acid complex
NO2593547T3 (sk) 2010-07-14 2018-04-14
DK2625197T3 (en) 2010-10-05 2016-10-03 Genentech Inc Smoothened MUTANT AND METHODS OF USING THE SAME
CA2813901C (en) 2010-10-06 2019-11-12 Curna, Inc. Treatment of sialidase 4 (neu4) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to neu4
US9222088B2 (en) 2010-10-22 2015-12-29 Curna, Inc. Treatment of alpha-L-iduronidase (IDUA) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IDUA
DK2633052T3 (en) 2010-10-27 2018-07-16 Curna Inc TREATMENT OF INTERFERON-RELATED DEVELOPMENT REGULATOR 1 (IFRD1) -RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENCE TRANSCRIPT TO IFRD1
WO2012061811A2 (en) 2010-11-05 2012-05-10 Fibrogen, Inc. Treatment method for lung remodeling diseases
WO2012065067A2 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Georgetown University Immortalization of epithelial cells and methods of use
CN103459599B (zh) 2010-11-23 2017-06-16 库尔纳公司 通过抑制nanog的天然反义转录物而治疗nanog相关疾病
WO2012092341A1 (en) 2010-12-28 2012-07-05 University Of Rochester Methods of modifying insulin signaling using biliverdin reductase (bvr) and bvr derived peptides
SI2670411T1 (sl) 2011-02-02 2019-06-28 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Protismiselne spojine, ki so usmerjene na rastni faktor veznega tkiva (CTGF), za uporabo v postopku zdravljenja keloidov ali hipertrofnih brazgotin
WO2012109495A1 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Metabolic Solutions Development Company, Llc Cellular targets of thiazolidinediones
WO2012124688A1 (ja) 2011-03-14 2012-09-20 国立大学法人北海道大学 肺送達のためのベクター、導入剤及び使用
US8658783B2 (en) 2011-04-13 2014-02-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
RU2620980C2 (ru) 2011-06-09 2017-05-30 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с фратаксином (fxn), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта fxn
AU2012271357A1 (en) 2011-06-16 2013-05-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of fibroblast growth factor receptor 4 expression
EP2753346B1 (en) 2011-09-07 2020-04-22 Mount Sinai School Of Medicine Ceramidase and cell differentiation
AU2012312433B2 (en) 2011-09-20 2017-07-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of GCGR expression
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
EP2771463A4 (en) 2011-10-25 2015-09-09 Isis Pharmaceuticals Inc ANTISENSE MODULATION OF GCCR EXPRESSION
JP2015511494A (ja) 2012-03-15 2015-04-20 キュアナ，インク． 脳由来神経栄養因子（ｂｄｎｆ）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｂｄｎｆ関連の疾患の処置
US9950001B2 (en) 2012-08-20 2018-04-24 The Regents Of The University Of California Polynucleotides having bioreversible groups
EP2943194A1 (en) 2012-09-17 2015-11-18 Chemedest Ltd. Treatment of peripheral neuropathy using gfr(alpha)3 type receptor agonists
WO2014055493A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
US9694050B2 (en) 2012-10-21 2017-07-04 University Of Rochester THY1 (CD90) as a novel therapy to control adipose tissue accumulation
US10415024B2 (en) 2012-11-16 2019-09-17 Poseida Therapeutics, Inc. Site-specific enzymes and methods of use
US10052364B2 (en) 2013-03-15 2018-08-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for cognitive disorders
US9822418B2 (en) 2013-04-22 2017-11-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Mutations in PDGFRB and NOTCH3 as causes of autosomal dominant infantile myofibromatosis
WO2014197938A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Antisense Therapeutics Ltd Combination therapy
AU2014317961B2 (en) 2013-09-05 2020-07-30 Murdoch University Antisense-induced exon2 inclusion in acid alpha-glucosidase
EP3047023B1 (en) 2013-09-19 2019-09-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions and methods for inhibiting jc virus (jcv)
US9975942B2 (en) 2013-11-11 2018-05-22 Wake Forest University Health Services EPHA3 And multi-valent targeting of tumors
WO2015116902A1 (en) 2014-01-31 2015-08-06 Genentech, Inc. G-protein coupled receptors in hedgehog signaling
WO2015120075A2 (en) 2014-02-04 2015-08-13 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2015171918A2 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Compositions and uses for treatment thereof
KR102589295B1 (ko) 2014-05-14 2023-10-13 타르그이뮨 테라퓨틱스 아게 개선된 폴리에틸렌이민 폴리에틸렌글리콜 벡터
EP3145550B1 (en) * 2014-05-19 2019-03-27 BioNTech AG Particles comprising protamine and rna in combination with endosome destabilizing agents
US10487314B2 (en) 2014-06-26 2019-11-26 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Inhibition of serotonin expression in gut enteroendocrine cells results in conversion to insulin-positive cells
CN106572974B (zh) 2014-07-15 2021-04-23 生命技术公司 用于将分子有效递送到细胞的具有脂质聚集体的组合物和方法
WO2016033424A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Genzyme Corporation Methods for the prevention and treatment of major adverse cardiovascular events using compounds that modulate apolipoprotein b
EP3226889A4 (en) 2014-11-19 2018-11-21 The Trustees of Columbia University in the City of New York Osteocalcin as a treatment for frailty associated with aging
JP2018504380A (ja) 2014-12-18 2018-02-15 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｒｅｖｅｒｓｉｒ（商標）化合物
MA41795A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
EP3302497A4 (en) 2015-06-01 2019-01-16 Sarepta Therapeutics, Inc. EXCLUSION OF EXON INDUCED PAT TECHNOLOGY ANTISENSE IN COLLAGEN TYPE VII
DK3310909T3 (da) 2015-06-17 2021-09-13 Poseida Therapeutics Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til at føre proteiner til specifikke loci i genomet
US10954300B2 (en) 2015-09-28 2021-03-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Use of pentoxifylline with immune checkpoint-blockade therapies for the treatment of melanoma
EP3359668A4 (en) 2015-10-09 2019-06-05 Sarepta Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING DUCHENNE MUSCLE DYSTROPHY AND ASSOCIATED ILLNESSES THEREOF
US11273151B2 (en) 2015-11-04 2022-03-15 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods of treating tumors and cancer, and identifying candidate subjects for such treatment
EP3370734B1 (en) 2015-11-05 2023-01-04 Children's Hospital Los Angeles Antisense oligo for use in treating acute myeloid leukemia
EP3411396A1 (en) 2016-02-04 2018-12-12 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
EP3445405A4 (en) 2016-04-18 2019-12-18 Sarepta Therapeutics, Inc. ANTISENSE OLIGOMERS AND METHOD FOR USE THEREOF TO TREAT DISEASES RELATING TO THE ACID ALPHA GLUCOSIDASE GENE
WO2017189730A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Treatment of hippo pathway mutant tumors and methods of identifying subjects as candidates for treatment
JP2019532027A (ja) 2016-08-17 2019-11-07 ソルスティス バイオロジクス，リミティッド ポリヌクレオチド構築物
US10994025B2 (en) 2017-05-12 2021-05-04 Massachusetts Institute Of Technology Argonaute protein-double stranded RNA complexes and uses related thereto
WO2019006455A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Solstice Biologics, Ltd. AUXILIARIES OF CHIRAL PHOSPHORAMIDITIS AND METHODS OF USE THEREOF
US11555189B2 (en) 2017-10-18 2023-01-17 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense oligomer compounds
WO2019126578A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
AU2019247490A1 (en) 2018-04-06 2020-10-22 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for somatic cell reprogramming and modulating imprinting
JP2024516168A (ja) 2021-04-22 2024-04-12 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド がんを治療するための組成物および方法

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IN165717B (sk) * 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US5166320A (en) * 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
US5428132A (en) * 1987-10-11 1995-06-27 United States Of America Conjugate and method for integration of foreign DNA into cells
US5192553A (en) * 1987-11-12 1993-03-09 Biocyte Corporation Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use
US5149782A (en) * 1988-08-19 1992-09-22 Tanox Biosystems, Inc. Molecular conjugates containing cell membrane-blending agents
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5108921A (en) * 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5240846A (en) * 1989-08-22 1993-08-31 The Regents Of The University Of Michigan Gene therapy vector for cystic fibrosis
JPH03127622A (ja) * 1989-10-09 1991-05-30 Green Cross Corp:The ｐＨ感受性リポソーム
ES2078521T3 (es) * 1990-05-18 1995-12-16 Boehringer Ingelheim Int Nuevos conjugados de proteina-polication.
AU660629B2 (en) * 1990-10-01 1995-07-06 University Of Connecticut, The Targeting viruses and cells for selective internalization by cells
WO1992019749A1 (en) * 1991-05-03 1992-11-12 The Board Of Regents Acting For And On Behalf Of The University Of Michigan Targeted delivery of genes encoding cell surface receptors
JPH06510524A (ja) * 1991-05-14 1994-11-24 ユニバーシティ オブ コネチカット 免疫原性タンパク質をコードする遺伝子の標的への配達
DE69231385T2 (de) * 1991-06-05 2001-04-12 Univ Connecticut Storrs Zielgerichtete freisetzung von genen, die sekretorische proteine kodieren
EP0666923A1 (en) * 1991-09-05 1995-08-16 The University Of Connecticut Targeted delivery of poly- or oligonucleotides to cells
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5521291A (en) * 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
US5981273A (en) 1991-09-30 1999-11-09 Boehringer Ingelheim Int'l. Gmbh Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
US5225182A (en) * 1991-10-31 1993-07-06 Sharma Yash P Vectored drug delivery system using a cephaloplastin linking agent and a methed of using the system
US5922859A (en) 1992-02-01 1999-07-13 Boehringer Ingelheim International Gmbh Complexes containing nucleic acid which can be taken-up by endocytosis into higher eukaryotic cells
US5583020A (en) * 1992-11-24 1996-12-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides
WO1994017832A1 (en) 1993-02-09 1994-08-18 The Scripps Research Institute Targeting and delivery of genes and antiviral agents into cells by the adenovirus penton
DE4311651A1 (de) 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
DE4335025A1 (de) 1993-10-14 1995-04-20 Boehringer Ingelheim Int Endosomolytisch wirksame Partikel
US5928944A (en) 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection

Also Published As

Publication number Publication date
HU211925A9 (en) 1996-01-29
IL103171A (en) 2003-04-10
ES2173083T3 (es) 2002-10-16
MX9205543A (es) 1993-05-01
EE03195B1 (sk) 1999-06-15
CZ293141B6 (cs) 2004-02-18
FI941474A (fi) 1994-03-30
BR9206559A (pt) 1994-11-08
NO316744B1 (no) 2004-04-26
HU9400898D0 (en) 1994-06-28
PL180304B1 (pl) 2001-01-31
NO941154L (no) 1994-03-29
HK1013104A1 (en) 1999-08-13
CZ74694A3 (en) 1995-05-17
ATE215990T1 (de) 2002-04-15
HU218846B (hu) 2000-12-28
CN1059705C (zh) 2000-12-20
NO941154D0 (no) 1994-03-29
SG44680A1 (en) 1997-12-19
US5547932A (en) 1996-08-20
AU671084B2 (en) 1996-08-15
HUT71312A (en) 1995-11-28
US6274322B1 (en) 2001-08-14
BG62740B1 (bg) 2000-06-30
US6022735A (en) 2000-02-08
CA2118816A1 (en) 1993-03-31
SK36894A3 (en) 1994-08-10
NZ244306A (en) 1995-07-26
DK0607206T3 (da) 2002-08-05
IL103171A0 (en) 1993-02-21
RO117861B1 (ro) 2002-08-30
WO1993007283A1 (de) 1993-04-15
BG98718A (bg) 1995-02-28
AU2652692A (en) 1993-05-03
CN1070946A (zh) 1993-04-14
US6077663A (en) 2000-06-20
SI9200236B (sl) 2002-10-31
CA2118816C (en) 2003-06-17
EP0607206A1 (de) 1994-07-27
DE59209951D1 (de) 2002-05-16
EP0545016A1 (de) 1993-06-09
FI941474A0 (fi) 1994-03-30
JPH10506001A (ja) 1998-06-16
PT607206E (pt) 2002-07-31
EP0607206B1 (de) 2002-04-10
SI9200236A (en) 1993-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK281682B6 (sk) Kompozícia na transfekciu buniek, komplex ako súčasť kompozície, konjugát ako súčasť komplexu, endozomolytický peptid, spôsob tvorby konjugátu, spôsob vnášania nukleových kyselín do buniek, farmaceutický prípravok s jeho obsahom a transfekčná súprava
US5981273A (en) Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
US5521291A (en) Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
JP3479298B2 (ja) 高等真核細胞に核酸を導入するための新規結合体
Guy et al. Delivery of DNA into mammalian cells by receptor-mediated endocytosis and gene therapy
JP3222461B2 (ja) 新規タンパク質―ポリカチオン結合体
JP2002514892A (ja) 遺伝子治療における合成ウイルス様粒子の使用
CA2222550A1 (en) Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
US5830852A (en) Compositions for insulin-receptor mediated nucleic acid delivery
KR100241685B1 (ko) 핵산 복합체를 고등 진핵세포내로 도입시키기 위한 조성물
WO2003078460A1 (fr) Peptides, compositions medicinales contenant ce peptide et compositions medicinales anticancereuses
RU2138553C1 (ru) Трансфекционная композиция для высших эукариотных клеток, комплекс нуклеиновой кислоты, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, конъюгат, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, эндосомолитический пептид, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции
EP1007549B1 (en) Compositions and methods for highly efficient transfection
HRP920602A2 (hr) Sastav za uvođenje kompleksa nukleinskih kiselina u više eukariotične stanice
US20030100496A1 (en) Compositions and methods for highly efficient transfection
Collins A non-viral vector system for efficient gene transfer via membrane integrins
Sarkar et al. Targeted delivery of genes
CA2241040A1 (en) Improved pharmaceutical compositions