CZ293141B6 - Prostředek pro transfekci vyšších eukaryotických buněk, jeho složky a způsob jejich výroby, způsob transfekce, sestava pro použití k transfekci a farmaceutický prostředek - Google Patents

Abstract

Prostředek pro transfekci vyšších eukaryotických buněk s obsahem komplexu nukleové kyseliny a látky s afinitou pro nukleovou kyselinu, popřípadě konjugovanou s internalizačním faktorem pro vyšší eukaryotické buňky, obsahuje endosomolytické činidlo, které a) je přítomno jako složka komplexu s nukleovou kyselinou, komplex je vytvořen přes vaznou oblast endosomolytického činidla pro nukleovou kyselinu nebo přes látku s afinitou pro nukleovou kyselinu, na níž je činidlo vázáno, komplex popřípadě ještě obsahuje internalizační faktor, rovněž tvořící komplex s nukleovou kyselinou přes látku s afinitou k nukleové kyselině, s níž je konjugován, nebo b) je endosomolytickým činidlem virus nebo složka viru se schopností proniknout do buňky, na níž má být transfekce uskutečněna, přičemž toto endosomolytické činidlo je přítomno vně komplexu, který obsahuje nukleovou kyselinu a látku s afinitou pro nukleovou kyselinu, popřípadě konjugovanou s internalizačním faktorem.ŕ

Description

Vynález se týká transfekce vyšších eukaryotických buněk uložením komplexů nukleových kyselin do těchto buněk, způsobu výroby prostředku pro transfekci těchto buněk, jakož i farmaceutických prostředků s obsahem nukleových kyselin.

Dosavadní stav techniky

Požadavky na účinný systém pro uložení nukleových kyselin do živých buněk vznikají především v oboru terapie genetických vad. K tomuto účelu je možno ukládat do buněk geny, jimiž je možno dosáhnout in vivo syntézy léčebných produktů genů, je například možno v případě genetického defektu nahradit chybějící gen. „Klasická“ léčebná metoda s použitím genu je založena na možnosti dosáhnout jednorázovým zákrokem dlouhotrvajícího vyléčení. Mimoto by však bylo zapotřebí nalézt také postupy, při nichž by se DNA s léčebným účinkem, nebo také mRNA podávala stejně jako jiná léčiva podle potřeby jednorázově nebo také opakovaně. Příkladem geneticky podmíněných onemocnění, u nichž by bylo možno genovou léčebnou metodu dosáhnout úspěchu mohou být hemofilie, beta-thalasemie a „závažná kombinovaná deficience imunologického systému“ (Severe Combined Immune Defíciency - SCID), jde o syndromu, který je vyvolán geneticky podmíněným nedostatkem enzymu adenosindeaminázy. Další možnosti použití této léčebné metody jsou při regulaci imunologických reakcí, kde je možno dosáhnout podáním určité funkční nukleové kyseliny, která je kódem pro bílkovinný antigen, který je vylučován nebo který není vylučován a představuje vlastně očkovací látku, dosáhnou humorální nebo nitrobuněčné imunity. Dalšími příklady genetických defektů, u nichž by bylo možno dosáhnout podáním nukleových kyselin, jejichž řetězec odpovídá chybějícímu genu, alespoň podstatného zlepšení mohou být svalová dystrofíe (dystrofinový gen), cystická fibrózy (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulátor gene), hypercholesterolemie (LDLreceptorový gen). Tento léčebný postup by měl být potenciálně úspěšný také v těch případech, kdy je zapotřebí syntetizovat hormony, růstové faktory nebo bílkoviny s cytotoxickým nebo imunomodulačním účinkem přímo v organismu.

Genová léčebná metoda by měla být úspěšná také v případě léčení zhoubných nádorů, kde by mohla představovat tak zvanou „protinádorovou vakcínu“. Aby bylo možno zvýšit imunogenitu nádorových buněk, jsou nádorové buňky pozměněny tak, aby buď způsobily jako silnější antigen, nebo aby vyměšovaly určité imunomodulační látky, například cytokiny, které pak vyvolají imunologickou odpověď. K dosažení těchto účinků se buňky podrobí transfekci pomocí DNA, která je kódem pro cytokin, například pro IL-2, IL-4, IFN-gama, TNF-alfa a podobně. Až dosud byl přenos genu v autologních nádorových buňkách prováděn převážně pomocí vektorů na bázi retrovirů.

Až dosud nejrozšířenější a nejprogresivnější technologie pro použití nukleových kyselin při genových léčebných metodách využívaly přenos genů do buněk retrovirového systému podle publikace Wilson a další, 1990, Kasid a další, 1990. Použití retrovirů je však problematické z toho důvodu, že jejich použití znamená alespoň do značné míry nebezpečí vzniku vedlejších účinků, například infekce virem rekombinací s endogenními viry nebo kontaminací pomocnými viry s možnou následnou mutací na patogenní formu, nebo může vzniknout nebezpečí vzniku nádorového bujení. Mimoto není stabilní transformace somatických buněk nemocného, tak jak je dosahována pomocí retrovirů, ve všech případech žádoucí vzhledem ktomu, že například při výskytu vedlejších účinků je velmi nesnadné tuto transformaci opět zrušit. Mimoto je při této formě léčebného zákroku obtížné dosáhnout dostatečně vysokého titru ktomu, aby došlo k infekci dostatečného počtu buněk.

-1 CZ 293141 B6

Nukleové kyseliny padají do léčebně účinné látky v úvahu mimoto také v případě potřeby inhibice určitých buněčných funkcí, například antimediátorovou RNA a DNA je možno použít jako účinný prostředek pro selektivní inhibici některých genových řetězců. Tento jejich účinek může uvolnit jejich použití jako léčebných látek k blokování exprese určitých genů (například deregulovaných onkogenů nebo virových genů) in vivo. Bylo již prokázáno, že krátké antimediátorové oligonukleotidy je možno uložit do buněk a v nich dosáhnout inhibičního účinku (Zamecnik a další, 1986) v případě, že je jejich nitrobuněčná koncentrace, například v důsledku omezení jejich příjmu buněčnou membránou vzhledem k silně negativnímu náboji nukleových kyselin příliš nízká.

Další možnost selektivní inhibice genů spočívá v použití ribozymů. Také zde vzniká požadavek dosáhnout jejich koncentrace v buňkách na co nejvyšší úrovni, přičemž omezujícím faktorem je i v tomto případě transport do buňky.

Použití genové terapie k dosažení nitrobuněčné imunity zahrnuje transdukci genů, které mají ochranný účinek proti virům (tzv. ochranných genů), například transdominantní mutaci genů, které jsou kódovými geny pro virové bílkoviny nebo mutací DNA, která je kódem pro tak zvanou „RNA decoys“.

Bylo by tedy zapotřebí mít k dispozici metody, jimiž by bylo možno dosáhnout exprese DNA v buňkách.

Byla již navržena celá řada řešení, která by mohla zlepšit transport nukleových kyselin do živých buněk vzhledem k tomu, že tento transport je při léčebném použití jedním z limitujících faktorů.

Pro transformaci buněk savců pomocí genů in vitro jsou známé různé postupy, použitelnosti těchto postupů in vivo je však značně omezena, nejčastěji používanými postupy jsou uloženy DNA do buňky pomocí liposomů, otevření pórů pomocí elektrického proudu, mikroinjekcí, fúze buněk, použití DEAD-dextranu nebo srážení fosforečnanem vápenatým.

V poslední době byly zkonstruovány rekombinantní virové vektory pro přenos genů, při němž slouží jako účinný mechanismus pro vstup do buňky mechanismu výchozích virů. Tato strategie byla použita při konstrukci rekombinantních vektorů na bázi retrovirů a adenovirů tak, aby bylo možno dosáhnout vysoce účinného přenosu genu in vitro i in vivo (Beckner, 1988). Při vší účinnosti mají i tyto vektory svá omezení, převážně s ohledem na velikost a konstrukci přenášené DNA. Mimoto přenášejí tyto prostředky určitá rizika, pokud jde o bezpečnost postupu, protože může dojít k současnému přenosu životaschopných prvků virových genů z původního viru.

Aby bylo možno překonat uvedená omezení, byly vyvinuty další postupy pro přenos genu. Při těchto mechanismem se využívá vlastních existujících buněčných mechanismů pro přenos makromolekul. Příkladem tohoto postupu může být přestup genů do buňky tak zvanou endocytózou, zprostředkovanou přes receptory, která je velmi účinná (Wu a Wu, 1987, Wagner a další, 1990, a EP č. 388 758). Při těchto postupech se využívá bifunkčních molekulových konjugátů, které jsou tvořeny vazbou oblastí DNA a oblastí, specifickou pro určitý receptor na povrchu buňky (Wu a Wu, 1987, Wagner a další 1990). Jakmile dojde k rozpoznání rozpoznávací oblasti receptorem na povrchu buňky, je konjugát endocytózou, zprostředkovanou receptorem přenesen do vnitřního prostoru buňky a současně je do buňky přenesena také DNA, vázaná ve formě konjugátu. Pomocí této metody je možno dosáhnout známým postupem pouze ve výjimečných případech (Zenke a další 1990).

Je možno prokázat, že dochází k expresi DNA, přenesené pomocí tohoto systému do vnitřního prostoru buňky a že v případě použití nukleové kyseliny s inhibičním účinkem není tento inhibiční účinek působením systému, použitého pro transport nijak ovlivněn.

-2CZ 293141 B6

PCT-přihláška WO 91/17773 popisuje systém pro transport nukleových kyseliny se specifickým účinkem pro T-buňky. Tento systém využívá bílkovin na povrchu buňky z linie, která je odbočena od linie T-buněk, například CD4, zejména jde o bílkoviny, využívané jako receptor virem HIV. Nukleová kyselina, která má být transportována do buňky se zpracuje na komplex s protein-polykationtovým konjugátem, jehož bílkovinná část je bílkovina se schopností vázat se na povrchovou bílkovinu T-buňky, například CD4 a buňky, u nichž dochází k expresi této povrchové bílkoviny se uvedou do styku se získaným komplexem protein-polykation a nukleové kyseliny. Bylo možno prokázat, že dochází k expresi DNA, která byla pomocí tohoto systému přenesena do buňky.

Oba uvedené postupy mají ten společný znak, že využívají specifických buněčných funkcí k umožnění nebo k usnadnění transportu nukleové kyseliny do buňky.

V obou případech probíhají mechanismy příjmu za účasti faktorů, které bývají označovány jako „intemalizační faktory“. Pod tímto pojmem se rozumí takové faktory, které v širším nebo užším smyslu jsou schopné se vázat na povrch buňky, popřípadě za spoluúčasti dalších faktorů, například bílkovin, nacházejících se na povrchu buňky, a pak pronikat dovnitř buňky, tento pochod se označuje jako intemalizace. V případě obou svrchu uvedených vynálezů je intemalizačním faktorem transferin nebo bílkovina, která se váže na povrch T-buněk nebo na antigen tohoto povrchu, například protilátka anti-CD4. Intemalizační faktor je konjugován se sloučeninou polykationtového charakteru, která vzhledem ke své afinitě k nukleovým kyselinám vytváří spojení mezi intemalizačním faktorem a nukleovou kyselinou. Sloučeniny tohoto typu budou dále označovány jako látky s afinitou k nukleovým kyselinám nebo také v souvislosti s DMA jako vazné oblasti DNA. V případě, že taková látka vytváří spojení mezi nukleovou kyselinou a intemalizačním faktorem v konjugátu, může být označována také jako „spojovací faktor“.

Jak je uvedeno ve svrchu zmíněných patentových spisech, bylo již prokázáno, že optimálních podmínek pro příjem nukleové kyseliny do buňky je možno dosáhnout tak, že se poměr konjugátu a nukleové kyseliny volí tím způsobem, že komplex intemalizačního faktoru, polykationtové sloučeniny a nukleové kyseliny je elektroneutrální. Na základě tohoto pozorování bylo možno podstatně zlepšit metody, které byly až dosud využívány pro přenos nukleových kyselin do vyšších eukaryotických buněk pomocí tvorby komplexu intemalizačního faktoru, spojovacího faktoru a nukleové kyseliny.

V publikaci Wagner a další, 1991, se popisuje postup, který je možno zlepšit účinnost systému, pří jehož použití dochází k příjmu nukleových kyselin prostřednictvím intemalizačních faktorů. Množství nukleové kyseliny, která je přijímána do buňky se nesnižuje v případě, že se část konjugátu transferinu a polykationtové látky nahradí nekovalentně vázanou polykationtovou látku, v určitých je dokonce možno dosáhnout podstatného zvýšení příjmu DNA. Sledování molekulového stavu komplexu transferinu, polykationtové látky a plazmidové DNA, prováděné na optimálním poměru DNA a konjugátu ukázala, že plazmidová DNA se nachází v přítomnosti konjugátu ve formě toroidních struktur s průměrem přibližně 80 až 100 nm, to znamená ve velmi zhuštěném stavu.

Pokusy, provedené s bílkovinami, vázanými na T-buňky jako intemalizačními faktory poskytovaly podobné výsledky.

Po přidání volných látek s afinitou k nukleovým kyselinám je rovněž možno pozorovat zvýšení účinnosti systému pro průnik do buňky v případě, že se jako spojovací faktor užije další látka s afinitou k nukleovým kyselinám.

Komplexy, popsané v publikaci Wagner a další, 1991a, které jsou do vyšších eukaryotických buněk přijímány prostřednictvím intemalizačního faktoru endocytózou obsahují nukleové kyseliny, vytvářející komplex s konjugátem intemalizačního faktoru a spojovacího faktoru. Mimoto obsahují tyto komplexy jednu nebo větší počet sloučenin s afinitou k nukleovým kyselinám, tyto

-3CZ 293141 B6 sloučeniny mohou být popřípadě totožné se spojovacím faktorem a nacházejí se v nekovalentně vázané formě tak, že dochází ke zvýšení intemalizace a/nebo exprese nukleové kyseliny působením konjugátu, příčinou tohoto jevu je patrně především kondenzační účinek, může však jít také o jiný mechanismus.

I v případě, že by bylo možno tímto způsobem běžně zvyšovat expresi cizorodé nukleové kyseliny, má tento postup svá omezení. Použitelnost tohoto systému není určena výlučně přítomností relevantního receptorů pro tento systém na povrchu buňky. Omezení systému vzniká v důsledku toho, že se intemalizovaný komplex konjugátu a DNA z endozomů dostává do lyzozomů, kde 10 dochází k jeho enzymatické přestavbě. Aby bylo možno zvýšit podíl nukleové kyseliny, který se dostává až do buněčného jádra, kde může dojít kjeho expresi, byly prováděny pokusy uskutečnit transfekci buněk v přítomnosti sloučenin, které mohou způsobit inhibici enzymatické účinnosti v lyzozomech, jde o tak zvané lyzozomotropní látky. Pomocí tohoto opotřebení bylo dosaženo zvýšené exprese cizorodé DNA. Dosažené výsledky však byly v závislosti na použitých látkách 15 velmi rozdílné, některé lyzozomotropní sloučeniny totiž zesilují přenos genu, kdežto jiné látky z této skupiny dokonce mohou způsobit inhibici tohoto přenosu. Bylo například prokázáno, že ukládaní DNA závisí na přítomnosti slabé báze chlorochinu, jak bylo popsáno v publikacích Zenke a další, 1990, a Cotten a další, 1990. Tento účinek, jehož bylo dosaženo použitím chlorochinu zvyšuje pH v lyzozomech. Pomocí různých pokusů bylo prokázáno, že jiné látky, 20 které stejně jako chlorochin mají schopnost měnit hodnotu pH, například monensin, chlorid amonný nebo methylamin nebylo možno použít místo chlorochinu vzhledem k tomu, že různých pokusech měly některé z těchto látek dokonce inhibiční účinek. Mimoto bylo prokázáno, že různé cílové buňky reagovaly velmi různě na tutéž sloučeninu s lyzozomotropním účinkem.

Vzhledem ktomu, že přenos genu fyziologickou cestou, kterou představuje endocytóza, zprostředkovaná receptorem při použití komplexů nukleových kyselin poskytuje velké výhody, jako jsou například netoxický mechanismus průniku buněčnou membránou, možnost použití biologicky aktivních nukleových kyselin, jako genů, jejich úseků nebo nukleových kyselin, které mohou způsobit specifickou inhibici buněčných funkcí opakovaně nebo kontinuálně, možnost 30 cíleného působení na buňky a možnost získání konjugátu ve velkém množství, bylo by zapotřebí nalézt způsobem, jak zvýšit účinnost tohoto systému.

Vynález si klade za úkol zlepšit možnost ukládání cizorodých nukleových kyselin do vyšších eukaryotických buněk. Pod pojmem „ukládání“ nebo „přenos“ se v průběhu přihlášky rozumí 35 průnik komplexů s obsahem nukleových kyselin do buňky buněčnou membránou, a také lokalizace komplexů nebo z komplexu uvolněné nukleové kyseliny v buňce až do dosažení místa, vhodného pro expresi. Vyšší eukaryotické buňky jsou běžně užívané buňky, kvasinky nejsou do těchto buněk zahrnuty, jak je popsáno v publikaci Watson a další, 1987.

Velké množství virů je schopno uskutečnit průnik do eukaryotické buňky přes mechanismy, které v podstatě odpovídají endocytóze, zprostředkované receptory. Virová infekce na bázi tohoto mechanismu obecně začíná vazbou virových částic na receptory na buněčné membráně. Pak dochází k intemalizaci virů do buňky. Tento intemalizační postup je obecnou cestou pro vstup fyziologických vazných látek nebo makromolekul do buňky. Spočívá v tom, že se receptory na 45 buněčném povrchu nejprve řadí do skupin, pak se membrána prohne směrem dovnitř a vytvoří měchýřek, obalený pláštěm. Tento měchýřek se pak oddělí a putuje směrem dovnitř pomocí protonového čerpadla v membráně, přičemž dochází k okyselení. Toto okyselení vyvolá uvolnění viru z endozomů. V závislosti na tom, zda virus má lipidový obal nebo nemá, může dojít ke dvěma typům způsobu uvolnění viru z endozomů. V případě tak zvaných „nahých“ virů, jako 50 jsou adenovirus, poliovirus nebo rhinovirus, může snížení pH vyvolat změny ve složení virových bílkovin. Z tohoto důvodu se uvolní hydrofobní oblasti, které nejsou při fyziologických hodnotách pH dostupné. Tyto oblasti pak poskytují možnost výměny látek s membránou endozomů, čímž může dojít k uvolnění genomu viru z endozomů do cytoplazmy. V případě virů s lipidovým obalem, jako jsou viry vesikulámí stomatitidy, viru Semliki Forest nebo chřipkový virus nemůže 55 dojít při nízkém pH k modifikaci struktury virových bílkovin, avšak může docházet k propojení

-4CZ 293141 B6 virové membrány s membránu endozomu. Viry, které se dostávají do buňky tímto mechanismem, mají určité molekulové zvláštnosti, které jim udělují schopnost rozrušit membránu endozomu, aby se mohly dostat až do cytoplazmy.

Další viry, například virus Sendai, HIV a některé virové kmeny leukemie Moloney s obalem, avšak také některé viry bez obalů, například viry SV40 a viry polyomu nepotřebují pro vstup do buňky snížené pH, nýbrž mohou být spojeny na povrchu buněk s membránou, například virus Sendai a patrně také HIV, nebo také mohou obsahovat mechanismy, které umožní rozrušení membrány nebo průchod membránou. Bylo již prokázáno, že také viry, které nejsou závislé na pH, mohou využít endocytózu pro vstup do buňky, jak je uvedeno v publikaci McClure a další, 1990.

Při řešení uvedeného úkolu se vycházelo z toho, že by snad bylo možno využít mechanismus, sloužící u některých virů ke vstupu do eukaryotické buňky také ke zvýšení vstupu komplexů nukleových kyselin do buňky a tak tím dosáhnout zvýšení exprese této nukleové kyseliny.

Byly již prováděny pokusy dosáhnout intemalizace bílkovin do buňky společně sviry, jak je popsáno v publikaci Otero a Carrasco, 1987. Přitom bylo prokázáno, že prostupnost buněčné stěny pro virus je možno využít pro makromolekulu. Při těchto pochodech může jít o mechanismy, probíhající v kapalné fázi.

Při podrobnějším zkoumání epidermálního růstového faktoru EGF, konjugovaného stoxinem bylo prokázáno, že tato přírodní vazná látka, která je po vazbě na receptorů endocytózou přijímána do buňky společně s denovirem, který je rovněž přijímán do buňky endocytózou, zprostředkovanou s receptorem se obě látky nacházejí v tomtéž endozomu a odtud je růstový faktor také uvolněn společně s virem, jak bylo popsáno v publikaci FitzGerald a další, 1983.

Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že v přítomnosti některých materiálů, například virů, složek virů nebo jiných účinných látek, které vzhledem ke svému vstupnímu mechanismu do eukaryotických buněk mají vlastnosti, totožné s vlastnostmi určitých virů je možno dosáhnout podstatného zvýšení exprese nukleové kyseliny, která byla do buňky uložena jako součást komplexu. Toto zjištění je překvapující zvláště vtom případě, že komplex nukleové kyseliny, přijímaný buňkou je velmi veliký, k čemuž dochází ve většině případů.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří prostředek pro transfekci vyšších eukaryotických buněk s obsahem komplexu nukleové kyseliny a látky s afinitou pro nukleovou kyselinu, popřípadě konjugovanou s intemalizačním faktorem pro vyšší eukaryotické buňky, který obsahuje endozomolytické činidlo, které

a) je přítomno jako složka komplexu s nukleovou kyselinou, komplex je vytvořen přes vaznou oblast endozomolytického činidla pro nukleovou kyselinu nebo přes látku s afinitou pro nukleovou kyselinu, na níž je činidlo vázáno, komplex popřípadě ještě obsahuje intemalizační faktor, rovněž tvořící komplex s nukleovou kyselinou přes látku s afinitou k nukleové kyselině, s níž je konjugován, nebo

b) je endozomyiickým činidlem virus nebo složka viru se schopností proniknout do buňky, na níž má být transfekce uskutečněna, přičemž toto endozomolytické činidlo je přítomno vně komplexu, který obsahuje nukleovou kyselinu a látku s afinitou pro nukleovou kyselinu, popřípadě konjugovanou s intemalizačním faktorem.

Schopnost endozomolytického materiálu být přijímán do buněk, určených k transfekci a uvolnit obsah endozomů, v nichž se po vstupu do buňky nachází, do cytoplazmy, bude dále označován

-5CZ 293141 B6 jako „příjmová funkce“. Tato příjmová funkce je vytvořena schopností aktivně přes endocytózu, závislou na receptoru nebo pasivně ve formě kapalné fáze nebo jako součást komplexu nukleové kyseliny se internalizovat a schopností rozrušit endozomy, což se obecně označuje jako „endozomolytická účinnost“ nebo „endozomolýza“.

V jednom z provedení vynálezu je endozomolytickým materiálem virus. V dalším možném provedení je endozomolytickým materiálem složka viru. Virus, popřípadě složka viru, které je možno použít v tomto provedení vynálezu, budou dále označovány jako „volný virus“ nebo „volná složka viru“.

V rámci vynálezu byla sledována účinnost zvyšujících se dávek adenoviru na schopnost přenosu genu v konstantním množství konjugátu transferinu a polylysinu v Hela-buňkách, přičemž jako srovnávací gen byl použit gen pro luciferázu. Zesílení přenosu genu, jehož bylo možno dosáhnout adenovirem, bylo nejvyšší při použití 1 x 10⁴ virových částic na buňku, což je počet, který odpovídá bezpečnému počtu pro receptory adenoviru v HeLa-buňkách. Až 2000-násobné zesílení exprese luciferázy oproti expresi, jíž bylo možno dosáhnout pouze při použití konjugátu transferinu a polylysinu odpovídalo vyšší dávce viru. V další řadě pokusů byla sledována kapacita omezeného množství komplexu s obsahem konjugátu DNA v přítomnosti stálé dávky adenoviru. Bylo prokázáno, že příjem adenoviru do buňky zesiloval přenos genu, zprostředkovaný konjugátem transferinu a polylysinu v širokém rozmezí přiváděného množství DNA. Maximální zesílení exprese genu, jehož bylo možno dosáhnout komplexem s obsahem konjugátu DNA odpovídalo zesílení, dosažitelného se lOOx menším množství DNA v případě, že byly užity adenoviry k zesílení účinnosti transfekce.

Účinnost adenoviru na přenos genu byla sledována u DNA, nezabudované do komplexu a také u DNA, která byla uvedena do komplexu s polysinem nebo s konjugátem transferinu a polylysinu, jak je znázorněno na obr. 3A. Podle této analýzy zesiluje přítomnosti adenoviru v průběhu transfekce přenos DNA, která není uvedena do komplexu jen v malé míře. Na rozdíl od tohoto pozorování byl přenos DNA, uvedené do komplexu s polylysinem nebo s konjugátem transferinu a polylysinu působením adenoviru zesílen, přičemž tento účinek byl podstatně vyšší v případě použití konjugátů transferinu a polylysinu. Vzhledem k tomu, že polykationtová část konjugátu neslouží pouze ke spojení mezi DNA a transferinem, nýbrž způsobí také podstatné strukturní změny DNA, například zhuštění do toroidních struktur podle publikace Wagner a další, 1991a, nebylo možno nejprve na základě těchto pokusů pozorovat žádné rozdíly, pokud jde o pozorovaný účinek na zesílení transportu s polykationty kondenzované DNA ve formě kapalné fáze nebo na zvýšení transportu komplexu s obsahem konjugátu DNA, vázaného na receptoru působením viru. Aby bylo možno zjistit rozdíl mezi oběma těmito možnostmi, byly prováděny vazné pokusy, znázorněné na obr. 3. Vazba komplexu transferin-polylysin-DNA nebo polylysin-DNA při nižší teplotě bez intemalizace umožní přebytečný komplex před působením adenoviru odstranit do kapalné fáze, jak je popsáno v publikaci FitzGerald a další, 1983. V případě, že se postupuje tímto způsobem, je transport komplexu transferin-polylysin-DNA, váhaného na receptoru podstatně zvýšen přidáním částic adenoviru, což není možno prokázat v případě komplexu polylysin-DNA. To znamená, že je specificky zesílen právě vstup DNA do buňky endocytózou, zprostředkovaná přes receptory.

Dále bylo zkoumáno, že specifická funkce adenoviru může způsobit zesílení přenosu genu, zprostředkovaného receptorem, jak je znázorněno na obr. 3C. Mírné tepelné zpracování virových částic nemění nic na schopnosti těchto částic vázat se na buněčnou membránu cílových buněk, avšak může ovlivnit jejich schopnost rozrušit endozomy po vstupu do buněk, jak je popsáno v publikaci Defer a další, 1990. Na základě tohoto zjištění bylo možno sledovat odděleně různé účinky vazby viru a vstupu viru do buňky. Pokusy, provedenými v rámci vynálezu bylo prokázáno, že inaktivace teplem úplně zničí schopnost viru zesílit přenos genu endocytózou pomocí receptoru. Bylo tedy uzavřeno, že zesílení přenosu genu pomocí konjugátu transferinu a polylysinu je způsobeno specificky schopností adenoviru rozrušit endozomy po příjmu do buňky. Skutečnost, že kmen viru, neschopný replikace mohl rovněž způsobit zesílení exprese genu je

-6CZ 293141 B6 možno vysvětlit tak, že zesílení exprese genu je možno vysvětlit tak, že zesílení je způsobeno příjmovou funkcí a nikoliv replikací.

Aby bylo možno prokázat možnost, že zesílení exprese genu je způsobeno transaktivací ukládaného genu působením viru, byly prováděny pokusy s buněčnou linií, u níž konstitutivně dochází k expresi genu pro RSV-LTR-luciferázu. U této buněčné linie nemají adenoviry žádný účinek, kdežto u původní buněčné linie, do niž byl gen uložen prostřednictvím konjugátu transferinu a polylysinu, došlo k podstatnému zesílení exprese genu. Je tedy zřejmé, že adenovirus může ovlivnit ty pochody, které probíhají před transkripcí a že zesilující účinek je na úrovni vstupu genu do buňky a nikoliv na úrovni exprese genu, jak je znázorněno na obr. 5.

Dále bylo v rámci vynálezu zkoumáno také to, jaký účinek na přenos genu pomocí konjugátu transferinu a polylysinu mají adenoviry u některých buněčných linií. Bylo prokázáno, že přítomnost receptorů pro transferin na cílových buňkách je nutné, avšak ve všech případech není dostatečná k umožnění přenosu genu působením konjugátu transferinu a polylysinu. Faktory, specifické pro buňky, které souvisí s přenosem komplexu konjugátu a DNA při intemalizaci v endozomu hrají podstatnou úlohu pro míru přenosu genu, které je možno dosáhnout při tomto způsobu přenosu. Z tohoto hlediska byly zvolené buněčné linie sledovány jak na přenos genu působením konjugátu transferinu a polylysinu, tak na zesílení přenosu genu působením adenovirů, jak je znázorněno na obr. 4. Buňky buněčné linie cystické fibrózy CFTI vykazují jen mírnou expresi genu pro luciferázu v případě, že jsou zpracovány pouze komplexem transferinu, polylysinu a DNA. Rozsah této exprese bylo možno podstatně zvýšit působením adenoviru d 1312. Na rozdíl od tohoto pozorování bylo možno pozorovat u buněk KB po zpracování komplexem transferinu, polylysinu a DNA přes přítomnost receptorů pro transferin expresi genu pro luciferázu, která sotva převýšila základní úroveň. Po působení adenoviru dl312 bylo však i u těchto buněk možno prokázat určitou účinnost luciferázy. Podobným způsobem působily adenoviry na HeLa-buňky, přičemž u těchto buněk byl účinek ještě podstatně silnější. Vzhledem ktomu, že HeLa-buňky a KB-buňky mají přibližně stejný počet receptorů pro adenovirus, bylo možno rozdíl v síle účinku, to znamená zintenzivnění přenosu genu připsat počtu transferinových receptorů, které jsou charakteristické pro každý buněčný typ. Velký rozdíl ve srovnání s těmito výsledky je však možno pozorovat v případě buněčných linií WI-38 a MRC-5, o nichž je známo, že u nich infekce adenovirem postupuje pouze pomalu, podle Precious a Russell, 1985, takže při použití dl312 dochází jen k malému zesílení exprese genu, kterého bylo dosaženo působením komplexu konjugátu a DNA. Působením adenoviru bylo tedy možno zesílit přenos genu k přenosu genu dochází endocytózou přes receptory, tak jak tomu je v případě buněk CFTI, a také v těch případech, kdy přenos genu touto cestou probíhá neúčinně, tak jak tomu je u HeLa-buněk a KB-buněk. Skutečnost, že se míra zesílení u různých typů buněk podstatně mění, může mít svou příčinu v tom, že konečný účinek je funkcí počtu receptorů pro virus, například receptorů pro adenovirus u určitého typu buněk, avšak také funkcí počtu transferinových receptorů.

V případě použití volného viru je látkou s afinitou k nukleovým kyselinám s výhodou organická polykationtová sloučenina, která je s výhodou konjugována s intemalizačním faktorem. V průběhu zkoumání způsobu podle vynálezu bylo prokázáno, že za určitých okolností je možno DNA, vytvářející komplex pouze s látkou s afinitou k nukleovým kyselinám přenést do buňky v přítomnosti viru také bez intemalizačního faktoru. Dále bylo prokázáno, že u některých buněk může probíhat příjem komplexu, tvořeného nukleovou kyselinou a látkou s afinitou k nukleovým kyselinám v kapalné fázi v případě, že je koncentrace komplexu dostatečně vysoká. Z pokusů, které byly provedeny, je možno uzavřít, že podstatným prvkem pro tuto možnost je kompaktnost komplexu, která záleží na kondenzaci nukleové kyseliny působením látky s afinitou k nukleovým kyselinám. V případě, že látka s afinitou k nukleovým kyselinám má kromě schopnosti elektricky neutralizovat komplex a schopnosti zhustit nukleovou kyselinu na kompaktní strukturu ještě dostatečnou schopnost se vázat na povrch buněk a společně s virem vstupovat do buňky, není již zapotřebí zvyšovat příjem vazbou intemalizačního faktoru kovalentním způsobem na látku s afinitou k nukleovým kyselinám k usnadnění endocytózy přes receptory. Některé buňky mají poměrně vysokou afinitu k určitým látkám s afinitou k nukleovým kyselinám, takže konjugáty

-7CZ 293141 B6 nukleové kyseliny a vazného faktoru jsou do buněk přijímány, aniž by bylo zapotřebí přidávat ještě intemalizační faktor. K tomuto jevu dochází například u jaterních buněk, u nichž bylo v rámci vynálezu prokázáno, že přijímají komplex DNA- a polylysinu.

Ve výhodném provedení vynálezu je endozomolytickým prostředkem virus, vázaný na látku s afinitou k nukleovým kyselinám a mající schopnost vstupovat do buňky jako součást komplexu konjugátu a nukleové kyseliny a pak uvolnit do cytoplazmy obsah endozomů, v nichž je komplex po vstupu do buněk lokalizován.

V dalším výhodném provedení je endozomolytickým prostředkem složka viru, která je vázána na látku s afinitou k nukleovým kyselinám a která má schopnost vstupovat do buněk jako součást komplexu konjugátu a nukleové kyseliny a pak uvolnit do cytoplazmy obsah endozomů, v nichž se komplex nachází po průniku do buněk.

Viry nebo složky virů, vázané na vaznou oblast nukleové kyseliny budou dále vzhledem k typu vazby označovány jako virové konjugáty.

Virové konjugáty, které rovněž tvoří součást podstaty vynálezu, obsahují virus nebo složku viru jako integrální součást své funkční konstrukce a spojují výhody vektorového systému na bázi konjugátů s obsahem intemalizačního vektoru s výhodami, které přinášejí do systému viry.

Mimoto mají virové konjugáty podle tohoto provedení vynález tu výhodu, že obcházejí základní omezení, které je vlastní známým bifunkčním konjugátovým systémům pro přenos genu endocytózou přes receptory tak, že dávají k dispozici specifický mechanismus, který je může uvolnit ze systému inkluzí ve vnitřním prostoru buněk. Virové konjugáty podle vynálezu tedy znamenají základní koncepční rozdíl ve srovnání s rekombinantními virovými vektory, v nichž je transportovaná cizorodá DNA uložena na vnější straně virionu. Konjugáty podle vynálezu tedy dovolují vytvoření velkých genových konstrukcí, které mohou proniknout do buňky, přičemž z hlediska řetězce neznamenají žádné omezení.

Schopnost viru vytvářet součást uvedeného systému ve volné formě nebo ve formě složky virů je definována schopností viru být přijímán do buněk. Vhodné viry jsou tedy takové viry, které mají schopnost vnikat v průběhu transfekce do buněk spolu s komplexem nukleových kyselin endocytózou, zprostředkovanou přes receptor a pak způsobit uvolnění nukleové kyseliny z endozomů do cytoplazmy. Aniž by bylo nutno se vázat na tuto teorii, je uvedený mechanismus pro zavedení komplexu nukleové kyseliny do buněk velmi příznivý vzhledem k tomu, že nukleové kyseliny se při intemalizaci nacházejí v týchž endozomech jako viry a společně s těmito viry se dostávají do endozomů do cytoplazmy. V případě, že komplexy nukleové kyseliny obsahují virus ve vázané formě, je endozomolytická účinnost viru příznivá pro celý komplex, který se tak snadno dostane z endozomů do cytoplazmy. Přitom je možno se vyvarovat fúze mezi endozomy a lyzozomy a tím i enzymatického odbourávání, k němuž v těchto buněčných organelách obvykle dochází.

Příkladem virů a vyšších eukaryotických buněk, do nichž mohou tyto viry proniknout, mohou být viry a typy buněk, uvedené v publikaci Fields a Knipe, 1990. Vhodnost určité buněčné linie pro transformaci působením virů, které jsou do buněk zavedeny k usnadnění vstupu komplexu nukleové kyseliny do buněk závisí na přítomnosti a na počtu receptorů pro uvedený virus na povrchu cílových buněk. Pokud jde o receptory pro adenovirus na povrchu buněk, byly postupy ke stanovení jejich počtu u HeLa-buněk a KB-buněk uvedeny v publikacích Svenson, 1990 a Defer, 1990:

Z virů, které jsou vhodné pro využití v různých provedeních vynálezu a u nichž na počátku infekce příjem probíhá endocytózou přes receptory, je možno uvést viry bez lipidového obalu, jako jsou adenovirus, poliovirus, nebo rhinovirus, avšak také viry, u nichž je obal možno prokázat, jako jsou virus vesikulámí stomatitidy, virus semliki forest a virus chřipky, dále jsou vhodné také kmeny, závislé na pH, jako virus moloney. Ze zvláště výhodných virů je možno uvést

-8CZ 293141 B6 adenovirus, podskupinu C, typ 5, virus semliki forest, virus vesikulámí stomatitidy, polyovirus, rhinoviry a kmeny leukemického viru moloney.

Použití NRA-virů, které nemají žádnou reverzní transkriptázu, má při provádění vynálezu tu výhodu, že při transfekci v přítomnosti takového viru nedochází ke tvorbě virové DNA v buňkách. V rámci vynálezu bylo prokázáno, že rhinovirus HRV2 ze skupiny pikomavirů zvyšuje expresi reporterového genu. Tuto schopnost rhinoviru bylo možno prokázat při použití volné formy i při použití viru ve formě konjugátu.

V rámci vynálezu se pod pojmem viry za předpokladu, že jsou přijímány do buněk a jsou schopné uvolnit obsah endozomů, v nichž se nacházejí, rozumí kromě divokých typů také mutanty, které vzniknou na základě mutace funkcí divokého typu a jsou odlišné od divokého typu v různých funkcích s výjimkou příjmu do buněk, například se mohou lišit schopností replikace.

Uvedené mutanty mohou být vytvořeny mutacemi, zvláště vypuštěním části bílkoviny viru, která je zodpovědná za replikační funkce a nemá tedy vliv na příjem do buněk, mutanty je možno vytvořit běžnými postupy. V případě adenovirů je možno uvést například ts-mutanty, které jsou citlivé na teplotní změny, El A- a ElB-mutanty, dále mutanty s obsahem mutací v genech MLP podle publikace Berkner, 1988 a také mutanty, které obsahují mutace v oblasti určitých obalových bílkovin. Vhodné jsou dále virové kmeny, které obsahují odpovídající přírodní mutace. Schopnost replikace je možno určit například pomocí zkoušky s plaky, které je známa v literatuře. Při této zkoušce se buněčné kultury převrství suspenzí, obsahují různé koncentrace viru a pak se určí počet rozrušených buněk, jak je popsáno v publikaci Dulbecco, 1980.

Pro použití v rámci vynálezu jsou mimoto vhodné ještě tak zvané defektní viry, to znamená ty viry, jimž chybí v jednom nebo ve větším počtu genů funkce, která je nutná pro autonomní replikaci viru. Představitelem této skupiny mohou být Dl-částice („defektní interferující částice“), které jsou odvozeny od standardního infekčního viru, mají tutéž strukturu bílkovin jako standardní virus, obsahují mutace a pro jejich replikaci je nutný standardní virus jako pomocný virus, jak bylo popsáno v publikacích Huang, 1987 a Holland, 1990. Představiteli této skupiny jsou dále satelitní viry podle publikace Holland, 1990. Další skupinou jsou parvoviry, často označované jako viry, přidružené kadenovirům podle Bems, 1990. Vzhledem ktomu, že cyklus příjmu pro velké množství virů do buněk ještě není zcela objasněn, je možné, že existují ještě další viry, které mají endozomolytickou účinnost, požadovanou pro jejich použitelnost v rámci vynálezu.

Dále je v rámci vynálezu možno použít atenuované živé vakcíny podle Ginsberg, 1980 a další kmeny, které jsou užívány k očkování.

Mimoto spadají pod pojem virů v rámci vynálezu také inaktivované viry, které byly chemicky zpracovány, například působením formaldehydu, nebo které byly zpracovány působením ultrafialového záření nebo obojím způsobem, popřípadě kombinaci působení bromdesoxyuridinu a ultrafialového záření, působením gama-záření nebo ostřelováním pomocí neutronů.

Inaktivované vity, používané například také jako vakcíny je možno připravit standardními postupy, známými z literatury, jako Davis a Dulbecco, 1980 nebo Hearst a Thiry, 1977, tyto viry byly rovněž zkoušeny na použití pro zvýšení příjmu komplexu DNA do buněk. Při pokusech, prováděných v rámci vynálezu byly adenoviry inaktivovány působením ultrafialového světla z běžné sterilizační lampy nebo působením formaldehydu a bylo pozorováno, že ínaktivace viru má vyšší rozsah než pokles účinku na přenos genu, jehož bylo dosaženo po přidání adenovirů do prostředí k provádění transfekce. Také pokusy, které byly prováděny s biotinylovaným adenovirem, inaktivovaným ultrafialovým zářením a konjugovaným s polylysinem, vázaným na streptavidin prokázaly, že v důsledku ínaktivace byl pokles titru viru podstatně vyšší než pokles schopnosti příznivě ovlivnit přenos genu. Příčinou tohoto jevu je patrně skutečnost, že u aktivního viru byly

-9CZ 293141 B6 rozrušeny mechanismy pro normální mechanismus infekce, avšak nebyly rozrušeny mechanismy, jichž je zapotřebí pro dosažení účinku na přenos genu.

Pod pojmem „složka viru“ se rozumí část viru, například bílkovinná část, zbavená nukleových kyselin, například prázdný obal viru, který je možno zkonstruovat pomocí rekombinantních postupů podle publikací Ansardi a další, 1991 nebo Urakawa a další, 1989. Jinak může jít také o bílkoviny, získané při frakcionaci nebo o peptidy, které mají větší schopnost rozrušit endozomy než neporušený virus. Tyto složky viru je možno připravit také synteticky, v závislosti na jejich velikosti pomocí syntézy peptidů nebo rekombinantními postupy. V rámci vynálezu bylo možno prokázat, že bílkoviny adenoviru, konjugované s polylysinem přes biotin/straptavidin mohou zesílit přenos genu. Příkladem bílkovinných fragmentů jiných virů, které jsou podstatné pro internalizaci virů mohou být například hemagglutininy chřipkového viru (HA). N-terminální řetězec podjednotky HA2 chřipkového viru působí uvolnění viru z endozomu. Bylo prokázáno, že peptidy, tvořené 20 aminokyselinami tohoto řetězce jsou schopné rozrušit lipidovou membránu podle Wharton a další, 1988. V rámci vynálezu byly použity autentické i modifikované peptidy chřipkového viru s dobrým výsledkem. Dalším příkladem mohou být obalové bílkoviny retrovirů, například HIV gp41 podle Rafalski a další, 1990 a popřípadě je možno použít také části těchto virových bílkovin.

Použití virů se schopností pronikat do buňky představuje pouze jedno hledisko, na němž jsou založena různá provedení vynálezu.

Viry nebo složky virů, které samy o sobě nemají schopnost se vázat na buňku a do ní pronikat, se užívají s výhodu ve formě svrchu definovaného virového konjugátu. Vazba s vaznou oblastí DNA, například polykationtem může zajistit, že virus nebo virová složka má silnou afinitu k molekulám DNA, dochází ke tvorbě komplexu a také k transportu do buněk ve formě složek komplexů DNA, které obsahují také konjugát intemalizačního faktoru a vazné oblasti pro DNA. Kromě dosaženého účinku na přenos může být vazba viru nebo složky viru na vaznou oblasti pro nukleovou kyselinu za následek také zlepšení endozomolytických vlastností.

Volnou intemalizačních faktorů je možno dosáhnou transfekce prakticky každé eukaryotické buňky při použití prostředků podle vynálezu.

Jednoduchými pokusy je možno v rámci vynálezu zjistit, zdaje určitý virus nebo virová složka vhodná způsobit zlepšení přenosu genu. Aby bylo možno při takovém pokusu zjistit použitelnost viru ve volné formě, je možno uvést cílové buňky do styku s komplexem DNA v přítomnosti a v nepřítomnosti viru. Množství komplexu DNA, které se uvolní do cytoplazmy, je možno stanovit jednoduchým způsobem průkazem značícího genu a jeho produktu, například luciferázy.

V příkladě, že v přítomnosti viru dochází ve vyšší míře k příjmu komplexu DNA do buněk a do cytoplazmy než v nepřítomnosti viru, je zřejmé, že virus může zlepšit příjem do buněk. Je také možno zkoumaný viru srovnávat, pokud jde o jeho příjmovou funkci s virem, o němž je známo, že má v tomto smyslu příznivý vliv, například sadenovirem podskupiny C, typ 5. Zkoušku tohoto typuje možno použít také v případě virových konjugátů, přičemž je možno zkoumat ještě vliv dalších parametrů, například konjugátů různých intemalizačních faktorů v různém množství. Na základě výsledků těchto testů je pak možnost posoudit schopnost virů zlepšit transport genů. Odborník může doplnit výsledky těchto zkoušek ještě o další běžně užívané zkoušky, je například možno provést zkoušku na propustnost stěny lipozomů, aby bylo možno jednoduchým způsobem zjistit složky viru nebo jiné prostředky s potenciálním endozomolytickým účinkem a využít je ke zvýšení exprese genu.

V případě, že mají být použity neporušené viry, je účelné provádět současně s předběžnými pokusy na schopnost viru zesílit přenos genů ještě také pokusy na schopnost replikace viru. Vyšetření replikační schopnosti viru je možno v případě cytopatických virů nebo v případě virů, které ovlivní výrazným způsobem růst cílových buněk uskutečnit zkouškou na přítomnost plaků, tak jak byla svrchu popsána. U jiných virů se obvykle používají zkoušky, specifické pro

-10CZ 293141 B6 zkoumaný virus, například zkouška na srážení krve nebo chemicko-fyzikální postupy, využít je možno také elektronového mikroskopu.

V rámci vynálezu jsou při použití volných virů výhodné zejména takové viry, které je možno získat ve vysokém titru, jsou stálé, mají v divoké formě malou patologenitu a je u nich možno cíleně vyřadit replikační funkce, zvláště jde o adenoviry. V případě, že má dojít ktransfekci určité populace buněk, jsou dále výhodné takové viry, které za běžných podmínek specificky infikují tyto populace buněk. V případě, že má dojít k transfekci různých typů buněk, je možno použít takové viry, které jsou infekční pro celou řadu buněčných typů.

Základním požadavkem na preparáty s obsahem viru je zejména co nejvyšší čistota a také přítomnosti pufru, který má na použitý virus co nejvyšší stabilizační účinek.

V každém případě padají v úvahu pro léčebné použití podle vynálezu na živých organismech pouze takové viry nebo složky virů, u nichž prakticky nedochází k bezpečnostním rizikům, zejména pokud jde o replikaci viru v buňce a o rekombinaci DNA viru s DNA cílových buněk.

S výhodou je možno využít vstupního mechanismu virů, které jsou infekční pro jiné živočichy než pro člověka k zesílení příjmu DNA a jejího uvolnění ve vyšších eukaryotických buňkách, zejména v případě lidských buněk, pokud si virus uchovává schopnost rozrušit endozomy uvnitř buněk. Ze skupiny adenovirů může jít zejména o viry, které byly izolovány z ptáků, obojživelníků a různých jiných zvířat, jak bylo popsáno v publikacích Laver a další, 1971, Bragg a další, 1991, Akopian a další 1991, Takase a další, 1990, Khang a Nagaraji, 1989 a Reece a další, 1987. Viry, zejména adenoviry obojživelníků, ptáků, skotu, psů, myší, ovcí, vepřů a opic a také lidské adenoviry je možno získat z veřejné sbírky kultur Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland, seznam je uveden v katalogu Američan Type Culture Collection Catalogue of Animal Viruses and Antisera, Chlamydae and Rickettsiae, 6. vydání, 1990, C. Buck a G. Paulino Hsg., str. 1 až 17.

Možnou výhodou použití viru, například adenovirus vzdálené čeledi živočichů je například snížená toxicita viru pro cílové buňky, například v případě adenovirů slepic nebo žab není možno očekávat, že dojde u těchto virů k replikaci v buňkách savců nebo k expresi. Ve srovnání s lidskými adenoviry jde tedy o snížené riziko a je také nižší možnost dalších poruch, které by mohly vzniknout například při tvorbě protilátek proti adenovirů člověka nebo myši. Skutečnost, že se nevytvářejí protilátky, je zvláště důležitá v případě, že se předpokládá použití virů pro genovou terapii u člověka nebo u myši.

Adenovirus slepic CELO (Chick Embryo Lethal Orphan Virus) nemá žádnou reaktivitu vzhledem k protilátkám, které rozpoznávají epitopy hlavní skupiny adenovirů, které jsou infekční pro savce. Mimoto mohou být viry CELO pěstovány ve vejcích s vyvíjejícími se zárodky, takže je možno získat velké množství viru, 0,5 g/vejce podle publikace Laver a další, 1971. Jak vyplývá z příkladů, je možno pomocí konjugátů CELO-polylysin zesílit transport DNA do Hela-buněk v míře, která je srovnatelná s výsledky, dosaženými při použití lidského adenovirů dl312. Použití konjugátů viru CELO k zesílení transportu DNA se tedy zdá být velmi slibné v případě genové léčby u lidí.

Viry ze vzdálenějších čeledí se s výhodou užívají jako složky virových konjugátů ve složitějších komplexech, například v prostředcích podle vynálezu.

V případě konjugátů podle vynálezu, které obsahují virus, může být vazba viru na vaznou oblast pro nukleovou kyselinu kovalentní nebo nekovalentní, nekovalentní vazbou může být například vazba přes biotin-streptavidinový můstek nebo v případě, že virus obsahuje na své povrchové bílkovině kyselé oblasti a může se tedy vázat na polykationtovou látku, může jít o iontovou vazbu.

-11 CZ 293141 B6

Při pokusech v rámci vynálezu byly vytvořeny komplexy za podmínek, které dovolují iontovou výměnu mezi adenovirem a polylysinem za současné tvorby komplexu s DNA. Jako kontrolní pokusy byly prováděny pokusy za podmínek, při nichž byl nejprve polylysin neutralizován DNA, takže již nebyl ve formě, schopné se vázat na adenovirus. Při těchto pokusech byla jasně prokázána vyšší výhodnost komplexů s iontově vázaným adenovirem.

Příkladem virových složek s endozomolytickým účinkem pro použití v konjugátech podle vynálezu mohou být prázdné obaly viru nebo virové peptidy. Vazba virových složek na vaznou oblast pro nukleovou kyselinu může být kovalentní, může například jít o chemickou vazbu virového peptidu s polylysinem, nebo může jít o nekovalentní vazbu, například o iontovou vazbu v případě, že virová složka obsahuje zbytky kyselé povahy, které dovolují její vazbu na polykationtovou složku.

Poměr viru nebo složky viru a látky s afinitou pro nukleovou kyselinu se může měnit. V případě konjugátu hemaglutininového peptidu chřipkového viru s polylysinem bylo v rámci vynálezu prokázáno, že je možno podstatně zesílit přenos genu v případě, že se zvýší obsah virového peptidu v konjugátu.

Podstatu vynálezu tvoří také způsob výroby konjugátu podle vynálezu, který je tvořen virem nebo virovou složkou a látkou s afinitou pro nukleové kyseliny.

Konjugáty s obsahem viru nebo virové složky je stejně jako konjugáty intemalizačního faktoru a polykationtové sloučeniny možno v případě, že virovou složkou a polykationtem jsou polypeptidy, připravit rekombinantním způsobem, například, který byl popsán v EP 388 758.

Vzájemná vazba viru, virových peptidů nebo virových bílkovin s polyaminosloučeninami chemickou cestou může probíhat způsobem, který je běžný v chemii peptidů, přičemž v případě potřeby je možno jednotlivé složky před vlastní vaznou reakcí opatřit vaznými řetězci. Toto opatření je vhodné zvláště v těch případech, kdy nejsou k dispozici žádné funkční skupiny, které by byly vhodné pro vazbu, například merkaptoskupina nebo alkoholová skupina. V případě vazných látek jde o bifunkční sloučeniny, které se nejprve uvádějí do reakce s funkčními skupinami jedné ze složek, pak se provádí vazba modifikované druhé složky.

Vlastní vazba může být uskutečněna například některým z následujících způsobů:

a) Disulfidovými můstky, které je možno opět odštěpit za redukčních podmínek, například při použití sukcinimidylpyridyldithiopropionátu podle publikace Jung a další, 1981.

b) Pomocí sloučenin, které jsou stále za biologických podmínek například pomocí thioetherů reakcí s maleimidovými vaznými řetězci se sulfhydrylovými skupinami vazného řetězce, vázaného na druhou složku.

c) Pomocí můstků, které jsou za biologických podmínek labilní, například vytvoří esterových vazeb nebo acetalových vazeb, které jsou nestálé ve slabě kyselém prostředí.

Při pokusech, které byly prováděny v rámci vynálezu, byly vzájemně navázány hemaglutininové HA2-peptidy chřipkového viru s endozomolytickým účinkem s polylysinem chemickou cestou při použití sukcinimidylpyridyldithiopropionátu SPDP. Ukázalo se, že modifikace uvedeného peptidu působením polylysinu zvýšila endozomolytickou účinnost. Při pokusech s transfekcí bylo prokázáno, že účinnost přenosu genu při použití transferinu-polylysinu byla podstatně zvýšena v případě, že byl konjugát peptidu chřipkového viru a polylysinu v komplexu DNA společně s komplexem transferin-polylysin.

Dále byl v rámci vynálezu různým způsobem vázán adenovirus na polylysin.

-12CZ 293141 B6

Jeden typ vazby na polylysin byl uskutečněn podobným způsobem jako výroba konjugátů transferin-polylysin podle publikace Wagner a další, 1990 po modifikaci defektního adenoviru dl312 působením heterobifunkčního reakčního činidla. Nenavázaný polylysin byl odstraněn odstředěním. Schopnost vazby DNA pak byla prokázána ve vazném pokusu při použití radioaktivně značené DNA.

V buňkách K562 bylo možno v nepřítomnosti chlorochinu při použití komplexů, tvořených DNA, konjugátem adenovirus polylysin a transferiin-polylysin dosáhnout podstatně vyššího přenosu genu než v případě, že byl použit nemodifikovaný adenovirus, který nebyl vázán na DNA. Dále bylo prokázáno, že v HeLa-buňkách bylo možno dosáhnout při použití adenoviru, modifikovaného polylysinem vysoké exprese genu při použití pouze 0,0003 mikrogramů DNA na 5x10’ HeLa-buněk.

V případě, že virus nebo virová složka obsahuje vhodné řetězce uhlohydrátů, je možno je vázat na látku s afinitou k nukleovým kyselinám přes jeden nebo přes větší počet uhlovodíkových řetězců glykoproteinu.

Vhodným způsobem pro výrobu konjugátů glykoproteinu a polykationtové sloučeniny je způsob, který je popsán ve zveřejněné SRN patentové přihlášce č. P 41 15 038.4 (Wagner a další, 1991b).

Dalším výhodným způsobem pro výrobu konjugátů podle vynálezu je enzymatická vazba viru nebo virové složky na sloučeninu s afinitou k nukleovým kyselinám, zejména na polyamin působením transglutaminázy.

Skupina enzymů transglutamináz zahrnuje celou řadu různých enzymů, které se mimo jiné vyskytují v kůži jako epidermální transglutamináza, v krvi, jako faktor XIII a v buňkách různých tkání, jako tkáňové transglutaminázy podle Folk, 1985. Transglutaminázy katalyzují v přítomnosti vápenatých iontů za současného odštěpení amoniaku tvorbu eta-(gama-glutamyl)lysinových vazeb. Důležité je, že musí být na bílkovinách k dispozici odpovídají glutamin a lysin, aby mohlo dojít k enzymatické reakci. Kromě eta-aminoskupiny lysinu mohou jako substrát sloužit také (poly)aminy, například ethanolamin, putrescin, spermin nebo spermidin podle Clarke a další, 1959. Není dosud zcela zřejmé, na jakých faktorech závisí, zda enzymatická reakce zasáhne glutamin nebo lysin v určité bílkovině nebo v určitém polyaminu. Je však známo, že působením transglutaminázy může být vázána velká řada buněčných bílkovin, například cytokeratiny podle Zatloukal a další, 1989, tubulin, bílkoviny buněčné membrány a také povrchové bílkoviny chřipkových virů podle Iwanij, 1977.

V rámci vynález je možno prokázat, že se polylysin prostřednictvím transglutaminázy může vázat na adenoviry. Bylo zjištěno, že tuto vazbu je možno uskutečnit v přítomnosti glycerolu. Výhoda tohoto postupu spočívá v tom, že preparát viru, například preparát adenoviru, který jako stabilizátor obsahuje v pufru glycerol, může být přímo užit pro vazbu. Pomocí konjugátů adenoviru a póly lysinu, které bylo společně s konjugátem transferinu a póly lysinu uvedeny do komplexu s plazmidovou DNA bylo možno dosáhnout několikanásobně vyšší exprese genu ve srovnání s použitím konjugátu transferinu a polylysinu v přítomnosti adenoviru, který nebyl vázán na polylysin.

Další, podle vynálezu výhodný postup pro výrobu konjugátu podle vynálezu spočívá v tom, že se virus nebo složka viru váže na polykationtovou sloučeninu přes biotin-proteinový můstek, s výhodou přes biotin-streptavidinový můstek.

Známé silné spojení biotinu se streptavidinem nebo avidinem, popsané v publikaci Wilchek a další, 1988, bylo použito k vazbě adenoviru na polylysin tím způsobem, že adenovirus byl modifikován biotinem a streptavidin byl chemicky konjugován s polylysinem obdobným způsobem, jakého se užívá při přípravě konjugátů transferinu a polylysinu podle publikace Wagner a další 1990. Komplexy, které jsou tvořeny z DNA a streptavidin-polylysinu, jsou vázány na virus,

-13CZ 293141 B6 modifikovaný biotinem a popřípadě obsahují ještě nekovalentně vázaný polylysin, mají velmi vysokou účinnost transfekce i v případech, kdy je koncentrace DNA nízká. Zvláště účinné komplexy je možno vytvořit tak, že se virus, modifikovaný biotinem nejprve váže na konjugát streptavidinu a polylysinu a teprve v následujícím stupni je uskutečněna vazba na příslušnou DNA.

Odpovídající vazby na biotin je možno dosáhnout také při použití avidinu.

Dále je možné dosáhnout vazby mezi virem nebo složkou viru a polylysinem tím způsobem, že se na jedné straně virus biotinyluje a na druhé straně se uskuteční konjugace protilátek proti biotinu s polylysinem, načež se dosáhne vazby mezi virem a polylysinem přes vazbu biotinu s protilátkou proti biotinu, při tomto postupu je možno použít jako polyklonální, tak monoklonální protilátky proti biotinu.

Vazby mezi virem a polylysinem je možno dosáhnout také tak, že se polylysin naváže na lektin, který má afinitu ke glykoproteinu, nacházejícímu se na povrchu viru, přičemž vazba v takovém konjugátu je uskutečněna vazbou mezi lektinem a glykoproteinem. V případě, že virus sám o sobě nemá k dispozici žádné vhodné postranní řetězce na uhlohydrátech, je možno jej odpovídajících způsobem modifikovat.

Virus může být navázán také na sloučeninu s afinitou k nukleovým kyselinám takovým způsobem, že se nejprve viru na svém povrchu modifikuje pomocí antigenu, který je pro virus cizorodou látkou (například digoxideninem DIG, Boehringer Mannheim, nebo biotinem), načež se vytvoří spojení mezi modifikovaným virem a sloučeninou s afinitou k nukleovým kyselinám přes protilátku, která je schopna se vázat na uvedený antigen.

Rozhodnutí, která z uvedených metod bude užita k přípravě konjugátu podle vynálezu závisí na celé řadě různých hledisek. Například vazba přes biotin je nejméně specifická a z tohoto důvodu nejužívanější a nejpoužitelnější metoda, vazba přes biotin je velmi silná nekovalentní vazba. Enzymatická reakce s translugaminázou má tu výhodu, že je možno ji uskutečnit také ve velmi malém měřítku. Chemická vazba se obecně využívá v těch případech, kdy má být získáno větší množství konjugátu, tento postup je obecně také nejúčelnější v těch případech, kdy mají být vázány virové bílkoviny nebo virové peptidy. V případě použití inaktivovaného viru se inaktivace uskuteční obvykle před prováděním vazby, pokud není následující vazba nepříznivě ovlivněna inaktivací viru.

V případě, že virus, například adenovirus nebo jeho endozomolytická složka obsahuje přístupné vazné oblasti, například oblasti kyselé povahy, vhodné pro vazbu polykationtové sloučeniny, může být uskutečněna také iontová vazba viru nebo složky viru na polykationtovou sloučeninu.

V tomto případě dochází k tomu, že pozitivní náboje polykationtové sloučeniny, popřípadě konjugované s intemalizačním faktorem jsou částečně neutralizovány oblastmi kyselé povahy ve viru nebo ve složce viru a zbytek pozitivních nábojů je v podstatě neutralizován nukleovou kyselinou.

V případě, že se jako sloučenina s afinitou k nukleovým kyselinám užije sloučenina, která je pro vazbu s virem nebo se složkou viru modifikována navázáním vhodného nevážného řetězce nebo spojovníku, může být uskutečněna také například vazba transglutaminázy se sperminem nebo s bifunkční skupinou, vhodnou pro chemickou vazbu, například s aktivním esterem.

Poměr viru nebo složky viru a sloučeniny s afinitou k nukleovým kyselinám se může měnit v širokém rozmezí. Vhodný poměr je možno zjistit pokusně například tak, že se vytvoří konjugát stálého množství viru nebo složky viru s různým množstvím polylysinu a pak se volí konjugát, který je pro uskutečnění transfekce optimální.

V dalším možném provedení vynálezu je možno virovou složku, například endozomolytický virový peptid modifikovat tak, aby se mohl přímo vázat na DNA. K. tomuto účelu může peptid

-14CZ 293141 B6 sám obsahovat vaznou oblast pro DNA. Takový peptid je možno běžnou syntézou peptidu připravit tak, aby obsahoval úsek řetězců aminokyselin s pozitivním nábojem, k tomuto účelu je možno peptid prodloužit, s výhodu na C-zakončení.

Při dalším možné provedení vynálezu se jako endozomolytický prostředek užije peptid nevirového původu, může jít také o syntetický peptid. Peptid tohoto typuje s výhodou v prostředku podle vynálezu obsažen tak, že je vázán iontovou vazbou na sloučeninu s afinitou k nukleovým kyselinám, například na polylysin v případě komplexů DNA, intemalizačního faktoru a polylysinu. Tímto způsobem je možno uskutečnit zabudování endozomolytického peptidu do komplexu s obsahem kyseliny nukleové tak, že se peptid naváže přes své kyselé zbytky aminokyselin na vaznou oblast nukleové kyseliny s pozitivním nábojem, s výhodou na polylysin. V závislosti na chemické povaze peptidu, zvláště jeho koncových skupin může vazba na polylysin probíhat také způsobem, který již byl svrchu popsán pro vazbu peptidů na polylysin. K tomuto účelu je možno v případě, že se užívá přírodně se vyskytující peptid, modifikovat tento peptid vazbou vhodné terminální aminokyseliny jako prostředku k uskutečnění konjugace.

Další způsob, jak zabudovat endozomolytické peptidy nevirového původu do komplexu nukleových kyseliny spočívá v tom, že se tyto peptidy opatří řetězcem, který se může vázat na DNA. Může však jít o řetězec, který neporuší endozomolytickou účinnost peptidu. K tomuto účelu je například možno peptidy, jejichž účinnost je založena na struktuře N-zakončeni, prodlužit na C-zakončení řetězci, schopnými vazby na DNA. Prodloužení tohoto typu je možno uskutečnit pomocí homologních nebo heterologních kationtových oligopeptidů, například pomocí oligolysinového prodloužení nebo je možno použít přirozenou vaznou oblast pro DNA, například peptid, odvozený od histonu. Tato prodloužení s obsahem 10 až 40 aminokyselin s výhodou zahrnují integrální část endozomolytického peptidu, tvořícího vazný řetězec pro DNA. Toto provedení vynálezu nabízí také možnost dosáhnout vyššího poměru endozomolytického řetězce a vazného řetězce pro DNA než v případě konjugátu peptidů, které obsahují vyšší podíl polykationtové sloučeniny, takže je možno dosáhnout vyšší účinnosti celého komplexu.

Endozomolytické peptidy nevirového původu by měly splnit následujícího požadavky.

S ohledem na endozomolytickou účinnost by měla být propustnost lipidové membrány, jíž je možno dosáhnout pomocí uvedeného peptidu vyšší při nižším pH 5 až 6, než při pH 7. Dále by měly být rozrušené oblasti membrány dostatečně velké k tomu, aby umožnily průchod komplexů DNA větších rozměrů, malé póry nejsou pro dosažení tohoto cíle dostatečné. Aby bylo možno prokázat, zda určitý peptid splní tyto požadavky, je možno provést in vitro pokusy, při nichž jsou zkoumané peptidy užity ve volné nebo ve vázané formě a/nebo ve formě, zabudované do komplexu DNA. Pokusy tohoto typu mohou zahrnovat také testy na prostupnost lipozomů nebo červených krvinek a také pokusy s buněčnými kulturami, při nichž se sleduje vliv na zesílení exprese určitého genu. Testy tohoto typu budou popsány v následujících příkladech. Optimální množství určitého peptidu je možno stanovit titraci peptidu, při němž je možno stanovit účinnost výsledného přenosu genu. Při těchto pokusech je nutno brát ohled na skutečnost, že účinnost různých peptidů a tím i optimální složení výsledného komplexu může záviset také na typu použitých buněk.

Peptidy, které jsou schopné rozrušit membrány, obvykle obsahují amfipatické řetězce, zejména hydrofobní místa, která mohou vstoupit do výměny látek s lipidovou membránou, a také hydrofilní místa, která stabilizují vodnou fázi v místě, kde dochází k rozrušení membrány.

V přírodě je možno prokázat příklady peptidů, které jsou schopné rozrušovat membránu. Jde obvykle o malé peptidy nebo o určité peptidové oblasti větších peptidů. Takové peptidy je možno v závislosti na jejich funkci v přírodním prostředí klasifikovat, a to zejména na peptidy, které membránu rozrušují, jde například o peptidy virů bez obalového materiálu a/nebo na peptidy, u nichž dochází ke spojení s membránou, například jde o peptidy virů, opatřených obalem. Pro rozrušení endozomů při použití syntetických peptidů je možno využít obě svrchu uvedené

- 15CZ 293141 B6 skupiny peptidových řetězců. Většina přírodních peptidů může vytvářet amfipatické šroubové útvary typu alfa.

Zabudováním kyselých zbytků na hydrofilní místa amfipatického alfa-šroubového řetězce tak, aby bylo možno šroubovici vytvořit pouze při kyselých hodnotách pH, avšak nikoliv při neutrálním pH, při němž náboj brání vzniku šroubovice, je možno dosáhnout účinnosti, specifické pro určité hodnoty pH. Tuto vlastnost je možno prokázat také v případě přírodně se vyskytujících řetězců, například na N-zakončení peptidu chřipkového viru HA2.

Zcela synteticky připravený amfipatický peptid s vlastnostmi, specifickými pro určité pH, vhodný k rozrušením membrán byl popsán v publikacích Subbarao a další, 1987 a Parente a další, 1990. Pro tento peptid ve volné formě bylo prokázáno, že je schopen v membránách vytvořit pouze malé póry, které dovolují průchod pouze malým sloučenin podle Parente a další, 1990.

V rámci jednoho z možných provedení vynálezu je při použití nevirových, popřípadě syntetických peptidů možno postupovat následujícím způsobem. Ze skupiny přírodně se vyskytujících nebo synteticky připravených peptidů se zvolí amfipatický peptidový řetězec. Peptidy tohoto typu jsou v oboru dostatečně známé, přehled těchto peptidů je uveden v tabulce 2. V případě potřeby je možno zavést zbytky kyselé povahy, například zbytek glutaminu nebo asparaginu tak, aby bylo možno účinnost peptidu vázat na specifickou hodnotu pH (jak tomu je například v případě mutantu hemaglutininového peptidu chřipkového viru s označením P50, tak jak bude dále podrobněji popsán v příkladu 37). V případě potřeby je možno kyselé zbytky zavádět také z toho důvodu, aby byla usnadněna vazba peptidu na polylysin. Aby bylo možno zařadit oblast pro vazbu polykationtové sloučeniny, je také možno řetězec prodloužit kyselými zbytky na Czakončení, například pomocí řetězce oligo-Glu.

Endozomolytické peptidy, vhodné k provádění vynálezu je možno připravit také tak, že se spolu spojí přírodně se vyskytující a syntetické řetězce. Při provádění vynálezu budou popsány příklady, při nichž byla užito různých peptidů, odvozených od syntetického peptidu GALA, popsaného v publikaci Parente a další, 1990. Některé v následujících příkladech použité deriváty tohoto peptidu byly získány tak, že peptid GALA nebo modifikace tohoto peptidu byly kombinovány s řetězci peptidů chřipkového viru nebo s modifikacemi těchto řetězců, čímž byly získány například peptidy s označením EALA-Inf a EALA-P50 z příkladu 37.

Délka peptidového řetězce může být s ohledem na amfipatickou šroubovici kritická. Zvýšení stability krátkých oblastí, které jsou odvozeny od přírodních bílkovin a jimž chybí souvislost se stabilizační bílkovinou je možno dosáhnout prodloužením šroubovice.

Aby bylo možno dosáhnout vyšší endozomolytické účinnosti peptidu, je možno vytvářet homodimery, heterodimery nebo oligomery. V následujících příkladech bude prokázáno, že dimer P50 má daleko vyšší účinnost než odpovídající monomer.

Účinnost syntetických peptidů na příjem DNA bude prokázána při použití konjugátu transferinu a polylysinu. Byla syntetizována celá řada různých peptidů a byla stanovena jejich schopnost zvýšit prostupnost lipozomů a červených krvinek a také jejich účinnost na expresi luciferázy u buněk TIB 73aNIH3T3.

V dalším možném provedení vynálezu se jako endozomolytický prostředek užívá amfipatická sloučenina nepeptidové povahy. Požadavky, které musí splnit taková sloučenina, aby byla vhodná pro použití při provádění vynálezu jsou v podstatě stejné jako požadavky, kladené na amfipatické peptidy, zejména pokud jde o schopnost integrace do komplexu nukleových kyselin, o specifičnost při určité hodnotě pH a podobně.

-16CZ 293141 B6

Vynález se v dalším provedení týká také komplexů, které mohou být přijímány do vyšších eukaryotických buněk, přičemž obsahují nukleové kyseliny a konjugát, který má schopnost tvořit s nukleovou kyselinou komplex, vhodný k průniku nukleové kyseliny do vyšších eukaryotických buněk. Tyto komplexy obsahují konjugát, tvořený sloučeninou s afinitou k nukleovým kyselinám a endozomolytickým prostředkem, který je vázán na sloučeninu s afinitou k nukleovým kyselinám a má schopnost být přijímán do buněk jako součást komplexu konjugátu a nukleové kyselinu a uvolnit do cytoplazmy obsah endozomů, z nichž je uvedený komplex po vstupu do buňky lokalizován.

Komplexy nukleových kyselin, které se používají v rámci vynálezu, jsou s výhodou komplexy, v nichž vytváří nukleová kyselina se sloučeninou s afinitou k nukleovým kyselinám takový komplex, který je v podstatě elektricky neutrální.

Ve výhodném provedení podle vynálezu se jako endozomolytický prostředek užívá virus nebo určitá složka viru, která může být popřípadě vázána na polykationtovou sloučeninu kovalentním způsobem.

Do oboru vynálezu jsou zahrnuty také konjugáty s endozomolytickým účinkem kromě konjugátů, v nichž je endozomolytický prostředek iontově vázán na vaznou oblast DNA. Může jít o endozomolytické prostředky, které jsou schopné se přímo vázat na DNA, například prostřednictvím svého bazického prodloužení, i když „konjugáty“ tohoto typu nejsou ve skutečnosti tvořeny konjugací, to znamená vazbou dvou složek navzájem. Funkce endozomolytických prostředků tohoto typu jako složek prostředku podle vynálezu není závislá na tom, zda tyto látky byly získány konjugací endozomolytického prostředku a vazné oblasti DNA nebo na tom, zda vazná oblast DNA již byla na počátku k dispozici v endozomolytickém prostředku.

V dalším výhodném provedení vynálezu obsahují komplexy kromě endozomolytického konjugátu další konjugát, v němž je sloučenina s afinitou k nukleovým kyselinám, v případě endozomolytickém polykationtovém konjugátu obecně tatáž sloučenina jako v konjugátu, vázána na internalizační faktor, který má afinitu k cílové buňce. Toto provedení vynálezu se užívá především v tom případě, kdy cílová buňka nemá receptory nebo má jen malé množství receptorů pro virus, který je užit jako složka endozomolytického konjugátu. Toto provedení vynálezu je možno použít také v tom případě, že virová složka, například přírodně se vyskytující se popřípadě modifikovaný peptid je tvořen nevirovým, popřípadě syntetickým endozomolytickým peptidem nebo virem vzdáleného typu, který nemá sám o sobě schopnost pronikat do buněk, k jejichž transfekci má dojít. V případě přítomnosti dalšího konjugátu intemalizačního faktoru a spojovacího faktoru je účinnost endozomolytických konjugátů zvýšena působením intemalizační schopnosti druhého konjugátu, takže společně s ním vytváří komplex s nukleovou kyselinou a jako složky takto vzniklého komplexu, který se obvykle označuje jako „kombinační komplex“ nebo „temámí komplex“ v průběhu dalšího popisuje přijímána do cílových buněk. Aniž by bylo nutno se vázat na tuto teorii, jsou kombinační komplexy do cílových buněk přijímány buď vazbou na povrchový receptor, specifický pro intemalizační faktor nebo, v případě použití viru nebo složky viru vazbou na receptor pro virus nebo vazbou na oba uvedené receptoiy pomocí endocytózy, která je přes uvedené receptory zprostředkována. Při uvolnění endozomolytického prostředku z endozomů dochází také k uvolnění DNA, která jev komplexu obsažena, do cytoplazmy a dochází tedy k lyzozomálnímu odbourání.

Při pokusech, které byly v rámci vynálezu prováděny na HeLa-buňkách, bylo možno při použití volného adenoviru dosáhnout transfekce téměř všech buněk. Míra účinnosti pro jatemí buňky však mohla ještě být dále zvýšena v těch případech, kdy byly použity temámí komplexy DNA, v nichž byla reporterová DNA uvedena do komplexu s konjugátem polylysinu a transferinu a vázána na adenovirus. V tomto případě bylo dosaženo společné lokalizace endozomolytického viru a komplexu vazné látky a receptorů v endozomů, přičemž pro různé buňky, například BNL.CL2- a HepG2-buňky bylo dosaženo transfekce prakticky všech buněk. Taková situace je

- 17CZ 293141 B6 typická pro pokusy, v nichž komplexy temámího typu s obsahem transferinu jsou do buněk K.562 přijímány spíše přes receptory pro transferin než přes receptory pro adenovirus.

Je překvapující, že se temámí komplex DNA přenášejí i ve velmi malém množství. Při použití 30 pg DNA na 3 x 10⁵ buněk bylo získáno 1,8 x 10⁴ světelných jednotek, které jsou výsledkem exprese řetězce, který byl obsažen v plazmidu a byl kódovým řetězcem pro luciferázu. Při uvedeném použitém množství se do jedné buňky dostane pouze 60 molekul DNA a pouze jedna jednotka PFU viru (PFU je jednotka pro tvorbu plaku). Pro srovnání je možno uvést, že při daleko méně účinném postupu se srážením pomocí vápníku se užívá 2 x 10⁵ molekul DNA na jednu buňku podle publikace Sambrook a další, 1989. To znamená, že využití prostředků podle vynálezu znamená velmi podstatný pokrok vzhledem k tomu, že je možno dosáhnout účinné transformace vyšších eukaryotických buněk i při použití velmi malých množství DNA.

Přítomnost virů, složek virů nebo endozomolytických prostředků nevirového původu jako složek endozomolytických konjugátů v komplexech DNA poskytuje následující výhody:

1) Širší využitelnost techniky pro přenos genů při použití komplexů nukleových kyselin vzhledem ktomu, že endozomolytické prostředky představují samy o sobě, zejména v případě, že se užije virus nebo virová složka, intemalizační faktor nebo také mohou být uvedeny v kombinaci s dalším intemalizačním faktorem, například transferinem nebo asialofetuinem a podobně do komplexu s DNA. Tímto způsobem je možné využít pozitivní účinek viru také v případě těchto buněk, které pro použitý virus nemají žádný receptorů.

2) Zlepšení účinnosti přenosu genu vzhledem k tomu, že vazbou endozomolytického konjugátu na DNA dochází ke společnému příjmu těchto látek do buněk. Při koordinovaném příjmu a uvolnění virů a DNA existuje dále možnost snížení množství DNA a viru, jehož je zapotřebí pro účinný přenos genů, což má zásadní význam zejména pro případné použití těchto materiálů in vivo.

Z intemalizačních faktorů se v rámci vynálezu pod tímto pojmem rozumí vazné řetězce nebo různé fragmenty, které jsou po vazbě na buňku endocytózou, s výhodou endocytózou, zprostředkovanou přes receptory intemalizovány, nebo také faktory, jejichž vazba a intemalizace je uskutečněna přes fúzi s prvky buněčné membrány. Z vhodných intemalizačních faktorů je možno uvést například transferin podle Klausner a další, 1983, conalbumin podle Sennett a další, 1981, asialoglykoproteiny, například asialotransferin, asialorosomukoid nebo asialofetuin podle Ashwell a další, 1982, lektiny, podle Goldstein a další, 1980 a Shardon, 1987, popřípadě také látky, které obsahují galaktózu a které jsou intemalizovány přes receptor pro asialoglykoproteiny, jako mannosylované glykoproteiny podle Stáhl a další, 1987, lyzozomální enzymy podle Sly a další, 1982, LDL podle Goldstein a další, 1982, modifikovaný LDL podle Goldstein a další, 1979, lipoproteiny, které jsou do buněk přijímány přes receptory, jako apo B100/LDL, virové bílkoviny, jako bílkovina gpl20 viru HIV, protilátky podle Mellman a další, 1984, Kuhn a další, 1982, Abrahamson a další 1982, dále fragmenty těchto látek proti antigenúm na povrchu buněk, například anti-CD4 nebo anti-CD7, cytokiny, jako interleukin-1 podle Mizel a další, 1987, Interleukin-2 podle Smith a další, 1985, TNF podle Imamure a další, 1987, interferony podle Anderson a další, 1982, faktor, stimulující tvorbu kolonií, CSF podle Walder a další, 1987, další faktory a růstové faktory, například inzulín podle Marshall, 1985, růstový faktor epidermálních buněk EGF podle Carpenter, 1984, růstový faktor, odvozený od krevních destiček, PDGF podle Heldin a další 1982, transformační růstový faktor beta TGFbeta podle Massague a další, 1986, růstový faktor nervové tkáně podle Hosang a další, 1987, růstový faktor I, podobný inzulínu podle Schalch a další, 1986, LH, FSH podle Ascoli a další, 1978, růstový hormon podle Hizuka a další, 1981, prolaktin podle Posner a další, 1982, glukagon podle Asada-Kubota a další, 1983, hormony štítné žlázy podle Cheng a další, 1980, alfa-2-makroglobulin proteáza podle Kaplan a další, 1979, a také „odzbrojené“ toxiny. Dalšími příklady mohou být ímunoglobuliny nebo jejich fragmenty jako vazné řetězce pro Fc-receptor nebo protilátky proti imunoglobulinu, schopné vazby na povrchové Ímunoglobuliny SIg. Tyto vazné řetězce mohou být přírodního nebo

-18CZ 293141 B6 syntetického původu, jak bylo souhrnně popsáno v publikaci Trends Pharmacol Sci., 1989 a citované literární údaje.

Podstatné pro způsobilost intemalizačních faktorů pro použití v rámci vynálezu je zejména skutečnost, aby tyto intemalizační faktory

a) byly schopny intemalizace specifickým buněčným typem, který byl zvolen pro zavedení nukleové kyseliny, přičemž schopnost intemalizace by neměla být ovlivněna nebo by alespoň neměla být podstatně ovlivněna konjugací s vazným faktorem a

b) byly schopny v rámci uvedené vlastnosti „vzít s sebou“ do vnitřního prostoru buňky nukleové kyseliny, k jejichž expresi má dojít.

V rámci vynálezu a pokusů, které byly provedeny, byla prokázána široká použitelnost vynálezu, pokud jde o intemalizační faktory a popřípadě přídatné intemalizační faktory a kombinační komplexy těchto faktorů na bázi konjugátů transferinu a polylysinu člověka a myši, konjugátů transferinu a polylysinu člověka a myši, konjugátů asialofetuinu a polylysinu, konjugátů galaktózy a polylysinu, konjugátů aglutininu z pšeničných klíčků a pL, konjugátů gpl20, specifického pro buňku a pL a konjugátu antiCD7 a pL, a dále konjugátů LDL-pL, Ig-pL a anti-Ig a pL a také komplexů DNA a polylysinu,které neobsahují žádný intemalizační faktor. Dále byla na bázi komplexů DNA a konjugátů polylysinu a viru nebo virové složky bez obsahu dalšího konjugátu intemalizačního faktoru nebo spojovacího faktoru prokázána účinnost konjugátu s obsahem virů podle vynálezu.

V jednotlivých případech je možno pomocí předběžných pokusů stanovit, zda v případě použití volného viru jako endozomolytického prostředku je možno zvýšit na zlepšit při použití intemalizačního faktoru nebo viru, složky viru nebo peptidu nevirového původu jako části endozomolytického konjugátu nebo případného vazného faktoru příjem komplexu nukleové kyseliny do buňky. Tyto testy spočívají obvykle v tom, že se provádí paralelní transfekce s použitím komplexu nukleové kyseliny, který v jednom případě neobsahuje přídatný intemalizační faktor, například v případě virových konjugátů s komplexy, tvořenými nukleovou kyselinou a virovým konjugátem, a ve druhém případě při použití komplexu, v němž je nukleová kyselina spojena s dalším konjugátem, obsahujícím další intemalizační faktor, pro který mají cílové buňky receptor.

Při použití intemalizačního faktoru nebo přídatného intemalizačního fakturu, to znamená v případě, že se užije kombinační komplex, se tento komplex především definuje s ohledem na cílové buňky, to znamená na bázi povrchových antigenů nebo receptorů, které jsou pro určité typy buněk specifické a z tohoto důvodu umožňují cílové ukládání řetězců nukleových kyselin do těchto specifických typů buněk.

V rámci vynálezu jsou vhodnými látkami s afinitou k nukleovým kyselinám například homology organických polykationtových sloučenin, jako polylysin, polyarginin, polyomithin nebo heterologní polykationtové sloučeniny, obsahující dvě nebo větší počet různých aminokyselin skladným nábojem, přičemž tyto polykationtové sloučeniny mohou mít různou délku řetězce, dále může jít o syntetické polykationtové sloučeniny nepeptidové povahy, například polyethylenimin. Vhodnými sloučeninami s afinitou k nukleovým kyselinám jsou dále bílkoviny polykationtového charakteru, schopné se vázat na přírodní DNA, například histony nebo protaminy nebo jejich analogy nebo fragmenty a také spermin nebo spermidin.

Délka polykationtové sloučeniny není kritická, pokud jsou vhodné komplexy s ohledem na výhodné provedení v podstatě elektroneutrální. Výhodná délka polylysinového řetězce je přibližně v rozmezí 20 až 1000 monomerů lysinu. Při dané délce řetězce DNA však neexistuje žádná kritická délka řetězce kationtové sloučeniny. V případě, že je DNA tvořena 6000 bp a má 12 000 negativních nábojů, může být množství polykationtu, užité na 1 mol DNA být například:

-19CZ 293141 B6 mol polylysinu 200 nebo mol polylysinu 400 nebo

120 mol polylysinu 100 atd.

Každý odborník může při použití běžných jednoduchých pokusů správně volit také jiné kombinace délky řetězce polykationtové sloučeniny a molámího množství této látky.

Dalšími vhodnými sloučeninami s afinitou k nukleovým kyselinám, vhodnými také jako součást konjugátu jsou interkalační látky, jako dimery ethidiových sloučenin, akridin nebo interkalační peptidy, obsahující tryptofan a/nebo tyrosin a/nebo fenylalanin.

Pokud jde o kvalitativní složení komplexu nukleové kyseliny, je nutno nejprve určit nukleovou kyselinu, která má být do buněk uložena. Tato nukleová kyselina je definována především biologickým účinkem, jehož má být o uložení do buněk dosaženo, v případě použití v rámci genové léčby jde o gen, jehož exprese je nutno dosáhnout nebo také o úsek genu například při pokusu o náhradu defektního genu nebo může jít o cílový řetězec pro gen, k jehož inhibicí má dojít. V případě nukleových kyselin, které mají být do buněk transportovány, může jít o DNA nebo o RNA, přičemž neexistují žádná omezení, která by se týkala nukleotidových řetězců těchto kyselin.

V případě, že způsob podle vynálezu má být použit v případe nádorových buněk tak, aby bylo tímto způsobem možno získat vakcínu proti nádorovému bujení, je DNA, která má být do buněk uložena s výhodou kódovým řetězcem pro imunomodulační látku, například pro cytokin, jako IL-2, IL-4, IFN-gama, TFN-alfa. Zvláště použitelné mohou být také kombinace DNA, které jsou kódovými řetězci pro cytokiny, například pro IL-2 a IFN-gama. Dalším genem, využitelným v případě nádorových buněk je tzv. „gen odolnosti proti velkému počtu látek“. V rámci vynálezu byly s dobiým výsledkem použity konjugáty transferinu, polylysinu a lipoproteinu s nízkou hustotou společně s konjugáty adenoviru pro transfekci nádorových buněk, zejména buněk melanomu. V závislosti na specifickém použití může být pomocí předběžných pokusů zjištěno, jaká vazná látka je vhodná pro zvláštní případ určitých nádorových buněk.

Je také možno do buněk uložit dva nebo větší počet různých řetězců nukleových kyselin, například plazmid, který obsahuje cDNA, které jsou kódem pro dvě od sebe odlišné bílkoviny, přičemž uvedené řetězce nukleových kyselin se ukládají pod kontrolou příslušných řídicích řetězců, neboje také možno použít dvou různých plazmidů, z nichž každý obsahuje jinou cDNA.

K léčebně účinným inhibičním nukleovým kyselinám, které jsou do buněk ukládány za účelem inhibice specifických řetězců genů je možno přečíst genové konstrukce, při jejichž transkripci se vytvoří antimediátorová DNA nebo ribozymy. Dále je také možno ukládat do buněk oligonukleotidy, například antimediátorové oligonukleotidy. Antimediátorové oligonukleotidy s výhodou obsahují alespoň 15 nukleotidů. Popřípadě je možno vytvářet z těchto oligonukleotidů multimery. Ribozymy jsou do buněk ukládány svýhodou jako součást konstrukce genu, která obsahuje stabilizační prvky, například tRNA-prvky pro geny. Genové konstrukce tohoto typu byly popsány v evropském patentovém spisu č. 387 775. Inhibiční nukleové kyseliny a mechanismy jejich účinku jsou odborníkům známé. V tomto směru je možno odkázat na souhrnné publikace Heléne a Toulme, 1990 a Takayama a Inouye, 1990 a na citace, uvedené v těchto publikacích.

Kromě molekul nukleových kyselin, které mohou na základě své komplementarity způsobit inhibicí genů, například virových genů, je možno použít také geny s jiným inhibičním účinkem. Příkladem mohou být například geny, které jsou kódovými řetězci pro virové bílkoviny s transdominantními mutacemi, jak bylo popsáno například v Herskowitz, 1987. Při expresi takových genů po jejich uložení do buněk vznikají bílkoviny, které převládají nad odpovídajícími bílkovinami divokého typu a tímto způsobem mohou chránit buňky při dosažení buněčné imunity tak, že brání replikace odpovídajícího viru. Vhodné jsou transdominantní mutace těchto virových bílkovin, které jsou nezbytné pro replikaci a expresi, například mutanty Gag, Tat a Rev, na nichž

-20CZ 293141 B6 je možno prokázat, že při jejich použití dochází k inhibici replikace viru HIV podle Trono a další, 1989, Green a další, 1989 A Malim a další, 1989.

Dalším mechanismem k dosažení nitrobuněčné imunity je dosažení exprese takových molekul RNA, které obsahují vazné místo pro základní virovou bílkovinu, může například jít o tzv. „TAR Decoys“ podle Sullenger a další, 1990.

Příklady pro geny, použitelné v rámci somatické genové léčby, které je možno použít v rámci vynálezu jako složky genových konstrukcí pro uložení do cílových buněk, mohou být faktory VIII v případě hemofilie A podle Wood a další, 1984, faktor IX v případě hemofilie B podle Kurachi a další, 1982, adenosindeamináza (SCID) podle Valerio a další, 1984, alfa-l-antitrypsin v případě rozedmy plic podle Ciliberto a další 1985 nebo tzv. gen pro řízení transmembránového přechodu při cystické fibróze podle Riordan a další, 1980. Tyto případy byly uvedeny pouze pro ilustraci a použití vynálezu na tyto případy není omezeno.

Pokud jde o velikost nukleových kyselin, je možno jejich použití v širokém rozsahu. Pomocí způsobu podle vynálezu je možno do buněk uložit molekuly nukleových kyselin s velikostí řádu 0,15 kb, například v případě genu pro ribozym, který je uložen vtRNA-genu, až do velikosti přibližně 50 kb. Menší molekuly nukleových kyselin je možno použít jako oligonukleotidy.

Je nutno uvést, že právě na základě skutečnosti, že vynález není omezen v žádném směru, pokud jde o řetězec genu a že je pomocí vynálezu možno přenášet také genové konstrukce s velkými molekulami je možno vynález využít pro řadu různých použití.

Jakmile je určena nukleová kyselina, kjejímuž přenosu má dojít, je možno stanovit sloučeninu s afinitou k nukleovým kyselinám, s výhodou organickou sloučeninu polykationtové povahy, kterou bude možno uvést do komplexu s nukleovou kyselinou tak, aby získaný komplex byl s výhodou v podstatě neutrální. V případě, že komplexy obsahují kromě endozomolytického konjugátu také konjugát intemalizačního faktoru a sloučeniny s afinitou k nukleovým kyselinám, je nutno brát v úvahu kationtovou část obou konjugátů, pokud jde o příští elektroneutralitu.

Na základě dřívějších zjištění bylo prokázáno, že optimálních podmínek pro ukládání nukleových kyselin do buněk je možno dosáhnout v případě, že se poměr konjugátu k nukleové kyselině volí tak, že komplex intemalizačního faktoru, polykationtové sloučeniny a nukleové kyseliny je pokud možno elektroneutrální. Bylo prokázáno, že množství nukleové kyseliny, transportované do buňky se nesnižuje v případě, že se část konjugátu transferinu a polykationtové sloučeniny nahradí nekovalentně vázanou polykationtovou sloučeninou. V určitých případech je tímto způsobem dokonce možno dosáhnout podstatného zvýšení příjmu DNA, jak bylo popsáno v publikaci Wagner a další, 1991a. Přitom bylo pozorováno, že se DNA uvnitř komplexu nachází ve zhuštěné formě a vytváří toroidní struktury, které mají průměr 80 až 100 nm. Množství polykationtové sloučeniny je tedy nutno volit s ohledem na oba důležité parametry, a to elektroneutralitu a dosažení kompaktní struktury, přičemž množství polykationtové sloučeniny, které se volí na základě náboje nukleové kyseliny s cílem dosáhnout neutrality je obvykle vhodné také z hlediska požadovaného zhuštění struktury DNA.

V dalším možném provedení vynálezu mohou komplexy navíc obsahovat látky, schopné vázat nukleovou kyselinu, v nekovalentně vázané formě, přičemž tyto látky mohou být totožné s vazným faktorem, to znamená se sloučeninou s afinitou k nukleovým kyselinám v konjugátech, nebo mohou být od vazného faktoru odlišné. V případě, že endozomolytickým prostředkem je volný virus, zahrnují tyto komplexy nukleovou kyselinu a konjugát intemalizačního faktoru. V případě, že se užije endozomolytický, například virový konjugát, nachází se nukleová kyselina v komplexu s tímto konjugátem, popřípadě společně s konjugátem přídatného intemalizačního faktoru. Volba nekovalentně vázané, „volné“ sloučeniny s afinitou k nukleovým kyselinám je určována povahou a množstvím konjugátu, přičemž jde především o vazný faktor, obsažený v konjugátu. V případě, že je vazným faktorem například sloučenina, která má jen malou

-21 CZ 293141 B6 schopnost ke kondenzaci DNA nebo tuto schopnost vůbec nemá, je z hlediska účinné internalizace komplexu obecně účelné přidávat k takovému komplexu sloučeniny s afinitou kDNA, aby komplexy měly tuto vlastnost ve větší míře. V případě, že obsažený vazný faktor je sám sloučenina, schopná kondenzovat nukleovou kyselinu a může zajistit s ohledem na účinnou internalizaci dostatečné zhuštění nukleové kyseliny, užije se s výhodou sloučenina s afinitou k nukleovým kyselinám, která zvýší expresi jiným mechanismem.

Z nekovalentně vázaných sloučenin s afinitou k nukleovým kyselinám je možno v rámci vynálezu uvést sloučeniny se schopností kondenzovat nukleové kyseliny a/nebo tyto kyseliny chránit před nežádoucím odbouráním v buňce, zejména jde o svrchu uvedené sloučeniny polykationtové povahy. Další skupinou vhodných sloučenin jsou látky, které mohou vazbou na nukleové kyselin způsobit zlepšení transkripce/exprese tak, že zlepšují přístupnost nukleové kyseliny pro mechanismus exprese v buňce. Příkladem takové látky může být chromozomová bílkovina nehistonového typu, HMG1, o níž je známo, že je schopna zajistit zhuštění DNA a dosažení exprese této DNA uvnitř buněk.

Při stanovení molámího poměru endozomolytického prostředku a/nebo intemalizačního faktoru ke sloučenině s afinitou k nukleové kyselině a k nukleové kyselině nebo kyselinám je zapotřebí brát ohled na to, že je zapotřebí dosáhnout tvorby komplexu nukleové kyseliny, vytvořený komplex se musí vázat na buňky, musí být intemalizován do buněk a pak jako takový nebo pomocí endozomolytického prostředku musí být z endozomů uvolněn.

Zvolený poměr intemalizačního faktoru, vazného faktoru a nukleové kyseliny závisí především na velikosti molekuly polykationtové sloučeniny a také na počtu a rozdělení skupin s kladným nábojem, jde o kritéria, která jsou odvozena od velikosti a struktury nukleové kyseliny, která má být do buněk uložena. Molámí poměr intemalizačního faktoru a sloučeniny s afinitou k nukleové kyselině je s výhodu přibližně 10 : 1 až 1 : 10.

Podle konstrukce a syntézy konjugátu a podle stanovení optimálního poměru konjugátu a DNA pro účinnost transfekce je možno pomocí titrace stanovit podíl intemalizačního faktoru a konjugátu, který může být nahrazen volnou sloučeninou s afinitou k nukleovým kyselinám. V případě, že je polykationtová sloučenina použita také jako vazný faktoru a jako volná sloučenina s afinitou k nukleovým kyselinám, mohou být použité polykationtové sloučeniny stejné nebo různé.

Při těchto provedeních vynálezu, při nichž se užívají virové konjugáty, spočívá vhodný postup pro stanovení poměru složek, obsažených v komplexu vtom, že se nejprve definuje genová konstrukce, která má být uložena do buněk a, jak již bylo svrchu popsáno, vyhledá se virus nebo složka viru, které jsou vhodné pro specifický případ transfekce. Pak se virus nebo virová složka váže na polykationtovou sloučeninu a vytvoří se komplex s konstrukcí genu. Na základě definovaného množství virového konjugátu je možno provést titrace tak, že se na cílové buňky působí tímto (konstantním) množstvím konjugátu a klesajícími koncentracemi DNA nebo obráceně. Tímto způsobem se zjistí optimální poměr DNA a virového konjugátu. Při použití přídatného intemalizačního faktoru je například možno postupovat tak, že se vychází ze stálého množství DNA a titrací se zjistí optimální poměr mezi konjugátem viru a konjugátem intemalizačního faktoru.

Komplexy je možno připravit tak, že se smísí jednotlivé složky, a to i) nukleová kyselina, ii) virový konjugát, popřípadě iii) konjugát intemalizačního faktoru a vazného faktoru a popřípadě iv) nekovalentně vázaná sloučenina s afinitou k nukleové kyselině, ve formě zředěných roztoků. V případě použití polykationtových sloučenin jako vazného faktoru a současně jako „volných“ polykationtů je obecně účelné nejprve vytvořit směs konjugátů s volnými polykationty a pak tuto směs smísit s DNA. Optimální poměr DNA ke konjugátu nebo ke konjugátům a polykationtovým sloučeninám je možno stanovit titračními pokusy, to znamená v řadě pokusů o transfekci při použití stálého množství DNA a zvyšujícího se množství konjugátu nebo konjugátů a směsi polykationtových sloučenin. Optimální poměr konjugátu nebo konjugátů k polykationtovým

-22CZ 293141 B6 sloučeninám ve směsi je možno zjistit pomocí běžných pokusů, například ze srovnání optimálních poměrů směsí, použitých v titračních pokusech.

Tvorba komplexu DNA může probíhat při fyziologických koncentracích chloridu sodného. Další možnost spočívá v použití vysokých koncentrací, například 2M chloridu sodného s následnou úpravou na fyziologické podmínky pomalým ředěním nebo dialýzou.

V jednotlivých případech je možno nejvhodnější pořadí míšení jednotlivých složek, a to nukleové kyseliny, konjugátu nebo konjugátů a popřípadě nekovalentně vázané volné sloučeniny s afinitou k nukleovým kyselinám stanovit pomocí předběžných pokusů. Může být účelné nejprve uvést do komplexu nukleovou kyselinu s konjugátem a teprve potom přidávat volnou sloučeninu s afinitou k nukleovým kyselinám, například polykationtovou sloučeninu, například v případě konjugátů transferinu, dimeru ethidia a polylysinu.

Ve výhodném provedení vynálezu se užije jako (přídatného) intemalizačního faktoru transferinu, vazným faktorem je polykationtová sloučenina. Pod pojmem „transferin“ se rozumí přírodní transferiny a také taková modifikace transferinu, které jsou schopné se vázat na receptor a tímto způsobme být transportovány do buněk.

Příjem nukleové kyseliny probíhá ve formě komplexu, tento komplex je tvořen konjugátem internalizačního faktoru s polykationtovou sloučeninou a nukleovou kyselinou. V případě, že komplex obsahuje nekovalentně vázanou sloučeninu s afinitou k nukleové kyselině, jde s výhodou o polykationtovou sloučeninu, která může být stejná s polykationtovou sloučeninou, která je obsažena v konjugátu, nebo může být od této sloučeniny odlišná.

V případě kombinačních komplexů je nukleová kyselina intemalizována ve formě komplex, které jsou tvořeny konjugátem intemalizačního faktoru a na druhé straně endozomolytickým prostředkem a nukleovou kyselinou.

Konjugáty intemalizačního faktoru a polykationtové sloučeniny, které je možno použít společně s volným virem nebo s konjugáty virů v kombinačních komplexech mohou být vytvořeny chemickým způsobem nebo v případě, že polykationtovou sloučeninou je polypeptid, také rekombinantním způsobem, pokud jde o způsoby výroby, je možno odkázat na evropský patentový spis č. 388 758.

Konjugáty je možno vytvořit také tak, že se naváže glykoprotein, například transferin a vazný faktor přes jeden nebo větší počet uhlovodíkových řetězců glykoproteinu. Takové konjugáty jsou na rozdíl od známých vazných postupů a na rozdíl od konjugátů, získaných těmito postupy prosté modifikací, které mohou vznikat při použití specifických vazných sloučenin. Tyto konjugáty mají v případě glykoproteinů, které obsahují pouze jednu nebo malé množství uhlohydrátových skupin, vhodných pro vazbu, jako je například transferin, ještě tu výhodu, že je možno je přesně definovat vzhledem k místu vazby mezi glykoproteinem a vazným faktorem.

Množství použitého endozomolytického prostředku a jeho koncentrace se řídí především transfekcí. Je účelem použít co nejmenší množství viru a komplexu nukleové kyseliny a k uvolnění těchto látek z endozomů. Množství viru (konjugátu) je určováno použitým typem buněk, je zapotřebí brát ohled především na infekčnost viru pro použitý typ buněk. Dalším kritériem je použitý konjugát intemalizačního faktoru a vazného faktoru, zejména s ohledem na intemalizační faktor, pro který obsahuje cílová buňka definovaných počet receptorů. Mimoto se řídí množství viru (konjugátu) množstvím DNA, která má být do buněk uložena. Pro stabilní transfekci, pro niž je zapotřebí pouze malé množství DNA, je obecně dostatečné také malé množství viru, kdežto pro přechodnou transfekci, která vyžaduje použití většího množství DNA, je nutno použít také větší množství viru. Pro specifické použití je možno v předběžných pokusech stanovit v případě cílových buněk, určených k transfekci nebo pro smíšenou populaci buněk v případě zvoleného vektorového systému pro transfekci optimální koncentraci viru titrací,

-23CZ 293141 B6 přičemž se jako DNA účelně užívá konstrukce genu, která je v souladu svojí velikostí s velikostí molekul, určených pro konkrétní použití a pro jednoduchost měření je možno využít reporterového genu při sledování účinnosti přenosu genu. V rámci vynálezu bylo pro tyto pokusy jako reporterového genu využito genu pro luciferázu a genu pro beta-galaktosidázu.

Podstatu vynálezu tvoří také způsob uložení komplexu nukleových kyselin, sloučeniny, schopné se vázat na nukleovou kyselinu a popřípadě intemalizačního faktoru do vyšších eukaryotických buněk. Tento postup spočívá v tom, že se buňky uvedou do styku s prostředkem, který má schopnost být jako takový nebo jako součást komplexu nukleové kyseliny přijímán do buňky a pak uvolnit obsah endozomů, v nichž je komplex nukleové kyseliny uložen do vstupu do buněk, do cytoplazmy těchto buněk.

Obecně je možno uvést, že výhodné je současné použití endozomolytického prostředku a komplexu nukleové kyseliny, je však možno postupovat také odlišným způsobem, přičemž v případě, že obě součásti nejsou použity současně, není pořadí jejich použití kritické, pokud se obě látky přidávají krátce po sobě, aby bylo možno zajistit pokud možnou současně styk buňky s oběma složkami. V případě použití volného viru ve zvláštním prostředku je možno uskutečnit současné smísení virového preparátu s komplexem tak, že prostředek s obsahem viru tvoří část prostředí pro transfekci, které obsahuje také komplex nukleové kyseliny. V případě současného použití volného viru se komplex nukleové kyseliny a prostředek s obsahem viru obvykle před použitím mísí.

Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu se užije endozomolytický prostředek, který tvoří součást kombinačního komplexu.

Aby bylo možno dosáhnout silnější exprese genu, je možno prostředky podle vynálezu použít také opakovaně.

Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu se užívá jako cílových buněk primárních nádorových buněk. Ve zvláště výhodném provedení tohoto postupu se jako nukleová kyselina užije DNA, která obsahuje jeden nebo větší počet řetězců, které jsou kódovými řetězci pro imunomodulační sloučeninu, s výhodou pro cytokin.

V dalším výhodném provedení tohoto postupu se jako cílové buňky používají myoblasty, s výhodu primární myoblasty.

V dalším možném provedení vynálezu se jako cílové buňky používají fibroblasty, s výhodou primární fibroblasty.

V dalším možném provedení způsobu podle vynálezu se jako cílové buňky používají jatemí buňky, s výhodou primární hepatocyty.

V dalším možném provedení způsobu podle vynález se jako cílové buňky užijí primární buňky endotelu.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu se jako cílových buněk užije primárních buněk epitelu dýchacích cest.

V dalším možném provedení vynálezu se jako cílových buněk užije T-buněk.

V dalším možném provedení vynálezu se jako cílových buněk užije B-buněk.

V tabulce 1 jsou znázorněny výsledky transfekce, která byla provedena při použití způsobu podle vynálezu u buněk různých typů.

-24CZ 293141 B6

Prostředek podle vynálezu byl použit také v případě transfekce B-fibroblastů u psů s hemofilií.

V těchto případech bylo možno dosáhnout exprese jak v případě genu pro luciferázu, tak v případě genu pro beta-galaktosidázu. Mimoto bylo uvedeného systému použito k uložení cDNA pro faktor IX psa do těchto fibroblastů. Pomocí zkoušky ELISA bylo pak možno faktor IX prokázat 24 hodin po transfekci.

V určitých případech může být účelné použít kromě endozomolytického prostředku ještě také lyzozomotropní látku, například v případě, že je endozomolytických prostředkem konjugát peptidu nebo retrovirus, jehož endozomolytická účinnost není přesně vázána na pH.

Je známo, že lyzozomotropní sloučeniny jsou schopné způsobit inhibici účinnosti proteáz a nukleáz a tak způsobit také inhibici odbourávání nukleových kyselin podle Luthmanna a Magnusson, 1983. K těmto sloučeninám náleží například chlorochin, monensn, nigericin a methylamin. Bylo možno prokázat, že monensin je schopen způsobit zvýšení exprese reporterového genu v případě použití viru moloney. Bylo rovněž možno prokázat, že v přítomnosti chlorochinu dochází u prakticky 100 % buněk K562 k expresi reporterového genu, který byl do buněk uložen pomocí DNA a transferinu. Buňky BNL.CL2 nebo Hepatocyty HepG2 nereagují na chlorochin tak dobře jako buňky K562, bylo však u nich možno uskutečnit transfekci na 5 až 10% v případě, že byly využity endozomolytické vlastnosti přidaného adenoviru s defektem replikace nebo chemicky inaktivovaného adenoviru.

Při použití způsobu podle vynálezu a prostředku podle vynálezu je možno zesílit výhodné vlastnosti biologických vektorů. Na základě rozdělení receptorů může dojít ktropismu jak pro intemalizační faktor, tak také pro virus. V případě, že se obě tyto složky volí v závislosti na použité populaci buněk, je možno dosáhnout zvýšené selektivity, což je výhodné především při předpokládaném léčebném využití způsobu podle vynálezu a prostředku podle vynálezu. Tyto skutečnosti by mohly mít význam především při léčebném využití vynálezu v plicích vzhledem ktomu, že různé populace buněk v plicích nesou různé receptory, což může příznivě ovlivnit konstrukci vektorů s vysokou vaznou afinitou pro určité populace buněk,například pro ty buňky dýchacích cest, které jsou opatřeny řasinkami. Z pomocných látek pro uskutečnění vazby padají v úvahu například lektiny. Konstrukce takových konjugátu vyžaduje mimo jiné stanovení vazných vlastností sloučenin, které padají v úvahu jako pomocné vazné látky při tvorbě konjugátů. Toto stanovení může být provedeno například při použití protilátek proti vazným látkám pomocí imunohistochemických postupů s využitím barvicích metod ve tkáni, v níž se předpokládá léčebné využití.

Podstatu vynálezu tvoří také farmaceutické prostředky, které jako svou účinnou složku obsahují komplex léčebně účinné nukleové kyseliny, s výhodou ve formě části genové konstrukce, dále endozomolytický prostředek, popřípadě konjugovaný, a popřípadě konjugát intemalizačního faktoru. Je možno použít jakýkoliv inertní, z farmaceutického hlediska přijatelný nosič, například roztok chloridu sodného, roztok chloridu sodného s fosfátovým pufrem nebo jakýkoliv jiný nosič, v němž je komplex DNA požadovaným způsobem rozpustný tak, aby bylo možno jej v rámci vynálezu využít k léčebným účelům. Pokud jde o způsoby pro výrobu farmaceutických prostředků, je možno odkázat na publikaci Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980.

Vynález nabízí možnost využít způsoby a prostředky podle vynálezu pro nejrůznější účely, například ve formě farmaceutických prostředků. Prostředek podle vynálezu může mít lyofilizovanou formu, nebo je možno jej uchovávat ve vhodném pufru ve hluboce zmrazeném stavu. Prostředek podle vynálezu je možno také transportovat a skladovat jako reakční činidlo, připravené pro použití roztoku, s výhodou ve zchlazeném stavu. Složky, jichž je zapotřebí k provedení transfekce, zejména DNA, endozomolytický prostředek, popřípadě konjugovaný nebo připravený pro konjugaci s další složkou, dále sloučenina, schopná vázat DNA, popřípadě konjugovaná s intemalizačním faktorem, popřípadě polykationtová volná sloučenina, mohou být odděleně ve vhodném pufru nebo částečně odděleně jako složky balíčku pro provedení transfekce, který rovněž tvoří součást podstatu vynálezu. Balíček podle vynálezu k provedení

-25CZ 293141 B6 transfekce obsahuje obal, v němž jsou uloženy potřebné pomůcky, jako trubičky, lahvičky a podobně, které obsahují materiály, jichž je zapotřebí k uskutečnění transfekce vyšších eukaryotických buněk podle vynálezu. V takovém balíčku může první zásobník obsahovat jednu nebo větší počet navzájem odlišných DNA, které jsou například kódovými řetězci pro různé antigeny. Druhý zásobník může obsahovat jeden nebo větší počet navzájem odlišných konjugátů intemalizačních faktorů, přičemž je použití balíčku ve formě stavebnicového systému. Budou-li jednotlivé složky v balíčku obsaženy jako prostředky, připravené pro přímé použití nebo odděleně, určené ke smísení těsně před použitím, závisí kromě specifických případů použití také na stálosti komplexu, kterou je možno zjistit běžnými pokusy. Ve výhodném provedení je uložen konjugát adenoviru a polylysinu, vázaný pomocí transglutaminázy a tedy při skladování stálý, v jednom ze zásobníků balíčku. V dalším výhodném provedení jsou uloženy biotinylovaný adenovirus a konjugát streptavidin-polylysin v oddělených zásobnících a jsou určeny ke smísení těsně před použitím. Je zřejmém, že každý odborník může na základě vynálezu navrhovat celou řadu od sebe odlišných zkušebních balíčků, určených pro specifická použití.

Léčebné použití prostředku podle vynálezu je možno uskutečnit systemicky, výhodné je nitrožilní podání prostředku podle vynálezu. Cílovými orgány v případě této lékové formy jsou například játra, slezina, plíce, kostní dřeň a také nádorové tkáně. Příkladem místního podání může být podání do plicní tkáně, například podání prostředku podle vynálezu ve formě kapaliny, určené ke vstřikování nebo ve formě aerosolu, určeného k inhalaci. Kromě vysoké specifičnosti vazných látek pro různé diferencované buňky dýchacích cest může být jako vedlejší opatření požadována také ovlivnění různých faktorů, které se nacházejí v blízkosti plicní tkáně a které mohou ovlivnit přenos genů, například snížení pohyblivosti řasinek, rozpuštění průduškového hlenu, použití inhibitorů různých proteáz. Dále je možno podávat farmaceutické prostředky podle vynálezu například přímým vstřikováním do jater, do svalové nebo nádorové tkáně, nebo může jít o místní podání do žaludečního a střevního systému. Dalším možným způsobem podání farmaceutického prostředku podle vynálezu je podání přes žlučový systém. Tímto způsobem je možno přímo ovlivnit membrány jatemích buněk ve žlučových kanálcích, přičemž se současně brání přístupu ke krevním buňkám.

Zásadně by bylo také možno využít myoblasty, to znamená nezralé svalové buňky k přenosu genu do svalových vláken. V současné době jsou v tomto směru prováděny pokusy na myších. Vzhledem ktomu, že bylo prokázáno, že produkty genů jsou zmyoblastů vylučovány do krevního oběhu, může mít tento postup i širší použití než pouze léčebné zásahy v případě genetických defektů svalových buněk, například v případě svalové dystrofie. Bylo by možno využít myoblasty k vylučování genů, které působí přímo v krvi nebo jsou krví transportovány do jiných míst. Pokusy prokázaly, že je možno podrobit transfekci myoblasty a podobné útvary s vysokou účinností. Transfekční prostředí, v němž bylo dosaženo nejlepších výsledků, obsahoval kombinační komplexy biotinylovaného adenoviru, transferin-polylysin a streptavidin-polylysin. Z produktů reportérových genů pro luciferázu a beta-galaktosidázu došlo u svalových buněk k expresi faktoru VIII. Mimoto byl použit adenovirus drůbeže CELO v kombinačních komplexech, které obsahovaly jako přídatný intemalizační faktor aglutinin, izolovaný z pšeničných klíčků.

Léčebné použití je možno uskutečnit také ex vivo, například tak, že se ošetřené buňky, například buňky kostní dřeně, hepatocyty nebo myoblasty vracejí do organismu, například podle publikací Ponder a další, 1991, a Dhawan a další, 1991. Další možnost použití ex vivo se týká vakcinace proti zhoubným nádorům. Princip tohoto léčebného postupu spočívá v tom, že se z nemocného izolují nádorové buňky a tyto buňky se podrobí transfekci působením DNA, která obsahuje kódový řetěz pro cytokin. V následujícím stupni se buňky popřípadě inaktivují, například ozářením tak, aby se již dále nerozmnožovaly, aby však u nich dále docházelo k expresi cytokinu. Pak se takto geneticky pozměněný materiál vrátí do organismu nemocného, z něhož byl odebrán, jako vakcína. V oblasti místa očkování aktivují vylučované cytokiny imunologický systém například aktivací cytotoxických T-buněk. Tyto aktivované buňky pak vykonávají svůj vliv na jiných místech těla a zpracovávají neošetřené nádorové buňky. Tímto způsobem je možno snížit

-26CZ 293141 B6 riziko vytvoření nového nádoru nebo vzniku metastáz. Způsob použití vakcíny proti zhoubným národům pro genovou terapii byl obecně popsán v publikaci Rosenberg a další, 1992. Místo retrovirových vektorů, navrhovaných Rosenbergem je možno použít systém pro přenos genů podle vynálezu. Při pokusech v rámci vynálezu bylo možno s úspěchem podrobit transfekci primární buňky melanomu s reportérovým genem při použití kombinačních komplexů polylysin-adenovirus, transferin-polylysin nebo LDL-polylysin.

Vynález je možno využít také při zkouškách, při nichž se zkoumá imunologická odpověď na daný antigen. Cytotoxické T-lymfocyty CTL, specifické pro určité antigeny a usmrcující infikované buňky hrají důležitou úlohu při obraně proti virovým infekcím nebo nádorům. Výměna účinku mezi T-buňkami a buňkami, na něž je vázán antigen, APC, je omezována působením HLA (antigeny lidských lymfocytů, jinak označované také MHC, hlavní molekuly histokompatibility). Aby bylo možno prokázat usmrcení buněk, u nichž dochází k expresi antigenu působením prezentován ve správném souhlasu s HLA, které jsou autologními cílovými buňkami. Test na „usmrcení buněk CTL“ je možno provést následujícím způsobem: APC se podrobí transfekci konstrukcí DNA, obsahující řetězec, který je kódovým řetězcem pro antigen. Epitopy antigenu se váží na molekuly MHC třídy I a na povrchu buněk jsou prezentovány jako cíl pro specifickou odpověď CTL. Po inkubaci se vzorkem séra nemocného dojde k závislosti na přítomnosti CTL k rozpuštění APC. Rozrušení buněk je možno měřit například sledováním uvolnění radioaktivního chrómu, který je vnesen do APC před přidáním séra. Ve zveřejněných pokusech, například podle publikace Walker a další, 1989 byly užity linie B-LCL, to znamená, buněčné B-lymfoblastoidní linie, u nichž byla pomocí transfekce rekombinantním virem planých neštovic indukována exprese genů pro antigen. V tomto případě dochází k uhynutí buněk, u nichž došlo k expresi antigenu alespoň po dobu jednoho dne, na základě lytického působení uvedeného viru. Tyto obtíže je možno překonat pokusy, při nichž se užije jako systému pro přenos genu systému podle vynálezu, jimiž je možno uložit do buněk DNA pro antigenu, například kódové řetězce pro antigeny pro HIV nebo pro různé nádory, jako buněk pro expresi je možno použít například fibroblastů, u nichž pak dochází k expresi antigenu. To má tu výhodu, že primární fibroblasty je možno snadno odebrat jako vzorky, snadno se pěstují a je možno je zvláště dobře podrobit transfekci podle vynálezu, přibližně v rozsahu 50 až 70 % buněk. Pokusy tohoto typu je možno využít například k tomu, identifikovat epitopy, které jsou rozpoznávány buňkami CTL, aby bylo možno snadno vyvinout vakcíny. Mimoto je tento postup s výhodou možno využít ke stanovení imunologické odpovědi proti určitému antigenu, která byla u daného jedince omezena HLA.

Vzhledem k vysoké míře, s níž dochází v případě genů, transportovaných podle vynálezu k expresi genu v prakticky všech buňkách, je možno vynález využít také k výrobě rekombinantních bílkovin. Také v tomto případě existuje jen malé nebo neexistuje vůbec žádné omezení, pokud jde o velikost přenášené DNA a mimoto existuje široké spektrum buněčných typů, u nichž je tímto způsobem možno uskutečnit transfekci. Uvedeným způsobem je možno použít téměř každý buněčný typ pro výrobu rekombinantních bílkovin a zajistit produkci rekombinantních bílkovin v přírodní formě nebo ve zcela modifikované formě po potranslačním zpracování tak, aby bylo možno vždy zajistit vysokou biologickou účinnost takto získaného produktu.

Přenos genů do buněk je možno uskutečnit například tak, jak je v následujících příkladech prokázáno na luciferáze a na IFN-alfa, transportovat je možno prakticky jakoukoliv konstrukci s obsahem genu pro požadovaný bílkovinný produkt. Požadovanou bílkovinu je možno po transfekci buněčné kultury získat 24 hodin až 1 týden a často ještě déle ze supematantu buněčné kultury nebo z homogenizátu buněk v závislosti na použitém způsobu produkce.

Použití systému pro přenos genů podle vynálezu k výrobě rekombinantních bílkovin má následující výhody:

1) Vzhledem k vysoké účinnosti transfekce více než 90% není zapotřebí žádná předběžná selekce buněk po transfekci a není také nutno získávat stabilní buněčné linie. Malá buněčná kultura může být dostatečná k získání požadovaného množství bílkovin.

-27CZ 293141 B6

2) Je možno transportovat velké konstrukce až 48 kb.

3) Exprese genů může probíhat u buněk, schopných provést po translaci zpracování a modifikaci, například karboxylaci srážecích faktorů v závislosti na vitaminu K podle Armentano a další, 1990, nebo glykosylaci, specifickou pro určitý buněčný typ.

4) Při použití systému podle vynálezu je k dispozici větší škála cílových buněk pro expresi genu.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněn vliv infekce adenovirem na přenos genu pomocí konjugátu transferin-polylysin.

Na obr. 2 je znázorněn účinek komplexu konjugátu a DNA v závislosti na dávce.

Na obr. 3 je znázorněno zesílení přenosu genu pomocí konjugátu transferin-polylysin působením adenovirů endocytózou, zprostředkovanou přes receptory:

A) působení na DNA ve formě komplexu,

B) působení na DNA, vázanou na receptor,

C) působení na přenos genu při použití konjugátu transferinu a polylysinu.

Na obr. 4 je znázorněno působení infekce adenovirem na přenos genu působením konjugátu transferin-polylysin u vybraných buněčných linií.

Na obr. 5 je znázorněn výsledek pokusů, zda zesílení exprese genu je uskutečněno na úrovni transportu genu neboje vyvoláno transaktivací.

Na obr. 6 je znázorněn konjugát tetragalaktospeptid-polylysin.

Na obr. 7 je znázorněna transfekce buněk HepG2 působením komplexů pRSVL-DNA v přítomnosti adenovirů.

Na obr. 8 je znázorněna transfekce buněk HepG2 působením komplexů pCMVL-DNA v přítomnosti adenovirů.

Na obr. 9 je znázorněna transfekce buněk TIB73 působením komplexů pCMVL-DNA.

A) srovnávací hodnoty s chlorochinem,.

B) v přítomnosti adenovirů.

Na obr. 10 je znázorněno ukládání pCMVL-DNA do T-buněk v přítomnosti adenovirů:

A) buňky H9,

B) primární lymfocyty.

Na obr. 11 je znázorněna ínaktivace adenovirů ultrafialovým světlem:

A) zesílení přenosu genů u HeLa-buněk působením viru, inaktivovaného UV-světlem,

B) srovnání ínaktivace ultrafialovým světlem s účinkem na přenos genu.

Na obr. 12 je znázorněna ínaktivace adenovirů působením formaldehydu.

-28CZ 293141 B6

Na obr. 13 je znázorněna transfekce buněk NIH3T3 působením komplexu transferin-polylysinDNA v přítomnosti viru moloney.

Na obr. 14 jsou znázorněny výsledky zkoušek na zjištění, zda účinek na přenos genů při transfekci buněk NIH3T3 komplexem transferin-polylysin-DNA je způsobem přítomností viru moloney.

Na obr. 15 je znázorněna úloha vzájemného působení transferinu a jeho receptorů na vliv viru moloney na přenos genu.

Na obr. 16 je znázorněn vliv hodnoty pH na vliv retrovirů na přenos genu.

Na obr. 17 je znázorněn vliv hemaglutininového peptidů chřipkového viru na prostupnost liposomů.

Na obr. 18 je znázorněn transfekce buněk K562 konjugátem transferin-polylysin v přítomnosti konjugátu polylysinu a peptidů chřipkového viru.

Na obr. 19 je znázorněn průběh transfekce HeLa-buněk konjugátem transferin-polylysin v přítomnosti konjugátu polylysinu a chřipkového viru.

Na obr. 20 je stanovena exprese genu pro beta-galaktosidázu po transfekci HeLa-buněk komplexem transferin-polylysin-pCMV-beta-gal-DNA v přítomnosti adenovirů.

Na obr. 21 je znázorněn in šitu průběh exprese genu pro beta-galaktosidázu v HeLa-buňkách v přítomnosti adenovirů.

Na obr. 22 je znázorněn průběh transfekce buněk kosmidem o 48 kb v přítomnosti adenovirů:

A: HeLa-buňky

B: buňky neurob lastomu.

Na obr. 23 je znázorněna příprava konjugátu adenovirus-polylysin pomocí chemické vazby.

Na obr. 24 je znázorněn průběh transfekce buněk K562 při použití chemicky vázaného konjugátu adenovirů.

Na obr. 25 je znázorněn průběh transfekce HeLa-buněk pomocí chemicky vázaného konjugátu adenovirů.

Na obr. 26 je znázorněna vazba polylysinu na adenovirus pomocí transglutaminázy.

Na obr. 27 je znázorněna transfekce jatemích buněk myší pomocí konjugátu adenovirů a polylysinu, vázaného s transglutaminázou.

Na obr. 28 je znázorněno zesílení účinnosti transfekce při použití konjugátu adenovirů a polylysinu, vázaného transglutaminázou ve srovnání s použitím viru, který není vázán ve formě konjugátu.

Na obr. 29 je znázorněn průběh transfekce HeLa-buněk pomocí konjugátu adenovirů, vázaného s konjugátem biotin-streptavidin.

Na obr. 30 je znázorněn průběh transfekce buněk K.562 při použití konjugátu adenovirů, vázaného s konjugátem biotin-streptavidin.

-29CZ 293141 B6

Na obr. 31 je znázorněn průběh transfekce buněk neuroblastomu pomocí kosmidu o velikosti 48 kb působením konjugátu adenoviru, vázaného na konjugát biotin-streptavidin.

Na obr. 32 je znázorněn průběh transfekce jatemích buněk v přítomnosti chlorochinu nebo adenoviru.

Na obr. 33 je znázorněn průběh transfekce buněk K.562 v přítomnosti různých endozomolytických prostředků.

Na obr. 34 je znázorněno srovnání průběhu transfekce na buněčné úrovni při použití betagalaktosidázy jako reporterového genu v přítomnosti různých endozomolytickych prostředků.

Na obr. 35 je znázorněn průběh dlouhodobé exprese luciferázy v souvislé vrstvě jatemích buněk, které již nejsou schopny se dělit.

Na obr. 36 je znázorněna exprese v HeLa-buňkách po transfekci v přítomnosti CELO-viru, volného nebo vázaného na polylysin přes biotin-streptavidin.

Na obr. 37 je znázorněna transfekce myoblastů a útvarů ze svalových vláken v přítomnosti adenoviru, volného nebo vázaného na polylysin přes biotin-streptavidin.

Na obr. 38 je znázorněna transfekce buněk primárních myoblastů a dalších útvarů ze svalových vláken ve tkáňové kultuře.

Na obr. 39 je znázorněno srovnání adenoviru dl313 a CELO-viru při transfekci HeLa-buněk a C2C12-myoblastů.

Na obr. 40 je znázorněno zlepšení transfekce CELO-virem při použití vazné látky na bázi lektinu.

Na obr. 41 je znázorněn průběh exprese cDNA pro faktor VIII v kulturách C2C12-myoblastů a jiných buněk na bázi buněk svalových vláken.

Na obr. 42 je znázorněno zlepšení transportu DNA působením bílkovin z adenoviru: A: HeLa-buňky, B: fibroblasty.

Na obr. 43 je znázorněna konstrukce konjugátu galaktózy a peptidů z chřipkového viru pro transport DNA v hepatocytech.

Na obr. 44 je znázorněna konstrukce konjugátu galaktózy a adenoviru pro transport DNA v hepatocytech.

Na obr. 45 je znázorněn přenos genu v B-lymfoblastoidních B-buňkách.

Na obr. 46 je znázorněn přenos DNA působením konjugátu transferin-polylysin v přítomnosti rhinoviru. A: volný rhinovirus, B: konjugovaný rhinovirus.

Na obr. 47 je znázorněn průběh transfekce primárních lidských melanomových buněk při použití kombinačního komplexu, obsahujícího konjugát transferinu a konjugát adenoviru.

Na obr. 48 je znázorněn průběh transfekce primárních lidských melanomových buněk při použití kombinačních komplexů, obsahujících konjugáty LDL a konjugáty adenoviru.

Na obr. 49 je znázorněn přenos genu v buňkách epitelu dýchacích cest u krys in vivo.

-30CZ 293141 B6

Na obr. 50 je znázorněna prostupnost liposomů při použití amfipathických peptidů.

Na obr. 51 je znázorněna prostupnost červených krvinek při použití amfipathických peptidů.

Na obr. 52 je znázorněna transfekce BNL C1.2-buněk v přítomnosti amfipathických peptidů.

Na obr. 53 je znázorněna transfekce NIH3T-buněk v přítomnosti amfipathických peptidů.

Na obr. 54 je znázorněna exprese IFN-alfa v HeLa-buňkách, podrobených transfekci v přítomio nosti různých endozomolytických prostředků.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady, které slouží k ilustraci vynálezu, avšak nikoliv k omezení jeho rozsahu. Pokud není uvedeno jinak, jsou v příkladové části použity následující materiály a postupy:

Příprava komplexů transferin-polylysin/DNA

a) Konjugát lidského transferinu a polylysinu

Při výrobě tohoto konjugátu byl použit způsob podle publikace Wagner a další, 1991b, při němž se polylysin váže na postranní uhlohydráty řetězec transferinu.

Roztok 280 mg, 3,5 mikromol lidského transferinu, prostého železa (Sigma) v 6 ml 30 mM pufru s octanem sodným o pH 5 se zchladí na teplotu 0 °C a pak se přidá 750 mikrolitrů 30 mM pufru 25 s octanem sodným o pH 5 s obsahem 11 mg, 51 mikromol jodistanu sodného. Směs se nechá stát minut v ledové lázni za nepřístupu světla. K odstranění produktů s nízkou molekulovou hmotností se provádí filtrace na gelu Sephadex G-25 (Pharmacia), získá se roztok, obsahující přibližně 250 mg oxidovaného transferinu, měřeno ninhydrinovou zkouškou. Aby bylo možno prokázat oxidovou formu, která obsahuje aldehydy a při barvení s anisaldehydem poskytuje 30 barevnou reakci, byly vzorky po kapkách naneseny na tenkou vrstvu silikagelu, usušeny a desky byly ponořeny do směsi p-anisaldehydu, kyseliny sírové a ethanolu v poměru 1:1:18, načež byly usušeny a zahřátý. Roztok modifikovaného transferinu byl rychle v průběhu 10 až 15 minut přidán k roztoku, který obsahoval 1,5 mikromol poly(L)lysinu, značeného fluorescencí s průměrnou délkou řetězce 190 lysinových monomerů ve 4,5 ml 100 mM octanu 35 sodného o pH 5. Hodnota pH roztoku byla upravena na 7,5 přidání pufru s 1M hydrogenuhličitanu sodného. Ke směsi se v intervalu 1 hodiny po čtyřech podílech přidá 28,5 mg, 450 mikromol kyanhydroborátu sodného. Po 17 hodinách se přidají ještě 2 ml 5M chloridu sodného, aby celková koncentrace roztoku byla přibližně 0,75 M. Reakční směs se pak nanese na sloupec kationtoměniče (Pharmacia Mono SHR 10/10) a frakcionace se provádí při použití 40 gradientu 0,75 až 2,5 M chloridu sodného při stálém obsahu 25 mM HEPES o pH 7,3. Vysoká koncentrace chloridu sodného při naplnění sloupce a na počátku frakcionace je důležitá pro získání konjugátu polykationtové sloučeniny. V promývací kapalině bylo ze sloupce vymyto také přibližně 30 % transferinu a malé množství fluorescenčního materiálu. Hlavní podíl konjugátu, značeného fluorescencí byl ze sloupce získán při koncentraci chloridu sodného 1,35 až 1,9 M 45 a byl rozdělen na tři frakce. Z těchto frakcí byla v pořadí, v němž byly frakce vymývány po dvojí dialýze proti 2 litrům 25 mM HEPES o pH 7,3 frakce A (TfpL190A) s obsahem 45 mg, 0,56 mikromol transferinu, modifikovaného pomocí 366 mol polylysinu, dále frakce B (TpfL190B) s obsahem 72 mg, 0,90 mikromol transferinu, modifikovaného 557 nmol polylysinu a frakce C (TfpL190C) obsahující 7 mg, 85 nmol transferinu, modifikovaného 225 nmol poly50 lysinu. Konjugáty transferinu byly po rychlém zmrazení v kapalném dusíku skladovány při teplotě -20 °C ve formě, prosté železa v případě, že nebyly okamžitě použity. Před zabudováním železa byly vzorky 0,5 až 1 mg upraveny přidáním chloridu sodného na fyziologickou koncentraci této látky, to znamená 150 mM chloridu sodného.

-31 CZ 293141 B6

Železo bylo do konjugátu zabudováno tak, že byly přidány 4 mikrolitry 10 mM pufru s citrátem železitým, pufr obsahoval 200 mM citrátu a přidáním hydrogenuhličitanu sodného bylo pH upraveno na 7,8, množství je uvedeno na 1 mg transferinu. Konjugát s obsahem železa byl před použitím ke tvorbě komplexu DNA rozdělen na malé podíly, které byly rychle zmrazený v kapalném dusíku nebo ve směsi suchého ledu a ethanolu a pak skladovány při teplotě -20 °C. Toto opatření je velmi účelné vzhledem k tomu, že po vícenásobném zmrazení a roztáni může docházet k rozkladu konjugátu.

b) Konjugáty myšího transferinu s polylysinem

Postup byl prováděn stejným způsobem jako při použití lidského transferinu tak, že vazba byla uskutečněna přes postranní řetězce uhlohydrátu. Při použití 4,1 mg, 51 nmol myšího transferinu a 2,1 mg, 34 nmol polylysinu pL290 byly získány konjugáty, obsahující 15,5 nmol myšího transferinu a 13 nmol pL290.

Plazmidová DNA

a) pRSVl-DNA mikrogramů plazmidové DNA pRSVL, získané z gelu pro luciferázu Photinus pyralis pod řízením zesilovače transkripce/promotoru z Rousova viru sarkomu LTR podle publikace Uchida a další, 1977, De Wet a další, 1987, materiál byl připraven standardním postupem při použití tritonu X podle Maniatise, pak byl odstředěn při použití hustotního gradientu CsCl/EtBr, odbarven butanolem-1, načež byla provedena dialýza proti 10 mM tris/HCl o pH 7,5 s 1 mM EDTA. DNA plazmidu ve 350 mikrolitrech HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,3) se 30 minut mísí s 12 mikrogramy konjugátu transferinu a polylysinu ve 150 mikrolitrech HBS před přidáním k buněčnému materiálu.

b) pCMV-DNA

Plazmid pCMV byl připraven tak, že z plazmidu pSTCX556 (Seveme a další, 1988) byla odstraněna část, vložená do místa působení enzymu BamHI, plazmid byl zpracován působením Klenowova fragmentu a do plazmidu byl uložen fragment HindlII/SspI a fragment po zpracování Klenowovým fragmentem z plazmidu pRSVL, obsahující řetězec, který je kódovým řetězcem pro luciferázu nebo kódový řetězec pro beta-galaktosidázu (Macgregor a Caskey, 1989). Tvorba komplexu se provádí analogickým způsobem jako v případě pRSVL.

Příprava virových preparátů

a) preparáty adenoviru

Byl užit kmen adenoviru d 1312, popsaný v publikaci Jones a Shenk, 1979, obsahující vypuštěnou část z oblasti Ela. Pomnožení viru bylo uskutečněno v Ela-transkomplementámí buněčné linie 293, a to ve velkém měřítku způsobem, popsaným v publikaci Davidson a Hassell, 1987. Čištěný virus byl uložen do pufru pro skladování (100 mM tris, o pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 % BSA, 50 % glycerolu) nebo do pufru HBS se 40 % glycerolu a po rozdělení na podíly byl materiál skladován při teplotě -70 °C. Stanovení koncentrace virionu bylo uskutečněno spektrofotometrickou analýzou extrahované DNA genomu viru v ultrafialovém světle při optické hustotě OD: A₂«) odpovídá uvedená hodnota IO¹² částic viru/ml podle Chardonnet a Dales, 1970.

b) Preparáty retroviru

Retrovirus moloney myší leukemie N2 byl uložen do ekotropní buněčné linie podle Keller a další, 1985 a Armentano a další, 1987. Supematanty buněčných linií, u nichž dochází k expresi viru, byly odděleny, rychle zmrazený v kapalném dusíku a skladovány při teplotě -20 °C.

-32CZ 293141 B6

Supematanty, použité v příkladech měly titr přibližně 10⁶ cfu/ml, titr byl měřen tvorbou kolonií, odolných proti neomycinu při použití buněk NIH3T3. Při pokusech na koncentraci viru byly supematanty filtrovány pod tlakem plynného dusíku membránovým filtrem, oddělujícím sloučeniny od 300 kb (FILTRON) v koncentračním zařízení AMICON. Tímto způsobem bylo obvykle možno desetkrát zkoncentrovat supematanty s objemem 10 až 30 ml.

Buňky a prostředí

HeLa-buňky byly pěstovány v živném prostředí DMEM, které bylo doplněno 5% fetálního telecího séra FCS, inaktivovaného působením tepla, penicilinem na 100 MJ/ml, streptomycinem na 100 mikrogramů/ml a 2 mM glutaminu. Buňky WI-38, MRC-5 a KB byly pěstovány v prostředí EMEM (Eaglovo modifikované základní prostředí) prostředí bylo doplněno 10% FCS po inaktivaci teplem, stejnými antibiotiky jako prostředí DMEM, 10 mM neesenciálních aminokyselin a 2 mM glutaminu. Buňky CFT1, buněčná linie cystické fibrózy epitelu dýchacích cest byla vyrobena podle publikace Yankaskas a další, 1991, a je charakterizována tím, že jde ohomozygotní CF-mutaci po vypuštění deltaF508, linie byla pěstována v prostředí F12-7X podle Willumsen a další, 1989. Pro pokusy na přenos genu byly buňky pěstovány na plotnách pro pěstování buněčných kultur s průměrem 6 cm tak dlouho, až se vytvořila vrstva buněk, splývající přibližně na 50 % což odpovídá počtu buněk 5 x 10⁵. Pak bylo živné prostředí odstraněno a byl přidán 1 ml prostředí DMEM nebo EMEM se 2 % FCS. Pak byly přidány komplexy konjugátu a DNA a bezprostředně potom byl přidán adenovirus dl312 v množství 0,05 až 3,2 xlO⁴ částic/buňka nebo srovnatelný bojem pufru pro skladování viru, to znamená 1 až 80 mikrolitrů. Plotny jsou pak uloženy na jednu hodinu při teplotě 37 °C do atmosféry, obsahující 5 % oxidu uhličitého a pak se přidají 3 ml úplného živného prostředí. Po inkubaci po dobu dalších 24 hodin se buňky oddělí, aby bylo možno určit, zda došlo k expresi genu pro luciferázu. V případě buněk CFT1 byly buněčné materiály před pokusem s přenosem genu uloženy na 4 hodiny do živného prostředí F12-7X v nepřítomnosti lidského transferinu.

Z veřejné sbírky ATCC byly získány podle příslušných čísel katalogů následující linie: CCL 2, K562-bufiky, CCL 243, HepG2-buňky, HB 8065, TIB-73-buňky, TIB 73 (BNL CL.2), NIH3T3-buňky, CRL 1658, 293-buňky, CRL 1573, KB-buňky, CC1 17, WI-38-buňky, CCL 75, MRC-5-buňky, CCL 171. H9-buňky byly získány od AIDS Research and Reference Reagent Program US Department of Healt and Human Services, č. katalogu 87.

Primární lymfocyty byly získány tak, že krev z pupeční šňůry byla uložena do zkumavky s obsahem EDTA, jednotlivé vzorky měly objem 25 ml. Jednotlivé podíly byly podvrstveny

4,5 ml Ficcoll-hypaque (Pharmacia) a odstraněny 15 minut při 2500 ot/min. Hnědavá vrstva mezi horní vrstvou plazmy a spodní čirou vrstvou ficollu s objemem přibližně 10 ml byla odebrána, bylo přidáno 40 ml IMDM s 10% FCS a vzorek byl znovu odstředěn 15 minu při 1200 ot/min a usazenina buněk byla smísena s 50 ml čerstvého IMDM s 10% FCS, hustota buněk byla přibližně 2x 10⁶ buněk/ml. Pak bylo přidáno 250 mikrolitrů phytohemaglutininu (PHA P, DIFCO) a kultura byla inkubována 48 hodin při teplotě 37 °C v atmosféře s obsahem 5 % oxidu uhličitého a pak byl přidán rekombinantní IL-2 (BMB) v koncentraci 20 jednotek/ml. Pak byly buňky rozděleny v poměru 1 : 3 do prostředí IMDM/20 % FCS s obsahem dvou jednotek IL-2/ml. Podíly buněčného materiálu byly zmrazený kapalným dusíkem ve FCS s přísadou 5 % DMSO. Před použitím byly buňky pěstovány v prostředí IMDM s 20 % FCS a s obsahem 2 jednotky IL-2/ml.

Pro následující zkoušky na uskutečnění vazby byly HeLa-buňky uvedeny do rovnovážného stavu při teplotě 4 °C v 1 ml živného prostředí DMEM, doplněného 2 % FCS. Konjugáty komplexu DNA byly přidávány stejným způsobem jak v průběhu ostatních pokusů a plotny byly inkubovány 2 hodiny při teplotě 4 °C. Pak byly plotny důkladně promývány prostředím DMEM se 2 % FCS, vychlazeným ledem a nakonec byly přidány 2 ml tohoto živného prostředí. Pak byl přidán adenovirus Dl312 nebo pufr pro skladování viru, buněčný materiál v živném prostředí se

-33CZ 293141 B6 nechal pomalu zteplat a pak byl na 24 hodin uložen do inkubátoru. Po inkubaci byly buňky odděleny a sledovány na expresi genu pro luciferázu.

Zkouška na luciferázu

Výroba buněčných extraktů, standardizace obsahu bílkovin v těchto buněčných extraktech a také stanovení účinnosti luciferázy bylo uskutečněno způsobem podle publikací Zenke a další, 1990, Cotten a další 1990 nebo způsobem, popsaným v EP 388 758.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Stanovení účinku adenoviru na přenos genu při použití konjugátu transferinu a polylysinu

Nejprve byl sledován účinek zvyšující se dávky viru na schopnost definovaného množství komplexu konjugátu a DNA uskutečnit přenos genu. K tomuto účelu byl komplex vytvořen smísením 6 mikrogramů plazmidu pRSVL s 12 mikrogramy konjugátu lidského transferinu a polylysinu (hTfpL190B). Komplex konjugátu a DNA spolu s různým množstvím adenoviru dl312 v rozmezí 0,05 až 3,2 x 10⁴ částic viru/buňka byl přidán kHeLa buňkám. Výsledek této analýzy je znázorněn na obr. 1. Účinnost luciferázy je vyjádřena v jednotkách světla na 50 mikrogramů buněčné bílkoviny. Podle této analýzy bylo možno přidáváním odpovídajícího množství adenoviru dosáhnout zvyšujícího se přenosu genu. Na výkrese jsou znázorněny průměrné hodnoty, získané ze 2 až 4 nezávislých pokusů. Na křivce jsou také znázorněny standardní odchylky.

Příklad 2

Vliv dávky komplexu DNA a konjugátu

Logaritmické ředění komplexu DNA a konjugátu, připravené stejným způsobem jako v příkladu 1 bylo přidáno k HeLa-buňkám a mimoto byla nebo nebyly přidána ještě stálá dávka adenoviru dl313, 1 x 10⁴ částic viru/buňka. Pak byla stanoveny aktivita luciferázy stejným způsobem jako v příkladu 1. Výsledky jsou znázorněny na obr. 2.

Příklad 3

Zesílení přenosu genu adenovirem při použití konjugátu transferin-polylysin je způsobeno endocytózou, zprostředkovanou přes receptory

a) Vliv působení adenoviru na přenos DNA ve formě komplexu

K transfekci byly užity následující složky:

mikrogramů DNA z plazmidu pRSVL bez konjugátu transferin-polylysin (DNA), mikrogramů DNA plazmidu pRSVL spolu s 6 mikrogramy nekonjugovaného polylysinu 270 (DNA + pL), mikrogramů DNA plazmidu pRSVL spolu s 12 mikrogramy konjugátu transferinu a polylysinu z předchozích příkladů (DNA + hTfpL190B).

Tyto materiály pro transfekci byly přidávány ke kultuře HeLa-buněk s přidáním nebo bez přidání adenoviru dl312 v množství 1 x 10⁴ částic viru/buňka. Příprava buněčného extraktu, standardizace celkové buněčné bílkoviny a stanovení účinnosti luciferázy bylo prováděno stejným způsobem jako v předchozích příkladech. Výsledky těchto pokusů jsou uvedeny na obr. 3A.

-34CZ 293141 B6

b) Vliv působení adenoviru na přenos DNA, vázané na receptor

Komplexy konjugátu a DNA (DNA + hTfpL190B) nebo komplexy polylysinu a DNA (DNA + pL) byly navázány na kultury HeLa-buněk, aniž by došlo k intemalizaci tak, že inkubace byla prováděna při teplotě 4 °C. Nenavázaný komplex byl odstraněn před přidáním adenoviru dl312 v množství 1 x 10⁴ částic viru/buňka nebo byl odstraněn srovnatelný objem pufru. Následná inkubace se provádí při teplotě 37 °C, aby byla umožněna intemalizace navázaného komplexu DNA a adenoviru. Stanovení aktivity luciferázy bylo prováděno svrchu uvedeným způsobem, výsledky jsou znázorněny na obr. 3B.

c) Vliv působení adenoviru na přenos genu při použití konjugátu transferinu a polylysinu

Komplex konjugátu a DNA, obsahující 6 mikrogramů DNA zplazmidu pRSVL spolu s 12 mikrogramy konjugátu transferin-polylysin (DNA + hTfpL190B) byl přidáván ke kulturám HeLa-buněk spolu s množstvím 1 x 10⁴ částic adenoviru D1312/buňka nebo se srovnatelným množstvím téhož adenoviru, inaktivovaného teplem (d 1312 h.i.). Inaktivace teplem byla uskutečněna inkubací po dobu 30 minut při teplotě 45 °C podle Defer a další, 1990.

Příklad 4

Vliv působení adenoviru na přenos genu při použití konjugátu transferinu a polylysinu u některých buněčných linií

Komplex konjugátu a DNA (6 mikrogramů pRSVL + 12 mikrogramů hTfpL190B) byl přidán k buněčným liniím CFT1, KB, HeLa, WI38 a MRC5 v nepřítomnosti nebo v přítomnosti adenoviru D1312 v množství 1 x 10⁴ částic viru/buňka. Účinnost přenosu genu u různých buněčných linií pak byla stanovena stejně jako v předchozích příkladech zkouškou na aktivitu enzymu luciferázy. Výsledky uvedených zkoušek jsou znázorněny na obr. 4.

Příklad 5

Zesílení exprese genu pro luciferázu působí na úrovni přenosu genu a nikoliv na transaktivaci

Nejprve byla připravena buněčná linie, u níž konstitutivně dochází k expresi luciferázy a tato linie byla označena K562 10/6. Linie byla připravena tak, že buňky byly podrobeny transfekci plazmidem s obsahem fragmentu genu pro RSV-luciferázu (fragment Apal/Pvul z plazmidu pRSVL podle De Wet a další, 1987), fragment byl klonován v místě štěpení Clal plazmidu pUC podle Collis a další, 1990. Tento plazmid byl pak uveden do komplexu s konjugátem transferinu a polylysinu a buňky K562 byly podrobeny transfekci při použití tohoto komplexu, bylo použito postupu podle publikace Cotten a další, 1990. Vzhledem ktomu, že mikro-locus plazmidu uPC obsahuje gen pro odolnost proti neomycinu, bylo možno provést selekci klonů, u nichž dochází k expresi luciferázy na základě odolnosti proti neomycinu. Pro další pokusy byl vybrán klon s označením K562 10/6.

Podíly rodičovské buněčné linie K562 (ve 200 mikrolitrech prostředí RPMI 1640 se 2 % FCS, 500 000 buněk/vzorek) byly zpracovány působením 12 mikrogramů TgpL plus 6 mikrogramů plazmidu pRSVL nebo působením 40 mikrogramů pL90 plus 6 mikrogramů pRSVL, vždy v 500 mikrolitrech HBS. Úvedená množství adenoviru dl312, jak je zřejmé z obr. 5, působila na buňky vždy 1,5 hodiny při teplotě 37 °C, pak byly přidány 2 ml prostředí RPMI s 10 % FCS. Pak byly kultury inkubovány dalších 24 hodin při teplotě 37 °C a pak byly buňky připraveny pro stanovení účinnosti luciferázy. Bylo prokázáno, že inkubace spolu s adenovirem vede k podstatnému zvýšení aktivity luciferázy, jak je zřejmé z obr. 5A. To platí také pro komplex TfpL (200 světelných jednotek ve srovnání s 25 000 světelnými jednotkami a pro komplexy pL90 (0 ve

-35CZ 293141 B6 srovnání s 1,9 x 10⁶ světelných jednotek). Je zřejmé, že buněčná linie K562 má schopnost zajistit intemalizaci komplexu pRSVL a polylysinu a že tato intemalizace, měřená expresí luciferázy, je podstatně zvýšena v přítomnosti adenovirů.

Analogické pokusy byly prováděny s buňkami typu K562 10/6, u nichž dochází ke konstitutivní expresi genu RSVL pro luciferázu, přičemž bylo použito obdobné množství adenovirů dl312. Podíly po 500 000 buňkách (ve 200 mikrolitrech prostředí RPMI se 2 % FCS) byly inkubovány

1.5 hodiny s adenovirem d 1312 při teplotě 37 °C. Pak byl buněčný materiál stejně jako v případě rodičovské buněčné linie dále inkubován v prostředí RPMI s 10 % FCS celkem 24 hodin a pak byla stanovena aktivita luciferázy. Jak je zřejmé z obr. 5B, nepůsobilo zpracování těchto buněk adenovirem nijak prokazatelně na aktivitu luciferázy. Kontrolní hodnoty leží ve stejném rozmezí jako hodnoty pro vzorky, zpracované virem.

Příklad 6

Transfekce jatemích buněk konjugátem asialofetuinu a polylysinu (AFpL) nebo konjugátem tetragalktospeptidu a pL ((gal)4pL) v přítomnosti adenovirů

a) Příprava laktosylovaného peptidu

3.5 ml, 1,92 mikromol rozvětveného peptidu vzorce Lys-(N8-Lys)Lys-Gly-Ser-Gly-Gly-SerGly-Gly-Ser-GIy-Gly-Cys, získaného metodou Fmoc při použití syntetizátoru peptidů Applied Biosystems 431A s obsahem dithiopyridinové skupiny v případě Cys, bylo vystaveno působení roztoku s obsahem 7,85 mg laktóz ve 40 mikrolitrech 10 mM vodného octanu sodného o pH 5 při teplotě 37 °C. K roztoku se přidají čtyři podíly po 0,6 mg, 10 mikromol kyanhydroborátu sodného v intervalech přibližně 10 hodin. Po celkem 64 hodinách inkubace při teplotě 37 °C se přidá ještě 0,5 ml pufru HEPES o pH 7,3 a 15 mg dithiothreitolu DTT. Po frakcionaci filtrací na gelu Sephadex G-10, ve sloupci s rozměrem 12 x 130 mm a při použití 20 mM chloridu sodného jako elučního činidla pod argonem se získá 3,6 ml roztoku laktosylovaného peptidu ve volné merkaptoformě (1,73 mikromol podle Ellmannsova testu, výtěžek 84 %). Vzorky modifikovaného peptidu poskytují barevnou reakci s anisaldehydem, avšak nikoliv s ninhydrinem, což zcela odpovídá předpokladu, že všechny čtyři N-terminální aminoskupiny jsou laktosylovány. Konjugát tetragalaktospeptidu a polylysinu je znázorněn na obr. 6.

b) Příprava polylysinu, modifikovaného 3-dithiopyridinpropionátem

K roztoku 0,60 mikromol poly-L-lysinu, získaného filtrací na gelu, s průměrnou délkou řetězce 290 lysinových monomerů (pL 290, hydrobromid, Sigma) v 1,2 ml 100 mM HEPES o pH 7,9 se za intenzivního míchání přidá 400 mikrolitrů 15 mM ethanolového roztoku SPDP (6,0 mikromol). Po další hodině se přidá ještě 500 mikrolitrů 1M octanu sodného o pH 5. Po filtraci na gelu Sephadex G-25 při použití 100 mM octanu sodného se získá roztok s obsahem 0,56 mikromol pL290 s 5,77 mikromol dithiopyridinového vazného řetězce.

c) Konjugace peptidu s polylysinem

Konjugáty byly vytvořeny tak, že 1,5 mikromol laktosylovaného peptidu, získaného v odstavci a) ve 3 ml 20 mM chloridu sodného bylo smíseno s 0,146 mikromol modifikovaného pL290, získaného v odstavci b) v 620 mikrolitrech 100 mM pufru soctanem sodným v argonové atmosféře. Po přidání 100 mikrolitrů 2M HEPES o pH 7,9 se reakční směs nechá 18 hodin stát při teplotě místnosti. Přidáním chloridu sodného se koncentrace této látky upraví na 0,66 M a konjugáty se oddělí chromatografíí na aniontoměniči (Pharmacia, sloupec Mono S HR 5/5, eluce při použití gradientu, pufr A: 50 mM HEPES o pH 7,3, pufr B: pufr A plus 3 M NaCl). Frakce produktu se vymývají při koncentraci chloridu sodného v rozmezí 1,2 až 1,8 M a z frakcí s obsahem produktu se vytvoří dvě frakce konjugátu. Tyto frakce se označují (gal)4pLl a

-36CZ 293141 B6 (gal)4pL2. Dialýzou proti 25 mM HEPES o pH 7,3 se získá frakce konjugátu (gal)4pLl s obsahem 24 nmol modifikovaného pL290 a frakce (gal)4pL2, která obsahuje 24,5 nmol modifikovaného pL290.

d) Příprava konjugátů asialofetuinu

Konjugáty byly připravovány na stejném principu jako konjugáty transferinu. Podobný postup pro přípravu konjugátů asialoorosomukoidu a polylysinu byl popsán v publikaci Wu a Wu, 1988.

ío Vazba asialofetuinu na polylysin byla uskutečněna vazbou přes disulfidové můstky po modifikaci bifunkčním reakčním činidlem SPDL (Pharmacia). Roztok 100 mg (2,2 mikromol) asialofetuinu (Sigma) ve 2 ml 100 mM HEPES o pH 7,9 byl podroben gelové filtraci na sloupci Sephadexu G-25. K získaným 4 ml roztoku se za energického míchání přidá 330 mikrolitrů 15 mM ethanolového roztoku SPDP, 5,0 mikromol. Po jedné hodině stání při teplotě místnosti se 15 materiál čistí další filtrací na Sephadexu G-25, získá se 5 ml roztoku s obsahem 1,4 mikromol asialofetuinu, modifikovaného 2,25 mikromoly dithiopyridinového vazného řetězce.

Konjugáty se získají tak, že se 1,4 mikromol modifikovaného asialofetuinu v 5 ml 100 mM HEPES o pH 7,9 smísí s 0,33 mikromol modifikovaného pL190 (s obsahem 1,07 mikromol 20 merkaptopropionátových skupin, postupuje se tedy přesně jako při přípravě konjugátů transferinu) v 6,5 ml 200 mM HEPES o pH 7,6 v argonové atmosféře. Reakční směs se nechá stát 24 hodin při teplotě místnosti. Konjugát se z reakční směsi izolují chromatografii na kationtoměniči (Pharmacia, sloupec Mono S HR 10/10, eluce při použití gradientu, pufr A: 50 mM HEPS o pH 7,9, pufr B: pufr A pulsu 3 M chloridu sodného) a pak se chlorid sodný přidává až do konečné 25 koncentrace 0,6 M. Frakce produktu se ze sloupce vymývají při koncentraci přibližně 1,5 M chloridu sodného. Dialýzou proti HBS se získají konjugáty, obsahující 0,52 mikromol asialofetuinu, modifikovaného 0,24 mikromoly pL190.

e) Transfekce buněk HepG2 působením komplexu pRSVL-DNA

Buňky HepG2 se pěstují v živném prostředí DMEM s obsahem 10% FCS, lOOMJ/mol penicilinu, 100 mikrogramů/ml streptomycinu a 2 mM glutaminu v lahvích T25. Transfekce byla uskutečněna na buněčném materiálu s obsahem 400 000 buněk/láhev. Před transfekcí byly buňky promyty 4 ml čerstvého prostředí s obsahem 10 % FCS. Bezprostředně před transfekcí byl přidán 35 chlorochin (Sigma) do konečné koncentrace v buněčné suspenzi včetně roztoku DNA 100 mikroM.

lOmikrogramů DNA plazmidu pRSVL ve 300 mikrolitrech HBS se smísí skonjugátem TfpL190B (TfpL), konjugátem asialofetuinu a pL90 (AfpL), polylysinem 290 (pL) nebo konju40 gátem tetragalaktospeptidu a polylysinu (gal)4pl v množstvích, uvedených na obr. 7, vždy ve

170 mikrolitrech HBS. V pokusech na kompetici bylo po 30 minutách přidáno 240 mikrogramů asialofetuinu ((gal)4pL + Af) nebo 30 mikrogramů laktosylovaného peptidu ((gal)4pL + (gal)4). Směs byla přidána k buněčnému materiálu, který byl pak inkubován ještě 4 hodiny při teplotě 37 °C, načež bylo prostředí pro uskutečnění transfekce nahrazeno 4 ml čerstvého živného 45 prostředí DMEM s 10% FCS. Po 24 hodinách byly buňky odděleny k provedení zkoušky na aktivitu luciferázy. Hodnoty, které jsou uvedeny na obr. 7, uvádějí celkovou aktivitu luciferázy u buněk po transfekcí. Jak je z obr. 7 zřejmé, že možno po působení pL a TfpL pozorovat nízkou účinnost luciferázy. Po působení (gal)4pL je možno pozorovat podobnou úroveň aktivity jako v případě AfpL, po přidání (gal)4 nebo Af dochází ke kompetici a receptor pro asialo50 glykoprotein a dochází tedy ke snížení výsledných hodnot, jak bylo očekáváno.

-37CZ 293141 B6

f) Transfekce buněk HepG2 při použití komplexů pCMVL-DNA

Buňky HepG2 byly pěstovány na plotnách s průměrem 6 cm až do hustoty buněk 300 000 buněk/plotna, tak jak již bylo uvedeno v odstavci e). Před transfekcí byly buňky promyty při použití 1 ml čerstvého živného prostředí, které obsahovaly ještě 2 % FCS.

mikrogramů DNA plazmidu pCMVL v HBS bylo smíseno s konjugátem TfpL19OB (TfpL), s konjugátem asialofetuinu a pL (AFpL), spolylysinem 290 (pLys290), s (gal)4pLl nebo (gal)4pL2 v množstvích, uvedených na obr. 8, vždy ve 170 mikrolitrech HBS. Po 30 minutách bylo ke každému komplexu DNA a konjugátu přidáno množství 1 ml živného prostředí DMEM s obsahem 2% FCS a 50 mikrolitrů základního roztoku adenoviru dl312C. V pokusech na kompetici bylo, jak již bylo svrchu uvedeno, přidáno 30 mikrogramů laktosylovaného peptidu (gal)4pL, ((gal)4pLl + (gal)4 nebo (gal)4pL2 + (gal)4). Směs byl přidána k buněčnému materiálu, který byl pak inkubován ještě 2 hodiny při teplotě 37 °C a pak bylo přidáno ještě

1,5 ml živného prostředí s obsahem 10% FCS. Po dalších 2 hodinách bylo prostředí pro uskutečnění transfekce nahrazeno 4 ml čerstvého prostředí DMEM s obsahem 10% FCS. Po 24 hodinách byl buněčný materiál oddělen k provedení zkoušky na aktivitu luciferázy. Hodnoty, které jsou uvedeny na obr. 8 představují celkovou aktivitu luciferázy u buněk po transfekci. Je zřejmé, že v případě působení pLys290 došlo k určitému účinku, při působení (gal)4pL bylo možno pozorovat silnější účinek, avšak po přidání (gal)4 došlo ke kompletici o receptor pro asialoglykoprotein, takže hodnota byla snížena na hodnotu pro polylysin.

g) Transfekce buněk TIB73 působením komplexu pCMVL-DNA

Buňky embryonální myší linie jatemích buněk ATCC TIB73 (BNL C1.2, Patek a další, 1978), byly pěstovány při teplotě 37 °C v atmosféře s obsahem 5 % oxidu uhličitého v živném prostředí DMEM s vysokým obsahem glukózy 0,4 %, prostředí bylo doplněno 10 % FCS, inaktivovaného působením tepla a dále obsahovalo 100M.J./ml penicilinu, 100 mikrogramů/ml streptomycinu a 2 mM glutaminu, k pěstování buněk byly užity plotny s průměrem 6 cm.

Transfekce byla uskutečněna po dosažení hustoty buněk 300 000 buněk/plotna. Před transfekcí byl buněčný materiál promyt 1 ml čerstvého živného prostředí, které bylo doplněno 2 % FCS.

mikrogramů DNA plazmidu pCMVL ve 300 mikrolitrech HBS bylo smíseno s konjugátem vyššího transferinu a polylysinu 290 (mTfpL), s konjugátem asialofetuinu a pL (AFpL), s polylysinem 290 (pLys290), (gal)4pLl nebo (gal)4pL2 v množství, uvedeném na obr. 9, vždy ve 170 mikrolitrech HBS. Po 30 minutách byl ke každému komplexu DNA a konjugátu přidán 1 ml prostředí DME s obsahem 2 % FCS a 50 mikrolitrů základního roztoku adenoviru dl312C. Směs byla přidána k buněčnému materiálu, který byl pak ještě 2 hodiny inkubován při teplotě 37 °C, načež bylo přidáno 1,5 ml živného prostředí s obsahem 10 % FCS. Po dalších 3 hodinách bylo prostředí pro uskutečnění transfekce nahrazeno 4 ml čerstvého živného prostředí. Po 24 hodinách byl buněčný materiál oddělen pro stanovení aktivity luciferázy. Hodnoty, které jsou uvedeny na obr. 9A, přestavují celkovou aktivitu luciferázy u buněk po transfekci.

Pro srovnání byla provedena ještě transfekce bez adenoviru v přítomnosti chlorochinu. Tato transfekce byla rovněž provedena po dosažení hustoty 300 000 buněk/plotna. Před uskutečněním transfekce byl buněčný materiál promyt 1 ml čerstvého živného prostředí, obsahujícího 2 % FCS. Bezprostředně po transfekci byl přidán chlorochin (Sigma) do konečné koncentrace v buněčné suspenzi včetně roztoku DNA lOOmikromol. 6 mikrogramů DNA plazmidu pCMVL ve 330 mikrolitrech HBS bylo smíseno s uvedeným množstvím mTfpL, AFpL, pLys290, (gal)4pLl nebo (gal)4pL2, vždy ve 170 mikrolitrech HBS. Po 30 minutách byly komplexy, obsahující DNA, přidány k buněčnému materiálu. Tento materiál byl pak 2 hodiny inkubován při teplotě 37 °C, načež bylo přidáno 1,5 ml živného prostředí, obsahujícího 10% FCS a lOOmikromolu chlorochinu. Po dalších 2 hodinách bylo prostředí pro uskutečnění transfekce nahrazeno 4 ml

-38CZ 293141 B6 čerstvého živného prostředí. Po 24 hodinách byl buněčný materiál oddělen pro stanovení aktivity luciferázy. Hodnoty, které byly pro aktivitu luciferázy naměřeny, jsou uvedeny na obr. 9B, jde o celkovou aktivitu luciferázy v buňkách po transfekci.

Příklad 7

Uložení DNA do T-buněk

a) Způsob výroby konjugátů antiCD7 a polylysinu 190

Roztok 1,3 mg protilátky antiCD7 (Imunotech) v 50 mM HEPES o pH 7,9 se smísí se 49 mikrolitry 1 mM ethanolového roztoku SPDP (Pharmacia). Po 1 hodině při teplotě místnosti se materiál zfiltruje přes sloupec gelu Sephadex G25, k eluci se užije 50 mM pufru HEPES o pH 7,9, čímž se získá 1,19 mg, 7,5 nmol protilátky antiCD7, modifikované 33 nmol pyridyldithiopropionátových zbytků. Poly(L)lysinl90, s fluorescenčním označením pomocí TITC byl modifikován pomocí SPDP analogickým způsobem a pak byl působením dithiothreitolu s následnou filtrací na gelu převeden na modifikovanou formu s obsahem volných merkaptoskupin.

Roztok 11 nmol polylysinu 190, modifikovaného 35 nmol merkaptoskupin v 0,2 ml 30 mM pufru s octanem sodným byl s vyloučením přístupu kyslíku smísen s modifikovanou protilátkou antiCD7 v 0,5 ml 300 mM pufru HEPES o pH 7,9 a směs byla ponechána přes noc při teplotě místnosti. Pak byla molámí koncentrace chloridu sodného upravena přidáváním 5 M chloridu sodného na přibližně 0,6 M. Konjugát byl izolován chromatografií na iontoměniči (Mono S, Pharmacia, 50 mM HEPES o pH 7,3, gradient 0,6 až 3 M chloridu sodného), po dialýze proti 10 mM HEPES o pH 7,3 byly získány odpovídající konjugáty, tvořené 0,51 mg, 3,2 nmol protilátky antiCD7, modifikované 6,2 nmol polylysinu 190.

b) Příprava konjugátů gpl20-polylysin 190

Vazba byla uskutečněna postupy, známými z literatury vazbou thioetheru po modifikaci N-hydroxysukcinimidesterem kyseliny 6-maleimidokapronové (EMCS, Sigma) podle Fujiwara a další, 1981.

Konjugáty gpl20-polylysin 190, vázané pomocí thioetheru

Roztok 2 mg rekombinantního gpl20 v 0,45 ml 100 mM HEPES o pH 7,9 se smísí se 17 mikrolitry 10 mM roztoku EMCS v dimethylformamidu. Po jedné hodině při teplotě místnosti se směs zfiltruje přes sloupec gelu s následným Sephadex G-25, jako eluční činidlo se užije 100 mM pufr HEPES o pH 7,9. 1,2 ml roztoku produktu se pak smísí za nepřístupu kyslíku s roztokem, který obsahuje 9,3 nmol polylysinu 190 s fluorescenčním značením po modifikaci 30 nmol merkaptoskupin, užije se 90 mikrolitrů roztoku s obsahem 30 mM octanu sodného o pH 5,0, roztok se nechá stát přes noc při teplotě místnosti. Pak se molámí koncentrace reakční směsi přidáním 5 M chloridu sodného upraví na 0,6 M této látky. Konjugát se izoluje chromatografií na iontoměniči (Mono s, Pharmacia, 50 mM HEPES o pH 7,3, užije se gradient 0,6 M až 3 M chloridu sodného). Po frakcionaci a dialýze proti 25 mM HEPES o pH 3 se získají tri frakce konjugátu, A, B a C, které obsahují 0,40 mg rgpl20, modifikovaného 1,9 nmolem polylysinu 190 v případě frakce A, 0,25 mg rgpl20, modifikovaného 2,5 nmolem polylysinu 190 v případě frakce B a 0,+ mg rgpl20, modifikovaného 1,6 nmolem polylysinu 190 v případě frakce C.

DNA plazmidu pCMWL (6 mikrogramů na vzorek) se pak uvede do komplexu s uvedeným množstvím polylysinu 90 nebo uvedeným množstvím konjugátu polylysinu v 500 mikrolitrech HBS. Mezitím se připraví podíly buněk H9 (10⁶ buněk v 5 ml RPMI se 2 % FCS) nebo primárních lidských lymfocytů (3 x 10⁶ buněk vlscovem modifikovaném Dulbeccově prostředí IMDM se 2 % FCS). Komplexy polylysinu a DNA se přidají ke každému vzorku buněk. Po

-39CZ 293141 B6 dalších 5 minutách se přidá uvedené množství adenoviru dl312. Pak se buňky inkubují

1,5 hodiny při teplotě 37 °C a pak se přidá 15 ml RPMI v případě buněk H9 nebo prostředí IMDM v případě primárních lymfocytů, ke každému vzorku se přidá ještě 20 % FCS. Buňky se pěstují 24 hodin při teplotě 37 °C, pak se izolují a ke stanovení aktivity luciferázy se zpracovávají 5 stejně jako v předchozích příkladech. Výsledky provedených pokusů jsou znázorněny na obr. 10A pro buňky H9 a na obr. 10B pro primární lymfocyty. V případě buněk H9 poskytoval konjugát protilátky antiCD7 (obr. 10A, sloupec 7 až 9) a konjugát gpl20 (sloupec 10 až 12) nej lepší výsledky, pokud jde o přenos genu, dosažený v přítomnosti adenoviru, přičemž v případě konjugátu gpl20 je možno dosáhnout také v nepřítomnosti adenoviru značné exprese genu pro 10 luciferázu. Je nutno uvést, že v prováděných pokusech byl pouze konjugát gpl20 schopen uskutečnit přenos DNA do primárních lymfocytů, a to ještě pouze v přítomnosti defektivního adenoviru, jak je zřejmé z obr. 10B, sloupec 7 a 8.

Příklad 8

Inaktivace adenovirů

a) Inaktivace ultrafialovým světlem

Preparát adenoviru dl312, připravený a skladovaný tak, jak je uvedeno v úvodu k příkladové části byl uložen do vyhloubení s průměrem 2 cm v plotně pro pěstování buněčných materiálů (300 mikrolitrů/vyhloubení) v ledu ve vzdálenosti 8 cm od 2UV-lamp (Philips TUV15 (G15 T8)). Virus byl ozařován ultrafialovým světlem po dobu, která je uvedena na obr. 11A a podíly každého preparátu byly sledovány na titr viru a také na schopnost, zda a v jakém rozsahu tyto 25 preparáty mohou zesílit přenos genu při použití konjugátů polylysinu a transferinu u HeLa-buněk.

Pěstování buněk a transfekce byly prováděny v podstatě tak, jak již bylo svrchu uvedeno v kapitole „buňky a živná prostředí“. Složky, které byly použity pro transfekci, jsou uvedeny na 30 obr. 11 A. Komplexy DNA z plazmidu pCMVL a 12 mikrogramů TfpL byly připraveny v 500 mikrolitrech HBS a pak bylo přidáno 3 x 110⁵ HeLa buněk v 1 ml prostředí DMEM se 2 % FCS. Po 5 minutách bylo do každé kultury přidáno 54 mikrolitrů preparátu viru a kultura byla inkubována až 2 hodiny při teplotě 37 °C. Pak bylo ke každé kultuře přidání 5 ml prostředí DME s 10% FCS, kultury byly inkubovány 24 hodin při teplotě 37 °C, pak byly kultury ukončeny 35 a buněčný materiál byl vyšetřen na aktivitu luciferázy. Hodnoty, získané pro 54 mikrolitrů neozářeného viru nebyly v oblasti nasycení, to znamená, že zkouška je citlivá na alespoň třikrát vyšší množství viru. Získané hodnoty pro expresi luciferázy jsou uvedeny na obr. 11B jako uzavřené čtverce.

Titr viru pro každý preparát byl stanoven při použití ElA-komplementámí buněčné linie 293. Nejprve bylo připraveno sériové ředění neozářených a ozářených vzorků viru v prostředí DMEM se 2 % FCS. Současně byly připraveny vzorky, obsahující ve vyhloubení s průměrem 2 cm 5 x 10⁴ buněk 293 a 200 mikrolitrů DMEM se 2 % FCS. Podíl 5 mikrolitrů každého ředění byl pro srovnání vždy uložen do druhého vyhloubení. Aby mohlo dojít k vazbě viru na buněčný 45 materiál, byla kultura pěstována 1,5 hodiny při teplotě 37 °C a pak byly do každého vyhloubení přidány 2 ml prostředí DMEM s 10% FCS. Po 48 hodinách byly počítány obsahy buněk v kulturách, aby bylo možno prokázat cytopatický účinek. Ředění viru, při němž je možno na méně než 50 % buněk v kultuře po 48 hodinách pozorovat význam cytopatický účinek je měřítkem relativního množství infekčního viru v každém preparátu viru. Získané hodnoty jsou 50 uvedeny na obr. 11B, jako prázdné čtverečky. Výsledky těchto pokusů prokazují, že při poklesu titru viru 40x při ozáření ultrafialovým zářením dojde pouze ke dvacetinásobnému snížení přenosu genů pro luciferázu. To znamená, že mechanismy, které způsobí infekčnost virů, je možno rozrušit, aniž by byla ovlivněna schopnost viru zesílit přenos genu.

-40CZ 293141 B6

Bylo pozorováno, že při nižších dávkách viru dochází rovněž pouze k malému poklesu zesílení přenosu genů působením tohoto viru, jak je zřejmé z obr. 1 IA, sloupec 3 až 6 a že tento účinek je zřejmější při vyšší dávkách, jak je zřejmé ze sloupců 7 až 10.

b) Inaktivace adenovirů formaldehydem ml preparátu adenovirů byly naneseny na sloupce s obsahem 10 ml G25 (Pharmacia PD 10 G, 25 M), sloupec byl předem uveden do rovnovážného stavu ve 150 mM NaCl, 25 mM HEPES o pH 7,9, 10 % glycerolu, materiál byl na sloupec nanesen v objemu 2,5 ml. Podíly preparátu viru po filtraci na gelu byly inkubovány v ledu bez formaldehydu (0), v přítomnosti 0,01, 0,1 nebo 1 % formaldehydu celkem 20 hodin. Pak byl přidán tris-pufr o pH 7,4 do koncentrace 100 mM a vzorky byly dialyzovány nejprve 2 hodiny proti jednomu litru 150 mM chloridu sodného, 50 mM tris o pH 7,4 s 50 % glycerolu a pak přes noc proti 2 x 1 litr 150 mM chloridu sodného, 20 mM HEPES o pH 7,9 a 50 % glycerolu.

Podíly viru pak byly sledovány při použití buněk 293 na titr, byla užita zkouška CPE na koncový bod nebo zkouška na tvorbu plaků podle Precious a Russel, 1985. Pak byla stanovena účinnost virů, zpracovaných působením formaldehydu na přenos genu v HeLa buňkách (300 000) stejně jako v předchozích příkladech, v nichž je měřena také aktivita luciferázy. 90 mikrolitrů preparátu viru způsobilo přenos DNA, odpovídající více než 10⁸ světelných jednotek. Při zpracování viru 0,01% nebo 0,1% formaldehydem došlo k mírnému poklesu při koncentraci 0,1 %. Při použití 1% formaldehydu sice došlo k podstatnému poklesu účinku na přenos genu, avšak 90 mikrolitrů viru stále ještě vyvolalo expresi genu, odpovídající 10⁴ světelných jednotek.

Při působení 0,1% formaldehydu došlo k poklesu titru viru na 10⁵ PFU (jednotek pro tvorbu plaků), přičemž aktivita luciferázy poklesla pouze o 10%. Výsledky těchto pokusů jsou znázorněny na obr. 12A.

c) Inaktivace adenovirů působí kombinace ultrafialového světla a delší vlnovou délkou a 8-methoxypsoralenu

Podíly čištěného preparátu viru byly upraveny na koncentraci 8-methoxypsoralenu 0,33 mikrogramů/ml (zásobní roztok má koncentraci 33 mikrogramů/ml této látky v DMSO) a po uložení do ledu bylo na preparát působeno ze vzdálenosti 4 cm zdrojem ultrafialového záření s vlnovou délkou 365 nm (UVP Model TL-33). Doba ozařování byla 15 až 30 minut, jakje zřejmé z obr. 12B. Vzorky pak byly naneseny na sloupec s náplní gelu Sephadex G-25 (Pharmacia, PD-10), v rovnovážném stavu s HBS + 40 % glycerolu a získaný materiál se pak uloží při teplotě -70 °C. Preparáty viru se pak zkoumají jednak na schopnost zesílit přenos genu při použití komplexu pCMVL/hTfpL v HeLa buňkách (znázorněno jako světelné jednotky, pravá osa na obr. 12B) a také neschopnost replikace v buňkách 293 (titr viru, levá osa na obr. 12B).

Příklad 9

Transfekce buněk NIH3T3 virem moloney

V tomto i v následujících příkladech bude prokázáno zesílení intemalizace komplexu DNA s konjugátem transferin a polylysin při použití retrovirů a pokud není uvedeno jinak, jsou použity následující materiály a metody:

Konjugát transferin-polylysin 190 a komplex DNA a tohoto konjugátu se získávají jako v předchozích příkladech s tím rozdílem, že se komplex připravuje v objemu 50 mikrolitrů mM chloridu sodného, 20 mM HEPES o pH 7,4.

-41 CZ 293141 B6

Buňky NH3T3 se pěstují v prostředí DMEM s přísadou 10% FCS, 100 M.J./ml penicilinu, 100 mikrogramů/ml streptomycinu a 2 mM glutaminu. Pro transfekci se užije 5 až 7 x 10⁵ buněk na jednu láhev T25 v době 18 až 24 hodin před transfekci. Těsně před uskutečněním transfekce se buněčný materiál uloží do čerstvého živného prostředí a přidají se různé složky k provedení 5 transfekce v následujícím pořadí: 100 mikromol chlorochinu, komplex DNA a konjugátu polylysinu a transferinu a preparát retroviru. Buňky se pak inkubují 4 hodiny při teplotě 37 °C, pak se prostředí vymění a po dalších 24 hodinách se buňky oddělí. Extrakty se připraví třemi cykly zmrazením s následným roztáním. Podíly extraktu, standardizované na určitý obsah bílkovin se pak zkoumají na aktivitu luciferázy tak, jak bylo vysvětleno v předchozích příkladech.

Za uvedených podmínek byla uskutečněna transfekce 10⁶ buněk NIH3T3 při použití komplexu DNA a TfpL v přítomnosti 100 mikroM chlorochinu nebo bez chlorochinu, jak je znázorněno na obr. 13. Bylo prokázáno, že v nepřítomnosti chlorochinu dosahuje hodnota aktivity luciferázy pouze hodnoty pozadí, jak je zřejmé ze sloupce 1, kdežto v přítomnosti chlorochinu je možno 15 prokázat vysokou expresi reporterového genu pRSVL, jak je zřejmé ze sloupce 2. Stoupající množství leukemického viru moloney v případě současného podání s komplexem DNA k buněčnému materiálu způsobí stoupání exprese genu pro luciferázu. Na bor. 13 jsou uvedena množství v ml.

Příklad 10

Zkouška na zvýšení přenosu genu působením retroviru

Preparát viru, který byl použit v přikladu 9 byl surový, nefrakcionovaný supematant buněk, 25 u nichž dochází k expresi retroviru. Aby bylo možno prokázat, zda zvýšení ukládání DNA, dosažené tímto preparátem viru je skutečně způsobeno virem, byl svrchu uvedený supematant podroben dialýze a čištění za současné koncentrace, přičemž došlo ke koncentraci supematantu retroviru, který je na výkrese naznačen zkratkou RVS celkem desetkrát. V případě, že zesílení je způsobeno retrovirem, měla by účinnost materiálu, zadrženého membránou i v případě, že se bere 30 v úvahu inaktivace nejlabilnějších retrovirů v průběhu koncentrace odpovídat přibližně lOnásobku původní účinnosti supematantu. Stejně jako v předchozím příkladu bylo 10⁶ buněk NIH3T3 podrobeno transfekci za podmínek, které jsou uvedena na obr. 14. Z obr. 14 je zřejmé, že účinek, který je zesilován přenos genů, je způsoben materiál, který byl zadržen membránou. Bylo použito 20 až 600 mikrolitrů v drahách 3 až 6. Mimoto bylo prokázáno, že 200 a 600 mikrolitrů desetkrát 35 koncentrovaného preparátu má přibližně poloviční účinnost jako 2 až 6 ml původního nekoncentrovaného preparátu retroviru, jak je zřejmé z drah 7 a 8.

Současně byly provedeny také pokusy s lidskou buněčnou linií K562, tato linie nemá žádný receptor pro ekotropní nižší retrovirus. Jak bylo očekáváno, nedošlo k žádnému zesílení exprese 40 genu.

Příklad 11

Vliv vzájemného působení transferinu a jeho receptorů na účinek na přenos genu při použití viru 45 moloney

Aby bylo možno vyloučit možnost, že přenos komplexu TfpL/pRSVL do buněk je způsoben nespecifickou vazbou polylysinu na retrovirus a aby bylo možno dále vyjasnit vstupní mechanismy, byl retrovirus zkoumán na svou schopnost usnadnit vstup DNA plazmidu do buňky 50 v případě, že tato DNA je uvedena do komplexu pouze s polylysinem. Použití množství polylysinu odpovídalo optimálnímu množství, tak jak bylo již dříve stanoveno, toto množství působí úplnou kondenzací DNA plazmidu a blíží se tomu množství polylysinu, které se užívá v konjugátu polylysinu a transferinu podle Wagner a další,1991a. Pokusy, jejichž výsledky jsou znázorněny na obr. 15 potvrdily, že v případě nepřítomnosti chlorochinu nedochází k expresi

-42CZ 293141 B6 reporterového genu ani ve formě komplexu TfpL-pRSVL, ani ve formě komplexu pL-pRSVL, jak je zřejmé ze sloupců 1 a 2. Naproti tomu v přítomnosti retroviru došlo k expresi DNA reporterového genu ve formě komplexu TfpL, avšak nikoliv ve formě komplexu pL-DNA, jak je zřejmé z porovnání sloupců 3 a 4 se sloupci 5 a 6. Dále je z výsledků provedených pokusů zřejmé, že v přítomnosti přebytku volného transferinu dochází k poklesu přenosu DNA, usnadněného retrovirem, jak je zřejmé ze sloupců 7 a 8. Také tyto výsledky podporují předpoklad, že vzájemné působení transferinu a jeho receptoru hraje důležitou úlohu při zesílení příjmu DNA, které je způsobeno retrovirem.

Příklad 12

Vliv hodnoty pH na přenos genu, způsobený retrovirem

Pokusy, provedené v rámci tohoto příkladu měly prokázat, zda hodnota pH má nějaký vliv na schopnost retrovirů zesilovat přenos genu. Pokusy s transfekci byly prováděny stejným způsobem jako v předchozích příkladech. Aby bylo možno stanovit, zdaje nízká hodnota pH podstatná pro vliv na přenos genu, byly použity oba dobře charakterizované inhibitory poklesu hodnoty pH v endozomech, monensin a chlorid amonný. Vycházelo se z předpokladu, že obě tyto látky by pak měly ovlivnit přenos genu v případě, že by pro působení retroviru na přenos genu bylo podstatné nízké pH v endozomech. V případě, že by za tento účinek byly zodpovědné jiné mechanismy, zejména přímá fúze na povrchu cytoplazmy, tak jak tomu je v případě vstupního mechanismu pro virus HIV, neměly by uvedené látky mít žádný negativní účinek a mohly by mít i zesilující účinek v případě, že by měnily cestu pro příjem komplexu TfpL-DNA. Výsledky provedených pokusů, které jsou znázorněny na obr. 16, podporují druhý předpoklad. Byl zkoumán účinek obou uvedených látek na přenos TfpL-DNA a bylo prokázáno, že ani jedna z obou sloučenin nemůže svou funkcí nahradit chlorochin. Při vysokých koncentracích chloridu amonného bylo možno pozorovat mírný vzestup exprese genu pro luciferázu, jak je zřejmé ze sloupců 1 až 5. Retrovirus sám o sobě působil mírné zesílení přenosu DNA, jak již bylo pozorováno v předchozích příkladech a jak je zřejmé z dráhy 6. Silnější vzestup bylo možno pozorovat v případě, že byl retrovirus použit v přítomnosti 1 mikroM monensinu, jak je zřejmé z dráhy 7. Poněkud slabší účinek bylo možno pozorovat pří vyšší koncentraci monensinu v dráze 8, stejně jako v přítomnosti chloridu amonného, jak je zřejmé z drah 9 a 10.

Příklad 13

Zesílení přenosu genu vlivem konjugátu transferinu při použití N-terminálního endozomolytického peptidů z hemaglutininu HA2 chřipkového viru

a) Syntézu peptidů

Byl syntetizován peptid s řetězcem (řetězec č. 1):

Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-GlyGly-Gly-Cys při použití Fmoc (fluorenylmethoxykarbonylové metody) podle publikace Atherton a další, 1979, při použití syntetizátoru peptidů (Applied Biosystems 431 A). Ochrannými skupinami na postraních řetězcích byly terč, butyl v případě Cys, Glu a Asp a trityl v případě Asn. Po vazné reakci byl proveden ninhydrinový test, který prokázal stupeň vazby vyšší než 98% v každém z provedených stupňů. Počínaje od aminokyseliny 19 byla provedena vždy dvojnásobná vazba. N-terminální skupiny Fmoc byly odstraněny působením 20% piperidinu v NMP (N-methylpyrrolidon) z části peptidů, vázané na pryskyřici. Pak byly frakce s ochrannými skupinami Fmoc i frakce bez ochranných skupin promyty dichlormethanem DCM a sušeny ve vysokém vakuu. Bylo získáno 293,6 mg peptidové pryskyřice, prosté Fmoc a 36,5 mg peptidové pryskyřice s ochrannými skupinami Fmoc. 111,1 mg peptidové pryskyřice, prosté Fmoc se štěpí 1,5 hodiny působením kyseliny trifluoroctové, při tomto štěpení se užije směs

-43CZ 293141 B6 ml TFA, 0,75 g fenolu, 300 mikrolitrů ethandithiolu EDT, 250 mikrolitrů ethylmethylsulfidu Et-A-Me a 500 mikrolitrů vody. Peptid se zfíltruje k odstranění pryskyřice přes skleněný sintr. Pryskyřice se promyje DCM a přidá se k filtrátu. Filtrát se odpaří na objem přibližně 2 ml a pak se po kapkách za míchání směs přidá ke 40 ml etheru. Sraženina peptidů se odstředí a etherový supematant se odloží. Sraženina se promyje 3 x 40 ml etheru a suší ve vysokém vakuu. Získá se 58 mg surového produktu, který se rozpustí ve 3,5 ml 20 mM uhličitanu amonného s 300 mikrolitry 25% amoniaku v 1 litru. Roztok se při použití téhož pufru zfíltruje přes sloupec s náplní Sephadex G-25 (Pharmacia PD-10). Získaný materiál se nanese na sloupec s náplní materiálu Mono Q (Pharmacia, 100 x 14 mm), načež se použije gradientu 0 - 10 minut 100% A, 10 100 minut 0 - 100 % B. A: 20 mM hydrogenuhličitanu amonného + 300 mikrolitrů amoniaku na litr, B: A + 3 M chloridu sodného. Měření se provádí při 280 nm, Trp—fluorescence se sleduje při 354 nm, rychlost průtoku 1 mol/min. Produkt se vymývá při použití 1 M chloridu sodného. Hlavní fáze ze sloupce mono Q se dále čistí pomocí HPLC v reverzní fázi při použití sloupce BIORAD-HI-Pore RP-304 s rozměry 250 x 10 mm. Užije se gradient 50 až 100% pufru B prvních 12,5 minut, pak v průběhu 12,5 až 25 minut 100% B. A: 20 mM hydrogenuhličitanu amonného + 300 mikrolitrů amoniaku/litr, B: A v 98% methanolu, rychlost průtoku 3 ml/min, měření při 237 nm. Produkt vychází ze sloupce při použité 100 % B. Frakce produktu se odpaří na odpařovači Speedvac, znovu se rozpustí v pufru A a pak se lyofílizují. Výtěžek je 8,4 mg produktu, čištěného pomocí HPLC ve formě, v níž je cysteinový zbytek chráněn, tento peptid byl označen „PÍ6“. Aby bylo možno peptid znovu získat ve volné merkaptoformě, byla sloučenina s terc.butylovou ochrannou skupinou zpracovávána působením směsi thioanisolu, ethandithiolu, kyseliny trifluoroctové a kyseliny trifluormethansulfonové v poměru 2 : 1:40:3, kyselina trifluormethansulfonová byla přidána v uvedeném poměru jako poslední složka. Po působení této směsi po dobu 30 minut byl peptid izolován vysrážením působením etheru s následnou filtrací na gelu Sephadex G-25 při použití svrchu uvedeného pufru A v argonové atmosféře.

b) Vazba peptidů chřipkového viru na polylysin bl) Přímá vazba přes SODP (sikcinimidylpyridyldithiopropionát)

19,8 mg polylysin(pL)300-hydrochloridu (Sigma) se zfíltruje na sloupci gelu Sephadex G-25 (Pharmacia PD-10) v octanu sodném při pH 5, aby byly odstraněny nízkomolekulámí frakce. Na základě ninhydrinové zkoušky byla koncentrace pL po filtraci na gelu 3,16 mg/ml. Hodnota pH roztoku byla nastavena na 7 až 8 přidáním 1M hydroxidu sodného. Ke 2,5 ml roztoku pL s obsahem 7,9 mg pL, 0,13 mikromol, se přidá 0,64 mikromol SPDP (Pharmacia) ve formě 40 mM roztoku v absolutním ethanolu. Toto množství odpovídá molámímu poměru SPDP: pL 5 : 1. Směs se nechá reagovat přes noc a pak se zfíltruje na sloupci gelu G-25 při použití 20 mM hydrogenuhličitanu amonného o pH 8,2. Po redukci podílu filtrátu přidáním dithiothreitolu DTT je možno měřením množství thiopyridonu prokázat, že reakce je zcela ukončena. 0,3 mikromol pL-SPDP (vztaženo na mikromol SPDP) se v objemu 2,212 ml nechá reagovat s 0,35 mikromol peptidů ve thiolové formě. Bílá sraženina, která vznikne po smísení peptidů a PÍ se rozpustí tak, že se roztok upraví na 2 M guanidinhydrochloridu a reakce se nechá probíhat přes noc. Fotometrickým měřením množství thiopyridonu v reakční směsi je znovu možno prokázat úplné ukončení reakce. Pak se směs dvakrát dialyzuje proti 2 litrům 20 mM HEPES/0,5 M guanidinhydrochloridu. Získaný roztok se nanese na sloupec Mono S s rozměrem 0,7 x 6 cm (Pharmacia), použije se gradientu v prvních 0 až 20 minutách 100 % A, 20 až 140 minut 0 až 100 % B: A: 20 mM HEPES o pH 7,3/0,5 M guanidinhydrochloridu, B: 20 mM HEPES o PH 7,3/3 M guanidinhydrochloridu, rychlost průtoku 0,3 ml/min. Stanovení bylo prováděno při 280 nm a fluorescenční stanovení při 354 nm, nastavení při 280 nm. Frakce produktu, k jejíž eluci došlo při použití 1,5 M guanidinhydrochloridu byla dialyzována proti 2x2 litrům HBS. Následné stanovení koncentrace pL ninhydrinovým testem prokázalo koncentraci přibližně 1,14 mg/ml. Množství peptidů v roztoku konjugátu bylo vypočítané z jeho absorpce při 280 nm, molámí poměr peptidů a pL byl 4 : 1.

-44CZ 293141 B6 b2) Vazba přes polyethylenglykolový vazný řetězec

14,6 mg pL 300 ve formě hydrobromidu (Sigma) bylo zfiltrováno na gelu tak, jak je uvedeno v odstavci bl). Na základě ninhydrinového testu byla koncentrace pL po filtraci na gelu 5 4,93 mg/ml Hodnota pH roztoku byla nastavena na 7 až 8 přidáním 1 M hydroxidu sodného.

K 2,7 ml roztoku pL (13,3 mg pL = 0,22 mikromol) se přidá 4,33 mikromol SPDP (Pharmacia) ve formě 30 mM roztoku v absolutním ethanolu. Toto množství odpovídá molámímu poměru SPDP a pL 20 : 1. Po 1,5 hodinách reakce se reakční směs zfiltruje na sloupci s obsahem gelu Sephadex G-25 ve směsi 0,1 M octanu sodného a 3 M guanidinhydrochloridu. Po redukci podílu 10 filtrátu působením DTT se stanoví množství thiopyridonu, je možno prokázat 3,62 mikromol

SPDP ve frakci produktu. Pak se pL, modifikovaný SPDP redukuje tak, že se k roztoku přidá mg DTT. Po 2 hodinách redukce se roztok znovu zfiltruje za svrchu uvedených podmínek přes sloupec s obsahem G-25. Stanovení thiolu pomocí Ellmannova testu prokázalo koncentraci thiolu 3,15 mikromol ve 2,224 ml vzorku.

17,62 mg, 5 mikromol bis(6-aminohexyl)polyoxyethylenu, POE (Sigma) se rozpustí v 500 mikrolitrech 20 mM hydrogenuhličitanu sodného 3 M guanidinhydrochloridu o pH 7 až 8 a směs se nechá reagovat s 13,8 mg, 44,7 mikromol N-hydroxysukcinimidesteru kyseliny etamaleimidokapronové (Sigma), rozpuštěné ve 300 mikrolitrech dimethylformamidu, DMF. Po 20 30 minutách se roztok zfiltruje přes sloupec gelu G-25 ve směsi 20 mM hydrogenuhličitanu sodného a 3 M guanidinhydrochloridu. Fotometrické stanovení maleimidoskupiny při 300 nm prokázalo koncentraci 6,36 mikromol zreagovaného EMCS ve 2 ml roztoku.

K 1,049 ml tohoto roztoku (odpovídá 3,34 mikromol ENCS) se po kapkách za intenzivního 25 promíchávání míchacím zařízením v proudu argonu přidá 1,39 mikromol peptidu ve formě thiolu ve 2,5 ml směsi 20 mM hydrogenuhličitanu sodného a 3 M guanidinhydrochloridu. Po 15 minutách již nebylo možno pomocí Ellmannova testu prokázat ve vzorku žádné volné thiolové skupiny.

Roztok redukovaného pL, modifikovaného SPDP se přidáním 1M hydroxidu sodného upraví na hodnotu pH 7 až 8. 1,373 ml tohoto roztoku se při intenzivním promíchávání míchacím zařízením přidá ke svrchu uvedené reakční směsi. Molámí poměr peptidu v SH-formě, POE-EMCS a pL-SH je 1 : 2,4 : 1,4 (vztaženo na EMCS popřípadě SH). Po 2,5 hodinách reakce již není možno pomocí Ellmannova testu prokázat žádné volné thiolové skupiny. Materiál se pak dialyzuje přes noc při 2 1 20 mM HEPES o pH 7,3 a 0,6 M chloridu sodného a pak se materiál nanese na sloupec Mono S při použití gradientu 0 až 20 minut 22 % A, 20 až 150 minut 22 až 100 % B. A: 20 mM HEPES o PH 7,3, B: A + 3 M chloridu sodného, rychlost průtoku 0,3 ml/min. Měření bylo prováděno při 280 nm, fluorescenční měření při 354 nm. Produkt, k jehož eluci dochází při použití 1,5 až 1,6 M chloridu sodného se dialyzuje proti 2 litrům HBS. Stanovení koncentrace pL pomocí ninhydrinového testu a fotometrické stanovení koncentrace peptidu při 280 mm prokazuje vypočítaný poměr peptidu a pL 12 : 1 při koncentraci pL 0,49 mg/ml v celkovém objemu vzorku 4,5 ml.

c) Příprava liposomů

Pomocí metody REV (odpařování v reverzní fázi) byly připraveny liposomy podle publikace Szoka a Papahadjopoulos, 1978, Straubinger a Papahadjopoulos, 1983. Vodná fáze 10 mM HEPES o pH 7,3, 100 mM kalceinu a 150 mM chloridu sodného a organická fáze, roztok 300 mikromol L-alfa-lecithinu (z vaječného žloutku, převážně palmitoyloleoylfosfatidylcholin, 50 Avanti Polar Lipids) ve 260 mikrolitrech chloroformu se odpaří při použití rotačního odpařovače.

Pak se materiál suší ve vysokém vakuu, načež se znovu rozpustí ve 3 ml diethyletheru. 1 ml vodné fáze se důkladně promísí s etherovou fází při použití míchacího zařízení a směs se zpracovává 5 minut při teplotě 0 °C působením ultrazvuku z generátoru ultrazvuku (Badtyp). Po 30 minutách v ledu se materiál zpracovává ještě 10 minut působením ultrazvuku. Výsledná stálá

-45CZ 293141 B6 emulze se pak pomalu odpařuje při použití rotačního odpařovače. Po odstranění diethyletheru při tlaku 10 kPa se přidá 0,75 ml vodné fáze. Zbývající stopy etheru se odstraní dalším odpařováním 30 minut při tlaku 5 kPa. Získá se 1,7 ml emulze, která se odstředí při 500 ot/min a pak se nechá projít polykarbonátovou membránou (Nucleopore) s průměrem otvorů 0,1 mikrometrů, čímž se získá výsledný objem 0,7 ml roztoku liposomů. Tyto liposomy se zbaví materiálu, který do nich není uzavřen pomocí filtrace na sloupci gelu Sephadex G-50 (Pharmacia), užije se objem 23 ml gelu a lOmM HEPES o pH 7,3 se 150 mM chloridu sodného. Odebere se 6 frakcí po 500 mikrolitrech. Fosfor v lipidech se stanoví způsobem podle publikace Bertlerr, 1959 při použití koncentrace 2 mM.

d) Zkouška na propustnost liposomů

Uvolnění obsahu liposomů (propustnost) se měří podle výstupu uzavřeného kalceinu na základě výsledného ředění, které podle publikace Bondeson a další, 1984 způsobí samovolné potlačení fluorescence. Fluorescence kalceinu se měří spektrálním fluorimetrem Kontron SMF 25, nastavení při 490 nM, emise při 515 nm. K. uvedenému účelu se vzorky s objeme 100 mikrolitrů svrchu uvedeného roztoku liposomů stokrát zředí přidáním 0,1 M octanu sodného nebo pufrem s obsahem 10 mM HEPES a 150 mM chloridu sodného s odpovídající hodnotou ph 4,3, 4,5, 5,0, 6,0 a 7,3 tak, aby vzorek měl objem 1 ml. K tomuto roztoku se pak přidá 2,5 mikrogramů peptidu ve formě, chráněné terc.butylovými skupinami, 1 mikrogram/mikrolitr roztoku v HBS, roztok se ukládá do kyvet za míšení proudem argonu, konečná koncentrace peptidu je 400 nM. Fluorescence kalceinu se měří po určitých časových intervalech po přidání peptidu. Hodnota pro 100% propustnost liposomů se stanoví po přidání 2 mikrolitrů prostředku Triton X-100 (Fluka).

Tyto předběžné pokusy byly uskutečněny ktomu účelu, aby bylo možno měřit fluorescenci kalceinu po přidání konjugátů peptidu a pL k roztoku liposomů. 2,5 mikrogramy konjugátu (1 mikrogram/mikrolitr, koncentrace je vztažen pouze na množství pL) se přidá k 1 ml roztoku liposomů, konečná koncentrace je 20 mM modifikovaného peptidu. Analogickým způsobem se stanoví propustnost také při použití 2,5 mikrogramů konjugátu peptidu a polylysinu po inkubaci s 5 mikrogramy DNA po dobu 15 minut.

Bylo prokázáno, že peptid je schopen způsobit uvolnění obsahu liposomů pouze v oblasti kyselého pH, jak je zřejmé z obr. 17. Konjugát peptidu byl účinný při podstatně nižší hodnotě pH, přičemž při neutrální hodnotě pH již bylo možno pozorovat silný účinek, který bylo možno ještě dále zesílit snížením hodnoty pH.

Při tvorbě komplexu konjugátu s DNA došlo k vymizení účinnosti při neutrální hodnotě pH, kdežto při kyselé hodnotě pH byl komplex stále ještě velmi účinný.

e) Transfekce buněk K562

Buňky K562 byly pěstovány v suspenzi v živném prostředí RPMI 1640 (Gibco BRL se 2 g hydrogenuhličitanu sodného/litr) s 10 % FCS, 100 MJ/ml penicilinu, 100 mikrogramu/ml streptomycinu a 2 mM glutaminu až do hustoty 500 000 buněk/ml. 12 až 20 hodin před transfekci byl buněčný materiál přenesen do čerstvého živného prostředí s obsahem 50 mikroM desferioxaminu (toto opatření mělo zajistit zvýšení počtu receptorů pro transferin). V den transfekce byl buněčný materiál oddělen, uveden do suspenze v čerstvém živném prostředí s obsahem 10% FCS a 50 mikroM desferioxaminu při hustotě 250 000 buněk/ml a vždy 2 ml suspenze byly použity pro jednu plotnu s 24 vyhloubeními.

mikrogramů DNA plazmidu pCMVL ve 160 mikrolitrech HBS bylo smíseno s množstvím konjugátu TfpL, uvedeným na obr. 18, nebo s pL300 ve 160 mikrolitrech HBS a po 15 minutách byla přidána uvedená množství konjugátu peptidu chřipkového viru a pL (P16pL), po dalších 15 minutách byla směs přidána k buňkám K.562. Pak byl buněčný materiál inkubován 24 hodin při teplotě 37 °C, načež byl oddělen pro stanovení aktivity luciferázy. Aktivita luciferázy byla

-46CZ 293141 B6 stanovena stejným způsobem jako v předchozích příkladech. Hodnoty, které jsou uvedeny na obr. 18, jsou hodnoty pro Celkovou účinnost luciferázy u buněk pro transfekci.

f) Transfekce HeLa buněk

HeLa-buňky byly pěstovány v miskách s průměrem 6 cm tak, jak je uvedeno v kapitole „Buňky a živná prostředí“. Transfekce byla prováděna po dosažení hodnoty 300 000 buněk na misku. Před transfekci byl buněčný materiál inkubován v 1 ml čerstvého živného prostředí s obsahem 2 % FCS.

mikrogramů DNA zplazmidu pCMVL ve 160 mikrolitrech HBS bylo smíseno s množstvím konjugátu PfpL, uvedeným na obr. 19 nebo s pL300 nebo se směsí obou těchto látek vždy v objemu 169 mikrolitrů HBS. Po 15 minutách byla přidána uvedená množství konjugátu peptidu chřipkového viru a pL (P16pL) a po dalších 15 minutách byla směs přidána k buňkám. Buněčný materiál byl inkubován 2 hodiny při teplotě 37 °C a pak bylo přidáno 2,5 ml čerstvého živného prostředí s 10 % FCS. Pak byly buňky inkubovány ještě 24 hodin při 37 °C, načež byly odděleny pro stanovení aktivity luciferázy. Tato hodnota byla stanovena stejným způsobem jako v předchozích příkladech. Hodnoty, uvedené na obr. 19 jsou hodnoty pro celkovou aktivitu luciferázy u buněk po transfekci.

Příklad 14

Zesílení přenosu genu, vyvolaného konjugátem transferinu pomocí dalšího N-terminálního endozomolytického hemaglutininového HA2-peptidu z chřipkového viru

a) Příprava konjugátů peptidu a polylysinu

Peptid s řetězcem (řetězec č. 2) Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-GlyTrp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys, označení p41 byl syntetizován obdobným způsobem jako peptid, popsaný v příkladu 13a). Vazba peptidu na polylysin pL300 byla provedena stejně jako v příkladu 13 bl) vazbou přes SPDP. Tímto způsobem byly získány konjugáty s molámím poměrem peptidu a polylysinu 4:1.

b) Transfekce HeLa buněk pomocí konjugátů, obsahujících peptid chřipkového viru

HeLa buňky byly, jak již bylo uvedeno, pěstování v miskách s průměrem 6 cm, transfekce byla uskutečněna po dosažení hustoty buněk 300 000 buněk/miska. Před transfekci byly buňky inkubovány v 1,5 ml čerstvého živného prostředí s obsahem 2 % FCS. 6 mikrogramů DNA plazmidu pCMVL ve 160 mikrolitrech HBS (150 mM chloridu sodného, 20 mM HEPES o pH 7,3) bylo přidáno spolu se 6 mikrogramy konjugátu TfpL19OB ve 160 mikrolitrech HBS, po 15 minutách bylo přidáno ještě 10 mikrogramů konjugátu peptidu chřipkového viru a polylysinu, p41pL nebo pro srovnání 18 mikrogramů konjugátu peptidu chřipkového viru a polylysinu P16pL podle příkladu 13, jak je znázorněno na obr. 20. Uvedená množství obou konjugátů peptidů byla použita pro zjištění, zda jsou tato množství optimální pro zesílení přenosu genu. Po dalších 15 minutách byla přidána směs buněk. Po 24 hodinách byly buňky odděleny k provedení zkoušky na luciferázu. Hodnoty, znázorněné na obr. 20A představují celkovou účinnost luciferázy u buněk po transfekci. Při srovnání pokusů, provedených s oběma konjugáty bylo možno prokázat, že k více než 3,5násobnému zesílení přenosu genu došlo při použití konjugátu peptidu P41pL.

c) Transfekce buněk BNL CL.2 při použití konjugátu peptidu chřipkového viru

Buňky BNL C1.2 byly pěstovány způsobem, který byl popsán v příkladu 6. Peptid chřipkového viru P41 byl konjugován s polylysinem 300 při molámím poměru peptidu a polylysinu 1:1,3:1 a 8 : 1. K. buněčnému materiálu pak byly přidány komplexy, vytvořené ze 6 mikrogramů DNA

-47CZ 293141 B6 plazmidu pCMVL a 20 mikrogramů konjugátu. Pro srovnání bylo použito ještě 20 mikrogramů pL300 nebo 20 mikrogramů konjugátu pl6 a polylysinu, připraveného způsobem podle příkladu 13. Pak byly buňky inkubovány 4 hodiny při teplotě 37 °C, načež byly přidány 2 ml živného prostředí s obsahem 18 % FCS. Po 24 hodinách byly buňky odděleny k provedení zkoušky na luciferázu, výsledky této zkoušky jsou znázorněny na obr. 20B. Při zkoušce na propustnost liposomů, jejíž výsledek je znázorněn na obr. 20C a která byla provedena způsobem, popsaným v případu 13, bylo prokázáno, že účinnost konjugátu (množství odpovídalo 2,5 mikrogramům polylysinu, pH 5) se zvyšovala s obsahem peptidů v konjugátu (na obr. 20C je peptid P41 označen jako „influ2“).

Příklad 15

Transfekce HeLa buněk pomocí konstrukce s obsahem reporterového genu pro beta-galaktosidázu a stanovení exprese beta-galaktosidázy in šitu

a) Pěstování a transfekce buněk

Pro transfekci se pěstují HeLa buňky v živném prostředí DMEM s obsahem 5 % FCS, penicilinu, streptomycinu a glutaminu obdobným způsobem, jako bylo uvedeno v předchozích příkladech, k pěstování se užijí misky s průměrem 3 cm a buněčný materiál se postupem při použití krycích sklíček při hustotě buněk 3 x 10⁴/miska.

Pro transfekci se vytvoří komplex při použití 6 mikrogramů konstrukce s obsahem reporterového genu pro beta-galaktosidázu (pCMV-beta-gal) ve 160 mikrolitrech HBS a 12 mikrogramů TpfL190B ve 160 mikrolitrech HBS a směs se inkubuje 30 minut při teplotě místnosti.

V dalším pokusu se inkubuje 6 mikrogramů pCMV-beta-gal ve 160 mikrolitrech HBS se 6mikrogramy TfpL190B v 80 mikrolitrech HBS 15 minut při teplotě místnosti. Pak se přidá 12 mikrogramů konjugátu peptidů chřipkového viru, P16gL, připraveného podle příkladu 13, v 80 mikrolitrech HBS a výsledná směs se inkubuje ještě 15 minut. Tyto komplexy DNA a polykationtové sloučeniny se pak smísí s 1 ml prostředí DMEM se 2 % FCS, antibiotiky a glutaminem tak, jak bylo uvedeno svrchu. Aby bylo možno prokázat účinek chlorochinu a adenoviru na stupeň transfekce, byl v dalších pokusech k prostředí s obsahem komplexu DNA a polykationtové sloučeniny přidáván ještě chlorochin do konečné koncentrace 100 mikroM nebo bylo přidáváno 50 mikrolitrů zásobního roztoku adenoviru dl312C.

Pro transfekci se původní živné prostředí od buněčného materiálu oddělí a přidá se 1 ml prostředí, obsahujícího komplex DNA, případně v přítomnosti chlorochinu nebo viru. Po době inkubace 2 hodiny při teplotě 37 °C se k buněčnému materiálu přidá ještě 1 ml prostředí DME s obsahem 10 % FCS, antibiotik a glutaminu a směs se inkubuje další 2 hodiny. Pak se prostředí znovu odstraní a buněčný materiál se pěstuje ve 3 ml čerstvého živného prostředí DMEM s 10 % FCS, antibiotiky a glutaminem.

b) Zkouška na beta-galaktosidázu hodin po transfekci se prostředí odstraní, buněčný materiál se promyje roztokem chloridu sodného s fosfátovým pufrem, PBS a pak se fixuje 5 minut při teplotě místnosti při použití 0,5% glutardialdehydu v PBS. Pak se fixační prostředek odstraní a buněčný materiál se promyje PBS, načež se inkubuje s barvicím roztokem, který obsahuje 10 mM fosfátového pufru o pH 7,0, 150mM chloridu sodného, 1 mM chloridu hořečnatého, 3,3 mM feríkyanidu draselného.3H₂, 3,3mM K₃Fe(CN)₆ a 0,2% 5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-galaktopyranosidu, inkubace trvá 20 minut až 3 hodiny při teplotě 37 °C podle publikace Lim a Chae, 1989. Pak se krycí sklíčka opláchnou PBS, vodou a 96% ethanolem, usuší a překryjí Mowiolem na podložce pro objekt mikroskopu. K analýze se použije mikroskop Zeiss Axiophot.

-48CZ 293141 B6

Na obr. 21 jsou uvedeny mikrofotografie ve zvětšení 112x. A: HeLa-buňky po transfekcí 6 mikrogramy pCMV-beta-gal ve formě komplexu se 12 mikrogramy TfpL190B. Barevná reakce na beta-galaktosidázu se vytvořila v průběhu 3 hodin. Je zřejmé, že u velmi malého množství buněk (55 buněk, skupina buněk je označena šipkou) dochází k expresi enzymu beta-galaktosidázy. B. HeLa-buňky po transfekcí 6 mikrogramy pCMV-beta-gal ve formě komplexu se 6 mikrogramy TfpL190B a 12 mikrogramy P16pL. Barevná reakce probíhá 3 hodiny. U malého množství 250 buněk dochází k expresi genu pro beta-galaktosidázu. Reakce je o něco silnější než v případě A. C: HeLa-buňky po transfekcí 6 mikrogramy pCMV-beta-gal ve formě komplexu se 6 mikrogramy TfpL19OB a 12 mikrogramy P16pL v přítomnosti lOOmikroM chlorochinu. Barevná reakce trvá 3 hodiny. V tomto případě má více než 1000 buněk silně pozitivní reakci. D: HeLa-buňky po transfekcí 6 mikrogramy pCMV-beta-gal ve formě komplexu s 12 mikrogramy TÍL19OB v přítomnosti adenoviru dl312. Barvení trvalo 20 minut. Téměř všechny buňky, více než 90 % těch buněk má pozitivní reakci. E: HeLa-buňky bez transfekce jako kontrola na specifičnost reakce na beta-galaktosidázu. Doba barvení byla 3 hodiny.

Příklad 16

Transfekce HeLa-buněk při použití kosmidu o velikosti 48 kb v přítomnosti volného adenoviru

a) Příprava kosmidu, obsahujícího kódový řetězec pro luciferázu

Fragment Sáli o velikosti 3,0 kb, obsahující řetězec s kódem pro luciferázu zP. pyralis pod řízením promotoru RSV byl navázán při použití plazmidu p22RSV Lucalfa do jediného místa působením enzymu Sáli klonu kosmidu Cl-7al za vzniku konkatamerů. Klon Cl-7al obsahuje fragment Sau3A o velikosti 37 kb DNA lidského genomu po částečném rozštěpení, tento fragment obsahuje kódový řetězec pro gen, který se pak klonuje v místě štěpení BamHI kosmidu pW15 (Stratagene) jako vektoru. Produkt vazné reakce se pak užije k infekci částic fágů v E. coli MN544 a materiál se nanese na plotny LB amp. Rekombinanty byly zjištěny pomocí hybridizace kolonií při použití fragmentů Sáli o velikosti 3,0 kb, značených ³²P s použitím náhodných primerů jako hybridizační sondy a pozitivní kolonie se analyzují pomocí restrikčních enzymů. Konstrukce typu kosmidu CosLuc, obsahující jedinou kopii fragmentu Sáli se pěstuje a čistí při použití gradientu cezia, celková velikosti je 48 kb. Malý kontrolní kosmid pWELuc o velikosti 12 kb se připraví rozštěpením CosLuc působením Notl, pak se uskuteční zpětná vazba, transformace bakterií a izolace správného plazmidu. Tímto způsobem se získá molekula DNA o velikosti 12 kb, v níž chybí část uloženého fragmentu DNA lidského genolu a část vazného řetězce z CosLuc. Plazmid pSPNeoLuc o velikosti 8 kb je plazmid, popsaný v příkladu 5 s obsahem fragmentu genu pro RSV-luciferázu (fragment Apal/Pvul plazmidu pRSVL, klonovaný v místě působení Clal plazmidu pUC v jeho mikrologu).

b) Transport kosmidu do HeLa-buněk

HeLa-buňky v množství 3 x 10⁴ buněk na jednu misku s průměrem 6 cm, překryté 1 ml prostředí DMEM se 2 % FCS byly inkubovány s komplexy TfpL/DNA, připravenými podle úvodních odstavců příkladové části, komplexy obsahovaly uvedená množství hTfpL, vodného polylysinu a DNA. Mimoto bylo k inkubační směsi přidáno lOOmikroM chlorofilu (sloupce 1 a 2) nebo lOmikrolitrů adenoviru dl312 s obsahem 5 x 10¹¹ částic na ml (sloupec 3 až 12). Směs se inkubovala 2 hodiny při teplotě 37 °C a pak se ke každé misce přidají 4 ml prostředí DMEM s 10 % FCS. Po dalších 24 hodinách se buněčný materiál oddělí a měří se účinnost luciferázy. Výsledky jsou uvedeny na obr. 22A.

-49CZ 293141 B6

c) Transport kosmidu do buněk neuroblastomu

Buňky buněčné linie neuroblastomu s označením GI-ME-N podle Donti a další, 1989 v množství 1 x 10⁶ buněk na misku s průměrem 6 cm, překryté 1 ml prostředí DMEM se 2 % FCS se zpracovávají působením komplexů TfpL/DNA, připravených svrchu uvedeným způsobem a obsahujících uvedená množství hTfpL, volného polylysinu s DNA. Mimoto se do inkubační směsi přidá 100 mikroM chlorochinu (sloupec 3 a 4) nebo 10 mikrolitrů adenoviru dl312 s obsahem 5 x 10¹¹ částic na ml (sloupec 5 a 6). Směs se inkubuje 2 hodiny při teplotě 37 °C a pak se do každé misky přidají 4 ml prostředí DMEM s 10 % FCS. Po 24 hodinách se buněčný materiál oddělí a měří se aktivita luciferázy. Výsledky této zkoušky jsou znázorněny na obr. 22B.

Příklad 17

Přenos genu při použití chemicky vázaných konjugátů adenoviru a polylysinu

a) Příprava konjugátu adenoviru a polylysinu pomocí chemické vazby

2,35 ml roztoku adenoviru dl312 s obsahem částic 10¹¹ po filtraci na gelu Sephadex G-25 PD10 (Pharmacia) ve 150 mM chloridu sodného/25 ml HEPES o pH 7,9/10% glycerolu se smísí s 10 mikrolitry, 10 nmol roztoku 1 mM SPDP (Pharmacia). Směs se nechá stát 3,5 hodiny při teplotě místnosti a pak se modifikovaný virus oddělí od přebytečného reakčního činidla filtrací na gelu stejným způsobem jako svrchu. Získá se 2,5 ml roztoku, který se propláchne argonem a pak se nechá reagovat s vyloučením přístupu kyslíku pod argonem se 42 mikrolitry roztoku s obsahem 1 nmol polylysinu, značeného FITC a modifikovaného pomocí 2,3 nmol merkaptopropionátových skupin, materiál byl připraven způsobem podle EP 388 758. Po 18 hodinách stání při teplotě místnosti se polovina roztoku přenese do zkumavky pro odstředivky, opatrně se podvrství 1 ml roztoku chloridu cezného s obsahem 1,33 g/ml této látky a pak se směs odstředí 2 hodiny při teplotě místnosti a při 35 000 ot/min při použití rotoru SW60. Pásy viru se oddělí jako frakce v chloridu cezném s objemem 200 mikrolitrů a zředí se na objem 1 ml přidáním HBS s 50 % glycerolu. Zkouška na vazbu DNA se pak provádí s použitím 300 mikrolitrů modifikovaného viru. Roztok viru se zředí 1 ml HBS a smísí se se 100 mikrolitry roztoku DNA, značené ³⁵S (15 ng pRSVL, příprava translací). Jako kontrola se provádí tentýž pokus se stejným množstvím nemodifikovaného viru dl312. Po 30 minutách se vzorky přenesou do zkumavek pro odstředivku, rovněž se opatrně podvrství 1 ml roztoku chloridu cezného s obsahem 1,33 g/ml této látky a směs se odstředí 2 hodiny při teplotě místnosti a při 35 000 otáčkách za minutu při použití rotoru SW60. Získaný gradient se rozdělí na 5 frakcí. Frakce 1 s objemem 1 ml, frakce 2 s objemem 0,6 ml a frakce 3 až 5 po 200 mikrolitrech. Pak se stanoví radioaktivita vždy ve 200 mikrolitrech jednotlivých frakcí, výsledky jsou znázorněny na obr. 23. Je zřejmé, že ve frakcích s obsahem viru, to znamená ve frakcích 3 až 5 a převážně ve frakci 3 je možno prokázat podstatně vyšší radioaktivitu než u kontrolního pokusu, tento jev je zřejmě způsoben specifickou asociací adenoviru, modifikovaného při použití polylysinu s radioaktivně značeným vzorkem DNA.

b) Transfekce buněk K.562

Buňky K.562, ATCC CCL 243 se pěstují v suspenzi v živném prostředí RPMI 1640 (Gibco BRL se 2g hydrogenuhličitanu sodného na litr) s 10% FCS, lOOMJ/ml penicilinu, lOOmikrogramy/ml streptomycinu a 2 mM glutaminu až do hustoty 500 000 buněk/ml. 12 až 20 hodin před transfekcí se buněčný materiál přenese do čerstvého živného prostředí s obsahem 50 mikroM desferioxaminu (toto opatření bylo zvoleno pro dosažení většího počtu receptorů pro transferin). V den transfekce se buněčný materiál oddělí, uvede se do suspenze v čerstvém živném prostředí, které obsahuje 10 % FCS a 50 mikroM desferioxaminu při hustotě buněk 250 000/ml a materiál se rozdělí vždy po 2 ml na jednu plotnu se 24 vyhloubeními. Pak se přimísí uvedená množství DNA plazmidu pCNVL (6, 0,6, nebo 0,06 mikrogram) ve 100 mikrolitrech HBS s 50 mikrolitry

-50CZ 293141 B6 konjugátu polylysin-adenovirus, pLAdeno, a popřípadě odpovídající množství 35 mikrolitrů adenoviru dl312 v kontrolním pokusu. Po 20 minutách se přidá odpovídající množství (12, 1,2 nebo 0,12 mikrogramů) konjugátu TfpL190B ve 150 mikrolitrech HBS. Po dalších 20 minutách se směs přidá k buňkám K562. Buněčný materiál se inkubuje 24 hodin při teplotě 37 °C a pak se buněčný materiál oddělí pro stanovení účinnosti luciferázy. Tato účinnost se stanoví stejným způsobem jako v předchozích příkladech. Hodnoty, uvedené na obr. 24 jsou hodnoty pro celkovou aktivitu luciferázy u buněk po transfekci.

c) Transfekce HeLa-buněk

Jedním ze způsobů, jak prokázat účinnost konjugátu polylysinu a viru je zkouška na schopnost konjugátu zajistit transport velmi malého množství DNA, nižšího než 1 mikrogram. Vyšší kapacitu pro transport DNA je možno očekávat v případě, že je adenoviru přímo vázán na DNA, kondenzovanou působením polylysinu vzhledem k tomu, že intemalizační faktory, to znamená transferin a bílkovina adenoviru, jsou v tomto případě v asociaci s DNA, která má být transportována. Aby bylo možno prokázat správnost tohoto předpokladu, bylo uvedeno do komplexu stálé množství konjugátu polylysinu a adenoviru (2,5 mikrolitrů, přibližně 5 x 10⁷ částic viru) s různým množstvím, 3 a 0,0003 mikrogramy receptorového plazmidu ve 475 mikrolitrech HBS. Po 15 minutách inkubace při teplotě místnosti bylo přidáno ke každému vzorku odpovídající množství transferinu a polylysinu v závislosti na množství DNA. Uvedená množství TgfpL byla zvolena tak, aby bylo možno zajistit úplnou elektroneutralitu 50 % DNA plazmidu a současně vytvořit prostor pro vazbu konjugátu viru a polylysinu. Po přidání TgfpL byly získané směsi inkubovány 15 minut a pak byla každá směs uložena do misky s průměrem 6 cm a s obsahem 300 000 HeLa-buněk v 1 ml prostředí DMEM se 2 % FCS. Pak byl buněčný materiál inkubován

1.5 hodiny při teplotě 37 °C a pak byly přidány 4 ml prostředí DMEM s 10 % FCS. Paralelně byla uvedena do komplexu ekvivalentní množství DNA s dvojnásobným hmotnostním přebytek TfpL (množství, jehož je zapotřebí pro úplnou kondenzaci DNA) a pak byl materiál použit pro přenos genu do HeLa-buněk jako takový nebo v přítomnosti 25 mikrolitrů adenoviru dl312, nenavázaného na polylysin. Po 24 hodinách byl buněčný materiál oddělen, byly připraveny extrakty a jejich podíly byly zkoumány na aktivitu luciferázy. Výsledky těchto pokusů jsou znázorněny na obr. 25. V nepřítomnosti adenoviru není možno pozorovat při použití 0,3 mikrogramů DNA žádnou aktivitu luciferázy. Adenoviru, vázaný i nevázaný na polylysin byl v případě velkého množství DNA, 3 nebo 0,3 mikrogramy účinný. V případě nenavázaného adenoviru byl však prokázán přibližně lOOkrát nižší účinek při použití DNA v množství 0,03 mikrogramů, takže pro toto množství DNA byla účinnost již zanedbatelná. Na rozdíl od tohoto vzorku si virus, vázaný na polylysin uchovává svou schopnost usnadnit přenos genu při použití 0,003 i 0,0003 mikrogram DNA: Toto množství DNA odpovídá přibližně 100 molekulám DNA na jednu buňku a přibližně jedné částici viru na molekulu DNA.

Příklad 18

Přenos genu pomocí adenoviru, enzymaticky vázaného na polylysin

a) Enzymatická reakce ml preparátu adenoviru, kmen d 1312, 5 x 10¹⁰ PFU/ml se nanese na sloupec pro gelovou filtraci s náplní Sephadex G-25 (Pharmacia) v rovnovážném stavu s 25 ml pufru pro reakci, který obsahuje 0,1 M tris-HCl o pH 8,0, 2 mM DTT a 30 % glycerolu. Eluce se provádí při použití

3.5 ml reakčního pufru. Reakční směs pro enzymatickou vazbu obsahuje 1150 mikrolitrů frakce viru po eluci, 0,5 nmol transglutaminázy TG za jater morčete (Sigma), 2 nmol nebo 20 nmol polylysinu 290, lOmM chloridu vápenatého a reakční pufr do konečného objemu 1500 mikrolitrů. Reakce se nechá probíhat jednu hodinu při teplotě 37 °C a pak se zastaví přidáním 30 mikrolitrů 0,5 M EDTA. Pro kontrolu specifičnosti vazby se nechá reagovat také vzorek reakční směsi bez transglutaminázy. Nenavázaný polylysin se od viru oddělí odstředěním při

-51 CZ 293141 B6 použití gradientu chloridu cezného s obsahem 1,33 g/ml této látky, 170 000 g, 2 hodiny. Frakce s obsahem viru se oddělí, přidá se k nim stejný objem glycerolu, frakce se pak zmrazí v kapalném dusíku a uschovají pro další použití při teplotě -70 °C.

b) Průkaz vazby polylysinu na adenoviry

Reakce se provádí při použití polylysinu, značeného ^l2’I pomocí Bolton-Hunterova reakčního činidla (Amersham) stejným způsobem jako svrchu. Po odstředění při použití gradientu chloridu cezného se frakce viru oddělí a znovu dělí při použití dalšího gradientu chloridu cezného. Pak se materiál podrobí frakcionaci a radioaktivita se ve všech frakcích stanoví pomocí scintilačního počítače. Výsledky jsou znázorněny na obr. 26 a prokazují, že v případě použití TG (dl312/TGpL) je frakce viru obohacena o radioaktivní polylysin. Při kontrole bez TG (dl312/pL) nebylo možno pozorovat žádné obohacení virové praxe o radioaktivní polylysin.

c) Zkoušky frakcí adenoviru, modifikované polylysinem na účinek těchto frakcí na účinnost transfekce

i) Buňky a živná prostředí

Pro transfekci bylo uloženo 5 x 10⁵ buněk (jatemí buňky myší, ATC č. TIB 73) v prostředí DMEM spolu s 10% fetálního telecího séra, inaktivovaného teplem, TCS, 2mM glutaminu, 100 MJ/ml penicilinu a 100 mikrogram/ml streptomycinu do misek s průměrem 6 cm.

ii) Tvorba komplexů viru, DNA a transferinu mikrolitrů virové frakce, modifikované polylysinem se smísí se 6 mikrogramy DNA plazmidu pCMVL v 10 mikrolitrech HBS a směs se inkubuje 20 minut při teplotě místnosti. Pak se ke směsi přidá 8 mikrogramů konjugátu myšího transferinu a polylysinu 290B (mTfpL) a směs se ještě 10 minut inkubuje.

iii) Transfekce myších jatemích buněk

Komplex viru, DNA a transferinu se smísí s 1,5 ml prostředí DMEM se 2 % FCS, 2 mM glutaminu a antibiotiky a směs se přidá k buněčnému materiálu po oddělení původního živného prostředí. Po inkubaci 2 hodiny při teplotě 37 °C se k buněčnému materiálu přidají 2 ml prostředí DME s 10 % FCS, glutaminem a antibiotiky. Pak se buňky pěstují ještě další 2 hodiny, prostředí se odstraní a k buněčnému materiálu se přidají 4 ml čerstvého prostředí DMEM s 10% FCS, glutaminem a antibiotiky.

iv) Stanovení exprese luciferázy hodin po transfekci se buněčný materiál oddělí a stanovení aktivity luciferázy se uskuteční svrchu uvedeným způsobem.

Jak je zřejmé z obr. 27, v němž jsou uvedeny výsledky tohoto stanovení,bylo nejsilnější exprese 153 540 000 světelných jednotek dosaženo v případě preparátů virů, v nichž byl adenoviru zpracován pomocí TG a 20 nmol polylysinu (dl312/TG-20 nmol pL). Preparáty viru sTG a 2 nmol polylysinu (dl312/TG-2 nmol pL) byly poněkud méně účinné a bylo naměřeno 57 880 000 světelných jednotek. Kontrolní frakce, u níž bylo užito adenovirů s 20 nmol polylysinu, avšak bez TG, byla přibližně 500x méně účinná. Pro srovnání byly pro transfekci použity ještě komplexy s obsahem výchozího preparátu adenoviru, který nebyl podroben působení TG ani působení polylysinu, D1312. Při použití těchto preparátů bylo dosaženo účinnosti 4 403 000 světelných jednotek.

-52CZ 293141 B6

d) Zvýšení účinnosti transfekce při použití adenovirů, modifikovaných polylysinem ve srovnání s nemodifikovanými adenoviry, zvláště při použití nižšího množství DNA

Transfekce byla provedena obdobným způsobem jako v příkladu 3c), přičemž pro tvorbu komplexu bylo užito 50 mikrolitrů frakce adenovirů dl312/TG-20 nmol pL a 6 mikrogramů pCMVL/8 mikrogramů mTfpL, 0,6 mikrogramů pCMV-Luc/0,8 mikrogramů mTfpL nebo 0,06 mikrogramů pCMVL/0,08 mikrogramů mTfpL. Pro srovnání byla provedena také transfekce při použití 6, 0,6 nebo 0,06 mikrogramů komplexu pCMVL/mTfpL a nemodifikovaného adenoviru dl312. Prokázalo se, že při použití komplexu adenovirů, modifikovaných polylysinem bylo možno ještě při použití nízkého množství DNA dosáhnout vysoké úrovně exprese, kdežto při použití nemodifikovaných adenovirů došlo k silnému poklesu exprese, jak je zřejmé z obr. 28.

Příklad 19

Přenos genu při použití konjugátu, v nichž je adenovirů a polylysin vzájemně vázán přes biotinstreptavidinový můstek

a) Biotinylace adenovirů dl312

2,4 ml roztoku adenovirů dl312 s obsahem přibližně 10¹¹ částic po filtraci na gelu Sephadex G-25 PD10 (Pharmacia), ve 150 mM chloridu sodného/5 mM HEPES o pH 7,9/10 % glycerolu se smísí s 10 mikrolitry, 10 nmol 1 mM roztoku NHS-LC-biotinu (Pierce 21335). Po 3 hodinách při teplotě místnosti se virus, modifikovaný biotinem oddělí od přebytku reakčního činidla filtrací na gelu stejným způsobem jako svrchu. Roztok se upraví přidáváním glycerolu na koncentraci glycerolu 40 % (celkový objem 3,2 ml) a pak se uchovává při teplotě -25 °C. Biotinylaci viru je možno prokázat kvalitativně tak, že se kapky různého ředění nanesou na membránu z nitrátu celulózy. Po usušení 2 hodiny při teplotě 80 °C ve vakuu v sušicí peci, po blokování pomocí BSA, inkubaci s alkalickou fosfatázou, konjugovanou s streptavidinem, BRL, promytí a inkubaci 1 hodinu s vyvíjecím roztokem, obsahujícím NBT/X-fosfát (tetrazolylová sůl nitromodři/toluidinová sůl 5-brom-4-chlor-3-indolylfosfátu, Boehringer Mannheim) je možno prokázat pozitivní barevnou reakci.

b) Příprava konjugátů streptavidin-polylysin

Vazba streptavidinu na polylysin byla uskutečněna způsobem podle publikace Wagner a další, 1990 a podle EP-A1 388 758.

nmol. 4,7 mg streptavidinu v 1 ml 200 mM HEPES o pH 7,9 a 300 mM NaCl se smísí sl5mM, 236 nmol ethanolového roztoku SPDP. Po 1,5 hodině při teplotě místnosti se modifikovaná bílkovina podrobí filtraci na gelu Sephadex G-25 ve sloupci, čímž se získá 75 nmol streptavidinu, imodifikovaného 196 nmol diethiopyridonového vazného řetězce. Modifikovaná bílkovina byla uvedena do reakce se 75 nmol polylysinu, modifikovaného 3-merkaptopropionátovými skupinami (průměrná délka řetězce 290 lysinových monomerů, modifikovaných 190 nmol merkaptopropionátového vazného řetězce) ve 2,6 ml 100 mM HEPES o pH 7,9, 150 mM chloridu sodného v argonové atmosféře. Konjugáty byly izolovány chromatografií na sloupci kationtoměniče Mono S HR5 (Pharmacia). Bylo užito gradientu 20 až 100 % pufru. Pufr A: 50 nM HEPES o pH 7,9, pufr B: pufr A s 3 M chloridu sodného. Frakce produktu byla získána při koncentraci soli v rozmezí 1,2 M a 1,7 M. Při dialýze proti HBS (20 mM HEPES o pH 7,3, 150 mM chloridu sodného) se získá konjugát, tvořený 45 nmol streptavidinu a 53 nmol polylysinu.

-53CZ 293141 B6

c) Transfekce HeLa-buněk

HeLa-buňky byly pěstovány v miskách s průměrem 6 cm způsobem, uvedeným v příkladu 1.

Transfekce byla uskutečněna po dosažení hustoty buněk 300 000/miska. Před transfekcí byl buněčný materiál inkubován s 1 ml čerstvého prostředí s obsahem 2 % FCS.

mikrogramů DNA plazmidu pCMVL ve 100 mikrolitrech HBS se smísí s 0,8 mikrogramů konjugátu streptavidin-polylysin ve 170 mikrolitrech HBS. Po 20 minutách se přidají 3 mikro10 litry polylysinu pL300 ve 170 mikrolitrech HBS. Po dalších 20 minutách se přidá ještě 65 mikrolitrů biotinylovaného adenoviru nebo jako kontrola odpovídající množství 30 mikrolitrů adenoviru dl312, jde o výchozí virus před modifikací. Směsi komplexu („biotinAdV/komplex A“ nebo „kontrolní AdV“, obr. 29) se nechají stát ještě 20 minut.

Komplex je možno vytvořit také tak, že se nejprve smísí 65 mikrolitrů biotinylovaného adenoviru s 0,8 mikrogramy konjugátu streptavidin-polylysin v 50 mikrolitrech HBS, po 20 minutách se přidá ještě 6 mikrogramů DNA plazmidu pCMVL ve 170 mikrolitrech HBS a po dalších 20 minutách se přidají ještě 3 mikrolitry polylysinu pL300 ve 200 mikrolitrech HBS (komplex „biotinAdV/komplex B“).

0,6 mikrogramů DNA plazmidu pCMVL v 67 mikrolitrech HBS se smísí s 0,3 mikrogramy konjugátu streptavidin-polylysin ve 33 mikrolitrech HBS. Po 20 minutách se přidá ještě 65 mikrolitrů biotinylovaného adenoviru nebo jako kontrola odpovídající množství 30 mikrolitrů adenoviru dl312, jde o výchozí viru před modifikací. Komplexy („biotinAdV/komplex A“ nebo 25 „kontrolní AdV“, obr. 29) se nechají stát ještě 20 minut a pak se zředí přidáním HBS na objem

500 mikrolitrů. Komplex je možno vytvořit také tak, že se nejprve 65 mikrolitrů biotinylovaného adenoviru smísí s 0,3 mikrogramy konjugátu streptavidin-polylysin v 50 mikrolitrech HBS, po 20 minutách se přidá ještě 0,6 mikrogramů DNA plazmidu pCMVL v 50 mikrolitrech HBS. Vzniklý komplex („biotinAdV/komplex B“) se nechá stát dalších 20 minut a pak se přidáním 30 HBS zředí na 500 mikrolitrů.

Směs se přidají k buněčnému materiálu, který se pak inkubuje 2 hodiny při teplotě 37 °C a pak se přidá 2,5 ml čerstvého prostředí s 10 % FCS. Pak se buňky inkubují ještě 24 hodin při teplotě 37 °C a pak se oddělí pro stanovení účinnosti luciferázy. Stanovení se provádí obdobným 35 způsobem jako v předchozích příkladech. Hodnoty, které jsou uvedeny na obr. 29 jsou hodnoty pro celkovou účinnost luciferázy u buněk po transfekci.

Paralelně byla prováděna také transfekce HeLa-buněk tak, že jako virová složka konjugátu byl použit biotinylovaný virus, který byl inaktivován působením psoralenu a ultrafialového světla. 40 Inaktivace byla uskutečněna následujícím způsobem. Vždy 200 mikrolitrů biotinylovaného viru bylo uloženo do dvou vyhloubení misky s průměrem 1,6 cm. Ke každému vzorku byly přidány 2 mikrolitry 8-methoxypsoralenu v DMSO s obsahem 33 mg/ml této látky, miska byla uložena do ledu a vzorek byl 10 minut ozařován zdrojem ultrafialového světla (365 nm, lampa UVP TL-33), přičemž vzdálenost vzorku od filtru byla 4 cm. Po ozáření byly oba vzorky spojeny 45 a podrobeny filtraci na gelu G50 (Pharmacia), sloupec se předběžně uvede do rovnovážného stavu ve 40% glycerolu a HBS. Podíly po 75 mikrolitrech se uvedou do komplexu s 0,8 mikrogramy konjugátu streptavidin-polylysin a použijí k transformaci HeLa buněk svrchu popsaným způsobem.

Zkouška na cytopatický účinek bylo stanoveno, že titr viru klesl inaktivací o faktor vyšší než 10⁴, kdežto schopnost přenosu při vysoké koncentraci poklesla o méně než 50 % a při nižších koncentracích pouze pětkrát.

-54CZ 293141 B6

d) Transfekce buněk K562

Buňky 562 byly pěstovány v suspenzi v živném prostředí RPMI 1640 (Gibco BRL, se 2 g hydrogenuhličitanu sodného na litr) s 10% FCS, lOOMJ/ml penicilinu, 100 mikrogramů/ml streptomycinu a 2 mM glutaminu až do hustoty 500 000 buněk na ml. 16 hodin před transfekcí se buněčný materiál přenese do čerstvého prostředí s obsahem 50 mikroM deferioxaminu (Sigma). V den transfekce se buněčný materiál přenese do čerstvého prostředí při hustotě 250 000 buněk/ml, prostředí obsahuje 10% FCS a 50 mikroM deferioxaminu, načež se 2 ml výsledné suspenze uloží vždy do jedné plotny, obsahující 24 vyhloubení.

Připraví se tři různé druhy komplexů DNA:

a) roztok 6 mikrogramů DNA plazmidu pCMVL ve 160 mikrolitrech HBS (150 mM chloridu sodného, 20 mM HEPES o pH 7,3) se smísí s 12 mikrogramy konjugátu TfpL190B ve 160 mikrolitrech HBS, po 30 minutách se přidá 20 mikrolitrů adenovirů d 1312 a výsledná směs se přidá k buněčnému materiálu.

b) Roztok 900 ng konjugátu streptavidin-polylysin ve 160 mikrogramech HBS se spolu s 20 mikrolitry biotinylovaného adenovirů, připraveného ve stupni a) důkladně promísí, pak se po 30 minutách přidá ještě roztok 6 mikrogramů DNA plazmidu pCMVL ve 160 mikrolitrech HBS a po dalších 30 minutách se roztok smísí s 10 mikrogramy konjugátu TfpL190 ve 160 mikrolitrech HBS. Po 30 minutách se směs přidá k buněčnému materiálu.

c) Komplexy DNA se připraví stejným způsobem jako u postupu b) s tím rozdílem, že se místo TfpL190B přidá roztok 3,5 mikrogramů poly(L)lysinu p(Lys)290. Buněčný materiál se inkubuje 24 hodin při teplotě 37 °C a pak se oddělí pro stanovení luciferázy. Hodnoty, uvedené na obr. 30 jsou hodnoty pro celkovou aktivitu luciferázy u buněk po transfekcí.

Příklad 20

Přenos genu v primárních buňkách kostní dřeně

a) Izolace buněk kostní dřeně

Primární buňky kostní dřeně myší se získají tak, že se živným prostředím IMDM s obsahem 10 % FCS, 5 x 10'⁵M beta-merkaptoethanolu, 1 % IL-3 prostředí a antibiotika pomocí injekční jehly s průměrem 0,4 nebo 0,5 mm, spojené s ampulí s objemem 1 ml propláchne stehenní nebo holenní kost myši. Buněčný materiál se pak promyje živným prostředím tak, že se suspenze odstředí 8 minut při 100 g. Pak se buňky znovu uvedou do suspenze v množství 10⁷ buněk/ml a nanesou do lahví T25 pro pěstování buněčných kultur. Po 4 hodinách se buňky, které k živnému prostředí nepřilnou, přenesou do nových lahví T25 a v nich se pěstují před noc v přítomnosti 50 mikroM deferioxaminu.

b) Tvorba komplexu adenovirus-transferin-polylysin/DNA

Pro tvorbu komplexu se inkubuje 50 mikrolitrů biotinylovaného adenovirů se 400 ng polylysinu modifikovaného streptavidinem ve 20 mikrolitrech HBS celkem 20 minut. Pak se přidá 20 mikrolitrů HBS s obsahem 6 mikrogramů plazmidu pCMVL. Po době inkubace 20 minut se přidá ještě 7 mikrogramů konjugátu myšího transferinu a polylysinu (mTfpL) ve 160 mikrolitrech HBS a výsledná směs se inkubuje ještě 20 minut.

-55CZ 293141 B6

c) Transfekce

Pro transfekci se buněčný materiál z kostní dřeně oddělí od živného prostředí odstředěním 8 minut při 100 g. Usazenina buněk se smísí se 3 ml živného prostředí s obsahem 2 % FCS a 250 mikrolitrů komplexu adenovirů, transferinu, polylysinu a DNA a buňky se pěstují v nové lahvi T25 celkem 3 hodiny při teplotě 37 °C. Pak se přidají 3 ml a po 2 hodinách ještě 6 ml živného prostředí, obsahujícího 10 % FCS.

d) Stanovení exprese genu pro luciferázu hodin po transfekci se buněčný materiál oddělí a stanoví se exprese genu pro luciferázu stejným způsobem jako v předchozích případech. V tomto případě vedle transfekce k účinnosti luciferázy, která odpovídá hodnotám 310 x 10³ světelných jednotek/100 mikrogramů celkového obsahu buněčné bílkoviny.

Příklad 21

Transfekce neuroblastomových buněk kosmidem o velikosti 48 kb v přítomnosti volného adenovirů a konjugátu adenovirů a polylysinu

Buňky buněčné linie s označením GI-ME-N byly podrobeny transfekci způsobem podle příkladu 16 při použití kosmidu o velikosti 48 kb a uvedeného množství pTfpL, volného polylysinu a DNA. Mimoto bylo k inkubovaným směsím přidáno 100 mikroM chlorochinu ve sloupcích 3 a 4 nebo 10 mikrolitrů adenovirů dl312 s obsahem 5 x 10¹¹ částic na ml ve sloupcích 5 a 6. K posledním dvěma vzorkům ve sloupcích 7 a 8, (StpL/biotin) bylo přidáno 15 mikrolitrů biotinylovaného adenovirů dl312 s obsahem 1 x 10¹¹ částic a vzorky byly inkubovány 30 minut s 0,8 mikrogramy konjugátu streptavidin-polylysin, připraveného podle příkladu 19, ve 150 mikrolitrech HBS. Pak bylo přidáno 6 mikrogramů DNA ve 150 mikrolitrech HBS, vzorky byly ponechány 30 minut při teplotě místnosti a pak bylo přidáno ještě 150 mikrolitrů HBS s obsahem 6 mikrogramů hTfpL s 1 mikrogramem volného pL. Po dalších 30 minutách inkubace při teplotě místnosti byla směs přidána k buněčnému materiálu. Pak byla směs inkubována ještě 2 hodiny a pak byly do každé misky přidány 4 ml prostředí DMEM s 10 % FCS. Po dalších 24 hodinách byl buněčný materiál oddělen a byla měřena účinnost luciferázy. Výsledky jsou shrnuty na obr. 31.

Příklad 22

Přenos genu u buněk primárního epitelu dýchacích cest

Předběžné pokusy, provedené ke zjištění, zda by nebylo možno uskutečnit genetickou úpravu cystické fibrózy prokázaly, že imortalizované buněčné linie, odvozené od epitelu dýchacích cest je možno podrobit přenosu genu způsobem posle vynálezu. Aby bylo možno vyloučit skutečnost působení tohoto jevu na epitel dýchacích cest, byly pokusy s konjugátem transferinu a polylysinu prováděny také na primárních epitelových buňkách dýchacích cest (1°AE).

Buňky 1°EA byly získány způsobem podle publikace Yankaskas a další, 1987, ze vzorků nosních polypů nemocných. Tkáně byly promyty sterilním roztokem chloridu sodného a pak byly buňky přeneseny do Joklikova minimálního základního prostředí MEM s přísadou antibiotik, a to 50mJ/ml penicilinu, 50 mikrogramů/ml streptomycinu a 40 mikrogramů/ml gentamycinu při teplotě 4 °C. Přebytečná chrupavka a podslizniční tkáň byly uvolněny a odstraněny a vrstva epitelu byla inkubována v roztoku proteázy (Sigma, typ 14, 0,1 mg/dl) v prostředí MEM při teplotě 4 °C celkem 16 až 48 hodin. Pak bylo přidáno 10 % fetálního síra skotu FBS k neutralizaci proteázy a buněčný materiál byl uvolněn místným pohybem. Získaná suspenze buněk byla

-56CZ 293141 B6 zfiltrována přes nylonovou mřížku s průměrem ok 10 mikrometrů, aby bylo možno odstranit buněčnou drť a pak byl materiál odstředěn 5 minut při 150 g a promyt prostředím F12 s 10 % FBS.

Pak byl buněčný materiál zpracován konjugátem transferin-polylysin (hTfpL) a mimoto plazmidem pRSVL s kódovým řetězcem pro luciferázu jako reportérovým genem. Při tomto pokusu neměly primární buňky pro tento komplex stejnou citlivost jako odpovídající imortalizované buněčné linie (pozadí = 429 světelných jednotek, po přidání konjugátu bylo dosaženo 543 světelných jednotek), což znamená, že buňky 1°AE jsou poměrně chudé na receptory pro transferin.

Aby bylo možno u těchto buněk využít jiný receptor, byly použity biotinylované vzorky adenoviru podle příkladu 19. U buněk, zpracovaných pomocí tohoto konjugátu bylo možno pozorovat podstatně zvýšenou expresi proti hodnotným pozadí, bylo dosaženo 2 585 735 ± 453 585 světelných jednotek. Mimoto bylo prokázáno také pro primární buňky epitelu dýchacích cest jiných živočišných druhů, že je tímto způsobem možno dosáhnou u tohoto materiálu přenosu genu, například u myši bylo dosaženo 3 230 244 ± 343 153 a u opic bylo dosaženo 53 498 880 ± 869 481 světelných jednotek.

Příklad 23

Přenos genu u jatemích a krevních buněk

V pokusech, provedených v tomto příkladu byly použity následující materiály a metody.

Transfekce buněk tkáňových kultur

Buňky buněčné linie BNL CL.2 byly pěstovány způsobem, popsaným v příkladu 6. HeLa-buňky a hepatocyty byly pěstovány v Petriho miskách s průměre 6 cm. Transfekce byla uskutečněna při hustotě přibližně 3 x 10⁵ buněk v jedné misce. Před transfekcí bylo standardní prostředí pro pěstování kultur nahrazeno 1 ml čerstvého prostředí se 2 % FCS.

Tvorba binárních komplexů

Biotinylované adenoviry s obsahem přibližně 10⁹ PFU podle příkladu 19a) a 19b) byly uvedeny do reakce s 800 ng polylysinu, modifikovaného streptavidinem v 50 mikrolitrech HBS. Po 30 minutách při teplotě místnosti bylo přidáno 6 mikrogramů DNA plazmidu pCNVL ve 170 mikrolitrech HBS, směs byla inkubována ještě 30 minut a pak byly přidány 3 mikrogramy pL300 ve 200 mikrolitrech HBS a po dalších 30 minutách byl roztok použit pro transfekcí.

Tvorba temámích komplexů

Biotinylované adenoviry s obsahem přibližně 10⁹ PFU byly uvedeny do reakce s 800 ng polylysinu, modifikovaného streptavidinem v 50 mikrolitrech HBS. Po 30 minutách při teplotě místnosti bylo přidáno 6 mikrogramů DNA plazmidu pCMVL ve 170 mikrolitrech HBS, směs byla inkubována 30 minut a pak bylo přidáno 10 mikrogramů TfpL19OB ve 200 mikrolitrech HBS a po dalších 30 minutách byl roztok použit pro pokusy na transfekcí.

Zkouška na beta-galaktosidázu

Buňky BNL CL.2 byly naneseny na krycí sklíčka a podrobeny transfekcí po dobu 24 hodin při použití reporterového plazmidu pCMV-beta-gal podle publikace Lim a Chae, 1989. Po 48 hodinách byl proveden test na beta-galaktosidázu způsobem podle příkladu 15.

-57CZ 293141 B6

a) Spojení mezi kondenzátem DNA a adenovirem může do značné míry způsobit zesílení exprese reporterového genu pro luciferázu

Výsledky přenosu DNA do jatemích buněk při použití binárních a temámích komplexů DNA je znázorněno na obr. 32. Je zřejmé, že přenos genu je zesílen v přítomnosti volného adenoviru. Sloupec s označením pLdenoV/TfpL uvádějí výsledky transfekce při použití adenoviru, který byl pomocí transglutaminázy konjugován s polylysinem a pak byl uveden do reakce s DNA, v níž došlo k neutralizaci části negativních nábojů. Později byl přidán konjugát transferinu a polylysinu, který neutralizoval zbývající negativní náboje. Tímto způsobem byl vytvořen temámí komplex adenovirus-polylysin/transferin-polylysin/DNA. Jak je z výkresu zřejmé, byla dosažena výjimečně vysoká hodnota 1,5 x 10⁹ světelných jednotek, což odpovídá přibližně 5000 světelným jednotkám na jednu buňku. Ve sloupci, kteiý je označen adenov+pL+TfpL byly smíseny adenovirus a polylysin stejně jako v případě použití transglutaminázy. Aby bylo možno prokázat specifičnost vazby polylysinu na viru při použití transglutaminázy, byl enzym v tomto případě vynechán. Pak byl viru uveden do komplexu se stejným množstvím DNA a TfpL jako v případě pLAdeno/TfpL. V tomto případě došlo k menšímu stupni transfekce než při použití AdenoV+TfpL, v obou pokusech byla lokalizace viru a komplexu DNA/transferin-polylysin stochastickým postupem na rozdíl od pokusu ve sloupci s označením pLAdenoV/TfpL, v němž lokalizace při spojení viru a DNA vtemámím komplexu způsobila vysoký stupeň transfekce transferinem.

b) Transfekci buněk K.562 je možno prokázat endozomolytické působení adenoviru

Buňky lidské buněčné linie K.562 (erytroleukemie) obsahují přibližně 150 000 receptoru pro transferin podle publikace Klausner a další, 1983b. V přítomnosti chlorochinu je možno u těchto buněk uskutečnit transfekci také v nepřítomnosti adenoviru poměrně do značné míry při použití komplexu TfpL/DNA pro reporterový gen, jak je zřejmé také z obr. 33, TfpL a jak již bylo uvedeno v publikaci Cotten a další, 1990. Při použití týchž komplexů je možno dosáhnout v přítomnosti volného adenoviru, avšak v nepřítomnosti chlorochinu poměrně slabé exprese reporterového genu (AdenoV/TfpL) pravděpodobně z toho důvodu, že buňky K562, stejně jako jiné krevní buňky obsahují malé množství receptorů pro adenovirus, jak již bylo uvedeno v publikacích Silver a další, 1988 a Horvath a další, 1988. V případě, že se adenovirus naváže přes biotin/streptavidinový můstek na polylysin a DNA pro reporterový gen se kompenzuje přidáním většího množství polylysinu, čímž se doplní binární komplex pLAdenoV/pL, je možno dosáhnout při použití adenoviru středních hodnot transfekce, pravděpodobně vzhledem k tomu, že dojde k účinnému využití veškerého množství receptorů pro adenovirus. Avšak v případě, že se DNA, uvedená do komplexu a adenovirem a polylysinem zcela kondenzuje a přidáním konjugátu transferin-polylysin se neutralizuje za vzniku temámího komplexu (pLAdenoV/TrpL) a je možno využít početné receptory buněk pro transferin, dochází ke zvýšení účinnosti transfekce v důsledku účinné vazby transferinu i v důsledku endozomolytického působení viru minimálně o další dva řády, jak je zřejmé z obr. 33.

c) Temárními komplexy DNA je možno dosáhnout exprese reporterového genu u přibližně 100 % hepatocytů

Aby bylo možno vyzkoušet účinnost transportního systému u myších hepatocytů BNL CL.2, byly buňky podrobeny transfekci při použití reporterového genu pro beta-galaktosidázu. Na obr. 34 je znázorněn výsledek zkoušky na beta-galaktosidázu

a) po transfekci transferinem v přítomnosti chlorochinu,

b) po transfekci v přítomnosti volného adenoviru d 1312,

c) po transfekci při použití temámího komplexu adenovirus-dl312-polylysin-transferinDNA.

-58CZ 293141 B6

Při standardním provedení transfekce transferinem v nepřítomnosti adenoviru dochází k expresi reporterového genu jen u malého množství buněk. Transfekce, vyjádřená v procentech je méně než 0,1 %. V případě, že se současně použije chlorochin, stoupne tato hodnota na 0,2%, jak je zřejmé z obr. 34A. Při použití volného adenoviru dochází k expresi reporterového genu u přibližně 5 až 10 % buněk, jak je zřejmé z obr. 34B, kdežto při použití temámích komplexů s obsahem viru, modifikovaného transglutaminázou dochází k expresi u většiny nebo téměř všech buněk, jak je zřejmé z obr. 34C. Vzhledem k tomu, že temámí komplex je možno použít ve velkém zředění, nemůže dojít k toxickému účinku volného inaktivovaného adenoviru, který je možno pozorovat při jeho vysokých dávkách. Je však nutno dbát toho, že při použití temámího komplexu ve vysoké koncentraci k dosažení exprese genu u 100% buněk v kultuře by mohlo k takovému toxickému účinku dojít. Toxické účinky mohou být způsobeny zbývající účinností virového genu nebo jeho endozomolytickými vlastnostmi, nebo mohou být jednoduše důsledkem příliš vysoké exprese použitého genu.

d) Exprese reporterového genu, použitého pro transfekci je přechodná, avšak u nedělících se hepatocytů přetrvává po několik týdnů

Temámí komplexy pro transport (pLAdenoV/TfpL) se připraví při použití konjugátu polylysin-adenoviru a při použití modifikovaného adenoviru, který byl dále inaktivován reakcí s psoralenem. Buněčná kultura hepatocytů s buněčným materiálem, vytvářejícím do 2/3 spojitou vrstvu buněk byla podrobena transfekci plazmidem pCMVL s obsahem reporterového genu pro luciferázu stejným způsobem, jaký je znázorněn na obr. 34B a aktivita luciferázy byla měřena v různých časových intervalech. Jak je zřejmé z obr. 35, byla aktivita luciferázy po 3 dnech, kdy hepatocyty vytvořily v kultuře spojitou vrstvu a buněčný materiál byl před dělením, nej vyšší. Exprese reporterového genu se udržovala na téže úrovni u buněk, u nichž nedošlo k dělení, aniž by bylo použito selekce na obsah genu, exprese trvala alespoň šest týdnů, zvláště v případě, že pro tvorbu temámího komplexu byl použit adenovirus, inaktivovaný psoralenem.

Příklad 24

Použití slepičího adenoviru CELO k zesílení transportu DNA do lidských buněk

V tomto příkladu byl zkoumán slepičí adenoviru CELA na svou schopnost zesílit přenos DNA do lidských HeLa buněk analogickým způsobem jako v předchozích příkladech, v nichž byl použit lidský adenovirus, typ 5.

K pokusům byl použit slepičí adenovirus CELO, kmen Phelps, serotyp FAV-1,7, pasážovaný přes ledvinové buňky slepic. 2 ml preparátu viru se nechaly projít sloupcem PD-10 pro filtraci na gelu, sloupec byl uveden do rovnovážného stavu s 20 mM HEPES o pH 7,3, 150 mM chloridu sodného (HBS) s 10 % glycerolu, 2 ml eluátu pak byly uvedeny do reakce na 3 hodiny při teplotě místnosti s 20 mikrolítry 1 mM NHS-LC-biotinu (Pierce). Biotinylovaný virus pak byl dialyzován při teplotě 4 °C proti 3 x 300 ml HBS se 40 % glycerolu a jednotlivé podíly dialyzátu pak byly skladovány při teplotě -70 °C.

HeLa-buňky v množství 5 x 10⁵ buněk na misku s průměrem 6 cm byly inkubovány se 2 ml DMEM se 2 % FCS se 6 mikrogramy plazmidu pCMVL ve formě komplexu se směsí polylysin(pLys)- nebo transferin-polylysin (TfpL) v 500 mikrolitrech HBS, komplexy byly předem inkubovány 30 minut při teplotě místnosti. Pak byly vzorky přidány k buněčnému materiálu v přítomnosti viru v množství, které je uvedeno na obr. 36. V případě vzorků, které obsahovaly biotinylovaný virus CELO, bylo uvedené množství viru předem inkubováno s uvedeným množstvím polylysinu, modifikovaného streptavidinetn (StrpL) ve 200 mikrolitrech HBS 30 minut při teplotě místnosti před přidáním 6 mikrogramů plazmidu pCMVL ve 100 mikrolitrech HBS. Po inkubaci 30 minut při teplotě místnosti bylo k buněčnému materiálu

-59CZ 293141 B6 přidáno při teplotě 37 °C uvedené množství TfpL. Po dalších 2 hodinách bylo přidáno ještě 5 ml prostředí DMEM s 10% FCS, po 24 hodinách byl buněčný materiál oddělen a připraven ke zkoušce na luciferázu.

Jak je zřejmé z obr. 36, byl virus CELO ve volné formě schopen zesílit transport DNA do HeLa buněk, jak je uvedeno ve sloupcích 1 až 6. Avšak v případě, že tento virus byl modifikován biotinem a uveden do komplexu se streptavidinem, ukázalo se, že virus je schopen zesílit v přítomnosti i v nepřítomnosti konjugátu transferin-polylysin přenos DNA v míře, která je srovnatelná se zesílením působením lidského adenoviru dl312. Specifická buněčná linie HeLabuněk má vysokou vaznou schopnost pro komplexy polylysin/DNA v nepřítomnosti transferinu, jak je zřejmé z aktivity luciferázy ve vzorcích 1 a 4 na obr. 36. Zařízení viru CELO do komplexu polylysinu a DNA je tedy dostatečné k tomu, aby došlo k příjmu celého komplexu do buněk.

Příklad 25

Transfekce myoblastů

a) Transfekce myoblastů a trubicových svalových vláken při použití komplexů DNA/transferin-polylysin v přítomnosti volného adenoviru a v přítomnosti adenoviru, vázaného na biotin/streptavidin

Myoblasty C2C12 (Blau další, 1985, ATCC č. CRL 1772) a G8-myoblasty (ATCC č. CRL 1456) byly podrobeny transfekci v prostředí DMEM s vysokým obsahem glukózy a 10 % FCS při vytvoření téměř spojité vrstvy s obsahem 5 x 10⁵ buněk na jednu misku s průměrem 6 cm. Kultury trubicových svalových vláken byly získány tak, že myoblasty byly naneseny do misek s průměrem 6 cm v množství přibližně 5 x 10⁵ buněk na jednu misku a jakmile došlo ke tvorbě spojité vrstvy buněk, bylo prostředí vyměněno za prostředí DMEM s vysokým obsahem glukózy se 2% koňského séra podle Barr a Leiden, 1991 a Dhawan a další, 1991. Transfekce byla provedena 5 až 7 dnů později. Komplexy pro transfekci byly vytvořeny stejným způsobem jako v příkladu 19, byla použita uvedená množství TfpL, StrpL a biotinylovaného adenoviru dl312. Buněčný materiál byl oddělen 20 hodin po transfekci a byla stanovena aktivita luciferázy. Aktivita luciferázy, uvedená na obr. 37 se vztahuje na celý vzorek buněk. Ukázalo se, že je možno podrobit s vysokou účinností transfekci jak kultury myoblastů, tak kultury trubicových svalových vláken. Po diferenciaci na tato vlákna poklesla účinnost transfekce o méně než 1 log (C2C12) nebo nedošlo k žádnému významnému poklesu (G8). Tvorba trubicových svalových vláken se vyskytovala u buněčné linie G8 méně často, což je patrně příčinou toho, že u diferencované kultury nebylo možno zjistit prokazatelný pokles účinnosti transfekce. Úloha vzájemného působení mezi transferinem a receptorem pro transferin není pro transport DNA u tohoto typu buněk podstatná. Ve všech čtyřech buněčných preparátech bylo možno pozorovat pouze slabý transport DNA při použití komplexu TfpL/DNA v přítomnosti volného adenoviru dl312, jak je zřejmé ze sloupců 1, 4, 7 a 10. Při použití vázaného viru došlo k zesílení účinnosti transfekcejak je zřejmé ze sloupců 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11 a 12. Při srovnání s kombinačními komplexy, obsahujícími pouze virus a polylysin/StrpL dosahoval přenos genů oproti komplexům s obsahem konjugátu transferin-polylysin hodnot vyšších o méně než 1 log (je možno srovnat například sloupec 2 bez transferinu se sloupcem 3 s obsahem transferinu). Vzhledem k nízké transfekci při použití volného viru a zesílené transfekci při použití komplexu s vázaným virem, a to jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti konjugátu transferinu a polylysinu, je možno předpokládat, že u těchto buněk slouží adenovirus jako vazný řetězec a že se volný virus může do buněk transportovat také bez vazby, avšak v tomto případě se do buněk nedostane komplex TfpL/DNA v produktivní míře (DNA plazmidu pCMVL je v tomto případu na výkrese označené pCLuc).

-60CZ 293141 B6

b) Histochemická analýza častosti transfekce u trubicových svalových vláken

Kultury trubicových svalových vláken buněk C2C12 (naneseny ve formě myoblastů do misek s průměrem 6 cm v množství 5 x 10⁵ buněk a pak diferenciované na trubicové útvary), byly získány způsobem, popsaným v odstavci a). U vzorků s volným virem bylo 6 mikrogramů DNA plazmidu pCMV-beta-gal uvedeno do komplexu s 8 mikrogramy TfpL v přítomnosti 500 mikrolitrů HBS a materiál byl přidán k buňkám v přítomnosti 18 mikrolitrů adenoviru dl312 s obsahem 1 x 10¹² částic viru na ml, ve 2 ml prostředí DMEM se 2 % FCS. Vzorky s vázaným virem byly připraveny při použití 6 mikrogramů DNA plazmidu pCMVLacz, DNA byla uvedena do komplexu se 7 mikrogramy TfpL a 800 ng StrpL + 18 mikrolitrů biotinylovaného adenoviru dl312 s obsahem 1 x 10¹² částic viru na ml v 500 mikrolitech HBS a materiál byl přidán k buňkám ve 2 ml prostředí DME se 2 % FCS. Po inkubaci 24 hodin byl buněčný materiál stejně jako v příkladu 15 barven ke stanovení aktivity enzymu beta-galaktosidázv.

Barevný vzor pro beta-galaktózu byl v souladu s výsledky transfekce, při nichž byla použita jako produkt reporterového genu luciferáza, jak je uvedeno v odstavci a). V kulturách trubicových svalových vláken bylo dosaženo velmi nízké exprese genu v případě, že byl použit volný virus, kdežto při vazbě viru a DNA bylo možno dosáhnout vysoké úrovně exprese genu. Přítomnost modře zbarvených trubic s větším počtem jader prokazovala úspěšný přenos genu do těchto diferencovaných buněk v přítomnosti volného adenoviru.

c) Přenos DNA do primárních kultur myších myoblastů a do kultur myších trubicových svalových vláken

Velké kosterní svaly obou zadních končetin myšího samce kmene C57B1/6 ve stáří 4 týdny byly sterilně přeneseny do PBS a rozděleny na části s velikostí přibližně 5 mm. Pak byl materiál uveden do suspenze ve 20 ml PBS, po usazení 2 minuty byl supematant ve 20 ml PBS, po usazení 2 minuty byl supematant odstraněn odsátím. Toto promývání bylo třikrát opakováno. Pak byl materiál smísen s 3,5 ml PBS s obsahem 0,5 ml trypsin/EDTA, 0,5 ml kolagenázy s obsahem 1 g/ml této látky (Sigma, typ 2) a 0,5 ml 1% BSA (frakce V ve 4 mM chloridu vápenatém) a pak se materiál inkubuje 30 minut při teplotě 37 °C za častého opatrného promíchání. Na konci 30minutové inkubace se nechá zbývající tkáň usadit, supematant se odstraní a smísí s 5 ml prostředí DME s 20 % FCS. Inkubace s proteázou se 3 až 4x opakuje, až je tkáň úplně dispergována. Pak se buněčná suspenze nechá projít sítem (Falcon) k odstranění shluků a fragmentů tkáně, načež se materiál odstředí celkem 15 minut při 500 g. Usazenina buněk se znovu uvede do suspenze v 10 ml prostředí DMEM s 20% FCS a fíbroblasty se odstraní, načež se buněčný materiál nanese na 60 minut na překrytou misku pro pěstování kultur s průměrem 15 cm. Buňky, které k prostředí nepřilnuly, se pak opatrně odstraní a nanesou do pěti misek pro pěstování tkáňových kultur s vrstvou lamininu, průměrem 10 cm a obsahem 15 ml prostředí DME s 20 % FCS v každé misce. Po dosažení spojité vrstvy buněk přibližně po jednom týdnu se buněčný materiál zpracuje působením trypsinu a pak se znovu nanese do misek s průměrem 6 cm s vrstvou lamininu v množství 1 x 10⁶ buněk na misku. Aby došlo k diferenciaci na trubicová vlákna, bylo po pěti dnech, kdy buňky vytvořily spojitou vrstvu prostředí nahrazeno prostředím DME se 2 % koňského séra, po dalším týdnu byla uskutečněna v miskách s průměrem 6 cm po dosažení přibližně 80% spojité vrstvy buněk. Misky s povlakem lamininu byly připraveny následujícím způsobem:

Misky pro pěstování kultur byly opatřeny vrstvou, obsahující 0,025 mg/ml polylysinu s molekulovou hmotností 30 000 až 70 000 (Sigma) ve sterilní vodě, převrstvení trvalo 30 minut. Pak byly misky třikrát vypláchnuty sterilní vodou a usušeny na vzduchu. Pak byl materiál převrstven přes noc při teplotě místnosti pří použití 8 mikrogramů/ml lamininu (EHS, Sigma) ve vodě. Pak byly plotny třikrát promyty před naočkováním buněk.

-61 CZ 293141 B6

Komplexy DNA, použité pro transfekci byly připraveny tak, že se uvedené množství psoralenu/biotinylovaného adenoviru dl312, inaktivovaného ultrafialovým světlem a připraveného podle příkladu 19 zředí 150 mikrolitry HBS, přidá se 1 mikrogram AtrpL ve 150 mikrolitrech HBS a pak se směs 30 minut inkubuje při teplotě místnosti. Pak se ke každému vzorku přidá 100 mikrolitrů HBS s obsahem 6 mikrogramů plazmidu pCMVL (na výkrese je označen pCLuc) a směs se ještě 30 minut inkubuje při teplotě místnosti. Pak se ke každému vzorku přidá 7 mikrogramů TfpL ve 100 mikrolitrech HBS, směs se inkubuje ještě 30 minut při teplotě místnosti a pak s směs přidá ke kultuře myoblastů nebo ke kultuře trubicových svalových vláken v miskách s průměrem 6 cm a s obsahem 2 ml prostředí DME se 2 % FCS. Po další hodině inkubace se prostředí nahradí ml DMEM s 20 % FCS v případě myoblastů nebo DMEM se 2 % koňského séra v případě trubicových svalových vláken, načež se po dalších 48 hodinách buněčný materiál oddělí pro stanovení luciferázy. Účinnost luciferázy pro vzorek buněk je znázorněna na obr. 38.

Příklad 26

Zlepšení přenosu u myoblastů pomocí viru CELO při použití lektinových vazných řetězců

a) Srovnávací analýza adenoviru d 1312 a viru CELO u HeLa buněk a u C2C12-myoblastů

Vzorky HeLa buněk nebo C2C12-myoblastů, vždy v množství 5 x 10⁵ buněk na misku s průměrem 6 cm se podrobí transfekci při použití 6 mikrogramů pCMVL (na výkrese je označen pCLuc), uvedeného do komplexu s 1 mikrogramem StrpL/7 mikrogramů TfpL a 5 mikrolitry biotinylovaného adenoviru dl312 (příklad 19, 1 x 10¹² částic na ml), nebo se užije 18 mikrolitrů biotinylovaného viru CELO (příklad 24, 0,3 x 10¹² částic na ml). Směs se inkubuje 20 hodin, pak se buněčný materiál oddělí a připraví pro měření aktivity luciferázy. Na obr. 39 je znázorněna celková aktivita luciferázy pro každý vzorek buněk.

Transfekce HeLa buněk byla uskutečněna při použití komplexů lidský adenoviru d 1312/StrpL/TfpL/DNA, tyto komplexy mohou být transportovány do buněk přes receptor pro adenovirus nebo přes receptor pro transferin, nebo byla transfekce uskutečněna pro použití komplexů CELO-virus/StrpL/TfpL/DNA, tyto komplexy mohou být transportovány do buněk přes receptory pro transferin, oba typy transfekce měly přibližně srovnatelnou účinnost. Avšak v případě přenosu DNA do C2C12-myoblastů se ukázalo, že komplexy s obsahem adenoviru D1312 jsou i v tomto případě účinné,kdežto funkce komplexů s obsahem CELO-virů je u těchto buněk nedostatečná. Dřívější pokusy prokázaly, že receptor pro transferin hraje při transportu kombinačních komplexů do těchto buněk pouze malou úlohou. Je zřejmé, že receptor pro adenovirus je hlavním místem pro vstup do buněk. Slabá účinnost CELO-viru u myoblastů je tedy patrně způsobena tím, že se na C2C12-myoblasty slabě váže nejen transferin, nýbrž také CELO-virus.

b) Zlepšení transfekce C2C12-myoblastů působením CELO-viru při použití aglutininu z pšeničných klíčků jako vazného řetězce

Vzhledem k nedostatečnému transportu, dosaženému svrchu u postupu a) bylo použito v dalších pokusech jako náhrady pro transferin nového vazného řetězce, biotinylovaného aglutininu z pšeničných klíčků, obsahujícího 2 až 4 mol biotinu na 1 mol bílkoviny (Boheringer Mannheim). Biotinylovaný CELO-virus byl připraven svrchu uvedeným způsobem. Komplexy, obsahující mikrogramů plazmidu pCMVL a uvedená množství AtrpL, TfpL, biotinylovaného aglutininu z pšeničných klíčků (WGA-B) a CELO-viru byly připraveny následujícím způsobem:

Virus a WGA byly společně zředěny ve 150 mikrolitrech HBS. StprL byl rovněž zředěn 150 mikrolitry HBS, oba roztoky byly smíseny a 30 minut inkubovány při teplotě místnosti. DNA, zředěná 100 mikrolitry HBS byla pak přidána k roztoku StprL/virus/WGA a po dalších 30 minutách inkubace při teplotě místnosti byl ke směsi přidán TfpL ve 100 mikrolitrech HBS

-62CZ 293141 B6 a směs byla znovu inkubována 30 minut při teplotě místnosti. Komplexy pak byly přidány k C2C12-myobIastům v množství 5 x 10⁵ buněk v misce s průměrem 6 cm, ve 2 ml DMEM se % FCS. Po další hodině bylo přidáno ještě 5 ml DMEM s 10 % FCS a po dalších 20 hodinách byl buněčný materiál oddělen a připraven pro měření aktivity luciferázy. Aktivita ve světelných jednotkách je jako celková aktivita pro každý vzorek znázorněna na obr. 40, DNA, použitá v tomto případu byl plazmid pCMVL, který je na výkrese označen jako pCLuc:

V nepřítomnosti viru bylo dosaženo velmi slabého přenosu DNA jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti WGA, jak je zřejmé ze sloupců 1 a 6. Mírného přenosu bylo dosaženo při použití vázaného CELO-viru, jak je zřejmé ze sloupce 2, avšak v případě, že komplex obsahoval WGAB, bylo dosaženo 16x vyšší hodnoty. Při zvýšení množství WGA v komplexu z 1 na 5 mikrogramů došlo k mírnému poklesu přenosu, jak je zřejmé z výsledků ve sloupcích 3 a 4, kdežto při zvýšení obsahu StrpL v komplexu z 1 na 2 mikrogramy došlo k mírnému zvýšení přenosu. Tyto výsledky zřejmě prokazují, že WGA-B jako vazný řetězec zesiluje transport DNA do buněk C2C12 při použití CELO-viru.

d) Exprese genu pro faktor VIII v C2C12-myoblastech a v kulturách trubicových svalových vláken

Kultury myoblastů a trubicových svalových vláken byly připraveny svrchu uvedeným způsobem. Transfekce byla uskutečněna při použití 6 mikrogramů plazmidu, který obsahoval plnou délku cDNA pro faktor VIII podle Wood a další, 1984 a Eaton a další, 1986, uvedenou do komplexu běžným způsobem při použití 5 nebo 15 mikrolitrů biotinylového adenoviru, připraveného uvedeným způsobem a 0,5 nebo 1 mikrogram StrpL a 7 nebo 6 mikrogramů TfpL.

Komplexy DNA/virus byly přidány k buněčnému materiálu v prostředí DMEM se 2 % FCS. Po inkubaci 4 hodiny při teplotě 37 °C byly do každé misky přidány 3 ml čerstvého prostředí DMEM s 10% FCS. Po dalších 18 hodinách bylo prostředí odděleno a bylo zkoumáno na přítomnost faktoru VIII při použití zkušebního systému COATEST (KABI, Pharmacia) při použití mezinárodního standardu jako referenčního vzorku. Množství faktoru VIII bylo vyjádřeno v milijednotkách, vytvořených za 24 hodin ve vzorku s obsahem 1 x 10⁶ buněk, výsledky jsou znázorněny na obr. 41.

Příklad 27

Použití bílkoviny adenoviru pro transport DNA

Adenovirus, divoký typ 300, byl pěstován v HeLa-buňkách, čištěn a biotinylován způsobem, který byl svrchu popsán pro adenovirus dl312. 1,2 ml viru bylo dialyzováno proti 3 x 300 ml 5 mM MES (kyselina 2-(N-morfolino)ethansulfonová), 1 mM EDTA o pH 6,25 při teplotě 4 ;C celkem 18 hodin. Pak byl materiál odstředěn 30 minut při 27 K v rotoru SW60. Supematant byl opatrně odstraněn a usazenina buněk byla znovu uvedena do suspenze v HBS se 40 % glycerolu. K supematantu byl přidán pufr HEPES o pH 7,5 do 20 mM a chlorid sodný do 150 mM a jak usazenina buněk (obsahující bílkoviny jádra viru a hlavní podíl hexonkapsidu, na obr. 42 je tento podíl označen jako Jádro“) a také frakce supematantu (obsahující vertexy, na obr. 42 s tímtéž označením), byly sledovány na účinnost při transportu DNA do myších fibroblastů Movl3 podle Strauss a Jaenisch, 1992 a do HeLa-buněk.

Tvorba komplexu s DNA byla uskutečněna následujícím způsobem: Uvedené množství každé frakce, rozrušený virus před odstředěním nebo neporušený virus, vyjádřeno v mikrogramech bílkoviny, stanovené Bradfordovou zkouškou, se zředí 300 mikrolitry HBS. Pak se přidají mikrogramy polylysinu, modifikovaného streptavidinem v 50 mikrolitrech HBS a pak se směs inkubuje 30 minut při teplotě místnosti. 6 mikrogramů plazmidu pCMVL, označeného na výkrese pCLuc se zředí 100 mikrolitry HBS a přidá se k prvnímu roztoku, načež se směs ještě 30 minut

-63CZ 293141 B6 inkubuje. Pak se přidají ještě 2 mikrogramy TfpL ve 100 mikrolitrech HBS a směs se znovu inkubuje dalších 30 minut. Ve vzorcích, připravených pouze s použitím TfpL se smísí 8 mikrogramů TtpL ve 170 mikrolitrech HBS se 6 mikrogramy pCMVL ve 330 mikrolitrech HBS 30 minut při teplotě místnosti. Uvedená množství virové bílkoviny se zředí 300 mikrolitry HBS a pak přidá ke komplexům TfpL/DAN. Všechny vzorky se pak přidají na 1 hodinu k množství 5 x 10⁵ buněk v misce s průměrem 6 cm, obsahující 2 ml DMEM s 10 % FCS a HeLa-buňky nebo Movl3-fibroblasty. Pak se přidá ještě 5 ml čerstvého prostředí s obsahem 10 % FCS a po dalších 20 hodinách se buněčný materiál oddělí a připraví pro stanovení aktivity luciferázy. Získané hodnoty pro aktivitu luciferázy ve světelných jednotkách jsou uvedeny na obr. 42 jak pro HeLa-buňky (tabulka A), tak pro Movl3-fibroblasty (tabulka B).

U obou buněčných typů je možno prokázat stoupání účinnosti přenosu DNA v závislosti na dávce v souvislosti s přidáním vertexové frakce, jde o vzorky 4 až 6 v obou tabulkách. V případě, že bylo obsaženo totéž množství biotinylového viru v komplexech TfpL/DNA v nepřítomnosti polylysinu, modifikovaného streptavidinem, bylo možno pozorovat transport DNA, blížící se hodnotě pozadí, jde o vzorky 3 v obou tabulkách.

Příklad 28

Zesílení přenosu genu při použití temámích komplexů DNA, obsahujících konjugát galaktózy a vazného řetězce

a) Temámí komplexy, obsahující konjugát peptidů chřipkového viru

V příkladech 13 a 14 bylo prokázáno, že peptidy, konjugované s polylysinem a obsahující řetězec, odvozené od N-zakončení hemaglutininové podjednotky HA-2 chřipkového viru mohou v komplexech s obsahem DNA/transferin-polylysin podstatně zvýšit přenos genu transferinem-polylysinem.

Podobné DNA-kombinační komplexy, obsahující konjugát galaktózy, vazného řetězce a polylysinu a peptid chřipkového viru, modifikovaný polylysinem a připravený podle příkladu 6 nebo 13, byly připraveny tak, že konjugát vazného řetězce a polylysinu byl přidán kDNA plazmidu pCMVL k neutralizaci poloviny nábojů DNA a zbytek náboje byl použit k vytvoření komplexu s konjugátem peptidů chřipkového viru a polylysinu. Transport těchto komplexů DNA, obsahujících syntetické vazné řetězce (gal)₄ do hepatocytů BNL CL.2 (transfekce byla provedena způsobem podle příkladu 6g) měl za následek expresi genu pro luciferázu, která je znázorněna na obr. 43 a která je významně vyšší než exprese, jíž je možno dosáhnout při použití transferinu jako vazného řetězce. Tato exprese byla také více než 500x vyšší než exprese, dosažená při použití komplexu DNA bez peptidů chřipkového viru, ale se stejným množstvím polylysinu, jak je rovněž znázorněno na obr. 43. Aktivita, dosažená při použití kombinačních komplexů DNA byla také přibližně 30x vyšší než aktivita, jíž bylo dosaženo při použití komplexů DNA/(gal)₄pL, s nimiž byly buněčné materiály inkubovány v přítomnosti chlorochinu.

b) Temámí komplexy s obsahem konjugátu adenoviru

Komplexy byly připraveny tak, že biotinylovaný adenovirus D1312, získaný podle příkladu 19 v množství 2, 6 nebo 18 mikrolitrů při obsahu 10¹² částic v ml byl v 50 mikrolitrech HBS smísen se 100, 160 nebo 480 ng polylysinu, modifikovaného streptavidinem ve 100 mikrolitrech HBS. Po inkubaci 30 minut byl přidán roztok 6 mikrogramů plazmidu pCMVL ve 200 mikrolitrech HBS a o dalších 30 minutách ještě roztok 3,8 mikrogramů (gal)₄pL, připravený podle příkladu 6, nebo 7 mikrogramů TfpL ve 150 mikrolitrech HBS. Roztoky komplexů DNA byly přidány vždy k množství 300 000 buněk (ATCC TIB73, ATCC TIB74, ATCC TIB75, ATCC TIB76) v miskách s průměrem 6 cm v prostředí DMEM s vysokým obsahem glukózy a se 2 % FCS. Dále byly buněčné kultury zpracovávány stejným způsobem jako v předchozích příkladech a také

-64CZ 293141 B6 aktivita luciferázy byla stanovena svrchu uvedeným způsobem. Hodnoty pro expresi genů po 24 hodinách jsou shrnuty na obr. 44.

Příklad 29

Přenos genů do B-lymfoblastoidních B-buněk

Konjugáty lidského Ig a protilátky proti lidskému Ig- a polylysinu byly připraveny následujícím způsobem, přičemž vazba byla uskutečněna postupy, známými z literatury zavedením disulfídových můstků po modifikaci sukcinimidylpyridyldithiopropionátem podle SPDP, Jung a další, 1981.

a) Příprava konjugátů protilátky proti lidskému Ig a polylysinu 300

Roztok 2 mg kozí protilátky proti lidskému Ig (Southem Biotechnology Associates, lne., Birmingham, AL, USA) v HBA (150 M chloridu sodného, 20 mM HEPES opH 7,8) se smísí se 14 mikrolitry 5 mM ethanolového roztoku SPDP (Pharmacia). Po 10 hodinách inkubace při teplotě místnosti se směs zfiltruje přes sloupec gelu Sephadex G25, jako eluční činidlo se užije 100 mM HEPES o pH 7,3, čímž se získá 1,3 mg protilátky proti lidskému Ig, modifikované 30 nMol pyridyldithiopropionátových zbytků. Poly(L)lysin 300 s průměrným stupněm polymerace 300 lysinových zbytků (Sigma) se analogickým způsobem modifikuje při použití SPDP a pak se působením dithiothreitolu a následnou filtrací na gelu převede na modifikovanou formu s obsahem volných merkaptoskupin. Roztok 12 nmol polylysinu 300, modifikovaného 29nmol merkaptoskupin v 0,3 ml HBS se smísí za nepřístupu kyslíku se svrchu uvedenou modifikovanou protilátkou proti lidskému Ig a směs se nechá stát přes noc při teplotě místnosti. Pak se reakční směs přidáním 5M chloridu sodného upraví na 0,6 M chloridu sodného. Izolace konjugátu se uskuteční chromatografií na iontoměniči (Pharmacia, Mono S HR 5/5), po dialýze proti 25 mM HEPES o pH 7,3 se získají odpovídající konjugáty, tvořené 0,33 mg protilátky proti lidskému Ig, modifikované 4 nmol polylysinu 300, molámí poměr 1 : 2.

b) Příprava konjugátu lidského IgG a polylysinu 300

Roztok 19,5 mg 122 nmol protilátky (Sigma 1-4506) ve 2 ml HBS se smísí s 39 mikrolitry 10 mM ethanolového roztoku sukcinimidylpyridyldithiopropionátu, SPDP (Pharmacia). Po 2,5 hodinách při teplotě místnosti se směs zfiltruje přes sloupec gelu Sephadex G 25, jako eluční činidlo se užije 100 mM pufr HEPES o pH 7,9, čímž se získá 19 mg, 119 mmol lidského-IgG, modifikovaného 252 nmoly pyridyldithiopropionátových zbytků. Poly(L)lysin 300 s průměrným stupněm polymerace 300 lysinových zbytků (Sigma) se analogickým způsobem modifikuje při použití SPDP a pak se zpracovává působením dithiothreitolu s následnou filtrací na sloupci gelu, čímž se převede do modifikované formy, obsahující volné merkaptoskupiny. Roztok 119 nmol polylysinu 300, modifikovaného 282 nmoly merkaptoskupin se v 1 ml HBS s vyloučením přístupu kyslíku smísí se svrchu připraveným modifikovaným lidským IgG a směs se nechá stát přes noc při teplotě místnosti. Pak se reakční směs přidáváním 5 M roztoku chloridu sodného upraví na obsah přibližně 0,6 M chloridu sodného. Izolace získaného konjugátu se pak uskuteční chromatografií na iontoměniči (Mono S, Pharmacia, 50 mM HEPES o pH 7,3, gradient soli 0,6 M až 3 M chloridu sodného). Pak se směs dialyzuje proti HBS o pH 3, čímž se získají odpovídající konjugáty, které jsou tvořeny 9 mg, 57 nmol protilátky, modifikované 90 nmol polylysinu 300, molámí poměr 1 :1,6.

c) Tvorba komplexu a transfekce

Komplexy byly připraveny tak, že biotinylovaný adenovirus dl312 v množství 30 mikrolitrů, 10¹² částic na ml v 50 mikrolitrech HBS byl smísen s 800 ng polylysinu, modifikovaného streptavidinem ve 100 mikrolitrech HBS, po 30 minutách inkubace byl přidán roztok

-65CZ 293141 B6 mikrogramů plazmidu pCMVL ve 200 mikrolitrech HBS. Po dalších 30 minutách byl přidán roztok 5,1 mikrogramů polylysinu pLys450, 10,2 mikrogramů TfpL, 12 mikrogramů konjugátu lidského IgG a polylysinu nebo 10 mikrogramů konjugátu protilátky proti lidskému Ig a polylysinu ve 150 mikrolitrech HBS. Komplexy DNA byly přidány vždy v množství 10⁶ B-lymfo- blastoidních buněk. Buňky byly získány z lidských periferních mononukleárních krevních buněk po imortalizaci pomocí viru Epstein Baar způsobem podle Wass a Crawford, 1989 a byly pěstovány na plotnách, obsahujících 24 vyhloubení v 1 ml prostředí RPMI 1640 se 2 % FCS. Buněčné kultury byly dále zpracovávány obdobným způsobem jako v předchozích příkladech a také aktivita luciferázy byla stanovena svrchu uvedeným způsobem. Získané hodnoty pro expresi 10 genů podle naměřené aktivity luciferázy ve světelných jednotkách jsou znázorněny na obr. 45.

Příklad 30

Transport DNA při použití konjugátu transferin-polylysin v přítomnosti volného 15 a konjugovaného rhinoviru

a) Příprava rhinoviru HRV-2

Rhinovirus HRV-2 byl připraven a čištěn způsobem podle Skem a další, 1984.

Roztok 400 mikrolitrů rhinoviru s obsahem přibližně 30 mikrogramů tohoto viru v HBS (150 mM chloridu sodného, 5 mM HEPES o pH 7,9) s 10 % glycerolu byl zpracován působením nmol NHS-LC-biotinu (Pierce 21335). Po 3 hodinách inkubace při teplotě místnosti byl viru oddělen dialýzou proti HBS se 40 % glycerolu při teplotě 4 °C od nenavázaného biotinu.

Na světlo citlivý rhinovirus, připravený pěstováním viru v přítomnosti akridinové oranži byl inaktivován podle Madshus a další, 1984.

b) Příprava komplexů DNA a transfekce

i) Komplexy transferin-polylysin/DNA byly připraveny tak, že roztok 6 mikrogramů DNA plazmidu pCMVL ve 330 mikrolitrech HBS (150 mM chloridu sodného, 20 mM HEPES o pH 7,3) byl smísen s roztokem 8 mikrogramů TgpL290 ve 170 mikrolitrech HBS. Komplexy DNA byly smíseny s 1,5 ml prostředí DMEM se 2% FCS a se 0,14 až 3,5 mikrogramy rhinoviru

HRV-2 nebo inaktivovaného HRV-2. Směsi byly přidány k buňkách NIH3T3, bylo užito

300 000 buněk na misku s průměrem 6 cm. Po 4 hodinách bylo prostředí, použité pro transfekci nahrazeno 4 ml čerstvého prostředí DMEM s 10% FCS. Buněčný materiál byl oddělen po 24 hodinách a aktivita luciferázy byla stanovena stejným způsobem jako svrchu, výsledky tohoto stanovení jsou znázorněny na obr. 46A.

ii) Kombinační komplex DNA, obsahující konjugáty transferin-polylysin a rhinovirus-polylysin se připraví tak, že se 100 mikrolitrů roztoku biotinylovaného rhinoviru HRV-2 s obsahem 3,5 mikrogramů tohoto viru v HBS smísí s 1 mikrogramech StrpL ve 100 mikrolitrech HBS, další koncentrace viru se smísí s odpovídajícími podíly. Po 30 minutách inkubace při teplotě místnosti se roztok smísí se 6 mikrogramy plazmidové DNA ve 150 mikrolitrech HBS, směs se inkubuje dalších 30 minut při teplotě místnosti a pak se smísí se 6 mikrogramy TfpL290 ve 150 mikrolitrech HBS. Komplexy DNA se smísí s 1,5 ml živného prostředí DMEM se 2 % FCS a směs se přidá ke 300 000 buněk NIH 3T3 v miskách s průměrem 6 cm. Další zpracování buněčných kultur a stanovení aktivity luciferázy se provádí stejným způsobem jako v odstavci i), výsledky 50 jsou znázorněny na bor. 46B.

-66CZ 293141 B6

Příklad 31

Transfekce HeLa-buněk při použití kombinačních komplexů, obsahujících iontově vázaný adenoviru

Tvorba komplexu A

Komplex DNA se připraví tak, že se nejprve smísí 300 mikrolitrů adenoviru dl312 s obsahem přibližně 10⁹ PFU s 1 mikrogramem polylysinu pLys450 s průměrnou délkou řetězce 450 monomerů ve 170 mikrolitrech HBS a po 30 minutách inkubace při teplotě místnosti se přidá ještě ómikrogram DNA plazmidu pCMVL ve 170 mikrolitrech HBS. Směs se inkubuje ještě 30 minut a pak se komplexy smísí s 9 mikrogramy TfpL190 ve 170 mikrolitrech HBS. Pak se podíl komplexní směsi (10% = 50 mikrolitrů roztoku, 600 ng DNA nebo 1% = 5 mikrolitrů roztoku, 60 ng DNA) zředí 1,5 ml prostředí DME se 2% FCS a roztok se přidá ke 300 000 HeLa-buněk. Po 4 hodinách se přidají ještě 2 ml prostředí DMEM s 20 % FCS. Buněčný materiál se po 24 hodinách oddělí a aktivita luciferázy se stanoví svrchu uvedeným způsobem. Aktivita luciferázy, odpovídající celému množství extraktu bylo 405 000 světelných jednotek při použití 600 ng DNA a 200 světelných jednotek při použití 60 ng DNA.

Tvorba komplexu B (kontrolní pokus)

Komplex DNA se připraví tak, že se nejprve smísí 6 mikrogramů DNA plazmidu pCMVL ve 170 mikrolitrech HBS s 1 mikrogramem polylysinu pLys450 po vel 70 mikrolitrech HBS a po 30 minutách při teplotě místnosti se přidá ještě 9 mikrogramů TfpL190 ve 170 mikrolitrech HBS. Po inkubaci dalších 30 minut se přidají ještě ke komplexům podíly 30 mikrolitrů adenoviru d!312 s obsahem přibližně 10⁹ PFU.Podíly směsi s obsahem komplexu(10 % = 50 mikrolitrů roztoku, s obsahem 600 ng DNA nebo 1% = 5 mikrolitrů roztoku, 60 ng DNA) zředí 1,5 ml DMEM se 2 % FCS a roztoky se přidají ke 300 000 HeLa-buněk. Po 4 hodinách se přidají ještě 2 ml DMEM s 20 % FCS. Po 24 hodinách se buněčný materiál oddělí a aktivita luciferázy se stanoví svrchu uvedeným způsobem. Aktivita luciferázy, odpovídající celému množství extraktu bylo 405 000 světelných jednotek při použití 600 ng DNA a 200 světelných jednotek při použití 60 ng DNA.

Příklad 32

Místní podání komplexů DNA/adenovirus/transferin-polylysin do jater krys

a) Přímá injekce

Komplexy DNA se připraví stejným způsobem jako v příkladu 19. Tyto komplexy obsahují 200 mikrolitrů adenoviru dl312, 6 mikrogramů polylysinu, modifikovaného streptavidinem, 48 mikrogramů pCMVL a 48 mikrogramů TfpL290 v celkovém objemu 2000 mikrolitrů HBS. Krysí samci kmene Spreague-Dawley s hmotností 240 g byli anestetizovány avertinem a byl proveden řez břišní stěnou s délkou 4 cm. Injekce komplexu byla uskutečněna v průběhu 2 minut do levého postranního laloku jater. Pak byl chirurgický řez po jednotlivých vrstvách uzavřen. Krysy byly 48 hodin po vstřiknutí komplexu usmrceny etherovou narkózou a pak byla stanovena exprese genu pro luciferázu v různých vzorcích jatemí tkáně. V homogenátu jater v oblasti injekce bylo možno pozorovat aktivitu luciferázy 5615 světelných jednotek/mg bílkoviny. Celková aktivita byl 370 600 světelných jednotek. V částech jater, vzdálených od místa vstřiknutí nebylo možno prokázat žádnou aktivitu luciferázy.

-67CZ 293141 B6

b) Podání komplexu do jater přes žlučové cesty

Komplexy se připraví tak, že se inkubuje 200 mikrolitrů biotinylovaného adenoviru dl312, zředěného 200 mikrolitry HBS s 6,4 mikrogramy polylysinu, modifikovaného streptavidinem ve 400 mikrolitrech HBS 30 minut při teplotě místnosti. Pak se přidá 48 mikrogramů plazmidu pCMVL v 80 mikrolitrech HBS. Směs se inkubuje 30 minut a pak se přidá 48 mikrogramů TfpL v 900 mikrolitrech HBS. Pro použití komplexu se anestetizují krysí samci kmene SpragueDawley s hmotností 250 g avertinem a břicho se otevře řezem ve střední čáře. Střevo se odloží na levou stravu a do žlučovodu se zavede jehla 27 G, spojená hadičkou s injekční stříkačkou s objemem 1 ml. Injekce celého komplexu trvá 4 minuty. Pak se jehla ze žlučovodu opět vyjme a místo injekce se uzavře pomocí fibrinového materiálu (Immuno). Rána v břišní stěně se uzavře stehy a kovovými svorkami. Po 30 hodinách se krysy usmrtí a vyšetří se jednotlivé jatemí laloky na expresi genu pro luciferázu. Nejvyšší naměřené hodnoty pro aktivitu luciferázy byly 19 000 světelných jednotek na mg bílkoviny. Vypočítaná celková exprese v celých játrech byla přibližně 2,7 x 10⁶ světelných jednotek.

Příklad 33

Podání komplexů DNA/adenovirus/TfpL do podvázané ocasní žíly u myší

Komplexy se vytvoří stejným způsobem jako v příkladu 19. Obsahují 45 mikrolitrů adenoviru dl312, 0,8 mikrogramů polylysinu, modifikovaného streptavidinem, 6 mikrogramů plazmidu pCMVL a 24 mikrogramů mTfp“290 v celkovém objemu 150 mikrolitrů HBS. Komplexy se vstříknou do ocasní žíly myšího samce kmene C3H/He ve stáří 2 měsíce v anestezii avertinem. Bezprostředně po ukončení injekce se ocasní žíla na proximálním i distálním konci ocasu stlačí, takže roztok komplexu zůstává v průběhu tohoto stlačení, které trvá 25 minut v tom úseku ocasní žíly, Do nějž byl vstříknut a nedochází k vyplavování komplexu do krevního oběhu. Po 48 hodinách po provedení injekce se myši usmrtí zlomením vazu a ocasní žíla, do níž byly komplex vstřiknut, se vypreparuje. Pak se měří exprese genu pro luciferázu v homogenátu tohoto úseku ocasní žíly. Byla prokázána aktivita luciferázy 2600 světelných jednotek/3 cm ocasní žíly.

Příklad 34

Transfekce primárních buněk lidského melanomu

a) Transfekce pomocí komplexů adenovirus-polylysin/transferin-polylysin

Primární buňky melanomu byly izolovány z chirurgicky odstraněného melanomu nemocného. K tomuto účelu byl nádor mechanicky rozdělen na menší části v živném prostředí RPMI 1640 pro pěstování tkáňových kultur s 5 % FCS, 2 mM glutaminu a s přísadou antibiotik a fragmenty tkáně byly protlačeny přes ocelové síto. Pak byly nádorové buňky několikrát promyty odstředěním a opětným uvedením do suspenze a pak byly naočkovány do lahví T25 pro pěstování kultur. 24 hodin po izolaci nádorových buněk byla uskutečněna transfekce při použití temámích komplexů, které obsahovaly 3, 9 nebo 27 mikrolitrů biotinylovaného adenoviru dl312 s obsahem 1 x 10¹² částic/ml, 0,5 mikrogramů polylysinu, modifikovaného streptavidinem, 6 mikrogramů pCMVL a 7 mikrogramů TfpL290 (při použití 27 mikrolitrů adenoviru: 1 mikrogram streptavidin-polylysin a 6 mikrogramů TgfpL290) v celkovém objemu 500 mikrolitrů HBS. 36 hodin po transfekci byl buněčný materiál oddělen a byla měřena aktivita luciferázy ve světelných jednotkách Výsledek je znázorněn na obr. 47. V horní části jsou uvedeny výsledky, získané u buněk v suspenzi, ve spodní části jsou uvedeny výsledky, získané u buněk, pěstovaných v pevném živném prostředí.

-68CZ 293141 B6

b) Transfekce pomocí kombinačních komplexů adenovirus-polylysin/lipoprotein s nízkou hustotou-polylysinu

i) Příprava konjugátu LDL-polylysin

Roztok 10 mg 14,3 nmol LDL (lipoprotein s nízkou hustotou, sigma, L-2139, molekulová hmotnost 3 500 000, průměr částic přibližně 26 nm) ve 2 ml HBS se smísí se 143 mikrolitry 10 mM ethanolového roztoku 1,43 mikromol SPDP (Pharmacia) a směs se nechá reagovat 2 hodiny při teplotě místnosti. Pak se směs zfiltruje přes sloupec gelu Sephadex G25 s rozměrem 14 x 140 mm při použití HBS, čímž se získá 3,2 ml roztoku, obsahujícího přibližně 10 mg LDL, modifikovaného 0,70 mikromol pyridyldithiopropionátových zbytků. Roztok se smísí s 1,2 ml 5M roztoku chloridu sodného, aby nedošlo při následném přidání polylysinu k vysrážení materiálu z roztoku. Poly-(L)lysin s průměrnou délkou řetězců 300 monomerů byl modifikován působením SPDP svrchu popsaným způsobem a pak byl zpracováním působením dithiothreitolu a následující filtrací na sloupci gelu převeden na modifikovanou formu, obsahující merkaptoskupiny. Svrchu popsaný roztok modifikovaného LDL byl smísen s roztokem 0,33 mikromol polylysinu 300, modifikovaného 0,76 mikromol merkaptoskupin ve 4 ml 2N chloridu sodného, 0,5 M HEPES o pH 7,9 v argonové atmosféře a směs byla ponechána 48 hodin při teplotě místnosti. Pak byl reakční roztok přidáním sterilní vody zředěn na objem 32 ml (koncentrace chloridu sodného přibližně 0,5 M) a pak byla směs podrobena chromatografii na iontoměniči (Biorad Macroprep S, 10 x 100 mm, 20 mM HEPES o pH 7,3, gradient 0,2 - 3 M NaCl). Frakce s obsahem produktu byly ze sloupce vymývány při koncentraci chloridu sodného 1,8 až 2,2M, tyto frakce byly spojeny. Po dialýze proti HBS byly získány konjugáty, které obsahovaly 2,35 mg, 3,4 nmol LDL, modifikovaného 190 nmol polylysinu, což odpovídá 7,5 mg volného polylysinu ve formě báze. Toto množství odpovídá průměrné modifikaci částice LDL 55 řetězci polylysinu.

ii) Tvorba komplexu a transfekce mikrolitrů biotinylovaného adenoviru D1312 se zředí pomocí HBS na objem 100 mikrolitrů. 12 mikrolitrů polylysinu, modifikovaného streptavidinem se přidáním HBS upraví na objem 100 mikrolitrů a smísí se 100 μΐ svrchu připraveného roztoku adenoviru. Po 30 minutách se přidá ještě 150 mikrolitrů HBS s obsahem 6 mikrogramů pCMVL. Po dalších 30 minutách se přidá ještě 300 mikrolitrů HBS s obsahem 4 mikrogramy LDLpL s obsahem polylysinu 20 mikrogramů. Připravený roztok se smíchá s 1,5 ml DMEM s 10 % FCS a přidá k 3 x 10⁵ primárních buněk melanomu, které byly připraveny způsobem podle odstavce a) a označeny HMM1 aHMM4, buňky byly uloženy do misky pro pěstování kultur s průměrem 6 mm. Pak byly kultury buněk zpracovávány svrchu uvedeným způsobem a také měření aktivity luciferázy bylo provedeno podle odstavce a). Exprese genu je znázorněna na obr. 48. V horní části jsou uvedeny výsledky, získané s melanomovými buňkami HMM1. Pokusy byly provedeny při použití konjugátů AdpL, což není na výkrese výslovně uvedeno. Ve spodní části jsou uvedeny výsledky pokusů při použití melanomových buněk HMM4, pokusy byly provedeny při použití konjugátů AdpL, které jsou výslovně uvedeny pouze v posledním sloupci (označení d 1312/16 se vztahuje na specifický preparát viru. Při provádění pokusu, jehož výsledek je uveden na sloupci 2, byl použit LDL ve 25násobném přebytku, toto opatření vedlo vzhledem ke kompetici o receptor pro LDL ke snížení účinnosti přenosu genu.

Příklad 35

Transfekce primárních lidských fibroblastů

Bioptické vzorky lidské kůže byly uloženy do Petriho misky s průměre 6 cm, obsahující prostředí DMEM s 2 mM glutaminu, 20 % FCS a antibiotiky. Pak byly vzorky pomocí skalpelů důkladně rozděleny na velmi malé části a pěstovány 5 dnů v přítomnosti 3 ml živného prostředí. Pak byl

-69CZ 293141 B6 buněčný materiál promyt čerstvým živným prostředím, stejným jako svrchu, načež byly buňky pěstovány ještě 7 dnů. Pak byl buněčný materiál zpracován působením trypsinu a dále pěstován po přenesení do nových Petriho misek. Jakmile došlo k vytvoření téměř souvislé vrstvy buněk, byl materiál opět zpracován působením trypsinu a skladován ve zmrazeném stavu až do transfekce. Pro transfekci byl buněčný materiál rozmražen, nanesen do Petriho misek s průměrem 6 cm a pěstován v prostředí DMEM s obsahem 2 mM glutaminu, 10% FCS a antibiotiky. Konjugáty pro uskutečnění transfekce byly připraveny následujícím způsobem: 3, 10, 20 nebo 30 mikrolitrů biotinylovaného adenoviru dl312 bylo inkubováno s 0,1, 0,3, 0,5 nebo 0,8 mikrogramy polylysinu, modifikovaného streptavidinem a materiál byl inkubován ve 150 mikrolitrech HBS 30 minut při teplotě místnosti. Pak bylo přidáno 6 mikrogramů plazmidu pCMV-beta-gal ve 170 mikrolitrech HBS a směs byla inkubována ještě 30 minut. V posledním stupni bylo přidáno 7,8 mikrogramů TfpL v případě konjugátů s obsahem 3 mikrolitry d 1312, 6 mikrogramů TfpL pro konjugáty s obsahem 20 nebo 30 mikrolitrů dl312 ve 170 mikrogramech HBS. Po době inkubace 30 minut byly konjugáty přidány k buněčnému materiálu ve 2 ml prostředí DMEM s obsahem 2 mM glutaminu, 2 % FCS a antibiotik a buňky byly inkubovány 4 hodiny při teplotě 37 °C. Pak bylo živné prostředí odstraněno a buněčný materiál byl při teplotě 37 °C smísen s prostředím DME s 2 mM glutaminu, 10 % FCS a antibiotiky. Po 48 hodinách byla stanovena exprese genu pro galaktosidázu stejným způsobem jako v předchozích příkladech.

Při transfekci s použitím 3 mikrolitrů dl312 bylo možno u 14 % buněk prokázat produkci beta-galaktosidázy, při použití 10 mikrolitrů d 1312 bylo prokázáno 32 % pozitivních buněk, při použití 20 mikrolitrů d 1312 bylo prokázáno 39 % pozitivních buněk a při použití 30 mikrolitrů dl312 bylo prokázáno 64 % pozitivních buněk.

Příklad 36

Přenos genu v buňkách epitelu dýchacích cest z krys in vivo při použití kombinačních komplexů

a) Příprava kombinačních komplexů TfpL/AdpL

Komplexy lidského transferinu, polylysinu a DNA (hTfpL) byly připraveny kombinací 8 mikrogramů konjugátu transferin-polylysin (Serva Biochemical) ve 150 mikrolitrech HBS (150 mM chloridu sodného /20 mM HEPES o pH 7,3) se 6 mikrogramy DNA plazmidu pCMVL ve 350 mikrolitrech HBS a směs byla inkubována 30 minut při teplotě místnosti. Pak byly připraveny konjugáty adenoviru a polylysinu stejným způsobem jako v příkladu 19c), byl užit adenovirus, inaktivovaný psoralenem a ultrafialovým světlem. Kombinační komplex hTfpL/AdpL byly připraveny způsobem podle příkladu 23c).

b) Použití připravených komplexů in vivo intratracheálnim podáním

Pro tyto pokusy byl použity krysy kmene Sigmodon hispidus („Cotton Rat“), u nichž bylo prokázáno, že běží o vhodný živočišný model pro plicní onemocnění lidí, způsobená adenovirem podle Pacini a další, 1984. Zvířata byla anestetizována methoxyfluranem. Po vertikálním řezu na ventrální straně krku byly vypreparovány dýchací cesty. Komplexy v množství 250 až 300 mikrolitrů s obsahem 3 mikrogramy plazmidové DNA byly vstřiknuty pod zrakovou kontrolou přímo do průdušnice jehlou, zavedenou v úhlu 45°. V intervalech po injekci, uvedených na obr. 49 byla zvířata usmrcena pomocí oxidu uhličitého a plíce byly vyjmuty po promytí chladným roztokem chloridu sodného s fosfátovým pufrem (PBS) in šitu. Pro zkoušku na luciferázu byla plicní tkáň homogenizována v extrakčním pufru a materiál s obsahem rozrušených buněk byl standardizován na celkový obsah bílkovin, načež byla měřena luciferáza a tím exprese genu pro luciferázu uvedeným způsobem. Světelné jednotky, které jsou na výkrese uvedeny, se vztahují na 1 250 mikrogramů celkové bílkoviny, získané z lyzátu plicní tkáně. Pokusy byly prováděny vždy 3x až 4x, výsledky jsou uvedeny jako průměrné hodnoty ± standardní odchylka.

-70CZ 293141 B6

Příklad 37

Přenos genů při použití endozomolytického prostředku nevirového původu

a) Syntéza peptidů, schopných rozrušit membránu

i) Syntéza peptidů

Peptidy byly připraveny pomocí automatického syntetizátoru ABI 431A metodou na pevné bázi při použití p-alkoxybenzylalkoholové pryskyřice 0,97 mMol/g jako pevné fáze a při použití aminokyselin s ochrannými skupinami Fmoc. Karboxyterminální aminokyseliny byly vázány na pryskyřici přes symetrický anhydrid. Následující aminokyseliny pak byly navázány pomocí 1-hydroxybenzotriazoldicyklohexylkarbodiimidové metody. Na postranních řetězcích byly použity následující ochranné skupiny: (Trt)Asn, (Trt)Cys/(t-Bu)Cys v případě EALA a GLF, (t-Bu)Glu, (Trt)His a (t-Bu)Ser.

Byly připraveny peptidy s následujícími řetězci:

EALA: (řetězec i	2 . 5	): ..	Trp	Glu	Ala	Ala	Leu	Ala	Glu	Ala
Leu	Ala Glu Ala	Leu	Ala	Glu	His	Leu	Ala	Glu	Ala	Leu	Ala
Glu	Ala Leu Glu	Ala	Leu	Ala	Ala	Gly	Gly	Ser	Cys
GLF	(řetězec č.	6):		Gly	Leu	Phe	Gly	Ala	Leu	Ala	Glu
Ala	Leu Ala Glu	Ala	Leu	Ala	Glu	His	Leu	Ala	Glu	Ala	Leu
Ala	Glu Ala Leu	Glu	Ala	Leu	Ala	Ala	Gly	Gly	Ser	Cys,
GLF-	•II (řetězec	č.	7):	Gly	Leu	Phe	Gly	Ala	Leu	Ala	Glu
Ala	Leu Ala Glu	Ala	Leu	Ala	Glu	Ala Leu Ala Glu Ala
Leu	Ala Glu Ala	Leu	Glu	Ala	Leu	Ala	Ala Gly Gly	Ser	Cys.
GLF	-delta (řetězec	c. 8)Gly	Leu	Phe	Glu	Leu	Ala	Glu	Ala

Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys·

EALA-Inf (řetězec č. 9): Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.

EALA-P50 (řetězec č. 10): Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.

-71 CZ 293141 B6

P50 (řetězec č. 11): Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly

Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys.

Peptidy byl odštěpeny od pryskyřice a ochranné skupiny na postranních řetězcích s výjimkou (t-Bu)Cys, byly odstraněny tak, že 100 mg pevné fáze s navázaným peptidem bylo zpracováno 5 působením 3 ml směsi fenolu, ethandithiolu, thioanisolu, vody a kyseliny trifluoroctové v poměru

0,75 : 0,25 : 0,25 : 0,5 : 10 při teplotě místnosti celkem 1,5 hodiny. Surové peptidy byly vysráženy etherem a dvakrát promyty. S-t-Bu-chráněné peptidy EALA a GLF byly rozpuštěny v malém objemu 1 M triethylamoniumhydrogenuhličitanu (TEAB) o pH 8, roztok byl zředěn na 100 nM TEAB a pak byl dále čištěn HPLC v reverzní fázi při použití sloupce Nucleosil 500-5C4 a ío gradientu 0,1% TFA/acetonitril, oba peptidy vycházely ze sloupce při koncentraci acetonitrilu přibližně 50 %. Volná Cys-SH-forma peptidů byla získána tak, že se z Trt-Cys-peptidů odstranily ochranné skupiny svrchu uvedeným způsobem. 5 mg surových peptidů pak bylo rozpuštěno ve 100 mikrolitrech 100 mM TEAB o pH 8 s obsahem 1 mikrolitr beta-merkaptoethanolu a pak byly peptidy čištěny filtrací na gelu Sephadex G-25 při použití 100 mM TEAB a 0,5 mM EDTA 15 a lyofilizací nebo chromatografíí na iontoměniči Mono Q (Pharmacia) při použití 20 mM HEPES o pH 7,3 a gradientu 0 až 3 M chloridu sodného, peptid byl ze sloupce získán při koncentraci chloridu sodného 1,5 M.

ii) Modifikace působení N-(hydroxyethyl)maleimidu

C-terminální skupin SH peptidů GLF-delta, GLF-Π, EALA-Inf, EALA-P50 a P50 byly po filtraci na gelu Sephadex G-25, 20 mM HEPES o pH 7,3 s 0,5 mM EDTA blokovány reakcí s 1,3 až desetinásobným molámím přebytkem N-(hydroxyethyl)maleimidu, reakce trvala 1 hodinu při teplotě místnosti. Přebytečný maleimid byl odstraněn filtrací na gelu Sephadex G-25, 100 mM TEAB o pH 8, a peptidy FLF-delta-mal, GLF-ll-mal, EALA-lnf-mal, EALA-P50-mal a 25 P50-mal, byly získány po lyofilizací ve formě triethylamoniových solí.

iii) Modifikace 2,2'-dithiobispyridinu

Volné SH-peptidy byly přes noc při teplotě místnosti uvedeny do reakce s 10 ekvivalenty 2,2'-dithiobispyridinu (20 mM HEPES o pH 7,9, 0,5 mM EDTA). Přebytečné reakční činidlo 30 bylo odstraněno filtrací na gelu Sephadex G-25, 100 mM TEAB o pH 8 nebo chromatografíí na iontoměniči Mono Q (Pharmacia), 20 mM HEPES o pH 7,3, gradient 0 až 3 M chloridu sodného, peptid vycházel ze sloupce při koncentraci chloridu sodného 1,5 M, čímž byly získány (2-pyridylthio)-cis-peptidy, GLF-delta-SSPy, GLF-II-SSPy, EALA-Inf-SSPy, EALA-P50SSPy a P50-SSPy.

iv) Dimerizace peptidů

Homodimer peptidu P50, P50 FIM byl získán tak, že bylo ekvimolámí množství P50-Cys-(2pyridylthio) a P50-Cys-SH-uvedeno do reakce tři dny při teplotě místnosti ve 20 mM HEPES o pH 7,3. Reakční směs pak byla dělena na sloupci Mono Q (HR-5/5 Pharmacia, 20 mM HEPES 40 o pH 7,3, gradient 0,09 M až 3 M chloridu sodného, P50-dimery vystupovaly ze sloupce při koncentraci 1,1 M). Heterodimer GLF-SS-P50-byl získán analogicky reakcí peptidu P50 ve solné merkaptoformě s peptidem GLF, modifikovaným pyridylthioskupinami.

b) Zkouška na propustnost liposomů

Schopnost syntetických peptidů rozrušit liposomy byla měřena na výstupu fluorescenčního barviva z liposomů při použití různých koncentrací kalceinu. Liposomy byly připraveny postupem, označeným jako REV (odpařování v reverzní fázi) podle Szoka a Papahadjopoulos, 1978, při použití vodné fáze s obsahem 100 mM kalceinu, 375 mM sodíkových iontů, 50 mM chloridu 50 sodného o pH 7,3 a roztok byl protlačován polykarbonátovým filtrem s průměrem otvorů 100 nm

-72CZ 293141 B6 podle MacDonald a další, 1991, aby bylo dosaženo rovnoměrného rozdělení velikosti liposomů. Pak byly liposomy odděleny od nezabudovaného materiálu filtrací na gelu Sephadex G-25 při použití izo-osmotického pufru, obsahujícího 200 mM chloridu sodného a 25 mM HEPES o pH 7,3. Pro zkoušku na propustnost při různých hodnotách pH byl zásobní roztok s obsahem 6 mikrolitrů/ml zředěn dvojnásobnou koncentrací pufru pro provedení zkoušek, který obsahoval 400 mM chloridu sodného a 40 mM citrátu sodného. Podíl 100 mikrolitrů byl zkoumán po přidání k 80 mikrolitrům sériového ředění peptidů ve vodě v mikrotitrační plotně s 96 vyhloubeními při konečné koncentraci lipidu 25 mikroM při vlnové délce 600 nm po roztavení při 490 nm po 30 minutách inkubace při teplotě místnosti a při použití fluorescenčního fotometru pro odečítání mikrotitračních ploten, sledována byla fluorescence kalceinu. Hodnota pro 100% propustnost byla získána přidáním 1 mikrolitrů 10% roztoku Tritonu X-100. Jednotky pro propustnost byly vypočítány jako převrácená hodnota koncentrace peptidů, při níž bylo možno pozorovat 50% propustnost, to znamená, že běží o objem roztoku liposomů v mikrolitrech, k jehož rozrušení dochází na 50%, mikrogramech peptidů. Hodnoty pod 20 jednotek byly extrapolovány. Výsledky zkoušek na propustnost liposomů jsou uvedeny na obr. 50. Nejvyšší účinnost, závislou na pH měly GLG a EALA.

c) Zkouška na rozrušení červených krvinek

Čerstvé lidské červené krvinky byly vícenásobně promyty pomocí HBS a pak byly znovu uvedeny do suspenze ve dvojnásobné koncentraci pufru pro provádění zkoušek při příslušné hodnotě pH (300 nM chloridu sodného, 30 mM citrátu sodného), koncentrace buněk byla 6,6 x 10⁷/ml. Podíl 75 mikrolitrů byl přidán k 75 mikrolitrům sériového ředění peptidů ve vodě ve vyhloubení mikrotitrační plotny s 96 vyhloubeními (kónický typ) a směs byla inkubována jednu hodinu za stálého protřepávání při teplotě 37 °C. Po odstranění nerozrušených červených krvinek odstředěním 5 minut při 1000 ot/min bylo 100 mikrolitrů supematantu přeneseno na nové mikrotitrační plochy a absorpce hemoglobinu byla měřena při hodnotě 450 nm s opravou na hodnotu pozadí při 750 nm. 100% rozrušení buněk bylo dosaženo přidáním 1 mikrolitrů 10% roztoku Triton X-100 před odstředěním. Hemolytické jednotky byly vypočítány jako převrácená hodnota koncentrace peptidů, při níž dochází k 50% propustnosti, to znamená, že běží o objem roztoku erytrocytů v mikrolitrech, který je na 50 % rozrušen mikrogramem peptidů. Hodnoty pod 3 hemolytické jednotky byly extrapolovány. Získané výsledky jsou znázorněny na obr. 51. Je zřejmé, že P50 dim a EALA-P50 měly nejvyšší účinnost, specifickou při určitém pH, pokud jde o rozrušení buněk a/nebo o uvolnění větších molekul, například hemoglobinu. P50-monomery, P50mal a P50 SS-Py měly nižší účinnost. Nejvyšší účinnost měl melittin, tato účinnost však nebyla specifická pro kyselé pH.

d) Příprava kombinačních komplexů DNA

Komplexy DNA byly připraveny tak, že nejprve bylo smíseno 6 mikrogramů DNA pCMVL ve 150 mikrolitrech HBS se 4 mikrogramy TfpL290 ve 150 mikrolitrech HBS a po 30 minutách při teplotě místnosti a přidá ještě 4 až 20 mikrogramů poly(L)lysinu 290 ve 100 mikrolitrech HBS. Po dalších 30 minutách inkubace při teplotě místnosti se přidá ještě 0,3 až 30 mikrogramů peptidu ve 100 mikrolitrech HBS a směs se ještě 30 minut inkubuje. Optimální množství endozomolytického prostředí se stanoví pomocí předběžné titrace, při níž se měří dosažená účinnost přenosu genu, jakje uvedena v tabulce 3 s názvem: Přenos genu do buněk BNL CL.2. Ukázalo se, že při současném přidání polylysinu a endozomolytického prostředku stejně jako při použití většího objemu pro přípravu komplexu (1,5 ml konečného objemu) je možno získat srovnatelnou nebo zvýšenou účinnost transfekce. Při těchto pokusech se také ukázalo, že i amfipatické látky, jako kyselina desoxycholová a kyselina olejová zesilují přenos DNA.

e) Transfekce buněk

Buněčné linie BNL CL.2 hepatocytů nebo buněk NIH 3T3 byly pěstovány 1 až 2 dny před transfekcí na pevném prostředí v miskách s průměrem 6 cm a s obsahem prostředí DMEM

-73CZ 293141 B6 s 10% FCS v množství 300 000 buněk/miska. Pak bylo prostředí odstraněno a k buněčnému materiálu bylo přidáno 1,5 ml prostředí DMEM se 2 % FCS a 500 mikrolitrů komplexu DNA. Bylo také užito 0,5 ml prostředí DMEM se 6% FCS a 1,5 ml komplexu DNA. Po 4 hodinách inkubace byly přidány ještě 2 mikrolitry prostředí DMEM s 18% FCS. Bylo zjištěno, že toto prostředí může být také nahrazeno 4 mikrolitry prostředí DMEM s 10% FCS. 24 hodin po transfekci byl buněčný materiál oddělen a byla provedena zkouška na účinnost luciferázy svrchu popsaným způsobem. Na obr. 52 jsou uvedeny hodnoty, které ve světelných jednotkách představují celkovou aktivitu luciferázy u buněk po transfekci. Na obr. 52 je znázorněna také transfekce jatemích buněk BNL CL.2

Obr. 52A: Komplexy DNA byly připraveny tak, že bylo nejprve smíseno 6 mikrogramů DNA pCMVL ve 250 mikrolitrech HBS se 4 mikrogramy TfpL290 ve 250 mikrolitrech HBS a po 30 minutách inkubace při teplotě místnosti bylo přidáno ještě 20 mikrogramů poly(L)lysinu 290 v 750 mikrolitrech HBS. Po dalších 30 minutách inkubace při teplotě místnosti bylo přidáno ještě uvedené množství peptidů ve 250 mikrolitrech HBS. Po inkubaci dalších 30 minut byly komplexy smíseny s 0,5 ml prostředí DMEM s 6 % FCS a směs byla přidána k množství 450 000 buněk.

Obr. 52B: Komplex DNA byly připraveny tak, že bylo nejprve smíseno 6 mikrogramů DNA pCMVL v 500 mikrolitrech HBS se 4 mikrogramy TfpL290 ve 250 mikrolitrech HBS a směs byla ponechána 30 minut při teplotě místnosti. Pak bylo 500 mikrolitrů roztoku 20 mikrogramů poly(L)lysinu 290 v HS smíseno s uvedeným množstvím peptidů ve 250 mikrolitrech HBS a materiál byl okamžitě přidán ke směsi TfpL/DNA. Po dalších 30 minutách inkubace při teplotě místnosti byly komplexy smíseny s 0,5 ml DMEM se 6 % FCS a materiál byl přidán k množství 450 000 buněk. Po 24 hodinách po transfekci byl buněčný materiál oddělen a zkoušky na aktivitu luciferázy byly provedeny svrchu uvedeným způsobem.

Pokusy, provedené s buňkami NIH 3T3 jsou znázorněny na obr. 53. Komplexy A) a B) byly připraveny obdobným způsobem, jako v případě transfekce jatemích buněk BNL CL.2.

V pokusech s buněčnými kulturami měly nejvyšší účinnost peptidy P50 dim a EALA-P50, prostřední účinnost měly peptidy EALA a GLF, kdežto monomery P50 a melittin měly nižší účinnost.

Příklad 38

Přenos genu při použití syntetického nevirového peptidu s oligolysinovým prodloužením na C-zakončení

Peptid s řetězcem (řetězec č. 4) Met Ala Gin Asp Ile Ile Ser Thr Ile Gly Asp Leu Val Lys Trp Ile Ile Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys byl syntetizován a čištěn způsobem, popsaným v předchozím příkladu. Tento peptid je odvozen od delta-toxinu Staphylococcus aureus s řetězcem č. 3: Met Ala Gin Asp Ile Ile Ser Thr Ile Gly Ssp Leu Val Lys Trp Ile Ile Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys, o němž je známo, zeje specifický pro rozrušení membrány při kyselé hodnotě pH, peptid s řetězcem č. 4 je prodloužením tohoto peptidu o 10 lysinových zbytků.

Komplexy DNA byly připraveny tak, že bylo nejprve smíseno 6 mikrogramů DNA pCMVL ve 170 mikrolitrech HBS se 4 mikrogramy TfpL290 ve 170 mikrolitrech HBS a pak byly po inkubaci 30 minut při teplotě místnosti přidány přibližně 3 mikrogramy peptidu ve 170 mikrolitrech HBS. Po dalších 30 minutách inkubace při teplotě místnosti byly komplexy smíseny s 1,5 ml DMEM se 2 % FCS a směs byla přidána ke 450 000 jatemích buněk BNL CL.2. Po 2 hodinách byly přidány ještě 2 ml DMEM s 20 % FCS. Po 24 hodinách po transfekci byl buněčný materiál oddělen a byl měřena aktivita luciferázy stejným způsobem jako v předchozích

-74CZ 293141 B6 příkladech. Aktivita luciferázy, odpovídající celkovému extraktu byla přibližně 481 000 světelných jednotek.

Příklad 39

Transfekce jatemích buněk v přítomnosti peptidů, odvozených od melittinu s oligolysinovým prodloužením na C-zakončení

Peptidy s řetězcem (řetězec č. 12, směs od N- k C-zakončení): Gly Ile Gly Ala Via Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gin Gin Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys, označený jako řetězec mel 1, a řetězec č. 13: Gly Ile Gly Ala Val Leu Glu Val Leu Glu Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gin Gin Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys, kyselá mutanta, označení jako mel 2, byly syntetizovány obdobným způsobem jako v příkladu 38.

Komplex DNA byl připraven tak, že nejprve bylo smíseno 6 mikrogramů DNA pCMVL ve 170 mikrolitrech HBS se 4 mikrogramy TfpL290 ve 170 mikrolitrech HBS a pak po 30 minutách inkubace při teplotě místnosti byly přidány přibližně 3 mikrogramy peptidů mell nebo 5 mikrogramů mel2 ve 170 mikrolitrech HBS. Po inkubaci dalších 30 minut byl komplex smísen s 1,5 ml DME se 2 % FCS a směs byla přidána ke 450 000 jatemích buněk BNL CL.2, které byly pěstovány stejným způsobem jako v příkladu 38. Po 24 hodinách po transfekci byl buněčný materiál oddělen a byl provedena zkouška na aktivitu luciferázy svrchu popsaným způsobem. Aktivita luciferázy, vztažená na celkový extrakt byla 9200 světelných jednotek při použití peptidů mell a 9400 světelných jednotek při použití peptidů mel2.

Příklad 40

Exprese interferonu alfa u HeLa-buněk

HeLa-buňky v množství 5 x 10⁵ na misku s průměrem 6 cm byly podrobeny transfekci při použití plazmidu pAD-CMVI-IFN, který obsahuje kódový řetězec pro lidský interferon alfa2c pod řízením zesilovače transkripce CMV/promotoru, plazmid je popsán vDE 40 21 917 A. Plazmid pAD-CMVI-IFN byl získán tak, že vložená část HindlII-Xbal IFN-alfa2c byla znovu klonována v plazmidu pAD-CMVl. Vzorky 6 mikrogramů DNA ve 300 mikrolitrech HBS byly smíseny s 8 mikrogramy TfpL ve 330 mikrolitrech HBS a směs se nechala stát 30 minut při teplotě místnosti. Ke vzorkům 6 až 10 byly přidány pouze 4 mikrogramy TfpL a po prvních 30 minutách inkubace byl ke vzorkům 6 a 7 přidán podíl 20 mikrogramů plópL ve 160 mikrolitrech HBS a ke vzorkům 8, 9 a 10 byl přidán podíl 20 mikrogramů pLys 290. Po dalších 30 minutách inkubace byly ještě přidány podíly 160 mikrolitrů HBS s obsahem 10 mikrolitrů (vzorek 8) nebo 50 mikrolitrů (vzorky 9 a 10) volného P16 k syntéze P16 a P16pL podle příkladu 13. Po dalších 30 minutách byly vzorky naneseny na HeLa buňky ve 2 ml prostředí DMEM se 2% FCS v přítomnosti následujících přídatných složek: ke vzorkům 2, 7 a 10 bylo přidáno lOOmikroM chlorochinu, ke vzorkům 3 a 4 bylo přidáno 5 a 15 mikrolitrů adenovirů dl312 s obsahem 1 x 10¹² částic/ml, ke vzorku 5 bylo přidáno 15 mikrolitrů téhož viru, inaktivovaného psoralenem. Jako kontrola pro stimulaci endogenní produkce interferonu adenovirem byly vzorky 11,12 a 13 zpracovány podílem viru stejným způsobem jako v příkladech 3,4 a 5. Po 2 hodinách po transfekci bylo k buněčnému materiálu přidáno 5 ml čerstvého prostředí DMEM s 10 % FCS. Po 48 hodinách po transfekci bylo prostředí odstraněno a nahrazeno 2 ml čerstvého prostředí DMEM s 10% FCS. Toto prostředí bylo odděleno 72 hodin po transfekci a byl provedena zkouška ELISA ke stanovení IFN-alfa podle DE 40 21 917 A: Naměřená množství v ng/ml jsou uvedena na obr. 54.

-75CZ 293141 B6

V souladu s dřívějším pozorováním, provedeným s použitím reporterového genu pro luciferázu nebo pro beta-galaktosidázu je možno pozorovat, že TfpL je pouze slabě funkční při přenosu genu pro IFN do uvedených buněk. V přítomnosti chlorofinu bylo možno získat zjistitelný signál (přibližně 7 ng/ml, vzorek 2). Naproti tomu stimuloval adenoviru d 1312 přenos DNA v závislosti 5 na použité dávce, jak je zřejmé ze vzorků 3 a 4. Při zpracování těchto buněk srovnatelným množstvím viru v nepřítomnosti komplexu IFN-DNA nebylo možno získat žádný zjistitelný signál při IFN, jak je zřejmé ze vzorků 11 a 12. Při transfekci pomocí syntetického, od peptidů chřipkového viru odvozeného endozomolytického peptidů P16 z příkladu 13 ve formě konjugátu (vzorky 6 a 7) nebo ve formě peptidů, iontově vázaného na povrch komplexu TfpL/DNA (vzorky ίο 8, 9 a 10, vazba peptidů je uvedena v příkladu 37), bylo možno prokázat zjistitelnou produkci interferonu, která byl při použití konjugátu peptidů zesílena v přítomnosti chlorochinu, jak je zřejmé ze vzorku 7.

Tabulka IA

Způsob transfekce

Typ buněk komplex:	TfpL (A.)	TfpL + chlorchinolin (A.)	Tfpl + volný AdenoV (B.)	TfpL + vázaný AdenoV (E.)	TfpL + influ pLys (F.)
Hepatocyty
HepG2	-	+/-	+++
BNL.CL2	-	+/-	++++	4-H-H-	+++
primární	-	-	-	++

Myoblasty/trubicová svalová vlákna

C2C12 G8 primární	+/+/-	+/- +/-	+++++ +4-H-4+++
Fibroblasty
3T3	+	++	+++	+++++	4-4-
Mov-13 buněk	+/-	+/-		4-H-H-	+
Myší L-buňky	+/-	+	+	4-H-H-	++
primární				4-4-4-4-

-76CZ 293141 B6

Tabulka 1B

Buňky endotelu aorta vepře	+/-	+	+++	+/-
Lidská buněčná linie
GI-ME-N	+/-	+/-	+++	++++
HeLa-buňky	+	+	+++++	+++++	+++
Myši ES buňky
CCE	+/-		+	++
Bruče 4	+/-		++	+++
Erytroidní buňky
K.562	-	++++	+	+++++	+
slepičí HD3	++	++-H-	+++	+++++
Kostní dřeň
myš	-		-	++
slepice	+/-		+	+++

EBV-transformované

lidské buňky	-	-	-	+++	+
myší linie		+	++	+++

plazmatických buněk (MPC11.SP2/0) +/- aktivita luciferázy 1000-10 000 světelných jednotek na 10⁶ buněk + 10 000-10⁶ světelných jednotek ++ 1-5 x 10⁶ světelných jednotek +++ 5-50 x 10⁶ světelných jednotek tlil· 50-10 x 10⁶ světelných jednotek +++++ 100 x 10⁶ světelných jednotek

TgfpL transferin-poly lysin

AdenoV adenovirus dl312 s defektem replikace

Influ-Lys HA-2 N-terminální peptid-polylysin chřipkového viru

-ΊΊCZ 293141 B6

Tabulka 2A

Bílkoviny s aktivitou na membránách

Virové složené bílkoviny N-terminální řetězec složené bílkoviny

Viry s obalem

Influenzavirus	Myxoviridae	HA2	pH 5	Whiter, 1990, Takahashi, 1990
VSV	Rhabdoviridae	G	pH 5	Hoekstra, 1990
Vacciniavirus		14 kDa	pH 5	Gong a další, 1990
Sendavirus	Parainfluenzav.	F1	pH 7	Hoekstra 1990 Gething a další, 1978
virus spalniček	Parainfluenzav.	F	pH 7	Takahaski, 1990
HIV	Retroviridae	gp41	pH 7	Slepushkin a další, 1992
SIV	Retroviridae	gp41	pH 7	Ruysschaert a Vandenbranden 1991, Franchini, 1989
Viry bez obalu Polyovirus	Enteroviridae	vpl	pH 5	Fricks a Hogle, 1990
Coxackievirus	Enteroviridae	vpl	pH 5	Gething a další, 1978
Rhinovirus		vpl	pH 5

Vnitřní řetězec složené bílkoviny

Tabulka 2B

Viry s obalem

Semliki Forest V. Togaviridae	El	pH 5	White, 1990
Sindbisvirus Viry bez obalu			White, 1990
Rhesus Rotavirus Toxiny mikroorganismů	vp5		Mackov a další, 1988
Streptolysin O Streptococcus sulfhydryl-aktivace vazby na cholesterol 20-80mer,	69 kDa	pH 7	Kehoe a další, 1987
15 nm zóny Listeriolysin O. L. monocytogenes sulfhydryl-aktivace vazba na cholesterol příbuzný	60 kDa	pH 5	Geoffroy a další, 1987
s C9 a Streptolysinem 0 alfa-toxin Staphylococcus amphipatická povrchová plocha beta-struktura hexamemí léze 2 nm Poren	34 kDa	pH7
Haemolysin E. coli	416 AA	pH7	Oropeza-W erkerle
8 amphip. Helixy			a další, 1992
Haemolysin Trypanosoma cruzi analogie s Perforiny příbuzný s C9 Imunitní systém obratlovců	75 kDa	pH 5	Andrews a další, 1990
Perforin cytotoxické T-buňky Ca2+-závislost			Ojcius a Jing, 1991
komplement C9 (MAC C5b-8 9l-4)			Bhakdi a Tranum-
dutý, bílkovinný válec			Jensen, 1991, Esser,
10 nm kanál			1991
vysoce řízená účinnost Složená bílkovina
pH-30 spermie-vajíčko alfa-podjednotka povrcho-		pH7	Blobel a další, 1992

vé bílkoviny, vnitřní řetězec složené bílkoviny

-78CZ 293141 B6

Tabulka 2C

Peptidy s aktivitou na membránách

Tabulka 2C

Peptidy s aktivitou na membránách

5 Ochranné jedy (toxiny) Melittin včelí jed	26AA
Bombolitin jed včeláka	17AA
Mastoparan jed vosy	14AA
Crabrolin jed sršně	13AA
Pardaxin moses sole físh	33AA
(Hairepellant)
Antibakteriální peptidy
Sarcotoxin IA masařka
(v hemolymfě)
Cecropiny hmyz (humorální	37AA
imunitní systém, bourec)
Maganin kůže Xenopus	23 AA
laevis
Alematicin houba	15-24AA
(Trichoderma viride)
Bakteriální toxiny
δ-toxin	26AA
Staphylococcus aureus
Amoebapor	25AA
Entamoeba hi stolytica
Imunitní systém obratlovců
defensiny vícejademé	29-34AA
neutrofily

amph. alfa-Helix, Pro-otočený amph. alfa-Helix amph. alfa-Helix amph. alfa-Helix amph. alfa-Helix Pro-otočený	Blondelle a Hougten, 1991, Dempsey a další, 1991, Ikura a Inagaki, 1991 Argiolas a Pisano, 1985 Argiolas a Pisano, 1985 Argiolas a Pisano, 1985 Shai a další, 1990
amph. alfa Helix Pro-otočený amph. alfa-Helix	Esser, 1991 Marion a další, 1988
amph. alfa-Helix alfa-amino máselná kyselina	Esser, 1991
amph. alfa-Helix indukce kyselinou amph. alfa-Helix indukce kyselinou	Thiaudiere a další, 1991, Alouf a další, 1989 Leippe a další, 1991
beta-struktura (SS-můstek)	Lehrer a další, 1991

-79CZ 293141 B6

Tabulka 3

Transfekce BNL CL.2 buněk (6 pg pCMV-L DNA, 4 pg TfpL290

pLys		Ogg	03 pg	1 Mg	3 Mg	10 Mg	20 Mg	30 Mg
Qpg	P50 dim GLF Melittin	160	330 490 0	540 290 0	300 340 0	70		425
4 Mg	P50 dim GLF EALA	3100	670 3140	200 600 150	430 170 560	180	410
10 pg	P50dim GLF EALA	5700	1950 2120	16600 16800	217000 179300	760 215000 181700	1330 1980 76360	3424800
20 pg	P50 dim GLF EALA Meilittin	3200			23300 418400 191000 6545	185100 320600 181000	7054800 294200 273600	9344000
kyselina desoxycholová			6730	34700	16000
kyselina olejová			12200	11900	4100

-80CZ 293141 B6

Literatura:

Abrahamson, D.R. et al., 1981, J. Cell Biol., 91, 270280.

Akopian, T.A. et al., 1991, Nucl. Acids Res. 19, 424. Alouf, J.E., Dufourcq J., Siffert O., Thiaudiere E. und

Geoffroy Ch., 1989, Eur. J. Biochem. 183, 381-390. Anderson, P. et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 1130111304.

Andrews, N.W., Abrams C.K., Slatin S.L. und Griffiths

G., 1990, Cell 61, 1277-87.

Ansardi, D.C. et al., 1991, J. Virology 65, 2088-2092. Argiolas, A. und Pisano J.J., 1985, J. Biol. Chem. 260, 1437-1444.

Armentano, D., Yu, S., Kantoff, P., von Ruden, T., Anderson, W.F. und Gilboa, E., 1987, J. Virol. 61, 1647-1650.

Armentano, D. et al., 1990, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87, 6141-6145.

Asada-Kubota, M. et al., 1983, Exp. Pathol., 23, 95-

101.

Ascoli, M. et al., 1978, J. Biol. Chem., 253, 78327838.

Ashwell, G. et al., 1982, Annu. Rev. Biochem.·, 51, 531554.

Atherton, E., Gait, M.J., Sheppard, R.C. und Williams, B.J., 1979, Bioorg. Chem. 8, 351.

Barr, E. und Leiden, J., 1991, Science 254, 1507-1509. Bartlett, G.R., 1959, J. Biol. Chem. 234, 466.

Berkneř, K.L., 1988, BioTechniques 6, 616-629.

Berns, K.I., 1990, Virology, 2nd Edition, Ed. by

Fields, B.N., Knipe, D.M. et al., Raven Press Ltd., New York, 1743-1759.

Bhakdi, S. und Tranum-Jensen J., 1991, Inununology today 12, 318-320.

Blau, H. et al., 1985, Science 230, 758-766.

-81 CZ 293141 B6

Blobel, C.P., Wolfsberg T.G., Turuck C.W., Myles D.G.,

Primakoff P. und White J.M., 1992, Nátuře 356,

248-252.

Blondelle, S.E. und Houghten R.A., 1991, Biochemistry

30, 4671-4678.

Bondeson, J., Wijkander, J. und Sundlez, R., 1984, Biochim. Biophys. Acta 777, 21-27.

Boulanger, P.A. und Puvion, F., 1973, Eur. J. Biochem. 39, 37-42.

Bragg, R.R. et al., 1991, Onderstepoort J. Vet. Res. 58, 309-310.

Carpenter, G., 1984, Cell, 37, 357-353.

Chardonnet, Y. und Dales, S., 1970, Viology 40, 462477.

Cheng, S-Y. et al., 1980, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 77, 3425-3429.

Ciliberto, G., Dente, L., Cortese, R., 1985, Cell 41, 531-540.

Clarke, D.D., Myček, M.J., Neidle, A. und Waelsch, H., 1959, Arch. Biochem. Biophys. 79, 338-354.

Collis, P., Antoniou, M. und Grosveld, F., 1990, EMBO J. 9, 233-240.

Cotten, M., Laengle-Rouault, F., Kirlappos., H., Wagner, E., Mechtler, K., Zenke, M., Beug, H., und Bimstiel, M.L., 1990, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 87, 4033-4037.

Davidson, D. und Hassell, J.A., 1987, J. Virol. 61, 1226-1239.

Davis, B.D. und Dulbecco, R., 1980, Microbiology, 3rd Edition, Ed. by Davis, B.D. et al., Harper & Row, Sterilization and Disinfection, 1263-1274.

Defer, C., Bělin, M., Caillet-Boudin, M. und Boulanger, P., 1990, J. Virol. 64, 3661-3673.

Dempsey, C.E., Bazzo R., Harvey T.S., Syperek I., Boheim G. und Campbell I.D., 1991, FEBS Lett. 281, 240-244.

-82CZ 293141 B6

De Wet, J., Wood, K., DeLuca, M., Helinski, D. und

Subramani, S., 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 725-737.

Dhawan, J. et al., 1991, Science 254, 1509-1512.

Donti, E. et al., 1988, Cancer Genet. Cytogenet. 30,

225-231.

Dulbecco, R., 1980, Microbiology, 3rd Edition, Ed. by Davis, B.D. et al., Harper & Row, The Nátuře of Viruses, 853-884.

Eaton, D.L. et al., 1986, Biochemistry 25, 8343-8347.

Esser, A.F., 1991, Immunology today 12, 316-318.

Fields, B.N. und Knipe, D.M., 1990, Virology, 2nd edition, Raven Press, Ltd., New York.

FitzGerald, D., Padmanabhan, R., Pastan, I. und Willingham, M., 1983, Cell 32, 607-617.

Folk, J.E., 1985, Methods Enzymol. 113, 358-375. Franchini, G., 1989, Science 244, 694-697.

Fricks, C.E. und Hogle J.M., 1990, J. Virol. 64, 19341945.

Fujiwara, et al., 1981, J. Immunol. Meth. 45, 195.

Geoffroy, C., Gaillard J.-L., Alouf J.E. und Berche P., 1987, Infection and Immunity 55, 1641-1646.

Gething, M.J., White J.M. und Waterfield M.D., 1978, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75, 2737-2740.

Ginsberg, H.S., 1980, Microbiology, 3rd Edition, Ed. by Davis, B.D. et al., Harper & Row, Picornaviruses, 1095-1117.

Goldmacher, V.S., Biattler, W.A., Lambert, J.M., Mclntyre, G. und Steward, J., 1989, Molecular Pharmacology 36, 818-822.

Goldstein, J.L. et al., 1982, Clin. Res., 30, 417-426
Goldstein, J.L.	et	al.,	1979,	Proč. Nati Acad. Sci.
USA, 76, 333-337.
Goldstein, L.J.	et	al,,	1980,	Nátuře 285, 66

Gong, S., Lai C. und Esteban M., 1990, Virology 178, 81-91.

Green, M. et al., 1989, Cell 58, 215-223.

-83CZ 293141 B6

Hearst, J. E. und Thiry, L., 1977, Nucl. Acids Res. 4,

1339-1347.

Heldin, C-H. et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 42164221.

Hělěne, C. und Toulme J.-J., 1990, Biochem. Biophvs. Acta 1049, 99-125.

Herskowitz, I., 1987, Nátuře 329, 219.

Hizuka, N. et al., 1981, J. Biol. Chem., 256, 45914597.

Hoekstra, D., 1990, J. Bioenerg. Biomembr. 22, 121-155.

Holland, J.J., 1990, Virology,2nd Edition, Ed. by Fields, B.N., Knipe, D.M. et al., Raven Press Ltd., New York, Defective Viral Genomes, 151-165.

Horvath, J. et al., 1988, J. Virol. 62, 341-345.

Horwitz, M.S., 1990, Virology, 2nd Edition, Ed. by Fields, B.N., Knipe, D.M. et al., Raven Press Ltd., New York, Adenoviridae and their replication, 1679-1721.

Hosang, M. et al., 1987, EMBO J., 6, 1197-1202.

Huang, A.S., 1987, The Molecular Basis of Viral Replication, Ed. by Bercoff, R.P., Plenům Press New York and London, The Role of Defective Interfering (Dl) Particles in Viral Infection, 191-194.

Ikura, T., Go N. und Inagaki F., 1991, Proteins 9, 81-

89.

Imamura, K. et al., 1987, J. Immunol., 139, 2989-2992. Iwanij, V., 1977, Eur. J. Biochem. 80, 359-368.

Jones, N. und Shenk, T-, 1979, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 76, 3665-3669.

Jung, et al., 1981, Biochem. Res. Commun. 101, 599.

Kaplan, J. et al., 1979, J. Biol. Chem., 254, 73237328.

Kasid, A., Morecki, s., Aebersold, P., Cornetta, K., Culver, K., Freeman, S., Director, E., Lotze, M.T., Blaese, R.M., Anderson, W.F. und Rosenberg,

-84CZ 293141 B6

S.A., 1990, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 87, 473-477.

Kehoe, M.A., Miller L., Walker J.A. und Boulnois G.J.,

1987, Infect. Irranun. 55, 3228-3232.

Keller, G., Paige, C., Gilboa, E. und Wagner, E.F.,

1985, Nátuře 318, 149-154.

Khang, C. und Nagaraji. K.V., 1989, Am. J. Vet. Res.

50, 1466-1470.

Klausner, R.D. et al., 1983, J. Biol. Chem., 258, 47154724.

Klausner, R.D. et al., 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80, 2263-2266.

Kuhn, L.C. et al., 1982, Trends Biochem. Sci., 7, 299302.

Kurachi, K., Davie, E.W., 1982, Proč. Nati. Acad. Sci USA 79, 6461-6464.

Laver, W.G. et al., 1971, Virology 45, 598-614.

Lehrer, R.I., Ganz T. und Selsted M.E., 1991, Cell 64, 229-230.

Leippe, M., Ebel S., Schoenberger O.L., Horstmann R.D. und Muller-Eberhard H.J., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 7659-7663.

Lim, K. und Chae, C.B., 1989, BioTechniques 7, 576-579. Luthmann, H. und Magnusson, G., 1983, Nucl. Acids Res.

11, 1295-1308.

MacDonald, R.C. et al., 1991, Biochim. Biophys. Acta 1061, 297-303.

Macgregor, G. und Caskey, C.T., 1989, Nucl. Acids Res. 17, 2365.

Mackow, E.R., Shaw R.D., Matsui S.M., Vo P.T., Dang

M.N. und Greenberg H.B., 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 645-649.

Madshus, I.H., Olsnes, S. und Sandvig, K., 1984, Virology 139, 346-357.

Malim, M. et al., 1989, Cell 58, 205-214.

Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrook, J. (1982)

Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring

-85CZ 293141 B6

Harbor Laboratory, 474.

Marion, D., Zasloff M. und Bax A., 1988, FEB 227, 21.

Marshall, S., 1985, J Biol. Chem., 250, 4133-4144.

Massague, J. et al., 1986, J. Cell. Physiol., 128, 216222.

McClure, M.O., Sommerfelt, M.A., Marsh, M. und Weiss, R-A., 1990, J. Generál Virol. 71, 767-773.

Mellman, I.S. et al., 1984, J. Cell Biol., 98, 11701177.

Mizel, S.B. et al., 1987, 1987, J. Immunol., 138, 29062912.

Ojcius, D.M. und Young J.D., 1991, TIBS 16, 225-229.

Oropeza-Werkerle, R.L., Muller S., Briand J.P., Benz

R., Schmid A. und Goebel W., 1992, Mol. Microbiol. 6, 115-121.

Otero, M.J. und Carrasco, L., 1987, Virology 160, 75-

80.

Pacini, D.L. et al., 1984, J. Infect. Dis. 150, 92-97. Parente, R.A. et al., 1990, Biochemistry 29, 8720-8728. Patek, P.Q., Collins, J.L. und Cohn, M. 1978, Nátuře 276, 510-511.

Ponder, J.P. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 1217-1221.

Posner, B.l. et al., 1982, J. Cell Biol., 93,- 560-567.

Precious, B. und Russell, W.C., 1985, Virology, ed. Mahy, B.W.J., IRL Press, Oxford, Washington, DC, 193-205.

Rafalski, M., Lear, J.D. und DeGrado, W.F., 1990, Biochemistry 29, 7917-7922.

Reece, R.L. et al, 1987, Aust. Vet. J. 64, 365-367.

Riordan, J.R. et al., 1989, Science, 245, 1066-1073. Rosenberg, St.A. et al., 1992, Human Gene Therapy 3, 75-90.

Ruysschaert, J.-M. und Vanderibranden M-, 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 175, 872-879.

Sambrook, J. et al. (Eds.), 1989, Molecular Cloning,

-86CZ 293141 B6

2nd Edition, Vol. 3, 16.39-16.40.

Schalch, D.S. et al., 1986, Endocrinology, 118, 15901597.

Sennett, C. et al., 1981, Annu. Rev. Bicchem., 50, 1053-1086.

Seťn, P., FitzGerald, D., Ginsberg, H., Willingham, M. und Pastan, I., 1984, Mol. Cell. Biol. 4, 15281533.

Severne, Y., Wielana, S., Schaffner, W. und Rusconi,

S., 1988, EMBO J. 7, 2503-2508.

Shai, Y., Bach D. und Yanovsky A., 1990, JBS 265, 20202-20209.

Sharon, N., 1987, Cell Separation: Methods and Selected Applications, Vol. 5, Academie Press lne., pp.13-

44.

Silver, I». et al., 1988, Virology 165, 377-387.

Sipe, D.M. et al., 1991, J. Biol. Chem. 256, 3469-3474. Skern, T. et al., 1984, Virology 136, 125-132.

Slepushkin, V.A,, Andreev S.M., Siderova M.V., Melikyan G.B., Grigoriev V.B., Chumakov V.M., Grinfeldt A.E., Manukyan R.A. und Karamov E.V., 1992, AIDS Res. Human Retroviruses 8, 9-18.

Sly, W. et al., 1982, J. Cell Biochem., 18, 67-85.

Smith, K.A. et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82, 864-867.

Stáhl, P.D. et al., 1978, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 75, 1399-1403.

Straubinger, R.M. und Papahadjopoulos, D., 1983, Meth. Enzymol. 101, 512-527.

Strauss, W. und Jaenisch, R., 1992, EMBO J. 11, 417422.

Subbarao, N.K. et al., 1987, Biochemistry 26, 29642972.

Sullenger, B.A. et al., 1990, Cell 63, 601-608. Svensson, U., 1985, J.Virol., 55, 442-449.

Szoka, F. und Papahadjopoulos, D., 1978,

-87CZ 293141 B6

Proč.Mat1.Acad.Sci. USA 75, 4194-4198.

Takahashi, S., 1990, Biochemistry 29, 6257-6264.

Takayama, K.M. und Inouye, M., 1990, Critical reviews in Biochem. and Mol.Biol. 25, 155-184.

Takese, K. et al., 1990, Nippon Juigaki Zasshi 52, 207215.

Thiaudiere, E., Siffert 0., Talbot J.-C., Bolard J.,

Alouf J.E. und Dufourcq J., 1991, Eur. J. Biochem. 195, 203-213.

Trono, D. et al., 1989, Cell 59, 113-120.

Uchida, Y., Tsukada, U. und Sugimori, T., 1977, J.

Biochem. 82, 1425-1433.

Urakawa, T., et al., 1989, J. Gen. Virol. 70, 14531463.

Valerio, D., Mclvor, R.S., Williams, S.R., Duyvesteyn, M.G.C., Van Ormondt, H., Van der Eb, A.J., Martin, D.W. Jr, 1984, Gene, 31, 147-153.

van Oostrum, J. und Burnett, R.M., 1985, J. Virol. 56, 439-448.

Wagner, E., Zenke, M., Cotten, M., Beug, H. und Birnstiel, M.L., 1990, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 87, 3410-3414,

Wagner, E., Cotten, M., Foisner, R. und Birnstiel,

M.L., 1991a, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 88,· 42554259.

Wagner, E., Cotten, M., Mechtler, K., Kirlappos, H. und Birnstiel, M.L., 1991b, Bioconjugate Chemistry 2, 226-231.

Walker, F. et al., 1987, J. Cell Physiol., 130, 255261.

Walker, R.D. et al., 1989, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 86, 9514-9518.

Walls, E.V. und Crawford, D.H., 1989, Lymphocytes, a practical approach, G.G.B. Klaus, Ed., IRL press Oxford, 149-162

Watson, J.D., et al., 1987, Mol. Biol. of the Gene,

-88CZ 293141 B6

Benjamin/Cummings Publ. Company lne., 676-677.

Wharton, S.A., Martin, S.R., Ruigrok, R.W.H., Skehel,

J.J. und Wiley, D.C., 1988, J. Gen. Virol. 69,

1847-1857.

White, J.M., 1990, Annu. Rev. Physiol 52, 675-697

Wilchek, M. et al., 1988, Anal. Biochem. 171, 1.

Wilson, J.M., Danos, 0., Grossman, M., Raulet, D.H. und Mulligan, R.C., 1990, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 87, 439-443.

Willumsen, N.J., Davis, C.W. und Boucher, R.C., 1989, Ant. J. Physiol. 256 (Cell Physiol. 25), 1033-1044.

Wood, W.I., Capon, D.J., Simonsen, C.C., Eaton, D.L., Gitschier, J., Keyt, B., Seeburg, P.H., Smith, D.H., Hollinshead, P., Wion, K.L., Delwart, E., Tuddenham, E.G.D., Vehar, G.A., Lawn, R.M., 1984, Nátuře, 312, 330-337.

Wu, R., Yankaskas, J.R., Cheng, E., Knowles, M.R. und Boucher, R., 1985, Am.Rev.Respir.Dis. 132, 311320.

Wu, G.Y. und Wu, 4432.	C.H.,	1987,	J. Biol.	Chem.	262, 4429-
Wu, G.Y. und Wu,	C.H.,	1988,	J. Biol.	Chem.	263, 14621-
14624.
Yankaskas, J.R.,	Stutts	;, M.J	., Cotton,	C.U.	, -Knowles,

M.R., Gatzy, J.T. und Boucher, R.C., 1987, Genetics and Epithelial Cell Dysfunction in Cystic Fibrosis, Alan R. Liss, lne., pp. 139-149.

Yankaskas, J.R., Haizlip, J.E., Conrad, M., Koval, D., Schlegel, R. und Boucher, R.C., 1991, Am. Rev. Respir. Dis. 143, A139.

Zámečník, P.C., Goodchild, J., Taguchi, Y. und Sarin, P.S., 1986, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 83, 4143-4146.

Zatloukal, K., Denk, H., Lackinger, E. und Rainer, I., 1989, Lab. Invest. 61, 603-608.

Zenke, M., Steinlein, P., Wagner, E., Cotten, M., Beug,

H. und Birnstiel, M.L., 1990, Proč.Nati.Acad.Sci.

-89CZ 293141 B6

USA 87, 3655-3659.

Zon, G., 1988, Pharmaceut. Research 5, No.9, 539-549.

Remington*s Pharmaceutical Sciences, 1980, Mack Publ.

Co., Easton, PA, Osol (ed.).

Trends Pharmacol. Sci. 10, 1989, 458-462.

Seznam řetězců ii) Název vynálezu: Prostředek pro transfekcí vyšších eukaryotických buněk, způsob výroby jeho složek, způsob transfekce a farmaceutické prostředky s obsahem nukleových kyselin iii) Počet řetězců: 13 iv) Forma, odečitatelná v počítači.

A) Typ prostředí: Floppy dik

B) Počítač: IBM PC kompatibilní

C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS

D) Sofitwar: Patentln Release 1,0, verze 1,25 (EPO).

2) Informace pro řetězec č. 1:

1) Vlastnosti řetězce:

A) Délka: 23 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

C) Forma: jednotlivý řetězec

D) Topologie: obě ii) Povaha molekuly: peptid xi) Popis řetězce č. 1:

Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp 15 10

Glu Gly Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys

20

2) Informace pro řetězec č. 2:

i) Vlastnosti řetězce:

A) Délka: 23 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

C) Forma: jednotlivý řetězec

D) Topologie; obě i i) Povaha molekuly: peptid xi) Popis řetězce č. 2:

-90CZ 293141 B6

2)

i) i>) xi)

Gly Leu Phe Gly Ala

5

Glu Gly Met Ile Asp

Informace pro řetězec č. 3:

Vlastnosti řetězce:

A)

B)

C)

D)

Délka: 26 aminokyselin Typ: aminokyselina Forma: jednotlivý řetězec Topologie: obě

Povaha molekuly: peptid

Ile

Ale

Gly

Phe

Ile

Glu

Asn Gly Trp

Gly

Gly

Gly

Cys

Popis řetězce č. 3:

Met	Ala	Gin	Asp	Ile	Ile	Ser	Thr	Ile	Gly	Asp	Leu Val Lys
1				5					10
Trp	Ile	Ile	Asp	Thr	Val	Asn	Lys	Phe	Thr	Lys	Lys
15					20					25

2) Informace pro řetězec č. 4:

i) Vlastnosti řetězce:

A) Délka: 36 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

C) Forma: jednotlivý řetězec

D) Topologie: obě ii) Povaha molekuly: peptid xi) Popis řetězce č. 4:

Met

Ala

Gin

Asp

Ile

Ile

Ser

Thr

Ile

Gly

Asp

Leu

Val

Lys

1

5

10

Trp

Ile

Ile

Asp

Thr

Val

Asn

Lys

Phe

Thr

Lys

Lys

Lys

Lys

15

20

25

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

30

35

2) Informace pro řetězec č.5:

i) Vlastnosti řetězce:

A) Délka: 34 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

C) Forma: jednotlivý řetězec

D) Topologie: obě

-91 CZ 293141 B6 ii) Povaha molekuly: peptid

Popis

řetězci

e č. 5:

Trp

Glu

Ala

Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu Ala

1

5

10

Glu

His

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Glu

Ala Leu

15

20

25

Ala

Ala

Gly

Gly

Ser

Cys

2) Informace pro řetězec č. 6:

i) Vlastnosti řetězce:

A) Délka: 35 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

C) Forma: jednotlivý řetězec

D) Topologie: obě ii) Povaha molekuly: peptid xi) Popis řetězce č. 6:

Gly

Leu

Phe

Gly Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

1

5

10

Ala

Glu

His

Leu Ala

Glu

Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Glu

Ala

15

20

25

Leu

Ala

Ala

Gly Gly

Ser

Cys

30

35

2) Informace pro řetězec č. 7:

i) Vlastnosti řetězce:

A) Délka: 35 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

C) Forma: jednotlivý řetězec

D) Topologie: obě ii) Povaha molekuly: peptid xi) Popis řetězce č. 7:

Gly

Leu

Phe

Gly

Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Ala

Glu

Ala Leu

1

5

10

Ala

Glu

Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Glu Ala

15

20

25

Leu

Ala

Ala

Gly Gly

Ser

Cys

30

35

-92CZ 293141 B6

2) Informace pro řetězec č. 8:

i) Vlastnosti řetězce:

A) Délka: 34 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

C) Forma: jednotlivý řetězec

D) Topologie: obě ii) Povaha molekuly: peptid xi) Popis řetězce č. 8:

Gly

Leu

Phe

Glu

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Ala

1

5

10

Glu

Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Glu

Ala

Leu

15

20

25

Ala

Ala

Gly

Gly

Ser

Cys

30

2) Informace pro řetězec č. 9:

i) Vlastnosti řetězce:

A) Délka: 34 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

C) Forma: jednotlivý řetězec

D) Topologie: obě ii) Povaha molekuly: peptid xi) Popis řetězce č. 9:

Gly

Leu

Phe

Gly

Ala

Ile

Ala

Gly

Phe

Ile

Glu

Asn

Gly

Trp

1

5

10

Glu

Gly

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Glu

Ala

Leu

15

20

25

Ala

Ala

Gly

Gly

Ser

Cys

2) Informace pro řetězec č. 10:

i) Vlastnosti řetězce:

A) Délka: 34 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

C) Forma: jednotlivý řetězec

D) Topologie: obě ii) Povaha molekuly: peptid xi) Popis řetězce č. 10:

-93CZ 293141 B6

Gly

Leu

Phe

Glu

Ala

Ile

Glu

Gly

Phe

Ile

Glu

Asn

Gly

Trp

1

5

10

Glu

Gly

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Glu

Ala

Leu

15

20

25

Ala

Ala

Gly

Gly

Ser

Cys

2) Informace pro řetězec č. 11:

i) Vlastnosti řetězce:

A) Délka: 23 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

C) Forma: jednotlivý řetězec

D) Topologie: obě ii) Povaha molekuly: peptid xi) Popis řetězce č. 11:

Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp 15 10

Glu Gly Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys

20

2) Informace pro řetězec č. 12:

i) Vlastnosti řetězce:

A) Délka: 36 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

C) Forma: jednotlivý řetězec

D) Topologie: obě ii) Povaha molekuly: peptid xi) Popis řetězce č. 12:

Gly

Ile

Gly

Ala

Val

Leu

Lys

Val

Leu

Thr

Thr

Gly

Leu

Pro

1

5

10

Ala

Leu

Ile

Ser

Trp

Ile

Lys

Arg

Lys

Arg

Gin

Gin

Lys

Lys

15

20

25

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

30

35

2) Informace pro řetězec č. 13:

i) Vlastnosti řetězce:

A) Délka: 36 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

-94CZ 293141 B6

C) Forma: jednotlivý řetězec

D) Topologie: obě ii) Povaha molekuly: peptid xi) Popis řetězce č. 13:

Gly	Ile	Gly	Ala	Val	Leu	Glu	Val	Leu	Glu	·> Λ	Gly Leu Pro
1				5					10
Ala	Leu	Ile	Ser	Trp	Ile	Lys	Arg	Lys	Arg	Gin	Gin Lys Lys
15					20					25
Lys	Lys	Lys	Lys	Lys	Lys	Lys	Lys
	30					35

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Prostředek pro transfekci vyšších eukaryotických buněk s obsahem komplexu nukleové kyseliny a látky s afinitou pro nukleovou kyselinu, popřípadě konjugovanou s intemalizačním faktorem pro vyšší eukaryotické buňky, vyznačující se tím, že prostředek obsahuje endozomolytické činidlo, které

Claims (114)

1. Prostředek pro transfekci vyšších eukaryotických buněk s obsahem komplexu nukleové kyseliny a látky s afinitou pro nukleovou kyselinu, popřípadě konjugovanou s intemalizačním faktorem pro vyšší eukaryotické buňky, vyznačující se tím, že prostředek obsahuje endozomolytické činidlo, které

a) je přítomno jako složka komplexu s nukleovou kyselinou, komplex je vytvořen přes vaznou oblast endozomolytického činidla pro nukleovou kyselinu nebo přes látku s afinitou pro nukleovou kyselinu, na níž je činidlo vázáno, komplex popřípadě ještě obsahuje intemalizační faktor, rovněž tvořící komplex s nukleovou kyselinou přes látku s afinitou k nukleové kyselině, a níž je konjugován, nebo

b) je endozomolytickým činidlem virus nebo složka viru se schopností proniknout do buňky, na níž má být transfekce uskutečněna, přičemž toto endozomolytické činidlo je přítomno vně komplexu, který osahuje nukleovou kyselinu a látku s afinitou pro nukleovou kyselinu, popřípadě konjugovanou s intemalizačním faktorem.

2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že endozomolytické Činidlo podle odstavce a) je kovalentně vázáno na látku s afinitou k nukleové kyselině.

3. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že endozomolytické činidlo podle odstavce a) je na látku s afinitou k nukleové kyselině vázáno nekovalentním způsobem.

4. Prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že vazba je uskutečněna přes biotinstreptavidinový můstek.

5. Prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že vazba je uskutečněna iontovým způsobem.

6. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako endozomolytický prostředek podle odstavce a) obsahuje virus nebo složku viru.

-95CZ 293141 B6

7. Prostředek podle nároku 1 nebo 6, v y z n a č u j í c í se tím, že jako endozomolytické činidlo podle odstavce a) nebo b) obsahuje adenovirus.

8. Prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že obsahuje mutant adenoviru.

9. Prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že obsahuje pro replikaci nekompetentní mutant adenoviru.

10. Prostředek podle nároku 9, vyznačující se tím, že adenovirus obsahuje jednu nebo větší počet mutací a/nebo delecí v oblasti El A.

11. Prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že obsahuje inaktivovaný adenovirus.

12. Prostředek podle nároku 11, vyznačující se tím, inaktivovaný ultrafialovým světlem s kratší vlnovou délkou.

13. Prostředek podle nároku 11, vyznačující se tím, inaktivovaný ultrafialovým světlem a psoralenem.

že obsahuje adenovirus, že obsahuje adenovirus,

14. Prostředek podle nároku 11, vyznačující se tím, že obsahuje adenovirus, inaktivovaný formaldehydem.

15. Prostředek podle nároku 6, vyznačující se tím, že virová složka je tvořena jedním nebo větším počtem proteinů adenoviru.

16. Prostředek podle nároku 1 nebo 6, v y z n a č u j í c í se tím, že jako endozomolytické činidlo v odstavci a) nebo b) obsahuje pikomavirus.

17. Prostředek podle nároku 16, vyznačující se tím, že jako pikomavirus obsahuje rhinovirus, popřípadě inaktivovaný.

18. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že endozomolytickým činidlem podle odstavce a) nebo b) je virus nebo složka virů, které nejsou infekční pro člověka.

19. Prostředek podle nároku 18, vyznačující se tím, že jako virus obsahuje adenovirus.

20. Prostředek podle nároku 19, vyznačující se tím, že jako adenovirus obsahuje adenovirus ptáků.

21. Prostředek podle nároku 20, vyznačující se tím, že jako adenovirus obsahuje virus, letální pro kuřecí embryo.

22. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako endozomolytické činidlo podle odstavce a) obsahuje endozomolytický virový peptid, popřípadě modifikovaný.

23. Prostředek podle nároku 22, vyznačující se tím, že jako endozomolytický peptid obsahuje hemaglutinin HA2 chřipkového viru.

24. Prostředek podle nároku 23, vyznačující se tím, že jako endozomolytické činidlo obsahuje peptid s řetězcem Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-AsnGly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.

-96CZ 293141 B6

25. Prostředek podle nároku 23, vyznačující se tím, že jako endozomolytické činidlo obsahuje peptid s řetězcem Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-AsnGly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Cys.

26. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako endozomolytické činidlo podle odstavce a) obsahuje přírodní nebo syntetický peptid nevirového původu, popřípadě modifikovaný, schopný rozrušit buněčné membrány a schopný detekce zkouškou na permeabilitu liposomů a/nebo rozrušení erytrocytů.

27. Prostředek podle nároku 26, vyznačující se tím, že jako endozomolytické činidlo obsahuje peptid s řetězcem Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys.

28. Prostředek podle nároku 26, vyznačující se tím, že jako peptid sendozomolytickým účinkem obsahuje homo- nebo heterodimer peptidů podle nároku 27.

29. Prostředek podle nároku 28, vyznačující se tím, že obsahuje homodimer peptidů podle nároku 27.

30. Prostředek podle nároku 28, vyznačující se tím, že jako endozomolytické činidlo obsahuje heterodimer peptidů s řetězcem Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.

31. Prostředek podle nároku 26, vyznačující se tím, že jako endozomolytické činidlo obsahuje peptid s řetězcem Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.

32. Prostředek podle nároku 26, vyznačující se tím, že jako endozomolytické činidlo obsahuje peptid s řetězcem Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.

33. Prostředek podle nároku 22 nebo 26, vyznačující se tím, že peptid obsahuje vaznou oblast pro nukleovou kyselinu.

34. Prostředek podle nároku 33, oligolysinovým prodloužením.

vyznačující tím, že obsahuje peptid, opatřený

35. Prostředek podle nároku 1, obsahuje transferin.

vyznačující tí m, že jako intemalizační faktor

36. Prostředek podle nároku 1, obsahuje vazný řetězec pro T-buňky.

vyznačující tím, že jako intemalizační faktor

37. Prostředek podle nároku 1, vyznačující obsahuje vazná řetězec pro B-buňky.

se tím, že jako intemalizační faktor

38. Prostředek podle nároku 37, vyznačující obsahuje imunoglobulin.

tím, že jako intemalizační faktor

39. Prostředek podle nároku 37, v y z n a č u j í c í se tím, že jako vazný řetězec obsahuje antiimunoglobulin.

40. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako intemalizační faktor obsahuje ligand pro hepatocyty.

-97CZ 293141 B6

41. Prostředek podle nároku 40, vyznačující obsahuje ligand pro asialoglykoproteinový receptor.

tím, že jako intemalizační faktor

42. Prostředek podle nároku 41, vyznačující obsahuje tetragalaktózu-polylysin.

se tím, že jako intemalizační faktor

43. Prostředek podle nároku 1, vyznačující obsahuje lektin.

se tí m, že jako intemalizační faktor

44. Prostředek podle nároku 1, vyznačující obsahuje lipoprotein s nízkou hustotou, LDL.

tím, že jako intemalizační faktor

45. Komplex jako složka prostředku podle nároků laž44, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu nukleovou kyselinu s endozomolytickým činidlem, přičemž je komplex vytvořen přes vaznou oblast pro nukleovou kyselinu nebo přes látku s afinitou k nukleové kyselině k níž je vázán, a popřípadě ještě intemalizační faktor, vázaný na látku s afinitou k nukleové kyselině.

46. Komplex podle nároků 45, v y z n a č u j í c í se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu s léčebným účinkem.

47. Komplex podle nároků 46, vyznačující se tím, že nukleová kyselina je tvořena alespoň jednou molekulou DNA s geneticky léčebným účinkem.

48. Komplex podle nároků 47, vyznačující se tím, že obsahuje kódovou molekulu DNA pro cytokiny.

49. Komplex podle nároků 47, vyznačující se tím, že obsahuje kódovou DNA pro faktor Vlil.

50. Komplex podle nároků 46, vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu s nukleotidovými řetězcem, z nějž je možno transkribovat molekulu RNA, specificky inhibující určité buněčné funkce.

51. Komplex podle nároků 45, vyznačující se tím, že jako látku safinitou k nukleové kyselině obsahuje organickou polykationtovou sloučeninu.

52. Komplex podle nároků 51, vyznačující se tím, že jako polykation obsahuje polylysin.

53. Komplex podle nároků 51, vyznačující se tím, že jako polykation obsahuje polyethylenimin.

54. Komplex podle nároků 45, vyznačující se tím, že obsahuje endozomolytické činidlo a intemalizační faktor, vázané na tutéž látku s afinitou k nukleové kyselině.

55. Komplex podle nároků 54, vyznačující se tím, že jako látku safinitou pro nukleovou kyselinu obsahuje polylysin.

56. Komplex podle nároků 55, vy z n ač uj í c í se tím, že mimoto obsahuje nekovalentně vázaný polylysin.

57. Konjugát jako složka komplexu podle nároků 45 až 56, v y z n a č u j í c í se tím, že je tvořen endozomolytickým činidlem a látkou s afinitou k nukleové kyselině.

-98CZ 293141 B6

58. Konjugát podle nároků 57, vyznačující se tím, že obsahuje endozomolytické činidlo, kovalentně vázané na látku s afinitou k nukleové kyselině.

59. Konjugát podle nároků 57, vyznačující se tím, že obsahuje endozomolytické činidlo, nekovalentně vázané na látku s afinitou k nukleové kyselině.

60. Konjugát podle nároků 59, vyznačující se tím, že vazba je uskutečněna přes biotinstreptavidinový můstek.

61. Konjugát podle nároků 59, vyznačující se tím, že běží o iontovou vazbu.

62. Konjugát podle nároků 57, vyznačující prostředek obsahuje virus nebo složku viru.

se tím, že jako endozomolytický

63. Konjugát podle nároku 62, vyznačující se obsahuje adenovirus.

tím, že jako endozomolytické činidlo

64. Konjugát podle nároku 63, vyznačující se tím, že obsahuje mutant adenovirů.

65. Konjugát podle nároku 64, vyznačující se tím, že obsahuje mutant adenovirů, nekompetentní pro replikaci.

66. Konjugát podle nároku 65, vyznačující se jednou mutací a/nebo delecí v oblasti El A.

tím, že obsahuje adenovirus s alespoň

67. Konjugát podle nároku 63, vyznačující adenovirus.

se tím, že obsahuje inaktivovaný

68. Konjugát podle nároku 67, vyznačující inaktivovaný ultrafialovým světlem s krátkou vlnovou délkou.

se tím, že obsahuje adenovirus,

69. Konjugát podle nároku 67, vyznačující se tím, inaktivovaný ultrafialovým světlem a psoralenem.

že obsahuje adenovirus,

70. Konjugát podle nároku 67, vyznačující se tím, inaktivovaný formaldehydem.

že obsahuje adenovirus,

71. Konjugát podle nároku 62, vyznačující se tím, že obsahuje virovou složku, tvořenou alespoň jedním proteinem adenovirů.

72. Konjugát podle nároku 62, vyznačující se t í m ₃ že jako virus obsahuje pikornavirus.

73. Konjugát podle nároku 72, vyznačující se tím, že jako virus obsahuje rhinovirus, popřípadě inaktivovaný.

74. Konjugát podle nároku 57, vyznačující se tím, že obsahuje endozomolytické činidlo, které samo o sobě nemá schopnost proniknout do buněk, jejichž transfekce má být dosaženo.

75. Konjugát podle nároku 74, vyznačující se tím, že jako endozomolytické činidlo obsahuje virus nebo složku viru, která není intemalizačním faktorem pro lidské buňky.

-99CZ 293141 B6

76. Konjugát podle nároku 75, vyznačující se tím, že jako endozomolytické činidlo obsahuje virus, infekční pro živočišné druhy, odlišné od člověka.

77. Konjugát podle nároku 76, vyznačující se tím, že jako virus obsahuje adenovirus.

78. Konjugát podle nároku 77, vyznačující se tím, že jako adenovirus obsahuje adenovirus ptáků.

79. Konjugát podle nároku 78, vyznačující se tím, že jako adenovirus obsahuje virus, letální pro kuřecí embrya.

80. Konjugát podle nároku 74, vyznačující se tím, že jako endozomolytické činidlo obsahuje endozomolytický virový peptid, popřípadě modifikovaný, s vlastnostmi, uvedenými v nároku 26.

81. Konjugát podle nároku 80, vyznačující se tím, že jako endozomolytický peptid obsahuje hemaglutininový peptid HA2 chřipkového viru.

82. Konjugát podle nároku 81, vyznačující se tím, že jako endozomolytický peptid obsahuje peptid s řetězcem Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-TrpGlu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.

83. Konjugát podle nároku 81, vyznačující se tím, že jako endozomolytický peptid obsahuje peptid s řetězcem Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Ala-GIy-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-TrpGlu-Gly-Met-Ile-Asp-gly-Gly-Gly-Cys.

84. Konjugát podle nároku 74, v y z n a č u j í c í se tím, že jako endozomolytické činidlo obsahuje peptid, definovaný v nároku 26.

85. Konjugát podle nároku 84, vyznačující se tím, že jako endozomolytické činidlo obsahuje peptid s řetězcem Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys.

86. Konjugát podle nároku 84, vyznačující se tím, že jako endozomolytické činidlo obsahuje homo- nebo heterodimer peptidu podle nároku 85.

87. Konjugát podle nároku 86, vyznačující se tím, že obsah homodimer peptidu.

88. Konjugát podle nároku 86, vyznačující se tím, že obsahuje heterodimer peptidu s řetězcem Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.

89. Konjugát podle nároku 84, vyznačující se tím, že obsahuje peptid sřetězcem Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.

90. Konjugát podle nároku 84, vyznačující se tím, že obsahuje peptid sřetězcem Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.

91. Konjugát podle nároku 84, vyznačující se tím, že obsahuje peptid svaznou oblastí pro nukleovou kyselinu.

-100CZ 293141 B6

92. Konjugát podle nároku 91, vyznačující se tím, že obsahuje peptid s oligolysinovým prodloužením.

93. Endozomolytický peptid, vhodný jako složka prostředku podle nároku 33, kterým je syntetický peptid, obsahující endozomolytickou oblast a oblast pro vazbu nukleové kyseliny.

94. Endozomolytický peptid podle nároku 93, který jako vaznou oblast pro nukleovou kyselinu obsahuje oligolysinové prodloužení.

95. Způsob výroby konjugátu podle nároku 58, vyznačující se tím, že se virus nebo (poly)peptidové endozomolytické činidlo enzymaticky váže na polyamin v přítomnosti transglutaminázy.

96. Způsob výroby konjugátu podle nároku 58, vyznačující se tím, že se virus nebo (poly)peptidový endozomolytický prostředek váže na polyamin chemickou cestou.

97. Způsob výroby konjugátu podle nároku 60, vyznačující se tím, že se virus nebo virová složka modifikuje biotinem a pak se naváží na polyamin, vázaný na streptavidin.

98. Způsob výroby nukleové kyseliny do vyšších eukaryotických buněk in vitro nebo ex vivo, vyznačující se tím, že se na buňky působí prostředkem podle nároku 1 až 44.

99. Způsob podle nároku 98,

100. Způsob podle nároku 99,

101. Způsob podle nároku 99,

102. Způsob podle nároku 99,

103. Způsob podle nároku 99, vyznačující vyznačující vyznačující vyznačující

s e tím, s e tím, s e tí m, s e tím, se tím,

že se působí na lidské buňky.

že se působí na nádorové buňky.

že se působí na myoblasty.

že se působí a fibroblasty.

že se působí na hepatocyty.

104.Způsob podle nároku 99, vyznačující se tím, že se působí na endoteliální buňky.

105. Způsob podle nároku 104, vyznačující se tím, že se působí na buňky dýchacích cest.

106. Způsob podle nároků 99 až 105, vyznačující se tím, že se působí prostředkem s obsahem nukleové kyseliny s léčebným účinkem genetické povahy.

107. Způsob podle nároku 100al06, vyznačující se tím, že se prostředkem působí na nádorové buňky ex vivo a užije se DNA, která je kódem pro alespoň jednu imunomodulační látku, s výhodou pro cytokin.

108. Způsob výroby heterologní bílkoviny ve vyšší eukaryotické buňce, vyznačující se tím, že se na buňky působí prostředkem podle nároku 1, v němž nukleová kyselina obsahuje kódový řetězec DNA pro požadovanou bílkovinu, načež se buněčný materiál pěstuje za podmínek, vhodných pro expresi bílkoviny a bílkovina se izoluje.

109. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že jako svou účinnou složku obsahuje prostředek podle nároků 1 až 44, obsahující nukleovou kyselinu s léčebným účinkem a farmaceutický nosič.

-101 CZ 293141 B6

110.Sestava pro použití transfekcí, vyznačující se tím, že obsahuje jednotku s alespoň dvěma zásobníky, z nichž první zásobník obsahuje látku s afinitou k nukleové kyselině, popřípadě vázanou na intemalizační faktor, vhodný pro vyšší eukaryotické buňky a druhý zásobník obsahuje prostředek se schopností uvolnit do cytoplazmy obsah endozomů po průniku do vyšších eukaryotických buněk.

111.Sestava pro použití transfekcí, vyznačující se tím, že obsahuje jednotku s alespoň dvěma zásobníky, z nichž první zásobník obsahuje látku s afinitou k nukleové kyselině, popřípadě vázanou na intemalizační faktor, vhodný pro vyšší eukaryotické buňky a druhý zásobník obsahuje látku s afinitou k nukleové kyselině, která je vázána na prostředek se schopností pronikat jako složka komplexu s obsahem nukleových kyselin do vyšších eukaryotických buněk a pak uvolnit obsah endozomů v těchto buňkách do cytoplazmy.

112.Sestava se použitá ktransfekcí podle nároku 111, vyznačující se tím, že v prvním zásobníku obsahuje konjugát adenoviru a polylysinu, vázaný na transglutaminázu.

113.Sestava pro použití ktransfekcí, vyznačující se tím, že obsahuje nosnou jednotku s alespoň dvěma zásobníky, z nichž první zásobník obsahuje endozomolytické činidlo, modifikované biotinem a druhý zásobník obsahuje látku s afinitou k nukleové kyselině, modifikovanou streptavidinem.

114. Sestava pro použití k transfekcí podle nároku 113, vyznačující se tím, že první zásobník obsahuje biotinylovaný adenovirus a druhý zásobník obsahuje polylysin, vázaný na streptavidin.