HRP920602A2 - Sastav za uvođenje kompleksa nukleinskih kiselina u više eukariotične stanice - Google Patents

Abstract

Sastav za transfekciju viših eukariontskih stanica, koji obuhvaća komplekse nukleinske kiseline i supstanciju koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu te po izboru inkorporirajući faktor, sadrži endosomolitički agens, na pr. virus ili virusnu komponentu, koja može biti konjugirana. Endosomolitički agens, koji može biti dio kompleksa nukleinske kiseline, inkorporira se u stanice zajedno sa kompleksom te oslobađa sadržaje endosoma u citoplazmu, čime se povećava kapacitet prijenosa gena. Objelodanjeni su također farmaceutski pripravci, transfekcijski kompleti i metode za uvođenje nukleinske kiseline u više eukariotične stanice, obradom stanica sastavom.

Description

Izum je sa područja tehnologije DNA. Izum se posebno odnosi na nove sastave koji se mogu koristiti za uvođenje nukleinskih kiselina u više eukariotične stanice.

Postoji potreba za djelotvornim sistemom uvođenja nukleinske kiseline u žive stanice, osobito u terapiji gena. Geni se prenose u stanice u svrhu postizavanja “in vivo” sinteze terapetutski učinkovitih genetskih proizvoda, npr. zamjene defektnog gena u slučaju genetičkog nedostatka.”Konvencionalna” se terapija gena zasniva na principu postizavanja trajnog izlječenja jednim jedinim tretmanom u kojem se teraputski djelotvorna DNA (ili mRNA) daje kao lijek (“genetsko terapeutsko sredstvo”) na jednom ili po potrebi više puta za redom. Primjeri genetički prouzrokovanih bolesti, kod kojih genska terapija predstavlja obećavajući pristup, jesu: hemofilija, beta-talasemija i “teški kombinirani imunski nedostatak”, SCID (Severe Combined Immune Definiency), sindrom uzrokovan genetički uvedenim nedostatkom enzima adenozin deaminaze. Druge su primjene moguće u imunskom reguliranju, pri čemu se humoralni ili intracelularni imunitet postiže davanjem funkcionalne nukleinske kiseline, koja djeluje kao prikriveni proteinski antigen ili kao neprikriveni proteinski antigen, koji se može smatrati vakcinacijom.Drugi primjeri genetskih nedostataka, kod kojih se može dvati nukleinska kiselina, kao zamjena za oštećeni gen, npr. u obliku pojedinačno određenom za posebni zahtjev, predstavljaju mišićna distrofija (dystrophin gene), cistična fibroza (gen cistične fibroze koji regulira transmembransku provodljivost), hiperholesterolemija (LDL receptor gen). Metode genske terapije su također potencijalno korisne kada treba u tijelu sintetizirati hormone, faktora rasta ili proteinesa citotoksičnim ili imuno-modulacijskim djelovanjem.

Genska se terapija javlja kao nada u obradi raka, davanjem tzv. “kancer vakcine”. Radi povećanja imunogeniciteta tumorskih stanica, one se mijenjaju da bi postale više antigenske ili da bi se postiglo da proizvode izvjesne imuno-modulirajuće tvari, npr. citokine, da bi se potaknuo imunski odgovor. To se postiže transfekcijom stanica sa DNA koja označava citokin, npr. IL-2, IL-4, IFN gama TNF alfa. Do danas, većina se prijenosa gena u autologne tumorske stanice postiže putem retroviralnih vektora.

Tehnologije, koje su do sada najnaprednije u davanju nukleinskih kiselina u genskoj terapiji, koriste retroviralne sisteme za prijenos gena u stanice (Wilson I sur., 1990, Kasid I sur., 1990). Međutim, upotreba retrovirusa je problematična, jer ona donosi, makar u maloj mjeri, opasnost od nuspojava, kao što je infekcija virusom (rekombinacijom sa endogenim virusima ili kontaminacijom sa helper virusima I zatim mogućom mutacijom u patogeni oblik) ili tvorba raka.Nadalje, stalna tansformacija tjelesnih stanica u pacijentu, koja se postiže retrovirusima, nije u svakom slučaju poželjna, jer ona može otežavati obradu u suprotnom smislu, npr. ako se poajve nuspojave. Osim toga, ovom je vrstom terapije teško postići dovoljno visoki titar da bi se inficiralo dosta stanica.

Nukleinske kiseline, kao terapeutski djelotvorne supstancije, mogu se također koristiti za inhibiciju određenih staničnih funkcija, npr. RNA i DNA kiseline su se pokazale djelotvorne za selektivnu inhibiciju specifičnih nizova gena. Njihov način djelovanja omogućava da se koriste kao terapeutska sredstva za zaustavljanje izražaja nekih gena “in vivo” (kao što su neodređeni onkogeni ili viralni geni). Već je pokazano da kratki oligonukleotidi mogu biti unešeni u stanice i da tu mogu ispoljavati svoj inhibitorski učinak (Zamecnik I sur., 1986), čak I uz nisku intracelularnu koncentraciju, uzrokovanu, među ostalim, njihovim ograničenim prihvaćanjem po staničnoj membrani kao rezultat jakog negativnog naboja nukleinskih kiselina. Drugi je pristup selektivnoj inhibiciji gena upotreba ribozima. I tu je potrebno osigurati najveću moguću koncentraciju aktivnih ribozima u stanici, pri čemu je transport u stanici jedan od ograničavajućih faktora.

Primjena genske terapije za postizavanje intracelularnog imuniteta uključuje prevođenje gena koji zaštićuju protiv virusa, t. zv. “zaštitnih gena”, npr. transdominantnih mutanata gena koji znače viralne proteine, ili molekule DNA, koje označavaju t. zv. RNA mamce. Prema tome, postoji potreba za metodama omogućavanja prenošenja i izražaja DNA u stanici.

Poznate su različite tehnike transformacije gena u stanicama sisavaca “in vitro”, ali njihovo korištenje “in vivo” je ograničeno (ove tehnike uključuju uvođenje DNA pomoću liposoma, elektropracije, mikroinjekcije, stanične fuzije, metode DEAE-dekstran ili kalcij fosfat precipitacije).

U novije vrijeme razvijeni su rekombinantni viralni vektori koji doprinose prijenosu gena korištenjem djelotvornih ulaznih mehanizama njihovih matičnih virusa; ova je strategija korištena u konstrukciji rekombinantnih retroviralnih i adenoviralnih vektora sa ciljem da se postigne visoko učinkovit prijenos gena “in vitro” i “in vivo” (Berkner, 1988). Unatoč njihovoj djelotvornosti ovi su vektori podvrgnuti ograničenjima s obzirom na veličinu i konstrukciju DNA koja se prenosi. Nadalje, ova sredstva predstavljaju sigurnosni rizik s obzorm na istovremeni prijenos za život sposobnih viralnih elemenata gena originalnog virusa.

U svrhu zaobilaženja ovih ograničenja razvijene su alternativne stategije za prijenos gena, koje se osnivaju na mehanizmima koje stanice koriste za prijenos makromolekula. Jedan primjer ovoga je prijenos gena u stanicu osobito djelotvnim putem receptorom posredovane endocitoze (Wu i Wu, 1987, Wagner i sur., 1990., EP-A1 0388 758, čije je otkriće ovdje objavljeno). Ovaj prisutp koristi bifunkcionalne molekularne konjugate koji imaju domenu DNA veze i domenu specifičnu za receptore stanične površine (Wu i Wu, 1987, Wagner i sur. 1990). Ako se porepoznatljiva domena prepoznaje po receptoru stanične površine, konjugat se očituje putem receptorski upravljane endocitoze, u kojoj se DNA veza uz konjugat također prenosi. Korištenjem ove metode moguće je postići brzine prijenosa gena barem tako dobre, kavi se postižu konvencionalnim metodama (Zenke i sur., 1990). Nadalje, pokazano je da aktivnost nukleinske kiseline, npr. inhibitorski učinak ribozima, nije oslabljena sistemom transporta.

PCT prijava WO 91/17773 odnosi se na sistem prijenosa nukleinskih kiselina specifčne aktivnosti za T-stanice. Ovaj sistem koristi proteine stanične površine porijekla T-stanica, npr. CD4, receptor korišten po HIV virusu. Nukleinska kiselina koju će se unijeti kompleksirana je sa protein-polikationskim konjugatom, čija je proteinska komponenta, t.j. prepoznatljiva domena, protein sposoban da se veže na površinski protein T-stanice, npr. CD4, a stanice koje pokazuju taj površinski protein, dovedene su u kontakt sa nastalim kompleksima protein-polikation/nukleinska kiselina. Pokazano je da DNA transportirana u stanicu ovim sistemom dolazi u stanicu.

Jedna je osobina zajednička kod oba sistema (izuma) a to je da se kod njih koriste specifične funkcije stanica koje mogućuju ili olakšavaju prijenos nukleinske kiseline u stanicu. U oba se slučaja mehanizmi prihvaćanja dešavaju uz učestvovanje domena prepoznavanja, koje se nazivaju “unutarnjim faktorima” unutar djelokruga sadašnjeg izuma. Taj izraz označava ligande, koji kao specifični za tip stanice u užem ili širem smislu, se vežu na površinu stanice te se uvuku unutra, možda uz sudjelovanje drugih faktora (npr. proteina površine stanice). (U slučaju dvaju gore spomenutih izuma internalizirajući je faktor transferin ili protein koji se veže na antigen površine T-stanice, npr. anti-CD4 antitijelo). Internalizirajući je faktor konjugiran sa supstancijom polikationske prirode koja, na osnovi svojeg afiniteta sa nukleinskim kiselinama, tvori jaku povezanost između internalizirajućeg faktora i nukleinske ksieline. (Tvari ove vrste navode se dalje kao “tvari sa afinitetom za nukleinsku kiselinu” ili s obzirom na DNA, “domena vezanja DNA”. Ako supstancija ove vrste stvara vezu između nukleinske kiseline i internalizirajućeg faktora, ona se u daljnjem tekstu navodi kao “faktor povezivanja”).

Tijekom ovih dvaju izuma optimalno je prihvaćanje nukleinske kiseline u stanicu bilo postignuto kad je odnos konjugata prema nukleinskoj kiselini bio takav da su kompleksi internalizirajući faktor-polikation/nukleinska kiselina bili približno elektroneutralni. Polazeći od toga zapažanja, metode koje upotrebljavaju komplekse internalizirajući faktor-faktor povezivanja/nukleinska kiselina za uvođenje nukleinske kiseline u više eukariotične stanice, bile su poboljšane.

Metodu poboljšanja učinkovitosti sistema u kojima se prihvaćanje nukleinskih kiselina izvodi pomoću internalizirajućih faktora, opisali su Wagner i sur., 1991. U ovoj se metodi količina nukleinske kiseline prihvaćene u stanicu nije smanjila, ako je dio transferinpolikation konjugata zamijenjen nekovalentno vezanim (“slobodnim”) polikationom. U nekim slučajevima to čak može i povećati prihvaćanje DNA u znatnoj mjeri. Istraživanja o molekularnom stanju transferin-polikation-plasmid DNA kompleksa proizvedenih uz optimalne odnose DNA/konjugat, pokazala su da se plasmid DNA u prisutnosti konjugata kondenzira u toroidalne strukture (slične uštipcima) promjera oko 80 do 100 nm.

Pokusi provedeni sa proteinima vezanim na stanice kao internalizirajućim faktorom, dali su slične rezultate.

Dodatak “slobodnih” supstancija sa afinitetom za nukleinsku kiselinu također rezultira povećanjem učinkovitosti uvođenja sistema, čak i kad se koriste drugi faktori povezivanja.

Kompleksi opisani po Wagneru i sur., 1991a, koji su prihvaćeni u više eukariotične stanice putem endocitoze pomoću internalizirajućeg faktora, sadrže nukleinsku kiselinu kompleksiranu sa konjugatom internalizirajućeg faktora i faktora povezivanja. Uz to kompleksi sadrže jednu ili više tvari sa afinitetom za nukleinsku kiselinu, koje mogu biti identične sa faktorom povezivanja, u nekovalentnom obliku, tako da je internalizacija i/ili izražaj nukleinske kiseline postignut pomoću konjugata povećan, što se čini da je uzrokovano prvenstveno kondenzirajućim učinkom, no moguće je da bude uzrokovano i drugim mehanizmima.

Čak i kad bi brzine izražaja unešene nukleinske kiseline mogle biti ovom metodom povećane, tu još postoje ograničenja. Praktičnost ovog sistema u datom kontekstu nije određena samo prisutnošću receptora stanične površine relevantnog sa sistemom; ograničenja vezana uz upotrebu ovog sistema vjerojatno su rezultat činjenice da konjugat-DNA kompleksi internalizirani u endosima ulaze u lizosome, gdje se enzimatksi degradiraju. Da bi se povećao odnos nukleinske kiseline koja dostiže staničnu jezgru i tu dolazi do izražaja, što se je i željelo, vršeni su pokušaji eksperimentima koji su prethodili ovom izumu, da se provede transfekcija stanica u prisutnosti supstancija koje inhibiraju enzimatsku aktivnost u lizosomima, tzv. lizosomatropskih supstancija. Ovom je strategijom postignut povećani izražaj prenešene DNA; međutim, postignute reakcije bile su vrlo promjenljive, ovisno o upotrebljenoj supstanciji; odabrane lizosomatropske tvari dovele su do povećanja u prijenosu gena, dok su druge upravo to inhibirale. Tako je, na primjer, nađeno da djelotvoran prijenos DNA ovisi o prisutnosti slabe baze klorokina (Zenke i sur. 1990, Cotten i sur., 1990). Ovaj učinak, postignut pomoću klorokina, ne mora, barem isključivo, biti uzrokovan činjenicom da klorokin povećava pH u lizosomima; nađeno je na osnovi brojnih različitih eksperimenata da druge tvari, koje kao i klorokin imaju sposobnost mijenjanja pH, kao monensin, amonijev klorid ili metilamin, ne mogu zamijeniti klorokin, a u nekim eksperimentima neke od tih tvari pokazale čak i inhibirajuće djelovanje. Nađeno je nadalje da razne ciljne stanice pokazuju različite odgovore na iste supstancije koje imaju lizosomatropsko djelovanje.

Budući da prijenos gena fiziološkim putem, kao što je predstavljeno receptorski upravljanom endocitozom uz korištenje kompleksa nukleinskih kiselina, ima glavne prednosti (netoksični mehanizam prolaza kroz staničnu membranu; mogućnost davanja biološki aktivnih nukleinskih kiselina, kao što su nukleinske kiseline koje posebno inhibiraju gene, ili stanične funkcije, na ponavljanoj ili kontinuiranoj osnovi; mogućnost stanično speficičnog ciljanja; mogućnost produciranja konjugata u velikim količinama), postoji potreba da se ovaj sistem učini djelotvornijim.

Opis slika

Sl. 1: Učinak infekcije adenovirusom na prijenos gena pomoću transferin-polilisin konjugata.

Sl. 2: Učinak doziranja konjugat-DNA-kompleksa.

Sl. 3: Pojačanje prijenosa gena upravljanog transferin-polilisinom, putem adenovirusa, javlja se pomoću receptorski upravljane endocitoze

A) Učinak na kompleksiranu DNA

B) Učinak na receptorski vezanu DNA

C) Učinak na prijenos gena putem transferin-polilizin konjugata.

Sl. 4: Učinak adenovirusne infekcije na prijenos gena pomoću transferin-polilizin konjugata i odabranim staničnim linijama.

Sl. 5: Istraživanja da li pojačanje izražaja gena ovisi o prijenosu gena ili o transaktivaciji.

A) Stanična linija K562

B) Stanična linija K562 10/6 koja konstitucijski izražava luciferazu.

Sl. 6: Tetra-galaktozni peptid-polilizin konjugat.

Sl. 7: Transfekcija HepG2 stanice u prisutnosti adenovirusa.

Sl. 8: Transfekcija HepG2 stanica u prisutnosti adenovirusa.

Sl. 9: Transfekcija TIB73 stanica

A) Usporedne vrijednosti sa klorokinom

B) U prisutnosti adenovirusa.

Sl. 10: Transfekcija T stanica u prisutnosti adenovirusa:

A) H9 stanice

B) Primarni limfociti.

Sl. 11: UV-inaktivacija adenovirusa:

A) Pojačanje učinka prijenosa gena u HeLa stanicama sa UV-inaktiviranim virusima

B) Usporedba UV-inaktivacije sa učinkom prijenosa gena.

Sl. 12: Inaktivacija adenovirusa pomoću formaldehida.

Sl. 13: Transfekcija NIH3T3 stanica u prisutnosti Moloney virusa.

Sl. 14: Istraživanja da li učinak prijenosa gena u transfekciji NIH3T3 stanica sa kompleksima transferina-polilizin DNA, može biti pripisan Moloney virusu.

Sl. 15: Interakcija između transferina i receptora igraju ulogu u učinku prijenosa gena Moloney virusa.

Sl. 16: Utjecaj pH na učinak retrovirusa na prijenos gena.

Sl. 17: Influenca-hemaglutinin peptid; pokus lipozomskog propuštanja.

Sl. 18: Transfekcija K562 stanica u prisutnosti konjugata influenca peptid, polilizin pl6pL.

Sl. 19: Transfekcija HeLa stanica u prisutnosti influenca peptid-polilizin konjugata p16pL.

Sl. 20: Transfekcija HeLa stanica sa transferin-polizin konjugatima u prisutnosti influenca peptid-polilizin konjugata p4IpL.

Sl. 21: In situ dokaz izražaja beta-galaktosidaze nakon transfekcije HeLa stanica u prisutnosti adenovirusa.

Sl. 22: Transfekcija stanica sa 48 kb kosmidom u prisutnosti adenovirusa

A: HeLa stanice

B: Stanica neuroblastoma

Sl. 23: Priprema adenovirus-polilizin konjugata kemijskim spajanjem.

Sl. 24: Transfekcija K562 stanica pomoću kemijski vezanih adenovirus konjugata.

Sl. 25: Transfekcija HeLa stanica pomoću kemijski vezanih adenovirus konjugata.

Sl. 26: Vezanje polilizina na adenovirus pomoću transglutaminaze.

Sl. 27: Transfekcija mišjih hepatocita pomoću transglutaminazom vezanih adenovirus konjugata.

Sl. 28: Povećanje učinkovitosti transfekcije sa transglutaminazom vezanim adenovirus konjugatima.

Sl. 29: Transfekcija HeLa stanica sa biotin-streptavidin-vezanim adenovirus konjugatima.

Sl. 30: Transfekcija K562 stanica sa biotin-streptavidin vezanim adenovirus konjugatima.

Sl. 31: Transfekcija neuroblastomnih stanica sa kb kosmidom pomoću biotin-streptavidin vezanim adenovirusom.

Sl. 32: Transfekcija hepatocita u prisutnosti klorokina ili u prisutnosti adenovirusa.

Sl. 33: Transfekcija K562 stanica u prisutnosti raznih endosomo

Sl. 34: Usporedba transfekcijskih protokola na staničnoj razini sa beta-galaktisidazom kao dokaznim genom, u prisutnosti raznih endosomolitičkih sredstava.

Sl. 35: Dugotrajnost izražaja luciferaze u spojenim, nerazdvojenim hepatocitima.

Sl. 36: Usporedba izražaja u HeLa stanicama transficiranim u prisutnosti letalnog virusa pilećeg embrija (CELO) u slobodnom obliku i sa CELO virusom vezanim na polilizin putem biotin-streptavidina.

Sl. 37: Transfekcija mioblasta i miotuba sa DNA/transferin-polilizin kompleksima u prisutnosti slobodnih adenovirusa i u prisutnosti biotin/streptavidinom vezanim adenovirusima.

Sl. 38: Predaja DNA kulturama mišjih primarnih mioblasta i miotuba.

Sl. 39: Komparativna analiza adenovirusa D1312 i CELO virusa kod transfekcije HeLa stanica i C2C12 mioblasta.

Sl. 40: Poboljšanje predaje CELO virusa mioblasta uz upotrebu lektin liganda.

Sl. 41: Izražaj pune dužine faktora VIII cDNA u kulturama C2C12 mioblasta i miotuba.

Sl. 42: Povećanje predaje DNA po proteinima adenovirusa.

A) HeLa stanice

B) Fibroblasti

Sl. 43: Konjugati galaktoza-influenca peptidi za prijenos DNA u hepatocite.

Sl. 44: Konjugati galaktoza-adenovirusa za prijenos DNA u hepatocite.

Sl. 45: Prijenos DNA sa transferin-polilizinom u prisutnosti rinovirusa

A) Slobodni rinovirus

B) konjugirani rinovirus

Sl. 46: Transfekcija stanica primarnog humanog melanoma sa kombiniranim kompleksima koji sadrže konjugate adenovirusa.

Sl. 47: Pokus popuštanja liposoma amfipatičnih peptida.

Sl. 48: Pokus propuštanja eritrocita amfipatičnih peptida.

Sl. 49: Transfekcija BNL CL.2 stanica u prisutnosti amfipatičnih peptida.

Sl. 50: Transfekcija NIH3T3 stanica u prisutnosti amfipatičnih peptida.

Sl. 51: Izražaj interferona alfa u HeLa stanicama transficiranim u prisutnosti raznih endosomolitičkih sredstava.

Cilj je sadašnjeg izuma bio da se poboljša prijenos nukleinske kiseline u više eukariotične stanice.(Termin “prijenos” u smislu ovoga izuma znači, mimo uvođenja kompleksa nukleinskih kiselina u stanicu kroz staničnu membranu, transport kompleksa ili nukleinske kiseline oslobođene odatle unutar stanice, sve dok ne dostigne odgovarajući položaj da dođe do izražaja). Više eukariotične stanice su dobro poznate, a ne obuhvaćaju kvaščeve gljivice. Vidi “Molecular Biology of the Gene, James D. Watson i sur., Benjamin-Cummings Publishing Company, Inc., str. 676-677 (1987).

Većina virusa ostvaruje svoj ulaz u eukariotične stanice putem mehanizama koji u osnovi odgovaraju mehanizmu receptorski upravljanje endocitoze. Virusna infekcija, bazirana na tom mehanizmu, općenito počinje povezivanjem čestica virusa sa receptorima na staničnoj membrani. Nakon toga virus ulazi u stanicu. Ovaj proces ulaženja slijedi uobičajeni put, koji odgovara ulazu fizioloških liganda ili makromolekula u stanicu: receptori na površini stanice se grupiraju a membrana se okrene prema unutra te stvara mjehurić okružen isprepletenom prevlakom.

Nakon toga mjehurić se oslobađa prevlake, dolazi do zakiseljavanja unutar njega putem protonske crpke smještene u membrani. To potiče otpuštanje virusa iz endosoma.Ovisno o tome da li virus ima lipidnu prevlaku ili nema, u obzir dolaze dva tipa otpuštanja virusa iz endosoma: u slučaju t. zv. “golik” virusa (na primjer adenovirusa, poliovirusa, rinovirusa) predpostavljeno je da niski pH uzrokuje promjene konfiguracije virusnih proteina. To ističe hirofobične domene, koje nisu dostupne uz fiziološku pH vrijednost. Ove domene stoga postižu sposobnost da stupe u interakciju sa endosomnom membranom te time uzrokuju odpuštanje virusnog genoma iz endosoma i citoplazmu. Što se tiče virusa sa lipidnom prevlakom (npr. virus vesikularnog stomatitisa, Semliki Forest virus, virus influence), predpostavlja se da niski pH modificira strukturu ili konfiguraciju nekih virusnih proteina, čime se potiče spajanje membrane virusa sa membranom endosoma. Virusi koji penetriraju u stanicu putem ovog mehanizma imaju izvjesne molekularne osbujnosti koje im omogućuju da prekinu membranu endosoma da bi mogli ući u citoplazmu.

Drugi virusi, npr. prevučeni virusi Sendai, HIV i neke vrste Moloney virusa leukemije, ili nepresvučeni virusi SV40 i polioma, ne trebaju niski pH da bi ušli u stanicu. Oni mogu ili dovesti do fuzije sa membranom direktno na površini stanice (Sendai virus, vjerojatno HIV) ili su sposobni da potaknu mehanizme kidanja stanične membrane ili prolaze kroz nju. Predpostavlja se da su virusi, koji su neovisni o pH, također sposobni da se koriste putem endocitoze (McClure i sur., 1990).

Pri rješavanju problema izuma početna je premisa bila da se iskoristi mehanizam nekih virusa za ulaz u eukariotične stanice, da bi se poboljšao prijenos kompleksa nukleinskih kiselina u stanicu, a time da se pojača izražaj.

Izvedeni su pokušaji da se uvedu proteini zajedno sa virusima u stanicu (Otero i Carrasco, 1987). Nađeno je da je propusnost postignuta u stanici virusom, iskorištena za oslobađanje makromolekula. Činilo se da su ti postupci mehanizmi fluidne faze.

Korištenjem epidermalnog faktora rasta. EGF, konjugiranog na toksin, nađeno je da taj prirodni ligand, koji je ušao u stanicu endocitozom nakon povezivanja sa svojim receptorom, dospijeva u isti endosom zajedno sa adenovirusom, koji je također ušao u stanicu receptorski upravljanom endocitozom, a otpušten je iz tog endosoma, opet zajedno sa virusom, u citosol (FitzGerald i sur., 1983).

Sadašnjim je izumom, iznenađujuće, nađeno da izvjesi agensi (npr. virusi, virusne komponente ili drugi spojevi), koji pokazuju karakteristike određenih virusa s obzirom na njihov mehanizam ulaza u eukariotične stanice, bitno povećavaju izražaj nukleinske kiseline unešene u stanicu kao dio kompleksa. To je otkriće osobito iznenađujuće, jer su kompleksi nukleinskih kiselina, prihvaćeni u stanicu, veoma veliki.

Sadašnji se izum stoga odnosi na sastav za transfekciju viših eukariotičnih stanica sa kompleksom nukleinske kiseline i supstancijom koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, a koja supstancija može biti vezana uz internalizirajući faktor karakteriziran time što sadrži sredstvo sposobno da bude uvučeno u stanice koje se trandficiraju, bilo “per se” ili kao komponenta kompleksa nukleinske kiseline, ili da otpušta sadržaje endosoma u kojima je kompleks smješten nakon ulaska u stanicu, u citoplazmu.

Ovaj se agens nadalje spominje kao “endosomolitično sredstvo”. Sposobnost endosomolitičkih sredstava da budu prihvaćena u stanice i da oslobađaju sadržaje endosoma, u kojima su smješteni nakon ulaska u stanicu, u citoplazmu, u daljenjem se tekstu spominje kao “funkcija prihvačanja”. Ova funkcija obuhvaća sposobnost da se aktivno uvuče u stanice putem endocitoze ovisne o receptoru, ili pasivno, putem tekuće faze ili kao konstituent kompleksa nukleinske kiseline, te sposobnost da prekine endosome, što se općenito navodi kao endosomoliza.

U jednom ostvarenju izuma endosomolitično je sredstvo virus. U drugom je endosomolitično sredstvo virusna komponenta. Virus ili virusna komponenta, korištena u ovim ostvarenjima izuma, niže se navodi kao “slobodni” virus (komponenta).

Na polju sadašnjeg izuma istraživano je djelovanje povećane doze slobodnog adenovirusa na kapacitet prijenosa gena konstantne količine transferin-polilizin konjugata u HeLa stanicama, uz korištenjegena luciferaze kao referentnog gena. Povećanje prijenosa gena do kojeg dolazi dodatkom slobodnog adenovirusa, dostiže maksimum kod 1x104 čestica virusa po stanici, a to je broj koji odgovara približnom broju adenovirusnih receptora po HeLa stanici. Povećanje do 2000 puta izražaja luciferaze, u usporedbi sa izražajem postignutim sa samim transferin-polilizin konjugatima, odgovara višoj dozi virusa. U drugoj seriji pokusa ispitivan je kapacitet graničnih količina kompleksa konjugat-DNA, u prisutnosti konstantne doze slobodnog adenovirusa. Nađeno je da je prihvaćanje adenovirusa u stanicama povećalo prijenos gena upravljanog transferin-polilizinom u širokom rasponu doza DNA. Maksimalni intenzitet izražaja gena postignutog pomoću kompleksa konjugat-DNA, odgovarao je intenzitetu postignutom sa 100 puta manje DNA, kad su adenovirusi bili korišteni za povećanje učinkovitosti transfekcije.

Učinak adenoviralne infekcije na prijenos gena isitivan je za nekompleksiranu DNA kao i za DNA kompleksiranu sa polilizinom ili konjugatima transferin-polilizin (Sl. 3A). Po ovoj analizi adenoviralna infekcija nije značajno povećala prijenos gole, nekompleksirane DNA tijekom transfekcije. Nasuprot tome, prijenos DNA kompleksirane sa polilizinom ili konjugatima transferin-polilizin, adenoviralnom je infekcijom povećan. Ovaj je učinak, međutim za konjugate transferin-polilizin znatno veći. Budući da polikationski dio molekule konjugata ne služi samo za pričvršćenje transferina na DNA, nego znatno utječe i na strukturalne promjene u DNA (Sabijanje u toroidalne strukture, Wagner i sur., 1991a), ovi pokusi nisu mogli u početku razlikovati da li su zapaženi učinci na bazi pojačanog fluidno-fazno transporta polikationski kondenzirane DNA ili virusom povećanog prihvaćanja receptorski vezanog kompleksa konjugat-DNA. Radi razlikovanja između ovih mogućnosti izvedeni su daljnji povezani eksperimenti (Sl. 3b). Povezivanje kompleksa transferin-polilizin-DNA ili polilizin-DNA, kod niske temperature bez internalizacije, dopustilo je uklanjanje viška kompleksa u fluidnoj fazi prije adenoviralne infekcije (FitzGerald i sur., 1983). Kad je data u tom obliku, predaja kompleksa receptorski vezanih transferin-polilizin-DNA, bila je znatno povećana dodatkom adenoviralnih čestica, dok za komplekse polilizin-DNA to nije bio slučaj. Stoga je posebno pojačan ulaz DNA putem receptorski upravljanje endocitoze.

Nadalje, izvršena je analiza specifične adenoviralne funkcije, koja dovodi do pojačanog receptorski upravljanog prijenosa gena (Sl. 3C). Obrada viriona blagim zagrijavanjem ne mijenja njihovu sposobnost da se vežu na ciljane stanične membrane, ali utječe na njihov kapacitet da raskinu endosome nakon interalizacije (Defer i sur., 1990). Stoga se različiti utjecali viralnog povezivanja i viralni ulaz mogu odvojeno ocijenjivati. U ovoj analizi, toplinska inaktivacija adenovirusa potpuno ukida njihovu sposobnost da pojačaju receptorski upravljani prijenos gena. To navodi na to da je kapacitet adenovirusa da prekidaju endosome kao dio njihova ulaznog mehanizma, upravo ono što specifično utječe na pojačanje oslobađanja gena putem konjugata transferin-polilizin. Činjenica da za obnavljanje defektne vrste virusa mogu dovesti do povećanja izražaja gena, potvrđuje predpostavku da taj fenomen ne ovisi o funkciji obnavljanja, nego o funkciji prihvaćanja viriona.

Da bi se isključila mogućnost da se pojačanje izražaja gena može pripisivati mogućoj transaktivaciji unešenog gena virusom, izvedeni su pokusi sa staničnom linijom, koja konstitutivno izražava gen RSV-LTR luciferaze: adenovirusi ne pokazuju učinke na tu staničnu liniju, dok u matičnoj liniji, u koju je gen bio uveden putem tranferin-polilizin konjugata, postoji značajan porast izražaja gena. Ovo otkriće pokazuje da adenovirus utječe na događaje koji se dešavaju prije prijepisa i da njegov pojačavajući utjecaj na prijenos gena stoga djeluje na razinu prijenosa gena, a ne na razinu izražaja gena (Sl. 5).

Isto tako su provedena istraživanja u okviru izuma, da bi se pronašlo kakav učinak ima slobodni adenovirus na prijenos gena putem transferin-polilizin konjugata u odabranim staničnim linijama. Nađeno je da prisutnost transferin receptora je na ciljanim stanicama neophodna, no nije u svakom slučaju dovoljna da omogući prijenos gena konjugatima transferin-polilizin. Stanični specifični faktori o kojima ovisi sudbina endosomom internaliziranih kompleksa konjugat-DNA, izvanredno su važan odlučujući faktor za razine prijenosa gena, koje se mogu postići tim putem. S obzirom na to, odabrane su stanične linije ispitivane na prijenos gena transferin-polizin konjugatima kao i na povećanje prijenosa gena adenovirusima (Sl. 4). Stanice stanične linije cistične fibroze (CTFl) pokazale su umjerene razine izražaja gena luciferaze, nakon obrade kompleksima transferin-polilizin-DNA. Ta je razina izražaja znatno uvećana obradom sa adenovirusom d1312. Sasvim suprotno, KB stanica obrađene transferin-polilizin-DNA kompleksima pokazale su razine izražaja gena luciferaze jedva iznad osnovnih razina, usprkos prisutnosti transferin receptora. Obrada adenovursom d1312, međutim, rezultirala je jasno uočljivim aktivnostima luciferaze u tim stanicama. Obrada HeLa stanicama adenovirusima imala je sličan učinak, premda je taj učinak u tim stanicama bio znatno jači. Budući da HeLa stanice i KB stanice posjeduju približno jednaki broj receptora za adenovirus, razlika u povećanju prijenosa gena može biti odraz broja transferin receptora karakterističnog za svaki tip stanica. Međutim, nasuprot ovim rezultatima, stanične linije WI-38 i MRC-5, koje su poznate po tome da veoma slabo podržavaju adenoviralnu infekciju (Precious i Russell, 1985), pokazale su veoma slabo povećanje sa d1312 izražaja gena postignutog pomoću samih konjugat-DNA kompleksa. Obrada slobodnim virusom, npr. adenovirusom, čini se da povećava prijenos gena pomoću konjugat-DNA kompleksa u onim slučajevima gdje je prijenos gena moguć receptorski upravljanim endocitozom, kao u slučaju CFT1 stanica, te u nekim primjerima gdje se prijenos gena ovim putem čini nedjelotvoran, kao kod HeLa i KB stanica.

Razina postignutog povećanja znatno varira među različitim ciljanim stanicama, što navodi na to da je taj učinak funkcija broja virusnih receptora, npr. receptora adenovirusa, nekog tipa stanica, kao i broja receptora transferina.

U slučaju upotrebe slobodnog virusa, najradije se konjugira sa internalizirajućim faktorom supstancija koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, obično jedan organski polikation. Prema izumu je, međutim, nađeno da pod izvjesnim okolnostima mogu biti uvedeni u stanicu, u prisutnosti slobodnog virusa, samo DNA kompleksi sa supstancijom koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, t.j. bez internalizirajućeg faktora. Također je nađeno da se neke stanične linije mogu uvesti kroz fluidnu fazu kompleksi, koji se sastoje iz nukleinske kiseline i supstancije koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, ako je koncentacija kompleksa dovoljno visoka. Pokusi izvedeni u okviru sadašnjeg izuma i nekih ranijih, pokazali su da je bitni element za kapacitet prihvaćanja kompleksa nukleinskih kiselina njihova kompaktnost, koja se može pripisati kondenziranju nukleinske kiseline sa supstancijom koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu. Ako supstancija, koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, ima dovoljan kapacitet vezanja na površinu stanica radi ulaza u stanicu zajedno s virusom, te koja je sposobna učiniti kompleks gotovo elektroneutralan i kondenzirati nukleinsku kiselinu u kompletnu strukturu, tada nema potrebe povećanja kapaciteta ulaženja kovalentnim povezivanjem internalizirajućeg faktora na supstanciju koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, u svrhu prijenosa kompleksa u stanicu receptorski upravljanom endocitozom. Mnoge stanice imaju relativno visoki afinitet za neke supstancije koje imaju afinitete za nukleinsku kiselinu, tako da se konjugati nukleinske kiseline i faktor povezivanja uvuku u stanicu bez potrebe za internalizirajućim faktorom. To vrijedi, na primjer, za hepatocite, za koje je u okviru sadašnjeg izuma nađeno da prihvaćaju DNA-polilizin komplekse.

U iznešenom ostvarenju izuma endosomolitično sredstvo je virus koji je vezan na susptanciju, koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu i koja ima sposobnost da uđe u stanicu kao dio kompleksa konjugat/nukleinska kiselina i da oslobodi sadržaje endosoma, u kojima je kompleks smješten nakon ulaska u stanicu, u citplazmi.

U drugom iznošenom ostvaranje, endosomolitičko je sredstvo virusna komponenta koja je vezana na supstanciju koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu i koja ima sposobnost da uđe u stanicu kao dio kompleksa konjugat/nukleinska kiselina i da oslobodi sadržaje endosoma u kojima je kompleks smješten nakon ulaska u stanicu, u citoplazmu.

Virusi ili virusne komponente vezane na domenu nukleinske kiseline, bez obzira na tip veze, niže se označuju kao “viralni konjugati”.

Viralni konjugati, koji su također predmet sadašnjeg izuma sadrže virus ili virusnu komponentu kao integralni dio njihove funkcionalne strukture te spajaju prednosti vektorskih sistema, koji se zasnivaju na konjugatima internalizirajućeg faktora, sa prednostima koje u te sisteme dnose virusi.

Nadalje, viralni konjugati, prema ovim ostvarenjima izuma, da sprečavaju osnovno ograničenje svojstveno kod poznatih sistema molekularnih konjugata, time što za razliku od poznatih konjugata, korištenih za prijenos gena putem receptorski upravljane endocitoze, oni imaju specifičan mehanizam koji im omogućuje da budu oslobođeni iz sistema stanične šupljine.

Vektorski sistem koji koristi viralne konjugate, predstavlja osnovno konceptualno odstupanje od rekombinantnih viralnih vektora po tome što strana DNA, koju treba transportirati, je nošena na vanjskoj strani viriona. Prema tome, viralni konjugati prema iznešenom ostvarenju izuma mogu transportirati veoma velike konstrukcije gena u stanicu, bez ograničenja.

Pogodnost virusa, koji će se koristiti kao slobodni ili vezani virus ili dio virusa kao virusna komponenta, u okviru sadašnjeg izuma određena je po svojem faktoru prihvaćanja, kakav je ovdje definiran. Pogodni virusi su, s jedne strane, oni koji imaju sposobnost ulaženja u stanicu receptorski upravljanom endocitozom tijekom transfekcije stanica sa kompleksom nukleinske kiseline i koji doprinose njihovom oslobađanju - a stoga i oslobađanju nukleinske kiseline - iz endosoma u citoplazmu. Takvi su virusi oni koji su otkriveni ovdje, kao i drugi virusi sposobni da budu prihvaćeni od pojedine stanice, uzrokujući oslobađanje sadržaja endosoma u citoplazmu.

Za primjer virusa i viših eukariotičnih stanica u koje mogu penetrirati postoje reference od Fieldsa B.N. i Knipe-a, D.M. (1990). Osjetljivost date stanične linije na transformaciju putem virusa kao olakšavača ulaza konjugata kao “slobodnog virusa”, ovisna je o prisutnosti i broju površinskih receptora ciljane stanice za virus. S obzirom na površinski receptor adenoviralne stanice, za određivanje njegova broja na HeLa i KB stanicama predložene su metode po Svenssonu, 1990., i Deferu, 1990. Mislilo se da je receptor za denovirus prilično naširoko izražen.

Pogodni virusi obuhvaćaju, s jedne strane, one koji su sposobni prodrijeti u stanicu putem receptorski upravljane endocitoze tijekom transfekcije stanica sa kompleksom nukleinske kiseline i koji doprinose njihovom oslobađanju, a stoga i oslobađanju nukleinske kiseline, iz endosoma u citoplazmu. Bez želje vezanja uz tu teoriju, ova aktivnost endosomolize može, u slučaju upotrebe slobodnog virusa, koristiti da se kompleksi nukleinske kiseline prenesu u stanicu, u toliko što se ti kompleksi prenose zajedno sa virusom iz endosoma u citoplazmu, predpostavljajući da oni stižu u iste endosome kao i virusi koji su internalizirani. Kad kompleksi sadrže virus u vezanoj formi, oni se koriste virusnom endosomolitičkom aktivnošću i prenose se iz endosoma u citoplazmu. To sprečava spajanje između endosoma i lizosoma, dakle i enzimatsku degradaciju koja se normalno događa u tim staničnim organima.

Osobito, virusi, koji su sposobni za sastav prema izumu i čija se funkcija prihvaćanja, pojavljujući se na početku infekcije, zapaža po receptorski upravljanoj endocitozi, obuhvaćaju s jedne strane viruse bez lipidne prevlake, kao što je adenovirus, poliovirus, rinovirus, a s druge stane presvučene viruse, virus vesikularnog stomatitisa, Semliki Forest virus, virus influence; pogodne su također vrste Maloney virusa, ovisne o pH. Virusi koji se osobito mogu koristiti u praksi izuma, obuhvaćaju Adenovirus podgrupe C, tip 5, Semliki Forest virus, virus vesikularnog stomatitisa, poliovirus, rinovirusi i Maloney virus leukemije.

Upotreba DNA virusa koji nema reverzne transkriptaze, ima u sadašnjem izumu prednost, što transfekcija u prisutnosti takvog virusa ne dovodi do stvaranja viralne DNA u transficiranoj stanici.

Pokazalo se u sadašnjem izumu da Rinovirus HRV2, predstavnik grupe Picorna virusa, pojačava izražaj referentnog gena. Djelotvornost Rinovirusa bila je izražena i u slobodnoj formi kao i u obliku virusnih konjugata.

Unutar okvira sadašnjeg izuma, naznačeni virusi, uz predpostavku da su prihvaćeni u stanicu i da oslobađaju sadržaje endosoma u koje su stigli, obuhvaćaju, uz divlje tipove mutante koji su izgubili izvjesne funkcije divljeg tipa, koje se razlikuju od funkcije njihova prihvaćanja, osobito sposobnost da se obnavljaju, kao rezultat jedne ili više mutacija.

Mutanti su proizvedeni uobičajenim procesima mutageneze, mutacijama u područjima virus-protein, koje su odgovorne za funkcije obnavljanja i koje mogu biti dopunjene omotnim nizom.Ovi mutanti obuhvaćaju, npr. u slučaju adenovirusa, ts-mutante (temperaturno osjetljive mutante), E1A- i E1B-mutante, mutante koji ispoljavaju mutacije u MLP-pokretanim genima (Berkner, 1988) i mutante koji ispoljavaju mutacije u područjima nekih kapsidnih proteina. Virusne vrste koje imaju odgovarajuće prirodne mutacije također su pogodne.Sposobnost virusa da se obnavljaju može se ispitati, na primjer, korištenjem “plaque” pokusa poznatih iz literture, kod kojih se stanične kulture prekrivaju suspenzijama različitih koncentracija virusa, a broj razorenih stanica, koje su vidljive putem prevlake (plaque) se bilježi (Dulbecco, 1980).

Drugi virusi koji mogu biti pogodni za upotrebu u okviru izuma obuhvaćaju tzv. defektne viruse, t.j. viruse kojima nedostaje funkcija potrebna za autonomnu virusnu obnovu u jednom ili više gena, za što oni zahtijevaju pomoćne viruse. Primjeri ove kategorije su DI-čestice (Defective Interfering Particles) koje se izvode iz infektivnog standardnog virusa, imaju iste strukturalne proteine kao i standardni virus, imaju mutacije te zahtijevaju standardni virus kao pomoćni virus za obnavljanje (Huang, 1987; Holland, 1990). Primjeri ove grupe osim toga obuhvaćaju satelitne viruse (Holland, 1990). Druga je grupa klasa parvovirusa nazvana adeno-pridruženi virus (Berns, K.I. 1990).

Budući da ulazni ciklusi mnogih virusa nisu potpuno okarakterizirani, moguće je da su tu drugi virusi koji će ispoljiti endosomolitičnu aktivnost, potrebnu za njihovu prikladnost u sadašnjem izumu.

Osim toga, u okviru ovoga izuma, pogodne mogu biti oslabljene žive vakcine (Ginsberg, 1980) ili sojevi za vakcinaciju.

Virusi navedeni u okviru sadašnjeg izuma uključuju također inaktivirane viruse, npr. viruse inaktivirane kemijskom obradom, kao što je obrada formaldehidom, UV. zračenjem, kemijskom obradom kombiniranom sa UV-zračenjem, npr. psoralen/UV-zračenje, gama-zračenjem ili neutronskim bombardiranjem. Inaktivirani virusi, npr. takvi kakvi se koriste i za vakcine, mogu se prirediti standardnim metodama poznatim iz literature (Davis i Dulbecco, 1980; Hearst i Thiry, 1977) i ispitanim na pogodnost da povećaju prijenos DNA kompleksa. U pokusima izvedenim u okviru sadašnjeg izuma, pripravci adenovirusa su inaktivirani pomoću uobičajene lampe za UV sterilizaciju ili formaldehidom. Iznenađujuće je pronađeno da je stupanj inaktivacije virusa bitno veći nego što je smanjenje učinka prijenosa gena, koji je postignut kad je adenovirus dodan mediju transfekcije.

Eksperimenti koje su izumitelji proveli sa pripravcima biotiniliranim adenovirusom inaktiviranim kombinacijom psoralen/UV-zračenje, koji je spojen sa streptavidinom vezanim polilizinom, također su pokazali da je kao rezultat inaktivacije, titar virusa smanjen znatno jače nego kapacitet prijenosa gena. To je jasni pokazatelj da mehanizmi koji su vezani uz normalno obnavljanje u aktivnom virusu, mogu biti razoreni, a da ne bude razoren učinak bitan za prijenos gena.

Izraz “virusne komponente” označava dijelove virusa, npr. proteinski dio oslobođen iz nukleinske kiseline (prazan virusni kapsid koji može biti proizveden rekombinantnim metodama, npr. Ansardi i sur., 1991; Urakawa i sur., 1989), proteine dobivene frakcioniranjem ili peptide koji imaju endosomolitičku funkciju intaktnog virusa. Ove virusne komponente mogu biti proizvedene sintetički, ovisno o njihovoj veličini, bilo sintezom peptida ili rekombinantnim metodama.U sadašnjem izumu pokazano je da proteini adenovirusa konjugirani putem biotin/streptavidina u polilizin, povećavaju prijenos gena. Primjeri fragmenata ili proteini iz drugih virusa, a ne iz adenovirusa, koji su bitni za internalizaciju, uključuju hemaglutinin virusa influenze (HA). N-terminalni niz hemaglutinina virusa influenze, podjedinica HA2, odgovorna je za oslobađanje virusa iz endosoma. Pokazalo se da peptidi toga niza, koji se sastoje iz 20 aminokiselina mogu stapati lipidne membrane i djelomično ih otvarati ili razoriti (Wharton i sur., 1988). U sadašnjem su izumu uspješno upotrebljavani autentični i modificirani peptidi influence u različitim ostvarenjima. Drugi primjeri su proteinske prevlake retrovirusa, npr. HIV gp41 (Rafalski i sur., 1990) ili dijelovi ovih virusnih proteina.

Upotreba virusa koji su sami po sebi sposobni da uđu u stanicu i time djeluju kao faktori internalizacije, samo je jedan aspekt sadašnjeg izuma.

Virusi ili virusne komponente koje same ne donose kapacitet vezanja na stanicu i ulaze u nju, radije se koriste kao viralni konjugati, kao što je gore navedeno. Povezivanje na DNA domenu spajanja, npr. polikation, osigurava da virus (komponenta) stekne visoki afinitet prema DNA molekulama i stoga se kompleksira s njim i transportira u stanicu kao komponenta kompleksa nukleinske kiseline, koji također sadrži konjugat faktora internalizacije i domene vezanja DNA. Uz tako postignut učinak prijenosa, povezivanje virusa (komponente) na domenu povezivanja nukleinske kiseline, može također rezultirati poboljšanjem njegovih endosomolitičkih svojstava.

Odabiranjem drugih faktora internalizacije, opisanih ovdje, praktički svaka viša eukariotična stanica može biti transficirana sastavima sadašnjeg izuma.

Jednostavnom pokusnom provjerom može se odrediti da li neki virus (komponenta) ima funkciju prihvaćanja i da li može biti upotrebljen u praksi izuma. U tom pokusu, npr. za provjeravanje primjenjljivosti virusa kao slobodnog virusa, ciljane se stanice dovedu u dodir sa DNA kompleksom u prisutnosti ili odsutnosti virusa. Količina DNA kompleksa odpuštena u citoplazmu može se zatim lako odrediti detekcijom produkta gena označivača, npr. luciferaze. Ako prisutnost virusa uzrokuje da se DNA kompleks prihvaća i odpušta u citoplazmu na većoj razini nego bez virusa, to se može pripisati funkciji prihvaćanja virusa. Moguće je također usporediti razinu prihvaćanja DNA kompleksa sa test virusom u usporedbi sa drugim virusom poznatim po tome što ima povoljnu funkciju prihvaćanja, npr. adenovirusom podgrupe C, tip 5. Testovi ove vrste mogu se primijeniti i na viralne konjugate, dodatni parametri kao što su različiti konjugati faktora internalizacije u različitim količinama, mogu biti podvrgnuti takvim testovima. Osim toga, osoba osposobljena za taj rad može lako izvesti pokus ove vrste, po želji u kombinaciji sa drugim testovima kao što su npr. pokusi propuštanja liposoma, za ispitivanje komponenata virusa ili drugih sredstava sa potencijalnom endosomolitičkom aktivnošću na njihovu sposobnost povećanja izražaja gena.

Kad se koriste netaknuti virusi, testovi se izvode, najbolje paralelno sa preliminarnim testovima sposobnosti virusa da pojača prijenos, da bi se vidjelo da li je virus sposoban za obnavljanje. Istraživanja na sposobnost obnavljanja provode se upotrebom “plaque” pokusa (vidi gore) ili CPE pokusa ili određivanjem ranijeg izražaja gena u slučaju citopatskih virusa ili u slučaju virusa koji značajno ometaju rast domaćinskih stanica. Za druge viruse koriste se metode specifične za dotični virus, npr. test hemaglutinacije, ili kemijsko-fizičke metode, npr. upotreba elektronskog mikroskopa.

U okviru ovoga izuma, najbolji su virusi, osobito koji se primjenjuju kao slobodni virusi, oni koji se mogu prirediti sa visokim titrom, koji su stabilni, koji imaju slabu patogeničnost u njihovom prirodnom stanju i u kojima je moguća ciljana eliminacija sposobnosti obnavljanja, naročito adenovirusi. Ako treba transficirati specifičnu staničnu populaciju, mogu se upotrijebiti virusi koji naročito inficiraju tu staničnu populaciju. Ako se transfekcijom namjerava ciljati različite tipove stanica, mogu se koristiti virusi koji su infektivni za široki raspon tipova stanica.

Zahtjevi na sastave slobodnog virusa sastoje se u biti u tome da pripravak virusa mora biti što je moguće veće čistoće i da pufer za stabilizaciju mora biti takav da se slaže s pojedinim virusom.

U svakom slučaju, za terapeutsku upotrebu izuma mogu se koristiti samo oni virusi ili virusne komponente čiji su rizici sigurnosti minimalni kolikogod je to moguće, osobito rizik obnavljanja virusa u ciljanoj stanici i rekombinacija virusa DNA sa DNA domaćinom.

Mehanizam ulaza virusa koji inficiraju životinjska bića, drugačija od ljudskih, korisno se može upotrijebiti za pojačanje prihvaćanja i odpuštanja DNA u više eukariotične stanice, osobito ljudskih, dok god virus izražava aktivnost razaranja endosoma u višim eukariotičnim stanicama. Članovi obitelji adenovirusa bili su izolirani iz ptičjih vrsta, iz vodozemaca i različitih drugih životinja.

Vidi, na primjer, Laver, W.G- i sur., 1971; Bragg, R.R. i sur., 1991; Akopian, T.A. i sur., 1991; Takase, K. i sur., 1990; Khang, C. i Nagaraji, K.V., 1989; i Reece, R.L. i sur., 1987. Adenovirusi vodozemaca, ptica, goveda, pasa, miševa, ovaca, svinja i majmuna, kao i humani adenovirusi mogu se dobaviti od American Type Culture Collection, Rockville, Maryland (Vidi katalog kolekcije kultura životinjskih virusa, antiseruma, Klamida, rikecija, Šesto izdanje, 1990, C. Buck i G. Paulino izdavači, str. 1-17).

Jedna moguća prednost upotrebe virusa, npr. adenovirusa, iz dalje vrste mogla bi biti smanjena toskičnost u ciljanim stanicama (npr. pileći ili žablji adenovirus ne bi se trebao obnavljati ili potaknuti rani izražaj gena u stanicama sisavaca), smanjena opasnost za istraživača koji priprema dalji adenovirus, u usporedbi sa humanim adenovirusom, te smanjeno upletanje u ciljani organizam iz antitijela protiv humanog ili mišjeg adenovirusa. Odsutnost od upletanja ljudskih ili mišjih antitijela osobito je važna kad se virusi upotrebljavaju u genskoj terapiji kod ljiudi i miševa.

Pileći adenovirus CELO (Chick Embrio Lethal Orphan Virus) ne pokazuje reaktivnost na antitijela koja dopuštaju epitope većine grupa adenovirusa koji inficiraju stanice sisavaca. Osim toga, CELO može biti uzgajan na embriju jajeta da bi dostigao visoke razine virusa (0,5 mg/jaje; Lavel i sur., 1971). Kao što je pokazano u Primjerima, CELO-polilizin konjugati pojačavaju otpremu DNA u HeLa stanice na razinama koje se mogu usporediti sa ljudskim adenovirusom d1312. Stoga korištenje CELO konjugata za pojačanje odpuštanja DNA daje velike izglede u eksperimetima humane genske terapije.

Virusi odvojenih vrsta se radije koriste kao konstituenti viralnih konjugata u kombinacijskim kompleksima, kao što je ovdje opisano.

U konjugatima izuma koji sadrže virus, povezivanje virusa na vezujuću domenu nukleinske kiseline može biti kovalentno ili nekovalentno, npr. ionska veza u slučaju virusa ima područja na svojim površinskim proteinima, koja su kisela pa se stoga može vezati na polikation.

U pokusima sadašnjeg izuma, kompleksi su stvarani pod uvjetima koji dopuštaju ionsku interakciju između adenovirusa i polilizina, prije kompleksiranja sa DNA. Kontrolni su pokusi provedeni pod uvjetima gdje je polilizin prvo neutraliziran sa DNA pa stoga nije slobodan da veže adenovirus. U tim eksperimentima uspješniji su bili kompleksi sa ionski vezanim adenovirusom.

Primjeri za virusne komponente u endosomolitičkim konjugatima izuma su prazne virusne kapside ili viralni peptidi. Vezanje virusne komponente na povezujuću domenu nukleinske kiseline može biti kovalentno, npr. kemijskim spajanjem viralnog peptida sa polilizinom, ili ne-kovalentno, npr. ionsko, u slučaju da virusna komponenta ima kisele ostatke da se vežu na polikation.

Odnos virusa ili virusne komponente prema supstanciji koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, može varirati. U slučaju peptid-polilizin konjugata hemaglutinina influence nađeno je u sadašnjem izumu da prijenos gena može biti u znatnoj mjeri pojačan kad je sadržaj viralnog peptida u konjugatima veći.

S druge strane, sadašnji se izum odnosi na metode priprave viralnih konjugata, prema izumu.

Konjugati virusa ili virusne komponente i supstancija koja ima afinitt za nukleinsku kiselinu, može se prirediti (kao internalizirajući faktor-polikation konjugati) povezivanjem spojeva ili, ako su virusna komponenta i vezujuća domena nukleinske kiseline polipeptidi, rekombinantnom metodom. S obzirom na metode priprave data je referenca o otkriću EP 388 758.

Vezanje virusa ili viralnih proteina, odnosno peptida sa poliaminskim spojevima kemijskom metodom, može se izvesti na način koji je već poznat za spajanje peptida, a po potrebi mogu se pojedine komponente snabdjeti sa povezujućim supstancijama prije reakcije spajanja (ova je mjera potrebna ako nema funkcionalnih grupa koje su priladne za spajanje, npr. merkapto ili alkoholnih grupa). Vezne supstancije su bifunkcionalni spojevi koji reagiraju najprije sa funkcionalnim grupama pojedinih komponenata, nakon čega se modificirane pojedine komponente spajaju.

Spajanje se može provesti pomoću:

a) Disulfidni mostovi, koji se mogu ponovno cijepati pod ograničenim uvjetom (npr. kad se koristi sukcinimidil-piridilditiopropionat (Jung i sur., 1981).

b) Spojevi koji su bitno stabilni pod biološkim uvjetima (npr. tioeteri reakcijom meimido spojnika sa sulfhidril grupama spojnika vezanog na drugu komponentu).

c) Mostovi koji su pod biološkim uvjetima nestabilni, npr. veze estera ili acetalne ili ketalne veze, koje su pod slabo kiselim uvjetima nestabilni.

U pokusima izvedenim unutar okvira sadašnjeg izuma, spojeni su endosomolitički HA2-peptidi influenca-hemaglutinina sa poliliznom, kemijskom metodom uz upotrebu sukcinimidilpiridilditiopropionata (SPDP). Pokazano je da modifikacija peptida sa polilizinom povećava endosomolitičku aktivnost. Pokusi transfekcije pokazali su da učinkovitost prijenosa gena, upravljanog transferin-polilizinom, bitno raste ako su konjugati peptida influence-polilizina prisutni zajedno sa transferin-polilizinom u DNA kompleksu.

Nadalje, u okviru sadašnjeg izuma, adenovirus je bio vezan na polilizin nizom različitih metoda. Jedan način konjugirana virusa sa polilzinom bio je proveden na sličan način kao i proizvodnja transferin-polilizin konjugata (Wagner i sur., 1990) nakon modifikacije oštećenog adenovirusa d1312 pomoću heterobifunkcionalnog reagensa. Nevezani polilizin bio je uklonjen centrifugiranjem. Vezujući kapacitet DNA bio je pokazan u pokusu povezivanja pomoću radioaktiovno označene DNA.

(Kod K562 stanica, u odsutnosti klorokina, nađen je bitno viši prijenos gena sa kompleksima koji se sastoje iz DNA, adenovurs-polilizina i transferin-polilizina, nego sa nemodificiranim adenovirusom koji nije vezan na DNA. Nađeno je također da se značajan izražaj gena javlja sa samo 0,0003µg DNA u 5x105 HeLa stanica pomoću polilizinom modificiranog adenovirusa

Ako virus ili virusna komponenta (ili dodatni faktor internalizacije, kao npr. u slučaju transferina) sadrži pogodne lance ugljikohidrata, oni mogu biti vezani na supstanciju koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, putem jednog ili više ugljikohidratnih lanaca glikoproteina.

Druga pogodna metoda priprave viralnih konjugata ovog izuma je metoda putem enzimatskog spajanja virusa ili virusne komponente sa supstancijom koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, naročito sa poliaminom, pomoću transglutaminaze.

Kategorija transglutaminaze obuhvaća niz različitih ezima, koji se među ostalima javljaju u epidermi (epidermalna transglutaminaza) u krvi (faktor XIII) i u stanicama različitih tkiva (npr. transglutaminaza jetre) (Folk, 1985). Transglutaminaze kataliziraju stvaranje ε-(γ-glutamil)lizin veza u prisutnosti Ca++ i uz kidanje NH3. Uvjet za to je da u proteinima moraju biti prisutni odgovarajući glutamini i lizini, sposobni da reagiraju sa enzimom.

Bez obzira na ε-amino grupu lizina, mogu se kao supstrat koristiti i (poli)amini, kao što je etanolamin, putrescin, spermin, ili spermidin (Clarke i sur., 1959). Za sada još nije jasno koji su kritični faktori koji određuju da li glutamin ili lizin proteina ili poliamin može reagirati sa enzimom. Poznato je samo da poliamini mogu biti vezani pomoću transglutaminaze na brojne stanične proteine, kao što su citokeratini (Zatloukal i sur., 1989), tubulin, proteini stanične membrane i površinski proteini virusa influenze (Iwanij, 1977).

U okviru sadašnjeg izuma bilo je pokazano da polilizin može biti spojen sa adenovirusima pomoću transglutaminaze. Nađeno je da spajanje može biti izvedeno u prisutnosti glicerola. To ima prednost što se virusni pripravak, npr. preparat adenovirusa koji sadrži glierol kao stabilizator u puferu, može direktno koristiti za spajanje. Upotrebom adenovirus-polilzin konjugata koji su kompleksirani sa plasmid-DNA zajedno sa transferin-polilizin konjugatima, moguće je bilo postići mnogo puta veći izražaj gena nego sa transferinpolilizin konjugatima u prisutnosti adenovirusa koji nije spojen sa polilizinom.

Druga metoda priprave konjugata koja je u okviru izuma povoljna, sastoji se u spajanju virusa ili virusne komponente sa polikationom putem biotin-protein mosta, naročito bioten-streptavidin mosta.

Poznato jaka veza biotina sa streptavidinom ili avidinom (Wilchek i sur., 1988) korištena je za spajanje adenovirusa sa polilizinom, modificiranjem adenovirsa sa biotinom i kemijskim konjugiranjem streptavidina sa polilizinom, na sličan način kao što se proizvode transferin-polilizin konjugati (Wagner i sur., 1990). Kompleksi koji se sastoje od DNA i streptavidin-polilizina, na koje je vezan biotinom modificirani virus, te po želji nekovalentno vezani polilizin, imaju veoma visoku djelotvornost transfekcije čak i uz niže koncentracije DNA. Osobito učinkoviti kompleksi se stvaraju kad se biotinom modificirani virus prvo veže na strepatvidin-polilizin, a vezanje na DNA se javlja tek u drugoj fazi.

Ako se želi, vezanje na biotin može se također izvesti pomoću avidina.

Moguće je također uspostaviti vezu između virusa (komponente) i polizina biotiniliranjem virusa, s jedne strane, i konjugiranjem antibiotin antitijela sa polilizinom, s druge strane, te uspostavljanjem veze između virusa i polilizina pomoću veze biotin-antitijelo, korištenjem standardnog komercijalno pristupačnog poliklonala ili monoklonalnih anti-biotin antitijela.

Povezivanje između virusa i polizina može se također postići spajanjem polizina sa lektinom koji ima afinitet za glikoprotein površine virusa, s tim da je vezanje u takav konjugat izvedeno pomoću veze između lektina i glikoproteina. Ako virus sam nema pogodnog ugljkohidratnog postranog lanca, on se može prikladno modificirati. Virus također može biti vezan na supstanciju, koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, tako da najprije bude modificiran na površini sa antigenom stranim virusu (npr. sa digoksigeninom DIG, koji se može dobiti od Boehringer Mannheim; ili sa biotinom) a onda se ustanovi veza između modificiranog virusa i supstancije koja ima afinitet za nukleinsku ksielinu, putem antitijela koje se veže na taj antigen. Koja će se pojedina metoda koristiti za proizvodnju konjugata prema izumu, ovisi o različitim kriterijima.

Tako na primjer, spajanje pomoću biotina je najmanje specifično pa je stoga to najšire primjenjivana metoda, dok biotinom upravljano povezivanje stvara veoma jaku ne-kovalentnu vezu. Enzimatska reaakcija sa transglutaminazom ima prednost što se može izvesti u veoma malom mjerilu. Kemijsko se spajanje općenito koristi kad treba sintetizirati veće količine konjugata i ova je metoda općenito najbolja kad se spajaju virusni proteini ili peptidi. Ako se koriste inaktivirani virusi, inaktivacija se općenito izvodi prije spajanja, uz predpostavku da inaktivacija nije utjecala na spajanje.

Ako virus, npr. adenovirus ili njegova endosomolitička komponenta, ima pristupačnu domenu povezivanja, npr. kisele domene za vezanje na polikation, vezanje virusa na polikation, može također biti ionsko. U tom slučaju, pozitivni naboji polikationa, koji se može konjugirati sa internalizirajućim faktorom, djelomično se neutraliziraju kiselom domenom virusa (komonente), a ostatak pozitivnih naboja će uglavnom biti neutraliziran nukleinskom kiselinom.

Ako je supstancija koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, jedna posredna supstancija, ona se modificira sa veznim sredstvom koje je pogodno za pojedino spajanje virusa (komponente), npr. za spajanje sa transglutaminazom, ona se modificira sa sperminom ili sa bifunkcionanom grupom odgovornom za kemijsko spajanje, npr. sa aktivnim esterom.

Odnos virusa (komponente) prema supstancijama povezivanja nukleinske kiseline može varirati, što se obično utvrđuj empirijski, npr. spajanjem konstantne količine virusa (komponente) sa različitim količinama polilizina i odabiranjem optimalnog konjugata za transfekciju.

U drugom ostvarenju izuma, virusna komponenta, npr. endosomolitički viralni peptid može biti modificiran u svrhu povezivanja direktno na DNA. Konačno, sam peptid može sadržavati domenu vezanja DNA, koja se može postići proizvodnjom peptida pomoću sinteze petida i pribavljanjem dobrog dijela pozitivno nabijenih aminokiselina, osobito proširenjem peptida, najbolje, na C-kraju.

U još jednom ostvarenju izuma endosomolitično je sredstvo ne-viralni, obično sintetički petid. Peptid ove vrste je obično sadržan u sastavu prema izumu na takav način da je on ionski vezan na supstanciju sa afinitetom za nukleinsku kiselinu, npr. na polilzin u slučaju kompleksa DNA-internalizirajući faktor-polilizin. Stoga je ugradnja endosomolitičkog peptida u komplekse nukleinske kiseline izvršena povezivanjem peptida putem njegovih kiselih aminokiselinskih ostataka na pozitivno nabijenu povezivajuću domenu nukleinske kiseline, najbolje polizin.

Ovisno o kemijskoj strukturi peptida, osobito s obzirom na njegovu krajnju grupu, povezivanje na polilizin se može obaviti metodama ovdje opisanim za vezanje peptida na polilizin. Konačno, ako se upotrebljava peptid koji se javlja u prirodi, on se može modificirati pogodnom terminalnom aminokiselinom, kao sredstvo za spajanje.

Drugi je način ugradnje ne-viralnih endosomolitičkih peptida u komplekse nukleinske kiseline, da ih se opskrbi nastavcima koji se vežu na DNA. Lokacija takvog nastavka mora biti takva da ne interferira sa endosomolitičkom aktivnošću peptida. Stoga su, na primjer, peptidi čije je N-kraj odgovoran za tu aktivnost, rašireni po DNA povezujućim nizovima na C-kraj. Produljenja ove vrste mogu biti homologni ili heterologni kationski oligopeptidi, npr. jedanoligolizinski rep, ili prirodna DNA povezujuća domena, npr. peptid izveden iz histona. Uglavnom ovi DNA povezujući nizovi, kao integralni dio endosomolitičkog peptida, sadrže približno 10 do 40 aminokiselina. Ovo ostvarenje izuma daje mogućnost većeg odnosa endosomolitičkog niza prema DNA povezujućem nizu, nego kod konjugata koji sadrže veće količine polikationa u svrhu postizavanja veće učinkovitosti kompleksa.

Ne-viralni endosomolitički peptidi moraju ispuniti slijedeće zahtjeve:

S obzirom na endosomolitičku aktivnost propuštanje lipidne membrane, postignuto peptidom, mora općenito biti više kod niskog pH (5-6) nego kod pH 7. Nadalje, razorene površine membrane moraju biti dovoljno velike da dopuste prolaz velikih kompleksa DNA (male pore nisu dovoljne). U svrhu određivanja da li peptid ispunjava ove zahtjeve, mogu se provesti in vitro testovi primjenom peptida u slobodnom ili vezanom obliku ili ugrađeno u DNA kompleks. Takvi pokusi mogu obuhvaćati pokuse liposomnog propuštanja, pokuse eritrocitnog propuštanja i eksperimente stanične kulture, kojima se određuje povećanje izražaja gena. Testovi ovoga tipa su opisani u poglavlju Eksperimenti, odnosno Primjeri. Optimalna količina peptida se može odrediti preliminarnim titracijama pomoću pokusa učinkovitosti rezultirajućeg prijenosa gena. Treba imati na umu da učinkovitost različitih peptida i optimalni sastav kompleksa može ovisiti o tipu stanice.

Peptidi koji razaraju membranu sadrže, uglavnom, amfipatične nizove, naime hidrofobičnu stranu koja reagira sa lipidnom membranom, hidrofilnu stranu koja stabilizira vodenu fazu na mjestu raskida membrane.

Postoji niz primjera u prirodi za peptide koji razaraju membranu, to su obično mali peptidi ili peptidne domene velikih polipeptida. Takvi se peptidi mogu klasificirati prema njihovoj prirodnoj funkciji, naime, ili u peptide koji razaraju membranu (npr. peptide golih virusa) i/ili u peptide koji spajaju membrane (npr. obučeni virusi). U svrhu raskida endosoma, kontekstu sintetičkih peptida, obje klase nizova peptida mogu biti korisne. Većina je prirodnih peptida sposobna stvarati amfipatične α-helikse.

pH-specifičnot se može postići ugradnjom kiselinskih ostataka na hidrofilnu stranu navodnog amfipatičnog α-heliksa, na taj način da se heliks može stvarati samo uz kiseli pH, ali ne uz neutralni pH, gdje odbojnost između negativno nabijenih kiselinskih ostataka sprečava formiranje heliksa. Ovo je svojstvo nađeno i kod nizova koji se javljaju u prirodi. (npr. influenca HA-2 N-kraj).

Opisan je potpuno sintetički, racionalno označen, peptid (amfipatični) specifičnih svojstava razaranja membrane s obzirom na pH (Subbarao i sur., 1987; Parente i sur., 1990). Pokazalo se da taj peptid (u slobodnom obliku) stvara samo male pore u membranama, te dopušta propuštanje malih spojeva (Parente i sur. 1990).

Prema ostvarenju izuma u kojem se koriste neviralni, moguće i sintetički peptidi, obično se provode slijedeće faze: niz amfipatskih peptida se odabere iz onih koji se javljaju u prirodi ili iz grupe arificjelnih peptida. Pregled primjera peptida ove vrste, poznatih u praksi, dat je u tabeli 2.

Po potrebi se uvedu kiselinski ostaci (Glu, Asp) da bi aktivitet razaranja peptidne membane bio, s obzirom na pH što specifičniji (npr. dvostruki kiseli mutant hemaglutinin peptida influence, prema primjer 35, označen sa p50).

Ako je potrebno kiselinski se ostaci mogu uvesti također u svrhu olakšanja veze peptida na polizin. Jedan način da se dobije takva polikationska domena povezivanja, može biti uvođenje produženja (kiselinskog), npr. oligo-Glu-produžetka.

Endosomolitički peptidi, pogodni za sadašnji izum, mogu se također dobiti spajanjem nizova koji se javljaju u prirodi sa artificijelnim. U sadašnjem su izumu provedeni eksperimenti sa različitim peptidima koji su bili izvedeni iz sintetičkog peptida GALA, opisanog po Parenteu i sur., 1990. Neki od derivata upotrebljenih u pokusima sadašnjeg izuma, dobiveni su kombinacijom peptida Gala ili njegovih modifikacija, sa nizovima peptida influence ili njegovim modifikacijama, npr. peptidima označenim sa EALA-Inf i EALA-P50, prema primjeru 33.

Dužina peptidnog niza može biti kritična s obzirom na stabilnost amfipatičnog heliksa; povećanje stabiliteta kratkih domena izvedenih iz prirordnih proteina, može se postići produženjem heliksa.

U svrhu povećanja endosomolitičke aktivnosti peptida, mogu se formirati homodimeri, heterodimeri ili oligomeri. U pokusima sadašnjeg izuma pokazalo se je da P50 dimer ima mnogo veću aktivnost nego monomer.

Sadašnji su izumitelji pokazali utjecaj sintetičkih peptida na prihvaćanje DNA upravljano transferin-polilizin konjugatima. Sintetiziran je niz različitih peptida, ispitano je njihovo propuštanje liposoma i eritrocita i testiran je njihov utjecaj na izražaj luciferaze u TIB stanicama i u NIH 3T3 stanicama. U jednom drugom ostvarenju izuma može endosomolitičko sredstvo biti ne-peptidna amfipatična supstancija. Zahtjevi koje mora takva supstancija ispuniti da bude pogodna za sadašnji izum su u biti jednaki kao i amfipatične peptide, t.j. sposobnost da budu ugrađeni u komplekse nukleinske kiseline, pH specifičnosti i t.d.

S drugog se aspekta izum odnosi na komplekse koji su prihvaćeni u više eukariotične stanice, koje sadrže nukleinsku kiselinu i konjugat sposoban da formira kompleks sa nukleinskom kiselinom, za uvođenje nukleinske kiseline u više eukariotične stanice.

Kompleksi su karakterizirani time što se konjugat sastoji iz supstancije koja ima afinitet za nukelinsku kiselinu i endosomolitičnog sredstva koje je vezano na supstanciju koja ima afinitet za nukelinsku kiselinu i koja je sposobna da se internalizira u stanicu kao kompleks konjugat/nukleinska kiselina i da oslobađa sadržaje endosoma u kojima je kompleks smješten nakon ulaska u stanicu, u citoplazmu.

Kompleksi nukleinske kiseline, korišteni u okviru izuma, uglavnom su oni u kojima je nukleinska kiselina kompleksirana sa supstancijom koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, na taj način da su kompleksi bitno elektroneutralni.

U povoljnom ostvarenju izuma, endosomotično je sredstvo virus ili virusna komponenta kovalentno vezana na polikation.

U okviru sadašnje izuma, endosomolitički konjugati obuhvaćaju, uz konjugate u kojima su endosomolitična sredstva ionski vezana na povezujuću domenu DNA, i ondosomolitična sredstva koja se povezuju na DNA direktno, npr. putem njihova osnovnog produženja, premda se “konjugati” ove vrste, zapravo, ne dobivaju konjugacijom, t.j. spajanjem dviju komponenata međusobno. Funkcija endosomolitičkih sredstava ove vrstem kao spojeva sastava prema izumu, je neovisna o tome da li su ona sintetizirana konjugatom endosomolitičkog sredstva i povezujuće domene DNA ili je povezujuća domena DNA originalno bila prisutna u endosomolitičkom sredstvu.

U drugom povoljnom ostvarenju izuma kompleksi sadrže, uz endosomolitički konjugat, drugi konjugat u kojem je supstancija, koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, u slučaju endosomolitičkog polikationskog konjugata općenito istog kationa kao u konjugatu, konjugirana uz internalizirajući faktor koji ima afinitet za ciljanu stanicu. Ovo se ostvarenje izuma koristi osobito kad ciljana stanica nema, ili ima malo receptora za upotrebljeni virus kao dio endosomolitičkog konjugata. Druga je primjena ovog ostvarenja izuma kad se upotrebljava virusna komponenta, npr. peptid koji dolazi u prirodi, kao i modificirani peptid, ne-viralni, može i sintetički endosomolitički peptid ili virus iz daljih vrsta, koji nemaju sposobnost da sami po sebi prodru u stanice koje treba transficirati. U prisutnosti dodatnog faktorskog konjugata koji internalizira povezujući faktor, endosomolitički konjugati crpe korist iz interalizirajuće sposobnosti drugog konjugata, time što su kompleksirani na nukleinsku kiselinu zajedno sa drugim konjugatom i što su prihvaćeni u ćeliju kao dio rezultirajućeg kompleksa, koji se u daljnjem tekstu spominje kao “kombinacijski kompleks” ili kao “trostruki kompleks”. Bez obzira na ovu teoriju, kombinacijski se kompleksi prihvaćaju u stanice, bilo povezivanjem na površinski receptor koji je specifičan za dodatni internalizirajući faktor, ili npr. u slučaju virusa ili virusne komponente, povezivanjem na virusni receptor ili povezivanjem uz oba receptora, iztenalizacijom receptorski upravljanom endocitozom. Kad se endosomolitična srdstva oslobađaju iz endosoma, DNA sadržana u kompleksima se također oslobađa u citoplazmu i tako se izbjegava lizosomna degradacija.

U eksperimetima sadašnjeg izuma, gotovo se sve HeLa stanice mogu transficirati sa slobodnim adenovirusom. Djelotvornost za hepatocite se može još dalje poboljašti, ako se koriste trostruki DNA kompleksi u kojima je referentna DNA kompleksirana sa polilizin-transferin konjugatima i povezana uz adenovirus. Ovdje je određivanje mjesta endosomolitičkog virusa i kompleksa receptora liganda u endosomu garantirana donoseći transfekciju u gotovo sve stanice za niz stanica, kao BNL.CL2 i HepG2 stnice. U tom slučaju i viralni i transferin receptori na površini stanice mogu djelovati tako da uhvate trostruke DNA komplekse. Međutim, može se također predvidjeti da DNA trostruki kompleksi mogu biti internalizirani samo djelovanjem celularne asocijacije ligand/receptor. Takva se situacija može aproksimirati u pokusima gdje trostruki DNA kompleksi, koji sadrže transferin, postižu pristup K562 stanicama uglavnom putem tansferinskog receptora, radije nego putem receptora adenovirusa.

Neočekivano, trostruki su kompelsi prenosili DNA čak i kad su bili prisutni za prijenos DNA u veoma niskim razinama. Tako se uz dodatak od 30 pg DNA/3x105 stanice dobije 1,8x104 jedinica (rezultirajućih iz luciferazom kodiranog plasmida). Kod tog ulaza ima tek 60 molekula DNA i 1 PFU virusa po stanici. To treba usporediti sa manje efikasnim postupkom taloženja kacija, koji upotrebljava 105 molekula DNA po stanici (Molecular Cloning, Samobrook, J. i sur. 2. izdanje, Vol. 3, str. 16.39-16.40, 1989). Stoga sadašnji izum predstavlja značajan napredak u praksi, budući da on omogućava djelotvornu transformaciju viših eukariotičnih stanica sa veoma malom količinom DNA.

Prisutnost virusa, virusnih komponenata ili neviralnih endosomolitičkih agensa u DNA kompleksima, kao konstituenata endosomolitičkih konjugata, ima slijedeće prednosti:

1) Šira mogućnost primjene tehnologije prijenosa gena kompelsima nukleinske kiseline, budući da sam endosomolitički agnes, osobito u slučaju kad se koristi virus (komponenta), može sadržavati interalizirajući faktor ili može biti također kompleksiran sa DNA zajedno sa drugim internalizirajućim faktorom (npr. transferinom ili asialofetuinom itd.). Na taj je način moguće iskoristiti pozitivni učinak virusa čak i za stanice koje nemaju nikakvog receptora za dotični virus.

2) Poboljšanje djelotvornosti prijenosa gena, budući da vezanje endosomolitičkih konjugata na DNA osigurava da se oni zajednički prihvate u stanice. Koordinirano prihvaćanje i oslobađanje virusa i DNA također povećava mogućnost smanjenja količine DNA i virusa potrebnih za efikasan prijenos gena, što je od osobite važnosti za korištenje in vivo.

Termin “internalizirajući faktor” odnosi se za svrhe sadašnjeg izuma na ligande ili njihove fragmente, koji se nakon vezanja na stanicu internaliziraju endocitozom, i to receptorski upravljanom endocitozom, ili na faktore čije se povezivanje ili internalizacije izvodi spajanjem sa elementima stanične membrane.

Pogodni internalizirajući faktori uključuju ligande kao transferin (Klausner, R.D. i sur.,1983), konalbumin (Sennett, C. i sur., 1981), asialoglikoproteini (kao što je asialotransferin, asialorosomukoid ili asialofetuin) (Ashwell, G. i sur., 1982), lektini (Goldestein i sur., 1980, Shardon, 1987) ili supstancije koje sadrže galaktozu, a internalizirane su asialoglikoproteinskim receptorom kao što su: manozilirani glikoproteini (Stahl, P.D. i sur., 1987), lizosomalni enzimi (Sly, W. i sur., 1982), LDL (Goldstein, J.L. i sur., 1982), modificirani LDL (Goldstein, J.L. i sur., 1979), lipoproteini koji su prihvaćeni u stanicu putem receptora (apo B100/LDL); viralni proteini kao što je HIV protein gp120; antitijela (Mellman, L..S. i sur., 1984., Kuhn, L.C. i sur., 1982, Abrahamson, D.R., i sur., 1982) ili njihovi fragmenti nasuprot antigena stničnih površina, npr. anti-CD4, anti-CD7; citokini kao što je interleukin-1 (Mizel, S.B. i sur., 1987), interleukin-2 (Smith, K.A. i sur., 1985), TNF (imamure, K. i sur., 1987), interferon (Anferson, P. i sur., 1982), faktor koji stimulira kolonije (Walker, F. i sur., 1987); faktori i faktori rasta kao što je insulin Marshall, S., 1985), EGF (Carpenter, G., 1984), faktor rasta izveden iz plateleta (Heldin, C.H. i sur., 1982), transformirajući faktor rasta β(Massague, J. i sur., 1987), insulinu sličan faktor rasta I (Schalch, D.S. i sur., 1986), LH, FSH, (Ascoli, M. i sur., 1978), hormoni rasta (Hizuka, N. i sur., 1981), prolaktin (Posner, B.I. i sur., 1982), glukagon (Asada-Kubota, M. i sur., 1983), hormoni tiroide (Cheng, S. - Y. i sur., 1980); α-2-makroglobulin proteaze (Kaplan, J. i sur., 1979); i “razoružani” toksini. Daljnji su primjeri imunoglobulina ili njegovi fragmenti kao ligandi za Fc receptor ili antiimunoglobulin antitijela, koja se vežu na Sigs (površinske imunoglobuline). Ligandi mogu biti prirodnog ili sintetičkog porjekla. Vidi: Trends Pharmacol. Sci. 10:458-462 (1989) i tu citirane reference.

Bitni zahtjevi za pogodnost takvih faktora, prema sadašnjem su izumu slijedeći,

a) oni mogu biti internalizirani specifičnom vrstom stanice u kojima mora biti uvedena nukleinska kiselina, a njihovu sposobnost da budu internalizirni ne utječe, ili samo neznatno utječe, ako su konjugirani sa povezujućim faktorom i

b) u okviru ovog svojstva oni su sposobni da nose “na leđima” nukleinsku kiselinu u stanicu.

U pokusima izvedenim prema izumu pokazan je široki raspon korištenja izuma s obzirom na internalizirajući faktor, ili na dodatni internalizirajući faktor, odnosno u kombinacijskim kompleksima, pomoću humanih i mišjih transferin-polilizin konjugata, asialofetuin-pL konjugata, galaktoza-pL konjugata, aglutinin konjugata pšenične klice, za T-stanicu specifični gp120-pL i antiCD7-pL konjugata i pomoću DNA polilizin konjugata koji ne sadrže nikakav internalizirajući faktor. Osim toga, svojstva virusnih konjugata, prema izumu, pokazana su pomoću kompeksa DNA i polilizinom konjugiranog virusa (ili virusne komponente) koji nisu sadržavali dodatnih konjugata internalizirajućeg faktora s faktorom povezivanja

Mogu se izvesti specifični prelimiranrni testovi radi odrđivanja da li, u slučaju da je endosomogitični agens slobodni virus, ili slučaju da je endosomolitični agens virus ili virusni spoj ili ne-viralni peptid koji je dio endosomolitičkog konjugata, upotreba internalizirajućeg faktora omogućava ili poboljšava prihvćanje kompleksa nukleinske kiseline. Ovi testovi obuhvaćaju paralelne transfekcije sa kompleksima nukleinske kiseline, prvenstveno bez (dodatnog) faktora internalizacije, npr. u slučaju virusnih konjugata sa kompleksima koji se sastoje od nukleinske kiseline i virusnog konjugata, i u drugom redu sa kompleksima u kojima je nukelinska kiselina kompleksirana sa drugim konjugatom koji se sastoji do dodatnog faktora internalizacije, za koji ciljane stanice imaju receptor, i supstancije koje ima afinitet za nukleinsku kiselinu.

Ako se koristi faktor internalizacije ili ako se koristi dodatni faktor internalizacije, t.j. ako je primjenjen kombinacijski kompleks, time je određeno, osobito po ciljanim stanicama, npr. po specifičnim površinskim antigenima ili receptorima, specifičnim za vrst stanice koja tako omogućava ciljani prijenos nukleinske kiseline u taj tip stanice.

Supstancije sa afinitetom za nukleinsku kiselinu, koje se mogu upotrijebiti prema izumu, obuhvaćaju, na primjer homologne organske polikatione, kao što su polilzin, poliarginin, poliornitin, ili heterogene polikatione koji imaju dvije ili više različitih pozitivno nabijenih aminokiselina, a ti polikationi imaju možda lance različitih dužina, te također ne-peptidne sintetičke polikatione kao što je polietilenimin. Druge supstancije sa afinitetom za nukleinsku kiselinu, koje su pogodne, jesu prirodni DNA-vežući proteini polikationske prirode, kao što su histroni ili protamini ili analozi ili njihovi fragmenti, kao i spermin ili spermidini.

Dužina polikationa nije kritična, dok god su kompleksi u biti elektroneutralni. Povoljan je raspon dužine polilizinskog lanca od oko 20 do oko 1000 lizin monomera. Međutim, za datu dužinu DNA, nema kritične dužine polikaziona. Kad se DNA sastoji od 6.000 bp i 12.000 negativnih naboja, količina polikationa po molu DNA može biti,

60 molova polilizin 200

30 molova polilizina 400; ili

120 molova polilizina 100, itd.

Tko je normalno izvježban u sasvim rutinskoj eksperimentaciji, taj može odabrati druge kombinacije dužine polikationa i molarne količine.

Druge pogodne supstancije sa afinitetom za nukleinsku kiselinu, kao dio konjugata, jesu supstancije koje se umeću, kao što su ethidium dimeri, akridin ili peptidi koji se umeću, a sadrže triptofan i/ili tirozin i/ili fenilalanin.

Što se tiče kvalitativnog sastava kompleksa nukleinske kiseline, općenito se prvenstveno određuje nukleinska kiselina koju treba prenijeti u stanicu. Nukleinska kiselina je definirana prvenstveno po biološkom utjecaju koji treba postići u stanici te, u slučaju upotrebe za gensku terapiju, po genu ili dijelu gena koji treba biti izražen, npr. u svrhu zamjene oštećenog gena ili po cijlanom nizu gena koji treba inhibirati. Nukleinske kiseline koje će se transportirati u stanicu mogu biti DNA ili RNA, dok na nukleotidni niz nema postavljenih ograničenja. Ako se izum primjenjuje na tumorske stanice, u svrhu njihove upotrebe kao vakcine raka, DNA koju treba uvesti u stanicu, obično se označava kao imuno-modulirajuća supstancija, npr. citokin kao IL-2, IL-4, IFN gama, TNF alfa. Kombinacije DNA koje umeću citokin mogu biti naročito korisne, npr. IL-2 i IFN gama. Drugi korisni gen za uvođenje u tumorske stanice može biti “gen otpornosti na mnoge lijekove” (multi drug resistance gene) mdr. Moguće je također uvesti u stanicu dva ili više različitih niza nukleinske kiseline, npr. cDNA koja sadri plasmid, koji označava dva različita proteina pod kontrolom pogodnih regulatornih nizova, ili dvije različite konstrukcije plasmida koje sadrže različite cDNA.

Terapeutski djelotvorne inhibirajuće nukleinske kiseline za prijenos u stanice radi inhibicije specifičnih nizova gena obuhvaćaju konstrukcije gena iz kojih su prevedeni antisense-RNA ili ribozimi. Osim toga, moguće je također uvesti oligonukleotide u stanice. Anti sense nukleotidi obuhvaćaju obično 15 ili više nukleotida. Po želji, oligonukleotidi mogu biti multimerizirani. Kad treba u stanicu uvest iribozime, oni se obično uvode kao dio konstrukcije gena, koja sadrži stabilizirajuće elemente gena, npr. tRNA elemente gena. Konstrukcije gena ovoga tima objavljene su u EP A 0 387 775.

Bez obzira na molekule nukleinske kiseline koje inhibiraju gene, npr. viralne gene, mogu se, s obzirom na njihovu komplementarnost upotrijebiti geni sa različitim načinom inhibitornog djelovanja. Primjeri su geni označeni kao viralni proteini, koji imaju tzv. trans-dominantne mutacije (Herskowitz, 1987). Izražaj gena u stanici stvara proteine koji dominijraju odgovarajućim prrodnim proteinom i tako zaštićuju stanice, koje stiču “stanični imunitet” inhibiranjući viralnu obnovu.

Pogodne su trans-dominantne mutacije viralnih proteina, koje su potrebne za obnavljanje i izražaj, npr. Gag-, Tat i Rev mutanti, za koje je pokazano da inhibiraju HIV obnavljanje (Trono i sur., 1989; Green i sur., 1989; Malim i sur., 1989).

Jedan drugi mehanizam postizavanja unutarstaničnog imuniteta obuhvaća izražaj molekula RNA koje sadrže mjesto za povezivanje esencijalnog viralnog proteina, na primjer tzv. TAR mamce (Sullenger i sur., 1990).

Primjeri gena koji se mogu koristiti u somatskoj genskoj terapiji i koji se mogu prenijeti u stanice kao komponente konstrukcije gena, pomoću sadašnjeg izuma, uključuju faktor VIII (hemofilija A) (vidi, npr. Wood i sur., 1984), faktor IX (hemofilija B) (vidi, npr. Kurachi, K. i sur., 1982), adenosin deaminazu (SCID) (vidi, npr. Vlerio, D. i sur., 1984), -1 antitripsin (plućni emfizem) (vidi, npr. Ciliberto, G. i sur., 1985) ili regulatorski gen transmembranske provodljivosti cistične fibroze (vid, na primjer, Riordan, J.R. i sur., 1989). Ovi primjeri ne predstavljaju ni u kom pogledu nikakvo ograničenje.

Što se tiče veličine nukleinskih kiselina, moguć je veliki raspon. Putem sadašnjeg izuma mogu se u stanice prenijeti konstrukcije gena od oko 0,15 kb (u slučaju tRNA gena koji sadrži ribozim) do oko 50 kb ili više. Manje molekule nukleinske kiseline mogu se primjeniti kao oligonukleotidi.

Jasno je da je najšira mogućnost primjene omogućena upravo činjenicom da sadašnji izum nije podvrgnut nikakvom ograničenju na niz gena te činjenicom da veoma velike konstrukcije gena mogu također biti prenešene putem izuma.

Polazeći od nukleinske ksieline, supstancija koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, pogotovo jedna organska polikationska supstancija, određena je da osigura kompleksiranje nukleinske kiseline, s tim da su dobiveni kompleksi bitno elektroneutralni. Ako kompleksi sadrže konjugat dodatnog internalizirajućeg faktora i supstancije koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, polikationska komponenta konjugata se uzima u obzir u odnosu na spekt elektroneutralnosti. Tijekom ranijih izuma bilo je nađeno da se optimalni prijenos nukleinske kiseline u stanicu može postići, ako je odnos konjugata prema nukleinskoj kiselini odabran tako da su kompleksi internalizirajući faktor-polikation/nukleinska kiselina bitno elektroneutralni. Nađeno je da se količina nukleinske kiseline prihvaćene u stanicu ne smanjuje, ako se nešto od transferin-polikation konjugata zamijeni ne-kovalentno povezanim polikationom. U nekim slučajevima može čak biti i bitnog porasta u prihvaćanju DNA (Wagner i sur., 1991a). Bilo je primjećeno da je DNA kompleksa prisutna u obliku pritisnutom u toroidalne strukture s promjerom od 80 do 100 nm. Količina polikationa je stoga odabrana, s obzirom na dva parametra elektroneutralnosti postizavanja kompaktne strukture, dok količinu polikationa koja rezultira iz nabijanja nukleinske ksieline, s obzirom na postugnutu elektroneutralnost, općenito također garantira kompaktnost DNA.

Tako, u daljenjem ostvarenju izuma, kompleksi također supstancije koje povezuju nukleinsku kiselinu u ne-kovalentno vezanom obliku, koji može biti jednak ili različit od faktora povezivanja. U slučaju da je endosomolitički agnes slobodni vbirus, kompleksi sadrže nukleinsku ksielinu i konjugat internalizirajućeg faktora. U slučaju da je upotrebljen endosomolitički, npr. viralni konjugat, nukelinska je kiselina kompleksirana s tim konjugatom, u skladu sa konjugatom dodatnog internalizirajućeg faktora. Izbor ne-kovalentno vezanih “slobodnih” supstitucija, koje imaju afinitet za nukleinsku kiselinu, po njihovoj prirodi i količini, također je određen po konjugatu (konjugatima), posebno vodeći računa o faktoru povezivanja sadržanom u konjugatu; ako, na primjer, faktor povezivanja je supstancija koja ima nikakav ili ograničen kapacitet za kondenzaciju DNA, općenito je preporučljivo, s obzirom na postizavanje efikasne internalizacije kompleksa, koristiti supstancije koje imaju afinitet za DNA, i koje imaju to svojstvo u velikoj mjeri. Ako je sam faktor povezivanja supstancije koja kondenzira nukleinsku kiselinu i ako je već postgao kompaktiranje nukleinske kiseline, dovoljno za učinkovitu internalizaciju, preporučljivo je upotrijebiti supstanciju koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, koja dovodi do povećanja izražaja na temelju drugih mehanizama.

Pogodne “slobodne” supstancije koje imaju afinitet za nukleinsku ksielinu, prema izumu obuhvaćaju spojeve sposobne da sažimlju (kondenziraju) nukleinsku kiselinu i/ili da ju zaštite od nepoželjne degradacije u stanicama, osobito supstancije polikationske prirode koje su prije spomenute. Druga grupa pogodnih supstancija obuhvaća one, koje povezivanjem na nukleinsku kiselinu doprinose poboljšanju njezinog prevođenja/izražaja, poboljšanjem pristupačnosti nukleinske kiseline za mehanizam izražaja stanice. Primjer supstancije ove vrste je kromosomski ne-histonski protein HMG1, za kojeg je bilo nađeno da posjeduje kapacitet da čini DNA kompaktnom te doprinosi izražaju u stanici.

S obzirom na komplekse, kad se određuju molarni odnosi endosomolitičkog agensa i/ili internalizirajućeg faktora prema supstanciji koja ima afinitet za nukelinsku ksielinu (ili kiseline), treba imati na umu da događa kompleksiranje nukleinske kiseline (kiselina), da se stvoreni kompleksi mogu veziati na stanicu i internalizirati i da se, ili sam po sebi ili uz pomoć endosomolitičkog agensa, oslobađa iz endosoma.

Odnos internalizirajući faktor: faktor povezivanja; nukleinska kiselina ovisi osobito o veličini polikationskih molekula i o broju i raspodjeli pozitivno nabijenih grupa, čiji kriteriji odgovaraju veličini i strukturi nukleinske kiseline (kiselina) koje treba transportirati. Povoljno je da molarni odnos internalizirajućeg faktora i supstacije koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, bude u rasponu od oko 10/1 do oko 1/10.

Nakon konstrukcije i sinteze konjugata i određivanja optimalnog odnosa konjugata: DNA, za djelotvornu transfekciju, količina konjugata koja se može zamijeniti, ako se želi, slobodnom supstancijom koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, može se odrediti titracijom. Ako se koriste polikationi i kao faktori povezivanja i kao sloodna supstancija koja ima afinitet za nukelinsku ksielinu, polikationi mogu biti identični ili različiti.

Za ostvarenje izuma koji uptorebljava viralne konjugate, metoda pogodna za određivanje odnosa komponenata sadržanih u kompleksima, može se sastojati prvenstveno u određivanju konstrukcije gena kojeg treba uvesti u stanice, a zatim, kao što je gore opsano, u pronalaženju virusa ili virusne komponente pogodne za pojedinu transfekciju. Zatim se virus ili virusna komponenta povezuje sa polikationom i komleksira sa konstrukcijom gena. Polazeći od određene količine viralnog konjugata, titracije se mogu izvoditi obradom ciljanih stanica tom (konstantnom) količinom konjugata te smanjujući koncentracije DNA, ili obratno. Na taj je način određen optimalni odnos DNA: virusni konjugat. Ako se koristi dodatni internalizirajući faktor, postupak može biti izveden, na primjer, za određivanje optimalnog odnosa virusnog konjugata prema konjugatu internalizirajućeg faktora polazeći od konstantne količine DNA, titracijom.

Kompleksi se mogu prirediti mješanjem komponenata 1) nukleinske kiseline, 2) viralnog konjugata po izboru, 3) konjugata internalizirajući faktor/faktor povezivanja, te po izboru, 4) nekovalentno vezane supstancije koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu što sve može biti prisutno u obliku razrjeđenih otopina. Ako se poliaktioni koriste kao faktor povezivanja i istovremeno kao “slobodni” polikationi, obično se preporuča prije svega, prirediti smjesu konjugata sa “slobodnim” polikationima, a zatim kombinirati tu smjesu sa DNA. Optimalni odnos DNA: konjugat (i): polikationi određuje se polusima titracije tj. korištenjem u nizu pokusa transfekcije konstantne količine DNA, te povećavanjem količine konjugat/polikation smjese. Optimalni odnos konjugata prema kationima u smjesi postiže se rutinskim pokusima ili uspoređivanjem optimalnih proporcija smjesa korištenih u pokusima titracije.

DNA kompleksi se mogu pripremiti u koncentracijama fiziološke otopine soli. Druga je mogućnost da se koriste visoke koncentracije soli (oko 2 M NaCl) i zatim da se podese na fiziološke uvjete polaganim razređenjem ili dijalizom.

Najpogodniji slijed za miješanje komponenata nukleinske ksieline, konjugata, možda i nekovalentno vezane supstancije sa afinitetom za nukleinsku kiselinu, određen je prijašnjim eksperimentima. U nekim se slučajevima može pokazati preporučljivim najprije kompleksirati nukleinsku ksielinu sa konjugatom (konjugatima), a zatim dodati “slobodnu” supstanciju koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, na primjer, polikation, npr. u slučaju konjugata transferin-etidium dimera i polilizina.

U povoljnom ostvarenju izuma, internalizirajući faktor, odnosno dodatni internalizirajući faktor je transferin, a faktor povezivanja je polikation. Izraz “transferin” označava prirodne transferione kao i one modifikacije transferina koje su povezane receptorom i transportirane u stanicu.

Nukleinska se kiselina prihvaća u obliku kompleksa u kojima su konjugati internalizirajući faktor-polikation kompleksirani sa nukleinskom kiselinom. Ako je u sastavu nekovalentno vezana supstancija koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, to je oblično polikation. Taj je drugi polikation identičan ili različit od polikationa sadržanog u konjugatu ili u oba konjugata.

U slučaju “kombinacijskih kompleksa” nukleinska kiselina se internalizira u obliku kompleksa u kojima su konjugati internalizirajućeg faktora, s jedne strane, a endosomolitički konjugati, s druge strane, komleksirani sa nukleinskom ksielinom.

Konugati internalizirajućeg faktora i polikationa, koji se koriste zajedno sa slobodnim virusom ili zajedno sa viralnim konjugatima u kombinacijskim kompleksima, mogu se prirediti kemijskom metodom ili rekombinatnom metodom, ako je polikation polipetid. Metode priprve obavljene su izumom EP 388 758.

Obično su, u okviru sadašnjeg izuma, korišteni konjugati u kojima su glikoprotein, npr. transferin, i faktor povezivanja međusobno spojeni putem jednog ili više ugljikohidratnih lanaca gliko proteina.

Za razliku od konjugata priređenih konvencionalnim metodama spajanja, konjugati ove vrste su slobodni od modifikacija koje potiču upotrebljenih veznih supstancija. U slučaju glikoproteina koji imaju samo jednu ili tek nekoliko ugljikohidratnih grupa pogodnih za spajanje, npr. transferin, ove konjugati imaju i tu prednost da su točno određeni s obzirom na njihov položaj vezanja za glikoproteine/faktor povezivanja.

Pogodna metoda pripreme konjugata glikoprotein-polikation, objavljena je u njemačkoj patentnoj priajvi P 41 15 038.4; nedavno su opisali Wagner i sur., 1991b.

Količina upotrebljenog endosomolitičkog agensa i njegova koncentracija ovise o pojedinim transfekcijama koje su poduzete. Poželjno je koristiti minimalnu količinu virusa ili virusnog konjugata, koja je potrebna da se osigura intrnalizacija virusa (konjugata) i kompleksa nukleinske kiseline i da se oslobodi iz endosoma. Količina virusa se usklađuje sa pojedinom vrstom stanica, a iznad svega treba uzeti u obzir infektivnost virusa za taj tip stanica. Drugi kriterij je pojedini konjugat internalizirajućeg faktora i faktora povezivanja, osobito s obzirom na intenalizirajući faktor, za koji ciljana stanica ima specifični broj receptora. Osim toga, količina virusa (konjugata) ovisiti će o kolilini DNA koju treba unijeti. Općenito, mala količina virusa je dovoljna za stabilnu transfekciju koja zahtijeva samo malu količinu DNA, dok prolazna transfekcija, koja traži velike količine DNA, zahtjeva veliku količinu virusa. Za pojedinu primjenu izvode se testovi sa ciljanim stanicama namijenjenim za transfekciju, po mogućnosti sa miješanom populacijom stanica, a vektorski sistem predviđen za transfekciju, u svrhu određivanja optimalne koncetracije virusa titracijom, dok je upotrebljena DNA konstrukcija gena koja se uvelike slaže sa onom namijenjenom za konkretnu upotrebu, s obzirom na veličinu, te sadrži referentni gen za lakše mjerenje učinkovitosti prijenosa gena. U okviru sadašnjeg izuma pokazali su se pogodni, kao referentni geni za takve testove geniluciferaze i β-galaktosidaze.

Drugi se aspekt izuma odnosi na proces uvođenja kompleksa nukleinske kiseline, supstancije za povezivanje nukleinske kiseline i, po želji, internalizirajućeg faktora, u više eukariotične stanice. Metoda je karakterizirana time da se stanice dovode u kontakt sa agensom koji ima sposobnost da bude internaliziran u stanice, bilo sam po sebi ili kao komponenta kompleksa nukleinske ksieline, te da oslobađa sadržaje endosoma, u kojima su smješteni kompleksi nukleinske kiseline, u citoplazmi.

Općenito je najbolje da se kompleksi nukleinske ksieline i endosomolitičko sredstvo primjene zajednom no mogu se primjeniti i jedno za drugim. U slučaju odvojenih primjena, slijed primjene nije kritičan dokle god se faze izvode kratko jedna za durgom, da bi se osiguralo da će komponente biti u djelotvornom zajedničkom kontaktu.

U slučaju upotrebe slobodnog virusa u odvojenom postupku, istovremeno dodavanje pripravka slobodnog virusa sa kompleksima može biti osigurano, ako je virusni pripravak diomedija transfekcije koji sadržava kompleks nukleinske kiseline.

U slučaju istovremenog dodavanja slobodnog virusa, kompleksi nukleinske kiseline i pripravak virusa se zajedno pomiješaju prije nego što će biti dodavani.

U ponovljenom ostvarenju, endosomolitički je agens komponenta kombinacijskog kompleksa. Da bi se pojačao izražaj gena, sastavi prema ovom izumu mogu se dodavati višestrukim ponavljanjem.

U ponovljenom ostvarenju, stanice su prvenstveno tumorske stanice. U osobito povoljnom ostvarenju nukleinska je ksielina DNA koja sadrži jedan ili više nizova označenih kao imuno modulirajuća supstancija, obično citokin.

U drugom su ostvarenju stanice mioblasti, obično primarni mioblasti.

U jednom drugom ostvarenju stanice su fibroblasti, obično primani fibroblasti.

U jednom drugom ostvarenju stanice su hepatokrati, obično primarni hepatociti.

U jednom drugom ostvarenju stanice su primarne endotelialne stanice.

U drugom ostvarenju stanice su primarne značne epitelijske stanice.

Tabela 1. pokazuje transfekcije sadašnjeg izuma prikazan primjerima sa nizom različitih vrsta stanica.

Sastav izuma ispitan je i za transfekciju fibroblasta psećje hemofilije B. U tim stanicama mogu biti uspješno izražene luciferaza i β-galaktosidaza. Osim toga, sistem je korišten za odpuštanje 1.4kb pasjeg faktora IX cDNA u fibroblaste iz pasje hemofilije. U ELISA sendviču pasji se faktor IX može detektirati 24 sata nakon transfekcije.

U nekim je slučajevima preporučljivo upotrijebiti lisosomatropnu supstanciju uz endosomolitičko sredstvo, npr. ako je sredstvo konjugat endosomotiličkog peptida ili retrovirus, čije endosomolitičke aktivnosti nisu striktno ovisne o kiselom pH.

Poznato je da lizosomatropične supstancije inhibiraju aktivnost proteaza i nukleaza te stoga mogu inhibirati degradaciju nukleinskih kiselina (Luthmann i Mangusson, 1983). Ove supstancije obhvaćaju klorokin, monensin, nigericin i metilamin.

Pokazano je da monensin doprinosi povećanju u izražaju referentnog gena kad se upotreblajva Moloney retrovirus.

Prisutnost klorokina može dovesti do izražaja referentnog gena, unešenog transferinom upravljanim primjesom DNA, u gotovo 100% stanica K562. Hepatociti BNL.CL2 ili HepG2 nisu odgovarali na klorokin tako dobro kao K562 stanice, no one mogu biti transficirane do razine od 5-10% kad se iskoriste endosomotilička svojstva dodanog, za obnavljanje oštećenog ili kemijski inaktiviranog slobodnog adenovirusa.

Pomoću sadašnjeg izuma uvećane su prednosti bioloških vektora. Kao rezultat raspodjele receptora postoji tropizam i za internalizirajući faktor i za virus. Usklađujući ove dvije komponente sa pojedinom populacijom stanica, moguće je postići veću selektivnost koja je od naročite važnosti u terapeutskoj primjeni ovog izuma.

S druge strane, sadašnji se izum odnosi na farmaceutske sastave koje kao aktivnu komponentu sadrže kompleks terapeutski aktivne nukleinske kiseline, obično kao dio konstrukcije gena, endosomolitičko sredstvo (po želji konjugirano) i, možda, konjugat internalizirajućeg faktora. Može se upotrijebiti i svaki, farmaceutski prihvatljiv nosač, kao što je otopina soli ili otopina soli sa fosfatnim puferom, ili svaki takav nosač u kojem se kompleksi DNA dobro otapaju, da bi se koristio u metodi sadašnjeg izuma. Reference su objavljene u Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, Osol (ed.) (1980), u vezi sa metodama formulacije farmaceutskih sastava.

Sadašnji izum pruža prednost najveće moguće fleksibilnosti u primjeni, među ostalim kao farmaceutski sastav. Sastav izuma se može javljati kao liofilizat ili u pogodnom puferu u duboko zamrznutom stanju. Može također biti predviđen kao reagens spreman za upotrebu u otopini, obično u otopini hlađen. Po želji, komponente potrebne za transfekciju, t.j. DNA, endosomolitičko sredstvo, konjugati ili za konjugiranje spremni sa odvojenim partnerom konjugiranja, supstancija za povezivanje DNA, po želji konjugirana sa internaliziranjućim faktorom, po želji slobodni polikation, mogu biti prisutne u posebnoj puferskoj otopini, ili djelomično odvojene kao sastavni dio kompleta za transfekciju, koji je također predmet sadašnjeg izuma. U takvom kompletu za transfekciju mogu biti prisutne različite DNA kiseline, npr. koje predstavljaju za različite antigene, i/ili različiti konjugati internalizirajućeg faktora, da bi se komplet zatransfekciju mogao koristiti kao prilagodljiv sistem. Da li su konstituenti prisutni kao “za upotrebu spremni” pripravak ili zasebnom, da bi se pomiješali neposredno prije upotrebe, ovisi, bez obzira na specifičnu primjenu, o stabilnosti kompleksa, koja može bii određena rutinskim testovima stabilnosti. Kao sastavni dio kompleta koristi se, u povoljnom slučaju, transglutaminazom spojen konjugat adenovirus-polilzin, koji se je pokazao stabilnim pri uskladištenju. U drugom povoljnom ostvarenju miješaju se prije upotrebe biotinilirani adenovirusi steptavidin-polilizin. Obično uvježbani praktičar može razraditi niz različitih kompleta za transfekciju da bi se ostvarila prednost fleksibilnsoti izuma.

Za terapeutske potrebe, sastav se može primjeniti sistemično obično intravenoznim putem, kao dio farmaceutskog sastava. Ciljani organi za ovu primjenu mogu biti npr. jetra, slezena, pluća, koštana srž i tumori.

Primjer lokalne primjen je plućno tkivo (upotreba sastava prema izumu kao dio farmaceutskog sastava u tekućem obliku za ulijevanje ili kao aerosol za inhaliranje). Osim toga, farmaceutski sastavi izuma mogu se davati direktnom injekcijom u jetru, mišićno tkivo, u tumor ili lokalnom primjenom u intestinalni tract. Daljnja metoda primjene farmaceutskog sastava je davanje putem sustava žučne drenaže. Ova metoda primjene omogućava direktan pristup membranama hepatocita u žučnim vodovima, sprečavajući interakciju sastava sa sastojcima krvi.

Nedavno je prikazana mogućnsot korištenja mioblasta (nedozrelih mišićnih stanica) za prijenos gena u mišićna vlakna miševa. S obzirom da je pokazano da mioblasti izlučuju produkt gena u krv, ova metoda može imati mnogo širu primjenu nego što je obrada genetičnih oštećenja mišićnih stanica, kao što je oštećenje prisutno kod mišićne distrofije. Tako, izvedeni mioblasti mogu biti korišteni za odpuštanje proizvoda gena koji djeluju u krvi ili se putem krvi transportiraju. Eksperimenti su u sadašnjem izumu pokazali da se kulture mioblasta kao i miotuba, osobito efikasno mogu transficirati. Najuspješnija sredina za transfekciju sadržava kombinacijske komplekse biotiniliranog adenovirusa, transferin-polilizina i streptavidin-polilizina. Uz referentne gene luciferazu i β-galaktosidazu u mišićnim je stanicama izražen faktor VIII. Osim toga, upotrebljavan je pileći adenovirus CELO u kombinacijskim kompleksima, koji sadrže aglutinin pšenične klice kao dodatni internaliozirajući faktor.

Terapeutska primjena može također biti “ex vivo”, pri čemu se obrađene stanice, npr. koštne srži, hepatociti ili mioblasti, vraćaju u tijelo (npr. Ponder i sur., 1991, Dhawan i sur., 1991). Daljnja primjena ex vivo sadašnjeg izuma, odnosi se na tzv. “kancer vakcine”. Osnova ovog terapeutskog pristupa je u izolaciji tumorskih stanica iz pacijenta, te transfekciji stanica sa citokinom označenom DNA. Slijedeća faza može obuhvatiti inaktivaciju stanica, npr. ozračivanjem, na takav način da se one ne mogu više obnavljati, no još uvijek izražavaju citokin. Zatim se genetski modificirane stanice dodaju pacijentu iz kojega su bile izolirane, kao vakcina. U okolini mjesta vakcijacije izlučeni citokini aktiviraju imunski sustav, među ostalim, putem aktiviranja citotoskičnih T stanica. Ove aktivirane stanice su sposobne da izraze svoj utjecaj na drugim dijelovima tijela i da napadnu i netretirane tumorske stanice.Tako je rizik ponovnog javljanja tumora i razvoja metastaze smanjen. Pogodan način primjene kancer vakcina za gensku terapiju opisali su Rosenberg i sur., 1992. Umjesto retroviralnih vektora koje predlaže Rosenberg, može se upotrijebiti sistem prijenosa gena prema sadašnjem izumu. U pokusima sadašnjeg izuma primarne su stanice melanoma bile uspješno transficirane referentnim genom sadržanim u kombinacijskim kompleksima poliliziranom vezanih adenovirusa i transfein polilizina.

Sadašnji se izum može također koristiti u pokusima za određivanje domaćinskog imunskog odgovora na dati antigen. Takvi se pokusi osnivaju na prijenosu gena na antigenom izražene stanice.

Antigen-specifični citotoksični T limfociti (CTL) koji ubijaju inficirane stanice, igraju važnu ulogu u samoobrani protiv viralnih infekcija ili tumora. Interakcija između T-stanice i stanice predstavljene antigenom (APC) je ograničena humanim limfocitnim antigenima (HLA). Za studiranje CTL ubijanja stanica, koje izražavaju antigen u in vitro pokusu CTL ubijanja, mora se prikazati antigen na CTL u ispravnom HLA kontekstu, što obično znači na ciljanu stnicu.

Pokus CTL-uništavanja može biti izveden kako slijedi:

APC stanice se transformiraju sklopom DNA koja sadrži antigenom označen niz. Antigen epitopi će biti vezani na MHC klase I molekule i pridodane na površinu stanice kao cilj za specifični CTL odgovor. Tako će, nakon inkubacije sa uzorkom pacijentova seruma, ovisno o prisutnosti specifičnih CTL limfocita, ACP stanice biti razorene. Raspored se mjeri praćenjem odpuštanja, npr. radioaktivnog kroma koji je bio ugrađen u APV staice prije dodatka seruma.

Utvrđeni protokoli (Walkner i sur., 1989) koriste B-LCL uvedene da izraze antigen gene transfekcijom sa rekombinantnim caccinia virusima. No, stanice koje izražavaju antigen efikasno za oko jedan dan, umiru radi razarajućeg djelovanja vaccinia virusa.

Ove se poteškoće mogu predusresti pokusima CTL uništavanja uz upotrebu sistema prijenosa gena, izuma za uvođenje antigenom označenih struktura DNA, npr. struktura koje označavaju HIV ili tumorkse antigene u fibrolaste, da bi im se vratio antigenski izražaj.

Primarni se fibroblasti lako dobiju iz biopsija, lako se razviju, a pokazalo se je da se mogu transficirati sa osobito visokim učinkom (oko 50 do 70%) po sadašnjem izumu.

Takvi su pokusi korisni za identifikaciju epitopa uočenih po stanicama ubojicama, u pogledu građe vakcina. Nadalje, oni mogu biti korisno upotrebljeni u svrhu određivanja pojedinog sa HLA ograničenog imunog odgovora protiv datog antigena.

Budući da se visoka razina izražaja prenešenih gena može postići u gotovo svim stanicama, izum se može koristiti za proizvodnju rekombinantnih proteina. No, tu nema, ili ima malo ograničenja u vezi sa slijedom, odnosno molekularnom težinom prenešene DNA. Postoji također široki spekar tipova stanica koje se mogu transfektirati sa strukturama DNA sadašnjeg izuma. Prema tome, za produkciju rekombinantnih proteina može se upotreijebii gotovo svaki tip stanice, koji osigurava da je rekombinantni protein proizveden u pouzdanom i potpuno modificiranom obliku koji garantira visoku biološku aktivnost produkta.

Prijenos gena u stanice može se izvršiti kao što je pokazano za luciferazu i za interferon alfa, a gotovo svaka konstrukcija gena koja daje porast željenoj produkciji proteina, može biti prenešena. Željeni se proteinski produkt može dobiti iz transficirane stanične kulture (ili staničnog supernatanta ili odgovarajućeg staničnog homogenata, prema protokolu za pojedini proteinski produkt), 24 sata do tjedan dana, ili više, nakon transfekcije.

Primjena sistena prijenosa gena, prema sadašnjem izmu za proizvodnju rekombinantnih proteina ima slijedeće prednosti:

1) Zbog visoke učinkovitosti transfekcije (više od 90% transficiranih stanica može iskazati prenešeni gen u velikoj mjeri), nije potrebno unaprijed birati pozitivno transficirane stanice i nema potrebe za ustanovljenje stabilnih staničnih linija. Stanična kultura u malom mjerilu može biti dovoljna za proizvodnju upotrebljivih količina proteina.

2) Velike konstukcije gena se mogu prenositi uspiješno su prenešene do sada i do 48 kb.

3) Izražaj gena može se očitovati u stanicama koje obećavaju odgovarajuću obradu i modifikaciju (npr. karboksilacija faktora zgrušavanja ovisna o vitaminu K, vidi: Armentano, i sur., 1990, ili glikosilacija specifičnog tipa stanice).

4) Upotrebom ove metode omogućen je širi izbor vrsta ciljanih stanica za izražaj gena.

Nakon što je općenito opisan izum, on će biti još razumljiviji putem reference slijedećih primjera, koji su iznešeni ilustracijama, no nije im namjera da budu na bilo koji način faktor ograničenja. Svi su patenti i publikacije, koje su ovdje navedene, iznešene u cjelosti.

PRIMJERI

U Primjerima koji slijede, a koji prikazuju sadašnji izum, korišteni su slijedeći mateijali i metode (ako nije drugačije naznačeno).

Priprava kompleksa transferin-polilizin/DNA

a) Humani transferin-polilizin konjugati

Korištena je metoda opisana po Wagneru i sur., 1991b, prema kojoj je polilizin spojen na lance ugljikohidratne strane transferina. Otopina od 280 mg (3,5 µmol) humanog transferina (bez željeza, Sigma) u 6 ml matrij acetatnog pufera 30 mM, pH 5, ohladi se na 0ºC i doda se 750 µl 30mM Na-acetatnog pufera pH 5, koji sadrži 11 mg (51µmol) natrijeva perjodata. Smjesa se ostavi 90 minuta u mraku na ledenoj kupelji.

Radi uklanjanja niskomolekularnih produkata, izvedena je gel filtracija (Sephadex G-25, Pharmacia), što daje otopinu koja sadržava oko 250 mg oksidairanog transferina (mjereno ninhidrin pokusom). (Da bi se pokazao oksidirani oblik, koji sadrži aldehide i daje obojenu reakciju sa anisaldehidom, uzorci su dodani, kap po kap, na tankoslojnu ploču silika gela i osušeni, a ploče su zatim uronjene u p-anisaldehid/sumporna kiselina/etanol (1/1/18), osušene i zagrijane). Otopina modificiranog transferina dodana je brzo (unutar 10 do 15 minuta) u otopinu koja sadrži 1,5µmola fluoresceinom obilježenog poli(l)lizina prosječne dužine lanca od 190 monomera lizina, u 4,5 ml 10 mM natrijeva acetata pH 5. pH otopine se podesi na pH 7,5 dodatkom 1 M natrijum bikarbonatnog pufera. U smjesu se dodaje u razmacima od jednog sata, 4 obroka od 28,5 mg (450µmola) natrijeva cijanoborhidrida. Nakon 17 sati doda se 2 ml 5M natrijeva klorida da bi se postigla ukupna koncentracija otopine na 0,75M. Reakcijska se smjesa doda u kolonu sa kationskim izmjenjivačem (Pharmacia Mono S HR 10/10) i eluira sa gradijentom soli od 0,75M do 2,5M natrijeva klorida sa stalnim sadržajem od 25 mM HEPES, pH 7,3. Visoka koncentracija soli pri dodavanju u kolonu i u početku gradijenta, bitna je za dobivanje polikationskih konjugata. Protokom se eluira nešto transferina (oko 30%) zajedno sa slabom fluorescentnom aktivnosti. Glavni dio fluorosceinom označenog konjugata eluira se kod koncentracije soli između 1,35M i 1,9M, i hvata u tri frakcije. ove frakcije (redom kojim su eluirane) dale su nakon dvije dijalize prema 2 lit. 25M HEPES.a pH 7,3, frakciju A (TfpL190A) koja je sadržavala 45 mg (0,56 µmola) transferina, modificiranog sa 366 µmola polilizina, frakciju B (TfpL190B) koja je sadržavala 72 mg (0,90 µmola) transferina, modificiranog sa 557 µmola polilizina te frakciju C (TfpL190C), koja je sadržavala 7 mg (85 nmola) transferina, modificiranog sa 225 nmola polilizina. Ako se ne koriste odmah, konjugati se zamrznu tekućim dušikom i čuvaju kod -20ºC u obliku “bez željeza”. Prije unošenja željeza, uzorci (0,5 do 1 mg) se podese na fiziološku koncentraciju soli (150 mM) natrijevim kloridom. Željezo se unosi dodavanjem 4 µl 10mM željezo(III)citrat pufera (koji sadrži 200 mM citrata, a podešen je na pH 7,8 dodatkom natrijeva bikarbonata) po miligramu sadržaja transferina. Konjugati koji sadrže željezo, podijeljeni su u male alikvote prije upotrebe za DNA kompleksiranje, zatim su zamrznuti u tekućem dušiku ili smjesi suhog leda i etanola, te čuvani na -20ºC. (Ovaj se postupak pokazao pogodnim, no nađeno je da ponavljano otapanje i zamrzavanje uzrokuje gubitak aktivnosti konjugata.

b) Transferin-polilizin konjugati glodavaca

Slična je metoda upotrebljena kao za humani transferin, po tome što je spajanje izvedeno putem lanana ugljikohidratne strane. Konjugati od 15,5 nmola transferina glodavaca i 13 umola pL290 dobiveni su iz 4,1 mg (51 nmol) transferina glodavaca i 2,1 mg (34 nmola) pL290.

Plasmid-DNA

a) pRSVL-DNA

DNA plasmid pRSVL (koji sadržava Photinus pyralis gen luciferaze pod kontrolom Rous Sarcoma Virusa LTR Enhancer/Promoter (Uchida i sur., 1977, De Wet i sur., 1987), priređen je korištenjem Triton- x Lysis standardne metode (Maniatis), a zatim Cs/EtBr ravnotežnim centrifugiranjem gradijentom gustoće dekoloriranjem sa butanolom te dijalizom prema 10mM Tris/HC1 pH 7,5 1 mM EDTA). Za stvaranje kompleksa, uglavnom, miješa se 6 µg DNA plasmid materijala u 350 µl HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,3) sa 12 µg transferin-polilizin konjugata u 150 µl HBS, 30 minuta prije dodavanja stanicama.

b)pCMVL-DNA

Plasmid pCMVL (referentna struktura gena koja sadrži Photinus pyralis gen luciferaze pod kontrolom citomegalovirusnog promotora) pripremljen je uklanjanjem BamHI-Inserta plasmida pSTCX556 (Severne i sur., 1988), plasmid je obrađen Klenow fragmentom i HindIII/Sspl te Klenow-obrađenim fragmentom iz plasmida pRSVL, koji sadrži niz naznačen za luciferazu, te je uveden. pCMV gal opisali su MacGregor i Caskey (1989). Pripravak DNA je izrađen analogno kao pRSVL.

Proizvodnja virusnih pripravaka

a) Pripravci adenovirusa

Korišten je soj adenovirusa d1312, opisan po Jonesu i Shenku, 1979, koji ima nedostatak u Ela području. Obnavljanje virusa izvedeno je u Ela-trans-dopunjavajućoj staničnoj liniji 293, a purifikacija je u velikom mjerilu obavljena kao što su opisali Davidson i Hassell, 1987. Pročišćeni virus je spremljen u pufer (100 mM Tris, pH 8,0 100 mM, NaCl, 0,1%, BSA, 50% glicerola) ili u HBS/40% glicerola, a alikvoti su čuvani na -70ºC. Koncentracija viriona je određena UV-spektrofotometrijskom analizom ekstrahirane genomične viralne DNA

(Formula: jedna jedinica optičke gustoće, OD, A260, odgovara 1012 viralnih čestica/ml) (Chardonnet i Dales, 1970).

(b) Priprema retrovirusa

Moloney retrovirus leukemije glodavaca N2 je pakovan ekotrpskim načinom pakovanja (Keller i sur., 1985, Armentano i sur., 1987). Supernatanti virusnih izažetih stanica su sabrani, zamrznuti u tekućem dušiku i čuvani na -20ºC. Korišteni supernatanti u Primjerima, imali su titar od približno 106 cfu/ml, mjeren formiranjem kolonije otporne na neomicin sa NIH3T3 stanicama. Za pokuse virusne koncentracije, superntanti su propušteni kroz 300 kD nepropusnu membranu (FILTRON) u AMICON staničnom koncetratoru, pod tlakom dušika. Ovom se metodom normalno koncentrira 10 do 30 ml supernatanta deset puta.

Stanice i hranilišta

HeLa stanice su kultivirane u DMEM-hranilištu, kojemu je dodano 5% toplinski inkativiranog seruma telećeg fetusa (FCS), penicilina u količinama od 100 i.j./ml, streptomicina (100 ug/ml) i 2 mM glutamina. WI-38, MRC-5 i KB stanice kultivirane su u EMEM-hranilištu (Eagle-ov Modificirani Esencijalni Medij), dopunjenom sa 10% toplinski inaktiviranog FCS, antibioticima, kao što je DMEM hranilište, 10 mM ne-esencijalnih aminokiselina i 2mM glutamina. CFT1, linije epitelijalnih stanica respiratorne cistične fibroze (pripremljena je metodom opisanom po Yankaskasu i sur., 1991; CFT1 stanična linija je karakterizirana time što je homozigotična za CF-mutaciju F508 raspada) kultivirana je u F12-7x-hranilištu (Willumsen i sur., 1989). Za eksperimente prijenosa gena stanice su kultivirane u 6 cm pločama, sve dok nisu bile 50% skupljene (5 x 105 stanica). Hranilište je uklonjeno i dodan 1 ml DMEM ili EMEM/2% FCS hranilišta. Zatim su dodani konjugat-DNA kompleksi, a odmah nakon toga adenovirus d1312 (0,05 - 3,2 x 104 čestica po stanici) ili usporedljivi volumen pufera za čuvanje virusa 1 - 80 ul). Ploče su vraćene na jedan sat u inkubator (5% CO2, 37ºC), a zatim je dodano 3 ml kompletnog hranilišta. Nakon daljnjih 24 sata inkubacije stanice su sabrane radi mjerenja izražaja gena luciferaze. U slučaju CFT1, stanice su kultivirane 4 sata u F12-7X hranilištu bez humanog transfera, prije eksperimenta prijenosa gena.

Slijedeće stanične linije dobavljene su od ATCC, a mogu se dobiti pod datim brojevima kataloga. HeLa stanice: CCL 2, K562 stanice: CCL 243, HepG2 stanice: HB 8065, TIB-73-stanice: TIB 73 (BNL CL.2), NIH3T3 stanice: CRL 1658, 293 stanice: CRL 1573, KB stanice: CCL 17, Wi-38 stanice: CCL 75, MRC 5 stanice CCL171. H9 stanice su dobavljene iz AIDS Research and Reference Reagent Program, U.S. Department of Health and Human Services, Katalogu broj 87.

Primarni limfociti su dobiveni uzimanjem 25 ml krvi pupčane vrpce u epruvete koje su sadržavale EDTA. Alikvoti su preliveni sa 4,5 ml reagensa Ficoll-Hypaque (Pharmacia) te su centrifugirani 15 minuta sa 2500 rpm. Smeđi sloj između gornjeg sloja plazme i bistrog sloja Ficolla se ukloni (oko 10 ml). Doda se 40 ml IMDM sa 10% FCS, uzorak se centrifugira sa 1200 rpm 15 minuta, a stanična se peleta suspendira u 50 ml svježeg IMDM sa 10% FCS (gustoća sanica bila je oko 2 x 106 stanica/ml). Doda se 250 ul fitohemaglutinina (PHA P, DIFCO), kultura se inkubira 48 sati kod 37ºC i uz 5% CO2, doda se rekombinant IL-2 (BMB) u koncentraciji od 20 jedinica/ml. Stanice se zatim razdijele 1:3 sa IMDM/20% FCS, 2 jedinice/ml IL-2. Alikvoti stanica se zamrznu u tekućem dušiku u FCS sa 5% DMSO. Prije upotrebe stanice se razmnože u IMDM sa 20% FCS i 2 jedinice/ml IL-2.

Za daljnja istraživanja povezivanja HeLa stanice su održavane kod 4ºC u 1 ml DMEM, uz dodatak 2% FCS. Dodani su konjugat-DNA kompleksi, kao i u drugim testovima, i ploče se inhibiraju 2 h kod 4ºC. Zatim se ploče temeljito peru ledenim DMEM/2% FCS, i onda se doda 2 ml toga hranilišta. Adenovirus d1312 ili virusni pufer se zatim doda i stnice se ostave da se polako ugriju prije nego što se stave u inkubator na daljnja 24 sata. Nakon ove inkubacije stanice se pokupe i ispitaju na izražaj gena luciferaze.

Pokus luciferaze

Priprema staničnih ekstrakata, standardzacija sadržaja potebna i određivanje aktivnosti luciferaze izvodi se kao što su opisali Zenke i sur., 1990, Cotten i sur., 1990, te EP 388 758.

Primjer 1 - Određivanje učinka obrade adenovirusom na prijenos gena transferin-polilizin konjugatima.

Prije svega ispitivan je bio učinak povećanja doze virusa na sposobnost određene količine konjugat_DNA kompleksa da bi se postigao prijenos gena. Za stvaranje kompleksa pomiješa se 6µg plasmida pRSVL sa 12µg humanog transferin-polilizin konjugata (hTfpL190B). Kompleks konjugat-DNA sa različitim količinama adenovirusa d1312 (0,05 - 3,2 x 104 čestica virusa po stanici) dodavan je stanicama HeLa. Rezultati ove analize prikazani su na slici 1. Aktivnost luciferaze je izražena u jedinicama od 50µg ukupnog staničnog proteina. Prema toj analizi povećanje količina dodanog adenovirusa dovodi do povećanja prijenosa gena. Slika prikazuje prosječne vrijednosti iz 2 do 4 posebna pokusa. Razmaknute crte prikazuju standardne devijacije.

Primjer 2 - Učinak doziranja kompleksa konjugat-DNA

Logoritamska razređenja kompleksa konjugat-DNA, pripremljena kao u primjeru 1, dodana su HeLa stanicama, sa ili bez dodatka stalne doze adenovirusa d1312 (1 x 104 viralnih čestica po stanici). Aktivnost luciferaze je određena kao u primjeru 1. Rezultati su prikazani na slici 2.

Primjer 3 - Povećanje prijenosa gena uzrokovano transferin polilizinom pomoću adenovirusa, javlja se putem receptorski upravljane endocitoze.

a) Učinak adenovirusne obrade na prijenos kompeksirane DNA.

Za transfekciju su upotrebljene slijedeće komponente:

6µg pRSVL-DNA bez transferin-polilizin konjugata (DNA); 6µg pRSVL-DNA ijoš k tome 6µg nekonjugiranog polilizina 270 (DNA+pL); 6ug PRSVL-DNA sa 12 ug transferin-polilizin konjugata korištenog u prijašnjim primjerima (DNA + HTfpL190B). ovi materijali za transfekciju dodavani su HeLa stanicama sa ili bez adenovirusa d1312 (1 x 104 virusnih čestica po stanici. Priprava staničnih ekstrakata, standardizacija ukupnog proteina te određivanje aktivnosti luficeraze izvedeno je ako i u prijašnjima primjerima. Rezultati testova prikazani su slikom 3A.

b) Učinak obrade adenovirusom na prijenos receptorski vezane DNA.

Kompleksi konjugat-DNA (DNA + hTfpL190B) ili polilizin-DNA kompleksi (DNA + pL) povezani su sa HeLa, bez internalizacije, inkubiranjem kod 4ºC. Nevezani kompleks je uklonjen prije dodatka adenovirusa d1312 (d1312) (1 x 104 virusnih čestica po stanici) ili odgovarajućeg volumena pufera. Nakon toga izvedena je inkubacija kod 37ºC, da bi se omogućila internalizacija vezanih DNA kompleksa i adenovirusa. Aktivnost luciferaze određena je kao što je opisano (slika 38).

c) Učinak obrade adenovirusom na prijenos gena konjugatima transferin-polilizin.

Kompleksi konjugat-DNA koji sadrže 6 µg pRSVL-DNA i uz to 12µg transferin-polilizina (DNA +hTfpL190B) dodani su HeLa stanicama sa 104 čestica adenovirusa (d1312) po stanici ili odgovarajuća količina toplinski inaktiviranog adenovirusa d1312 (d1312 h.i.). Toplinska je inaktivacija izvedena inkubiranjem 30 minuta kod 45ºC (Defer i sur., 1990). Slika 3C pokazuje aktivnost luciferaze.

Primjer 4 - Učinak obrade adenovirusom na prijenos gena konjugatima transferin-polilizin u odabranim staničnim linijama.

Konjugat-DNA kompleksi (6 µg pRSVL + 12 µg hTfpL190B) dodani su stanicama staničnih linija CFT1, KB, HeLa, WI38 i MRC5, sa ili bez adenovirusa d1312 (1 x 104 čestica virusa po stanici). Učinkovitost prijenosa gena za različite linije stanica određena je kao i u prijašnjim primjerima pokusom luciferaze (slika 4).

Primjer 5 - Pojačanje funkcija izražaja gena luciferaze na razini prijenosa gena, a ne na razini tansaktivacije

Stanična linija označena sa K562 10/6 koja po sastavu izražava luciferazu, pripremljena je transfekcijom stanica sa plasmidom koji je sadržavao fragment gena luciferaze RSV (Apal/Pvul fragment pRSVL; De Wet i sur., 1987), kloniran u Clal položaj pUCµ Locusa (Collis i sur., 1990). ovaj je plasmid kompleksiran sa transferin-polilizin konjugatom, a K562 stanice su transferirane tim kompleksima, po metodi koju su opisali Cotten i sur., 1990. Budući da pUCµ Locus plasmid sadrži gen otporan na neomicin, moguće je odabrati ga za klonove koji izražavaju luciferazu, na osnovu otpornosti na neomicin. Za daljnje je pokuse odabran klon K562 10/6.

Alikvoti roditeljske stanične linije K562 (u 200 µl RPMI 1640 sa 2% FCS; 500.000 stanica po uzorku) obađeni su ili s 12µg TfpL plus 6µg pRSVL, ili sa 4 µg pL 90 plus 6 µg pRSVL, u 500 µl HBS u oba slučaja. Specificirane količine adenovirusa d1312 (Slika 5) ostavljene su da djeluju na stanice 1,5 sati kod 37ºC, nakon čega je dodano 2 ml RIMI i 10% FCS. Zatim se inkubacija nastavlja kod 37ºC još 24 sata i zatim se stanice pripreme

za mjerenje aktivnosti luciferaze. Nađeno je da je inkubacija sa adenovirusom dovodi do značajnog porasta aktivnosti luciferaze (Slika 5A). To se primjenjuje kako na TfpI komplekse (2000 lakih jedinica u usporedbi sa 25.000 lakih jedinica), tako na pL 90 kompleksa (0 u usporedbi sa 1,9 x 106 lakih jedinica). To pokazuje da stanična linija K562 ima sposobnost da internalizira pRSVL polilizin kompleksa i da je ta internalizacija, mjerena izražajem luciferaze, znatno povećana prisutnošću adenovirusa.

Analogni su testovi izvedeni sa K561 10/6 stanicama, koje po prirodi izražavaju RSVI gen luciferaze, a upotrebljene su slične količine adenovirusa d1312. Alikvoti od 500.000 stanica (u 200 µl RPMI sa2% FCS) inihibirani su kod 37ºC 1,5 h, sa količinama adenovirusa d1312 naznačenim u Sl. 5B. Zatim se doda, kao i u roditeljskoj staničnoj liniji, RPMI plus 10% FCS, inhibicija se nastavlja 24 sata i odredi se aktivnost luciferaze. Kao što se vidi iz slika 5B, obrada ovih stanica sa adenovirusom nije imala uočljivi utjecaj na aktivnost luciferaze. Kontrolne su vrijednosti u istom rasponu kao i vrijednosti za virusom obrađene uzorke.

Primjer 6 - Transfekcija stanica jetre sa konjugatima asialofetuin-polilizin (AFpL) ili sa konjugatima Tetra-galaktoza peptid-pL (gal 4pL) u prisutnosti adenovirusa.

a) Priprava laktosiliranog peptida

3,5 mg (1,92 umola) razgranatog peptida Lys-(N-Liz)Lys-Gly-Ser- Gly-Gly-Ser - Gly-Gly-Ser- Gly-Gly-Cys, pripremljenog Fmoc metodom korištenjem “Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer, koji sadrži ditiopiridinsku grupu za Cys, obrađivano je otopinom od 7,85 mg laktoze u 40 µl 10 mM vodene otopine natrijeva acetata pH 5, kod 37ºC. Otopini se doda 4 alikvota po 0,6 mg (10 µmola) natrijeva cijanoborhidrida, u intevalima od oko 10 sati. Nakon ukupno 64 sata doda se kod 37ºC, 0.5 ml HEPES pH 7,3 i 15 mg ditiotreitola (DTT). Frakcioniranje gel filtracijom (Sephadex G-10, 12 y 130 mm. Eluent: 20 mM NaCl) pod argonom dalo je 3,6 ml otopine laktosiliranog peptida u slobodnoj merkapto formi (1,74µmola što odgovara Ellmann-ovu testu prinos 84%). Uzorci modificiranog peptida pokazali su reakciju obojenja sa anisaldehidom, ali sa ninhidrinom nije bilo reakcije. To se slaže s pretpostavkom da su sve četiri terminalne amino grupe laktosilirane. Konjugat tetra-galaktoze peptid-polilizin prikazan je na slici 6.

b) Priprema 3-ditioiridin propionatom modificiranog polizina.

400 µl 15mM etanolne otopine SPDP (6,0 µmola) da se, uz snažno miješanje, gel-filtriranoj otopini 0,60 µmola poli-L-lizina sa prosječnom dužinom lanca od 290 monomera lizina (pL290, hidrobromid, Sigma) u 1,2 ml 100 nm HEPES Ph 7,9. Jedan sat kasnije, 500 µl 1M natrijeva acetata, pH 5, doda se nakon gel-filtracije (Sephadex G-15) sa 100 mM natrijeva acetata, otopina je sadržavala 0,56 µmola pL290 sa 5,77 µmola ditiopiridin vezane.

c) Spajanje peptida sa polilizinom.

Konjugati su pripremljeni miješanjem 1,5 µmola laktosiliranog peptida priređenog u a) u 3 ml 20mM NaCl s 0,146 µl modificiranog pL290 dobivenog iz b) u 620 µl 100mM natrij-acetatnog pufera, pod argonom. Nakon dodatka 100 µl 2M HEPES, pH 7,9, reakcijska se smjesa ostavi stajati 18 sati na sobnoj temperaturi, Dodatkom BNaCl koncentracija soli se podesi na 0,66 M i konjugati se izoliraju kromatografijom sa kationskim izmjenjivačem (Pharnacia Mono S kolona HR 5/5; gradijent eluiranja: Pufer A 50 mM HEPES pH 7,3; Pufer B: pufer A sa 3 M NaCl). Frakcije produkta su eluirane sa koncentracijom soli od oko 1,2 M - 1,8 M, a hvatane su u dvije frakcije konjugata: frakcije konjugata su nazvane ga14pL1 i ga14pL2. Dializa sa 25 mM HEPES pH 7,3 dala je frakcija konjugata ga14pL1, sa 24 nmola modificiranog pL290 i ga13pL2 sa 24,5 nmola modificiranog pL290.

d) Priprava asialofetuin konjugata

Konjugati su priređeni na istoj osnovi kao transferin konjugati. Sličnu metodu priprave asialoorosomukoid-polilizin konjugata opisali su Wu i Wu 1988.

Spajanje asialofetuina sa polilizinom izvedeno je sa bifunkcionalnim reagensom SPDP (Pharmacia). Otopina od 100 mg (2,2 µmola) asialofetuina (Sigma) u 2 ml 100mM HEPES pH 7,9 podvrgnuta je gelfiltraciji na Sephadex G-25 koloni. U 4 ml dobivene otopine dade se 330 µm 15mM etanolne otopine SPDP (5,0 µmola), uz snažno mješanje. Nakon jednog sata stajanja na sobnoj temperaturi, purifikacija se izvodi drugom gel filtracijom (Sephadex G-25); tako da se dobiva 5 ml otopine 1,4 µmola asialofetuina, modificiranog sa 2,5 µmola ditiopiridin veziva.

Konjugati se pripremaju miješanjem 1,4 µmola asialofetuina u 5 ml 100mM HEPES pH 7,9, sa 0,33 µmola modificiranog pL190 (koji sadrži 1,07 µmola merkaptopropionatnih grupa; isti je postupak korišten za pripravu transferin konjugata) u 6,5 ml 100mM HEPES pH 7,6, pod atmosferom dušika. Reakcijska se smjesa ostavi 24 sata na sobnoj temperaturi. Konjugati se izoliraju iz reakcijske smjese kromatografijom na kationskom izmjenjivaču (pharmacia Mon s-kolona HR 10/10; gradijent eluiranja, pufer A: 50mM HEPES pH 7,9; pufer B: pufer A plus 3M natrijeva klorida) i doda se natrijeva klorida toliko da se postigne konačna koncentracija 0,6 M, prije dodatka u kolonu. Frakcija produkta se eluira uz koncentraciju soli od oko 1,5 M. Dijaliza sa HBS dala je konjugate, koji su sadržavali 0,52 µmola asialofetuina modificiranog sa 0,24 µmola pL190.

e) Transfekcija HepG2 stanica sa pRSVL-DNA kompleksima.

HepG2 stanice su uzgajane u DMEM hranilištu plus 10% FCS, 100 i.j./ml penicilina, 100 µg/ml steptomicina i 2 mM glutamina, u T25 bočicama. Transfekcije su obavljene uz gustoću od 400.000 stanica po bočici. Prije transfekcije, stanice su prane sa 4 ml svježeg hranilišta koje je sadržavalo 10% FCS. Neposredno prije transfekcije doda se klorokina (Sigma) toliko da konačna koncentracija u staničnoj suspenziji (sa DNA-otopinom) bude 100 µM.

10 ug pRSVL-DNA u 330 µl HBS pomiješa se sa količinama TfpL190B konjugata, asialofetuina pL90 konjugata (AFpL), polilizina 290 (pL) ili tetra-galaktozopeptid polilizin konjugata ga14pL, specificiranim u slici 7, u 170 µl HBS. U usporednim pokusima doda se nakon 30 min. 40 µg asialofetuina (gal)4pL +Af) ili 30 µg laktosiliranog peptida ((gal)4pL + (gal)4). Smjesa se doda u stanice. Stanice se inkubiraju kod 37ºC, 4 sata, a zatim se transfektivni medij zamijeni sa 4 ml svježeg DMEM medija plus 10% FCS. Nakon 24 sata stanice se pokupe za pokus luciferaze. Vrijednosti date u slici 7 prikazuju ukupu aktivnost luciferaze transficiranih stanica. Kao što slika pokazuje, pL i TfpL pokazuju slabu aktivnost luciferaze. (gal)4pL pokazuje vrijednosti jednako visoke kao AfpL. (gal)4 ili Af se takmiče za asialoglikoproteinski receptor i, kao što se očekivalo, snizuju vrijednosti.

f) Transfekcija HepG2 stanica sa pCMVL-DNA kompleksima.

HepG2 stanice su uzgajane na 6 cm pločama, do gustoće od 300.000 stanica po ploči, kao što je opisano pod e). Prije transfekcije stanice su isprane sa 1 ml svježeg medija, koji je sadržavao 2% FCS.

6 µg pCMVL-DNA u HBS pomiješa se sa količinama TfpL10B konjugata (TfpL), asialofetuin-pL konjugata (AfpL), polilizina 290 (pLys290), (gal)4pL1 ili (gal)4pL2, kakve su specificirne u slici 8, u 170µ1 HBS. Nakon 30 minuta svakom se DNA-konjugat kompleksu doda 1 ml DMEM koji sadržava 2% FCS, i 50 µl standardne otopine adenovirusa d1312C. U paralelnim pokusima dodano je 30 µg laktosiliranog peptida (gal)4pL ((gal)4pL1 + (gal)4 ili (gal)4pL2 + (gal)4), kao što je specificiramo. Smjesa se doda stanicama. Stanice se inkubiraju 2 h kod 37ºC, a zatim se doda 1,5 ml medija koji sadržava 10% FCS. Dva sata kasnije transfekcijski se medij zamijeni sa 4 ml svježeg DMEM medija plus 10% FCS. Nakon 24 sata stanice se pokupe za pokus luciferaze. Vrijednosti u slici 8 prikazuju ukupnu aktivnost lucifera transformiranih stanica. pLys290 pokazuje učinak, (gal)4pL pokazuje jači učinak; dodatak (gal)4, koji se takmiči za asialogilikoproteinski receptor, smanjuje vrijednosti do vrijednosti dobivene za polilizin.

g) Transfekcija TIB73 stanica sa pCMVL-DNA kompleksima.

Stanice linije jetrenih stanica embrija glodavaca ATCC TIB73 (BNL CL.2; Patek i sur., 1978) uzgajane su kod 37ºC u atmosferi sa 5% Co2, u “visoko glukoznom” DMEM (0,4% glukoze), uz dodatak 10% toplinski inaktiviranog FCS, koji sadržava 100 i.j./ml penicilina, 100 µg/ml streptomicina 2 mM glutamina, u pločama od 6 cm.

Transfekcije su izvedene do gustoće stanica od 300.000 stanica po ploči. Prije transfekcije, stanice su isprane sa 1 ml svježeg medija plus 2% FCS.

6 µg pCMVL u 300 µl HBS pomiješa se sa specificiranim količinama transferin-polilizin 290 konjugata glodavaca (mTfpL), asialofetuin-pL konjugata (AFpL), polilizina 290 (pLys290), (gal)4pL1 ili (gal)4pL2, u 170 µl HBS. Nakon 30 minuta, svakom se kompleksu DNA konjugata doda 1 ml DMEM, koji sadržava 2% FCS, i 50 µl standardne otopine adenovirusa d1312. Smjesa se doda stanicama, stanice se inkubiraju 2 sata kod 37ºC, a onda se doda 1,5 ml medija koji sadržava 10% FCS. Dva sata kasnije, transfekcijski se medij zamijeni sa 4 ml svježeg medija. Nakon 24 sata stanice se pokupe za pokus luciferaze. Vrijednosti prikazane u slici 9B pokazuju ukupnu akivnost luciferaze transficiranih stanica.

Za usporedbu transfekcija je izvedena bez adenovirusa u prisutnosti klorikina. Transfekcija je obavljena uz gustoću stanica od 300 tisuća stanica po ploči. Prije transfekcije stanice su ispirane sa 1 ml svježeg medija, koji je sadržavao 2% FCS. Neposredno prije transfekcije doda se klorokina (Sigma) toliko da konačna koncentracija u suspenziji stanica (plus Dna-otopina) bude 100 µM. 6 ug pCMVL-DNAu 330 µl HBS miješa se sa specificiranim količinama mTfpL, AFpL, pLys290, (gal)4pL1 ili (gal)4pL2, u 170 µl HBS. Nakon 30 minuta daju se u stanice DNA kompleksi. Stanice se inkubiraju 2 sata kod 37ºC, a zatim se doda 1,5 ml medija koji sadržava 10% FCS, te 100 µM klorokina. Dva sata kasnije transfekcijski se medij zamijeni sa 4 ml svježeg medija. Nakon 24 sata stanice se pokupe za mjerenje luciferaze. Vrijednosti dobivene za aktivnost luciferaze prikazane su na slici 9A.

Primjer 7- Uvođenje DNA u T stanice.

a) Priprava antiCD7 polilizin190 konjugata.

Otopina od 1,3 mg antiCD7 antitijela (Immunotech) u 50 mM HEPES pH 7,9, pomiješa se sa 49 µl 1 mM etanolne otopine SPDP (Pharmacia). Jedan sat nakon stajanja na sobnoj temperaturi smjesa se filtrira kroz Sephadex G-25 gel kolonu (eluent 50 mM HEPES pufer pH 7,9), pri čemu se dobije 1,19 mg (7,5 nmola) anti CD7, modificiranog sa 33 nmola piridilditiopropionat grupa.Poli(L)lizin190, označen fluoresceinom FITC, modificiran je analogno kao i SPDP i doveden je u formu modificiranu sa slobodnim merkapto grupama, obradom sa ditiotreitolom, a zatim gel filtracijom. Otopina od 1 nmola polizina190 modificiranog sa 35 nmola merkapto grupa, u 0,2 ml 30 mM natrij acetatnog pufera, miješa se sa modificiranim antiCD7 (u0,5 ml 300 mM HEPES pH 7,9), uz isključenje kisika, i sotavi preko noći na sobnoj temperaturi. Reakcijska se smjesa podesi na sadržaj od oko 0,6 M, dodatkom 5 M otopine NacL. Izolacija konjugata izvedena je kromatografijom putem ionske izmjene (Mono S, Pharmacia, 50 mM HEPES pH 7,3 gradijent soli 0,6 M do 3 M NaCl). Nakon dijalize prema HEPES (10 mM, pH 7,3) dobiveni su odgovarajući konjugati, koji su se sastojali od 0,51 mg (3,2 nmola) antiCD7-antitijela, modificiranog sa 6,2 nmola polilizina 190.

b) Priprava gp120-polilizin190 konugata.

Spajanje je provedeno metodama poznatim iz literature, tioeterskim povezivanjem nakon modifikacije sa N-hidroksisukcinimid esterom 6-maleimidokapronske kiseline (EMCS, Sigma) (Fujiwara i sur., 1981). Tieterski vezani gp120-polilizin190 konjugati:

Otopina od 2 mg rekombinantnog gp120 u 0,45 ml 100 mM HEPES pH 7,9 pomiješa se sa 17 µl 10 mM otopine EMCS u dimetilformamidu. Nakon jednog sata kod sobne temperature, provede se filtracija kroz Sephadex G-25 gel kolonu (eluent 100 mM HEPES-pufer 7,9). Dobivena otopina (1,2 ml) odmah reagira, uz isključenje kisika, s otopinom od 9,3 nmola polilizina 190, označenog fluoresceinom i modificiranog sa 30 nmola merkapto grupa (u 90 µl 30 mM natrijeva acetata pH 5,0), te se ostavi preko noći na sobnoj temperaturi. Reakcijska se smjesa podesi na sadržaj od oko 0,6 M dodatkom 5 M NaCl. Konjugati se izoliraju kromatografijom ionske izmjene (Mono S, Pharmacia 50 mM HEPES pH 7,3, gradijent soli 0,6 M do 3 M NaCl). Nakon frakcioniranja i dijalize prema 25 mM HEPES pH 7,3, dobivene su 3 frakcije konjugata A, B i C, koje su se sastojale od: 0,40 mg rgp120 modificiranog sa 1,9 nmola polilizina 190 (u slučaju frakcije A), ili 0,25 mg rpg120 modificiranog sa 2,5 nmola polilizina 190 (frakcija B), ili 0,1 mg rgp120 modificirano sa 1,6 nmola polilizina 190 (frakcija C).

pCMVL-DNA (6 µg/uzorak) kompleksirani su sa specificiranim količinama polilizina90 ili specificiranim polilizin konjugatima u 500 ul HBS. Istovremeno priređeni su alikvoti od H9 stanice (106 stanica u 5 ml RPMI sa 2% FCS) ili primarnih humanih limfocita (3 x 106 stanica u Dulbeccovom mediju, modificirano po Iscove-u (IMDM) sa 2% FCS). Svakom uzorku stanica dodani su polilizin-DNA kompleksi. Nakon 5 minuta je specificirana količina adenovirusa d1312. Stanice su zatim inkubirane 1,5 h kod 37ºC, a onda se u svaki uzorak doda 15 ml RPMI (u slijaču H9 stanica) ili IMDM (u slučaju primarnih limfocita) plus 20% FCS. Stanice se inkubiraju 24 sata kod 37ºC, pokupe se u obradu kao u drugim primjerima za određivanje aktivnosti luciferaze. Rezultati izvedenih testova dati su u slici 10A (H9 stanice) i slici 10B (primarni limfociti): u H9 stanicama antiCD7 konjugat (sl. 10A stupac 7 do 9) i gp120 konjugat (sl. 10A, stupci 10 do 12) pokazali su najbolje rezultate, s obzirom na prijenos gena, postignute sa adenovirusom, dok je gp120 konjugat postigao jasniji izražaj gena luciferaze čak i udsutnosti adenovirusa. Vrijedno je zapaziti da je u izvedenim testovima, samo gp120 konjugat imao sposobnost da uvede DNA u primarne limfocite, i to samo u pristnosti oštećenog adenovirusa (Slika 10B, stupci 7 i 8).

Primjer 8 - Inaktivacija adenovirusa

a) UV inaktivacija

Pripravak adenovirusa d1312, priređen i pohranjen kao što je opisano u uvodnom dijelu Primejra, stavi se u udubljenje, promjera 2 cm, ploče za stanične kulture (300 ul po udubini) na ledu, udaljenje 8 cm od dvije UV lampe (Philips TUV15, G15 T8). Virus je izložen UV zračenju u vremenima specificiranim u slici 11A, i alikvoti svakog pripravka su ispitivani na njihov virusni titar, da bi se odredilo da li su, i u kojoj mjeru su sposobni pojačati prijenos gena sa polilizin-transferin konjugatima u HeLa sanicama.

Kultiviranje stanica i transfekcija izvedena je uglavnom kao što je upisano gore od “stnice i hranilišta”. Komponente upotrebljene za transfekciju prikazane su na slici 11A. Kompleksi pCMVL i 12 µg TfpL priređeni su u 500 ul HBS i dodani su 3x105 HeLa stanicama (u 1 ml DMEM plus 2% FCS. Oko 5 minuta kasnije, svakoj se kulturi doda 54 µl svakog virusnog prirpavka i kultura se inkubira kod 37ºC 1,5 do 2 sata. Zatim se 5 ml alikvot DMEM plus 10% FCS doda svakoj kulturi, inkubacija se nastavlja kod 37ºC za 24 sata i kulture se pokupe i ispituju na aktivnost luciferaze. Količina od 54 ul ne-ozračenog virusa nije u okviru zasićenja, t.j. test je osjetljiv na količinu virusa koja je barem tri puta veća. Rezultati dobiveni za izražaj luciferaze prikazani su na slici 11B (iscrtkani pravokutnici). Virusni titar svakog pripravka određen je uporabom “Ela dopunske stanične linije 293”. Serijska razrjeđenja ne-označenih i označenih uzoraka virusa priređeni su u DMEM plus 2% FCS. Usporedo s tim, priređeni su uzorci od 5x104 293 stanica (u udubljenja od 2 cm) u 200 µl DMEM plus 2% FCS. U svaku je udubinu stavljen alikvot od 5 µl svakog razrjeđenja. Da bi se omogućilo da se virus veže na stanice, izvedena je inkubacija od 37ºC 1,5 h, a zatim je u svaku udubinu dodano 2 ml DMEM plus 10% FCS. Nakon 48 sati kulture se ispitaju da bi se odredio citopatski utjecaj. Gornje virusno razrjeđenje, u kojem manje od 50% stanica u kulturi pokazuje značajni citopatski učinak nakon 48 sati, ukazuje na relativnu količinu infektivnog virusa u svakom virusnom pripravku. Dobiveni rezultati su prikazani na slici 11B (prazni pravokutnici). Rezultati testova izvedenih u ovom primjeru, pokazuju da je smanjenje za 4 log u tiru virusa, kao rezultat UV zračenja, povezano sa samo dvadeseterostrukim smanjenjem prijenosa gena luciferaze. To pokazuje da mehanizmi, koji su presudni za infektivnost virusa, mogu biti uništeni bez utjecaja na sposobnost virusa da pojača prijenos gena.

Zapaženo je da pri niskim dozama virusa, povećanje prijenosa gena, prouzrokovano virusom, ponešto opada (Slika 11A, stupci 3 do 6) i da je taj učinak značajniji kod viših doza (stupci 7 do 10).

b) Inaktivacija adenovirusa formaldehidom.

2 ml pripravka adenovirusa propušta se kroz 10 ml G25 kolonu (Pharmacia Sephadex G 25, PD10), priređenu sa 150 mM NaCl, 25 mM HEPES pH 7,9 10% glicerola i dovedenu do volumena od 2,5 ml. Alikvoti gel-filtriranog virusnog pripravka inkubirani su 20 sati na ledu, bez formaldehida (O), sa 0,01%, 0,1% ili 1% formaldehida. Zatim se doda tris pH 7,4 da se dobije koncentracija od 100 mM, a onda se uzorci dijaliziraju, naprije prema 1 litri 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,4 i 50% glicerola, a zatim, preko noći, prema 2 x 1 lit 150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,9 i 50% glicerola.

Alikvoti virusa su zatim ispitivani na njihov titar na 293 stanice (pokus CPE završne točke, ili “plaque” pokus, Precious i Russel, 1985). Zatim je određivan utjecaj formaldehidom obrađenih virusa na prijenos gena, u HeLa stanicama (300.000), kao i u prijašnjim primjerima, mjerenjem aktivnosti luciferaze. 90 ul virusnog pripravka dovelo je do prijenosa DNA, koji je odgovarao kao više od 108 lakih jedinica. Obrada virusa sa 0,01% ili sa 0,1% formaldehida rezultirala je slabim smanjenjem aktivnosti prijenosa gena (približno deterostruko smanjenje kod 0,1%). Premda obrada sa 1% formaldehida uzrokuje upadljiv gubitak aktivnosti prijenosa gena, 90 µl virusa je još bilo dovoljno da proizvede izražaj gena koji odgovaraju 104 lakih jedinica.

Pri obradi sa 0,1% formaldehida redukcija virusnog titra na 105 PFU (jedinice koje formiraju “plaque”) bila je povezana sa smanjenjem aktivnosti luciferaze za samo 10%. Rezultati testa su prikazani na slici 12A.

c) Inaktivacija adenovirusa sa dugovalnim UV zračenjem + 8-metoksi psoralenom.

Alikvoti pročišćenog virusa su podešeni na 0,33 µg/µl sa 8-metoksi psoralenom (standardna je koncentracija 33 µg/µl 8-metoksi psoralena otopljenog u DSMO) te su izloženi izvoru UV zračenja valne dužine 365 nm (UVP model TL-33), na ledu, u udaljenosti od 4 cm od filtera lampe. Izlaganje UV svjetlu trajalo je 15-30 minuta, kako to pokazuje legenda slike. Virusni su uzorci zatim propušteni kroz Sephadex G-25 kolonu (Pharnacia, PD-10), pripremljeni sa HBS + 40% glicerola te su čuvani na -70ºC.

Virusni su pripravci testirani ili na njihovu aktivnost u povećanju odpuštanja pCMVL/hTfpL konjugata u HeLa stanice (kao što je očito po rezultatitma lakih jedinica aktivnosti luciferaze, slika 12B, desna ordinata) ili na sposobnost obnavljanja u 293 stanice (viralni titar, lijeva ordinata slike 12B).

U primjerima koji slijede, a koji pokazuju povećanje internalizacije transferin-polilizin-DNA kompleksa pomoću retrovirusa, upotreljene su slijedeće metode i materijali:

Transferin-polilizin190 konjugati i konjugat-DNA kompleksi priređeni su jednako kao u prethodnim primjerima. NIH3T3 stanice su uzgajane na DMEM mediju, uz dodatak 10% FCS, 100 i.j. penicilina, 100 µg(ml streptomicina i 2 mM glutamina. Za transfekciju je 5 do 7x105 stanica po T25 izdvajano iz ploče 18 do 24 sata prije transfekcije. Neposredno prije trnsfekcije, stanice su stavljene na svježi medij te su dodavane razne komponente korištene za transfekciju, slijedećim redom: klorokin (100 uM, gdje je navedeno), polilizin-transferin-DNA kompleks i pripravak retovirusa. Stanice su zatim inkubirane 4 sata kod 37ºC, medij je promijenjen i stanice su nakon 24 sata pokupljene. Ekstrakti su pripremljeni u tri ciklusa zamrzavanje-topljenje. Alikvoti ekstrakta, standardizirani na sadržaj proteina, ispitani su na aktivnost luciferaze, kao što je navedeno u prethodnim primjerima.

Primjer 9 - Transfekcija NIH 3T3 stanice sa Moloney virusom.

Pod uvjetima koji su navedeni, transfekcije 106 NIH3T3 stanica izvedene su sa TfpL-DNA kompleksima u prisutnosti 100 µM klorokina, ili bez klorokina, kao što pokazuje slika 13. Nađeno je da bez klorokina vrijednosti za aktivnost luciferaze dostižu jedva osnovnu razunu (stupac 1), dok je u prisutnosti klorokina izmjeren visoki izražaj pRSVL referentnog gena (stupac 2). Povećane količine Maloneyvirusa leukemije (na slici označenog sa RVS), koje su dodavane stanicama istovremeno sa DNA kompleksima, bile su u stanju da povećaju još više izražaj gena luciferaze.

Primjer 10 - Istraživanja da li utjecaj prijenosa gena u transfekciji NIH3T3 stanica sa transferin-polilizin DNA kompleksima, može biti pripisan Moloney virusu.

Virusni pripravak korišten u Primjeru 9, bio je sirov, nefrakcioniran supernatant stanica koje izražavaju retrovirus. Sa ciljem da se dobije uvid da porast u prijenosu DNA, postignut sa tim virusnim pripravkom, može doista biti pripisan virusu, supernatant je podvrgnut purifikaciji dijalizom/koncentriranjem opisanom gore, s da je retrovirusni supernatant (prikazan kao RVS na crtežu) koncentriran faktorom 10. Ako je retrovirus odgovoran za porast, aktivnost zadržana membranom morala bi, bez obzira na bilo kakvu inaktivaciju ekstremno nestabilnog retrovirusa tijekom faze koncentriranja, biti približno 10 puta veća od polaznog supernatanta. Kao i u prijašnjem primjeru, 106NIH3T3 stanica je bilo transficirano pod uvjetima datim na slici 14. Slika 14 pokazuje da je rastući utjecaj na prijenos gena prisutan u retentatu membrane (20 do 600 ul je upotrebljeno, stupci 3-6). Također je nađeno da je 200 do 600 ul deseterostrukog koncentrata pripravka za oko polovine manje aktivno, nego 2 do 6 ml originalnog, nekoncentriranog pripravka retrovirusa (stupci 7 i 8). Paralelni su testovi izvedeni sa humanim stanicama K562, koje nemaju receptora za ekotropne retroviruse glodavaca. Kao što je bilo očekivano, tu nije bilo porasta u izražaju gena.

Primjer 11 - Interakcije između transferina i njegova receptora igraju ulogu u utjecaju Moloney virusa na prijenos gena.

Radi isključivanja mogućnosti da se prijenos TfpL/pRSVL kompleksa u stanici može pripisati nespecifičnom povezivanju polilizina sa retrovirusom, i sa ciljem da se objasni mehanizam ulaza detaljnije, ispitana je sposobnost retrovirusa da transportira plasmid DNA, kompleksiran samo sa polilizinom, u stanicu. Količina potrebnog polilizina odgovara optimumu količine određene ranije, koja doprinosi ukupnoj kondenzaciji plasmidne DNA, a slična je količini polilizina potrebnog za polilizin-transferin konjugat (Wagner sur., 1991). Testovi, čiji su rezultati prikazani na slici 15, pokazali su da referentni gen, u odsutnosti klorokina, nije izražen niti u formi kompleksa TfpL-pRSVL, niti u formi pL-pRSVL kompleksa (stupci 1 i 2). U prisutnosti retrovirusa, s druge strane, referentna DNA, primijenjena kao TfpL kompleks, bila je izražena, ali ne u obliku pL-DNA kompleksa (vidi stupce 3 i 4 zajedno sa stupcima 5 i 6). Osim toga, izvedeni su testovi pokazali su da je prisutnost viška slobodnog transferina rezultirala smanjenjem prijenosa DNA, olakšanog retrovirusom (stupci 7 i 8). Ovi su rezultati potvrda predpostavke da interakcija između transferina i njegova receptora igra bitnu ulogu u povećanju prihvaćanja DNA, na koji utječe retrovirus.

Primjer 12 - Utjecaj pH na učinak retrovirusa na prijenos gena.

Izvedeni pokusi u ovom primjeru, obavljeni su sa ciljem da se ispita utjecaj pH na sposobnost retrovirusa da pojačaju prijenos gena. Eksperimenti transfekcije su izvedeni kao u prethodnim primjerima. Upotrebljena su dva dobro ocijenjena inhibitora endosomne pH redukcije monensin i amonijev klorid. Rezultati pokusa prikazani su na slici 16. Ispitivan je utjecaj ovih dviju supstancija na TfpL-DNA prijenos i nađeno je da nijedna od njih ne može dolično zamijeniti klorokin. Međutim, nađeno je da više koncentracija amonijeva klorida ponešto povećavaju izražaj gena luciferaze (stupci 1 do 5). Sam retrovirus pokazuje neznatno povećanje prijenosa DNA, prema zapaženom u prijašnjim primjerima (stupac 6). Nagli je porast zapažen kad je retrovirus upotrebljen u prisutnosti 1 uM monensina (stupac 7). Manji je učinak zapažen kod više koncentracija monensine (stupac 8) i u prisutnosti amonijeva klorida (stupci 9 i 10).

Primjer 13 - porast prijenosa gena postignut transferin konjugatima pomoću N-terminalnog endosomolitičkog peptida hemaglutinina influence HA2.

a)Sinteza peptida

Peptid niza (SEQ ID NO:1) Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys, sintetiziran je metodom Fmoc (fluorenylmetoksikarbonil) (Atherton i sur., 1979), uz upotrebu Applied “Biosystems 431A Peptide Synthesizer”-a. Zaštitne grupe postranog lanca bile su t-butil za Cys, Glu i Asp i tritil za Asn. Nakon reakcije spajanja izveden je ninhidrin test, koji je pokazao razinu spajanja veću od 98% za svaku fazu. Dvostruka su spajanja izvedena počevši od aminokiseline 19. N-terminalna Fmoc grupa je uklonjena iz dijela peptidne smole sa 20% piperidinom u NMP (N-metilpiperidinu). Zatim su frakcije Fmoc, zaštićene i nezaštićene, isprane sa DCM (diklormetanom) te osušene pod visokim vakuumom. Prinosi su bili 294 mg F-moc-slobodne peptidne smole i 367 mg F-moc-zaštićene peptidne smole. Količina od 111 mg Fmoc-slobodne peptidne smole podvrgnuta je cijepanju trifluoroctenom kiselinom, u vremenu do 1,5 h, pomoću smjese od 10 ml TFA, 0,75 g fenola, 300 µl EDT (etanditiola), 250 µl Et-S-Me (etilmetilsulfida) i 500 µl vode. Peptid se filtrira iz smole kroz stakleni sinter filtar. Smola se ispere sa DCM i doda filtratu. Filtrat se koncentrira do oko 2 ml i zatim se doda, kap po kap, u 40 ml etera, uz miješanje. Peptidni se talog ukloni centrifugiranjem, a eterski se supernatant odbaci. Talog se pere tri puta sa 40 ml etera i suši u visokom vakuumu. 58 mg dobivenog sirovog produkta se otopi u 3,5 ml 20 mM NH4HCO3, u kojem je sadržano 300 µl 25% NH3/1. Otopina se gel-filtrira upotrijebivši isti pufer na prethodno punjenoj Sephadex G-25 koloni (Pharmacia PD-10). Sav je materijal stavljen na Mono Q kolonu (Pharmacia); gradijent: C10 min 100% A, 10-100 min 0-100% B. A: 20 mM NH4HCO3 + 300 ul NH3/1. B: A + 3 M NaCl. Mjereno kod 280 nm, Trp-fluorescencija detektirana kod 354 nm. Brzina protoka: 1 ml/min. Produkt je eluiran sa 1 M NaCl. Glavna frakcija Mono Q kolone je dalje pročišćavana reverznom faznom HPLC (visokotlačnom tekućinskom kromatografijom) sa kolonom BIORAD-HI-Pore RP-304 (250x10 mm); gradijent 50 do 100% pufera B u 12,5 min, 12,5 do 25 min 100% B; A: 20mM NH4HCO3 + 300 µl NH3/1, B: A u 98% metanolu. Brzina protoka: 3 ml/min. Mjereno kod 237 nm. Produkt je eluiran do 100% B. Frakcije produkta su odparene na Speedovac isparivaču, ponovno otopljene u puferu A te konačno liofilizirane. Dobiven je prinos od 8,4 mg HPLC-pročišćenog produkta u obliku zaštićenom cisteinom. Ovaj je peptid označen sa P16. U svrhu dobivanja P16 u slobodnoj merkapto formi, t-butilom zaštićena supstancija se obrađuje 30 minuta kod sobne temperature sa tioanisol/etanditiol/trifluoroctena kiselina/trifluorometansulfonska kiselina (2/1/40/3). Trifluorometansulfonska kiselina je dodana u navedenoj proporciji, nakon drugih komponenata. Peptid je izoliran taloženjem sa eterom i zatim gel filtracijom (Sephadex G-25) uz upotrebu gore spomenutog pufera A, pod atmosferom argona.

b) Spajanje peptida influence na polilizin

b1) Direktno povezivanje putem SPDP (sunkcinimidilpiridilditiopropionata)

19,8 mg polilizin 300 hidrobromida (Sigma) gel-filtrira se na Sephadex G-25 koloni (Pharmacia PD-10) u natrijevom accetatu pH 5, da bi se eliminirale niskomolekularne frakcije. Na osnovi ninhidrin testa, koncentracija pL nakon gel filtracije, bila je 3,16 mg/ml. pH vrijednost otopine se podesi na 7-8 sa 1M maOH. 0,64 µmola SPDP (Pharmacia: 40 mM otopine u apsolutnom etanolu) doda se u 2,5 mlpL otopine (7,5 mg pL = 0,13 µmola). To odgovara molarnom odnosu SPDP naprama pL od 5:1. Smjesa se ostavi da reagira preko noći te se gel-filtrira u 20 mM NH4HCO3 pH 8,2, na G-25 koloni. Nakon redukcije 1 alikvota filtrata sa DTT (ditiotreitolom), mjerenje tiopiridona je pokazalo da je reakcija dovršena.

0,3 µmola pL modificiranog sa PDP (na bazi umola PDP) u 2,2 ml, ostavi se da reagira sa 0,35 µmola peptida u tiol formi. Bijeli talog koji se javlja kad se peptid i pL pomiješa, otopi se podešavanjem otopine na 2 M gvanidinium hidroklorid, s tim da reakcija teče preko noći. Fotometrijsko mjerenje tiopiridona u reakcijskoj smjesi ponovo potvrđuje da je reakcija dovršena. Smjesa se zatim dijalizira dva puta prema 2 litre 20 mM HEPES/0,5 M gvanidinuim hidroklorida. Dobivena se otopina doda u Mono S kolonu (0,7 x 6 cm, Pharmacia) (gradijent: 0 do 20 min 100% A, 20 do 140 min 0-100% B. A: 20 mM HEPES pH 7,3/0,5 M gvanidinium hidroklorida, B: 20 mM HEPES pH 7,3/3 M gvavndinium hidroklorida, 0,3 ml/min. Detekcija kod 280 nm, a fluorescentna detekcija kod 354 nm, ekscitacija kod 280 nm). Frakcija produkta, koja je eluirana sa 1,5 M gvanidinium hidrokloridom, dijalizirana je prema 2 litre HBS. Nakon toga, određivanje koncentracije pL, minhidrin testom, pokazalo je koncentraciju od oko 1,14 ml/ml. Količina peptida u otopini konjugata izračunata je iz njegove apsorpcije kod 280 nm; to je dalo molarni odnos peptida prema pL od 4:1.

b2) Povezivanje putem polietilenglikolne veze.

14,6 mg pL 300 hidrobromida (Sigma) gel-filtrirano je što je opisano u b1). Prema ninhidrin testu, koncentacija pL nakon gel filtracije, bila je 4,93 mg/ml. pH-vrijednost otopine podešena je na 7 do 8 sa 1 M NaOH. U 2,7 ml pL otopine (13,3 mg pL = o,22 µmola) doda se 4,33 µmola PDP (Pharmacia; 30 mM otopina u apsolutnom etanolu). To odgovara molarnom odnosu PDP:pL od 20:1. Nakon 1,5 h reakcijska se smjesa filtrira u Sephadex G-25 koloni u 0,1 M otopini natrijeva acetata/3M gvanidinium hidroklorida. Nakon redukcije jednog alikvota filtrata sa DTT, odredi se tiopiridon, čime je pokazano da frakcija produkta sadržava 3,62 µmola PDP. Sa PDP modificiran pL reduciran je dodatkom 79 mg DTT. Nakon 2 sata redukcija otopina se ponovno filtrira na G-25, pod specificiranim uvjetima. Test na tiol po Ellamanu pokazao je koncentraciju tiola od 3,15 µmola u 2,224 ml.

U 500 µl 20 mM NaHCO3/3 M gvanidinium hidroklorida otopi se 17,6 mg = 5 µmola POE (polioksietilen-bis(6-aminoheksil), Sigma) i regira sa 13,8 mg EMCS (N-hidroksisukcinimid ester -meleimidokapronske kiseline, Sigma) = 44, 7 µmola, otopljenog u dimetilformamidu, 300 ul. Nakon 30 minuta otopina se gel-filtrira na G-25 (20 mM NaHCO3/3 M gvanidinium hidroklorid). Fotometrijsko je mjerenje, kod 300 nm, pokazalo koncentraciju od 6,36 µmola reagiranog EMCS u 2 ml otopine.

1,39 umola peptida u formi tiola (u 2, ml 20 mM NaHCO3/3 M gvanidinium hidroklorida) doda se, kap po kap, u 1,05 ml ove otopine (što odgovara 3,34 µmola EMCS) uz intenzivno miješanje smjese, u struji argona. Nakon 15 minuta nije se moglo Ellmanovim testom ustanoviti prisutnost slobodnih tiolnih grupa. Otopina reduciranog, merkaptomodificiranog pL podesi se na pH 7-8 dodatkom 1 M NaOH. 1,37 ml ove otopine doda se u gornju reakcijsku smjesu uz intenzivno miješanje izvedeno pomoću Vortex mješalice. To je dalo molarni odnos peptid-SH: POE-EMCS:pL-SH od 1:2, 4:1,4 (na bazi EMCS i SH). Nakon 2,5 h reakcije, nije se više moglo Ellmanovim testom dokazati prisutnost tiolnih grupa. Materijal je dijaliziran preko noći prema 2 litre 20 mM HEPES pH 7,3/0,6 M NaCl, a zatim je dodan u Mono S kolonu (gradijent: O do 20 min 22%A, 20-150 min 22-100% B. A: 20 mM HEPES pH 7,3, B: A + 3 M NaCl. Brzina protoka 0,3 ml/min. UV mjerenja su vršena kod 280 nm te mjerenja fluorescencije kod 354 nm). Produkt koji je eluiran sa 1,5 - 1,6 M NaCl, dijaliziran je prema 2 litre HBS. Mjerenje koncentracije pL pomoću minhidrin testa te fotomaterijsko određivanje koncentracije peptida, kod 280 nm, dalo je izračunati pL odnos od 12:1, uz koncentraciju pL od 0,49 mg/ml u ukupnom volumenu od 4,5 ml.

c) Priprava liposoma

Liposomi su priređeni metodom REV (reverznim faznim odparavanjem) (Szoka i Papahađopoulos, 1978; Straubinger i Papahađopoulos, 1983): vodena faza 10 mM HEPES pH 7,3; 100 mM kalceina/150 mM NaCl; organska faza: otopina od 300 umola L-α-lecitina (iz žumanjca jajeta, uglavnom palmitoiloleoilfosfatidilholin; Avanti Polar Lipidi) u 260 ul kloroforma ispari se na rotirajućem isparivaču. Materijal se zatim suši u visokom vakuumu te ponovno otopi u 3 ml dietiletera. 1 ml vodene faze se dobro ispere eterskom fazom pomoću Vortex mješalice, a zatim se obradi ultrazvukom, 5 min kod 0ºC, (u “sonikatoru” tipa kupelji). Nakon 30 minuta na ledu, materijal se ponovno tretira ultrazvukom daljnjih 10 minuta. Dobivena stabilna emulzija se polako otpari na rotacionom isparivaču. Nakon što je dietileter uklonjen kod 100 mbara, doda se 0,75 ml vodene faze. Preostali tragovi dietil etera se uklone daljnjim odparavanjem kod 50 mbara, 30 minuta. Dobiveni je pripravak centrifugiran sa 500 rpm. Od toga je 1 ml istisnut kroz “nucleopore” polikarbonatnu membranu (0,1 um), te je dobiven konačni volumen od 0,7 ml otopine liposoma. Liposomi su odjeljeni od nepripadajućeg materijala gel filtracijom (Sephadex G-50, Pharmacia; 23 ml gel volumen, 10 mM HEPES pH 7,3/150 mM NaCl). Skupljeno je 6 frakcija od 500 ul. Lipidni je fosfor određen metodom Bartlet-a, 1959, sa 2 mM.

d) Pokus propuštanja liposoma

Oslobađanje sadržaja liposoma (propuštanje) mjereno je pomoću izlaza uključenog kalceina i rezultirajućeg razrjeđenja, koje zaustavlja gašenje fluorescencije (Bondeson i sur., 1984). Fluorescencija kalceina je mjerena KONTRON SMF 25 spektralnim fluorometrom (pobuđivanje kod 490 nm, emisija kod 515 nm). U tu su svrhu alikoti otopine liposoma razrjeđeni 100 puta sa 0,1 M natrijevim acetatom/50 mM NaCl ili 10 mM HEPES/150 mM NaCl puferom odgovarajuće pH vrijednosti (4,3, 4,5, 5,0, 6,0, 7,3), da bi se postigla vrijednost do 1 ml. Otopinama je dodano 2,5 µl peptida (t-butilom zaštićenog oblika; 1 µg/µl otopine u HBS), u kivete, uz blagu struju argona (Konačna koncentracija 400 nM peptida). Fluorescencija kaceina je mjerena u različitim vremenskim razmacima nakon dodatka peptida. Vrijednosti za 100% propuštanje u određene dodatkom 2 µl Tritona X-100 (Fluka).

Isti je postupak korišten za mjerenje fluorescencije kalceina nakon dodatka peptid-pL konjugata u otopinu liposoma. 2,5 µg konjugata (1 µg/µl koncentracija na bazi samog pL) doda se u 1 ml otopine liposoma (konačna koncentracija 20 nM modificiranog peptida). Slično, 2,5 µg peptid-polilizin konjugata je podvrgnuto pokusu propuštanja, nakon inkubacije sa 4 µg DNA (15 minuta).

Nađeno je da peptid uzrokuje oslobađanje liposoma samo u kiselom području (slika 17). Peptidni je konjugat bio aktivan kod bitno niže pH vrijednosti, dok je čak i kod neutralnog pH nađena jaka aktivnost, koja je dalje rasla s opadanjem pH vrijednosti. Kompleksiranje konjugata sa DNA eliminaralo je aktivnost kod neutralnog pH, dok je kod kiselih pH vrijednosti postojala znatna aktivnost.

e) Transfekcija K562 stanica

K562-stanice su uzgajane u suspenziji na RPMI 1640 mediju (Gibco BRL plus 2 g natrijeva bikarobnata/1) plus 10% FCS, 100 i.j. po ml penicilina, 100 µg/ml streptomicina i 2mM glutamina, do gustoće od 500.000 stanica/ml. 12 do 15 sati prije transfekcije, stanice su stavljene u svježi medij koji je sadržavao 50 µM desferioksamina (ova je mjera poduzeta da bi se povećao broj receptora transferina). Na dan transfekcije, stanice su skupljene, suspendirane u svježem mediju, koji je sadržavao 10% FCS plus 50 µM desferioksamina (250.000 stanica po ml) i 2 ml obroci su smješteni na ploču sa 24 udubljenja.

6 µg pCMVL-DNA u 160 µl HBS pomiješa se sa količinama tFpL konjugata specificiranim na slici 18. ili sa pL300 u 160 ul HBS, zatim nakon 15 minuta se dodaju navedene količine peptid-pL-konjugata influence (P16pL), a nakon daljnjih 15 minuta smjesa se doda stanicama K562. Stanice se inkubiraju 24 sata kod 37ºC i zatim skupe za test luciferaze. Aktivnost luciferaze je određena kao što je navedeno u ranijim primjerima. Vrijednosti date u slici 18 predstavljaju ukupnu aktivnost luciferaze transficiranih stanica.

f) Transfekcija HeLa stanica

HeLa stanice su kultivirane u posudicama od 6 cm, kao što je opisano pod “stanice i hranilišta”. Transfekcije su izvedene kod gustoće od 300.000 stanica po ploči. Prije fransfekcije stanice su inkubirane sa 1 ml svježeg medija, koji je sadržavao 2% FCS. 6 ug pCMVL-DNA u 160 ml HBS pomiješa se sa količinama TfpL konjugata specificiranim na slici 19, ili sa pL300 ili sa smjesom jednog i drugog u 160 µl HBS. Nakon 15 minuta dodaju se naznačene količine peptid-pL-konjugata influence (p16pL) te nakon daljnjih 15 minuta, smjesa se doda stanicama. Stanice se inkubiraju 2 sata kod 37ºC, zatim se doda 2,5 ml svježeg medija uz dodatak 10% FCS. Stanice se inkubiraju 24 sata kod 37ºC i zatim se skupe za pokus luciferaze. Aktivnost luciferaze se odredi kao što je opisano u prethodnim primjerima. Vrijednosti date na slici predstavljaju ukupnu aktivnost luciferaze fransficiranih stanica.

Primjer 14 - Pojačanje prijenosa gena postignuto konjugatima transferina, pomoću drugog N-terminalnog endosomolitičkog peptida hemaglutinina influence HA2

a) Sinteza peptid influence - polilizin konjugata

Peptid niza (SEQ ID MO:2) Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Ile-Ala-Gyl-Phe-Ile-Gli-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Cys (označen P41), sintetiziran je na isti način kao i peptid opisan u primjeru 13,a). Spajanje peptida influence sa polilizinom (pL300) izvršeno je kao i u primjeru 13, b1), vezanjem putem SPDP. Time su dobiveni konjugati (P41pL) sa molarnim odnosom peptida prema pL od 4:1.

b) Transfekcija HeLa stanica.

HeLa stanice su uzgajane na DMEM hranilištu 5% FCS, 100 i.j. penicilina po ml, 100 µg/ml streptomicina i 2 mM glutamina, u pločama od 6 cm. Transfekcije su izvršene uz gustoću od 300.000 stanica po ploči. Prije transfekcije stanice su inkubirane sa 1,5 ml svježeg hranilišta, koje je sadržavalo 2% FCS. 6 µg pCMVL-DNA u 160 µl HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES 7,3) pomiješa se sa 6 µg TfpL190B konjugata u 160 µl HBS, a nakon 15 minuta doda se 10 µg peptid-pL-konjugata influence P41pL ili, za usporedbu, 18 µg peptid-pL-konjugata influence P16pL (vidi primjer 13), (slika 20). Navenene količine dvaju peptidnih konjugata provjerene su kao optimalne količine za povećanje prijenosa gena. Nakon daljnjih 15 minuta smjesa se doda stanicama. Stanice se inkubiraju kod 37ºC 4 sata, zatim se doda 2 ml hranilišta, koje sadržava 18% FCS. Nakon 24 sata stanice se pokupe za test luciferaze. Vrijednosti koje su prkazane na slici 20 predstavljaju ukupnu aktivnost luciferaze transficiranih stanica.

Usporedba eksperimenata sa dva peptidna konjugata pokazuje više nego 3,5 puta veće povećanje prijenosa gena postignutog sa drugim peptidnim konjugatom P41pL.

c) Transfekcija BNL CL.2 stanica sa peptid-polilizin konjugatima influence.

BNL CL.2 stanice su uzgajane kao što je opisano u primjeru 6. Peptid influence P14 konjugiran je sa polilizinom 300 uz molarni odnos peptida prema polilizinu 1:1, 3:1 i 8:1,

Stanicama su dodani kompleksi od 6 µg pCMVL DNA i 20 µg konjugata. Za usporedbu, upotrebljeno je 20 µg pL300 ili 20 µg P16 polilizin konjugata, priređenog kaa što je opisano u primjeru 13. Stanice su inkubirane kod 37ºC 4 sata, i zatim je dodano 2 ml medija koji je sadržavao 18% FCS. Nakon 24 sata stanice se pokupe za pokus luciferaze, čije rezultate pokazuje slika 20B. Sadržaj peptida u konjugatima u odnosu je sa pojačanjem izražaja gena. U pokusima propuštanja liposoma (slika 20C), koji su izvedeni kao što je opisano u pokusu 13, aktivnost je konjugata (kod pH 5, koja odgovara količini od 2,5 µg polilizina) rasla sa njihovim sadržajem peptida. (na slici P41 je označen sa “influ2”).

Primjer 15 - Transfekcija HeLa stanica sa konstrukcijom referentnog gena β-galaktosidaze i “in situ” prikaz izražavanja β-galaktosidaze.

a) Kultiviranje i transfekcija stanica.

Za transfekciju, HeLa stanice su uzgajanje u DMEM hranilištu, koje je sadržavalo 5% FCS, penicilina, streptomicina i glutamina, kao što je opisano u prethodnim primjerima, u posudicama s poklopcima /vel. 3 cm). (3 x 104 stanica po posudici).

Za transfekciju kompleksira se 6 µg β-galaktosidaze konstrukcije referentnog gena (pCMV-β-gal) u 160 µl HBS sa 12 µg TfpL190B u 160 µl HBS te se inkubira 30 minuta kod sobne temperature.

U drugom primjeru, 6 µg pCMV-β-gal u 160 µl HBS inkubira se sa 6 µg TfpL190B u 80 µl HBS, 15 minuta kod sobne temperature. Zatim se doda 12 µg peptidnog konjugata influenze (P16pL), priređenog u primjeru 13 u 80 µl HBS, i smjesa se inkubira daljnjih 15 minuta. Ovi se DNA-polikationski kompleksi pomiješaju sa 1 ml DMEM plus 2% FCS, antibioticima i glutaminom, kao što je gore opisano. Da bi se pokazao učinak klorokina i adenovirusa na uspiješnost transfekcije, u dodatnim je eksperimentima također dodan klorokin u hranilište, koje je sadržavalo DNA polikationske komplekse, u konačnoj koncetraciji od 100 µmola ili 50 µl otopine adenovirusa soja d1312.

Za transfekciju je originalno hranilište uklonjeno od stanica i dodan je 1 ml hranilišta koje je sadržavalo DNA komplekse sa ili bez klorokina ili virusa. Napokon perioda inkubacije od 2 sata kod 37º doda se stanicama 1 ml DMEM, koji je sadržavao 10% FCS, antibiotike i glutamin i inkubacija je nastavljena daljnja dva sata. Zatim je medij uklonjen i stanice su uzgajane u 3 ml svježeg DMEM plus 10FCS, antibioticima i glutamin.

b) Pokus β-galaktosidaze

48 sati nakon transfekcije hranilište je uklonjeno, stanice su isprazne jedanput sa otopinom fosfatnog pufera (PBS) i fiksirane sa 5% glutardialdehidom u PBS 5 minuta kod sobne temperature. Zatim se fiksativ odbaci, a stanice se isperu jedanput sa PBS. Zatim se provodi inkubacija sa otopinom za bojadisanje (10mM fosfatnog pufera pH 7,0, 150mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3,3 mM K4Fe(CN)6·3H2O, 3,3 mM K3Fe(CN)6 i 0,2% 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-galaktopiranozid), kod 37ºC, 20 minuta do 3 sata (lim i Chae, 1989). Zatim se poklpci isperu u PBS, vodi i 96% etanolu, osuše i stave u “Mowiol” na objektna stakla. Za analizu je upotrebljen Zeiss Axiophot mikroskopa.

Slika 21 pokazuje mikroskopska povećanja (112 puta). A: HeLa stanice transformirane sa 6 µg pCMV-β-gal, kompleksirane sa 12 µg TfpL190B. Reakcija bojenja za β-galaktosidazu trajala je 3 sata. Slika pokazuje da tek nekoliko stanica izražava gen β-galaktosidaze (55 stanica; obojene stanice su označene strelicom). B: HeLa stanice transficirane sa 6 µg pCMV-β-gal, kompleksirane sa 6 µg TfpL190B i 12 µg P16pL. reakcija bojenja: 3 sata. Nekoliko stanica (250 stanica) izražava β-galaktosidaze. Međutim, reakcija stanica je jača nego u A. C: HeLa stanice transficirane sa 6 µg pCMV-β-gal, kompleksirane sa 6 µg TfpL190B i 12 µg Pl6pL u prisutnosti 100 µM klorokina. Reakcija bojenja. 3 sata. Brojne grupe stanica pokazuju jako pozitivnu reakciju (više od 1.000 stanica). D: HeLa stanice transficirane sa 6 µg pCMV-β-gal, kompleksirane sa 12 µg TfpL190 u prisutnosti adenovirusa d1312. Reakcija bojenja: 20 minuta. Gotovo sve stanice (više od 90% pokazuju pozitivnu reakciju. E. Ne-tranficirane HeLa stanice (kontrola na specifičnost reakcije -galaktosidaze).

Primjer 16 - Transfekcija HeLa stanica sa 48 kb kosmidom u prisutnosti adenovirusa.

a) Priprava kosmida koji sadrži luciferazom označeni niz.

Fragment 3,0 kb Sal I, koji sadrži pojedinčani P. pyralis niz označen luciferazom, pod kontrolom RSV promotora, izoliran je iz plasmida p220RSVLuca i povezan u jedinstvenom Sal I položaju kosmidnog klona Cl-7aAl, da bi se formirali konkatameri. (Cl-7aAl ouhvaća 37 kb humani genomični DNA Sau3A fragment, koji ne označava očito gene, kloniran u BamHI položaju kosmičkog vektora pWE15 (Stratagen). Produkt reakcije vezanja je zatim spojen “in vitro”, a rezultirajuće čestice faga su inficirane u E. coli NM544 i stavljene na LB amp ploče. Rekombinanti su podvrgnuti selekciji hibridizacijom kolonija, uz upotrebu 3,0 kb Sal I fragmenta (32p označenog slučajnim namazom) kao ispitivača hibridizacije, i brojnih činjenica analiziranih prema ustanovljenim ograničenjima. Struktura kosmida (CosLuc), koja sadrži pojedinačni uzorak Sal I uloška, uzgajana je i pročišćena na CsCl gradijentu (ukupne veličine = 48 kb).

Mali je kontrolni kosmid pWELuc (12 kb) pripremljen digeriranjem CosLuc sa Not I, ponovnim povezivanjem, transformiranjem bakterija i izoliranjem klona koji sadržava odgovarajući plasmid. To je rezultiralo 12 kb DNA molekulom kojoj nedostaje humani DNA umetak i dio “polilinkeea” CosLuc. Plasmid pSPNeoLuc (8 kb) je plasmid opisan u primjeru 5, koji sadrži fragment gena RSV-luciferaze (Apal/Pvul fragment pRSVL, kloniran u Cla 1 položaju pUCu Locus-a).

b) Odpuštanje kosmida u HeLa stanice.

HeLa stanice (3 x 104stanica po posudici od 6 cm) prekrivene su sa 1 ml DMEM + 2% FCS te inkubirane sa TfpL/DNA kompleksima pripremljenim kao što je opisano u poglavlju “Materijali i metode”, koji su sadržavali navedene količine hTfpL, slobodnog pL i DNA. Smjesa stanične inkubacije sadržavala je, osim toga, ili 100 µg klorokina (stupci 1 i 2) ili 10 µl adenovirusa d1312 koji je sadržavao 5x1011 čestica po ml, (stupci 3-12). Nakon 2 sata inkubacije kod 37º doda se 4 ml DMEM + 10% FCS u svaku posudicu. Nakon 24 sata stanice se pokupe (požanju) i izmjeri se aktivnost luciferaze. Rezultati su prikazani na slici 22A.

c) Odpuštanje kosmida u Neuroblastoma stanice.

Stanice neuroblastomne stanične linije, označene sa GIME-N (Donti i sur. 1988) (1x106 stanica po posudici od 6 cm), prekrivene sa 1 ml DMEM + 2% FCS, inkubirane su sa TfpL/DNA kompleksima pripremljenim kao što je opisano u poglavlju “Materijali i metode”, koje su sadržavali navedene količine hTfpL, slobodnog pL i DNA. Smjese za inkubaciju stanica sadržavale su, osim toga, ili 100 µM klorokina (stupci 3 i 4) ili 10 µl adenovirusa d1312, koji je sadržavao 5 x 1011 čestica po ml, (stupci 5 i 6). Nakon 2 sata inkubacije kod 37ºC doda se u svaku posudicu po 4 ml DMEM + 10% FCS. Nakon 24 sata stanice se pokupe izmjeri se aktivnost luciferaze. Rezultati su prikazani na slici 22B.

Primjer 17 - Prijenos gena putem kemijski vezanih konjugata adenovirus-polilizin

a) Priprema konjugata adenovirus-polilizin kemijskim povezivanjem.

2,35 ml gel-filtrirane otopine adenovirusa (Sephadex G-25 PD10.Pharmacia) (d1312, pribl. 1011 čestica) u 150 mM NaCl/25 mM HEPES, pH 7,9/10% glicerola, pomiješa se sa 10 ul (10nmola) 1 mM otopine SPDP (Pharmacia). Nakon 3,5 sata kod sobne temperature, modificirani se virus odijeli od viška reagensa gel filtracijom (kao gore). Otopina se pročisti argonom i ostavi da reagira, uz isključenje kisika (pod argonom) sa 42 ul otopine FITC-om označenog polilizina (1nmol), modificiranog s 2,3 nmola merkaptopropionatnih grupa (pripremljenih kao što je opisano u EP 388 758). Nakon 18 sati stajanja na sobnoj temperaturi, polovina otopine se prenese u epruvetu za cntrfugiranje, pažljivo se prekrije s otopinom cezijeva klorida (gustoće 1,33 g/ml) i centrifugira kod sobne temperature, 2 sata sa 35000 rpm (SW60 rotor). Virusni se sloj skupi, kao 200 ul frakcija cezijeva klorida, i razrijedi se na 1 ml sa HBS/50% glicerol. Pokus pokazuje da DNA izveden je sa 200 ul modificiranog virusa;: virusna je otopina razrijeđena sa 1 ml HBS i pomiješana sa 100 µl ootpine DNA, označene sa 35S (15 ng pRSVL, priređenog premještanjem po Micku). Za kontrolu, paralelno je izveden isti pokus sa istom količinom nemodificiranog virusa d1312. Nakon 30 minuta uzorci su prenešeni u epruvete za centrifugirnje, pažljivo su prekriveni sa po 1 ml otopine cezijeva klorida (gustoća 1,33 g/ml) i centrifugirani 2 sata u 35000 rpm (SW60 rotor) kod sobne temperature. Gradijent je podijeljen u 5 frakcija: frakcija 1, 1 ml; frakcija 2, 0,6 ml; frakcija 3-5, svaka 200 µl. Radioaktivnost 200 µl svih frakcija je mjerena, a rezultate pokazuje slika 23. Frakcije koje sadržavaju viru, osobito frakcija 3, pokazuju znantno veću radioaktivnost nego konrolirana frakcija. To se može pripisati posebnom povezivanju polilzinom modificiranom adenovirusu sa označenom DNA, a prisutnost cezijeva klorida možda uzrokuje djelomičnu disocijaciju kompleksa.

b) Transfekija K562 stanica.

K-562 stanice (ATCC CCL 243) su uzgajane u suspenziji u RPMI 1640 hranilištu (Givco BRL, + 2g natrijeva bikarbonata/1 10% FCS, 100 j./ml penicilina, 100 µl/ul streptomicina i 2 mM glutamina) do gustoće od 500.000 stanica/ml. 12 do 20 sati prije transfekcije stanice su stavljene u svjesubstrat koji je sadržavao 50 µM desferioksamina (ova je mjera poduzeta da poveća broj receptora transferina). Na dan transfekcije stanice se sakupe, suspendiraju u svježem mediju, koji je sadržavao 10% FCS + 50 µM desferioksamina (250.000 stanica po ml) i 2 ml obroci su stavljeni na ploču sa 24 udubljenja.

Određene količine pCMVL-DVA (6, 0,06, 0,06 µg) u 100 µl HBS, pomiješane su sa 50 µl polilizin adenovirusa (pLadeno) ili sa odgovarajućim količinama (35 µl) kontroliranog adenovirusa d1312). Nakon 20 minuta dodaju se odgovarajuće količine (12, 1,2, 0,12 µg) konjugata TfpL1=OB u 150 µl HBS. Nakon daljnjih 20 minuta, smejsa se doda stanicama K562. Stanice se inkubiraju 24 sata kod 37ºC, a zatim se sakupe za pokus luciferaze. Aktivnost luciferaze se odredi kao u prethodnim primjerima. Vrijednosti date na slici 24 predstavljaju ukupnu aktivnost luciferaza transficiranih stanica.

c) Transfekcija HeLa stanica.

Jedna metoda ispitivanja aktivnosti konjugata polilizin-virus, sastoji se u provjeravanju sposobnosti konjugata da prenosi veoma male količine DNA (manje od 0,1 µg). Povećan kapacitet prijenosa DNA je bio očekivan, ako je adenovirus direktno vezan na polilizinom kondenziraju DNA, jer su internalizirajući faktori (transferin i adenovirus (protein)) direktno vezani sa DNA koja će se transportirati. Da bi se provjerila ova pretpostavka, konstantna je količina konjugata polilizin-adenovirus (2,5 µl, oko 5x107 virusnih čestica) kompleksirana sa različitim količinama (3 do 0,0003 µg) referentnog plasmida u 475 µl HBS. Nakon 15 minuta inkubacije kod sobne temperature, doda se količina transferin-polilizina koja odgovara masi DNA, u svaki uzorak (ova je količina TfpL odabrana, jer ona garantira potpuno “omatanje” (elektroneutralnost) 50% plasmidne DNA, a u isto vrijeme osigurava prostor za povezivanje konjugata virus-polilizin. Nakon dodatka TfpL smjese se inkubiraju 15 minuta, a zatim je svaka smjesa stavljena u uzgojnu posudicu od 6 cm, koja sadrži 300.000 HeLa stanica u 1 ml DMEM/2% FCS. Zatim se stanice inkubiraju 1,5 h kod 37ºC, a onda se doda 4 ml DMEM/10% FCS. Paralelno se ekvivalentne količine DNA kompleksiraju sa dvostrukom masom TfpL (količina za potpunu kondenzaciju DNA) i upotrebe za prijenos gena u stanice HeLa (jedanput same i jedanput sa 25 ul pripravka adenovirusa d1312 koji nije vezan na polilizin). Nakon 24 sata stanice se pokupe, pripreme se ekstrakti i alikvoti se ispitaju na aktivnost luciferaze. Rezultati ovih testova su prikazani na slici 25. U odsutnosti adenovirusa nije se mogla ustanoviti aktivnost luciferaze u količini DNA manjoj od 0,3 µg. Adenovirus vezan na polilizin, kao i nevezan, djelovali su dobro sa velikim količinama DNA (3 µg i 0,3 µg). Međutim, sa nevezanim adenovirusom pokazao se približno stostruki pad aktivnosti sa 0,03 µg, a tek neznatna aktivnost ispod te količine DNA. Nasuprot tome, polilizin vzean adenovirus zadržava svoj kapacitet prijenosa gena i uz 0,0003 µg, DNA. Ova količina DNA odgovara količini od 150 DNA molekula po stanici i oko jedne virusne čestice po stanici.

Primjer 18 - Prinos gena pomoću adenovirusa enzimatski vezanih na polilizin.

a) Enzimatska reakcija

2 ml pripravka adenovirusa (soj d1312; 5x1010PFU/ml) stavi se u Sephadex G-25 kolonu za gel filtraciju (Pharmacia) puferira sa 25 ml reakcijskog pufera (0,1 M Tris-HC1; pH 8,0 2 mM DTT, 30% glicerola). Eluiranje je izvedeno sa 3,5 ml reakcijskog pufera. Reakcijska smjesa za enzimatsko povezivanje sastoji se od 1150 µl frakcije virusnog eluata, 0,5 nmola transglutaminaze jetre zamorca (TG) (Sigma), 2 nmola ili 20 nmola polilizina 290, 10nm CaCl2 i reakcijskog pufera do konačnog volumena od 1500 µl. Reakcija se provodi 1 sat kod 37ºC, a zatim je zaustavljena dodatkom 30 µl 0,5 M EDTA. U svrhu praćenja specifičnosti povezivanja, reakcijske su smjese također priređene bez transglutaminaze. Ne-ugrađeni polilizin se odvoji od virusa centrifugiranjem u CsCl gradijentu (gustoća 1,33 g/ml; 170.000xg, 2 sata). Frakcija koja sadrži viruse se skupi, pomiješa sa jednakim volumenom glicerola, zamrzne u tekućem dušiku i čuva na -70ºC.

b) Prikaz povezivanja polilizina sa adenovirusima.

Reakcija se izvodi kao što je gore opisano, sa polilizinom označenim sa J125 (sa Bolton-Hunter reagensom, Amersham). Nakon centrifugiranja CsCl gradijenta, virusna je frakcija uklonjena i odijeljena pomoću drugog CsCl gradijenta. Gradijent je zatim frakcioniran i određena je radioaktivnost svake frakcije upotrebom scintilacijskog brojača. Kao što pokazuje slika 26, jasno je da je u radioaktivnoj smjesi sa TG (d1312/TG-pL) radioaktivni polilizin akumuliran u virusnoj frakciji (virus). U kontrolnoj smjesi bez TG (d1312/pL) nije bilo nagomilavanja radioaktivnog polilizina u virusnoj frakciji.

c) Testiranje polilizinom modificiranih frakcija adenovirusa na njihov utjecaj na učinkovitost transfekcije.

I) Stanice i hranilišta

Za transfekciju nasađeno je u posudice od 6 cm 5x105 stanica (hepatociti glodavaca; ATCC No.: TIB 73) u DMEM sa 10% toplinski inaktiviranog fetalnog telećeg seruma (FCS), 2 mM glutamina, 100 i.j. po ml penicilina i 100 µg/ml streptomicina.

II) Stvaranje kompleksa virus-DNA-transferin.

50 µl polilizinom modificirane frakcije virusa pomiješa se sa 6 µg DNA plasmida pCMVL u 10 µl HBS i inkubira 20 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim se 8 µg mišjeg transferin-polilizina290B (mTfpL) doda smjesi i inkubira se dalje još 20 minta.

III) Transfekcija mišjih hepatocita

Virus.DNA-transferin kompleksi se pomiješa sa 1,5 ml substrata (DMEM sa 2% FCS, 2 mM glutamina i antibioticima) i dodaju se stanicama, nakon uklanjanja starog substrata. Nakon 2 sata inkubacije kod 37ºC doda se stanicama 2 ml DMEM sa 10% FCS, glutaminom i antibioticima. Nakon daljnja dva sata uzgoja čitav se substrat ukloni i doda se stanicama 4 ml svježeg DMEM sa 10% FCS, glutaminom i antibioticima.

IV) Određivanje izražaja luciferaze.

24 sata nakon transfekcije stanice se pokupe i izvede se pokus luciferaze, kao što je gore opisano. Kao što se može vidjeti iz slike 17, virusni pripravak u kojem su adenovirusi bili obrađeni sa TG i 20 nmola polilizina (d1312/TG-20 nmola pL) pokazao je najjači izražaj 153540000 “lakih jedinica”). Virusni pripravak sa TG i 2 nmola polilizina (d1312/TG-1 nmola pL) je nešto manje aktivan (57880000 lakih jedinica). Kontrolna frakcija u kojoj su adenovirusi bili obrađeni sa 20 nmola polilizina, ali bez TG, bila je manje djelotvorna, približno za faktor 500. Za usporedbu, daljnji su kompleksi, korišteni za transfekciju sa početnim pripravkom adenovirusa obrađenim i bez TG i bez polilizina (d1312). Ovaj je pripravak dao prinos od 440300 l.j.

d) Povećanje učinkovitosti transfekcije polilizinom modificiranih adenovirusa u usporedbi sa nemodificiranim adenovirsima, osobito s malim količinama DNA

Transfekcija je izvedena kao što je opisano u primjeru c), sa 50 µl frakcije adenovirusa d1312/TG-20 nmola pL i 6 µg pCMV-Luc/8 ug mTfpL, 0,06 µg pCMVL(=pCMV-Luc)/0,8 µg mTfpL ili 0,06 µg pCMV-Luc/0,08 µg mTfpL za kompleksiranje. Za usporedbu, transfekcije su izvedene također sa 6 µg, 0,6 µg, 0,06 µg pCMV-Luc/mTfpL kompleksa i nemodificiranim adenovirusima (d1312). Nađeno je da kompleksi sa polilizinom modificiranim adenovirusima daju visoke razine izražaja, čak i sa malim količinama DNA, dok je sa nemodificiranim adenovirusima izražaj jako smanjen (slika 28).

Primjer 19 - Prijenos gena sa konjugatima u kojima je veza između adenovirusa i polilizina postignuta putem biotin-streptavidin mosta

a) Biotiniliranje adenovirusa d1312.

2,4 ml gel-filtrirane otopine (Sephadex G-25 PD102, Pharmacia) adenovirusa d1312 (oko 1011 čestica) u 150 mM NaCl/5 mM HEPES, pH 7,9/10% glicerola, miješa se sa 10 ul (10 nmola) 1 mM otopine NHS-LC biotina (Pierce 21335). Nakon 3 sata stajanja kod sobne temperature biotinom modificirani virus se odijeli od viška reagensa gel filtracijom (kao gore). Otopina se podesi na koncnetraciju glicerola od 40% dodatkom glicerola (ukupni volumen 3,2 ml) i čuva se na -25ºC. Biotinilacija virusa je dokazana kvalitativnim pokusom, nakon dodatka, kap po kap, različitih razrjeđenja na membranu od celuloznog nitrata. Nakon sušenja kod 80ºC, 2 sata u vakuum sušioniku, nakon “blokiranja” sa BSA, inkubacije sa streptovidinom konjugiranom alkalnom fosfatazom (BRL), pranja i 1 sat inkubacije sa otopinom za razvijanje NBT/X-fosfatom (nitro-plava-tetrazolium sol/5 bromo-4-kloro-3-indolilfosfat, toluidin sol, Boehringen Mannheim), dobivena je pozitivna reakcija obojenja.

b) Priprava streptovidin-polilizin konjugata.

Spajanje streptovidina na polilizin je izvedeno metodom opisanom po Wagneru i sur., 1990, te u EP-Al 388 758. 79 nmola (4,7 mg) streptavidina u 1 ml 20 mM HEPES pH 7,9 i 300 mM NaCl, obradi se sa 15 mM etanolne otopine SPDP (236 nmola). Nakon 1,5 h kod sobne temperature modificirani se protein gel filtrira preko Sephadex G-15 kolone, pri čemu se dobije 75 nmola streptovidina modificiranog sa 196 nmola ditiopiridinskog povezivača. Modificirani protein reagira pod atmosferom argona, sa 3-merkaptopropionatom modificiranim polilizinom (75 nmola, prosječne dužine lanca od 290 monomera lizina, modificiranog sa 190 nmola merkapto-propionat povezivača) u 2,6 ml 100 mM HEPES pH 7,9, 150 mM NaCl. Konjugati su izolirani kromatografijom sa kationskim izmjenjivačem kao Mono S HR5 koloni (Pharmacia). Gradijent: 20-100% pufera B. Pufer A: 50 mM HEPES pH 7,9; pufer B: pufer A + 3 M natrijev klorid). Frakcija produkta je eluirana uz koncnetraciju soli između 1,2 M i 1,7 M. Dijaliza prema HBS (20 mM HEPES pH 7,3, 150 mM NaCl) dala je konjugat koji je sačinjen od 45 nmola streptavidina i 53 nmola polilizina.

c) Transfekcija HeLa stanica.

HeLa stanice su uzgajane na posudicama od 6 cm, kao što je opisano u primjeru 13. Transfekcije su izvedene uz gustoću od 300.000 stanica po ploči. Prije transfekcije stanice su inkubirane sa 1 ml svježeg substrata koji je sadržavao 2% FCS.

6 µg pCMVL-DNA u 100 µl HBS, pomiješa se sa 0,8 µg streptovidin-polilizina u 170 µl HBS. Nakon 20 minuta doda se 3 µg polilizina pL300 u 170 µl HBS. Nakon drugih 20 minuta doda se 65 µl biotidiniliranog adenovirusa ili, za kontrolu, odgovarajuća količina adenovirusa d1312 (30 µl, početnog virusa za modifikaciju). Smjesa kompleksa (“biotinAdV/kompleks A” ili “kontrolni AdV”, vidi sliku 29) se ostave da stoje daljnjih 20 minuta.

Drugi je način kompleksiranja izveden mješanjem 65 µl biotiniliranog adenovirusa, prvo se sa 0,8 µg streptovidin-polilizina u 50 µl HBS, zatim dodavanjem 6 µl pCMVL-DNA u 170 µl HBS, nakon 20 minuta, a nakon daljnjih 20 minuta, dodavanjem 3 µg polilizina pL300 u 200 µL HBS. (kompleksna smjesa (“biotinAdV/kompleks B).”

0,6 µg pCMVL-DNA u 67 µl HBS, pomiješa se sa 0,3 µg streptavidin-polilizina u 33 µl HBS. Nakon 20 minuta doda se 65 µl biotiniliranog adenovirusa ili, za kontroli, odgovarajuće količine adenovirusa d1312 (30 µl, polaznog virusa za modifikaciju). Kompleksne smjese (“biotinAdV/kompleks A” ili “kontrolni AdV”, vidi sliku 29) se ostave da stoje daljnjih 20 minuta., a zatim se razrijede na 500 µl sa HBS. Alternativno je kompleksiranje izvedeno miješanjem 65 µl biotiniliranog adenovirusa, najprije sa 0,3 µg streptavidin-polilizina u 50 µl HBS, nakon 20 minuta dodatkom 0,6 µg pCMVL-DNA u 50 µl HBS. Kompleksna se smjesa (“biotinAdV/kompleks B)” ostavi daljnjih 20 minuta, a zatim se razrijedi do 500 µl sa HBS.

Smjese se dodaju stanicama, stanice se inkubiraju 2 sata kod 37ºC, a zatim se doda 2,5 ml svježeg medija, koji je sadržavao 10% GCS. Stanice se inkubiraju 24 sata kod 37ºC, te se skupe (požanju) za pokus luciferaze. Aktivnost luciferaze je određena kao što je opisano u prethodnim primjerima, Vrijednosti date u slici 29 predstavljaju ukupnu aktivnost luciferaze transferiranih stanica.

Paralelno su izvedene transfekcije HeLa stanica uz korištenje kao virusne komponente konjugata, bitiniliranog virusa, koji je bio inaktiviran obradom sa psoralen/UV-zrčenjem. Inaktivacija je izvedena na slijedeći način: šarža od po 200 µl biotiniliranog virusa smjeste se u dvije udubine ploče za kulturu tkiva, od 1,6 cm. U svaki se uzorak doda µl (33 mg/ml) 8-metoksipsoralena (u DMSO), posudica se stavi na led te zrači 10 minuta UV-lampom (365 nm; UVP TL-33 lampa) na udaljenosti uzorka od 4 cm od filtra. Nakon zračenja dva se uzorka spoje i gel-filtriraju (G-50, Nick kolona, Pharmacia), kroz kolonu koja je prethodno pripravljena sa 40% glicerola u HBS. Alikvoti od 75 µl su kompleksirani sa 0,8 µg streptavidin-polilizinom i upotrebljeni za transfekciju HeLa stanica kao što je gore opisano.

Pokusom citopatske završne točke utvrđeno je da se virusni titar smanjuje za faktor veći od 104 inaktivacijom, dok se kapacitet prijenosa smanjuje za manje od 50% visokih koncentracija, a za faktor 5 kod niskih koncentracija.

d) Frakcija K562 stanica.

K562 stanice se uzgajaju u suspenziji u RPMI 1640 substratu (Gibco BRL, +2g natrijeva bikarbonata na 1 litru) + 10% FCS, 100 jedinica/ml penicilina, 100 µg/ml streptomicina i 1mM glutamina, te postižu gustoću od 500.000 stanica/ml. Na 16 sati prije transfekcije stanice su stavljene u svježi substrat, koji je sadržavao 50 µM desferioksamina (Sigma). Jutrom nakon transfekcije, stanice se skupe, ponovno suspendiraju u svježi medij, koji je sadržavao 10% FCS (+50% uM desferioksamina) do 250.000 stanica po ml, te se stave na ploču sa 24 udubljenja (2 ml po udubljenju).

Priređena su tri različita tipa kompleksa: a) Otopina od 6 µg pMCVL-DNA u 160 ul HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES 7,3) pomiješa se sa 12 µg TfpL190B konjugatom u 160 µl HBS, nakon 30 minuta doda se 20 µl adenovirusa d1312 i smjesa se doda K562 stanicama. b) Otopina od 800 ng streptavidin-polilizina u 160 µl HBS pomiješa se sa 20 µl biotiniliranog adenovirusa, priređenog kao što je opisano pod a), nakon 30 minuta doda se otopina od 6 µg pCMVL-DNA u 160 µl HBS i nakon daljnjih 30 minuta otopine se pomiješa sa 10 µg TfpL190B konjugatom u 160 µl HBS. nakon 30 minuta doda se stanicama.

c) DNA kompleksi su priređeni jednako kao u b) s razlikom što je umjesto TfpL190B konjugata dodana otopina od 3,5 µg poli(L)lizina, p(Lys)290.

Stanice se inkubiraju kod 37ºC 24 sata i zatim se požanju za pokus luceraze. Vrijednosti koje prikazuje slika 30 predstavljaju ukupnu aktivnost luciferaze transferiranih stanica.

Primjer 20 - Prinos gena u izvorne stanice koštane srži.

Izvorne stanice koštane srži su skupljene iz miševa ubrzigavanjem medija za kulturu (IMDM koji sadržava 10% FCS, 5x10-5 M β-merkaptoetanola, 1% IL-3 prilagođenog medija i antibiotika) injekcijskom iglom, (0,4 mm ili 0,5 mm promjera) nataknutom na špricu od 1 ml, kroz izolirane femure i tibije. Stanice se zatim ispiru jednom u mediju kulture centrifugiranjem sa 100xg, 8 minuta. Nakon toga stanice se ponovno suspendiraju u koncentraciji od 107 stanica/ml i nasade u boce za kulture. Nakon 4 sata neprimljene se stanice prenesu u nove T25 boce i uzgajaju se preko noći u prisutnosti 50 µM desferioksamina.

b) Stvaranje adenovirus-DNA-transferin kompleksa.

Za stvaranje adenovirus-DNA-transferin kompleksa, 50 µl biotiniliranog adenovirusa se inkubira s streptavidinom modificiranog polilizina u 20 µl HBS, 20 minuta. Zatim se doda 20 µl HBS koji sadrži 6 µg pCMVL. Nakon perioda inkubacije od 20 minuta doda se 7 µg mišjeg transferin-polilizin konjugata (mTfpL) u 160 µl HBS i čitava se smjesa inkubira daljnjih 20 minuta.

c) Transfekcija

Za transfekciju se stanice koštane srži dobiju iz medija kulture boca T25 centrifugiranjem sa 100xg, 8 minuta. Stanični se talog ponovno suspendira u 3 ml substrata koji sadrži 2% FCS i 250 µl kompleksa adenovirus-DNA-transferin, i razmaže se u novoj T25 boci, 3 sata kod 37ºC. Zatim se doda 3 ml te nakon 2 sata daljnjih 6 ml substrata koji sadrži 10% FCS.

d) Određivanje izražaja luciferaze.

Stanice koštane srži se požanju 48 sati nakon transfekcije i analiziraju na izražaj luciferaze, kao što je gore opisano. Transfekcija je dovela do izražaja aktivnosti luciferaze, koji odgovara 310x103 l.j. (light units) na 100 µg ukupnog staničnog proteina.

Primjer 21 - Transfekcija stanice neuroblastoma sa 48 kb kosmida u prisutnosti adenovirusa.

a) Priprava kosmida koji sadrži luciferazom označeni niz.

3,0 kb Sal I fragment, koji sadržava pojedinačni P. pyralis luciferazom označni niz pod kontrolom RSV promotora (De Wet i sur., 1987), povezan je na jedinstveni Sal I položaj kosmidnog klona Cl-7aAl, da bi se stvorili konkatameri. (Cl-7aAl obuhvaća 37 kb humani genomični fragment DNA Sau 3A, koji ne označava jasno gene, kloniran u Bam HI položaju kosmidnog vektora pWE15 Stratagena). Produkt reakcije povezivanja je zatim uklonjen in vitro i alikvot dobivenih čestica faga inficiran u E. coli NM544 i stavljen na LB amp ploče. Rekombinanti su prikazani hibridizacijom kolonije, korištenjem 3,0 kb Sal I fragmenta, kao provjerom hibridizacije i niza činjenica analiziranih obilježavanjem ograničenja. Kosmidni sastav (CosLuc) koji sadržava pojedini primjerak Sal I uloška, uzgajan je i pročišćen na CsCl gradijentu (ukupna veličina = 48 kb).

Mali kontrolni kosmid pWELuc (12kb) priređen je digeriranjem CosLuc sa Not I, ponovnim povezivanjem, transformiranjem bakterija i izoliranjem klona, koji sadrži odgovarajući plasmid. To je rezultiralo da je u 12 kb DNA molekuli nedostajao uložak humane DNA i dio polilinkera CosLuc.a.

b) Odpuštanje kosmida u stanice neuroblastoma.

Stanice linije Neuroblastoma, označena sa GI-ME-N (Donti i sur., 1988) (1 x 106 stanice po posudici od 6 cm) prekrivene sa 1 ml DMEM +2% FCS, inkubirane su sa TfpL/DNA kompleksima priređenim kao što je opisano u poglavlju “Materijali i metode”, koji su sadržavali navedene količine hTfpL, slobodnog pL i DNA. Kao što je pokazano, smjese stanične inkubacije obuhvaćale su, osim toga, ili 10 µM klorokina (stupci 3 i 4) ili 10 µl adenovirusa d1312 koji je sadržavao 5 x 1011 čestica po ml (stupci 5 i 6). Posljednja dva uzorka (označena sa StpL/Biotin) sadržavala su ul biotiniliranog adenovirusa d1312 (1 x 10 11 čestica) inkubirana su sa streptovidin-polilizinom (0,8 µg pripremljenog kao u primjeru 19) 30 minuta, u 150 µl HBS. Zatim se doda 6 µg DNA (u 150 µl HBS) uzorku na 30 minuta kod sobne temperature, a onda još 150 µl HBS) uzorku na 30 minuta kod sobne temperature, a onda još 150 µl HBS koja sadržava 6 µg hTfpL + 1 µg slobodnog pL. Nakon daljnjih 30 minuta inkubacije kod sobne temperature, smjesa se doda stanicama. Nakon 2 sata inkubacije kod 37 ºC doda se u svaku posudicu 4 ml DMEM + 10% FCS. 24 sata kasnije stanice se pokupe i izmjeri se aktivnost luciferaze. Rezultate pokazuje slika 31.

Primjer 22 - Prijenos gena u izvorne “airway” epitelne stanice uz primjenu molekularnih vektora konjugata.

Početne studije radi ocjenjivanja mogućnosti upotrebe prijenosa gena uz primjenu molekularnih vektora konjugata za genetsku korekciju cistične fibroze, pokazala su da neumrtvljene stanične linije, izvedene iz humanog “airway” epitela, izražavaju osjetljivotst za ovu metodu prijenosa gena. Da bi se isključila mogućnost da taj fenomen bude rezultat imortalizacijom uvedenih izmjena respiratornog epitela, transferin-polilizin molekularni konjugat se također vrednuje u stanicama izvornog respiratornog humanog epitela (1ºAE).

1ºAE stanice su dobivene iz uzoraka nazalnog polipa pacijenta, kao što su opisali Yankaskas, J.R. i sur., 1987. Ukratko, tkiva se isperu sterilnom otopinom soli, zatim Joklik-ovim “Minimalnim Esencijalnim Medijem” (MEM) + antibiotici (penicilin 50 j/ml, streptomicin 50 µg/ml, gentamicin 40 µg/ml) i prenesu se u laboratorij uz temperaturu od 4ºC. Hrskavica i višak submukoznog tkiva se ukloni, a epitelni se listići inkubiraju otopini proteaze (Sigma, tip 14, 0,1 mg/dl) u MEM kod 4ºC, 16 do 18 sati (Wu, R. 1985). Fetalni serum goveda (FBS, 10%) se doda da se neutralizira proteaza i stanice se odvoje blagim miješanjem. Dobivena suspenzija se filtrira kroz 10 um nylom mesh, da se uklone ostaci, zatim se tabletira centrifugiranjem (150 x g, 5 min) i ispere u F12 + 10% FBS.

1ºAE stanice se zatim obrade sa transferin-polilizin konjugatm (hTfpL) koji sadržava luciferazom označen plasmid (pRSVL) kao reporter gen (L.U.). U toj analizi izvorne stanice nisu pokazale osjetljivost na ovaj vektor izražen odgovarajućim neumtrvljenim staničnim linijama (1ºAE: osnova = 429 ±41; + hTfpL = 543 ±L.U.), vjerojatno pokazujući relativno mali broj receptora transferina na 1ºAE.

Da bi se iskoristio alternativni ciljni receptor na 1ºAE, konjugati su konstruirani tako da ugrađuju za obnovu nesposoban adenovirus kao dio liganda (bAdpL; vidi primjer 19a i 19b) za pripravu biotiniliranog adenovirusa i streptavidin-polilizin konjugata. Luciferazom označen plasmid je upotrebljen kao reporter gen). Humani 1ºAE obrađen ovim konjugatom pokazuje razine izražaja reporter-gena znatno jači nego osnova (+ bAdpL = 2585753 ±453585 L.U.). Osim toga, 1ºAE izveden iz drugih vrsta, također pokazuje visoku razinu osjetljivosti na prijenos gena ovim putem (miš = 3230244 ±343153; majmun = 5348880 ±869481 L.U.). Stoga, sposobnost da se obavi prijenos gena do 1ºAE utvrđuje potencijalnu korist ovoga pristupa za postizavanje direktnog “in vivo” oslobađanja gena.

Primjer 23 - Prijenos gena na hepatocite sa vektorima molekularnih konjugata

a) Transfekcija stanica kulture tkiva.

Stanice hepatocitne linije mišjeg embrija BNL CL.2 (ATCC TIB 73) uzgajaju se kao što je opisano u primjeru 6. HeLa stanice i hepatociti su uzgajani na 6 cm plastičnim petrijevim posudicama. Transfekcija je izvedena uz gustoću stanica od oko 3 x 105 stanica po posudici. Prije transfekcije zamijenjen je standardni medij sa 1 ml svježeg medija, koji sadržava 2% FCS.

b) Stvaranje binarnih kompleksa.

Biotinilirani adenovirusi (pribl. 109 PFU; vidi primjer 19 a) i 19 b) reagiraju sa 800 ng streptavidiniliranog polilizina u 50 µl HBS. Nakon 30 minuta kod sobne temperature, doda se 6 µg pCMVL-DNA u 170 µl HBS, inkubira se 30 minuta i zatim se doda 3 µg polilizina pL300 u 200 µl HBS, a onda se, nakon daljnjih 30 minuta otopina koristi za pokuse transfekcije.

c) Stvaranje ternarnih kompleksa.

Ternarni DNA kompleksi, koji sadržavaju adenovirus i transferin, stvarani su na slijedeći način: biotinilirani adenovirusi (oko 109 viralnih čestica) pomiješa se sa 800 ng streptavidiniliranog polilizina. Nakon 30 minuta kod sobne temperature, otopina se miješa sa 6 µg plasmid DNA u 170 ml HBS, inkubira 30 minuta, zatim se doda 10 µg transferin-polilizina TfpL190B (Wagner, E. i sur., 1991b) u 200 ul HBS, a nakon daljnjih 30 minuta otopina se koristi za pokuse transfekcije.

d) Pokusi β-galaktosidaze

BNL CL.2 stanice se nasade na poklopce i 24 sata kasnije stanice se transficiraju u pCMV-β-gal (Lim, K. i Chae, 1989) reporter genom. Nakon 48 sati β-galaktosidaza je ispitivana prema Limu i Chae-u.

Birani prijenosno kompleksi. Biotinilirani adenovirus je spojen sa streptovidiniliranim polilizinom. Alternativno, adenovirus je povezan kovalentno sa polilizinom putem djelovanja transglutaminaze. Adenovirus-polilizin konjugat je dodan DNA, omogućujući stvaranje kompleksa između DNA i polilizina, i tako neutralizirajući poznatu frakciju (cca 1/4) negativnih naboja DNA. Zatim je dodana izračunata količina polilizina, da bi se neutralizirali preostali naboji. Kompleksi koji se sastoje od DNA vezane na adenovirus-polilizin konjugat i na polilizin objavljeni su kao binarni transportni kompleksi.

Postoje, u biti, dva načina sasavljanja binarnih prijenosnih kompleksa. DNA može biti vezana na strepatvinilirani polilizin i zatim spojena na biotinilirani adenovirus ili je adenovirus vezan na polilizin, a kasnije se kompleksno veže sa DNA. Potonji postupak, posve jasno, daje bolje rezultate, naročito uz niski sadržaj DNA, te je stoga radije korištena metoda za sastavljanje i binarnih i ternarnih kompleksa.

Ternarni prijenosni kompleksi koji sadrže transferin.

Adenovirus-polilizin konjugati dodaju se DNA, omogućujući stvaranje kompleksa i neutralizaciju dijela (oko 1/4) negativnih naboja DNA. Izračunata količina transferin-polilizin konjugata doda se zatim kompleksu i neutralizira ostatak DNA. Kompleksi koji sadrže DNA, adenovirus-polilizin i transferin-polilizin, opisuju se kao ternarni kompleksi. U osnovi, takovi bi ternarni kompleksi morali imati kapacitet da budu endocitozirani povezivanjem bilo na stanične receptore adenovirusa ili na receptore transferina.

Povezivanje između DNA kondenzata i adenovirusa znatno pojačava izražaj reporterskog gena luciferaze. Fizičko se povezivanje između adenovirusa, soja d1312, i polilizina može postići ili inkubiranjem dvaju komponenata sa transglutaminazom, ili biotinilacijom adenovirusa i streptavidinilacijom polilizina. Utjecaj povezivanja na učinkovitost transfekcije (ovaj termin označava transferinom upravljanu transfekciju) u prisutnosti slobodnog adenovirusa je porasla, pokazujući tipično pojačanje oslobađanja transferin.-polilizin DNA kompleksa u stanice. Na određenom mjestu pLAdenoV/TpfL, adenovirus se konjugira sa polilizinom pomoću transflutaminaze i zatim reagira sa DNA neutralizirajući dio negativnih naboja DNA. Kasnije se doda transferin-polilizinm koji neutralizira ostatak naboja. Na taj se način sintetizira trenarni kompleks adenovirus-polilizin/transferin-polilizin/DNA. Kao što se može vidjeti, izvanredno visoka vrijednost od 1,5 x 109 l.j. (light units) luciferaze se postiže (ili pribl. 5000 l.j. po stanici).

Da bi se pokazala specifičnost transglutaminazom upravljanog povezivanja polilizina sa virusom, enzim se izostavlja. Zatim se virusni pripravak kompleksira sa istom količinom DNA i TfpL kao i u pLAdenoV/TfpL. U tom je slučaju transfekcija bila umjerena, kao i u AdenoV + TfpL, jer je u oba eksperimenta zajedničko mjesto virusa i transferin DNA stohastički proces, nasuprot PLAdenoV/TfpL gdje ko-internalizacija osigurana fizičkom vezom virusa i DNA i ternarnom kompleksu daje visoku razinu transferinfekcije.

Transfekcija K562 stanica odaje endosomolitička svojstva adenovirusa. Humana eritroleukemična stanična linija K562 sadrži cca 150.000 transferin receptora (Klausner, R.D., i sur., 1983b). U prisutnosti klorokina, kao što su ranije objavili Cotton M. i sur., 1990, ove stanice mogu biti transferinficirane u veoma visokoj mjeri, sa polilizin-transferin reporter DNA kompleksima, čak i u odsutnosti adenovirusa (TfpL, slika 33). Isti kompleksi sa dodatkom slobodnog adenovirusa, i u odsutnosti korokina, dali su relativno slabe razine izražaja reporter-gena (AdenoV/TfpL), vjerojatno zato što K562 stanice, kao i druge krvne stanice, (Silver, L. i sur., 1988; Horvath, J. i sur., 1988), imaju niske razine adenovirusnih receptora. Kad se adenovirus poveže na polilizin putem biotih/streptavidin mosta, a reporter DNA se sasvim kondenzira dodatkom više polilizina da bi se popunio binarni kompleks, (pLAdenoV/pL), adenovirusom podpomognuta transfekcija dostiže srednje razine. Vjerojatno se neki receptori adenovirusa na K562 stanicama koriste djelotvorno. Ako se, međutim, vezana adenovirus-polilizin-reporter DNA potpuno kondenzira i neutralizira dodatkom polilizin-transferina, da bi se formirao ternarni kompleks pLAdenoV/TfpL i da bi brojni stanični receptori transferina dobili ulogu, učinkovitost transfekcije, zahvaljujući kako efikasnom povezivanju transferina, tako i endosomolitičkim svojstvima virusa, povećava se najmanje za dva reda veličine (slika 33).

Ternarni DNA kompleksi dovode do izražaja reporter-gena gotovo u 100% hepatocita. Djelotvornost novih DNA transportnih kompleksa testirana je također u mišjim hepatocitima (BNL CL.2), određivanjem postotaka stanica, koje se mogu dostići našim raznim protokolima transfekcije. Kao reporter-gen upotrebljavan je gen β-galaktosidaze, tjeran CMV promotorom. Nakon ustaljivanja stanica ustanovi se aktivnost - galaktosidaze prema Limu i Chae-u, 1989.

Slika 34 pokazuje pokus galaktosidaze na mišjim hepatocitima nakon a) transferinfekcije u prisutnosti klorokina, b) transferinfekcije u prisutnosti slobodnog d1312 adenovirusa i c) transfekcije sa ternarim, povezanim (d1312) kompleksima adenovirus-polilizin-transferin-reporter DNA. U odsutnosti adenovirusa, nakon standardne transferinfekcije reporter-DNA, tek nekoliko stanica izražava reporter gen. Postotak transfekcije je manji od 0,1%. Kad je uključen klorokin, procenat poraste do oko 0,2% (slika 34a). Sa slobodnim adenovirusom oko 5 do 10% stanica izražava reporter-gen (slika 34b), dok ternarni kompleksi sa transglutaminazom modificiranim virusom dovode do izražaja u većini, ako ne u svim stanicama (slika 34c). Budući da se ternarni kompleksi mogu upotreblajvati u velikom razrjeđivanju, toksički se učinak, koji je uočljiv kod visokih doza adenovirusa (slobodnog, inaktiviranog) obično ne pojavljuje. No, treba naglasiti da se u slučaju kad se ternarni kompleksi pojavljuju u visokoj koncentraciji sa ciljem da se dohvati 100% stanica kulture tkiva, postaje uočljiv sličan tolsični učinak. Toksični učinci mogu biti uzrokovani preostalom viralnom aktivnošću gena, endosomolitičkim osobinama dodanog virusa ili jednostavno kao posljedica veoma visoke razine izražaja transficiranog gena.

Izražaj transficiranog reporter gena je prolazan, no u nepodijeljenim hepatocitima traje tjednima. Ternarni transportni kompleksi (pLAdenoV/TfpL) su načinjeni sa d1312 polilizin adenovirusom i d1312 modificiranim adenovirusom, zatim su inaktivirani reakcijom virusa sa psoraleom. Dvije trećine spojene hepatocitične kulture stanica transficirano je kao na slici 34b, sa reporter genom luciferaze CMVL, a aktivnost luciferaze je određena u različitim vremenskim točkama. Kao što se može vidjeti iz slike 35, aktivnost luciferaze je najveća nakon tri dana, kad kultura hepatocitičnih stanica postane zajedno skupljena i stanice se prestanu dijeliti. Izražaj reporter gena ostaje u nepodijeljenim stanicama kulture, bez primjene selekcije za održavanje gena i traje najmanje 6 tjedana, osobito kad se za stvaranje ternarnih transferin transportnih kompleksa koristi proralenom inaktivirani adenovirus.

Primjer 24 - Upotreba pilećeg adenovirusa CELO za povećanje predaje DNA u humane stanice.

U ovom je primjeru testiran pileći adenovirus CELO na njegovu sposobnost da pojača prenošenje DNA u humane HeLa stanice, na način jednak kao u gornjim eksperimentima u kojima se koristi humani adenovirus 5.

Pileći adenovirus CELO (Phelps soj, serotip FAV-1,7, prolaz pilećih bubrežnih stanica) je korišten u ovim pokusima. Virus (2 ml) se propušta kroz kolonu za gel filtraciju, pripremljenu sa 20 mM HEPES pH 7,3 150 mM NaCl, (HBS) + 10% glicerola i 2 ml eluenta reagira sa 20 µl l mM NHS-LC-biotin (Pierce), 3 sata kod sobne temperature. Biotinilirani se virus zatim dijalizira prema 3 x 300 ml HBS + 40% glicerola, kod 40ºC i alikvoti se čuvaju na -70ºC.

HeLa stanice (5x105 stanica po posudici od 6 cm) inkubiraju se u 2 ml DMEM + 2% FCS sa 6 µg plasmida pCMVL kompleksiranog sa polilizinom (pLys) ili transferin-polilizinom (TfpL) smjesama u 500 µl HBS (kompleksi su prethodno inkubirani 30 minuta kod sobne tempeature). Uzorci se zatim dodaju stanicama kod 37ºC u prisutnosti količine virusa naznačene na slici 36. Sa uzorcima koji sadrže biotinilirani CELO virus, navedena količina streptavidin-polilizina (StrpL) u 200 µl HBS se prethodno inkubira 30 minuta kod sobne temperature, prije dodavanja 6 µl plasmida (pCLuc) u 100 µl HBS. Nakon 30 minuta inkubacije kod sobne temperature, naznačena se količina TfpL materijala doda stanicama kod 37ºC. Dva sata kasnije doda se 5 ml DMEM + 10% FCS, a 24 sata kasnije stanice se požanju i prirede za pokus luciferaze. Rezultati su prikazani na slici 36.

Kao što se na slici 36 vidi, CELO virus kao slobodni entitet, pojačava prijenos DNA u HeLa stanice (stupci 1-6). Međutim, kad je CELO virus modificiran sa biotinom i uključen u kompleks sa streptavidinom, bilo sa ili bez dodatnog transferin-polilizina, nađeno je da virus pojačava prijenos DNA na razinu koja se može usporediti s onom postignutom uz upotrebu humanog adenovirusa d1312. Pojedine linije HeLa stanica pokazuju veliki kapacitet povezivanja sa polilizin/DNA kompleksima u odsutnosti transferina (usporedi aktivnost luciferaze uzoraka 1 i 4 na slici 36), stoga je uključivanje CELO virusa u polilizin/DNA kompleks dovoljno da potakne prihvaćanje virusa.

Primjer 25 - Transfekcija mioblasta.

a) Transfekcija mioblasta i miotuba sa DNA/transferin-polilizin kompelksima u prisutnosti slobodnog adenovirusa i u prisutnosti biotin/streptavidinom vezanog adenovirusa

C2Cl2 mioblasti (Blau i sur., 1985; ACTT No.: CRL 1772) i G8 mioblasti (ATCC No.: 1456) uzgajani su u visoko glukoznom DMEM + 10% FCS. Kulture mioblasta su transferirane sa cca 5 x 105 stanica po posudici. Kulture miotuba su pripremljene stavljanjem mioblasta na ploče 6 cm posudica (ca 5 x 105 stanica po posudici) i mijenjanjem medija sa visoko glukoznim DMEM + 2% konjskog seruma kad stanice dostignu spajanje (Barr i Leiden, 1991; Dhawan i sur., 1991). Transfekcija miotuba se izvede 5-7 dana kasnije. Transfekcijski su kompleksi priređeni kao što je opisano u primjeru 19, uz upotrebu naznačenih količina TfpL, StrpL i biotiniliranog adenovirusa d1312. Stanice se pokupe 20 sati nakon transfekcije i izvede se mjerenje aktivnosti luciferaze. Slika 37 pokazuje dobivene aktivnosti luciferaze u l.j. (Light Units) za cijeli uzorak stanica. Kulture mioblasta kao i kulture miotuba mogu se transficirati voema efikasno. Po diferencijaciji na miotube bilo je manje od jednog log smanjenja djelotvornosti transfekcije (C2Cl2), ili nije bilo značajnijeg smanjenja (G8). Udio u stvaranju miotuba zapažen je kod nižih gustoća sa G8 linijom, koja se može pripisati nedostatku primjetljivog smanjenja efikasnosti kod diferencirane kulture. Uloga transferin/transferin receptorske interakcije u prijenosu DNA u taj tip stanice nije velik. U sva četiri pripravka stanca bilo je slabog prijenosa DNA pomoću TfpL/DNA kompleksa, u prisutnosti slobodnog adenovirusa d1312 (stupci 1, 4, 7, 10). Učinkovitost transfekcije je pojačana upotrebom spojenih virusnih sustava (stupci 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12). Tu je biilo manje od 1 log povećanja učinkovitosti, upoređujući prijenos sa kombinacijskim kompleksima koji su sadržavali samo virus i polilizin/StrpL kondenziran na komplekse, koji obuhvaćaju transferin-polilizin (usporedi, na primjer, stupce 2, bez transferina, sa stupcem 3, transferin). Slaba transfekcija sa slobodnim virusom i visoka transfekcija sa spojenim virusnim kompleksima, bilo u prisutnosti ili u odsutnosti transferin-pL, sugerira da adenovirus služi kao ligand u tim stanicama te u odsutnosti spajanja slobodni virus može ući u stanice ali TfpL/DNA kompleks ne ulazi. (DNA korištena u ovom primjeru je bila pCMVL, označena kao pCLuc na slici).

b) Histokemijska analiza učestalosti transfekcije u miotuba.

C2Cl2 kulture miotuba (5 x 105 stanica, kao mioblasta, nasađenih po posudici od 6 cm i diferenciranih u miotube) pripremljene su na u a). Sa uzorcima slobodnog virusa kompleksira se pCMV-β-gal DNA (6 µg) sa 8 µg TfpL u 500 µl HBS i doda se stanicama u prisutnosti 18 µl adenovirusa d1312 (1 x 1012 virusa/ml) u 2 ml DMEM/2% FCS. Spojeni uzorci virusa se pripremaju sa pCMVLacZ DNA (6 µg) kompleksiranom sa 7 µg TfpL i 800 ng StrpL + 18 µl biotiniliranog adenovirusa d 1312 (1 x 1012 virusa po ml) u 500 µl HBS i doda se stanicama u 2 ml DMEM/2% FCS. Nakon 24 sata inkubacije stanice su pripremljene za aktivnost β-galaktosidaze, kao što je opisano u primjeru 15. Za β-galaktosidazu označeni primjerci bili su u skladu sa rezultatitma transfekcija uz luciferazu kao reporter gen (vidi a). Veoma slabi izražaj gena je postignut u kulturama miotuba sa slobodnim virusom, dok je spajanje virusa i DNA dovelo do visoke razine izražaja gena. Prisutnost plavkastih multi-nuklearnih tubula pokazala je uspješani prijenos gena ovim diferenciranim stanicama, u prisutnosti slobodnog adenovirusa.

c) Prijenos DNA mišjem izvornom mioblastu i kulturama miotuba.

Veći skeletni mišići stražnjih nogu 4 tjedna starog miša mužjaka (C5781/6) sterilno su izolirani u PBS i samljeveni u komadiće od cca 5 mm. Tkivo je suspendirano u 20 ml PBS, ostavljeno da se slegne cca 2 minute i supernatant je odsisan. Ovo je pranje ponovljeno tri puta. Tkivo se zatim pomiješa sa 3,5 ml PBS + 0,5 ml tripsin/EDTA, 0,5 ml 1% (tež.) kolagenaze (tip II, Sigma), i 0,5 ml 1% BSA (frakcija V, u 4 mM CaCl2) i ostavljeno je na inkubaciji kod 37ºC 30 min, uz češće blago miješanje. Nakon 30 minuta inkubacije ostavi se preostalo tkivo da se slegne i supernatant se ukloni i pomiješa sa 5 ml DMEM + 20% FCS. Inkubacija sa proteazom se ponavlja 3-4 puta, sve dok se tkivo potpuno ne dispergira. Suspenzija stanica se zatim propušta kroz cjedilo za stanice (Falcon) da se uklone nakupine i fragmenti tkvia te se centrifugira kod 500 g, 15 minuta. Peleta stanice se ponovo suspendira u 10 ml DMEM + 20% FCS i fibroblasti se uklone razmazom stanica na nepokrivenu posudu za kulturu tkiva, promjera 15 cm, 60 minuta. Slobodne stanice se zatim pažljivo uklone i razmažu na 5 lamininom prevučenih posudica za kulturu tkiva, od 10 cm Ø, sa 15 ml DMEM + 20 FCS po posudici. Nakon što se stanice spoje (približno nakon tjedan dana), one se tripsiniziraju i ponovno razmažu na lamininom prevučene posudice od 6 cm, približno 1 x 106 stanica po posudici. Da bi se stvorile kulture miotuba, približno 5 dana kasnije (kad stanice postignu spajanje), medij se izmijeni na DMEM + 2% konjskog seruma te jedam tjedan kasnije izvede se transfekcija u 6 cm posudicama uz cca 80% spajanja stanica. Lamininom presvučene ploče za kulture stanica pripremljene su na slijedeći način. Posudice za stanične kulture prevuku se sa 0,025 mg/ml polilizina (m.tež. 30.000 do 70.000, Sigma) u sterilnoj vodi, 30 minuta kod sobne temperature. Ploče se isperu tri puta sterinom vodom i osuše na zraku. Zatim se ploče premažu sa 8 µg/ml laminina (EHS, Sigma) u vodi, preko noći kod sobne temperature. Ploče se zatim isperu tri puta sterilnom vodom, prije nasađivanja stanica.

DNA kompleksi uzeti za transfekciju priređeni su razrjeđenjem navedene količine psoralena ili UV-zračenjem inaktiviranog biotiniliranog adenovirusa d1312 (pripremljenog kao što je opisano u primjeru 19) u 150 µl HBS te dodatkom 1 µg StrpL u 150 µl HBS , a zatim inkubacijom kod sobne temperture 30 minuta. Zatim se doda HBS (100 µl) koji sadržava 6 µg pCMVL (označenog u slici sa pCLuc) u svaki uzorak, a inkubacija se provodi još 30 minuta kod sobne temperature. Na kraju se doda 7 µg TfpL u 100 µl HBS, svakom uzorku inkubiranom 30 minuta, te se doda ili kulturi mioblasta ili kulturi miotuba, u posudicama od 6 cm, koja sadrži 2 ml DMEM + 2% FCS. Nakon jednog sata inkubacije, medij se zamijeni sa 5 ml DMEM + 20% FCS (mioblasti) ili DMEM + 2% konjskog seruma (miotubi) i 48 sati kasnije stanice se požanju za analizu luciferaze. Aktivnost lucifraze iz čitavog uzorka stanica prikazana je na slici 38.

Primjer 26 - Poboljšanje prijelaza CELO virusa u mioblaste uz upotrebu lektin liganda

a) Komparativna analiza adenovirusa d1312 i CELO virusa u HeLa i C2Cl2 mioblastima,

Uzorci ili HeLa stanica ili C2Cl2 mibolasta (5 x 105 stanica po posudici od 6 cm) transficiraju se sa 6 ug pCML (označeno u slici sa pCluc) kompleksiranog sa 1 µg StrpL/7 µg TfpL + 5 µl biotiniliranog adenovirusa d1312 (vidi primjer 19, 1 x 1012 čestica/ml) ili 18 ul biotiliniliranog CELO virusa (vidi primjer 24, 0,3 x 1012 čestica po ml. Nakon 20 sati inkubacije stanice se pokupe i pripreme za mjerenje aktivnosti luciferaze. Rezultate aktivnosti luciferaze svakog cijelog uzorka stanica prikazuje slika 39.

Treansfekcija u HeLa stanicama se može izvesti sa usporedljivim učincima pomoću adenovirus d1312/StrpL/TfpL/DNA kompleksa, koji mogu ući u stanice putem adenovirusnih receptora ili putem transferin receptora, ili pomoću kompleksa virus/StrL/TfpL/DNA, koji mogu ući putem transferin receptora. Međutim, dok prijelaz DNA u C2Cl2 mioblaste može biti efikasno proveden sa kompleksima adenovirusa d1312, kompleksi koji sadrže CELO virus, u tim stanicama djeluju slabo. Prijašnji su pokusi pokazali da transferin receptor ima malu ulogu u prijelazu kombinacijskog kompleksa u stanice. Vjerojatno je receptor adenovirusu glavno mjesto ulaza. Slaba aktivnost CELO virusa u mioblastu može, zatim, biti uzrokovana slabom vezom i CELO virusa i transferia sa C2C12 mioblastima.

b) Poboljšanje transfekcije mioblasta C2Cl2 virusom CELO, pomoću aglutinina pšeničnih klica kao liganda.

Radi slobog prijelaza postignutog u a), odabran je novi ligand kao zamjena za transferin.

Biotinilirani alutinin pšenične klice (2-4 mola biotina na mol proteina) nabavljen je od Boerhringer Mannheim. Biotinilirani CELO virus je priređen kao što je prethodno opisano. Kompleksi, koji sadrže 6 µg pCMVL + naznačene količine StrpL, TfpL, biotiniliranog aglutinina pšeničnih kica (WGA-B) i CELO virus, priređeni su na slijedeći način. Virus i WGA su zajedno razrjeđeni u 150 µl HBS i obje su otopine pomiješane i inkubirane kod sobne temperature, 30 minuta. Otopini StrL/Virus/WGA doda se DNA razrjeđena u 100 µl HBS i inkubacija se provodi daljnjih 30 minuta, kod sobne temperature. Konačno, doda se TfpL u 100 µl HBS i smjesa se inkubira još 30 minuta kod sobne temperature. Kompleksi se dodaju C2Cl2 mioblastima (5 x 105 stanica po 6 cm posudici) u 2 ml DMEM + 2% FCS. Jedan sat kasnije doda se stanicama 5 ml DMEM + 10% FCS, a 20 sati kasnije stanice se prirede za mjerenje aktivnosti luciferaze. Aktivnost (light units) u svakom cijelom uzorku stanica iskazana je na slici 40. (DNA korištena u tom primjeru bila je PCMVL, označena na slici kao pCluc).

U odsutnosti virusa postignut je veoma slabi prijelaz DNA, bilo sa ili bez WGA (stupci 1, 6). Umjereni prijelaz je postignut sa spojenim CELO virusom (stupac 2), međutim, ako je u kompleks bio uključen WGA, postignuto je 16-erostruko povećanje prijelaza. Povećanje količine WGA u kompleksu (od 1 µg do 5 µg) dovelo je do neznatnog smanjenja prijelaza (usporedi stupce 3 i 4) dok je povećanje sadržaja StrpL u kompleksu (od 1 µg do 2 µg) neznatno povećalo prijelaz (usporedi stupce 3 i 5). Ovi rezultati očito pokazuju da WGA-B kao ligand, povećava CELO virusom upravljani prijenos DNA u C2Cl2 stanice.

d) Izražaj pune dužine gena fatora VIII u kulturama C2Cl2 mioblasta i mituba.

Kulture C2Cl2 mioblasta i miotuba priređene su kao što je gore opisano. Transfekcije su izvedene sa 6 µg plasmida koji označava punu dužinu humanog faktora VIII cDNA (Wood i sur., 1984; Eaton i sur., 1986) kompleksirane sa 5 ili 15 ul biotiniliranog adenovirusa (kako je naznačeno) + 0,5 ili 1 µg StrpL, i 7 ili 6 µg TfpL u standardnom protokolu stvaranja kompleksa.

Kompleksi DNA/virs dodani su stanicama u 2% FCS/DMEM. Nakon 4 sata inkubacije kod 37ºC, doda se u svaku posudicu po 3 ml svježeg DMEM + 10% FCS. Nakon 18 sati substrat se požanje i izvede se pokus na prisutnost faktora VIII, pomoću COATEST (KABI, Pharmacia) test sistema sa internacionalnim standardom kao referentnim uzorkom. Faktor VIII je unešen u dijagram u m jedinicama stvorenim u 24 sata po 1 x 106 stanica (slik 41).

Primjer 27 - Upotreba proteina adenovirusa za prijenos DNA.

Adenovirus wt300 uzgajan je u HeLa stanicama, pročišćen i biotiniliziran kao što je opisano za adenovirus d1312. 1,2 ml virusa se dijalizira prema 3 x 300 ml 5 mM MES, 1 mM EDTA pH 6,25 4ºC, 18 sati. Materijal je zatim centrifugiran 30 minuta kod 27 K u SW60 rotoru. Supernatant je pažljivo uklonjen, peleta je ponovno suspendirana u HBS/40% glicerola. HEPES pH 7,4 i NaCl se doda supernatantu do 20 mM i 150 mM, a zatim su dijelovi pelete (koji sadržavaju virusnu jezgru i masu hekson kapsida, “jezgra” u slici 42) kao i supernatanta testirani na DNA prijelaz i u Mov13 mišje fibroblaste (Strauss i Jaenisch, 1992) i u HeLa stanice.

Stvaranje kompleksa sa DNA je izvedeno na slijedeći način. Naznačene količine svake frakcije, raspadnuti virus prije centrifugiranja ili intaktni virus (izražen u ug proteina određenim po Bradfordu), razrjeđeni su u 300 µl HBS). Streptavidin-polilzin (3 µg u 50 µl HBS) se doda, a zatim se inkubira 30 minuta kod sobne temperature. 6 µg pCMVL (na slici označenog pCluc) razrijedi se u 100 µl HBS i doda prvoj otopini za inkubaciju 30 minuta. U uzorcima priređenim samo sa TflpL u 170 µl HBS pomiješa se sa 6 µg pCMVL u 330 µl HBS, 30 minuta kod sobne temperature. Naznačene količine virusnog proteina razrijedi se u 300 µl HBS i aztim se dodaju kompleksima TfpL/DNA. Svi su uzorci zatim dodani u 5 x 105 stanica, u posudici od 6 cm, koja je sadržavala 2 ml DMEM/10% FCS (bilo HeLa ili Mov13 fibroblasti), na 1 sat. Zatim se doda 5 ml sviježeg medija koji sadržava 10% FCS i stanice se prirede za aktivnost luciferaze 20 sati kasnije. Rezultat aktivnosti luciferaze (u jedinicama l.j. - “Light units”) prikazan je na slici 42, za HeLa stanice (grafikon A) ili za Mov13 fibroblaste (grafikon B).

Kod oba tima stanica postoji o dozi ovisna aktivnost prijela DNA, vezana na najvišu frakciju (uzorak 4-6 u obadva grafikona). Kad je ista količina biotiniliranog virusnog proteina obuhvaćena sa kompleksima TfpL/DNA, bez streptavidin-polilizina, zapažen je prijelaz DNA sasvim na razinama osnove (uzorak 3 u svakom grafikonu).

Primjer 28 - Pojačani prijenos gena upotrebom DNA ternarnih kompleksa, koji sadrže konjugat galaktoznog liganda.

a) Ternarni kompleksi koji sadrže konjugat peptida influence.

Prisutnost polilizinom konjugiranih peptida, koji sadrže nizove izvedene iz N-terminusa virusnog hemaglutinina influence, podjedinice HA-2, DNA/transferin-polilizin kompleksima bitno povećava prijenos gena upravljan transferin-polilizinom. (Primjeri 13 i 14).

Slični kombinacijski DNA kompleksi, koji sadrže “tetra-antenski” ligand-polilizin konjugat galaktoze i polilizinom modificirani peptid influence InflupL (pripremljen kao što je opisano u primjeru 6, odnosno 13), priređeni su dodavanjem konjugata ligand-polilizin plasmidu DNA pCMVL, da se neutralizira polovina DNA naboja, s tim da se ostatak naboja koristi za nabijanje kompleksa sa konjugatom influence. Prijelaz ovih DNA kompleksa, koji sadrže sitetički ligand (gal)4, BNLCL.2 hepatocitima (transfekcije su izvedene kao što je opisano u primjeru 6 g), rezultirao je izražajem gena luciferaze (slika 43) koji je znatno veći od izražaja postignutog sa transferinom kao ligandom. Izražaj je više od 500 puta veći nego kod kontrolnih eksperimenata, postignut sa DNA kompleksima bez peptida influence, ali sa istom količinom polilizina (slika 43). Aktivnost postignuta sa DNA kombinacijskim kompleksima, bila je također oko 30 puta veća nego sa DNA/(gal)4pL kompleksima inkubiranim sa stanicama u prisutnosti klorokina.

b) Ternarni kompleksi koji sadrže konjugat adenovirusa.

Kompleksi su pripremljeni kako slijedi: biotinilirani adenovirus d1312 (priređen kao u primjeru 19; 2 µl, 6 µl ili 18 µl; 1012 čestica/ml) u 50 µl HBS, pomiješa se sa streptavidin-polilizinom (100 ng, 160 ng ili 480 ng) u 100 µl hbs. Nakon 30 minuta inkubacije doda se otopina od 6 µg pCMV-L u 200 µl HBS i, nakon daljnjih 30 minuta, doda se otopina od 3,8 µg (gal)4pL (priređenog kao u primjeru 6) ili 7 µg TfpL u 150 µl HBS.

Otopina DNA kompleksa se dodaju na svakih 300.0000 stanica (ATCC TIB 73, ATCC TIB74, ATCC TIB75, ATCC TIB76) uzgajanih na pločama od 6 cm u visoko glukoznom DMEM + 2% FCS. Daljnji pokusi kultura stanica i testovi luciferaze, izvedeni su kao što je opisano. Izražaj gena (nakon 24 sata) prikazan je na slici 44.

Primjer 29 - Prijenos DNA sa transferin-polilizinom u prisutnosti slobodnog i konjugiranog rhinovirusa

a) Priprema rhinovirusa HRV-2.

Rhinovirus HRV-2 je priređen i pročišćen kao što je opisano (Skern i sur., 1984).

400 µl otopine rhinovirusa (pribl. 30 µg) u HBS (150 mM NaCl/5mM HEPES pH 7,9)/10% glicerola, obradi se sa 10 nmola NHS-LC-biotina (Pierce 21335). Nakon 3 sata inkubacije kod sobne temperature, virus je odijeljen od neugrađenog biotina dugom dijalizom prema HBS/glicerolu kod 4ºC.

Na svjetlo osjetljivi rhinovirus, pripremljen uzgojem virusa u prisutnosti akritin-oranža, inaktiviran je kao što je opisano (Madshus i sur., 1984).

b) Priprava DNA kompleksa i transfekcije.

I)Transferin-polilizin / DNA kompleksi su priređeni miješanjem otopine od 6 µg DNA plasmida pCMVL i 330 µl HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,3) sa otopinom od 8 µg TfpL290 u 170 µl HBS.

DNA kompleksi se miješaju sa 1,5 ml substrata (DMEM + 2% FCS) i sa 0,14 µg do 3,5 µg rhinovirusa HRV-2 (ili inaktiviranog HRV-2). Smjesa se doda u NIH 3T3 stanice (300.000 stanica po 6 cm ploči). Četiri sata kasnije transficirani se medij zamijeni sa 4 ml svježeg DMEM + 10% FCS. Stanice se pokupe nakon 24 sata i izmjeri se aktivnost luciferaze kao što je prije opisano (slika 45A).

II) DNA kombinacijski kompleksi, koji sadržavaju transferin-polilizin i rhnovirus-polilizin konjugate, pripremljeni su kako slijedi:

100 µl otopine biotiniliranog rhinovirusa HRV-2 (3,5 µg) u HBS pomiješa se sa 1 µg streptavidiniliranog polilizina u 100 µl HBS. (druge su kombinacije virusa pomiješane sa odgovarajućim količinama). Nakon 30 minuta kod sobne temperature, otopina se pomiješa sa 6 µg DNA plasmida u 150 µl HBS, inkubira se daljnjih 30 minuta kod sobne temperature i zatim se pomiješa sa 6 µg TfpL290 u 150 µl HBS.

DNA kompleksi se miješaju sa 1,5 ml medija (DMEM + 2% FCS) i dodaju se stanicama NIH 3T3 (300.000 stanica po ploči od 6 cm).

Daljnja obrada kultura i test na aktivnost luciferaze izveden je kao što je opisano u I) (slika 45B).

Primjer 30 - Transfekcija HeLa stanice sa kombinacijskim kompleksima koji sadrže ionski vezani adenovirus

Stvaranje kompleksa A) DNA kompleksi se priređuju miješanjem 30 µl adenovirusa d1312 (pribl. 109 PFUs) sa 1 µg polilizina pLys450 (prosječne dužine lanca od 450 monemera) u 170 µl HBS i, nakon 30 minuta kod sobne temperature, miješanjem sa 6 µg pCMVL-DNA u 170 µl HBS. Nakon inkubacije daljnjih 30 minuta, kompleksi se miješaju sa 9 µg TfpL190 u 170 µl HBS. Alikvot kompleksne smjese (10% = 50 µl otopine, 600 ng DNA; ili 1% 0 5 µl otopine 60 ng DNA) razrijedi se u 1,5 ml DMEM + 2% FCS i doda na 300.000 HeLa stanica. Nakon 4 sata doda se 2 ml DMEM + 20% FCS. 24 sata nakon transfekcije izvrši se žetva stanica i pokus lucireraze, kako je opisano. Aktivnost luciferaze, koja odgovara ukupnom ekstraktu, bila je 29115000 l.j. (“Light units”), u slučaju 600 ng DNA te 1090000 l.j. u slučaju od 60 ng DNA.

Kontrolni eksperiment: Stvaranje kompleksa B) DNA kompleksi su priređeni najprije miješanjem 6 µg pCMVL-DNA u 170 µl HBS sa 1 µg polilizina pLys450 (prosječne dužine lanca od 450 monomera) u 170 µl HBS i nakon 30 minuta kod sobne temperature, miješanjem sa 9 µg TfpL190 u 170 µl HBS. Nakon daljnjih 30 minuta inkubacije, kompleksi se miješaju sa 30 µl adenovirusa d1312 (pribl. 109 PFUs). Alikvot smjese kompleksa (10% 0 50 µl otopine, 600 ng DNA; ili 1% = 5 µl otopine, 60 ng DNA) razrijedi se u 1,5 ml DMEM + 2% FCS i doda se na 300.000 HeLa stanica. Nakon 4 sata doda se 2 ml DMEM + 20% FCS. 24 sata nakon transfekcije se obavi žetva stanica i pokus luciferaze, kao što je prije opisano. Aktivnost luciferaze, koja odgovara ukupnom ekstraktu bila je 405000 l.j. (u slučaju 600 ng DNA) i 200 l.j. (u slučaju 60 ng DNA).

Primjer 31 - Lokalna primjena DNA/adenovirus/transferin-polilizin konjugata u jetru štakora.

a) Direktna injekcija

Kompleksi su pripremljeni kao što je opisano u primjeru 19. Oni obuhvaćaju 200 µl biotiniliranog adenovirusa d1312, 6,4 µg streptavidin-polilizina, 48 µg pCMVL i 48 µg TfpL290 u ukupnom volumenu od 2000 µl HBS. Mužjak štakora Sprague-Dawley, od 240 g je anesteziran Avertinom i izvršena je laparotomija od 4 cm. Otopina kompleksa je injektirana u lijevi režanj jetre. zatim je rana zatvorena u slojevima. Nakon 48 sati injekcije kompleksa štakor je žrtvovan i izmjerena j aktivnost luciferaze. U području injiciranja je izmjereno 5615 l.j./po mg proteina homogenata jetre. Ukupna aktivnost luciferaze, na mjestu injiciranja, bila je 370.600 l.j.

b) Primjena konjugata u jetru putem sustava žučne drenaže.

Kompleksi su pripremljeni kako slijedi: 200 µl biotiniliranog adenovirusa d1312 razrijedi se sa 200 µl HBS i inkubira sa 6,4 µg streptavidinom modificiranog polilizina u 400 µg pCMVL u 800 µl HBS. Nakon 30 minuta inkubacije, doda se još 48 µg TfpL u 900 µl HBS. Za primjenu kompleksa anestezirani su mužjaci štakora Sprague-Dawley (250 g tjelesne težine) Avertinom i otvoren je abdomen središnjim rezom. Crijeva su pomaknuta na lijevu stranu tijela i u žučni vod je uložena igla G 27, koja je pričvršćena na cijev i špricu od 1 ml. Injekcija kompleksa je izvedena tijekom perioda od 4 minute. Zatim je igla izvučena iz učovoda i mjesto injiciranja je zalijepljeno fibrinskim ljepilom (immuno). Abdominalna je rana zatvorena šavovima i metalnim kopčama. Nakon 30 sati štakor je žrtvovan i uzorci različitih režnjeva jetre su ispitani na izražaj gena luciferaze. Maksimum aktivnosti luciferaze bio je 19000 l.j./mg proteina, a izračunati ukupni izražaj u cijeloj jetri bio je u rasponu od 2,7 x 106 light units.

Primjer 32 - Lokalna primjena DNA/adenovirus/tranferin-polilizin konjugata u štipaljkom stisnutoj veni mišjeg repa.

Kompleksi su pripravljeni kao što je opisano u primjeru 19.

Oni sadržavaju 45 µl biotiniliranog adenovirusa d 1312, 0,8 µg streptavidin-polilizina, 6 µg pCMVL i 24 µg TfpL290 u ukupnom volumenu od 170 µl HBS. Kompleksi su injektirani u venu repa mužjaka C3H/He miša (starog dva mejseca), koji je anesteziran Avertinom. Neposredno nakon injektiranja vena je na 20 minuta stegnuta štiopaljkom na proksimalnom i distalnom kraju repa, tako da je otopina kompelksa orgraničena na segment vene repa u koji je uštrcana, a ne može se razići putem krvi. 48 sati nakon injekcije miš je žrtvovan i vena repa je preprarirana. Izražaj luciferaze je izmjeren u homogenatu segmenta vne repa. Izražaj je rezultirao u 2.600 l.j./3 cm repa.

Primjer 33 - Transfekcija izvornih stanica humanog melanoma.

Stanice primarnog melanoma izolirane su iz melanoma, koji je bio kiruški uklonjen iz pacijenta, mehaničkim mrvljenjem tumora u RPMI 1640 mediju + 5% FCS, 2 mM glutamina i antibiotika te tlačenjem fragmenata tkiva kroz čelično sito. Tumorske su stanice isprane centrifugiranjem i ponovnim suspendiranjem te su nasađene u T25 bočice za kulturu stanica. 24 sata nakon izolacije tumorske su stanice transficirane kombinacijskim kompleksima koji su sadržavali 3 µl, 9 µl ili 27 µl biotiniliranog adenovirusa d1312 (1 x 1012 virusa/ml), 0,5 µg streptavidinin-polilizina, 6 µg pCMVL i 7 µg TfpL290 u ukupnom volumenu od 500 µl HBS. 36 sati nakon transfekcije stanice se pokupe i odredi se izražaj luciferaze. Rezultati su prikazani na slici 46.

Primjer 34 - Transfekcija izvornih humanih fibroblasta.

Biopsije humane kože stavljene su na petrijevu posudicu od 6 cm, koja je sadržavala DMEM, 2 mM glutamina, 20% FCS i antibiotike. Zatim su biopsije temeljito usitnjene kiruškim nožem i uzgajane u prisutnosti 3 ml substrata, 5 dana. Nakon toga stanice su isprane svježim DMEM, koji je sadržavao 2 mM glutamina, 10% FCS i antibiotike, i uzgajane su daljnjih 7 dana. Nakon toga stanice su tripsinizirane i opet uzgajane u novim petrijevim posudicama. Kad su se stanice gotovo spojile, one su ponovno tripsinizirane i čuvane zamrznute do transfekcije. Za transfekciju stanice se rastope i nasade u 6 cm petrijeve posudice te se uzgajaju u DMEM, koji sadrži 2 mM glutamina 10% FCS i antibiotike. Transficirani se konjugati pripremaju kako slijedi: 3 µl, 10 µl, 20 µl i 30 µl biotiniliranog adenovirusa d1312 inkubiraju se sa 0,1 µg, 0,3 µg, 0,5 µg i 0,8 µg polilizinom modificiranog streptavidina u 150 µl HBS, 30 minuta kod sobne temperature. Zatim se doda 6 µg pCMV- gal plasmida u 170 µl HBS i smjesa se inkubira daljnjih 30 minuta. U konačnoj se fazi doda 7,8 µg TfpL za konjugate sa 3 µl d1312, 7 µg TfpL za 10 µl d1312 i 6 µg TfpL za konjugate sa 20 µl i 30 µl d1312 i 179 µg HBS. Nakon 30 minuta inkubacije konjugati se dodaju stanicama u 2 ml DMEM koji sadrži 2 mM glutamina, 2% FCS i antibiotike i stanice se inkubiraju 4 sata kod 37ºC sa DMEM kojis adržu 2mM glutamina, 10% FCS i antibiotike. Nakon 48 sati pokazan je izražaj β-galaktosidaze, kao što je opisano u prethodnim primjerima.

U transfekciji sa 3 µl d1312 14% stanica je pokazalo produkciju β-galaktosidaze, sa 10 µl d1312 32% pozitivnih stanica je dobiveno, sa 20 µl d1312 39% i sa 30 µl d1312 64% stanica bilo pozitivno.

Primjer 35 - Prijenos gena pomoću ne-virusnih adenosomolitičkih agensa.

a) Sinteza peptida koji razaraju membrane.

I) Sinteza peptida:

Peptidi su sintetizirani na automatskom sinthesizeru (ABI 431A) metodom čvrste faze, uz upotrebu p-alkoksibenzilalkoholne smole (0,97 nmola/g) kao čvrstog nosača i Fmoc-zaštićenih aminokiselina. Karboksi-terminalna aminokiselina se spaja sa smolom putem 1-hidroksi-benzotriazol-dicikloheksilkarbodiimida. Slijedeće su zaštitne grupe postranog lanca upotrebljene: (Trt)Asn, (Trt)Cys (t-Bu)Cys u slučaju EALA i CLF, (t-Bu)Glu, (Trt)His, (t-Bu)Ser.

EALA: (SEQ ID NO:5) Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys

GLF (SEQ ID NO:6) Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Cly Ser Cys

GLF-II (SEQ ID No:7) Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys

GLF-delta (SEQ ID No:8) Gly Leu Phe Glu Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.

EALA-Inf (SEQ ID No:9) Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys

EALA-P50 (SED ID No:10) Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cyd

P50 (SED ID No:11) Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys

Peptidi se odcijepe iz smole i odstrane se zaštitne grupe postranog lanca (izuzev (t-But)Cys), obradom 100 mg nosača na kojem je peptid, sa 3 ml smjese fenol/etanditiol/tioanisol/voda/trifluoroctena kiselina u omjeru 0,75 : 0,25 : 0,5 : 0,5 : 10, kod sobne temperature 1,5 h. Sirovi peptidi se istalože u eteru i isperu dvaput. S-t-Bu zaštićeni peptidi EALA i GLF otope se u malom volumenu 1M trietil-amonijeva bikarobnata (TEAB) pH 8, razrijede se na 100 mM TEAB i dalje pročišćavaju reverzno fazom visoko tlačnom tekućinskom kromatografijom (HPLC) na koloni Nucleosil 500-5C4 (0,1% TFA-acetonitril gradijent). I jedni i drugi peptidi se eluiraju sa oko 50% Ac-nitrila. Slobodna Cys-SH forma peptida dobije se deprotektiranjem TrT-Cys peptida, na isti način kako je gore opisano. Sirovi se peptidi (5mg) otope u 100 µl 100 mM TEAB, pH 8, koji sadrži 1 µl β-markaptoetanola i pročišćavaju gel filtracijom (Sephadex G-25, 100 mM TEAB, 0,5 mM EDTA) i sušenjem zamrzavanjem, ili ionsko-izmjenjivačkom kromatografijom (Mono Q Pharmacia, 20 mM HEPES, pH 7,3 gradijent 0 do 3M NaCl, peptid se eluira sa 1,5 M NaCl).

II) Modifikacija sa N-(hidroksietil)maleimidom

C-terminalna SH grupa GLF-delta, GLF-II, EALA-Inf, EALA-P50, P50 se blokira nakon gel filtracije slobodne SH forme (sephadex G-25, 20 mM HEPES, pH 7,3 0,5 mM EDTA) reakcijom sa 1,3 - 10-ostrukim molarnim viškom N-(hidroksietil)maleimida (1 h kod sobne temperature). Višak maleimida se ukloni gel filtracijom (Sephadex G-25, 100 mM TEAB, pH 8) i peptid (GLF-delta-mal, GLF-II-mal, EALA-Inf-mal. EALA-P50-mal,, P50-mal) se dobiju kao trietilamonijeve soli, nakon sušenja zamrzavanjem.

III) Modifikacija sa 2,2’-ditiobispiridinom:

Slobodni SH peptidi reagiraju sa 10 ekvivalenata 2,2’-ditiobispiridina (20 mM HEPWS, pH 7,9 0,5 mM EDTA) preko noći, kod sobne temperature. Višak reagensa se ukloni gel filtracijom (Sephadex G-25), 100 mM REAB, pH 8) ili kromatografijom ionskim izmjenjivačem (Mono Q Pharmacia, 20 mM HEPES, pH 7,3, gradijent 0 do 3 M NaCl, peptid eluiran sa 1,5 M NaCl) te se dobiju (2-piridiltio)-Cys peptidi (GLF-delta-SSPy, GLF-II-SSPy, EALA-P50-SSPy, P50-SSPY).

IV) Dimerizacija peptida:

Monomer peptida 150 (150 dim) priređen je reakcijom ekvimolarnih količina P50-Cys-(2-piridiltio) i P50-Cys-SH u 20 mM HEPES, pH 7,3, tri dana, kod sobne temperature. Reakcijska se smjesa odijeli na Mono Q koloni (HR 5/5 Pharmacia; 20 mM HEPES, pH 7,3, gradijent 0,09 3 M NaCl, P50-dimer eluiran sa 1,1 NaCl). Heterodimer GLF-SS-P50 je priređen analogno, reakcijom peptida P50, slobodne merkapto forme, sa piridiltio-modificiranim peptidom GLF.

b) Pokus propuštanja liposoma:

Sposobnost sintetičkih peptida da razore liposome ispitivana je oslobađanjem fluprescentne boje iz liposoma nabijenih samogasećom koncentracijom kalceina. Liposomi su priređeni iz fosfatidilholina jajeta reverzno faznim odparavanjem (Szoka i Papahadjopoulos, 1978) sa vodenom fazom od 100 mM kalceina, 375 mM Na+, 50 mM NaCl, pH 7,3 i protiskivanjem kroz 100 nm polikarbonatni filter (MacDonald i sur., 1991) da bi se postigla jednolična raspodjela veličine. Liposomi su odjeljeni iz jednolikog materijala gel filtracijom na Sephadex G-25, sa izo-osmotskim puferom (200 mM NaCl, 25 mM Hepes, pH 7,3). Za ispitivanje propuštanja kod različitih pH vrijednosti, standardna je otopina liposoma razrijeđena 6 µl/ml) u 2 x test puferu (400 mM NaCl, 40 mM Na-citrata). Alikvot od 100 µl se doda u 80 µl serijskog razrjeđenja peptida u vodi, u mikro-titar ploči sa 96 udubljenja (konačna koncentracija lipida: 25 µM) te se ispita na fluorescenciju kalceina kod 600 nm (ekscitacija 490 nm) fluorescentnim fotometrom za mikrotitar ploče, nakon 30 minuta inkubacije kod sobne temperature. Vrijednost za 100% propuštanje dobivena je dodatkom 1 µl 10% otopine Tritona X-100. Jedinice propuštanja su izračuinate kao recipročna vrijednost koncentracije peptida, gdje je zapaženo 50% propuštanje (t.j. volumen (µl), liposomne otopine koja sadrži do 50% po µg peptida. Vrijednosti ispod 20 jedinica se ekstrapoliraju. Rezultati pokusa propuštanja liposoma su prikazani na slici 47. GLF i EALA pokazuju najviše pH specifične aktivnosti.

c) Pokus raspada eritrocita:

Svježi humani eritrociti se isperu nekoliko puta sa HBS i ponovno suspendiraju 2x test puferu odgovarajuće pH vrijednosti (300 mM NaCl, 30 mM Na-citrata) u koncentraciji od 6,6 x 107/ml. Alikvot od 75 ul se doda na 75 ul serijskog razrjeđenja peptida u vodi, u mikro-titar ploči sa 96 udubljenja (konični tip) i inkubira se 1 h kdo 37ºC, uz stalno mućkanje. Nakon uklanjanja neraspadnutih eritrocita centrifugiranjem (1000 rcf, 5 min), 100 ul supernatanta se prenese u novu mikro-titar ploču i odredi se osorpcija hemoglobina kod 450 nm (korekcija osnove kod 750 nm). 100% raspad je određen dodatkom 1 µl 10% Tritona X-100, prije centrifugiranja. Hemolitičke jedinice su izračunate kao recipročna vrijednost koncetracije peptida, kad je zapažen 50% raspad (t.j. volumen (µl) otopine eritrocita koja je raspadnuta od 50% po µg peptida). Vrijednosti ispod 3 hemolitičke jedinice se ekstrapoliraju. Vrijednosti su date na slici 48. Kao što se može vidjeti, P50 dim i EALA-P50 pokazuju najveće pH specifične aktivnosti s obzirom na raspad stanica i/ili oslobađanja većih molekula kao što je hemoglobin. P50 monomeri P50mal i P50 SS-Py imaju nižu aktivnost. Melitin je pokazao najveću aktivnost, no ta aktivnost nije specifična za kisele pH vrijednosti.

d) Priprava DNA kombinacijskih kompleksa:

DNA kompleksi su pripremljeni najprije miješanjem 6 µg pCMVL-DNA u 150 µl HBS sa 4 µg TfpL290 u 150 µl HBS, a zatim miješanjem sa 4 do 20 µg poli(L)lizina290 u 100 µl HBS, nakon 30 minuta kod sobne temperature. Nakon daljnjih 30 minuta inkubacije kod sobne temperature, doda se 0,3 do 30 µg peptida u 100 µl HBS i inkubira se još 30 minuta. Optimalna količina endosomolitičkog agensa se odredi prethodnim titracijama ispitivanjem djelotvornosti prijenosa gena (vidi tabelu 3, za prijenos gena u BNLCL.2 stranice). Istovremeni dodatak plVS i endosomolitičkog agens, kao i upotreba većih volumena za pripravu kompleksa (1,5 ml konačni volumen) dao je, kao što se vidi, usporedljive (ili bolje) učinke transfekcije. Ovim pokusima pokazalo se da ne-peptidni amfipatski spojevi, dezoksiholinska kiselina i oleinska kiselina, također pojačavaju DNA prijelaz.

e) Transfekcija stanica:

Pripadne stanične linije (BNL CL.2 hepatociti ili NIH 3T3 stanice) uzgajane su u 6 cm posudicama 1 do 2 dana prije transfekcije (DMEM medij sa 10% FCS; 300.000 stanica po posudici). Medij se ukloni i doda se k,5 ml DMEM (2% FCS) i 500 µl DNA kompleksa. Alternativno, koristi se 0,5 ml DMEM 6% FCS i 1,5 ml DNA kompleksa. Nakon 4 sata inkubacije doda se 2 ml DMEM (18% FCS).

Alternativno, transfekcijski se medij može zamijeniti sa 4 ml DMEM sa 10% FCS. Žetva stanica i pokusi luciferaze obavljeni su 24 sata nakon transfekcije, kako je to prije opisano. Vrijednosti l.j. - (lihgt units) koje su pokazane predstavljaju ukupnu aktivnost luciferaze transficiranih stanica.

Transfekcija BNL CL.2 hepatocita prikazana je na slici 49.

Slika 49A) DNA kompleksi su priređeni, prvo, miješanjem 6 µg pCMVL-DNA u 250 µl HBS sa 4 µg TfpL290 u 250 µl HBS, a zatim miješanjem sa 20 µg poli(lizina290 u 750 µl HBS, nakon 30 minuta kod sobne temperature. Nakon daljnjih 30 minuta inkubacije kod sobne temperature, naznačene količine peptida u 250 µl HBS, dodaju se smjesi. Nakon inkubacije u daljnjih 30 minuta, kompleksi se miješaju sa 0,5 ml DMEM + 6% FCS i dodaju se na 450.000 stanica.

Slika 49B) DNA kompleksi se pripremaju kako slijedi: Otopina od 6 µg pCMVL-DNA u 500 µl HBS miješa se sa 4 µg TfpL290 u 250 µl HBS i ostavi se 30 minuta od sobne temperature. Otopina od 20 µg poli(L)-lizia u 500 µl HBS, miješa se sa naznačenim količinama peptida u 250 µl HBS i odmah se doda smjesi TfpL/DNA. Nakon daljnjih 30 minuta inkubacije kod sobne temperature, kompleksi se pomiješaju sa 0,5 ml DMEM + 6% i dodaju se u 450.000 stanica. Žetva stanica 24 sata nakon transfekcije i testovi luficeraze provedeni su kao što je prije opisano.

Eksperimenti izvedeni sa NIH3T3 stanicama prikazani su na slici 50. Priprema kompleksa, prema A9 i B) bila je ista kao i za transfekciju TIB 73.

U pokusima kulture stanica, p50 dim i ELA P50 pokazali su naveću aktivnost, EALA i GLF srednju, dok su P50 monomeri i melitin imali slabu aktivnost.

Primjer 36 - Prijenos gena upotrebom sintetičkog ne-virusnog peptida sa oligolizinskim C-terminalnim produženjem.

Peptid niza (SEQ ID NO:4) Met Ala Gln Asp Ile Ile Ser Thr Ile Gly Asp Leu Val Lys Trp Ile Ile Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys, sintetiziran je i pročišćen prema metodi opisanoj u prethodnom primjeru. Ovaj je peptid izveden iz δ-toksina Staphylococcusa aureusa (SEQ ID NO:3) Met Ala Gln Asp Ile Ile Ser Thr Ile Gly Asp Leu Val Lys Trp Ile Ile Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys, za koji se zna da posjeduje specifičnost za razaranje membrane kod kiselog pH (Thiaudiere i sur., 1991; Alouf i sur., 1989), proširenjem sa dodatnih 10 ostataka lizina

DNA kompleksi su priređeni, najkasnije, miješanjem 6 µg pCMVL-DNA u 170 µl HBS sa 4 µg TfpL290 u 170 µl HBS, a zatim miješanjem sa približno 3 µg peptida u 170 µl HBS, nakon 30 minuta kod sobne temperature. Nakon inkubacije od daljnjih 30 minuta kompleksi se pomiješaju sa 1,5 ml DMEM + 2% FCS i dodaju k 450.000 BNL CL.2 hepatocita. Nakon 2 sata doda se 2 ml DMEM + 20% FCS. Žetva stanica 24 sata naon transfekcije te mjerenje aktivnosti luciferaze provodi se kao što je opisano u prethodnim primjerima. Aktivnost luciferaze koja odgovara ukupnom ekstraktu iznosila je 481.000 “light units”.

Primjer 37 - Transfekcija hepatocita u prisutnosti melitin-peptida sa C-terminalnim oligo-Lys repom.

Peptidi niza (N do C kraj) (SEQ ID NO:12) Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys (označen sa mel 1)

i (SEQ ID NO:13) Gly Ile Gly Ala Val Leu Glu Val Leu Glu Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Serp Trp Ile Lys Arg Lys Ark Gln Gln Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys (kiseli mutant, označen sa mel 2), sintetizirani kao što je opisano u primjeru 36.

DNA kompleksi su priređeni, prvo, miješanjem 6 µg pCMVL-DNA u 170 µl HBS sa 4 µg TfpL290 u 170 µl HBS, a zatim miješanjem sa približno 3 µg peptida mel l ili 5 µg peptida mel 2 u 170 µl HBS, nakon 30 minuta, kompleksi se pomiješaju sa 1,5 ml DMEM + 2% FCS i dodaju u 450.000 BNL CL. 2 stanica, uzganih kao što je opisano u primjeru 36. Nakon 4 sata doda se 2 ml DMEM + 20% FCS. Žetva stanica, 24 h nakon transfekcije te testovi luciferaze, obavljeni su kao što je opisano. Aktivnost luciferaze, koja odgovara ukupnom ekstraktu, bila je 9200 “light units” (u slučaju mel l) i 9400 “light units” (u slučaju mel 2).

Primjer 38 - Izražaj interferona alfa u HeLa stanicama.

HeLa stanice (5 x 105 stanica po posudici od 6 cm) su transficirane sa pAD-CMVl-IFN kodiranim humanim interferonom alfa2c, pod kontrlom CMV pojačala/promotora (opisanog u DE 40 21 917 A. pADCMV1-ifn je dobiven rekloniranjem HindIII-XbaI IFN-2c inserta u pADCNV1). Uzorci od 6 µg DNA u 330 µl HBS, pomiješaju se sa 8 µg TfpL u 330 µl HBS i ostavljeni su da se povežu, 30 minuta kod sobne temperature. Uzorci 6-10 sadržavali su samo 4 µg TfpL, a nakon prvih 30 minuta inkubacije dodan je alikvot od P16pL (20 µg) u 160 µl HBS u uzorke 6 i 7 te alikvot pLys 290 (20 µg) u uzorke 8 i 10. Nakon daljnjih 30 minuta inkubacije doda se alikvot od 160 µl HBS, koji je sadržavao 10 µl (uzorak 8) ili 50 µl (uzorci 9 i 10) slobodnog P16 (vidi primjer 13 za sintezu P16 i P16pL). Nakon dodatnih 30 minuta inkubacije uzorci se dodaju HeLa stanicama u 2 ml DMEM/2%FCS, u prisutnosti slijedećih dodatnih spojeva. Uzorci 2, 7 i 10 su sadržavali 100 µM klorokina, uzorak 3 i 4 sadržavao je 5 i 15 µl adenovirusa d1312, (1 x 1012 čestica/ml), uzorak 5 je sadržavao 15 µl istog virusa inaktiviranog psoralenom. Za kontrolu adenovirusne stimulacije produkcije endogenog interferona, uzorci 11, 12 i 13 obrađeni su sa alikvotima virusa jednakim uzorcima 3, 4 i 5). Dva sata nakon transfekcije doda se 5 ml svježeg DMEM + 10% FCS. 48 sati nakon transfekcije medij se ukloni i zamijeni sa 2 ml svježeg DMEM + 10% FCS. Ovaj se medij požanje 72 sata nakon transfekcije i obavi se ELISA analiza na interferon alfa, kao što je opisano u DE 40 21 017. Razine interferona alfa (u ng/ml) prikazane su na slici 51. TfpL je djelovao slabo na prijelaz IFN gena ovim stanicama, u suglasnosti sa prethodnim zapažanjima sa luciferazom ili β-gal reporter genima. Prisutnost klorokina je stvorila uočljivi signal (cca 7 ng/ml, uzorak 2), no adenovirus d1312 je stimulirao prijelaz DNA u mjeri ovisnoj o dozi (uzorci 3 i 4). Obrada ovih stanica sa uporedljivim količinama virusa, u odsutnosti IFN DNA kompleksa, nije dovela do primjetnog signala interferona (uzorci 11 i 12).

Transfekcija sa sintetičkim, iz influence izvedenim endosomolitičkim peptidom P16 (vidi primjer 13), kao konjugatom (uzorak 6, 7) ili kao ionski povezanim peptidom na površinu TfpL/DNA kompleksa (uzorci 8, 9 i 1o; za vezanje peptida vidi primjer 35) stvorila je primjetne razine produkcije interferona, koja je povećana peptidnim konjugatom u prisutnosti koorokina (uzorak 7)

Bibliography

Abrahamson, D.R. et al., 1981, J.Cell Biol., 91 270-280

Akopian, T.A. et al., 1991, Nulc. Acids Res. 19, 424.

Alouf J.E., Dufourcq J., Siffert O., Thiaudiere E. and Geoffroy Ch., 1989, Eur. J.Biochem.

183, 381-390

Anderson, P. et al., 1982, J.Biol. Chem., 157, 11301-11304.

Andrews N.W., Abrams C.K., Slatin S.L: and Grifiths G., 1990, Cell 61, 1277-87

Ansardi, D.C. et al., 1991, J.Virology 65, 2088-2092

Agriolas A. and Pisano J,.J. 1985, J.Biol. Chem. 260, 1437-1444.

Armentano, D., Yu, S., Kantoff, P., von Rüden, T., Anderson, W.F. and Gilboa, E., 1987, J. Virol. 61, 1647-1650.

Armentano, D. et. al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6141-6145.

Asada-Kubota, M. et al., 1983, Exp. Pathol., 23, 95-101.

Ascoli, M.. et al., 1987, J. Biol. Chem., 253, 7832-7838.

Ashwell, G. et al., 1982, Annu. Rev. Biochem., 51, 531*554.

Atherton, E., Gait, M.J., Sheppard, R.C. and Williams, B.J., 1979, Bioorg. Chem. 8 351.

Barr, E. and Leiden, J., 1991, Science 154, 1507-1509.

Bartlett, G.R., 1959, J. Biol. Chem. 234, 466.

Berkner, K.L., 1988, BioTechniques 6, 616-629.

Berns, K.I., 1990, Viroloy, 2nd Edition, Ed. by Fields, B.N., Kipe, D.M. et al., Raven Press Ltd., New York, 1743-1759.

Bhakdi S. and Tranum-Jensen J., 1991, Immunology today 12, 318-320.

Blau, H. et al., 1985, Science 230, 758-766.

Blobel C.P. Wolfsberg T.G., Turuck C.W., Myles D.G., Primakoff P. and White J.M., 1992, Nature 356, 248-252.

Blondalle S.E. and Houghten R.A., 1991, Biochemistry 30, 4671-4678.

Bondeson, J., Wijkande, J. and Sundler, R. 1984, Biochim. Biophys. Acta 777, 21-27.

Boulanger, P.A. and Puvion, F., 1973, Eur. J. Biochem. 39, 309-310.

Carpenter, G., 1984, Cell, 37, 357-358.

Charonnet, Y. and Dales, S., 1970. Viology 40, 462-477.

Cheng, S-Y. et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3425-3429.

Ciliberto, G. Dente, L., Cortese, R., 1985,Cell 41, 531-540.

Clarke, D.D., Mycek, M.J., Neidle, A. and Waelsch, H., 1959, Arch. Biochem. Biphys. 79, 338-354.

Collis, P., Antonou, M. and Grosveld, F., 199, EMBO J. 9, 233-240.

Cotten, M., Laengle-Rouault, F., Kirlappos., H., Wagner, E., Mechtler, K., Zenke, M., Beug, H., and Birnstiel, M.L., 1990, proc.Natl.Acad.Sci. USA 87, 4033-4037.

Davidson, D. and Hassell, J.A. 1987, J. Virol. 61, 1226-1239.

Davis, B.D. and Dulbecco, R., 1980, Microbiology, 3rd Edition, Ed. by Davis, B.D. et al., Harper & Row, Sterilization and Disingection, 1263-1274.

Defer, C., Belin, M., Caillet-Boudin, M. and Boulanger P., 1990, J.Virol. 64, 3661-3673.

Dempsey C.E., Bazzo R., Harvey T.S., Syperek I., Boheim G. and Campbell I.D., 1991, FEBS Lett. 281, 240-244.

De Wet, J., Wood, K., DeLuca, M., Helinski, D., and Subramani, S., 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 725-737.

Dhawan, J., et al., 1991, Science 154, 1509-1512.

Donti, E., et al., 1988, Cancer Genet. Cytogenet. 30,225-231.

Dulbecco, R., 1980, Microbiology, 3rd Edition, Ed. by Davis, B.D. et al., Harper & Row, The Nature of Viruses, 853-884.

Eaton, D.L. et al., 1986, Biochemistry 25, 8343-8347.

Esser A.F., 1991, Immunology today 12, 316-318.

Fields, B.N. and Knipe, D.M., 1990, Virology 2nd edition, Raven Press, Ltd., New York.

FitzGerald, D., Padmanabhan, R., Pastan, I. and Willingham, M., 1983, Cell 32, 607-617

Folk, J.E., 1985, Methods Enzymol. 113, 358-375.

Franchini G., 1989, Science 244, 694-697.

Fricks C.E. and Hogle J.M., 1990, J. Virol. 64, 1934-1945.

Fujiwara et al., 1981, J.Immunol. Meth. 45, 195.

Geoffroy C., Gaillard J._l., Alouf J.E. and Berche P., 1987, Infection and Immunity 55, 1641-1646

Gething M.J., White J.M. and Waterfield M.D., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 2737-2740.

Gonseberg, H.S., 1980, Microbiology, 3rd Edition, Ed. by Davis, B.D. et el., Harper & Row, Picornaviruses, 1095-1117.

Goldmacher,V.S., Blättler, W.A., Lambert, J.M., McIntyre, G. and Steward, J., 1989, Molecular Pharmacology 36, 818-822.

Goldstein, J.L., et al., 1982, Clin.Res., 30, 417-426.

Goldstein, J.L., et al., 1989, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 76, 333-337.

Goldstein, J.L., et al., 1980, Nature 285, 66

Gong S., Lai C. and Esteban M., 1990, Virology 178, 81-91.

Green, M et al., 1989, Cell 59, 215-223.

Hearst, J.E. and Thiry, L., 1977, Nucl. Acids Res. 4, 1339-1347.

Heldin, C-H. et. al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 4216-4221.

Herskowitz, I., 1987, Nature 329, 219.

Hizuka, N. et al., 1981, J. Biol. Chem., 256, 4591-4597.

Hoekstra D., 1990, J. Bioenerg. Biomembr. 22, 121-155.

Holland, J.J., 1990. Virology, 2nd Edition, Ed. by Fields, B.N., Knipe, D.M., et al., Raven Press Ltd., Nwe York, Defective Viral Genomes, 151-165.

Horvath, J. et al., 1988, J. Virol. 62, 341-345.

Horwitz, M.S., 1990, Virology, 2nd Edition, Ed. by Fields, B.N., Knipe, D.M. et el., Raven Press Ltd., New York, Adenoviridae and their Replication, 1679-1721.

Hosang, M. et al., 1987, EMBO J., 6, 1197-1202.

Huang, A.S., 1987, The Molecular Basis of Viral Replication, Ed. by Bercoff, R.P., Plenum Press New York and London, The Role of Defective Interfering (DI) Particles in Viral Infection, 191-194.

Ikura T., Go N. and Inagaki F., 1991, Proteins 9, 81-89.

Imamura, K. et al., 1987, J.Immunol., 139, 2989-2992.

Iwanij, V., 1977, Eur. J. Biochem. 80, 359-368.

Jones, N. and Shenk, T., 1979, Proc. Natl. Adac. Sci. USA 76, 3665-3669.

Jung et el., 1981, Biochem. Res. Commun. 104, 599.

Kaplan, J. et al., 1979, J. Biol. Chem., 254, 7323-7328.

Kasid, A., Morecki, S., Aebersold, P., Cornetta, K., Culver, K., Freeman, ., Director, E., Lotze, M.T., Blaese, R.M., Anderson, W.F. and Rosenberg, S.A., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. UsA 87, 473-477.

Kehoe M.A., Miller L., Walker J.A. and Boulnois G. J., 1987, Infect. Immun. 55, 3228-3232.

Keller, G., Paige, C., Gilboa, E. and Wagner, E.F., 1985, G., Nature 318, 149-154.

Khang, C. and Nagaraji. K.V., 1989, Am. J. Vet. Res. 50, 1466-1470.

Klausner, R.D. et. al., 1983, J.Biol. Chem., 258, 4715-4724.

Klausner, R.D. et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2263-2266.

Kuhn, L.C. et al., 1982, Trends Biochem, Sci., 7, 299-302.

Kurachi, K., Davie, E.W., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci USA 79, 6461-6464.

Laver, W.G. et al., 1971, Virology 45, 598-614.

Lehrer R.I., Ganz T. and Selsted M.E., 1991, Cell 64, 229-230.

Leippe M., Ebel S., Schoenberger O.L., Horstmann R.D. and Müller-Eberhard H.J., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7659-7663.

Lim K. and Chae, C.B., 1989, BioTechniques 7, 576-579.

Luthmann, H. and Magnusson, G., 1983, Nucl. Acids Res. 11, 1295-1308.

MacDonald, R.C. et al., 1991, Biochim, Biophys, Acta 1061, 297-303.

Macgregor, G. and Caskey, C.T., 1989, Mucl. Acids Res. 17, 2365.

Mackow E.R., Shaw R.D., Matsui S.M., Vo P.T., Dang M.N. and Greenberg H.B., 1988, Proc. Natl. Avad. Sci. USA 85, 645-649.

Madsus, I.H., Olsens, S. and Sandvig, K., 1984, Virology 139, 346-357.

Malim, M. et al., 1989, Cell 58, 205-214.

Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning A. Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 474.

Marion D., Zasloff M. and Box A., 1988, FEB 227, 21.

Marshall, S., 1985, J Biol. Chem., 250, 4133-4144.

Massague, J. et al., 1986, J. Cell. Physiol., 128, 216-222.

McClure, M.O., Sommerfelt, M.A., Marsh, M. and Weiss, R.A., 1990, J. General Virol. 71, 767-773.

Mellman, I.S. et al., 1984. J. Cell Biol., 98, 1170-1177.

Mizel, S.B., et al., 1987, 1987, J. Immunol., 138, 2906-2912.

Ojcius D.M. and Young J.D., 1991, TIBS 16, 225-229.

Oropeza-Werkerle R.L., Muller S., Briand J.P., Benz R., Schmid A. and Goebel W., 1992, Mol. Microbiol. 6, 115-121.

Otero, M.J. and Carrasco, L., 1987, Virology 160, 75-80.

Perente, R.A. et al., 1990, Biochemistry 29, 8720-8728.

Petek, P.Q., Collins, J.L. and Cohn, M. 1978, Nature 276, 510-511.Ponder, J.P. et al., Proc. Natl. Acad, Sci,. USA, 1991, 88, 1217-1221.

Posner, B.I. et al., 1982, J. Cell Biol., 93, 560-567.

Precious, B. and Russell, W.C., 1985, Virology, ed. Mahy, B.W.J., IRL Press, Oxford, Washington, DC, 193-205.

Rfačslo, M., Lear, J.D. and DeGrado, W.F., 1990, Biochemistry 29, 7917-7922.

Reece, R.L., et al., 1987, Aust. Ver. J. 64, 365-367.

Riordan, J.R., et al., 1989, Science, 245, 1066-1073.

Rosenberg, St.A. et al., 1992, Human Gene Therapy 3, 75-90.

Ruysschaert J.M., and Vandenbranden M., 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 175, 872-879.

Schalch, D.S. et al., 1986, Endocrinology, 118, 1590-1597.

Sennett, C. et al., 1981, Annu. Rev. Biochem., 50, 1053-1086.

Seth, P., FitzGerald, D., Ginsberg, H., Willingham, M. and Pastan, I., 1984, Mol. Cell. Biol. 4, 1528-1533.

Severne, Y., Wieland, S., Schaffner, W. and Rusconi, S., 1988, EMBO J. 7, 2503-2508.

Shai Y., Bach D. and Yanovsky A., 1990, JBS 265, 20202-20209.

Sharon, N., 1987, Cell Separation: Methods and Selected Applications, Vol. 5, Academic Press Inc., pp.13-44.

Silver, L. et al., 1988, Virology 165, 377-387.

Sipe, D.M. et al., 1991, J. Biol. Chem. 256, 3469-3474.

Skern, T. et al., 1984, Virology 136, 125-132.

Slepushkin V.A., Andreev S.M., Siderova M.V., Melikyan G.B., Grigoriev V.B., Chumakov V.M., Gringeldt A.E., Manukyan R.A. and Karamov E.V., 1992, AIDS Res. Human Retroviruses 8, 9-18.

Sly, W. et al., 1982, J. Cell Biochem., 18, 67-85.

Smith, K.A. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 864-867.

Stahl, P.D. et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1399-1403.

Straubinger, R.M. and Papahadjopoulos, D., 1983, Meth. Enz\mol. 101, 512-527.

Strauss W. and Jaenisch, R., 1992, EMBO J. 11, 417-422.

Subbarao, N.K. et al., 1987, Biochemistry 26, 2964-2972.

Sillenger, B.A:, et al., 1990, Cell 63, 601-608.

Svensson, U., 1985, J. Virol., 55, 442-449.

Szoka, F. and Papahadjopoulos, D., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 4194-4198.

Takahashi S., 1990, Biochemistry 29, 6257-6264.

Takese, K. et al., 1990, Nippon Juigaki Zasshi 52, 207-215.

Thiaudiere E., Siffert O., Talbot J.-C., Bolard J., Alouf J.E. and Dufourcq J., 1991, Eur. J. Biochem. 195, 203-213.

Trono, D. et al., 1989, Cell 59, 113-120.

Uchida, Y., Tsujada, U. and Sugimori, T., 1977, J. Biochem. 82, 1425-1433.

Urakawa, T., et al., 1989, J. Gen. Virol. 70m 1453-1463.

Valerio, D., McIvor, R.S., Williams, S.R., Duyvesteyn, M.G.C., Van Ormondt, H., Van der Eb., A.J., Martin, D.W. Jr, 1984, Gene, 31, 147-153.

van Oostrum, J. and Nurnett, R.M., 1985, J. Virol, 56, 439-448.

Wagner, E., Zenke, M., Cotten, M., Beug, H. and Birnstiel, M.L., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414.

Wagner, E., Cotten, M., Foisner, R. and Birnstiel, M.L., 1991a, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4255-4259.

Wagner, E., Cottn, M., Mechtler, K., Kirlappos, H. and Birnstiel, M.L., 1991b, Bioconjugate Chemistry 2, 226-231.

Walker, F. et al., 1987, J. Cell Physiol, 130, 255-261.

Walker, R.D. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9514-9518.

Wharton, S.A., Martin, S.R., Ruigrok, R.W.H., Shehel, J.J. and Wiley, D.C., 1988, J. Gen. Virol. 69, 1847-1857.

White J.M., 1990, Annu. Rev. Physiol 52, 675-697.

Wilchek, M. et al., 1988, Anal. Biochem. 171, 1.

Wilson, J.M., Danos, O., Grossman, M., Raulet, D.H. and Mulligan, R.C., 1990, Proc. Atl. Acad. Sci. USA 87, 439-443.

Willumsen, N.J., Davis, C.W. and Boucher, R.C., 1989, Am. J. Physiol. 256 (Cell Physiol. 25), 1033-1044.

Wood, W.I., Capon, D.J., Simonsen, SC.C., Eaton, D.L., Gitschier, J., Keyt, B., Seeurg, P.H., Smith, D.H., Hollishead, P., Wion, K.L., Delwart, E., Tuddenham, E.G.D., Vehar, G.A:, Lawn, R.M., 1984, Nature, 312, 330-337.

Wu, R., Yankaskas, J.R., Cheng, E., Knowles, M.R. and Boucher, R., 1985, Am, Rev. Respir. Dis. 132, 311-320.

Wu, G.Y. and Wu, C.H., 1987, J. Biol. Chem. 262, 44429-4432.

Wu, G.Y. and Wu, C.H., 1988, J. iol. Chem. 263, 14621-14624.

Yankaskas, J.R., Stutts, M.J., Cotton, C,U., Knowles, M.R., Gatzy, J.T. and Boucher, R.C., 1987, Genetics and Epithelial Cell Dysfunction in Cystic Fibrosis, Alan R. Liss, Inc., pp. 139-149.

Yankaskas, J.R., Haizlip, J.E., Conrad, M., Koval, D., Schlegel, R. and Boucher, R.C., 1991, Am. Rev. Respir. Dis. 143, A139.

Zamecnik, P.C., Goodchild, J., Taguchi, Y. and Sarion, P.S., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 83, 4143-4146.

Zatloukal, K., Denk, H., Lackinger, E. and Rainer, I., 1989., Lab. Invest. 61, 603-608.

Zenke, M., Steinlein, P., Wagner, E., Cotten, M., Beug, H. and Birnstiel, M.L., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3655-3659.

Zon, G., 1988, Pharmaceut. Research 5, No.9, 539-549.

SEQUENCE LISTING

(I GNERAL INFORMATION:

(ii) TITLE OF INVENTION: Composition for introducing nucleic acid complexes intro higher eucaryotic colls

(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 13

(iv) COMPUTER READABLE FORM:

(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0. Version #1.25 (EPO)

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 23 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: both

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1:

Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly

1 5 10 15

Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys

20

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 23 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: both

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:

Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly

1 5 10 15

Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys

20

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 26 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: both

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:

Met Ala Gln Asp Ile Ile Ser Thr Ile Gly Asp Leu Val Lys Tpr Ile

1 5 10 15

Ile Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys

20 25

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 36 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: both

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:

Met Ala Gln Asp Ile Ile Ser Thr Ile Gly Asp Leu Val Lys Tpr Ile

1 5 10 15

Ile Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys

20 25 30 35

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 34 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: both

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5:

Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His

1 5 10 15

Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala GLy Gly Ser Cys

20 25 30

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 35 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: both

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6:

Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu

1 5 10 15

His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys

20 25 30 35

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 35 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: both

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7:

Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu

1 5 10 15

Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Glu Gly Ser Cys

20 25 30 35

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 34 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: both

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8:

Gly Leu Phe Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala

1 5 10 15

Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys

20 25 30

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 34 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: both

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9:

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gluy Phe Ile Glu Asn Glu Trp Glu Gly

1 5 10 15

Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys

20 25 30

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 34 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: both

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 10:

Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly

1 5 10 15

Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys

20 25 30

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 23 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: both

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 11:

Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly

1 5 10 15

Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys

20

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 36 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: both

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 12:

Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu

1 5 10 15

Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys

20 25 30 35

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 36 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: both

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 13:

Gly Ile Gly Ala Val Leu Glu Val Leu Glu Thr Gly Leu Pro Ala Leu

1 5 10 15

Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys

20 25 30 35

Claims (95)

1. Sastav za transfekciju viših eukariotičnih stanica sa kompleksom nukleinske kiseline i supstancijom koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu, koja supstancija može biti povezana s internalizirajućim faktorom za navedene stanice, naznačen time što spomenuti sastav sadrži agens koji ima sposobnost da bude izternaliziran u stanice, bilo “per se” ili kao komponenta kompleksa nukleinske kiseline, te da odpušta sadržaje endosoma, u kojem je kompleks smješten nakon ulaska u stanicu, u citoplazmu.

2. Sastav prema zahtjevu 1, naznačen time što je endosomolitički agens virus ili virusna komponenta koja je internalizirajući faktor “per se” za spomenute stanice.

3. .Sastav prema zahtjevu 1, naznačen time što endosomolitički agensima domenu za povezivanje nukleinske ksieline ili je povezan sa supstancijom koja ima afinitet za nukleinsku kisleinu i ima sposobnost da bude internaliziran u spomenute stanice kao komponenta kompleksa konjugat/nukleinska kiselina, a spomenuti kompleks dalje može sadržavati internalizirajući faktor za stanice.

4. Sastav prema zahtjevu 3, naznačen time što je endosomolitički agens kovalentno vezan na supstanciju koja ima agfinitet za nukleinsku kiselinu.

5. Sastav prema zahtjevu 3, naznačen time što endosomolitički agens nije kovalentno povezan sa supstancijom koja ima afinitet za nukleisnku kiselinu.

6. Sastav prema zahtjevu 5, naznačen time što se povezivanje vrši putem biotin-streptavidin mosta.

7. Sastav prema zahtjevu 5, naznačen time što se spajanje postiže ionskim načinom.

8. Sastav prema zahtjevu 3, naznačen time što je endosomolitilki agens vezan na nukelinsku kiselinu direktno putem povezujuće domene nukleinske kiseline.

9. Sastav prema zahtjevu 3, naznačen time što je endosomolitički agens virus ili virusna komponenta.

10. Sastav prema zahtjevima 2 i 9, naznačen time što je endosomolitički agens adenovirus.

11. Sastav prema zahtjevu 10, naznačen time što je adenovirus mutant.

12. Sastav prema zahtjevu 11, naznačen time što je adenovirus za obnavljanje neodgovoran mutant.

13. Sastav prema zahtjevu 12, naznačen time što adenovirus ima jednu ili više muacija i/ili raspada u ElA području.

14. Sastav prema zahtjevu 10, naznačen time što je adenovirus inaktiviran.

15. Sastav prema zahtjevu 14, naznačen time što je adenovirus inaktiviran kratkovalnim UV-zračenjem.

16. Sastav prema zahtjevu 14, naznačen time što je adenovirus inaktiviran pomoću UV/psoralena.

17. Sastav prema zahtjevu 14, naznačen time što je adenovirus inaktiviran formaldehidom.

18. Sastav prema zahtjevu 9, naznačen time što je virusna komponenta jedan ili više adenovirusnih proteina.

19. Sastav prema zahtjevu 2 ili 9, naznačen time što je virus picorna virus, prvenstveno rhinovirus.

20. Sastav prema zahtjevu 19, naznačen time što je rhinovirus inaktiviran.

21. Sastav prema zahtjevu 3, naznačen time što je endosomolitički agens nije internalizirajući faktor “per se” za stanicu i što kompleks nukleinske kiseline osim toga obuhvaća internalizirajući faktor za dotičnu stanicu, koji faktor je vezan na supstanciju koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu.

22. Sastav prema zahtjevu 21, naznačen time što je endosomolitički agens virus ili virusna komponenta koja nije internalizirajući faktor za humanu stanicu.

23. Sastav prema zahtjevu 22, naznačen time što je endosomolitički agens virus koji je infektiviran za vrste koje nisu ljudske.

24. Sastav prema zahtjevu 23, naznačen time što je virus adenovirus.

25. Sastav prema zahtjevu 24, naznačen time što je adenovirus avian.

26. Sastav prema zahtjevu 23, naznačen time što je adenovirus virus posmtrtnog pilećeg embrija.

27. Sastav prema zahtjevu 21, naznačen time što endosomolitički agens može biti modificirani endosomolitički virusni peptid.

28. Sastav prema zahtjevu 27, naznačen time što je endosomolitički peptid, peptid hemaglutinina HA2 influence.

29. Sastav prema zahtjevu 28, naznačen time što peptid iam niz Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Gly The Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys.

30. Sastav prema zahtjevu 28, naznačen time što peptid ima niz Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Ap Gly Gly Gly Cis.

31. Sastav prema zahtjevu 21, naznačen time što je endosomolitički agens ne-virusni, po želji modificirani prirodni ili sintetički peptid.

32. Sastav prema zahtjevu 27 ili 31, naznačen time što peptid ima domenu povezivanja nukleinske ksieline.

33. Sastav prema zahtjevu 3 ili 21, naznačen time što je internalizirajući faktor transferin.

34. Sastav prema zahtjevu 3 ili 21, naznačen time što je internalizirajući faktor ligand za hepatocite.

35. Sastav prema zahtjevu 34, naznačen time što je internalizirajući faktor ligand za asialoglikoprotein receptor.

36. Sastav prema zahtjevu 35, naznačen time što je internalizirajući faktor tetra-galaktoza-polilizin.

37. Kompleks nukleinske ksieline upotrebljiv kao konstituent sastava prema svim zahtjevima od 3 do 36, s tim da navedeni kompleks uključuje jednu ili više nukleinskih ksielina koje će biti izražene u stanici, endosomolitičko sredstvo koje izvorno ima domenu koja povezuje nukleinsku kiselinu ili koje je vezano na supstancu koja ima afininitet za nukleinsku kiselinu, koji kompleks osim toga može sadržavati internalizirajući faktor koji je povezan na supstanciju koja ima afinitet za nukelinsku ksielinu.

38. Kompleks prema zahtjevu 37, naznačen time što je nukelinska kiselina terapijski aktivna.

39. Kompleks prema zahtjevu 38, naznačen time što spomenuta nukleinska kiselina obuhvaća jednu ili više molekula DNA koja su aktivne u genskoj terapiji.

40. Kompleks prema zahtjevu 39, naznačen time što spomenuta DNA molekule kodiraju citokine.

41. Kompleks prema zahtjevu 38, naznačen time što spomenuta nukleinska kiselina sadrži niz nukleotida, iz koejg se mogu prevesti RNA molekule, koej specifično inhibiraju stanične funkcije.

42. Kompleks prema zahtjevu 37, naznačen time što je supstancija, koja ima afinitet za nukleinsku ksielinu, organski polikatiopn.

43. Kompleks prema zahtjevu 42, naznačen time što je polikation, polilizin.

44. Kompleks prema zahtjevu 37, naznačen time što je i endosomolitički agens i internalizirajući faktor povezan na istu supstanciju, koja ima afinitet za nukleinsku kiselinu.

45. Kompleks prema zahtjevu 44, naznačen time što su i endosomolitički agens i internalizirajući faktor vezani na polilizin.

46. Kompleks prema zahtjevu 45, naznačen time što on osim toga, sadrži nekovalentno vezani polilizin.

47. Konjugat upotrebljiv kao konstituent kompelksa prema zahtjevima 37 do 46, naznačen time što spomenuti konjugat obuhvaća endosomolitički agens koji je vezan na supstanciju koja ima afinitet za nukelinsku kiselinu.

48. Konjugat prema zahtjevu 47, naznačen time što je endosomolitički agens kovalentno vezan na supstanciju koja ima afinitt za nukelinsku kiselinu.

49. Konjugat prema zahtjevu 47, naznačen time što je endosomolitički agens ne-kovalentno vezan na supstanciju koja ima afinitet za nukleinsku ksielinu.

50. Konjugat prema zahtjevu 49, naznačen time što je povezivanje izvedeno putem biotin-strptavidin mosta-

51. Konjugat prema zahtjevu 49, naznačen time što je povezivanje izvedeno ionski.

52. Konjugat prema zahtjevu 47, naznačen time što je endosomolitički agens virus ili virusna komponenta.

53. Konjugat prema zahtjevu 52, naznačen time što je endosomolitički agens adenovirus.

54. Konjugat prema zahtjevu 53, naznačen time što je adenovirus mutant.

55. Konjugat prema zahtjevu 54, naznačen time što je adenovirus za obnavljanje neodgovoran mutant.

56. Konjugat prema zahtjevu 55, naznačen time što adenovirus ima jednu ili više mutacija i/ili raspada u ElA pdoručju.

57. Konjugat prema zahtjevu 53, naznačen time što je adenovirus inaktiviran.

58. Konjugat prema zahtjevu 57, naznačen time što je adenovirus inaktiviran kratkovalnim UV-zračenjem.

59. Konjugat prema zahtjevu 57, naznačen time što je adenovirus inaktiviran UV/psoralenom.

60. Konjugat prema zahtjevu 57, naznačen time što je adenovirus inaktiviran formaldehidom.

61. Konjugat prema zahtjevu 52, naznačen time što je virusna komponenta adenovirusni protein.

62. Konjugat prema zahtjevu 52, naznačen time što je virus picorna-virus, poglavito rhinovirus.

63. Konjugat prema zahtjevu 62, naznačen time što je rhinovirus inaktiviran.

64. Konjugat prema zahtjevu 47, naznačen time što je endosomolitički adenovirus nije internalizirajući faktor sam po sebi, za stanicu koja će biti transficirana.

65. Konjugat prema zahtjevu 64, naznačen time što je endosomolitički agens virus ili virusna komponenta koja nije internalizirajući faktor za humanu stanicu.

66. Konjugat prema zahtjevu 64, naznačen time što je andosomolitički agens virus koji je infektivan za vrste koje nisu ljudske.

67. Konjugat prema zahtjevu 66, naznačen time što je virus adenovirus.

68. Konjugat prema zahtjevu 67, naznačen time što je adenovirus avian.

69. Konjugat prema zahtjevu 68, naznačen time što je adenovirus posmrtni virus pilećeg ambrija.

70. Konjugat prema zahtjevu 64, naznačen time što endosomolitički agens može biti modificirani endosomolitički virusni peptid.

71. Konjugat prema zahtjevu 70, naznačen time što je endosomolitički agens peptid hemaglutinina influence HA2.

72. Konjugat prema zahtjevu 71, naznačen time što peptid ima niz Gly Leu Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys.

73. Konjugat prema zahtjevu 71, naznačen time što peptid ima niz Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Net Ile Asp Gly Gly Gly Cys

74. Konjugat prema zahtjevu 47, naznačen time što je endosomolitički agens ne-virusni, po želji modificirani prirodni ili sintetički peptid.

75. Endosomolitički peptid upotrebljiv kao sastojak sastava iz zahtjeva 32, naznačen time što ima endosomolitičku domenu i vezujuću domenu nukleinske kiseline.

76. Endosomolitički peptid iz zahtjeva 75, naznačen time što je vezujuća domena nukleinske kiseline produžetak oligolizina.

77. Postupak priprave konjugata iz zahtjeva 48, naznačen time što je virus ili (poli)peptidni endosomolitički agens i poliamin enzimatski vezan u prisutnosti transflutaminaze.

78. Postupak priprave konjugata iz zahtjeva 48, naznačen time što je virus ili (poli)peptidni endosomolitički agens i poliamin, kemijski vezan.

79. Postupak priprave konjugata iz zahtjeva 49 koji obuhvaća a) modifikaciju virusa ili virusne komponente sa biotinom i b) povezivanje modificiranog virusa ili modificirane virusne komponente dobive u fazi a), u treptavidinom vezani poliamin.

80. Postupak za uvođenje nukleinske kiseline u vieš eukariotične stanice, naznačen time što su stanice u vezi sa sastavom prema vilo kojem zahtjevu od 1 do 36.

81. Postupak prema zahtjevu 80, naznačen time što su stanice humane stanice.

82. Postupak prema zahtjevu 81, naznačen time što su stanice humane tumorske stanice.

83. Postupak prema zahtjevu 81, naznačen time što su stanice humani mioblasti.

84. Postupak prema zahtjevu 81, naznačen time što su stanice humani fibroblasti.

85. Postupak prema zahtjevu 81, naznačen time što su stanice humani hepatociti.

86. Postupak prema zahtjevu 81, naznačen time što su stanice humane endotelne stanice.

87. Postupak prema zahtjevu 81, naznačen time što su stanice humane epitelne stanice pluća.

88. Postupak prema zahtjevu 81, naznačen time što je nukleinska kiselina sastava DNA aktivna u genskoj terapiji.

89. Postupak prema zahtjevu 82 i 88, naznačen time što su stanice tumora u kontaktu sa sastavom “ex vivo” i što spomenuta DNA kodira jednu ili više imuno modulirajućih supstancija, osobito citokine.

90. Postupak priprave proteina od interesa u višoj eukariotičnoj stanici, naznačen time što se stanice obrađuju sa sastavom iz zahtjeva 1, što nukleinska kiselina obuhvaća DNA niz koji kodira željeni protein, što se stanice uzgajaju pod uvjetima pogodnim za izražaj proteina, i što se protein regenerira.

91. Farmaceutski pripravak koji obuhvaća sastav iz bilo kojeg zahtjeva od 1 do 36, u kojem je nukleinska kiselina terapeutski aktivna i farmaceutski prihvatljiv nosač.

92. Transfekcijski komplet, naznačen time što sadržava konstituente kompleksa nukleinske kiseline sastava iz zahtjeva 1 i/ili endosomolitički agens spomenutog sastava ili konstituente spomenutog endosomolitičkog agensa, kao odvojene ili djelomično odvojene komponente.

93. Transfekcijski komplet iz zahtjeva 92, naznačen time što sadržava transglutaminazom vezan konjugat adenovirus-polilizin, kao odvojeni konstituent.

94. Transfekcijski komplet iz zahtjeva 92, naznačen time što sadržava biotinom modificirani endosomolitički agens i steptavidinom modificiranu supstanciju koja ima afinitet za nukelinsku ksielinu kao odvojeni konstituent za konjugate neposredno prije primjene.

95. Transfekcijski komplet iz zahtjeva 94, naznačen time što sadržava biotinilirani adenovirus i streptavidin-polilizin.