JP3479298B2 - 高等真核細胞に核酸を導入するための新規結合体 - Google Patents

高等真核細胞に核酸を導入するための新規結合体

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は高等真核細胞への核酸の導入に関する。
特に遺伝子治療において生細胞に核酸を導入する効率
的なシステムが望まれている。例えば遺伝子欠陥がある
場合に該欠陥遺伝子を置換するためのように、治療的に
有効な遺伝子生産物の生体内（in vivo）合成を達成さ
せるために、遺伝子は細胞内に導入される。「従来の」
遺伝子治療は、単一の治療によって持続的治療を達成す
るという原則に基づいている。しかしながら、必要に応
じて一度に、または反復して医薬（「遺伝子治療薬」）
のように治療的に有効なDNA（またはmRNA）を投与する
治療法も必要とされている。期待される研究方法として
遺伝子治療が挙げられる遺伝的に原因のある病気の例に
は、血友病、β−サラセミアおよび酵素アデノシンデア
ミナーゼの遺伝的に誘導される欠乏によって起こる症候
群である「重度合併免疫不全」（SCID）がある。その他
に可能な応用には、体液性または細胞内免疫が分泌型タ
ンパク質抗原または非分泌型タンパク質抗原をコードす
る機能的核酸の投与により、免疫感作によって達成され
る免疫調節があげられる。欠陥遺伝子をコードする核酸
が特定の条件に各々適合する形態において投与されるよ
うな遺伝子欠陥の他の例には筋ジストロフィー症（ジス
トロフィン遺伝子）、嚢胞性繊維症（嚢胞性繊維症トラ
ンスメンブレン・コンダクタンス調節遺伝子）、高コレ
ステロール血症（LDLレセプター遺伝子）が含まれる。
また、ホルモン、成長因子または細胞毒性または免疫調
節活性を有するタンパク質が体内で合成される場合は遺
伝子治療という処置を使用することが可能である。
また、遺伝子治療はいわゆる「ガンワクチン」を投与
するガンの治療にも期待されているようである。腫瘍細
胞の免疫原性を高めるために、腫瘍細胞は変化してそれ
らがより免疫原性を発揮するようになるか、または免疫
応答を誘発するためにサイトカインのような一定の免疫
調節物質を生産するようになる。これは該細胞にサイト
カイン、例えばIL−２、IL−４、IFN−γ、TNF−αをコ
ードするDNAをトランスフェクションすることによって
行われる。今日までのところ、自己複製する腫瘍細胞へ
の遺伝子転移はレトロウイルスベクターを介して行われ
ている。
リボザイムと同様にアンチセンスRNAおよびDNAの活性
の様式は、生体内における一定の遺伝子（調節されてい
ない腫瘍遺伝子またはウイルス遺伝子等）の発現を阻害
するための治療薬としてそれらを使用することを可能に
している。既に、短いアンチセンス・オリゴヌクレオチ
ドを細胞内に導入して、中でも核酸の強い負電荷の結果
として細胞膜による取り込みが制限されることによって
生じるような低い細胞内濃度でさえも、それらの阻害効
果がそこで現れたことが示された（ザメクニク（Zamecn
ik）等、1986）。
試験管内（in vitro）での哺乳類細胞への遺伝子転移
のための各種の方法は知られているが、生体内での使用
は制限されている（それらにはリポソーム、エレクトロ
ポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、
DEAE−デキストランまたはリン酸カルシウム沈殿法によ
るDNAの導入が含まれる）。
最近、それらの親ウイルスの効率的な侵入メカニズム
を用いることによる遺伝子転移をもたらすための生物学
的ベクターが開発された。この戦略は試験管内および生
体内において非常に効率的な遺伝子転移を達成するため
に、組み換えレトロウイルスおよびアデノウイルスベク
ターの構築に使用された（バークナー（Berkner）、198
8）。それらの効率のすべてに関して、これらのベクタ
ーは転移されるDNAのサイズおよび構造の点で制限を受
ける。さらに、これらの試薬は元のウイルスの生育可能
なウイルス遺伝子要素を同時転移という点で安全性につ
いての危険性を有している。従って、例えば、レトロウ
イルスの使用はウイルスによる感染のような副作用（内
在性ウイルスとの組み換え、またはヘルパーウイルスの
混入および病原型への変異が続く可能性）またはガンの
形成という危険性を少なくとも少量の割合で含むため
に、その使用には問題が残る。さらに、患者の体細胞の
安定な形質転換は、レトロウイルスによって達成される
場合は、もし副作用が発生した場合などに、その治療を
元に戻すことがさらに困難となりうるために各場合にお
いて望ましいものではない。
これらの制限を回避するために、細胞を高分子の転移
のために使用するメカニズムに基づく遺伝子転移のため
の別の戦略が開発された。この一例として受容体仲介エ
ンドサイトーシスの極めて効率的な経路を介して細胞に
遺伝子を転移するものがある（ウ（Wu）およびウ（W
u）、1987、ワグナー（Wagner）等、1990およびEP−A1
0388 758）。この方法はDNA結合ドメインと細胞表面受
容体に特異性を有するドメインを有する二機能性分子結
合体を使用する（ウ（Wu）およびウ（Wu）、1987、ワグ
ナー（Wagner）等、1990）。認識ドメイン（以後「イン
ターナライジング因子」と呼ぶ）が細胞表面受容体によ
り認識されると、その結合体が受容体仲介エンドサイト
ーシスの経路によって取り込まれ、該結合体に結合して
いるDNAもまた転移されることになる。この方法を使用
すると、従来の方法で達成されるのと少なくとも同等の
遺伝子転移率を達成することができる（ゼンケ（Zenk
e）等、1990）。
このベクターシステムは適当な細胞表面受容体を有す
る細胞に大量のDNAを転移することができるが、対応す
る遺伝子発現が転移量と一致しないことが非常に多い
（コットン（Cotten）等、1990）。この現象の理由とし
ては受容体仲介エンドサイトーシスにより細胞内に運搬
されたDNAがリソソームに沈着し、そこで分解するため
であると中でも考えられた（ゼンケ（Zenke）等、199
0、コットン（Cotten）等、1990）。それゆえにリソソ
ーム中に取り込まれたDNAは細胞内の運搬システムを残
すための特定のメカニズムを全く有しないという事実は
この輸送システムに固有の制限を構成している。
本発明の目的は、この制限を軽減または消滅させるこ
とである。
多くのウイルスは、主として受容体仲介エンドサイト
ーシスのメカニズムに対応するメカニズムによって真核
細胞宿主に侵入する。このメカニズムに基づくウイルス
感染は一般的に細胞膜上の受容体に対するウイルス粒子
の結合とともに開始する。この後、ウイルスは細胞の中
に取り込まれる。この取り込み過程は細胞中への生理学
的リガンドまたは高分子の侵入に対応する共通の経路に
従う：最初に、細胞表面上の受容体が群になって各自整
列して所謂「被覆膜孔（coated pit）」を形成し、膜が
内部に逆転し被覆によって囲まれた小胞（vesicle）を
形成する。この小胞がクラスリン・コートから抜け出し
た後、膜に存在するプロトンポンプによりその内部で酸
性化が起こる。これがウイルスのエンドソームからの放
出を誘発する。ウイルスが脂質被覆を有しているかどう
かに依存してエンドソームからのウイルスの放出には２
つのタイプが考えられている。いわゆる「裸の」ウイル
ス（例えばアデノウイルス、ポリオウイルス、ライノウ
イルス）の場合、低pHがウイルスタンパク質の構造に変
化を起こすと提唱されている。これにより生理学的pHで
は接近しえない疎水性ドメインが露出する。このように
これらのドメインはエンドソーム膜と相互作用し、それ
によってエンドソームから細胞質へウイルスゲノムを放
出させるための能力を獲得する。被覆を有するウイルス
（水疱性口炎ウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、イン
フルエンザ・ウイルス等）の場合は、低pHがいくつかの
ウイルスタンパク質の構造または立体配座を変化させ、
それによりエンドソーム膜とウイルス膜との融合が進行
すると考えられている。このメカニズムにより細胞内に
侵入するウイルスは細胞質への侵入を獲得するためにエ
ンドソーム膜の破壊を可能にする一定の分子的特性を有
している。
他のウイルス、例えば被覆ウイルスではセンダイ、HI
Vおよびある腫のモロニー白血病ウイルス、また非被覆
ウイルスではSV40およびポリオーマは、細胞への侵入の
ために低pHを必要としない：これらは細胞の表面上で直
接膜に融合するか（センダイ・ウイルス、おそらくHIV
も）、または細胞膜を分解するかまたはそれを通過する
メカニズムを誘発することができる。pHに依存していな
いウイルスもエンドサイトーシスの経路を使用すること
ができると考えられている（マクルレ（McClure）等、1
990）。
本発明に先行する実験において、インターナライジン
グ因子に任意に結合したポリカチオン、例えばトランス
フェリン・ポリリジン結合体と核酸が複合体を形成して
いる核酸複合体による遺伝子転移は、アデノウイルス、
特定のレトロウイルスまたは該ウイルスフラグメントに
よる処理により有意に増加することが確認された。この
効果はこれらのウイルスがエンドサイトーシスというメ
カニズムにより細胞内に取り込まれ、例えばアデノウイ
ルスの場合のようにエンドソームを打ち破ることにより
小胞システムから開放するための特別のメカニズムを有
しているという現象を利用することによって達成される
（パスタン（Pastan）等、1986）。
これらの観察から出発して、本発明の課題は機能性構
築物の統合部分としてウイルスを含む生物結合体を開発
することによって解決した。
従って、本発明は、高等真核細胞に核酸を導入するた
めの、核酸と複合体を形成する能力を有しインターナラ
イジング因子および核酸に対する親和性を有する物質を
含む結合体に関する。該結合体はインターナライジング
因子が抗体を介して核酸結合物質に結合されているウイ
ルスであり、その結果、それ自体が結合体／核酸複合体
の一部として細胞に侵入し、かつ、細胞に侵入後複合体
が存在するエンドソームの内容物を細胞質に放出するこ
とができるという特徴を有する。
さらに別の側面において本発明は本発明による結合体
が核酸とともに形成する複合体に関する。
ウイルスが細胞に侵入し、結合体／核酸複合体が存在
するエンドソームの内容物を細胞質に放出するという能
力を以後「取り込み機能」と呼ぶ。
本発明による結合体は、インターナライジング因子結
合体に基づくベクターシステムの利点とウイルスがこれ
らのシステムにもたらす利点とを組み合わせている。受
容体仲介エンドサイトーシスによる遺伝子転移と比べ
て、本発明によるウイルス・ポリカチオン・DNA複合体
は、これらが従来の分子結合体システムに内在する基本
的制限を回避するという、即ち、従来の結合体とは異な
り、細胞小胞システムから放出されることを可能にする
特定のメカニズムを有しているという利点を有してい
る。生物学的ベクターと比べて、本発明によるベクター
システムは輸送される外来DNAがビリオンの外側上に運
ばれるという点で組み換えウイルスベクターとは基本的
概念の逸脱を構成する。従って、本発明による結合体は
配列に関していかなる種類の制限を伴わずに、細胞内に
非常に大きい遺伝子構築物を輸送しうる。
一方、適当なウイルスには、受容体仲介エンドサイト
ーシスにより細胞に侵入することができ、エンドソーム
から細胞質への放出−それゆえ核酸の放出−を引き起こ
すことができるものが含まれる。（さらに本発明の範囲
内のウイルスの好適性は、さらにそれらが核酸複合体の
成分であるときでさえもこの性質を維持しているという
点で定義される。）この理論に束縛されることを望むわ
けではないが、エンドソームの内容物を放出するという
ウイルスの能力がエンドソームとリソソーム間の融合を
阻害し、その結果これらの細胞オルガネラ中で通常生じ
る酵素的分解を阻害する限りにおいて、本メカニズムは
細胞内に輸送された核酸複合体に恩恵を提供しうる。
高等真核細胞は良く知られているものであるが酵母は
含まれない。（ワトソン（Watson）等、1987）。アデノ
ウイルス感染が可能な高等真核細胞の例はフィールズ
（Fields）およびナイプ（Knipe）（1990）によって報
告されている。
感染の開始時に起こる取り込み機能が受容体仲介エン
ドサイトーシスによって生じ、かつこの性質によって本
発明の結合体の一部として好適であるウイルスには、一
方ではアデノウイルス、ポリオウイルス、ライノウイル
スのような脂質被覆を有しないウイルスが含まれ、そし
て他方では外皮を被ったウイルスである水疱性口炎ウイ
ルス、セムリキ森林熱ウイルス、インフルエンザ・ウイ
ルス、モロニー・ウイルスのpH依存株も好適である。特
に本発明において使用するのに好適なウイルスは、アデ
ノウイルス・サブグループＣ、タイプ５、セムリキ森林
熱ウイルス、水疱性口炎ウイルス、ポリオウイルス、ラ
イノウイルスおよびモロニー白血病ウイルスである。逆
転写酵素を有しないRNAウイルスを本発明のために使用
することは、そのようなウイルスの存在下でのトランス
フェクションが細胞中でウイルスDNAの生成を導かない
という利点を有している。
本発明から誘導される重要な利点とは、転移されるべ
きDNAが標準の組み換えウイルスベクターを使用する場
合のように親ウイルスのゲノム中に組み込まれないとい
うことである（バークナー（Berkner）、1988;エグリチ
ス（Eglitis）およびアンダーソン（Anderson）、1988
を参照）。従って、本発明は転写が親ウイルス遺伝子中
のプロモーターに依存しないために、発現されるべき外
来遺伝子配列の設計に関して非常により大きな柔軟性を
提供する。さらに、この戦略は、ウイルスのパッケージ
ングの制約が外部上に運搬されうるDNA量を制限しない
ことから転移しうるDNAのサイズを非常に大きくするこ
とができる。これらの実質的かつ直接的利点に加えて、
重要な潜在的安全性の特徴がベクターの設計から誘導さ
れる。従来の組み換えウイルスベクターは親ウイルスの
ゲノム要素の必然的供給を仲介しており、そこから潜在
的な安全に関する障害が発生する（レドリー（Ledle
y）、1989;アンダーソン（Anderson）、1984）。本発明
の結合体はウイルスの侵入特性を選択的に利用している
ため、ウイルスゲノムは本質的な特徴ではない。この設
計により、親ウイルスからの生活力のある遺伝子の転移
から派生する安全障害を最小にするために機能的および
／または構造的に“不活性化したウイルスゲノム”を使
用して本システムを修正することが可能になる。
本発明の範囲内において、上で定義したような取り込
み機能を有するならば、ウイルスという語には野生型に
加えて、１以上の変異の結果として取り込み機能以外の
野生型の一定の機能、特には複製能力を欠いた変異体も
含まれる。しかしながら、以下に定義する「ターナリー
複合体」の一部として使用され、かつ、該変異体ウイル
スがそのエンドソロモリチック（endosomolytic）活性
を失っていないかぎり、取り込み機能を欠いた変異体も
本発明の実施において使用することができる。
変異体は、複製機能および取り込み機能の原因となり
かつパッケージ・ラインによる補填が可能なウイルスタ
ンパク質領域における変異によって従来の突然変異誘発
法によって生成しうる。例えば、アデノウイルスの場
合、ts−変異体（温度感受性変異体）、E1A−およびE1B
−変異体、MLP−駆動遺伝子に変異を示す変異体（バー
クナー（Berkner）、1988）および一定のキャプシドタ
ンパク質の領域に変異を示す変異体が含まれる。対応す
る天然の変異を有するウイルス株も好適である。ウイル
スの複製能は、例えば文献から知られるプラーク検定法
で調べることができ、この方法においては細胞培養液を
種々のウイルス濃度の懸濁液で覆い、プラークにより観
察できる分解細胞の数を記録するのである（ダルベッコ
（Dulbecco）、1980）。
本発明の範囲内で使用するのに好適な他のウイルスに
はいわゆる欠陥ウイルス、即ち１以上の遺伝子において
自己ウイルス複製に必要な機能を欠き、そのためヘルパ
ーウイルスを必要とするようなウイルスが含まれる。こ
のカテゴリーの例には、感染性の標準ウイルスから誘導
され、標準ウイルスと同様の構造タンパク質を有し、変
異を有し、かつ複製のためのヘルパーウイルスとして標
準ウイルスを必要とするDI−粒子（欠失妨害粒子）があ
るハング（Huang）、1987;ホーランド（Holland）、199
0）。また、このグループの例には、サテライト・ウイ
ルスが含まれる（ホーランド（Holland）、1990）。も
う一つのグループにはアデノ関連ウイルスと呼ばれるパ
ルボウイルスのクラスがある（バーンズ（Berns）、199
0）。
多くのウイルスの細胞への取り込みサイクルはまだ十
分に説明されていないので、本発明での好適な使用に必
要とされるエンドソモリチック活性を有するその他のウ
イルスが存在するということを想定しなければならな
い。
また、弱毒化生ワクチン（ギンスバーグ（Ginsber
g）、1980）またはワクチン化株は本発明の範囲内で好
適である。
また、本発明の範囲内のウイルスという語には、無傷
のウイルスの取り込み機能を維持しているという条件下
で、不活性化ウイルス、例えばホルムアルデヒドによる
処理のような化学的処理、UV照射、UV照射の組み合わせ
た化学的処理、例えばソラレン・UV照射、ガンマ線照射
または中性子衝突で不活性化したウイルス並びにウイル
スの一部、例えば核酸の抜けたタンパク質部分（空のウ
イルスキャプシド）が含まれる。
ワクチンとしても使用される不活性化ウイルスは、例
えば文献から知られている従来法で調製され（デービス
（Davis）およびダルベッコ（Dulbecco）、1980、ハー
スト（Hearst）およびサリィ（Thiry）、1977）、本発
明の結合体の成分として好適であるかどうか調べるため
に試験される。
おそらくウイルスはその取り込み機能に必要ではない
領域に外来のエピトープを有するキメラウイルスであ
る。しかしながら、このようなキメラウイルスがその取
り込み機能を失ったときでさえ、このウイルスがエンド
ソモリチック特性を失っていないかぎり組み合わせ複合
体の範囲で使用しうる。
実行するべき特定のトランスフェクション用のウイル
ス、不活性化ウイルスまたはウイルス成分を選択するた
めに、例えば先ず核酸／ポリカチオン複合体が標的細胞
に取り込まれる際に影響を有するかどうかを判定する予
備実験においてウイルスを調査するための方法を使用し
てもよい。さらに、その取り込み機能を、生結合体、例
えばトランスフェリン−ポリカチオン結合体またはトラ
ンスフェクトするべき標的細胞に特異的な別の生結合体
とともにトランスフェクションにおいてそれを使用し
て、レポーター遺伝子の発現を測定することにより遺伝
子転移能を増加させる能力をチェックすることによって
試験してもよい。
無傷ウイルスを使用する場合、ウイルスが複製できる
かどうかを見るために、提案されたトランスフェクショ
ンに対する好適性についてウイルスを調べる予備試験も
同時に平行して行うことが望ましい。複製能力の調査は
細胞毒性ウイルスの場合または宿主細胞の生育を著しく
阻害するウイルスの場合にはプラーク検定法（上述）を
使用して行う。他のウイルスの場合は、問題のウイルス
に特異的な検出法、例えばヘマグルチネーション試験、
又は物理化学的方法（電子顕微鏡を使用する）が使用さ
れる。
本発明の範囲内において、好ましいウイルスは、高力
価で生産することができ、安定であり、天然の状態で病
原性が低く、複製能力を標的とした除去が可能であるよ
うなウイルスであり、特にはアデノウイルスである。も
し、特定の細胞集団がトランスフェクションされる場
合、この細胞集団に特異的に感染するウイルスが好まし
い。もしトランスフェクションが異なる細胞型を攻撃す
ることを意図するものであるならば、広範囲の細胞型に
感染性を示すウイルスが使用される。
いずれの場合にも、本発明を生体内で治療用に使用す
る場合、安全性に関する危険性、特に細胞内でのウイル
スの複製および宿主DNAとウイルスDNAの組み換えの危険
性をできるかぎり少なくするようなウイルスまたはウイ
ルス成分のみが使用される。
予備試験において、アデノウイルス調製物を慣用のUV
滅菌ランプまたはホルムアルデヒドを用いて不活性化し
たところ、意外にもウイルスの失活の程度が遺伝子転移
効果の減少よりも実質的に大きいことが分かった。この
ことは、活性ウイルスにおける通常の感染メカニズムに
関連するメカニズムを遺伝子転移に必要な効果を除外す
ること無しに破壊することができることを明確に示して
いる。
本発明により使用される核酸に対する親和性を有する
物質には、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリ
オルニチンのようなホモポリカチオン、または２以上の
異なる正電荷を帯びたアミノ酸を有するヘテロポリカチ
オンであって、異なる鎖長を持つもの、およびポリエチ
レンイミンのような非ペプチド合成ポリカチオンも含ま
れる。また、核酸に対する親和性を有する好適な他の物
質にはヒストンまたはプロタミンまたはその類似体また
はそれらの断片のようなポリカチオン性の天然のDNA結
合タンパク質がある。
細胞への結合体の侵入を容易にするかまたはこの細胞
型に対するリガンドを構成するウイルスによる形質転換
に対する所定の細胞株の感受性は、標的細胞上のウイル
スに関する受容体の存在および数に依存する。細胞表面
上のアデノウイルス受容体の数の測定方法はHeLa細胞お
よびKB細胞に関してはスベンソン（Svensson）、1985お
よびデファー（Defer）、1990に報告されている。アデ
ノウイルス受容体は公平に分散して発現されていると考
えられている。
それゆえに、アデノウイルスまたはその一部を含むベ
クターシステムを用いて多くの細胞株を形質転換するこ
とができる。しかしながら、ある高等真核細胞はほとん
どまたは全くウイルス受容体を有していない。この様な
細胞を形質転換する場合、核酸に対する親和性を有する
物質に結合しているインターナライジング因子の第２結
合体であって、そのインターナライジング因子が高等真
核細胞の表面受容体に特異的であり、そのウイルス結合
体およびインターナライジング因子結合体が核酸と複合
しているような結合体を使用する必要がある。この様な
複合体をうまく使用することでアデノウイルス受容体の
細胞表面密度が比較的低い呼吸器管上皮細胞のような高
等真核細胞の形質転換を行うことができる（例えば、細
胞株HBE1）。
従って、本発明の好ましい態様においては、複合体に
は場合によってはウイルス結合体に加えて、一般にはウ
イルス結合体の場合と同様の核酸に対する親和性を有し
ている物質が標的細胞に対する親和性を有するインター
ナライジング因子と結合しているような他の結合体が含
まれる。本発明のこの態様は特に標的細胞がウイルスに
対する受容体を全くまたはほとんど有していない場合に
使用される。別のインターナライジング因子−結合因子
結合体の存在下で、これらのエンドソモリチック結合体
は第２結合体とともに核酸と複合体を形成し、以後「組
み合わせ複合体」または「ターナリー複合体」と呼ばれ
る生成した複合体の一部として細胞に取り込まれること
によって第２結合体の取り込み活性の恩恵を受けてい
る。
特に、（別の）インターナライジング因子の使用が核
酸複合体の取り込みを可能にするかまたは改良するかど
うかを決定するための予備試験は、先ず付加的インター
ナライジング因子なしに、即ち核酸とウイルス結合体を
含む複合体とともに、次いで核酸が標的細胞が受容体を
有するための付加的インターナライジング因子を含む別
の結合体と結合しているような複合体とともに、核酸複
合体とともにトランスフェクションを平行して行うこと
によってなされる。別のインターナライジング因子を使
用する場合は、それは特に標的細胞、例えばあるタイプ
の細胞への核酸の標的転移を可能にする該細胞型に特異
的な表面抗原又は受容体により限定される。
本発明の目的にとって「インターナライジング因子」
という語は、細胞への結合後、エンドサイトーシス、好
ましくは受容体仲介エンドサイトーシスにより取り込ま
れるかリガンドまたは断片、またはその結合または取り
込みが細胞膜の要素との融合によって進行する因子を示
す。
好適なインターナライジング因子には、リガンドであ
るトランスフェリン（クロースナー（Klausner）等、19
83）、コンアルブミン（セネット（Sennett）等、198
1）、アシアログリコプロテイン（アシアロトランスフ
ェリン、アシアロロソムコイドまたはアシアロフェチュ
イン等）（アッシュウェル（Ashwell）等、1982）また
はレクチン（ゴールドシュタイン（Goldstein）等、198
0およびシャードン（Shardon）、1987）またはガラクト
ースを含みアシアログリコプロテイン受容体により取り
込まれる物質、マンノシル化糖蛋白質（ストール（Stah
l）等、1987）、リソソーマル酵素（スライ（Sly）等、
1982）、LDL（ゴールドシュタイン（Goldstein）等、19
82）、修飾LDL（ゴールドシュタイン（Goldstein）等、
1979）、受容体を介して細胞に取り込まれるリポ蛋白質
（アポB100/LDL）、HIV蛋白質gp120等のウイルス蛋白
質、例えば抗CD4および抗CD7等の細胞表面抗原に対する
抗体（メルマン（Mellman）等、1984;クン（Kuhn）等、
1982、アブラハムソン（Abrahamson）等、1982）または
その断片、インターロイキン−２（スミス（Smith）
等、1985）、TNF（イマムレ（Imamure）等、1987）、イ
ンターフェロン（アンダーソン（Anderson）等、198
2）、CSF（コロニー刺激因子）（ウォーカー（Walker）
等、1987）等のサイトカイン類、インシュリン（マーシ
ャル（Marshall）、1985）、EGF（上皮成長因子）（カ
ーペンター（Carpenter）、1984）、PDGF（血小板由来
成長因子）（ヘルジン（Heldin）等、1982）、TGFB（形
質転換成長因子β）（マサグ（Masague）等、1986）、
神経成長因子（ホサン（Hosang）等、1987）、インシュ
リン様成長因子Ｉ（シャルチ（Schalch）等、1986）、L
H、FSH（アスコリ（Ascoli）等、1978）、成長ホルモン
（ヒズカ（Hizuka）等、1981）、プロラクチン（ポスナ
ー（Posner）等、1982）、グルカゴン（アサダ・クボタ
（Asada−Kubota）等、1983）、チロイドホルモン（チ
ェン（Cheng）等、1980）等の因子または成長因子、α
−２−マクログロブリンプロテアーゼ（カプラン（Kapl
an）等、1979）、および「ジィスアームド（disarme
d）」トキシン類が含まれる。その他の例にはFc−受容
体に対するリガンドとして免役グロブリンまたはその断
片またはSIg（表面免役グロブリン）に結合する抗免役
グロブリン抗体がある。このリガンドは天然のものでも
合成したものでもよい（Trends Pharmacol.Sce.（198
9）および本明細書で引用している文献参照）。
以下に示したものは本発明に従うようなインターナラ
イジング因子の適性に関する必要条件である。
（ａ）核酸が導入されるべきであり、結合因子と結合し
ている場合にもその導入活性が全くまたは殆ど影響を受
けないような特定の細胞型によって取り込まれることが
できるということ。
（ｂ）この性質の範囲内で、使用される経路を介して核
酸を「ピギーバック方式」で細胞内に運びうること。
この理論に拘束されることなく、組み合わせ複合体は
インターナライジング因子に特異的な表面受容体への結
合、またはウイルスまたはウイルス成分が使用される場
合には、ウイルス受容体への結合または受容体仲介エン
ドサイトーシスによる両受容体への結合のどちらかによ
り細胞によって取り込まれる。エンドソモリチック細胞
がエンドソームから放出される場合、複合体中に含まれ
るDNAも細胞質中に放出され、その結果リソソマール分
解が免れる。
DNA複合体中のエンドソモリチック結合体の成分とし
てのウイルス、ウイルス成分または非ウイルス性エンド
ソモリチック試剤の存在は以下に示す利点を有してい
る。
１）特にウイルスまたはウイルス成分を使用する場合
にはエンドソモリチック試剤はインターナライジング因
子を構成したりあるいは他のインターナライジング因子
（例えばトランスフェリンまたはアシアロフェチュイ
ン）と共にDNAと結合して複合体を形成しうることによ
る、核酸複合体を用いた遺伝子転移技術の広範囲な応
用。この点において、問題のウイルスに対する受容体を
全く持たない細胞に対してさえ該ウイルスの積極的作用
を利用することができる。
２）DNAに対するエンドソモリチック結合体の結合に
よってそれらが一緒に細胞内へ取り込まれることが保証
されることによる、遺伝子転移の効率の改善。また、ウ
イルスおよびDNAの一致した取り込みおよび放出は効率
的な遺伝子転移に必要とされるDNAおよびウイルス量の
軽減の可能性を生じさせ、このことは生体内で使用する
場合に特に重要となる。
本発明に従って行う実験において、ヒトトランスフェ
リンを付加的インターナライジング因子として使用し
た。さらに、本発明の結合体の性能は付加的インターナ
ライジング因子−結合因子結合体を含まないDNAおよび
ポリリジン結合ウイルスの複合体によって証明された。
核酸に対する親和性を持つ物質に対するウイルスの結
合は、核酸に対する親和性を有する物質の抗体への共有
結合により達成される。ウイルスの取り込み機能に関係
しないウイルスタンパク質領域におけるエピトープに結
合する抗体を使用することが好ましい。
本発明の範囲内で実行される試験において、アデノウ
イルスとポリカチオン間の結合はアデノウイルス・キャ
プシドに対する特異性を有する抗体をポリリジン分子に
共有結合させることによって達成した。アデノウイルス
繊維およびペントンタンパク質がウイルスの結合および
細胞内へのその取り込みに必要であることが知られてい
るが、一方、主キャプシドタンパク質ヘクソンは、これ
らの過程においてあまり重要ではない。それゆえに、ヘ
クソンタンパク質上のエピトープの認識によってアデノ
ウイルスのポリリジンへの結合を生じさせる抗体を使用
した。この特異的な結合は、一方ではそのヘクソンタン
パク質の表面領域に外来エピトープを有するキメラアデ
ノウイルスを用いることにより達成された。一方では、
ヘテロエピトープに特異的なモノクローナル抗体を使用
した。（この構築物は第１図に模式図で示した）。これ
はキャプシドタンパク質を機能的に破壊することなしに
アデノウイルスをポリリジンに結合させる。
ウイルスおよび核酸結合物質間の結合を確立するため
の特定の抗体の使用は重要ではない。特定の抗体の好適
性に関する必要条件は、ウイルスの取り込み機能を中和
しないか、または部分的にだけ中和するということであ
る。
本発明の範囲においては、取り込み機能に関して本質
的ではないウイルスタンパク質のエピトープに対する抗
体が好ましい。このようなウイルス領域の例には上述の
アデノウイルスのヘクソンタンパク質またはインフルエ
ンザのニューラミニダーゼがある。
しかしながら、取り込み機能に関係するウイルスタン
パク質に対する特異性を有する抗体も、好適な化学量論
比を維持することによって抗体がウイルスの細胞結合領
域の一部分しか専有せず、その結果細胞に対するウイル
スの結合に関して自由で十分なドメインがまだ存在する
ことが保証されるならば、好適である。一方、複合体が
さらにインターナライジング因子および核酸結合物質を
含む第２結合体を含む複合体、即ち組み合わせ複合体で
ある限り、ウイルスの取り込み機能を阻害する抗体を使
用してもいい。
特定の用途に好適な抗体量は滴定で測定することがで
きる。
モノクローナル抗体、またはそのFab'フラグメントが
好ましい。
もしウイルスが外来エピトープを有するキメラウイル
スであるならば、抗体はこのエピトープに向けられる。
好ましくは、このウイルスは、ヘクソン領域のコード配
列を修正して抗体が生成することができる非対応タンパ
ク質をコードする配列を含むようにした場合、キメラア
デノウイルスである。ヘキソンタンパク質は、１つの非
常に保存性の高い基本ドメインおよびビロン（Viron）
の表面に大きく露出している保存性の低い３つのループ
を含んでいる（ロバーツ（Roberts）等、1986）。これ
らのループ中には幾つかの短い領域が存在し、その中の
Ad2およびAd5のアミノ酸配列は異なるものでAd5はAd2に
比べて変異および欠失を含んでいる。これらは核酸に対
する親和性を有する物質にアデノウイルスを免疫学的に
結合させるために使用される外来タンパク質をコードす
る外来遺伝子配列の挿入のための潜在的部位である。好
ましくは、外来遺伝子配列はAd5遺伝子配列中に、各々
部位Ｉ、II、IIIおよびIVと称されるアミノ酸部位161−
165、188−194、269−281および436−438に挿入される
（第８図参照）。各潜在的部位の所で、Ad5ヘキソン遺
伝子のサブクローンの部位特異的突然変異誘発により特
定の制限部位を作製することができる。非保存的アミノ
酸をコードするヌクレオチドを同時に欠失させ、外来遺
伝子配列の挿入のための空間をより大きくしうる。一般
に、部位Ｉ、II、IIIおよびIVに挿入しうるアミノ酸の
数が小さい（約65個まで）ことから、外来遺伝子配列
は、エピトープと少数の隣接配列に対応するアミノ酸し
かコードしていない（部位特異的突然変異誘発によりAd
5ヘクソン遺伝子配列中に生成される可能な挿入部位を
第８図に示す。ヘクソンサブユニットの三次元的スケッ
チのために、ロバーツ（Roberts）等、1986による表示
方法を採用した。） 特定のモノクローナル抗体の外来タンパク質に対する
エピトープ特異性はペプチドスキャンニングにより測定
することができる。ギーセン（Geysen）等、1984、198
5、1986、1987、EP−Ａ−392,369（本公開は本明細書に
おいて参考として引用する）を参照。本方法に従い、外
来タンパク質の重複する８アミノ酸ペプチドを固相合成
法により調製した。例えば、ペプチド１はアミノ酸１−
８からなり、ペプチド２はアミノ酸２−９からなるとい
う具合に調製した。合成後、ペプチドは固相担体に結合
したままにしておく。ELISAにより固定化ペプチドに対
する反応性について、ハイブリドーマ細胞培養上清また
はその精製したモノクローナル抗体について試験した。
一度エピトープ領域を同定すれば、エピトープ領域をコ
ードする遺伝子配列は領域Ｉ、II、IIIまたはIVの制限
部位の任意のところに挿入される。タンパク質およびこ
のタンパク質に特異的な抗体の例はたくさんある。当業
者はせいぜい決まりきった実験を行うだけで本発明にお
いて使用できる外来タンパク質−抗体の組み合わせを選
択することができる。例えば、それに対する抗体が既知
であるようなタンパク質をコードする既知の配列をアデ
ノウイルスのヘクソン領域に挿入する。それから生成し
たキメラウイルスについて、例えば競合実験、ELISAま
たは他の免役検定法において標識抗体に対する免疫学的
結合に関し試験することができる。このような免役検定
技術は既知であり、当業者により決まりきまった方法で
実施されている。
抗体−ポリカチオン結合体はペプチドを結合するため
のそれ自体既知の方法、好ましくはワグナー（Wagner）
等、1990およびEP−A1 388 758に報告されている方法を
使用して化学的に製造することができる。
モノクローナル抗体が重鎖の定常領域に好適な炭水化
物側鎖、特に末端がシアル酸のものを有している場合に
は、結合体はワグナー（Wagner）等、1991bに報告され
ている方法を使用してポリカチオンを炭水化物側鎖に結
合することによって調製することができる。
本発明のもう一つの側面は、核酸並びに、インターナ
ライジング因子および核酸に対する親和性を有する物質
の結合体を含む複合体であって、高等真核細胞に取り込
まれる複合体に関する。この複合体は、インターナライ
ジング因子が抗体を介して核酸に対する親和性を有する
物質に結合するウイルスであり、その結果、結合体／核
酸複合体の一部として細胞に侵入し、細胞に侵入した後
に複合体が存在するエンドソームの内容物を細胞質中に
放出する能力を有することを特徴としている。
核酸複合体の定性的組成に関しては、一般に細胞に転
移するべき核酸を最初に決定する。核酸は細胞内で達成
すべき生物学的効果によって主として定められ、 遺伝子治療のために使用する場合には、例えば欠陥遺伝
子を置換することを目的として発現されるべき遺伝子ま
たは遺伝子断片、または阻害すべき遺伝子の標的配列に
よって決定される。細胞に輸送するべき核酸はDNAでもR
NAでもよく、核酸配列に制限はない。
もし、本発明をガンワクチンとして使用するために腫
瘍細胞に適用するならば、細胞内に導入されるべきDNA
は免役調節物質、例えばIL−２、IL−４、IFN−γ、TNF
−αのようなサイトカインをコードすることが好まし
い。サイトカインをコードするDNAの組み合わせ、例え
ば、IL−２およびIFN−γの組み合わせは特に有用であ
る。腫瘍細胞への挿入のために有用なその他の遺伝子に
は多薬剤耐性遺伝子（mdr）がある。
また、細胞内に２以上の異なる核酸配列、例えば適当
な調節配列の調節下にある２つの異なるタンパク質をコ
ードするcDNAを含むプラスミドまたは異なるcDNAを含む
２種類のプラスミド構築物等を導入することも可能であ
る。
特定の遺伝子配列を阻害するために細胞内に転移する
ための治療的に有効な阻害性核酸にはアンチセンスRNA
またはリボザイムに転写される遺伝子構築物が含まれ
る。さらに、細胞内にオリゴヌクレオチド、例えばアン
チセンスオリゴヌクレオチドを導入することも可能であ
る。アンチセンスオリゴヌクレオチドには15以上のヌク
レオチドが含まれることが好ましい。場合によっては、
オリゴヌクレオチドは重合化していてもよい。リボザイ
ムを細胞内に導入する場合、安定化遺伝子要素、例え
ば、tRNA遺伝子要素を含む遺伝子構築物の一部分として
導入することが好ましい。この型の遺伝子構築物はEP A
0 387 775に開示されている。
それらの相補性の理由から遺伝子、例えばウイルス遺
伝子を阻害する核酸分子とは異なり、別の阻害様式を有
する遺伝子を使用してもよい。その例にはいわゆるトラ
ンス−ドミナント変異を有するウイルスタンパク質をコ
ードする遺伝子がある（ハースコビッツ（Herskowit
z）、1987）。細胞内での遺伝子の発現によって対応す
る野生型のタンパク質を超えるタンパク質が生成し、ウ
イルスの複製を阻害することにより「細胞性免役」を獲
得した細胞が保護される。HIV複製を阻害することが示
されている、例えばGag−、TatおよびRev変異体等のよ
うな、複製および発現に必要なウイルスタンパク質のト
ランス・ドミナント変異が好適である（トロノ（Tron
o）等、1989、グリーン（Green）等、1989、マリム（Ma
lim）等、1989）。
細胞内免役を達成するもう一つのメカニズムには例え
ば、いわゆるTARデコイ（decoys）のような必須ウイル
スタンパク質に対する結合部位を含むRNA分子の発現が
含まれる（スレンジャー（Sullenger）等、1990）。
ソマチック遺伝子治療で使用でき、かつ本発明により
遺伝子構築物の成分として細胞内に転移できる遺伝子の
例には、因子VIII（ヘモフィリアＡ）（例えばウッド
（Wood）等、1984参照）、因子IX（ヘモフィリアＢ）
（例えばクラチ（Kurachi）等、1982参照）、アデノシ
ンデアミナーゼ（SCID）（例えば、バレリオ（Valeri
o）等、1984参照）、α−１アンチトリプシン（肺のエ
ンフィセマ）（例えばチリベルト（Ciliberto）等、198
5参照）または嚢胞性線維症トランスメンブレン・コン
ダクタンス調節遺伝子（例えばリョウダン（Riordan）
等、1989参照）が含まれる。これらの例にはいかなる種
の制限も含まれない。
核酸のサイズに関しては広い範囲が可能である；約0.
15kb（リボザイム遺伝子を含むtRNA遺伝子の場合）から
約50kb以上の遺伝子構築物が本発明の方法で細胞内に転
移され、オリゴヌクレオチドのようなより小さい核酸分
子を使用してもよい。
本発明は遺伝子配列に関して何ら制限が無く、また本
発明により非常に大きな遺伝子構築物でさえ輸送できる
ために、可能な応用は非常に広いということは明らかで
ある。
抗体−ポリカチオン：核酸のモル比を決定する場合、
核酸の複合体化が起こることに留意しなければならな
い。より初期の発明において、細胞中への核酸の最適転
移は、もしインターナライジング因子−ポリカチオン／
核酸複合体が実質的に電気的中性になるように核酸に対
する結合体の比を選択すれば、達成することができるこ
とが確認されている。もしいくらかのトランスフェリン
−ポリカチオン結合体が非共有結合ポリカチオンと置換
されれば、細胞に取り込まれる核酸の量は減少しないこ
とが分かった；ある場合にはDNA取り込みの増加さえあ
った（ワグナー（Wagner）等、1991a）。複合体内のDNA
は直径80から100nmのトロイド状構造に濃縮された形態
で存在することが観測された。このようにポリカチオン
量は電気的中性およびコンパクトな構造の達成という２
つのパラメーターの観点から選択される一方、本発明に
よって好ましいとされるように複合体の電気的中性を達
成するという観点から核酸の電荷から生じるポリカチオ
ンの量は一般的にはDNAの圧縮をも保証する。
本発明の複合体中に含まれる成分の比を決定するため
の好適な方法は、第一に細胞に転移するべき遺伝子構築
物を決定し、さらに、上記したように特定のトランスフ
ェクションに対して好適なウイルスを決定することであ
る。それからこのウイルスに結合する抗体をポリカチオ
ンと結合し、遺伝子構築物と複合体を形成させる。決定
したウイルス量から出発して、次にこの（一定）量のウ
イルスと減少していく種々の濃度のDNA複合体（場合に
よってはこの逆）で標的細胞を処理することによって滴
定を行う。このようにして、ウイルスに対するDNA複合
体の最適比を決定する。第２段階において、細胞を減少
していく種々の濃度のウイルス/DNA複合体混合物（複合
体に対するウイルスの比は一定）で処理し、最適濃度を
決定する。好ましくは、このウイルスはアデノウイルス
であって、核酸に対する親和性を有する物質に対するア
デノウイルスのモル比は約1:1から約1:100である。
好ましい態様に関して、複合体が実質的に電気的中性
である限り、ポリカチオンの長さは重要ではない。ポリ
リジン鎖長の好ましい範囲は約20から約1000リジンモノ
マーである。しかしながら、所定の長さのDNAに対し臨
界的なポリカチオンの長さはない。DNAが6,000bpから成
り、12,000の負電荷を有する場合、DNAモル当たりのポ
リカチオン量は、例えば、 ポリリジン200では60分子 ポリリジン400では30分子または ポリリジン100では120分子等となる。
当業者はありきたりの実験さえすればポリカチオンの
長さおよびポリカチオン量の別の組み合わせを選択する
ことができる。
本発明の複合体は希釈溶液の形態で存在する核酸およ
び抗体結合ポリカチオンを混合する事により調製するこ
とができる。DNA複合体は生理的塩濃度で調製すること
ができる。別の可能性としては高塩濃度（約2M NaCl）
を使用し、次にゆっくり希釈するか透析することにより
生理的条件に調整する。核酸成分、抗体−ポリカチオン
結合体およびウイルスを混合する際の最良の順番は個々
の予備試験によって決定する。
本発明はもう一つの側面においては、細胞を本発明の
複合体と接触させ、複合体を取り込ませた後、そのエン
ドソームから複合体を放出させるという高等真核細胞へ
核酸を導入するための方法に関する。
また本発明はもう一つの側面においては、治療的に活
性な核酸、好ましくは遺伝子構築物の一部分として、お
よびポリカチオンを介して結合される抗体から成る複合
体を活性成分として含有する医薬製剤に関する。好まし
くは、この製剤は凍結乾燥状態の形態においてまたは深
い凍結状態の好適な緩衝液中に存在し、ウイルス調製物
は使用直前に複合体溶液と混合される。もしかすると、
ウイルスは医薬製剤中にすでに含まれていてもよく、そ
の場合は深い凍結状態にある。任意の不活性な医薬的に
許容しうる担体、例えば、塩溶液またはリン酸緩衝液、
またはDNA複合体が本発明の枠組み内で使用されるのに
適した溶解性を有するような担体を使用することができ
る。医薬製剤の処方するための方法はReminington's Ph
armaceutical Sciences,1980が参照される。
おそらく、トランスフェクションに必要な成分、即
ち、DNA、ウイルス調製物および抗体結合体または結合
パートナー、さらにインターナライジング因子結合体お
よび遊離ポリカチオンはたぶん本発明の別の対象である
トランスフェクションキットの成分として適当な緩衝液
中で個別にまたは部分的に分別して保存される。本発明
のトランスフェクションキットには、本発明による高等
真核細胞へのトランスフェクションに必要とされる物質
を含む試験管、アンプル等のような１以上の容器を含む
担体が含まれる。このようなトランスフェクションキッ
トでは第一の容器に１以上の異なるDNAが含まれる。第
二の容器にはトランスフェクションキットをモジュール
システムとして使用することを可能にする１以上の異な
るインターナライジング因子結合体が含まれる。各成分
がすぐに使用できる調製物として存在するか、または使
用直前に混合するよう別々にしてあるかは特定の用途ば
かりではなく、安定性試験を使用して決まりきまった方
法で調査することができる複合体の安定性にも依存して
いる。
治療目的のためには、調製物は全身的、好ましくは静
脈注射で投与される。この型の投与のための標的器官に
は、例えば、肝臓、脾臓、肺、骨髄および腫瘍がある。
最近、マウスの筋肉繊維に遺伝子を運搬するためにミ
オブラスト（未成熟筋肉細胞）を使用できる可能性が示
された。ミオブラストは血液中に遺伝子産物を分泌する
ことが示されているので、この方法は筋ジストロフィー
に関連する欠陥のような筋肉細胞の遺伝的欠陥の治療以
外にも非常に広く応用しうる。従って、作製したミオブ
ラストは、血液中で作用するかまたは血液によって輸送
される遺伝子産物を運搬するために使用してもよい。
局所的適用の例には肺組織（注入用の液体または吸入
用のエアロゾルとして本発明の複合体を使用する）、肝
臓、筋肉組織または腫瘍への直接的注射、胃−消化管へ
の局所的投与等がある。医薬組成物を投与するための別
の方法にはバイル・ダクト・システムがある。この投与
方法はバイル・ダクト上の肝細胞膜への直接的接近が可
能であり、その結果血液構成物との相互作用を回避でき
る。
また、体外での治療的応用も可能であり、その場合治
療した細胞、例えば骨髄細胞、肝細胞またはミオブラス
トは体内に戻される（例えば、ポンダー（Ponder）等、
1991、ダワン（Dhawan）等、1991）。本発明のその他の
体外の応用には、いわゆるガンワクチンに関するもので
ある。この治療的可能性の原理は患者から腫瘍細胞を単
離し、この細胞にサイトカインをコードするDNAをトラ
ンスフェクションするものである。次の段階において、
この細胞を場合によっては、例えば照射によって不活性
化し、その結果複製は行わないがサイトカインは発現す
るようにする。それから、この遺伝的に修正した細胞を
それをとってきた元の患者にワクチンの形で投与する。
ワクチン部位周辺の領域において、分泌されたサイトカ
インが細胞毒性Ｔ細胞を活性化することにより部分的に
免役形を活性化する。これらの活性化した細胞は体の他
の部分においてもその活性を行使し、未処理の腫瘍細胞
でさえも攻撃することができる。このようにして腫瘍再
発および転移発達とう危険が軽減される。遺伝子治療に
ガンワクチンを使用するための好適な操作はロゼンバー
グ（Rosenberg）等、1992に記載されている。ロゼンバ
ーグによって提唱されたレトロウイルスベクターの代わ
りに、本発明の遺伝子転移システムを使用することがで
きる。
アデノウイルス−抗体−ポリカチオン/DNA複合体の遺
伝子転移に関する能力を測定する為に、レポーター遺伝
子としてホチナス・ピラリス・ルシフェラーゼをコード
する遺伝子を含むプラスミド（デ・ウェット（De Wet）
等、1987）をDNAとして使用した。複合体のための標的
細胞としてはHeLa細胞を使用した；これらの細胞は決ま
った量のアデノウイルスに対する細胞表面受容体を有し
ている（フィリプソン（Philipson）等、1968）。本発
明の結合体の成分（ウイルス、抗体−ポリリジン−結合
体、DNA）を一緒に使用する場合、ルシフェラーゼ・レ
ポーター遺伝子の発現に関して高い値が得られた（第３
図）：比較実験では、アデノウイルスが非複合体化プラ
スミド−DNAの転移をわずかしか増加させないことが分
かった。また、抗体結合ポリリジン（ウイルスとの結合
無し）と複合体を形成するDNAはHeLa細胞中にうまく取
り込まれないことも分かった。これとは極めて対照的
に、DNAが抗体を介して結合することによってアデノウ
イルスと相互作用することができる場合は高い遺伝子発
現の値が得られた。この効果は複合体化の前にビリオン
を熱処理する時に停止した。この処理はウイルスの構造
的統合性を破壊することなしにウイルスの取り込み機能
を選択的に除外するので（デファー（Defer）等、199
0）、これらの実験から遺伝子転移の成功に基本的に寄
与しているのはアデノウイルスの特異的取り込み機能で
あるということが結論付けられる。また、特異的な非ポ
リリジン結合モノクローナル抗体によるキメラアデノウ
イルスの表面上の外来エピトープに対する競争もまた正
味の遺伝子発現の減少をもたらすことが分かった。それ
ゆえに、複合体による機能的遺伝子転移の達成に本質的
に必要なものは、抗体結合DNAと対応するアデノウイル
ス表面エピトープとの間の特異的相互作用である。ポリ
リジン−複合DNAがアデノウイルスによって標的細胞中
に評価できるほど転移されないということも分かった。
このことは、複合体の遺伝子転移能力がDNAの濃縮に基
づくものではなく、レポーター遺伝子のビリオンに対す
る抗体仲介結合に依存していることを示している。
これに従って、ポリリジン結合抗体によって認識され
るエピトープを有しないウイルスを使用しても、このエ
ピトープを有するウイルスによって達成される高い遺伝
子発現値を達成することはできない。しかしながら、こ
のウイルスは遺伝子転移の範囲をバックグランドレベル
以上まで達成することができた。アデノウイルスは液相
を通しての細胞の高分子の細胞の取り込みを非特異的に
増強することができることが分かっているので（デファ
ー（Defer）等、1990）、この結果は予想されていなか
った。この非特異的輸送が抗体−ポリリジン/DNA複合体
に結合することができる特異的ウイルスよりも有意に低
いレポーター遺伝子発現をもたらすという事実、複合体
の成分の特異的結合の重要性を証明している。
プラスミドDNAとポリリジン結合体の相互作用は、DNA
分子に有意な構造変化をもたらし、そのもっとも顕著な
ものは直径80から100nmのトロイド構造への収縮によっ
て特徴付けられる（ワグナー（Wagner）等、1991a）。
ウイルスの直径は70から80nmの水準である（フィリプソ
ン（Philipson）、1983）。それゆえに、立体的考察に
基づき、抗体−ポリリジン−複合体化DNAに対するアデ
ノウイルスの最適比はせいぜい1:1であると考えられ
る。さらに、受容体仲介エンドサイトーシスの最初の取
り込み段階が行われる被覆ピットの直径は約100nmであ
る（ダーネル（Darnell）等、1975）。この事実に基づ
き、このサイズを超えるマルチマーはその取り込み能力
を制限されると考えられた。本発明の範囲内でこれらの
相関関係が分析される一方、抗体−ポリリジン−複合体
化DNAに対して過剰のモルのアデノウイルスの使用によ
ってレポーター遺伝子の最大の発現が1:1の比で達成さ
れることが示された（第４図）。それゆえに、行われた
実験の範囲内において、最適結合体は単一の抗体−ポリ
リジン/DNA結合ドメインと共に単一のアデノウイルスイ
ンターナライジングドメインから成るものであることが
分かった。
次に、この最適比率を有するアデノウイルス−抗体−
ポリカチオン結合体の遺伝子転移効率を調べた。複合体
の対数的希釈物を標的細胞に添加すると、レポーター遺
伝子の発現も対応して対数的に減少したが（第５図）、
本ベクターシステムを使用する106個のHeLa細胞に対し
て107個のDNA分子を適用するとレポーター遺伝子の検出
可能な発現が生じたことは注目される。意外にも、それ
ゆえにアデノウイルス−ポリカチオン−DNA複合体の形
態で細胞当たりたった10個のDNA分子を用いて外来遺伝
子の効率的発現が達成された。
それゆえに、DNA取り込みの規模に関して、本発明の
結合体は細胞当たり約500,000個の数のDNA分子を必要と
するDNA遺伝子転移ベクターよりも明らかに優れている
ことが示される（フェルグナー（Felgner）等、1987、
フェルグナー（Felgner）等、1989、マーラー（Maure
r）、1989）。これらの方法は大多数のDNAを細胞の標的
領域、すなわちサイトゾルに効率的に輸送するので（フ
ェルグナー（Felgner）等、1989、マロン（Malone）
等、1989、ロイター（Loyter）等、1982）、本発明の結
合体の効率はおそらく細胞質への外来DNAの放出の増加
に排他的に基づくものではおそらくない；遺伝子輸送の
経路上の別のメカニズムもまた促進されているかもしれ
ない。
アデノウイルス−ポリリジン−DNA複合体の立体配置
において、アデノウイルス部分はエンドソームを破壊す
るための試剤および複合体のリガンドドメインとしての
両方の作用をする。それゆえに、所定の標的細胞に対す
る複合体の遺伝子転移効率は、アデノウイルス細胞表面
受容体の相対的数を反映するはずである。大量のアデノ
ウイルス受容体を有する（フィリプソン（Philipson）
等、1968）HeLa細胞株およびKB細胞株は両方ともアデノ
ウイルス−ポリリジン−DNA複合体によって遺伝子転移
に関して対応するような高い接近性を示した（第６
図）。対照的に、細胞株MRC−５（プリシャス（Preciou
s）およびラッセル（Russell）1985）およびHBE1の特徴
である比較的少数のアデノウイルス受容体は、細胞中へ
の複合体による低遺伝子転移効率に反映している。
アデノウイルスに加えて別の細胞表面リガンド（イン
ターナライジング因子）を含む３成分複合体は、トラン
スフェリンまたはアデノウイルスリガンドドメインのみ
を有する結合体よりも有意に高い水準を示した（第7A
図）。この増加の規模は、明らかにトランスフェリン−
ポリリジン−DNA複合体とアデノウイルス−ポリリジン
−DNA複合体の相加的効果に基づくものではない。３成
分複合体はアデノウイルスまたはトランスフェリン取り
込みメカニズムで取り込むことができるので、この明ら
かな相互作用によって、アデノウイルスドメインが、お
そらくアデノウイルスによってもたらされるエンドサイ
トーシスに基づく両方の経路による細胞への侵入を可能
にしていると考えることができる。エンドソームが破壊
されるとき３成分複合体のアデノウイルス・ドメインの
選択的協同作用を示すために、アデノウイルス−ポリリ
ジン−DNA複合体に対して異なる受容性を有する細胞株
に組み合わせ複合体を作用させた（第7B図）。上皮呼吸
管細胞株はHeLa細胞と比べてAdpL−DNA複合体によって
達成される遺伝子転移の値が非常に低く（第６図）、こ
れはこの細胞株に特徴的であるアデノウイルス受容体の
細胞表面密度が比較的低いことを反映している。これと
は明確に対照的に、３成分AdpL/TfpL複合体の使用はHeL
a細胞で見られる水準に匹敵する水準の遺伝子発現をも
たらした。３成分複合体による遺伝子転移に関するこの
細胞株の受容性は、アデノウイルスドメインがトランス
フェリンメカニズムにより取り込まれるという考え方と
一致する一方で、エンドソームの破壊を引き起こすこと
によって遺伝子転移を増強するものである。これによ
り、結合体の構築の際にアデノウイルスまたは他のウイ
ルスのエンドソモリチック性を利用し、その事により細
胞分泌小胞系から逃れることが可能になるという可能性
が生ずる。
本発明の範囲内において、本発明の複合体による呼吸
管上皮への遺伝子の直接的生体内転移を齧歯類モデルに
おいて証明した。これは本発明を使用して呼吸器管上皮
における一時的遺伝子発現を達成できることを支持す
る。組織で（in situ）で呼吸器官細胞の遺伝的修正を
達成できることにより、呼吸器管上皮の疾患のための遺
伝子治療の戦略の可能性を開いた。実行した試験におい
て、トランスフェリン−ポリリジン−DNA複合体は低水
準のレポーター遺伝子の発現を示した。これはこの型の
結合体がエンドソームの中に閉じ込められているはずだ
という事実と一致する。アデノウイルスポリリジン２成
分複合体は有意に高い遺伝子発現をもたらした。さら
に、これは組み合わせ複合体hTfpL/AdpLにおいて第２の
インターナライジング因子の使用により増加した。正味
の遺伝子発現がトランスダクション効率と一致するかど
うかを調べるために、各種の型の複合体でトランスダク
ションした細胞の割合を測定した。その結果、そのよう
な一致があることが分かった；初代培養物中hTfpLで修
正した呼吸器管上皮は１％以下のトランスダクション頻
度であったが、AdpL複合体は20から30％の範囲の頻度を
示し、さらに組み合わせ複合体は50％以上の修正細胞を
示した。
齧歯類モデルにおいて生体内で行った実験は初代培養
物で得られた結果と一致した。LacZ組み合わせ複合体で
処理したラット由来の組織学的肺切片の実験は多数の陽
性細胞を含むβ−ガラクトシダーゼ活性の不均等なゾー
ンを示した。この陽性領域は呼吸器管の細気管支および
末梢領域と関連があった。
図式の簡単な説明 第１図：アデノウイルスキャプシド上に外来エピトー
プを含むアデノウイルス−ポリカチオン−DNA複合体の
模式図。
第２図：キメラ−アデノウイルスAd5−P202の調製。
第３図：アデノウイルス−ポリカチオン−DNA複合体
を用いたHeLa細胞への遺伝子転移。
第４図：アデノウイルスおよびポリリジン−抗体−複
合体化DNAの最適比の測定。
第５図：アデノウイルス−ポリカチオン−DNA複合体
によって達成される遺伝子転移の測定。
第６図：アデノウイルス−ポリカチオン−DNA複合体
によって仲介される各種の真核細胞への遺伝子転移。
第７図：アデノウイルスおよびヒトトランスフェリン
結合体を含む組み合わせ複合体によって仲介される遺伝
子転移。
A:HeLa細胞における組み合わせ複合体と２成分複合体
の効率の比較。
B:組み合わせ複合体による遺伝子転移の効率に関する
HeLa細胞およびHBE1細胞の比較。
第８図：ヘクソンサブユニットの三次元的表示；部位
特異的突然変異誘発によって得られるAD5ヘクソン遺伝
子配列中における可能な挿入部位。
第９図：初代呼吸器管上皮細胞培養物のトランスフェ
クション。正味の遺伝子転移の相対的水準。
第10図：初代呼吸器管上皮細胞培養物のトランスフェ
クション。トランスダクションの相対的頻度。
第11図：生体内における気管内経路を介した遺伝子転
移。生体内における正味の遺伝子転移の相対的水準。
第12図：生体内における気管内経路を介した遺伝子転
移。呼吸器管上皮における外来遺伝子発現の位置の特
定。
第13図：キメラアデノウイルス−レクチン−ポリリジ
ンDNA複合体の生体内での適用。
実施例 本発明を以下の実施例によって説明する。
実施例１ 抗体−ポリリジン結合体の調製 １）キメラアデノウイルスAd−P202の調製 Ad5ヘクソン遺伝子に変化を与えるために、最初にこの
遺伝子をサブクローニングする必要があった。プラスミ
ドpEcoR I A−Ad5（バークナー（Berkner）およびシャ
ープ（Sharp）、1983）はマップ・ユニット（m.u.）０
から76に相当するアデノウイルスゲノムの左部分を含ん
でいる。ヘクソン遺伝子はm.u.52とm.u.60の間である。
2.3kbpのHind III/Sst I断片は変化を起こすべきヘクソ
ン遺伝子の部分を含んでいる。多数のHind IIIおよびSs
t I部位がpEcoR I A−Ad5中に含まれているので元のプ
ラスミド中で修正したヘクソン遺伝子を組み立てること
ができるようにするためにいくつかの中間プラスミドを
構築する必要があった。Sal I/BamH I断片（m.u.46−6
0）は付加的なHind IIIまたはSst I部位を全く含まない
ヘクソン遺伝子を含む。最初に、Sst IまたはHind III
部位を含まないp142と称するベクター（Pvu IIによる制
限消化およびEcoR Iリンカーの挿入によって市販のプラ
スミドpIB I24（IB I,Inc.）から誘導したもの）を用い
てアデノウイルスをm.u.0から76まで再クローニングし
た。それからm.u.26のSal I部位をXba I断片（m.u.3.7
−29）を欠失させることにより除外した；生成したベク
ターをp141−12と命名する。最後に、所望のHind III/S
st I断片をM13mp18にクローニングし、突然変異の用意
ができた。キュンケル（Kunkel）、1985に記載の方法を
用いて生成したクローンの１つを用いて部位特異的突然
変異誘発を行った。ヘクソン遺伝子のコドン188から194
を除外し、この位置に一度だけしか生じない唯一のPml
I部位を導入した。それから得られたクローン（167−
１）をPml Iで切断しマイコプラズマ・ニュウモニアエ
（mycoplasma pneumoniae）P1−タンパク質のアミノ酸9
14−928をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを挿入
した（イナミネ（Inamine）等、1988）。P1配列はその
調製方法は以後に述べるモノクローナル抗体301によっ
て認識されるエピトープを含んでいる。修正したHind I
II/Sst I断片をp167−１から単離し、元のプラスミドpE
coR I A−Ad5にライゲーションして戻した。Ad−P202の
調製を第２図に示す。
２）キメラアデノウイルスに対する特異性を有するモノ
クローナル抗体（MP301）の調製 ａ） 免疫化 標準法によってモノクローナル抗体を調製した。
マイコプラズマ・ニュウモニアエＭ−129株（ATCC＃2
9342）を抗原として使用した。培養フラスコ中での培養
後（フ（Hu）等、1977）、PBSで３回洗浄し、マイコプ
ラズマ・ニュウモニアエを回収して、0.5mlのPBSに懸濁
した。10μｇの抗原を免疫化のために使用した：以下の
手順に従って３匹の雌の週令約６週のBALB/cマウスを免
疫化した。
１次免疫化：マウス当たり完全フロイント（Freund's）
アジュバント中約10μｇの抗原を腹腔内経路で投与し
た。
２次免疫化:1次免疫化から３週間後、マウス当たり不完
全フロイントアジュバント中約10μｇの抗原を皮下経路
で投与した。
３次免疫化:2次免疫化から２週間後、マウス当たり不完
全フロイントアジュバント中約10μｇの抗原を腹腔内経
路で投与した。
１週間後、血清試料をマウスから採取し、血清力価を
測定した。最も高い力価を有するマウスに対し、尻尾か
ら10μｇの抗原をi.v.注射で投与した。３日後、このマ
ウスの脾細胞を採取しハイブリドーマとの融合に使用し
た。
ｂ）融合 ケラー（Ｋhler）およびミルシュタイン（Milstei
n）、1975の方法を使用してPEG4000（無血清培養培地中
50％）の存在下、約108個の脾細胞を約108個のSP2/0Ag1
4株のミエローマ細胞（ATCC CRL−1581）と融合した。
これからこの細胞をHAT選択培地中２週間、次いでHT培
地中で１週間、最後に通常の培養培地（10％FCSおよび
ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むDMEM）中で
培養した。ラジオイムノソルベント検定法（RIA）によ
り抗体産生クローンに関するスクリーニングを行い、マ
イコプラズマ・ニュウモニアエP1タンパク質に対する特
異性をウエスタンブロットを使用して測定した。「軟寒
天」法を使用して単一のクローンを得た。
ｃ）アデノウイルスAd−P202の中和効果に関するモノク
ローナル抗体MP301の試験 モノクローナル抗体MP301がウイルスの細胞へ感染す
る能力を中和するかどうかを決定するために、Ad−P202
の力価を標的細胞としてHeLa細胞（96穴プレート上で２
％FCS/DMEM中約50％の集密度）を使用して、抗体の添加
ありの場合を１回およびなしの場合を１回測定した。各
種の希釈率のAd−P202を調製し抗体とともにまたはそれ
なしでHeLa−力価プレートに与えた。このプレートを37
℃、５％CO2下で48時間インキュベートし、クリスタル
バイオレットで染色し、IC50（約50％の細胞分解が起こ
るときの阻害濃度）を測定した。抗体ありまたはなしで
1:2048の力価が得られた。
ｄ）MP301−ポリリジン結合体の調製 モノクローナル抗体のポリリジンへの結合は、ワグナ
ー（Wagner）等、1990およびEP−A1 388 758に記載の方
法を使用して行った。
1mlの200mM HEPES（pH7.9）中の20.6nmol（3.3mg）の
モノクローナル抗体MMP301をSPDP（100nmol）の5mMエタ
ノール溶液で処理した。室温で３時間後、修飾された抗
体をセファデックスＧ−25カラムでゲル濾過し、それに
よって62nmolのジチオピリジンリンカーで修飾された19
nmolの抗体を得た。修飾された抗体をアルゴン大気下、
100mM HEPES（pH7.9）中、３−メルカプトプロピオネー
ト修飾ポリリジン（22nmol、平均鎖長300リジンモノマ
ー、FITC標識、56nmolメルカプトプロピオネートリンカ
ーで修飾）と反応させた。Mono S HR5カラム（ファルマ
シア）上の陽イオン交換クロマトグラフィーによって結
合体を単離した。（勾配:20から100％緩衝液。緩衝液A:
50mM HEPES（pH7.9）；緩衝液B:3M塩化ナトリウムを含
む緩衝液Ａ）生成物分画は1.65Mと2Mの間の塩濃度で溶
出した。HBS（20mM HEPES（pH7.3）、150mM NaCl）に
対する透析で9.1nmol MP301および9.8nmolポリリジンか
ら成る結合体が生成した。
実施例２ 真核細胞におけるアデノウイルス−ポリカチオン−DNA
複合体による遺伝子転移 本実施例で行われる実験では、特異的および非特異的
複合体成分を各種の組み合わせをHeLa細胞およびその他
の細胞中へレポーター遺伝子を輸送する能力に関して検
定した。
抗体結合ポリリジンとのDNAの複合体化は、HBS（150m
M NaCl、20mM HEPES、pH7.3）中、６μｇの精製したp
RSVL−DNAを最終容量350μｌとなるように希釈し、これ
を最終容量150μｌの同じ緩衝液中で、9.5μｇのMP301p
Lで精製することによって行った。（pRSVLはラウス ザ
ルコーマ ウイルスLTRエンハンサー／プロモーターの
調節下にあるフォチナス ピラリスルシフェラーゼ遺伝
子を含み（ウチダ（Uchida）等、1977、デ ウエット
（De Wet）等、1987）、Triton X分解標準法（マニアチ
ス（Maniatis））、次にCsCl/EtBr平衡密度勾配遠心
法、ブタノール−１による脱色そして350μlHBS（150mM
NaCl、20mM HEPES、pH7.3）中の10mMのトリス/HCl
（pH7.5）、1mMのEDTAの溶液に対する透析で調製し
た）。抗体結合ポリリジンの量は輸送されるDNAの電気
的中和を達成するのに必要な量の計算に基づく。ポリリ
ジン−抗体複合体化DNAをHBS中で希釈して、最終濃度が
1ml当たり２×1011DNA分子にした。アデノウイルスP202
−Ad5は、２％FCSを補った氷冷DMEM中で、最終濃度が1m
l当たり２×1011ウイルス粒子となるよう希釈した。等
容量の抗体−ポリリジンDNAおよびウイルスを混合し、
室温で30分間インキュベートした。遺伝子転移のために
使用される標的細胞は60mm組織培養プレート中で５％FC
S、100I.U.ペニシリン/mlおよび100μｇストレプトマイ
シン/mlを補ったDMEM培地中で生育したHeLa細胞（300,0
00細胞）であった。HeLa細胞との比較のため、細胞株HB
E1、KB（ATCC No.CCL 17）およびMRC−５（ATCC No.CCL
171）の評価も行った。呼吸器系細胞株HBE1をウィルム
ソン（Willumson）等、1989に記載されたようにF12−7X
培地中で培養した。KBおよびMRC−５をイーグル最小基
礎培地/10％熱失活FCS/ml当たり100国際単位のペニシリ
ン/ml当たり100μｇのストレプトマイシン/10mM非必須
アミノ酸/2mMグルタミン中で培養した。
トランスフェクション培地に移す前にプレートを４℃
で30分間冷却し、培地を除去した後、1mlのトランスフ
ェクション培地を添加して細胞を４℃で２時間インキュ
ベートした。このステップはDNA複合体が細胞に取り込
まれること無しに細胞に結合されることを目的として行
った。この結合ステップの後、液相中の何らかの非結合
反応成分を除去するためにプレートを氷冷２％FCS/DMEM
で３回洗浄した。2mlの氷冷２％FCS/DMEMの添加後、プ
レートをゆっくり加熱した。次いでプレートをインキュ
ベーター中に16時間置いた（37℃、５％CO2）。レポー
ター遺伝子の発現を測定するために、細胞分解物を調製
し、総タンパク質含量を標準化してゼンケ（Zenke）
等、1990に記載されているようにルシフェラーゼ活性を
正確に測定した（ルミノメーターは、ルシフェラーゼ１
ピコグラムが50,000光単位を生ずるように校正した）。
pRSVLレポータープラスミドDNAを予めポリリジン抗体
結合体と複合体を形成していないアデノウイルスP202−
Ad5と組み合わせた（DNA＋P202−Ad5）。さらに、抗体
結合ポリリジンと複合体を形成したpRSVL−DNAを特異的
ウイルスの非存在下で検定し（DNA＋MP301pL）、これら
２つの反応培地を複合体成分の全組み合わせを含む反応
培地と比較した（DNA＋MP301pL＋P202Ad5）。同様に、
複合体形成の前に熱で失活させた（50℃、30分）特異的
抗体を用いることによって複合体の遺伝子転移能力を検
定した（DNA＋MP301pL＋P202−Ad5）。ポリリジン結合
抗体MP301および10倍モル過剰量の非ポリリジン結合MP3
01存在下（DNA＋MP301pL＋MP301＋P202−Ad5）、または
MP301pLおよび10倍モル過剰量の非結合非関連モノクロ
ーナル抗体、抗ラットIgGの存在下（DNA＋MP301pL＋抗
ラットIgG＋P202−Ad5）特異的アデノウイルスを用いて
競争実験を行った。さらに、特異的ウイルスとのインキ
ュベーション前に、レポータープラスミドDNAを抗体結
合ポリリジンと等モル量の非結合ポリリジン（４μｇ）
と複合体を形成させた（DNA＋pL＋P202−Ad5）。MP301
によって認識されるエピトープを欠くアデノウイルスWT
300を用いた複合体形成反応を、特異的ウイルスP202−A
d5の場合と全く同様に行った。実験は全部で３回行っ
た。結果を第３図に示す。データは平均値±SEMで示さ
れている。点線の平行線は未処理のHeLa細胞のバックグ
ランドシグナルを示す。HeLa細胞と比較した細胞株HBE
1、KBおよびMRC−５で得られた結果は第６図に示され
る。
実施例３ 遺伝子転移に関するアデノウイルスと抗体−ポリリジン
/DNAの最適比の決定 第４図に結果を示した本実施例で行った実験では、He
La細胞への遺伝子転移を許す能力に関して各種の割合の
複合体成分を有するアデノウイルス−抗体−ポリリジン
/DNA複合体を試験した。複合体形成反応は、異なる量の
特異的アデノウイルスP202−Ad5と共に、抗体−ポリリ
ジン結合体と複合体を形成した2.5×1010個のDNA分子を
使用したこと以外は実施例２の場合と同様に行った。細
胞の培養、細胞への複合体の適用、細胞のインキュベー
ションおよびレポーター遺伝子発現の測定も実施例２の
場合と同様に行った。示されているデータは４回の異な
る実験からの平均値±SEMを表す。
実施例４ アデノウイルス−ポリリジン−DNA複合体の遺伝子転移
の性能の測定 実施例２の場合と全く同様に調製した複合体の限定希
釈物に関して、それらがHeLa細胞におけるレポーター遺
伝子の検出可能な発現を可能にする点においてどのくら
い有効であるかを調べるために試験した。複合体形成
後、２％FCS/DMEM中の複合体の対数的希釈物を調製し
た。各種の希釈物1mlずつを５×105個のHeLa細胞を含む
60mm組織培養皿に添加した。１時間のインキュベート後
（37℃、５％CO2）、3mlの５％FCS/DMEMを添加し、プレ
ートをさらに同条件下で16時間インキュベートした。レ
ポーター遺伝子の発現は実施例２の場合と同様に測定し
た。第５図に示されているルシフェラーゼ発現の値は３
または４回の実験からの平均値±SEMに相当している。
点線の平行線は未処理のHeLa細胞のバッググランドシグ
ナルを示す。
実施例５ アデノウイルスおよびヒトトランスフェリンを含む組み
合わせ複合体による遺伝子転移 アデノウイルスおよびヒトトランスフェリンドメイン
の組み合わせを含む３成分複合体を調製するために、エ
ピトープ結合アデノウイルスP202−Ad5（2.5×1010粒
子）を750μｌの２％FCS/DMEM中に希釈し、250μlHBSで
希釈したポリリジンモノクローナル抗体MP301pLys（２
μｇ）と混合した。室温で30分間のインキュベーション
を行った。それから250μｌのHBSで希釈したプラスミド
DNA pRSVL（６μｇ）をこの混合物に添加し、室温でさ
らに30分間インキュベートした。生じるアデノウイルス
−ポリリジン−DNA複合体は全ポリリジン含有量に基づ
き不完全に収縮したDNAを有すると予想される。DNAの収
縮を完全なものにし、ヒトトランスフェリン部分を複合
体に寄与せしめるために、250μｌのHBS中に希釈したヒ
トトランスフェリンポリリジン結合体（ワグナー（Wagn
er）等、1990）（９μｇ）をアデノウイルス−ポリリジ
ン−DNA複合体に添加した。最後に、室温で30分間のイ
ンキュベーションを行った。形成された組み合わせ複合
体の特異的結合を達成するために生じる組み合わせ複合
体を組織培養細胞とインキュベートした（４℃、２時
間）。それからこのプレートを氷冷２％FCS/DMEMで３回
洗浄し、2mlの２％FCS/DMEMを添加した後、16時間イン
キュベートし直した（37℃、５％CO2）。レポーター遺
伝子の発現の評価を以前と同様に行った。
第7A図は、ヒトトランスフェリン−ポリリジン−DNA
複合体（hTfpL）、アデノウイルス−ポリリジン−DNA複
合体（AdpL）および３成分複合体によって生じるHeLa細
胞での遺伝子発現の相対値を示す。第7B図は、HeLa細胞
およびHBE1細胞の３成分複合体（AdpL/hTfpL）による遺
伝子転移に関する相対的感受性を示す。
実施例６ ２成分および３成分アデノウイルス複合体を使用する呼
吸器管上皮細胞における遺伝子転移 これらの実験では、ヒトアデノウイルス性肺疾患に好
適な動物モデルであることが分かっているラットのシグ
モドン ヒスピダス（Sigmodon hispidus）（「コット
ン ラット」）を使用した（パシニ（Pacini）等、198
4）。さらに、先の実施例で記載した２成分および３成
分複合体を使用した。
ａ）呼吸器管上皮細胞の初代培養物のトランスフェクシ
ョン 従来法によって初代培養物を調製した（ヴァン スコ
ット（Van Scott）等、1986）。分離した細胞を収穫
し、F12−7X培地で３回洗浄したのち、皿当たり５×105
細胞の密度になるように3cm組織培養皿にプレーティン
グした。細胞をF12−7X培地中に保持し、50から75％の
集密度に達したときに遺伝子転移実験のために使用し、
通常これに２から３日を要した。遺伝子転移実験のため
には、複合体を直接細胞に添加し24時間インキュベート
した。これらの実験には、pCMV DNAを使用した。プラス
ミドpSTCX556のBAMH1挿入物を除去し（セバーン（Sever
ne）等、1988）、このプラスミドをクレノーフラグメン
トで処理し、さらに、ルシフェラーゼをコードする配列
またはβ−ガラクトシダーゼをコードする配列を含むプ
ラスミドpRSVL由来のHind III/Ssp Iおよびクレノーフ
ラグメント処理断片を使用することによって（マグレガ
ー（McGregor）およびカスキー（Caskey）、1989）プラ
スミドpCMVを調製し、生成したプラスミドをpCMVLおよ
びpCMVβ−galと命名した。複合体の形成はpRSVLと同様
に行った。
ｉ）正味の遺伝子転移の相対的水準 これらの実験のために、レポータープラスミドpCMVL
を使用した。24時間後、細胞のルシフェラーゼ遺伝子発
現を検定した。結果は第９図に示される。下の軸は未修
正細胞の測定値を示し、Ｙ軸は細胞分解物から得られた
25μｇの総タンパク質当たりの光単位としてルシフェラ
ーゼ遺伝子発現を示す。実験は各々３−４回行い、結果
はその平均値±SEMで示されている。
ii）相対的トランスダクション頻度 これらの実験ではレポーターDNAとしてプラスミドpCM
Vβ−galを使用した。細胞は先に説明したようにトラン
スフェクションされ、24時間後、マグレガー（MacGrego
r）等、1989に記載された方法を用いて染色することに
よりレポーター遺伝子の発現を測定した。この結果を第
10図に示す（倍率:320×）。A:hTfpL、B.AdpL、C:hTfpL
/AdpL。
ｂ）生体内での気管支経路を介した遺伝子転移 動物にメトキシフルランで麻酔をかけた。首の腹側を
垂直に切断した後、気管を四角く切りだした。45゜の角
度に位置させた動物中の気管全体に複合体（250−300μ
l:3μｇプラスミドDNA）を直接注入した。動物をCO2で
殺し、その気管と肺を組織中で（in situ）冷リン酸緩
衝液（PBS）でリンスした後にまとめて収穫した。ルシ
フェラーゼ試験のために肺組織を抽出緩衝液中でホモジ
ナイズし、その分解物を総タンパク質含量に対して標準
化を行い、上述したようにルシフェラーゼ遺伝子発現を
測定した。
ｉ）生体内での正味の遺伝子転移の相対的水準 トランスフェクションから24時間後、ルシフェラーゼ
発現を測定した。結果を第11図に示す。特定された光単
位は肺分解物から得られた1250μｇの総タンパク質に相
当する。実験は各々３から４回行い、結果は平均値±SE
Mで示されている。
ii）呼吸器管上皮における外来遺伝子発現の位置の特定 このテストのために、レポーターDNAとしてプラスミ
ドpCMVβ−galを使用した。組み合わせ複合体hTfpL/Adp
Lを使用した。注入から24時間後、収穫した肺の凍結断
片14μｇについてＸ−galによる染色およびニュウクリ
ア・ファースト・レッドによる逆染色によってレポータ
ー遺伝子の発現を検定した。染色を第12図に示す（倍
率:600×）。これらはlacZレポータープラスミドを含む
pRc/RSVまたはpCMVβ−galと命名される非関連非lacZプ
ラスミドを含むhTfpL/AdpL複合体で処理されたラットの
トランスフェクションの結果を示している。A:pRc/RSV
を含む複合体で処理した気管支の例;B:pCMBβ−galを含
む複合体で処理した気管支の例;C:pRc/RSVを含む複合体
で処理した末梢呼吸気管領域の例;D:pCMVβ−galを含む
複合体で処理した末梢呼吸器管領域の例;E:pCMVβ−gal
を含む複合体で処理した肺由来のβ−ガラクトシダーゼ
陽性領域の拡大図（倍率:1000×）。
実施例７ 肺領域に対する特異性を有する結合体の構築 呼吸器管上皮の繊毛化切片に対する選択的結合を考え
て結合体を構築した。このような結合体の構築は（この
特定の例と同様に一般にも）、結合体の構造におけるリ
ガンド候補の結合特性の確認を必要とする。一つの候補
としてSNAレクチンを選択した。
ａ）アデノウイルス−ポリリジン／レクチン−ポリリジ
ン/DNAの３成分複合体の調製 先の実施例の場合のように、キメラアデノウイルスP2
02（２×1010粒子）を250μl HBS中で抗体ポリリジン結
合体MP301pL（1.25μｇ）と混合し、室温で30分間イン
キュベートした。次いで、レポータープラスミドpCMVL
（125μｌのHBS中６μｇ）を添加し、室温でさらに30分
間インキュベーションを続けた。62.5μｌのHBS中にお
ける市販のビオチン化レクチンSNA（Ｅ−Y Lab、サンマ
テオ、CA:2.8μｇ）をストレプトアビジン−ポリリジン
（62.5μl HBS中1.35μｇ）と混合し、SNA−ポリリジン
を形成させるために室温で30分間静置しておいた。この
SNA−ポリリジンをSNA−アデノウイルス−ポリリジンDN
A複合体を形成するために上記反応混合物と混合した。
比較として、先に述べた実施例の記載と同様にしてSNA
リガンドを含まない複合体を調製した。
ｂ）肺におけるレクチン複合体の生体内使用 繊毛を有するヒト呼吸器管上皮細胞に対するレクチン
SNAの細胞特異的屈性は本実験において動物モデルとし
て使用される白イタチにその相当物が見られる。体重約
1.5kgの雄を使用した。各動物に、ａ）で調製した複合
体を４倍量において使用した。動物に麻酔をかけ、複合
体を気管内視鏡を用いて右肺の中央葉に導入した。24時
間後、異なる肺領域を収穫し、ホモジナイズしてルシフ
ェラーゼ活性を検定した。検定した肺の領域には複合体
を投与した時に複合体が接触しない部分（肺左上部分、
左上肺葉の柔組織、気管の低部）および複合体が接触す
る部分（右中央肺葉、右中央肺葉の柔組織）が含まれ
る。また、第13図に見られるように、複合体と接触した
領域はルシフェラーゼ発現を示したが（右中央肺葉、右
中央肺葉の柔組織、第２および第３のバー）、他の領域
（気管の低部、第１のバー；左上肺葉の柔組織、第４の
バー；肺左上部分、第５のバー）は発現を示さなかっ
た。
ｃ）リガンドの特異性の検定 これに平行して、レクチン結合体の結合の特異性に関
して調べた。抗レクチン抗体は使用できないので、トラ
ンスフェリン／レクチン−ポリリジン/DNA複合体を調製
し、一次抗トランスフェリン抗体との結合を行い、次い
で、二次ホース−ラデッシュ・ペルオキシダーゼ結合抗
マウス抗体でバックアップした。この結合体は繊毛細胞
集団の頂上部分に検出されたが、試験計画のために特異
的結合に関しては明確な結論は得られなかった。
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ８６４，７５８ (32)優先日 平成４年４月７日(1992．4．7) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (73)特許権者 999999999 ザ ユニヴァーシティー オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル アメリカ合衆国 ノースカロライナ州 27599−7020 チャペル ヒル バーネ ット ウォーマック ビルディング 724 シービー 7020 (73)特許権者 999999999 ジェネンテック インコーポレイテッド アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94080 サウス サン フランシスコ ポイント サン ブルーノ ブールヴァ ード 460 (72)発明者 キュリール ディヴィッド アメリカ合衆国 ノースカロライナ州 27516 チャペル ヒル ウェスト ウ ッド ドライヴ 405 (72)発明者 ヒュー ピン チュアン アメリカ合衆国 ノースカロライナ州 27516 チャペル ヒル ティンカーベ ル ロード 729 (72)発明者 ヴァーグナー エルンスト オーストリア アー2103 ランゲンツェ ルスドルフ ヴィーネル シュトラーセ 201 (72)発明者 ビルンシュティール マックス エル オーストリア アー1100 ウィーン グ ルンデッケルガッセ 49 (72)発明者 コッテン マット オーストリア アー1130 ウィーン マ キシングシュトラーセ 22−24−３−８ (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．80，ｐｐ．4134− 4138（1983) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．88，ｐｐ．4255− 4259（1991) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．89，ｐｐ．6099− 6103（1992) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (23)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】核酸と複合体を形成することができ、か
    つ、インターナライジング因子および核酸に対する親和
    性を有する物質からなる、高等真核細胞に核酸を導入す
    ることを目的とする新規な結合体であって、該インター
    ナライジング因子が抗体を介して核酸に親和性を有する
    物質に結合するウイルスであり、該ウイルスが結合体／
    核酸複合体の一部として細胞に侵入し、かつ、細胞への
    侵入後複合体が存在するエンドソーム内容物を細胞質に
    放出しうることを特徴とする結合体。
  2. 【請求項２】ウイルスの細胞への侵入およびエンドソー
    ム内容物の放出という機能に関係しない該ウイルスのタ
    ンパク質に抗体が結合することを特徴とする請求項１記
    載の結合体。
  3. 【請求項３】ウイルスがアデノウイルスであることを特
    徴とする請求項１または２記載の結合体。
  4. 【請求項４】抗体がヘクソン領域のエピトープに結合す
    ることを特徴とする請求項３記載の結合体。
  5. 【請求項５】アデノウイルスがヘクソンタンパク質をコ
    ードする配列においてコドン188から194の代わりにマイ
    コプラズマ・ニュウモニアエタンパク質P1のアミノ酸91
    4から928をコードする配列を含むキメラウイルスであ
    り、かつ、抗体がP1領域に結合することを特徴とする請
    求項３または４に記載の結合体。
  6. 【請求項６】抗体がモノクローナル抗体であることを特
    徴とする請求項２から５のいずれか１項記載の結合体。
  7. 【請求項７】核酸に対する親和性を有する物質がポリカ
    チオンであることを特徴とする請求項１から６のいずれ
    か１項記載の結合体。
  8. 【請求項８】ポリカチオンがポリリジンであることを特
    徴とする請求項７記載の結合体。
  9. 【請求項９】結合体として請求項１から８で定義される
    結合体の一つを含むことを特徴とする核酸、並びにイン
    ターナライジング因子および核酸に対する親和性を有す
    る物質からなる結合体の複合体。
  10. 【請求項１０】核酸が治療的に活性な遺伝子を含む遺伝
    子構築物であることを特徴とする請求項９記載の複合
    体。
  11. 【請求項１１】遺伝子が遺伝子治療において活性を有す
    る遺伝子または遺伝子断片であることを特徴とする請求
    項10記載の複合体。
  12. 【請求項１２】遺伝子構築物が、特異的に細胞機能を阻
    害するRNA分子を転写し得る領域を含むことを特徴とす
    る請求項10記載の複合体。
  13. 【請求項１３】ウイルスがそれ自体細胞に対するインタ
    ーナライジング因子であることを特徴とする請求項９記
    載の複合体。
  14. 【請求項１４】結合体がそれ自体は細胞に対するインタ
    ーナライジング因子ではないウイルスを含み、かつ複合
    体がさらにインターナライジング因子を含むことを特徴
    とする請求項９記載の複合体。
  15. 【請求項１５】複合体が、核酸に対する親和性を有する
    物質および高等真核細胞の表面受容体に特異的なインタ
    ーナライジング因子を有する第２の結合体をさらに含む
    ものであって、ウイルス結合体およびインターナライジ
    ング因子結合体が核酸と複合体を形成することを特徴と
    する請求項９〜14のいずれか１項に記載の複合体。
  16. 【請求項１６】第２の結合体の核酸に対する親和性を有
    する物質が有機ポリカチオンであることを特徴とする請
    求項15記載の複合体。
  17. 【請求項１７】ポリカチオンがポリリジンであることを
    特徴とする請求項16記載の複合体。
  18. 【請求項１８】第２のインターナライジング因子がトラ
    ンスフェリンであることを特徴とする請求項15記載の複
    合体。
  19. 【請求項１９】第２のインターナライジング因子がレク
    チンであることを特徴とする請求項15記載の複合体。
  20. 【請求項２０】細胞を請求項９から19で定義される複合
    体の一つでin vitroにおいて処理することを特徴とする
    高等真核細胞に核酸をin vitroで導入するための方法。
  21. 【請求項２１】２つ以上の容器を含むキャリヤーユニッ
    トであって、第１の容器は抗体に結合した核酸に対する
    親和性を有する物質を含み、かつ、第２の容器は該抗体
    が免疫反応を起こすウイルスであって、もし該ウイルス
    が核酸に対する親和性を有する物質及び核酸の複合体の
    一部である場合には高等真核細胞に侵入することがで
    き、かつ細胞への侵入後複合体が存在するエンドソーム
    の内容物を細胞質に放出させることができるウイルスを
    含むようなキャリヤーユニットを含むトランスフェクシ
    ョンキット。
  22. 【請求項２２】１つ以上の容器を含むキャリヤーユニッ
    トであって、第１の容器が、もうしウイルスが核酸に対
    する親和性を有する物質及び核酸の複合体の一部である
    場合には高等真核細胞に侵入することができるウイルス
    であって、かつ細胞への侵入後複合体が存在するエンド
    ソームの内容物を細胞質に放出することができる該ウイ
    ルスに抗体を介して免疫学的に結合する、核酸に対する
    親和性を有する物質を含んでいるようなキャリヤーユニ
    ットを含むトランスフェクションキット。
  23. 【請求項２３】容器の一つがさらに高等真核細胞に対す
    るインターナライジング因子及び核酸に対する親和性を
    有する物質からなる第２の結合体を含むことを特徴とす
    る請求項21または22記載のトランスフェクションキッ
    ト。
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