DE19845420C2 - Interzelluläre Ausbreitung rekombinanter DNA - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Vektor, welcher eine für ein Transport­ protein kodierende Nukleinsäuresequenz und mindestens eine zu transportierende Nukleinsäuresequenz enthält, wobei der Vektor zur Expression des Transport­ proteins in einer Wirtszelle befähigt ist, und das Transportprotein mindestens eine Bindungsstelle für den Vektor aufweist und zum interzellulären Transport des Vektors befähigt ist. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung dieses Vektors zur Steigerung der Transfektionseffizienz von Nukleinsäuresequenzen. Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich insbesondere um ein neuartiges System, das vorzugsweise die beiden Nukleinsäure-spezifischen biologischen Funktionen "Replikation (Vermehrung)" und "interzellulärer Transport (Aus­ breitung)" auf neuartige Weise kombiniert. Dadurch entsteht ein System, das genetische Information auf virusähnliche Weise in Zellen, Gewebe und Organis­ men einschleusen und daraus weitertragen kann.

Das Einschleusen rekombinanter Nukleinsäuresequenzen in Wirtszellen, Zell­ verbände, Gewebe und Organismen zur Veränderung ihres genetischen Materials ist eine der grundlegenden Techniken der Gentechnologie. Die durch die einge­ schleusten Nukleinsäuresequenzen genetisch veränderten Wirtszellen können dann z. B. durch Expression dieser eingeschleusten Nukleinsäuresequenzen wirtszellenfremde Proteine produzieren. In der Gentherapie können z. B. durch Expression wirtsfremder Nukleinsäuresequenzen in einer Wirtszelle RNA-Molekü­ le oder Proteine mit therapeutischer Wirkung hergestellt werden. Da jedoch durch die bekannten Verfahren zum Einschleusen von Vektoren in Zielgewebe oder Zielkulturen, insbesondere in vivo, stets nur einige Zellen eines Zielgewebes von den Vektoren erreicht werden können, ist die Wirksamkeit therapeutischer DNA und der durch Expression entstehenden Genprodukte im allgemeinen auf Zellen mit eingeschleustem Vektor beschränkt. Dies kann zum Verlust der therapeutischen oder biologischen Wirksamkeit führen.

Um neben diesen wenigen Zellen mit eingeschleuster Vektor-DNA auch benach­ barte Zellen eines Zielgewebes oder -organismus mit dem Vektor zu erreichen, wäre eine infektionsartige Ausbreitung des Vektors von einer Zelle zu ihren Nachbarzellen von Vorteil. Bekannte Methoden greifen jedoch nicht auf die Ebene eines derartigen Zell-Zell-Transports expressionsfähiger DNA bzw. replizie­ render Systeme zurück, sondern lediglich auf den interzellulären Transport von Proteinen als Genprodukt.

Erst ein neuerer Ansatz benutzt sogenannte Fusionsproteine mit dem HSV-VP22- Protein, welche den interzellulären Proteintransport des Fusionsproteins ver­ mitteln. Allerdings werden auf diese Weise nur die durch Expression entstehen­ den Genprodukte, nicht jedoch die eigentlichen rekombinanten Nukleinsäurese­ quenzen übertragen. Ein interzellulärer DNA-Transport nach dem hier beschriebe­ nen Weg ist demnach im Stand der Technik nicht bekannt.

WO 97/05265 A1 betrifft den Transport von Proteinen und Verfahren zum Liefern von Proteinen zu Zielpopulationen von Zellen. WO 98/32866 A1 betrifft Verbesserungen, Änderungen und Entwicklungen hinsichtlich eines solchen Transports von Proteinen, intrazellulären Transport und Anwendungen von diesen.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, Vektoren zur Verfügung zu stellen, welche in einem Zellverband, Gewebe oder Organismus den interzellulären Transport von Nukleinsäuresequenzen ermöglichen, so daß diese Nukleinsäuresequenzen in möglichst viele Zellen eines Zielgewebes oder einer Zielkultur eingeschleust und gegebenfalls zur Expression gebracht werden können. Durch dieses Konzept "Artifizieller Viren" soll die biologische und gegebenfalls klinische Wirksamkeit der Expression dieser spezifischen Nuklein­ säuresequenzen erheblich gesteigert werden.

Diese Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstände der vorliegenden Erfindung gelöst.

Ein erster erfindungsgemäßer Gegenstand betrifft einen Vektor, welcher eine für ein Transportprotein kodierende Nukleinsäuresequenz und mindestens eine zu transportierende Nukleinsäuresequenz enthält, wobei der Vektor zur Expression des Transportproteins in einer Wirtszelle befähigt ist, und das Transportprotein mindestens eine Bindungsstelle für den Vektor aufweist und zum interzellulären Transport des Vektors befähigt ist.

Unter Vektoren werden dabei Nukleinsäureelemente verstanden, die zur Ein­ schleusung von fremden Nukleinsäuresequenzen in eine Zielzelle benutzt werden können. Beispielsweise kann es sich um selbständig replizierende DNA-Einheiten, wie Plasmide, Virus-Genome oder künstlich hergestellte Mikrochromosomen der Hefe, handeln, wobei Plasmide besonders bevorzugt sind. Als Beispiele können Plasmidvektoren, pBR322, Lambda-Vektoren, Cosmide usw. genannt werden. Vektoren enthalten mindestens einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Stellen zur Insertion der zu übertragenden Nukleinsäuresequenz, Gene bzw. Nukleinsäuresequenzen zur Erkennung oder Selektionierung, wie Antibiotikaresi­ stenzgene, und gegebenenfalls Systeme zur Unterscheidung von Vektoren mit ursprünglicher und rekombinater Nukleinsäuresequenz. Vektoren können ferner weitere regulatorische Elemente, wie Promotoren, Enhancer, Terminatorsequen­ zen, usw. enthalten.

Transportproteine im Sinne der vorliegenden Erfindung dienen dazu, an sie gebundene Nukleinsäuren, beispielsweise der erfindungsgemäße Vektor, aus einer Zelle heraus bzw. in eine Zelle hinein zu transportieren. Es kann sich bei ihnen dabei auch um Fusionsproteine handeln. Fusionsproteine sind solche Proteine, welche durch Expression von Fusionsgenen entstanden sind. Sie können z. B. durch Verknüpfung des kodierenden Gens mit dem ersten Struktur­ gens eines Operons, um die Expressionsrate des gewünschten Produkts wesent­ lich zu erhöhen oder durch Verknüpfung mit Signalpeptiden entstehen. Erfin­ dungsgemäß ist das Transportprotein vorzugsweise ein Fusionsprotein, in wel­ chem das eigentliche Transportprotein mit einem Protein, welches zu Anbinden an den Vektor befähigt ist, verknüpft ist.

Durch Anlagerung des Transportproteins an die Bindungsstelle für das Transport­ protein auf dem Vektor bildet sich ein Komplex aus Transportprotein und Vektor, welcher zur interzellulären Transport/Mobilität befähigt ist.

"Nukleinsäuresequenzen" können Abfolgen natürlicher, halbsynthetischer, synthetischer oder modifizierter Nukleinsäuremoleküle aus Desoxyribonukleinsäu­ re (DNA) und/oder Ribonukleotiden und/oder modifizierten Nukleotiden sein. Bevorzugt handelt es sich bei der zu transportierenden Nukleinsäuresequenz um rekombinate DNA.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enthält der erfindungsgemäße Vektor ferner einen Replikationsursprung (ori) zur Replika­ tion in eukaryontischen Wirtszellen und/oder einen Replikationsursprung (ori) zur Replikation in prokaryontischen Wirtszellen. Durch die Replikation des Vektors kann eine weitere Steigerung der Transfektionseffizienz erreicht werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Vektor zur Expression eines Genprodukts, für welches die zu transportierende bzw. trans­ portierte Nukleinsäuresequenz kodiert, befähigt.

Ferner kann gemäß einer anderen Ausführungsform der erfindungsgemäße Vektor auch zur stabilen Integration der zu transportierenden Nukleinsäurese­ quenz in das genetische Material der Wirtszelle befähigt sein.

Das anfängliche Einschleusen des Vektors in die Wirtszellen einer Zielkultur oder eines Zielgewebes kann sowohl in vivo als auch in vitro erfolgen. Es können dazu die im Stand der Technik bekannten Verfahren angewandt werden. Als Beispiele können dabei der direkte Gentransfer des Vektors mittels Polyethylen­ glykol, Elektroporation oder Partikelbeschuß der Wirtszellen genannt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung des erfindungsgemäßen Vektors zur Steigerung der Transfektionseffizienz von Nukleinsäuresequenzen.

Der erfindungsgemäße Vektor wird mit den im Stand der Technik bekannten Verfahren zunächst in einige Zellen einer Zielkultur oder eines Zielgewebes eingeschleust. Dort wird dann die Expression der für das Transportprotein kodierenden Nukleinsäuresequenz bewirkt. Durch Anlagerung des entstandenen Transportproteins an den Vektor wird der interzellulärer Transport des Vektors in benachbarte Wirtszellen ausgelöst. Dadurch ergibt sich als erster Vorteil des erfindungsgemäßen Vektors eine gleichmäßigere Verteilung der eingeschleusten Nukleinsäuresequenzen im Zielgewebe oder in der Zielkultur. Bevorzugt findet aber in den Wirtszellen ferner eine Replikation des Vektors statt. Der vervielfäl­ tigte Vektor wird dann vom Transportprotein in eine Vielzahl von benachbarten Zellen der Zielkultur oder des Zielgewebes transportiert. Im Idealfall können so alle Zellen einer Zielkultur oder eines Zielgewebes mit dem Vektor "infiziert" und genetisch verändert werden. Entweder ist mit dieser Veränderung des geneti­ schen Materials der Wirtszelle schon die gewünschte Wirkung erreicht, oder die eigentliche Wirkung der eingeschleusten Nukleinsäuresequenz erfordert eine gegebenfalls kontinuierliche Expression der eingeschleusten Nukleinsäuresequenz und damit die Produktion transgener Proteine.

Durch das neuartige System zur "infektiösen" Ausbreitung von fremden Nu­ kleinsäuresequenzen in Zellkulturen, Zellverbänden und Geweben unter Verwen­ dung des erfindungsgemäßen Vektors kann durch den interzellulären Transport des Vektors eine gleichmäßige Verteilung eines Vektors in einer Zielkultur oder einem Zielgewebe erreicht werden. Durch Ausstattung des Vektors mit einer Replikationsfunktion kann durch Transport und Replikation der dem Vektor zugrundeliegenden Nukleinsäuresequenzen und gegebenenfalls deren kontinuierli­ cher Expression der intrazelluläre Spiegel der gewünschten Genprodukte erheb­ lich gesteigert werden. Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Vektors kann die Transfektionseffizienz und gegebenfalls die Expressionsstärke einer eingeschleusten Nukleinsäuresequenz erheblich gesteigert werden.

Die vorliegende Erfindung kann in vielen Gebieten beispielsweise in der molekula­ ren Medizin, Molekularbiologie, Immunologie und Zellbiologie, bei in vivo-Anwen­ dungen der Entwicklungsbiologie und in der Veterinärmedizin angewendet werden.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 zeigt schematisch ein Vektorplasmid einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.

Fig. 2 zeigt in (A) eine schematische Darstellung des in Beispiel 1 verwendeten Vektors und in (B) die schematische Struktur-Funktionsbeziehung dieses Vektors. Zur DNA-Replikation in Säugerzellen beispielsweise mit Hilfe des SV40 ori wird das SV40 T-Ag benötigt, welches grundsätzlich plasmidkodiert sein kann, hier jedoch zunächst aus Sicherheitsgründen nicht plasmidkodiert, sondern durch die verwendeten Zellinien in trans bereit gestellt wird.

Das nachfolgende Beispiel dient zur näheren Erläuterung der vorliegenden Erfin­ dung.

Beispiel

Als Grundgerüst des erfindungsgemäßen Plasmidvektors diente eine Variation des pBR322 (pEGFP-C1 der Firma CLONTECH). Als Transportprotein wurde das Fusionsprotein HSV VP22/GFP/tet^Repressor verwendet, wobei der Indikator GFP zur Ausführung der vorliegenden Erfindung nicht notwendig ist und als das "zu transportierende Protein" verwendet wird und der tet^Repressor-Abschnitt des Fu­ sionsproteins als Bindungsstelle für den Nukleinsäureabschnitt tet^Operator des Vektors verwendet wird. Als Promotor diente der h-CMV Promotor. Der Plasmid­ vektor enthielt den Replikationsursprung SV40/T-Ag zur DNA-Replikation des Vektors in eukaryontischen Zellen mit Hilfe des SV40/T-Ag. SV40T-Ag muß jedoch nicht plasmidkodiert vorliegen, sondern kann auch in den verwendeten Zellinien in trans bereitgestellt werden. Der Plasmidvektor wurde ex vivo in einige der Wirtszellen, bei denen es sich um Säugerzellen (293T, COS) handelte, eingeschleust, z. B. mit Lipofektion, Elektroporation oder Calciumphosphat- Kopräzipitation.

Sämtliche, im Beispiel zur Anwendung kommenden Methoden für die Herstellung der erforderlichen Genkonstrukte entsprechen Standardverfahren molekularbiolo­ gischen Arbeitens (vgl. Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidmann, J. G., Smith, J. A. und Struhl, K. in Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987-1998).

Claims (6)

1. Vektor, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, welche für ein Transport­ protein kodiert, und mindestens eine zu transportierende Nukleinsäurese­ quenz, wobei der Vektor zur Expression des Transportproteins in einer Wirtszelle befähigt ist, und das Transportprotein mindestens eine Bin­ dungsstelle für den Vektor aufweist und zum interzellulären Transport des Vektors befähigt ist.

2. Vektor nach Anspruch 1, ferner enthaltend einen Replikationsursprung (ori) zur Replikation in eukaryontischen Wirtszellen.

3. Vektor nach Anspruch 1 oder 2, ferner enthaltend einen Replikations­ ursprung (ori) zur Replikation in prokaryontischen Wirtszellen.

4. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Vektor zur Expression eines von der zu transportierenden Nukleinsäuresequenz kodierten Genprodukts befähigt ist.

5. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Vektor zur stabilen Integration der zu transportierenden Nukleinsäuresequenz in das geneti­ sche Material der Wirtszelle befähigt ist.

6. Verwendung des Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Steigerung der Transfektionseffizienz von Nukleinsäuresequenzen.