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Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf ein Verfahren unter anderem für die Verwendung bei der molekularbiologischen
Arbeit.
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Stand der Technik
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In den Gebieten der biotechnologischen
und biomedizinischen Forschung ist es oftmals notwendig, große Moleküle oder
ein Bioteilchen in eine biologische Struktur wie etwa eine Bakterienzelle
zu bringen. Zellen und ebenfalls Viren haben eine äußere Barriere
zum Schutz gegen die Umwelt und ebenso ein selektives Transportsystem
für Nährstoffe.
Um den natürlichen
Schutzmechanismus aufzubrechen und eine Substanz, welche nicht wünschenswert
für Zielorganismus
ist, einzubringen, ist eine chemische oder physikalische Behandlung
der Zielzelle notwendig. Beispiele von Techniken zum Aufbrechen
der äußeren Zellmembran
von Zellen, und wo angebracht ebenfalls der Zellwand, sind in den
Gebieten der gentechnischen und molekularbiologischen Forschung verfügbar.
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Falls ein neuer genetischer Code
in eine speziell ausgewählte
Wirtszelle transferiert wird, wird die Technik als Transformation
oder Transfektion bezeichnet. Es gibt kein allgemeines für alle Zellarten zu
verwendendes Verfahren, aber eine Technik für jeden Zelltyp und Zweck ist
verfügbar. Überdies
ist es nicht möglich,
alle Zelltypen unter Verwendung der bisher erhältlichen Techniken zu transformieren. 1970 berichteten
Mandel und Higa (J. Mol. Bio. 53: 159–162), das E. coli-Zellen,
welche mit CaCl2 vorbehandelt wurden, fremde
DNA aufnahmen, falls sie einem Temperaturschock ausgesetzt wurden.
Danach wurde das Verfahren kontinuierlich weiterentwickelt (siehe
z. B. WO 9728248). Durch Aussetzen der Zellen mit einem elektrischen
Hochspannungsimpuls für einen
Bruchteil einer Sekunde, öffnen
sich Poren in Zellmembranen, was als Elektroporation bezeichnet wird
(Zimmermann et al. J. Membr. Biol. 67: 165–82 (1983)), welche häufig als
Transformationstechnik verwendet wird. Bakterien, Hefen und in einigen
Fällen
ebenfalls Säugetierzellen
und Pflanzenzellen können
unter spezifischen Bedingungen mittels Elektroporation transformiert
werden. Ebenfalls in diesem Fall ist eine kontinuierliche Entwicklung
im Fortschreiten (siehe WO 981231 und WO 9906101). In den vorher
beschriebenen zwei Verfahren wird die Zellhülle ausreichend lange für das DNA-Molekül geöffnet, um
in die Zelle zu gelangen. Das dritte und zuletzt entwickelte Verfahren
für die
Transformation ist die sogenannte Lipofektion (Old und Primrose,
in Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Gene Manipulation,
Blackwell Science (1995)), wo die fremde DNA eingeschlossen wird
in/bindet an ein kationisches Liposom, welches mit der äußeren Membran
der Zielzelle fusioniert. Es gibt eine weitere kommerzielle Technik
zur Transformation von Pflanzenzellen, wo ein für diesen Zweck ausgewählter Pflanzenteil
mit kleinen Goldkörnern
bombardiert wird, welche mit dem fremden Gen präpariert werden (Boynton J.
E. et. Science 240, 1534–1538,
1988). Ein derartiger Gentransfer wurde für die Transformation anderer
Gewebe, wie etwa Bakterien, Pilze, Insekten und Säugetierzellen
entwickelt (Johnston S. A. Nature 346, 776–777, 1990).
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Ein weiteres Verfahren zur Schaffung
transienter Poren in biologischen Membranen wird durch T. E. Vaughan & J. C. Weaver
(siehe Biophys. J. (1996) 71, 616–622 und Bioelectrochem. Bioenerg.
(1998) 46, 121–128)
beschrieben, welches auf der Anwendung eines pulsierenden magnetischen
Felds an biologische Zellen oder Gewebe mit natürlich auftretenden magnetischen
Teilchen basiert.
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Insbesondere in den vorher beschriebenen Anwendung
kann die vorliegende Erfindung verwendet werden. Jedoch ist es unter
Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung
gut möglich
andere exogene Materialien bei Anwendungen einzuführen, wie
etwa ein Direkttransfer von Proteinen, RNA-Molekülen, Fettsäuren, Peptiden, medizinischen
Zubereitungen usw., um die Antwort spezifischer Zellen und Viren
zu untersuchen. Überdies
ist die erfindungsgemäße Vorrichtung
insbesondere für
die Zelllyse zum Zwecke der Durchführung der Lyse als auch zur
Identifikation und Isolation spezifischer zellulärer Bestandteile in ein und
demselben Verfahren geeignet.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Folglich bezieht sich die vorliegende
Erfindung auf ein Verfahren zum Einführen und/oder der Extraktion
von Teilchen in/aus biologischen membranumhüllten Strukturen, wie in den
anhängenden
Ansprüchen
definiert. Die verwendete Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet,
dass sie wenigstens eine Spule umfasst, in welcher ein alternierendes
Magnetfeld erzeugt werden kann, und in welchem eine Probe eingesetzt
werden kann, wobei das Magnetfeld einen Anstieg der thermischen
und/oder kinetischen Energie von magnetisch empfänglichen Teilchen der Probe
verursacht, wobei die angestiegene thermische und/oder kinetische
Energie der Teilchen die Bildung von Poren in biologischen membranumhüllten Strukturen
verursacht, welche in der Probe vorgefunden werden, wobei die Poren
die Einführung
oder Extraktion von Teilchen in/aus den biologischen membranumhüllten Strukturen
ermöglicht.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird für die spezifische
Lyse von Zellen oder zur Modifikation des genetischen Codes und/oder
des Metabolismus einer Wirtszelle verwendet.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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Die 1 ist
eine prinzipielle Skizze der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
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Die 2 ist
ein Beispiel eines elektrischen Zufuhrstromkreises.
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Die 3 ist
ein Beispiel eines Anschlusses einer Spule.
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Die 4 zeigt
ein Beispiel eines magnetisch empfänglichen Teilchens.
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Die 5 zeigt
eine Vorrichtung, welche ein Gradientenfeld erzeugen kann.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Gemäß einem Gesichtspunkt der Erfindung ist
das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das magnetische Feld
eine alternierende Feldrichtung einer Frequenz im Bereich von 1–5 MHz hat.
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Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt
ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das Magnetfeld eine
Feldstärke
von wenigstens 1 mT hat.
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Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt
ist die Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass das magnetische Feld
nicht homogen ist und eine alternierende Gradientfeldrichtung hat,
wobei die Richtung des alternierenden Gradientfeldes durch zwei
Spulen erzeugt wird und die Probe zwischen den Spulen eingesetzt
wird.
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Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt
ist das erfindungsgemäße Verfahren
dadurch gekennzeichnet, dass die Spulen mit einem Wechselstrom verschiedener
Frequenzen versorgt werden.
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Gemäß noch einem weiteren Gesichtspunkt ist
das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Spulen entweder mit
dem positiven oder dem negativen Teil des zugeführten Wechselstroms versorgt werden.
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Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt
umfasst das Verfahren die Verwendung eines Thermostats für die genaue
Temperatursteuerung der Spule oder Spulen und/oder der Probe.
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Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt
erfordert das Verfahren eine variable Zeitsteuerung für die genaue
Steuerung der Zeit während
welcher der Wechselstrom an ist und während welcher die Probe dem
ausgeübten
magnetischen Feld ausgesetzt wird.
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Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt
umfasst das Verfahren die Verwendung eines Steuerungssystems zur
genauen Einstellung der Stärke und
Frequenz des Wechselstroms.
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Die biologischen membranumhüllten Strukturen
bestehen unter anderem aus Körpergeweben, Zellen,
Bakterien, Viruspartikeln, Organellen im subzellulären Bereich,
Liposomen oder Proteinen.
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Die für die Einführung in/Extraktion aus den membranumhüllten Strukturen
geeigneten Bioteilchen sind, unter anderem DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, Proteine,
andere Biopolymere, Peptide, chemische Zubereitungen, organische
Verbindungen, anorganische Verbindungen oder synthetische Polymere
oder Kombinationen davon.
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Die Technik, auf welcher die Erfindung
teilweise basiert, ist eine Kombination einer magnetischen Nanotechnologie
und der Peptidchemie. Ein magnetisch empfängliches Teilchen mit einer
Größe zwischen
einigen zehn Mikrometern und einem Nanometer wird als ein Reagenz
in der Technik verwendet. Falls ein derartiges Teilchen einem bestimmten Magnetfeld
ausgesetzt wird, vibriert er und erzeugt Wärme. Die 1 ist eine prinzipielle Skizze der vorliegenden
Erfindung. Die biologische Probe wird mit einem für den Zweck
bestimmten Reagenz gemischt und dann in einen Probenhalter (a) platziert.
Die gewünschte
Stärke
und Frequenz der Magnetquelle (b) werden eingestellt, wonach die
gewünschte
Temperatur des Kühlelements
(c) eingestellt wird. Die Magnetquelle ist entweder eine Spule oder
zwei Spulen, wobei die Probe zwischen ihnen gemäß 5 angeordnet wird. Die Magnetquelle und
der Probenhalter sind in einer isolierten Einheit eingeschlossen,
in welcher die Temperatur durch das Kühlelement bestimmt wird. Um
die korrekte Temperatur in dem Probenhalter sicherzustellen kann
ein Temperaturmessfühler
(d) mit dem System verbunden werden. Die Variablen Temperatur, Stärke und
Frequenz des Magnetfeldes und die Behandlungsintervalle werden gesteuert
und können
auf einem digitalen Display (e) verfolgt werden.
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Die 2 stellt
ein Beispiel eines elektronischen Zufuhrstromkreises dar, welches
einen Oszillator (1), basierend auf dem Stromkreis XR2206
umfasst, dessen Ausgabesignal (2) in einem Stromverstärkungsschritt
(3) verstärkt
wird, welcher auf dem Schaltkreis PBD 3548/1 basiert, dessen Ausgabesignal
(4) einen Wechselstrom (1MHz, 2 A) durch ein oder mehrere
Spulen steuern kann. Ein Beispiel für den Anschluss der Spule wird
in der 3 gezeigt, mit
einem oszillierenden Schaltkreis bestehend aus einem 2 Ω Widerstand
(6) einem 0,50 nF Kondensator (7) und einer 50 μH Spule (8),
wobei der Schaltkreis mit Wechselstrom (5) versorgt wird.
Für eine Fachperson
ist es offensichtlich, dass das in den 2 und 3 dargestellte
Beispiel einfach modifiziert werden kann, und dass das gleiche Ergebnis
mit der Hilfe von alternativen Anschlüssen und Spulen erhalten werden
kann.
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Beispiele von magnetischen Materialien,
die in dem erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden, werden in der Patentliteratur beschrieben, zum
Beispiel in
US 4,323,056 (Borelli
et al.). Die magnetisch empfänglichen
Teilchen und ein möglicher Aufbau
werden ebenfalls in der
4 dargestellt.
Der magnetisch empfängliche
Kern (
9) des Teilchens besteht im Wesentlichen aus Magnetit
(Eisenoxid). Weiterhin ist das Teilchen mit einer äußeren Schicht
(
10) beschichtet, bestehend aus einem derivatisierten Polymer
(Dextran), oder einer Molekularschicht oder alternativ einer Doppelschicht
von derivatisierten Fettsäuren.
Die Auswahl des Typs (Anzahl der Aminosäuren oder Kohlenwasserstoffeinheiten
und Sequenz) des Liganden
11, welcher für die Derivatisierung verwendet
wird, wird individuell für
jede Anwendung der magnetisch empfänglichen Teilchen eingerichtet,
wobei die Wirkung davon durch weitere Modifikationen seiner Oberfläche mit
einem oder mehreren Effektormolekülen
12 noch mehr verstärkt werden
kann.
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Durch Zugabe der Teilchen zu einer
Zellsuspension und Aussetzen der Zellen mit einem magnetischen Feld
mit alternierender Feldrichtung, wird ein sofortiges Erwärmen des
jedes magnetisch empfängliche
Teilchen umgebenden Mediums erzielt. Die Wärme induziert einen Temperaturschock
in der Zelle und der Zellmembran, welcher temporäre Öffnungen in der Zellmembran
verursacht. Die Wärme
wird schnell und homogen in der gesamten Probe induziert, was es
ermöglicht
die Probe und die Zellen für eine
kurze Zeitspanne der Behandlung auszusetzen, was die Überlebenshäufigkeit
der ausgesetzten Zellen erhöht.
Beispiel 1 beschreibt die Transformation von Escherichia coli.
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In einem herkömmlichen, einen Temperaturschock
umfassenden Transformationsverfahren, wird das die Zellsuspension
enthaltende Teströhrchen
einer höheren
Umgebungstemperatur (42°C) ausgesetzt,
wobei ein Temperaturgradient von der Teströhrchenwand in die Probe sich
aufbaut, wobei die Zusammensetzung davon eine längere Zeit als das erfindungsgemäße Verfahren
erfordert und was weiterhin impliziert, dass die am nächsten zu
der Zellwand lokalisierten Zellen einer höheren Temperatur für eine längere Zeit
ausgesetzt werden als die in der Mitte des Röhrchens. Folglich werden einige
Zellen aufgrund der erhöhten
Temperatur sterben, während eine
Zellfraktion unbehandelt bleibt. Das erfindungsgemäße Verfahren
umgeht dieses Problem durch die sofortige Erwärmung um jedes Teilchen in
dem Probenhalter. Die Wirkung wird verstärkt, wenn daneben die Teilchen
sofort auf die Zellhülle über die
Ligandmoleküle
auf der Oberfläche
der Teilchen gerichtet sind. Dies ist verglichen mit herkömmlichen
Transformationsverfahren ein großer Vorteil, wo das Gleichgewicht
zwischen Hitzeschock und Zelltod wichtig für das Endergebnis ist.
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Überdies
kann die Feldstärke
des Magnetfeldes im Raum variiert werden, ein sogenanntes Gradientenfeld,
welches in Kombination mit einer alternierenden Feldrichtung in
den Teilchen mechanische Vibrationen verursacht (kinetische Energie
steigt an), was in Kombination mit der Wärmeabstrahlung (thermische
Energie) die Wirkung der Teilchen auf die alle Zellen umgebende
Zellmembran (und wo angebracht, die Zellwand) verstärkt. Die
vorliegende Erfindung beschreibt ein vollständig neues Verfahren, das die
Wärmeinduktion
oder starkes Einsetzen von Scherkräften oder eine Kombination
davon umfasst. Die Scherkräfte
initiieren Dislokationen in der Zellmembran aufgrund der mechanischen
Ermüdung, welche
in Brüchen
in Zellmembranen (und in Zellwänden
in den Fällen,
wo die Zielzelle zum Beispiel ein Bakterium ist) resultiert. Das
Verfahren basiert auf der Verwendung eines alternierenden, außerhalb ausgeübten Gradientenmagnetfelds.
Ein Gradientenfeld wird an wenigstens zwei Spulen zur Verfügung gestellt,
welche entweder mit dem positiven oder dem negativen Teil des angelegten
Wechselstroms versorgt werden, oder alternativ werden die Spulen mit
Wechselstrom verschiedener Frequenzen versorgt. Eine Vorrichtung,
welche ein Gradientenfeld erzeugen kann, wird in der 5 beschrieben. Das Funktionsprinzip
basiert auf zwei gemäß 5 zueinander gegenüber angeordneten
Spulen (A) und (B) (mit oder ohne Ferritkern). Eine Steuerungseinheit
(C) steuert den Strom durch die Spulen, so dass die Spulen nur eine
zu einem Zeitpunkt einen Strom durch ihre Windungen führt. Dieser
Stromwechsel, dessen Frequenz mittels des Oszillators (OSC) gesteuert
wird, resultiert in den Spulen in einer alternierenden Erzeugung
von Gradientenmagnetfeldern (D) und (E) mit verschiedenen Gradientenrichtungen.
Ein zwischen den Spulen angeordnetes magnetisch empfindliches Teilchen
(P) wird ein Gradientenmagnetfeld mit einer periodisch alternierenden
Richtung erfahren, welches eine mechanische Vibration induzieren
wird. Alternativ kann ein Gradientenfeld erzeugt werden, falls die
zwei Spulen mit Strom von zwei verschiedenen Frequenzen versorgt
werden. Der Frequenzunterschied zwischen dem Strom in den zwei Spulen
steuert die Frequenz des Gradientenwechsels.
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Durch die Magnetbehandlung über eine
kurze Zeitspanne werden Bedingungen für eine große Anzahl überlebender Zellen nach der
Behandlung erzeugt. Solange die Zellhülle offen ist, sollte das zu transformierende
Molekül
in die Zelle eingeführt
werden. Um diesen Vorgang zu optimieren, kann das Molekül ebenfalls
auf die Zellhülle
gerichtet sein. Beide Verfahren werden durch Verbindung der Erkennungsmoleküle zum Binden
einerseits an die Zelloberfläche
und auf der anderen Seite an die Moleküle von ein und demselben ferromagnetischen
Teilchen durchgeführt.
Moleküle,
welche auf einer biochemischen Grundlage biologische Strukturen
verschiedener Art erkennen und an sie binden können, können zum Beispiel kurze synthetische
Peptide, Teile eines Antikörpers
oder eines Enzyms sein.
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Durch Verbindung eines Erkennungsmoleküls eines
Zielproteins, wie etwa einem rekombinanten Protein, an die magnetisch
empfänglichen
Teilchen, kann die erfindungsgemäße Vorrichtung
für die Lyse
und spezifische Reinigung des Zielproteins in ein und demselben
Verfahren verwendet werden. Verglichen mit alternativen Lyseverfahren
(hauptsächlich
enzymatische und mechanische Lyse) in Kombination mit einem oder
mehreren Reinigungsschritten, spart die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung
vor allem Zeit, aber ebenfalls Material.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann vorteilhafterweise
einerseits für
ein Transformationsverfahren und auf der anderen Seite für die Reinigung spezifischer
Zellbestandteile verwendet werden, was die Vorrichtung einmalig
macht. Ohne Rücksicht
auf den Zweck sollte das Verfahren stattfinden, während die
Spulen bei einer konstanten Temperatur gehalten werden, was bedeutet,
das ein Kühlelement
und eine Temperatursteuerung in die steuerbare, magnetische Ausrüstung eingebaut
sein sollte. Überdies
ist es für die
verschiedenen potenziellen Anwendungsgebiete der Vorrichtung vorteilhaft,
dass sowohl die Stärke und
Frequenz des magnetischen Feldes als auch die Zeit, während der
die Probe der Behandlung ausgesetzt wird, variabel sind.
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Beispiel 1
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Das folgende Beispiel schreibt ein
Verfahren zur Transformationen von Escherichia coli (E. coli) mit
dem pUC18-Plasmid:
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100 μl kompetenter E. coli-Zellen
werden bei 0°C
mit 500 μg
pUC18 gelöst
in 30 μl
0,05 M CaCl2 gemischt. Die Probe wird in
den Probenbehälter
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
eingeführt
und für 30
min bei 0°C
in der Spule inkubiert. Dann wird die Probe für 30 s bei 1MHz, 2 A behandelt.
1 ml sterile LB-Boullion wird dann zu der Probe gegeben, welche dann
in einem Wasserbad für
1 h bei 37°C
inkubiert wird. Nachfolgend werden die Zellen auf Agarplatten mit
Selektionsdruck, für
50 μg/μl Ampicillin,
plattiert, um nur transformierte Bakterien zu erhalten. Das Experiment
sollte eine Vergleichsprobe enthalten, welche kein pUC18 enthält, um die Überlebens-
und Transformationshäufigkeit
zu bestimmen.