JPH02138976A - タンパク質の細胞への転移方法 - Google Patents
タンパク質の細胞への転移方法Info
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- JPH02138976A JPH02138976A JP4146689A JP4146689A JPH02138976A JP H02138976 A JPH02138976 A JP H02138976A JP 4146689 A JP4146689 A JP 4146689A JP 4146689 A JP4146689 A JP 4146689A JP H02138976 A JPH02138976 A JP H02138976A
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Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、タンパク質の細胞への転移方法に関する。
単離されたタンパク質の生物学的機能を研究するだめの
１つの方法として、タンパク質を細胞中に直接転移して
、その細胞上でのそのクンバク質の生物学的作用を検査
する方法がある。
１つの方法として、タンパク質を細胞中に直接転移して
、その細胞上でのそのクンバク質の生物学的作用を検査
する方法がある。
種々の場合におけるこの目的を達成するために微量注射
が用いられるが、この技術は多くの欠点を有している。
が用いられるが、この技術は多くの欠点を有している。
微量注射は、使用者１人１人の練習と熟練技術があって
初めて有効となる。さらに、微量注射を行なうために細
胞が環境にさらされなければならない時間についてコン
トロールがほとんどできないか、または全くできない。
初めて有効となる。さらに、微量注射を行なうために細
胞が環境にさらされなければならない時間についてコン
トロールがほとんどできないか、または全くできない。
電界の影響下で外来のＤＮＡ及びＲＮＡを哺乳類、植物
及び細菌の細胞中に転移することは既に実施されている
が、タンパク質を生きている細胞中に転移するだめの技
術については、未だ成功例が知られていない。
及び細菌の細胞中に転移することは既に実施されている
が、タンパク質を生きている細胞中に転移するだめの技
術については、未だ成功例が知られていない。
従って、本発明の目的は、電界の影響下で、夕ンパク質
を生きている細胞中に導入する方法を提供することにあ
る。本発明の方法は、細胞中−＼直接注入するための時
間浪費的な手先の技術を必要としない点で有利である。
を生きている細胞中に導入する方法を提供することにあ
る。本発明の方法は、細胞中−＼直接注入するための時
間浪費的な手先の技術を必要としない点で有利である。
本発明の好適な具体例によれば、転移されるタンパク質
と目標の細胞とを含有する溶液、懸濁液またはその池の
混合物を電界にさらされた容器中に入れる。細胞及びク
ンバク質を含有する溶液または懸濁液に対して与えられ
ることができる電界は、高電界または放電状態を与えら
れる位高くなければならないが、細胞またはタンパク質
を実質的に変化または破壊するほど高くてはならない。
と目標の細胞とを含有する溶液、懸濁液またはその池の
混合物を電界にさらされた容器中に入れる。細胞及びク
ンバク質を含有する溶液または懸濁液に対して与えられ
ることができる電界は、高電界または放電状態を与えら
れる位高くなければならないが、細胞またはタンパク質
を実質的に変化または破壊するほど高くてはならない。
約２０ｋｖまでの電圧が有用であるが、最大圧力限界は
、細胞が電気ショフクに対して生き残る能力によって決
定される。
、細胞が電気ショフクに対して生き残る能力によって決
定される。
電界をタンパク質−細胞混合物に与えた場合、電界の保
持時間は通常、目標細胞の性質によって約５０μ秒から
約３分間の範囲で変化することができるが、通常１分未
満である。細胞及びタンパク質を含有する溶液、懸濁液
または混合物に与えられることができるパルス数は、パ
ルス幅及び強度並びに細胞の性質によって、約７パルス
から約３００パルスの範囲で変化することができる。
持時間は通常、目標細胞の性質によって約５０μ秒から
約３分間の範囲で変化することができるが、通常１分未
満である。細胞及びタンパク質を含有する溶液、懸濁液
または混合物に与えられることができるパルス数は、パ
ルス幅及び強度並びに細胞の性質によって、約７パルス
から約３００パルスの範囲で変化することができる。
本発明によって、タンパク質は、微生物、植物、動物及
びヒ１−の細胞、並びにその他の種類の原核生物または
直積生物の細胞を包含する細胞へ転移することができる
。
びヒ１−の細胞、並びにその他の種類の原核生物または
直積生物の細胞を包含する細胞へ転移することができる
。
細胞中へ転移することができるタンパク質としては、抗
体、ホルモン、成長因子、遺伝子リプレノザー等が挙げ
られる。一般的に、このようなタンパク質を包含するが
、これらに限定されることはなく、分子量３５〜２００
キロダルトンのタンパク質であればいずれのものでもよ
い。
体、ホルモン、成長因子、遺伝子リプレノザー等が挙げ
られる。一般的に、このようなタンパク質を包含するが
、これらに限定されることはなく、分子量３５〜２００
キロダルトンのタンパク質であればいずれのものでもよ
い。
本発明は、セルライン中の遺伝子欠陥を修正するため、
または血液の治療学的処理のために用いることができる
。
または血液の治療学的処理のために用いることができる
。
多種類の商業的に入手可能な装置を用いて、本発明のタ
ンパク質転移を実施することができる。
ンパク質転移を実施することができる。
好ましい装置は、ＢＡＥＫＯＮ２０００システム（米国
カリフォルニア州、Ｂａｅｋｏｎ社製）であるが、それ
は、この装置が非接触型の操作方式で用いられる非コン
デンサーベースのエレクトロニクスヲ採用シているので
、再現性のある結果が得られ、処理された細胞の生存率
が高いからである。さらに、この装置を用いる処理は極
めて速く、通常１分未満である。
カリフォルニア州、Ｂａｅｋｏｎ社製）であるが、それ
は、この装置が非接触型の操作方式で用いられる非コン
デンサーベースのエレクトロニクスヲ採用シているので
、再現性のある結果が得られ、処理された細胞の生存率
が高いからである。さらに、この装置を用いる処理は極
めて速く、通常１分未満である。
以下、実施例によって本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれに限定されるものではない。
、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１
妊馬血清（米国シグマ社製）５１Ｕ／マウス−匹及びヒ
ト絨毛性性腺刺激ホルモン（ングマ社製）５ＩＵ／マウ
ス−匹を注射されたＣＤｌ−１マウスの卵管から、マウ
ス卵母細胞を採取した。積層細胞の除去を、ヒアルロニ
ダーセ（ンクマ社製）３０μｇ／ｄを用いて卵母細胞を
インキュベートすることにより実施した。卵母細胞を電
気処理のために、Ｎ２培地（マウスの胚を操作、実験マ
ニュアル、Ｃ３Ｈ）へ移した。
ト絨毛性性腺刺激ホルモン（ングマ社製）５ＩＵ／マウ
ス−匹を注射されたＣＤｌ−１マウスの卵管から、マウ
ス卵母細胞を採取した。積層細胞の除去を、ヒアルロニ
ダーセ（ンクマ社製）３０μｇ／ｄを用いて卵母細胞を
インキュベートすることにより実施した。卵母細胞を電
気処理のために、Ｎ２培地（マウスの胚を操作、実験マ
ニュアル、Ｃ３Ｈ）へ移した。
ローダミン結合のチューブリンを製造し、チュプリンを
ブタの脳から単離、精製した後に、カラムクロマ１へグ
ラフィーにより精製した。ローダミン結合マウスＩｇＧ
はシグマ社から購入した。
ブタの脳から単離、精製した後に、カラムクロマ１へグ
ラフィーにより精製した。ローダミン結合マウスＩｇＧ
はシグマ社から購入した。
す１３型的な実験は、Ｍ２培地中の３０卯母細胞をロー
ダミンで標識したタンパク質１０μｇと混合して、最終
容積を２５μｐとするごとによって行なった。この混合
物を室温において前記のＢＩＩＥＫＯＮ２０００システ
ムにおける処理のためにｌ１ＡＩＥＫＯＮ容器へ移した
。処理された卵母細胞を螢光顕微鏡によって検査して、
標識されたタンパク質が卵母細胞中に存在するか否かを
調査した。処理された卵母細胞を３７°Ｃにおける０、
４％ＢＳＡと５％ＣＯ２を追加したＭ ］、、 ６培地
中で培養した。卵母細胞をローダミン標識されたチュー
ブリンと混合し、非接触方式を用いるＢ／１ＥＫＯＮ２
０００によって、振幅−７，５ｋＶ、バフ１／ ス数−
５１２、パルス幅−１６０μｓ、破裂時間−０４４、ザ
イクルー３及びダイアル設定＝ １ ＋−ｏ、 ５の条
件下で処理した。卵母細胞を顕微鏡で調べたとごろ、螢
光性を示していた。
ダミンで標識したタンパク質１０μｇと混合して、最終
容積を２５μｐとするごとによって行なった。この混合
物を室温において前記のＢＩＩＥＫＯＮ２０００システ
ムにおける処理のためにｌ１ＡＩＥＫＯＮ容器へ移した
。処理された卵母細胞を螢光顕微鏡によって検査して、
標識されたタンパク質が卵母細胞中に存在するか否かを
調査した。処理された卵母細胞を３７°Ｃにおける０、
４％ＢＳＡと５％ＣＯ２を追加したＭ ］、、 ６培地
中で培養した。卵母細胞をローダミン標識されたチュー
ブリンと混合し、非接触方式を用いるＢ／１ＥＫＯＮ２
０００によって、振幅−７，５ｋＶ、バフ１／ ス数−
５１２、パルス幅−１６０μｓ、破裂時間−０４４、ザ
イクルー３及びダイアル設定＝ １ ＋−ｏ、 ５の条
件下で処理した。卵母細胞を顕微鏡で調べたとごろ、螢
光性を示していた。
肉眼観察による評価では、８０％以」二の卯母細胞に様
々の量のタンパク質が組みこまれていた。
々の量のタンパク質が組みこまれていた。
実施例２
生きているマウスの卵母細胞は透明帯を有しているので
、その透明帯がタンパク質の細胞への導入のバリアを有
しているか否かを調べるために試験を行なった。卵母細
胞を電気処理後に酸クイロードで処理して透明帯を除去
した。実施例１と同様の操作を行なった後に卵母細胞に
おいて螢光性が示されたが、これは、ローダミン標識さ
れたチューブリン分子が、透明帯の表面に吸着されるの
ではなく卵母細胞内部に存在していることを表わしてい
る。この結果は、透明帯はタンパク質転移メカニズムの
バリアーとはならないことを示唆するものである。
、その透明帯がタンパク質の細胞への導入のバリアを有
しているか否かを調べるために試験を行なった。卵母細
胞を電気処理後に酸クイロードで処理して透明帯を除去
した。実施例１と同様の操作を行なった後に卵母細胞に
おいて螢光性が示されたが、これは、ローダミン標識さ
れたチューブリン分子が、透明帯の表面に吸着されるの
ではなく卵母細胞内部に存在していることを表わしてい
る。この結果は、透明帯はタンパク質転移メカニズムの
バリアーとはならないことを示唆するものである。
実施例３
０−ダミン標識されたマウス免疫グロブリンＧを卵母細
胞と混合し、振幅−７，５ｋＶ、パルス数−２５６、パ
ルス幅−１６０μｓ１破裂時間−１６８、サイクル−３
、ダイアル設定−１１０，５の条件下で、実施例１と同
様にして処理した。卵母細胞内は螢光性を示したが、こ
のことは、少くとも１７０ＫＯのタンパク質が卵母細胞
中に転移され得ることを示唆するものである。
胞と混合し、振幅−７，５ｋＶ、パルス数−２５６、パ
ルス幅−１６０μｓ１破裂時間−１６８、サイクル−３
、ダイアル設定−１１０，５の条件下で、実施例１と同
様にして処理した。卵母細胞内は螢光性を示したが、こ
のことは、少くとも１７０ＫＯのタンパク質が卵母細胞
中に転移され得ることを示唆するものである。
処理された卵母細胞を一晩培養した場合、卵母細胞の生
存率は、異なる処理条件により３５〜７５％の範囲で変
化することが認められた。
存率は、異なる処理条件により３５〜７５％の範囲で変
化することが認められた。
Claims (3)
- （１）タンパク質と細胞の混合物を電界にさらす工程を
含むタンパク質の細胞中への転移方法。 - （２）混合物が細胞とタンパク質を含有する懸濁液であ
る請求項（１）に記載の方法。 - （３）タンパク質の分子量が３５〜２００キロダルトン
である請求項（１）に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US15981088A | 1988-02-24 | 1988-02-24 | |
| US159810 | 1988-02-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02138976A true JPH02138976A (ja) | 1990-05-28 |
Family
ID=22574135
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4146689A Pending JPH02138976A (ja) | 1988-02-24 | 1989-02-21 | タンパク質の細胞への転移方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02138976A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010032006A (ja) * | 2008-07-30 | 2010-02-12 | Nidec Copal Corp | ウォームギア |
-
1989
- 1989-02-21 JP JP4146689A patent/JPH02138976A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010032006A (ja) * | 2008-07-30 | 2010-02-12 | Nidec Copal Corp | ウォームギア |
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