-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vivo-Identifizierung
intrazellulärer
Epitope. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum in
vivo-Kartieren von Epitopen eines Antigens, das normalerweise in
einer Zelle vorhanden ist, unter Verwendung intrazellulärer Antikörper.
-
Ein
wesentliches Element zur effizienten Verwendung von Antikörpern sowie
von intrazellulären
Antikörpern
ist die Identifizierung seines Epitops/seiner Epitope, d. h. des
Antigenanteils, den der Antikörper
selbst erkennt. Es ist in der Tat für Forschung, Diagnostik und
Therapie erwünscht,
das Epitop eines Antigens zu kennen und Antikörper zu selektieren, die an
dasselbe binden können.
-
Es
sind viele verschiedene Ansätze
verwendet worden, um die Epitope eines Antigens zu kartieren, die
alle in vitro-Technologien
und sehr arbeitsintensive Verfahren verwenden. Die Einschränkung der
in vitro-Technologien leitet sich aus der Tatsache ab, dass die
Antigen-Antikörper-Bindung
nicht in dem natürlichen funktionalen
Kontext des Antigens untersucht worden ist, d. h. der intrazellulären Umgebung.
-
Ein
Verfahren (Peptid-Scanning) verwendet: a) Synthese von Peptiden,
die wenige um Aminosäuren überlappen
und als ganzes die vollständige
Aminosäuresequenz
des untersuchten Antigens umfassen, und b) Provozieren jedes Peptids
mit Antikörpern.
Das Verfahren ist sehr zeitraubend, arbeitsintensiv, teuer und liefert insgesamt
nicht immer befriedigende Ergebnisse. In der Tat besteht ein Epitop,
das von einem Antikörper
erkannt wird, nicht immer aus einer linearen Aminosäuresequenz.
-
Derzeit
ist die nützlichste
Technologie zur Identifizierung von Epitopen, die von unterschiedlichen
Antikörpern
erkannt werden, die Verwendung von Peptiden mit Zufallssequenzen,
die entweder aus Peptid-Phagen-Bibliotheken ausgewählt oder synthetisch
synthetisiert worden sind. Die Strategie ermöglicht ferner das Identifizieren
von Peptiden, die als Epitope aktiv sind, ohne Homologie mit der
Antigen-Primärsequenz
zu haben, was zu einem diskontinuierlichen oder Konformationsepitop
führt.
Die Methodik ermöglicht
damit das Kartieren einer virtuellen Kollektion von Epitopen, die
von einem gegebenen Antikörper
erkannt werden, selbst ohne strukturelle Korrelation mit dem Ausgangsantigen.
-
Alternativ
können
mutierte, abgeschnittene oder deletierte Formen des Ziel-Antigens
gentechnisch verändert,
in geeigneten zellulären
Systemen exprimiert, gereinigt und individuell Assays unterzogen
werden. Dieses Verfahren ist offensichtlich auch sehr arbeitsintensiv.
-
Die
Autoren der vorliegenden Erfindung stellen nun ein Verfahren zur
Verfügung,
das in vivo in der natürlichen
Umgebung Epitope von intrazellulären
Antigenen mittels Antikörpern
identifiziert, die in der zellulären Umgebung
exprimiert werden und aktiv sind (intrazelluläre Antikörper).
-
Die
Verwendung intrazellulärer
Antikörper,
d. h. Antikörpern
oder Teilen davon, die innerhalb einer Zelle exprimiert werden und
aktiv sind, stellt eine erfolgreiche Technologie dar, um mit der
Funktion eines Proteins innerhalb seiner physiologischen intrazellulären Umgebung
in Wechselwirkung zu treten (Cattaneo & Neuberger, 1987; Carlson, 1988;
Biocca & Cattaneo,
1995; Cattaneo & Biocca,
1997; Cattaneo & Biocca,
1999; Marasco, 1997). Die Technologie ermöglicht somit das Erreichen
des funktionalen Ausschaltens des Zielproteins. Es ist damit möglich, einer
Zelle oder einem Organismus mittels geeigneter intrazellulärer Antikörper einen
gegebenen Phänotyp
zu verleihen.
-
Die
Technologie von intrazellulären
Antikörpern
basiert auf zwei vorteilhaften Aspekten: 1) der praktisch unbegrenzten
Verfügbarkeit
des (natürlichen
oder künstlichen)
Repertoires des Immunsystems, wodurch eine Quelle für Moleküle bereitgestellt
wird, die für
Reaktionen gegen jegliches Protein mit hoher Affinität und Spezifität geeignet
sind, und 2) der Möglichkeit,
ein Protein (und danach einen Antikörper) durch geeignete autonome
und dominante intrazelluläre
Lokalisierungssignale zu unterschiedlichen intrazellulären Kompartments
zu führen.
-
Die
Technologie wird geeigneterweise für Forschungs- und Biotechnologieanwendungen
verwendet, insbesondere für
die Gentherapie für
Pathologien bei Mensch und Tier, um experimentelle Modelle für Pathologien
zu liefern, sowie in der Pflanzenbiotechnologie, um pathogenresistente
transgene Pflanzen zu produzieren.
-
Die
in letzter Zeit erfolgte umfassende Entwicklung von Genomsequenzierungstechnologien
sowohl für
Menschen als auch für
andere Spezies führte
zu einer erhöhten
Nachfrage nach der Bereitstellung von Technologien, die zur Aufklärung der
Funktion der identifizierten Gene geeignet sind, was somit zu einem
neuen Forschungsgebiet führte,
das als funktionale Genomforschung bezeichnet wird. Hierzu gehören Verfahren und
Technologien, die zum Identifizieren von Genfunktionen in einer
Weise geeignet sind, die so weit wie möglich parallel, mit hohem Durchsatz
und automatisierungsgeeignet ist. Derzeit stellt diese Stufe einen
bedeutsamen Flaschenhals für
die Industrie und insbesondere für
die Verfahren dar, die von Genen zu neuen Klassen von Arzneimitteln
führen.
-
In
neuerer Zeit wurde eine Entwicklung der intrazellulären Antikörpertechnologie
eingeführt,
die ihre Verwendung als elektive Methodik für Programme der funktionalen
Genomforschung ermöglicht,
die sogenannte ITT (intrabody trap technology; Technologie des Einfangens
innerhalb des Körpers).
Die Methodik ermöglicht
das Isolieren oder Selektieren der Subpopulation, die effizient
in vivo arbeiten kann, von allen Antikörpern, die gegen ein Zielprotein
gerichtet sind, in der intrazellulären Umgebung. Die Technologie
ist in der Internationalen Patentanmeldung PCT WO 00/54057 beschrieben.
Sie besteht zusammengefasst aus einem Verfahren zum Selektieren
von Antikörpern
aus Phagenbibliotheken oder aus Immun-Splenozyten, wobei ihre Fähigkeit
zur Bindung eines Antigens in der intrazellulären Umgebung gegeben ist. Das
Verfahren ermöglicht das Überwinden
einer Einschränkung
in der intrazellulären
Antikörpertechnologie,
d. h. der Tatsache, dass nicht alle Antikörper, die in vitro ein Antigen
binden können,
danach in der Lage sind, das gleiche Antigen zu binden, wenn sie
als zytoplasmische Antikörper
exprimiert werden. Antikörper,
die durch das ITT-Verfahren auf Basis des Doppelhybridsystems selektiert
sind, können
sich in der intrazellulären
Umgebung korrekt falten und dort an das Zielantigen binden. Sie
sind daher für
die Verwendung als intrazelluläre
Antikörper "validiert" worden (Visintin
et al., 1999). In allen Anwendungen der ITT wird das Antigen mit
einer Antikörperbibliothek
provoziert.
-
Die
Autoren der vorliegenden Erfindung haben diese Technologie zur Identifizierung
von Epitopen, d. h. den Antigenabschnitten, die einen Antikörper erkennen
und an ihn binden können,
vorteilhaft angepasst und modifiziert. Derartige Epitope werden
mittels der Selektierungstechnik in vivo von dem Antikörper selbst
erkannt. Gemäß der Technologie
der Erfindung ist im Gegensatz zu ITT der Antikörper das konstante Element, das
mit einer Bibliothek oder einer Reihe von Antigenen provoziert wird.
Diese neue Technik der in vivo-Epitopkartierung eines spezifischen
intrazellulären
Antikörpers
(IVEM) stellt eine geeignete Alternative zu den bekannten in vitro-Techniken
dar.
-
Die
Einfachheit der Technik macht dieselbe für Screening im Großmaßstab anwendbar.
Der Vorteil des Verfahrens resultiert auch aus der Tatsache, dass
die Epitopidentifizierung in vivo ohne Notwendigkeit von Peptidsynthese
stattfindet, jedoch mit der gleichen, wenn nicht einer höheren Genauigkeit
als bekannte Verfahren. Das Verfahren ist auch in der Lage, die
Identifizierung von Epitopen, die für klinische, diagnostische und
pharmakologische Anwendungen brauchbar sein sollen, mit Screenings
im Großmaßstab innerhalb
einer physiologischen Umgebung zu beschleunigen.
-
Weil
sich zunehmend abzeichnet, dass die aktiven Stellen eines Proteins
besser konserviert werden als die Gesamtstruktur, ist es ferner
durch das erfindungsgemäße Verfahren
möglich,
ancestrale Proteine (Urproteine) mit ähnlichen Funktionen zu identifizieren.
-
Das
Verfahren ermöglicht
daher die in vivo-Identifizierung der Epitope eines intrazellulären Proteins. Es
ist bekannt, dass viele intrazelluläre Proteine strukturell homologe
Domänen
oder Module enthalten, die an Protein-Protein-(z. B. SH2, SH3, PH, WW, PTB, PDZ-Domänen; Pawson,
1965) oder Protein-DNA-Wechselwirkungen beteiligt sind (z. B. Zinkfinger,
Homeo-box, Helix-Schleife-Helix, Chromodomänen, Bromodomänen). Die
Kenntnis der Spezifität
des Antikörpers
für eine
Domäne
in Bezug auf ähnliche
Domänen,
die zu anderen Proteinen gehören,
ist eine wesentliche Vorbedingung für Anwendungen, die für intrazelluläre Antikörper vorgesehen
sind.
-
Die
Informationen sind auch in allen der konventionelleren Verwendungen
von Antikörpern
wesentlich, und die Einfachheit des vorliegenden Verfahrens bietet
eine einfache Lösung
für diesen
Bedarf. Demnach wird ein interessierender Antikörper, der auf eine(n) dieser
Proteinmodule oder -domänen
zielt, mit einer Bibliothek der Proteindomänen derselben Familie provoziert.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht
somit in analoger Weise das Identifizieren der Spezifität eines
gegebenen Antikörpers
für eine
Familie korrelierter Proteine sowie Isoformen eines Proteins (d.
h. Isoformen, die aus alternativem Splicing resultieren) und der
Spezifität
eines gegebenen Antikörpers
für Familien von
evolutionär
korrelierten Proteinen. Dadurch können phylogenetische Studien
sehr leicht durchgeführt
werden.
-
Eine
weitere sehr interessante Anwendung, die durch die vorliegende Erfindung
möglich
wird, wird durch die leichtere Isolierung spezifischer Antikörper für mutierte
Formen eines gegebenen Proteins wiedergegeben. In diesem Aspekt
besteht die Antigenbibliothek aus einer Sammlung von Punktmutanten
des interessierenden antigenen Proteins. Die Isolierung von Antikörpern für mutierte
Formen von intrazellulären tau-Proteinen,
die in neurodegenerativen Pathologien als tau-Pathien vorhanden
sind (M. Hong et al., 1998; M. G. Spillantini et al., 1998; Goedert
et al., 1999), oder für
p21-ras, das in vielen menschlichen Krebsen vorhanden ist (Barbacid,
1987; Grand und Owen, 1991), kann leichter als zuvor durchgeführt werden.
-
Als
beispielhaftes experimentelles System haben die Autoren tau-Protein
verwendet, ein Protein, das an Morbus Alzheimer beteiligt ist. Die
Erfindung betrifft jedoch ein allgemeines Verfahren für die Epitopidentifizierung.
-
Daher
ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum
Identifizieren von Epitopen des tau-Proteins, die intrazellulär an einen
spezifischen Antikörper
binden können,
umfassend:
- a) Cotransformieren von Zellen mittels
eines ersten Vektors, der die Nukleotidsequenz enthält, die
die Region eines Anti-tau-Antikörpers
kodiert, die das tau-Protein erkennen und intrazellulär daran
binden kann, und mittels einer zweiten Vektorfamilie, wobei jedes
Mitglied der Familie eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein Peptid
kodiert, wobei eine Peptidbibliothek als Ganzes gebildet wird;
- b) Züchten
cotransformierter Zellen in einer derartigen Umgebung, dass nur
Zellen, bei denen die Antikörperregion
und das Peptid einander erkennen und miteinander in Wechselwirkung
treten, sich replizieren können
und/oder erkennen können,
weil die Antikörperregion,
die das Peptid erkennen und intrazellulär daran binden kann, mit einem
ersten Molekül
assoziiert ist; das Peptid mit einem zweiten Molekül assoziiert ist;
die Wechselwirkung zwischen dem ersten und dem zweiten Molekül einen
selektierbaren Phänotyp und/oder
ein erkennbares Signal erzeugt; und die Wechselwirkung zwischen
dem ersten und dem zweiten Molekül
nur erfolgt, wenn die Antikörperregion
und das Peptid einander erkennen und miteinander in Wechselwirkung
treten;
- c) Selektieren der Zellen und Identifizieren des Peptids als
Epitop.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
ist die Peptidbibliothek eine Bibliothek von tau-Peptidfragmenten
oder phylogenetischen Varianten oder mit Pathologie assoziierten
Mutanten oder Splicing-Isoformen davon.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
sind die Zellen Hefezellen.
-
Die
Erfindung wird nun gemäß bevorzugten
Ausführungsformen
in Bezug auf die folgenden Figuren beschrieben: 1 ist
ein Schema von tau-Protein-Deletionsmutanten; 2 zeigt die
Western-Blot-Analyse von lexA-tau-Deletionsmutanten-Fusionsproteinen,
die unter Verwendung eines polyklonalen Anti-lexA-Antikörpers (Gruppe
a), eines generischen monoklonalen Anti-tau-Antikörpers (Tau-1)
(Gruppe a), eines weiteren generischen monoklonalen Anti-tau-Antikörpers (7.51)
(Gruppe c) sichtbar gemacht wurden.
-
3 zeigt
die Karte der tau-Deletionsmutanten, wie beschrieben in Fasulo et
al. 200 (Gruppe a), und die Anti-tau-Spezifität von scFv2,
scFv14 und scFv52-Fragmenten in Bezug auf verschiedene Deletionsmutanten
in vivo (Gruppe b). Die Epitop-scFv-Bindung wird mittels ITT-Technologie
detektiert, wobei die Transaktivierung von HIS3 und lacZ-Genen und daher die
Fähigkeit
der Zellen gemessen wird, in einem Medium ohne Histidin zu wachsen
und β-Galactosidase
zu synthetisieren.
-
Beispiel 1
-
Tau-Mutanten und Fusionskonstrukte
mit lexA
-
Deletionsmutanten
des tau-Proteins wurden "in
frame" an lexA-Bindungsdomänen fusioniert.
Diese DNA-Bindungsdomäne
stammt von einem Repressorprotein von E. coli (Brent & Ptashne, 1985)
(Golemis & Brent,
1992) (Silver et al., 1986). LexA-Bindungsstellen sind stromaufwärts von
Reportergenen an der Transkriptionsaktivierungsregion oder dem Promoter
lokalisiert. Die Bindung von lexA-tau-Deletionsmutantenproteinen kann lexA-Bindungsstellen
erreichen und binden, sie können
die Transkription der Reportergene jedoch nicht aktivieren, weil
die Transkriptionsaktivierungsdomäne fehlt. Tau-Fragmente sind
in 1 dargestellt und sind:
- – Tau 151-274
einschließlich
der Prolin-reichen Domäne
und der R1-Wiederholungssequenz, die an Mikrotubuli binden kann;
- – Tau
151-305 einschließlich
der Prolin-reichen Domäne
und der R1- und R2-Wiederholungssequenzen, die an Mikrotubuli binden
können;
- – Tau
151-336 einschließlich
der Prolin-reichen Domäne
und der R1-, R2- und R3-Wiederholungssequenzen, die an Mikrotubuli
binden können;
- – Tau
151-368 einschließlich
der Prolin-reichen Domäne
und der R1-, R2-, R3- und R4-Wiederholungssequenzen, die an Mikrotubuli
binden können;
- – Tau
151-391 einschließlich
der Prolin-reichen Domäne
und der R1-, R2-, R3- und R4-Wiederholungssequenzen, die sich bis
zu dem Glu-391-Rest erstrecken;
- – Tau
151-402 einschließlich
der Prolin-reichen Domäne
und all der Wiederholungssequenzen, die sich bis zu dem Asp-402-Rest erstrecken;
- – Tau
151-412 einschließlich
der Prolin-reichen Domäne
und all der Wiederholungssequenzen, die sich bis zu dem Ser-412-Rest erstrecken;
- – Tau
151-422 einschließlich
der Prolin-reichen Domäne
und all der Wiederholungssequenzen, die sich bis zu dem Ser-422-Rest erstrecken;
- – dGAE
einschließlich
der minimalen Region, die den PHF-Filamentkern bildet, der bei Patienten
mit Morbus Alzheimer beobachtet wurde.
-
Beispiel 2
-
Transformation
mit tau-Mutanten und deren Exprimierung
-
Plasmid-DNA,
die lexA-Domäne
kodiert, fusioniert an tau-Protein-Deletionsmutanten,
wurde nach einem Standardver fahren, das Lithiumacetat enthielt,
zum Transformieren des L40 Hefestamms (Hollenberg et al., 1995)
verwendet, um permeable Hefezellen herzustellen. Das Verfahren wurde
von Clontech auf Basis der zuvor veröffentlichten Protokolle bereitgestellt
(Gietz et al., 1992; Hill et al., 1991; Schiestl & Gietz, 1989).
Hefezellen wurden unter Verwendung von 0,1 μg Plasmid-DNA und 100 μg Lachssperma
als Träger
in einer Lösung,
die Lithiumacetat, Polyethylenglykol und Dimethylsulfoxid enthielt,
transformiert. Transformierte Zellen wurden auf Minimalmedium (Synthetic
Dropout) ausgestrichen, das alle Aminosäuren außer Tryptophan enthielt, um
den erhaltenen Phänotyp
zu identifizieren. Der Vektor, der zum Exprimieren der an tau-Deletions-Mutantproteine
fusionierten lexA-Domäne
verwendet wurde, konnte in der Tat das Ernährungsdefizit ausgleichen, das
aus dem Mangel an Tryptophan resultierte, wodurch Hefewachstum ohne
diese Aminosäure
möglich
war.
-
Von
Hefezellen produzierte Hybridproteine wurden aus transformierter
Hefekultur mit einem Extraktionspuffer extrahiert, der 10% β-Merkaptoethanol,
2% SDS, 0,1% Bromphenolblau und 10% Glycerin enthielt (Sambrook
et al., 1990).
-
Das
Exprimierungsniveau von Fusionsproteinen wurde durch Western Blot-Analyse
unter Verwendung polyklonaler Anti-lexA-Protein-Antikörper (2a),
Anti-tau mAbs: Tau-1 (Roche) (2b)
und 7.51 (Novak et al., 1991) (2c)
bewertet.
-
Die
Experimente zeigen, dass tau-Deletionsmutanten durch die beiden
Anti-tau-Antikörper
in unterschiedlicher Weise erkannt werden, wodurch gezeigt wird,
dass gut exprimierte Proteine ein geeignetes Molekulargewicht haben
und dann die Translation korrekt durchlaufen und korrekt bekannte
Epitope exprimieren, die von verschiedenen verwendeten Antikörpern erkannt
werden.
-
Beispiel 3
-
Cotransformation von tau-Mutanten
mit einkettigen (ScFv) Anti-tau-Antikörperfragmenten, die mit der
ITT-Methode selektiert wurden
-
Das
Experiment verwendete eine Gruppe von einkettigen Fv-Fragmenten (scFv),
die mittels ITT-Technologie selektiert worden waren (Visintin et
al., 1999 und PCT WO 00/54057). Eine scFv-Fragmentbibliothek, die
auf der Oberfläche
filamentförmiger
Bakteriophagen offenlag, wurde Screening mit dem gereinigten rekombinanten
tau-Protein unterzogen, das an eine feste Phase gebunden war. Nach
zwei Adsorptionszyklen, Eluierung, Wachstum der eluierten Phagen
in E. coli, wurde die "polyklonale" Population von mit
Anti-tau-Protein angereicherten Antikörperfragmenten in dem Doppelhybrid-Expressionsvektor
subkloniert und in dem Doppelhybridsystem auf tau-Protein-Bindungsfähigkeit
getestet. Aus Hefezellen, die in Abwesenheit von Histidin selektiert
worden waren, wurden Anti-tau-scFv-Antikörperfragmente isoliert, die
tau intrazellulär
binden konnten.
-
Hefekolonien,
die mit tau-Mutanten und mit jedem der ITT-selektierten scFvs transformiert worden
waren, wurden auf Medium ausgestrichen, das für die Identifizierung des Phänotyps aus
dem Ernährungsreporter HIS3
selektiv war, der sich unter der Kontrolle der lexA-Bindungsstellen
befand, dessen Exprimierung den Zellen das Wachstum in Abwesenheit
von Histidin ermöglicht.
-
Die
Rekonstitution des Transkriptionsfaktors durch spezifische Antigen-Antikörper-Wechselwirkung ermöglicht die
Transkription von sowohl HIS3- als auch lacZ-Reportergenen. Die
Identifizierung dieser Wechselwirkung erfolgt durch qualitative
Analyse von Kolonien, die in Abwesenheit von Histidin gewachsen
sind, und durch Farbveränderung
(von weiß nach
blau) der gleichen Kolonie in einem kolorimetrischen Assay auf Exprimierung
von β-Galactosidase.
-
Die
Spezifität
der drei unterschiedlichen scFv-Fragmente (2, 14, 52) gegen die
Gruppe der tau-Antikörperfragmente
ist in 3 gezeigt und in Tabelle 1 zusammengefasst.
-
-
3 zeigt
die Identifizierung von tau-Proteinepitopen durch einkettige variable
Anti-tau-Fragmente, scFv2, scFv14 und scFv52. Das Wachstum auf His–-Schalen
und der β-Gal-Phänotyp zeigen,
dass tau-Peptide mit einem oder mehreren der drei scFv-Fragmente
in Wechselwirkung treten. Insbesondere die S412-S422- und N368-E391-Fragmente
enthalten ein in vivo erkennbares Epitop.
-
Beispiel 4
-
Selektion mit dem IACT-Verfahren
-
Gemäß dem Verfahren,
das in der PCT-Anmeldung WO 00/54057 offenbart wird, wurde eine
Reihe von 18 neuen Anti-tau-ScFvs
(A bis Y) selektiert und mit der gleichen Gruppe der Tau-Deletionsmutanten
von Beispiel 1 außer
dGAE charakterisiert.
-
Jeder
Antikörper
wurde in vivo mit jeder der tau-Deletionsmutanten gemäß dem Verfahren
von WO 00/54057 provoziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt
und zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren (IVEM) die Identifizierung
von drei Hauptregionen (I151-K274; N368-E391; D402-S412) von tau
ermöglichte,
die von mit dem IACT-Verfahren selektierten Antikörpern erkannt
wurden.
-
-
Dann
ermöglichte
das Selektionsverfahren (IVEM) eine rasche Identifizierung der Epitope,
die in vivo von ScFvs erkannt wurden, welche zuvor mit dem IACT-Verfahren
selektiert worden waren, wodurch eine wirksame Alternative zu traditionellen
teuren und zeitraubenden Verfahren geboten wird. Außerdem wird
nur mit Hilfe der vorliegenden Technik eine leichte und präzise Identifizierung
der in vivo erkennenden Antigenregion erreicht.
-
Bibliographie
-
- – Barbacid
(1987) ras genes. Annu. Rev. Biochem. 56, 779–828.
- – S.
Biocca & A. Cattaneo
(1995). Intracellular immunization: antibody targeting to subcellular
compartments. Trends Cell Biol 5, 248–252.
- – R.
Brent & M. Pthashne
(1985) A eukaryotic transcriptional activator bearing the DNA specificity
of a prokaryotic repressor. Cell 43 (3 Pt 2), 729–36.
- – J.
R. Carlson (1988). A new means of inducibly inactivating a cellular
protein. Mol Cell Biol 8(6), 2638–46.
- – A.
Cattaneo & S.
Biocca (1997). Intracellular Antibodies: Development and Applications
(Springer, Herausgeber).
- – A.
Cattaneo & S.
Biocca (1999). The selection of intracellular antibodies. Trends
Biotechnol 17(3), 115–21.
- – A.
Cattaneo & M.
S. Neuberger (1987). Polymeric immunoglobulin M is secreted by transfectants
of non-lymphoid
cells in the absence of immunoglobulin J chain. Embo J 6(9), 2753–8.
- – A.
Fasulo et al. (2000). J. Neurochem. 75, 624–633.
- – D.
Gietz et al., (1992). Improved method for high efficiency transformation
of intact yeast cells. Nucleic Acids Res 20(6), 1425.
- – Goedert
et al., (1999). Tau gene mutation in familial progressive subcortical
gliosis. Nature Medicine, 5, 454–457.
- – E.
A. Golemis & R.
Brent (1992). Fused protein domains inhibit DNA binding by LexA.
Mol Cell Biol 12(7), 3006–14
- – Grand
und Owen (1991). The biochemistry of ras p21. Biochem. J. 279, 609–631.
- – J.
Hill et al., (1991). DMSO-enhanced whole cell yeast transformation
[veröffentlichtes
Erratum erschien in Nuclei Acids Res, 11. Dezember 1991; 19(23):
6688] Nucleic Acids Res 19(20), 5791.
- – S.
M. Hollenberg et al., (1995). Identification of a new family of
tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid
system. Molecular and Cellular Biology 15(7), 3813–3822.
- – M.
Hong et al. (1998). Mutation-specific functional impairments in
Distinct Tau isoforms of Heriditary FTDP-17. Science, 282, 1914–1917.
- – W.
A. Marasco (1997). Intrabodies: turning the humoral immune system
outside in for intracellular immunization. Gene Ther 4(1), 11–5.
- – M.
Novak et al. (1991). Difference between the tau protein of Alzheimer
paired helical filament core and normal tau revealed by epitope
analysis of monoclonal antibodies 423 and 7.51. Proc Natl Acad Sci
USA 88(13), 5837–41.
- – J.
Sambrook, E. F. Fritsch & R.
Maniatis (1990). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor NY edit (Press, C. S. H. I., Herausgeber)
- – R.
H. Schiestl & R.
D. Gietz (1989). High efficiency transformation of intact yeast
cells using single stranded nucleic acids as a carrier Curr Gen
16(5–6),
339–46.
- – P.
A. Silver, R. Brent & M.
Ptashne (1986). DNA binding is not sufficient for nuclear localization
of regulatory proteins in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol
6(12), 4763–6.
- – M.
G. Spillantini et al. (1998). Mutation in the gene in familial multiple
system taupathy with presenile dementia. Proc. Natl. Acad Sci USA,
95, 7737–7741.
- – Visintin
et al. (1999). Selection of antibodies for intracellular function
using a two-hybrid system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 11723–11728.
