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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist das Gebiet der Proteom-Analyse (Proteomik)
und Verfahren zur Generierung von Werkzeugen für die Proteomik und die Verwendung
dieser Werkzeuge bei zum Beispiel der Proteinexpression.
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Die
letzten Jahre haben eine noch nie dagewesene Zunahme der Gensequenzierung
und -identifikation angekündigt,
wie anhand der Ankündigung der
kompletten Genomsequenz von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen
und Organismen, einschließlich
des Modelleukaryoten C. elegans (siehe http://www.nih.gov/news/pr/dec98/nhgri-09.htm
erläutert
(Science, 11. Dezember 1998).
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Die
Sequenzierung des humanen Genoms wird weiterhin beschleunigt, wobei
die Vervollständigung
in 3- bis 4jähriger
Zeit prognostiziert wird. Diese anwachsenden DNA-Sequenzdaten werden
als eine Plattform für
die systematische Untersuchung der Gen-(mRNA)-Expression und -Funktion
verwendet. Solche Untersuchungen kombiniert mit der damit einhergehenden
Informatik transformieren die biologische Grundlagenforschung und
werden die Entdeckung, Entwicklung von und die Abgabeverfahren für Arzneimittel
transformieren. Es wurde jedoch zunehmend offensichtlich, dass die
DNA-Sequenzdaten selbst oft wenig Information über die Funktion der kodierten
Proteinprodukte bereitstellen. Messungen der Genexpression auf der
mRNA-Ebene liefern weiter nicht immer eine akkurate Darstellung
von der Expression der entsprechenden Proteine noch in der Tat vom
Ausmaß,
in dem sie posttranslational modifiziert werden könnten. Wichtig
ist, dass es sich vorwiegend um Proteine handelt, welche die biologische Funktion
ausüben.
Folglich besteht zunehmend der Wunsch, die Expression und Aktivität der Proteinprodukte
eines Genoms von einem Organismus auf systematische und umfassende
Weise zu analysieren – wobei
dieses Ziel eine funktionierende Definition der Proteom-Analyse
(oder Proteomik) bereitstellt (siehe Pennington et al. Proteome
analysis: from protein characterisation to biological function.
Trends Cell Biol. 7, 168–173
und darin enthaltende Referenzen). Es ist wichtig zu betonen, dass
die Aktivität
individueller Proteine mittels einer Anzahl verschiedener Mechanismen,
einschließlich
ihres Expressionsspiegels in individuellen Geweben oder Zellen,
des Ausmaßes und
des Typs posttranslationaler Modifikationen, ihrer subzellulären Lokalisierung
und ihren Interaktionen mit anderen Proteinen reguliert werden kann.
Die Proteomik umfasst deshalb einen breitgefächerten Bereich experimenteller
Ansätze.
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Existierende
Ansätze
für die
Proteomik werden am besten durch die Verwendung der zweidimensionalen
Elektrophorese (2-DE) zum Auftrennen und Quantifizieren der Expression
von mehreren tausend Proteinen simultan mit der Applikation eines Portfolios
von Verfahren zur Identifikation der aufgetrennten Proteine erläutert. Die
Proteinidentifikation und vollständige
primäre
Sequenzbestimmung verlässt
sich jedoch noch häufig
auf die Applikation existierender DNA-Sequenzdaten oder auf der
Molekularbiologie basierenden Verfahren zur Identifikation der entsprechenden
Gensequenz. Versuche zur Entwicklung alternativer orthogonaler Ansätze zur High-Throughput-Messung
der Proteinexpression, die wie die 2-DE auf der anfänglichen
Trennung der Proteine aus Gemischen basieren, werden unternommen.
Es ist jedoch bemerkenswert, dass einige der dramatischsten Verbesserungen
bei der Messung der mRNA-Expression von seiten trennungsunabhängiger Verfahren
gekommen ist, die sich auf die molekulare Erkennung verlassen. Existierende
Ansätze
zur Messung der Proteinexpression weisen zusammenfassend viele inhärente Limitationen
auf – sie
sind umständlich,
zeitaufwendig, leiden an Reproduzierbarkeitsproblemen, sind nicht
so empfindlich wie erforderlich und sie sind wahrscheinlich nicht ohne
weiteres auf die simultane Analyse aller Proteine von selbst einem
,einfachen' Genom
aufwendbar. Sie weisen überdies
eine vordringliche Limitation auf – sie führen nicht als solches zur
Generierung experimenteller Werkzeuge zur Messung oder Manipulation
der Proteine. Wenn folglich zum Beispiel die 2-DE (oder in der Tat
jedwedes andere auf Protein basierende existierende Verfahren) zur
Identifikation einer Gruppe von mit einer bestimmten Krankheit einhergehenden
Proteinen (durch Differenzialanalyse der Proteinexpression) verwendet
wird, wird das Verfahren zur Identifikation der Proteine nicht zur
Produktion der experimentellen Werkzeuge geführt haben. Ein Beispiel solcher
Werkzeuge stellen Moleküle oder
Liganden dar, die spezifisch an die individuellen Proteine von Interesse
mit angemessener Affinität zur
gewünschten
Applikation binden können – ,Protein-Affinitätsliganden'. Solche Werkzeuge
besitzen viele Verwendungszwecke. Sie könnten zum Beispiel zum Messen
der Proteinexpression, Reinigung des Proteins zur Funktionsanalyse,
Einfluss der Aktivität der
Proteine verwendet werden oder könnten
als diagnostische Reagenzien eingesetzt werden.
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Gegenstand
der hierin beschriebenen Erfindung ist ein High-Throughput-Verfahren
zur Produktion und Identifikation solcher ,Protein-Affinitätsliganden', entweder an Proteine
von Interesse oder an Proteine, die zuvor noch nicht identifiziert
worden sein könnten.
Es ist ein erfindungsgemäßes Ziel,
zur Produktion ,katalogisierter' Bibliotheken
von ,Protein-Affinitätsliganden' ein High-Throughput-Verfahren bereitzustellen.
Diese ,Protein-Affinitätsliganden' besitzen viele potenzielle
Applikationen und besitzen Anwendbarkeit bei der Identifikation
und Validierung von Arzneimittel-Targets, Arzneimittelentdeckung und
-entwicklung und als diagnostische Werkzeuge. Sie werden auch wichtige
Werkzeuge für
die Entwicklung der Trennung unabhängiger Ansätze zur Messung der Proteinexpression
und posttranslationalen Modifikation bereitstellen.
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Unter
dem Begriff ,Protein-Affinitätsligand', wie hierin verwendet,
versteht man ein Molekül
(groß oder
klein), das an ein Protein bindet, sei es die Polypeptidhauptkette
(oder ein Teil davon) oder jedweden modifizierten Teil des Proteins,
wie zum Beispiel eine phosphorylierte, Fettsäure acylierte, ADP-ribosylierte
oder glycosylierte Komponente oder in der Tat jedwede bekannte oder
bisher nicht identifizierte Modifikation, entweder natürlich oder
durch experimentelle Intervention eingeführt. Solche Protein-Affinitätsliganden
können
am besten durch polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper oder
Phagen-Display-Antikörper
erläutert
werden, schließen aber
Peptid- oder Peptoidkomponenten (einschließlich Peptid-Nukleinsäure-Moleküle), Oligonukleotide, modifizierte
Oligonukleotide oder in der Tat jedwedes Molekül oder jedwede Chemikalie ein,
das/die an ein Protein mit angemessener Spezifität und Affinität bindet/binden.
Unter den Chemikalien könnten
die eingeschlossen werden, die aus kombinatorischen Bibliotheken
ausgewählt
werden. Eine erfindungsgemäße Ausführungsform
ist folglich auf Antikörper
als die ,Protein-Affinitätsliganden' gerichtet, obwohl
andere Affinitätsliganden
erfindungsgemäß produziert
und identifiziert werden können.
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Hierin
ist ein Verfahren beschrieben, das als „inverses Screening" bezeichnet wird,
zur Identifikation und Isolation von ,Protein-Affinitätsliganden' an individuelle
Proteine. Hierin ist auch ein Verfahren zur Verwendung von Proteingemischen
zur Generierung von Bibliotheken von gut charakterisierten ,Protein-Affinitätsliganden' beschrieben. Es
ist ein erfindungsgemäßes Merkmal,
dass ,Protein-Affinitätsliganden' an individuelle Proteine
generiert werden können,
ohne Zugang zum individuellen Protein erforderlich zu machen. Die
so durch das vorliegende Verfahren und ihre Protein-Targets (wenn
zuvor unbekannt) generierten und identifizierten ,Protein-Affinitätsliganden' sind deshalb auch
ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Auswahl und/oder
Identifikation von einem oder mehr Protein-Affinitätsliganden, der/die
an ein oder mehr Protein(e) von Interesse bindet binden, umfassend
die Schritte von:
- (A) Erhalt eines echten oder
theoretischen Peptid-Massenfingerprints oder einer anderen auf der Massenspektrometrie
basierenden Charakterisierung oder einer anderen Proteincharakterisierung des
einen Proteins oder von mehr Proteinen durch entweder:
- i. Aussetzen des einen Proteins oder von mehr Proteinen dem
Peptid-Massenfingerprinting
oder einer anderen auf der Massenspektroskopie basierenden Charakterisierung
oder einer anderen Proteincharakterisierung; oder
- ii. Vorhersagen des Peptid-Massenfingerprints oder einer anderen
auf der Massenspektrometrie basierenden Charakterisierung oder einer
anderen Proteincharakterisierung aus bekannten Daten;
- (B) Verwendung des einen Proteins oder von mehr Proteinen entweder
individuell oder als ein Gemisch zum:
- i. Generieren von einem oder mehr Antikörper(n) dazu durch Immunisierung;
und/oder
- ii. Auswählen,
unter Verwendung von einer einzelnen oder mehrfachen Bindungsrunde(n),
von einem oder mehr Protein-Affinitätsliganden dazu;
- (C) Screening des in Schritt (B)(i) generierten einen Antikörpers oder
von mehr Antikörpern und/oder
des in Schritt (B)(ii) ausgewählten
einen oder von mehr Protein-Affinitätsliganden
durch:
- (i) Zufügen
des einen Proteins oder von mehr Proteinen, individuell oder als
ein Gemisch aus Proteinen zum in Schritt (B)(i) generierten einen
oder von mehr Antikörper(n),
oder dem in Schritt (B)(ii) ausgewählten einen oder von mehr Protein-Affinitätsliganden,
wobei jeder Antikörper
oder Protein-Affinitätsligand
individuell verwendet wird, und
- (ii) nach Entfernung jeglicher Proteine, die nicht gebunden
wurden, Eluieren des mindestens einen Proteins, das gebunden wurde;
- (D) Aussetzen des mindestens einen eluierten Proteins dem Peptid-Massenfingerprinting und/oder
einer anderen auf der Massenspektrometrie basierenden Charakterisierung
und/oder einer anderen Proteincharakterisierung; und
- (E) durch Vergleich der in Schritten (A) und (D) erhaltenen
Peptid-Massenfingerprints
oder einer anderen auf der Massenspektroskopie basierenden Charakterisierung
oder einer anderen Proteincharakterisierung, wobei der mindestens
eine Protein-Affinitätsligand,
der an ein oder mehr Protein(e) von Interesse bindet, ausgewählt und/oder identifiziert
wird.
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Die
anderen Proteincharakteristika könnten zum
Beispiel die Aminosäurezusammensetzungsanalyse
oder andere empfindliche und spezifische Verfahren einschließen.
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Die
anderen auf der Massenspektrometrie basierenden Charakteristika
könnten
zum Beispiel die Verwendung von Sequenz-Tag-Daten einschließen.
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Das
Gemisch aus Proteinen, auf das vorstehend verwiesen wird, kann einfach
oder komplex sein; sie können
von jedwedem Organismus, jedem Gewebetyp, jedweder Zelle oder Kombinationen
davon gewonnen werden, die jedweder Behandlung unterzogen worden
sein können.
Das Proteingemisch kann auch aus der Fraktionierung eines Organismus, eines
Gewebes oder einer Zelle, wie zum Beispiel sezernierte membranöse, cytoplasmatische,
organellare oder nukleäre
Proteine oder Fraktionen von Proteinen, die Modifikationen tragen,
wie zum Beispiel Kohlenhydrat enthaltende oder phosphorylierte Proteine,
erhalten werden. Das Proteingemisch kann auch durch in vitro-Expression
von cDNAs erhalten werden. Die Proteine können nativ sein oder sie können auf
jedwede Weise, zum Beispiel durch Biotinylierung oder durch Zufügen von
fluoreszierenden oder anderen chemischen Komponenten, modifiziert worden
sein.
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Die
,Protein-Affinitätsliganden' können spezifisch
mehr als ein Protein, zum Beispiel mittels Bindung an Proteine,
die miteinander interagieren, erkennen. Unter diesen Umständen können die
Massenspektrometrie-Daten zum Aufdecken solch multipler Proteine
verwendet werden und die ,Protein-Affinitätsliganden' könnten
zusätzlichen
Wert und/oder aufgrund ihrer Fähigkeit
Verwendung haben, (i) multiple Proteine von zum Beispiel einer Proteinfamilie oder
(ii) Proteine, die durch Protein:Protein-Interaktionen aneinander gebunden sind,
zu erkennen.
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Das
eine Protein oder mehr Proteine von Interesse wird werden bevorzugt
mittels der 2D-Elektrophorese aufgetrennt.
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Die
in Schritt (B)(i) erhaltenen Antikörper werden bevorzugt vor Schritt
(C) kloniert.
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Die
Antikörper
werden bevorzugt auf einem Festphasenträger immobilisiert. Der Träger stellt
bevorzugt Nitrocellulose oder PVDF dar. Es wurde gefunden, dass
solche Träger
bei der Bindung von Proteinen in den erfindungsgemäßen Verfahren
besonders wirksam sind.
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Die
verbleibenden Bindungsstellen auf dem festen Träger werden, nachdem die Antikörper darauf
immobilisiert sind, zur Verhinderung nicht spezifischer Proteinbindung
bevorzugt blockiert. Herkömmliche
Mittel erwiesen sich für
die erfindungsgemäße Methodologie
als unwirksam. Oligosaccharide und Polyvinylpyrrolidine erwiesen
sich jedoch besonders wirksam.
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Ein
flüchtiges
Reagens, d. h. eines, das ohne weiteres durch zum Beispiel Verdampfung
entfernt wird, wird bevorzugt als das Elutionsmittel verwendet.
Es wurde gefunden, dass Ameisensäure
besonders bevorzugt ist, da sie mit einer weiten Reihe von Antikörpern verwendet
werden konnte und ausreichend flüchtig
ist, um leicht entfernt werden zu können. Ihre Verwendung hatte
den Vorteil, dass anschließende
Manipulationsschritte zur Entfernung des Elutionsmittels vermieden
wurden.
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In
einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
ist ein Verfahren zur Generierung monoklonaler Antikörper gegen
ein oder mehr targetierte Protein(e) bereitgestellt, umfassend die
Schritte von:
- (a) Auftrennung individueller
Proteine aus einem Proteingemisch;
- (b) Aussetzen des aufgetrennten Proteins/der aufgetrennten Proteine
dem Peptid-Massenfingerprinting
zum Erhalt eines Peptid-Massenprofils;
- (c) Nutzung von einem oder mehr der aufgetrennten Proteine zur
Generierung von einem oder mehr monoklonalen Antikörpern(n)
dazu durch Immunisierung und Generierung von Hybridomen;
- (d) Zufügen
eines Proteingemischs zum in Schritt (c) generierten einen oder
mehr Antikörper(n)
zur Auswahl der Proteine, die den einen oder mehr monoklonale(n)
Antikörper
binden und Aussetzen des/der ausgewählten Proteins/Proteine dem Peptid-Massenfingerprinting
zum Erhalt eines Profils von der Peptidmasse;
- (e) Vergleich der in Schritten (b) und (d) erhaltenen Daten
und Auswahl eines Hybridomklons oder von mehr Hybridomklonen von
Interesse.
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In
dieser Ausführungsform,
in dem das/die Protein(e) von Interesse zuvor bekannt ist/sind und die
DNA-Sequenzdaten für
das entsprechende Gen/die entsprechenden Gene existieren, kann Schritt
(b) ausgelassen werden, weil unter diesen Umständen Schritt (e) durch Vergleich
der in Schritt (d) erhaltenen Daten mit den aus dem theoretischen Peptid-Massenfingerprinting
der entsprechenden DNA-Sequenz erhaltenen unternommen werden könnte.
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In
einer zweiten erfindungsgemäßen Ausführungsform
ist ein Verfahren zur Generierung einer Bibliothek von Antikörpern bereitgestellt,
umfassend die Schritte von:
- (a) Auftrennung
individueller Proteine aus einem Proteingemisch;
- (b) Aussetzen des/der aufgetrennten Proteins/Proteine dem Peptid-Massenfingerprinting zum
Erhalt eines Profils einer Peptidmasse;
- (c) Nutzung eines Proteingemischs zur Generierung eines monoklonalen
Antikörpers
oder mehr monoklonaler Antikörper
dazu durch Immunisierung und Generierung von Hybridomen;
- (d) Zufügen
eines Proteingemischs zu dem in Schritt (c) generierten einen oder
mehr monoklonalen Antikörper(n)
zur Auswahl der Proteine, die den einen oder mehr monoklonale(n)
Antikörper binden
und Aussetzen des/der ausgewählten
Proteins/Proteine dem Peptid-Massenfingerprinting zum Erhalt eines
Profils einer Peptidmasse;
- (e) Vergleich der in Schritten (b) und (d) erhaltenen Daten;
und
- (f) Identifizierung der monoklonalen Antikörper von potenziellem Interesse
für eine
monoklonale Antikörperbibliothek.
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In
dieser Ausführungsform
können
Schritte (a) und (b) ausgelassen werden, wenn sich das Proteingemisch
von einem Organismus herleitet, für den signifikante DNA-Sequenzdaten
zur Verfügung
stehen, da unter diesen Umständen
Schritt (e) durch Vergleich der in Schritt (d) erhaltenen Daten
mit denen aus dem theoretischen Peptid-Massenfingerprinting der
potenziellen offenen Leserahmen, die in den DNA-Sequenzdaten kodiert
sind, unternommen werden könnten.
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In
einer dritten erfindungsgemäßen Ausführungsform
ist ein Verfahren zur Auswahl gewünschter Glieder einer Affinitätsliganden-Bibliothek
bereitgestellt, umfassend die Schritte von:
- (a)
Auftrennung eines Proteingemischs;
- (b) Aussetzen des aufgetrennten Proteins/der aufgetrennten Proteine
zum Peptid-Fingerprintung zum Erhalt eines Profils einer Peptidmasse;
- (c) Nutzung von einem oder mehr der aufgetrennten Proteine zur
Auswahl von einem oder mehr Affinitätsliganden aus einer Bibliothek;
- (d) Zufügen
des Proteingemischs zu dem einen oder mehr Affinitätsliganden,
die im Schritt (c) zur Auswahl der Proteine generiert wurden, die
den einen oder mehr Affinitätsliganden
binden und Aussetzen des/der ausgewählten Proteins/Proteine zum
Peptid-Massenfingerprinting zum Erhalt eines Profils einer Peptidmasse;
- (e) Vergleich der in den Schritten (b) und (d) erhaltenen Daten;
und
- (f) Auswahl von einem oder mehr Affinitätsliganden von Interesse.
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In
dieser Ausführungsform
können
Schritte (a) und (b) ausgelassen werden, wenn sich das Proteingemisch
von einem Organismus herleitet, für den signifikante DNA-Sequenzdaten
zur Verfügung
stehen, da unter diesen Umständen
Schritt (e) durch Vergleich der in Schritt (d) erhaltenen Daten
mit denen aus dem theoretischen Peptid-Massenfingerprinting der
potenziellen offenen Leserahmen, die in den DNA-Sequenzdaten kodiert
sind, unternommen werden könnten.
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In
jeder Ausführungsform
kann muss aber nicht das in Schritt (d) verwendete Proteingemisch das
in den vorherigen Schritten verwendete sein.
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Das
Verfahren stellt folglich eine neue Verknüpfung zwischen der Auftrennung
und Identifikation durch eine Proteincharakterisierung, wie zum
Beispiel Massenspektrometrie der individuellen in Proteingemischen
vorliegenden einzelnen Proteine mit dem Screening von Affinitätsliganden
durch solche Mittel dar. Der signifikanteste Vorteil des Verfahrens ist
die Bereitstellung eines Verfahrens zur Generierung und zum Screening
von Affinitätsliganden
an Proteine, ohne reines Protein zu benötigen. Bisher wurde kein anderes
Screening-Verfahren beschrieben, welches den Bedarf an reinem Protein
umgeht. Es wird weiter ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Generierung
großer
Anzahlen von ,Protein-Affinitätsliganden
bereitgestellt, für
die die Target-Proteine ohne die Notwendigkeit von Zugang zu den
reinen Proteinen identifiziert werden.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung zur Durchführung der
Schritte, worin Proteine von einem ,Protein-Affinitätsliganden' ausgewählt werden
und anschließend
durch zum Beispiel Massenspektrometrie (d. h. Schritt (d)) direkt auf
die massenspektrometrischen Targets oder als Alternative nach etwas
zusätzlicher
Verarbeitung von ,Protein-Affinitätsliganden' oder den ausgewählten Proteinen vor der Massenspektrometrie
analysiert werden. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch
die Bereitstellung zur Isolierung und Manipulation von ,Protein-Affinitätsliganden', zum Beispiel die Affinitätsisolierung
von Antikörpern
aus Gewebekulturüberständen vor
der Verwendung zum inversen Screening.
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Es
wird eine Anzahl erfindungsgemäßer Aspekte
lediglich mithilfe des Beispiels unter Bezugnahme auf die folgenden
Beispiele und Fließdiagramme ausführlicher
beschrieben.
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Vergleichsbeispiele
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Aktueller
Ansatz
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In
einem üblichen
Ansatz zur Generierung von Antikörpern
wird ein Antigen oder ein Gemisch aus Antigenen an Mäuse, Ratten
oder andere Tiere verabreicht und die Immunantwort auf das/die Antigen(e)
wird mittels ELISA, Dot-Blotting oder weniger häufig Western-Blotting überwacht.
Wenn man Tiere identifiziert hat, die eine adäquate Immunantwort produziert
haben, können
monoklonale Antikörper
produziert werden, wobei man die Zellen aus der Milz des Tieres
entnimmt und sie mit Zellen einer Myelomzelllinie zur Generierung
von Hybridomen fusioniert – immortalisierte
Zellen, die Antikörper
produzieren. Die Hybridomzeilen werden zum Beispiel durch limitierende
Verdünnung
kloniert und die Klone dann durch einen Bereich verschiedener Screening-Ansätze zur
Bestimmung, welche Zellen die gewünschten Antikörper produzieren,
gescreent. Für
die wirksame Selektion von Hybridomen muss das Screening-Verfahren
robust, schnell und zuverlässig
sein, weil es parallel zu der initialen Kultur von den Hybridomzellen
durchgeführt
wird. Es gibt drei Klassen der Screening-Strategie: Antikörper-Capture-Assays, Antigen-Capture-Assays
und funktionelles Screening. Im Allgemeinen wird die überwiegende
Mehrzahl von Screenings durch Antikörper-Capture unternommen. In
diesem Ansatz wird das an eine feste Oberfläche gebundene reine Antigen
verwendet, um die Antikörper
einzufangen, und diese werden dann mit angemessen markierten Antiimmunglobulin-Antikörpern nachgewiesen.
Dieses Verfahren screent auf Antikörper gegen ein individuelles
Proteinantigen und erfordert signifikante Mengen gereinigten Proteins.
Antigen-Capture-Screening wird selten verwendet, sofern nicht das
Proteinantigen in großen
Mengen zur Verfügung
steht – dies
ist darauf zurückzuführen, dass
sie die Markierung des Antigens erfordern (oft mit Radioisotopen,
d. h. 125I).
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Obwohl
die Immunisation nur kleine Mengen eines individuellen Proteinantigens
erfordern könnte (oftmals
sind weniger als 1 μg
angemessen), erfordert das Screening-Verfahren folglich relativ große Mengen
reinen Proteins. Im Zusammenhang mit augenblicklichen Ansätzen zur
Proteom-Analyse, wenn die 2-DE zum Auftrennen von Tausenden von
Proteinen in Sub-μg-Mengen
verwendet wird, sind existierende Verfahren zur Antikörper-Produktion
und Isolation folglich ungeeignet.
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Ein
anderes wichtiges Merkmal der existierenden Verfahren besteht darin,
dass die Hybridom-Klone oder Gemische davon, die keine Antikörper produzieren,
die das Target-Antigen erkennen, verworfen werden. Die Hybridome
oder andere ,Protein-Affinitätsliganden' werden erfindungsgemäß auf einer
frühen
Stufe kloniert und jeder Antikörper
gescreent. Durch Archivieren der klonierten Hybridome oder anderer
,Protein-Affinitätsliganden' ist es möglich, sie
unter anderen Bedingungen und gegen andere Proteingemische erneut
zu screenen.
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Das
nachstehend beschriebene Verfahren stellt einen neuen Ansatz zur
weit verbreiteten Produktion von Antikörpern oder anderen ,Protein-Affinitätsliganden' an individuelle
Proteine oder in Gemischen bereit. Die neue Verknüpfung zwischen
der Auftrennung von Protein-Gemischen und dem Screening von Affinitätsliganden
durch, zum Beispiel Massenspektrometrie, stellt einen leistungsfähigen Ansatz
zur Generierung von charakterisierten ,Protein-Affinitätsliganden' dar.
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Beispiel 1
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Auf die Generierung monoklonaler
Antikörper
gegen ,targetierte Proteine' berichtetes
Verfahren
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Ein
Proteingemisch wird zum Beispiel durch die zweidimensionale Elektrophorese
(2-DE) oder durch jedwedes andere Mittel zur Bereitstellung individueller
,Target-Proteine' davon
getrennt.
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Die
Proteine von Interesse werden dem Peptid-Massenfingerprinting oder
einem anderen auf der Massenspektrometrie basierenden Verfahren
ausgesetzt – dies
ergibt ein charakteristisches Peptidmuster und andere Daten, wie
zum Beispiel Sequenz-Tag, die für
jedes der Proteine einzigartig sind, und es sind diese Daten, die
zur Auswahl von Antikörpern
ausgenutzt werden, die zur Bindung der ,Target-Proteine' fähig sind.
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Aus
individuellen Hybridom-Klonen sezernierte Antikörper dürfen mit einem Proteingemisch, enthaltend
das Protein oder die Proteine, für
welche Antikörper
erwünscht
sind, interagieren. Die entsprechenden Antikörper binden das/die Target-Protein(e) von Interesse,
und das durch jeden Antikörper
gebundene Protein kann dann eluiert und dem Peptid-Massenfingerprinting
oder einer anderen auf der Massenspektrometrie basierenden Analyse
unterzogen werden. Die Spezifität
und Empfindlichkeit der Massenspektrometrie ermöglicht die Identifikation des/der
Target-Proteins/Target-Proteine
von Interesse und zeigt auf diese Weise, welche Hybridomzellen Antikörper gegen
das/die Target-Protein(e) produzieren.
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Dieses
Verfahren wird ausführlicher
unter Bezugnahme auf 1 beschrieben, bei der es sich um
ein Fließdiagramm
des Verfahrens handelt.
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Zur
Generierung monoklonaler Antikörper gegen
Protein(e) von Interesse werden Säuger, zum Beispiel Ratten oder
Mäuse,
mit individuellen Proteinen, die zum Beispiel aus 2-DE-Gelen zurückgewonnen
werden, immunisiert (Schritt C). Ein Aliquot des Proteins/der Proteine
kann dem Peptid-Massenfingerprinting (Schritt B) unterzogen werden.
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Nach
dem Fusionieren der Milzzellen mit Myelomzelllinien werden die sich
ergebenden Hybridome zum Beispiel durch limitierende Verdünnung der Zellen
kloniert. Die durch individuelle Klone oder Gemische von Klonen
produzierten Antikörper
werden anhand der Massenspektrometrie gescreent. Die monoklonalen
Antikörper
werden folglich aus dem Gewebekulturmedium zurückgewonnen und an einem Festphasenträger, bei
dem es sich zum Beispiel um eine 96-Well-Platte handeln kann, immobilisiert. Den
immobilisierten monoklonalen Antikörpern wird ein Proteingemisch
zugefügt,
und die Proteine, die an individuelle monoklonale Antikörper gebunden
wurden, werden eluiert und dem Peptid-Massenfingerprinting (Schritt
D) oder einer anderen auf der Massenspektrometrie basierenden Charakterisierung
unterzogen. Durch Vergleich der erhaltenen Daten (Schritt E) mit
den Daten für
die Proteine von Interesse wird es möglich, die monoklonalen Antikörper auszuwählen (Schritt
F), die für
die Proteine spezifisch sind und folglich die relevanten Klone isolieren.
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Bei
einer weiteren Verbesserung wird das Verfahren durch Applikation
einer automatisierten Multiwell-Platten-Handhabungstechnologie und
automatisierten High-Throughput-Massenspektrometrie,
zum Beispiel durch Verwendung von automatisierter Probentarget-Ladung
zur Erleichterung des Screenings einer großen Anzahl individueller Zellklone
zu rationalisieren.
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Beispiel 2
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Auf die Generierung
einer Antikörperbibliothek
gerichtetes Verfahren
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Dieses
Verfahren wird unter Bezugnahme auf 2 beschrieben,
bei dem es sich um ein Fließdiagramm
des Verfahrens handelt.
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Mäuse/Ratten
werden mit einem Gemisch aus Proteinen immunisiert (Schritt C) und
die Immunantwort kann durch ELISA unter Verwendung des Proteingemischs
gescreent werden. Zur Etablierung der ,Verteilung' von generierten
Antikörpern – d. h. die
Abdeckung der polyklonalen Bibliothek, kann das Antiserum zum Western-Blotting
zum Beispiel gegen mit 1-DE- oder 2-DE aufgetrennten Proteinen des Originalproteingemischs
(Schritt A) oder jedweden anderen Proteingemischs verwendet werden.
Für die Tiere,
die Antikörper
der gewünschten
Abdeckung produzieren, werden die Milzzellen mit einer Myelomzelllinie
zum Generieren von Hybridomen fusioniert und die durch den Gesamtpool
von Hybridomzellen produzierten Antikörper können erneut gescreent werden,
zum Beispiel mittels Western-Blotting gegen die mittels 1-DE oder
2-DE aufgetrennten Proteine. Dies kann zur Bestätigung verwendet werden, dass geeignete
Antikörper
produzierende Hybridome generiert wurden. Das Hybridomgemisch wird
dann zum Beispiel durch limitierende Verdünnung kloniert und die Antikörper immobilisiert,
ein komplexes Gemisch aus Proteinen zugefügt, die Proteine, die gebunden
wurden, eluiert (Schritt D) und mittels der Massenspektrometrie
gescreent. Wie mit Beispiel 1 können
die Daten verglichen (Schritt E) und die Klone von Interesse ausgewählt werden
(Schritt F).
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Die
wichtigsten Vorteile der vorstehend angegebenen Ansätze sind:
Gereinigtes
Protein ist zum Screening nicht erforderlich;
monoklonale Zelllinien
sind relativ stabil und können archiviert
werden;
Antikörper
von hoher Affinität
und angemessener Selektivität
werden produziert; und
das zum Screening der Antikörper verwendete
Proteingemisch kann den Antikörpern
in einer Form präsentiert
werden, die auf die wahrscheinliche Endapplikation maßgeschneidert
sind, d. h. die Proteine können
in nativer oder denaturierter Form präsentiert werden.
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Beispiel 3
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Verfahren
zur Auswahl von Phagen-Display-Antikörpern
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Dieses
Verfahren wird unter Bezugnahme auf 3 beschrieben,
bei dem es sich um ein Fließdiagramm
des Verfahrens handelt.
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Nach
der Trennung der Proteingemische durch zum Beispiel 2-DE (Schritt
A) werden die Proteine unter Verwendung einer Antikörper-Phagen-Bibliothek
mit Nachweis von gebundenem Phagen im Western-Blot bestimmt. Individuelle
Protein-Spots von Interesse und der damit assoziierte Antikörper-Display-Phage
werden aus dem Western-Blot exzidiert, der Phage eluiert und zur
Reinfektion von E. coli verwendet. Individuelle Kolonien von E.
coli können
(im 96-Well-Plattenformat) propagiert werden, die Phagen-Antikörper-Sekretion
mit IPTG induziert und individuelle Antikörper (PhAbs) zurückgewonnen
werden. Die PhAbs werden dann immobilisiert und ein Proteingemisch
zugefügt.
Proteine, die binden, werden dann eluiert (Schritt D) und mittels Peptid-Massenfingerprinting
charakterisiert. Wie mit Beispiel 1 können die Daten verglichen werden (Schritt
E) und PhAbs, die das/die Protein(e) von Interesse binden, werden
ausgewählt
(Schritt F).
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Die
wichtigsten Vorteile des vorstehend angegebenen Ansatzes sind:
Er
vermeidet die typischen 4–5
Runden der Phagen-Selektion, kann aber mit jedwedem üblichen Phagen-Selektionsverfahren
verwendet werden;
gereinigtes Protein ist zum Screening nicht
erforderlich;
das Verfahren gibt auch zu erkennen, dass irgendwelche
PhAbs, die während
des Western-Blotting an das Protein binden, für andere Proteine im Proteingemisch
spezifisch sind. Jedes Screening produziert deshalb PhAbs gegen
mindestens das Protein von Interesse und potenziell auch andere;
der
Phage kann zur Generierung einer stabilen Quelle von PhAbs archiviert
werden (Schritt F).
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Die
Modifikation der Selektionsbedingungen mittels Western-Blotting
und die Bedingungen unter denen das Proteingemisch den individuellen
PhAbs zugefügt
und aus ihnen gewaschen wird, kann zum Isolieren der PhAbs der gewünschten
Eigenschaften (d. h. Affinität,
Avidität)
modifiziert werden; und der relevante ausgewählte Phage kann zur Veränderung der
Eigenschaften von PhAbs genetisch modifiziert werden.
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Beispiel 4
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Inverses Screening eines
polyklonalen Antiserums gegen ein ,Target-Protein' – bovines Serumalbumin
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Das
inverse Screening-Verfahren wurde zum Screening eines gewerblich
erhältlichen
polyklonalen Antikörpers
gegen bovines Serumalbumin (BSA) gegen ein Gemisch aus Proteinen
(enthaltend BSA) verwendet. Polyklonale anti-BSA-Antikörper (5–80 μg; Sigma
B-3759) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurden in den Wells
von 96-Well-Filtrationsplatten, die eine hydrophobe PVDF-Membran
mit hoher Proteinbindung (Millipore MultiScreen® ImmobilonTM-P-Filtrationsplatten) durch Inkubation
der vorbenetzten Membranen mit der Antikörper enthaltenden Lösung 2 h
bei Raumtemperatur immobilisiert. Die Membranen wurden gemäß den Anleitungen
des Herstellers vorbenetzt; dann wurden jedem Well 50 μl 50% Ethanol
zugefügt
und die Membranen 1 min bei Raumtemperatur inkubiert, und nach der
Vakuum-Aspiration der Wells wurde jedes Well zweimal mit 200 μl deionisiertem
Wasser oder PBS gewaschen. Nach der Antikörperbindung wurden die Wells
gründlich
mit PBS (6 × 0,35
ml) gewaschen. Es geht daraus deutlich hervor, dass für die Immobilisation
von Antikörpern
verschiedene Bedingungen verwendet werden können, und viele wurden ausführlich untersucht.
Zu diesen anderen Verfahren gehört
die Verwendung verschiedener Puffer, verschiedener Inkubationszeiten
und Temperaturen, verschiedener Verfahren zur Entfernung der übrigen Antikörper-Lösungen (Vakuum-Aspiration
durch die Membran oder direkte Entfernung), die dem Fachmann alle
bekannt sind. Das hier beschriebene Verfahren erwies sich für den in
diesem Beispiel verwendeten Antikörper als optimal. Andere beschriebene Verfahren
waren für
die anderen angegebenen Beispiele gegebenenfalls optimal. Die Verwendung
von üblichen
96-Well-Platten oder anderen Festphasenträgern, die bei Immunassays häufig verwendet
werden, wiesen keine ausreichende Proteinbindungskapazität zur Immobilisation
von Antikörpern
auf. Dies ist wichtig, weil genügend
Protein aus den Antikörpern
zur anschließenden
Charakterisierung zurückgewonnen
werden muss. Die Verwendung eines Festphasenträgers, in diesem Fall PVDF,
in einem geeigneten Format zur High-Throughput-Applikation stellt einen
signifikanten erfinderischen Schritt dar und ist für einige
der hierin angegebenen Beispiele kritisch.
-
Das
Ausmaß,
in dem eine Antikörperbindung bewirkt
wurde, wurde mittels mehrerer Verfahren untersucht. Am routinemäßigsten
wurde es durch Bestimmung der Proteinkonzentration (Bradford-Assay) von
der Antikörper-Lösung, nachdem
sie mit den Wells inkubiert wurde, untersucht. Unter den beschriebenen
Bedingungen wurden mehr als 95% des Antikörpers immobilisiert, wenn die
Antikörper-Lösungen,
enthaltend bis zu 40 μg
Antikörper,
jedem Well zugefügt
wurden. Die aufgezeichnete maximale Proteinbindung (unter Verwendung
von Lösungen, die
bis zu 80 μg
Antikörper
enthielten) betrug 44 μg, was
sich in enger Übereinstimmung
mit den Daten des Herstellers befand.
-
Es
wurde gefolgert, dass die Fähigkeit,
die aus immobilisierten Antikörpern
eluierten Proteine zu identifizieren, von der Wirksamkeit kritisch
abhängig wäre, mit
den verbleibenden Proteinbindungsstellen auf dem Festphasenträger zur
Verhinderung von sich anschließender
nicht spezifischer Proteinbindung blockiert werden könnten. Folglich
schien es wahrscheinlich zu sein, dass nicht spezifische Proteine, die
mit dem Antikörper
gebundenes Protein eluieren, die Fähigkeit zum Erhalt eines zum
Matching eines geeigneten Peptid-Massenfingerprints signifikant
reduzieren würden.
Aus diesem Grund wurde eine Anzahl verschiedener Blockierungsreagenzien
und -bedingungen untersucht. Es wurde bedauerlicherweise gefunden,
dass viele dieser Reagenzien (Detergenzien, wie zum Beispiel Tween
und Triton, Proteinblöcke usw.)
das Peptid-Massenfingerprinting mittels der MALDI-Massenspektrometrie
beeinträchtigen.
Folglich untersuchte der Anmelder eine Reihe von Blockierungsreagenzien,
einschließlich
Polyvinylpyrrolidonen und Oligosacchariden, die in der Regel in
Immunassays nicht verwendet werden. Es wurde gefunden, dass die
Qualität
der Daten vom Peptid-Massenfingerprinting, die aus den aus Antikörpern eluierten
Proteinen erhalten wurden, durch Verwendung dieser genannten Blockierungsreagenzien,
insbesondere Ficoll, signifikant verbessert wurden. Dies stellt
einen wichtigen erfinderischen Schritt dar. Sobald die Antikörper folglich
immobilisiert wurden, wurden die verbleibenden Proteinbindungsstellen
durch Inkubation 2 h bei Raumtemperatur mit 0,5% Ficoll in PBS blockiert.
Die Wells wurden dann gründlich
mit PBS (6 × 0,35
ml) gewaschen, mit Elutionsreagens (0,5% Ameisensäure) inkubiert
und wieder mit PBS (6 × 0,35
ml) gewaschen. Es wurde auch gefunden, dass ein weiteres Verfahren
wirksam war, das die Kombination des vorstehend beschriebenen Ficoll-Blocks
mit Trockenblockierung, wie für
den Hersteller zur Behandlung von ImmobilonTM-P-Membranen
empfohlen, beinhaltete, wenn es in Standard-Western-Blotting-Applikationen
verwendet wurde. In diesem Ansatz wurden die Wells durch sorgfältiges Entfernen
der gesamten übrigen
Lösung
getrocknet und in einer exsikkierten Umgebung 2 h bei 37°C inkubiert.
Die Wells wurden dann mit 0,5% Ficoll in PBS 2 h bei Raumtemperatur
behandelt, gewaschen, mit Elutionsreagens behandelt und wie vorstehend
beschrieben wieder gewaschen.
-
Nachdem
der Antikörper
immobilisiert und die restlichen Proteinbindungsstellen auf dem
Festphasenträger
blockiert wurden, wird der Antikörper einem
Proteingemisch ausgesetzt und spezifisch gebundenes Protein/gebundene
Proteine eluiert. Die Elutionsreagenzien und -bedingungen müssen offensichtlich
mit dem sich anschließenden
Proteincharakterisierungsverfahren kompatibel sein, bei dem es sich
in diesem Fall um das Peptid-Massenfingerprinting mittels der MALDI-Massenspektrometrie
handelte. Eine große
Anzahl an Elutionsbedingungen wurden untersucht, wobei sich die
Aufmerksamkeit auf die konzentrierte, die die sich anschließenden Manipulationsschritte
minimieren würden
und mit der MALDI-Massenspektrometrie kompatibel sind. Der Anmelder
entdeckte, dass Ameisensäure
bei der Elution von Protein aus einer weiten Reihe von Antikörpern besonders
wirksam und ausreichend flüchtig war,
dass sie vor der MALDI-Massenspektrometrie ohne weiteres aus den
eluierten Proteinproben entfernt werden konnte. In diesem Beispiel
wurde der immobilisierte Antikörper
folglich mit einem Proteingemisch (0,5–1,0 mg; Sojamilchproteine),
enthaltend das Proteinantigen (BSA, 0,015–1,0 mg), 2 h bei Raumtemperatur
inkubiert. Die Wells wurden mit PBS (6 × 0,35 ml) gewaschen und gebundenes
Protein durch Inkubation mit 20–100 μl 0,5%iger
Ameisensäure
10 min bei Raumtemperatur eluiert. Das Elutionsreagens wurde dann
durch Verdampfung der Proben auf Trockene unter Vakuum in einem
Rotationsverdampfer entfernt.
-
Eluierte
Proteine wurden dem Peptid-Massenfingerprinting mittels Standardprotokollen
unterzogen (siehe Courchesne, P. L. und Patterson, S. D. (1999)
2-D Proteome Analysis Protocols [Hrsg. Link], Methods in Molecular
Biology 112, 487–511.
Humana Press). Die Proteinproben wurden folglich dem enzymatischen
Aufschluss (37°C,
18 Stunden) in 25 mM Ammoniumbicarbonat, pH 7,8, enthaltend 50 ng Trypsin,
unterzogen. Die Protein-dotierten Kristalle wurden unter Verwendung
von α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (HCCA)
als Matrix hergestellt. Eine gesättigte
HCCA-Matrixlösung
(10 mg/ml) wurde in 70% MeCN/0,1% TFA hergestellt und jedwede nicht
aufgelöste
Matrix durch Zentrifugation entfernt. Ein Aliquot (0,3–0,5 μl) der Probe
wurde mit einem gleichen Volumen Matrixlösung auf dem Target gemischt
und luftrocknen lassen. In einigen Fällen erwies es sich als wirksam,
Verunreinigungen durch Waschen der Kristalle durch das Zufügen von
5 μl eiskalter 0,1%iger
TFA zu reinigen, die nach wenigen Sekunden aspiriert wurden. Die
Waschschritte wurden bis zu 3-mal wiederholt. Die Proben wurden
der MALDI-Massenspektrometrie an einem Lasermat 2000 (Thermo Bioanalysis)
oder TOFSPEC 2E (Micromass) unterzogen, und ein repräsentatives
Massenspektrum wird in 4A und 4B gezeigt.
-
Die
prädominierenden
Peptidmassen vom in 4A und 4B gezeigten
Spektrum wurden 'blind' ausgewählt (nach
Subtraktion von Peaks, von denen gezeigt wurde, dass sie von der
restlichen nicht spezifischen Proteinbindung durch Verwendung einer
geeigneten Kontrolle herrührten – d. h.
aus Wells zurückgewonnene
Proteine, in denen kein Antikörper
immobilisiert wurde) und zum Durchsuchen von Proteinsequenz-Datenbanken verwendet
wurden. Die auf diese Weise erhaltenen Peptidmassen führten zur
Identifikation von 3 zusammenpassenden Proteinen, wobei das BSA
als das erste Protein in der Rangordnung und weit über den
anderen beiden rangierten Proteinen identifiziert wurde.
-
Beispiel 5
-
Inverses Screening
eines monoklonalen Antikörpers gegen
ein Target-Protein – bovines
Serumalbumin
-
Das
inverse Screening-Verfahren wurde zum Screening eines gewerblich
erhältlichen
monoklonalen Antikörpers
gegen bovines Serumalbumin (BSA) gegen ein Gemisch aus Proteinen
(enthaltend BSA) verwendet. Monoklonaler anti-BSA-Antikörper (5–80 μg; Chemicon)
in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurde in den Wells
von 96-Well-Filtrationsplatten,
die eine hydrophobe PVDF-Membran mit hoher Proteinbindung (Millipore
MuitiScreen® ImmobilonTM-P-Filtrationsplatten) inkorporierten,
durch Inkubation der vorbenetzten Membranen mit der Antikörper-enthaltenden
Lösung
2 h bei Raumtemperatur immobilisiert. Die Membranen wurden gemäß den Anleitungen
des Herstellers vorbenetzt; folglich wurden jedem Well 50 μl 50%iges
Ethanol zugefügt
und die Membranen 1 min bei Raumtemperatur inkubiert und nach Vakuum-Aspiration
der Wells wurde jedes Well zweimal mit 200 μl PBS gewaschen. Nach der Antikörperbindung
wurden die Wells gründlich
mit PBS (6 × 0,35
ml) gewaschen. Es ist deutlich, dass unterschiedliche Bedingungen
zur Immobilisation von Antikörpern
verwendet werden können
und viele wurden ausführlicher
untersucht. Diese anderen Verfahren schließen die Verwendung unterschiedlicher Puffer,
unterschiedlicher Inkubationszeiten und Temperaturen, unterschiedlicher
Verfahren zur Entfernung der verbleibenden Antikörper-Lösungen (Vakuum-Aspiration durch
die Membran oder direkte Entfernung) ein, die alle dem Fachmann
bekannt sind. Das hier beschriebene Verfahren erwies sich für den in
diesem Beispiel verwendeten Antikörper als optimal. Andere beschriebene
Verfahren waren gegebenenfalls für
die anderen angegebenen Beispiele optimal.
-
Das
Ausmaß,
in dem die Antikörperbindung wirksam
war, wurde mittels mehrerer Verfahren untersucht. Sie wurden am
routinemäßigsten
durch Bestimmung der Proteinkonzentration (Bradford-Assay) der Antikörper-Lösung untersucht,
nachdem sie mit den Wells inkubiert wurde. Unter den beschriebenen Bedingungen
wurden mehr als 95% des Antikörpers immobilisiert,
wenn jedem Well Antikörper-Lösungen,
enthaltend bis zu 40 μg
Antikörper,
zugefügt wurden.
-
Sobald
die Antikörper
immobilisiert wurden, wurden die verbleibenden Proteinbindungsstellen durch
Inkubation mit 0,5% Ficoll in PBS 2 h bei Raumtemperatur blockiert.
Die Wells wurden dann mit PBS (6 × 0,35 ml) gründlich gewaschen,
mit Elutionsreagens (0,5% Ameisensäure) inkubiert und wieder mit
PBS (6 × 0,35
ml) gewaschen. Es können wiederum
eine Anzahl unterschiedlicher Blockierungsbedingungen verwendet
werden und wurden untersucht, und diese sind dem Fachmann offensichtlich.
Ein Verfahren, das als wirksam befunden wurde, beinhaltete die Kombination
des wie vorstehend beschriebenen Blocks mit Ficoll mit trockner Blockierung
wie für
den Hersteller zur Behandlung von ImmobilonTM-P-Membranen
empfohlen, wenn sie in Standard-Western-Blotting-Applikationen verwendet
werden. In diesem Ansatz wurden die Wells durch sorgfältige Entfernung
der gesamten verbleibenden Lösung
getrocknet und in einer exsikkierten Umgebung 2 h bei 37°C inkubiert.
Die Wells wurden dann mit 0,5% Ficoll in PBS 2 h bei Raumtemperatur behandelt,
gewaschen, mit Elutionsreagens behandelt und wieder wie vorstehend beschrieben
gewaschen.
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Der
immobilisierte Antikörper
wurde dann mit einem Proteingemisch (0,5–1,0 mg; Sojamilchproteine),
enthaltend das Proteinantigen (BSA, 0,015–1,0 mg) 2 h bei Raumtemperatur
inkubiert. Die Wells wurden mit PBS (6 × 0,35 ml) gewaschen und gebundenes
Protein durch Inkubation mit 20–100 μl Elutionsreagens
(0,5% Ameisensäure)
10 Minuten bei Raumtemperatur eluiert. Das Elutionsreagens wurde dann
entfernt und unter Vakuum in einem Rotationsverdampfer auf Trockene
verdampft. Die eluierten Proteine wurden mittels Standard-Protokollen
dem Peptid-Massenfingerprinting unterzogen (siehe Courchesne, P.
L. und Patterson, S. D. (1999) 2-D Proteome Analysis Protocols [Hrsg.
Link], Methods in Molecular Biology 112, 487–511. Humana Press]. Die Proteinproben
wurden folglich dem enzymatischen Aufschluss (37°C, 18 Stunden) in 25 mM Ammoniumbicarbonat,
pH 7,8, enthaltend 50 ng Trypsin, unterzogen. Proteindotierte Kristalle
wurden unter Verwendung von α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (HCCA) als
eine Matrix hergestellt. Eine gesättigte HCCA-Matrix-Lösung (10
mg/ml) wurde in 70% MeCN 0,1%iger TFA hergestellt und jedwede unaufgelöste Matrix
durch Zentrifugation entfernt. Ein Aliquot einer (0,3–0,5 μl) Probe
wurde mit einem gleichen Volumen Matrix-Lösung auf dem Target gemischt
und lufttrocknen lassen. In einigen Fällen erwies sich die Entfernung
von Verunreinigungen durch Waschen der Kristalle durch das Zufügen von
5 μl eiskalter
0,1%iger TFA, die nach wenigen Sekunden aspiriert wurde, als wirksam.
Die Waschschritte wurden bis zu 3-mal wiederholt. Die Proben wurden
der MALDI-Massenspektrometrie an einem Lasermat 2000 (Thermo Bioanalysis)
oder TOFSPEC 2E (Micromass) unterzogen und ein repräsentatives
Massenspektrum wird in 5A und 5B gezeigt.
-
Die
prädominierenden
Peptidmassen von dem in 5A und 5B gezeigten
Spektrum wurden (nach der Subtraktion von Peaks, von denen gezeigt
wurde, dass sie von restlicher nicht spezifischer Proteinbindung
herrühren,
unter Verwendung einer geeigneten Kontrolle – Proteine, die aus den Wells,
in denen kein Antikörper
immobilisiert wurde, wiedergewonnen wurden) 'blind' ausgewählt und zur Durchsuchung der
Proteinsequenz-Datenbanken unter Verwendung von öffentlich zur Verfügung stehender Software
(siehe zum Beispiel http/www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch)
verwendet. BSA wurde wiederum als das erste Protein in der Rangfolge
identifiziert.
-
Beispiel 6
-
Generierung
und inverses Screening eines monoklonalen Antikörpers gegen ein Target-Protein – bovines Serumalbumin
-
Zur
Generierung monoklonaler Antikörpern gegen
bovines Serumalbumin (BSA) wurden Mäuse mit dem Protein mittels
Standardverfahren immunisiert (siehe Antibodies, a Laboratory Manual,
E. Harlow und D. Lane (Hrsg.)). Vor der Immunisation wurde folglich
von jeder Maus Vorblut entnommen, die dann subkutan an 2 Stellen
mit einem Gemisch aus Protein und Freund's inkompletten Adjuvans (1:1; insgesamt
100 μl)
injiziert wurde. 21 Tage später
wurde Schwanzblut entnommen und jede Maus subkutan an 2 Stellen
mit weiteren 100 μl
eines Gemisch aus Protein und PBS (1:1) injiziert. Weitere 21 Tage später wurde
wieder Schwanzblut entnommen und jede Maus subkutan an 2 Stellen
mit weiteren 100 μl eines
Gemischs aus Protein und PBS (1:1) injiziert. Nach weiteren 3 Tagen
wurden einige Mäuse
splenektomiert, und es wurde terminales Blut gewonnen. Die Splenozyten
wurden aus der Milz von geeigneten Mäusen extrahiert, mit der Myelomzelllinie Sp2/0-Ag14
fusioniert und unter Selektionsdruck kultiviert, bis die Kulturüberstände zum
Screening bereit waren. Vor dem Screening durch das inverse Screening-Verfahren
wurden Hybridome mittels eines üblichen
Antikörper-Capture-ELISA (siehe Antibodies,
a Laboratory Manual, E. Harlow und D. Lane (Hrsg.)) gescreent. BSA
wurde folglich mittels Inkubation mit 0,5–10 μg Protein/Well mittels Standardverfahren
an die Wells von 96-Well-Platten gebunden. Die Wells wurden mittels
Inkubation mit 20% Sojamilch in PBS 2 Stunden bei Raumtemperatur
blockiert und dann mit PBS gewaschen, bevor in jedes Well 100 μl Hybridomkultur-Überstand
2 Stunden bei Raumtemperatur appliziert wurde. Die Wells wurden
mit PBS gewaschen, bevor ein Anti-Maus-Ig-HRP-Konjugat (Boehringer
Mannheim) zum Hybridom-Screening
verdünnt
in 20% Sojamilch 2 Stunden bei Raumtemperatur appliziert wurde.
Die Wells wurden, bevor positive Wells durch die Applikation von
ABTS sichtbar gemacht wurden, wieder mit PBS gewaschen. Es ist wichtig,
zu betonen, dass dieser Vorscreening-Schritt aus Zweckmäßigkeit
der Identifikation positiver Hybridome unternommen wurde und um
somit unnötiges inverses
Screening negativer Hybridome zu vermeiden. Mit ausreichender Zeit
und Bemühung
oder in einer Umgebung mit High-Throughput
ist jedoch ein Vorscreening-Verfahren vollkommen unnötig.
-
Wells,
die aktiv wachsende Hybridome enthielten, wurden durch limitierende
Verdünnung
kloniert und in ein serumfreies Medium transferiert. Nach einer
angemessenen Inkubationsperiode wurden Aliquots des Kulturüberstands,
enthaltend Antikörper
dem inversen Screening gegen ein Gemisch aus Proteinen (Sojamilchproteine,
enthaltend BSA), wie in den vorherigen Beispielen detailliert, unterzogen.
Auf diese Weise wurde das Peptid-Massenfingerprinting zur Identifikation
der Hybridom-Klone verwendet, die monoklonale Antikörper gegen
BSA produzieren. In einigen Fällen
wurde die Wirksamkeit der Antikörper-Immobilisation
und die sich anschließende
Rückgewinnung
von BSA aus dem Proteingemisch zur Analyse durch Präzipitation
des Antikörpers
aus dem Überstand
der Gewebekultur (unter Verwendung von TCA und Standardverfahren)
vor der Immobilisation verbessert. Es ist auch bemerkenswert, dass
die gewerblich verfügbaren
serumfreien Medien zur Aufrechterhaltung und Propagation von Hybridomen
mit der direkten Rückgewinnung und
Immobilisation von Antikörpern
aus den Überständen der
Gewebekultur nicht kompatibel waren. Dies scheint am wahrscheinlichsten
aus der Anwesenheit von Tensiden in solchen Mediumvorbereitungen
zu entstehen, die die Antikörperbindung
an ImmobilonTM-P abschwächen. Es sind erfindungsgemäß Vorkehrungen
zur Manipulation der Antikörper vor
der Immobilisation eingeschlossen.
-
Beispiel 7
-
Generierung und inverses
Screening von monoklonalen Antikörpern
gegen Proteine von Hefe (S. cerevisiae)
-
Zur
Generierung monoklonaler Antikörper gegen
Proteine von S. cervisiae wurden Mäuse mit dem Protein mittels
Standardverfahren immunisiert (siehe Antibodies, a Laboratory Manual,
E. Harlow und D. Lane (Hrsg.)). Vor der Immunisation wurde folglich
Vorblut von jeder Maus entnommen, die dann an 2 Stellen subkutan
mit einem Gemisch aus Protein und Freund's komplettem Adjuvans (1:1; insgesamt 100 μl) injiziert
wurden. 21 Tage später
wurde Schwanzblut entnommen und jede Maus an 2 Stellen mit weiteren
100 μl eines
Gemischs aus Protein und PBS (1:1) subkutan injiziert. Weitere 21
Tage später wurde
wieder Schwanzblut entnommen und jede Maus an 2 Stellen mit weiteren
100 μl eines
Gemischs aus Protein und PBS (1:1) subkutan injiziert. Zur Etablierung,
ob jedes Tier Antikörper
gegen eine Anzahl verschiedener Proteine produzierte, wurde das
Serum von den verschiedenen Blutentnahmen zur Durchführung eines
Western-Blot an Hefeproteinen verwendet, die durch 1-DE-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
getrennt und mittels Standardverfahren an Nitrocellulose transferiert
wurden (siehe Antibodies, a Laboratory Manual, E. Harlow und D.
Lane (Hrsg.)). Die Blots wurden mittels Inkubation mit 20% Sojamilch
in PBS über
Nacht bei 4°C blockiert
und dann mit Seren von Blut vom Tag 0, 21 und 42, verdünnt 1:200–1:500 in
20% Sojamilch inkubiert. Die Antikörperbindung an Hefe wurde durch
Inkubation mit Anti-Maus-Ig, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase
(Sigma), nachgewiesen und die Immunblots durch Enhanced Chemilumineszenz
(ECL, Amersham) entwickelt. Die individuellen Tiere zeigten verschiedene
Muster der Antikörper-Reaktivität und produzierten
Antikörper
gegen eine signifikante Anzahl an Proteinen (zu beachten ist, dass
das 1-DE-Western-Blotting notgedrungen das potenzielle Antikörper-Repertoire
der Tiere unterschätzt).
Nach weiteren 3 Tagen wurden einige Mäuse splenektomiert und es wurde
terminales Blut gewonnen. Die Splenozyten wurden aus der Milz extrahiert
und mit der Myelomzelllinie Sp2/0-Ag14 fusioniert und unter Selektionsdruck
kultiviert, bis die Kulturüberstände zum
Screening bereit waren. Vor dem Screening durch das inverse Screening-Verfahren
wurden die Hybridome mittels eines üblichen Antikörper-Capture-ELISA
gescreent (siehe Antibodies, a Laboratory Manual, E. Harlow und
D. Lane (Hrsg.)). Hefeproteine wurden folglich durch Inkubation
mit 0,5–10 μg Proben/Well
mittels Standardverfahren an die Wells von 96-Well-Platten gebunden.
Die Wells wurden durch Inkubation mit 20% Sojamilch in PBS 2 Stunden
bei Raumtemperatur blockiert und dann mit PBS gewaschen, bevor 100 μl des Überstandes
der Hybridomkultur 2 Stunden lang bei Raumtemperatur an jedes Well
appliziert wurde. Die Wells wurden mit PBS gewaschen, bevor ein
Anti-Maus-Ig-HRP-Konjugat (Boehringer-Mannheim) zum Hybridom-Screening,
verdünnt
in 20% Sojamilch 2 Stunden bei Raumtemperatur appliziert wurde.
Wells, die aktiv wachsende Hybridome enthielten, wurden durch limitierende
Verdünnung
kloniert und an ein serumfreies Medium transferiert. Nach einer
angemessenen Inkubationszeit wurden Aliquote des Kulturüberstandes,
enthaltend Antikörper,
wie in den vorherigen Beispielen detailliert wurde, dem inversen
Screening gegen ein Gemisch aus Proteinen (Hefeproteinen) unterzogen.
Auf diese Weise wurde und wird Peptid-Massenfingerprinting zur Identifikation
der Hybridom-Klone verwendet, die monoklonale Antikörper gegen
Hefeproteine produzieren. Es ist bemerkenswert, dass in diesem Beispiel
keine vorherige experimentelle Bestimmung des Peptid-Massenfingerprints von
individuellen Hefeproteinen notwendig ist, da die komplette Genomsequenz
von S. cerevisiae bekannt ist und folglich die vom inversen Screening-Verfahren erhaltenen
Peptid-Massenfingerprints
direkt mit dem theoretischen Peptid-Massenfingerprints für alle Proteine
von S. cerevisiae verglichen werden können.
-
Es
ist wichtig zu betonen, dass beide Vorscreening-Schritte (Western-Blotting
und anschließend
ELISA) aus Zweckmäßigkeit
zur Bestätigung des
potenziellen Wertes von jedem Tier zur Herstellung multipler Antikörper bzw.
zur Identifikation positiver Hybridome und folglich zur Vermeidung
von unnötigem
inversem Screening negativer Hybridome unternommen wurden. Mit ausreichender
Zeit und Bemühungen
oder in einer High-Throughput-Umgebung wären solche Vorscreening-Verfahren
jedoch vollkommen unnötig.