DE60317904T2

DE60317904T2 - Ein verfahren zum identifizierung von arzneimittelzielen

Info

Publication number: DE60317904T2
Application number: DE60317904T
Authority: DE
Inventors: Joel Vandekerckhove; Kris Gevaert
Original assignee: Universiteit Gent; Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Current assignee: Universiteit Gent; Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Priority date: 2002-09-12
Filing date: 2003-09-11
Publication date: 2008-11-06
Anticipated expiration: 2023-09-12
Also published as: CA2498352C; US20060160131A1; AU2003297312B2; ES2298612T3; JP4395439B2; JP2005538369A; EP1537421A2; EP1537421B1; WO2004025243A2; AU2003297312A1; DE60317904D1; ATE380344T1; DK1537421T3; WO2004025243A3; CA2498352A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Arzneimittelentwicklung. Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Arzneimittelzielen (Targets) bereit. Das Verfahren kann auch zur Analyse von Proteomen verwendet werden. Das Verfahren nutzt im Wesentlichen eine Kombination von zwei chromatographischen Trennungen derselben Art, die mittels eines Schritts getrennt werden, in dem die Population der arzneimittelgebundenen Ziele spezifisch an dem Arzneimittel derart modifiziert wird, dass das chromatographische Verhalten der modifizierten arzneimittelgebundenen Ziele in der zweiten chromatographischen Trennung sich von dem chromatographischen Verhalten von dessen unmodifizierter Version unterscheidet. Das unterschiedliche chromatographische Verhalten der modifizierten arzneimittelgebundenen Ziele wird zur Isolation und anschließenden Identifizierung der Ziele verwendet.
Allgemeiner Stand der Technik
In der jetzigen Post-Genom-Ära werden gegenwärtig viele Strategien zur Analyse von Proteinen entwickelt. Die meisten herkömmlichen Ansätze konzentrieren sich auf das Aufzeichnen von Variationen der Proteinkonzentration. Diese Ansätze werden gewöhnlich als „Proteomik" bezeichnet. Im Allgemeinen strebt die Proteomik danach, die Abundanz breiter Profile von Proteinen aus komplexen biologischen Gemischen zu messen. In den herkömmlichsten Ausführungsformen schließt die Proteomik das Trennen der Proteine in einer Probe mittels zweidimensionaler SDS-PAGE ein. Dann können die individuellen Proteinfleckenmuster dieser Gele verglichen werden, um Hinweise in Bezug auf die relative Abundanz eines bestimmten Proteins in zwei Vergleichsproben zu erhalten. Der Ansatz kann sogar erweitert werden, um die molekulare Identität der individuellen Proteinflecken zu ermitteln, indem die Flecken exzisiert und einem Peptid-Massen-Fingerprinting unterzogen werden. In letzter Zeit wurden Verfahren zum Eliminieren der Elektrophoreseschritte und Durchführen der Proteomik durch direktes Analysieren des komplexen Gemischs mittels Massenspektrometrie beschrieben. Zum Beispiel stellen derzeit in der Technik beschriebene Verfahren chemisch reaktive Verbindungen bereit, die mit einem Proteingemisch umgesetzt werden können, um viele Proteine in diesem Gemisch auf unspezifische oder nicht gerichtete Weise zu markieren, die nur eine quantitative Analyse von Proteinen bereitstellt (Link et al. (1999), Nat. Biotechnol. 17, 676–682, Gygi et al. (1999), Nat. Biotechnol. 17, 994–999). Solche Verfahren lehren, dass es viele chemisch reaktive Aminosäurereste in einem Protein gibt, das an chemische Sonden konjugiert werden kann, wodurch die resultierenden Proteinkomplexe anschließend quantifiziert werden können, um eine Anzeige der Proteinabundanz zu erzielen. In WO 01/77668 wird die Verwendung von aktivitätsbasierten Sonden (activity-based grobes, ABP) zum Screenen auf Zielproteine dieser ABP beschrieben. In dieser Technologie werden die ABP mit einem Affinitätsliganden gekoppelt, der zum Nachweisen der Komplexe aus Arzneimittel und Ziel dient. Es besteht jedoch dringend Bedarf an der Entwicklung von Verfahren, die eine Analyse eines komplexen Gemischs von Proteinen oder sogar eines ganzen Proteoms in mehr Einzelheiten ermöglichen. Es ist gut bekannt, dass die Kontrolle (Aktivierung oder Inhibition) von Proteinaktivitäten in einer Zelle aufgrund von Änderungen der Proteinstruktur anderen Komponenten in der Zelle zur Verfügung steht. Konformationsänderungen und Bewegungen in den Gelenkregionen von Proteinen legen spezifische Teile dieser Proteine frei und ermöglichen ihnen, einen Kontakt zu Verbindungen wie Enzymsubstraten, Adaptorproteinen und anderen Komponenten, wie Arzneimitteln, herzustellen. Des Weiteren ist die Aktivität von Arzneimitteln auf die spezifische Interaktion mit Proteinen, die ihre biologische Aktivität beeinflussen, zurückzuführen. In mehreren Fällen sind die Proteinziele existierender Arzneimittel bekannt: z. B. reagiert Aspirin mit den Cyclooxygenasen, Penicillin ist ein Pseudosubstrat der Peptidoglycan-Aminotransferase von gram-positiven Bakterien usw. In einigen Sonderfällen wurden Arzneimittel auf Basis der 3D-Struktur des Zielproteins entworfen und verbessert. In den meisten Fällen wurden jedoch bisher Komponenten mit biologischen Aktivitäten nicht ihren Zielproteinen zugeordnet und somit sind die Ziele (Targets) der meisten Arzneimittel unbekannt. Die verlässliche Identifizierung der Ziele existierender Arzneimittel oder sich in der Entwicklung befindlicher Arzneimittel wäre für die Beurteilung der Spezifität und Vorhersage von Nebenwirkungen der Arzneimittel äußerst wertvoll. Des Weiteren ist bekannt, dass die Reaktion auf Arzneimittel zwischen Einzelpersonen beträchtliche Unterschiede aufweisen kann. Die Zielsetzung der modernen Arzneimittelentwicklung besteht darin, maßgeschneiderte Arzneimittel herzustellen, die für individuelle Patientenkategorien wirksam sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Lösung der oben angeführten Probleme und offenbart ein Verfahren zum Bestimmen der Interaktionspartner von Arzneimitteln und auch der Interaktionstelle in der primären Struktur des Zielproteins. Das Verfahren kann zum Beurteilen einer Korrelation zwischen der Krankheitsreaktion auf ein bestimmtes Arzneimittel mit den Zielen des Arzneimittels, die in individuellen Patienten oder Patientengruppen identifiziert wurden, verwendet werden. Unser Verfahren ist von der Verwendung nachweisbarer oder Affinitätsmarker, die mit den Arzneimitteln gekoppelt sind, unabhängig, wie in WO 01/77668 beschrieben. Darüber hinaus bietet das Verfahren den Vorteil, dass die Arzneimittelziele in einem Chromatographieschritt effektiv isoliert werden können. Darüber hinaus kann die Stelle in der primären Struktur oder das Proteinziel, an das das Arzneimittel bindet, mit der aktuellen Erfindung effektiv bestimmt werden.
Die US-Patentschrift 6,027,890 beschreibt ein Verfahren zum Nachweisen der Bindung eines markierten ersten Elements an ein zweites Element eines Ligandenpaars, das die Schritte des Kombinierens eines ersten Satzes von ersten markierten Elementen mit einer biologischen Probe, des Trennens gebundener erster und zweiter Elemente von ungebundenen Elementen und des Spaltens des Markers von dem markierten ersten Element umfasst.
Kurzbeschreibung der Figuren
1A): Aktin wurde mit einem Zielpeptid „VP" inkubiert und mit Transglutaminase vernetzt. Die vernetzten Komponenten wurden mit Endo-Lys-C verdaut. Das UV-Absorptionsprofil von Endo-Lys-C-Peptiden, die auf einer C-18-Umkehrphasensäule (Durchlauf 1) getrennt wurden, ist in 1A gezeigt. Lösemittel A ist 0,1%-ige TFA, Lösemittel B ist 70%-iges Acetonitril in 0,1%-igem TFA/Wasser. Der Gradient von Lösemittel B ist angezeigt. Eluierende Peptide werden in Zeitintervallen von 5 min gesammelt und getrocknet. B) Fraktion 6, die das vernetzte Peptid enthielt, wurde erneut unter denselben Chromatographiebedingungen wie in Durchlauf 1 nach spezifischer Spaltung mit Faktor Xa durchlaufen gelassen. Das verschobene Peptid, das die Vernetzung trägt, ist in 1B vor der Masse unmodifizierter Peptide (in schwarz) sichtbar.
2: Das vernetzte Peptid, das sich vor die Fraktion 6 schob (1B), wurde mittels Elektrospray-Ionisationsmassenspektrometrie analysiert. Die unterschiedlich geladenen Peptidionen sind gezeigt und ermöglichen die Bestimmung der Masse dieses vernetzten Dipeptids. Die Analyse wurde auf einem Micromass-Q-TOF-Gerät durchgeführt.
3A): Ein Gesamtlysat von Jurkat-Zellen wurde mit Endo-Lys-C verdaut. Dieses Peptidgemisch wurde mit einem ähnlichen Verdau des Aktin-VP-Konjugats gemischt. Das Peptidgemisch wurde wie in 1A mittels Umkehrphasenchromatographie getrennt. Der erste Teil des Chromatogramms wurde bei AUFS 0,1, der zweite Teil bei AUFS 0,2 aufgezeichnet. Das Eluat wurde in Fraktionen von 2 min gesammelt. Diese Fraktionen wurden getrocknet und wie in Tabelle 1 rekombiniert, bevor sie mit Faktor Xa behandelt wurden.
3B) zeigt die UP-Spuren der Peptide in Pool D (siehe Tabelle 1). Die Profile der primären Fraktionen 9, 14 und 19 sind gezeigt. 9* ist ein Peak, der vor der Masse der Peptide eluiert. 9** ist das Peptid Ac-F-I-E-G-R, das vom VP-Überschuss abgeleitet und mit Faktor XA gespalten wurde. Man beachte einen Peak (dunkel), der vor Fraktion 14 eluiert. Alle Chromatographiebedingungen waren wie im Versuch von 1.
Ziele und ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein alternatives Verfahren zur Isolation und Identifizierung von Arzneimittelzielen (Targets) bereit. Das Verfahren ermöglicht außerdem die Quantifizierung von Expressionsniveaus und/oder Aktivitäten von Klassen von Proteinen oder/und Enzymen oder individuellen Proteinen oder/und Enzymen in einem allgemeinen Zelllysat-Hintergrund. Das Verfahren nutzt im Wesentlichen eine Kombination von zwei chromatographischen Trennungen derselben Art, die mittels eines Schritts getrennt werden, in dem die Population der arzneimittelgebundenen Ziele spezifisch an dem Arzneimittel derart modifiziert wird, dass das chromatographische Verhalten der modifizierten arzneimittelgebundenen Ziele in der zweiten chromatographischen Trennung sich von dem chromatographischen Verhalten von dessen unmodifizierter Version unterscheidet. Das unterschiedliche chromatographische Verhalten der modifizierten arzneimittelgebundenen Ziele wird zur Isolation und anschließenden Identifizierung der Ziele verwendet.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Isolieren mindestens eines Zielmoleküls einer Verbindung bereit, wobei diese Verbindung eine funktionelle Gruppe umfasst, die chemisch oder enzymatisch oder chemisch und enzymatisch modifiziert sein kann, so dass ein Komplex aus modifizierter Verbindung und Zielmolekül in derselben chromatographischen Trennung anders als seine unmodifizierte Version migriert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Zugeben der Verbindung zu einem komplexen Gemisch von Molekülen, wobei die Verbindung mit mindestens einem der Moleküle stabil interagiert, wodurch ein Komplex aus Verbindung und Zielmolekül gebildet wird,
(b) Trennen des resultierenden komplexen Gemischs von Molekülen und Komplexen aus Verbindung und Zielmolekül in mehrere Fraktionen in einem ersten Chromatographieschritt, wobei in einer Fraktion, die von diesem Chromatographieschritt abgeleitet wird, sowohl Moleküle als auch Komplexe aus Verbindung und Zielmolekül gefunden werden,
(c) chemisches oder enzymatisches oder chemisches und enzymatisches Modifizieren der Verbindung, die in mindestens einem Komplex aus Verbindung und Zielmolekül in jeder Fraktion vorliegt, und
(d) Isolieren mindestens eines Zielmoleküls, das mit der Verbindung interagiert, in einem zweiten Chromatographieschritt, wobei die Chromatographie der Schritte (b) und (d) mit derselben oder einer im Wesentlichen ähnlichen Chromatographieart durchgeführt wird.

In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Isolieren mindestens eines Zielproteins einer Verbindung bereit, die eine funktionelle Gruppe umfasst, die spezifisch modifiziert sein kann. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Zugeben der Verbindung zu einem komplexen Gemisch von Proteinen, wobei die Verbindung mit mindestens einem Zielprotein stabil interagiert, wodurch ein Komplex aus Verbindung und Protein gebildet wird, (b) Trennen des resultierenden komplexen Gemischs von Proteinen und Komplexen aus Verbindung und Protein in Fraktionen mittels Chromatographie, (c) chemisches oder enzymatisches oder chemisches und enzymatisches Modifizieren der Verbindung, die in mindestens einem Komplex aus Verbindung und Protein in jeder Fraktion vorliegt, und (d) Isolieren mindestens eines Zielproteins, das mit dem Molekül interagiert, mittels Chromatographie, wobei die Chromatographie der Schritte (b) und (d) mit derselben Chromatographieart durchgeführt wird.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Isolieren mindestens eines Zielpeptids einer Verbindung bereit, die eine funktionelle Gruppe umfasst, die spezifisch modifiziert sein kann. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Zugeben der Verbindung zu einem komplexen Gemisch von Proteinen, wobei die Verbindung mit mindestens einem Zielprotein stabil interagiert, wodurch ein Komplex aus Verbindung und Protein gebildet wird, (b) Spalten des resultierenden komplexen Proteingemischs und Komplexen aus Verbindung und Protein in ein Protein/Peptid-Gemisch, (c) Trennen des Protein/Peptid-Gemischs in Fraktionen mittels Chromatographie, (d) chemisches oder enzymatisches oder chemisches und enzymatisches Modifizieren der Verbindung, die in mindestens einem Komplex aus Verbindung und Peptid in jeder Fraktion vorliegt, und (e) Isolieren mindestens eines Zielpeptids, das mit der Verbindung interagiert, mittels Chromatographie, wobei die Chromatographie der Schritte (c) und (e) mit derselben Chromatographieart durchgeführt wird.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Isolieren mindestens eines Ziels einer Verbindung bereit, die eine funktionelle Gruppe umfasst, die spezifisch modifiziert sein kann, wobei die Verbindung direkt einem Protein/Peptid-Gemisch zugegeben wird und wobei die Verbindung mit mindestens einem Zielpeptid stabil interagiert, wodurch ein Komplex aus Verbindung und Peptid gebildet wird.
In noch einer anderen Ausführungsform sind die Chromatographiebedingungen, die in den vorstehenden Verfahren angewendet werden, identisch oder im Wesentlichen ähnlich. Wie hierin verwendet, ist ein „Protein/Peptid-Gemisch" in der Regel ein komplexes Gemisch von Peptiden, das infolge der Spaltung einer Probe, die Proteine umfasst, erhalten wurde. Eine solche Probe ist in der Regel ein beliebiges komplexes Gemisch von Proteinen, wie, ohne Einschränkung, ein prokaryontisches oder eukaryontisches Zelllysat, oder ein beliebiges komplexes Gemisch von Proteinen, das aus einer Zelle oder einer spezifischen Organellenfraktion, einer Biopsie, mittels Lasererfassung zerteilten Zellen oder einem beliebigen großen Proteinkomplex, wie Ribosome, Viren und dergleichen, isoliert wurde. Es kann erwartet werden, dass, wenn solche Proteinproben in Peptide gespalten werden, sie leicht bis zu 1000, 5000, 10.000, 20.000, 30.000, 100.000 oder mehr unterschiedliche Peptide enthalten können. In einem besonderen Fall kann ein „Protein/Peptid-Gemisch" jedoch auch direkt von einer Körperflüssigkeit oder allgemeiner einer beliebigen Lösung biologischen Ursprungs stammen. Es ist gut bekannt, dass beispielsweise Urin neben Proteinen ein sehr komplexes Peptidgemisch enthält, das aus dem proteolytischen Abbau von Proteinen im Körper resultiert, von dem die Peptide über die Nieren eliminiert werden. Noch eine andere Veranschaulichung eines Protein/Peptid-Gemischs ist das Gemisch von Peptiden, das in Hirnflüssigkeit vorliegt.
Der Ausdruck „mindestens ein Ziel einer Verbindung" bedeutet, dass eine bestimmte Verbindung mit einem oder mehreren Zielmolekülen oder einer Klasse von Molekülen stabil interagiert. Die Bindung einer Verbindung an das Ziel ist spezifisch, was bedeutet, dass die Verbindung an mindestens ein Molekül in einem komplexen Gemisch von Molekülen und nicht an andere Moleküle bindet. Gewöhnlich ist eine Verbindung ein Arzneimittel, ein Arzneimittelanalogon oder ein Arzneimittelderivat. Vorzugsweise bewirkt die Bindung eine Inaktivierung oder eine Teilinaktivierung des Moleküls (z. B. inhibiert sie dessen Aktivität) und die Bindung erfolgt vorzugsweise an der aktiven Stelle des Moleküls (z. B. eines Proteins). Da die Bindung an der aktiven Stelle eines Proteins erfolgt, kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch zur Isolation einer spezifischen Klasse von aktiven Proteinen verwendet werden. Aktiv bedeutet, dass die aktive Stelle für die Verbindung zugänglich ist, wohingegen inaktive Proteine derselben Klasse nicht isoliert werden, da die aktive Stelle nicht für die Verbindung zugänglich ist.
Hier bezieht sich eine „aktive Stelle" eines Proteins auf den spezifischen Bereich an der Oberfläche eines Proteins (z. B. eines Enzyms oder Rezeptors), an den eine Verbindung (z. B. ein Substrat, ein Ligand, ein Arzneimittel oder ein Arzneimittelanalogon oder ein Arzneimittelderivat) binden kann, was in einer Änderung der Konfiguration des Proteins resultiert. In Bezug auf einen Rezeptor kann das Protein aufgrund der Konformationsänderung für eine Phosphorylierung oder Dephosphorylierung oder andere Verarbeitung empfänglich. Im Hinblick auf andere Proteine wird die aktive Stelle die Stelle bzw. die Stellen sein, an der bzw. denen das Substrat und/oder der Kofaktor oder das Arzneimittel oder Arzneimittelanalogon oder Arzneimittelderivat bindet oder an der bzw. denen das Substrat und der Kofaktor eine katalytische Reaktion erfahren oder an der bzw. denen zwei Proteine einen Komplex bilden (z. B. zwei Kringle-Strukturen verbinden sich, Stellen, an denen sich Transkriptionsfaktoren an andere Proteine binden, Stellen, an denen sich Proteine an spezifische Nukleinsäuresequenzen binden usw.).
Die „Verbindungen" der Erfindung sind chemische Reagenzien, bei denen es sich um polyfunktionelle Mittel zur nichtkompetitiven oder im Wesentlichen unumkehrbaren Bindung an ein Zielmolekül handelt. „Verbindungen" umfassen kleine Verbindungen (organisch oder anorganisch), existierende Arzneimittel, sich in der Entwicklung befindliche Arzneimittel, Arzneimittelanaloga oder Arzneimittelderivate. Eine einzelne Verbindung, einen Untersatz Verbindungen oder der vollständige Satz Verbindungen, die von einer Bibliothek von Verbindungen abgeleitet wurden, wie einer Bibliothek, die mittels Kombinationschemie erstellt wurde. So allgemein wie möglich ausgedrückt, besteht die Verbindung aus (1) einer chemischen Struktur, die die spezifische Interaktion zwischen der Verbindung und deren Zielmolekül bestimmt (der „S"-Teil), (2) einer chemisch reaktiven Gruppe, mittels derer die Verbindung und ihr Ziel eng vernetzt sein können (der „L"-Teil), und (3) einer funktionellen Gruppe, die auf spezifische und steuerbare Weise modifiziert werden kann (der „A"-Teil). Diese drei Eigenschaften („S” für Spezifität, „L" für Vernetzung und „A" für Modifizierung) können unterschiedlich über die Verbindungsstruktur verteilt sein.
Erfindungsgemäß ist ein Komplex aus Verbindung und Ziel zwischen den zwei chromatographischen Trennungen chemisch oder enzymatisch oder chemisch und enzymatisch modifiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Verbindung ein Arzneimittel, ein Arzneimittelanalogon oder ein Arzneimittelderivat. Ein Arzneimittelderivat ist ein Arzneimittel (beispielsweise ein existierendes Arzneimittel), an der eine zusätzliche Gruppe, wie beispielsweise ein Modifizierungsteil („A"-Teil), oder eine funktionelle Gruppe, mittels der die Verbindung und ihr Ziel eng vernetzt sein können („L"-Teil), angelagert ist. Die „A"-Gruppe oder der „A"-Teil ist erforderlich und reicht für die chemische oder enzymatische oder chemische und enzymatische Modifizierung zwischen den zwei chromatographischen Trennungen aus.
Um den „S"-, den „L"- und den „A"-Teil eines Zielmoleküls von der Ein-Buchstaben-Kennzeichnung der Aminosäuren Ser (S), Leu (L) und Ala (A), die in dieser Beschreibung der Erfindung verwendet wird, zu unterscheiden: S, L und A werden zum Definieren ihrer entsprechenden Aminosäuren verwendet, während „S", „L" und „A" oder „S”-Teil, „L"-Teil und „A”-Teil oder „S"-Einheit, „L"-Einheit und „A"-Einheit zum Anzeigen funktioneller Einheiten in den Verbindungen verwendet werden. „S" – bestimmt die Spezifität der Reaktion, „L" – bestimmt die Gruppe, die für das Erzeugen der kovalenten oder engen Verknüpfung zwischen Verbindung und Zielmolekül verantwortlich ist, und „A" – bestimmt die Gruppe, die spezifisch modifiziert sein kann.
Obgleich „S", „L" und „A" unterschiedliche Einheiten in der Verbindung sein könnten, könnten sie sich identische Funktionen teilen, entweder als Paare oder alle drei zusammen.
In den folgenden Beispielen werden unterschiedliche „SLA"-Komponenten veranschaulicht.
Der die Spezifität bestimmende Teil (der „S"-Teil) der Verbindung besteht aus einer funktionellen Gruppe oder einer Ansammlung funktioneller Gruppen, die eine chemische Einheit umfasst, die mit einer bestimmten Konformation des Ziels (z. B. der aktiven Stelle eines Enzyms) interagiert. Aufgrund dieser Interaktion wird die komplette Verbindung mit dem Ziel in engen Kontakt gebracht, was ermöglicht, dass die Verknüpfung in annehmbaren Konzentrationen der Verbindung hergestellt wird. Es ist gut bekannt, dass wachsende Konzentrationen der Verbindung die Spezifität verringern werden. Somit sollte der „S"-Teil der Verbindung mit ihrem Ziel unter physiologisch relevanten Konzentrationen interagieren. In einigen Situationen wird der „S"-Teil der Verbindung das aktive von dem inaktiven Ziel unterscheiden können. Das bedeutet, dass bestimmte Verbindungen (z. B. Arzneimittel) sich nur auf aktive Formen von Proteinen richten oder, seltener, werden andere sich nur auf inaktive Proteine richten. In anderen Situationen, der Konformation des Zielproteins bzw. der Zielproteine, mit einer reaktiven Funktionalität oder die eine Aktivierung erfordert, wird die vorwiegende Reaktion an der aktiven Stelle vorliegen. Die Verbindung enthält auch eine chemisch reaktive Gruppe („L"-Teil), die mit einer Funktionalität reagiert, die in dem Zielprotein vorliegt. Die Verknüpfung zwischen der Verbindung und ihrem Ziel ist am idealsten kovalent beschaffen. Eine beliebige Bindung, die ausreichend stark und gegen alle chemischen und/oder enzymatischen Behandlungen, gegen Lösemittel und Puffer, die in allen Chromatographieschritten verwendet werden, und gegen alle anderen Schritte, die in dem ganzen Sortiervorgang angewendet werden, resistent ist, könnte jedoch in Erwägung gezogen werden. Eine solche nichtkovalente, jedoch ausreichend starke Bindung kann beispielsweise zwischen koplanaren Cyshydroxylgruppen und Borsäurederivaten gebildet werden. Der „L"-Teil könnte in dem „S"-Teil der Verbindung eingebettet sein, wie zum Beispiel für die Enzym-Suizidinhibitoren wie Penicillin, 5-Fluoruracil oder der Caspase-1-Inhibitor. Die die Spezifität bestimmende Gruppe und die Verknüpfungsgruppe sollten nicht notwendigerweise in derselben Einheit vorliegen, sondern könnten in der Verbindungsstruktur räumlich getrennt sein. Dies ist in Beispiel 1.4 dargestellt, in dem der „S"-Teil und der „L”-Teil mit unterschiedlichen Oberflächen an dem Zielprotein in Kontakt stehen. Eine solche chemisch reaktive Gruppe kann eine photoaktivierbare Gruppe sein, wie Diazoketon, Arylazid, Arylketon, Arylmethylhalogenid usw., von denen jede nichtselektiv an ein Zielprotein binden kann, die jedoch von dem „S"-Teil an eine spezifische Stelle des Zielproteins übertragen wird. Eine solche chemisch reaktive Gruppe kann aus einer funktionellen Gruppe mit höherer Selektivität bestehen. Selektivität für Aminogruppen, wie Amidate, Bernsteinsäureanhydrid und dergleichen; für SH-Gruppen wie Methylmaleinimid oder Acetylhalogenide und dergleichen. Solche chemisch reaktiven Gruppen können Verknüpfungen bilden, die später gebrochen werden können. Zum Beispiel können Verbindungen, die zwischen Maleinsäureanhydrid und Aminogruppen gebildet wurden, mittels Säurebehandlung gebrochen werden. Solche Verknüpfungen zwischen dem „L"-Teil und dem Zielprotein können mittels enzymatischer Katalyse gebildet werden. Zum Beispiel könnten Verknüpfungen zwischen einer Glutaminseitenkette an dem Ziel und einer Lysin-∊NH₂-Gruppe an der Verbindung mittels der Aktion einer Transglutaminase gebildet werden.
In bestimmten Ausführungsformen ist das biologische Zielmolekül ein Polypeptid, eine Nukleinsäure, ein Kohlenhydrat, ein Nukleoprotein, ein Glykopeptid oder ein Glykolipid, vorzugsweise ein Polypeptid, bei dem es sich beispielsweise um ein Enzym, ein Hormon, einen Transkriptionsfaktor, einen Rezeptor, einen Peptidliganden für einen Rezeptor, einen Wachstumsfaktor, ein Immunglobulin, einen Steroidrezeptor, ein Kernprotein, eine Signaltransduktionskomponente, einen allosterischen Enzymregulator und dergleichen handeln kann. Das biologische Ziel kann auch eine Klasse oder Familie von Polypeptiden, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten, Glykopeptiden oder Glykolipiden sein, vorzugsweise eine Klasse von Proteinen, wie Hydrolasen, Dehydrogenasen, Ligasen, Transferasen und Proteinen, die aneinander oder an andere biologische Strukturen binden.
Der Ausdruck „modifizieren" oder „modifiziert" oder „Modifizierung", wie hierin in Bezug auf einen Komplex aus Verbindung und Ziel (z. B. einer Arzneimittel/Protein-Interaktion) verwendet, bezieht sich auf die Einführung einer spezifischen Modifikation in der Verbindung (z. B. eines Arzneimittels) mit der deutlichen Absicht, das chromatographische Verhalten eines solchen Komplexes aus Verbindung und Ziel, der die modifizierte Verbindung enthält, zu ändern. Gewöhnlich liegt die Modifizierung in dem „A"-Teil der Verbindung (Modifizierungsteil) vor, die Modifizierung kann jedoch auch in dem „S"- oder dem „L"-Teil der Verbindung (Spezifitäts- oder Verknüpfungsteil) erfolgen. Eine solche Modifizierung kann eine stabile chemische oder enzymatische Modifikation sein. Eine solche Modifizierung kann auch eine transiente Interaktion mit einem Molekül einführen. In der Regel wird eine Modifizierung eine kovalente Reaktion sein, eine Modifizierung kann jedoch auch aus einer Komplexbildung zwischen dem Verbindung, die an das Ziel gebunden ist, bestehen, vorausgesetzt, dass dieser Komplex während der Chromatographieschritte ausreichend stabil ist. In der Regel resultiert eine Modifizierung in einer Veränderung der Hydrophobizität oder Nettoladung, so dass der modifizierte Komplex aus Verbindung und Ziel in Umkehrphasenchromatographie anders als seine unmodifizierte Version migriert. Alternativ resultiert eine Modifizierung in einer Veränderung der Nettolast eines Komplexes aus Verbindung und Target, so dass der modifizierte Komplex aus Verbindung und Ziel in Ionenaustauschchromatographie, wie eine Anionenaustausch- oder eine Kationenaustauschchromatographie, anders als seine unmodifizierte Version migriert. Alternativ kann eine spezifische Veränderung der Nettolast eines Komplexes aus Verbindung und Ziel ebenso mit Elektrophoresesystemen, insbesondere Kapillarelektrophorese ausgenutzt werden. Zudem kann die Modifizierung die Spaltung eines Teils des Komplexes aus Arzneimittel und Ziel sein, beispielsweise des „A"-Teils des Komplexes aus Arzneimittel und Ziel. Außerdem kann eine Modifizierung in einer beliebigen anderen biochemischen, chemischen oder biophysikalischen Veränderung eines Komplexes aus Verbindung und Ziel resultieren, so dass der modifizierte Komplex aus Verbindung und Ziel in einer chromatographischen Trennung anders als seine unmodifizierte Version migriert. Der Ausdruck „migriert anders" bedeutet, dass ein bestimmter modifizierter Komplex aus Verbindung und Ziel in Bezug auf die Elutionszeit des gleichen unmodifizierten Komplexes aus Verbindung und Ziel in Durchlauf 1 mit einer anderen Elutionszeit in Durchlauf 2 eluiert. Solche Modifizierungen könnten entweder eine Vorwärts- oder Rückwärtsverschiebung des sortierten Komplexes in dem sekundären Durchlauf induzieren. Der Modifizierungsschritt sollte für den Komplex aus Verbindung und Ziel spezifischer sein und sollte nicht an mehr als einem oder mehr als einem begrenzten Satz Peptide, die die Verbindung nicht tragen, erfolgen. In diesem Fall könnte der modifizierte Komplex aus Verbindung und Ziel mittels Differentialanalyse von den modifizierten Peptiden unterschieden werden. Vorzugsweise ist der Modifizierungsschritt für den Komplex aus Verbindung und Ziel sehr spezifisch und erfolgt nicht an einem beliebigen anderen Peptid, das die Verbindung nicht trägt.
Eine Modifizierung kann mittels einer chemischen Reaktion oder einer enzymatischen Reaktion oder einer Kombination einer chemischen und einer enzymatischen Reaktion der Verbindung erzielt werden. Eine nicht einschränkende Liste chemischer Reaktionen beinhaltet Alkylierung, Acetylierung, Nitrosylierung, Oxidation, Hydroxylierung, Methylierung, Reduktion, Hydrolyse (basisch oder sauer) und dergleichen. Eine nicht einschränkende Liste enzymatischer Reaktionen beinhaltet das Behandeln des Komplexes aus Verbindung und Ziel mit Phosphatasen, Acetylasen, Glykosidasen, spezifischen Proteinasen oder anderen Enzymen, die ko- oder posttranslationale Modifikationen modifizieren, die auf Verbindungen vorliegen. Die chemische Modifizierung kann eine chemische Reaktion umfassen, kann jedoch auch mehr als eine Reaktion umfassen, wie zum Beispiel zwei aufeinander folgende Reaktionen, um die Modifizierungseffizienz zu steigern. In ähnlicher Weise kann die enzymatische Modifizierung eine oder mehrere enzymatische Reaktionen umfassen. Eine solche Modifizierung wird zwischen zwei chromatographischen Trennungen derselben Art angewendet.
Das resultierende modifizierte Produkt ist im Idealfall ein Peptid, das ein modifiziertes Molekül (ein Tag) an der Stelle der ursprünglichen kovalenten oder engen Bindung trägt. Im Idealfall sollte ein solcher Tag klein sein und eine begrenzte Anzahl von Atomen enthalten, um eine einfache und genaue Analyse und Identifizierung zu ermöglichen. Noch idealer, obgleich nicht unbedingt notwendig, sollte ein solcher Tag eine funktionelle Gruppe enthalten, die entweder mit schweren oder leichten stabilen Isotopen markiert sein kann, was eine quantitative Differentialanalyse mittels Massenspektrometrie erleichtert.
Der Ausdruck „interagiert stabil" bezieht sich auf die Interaktion zwischen einer Verbindung (z. b. einem Arzneimittel oder Arzneimittelderivat), die einem komplexen Gemisch von Molekülen (z. B. einem komplexen Proteingemisch oder einem Protein/Peptid-Gemisch) zugegeben wurde. Die Interaktion ist zur Isolierung eines Partners für die Verbindung, anders ausgedrückt eines Zielmoleküls für die Verbindung stark genug. Die Interaktion ist während der zwei chromatographischen Trennungen ausreichend stabil. In einer bestimmten Ausführungsform ist die Interaktion eine kovalente Interaktion.
Dieselbe Art von Chromatographie bedeutet, dass die Chromatographieart in sowohl der ersten Trennung als auch der zweiten Trennung dieselbe ist. Die Chromatographieart basiert zum Beispiel in beiden Trennungen auf der Hydrophobizität der Moleküle (z. B. Peptide) und Komplexen aus Verbindung und Molekül. In ähnlicher Wiese kann die Chromatographieart in beiden Schritten auf der Ladung der Moleküle (z. B. Peptide) und der Verwendung von Ionenaustauschchromatographie oder Kapillarelektrophorese basieren. In noch einer anderen Alternative basiert die chromatographische Trennung in beiden Schritten auf einer Größenausschlusschromatographie oder einer beliebigen anderen Chromatographieart.
Die erste chromatographische Trennung, vor der Modifizierung, wird hierin im Folgenden als der „primäre Durchlauf" oder der „primäre chromatographische Schritt" oder die „primäre chromatographische Trennung" oder „Durchlauf 1" bezeichnet. Die zweite chromatographische Trennung der modifizierten Fraktionen wird hierin im Folgenden als der „sekundäre Durchlauf" oder der „sekundäre chromatographische Schritt" oder die „sekundäre chromatographische Trennung" oder „Durchlauf 2" bezeichnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Chromatographiebedingungen des primären Durchlaufs und des sekundären Durchlaufs identisch oder, für einen Fachmann, im Wesentlichen ähnlich. Im Wesentlichen ähnlich bedeutet zum Beispiel, dass kleine Veränderungen des Flusses und/oder des Gradienten und/oder der Temperatur und/oder des Drucks und/oder der Chromatographie-Perlen und/oder der Lösemittelzusammensetzung zwischen Durchlauf 1 und Durchlauf 2 toleriert werden, solange die Chromatographiebedingungen zu derselben oder vorhersehbaren Elution der unmodifizierten Moleküle in Durchlauf 2 und zu einer Elution der modifizierten Komplexe aus Verbindung und Ziel (z. B. modifizierten Komplexe aus Arzneimittel und Protein oder modifizierten Komplexe aus Arzneimittel und Peptid) resultieren, die sich vorhersehbar von den unmodifizierten Komplexen aus Molekül und Ziel unterscheiden, und dies für jede Fraktion, die aus Durchlauf 1 gesammelt wurde. Modifizierte Komplexe aus Verbindung und Ziel weisen in Durchlauf 2 ein anderes chromatographisches Verhalten auf. Die Modifizierung induziert eine Verschiebung der modifizierten Komplexe aus Verbindung und Ziel. Aufgrund dieser Verschiebung eluieren die modifizierten Komplexe aus Verbindung und Ziel im Vergleich zu Durchlauf 1 in Durchlauf 2 an einer anderen Positionierung und die Komplexe können demzufolge isoliert und identifiziert werden (siehe weiter hierin).
In einem bestimmten Beispiel, in dem Proteinziele einer bestimmten Verbindung nach Zugabe der Verbindung zu einem Protein/Peptid-Gemisch und Trennen des behandelten Protein/Peptid-Gemischs in Fraktionen mittels eins primären Chromatographieschritts bestimmt werden sollen, erfordert die aktuelle Erfindung, dass die Modifizierung von Komplexen aus Verbindung und Peptid in jeder der Peptidfraktionen aus dem primären Durchlauf wirksam ist. In einer Fraktion, die von dem primären Durchlauf abgeleitet wurde (in einem ersten Chromatographieschritt), können Peptid und unmodifizierte Komplexe aus Verbindung und Peptid gefunden werden. Somit müssen die modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid in jeder Fraktion, die aus dem primären Chromatographieschritt erhalten wurde, anders als die unmodifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid in dem sekundären Chromatographieschritt migrieren. Die Modifizierung des Verbindungsteils der Komplexe aus Verbindung und Peptid induziert eine Verschiebung der Elution des modifizierten Komplexes aus Verbindung und Peptid. Je nach der Art der angewendeten Modifizierung kann die Verschiebung von einer Veränderung der Hydrophobizität, der Nettoladung und/oder der Affinität für einen Liganden (z. B. ein Metallion) der modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid verursacht werden. Diese Verschiebung wird δp genannt und ist für jeden individuellen modifizierten Komplex aus Verbindung und Peptid spezifisch. Im Beispiel einer Veränderung der Hydrophobizität können δp-Werte als Veränderungen des hydrophoben Moments oder als ein Prozentanteil organischer Lösemittel in Chromatographiedurchläufen, am praktischsten jedoch in Zeiteinheiten unter gegebenen Chromatographie-/Elektrophoresebedingungen ausgedrückt werden. Somit ist δp nicht unbedingt für jeden modifizierten Komplex aus Verbindung und Peptid identisch und liegt zwischen δ_max und δ_min. δp wird von einer Reihe von Faktoren beeinflusst, wie der Beschaffenheit der induzierten Modifizierung, der Beschaffenheit der stationären Phase der Säule, der mobilen Phase (Puffer, Lösemittel), der Temperatur und anderen. Alle δp-Werte grenzen zusammengenommen die Extreme von δ_max und δ_min ab. Wenn t₁ und t₂, die Zeiten, die den Beginn und das Ende des Intervalls der verschobenen modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid abgrenzen, und t₃ und t₄, die Zeiten, die die Fraktion einschließen, die von dem primären Durchlauf genommen wurde, gegeben sind, wird δ_min (die minimale Verschiebung) mit t₃ – t₂ bestimmt, während δ_max (die maximale Verschiebung) mit t₄ – t₁ bestimmt wird. Das Fenster w₁ ist das Fraktionsfenster, in dem die unmodifizierten Peptide im sekundären Durchlauf eluieren, w₁ = t₄ – t₃. Das Fenster w₂ ist das Fenster, in dem die modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid eluieren werden, w₂ = t₂ – t₁. Somit: δ_min t₃ – t₂; δ_max = t₄ – t₁; w₁ = δ_max + t₁ – δ_min – t₂ und w₂ = t₂ – t₁ = δ_max – δ_min – w₁. Wichtige Elemente im Sortierungsvorgang sind: δ_min, das die Distanz zwischen den unmodifizierten Komplexen aus Verbindung und Peptid und dem am wenigsten verschobenen der modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid in einer gegebenen Fraktion abgrenzt, und w₂, das Zeitfenster, in dem die modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid eluiert werden. Das Wort „sortiert" ist in dieser Erfindung mit dem Wort „isoliert" gleichwertig. δ_min muss ausreichen, um zu verhindern, dass modifizierte Komplexe aus Verbindung und Peptid innerhalb des Fensters w₁ eluieren (und als solche mit den unmodifizierten Komplexen aus Verbindung und Peptid überlappen würden), und diese Regel sollte für jede Fraktion gelten, die aus dem primären Durchlauf gesammelt wurden. Vorzugsweise sollte δ_min w₁ oder größer sein, um eine Überlappung zwischen modifizierten und unmodifizierten Komplexen aus Verbindung und Peptid zu minimieren. Zum Beispiel, wenn w₁ = 1 Minute, sollte δ_min vorzugsweise 1 Minute oder mehr sein. Das Verhindern einer Überlappung oder Koelution modifizierter Komplexe aus Verbindung und Peptid verbessert die Möglichkeit des Identifizierens einer optimalen Anzahl individueller modifizierter Komplexe aus Verbindung und Peptid. Aus diesem Blickwinkel hat die Größe des Fensters w₂ einen Einfluss auf die Anzahl modifizierter Komplexe aus Verbindung und Peptid, die identifiziert werden können. Größere Werte von w₂ resultieren in einer Dekompression der Elutionszeit der modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid, was eine bessere Isolierung modifizierter Komplexe aus Verbindung und Peptid und eine bessere Möglichkeit zur Analyse, indem die Ziele (modifizierte Komplexe aus Verbindung und Peptid) Analysatoren, wie Massenspektrometern, allmählich vorgelegt werden, bereitstellt. Obgleich Fenster w₂ kleiner als w₁ sein kann, wird w₂ in einer bevorzugten Ausführungsform größer als w₁ sein. Zum Beispiel, wenn w₁ = 1 Minute, kann w₂ 1 Minute oder mehr sein. Es ist bevorzugt, dass die Größe von w₂ und der Wert von δ_min und δ_max für jede Fraktion, die aus dem primären Durchlauf gesammelt wurde, identisch oder sehr ähnlich. Es ist jedoch augenscheinlich, dass geringfügige Kontaminationen unmodifizierter Komplexe aus Verbindung und Peptid in dem Elutionsfenster der modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid nicht bevorzugt sind, es ist jedoch annehmbar. Eine Manipulation der Werte von δ_min, δ_max und w₂, um eine optimale Trennung der modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid von den unmodifizierten Komplexen aus Verbindung und Peptid in jeder Fraktion des primären Durchlaufs zu erzielen, ist Teil der aktuellen Erfindung und umfasst, unter anderem, die richtige Kombination der Verbindung, die zur Modifizierung ausgewählt wurde, die Modifizierungsart und die Chromatographiebedingungen (Säulenart, Puffer, Lösemittel usw.). Obgleich die Gesichtspunkte der hydrophilen Verschiebung hierin oben ausgearbeitet wurden, könnte ebenfalls eine ähnliche Beschreibung bereitgestellt werden, in der eine hydrophobe Verschiebung induziert wurde, um die modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid von den unmodifizierten Komplexen aus Verbindung und Peptid zu trennen. Hier definieren t₃ und t₄ das Fenster w₁, in dem die unmodifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid eluieren, während t₅ und t₆ das Fenster w₂ definieren, in dem die modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid eluieren. Die maximale hydrophobe Verschiebung δ_max = t₆ – t₃, die minimale Verschiebung = t₅ – t₄. Man wird zu schätzen wissen, dass ähnliche Berechnungen für Bedingungen, in denen Fraktionen gepoolt werden, angewendet werden können. Für einen Fachmann ist offensichtlich, dass derselbe Ansatz zum Isolieren von Komplexen aus Verbindung und Peptid mit, zum Beispiel, Ionenaustauschchromatographie oder anderen Chromatographiearten angewendet werden kann.
Somit ist im Fall eines komplexen Gemischs von Peptiden (z. B. einem Protein/Peptid-Gemisch), in dem die Verbindung nur mit einem Zielpeptid oder einer begrenzten Anzahl von Zielpeptiden verknüpft ist, während die überwiegende Mehrheit der Peptide nicht an die Verbindung konjugiert ist, der Sortierungsvorgang wie folgt. Das gesamte Peptidgemisch wird zunächst in dem primären Chromatographieschritt getrennt. Die eluierenden Peptide werden in einer adäquaten Anzahl von Fraktionen gesammelt. Dann wird der Modifizierungsschritt ausgeführt, beispielsweise an dem „A"-Teil der Komplexe aus Verbindung und Peptid, die in jeder gesammelten Fraktion vorliegen. Prinzipiell wird jede Fraktion einem zweiten Chromatographieschritt unterzogen. Peptide, die mit der Verbindung verknüpft sind (so genannte Verbindung/Peptid-Gemische), werden modifiziert und zeigen eine chromatographische Verschiebung. Peptide, die nicht mit der Verbindung verknüpft sind, werden in Bezug auf Durchlauf 1 während des Durchlaufs 2 in derselben vorhersehbaren Position eluieren. Da jede Fraktion von Durchlauf 1 nur einen Bruchteil des gesamten Trennungsprotokolls von Durchlauf 2 belegt, können wir mehrere Fraktionen von Durchlauf 1 zur Sortierung in Durchlauf 2 vereinen. Die Fraktionen werden derart vereint, dass die sortierten Peptide (hier die Komplexe aus Verbindung und Peptid) nicht mit den unmodifizierten Peptiden benachbarter Fraktionen überlappen. Somit betrifft die Erfindung in noch einer anderen Ausführungsform die Verwendung einer Sortiervorrichtung, die das Verfahren der Erfindung ausführen kann. Als ein nicht einschränkendes Beispiel, in dem die Moleküle der Erfindung Proteine oder Peptide sind, kann das Verfahren zwei aufeinander folgende Chromatographieschritte umfassen: einen primären Chromatographieschritt unter Verwendung beispielsweise eines Protein/Peptid-Gemischs (dem eine Verbindung, die eine funktionelle Gruppe umfasst, die modifiziert sein kann, mit einer Spezifität für ein bestimmtes Peptid oder eine bestimmte Klasse von Peptiden zugegeben wurde), der das Gemisch in Fraktionen unterteilt, und einen zweiten Chromatographieschritt, der nach der spezifischen chemischen und/oder enzymatischen Modifizierung mindestens eines Komplexes aus Verbindung und Peptid, der in den Fraktionen vorliegt, durchgeführt wird. Wie hierin beschrieben, bezieht sich der Ausdruck „Peptidsortierer" auf eine Vorrichtung, die die modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid effizient von den unmodifizierten Komplexen trennt. In einem bevorzugten Gesichtspunkt werden in den zwei Chromatographieschritten identische oder sehr ähnliche Chromatographiebedingungen angewendet, so dass die unmodifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid während des zweiten Durchlaufs bei ihren ursprünglichen Elutionszeiten bleiben und die modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid induziert werden, um eine Verschiebung der Elutionszeit zu erfahren. Darüber hinaus nehmen wir in einem anderen bevorzugten Gesichtspunkt an, dass die Modifizierung von Verbindung/Peptid-Gemischen bis nahezu zur Vollständigkeit erfolgt. Wie hierin beschrieben, bezieht sich die Verwendung von beispielsweise einem Peptidsortierer insbesondere auf das Poolen von Fraktionen, die nach Durchlauf 1 erhalten wurden, und die optimale Organisation des zweiten Chromatographieschritts (z. B. dem Schritt, in dem die modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptiden von den unmodifizierten Komplexen getrennt werden, um die Isolierung der modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid aus jeder der Fraktionen des Durchlaufs 1 zu beschleunigen). Ein Ansatz um Isolieren und Identifizieren modifizierter Komplexe aus Verbindung und Peptid, die aus einem Protein/Peptid-Gemisch isoliert wurden, besteht darin, jede Fraktion unabhängig aus der primären chromatographischen Trennung zu sammeln, die chemische und/oder enzymatische Modifizierung an den Komplexen aus Verbindung und Peptid in jeder der Fraktionen auszuführen und jede Fraktion unabhängig unter denselben Chromatographiebedingungen und auf derselben oder einer im Wesentlichen ähnlichen Säule erneut durchlaufen zu lassen. Anschließend werden die modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid, die jeweils im sekundären Durchlauf unabhängig durchlaufen gelassen wurden, gesammelt und zu einem Analysegerät, wie einem Massenspektrometer, geleitet. Ein solcher Ansatz erfordert jedoch einen beträchtlichen Umfang an Chromatographiezeit und belegt wichtige Maschinenzeit auf dem Massenspektrometer. Um eine effizientere und wirtschaftlichere Verwendung sowohl der Chromatographieausrüstung sowohl des Massenspektrometers zu erzielen, stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Peptidsortierern bereit, die das Poolen mehrerer Fraktionen der primären chromatographischen Trennung ermöglicht, während eine Elutionsüberlappung zwischen modifizierten Komplexen aus Verbindung und Peptid, die von verschiedenen Fraktionen stammen, und zwischen modifizierten Komplexen aus Verbindung und Peptid von einer Fraktion und Peptiden von einer oder mehreren Fraktionen verhindert wird. In jeder aus dem primären Chromatographieschritt erhaltenen Fraktion eluieren modifizierte Komplexe aus Verbindung und Peptid anders als die unmodifizierten Komplexe. Wenn mehrere Fraktionen des primären Durchlaufs vereint (gepoolt) werden, ist es wichtig, dass während des zweiten Durchlaufs mit den gepoolten Fraktionen die sortierten modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid aus einer ausgewählten Fraktion nicht gemeinsam mit den (unmodifizierten) Peptiden einer der vorherigen Fraktionen eluieren (nicht koeluieren). Die Wahl der Anzahl von Pools wird unter anderem von (i) der Intervallverschiebung δp, die von der chemischen und/oder enzymatischen Modifizierung induziert wurde, ii) dem Elutionsfenster der Fraktionen, die aus der primären chromatographischen Trennung gesammelt wurden, und iii) dem Bedarf am Optimieren der Chromatographiezeit und der Analysezeit abhängen. Die aktuelle Erfindung stellt außerdem die Verwendung eines Parallelsäulensortierers bereit. Mit einem Parallelsäulensortierer wird das Verfahren, das auf einer einzigen Säule basiert, mit einer Reihe Säulen, die parallel (d. h. synchron) arbeiten, ausgeführt. Der Parallelsortierer enthält eine Reihe identischer Säulen, die unter exakt denselben Bedingungen (Durchflussgeschwindigkeit, Gradient usw.) laufen gelassen werden. Ein Parallelsäulensortierer ist am zweckmäßigsten eine Vorrichtung, in der 2, 3, 4 oder mehr Säulen gleichzeitig einen sekundären chromatographischen Durchlauf unter im Wesentlichen ähnlichen Bedingungen (Durchflussgeschwindigkeit, Gradient usw.) durchführen und wobei der Auslauf des Parallelsortierers direkt mit einem Analysator verbunden ist. Ein Parallelsäulensortierer teilt die Zeit zur chromatographischen Trennung, die normalerweise für eine Reihe serieller einzelner Säulen erfordert wird, durch ungefähr die Anzahl der Säulen, die in dem Parallelsortierer verwendet werden. Der Vorteil des Verwendens eines Parallelsäulensortierers ist nicht nur, dass die Gesamtsortierzeit für Komplexe aus Verbindung und Peptid beträchtlich verringert werden kann, sondern auch dass es eine begrenzte Anzahl von toten Intervallen zwischen der Auswahl der modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid aus den modifizierten Fraktionen gibt, so dass der Nachweis modifizierter Komplexe aus Verbindung und Peptid auf kontinuierliche Weise erfolgen kann. In einem anderen Gesichtspunkt der Erfindung kann ein Multisäulenpeptidsortierer verwendet werden. Ein solcher Multisäulenpeptidsortierer wird erstellt und besteht im Wesentlichen aus einer Reihe Parallelsäulensortierern, die in einem vereinten Parallel- und Serialmodus arbeiten. Ein solcher Parallelsortierer umfasst im Wesentlichen y-mal einen Satz von z Säulen, wobei die z Säulen parallel verbunden sind. In einem nicht einschränkenden Beispiel ist ein Multisäulensortierer, in dem y = 3 und z = 3, ein Neun-Säulen-Sortierer. Ein solcher Neun-Säulen-Sortierer arbeitet mit drei Sätzen von jeweils drei Säulen, die parallel verbunden sind. Die drei Parallelsäulensätze werden als A, B und C bezeichnet. Die einzelnen Säulen von A werden als I, II und III bezeichnet; die einzelnen Säulen von B werden als I', II' und III' bezeichnet und die einzelnen Säulen von C werden als I'', II'' und III'' bezeichnet. Ein Satz Parallelsäulen arbeitet mit einer Verzögerung (namens θ) im Vergleich zum vorherigen Satz. Folglich startet der Parallelsortierer B mit einer Verzögerung von θ in Bezug auf den Parallelsortierer A und der Parallelsortierer C startet mit einer Verzögerung von θ nach dem Start des Parallelsortierers und mit einer Verzögerung von 2θ nach dem Start des Parallelsortierers A. Es ist wichtig anzumerken, dass in dem Multisäulensortierer nur eine Fraktion modifizierter Komplexe aus Verbindung und Peptid von Durchlauf 1 zu einer gegebenen Zeit pro Säule verarbeitet wird. Folglich werden in dem Beispiel eines Neun-Säulen-Sortierers neun Fraktionen modifizierter Komplexe aus Verbindung und Peptid gleichzeitig verarbeitet. Dies unterscheidet sich von den zwei zuvor beschriebenen Sortierern (d. h. einem Ein-Säulen-Peptidsortierer und einem Parallelsortierer), in denen mehrere modifizierte Fraktionen strategisch gepoolt und gleichzeitig geladen werden. Da nur jeweils eine Fraktion modifizierter Komplexe aus Verbindung und Peptid auf dem Multisäulensortierer verarbeitet wird, ist die Steuerung der Durchflussgeschwindigkeitsgenauigkeit (d. h. in dem sekundären Chromatographieschritt) nicht so wichtig wie in den vorherigen Sortierern. Ein anderer Vorteil des Multisäulensortierers besteht darin, dass er gut darauf eingerichtet ist, modifizierte Komplexe aus Verbindung und Peptid von unmodifizierten Komplexen in Fällen zu trennen, in denen die chromatographische Verschiebung modifizierter Komplexe aus Verbindung und Peptid über die unterschiedlichen Fraktionen beträchtlich variiert. Es wird Fachmännern klar sein, dass andere Kombinationen von Parallel- und Seriellsäulen zu ähnlichen Ergebnissen führen können. Die Wahl der Anzahl von Säulen, ihrer Anordnung und der Fraktionen, die auf die Säulen geladen werden, wird unter anderem von (i) dem Intervall δp, das von der chemischen oder enzymatischen Modifizierung induziert wurde, ii) dem Elutionsfenster der Fraktionen, die aus der primären chromatographischen Trennung gesammelt wurden, und iii) dem Bedarf am Optimieren der Chromatographiezeit und der Analysezeit abhängen. Es wird einem Fachmann weiterhin klar sein, dass Peptidsortierern, die das Verfahren der aktuellen Erfindung ausführen, auch auf voll automatisierte Weise durchgeführt werden könnten, wobei im Handel erhältliche Autoinjektoren, HPLC-Ausrüstung und automatisierte Fraktionssammler verwendet werden. Folglich sollten die vorliegenden Beispiele von Peptidsortierern nicht als erschöpfend betrachtet werden. Mehrere Varianten, darunter Elektrophorese- und Ionenaustauschchromatographiesysteme, sind ebenso praktikabel. Die veranschaulichende Ausführungsform stellt weiterhin ein System zum Durchführen des oben beschriebenen Verfahrens der Proteomanalyse in selektiver und effizienter Weise bereit. Wie erörtert, führt eine primäre Chromatographiesäule eine erste Trennung des komplexen Peptidgemischs durch. Die primäre Chromatographiesäule trennt das komplexe Peptidgemisch unter einem definierten Bedingungssatz in mindestens zwei Fraktionen. Zum Beispiel trennt die primäre Chromatographiesäule das Protein/Peptid-Gemisch, indem die Säule mit einem vorherbestimmten Lösemittelgradient und einer vorherbestimmten Durchflussgeschwindigkeit eluiert wird. Die aus der primären chromatographischen Trennung resultierenden Fraktionen können strategisch gepoolt werden, um mehrere Fraktionen mit unterschiedlichen Elutionszeiten zu mehreren gepoolten Fraktionen zu vereinen, wie oben beschrieben. Die gepoolten Fraktionen können anschließend modifiziert werden, um in einem Satz modifizierter Peptide und einem Satz unmodifizierter Peptide für jede Fraktion zu resultieren. Gemäß einer alternativen Ausführungsform werden die Fraktionen zunächst unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren modifiziert und dann strategisch zu einem Satz gepoolter Fraktionen gepoolt, wobei jede Fraktion in einer gepoolten Fraktion einen Satz modifizierter Komplexe aus Verbindung und Peptid und einen Satz unmodifizierter Komplexe aus Verbindung und Peptid umfasst. In einer sekundären chromatographischen Trennung werden die modifizierten Komplexe von den unmodifizierten Komplexen getrennt. Die isolierten Ziele (= die modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid) können dann analysiert werden, um ein Protein zu identifizieren.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung weiterhin ein Verfahren zum Identifizieren der isolierten Ziele (= die modifizierten Komplexe aus Verbindung und Target) bereit. In einer bestimmten Ausführungsform kann die Identifizierung der Ziele mit einem Massenspektrometrieansatz ausgeführt werden.
In einer anderen bestimmten Ausführungsform, in der die Zielmoleküle Proteine oder Peptide sind, wird der Identifizierungsschritt mittels eines Verfahrens durchgeführt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden besteht: einem Tandem-Massenspektrometrieverfahren, einer Post-Source-Decay-Analyse, einer Messung der Masse der Peptide, in Verbindung mit einer Datenbanksuche. In noch einer anderen bestimmten Ausführungsform basiert das Identifizierungsverfahren, das auf der Massenmessung der Peptide basiert, weiterhin auf einem oder mehreren der Folgenden: (a) der Bestimmung der Anzahl freier Aminogruppen in den Zielpeptiden; (c) der Kenntnis der Spaltungsspezifität der Protease, die zum Erzeugen des Protein/Peptid-Gemischs verwendet wurde; und (d) dem Grand Average der Hydropathie der Zielpeptide.
In einer bestimmten Ausführungsform sind die Ziele Proteine oder Peptide und folglich ist das Verfahren der Erfindung weiterhin mit einer Peptidanalyse verbunden. Die vorliegende Erfindung stellt folglich weiterhin ein Verfahren zum Identifizieren von Zielpeptiden und ihren entsprechenden Proteinen bereit. In einem bevorzugten Ansatz wird die Analyse modifizierter Komplexe aus Arzneimittel und Peptid mit einem Massenspektrometer durchgeführt. Komplexe aus Arzneimittel und Peptid können jedoch auch unter Verwendung anderer Verfahren, wie Elektrophorese, Aktivitätsmessung in Assays, Analyse mit spezifischen Antikörpern, Edman-Sequenzierung usw., weiter analysiert und identifiziert werden. Ein Analyse- oder Identifizierungsschritt kann auf unterschiedliche Weisen ausgeführt werden. In einer Methode werden modifizierte Komplexe aus Arzneimittel und Peptid (die markierten Peptide), die aus den Chromatographiesäulen eluieren, unverzüglich zu dem Analysator geleitet. In einem alternativen Ansatz werden modifizierte Komplexe aus Arzneimittel und Peptid in Fraktionen gesammelt. Solche Fraktionen können manipuliert werden oder auch nicht, bevor sie einer weiteren Analyse oder einer Identifizierung unterzogen werden. Ein Beispiel einer solchen Manipulation besteht aus einem Konzentrationsschritt, auf den das Beflecken jedes Konzentrats auf zum Beispiel einem MALDI-Target zur weiteren Analyse und Identifizierung folgt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden modifizierte Komplexe aus Arzneimittel und Peptid mit Massenspektrometrietechniken mit hohem Durchsatz analysiert. Die erhaltene Information ist vor allem die Masse des markierten Peptids bzw. der markierten Peptide. Die Masse ist die Summe der Masse des Peptids und der Masse des Tags (der modifizierten Verbindungskomponente). Da die letztere Masse aus der Modifizierungsreaktion bekannt ist, kann diese Tag-Masse von der Gesamtmasse des markierten Peptids subtrahiert werden, was in einer Peptidmasse resultiert, die die Basis beim weiteren Suchen nach Algorithmen darstellen wird.
Im Allgemeinen reicht eine Masseninformation für eine eindeutige Peptididentifizierung nicht aus. Folglich werden die markierten Peptide (= die modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid) weiter fragmentiert. Dies wird oftmals mittels kollisionsinduzierter Dissoziation (collision-induced dissociation, CID) in einem Elektrosprayinstrument oder MALDI durchgeführt und wird im Allgemeinen als MS/MS oder Tandem-Massenspektrometrie bezeichnet. Eine manuelle oder automatisierte Deutung dieser MS/MS-Spektren führt zur Zuordnung von Sequenz-Tags und zur Identifizierung der Peptidsequenz-Tags und zur Lokalisierung des Tags. Proteinidentifizierungssoftware, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um die Versuchsfragmentierungsspektren des markierten Peptids mit Aminosäuren, die in Peptiddatenbanken gespeichert sind, zu vergleichen. Solche Algorithmen stehen in der Technik zur Verfügung.
Ein solcher Algorithmus, ProFound, verwendet einen bayesianischen Algorithmus, um eine Protein- oder DNA-Datenbank abzusuchen, um die beste Übereinstimmung zwischen den Versuchsdaten und dem Protein in der Datenbank zu identifizieren. Auf ProFound kann auf dem Internet unter <http//prowl.rockefeller.edu> und <http//www.proteometrics.com> zugegriffen werden. ProFound greift auf die nichtredundante Datenbank (NR) zu. Auf Peptide Search kann auf der EMBL-Website zugegriffen werden. Siehe auch P. Chaurand et al. (1999), J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 10, 91, S. D. Patterson (2000), Am. Physiol. Soc., 59–65, JR Yates (1998), Electrophoresis, 19, 893. MS/MS-Spektren können auch mit MASCOT (unter http://www.matrixscience.com verfügbar, Matrix Science Ltd. London) analysiert werden.
Ein beliebiges Massenspektrometer kann zum Analysieren der modifizierten Komplexe aus Arzneimittel und Peptid verwendet werden. Zu nicht einschränkenden Beispielen von Massenspektrometern zählen das MALDI-TOF-MS (MALDI = matrixassistierte Desorption/Ionisation; TOF = time-of-flight, Flugzeit; MS = Massenspektrometer), das von PerSeptive Biosystems, Framingham, Massachusetts, USA, erhältlich ist; das Ettan-MALID-TOF von AP Biotech und das Reflex III von Brucker-Daltonias, Bremen, Deutschland, zur Verwendung in der Post-Source-Decay-Analyse; das ESI-Ionenfallenmassenspektrometer (ESI = Elektrosprayionisation), das von Finnigan MAT, San Jose, Kalifornien, USA, erhältlich ist; das ESI-Quadrupolmassenspektrometer, das von Finnigan MAT erhältlich ist, oder das QSTAR-Pulsar-Hybrid-LC/MS/MS-System der Applied Biosystems Group, Foster City, Kalifornien, USA, und ein Fourier-Transformationsmassenspektrometer (FTMS), das ein internes Kalibrierungsverfahren anwendet (O'Connor und Costello (2000), Anal. Chem. 72, 5881–5885).
Alternativ können markierte Peptide während ihres Flugs, nachdem sie in einem MALDI-TOF-MS verflüchtigt und ionisiert wurden, zerfallen. Dieser Vorgang wird Post-Source-Decay (PSD) genannt. Unter Kenntnis der Peptidsequenzen, die in Peptidsequenzdatenbanken gespeichert sind, ist es möglich, Teile der Sequenz oder die gesamte Sequenz von solchen PSD-Spektren abzuleiten. Wie oben kann diese Analyse manuelle oder unter Verwendung von Computeralgorithmen, die in dem Gebiet gut bekannt sind, vorgenommen werden. Ein solcher Algorithmus ist zum Beispiel das MASCOT-Programm.
In einer bestimmten Ausführungsform können weitere Sequenzinformationen in einer MALDI-PSD-Analyse erhalten werden, wenn der alpha-NH₂-Terminus der Zielpeptide mit einer Sulfonsäureneinheitsgruppe modifiziert wird. Zielpeptide, die einen NH₂-terminale Sulfonsäurengruppe tragen, werden zu bestimmten Fragmentierungsmustern induziert, wenn sie im MALDI-TOF-MS-Modus erfasst werden. Der letztere ermöglicht eine sehr schnelle und einfache Ableitung der Aminosäuresequenz.
Alternativ könnten markierte Peptide mittels herkömmlichen Edman-Abbaus analysiert und die erhaltene Aminosäuresequenz mit Sequenzen verglichen werden, die in Protein oder Genomsequenzdatenbanken gespeichert sind. In dem Fall, in dem die Verbindung selbst ein Peptid ist, wird Edman-Sequenzierung in jedem Zyklus eine doppelte Aminosäurenidentifizierung erstellen, bis der Abbau den Rest einer der Ketten erreicht, die an der Isopeptid-Verknüpfung beteiligt ist.
Wenn ein markiertes Peptid eindeutig mittels MS-basierter Fragmentierungsanalyse identifiziert wurde, können weitere ähnliche Versuche einfach dessen Gesamtmasse verwenden. Dies ist zum Beispiel der Fall, wenn aktivitätsbasierte Proteinprofilerstellung eines spezifischen Ziels an einer großen Zahl von Proben ausgeführt wird. In der Tat wird die Menge an gebildetem markiertem Peptid von der Zugänglichkeit und spezifischen Reaktivität des Ziels abhängen. Sobald das spezifische markierte Peptid in Bezug auf Gesamtmasse und Elutionszeiten vollständig charakterisiert wurde, reicht es aus, das markierte Peptid auf Basis seiner exakten Masse auszuwählen. Eine Peptidmasse kann mit einem Fourier-Transformationsmassenspektrometer (FT-MS) oder unter Verwendung von vor kurzem entwickelten, auf MALDI basierenden Flugzeitgeräten ausreichend genau gemessen werden.
Solche Geräte werden zum Beispiel von Bruker-Daltonics, Bremen, Deutschland, (Ultraflex) konstruiert.
Wenn die Genauigkeit, mit der die Masse des markierten Peptids gemessen werden kann, nicht unterschiedlich genug ist, können weitere Informationen erstellt werden. Zum Beispiel ist die Elutionszeit, in der ein gegebenes Peptid während der Chromatographie eluiert, ein Parameter, der von der Peptidmasse völlig unabhängig ist.
Somit ist die Wahrscheinlichkeit gering, dass zwei oder mehr Peptide, mit identischen Massen oder mit Massen, die in den Fehlerbereich der Massenmessungen fallen, während der Chromatographie ebenfalls mit identischen oder sehr ähnlichen Retentionszeiten eluieren. Da die Retentionszeit eines Peptids während einer Umkehrphasenchromatographie vorwiegend mit seiner Gesamthydrophobizität, dem GRAVY-Index (GRAVY = Grand Average der Hydropathie) zusammenhängt, der unter Verwendung von Hydropathiewerten, die jeder natürlichen Aminosäure gegeben wurden, berechnet werden kann. Somit sind die Masse zusammen mit dem GRAVY-Index zwei unabhängige Parameter, die für ein gegebenes Peptid sehr charakteristisch sind.
In einer anderen Ausführungsform kann das Verfahren zum Bestimmen der Identität des Elternproteins, indem nur die Peptidmasse mindestens eines Zielpeptids genau gemessen wird, verbessert werden, indem der Informationsgehalt der ausgewählten Zielpeptide weiter angereichert wird. Als ein nicht einschränkendes Beispiel, wie Informationen den Zielpeptiden hinzugefügt werden können, können die freien NH₂-Gruppen dieser Peptide in einer chemischen Reaktion mittels Zugabe von zwei mit unterschiedlichen Isotopen markierten Gruppen spezifisch chemisch verändert werden. Infolge dieser Veränderung erwerben die Peptide eine vorherbestimmte Anzahl markierter Gruppen. Da das Änderungsmittel ein Gemisch von zwei chemisch identischen, jedoch in Bezug auf das Isotop unterschiedlichen Mitteln ist, werden die Zielpeptide in den Massenspektren als Peptidzwillinge offenbart. Der Umfang der Massenverschiebung zwischen diesen Peptiddubletten zeigt die Anzahl freier Aminogruppen, die in dem Peptid vorliegen, an. Um dies weiter zu veranschaulichen, der Informationsgehalt von Zielpeptiden kann beispielsweise angereichert werden, indem freie NH₂-Gruppen in den Peptiden unter Verwendung eines äquimolaren Gemischs von N-Hydroxysuccinimidessigsäureester und N-Hydroxysuccinimidtrideuterioessigsäureester spezifisch verändert werden. Infolge dieser Umwandlungsreaktion erwerben Peptide eine vorherbestimmte Anzahl von CH₃-CO-Gruppen (CD₃-CO-Gruppen), die einfach von dem Umfang der beobachteten Massenverschiebung in den Peptiddubletten abgeleitet werden kann. Als solche entspricht eine Verschiebung von 3 amu einer NH₂-Gruppe, entspricht eine Verschiebung von 3 und 6 amu zwei NH₂-Gruppen und offenbart eine Verschiebung von 3, 6 und 9 amu das Vorliegen von drei NH₂-Gruppen in dem Peptid. Diese Information ergänzt die Daten in Bezug auf die Peptidmasse und/oder die Kenntnis, dass das Peptid mit einer Protease mit bekannter Spezifität erzeugt wurde, weiter.
Die Verwendung der Masse eines sortierten markierten Peptids als dem einzigen Peptid-/Proteinidentifizierungskriterium wird wichtig und sinnvoll, sobald das markierte Peptid (zuvor) mit anderen Mitteln, wie den oben beschriebenen, vollständig identifiziert wurde.
Zum Beispiel kann, sobald das markierte Peptid mittels MS-Fragmentierungsanalyse und Datenbanksuche vollständig identifiziert wurde, eine weitere Identifizierung auf der genau gemessenen Masse des markierten Peptids basiert werden, ohne jedes Mal die MS/MS-Analyse zu wiederholen.
Somit bedeuten die Expressionsniveaus oder die Aktivität und Expressionsniveaus eines biologischen Ziels oder verschiedener biologischer Ziele, die in einer Vielzahl von Proben vorliegen, mehr als eine, vorzugsweise mehr als fünf, mehr bevorzugt mehr als einhundert und mehr bevorzugt mehr als tausend und mehr bevorzugt eine Zahl, die in der Regel bei einer Analyse mit hohem Durchsatz angetroffen wird. Ein sehr komplexes Gemisch von Proteinen bezieht sich auf Zelllysate, Zellfraktionen, Gewebe, biologische Flüssigkeiten und dergleichen, wie sie im Folgenden beschrieben sind.
In Fällen, in denen die Erfindung zu der Identifizierung der Mitglieder einer Klasse von biologischen Zielen führt, könnte die Masse jedes markierten Peptids für sein entsprechendes biologisches Zielprotein charakteristisch sein, und die Erfindung würde eine allgemeine Analyse von Konzentrationen oder Konzentrationen und/oder Aktivitäten jedes Mitglieds der Familie ermöglichen. Zum Beispiel kann die Verwendung von FSBA zum Targetieren von ATP-Bindeproteinen und insbesondere der Kinasefamilien zu einer Reihe markierter Peptide führen. Jedes dieser markierten Peptide wird denselben Tag tragen, wird sich jedoch anderweitig von der Peptideinheit unterscheiden. Somit wird jede Kinasekonzentration und/oder -aktivität von der spezifischen Peptidmasse in dem markierten Peptid reflektiert. Eine relative Quantifizierung jedes markierten Peptids wird ein allgemeines Profil von Konzentrationen und/oder Aktivitäten der Mitglieder einer Familie von biologischen Zielen liefern.
Obgleich eine absolute Quantifizierung von Peptiden mittels Massenspektrometrie sehr schwierig ist, sind MS-basierte Techniken zur Vergleichsanalyse geeignet.
Folglich wird in einer anderen Ausführungsform ein Verfahren zum Bestimmen des relativen Umfangs der Konzentration und/oder Aktivität mindestens eines Zielpeptids in mehr als einer Probe, die Peptide umfasst, bereitgestellt, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: (a) die Zugabe einer Verbindung, wobei diese Verbindung eine funktionelle Gruppe umfasst, die chemisch oder enzymatisch oder chemisch und enzymatisch modifiziert sein kann, so dass ein Komplex aus modifizierter Verbindung und Zielpeptid in derselben chromatographischen Trennung anders als seine unmodifizierte Version migriert, und eines ersten Isotops zu einer ersten Probe, die Peptide umfasst, wobei die Verbindung mit mindestens einem Peptid stabil interagiert, wodurch ein Komplex aus Verbindung und Zielpeptid gebildet wird; (b) die Zugabe einer Verbindung, wobei diese Verbindung eine funktionelle Gruppe umfasst, die chemisch oder enzymatisch oder chemisch und enzymatisch modifiziert sein kann, so dass ein Komplex aus modifizierter Verbindung und Zielpeptid in derselben chromatographischen Trennung anders als seine unmodifizierte Version migriert, und eines zweiten Isotops zu einer zweiten Probe, die Peptide umfasst, wobei die Verbindung mit mindestens einem Peptid stabil interagiert, wodurch ein Komplex aus Verbindung und Zielpeptid gebildet wird; (c) Vereinen des Peptid-Gemischs der ersten Probe mit dem Peptid-Gemisch der zweiten Probe; (d) Trennen der vereinten Peptid-Gemische in mehrere Fraktionen in einem ersten Chromatographieschritt, wobei in einer Fraktion, die von diesem Chromatographieschritt abgeleitet wird, sowohl Peptide als auch Komplexe aus Verbindung und Zielpeptid gefunden werden; (e) chemisches oder enzymatisches oder chemisches und enzymatisches Modifizieren der Verbindung, die in mindestens einem Komplex aus Verbindung und Zielpeptid in jeder Fraktion vorliegt; (f) Isolieren der Komplexe aus modifizierter Verbindung und Zielpeptid aus jeder Fraktion in einem zweiten Chromatographieschritt, wobei die Chromatographie der Schritte (b) und (d) mit derselben oder einer im Wesentlichen ähnlichen Chromatographieart wie in Schritt (d) durchgeführt wird; (g) Durchführen einer massenspektrometrischen Analyse der isolierten Komplexe aus modifizierter Verbindung und Zielpeptid; (h) Berechnen der relativen Mengen der Komplexe aus modifizierter Verbindung und Zielpeptid in jeder Probe durch Vergleichen der Peak-Höhen der identischen, jedoch unterschiedlich, isotopenmarkierten Komplexe aus modifizierter Verbindung und Zielpeptid und (i) Bestimmen der Identität der Zielpeptide in den Komplexen aus modifizierter Verbindung und Zielpeptid und von deren entsprechenden Proteinen.
Um die Konzentration und/oder Aktivität der Ziele in zwei unterschiedlichen Proben zu vergleichen, kann eine unterschiedliche Massenmarkierung verwendet werden. Folglich können die Komplexe aus Verbindung und Peptid (die markierten Peptide) der ersten Probe mit „leichten" Atomen markiert werden, während das markierte Peptid der zweiten Probe mit „schweren Atomen" markiert wird. Die Markierung kann zum Beispiel mittels Verwendung einer Verbindung, die ein Isotopenmarker trägt, ausgeführt werden. Vor dem primären chromatographischen Durchlauf werden die Komplexe aus Verbindung und Peptid beider Proben gemischt. Die „leichten" und die schweren" Komponenten werden während des primären Durchlaufs auf identische oder nahezu identische Weise eluieren oder migrieren. Ihre Modifizierung wird ebenfalls auf gleiche Weise verlaufen. Die „leichten" und die „schweren” markierten Peptide werden auf identische oder nahezu identische Weise eluieren oder migrieren und zusammen zum Massenspektrometer überführt. Nur während der Analyse mit dem letzteren werden sich „leichte" und „schwere" markierte Peptidionen trennen und ihre relativen Intensitäten können gemessen werden. Es ist wichtig zu betonen, dass die unterschiedlichen Atome nach dem Modifizierungsschritt an dem markierten Peptid angelagert bleiben. Somit sind sowohl die „leichten" als auch die „schweren" Atome Teil des Tags an dem markierten Peptid.
Als Paar leichter und schwerer Atome können H/D, ¹⁶O/¹⁸O, ¹²C/¹³C, ¹⁴N/¹⁵N oder ein beliebiges Paar stabiler Isotope, die stabil in organische und anorganische Verbindungen integriert werden können, verwendet werden. In einer alternativen Ausführungsform können die Proteine anstelle der Verbindungen markiert werden. Die Markierung mit unterschiedlichen Isotopen von Peptiden in einer ersten und einem zweiten Probe kann auf viele verschiedene Arten, die in der Technik zur Verfügung stehen, vorgenommen werden. Ein Schlüsselelement besteht darin, dass ein bestimmtes Peptid, das aus demselben Protein stammt, in einer ersten und einer zweiten Probe identisch ist, mit Ausnahme der Gegenwart eines unterschiedlichen Isotops in einer oder mehreren Aminosäuren des Peptids. In einer typischen Ausführungsform wird das Isotop in einer ersten Probe das natürliche Isotop sein, was sich auf das Isotop bezieht, das vorwiegend in der Natur vorliegt, und das Isotop in einer zweiten Probe wird ein weniger gewöhnliches Isotop sein, das hierin im Folgenden als ein ungewöhnliches Isotop bezeichnet wird. Beispiele von Paaren natürlicher und ungewöhnlicher Isotope sind H und D, O¹⁶ und O¹⁸, C¹² und C¹³, N¹⁴ und N¹⁵. Peptide, die mit dem schwersten Isotop eines Isotopenpaars markiert sind, werden hierin auch als schwere Peptide bezeichnet. Peptide, die mit dem leichtesten Isotop eines Isotopenpaars markiert sind, werden hierin auch als leichte Peptide bezeichnet. Zum Beispiel wird ein Peptid, das mit H markiert ist, das leichte Peptid genannt, während das gleiche Peptid, das mit D markiert ist, das schwere Peptid genannt wird. Peptide, die mit einem natürlichen Isotop markiert ist, und deren Gegenstücke, die mit einem ungewöhnlichen Isotop markiert sind, sind chemisch sehr ähnlich, trennen sich chromatographisch auf dieselbe Weise und ionisieren zudem auf dieselbe Weise. Wenn die Peptide jedoch einem Analysator, wie einem Massenspektrometer, zugeführt werden, werden sie sich in die leichten und die schweren Peptide trennen. Das schwere Peptid weist aufgrund des höheren Gewichts des integrierten, gewählten Isotopenmarkers eine geringfügig höhere Masse auf. Aufgrund der unbedeutenden Differenz zwischen den Massen der mit unterschiedlichen Isotopen markierten Peptide werden die Ergebnisse der massenspektrometrischen Analyse isolierter modifizierter Komplexe aus Verbindung und Peptid mehrere Paare eng beabstandeter Doppelpeaks sein, wobei jeder Doppelpeak einen schweren und einen leichten modifizierten Komplex darstellt. Jeder der schweren Komplexe stammt von der Probe, die mit dem schweren Isotop markiert ist, jeder der leichten Komplexe stammt von der Probe, die mit dem leichten Isotop markiert ist. Dann werden die Verhältnisse (relative Abundanz) der Peak-Intensitäten des schweren und des leichten Peaks in jedem Paar gemessen. Diese Verhältnisse geben ein Maß der relativen Menge (unterschiedliches Vorkommen) dieses Ziels (wie eines isolierten modifizierten Verbindungskomplexes) in jeder Probe. Die Peak-Intensitäten können auf herkömmliche Weise berechnet werden (z. B. indem die Peak-Höhe oder die Peak-Oberfläche berechnet wird). Wie hierin oben beschrieben, können die modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid ebenfalls identifiziert werden, was die Identifizierung von Proteinen in den Proben ermöglicht. Wenn ein Proteinziel für eine bestimmte Verbindung in einer Probe, jedoch nicht in einer anderen vorliegt, werden die isolierten modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid (die diesem Protein entsprechen) als ein Peak erkannt, der entweder das schwere oder das leichte Isotop enthalten kann. In einigen Fällen kann es jedoch schwierig sein zu bestimmen, welche Probe den Einzelpeak erzeugte, der während der massenspektrometrischen Analyse der vereinten Probe beobachtet wurde. Dieses Problem kann durch Doppelmarkieren der ersten Probe, entweder vor oder nach der proteolytischen Spaltung, mit zwei unterschiedlichen Isotopen mit zwei unterschiedlichen Anzahlen schwerer Isotope gelöst werden. Beispiele von Markierungsmitteln sind Acylierungsmittel.
Die Integrierung des natürlichen und/oder ungewöhnlichen Isotops in Peptiden kann auf mehrere Weisen erzielt werden. In einem Ansatz werden Proteine in den Zellen markiert. Zellen für eine erste Probe werden zum Beispiel in Medien gewachsen, die mit einer Aminosäure supplementiert sind, die das natürliche Isotop enthält, und Zellen für eine zweite Probe werden in Medien gewachsen, die mit einer Aminosäure supplementiert sind, die das ungewöhnliche Isotop enthält. In einer anderen Ausführungsform kann die Integrierung der unterschiedlichen Isotope auch mittels eines enzymatischen Ansatzes erzielt werden. Zum Beispiel kann die Markierung ausgeführt werden, indem eine Probe, die Proteine umfasst, mit Trypsin in „normalem" Wasser (H₂ ¹⁶O) und die zweite Probe, die Proteine umfasst, mit Trypsin in „schwerem" Wasser (H₂ ¹⁸O) behandelt wird. Wie hierin verwendet, bezieht sich „schweres Wasser" auf ein Wassermolekül, in dem das O-Atom das ¹⁸O-Isotop ist. Trypsin zeigt die gut bekannte Eigenschaft des Integrierens von zwei Sauerstoffen von Wasser an den COOH-Termini der neu erzeugten Stellen. Somit weisen Peptide in Probe eins, die in H₂ ¹⁶O trypsiniert wurde, „normale" Massen auf, während Peptide (mit Ausnahme der meisten der COOH-terminalen Peptide) in Probe zwei einen Massenanstieg von 4 amu aufweisen, der mit der Integrierung von zwei ¹⁸O-Atomen übereinstimmt. Diese Differenz von 4 amu reicht dazu aus, zwischen der schweren und der leichten Version der modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid in einem Massenspektrometer zu unterscheiden und die Verhältnisse der leichten zu den schweren Peptiden genau zu messen und somit das Verhältnis der entsprechenden Zielpeptide/Zielproteine in den zwei Proben zu bestimmen.
Die Integrierung der unterschiedlichen Isotope kann weiterhin mit mehreren Markierungsvorgängen auf Basis bekannter chemischer Reaktionen erzielt werden, die auf der Protein- oder der Peptidebene ausgeführt werden. Zum Beispiel können Proteine mittels der Guadinylierungsreaktion mit O-Methylisoharnstoff geändert werden, die NH₂-Gruppen in Guanidiniumgruppen umsetzt, wodurch Homoarginin an jeder vorherigen Lysin-Position erzeugt wird. Proteine von einer ersten Probe können mit einem Reagens mit den natürlichen Isotopen umgesetzt werden und Proteine von einer zweiten Probe können mit einem Reagens mit einem ungewöhnlichen Isotop umgesetzt werden. Peptide könnten auch mittels Bildung von Shiff-Basen mit deuteriertem Acetaldehyd, gefolgt von Reduktion mit normalem oder deuteriertem Natriumborhydrid geändert werden. Diese Reaktion, von der bekannt ist, dass sie in milden Bedingungen verläuft, kann zur Integrierung einer vorhersehbaren Anzahl von Deuteriumatomen führen. Peptide werden entweder an der α-NH₂-Gruppe oder den ε-NH₂-Gruppen von Lysinen oder an beiden geändert. Ähnliche Änderungen können mit deuteriertem Formaldehyd ausgeführt werden, worauf eine Reduktion mit deuteriertem NaBD₄ folgt, was eine methylierte Form der Aminogruppen erzeugen wird. Die Reaktion mit Formaldehyd könnte entweder an dem gesamten Protein, wobei Deuterium nur an Lysin-Seitenketten integriert wird, oder an dem Peptidgemisch, wobei sowohl die α-NH₂- als auch die von Lysin abgeleiteten NH₂-Gruppen markiert werden, ausgeführt werden. Da Arginin nicht umgesetzt wird, stellt dies auch ein Verfahren zum Unterscheiden zwischen Arg und Lys enthaltenden Peptiden bereit.
Primäre Aminogruppen werden leicht mit beispielsweise Acetyl-N-hydroxysuccinimid (ANHS) acyliert. Somit kann eine Probe mit normalem ANHS acetyliert werden, wohingegen eine zweite Probe mit entweder ¹³CH₃CO-NHS oder CD₃CO-NHS acyliert wird. Zudem wird die ε-NH₂-Gruppe aller Lysine auf diese Weise zusätzlich zu dem Aminoterminus des Peptids derivatisiert. Noch andere Markierungsverfahren sind beispielsweise Essigsäureanhydrid, das zum Acetylieren von Hydroxylgruppen verwendet werden kann, und Trimethylchlorsilan, das zur weniger spezifischen Markierung von funktionellen Gruppen, einschließlich Hydroxylgruppen und Aminen, verwendet werden kann.
In noch einem anderen Ansatz werden die primären Aminosäuren mit chemischen Gruppen markiert, die ermöglichen, zwischen den schweren und den leichten Peptiden um 5 amu, um 6 amu, um 7 amu, um 8 amu oder sogar um eine größere Massendifferenz zu unterscheiden. Alternativ kann die Markierung mit unterschiedlichen Isotopen am carboxyterminalen Ende der Peptide ausgeführt werden, was die Unterscheidung zwischen den schweren und den leichten Varianten um mehr als 5 amu, 6 amu, 7 amu, 8 amu oder noch größere Massendifferenzen ermöglicht. Da die Verfahren der vorliegenden Erfindung keine Vorkenntnis der Art der Zielproteine, die in den Proben vorliegen können, erfordern, können sie zum Bestimmen der relativen Mengen sowohl bekannter als auch unbekannter Zielproteine, die in den untersuchten Proben vorliegen, verwendet werden.
Die in der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Verfahren zum Bestimmen von relativen Konzentrationen mindestens eines Proteinziels und/oder der Aktivität eines Proteins in mindestens zwei Proben können allgemein angewendet werden, um Proteinkonzentrationen in zum Beispiel Zellen, Geweben oder biologischen Flüssigkeiten, Organen und/oder kompletten Organismen zu vergleichen. Ein solcher Vergleich beinhaltet das Beurteilen von subzellulären Fraktionen, Zellen, Geweben, Flüssigkeiten, Organen und/oder kompletten Organismen, die beispielsweise erkrankt oder nicht erkrankt, belastet und nicht belastet, mit Arzneimittel behandelt und nicht mit Arzneimittel behandelt, gutartig und bösartig, anhaftend und nicht anhaftend, infiziert und nicht infiziert, umgewandelt und nicht umgewandelt sind. Das Verfahren ermöglicht außerdem, Proteinzielkonzentrationen oder die Aktivität von einem oder mehreren Proteinen in subzellulären Fraktionen, Zellen, Geweben, Flüssigkeiten, Organismen, kompletten Organismen, die unterschiedlichen Stimuli ausgesetzt sind oder in unterschiedlichen Entwicklungsphasen oder in Bedingungen, in denen ein oder mehrere Gene abgeschaltet oder überexprimiert sind, oder in Bedingungen, in denen ein oder mehrere Gene „knocked out" sind, zu vergleichen.
In einer anderen Ausführungsform können die hierin beschriebenen Verfahren auch in Diagnoseassays zum Nachweis der Gegenwart, der Abwesenheit oder einer Variation der Konzentration von einem oder mehreren Proteinzielen und/oder der Aktivität eines Proteins oder eines spezifischen Satzes von Proteinen, die auf einen Krankheitszustand hinweisen (z. B. wie Krebs, neurodegenerative Erkrankung, Entzündung, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Virusinfektionen, bakterielle Infektionen, Pilzinfektionen oder eine beliebige andere Erkrankung), eingesetzt werden. Zu spezifischen Anwendungen zählen die Identifizierung von Zielproteinen, die in metastasierenden und invasiven Karzinomen vorliegen, die unterschiedliche Expression von Proteinen in transgenen Mäusen, die Identifizierung von Proteinen, die in erkrankten Geweben hoch- oder herunterreguliert sind, die Identifizierung von intrazellulären Veränderungen in Zellen mit physiologischen Veränderungen, wie einer metabolischen Verschiebung, die Identifizierung von Biomarken in Karzinomen, die Identifizierung von Signalstoffwegen.
Zu Proben, die mit Verfahren der Erfindung analysiert werden können, zählen biologische Proben, wie Zelllysate, mikrosomale Fraktionen, Zellfraktionen, Gewebe, Organelle usw., und biologische Flüssigkeiten, einschließlich Urin, Sputum, Speichel, Synovia, Aspirationsflüssigkeit der Mamillen, Fruchtwasser, Blut, Hirnflüssigkeit, Tränen, Samenflüssigkeit, Serum, Flüssigkeit im Pleuraraum, Aszitesflüssigkeit, Stuhl, oder eine Biopsieprobe. Wenn die Probe unrein ist (z. B. Plasma, Serum, Stuhl, Samenflüssigkeit, Sputum, Speichel, Hirnflüssigkeit oder Blut oder eine Probe, die in Paraffin eingebettet ist), kann sie vor Einsetzen eines Verfahrens der Erfindung behandelt werden, häufig, um Verunreinigungen der Komponenten von Interesse zu entfernen. Zu Vorgängen zählen beispielsweise Filtration, Extraktion, Zentrifugation, Affinitätssequestrierung usw. Wenn die Sonden nicht einfach durch eine Zellmembran hindurchgehen, intakt oder permeabilisiert, oder wenn ein Lysat wünschenswert ist, werden die Zellen mit einem Reagens behandelt, das dahingehend wirksam ist, die Zellen, die in den Flüssigkeiten, Geweben oder Tierzellmembranen der Probe enthalten sind, zu lysieren und die darin enthaltenen Proteine freizulegen und, soweit erforderlich, die Proteine zum Teil von anderen Aggregaten oder Verbindungen, wie Mikrosomen, Lipiden, Kohlenhydraten und Nukleinsäuren, in der Probe zu trennen. Verfahren zum Reinigen oder Teilreinigen von Proteinen aus einer Probe sind in der Technik gut bekannt (z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989). Die Proben können von unterschiedlichen Quellen kommen und für unterschiedliche Zwecke verwendet werden.
Gewöhnlich wird ein Proteom analysiert. Mit einem Proteom ist gemeint, dass mindestens etwa 20% des gesamten Proteins von einer biologischen Probenquelle kommen, gewöhnlich mindestens etwa 40%, gewöhnlicher mindestens etwa 75% und im Allgemeinen 90% oder mehr, bis zu und einschließlich des gesamten Proteins, das von der Quelle erhalten werden kann. Somit kann das Proteom in einer intakten Zelle, einem Lysat, einer mikrosomalen Fraktion, einer Organelle, einem zum Teil extrahierten Lysat, biologischer Flüssigkeit oder dergleichen vorliegen. Das Proteom wird ein komplexes Gemisch von Proteinen sein, das im Allgemeinen mindestens etwa 20 verschiedene Proteine, gewöhnlich mindestens etwa 50 verschiedene Proteine und in den meisten Fällen 100 verschiedene Proteine oder mehr aufweist. In der Tat ist das Proteom ein komplexes Gemisch von Proteinen von einer natürlichen Quelle und wird in der Regel beinhalten, das es das Potential hat, 10, gewöhnlich 20 oder mehr Proteine aufzuweisen, bei denen es sich um Zielproteine für eine spezifische Verbindung handelt, die zum Analysieren des Proteomprofils verwendet wird. Die Probe wird für die Zielproteine von Interesse repräsentativ sein. Die Probe kann auf Wunsch auf die entsprechende Pufferkonzentration und den entsprechenden pH-Wert eingestellt werden. Ein oder mehrere Verbindungen mit der Struktur SLA können dann hinzugefügt werden, jedes in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,001 mM bis 20 mM. Nach Inkubieren des Reaktionsgemischs, im Allgemeinen für einen Zeitraum, in dem die Reaktion im Wesentlichen zum Abschluss kommt, im Allgemeinen für etwa 1–60 min, bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20–40°C, kann die Reaktion abgeschreckt werden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist beim Unterstützen der Entwicklung neuer Arzneimittel und Identifizieren (neuer) Arzneimittelziele von Nutzen. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist insbesondere zum schnellen Screenen einer Reihe von Arzneimittelkandidatenverbindungen von Nutzen. Die Erfindung ist außerdem zum systematischen Analysieren einer Reihe von Verbindungen, die sich in Bezug auf ihre chemische Struktur oder Zusammensetzung stark unterscheiden können oder sich in weniger bedeutenden Gesichtspunkten ihrer chemischen Struktur oder Zusammensetzung unterscheiden können, von Nutzen. Die Erfindung ist zudem zum Optimieren von Kandidatenarzneimitteln von Nutzen, die aus medizinischer Sicht die beste Aussicht versprechen, was heißt, dass sie an ein bestimmtes, gewünschtes Ziel und nicht an andere binden. Die Erfindung kann auch zum Messen von enzymatischen Aktivitäten oder biologischen Aktivitäten im Allgemeinen oder der Summe von Expressionsniveaus und Aktivitäten biologischer Moleküle in Gesamtextrakten von Geweben, Zellen, Zellorganellen und Proteinkomplexen verwendet werden. Die Fähigkeit, die toxischen Wirkungen potentieller neuer Arzneimittel vorherzusagen, ist für das Prioritisieren von Verbindungspipelines und Eliminieren teurer Misserfolge bei der Arzneimittelentwicklung von entscheidender Bedeutung. Die Toxikogenomik, die sich vorwiegend mit den Wirkungen von Verbindungen auf Genexpressionsmustern in Zielzellen oder -geweben befasst, entwickelt sich zu einem Schlüsselansatz beim Screenen von neuen Arzneimittelkandidaten, da sie genetische Signaturen offenbaren kann, die zum Vorhersagen der Toxizität in diesen Verbindungen verwendet werden kann. Die aktuelle Erfindung konzentriert sich auf einen Proteomansatz zum Erkennen von Arzneimittelzielen und somit könnte das Verfahren als Toxikoproteomik bezeichnet werden. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung könnte auch für das Design und die Optimierung klinischer Versuche angewendet werden. Mit dem Verfahren ist es möglich, potentiell kleinere klinische Versuche zu entwickeln, die spezifischere Populationen targetieren, von denen wahrscheinlich ist, dass sie auf das Arzneimittel ansprechen, und von denen nicht wahrscheinlich ist, dass sie nachteilige Arzneimittelreaktionen entwickeln. Dadurch könnte die Anwendung des Verfahrens wiederum potentiell die Kosten und den Zeitaufwand, die für klinische Versuche benötigt werden, reduzieren.
Im Folgenden wird eine informativere Beschreibung mehrerer der unterschiedlichen Schritte der Erfindung dargestellt.
I. Herstellung eines Protein/Peptid-Gemischs
Protein/Peptid-Gemische, die von einer Probe stammen, die Proteine umfasst, für eine Verbindung, die mit einer Probe behandelt wird, die Proteine umfasst, werden mittels in der Technik beschriebener Verfahren, wie chemische oder enzymatische Spaltung oder Verdau, erhalten. In einem bevorzugten Gesichtspunkt werden die Proteine und Komplexe aus Verbindung und Protein mit einem proteolytischen Enzym verdaut. Trypsin ist ein besonders bevorzugtes Enzym, da es an den Stellen von Lysin und Arginin spaltet, was geladene Peptide erzielt, die in der Regel eine Länge von etwa 5 bis 50 Aminosäuren und ein Molekulargewicht zwischen etwa 500 und 5000 Dalton aufweisen. Solche Peptide sind besonders zur Analyse mittels Massenspektrometrie geeignet. Zu einer nicht einschränkenden Liste von Proteasen, die in dieser Erfindung verwendet werden können, zählen Lysobacter-enzymogenes-Endoproteinase-Lys-C, Staphylococcus-aureus-Endoproteinase-Glu-C (V8-Protease), Pseudomonas-fragi-Endoproteinase-Asp-N und Clostripain. Proteasen mit niedrigerer Spezifität, wie Bacillus-subtillis-Subtilisin, Prokainpepsin und Tritirachium-album-Proteinase K, können ebenfalls in dieser Erfindung verwendet werden.
Alternativ können auch chemische Reagenzien zum Spalten der Proteine in Peptide verwendet werden. Zum Beispiel kann Bromcyan zum Spalten von Proteinen in Peptide an Methioninresten verwendet werden. Chemische Fragmentierung kann ebenfalls mittels eingeschränkter Hydrolyse unter sauren Bedingungen angewendet werden. Alternativ kann BNPS-Skatol zum Spalten an der Stelle von Tryptophan verwendet werden. Ein zum Teil vorgenommener NH₂terminaler Abbau entweder unter Verwendung chemisch induzierter Leitern mit Isothiocyanat oder unter Verwendung von Aminopeptidase-Behandlung kann ebenso angewendet werden.
II. Chromatographie
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „chromatographischer Schritt" oder „Chromatographie" auf Verfahren zum Trennen chemischer Substanzen und sind in der Technik weit gehend erhältlich. In einem bevorzugten Ansatz macht er von den relativen Raten Gebrauch, mit denen chemische Substanzen von einem sich bewegenden Gas- oder Flüssigkeitsstrom auf einer stationären Substanz adsorbiert werden, bei der es sich gewöhnlich um einen fein verteilten Feststoff, ein Blatt Filtermaterial oder eine dünne Schicht einer Flüssigkeit auf der Oberfläche eines Feststoffs handelt. Chromatographie ist ein vielseitiges Verfahren, das Gemische von Molekülen sogar bei Fehlen detaillierter Vorkenntnis der Anzahl, Beschaffenheit oder relativen Mengen der vorliegenden individuellen Substanzen trennen kann. Das Verfahren wird weit gehend zur Trennung chemischer Moleküle biologischen Ursprungs (beispielsweise Aminosäuren, Fragmente von Proteinen, Peptide, Proteine, Phospholipide, Steroide usw.) und komplexer Gemische von Mineralöl und flüchtiger aromatischer Gemische, wie Duftstoffe und Aromastoffe, verwendet. Die weitest gehend verwendete Säulenflüssigkeitstechnik ist Hochdruckflüssigchromatographie, in der eine Pumpe mit hohem Druck die flüssige mobile Phase durch eine eng gepackte Säule mit hoher Effizienz zwängt. Neuere Überblicke über chromatographische Techniken werden von M. Meyer, 1998, ISBN: 047198373X, und A. Cappiello et al. (2001), Mass Spectrom. Rev. 20(2): 88–104 beschrieben. Andere kürzlich entwickelte Verfahren, die in der Technik beschrieben werden, und neuartige Chromatographieverfahren, die in der Technik zur Verfügung stehen werden, können ebenfalls angewendet werden. Einige Chromatographiebeispiele sind Umkehrchromatographie (reversed Phase chromatography, RP), Ionenaustauschchromatographie, Hydrophobchromatographie, Größenausschlusschromatographie, Gelfiltrationschromatographie oder Affinitätschromatographie, wie Immunaffinitäts- und immobilisierte Metallaffinitätschromatographie.
Chromatographie ist eine von mehreren Trenntechniken. Elektrophorese und alle Varianten wie Kapillarelektrophorese, Freiflusselektrophorese usw. ist ein anderes Mitglied dieser Gruppe. Im letzteren Fall ist die Antriebskraft ein elektrisches Feld, das unterschiedliche Kräfte auf gelöste Stoffe mit unterschiedlicher Ionenladung ausübt. Die Widerstandskraft ist die Viskosität des nicht fließenden Lösemittels. Die Kombination dieser Kräfte ergibt Ionenmobilitäten, die für jeden gelösten Stoff eigen sind. Einige Beispiele sind Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und Nativgelelektrophorese. Zu Kapillarelektrophoreseverfahren zählen Kapillargelelektrophorese, Kapillarzonenelektrophorese, Kapillarelektrochromatographie, Kapillarelektrofokussierung und Affinitätselektrophorese. Diese Techniken sind in P. McKay, An Introduction to Chemistry, Science Seminar, Department of Recovery Sciences, Genentech, Inc., beschrieben.
III. Puffer
Die Verfahren der Erfindung bedingen Kompatibilität zwischen den Trennbedingungen im primären Durchlauf, den Reaktionsbedingungen im Modifizierungsschritt, den Trennbedingungen im sekundären Durchlauf und den Bedingungen zum Analysieren der eluierenden modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid in Analysatoren wie Massenspektrometern. Wie zuvor erwähnt, bestimmt die Kombination der Chromatographiebedingungen in dem primären und dem sekundären Durchlauf und der chromatographischen Verschiebungen, die von der Modifizierungsreaktion induziert werden, die Möglichkeit, die modifizierten Komplexe aus Verbindung und Peptid aus jeder Fraktion, die aus einem Protein/Peptid-Gemisch im primären Durchlauf erhalten wurde, zu isolieren. Wie ebenfalls zuvor erwähnt, sind die Chromatographiebedingungen des primären Durchlaufs und des sekundären Durchlaufs identisch oder im Wesentlichen ähnlich.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform sind Puffer und Lösemittel, die in beiden Chromatographieschritten verwendet werden, mit den Bedingungen kompatibel, die zum Ermöglichen eines effizienten Ablaufs der chemischen und/oder enzymatischen Reaktionen im Modifizierungsschritt zwischen den zwei Chromatographieschritten erforderlich sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Beschaffenheit der Lösemittel und Puffer in dem primären Durchlauf, dem sekundären Durchlauf und dem Modifizierungsschritt identisch oder im Wesentlichen ähnlich. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform sind die Puffer und Lösemittel mit den Bedingungen kompatibel, die zum Durchführen einer massenspektrometrischen Analyse erforderlich sind. Das Definieren solcher Puffer und Lösemittel erfordert ein Abstimmen und Feinabstimmen [und solche Bedingungen stehen im Stand der Technik nicht zur Verfügung].
Für einige Ausführungsformen der Erfindung mit bestimmten Arten modifizierter Komplexe aus Verbindung und Peptid ist es sehr schwierig, wenn nicht unmöglich, einen Satz identischer oder im Wesentlich ähnlicher Puffer und/oder Lösemittel zu entwerfen, der im gesamten Vorgang aus primärem Durchlauf, Modifizierungsschritt, sekundärem Durchlauf und Analyse verwendet werden kann.
Zum Beispiel kann die chemische und/oder enzymatische Reaktion zum Modifizieren der Komplexe aus Verbindung und Peptid im Modifizierungsschritt spezifische Reaktionsbedingungen erfordern, die mit den Puffern, die im primären und/oder sekundären Durchlauf verwendet werden, nicht kompatibel sind. In diesen Fällen werden die Puffer-/Lösemittelbedingungen in den Fraktionen vor dem Modifizierungsschritt und/oder nach dem Modifizierungsschritt geändert, wobei diese Änderung mit Verfahren durchgeführt werden, die in der Technik beschrieben sind, wie beispielsweise einer Extraktion, einem Lyophilisierungs- und Wiederauflösungsschritt, einem Präzipitations- und Wiederauflösungsschritt, einer Dialyse gegen einen adäquaten Puffer/ein adäquates Lösemittel oder sogar einer schnellen Umkehrphasentrennung mit einem steilen Gradienten.
Eine andere Komplikation kann die Zusammensetzung des Puffers/Lösemittels sein, der bzw. das in einem komplexen Proteingemisch oder einem Protein/Peptid-Gemisch vorliegt, bevor der primäre Durchlauf gestartet wird. Die Anwendung eines Vorbehandlungsschritts kann spezifische Puffer-/Lösemittelbedingungen bedingen, die nicht mit dem Puffer/Lösemittel kompatibel sind, um den primären Durchlauf durchzuführen. Alternativ können die Bedingungen zur Herstellung/Isolierung von Proteinen aus ihrer biologischen Quelle in der Verunreinigung der Proteingemische oder Protein/Peptid-Gemische mit Verbindungen, die sich negativ auf die Verbindungsreaktion und/oder den primären Durchlauf auswirken, resultieren. In diesen Situationen wird die Puffer-/Lösemittelzusammensetzung des Proteingemischs oder des Protein/Peptid-Gemischs geändert, um sie mit dem primären Durchlauf kompatibel zu machen. Eine solche Änderung wird mit Verfahren durchgeführt, die in der Technik beschrieben sind, wie beispielsweise einer Extraktion, einem Lyophilisierungs- und Wiederauflösungsschritt, einem Präzipitations- und Wiederauflösungsschritt, einer Dialyse gegen einen adäquaten Puffer/ein adäquates Lösemittel oder sogar einer schnellen Umkehrphasentrennung mit einem steilen Gradienten.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist der Puffer/das Lösemittel des sekundären Durchlaufs nicht mit der Durchführung der Analyse der eluierenden modifizierenden Komplexe aus Verbindung und Peptid kompatibel. In solchen Fällen wird der Puffer/das Lösemittel in den Fraktionen, die aus dem sekundären Durchlauf gesammelt werden, geändert, um die Bedingungen mit der Analyse mit zum Beispiel einem Massenspektrometer kompatibel zu machen. Eine solche Änderung wird mit Verfahren durchgeführt, die in der Technik beschrieben sind, wie beispielsweise einer Extraktion, einem Lyophilisierungs- und Wiederauflösungsschritt, einem Präzipitations- und Wiederauflösungsschritt, einer Dialyse gegen einen adäquaten Puffer/ein adäquates Lösemittel oder sogar einer schnellen Umkehrphasentrennung mit einem steilen Gradienten. Alternativ können die Fraktionen mit den modifizierten Komplexen aus Verbindung und Peptid gesammelt und für eine dritte Reihe Trennungen, hierin im Folgenden als ein ternärer Durchlauf bezeichnet, rekombiniert werden. Dieser ternäre Durchlauf wird derart entworfen, dass die eluierenden markierten oder Identifizierungspeptide mit einem Massenspektrometer analysiert werden können.
Äquivalente
Fachmänner werden viele Äquivalente der spezifischen Ausführungsform der Erfindung, die hierin beschrieben sind, erkennen oder dazu im Stande sein, diese mit nicht mehr als Routineversuchen zu ermitteln. Zum Beispiel kann Chromatographie in vielen Fällen durch Elektrophorese ersetzt werden. Zu Elektrophoresetechniken zählen (Kapillar)-Gelelektrophorese, (Kapillar)-Elektrochromatographie, (Kapillar)-Elektrofokussierung und Affinitätselektrophorese.
Beispiele
1. Die Identifizierung von Arzneimittelzielen

1.1 In einer bestimmten Verbindung befinden sich alle drei Eigenschaften „SLA" in derselben Einheit.

Zum Beispiel bildet die Verbindung Benzoylpenicillin ein Acyl-Enzym-Addukt mit seinem Ziel, der bakteriellen DD-Aminotranspeptidase. Nach proteolytischer Spaltung wird ein Penicilloylpeptid erzeugt. Der Modifizierungsschritt kann in einer Umsetzung des Thioethers in ein Sulfoxidderivat, das hydrophiler ist und sich während des chromatographischen Durchlaufs 2 anders trennt, bestehen.

1.2. In einer bestimmten Verbindung werden die „SLA"-Teile zum Teil getrennt. Der „S"-Teil interagiert mit dem Zielmolekül. Die chemische Vernetzung wird von derselben Gruppe geschaffen. Somit sind „S" und „L" identisch. Die dritte „A"-Gruppe wird modifiziert.

Zum Beispiel könnte das Molekül aus einem Lys enthaltenden Peptid bestehen, das mittels der katalytischen Wirkung einer Transglutaminase wie Faktor XIIIa mit Gln-41 von G-Aktin vernetzt sein kann (es wurde zuvor von einer spezifischen Markierung von G-Aktin an Gln-41 mit Cadaverin oder Cadaverinderivaten mittels Nulllängenvernetzung mit einer Transglutaminase berichtet (Takashi (1988), Biochemistry 27(3): 938)). Die Isopeptid-Verknüpfung, die zwischen Gln-41 von Aktin und dem Lys enthaltenden Peptid erzeugt wurde, ist ähnlich.
Die Sequenz des Verbindungspeptids in der Ein-Buchstaben-Kennzeichnung ist Ac-F-I-E-G-R-A-D-S-K-S-S-COOH weist einen acetylierten freien α-NH₂-Terminus und einen freien COOH-Terminus auf. Gemäß unser „SLA"-Definitionen unterscheiden wir die folgenden Funktionen: Die die Spezifität bestimmende Gruppe („S") besteht aus dem Lys-Rest, der auf beiden Seiten von Ser-Resten flankiert wird. Die Ser-Reste und das Asp, die in den COOH-terminalen Teil integriert sind, tragen weiter zum hydrophilen Charakter (und somit zur Löslichkeit) des endgültigen vernetzten Peptids bei. Sie stehen zudem im Gegensatz zu dem hydrophoben Phe-Ile-Cluster, der sich im äußersten NH₂-Terminus befindet, wodurch ein Gleichgewicht zwischen hydrophob und hydrophil gebildet wird, und der während des Modifizierungsschritts gebrochen wird.
Der Lys-Rest, der die Transglutaminase-Reaktionsspezifität bestimmt, ist zudem der Rest, der an der Nulllängen-Isopeptid-Bildung beteiligt ist. Somit sind hier „S" und „L" dieselben Teile.
Die Faktor-Xa-Restriktionsspaltungsstelle bildet den „A"-Teil der Verbindung und ist räumlich von dem „S-L"-Teil getrennt. Bei Freisetzung mittels Spaltung wird sich die hydrophobe Ac-F-I-E-G-R-Fracht trennen, wobei eine hydrophilere Verbindung immer noch an ihrem Zielpeptid angelagert bleibt. Im sekundären Durchlauf (Durchlauf 2) wird sich dieses hydrophilere Peptid vor die Masse unmodifizierter Peptide schieben.
Dieser Versuch wird in den Beispielen 1.5 und 1.6 ausführlich beschrieben.

1.3 In einer bestimmten Verbindung sind die drei Eigenschaften „SLA" mehr getrennt: Die die Spezifität bestimmende Gruppe „S" interagiert mit dem Zielmolekül, die chemische Vernetzung („L") von einer zweiten Gruppe geschaffen, während eine dritte Einheit („A") einer Modifizierung unterzogen wird. Das resultierende markierte Peptid trägt noch immer die „S"-Einheit oder einen Teil der „S"-Einheit.

Zum Beispiel könnte das Molekül aus dem Caspase-1-inhibierenden Peptidaldehyd Ac-YVAD-CHO bestehen, das im Vergleich zur N-terminalen Seite mit einem kurzen Peptid verlängert ist, das die Faktor-X_a-Restriktionsspaltungsstelle trägt, zum Beispiel:
Ac-A-A-I-E-G-R-Y-V-A-D-CHO. Während die Y-V-A-D-Sequenz das Molekül zu der aktiven Stelle der Caspase-1-Typ-Proteasen („S"-Gruppe) leiten wird, wird der COOH-Terminus, der in ein Aldehyd umgesetzt wurde, die Vernetzung („L"-Gruppe) erzeugen. Der NH₂-terminale Teil des Moleküls kann unter Verwendung von Faktor X_a abgespalten werden.

1.4 In einer Verbindung sind die drei Eigenschaften „SLA" mehr getrennt: Die die Spezifität bestimmende Gruppe „S" interagiert mit dem Zielmolekül. Die Vernetzung wird von einer anderen Einheit in dem Molekül, die mit einem anderen Teil des Ziel reagiert, geschaffen. Die Modifizierung besteht in der Trennung der „S"- und der „L"-Einheit. Der Tag enthält nun keine „S"-Gruppe mehr, sondern die „L"-Gruppe oder einen Teil der „L"-Gruppe.

Zum Beispiel kann Fluorsulfenylbenzoyladenosin, FSBA, einen Komplex mit ATP-Bindeproteinen bilden. FSBA reagiert kovalent mit einem Lysinderivat, das sich im aktiven Zentrum gegenüber der Interaktionsstelle der Adenosyl-Einheit befindet. Der Komplex aus FSBA und Peptid wird bei proteolytischer Spaltung erzeugt. Der Modifizierungsschritt besteht aus einer alkalininduzierten Hydrolyse des Moleküls, wobei nur die Sulfenylbenzoyl-Einheit als Tag an dem Peptid angelagert bleibt. Da von FSBA bekannt ist, dass es ATP-Bindung nachahmt, könnte dieses Verfahren zum Lokalisieren der ATP-Bindungsstelle bzw. ATP-Bindungsstellen in der primären Struktur von Zielproteinen, zum Identifizieren von ATP-Bindeproteinen und zum Profilieren von Kinaseaktivitäten in einem allgemeinen Zellzusammenhang angewendet werden.
1.5 Identifizierung der Zielstelle einer Verbindung in einem gereinigten Protein
In diesem Beispiel wurde gereinigtes Aktin aus Skelettmuskel kovalent mit einem synthetischen, Lys enthaltenden Peptid an der Gln-41-Position von Aktin verknüpft. Das Design und die Sequenz des synthetischen Peptids, hier als „Verbindungspeptid oder VP" bezeichnet, sind in Beispiel 1.2 beschrieben.
Das VP wurde über Nacht in 5-fachem molarem Überschuss gegenüber 10 nmol G-Aktin in 400 μl 5 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM ATP, 1 mM CaCl₂ und 10 mM β-Mercaptoethanol inkubiert. Die Isopeptid-Verknüpfung zwischen dem Lys-9 des VP und Gln-41 des Aktins wurde mittels Katalyse von 0,25 Einheiten Transglutaminase aus Meerschweinchenleber gebildet.
Nach der Inkubation bei 4°C über Nacht wurde das Gemisch durch Kochen für 5 min denaturiert und weiter mit Endoproteinase-Lys-C in dem folgenden Puffer verdaut: 25 mM Tris-HCl, pH 8,5, 1 mM EDTA, mit einem Gewichtsverhältnis von Enzym zu Substrat von 1:50. Der Verdau wurde über 5 h bei 37°C ausgeführt und mittels Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA) bis zu einer Endkonzentration von 0,2% gestoppt. Das Peptidgemisch wurde zentrifugiert und auf eine C-18-Umkehrphasensäule (4,6 mm × 250 mm) geladen (100 μl, was 84 μg (2 nmol) Aktin entsprach). Die Peptide wurden mit einem linearen Acetonitril-Gradienten (Erhöhung von 1,4% pro Minute) in 0,1% TFA (zwecks Einzelheiten siehe 1A) eluiert und mittels UV-Absorption bei 214 nm aufgezeichnet. Das Peptidelutionsprofil des Endo-Lys-C-Verdaus an dem Aktin-Peptid-Konjugat ist in 1A gezeigt. Die Peptide wurden in 5-min- oder 5-ml-Fraktionen gesammelt und mittels Vakuumzentrifugation (Savant Instrument) getrocknet. Jede Fraktion wurde erneut in 400 μl Tris-HCl von 40 mM, pH 7,3, 50 mM NaCl gelöst und mit 0,12 Einheiten Faktor Xa (Promega) behandelt. Nach Verdau für 3 h bei Raumtemperatur wurde TFA zugegeben (Endkonzentration: 0,5%) und auf dasselbe RP-Chromatographiesystem geladen. Von allen analysierten Fraktionen zeigte nur Fraktion 6 ein sich verschiebendes (Schatten-Peak) Peptid (1B).
Elektrospray-Ionisationsmassenspektrometrie, die mit einem Q-TOF-Micromass-Gerät ausgeführt wurde, bestätigte die Masse des vernetzten Peptids (2): abs. MM: 3883,7 (berechn. MM: 3883,9), was dem
entsprach.
Ein Edman-Abbau bestätigte die Sequenz der zwei vernetzten Ketten weiter: Zyklus 1: Ala; Zyklus 2: Gly + Asp; Zyklus 3: Phe + Ser; Zyklus 4: Ala; Zyklus 5: Gly + Ser; Zyklus 6: Asp; Zyklus 7: Asp; Zyklus 8: Ala; Zyklus 9: Pro; mit der ADSXS-Sequenz von dem VP und der AGFAGDDAP-Sequenz, die von der 19-27-Aktin-Sequenz abgeleitet war.
Dieser Versuch zeigte die Möglichkeiten des Verfahrens und demonstrierte zudem, dass die Verschiebung, die von der Freisetzung des NH₂-terminalen Teils des VP induziert wurde, ausreichend groß war, um in dieser Erfindung von Nutzen zu sein.
1.6. Identifizierung der Zielstelle einer Verbindung an einem spezifischen Protein, das in einem sehr komplexen Gemisch wie einem Zelllysat vorliegt.
Jurkat-Zellen wurden mittels Inkubation mit 0,7% CHAPS, 0,5 mM EDTA, 100 mM NaCl, 50 mM Hcps, pH 7,5, und einem Proteaseinhibitormix lysiert. Dieses Extrakt enthielt 2 mg Gesamtprotein/ml. Fünfhundert μl wurden auf einer MAP5-Einwegsäule, die mit 25 mM Tris-HCl, pH 8,5, 1 mM EDTA, äquilibriert worden war, entsalzt. Einem ml des entsalzten Proteingemischs (1 mg) gaben wir 50 μl Acetonitril und 1,5 μg Endo-Lys-C zu. Der Verdau wurde 5 h bei 37°C ausgeführt.
Fünfhundert μl dieses Verdaus wurden mit 30 μl des Aktin-VP-Endolysin-C-Verdaus, das im vorherigen Versuch erzeugt wurde (Beispiel 1.5), gemischt und 200 μl 1%-ige TFA in Wasser wurden zugegeben. Dieses Gemisch wurde zentrifugiert und auf eine RP-Säule von 4,6 mm × 250 mm (Vydac Separations Group) geladen. Die Peptide wurden genau wie in 1A beschrieben eluiert. Nach 10 min wurden Fraktionen zu 2 min (2-ml-Volumen) während zusätzlicher 50 min gesammelt. Um die Anzahl sekundärer Durchläufe zu verringern, poolten wir die Fraktionen wie in Tabelle 1 angezeigt.
Jede der vereinten Fraktionen (A–E) gemäß Tabelle 1 wurde vakuumgetrocknet und mit Faktor Xa verdaut. Diese spezifische Spaltung wurde in 2,5 ml Puffer, der 40 mM Tris-HCl, pH 7,3, 60 mM NaCl und 0,12 Einheiten Faktor-Xa-Protease enthielt, ausgeführt. Nach 2 h wurden 100 μl 1%-ige TFA zugegeben und das Gemisch wurde auf dasselbe Chromatographiesystem wie in 1A geladen.
Die Peptidelution war wie in 1A. Das Peptidelutionsprofil der gepoolten Fraktion D, die die primären Fraktionen 4-9-14-19-24 enthielt, ist in 3A gezeigt. Wir beobachten Peaks, die von den Intervallen 9 und 14 ausgehen. Peak 9*, der vor Intervall 9 eluiert, konnte nicht als ein Peptid identifiziert werden. Peak 9**, der an der nachlaufenden Seite von Intervall 9 eluiert, stammt vom Überschuss des VP, der nicht mit Aktin reagiert. Es ist der NH₂-terminale Teil des VP mit der Sequenz Ac-Phe-Ile-Glu-Glu-Arg. Dies wurde mittels Massenspektrometrie bestätigt.
Von Intervall 14 gibt es einen neuen Peak, der vor der Masse unmodifizierter Peptide auftritt (in Schwarz gezeigt). Dieser Peak wurde mittels Massenspektrometrie und Edman-Abbau (siehe auch 2) als das vernetzte Peptid
identifiziert. Keine anderen Fraktionen zeigten Peptide, die sich während des sekundären Durchlaufs verschoben
Dieser Versuch demonstriert, dass es möglich ist, Regionen, Segmente oder kurze Sequenzen von Proteinen, die kovalent auf Verbindungen targetiert sind, die mit Proteinen mittels der Regionen, Segmente oder kurzen Sequenzen interagieren, spezifisch auszuwählen. Tabelle 1. Fünfundzwanzig Fraktionen, die in der ersten chromatographischen Trennung gesammelt wurden, wurden in fünf Pools (A–E) gesammelt, die jeweils die folgenden Kombinationen primärer Fraktionen enthielten:

Gepoolte Fraktion Nr. Fraktionszahlen des primären Durchlaufs

A 1-6-11-16-21

B 2-7-12-17-22

C 3-8-13-18-23

D 4-9-14-19-24

E 5-10-15-20-25
2. Unterschiedliche Markierung der Komplexe aus Verbindung und Protein

2.1. Die Penicilloyl-Einheit könnte ein Deuterium-, mehr bevorzugt zwei Deuterium-, mehr bevorzugt drei Deuterium-, mehr bevorzugt vier Deuterium-, vorzugsweise mehr als vier Deuteriumatome tragen, die die entsprechende H-Atome in der „leichten" Verbindung ersetzen. Es sollte hier deutlich gemacht werden, dass, obwohl es besser zu sein scheint, für eine genauere relative Quantifizierung große Massendifferenzen zwischen der „leichten" und der „schweren" Spezies zu erzeugen, ebenso klar ist, dass umgekehrt eine gemeinsame Elution oder gemeinsame Migration der „leichten" und der „schweren" Form des markierten Peptids in dem verwendeten Chromatographiesystem mit zunehmender Massendifferenz weniger wahrscheinlich ist. Somit sollte die letztlich verwendete Massendifferenz zum Unterscheiden zwischen „leichten" und „schweren" Verbindungen ein Gleichgewicht zwischen der größten Massendifferenz zur genauen relativen Quantifizierung und Differenzen, die noch immer identische oder sehr ähnliche chromatographische Eigenschaften zur Folge haben, sein.
2.2. Eine oder mehrere der Aminosäuren, die die Caspase-1 inhibierende Aktivität spezifizieren, könnten durch eine äquivalente deuterierte Aminosäure ersetzt werden. Zum Beispiel könnte der Valinrest durch d₇-Valin oder d₈-Valin ersetzt werden. Alternativ könnte der Alaninrest durch d₃-Alanin ersetzt werden. Somit wird in Probe eins die „leichte" Verbindung mit ihren biologischen Zielen verknüpft, während in Probe zwei die gleiche Verbindung, nun jedoch mit einer oder mehreren Aminosäuren, die durch ihre deuterierten Homologa ersetzt wurden, mit den biologischen Zielen verknüpft wird. Die Peptidgemische, einschließlich der Verbindungszielpeptide der Proben eins und zwei, werden gemischt. Die markierten Peptide eluieren gemeinsam und werden gemeinsam in das Massenspektrometer überführt, in dem sie sich aufgrund ihrer Massendifferenzen trennen. Die Ionenintensitäten, die beiden Massen entsprechen, werden zum Berechnen der Verhältnisse von beiden markierten Peptiden, somit von beiden Proteinkonzentrationen oder/und Aktivitätsniveaus verwendet.
2.3. Die unterschiedliche Markierung erfolgt am zweckmäßigsten an der Phenylgruppe, die in dem Sulfenylbenzoyl-Tag von FSBA vorliegt. Diese Gruppe kann vier Deuteriumatome beherbergen. In Analogie zu dem, was in den vorherigen Beispielen beschrieben wird, wird das Proteingemisch 1 mit dem H⁴-FSBA-Reagens (leichtes Reagens) markiert, während das Proteingemisch 1 mit FS4dBA (schweres Reagens) markiert wird. Nach dem Sortieren können sowohl die leichten als auch die schweren markierten Peptide auf Basis der relativen Intensitäten ihrer jeweiligen Ionen nach Trennung mittels Massenspektrometrie verglichen.

Claims

Verfahren zum Isolieren mindestens eines Zielmoleküls einer Verbindung, wobei diese Verbindung eine funktionelle Gruppe umfasst, die chemisch oder enzymatisch oder chemisch und enzymatisch modifiziert sein kann, so dass ein Komplex aus modifizierter Verbindung und Zielmolekül in derselben chromatographischen Trennung anders als seine unmodifizierte Version migriert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Zugeben der Verbindung zu einem komplexen Gemisch von Molekülen, wobei die Verbindung mit mindestens einem der Moleküle stabil interagiert, wodurch ein Komplex aus Verbindung und Zielmolekül gebildet wird, (b) Trennen des resultierenden komplexen Gemischs von Molekülen und Komplexen aus Verbindung und Zielmolekül in mehrere Fraktionen in einem ersten Chromatographieschritt, wobei in einer Fraktion, die von diesem Chromatographieschritt abgeleitet wird, sowohl Moleküle als auch Komplexe aus Verbindung und Zielmolekül gefunden werden, (c) chemisches oder enzymatisches oder chemisches und enzymatisches Modifizieren der Verbindung, die in mindestens einem Komplex aus Verbindung und Zielmolekül in jeder Fraktion vorliegt, und (d) Isolieren mindestens eines Zielmoleküls, das mit der Verbindung interagiert, in einem zweiten Chromatographieschritt, wobei die Chromatographie der Schritte (b) und (d) mit derselben oder einer im Wesentlichen ähnlichen Chromatographieart durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem komplexen Gemisch von Molekülen um ein komplexes Gemisch von Proteinen handelt.
Verfahren nach Anspruch 2, das weiterhin die Spaltung des komplexen Proteingemischs in ein Protein/Peptid-Gemisch, bevor Schritt (b) durchgeführt wird, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem komplexen Gemisch von Molekülen um ein Protein/Peptid-Gemisch handelt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, das weiterhin den Schritt des Identifizierens der Ziele umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zielmoleküle Proteine oder Peptide sind und wobei der Identifizierungsschritt mittels eines Verfahrens durchgeführt wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden besteht: einem Tandem-Massenspektrometrieverfahren, einer Post-Source-Decay-Analyse, einer Messung der Masse der Peptide, in Verbindung mit einer Datenbanksuche.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Identifizierungsschritt, der auf der Massenmessung der Zielpeptide basiert, weiterhin auf einem oder mehreren der Folgenden basiert: (a) der Bestimmung der Anzahl freier Aminogruppen in den Zielpeptiden; (c) der Kenntnis der Spaltungsspezifität der Protease, die zum Erzeugen des Protein/Peptid-Gemischs verwendet wurde; und (d) dem Grand Average der Hydropathie der Zielpeptide.
Verfahren zum Bestimmen des relativen Umfangs der Konzentration und/oder Aktivität mindestens eines Zielpeptids in mehr als einer Probe, die Peptide umfasst, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: (a) die Zugabe einer Verbindung, wobei diese Verbindung eine funktionelle Gruppe umfasst, die chemisch oder enzymatisch oder chemisch und enzymatisch modifiziert sein kann, so dass ein Komplex aus modifizierter Verbindung und Zielpeptid in derselben chromatographischen Trennung anders als seine unmodifizierte Version migriert, und eines ersten Isotops zu einer ersten Probe, die Peptide umfasst, wobei die Verbindung mit mindestens einem Peptid stabil interagiert, wodurch ein Komplex aus Verbindung und Zielpeptid gebildet wird; (b) die Zugabe einer Verbindung, wobei diese Verbindung eine funktionelle Gruppe umfasst, die chemisch oder enzymatisch oder chemisch und enzymatisch modifiziert sein kann, so dass ein Komplex aus modifizierter Verbindung und Zielpeptid in derselben chromatographischen Trennung anders als seine unmodifizierte Version migriert, und eines zweiten Isotops zu einer zweiten Probe, die Peptide umfasst, wobei die Verbindung mit mindestens einem Peptid stabil interagiert, wodurch ein Komplex aus Verbindung und Zielpeptid gebildet wird; (c) Vereinen des Peptid-Gemischs der ersten Probe mit dem Peptid-Gemisch der zweiten Probe; (d) Trennen der vereinten Peptid-Gemische in mehrere Fraktionen in einem ersten Chromatographieschritt, wobei in einer Fraktion, die von diesem Chromatographieschritt abgeleitet wird, sowohl Peptide als auch Komplexe aus Verbindung und Zielpeptid gefunden werden; (e) chemisches oder enzymatisches oder chemisches und enzymatisches Modifizieren der Verbindung, die in mindestens einem Komplex aus Verbindung und Zielpeptid in jeder Fraktion vorliegt; (f) Isolieren der Komplexe aus modifizierter Verbindung und Zielpeptid aus jeder Fraktion in einem zweiten Chromatographieschritt, wobei die Chromatographie der Schritte (b) und (d) mit derselben oder einer im Wesentlichen ähnlichen Chromatographieart wie in Schritt (d) durchgeführt wird; (g) Durchführen einer massenspektrometrischen Analyse der isolierten Komplexe aus modifizierter Verbindung und Zielpeptid; (h) Berechnen der relativen Mengen der Komplexe aus modifizierter Verbindung und Zielpeptid in jeder Probe durch Vergleichen der Peak-Höhen der identischen, jedoch unterschiedlich, isotopenmarkierten Komplexe aus modifizierter Verbindung und Zielpeptid und (i) Bestimmen der Identität der Zielpeptide in den Komplexen aus modifizierter Verbindung und Zielpeptid und von deren entsprechenden Proteinen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Bestimmen der Identität der Komplexe aus modifizierter Verbindung und Peptid mittels eines Verfahrens durchgeführt wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden besteht: dem Tandem- Massenspektrometrieverfahren, der Post-Source-Decay-Analyse, der Messung der Masse der Peptide, in Verbindung mit einer Datenbanksuche.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Bestimmen der Identität der Komplexe aus modifizierter Verbindung und Peptid weiterhin auf einem oder mehreren der Folgenden basiert: (a) der Bestimmung der Anzahl freier Aminogruppen in den Peptiden; (c) der Kenntnis der Spaltungsspezifität der Protease, die zum Erzeugen des Protein/Peptid-Gemischs verwendet wurde; und (d) dem Grand Average der Hydropathie der Peptide.