ES2298612T3 - Metodo para la identificacion de dianas farmacologicas. - Google Patents

Abstract

Método para aislar al menos una molécula diana de un compuesto, compuesto que comprende un grupo funcional que se puede alterar por vía química, o enzimática, o química y enzimática, de manera que un complejo alterado de compuesto-molécula diana migre de forma diferente a su versión inalterada en la misma separación cromatográfica, método que consta de los siguientes pasos: a) añadir dicho compuesto a una mezcla compleja de moléculas donde dicho compuesto interactúa de forma estable con al menos una de dichas moléculas formando un complejo de compuesto-moléculas diana b) separar la mezcla compleja resultante de moléculas y complejos de compuesto-moléculas diana en fracciones múltiples en un primer paso cromatográfico donde en una fracción derivada de dicha fase cromatográfica se hallan tanto las moléculas como los complejos de compuesto-moléculas diana. c) alterar por vía química, o enzimática, o química y enzimática, dicho compuesto presente en al menos un complejo de compuesto-moléculas diana en cada fracción, y d) aislar al menos una molécula diana de las que interactúan con dicho compuesto en un segundo paso cromatográfico, donde la cromatografía de los pasos b) y d) se lleva a cabo con el mismo tipo de cromatografía u otro sustancialmente similar.

Description

Método para la identificación de dianas farmacológicas.

Campo de aplicación de la invención

La presente invención se refiere al campo del desarrollo de los medicamentos. Más concretamente, la invención ofrece un método para la identificación de dianas farmacológicas. El método también se puede usar para el análisis de proteomas. El método utiliza en esencia una combinación de dos separaciones cromatográficas del mismo tipo, separadas por una fase en la que la población de las dianas ligadas a medicamentos está alterada específicamente en el medicamento de forma tal que el comportamiento cromatográfico de la versión alterada de las dianas ligadas a medicamentos en la segunda separación cromatográfica difiere del comportamiento cromatográfico de la versión inalterada. El diferente comportamiento cromatográfico de la versión alterada de las dianas ligadas a medicamentos se usa para el aislamiento y subsiguiente identificación de las dianas.

Ámbito de la invención

Actualmente, en la era post-genoma, se están desarrollando muchas estrategias para el análisis de proteínas. La mayoría de los enfoques tradicionales se concentran en el registro de variaciones en el nivel de proteínas. Estos enfoques reciben normalmente la denominación de "proteómicos". En general, la proteómica pretende medir la abundancia de perfiles de proteínas anchos en complejas mezclas biológicas. En las materializaciones más corrientes, la proteómica supone separar las proteínas en una muestra mediante SDS-PAGE bidimensional. Luego se pueden comparar los esquemas de las manchas de proteína específica de cada uno de estos geles para obtener indicaciones sobre la abundancia relativa de una proteína específica en dos muestras comparativas. El enfoque puede incluso ampliarse para determinar la identidad molecular de las manchas de proteína específica extirpando las manchas y sometiéndolas a una toma de huella dactilar masiva peptídica. Más recientemente se han descrito métodos para eliminar las fases de la electroforesis y ejecutar la proteómica mediante el análisis directo de una mezcla compleja por espectometría de masa. Por ejemplo, los métodos que se describen actualmente en la técnica proporcionan compuestos químicamente reactivos que se pueden hacer reaccionar con una mezcla de proteínas para etiquetar muchas proteínas en esa mezcla de manera no específica, o no dirigida, que ofrece sólo un análisis cuantitativo de las proteínas (Link et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17, 676-682, Gygi et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17, 994-999. Dichos métodos muestran que en una proteína hay muchos residuos de aminoácidos químicamente reactivos que se pueden conjugar con sondas químicas, a través de las cuales se pueden cuantificar a continuación los complejos de proteínas resultantes para producir un indicador de la abundancia de proteínas. En WO 01/77668 se describe el uso de sondas basadas en actividades (ABP) para hallar mediante cribado las proteínas diana de dichas APPs. En esta tecnología, las ABPs van acopladas a un ligando de afinidad que sirve para detectar los complejos de dianas farmacológicas. No obstante, hace falta desarrollar urgentemente métodos que permitan un análisis más detallado de una mezcla compleja de proteínas o incluso de un proteoma entero. Es bien conocido que el control (activación o inhibición) de las actividades proteínicas en una célula se debe a cambios en la estructura de la proteína disponible para otros componentes de la célula. Los cambios de conformación y los movimientos en las zonas de articulación de las proteínas exponen partes específicas de estas proteínas y permite que entren en contacto con compuestos tales como sustratos de enzimas, proteínas adaptadoras y otros componentes como medicamentos. Además, la actividad de los medicamentos se debe a la interacción específica con proteínas que influyen en su actividad biológica. En varios casos se conocen las dianas proteínicas de medicamentos existentes, por ej., la aspirina reacciona con las ciclo oxigenasas, la penicilina es un pseudo sustrato de la transferasa amino glican peptídica de Gram + bacterias, etc. Igualmente, en casos excepcionales, se han diseñado y mejorado medicamentos basándose en la estructura en 3D de la proteína diana. No obstante, en la mayoría de los casos a los componentes con actividades biológicas no se los ha distribuido a sus proteínas diana y por eso no se conoce las dianas de la mayoría de los medicamentos. La identificación fiable de las dianas de los medicamentos existentes o de los medicamentos en desarrollo tendría un enorme valor para la estimación de la especificidad y la predicción de los efectos secundarios de los medicamentos. Además, se sabe que la respuesta interindividual a los medicamentos varía considerablemente. El objetivo del moderno desarrollo de los medicamentos es generar medicamentos personalizados que sean eficientes para categorías de pacientes individuales. La presente invención se refiere a una solución a los problemas mencionados más arriba y da a conocer un método para determinar los socios de interacción de los medicamentos y también el sitio de interacción en la estructura primaria de la proteína diana. Se puede usar el método para estimar una correlación entre la respuesta de la enfermedad a un determinado medicamento con las dianas de éste último identificadas en pacientes individuales o grupos de pacientes. Nuestro método es independiente del uso de etiquetas detectables o de afinidad que se acoplen a los medicamentos, como se explica en WO 01/77668. Además, el método ofrece la ventaja de que las dianas farmacológicas se pueden aislar eficientemente en una fase cromatográfica. Y por último, con la presente invención se puede determinar eficientemente el sitio en la estructura primaria o la diana proteínica a la que se liga el medicamento.

La patente USA 6.027.890 describe un método para detectar el enlace de un primer miembro etiquetado con un segundo miembro de un par de ligandos, que comprende los pasos de combinar un conjunto de primeros miembros etiquetados con una muestra biológica, separando el primer y segundo miembro ligados de los miembros no ligados, y de segmentar la etiqueta del primer miembro etiquetado.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1A): Se incubó actina con un péptido de diana "CP" y se la entrecruzó mediante transglutaminasa. Se digirió los componentes entrecruzados con endo-Lys-C. En la fig. 1A se ve en una columna de fase invertida (operación 1) el perfil de absorción UV de los péptidos endo-Lys-C separados. El disolvente A es 0,1% de TFA, el disolvente B es 70% de actonitrilo en 0,1% de agua TFA. El gradiente del disolvente B aparece indicado. Los péptidos eluyentes se recogen a intervalos de 5 minutos y se secan. B) Se volvió a ejecutar la fracción 6, que contenía el péptido entrecruzado, en las mismas condiciones cromatográficas que la operación 1 tras segmentación específica con factor X_{a}. En la figura 1B se ve el péptido desplazado, con la retícula, delante de la masa peptídica sin modificar (en negro).

Fig. 2: El péptido entrecruzado, que se desplaza delante de la fracción 6 (Fig. 1B), se analizó mediante espectometría de masa de ionización por electrospray. Se ve los iones del péptido con carga diferente, que permiten la determinación de la masa de este dipéptido entrecruzado.

Fig. 3A): Se digirió un lisado total de células Jurkat con endo-Lys-C. Esta mezcla de péptidos se mezcló a su vez con un compendio similar del conjugado de actina-CP. La mezcla de péptidos se separó mediante cromatografía de fase invertida, como en la Fig. 1A. La primera parte del cromatograma se grabó en AUFS 0.1, y la segunda en AUFS 0.2. La elución se recogió en fracciones de 2 minutos. Dichas fracciones se secaron y recombinaron como en la Tabla I antes de ser tratadas con el factor X_{a}.

Fig. 3B): Muestra las huellas UV de los péptidos en el banco D (véase Tabla I). Se aprecian los perfiles de las fracciones primarias 9, 14 y 19. 9* es un pico en elución delante de la masa peptídica. 9** es el péptido Ac-F-I-E-G-R derivado del sobrante de CP y segmentado por el factor X_{a}. Obsérvese un pico (en negrita) que se eluye delante de la fracción 14. Se dieron las mismas condiciones cromatográficas que en el experimento de la figura 1.

Objetivos y descripción detallada de la invención

Se incubó actina con La presente invención ofrece un método alternativo para el aislamiento e identificación de dianas farmacológicas. El método permite también la cuantificación de los niveles de expresión y/o las actividades de las clases de proteínas o/y las enzimas de proteínas en particular o/y las enzimas en un fondo global de lisado de células. El método utiliza en esencia una combinación de dos separaciones cromatográficas del mismo tipo, separadas por una fase en la que la población de las dianas ligadas a medicamentos está alterada específicamente en el medicamento de tal manera que el comportamiento de cromatográfico de las dianas alteradas ligadas a medicamentos es distinto del comportamiento cromatográfico en su versión inalterada. El diferente comportamiento cromatográfico de las dianas alteradas ligadas a medicamentos se usa para el aislamiento y posterior identificación de las dianas.

En una de las materializaciones, la invención ofrece un método para aislar al menos una molécula diana de un compuesto, compuesto que consta de un grupo que puede estar alterado por vía química, o enzimática, o química y enzimática, de manera que un complejo de molécula diana-compuesto alterado migre de forma diferente a su versión inalterada en la misma separación cromatográfica, método que consta de los siguientes pasos:

a) añadir dicho compuesto a una mezcla compleja de moléculas donde dicho compuesto interactúa de forma estable con al menos una de dichas moléculas formando un complejo de moléculas diana-compuesto.

b) separar la mezcla compleja resultante de moléculas y complejos de moléculas diana- compuesto en fracciones múltiples en un primer paso cromatográfico donde en una fracción derivada de dicha fase cromatográfica se hallan tanto las moléculas como los complejos de moléculas diana-compuesto.

c) alterar por vía química, o enzimática, o química y enzimática, dicho compuesto presente en al menos un complejo de moléculas diana-compuestos en cada fracción, y

d) aislar al menos una molécula diana de las que interactúan con dicho compuesto en un segundo paso cromatográfico, donde la cromatografía de los pasos b) y d) se lleva a cabo con el mismo tipo de cromatografía u otro sustancialmente similar.

En otra de las materializaciones, la invención ofrece un método para aislar al menos una proteína diana de un compuesto que consta de un grupo funcional que pueda ser específicamente alterado. Dicho método comprende los siguientes pasos: a) añadir dicho compuesto a una mezcla compleja de proteínas donde dicho compuesto interactúa de forma estable con al menos una de dichas proteínas diana formando un complejo de proteínas- compuestos; b) separar la mezcla compleja resultante de proteínas y complejos de proteínas- compuestos en fracciones múltiples mediante cromatografía; c) alterar por vía química, o enzimática, o química y enzimática, dicho compuesto presente en al menos un complejo de proteínas-compuestos en cada fracción, y d) aislar al menos una proteína diana de las que interactúan con dicho compuesto mediante cromatografía, donde la cromatografía de los pasos b) y d) se lleva a cabo con el mismo tipo de cromatografía.

En otra materialización la invención ofrece un método para aislar al menos un péptido diana de un compuesto constituido por un grupo funcional que se pueda alterar específicamente. Dicho método consta de los siguientes pasos: a) añadir dicho compuesto a una mezcla compleja de proteínas donde dicho compuesto interactúa de forma estable con al menos una de dichas moléculas formando un complejo de proteína-compuesto; b) separar la mezcla compleja resultante de proteínas y complejos de proteínas-compuestos en una mezcla de péptidos y proteínas; c) separar dicha mezcla de péptidos y proteínas en fracciones mediante cromatografía; d) alterar por vía química, o enzimática, o química y enzimática, dicho compuesto presente en al menos un complejo de péptidos-compuestos en cada fracción, y e) aislar al menos un péptido diana de los que interactúan con dicho compuesto mediante cromatografía, donde la cromatografía de los pasos c) y e) se lleva a cabo con el mismo tipo de cromatografía.

En una materialización más, la invención ofrece un método para aislar al menos una diana de un compuesto formado por un grupo funcional que se puede alterar específicamente, donde dicho compuesto se añade directamente a una mezcla de péptidos y proteínas y donde dicho compuesto interactúa de forma estable con al menos un péptido diana, formando un complejo de compuesto-péptido.

En otra materialización, las condiciones cromatográficas usadas son las mismas que en los métodos precedentes o sustancialmente similares. Tal como se usa aquí, una "mezcla de proteínas y péptidos" es típicamente una mezcla compleja de péptidos obtenida como resultado de la segmentación de una mezcla que comprende proteínas. Dicha mezcla es típicamente cualquier mezcla compleja de proteínas como, sin que el ejemplo sea excluyente, un lisado de células procariótidas o eucarióticas o cualquier mezcla compleja de proteínas aisladas de una célula o de una fracción de orgánulo específico, una biopsia, células diseccionadas captadas por láser o cualquier complejo proteínico grande, como ribosomas, virus y similares. Es de esperar que, cuando dichas muestras proteínicas se segmenten en péptidos, contengan fácilmente hasta 1.000, 5.000, 10.000, 20.000, 30.000, 100.000 o más péptidos diferentes. Sin embargo, en algún caso concreto una "mezcla de proteínas y péptidos" también se puede originar directamente de un fluido corporal o, más generalmente, de cualquier solución de origen biológico. Es bien conocido, por ejemplo, que la orina contiene, además de proteínas, una mezcla de péptidos muy compleja que resulta de la degradación proteolítica de proteínas en el cuerpo del que se eliminan las proteínas por vía renal. Un ejemplo más de mezcla de péptido y proteína lo constituye la mezcla de péptidos presentes en el líquido cefalorraquídeo.

El término "al menos una diana de un compuesto" significa que un compuesto concreto interactúa de forma estable con una o más moléculas diana, o con una clase de moléculas. El enlace de un compuesto con la diana es específico, lo que significa que dicho compuesto enlaza al menos con una molécula en una mezcla compleja de moléculas y no con otras moléculas. El complejo suele ser un medicamento, un análogo de medicamento o un derivado de medicamento. Preferiblemente dicho enlace provoca una inactivación total o parcial de la molécula (por ej. inhibe su actividad) y el enlace se da preferentemente en el sitio activo de la molécula (por ej. de una proteína). Como en el enlace se da en el sitio activo de una proteína, el método de la presente invención puede usarse también para el aislamiento de una clase específica de proteínas activas. Activas significa que el sitio activo es accesible para el compuesto, mientras que las proteínas inactivas de la misma clase no quedan aisladas porque el sitio activo no es accesible para el compuesto.

Aquí el "sitio activo" de una proteína se refiere a la zona específica de la superficie de una proteína (por ej. una enzima o receptor) con el que puede enlazar un compuesto (por ej. un sustrato, un ligando, un medicamento, un análogo de medicamento o un derivado de medicamento), lo que da como resultado un cambio de configuración en la proteína. Con respecto al receptor, debido al cambio de conformación, la proteína puede hacerse susceptible a la fosforilación o defosforilación u otros procesos. Con respecto a las otras proteínas, el sitio activo será el/los sitio/s donde el sustrato y/o el cofactor o medicamento, o análogo de medicamento, o derivado de medicamento, se enlace, o donde el sustrato y el cofactor se sometan a una reacción catalítica, o donde dos proteínas formen un complejo (por ej. enlace de dos estructuras kringle, sitios en los que los factores de transcripción enlazan con otras proteínas, sitios en los que las proteínas enlazan con secuencias específicas de ácido nucleico, etc.).

Los "compuestos" de la invención son reactivos químicos que son agentes polifuncionales para enlace no competitivo u sustancialmente irreversible con una molécula diana. Los "compuestos" comprenden pequeños compuestos (orgánicos o inorgánicos), medicamentos ya existentes, medicamentos en desarrollo, derivaciones de medicamentos, análogos de medicamentos o derivados de medicamentos. Un compuesto individual, un subconjunto de compuestos del conjunto completo de compuestos derivado de un banco de compuestos, como por ejemplo un banco establecido mediante química combinatoria. El los términos más generales, el compuesto consta de 1) una estructura química que determina la interacción específica entre dicho compuesto y su molécula diana (la parte "S"), 2) un grupo químicamente reactivo mediante el cual el compuesto y su diana pueden entrecruzarse estrechamente (la parte "L") y 3) un grupo funcional que puede alterarse de manera específica y controlable (la parte "A"). Estas tres propiedades ("S" para especificidad, "L" para entrecruzamiento y "A" para alteración) puede distribuirse de forma diversa por la estructura del compuesto.

Según la invención, un complejo de compuesto-diana se halla alterado por vía química, o enzimática, o química y enzimática, entre las dos separaciones cromatográficas. En una de las materializaciones elegidas, el compuesto es un medicamento, un análogo de medicamento o un derivado de medicamento. Un derivado de medicamento es un medicamento (por ejemplo un medicamento ya existente) al que va unido un grupo extra, como por ejemplo un parte de alteración (parte "A") o un grupo funcional mediante el cual el compuesto y su diana pueden entrecruzarse estrechamente (parte "L"). Dicho grupo "A" o parte "A" es necesario y suficiente para la alteración química o enzimática o química y enzimática entre las dos separaciones cromatográficas.

A fin de distinguir las partes "S", "L" y "A" de una molécula diana de la notación de una letra de los aminoácidos Ser (S), Leu (L) y Ala (A) usada en la descripción de la invención, se usará S, L y A para definir sus correspondientes aminoácidos, y "S", "L" y "A", o parte "S", parte "L" y parte "A", o fracción "S", fracción "L" y fracción "A" para indicar entidades funcionales dentro de los compuestos. "S", que determina la especificidad de la reacción; "L", que determina el grupo responsable de la creación el covalente o vínculo estrecho entre compuesto y molécula diana, y "A", que determina el grupo que se puede alterar específicamente.

Mientras "S", "L" y "A" sean entidades diferentes dentro del compuesto, pueden compartir idénticas funciones, bien en parejas o bien los tres juntos.

En los siguientes ejemplos aparecerán diferentes componentes "SLA".

La parte determinante de la especificidad (la parte "S") del compuesto consta de un grupo funcional o de un ensamblaje de grupos funcionales formado por una fracción que interactúa con una determinada configuración de la diana (por ej. el sitio activo de una enzima). A causa de esta interacción, el compuesto completo entra en estrecho contacto con la diana, permitiendo que se establezca el enlace a concentraciones razonables del compuesto. Es bien sabido que si aumentan las concentraciones del compuesto disminuye la especificidad. Por lo tanto, la parte "S" del compuesto debe interactuar con su diana en condiciones fisiológicas relevantes. En algunas situaciones, la parte "S" del compuesto es capaz de distinguir la diana activa de la inactiva, lo que significa que ciertos componentes (por ej. los medicamentos) sólo tienen como diana formas activas de proteínas o que, más raramente, otros sólo tienen como diana proteínas inactivas. En otras situaciones significa la configuración de la/s proteína/s diana, mediante la cual, con una funcionalidad reactiva u otra que requiera activación, la reacción predominante estará en el sitio activo. El compuesto también contiene un grupo químicamente reactivo(parte "L") que reacciona con una funcionalidad presente en la proteína diana. El enlace ideal entre dicho compuesto y su diana debe ser de naturaleza covalente. Sin embargo, puede valer cualquier enlace que sea suficientemente fuerte y resistente contra todos los tratamientos químicos y/o enzimáticos, contra los disolventes y tampones usados en todos los pasos cromatográficos y contra todos los demás pasos seguidos en todo el procedimiento de clasificación. Dicho enlace no covalente, pero suficientemente fuerte, puede formarse, por ejemplo, entre grupos cis-hidroxilo coplanares y derivados del ácido borónico. La parte "L" puede incorporarse a la parte "S" del compuesto, por ejemplo para los inhibidores suicidas de enzimas, como la penicilina, el 5-fluoracil o el inhibidor de caspasa-1. El grupo determinante de la especificidad y el grupo de enlace no tienen necesariamente por qué estar presentes en la misma fracción, pero pueden estar parcialmente separados en la estructura del compuesto. Esto aparece representado en el ejemplo 1.4, donde la parte "S" y la parte "L" se hallan en contacto con diferentes superficies en la proteína diana. Dicho grupo químicamente reactivo puede ser un grupo fotoactivable, como una diazocetona, una arilazida, una arilcetona, un arilmetilhaluro etc., uno de los cuales puede enlazar no selectivamente con una proteína diana, pero que es trasladada por la parte "S" a un sitio específico de la proteína diana. Dicho grupo químicamente reactivo puede constar de un grupo funcional con selectividad más alta. Selectividad para aminogrupos como los amidatos, el anhídrido de ácido succínico y similares; para grupos SH como la metilmaleimida o los acetilhaluros y similares. Dichos grupos químicamente reactivos pueden formar enlaces que después se pueden romper. Por ejemplo, los enlaces formados entre el anhídrido de ácido maleico y los aminogrupos se puede romper mediante tratamiento ácido. Dichos enlaces entre la parte "L" y la proteína diana pueden formarse mediante catálisis enzimática. Por ejemplo, se pueden formar enlaces entre una cadena lateral de glutamina en la diana y un grupo de lisina de NH_{2} en el compuesto por la acción de una transglutaminasa.

En materializaciones concretas, la molécula diana biológica es un polipéptido, un ácido nucleico, un hidrato de carbono, una nucleoproteína, un glucopéptido o un glucolípido, preferiblemente un polipéptido, que puede ser, por ejemplo, una enzima, una hormona, un factor de transcripción, un receptor, un ligando péptido para un receptor, un factor de crecimiento, una inmunoglobina, un receptor esteroide, una proteína nuclear, un componente de transducción de señal, un regulador de enzima alostérica y similares. La diana biológica puede ser también una clase o familia de polipéptidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, glucopéptidos o glucolípidos, preferiblemente una clase de proteínas como las hidrolasas, las deshidrogenasas, las ligasas, las transferasas y las proteínas que enlazan unas con otras o con otras estructuras biológicas.

El término "alterar" o "alterado" o "alteración", tal como se usa aquí en relación con un complejo de compuesto-diana (por ej. una interacción medicamento-proteína), se refiere a la introducción de una modificación específica en el compuesto (por ej. un medicamento) con la clara intención de cambiar el comportamiento cromatográfico de tal complejo de compuesto-diana que contiene dicho compuesto alterado. La alteración suele darse en la parte "A" del compuesto (parte de alteración), pero también puede tener lugar en la parte "S" o "L" del compuesto (parte de especificidad o de enlace). Dicha alteración puede ser una modificación enzimática o química estable. Dicha alteración puede introducir también una interacción transitoria con una molécula. La alteración será típicamente una reacción covalente; no obstante, la alteración puede constar también de una formación compleja entre el compuesto enlazado con la diana, siempre y cuando este complejo sea lo bastante estable durante el proceso cromatográfico. La alteración da típicamente como resultado un cambio en la hidrofobicidad o carga neta, de manera que el compuesto-diana alterado migra de forma diferente a su versión inalterada en la cromatografía de fase invertida. Si no es así, la alteración da como resultado un cambio en la carga neta de un complejo de compuesto-diana, de manera que el compuesto-diana alterado migra de forma diferente a su versión inalterada en la cromatografía de intercambio de iones, como un intercambio de iones o una cromatografía de intercambio de cationes. Como alternativa, se puede lograr igualmente un cambio específico en la carga neta de un complejo de compuesto-diana mediante sistemas electroforéticos, más concretamente mediante electroforesis capilar. Igualmente, la alteración puede ser la segmentación de una parte del complejo de medicamento-diana, por ejemplo la parte "A" del complejo de compuesto-diana. Igualmente, la alteración puede dar como resultado cualquier otro cambio bioquímico, químico o biofísico en un complejo de compuesto-diana, de manera que el compuesto-diana alterado migra de forma diferente a su versión inalterada en una separación cromatográfíca. Los términos "migra de forma diferente" significan que un complejo concreto de compuesto alterado-diana eluye a diferente tiempo de elución en la operación 2 con respecto al tiempo de elución del mismo complejo de compuesto inalterado-diana en la operación 1. Dichas alteraciones pueden provocar un desplazamiento bien hacia delante o bien hacia atrás del complejo clasificado en la operación secundaria. El paso de alteración debe ser más específico para el complejo de compuesto-diana y no debe tener lugar en más de uno en más de un conjunto limitado de péptidos que no llevan el compuesto. En este caso el complejo de compuesto alterado-diana se puede diferenciar de los péptidos alterados por análisis diferencial. Preferiblemente, el paso de alteración es altamente específico para el complejo de compuesto-diana y no tiene lugar en ningún otro péptido que no lleve el compuesto.

La alteración puede obtenerse por reacción química, o por reacción enzimática, o por una combinación de reacción química y enzimática del compuesto. Una lista no exhaustiva de reacciones químicas estaría formada por alquilación, acetilación, nitrosilación, oxidación, hidroxilación, mutilación, reducción, hidrólisis (básica o ácida) y similares. Una lista no exhaustiva de reacciones enzimáticas estaría formada por el tratamiento del complejo de compuesto-diana con fosfatasas, acetilasas, glucosidasas, proteinasas específicas u otras enzimas que modifiquen las modificaciones co- o post-translacionales presentes en los compuestos. La alteración química puede constar de una reacción química, pero también puede constar de más de una reacción, como por ejemplo dos reacciones consecutivas, a fin de aumentar la eficiencia de la alteración. De forma análoga, la alteración enzimática puede constar de una o más reacciones enzimáticas. Dicha alteración se aplica entre medias de dos separaciones cromatográficas del mismo tipo.

El producto alterado resultante ideal debe ser un péptido que lleve una molécula alterada (una etiqueta) en el sitio del covalente original o enlace estrecho. La etiqueta ideal debe ser pequeña y contener un número limitado de átomos a fin de permitir un análisis e identificación rápidos y precisos. Un aspecto aún más ideal de dicha etiqueta, aunque no absolutamente necesario, es que contenga un grupo funcional que pueda etiquetarse bien con isótopos pesados o bien con ligeros que faciliten el análisis diferencial cuantitativo por espectrometría de masa.

Los términos "interactúa de forma estable" se refieren a la interacción entre un compuesto (por ej. un medicamento o un derivado de medicamento) añadido a una mezcla compleja de moléculas (por ej. una mezcla compleja de proteínas o una mezcla de proteínas y péptidos). Dicha interacción es lo bastante fuerte para aislar un socio para dicho compuesto, en otras palabras, una molécula diana para dicho compuesto. La interacción es suficientemente estable durante las dos separaciones cromatográficas. En una materialización en particular, dicha interacción es una interacción covalente.

El mismo tipo de cromatografía significa que el tipo de cromatografía es el mismo tanto en la separación inicial como en la segunda separación. El tipo de cromatografía, por ejemplo, se basa en ambas separaciones en la hidrofobicidad de las moléculas (por ej. péptidos) y complejos de compuesto-molécula. De forma análoga, el tipo de cromatografía puede basarse en ambos pasos en la carga de las moléculas (por ej. péptidos) y el uso de la cromatografía de intercambio de iones o electroforesis capilar. En otra alternativa más, la separación cromatográfica se basa en ambos pasos en una cromatografía de exclusión por el tamaño o cualquier otro tipo de cromatografía.

La primera separación cromatográfica, antes de la alteración, se denominará de aquí en adelante "operación primaria", o "paso cromatográfico primario", o "separación cromatográfica primaria", u "operación 1". La segunda separación cromatográfica de las fracciones alteradas se denominará de aquí en adelante "operación secundaria", o "paso cromatográfico secundario", o "separación cromatográfica secundaria", o "operación 2".

En una de las materializaciones de la invención elegidas, las condiciones cromatográficas de la operación primaria y la operación secundaria son idénticas o, para los experimentados en la técnica, sustancialmente parecidas. Sustancialmente parecidas significa por ejemplo que se toleran pequeños cambios entre la operación 1 y la operación 2 en el flujo y/o el gradiente y/o la temperatura y/o la presión y/o las partículas cromatográficas y/o la composición del disolvente siempre y cuando las condiciones cromatográficas lleven a la misma o previsible elución de las moléculas inalteradas en la operación 2 y a una elución de los complejos de compuesto alterado-diana (por ej. complejos de medicamento alterado-proteína o de medicamento alterado-péptido) que es previsiblemente distinta de los complejos de molécula inalterada-diana, y esto para cada fracción recogida de la operación 1. Los complejos de compuesto alterado-diana tienen un comportamiento cromatográfico diferente en la operación 2. La alteración provoca un desplazamiento de los complejos de compuesto alterado-diana. A causa de este desplazamiento los complejos de compuesto alterado-diana se eluyen en una operación 2 de posicionamiento diferente en comparación con la operación 1, y por consiguiente dichos complejos pueden aislarse e identificarse (véase más abajo en este mismo documento).

En un ejemplo concreto donde se intenta determinar las dianas proteínicas de un compuesto en particular, tras añadir dicho compuesto a una mezcla de proteínas y péptidos y separar en fracciones dicha mezcla tratada de proteína y péptido mediante un paso cromatográfico primario, la presente invención requiere que la alteración de los complejos de compuesto-péptido sea efectiva en cada una de las fracciones de péptido de la operación primaria. En una fracción derivada de cada dicha operación primaria (en un primer paso cromatográfico) se pueden encontrar péptido y complejos de compuesto inalterado-péptido. Por lo tanto, en cada fracción obtenida del paso cromatográfico primario, los complejos de compuesto alterado-péptido tienen que migrar claramente de los complejos de compuesto inalterado-péptido en el paso cromatográfico secundario. La alteración de la parte del compuesto de los complejos de compuesto-péptido provoca un desplazamiento en la elución de dicho complejo de compuesto alterado-péptido. Dependiendo del tipo de alteración aplicada, el desplazamiento puede estar causado por un cambio de hidrofobicidad, la carga neta y/o la afinidad hacia un ligando (por ej. un ion metálico) de los complejos de compuesto alterado-péptido. Este desplazamiento recibe el nombre de dp y es específico para cada complejo de compuesto alterado-péptido en particular. En el ejemplo de un cambio de hidrofobia, los valores dp se pueden expresar como cambios en el momento hidrófobo, o como porcentaje de disolventes orgánicos en ejecuciones cromatográficas, pero lo más práctico es en unidades de tiempo bajo condiciones cromatográficas/electroforéticas. Por lo tanto, dp no es necesariamente idéntico para cada complejo de compuesto alterado-péptido y oscila entre \delta_{max} y \delta_{min}. \delta_{p} es afectado por una serie de factores, como la naturaleza de la alteración provocada, la naturaleza de la fase estacionaria de columna, la fase móvil (tampones, disolventes), la temperatura y otros. Todos los valores dp juntos señalan los extremos de \delta_{max} y \delta_{min}. Dados t1 y t2, los tiempos que señalan el comienzo y el final del intervalo de los complejos de compuesto alterado desplazado-péptido, y t3 y t4, los tiempos que engloban al fracción tomada del primer paso, entonces \delta_{min} (el desplazamiento mínimo) se determinará mediante t3 - t2, mientras que \delta_{max} (el desplazamiento máximo) se determinará mediante t4 - t1. La ventana w1 es la ventana de fracción en la que los péptidos no modificados se eluyen en la operación secundaria w1 = t4 - t3. La ventana w2 es la ventana de fracción en la que los complejos de compuesto alterado-péptido se eluirán w2 = t2 - t1. Por lo tanto, \delta_{min} = t3 - t2; \delta_{max} = t4 - t1; w1 = \delta_{max} + t1 - \delta_{min} - t2 y w2 = t2 - t1 = \delta_{max} - \delta_{min} - w1. En el proceso de clasificación son elementos importantes: \delta_{min}, que señala la distancia entre el complejo inalterado y el menos desplazado de los complejos de compuesto alterado-péptido en una fracción dada, y w2, la ventana de tiempo en la que se eluyen complejos de compuesto alterado-péptido. La palabra "clasificado" es en esta invención equivalente a la palabra "aislado", \delta_{min} tiene que ser suficiente para impedir que los complejos de compuesto alterado-péptido se eluyan en la ventana w1 (y por consiguiente se superpongan a los complejos de compuesto inalterado-péptido). Esta regla debe aplicarse a cada fracción recogida de la operación primaria. Preferiblemente, \delta_{min} debe ser w1 o mayor a fin de minimizar la superposición entre complejos de compuesto alterado e inalterado-péptido. Por ejemplo, si w1 = 1 minuto, \delta_{min} debe ser preferiblemente 1 minuto o más. Al evitar la superposición o co-elución de los complejos de compuesto alterado-péptido aumentan las posibilidades de identificar un número óptimo de complejos individuales de compuesto alterado-péptido. Desde este punto de vista, el tamaño de la ventana w2 tiene incidencia en el número de complejos de compuesto alterado-péptido que pueden identificarse. En w2, valores mayores dan como resultado una descompresión del tiempo de elución del complejo de compuesto alterado-péptido, proporcionando un mejor aislamiento de los complejos de compuesto alterado-péptido y una mejor oportunidad para el análisis, al presentar gradualmente las dianas (complejos de compuesto alterado-péptido) para su identificación mediante analizadores como espectrómetros de masa. Aunque la ventana w2 puede ser menor que w1, en una de las materializaciones elegidas w2 será mayor que w1. Por ejemplo, si w1 = 1 minuto, w2 puede ser 1 minuto o más. Es preferible que el tamaño de w2 y el valor de \delta_{min} y \delta_{max} sean idénticos o muy parecidos para cada fracción recogida de la operación primaria. No obstante, es preferible, obviamente, que no haya contaminaciones menores de complejos de compuesto inalterado-péptido en la ventana de elución de los complejos de compuesto alterado-péptido, aunque es aceptable. La manipulación de los valores de \delta_{min}, \delta_{max} y w2 para obtener una separación óptima de los complejos de compuesto alterado-péptido de los complejos de compuesto inalterado-péptido en cada fracción de la operación primaria es parte de la presente invención y comprende, entre otros, la correcta combinación del compuesto seleccionado para alteración, el tipo de alteración y las condiciones cromatográficas (tipo de columna, tampones, disolvente, etc.) Aunque ya se han desarrollado más arriba los aspectos del desplazamiento hidrófilo, también se puede proporcionar una descripción parecida cuando se provoque un desplazamiento hidrófobo con el fin de separar los complejos de compuesto alterado-péptido de los complejos de compuesto inalterado-péptido. Aquí t3 y t4 definen la ventana w1, en la que se eluyen los complejos de compuesto inalterado-péptido, mientras que t5 y t6 definen la ventana w2, en la que se eluyen los complejos de compuesto alterado-péptido. El desplazamiento hidrófobo \delta_{max} máximo = t6 - t3, el desplazamiento mínimo = t5 - t4. Hay que advertir que se puede usar parecidos cálculos para condiciones en las que las fracciones están reunidas.

Resultará evidente para los experimentados en la técnica que se puede aplicar este mismo enfoque para aislar complejos de compuesto-péptido con, por ejemplo, cromatografía de intercambio de iones u otro tipo de cromatografía.

De este modo, en caso de una mezcla compleja de péptidos (por ej. una mezcla de proteínas y péptidos) en la que el compuesto sólo está ligado a un péptido diana o a un número limitado de péptidos diana, mientras que la inmensa mayoría de péptidos no está conjugada en el compuesto, el proceso de clasificación es como sigue: primero se separa la mezcla total de péptidos en el paso cromatográfico primario. Los péptidos eluyentes se recogen en un número apropiado de fracciones. Luego se ejecuta el paso de la alteración, por ejemplo en la parte "A" de los complejos compuesto-péptido presentes en cada fracción recogida. En principio cada fracción está sujeta a un segundo paso cromatográfico. Los péptidos ligados al compuesto (las llamadas mezclas de compuesto-péptido) resultarán alterados y mostrarán un desplazamiento cromatográfico. Los péptidos no ligados al compuesto se eluirán durante la operación 2 en la misma posición predecible que en la operación 1. Como cada fracción de la operación 1 ocupa sólo un fragmento del protocolo de separación total de la operación 2, podemos combinar múltiples fracciones de la operación 1 para clasificarlas en la operación 2. La fracciones se combinan de forma que los péptidos clasificados (aquí los complejos compuesto-péptido) no se superponen a los péptidos inalterados de las fracciones contiguas. Así, en otra materialización más, la invención va dirigida al uso de un dispositivo de clasificación que es capaz de ejecutar el método de la invención. Como ejemplo no excluyente cuando las moléculas de la invención sean proteínas o péptidos, el método puede constar de dos pasos cromatográficos consecutivos: un paso cromatográfico primario mediante, por ejemplo, una mezcla de proteínas y péptidos (a la que se haya añadido un compuesto que lleve un grupo funcional que pueda alterarse, con una especificidad hacia un péptido o grupo de péptidos concreto) que divide dicha mezcla en fracciones, y un segundo paso cromatográfico que se ejecuta después de la alteración específica química y/o enzimática de al menos un complejo de compuesto-péptido presente en las fracciones. Como se explica en este documento, los términos "clasificador de péptidos" se refiere a un dispositivo que separa eficientemente los complejos de compuesto alterado-péptido de los complejos no alterados. En un aspecto elegido, en los dos pasos cromatográficos se usan condiciones cromatográficas idénticas o muy parecidas, de manera que durante el segundo paso los complejos de compuesto inalterado-péptido permanecen en sus tiempos de elusión originales y los complejos de compuesto alterado-péptido son inducidos a experimentar un desplazamiento en el tiempo de elusión. Además, en otro aspecto elegido, suponemos que la alteración de las mezclas de compuesto-péptido se da casi en su totalidad. Como se explica en el documento, el uso de, por ejemplo, un clasificador de péptidos se refiere especialmente a la reunión de fracciones obtenidas después del paso 1 y la organización óptima del segundo paso cromatográfico (por ej. el paso en que los complejos de compuesto alterado-péptido se separan de los complejos inalterados para acelerar el aislamiento de los complejos de compuesto alterado-péptido de cada una de las fracciones del paso 1). Una forma de aislar e identificar complejos de compuesto alterado-péptido aislados de una mezcla de de proteína y péptido es recoger independientemente cada fracción de la separación cromatográfica primaria, llevar a cabo la alteración química y/o enzimática en los complejos de compuesto-péptido en cada una de las fracciones y volver a ejecutar cada fracción independientemente en las mismas condiciones cromatográficas y en la misma columna u otra sustancialmente similar. A continuación se recoge los complejos de compuesto alterado-péptido de cada operación secundaria realizada independientemente y pasan a un instrumento analítico, como un espectrómetro de masa. Sin embargo, dicha forma requiere una considerable cantidad de tiempo de cromatografía y ocupa un gran espacio de tiempo de funcionamiento en el espectrómetro de masa. Con el fin de lograr un uso más eficiente y económico tanto del equipo cromatográfico como del espectrómetro de masa, la presente invención proporciona el uso de clasificadores de péptidos que permiten la reunión de varias fracciones de la separación cromatográfica primaria impidiendo al mismo tiempo la superposición de la elución entre complejos de compuesto alterado-péptido que se originan de diferentes fracciones, y entre complejos de compuesto alterado-péptido de una fracción y péptidos de otra u otras fracciones más. En cada fracción obtenida del paso cromatográfico primario, complejos de compuesto alterado-péptido se eluyen separadamente de los complejos inalterados. Cuando varias fracciones de la operación primaria se combinan (reúnen), es importante que durante la segunda operación con las fracciones reunidas los complejos de compuesto alterado clasificado-péptido de una fracción seleccionada no se co-eluyan con los péptidos (inalterados) de una de las fracciones previas. La elección del número de bancos dependerá, entre otros factores, de: i) el desplazamiento dp del intervalo provocado por la alteración química y/o enzimática, ii) la ventana de elución de las fracciones recogidas de la separación cromatográfica primaria y iii) la necesidad de optimizar el tiempo de cromatografía y el tiempo de análisis. La presente invención también suministra el uso de un clasificador de columnas en paralelo. Con un clasificador de columnas en paralelo, el método basado en columna simple se ejecuta con una serie de columnas que operan en paralelo (esto es, sincronizadamente). El clasificador en paralelo contiene una serie de columnas idénticas que se ejecutan exactamente en las mismas condiciones (tasa de flujo, gradiente, etc.) Un clasificador de columnas en paralelo es preferentemente un dispositivo donde 2, 3, 4 o más columnas realizan una operación cromatográfica secundaria al mismo tiempo en básicamente las mismas condiciones (tasa de flujo, gradiente, etc.) y donde la salida del clasificador en paralelo va conectada directamente a un analizador. Un clasificador de columnas en paralelo divide el tiempo de separación cromatográfica que se necesita normalmente para una serie de columnas simples en serie entre el número aproximado de columnas que se usan en dicho clasificador en paralelo. La ventaja de usar un clasificador de columnas en paralelo no sólo consiste en que se puede reducir significativamente el tiempo total de clasificación de complejos de compuesto-péptido, sino también que hay un número limitado de intervalos muertos entre la selección de complejos de compuesto alterado-péptido de las fracciones alteradas para que la detección de los complejos de compuesto alterado-péptido pueda darse de manera continuada. En otro aspecto de la invención, se puede usar un clasificador de péptidos de multi-columna. Dicho clasificador de péptidos de multi-columnas se crea y existe básicamente por una serie de clasificadores de columnas en paralelo que operan en modo combinado paralelo y en modo en serie. Dicho clasificador en paralelo comprende básicamente y veces un conjunto de z columnas, donde las z columnas van conectadas en paralelo. En un ejemplo no excluyente, un clasificador de multi-columna donde y=3 y z=3 es un clasificador de nueve columnas. Dicho clasificador de nueve columnas opera con tres conjuntos de tres columnas conectadas en paralelo cada uno. Los tres conjuntos de columnas en paralelo se denominan A, B y C. Las columnas individuales de A se denominan I, II y III, las columnas individuales de B se denominan I', II' y III' y las columnas individuales de C se denominan I'', II'' y III''. Un conjunto de columnas en paralelo funciona con un retardo (llamado q) con respecto al conjunto precedente. Por lo tanto, el clasificador en paralelo B comienza con un retardo de q con respecto al clasificador en paralelo A, y el clasificador en paralelo C comienza con un retardo de q tras el inicio del clasificador en paralelo B y con un retardo de 2q tras el inicio del clasificador en paralelo A. Es importante advertir que en el clasificador de multi-columna, sólo una fracción de la operación 1 de los complejos alterados de compuesto-péptido se procesa a un tiempo dado por columna. De este modo, en el ejemplo de un clasificador de nueve columnas, se procesan simultáneamente nueve fracciones de complejos alterados compuesto-péptido. Esto difiere de los dos clasificadores descritos más arriba (esto es, un clasificador de péptidos de una columna y un clasificador en paralelo) donde varias fracciones alteradas se reúnen y cargan simultáneamente. Como sólo se procesa cada vez una fracción de complejos alterados compuesto-péptido en el clasificador de multi-columna, el control de la precisión de la tasa de flujo (esto es, en el paso cromatográfico secundario) no es tan importante como en los clasificadores anteriores. Otra ventaja del clasificador de multi-columna es que está bien adaptado a complejos alterados compuesto-péptido separados de complejos inalterados en casos en que el desplazamiento cromatográfico de complejos alterados compuesto-péptido varía significativamente en todas las diferentes fracciones. Los experimentados en la técnica advertirán en seguida que con otras combinaciones de columnas en serie y en paralelo se puede obtener resultados parecidos. La elección del número de columnas, su disposición y las fracciones cargadas en las columnas dependerán, entre otros factores, de: i) el dp del intervalo provocado por la alteración química o enzimática, ii) la ventana de elución de las fracciones recogidas de la primera separación cromatográfica primaria y iii) la necesidad de optimizar el tiempo de cromatografía y el tiempo de análisis. Los experimentados en la técnica advertirán además que los clasificadores de péptidos que llevan a cabo el método de la presente invención pueden operar también de manera totalmente automática, mediante auto-inyectores disponibles en el mercado, equipo HPLC y colectores de fracción automatizados. Por lo tanto, los presentes ejemplos de clasificadores de péptidos no deben considerarse como exhaustivos. Hay diversas variantes que son igualmente factibles, incluidos sistemas de cromatografía electroforética y por intercambio de iones. La materialización ilustrativa suministra además un sistema para ejecutar el método de análisis de proteoma descrito más arriba de manera selectiva y eficiente. Como se ha explicado, una columna cromatográfica primaria efectúa una separación inicial de la mezcla compleja de péptidos en al menos dos fracciones bajo un conjunto bien definido de condiciones. Por ejemplo, la columna cromatográfica primaria separa la mezcla de proteínas y péptidos eluyendo la columna con un gradiente predeterminado de disolvente y una tasa de flujo predeterminada. Las fracciones resultantes de la separación cromatográfica primaria pueden reunirse estratégicamente para combinar una pluralidad de fracciones que tengan distintos tiempos de elución en una pluralidad de fracciones reunidas, como se explica más arriba. Las fracciones reunidas pueden alterarse a continuación y dar como resultado un conjunto de péptidos alterados y un conjunto de péptidos inalterados para cada fracción. Según una materialización alternativa, las fracciones primero se alteran mediante los métodos explicados más arriba y luego se reúnen estratégicamente en un conjunto de fracciones reunidas, donde cada fracción en una fracción reunida comprende un conjunto de complejos alterados compuesto-péptido y un conjunto de complejos inalterados compuesto-péptido. En una separación cromatográfica secundaria, los complejos alterados se separan de los complejos inalterados. Las dianas aisladas (= los complejos alterados compuesto-péptido) pueden analizarse entonces para identificar una proteína.

En otra materialización, la presente invención suministra además un método para identificar las dianas aisladas (= los complejos alterados compuesto-péptido). En una materialización en particular, la identificación de las dianas puede efectuarse mediante un enfoque espectrométrico de masa.

En otra materialización en concreto, donde las moléculas diana son proteínas o péptidos, dicho paso de identificación se ejecuta mediante un método seleccionado del grupo formado por: un método de espectrometría de masa tándem, un análisis de Degradación Post-Source y la medición de la masa de los péptidos, en combinación con la búsqueda en bases de datos. En otra materialización específica más, el método de identificación basado en la medición de la masa de los péptidos se basa además en uno o varios de los siguientes factores: a) la determinación del número de grupos aminados libres en los péptidos diana; c) el conocimiento de la especificidad de segmentación de la proteasa usada para generar la mezcla de proteínas y péptidos, y d) la media total de la hidropatía de los péptidos diana.

En una materialización en concreto, las dianas son proteínas o péptidos, por lo que el método de la invención va emparejado además a un análisis de péptidos. Por consiguiente, la presente invención ofrece además un método para identificar péptidos diana y sus correspondientes proteínas. En un enfoque elegido, el análisis de complejos alterados de medicamento-péptido se lleva a cabo mediante espectrómetro de masa. No obstante, los complejos de medicamento-péptido también se pueden analizar e identificar mediante otros métodos, como la electroforesis, la medida de actividad en ensayos, el análisis con anticuerpos específicos, la secuenciación Edman, etc. El paso del análisis o la identificación se puede llevar a cabo de diferentes maneras. Una de ellas consiste en que complejos alterados de medicamento-péptido (los péptidos etiquetados) que eluyen de las columnas cromatográficas son dirigidos inmediatamente al analizador. En un enfoque alternativo, los complejos alterados de medicamento-péptido se recogen en fracciones. Dichas fracciones pueden manipularse o no antes de proceder a un análisis o identificación posteriores. Un ejemplo de dicha manipulación consiste en un paso de concentración, para a continuación posicionar cada concentrado en una diana MALDI para posterior análisis e identificación. En una de las materializaciones elegidas, los complejos alterados de medicamento-péptido se analizan con técnicas espectrométricas de masa de alto rendimiento. La información obtenida es primariamente la masa del/los péptido/s etiquetado/s. Esta masa es la suma de de la masa del péptido y de la masa de la etiqueta (el componente alterado del compuesto). Puesto que la última masa se conoce por la reacción de alteración, esta masa de etiqueta puede sustraerse de la masa total del péptido etiquetado resultante en una masa peptídica que será la base de posteriores algoritmos de búsqueda. Generalmente, una información de masa no es suficiente para una identificación de péptidos no ambigua. Por lo tanto, los péptidos etiquetados (= los complejos alterados de compuesto-péptido) se siguen fragmentando. Esto se suele hacer mediante disociación inducida por colisión (CID) en un nebulizador eléctrico o MALDI y se lo suele denominar MS/MS o espectrometría de masa tándem. La interpretación manual o automática de estos espectros MS/MS conduce a la asignación de etiquetas de secuencia y a la identificación de las etiquetas de secuencia de péptidos y a la situación de las etiquetas. El software de identificación de proteínas que puede usarse en la presente invención para comparar los espectros de fragmentación experimental del péptido etiquetado con secuencias de aminoácidos almacenadas en bases de datos de péptidos.

Dichos algoritmos se hallan disponibles en la técnica. Uno de esos algoritmos, ProFound, usa un algoritmo bayesiano para buscar proteína o bases de datos de ADN para identificar la coincidencia óptima entre los datos experimentales y la proteína en la base de datos. Se puede acceder a ProFound en la web internacional en la dirección <httpllprowl.rockefeller.edu> y http://www.proteometrics.com.

Con Profound se accede a la base de datos no redundante (NR). Se puede acceder a la búsqueda de péptidos en el sitio web EMBL. Véase también Chaurand P. et al. (1999) J. Am. Soc. Mass. Spectrom 10, 91, Patterson S.D., (2000), Am. Physiol. Soc., 59-65, Yates JR (1998) Electrophoresis, 19, 893). Los espectros de MS/MS se pueden analizar también con MASCOT (disponible en http://www.matrixscience.com, Matrix Science Ltd. London).

Se puede usar cualquier espectrómetro de masa para analizar los complejos alterados de compuesto-péptido. Como ejemplos no excluyentes de espectrómetros de masa están el espectrómetro de masa MS de tiempo de vuelo ("TOF") de deserción/ionización por láser asistido por matriz ("MALDI"), o MALDI-TOF-MS, suministrado por PerSeptive Biosystems, Framingham, Massachussets; el Ettan MALDI TOF, de AP Biotech, y el Reflex III, de Brucker-Daltonics, Bremen, Alemania, que se usan para el análisis de degradación post-source; el espectrómetro de masa de trampa iónica por ionización con nebulizador eléctrico (ESI), suministrado por Finnigan MAT, San José, California; el espectrómetro de masa cuadripolar, suministrado por Finnigan MAT, o el sistema QSTAR Pulsar Hybrid LC/MS/MS, de Applied Biosystems Group, Foster City, California, y un espectrómetro de masa con transformada de Fourier (FTMS) que usa un procedimiento de calibrado interno (O'Connor and Costello (2000) Anal. Chem. 72, 5881-5885).

Como alternativa, los iones péptidos etiquetados pueden desintegrarse durante su vuelo tras volatilizarse e ionizarse en un MALDI-TOF-MS. Este proceso se llama degradación post-source (PSD). Conociendo las secuencias de péptidos almacenadas en las bases de datos de de secuencias de péptidos, es posible deducir partes de o la secuencia total de dichos espectros PSD. Como en los ejemplos de más arriba, este análisis puede hacerse manualmente o mediante algoritmos informáticos que son bien conocidos en la técnica. Uno de dichos algoritmos se halla, por ejemplo, en el programa MASCOT.

En una materialización en concreto, se puede obtener información adicional de secuencias en análisis MALDI-PSD cuando el alfa-NH_{2}-terminal de los péptidos diana se altera con un grupo de fracción de ácido sulfónico. Los péptidos diana que llevan un grupo de ácido sulfónico con terminal alfa-NH_{2} se inducen a esquemas de segmentación específicos cuando se detectan en el modo MALDI-TOF-MS. Éste último permite deducir muy rápida y fácilmente la secuencia de aminoácidos.

Otra opción es analizar péptidos etiquetados por degradación Edman convencional para comparar luego la secuencia de aminoácidos obtenida con las secuencias almacenadas en bases de datos de secuencias de proteínas o genomas. En caso de que el propio compuesto sea un péptido, la secuenciación Edman generará en cada ciclo una doble identificación de aminoácidos, hasta que la degradación llegue al residuo de una de las cadenas que se hallan implicadas en el enlace de péptidos.

Una vez el péptido etiquetado ha sido identificado de manera no ambigua mediante análisis de fragmentación basado en MS, en experimentos similares posteriores bastará con usar simplemente su masa total. Este el caso, por ejemplo, cuando una proteína basada en actividad y con perfil de una diana específica se lleva a cabo en un gran número de muestras. En efecto, la cantidad de péptido etiquetado formado dependerá de la accesibilidad y reactividad específica de la diana. Una vez el péptido etiquetado específico ha sido totalmente caracterizado en términos de masa total y tiempos de elusión, basta con seleccionar el péptido etiquetado en su masa exacta. Una masa peptídica se puede medir con suficiente precisión con un espectrómetro de masa con transformada de Fourier (FTMS), o mediante las recién inventadas máquinas de tiempo de vuelo basado en MALDI. Dichas máquinas las fabrica, por ejemplo, Brucker-Daltonics, Bremen, Alemania (Ultraflex). Si la precisión con la que se puede medir el péptido etiquetado no es lo bastante diferenciadora, se puede generar entonces información adicional. Por ejemplo, el tiempo de elución con que se eluye un péptido concreto durante la cromatografía es un parámetro totalmente independiente de la masa peptídica.

Por lo tanto, es poco probable que dos o más péptidos con idénticas masas o con masas que caigan dentro del margen de error de las mediciones de masa se eluyan también con tiempos idénticos o muy parecidos durante la cromatografía. Como el tiempo de retención de un péptido durante la cromatografía RP está en relación primaria con su hidrofobicidad total, el índice de Media Total de hidropatía (GRAVY), que puede calcularse mediante valores de hidropatía dados a cada aminoácido natural.... Por lo tanto, la masa junto con el índice GRAVY son dos parámetros independientes muy característicos para un péptido en concreto.

En otra materialización, el método para determinar la identidad de la proteína madre sólo midiendo con precisión la masa peptídica de al menos un péptido diana puede mejorarse enriqueciendo aún más el contenido de información de los péptidos diana seleccionados. Como ejemplo no excluyente de cómo se puede añadir información a los péptidos diana diremos que los grupos NH_{2} libres de estos péptidos pueden cambiarse de forma específicamente química a reacción química añadiendo dos grupos con diferente etiquetado isotópico. Como resultado de este cambio, dichos péptidos adquieren un número predeterminado de grupos etiquetados. Como el agente del cambio es una mezcla de dos agentes químicamente idénticos pero isotópicamente diferentes, los péptidos diana quedan visibles como péptidos gemelos en los espectros de masa. El grado de desplazamiento de masa entre estos dobletes péptidos es indicativo del número de grupos aminados libres presentes en dicho péptido. Para ilustrar más esto último, diremos por ejemplo que el contenido de información de los péptidos diana puede enriquecerse cambiando específicamente grupos NH_{2} libres en los péptidos mediante una mezcla equimolar de éster de N-hidroxisuccinimida de ácido acético y éster de N-hidroxisuccinimida de ácido trideuteroacético.

Como resultado de esta reacción de conversión, los péptidos adquieren un número determinado de grupos CH3-CO (CD3-CO), que se pueden deducir fácilmente del grado de desplazamiento de la masa observado en los dobletes péptidos. Como tal, un desplazamiento de 3 unidades de masa corresponde a un grupo NH_{2}, un desplazamiento de 3 y 6 unidades de masa corresponde a dos grupos NH_{2} y un desplazamiento de 3, 6 y 9 unidades de masa corresponde a tres grupos NH_{2} en el péptido. Esta información consiste en un suplemento adicional a los datos concernientes a la masa péptida y/o para el conocimiento de que el péptido se generó con una proteasa de especificidad conocida.

El uso de la masa de un péptido etiquetado clasificado como único criterio de identificación péptido/proteína se hace importante y razonable una vez que dicho péptido etiquetado ha sido completamente identificado (anteriormente) por otros medios como los descritos más arriba.

Por ejemplo, una vez que un péptido etiquetado ha sido completamente identificado por análisis de fragmentación MS y búsqueda en bases de datos, la identificación posterior se puede basar en la masa, medida con precisión, de del péptido etiquetado, sin tener que repetir cada vez el análisis MS/MS.

Por lo tanto, los niveles de expresión de la actividad y niveles de expresión de una diana biológica o las diferentes dianas biológicas presentes en una multitud de muestras significa más de uno, preferiblemente más de cinco, más preferiblemente más de cien, más preferiblemente más de mil y más preferiblemente un número encontrado típicamente durante el análisis de alto rendimiento. La expresión "una mezcla muy compleja de proteínas" se refiere a lisados celulares, fracciones celulares, tejidos, fluidos biológicos y similares, tal como se describen más abajo.

En los casos en que la invención conduzca a la identificación de los miembros de una clase de dianas biológicas, la masa de cada péptido etiquetado puede ser representativa de su correspondiente proteína peptídica diana biológica y la invención permitirá un análisis global de niveles o niveles y/actividades de cada miembro de la familia. Por ejemplo, el uso de FSBA para marcar como diana las proteínas de enlace con ATP y especialmente las familias de quinasa puede conducir a una serie de péptidos etiquetados. Cada uno de estos péptidos etiquetados llevará la misma etiqueta, pero también irá etiquetado de otra forma por la fracción peptídica. De este modo, cada nivel de quinasa y/o actividad irá reflejado por la masa peptídica específica en el péptido etiquetado. La cuantificación relativa de cada péptido etiquetado ofrecerá un perfil global de niveles y/o actividades de los miembros de una familia de dianas biológicas.

Aunque la cuantificación absoluta de péptidos por espectrometría de masa es muy difícil, las técnicas basadas en MS son adecuadas para análisis comparativo.

Por lo tanto, en otra materialización se proporciona un método para determinar la cantidad relativa del nivel y/o actividad de al menos un péptido diana en más de una mezcla que contenga péptidos, comprendiendo dicho método los siguientes pasos:

a)

añadir un compuesto formado por un grupo funcional que puede estar alterado por vía química, o enzimática, o química y enzimática, de forma que un complejo alterado de compuesto-péptido diana migre de forma diferente a su versión inalterada en la misma separación cromatográfica, y un primer isótopo, a una primera muestra compuesta de péptidos donde dicho compuesto interactúa de forma estable con al menos un péptido, formando un complejo de compuesto-péptido diana;

b)

añadir un compuesto formado por un grupo funcional que puede estar alterado por vía química, o enzimática, o química y enzimática, de forma que un complejo alterado de compuesto-péptido diana migre de forma diferente a su versión inalterada en la misma separación cromatográfica, y un segundo isótopo, a una segunda muestra compuesta de péptidos donde dicho compuesto interactúa con al menos un péptido, formando un complejo de compuesto-péptido diana;

c)

combinar la mezcla de péptidos de la primera muestra con la mezcla de péptidos de la segunda muestra;

d)

separar las mezclas combinadas de péptidos en múltiples fracciones en un primer paso cromatográfico, donde en la fracción derivada de dicho paso cromatográfico se hallan tanto los péptidos como los complejos de compuesto-péptido diana;

e)

alterar por vía química, o enzimática, o química y enzimática, dicho compuesto presente en al menos un complejo de compuesto-péptido diana en cada fracción;

f)

aislar los complejos alterados de compuesto-péptido diana fuera de cada fracción en un segundo paso cromatográfico, donde la cromatografía se realiza con el mismo tipo de cromatografía, o parecido, que en el paso d);

g)

realizar un análisis espectrométrico de masa de los complejos aislados alterados de compuesto-péptido diana;

h)

calcular las cantidades relativas de los complejos alterados de compuesto-péptido diana en cada muestra comparando las alturas del pico de los idénticos, pero etiquetados de forma diferente, complejos alterados de compuesto-péptido diana, e

i)

determinar la identidad de dichos péptidos diana en los complejos alterados de compuesto-péptido diana y sus correspondientes proteínas.

Para comparar el nivel y/o la actividad de las dianas en dos muestras diferentes, se puede usar el etiquetado de masa diferencial. Por lo tanto, los complejos de compuesto péptido (los péptidos etiquetados) de la primera muestra pueden etiquetarse con "átomos ligeros", mientras que el péptido etiquetado de la segunda muestra se etiquetará con "átomos pesados". El etiquetado se puede realizar, por ejemplo, mediante un compuesto que lleve una etiqueta isotópica. Antes de la operación cromatográfica primaria se mezclarán los complejos de compuesto-péptido diana de ambas muestras. Los componentes "ligero" y "pesado" se eluirán o migrarán de manera idéntica o casi idéntica durante la operación primaria. Para su alteración se procederá de la misma manera. Los péptidos etiquetados "ligero" y "pesado" se eluirán o migrarán de manera idéntica o casi idéntica y se co-transferirán al espectrómetro de masa. Sólo durante el análisis con éste último se segregarán iones de péptidos etiquetados "ligero" y "pesado", cuyas intensidades relativas se podrán medir. Hay que insistir en que los átomos diferenciadores permanecen unidos al péptido etiquetado tras el paso de alteración. Por consiguiente, tanto los átomos "ligeros" como los "pesados" son parte de la etiqueta del péptido etiquetado.

Como par de átomos ligero y pesado se puede usar H/D, ^{16}O/^{18}O, ^{12}C/^{13}C, ^{14}N/^{15}N, ó cualquier par de isótopos estables que puedan incorporarse de forma estable a compuestos orgánicos e inorgánicos. En una materialización alternativa, las proteínas se pueden etiquetar en lugar de los componentes. El etiquetado isotópico diferencial de péptidos en una primera y una segunda muestra puede hacerse de muchas formas diferentes existentes en la técnica. Un elemento clave es que un péptido en particular que se origina de la misma proteína en una primera y una segunda muestra es idéntico, excepto por la presencia de un isótopo diferente en uno o varios aminoácidos del péptido. En una materialización típica, el isótopo será en una primera mezcla el isótopo natural, refiriéndose al isótopo que está presente predominantemente en la naturaleza, mientras que en una segunda mezcla el isótopo será un isótopo algo menos corriente, por lo que de aquí en adelante se le denominará isótopo no común. Como ejemplos de pares de isótopos natural y no común están H y D, O^{16} y O^{18}, C^{12} y C^{13}, N^{14} y N^{15}. Los péptidos etiquetados con el isótopo más pesado de un par isotópico se denominan en este documento péptidos pesados. Los péptidos etiquetados con el isótopo más ligero de un par isotópico se denominan en este documento péptidos ligeros. Por ejemplo, a un péptido etiquetado con H se le llama el péptido ligero, mientras que al mismo péptido etiquetado con D se le llama péptido pesado. Los péptidos etiquetados con un isótopo natural y con sus homólogos etiquetados con un isótopo no común son químicamente muy parecidos, están separados cromatográficamente de la misma manera y también ionizan de la misma manera. No obstante, cuando los péptidos se introducen en un analizador, como por ejemplo un espectrómetro de masa, se separan en péptido ligero y péptido pesado. El péptido pesado tiene una masa ligeramente mayor debido al mayor peso de la etiqueta isotópica elegida e incorporada. Debido a la pequeña diferencia entre las masas de los péptidos etiquetados isotópicamente de forma diferente, los resultados del análisis de espectrometría de masa de complejos aislados alterados de compuesto-péptido serán una pluralidad de pares de picos gemelos a poca distancia uno de otro, representando cada pico gemelo un complejo alterado pesado y ligero. Cada uno de los complejos pesados se origina a partir de la muestra etiquetada con el isótopo pesado. Entonces se mide los índices (relativa abundancia) de las intensidades pico de los picos pesado y ligero de cada par. Estos índices dan una medida de la cantidad relativa (frecuencia diferencial) de esa diana (como complejo aislado alterado de compuesto-péptido) en cada muestra. Las intensidades pico pueden calcularse de manera convencional (por ej. calculando la altura de pico o la superficie de pico). Como se explica más arriba, los complejos aislados alterados de compuesto-péptido se pueden identificar también permitiendo la identificación de proteínas en la muestras. Si una proteína diana para un compuesto en particular está presente en una muestra pero en otra no, los complejos aislados alterados de compuesto-péptido (que se corresponden con su proteína) serán detectados como un pico que puede contener o el isótopo pesado o el ligero. Sin embargo, en algunos casos puede ser difícil determinar qué muestra ha generado el pico simple observado durante el análisis de espectrometría de masa de la muestra combinada. Este problema puede resolverse con el doble etiquetado de la primera muestra, bien antes o bien después de la segmentación proteolítica, con dos isótopos diferentes o con dos números diferentes de isótopos pesados. Un ejemplo de agentes de etiquetado lo constituyen los agentes acilantes.

La incorporación del isótopo natural o del no común a los péptidos puede obtenerse de muchas formas. En una versión, las proteínas se etiquetan en las células. Las células para una primera muestra se cultivan por ejemplo en medios complementados con un aminoácido que contiene el isótopo natural, mientras que las células para una segunda muestra se cultivan en medios complementados con un aminoácido que contiene el isótopo no común. En otra materialización la incorporación de los isótopos diferenciales se puede obtener también mediante un enfoque enzimático. Por ejemplo, el etiquetado se puede llevar a cabo tratando con tripsina en "agua normal" (H_{2}^{16}O) una muestra que contiene proteínas, y la segunda muestra, que contiene proteínas con tripsina, con "agua pesada" (H_{2}^{18}O). Tal como se usa aquí, "agua pesada" se refiere a una molécula de agua en la que el O-átomo es el ^{18}O-isótopo. La tripsina presenta la propiedad bien conocida de incorporar dos oxígenos de agua en los terminales COOH de los sitios recién generados. De este modo, en la muestra uno, que ha sido tripsinizada en H_{2}^{16}O, los péptidos tienen masas "normales", mientras que en la muestra dos, los péptidos (excepto la mayoría de los péptidos con terminal COOH) tienen un incremento de masa de 4 unidades de masa, que se corresponde con la incorporación de dos ^{18}O-átomos. Esta diferencia de 4 unidades de masa es suficiente para distinguir las versiones pesada y ligera de los complejos alterados de compuesto-péptido en un espectrómetro de masa y para medir con precisión las proporciones entre los péptidos ligeros y los pesados y determinar de este modo la proporción de los correspondientes péptidos diana/proteínas diana en las dos muestras.

La incorporación de los isótopos diferenciales puede obtenerse además con múltiples procedimientos de etiquetado basados en conocidas reacciones químicas que pueden llevarse a cabo en la proteína del nivel péptido. Por ejemplo, las proteínas se pueden cambiar mediante la reacción de guanidilación con O-metilisourea, convirtiendo grupos NH_{2} en grupos de guanidino, generando de este modo homoarginina en cada posición previa de lisina. Las proteínas de una primera muestra pueden hacerse reaccionar con un reactivo con los isótopos naturales, y las proteínas de una segunda muestra pueden hacerse reaccionar con un reactivo con un isótopo no común. Los péptidos también se puede cambiar mediante una formación de base Shiff con acetaldehído de deuterio seguido de reducción con sodiumborohídrido normal o de deuterio. Esta reacción, que se sabe que tiene lugar en condiciones suaves, puede llevar a la incorporación de un número predecible de átomos de deuterio. Los péptidos se cambiarán bien en el grupo \alpha-NH_{2}, o bien en los grupos \varepsilon-NH_{2} de lisinas, o bien en ambos. Parecidos cambios pueden llevarse a cabo con formaldehído de deuterio seguido de reducción con NaBD4 de deuterio, lo que generará una forma de metilato de los grupos aminados. La reacción con formaldehído puede llevarse a cabo o con la proteína total, incorporando deuterio sólo en las cadenas laterales de lisina o bien en la mezcla peptídica, donde tanto ambos grupos, el \alpha-NH_{2} y el \varepsilon-NH_{2} derivado de lisina, quedarán etiquetados. Como la arginina no es reactiva, esto supone un método para diferenciar los péptidos que contienen Arg- de los que contienen Lys-. Los grupos aminados primarios se acilan fácilmente con, por ejemplo, acetil N-hidroxisuccinimida (ANHS). De este modo, una primera muestra se puede acetilar con ANHS, mientras que una segunda muestra se puede acetilar bien con ^{13}CH_{3}CO-NHS o bien con CD_{3}CO-NHS. También el grupo e-NH_{2} de todas las lisinas se deriva de este modo, además del amino-terminal del péptido. Entre otros ejemplos de métodos de etiquetado están el anhídrido acético, que se puede usar para acetilar grupos de hidroxilo, y el trimetilclorosilano, que se puede usar para etiquetado menos específico de grupos funcionales, entre ellos los grupos de hidroxilo y los aminos.

En otro enfoque más, los aminoácidos primarios se etiquetan con grupos químicos que permiten diferenciar entre los péptidos pesados y ligeros por 5 unidades de masa, por 6 unidades de masa, por 7 unidades de masa, por 8 unidades de masa o incluso por diferencias de masa mayores. Como alternativa, el etiquetado isotópico diferencial se realiza en el extremo carboxi-terminal de los péptidos, permitiendo la diferenciación de entre las variantes ligera y pesada en más de 5 unidades de masa, 6 unidades de masa, 7 unidades de masa, 8 unidades de masa o incluso diferencias de masa mayores. Como los métodos de la presente invención no requieren ningún conocimiento previo del tipo de proteínas diana que pueden estar presentes en las muestras, puede usarse para determinar las cantidades relativas de las proteínas diana, tanto las conocidas como las desconocidas, que están presentes en las muestras
examinadas.

Los métodos suministrados en la presente invención para determinar las cantidades relativas de al menos una diana proteínica y/o la actividad de una proteína en al menos dos muestras puede aplicarse en términos generales para comparar los niveles proteínicos en, por ejemplo, células, tejidos, fluidos, órganos y/o organismos completos. Dicha comparación supone evaluar fracciones subcelulares, células, tejidos, fluidos, órganos y/o organismos completos que están, por ejemplo, enfermos y no enfermos, tensos y no tensos, medicados y no medicados, benignos y malignos, adherentes y no adherentes, infectados y no infectados, transformados y no transformados. El método también permite comparar los niveles de la diana proteínica o la actividad de una o más proteínas en fracciones subcelulares, células, tejidos, fluidos, organismos y/o organismos completos expuestos a diferentes estímulos o en diferentes etapas de desarrollo o en condiciones en que uno o varios genes están silentes, o sobrexpresados, o en estados en los que uno o varios genes han sido expulsados.

En otra materialización los métodos descritos en este documento se pueden emplear también en ensayos diagnósticos para la detección de la presencia, la ausencia o una variación en el nivel de una o más dianas proteínicas y/o la actividad de una proteína o un conjunto específico de proteínas indicativas de una enfermedad (por ej., cáncer, enfermedad neurodegenerativa, inflamación, enfermedades cardiovasculares, infecciones virales, infecciones bacterianas, infecciones de hongos o cualquier otra enfermedad). Entre las aplicaciones específicas están la identificación de proteínas diana que están presentes en cánceres metastásicos e invasivos, la expresión diferencial de proteínas en ratones transgénicos, la identificación de proteínas de regulación ascendente o descendente en tejidos enfermos, la identificación de cambios intracelulares en células con cambios fisiológicos tales como desplazamiento metabólico, la identificación de marcadores biológicos en cánceres o la identificación de rutas de señalización.

Entre las muestras que pueden analizarse con métodos de la invención están las muestras biológicas como lisados celulares, fracciones microsómicas, fracciones celulares, tejidos, orgánulos, etc. y fluidos biológicos como orina, esputos, saliva, líquido sinovial, aspiración de líquido del pezón, líquido amniótico, sangre, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, semen, suero, líquido pleural, líquido ascítico, heces o una muestra de biopsia. Si la muestra es impura (por ej. plasma, suero, heces, semen, esputos, saliva, líquido cefalorraquídeo o una muestra embebida en parafina), puede tratarse antes de emplear un método de la invención, frecuentemente para eliminar contaminantes de los componentes de interés. Entre los procedimientos se hallan, por ejemplo, el filtrado, la extracción, el centrifugado, el secuestrado de afinidad, etc. Allí donde las sondas no pasen fácilmente por una membrana celular, intacta o permeabilizada, o donde se desee un lisado, las células se tratan con un reactivo que sea eficaz para lisar las células contenidas en líquidos, tejidos o membranas celulares animales de la muestra, y para exponer las proteínas contenidas en los mismos y, según convenga, separar parcialmente las proteínas de otros agregados o compuestos como microsomas, lípidos, hidratos de carbono y ácidos nucleicos en la muestra. Los métodos para purificar proteínas total o parcialmente de una muestra son bien conocidos en la técnica (por ej. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989). Las muestras pueden tener diferentes orígenes y usarse con diferentes fines.

Normalmente se analizará un proteoma. Se entiende por proteoma el 20% como mínimo del total de proteína procedente de una muestra de origen biológico, habitualmente el 40% como mínimo, más habitualmente el 75% como mínimo y generalmente el 90% o más, hasta el total de la proteína obtenible del origen. Por lo tanto, el proteoma puede estar presente en una célula inalterada, un lisado, una fracción microsómica, un orgánulo, un lisado parcialmente extraído, fluido biológico y similares. El proteoma será una mezcla compleja de proteínas, consistente por lo general en unas 20 proteínas diferentes, habitualmente unas 50 proteínas diferentes como mínimo y en la mayoría de los casos 100 proteínas diferentes o más. En efecto, el proteoma es una mezcla compleja de proteínas de origen natural y normalmente ello supondrá tener un potencial de 10 y habitualmente 20 o más proteínas que son proteínas diana para un compuesto específico usado para analizar el perfil del proteoma. La muestra será representativa de las proteínas diana de interés. La muestra puede ajustarse al concentración tampón y pH adecuados, si así se desea. Luego se puede añadir uno o varios compuestos que tengan la estructura SLA, cada uno de ellos con una concentración del orden de 0,001 mM a 20 mM. Después de incubar la reacción, generalmente durante un tiempo para que la reacción progrese sustancialmente hasta completarse, generalmente de 1 a 60 minutos, a una temperatura del orden de 20-40ºC, puede entonces enfriarse la misma.

El método de la presente invención sirve para fomentar el desarrollo de nuevos medicamentos e identificar (nuevas) dianas farmacológicas. Una de las materializaciones de la presente inyección tiene especial utilidad para cribar rápidamente una serie de compuestos candidatos a medicamentos. La invención también sirve para analizar sistemáticamente una serie de compuestos que pueden variar considerablemente en su estructura o composición químicas, o que pueden variar en aspectos menores de su estructura o composición químicas. La invención también es útil para optimizar medicamentos candidato muy prometedores en el aspecto médico, lo que significa enlazar con una diana concreta y deseada y con ninguna otra. La invención también puede usarse para medir actividades enzimáticas o actividades biológicas en general, o la suma de niveles de expresión y actividades de moléculas biológicas en extractos totales de tejidos, células, orgánulos celulares y complejos proteínicos. La capacidad para predecir los efectos tóxicos de los nuevos medicamentos potenciales es crucial a la hora de priorizar conductos de compuestos y eliminar costosos fallos en el desarrollo farmacológico. La toxicogenómica, que trata primariamente de los efectos de los compuestos en los esquemas de expresión de genes en células o tejidos diana, está emergiendo como un enfoque clave para seleccionar nuevos medicamentos candidato puesto que puede poner de manifiesto firmas genéticas que pueden usarse para predecir la toxicidad en dichos compuestos. La presente invención supone un enfoque proteómico para la detección de dianas farmacológicas, por lo que el método puede denominarse toxicoproteómica. El método de la presente invención puede usarse también para el diseño y optimización de ensayos clínicos. Con el método es posible desarrollar potencialmente ensayos clínicos menores destinados a poblaciones más específicas de las que es probable que respondan al medicamento y de las que no es probable que desarrollen reacciones adversas al medicamento. A su vez, el uso del método podría reducir potencialmente el coste y el tiempo necesario para ensayos clínicos.

A continuación se hace una descripción más informativa de algunos de los diferentes pasos de la invención.

I. Preparación de una mezcla de proteínas y péptidos

Las mezclas de proteína y péptido que se originan de una muestra que comprende proteínas para una muestra tratada de compuesto que comprende proteínas se obtienen con métodos descritos en la técnica, como segmentación o digestión química o enzimática. En un aspecto elegido, las proteínas y los complejos de compuesto-proteína son digeridos por una enzima proteolítica. La tripsina es una enzima especialmente conveniente, porque se segmenta en los sitios de lisina y arginina y produce péptidos cargados que tienen típicamente una longitud de 5 a 50 aminoácidos aproximadamente y un peso molecular que oscila entre 500 a 5.000 dalton. Dichos péptidos son especialmente apropiados para análisis por espectrometría de masa. Una lista no exhaustiva de proteasas que también pueden usarse en esta invención incluiría la Lysobacter enzimogenes endoproteinasa Lys-C, la Staphylococcus aureus endoproteinasa Glu-C (V8 proteasa), la Pseudomonas fragi endoproteinasa Asp-N y la clostripaína. Otras proteasas con especificidad más baja, como la Bacillus subtilis subtilisina, la procaína pepsina y la Tritirachium album proteinasa K, también pueden usarse en esta invención.

Otra opción es usar reactivos químicos para segmentar las proteínas en péptidos. Por ejemplo, el bromuro cianógeno puede usarse para segmentar proteínas en péptidos en residuos de metionina. La fragmentación química también se puede aplicar mediante hidrólisis limitada bajo condiciones de ácido. Como alternativa, se puede usar BNPS-skatole para segmentar en el sitio del triptófano. Asimismo se puede usar una degradación parcial de terminal NH_{2} bien mediante indicadores de nivel inducidos químicamente con isotiocianato o bien mediante tratamiento con aminopeptidasa.

II. Cromatografía

Tal como se usa aquí, el término "paso cromatográfico" o "cromatografía" se refiere a métodos para separar sustancias químicas, que son muy abundantes en la técnica. En un enfoque elegido hace uso de las tasas relativas a las que las sustancias químicas son adsorbidas de una corriente móvil de gas o de líquido en una sustancia estacionaria, que suele ser sólido finamente dividido, una hoja de material filtrante o una fina película de un líquido en la superficie de un sólido. La cromatografía es un método versátil que puede separar mezclas de moléculas incluso en ausencia de conocimiento detallado previo del número, naturaleza o cantidades relativas de las sustancias individuales presentes. El método es ampliamente usado para la separación de moléculas químicas de origen biológico (por ejemplo, aminoácidos, fragmentos de proteínas, péptidos, proteínas, fosfolípidos, esteroides, etc.) y de mezclas complejas de petróleo y mezclas aromáticas volátiles, como perfumes y aromatizantes. La técnica columnar de líquido más ampliamente usada es la cromatografía de líquidos de alto rendimiento, en la cual una bomba hace pasar la fase móvil del líquido por una columna de alta eficiencia que va estrechamente empaquetada a alta presión. En Meyer M., 1998, ISBN: 047198373X y Cappiello A. et al. (2001) Mass Spectrom. Rev. 20(2): 88-104 aparecen descritas recientes visiones generales de técnicas cromatográficas. También se puede usar otros métodos recientemente desarrollados y descritos en la técnica, así como nuevos métodos cromatográficos que acaban de aparecer en la técnica. Algunos ejemplos de cromatografía son la cromatografía de fase invertida (RP), la cromatografía de intercambio de iones, la cromatografía de interacción hidrófoba, la cromatografía de exclusión, la cromatografía sobre gel o la cromatografía de afinidad, como la cromatografía de inmunoafinidad y la de afinidad de metal inmovilizado. La cromatografía es una de entre varias técnicas de separación. Otro miembro de este grupo es la electroforesis y todas sus variantes, como la electroforesis capilar, la electroforesis de libre flujo, etc. En el último caso, la fuerza de empuje es un campo eléctrico que ejerce diferentes fuerzas sobre soluciones de diferente carga iónica. La fuerza resistiva es la viscosidad del disolvente no fluido. La combinación de estas fuerzas produce una movilidad especial de iones para cada solución. Algunos ejemplos son la electroforesis de gel de poliacrilamida de sulfato dodecilo de sodio (SDS-PAGE) y electroforesis de gel nativo. Entre los métodos de electroforesis capilar están la electroforesis capilar de gel, la electroforesis capilar de zona, la electrocromatografía capilar y la electroforesis capilar de enfoque isoeléctrico y afinidad. Estas técnicas se describen en McKay P., An Introduction to Chemistry, Science Seminar, Department of Recovery Sciences, Genentech, Inc.

III. Tampones

Los métodos de la invención requieren compatibilidad entre las condiciones de separación en la operación primaria, las condiciones de reacción en la operación secundaria y las condiciones para analizar los complejos eluyentes alterados de compuesto-péptido en analizadores tales como los espectrómetros de masa. Como se ha mencionado más arriba, la combinación de las condiciones cromatográficas en las ejecuciones primaria y secundaria y los desplazamientos cromatográficos inducidos por la reacción de alteración determina la posibilidad de aislar los complejos alterados de compuesto-péptido de cada fracción obtenida de una mezcla de proteínas y péptidos en la operación primaria. Como también se ha mencionado más arriba, en una materialización elegida las condiciones cromatográficas de la operación primaria son iguales o sustancialmente parecidas.

En otra materialización elegida, los tampones y/o disolventes usados en ambos pasos cromatográficos son compatibles con las condiciones necesarias para que se dé un procedimiento eficaz de las reacciones químicas y/o enzimáticas en el paso de alteración entre los dos pasos cromatográficos. En una materialización especialmente preferida la naturaleza de los disolventes y el tampón en la operación primaria, la operación secundaria y el paso de alteración son idénticas o sustancialmente similares. En otra materialización elegida, dichos tampones y disolventes con compatibles con las condiciones que deben darse para realizar un análisis de espectrometría de masa. Para definir dichos tampones y disolventes son precisos ajuste y ajuste fino [y dichas condiciones no se daban en el estado anterior de la técnica].

Para algunas materializaciones de la invención con tipos especiales de complejos alterados de compuesto-péptido es muy difícil, si no imposible, diseñar un conjunto de tampones y/o disolventes idénticos o sustancialmente similares que puedan usarse a lo largo de todo el procedimiento de operación primaria, paso de alteración, operación secundaria y análisis.

Por ejemplo, la reacción química y/o enzimática para alterar los complejos de compuesto-péptido en el paso de alteración puede que requiera condiciones de reacción específicas que no son compatibles con los tampones usados en la primera operación y/o la segunda. En estos casos las condiciones de disolvente/tampón en las fracciones cambian antes del paso de alteración y/o después del paso de alteración cambio que se efectúa con métodos descritos en la técnica, como por ejemplo una extracción, un paso de liofilización y redisolución, un paso de precipitación y redisolución, una diálisis contra un tampón/disolvente apropiado o incluso una separación rápida de fase invertida con un gradiente pronunciado.

Otra complicación puede consistir en la composición del tampón/disolvente presente en una mezcla compleja de proteínas o una mezcla de proteínas y péptidos antes de iniciar las operación primaria. La aplicación de un paso de pre-tratamiento puede requerir condiciones de tampón/disolvente específicas que no son compatibles con el tampón/disolvente para efectuar la operación primaria. Si no se dan, las condiciones para la/el preparación/aislamiento de proteínas de su fuente biológica puede resultar en la contaminación de las mezclas de proteínas o mezclas de proteínas y péptidos con compuestos que interfieren negativamente con la reacción del compuesto y/o con la operación primaria. En estas situaciones, la composición tampón/disolvente de la mezcla de proteínas o de la mezcla de proteínas y péptidos cambia para hacerlos compatibles con la operación primaria. Dicho cambio se lleva a cabo con métodos descritos en la técnica, como por ejemplo una extracción, un paso de liofilización y redisolución, un paso de precipitación y redisolución, una diálisis contra un tampón/disolvente apropiado o incluso una separación rápida de fase invertida con un gradiente pronunciado.

En otra materialización de la invención, el tampón/disolvente de la operación secundaria no es compatible con la realización del análisis de los complejos eluyentes alterados de compuesto-péptido. En esos casos, el tampón/solvente en las fracciones recogidas de la operación secundaria cambia para hacer las condiciones compatibles con el análisis de, por ejemplo, una extracción, un paso de liofilización y redisolución, un paso de precipitación y redisolución, una diálisis contra un tampón/disolvente apropiado o incluso una separación rápida de fase invertida con un gradiente pronunciado. De no ser así, las fracciones con los complejos alterados de compuesto-péptido pueden recogerse y recombinarse para una tercera serie de separaciones, que de aquí en adelante se denominarán operación ternaria. Dicha operación ternaria está diseñada de forma que los péptidos eluyentes de señalización o identificación se puedan analizar con un espectrómetro de masa.

Equivalentes

Los experimentados en la técnica reconocerán, o serán capaces de verificar con sólo una experimentación rutinaria, muchos equivalentes de las materializaciones específicas de la invención descritas en este documento. Por ejemplo, la cromatografía se puede sustituir en muchos casos por la electroforesis. Las técnicas electroforéticas comprenden la electroforesis capilar de gel, la electroforesis capilar de zona, la electrocromatografía capilar y la electroforesis capilar de enfoque isoeléctrico y afinidad.

Ejemplos 1. La identificación de dianas farmacológicas

1.1. En un compuesto en concreto las tres propiedades "SLA" residen en la misma fracción.

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Por ejemplo, el compuesto benzoilo-penicilina forma un aducto de acil-enzima que tiene como diana la DD-aminotranspeptidasa. Tras una segmentación proteolítica se genera un peniciloilo-péptido. El paso de alteración puede consistir en una conversión del tioéter en un derivado sulfóxido que es más hidrófilo y se separa con nitidez durante la operación cromatográfica 2.

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1.2. En un compuesto en concreto las fracciones "SLA" están parcialmente separadas. La parte "S" interactúa con la molécula diana. El entrecruzamiento químico se establece mediante el mismo grupo, por lo que "S" y "L" son lo mismo. El tercer grupo "A" está alterado.

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Por ejemplo, la molécula puede estar compuesta de un péptido con contenido de Lys que puede entrecruzarse con Gln-41 de G-actina, mediante la acción catalítica de una transglutaminasa como el factor XIIIa (etiquetado específico de G-actina en G-41 con cadaverina o derivados de cadaverina mediante entrecruzamiento de longitud cero con una transglutaminasa) ya se ha informado del mismo (Takashi (1988) Biochemistry 27 (3): 938).

El enlace isopeptídico creado entre Gln-41 de actina y el péptido con contenido de Lys es similar.

La secuencia del péptido compuesto en la notación de una letra es Ac-F-I-E-G-R-A-D-S-K-S-S-COOH, y tiene un terminal libre acetilado a-NH_{2} y un terminal libre COOH. Según nuestras definiciones "SLA", distinguimos las siguientes funciones:

El grupo determinante de la especificidad ("S") se compone del residuo Lys flanqueado a ambos lados por residuos Ser. Los residuos Ser y el Asp, incorporado en la parte del terminal COOH, contribuyen más al carácter hidrófilo (y por lo tanto a la solubilidad) del péptido entrecruzado final. También contrastan con el grupo hidrófobo Phe-Ile, situado en el terminal extremo NH_{2}, formando un equilibrio hidrófobo-hidrófilo que se romperá durante el paso de alteración.

El residuo Lys, que determina la especificidad de la reacción de transglutaminasa, también es el residuo implicado en la formación del isopéptido de longitud cero, por lo que "S" y "L" son las mismas fracciones.

El sitio de segmentación de restricción del factor X_{a} forma la parte "A" del compuesto y está espacialmente separada de de la parte "S-L". Cuando se libera por la segmentación, la carga hidrófoba Ac-F-I-E-G-R se separa, dejando incompuesto más hidrófilo unido todavía a su péptido diana. En la operación secundaria (operación 2) este péptido más hidrófilo se desplaza delante de la masa de péptidos no modificados.

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Este experimento se describe detalladamente en los ejemplos 1.5 y 1.6.

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1.3. En un compuesto en concreto las tres propiedades "SLA" están más separadas; el grupo determinante de la especificidad "S" interactúa con la molécula diana y un segundo grupo establece entrecruzado químico ("L") mientras una tercera fracción ("A") queda sujeta a alteración. El péptido etiquetado resultante lleva todavía la fracción "S" o parte de "S".

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Por ejemplo, la molécula puede componerse del aldehído péptido Ac-YVAD-CHO inhibidor de caspasa-1, prolongado contra el lado del N-terminal mediante un péptido corto que contiene el sitio de segmentación de restricción del factor X_{a}, por ejemplo Ac-A-A-I-E-G-R-Y-V-A-D-CHO. Mientras que la secuencia Y-V-A-D dirige la molécula al sitio activo de las proteasas de caspasa de tipo 1 (grupo "S"), el terminal COOH convertido en aldehído crea el entrecruzamiento (grupo "L"). La parte del terminal NH_{2} de la molécula puede separarse por segmentación mediante el factor X_{a}.

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1.4. En un compuesto las tres propiedades "SLA" están más separadas

El grupo determinante de la especificidad "S" interactúa con la molécula diana. El entrecruzamiento lo establece otra fracción en la molécula que reacciona con otra parte de la diana. La alteración consiste en la separación de las fracciones "S" y "L". Ahora la etiqueta ya no contiene el grupo "S", sino el grupo "L" o parte del grupo "L".

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Por ejemplo, la fluorosulfenilbenzoilo adenosina FSBA puede formar un complejo con proteínas de enlace con ATP. FSBA reacciona de forma covalente con un derivado de lisina situado en el centro activo, frente al sitio de interacción de la fracción de adenosilo. El complejo de FSBA-péptido se genera por segmentación proteolítica. El paso de alteración consta de una hidrólisis de inducción alcalina de la molécula que sólo deja la fracción de sulfenilbenzoilo unida al péptido como etiqueta. Como se sabe que FSBA imita el enlace con ATP, este método puede usarse para localizar el/los sitio/s de enlace con ATP en la estructura primaria de las proteínas diana, para identificar proteínas de enlace con ATP y para perfilar actividades de quinasa en un contexto celular global.

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1.5. Identificación del sitio diana de un compuesto en una proteína purificada

En este ejemplo, se enlazó de forma covalente actina purificada de músculo esquelético con un péptido sintético con contenido de Lys en la posición de actina Gln-41. El diseño y secuencia del péptido sintético, que aquí se denomina "péptido compuesto de CP", se describe en el ejemplo 1.2.

Se incubó el CP durante la noche a un exceso molar de 5 sobre 10 nmoles de G-actina en 400 \mul de 5 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 1 mMATP 1 mM de CaCl_{2} y 10 mM de \beta-mercaptoetanol. El enlace isopéptido entre el Lys-9 de CP y Gln-41 de actina se formó mediante catálisis de 0,25 unidades de transglutaminasa de hígado de conejillo de
Indias.

Tras incubar la mezcla de noche a 4ºC, se la desnaturalizó hirviéndola durante 5 minutos y a continuación se la digirió con endoproteinasa Lys C en el siguiente tampón: 25 mM Tris-HCl pH 8.5 1 mM EDTA con una proporción de enzima/sustrato de 1/50 de peso. La digestión se llevó a cabo durante 5 horas a 37ºC y se la detuvo añadiendo ácido trifluoroacético (TFA) a un concentrado final del 2%. Se centrifugó la mezcla peptídica y se la cargó (100 \mul, correspondientes a 84 \mug (2 nmol) de actina) en una columna C-18 de fase invertida (4,6 mm x 250 mm). Se eluyó los péptidos con un gradiente lineal de acetonitrilo (con un aumento de 1,4% por minuto en 0,1 % de TFA (véase los detalles en Fig. 1A) y se los registró mediante absorción UV a 214 nm. El perfil de la elución peptídica del compendio endo Lys C en el conjugado de actina-péptido se ve en la Fig. 1A. Se recogió los péptidos en 5 minutos o 5 fracciones de ml y se los secó mediante centrifugado al vacío (con instrumento Savant). Se volvió a disolver cada fracción en 400 \mug 40 mM de Tris-HCl pH7.3, 50 mM de NaCl y se las trató con 0,12 unidades de factor X_{a} (Promega). Tras una digestión de 3 horas a temperatura ambiente, se les añadió TFA (concentrado final 0,5%) y se las cargó en el mismo sistema cromatográfico RP. De todas las fracciones analizadas, sólo la fracción 6 mostró un péptido en desplazamiento (pico en sombreado) (Fig. 1B).

Una espectrometría de masa efectuada por nebulización eléctrica-ionización con un instrumento Micromass Q-TOF confirmó la masa del péptido entrecruzado (Fig. 2): Mm abs.: 3883,7 (Mm calc.: 2883,9), correspondiente a la degradación Edman

dipéptido A-D-S-K-S-S

19-actina 50

que confirmó a su vez la secuencia de las dos cadenas entrecruzadas: Ciclo 1:

Mcnd Mnnn Ala; Ciclo 2: Gly + Asp; Ciclo 3: Phe + Ser; Ciclo 4: Ala; Ciclo 5: Gly + Ser; Ciclo 6: Asp; Ciclo 7: Asp; Ciclo 8: Ala; Ciclo 9: Pro; con la secuencia ADSXS del CP y la secuencia AGFAGDDAP derivada de la secuencia de actina 19-27.

Este experimento mostró las posibilidades del procedimiento y demostró también que el desplazamiento inducido por la liberación de la parte del terminal NH_{2} de CP era suficientemente grande para ser de utilidad en esta invención.

1.6 Identificación del sitio diana de una compuesto en una proteína específica presente en una mezcla de gran complejidad como un lisado celular.

Se lisó células Jurkat mediante incubación con 0.7% de CHAPS, 0,5 mM de EDTA, 100 mM de NaCl, 50 mM de Hcpcs, pH7.5 y una mezcla de inhibidor de proteasa. Este extracto contenía 2 mg. de proteína/ml total. Se desaló quinientos \mul en una columna disponible MAP5 equilibrada con 25 mM de Tris-HCl pH 8,5, 1 mM de EDTA. A un ml de la mezcla de proteína desalada (1 mg) le añadimos 50 \mul de acetonitrilo y 1,5 \mug de endo Lys C. La digestión se prolongó durante 5 horas a 37ºC.

Se mezcló quinientos \mul de este compendio con 30 \mul del compendio de actina-CP y endolisina C generado en el experimento anterior (ejemplo 1.5) y se le añadió 200 \mul de 1% de TFA en agua. Se centrifugó esta mezcla y se la cargó en una columna RP de 4,6 mm, 250 mm (Vydac Separations Group). Se eluyó los péptidos exactamente como se explica en la Fig. 1A. A los 20 minutos se recogió fracciones de 2 min. (2 ml de volumen) durante 50 min. adicionales. Con el fin de reducir el número de operaciones secundarias, agrupamos las fracciones como se indica en la
Tabla I.

Cada una de las fracciones combinadas (A-E) según la Tabla 1 se secó y digirió al vacío con el factor X_{a}. Esta segmentación específica se llevó a cabo en 2,5 ml de tampón que contenía 40 mM de Tris-HCl pH7.3, 60 mM de NaCl y 0,12 unidades de proteasa de factor X_{a}. A las 2 horas se le añadió 100 \mul de 1% de TFA y se cargó la mezcla en el mismo sistema cromatográfico que en la Fig. 1A. La elución peptídica fue como en la Figura 1A. El perfil de la elución peptídica de la fracción agrupada D, que contiene las fracciones primarias 4-9-14-19-24 se puede ver en la Fig. 3A. Observamos picos que emergen de los intervalos 9 y 14. El pico 9* que se eluye delante del intervalo 9 no pudo identificarse como péptido. El pico 9** que se eluye en la parte trasera del intervalo 9 procede del sobrante de CP que no reaccionó con actina. Es la parte del terminal NH_{2} con secuencia Ac-Phe-Ile-Glu-Glu-Arg. Esto quedó confirmado mediante espectrometría de masa.

Desde el intervalo 14 hay un nuevo pico que emerge delante de la masa de péptidos no modificados (que aparecen en negrita). Este pico se identificó como el péptido entrecruzado

9

mediante espectrometría de masa y degradación Edman (véase también Fig. 2). Ninguna otra fracción mostró péptidos que se desplazaran durante la segunda operación.

Este experimento demuestra que es posible seleccionar específicamente regiones, segmentos o secuencias cortas de proteínas que se señalen como diana de forma covalente a compuestos que interactúan con proteínas mediante dichas regiones, segmentos o secuencias cortas.

10

2. Etiquetado diferencial de los complejos compuesto-proteína

2.1 la fracción de peniciloílo puede llevar un átomo de deuterio, preferiblemente dos átomos de deuterio, más preferiblemente aún tres átomos de deuterio, más preferiblemente aún cuatro átomos de deuterio y por último más preferiblemente aún más de cuatro átomos de deuterio, en sustitución de los correspondientes átomos H del compuesto "ligero". Aquí hay que dejar claro que aunque parezca mejor generar grandes diferencias de masa entre las especies "ligera" y "pesada" para conseguir mayor precisión en la cuantificación relativa, también es seguro que, a la inversa, la coelución o comigración de las formas "ligera" y "pesada" del péptido etiquetado en el sistema cromatográfico usado es menos probable cuando aumenta la diferencia de masa. Por lo tanto, la diferencia final de masa usada para distinguir los compuestos "ligeros" de los "pesados" debe ser un equilibrio entre la mayor diferencia de masa, para la precisión en la cuantificación relativa, y diferencias que aún dan origen a propiedades cromatográficas idénticas o muy parecidas.

2.2 uno o varios de los aminoácidos que especifican la actividad inhibitoria de la caspasa-1 se puede sustituir por un aminoácido de deuterio equivalente. Por ejemplo, el residuo de valina se puede sustituir por d-_{7}-valina o d-_{8}-valina. Como alternativa, el residuo de alanina se puede sustituir por d-_{3}-alanina. Por lo tanto, en la muestra uno, el componente "ligero" irá ligado a sus dianas biológicas, mientras que en el ejemplo dos el mismo componente, pero ahora con uno o dos aminoácido(s) sustituidos por sus homólogos de deuterio, irá ligado a las dianas biológicas. Las mezclas de péptidos, incluido los péptidos diana compuestos de las muestras uno y y dos están mezcladas. Los péptidos etiquetados co-eluyen y se co-transfieren al espectrómetro de masa en el que segregan, debido a sus diferencias de masa. Las intensidades iónicas que corresponden a ambas masas se usan para calcular las proporciones de ambos péptidos etiquetados, por lo tanto, de ambos niveles de proteínas y/o niveles de actividad.

2.3 el etiquetado diferencial puede darse de la forma más conveniente en el grupo fenilo, presente en la etiqueta sulfenilbenzoílo de FSBA. Este grupo puede alojar cuatro átomos de deuterio. De forma similar a lo que se ha explicado en ejemplos anteriores, la mezcla de proteínas 1 se etiquetará con el reactivo H4-FSBA (reactivo pesado). Tras la clasificación, tanto los péptidos etiquetados ligeros como los pesados se pueden comparar sobre la base de las intensidades relativas de sus respectivos iones después de la separación por espectrometría de masa.

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<110> Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw

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<120> Método para la identificación de dianas farmacológicas

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<130> JVK-ChP-V127

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<150> EP 02078801.4

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<151> 2002-09-12

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<160> 8

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Péptido usado en la figura 3B y está acetilado.

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<400> 1

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\sa{Phe Ile Glu Gly Arg}

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<210> 2

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> El péptido usado en el ejemplo 1.2 tiene un terminal libre acetilado alpha-NH_{2} y un terminal libre COOH.

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<400> 2

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\sa{Phe Ile Glu Gly Arg Ala Asp Ser Lys Ser Ser}

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<210> 3

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> El péptido del ejemplo 1.3; el grupo Asp lleva un aldehído, el primer Ala está acetilado.

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<400> 3

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\sa{Ala Ala Ile Glu Gly Arg Tyr Val Ala Asp}

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<210> 4

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> El péptido del ejemplo 1.3; el grupo Asp lleva un aldehído, el Tyr está acetilado.

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<400> 4

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\sa{Tyr Val Ala Asp}

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<210> 5

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> El péptido usado en el ejemplo 1.5 y Lys lleva 19-actina-50.

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<400> 5

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\sa{Ala Asp Ser Lys Ser Ser}

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<210> 6

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Péptido usado en el ejemplo 1.5; secuencia del péptido compuesto.

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<220>

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<221> RASGO MISCELÁNEO

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<222> (4)..(4)

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<223> XAA puede ser cualquier aminoácido.

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<400> 6

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\sa{Ala Asp Ser Xaa Ser}

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<210> 7

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> El péptido usado en el ejemplo 1.5; secuencia derivada de la secuencia de actina 19 -27.

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<400> 7

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\sa{Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro}

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<210> 8

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> El péptido usado en el ejemplo 1.6: la parte del terminal NH_{2} del péptido compuesto; el Phe está acetilado.

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<400> 8

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\sa{Phe Ile Glu Glu Arg}

Claims (10)

1. Método para aislar al menos una molécula diana de un compuesto, compuesto que comprende un grupo funcional que se puede alterar por vía química, o enzimática, o química y enzimática, de manera que un complejo alterado de compuesto-molécula diana migre de forma diferente a su versión inalterada en la misma separación cromatográfica, método que consta de los siguientes pasos:

a)

añadir dicho compuesto a una mezcla compleja de moléculas donde dicho compuesto interactúa de forma estable con al menos una de dichas moléculas formando un complejo de compuesto-moléculas diana

b)

separar la mezcla compleja resultante de moléculas y complejos de compuesto-moléculas diana en fracciones múltiples en un primer paso cromatográfico donde en una fracción derivada de dicha fase cromatográfica se hallan tanto las moléculas como los complejos de compuesto-moléculas diana.

c)

alterar por vía química, o enzimática, o química y enzimática, dicho compuesto presente en al menos un complejo de compuesto-moléculas diana en cada fracción, y

d)

aislar al menos una molécula diana de las que interactúan con dicho compuesto en un segundo paso cromatográfico, donde la cromatografía de los pasos b) y d) se lleva a cabo con el mismo tipo de cromatografía u otro sustancialmente similar.

2. Método según la reivindicación 1, donde dicha mezcla compleja de moléculas es una mezcla compleja de proteínas.

3. Método según la reivindicación 2, que comprende además la segmentación de dicha mezcla compleja de proteínas en una mezcla de proteínas y péptidos antes de ejecutar el paso b).

4. Método según la reivindicación 1, donde dicha mezcla compleja de moléculas es una mezcla de proteínas y péptidos.

5. El método de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además el paso de identificación de las dianas.

6. El método de la reivindicación 5, donde dichas moléculas diana son proteínas o péptidos donde dicho paso de identificación se ejecuta con un método seleccionado de un grupo formado por: un método de espectrometría de masa tándem, un análisis de Degradación Post-Source y la medición de la masa de los péptidos, en combinación con la búsqueda en bases de datos.

7. El método de la reivindicación 6, donde dicho paso de identificación basado en la medición de la masa de los péptidos diana se basa además en uno o varios de los siguientes factores: a) la determinación del número de grupos aminados libres en los péptidos diana; c) el conocimiento de la especificidad de segmentación de la proteasa usada para generar la mezcla de proteínas y péptidos, y d) la media total de la hidropatía de los péptidos dia-
na.

8. Método para determinar la cantidad relativa del nivel y/o actividad de al menos un péptido diana en más de una muestra que comprende péptidos, que consta de los siguientes pasos: a) añadir un compuesto formado por un grupo funcional que puede estar alterado por vía química, o enzimática, o química y enzimática, de forma que un complejo alterado de compuesto-péptido diana migre de forma diferente a su versión inalterada en la misma separación cromatográfica, y un primer isótopo, a una primera muestra compuesta de péptidos donde dicho compuesto interactúa de forma estable con al menos un péptido, formando un complejo de compuesto-péptido diana; b) añadir un compuesto formado por un grupo funcional que puede estar alterado por vía química, o enzimática, o química y enzimática, de forma que un complejo alterado de compuesto-péptido diana migre de forma diferente a su versión inalterada en la misma separación cromatográfica, y un segundo isótopo, a una segunda muestra compuesta de péptidos donde dicho compuesto interactúa con al menos un péptido, formando un complejo de compuesto-péptido diana; c) combinar la mezcla de péptidos de la primera muestra con la mezcla de péptidos de la segunda muestra; d) separar las mezclas combinadas de péptidos en múltiples fracciones en un primer paso cromatográfico, donde en la fracción derivada de dicho paso cromatográfico se hallan tanto los péptidos como los complejos de compuesto-péptido diana; e) alterar por vía química, o enzimática, o química y enzimática, dicho compuesto presente en al menos un complejo de compuesto-péptido diana en cada fracción; f) aislar los complejos alterados de compuesto-péptido diana fuera de cada fracción en un segundo paso cromatográfico, donde la cromatografía se realiza con el mismo tipo de cromatografía, o parecido, que en el paso d); g) realizar un análisis espectrométrico de masa de los complejos aislados alterados de compuesto-péptido diana; h) calcular las cantidades relativas de los complejos alterados de compuesto-péptido diana en cada muestra comparando las alturas del pico de los idénticos, pero etiquetados de forma diferente, complejos alterados de compuesto-péptido diana, e i) determinar la identidad de dichos péptidos diana en los complejos alterados de compuesto-péptido diana y sus correspondientes proteínas.

9. El método de la reivindicación 8, donde al determinación de la identidad de los complejos alterados de compuesto-péptido se lleva a cabo con un método seleccionado del grupo formado por: un método de espectrometría de masa tándem, un análisis de Degradación Post-Source y la medición de la masa de los péptidos, en combinación con la búsqueda en bases de datos.

10. El método de la reivindicación 9, donde la determinación de la identidad de los complejos alterados compuesto-péptido se basa además en uno o más de los siguientes factores: a) la determinación del número de grupos aminados libres en los péptidos diana; c) el conocimiento de la especificidad de segmentación de la proteasa usada para generar la mezcla de proteínas y péptidos, y d) la media total de la hidropatía de los péptidos diana.