ES2242864T3

ES2242864T3 - Procedimientos y aparatos para el analisis cualitativo y cuantitativo sin gel de proteoma, y sus usos.

Info

Publication number: ES2242864T3
Application number: ES02735176T
Authority: ES
Inventors: Joel Vandekerckhove; Kris Gevaert
Original assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Current assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Priority date: 2001-03-22
Filing date: 2002-03-22
Publication date: 2005-11-16
Anticipated expiration: 2022-03-22
Also published as: AU2006201455B2; CA2419492A1; WO2002077016A2; WO2002077016A3; DE60204669T2; US6908740B2; US20050196823A1; AU2002310985B2; DE60204669D1; CA2419492C; JP2005500990A; EP1370571B1; CA2504413A1; PT1370571E; ATE297944T1; US20040005633A1; DK1370571T3; EP1370571A2; AU2006201455A1; JP4300029B2

Abstract

Un procedimiento para aislar un subconjunto de péptidos de una mezcla peptídica de proteínas, que comprende las etapas de: (a) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones de péptidos mediante cromatografía; (b) alterar química o enzimáticamente, o química y enzimáticamente al menos un aminoácido de al menos uno de los péptidos en cada fracción, generando así un subconjunto de péptidos alterados; y (c) aislar dichos péptidos alterados o llamados señalizados de cada fracción mediante cromatografía, en el que la cromatografía de las etapas (a) y (c) se realiza con el mismo tipo de cromatografía.

Description

Procedimientos y aparatos para el análisis cualitativo y cuantitativo sin gel de proteoma, y sus usos.

Resumen de la invención

Se proporcionan procedimientos y aparatos para el análisis cualitativo y cuantitativo de proteoma. Los procedimientos y aparatos permiten aislar un subconjunto de péptidos de mezclas complejas de péptidos. El aislamiento se basa en una alteración química y/o enzimática específica de uno o más tipos de péptidos. Esta alteración modifica las propiedades biofísicas, químicas o cualquier otra propiedad bioquímica de los tipos de péptidos afectados (por ejemplo, la carga eléctrica neta y/o la hidrofobicidad) de modo que los péptidos alterados se pueden separar de los péptidos inalterados.

En una realización, esta alteración se aplica entre una primera separación cromatográfica de la mezcla compleja de péptidos y una segunda separación cromatográfica de la mezcla compleja alterada, usando el mismo tipo de separación cromatográfica en la primera y segunda separación. El "mismo tipo de separación cromatográfica" significa que tanto la primera como la segunda separación cromatográfica se basan en la hidrofobicidad, o tanto la primera como la segunda separación cromatográfica se basan en intercambio iónico. Por lo tanto, los procedimientos de la presente invención usan una primera etapa de separación mediante la cual las mezclas complejas de péptidos se separan en fracciones basadas en sus patrones de elución o de migración. Posteriormente, cada fracción se somete a una reacción de alteración específica que se puede llevar a cabo de forma química o enzimática o química y enzimática. Después, cada fracción se vuelve a someter a una segunda separación. Basándose en i) el tipo de alteración, y ii) las condiciones de separación, el subconjunto de péptidos alterados en cada fracción eluirá o migrará separado de los péptidos inalterados.

Además, la presente invención usa un aparato para llevar a cabo los procedimientos de una forma selectiva y eficaz, usando un sistema de una sola columna o un sistema de múltiples columnas, de columnas idénticas o similares, que se pueden usar en un modo exclusivamente paralelo, exclusivamente en serie o en un modo combinado serie/paralelo. Después, los péptidos aislados se pueden liberar gradualmente o en serie y pasarlos a sistemas analíticos para la identificación.

Antecedentes de la invención

El proteoma se ha definido como la dotación entera de proteínas expresada por una célula, tipo de tejido u organismo, y por consiguiente, la proteómica es el estudio de esta dotación expresada en un momento dado o en determinadas condiciones medioambientales. Dicho análisis global requiere que se identifiquen y caractericen de forma rutinaria miles de proteínas de una sola muestra. Se considera que la electroforesis en gel de poliacrilamida de dos dimensiones (PAGE-2D) es una herramienta importante para la proteómica, que produce separaciones que presentan miles de manchas puntuales de proteínas en el gel 2D. Las proteínas en un gel se pueden detectar usando diferentes tinciones, que permiten en cierta medida, la cuantificación y comparación entre geles de diferentes muestras. Se pueden identificar proteínas, por ejemplo, cortando una mancha puntual de proteína y haciendo digerir la mancha puntual con una proteasa de especificidad conocida. Los péptidos que resultan de dicha escisión tienen masas particulares que se pueden determinar posteriormente por espectrometría de masas. Estos datos se comparan con las masas de péptidos en las bases de datos. Estas últimas masas son datos in silico que se obtienen calculando el peso molecular de cada proteína y sus fragmentos de escisión partiendo, por ejemplo, de datos de la secuencia de ADN. Cuando una masa de un péptido determinada espectrométricamente y con precisión se corresponde con la masa de un péptido in silico, esto normalmente es suficiente para anotar el péptido con su proteína de origen. O viceversa, se puede identificar una proteína particular en una muestra identificando uno o más de sus fragmentos peptídicos constituyentes (llamados la huella peptídica de la masa del péptido).

Sin embargo, la PAGE 2D es secuencial, requiere un trabajo intenso y es difícil de automatizar. Además, hay clases específicas de proteínas, tales como las proteínas de membrana, proteínas muy grandes y muy pequeñas, y proteínas muy ácidas o básicas, que son difíciles de analizar usando este procedimiento. Otro fallo importante es su tendencia a las proteínas muy abundantes, de modo que las proteínas reguladoras menos abundantes (tales como factores de transcripción y proteína quinasas) raramente son detectadas cuando se analizan los lisatos celulares totales.

Debido a estos inconvenientes, los científicos han buscado estrategias alternativas para analizar el proteoma sin necesidad de purificar cada proteína hasta homogeneidad. Estas tecnologías se denominan en el presente documento "sistemas sin gel", y no usan una etapa de separación en gel. La estrategia de la huella peptídica de la masa ha enseñado que las proteínas se pueden identificar basándose en la masa de uno o más de sus péptidos constituyentes. Una estrategia para analizar proteínas en una muestra biológica ha sido llevar a cabo la proteolisis de las proteínas y determinar la masa de los péptidos resultantes. En la medida en que la muestra solo contenga una cantidad pequeña de proteínas diferentes, el número resultante de péptidos es pequeño y se puede identificar separando los péptidos por cromatografía seguido de análisis por espectrometría de masas. En muestras biológicas más complejas, la proteolisis de las proteínas producirá miles de péptidos y esto sobrepasa la capacidad de resolución de cualquier sistema cromatográfico conocido. Da como resultado la coelución y por lo tanto la separación y aislamiento ineficaces de los péptidos individuales. Además, la potencia de resolución de la espectrometría de masas acoplada con dicha cromatografía no es suficiente para determinar de forma adecuada la masa de los péptidos individuales. Una estrategia para mejorar la resolución de las mezclas complejas de péptidos es usar la cromatografía multidimensional, tal como el procedimiento descrito recientemente de análisis directo de complejos de proteínas grandes (DALPC) (Link y col. (1999)). El procedimiento DALPC usa las propiedades físicas independientes de carga e hidrofobicidad para resolver las mezclas complejas de péptidos mediante una combinación de cromatografía de intercambio catiónico fuerte y de fase inversa. Aunque esta estrategia mejora la separación de la mezcla compleja en sus componentes individuales, la capacidad de resolución de esta estrategia todavía es muy insuficiente para identificar de forma reproducible los péptidos constituyentes de las muestras biológicas. Son desventajas adicionales del procedimiento DALPC la incompatibilidad con el análisis de proteínas poco abundantes, y el hecho de que el procedimiento no se puede usar de forma cuantitativa.

Una segunda estrategia descrita recientemente, el procedimiento ICAT, se basa en el uso de una combinación de nuevos reactivos químicos particularmente marcadores de afinidad isotópica (ICAT, por sus siglas en inglés isotope-coded affinity tags) y espectrometría de masas en tándem (Gygi y col. (1999)). El procedimiento ICAT se basa en la modificación de las proteínas que contienen cisteína mediante un derivado de yodoacetato que lleva un marcador de biotina. Después de escindir enzimáticamente las proteínas modificadas en péptidos, en una etapa de purificación por afinidad sólo los péptidos marcados son empujados hacia abajo con las perlas recubiertas de estreptavidina. La etapa de purificación por afinidad reduce la complejidad de la mezcla de péptidos original, haciendo que la separación de los péptidos constituyentes por cromatografía líquida combinada con espectrometría de masas sea un objetivo más viable y realista. Sin embargo, las desventajas son que una etapa de purificación por afinidad normalmente necesita usar cantidades mayores de material de partida debido a la pérdida de material durante la etapa de purificación. Además, el marcaje ICAT es una modificación relativamente grande (\sim500 Da) que permanece en cada péptido a lo largo del análisis por EM complicando los algoritmos de búsqueda de las bases de datos, especialmente para péptidos pequeños. El procedimiento también falla para proteínas que no contienen restos de cisteína. Además, debido a la etapa de purificación por afinidad, los péptidos modificados son generados de una vez y son liberados en una mezcla llamada comprimida.

Esto significa que no hay una separación cromatográfica óptima y que hay una detección espectrométrica de masas menos eficaz de los péptidos modificados. Igualmente, otras dos publicaciones (Geng y col., 2000 y Ji y col., 2000) usan cromatografía de afinidad para seleccionar un subconjunto de péptidos y usan péptidos representativos aislados para identificar las proteínas de origen correspondientes.

La presente invención describe una nueva metodología sin gel para el análisis cualitativo y cuantitativo de proteoma sin necesidad de cromatografía multidimensional y sin usar marcadores de afinidad. La metodología es muy flexible, se puede aplicar a una plétora de clases diferentes de péptidos e incluso se puede aplicar a muestras biológicas que comprenden un número pequeño de células.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Esquema que demuestra el procedimiento de separación de péptidos directo y que indica los diferentes parámetros usados para describir el procedimiento de separación. (A) La mezcla peptídica de proteínas total separada en la serie primaria; t_{3} y t_{4} indican el intervalo de tiempo que tarda una fracción dada (w_{1}). (B) Los péptidos señalizados presentan desplazamientos hidrófilos entre \delta_{min} y \delta_{max}. Eluyen entre intervalos de tiempo t_{1} y t_{2} en la ventana w_{2}. (C) Los péptidos señalizados son más hidrófobos, muestran desplazamientos hidrófobos entre \delta'_{min} y \delta'_{máx}, eluyen entre los tiempos t_{5} y t_{6} en la ventana w'_{2}.

Figura 2: Se mezclaron cuatro fracciones de la serie primaria (Fig. 1A) y se sometieron al procedimiento de alteración. Se someten a la serie secundaria, y los péptidos señalizados eluyen entre t_{1} y t_{2}, t'_{1} y t'_{2}, t''_{1} y t''_{2} y t'''_{1} y t'''_{2}, respectivamente. Las fracciones se combinan de forma que los péptidos separados no solapen con los péptidos inalterados de la fracción previa. Mezclando las fracciones, se reduce el número de series secundarias.

Figura 3: Perfiles de absorbancia UV a 214 nm de separaciones por RP-HPLC de NH_{2}-YSFVMTAER-COOH (A), NH_{2}-YSFVC-TAER-COOH (B) y NH_{2}-YSFVWTAER-COOH (C), antes (señal inferior) y después de tratamiento (señal superior) con H_{2}O_{2} al 0,5% en TFA al 1%, a 30ºC durante 30 min. En los paneles D-F se muestran los espectros de MALDI-RETOF-MS de los péptidos control y tratados con H_{2}O_{2} que eluyen (respectivamente señal inferior frente a señal superior).

Figura 4: (A) Perfil de absorbancia UV a 214 nm del péptido NH_{2}-YSFVCTAER-COOH, separado en una columna de HPLC C18 de fase inversa. El péptido se alteró mediante acrilamida seguido de oxidación a su derivado de S-propionamido-cisteína-sulfóxido (señal inferior), el cual cuando se cromatografía en las mismas condiciones de HPLC muestra un desplazamiento hidrófilo de aproximadamente 2 minutos comparado con el péptido inalterado (señal superior). Obsérvese la presencia del doblete enantiómero que migra junto, típico del derivado de sulfóxido en el sistema de TFA-acetonitrilo. (B) Espectro de MALDI-RETOF-MS del derivado de S-propionamido-cisteína-sulfóxido del péptido NH_{2}-YSFVCTAER-COOH. Los fragmentos iónicos que proceden de la rápida pérdida neutra de la cadena lateral alterada del resto de cisteína se indican en azul y son de gran ayuda para identificar la presencia de una cisteína modificada en los péptidos de origen.

Figura 5: Visión de conjunto de la secuencia de reacciones usada para la separación de los péptidos que contienen metionina, cisteína y la suma de metionina y cisteína.

Figura 6: Descripción esquemática de las etapas principales de separación del subconjunto de péptidos bloqueados en el extremo NH_{2}. Se indican los restos de aminoácidos críticos. R = Arg, K = Lys, hR = homoArg, PIC = isocianato de fenilo, PC = fenilcarbamilo. Todos los PTC-péptidos se vuelven más hidrófobos. Los péptidos N-acetilados no cambian y eluirán en la serie 2 exactamente de la misma forma que en la serie 1. Así, los péptidos bloqueados se segregarán de la mayoría de los PCT-péptidos.

Figura 7: Gráfico circular que indica el número de masas peptídicas "únicas" generadas por una digestión con Lys-C endoproteinasa in silico en accesos de proteínas de SwissProt curadas de origen tanto humano como de E. coli. Como puede verse, en ambos casos más del 90% de las masas peptídicas (calculadas con una presión de 0,001 Da) corresponden a secuencias peptídicas únicas que contienen al menos un resto metionina, en la base de datos y por lo tanto se pueden usar para identificar sus proteínas de origen.

Figura 8: Resumen esquemático de las reacciones que conducen a una estrategia proteómica diferencial cuantitativa basada en el péptido NH_{2}-terminal. Se indican las cadenas laterales de los aminoácidos críticos. R = Arg, K = Lys, hR = homoArg, PIC = isocianato de fenilo, PC = fenilcarbamilo, TNBS = trinitrobencenosulfonato. ^{16}O/^{18}O se refiere al marcaje diferencial obtenido por digestión en H_{2}^{16}O o H_{2}^{18}O respectivamente.

Figura 9: La columna única del Separador de Péptidos: la separación de péptidos se produce durante las series secundarias, después de haber llevado a cabo las alteraciones en las fracciones de las series primarias. Las fracciones de péptidos de la serie primaria se combinaron como se establece en la Tabla IVA y se cargaron mediante el inyector de muestras. Todas las condiciones (adsorbentes RP, caudales, gradientes, disolventes, etc.) se mantuvieron idénticos en las series primarias así como en las secundarias. En la versión de una sola columna, todos los péptidos pasan la misma columna. Después de cargar la muestra, se crea un gradiente usando sistemas de bomba de HPLC de alta presión convencionales y disponibles en el comercio (aquí denominados bombas de disolvente). Las válvulas son manejadas automáticamente (a y b son válvulas de alta presión; y y z son válvulas de baja presión) dirigiendo los flujos de disolvente en la dirección deseada, sea a los instrumentos analíticos (colector de fracciones, espectrómetro de masas, o dianas MALDI) o a los residuos.

Figura 10: Perfil de absorbancia UV a 214 nm en una separación por RP-HPLC (columna C18 d.i. 2,1 x 250 mm) de una digestión total con tripsina de un lisato de 50.10^{6} células de E. coli. Los péptidos trípticos se eluyen usando un gradiente lineal creciente de 1% de B/min con un caudal constante de 80 \mul/min, empezando con 5% de B (disolvente B = acetonitrilo al 70% en TFA en agua al 0,09%, el disolvente A es TFA en agua al 0,1%). Los péptidos trípticos que eluyen entre 23% de disolvente B y 63% de disolvente B se recogen en 40 fracciones de 80 \mul cada una. La primera fracción recogida se numera con el número 10, y la última se numera con el número 49 (véase también el Ejemplo 18). Las fracciones que se cogieron y se volvieron a procesar, se indican en la Figura 11 con recuadros rectangulares azules.

Figura 11: Perfiles de absorbancia UV a 214 nm que muestran la recolección de los péptidos con metionina-sulfóxido obtenidos después de oxidación suave (usando H_{2}O_{2} al 0,5% en TFA al 1%) de los péptidos presentes en las fracciones 10, 22, 34 y 46 (serie primaria). La recolección de los péptidos con Met-SO se inicia 6 minutos antes de eluir la mayor parte de los péptidos no modificados y tarda 4 minutos. Las condiciones cromatográficas eran idénticas a las mostradas en la Figura 10. Las fracciones que contienen los péptidos no modificados se indican con flechas azules, los péptidos separados están trazados en rojo: 4-7, 16-19, 28-31 y 40-43 (Tabla IVA).

Figura 12: Separador de péptidos de triple columna: Este sistema trabaja con tres columnas RP idénticas conectadas en paralelo. Aquí también se mantienen las mismas condiciones, no sólo entre las series paralelas sino también comparado con la serie primaria. Las fracciones recogidas de la serie primaria se combinaron, se modificaron y se distribuyeron en cada una de las columnas como se establece en la Tabla V. Los flujos de disolvente se mantienen constantes a lo largo de las tres columnas. Esto se puede lograr conectando cada columna individual a un sistema de bomba de alta presión, usando por lo tanto tres de dichas bombas (versión A), o usando una sola bomba de alta presión pero controlando los caudales que van a cada una de las columnas, usando un sistema distribuidor controlado (versión B). Dichos reguladores de caudal ahora están disponibles en el comercio (Las válvulas a, b, c, d, e, f, g, w y x son válvulas de alta presión, las válvulas j-o son válvulas de baja presión). Estas válvulas se pueden manejar con un PC, permitiendo un funcionamiento completamente automático, incluyendo la carga, separación y análisis (recolección de fracciones, espectrómetro de masas o diana MALDI).

Figura 13: El Separador de péptidos de nueve columnas: Este sistema difiere del aparato previo en varios aspectos: i) se carga cada vez en una columna una fracción de la serie primaria, ii) cada una de las columnas es más pequeña que la columna de la serie primaria y puede consistir en material desechable, y iii) se hacen trabajar en un modo en serie/paralelo combinado de forma que cada columna se desarrolla completamente antes de dirigir el gradiente hacia la siguiente columna. Puesto que las columnas son más pequeñas, los tiempos de funcionamiento pueden ser menores. Las válvulas a-g, que controlan la entrada de las columnas son válvulas de alta presión. Las válvulas h-o y p-r controlan los flujos de salida de las diferentes columnas al residuo o a los sistemas de análisis, y pueden ser válvulas de baja presión de volumen muerto. Las columnas I, II y III se desarrollan con el mismo gradiente de disolvente, dirigiendo la primera parte del gradiente hacia la columna I, usando la segunda parte para la columna II y dirigiendo la tercera parte a la columna III (para los detalles véase el Ejemplo 13). La segregación de los péptidos señalizados e inalterados se dirige mediante el ajuste de la válvula que se puede hacer funcionar usando un PC. El separador de nueve columnas trabaja con tres conjuntos de tres columnas cada uno, que van un retraso frente al conjunto previo, en los ejemplos descritos aquí, el retraso se fija en tres minutos; B empieza tres minutos más tarde que A y C empieza tres minutos después de que empiece B. Los péptidos que eluyen obtenidos de cada uno de los conjuntos de columnas son dirigidos mediante las válvulas p-r hacia los sistemas analíticos como se ha descrito antes.

Figura 14: (A) Perfil de absorción UV (214 nm) de una separación por RP-HPLC de la mezcla de péptidos de referencia NH_{2}-Alan-Arg-COOH (m = 7 a 42). Se pueden observar claramente los componentes de esta mezcla que difieren en un resto alanina adicional. La separación se hizo en una columna C18 de RP-HPLC de 2,1 mm de d.i. usando un gradiente lineal de acetonitrilo en TFA al 0,1%. (B) Espectro de MALDI-RETOF-MS que pone de manifiesto los diferentes componentes presentes en esta mezcla separada por 71 uma.

Figura 15: Espectro de masas de MALDI-RETOF de los péptidos presentes en dos fracciones de péptidos con Met-SO recogidos (paneles A y B). Se dan las masas de los péptidos con Met-SO identificados y su producto de fragmentación característico y se indica una pérdida de ácido metanosulfónico observada en el modo de reflectrón, que da un fragmento más corto (indicado con una flecha azul).

Figura 16A: Un esquema de la estrategia proteómica diferencial cuantitativa que separa los péptidos con metionina. MSO se refiere a la metionina-sulfóxido.

Figura 16B: Se ensayó la incorporación de ^{18}O para usar el análisis cuantitativo relativo. Brevemente, antes de la serie primaria, una parte de una digestión con ^{16}O se mezcló con dos partes de una digestión con ^{18}O, la muestra se acidificó hasta TFA al 1%, y los péptidos señalizados con metionina se separaron de la mezcla de péptidos. En el análisis por CL-EM se calcularon las proporciones ^{18}O/^{16}O de los iones de péptidos observados. Los resultados de este análisis confirman que las proporciones de péptidos generalmente varían alrededor de 2.

Figura 17: Proporciones isotópicas medidas en MALDI-RETOF-MS (valores del eje Y) de 19 péptidos (masas peptídicas en el eje X) obtenidas de un total de 5 pmoles de una mezcla 1/1 de digestiones trípticas de BSA marcadas con ^{16}O y ^{18}O. Se obtuvo un valor medio de 1,03 para la proporción medida de la mezcla de BSA.

Figura 18: Diagrama que representa el número de péptidos con Met-SO (mostrados en azul) usando MALDI-RETOF-MS en las fracciones primarias de una digestión tríptica del material proteico de 50.10^{6} células E. coli frente a los péptidos que no se pudo demostrar que contuvieran metionina (mostrados en rojo).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento y un aparato para aislar e identificar un subconjunto de péptidos de una mezcla compleja de péptidos.

El procedimiento utiliza una combinación de dos separaciones cromatográficas del mismo tipo, separadas por una etapa en la que una población de péptidos seleccionada se altera de modo que el comportamiento cromatográfico de los péptidos alterados en la segunda separación cromatográfica difiere del comportamiento cromatográfico de la versión inalterada.

Para aislar un subconjunto de péptidos de una mezcla peptídica de proteínas, la presente invención se puede aplicar con dos modos de acción. En un primer modo, se altera una minoría de los péptidos en la mezcla peptídica de proteínas, y se aísla el subconjunto de péptidos alterados. En este modo de acción los péptidos alterados se llaman péptidos señalizados. En un segundo modo inverso, se altera la mayoría de los péptidos en la mezcla peptídica de proteínas y se aísla el subconjunto de péptidos inalterados. En este modo de acción los péptidos inalterados se llaman los péptidos de identificación.

En una realización, la invención proporciona un procedimiento para aislar un subconjunto de péptidos de una mezcla peptídica de proteínas, que comprende las etapas de:(a) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones de péptidos mediante cromatografía; (b) alterar química o enzimática, o química y enzimáticamente al menos un aminoácido de al menos uno de los péptidos en cada fracción, generando de esta forma un subconjunto de péptidos alterados; y (c) aislar dichos péptidos alterados o llamados señalizados de cada fracción mediante cromatografía, en la que la cromatografía de las etapas (a) y (c) se lleva a cabo con el mismo tipo de cromatografía.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para aislar un subconjunto de péptidos de una mezcla peptídica de proteínas, que comprende las etapas de a) una separación inicial de la mezcla peptídica de proteínas en fracciones mediante cromatografía, b) alterar química o enzimática, o química y enzimáticamente al menos un aminoácido de la mayoría de los péptidos en cada fracción, generando así un subconjunto de péptidos inalterados, y c) aislar dichos péptidos inalterados o llamados de identificación mediante una segunda cromatografía, de modo que la cromatografía de la etapa de separación inicial y la segunda se llevan a cabo con el mismo tipo de cromatografía.

El mismo tipo de cromatografía significa que el tipo de cromatografía es el mismo tanto en la separación inicial como en la segunda separación. Por ejemplo, el tipo de cromatografía en ambas separaciones se basa en la hidrofobicidad de los péptidos. Igualmente, el tipo de cromatografía en ambas etapas se puede basar en la carga de los péptidos y el uso de cromatografía de intercambio iónico. Todavía en otra alternativa, la separación cromatográfica en ambas etapas se basa en la cromatografía por exclusión de tamaños o en cualquier otro tipo de cromatografía.

La primera separación cromatográfica, antes de la alteración, se denomina en lo sucesivo la "serie primaria" o la "etapa cromatográfica primaria" o la "separación cromatográfica primaria" o "serie 1". La segunda separación cromatográfica de las fracciones alteradas se denomina en lo sucesivo la "serie secundaria" o la "etapa cromatográfica secundaria" o la "separación cromatográfica secundaria" o "serie 2".

En una realización preferida de la invención las condiciones cromatográficas de la serie primaria y serie secundaria son idénticas, o para un experto en la técnica, sustancialmente iguales. Sustancialmente similares significa que, por ejemplo, se toleran pequeños cambios en el flujo y/o gradiente y/o temperatura y/o presión y/o perlas cromatográficas y/o composición del disolvente, entre la serie 1 y la serie 2, siempre que las condiciones cromatográficas conduzcan a una elución de los péptidos alterados que es previsiblemente distinta de la de los péptidos no alterados, y esto para cada fracción recogida de la serie 1.

Tal como se usa en el presente documento, una "mezcla peptídica de proteínas" típicamente es una mezcla compleja de péptidos obtenida como resultado de la escisión de una muestra que comprende proteínas. Dicha muestra típicamente es cualquier mezcla compleja de proteínas tal como, sin limitar, un lisato de células procariotas o eucariotas o cualquier mezcla compleja de proteínas aislada de una células o una fracción de organelos específicos, una biopsia, células diseccionadas por captura láser o cualquier complejo de proteínas grande tales como ribosomas, virus y similares. Se puede esperar que cuando dichas muestras de proteínas se escindan en péptidos, pueden contener fácilmente hasta 1.000, 5.000, 10.000, 20.000, 30.000, 100.000 o más péptidos diferentes. Sin embargo, en un caso particular una "mezcla peptídica de proteínas" también puede provenir directamente de un fluido corporal o más generalmente de cualquier solución de origen biológico. Se sabe que la orina, por ejemplo, contiene además de proteínas, una mezcla de péptidos muy compleja que resulta de la degradación proteolítica de las proteínas en el cuerpo del cual los péptidos son eliminados por los riñones. Todavía otra ilustración de una mezcla peptídica de proteínas es la mezcla de péptidos presente en el líquido cefalorraquídeo.

Hablando de forma más general, la invención se aplica a cualquier mezcla compleja de péptidos. Tal como se usa en el presente documento, una "mezcla compleja de péptidos" se refiere a una mezcla de más de 100 péptidos diferentes, típicamente más de 500 péptidos diferentes e incluso más típicamente más de 1.000 péptidos diferentes. En la presente invención las expresiones "mezcla peptídica de proteínas" y "mezcla compleja de péptidos" se usan de forma intercambiable.

También, tal como se usa en el presente documento, "un subconjunto de péptidos" de una mezcla peptídica de proteínas significa una determinada fracción del número total de péptidos presentes en la mezcla peptídica de proteínas. Dicha fracción sin duda es menor que el 50% del número de péptidos inicial, y típicamente representará menos del 20%, e incluso más típicamente menos del 10% del número inicial de péptidos en la mezcla peptídica de proteínas.

El término "alterar" o "alterado" o "alteración" tal como se usa en el presente documento en relación con un péptido, se refiere a la introducción de una modificación específica en un aminoácido de un péptido, con la clara intención de cambiar el comportamiento cromatográfico de dicho péptido que contiene dicho aminoácido modificado.

Un "péptido alterado" tal como se usa en el presente documento contiene un aminoácido que es modificado como consecuencia de una alteración.

Dicha alteración puede ser una modificación química o enzimática estable. Dicha alteración también puede introducir una interacción transitoria con un aminoácido. Típicamente, una alteración será una reacción covalente, sin embargo, una alteración también puede consistir en una formación de complejo, con la condición de que el complejo sea suficientemente estable durante las etapas cromatográficas.

Típicamente, una alteración da como resultado un cambio en la hidrofobicidad, tal que el péptido alterado migra de forma diferente a la versión inalterada en la cromatografía por hidrofobicidad. Alternativamente, una alteración da como resultado un cambio en la carga neta del péptido, tal que el péptido alterado migra de forma diferente que su versión inalterada en una cromatografía de intercambio iónico, tal como una cromatografía de intercambio aniónico o de intercambio catiónico. También, una alteración puede dar como resultado cualquier otro cambio bioquímico, químico o biofísico en un péptido, de modo que el péptido alterado migra de forma diferente a su versión inalterada en una separación cromatográfica. La expresión "migra de forma diferente" significa que un péptido alterado particular eluye con un tiempo de elución diferente con respecto al tiempo de elución del mismo péptido sin alterar.

La alteración se puede obtener mediante una reacción química o una reacción enzimática o una combinación de una reacción química y una enzimática. Una lista no limitante de reacciones químicas incluye alquilación, acetilación, nitrosilación, oxidación, hidroxilación, metilación, reducción y similares. Una lista no limitante de reacciones enzimáticas incluye tratar los péptidos con fosfatasas, acetilasas, glicosidasas u otras enzimas que modifican las modificaciones co o postraduccionales presentes en los péptidos. La alteración química puede comprender una reacción química, pero también puede comprender más de una reacción (por ejemplo, una reacción de \beta-eliminación y una oxidación) tal como, por ejemplo, dos reacciones consecutivas con el fin de aumentar la eficacia de la alteración. Igualmente, la alteración enzimática puede comprender una o más reacciones enzimáticas.

Otra característica esencial de la alteración en la presente invención es que la alteración permite el aislamiento de un subconjunto de péptidos de una mezcla peptídica de proteínas. Una reacción química y/o enzimática que de como resultado una modificación general en todos los péptidos en una mezcla peptídica de proteínas, no permitirá el aislamiento de un subconjunto de péptidos. Por lo tanto, una alteración debe alterar una población de péptidos específica en una mezcla peptídica de proteínas para permitir aislar un subconjunto de péptidos, en el caso de que dicha alteración se aplique entre dos separaciones cromatográficas del mismo tipo.

Una estrategia para poder aislar un subconjunto de péptidos compuesto de péptidos señalizados es dirigir la alteración a un aminoácido poco común. Un aminoácido poco común se considera que es un aminoácido que no está presente con demasiada abundancia en la mezcla compleja de péptidos. Por ejemplo, si el aminoácido específico estuviera representado con demasiada abundancia en la mezcla de péptidos (por ejemplo, en más del 50% de los péptidos), entonces se seleccionarían demasiados péptidos, y otra vez sería imposible una separación seleccionada y eficaz de los péptidos señalizados. Preferiblemente se seleccionan menos del 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01% o incluso menos, de los péptidos de la mezcla compleja de péptidos.

En una realización preferida, el aminoácido específico seleccionado para alterar comprende uno de los siguientes aminoácidos: metionina (Met), cisteína (Cys), histidina (His), tirosina (Tyr), lisina (Lys), triptófano (Trp), arginina (Arg), prolina (Pro) o fenilalanina (Phe).

Alternativamente, la alteración se dirige específicamente a una población de aminoácidos que llevan una modificación co o postraduccional. Son ejemplos de dichas modificaciones co o postraduccionales la glicosilación, fosforilación, acetilación, formilación, ubiquitinación, pirroglutamilación, hidroxilación, nitrosilación, \varepsilon-N-acetilación, sulfatación, bloqueo del NH_{2}-terminal. Ejemplos de aminoácidos modificados alterados para aislar un subconjunto de péptidos de acuerdo con la presente invención son la fosfoserina (fosfo-Ser), fosfo-treonina (fosfo-Thr), fosfo-histidina (fosfo-His), fosfo-aspartato (fosfo-Asp) o acetil-lisina.

Una lista adicional de ejemplos, no limitante, de aminoácidos que se pueden alterar y se pueden usar para seleccionar un subconjunto de péptidos son otros aminoácidos modificados (p. ej. un aminoácido glicosilado), D-aminoácidos incorporados artificialmente, selenoaminoácidos, aminoácidos que llevan un isótopo no natural, y similares. Una alteración también puede marcar un resto particular (p. ej. un grupo NH_{2}-terminal libre) en uno o más aminoácidos o añadir modificaciones in vitro a determinados aminoácidos.

En una realización preferida de la invención, el aminoácido seleccionado que se va a alterar debe ser poco común, pero no obstante debe estar presente en la inmensa mayoría de las proteínas en la muestra que comprende proteínas. La inmensa mayoría de las proteínas debe contener al menos uno y preferiblemente dos, tres o un número limitado de restos del aminoácido seleccionado. Por ejemplo, la cisteína es un aminoácido poco común y sólo el 14,55% de las proteínas y/o de los marcos de lectura abiertos de secuencias genómicas de E. coli no contienen Cys. Este número es 11,34% para el Trp, 4,12% para la His y 0,32% para la Met, respectivamente. Este último aumenta a 3,17% después de omitir la metionina iniciadora, la cual es procesada con frecuencia. En la Tabla I se resume un análisis teórico similar usando otras secuencias genómicas almacenadas en la base de datos Swiss-Prot (versión 39.0). Estos estudios ponen de manifiesto que entre los aminoácidos poco comunes, la metionina representa una excelente representatividad en las proteínas en especies tan diversas como mamíferos, levaduras y E. coli. Más del 96% de las proteínas contienen al menos una metionina interna. Este número es bastante menor para la cisteína que, dependiendo del organismo, está presente en el 85% a 95% de las proteínas predichas. Estos valores están de acuerdo con los resultados de estudios anteriores basados en los fragmentos corregidos de las bases de datos comentadas SWISS-PROT y SWISS-NEW, que usando 72.101 secuencias indicaron que el 2,3% de las proteínas no contenía Met, mientras que el 12,8% de las proteínas carecía de Cys (Vuoung y col., 2000). Además, estos estudios pusieron de manifiesto una distribución más homogénea de la Met que de la Cys en las diferentes proteínas.

La metionina es un aminoácido que se marca preferiblemente para la alteración en la presente invención.

La cisteína, histidina y triptófano también son a aminoácidos preferidos. También se pueden usar en la invención otros aminoácidos observados con menos frecuencia tales como lisina, fenilalanina y tirosina. La elección de un aminoácido para alterar depende de la complejidad y el origen (p. ej. plantas, animales, bacterias o virus) de las proteínas de la muestra. Por ejemplo, en plantas, la metionina es un aminoácido poco representado, y por lo tanto es más adecuado seleccionar un aminoácido tal como cisteína como aminoácido específico para alterar.

Alternativamente, la reacción química y/o enzimática específica tiene especificidad para más de un resto de aminoácido (p. ej., fosfoserina y fosfotreonina o la combinación de metionina y cisteína) y permite separar un subconjunto de péptidos de una mezcla peptídica de proteínas. Típicamente, sin embargo, el número de aminoácidos seleccionados que se va a alterar será uno, dos o tres. En otro aspecto, se pueden alterar dos tipos diferentes de aminoácidos seleccionados en una mezcla peptídica de proteínas y se puede aislar un subconjunto de péptidos señalizados que contienen uno o ambos aminoácidos alterados. Todavía en otro aspecto, en la misma mezcla peptídica se puede alterar primero un aminoácido, se puede aislar un subconjunto de péptidos señalizados, y posteriormente, se puede hacer una segunda alteración en el resto de la muestra inalterada previamente, y se puede aislar otro subconjunto de péptidos señalizados.

La presente invención requiere que la alteración sea eficaz en cada una de las fracciones de péptidos de la serie primaria. Por lo tanto, en cada fracción obtenida de la etapa cromatográfica primaria, los péptidos señalizados tienen que migrar de forma distinta de los péptidos inalterados en la etapa cromatográfica secundaria. La alteración de un aminoácido en un péptido señalizado induce un desplazamiento de la elución de dicho péptido señalizado. Dependiendo del tipo de alteración aplicada, el desplazamiento puede estar causado por un cambio en la hidrofobicidad, la carga neta y/o la afinidad por un ligando (por ejemplo, un ion metálico) de los péptidos señalizados. Este desplazamiento se llama \deltap y es específico para cada péptido individual señalizado. En el ejemplo de un cambio en la hidrofobicidad, los valores de \deltap se pueden expresar como cambios en el momento hidrófobo, o como un porcentaje de disolventes orgánicos en las series cromatográficas, pero de forma más práctica en unidades de tiempo en las condiciones cromatográficas/ eletroforéticas dadas.

Por lo tanto \deltap no es necesariamente idéntico para cada péptido señalizado, y está entre \delta_{max} y \delta_{min} (véase la figura 1). En \deltap afectan una serie de factores tales como la naturaleza de la alteración inducida, la naturaleza de la fase estacionaria de la columna, la fase móvil (tampones, disolventes), la temperatura y otros. Todos los valores de \deltap considerados juntos delimitan los extremos de \delta_{max} y \delta_{min} (véase la figura 1). Dados t_{1} y t_{2}, los tiempos que delimitan el inicio y el final del intervalo de los péptidos señalizados desplazados, y t_{3} y t_{4}, los tiempos que encierran la fracción cogida de la serie primaria, entonces \delta_{min} (el desplazamiento mínimo) se determinará por t_{3}-t_{2}, mientras que \delta_{max} (el desplazamiento máximo) se determinará por t_{4} - t_{1}. La ventana w_{1} es la ventana de la fracción cogida de la serie primaria w_{1} = t_{4}-t_{3}. La ventana w_{2} es la ventana en la que eluirán los péptidos señalizados w_{2} = t_{2}-t_{1}. Por lo tanto: \delta_{min} = t_{3}-t_{2}; \delta_{max} = t_{4}-t_{1}; w_{1} = \delta_{max}+t_{1}-\delta_{min}-t_{2} y w_{2} = t_{2}-t_{1} = \delta_{max}-\delta_{min}-w_{1}. Son elementos importantes en el procedimiento de separación: \delta_{min}, que delimita la distancia entre los péptidos inalterados y el menos desplazado de los péptidos señalizados en una fracción dada, y w_{2}, la ventana de tiempo en la que eluyen los compuestos señalizados. La palabra "separado" en esta invención es equivalente a la palabra "aislado".

\delta_{min} debe ser suficiente para evitar que los péptidos señalizados eluyan dentro de la ventana w_{1} (y por lo tanto solapen con los péptidos inalterados), y esta regla se aplicará para cada fracción recogida de la serie primaria. Preferiblemente \delta_{min} debería ser w_{1} o mayor con el fin de minimizar el solapamiento entre los péptidos señalizados y los inalterados. Por ejemplo, si w_{1} = 1 minuto, \delta_{min} debería ser preferiblemente 1 minuto o más.

El evitar la superposición o coelución de los péptidos señalizados mejora la posibilidad de identificar un número óptimo de péptidos individuales. Desde esta perspectiva, el tamaño de la ventana w_{2} tiene un impacto en el número de péptidos que se pueden identificar. Valores mayores de w_{2} darán como resultado una descompresión del tiempo de elución de los péptidos señalizado, proporcionando un aislamiento mejor de los péptidos señalizados y una mejor oportunidad para el análisis presentando gradualmente los compuestos para la identificación a los analizadores tales como espectrómetros de masas. Aunque la ventana w_{2} puede ser menor que w_{1}, en una realización preferida, w_{2} será mayor que w_{1}. Por ejemplo, si w_{1} = 1 minuto, w_{2} puede ser 1 minuto o más. Se prefiere que el tamaño de w_{2} y el valor de \delta_{min} y \delta_{max} sean iguales o muy similares para cada fracción recogida de la serie primaria. Sin embargo, es bastante evidente que no es preferible aunque es aceptable, las contaminaciones minoritarias de los péptidos inalterados en la ventana de elución de los péptidos señalizados.

La manipulación de los valores de \delta_{min}, \delta_{max} y w_{2} para obtener una separación óptima de los péptidos señalizados de los péptidos inalterados en cada fracción de la serie primaria, es parte de la presente invención, y comprende, entre otros, la combinación adecuada del(los) aminoácido(s) seleccionado(s) para la alteración, el tipo de alteración, y las condiciones cromatográficas (tipo de columna, tampones, disolvente, etc.).

Aunque se han resuelto los aspectos del desplazamiento hidrófilo antes en el presente documento, también podría proporcionarse una descripción similar en la que un desplazamiento hidrófobo fuera inducido con el fin de separar los péptidos señalizados de los péptidos no alterados. Aquí, t_{3} y t_{4} definen la ventana w_{1} en la que eluyen los péptidos inalterados, mientras que t_{5} y t_{6} definen la ventana w_{2} en la que eluyen los péptidos señalizados. El desplazamiento hidrófobo máximo \delta_{max} = t_{6}-t_{3}, el desplazamiento mínimo = t_{5}-t_{4} (Fig. 1C). Se observará que se pueden usar cálculos similares para las condiciones en las que se mezclan las fracciones.

Para un experto en la técnica es obvio que se puede aplicar la misma estrategia para aislar péptidos señalizados, por ejemplo, con cromatografía de intercambio iónico, u oros tipos de cromatografía.

En una realización, la invención proporciona un procedimiento para aislar péptidos que contienen metionina de una mezcla peptídica de proteínas, que comprende las etapas de (a) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones mediante una serie primaria, (b) alterar químicamente la metionina en los péptidos de cada fracción de péptidos, y (c) aislar los péptidos que contienen metionina señalizados mediante una serie secundaria. En una realización particular, la serie primaria y secundaria son separaciones cromatográficas basadas en la hidrofobicidad y la alteración de metionina induce un desplazamiento hidrófilo en los péptidos que contienen metionina señalizados. En una realización adicional particular, la cromatografía hidrófoba se realiza con una columna de fase inversa y la alteración de la metionina se obtiene con una oxidación suave. Todavía en otra realización, la serie primaria y serie secundaria se basan en la cromatografía de intercambio iónico y la alteración de la metionina es una reacción química con un haluro de alquilo tal como yoduro de metilo. Esta reacción induce un cambio en la carga de los péptidos señalizados y permite separar los péptidos señalizados en la serie secundaria en una columna de intercambio iónico.

En otra realización la invención proporciona un procedimiento para aislar péptidos fosforilados de la mezcla peptídica de proteínas, que comprende las etapas de (a) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones mediante una serie primaria, (b) alterar enzimática y/o químicamente los fosfopéptidos en cada una de las fracciones, y (c) aislar los fosfopéptidos señalizados por una serie secundaria. En una realización particular, la serie primaria y secundaria son separaciones cromatográficas basadas en la hidrofobicidad y la alteración de los fosfopéptidos es un tratamiento con fosfatasas. Los péptidos señalizados desfosforilados experimentan un desplazamiento hidrófobo y por lo tanto se pueden aislar de la mayoría de los péptidos inalterados en cada fracción mediante una serie secundaria en una columna hidrófoba. Se observará que se pueden usar fosfatasas específicas para aislar los fosfopéptidos específicos. Se puede usar una fosfatasa específica para las fosfotirosinas, para aislar los péptidos que contienen una tirosina fosforilada.

Todavía en otra realización, la invención proporciona un procedimiento para aislar péptidos señalizados alterados en la metionina y/o cisteína de una mezcla peptídica de proteínas, que comprende las etapas de (a) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones mediante una serie primaria, (b) alterar químicamente los restos de metionina y cisteína en los péptidos presentes en cada una de las fracciones, y (c) aislar los péptidos con metionina y cisteína señalizados mediante una serie secundaria. Todavía en otra realización la invención proporciona un procedimiento par aislar péptidos señalizados alterados en la cisteína de una muestra que comprende proteínas, que comprende las etapas de (a) oxidar la muestra de proteínas, (b) generar una mezcla peptídica de proteínas, (c) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones mediante una serie primaria, (d) alterar químicamente los restos de cisteína presentes en los péptidos en cada una de las fracciones, y (e) aislar los péptidos con cisteína señalizados mediante una serie secundaria. Todavía en otra realización la invención proporciona un procedimiento para aislar péptidos señalizados alterados en la fosfoserina y/o fosfotreonina de una muestra que comprende proteínas, que comprende las etapas de (a) oxidar la muestra de proteínas, (b) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones mediante una serie primaria, (c) alterar enzimáticamente los péptidos que comprenden fosfoserina y/o fosfotreonina en cada una de las fracciones, y (d) aislar los péptidos con fosfoserina y fosfotreonina señalizados mediante una serie secundaria.

Todavía en otra realización, la invención proporciona un procedimiento para aislar un subconjunto de péptidos de una mezcla peptídica de proteínas, que comprende las etapas de (a) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones mediante una serie primaria, (b) añadir un agente quelante a cada una de las fracciones primarias, y (c) aislar los péptidos quelados mediante una serie secundaria. Dichos compuestos de quelación pueden ser moléculas pequeñas que forman complejos, cofactores, anticuerpos y similares.

Todavía en otra realización, la invención proporciona un procedimiento para aislar péptidos fosforilados de una mezcla peptídica de proteínas, que comprende las etapas de (a) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones mediante una serie primaria, (b) añadir al menos un compuesto de quelación a dichas fracciones primarias, y (c) aislar los péptidos fosforilados mediante una serie secundaria. En una realización específica el compuesto de quelación usado para aislar los péptidos fosforilados comprende Fe^{3+} e iminodiacetato.

Todavía en otra realización, la invención proporciona un procedimiento para aislar un subconjunto de péptidos de una mezcla peptídica de proteínas, que comprende las etapas de (a) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones mediante una serie primaria, (b) añadir química o enzimáticamente un grupo con impedimento estérico y voluminoso a al menos un aminoácido en al menos uno de los péptidos en cada fracción, y (c) aislar dichos péptidos señalizados de cada fracción mediante una serie secundaria, de modo que la serie primaria y secundaria se lleven a cabo en una columna de exclusión por tamaños en condiciones iguales o sustancialmente similares.

Todavía en otra realización, la invención proporciona un procedimiento para aislar péptidos glicosilados de una mezcla peptídica de proteínas, que comprende las etapas de (a) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones mediante una serie primaria, (b) alterar química y/o enzimáticamente la estructuras de glicosilación presentes en los péptidos en cada una de las fracciones, y (c) aislar los péptidos señalizados que comprenden estructuras de glicosilación alteradas, mediante una serie secundaria. En una realización específica, la alteración de las estructuras con glicosilación, puede ser, por ejemplo, una desglicosilación química y/o enzimática, o alternativamente, los grupos glicosilo se pueden convertir en restos con diferentes propiedades biofísicas o bioquímicas, de modo que se puedan separar de los péptidos inalterados que de otra forma coeluirían. Por ejemplo, las cadenas de glicosilo sialiladas se pueden desialilar mediante tratamiento con neuraminidasa, dando como resultado desplazamientos en un medio cromatográfico.

Todavía en otra realización la invención proporciona un procedimiento para aislar péptidos \varepsilon-N-acetilados de una mezcla peptídica de proteínas, que comprende las etapas de (a) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones mediante una serie primaria, (b) desacetilar enzimáticamente los péptidos \varepsilon-N-acetilados en cada una de las fracciones, y (c) aislar los péptidos desacetilados señalizados mediante una serie secundaria.

Como se ha mencionado antes, el aislamiento de un subconjunto de péptidos señalizados con el procedimiento proporcionado por la presente invención requiere que se altere sólo una subpoblación de péptidos en la mezcla peptídica de proteínas. En varias aplicaciones, la alteración se puede realizar directamente en los péptidos. Sin embargo, (a) los tratamientos previos de las proteínas en la muestra y/o (b) tratamientos previos de los péptidos en la mezcla peptídica de proteínas permite ensanchar el espectro de clases de péptidos que se pueden aislar con la invención. Para ilustrar el principio, se describe un ejemplo de como se pueden aislar péptidos que contienen cisteína. Es evidente que los péptidos que contienen una o más cisteínas se pueden convertir en uno o más péptidos señalizados hidrófilos mediante una reacción química, por ejemplo, con acrilamida. Esta alteración química convierte la cisteína en la S-propionamido-cisteína más hidrófila. Este derivado de cisteína se puede convertir en una versión incluso más hidrófila mediante una reacción de oxidación. Dicha oxidación convierte la S-propinamido-cisteína en la S-propinamido-cisteína-sulfóxido. Los péptidos señalizados que contienen derivados de S-propinamido-cisteína-sulfóxido muestran un desplazamiento hidrófilo tan significativo, que se pueden aislar fácilmente de la mayoría de los péptidos inalterados usando la presente invención. Sin embargo, la aplicación de la alteración química anterior no altera sólo los péptidos que contienen cisteína, sino que altera también los péptidos que contienen metionina (puesto que la oxidación también convierte la metionina en su derivado de metionina-sulfóxido más hidrófilo). Como consecuencia se generan simultáneamente por la alteración dos tipos de péptidos señalizados y también se aislarán simultáneamente. Para evitar dicho aislamiento simultáneo de los péptidos con Cys y los péptidos con Met, se introduce una etapa de tratamiento previo.

En una realización particular, antes de escindirlas en sus péptidos constituyentes, las proteínas en la mezcla se oxidan. Este tratamiento previo da como resultado la oxidación de las metioninas en su derivado de metionina-sulfóxido. Posteriormente, las proteínas se hacen precipitar y se reducen para convertir los puentes disulfuro en grupos tiol. Después, la mezcla peptídica de proteínas que resulta de la escisión de las proteínas, de acuerdo con la invención, se somete a la serie primaria y las fracciones se alteran químicamente con acrilamida seguido de una oxidación. Puesto que las metioninas ya se han oxidado durante la etapa de tratamiento previo, ahora solo se alterarán los péptidos que contienen Cys. Los péptidos con S-propinamido-cisteína-sulfóxido señalizados se aíslan aplicando la serie secundaria, sin contaminación apreciable con péptidos con Met.

Este ejemplo ilustra que se puede obtener selectividad en la reacción de alteración hacia un aminoácido seleccionado (o aminoácido modificado o resto de aminoácido, etc.) mediante tratamiento previo de las proteínas en la muestra, antes de la serie primaria. Dicho tratamiento previo se puede dirigir igualmente bien a los péptidos en la mezcla peptídica de proteínas, antes de la serie primaria. En un caso particular también se podría llevar a cabo un tratamiento previo durante la serie primaria. Por lo tanto, la invención proporciona además un procedimiento para aislar péptidos señalizados de una mezcla peptídica de proteínas, que comprende (a) un tratamiento previo de las proteínas en la muestra y/o los péptidos en la mezcla peptídica de proteínas con el fin de prevenir que los aminoácidos no deseados se alteren simultáneamente en la etapa (c); (b) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones mediante una serie primaria; (c) alterar química y/o enzimáticamente al menos un aminoácido en al menos un péptido en cada fracción, y (d) aislar los péptidos señalizados mediante una serie secundaria. Dichos tratamiento previo puede comprender una o más reacciones químicas y/o enzimáticas.

En una realización particular, se pueden aislar los péptidos señalizados que derivan de proteínas con un extremo NH_{2} libre. Este último procedimiento comprende las siguientes etapas: (a) la muestra que comprende las proteínas se trata previamente con el fin de derivatizar las cadenas laterales de cisteína y convertir la lisina en homoarginina, (b) los grupos alfa-NH_{2} se convierten en un derivado de tiocarbamoilo, (c) se prepara una mezcla peptídica de proteínas, (d) los grupos NH_{2} recién generados en la mezcla se bloquean, (e) la mezcla se trata con un ácido que induce la pérdida de los restos NH_{2} terminales de los péptidos que se han bloqueado en la etapa b), (f) la mezcla peptídica de proteínas previamente tratada se separa en una serie primaria cromatográfica, (g) los grupos NH_{2} recién generados se alteran con un compuesto de acetilación, y de este modo se genera un subconjunto de péptidos señalizados, y (h) dichos péptidos señalizados se aíslan en una segunda etapa cromatográfica. En un caso particular, la etapa d) de la última realización se puede llevar a cabo sin ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS). En otro caso particular, la etapa e) se lleva a cabo con TFA.

Como se ha mencionado antes, en un modo de acción inverso, la invención proporciona un procedimiento para aislar péptidos de identificación de una mezcla peptídica de proteínas. En esta realización, la minoría de los péptidos de la mezcla peptídica de proteínas permanece inalterada, mientras que se altera la mayoría de los péptidos. Los péptidos alterados adquieren propiedades que cambian su comportamiento cromatográfico, mientras que los péptidos de identificación no son alterados y retienen su comportamiento cromatográfico original. Por lo tanto, los péptidos de identificación eluyen en el mismo tiempo durante la serie secundaria que lo hicieron en la serie primaria, mientras que los péptidos alterados son desplazados hacia adelante o hacia atrás. Esto permite separar en cada fracción los péptidos de identificación de los péptidos alterados y aislar los péptidos de identificación.

Al igual que en la situación con los péptidos señalizados como se ha descrito antes en el presente documento, la presente invención requiere que la alteración sea eficaz en cada una de las fracciones de péptidos de la serie primaria. Así, en cada fracción obtenida de la etapa cromatográfica primaria, los péptidos alterados tienen que migrar de forma distinta que los péptidos de identificación en la etapa cromatográfica secundaria. Dependiendo del tipo de alteración aplicada, el desplazamiento puede ser producido, por ejemplo, por un cambio en la hidrofobicidad o en la carga neta. Este desplazamiento se llama \deltap y es específico para cada péptido individual alterado. En el ejemplo de un cambio de hidrofobicidad, los valores de \deltap se pueden expresar como cambios en el momento hidrófobo, o como un porcentaje de los disolventes orgánicos en las series cromatográficas, pero de forma más práctica en unidades de tiempo en las condiciones cromatográficas/electroforéticas dadas. Así, \deltap no es necesariamente idéntico para cada péptido alterado y está entre \delta_{max} y \delta_{min}. En \deltap afectan una serie de factores tales como la naturaleza de la alteración inducida, la naturaleza de la fase estacionaria de la columna, la fase móvil (tampones, disolventes), la temperatura y otros. En un ejemplo en el que los péptidos en una fracción de la serie primaria eluyen en la ventana w1, los péptidos de identificación eluirán aproximadamente en la misma ventana w1 durante la serie secundaria. En una realización preferida \delta_{min} tiene que ser suficiente para evitar que los péptidos alterados eluyan dentro de la ventana w_{1} (y que por lo tanto solapen con los péptidos de identificación). Esta norma debe aplicarse a cada fracción recogida de la serie primaria. Preferiblemente \delta_{min} debería ser w_{1} o mayor con el fin de minimizar el solapamiento entre los péptidos alterados y los de identificación. Por ejemplo, si w_{1} = 1 minuto, \delta_{min} debería ser preferiblemente 1 minuto o más. Sin embargo, es evidente que es aceptable, pero no son preferibles los contaminantes minoritarios de péptidos alterados en la ventana de elución de los péptidos de identificación. La manipulación de los valores de \delta_{min} para obtener la separación óptima de los péptidos de identificación de los péptidos alterados en cada fracción de la serie primaria es parte de la presente invención, y comprende, entre otros, la combinación correcta del(los) aminoácido(s) seleccionado(s) para se alterados, del tipo de alteración, y de las condiciones cromatográficas (tipo de columna, tampones, disolventes, etc.). Para un experto en la técnica es evidente que se puede aplicar la misma estrategia para aislar péptidos de identificación, por ejemplo, con cromatografía de intercambio iónico u otros tipos de cromatografía.

Por lo tanto, la presente invención proporciona además un procedimiento para aislar un subconjunto de péptidos de una mezcla peptídica de proteínas, que comprende las etapas de: (a) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones de péptidos mediante cromatografía; (b) alterar química y/o enzimáticamente al menos el 50%, preferiblemente 60%, más preferiblemente 70%, incluso más preferiblemente 80%, y más preferiblemente más del 90% de los péptidos en cada fracción; y (c) aislar los péptidos de identificación mediante cromatografía, en el que la cromatografía de la etapa (a) y (c) se llevan a cabo con el mismo tipo de cromatografía. Al igual que en la estrategia de los péptidos señalizados, la alteración entre la serie primaria y la secundaria puede ser, por ejemplo, una alteración de un aminoácido, o de un aminoácido modificado (glicosilado, fosforilado, acetilado, etc.), o una modificación añadida in vitro a determinados aminoácidos y/o de un resto particular en uno o más aminoácidos.

Como se ha mencionado antes, el aislamiento de un subconjunto de péptidos de identificación con el procedimiento proporcionado en la presente invención, requiere que se altere la mayoría de los péptidos en la mezcla peptídica de proteínas. En varias aplicaciones, la alteración se puede realizar directamente en los péptidos.

Sin embargo, (a) los tratamientos previos de las proteínas en la muestra y/o (b) los tratamientos previos de los péptidos en la mezcla peptídica de proteínas permiten ensanchar el espectro de clases de péptidos que se pueden aislar con la invención. En un caso particular, también se podría llevar a cabo un tratamiento previo durante la serie primaria.

Para ilustrar el principio, se describe un ejemplo de como se pueden aislar péptidos con el amino-terminal bloqueado (es decir péptidos obtenidos de extremos amino-terminales de proteínas que in vivo tienen bloqueado su extremo amino). Los péptidos con el amino-terminal bloqueado se pueden aislar de acuerdo con la presente invención, mediante (a) separación de la mezcla peptídica de proteínas mediante cromatografía; (b) alteración del grupo amino-terminal de los péptidos (los péptidos derivados de una proteína con el amino-terminal bloqueado no tienen un grupo amino-terminal libre) y, (c) separación de los péptidos de identificación con el amino-terminal bloqueado de la mayoría de péptidos alterados mediante cromatografía, de modo que la cromatografía en la etapa (a) y (c) se lleva a cabo con el mismo tipo de cromatografía. Aunque esta estrategia permite aislar muchos péptidos con el amino-terminal bloqueado, la población de péptidos con el amino-terminal bloqueado que también contienen una lisina no será seleccionada en este procedimiento. Las lisinas también tienen un grupo amino libre y por lo tanto la alteración en la etapa (b) también alterará a los péptidos con el amino-terminal bloqueado que contienen una lisina. Por lo tanto, la población de péptidos con el amino-terminal bloqueado que también contienen una lisina será alterada, y por lo tanto no formará parte de los péptidos de identificación y será aislada. Para evitar la pérdida de esta población, se introduce una etapa de tratamiento previo que convierte, antes de la serie primaria, los grupos \varepsilon-NH_{2} de las lisinas de las proteínas en un grupo amino bloqueado. En una realización particular, las lisinas con un grupo \varepsilon-NH_{2} libre se convierten en homo-arginina, seguido de digestión con tripsina que escinde la proteína en la homoarginina y genera un \alpha-aminoácido libre en estas posiciones. Por consiguiente, los péptidos con el amino-terminal bloqueado que contienen una lisina ya no son alterados y serán aislados como péptidos de identificación.

Este ejemplo ilustra que la selectividad de la reacción de alteración hacia un aminoácido seleccionado (o aminoácido modificado o resto de aminoácido) es potenciada mediante tratamiento previo de las proteínas en la muestra, antes de la serie primaria. Dicho tratamiento previo se puede dirigir igualmente a los péptidos en la mezcla peptídica de proteínas. Por lo tanto, la invención proporciona además un procedimiento para aislar péptidos de identificación de una mezcla peptídica de proteínas que comprende, (a) un tratamiento previo de las proteínas en la muestra y/o los péptidos en la mezcla peptídica de proteínas; (b) separar la mezcla peptídica de proteínas mediante una serie primaria; (c) alterar química y/o enzimáticamente al menos un aminoácido en la mayoría de los péptidos en cada fracción, y (d) aislar los péptidos de identificación mediante una serie secundaria. Dicho tratamiento previo puede comprender una o más reacciones químicas y/o enzimáticas.

La invención proporciona además un procedimiento para aislar los péptidos con el amino-terminal bloqueado de las proteínas en una muestra que comprende proteínas, que comprende las etapas de: (1) convertir los grupos \varepsilon-NH_{2} de las lisinas de las proteínas en grupos guanidilo u otros restos, (2) digerir la muestra de proteínas de modo que las proteínas sean escindidas en la homoarginina y generar \alpha-aminoácidos libres en estas posiciones, (3) fraccionar la mezcla peptídica de proteínas en una serie primaria, (4) alterar los grupos amino-terminales libres de los péptidos en cada fracción con un componente hidrófobo, hidrófilo o cargado, y (5) aislar los péptidos de identificación no alterados en una serie secundaria.

Todavía en otra realización, la invención proporciona un procedimiento para aislar péptidos amino-terminales de las proteínas en una muestra que comprende proteínas. Este procedimiento comprende las etapas de: (1) convertir los grupos \varepsilon-NH_{2} de las lisinas de las proteínas en grupos guanidilo u otros restos, (2) convertir los grupos \alpha-amino libres en el lado amino-terminal de cada proteína para dar un grupo bloqueado (que ya no es reactivo), (3) digerir la muestra de proteínas produciendo péptidos con grupos NH_{2} libres recién generados, (4) fraccionar la mezcla peptídica de proteínas en una serie primaria, (5) alterar dichos grupos NH_{2} libres de los péptidos en cada fracción con un componente hidrófobo, hidrófilo o cargado, y (6) aislar los péptidos de identificación no alterados en una serie secundaria. Esta estrategia permite aislar específicamente los péptidos amino-terminales de las proteínas en la muestra de proteínas, que comprende tanto los péptidos amino-terminales con un grupo \alpha-aminoácido libre como los que tienen un grupo \alpha-aminoácido bloqueado. Llevar a cabo la etapa dos del protocolo anterior de forma que los grupos \alpha-amino libres se bloqueen con un resto isotópicamente marcado, permite distinguir los péptidos amino-terminales bloqueados in vivo de los péptidos amino-terminales con un grupo NH_{2} libre. Una aplicación de esta última realización es el estudio del procesamiento proteolítico interno de proteínas entre dos muestras diferentes que comprenden proteínas (véase, por ejemplo, el ejemplo 8).

Todavía en otra realización del modo de acción inverso, la alteración química o enzimática entre la serie primaria y secundaria, se dirige a aminoácidos que están presentes en una gran mayoría de péptidos. Dichos aminoácidos abundantes están presentes en al menos el 50% de los péptidos, preferiblemente en más del 75% de los péptidos, y más preferiblemente en más del 90% de los péptidos.

En otra realización, los péptidos de identificación son péptidos COOH-terminales (carboxi-terminales) de las proteínas.

Todavía en otra realización, la invención proporciona un procedimiento para aislar un subconjunto de péptidos de una mezcla peptídica de proteínas que comprende las etapas de (a) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones mediante una serie primaria, (b) añadir química o enzimáticamente un grupo con impedimento estérico y voluminoso a al menos un aminoácido en la mayoría de los péptidos en cada fracción, y (c) aislar dichos péptidos de identificación de cada fracción mediante una serie secundaria, de forma que la serie primaria y secundaria se llevan a cabo en una columna de exclusión por tamaños en condiciones idénticas o sustancialmente similares.

El procedimiento de acuerdo con la invención permite, en cada una de las fracciones, separar los péptidos señalizados de la mayoría de los péptidos inalterados y finalmente da como resultado el aislamiento de un subconjunto específico de péptidos señalizados de la mezcla peptídica de proteínas completa. Como se ha mencionado antes, dichos péptidos señalizados pueden ser, por ejemplo, péptidos que contienen una o más metioninas, péptidos que contienen una o más cisteínas, péptidos que contienen una o más metioninas y/o una o más cisteínas, fosfopéptidos, péptidos fosforilados en las tirosinas, péptidos que contienen una cisteína \varepsilon-N-acetilada, etc. Los péptidos señalizados son muy representativos de las proteínas que los originan, y por lo tanto los péptidos señalizados sirven de elementos de identificación de las correspondientes proteínas. Por lo tanto, la presente invención proporciona además un procedimiento para identificar un subconjunto de péptidos y sus correspondientes proteínas en una muestra que comprende proteínas. Por lo tanto, el aislamiento de los péptidos señalizados de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la invención se acopla además a un análisis de péptidos.

De igual forma, el procedimiento de acuerdo con la invención permite, en cada una de las fracciones, la separación de los péptidos de identificación de la mayoría de los péptidos alterados, y finalmente da como resultado el aislamiento de un subconjunto específico de péptidos de identificación de la mezcla peptídica de proteínas completa. Como se ha mencionado antes, dichos péptidos de identificación pueden ser, por ejemplo, péptidos amino-terminales, péptidos con el amino-terminal bloqueado, péptidos carboxi-terminales. Los péptidos de identificación son muy representativos de las proteínas que los originan, y por lo tanto los péptidos de identificación sirven de elementos de identificación para las correspondientes proteínas. Por lo tanto, la presente invención proporciona además un procedimiento para identificar un subconjunto de péptidos y sus correspondientes proteínas en una muestra que comprende proteínas. Por lo tanto, el aislamiento de los péptidos de identificación de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la invención se acopla además a un análisis de péptidos.

En una estrategia preferida, el análisis de péptidos señalizados o de identificación se realiza con un espectrómetro de masas. Sin embargo, los péptidos señalizados o de identificación también se pueden analizar e identificar usando otros procedimientos tales como electroforesis, medición de actividad en ensayos, análisis con anticuerpos específicos, secuenciación de Edman, etc.

Un análisis o etapa de identificación se puede llevar a cabo de diferentes modos. En uno de los modos, los péptidos señalizados o péptidos de identificación que eluyen de las columnas cromatográficas se dirigen directamente al analizador. En una estrategia alternativa, los péptidos señalizados o péptidos de identificación se recogen en fracciones. Dichas fracciones pueden ser manipuladas o no antes de ir al posterior análisis o identificación. Un ejemplo de dicha manipulación consiste en una etapa de concentración, seguido de aplicación con manchas puntuales de cada concentrado, por ejemplo, en una diana MALDI para el posterior análisis e identificación.

En una realización preferida los péptidos señalizados o péptidos de identificación se analizan por técnicas espectrométricas de masas de alta capacidad. La información obtenida es la masa de los péptidos señalizados o de identificación. Cuando la masa del péptido se define con mucha precisión, tal como con un espectrómetro de masas de transformada de Fourier (FTMS), usando un procedimiento de calibración interno (O'Connor and Costello, 2000), se puede correlacionar sin ambigüedad la masa del péptido con la masa de un péptido correspondiente en bases de datos de masas de péptidos, y por lo tanto identificar el péptido señalizado o péptido de identificación. Sin embargo, la precisión de algunos espectrómetros de masas convencionales no es suficiente para correlacionar sin ambigüedad la masa de cada péptido determinada espectrométricamente con su correspondiente péptido y proteína en bases de datos de secuencias. Para aumentar el número de péptidos que, no obstante, se pueden identificar sin ambigüedad, los datos de la masa del péptido se complementan con otra información. En una realización la masa del péptido determinada con el espectrómetro de masas se complementa con el conocimiento probado (por ejemplo, probado mediante la pérdida neutra de 64 uma en el caso de péptidos señalizados con metionina-sulfóxido) de que cada péptido señalizado contiene uno o más restos del aminoácido alterado y/o con el conocimiento de que el péptido se generó después de digestión de una muestra que comprende proteínas, usando una proteasa de escisión con especificidad conocida. Por ejemplo, la tripsina tiene la propiedad conocida de escindir exactamente en los sitios de lisina y arginina, dando péptidos que típicamente tienen un peso molecular entre aproximadamente 500 y 5.000 dalton y que tienen aminoácidos lisina o arginina C-terminales. Esta información combinada se usa para cribar bases de datos que contienen información respecto a la masa, la secuencia y/o la identidad de péptidos y identificar el correspondiente péptido y
proteína.

En otra realización, el procedimiento de determinar la identidad de la proteína de origen sólo mediante la medición exacta de la masa del péptido de al menos un péptido señalizado o péptido de identificación, se puede mejorar enriqueciendo adicionalmente el contenido de información de los péptidos señalizados seleccionados o péptidos de identificación. Como ejemplo no limitante de como se puede añadir información a los péptidos señalizados o de identificación, los grupos NH_{2} libres de estos péptidos se pueden cambiar químicamente de forma específica en una reacción química por adición de dos grupos isotópicamente marcados diferentes. Como resultado de este cambio, dichos péptidos adquieren un número predeterminado de grupos marcados. Puesto que el agente de cambio es una mezcla de dos agentes químicamente iguales pero isotópicamente diferentes, los péptidos señalizados o péptidos de identificación se presentan como péptidos dobles en el espectro de masas. El grado de desplazamiento de masa entre estos dobletes de péptidos indica el número de grupos amino libres en dicho péptido. Para ilustrar más esto, por ejemplo, el contenido de información de péptidos señalizados se puede enriquecer mediante cambio específico de los grupos NH_{2} libres en los péptidos usando una mezcla equimolar de éster de ácido acético y N-hidroxisuccinimida y éster de ácido trideuteroacético y N-hidroxisuccinimida. Como resultado de esta reacción de conversión, los péptidos adquieren un número predeterminado de grupos CH_{3}-CO (CD_{3}-CO), que se puede deducir fácilmente del grado del desplazamiento de la masa observado en los dobletes de péptidos. Por lo tanto, un desplazamiento de 3 uma corresponde a un grupo NH_{2}, un desplazamiento de 3 y 6 uma corresponde con dos grupos NH_{2}, y un desplazamiento de 3, 6 y 9 uma pone de manifiesto la presencia de tres grupos NH_{2} en el péptido. Esta información complementa más los datos relativos a la masa del péptido, el conocimiento sobre la presencia de uno o más restos del aminoácido alterado y/o el conocimiento de que el péptido fue generado con una proteasa con especificidad conocida.

Una parte adicional de información que también se puede usar para identificar péptidos señalizados o péptidos de identificación es el índice medio hidropático (GRAVY, por sus siglas en inglés Grand Average of Hydropathicity) de los péptidos, que se refleja en los tiempos de elución durante la cromatografía. Se pueden distinguir dos o más péptidos, con masas idénticas o con masas que están dentro del intervalo de error de las mediciones de masas, comparando su GRAVY determinado experimentalmente con el GRAVY predicho in silico.

Se puede usar cualquier espectrómetro de masas para analizar los péptidos señalizados o de identificación. Los ejemplos no limitantes de espectrómetros de masas incluyen espectrómetro de masas (MS) con ionización por desorción láser asistida por matriz ("MALDI") en tiempo de vuelo ("TOF") o MALDI-TOF-MS, disponible en PerSeptive Biosystems, Framingham, Massachusetts; Ettan MALDI-TOF de AP Biotech y Reflex III de Brucker-Daltonias, Bremen, Alemania, para usar en el análisis de descomposición metaestable; el espectrómetro de masas de ionización por electropulverización (ESI) con captura iónica disponible en Finnigan MAT, San Jose, California; el espectrómetro de masas ESI de cuadrupolo, disponible en Finnigan MAT o el sistema de LC-MS/MS de GSTAR Pulsar Hybrid de Applied Biosystems Group, Foster City, California y un espectrómetro de masas con transformada de Fourier (FTMS) que usa un procedimiento de calibración interno (O'Connor and Costello, 2000).

El software de identificación de proteínas usado en la presente invención para comparar los espectros de masas experimentales de los péptidos con una base de datos de masas de péptidos y las correspondientes proteínas, está disponible en la técnica. Uno de dichos algoritmos, ProFound, usa un algoritmo de Bayesian para buscar en bases de datos de proteínas o ADN para identificar la correspondencia óptima entre los datos experimentales y la proteína en la base de datos. Se puede acceder a ProFound en la página World-Wide-Web en <http//prowl.rockefeller.edu> y <http//www.proteometrics.com>. ProFound accede a las bases de datos no redundantes (NR). Se puede acceder a la búsqueda de péptidos en la página web de EMBL. Véase también, Chaurand P. y col. (1999) J. Am. Soc. Mass. Spectrom 10, 91, Patterson S.D., (2000), Am. Physiol. Soc, 59- 65, Yates JR (1998) Electrophoresis, 19, 893). Los espectros MS/MS también pueden ser analizados por MASCOT (disponible en http://www.matrixscience.com, Matrix Science Ltd. Londres).

En otra realización preferida, los péptidos señalizados o péptidos de identificación son sometidos individualmente a fragmentación en el espectrómetro de masas. De esta forma, la información sobre la masa del péptido se complementa además con datos de la secuencia (parcial) sobre el péptido señalizado o el péptido de identificación. La comparación de esta información combinada con información en las bases de datos de masas de péptidos y secuencias de péptidos y proteínas, permite identificar los péptidos señalizados o de identificación. En una estrategia, la fragmentación de los péptidos señalizados o de identificación se hace de forma más conveniente por disociación inducida por colisión (CID) y generalmente se denomina MS^{2} o espectrometría de masas en tándem. Alternativamente, los iones de péptidos señalizados o iones de péptidos de identificación se pueden descomponer durante su vuelo después de ser volatilizados e ionizados en un MALDI-TOF-MS. Este procedimiento se llama descomposición metaestable (PSD). En una de dichas estrategias de espectrometría de masas, los péptidos señalizados o péptidos de identificación seleccionados se transfieren directa o indirectamente a la fuente de iones de un espectrómetro de masas de electropulverización, y después son fragmentados en el modo MS/MS. Por lo tanto, en un aspecto se recoge información de la secuencia parcial de los péptidos señalizados o péptidos de identificación de los espectros de fragmentación de MS^{n} (donde se entiende que n es mayor o igual a 2) y se usa para la identificación de péptidos en bases de datos de secuencias descritas en el presente documento.

En una realización particular, se puede obtener información adicional sobre la secuencia en el análisis de MALDI-PSD cuando se altera el extremo alfa-NH_{2} de los péptidos con un grupo con resto ácido sulfónico. Los péptidos señalizados que llevan un grupo ácido sulfónico en el NH_{2}-terminal son inducidos a modelos de fragmentación particulares cuando se detectan en el modo de MALDI-TOF-MS. Esto último permite una deducción muy rápida y fácil de la secuencia de aminoácidos. En particular, el ejemplo 6b describe un procedimiento de como se aíslan péptidos señalizados en el NH_{2}-terminal de proteínas con un extremo NH_{2} libre.

La presente invención proporciona además un procedimiento para identificar una o más proteínas en una muestra que comprende proteínas. Por un lado se sabe que la escisión de una muestra que comprende proteínas da como resultado una mezcla peptídica de proteínas que comprende miles de péptidos y esto sobrepasa la capacidad de resolución de los sistemas cromatográficos y sistemas de espectrometría de masas actualmente disponibles. Por otra parte, se sabe que se puede identificar una proteína basándose en la identificación de uno o más de sus péptidos constituyentes. La presente invención proporciona procedimientos para aislar e identificar un espectro de tipos diferentes de péptidos señalizados o péptidos de identificación de una mezcla peptídica de proteínas. Cada grupo de péptidos señalizados o péptidos de identificación representa un subconjunto de los péptidos en la mezcla peptídica de proteínas. Esta simplificación de la mezcla peptídica original reduce significativamente la coelución de péptidos en la serie secundaria, y da como resultado una identificación eficaz de los péptidos señalizados o péptidos de identificación con analizadores tales como espectrómetros de masas u otros. Puesto que los péptidos señalizados o péptidos de identificación con frecuencia son elementos de identificación únicos para sus correspondientes proteínas de origen, la identificación de los péptidos señalizados o péptidos de identificación permite identificar las proteínas de la muestra original que comprendía proteínas. Por lo tanto, con los procedimientos de la presente invención, se hace posible el trabajo de identificar proteínas en una muestra que comprende proteínas, aislando e identificando uno o más de sus péptidos componentes.

Por lo tanto, la presente invención proporciona además un procedimiento para identificar proteínas en una muestra que comprende proteínas, que comprende las etapas de (a) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones de péptidos mediante cromatografía; (b) alterar química y/o enzimáticamente al menos un aminoácido de al menos uno de los péptidos en cada fracción, generando así un subconjunto de péptidos alterados; (c) aislar los péptidos señalizados de cada fracción mediante una serie secundaria; (d) identificar los péptidos señalizados y sus correspondientes proteínas.

Por lo tanto, la presente invención también proporciona un procedimiento para identificar proteínas en una muestra que comprende proteínas, que comprende las etapas de (a) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones de péptidos mediante cromatografía; (b) alterar química y/o enzimáticamente al menos un aminoácido de la mayoría de los péptidos en cada fracción, generando así un subconjunto de péptidos inalterados; (c) aislar los péptidos de identificación de cada fracción mediante una serie secundaria; (d) identificar los péptidos de identificación y sus correspondientes proteínas.

Para un experto en la técnica, es evidente que estas realizaciones de la invención se pueden aplicar igualmente cuando hay un tratamiento previo de las proteínas o los péptidos antes de la etapa (a), como se ha descrito también en lo que antecede. Es igualmente evidente para un experto en la técnica, que al partir de la identidad conocida de un péptido señalizado o un péptido de identificación, se puede determinar fácilmente la identidad de la correspondiente proteína mediante cribado de bases de datos de secuencias de ADN, proteínas y péptidos. Tanto las bases de datos como el software para el cribado están disponibles en la técnica.

Los péptidos señalizados que se pueden usar de acuerdo con la invención, para identificar proteínas en una muestra que comprende proteínas son, por ejemplo: péptidos que contienen metionina, péptidos que contienen cisteína, péptidos que contienen histidina, péptidos que contienen tirosina, péptidos que contienen lisina, péptidos que contienen triptófano, péptidos que contienen arginina, péptidos que contienen prolina, péptidos que contienen fenilalanina o una combinación de dos o más de estos péptidos señalizados.

Se pueden usar otros péptidos señalizados de acuerdo con la invención para identificar la presencia de proteínas modificadas co o postraduccionalmente en una muestra que comprende proteínas. La presente invención proporciona, por ejemplo, un procedimiento para identificar las proteínas fosforiladas en una muestra que comprende proteínas. En una estrategia, los péptidos que contienen un aminoácido fosforilado son alterados y aislados como péptidos señalizados de acuerdo con la invención. La posterior identificación de estos péptidos señalizados y de sus proteínas correspondientes da como resultado la identificación de las proteínas fosforiladas (o el fosfoproteoma) en una muestra. La presente invención también proporciona procedimientos para identificar otros tipos de proteínas modificadas co o postraduccionalmente en una muestra que comprende proteínas, tal como proteínas glicosiladas, proteínas fosforiladas en las tirosinas, proteínas fosforiladas en las serinas y/o treoninas, proteínas acetiladas, proteínas \varepsilon-N-acetiladas, proteínas sulfatadas, etc.

Los péptidos de identificación que se pueden usar de acuerdo con la invención para identificar proteínas en una muestra son, por ejemplo, los péptidos amino-terminales de las proteínas. Las masas de cada uno de estos péptidos se puede determinar usando espectrometría de masas. La combinación de la masa de dichos péptidos con el conocimiento de que dicho péptido es un péptido amino-terminal, para la gran mayoría de los péptidos, es suficiente para identificar sin ambigüedad las correspondientes proteínas de origen. En una realización adicional de este aspecto de la invención, se diseñan bases de datos que sólo contienen las masas de los péptidos amino-terminales, y las masas de los péptidos de identificación amino-terminales aislados se prueban frente a estas bases de datos. En esta estrategia hay una probabilidad muy alta de que un péptido de identificación aislado se corresponda únicamente con una masa en las bases de datos restringida. Además, este estrategia reduce considerablemente la complejidad de la estrategia del proteoma basado en péptidos y aumenta significativamente la velocidad de análisis.

Además es importante mencionar que la invención permite identificar una amplia gama de proteínas en una muestra que comprende proteínas que varía, por ejemplo, de proteínas muy abundantes a poco abundantes, de ácidas a básicas, de pequeñas a grandes, de solubles a proteínas de membrana. Además, la invención proporciona un procedimiento para identificar proteínas en una muestra que comprende proteínas, partiendo de cantidades muy pequeñas de células. Los procedimientos proporcionados por la invención son tan eficaces y sensibles que se puede, por ejemplo, identificar desde algunos cientos a más de miles de proteínas partiendo de tan poco como 50.000 células humanas. Incluso con un número menor de células como material de partida, se pueden identificar cientos de proteínas en una muestra que contiene proteínas. Evidentemente, los procedimientos de la invención también se pueden aplicar a números mayores de células.

Se pueden usar otros péptidos de identificación, por ejemplo, para identificar proteínas con el amino-terminal bloqueado o proteínas escindidas proteolíticamente.

En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para determinar la cantidad relativa de una o más proteínas en una o más muestras que comprenden proteínas. El procedimiento comprende usar péptidos señalizados o péptidos de identificación marcados isotópicamente de forma diferente. En este procedimiento, las dos muestras se tratan de forma que los péptidos señalizados o péptidos de identificación aislados de una muestra contienen un isótopo y los péptidos señalizados o péptidos de identificación aislados de una segunda muestra contienen otro isótopo del mismo elemento.

El procedimiento comprende las etapas de (a) marcar los péptidos presentes en una primera muestra con un primer isótopo; (b) marcar los péptidos presentes en una segunda muestra con un segundo isótopo; (c) combinar la mezcla peptídica de proteínas de la primera muestra con la mezcla peptídica de proteínas de la segunda muestra; (d) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones de péptidos por cromatografía; (e) alterar química, o enzimáticamente o química y enzimáticamente al menos un aminoácido de al menos uno de los péptidos de cada fracción; (f) aislar los péptidos señalizados de cada fracción por cromatografía, en el que la cromatografía se lleva a cabo con el mismo tipo de cromatografía que en la etapa (d); (g) llevar a cabo el análisis espectrométrico de masas de los péptidos señalizados aislados; (h) calcular la cantidad relativa de péptidos señalizados en cada muestra comparando las alturas de los picos de los péptidos señalizados marcados isotópicamente de forma diferente; e (i) determinar la identidad del péptido señalizado y su correspondiente proteína.

Se puede seguir la misma estrategia con el modo de acción inverso, en el que el procedimiento comprende las etapas de (a) marcar los péptidos presentes en una primera muestra con un primer isótopo; (b) marcar los péptidos presentes en una segunda muestra con un segundo isótopo; (c) combinar la mezcla peptídica de proteínas de la primera muestra con la mezcla peptídica de proteínas de la primera muestra con la mezcla peptídica de proteínas de la segunda muestra; (d) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones de péptidos por cromatografía; (e) alterar química, o enzimáticamente, o química y enzimáticamente al menos un aminoácido de la mayoría de los péptidos de cada fracción; (f) aislar los péptidos de identificación de cada fracción por cromatografía, en el que la cromatografía se lleva a cabo con el mismo tipo de cromatografía que en la etapa (d); (g) llevar a cabo el análisis espectrométrico de masas de los péptidos de identificación aislados; (h) calcular la cantidad relativa de péptidos de identificación en cada muestra comparando las alturas de los picos de los péptidos de identificación marcados isotópicamente de forma diferente; e (i) determinar la identidad del péptido de identificación y su correspondiente proteína.

Es evidente, que se puede seguir la misma estrategia combinada con una etapa de tratamiento previo como se ha mencionado en lo que antecede. El procedimiento también se puede aplicar si las separaciones cromatográficas en la etapa (d) y (f) son idénticas o sustancialmente similares. También es evidente que en lugar de mezclar los péptidos de ambas muestras en la etapa (c), los péptidos de una primera y segunda muestra se pueden someter por separado a las etapas (d) y/o (e) y/o (f) y combinar en la etapa (d) o (e) o (f) o (g).

El diferente marcaje isotópico de los péptidos en una primera y una segunda muestra se puede hacer de muchas formas diferentes disponibles en la técnica. Un elemento clave es que un péptido particular que se origina de la misma proteína en una primera y segunda muestra es idéntico, excepto por la presencia de un isótopo diferente en uno o más aminoácidos del péptido. En una realización típica, el isótopo en una primera muestra será el isótopo natural, que se refiere al isótopo que está presente predominantemente en la naturaleza, y el isótopo en una segunda muestra será un isótopo menos común, en lo sucesivo denominado isótopo poco común. Ejemplos de parejas de isótopos naturales y poco comunes son H y D, O^{16} y O^{18}, C^{12} y C^{13}, N^{14} y N^{15}. Los péptidos marcados con el isótopo más pesado de una pareja isotópica se denominan también en el presente documento péptidos pesados. Los péptidos marcados con el isótopo más ligero de una pareja de isótopos se denominan también en el presente documento péptidos ligeros. Por ejemplo, un péptido marcado con H se llama el péptido ligero, mientras que el mismo péptido marcado con D se llama el péptido pesado. Los péptidos marcados con un isótopo natural y su homólogo marcado con un isótopo poco común son muy similares químicamente, se separan por cromatografía de la misma forma y también se ionizan de la misma forma. Sin embargo, cuando se alimentan los péptidos en un analizador, tal como un espectrómetro de masas, se separan en el péptido ligero y el pesado. El péptido pesado tiene una masa ligeramente mayor debido al peso mayor del marcador isotópico elegido incorporado. Debido a las diferencias poco importantes entre las masas de los péptidos marcados isotópicamente de forma diferente, los resultados del análisis espectrométrico de masas de los péptidos señalizados o de identificación aislados será una pluralidad de parejas de picos gemelos muy poco separados, representando cada uno de los picos gemelos un péptido pesado y uno ligero. Cada uno de los péptidos pesados se origina de la muestra marcada con el isótopo pesado; cada uno de los péptidos ligeros se origina de la muestra marcada con el isótopo ligero. Después, se miden las proporciones (abundancia relativa) de las intensidades de los picos del pico pesado y del ligero en cada pareja. Estas proporciones dan una medida de la cantidad relativa (aparición diferencial) de este péptido (y su correspondiente proteína) en cada muestra. Las intensidades de los picos se pueden calcular de una forma convencional (por ejemplo, calculando la altura del pico o el área del pico). Como se ha descrito antes en el presente documento, los péptidos señalizados o de identificación también se pueden identificar permitiendo la identificación de proteínas en las muestras. Si una proteína está presente en una muestra pero no en otra, el péptido señalizado o de identificación aislado (que se corresponde con esta proteína) será detectado como un pico que puede contener el isótopo pesado o el ligero. Sin embargo, en algunos casos puede ser difícil determinar que muestra ha generado el pico individual observado durante el análisis espectrométrico de masas de las muestras combinadas. Este problema se puede resolver mediante el marcaje doble de la primera muestra, antes o después de la escisión proteolítica, con dos isótopos diferentes o con dos números diferentes de isótopos pesados. Ejemplos de agentes de marcaje son agentes de acilación.

La incorporación del isótopo natural y/o poco común en péptidos se puede obtener de muchas formas. En una estrategia, las proteínas se marcan en las células. Las células para una primera muestra se hacen crecer, por ejemplo, en medio complementado con un aminoácido que contiene el isótopo natural, y las células para una segunda muestra se hacen crecer en medio complementado con un aminoácido que contiene el isótopo poco común. En una realización, el aminoácido isotópicamente marcado de forma diferente es el aminoácido que se selecciona para alterar. Por ejemplo, si la metionina es el aminoácido seleccionado, las células se hacen crecer en medio complementado con L-metionina sin marcar (primera muestra) o con L-metionina que está deuterada en la posición C\beta y C\gamma, y que por lo tanto es 4 uma más pesada (segunda muestra).

La mezcla de las proteínas/péptidos de ambas muestras se puede hacer en diferentes momentos. La mezcla se puede hacer en la muestra (por ejemplo, mezclar un número igual de células de ambas muestras) o se pueden aislar por separado las proteínas de la muestra 1 y muestra 2 y posteriormente mezclar, o las proteínas de la muestra 1 se hacen digerir en péptidos, y las proteínas de la muestra 2 se hacen digerir en péptidos y los péptidos procedentes de la muestra 1 y la muestra 2 se mezclan, etc. Sea donde sea el procedimiento de mezcla, la presente invención se usa además para aislar los péptidos con metionina señalizados de la mezcla peptídica de proteínas. Los péptidos con metionina se aislarán independientemente de su constitución isotópica, y el análisis del péptido con metionina en un espectrómetro de masas como se ha descrito antes, permite determinar la cantidad relativa de su proteína correspondiente en la muestra 1 y la muestra 2.

La incorporación de los diferentes isótopos también se puede obtener mediante una estrategia enzimática. Por ejemplo, el marcaje se puede llevar a cabo tratando una muestra que comprende proteínas con tripsina en agua "normal" (H_{2}^{16}O) y la segunda muestra que comprende proteínas con tripsina en agua "pesada" (H_{2}^{18}O). Tal como se usa en el presente documento "agua pesada" se refiere a una molécula de agua en la que el átomo de O es el isótopo ^{18}O. La tripsina muestra la propiedad conocida de incorporar dos oxígenos del agua en el extremo COOH de los sitios recién generados. Por lo tanto, en la muestra 1, que se ha tripsinizado en H_{2}^{16}O, los péptidos tienen masas "normales", mientras que en la muestra 2 los péptidos (excepto para la mayoría de los péptidos con COOH-terminal) tienen una masa 4 uma mayor que corresponde a la incorporación de dos átomos de ^{18}O. Esta diferencia de 4 uma es suficiente para distinguir la versión pesada de la ligera de los péptidos señalizados o péptidos de identificación en un espectrómetro de masas y medir con precisión las proporciones de los péptidos ligeros frente a los pesados, y así determinar la proporción de los péptidos/proteínas correspondientes en las dos muestras. Por lo tanto, la presente invención proporciona además un procedimiento para determinar la cantidad relativa de al menos una proteína en al menos dos muestras, que comprende las etapas de: a) hacer digerir las proteínas de la primera muestra con tripsina en presencia de H_{2}^{16}O y hacer digerir las proteínas de una segunda muestra con tripsina en presencia de H_{2}^{18}O; b) combinar las dos mezclas peptídicas de proteínas digeridas con tripsina; c) someter la mezcla combinada a una serie primaria (debido a que los péptidos isotópicamente marcados de forma diferente tienen el mismo comportamiento cromatográfico, se separan en las mismas fracciones); d) alterar química y/o enzimáticamente al menos un aminoácido de al menos un péptido en cada fracción; e) aislar los péptidos señalizados o los péptidos de identificación mediante una serie secundaria (debido a que los péptidos señalizados o de identificación marcados isotópicamente de diferente forma tienen el mismo comportamiento cromatográfico, se separan en las mismas fracciones); f) analizar los péptidos aislados en un espectrómetro de masas; g) calcular las cantidades relativas de los péptidos pesados y ligeros correspondientes comparando las alturas de sus picos, y h) identificar los péptidos y sus proteínas correspondientes.

La incorporación de los isótopos diferentes se puede obtener además con procedimientos de marcaje múltiple basados en reacciones químicas conocidas que se pueden llevar a cabo en la proteína o el péptido. Por ejemplo, las proteínas se pueden cambiar por reacción de guadinilación con O-metilisourea, convirtiendo los grupos NH_{2} en grupos guanidinio, y generando así homoarginina en cada posición de lisina previa. Las proteínas de una primera muestra se pueden hacer reaccionar con un reactivo con los isótopos naturales y las proteínas de una segunda muestra se pueden hacer reaccionar con un reactivo con un isótopo poco común. Los péptidos también se pueden cambiar por formación de la base de Shiff con acetaldehído deuterado seguido de reducción con borohidruro sódico normal o deuterado. Esta reacción, que se sabe que transcurre en condiciones suaves, puede conducir a la incorporación de un número predecible de átomos de deuterio. Los péptidos se cambiarán en el grupo \alpha-NH_{2} o los grupos \varepsilon-NH_{2} de las lisinas o en ambos. Se pueden llevar a cabo cambios similares con formaldehído deuterado seguido de reducción con NaBD_{4} deuterado, que generará una forma metilada de los grupos amino. La reacción con formaldehído se podría llevar a cabo en la proteína total, incorporando deuterio sólo en las cadenas laterales de las lisinas, o en la mezcla peptídica, donde se marcarán tanto los grupos \alpha-NH_{2} como los NH_{2} derivados de las lisinas. Puesto que la arginina no reacciona, esto también proporciona un procedimiento para distinguir entre los péptidos que contienen Arg y Lys.

Los grupos amino primarios se acilan fácilmente, por ejemplo, con acetil-N-hidroxisuccinimida (ANHS). Por lo tanto, se puede acetilar una muestra con ANHS normal mientras que se puede acetilar una segunda muestra con ^{13}CH_{3}CO-NHS o CD_{3}CO-NHS. Además, de esta forma se derivatiza el grupo \varepsilon-NH_{2} de todas las lisinas además del extremo amino del péptido. Todavía otros procedimientos de marcaje son, por ejemplo, anhídrido acético que se puede usar para acetilar grupos hidroxilo y trimetilclorosilano que se puede usar para marcaje menos específico de grupos funcionales incluyendo grupos hidroxilo y aminas.

Todavía en otra estrategia los aminoácidos primarios se marcan con grupos químicos que permiten diferenciar entre los péptidos pesados y ligeros en 5 uma, 6 uma, 7 uma, 8 uma o incluso una diferencia de masa mayor. En el ejemplo 16 se mencionan ejemplos de dichos compuestos. Alternativamente, el marcaje isotópico diferente se lleva a cabo en el extremo carboxi-terminal de los péptidos, permitiendo una diferenciación entre las variantes pesadas y las ligeras de más de 5 uma, 6 uma, 7 uma, 8 uma o incluso diferencias de masa mayores. Puesto que los procedimientos de la presente invención no requieren ningún procedimiento previo del tipo de proteínas que pueden estar presentes en las muestras, se pueden usar para determinar las cantidades relativas tanto de proteínas conocidas como desconocidas que están presentes en las muestras examinadas.

Los procedimientos proporcionados en la presente invención para determinar cantidades relativas de al menos una proteína en al menos dos muestras se pueden aplicar ampliamente para comparar niveles de proteínas, por ejemplo, en células, tejidos, o fluidos biológicos (por ejemplo, líquido de aspiración del pezón, saliva, esperma, líquido cefalorraquídeo, orina, suero, plasma, líquido sinovial), órganos, y/u organismos completos. Dicha comparación incluye evaluar fracciones subcelulares, células, tejidos, fluidos, órganos y/u organismos completos que, por ejemplo, están enfermos y no enfermos, estresados y no estresados, tratados con fármacos y no tratados con fármacos, benignos y malignos, adherentes y no adherentes, infectados y no infectados, transformados y no transformados. El procedimiento también permite comparar niveles de proteínas en fracciones subcelulares, células, tejidos, fluidos, organismos, organismos completos expuestos a diferentes estímulos o en diferentes etapas del desarrollo, o en estados en los que se silencian o sobreexpresan uno o más genes, o en condiciones donde se ha suprimido la expresión de uno o más genes.

En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento, también se pueden usar en ensayos de diagnóstico, para detectar la presencia, la ausencia o una variación en el nivel de expresión de uno o más marcadores de proteínas o un conjunto específico de proteínas que indica un estado patológico (por ejemplo, tal como cáncer, enfermedad neurodegenerativa, inflamación, enfermedades cardiovasculares, infecciones víricas, infecciones bacterianas, infecciones fúngicas o cualquier otra enfermedad). Las aplicaciones específicas incluyen la identificación de proteínas diana que están presentes en cánceres metastáticos e invasivos, la expresión diferente de proteínas en ratones transgénicos, la identificación de proteínas que son favorecidas o reducidas en los tejidos enfermos, la identificación de cambios intracelulares en células con cambios fisiológicos tales como desplazamiento metabólico, la identificación de biomarcadores en cánceres, la identificación de rutas de señalización.

El análisis cuantitativo de conjuntos grandes de proteínas en diferentes muestras se puede llevar a cabo tanto con péptidos señalizados como con péptidos de identificación. En un ejemplo típico se usarán los péptidos señalizados basados en una alteración de las metioninas o cisteínas o histidinas o una combinación de dos de estos aminoácidos. En otro ejemplo típico, se usan los péptidos de identificación basados en péptidos amino-terminales o péptidos carboxi-terminales. Además la invención se puede usa para lograr los análisis cualitativos y cuantitativos del extenso proteoma, del estado de modificación de las proteínas. Por ejemplo, en varias rutas de transducción de señales, los restos de serina, treonina y tirosina, presentes en las proteínas, con frecuencia son fosforiladas. En una realización específica los péptidos señalizados isotópicamente marcados de forma diferentes son péptidos señalizados seleccionados según la presencia de una fosfo-aminoácido. La comparación de la abundancia relativa de los péptidos señalizados pesados y ligeros permite la comparación de la abundancia relativa de las proteínas fosforiladas en dos muestras que comprenden proteínas. Todavía en otra realización los péptidos señalizados, isotópicamente marcados de forma diferente, son péptidos señalizados seleccionados según la presencia de una fosfoserina y/o fosfotreonina o fosfotirosina. Todavía en otra realización, los péptidos señalizados, isotópicamente marcados de forma diferente son péptidos señalizados seleccionados según la presencia de péptidos que contienen lisina \varepsilon-N-acetilada. Todavía en otra realización los péptidos señalizados marcados isotópicamente de forma diferente son péptidos señalizados seleccionados según la presencia de un grupo glicosilo.

La presente invención además proporciona un procedimiento para cuantificar la cantidad de una o más proteínas en una sola muestra que comprende proteínas. El procedimiento comprende las etapas de: (a) preparar una mezcla peptídica de proteínas; (b) añadir a la mezcla una cantidad conocida de un péptido sintético de referencia marcado con una forma de isótopo distinguible del isótopo del péptido de referencia; (c) separar la mezcla en fracciones de péptidos mediante cromatografía; (d) alterar química o enzimáticamente, o química y enzimáticamente al menos un aminoácido de al menos uno de los péptidos en cada fracción; (e) aislar los péptidos señalizados de cada fracción por cromatografía, en el que la cromatografía se lleva a cabo con el mismo tipo de cromatografía que en la etapa (c); (f) llevar a cabo el análisis espectrométrico de masas de los péptidos señalizados; y (g) determinar la cantidad de la proteína presente en la muestra comparando las alturas de los picos del péptido sintético de referencia y el péptido de referencia.

Se puede aplicar el mismo procedimiento con el modo de acción inverso, en el que el procedimiento comprende las etapas de: (a) preparar una mezcla peptídica de proteínas; (b) añadir a la mezcla una cantidad conocida de un péptido sintético de referencia marcado con una forma de isótopo distinguible del isótopo del péptido de referencia; (c) separar la mezcla en fracciones de péptidos mediante cromatografía; (d) alterar química o enzimáticamente, o química y enzimáticamente al menos un aminoácido en la mayoría de los péptidos en cada fracción; (e) aislar los péptidos de identificación de cada fracción por cromatografía, en el que la cromatografía se lleva a cabo con el mismo tipo de cromatografía que en la etapa (c); (f) llevar a cabo el análisis espectrométrico de masas de los péptidos de identificación; y (g) determinar la cantidad de la proteína presente en la muestra comparando las alturas de los picos del péptido sintético de referencia y el péptido de referencia.

Es evidente que se pueden seguir los mismos procedimientos combinados con una etapa de tratamiento previo como se ha mencionado antes en el presente documento. Los procedimientos también se pueden aplicar si las separaciones cromatográficas en la etapa (c) y (e) son iguales o sustancialmente similares.

"Péptidos de referencia" tal como se usa en el presente documento, son péptidos cuya secuencia y/o masa es suficiente para identificar sin ambigüedad su proteína de origen. Preferiblemente, es fácil la síntesis de péptidos equivalentes a péptidos de referencia. Para mayor claridad, un péptido de referencia, tal como se usa en el presente documento, es el péptido nativo como se observa en la proteína que representa, mientras que un péptido sintético de referencia, tal como se usa en el presente documento, es un homólogo sintético del mismo péptido. Dicho péptido sintético de referencia se produce de forma conveniente mediante síntesis de péptidos, pero también se puede producir de forma recombinante. La síntesis de péptidos se puede llevar a cabo, por ejemplo, con un sintetizador de péptidos múltiple. La producción recombinante se puede obtener con una multitud de vectores y hospedantes que están ampliamente disponibles en la técnica. Los péptidos de referencia preferiblemente ionizan bien en la espectrometría de masas. Un ejemplo no limitante de un péptido de referencia que ioniza bien es un péptido de referencia que contiene una arginina. Preferiblemente, un péptido de referencia también es fácil de aislar como péptido señalizado o como péptido de identificación. En la última realización preferida, el péptido de referencia simultáneamente también es un péptido señalizado o un péptido de identificación.

Un péptido de referencia y su péptido sintético de referencia homólogo químicamente son muy similares, se separan cromatográficamente de la misma forma y también ionizan de la misma forma. Sin embargo, el péptido de referencia y su péptido sintético de referencia homólogo están isotópicamente marcados de forma diferente. Por consiguiente, en una realización preferida en la que el péptido de referencia también es un péptido señalizado o péptido de identificación, el péptido de referencia y su péptido sintético de referencia homólogo son alterados de una forma similar, y se aíslan en la misma fracción de la serie primaria y secundaria, y en una eventual tercera serie. Sin embargo, cuando se alimentan un péptido de referencia y su péptido sintético de referencia en un analizador, tal como un espectrómetro de masas, se separan en el péptido ligero y el pesado. El péptido pesado tiene una masa ligeramente mayor debido al mayor peso del isótopo pesado elegido incorporado.

Debido a esta diferencia de masa muy pequeña entre un péptido de referencia y su péptido sintético de referencia, ambos péptidos aparecerán como un pico doble con poca separación reconocible en un análisis espectrométrico de masas. Se puede calcular la proporción entre las alturas de los picos o las intensidades de los picos, y esto determina la proporción entre la cantidad del péptido de referencia frente a la cantidad del péptido sintético de referencia. Puesto que se añade una cantidad absoluta del péptido de referencia a la mezcla peptídica de proteínas, se puede calcular fácilmente la cantidad del péptido de referencia y se puede calcular la cantidad de la correspondiente proteína en la muestra que comprende proteínas.

Hay varios procedimientos conocidos en la técnica para marcar isotópicamente de forma diferente un péptido de referencia y su péptido sintético de referencia. En una primera estrategia, el péptido de referencia lleva el isótopo poco común y el homólogo sintético lleva el isótopo natural. En esta estrategia, los péptidos sintéticos de referencia se pueden sintetizar químicamente de forma eficaz con sus isótopos naturales en preparaciones a gran escala. Para marcar el péptido de referencia con un isótopo poco común, se puede aplicar cualquiera de los procedimientos mencionados antes para marcar isotópicamente de forma diferente un péptido con un isótopo poco común (marcaje in vivo, marcaje enzimático, marcaje químico, etc.). Un ejemplo del marcaje in vivo es incorporar la metionina deuterada CH_{3}-SCD_{2}-CD_{2}-CH-(NH_{2})-COOH disponible en el comercio, añadiendo 4 uma a la masa peptídica total. Alternativamente, los péptidos sintéticos de referencia también podrían contener arginina deuterada H_{2}NC-(NH)-NH-(CD_{2})_{3}-CD-(NH_{2})-COOH, que añadiría 7 uma a la masa peptídica total. Será evidente para un experto en la técnica que se puede considerar en este protocolo todo aminoácido del cual puedan existir formas deuterada o con ^{15}N o ^{13}C. Otro ejemplo de esta estrategia es llevar a cabo la proteolisis de la muestra que comprende proteínas con tripsina en presencia de H_{2}^{18}O, pero se pueden usar muchos otros procedimientos. Por lo tanto, en una realización preferida, el análisis cuantitativo de al menos una proteína en una muestra que comprende proteínas, comprende las etapas de: a) preparar una mezcla peptídica de proteínas en la que los péptidos llevan un isótopo poco común (por ejemplo, un isótopo pesado); b) añadir a la mezcla peptídica de proteínas una cantidad conocida de un péptido sintético de referencia que lleva isótopos naturales (por ejemplo, un isótopo ligero); c) la mezcla peptídica de proteínas, que también contiene el péptido sintético de referencia, se separa en fracciones mediante una separación cromatográfica primaria; d) la alteración química y/o enzimática de al menos el péptido de referencia y su péptido sintético de referencia homólogo; e) aislar el péptido de referencia señalizado y el péptido sintético de referencia señalizado mediante una separación cromatográfica secundaria; f) determinar por espectrometría de masas la proporción entre las alturas de los picos del péptido de referencia frente a los péptidos sintéticos de referencia, y g) cálculo de la cantidad de proteína, representada por el péptido de referencia, en la muestra que comprende proteínas.

En otra realización preferida, el péptido de referencia es simultáneamente un péptido de identificación. El procedimiento anterior se puede aplicar igualmente a esta estrategia, pero en la etapa d) el péptido de referencia y su péptido sintético de referencia permanecerán inalterados, y en la etapa e) se aíslan los péptidos de identificación (incluyendo el péptido de referencia y su péptido sintético de referencia).

En otra realización preferida, la determinación cuantitativa de al menos una proteína en una sola muestra, comprende las etapas de: a) la digestión con tripsina en H_{2}^{18}O de dicha mezcla de proteínas en péptidos; b) la adición a la mezcla peptídica de proteínas resultante, de una cantidad de al menos un péptido sintético de referencia que lleva isótopos naturales; c) el fraccionamiento de la mezcla peptídica de proteínas en una separación cromatográfica primaria; d) la alteración química y/o enzimática de cada fracción en uno o más aminoácidos específicos (se alterarán tanto los péptidos de la mezcla peptídica de proteínas como los péptidos sintéticos de referencia que contienen el aminoácido específico); e) el aislamiento de los péptidos señalizados mediante una separación cromatográfica secundaria (estos péptidos señalizados comprenden tanto el péptido de referencia biológico como su péptido sintético de referencia homólogo); f) el análisis espectrométrico de masas de los péptidos señalizados y la determinación de las cantidades relativas del péptido de referencia y su péptido sintético de referencia homólogo. Otra vez, se puede seguir una estrategia similar con péptidos de referencia que son simultáneamente péptidos de identificación.

Además, los procedimientos anteriores se pueden aplicar igualmente de una forma en la que un péptido de referencia se marca con un isótopo natural y su péptido sintético de referencia homólogo se marca con un isótopo poco común.

Los procedimientos anteriores de la presente invención para cuantificar la cantidad de proteína en una muestra que comprende proteínas, se puede usar para cuantificar desde una hasta cientos de proteínas en la muestra. Para cada proteína que se va a cuantificar, es necesario al menos uno y preferiblemente dos o más péptidos de referencia. En una realización particular, todo péptido sintético de referencia se añade en una cantidad equimolar a la cantidad esperada de su péptido de referencia homólogo.

Los procedimientos proporcionados en la presente invención para cuantificar al menos una proteína en una muestra que comprende proteínas se pueden aplicar en líneas generales para cuantificar proteínas de diferente interés. Por ejemplo, se pueden desarrollar ensayos de diagnóstico mediante los cuales se determina el nivel de una o más proteínas en una muestra, usando la presente invención.

En otro ejemplo, los péptidos de referencia se pueden usar para cuantificar variantes de religación conocidas específicas de proteínas particulares en una muestra. Si se conoce una variante de religación particular de una proteína específica y se pretende detectar dicha variante de religación, entonces se puede sintetizar un péptido sintético de referencia que sólo se corresponde con dicha variante de religación de una proteína particular. De hecho, ocurre con frecuencia que debido a la omisión de exones se forman nuevas uniones, y por lo tanto se puede elegir un péptido de referencia específico que no se encuentre en la proteína de origen y sólo se encuentra en la variante de religación. Sin embargo, en muchos casos se aconseja elegir dos o más péptidos de referencia con el fin de distinguir entre la proteína de origen y la variante de religación de interés. También es frecuente que una variante de religación particular se exprese junto con la proteína de origen en la misma célula o tejido, y por lo tanto que ambas estén presentes en la muestra. Con frecuencia los niveles de expresión de la variante de religación particular y la proteína de origen son diferentes. La detección y la abundancia entre los péptidos de referencia se pueden usar para calcular los niveles de expresión entre la variante de religación y su proteína de origen. Todavía en otro ejemplo, se sabe que los fármacos pueden influir mucho en la expresión de proteínas particulares en una célula. Con el presente procedimiento se puede medir con precisión la cantidad de uno o un conjunto de proteínas de interés en diferentes condiciones experimentales. Por lo tanto, se pueden aplicar tecnologías equivalentes tales como aplicaciones genómicas, en los niveles de proteínas, que comprenden farmacoproteómica y toxicoproteómica. Aunque los marcadores génicos de una enfermedad han recibido una gran atención con la secuenciación del genoma humano, los marcadores de proteínas son más útiles en muchas situaciones. Por ejemplo, se puede desarrollar un ensayo de diagnóstico basado en péptidos de referencia que representan marcados de enfermedad de proteínas, básicamente para cualquier enfermedad de interés. Más convenientemente, dichos marcadores de enfermedad se pueden cuantificar en muestras de células, tejidos u órganos o fluidos corporales que comprenden, por ejemplo, células de la sangre, plasma, suero, orina, esperma, saliva, líquido de aspiración del pezón, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, después los péptidos de referencia para los marcadores proteicos de enfermedades se pueden usar, por ejemplo, para controlar si el paciente tiene una evolución rápida o lenta de la enfermedad, si es probable que el paciente desarrolle determinada enfermedad e incluso para controlar la eficacia del tratamiento. De hecho, a diferencia de los marcadores génicos, tales como el SNF, los niveles de los marcadores proteicos de enfermedades, que indican una enfermedad específica, pueden cambiar rápidamente como respuesta a la modulación o progreso de la enfermedad. Los péptidos de referencia para los marcadores proteicos de enfermedades también se pueden usar, por ejemplo, de acuerdo con la presente invención, para un diagnóstico mejorado de enfermedades genéticas complejas, tales como por ejemplo, cáncer, obesidad, diabetes, asma e inflamación, trastornos neuropsiquiátricos incluyendo depresión, manía, trastorno de pánico y esquizofrenia. Muchos de estos trastornos se producen debido a sucesos complejos que se reflejan en múltiples sucesos y rutas celulares y bioquímicas. Por lo tanto se puede encontrar muchos marcadores proteicos que están correlacionados con estas enfermedades. La presente invención permite el seguimiento de una a varios cientos de marcadores proteicos de enfermedades simultáneamente. La identificación y posibilidad de cuantificación relativa y absoluta de marcadores proteicos usando la presente invención, pueden conducir a una subclasificación del diagnóstico más precisa.

La invención usa un dispositivo separador de péptidos que puede llevar a cabo el procedimiento de la invención. Como se describe en el presente documento, los procedimientos para analizar mezclas peptídicas de proteínas o mezclas peptídicas complejas pueden comprender dos etapas cromatográficas consecutivas: una etapa cromatográfica primaria que usa la mezcla peptídica de proteínas completa que divide dicha mezcla en fracciones, y una etapa cromatográfica secundaria que se lleva a cabo después de la alteración química y/o enzimática de al menos un aminoácido específico presente en los péptidos en las fracciones. Como se describe en el presente documento, la expresión "separador de péptidos" se refiere a un dispositivo que separa eficazmente los péptidos señalizados de los péptidos no alterados de acuerdo con la invención, o que alternativamente separa eficazmente los péptidos de identificación de los péptidos alterados de acuerdo con la invención. En un aspecto preferido, se usan condiciones cromatográficas iguales o muy similares en las dos etapas cromatográficas, de modo que durante la serie secundaria (i) los péptidos no alterados permanecen en sus tiempos de elución originales y los péptidos señalizados son inducidos a sufrir un desplazamiento en el tiempo de elución, o (ii) en el modo inverso, los péptidos de identificación permanecen en sus tiempos de elución originales y la mayoría de los péptidos alterados son inducidos a sufrir un desplazamiento en el tiempo de elución. Como se describe en el presente documento, un separador de péptidos se refiere particularmente a la mezcla de fracciones obtenida después de la serie 1 y a la organización óptima de la segunda etapa cromatográfica (por ejemplo, la etapa en la que los péptidos señalizados se separan de los péptidos no alterados, o alternativamente, la etapa en la que los péptidos de identificación se separan de los péptidos alterados), para acelerar el aislamiento de los péptidos señalizados (o péptidos de identificación) de cada una de las fracciones de la serie primaria.

Una estrategia para aislar e identificar los péptidos señalizados aislados de una mezcla peptídica de proteínas, es recoger independientemente cada fracción de la separación cromatográfica primaria, para llevar a cabo la alteración química y/o enzimática en cada una de las fracciones y volver a cromatografiar cada fracción independientemente en las mismas condiciones cromatográficas y en la misma columna o una columna sustancialmente similar. Posteriormente los péptidos señalizados de cada serie independientemente son recogidos y se pasan a un instrumento analítico tal como un espectrómetro de masas. Sin embargo, dicha estrategia requiere una cantidad considerable de tiempo de cromatografía y ocupa un tiempo importante en la máquina en el espectrómetro de masas. Con el fin de obtener un uso más eficaz y económico tanto del equipamiento cromatográfico como del espectrómetro de masas, la presente invención proporciona el uso de separadores de péptidos que permiten mezclar varias fracciones de la separación cromatográfica primaria a la vez que evitan el solapamiento de la elución entre los péptidos señalizados que provienen de diferentes fracciones, y entre los péptidos señalizados de una fracción y los péptidos inalterados de una o más fracciones distintas, o en el modo inverso, la invención proporciona el uso de separadores de péptidos que permiten mezclar varias fracciones de la separación cromatográfica primaria a la vez que evitan el solapamiento entre los péptidos de identificación que proceden de diferentes fracciones, y entre los péptidos de identificación de una fracción y los péptidos alterados de una o más fracciones distintas.

El principio general del sistema para separar péptidos se puede ilustrar como sigue. En cada fracción obtenida de la etapa cromatográfica primaria, los péptidos señalizados eluyen distinto de los péptidos inalterados. En el caso de que la alteración del(los) aminoácido(s) en los péptidos señalizados induzca un desplazamiento en la elución de los péptidos señalizados con un límite inferior de \delta_{min} y un límite superior de \delta_{max}, entonces la ventana de elución de cada fracción aislada de la serie cromatográfica primaria (w_{1}) puede ser igual a \delta_{min}, pero preferiblemente es menor o igual que \delta_{min}/2, con el fin de permitir la distinta elución de un número máximo de péptidos señalizados y péptidos inalterados dentro de una fracción. La serie primaria se divide en fracciones, aquí indicadas como w1, situada entre los tiempos t_{3} y t_{4}. En un ejemplo no limitante, w1 se considera como 1 min (Fig. 1A). Se representa un ejemplo de un desplazamiento cromatográfico debido a la conversión de los péptidos en sus derivados alterados en la Fig. 1B. Así, el concepto se ilustra seleccionando arbitrariamente una fracción de 1 min que eluye entre t_{3} y t_{4}. Los péptidos de esta reacción, que han sido alterados, mostrarán un desplazamiento hidrófilo expresado cono \deltap (el desplazamiento para cada péptido alterado). Puesto que el efecto de la alteración no es siempre igual para cada péptido obtenido de la fracción seleccionada, \delta_{p} mostrará valores diferentes para cada péptido alterado y por lo tanto variará entre dos valores extremos: \delta_{min} y \delta_{max} (así \delta_{min} \leq \deltap \leq \delta_{max}). Dados t_{1} y t_{2}, los tiempos a los que los péptidos señalizados separados empiezan y paran de eluir respectivamente; y siendo t_{3} y t_{4} los tiempos que encierran la fracción seleccionada, entonces \delta_{min} = t_{3}-t_{2} y \delta_{max} = t_{4}-t_{1}. Por lo tanto, la ventana en la que eluyen los péptidos separados (w2) se expresa en términos de desplazamiento hidrófilo y el tamaño de la fracción seleccionada (w1), w2 = t_{2}-t_{1} o w2 = \delta_{max}-\delta_{min}-w1 (ec. 1).

Cuando se combinan (mezclan) varias fracciones de la serie primaria, después es importante que durante la serie secundaria con las fracciones mezcladas, los péptidos señalizados separados de una fracción seleccionada no coeluyen con los péptidos inalterados de una de las fracciones previas. Esto se representa esquemáticamente en la Fig. 2. Así, t'_{1} debería empezar en una diferencia de tiempo w3, medido desde t_{4}. Puesto que siempre se observa algo de dispersión de los péptidos inalterados durante la serie secundaria, no se debe considerar w3 como cero. Esto significa que t'_{3} que es el tiempo de elución de la siguiente fracción se expresará como:

t'3 = t3+w1+w3+w2+\delta_{min}

o \ t'3=t3+w1+w3+w2+\delta_{max}-w1-w2

o \ t'3=t3+w3+\delta_{max}

(ec. 2)o \ t'3-t3=\Delta t=w3+\delta_{max}

Por lo tanto, el espacio entre dos fracciones consecutivas que preferiblemente se pueden mezclar, se determina por el espacio entre los péptidos inalterados de una fracción dada y los péptidos señalizados de la siguiente fracción y \delta_{max}. Así, cuando \delta_{max} = 7 min y w3 = 5 min, entonces las fracciones de la serie primaria que se pueden combinar preferiblemente para la serie secundaria están separadas 12 min (p. ej., las fracciones 10, 22, 34 etc., si w1 es igual a 1 minuto). Estos valores se aplican cuando \delta_{max} y \delta_{min} permanecen constantes a lo largo de todo el gradiente. Dependiendo de las condiciones cromatográficas, los valores de \deltap pueden variar ligeramente a lo largo de las fracciones. Por ejemplo, se ha observado que para los péptidos con metionina alterados, los desplazamientos hidrófilos en algunos casos son ligeramente menores para los péptidos más hidrófobos que para los más hidrófilos, eluyendo a tiempos anteriores. En el sistema de TFA/acetonitrilo, esta regresión está limitada y por lo tanto se puede corregir fácilmente. Sin embargo, en otras condiciones cromatográficas, está regresión es más pronunciada y por lo tanto hay que tenerla en cuenta. Por lo tanto, se proporciona un factor de corrección \lambdan (como se ilustra en el Ejemplo 18). \lambdan es el factor de corrección para los \deltap en una fracción dada (\eta) en la que la concentración de disolvente B viene dada como concBn. En el caso de que haya una correlación lineal entre \lambdan y ConcBn, esto se expresará como \lambdan = a.ConcBn+b (ec. 3). Usando el sistema de TFA/acetonitrilo descrito en el Ejemplo 18, una columna C18 de RP-HPLC y desplazamientos hidrófilos debidos a la oxidación de los péptidos con metionina, se determinó que a = -0,002 y b = 1,002. Así, en este ejemplo de la fracción que contiene 10% de disolvente B, \lambda10 = -0,002.10+1,002 = 1, y de la fracción que contiene 50% de disolvente B, \lambda50 = -0,002.50+1,002 = 0,902. Esto significa que cuando en la fracción con 10% de disolvente B, \delta_{min} = 2 min y \delta_{max} = 7 min, w2 será 7 min-2 min-1 min = 4 min. Este valor para w2 en el modo combinado o mezclado en la fracción que contiene 50% del disolvente B será w2c = 7 min.0,902-2 min.0,902-1 =
3,51 min.

Por lo tanto, con el fin de ajustar el sistema de separación, se determinan \delta_{max} y \delta_{min} para las fracciones que eluyen primeras y para las fracciones que eluyen al final respectivamente, y entonces los tiempos de recolección se fijan como \delta_{max} tomado de las fracciones primeras, y \delta_{min} se toma de las fracciones últimas. Así w2c: \delta_{max}.\lambda(primeras fracciones)-\delta_{min}.\lambda(últimas fracciones)-w1 (ec. 4)

En un ejemplo:

w2c = 7 \ min - 1,8 \ min - 1 \ min = 4,2 \ min

Después de usar un valor de w2c constante a lo largo de todo el procedimiento de separación, la regresión de \delta_{max} y \delta_{min} también se puede usar para seleccionar las fracciones de la serie primaria con el fin de alcanzar una mejor eficacia de separación. Este puede ser el caso cuando los desplazamientos están muy afectados en el transcurso del gradiente del disolvente B. Suponiendo que los valores de a y b de la ecuación 3 son a = -0,02 y b =1,2 y \delta_{min} = 2 min y \delta_{max} = 7 min, entonces los desplazamientos en la fracción 10 (10% del disolvente B) serán \delta_{max} = 7 min, y w2 = 4 min. Cuando \delta_{max} y \delta_{min} no estén afectados durante la serie, entonces la siguiente fracción debería ser a los 22 min. Sin embargo, suponiendo que los valores para a y b de la ecuación 3 son a = 0,02 y b = 1,2, entonces \lambda22 = -0,02x22+1,2=0,776 y \delta_{max}22 = 7x0,76 = 5,32 min. Con t'_{3} = 10 min + 5min + 5,32 min = 20,32 min. Así, la siguiente fracción ahora podría ser la fracción 21 en lugar de la fracción 22, y la nueva \lambda21 entonces sería: \lambda21 = 0,78 y \delta_{max}21 = 7x0,78 = 5,46 = 5,46 min. Así t'_{3} se podría considerar al menos a un tiempo de 10 min + 5 min + 5,46 min = 20,46 min. Dado que la siguiente fracción seleccionada es la fracción 21, se puede volver a calcular cual es la siguiente fracción más cercana después de la previa. Esta es la fracción 31, para la cual \lambda31 será: 0,58 y \delta_{max} = 4,06 min. Así t''3 será: t''3 = 21 min + 5 min + 4,06 min = 30,1 min. Siguiendo los mismo cálculos se puede incluir la fracción 39, para la cual \lambda39 = 0,42 y \delta_{max} = 2,94 min. Así t'''3 = 31 min + 5 min + 2,94 min = 38,94 min, etc. Para ilustrar el principio de la separación de péptidos, se ha ideado un ejemplo ilustrativo para péptidos señalizados y fracciones aisladas con una ventana de elución w_{1} igual a x/2 y sin regresión (se supone un desplazamiento constante a lo largo del gradiente entero). Si la ventana de elución total de la serie 1 de todos los péptidos procedentes de la mezcla peptídica de proteínas es igual a 20x, entonces se recogen 40 fracciones con una ventana x/2 (primera fracción: de 0 a x/2; segunda fracción: de x/2 a x; tercera fracción: de x a 3x/2,...). En la estrategia más sencilla, cada fracción se somete individualmente a la etapa de alteración química y/o enzimática de los aminoácidos, y los péptidos se someten a la serie 2 en condiciones cromatográficas sustancialmente similares a la serie 1. La serie 2 separa los péptidos señalizados de los péptidos inalterados.

Para limitar el tiempo de cromatografía y análisis, el procedimiento se ha optimizado mezclando fracciones obtenidas en la serie 1. La mezcla se puede hacer con las fracciones primarias antes de la reacción de alteración o se puede hacer con las fracciones alteradas. Una fracción alterada es una fracción en la que los péptidos se han sometido a alteración química y/o enzimática de acuerdo con la invención.

En el ejemplo la mezcla se hace con las fracciones antes de la reacción de alteración. Después de la serie cromatográfica primaria, se mezclas las siguientes fracciones: la fracción 1 (0 a x/2), con las fracciones 8 (7x/2 a 4x), 15 (7x a 15x/2), 22 (21x/2 a 11x), 29 (14x a 29x/2), y 36 (35x/2 a 18x). Igualmente, la fracción 2 se mezcla con las fracciones 9, 16, 23, 30 y 37; la fracción 3 se mezcla con las fracciones 10, 17, 24, 31 y 38; la fracción 4 se mezcla con las fracciones 11, 18, 25, 32 y 39; la fracción 5 se mezcla con las fracciones 12, 19, 26, 33 y 40; la fracción 6 se mezcla con las fracciones 13, 20, 27 y 34; y la fracción 7 se mezcla con las fracciones 14, 21, 28 y 35. Las 7 mezclas son alteradas química y/o enzimáticamente en al menos un aminoácido específico y cada una de las siete mezclas se somete por separado a la serie 2 en condiciones cromatográficas sustancialmente similares a la separación cromatográfica primaria. Gracias a la selección de la correcta combinación de fracciones en cada mezcla, los péptidos señalizados eluyen en ventanas distintas del tiempo en el que se sabe que eluyen los péptidos inalterados, y tampoco hay solapamiento entre los péptidos señalizados procedentes de diferentes fracciones en la misma mezcla. En un ejemplo no limitante donde la alteración del aminoácido específico en los péptidos señalizados induce un desplazamiento hacia delante en una columna de separación hidrófoba, variando el desplazamiento entre el valor x y 2x (esto implica los valores para \delta_{min} = x/2, \delta_{max} = 5x/2, w1 = x/2 y w3 = 7x/2), los péptidos señalizados en la primera mezcla se recogerán, por ejemplo, en las fracciones [-2x a -x/2], [3x/2 a 3x], [5x a 13x/2], [17x/2 a 10x], [12x a 27x/2] y [31x/2 a 17x]. Se sigue una estrategia similar para las mezclas dos a siete. Por lo tanto, en este ejemplo, en lugar de volver a hacer 40 series, con las mezclas sólo es necesario hacer 7 series secundarias. Los péptidos señalizados que eluyen durante esta serie secundaria se pueden pasar directamente, por ejemplo, a una fuente de iones de un espectrómetro de masas conectado en serie para la identificación inmediata. La estrategia de mezcla anterior es un ejemplo no limitante. Será evidente para los expertos en la técnica que se pueden desarrollar estrategias similares para crear más o menos mezclas, y que se pueden aplicar estrategias similares para los péptidos de identificación. La elección del número de mezclas dependerá, entre otros, de (i) el intervalo de desplazamiento \deltap inducido por la alteración química o enzimática, ii) la ventana de elución de las fracciones recogidas de la separación cromatográfica primaria, y iii) la necesidad de optimizar el tiempo de cromatografía y el tiempo de análisis. La presente invención también proporciona el uso de un separador de columna en paralelo. Con un separador de columna en paralelo, el procedimiento basado en una sola columna se ejecuta con una serie de columnas que se hacen funcionar en paralelo (es decir, de forma sincrónica). El separador en paralelo contiene una serie de columnas idénticas que funcionan exactamente en las mismas condiciones (caudal, gradiente, etc.).

El principio general de un separador en paralelo se puede explicar mediante el siguiente ejemplo no limitado, por el cual se generan 12 mezclas de fracciones de péptidos, y \deltap está entre x/2 y 5x/2 y es el desplazamiento hidrófilo entre los péptidos señalizados y los péptidos no alterados. Si la ventana de elución total de todos los péptidos procedentes de la serie primaria cromatográfica es igual a 20x, entonces se recogen 40 fracciones con una ventana de x/2. Así, después de la serie cromatográfica primaria, se pueden mezclar las siguientes fracciones: fracción 1 (0 a x/2), con las fracciones 13 (6x a 13x/2), 25 (12x a 25x/2,) y 37 (18x a 37x/2). Igualmente, la fracción 2 se mezcla con las fracciones 14, 26 y 38; la fracción 3 se mezcla con las fracciones 15, 27 y 39; la fracción 4 se mezcla con las fracciones 16, 28 y 40; la fracción 5 se mezcla con las fracciones 17 y 29; la fracción 6 se mezcla con las fracciones 18 y 30; la fracción 7 se mezcla con las fracciones 19 y 31; la fracción 8 se mezcla con las fracciones 20 y 32; la fracción 9 se mezcla con las fracciones 21 y 33; la fracción 10 se mezcla con las fracciones 22 y 34; la fracción 11 se mezcla con las fracciones 23 y 35; y la fracción 12 se mezcla con las fracciones 24 y 36. Después las 12 mezclas se alteran química y/o enzimáticamente en al menos un aminoácido seleccionado. En una estrategia alternativa cada fracción se somete primero a la alteración y la mezcla se lleva a cabo con las fracciones alteradas. La Tabla II, contiene cálculos de los desplazamientos teóricos de las 12 mezclas de péptidos señalizados. Si cada una de las 12 mezclas alteradas (es decir, una mezcla que contiene las fracciones alteradas) se somete a la serie 2, en las mismas condiciones cromatográficas o al menos muy similares a la separación cromatográfica primaria, en un separador de una sola columna, entonces en cada tiempo hay una ventana de elución "vacía" de 9x/2 entre las fracciones (presentes en una mezcla) que comprenden los péptidos señalizados. Esta ventana de elución vacía de 9x/2 es un "intervalo muerto" para la separación cromatográfica así como para el analizador, porque los péptidos señalizados no eluyen en esta ventana de elución, y por consiguiente se pueden enviar péptidos señalizados a un analizador adecuado. Un separador de columnas en paralelo es un dispositivo más conveniente, donde 2, 3, 4 ó más columnas llevan a cabo una serie cromatográfica secundaria al mismo tiempo en condiciones sustancialmente similares (caudal, gradiente, etc.) y en el que la salida del separador en paralelo está directamente conectada con un analizador. Un separador de columnas en paralelo divide el tiempo de separación cromatográfico que normalmente es necesario para una serie de columnas individuales en serie, en aproximadamente el número de columnas que se usan en dicho separador en paralelo. En un ejemplo no limitante donde un separador de columnas en paralelo consiste en 3 columnas, las mezclas alteradas se vuelven a cromatografiar en paralelo con una combinación preferida de mezclas alteradas. Así, la ventaja de usar un separador con columnas en paralelo no es sólo que el tiempo total de separación de los péptidos se puede reducir significativamente, sino que además hay un número limitado de intervalos muertos entre la selección de los péptidos señalizados de las fracciones alteradas, de modo que la detección de los péptidos señalizados se puede producir de una forma continua. Como se ilustra en la Tabla II, para el ejemplo no limitante descrito antes, una combinación preferida de mezclas alteradas es cuando las mezclas alteradas 1, 5 y 9 se cargan en tres columnas en paralelo en una serie primaria, las mezclas alteradas 2, 6 y 9 se cargan en tres columnas en paralelo en una serie secundaria, las mezclas alteradas 3, 7 y 11 se cargan en tres columnas en paralelo en una tercera serie, y las mezclas alteradas 4, 8 y 12 se cargan en tres columnas en paralelo en una cuarta serie. Con la combinación anterior de mezclas alteradas existe un alineamiento casi perfecto entre los intervalos en los que eluyen los péptidos señalizados de las columnas en paralelo en cada una de las cuatro series. Cuando se inician al mismo tiempo las columnas I, II y III, los péptidos señalizados de la columna I, mezcla 1, fracción 1 eluirán primero en una ventana de -2x a -x/2. El siguiente flujo de péptidos señalizados viene de la columna II, mezcla 5, fracción 5; estos péptidos señalizados eluirán en una ventana de 0 a 3x/2. A estos les siguen posteriormente los péptidos señalizados de la columna III, mezcla 9, fracción 9 que eluyen en una ventana de 2x a 7x/2. Los péptidos señalizados posteriores eluyen de la columna I, mezcla 1, fracción 13 en una ventana de 4x a 11x/2, y así... (para evitar un posible solapamiento entre los péptidos señalizados de las diferentes mezclas, se ha introducido una ventana de x/2 entre cada dos ventanas de elución de péptidos señalizados). En el separador de péptidos, los péptidos señalizados que eluyen de la columna I, II y III se pasan continuamente a un analizador tal como un espectrómetro de masas. El hecho de que los péptidos señalizados en cada serie eluyan sin interrupción conduce a un flujo continuo de péptidos al analizador. Una vez que se ha completado la primera serie, se puede empezar la segunda serie, seguido de la tercera y de la cuarta serie. La estrategia de mezcla anterior es un ejemplo no limitante. Será evidente para los expertos en la técnica que otras combinaciones de números de mezclas y columnas en paralelo pueden conducir a resultados similares, es decir, una elución cromatográfica continua de péptidos señalizados acoplados inmediatamente a un análisis continuo de los péptidos, por ejemplo, en un espectrómetro de masas. La elección del número de mezclas y columnas dependerá, entre otros, de i) el intervalo \deltap inducido por la alteración química o enzimática, ii) la ventana de elución de las fracciones recogidas de la separación cromatográfica primaria, y iii) la necesidad de optimizar el tiempo de cromatografía y el tiempo de análisis. También será evidente para los expertos en la técnica que esta estrategia de columnas en paralelo también se puede aplicar a los péptidos de identificación aislados.

La invención también puede usar un separador de péptidos de múltiples columnas. Dicho separador de péptidos con múltiples columnas consiste esencialmente en un grupo de separadores de columnas en paralelo que trabajan en un modo combinado en paralelo y en serie. Dicho separador en paralelo comprende esencialmente y veces un conjunto de z columnas, en el que las z columnas están conectadas en paralelo. En un ejemplo no limitante, un separador de múltiples columnas donde y = 3 y z = 3 es un separador de nueve columnas. Dicho separador de nueve columnas trabaja con tres conjuntos de tres columnas cada vez conectadas en paralelo. Los conjuntos de tres columnas en paralelo se denominan A, B y C. Las columnas individuales de A se denominan I, II y III; las columnas individuales de B se denominan I', II', y III'; y las columnas individuales de C se denominan I'', II'' y III''. Un conjunto de columnas en paralelo trabaja con un retraso (llamado \theta) frente al conjunto previo. Por lo tanto, el separador en paralelo B empieza con un retraso de \theta con respecto al separador en paralelo A, y el separador en paralelo C empieza con un retraso de \theta después de que empiece el separador en paralelo B, y con un retraso de 2\theta después de que empiece el separador en paralelo A. Es importante indicar que en un separador de múltiples columnas, sólo se procesa una fracción de la serie I por columna de péptidos alterados en un momento dado. Así, por ejemplo en un separador de nueve columnas, se procesan simultáneamente nueve fracciones de péptidos señalizados (o péptidos de identificación). Esto difiere de los dos separadores previamente descritos (es decir, un separador de péptidos de una columna y un separador en paralelo) donde se mezclan estratégicamente varias fracciones alteradas y se cargan simultáneamente. Puesto que en un separador de múltiples columnas sólo se procesa una fracción de péptidos señalizados (o péptidos de identificación) en un momento dado, el control de la precisión del caudal (es decir, la etapa cromatográfica secundaria) no es tan importante como en los separadores previos. Otra ventaja del separador de múltiples columnas es que está bien adaptado para separar los péptidos señalizados de los péptidos no alterados en los casos en los que el desplazamiento cromatográfico de los péptidos señalizados varía significativamente a lo largo de las diferentes fracciones. Igualmente, el separador de múltiples columnas está bien adaptado para separar los péptidos de identificación de los péptidos
alterados.

El mecanismo de un separador de péptidos de múltiples columnas se explica como un ejemplo no limitado para un separador de péptidos de nueve columnas para el cual se usan las ventanas de elución de las fracciones alteradas representadas en la Tabla II. En la columna I se carga la fracción alterada 1, en la columna II se carga la fracción alterada 13, en la columna III se carga la fracción alterada 25. El sistema B (columnas I', II' y III') se carga con las fracciones alteradas 2, 14 y 26, respectivamente, y el sistema C (columnas I'', II'', y III'') se carga con las fracciones alteradas 3, 15 y 27, respectivamente. Como puede observarse en la Tabla II, cuando las 3 columnas del sistema A se inician simultáneamente, las 3 columnas del sistema B empiezan todas con un retraso de \theta = 3x/2 y las 3 columnas del sistema C empiezan todas con un retraso de 2\theta = 3x (con respecto al sistema A), y hay una cantidad mínima de tiempo muerto durante la elución de los péptidos señalizados. Cuando el separador de péptidos de múltiples columnas se hace funcionar, por ejemplo, de acuerdo con los parámetros anteriores, los péptidos señalizados del sistema A, columna I, fracción 1 eluirán primero en una ventana predeterminada de -2x a -x/2, seguido de los péptidos señalizados del sistema B, columna I', fracción 2 que eluyen en una ventana de 0 a 3x/2, seguido posteriormente por los péptidos señalizados del sistema C, columna I'', fracción 3 que eluyen en una ventana de 2x a 7x/2, seguido posteriormente por los péptidos señalizados del sistema A, columna II, fracción 13 que eluyen en una ventana de 4x a 11 x/2, y así sucesivamente. Además, la separación completa de las fracciones presentadas en la Tabla II se puede llevar a cabo en cinco series: Serie 1: sistema A (1, 13, 25), sistema B (2, 14, 26), sistema C (3, 15, 27); Serie 2: sistema A (4, 16, 28), sistema B (5, 17, 29), sistema C (6, 18, 30); Serie 3: sistema A (7, 19, 31), sistema B (8, 20, 32), sistema C (9, 21, 33); Serie 4: sistema A (10, 22, 34), sistema B (11, 23, 35), sistema C (12, 24, 36); y Serie 5: sistema A (37), sistema B (38), sistema C (39, 40). Será evidente para un experto en la técnica que otras combinaciones de columnas en paralelo y en serie pueden conducir a resultados similares y que el separador de péptidos de múltiples columnas se puede aplicar igualmente a péptidos de identificación aislados. La elección del número columnas, su disposición y las fracciones cargadas en las columnas dependerá, entre otros, de i) el intervalo \deltap inducido por la alteración química o enzimática, ii) la ventana de elución de las fracciones recogidas de la separación cromatográfica primaria, y iii) la necesidad de optimizar el tiempo de cromatografía y el tiempo de análisis.

También será evidente para los expertos en la técnica que estos separadores de péptidos que llevan a cabo el procedimiento de la presente invención también se pueden usar de una forma completamente automática, usando autoinyectores, equipamiento de HPLC y colectores de fracciones automáticos disponibles en el comercio. Por lo tanto, los presentes ejemplos de los separadores de péptidos no deben considerarse exhaustivos. Son igualmente factibles varias variantes, incluyendo sistemas electroforéticos y de cromatografía de intercambio iónico. Para completar, los separadores de péptidos para separar péptidos de identificación se pueden diseñar basándose en los mismos principios.

La realización ilustrativa proporciona además un sistema para llevar a cabo el procedimiento antes descrito del análisis proteómico de una forma selectiva y eficaz. Como se ha discutido, una columna cromatográfica primaria realiza una separación inicial de la mezcla peptídica compleja. La columna cromatográfica primaria separa la mezcla peptídica compleja en al menos dos fracciones en un conjunto definido de condiciones. Por ejemplo, la columna cromatográfica primaria separa la mezcla peptídica de proteínas eluyendo la columna con un gradiente de disolvente predeterminado y un caudal predeterminado. Las fracciones que resultan de la separación cromatográfica primaria se pueden mezclar estratégicamente para combinar una pluralidad de fracciones que tienen distintos tiempos de elución en una pluralidad de fracciones mezcladas, como se ha descrito antes. Posteriormente, las fracciones mezcladas se pueden alterar para dar como resultado un conjunto de péptidos alterados y un conjunto de péptidos no alterados para cada fracción. De acuerdo con una realización alternativa, las fracciones primero se alteran usando los procedimientos antes descritos y después se mezclan estratégicamente en un conjunto de fracciones mezcladas, en el que cada fracción en una fracción mezclada comprende un conjunto de péptidos alterados y un conjunto de péptidos no alterados. En una separación cromatográfica secundaria, los péptidos alterados se separan de los péptidos inalterados. Los péptidos aislados después se pueden analizar para identificar una proteína.

La separación cromatográfica secundaria se puede llevar a cabo usando un separador de péptidos 10 de una sola columna, como se ilustra en la Figura 9. De acuerdo con la realización ilustrativa, el separador de péptidos 10 de una sola columna trabaja de forma secuencial con una columna cromatográfica primaria, y comprende una columna cromatográfica secundaria 11. De acuerdo con la realización ilustrativa, la columna cromatográfica secundaria 11 es sustancialmente igual en tipo, tamaño, forma y otros parámetros a la columna cromatográfica primaria. La columna cromatográfica secundaria 11 ilustrativa trabaja además en condiciones cromatográficas sustancialmente similares. Por ejemplo, de acuerdo con la realización ilustrativa, la columna cromatográfica secundaria se eluye con un gradiente de disolvente igual o sustancialmente similar al gradiente de disolvente usado para realizar la separación en la columna cromatográfica primaria y un caudal igual o sustancialmente similar. El separador de péptidos 10 ilustrativo además incluye un sistema de disolvente que incluye una bomba de disolvente 12 conectada con al menos un depósito de disolvente. La bomba de disolvente 12 proporciona el gradiente de disolvente predeterminado a la columna secundaria 11. Se proporciona un inyector de muestra 13 para introducir una fracción o una fracción mezclada a la columna para la separación. El sistema de separación de péptidos 10 incluye además un conjunto de válvulas de entrada 14 para controlar y dirigir el flujo de disolvente y muestra a la entrada de la columna secundaria 15. El sistema de separación de péptidos 10 de la Figura 9 además incluye un conjunto de válvulas de salida 51 para controlar el flujo de la salida 16 de la columna secundaria 10 y dirigir el eluato de la columna secundaria 10 a un recipiente de residuos 17, un colector de fracciones 18 y/o una fuente de iones de un analizador 19 conectado en serie. Se proporciona un sistema de control de válvulas 50 para controlar y guiar el funcionamiento de las válvulas 14, 51. De acuerdo con la realización ilustrativa, el analizador 19 comprende un espectrómetro de masas, aunque un experto en la técnica reconocerá que se puede usar cualquier analizador adecuado para identificar una proteína, tal como los descritos en el presente documento. Como se ha discutido, los péptidos alterados eluyen de forma distinta que los péptidos no alterados en la columna secundaria 11, permitiendo el aislamiento y la identificación de los péptidos alterados. Es evidente para un experto en la técnica que se pueden usar los mismos principios (columna) para separar los péptidos de identificación de los péptidos alterados.

Aunque la columna usada para llevar a cabo la etapa cromatográfica secundaria se ilustra como separada y distinta de la columna primaria, un experto en la técnica reconocerá que se puede usar una sola columna para llevar a cabo las etapas cromatográficas primarias y secundarias de la realización ilustrativa. Por ejemplo, la mezcla compleja se puede separar en fracciones usando una columna cromatográfica dada. La columna dada se puede limpiar y posteriormente volver a usar para la etapa cromatográfica secundaria.

De acuerdo con una realización alternativa, la separación de las fracciones alteradas se puede realizar usando un sistema de separación de péptidos de columnas en paralelo, como se ilustra en las Figuras 12a y 12b. Como se ha discutido, la mezcla compleja primero se separa usando una columna cromatográfica primaria, se alteran usando los procedimientos descritos antes y se mezclan estratégicamente antes o después de la etapa de alteración. Después, las fracciones alteradas y mezcladas sufren una segunda etapa cromatográfica para realizar la separación de los péptidos alterados y no alterados. El sistema de separación de péptidos de columnas en paralelo 20 ilustrado en la Figura 12a, mejora significativamente la eficacia y velocidad de la etapa cromatográfica secundaria. Como se ilustra, el sistema de columnas en paralelo 20 comprende una pluralidad de columnas de cromatografía secundaria 21a, 21b, 21c sustancialmente iguales conectadas en paralelo. Las columnas de cromatografía secundarias 21a, 21b, 21c del sistema de columnas en paralelo 20, son idénticas o sustancialmente similares en tamaño, forma y otros parámetros cromatográficos a la columna cromatográfica primaria usada para realizar una primera separación de una mezcla compleja. De acuerdo con la realización ilustrativa, el sistema de separación de péptidos comprende tres columnas secundarias. Sin embargo, un experto en la técnica reconocerá que se puede usar cualquier número adecuado de columnas de cromatografía conectadas en paralelo, y que la presente invención no se limita a la realización ilustrativa de las tres columnas. También se pueden aplicar los mismos principios mecánicos para aislar péptidos de identificación.

Como se muestra en la Figura 12a, el sistema de columnas en paralelo 20 incluye un conjunto de sistemas de disolventes 22a, 22b, 22c correspondientes a cada columna 21a, 21b, 21c respectivamente. Cada bomba de disolvente está conectada a un conjunto de depósitos de disolventes y proporciona un gradiente de disolvente predeterminado a la correspondiente columna secundaria. El separador de péptidos de columnas en paralelo 20 comprende además un inyector de muestra 23 acoplado a las entradas 25a, 25b, 25c de las columnas secundarias 21a, 21b, 21c para introducir una muestra en una o más de las columnas secundarias. Se proporciona un conjunto de válvulas de entrada 24 para controlar y dirigir el flujo de disolvente y muestra a una columna secundaria seleccionada. Se proporciona un conjunto de válvulas de salida 53 para controlar y dirigir el eluato de las salidas 26a, 26b, 26c de las columnas secundarias 21a, 21b, 21c entre un recipiente de residuos 27, un colector de fracciones 28 y/o una fuente de iones de un analizador 29 conectado en serie, tal como un espectrómetro de masas. Se proporciona un sistema de control de las válvulas 55 para controlar y guiar el funcionamiento de las válvulas 24, 53.

De acuerdo con una realización alternativa del sistema de separación de péptidos de columnas en paralelo, mostrado en la Figura 12b, se usa una sola bomba de disolvente 58 para proporcionar un gradiente de disolvente a las columnas secundarias en paralelo 20'a, 20'b, 20'c en el sistema de separación de péptidos 20'.

El sistema de separación de péptidos de la Figura 12b es sustancialmente similar al sistema de separación de péptidos de la Figura 12a, con la excepción del sistema de disolvente. Como se ilustra, se usa una sola bomba de disolvente 58 para bombear una mezcla de disolventes desde los depósitos de disolventes a las columnas secundarias en paralelo. En la realización ilustrada en la Figura 12b, se usa un sistema distribuidor controlado, que comprende un conjunto de reguladores del caudal 59, para controlar y dirigir el flujo de disolvente desde la bomba de disolvente 58 a las columnas secundarias en paralelo 20'a, 20'b, 20'c.

De acuerdo con todavía otra realización, mostrada en la Figura 13, un sistema de separación de péptidos 30 alternativo para realizar la etapa cromatográfica secundaria de la invención, comprende una pluralidad de conjuntos de columnas en paralelo que trabajan en un modo en serie/paralelo combinado. De acuerdo con la realización ilustrativa, el sistema de separación de péptidos 30 de la Figura 13 comprende una pluralidad de conjuntos de columnas secundarias 41, 42, 43 conectados en serie. Cada conjunto de columnas secundarias 41, 42, 43 comprende una pluralidad de columnas secundarias 41a, 41b, 41c, 42a, 42b, 42c, 43a, 43b, 43c conectadas en paralelo. Un experto en la técnica reconocerá que el sistema de separación de péptidos ilustrativo no está limitado al número de columnas y conjuntos de columnas ilustrado, y que se puede usar cualquier número adecuado de columnas en paralelo y conjuntos de columnas en serie para realizar la etapa cromatográfica secundaria de la realización ilustrativa.

En el sistema de separación de péptidos 30 de la Figura 13, una sola fracción alterada de péptidos producida en la serie cromatográfica primaria es procesada en un momento dado por columna. Las fracciones se cargan a la vez en una columna seleccionada y se proporciona un gradiente de disolvente a cada columna respectiva para realizar la separación de los péptidos alterados en cada fracción de los péptidos no alterados. Se proporciona un inyector de muestra 13a, 13b, 13c y está conectado a cada conjunto de columnas secundarias 41, 42, 43, respectivamente, para introducir una fracción de péptidos en una columna secundaria seleccionada en el conjunto de columnas secundarias. Se proporciona un sistema de disolvente, que incluye una bomba de disolvente 12a, 12b, 12c, y está conectado a cada conjunto de columnas secundarias 41, 42, 43, respectivamente, para proporcionar un gradiente de disolvente predeterminado en un tiempo predeterminado al respectivo conjunto de columnas. Los sistemas de válvulas de los conjuntos de columnas secundarias 41, 42, 43 están numerados respectivamente como a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, en 41; a', b', c', d', e', f, g', h', i', j', k', l', m', n', o', en 42; a'', b'', c'', d'', e'', f, g'', h'', i'', j'', k'', l'', m'', n'', o'' en 43. Un conjunto de válvulas de entrada 44 controla y dirige el flujo de disolvente desde las bombas de disolvente y el flujo de muestra desde los inyectores de muestra a las entradas de las columnas secundarias en los conjuntos de columnas secundarias 41, 42, 43. Las salidas de las columnas secundarias 41a, 41b, 41c, 42a, 42b, 42c, 43a, 43b, 43c están conectadas y dirigen el eluato desde las columnas secundarias a un recipiente de residuos 27, un colector de fracciones 48 y/o una fuente de iones de un analizador 29 conectado en serie. Se proporciona un sistema de control de válvulas 50 para controlar y guiar el funcionamiento de las válvulas 14, 51.

Las bombas de disolvente 12a, 12b, 12c están configuradas para iniciar un gradiente de disolvente predeterminado para los respectivos conjuntos de columnas 41, 42, 43 en un periodo de tiempo seleccionado. Por ejemplo, la primera bomba de disolvente 12a inicia un primer gradiente de disolvente adecuado en el conjunto de columnas 41 en un primer tiempo predeterminado para realizar la separación de cada fracción en las columnas secundarias 41a, 41b, 41c del primer conjunto 41. El gradiente de disolvente avanza por cada columna secundaria 41a, 41b, 41c en el primer conjunto. Después de un retraso seleccionado, la segunda bomba de disolvente 12b inicia un gradiente de disolvente igual o sustancialmente igual en el segundo conjunto de columnas secundarias 42 en un segundo tiempo predeterminado. El segundo sistema de disolvente desarrolla el gradiente de disolvente por cada una de las columnas secundarias 42a, 42b, 42c para realizar la separación de cada fracción en las columnas secundarias 42a, 42b, 42c en el segundo conjunto 42. Finalmente, después de un retraso seleccionado, la tercera bomba de disolvente 12c inicia un gradiente de disolvente igual o sustancialmente igual en el tercer conjunto de columnas secundarias 43 para realizar la separación de un tercer conjunto de fracciones. La configuración descrita proporciona una corriente continua de péptidos separados y aislados al colector de fracciones 48 y/o a la fuente de iones del analizador 49 conectado en serie para identificar un péptido alterado en la fracción y la correspondiente proteína del péptido alterado.

El sistema de separación de péptidos 30 de la Figura 13 se puede implementar usando un conjunto de columnas secundarias 41a, 41b, 41c, 42a, 42b, 42c, 43a, 43b, 43c que son sustancialmente más pequeñas que la columna primaria. Las columnas secundarias 41a, 41b, 41c, 42a, 42b, 42c, 43a, 43b, 43c también pueden estar formadas de materiales desechables más baratos. De esta forma el sistema de separación de péptidos 30 de la realización ilustrativa no solo mejora significativamente la velocidad y eficacia del análisis de proteoma de la presente invención, sino que el sistema de separación de péptidos 30 ilustrativo reduce además el coste de realización del análisis. El principio mecánico anterior se puede usar para separar péptidos señalizados de péptidos no alterados, o para separar péptidos de identificación de péptidos alterados.

Así, en otra realización, la invención proporciona un sistema para separar péptidos que comprende a) una columna cromatográfica primaria para separar una mezcla peptídica de proteínas en una pluralidad de fracciones en un conjunto definido de condiciones y por el cual cada fracción posteriormente se somete a una alteración de al menos un aminoácido para generar péptidos señalizados y en el que las fracciones alteradas se mezclan en un conjunto de fracciones mezcladas, comprendiendo cada fracción mezclada al menos dos fracciones alteradas, b) un conjunto de columnas cromatográficas secundarias que comprenden una primera columna cromatográfica secundaria para separar una primera fracción mezclada y al menos una segunda columna cromatográfica secundaria dispuesta en paralelo con la primera columna cromatográfica secundaria para separar una segunda fracción mezclada, en el que el conjunto de columnas cromatográficas secundarias realiza el aislamiento de los péptidos señalizados en condiciones sustancialmente idénticas al conjunto de condiciones definidas, de modo que no hay solapamiento de elución entre i) los péptidos señalizados de diferentes fracciones dentro de una mezcla o entre las mezclas, y ii) los péptidos señalizados y los péptidos inalterados.

Todavía en otra realización, la invención proporciona un sistema de separación de péptidos que comprende: una columna cromatográfica primaria para separar una mezcla peptídica de proteínas en una pluralidad de fracciones en un conjunto de condiciones definido y por el cual cada fracción posteriormente se somete a una alteración de al menos un aminoácido para generar péptidos alterados y péptidos inalterados y en el que las fracciones alteradas se mezclan en un conjunto de fracciones mezcladas, comprendiendo cada fracción mezclada al menos dos fracciones alteradas, y un conjunto de columnas cromatográficas secundarias que comprenden una primera columna cromatográfica secundaria para separar una primera fracción mezclada y al menos una segunda columna cromatográfica secundaria dispuesta en paralelo con la primera columna cromatográfica secundaria para separar una segunda fracción mezclada, en el que el conjunto de columnas cromatográficas secundarias realizan el aislamiento de los péptidos de identificación en condiciones sustancialmente iguales al conjunto de condiciones definido, por el cual no hay solapamiento de la elución entre i) los péptidos de identificación de diferentes fracciones con una mezcla o entre mezclas, y ii) los péptidos de identificación y los péptidos alterados.

En otra realización el sistema comprende además una salida al conjunto de columnas cromatográficas secundarias para recoger el eluato de la primera columna cromatográfica secundaria y la segunda columna cromatográfica secundaria.

En otra realización el sistema comprende además un analizador conectado a la salida.

En otra realización el sistema comprende además un recipiente para residuos conectado a la salida para recoger el producto residual del conjunto de columnas cromatográficas secundarias.

Todavía en otra realización el sistema comprende además un inyector de muestra acoplado al conjunto de columnas cromatográficas secundarias para inyectar una fracción mezclada en una de la primera columna secundaria y la segunda columna secundaria.

Todavía en otra realización el sistema comprende además un conjunto de válvulas de inyección de muestra para dirigir la fracción mezclada desde el inyector de muestra a una de la primera columna secundaria y la segunda columna secundaria.

Todavía en otra realización el sistema comprende además un sistema de disolvente para proporcionar un gradiente de disolvente al conjunto de las columnas cromatográficas secundarias.

Todavía en otra realización dicho sistema de disolvente comprende una primera bomba de disolvente para proporcionar un gradiente de disolvente a la primera columna cromatográfica secundaria, y una segunda bomba de disolvente para proporcionar un gradiente de disolvente a la segunda columna cromatográfica secundaria.

Todavía en otra realización dicho sistema de disolvente comprende: una bomba de disolvente conectada a la primera columna cromatográfica secundaria y la segunda columna cromatográfica secundaria; un sistema distribuidor controlado que comprende un primer regulador del caudal para regular un flujo de disolvente a la primera columna cromatográfica secundaria y un segundo regulador de caudal para regular el flujo de disolvente a la segunda columna cromatográfica secundaria.

Todavía en otra realización el sistema comprende además un colector de fracciones para recoger un eluato del conjunto de columnas cromatográficas secundarias.

Todavía en otra realización el sistema comprende además un sistema de control de válvulas para controlar el conjunto de válvulas de inyección de muestra.

Todavía en otra realización en dicho sistema la primera y segunda columnas cromatográficas secundarias son sustancialmente iguales a la columna primaria.

Todavía en otra realización en dicho sistema se aplica un primer gradiente de disolvente a la columna primaria para realizar la separación de la mezcla peptídica de proteínas y se aplica un segundo gradiente de disolvente que es sustancialmente igual al primer gradiente de disolvente a las columnas secundarias para realizar la separación de las fracciones mezcladas.

En otra realización la invención proporciona un procedimiento para aislar un péptido señalizado de una mezcla peptídica de proteínas, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una columna cromatográfica primaria para separar la mezcla peptídica de proteínas; (b) inyectar la mezcla peptídica de proteínas en la columna cromatográfica primaria para separar la mezcla peptídica de proteínas en un conjunto de fracciones en un conjunto de condiciones definidas; (c) alterar al menos una de las fracciones en el conjunto de fracciones para formar un conjunto de fracciones alteradas, en el que una fracción alterada comprende un subconjunto de péptidos señalizados y un subconjunto de péptidos inalterados; (d) mezclar una primera fracción alterada y una segunda fracción alterada para formar una primera fracción mezclada, en el que no hay solapamiento en la elución entre i) los péptidos señalizados de la primera y segunda fracción alterada y ii) los péptidos señalizados y los péptidos inalterados de dichas fracciones; (e) mezclar una tercera fracción alterada y una cuarta fracción alterada para formar una segunda fracción mezclada, en el que no hay solapamiento en la elución entre i) los péptidos señalizados de la tercera y cuarta fracciones alteradas y ii) los péptidos señalizados y los péptidos inalterados de dichas fracciones; (f) proporcionar una primera columna cromatográfica secundaria para separar un subconjunto de péptidos señalizados de un subconjunto de péptidos inalterados; y (g) separar la primera fracción mezclada usando la columna cromatográfica secundaria en el conjunto de condiciones definidas para aislar los subconjuntos de péptidos señalizados en la primera fracción alterada y la segunda fracción alterada.

En otra realización la invención proporciona un procedimiento para aislar un péptido de identificación en una mezcla peptídica de proteínas, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una columna cromatográfica primaria para separar la mezcla peptídica de proteínas; (b) inyectar la mezcla peptídica de proteínas en la columna cromatográfica primaria para separar la mezcla peptídica de proteínas en un conjunto de fracciones en un conjunto de condiciones definidas; (c) alterar al menos una de las fracciones en el conjunto de fracciones para formar un conjunto de fracciones alteradas, en el que una fracción alterada comprende un subconjunto de péptidos alterados y un subconjunto de péptidos de identificación; (d) mezclar una primera fracción alterada y una segunda fracción alterada para formar una primera fracción mezclada, en el que no hay solapamiento en la elución entre i) los péptidos alterados de la primera y segunda fracciones alteradas y ii) los péptidos alterados y los péptidos de identificación de dichas fracciones; (e) mezclar una tercera fracción alterada y una cuarta fracción alterada para formar una segunda fracción mezclada, en el que no hay solapamiento en la elución entre i) los péptidos de identificación de la tercera y cuarta fracciones alteradas y ii) los péptidos alterados y los péptidos de identificación de dichas fracciones; (f) proporcionar una primera columna cromatográfica secundaria para separar un subconjunto de péptidos alterados de un subconjunto de péptidos de identificación; y (g) separar la primera fracción mezclada usando la columna cromatográfica secundaria en el conjunto de condiciones definidas para aislar los subconjuntos de péptidos de identificación en la primera fracción alterada y la segunda fracción alterada.

Todavía en otra realización, los procedimientos previos además comprenden la etapa de separar la segunda fracción mezclada usando la primera columna cromatográfica secundaria en el conjunto definido de condiciones para aislar los subconjuntos de péptidos señalizados o de identificación en la tercera fracción alterada y la cuarta fracción alterada.

Todavía en otra realización, los procedimientos previos comprenden además las etapas de: (h) proporcionar una segunda columna cromatográfica secundaria dispuesta sustancialmente en paralelo con la primera columna cromatográfica secundaria para separar un subconjunto de péptidos alterados de un subconjunto de péptidos inalterados en una fracción; y (i) separar la segunda fracción mezclada usando la segunda columna cromatográfica secundaria en el conjunto definido de condiciones para aislar los subconjuntos de péptidos alterados en la tercera fracción alterada y la segunda fracción alterada.

Todavía en otra realización, los procedimientos previos comprenden además la etapa de dirigir los péptidos señalizados o de identificación a un analizador.

Todavía en otra realización, los procedimientos previos comprenden además la etapa de identificar un péptido de identificación o señalizado y su correspondiente proteína usando el analizador combinado con una búsqueda en una base de datos.

A continuación se presenta una descripción más informativa de varias de las diferentes etapas de la invención.

I. Preparación de una mezcla peptídica de proteínas

Las mezclas peptídicas de proteínas procedentes de una muestra que comprende proteínas (las mezclas peptídicas de proteínas) se obtienen por procedimientos descritos en la técnica tales como escisión o digestión química o enzimática. En un aspecto preferido, las proteínas se hacen digerir con una enzima proteolítica. La tripsina es una enzima particularmente preferida porque escinde en los sitios de lisina y arginina, dando péptidos cargados que típicamente tienen una longitud de aproximadamente 5 a 50 aminoácidos y un peso molecular entre aproximadamente 500 y 5.000 dalton. Dichos péptidos son particularmente adecuados para el análisis por espectrometría de masas. Una lista no limitada de proteasas que se pueden usar en esta invención, incluye Lys-C endoproteasa de Lysobacter enzymogenes, Glu-C endoproteasa de Staphylocolococus aureus (proteasa V8), Asp-N endoproteasa de Pseudomonos fragi y clostripaina. También se pueden usar en esta invención proteasas con menor especificidad tales como subtilisina de Bacillus subtilis, procaina pepsina y proteinasa K de Tritirachium album.

Alternativamente, también se pueden usar reactivos químicos para escindir las proteínas en péptidos. Por ejemplo, se puede usar bromuro de cianógeno para escindir proteínas en péptidos en los restos de metionina. También se puede aplicar la fragmentación química mediante hidrólisis limitada en condiciones ácidas. Alternativamente, se puede usar BNPS-escatol para escindir en el sitio del triptófano. También se puede usar la degradación parcial del NH_{2}-terminal usando el escalonamiento inducido químicamente con isotiocianato o usando tratamiento con aminopeptidasa.

II. Cromatografía

Tal como se usa en el presente documento "etapa cromatográfica" o "cromatografía" se refiere a procedimientos para separar sustancias químicas y están ampliamente disponibles en la técnica. En una estrategia preferida se usan las velocidades relativas a las cuales las sustancias químicas son adsorbidas de una corriente móvil de gas o líquido en una sustancia estacionaria, que normalmente es un sólido finamente dividido, una lámina de material de filtro, o una película fina de un líquido sobre la superficie de un sólido. La cromatografía es un procedimiento versátil que puede separar mezclas de compuestos incluso en ausencia del conocimiento previo detallado del número, naturaleza o cantidades relativas de las sustancias individuales presentes. El procedimiento se usa ampliamente para separar compuestos químicos de origen biológico (por ejemplo, aminoácidos, fragmentos de proteínas, péptidos, proteínas, fosfolípidos, esteroides, etc.) y mezclas complejas de petróleo y mezclas de productos aromáticos volátiles, tales como perfumes y aromas. La técnica de líquidos con columna más ampliamente usada es la cromatografía líquida de alta eficacia, en la que una bomba fuerza a la fase móvil líquida a través de una columna empaquetada de forma ajustada de alta eficacia, a alta presión. Describen visiones generales recientes sobre técnicas cromatográficas Meyer M., 1998, ISBN: 047198373X y Cappiello A. y col. (2001) Mass Spectrom. Rev. 20(2): 88-104, incorporados en el presente documento por referencia. También se pueden usar otros procedimientos recientemente desarrollados descritos en la técnica y nuevos procedimientos cromatográficos que están disponibles en la técnica. Algunos ejemplos de cromatografía son la cromatografía de fase inversa (RP), cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía por exclusión de tamaños, cromatografía de filtración en gel o cromatografía de afinidad tal como cromatografía de inmunoafinidad y afinidad con metal inmovilizado.

La cromatografía es una de las diferentes técnicas de separación. Otro miembro de este grupo es la electroforesis y todas las variantes tales como electroforesis capilar, electroforesis de flujo libre etc. En el último caso, la fuerza conductora es un campo eléctrico, que ejerce diferentes fuerzas sobre los solutos de diferente carga iónica. La fuerza de resistencia es la viscosidad del disolvente que no fluye. La combinación de estas fuerzas produce movilidades de iones particulares para cada soluto. Algunos ejemplos son electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil-sulfato sódico (SDS-PAGE) y electroforesis en gel nativo. Los procedimientos de electroforesis capilar incluyen electroforesis capilar en gel, electroforesis capilar de zonas, electrocromatografía capilar, enfoque isoeléctrico capilar y electroforesis de afinidad. Estas técnicas son descritas por McKay P., An Introduction to Chemistry, Science Seminar, Department of Recovery Sciences, Genentech, Inc. Incorporado en la presente memoria por referencia.

III. Tampones

Los procedimientos de la invención requieren compatibilidad entre las condiciones de separación de la serie primaria, las condiciones de reacción en la etapa de alteración, las condiciones de separación en la serie secundaria y las condiciones para analizar los péptidos señalizados o de identificación que eluyen en los analizadores tales como espectrómetros de masas. Como se ha mencionado antes, la combinación de las condiciones cromatográficas en la serie primaria y secundaria y los desplazamientos cromatográficos inducidos por la reacción de alteración determinan la posibilidad de aislar los péptidos señalizados o de identificación de cada fracción obtenida de una mezcla peptídica de proteínas en la serie primaria. Como se ha mencionado antes también, en una realización preferida las condiciones cromatográficas de la serie primaria y de la serie secundaria son iguales o sustancialmente similares.

En una realización preferida adicional, los tampones y disolventes usados en ambas etapas cromatográficas son compatibles con las condiciones necesarias para permitir un transcurso eficaz de las reacciones químicas y/o enzimáticas en la etapa de alteración entre las dos etapas cromatográficas. En una realización preferida particular la naturaleza de los disolventes y del tampón en la serie primaria, serie secundaria y la etapa de alteración son iguales o sustancialmente similares. En una realización preferida adicional dichos tampones y disolventes son compatibles con las condiciones necesarias para realizar un análisis espectrométrico de masas. El definir dichos tampones y disolventes requiere un ajuste y un ajuste fino (y dichas condiciones no están disponibles en la técnica anterior). Se describen ejemplos para ilustrar este ajuste, por ejemplo, en el ejemplo 9.

Para algunas realizaciones de la invención con tipos particulares de péptidos señalizados o péptidos de identificación es muy difícil, o imposible, diseñar un conjunto de tampones y/o disolventes iguales o sustancialmente similares que se puedan usar a lo largo del procedimiento de la serie primaria, etapa de alteración, serie secundaria y análisis.

Por ejemplo, la reacción química y/o enzimática para alterar los péptidos en la etapa de alteración puede requerir condiciones de reacción específicas que no son compatibles con los tampones usados en la serie primaria y/o secundaria. En estos casos, las condiciones de los tampones/disolventes en las fracciones se cambian antes de la etapa de alteración y/o después de la etapa de alteración, y dicho cambio se lleva a cabo con procedimientos descritos en la técnica, tal como por ejemplo, una extracción, una etapa de liofilización y redisolución, una etapa de precipitación y redisolución, una diálisis contra un tampón/disolvente adecuado o incluso una separación en fase inversa rápida con un gradiente pronunciado.

Otra complicación puede ser la composición del tampón/disolvente presente en la mezcla peptídica de proteínas antes de empezar la serie primaria. La aplicación de una etapa de tratamiento previo como se ha mencionado antes en el presente documento puede requerir condiciones de tampón/disolvente específicas que no sean compatibles con el tampón/disolvente para llevar a cabo la serie primaria. Alternativamente, las condiciones para la preparación/aislamiento de las proteínas de sus fuentes biológicas puede dar como resultado la contaminación de las mezclas de proteínas o mezclas peptídicas de proteínas con compuestos que interfieran negativamente con la serie primaria. En estas situaciones, se cambia la composición del tampón/disolvente de la mezcla de proteínas o la mezcla peptídica de proteínas para hacerla compatible con la serie primaria. Dicho cambio se lleva a cabo con procedimientos descritos en la técnica tales como, por ejemplo, una extracción, una etapa liofilización y redisolución, una etapa de precipitación y redisolución, una diálisis contra un tampón/disolvente adecuado o incluso una separación en fase inversa rápida con un gradiente pronunciado.

Todavía en otra realización de la invención, el tampón/disolvente de la serie secundaria no es compatible con realizar el análisis de los péptidos señalizados o péptidos de identificación que eluyen. En dichos casos, se cambia el tampón/disolvente en las fracciones recogidas de la serie secundaria para hacer que las condiciones sean compatibles con el análisis, por ejemplo, con un espectrómetro de masas. Dicho cambio se lleva a cabo por procedimientos descritos en la técnica tales como, por ejemplo, una extracción, una etapa liofilización y redisolución, una etapa de precipitación y redisolución, una diálisis contra un tampón/disolvente adecuado o incluso una separación en fase inversa rápida con un gradiente pronunciado. Alternativamente, las fracciones con los péptidos señalizados o péptidos de identificación se pueden recoger y volver a combinar para una tercera serie de separaciones, en lo sucesivo denominada una serie terciaria. Dicha serie terciaria se diseña de modo que los péptidos señalizados o péptidos de identificación que eluyen se puedan analizar con un espectrómetro de masas. Un ejemplo de la estrategia y de la estrategia de mezcla se describe, por ejemplo, en el ejemplo 18.

Equivalentes

Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar usando sólo experimentación rutinaria, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descrita en el presente documento. Por ejemplo, en muchos casos la cromatografía se puede sustituir por la electroforesis. Las técnicas electroforéticas incluyen electroforesis en gel (capilar), electrocromatografía (capilar), enfoque isoeléctrico (capilar) y electroforesis de afinidad. Todavía en otro ejemplo equivalente, una alteración también podría ser una alteración física. Por ejemplo, la exposición de los péptidos a una temperatura elevada puede dar como resultado el desplegamiento (parcial) de los péptidos sensibles a la temperatura, y por consiguiente, esos péptidos adquirirán otro comportamiento cromatográfico.

Por ejemplo, la presente invención proporciona un procedimiento para aislar un subconjunto de péptidos de una mezcla peptídica de proteínas, que comprende las etapas de: (a) separar inicialmente la mezcla peptídica de proteínas en fracciones de péptidos mediante cromatografía, (b) exponer cada fracción a una temperatura elevada, y (c) aislar los péptidos físicamente alterados mediante una segunda cromatografía de modo que la cromatografía de la etapa de separación inicial y la segunda se llevan a cabo con el mismo tipo de cromatografía, y de modo que las condiciones cromatográficas en ambas separaciones son preferiblemente las mismas o sustancialmente similares. En un modo inverso, los péptidos que están inalterados después de la exposición a una temperatura elevada se aíslan en la etapa c). En una realización particular, la exposición a una temperatura elevada se puede aplicar incluso durante la serie secundaria en lugar de antes de la serie secundaria.

Otra posibilidad es que la serie 1 y la serie 2 se lleven a cabo en presencia de un campo magnético. Después, este campo magnético influye en la elución o migración de los péptidos sensibles al magnetismo. Por ejemplo, se podrían añadir partículas magnéticas recubiertas con anticuerpos específicos dirigidos contra la fosfotirosina en una mezcla peptídica de proteínas. Los péptidos que contienen fosfotirosina serán específicamente afectados por la influencia de un campo magnético.

Ejemplos Ejemplo 1 Alteración química específica de los restos de metionina

Se generó una mezcla peptídica de proteínas de acuerdo con el procedimiento descrito en la invención y se seleccionó el aminoácido relativamente poco común metionina para la alteración. Como está documentado en la bibliografía, una estrategia para alterar la metionina es por oxidación química, la cual puede conducir a la formación de sulfóxido y a la formación de sulfona. Los péptidos que comprenden metionina se pueden convertir en sus derivados de sulfona usando condiciones oxidantes fuertes tales como ácido perfórmico u otros perácidos (Toennies and Hommiller, 1942, y Hirs, 1956). Se sabe que las condiciones oxidantes más fuertes son bastante duras y no son suficientemente selectivas. La formación del sulfóxido de la metionina transcurre por contacto de la metionina con el aire. Sin embargo, en presencia de H_{2}O_{2} al 0,5% a temperatura ambiente y pH bajo (TFA al 1%) está reacción se completa en menos de 30 minutos. Es interesante que en estas condiciones suaves, se observó que tanto la cisteína como el triptófano, otros dos restos que son muy sensibles a la oxidación, se oxidan poco o no oxidan en absoluto. Se llegó a esta conclusión oxidando una gran variedad de péptidos con Trp, péptidos con Cys y péptidos con Met, seguido de análisis por HPLC y espectrometría de masas de los productos de reacción. Se muestra un ejemplo ilustrativo de la especificidad de la reacción en la Figura 3. Ambas alteraciones de la metionina (el derivado de sulfóxido y el de sulfona) son más hidrófilas (el derivado de sulfona en menor grado que el derivado de sulfóxido) que la metionina no alterada. Se aprovechó preferiblemente en esta invención la oxidación química suave específica de los péptidos que contienen restos de metionina, a metionina-sulfóxido, debido a la especificidad de la alteración para la metionina y debido a las propiedades óptimas para separar los péptidos señalizados de los péptidos no alterados. Los experimentos demuestran que, en las condiciones de la invención, esta alteración de la metionina se puede usar eficazmente para separar en gran parte los péptidos alterados con metionina-sulfóxido de los péptidos no alterados en una mezcla compleja de péptidos o una mezcla peptídica de proteínas. Un elemento importante de la invención es la gran disminución de hidrofobicidad cuando los péptidos se convierten de metionina en sus formas con metionina-sulfóxido. Esto se ilustra mediante un desplazamiento en la elución de los péptidos oxidados hacia concentraciones menores del disolvente orgánico durante la cromatografía de fase inversa (denominado aquí el desplazamiento del frente o hidrófilo). Usando diferentes péptidos que contienen metionina y usando también condiciones de cromatografía de fase inversa, se demuestra que se puede separar eficazmente un gran espectro de péptidos que contienen metionina oxidada de la mezcla de péptidos inalterados. Dependiendo de las condiciones cromatográficas, se demuestra que el desplazamiento hidrófilo en la elución de los péptidos oxidados puede diferir significativamente. Los resultados muestran que usando las condiciones correctas, se pueden obtener desplazamientos de 3 min a más de 7 min con gradientes estándar hacia concentraciones del modificador menores. Esto se ilustra para un péptido cromatografiado en diferentes sistemas (Tabla III). Se observaron sistemáticamente desplazamientos grandes con el sistema de NH_{4}Ac/metanol. Se observaron desplazamientos más pequeños, pero todavía significativos, con la combinación de TFA/acetonitrilo o HCOOH/acetonitrilo. En principio, se pueden usar todos los sistemas indicados en la Tabla III en el procedimiento de separación. En todos los ejemplos que siguen se usaron las mezclas de TFA al 0,1%/acetonitrilo o HCOOH al 0,1%/acetonitrilo. Debe quedar claro que el sistema de separación de péptidos no excluye el uso de otros sistemas de disolventes. La combinación de HCOOH/acetonitrilo es una estrategia que se puede usar cuando se van a analizar los péptidos señalizados por EM por electropulverización. Es interesante que los desplazamientos hidrófilos de los péptidos señalizados (incluso cuando proceden de la misma fracción en la serie cromatográfica primaria) no son iguales e incluso pueden variar considerablemente. Así, parece que la oxidación tiene un efecto variable que puede depender de la secuencia. En particular, los péptidos con metionina que se han recogido en un intervalo de 1 min en la serie primaria, ahora eluirán como sus formas de sulfóxido en un intervalo de tiempo mayor (por ejemplo, en 4 minutos) en las series secundarias. Esto es una ventaja importante, porque los péptidos que contienen metionina seleccionados eluyen durante la serie secundaria en un intervalo de tiempo mayor y esto aumenta significativamente la capacidad de resolución del sistema de separación. Por consiguiente, disminuye la coelución de péptidos señalizados, los péptidos eluyen de forma más gradual, de una forma menos comprimida, permitiendo una mejor presentación para la identificación en el espectrómetro de masas.

Una estrategia alternativa para alterar las cadenas laterales con metionina en los péptidos es la reacción con haluros de alquilo, tales como yoduro de metilo, que da como resultado la formación del ion sulfonio (Rothgeb y col., 1977). Esta reacción transcurre lentamente y se completa después de más de ocho horas. Se genera una mezcla peptídica de proteínas de acuerdo con el procedimiento descrito en la invención. Se lleva a cabo una serie primaria, por ejemplo, con una columna de intercambio iónico y se recogen las fracciones. Dichas fracciones se alteran, por ejemplo, con yoduro de metilo que reacciona específicamente con los péptidos que comprenden restos de metionina. Como resultado, los péptidos que comprenden metionina son alterados (los restos de metionina son alterados formando iones sulfonio) y tienen una carga diferente, y los péptidos señalizados resultantes migran de forma diferente de los péptidos inalterados en las columnas de intercambio iónico. Las condiciones cromatográficas de la serie primera y secundaria se llevan a cabo en condiciones cromatográficas iguales o similares. Más específicamente, esta alteración da como resultado una velocidad de elución más rápida de los péptidos señalizados cuando dichos péptidos se pasan sobre un intercambiador de aniones (por ejemplo, columnas MONO Q o DEAE) o una velocidad de elución menor en un intercambiador de cationes (por ejemplo, Mono S, fosfocelulosa).

Ejemplo 2 Alteración química específica de los restos de cisteína

Se genera una mezcla peptídica de proteínas con uno de los procedimientos descritos antes en el presente documento y se lleva a cabo una alteración química específica de las cisteínas. Dicha alteración se basa, por ejemplo, en la conversión específica de péptidos con cisteína en un derivado más hidrófilo, que sufre un desplazamiento hidrófilo durante la HPLC de fase inversa. Varios reactivos pueden cumplir estos requisitos. Por ejemplo, las reacciones con yodoacetamida, yodoacetato, etilenimina, bromoetilamina, acrilamida y 4-vinil-piridina, convierten todos la cisteína en compuestos que se comportan de forma más hidrófila en las condiciones de fase inversa. Además, todos estos compuestos experimentan oxidación con H_{2}O_{2} que da como resultado la formación de sus correspondientes derivados sulfóxidos, que son incluso más hidrófilos. Es importante mencionar que el desplazamiento debido a la oxidación aquí es menos pronunciado que en el caso de la oxidación de la metionina. Sin embargo, cuando se combinaron los desplazamientos entre el derivado de cisteína con el tiol libre y sus homólogos alterados y oxidados, se obtuvieron desplazamientos totales de los péptidos señalizados que son similares a los medidos para la formación de la metionina-sulfóxido (Fig. 4). El siguiente esquema de reacción (i) muestra un ejemplo de como los restos de cisteína se pueden alterar químicamente de forma específica de modo que la alteración se pueda usar para separar los péptidos con Cys señalizados de los péptidos no alterados de acuerdo con la invención. Así, el protocolo es el siguiente: la mezcla de proteínas se disuelve en urea 8 M en TFA al 1% y se trata primero con H_{2}O_{2} (concentración final 1%) durante 30 min a 25ºC, dando como resultado la formación del sulfóxido de todos los restos metionina presentes en la mezcla de proteínas. Después las proteínas se hacen precipitar durante la noche a -20ºC después de añadir 4 volúmenes de etanol. Las proteínas precipitadas se recuperan por centrifugación, se lavan una vez con 1 ml de etanol-agua (3:1, en volumen). El sedimento de proteínas lavado se vuelve a disolver en urea 8 M, Tris-HCl 0,1 M pH 8,6, y se añade un exceso molar de 2 veces de tributil-fosfina, convirtiendo todos los puentes de S-S en grupos tiol. Los péptidos se generan por escisión específica (de modo más conveniente se usa tripsina) y la mezcla peptídica de proteínas se separa por RP-HPLC (serie primaria) y se recoge en un número de fracciones que permita durante la serie 2 la separación de los péptidos señalizados de los péptidos no alterados en cada una de las fracciones recogidas. En cada fracción, el resto de cisteína se convierte en sus derivados de S-propionamida por reacción con acrilamida en tampón a pH 8,6 (Sechi and Chait, 1998).

A esta reacción le sigue inmediatamente la oxidación con H_{2}O_{2} en TFA al 1%, convirtiendo los derivados de S-propionamida en la forma de sulfóxido más hidrófila. Esto se describe a continuación (i)

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Ambas reacciones se completan en tiempos cortos y no se puede detectar ningún producto intermedio (Fig. 4). Además, estas reacciones se pueden llevar a cabo secuencialmente sin separar los reactivos en las etapas intermedias. Así, la mezcla entera obtenida después de la última etapa de oxidación se puede cargar en la columna de RP-HPLC y usando condiciones cromatográficas iguales o muy similares a las de la serie primaria, se pueden separar los péptidos señalizados de los péptidos no alterados. Posteriormente los péptidos señalizados se pasan a un analizador tal como un espectrómetro de masas para determinar la identidad del péptido señalizado y su correspondiente proteína. Este procedimiento se repite para cada fracción recogida durante la serie 1. Los separadores de péptidos que consisten en múltiples columnas, en paralelo y/o en serie, se pueden usar para optimizar el tiempo necesario para las separaciones cromatográficas y el análisis.

En una versión alternativa de la secuencia de reacciones, se puede omitir la etapa de oxidación previa de la proteína y precipitación, empezando con la escisión de las proteínas para generar una mezcla peptídica de proteínas. Después, la primera etapa de oxidación se lleva a cabo en la mezcla peptídica de proteínas a pH ácido, seguido de la reducción a pH 8,6 con exceso de NaBH_{4}, y las otras etapas de alteración (reacción con acrilamida y oxidación) como se ha descrito antes. Todas estas reacciones también se pueden llevar a cabo de una forma continua sin etapas de purificación intermedias.

Todavía otro procedimiento alternativo para seleccionar péptidos que contienen cisteína, que implica un procedimiento en una etapa, se basa en la reacción con 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoato) o DTNB que convierte los péptidos que contienen SH en su forma de disulfuro mixto. Esta reacción se ha usado para medir cuantitativamente el contenido de SH libre de proteínas y péptidos (Ellman, G.L. (1959)). La reacción de un péptido que contiene cisteína con DTNB se muestra en (ii).

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La forma de disulfuro mixto del péptido es más hidrófoba que su homólogo con SH y eluye más tarde en el procedimiento de separación de péptidos. Este procedimiento también permite discriminar entre los péptidos con SH libre y con disulfuro. De hecho, cuando se emite la etapa de reducción, se aíslan sólo los péptidos que llevan un SH libre con la presente invención, mientras que no se aíslan los péptidos con S-S. Sin embargo, si la mezcla de proteínas o péptidos se reduce antes de la serie primaria del procedimiento de separación, entonces se separa la suma de los péptidos con SH y S-S.

Ejemplo 3 Alteración química específica de la suma de los restos de metionina y cisteína

El procedimiento es idéntico al procedimiento para alterar específicamente los restos de cisteína (véase el Ejemplo 2), con la excepción de que se omite la etapa previa de oxidación de los restos de metionina. La secuencia de reacciones empieza con la reducción de una mezcla de proteínas con tributil-fosfina, seguido de escisión enzimática o química. La mezcla peptídica de proteínas se separa por RP-HPLC y se altera cada fracción por reacción con acrilamida, seguido inmediatamente por la oxidación con H_{2}O_{2}. Ahora los péptidos que contienen metionina se oxidan junto con los péptidos con cisteína alterada y ambos tipos de péptidos señalizados muestran un desplazamiento hidrófilo cuando se separan cromatográficamente usando condiciones similares a la serie primaria. La Fig. 5 resume las diferentes secuencias de reacciones en los modos de separación de Met, separación de Cys y separación de Met-Cys.

Ejemplo 4 Alteración específica de péptidos con fosfoserina y fosfotreonina

Se genera una mezcla peptídica de proteínas como se ha descrito antes en el presente documento, y se aíslan específicamente un tipo de péptidos modificados co o postraduccionalmente. Aquí se proporciona un ejemplo de una estrategia para aislar los péptidos que contienen fosfoserina y fosfotreonina. Los péptidos que contienen fosfoserina y fosfotreonina se alteran a sus derivados de deshidroalanina y ácido deshidroamino-2-butírico respectivamente por \beta-eliminación alcalina del resto fosfato. La adición de Michael del etanotiol convierte el primero en el derivado de S-etilcisteína y el último en el derivado de \beta-metil-S-etilcisteína (Weckwerth y col., 2000). Estos derivados de aminoácidos que contienen tioéter se alteran a sus respectivas formas de sulfóxido, siguiendo la reacción con H_{2}O_{2} que es similar a la oxidación de los restos de metionina. Con el fin de evitar la mezcla con los péptidos con metionina y evitar también la \beta-eliminación de las cisteínas durante el tratamiento alcalino, la mezcla de proteínas primero se oxida con ácido perfórmico, de acuerdo con Hirs (1956). Esta etapa convierte la metionina en la forma de sulfona y los restos de cisteína en ácido cisteico. Después de diálisis contra agua destilada, la mezcla de proteínas se digiere con tripsina en bicarbonato amónico 50 mM a 37ºC, durante la noche, con una relación de tripsina/proteína total de 1:100. La digestión tríptica (10 \mul) se añade a 50 \mul de una mezcla de H_{2}O/DMSO/EtOH/NaOH 5 M 2:2:1:0,65 y se añaden 60 \mul de etanotiol. La mezcla de reacción se calienta durante 3 h a 50ºC y después de enfriar se inactiva por adición de 60 \mul de ácido acético al 20% y 10 \mul de acetonitrilo. La mezcla peptídica de proteínas se separa por cromatografía en fase inversa (serie 1) en un número de fracciones que permite en la serie 2 separar los péptidos señalizados de los péptidos no alterados en cada una de las fracciones recogidas. En cada fracción los péptidos se oxidan con H_{2}O_{2}. Puesto que la metionina y la cisteína se han oxidado en la etapa anterior de oxidación, ahora sólo se oxidan la S-etilcisteína y \beta-metil-S-etilcisteína a sus derivados sulfóxidos (véase las ecuaciones de las reacciones iii y iv). Estos derivados sulfóxidos son significativamente más hidrófilos. Cada fracción se carga en una columna de RP-HPLC y usando condiciones cromatográficas iguales o similares a las de la serie 1, se separan los péptidos señalizados (S-etilcisteína-sulfóxido y \beta-metil-S-etilcisteína-sulfóxido, que representan respectivamente los péptidos que contienen fosfoserina y fosfotreonina) de los péptidos no alterados. Los péptidos señalizados posteriormente se pasan a un analizador tal como un espectrómetro de masas para identificar los correspondientes péptidos señalizados y su proteína fosforilada. Además, una pérdida neutra de RSOH (aquí R = etilo) (78 uma) durante el análisis espectrométrico de masas permite una verificación adicional de la autenticidad de ambos tipos de péptidos señalizados (Steen and Mann, 2000). Esto último significa que existe un control interno de la autenticidad del S-etilcisteína-sulfóxido y \beta-metil-S-etilcisteína-sulfóxido, que representan respectivamente los péptidos que contienen fosfoserina y fosfotreonina, debido a las pérdidas neutras observadas después de medir dichos péptidos señalizados por espectrometría de masas.

Es interesante señalar que la reacción de \beta-eliminación alcalina también se puede llevar a cabo en condiciones alcalinas más suaves, usando LiOH 0,5 M a 4ºC, sustituyendo así a la mezcla de H_{2}O/DMSO/EtOH/NaOH 5 M dada antes (Sakaguchi y col., 2001).

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Un sistema alternativo de separación de fosfopéptidos usa la diferencia hidrófoba entre los péptidos fosforilados y desfosforilados por cromatografía en fase inversa a pH 5,0. El procedimiento indicado a continuación es un ejemplo de dicha estrategia. Se genera una mezcla peptídica de proteínas como se ha descrito antes en el presente documento. Los péptidos presentes en dicha mezcla ahora se separan por RP-HPLC, usando NH_{4}Ac 10 mM, pH 5,0 / acetonitrilo (o NH_{4}Ac/metanol u otro) como disolvente de elución y se recogen en fracciones de 1 min. Los péptidos presentes en estas fracciones se tratan con una fosfatasa general (tal como una fosfatasa alcalina). Los péptidos desfosforilados son menos hidrófobos que sus precursores fosforilados y por lo tanto sufren un desplazamiento hidrófobo durante una separación cromatográfica secundaria en condiciones cromatográficas iguales o sustancialmente similares a la serie 1, y esto permite su separación. Es importante mencionar que el desplazamiento hidrófobo es más importante a pH 5,0 que a valores de pH menores, haciendo menos atractivo el uso de los sistemas con TFA al 0,1% o HCOOH al 0,1% en el procedimiento de separación.

Una opción interesante es el uso de sistemas de separación particularmente adaptados para la separación de compuestos que contienen fosforilo. Dicho sistema podría consistir, por ejemplo, en el material nucleótido-nucleósido Adsorbosphere (Alltech) combinado con NH_{4}H_{2}PO_{4} 60 mM y fosfato de tetrabutilamonio 5 mM, pH 5,0 como disolvente A y metanol (fosfato de tetrabutilamonio 5 mM) como disolvente B.

Otra forma de separar los fosfopéptidos usando un procedimiento de desfosforilación se basa en la pérdida del grupo fosforilo cargado negativamente. En este caso, las series 1 y 2 se llevan a cabo en columnas de intercambio iónico o por medios electroforéticos. Por ejemplo, cuando las series 1 y 2 se llevan a cabo en una columna Mono Q o una columna DEAE a pH 6,0, entonces todas las especies peptídicas desfosforiladas presentarán un desplazamiento hacia delante porque están unidos menos fuertemente al intercambiador de aniones. Se puede obtener un efecto similar usando la electroforesis capilar en la que las especies peptídicas desfosforiladas presentarán un desplazamiento anódico, que otra vez conduce al procedimiento de separación.

Es importante recalcar que cualquier procedimiento de separación, basado en una etapa de desfosforilación que se pueda llevar a cabo por medios enzimáticos (p. ej., fosfatasas generales o alcalinas) o químicos (p. ej., \beta-eliminación en condiciones alcalinas) proporciona la posibilidad de seleccionar una variedad de especies fosforiladas.

Todavía otro procedimiento para separar fosfopéptidos se basa en la formación de un complejo no covalente entre los fosfopéptidos y los quelatos de Fe^{3+}. Se genera una mezcla peptídica de proteínas como se ha descrito antes en el presente documento. Los péptidos presentes en dicha mezcla se separan en la serie 1 por RP-HPLC, usando NH_{4}Ac 10 mM, pH 5,0/acetonitrilo (o NH_{4}Ac/metanol u otro) como disolvente de elución, y se recogen en intervalos de tiempo de 1 minuto. Los péptidos presentes en cada una de dichas fracciones se separan en la serie 2 en la misma columna cromatográfica pero ahora con disolventes que contienen iminodiacetato y Fe^{3+} que forman un complejo de diquelato con los fosfopéptidos. Este complejo eluye en una posición diferente comparado con la de los fosfopéptidos libres, y permite aislar los fosfopéptidos. Otra vez la cromatografía diferencial forma la base de un procedimiento de separación eficaz.

Ejemplo 5 Selección para péptidos \varepsilon-N-acetilados

La acetilación de una serie determinada de grupos \varepsilon-amino de las lisinas de las histonas nucleosómicas H2A, H2B, H3 y H4 y posiblemente otros factores, modifica la estructura de la cromatina y conduce a un aumento de la actividad transcripcional. Es probable que las alteraciones en el grado de acetilación estén asociadas con la proliferación celular y podrían ser indicio de apoptosis, necrosis o varias otras situaciones patológicas. Además, el estado de acetilación puede distinguir ya en una etapa muy temprana entre las células normales y las neoplásicas (p. ej., en el cáncer de próstata). Otra vez, la presente invención se puede usar para separar selectivamente los péptidos acetilados usando, por ejemplo, la desacetilación como el principio de desplazamiento para la separación de péptidos. A continuación se proporciona un ejemplo de dicha estrategia como ilustración. Se genera una mezcla peptídica de proteínas de un extracto nuclear por escisión con tripsina de las proteínas aisladas. La tripsina escinde en la Arg y Lys, pero no en la cadena lateral de lisina acetilada. La mezcla peptídica obtenida se separa en la serie 1 por RP-HPLC usando TFA al 0,1% como disolvente A y TFA al 0,09% en acetonitrilo al 70% como disolvente B, con un gradiente creciente de 1% de disolvente B/min y un caudal de 80 \mul/min (columna de 2,1 mm de diámetro interno y 250 mm de longitud). Se recogen los péptidos que eluyen en intervalos de 1 min. Se seca cada fracción, se vuelve a disolver en el tampón adecuado y se trata con histona desacetilada (HDA). Por ejemplo, preparaciones total o parcialmente purificadas de la levadura Rpd3 (clase I), la levadura HDA1 (clase II) o las proteínas de clase Sir2 dependientes de NAD^{+} (para una revisión véase Furumai y col. 2001). Debido a la desacetilación, los péptidos se vuelven más hidrófilos y eluyen a concentraciones de acetonitrilo más bajas. Debido a esta diferencia de hidrofilicidad, y aplicando la presente invención, se pueden separar los péptidos desacetilados (péptidos señalizados) de los péptidos inalterados durante la serie secundaria. El desplazamiento en la elución es comparable con los desplazamientos medidos para la alteración de los péptidos con metionina a metionina-sulfóxido. La naturaleza de cada uno de los péptidos señalizados y sus correspondientes proteínas se determina, por ejemplo, usando MS/MS o una determinación muy exacta de la masa de cada péptido señalizado. Esto permite la identificación de las proteínas en la mezcla de proteínas original.

Para determinar cuantitativamente la diferencia de péptidos \varepsilon-N-acetilados entre dos muestras (p. ej., diferentes tipos de células), las mezclas peptídicas de proteínas se generan por digestión con tripsina en H_{2}^{16}O (muestra 1) o H_{2}^{18}O (muestra 2). Ambas mezclas peptídicas de proteínas se mezclan antes de la serie primaria y después se procesan juntas como se ha descrito antes. Un péptido señalizado de cualquier proteína X aleatoria en la muestra 1 coeluye en la serie secundaria con el mismo péptido señalizado de la misma proteína X en la muestra 2. Debido a que los péptidos señalizados en la muestra 1 y en la muestra 2 llevan respectivamente ^{16}O y ^{18}O, aparecen como picos gemelos en un análisis espectrométrico de masas. Se calcula la intensidad o área del pico y la proporción de péptido señalizado que contiene dos veces ^{16}O frente al péptido señalizado que contiene dos veces ^{18}O es proporcional al grado de acetilación de este péptido en ambas muestras comparadas.

Ejemplo 6a Selección de los péptidos NH_{2}-terminales obtenidos de proteínas con el NH_{2}-terminal bloqueado in vivo

Otra aplicación de la presente invención es el aislamiento de un subconjunto de péptidos que se obtienen de proteínas con el NH_{2}-terminal bloqueado. La mayoría de estas pueden ser péptidos acetilados (eucariotas) o péptidos formilados (procariotas). Para poder seleccionar sólo los péptidos con el NH_{2}-terminal bloqueado y evitar la pérdida de los péptidos con el amino-terminal bloqueado que comprenden un resto de lisina, la muestra que comprende proteínas se trata previamente. En una estrategia, la muestra primero se guanidina con O-metilisourea a pH 10, convirtiendo las cadenas laterales de las lisinas en sus derivados de guanidinio. Los grupos \alpha-amino reaccionan mucho más lentamente con este reactivo que los grupos \varepsilon-amino (Plapp y col., 1971) y por lo tanto no se convierten, o lo hacen en un grado mínimo, en sus derivados de guanidinio.

De acuerdo con la invención, posteriormente las proteínas se someten a una digestión con tripsina. La tripsina escinde tanto la arginina como la homoarginina aunque a una velocidad menor (este último deriva de las lisinas guanidinadas) y por lo tanto la digestión genera un grupo \alpha-amino libre en cada péptido generado, excepto en los que contienen el extremo amino de la proteína bloqueado. Ahora la mezcla peptídica de proteínas se pasa por una columna de fase inversa y se separa en un número tal de fracciones que permite, en cada una de las fracciones recogidas, la separación de los péptidos alterados de los péptidos no alterados durante la serie secundaria. En cada fracción, por ejemplo, se añade isocianato de fenilo (PIC) que reacciona con los grupos NH_{2} libres de los péptidos. Como resultado, todos los péptidos con un grupo NH_{2} libre adquieren un grupo fenilcarbamoilo (PC), que hace al péptido más hidrófobo (Fig. 6). Los péptidos obtenidos de las proteínas con el NH_{2}-terminal bloqueado no son alterados. La mezcla peptídica se carga en una columna de RP-HPLC y usando condiciones cromatográficas similares o iguales a las de la serie 1, se separan los péptidos alterados de los péptidos de identificación no alterados (es decir, los péptidos con el amino-terminal bloqueado). Así en este ejemplo, se altera la mayoría de los péptidos y se retardan (desplazamiento hidrófobo), mientras que el subconjunto de péptidos no alterados eluye en una posición sin cambio durante las series secundarias. Esto se llama el "procedimiento de separación inverso".

El grado de los desplazamientos hidrófobos se puede alterar cambiando la naturaleza química de los derivados que reaccionan con el NH_{2}-terminal. Procedimientos conocidos en la técnica describen una variedad de reacciones de alteración con isocianato (IC) que se pueden usar como una alternativa al PIC en el procedimiento de separación descrito en este capítulo. Por ejemplo, también se pueden usar las reacciones con IC de trifluoroacetilo, IC de alilo, IC de naftaleno, IC de fluoresceína etc. El desplazamiento hidrófobo de los péptidos con los grupos \alpha-NH_{2} libres también se puede obtener por cualquier otra reacción de alteración cuantitativa que sea específica para los grupos \alpha-NH_{2}. La lista de reactivos contiene, por ejemplo, acetil-N-hidroxisuccinimida y todos los reactivos de acilación, Fmoc-N-hidroxisuccinimida, ácido trinitrobenceno-sulfónico (TNBS) o nicotinoil(oxi)succinimida. En la elección final de reactivos y condiciones debe estar claro que la reacción de alteración se limite sólo a los grupos \alpha-NH_{2} y debe alterar al menos el 90%, preferiblemente 95%, más preferiblemente 99% y más preferiblemente incluso un porcentaje mayor de los péptidos con un grupo NH_{2} libre.

Ejemplo 6b Selección de los péptidos NH_{2}-terminales derivados de proteínas con un extremo NH_{2} libre

Este ejemplo muestra como se pueden separar los péptidos NH_{2}-terminales derivados de proteínas con un extremo NH_{2} libre presentes en una mezcla peptídica de proteínas. Una ventaja particular de este procedimiento recae en el hecho de que los péptidos señalizados se pueden obtener con un grupo ácido sulfónico unido en su extremo NH_{2} que es muy adecuado para el análisis MALDI-PSD de alta capacidad (Keough T. y col., 1999). La muestra que comprende proteínas primero se trata con tributilfosfina, seguido de yodoacetamida en tampones desnaturalizantes de proteínas. Esta etapa conduce a la derivatización de las cadenas laterales de las cisteínas y le sigue inmediatamente la reacción de guanidación, que convierte las lisinas en homoargininas. Después, los grupos \alpha-NH_{2} se bloquean con un derivado de isotiocianato tal como isotiocianato de fenilo (PITC) o el reactivo de Braunitzer bien conocido (1,5-disulfonilnaftaleno-3-isotiocianato). Así, las proteínas presentes en la mezcla ahora han formado derivados en sus grupos SH (como derivados de acetamida), sus grupos \varepsilon-NH_{2} (como homoarginina), y sus grupos \alpha-NH_{2} (como sus derivados de tiocarbamoilo). La escisión consecutiva con tripsina ahora genera un nuevo conjunto de grupos alfa-NH_{2} libres en cada nuevo sitio de escisión. Estos se pueden bloquear eficazmente por reacción con ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS). La mezcla peptídica de proteínas previamente tratada final ahora consiste en cuatro tipos de péptidos con el NH_{2}-terminal bloqueado. Primero, los péptidos derivados de proteínas bloqueadas in vivo: péptidos con el \alpha-NH_{2} acetilado (eucariotas) o formilado (procariotas), segundo, péptidos bloqueados con TNBS, tercero, péptidos bloqueados con ácido piroglutámico y que se pueden originar espontáneamente después de la escisión con tripsina frente a un resto de glutamina, y cuarto, péptidos bloqueados por un derivado de tiocarbamoilo (TC). Este último representa el subconjunto de péptidos que corresponde a los péptidos amino-terminales de las proteínas. De los cuatro tipos de péptidos con el NH_{2}-terminal bloqueado, sólo los péptidos con TC se sabe que son sensibles al tratamiento ácido y que perderán el resto NH_{2}-terminal de acuerdo con la química de Edman conocida. Por lo tanto, el tratamiento de la mezcla peptídica con TFA concentrado elimina el primer aminoácido de los péptidos con TC generando un nuevo extremo NH_{2} libre. En este momento, la mezcla peptídica se separa en la serie 1 y se recoge en un número de fracciones que permite, en cada una de las fracciones recogida, la separación de los péptidos alterados de los péptidos no alterados durante la serie secundaria. En cada fracción, se añade un reactivo específico para el NH_{2}, que altera selectivamente el subconjunto de péptidos con el grupo NH_{2} libre. Dicho reactivo puede ser TNBS o un compuesto de acetilación que conduzca a péptidos más hidrófobos. Sin embargo, en una realización particular este reactivo también puede consistir en la química desarrollada por Keough y col., 1999, o compuestos análogos que alteren los péptidos con un resto ácido sulfónico en el grupo \alpha-NH_{2}. Estos péptidos señalizados otra vez se pueden separar selectivamente usando cromatografía RP, o procedimientos de cromatografía de intercambio iónico ejecutados de acuerdo con la invención. Un aspecto importante de los péptidos que llevan un grupo ácido sulfónico en el NH_{2}-terminal es su particular fragmentación en las condiciones que se usan actualmente en el modo de MALDI-TOF-MS, que permite una deducción muy rápida y fácil de la secuencia de aminoácidos, abriendo así el camino para el análisis eficaz basado en MADLI de alta capacidad y la identificación de los péptidos separados.

A continuación se resume un ejemplo de las etapas químicas y enzimáticas consecutivas que conducen a la separación de los péptidos fácilmente secuenciables derivados de proteínas con un extremo NH_{2} libre:

Etapa 1: reducción seguida de reacción con yodoacetamida

Etapa 2: conversión de las cadenas laterales de lisina en homoarginina

Etapa 3: Conversión de los grupos \alpha-NH_{2} libres en derivados de tiocarbamoilo

Etapa 4: precipitación de las proteínas modificadas o purificación por filtración en gel

Etapa 5: escisión con tripsina

Etapa 6: modificación de péptidos con trinitrobencenosulfonato

Etapa 7: tratamiento con TFA concentrado

Etapa 8: dilución con agua y separación de la mezcla peptídica de proteínas en la serie primaria

Etapa 9: alteración de los péptidos de cada fracción con un reactivo de bloqueo del NH_{2}-terminal, preferiblemente por sulfoacetilación

Etapa 10: separación de los péptidos señalizados en la serie secundaria

Etapa 11: análisis de los péptidos señalizados por MALDI-PSD o ESC-CID o MALDI-CID

Etapa 12: identificación de péptidos basado en la secuencia producida por una serie de iones y

Este procedimiento se puede adaptar particularmente al estudio de la escisión interna de proteínas (ejemplo 8) ya que esto conduce invariablemente a nuevos extremos NH_{2}, que en general no llevan ningún grupo de bloqueo conocido. También merece la pena subrayar que este procedimiento de separación es otra vez una estrategia directa, que lleva a cabo una selección positiva para péptidos sulfoacetilados, evitando o minimizando la contaminación por péptidos no alterados, incluso cuando la reacción de sulfoacetilación (aquí la reacción de alteración) no transcurre hasta completarse.

Ejemplo 7 Selección de los péptidos NH_{2}-terminales derivados de proteínas presentes en una mezcla compleja de proteínas

La tecnología en la que una proteína de una mezcla compleja tal como un lisato es representada por un péptido de identificación (el péptido NH_{2}-terminal) se denomina a continuación proteómicas basadas en la masa de péptidos individuales (IPMBP, por sus siglas en inglés Individual Peptide Mass-Based Proteomics, véase el Ejemplo 10). Este procedimiento empieza con la conversión de las cisteínas de las proteínas con yodoacetamida o reactivos específicos para el SH similares conocidos en la técnica. Después, las proteínas se dejan reaccionar con O-metilisourea, convirtiendo las \varepsilon-lisinas en sus derivados de guanidinio (homoarginina). Es importante señalar que los grupos \alpha-NH_{2} cambian, mientras que los grupos \alpha-NH_{2} de las proteínas no cambian en las condiciones de reacción usadas. En una etapa posterior las proteínas son acetiladas, por ejemplo, con acetil-N-hidroxisuccinimida. En una etapa posterior, se genera una mezcla peptídica de proteínas por ejemplo, por escisión con tripsina, y dicha mezcla peptídica de proteínas se separa en una primera etapa cromatográfica. Se añade a cada fracción ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) que reacciona cuantitativamente con los grupos NH_{2} libres en los péptidos. Es importante observar que los péptidos derivados de los extremos amino de una proteína no pueden reaccionar con este reactivo porque el grupo NH_{2} de estos péptidos se ha bloqueado previamente con un grupo acetilo. Los péptidos con un grupo NH_{2} libre adquieren un grupo trinitrobenceno (TNB) haciendo estos péptidos más hidrófobos. Así, cuando se separan los péptidos de cada fracción en una serie en columna de RP-HPLC en condiciones cromatográficas similares a las de la serie 1, se separan los péptidos alterados que contienen TNB de los péptidos de identificación no alterados (es decir, todos los péptidos con el amino-terminal bloqueado). En este sistema los péptidos de identificación no alterados aislados derivan de los extremos amino de las proteínas y contendrán un grupo acetilo en el NH_{2}-terminal (p. ej., cuando se usan extractos de células eucariotas).

En otro procedimiento, la mezcla de proteínas se trata previamente convirtiendo las cisteínas de las proteínas en sus derivados de carboxamido. En la siguiente etapa las proteínas se acetilan con acetil-N-hidroxisuccinimida, tanto en sus grupos \varepsilon-NH_{2} como \alpha-NH_{2}. Después se genera una mezcla peptídica de proteínas por escisión con tripsina. Puesto que todas las cadenas laterales de lisinas se han acetilado antes, la escisión con tripsina se produce predominantemente en el extremo COOH de la arginina. Todas las etapas adicionales, incluyendo el procedimiento de separación de péptidos, se llevan a cabo como antes. Esto conduce a aislar los péptidos amino-terminales de todas las proteínas presentes en la mezcla. Se separan como péptidos de identificación no alterados.

En una estrategia alternativa, las proteínas son acetiladas con una mezcla equimolar de acetil y trideuteroacetil-N-hidroxisuccinimida, que conduce a una marcaje isotópico diferencial de los extremos \alpha-NH_{2} libres de las proteínas. En una etapa posterior, la mezcla de proteínas se hace digerir con tripsina y la mezcla peptídica de proteínas se pasa por una columna de fase inversa y se separa en un número de fracciones que permite, en cada una de las fracciones recogidas, la separación de los péptidos alterados de los péptidos no alterados durante la serie 2. Se añade ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) a cada fracción que reacciona cuantitativamente con los grupos NH_{2} libres en los péptidos. Así, otra vez, cuando se separan los péptidos de cada fracción en una serie en columna de RP-HPLC en condiciones cromatográficas similares a la serie 1, se separan los péptidos alterados que contienen TNB de los péptidos de identificación no alterados. En este sistema, los péptidos derivados de proteínas que ya estaban bloqueadas in vivo, llevan el grupo CH_{3}CO, mientras que los péptidos derivados de proteínas con un grupo \alpha-NH_{2} libre (que se alteraron en el curso del procedimiento) ahora están marcados con el doble marcaje del resto CH_{3}-CO/CD_{3}-CO. Los péptidos de identificación no alterados de cada fracción se pasan a un espectrómetro de masas para determinar la masa y la secuencia de cada péptido individual. Es importante, el que este análisis permite simultáneamente distinguir entre los péptidos derivados de proteínas que ya estaban bloqueadas in vivo y péptidos derivados de proteínas con un grupo NH_{2} libre, porque este último grupo de péptidos aparecerá como dobletes (separados por 3 uma).

Alternativamente, en el procedimiento se sustituye el TNBS por isocianato de fenilo (PIC) o compuestos similares que pueden bloquear los grupos NH_{2} libres. En el caso de péptidos formilados en el NH_{2}-terminal, se sigue el mismo procedimiento de separación. Por lo tanto, los péptidos formilados se separan junto con los péptidos que se marcaron con el doble marcador de CH_{3}-CO/CD_{3}CO (véase antes). Es importante indicar que el procedimiento de separación también separa péptidos que llevan ácido piroglutámico en su extremo NH_{2}. Dichos péptidos se pueden formar en el transcurso de la escisión enzimática cuando se genera glutamina en el NH_{2}-terminal. En la espectrometría de masas en la que se usa fragmentación de péptidos se puede distinguir entre un acetil y piroglutamato NH_{2}-terminales permitiendo distinguir entre el péptido NH_{2} terminal y cualquier péptido generado internamente.

Ejemplo 8 Identificación de proteínas proteolíticamente procesadas internamente en lisatos de células totales y localización de los sitios de procesamiento usando la invención

Con frecuencia las proteínas son escindidas internamente debido a la acción de proteasas específicas. Este fenómeno se observa, por ejemplo, en el inicio de la apoptosis debida a la activación de caspasas. El procesamiento de proteínas interno también puede ser una etapa importante durante el desarrollo celular normal, y dichos procesos pueden tener un papel fisiológico importante. Además, la escisión de proteínas en la molécula precursora es un proceso que conduce a la maduración de una proteína. La detección de estos procesos forma un elemento fundamental en la proteómica moderna. Esta invención permite identificar tanto la naturaleza de la proteína procesada como la localización del sitio del procesamiento. A continuación se describe un protocolo experimental típico pero no limitante. Primero, las proteínas obtenidas de un lisato celular total se reducen con tri-butilfosfina y los grupos SH se bloquean con yodoacetato. Esta reacción se lleva a cabo con concentraciones desnaturalizantes de guanidinio-HCl (6 M) a pH 8,6. Se aconseja no usar tampones que contengan urea para los procedimientos de separación inversos (por lo tanto procedimientos en los que los péptidos inalterados se seleccionan como péptidos de identificación). De hecho, el contacto prolongado con urea puede conducir a la carbamilación del péptido y dichos péptidos también serían separados como productos indeseados. En esta etapa, se eliminan el exceso de reactivo y de tampón por precipitación en cuatro volúmenes de etanol a -20ºC toda la noche. El precipitado de proteína se recoge por centrifugación y se vuelve a disolver en un pequeño volumen de guanidinio 6 M en tampón de fosfato, pH 8,5. Alternativamente, se pueden separar los reactivos y tampones por una etapa de filtración en gel en guanidinio-HCl 6 M en tampón de fosfato a pH 8,5. Se añade el éster de acetilo o nicotinoilo de la N-hidroxisuccinimida con el fin de convertir los grupos NH_{2} libres en sus correspondientes derivados de acetilo o nicotinoilo. Alternativamente, como en el ejemplo 7, se usa una mezcla 1/1 del derivado de acetilo y trideuterocetilo. En este segundo ejemplo, se usa una mezcla 1/1 de la forma H4 y D4 del derivado de nicotinoilo (Munchbach, M. y col., 2000). La reacción de acetilación se termina por adición de un exceso molar de Tris-HCl pH 8,5, sobre el reactivo de acetilación, se diluye con guanidinio-HCl 1 M o se dializa contra NH_{4}HCO_{3} al 0,5% y después se hace digerir con tripsina. Los péptidos resultantes se someten a la separación cromatográfica primaria. Después, cada fracción se trata con un reactivo que reacciona cuantitativamente con los grupos \alpha-NH_{2} de los péptidos libres recién generados (p. ej., sulfonato de trinitrobenceno, éster de acetilo de la N-succinimida, isocianato de fenilo, etc.). Una nueva cromatografía de estas fracciones tratadas en una serie secundaria, ahora mueve todos los péptidos que reaccionaron en la última etapa de reacción, a posiciones más hidrófobas, mientras que todos los péptidos que ya estaban bloqueados in vivo, o en los que se bloqueó el NH_{2}-terminal mediante tratamiento previo antes de la serie primaria, o los péptidos con ácido pirrolidona-carboxílico en el NH_{2} terminal, se recuperan como péptidos de identificación no alterados en la misma posición que eluían durante la serie primaria. Comparando los patrones de péptidos del lisato de proteínas de dos muestras diferentes, se pueden identificar péptidos derivados de los extremos NH_{2} recién generados que proporcionan información tanto de la naturaleza de la proteína procesada como del sitio exacto de escisión. El experimento resumido antes, se puede variar de varias formas, manteniendo todavía el principio general de la separación de los péptidos de identificación. Por ejemplo, después de convertir las proteínas con compuestos que reaccionan con SH y compuestos que reaccionan con NH_{2}, las proteínas se hacen digerir con tripsina en H_{2}^{16}O (muestra 1) y H_{2}^{18}O (muestra 2). Con este experimento, se puede estudiar una cuantificación diferencial del grado de procesamiento de las proteínas entre dos muestras. Así, después de la escisión con tripsina, la muestra 1 y la muestra 2 se combinan en proporciones iguales y dicha mezcla se separa en una primera serie cromatográfica. Después, cada fracción se trata con un reactivo que reacciona con los grupos alfa-NH_{2} libres (por ejemplo, sulfonato de trinitrobenceno, éster de acetil-N-succinimida, isocianato de fenilo etc.). Otra cromatografía de estas fracciones tratadas en una serie secundaria, ahora mueve todos los péptidos que reaccionaron en la última etapa de reacción, hacia posiciones más hidrófobas, mientras que todos los péptidos que ya estaban bloqueados in vivo, o en los que se bloqueó el NH_{2} terminal mediante tratamiento previo antes de la serie primaria, o los péptidos con ácido pirrolidona-carboxílico en el NH_{2}-terminal, se recuperan como péptidos de identificación no alterados en la misma posición que eluían durante la serie primaria. Los péptidos ligeros (^{16}O) y pesados (^{18}O) químicamente son muy similares y cada péptido se acopla por separado de la misma forma y también se ioniza de la misma forma. Durante la espectrometría de masas los péptidos ligeros y pesados se separan porque el péptido pesado tiene un aumento de masa de 4 uma. Esta separación es suficiente para medir con precisión la cuantificación diferencial del grado de procesamiento de las proteínas en las dos muestras.

Ejemplo 9 Sistemas tampón

Un elemento importante de la invención es la elección de las condiciones de separación de los péptidos en relación con e integrado con 1) las condiciones de reacción usadas para alterar los péptidos, y 2) el tipo de estrategia espectrométrica de masas que se usa para analizar e identificar los péptidos señalizados o los de identificación. Para ilustrar este punto a continuación se describen varios ejemplos de como seleccionar los péptidos con metionina de las mezclas peptídicas de proteínas, teniendo en cuenta este aspecto de integridad del procedimiento. En un ejemplo, la serie primaria se lleva a cabo en el sistema de TFA/acetonitrilo y la etapa de oxidación se hace en TFA al 1%/H_{2}O_{2}. La serie secundaria se lleva a cabo igualmente en el sistema de TFA/acetonitrilo, mientras que las mediciones de masas peptídicas se hacen por MALDI-TOF-MS o por PSD-MALDI-RETOF-MS que no es sensible a trazas de TFA (véase a continuación). Así, en este protocolo, el contraión TFA no se cambia al principio de la serie primaria a lo largo del procedimiento hasta la serie secundaria completa. En el caso de que la identificación de los péptidos señalizados o péptidos de identificación se haga por ionización por electropulverización (ESI-MS), entonces no se aconseja el sistema de TFA, ya que se sabe que el TFA forma agrupaciones de iones, que interfieren con las mediciones de EM (Mirza and Chait, 1994). Por lo tanto, como un segundo ejemplo, ahora tanto la serie primaria como la secundaria se llevan a cabo en un sistema de HCOOH/acetonitrilo, porque este sistema permite una ionización eficaz por ESI. Sin embargo, la etapa intermedia de oxidación para generar los péptidos con metionina-sulfóxido no se puede llevar a cabo en presencia de HCOOH porque esto conduce a la formación de ácido perfórmico y por lo tanto a la conversión de las cadenas laterales de metionina en los derivados tanto de sulfóxido como de sulfona. Por lo tanto, aquí la etapa de oxidación se lleva a cabo en una mezcla de TFA al 1% y H_{2}O_{2} al 0,5%. En este caso, la naturaleza de los contraiones entre las dos etapas cromatográficas consecutivas y la alteración no son los mismos, afectando potencialmente al efecto de formación de pares iónicos durante la serie secundaria. Aquí, debido a la concentración relativamente baja de TFA el efecto de perturbación no es importante. Esto podría convertirse en un problema cuando se aumenta la concentración de TFA o cuando los contraiones se usan con efecto de formación de pares iónicos más fuerte durante la etapa de alteración. En resumen, se prefiere mantener la naturaleza del tampón sin cambiar a lo largo de las series primaria y secundaria, durante la etapa de alteración y durante el análisis espectrométrico de masas. Si esto no se puede hacer, o si los tampones en el procedimiento de cromatografía son diferentes de los solvatos usados en la espectrometría de masas, entonces se puede llevar a cabo una serie cromatográfica terciaria.

En la misma línea, puede ser importante tener en cuenta los iones del tampón presentes en la mezcla peptídica de proteínas antes de empezar la seria primaria. Idealmente, los iones del tampón de la mezcla peptídica de proteínas deberían ser los mismos que los usados durante la serie primaria y la serie secundaria. En el caso de que los iones del tampón en la mezcla peptídica de proteínas sean demasiado divergentes, la adaptación necesaria se puede obtener con varios procedimientos disponibles en la técnica. Por ejemplo, se puede obtener dializando la mezcla de proteínas contra tampones adecuados antes de la digestión con tripsina. Alternativamente, se podría añadir una separación en fase inversa (RP) corta con un gradiente pronunciado, antes de empezar la serie primaria. Durante esta rápida separación de RP, se eliminan las sales y los péptidos adquieren los contraiones correctos que se usarán en las series primaria y secundaria. Los péptidos que eluyen de esta etapa de RP rápida se combinan y liofilizan antes de disolverlos en el tampón adecuado para la serie primaria. El procedimiento en el que la mezcla peptídica se lleva a las condiciones de iones más ideales se llama aquí, la etapa de acondicionamiento. A continuación se describe un ejemplo donde el acondicionamiento de la mezcla peptídica es importante.

Se prepara plasma humano por adición de tampón de citrato con el fin de inhibir la coagulación. Cuando una digestión tríptica de dicha preparación de proteínas de plasma total se somete directamente a la etapa cromatográfica primaria, en la separación de péptidos influirá el citrato originalmente presente en la mezcla peptídica. Cuando ahora los péptidos inalterados se pasan ahora por la serie secundaria, en la que el citrato está prácticamente ausente, puede haber un desplazamiento indeseado debido al cambio en los pares de iones. Este tipo de desplazamientos son más importantes para los péptidos más hidrófilos, que eluyen al principio del gradiente que para los péptidos hidrófobos que eluyen más tarde. El efecto del citrato en la serie primaria se evita pasando primero la mezcla peptídica de proteínas por una columna rápida de RP usando un gradiente pronunciado de disolvente orgánico. Se recogen los péptidos que eluyen durante todo el gradiente, se secan por liofilización o se secan a vacío, y se vuelven a disolver en el tampón adecuado antes de la serie primaria. Mediante el acondicionamiento de la mezcla peptídica de proteínas, se aseguran las mismas o idénticas condiciones cromatográficas durante todo el procedimiento de separación. La etapa de acondicionamiento también es importante como una etapa de limpieza para separar los compuestos que pueden contaminar gradualmente las columnas de separación.

Ejemplo 10 Proteómicas basadas en masas de péptidos individuales (IPMBP)

De acuerdo con la invención, se puede seleccionar un subconjunto de péptidos señalizados o péptidos de identificación de una mezcla compleja de péptidos. Además, con la invención los péptidos y las correspondientes proteínas son identificados con un analizador adecuado tal como un espectrómetro de masas. La masa de estos péptidos se mide con un espectrómetro de masas MALDI-TOF, sin embargo esto no siempre es suficiente para identificar los péptidos y sus correspondientes proteínas sin ambigüedad. En este ejemplo, se describen varias estrategias para aumentar el contenido de información de los péptidos señalizados o de identificación aislados. Esto permite determinar sin ambigüedad la identificación de un número creciente de dichos péptidos mediante una determinación sencilla de su masa con un espectrómetro de masas. Esta estrategia se denomina proteómicas basadas en la masa de péptidos individuales (IPMBP).

10.1 IPMBP en péptidos generados con Lys-C endoproteínasa

El uso de la invención permite seleccionar péptidos que contienen una o más especies de un aminoácido específico. El conocimiento de que este aminoácido tiene que estar presente en el péptido seleccionado se usa para aumentar el número de péptidos que se pueden identificar sin ambigüedad. Una estrategia es construir sub-bases de datos que contengan sólo las masas de péptidos que se sabe que contienen al menos un resto del aminoácido específico. Por ejemplo, si se ha seleccionado la metionina como el aminoácido específico, se crea una sub-base de datos con las masas de los péptidos que contienen al menos una metionina, y se criba la masa de cada uno de los péptidos señalizados que contienen metionina frente a dicha base de datos.

Se obtiene un aumento adicional del porcentaje de péptidos señalizados o péptidos de identificación que se determinan sin ambigüedad, usando proteasas específicas. En un ejemplo, se usa Lys-C endoproteínasa. En este ejemplo, se construyó una base de datos que contenía todos los péptidos posibles obtenidos por digestión con Lys-C endoproteínasa in silico de proteínas humanas y de E. coli (extraídas de la base de datos Swiss Port versión 39.0). A partir de esta base de datos se creó una su-base de datos de péptidos que cumplían criterios específicos: su masa monoisotópica debería estar entre 700 Da y 4.000 Da, y deberían contener al menos un resto metionina. La sub-base de datos se clasificó de acuerdo con la masa peptídica creciente y después se calculó el número de péptidos que se podían usar como identificadores únicos para sus proteínas de origen, es decir, péptidos cuya masa, medida con tres cifras exactas, corresponde a una secuencia peptídica única. A partir de estos cálculos, se observó que el 91% de las masas peptídicas humanas calculadas y el 95% de las masas peptídicas de E. coli calculadas sirven como péptidos identificadores únicos (Fig. 7). Igualmente, se calculó el número de proteínas en las bases de datos que contenían al menos uno de estos identificadores únicos, y se observó que para ambas especies se pueden identificar de esta forma más del 80% de las proteínas. Con el fin de usar esta estrategia para proteómicas basadas en péptidos de alta capacidad, es necesario medir las masas peptídicas con mucha precisión. Como se ha publicado recientemente, dicha alta precisión de las masas se podría obtener, por ejemplo, con un espectrómetro de masas de transformada de Fourier (FTMS) usando un procedimiento de calibración interno (O'Connor and Costello, 2000). En cuanto no se alcanza este nivel de precisión, se puede esperar una disminución muy rápida de la capacidad de identificación. Igualmente, desde un punto de vista estadístico, las bases de datos más grandes producen asignaciones con más ambigüedad que las más pequeñas. Por lo tanto, se prefiere dirigir los algoritmos de búsqueda de IPMBP a una sola especie u organismo. Para estos experimentos simulados se usó la Lys-C endoproteínasa que genera como media péptidos mayores que, por ejemplo, las digestiones con tripsina o quimiotripsina. El uso de estas últimas enzimas o combinaciones de diferentes proteasas, dará como resultado bases de datos de péptidos que tienen un número mayor de entradas, disminuyendo así tanto el número de masas peptídicas únicas como el número de proteínas que se pueden identificar de forma única por IPMBP.

10.2 Enriquecimiento del contenido de información de los péptidos

Con el fin de obtener criterios más restrictivos sin usar análisis de MS/MS que consumen tiempo, el contenido de información de los péptidos señalizados se enriqueció adicionalmente cambiando específicamente grupos NH_{2} libres en el péptido usando una mezcla equimolar de éster de ácido acético de la N-hidroxisuccinimida y ácido trideuteroacético de la N-hidroxisuccinimida. Como resultado de esta reacción de conversión, los péptidos señalizados o péptidos de identificación adquieren un número predeterminado de grupos CH_{3}-CO (CD_{3}-CO) dependiendo del número de grupos NH_{2} en estos péptidos. El número de grupos adquiridos se puede deducir fácilmente del grado de desplazamiento de la masa observado en los dobletes de los péptidos. Por ejemplo, un desplazamiento de 3 uma corresponde a la presencia de un grupo NH_{2}, un desplazamiento de 3 y 6 uma corresponde con dos grupos NH_{2}, y un desplazamiento de 3, 6 y 9 uma pone de manifiesto la presencia de tres grupos NH_{2} en el péptido. El cambio de los grupos NH_{2} libres se lleva a cabo de forma más conveniente después de la digestión de la proteína, pero antes de iniciar la serie primaria. La acetilación de los grupos NH_{2} libres en los péptidos aumenta la hidrofobicidad de los péptidos. A pesar de este efecto, el grado de los desplazamientos hidrófilos (\delta_{min} y \delta_{max}) obtenido después de, por ejemplo, oxidación de las metioninas (véase el ejemplo 1), es similar a cuando los péptidos no se acetilaron. Por lo tanto, la presente invención se puede usar igualmente en esta estrategia. Usando esta estrategia, combinada con la estrategia descrita en lo que antecede, se puede obtener la siguiente información para cada uno de los péptidos señalizados: (1) masa, determinada por EM, (2) número de restos de un aminoácido específico seleccionado (p. ej., metionina), y (3) número de grupos amino libres. Esta información combinada aumenta significativamente el número de péptidos señalizados o de identificación que se pueden identificar sin ambigüedad mediante cribado de bases de datos y sub-bases de datos como se ha descrito en lo que antecede.

Adicionalmente, esta estrategia se puede usar para determinar la proporción de péptidos presentes en dos mezclas. En este ejemplo, los péptidos que provienen de una muestra se acetilan con éster de ácido acético y N-hidroxisuccinimida y los péptidos de una segunda muestra se acetilan con éster de ácido trideuteroacético y N-hidroxisuccinimida. La proporción de las dos formas isotópicas de cada péptido señalizado medida en los espectros de masas, posteriormente se usa para hacer una comparación cuantitativa. En un procedimiento cuantitativo diferencial, recientemente Brancia y col. (2001) publicaron una estrategia similar, que usaban O-metilisourea para determinar el número de restos de lisina en péptidos trípticos, y mostraron que esta información adicional mejoraba el éxito total de la identificación de proteínas usando procedimientos de búsqueda convencionales. La combinación de esta estrategia con la presente invención, mejora adicionalmente de forma significativa el porcentaje de péptidos que se pueden identificar sin ambigüedad.

Una parte adicional importante de información es el tiempo de elución o migración de un péptido dado en el sistema de separación (p. ej., durante la serie primaria) porque permitirá distinguir entre péptidos con masa iguales o muy similares pero diferentes hidrofobicidades o cargas eléctricas netas.

10.3. IPMBP por selección de péptidos trípticos NH_{2}-terminales

En la invención actual se puede, por ejemplo, separar los péptidos NH_{2}-terminales de proteínas con el NH_{2}-terminal bloqueado (ejemplo 6a), pero esta idea se extiende a péptidos NH_{2}-terminales de todas las proteínas en una muestra (ejemplo 7). En la Figura 6 se muestra un procedimiento para la separación específica de péptidos derivados de proteínas con el NH_{2} bloqueado in vivo (probablemente NH_{2}-acetiladas, NH_{2}-formiladas o piroglutamiladas). Usando una variación de este procedimiento (ejemplo 7), también se puede separar específicamente los péptidos NH_{2}-terminales de la mayoría, sino todas, las proteínas presentes en una mezcla peptídica de proteínas. Este procedimiento también permite distinguir entre péptidos derivados de proteínas con NH_{2}-terminal bloqueado in vivo y proteínas con un extremo NH_{2}libre. Finalmente, la masa de estos péptidos NH_{2}-terminales separados se puede determinar fácilmente usando, por ejemplo, un espectrómetro de masas.

Una ventaja importante de esta estrategia es que selecciona los péptidos amino-terminales de las proteínas. Por consiguiente, la identificación de las proteínas que se corresponden con los péptidos se simplifica significativamente porque ahora la búsqueda para correlacionar la masa peptídica con masas de péptidos separados en bases de datos, se puede limitar a masas de péptidos amino-terminales en las bases de datos. Como resultado, para la gran mayoría de los péptidos se puede correlacionar sin ambigüedad el péptido con su proteína correspondiente. En una situación ideal, cada péptido NH_{2}-terminal se puede considerar como el único péptido de identificación representativo de su correspondiente proteína de origen, reduciendo el problema de identificación de proteínas principalmente a una correlación de una proteína-un péptido. Esto significa que para una mezcla de 1.000 proteínas diferentes, hay que buscar 1.000 péptidos de identificación diferentes. Es difícil verificar este supuesto por simple simulación por ordenador usando secuencias de ADN genómicas, porque no siempre se sabe el grado de procesamiento en el extremo NH_{2} durante la maduración de la proteína in vivo. Por ejemplo, primero se sintetiza la actina \beta-citoplasmática como: Met-Cys-Asp-Asp-Asp-lle-, pero finalmente es procesada a Acetil-Asp-Asp-Asp-lle..., con la eliminación consecutiva de Met y Cys antes de la adición del grupo acetilo (Redman y Rubenstein, 1984). El problema del procesamiento "impredecible" del NH_{2}-terminal de las proteínas se soluciona seleccionando primero y después identificando cada péptido de identificación por MS/MS o una estrategia de PSD. Estos estudios no son demasiado complicados porque los péptidos NH_{2}-terminales separados contendrán arginina u homoarginina (hArg), y se sabe que esto ioniza de forma muy eficaz y produce principalmente fragmentos iónicos de tipo y (Biemann, 1990) durante el análisis por MS/MS, conduciendo así al espectro fácilmente interpretable. Como ya se ha mencionado en la sección 10.2, el tiempo de elución o migración de un péptido de identificación puede ser un parámetro adicional valioso y suficiente para combinar con su masa total, con el fin de identificar completamente un péptido de identificación. Así, la masa de cada uno de los péptidos de identificación combinado con sus propiedades cromatográficas junto con la información de que proteína deriva este péptido específico se almacena en una base de datos relacionada. Esto significa, que en la mayoría de los casos se puede correlacionar sin ambigüedad la masa del péptido de identificación con su proteína de
origen.

10.4 El uso de IPMBP en una estrategia de proteoma diferencial cuantitativo

El procedimiento para usar la IPMBP en una estrategia de proteoma cuantitativa usando péptidos de identificación consiste en las siguientes etapas: de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 7, las proteínas de la mezcla peptídica de proteínas 1 primero se modifican en las cisteínas y se guanidinan, y después se acetilan los NH_{2}-terminales. Después las proteínas se hacen digerir con tripsina en presencia de H_{2}^{16}O. Se lleva a cabo el mismo procedimiento para la mezcla peptídica de proteínas 2, pero ahora la digestión con tripsina se lleva cabo en presencia de H_{2}^{18}O. La tripsina no sólo cataliza la escisión de sus enlaces peptídicos diana, sino que también incorpora dos átomos de oxígeno derivados del agua en los sitios de escisión (véase por ejemplo, Schnolzer y col., 1996) (Rose y col., 1983). Así, los péptidos derivados de la mezcla peptídica de proteínas 1 son marcados en el extremo COOH con dos isótopos de ^{16}O, mientras que los péptidos que provienen de la mezcla peptídica de proteínas 2 ahora llevan dos isótopos de ^{18}O, diferenciando en 4 uma el mismo péptido procedente de mezclas peptídicas diferentes. Ahora, las mezclas peptídicas se combinan y pasan por la primera columna (serie 1). Los péptidos se recogen otra vez en fracciones, y se marca sus grupos alfa-amino mediante un reactivo específico que lleva un grupo hidrófobo (o hidrófilo). Ahora los péptidos que derivan de proteínas con el NH_{2}-terminal bloqueado (in vivo o in vitro) no se moverán en la segunda serie y se pueden recoger en los mismos intervalos de tiempo de elución que en la serie 1. En contraste, todos los péptidos alterados en los que ha reaccionado el grupo NH_{2} después de la serie primaria sufren un desplazamiento hidrófobo / hidrófilo y se separan de la posición que tenían antes de ser marcados. Cuando se usan reactivos hidrófilos para alterar los grupos alfa-amino libres, se observa un desplazamiento hidrófilo de los péptidos alterados, comparado con los péptidos con el NH_{2}-terminal bloqueado. Sin embargo, puesto que el grupo alfa-amino libre del péptido ya es hidrófilo, la mayoría de los reactivos de bloqueo conducen a un compuesto más hidrófobo, que eluye más tarde que el péptido con el grupo amino libre. Por análisis espectrométrico de masas de los péptidos de identificación aislados, ahora se detectan dos tipos de dobletes de los péptidos de identificación: los que se separan 4 uma (la diferencia entre tener dos isótopos de ^{16}O frente a dos ^{18}O) y que derivan de las proteínas bloqueadas in vivo. Las proporciones de las intensidades de los picos o las áreas de los picos reflejan las proporciones relativas de las correspondientes proteínas en las dos mezclas. El segundo tipo de dobletes está separado 7 uma (la diferencia entre tener dos isótopos de ^{16}O frente a dos ^{18}O aumentada con la diferencia entre tener tres átomos de H frente a tres átomos de D) y derivan de proteínas en la muestra que tenían un extremo NH_{2} libre. Las proporciones de las intensidades de los picos o las áreas de los picos otra vez reflejan las proporciones relativas de las correspondientes proteínas en las dos mezclas. En la Fig. 8 se resume el esquema de reacción para la estrategia de los péptidos NH_{2}-terminales cuantitativa diferencial.

Una alternativa al procedimiento de marcaje diferencial con ^{16}O/^{18}O es el uso de péptidos señalizados o de identificación que se sintetizan químicamente y contienen al menos un aminoácido deuterado (o cualquier tipo de isótopo pesado ^{13}C, ^{15}N), que permita una separación suficiente del péptido de identificación natural frente al péptido de identificación "pesado" sintetizado, por espectrometría de masas. Ahora los péptidos "pesados" sirven de patrones internos. Así, el péptido sintetizado se añade en cantidades conocidas a la mezcla peptídica de proteínas y se separa junto con su homólogo natural. La comparación de las proporciones de los picos de los péptidos en el espectrómetro de masas permite un cálculo cuantitativo del péptido de identificación natural frente al péptido sintético añadido.

Dichos péptidos señalizados o de identificación isotópicamente marcados pueden contener, por ejemplo, leucina deuterada (p. ej., L-Leucina-d_{10}, que produce una diferencia de masa de 10 uma), o metionina deuterada. Este último puede ser conveniente cuando se separan los péptidos que contienen Met (véase, por ejemplo, los Ejemplos 1, 18, 19 y 20).

Puesto que la gran mayoría de los péptidos trípticos terminan con Arginina o Lisina, y puesto que la síntesis química de péptidos empieza por el extremo COOH y continua hacia el extremo NH_{2}, se podrían sintetizar todos los péptidos partiendo de lisina deuterada o arginina deuterada; mientras que los otros aminoácidos se podrían unir como sus derivados naturales. En este caso, se podría usan un soporte en fase sólida en el que la lisina ya deuterada o arginina ya deuterada se conecten mediante un brazo conector escindible con el soporte de la fase sólida. Dichas resinas en fase sólida se podrían usar como materiales de partida generales a partir de los cuales se podría sintetizar cualquier tipo de péptido señalizado o de identificación pesado por síntesis de péptidos en fase sólida convencional.

Ejemplo 11 Un dispositivo separador de péptidos mediante el uso de un sistema de una sola columna

El protocolo básico de la invención para aislar, por ejemplo, péptidos que contienen metionina de una mezcla peptídica de proteínas consiste en dos etapas cromatográficas consecutivas: una etapa de RP-HPLC de la mezcla peptídica de proteínas llevada a cabo en un sistema de disolvente que se ha encontrado que produce los desplazamientos más adecuados entre los péptidos con metionina oxidada y los péptidos no alterados, y que además también es compatible con los procedimientos de ionización por electropulverización o MALDI. La segunda serie de RP-HPLC que se lleva a cabo después de la etapa de oxidación se hace en las mimas condiciones cromatográficas o muy similares, de forma que sólo los péptidos oxidados se desplazan hacia delante, mientras que los péptidos no alterados permanecen en sus tiempos de elución originales. Este principio se usa de varias formas para separar los péptidos con metionina de los péptidos sin metionina. Así, en un sistema con una sola columna, representado esquemáticamente en la Figura 9, la serie primaria (serie 1) de la mezcla peptídica celular total se hace en una columna de fase inversa estándar (p. ej., una columna de RP C18 de 2,1 mm de D.I. x 25 cm, Vydac Separations Group, CA). Esto se denomina la serie primaria y en la Fig. 10 se muestra el perfil de absorbancia UV de péptidos de un lisato de E. coli. Después de una etapa inicial de lavado isocrático con 5% de disolvente B durante 10 min, la columna se eluye con un gradiente de acetonitrilo, aumentando linealmente 1% de disolvente B por minuto durante 95 min. El tampón A consiste en ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA), mientras que el tampón B consiste en TFA al 0,09% en acetonitrilo al 70%. El flujo se mantiene constante a una velocidad de 80 \mul/min y se recogen fracciones de 80 \mul en tubos Eppendorf de 0,5 ml. Se recogen 40 fracciones en total. La primera fracción que se recoge, se llama fracción nº 10 (que eluye entre 18 y 19 min después de empezar el gradiente y que corresponde a 23% de disolvente B). La última fracción recogida (que eluye entre 57 y 58 min después del inicio del gradiente y que corresponde a 63% de disolvente B) tiene el número 49. En este sistema experimental sólo los restos de metionina presentes en los péptidos en las fracciones, son alterados químicamente, los péptidos que contienen restos de metionina oxidados aquí se denominan péptidos con Met-SO. La alteración específica se hace como sigue. Cada fracción se seca a vacío y se vuelve a disolver en la mezcla de oxidación, que consiste en TFA al 1% en agua a la que se añade solución madre de H_{2}O_{2} al 30% para dar una concentración final de H_{2}O_{2} de 0,5%. La oxidación se deja transcurrir durante 30 min a 30ºC y después la solución se carga inmediatamente en la columna de RP para las series secundarias. De acuerdo con la invención es muy preferible volver a cromatografiar cada fracción después de la oxidación en las mismas condiciones cromatográficas o muy similares y en la misma columna. Usando las mismas condiciones en la serie 2, los péptidos con Met-SO eluyen entre 6 y 2 min delante de la mayoría de los péptidos inalterados. Una estrategia es cromatografiar cada fracción por separado y hacer esto para cada una de las 40 fracciones. Dicha estrategia no solo requiere una cantidad considerable de tiempo de HPLC, sino que también ocupa un tiempo de máquina importante en el espectrómetro de masas. Con el fin de obtener un uso más económico tanto del equipo de HPLC como del espectrómetro de masas, y con el fin de acelerar el procedimiento entero, se redujo el número de separaciones mezclando varias fracciones de la serie primaria, evitando el solapamiento de los péptidos señalizados que se desplazan hacia delante con los péptidos inalterados de las fracciones previas, y evitando el solapamiento de los péptidos señalizados de una fracción con los péptidos señalizados de otra fracción. Antes de establecer este protocolo se midieron los desplazamientos hidrófilos de un número significativo de péptidos sintéticos que contenían metionina después de oxidación, y se observó que la gran mayoría de los desplazamientos eran menores que el 6% pero mayores que el 2% de disolvente B; por lo tanto en una ventana entre 6 y 2 min en el gradiente usado en los experimentos de la invención (véase también la Tabla III). En la zona de 2 min que está entre los péptidos desplazados y la mayoría del material peptídico, sólo se observaron algunos péptidos con metionina, pero en su lugar también se observaron algunos péptidos no alterados, que se extendían desde el pico grande de la mayoría de los péptidos. Con el fin de evitar el solapamiento en la elución de péptidos señalizados que provienen de dos fracciones en este sistema experimental particular, tiene que haber al menos 6 minutos de diferencia de elución entre esas dos fracciones (p. ej., para la fracción 10, esta sería la fracción 17). Sin embargo, por razones de seguridad, se añadieron 5 min adicionales de elución después de la elución de la fracción del pico grande, antes de permitir la elución del siguiente grupo de péptidos con metionina oxidada. Esto significa que para las series secundarias se podían combinar fracciones que en la primera serie estaban separadas por intervalos de 12 minutos. Por lo tanto, la fracción 10 se combinó con la 22, 34 y 46. Igualmente se combinó la fracción 11 con las fracciones 23, 35 y 47, etc. En la Tabla IVA se muestra una lista completa de las mezclas de fracciones para las series secundarias. En la Fig. 11 se muestra el perfil de absorbancia UV de una serie secundaria típica (serie 2A, que combina las fracciones 10, 22, 34 y 46). Los péptidos con metionina-SO se recogieron cada vez en los intervalos entre seis y dos minutos anteriores al tiempo en el que se esperaba que eluyeran los péptidos inalterados. Así, en el ejemplo de la serie 2A anterior, los péptidos oxidados se recogieron en las fracciones 4-7, 16-19, 28-31 y 40-43 (Tabla IVA). Los péptidos oxidados en el resto de las series secundarias se recogieron como se lista en la Tabla IVA. Por lo tanto, en total hay que llevar a cabo doce separaciones secundarias de forma consecutiva, con el fin de cubrir todas las fracciones de la serie primaria. Aquí habría que añadir que los intervalos de tiempo y las ventanas usadas en el procedimiento de separación descrito aquí, están sometidos a cambios dependiendo al sistema cromatográfico seleccionado o al tipo de componentes que hay que separar. Por ejemplo, en el ejemplo 18 se describe un procedimiento de separación que usa diferentes intervalos de tiempo y ventanas para separar también los péptidos con metionina, pero usando el sistema de HCOOH/acetonitrilo. Es evidente que los intervalos de tiempo y ventanas deben adaptarse a cada caso particular (p. ej., separación de fosfopéptidos, separación de péptidos N-\varepsilon-acetilados, separación de péptidos NH_{2}-terminales, etc.).

Los péptidos con Met-SO que eluyen durante las series secundarias se pueden pasar directamente a una fuente de iones de un espectrómetro de masas conectado en serie (p. ej., un espectrómetro de masas basado en ESI) o se pueden recoger en pequeñas partes alícuotas para el posterior análisis por MALDI-TOF/RETOF-MS o aplicar directamente en pequeñas gotas sobre la placa diana MALDI para el análisis por MALDI-MS de alta capacidad. Alternativamente, los péptidos con Met-SO separados se pueden recoger en tubos Eppendorf y recombinar para una posible tercera serie de separaciones (denominadas aquí series terciarias). Esta última puede ser necesaria cuando la separación de péptidos se ha llevado a cabo en sistemas que contienen TFA, mientras que el análisis se hace por ESI-MS. De hecho se sabe que el TFA produce la formación de agrupaciones de iones durante la electropulverización, que dificultan seriamente la detección de péptidos y el análisis por MS/MS (Mirza and Chait, 1994). Este no es el caso cuando se usan como contraiones HCOOH al 0,05% o un tampón de NH_{4}Ac 10 mM a pH 5,7. Hay que entender que el uso de estos últimos sistemas puede producir desplazamientos en los tiempos de elución de los péptidos cuando se comparan con los sistemas con TFA usados en las series previas, que posiblemente conducen a la acumulación de picos indeseados y por lo tanto al riesgo de una identificación ineficaz de los péptidos. En las Tablas IVB y IVC se presentan dos esquemas diferentes que ilustran como se pueden mezclar las fracciones obtenidas de series secundarias para llevar a cabo una serie terciaria. En el caso de que se usen contraiones idénticos en el disolvente a lo largo de las diferentes series, se pueden combinar las fracciones que eluyen una después de otra. Por ejemplo, la fracción 4-7 de la serie 2A se puede combinar con la fracción 8-11 de la serie 2E, fracción 12-15 de la serie 21, fracción 16-19 de la serie 2A, fracción 20-30 de la serie 2E, fracción 24-27 de la serie 21, fracción 28-31 de la serie 2A, fracción 32-35 de la serie 2E, fracción 36-39 de la serie 21, fracción 40-43 de la serie 2A (marcado en azul en la Tabla IVB). El resto de las fracciones se combinan de una forma similar a la mostrada en la Tabla IVB, que conduce a cuatro mezclas de las cuales los componentes se pueden separar en cuatro series terciarias, 3A, 3B, 3C y 3D. En el caso de que se use HCOOH al 0,05% en las series terciarias, se aconseja combinar sólo la mitad de las fracciones cada vez. Así para la serie 3'A ahora se mezclan la fracción 4-7 de la serie 2A, con la fracción 12-15 de la serie 21, fracción 20-23 de la serie 2E, fracción 28-31 de la serie 2A y fracción 36-39 de la serie 21. Las otras combinaciones otra vez están listadas en la Tabla IVC, y se separan en ocho series terciarias diferentes (3'A hasta 3'H). También son posibles otras combinaciones de fracciones mezcladas de las series secundarias con el fin de realizar una serie terciaria. Aunque las series terciarias como se ha descrito antes, son importantes para obtener una dispersión mejor de los péptidos en varias series, es más eficaz y más rápido identificar los péptidos inmediatamente cuando eluyen de la columna en el transcurso de las series secundarias. Desde la perspectiva del tiempo, esto último no es óptimo con un dispositivo separador de péptidos de una sola columna, porque los péptidos con Met-SO eluyen a intervalos separados en bloques de 8 min, en los que no es posible recoger. Estos bloques de 8 min se pueden llenar con hasta dos eluciones de 4 min cuando se usan tres columnas simultáneamente. El diseño de dicho Separador de péptidos de tres columnas se describe en el ejemplo 12.

En el caso de que se use el procedimiento de separación inverso, en el que se separan los péptidos inalterados y se recogen como péptidos de identificación, mientras que los péptidos alterados que forman la mayoría de los péptidos de la mezcla peptídica de proteínas original, se descartan o se usan para otros análisis, el siguiente procedimiento es evidente.

Usando valores similares de los desplazamientos de péptidos a los usados en el ejemplo de la oxidación de metioninas usado antes, suponiendo que se han cogido las fracciones primarias de 1 min (w = 1 min), suponiendo todos los desplazamientos de los péptidos alterados entre 6 y 2 min delante de la posición de elución de los péptidos de identificación; entonces se recogen los péptidos de identificación en el mismo intervalo de tiempo en el que se cogieron en la serie primaria, mientras que los péptidos alterados que eluyen entre 6 y 2 min no son analizados. Será evidente, que ahora los péptidos alterados forman la mayoría de los péptidos, mientras que los péptidos no alterados representan una fracción minoritaria de la mezcla original. También es importante indicar que se puede producir algo ensanchamiento de la ventana en la que eluyen los péptidos inalterados durante la serie secundaria, debido a la ausencia de grandes cantidades de péptidos en la serie secundaria. Por lo tanto, los péptidos de identificación inalterados se recogen mejor en una ventana que es ligeramente más ancha que w_{1}: por ejemplo 0,5 min antes y después de los intervalos de tiempo de w_{1}.

Como en el ejemplo de la oxidación de las metioninas, otra vez, se pueden combinar las fracciones 10, 22, 34 y 46 de la serie primaria. Ahora los péptidos alterados que eluyen en las fracciones 4-7, 16-19, 28-31 y 40-43 se descartan, mientras que los péptidos de identificación ahora se recogen en las fracciones de 9,5-11,5 min, 21,5-23,5 min, 33,5-35,5 min y 45,5-47,5 min.

Por lo tanto, el procedimiento de separación inverso se puede llevar a cabo con el mismo aparato que el procedimiento de separación normal, con cambios mínimos en el programa de recogida de péptidos.

Otra vez, será evidente para el experto en la técnica, que los tiempos de desplazamientos pueden variar dependiendo del sistema cromatográfico y condiciones y de la química o procedimientos de alteración usados.

Ejemplo 12 Un dispositivo de separación de péptidos de tres columnas

Con el fin de reducir el tiempo total de separación de péptidos, ahora se ejecuta el procedimientos seguido en el ejemplo 11 basado en una sola columna de RP-HPLC para todas las etapas, con tres columnas que funcionan en paralelo y de forma sincrónica. En la Fig. 12 se muestra un vista esquemática de dicho sistema de separación. El dispositivo de separación de péptidos contiene tres columnas de RP idénticas que se hacen funcionar exactamente en las mismas condiciones (caudal, gradiente, etc.). Con el fin de lograr las condiciones idénticas, cada una de estas columnas está conectada a una bomba de alta presión y dispositivo de mezcla de disolventes, que controlan exactamente los caudales y gradientes en las tres columnas (Fig. 12A). Alternativamente, las tres columnas son alimentadas por una sola bomba de alta presión, mientras que los caudales a cada una de las columnas son controlados por una válvula de distribución que puede controlar los caudales (Fig. 12B). En la columna I se cargan las fracciones 10, 22, 34 y 46 de la serie 1. Se crea exactamente el mismo caudal y gradiente que en la serie 1. La columna primero se lava con TFA al 0,1% en disolvente B al 5% (p. ej., acetonitrilo al 70% en TFA al 0,09%) durante 10 min. Después, se continua el gradiente como en la serie 1 con un gradiente de disolvente B al 1% por minuto. Desde el min 4 hasta el final del min 7 (fracciones 4-7) se recogen los péptidos con Met-SO o se dirigen a la fuente de iones del aparato de EM para el análisis. Alternativamente, el eluato 4-7 se recoge en pequeñas partes alícuotas, por ejemplo, usando un MicroBlotter (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) para el análisis por MALDI-TOF-MS. Desde el min 8-15 el eluato se dirige otra vez a los residuos. A los 16 min, se recoge la segunda tanda de péptidos con Met-SO que proceden de la fracción 22 en la serie 1. Esta recolección o análisis se hace durante el intervalo de 16 a 19 min (fracción 16-19). Después se descarta otra vez el eluato hasta el intervalo de 28-31 min, durante el cual se recoge la tercera tanda de péptidos con Met-SO que derivan originalmente de la fracción 34. A los 32 min, se para la recolección y el eluato se vuelve a dirigir a los residuos. Se continúa el gradiente como en la serie 1 con una recolección adicional de las fracciones 40-43 y se completa a los 58 min del inicio del gradiente seguido por una etapa de reequilibrado con TFA al 0,1% durante 30 min. La columna II, que ahora se ha cargado con las fracciones 14, 26 y 38, funciona exactamente en las mismas condiciones descritas antes para la columna I. Ahora los péptidos con Met-SO se sacan en los intervalos de tiempo 8-11, 20-23 y 32-35. La columna III se carga con las fracciones 18, 30 y 42, se hace funcionar en las mismas condiciones y con la misma sincronía que las columnas I y II. Ahora los péptidos con Met-SO eluyen en los intervalos de tiempo 12-15, 24-27 y 36-39. Cuando las series con las tres columnas se hacen funcionar simultáneamente, ya no se observan intervalos muertos entre los análisis de péptidos con Met-SO. De hecho, como se demuestra en la Tabla V se analizan los productos de la columna I durante los minutos 4-7, 16-19, 28-31 y 40-43, los de la columna II durante los minutos 8-11, 20-23 y 32-35, mientras que los de la columna III se sacan durante los tiempos 12-15, 24-27 y 36-39. Estos diez intervalos de tiempo se pueden alinear perfectamente dando como resultado un flujo continuo de péptidos con Met-SO a los instrumentos de EM. Aquí otra vez es importante mencionar que los péptidos con metionina que se capturaron originalmente en un total de 10 min durante la serie primaria, ahora son suministrados después de la separación al aparato de EM esparcidos en un marco de tiempo total de 40 min, creando condiciones analíticas mucho mejores. Además, también se puede reducir el caudal durante el intervalo de tiempo en el que eluyen los péptidos con Met-SO, de forma que el espectrómetro de masas puede seleccionar y analizar más eficazmente los péptidos que eluyen. Así, se puede usar una especie de procedimiento de estacionamiento de picos (Davis y col., 1995) cuando los péptidos con Met-SO eluyen del sistema de separación. Esto requiere la adaptación de los tiempos de elución en las otras columnas conectadas. Ahora la segunda serie por triplicado se realiza con las fracciones combinadas 11, 23, 35 y 47 separadas en la columna I, con las fracciones 15, 27 y 39 en la columna II y con las fracciones 19, 31 y 43 en la columna III. Otra vez, los péptidos con Met-SO se recogen en los intervalos de tiempo 5-8, 17-20, 29-32 y 41-44 para la columna I, intervalos 9-12, 21-24 y 33-36 para la columna II e intervalos 13-16, 25-28 y 37-40 para la columna III. Todas las combinaciones de fracciones de la serie 1 y la recogida de los péptidos con Met-SO se representan esquemáticamente en la Tabla V. El funcionamiento de las válvulas durante el procedimiento completo se representa en la Tabla VI. Así, usando un separador de péptidos de tres columnas, ahora se pueden separar todos los péptidos con Met-SO de una mezcla compleja en un total de cuatro series secundarias. Puesto que cada serie tarda aproximadamente 120 min, incluyendo la carga, lavado, elución y reequilibrado, la etapa de separación de Met-SO entera de un lisato de células totales se puede ejecutar en aproximadamente 500 min. Este procedimiento de separación se puede controlar directamente usando un espectrómetro de masas conectado en serie. Alternativamente, los eluatos de péptidos con Met-SO se pueden recoger para una combinación adicional y análisis en series terciarias, o los eluatos se pueden aplicar en pequeñas partes alícuotas en dianas MALDI que permiten el análisis de alta capacidad consecutivo. Hay que mencionar que, además de las condiciones cromatográficas de RP-HPLC usadas aquí, se puede llevar a cabo el mismo procedimiento de separación con sistemas de columnas que permiten tiempos de elución mucho más rápidos, reduciendo así el procedimiento total de separación.

Ejemplo 13 Un dispositivo de separación de péptidos de nueve columnas

En la Figura 13 se representa una construcción de un dispositivo separador de péptidos de nueve columnas. Las tres primeras columnas están conectadas con una bomba de gradiente y un inyector de muestra. Hay una segunda y tercera serie de columnas que están conectadas cada una con una bomba de gradiente y un inyector de muestra. Las nueve columnas, que pueden ser columnas pequeñas desechables, se dividen en tres unidades. La unidad A contiene las columnas I, II y III, mientras que las unidades B y C contienen las columnas I', II' y III' y I'', II'' y III'' respectivamente. En la columna I se carga la fracción 12 de la serie 1, en la columnas II, la fracción 24, y en la columna III la fracción 36. A cada procedimiento de carga le sigue una etapa de lavado con disolvente A durante al menos 10 min. Después se empieza el gradiente (un aumento de 1% de disolvente B por min). El gradiente se pasa primero sólo por la columna I. Esta columna es acondiciona previamente entre 0 y 5 min. Los péptidos con Met-SO eluyen entre 6 y 9 min y la columna se lava entre 10 y 16 min. A los 17 min, las válvulas se disponen de modo que el gradiente ahora pase por la columna II que primero se equilibra durante 1 min. Los péptidos con Met-SO se recogen entre los 18 y 21 min y la columna se lava de 22 a 28 min. A los 29 min, el gradiente se dirige a la columna III que se acondiciona previamente durante 1 minuto. Los péptidos con Met-SO eluyen entre 30 y 33 min, seguido de un lavado desde los 34 min hasta el final del gradiente. El sistema B (columnas I', II' y III') se carga con las fracciones 13, 25 y 37 respectivamente y se desarrolla con un programa idéntico pero con un retraso de 3 min frente al sistema A. Así, los péptidos con Met-SO se separan en los tiempos 10-13 (I'), 22-23 (II') y 34-37 (III'). Se usa el mismo programa para el sistema C (columnas I'', II'' y III'') con las fracciones 14, 26 y 38 y un retraso de 6 min frente al sistema A. Los correspondientes péptidos con Met-SO se recogen en los intervalos 14-17 (I''), 26-29 (II'') y 38-41 (III''). Así, en un procedimiento de una etapa los péptidos con Met-SO se separan de nueve fracciones en una vez. Cuatro series como esta adicionales en las que se cargan y recogen las fracciones como se indicada en la Tabla VII, conducen a una separación completa de todos los péptidos con Met-SO presentes en la mezcla original. En la Tabla VIII se proporciona una descripción completa de los ajustes de las válvulas durante la serie completa. Un aspecto importante del dispositivo de separación de péptidos de nueve columnas es que las dimensiones de las columnas y el diseño global del sistema es diferente del usado en la serie primaria. Esto significa que incluso cuando los adsorbentes de RP y los sistemas de disolventes sean idénticos, se pueden producir tiempos de elución diferentes. Una solución para esta problema es el uso de una mezcla sintética de (Ala)_{n}-Arg coloreada (véase el ejemplo 14) añadida a la mezcla de péptidos. Esto permite usar los picos coloreados consecutivos como puntos de referencia, que guían la recolección de fracciones durante la serie primaria. Por lo tanto, las fracciones se pueden recoger entre dos picos coloreados consecutivos o alrededor de los picos coloreados. Después se pueden usar los mismos componentes de referencia coloreados para guiar la recolección de fracciones de los separadores de péptidos. El uso de un separador de péptidos de nueve columnas combinado con compuestos de referencia es particularmente beneficioso en el procedimiento de separación para péptidos NH_{2}-terminales (véase los ejemplos 6 y 7). En estos últimos, los péptidos separados no están alterados y permanecen junto con la mezcla de referencia coloreada, mientras que la mayoría de los péptidos no separados se retrasa y se mueve lejos de las referencias coloreadas.

Una serie con este separador de nueve columnas se logra en aproximadamente 60 min, que supone que el procedimiento de separación completo termina en \pm300 min o 5 h. Aquí es importante mencionar que se pueden usar columnas pequeñas y baratas en este separador. Puesto que sólo se procesa una fracción por columna, las exactitudes de los caudales no son tan importantes como en los sistemas en los que varias fracciones se cargan en una sola columna. Se pueden hacer también todas las series a una presión menor que representa menor demanda para las bombas y válvulas. El separador de nueve columnas también se adapta mejor para situaciones en las que los desplazamientos hidrófilos son mayores o menores que los medidos normalmente durante la formación del sulfóxido de metionina. Este puede ser el caso, cuando se usan los sistemas cromatográficos con metanol, o cuando se oxidan derivados de cisteína (véase la Tabla III). Los diferentes separadores de péptidos descritos aquí son ejemplos limitados que no excluyen la construcción de separados similares con un número diferente de columnas.

Ejemplo 14 Calibración de los separadores de péptidos

La eficacia y precisión de los separadores de péptidos depende principalmente de la reproducibilidad de las separaciones en las columnas. Por lo tanto, para instalar y también para el control regular de los separadores, es práctico usar una mezcla peptídica de calibración o una mezcla de componentes que cubra al intervalo entero de gradiente de disolventes y que se pueda controlar por espectrometría de masas, absorbancia de luz u otros medios. Como ejemplo no limitante, aquí se usa una mezcla de péptidos químicamente sintetizada que consiste en diferente número de alaninas a las que se une un resto arginina COOH-terminal (Ala_{n}-Arg, con n en el intervalo de 7 a 42). Esta mezcla se sintetiza usando procedimientos de síntesis en fase sólida convencionales (Merrifield, 1963). Usando una mezcla de 97% de Fmoc-Ala y 3% de tBoc-Ala para la elongación del péptido, se generan paradas prematuras después de cada ciclo en el 3% de las cadenas de péptidos en crecimiento. Ese tipo de estrategia de síntesis produce una mezcla en la que cada componente difiere del otro por la adición de una alanina dando un conjunto de péptidos que muestran un cambio continuo tanto de masa (71 uma) como de hidrofobicidad. Así, en el caso de los ejemplos anteriores, una ventana de elución dada (w1) también se puede caracterizar por uno o más péptidos de esta mezcla con valores de masas bien determinados. Como ilustración no limitada, se muestra el perfil de elución de la mezcla de NH_{2}-Ala_{n}-Arg-COOH en una columna C18-RP usando TFA al 0,1% como ion y acetonitrilo como modificador (Fig. 14A). Se puede obtener una versión coloreada de dicho compuesto de calibración sintetizando el péptido de poli-Ala con un resto de lisina adicional, que permite la unión covalente de un resto coloreado mediante el grupo amino en epsilon; Ala_{n}-Lys-Gly-Arg.

Esta mezcla peptídica de calibración se usa para controlar las propiedades y características de cada columna en el dispositivo separador de péptidos y para calibrar el sistema entero. Esto se puede hacer mezclando los péptidos de calibración con la mezcla peptídica derivada de la muestra durante la primera serie. Cualquier ajuste del perfil de elución del compuesto de calibración se lleva a cabo por medios convencionales conocidos en la técnica tales como cambio de la concentración del modificador, alteración del gradiente de elución, cambio de la temperatura de la columna, adición de agentes de formación de pares iónicos tales como octilamina o dodecilsulfato, o por adición de tetrahidrofurano o propanol al disolvente B, etc. También se usa la misma mezcla peptídica de calibración para calibrar el espectrómetro de masas en particular en las máquinas de MALDI-TOF-MS, con el fin de alcanzar un alto grado de precisión (Fig. 14B).

Ejemplo 15 Identificación de péptidos y asignación de las proteínas de origen

Los péptidos señalizados o péptidos de identificación que eluyen en una serie secundaria o de un sistema de columnas terciarias, se pasan directamente a la fuente de iones de un espectrómetro de masas de electropulverización y después se fragmentan más en el modo de MS/MS. Se recoge la información de la secuencia parcial del espectro de fragmentación de MS/MS y se usa para la identificación de péptidos en la base de datos de secuencias. Debido a que los péptidos señalizados eluyen gradualmente en la serie 2 en un intervalo de tiempo ancho, hay una coelución mínima de estos péptidos y se potencia significativamente el poder de resolución de MS/MS (véase, por ejemplo, el ejemplo 18). La presente invención también se usa para identificar péptidos por MALDI-TOF-MS. De hecho se usan técnicas de MALDI-TOF-MS de alta capacidad para barrer rápidamente los péptidos señalizados o péptidos de identificación. Por esto, en esta invención se usa, por ejemplo, el procedimiento de concentración de perla-péptido, donde los péptidos son adsorbidos en lotes sobre perlas POROS 50 R2, se transfieren al disco diana y sobre la diana se desorben con los compuestos de la matriz MALDI (Gevaert y col., 1997, y Gevaert y col., 1998). La información obtenida se limita a las masas peptídicas totales, lo cual no siempre es suficiente para la identificación sin ambigüedad cuando no se puede medir con precisión. Hay varias formas de recoger información adicional que conduce a la identificación más concluyente.

Por ejemplo, para los péptidos con Met-SO se verifica si los péptidos contienen Met-SO. Estos péptidos se caracterizan por una pérdida neutra eficaz de ácido metanosulfónico (64 uma) que se observa durante el análisis espectrométrico de masas (Fig. 15). Después de la pérdida de ácido metanosulfónico, parece que los péptidos han perdido su energía de vibración que les da una estabilidad aparente en el análisis de MALDI-PSD. Por lo tanto, es casi imposible generar espectros de descomposición metaestable (PSD) interpretables de los péptidos con Met-SO, perdiendo así una herramienta para la identificación de péptidos usando la espectrometría de masas MALDI. Hay varias formas de evitar este problema del PSD. Primero, los péptidos con Met-SO se pueden volver a reducir a su estructura original tratándolos con agentes de reducción tales como N-(metil)mercaptoacetamida (Houghten and Li, 1981). Segundo y más conveniente, los péptidos con Met-SO se oxidan adicionalmente a sus correspondientes derivados de sulfona usando ácido perfórmico (Hirs, 1956) o con una incubación más larga con H_{2}O_{2} (por ejemplo 24 h a temperatura ambiente). Tanto los péptidos con metionina-sulfona o con metionina dan espectros en MALDI-PSD mucho mejores que los correspondientes sulfóxidos. En esta etapa, sólo se observa una pequeña pérdida neutra de los péptidos con sulfona, que da espectros de PSD mucho mejores.

En una estrategia alternativa, los péptidos se pueden fragmentar por disociación activada por colisión (CAD). Este tipo de fragmentación es menos susceptible al dipolo inducido por el sulfóxido, y por lo tanto es una herramienta importante para generar información de la secuencia a partir de péptidos con Met-SO (ejemplo 18).

Otro procedimiento para obtener información se basa en la degradación parcial del NH_{2}-terminal usando una escala inducida químicamente con isotiocianato (Chait y col., 1993) o por aminopeptidasas (Caprioli and Fan, 1986). Este procedimiento proporciona suficiente información del extremo NH_{2} de cada péptido que conduce a la identificación completa. Dicha digestión con aminopeptidasa o secuenciación en escala es particularmente beneficiosa en un sistema de alta capacidad, pero también sólo es practicable con mezclas peptídicas menos complejas.

Por lo tanto, una combinación de la masa peptídica medida con precisión, la asignación de uno o más restos metionina combinado con la información de la secuencia parcial de los extremos NH_{2} de los péptidos, es suficientemente restrictiva con el fin de identificar sin ambigüedad la mayoría, sino todos, los péptidos de los lisatos totales.

En esta etapa, también se hace referencia a procedimientos adicionales descritos para la identificación de péptidos y proteínas de origen basados en masas medidas con precisión y que se describen en el ejemplo 10.

Ejemplo 16 Una determinación de cantidades relativas cuantitativas de proteínas en dos muestras

Con el fin de comparar de una forma cuantitativa relativa los niveles de expresión de proteínas en dos conjuntos de células o más generalmente en dos muestras diferentes, se hacen digerir lisatos de proteínas de cada preparación con tripsina. En una muestra, la digestión con tripsina se lleva a cabo en H_{2}^{16}O, mientras que la digestión de la segunda muestra se transcurre en H_{2}^{18}O. La tripsina tiene la posibilidad de incorporar dos oxígenos de las moléculas de agua en el extremo COOH de los sitios recién generados (Rose y col., 1983 y Schnölzer y col., 1996). Así, la muestra uno que se ha tripsinizado en H_{2}^{16}O tienen todos los péptidos con masas normales, mientras que la muestra dos contiene péptidos (excepto para la mayoría de los péptidos COOH-terminales) con masas con 2 y 4 uma más, que se corresponden con la incorporación de uno o dos isótopos de ^{18}O. La proporción relativa de las dos formas de ^{18}O de un péptido depende de varios factores, incluyendo la naturaleza del péptido, la actividad de la enzima y la pureza del ^{18}O-agua, y por lo tanto, cuando se va a usar la incorporación de ^{18}O para las mediciones cuantitativas relativas, se debe considerar el grado de incorporación de dos isótopos de ^{18}O en todos los péptidos en los cálculos globales (Stewart y col., 2001).

Aunque las digestiones se llevan a cabo por separado, todos los demás procedimientos incluyendo la separación de los péptidos con metionina pueden transcurrir en la mezcla de las dos digestiones, sin intercambio apreciable de los átomos de oxígeno. Se mezclan las digestiones con ^{16}O y ^{18}O y se someten al aislamiento de los péptidos señalizados alterados en las metioninas (péptidos con Met-SO). Los péptidos señalizados con metionina se pueden identificar, por ejemplo, como se describe en el ejemplo 15. Los péptidos ligeros (^{16}O) y pesados (^{18}O) químicamente son muy similares, y cada pareja se separará de la misma forma. También se ionizarán de la misma forma. Sólo durante la espectrometría de masas se separarán en los péptidos ligeros y los péptidos pesados (estos últimos tienen masas mayores en 2 y 4 uma debido a la incorporación de uno y dos átomos de ^{18}O). La separación de iones inducida por la incorporación de ^{18}O es suficiente para medir con precisión las relaciones de los péptidos ligeros frente a los pesados y determinar así la relación de una proteína en las dos muestras (p. ej., Mirgogdskaya y col., 2000). En la Fig. 16A se da una presentación esquemática del procedimiento entero.

Con el fin de ensayar la incorporación de ^{18}O para el análisis cuantitativo relativo, se ha hecho digerir una fracción citosólica de plaquetas y de esqueleto de membrana (preparadas como en los ejemplos 20 y 21) una vez en ^{16}O-agua "normal" y una vez en ^{18}O-agua (95% puro, ARC Laboratories, Amsterdam, Holanda) usando tripsina durante 16 h a 37ºC. Antes de la serie primaria, una parte de la digestión con ^{16}O se mezcló con dos partes de la digestión con ^{18}O, la muestra se acidificó con TFA al 1% y se separaron los péptidos señalizados con metionina de la mezcla peptídica como se ha descrito en el ejemplo 1, usando un sistema de separación de péptidos en una sola columna (ejemplo
11).

En el análisis por LC-MS, se calcularon las proporciones de ^{18}O/^{16}O de los iones peptídicos observados, como se ha descrito antes. Los resultados de este análisis se representan en la Fig. 16BB y confirman que las proporciones de péptidos generalmente varían alrededor de 2, indicando que este tipo de tecnología de marcaje isotópico es adecuado para el análisis proteómico cuantitativo.

Además, se ha verificado el uso del marcaje con ^{18}O mediante digestión de dos cantidades iguales de albúmina de suero bovino con tripsina, una en H_{2}O normal y la segunda en H_{2}^{18}O (95% de ^{18}O). Después de 18 h de digestión, se mezclaron ambas mezclas peptídicas, se separaron por HPLC y se analizaron por MALDI-TOF-MS. Para 19 péptidos se compararon las alturas de los picos de los isótopos a los que no afectaba el marcaje (p. ej., los isótopos de ^{13}C). Después, los valores se corrigieron para la presencia de 95% de H_{2}^{18}O y se combinaron en la Fig. 17. Se midió una relación media de 1,03 para los diecinueve péptidos, que se correspondía muy bien con la relación molar con la que se mezclaron las digestiones de proteínas al principio del experimento. La mayoría de los valores están de acuerdo con el valor esperado, con valores extremos de 0,84 y 1,20 (Tabla IX). Este experimento ilustra que el marcaje isotópico estable durante la digestión con tripsina forma la base para un estudio proteómico diferencial cuantitativo y se usa con la presente invención.

El marcaje isotópico diferencial también se puede hacer de formas alternativas, algunas de las cuales se mencionan brevemente a continuación. Los procedimientos de marcaje se basan en reacciones químicas conocidas y se pueden llevar a cabo en la proteína o en el péptido. A continuación se describe una serie de reacciones, que se usan para el marcaje diferencial. Los péptidos se pueden modificar, por ejemplo, con parejas de reactivos: isocianato de metilo /
isocianato de trideuterometilo (v); isocianato de etilo / isocianato de pentadeuteroetilo (vi); isocianato de fenilo / isocianato de pentadeuterofenilo (vii); acetil-N-hidroxisuccinimida / trideutero-acetil-N-hidroxisuccinimida (viii). Se sabe que todos estos compuestos reaccionan específicamente y cuantitativamente con los grupos \alpha-NH_{2} y \varepsilon-NH_{2}. La elección final del reactivo de alteración, dependerá de la disponibilidad de la forma deuterada, precio, estabilidad química y comodidad del laboratorio del reactivo. Otro aspecto importante es la estabilidad del aducto durante la etapa de ionización en el espectrómetro de masas. A continuación se dan las ecuaciones de las reacciones para cada uno de estos reactivos en su forma deuterada.

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En el caso de que se requieran diferencias de masas mayores entre los péptidos "ligeros" y "pesados", entonces se pueden usar grupos deuterados mayores o grupos en los que se combina ^{13}C, ^{15}N y deuterio. Por ejemplo, el uso de un grupo hidroxibutirilo (HO-CD_{2}-CD_{2}-CD_{2}-CO-) para marcar específicamente el extremo NH_{2} permitiría crear una diferencia de 6 uma. Alternativamente, el uso del grupo ^{13}CD_{3}-^{13}CD_{2}-CO-propionilo para marcar el extremo NH_{2} permitiría crear una diferencia de 7 uma. Incluso más explícitamente, el uso del derivado de nicotinoilo marcado con ^{13}C y deuterado (N^{13}C_{5}D_{4}CO-) permitiría usar una diferencia de masa de 9 uma. Los expertos en la técnica sabrán que a partir de todos estos grupos se pueden sintetizar los ésteres de N- hidroxisuccinimida o sulfo-N-hidroxisuccinimida.

También está claro que D representa deuterio ^{2}H en las fórmulas descritas en esta invención.

Los péptidos también se pueden alterar por formación de la base de Shiff con acetol deuterado seguido de reducción con borohidruro sódico (Geoghegan y col., 1979). Se ha descrito que esta reacción transcurre en condiciones suaves y conduce a la adición de sólo una molécula de acetol por grupo amino, creando una amina secundaria (ix). La amina deuterada ahora contendrá cinco átomos de deuterio no intercambiables y se separará 5 uma de su homóloga no deuterada. Los péptidos se alteran tanto en el grupo \alpha-NH_{2} como en los grupos \varepsilon-NH_{2} de las lisinas, conduciendo a un aumento de masa de cinco (para los péptidos con arginina) o diez uma (para los péptidos con lisina). Las reacciones subyacentes se muestran a continuación.

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Los ejemplos citados aquí representan sólo algunas ilustraciones de un amplio espectro de reacciones de alteración que se pueden usar para el marcaje isotópico diferencial.

Ejemplo 17 Una presentación proteómica diferencial cuantitativa para medir las relaciones molares de proteínas en una muestra

El procedimiento para la identificación de proteínas mediante sus péptidos representativos usando la espectrometría de masas es cualitativo pero no cuantitativo. De hecho, los péptidos muestran pérdidas diferenciales después de su purificación y los péptidos pueden ionizar de una forma muy variable e impredecible dependiendo de su naturaleza química y de los otros péptidos que están presentes en la mezcla. Este fenómeno es conocido en el campo de la EM como supresión de la ionización (Krause y col., 1999). Sin embargo, como se demuestra en el ejemplo 16, la espectrometría de masas se convierte en cuantitativa cuando una de las dos muestras se puede marcar con una marca isotópica que no diferencie los péptidos químicamente, pero que se peda distinguir y medir en el espectrómetro de masas. Ahora se usa el mismo principio del marcaje isotópico diferencial con el fin de medir las proporciones relativas de proteínas en una sola muestra. Esto se puede hacer añadiendo a la muestra cantidades conocidas de péptidos de referencia. Estos son péptidos que se obtienen de proteínas presentes en la muestra, y de los cuales la secuencia es suficiente para identificar sin ambigüedad su proteína de origen. Los péptidos de referencia también se seleccionan preferiblemente como péptidos aislados fácilmente que además ionizan bien en la espectrometría de masas. en el protocolo que selecciona péptidos señalizados con metionina (péptidos con Met-SO), los péptidos de referencia son péptidos que contienen metionina que preferiblemente también contienen un resto arginina o que se tratan para una ionización eficaz. Cada proteína que se va a cuantificar debe estar representada por al menos uno y preferiblemente dos o más péptidos de referencia. Los péptidos de referencia deben diferir de sus homólogos sintéticos por un marcaje isotópico diferencial que es suficientemente grande para distinguir ambas formas en los espectrómetros de masas convencionales. Como ya se ha señalado en el presente documento, es suficiente una diferencia de 4 uma. Dicha diferenciación isotópica se puede obtener de diferentes maneras y aquí se proporcionan algunos ejemplos. De forma más conveniente, se generan péptidos de referencia marcados isotópicamente mediante digestión con tripsina de la mezcla de proteínas en H_{2}^{18}O. Los homólogos sintéticos correspondientes de los péptidos de referencia se sintetizan con sus isótopos naturales. Dicha síntesis química se lleva a cabo a gran escala usando el Multiple Peptide Synthesizer (Zuckermanny col., 1992).

A continuación se resume un ejemplo de un protocolo para determinar la cantidad de una proteína diana en una muestra particular que contiene proteínas: (i) se selecciona un péptido de referencia de la proteína diana, (ii) se sintetiza el homólogo sintético correspondiente, (iii) la muestra de proteínas se hace digerir con tripsina en presencia de H_{2}^{18}O, (iv) se añade una cantidad conocida del péptido de referencia sintético a la mezcla peptídica de proteínas (preferiblemente, la cantidad de péptido de referencia sintético es comparable a la cantidad esperada de péptido de referencia), (v) la mezcla se somete a la invención para separar los péptidos señalizados, (vi) los péptidos señalizados, se analizan, por ejemplo, por MALDI-TOF-MS, (vii) el péptido de referencia y el péptido de referencia sintético coeluirán en el procedimiento y aparecerán como picos gemelos en el espectro de masas, (viii) se calcula el área de cada uno de los picos gemelos, (ix) la relación entre los dos picos permite calcular la cantidad del péptido de referencia, y correspondientemente la cantidad de la proteína diana en la muestra particular. Obviamente, este protocolo también se puede usar para los péptidos de identificación, y se puede adaptar de diferentes formas. Por ejemplo, se puede ampliar fácilmente a la determinación de la cantidad de múltiples proteínas diana (incluso más de 100) en una muestra, y así medir los niveles de expresión de muchas proteínas diana en una muestra dada. Obviamente esta estrategia también se puede usar para medir y comparar la cantidad de proteínas diana en un número de muestras grande. Estos resultados se pueden usar, por ejemplo, para pronosticar, seguir o diagnosticar enfermedades o el efecto y efectos secundarios de fármacos.

En una estrategia alternativa, los péptidos sintéticos llevan los isótopos poco comunes, mientras que los péptidos de referencia generados a partir de las proteínas son isótopos naturales. Por ejemplo, si se seleccionan los péptidos que contienen metionina, se pueden incorporar en los péptidos de referencia sintéticos la metionina deuterada (CH_{3}SCD_{2}CD_{2}CH(NH_{2})COOH) disponible en el comercio, añadiendo 4 uma a la masa total del péptido. Alternativamente, los péptidos de referencia sintéticos también contienen arginina deuterada que ahora añade 7 uma a la masa total del péptido. Debe quedar claro que en este protocolo se puede considerar todo aminoácido del que existan formas deuteradas, con ^{15}N o ^{13}C. Todavía otra estrategia alternativa es diseñar los péptidos de referencia sintéticos con un grupo unido coloreado, fluorescente o que se pueda medir de otra forma. Introduciendo una marca coloreada universal, que presente el mismo coeficiente de extinción molar para todos los péptidos de referencia, será fácil cuantificar la cantidad de cada péptido de referencia. El grupo cuantificable debe unirse al grupo con un anclaje o conector que sea suficientemente estable durante la conservación normal, pero que sea liberado de los péptidos de referencia por procedimientos químicos o enzimáticos controlados. Por ejemplo, un colorante coloreado tal como un grupo 2,4,6-trinitrobencenosulfonato (coeficiente de absorción molecular máximo de 557 nm) se puede unir mediante una secuencia conectora de Ala-Lys al péptido de referencia (Freedman and Radda, 1968). La digestión con tripsina, que normalmente se lleva a cabo para generar la mezcla peptídica de la lisina total, ahora también escindirá los péptidos de referencia en el extremo COOH unido al resto lisina, y así liberará el colorante y el conector del resto del péptido (x).

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Cuando la digestión de la proteína se lleva a cabo en H_{2}^{18}O, en presencia de péptidos de referencia coloreados, entonces los péptidos de referencia liberados también se convierten en isotópicamente marcados en su extremo COOH libre. Por lo tanto, la digestión con tripsina de los péptidos coloreados se hace por separado en H_{2}^{16}O, y sólo se añade a la mezcla peptídica total al final de la digestión. El conector entre el colorante y el péptido de referencia también se puede escindir químicamente en condiciones en las que el resto del péptido no se afecte.

Ejemplo 18 Análisis del proteoma de Escherichia coli (cepa K12)

Se separaron 10^{9} células de E. coli K12 de una fase de crecimiento estacionaria cultivada, se sedimentaron por centrifugación suave, se lavaron cuatro veces con 1 ml de NaCl 100 mM en tampón de fosfato 20 mM pH 7,2, y se lisaron con ultrasonidos en 1 ml de urea 4 M en tampón de fosfato 100 mM pH 8,0. El lisato se clarificó por centrifugación a 100.000 x g en una ultracentrífuga Airfuge, después de lo cual la concentración de urea se disminuyó a 1 M usando tampón de fosfato 100 mM a pH 8,0. Se añadieron 10 \mug de tripsina a 1 ml de mezcla de proteínas (correspondiente a 250.10^{6} células de E. coli) y la digestión se dejó transcurrir toda la noche a 37ºC, y se paró por acidificación con TFA. Una quinta parte de la mezcla peptídica de proteínas obtenida (correspondiente a 50.10^{6} células de E. coli) se cargó en una columna de HPLC de fase inversa C18 2,1 mm d.i. x 25 cm equilibrada con TFA al 0,1% (disolvente A). La columna primero se lavó durante 10 min con 5% del disolvente B (acetonitrilo al 70% en TFA al 0,09%), después de lo cual se usó un gradiente lineal de concentraciones crecientes de disolvente B para eluir los péptidos de la fase estacionaria de la columna: el caudal se mantuvo a 80 \mul/ml y se fijó un gradiente de 1% de disolvente B/min. Se recogieron fracciones de 1 min (es decir, 80 \mul). La primera fracción se recogió 18 min después de iniciar el gradiente y se numeró con el 10. A esta fracción le siguieron 39 fracciones adicionales de 80 \mul, y en la última fracción (fracción 49), la concentración del disolvente B alcanzó el 63% que correspondía a aproximadamente acetonitrilo al 44%. Se continuó el gradiente durante 37 min sin recoger fracciones y se terminó 105 min después del inicio de la serie de HPLC. En la Fig. 10 se muestra el perfil de absorbancia UV (a 214 nm) de esta serie (aquí denominada serie primaria). Todas las fracciones recogidas se secaron a vacío y se almacenaron a -20ºC hasta el uso posterior. Las fracciones que se mezclaron para las series secundarias se volvieron a disolver en 59 \mul de TFA al 1%, y se hicieron 0,5% en H_{2}O_{2} por adición de 1 \mul de solución madre de H_{2}O_{2} al 30%. La reacción de oxidación se dejó transcurrir durante 30 min a 30ºC, después de lo cual la muestra no se secó sino que se usó inmediatamente para la cromatografía. Usando un separados de péptidos de una sola columna (véase el ejemplo 11), se combinaron las fracciones 10, 22, 34 y 46 para la primera serie secundaria (serie 2A) y se recogieron los péptidos con metionina oxidada en los intervalos de tiempo 4-7, 16-19, 28-31 y 40-43. Para la mezcla de las otras fracciones de la serie primaria, se usaron las combinaciones y tiempos de recolección resumidos en la Tabla IVA. En la Fig. 11 se muestra el perfil de absorbancia UV de una serie secundaria típica (serie 2A en la que se combinaron las fracciones 10, 22, 34 y 46). Los intervalos de tiempo durante los cuales se recogieron estos péptidos se muestran entre las barras en la Fig. 11. Durante este periodo de 4 min, los péptidos se recogieron en ochos fracciones consecutivas de 30 segundos cada una (es decir, fracciones de 40 \mul). En total se obtuvieron 32 fracciones de la serie 2A. Se ejecutaron consecutivamente once series secundarias adicionales con el fin de cubrir el conjunto completo de péptidos (Tabla IVA). Se añadió una suspensión de perlas Poros® 50 R2 hidrófobas a las fracciones recogidas (Gevaert y col., 1997) y las fracciones se secaron a vacío. Los péptidos concentrados en las perlas añadidas se desorbieron en 0,7 \mul de solución de matriz MALDI (que contenía ácido \alpha-cianocinámico al 4% y ácido 2,5-dihidroxibenzoico al 1%) en TFA al 1%-acetonitrilo (1/1) y se transfirieron a la diana MALDI para el análisis de masas de los péptidos en el modo reflectrón (que permite el seguimiento y verificación rápidos de los péptidos que contienen sulfóxido de metionina). La Fig. 15 muestra los espectros de MALDI-TOF-MS de dos fracciones de la serie secundaria 2A en la que como se esperaba sólo se observaron péptidos con sulfóxido de metionina. Después del análisis de todos los péptidos presentes en las 320 fracciones secundarias recogidas, se pudieron medir 1720 péptidos diferentes de los cuales 1618 contenían al menos un resto metionina. Las masas medidas de estos 1618 péptidos están listadas en la Tabla IX. La Figura 18 muestra para cada fracción de la serie primaria, el número de péptidos con Met-SO (azul) frente a los péptidos de los cuales no se pudo demostrar que contuvieran una Met oxidada (rojo).

Esto se debe al hecho de que la pérdida de masa neutra típica de ácido metanosulfénico no se observaba claramente, o a que entraron algunos péptidos que no contenían metionina durante el procedimiento de separación. En este experimento, se verificó que los péptidos separados consistían en el 94% de los péptidos de los cuales se podía verificar la presencia de Met. Esto ilustra la especificidad del sistema de separación de la invención, incluso cuando se usaron lisatos celulares totales.

En una segunda etapa ahora se identificaron los péptidos separados y sus correspondientes proteínas. Por lo tanto, otra vez se hizo digerir 1 ml de mezcla de proteínas preparada a partir de 250.10^{6} células de E. coli K12 en urea 1 M y tampón de fosfato 0,1 M, pH 8,0. Se añadieron 10 \mug de tripsina y la digestión se dejó transcurrir toda la noche a 37ºC. Al final de la digestión, la mezcla de peptídica de proteínas resultante se redujo con tributilfosfina durante 5 min y se acidificó con ácido fórmico (concentración final 1%). Una quinta parte de la mezcla peptídica de proteínas obtenida (correspondiente a 50.10^{6} células de E. coli) se cargó en una columna de HPLC de fase inversa C18 (DI 2,1 mm x 250 mm; Vydac 218MS52). Esta columna se equilibró con HCOOH al 0,05% como disolvente A. La columna primero se lavó durante 10 min con 100% de disolvente A. Se usó un gradiente lineal de 1% de disolvente B/min (el disolvente B es HCOOH al 0,05% en acetonitrilo al 70%) para eluir los péptidos con un caudal de 80 \mul/min. Los perfiles de absorbancia UV de los péptidos se registraron a 214 nm usando un detector de UV (Applied Biosystems Inc., 759A Absorbance Detector). Se recogieron fracciones de 1 min. La primera fracción se recogió 30 min después de empezar el gradiente y se numeró como la 30. Se recogieron 50 fracciones más hasta la número 80. Todas las fracciones recogidas se secaron a vacío y se almacenaron a -20ºC hasta su uso posterior. Las fracciones que se habían mezclado para las series secundarias se volvieron a disolver en 59 \mul de TFA al 1% y se hicieron 0,5% en H_{2}O_{2} por adición de 1 \mul de solución madre de H_{2}O_{2} al 30%. La reacción de oxidación (la etapa de alteración para la metionina como aminoácido específico, de acuerdo con la presente invención) se deja transcurrir durante 30 min a 30ºC, después de lo cual la muestra no se seca sino que se carga inmediatamente en la columna RP para la serie secundaria. Usando un separador de péptidos de una sola columna descrito en el ejemplo 11, se combinaron las siguientes fracciones de la serie primaria: 41, 54, 67 y 80, y se recogieron los péptidos oxidados (los péptidos señalizados) en los respectivos intervalos de tiempo 31-39, 44-52, 57-65 y 70-78. Las fracciones mezcladas de la serie primaria y las fracciones recogidas de la serie secundaria se indican en la Tabla X. En contraste con el ejemplo previo donde los péptidos señalizados se recogieron en intervalos de tiempo de 4 min, ahora se recogieron los péptidos señalizados en un intervalo de tiempo de 8 min (8 fracciones de 80 \mul cada una) y 1 min antes de la elución de los péptidos inalterados. Así, \delta_{max} = 10 min, \delta_{min} = 1 min y w_{2} = 8 min con w_{1} = 1 min. Puesto que cada serie secundaria contenía cuatro ventanas combinadas (w_{2}), los péptidos con Met-SO (por lo tanto los péptidos señalizados alterados en la metionina) se recogieron en 32 fracciones de 80 \mul cada una. Después se combinaron todas las fracciones secundarias numeradas de forma desigual, se secaron y se volvieron a disolver en 45 \mul de disolvente A (= HCOOH al 0,05%); la mitad de esta mezcla se cargó en una nanocolumna de 0,075 mm de DI (15 cm de longitud) (C18 Pepmap, LC Packings) conectada a una columna de captura y un HPLC Applied Biosystems Inc. 120A Analyzer. Se formó un gradiente desde 0% de B a 100% de B en 220 minutos, con HCOOH al 0,05% como disolvente A y HCOOH al 0,05% en acetonitrilo al 70% como disolvente B. El caudal del disolvente distribuidor previo de 60 \mul/min se redujo a aproximadamente 200 nl/min usando un distribuidor de flujo (Acurate, LC Packings). Los péptidos eluídos se introdujeron en una aguja de sílice pirronizada recubierta de metal (FS360-20-10-D-5-C7, New Objective) en la fuente de iones de pulverización Z de un espectrómetro de masas Q-TOF (Micromass UK Limited, Altincham, Reino Unido). Los datos se analizaron en el modo de adquisición dependiente de datos Masslynx NT (versión 3.4). Se seleccionaron automáticamente sólo los iones doblemente cargados para el análisis por MS/MS. El umbral se fijó en 40 recuentos/s y los iones seleccionados se fragmentaron durante 4 s por colisión con átomos de argón. Se acumularon todos los espectros de MS/MS y se analizaron por MASCOT (Matrix Science Ltd, Londres) usando una base de datos de proteínas que contenía sólo proteínas de E. coli. La identificación sin ambigüedad se basó en la "puntuación Mowse basada en probabilidad" de MASCOT (Perkins y col., 1999). La otra mitad de cada una de las fracciones se sometió a nanoLC-MS/MS usando una lista de inclusión que contenía todos los iones doblemente cargados detectados en la serie previa. Ahora el umbral se fijó en 25 recuentos/min y los iones seleccionados se fragmentaron durante 5 s. Se repitió el mismo procedimiento para las fracciones numeradas regularmente. Finalmente se combinaron todos los datos de identificación de proteínas. A partir de todas las series de nano-LC-MS/MS, se generaron un total de 6437 espectros de CID (Tabla XI). Estos espectros de CID dieron como resultado 2543 espectros anotados después de someterlos al servidor MASCOT.

Una identificación de los péptidos con Met-SO separados de todas las fracciones condujo a la identificación de aproximadamente 767 péptidos de E. coli diferentes (Tabla XII). Cada proteína estaba cubierta por una media de 2,2 péptidos que contenían metionina por proteína.

Se identificaron todas las proteínas ribosómicas detectables, que representaban aproximadamente 10% de la masa total de proteínas de E. coli cercanas a las familias de proteínas minoritarias tales como las aminoacil-t-ARN-sintasas y cercanas a proteínas muy minoritarias tales como el represor de lac (confirmado por tres péptidos con Met aislados independientemente) y al menos otros 19 represores. Estos resultados ilustran el grado del intervalo dinámico alcanzado por la invención, que permite detectar proteínas poco abundantes en presencia de proteínas mayoritarias. Además también se identificó un número importante de proteínas de membrana conocidas y proteínas con un perfil hidrófobo alto, sugiriendo un mejor acceso a la amplia matriz de proteínas de membrana biológicamente importantes.

Cuando se analizó una cantidad doble de células de E. coli (100.10^{6} células) por análisis en gel 2D convencional, seguido de identificación de proteínas basada en MALDI, se identificaron 86 proteínas.

Comparado con las 767 proteínas en el estudio libre, hay una sensibilidad que es al menos diez veces y más probablemente incluso mucho mayor para este último. También es importante subrayar que la contaminación por queratinas de la piel humana, que se observa a menudo como "el clásico contaminante" cuando se hace la cromatografía en geles 2D, se reduce notablemente e incluso está completamente ausente cuando se usan los procedimientos de la invención. Estos análisis se llevaron a cabo con un equivalente de 50.10^{6} bacterias E. coli. Esto corresponde a cantidades de proteínas presentes en \pm50.000 a 100.000 células animales, que ilustra la alta sensibilidad de la técnica. La invención permite determinar el proteoma partiendo de números pequeños de células. Esto permite analizar la expresión diferencial de proteínas en situaciones que están fuera del alcance de las aplicaciones convencionales. La presente invención permite analizar la expresión de proteínas en biopsias de tumores pequeños, en subregiones pequeñas del cerebro, en células que se han seleccionado por separación celular, en subregiones pequeñas del corazón, en lugares de formación de placa en los vasos sanguíneos, etc. Los procedimientos de la presente invención separan eficazmente los péptidos con metionina de las mezclas altamente complejas. Además, los péptidos señalizados no se obtienen de una vez sino que se separan gradualmente en muchas fracciones y por lo tanto se alimentan en el espectrómetro de masas de una forma continua que garantiza una detección mucho más eficaz. Esto se ilustra mejor mediante la detección de 1618 péptidos con Met de un proteoma de E. coli usando la detección de MALDI-TOF-MS de eluatos de las series secundarias.

Hay que indicar que si se desea, los procedimientos de la presente invención se pueden llevar a cabo sin usar productos químicos tóxicos o corrosivos. Por ejemplo, el acetonitrilo se puede sustituir por etanol y el TFA por tampón de NH_{4}Ac sin afectar a la calidad global de la separación.

Ejemplo 19 Análisis del proteoma parcial del plasma humano

Como material de partida se usó 1 ml de plasma humano liofilizado (que contenía aproximadamente 60 mg de material proteínica y esencialmente sin células contaminantes). La muestra seca se volvió a disolver en 1 ml de urea 8 M recién preparada que contenía tributilfosfina al 2% y Tris-HCl 50 mM a pH 8,7. Antes de la digestión, la concentración de urea se diluyó 4 veces por adición de 30 ml de tampón de Tris-HCl (pH 8,7). Una fracción de esta muestra, 200 \mul (que correspondían a aproximadamente 3 mg de material proteínico), se usó para la digestión de las proteínas con 20 \mug de tripsina (tripsina modificada de calidad para secuenciación de Promega, Madison, WI, EE.UU.). La digestión transcurrió durante la noche a una temperatura constante de 37ºC y se paró por acidificación. La mitad de esta mezcla de digestión se preacondicionó pasando los péptidos por una columna RP Sample Cleanup (Agilent Technologies) (D.I. 2,1 mm x 20 mm, empaquetada con perlas RP VydacC18), usando un gradiente pronunciado de acetonitrilo en TFA al 0,1%. Se generó un gradiente lineal de 0% de disolvente B (acetonitrilo al 70% en TFA al 0,1% en agua) a 100% de disolvente B, durante 14 min con un caudal de 0,2 ml/min. Se recogió el eluato total, se secó a vacío y se volvió a disolver en 100 \mul de disolvente a (TFA al 0,1% en agua).

Después, la mezcla peptídica de proteínas se sometió al procedimiento de separación. Después de cargar la mezcla peptídica, las columnas se aclararon con TFA al 0,1% en agua (Baker Analysed HPLC, Mallinckrodt Baker B.V., Deventer, Holanda) (disolvente A) durante 20 min con un flujo constante de 1 ml/min usando un analizador Waters ACTION (Waters Corporate, Milford, MA, EE.UU.). Posteriormente, se usó un gradiente lineal a 70% de acetonitrilo (Baker Analysed HPLC) en TFA al 0,1% en agua (100% de disolvente B) en 70 min (por lo tanto un aumento de 1% de disolvente B por min) para eluir los péptidos de la columna de RP. En una última fase, la columna se aclaró con disolvente B y se volvió a equilibrar con disolvente A antes de la siguiente inyección de muestra. En la serie I los péptidos que eluían en un marco de tiempo entre 28 min (que correspondía a 1,4% de disolvente B u 8% de acetonitrilo) y 70 min (71,4% de disolvente B o 50% de acetonitrilo) se recogieron en fracciones de 1 min (o 1 ml) usando un manipulador de líquidos Gilson SAS, Villers LeBel, Francia). Así, se recogieron un total de 42 fracciones primarias.

Cada fracción primaria se secó hasta sequedad completa antes de la oxidación de los restos de metionina. Las fracciones primarias que se podían mezclar para las series secundarias (en un sistema análogo al descrito en la Tabla IVA) se volvieron a disolver en 100 \mul de TFA al 1% al que se añadieron 2 \mul de H_{2}O_{2} al 30%. La reacción de oxidación de los restos de metionina transcurrió durante 30 min a 30ºC, después de lo cual, las fracciones primarias se mezclaron y cargaron en la misma columna de RP-HPLC que se usó para la separación primaria, y los péptidos se fraccionaron en esta serie secundaria en las condiciones exactamente iguales a las de la serie primaria. Aquí, se recogieron los péptidos señalizados en un intervalo de tiempo de 8 min (8 subfracciones de 1 ml cada una), entre 9 y 1 min antes de la elución de los péptidos inalterados. Los análisis de LC-MS/MS se llevaron a cabo en los péptidos separados de las dos fracciones primarias. Por lo tanto, los péptidos separados recogidos de la fracción primaria 25 se combinaron todos, se secaron y se volvieron a disolver en 200 \mul de disolvente A (ácido fórmico al 0,05% en agua), y una quinta parte de esta mezcla se cargó en una nano-columna de 0,075 mm de D.I. (15 cm de longitud) (C18 Pepmap, LC Packings) conectada a una columna de captura y un HPLC analizador Applied Biosystems Inc. 120A Analyzer HPLC. Se hizo lo mismo para todos los péptidos separados de la fracción primaria 26.

Se formó un gradiente de 0% de B a 100% de B en 220 minutos, con HCOOH al 0,05% como disolvente A y HCOOH al 0,05% en acetonitrilo al 70% como disolvente B. El caudal del disolvente predistribuidor de 60 \mul/min se redujo a aproximadamente 200 nl/min usando un distribuidor de flujo (Acurate, LC Packings). Los péptidos eluídos se introdujeron mediante una aguja de sílice pirolizada recubierta de metal (FS360-20-10-D-5-C7, New Objective) en el espectrómetro de masas Q-TOF de fuente de iones por electropulverización Z (Mi-cromass UK Limited, Altincham, Reino Unido). Los datos se analizaron en un modo de adquisición dependiente de datos usado Masslynx NT (versión 3.4) y los iones doblemente cargados se seleccionaron automáticamente para el análisis por MS/MS. El umbral se fijó en 40 recuentos/s y los iones seleccionados se fragmentaron durante 4 s por colisión con átomos de
argón.

Se acumularon todos los espectros de MS/MS y se analizaron por MASCOT (Matrix Science Ltd, Londres) usando una base de datos de proteínas SWISS-PROT (Versión 40.10) y que restringía la búsqueda a proteínas humanas. La identificación se basó en la "puntuación Mowse basada en probabilidad" (Perkins y col., 1999). Después de la primera serie de LC-MS/MS, se hicieron listas de exclusión de iones y se usaron para las posteriores series de LC-MS/MS, de forma que aumentara el número de péptidos que eran analizados. Ahora el umbral se fijó en 25 recuentos/s y los iones seleccionados se fragmentaron durante 5 s.

Los datos de identificación de las proteínas resultantes de estas cuatro series de LC-MS/MS se combinaron y se muestran en la Tabla XIII. Como puede observarse, estaban presentes proteínas del plasma con abundancia de alta a moderada, tales como albúmina del suero (concentración de aproximadamente 3 a 4 g por 100 ml), alfa-microglobulina, apoliproteína B-100 y cadena beta del fibrinógeno, al lado de proteínas (nucleares) inesperadas como la subunidad del factor de religación U2AF de 35 kDa y una proteína de dedo de cinc. Este análisis limitado del proteoma de plasma humano ya demuestra claramente el alto intervalo dinámico de la técnica; se identifican proteínas muy abundantes junto con proteínas muy escasas. Además es importante indicar que las proteínas minoritarias se podrían identificar sin la eliminación previa de los componentes mayoritarios tales como albúmina de suero y los anticuerpos. Además, el volumen correspondiente al plasma que se usó para estos estudios de LC-MS/MS está en el intervalo de 1 microlitro, que ilustra la sensibilidad final de esta técnica.

Ejemplo 20 Análisis del proteoma parcial de trombocitos humanos

El material celular de la capa leucocitaria de una extracción de sangre humana, que contiene aproximadamente 500 x 10^{9} plaquetas se dividió en dos fracciones iguales y se centrifugó durante 10 min a 1.000 x g. Las plaquetas sedimentadas se lavaron 3 veces con 10 ml de tapón Tyrode I en el cual se omitió el BSA, cada vez seguido de una etapa de centrifugación durante 10 min a 1.000 x g, y finalmente se suspendieron en un total de 10 ml de tampón Tyrode I sin BSA (Ardlie y col., 1970). La suspensión de plaquetas se lisó por adición de 10 ml de Triton X-100 al 0,5% en tampón de fosfato sódico 25 mM a pH 7,5, que contenía un cóctel inhibidor de proteasa (Complete®, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). La suspensión de plaquetas lisadas se centrifugó durante 10 min a 10,000 x g para separar la fracción del citoesqueleto (Fox y col., 1993), después de lo cual se desalaron 2.5 ml de la mezcla de proteínas (es decir, un equivalente de 62,5 x 10^{9} plaquetas) en 3,5 ml de tampón de fosfato sódico 10m M a pH 9.0 en una columna Sephadex®G-25 M (columna PD-10, Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia). La mezcla de proteínas desalada se concentró a 1 ml en un concentrador de vacío centrífugo, se hirvió durante 5 min en un baño de agua y se puso en hielo durante 15 min. Se generó una mezcla peptídica de proteínas por digestión durante la noche de las proteínas con 20 \mug de tripsina (tripsina modificada de calidad para secuenciación, de Promega, Madison, WI, EE.UU.) a 37ºC.

Se inyectó una fracción de la digestión de proteína, 50 \mul, que correspondía al material de proteína extraído de aproximadamente 3 x 10^{9} plaquetas, en una columna de fase inversa de calibre pequeño ZORBAX® 300SB-C18 (D.I. 2,1 x 150 mm, Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) acoplada con un sistema de CL capilar Agilent Serie 1100 controlado por los módulos de software de Agilent ChemStation. Después de inyectar la muestra, se desarrolló un gradiente de disolvente con un flujo constante de 80 \mul/min. Primero, la columna se aclaró con TFA al 0,1% en agua (Baker Analysed HPLC, Mallinckrodt Baker B.V., Deventer, Holanda) (disolvente A) durante 10 min, seguido de un gradiente lineal hasta 70% de acetonitrilo (Baker Analysed HPLC) en TFA al 0,1% (disolvente B) en 100 min (por lo tanto un aumento de 1% de disolvente B/min) (serie primaria). Los péptidos se recogieron en un total de 48 fracciones de 1 min (o 80 \mul) cada una, en una microplaca de valoración usando el colector de fracciones Agilent Serie 1100, empezando a los 40 min (que correspondía a una concentración de 30% de disolvente B). Las fracciones que estaban separadas 12 min (véase la Tabla XIV) se mezclaron y secaron hasta sequedad completa en un concentrador de vacío de centrífuga.

Las fracciones secadas se volvieron a disolver en 70 \mul de TFA al 1% en agua y se pusieron en el muestreador de placa de pocillos Agilent Serie 1100. La reacción de oxidación de metionina transcurrió automáticamente en este compartimento transfiriendo 14 \mul de solución acuosa de H_{2}O_{2} al 3% reciente, al vial que contenía la mezcla peptídica. Esta reacción transcurrió durante 30 min a una temperatura constante de 30ºC, después de lo cual la muestra se inyectó inmediatamente en la columna de RP-HPLC. En las condiciones experimentales dadas, los péptidos que contienen sulfóxido de metionina generalmente eluyen en un marco de tiempo de 7 min a 1 min antes del tiempo equivalente de la fracción primaria correspondiente (véase la Tabla XIV), y se recogieron en 8 subfracciones. Después de recoger los péptidos con Met-SO, todas las subfracciones numeradas de igual forma se mezclaron, p. ej., para la serie 2A (Tabla XIV) se mezclaron las fracciones 12.1, 24.1, 36.1 y 48.1, y se secaron hasta sequedad completa antes del análisis por LC-MS/MS.

Los péptidos presentes en las subfracciones mezcladas y secadas de una serie secundaria, se disolvieron en 20 \mul de ácido fórmico al 0,1% en una mezcla de acetonitrilo/agua (2/98, en volumen) (disolvente A), de la cual se inyectaron automáticamente 10 \mul en una columna de captura de D.I. 0,3 mm x 5 mm (PepMap, LC Packings, Ámsterdam, Holanda) con un caudal de 20 \mul/min de disolvente A (tiempo total de carga 5 min) con un sistema CapLC (Micromass UK Limited, Cheshire, Reino Unido). Moviendo la válvula de corriente, la columna de captura se vuelve a purgar con un gradiente de disolvente binario, que empieza simultáneamente con el ciclo de inyección, y de esta forma la muestra se carga en una columna de fase inversa C18 de nanoescala (columna D.I. 0,75 x 150 mm PepMap®, LC Packings). El sistema de suministro de disolvente se hizo funcionar a un flujo constante de 5 \mul/min y usando un distribuidor de flujo 1/25, se dirigieron 200 nl/min de disolvente a través de la nanocolumna. Los péptidos eluyeron de la fase estacionaria usando un gradiente de 0% a 100% de disolvente B aplicado en 25 min. La salida de la nanocolumna estaba conectada en serie a una aguja de sílice pirolizada recubierta de metal PicoTip® (PicoTip® FS360-20-10-D-C7, New Objective, Inc., Wobum, MA, EE.UU.), puesta delante de la entrada de un espectrómetro de masas Q-TOF (Micromass UK Limited, Cheshire, Reino Unido). La adquisición dependiente de datos automática con el espectrómetro de masas Q-TOF se inició 15 min después de mover la válvula de corriente. Los parámetros de adquisición se eligieron de forma que sólo se seleccionaron los iones doble y triplemente cargados para la fragmentación. La válvula de corriente se volvió a mover 51 min después de empezar el ciclo de inyección.

Los espectros CID obtenidos en cada serie de LC-MS/MS se convirtieron automáticamente a un formato Mascot aceptable (formato pkl) usando Proteinlynx disponible en el software de Micromass' Masslynx software (versión 3.4). Las listas de picos del CID se usaron para la identificación de proteínas en una base de datos almacenada localmente que sólo contenía las secuencias humanas de SWISSPROT (Versión 40.10) usando el algoritmo de Mascot. Se usaron los siguientes parámetros de búsqueda: enzima: tripsina, número máximo de escisiones que faltan: 2, modificaciones fijadas: ninguna, modificaciones variables: oxidación (M), piro-Glu (E y Q N-terminal), tolerancia de péptidos: 0,3 Da, tolerancia de MS/MS: 0,25 Da y carga peptídica: 2+ o 3+. Se realizó un procesamiento discontinuo de conjuntos de resultados de Mascot, para obtener una lista final de los péptidos identificados. Sólo se conservaron los péptidos con las primeras clasificaciones de Mascot y los péptidos para los cuales la puntuación era menor que los umbrales de identidad o de homología se descartaron.

En la Tabla XV se presentan los resultados que se obtuvieron analizando los péptidos con sulfóxido de metionina separados de 8 fracciones primarias en dos series secundarias (2A y 2E, Tabla XIV). Se realizaron un total de 16 análisis de LC- MS/MS para secuenciar los péptidos señalizados. Usando un algoritmo de búsqueda en la base de datos MASCOR, se identificaron 201 péptidos que contenían al menos un resto de Met-SO. algunos péptidos señalizados, especialmente los de proteínas de plaquetas muy abundantes tales como la actina y miosina, estaban presentes en subfracciones consecutivas, explicando el hecho de que tras la "limpieza" de datos, sólo se podían retener 98 péptidos con Met-SO únicos. Estos péptidos con Met-SO correspondían a 74 proteínas diferentes (véase la Tabla XV). Algunas de las proteínas de plaquetas abundantes conocidas tales como la miosina, alfa-actinina, talina, vinculina y actina se identificaron mediante múltiples péptidos, sin embargo, una mayoría de proteínas, debido a su gran tamaño (por ejemplo, la talina (PM de 270 kDa) y la cadena pesada de la miosina (PM de 226 kDa), apenas se detectan en los geles 2D.

El intervalo dinámico de la tecnología de separación de péptidos de la invención para el análisis del proteoma ya es obvio en este conjunto limitado de datos. Por ejemplo, las proteínas poco abundantes, tales como las proteínas relacionadas con ras, que son difíciles de detectar en geles 2D, se identifican junto con las proteínas más abundantes tales como la actina, tubulina, las tropomiosinas, talina y miosina, que probablemente son al menos mil veces más abundantes en estas células. Es importante, que se identificaron 5 isoformas diferentes de estas proteínas (RAC1_HUMANO, RALA_HUMANO, RAPB-HUMANO, RB5A_HUMANO y RB5B_HUMANO) (Tabla XV), de las cuales, la RB5A-HUMANO, se identificó incluso con dos péptidos señalizados diferentes.

Una de las clases de proteínas que son difíciles de detectar en geles 2D son las proteínas hidrófobas. En el proteoma de plaquetas limitado de la invención, se han identificado proteínas muy hidrófobas tales como el dominio LIM y SH3 de la proteína 1 (valor GRAVY de -1,02), el precursor de calumenina (valor GRAVY de -1,01), y moesina (valor GRAVY de -0,98), que debido a su naturaleza hidrófoba normalmente son difíciles de detectar en geles 2D.

Ejemplo 21 Péptidos terminados en arginina amino-terminales acetilados del proteoma de trombocitos humanos

Como material de partida se usó una preparación citosólica y de esqueleto de membrana como se prepara en el ejemplo 20. Se secaron 1,5 ml de la mezcla de proteínas desalada (cantidad calculada de aproximadamente 9 mg a 300 nmoles de material de proteína total) en un concentrador de vacío de centrífuga a aproximadamente 1 ml. A esta mezcla de proteínas se añadió hidrocloruro de guanidinio sólido hasta una concentración final 4 M. Las proteínas se redujeron por adición de 40 \mul de tributilfosfina al 0,5% en n-propanol a esta mezcla e incubación durante 30 min a temperatura ambiente. Se añadieron 188 \mul de una solución recién preparada de yodoacetamida 40 nmol/\mul a la mezcla de proteínas reducida, y las proteínas se alquilaron durante 90 min a 37ºC en la oscuridad. La solución de proteínas se diluyó con agua hasta un volumen total de 1,5 ml, después de lo cual se desalaron 500 \mul de esta mezcla en una columna NAP®-5 (Amersham Pharmacia Biotech) y se recogió en 1 ml de Tris.HCl 250 mM, pH 7,9 que contenía hidrocloruro de guanidinio 250 mM. Esta mezcla de proteínas desalada se concentró a la mitad de su volumen por secado a vacío, se hirvió durante 5 min en un baño de agua, se puso en hielo durante 10 min, después de lo cual se añadieron 10 \mug de tripsina (tripsina modificada de calidad para secuenciación de Promega). La digestión proteolítica transcurrió durante la noche a una temperatura constante de 37ºC y se paró por acidificación con TFA.

Después de centrifugar para eliminar cualquier material insoluble, la mezcla peptídica obtenida se separó en una columna de HPLC de fase inversa (columna 4,6 D.I. x 250 mm RP-HPLC C18, Vydac Separations Group). Después de inyectar la muestra en la columna, se usó un gradiente de concentración creciente de acetonitrilo para fraccionar la mezcla peptídica. Primero, la columna se aclaró con TFA al 0,1% en agua (BAKER Analysed HPLC) (disolvente A) durante 5 min con u flujo constante de 1 ml/min usando con controlador de gradiente Waters y dos bombas de disolvente Waters Modelo 510. Posteriormente, se usó un gradiente lineal de 70% de acetonitrilo (BAKER Analysed HPLC) en TFA al 0m1% en agua (100% de disolvente B) en 70 min (por lo tanto, un aumento de 1% de acetonitrilo por min) para eluir los péptidos de la columna RP. En una última fase, la columna se aclaró bien con disolvente B y se volvió a equilibrar con disolvente a antes de la siguiente inyección de muestra. Se recogieron los péptidos que eluían entre 2 min (correspondiente a 0% de disolvente B) y 66 min (87,1% de disolvente B o 61% de acetonitrilo) en 16 fracciones primarias de 4 ml cada una.

Todas las fracciones primarias se secaron hasta sequedad completa en un concentrador de vacío de centrífuga y se volvieron a disolver en 1 ml de borato sódico 50 mM a pH 9,0. Para cada fracción primaria, se usó la mitad de la mezcla peptídica para bloquear los péptidos en sus grupos amino libres por adición de 3 \mul de solución acuosa de ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico 0,1 M (TNBS) (Sigma), mientras que la otro mitad se usó como testigo. La reacción transcurrió durante 60 min a 37ºC, después de lo cual se añadieron 3 \mul adicionales de TNBS 0,1 M y se incubó otra vez durante 60 min a 37ºC. La mayoría de los péptidos con TNB así como los subproductos de reacción del TNBS (p. ej., picrato) se extraen con 500 \mul de acetato de etilo (equilibrado con agua). Este procedimiento de extracción se repitió dos veces. La fase acuosa, que contenía los péptidos terminados en arginina y lisina libres y bloqueados en el grupo N- terminal (acetilados) se seca a vacío. La reacción de modificación con TNBS, como se ha descrito antes, se repite una segunda vez para permitir que reaccionen las trazas que queden de péptidos con un grupo amino libre. El producto seco se disuelve en disolvente A y se somete a una serie secundaria en la que se recogen péptidos en una ventana total de 7,5 min (empezando 2 min antes del inicio de la recolección de la fracción primaria original) en un total de 15 subfracciones de 500 \mul cada una. Cada subfracción se secó, se volvió a disolver en 20 \mul de ácido fórmico al 0,1% en una mezcla de acetonitrilo en agua (2/98 en volumen), de la cual se usaron 10 \mul para el análisis por LC-MS/MS y se usó para la identificación de proteínas como se describe en los ejemplos 19 y 20.

Como para la búsqueda en la base de datos basada en MASCOT, se usaron los siguientes parámetros de búsqueda: enzima: tripsina, número máximo de escisiones que faltan: 2, modificaciones fijadas: ninguna, modificaciones variables: acetilación (extremo N), oxidación (M), piro-Glu (E y Q N-terminal), tolerancia de péptidos: 0,3 Da, tolerancia de MS/MS: 0,25 Da y carga peptídica: 2+ o 3+. Se realizó un procesamiento discontinuo de conjuntos de resultados de Mascot, para obtener una lista final de los péptidos identificados. Sólo se conservaron los péptidos con las primeras clasificaciones de Mascot y que cumplían los umbrales de identidad y/u homología, y la Tabla XVI se combinan junto con sus correspondiente proteínas precursoras. Como se esperaba, después de los péptidos N-terminales bloqueados naturalmente (acetilados) que terminan con un residuo arginina, también se separan los péptidos que empiezan con un ácido piroglutámico y que empiezan con un resto prolina. Los primeros se deben a la formación de un resto cíclico bloqueante, mientras que las prolina N-terminal forma una amina secundaria, que no reacciona con TNBS.

Además de los péptidos identificados, se presenta una lista de 183 marcajes de secuencias peptídicas recién obtenidas de los espectros de MS/MS que no conducen a una identificación sin ambigüedad en la base de datos SWISSPROT usando el algoritmo de búsqueda de la base de datos MASCOT (Tabla XVII). La mayoría de los marcajes obtenidos son herramientas de búsqueda basadas en homologías tales como BLAST y PASTA. Lo más probable es que representan péptidos N-terminales acetilados de proteínas cuyas correspondientes secuencias todavía no están listadas en las bases de datos de secuencias disponibles.

Ejemplo 22 Un análisis de proteoma limitado basado en el aislamiento de péptidos NH_{2}-terminales de las proteínas presentes en los extractos de trombocitos humanos

A diferencia del ejemplo precio, aquí se modificó la química de alteración de modo que ahora se pueden aislar los péptidos de identificación NH_{2}-terminales de las proteínas presentes en la muestra, incluyendo las que tienen un extremo amino libre y las que lo tienen bloqueado, y usar para la identificación de proteínas.

Como material de partida se usó una preparación de esqueleto de membrana y citosólico de trombocitos humanos como se prepara en los ejemplos 20 y 21. Se concentraron 500 \mul de la mezcla de proteínas desalada (cantidad calculada de aproximadamente 3 mg) en un concentrador de vacío de centrífuga hasta aproximadamente 400 \mul. A esta mezcla de proteínas, se añadió hidrocloruro de guanidinio sólido hasta una concentración final 4 M. Las proteínas se redujeron por adición de trifenilfosfina (14 \mul de una solución reciente al 0,5% en n-propanol) durante 30 min a temperatura ambiente. Se añadieron 62,5 \mul de una solución recién preparada de yodoacetamida en H_{2}O 40 nmol/\mul a la mezcla de proteínas reducida, y las proteínas se alquilaron durante 90 min a 37ºC en la oscuridad. Posteriormente, esta mezcla se desaló en una columna NAP®-5 (Amersham Pharmacia Biotech) y se recogió en 1 ml de tampón de fosfato sódico 250 mM a pH 8,0 que contenía hidrocloruro de guanidinio 1 M. Este volumen se concentró hasta la mitad de su volumen en un concentrador de vacío de centrífuga. Se acetilaron tanto las aminas en \alpha como en \varepsilon por adición de un exceso molar de 50 veces de acetato de sulfo-N-hidroxisuccinimida sólida, e incubación de esta mezcla durante 90 min a temperatura ambiente. La posible acetilación de los grupos hidroxilo y COOH se invirtió por adición de 1 \mul de hidroxilamina a la mezcla de reacción de las proteínas. Antes de la proteolisis, la mezcla de proteínas se desaló en una columna NAP®-5 y se recogió en un volumen total de 1 ml de Tris.HCl 50 mM a pH 7,9, que contenía hidrocloruro de guanidina 250 mM. Esta mezcla de proteínas desalada se concentró hasta la mitad de su volumen por secado a vacío, se hirvió durante 5 min en un baño de agua, se puso en hielo durante 10 min, después de lo cual se añadieron 10 \mug de tripsina (tripsina modificada de calidad para secuenciación de Promega). La digestión proteolítica transcurrió durante la noche a una temperatura constante de 37ºC y se paró por acidificación con
TFA.

El procedimiento de separación de los péptidos amino-terminales acetilados se llevó a cabo en condiciones idénticas y en la misma columna de RP-HPLC descrita en el ejemplo 21. En la Tabla XVIII se muestran los resultados obtenidos después del análisis por LC-MS/MS de los péptidos amino-terminales separados de las dos fracciones primarias (9 y 10). Esto representa 1/8 del número total de fracciones. Se usó otra vez el algoritmo de MASCOT para identificar los péptidos fragmentados y los parámetros aquí se fijaron como se describe en el ejemplo 21, excepto que la acetilación de los restos lisina era una modificación variable adicional.

Este análisis parcial del proteoma produjo 26 proteínas diferentes que se pudieron identificar (véase la Tabla XVIII). Es interesante que las proteínas principales, tales como la actina, son identificadas después de las poco abundantes, tales como las quinasas y fosfatasas, y proteínas hidrófobas, tales como la proteína DAD-1, que se prevé que es una proteína integral de membrana. Además, como en el ejemplo 21, se han analizado una serie de iones de péptidos que no conducen a ninguna identificación usando el algoritmo de MASCOT, pero que dan espectros de fragmentación interpretables. Estos se interpretaron por primera vez, sin embargo, las 48 marcas de secuencias de péptidos (mostradas en la Tabla XIX) no condujeron a ninguna identificación sin ambigüedad usando herramientas de búsqueda en bases de datos basadas en homología de secuencias tales como FASTA y BLAST. Se supone que estas secuencias representan nuevas proteínas cuyas secuencias todavía no están disponibles en las bases de datos.

Ejemplo 23 Aislamiento específico de los péptidos COOH-terminales de proteínas en mezclas complejas

El procedimiento empieza con la conversión de las cisteínas de las proteínas con yodoacetamida o reactivos específicos para SH similares conocidos en la técnica. Después la mezcla de proteínas se hace digerir con tripsina, generando una mezcla peptídica de proteínas. Esta mezcla total de péptidos después se trata con un diazoderivado que forma éteres con la tirosina y ésteres con todos los grupos COOH, incluyendo los grupos COOH de la Arg y Lys en el extremo de los péptidos y los extremos COOH de los péptidos derivados de la parte COOH-terminal de las proteí-
nas.

Estos péptidos previamente tratados después se separan mediante cromatografía en fase normal o inversa, y los péptidos que eluyen se recogen en un número de fracciones que permite, en cada una de las fracciones recogidas, la separación de los péptidos alterados de los péptidos no alterados durante la serie secundaria.

En cada fracción se añade tripsina, los ésteres se vuelven a hidrolizar a los restos Arg y Lys, mientras que los ésteres del COOH, incluyendo el éster de los extremos COOH de las proteínas, que generalmente no consisten en restos Arg o Lys, no se vuelven a hidrolizar mediante la tripsina. Por lo tanto, todos los péptidos tratados con tripsina, excepto los péptidos COOH-terminales, son alterados y se desplazan durante la serie secundaria. Por lo tanto, los péptidos COOH-terminales se recuperan en la serie secundaria como péptidos no alterados en el mismo intervalo de tiempo en el que eluyeron durante la serie primaria.

Los candidatos de diazoderivados podrían ser el diazometano y fenildiazometano muy reactivos y tóxicos o más de forma más práctica los diazoderivados no volátiles, más estables y solubles en agua. Todos estos compuestos reaccionan con los grupos COOH a sus ésteres correspondientes o con los grupos fenólicos de los éteres correspondientes.

Los ésteres de los grupos COOH de Arg y Lys son sustratos de la tripsina y se hidrolizan de forma similar a los correspondientes enlaces peptídicos.

La reacción de hidrólisis del éster de benzoilo de la Lys COOH-terminal se representa en el esquema (xi).

7

Abreviaturas

2D: dos dimensiones

CAD: disociación activada por colisión

DTT: ditiotreitol

ESI: ionización por electropulverización

EST: marcadores de secuencia expresada

FTMS: espectrometría de masas por transformada de Fourier

ICAT: marcadores de afinidad codificado por isótopo

péptido ID: péptido de identificación

IPG: gradiente de pH inmovilizado

ITC: isotiocianato

LC: cromatografía líquida

LC-MS/MS: cromatografía líquida y EM en tándem

MALDI-RETOF-MS: TOF-MS con reflectrón MALDI

MALDI-TOF-MS: espectrometría de masas con ionización por desorción de láser asistida por matriz en tiempo de vuelo

Met-SO: sulfóxido de metionina

MS/MS: EM en tándem

EM: espectrometría de masas

PM: peso molecular

pI: punto isoeléctrico

PITC: isotiocianato de fenilo

PMF: huella de la masa peptídica

PSD: descomposición metaestable

PTC: feniltiocarbamilo

RP-HPLC: cromatografía líquida de alta eficacia de fase inversa

SDS: dodecil-sulfato sódico

TFA: ácido trifluoroacético

TABLA I

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TABLA II

9

10

TABLA III

12

TABLA IVA

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TABLA IVB

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TABLA IVC

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TABLA V

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TABLA VII

17

TABLA VI

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TABLA VIII

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TABLA IX

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TABLA IX (continuación)

21

TABLA IX (continuación)

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TABLA IX (continuación)

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TABLA IX (continuación)

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TABLA X

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TABLA XI Tabla que indica el número de espectros de MS/MS obtenidos que se obtuvieron y condujeron a la identificación de proteínas de E. coli

Número total de espectros CID	6.437
Número total de péptidos identificados	2.543	Tasa de éxito
		39,5%
Número de péptidos únicos	1.688
Número de proteínas únicas	767

TABLA XII

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TABLA XIII

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TABLA XIV

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TABLA XV

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TABLA XV (continuación)

68

TABLA XV (continuación)

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TABLA XV (continuación)

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TABLA XVI

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TABLA XVI (continuación)

72

TABLA XVI (continuación)

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TABLA XVII

Marcadores de secuencias de péptidos obtenidos nuevos de espectros de MS/MS de péptidos amino-terminales libres que contienen lisina y con arginina acetilada separados (ejemplo 21) que no conducen a una identificación sin ambigüedad de proteínas usando herramientas de búsqueda en bases de datos basadas en MS/MS tales como MASCOT. Se indica la fracción primaria a partir de la cual se separan los péptidos, la masa de los péptidos y el marcados de secuencia obtenido de N->C (m = metionina-sulfóxido, x = aminoácido sin asignar).

75

TABLA XVII (continuación)

76

TABLA XVIIIA

77

78

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TABLA XVIIIA (continuación)

79

TABLA XVIIIB k representa lisina acetilada

80

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TABLA XIX

81

TABLA XIX (continuación)

82

TABLA XIX (continuación)

83

Referencias

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Claims

1. Un procedimiento para aislar un subconjunto de péptidos de una mezcla peptídica de proteínas, que comprende las etapas de: (a) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones de péptidos mediante cromatografía; (b) alterar química o enzimáticamente, o química y enzimáticamente al menos un aminoácido de al menos uno de los péptidos en cada fracción, generando así un subconjunto de péptidos alterados; y (c) aislar dichos péptidos alterados o llamados señalizados de cada fracción mediante cromatografía, en el que la cromatografía de las etapas (a) y (c) se realiza con el mismo tipo de cromatografía.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las condiciones cromatográficas de las etapas (a) y (c) son iguales o sustancialmente similares.

3. El procedimiento de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la etapa (a) es precedida por una o más etapas previas de tratamiento.

4. El procedimiento de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, en el que el aminoácido sometido a alteración se selecciona del grupo que consiste en: arginina, prolina, cisteína, metionina, triptófano, lisina, tirosina, histidina, fenilalanina, y cualquier combinación de dos o tres de ellos.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el aminoácido sometido a alteración es la metionina.

6. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el aminoácido sometido a alteración es la cisteína.

7. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el aminoácido sometido a alteración es la metionina y la cisteína.

8. El procedimiento de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, en el que el aminoácido sometido a alteración es un aminoácido co o postraduccionalmente modificado.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la modificación co o postraduccional se selecciona del grupo que consiste en: glicosilación, fosforilación, acetilación, sulfatación, ubiquitinación, alquilación, nitrosilación, oxidación, hidroxilación y metilación, y cualquier combinación de estos.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el aminoácido co o postraduccionalmente modificado es un aminoácido fosforilado.

11. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el aminoácido co o postraduccionalmente modificado es un aminoácido glicosilado.

12. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el aminoácido co o postraduccionalmente modificado es un aminoácido \varepsilon-N-acetilado.

13. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a 12, que además comprende la etapa de identificar los péptidos señalizados y sus correspondientes proteínas.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicha etapa de identificación se realiza con un espectrómetro de masas en tándem combinado con la búsqueda en bases de datos.

15. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicha etapa de identificación se realiza por análisis de descomposición metaestable combinado con la búsqueda en bases de datos.

16. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicha etapa de identificación se realiza midiendo la masa de los péptidos combinado con la búsqueda en bases de datos.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que dicha etapa de identificación se basa además en uno o más de los siguientes: (a) la presencia del aminoácido alterado; (b) la determinación del número de grupos amino libres en los péptidos señalizados; (c) el conocimiento sobre la especificidad de escisión de la proteasa usada para generar la mezcla peptídica de proteínas; y (d) el índice medio hidropático de los péptidos.

18. Un procedimiento para determinar la cantidad relativa de al menos una proteína en más de una muestra que comprende proteínas, que comprende las etapas de: (a) marcar los péptidos presentes en una primera muestra con un primer isótopo; (b) marcar los péptidos presentes en una segunda muestra con un segundo isótopo; (c) combinar la mezcla peptídica de proteínas de la primera muestra con la mezcla peptídica de proteínas de la segunda muestra; (d) separar las mezclas peptídicas de proteínas combinadas en fracciones de péptidos mediante cromatografía; (e) alterar química o enzimáticamente, o química y enzimáticamente, al menos un aminoácido de al menos uno de los péptidos en cada fracción; (f) aislar los péptidos señalizados de cada fracción mediante cromatografía, en el que la cromatografía se realiza con el mismo tipo de cromatografía que en la etapa (d); (g) realizar el análisis espectrométrico de masas de los péptidos señalizados aislados; (h) calcular las cantidades relativas de los péptidos señalizados en cada muestra comparando las alturas de los picos de los péptidos señalizados idénticos pero isotópicamente marcados de forma diferente, e (i) determinar la identidad de dichos péptidos señalizados y sus correspondientes proteínas.

19. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la etapa (d) es precedida por una o más etapas de tratamiento previo.

20. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 18 ó 19, en el que las condiciones cromatográficas de las etapas (d) y (f) son iguales o sustancialmente similares.

21. El procedimiento de la reivindicación 18, 19 ó 20, en el que la determinación de la identidad del péptido señalizado se realiza por un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en: procedimiento espectrométrico de masas en tándem, análisis de descomposición metaestable, medición de la masa de los péptidos, y medición de la masa de los péptidos aminoterminales, combinado con la búsqueda en bases de datos.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que la determinación de la identidad del péptido señalizado se basa además en uno o más de los siguientes: (a) la presencia del aminoácido alterado; (b) la determinación del número de grupos amino libres en los péptidos señalizados; (c) el conocimiento sobre la especificidad de escisión de la proteasa usada para generar la mezcla peptídica de proteínas; y (d) el índice medio hidropático de los péptidos.

23. Un procedimiento para determinar la cantidad de al menos una proteína presente en una muestra, que comprende las etapas de: (a) preparar una mezcla peptídica de proteínas; (b) añadir a la mezcla una cantidad conocida de al menos un péptido sintético de referencia que está marcado isotópicamente de forma diferente comparado con su péptido de referencia homólogo y por el cual dicho péptido sintético de referencia y dicho péptido de referencia homólogo serán alterados en la etapa (d); (c) separar la mezcla en fracciones de péptidos mediante cromatografía; (d) alterar química o enzimáticamente, o química y enzimáticamente al menos un aminoácido de al menos uno de los péptidos en cada fracción; (e) aislar los péptidos señalizados de cada fracción por cromatografía, en el que la cromatografía se realiza con el mismo tipo de cromatografía que en la etapa (c); (f) realizar el análisis espectrométrico de masas de los péptidos señalizados; (g) calcular la cantidad de la proteína presente en la muestra comparando las alturas de los picos del péptido sintético de referencia con su péptido de referencia, y (h) determinar la identidad de dichos péptidos de referencia y sus correspondientes proteínas.

24. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23, en el que la etapa (c) es precedida por una o más etapas de tratamiento previo.

25. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 23 ó 24, en el que las condiciones cromatográficas de las etapas (c) y (e) son iguales o sustancialmente similares.

26. El procedimiento de la reivindicación 23, 24 ó 25, en el que la determinación de la identidad de los péptidos de referencia se realiza por un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en: el procedimiento espectrométrico de masas en tándem, análisis de descomposición metaestable, medición de la masa de los péptidos, y medición de la masa de los péptidos amino-terminales combinado con la búsqueda en bases de datos.

27. El procedimiento de la reivindicación 26, en el que la determinación de la identidad de los péptidos de referencia se basa además en uno o más de los siguientes: (a) la presencia del aminoácido alterado; (b) la determinación del número de grupos amino libres en los péptidos de referencia; (c) el conocimiento sobre la especificidad de escisión de la proteasa usada para generar la mezcla peptídica de proteínas; y (d) el índice medio hidropático de los péptidos.

28. Un procedimiento para aislar un subconjunto de péptidos de una mezcla peptídica de proteínas, que comprende las etapas de: (a) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones de péptidos por cromatografía; (b) alterar química o enzimáticamente, o química y enzimáticamente al menos un aminoácido en la mayoría de los péptidos en cada fracción, generando así un subconjunto de péptidos inalterados; y (c) aislar dichos péptidos inalterados o llamados de identificación de cada fracción mediante cromatografía, de modo que la cromatografía de las etapas (a) y (c) se realice con el mismo tipo de cromatografía.

29. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que las condiciones cromatográficas de las etapas (a) y (c) son iguales o sustancialmente similares.

30. El procedimiento de las reivindicaciones 28 ó 29, en el que la etapa (a) es precedida por una o más etapas de tratamiento previo.

31. El procedimiento de las reivindicaciones 28, 29 ó 30, en el que los péptidos de identificación son péptidos con el amino-terminal bloqueado.

32. Un procedimiento de las reivindicaciones 28, 29 ó 30, en el que los péptidos de identificación son péptidos amino-terminales.

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33. Un procedimiento de las reivindicaciones 28, 29 ó 30, en el que los péptidos de identificación son péptidos carboxi-terminales.

34. Un procedimiento de las reivindicaciones 28, 29 ó 30, en el que los péptidos de identificación son péptidos procesados proteolíticamente internamente.

35. Un procedimiento de la reivindicación 32, en el que los péptidos con el amino-terminal bloqueado in vivo se diferencian de los péptidos con el amino terminal libre no bloqueado in vivo.

36. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35, que además comprende la etapa de identificar los péptidos de identificación y sus correspondientes proteínas.

37. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que a dicha etapa de identificación contribuye un espectrómetro de masas en tándem combinado con la búsqueda en bases de datos.

38. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que a dicha etapa de identificación contribuye el análisis de descomposición metaestable combinado con la búsqueda en bases de datos.

39. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que dicha etapa de identificación se realiza midiendo la masa de los péptidos combinado con la búsqueda en bases de datos.

40. El procedimiento de la reivindicación 39, en el que dicha etapa de identificación se basa además en uno o más de los siguientes: (a) la determinación del número de grupos amino libres en los péptidos de identificación; (b) el conocimiento sobre la especificidad de escisión de la proteasa usada para generar la mezcla peptídica de proteínas; y (c) el índice medio hidropático de los péptidos.

41. Un procedimiento para determinar la cantidad relativa de al menos una proteína en más de una muestra que comprende proteínas, que comprende las etapas de: (a) marcar los péptidos presentes en una primera muestra con un primer isótopo; (b) marcar los péptidos presentes en una segunda muestra con un segundo isótopo; (c) combinar la mezcla peptídica de proteínas de la primera muestra con la mezcla peptídica de proteínas de la segunda muestra; (d) separar la mezcla peptídica de proteínas en fracciones de péptidos por cromatografía; (e) alterar química o enzimáticamente, o química y enzimáticamente al menos un aminoácido en la mayoría de los péptidos en cada fracción; (f) aislar los péptidos de identificación de cada fracción por cromatografía, en el que la cromatografía se lleva a cabo con el mismo tipo de cromatografía que en la etapa (d); (g) realizar el análisis espectrométrico de masas de los péptidos de identificación aislados; (h) calcular las cantidades relativas de los péptidos de identificación en cada muestra comparando las alturas de los picos de los péptidos de identificación iguales pero marcados isotópicamente de forma diferente; e (i) determinar la identidad de dichos péptidos de identificación y sus correspondientes proteínas.

42. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 41, en el que la etapa (d) es precedida por una o más etapas de tratamiento previo.

43. El procedimiento de acuerdo con las etapas 41 ó 42, en el que las condiciones cromatográficas de las etapas (d) y (f) son iguales o sustancialmente similares.

44. El procedimiento de las reivindicaciones 41, 42 ó 43, en el que la determinación de la identidad de los péptidos de identificación se realiza por un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en: el procedimiento espectrométrico de masas en tándem, análisis de descomposición metaestable, medición de la masa de los péptidos, y medición de la masa de los péptidos amino-terminales combinado con la búsqueda en bases de datos.

45. El procedimiento de la reivindicación 44, en el que la determinación de la identidad de los péptidos de identificación se basa además en uno o más de los siguientes: (a) la determinación del número de grupos amino libres en los péptidos de identificación; (b) el conocimiento sobre la especificidad de escisión de la proteasa usada para generar la mezcla peptídica de proteínas; y (c) el índice medio hidropático de los péptidos.

46. Un procedimiento para determinar la cantidad de al menos una proteína presente en una muestra, que comprende las etapas de: (a) preparar una mezcla peptídica de proteínas; (b) añadir a la mezcla una cantidad conocida de al menos un péptido sintético de referencia que está marcado isotópicamente de forma diferente comparado con su péptido de referencia homólogo y por el cual dicho péptido sintético de referencia y dicho péptido de referencia homólogo no serán alterados en la etapa (d); (c) separar la mezcla en fracciones de péptidos mediante cromatografía; (d) alterar química o enzimáticamente, o química y enzimáticamente al menos un aminoácido en la mayoría de los péptidos en cada fracción; (e) aislar los péptidos de identificación de cada fracción por cromatografía, en el que la cromatografía se realiza con el mismo tipo de cromatografía que en la etapa (c); (f) realizar el análisis espectrométrico de masas de los péptidos de identificación; (g) calcular la cantidad de la proteína presente en la muestra comparando las alturas de los picos del péptido sintético de referencia con su péptido de referencia homólogo, y (h) determinar la identidad de dichos péptidos de referencia y sus correspondientes proteínas.

47. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 46, en el que la etapa (c) es precedida por una o más etapas de tratamiento previo.

48. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 46 ó 47, en el que las condiciones cromatográficas de las etapas (c) y (e) son iguales o sustancialmente similares.

49. El procedimiento de la reivindicación 46, 47 ó 48, en el que la determinación de la identidad de los péptidos de referencia se realiza por un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en: el procedimiento espectrométrico de masas en tándem, análisis de descomposición metaestable, medición de la masa de los péptidos, y medición de la masa de los péptidos amino-terminales combinado con la búsqueda en bases de datos.

50. El procedimiento de la reivindicación 49, en el que la determinación de la identidad de los péptidos de referencia se basa además en uno o más de los siguientes: (a) la determinación del número de grupos amino libres en los péptidos de referencia; (b) el conocimiento sobre la especificidad de escisión de la proteasa usada para generar la mezcla peptídica de proteínas; y (c) el índice medio hidropático de los péptidos de referencia.

51. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 50, en el que el procedimiento se usa para diagnosticar una enfermedad o una predisposición a una enfermedad.

52. Un sistema de separación de péptidos que comprende: una columna cromatográfica primaria para separar una mezcla peptídica de proteínas en una pluralidad de fracciones en un conjunto definido de condiciones, y por el cual cada fracción posteriormente se somete a una alteración de al menos un aminoácido para generar péptidos señalizados, y en el que las fracciones alteradas se mezclan en un conjunto de fracciones mezcladas, comprendiendo cada fracción mezclada al menos dos fracciones alteradas, y un conjunto de columnas cromatográficas secundarias que comprende una primera columna cromatográfica secundaria para separar una primera fracción mezclada y al menos una segunda columna cromatográfica secundaria dispuesta en paralelo con la primera columna cromatográfica secundaria para separar una segunda fracción mezclada, en el que el conjunto de columnas cromatográficas secundarias lleva a cabo el aislamiento de los péptidos señalizados en condiciones sustancialmente iguales al conjunto de condiciones definidas, por el cual no hay solapamiento de la elución entre i) los péptidos señalizados de las diferentes fracciones dentro de una mezcla o entre mezclas, y ii) los péptidos señalizados y los péptidos inalterados.

53. Un sistema de separación de péptidos que comprende: una columna cromatográfica primaria para separar una mezcla peptídica de proteínas en una pluralidad de fracciones en un conjunto de condiciones definidas, y por el cual cada fracción posteriormente se somete a una alteración de al menos un aminoácido para generar péptidos alterados y péptidos inalterados, y en el que las fracciones alteradas se mezclan en un conjunto de fracciones mezcladas, comprendiendo cada fracción mezclada al menos dos fracciones alteradas, y un conjunto de columnas cromatográficas secundarias que comprende una primera columna cromatográfica secundaria para separar una primera fracción mezclada y al menos una segunda columna cromatográfica secundaria dispuesta en paralelo con la primera columna cromatográfica secundaria para separar una segunda fracción mezclada, en el que el conjunto de columnas cromatográficas secundarias llevan a cabo el aislamiento de los péptidos de identificación en condiciones sustancialmente iguales al conjunto de condiciones definidas, por el cual no hay solapamiento de elución entre i) los péptidos de identificación de las diferentes fracciones dentro de una mezcla o entre mezclas, y ii) los péptidos de identificación y los péptidos inalterados.

54. El sistema de las reivindicaciones 52-53, que además comprende una salida al conjunto de segundas columnas cromatográficas pare recoger el eluato de la primera columna cromatográfica secundaria y de la segunda columna cromatográfica secundaria.

55. El sistema de la reivindicación 54, que además comprende un analizador conectado a la salida.

56. El sistema de la reivindicación 54, que además comprende un recipiente de residuos conectado a la salida para recoger un producto residual del conjunto de columnas cromatográficas secundarias.

57. El sistema de las reivindicaciones 52-53, que además comprende un inyector de muestra acoplado al conjunto de columnas cromatográficas secundarias para inyectar una fracción mezclada en una de la primera columna secundaria y la segunda columna secundaria.

58. El sistema de la reivindicación 57, que además comprende un conjunto de válvulas de inyección de muestra para dirigir la fracción mezclada desde el inyector de muestra a una de la primera columna secundaria y la segunda columna secundaria.

59. El sistema de las reivindicaciones 52-53, que además comprende un sistema de disolvente para proporcionar un gradiente de disolvente al conjunto de las columnas cromatográficas secundarias.

60. El sistema de la reivindicación 59, en el que el sistema de disolvente comprende una primera bomba de disolvente para proporcionar un gradiente de disolvente a la primera columna cromatográfica secundaria y una segunda bomba de disolvente para proporcionar un gradiente de disolvente a la segunda columna cromatográfica secundaria.

61. El sistema de la reivindicación 59, en el que el sistema de disolvente comprende: una bomba de disolvente conectada a la primera columna cromatográfica secundaria y a la segunda columna cromatográfica secundaria; un sistema distribuidor controlado que comprende un primer regulador de caudal para regular un flujo de disolvente a la primera columna cromatográfica secundaria y un segundo regulador de caudal para regular un flujo de disolvente a la segunda columna cromatográfica secundaria.

62. El sistema de las reivindicaciones 52-53, que además comprende un colector de fracciones para recoger un eluato del conjunto de columnas cromatográficas secundarias.

63. El sistema de la reivindicación 58, que además comprende un sistema de control de válvulas para controlar el conjunto de válvulas de inyección de muestra.

64. El sistema de las reivindicaciones 52-53, en el que la primera y segunda columnas cromatográficas secundarias son sustancialmente iguales a la columna primaria.

65. El sistema de las reivindicaciones 52-53, en el que se aplica un primer gradiente de disolvente a la columna primaria para realizar la separación de la mezcla peptídica de proteínas, y se aplica un segundo gradiente de disolvente que es sustancialmente igual al primer gradiente de disolvente, a las columnas secundarias para realizar la separación de las fracciones mezcladas.

66. Un procedimiento para aislar un péptido señalizado de una mezcla peptídica de proteínas, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una columna cromatográfica primaria para separar la mezcla peptídica de proteínas; (b) inyectar la mezcla peptídica de proteínas en la columna cromatográfica primaria para separar la mezcla peptídica de proteínas en un conjunto de fracciones en un conjunto de condiciones definidas; (c) alterar al menos una de las fracciones en el conjunto de fracciones para formar un conjunto de fracciones alteradas, en el que una fracción alterada comprende un subconjunto de péptidos señalizados y un subconjunto de péptidos inalterados; (d) mezclar una primera fracción alterada y una segunda fracción alterada para formar una primera fracción mezclada, en la que no hay solapamiento en la elución entre i) los péptidos señalizados de la primera y segunda fracción alterada y ii) los péptidos señalizados y los péptidos inalterados de dichas fracciones; (e) mezclar una tercera fracción alterada y una cuarta fracción alterada para formar una segunda fracción mezclada, en la que no hay solapamiento en la elución entre i) los péptidos señalizados de la tercera y cuarta fracciones alteradas y ii) los péptidos señalizados y los péptidos inalterados de dichas fracciones; (f) proporcionar una primera columna cromatográfica secundaria para separar un subconjunto de péptidos señalizados de un subconjunto de péptidos inalterados; y (g) separar la primera fracción mezclada usando la columna cromatográfica secundaria en el conjunto definido de condiciones para aislar los subconjuntos de péptidos señalizados en la primera fracción alterada y la segunda fracción alterada.

67. Un procedimiento para aislar un péptido de identificación en una mezcla peptídica de proteínas, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una columna cromatográfica primaria para separar la mezcla peptídica de proteínas; (b) inyectar la mezcla peptídica de proteínas en la columna cromatográfica primaria para separar la mezcla peptídica de proteínas en un conjunto de fracciones en un conjunto de condiciones definidas; (c) alterar al menos una de las fracciones en el conjunto de fracciones para formar un conjunto de fracciones alteradas, en el que una fracción alterada comprende un subconjunto de péptidos alterados y un subconjunto de péptidos de identificación; (d) mezclar una primera fracción alterada y una segunda fracción alterada para formar una primera fracción mezclada, en la que no hay solapamiento en la elución entre i) los péptidos alterados de la primera y segunda fracciones alteradas y ii) los péptidos alterados y los péptidos de identificación de dichas fracciones; (e) mezclar una tercera fracción alterada y una cuarta fracción alterada para formar una segunda fracción mezclada, en la que no hay solapamiento en la elución entre i) los péptidos de identificación de la tercera y cuarta fracciones alteradas y ii) los péptidos alterados y los péptidos de identificación de dichas fracciones; (f) proporcionar una primera columna cromatográfica secundaria para separar un subconjunto de péptidos alterados de un subconjunto de péptidos de identificación; y (g) separar la primera fracción mezclada usando la columna cromatográfica secundaria en el conjunto de condiciones definidas para aislar los subconjuntos de péptidos de identificación en la primera fracción alterada y la segunda fracción alterada.

68. El procedimiento de las reivindicaciones 66 ó 67, que además comprende la etapa de separar la segunda fracción mezclada usando la primera columna cromatográfica secundaria en el conjunto definido de condiciones para aislar los subconjuntos de péptidos señalizados o de identificación en la tercera fracción alterada y la cuarta fracción alterada.

69. El procedimiento de la reivindicación 66 ó 67, que comprende además las etapas de: (h) proporcionar una segunda columna cromatográfica secundaria dispuesta sustancialmente en paralelo con la primera columna cromatográfica secundaria para separar un subconjunto de péptidos alterados de un subconjunto de péptidos inalterados en una fracción; y (i) separar la segunda fracción mezclada usando la segunda columna cromatográfica secundaria en el conjunto definido de condiciones para aislar los subconjuntos de péptidos alterados en la tercera fracción alterada y la segunda fracción alterada.

70. El procedimiento de la reivindicación 66 ó 67, que además comprende la etapa de dirigir los péptidos señalizados o de identificación a un analizador.

71. El procedimiento de la reivindicación 70, que además comprende la etapa de identificar el péptido de identificación o señalizado y su correspondiente proteína usando un analizador combinado con la búsqueda en una base de datos.