DE60204669T2 - Verfahren und vorrichtung zur gel-freien qualitativen proteomanalyse und deren verwendungen - Google Patents

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Description

  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Verfahren und eine Vorrichtung zur qualitativen und quantitativen Proteomanalyse werden bereitgestellt. Die Verfahren und die Vorrichtung erlauben die Isolierung einer Teilmenge von Peptiden aus einem komplexen Gemisch von Peptiden. Die Isolierung beruht auf einer spezifischen chemischen und/oder enzymatischen Veränderung einer oder mehrerer Arten von Peptiden. Diese Veränderung modifiziert die biophysikalische, chemische oder jede andere biochemische Eigenschaft der betroffenen Art von Peptiden (z.B. die Netto-Elektroladung und/oder Hydrophobizität) dergestalt, dass die veränderten Peptide von den unveränderten Peptiden getrennt werden können.
  • In einer Ausführungsform wird diese Veränderung zwischen einer ersten chromatographischen Trennung des komplexen Gemischs von Peptiden und einer zweiten chromatographischen Trennung des geänderten komplexen Gemischs durchgeführt unter Verwendung der gleichen Art chromatographischer Trennung in der ersten und zweiten Trennung. Die "gleiche Art chromatographischer Trennung" bedeutet, dass das sowohl die erste als auch die zweite chromatographische Trennung auf einer Hydrophobizität basieren oder sowohl die erste und die zweite chromatographische Trennung auf Ionenaustausch basieren. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwenden daher einen ersten Trennungsschritt, wobei komplexe Gemische von Peptiden in Fraktionen aufgetrennt werden, und zwar auf der Grundlage ihrer Auswaschungs- bzw. Eluierungs- oder Migrationsmuster. Folgerichtig wird jede Fraktion einer bestimmten Veränderungsreaktion unterzogen, welche chemisch oder enzymatisch oder chemisch und enzymatisch betrieben wird. Jede Fraktion wird dann erneut einer zweiten Trennung unterzogen. Auf der Grundlage i) der Art der Veränderung und ii) der Trennungsbedingungen wird die veränderte Teilmenge von Peptiden in jeder Fraktion getrennt von den unveränderten Peptiden eluieren oder migrieren.
  • Zusätzlich verwendet die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zum Durchführen der Verfahren auf einer selektive und effiziente Art unter Verwendung entweder eines Einzelsäulensystems oder eines Mehrsäulensystems von identischen oder ähnlichen Säulen, welche entweder in einer exklusiv parallelen, exklusiv seriellen oder in einer kombinierten seriellen/parallelen Betriebsart gefahren werden können. Die isolierten Peptide können dann allmählich und seriell ausgegeben und an analytische Systeme zur Identifizierung weitergereicht werden.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Das Proteom ist als das gesamte Komplement von Proteinen definiert worden, welche durch eine Zelle, Gewebeart oder Organismus ausgedrückt wird, und entsprechend ist die Proteomik das Studieren dieses Komplements, ausgedrückt zu einer gegebenen Zeit oder unter bestimmten Umgebungseinflüssen. Solch eine umfassende Analyse erfordert, dass Tausende von Proteinen aus einer einzelnen Probe routinemäßig identifiziert und charakterisiert werden. Zweidimensionale Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (2D-PAGE) wird als wichtiges Werkzeug für die Proteomik angesehen, welche Trennungen erzeugt, welche bis zu Tausend Proteinflecken auf dem 2D-Gel zeigen. Proteine in einem Gel können mittels verschiedener Einfärbemittel entdeckt werden, was es bis zu einem bestimmten Umfang erlaubt, eine Quantifizierung und einen Vergleich zwischen den Gelen von unterschiedlichen Proben durchzuführen. Eine Identifizierung von Proteinen ist möglich, beispielsweise durch Herausschneiden eines Proteinflecks und Aufschließen bzw. Verdauen des Flecks mit einer Protease einer gut bekannten Ausprägung bzw. Spezifität. Die aus einer solchen Spaltung resultierenden Peptide haben bestimmte Massen, welche folgend durch Massenspektrometrie bestimmt werden können. Diese Daten werden mit den Massen von Peptiden in Datenbanken verglichen. Die letzteren Massen sind in silico-Daten, welche durch man Berechnen des Molekulargewichts jedes Proteins und seiner Spaltfragmente erhält, und zwar ausgehend von Daten über die vorliegende DNA-Sequenz. Wenn eine spektrometrisch genau bestimmte Masse von Peptiden mit der Masse eines in silico-Peptides übereinstimmt, ist dies oft ausreichend, das Peptid seinem Ursprungs- bzw. Stammprotein zuzuordnen. Oder anders herum kann ein bestimmtes Protein in einer Probe durch Identifizieren eines oder mehrerer seiner einzelnen Peptidfragmente identifiziert werden (sogenannter Peptid-Massenfingerabdruck).
  • Jedoch ist 2D-PAGE sequenziell, arbeitsaufwendig und schwierig zu automatisieren. Zusätzlich sind bestimmte Klassen von Proteinen, wie beispielsweise Membranproteine, sehr große und sehr kleine Proteine sowie hochgradig saure oder basische Proteine schwierig mit diesem Verfahren zu analysieren. Ein anderer signifikanter Nachteil liegt in ihrer Ausrichtung zu sehr häufigen Proteinen hin, da weniger häufige Regelungsproteine (wie beispiels weise Transkriptionsfaktoren und Proteinkinasen) selten entdeckt bzw. detektiert werden, wenn die gesamten Zelllysate analysiert werden.
  • Aufgrund dieser Schwächen, haben Wissenschaftlicher alternative Zugänge gesucht, um die Proteome ohne die Notwendigkeit zu analysieren, jedes Protein bis zur Homogenität zu reinigen. Diese Technologien werden hierin als "gelfreie Systeme" bezeichnet und benötigen keinen Gel-Trennungsschritt. Der Peptid-Massenfingerabdruck-Ansatz hat uns gelehrt, dass Proteine auf der Grundlage der Masse einer oder mehrer ihrer einzelnen Peptide identifiziert werden können. Ein Ansatz, Proteine in einer biologischen Probe zu analysieren, war es, die Proteine zu proteolysieren und die Masse der sich ergebenden Peptide zu bestimmen. Insoweit die Probe nur eine kleine Menge unterschiedlicher Proteine beinhaltet, ist die Zahl der sich ergebenden Peptide klein und kann durch chromatographisches Trennen der Peptide, gefolgt durch eine Analyse mittels Massenspektrometrie, identifiziert werden. In den meisten komplexen biologischen Proben wird die Proteolyse der Proteine Tausende von Peptiden erzeugen, und dies überschreitet die Auflösungskapazität jedes bekannten chromatographischen Systems. Dies fährt zu Co-Elution und damit zu einer ungenügenden Trennung und Isolierung individueller Peptide. Zusätzlich ist die Auflösungsleistung der Massenspektrometrie, gekoppelt mit solcher Chromatographie, nicht ausreichend, um die Masse der einzelnen Peptide ausreichend zu bestimmen. Ein Ansatz, die Auflösung komplexer Gemische von Peptiden zu verbessern, ist es, mehrdimensionale Chromatographie zu verwenden, wie beispielsweise das vor kurzem beschriebene Verfahren einer direkten Analyse großer Proteinkomplexe ("direct analysis of large protein complexes; DALPC) (Link et al. (1999). Das DALPC-Verfahren verwendet die unabhängigen physikalischen Eigenschaften von Ladung und Hydrophobizität, um komplexe Peptidgemische über eine Kombination von starkem Kationenaustausch und umgekehrt-phasiger Chromatographie aufzulösen. Während diese Strategien die Trennung des komplexen Gemisches in seine individuellen Komponenten verbessern, ist die Zerlegungsleistung dieses Ansatzes im Großen immer noch nicht ausreichend, um die einzelnen Peptide in biologischen Proben reproduzierbar zu identifizieren. Weitere Nachteile des DALPC-Verfahrens sind die Inkompatibilität mit der Analyse seltener Proteine und die Tatsache, dass das Verfahren nicht quantitativ verwendet werden kann.
  • Ein zweiter vor kurzem beschriebener Ansatz, das ICAT-Verfahren, basiert auf der Verwendung einer Kombination neuer chemischer Reagenzien, die Isotopen-codierte Affinitäts-Marker (isotope-coded affinity tags; ICATs) und Tandem-Massenspektrometrie (Gygi et al. (1999) genannt werden. Das ICAT-Verfahren basiert auf der Modifikation von Cystein enthaltenen Proteinen durch ein Iodacetat-Derivat, welches ein Biotinmarkierung trägt. Nach enzymatischem Spalten der modifizierten Proteine in Peptide, werden nur die Cystein-modifizierten, markierten Peptide mit Streptavidin-überzogenen Perlen in einem Affinitäts-Reinigungsschritt heruntergezogen. Der Affinitätsreinigungsschritt vermindert die Komplexität des ursprünglichen Peptidgemischs, was die Trennung der einzelnen Peptide über Flüssigkeitschromatographie, kombiniert mit Massenspektrometrie, eine handhabbarere und realistischere Aufgabe macht. Jedoch sind die Nachteile, dass ein Affinitätsreinigungsschritt aufgrund des Verlustes an Material während des Reinigungsschritts allgemein die Verwendung großer Mengen von Ursprungs- bzw. Startmaterial benötigt. Zusätzlich ist die ICAT-Markierung eine relativ große Modifikation (ungefähr 500 Da), welche an jedem Peptid durch die massenspektrographische Analyse hindurch verbleibt, was die Datenbank durchsuchenden Algorithmen verkompliziert, insbesondere für kleine Peptide. Das Verfahren schlägt auch für Proteine fehl, welche keine Cysteinbestandteile enthalten. Darüber hinaus werden aufgrund eines Affinitätsreinigungsschritts die modifizierten Peptide auf einmal erzeugt und in einer sogenannten komprimierten Mischung freigesetzt.
  • Dies bedeutet, dass es keine optionale chromatographische Trennung und eine weniger effiziente massenspektrometrische Detektion der modifizierten Peptide gibt. In ähnlicher Weise verwenden zwei weitere Publikationen (Geng et al., 2000 und Ji et al., 2000) die Affinitätschromatographie, um eine Teilmenge von Peptiden auszuwählen und isolierte Signaturpeptide zu verwenden, um die korrespondierenden Ursprungsproteine zu identifizieren.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt eine neue gelfreie Methodik zur qualitativen und quantitativen Proteom-Analyse ohne die Notwendigkeit multidimensionaler Chromatographie und ohne die Verwendung von Affinitätsmarken. Die Methodik ist sehr flexibel, kann auf eine Vielzahl unterschiedlicher Klassen von Peptiden angewandt werden und ist sogar auf biologische Proben anwendbar, welche eine kleine Zahl an Zellen umfassen.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1: Schematisches Aufzeigen des direkten Peptidsortierungsverfahrens und Anzeigen der unterschiedlichen Parameter, welche zum Beschreiben des Sortierverfahrens verwendet werden. (A) Das gesamte im primären Durchlauf getrennte Protein-Peptid-Gemisch; t3 und t4 zeigen das für eine gegebene Fraktion genommene Zeitintervall (w1) dar. (B) Anzeige gekennzeichneter Peptide, die hydrophile Verschiebungen zwischen δmin und δmax zeigen: Sie eluieren zwischen Zeitintervallen t1 und t2 im Fenster w2. (C) Gekennzeichnete Peptide sind hydrophober, zeigen hydrophobe Verschiebungen zwischen δ'min und δ'max und eluieren zwischen Zeiten t5 und t6 in Fenster w2'.
  • 2: Vier Fraktionen aus dem primären Durchlauf (1A) wurden zusammengegeben und dem Veränderungsvorgang unterzogen. Sie werden dem sekundären Durchlauf unterworfen, und die gekennzeichneten Peptide eluieren zwischen t1 und t2, t'1 und t'2, t''1 und t''2 bzw. t'''1 und t'''2. Die Fraktionen werden so kombiniert, dass die sortierten Peptide sich nicht mit den unveränderten Peptiden aus der vorhergehenden Fraktion überlappen. Durch Vereinigen der Fraktionen wird die Zahl der sekundären Durchläufe reduziert.
  • 3: 214-nm-UV-Absorptionsprofile von RP-HPLC-Trennungen von NH2-YSFVMTAERCOOH (A), NH2-YSFVCTAER-COOH (B) und NH2-YSFVWTAER-COOH (C) vor (untere Spur) und nach Behandlung (obere Spur) mit 0,5% H2O2 in 1% TFA bei 30°C für 30 Minuten. MALDI-RETOF-MS-Spektren der eluierenden Steuerung und H2O2-behandelten Peptide (entsprechend untere Spur gegen obere Spur) sind in den Tafeln D–F gezeigt.
  • 4: (A) 214-nm-UV-Absorptionsprofil des Peptids NH2-YSFVCTAER-COOH, getrennt an einer Umkehrphasen-C18-HPLC-Säule. Das Peptid wurde durch Acrylamid verändert, gefolgt durch Oxidation seines S-Propionamidocysteinsulfoxid-Derivats (untere Spur), welches, wenn es unter den gleichen HPLC-Bedingungen durchlaufen wird, eine hydrophile Verschiebung von ungefähr 2 Minuten zeigt im Vergleich zum unveränderten Peptid (obere Spur). Beachte das Vorhandensein eines eng migrierenden enantiomeren Dubletts, welches typisch für die Sulfoxid-Derivate in dem TFA-Acetonitrilsystem ist. (B) MALDI-RETOF-MS-Spektrum des S-Propionamidocysteinsulfoxid-Derivats des Peptids NH2-YSFVCTAER-COOH. Fragmentionen, die sich aus dem schnellen neutralen Verlust der veränderten Seitenkette des Cysteinrests ergeben, sind in blau angegeben und von großer Hilfe bei der Identifizierung des Vorhandenseins eines modifizierten Cysteins im Stammpeptid.
  • 5: Überblick über die Folge von Reaktionen, welche für das Sortieren von Methionin, Cystein und der Summe von Cystein- und Methionin-enthaltenen Peptiden verwendet werden.
  • 6: Schematische Beschreibung der hauptsächlichen Schritte beim Sortieren der Teilmenge NH2-terminaler bzw. endständiger blockierter Peptide. Kritische Aminosäurenreste werden angezeigt. R = Arg, K = Lys, hR = homoArg, PIC = Phenylisocyanat, PC = Phenylcarbamyl. Alle PTC-Peptide werden hydrophober. Die N-acetylierten Peptide werden verändert und werden in Durchlauf 2 genau so eluieren, wie sie es in Durchlauf 1 gemacht haben. Die blockierten Peptide werden sich daher von der Masse der PTC-Peptide trennen.
  • 7: Tortendiagramm, das die Zahl "eindeutiger" Peptidmassen angibt, welche durch eine in silico-Endoproteinase-Lys-C-Verdauung auf kuratierten SwissProt-Proteineinträgen sowohl von menschlichem als auch von E. coli-Ursprung. Wie in beiden Fällen zu sehen ist, entsprechen mehr als 90% der Peptidmassen (berechnet auf 0,001 Da-Genauigkeit) eindeutigen Peptidsequenzen, welche mindestens einen Methioninrest in der Datenbank aufweisen und daher verwendet werden, um ihre Stammproteine zu identifizieren.
  • 8: Schematische Zusammensetzung der Reaktionen, die zu einem quantitativen differenzialen NH2-endständigen Peptid-basierten Proteom-Ansatz führen. Kritische Aminosäurenseitenketten sind angezeigt. R = Arg, K = Lys, hR = homoArg, PIC = Phenylisocyanat, PC = Phenylcarbamyl, TNBS = Trinitrobenzolsulfonat. 16O/18O bezieht sich auf die unterschiedlichen Markierungen, die man durch Verdauung in H2 16O bzw. H2 18O erhält.
  • 9: Der Einzelsäulen-Peptidsortierer: Peptidsortierung wird während des sekundären Durchlaufs durchgeführt, nachdem Veränderungen an Fraktionen des primären Durchlaufs durchgeführt worden sind. Peptidfraktionen aus dem primären Durchlauf werden wie in Tabelle IVA festgelegt kombiniert und über den Probeninjektor geladen. Alle Bedingungen (RP-Sorptionsmittel, Durchflussraten bzw. Durchsätze, Gradienten, Lösungsmittel usw.) werden im primären Durchlauf als auch während der sekundären Durchläufe gleich gehalten. In der Einzelsäulen-Version durchlaufen alle Peptide die gleiche Säule. Nach einem Laden der Proben, wird ein Gradient unter Verwendung herkömmlicher kommerziell verfügbarer Hochdruck-HPLC-Pumpsysteme (hier als Lösungsmittelpumpen bezeichnet) er zeugt. Die Ventile bzw. Hähne werden automatisch gesteuert (a und b sind Hochdruckventile bzw. -hähne; y und z sind Niederdruckhähne), so dass sie die Lösungsmittelflüsse in die gewünschte Richtung lenken, und zwar entweder zu analytischen Instrumenten (Fraktionssammler, Massenspektrometer oder MALDI-Targets) oder zum Abfall.
  • 10: 214-nm-UV-Absorptionsprofil einer RP-HPLC-Trennung (2,1 i.d. × 250 mm C18-Säule) einer Gesamttrypsinverdauung eines Lysats von 509,106 E. coli-Zellen. Tryptische Peptide, die durch Verwendung eines zunehmenden linearen Gradienten von 1% B/Minute mit einem konstanten Fluss von 80 μml/Minute eluieren, beginnend bei 5% B (Lösungsmittel B = 70% Acetonitril in 0,09% TFA in Wasser, Lösungsmittel A ist 0,1% TFA in Wasser). Tryptische Peptide, eluiert zwischen 23% Lösungsmittel B und 63% Lösungsmittel B, werden in 40 Fraktionen von jeweils 80 μl gesammelt. Die erste gesammelte Fraktion ist mit 10 nummeriert, die letzte ist mit 49 nummeriert (siehe auch Beispiel 18). Fraktionen, welche genommen und in 11 weiter verarbeitet werden, sind durch blaue offene rechteckige Boxen angezeigt.
  • 11: 214-nm-UV-Absorptionsprofil, das die Sammlung von Methioninsulfoxid-Peptiden zeigt, welche sich aus einer folgenden milden Oxidation (unter Verwendung von 0,5% H2O2 in 1% TFA) der in den Fraktionen 10, 22, 34 und 46 vorhandenen Peptide (primärer Durchlauf) ergaben. Sammlung von Met-SO-Peptiden wird 6 Minuten vor der Eluierung des Hauptteils der unmodifizierten Peptide begonnen und dauert 4 Minuten. Chromatographische Bedingungen waren zu denen aus 10 identisch. Fraktionen, welche die unmodifizierten Peptide enthalten, sind mit blauen Pfeilen angezeigt, die sortierten Peptide sind rot unterstrichen; 4–7, 16–19, 28–31 und 40–43 (Tabelle IVA).
  • 12: Der Dreifach-Säulen-Peptidsortierer: Dieses System arbeitet mit drei identischen RP-Säulen, die parallel verbunden sind. Auch hier sind alle Bedingungen nicht nur zwischen parallelen Durchläufen identisch gehalten worden, sondern auch im Vergleich zum primären Durchlauf. Vom primären Durchlauf gesammelte Fraktionen wurden kombiniert, verändert und über jede der Säulen verteilt, wie in Tabelle V festgelegt. Die Lösungsmittelflüsse sind über die drei Säulen konstant gehalten worden. Dies kann erreicht werden durch Verbinden jeder einzelnen Säule mit einem Hochdruck-Pumpsystem, wodurch drei solcher Pumpen verwendet werden (Version A), oder durch Verwenden einer einzelnen Hochdruckpumpe, wobei aber die Durchflussraten bzw. Durchsätze im Hinblick auf jede der Säulen gesteuert bzw. eingestellt werden, und zwar unter Verwendung eines eingestellten bzw. gesteuerten Aufteilungssystems (Version B). Solche Durchsatzregler sind nun kommerziell erhältlich (Hähne a, b, c, d, e, f, g, w und x sind Hochdruckhähne, Hähne j–o sind Niederdruckhähne. Diese Hähne können mittels eines PC gesteuert werden, was einen vollautomatischen Betrieb erlaubt, einschließlich Beladen, Trennen und Analyse (Fraktionssammlung, Massenspektrometer oder MALDI-Target).
  • 13: Der Neun-Säulen-Peptidsortierer: Dieses System unterscheidet sich von der vorhergehenden Vorrichtung in mehreren Aspekten: i) eine Fraktion des primären Durchlaufs wird jedes Mal in eine Säule geladen, ii) jede der Säulen ist schmaler als die Säule des primären Durchlaufes und kann aus Wegwerfmaterial bestehen und iii) sie werden in einem kombinierten Seriell/Parallelmodus dergestalt betrieben, dass jedes Säule voll entwickelt ist, bevor der Gradient auf die nächste Säule gerichtet wird. Da die Säulen kleiner sind, können die Betriebszeiten herabgesetzt werden. Hähne a–g, welche den Einlass der Säulen steuern, sind Hochdruckhähne. Die Hähne h–o und p–r steuern die Auslassflüsse der verschiedenen Säulen entweder zum Abfall oder zu den Analysesystemen und könnten Niedrigdruck-Nullvolumen-Hähne sein. Die Säulen I, II und II werden mit dem gleichen Lösungsmittelgradienten entwickelt, der erste Teil des Gradienten wird zu Säule I gelenkt, der zweite Teil wird für Säule II verwendet und der dritte Teil wird zur Säule III gelenkt (für Details, siehe Beispiel 13). Die Trennung der gekennzeichneten und der veränderten Peptide wird durch die Ventil- bzw. Hahnanordnung gesteuert, welche mittels eines PCs betrieben werden kann. Der Neunsäulensortierer arbeitet mit drei Sätzen von je drei Säulen, die mit einer Verzögerung bezüglich des vorhergehenden Satzes laufen, im hier beschriebenen Beispiel war die Verzögerung auf 3 Minuten gesetzt: B startet 3 Minuten später als A, und C startet 3 Minuten später als der Start von B. Eluierende Peptide, welche von jeder der Säulensätze abgeleitet werden, werden durch die Hähne p–r in Richtung der analytischen Werkzeuge gelenkt, wie oben beschrieben.
  • 14: (A) UV-Absorptions-Profil (214 nm) einer RP-HPLC-Trennung der Peptidreferenz-Mischung NH2-Alan-Arg-COOH (n = 7 bis 42). Die Komponenten dieses Gemischs, die sich in einem zusätzlichen Alanin-Rest unterscheiden, können klar bemerkt werden. Die Trennung wurde in einer 2,1 i.d. (innerer Durchmesser) mm RP-HPLC-C18-Säule durchgeführt unter Verwendung eines linearen Acetonitrilgradienten in 0,1% TFA. (B) MALDI- RETOF-MS-Spektrum, welches die unterschiedlichen in diesem Gemisch vorhandenen Komponenten enthüllt, getrennt durch 71 amu.
  • 15: MALDI-RETOF-Massenspektren der in zwei Fraktionen vorhandenen Peptide von gesammelten Met-SO-Peptiden (Tafeln A und B). Die Massen-identifizierten Met-SO-Peptide sind angegeben und ihr charakteristisches Fragmentierungsprodukt mit einem Verlust von Methansulfensäure, beobachtet in einem Reflektronmodus, werden angezeigt, was ein kürzeres Fragment ergibt (durch einen blauen Pfeil angedeutet).
  • 16A: Eine schematische Ansicht des quantitativen Differenzial-Proteom-Ansatzes, welcher nach Methioninpeptiden sortiert. MSO bezieht sich auf Methioninsulfoxid.
  • 16B: 180-Beimischung wurde zur Verwendbarkeit der relativen quantitativen Analyse getestet. Kurz vor dem primären Durchlauf wurde ein Teil eines 160-Digestes mit zwei Teilen eines 180-Digestes gemischt, die Probe wurde auf 1% TFA angesäuert und Methionin-gekennzeichnete Peptide wurden aus dem Peptidgemisch aussortiert. In einer LC-MS-Analyse wurden die 180/160-Verhältnisse der beobachteten Peptidionen berechnet. Die Ergebnisse dieser Analyse bestätigen, dass die Peptidverhältnisse allgemein um 2 variieren.
  • 17: MALDI-RETOF-MS-gemessene isotopische Verhältnisse (Y-Achsen-Werte) von 19 Peptiden (Peptidmassen auf der X-Achse), welche aus einer Gesamtmenge von 5 pmol auf einer 1/1-Mischung von 16O- und 18O-markierten tryptischen Digests von BSA erhalten wurden. Es ergab sich ein Gesamtwert von 1,03 wurde für das gemessene Verhältnis des BSA-Gemischs.
  • 18: Das Diagramm zeigt die Zahl der Met-SO-Peptide (in blau gezeigt) unter Verwendung der MALDI-RETOF-Massenspektroskopie in den primären Fraktionen eines trypsinhaltigen Verdauungsmittels aus dem Proteinmaterial von 50,166 E. coli-Zellen, aufgetragen gegen die Peptide, von denen nicht gezeigt werden konnte, dass sie Methionin enthalten (in rot gezeigt).
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Isolierung und Identifizierung einer Teilmenge von Peptiden aus einem komplexen Gemisch von Peptiden bereit.
  • Das Verfahren nutzt eine Kombination zweier chromatographischer Trennungen der gleichen Art, getrennt durch einen Schritt, in welchem eine ausgewählte Population der Peptide so verändert wird, dass das chromatographische Verhalten der veränderten Peptide bei der sekundären chromatographischen Trennung von dem chromatographischen Verhalten ihrer unveränderten Version unterschiedlich ist.
  • Um eine Teilmenge von Peptiden aus einem Protein-Peptid-Gemisch zu isolieren, kann die vorliegende Erfindung in zwei Durchführmodi angewendet werden. In einem ersten Modus wird eine Minderheit der Peptide in dem Protein-Peptid-Gemisch verändert, und die Teilmenge der veränderten Peptide wird isoliert. In diesem Durchführungsmodus werden die veränderten Peptide als gekennzeichnete Peptide bezeichnet. In einem zweiten Umkehrmodus wird die Mehrheit der Peptide in dem Protein-Peptid-Gemisch verändert, und die Teilmenge der unveränderten Peptide wird isoliert. In diesem Durchführungsmodus werden die unveränderten Peptide die Identifizierungspeptide genannt.
  • In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung einer Teilmenge von Peptiden aus einem Protein-Peptid-Gemisch bereit, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Trennen des Protein-Peptid-Gemischs in Fraktionen von Peptiden durch Chromatographie; (b) chemisches oder enzymatisches oder chemisches und enzymatisches Verändern mindestens einer Aminosäure mindestens eines der Peptide in jeder Fraktion, dadurch Erzeugen einer Teilmenge von veränderten Peptiden; und (c) Isolieren der veränderten oder sogenannten gekennzeichneten Peptide aus jeder Fraktion durch Chromatographie, wobei die Chromatographie der Schritte (a) und (c) mittels der gleichen Art von Chromatographie durchgeführt wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung einer Teilmenge von Peptiden aus einem Protein-Peptid-Gemisch bereit, welches die folgenden Schritte umfasst: a) anfängliche Trennung des Protein-Peptid-Gemischs in Fraktionen durch Chromatographie, b) chemisches oder enzymatisches oder chemisches und enzymatisches Verändern mindestens einer Aminosäure in der Mehrheit der Peptide in jeder Fraktion, dadurch Erzeugen einer Teilmenge unveränderter Peptide und c) Isolieren der unveränderten oder sogenannten Identifizierungspeptide durch eine zweite Chromatographie, wobei die Chromatographie des anfänglichen und des zweiten Trennungsschritts mittels der gleichen Art von Chromatographie durchgeführt werden.
  • Die gleiche Art von Chromatographie bedeutet, dass die Art von Chromatographie die gleiche sowohl bei der anfänglichen Trennung als auch bei der zweiten Trennung ist. Die Art von Chromatographie beruht beispielsweise in beiden Trennungen auf der Hydrophobizität der Peptide. Auf ähnliche Weise kann die Art der Chromatographie in beiden Schritten auf der Ladung der Peptide beruhen und der Verwendung von Ionenaustausch-Chromatographie. In noch einer Alternative beruht die chromatographische Trennung in beiden Schritten auf einer Größenausschluss-Chromatographie oder jeder anderen Art von Chromatographie.
  • Die erste chromatographische Trennung, vor der Veränderung, wird im Folgenden als der "primäre Durchlauf" oder der "primäre chromatographische Schritt" oder die "primäre chromatographische Trennung" oder "Durchlauf 1" bezeichnet. Die zweite chromatographische Trennung der veränderten Fraktionen wird im Folgenden als der "sekundäre Durchlauf" oder der "sekundäre chromatographische Schritt" oder die "sekundäre chromatographische Trennung" oder "Durchlauf 2" genannt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die chromatographischen Bedingungen des primären Durchlaufs und des sekundären Durchlaufs identisch oder für einen Fachmann im wesentlichen ähnlich. Im wesentlichen ähnlich bedeutet beispielsweise, dass kleine Änderungen im Durchfluss und/oder Gradienten und/oder der Temperatur und/oder dem Druck und/oder den chromatographischen Perlen und/oder der Lösungsmittelzusammensetzung zwischen Durchlauf 1 und Durchlauf 2 toleriert wird, solange die chromatographischen Bedingungen zu einer Elution der veränderten Peptide führen, welche voraussagbar verschieden von den nicht veränderten Peptiden ist, und dies für jede von Durchlauf 1 gesammelte Fraktion.
  • Wie hier verwendet, ist ein "Protein-Peptid-Gemisch" typischerweise ein komplexes Gemisch von Peptiden, welche sich als ein Ergebnis der Spaltung einer Protein enthaltenden Probe ergeben. Solche Proben sind typischerweise jedes komplexe Gemisch von Proteinen, wie beispielsweise – ohne Begrenzung darauf – prokaryotische oder eukaryotische Zelllysa te oder jedes komplexe Gemisch von Proteinen, welches von einer Zelle isoliert wurde oder eine bestimmte Organellenfraktion, eine Biopsie, Laser-erfasste zerteilte Zellen oder jeder große Proteinkomplex, wie beispielsweise Ribosome, Viren und dergleichen. Es kann erwartet werden, dass, wenn solche Proteinproben in Peptide zerteilt werden, sie ohne Schwierigkeiten bis zu 1.000, 5.000, 10.000, 20.000, 30.000, 100.000 oder mehr unterschiedliche Peptide enthalten. Jedoch kann in einem bestimmten Fall ein "Protein-Peptid-Gemisch" auch direkt von einer Körperflüssigkeit stammen, oder allgemeiner von jeder Lösung biologischen Ursprungs. Es ist gut bekannt, dass beispielsweise Urin neben Proteinen ein sehr komplexes Peptidgemisch enthält, welches aus einem proteolytischen Abbau von Proteinen im Körper stammt, aus welchem die Peptide über die Nieren beseitigt werden. Noch eine andere Darstellung eines Protein-Peptid-Gemisches ist das Gemisch von Peptiden, die in der Rückenmarkflüssigkeit vorhanden sind.
  • Allgemeiner gesprochen, ist die Erfindung auf jedes komplexe Peptidgemisch anwendbar. Wie im weiteren verwendet, betrifft ein "komplexes Gemisch von Peptiden" ein Gemisch von mehr als 100 unterschiedlichen Peptiden, typischerweise mehr als 500 unterschiedlichen Peptiden und noch typischer von mehr als 1.000 unterschiedlichen Peptiden. In der vorliegenden Erfindung werden die Ausdrücke "Protein-Peptid-Gemisch" und "komplexes Gemisch von Peptiden" austauschbar verwendet.
  • Wie hier ebenfalls verwendet, meint "eine Teilmenge von Peptiden" aus einem Protein-Peptid-Gemisch eine bestimmte Fraktion bzw. einen bestimmten Anteil an der Gesamtzahl der in dem Protein-Peptid-Gemisch vorhandenen Peptide. Eine solche Fraktion beträgt sicherlich wenig als 50% der ursprünglichen Zahl von Peptiden und wird typischerweise weniger als 20% darstellen, noch typischer sogar weniger als 10% der ursprünglichen Zahl von Peptiden in dem Protein-Peptid-Gemisch.
  • Der Ausdruck "verändern" oder "verändert" oder "Veränderung", wie er hier in Bezug auf ein Peptid verwendet wird, bezieht sich auf die Einführung einer bestimmten Modifikation bzw. Veränderung an einer Aminosäure eines Peptids mit der klaren Absicht, das chromatographische Verhalten solcher Peptide, welche die modifizierte Aminosäure enthalten, zu ändern.
  • Ein "verändertes Peptid", wie es hier verwendet wird, ist ein Peptid, das eine Aminosäure enthält, welche als Folge einer Veränderung modifiziert worden ist.
  • Eine solche Veränderung kann eine stabile chemische oder enzymatische Modifikation sein. Eine solche Änderung kann auch eine vorübergehende Wechselwirkung mit einer Aminosäure einführen. Typischerweise wird eine Veränderung eine kovalente Reaktion sein, jedoch kann eine Veränderung auch eine Komplexbildung umfassen, vorausgesetzt, dass der Komplex ausreichend stabil während der chromatographischen Schritte ist.
  • Typischerweise bewirkt eine Veränderung eine Änderung in der Hydrophobizität so, dass das veränderte Peptid im Vergleich zur unveränderten Ausführung in einer Hydrophobizitätschromatographie unterschiedlich wandert. Alternativ bewirkt eine Veränderung eine Änderung in der Nettoladung eines Peptids, so dass das veränderte Peptid bezüglich seiner unveränderten Ausführung bei einer Ionenaustauschchromatographie unterschiedlich wandert, wie beispielweise bei einer Anionenaustausch- oder Kationenaustausch-Chromatographie. Auch kann eine Veränderung jede andere biochemische, chemische oder biophysikalische Änderung in einem Peptid bewirken, so dass das veränderte Peptid unterschiedlich zu seiner unveränderten Ausführung bei einer chromatographischen Trennung wandert. Der Ausdruck "wandert unterschiedlich" bedeutet, dass ein bestimmtes verändertes Peptid bei einer unterschiedlichen Elutionszeit eluiert, und zwar bezüglich der Elutionszeit des gleichen, nicht veränderten Peptids.
  • Man kann eine Veränderung durch eine chemische Reaktion oder eine enzymatische Reaktion oder eine Kombination einer chemischen und einer enzymatischen Reaktion erreichen. Eine nicht-beschränkende Liste chemischer Reaktionen umfasst Alkylierung, Acetylierung, Nitrosylierung, Oxidation, Hydroxylierung, Methylierung, Reduktion und dergleichen. Eine nicht-beschränkende Liste enzymatischer Reaktionen umfasst das Behandeln von Peptiden mit Phosphatasen, Acetylasen, Glycosidasen oder anderen Enzymen, welche co- oder posttranslationale Modifikationen verändert, welche an den Peptiden vorhanden sind. Die chemische Veränderung kann eine chemische Reaktion umfassen, kann aber auch mehr als eine chemische Reaktion umfassen (z.B. eine β-Eliminierungsreaktion und eine Oxidation), wie beispielsweise zwei aufeinander folgende Reaktionen, um die Veränderungseffizienz zu erhöhen. Auf ähnliche Weise kann die enzymatische Veränderung ein oder mehrere enzymatische Reaktionen umfassen.
  • Ein weiteres wesentliches Merkmal der Veränderung in der vorliegenden Erfindung ist es, dass die Veränderung die Isolierung einer Teilmenge von Peptiden aus einem Protein-Peptid-Gemisch erlaubt. Eine chemische und/oder enzymatische Reaktion, welche zu einer allgemeinen Modifikation aller Peptide in einem Protein-Peptid-Gemisch führt, wird die Isolierung einer Teilmenge von Peptiden nicht erlauben. Daher muss eine Veränderung eine bestimmte Population von Peptiden in einem Protein-Peptid-Gemisch verändern, um die Isolierung einer Teilmenge von Peptiden für den Fall erlauben, dass eine solche Veränderung zwischen zwei chromatographischen Trennungen der gleichen Art durchgeführt wird.
  • Ein Ansatz, um in der Lage zu sein, eine Teilmenge von Peptiden zu isolieren, welche aus kennzeichneten Peptiden aufgebaut ist, ist es, auf die Veränderung einer seltenen Aminosäure abzuzielen. Eine seltene Aminosäure wird als eine Aminosäure angesehen, welche nicht zu häufig in dem komplexen Gemisch von Peptiden vorhanden ist. Falls beispielsweise die bestimmte Aminosäure zu häufig in dem Peptidgemisch vorhanden wäre (z.B. in mehr als 50% der Peptide), würden dann zu viele Peptide ausgewählt, und eine effiziente Trennung und Isolierung gekennzeichneter Peptide würde wieder unmöglich werden. Vorzugsweise weniger als 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01% oder sogar weniger der Peptide aus dem komplexen Gemisch von Peptiden werden ausgewählt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die für eine Veränderung ausgewählten bestimmten Aminosäuren eine der folgenden Aminosäuren: Methionin (Met), Cystein (Cys), Histidin (His), Tyrosin (Tyr), Lysin (Lys), Tryptophan (Trp), Arginin (Arg), Prolin (Pro) oder Phenylalanin (Phe).
  • Alternativ zielt die Veränderung insbesondere auf eine Population von Aminosäuren, welche co- oder posttranslationale Modifikationen tragen. Beispiele solcher co- oder posttranslationalen Modifikationen sind Glycosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Formylierung, Ubiquitinierung, Pyrroglutamylierung, Hydroxylierung, Nitrolysierung, ε-N-Acetylierung, Sulfatierung, NH2-terminale Blockierung. Beispiele modifizierter Aminosäuren, welche verändert wurden, um eine Teilmenge von Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung zu isolieren, sind Phosphoserin (phospho-Ser), Phosphothreonin (phospho-Thr), Phosphohistidin (phospho-His), Phospho-Aspartat (phospho-Asp) oder Acetyllysin.
  • Eine weitere nicht-beschränkende Liste von Beispielen für Aminosäuren, welche verändert und verwendet werden können, um eine Teilmenge von Peptiden auszusuchen, sind andere modifizierte Aminosäuren (z.B. eine glycosylierte Aminosäure), künstlich eingebaute D-Aminosäuren, Seleno-Aminosäuren, Aminosäuren, welche ein unnatürliches Isotop tragen und dergleichen. Eine Veränderung kann auch auf einen bestimmten Rest (z.B. eine freie NH2-Endgruppe) an einer oder mehreren Aminosäuren oder auf Modifikationen zielen, welche bestimmten Aminosäuren in vitro zugefügt worden sind.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sollten die zu verändernden Aminosäuren selten sein, aber nichtsdestotrotz in der großen Mehrheit der Proteine vorhanden sein, und zwar in der Proteine enthaltenen Probe. Diese Ausführungsform erlaubt es, gekennzeichnete Peptide zu isolieren, welche die große Mehrheit der Proteine in der Probe darstellen. Die große Mehrheit der Proteine sollte mindestens eine und vorzugsweise zwei, drei oder eine beschränkte Zahl von Resten der ausgewählten Aminosäure enthalten. Beispielsweise ist Cystein eine seltene Aminosäure, und nur 14,55% der Proteine und/oder offenen Leserahmen aus E. coli-Genomsequenzen enthalten kein Cys. Diese Zahlen sind 11,34% für Trp, 4,12% für His bzw. 0,32% für Met. Letzteres erhöht sich auf 3,17% nach Auslassen des Initiators Methionin, welcher häufig verarbeitet wird. Eine ähnliche theoretische Analyse unter Verwendung anderer Genomsequenzen, welche in der Swiss-Prot-Datenbank (Version 39.0) gespeichert sind, ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Diese Untersuchungen zeigen, dass unter den seltenen Aminosäuren Methionin eine hervorragende Proteinrepräsentanz in Spezies zeigt, welche so unterschiedlich sind wie Säugetiere, Hefe und E. coli. Mehr als 96% der Proteine umfassen mindestens ein internes Methionin. Diese Zahl ist durchgängig niedriger für Cystein, welches, abhängig von dem Organismus, in 85 bis 95% der vorhergesagten Proteine enthalten ist. Diese Werte stimmen mit den Ergebnissen früherer Studien überein, welche auf den Fragment-korrigierten SWISS-PROT- und SWISS-NEW-kommentierten Datenbanken, welche 72.101 Sequenzen nutzen, die anzeigen, dass 2,3% der Proteine kein Met verwendeten, während 12,8% der Proteine Cys fehlt (Vuong et al., 2000). Zusätzlich zeigen diese Untersuchungen eine homogenere Verteilung von Met über die unterschiedlichen Proteine als von Cys.
  • Methionin ist eine Aminosäure, welche vorzugsweise für eine Veränderung gemäß der vorliegenden Erfindung ausgesucht sind.
  • Cystein, Histidin und Tryptophan sind ebenfalls bevorzugte Aminosäuren. Andere weniger häufig beobachtete Aminosäuren, wie beispielsweise Lysin, Phenylalinin und Tyrosin, können in der Erfindung ebenfalls verwendet werden. Die Wahl einer Aminosäure für eine Veränderung hängt auch von der Komplexität und dem Ursprung (z.B. Pflanzen, Tiere, Bakterien oder Viren) der Probenproteine ab. Beispielsweise ist Methionin in Pflanzen eine unterrepräsentierte Aminosäure und ist daher geeigneter, eine Aminosäure auszuwählen, wie beispielsweise Cystein als eine spezifische zu verändernde Aminosäure.
  • Alternativ hat die spezifische chemische und/oder enzymatische Reaktion eine Spezifizität für mehr als einen Aminosäurerest (z.B. sowohl Phosphoserin und Phosphothreonin oder die Kombination aus Methionin und Cystein) und erlaubt eine Trennung einer Teilmenge von Peptiden aus einem Protein-Peptid-Gemisch. Typischerweise wird die Zahl der zum Verändern ausgesuchten Aminosäuren jedoch 1, 2 oder 3 sein. In einem weiteren Aspekt können zwei unterschiedliche Arten ausgewählter Aminosäuren in einem Protein-Peptid-Gemisch verändert werden, und eine Teilmenge gekennzeichneter Peptide, welche eine oder beide veränderten Aminosäuren enthält, kann isoliert werden. In einem weiteren Aspekt kann das gleiche Peptidgemisch zunächst an einer Aminosäure verändert werden, eine Teilmenge gekennzeichneter Peptide kann isoliert werden und darauf folgend kann eine zweite Veränderung an der übrigbleibenden, vorher unveränderten Probe durchgeführt werden, und eine weitere Teilmenge gekennzeichneter Peptide kann isoliert werden.
  • Die vorliegende Erfindung verlangt, dass die Veränderung in jedem der Peptidfraktionen aus dem primären Durchlauf effektiv ist. Daher müssen in jeder der aus dem primären chromatographischen Schritt erlangten Fraktionen die gekennzeichneten Peptide unterscheidbar von den unveränderten Peptiden im sekundären chromatographischen Schritt wandern. Die Veränderung einer Aminosäure in einem gekennzeichneten Peptid erzeugt eine Verschiebung in der Elution der gekennzeichneten Peptide. Abhängig von der Art der angelegten Veränderung kann die Verschiebung durch eine Änderung in der Hydrophobizität, der Nettoladung und/oder der Affinität für einen Liganden (z.B. ein Metallion) der gekennzeichneten Peptide verursacht sein. Diese Verschiebung wird δp genannt und ist spezifisch für jedes individuelle gekennzeichnete Peptid. Für das Beispiel einer Änderung der Hydrophobizität, können die δp-Werte als Änderungen im hydrophoben Moment ausgedrückt werden oder als Prozentanteil der organischen Lösungsmittel in den chromatographischen Durchläufen, aber am praktischsten in Zeiteinheiten unter gegebenen chromatographischen/elektrophoretischen Bedingungen.
  • Daher ist δp nicht notwendigerweise für jedes gekennzeichnete Peptid identisch und liegt zwischen δmax und δmin (siehe 1). δp wird durch eine Zahl von Faktoren beeinflusst, wie beispielsweise durch die Natur der angewandten Veränderung, die Natur der stationären Phase der Säule, der mobilen Phase (Puffer, Lösungsmittel), der Temperatur und anderen. Alle δp-Werte zusammengenommen beschreiben die Extreme von δmax und δmin (siehe 1). Falls t1 und t2 gegeben sind, welches die Zeiten sind, welche den Anfang und das Ende des Intervalls der verschobenen gekennzeichneten Peptide darstellen, und t3 und t4, welche die Zeiten darstellen, welche die Fraktion umfassen, die sich aus dem primären Durchlauf ergeben, wird δmin (die minimale Verschiebung) durch t3 – t2 bestimmt, während δmax (die maximale Verschiebung) durch t4 – t1 bestimmt wird. Das Fenster w1 ist das Fraktionsfenster aus dem primären Durchlauf mit w1 = t4 – t3. Fenster w2 ist das Fenster, in welchem die gekennzeichneten Peptide eluieren werden mit w2 = t2 – t1. Daher: δmin = t3 – t2; δmax = t4 – t1'; w1 = δmax + t1 – δmin – t2 und w2 = t2 – t1 = δmax – δmin – w1. Wichtige Elemente beim Sortierablauf sind: δmin, welches den Abstand zwischen dem unveränderten und dem letzten verschobenen der gekennzeichneten Peptide in einer gegebenen Fraktion angibt, und w2, das Zeitfenster, in welchem gekennzeichnete Verbindungen bzw. Verbünde eluiert werden. Das Wort "sortiert" ist in dieser Erfindung äquivalent zum Wort "isoliert".
  • δmin muss ausreichend sein, um zu vermeiden, dass gekennzeichnete Peptide innerhalb vom Fenster w1 eluieren (und als solches mit den unveränderten Peptiden überlappen würden), und diese Regel sollte auf jede aus dem primären Durchlauf gesammelte Fraktion angewandt werden. Vorzugsweise sollte δmin w1 oder größer sein, um eine Überlappung zwischen gekennzeichneten und unveränderten Peptiden zu minimieren. Falls beispielsweise w1 = 1 Minute ist, sollte δmin vorzugsweise 1 Minute oder mehr betragen.
  • Vermeiden einer Überlappung oder Co-Elution gekennzeichneter Peptide verbessert die Möglichkeit, eine optimale Zahl individueller Peptide zu identifizieren. Aus dieser Sicht hat die Größe von Fenster w2 einen Einfluss auf die Zahl der Peptide, welche identifiziert werden können. Größere Werte von w2 führen zu einer Dekomprimierung der Elutionszeit der gekennzeichneten Peptide, wodurch eine bessere Isolierung der gekennzeichneten Peptide bereitgestellt wird, als auch eine bessere Möglichkeit zur Analyse durch graduelles Weiterreichen der Verbindungen bzw. Verbünde zur Identifikation an Analysegeräte, wie beispielsweise Massenspektrometern. Während Fenster w2 kleiner sein kann als w1, wird in einer bevorzugten Ausführungsform w2 größer sein als w1. Falls beispielsweise w1 = 1 Minute ist, kann w2 1 Minute oder mehr sein. Es wird bevorzugt, wenn die Größe von w2 und der Wert von δmin und δmax identisch oder sehr ähnlich für jede aus dem primären Durchlauf gesammelte Fraktion sind. Es ist jedoch selbstverständlich, dass geringe Verschmutzungen unveränderter Peptide im Elutionsfenster der gekennzeichneten Peptide nicht bevorzugt sind, aber dies ist akzeptabel.
  • Manipulation der Werte von δmin, δmax und w2, um eine optimale Trennung der gekennzeichneten Peptide von den unveränderten Peptiden in jeder Fraktion des primären Durchlaufs zu erhalten, ist Teil der vorliegenden Erfindung, und umfasst u.a. die richtige Kombination der zur Veränderung ausgewählten Aminosäure(n), die Art der Veränderung sowie die chromatographischen Bedingungen (Art der Säule, Puffer, Lösungsmittel usw.).
  • Während die Aspekte der hydrophilen Verschiebung oben ausgeführt worden sind, könnte eine ähnliche Beschreibung auch gegeben werden, wo eine hydrophobe Verschiebung eingeführt wird, um die gekennzeichneten Peptide von den nicht veränderten Peptiden zu trennen. Hier definierten t3 und t4 das Fenster w1, in welchem die unveränderten Peptide eluieren, während t5 und t6 das Fenster w2 definieren, in welchem die gekennzeichneten Peptide eluieren. Die maximale hydrophobe Verschiebung δmax = t6 – t3, die minimale Verschiebung = t5 – t4 (1C). Es wird angemerkt, dass ähnliche Berechnungen für Bedingungen durchgeführt werden können, in welchen die Fraktionen zusammengegeben werden.
  • Es ist für den Fachmann naheliegend, dass der gleiche Ansatz auf isolierte gekennzeichnete Peptide angewandt werden kann, beispielsweise mittels Ionenaustausch-Chromatographie oder durch andere Typen von Chromatographie.
  • In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von Methionin enthaltenden Peptiden aus einem Protein-Peptid-Gemisch bereit, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Trennen des Protein-Peptid-Gemischs in Fraktionen mittels eines primären Durchlaufs, (b) chemisches Verändern des Methionin in den Peptiden jeder Peptid fraktion und (c) Isolieren der gekennzeichneten Methionin-enthaltenden Peptide mittels eines sekundären Durchlaufs. In einer besonderen Ausführungsform sind der primäre und der sekundäre Durchlauf chromatographische Trennungen, die auf Hydrophobizität beruhen, und die Veränderung des Methionin induziert eine hydrophile Verschiebung in den gekennzeichneten Methionin-enthaltenden Peptiden. In einer weiteren bestimmten Ausführungsform wird die hydrophobe Chromatographie mit einer Umkehrphasensäule durchgeführt, und die Veränderung des Methionin wird durch eine milde Oxidation erreicht. In noch einer weiteren Ausführungsform beruhen der primäre Durchlauf und der sekundäre Durchlauf auf einer Ionenaustausch-Chromatographie, und die Veränderung des Methionin ist eine chemische Reaktion mit einem Alkylhalogenid, wie beispielsweise Methyliodid. Diese Reaktion induziert eine Veränderung in der Ladung an den gekennzeichneten Peptiden und erlaubt es, die gekennzeichneten Peptide im sekundären Durchlauf an einer Ionenaustauschsäule zu trennen.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von phosphorylierten Peptiden aus dem Protein-Peptid-Gemisch bereit, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Trennen des Protein-Peptid-Gemischs in Fraktionen mittels eines primären Durchlaufs, (b) enzymatisches und/oder chemisches Verändern der Phosphopeptide in jedem der Fraktionen und (c) Isolieren der gekennzeichneten Phosphopeptide mittels eines sekundären Durchlaufs. In einer bestimmten Ausführungsform sind die primären und zweiten Durchläufe chromatographische Trennungen, die auf einer Hydrophobizität beruhen, und die Veränderung der Phosphopeptide ist eine Behandlung mit Phosphatase. Die dephosphorylierten gekennzeichneten Peptide unterlaufen eine hydrophobe Verschiebung und können daher von der Masse der unveränderten Peptide in jeder Fraktion mittels eines sekundären Durchlaufs an einer hydrophoben Säule isoliert werden. Es ist anzumerken, dass spezifische Phosphatasen verwendet werden können, um spezifische Phosphopeptide zu isolieren. Eine Phosphatase, die für Phosphotyrosine spezifisch ist, kann dazu verwendet werden, Peptide zu isolieren, welche ein phosphoryliertes Tyrosin enthalten.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung gekennzeichneter Peptide bereit, welche an Methionin und/oder Cystein aus einem Protein-Peptid-Gemisch verändert wurden, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Trennen des Protein-Peptid-Gemisch in Fraktionen mittels eines primären Durchlaufs, (b) chemisches Verändern der Methionin- und Cysteinreste in den in jeder Fraktionen vorhan denen Peptiden und (c) Isolieren der gekennzeichneten Methionin- und Cysteinpeptide mittels eines sekundären Durchlaufs. In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Isolieren gekennzeichneter Peptide bereit, welche an Cystein aus einer Probe verändert wurden, welche Proteine enthält, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Oxidieren der Proteinprobe, (b) Erzeugen einer Protein-Peptide-Mischung, (c) Trennen des Protein-Peptid-Gemischs in Fraktionen mittels eines primären Durchlaufs, (d) chemisches Verändern der in den Peptiden in jeder Fraktion enthaltenen Cysteinreste, und (e) Isolieren der gekennzeichneten Cysteinpeptide mittels eines sekundären Durchlaufs. In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung gekennzeichneter Peptide bereit, welche an Phophoserin und/oder Phosphothreonin aus einer Proteine umfassenden Probe verändert wurden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Oxidieren der Proteinprobe, (b) Trennen des Protein-Peptid-Gemischs in Fraktionen mittels eines primären Durchlaufs, (c) enzymatisches Verändern der Peptide, welche Phosphoserin und/oder Phosphothreonin enthalten, und zwar in jeder der Fraktionen, und (d) Isolieren der gekennzeichneten Phosphoserin- und Phosphothreoninpeptide mittels eines sekundären Durchlaufs.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung einer Teilmenge von Peptiden aus einem Protein-Peptid-Gemisch bereit, welches die folgende Schritte umfasst: (a) Trennen des Protein-Peptid-Gemischs in Fraktionen mittels eines primären Durchlaufs, (b) Hinzufügen eines Chelatbildners zu jeder der ersten Fraktionen und (c) Isolieren der chelierten Peptide mittels eines sekundären Durchlaufs. Die chelierten Verbunde können kleine komplexbildende Moleküle, Co-Faktoren, Antikörper und dergleichen sein.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung phosphorylierter Peptide aus einem Protein-Peptid-Gemisch bereit, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Separieren bzw. Trennen des Protein-Peptid-Gemischs in Fraktionen über einen primären Durchlauf, (b) Hinzufügen mindestens eines chelierenden Verbundes zu den ersten Fraktionen und (c) Isolieren der phosphorylierten Peptide mittels eines sekundären Durchlaufs. In einer bestimmten Ausführungsform wird der für die Isolierung phosphorylierter Peptide verwendete chelatisierende Verbund Fe3+ und Iminodeacetat umfassen.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Isolieren einer Teilmenge von Peptiden aus einem Protein-Peptid-Gemisch bereit, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Trennen des Protein-Peptid-Gemischs in Fraktionen über einen primären Durchlauf, (b) chemisches oder enzymatisches Hinzufügen einer raumgreifenden und voluminösen Einheit zumindest einer Aminosäure in mindestens einem der Peptide in jeder Fraktion und (c) Isolieren der gekennzeichneten Peptide aus jeder Fraktion mittels eines sekundären Durchlaufs, wobei die primären und sekundären Durchläufe an einer Größenausschlusssäule unter identischen oder im wesentlichen ähnlichen Bedingungen durchgeführt werden.
  • In noch einer weiteren Ausführung stellt die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung glycosylierter Peptide aus einem Protein-Peptid-Gemisch bereit, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Trennen des Protein-Peptid-Gemischs in Fraktionen mittels eines primären Durchlaufs, (b) chemisches und/oder enzymatisches Verändern der Glycosylierungsstrukturen, die an den Peptiden in jeder der Fraktionen vorhanden sind und (c) Isolieren der gekennzeichneten Peptide, welche veränderte Glycosylierungsstrukturen enthalten, mittels eines sekundären Durchlaufs. In einer bestimmten Ausführungsform kann die Veränderung der Glycosylierungsstrukturen beispielsweise eine chemische und/oder enzymatische Deglycosylierung sein, oder alternativ können die Glycosylgruppen in Gruppen mit unterschiedlichen biophysikalischen oder biochemischen Eigenschaften umgewandelt werden, so dass sie von den ansonsten co-eluierenden, nicht veränderten Peptiden getrennt werden können. Beispielsweise können sialylierte Glycosylketten durch Neuraminidasebehandlung desialysiert werden, was zu Verschiebungen an einem chromatographischen Medium führt.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von ε-N-acetylierten Peptiden aus einem Protein-Peptid-Gemisch bereit, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Trennen der Protein-Peptid-Mischung in Fraktionen mittels eines primären Durchlaufs, (b) enzymatisches Deacetylieren der ε-N-acetylierten Peptide in jeder der Fraktionen und (c) Isolieren der gekennzeichneten deacetylierten Peptide mittels eines sekundären Durchlaufs.
  • Wie oben angemerkt, benötigt die Isolierung einer Teilmenge gekennzeichneter Peptide mit der durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Verfahren, dass nur eine Teilpopulation von Peptiden in dem Protein-Peptid-Gemisch verändert wird. In verschiedenen Anwendun gen kann die Veränderung direkt an den Peptiden durchgeführt werden, jedoch erlauben es (a) Vorbehandlungen der Proteine in der Probe und/oder (b) Vorbehandlungen der Peptide in dem Protein-Peptid-Gemisch, das Spektrum von Klassen von Peptiden zu erweitern, welche mit der Erfindung isoliert werden können. Um das Prinzip zu illustrieren, wird ein Beispiel beschrieben, wie Cystein enthaltende Peptide isoliert werden können. Es ist klar, dass Peptide, die ein oder mehrere Cysteine umfassen, in ein hydrophileres gekennzeichnetes Peptid durch eine chemische Reaktion mit beispielsweise Acrylamid umgewandelt werden können. Diese chemische Veränderung wandelt Cystein in das hydrophilere S-Propionamidocystein um. Dieses Cysteinderivat kann durch eine Oxidationsreaktion in eine sogar noch hydrophilere Abart umgewandelt werden. Eine solche Oxidation wandelt das S-Propionamidocystein in S-Propionamidocysteinsulfoxid. Gekennzeichnete Peptide, die Derivate von S-Propionamidocysteinsulfoxid umfassen, zeigen eine signifikante hydrophile Verschiebung, welche einfach von der Hauptmenge der nicht veränderten Peptide unter Verwendung der vorliegenden Erfindung isoliert werden kann. Jedoch verändert das Anwenden der oben genannten chemischen Veränderung nicht nur die Cystein enthaltenden Peptide, sondern verändert auch die Methionin enthaltenden Peptide (da die Oxidation auch das Methionin in sein hydrophileres Methioninsulfoxid-Derivat umwandelt). Als Konsequenz werden zwei Arten gekennzeichneter Peptide simultan durch die Veränderung erzeugt und werden auch simultan isoliert. Um solche Simultanisolierungen von Cys-Peptiden und Met-Peptiden zu vermeiden, wird ein Vorbehandlungsschritt eingeführt.
  • In einer bestimmten Ausführungsform werden die Proteine in dem Gemisch oxidiert, bevor sie in ihre konstituierenden Peptide zerteilt werden. Diese Vorbehandlung führt zur Oxidation von Methionen in ihre Methioninsulfoxid-Derivate. Folglich werden die Proteine ausgefällt und reduziert, um Disulfid-Brücken in Thiol-Gruppen umzuwandeln. Das Protein-Peptid-Gemisch, das sich aus der Spaltung der Proteine ergibt, wird dann erfindungsgemäß dem primären Durchlauf unterworfen, und die Fraktionen werden chemisch mit Acrylamid verändert, gefolgt durch eine Oxidation. Da die Methionine schon während des Vorbehandlungsschritts oxidiert worden sind, werden nun nur die Cys-enthaltenden Peptide verändert. Die gekennzeichneten S-Propionamido-Cysteinsulfoxid-Peptide werden durch Durchführen des sekundären Durchlaufs isoliert, und zwar ohne merkliche Verunreinigung mit Met-Peptiden.
  • Dieses Beispiel zeigt, dass eine Selektivität der Veränderungsreaktion im Hinblick auf eine ausgewählte Aminosäure (oder eine modifizierte Aminosäure oder einen Aminosäurerest usw.) durch Vorbehandlung der Proteine in der Probe vor dem primären Durchlauf erreicht werden kann. Solch eine Vorbehandlung kann gleich gut auf die Peptide in dem Protein-Peptid-Gemisch vor dem primären Durchlauf angewandt werden. In einem bestimmten Fall könnte eine Vorbehandlung auch während des primären Durchlaufs durchgeführt werden. Die Erfindung stellt daher weiterhin ein Verfahren zur Isolierung gekennzeichneter Peptide aus einem Protein-Peptid-Gemisch bereit, welches umfasst: (a) eine Vorbehandlung der Proteine in der Probe und/oder der Peptide in dem Protein-Peptid-Gemisch, um zu verhindern, dass ungewünschte Aminosäuren in Schritt (c) mitverändert werden; (b) Trennen des Protein-Peptid-Gemischs in Fraktionen mittels eines primären Durchlaufs; (c) chemisches und/oder enzymatisches Verändern mindestens einer Aminosäure in mindestens einem Peptid in jeder Fraktion und (d) Isolieren der gekennzeichneten Peptide mittels eines sekundären Durchlaufs. Eine solche Vorbehandlung kann eine oder mehrere chemische und/oder enzymatische Reaktionen umfassen.
  • In einer bestimmten Ausführungsform können gekennzeichnete Peptide isoliert werden, welche von Proteinen mit einer freien NH2-Endgruppe abgeleitet worden sind. Das letztere Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) die Proteine umfassende Probe wird vorbehandelt, um Cysteinseitenketten abzuleiten und um Lysin in Homoarginin umzuwandeln, (b) die α-NH2-Gruppen werden in Thiocarbamoyl-Derivate umgewandelt, (c) ein Protein-Peptid-Gemisch wird hergestellt, (d) die neu erzeugten NH2-Gruppen in dem Gemisch werden blockiert, (e) das Gemisch wird mit einer Säure behandelt, wodurch der Verlust der NH2-terminalen Reste der Peptide induziert wird, welche in Schritt (b) blockiert worden sind, (f) das vorbehandelte Protein-Peptid-Gemisch wird in einem ersten chromatographischen Durchlauf getrennt, (g) die neu erzeugten NH2-Gruppen werden mit einer acetylierenden Verbindung verändert und dadurch wird eine Teilmenge gekennzeichneter Peptide erzeugt und (h) die gekennzeichneten Peptide werden in einem sekundären chromatographischen Schritt isoliert. In einem bestimmten Fall kann Schritt (d) der letzteren Ausführungsform mit Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) ausgeführt werden. In einem weiteren bestimmten Fall wird Schritt e) mit TFA durchgeführt.
  • Wie oben angeführt, stellt die Erfindung in einem Umkehrmodus ein Verfahren zur Isolierung von Identifizierungspeptiden aus einem Protein-Peptid-Gemisch bereit. In dieser Aus führungsform bleibt die Minderheit der Peptide in dem Protein-Peptid-Gemisch unverändert, während der Hauptteil der Peptide verändert wird. Die veränderten Peptide nehmen Eigenschaften an, welche ihr chromatographisches Verhalten ändern, während die Identifizierungspeptide nicht verändert werden und ihr ursprüngliches chromatographisches Verhalten beinhalten. So eluieren die Identifizierungspeptide zur gleichen Zeit während des sekundären Durchlaufs, so wie sie es während des primären Durchlaufs getan haben, während die veränderten Peptide vorwärts oder rückwärts verschoben werden. Dies erlaubt es, die Identifizierungspeptide in jeder Fraktion von den veränderten Peptiden zu trennen und die Identifizierungspeptide zu isolieren.
  • Ähnlich zur Situation mit den gekennzeichneten Peptiden, wie oben beschrieben, benötigt die vorliegende Erfindung, dass die Veränderung in jeder der Peptidfraktionen des primären Durchlaufs effektiv ist. Daher müssen die veränderten Peptide in jeder aus dem primären chromatographischen Schritt erlangten Fraktion im sekundären chromatographischen Schritt unterscheidbar von den Identifizierungspeptiden wandern. Abhängig von der Art der angelegten Veränderung kann die Verschiebung beispielsweise durch eine Änderung der Hydrophobizität oder der Nettoladung erzeugt werden. Diese Verschiebung wird δp genannt und ist für jedes individuelle veränderte Peptid eigentümlich. Für das Beispiel einer Änderung in der Hydrophobizität können die δp-Werte ausgedrückt werden als Änderungen im hydrophoben Moment oder als ein Prozentsatz der organischen Lösungsmittel in den chromatographischen Durchläufen, aber am praktischsten in Zeiteinheiten unter gegebenen chromatographischen/elektrophoretischen Bedingungen. Daher ist δp nicht notwendigerweise für jedes veränderte Peptid identisch und liegt zwischen δmax und δmin. δp wird durch eine Zahl von Faktoren beeinflusst, wie beispielsweise der Natur der induzierten Veränderung, der Natur der stationären Phase der Säule, der mobilen Phase (Puffer, Lösungsmittel), Temperatur und anderen. In einem Beispiel, wo die Peptide in einer Fraktion aus dem primären Durchlauf in Fenster w1 eluieren, werden die Identifizierungspeptide in ungefähr dem gleichen Fenster w1 während des sekundären Durchlaufs eluieren. In einer bevorzugten Ausführungsform muss δmin ausreichend sein, um zu vermeiden, dass veränderte Peptide innerhalb von Fenster w1 eluieren (und als solches mit den Identifizierungspeptiden überlappen würden). Diese Regel sollte für jede aus dem primären Durchlauf gesammelte Fraktion angewendet werden. Vorzugsweise sollte δmin w1 oder größer sein, um ein Überlappen zwischen veränderten und Identifizierungs-Peptiden zu minimieren. Falls beispielsweise w1 = 1 Minu te ist, sollte δmin vorzugsweise 1 Minute oder größer sein. Es ist jedoch selbstverständlich, dass kleinere Verunreinigungen veränderter Peptide im Elutionsfenster der Identifizierungspeptide nicht bevorzugt sind, aber dies akzeptabel ist. Eine Manipulation der Werte von δmin, um eine optimale Trennung der Identifizierungspeptide von den veränderten Peptiden in jeder Fraktion des primären Durchlaufs zu erhalten, ist Teil der vorliegenden Erfindung und umfasst u.a. die richtige Kombination der zur Veränderung ausgewählten Aminosäure(n), die Art der Veränderung und die chromatographischen Bedingungen (Art der Säule, Puffer, Lösungsmittel usw.). Es ist für einen Fachmann offensichtlich, dass der gleiche Ansatz angewendet werden kann, um Identifizierungspeptide mit beispielsweise einer Ionenaustausch-Chromatographie oder anderen Arten von Chromatographie zu isolieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt daher weiterhin ein Verfahren zur Isolierung einer Teilmenge von Peptiden aus einem Protein-Peptid-Gemisch bereit, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Trennen des Protein-Peptid-Gemischs in Fraktionen von Peptiden durch Chromatographie; (b) chemisches und/oder enzymatisches Verändern von mindestens 50%, vorzugsweise 60%, bevorzugter 70% und sogar noch bevorzugter 80% und am bevorzugtesten mehr als 90% der Peptide in jeder Fraktion; und (c) Isolieren der Identifizierungspeptide durch Chromatographie, wobei die Chromatographie der Schritte (a) und (c) durch die gleiche Art von Chromatographie durchgeführt wird. Ähnlich zum Ansatz mit gekennzeichneten Peptiden kann die Veränderung zwischen dem primären und sekundären Durchlauf beispielsweise eine Veränderung einer Aminosäure, einer modifizierten Aminosäure (glycosyliert, phosphoryliert, acetyliert usw.), einer in vitro hinzugefügten Modifikation zu bestimmten Aminosäuren und/oder ein bestimmter Rest an einer oder mehreren Aminosäuren sein.
  • Wie vorher angemerkt, benötigt die Isolierung einer Teilmenge von Identifizierungspeptiden mit dem durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Verfahren, dass die Mehrzahl der Peptide in dem Protein-Peptid-Gemisch verändert wird. In verschiedenen Anwendungen kann die Veränderung direkt an den Peptiden durchgeführt werden.
  • Jedoch erlauben es (a) Vorbehandlungen der Proteine in der Probe und/oder (b) Vorbehandlungen der Peptide in dem Protein-Peptid-Gemisch, das Spektrum an Klassen von Peptiden zu erweitern, welche mit der Erfindung isoliert werden können. In einem bestimmten Fall kann eine Vorbehandlung auch während des primären Durchlaufs durchgeführt werden.
  • Um das Prinzip zu illustrieren, wird ein Beispiel beschrieben, wie Amino-endständig blockierte Peptide (das sind Peptide, die von dem Amino-terminalen Ende von Proteinen abgeleitet sind, welche an ihrem Aminoende in vivo blockiert worden sind) isoliert werden können. Amino-terminale blockierte Peptide können gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert werden über: (a) Trennen des Protein-Peptid-Gemischs durch Chromatographie; (b) Verändern der freien Amino-endständigen Gruppe der Peptide (deren von einem Amino-endständig blockierten Protein abgeleiteten Peptide keine freie Amino-endständige Gruppe aufweisen) und (c) Trennen der Amino-terminal blockierten Identifizierungspeptide von der Hauptmenge der veränderten Peptide über Chromatographie, wobei die Chromatographie in Schritten (a) und (c) mit der gleichen Art von Chromatographie durchgeführt wird. Während es dieser Ansatz erlaubt, viele der Amino-endständig blockierten Peptide zu isolieren, wird die Population der Amino-endständig blockierten Peptide, welche außerdem Lysin enthalten, bei dem Vorgehen nicht ausgewählt. Lysine haben auch eine freie Aminogruppe, und die Veränderung in Schritt (b) wird daher auch diese Amino-endständig blockierten Peptide verändern, welche ein Lysin enthalten. Die Population bzw. Gesamtheit der blockierten Amino-terminalen Peptide wird auch ein Lysin enthalten, welches daher verändert wird, und wird daher nicht Teil der Identifizierungspeptide sein und wird nicht isoliert werden. Um den Verlust dieser Population zu vermeiden, wird ein Vorbehandlungsschritt eingeführt, welcher vor dem primären Durchlauf die Protein-Lysin-ε-NH2-Gruppen in eine blockierte Aminogruppe umwandelt. In einer bestimmten Ausführungsform werden die Lysine mit einer freien ε-NH2-Gruppe in Homoarginin umgewandelt, gefolgt durch Verdauung bzw. Digestion mit Trypsin, welches das Protein am Homoarginin spaltet und eine freie α-Aminosäure an diesen Positionen erzeugt. Als Folge werden blockierte Amino-terminale Peptide, welche ein Lysin enthalten, nicht länger verändert und werden als Identifizierungspeptide isoliert.
  • Dieses Beispiel zeigt, dass die Selektivität der Veränderungsreaktion im Hinblick auf eine ausgewählte Aminosäure (oder eine modifizierte Aminosäure oder einen Aminosäurerest) durch Vorbehandeln der Proteine in der Probe vor dem primären Durchlauf verbessert wird. So eine Vorbehandlung kann gleich gut auf die Peptide in dem Protein-Peptid-Gemisch angewandt werden. Die Erfindung stellt daher weiterhin ein Verfahren zur Isolierung von Identifizierungspeptiden aus einem Protein-Peptid-Gemisch bereit, das die folgenden Schrit te umfasst: (a) eine Vorbehandlung der Proteine in der Probe und/oder der Peptide in dem Protein-Peptid-Gemisch; (b) Trennen des Protein-Peptid-Gemischs in Fraktionen mittels eines primären Durchlaufs; (c) chemisches und/oder enzymatisches Verändern mindestens einer Aminosäure in der Mehrzahl der Peptide in jeder Fraktion und (d) Isolieren der Identifizierungspeptide mittels eines sekundären Durchlaufs. Eine solche Vorbehandlung mag eine oder mehrere chemische und/oder enzymatische Reaktionen umfassen.
  • Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren bereit, um die Amino-terminal blockierten Peptide des Proteins in einer Probe zu isolieren, welche Proteine umfasst, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: (1) Umwandeln der Protein-Lysin-ε-NH2-Gruppen in Guanidylgruppen oder anderen Gruppen, (2) Verdauung der Proteinprobe dergestalt, dass die Proteine am Homoarginin gespalten werden und eine freie α-Aminosäure an diesen Positionen erzeugt wird, (3) Fraktionierung des Protein-Peptid-Gemischs in einem primären Durchlauf, (4) Verändern der freien Amino-terminalen Gruppen der Peptide in jeder Fraktion mit einer hydrophoben, hydrophilen oder geladenen Komponente, und (5) Isolieren der nicht veränderten Identifizierungspeptide in einem sekundären Durchlauf.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, um die Amino-terminalen Peptide der Proteine in einer Protein umfassenden Probe zu isolieren. Dieses Verfahren umfasst die Schritte: (1) die Umwandlung der Protein-Lysin-ε-NH2-Gruppen in Guanidylgruppen oder andere Gruppen, (2) die Umwandlung der freien α-Aminogruppen an der Amino-terminalen Seite jedes Proteins, Erzeugen einer blockierten (nicht weiter reaktiven) Gruppe, (3) Verdauung der Proteingruppe, dadurch Erhalten von Peptiden mit neu erzeugten freien NH2-Gruppen, (4) Fraktionierung des Protein-Peptid-Gemischs in einem primären Durchlauf, (5) Verändern der freien NH2-Gruppen der Peptide in jeder Fraktion mit einer hydrophoben, hydrophilen oder geladenen Komponente und (6) Isolieren der nicht veränderten Identifizierungspeptide in einem sekundären Durchlauf. Dieser Ansatz macht es möglich, die Amino-terminalen Peptide der Proteine in der Proteinprobe spezifisch zu isolieren, wobei die Probe sowohl solche Amino-terminalen Peptide mit einer freien und solche mit einer blockierten α-Aminosäurengruppe umfasst. Das Durchführen von Schritt (2) im oberen Protokoll dergestalt, dass die freien α-Aminogruppen mit einem isotopisch markierten Rest blockiert werden, erlaubt es einem, die in vivo blockierten Amino-terminalen Peptide von den Amino-terminalen Peptiden mit einer freien NH2- Gruppe zu unterscheiden. Eine Anwendung der letzteren Ausführungsform ist die Untersuchung einer internen proteolytischen Verarbeitung von Proteinen zwischen zwei unterschiedlichen Proteine enthaltenden Proben (siehe beispielsweise Beispiel 8).
  • In noch einer weiteren Ausführung des Umkehrmodus wird auf die chemische oder enzymatische Veränderung zwischen dem primären und dem sekundären Durchlauf von Aminosäuren abgezielt, welche in der großen Mehrheit der Peptide vorhanden sind. Solche häufigen Aminosäuren sind in mindestens 50% der Peptide vorhanden, vorzugsweise in mehr als 75% der Peptide und noch günstiger in mehr als 90% der Peptide.
  • In einer weiteren Ausführungsform sind die Identifizierungspeptide COOH-terminale (Carboxy-terminale) Peptide der Proteine.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, um eine Teilmenge von Peptiden aus einem Protein-Peptid-Gemisch bereitzustellen, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Trennen des Protein-Peptid-Gemischs in Fraktionen mittels eines primären Durchlaufs, (b) chemisches oder enzymatisches Hinzufügen einer großen und voluminösen Einheit zu mindestens einer Aminosäure in der Mehrzahl der Peptide in jeder Fraktion und (c) Isolieren der Identifizierungspeptide aus jeder Fraktion mittels eines sekundären Durchlaufs, wobei der erste und der zweite Durchlauf an einer Größenausschlusssäule unter identischen oder im wesentlichen ähnlichen Bedingungen durchgeführt werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt in jeder der Fraktionen die Trennen der gekennzeichneten Peptide von der Hauptmenge der unveränderten Peptide und ergibt schlussendlich die Isolierung einer spezifischen Teilmenge gekennzeichneter Peptide aus dem gesamten Protein-Peptid-Gemisch. Wie oben angemerkt, können solche gekennzeichneten Peptide beispielsweise Peptide sein, die ein oder mehrere Methionine enthalten, Peptide, die ein oder mehrere Cysteine enthalten, Peptide, die ein oder mehrere Methionine und/oder ein oder mehrere Cysteine enthalten, Phosphopeptide, an Tyrosinen phosphorylierte Peptide, Peptide, die ein ε-N-acetyliertes Cystein enthalten usw., sein. Gekennzeichnete Peptide sind hochgradig für die Ursprungsproteine repräsentativ und als solche gekennzeichnete Peptide dienen als Identifizierungselemente für ihre korrespondierenden Proteine. Die vorliegende Erfindung stellt daher weiterhin ein Verfahren bereit, um eine Teilmenge von Peptiden und ihre korrespondierenden Proteine in einer Proteine umfassenden Probe zu identifizieren. Diesbezüglich wird die Isolierung gekennzeichneter Peptide gemäß irgendeiner der Ausführungsformen der Erfindung weiterhin mit einer Peptidanalyse gekoppelt.
  • Auf ähnliche Weise erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren in jeder der Fraktionen die Trennung der Identifizierungspeptide aus der Masse der veränderten Peptide und führt letztendlich zur Isolierung einer bestimmten Teilmenge von Identifizierungspeptiden aus dem gesamten Protein-Peptid-Gemisch. Wie oben angemerkt, können solche Identifizierungspeptide beispielsweise Amino-terminale Peptide, Amino-terminal blockierte Peptide, Carboxyterminale Peptide sein. Identifizierungspeptide sind hochgradig repräsentativ bezüglich der ursprünglichen Proteine, und als solche dienen die Identifizierungspeptide als Identifizierungselemente für ihre entsprechenden Proteine. Die vorliegende Erfindung stellt daher zusätzlich ein Verfahren zur Verfügung, um eine Teilmenge von Peptiden und die korrespondierenden Proteine in einer Proteine enthaltenen Probe zu identifizieren. Dazu wird die Isolierung der Identifizierungspeptide gemäß jeder der Ausführungsformen der Erfindung weiterhin mit einer Peptidanalyse gekoppelt.
  • In einem bevorzugten Ansatz wird eine Peptidanalyse gekennzeichneter oder Identifizierungs-Peptide mit einem Massenspektrometer durchgeführt. Jedoch können gekennzeichnete oder Identifizierungs-Peptide weiterhin auch unter Verwendung anderer Verfahren analysiert und identifiziert werden, wie beispielsweise durch Elektrophorese, Aktivitätsmessung in Proben bzw. Untersuchungen, Analyse mit spezifischen Antikörpern, Edman-Sequenzierung usw.
  • Eine Analyse oder ein Identifizierungsschritt kann auf unterschiedliche Arten ausgeführt werden. Bei einer Art werden gekennzeichnete Peptide oder Identifizierungspeptide, die aus den chromatographischen Säulen eluieren, direkt zum Analysegerät geführt. Bei einem alternativen Ansatz werden gekennzeichnete Peptide oder Identifizierungspeptide in Fraktionen gesammelt. Solche Fraktionen können oder brauchen nicht manipuliert zu werden, bevor sie einer weiteren Analyse oder Identifikation unterzogen werden. Ein Beispiel für eine solche Manipulation besteht aus einem Konzentrationsschritt, gefolgt durch Aufspüren jedes Konzentrats an beispielsweise einem MALDI-Target zur weiteren Analyse und Identifizierung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden gekennzeichnete Peptide oder Identifizierungspeptide durch massenspektrometrische Techniken mit hohem Durchsatz analysiert. Die erhaltene Information ist die Masse der gekennzeichneten oder Identifizierungspeptide. Wenn die Peptidmasse sehr genau definiert ist, wie beispielsweise durch ein Fourier-Transformations-Massenspektrometer (FTMS) unter Verwendung einer internen Kalibrierungsprozedur (O'Connor und Costello, 2000), ist es möglich, die Peptidmasse mit der Masse eines korrespondierenden Peptids in Peptidmassen-Datenbanken eindeutig zu korrelieren und dadurch das gekennzeichnete Peptid oder Identifizierungspeptid zu identifizieren. Die Genauigkeit einiger herkömmlicher Massenspektrometer ist jedoch nicht ausreichend, um die spektrometrisch bestimmte Masse jedes Peptids mit seinem korrespondierenden Peptid und Protein in Sequenz-Datenbanken eindeutig zu korrelieren. Um die Zahl der Peptide zu erhöhen, welche nichtsdestotrotz eindeutig identifiziert werden können, werden Daten über die Masse des Peptids mit anderer Information angereichert. In einer Ausführungsform wird die mittels des Massenspektrometers bestimmte Peptidmasse mit dem nachgewiesenen Wissen ergänzt (beispielsweise nachgewiesen durch neutralen Verlust von 64 amu in dem Fall von Methioninsulfoxid-gekennzeichneten Peptiden), dass jedes gekennzeichnete Peptid ein oder mehrere Reste der veränderten Aminosäure umfasst und/oder in der Kenntnis, dass das Peptid nach Verdauung einer Proteine enthaltenden Probe unter Verwendung einer Spaltungsprotease mit bekannter Spezifizität erzeugt wurde. Beispielsweise hat Trypsin eine gut bekannte Eigenschaft, genau an den Stellen von Lysin und Arginin zu spalten, was Peptide ergibt, welche typischerweise ein Molekulargewicht zwischen 500 und 5.000 Dalton haben, und welche C-terminales Lysin- oder Arginin-Aminosäuren aufweisen. Diese kombinierte Information wird verwendet, um Datenbanken zu durchsuchen, welche Information bezüglich der Masse, der Sequenz und/oder der Identität von Peptiden umfassen, und um das zugehörige Peptid und Protein zu identifizieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann das Verfahren zur Bestimmung der Identität des Stammproteins durch ausschließliches genaues Messen der Peptidmasse mindestens eines gekennzeichneten Peptids oder Identifizierungspeptids durch zusätzliches Anreichern des Informationsgehalts der ausgewählten gekennzeichneten Peptide oder Identifizierungspeptide verbessert werden. Als ein nicht beschränkendes Beispiel, wie Information zu den gekennzeichneten oder Identifizierungspeptiden hinzugefügt werden kann, können die freien NH2-Gruppen dieser Peptide spezifisch chemisch in einer chemischen Reaktion durch das Hinzufügen zweier unterschiedlicher isotopisch markierter Gruppen verändert werden. Als ein Ergebnis dieser Veränderung erhalten die Peptide eine vorbestimmte Zahl gekennzeichneter Gruppen. Da das Veränderungsmittel ein Gemisch zweier chemisch identischer, aber isotopisch unterschiedlicher Stoffe ist, werden die gekennzeichneten Peptide oder Identifizierungspeptide in den Massenspektren als Peptid-Dublett offenbart. Das Ausmaß der Massenverschiebung zwischen diesen Peptid-Dubletts zeigt die Zahl der in dem Peptid vorhandenen freien Aminogruppen an. Um dies weiter darzustellen, kann beispielsweise der Informationsgehalt der gekennzeichneten Peptide durch spezifisches Verändern freier NH2-Gruppen in den Peptiden unter Verwendung einer äquimolaren Mischung von Essigsäure-N-hydroxysuccinimidester und Trideuteroessigsäure-N-hydroxysuccinimidester angereichert werden. Als das Ergebnis dieser Umwandlungsreaktion bekommen die Peptide eine vorbestimmte Zahl von CH3-CO(CD3-CO)-Gruppen welche aus dem Ausmaß der beobachteten Massenverschiebung in den Peptid-Dubletts erkannt werden kann. Als solches korrespondiert eine Verschiebung von 3 amu mit einer NH2-Gruppe, eine 3- und 6-amu-Verschiebung entspricht zwei NH2-Gruppen und eine Verschiebung von 3, 6 und 9 amu offenbart das Vorhandensein dreier NH2-Gruppen in dem Peptid. Diese Information ergänzt weiterhin die Daten bezüglich der Peptidmasse, das Wissen über das Vorhandensein einer oder mehrerer Reste der veränderten Aminosäure und/oder das Wissen, dass das Peptid mit einer Protease bekannter Spezifität erzeugt wurde.
  • Ein weiteres Stück an Information, welches verwendet werden kann, um gekennzeichnete Peptide oder Identifizierungspeptide zu identifizieren, ist das Gesamtmittel der Hydrophatizität (Grand Average of Hydrophaticity; GRAVY) der Peptide, welches sich in den Elutionszeiten während einer Chromatographie wiederfindet. Zwei oder mehr Peptide mit identischen Massen oder mit Massen, welche in den Fehlerbereich der Massenmessungen fallen, können durch Vergleichen ihrer experimentell bestimmten GRAVY mit dem in silico vorausgesagten GRAVY unterschieden werden.
  • Jedes Massenspektrometer kann verwendet werden, um die gekennzeichneten oder Identifizierungspeptide zu analysieren. Nicht beschränkende Beispiele von Massenspektrometern umfassen das Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-/Ionisations- ("matrix-assisted laser desorption/ionization"; MALDI)Flugzeit-("time-of-flight", TOF)-Massenspektrometer ("MS") oder MALDI-TOF-MS, erhältlich von PerSeptive Biosystems, Framingham, Massachussetts; das Ettan-MALDI-TOF von AP Biotech und das Reflex III von Brucker-Daltonias, Bremen, Deutschland zur Verwendung in Post-Source-Decay-analyse; das E lektrosprühionisations-(Electrospray Ionization; ESI)-Ionenfallen-Massenspektrometer, erhältlich von Finnigan MAT, San Jose, Kalifornien; das ESI-Quadropol-Massenspektrometer, erhältlich von Finnigan MAT oder das GSTAR Pulsar Hybrid LC/MS/MS-System der Applied Biosystems Group, Foster City, Kalifornien und ein Fourier-Transformations-Massenspektrometer (FTMS) unter Verwendung einer internen Kalibrierungsprozedur (O'Connor und Costello, 2000).
  • Proteinidentifizierungs-Software, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, um die experimentellen Massenspektren der Peptide mit einer Datenbank der Peptidmassen und der korrespondierenden Proteine zu vergleichen, ist aus dem Stand der Technik verfügbar. Ein solcher Algorithmus, ProFound, nutzt einen Bayes-Algorithmus, um eine Protein- oder DNA-Datenbank zu durchsuchen, um die optimale Übereinstimmung mit den experimentellen Daten und dem Protein in der Datenbank zu identifizieren. Auf ProFound kann über das World Wide Web unter <http://prowl.rockefeller.edu> und <http://www.proteometrics.com> zugegriffen werden. Profound greift auf die nicht-redundante Datenbasis ("non-redundant database"; NR) zu. Auf eine Peptidsuche kann über die EMBL-Webseite zugegriffen werden. Siehe auch P. Chaurand et al. (1999) J. Am. Soc. Mass. Spectrum 10, 91, S.D. Patterson, Am. Physiol. Soc., 59–65, JR. Yates (1998), Electrophoresis, 19, 893). MS/MS-Spektren können auch durch MASCOT analysiert werden (verfügbar unter http://www.matrixscience.com, Matrix Science Ltd. London).
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden isolierte gekennzeichnete Peptide oder Identifizierungspeptide individuell einer Fragmentierung in dem Massenspektrometer unterzogen. Auf diese Weise wird Information über die Masse der Peptide zusätzlich mit (teilweisen) Sequenzdaten über die gekennzeichneten Peptide oder Identifizierungspeptide ergänzt. Vergleichen dieser kombinierten Information mit Information in Peptidmassen- und Peptid- und Protein-Sequenz-Datenbanken erlaubt es, die gekennzeichneten oder Identifizierungspeptide zu identifizieren. In einem Ansatz wird die Fragmentierung der gekennzeichneten oder Identifizierungspeptide günstigerweise durch Kollisions-induzierte Dissoziation ("collision induced dissociation"; CID) durchgeführt und wird allgemein als MS2 oder Tandemmassenspektrometrie bezeichnet. Alternativ können gekennzeichnete Peptidionen oder Identifizierungspeptidionen während ihres Fluges zerfallen, nachdem sie in einem MALDI-TOF-MS verdampft und ionisiert worden sind. Dieses Vorgehen wird Nachquellenzerfall ("post-source-decay"; PSD) genannt. In einem solchen massenspektrometrischen Ansatz werden ausgewählte gekennzeichnete Peptide oder Identifizierungspeptide direkt oder indirekt in die Ionenquelle eines Elektrosprüh-Massenspektrometers überfuhrt und dann weiter in dem MS/MS-Modus fragmentiert. Daher wird in einem Aspekt eine teilweise Sequenz-Information der gekennzeichneten Peptide oder Identifizierungspeptide aus den MSn-Fragmentierungsspektren gesammelt (wobei es so zu verstehen ist, dass n größer oder gleich 2 ist), und zur Peptid-Identifikation in den hierin beschriebenen Sequenzdatenbanken verwendet.
  • In einer bestimmten Ausführungsform kann man eine zusätzliche Sequenzinformation in einer MALDI-PSD-Analyse erhalten, wenn die α-NH2-Endgruppe der Peptide mit einer Sulfonsäure-Teilgruppe verändert wird. Gekennzeichnete Peptide, die eine NH2-terminale Sulfonsäuregruppe tragen, werden bestimmten Fragmentierungsmustern unterworfen, wenn sie in dem MALDI-TOF-MS-Modus entdeckt werden. Letzterer erlaubt eine sehr schnelle und einfache Ableitung der Aminosäuresequenz. Im Besonderen beschreibt Beispiel 6b ein Vorgehen, wie NH2-terminal gekennzeichnete Peptide von Proteinen mit einer freien NH2-Endgruppe isoliert werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung einer oder mehrerer Proteine in einer Proteine umfassenden Probe bereit. Auf der einen Seite ist es bekannt, dass Spaltung einer Proteine enthaltenden Probe zu einem Protein-Peptid-Gemisch führt, das Tausende von Peptiden enthält und dies die Trenngenauigkeit der zur Zeit verfügbaren chromatographischen Systeme und massenspektrometrischen Systeme überfordert. Auf der anderen Seite ist es bekannt, dass ein Protein auf der Grundlage der Identifizierung einer oder mehrerer seiner konstituierenden Peptide identifiziert werden kann. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit, um ein Spektrum unterschiedlicher Arten gekennzeichneter Peptide oder Identifizierungspeptide aus einem Protein-Peptid-Gemisch zu isolieren und zu identifizieren. Jede Menge gekennzeichneter Peptide oder Identifizierungspeptide repräsentiert eine Teilmenge der Peptide in dem Protein-Peptid-Gemisch. Diese Vereinfachung des ursprünglichen Peptidgemischs verringert die Co-Elution der Peptide im sekundären Durchlauf erheblich und fuhrt zu einer effizienten Identifizierung der gekennzeichneten oder Identifizierungspeptide mit Analysegeräten, wie beispielsweise Massenspektrometern oder anderen. Da gekennzeichnete Peptide oder Identifizierungspeptide im häufigsten Fall eindeutige Identifizierungselemente für ihre korrespondierenden Stammproteine sind, erlaubt eine Identifizierung der gekennzeichneten Peptide oder Identifizierungspeptide die Identifizierung der Proteine in der ursprünglichen Proteine enthaltenen Probe. So wird die Aufgabe, Proteine in einer Proteine enthaltenen Probe durch Isolieren und Identifizieren einer oder mehrerer ihrer Verbundpeptide zu identifizieren, mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung möglich.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Identifizieren von Proteinen in einer Proteine enthaltenen Probe bereit, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Trennen des Protein-Peptid-Gemischs in Fraktionen von Peptiden mittels Chromatographie; (b) chemisches und/oder enzymatisches Verändern mindestens einer Aminosäure an mindestens einem der Peptide in jeder Fraktion, dadurch Erzeugen einer Teilmenge veränderter Peptide; (c) Isolieren der gekennzeichneten Peptide aus jeder Fraktion mittels eines sekundären Durchlaufs; (d) Identifizieren der gekennzeichneten Peptide und ihrer korrespondierenden Proteine.
  • Die vorliegende Erfindung stellt daher weiterhin auch ein Verfahren bereit, Proteine in einer Proteine enthaltenen Probe zu identifizieren, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Trennen des Protein-Peptid-Gemischs in Fraktionen von Peptiden mittels Chromatographie; (b) chemisches und/oder enzymatisches Verändern mindestens einer Aminosäure der Mehrheit der Peptide in jeder Fraktion, dadurch Erzeugen einer Teilmenge unveränderter Peptide; (c) Isolieren der Identifizierungspeptide aus jeder Fraktion mittels eines sekundären Durchlaufs; (d) Identifizieren der Identifizierungspeptide und ihrer korrespondierenden Proteine.
  • Es ist für einen Fachmann naheliegend, dass diese Ausführungsformen der Erfindung gleichermaßen anwendbar sind, wenn eine Vorbehandlung der Proteine oder der Peptide vor Schritt (a) vorliegt, wie es auch oben beschrieben ist. Es ist für einen Fachmann gleichermaßen naheliegend, dass, beginnend von der bekannten Identität eines gekennzeichneten Peptids oder eines Identifizierungspeptids, die Identität des korrespondierenden Proteins durch Durchsuchen von Peptid-, Protein- und DNA-Sequenz-Datenbanken einfach bestimmt werden kann. Sowohl die Datenbanken als auch die Software zum Durchsuchen sind im Stand der Technik verfügbar.
  • Gekennzeichnete Peptide, welche erfindungsgemäß verwendet werden können, um Proteine in einer Proteine enthaltenen Probe zu identifizieren, sind beispielsweise: Methionin-enthaltende Peptide, Cystein-enthaltende Peptide, Histidin-enthaltende Peptide, Tyrosin- enthaltende Peptide, Lysin-enthaltende Peptide, Tryptophan-enthaltende Peptide, Arginin-enthaltende Peptide, Prolin-enthaltende Peptide, Phenylalanin-enthaltende Peptide oder eine Kombination zweier oder mehrerer dieser gekennzeichneten Peptide.
  • Andere gekennzeichnete Peptide können erfindungsgemäß dazu verwendet werden, die Anwesenheit von co- oder post-translational modifizierten Proteinen in einer Proteine umfassenden Probe zu identifizieren. Die vorliegende Erfindung stellt beispielsweise ein Verfahren bereit, um die phosphorylierten Proteine in einer Proteine umfassenden Probe zu identifizieren. Bei einem Ansatz werden Peptide, welche eine phosphorylierte Aminosäure enthalten, daher verändert und erfindungsgemäß als gekennzeichnete Peptide isoliert. Folglich führt die Identifizierung dieser gekennzeichneten Peptide und ihrer korrespondierenden Proteine zur Identifizierung der phosphorylierten Proteine (oder der Phosphoproteome) in einer Probe. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren bereit, um andere Arten co- oder post-translational modifizierter Proteine in einer Proteine enthaltenden Probe zu identifizieren, wie beispielsweise glycosylierte Proteine, Tyrosin-phosphorylierte Proteine, Serin- und/oder Threonin-phosphorylierte Proteine, acetylierte Proteine, ε-N-acetylierte Proteine, sulfatierte Proteine, usw.
  • Identifizierungspeptide können erfindungsgemäß verwendet werden, um Proteine in einer Probe zu identifizieren, beispielsweise die Amino-terminalen Peptide der Proteine. Die Massen jeder dieser Peptide können unter Verwendung von Massenspektrometrie bestimmt werden. Verbinden der Massen solcher Peptide mit dem Wissen, dass ein solches Peptid ein Amino-terminales Peptid ist, ist für die große Mehrheit der Peptide ausreichend, um die korrespondierenden Stammproteine eindeutig zu identifizieren. In einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung werden Datenbanken aufgebaut, die nur die Massen der Amino-terminalen Peptide enthalten, und die Massen der isolierten Amino-terminalen Identifizierungspeptide werden mit diesen Datenbanken abgeglichen. Bei diesem Ansatz ist es sehr wahrscheinlich, dass ein isoliertes Identifizierungspeptid eindeutig mit einer Masse in den beschränkten Datenbanken übereinstimmt. Darüber hinaus verringert dieser Ansatz die Komplexität des Peptid-basierten Proteom-Ansatzes erheblich und beschleunigt die Geschwindigkeit der Analyse erheblich.
  • Es ist weiterhin wichtig anzumerken, dass die Erfindung die Identifizierung eines ganzen Bereichs von Proteinen in einer Proteine enthaltenen Probe erlaubt, welcher sich beispiels weise von häufig zu selten erstreckt, von sauer zu basisch, von klein zu groß, von löslich zu Membranproteinen. Weiterhin stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, Proteine in einer Proteine enthaltenden Probe zu identifizieren, welche von einer sehr kleinen Anzahl von Zellen ausgeht. Die durch die Erfindung bereitgestellten Verfahren sind so effizient und empfindlich, dass es beispielsweise möglich ist, ausgehend von nur 50.000 menschlichen Zellen mehrere hundert bis mehr als tausend Proteine zu identifizieren. Sogar mit einer kleineren Zahl von Zellen als Startmaterial ist es immer noch möglich, Hunderte von Proteinen in einer Proteine enthaltenden Probe zu identifizieren. Offensichtlich können die Verfahren der Erfindung auch auf eine große Zahl von Zellen angewandt werden.
  • Andere Identifizierungspeptide können beispielsweise dazu verwendet werden, Amino-terminal blockierte Proteine oder proteolytisch gespaltene Proteine zu identifizieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, um die relative Menge eines oder mehrerer Proteine in zwei oder mehreren Proteine umfassenden Proben zu bestimmen. Das Verfahren umfasst die Verwendung differenzial bzw. unterschiedlich isotopenmarkierter gekennzeichneter Peptide oder Identifizierungspeptide. Bei diesem Verfahren werden zwei Proben dergestalt behandelt, dass die gekennzeichneten oder Identifizierungspeptide, die aus einer Probe isoliert wurden, ein Isotop enthalten, und die gekennzeichneten oder Identifizierungspeptide, die aus einer zweiten Probe isoliert worden sind, ein anderes Isotop des gleichen Elements enthalten.
  • Das Verfahren umfasst die Schritte: (a) Markieren der in einer ersten Probe vorhandenen Peptide mit einem ersten Isotop; (b) Markieren der in einer zweiten Probe vorhandenen Peptide mit einem zweiten Isotop; (c) Kombinieren des Protein-Peptid-Gemischs der ersten Probe mit dem Protein-Peptid-Gemisch der zweiten Probe; (d) Trennen des Protein-Peptid-Gemischs in Fraktionen von Peptiden mittels Chromatographie; (e) chemisches oder enzymatisches oder chemisches und enzymatisches Verändern an mindestens einer Aminosäure mindestens eines der Peptide in jeder Fraktion; (f) Isolieren der gekennzeichneten Peptide aus jeder Fraktion mittels Chromatographie, wobei die Chromatographie durch die gleiche Art von Chromatographie durchgeführt wird wie in Schritt (d); (g) Durchführen der Massenspektrometrie-Analyse der isolierten gekennzeichneten Peptide; (h) Berechnen der relativen Menge der gekennzeichneten Peptide in jeder Probe durch Vergleichen der Peak- bzw. Spitzenhöhen der identischen, aber unterschiedlich isotopisch markierten gekennzeichneten Peptide; und (i) Bestimmen der Identität des gekennzeichneten Peptids und seines korrespondierenden Proteins.
  • Dem gleichen Ansatz kann mit einer Umkehrmodus-Vorgehensweise gefolgt werden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Markieren der in einer ersten Probe vorhandenen Peptide mit einem ersten Isotop; (b) Markieren der in einer zweiten Probe vorhandenen Peptide mit einem zweiten Isotop; (c) Kombinieren des Protein-Peptid-Gemischs der ersten Probe mit dem Protein-Peptid-Gemisch der zweiten Probe; (d) Trennen des Protein-Peptid-Gemischs in Fraktionen von Peptiden mittels Chromatographie; (e) chemisches oder enzymatisches oder chemisches und enzymatisches Verändern an mindestens einer Aminosäure in der Mehrzahl der Peptide in jeder Fraktion; (f) Isolieren der Identifizierungspeptide aus jeder Fraktion mittels Chromatographie, wobei die Chromatographie mit der gleichen Art von Chromatographie wie in Schritt (d) durchgeführt wird; (g) Durchführen einer massenspektrometrischen Analyse der isolierten Identifizierungspeptide; (h) Berechnen der relativen Menge der Identifizierungspeptide in jeder Probe durch Vergleichen der Peakhöhen der identischen, aber isotopisch unterschiedlich markierten Identifizierungspeptide; und (i) Bestimmen der Identität des Identifizierungspeptids und seines korrespondierenden Proteins.
  • Es ist offensichtlich, dass dem gleichen Ansatz in Kombination mit einem Vorbehandlungsschritt gefolgt werden kann, wie oben angemerkt. Das Verfahren ist auch anwendbar, falls die chromatographischen Trennungen in Schritt (d) und (f) identisch oder im wesentlichen ähnlich sind. Es ist auch offensichtlich, dass anstatt des Mischens der Peptide aus beiden Proben in Schritt (c) Peptide aus einer ersten und einer zweiten Probe den Schritten (d) und (e) und/oder (f) separat unterworfen werden können und in Schritt (d) oder (e) oder (f) oder (g) kombiniert werden können.
  • Die unterschiedliche isotopische Markierung der Peptide in einer ersten und einer zweiten Probe kann auf viele verschiedene im Stand der Technik verfügbare Weisen geschehen. Ein Schlüsselelement ist, dass ein bestimmtes Peptid, das vom gleichen Protein in einer ersten und einer zweiten Probe stammt, identisch ist außer bezüglich des Vorhandenseins eines unterschiedlichen Isotops in einer oder mehreren Aminosäuren des Peptids. In einer typischen Ausführungsform wird das Isotop in einer ersten Probe das natürliche Isotop sein, was sich auf das Isotop bezieht, das in der Natur vorherrschend vorhanden ist, und das Isotop in einer zweiten Probe wird ein weniger häufiges Isotop sein, welches im Folgenden als ein ungewöhnliches Isotop bezeichnet wird. Beispiele von Paaren natürlicher und ungewöhnlicher Isotope sind H und D, O16 und O18, C12 und C13, N14 und N15. Peptide, die mit dem schwersten Isotop eines Isotopenpaars markiert sind, werden im Folgenden als schwere Peptide bezeichnet. Peptide, die mit dem leichtesten Isotop eines Isotopenpaares markiert worden sind, werden im Folgenden auch als leichte Peptide bezeichnet. Beispielsweise wird ein mit H markiertes Peptid das leichte Peptid genannt, während das gleiche Peptid, das mit D markiert ist, das schwere Peptid genannt wird. Mit einem natürlichen Isotop markierte Peptide und ihre mit einem ungewöhnlichen Isotop markierten Gegenstücks sind chemisch sehr ähnlich, trennen chromatographisch auf die gleiche Weise und ionisieren auch auf die gleiche Weise. Wenn die Peptide jedoch einem Analysegerät wie beispielsweise einem Massenspektrometer zugeführt werden, werden sie in das leichte und das schwere Peptid aufgetrennt. Das schwere Peptid hat aufgrund des höheren Gewichts der eingebauten ausgesuchten isotopischen Markierung eine etwas höhere Masse. Aufgrund des geringen Unterschieds zwischen den Massen der isotopisch unterschiedlich markierten Peptide werden die Ergebnisse der massenspektrometrischen Analyse der isolierten gekennzeichneten oder Identifizierungspeptide eine Mehrzahl von Paaren eng zusammenstehender Zwillingspeaks sein, wobei jeder Zwillingspeak ein schweres und ein leichtes Peptid darstellt. Jedes der schweren Peptide stammt aus der mit dem schweren Isotop markierten Probe, jedes der leichten Peptide stammt aus der mit dem leichten Isotop markierten Probe. Die Verhältnisse (relative Häufigkeit) der Peakintensitäten des schweren und des leichten Peaks jedes Paars werden dann gemessen. Diese Verhältnisse geben ein Maß für die relative Menge bzw. Häufigkeit (differenzielles Auftreten) jedes Peptid (und seines korrespondierenden Proteins) in jeder Probem an. Die Peakintensitäten können auf herkömmliche Weise berechnet werden (beispielsweise durch Berechnen der Peakhöhe oder der Peakoberfläche). Wie hierin beschrieben, können die gekennzeichneten oder Identifizierungspeptide auch identifiziert werden, so dass die Identifizierung von Proteinen in den Proben ermöglicht wird. Falls ein Protein in einer Probe vorhanden ist, aber nicht in der anderen, werden die isolierten gekennzeichneten oder Identifizierungspeptide (die diesem Protein entsprechen) als ein Peak entdeckt, welcher entweder das schwere oder das leichte Protein enthalten kann. Jedoch kann es in einigen Fällen schwierig sein, zu bestimmen, welche Probe das Einzelpeak erzeugt hat, welche während der massenspektrometrischen Analyse der kombinierten Probe gefunden worden ist. Dieses Problem kann gelöst werden durch doppeltes Markieren der ersten Probe, entweder vor oder nach der proteolytischen Spaltung, mit zwei unterschiedli chen Isotopen oder mit zwei unterschiedlichen Zahlen schwerer Isotope. Beispiele für Markierstoffe sind Acylierungsmittel.
  • Einbau des natürlichen und/oder ungewöhnlichen Isotops in Peptide kann auf unterschiedlichen Wegen erreicht werden. Bei einem Ansatz werden die Proteine in den Zellen markiert. Zellen für eine erste Probe werden beispielsweise in Medien gezüchtet, die mit einer Aminosäure versetzt sind, welche das natürliche Isotop enthält, und Zellen für eine zweite Probe werden in einem Medium gezüchtet, welches mit einer Aminosäure versetzt ist, welche das ungewöhnliche Isotop enthält. In einer Ausführungsform ist die isotopisch unterschiedlich markierte Aminosäure die Aminosäure, welche zum Verändern ausgewählt wird. Falls beispielsweise Methionin die ausgewählte Aminosäure ist, werden Zellen in Medien gezüchtet, welche entweder mit unmarkiertem L-Methionin (erste Probe) oder mit L-Methionin versetzt sind, oder mit L-Methionin, welches an der Cβ- und der Cγ-Position verdaut ist und welches daher um vier Atommassen (amu) schwerer ist (zweite Probe).
  • Mischen der Proteine/Peptide aus beiden Proben kann zu unterschiedlichen Zeitpunkten durchgeführt werden. Das Mischen kann auf Probenniveau durchgeführt werden (z.B. Mischen einer gleichen Zahl von Zellen aus beiden Proben), oder Proteine können getrennt aus Probe 1 und Probe 2 isoliert und im Folgenden gemischt werden, oder Proteine aus Probe 1 werden in Peptide verdaut und Proteine aus Probe 2 werden in Peptide verdaut, und die aus Probe 1 und Probe 2 stammenden Peptide werden gemischt usw. Wie auch immer der Mischablauf aussieht, wird die vorliegende Erfindung weiterhin dazu verwendet, die gekennzeichneten Methioninpeptide aus dem Protein-Peptid-Gemisch zu isolieren. Methioninpeptide werden unabhängig von ihrer isotopischen Zusammensetzung isoliert, und eine Analyse des Methioninpeptids in einem Massenspektrometer, wie oben beschrieben, erlaubt es, die relative Menge ihres korrespondierenden Proteins in Probe 1 und Probe 2 zu bestimmen.
  • Einbauen der unterschiedlichen Isotope kann auch mittels eines enzymatischen Ansatzes erreicht werden. Beispielsweise kann das Markieren ausgeführt werden durch Behandeln einer Proteine enthaltenden Probe mit Trypsin in "normalem" Wasser (H2 16O) und der zweiten Proteine umfassenden Probe mit Trypsin in "schwerem" Wasser (H2 18O). Wie hierin verwendet, bezieht sich "schweres" Wasser auf ein Wassermolekül, in welchem das O-Atom das 18O-Isotop ist. Trypsin zeigt die gut bekannte Eigenschaft, dass es zwei Sauerstoffatome des Wassers an die COOH-Endgruppe der neu erzeugten Stellen einbaut. Daher haben in Probe 1, welche in H2 16O trypsinbehandelt worden ist, Peptide "normale" Massen, während in Probe 2 die Peptide (außer für die meisten der COOH-terminalen Peptide) einen Massenanstieg von 4 amu aufweisen, welcher dem Einbau von zwei 18O-Atomen entspricht. Dieser Unterschied von 4 amu ist ausreichend, um die schwere und die leichte Ausführung der gekennzeichneten Peptide oder Identifizierungspeptide in einem Massenspektrometer zu unterschieden und um die Verhältnisse der leichten gegen die schweren Peptide genau zu messen und so das Verhältnis der korrespondierenden Peptide/Proteine in den zwei Proben zu bestimmen. Die vorliegende Erfindung stellt daher weiterhin ein Verfahren zur Bestimmung der relativen Menge mindestens eines Proteins in mindestens zwei Proben bereit, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Verdauen der Proteine einer ersten Probe mit Trypsin in der Anwesenheit von H2 16O und Verdauen der Proteine einer zweiten Probe mit Trypsin in der Anwesenheit von H2 18O; (b) Kombinieren der zwei mit Trypsin verdauten Protein-Peptid-Gemische; (c) Unterwerfen des kombinierten Gemischs einem primären Durchlauf (weil die isotopisch unterschiedlich markierten Peptide das gleiche chromatographische Verhalten zeigen, trennen sie sich in den gleichen Fraktionen); (d) chemisches und/oder enzymatisches Verändern an mindestens einer Aminosäure mindestens eines Peptids in jeder Fraktion; (e) Isolieren der gekennzeichneten Peptide oder der Identifizierungspeptide mittels eines sekundären Durchlaufs (weil die isotopisch unterschiedlich markierten gekennzeichneten oder Identifizierungspeptide das gleiche chromatographische Verhalten aufweist, sortieren sie sich in die gleichen Fraktionen); (f) Analysieren der isolierten Peptide in einem Massenspektrometer; (g) Berechnen der relativen Mengen der korrespondierenden schweren und leichten Peptide durch Vergleichen ihrer Peakhöhen; und (h) Identifizieren der Peptide und ihrer korrespondierenden Proteine.
  • Einbau der unterschiedlichen Isotope kann weiterhin erreicht werden durch mehrfache Markierungsvorgänge auf der Grundlage bekannter chemischen Reaktionen, welche auf der Protein- oder der Peptidstufe durchgeführt werden können. Beispielsweise können Proteine durch die Guadinylierungsreaktion mit O-Methylisoharnstoff verändert werden, wo NH2-Gruppen in Guanidin-Gruppen umgewandelt werden, wodurch Homoarginin an jeder der vorhergehenden Lysinpositionen erzeugt wird. Proteine aus einer ersten Probe können mit einem Reagenzmittel mit natürlichen Isotopen reagieren, und Proteine aus einer zweiten Probe können mit einem Reagenzmittel mit einem ungewöhnlichen Isotop reagieren. Peptide können auch verändert werden durch eine Schiff-Basen-Bildung mit deuteriertem Acetaldehyd, gefolgt durch Reduktion mit normalem oder deuteriertem Natriumborhydrid. Diese Reaktion, welche dafür bekannt ist, dass sie unter milden Bedingungen abläuft, kann zum Einbau einer vorhersagbaren Zahl von Deuteriumatomen führen. Peptide werden entweder an der α-NH2-Gruppe oder an ε-NH2-Gruppen von Lysinen oder beiden verändert. Ähnliche Änderungen können mit deuteriertem Formaldehyd durchgeführt werden, gefolgt durch Reduktion mit deuteriertem NaBD4, was eine methylierte Form der Aminogruppen erzeugen wird. Die Reaktion mit Formaldehyd könnte entweder an dem gesamten Protein, das Deuterium nur an Lysinseitenketten eingebaut hat, durchgeführt werden, oder an dem Peptidgemisch, wobei sowohl die α-NH2- als auch die Lysin-abgeleiteten NH2-Gruppen markiert werden. Da Arginin nicht reagiert, stellt dies auch ein Verfahren bereit, um zwischen Arg- und Lys-enthaltenen Peptiden zu unterscheiden.
  • Primäre Aminogruppen werden einfach acyliert mit beispielsweise Acetyl-N-hydroxysuccinimid (ANHS). Daher kann eine Probe mit normalem ANHS acetyliert werden, während eine zweite Probe entweder mit 13CH3-CO-NHS oder CD3CO-NHS acetyliert werden kann. Auch wird auf diese Art die ε-NH2-Gruppe aller Lysine zusätzlich zur Amino-endständigen Gruppe der Peptide derivatisiert. Noch weitere Markierungsverfahren sind beispielsweise saure Anhydride, welche dazu verwendet werden können, Hydroxyl-Gruppen zu acetylieren, sowie Trimethylchlorsilan, welches zum weniger spezifischen Markieren funktionaler Gruppen einschließlich Hydroxylgruppen und Aminen verwendet werden kann.
  • Bei noch einem anderen Ansatz werden die primären Aminosäuren durch chemische Gruppen gekennzeichnet, was es erlaubt, zwischen den schweren und den leichten Peptiden 5 amu, 6 amu, 7 amu, 8 amu oder sogar noch größere Massenunterschiede zu unterscheiden. Beispiele solcher Verbünde sind in Beispiel 16 angeführt. Alternativ wird das unterschiedlich isotopische Markieren an der Carboxy-Endgruppe der Peptide durchgeführt, was die Unterscheidung zwischen den schweren und leichten Varianten um mehr als 5 amu, 6 amu, 7 amu, 8 amu oder sogar um noch größere Massendifferenzen erlaubt. Da die Verfahren der vorliegenden Erfindung kein Vorwissen über die Art der Proteine benötigen, welche in den Proben vorhanden sein können, können sie verwendet werden, um die relativen Mengen von bekannten und unbekannten Proteinen zu bestimmen, welche in den untersuchten Proben vorhanden sind.
  • Die in der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Verfahren, um die relativen Mengen mindestens eines Proteins in mindestens zwei Proben zu bestimmen, kann im weitesten Sinne angewandt werden, um Proteinhöhen bzw. -pegel in beispielsweise Zellen, Geweben oder biologischen Flüssigkeiten (z.B. Brustwarzenansaugflüssigkeit, Speichel, Sperma, Rückenmarksflüssigkeit, Urin, Serum, Plasma, Gelenkflüssigkeit), Organen und/oder ganzen Organismen zu vergleichen. Solch ein Vergleich beinhaltet das Auswerten subzellularer Fraktionen, Zellen, Geweben, Flüssigkeiten, Organen und/oder ganzer Organismen, welche beispielsweise krank und gesund, belastet und nicht-belastet, drogenbehandelt und nicht-drogenbehandelt, gutartig und bösartig, anhaftend und nicht-anhaftend, infiziert und nicht-infiziert, umgewandelt und nicht-umgewandelt sind. Das Verfahren erlaubt es auch, Protein-Niveaus in subzellularen Fraktionen, Zellen, Geweben, Flüssigkeiten, Organismen und ganzen Organismen zu vergleichen, welche unterschiedlichen Anregungen ausgesetzt sind oder sich in unterschiedlichen Entwicklungsstadien befinden oder sich unter Bedingungen befinden, bei denen ein oder mehrere Gene stummgeschaltet oder überbetont sind oder unter Bedingungen, bei denen ein oder mehrere Gene deaktiviert bzw. entfernt worden sind.
  • In einer weiteren Ausführungsform können die hier beschriebenen Verfahren auch in diagnostischen Untersuchungen zur Detektion bzw. dem Feststellen des Vorhandenseins, der Abwesenheit oder einer Variation im Produktionsniveau einer oder mehrerer Proteinmarker oder eines bestimmten Satzes von Proteinen verwendet werden, welche einen Krankheitszustand anzeigen (wie beispielsweise Krebs, neurodegenerative Krankheit, Entzündung, kardiovaskuläre Krankheiten, Virusinfektionen, Bakterieninfektionen, Pilzinfektionen und jede weitere Krankheit). Besondere Anwendungen umfassen die Identifizierung von Targetproteinen, welche in metastatischen und invasiven Karzinomen vorhanden sind, die unterschiedliche Produktion von Proteinen in transgenen Mäusen, die Identifizierung von Proteinen, welche in kranken Geweben hoch- oder herunter-reguliert werden, die Identifizierung intrazellulärer Veränderungen in Zellen mit physiologischen Veränderungen wie beispielsweise einer metabolischen Verschiebung, die Identifizierung von Biomarkern in Karzinomen und die Identifizierung von Signalwegen.
  • Eine quantitative Analyse großer Sätze von Proteinen in unterschiedlichen Proben kann sowohl mit gekennzeichneten Peptiden als auch mit Identifizierungs-Peptiden durchgeführt werden. In einem typischen Beispiel werden gekennzeichnete Peptide auf der Grundlage einer Veränderung von Methionin oder Cystein oder Histidin oder einer Kombination von zweien dieser Aminosäuren verwendet. Bei einem weiteren typischen Beispiel werden Identifizierungspeptide auf der Grundlage Amino-endständiger Peptide oder Carboxy-endständiger Peptide verwendet. Weiterhin kann die Erfindung verwendet werden, um Proteom-weite, qualitative und quantitative Analysen des Modifikationszustands von Proteinen zu erreichen. Beispielsweise werden in verschiedenen Signalübertragungspfaden Serin-, Threonin- und Tyrosin-Reste, die in Proteinen vorhanden sind, häufig phosphoryliert. In einer bestimmten Ausführungsform sind die isotopisch unterschiedlich markierten gekennzeichneten Peptide gekennzeichnete Peptide, die in Anwesenheit einer Phosphoaminsäure ausgewählt worden sind. Vergleich der relativen Häufigkeit der schweren und leichten gekennzeichneten Peptide erlaubt den Vergleich der relativen Häufigkeit der phosphorylierten Proteine in zwei Proteine enthaltenden Proben. In einer weiteren Ausführungsform sind die isotopisch unterschiedlich markierten gekennzeichneten Peptide gekennzeichnete Peptide, die in Anwesenheit eines Phosphoserins und/oder Phosphothreonins oder Phosphotyrosins ausgewählt worden sind. In noch einer weiteren Ausführungsform sind die isotopisch differenziell markierten gekennzeichneten Peptide gekennzeichnete Peptide, die an der Anwesenheit von ε-N-acetylierten Lysin-enthaltenden Peptiden ausgewählt worden sind. In noch einer weiteren Ausführungsform sind die isotopisch differenziell markierten gekennzeichneten Peptide gekennzeichnete Peptide, die in der Anwesenheit einer Glycosyl-Gruppe ausgewählt worden sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Quantifizieren der Menge einer oder mehrerer Proteine in einer einzelnen Protein umfassenden Probe bereit. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Vorbereiten eines Protein-Peptid-Gemischs; (b) Hinzufügen einer bekannten Menge eines synthetischen Referenzpeptids, welches mit einem Isotop markiert ist, das von dem Referenzpeptid-Isotop unterscheidbar ist, zu dem Gemisch; (c) Trennen des Gemischs in Fraktionen von Peptiden mittels Chromatographie; (d) chemisches oder enzymatisches oder chemisches und enzymatisches Verändern an mindestens einer Aminosäure mindestens einer der Peptide in jeder Fraktion; (e) Isolieren der gekennzeichneten Peptide aus jeder Fraktion mittels Chromatographie, wobei die Chromatographie mit der gleichen Art von Chromatographie wie in Schritt (c) durchgeführt wird; (f) Durchführen einer massenspektrometrischen Analyse der gekennzeichneten Peptide; und (g) Bestimmen der Menge des in der Probe vorhandenen Proteins durch Vergleichen der Peakhöhen des synthetischen Referenzpeptids mit dem Referenzpeptid.
  • Das gleiche Verfahren kann mit dem Umkehrmodus-Verfahren durchgeführt werden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Erzeugen eines Protein-Peptid-Gemischs; (b) Hinzufügen einer bekannten Menge eines synthetischen Referenzpeptids zu dem Gemisch, wobei das synthetische Referenzpeptid mit einem Isotop markiert ist, das von dem Referenzpeptidisotop unterscheidbar ist; (c) Trennen des Gemischs in Fraktionen von Peptiden mittels Chromatographie; (d) chemisches oder enzymatisches oder chemisches und enzymatisches Verändern mindestens einer Aminosäure in der Mehrzahl der Peptide in jeder Fraktion; (e) Isolieren der Identifizierungspeptide aus jeder Fraktion mittels Chromatographie, wobei die Chromatographie mit der gleichen Art von Chromatographie durchgeführt wird wie in Schritt (c); (f) Durchführen einer massenspektrometrischen Analyse der Identifizierungspeptide und (g) Bestimmen der Menge des in der Probe vorhandenen Proteins durch Vergleichen der Peakhöhen des synthetischen Referenzpeptids mit dem Referenzpeptid.
  • Es ist offensichtlich, dass die gleichen Verfahren zusammen mit einem Vorbehandlungsschritt durchgeführt werden können, wie er hier angemerkt worden ist. Die Verfahren sind auch anwendbar, falls die chromatographischen Trennungen in Schritt (c) und (e) identisch oder im wesentlichen ähnlich sind.
  • "Referenzpeptide", wie hier im weiteren verwendet, sind Peptide, deren Sequenz und/oder Masse ausreichend ist, um ihr Stammprotein eindeutig zu identifizieren. Vorzugsweise ist eine Peptidsynthese von Äquivalenten von Referenzpeptiden einfach. Aus Gründen der Klarheit ist ein Referenzpeptid, wie hierin verwendet, das ursprüngliche Peptid, wie es in dem Protein beobachtet wird, welches es repräsentiert, während ein synthetisches Referenzpeptid, wie hier verwendet, ein synthetisches Gegenstück des gleichen Peptids ist. Ein solches synthetisches Referenzpeptid wird bequemerweise mittels Peptidsynthese erzeugt, kann aber auch rekombinant erzeugt werden. Eine Peptidsynthese kann beispielsweise mit einem Mehrfachpeptidsynthetisierer durchgeführt werden. Eine rekombinante Herstellung kann mit einer Vielzahl von Vektoren und Wirten erreicht werden, wie sie im Stand der Technik weit verbreitet sind. Referenzpeptide ionisieren vorzugsweise gut in einer Massenspektrometrie. Ein nicht-einschränkendes Beispiel eines gut ionisierenden Referenzpeptids ist ein Referenzpeptid, welches ein Arginin enthält. Vorzugsweise ist ein Referenzpeptid auch als gekennzeichnetes Peptid oder als Identifizierungspeptid einfach zu isolieren. In der letzteren bevorzugten Ausführungsform ist das Referenzpeptid gleichzeitig auch ein gekennzeichnetes Peptid oder ein Identifizierungspeptid.
  • Ein Referenzpeptid und sein synthetisches Referenzpeptid-Gegenstück sind chemisch sehr ähnlich, trennen chromatographisch auf dieselbe Art und ionisieren auch auf dieselbe Art. Das Referenzpeptid und sei synthetisches Referenzpeptid-Gegenstück sind jedoch unterschiedlich isotopisch markiert. Folgerichtig sind in einer bevorzugten Ausführungsform, in der das Referenzpeptid auch ein gekennzeichnetes oder Identifizierungs-Peptid ist, das Referenzpeptid und seine synthetische Referenzpeptid-Entsprechung auf gleiche Weise geändert und werden in der gleichen Fraktion des primären und des sekundären Durchlaufs und in einem möglicherweise vorliegenden tertiären Durchlauf isoliert. Wenn jedoch ein Referenzpeptid und sein synthetisches Referenzpeptid einem Analysiergerät wie beispielsweise einem Massenspektrometer zugeführt werden, werden sie sich in leichte und schwere Peptide aufteilen. Das schwere Peptid hat eine etwas größere Masse aufgrund des höheren Gewichts des eingebauten ausgewählten schweren Isotops.
  • Wegen dieses sehr kleinen Unterschieds in der Masse zwischen einem Referenzpeptid und seinem synthetischen Referenzpeptid, werden beide Peptide als eine erkennbare, nahe beieinander liegende Doppelspitze in einer massenspektrometrischen Analyse auftreten. Das Verhältnis zwischen den Peakhöhen oder Peakintensitäten kann berechnet werden, und diese bestimmen das Verhältnis zwischen der Menge des Referenzpeptids gegen die Menge des synthetischen Referenzpeptids. Da eine bekannte absolute Menge des synthetischen Referenzpeptids zum Protein-Peptid-Gemisch hinzugefügt worden ist, kann die Menge des Referenzpeptids einfach berechnet werden, und die Menge des korrespondierenden Proteins in der Protein enthaltenden Probe kann berechnet werden.
  • Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Verfahren bekannt, ein Referenzpeptid und sein synthetisches Referenzpeptid unterschiedlich isotopisch zu markieren. Bei einem ersten Ansatz trägt das Referenzpeptid das ungewöhnliche Isotop, und die synthetische Entsprechung bzw. Gegenstück trägt das natürliche Isotop. Bei diesem Ansatz können die synthetischen Referenzpeptide effizient chemisch mit ihren natürlichen Isotopen in Zubereitungen in großem Maßstab synthetisiert werden. Um die Referenzpeptide mit einem ungewöhnlichen Isotop zu markieren, kann jede der oben erwähnten Verfahren zum unterschiedlichen isotopischen Markieren eines Peptids mit einem ungewöhnlichen Isotop angewandt werden (in vivo-Markieren, enzymatisches Markieren, chemisches Markieren usw.). Ein Beispiel für ein in vivo-Markieren ist es, dass kommerziell erhältliche deuterisierte Methionin CH3-SCD2-CD2-CH-(NH2)-COOH einzubauen, was der Gesamtpeptidmasse 4 amus hinzufügt. Alternativ könnte das synthetische Referenzpeptid auch deuterisiertes Arginin H2NC-(NH) enthalten, welches 7 amu der Gesamtpeptidmasse hinzufügen würde. Es sollte dem Fachmann klar sein, dass jede Aminosäure, von der deuterisierte oder 15N- oder 13C-Formen existieren, in diesem Protokoll verwendet werden kann. Ein weiteres Beispiel dieses Ansatzes ist es, die Proteine umfassende Probe mit Trypsin in Anwesenheit von H2 18O zu proteolysieren, aber viele andere Verfahren können verwendet werden. Daher umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform die quantitative Analyse mindestens eines Proteins in einer Proteine umfassenden Probe die folgenden Schritte: (a) Zubereiten eines Protein-Peptid-Gemischs, wobei die Peptide ein ungewöhnliches Isotop (z.B. ein schweres Isotop) tragen; (b) Hinzufügen einer bekannten Menge eines natürlich Isotope (z.B. ein leichtes Isotop) tragenden synthetischen Referenzpeptids zu der Protein-Peptid-Mischung; (c) das Protein-Peptid-Gemisch, das auch das synthetische Referenzpeptid enthält, wird mittels einer primären chromatographischen Trennung in Fraktionen aufgeteilt; (d) chemisches und/oder enzymatisches Verändern mindestens des Referenzpeptids und seiner synthetischen Referenzpeptid-Entsprechung; (e) Isolierung des gekennzeichneten Referenzpeptids und des gekennzeichneten synthetischen Referenzpeptids mittels einer sekundären chromatographischen Trennung; (f) Bestimmung durch Massenspektrometrie des Verhältnisses zwischen den Peakhöhen des Referenzpeptids gegen das synthetische Referenzpeptid und (g) Berechnen der Menge des durch das Referenzpeptid dargestellten Proteins in der Proteine enthaltenden Probe.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Referenzpeptid gleichzeitig ein Identifizierungspeptid. Das oben beschriebene Verfahren kann gleich gut für diesen Ansatz angewendet werden, aber in Schritt (d) bleiben das Referenzpeptid und sein synthetisches Referenzpeptid unverändert, und in Schritt (e) werden die Identifizierungspeptide (einschließlich des Referenzpeptids und seines synthetischen Referenzpeptids) isoliert.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die quantitative Bestimmung mindestens eines Proteins in einer einzigen Probe die folgenden Schritte: (a) die Verdauung des Proteingemischs mit Trypsin in H2 18O in Peptide; (b) das Hinzufügen einer bekannten Menge mindestens eines synthetischen Referenzpeptids, das ein natürliches Isotop trägt, zum sich ergebenden Protein-Peptid-Gemisch; (c) die Fraktionierung des Protein-Peptid-Gemischs in einer primären chromatographischen Trennung; (d) die chemische und/oder enzymatische Veränderung jeder Fraktion an einer oder mehreren spezifischen Aminosäuren (sowohl die Peptide aus dem Protein-Peptid-Gemisch als auch die synthetischen Referenzpeptide, die die spezifische Aminosäure enthalten, werden verändert); (e) die Isolierung der gekennzeichneten Peptide mittels einer sekundären chromatographischen Trennung (diese gekennzeichneten Peptide umfassen sowohl die biologischen Referenzpeptide als auch ihre synthetischen Referenzpeptid-Entsprechungen bzw. -gegenstücke); (f) die massenspektrometrische Analyse der gekennzeichneten Peptide und die Bestimmung der relativen Mengen des Referenzpeptids und seiner synthetischen Referenzpeptid-Entsprechung. Auch hier kann ein ähnlicher Ansatz mit Referenzpeptiden verfolgt werden, welche gleichzeitig Identifizierungspeptide sind.
  • Zudem können die oben beschriebenen Verfahren ebenfalls in einem Modus angewandt werden, bei dem ein Referenzpeptid mit dem natürlichen Isotop gekennzeichnet ist, und seine synthetische Referenzpeptid-Entsprechung mit einem ungewöhnlichen Isotop gekennzeichnet ist.
  • Die oben beschriebenen Verfahren der vorliegenden Erfindung, um die Menge von Protein in einer Proteine umfassenden Probe zu quantifizieren, können verwendet werden, um eines bis zu Hunderten von Proteinen in der Probe zu quantifizieren. Für jedes zu quantifizierende Protein braucht man mindestens ein und vorzugsweise zwei oder mehr Referenzpeptide. In einer besonderen Ausführungsform wird jedes synthetische Referenzpeptid in einer Menge hinzugefügt, welche äquimolar zu der erwarteten Menge seiner Referenzpeptid-Entsprechung ist.
  • Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Verfahren, um mindestens ein Protein in einer Proteine enthaltenen Probe zu quantifizieren, können im weitesten Sinne verwendet werden, um Proteine mit unterschiedlichen Interessen zu quantifizieren. Beispielsweise können diagnostische Untersuchungen entwickelt werden, durch welche der Pegel bzw. das Niveau eines oder mehrerer Proteine in einer Probe bestimmt wird, und zwar durch Verwendung der vorliegenden Erfindung.
  • In einem weiteren Beispiel können Referenzpeptide dazu verwendet werden, spezifische bekannte Splice-Varianten bestimmter Proteine in einer Probe zu quantifizieren. Falls eine bestimmte Splice-Variante eines spezifischen Proteins bekannt ist und diese Splice-Variante entdeckt werden soll, kann dann ein synthetisches Referenzpeptid synthetisiert werden, das nur dieser Splice-Variante eines bestimmten Proteins entspricht. In der Tat passiert es oft, dass aufgrund eines Überspringen eines Exons neue Kontaktstellen gebildet werden, und als solches kann ein spezifisches Referenzpeptid ausgewählt werden, das im Stammprotein nicht auftaucht und nur in der Splice-Variante auftaucht. Es ist jedoch in vielen Fällen angeraten, zwei oder mehr Referenzpeptide zu wählen, um zwischen dem Stammprotein und der interessierenden Splice-Variante zu unterscheiden. Auch ist es üblich, dass eine bestimmte Splice-Variante zusammen mit dem Stammprotein in der gleichen Zelle oder Gewebe ausgedrückt wird und daher beide in der Probe vorhanden sind. Oft sind das Produktionsniveau der bestimmten Splice-Variante und des Stammproteins unterschiedlich. Die Detektion und die Häufigkeit zwischen den Referenzpeptiden kann verwendet werden, um das Produktionsniveau zwischen der Splice-Variante und seinem Stammprotein zu berechnen. In noch einem weiteren Beispiel ist es gut bekannt, dass Drogen den Ausdruck des bestimmten Proteins in einer Zelle hochgradig beeinflussen können. Mit dem vorliegenden Verfahren ist es möglich, die Menge eines oder eines Satzes interessierender Proteine unter unterschiedlichen experimentellen Bedingungen genau zu messen. Als solches können äquivalente Technologien, wie beispielsweise genomische Anwendungen, angewandt werden. Auf dem Proteinniveau umfasst dies die Pharmakoproteomik und die Toxikoproteomik. Obwohl Genmarker von Krankheiten eine hohe Aufmerksamkeit bei der Sequenzierung des menschlichen Genoms erhalten haben, sind Proteinmarker in vielen Situationen nützlicher. Beispielsweise kann eine diagnostische Untersuchung auf der Grundlage von Referenzpeptiden, die Proteinkrankheitsmarker darstellen, für grundsätzlich jede interessierende Krankheit hergestellt werden. Bequemerweise können Krankheitsmarker in der Zelle, dem Gewebe oder Organproben oder Körperflüssigkeiten quantifiziert werden, beispielsweise umfassend Blutzellen, Plasma, Serum, Urin, Sperma, Speichel, Brustwarzenansaugflüssigkeit, Gelenkflüssigkeit oder Rückenmarksflüssigkeit. Referenzpeptide für Protein-Krankheitsmarker können dann gemäß der vorliegenden Erfindung beispielsweise zur Überwachung verwendet werden, falls der Patient ein schneller oder langsamer Krankheits-Progredient ist, falls ein Patient voraussichtlich eine bestimmte Krankheit entwickelt und sogar, um die Wirksamkeit einer Behandlung zu überwachen. In der Tat könnten sich im Gegensatz zu genetischen Markern, wie beispielsweise SNFs, Niveaus von Protein-Krankheitsmarkern, die auf eine bestimmte Krankheit hinweisen, schnell als Antwort auf eine Krankheitsmodulation oder einen Krankheitsfortschritt verändern. Referenzpeptide für Protein-Krankheitsmarker können gemäß der vorliegenden Erfindung beispielsweise auch für eine verbesserte Diagnose komplexer genetischer Krankheiten verwendet werden, wie beispielsweise für Krebs, Fettsucht, Diabetes, Asthma und Entzündung, neuropsychiatrische Krankheiten, einschließlich Depression, Manie, Panik-Funktionsstörung und Schizophrenie. Viele dieser Funktionsstörungen treten aufgrund komplexer Ereignisse auf, welche sich in vielfachen zellularen und biochemischen Pfaden und Ereignissen widerspiegeln. Daher mögen viele Proteinmarker gefunden werden, welche zu diesen Krankheiten gehören. Die vorliegende Erfindung gestattet es, eine bis mehrere Hunderte dieser Protein-Krankheitsmarker gleichzeitig zu verfolgen. Die Identifizierung und die Möglichkeit einer relativen und absoluten Quantifizierung von Proteinmarkern unter Verwendung der vorliegenden Erfindung könnte zu einer genaueren diagnostischen Unterklassifizierung führen.
  • Die Erfindung nutzt eine Peptidsortiervorrichtung, welche in der Lage ist, das erfindungsgemäße Verfahren auszuführen. Wie hierin beschrieben, können Verfahren zum Analysieren von Protein-Peptid-Gemischen oder komplexen Peptid-Gemischen zwei aufeinander folgende chromatographische Schritte umfassen: einen primären chromatographischen Schritt unter Verwendung des gesamten Protein-Peptid-Gemischs, welcher dieses Gemisch in Fraktionen aufteilt, und einen sekundären chromatographischen Schritt, welcher nach der chemischen und/oder enzymatischen Veränderung mindestens einer in den Peptiden in den Fraktionen vorhandenen bestimmten Aminosäure durchgeführt worden ist. Wie hierin beschrieben, bezieht sich der Ausdruck "Peptidsortierer" auf eine Vorrichtung, welche die gekennzeichneten Peptide von den nicht veränderten Peptiden erfindungsgemäß effizient trennt, oder welche alternativ die Identifizierungspeptide von den veränderten Peptiden gemäß der Erfindung trennt. In einem bevorzugten Aspekt werden identische oder sehr ähnliche chromatographische Bedingungen in den zwei chromatographischen Schritten verwendet, so dass während des sekundären Durchlaufs (i) die nicht veränderten Peptide an ihren ursprünglichen Elutionszeiten verbleiben und die gekennzeichneten Peptide dazu gebracht werden, eine Verschiebung in der Elutionszeit zu durchlaufen, oder (ii) im Umkehrmodus die Identifizierungspeptide bei ihren ursprünglichen Elutionszeiten verbleiben und die Hauptmenge der veränderten Peptide dazu gebracht werden, eine Verschiebung in der Elutionszeit zu durchlaufen. Wie hierin beschrieben, bezieht sich ein Peptidsortierer im besonderen auf das Poolen bzw. Zusammengeben von Fraktionen, welche nach Durchlauf 1 erlangt wurden und auf die optimale Organisation des sekundären chromatographischen Schritts (z.B. des Schritts, in welchem die gekennzeichneten Peptide von den nicht veränderten Peptiden getrennt werden, oder alternativ der Schritt, in welchem die Identifizierungspeptide von den veränderten Peptiden getrennt werden, um die Isolierung der gekennzeichneten Peptide (oder Identifizierungspeptide) aus jedem Durchlauf/Fraktionen zu beschleunigen.
  • Ein Ansatz, um die gekennzeichneten Peptide, die aus einer Protein-Peptid-Mischung isoliert worden sind, zu isolieren und zu identifizieren, ist es, jede Fraktion unabhängig aus der primären chromatographischen Trennung aufzusammeln, die chemische und/oder enzymatische Veränderung in jeder der Fraktionen durchzuführen und jede Fraktion unabhängig unter den gleichen chromatographischen Bedingungen und an der gleichen oder einer im wesentlichen ähnlichen Säule nochmals durchlaufen zu lassen. Im folgenden werden die gekennzeichneten Peptide jedes unabhängig durchlaufenen sekundären Durchlaufs gesammelt und an ein analytisches Instrument wie beispielsweise ein Massenspektrometer weitergereicht. Jedoch benötigt ein solcher Ansatz eine erhebliche Menge an Chromatographiezeit und belegt wichtige Maschinenzeit an dem Massenspektrometer. Um eine effizientere und ökonomischere Verwendung sowohl der chromatographischen Ausrüstung als auch des Massenspektrometers zu erreichen, stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Peptidsortierern bereit, welche das Zusammengeben verschiedener Fraktionen der primären chromatographischen Trennung erlauben, während sie eine Elutionsüberlappung zwischen gekennzeichneten Peptiden vermeiden, welche aus unterschiedlichen Fraktionen stammen sowie zwischen gekennzeichneten Peptiden aus einer Fraktion und unveränderten Peptiden aus einer oder mehrerer anderer Fraktionen, oder im Umkehrmodus stellt die Erfindung die Verwendung von Peptidsortierern bereit, welche das Zusammengeben verschiedener Fraktionen der primären chromatographischen Trennung erlauben, während sie einen Elutionsüberlapp zwischen Identifizierungspeptiden, die aus unterschiedlichen Fraktionen stammen und zwischen Identifizierungspeptiden aus einer Fraktion und veränderten Peptiden aus einer oder mehreren anderen Fraktionen vermeiden.
  • Das allgemeine Prinzip des Systems zum Sortieren von Peptiden kann folgendermaßen beschrieben werden. In jeder aus dem primären chromatographischen Schritt erhaltenen Fraktion eluieren gekennzeichnete Peptide unterschiedlich von den unveränderten Peptiden. Für den Fall, dass die Veränderung der Aminosäure(n) in den gekennzeichneten Peptiden eine Verschiebung in der Elution der gekennzeichneten Peptide mit einer unteren Grenze von δmin und einer oberen Grenze von δmax einführt, mag dann das Elutionsfenster jeder aus dem primären chromatographischen Durchlauf isolierten Fraktion (w1) gleich zu δmin sein, aber es ist vorzugsweise kleiner als dieses oder gleich δmin/2, um eine unterscheidbare Elution einer maximalen Zahl gekennzeichneter Peptide und unveränderter Peptide innerhalb einer Fraktion zu erlauben. Der erste Durchlauf ist in Fraktionen unterteilt, hier als Fenster w1 bezeichnet, welche zwischen den Zeiten t3 und t4 liegen. In einem nicht beschränkenden Beispiel wird w1 als eine Minute angenommen (1A). Ein Beispiel einer chromatographischen Verschiebung aufgrund der Umwandlung der Peptide in ihre veränderten Derivate wird in 1B dargestellt. Daher ist das Konzept durch willkürliches Auswählen einer 1-Minuten-Fraktion dargestellt, welche zwischen t3 und t4 eluiert. Peptide aus dieser Fraktion, welche verändert worden sind, werden eine hydrophile Verschiebung zeigen, die als δp ausgedrückt wird (die Verschiebung jedes veränderten Peptids). Da der Effekt der Veränderung nicht immer für jedes aus der ausgewählten Fraktion abgeleitete Peptid identisch ist, wird δp unterschiedliche Werte für jedes veränderte Peptid zeigen und wird daher zwischen zwei extremen Werten variieren: δmin und δmax (daher δmin ≤ δp ≤ δmax). Falls t1 und t2 gegeben sind, nämlich die Zeiten, bei denen die sortierten gekennzeichneten Peptide beginnen bzw. aufhören zu eluieren; und mit t3 und t4 als den Zeiten, welche die ausgewählte Fraktion umschließen, ist dann δmin = t3 = t2 und δmax = t4 – t1. Daher wird das Fenster, in welchem die sortierten Peptide eluieren (w2), in Ausdrücken der hydrophilen Verschiebung und der ausgewählten Fraktionsgröße (w1) ausgedrückt: w2 = t2 – t1 oder w2 = δmax – δmin – w1 (Gleichung 1).
  • Wenn mehrere Fraktionen des primären Durchlaufs kombiniert (zusammengegeben) werden, ist es dann wichtig, das während des sekundären Durchlaufs mit den zusammengegebenen Fraktionen die sortierten gekennzeichneten Peptide aus einer ausgewählten Fraktion nicht mit den unveränderten Peptide einer der vorhergehenden Fraktionen co-eluieren bzw. mit diesen eluieren. Dies ist schematisch in 2 dargestellt. Daher sollte t'1 mit einem Zeitunterschied w3 starten, gemessen von t4 aus. Da immer eine gewisse Spreizung der unveränderten Peptide während des sekundären Durchlaufs bemerkt wird, sollte w3 nicht zu Null angenommen werden. Dies bedeutet, dass t'3 während der Elutionszeit der nächsten Fraktion ausgedrückt wird als: t'3 = t3 + w1 + w3 + w2 + δmin oder t'3 = t3 + w1 + w3 + w2 + δmax – w1 – w2 oder t'3 = t3 + w3 + δmax oder t'3 – t3 = Δt = w3 + δmax (Gleichung 2)
  • Daher kann der Abstand zwischen zwei aufeinander folgenden Fraktionen, welche vorzugsweise zusammengelegt bzw. zusammengegeben werden, durch den Abstand zwischen den unveränderten Peptiden einer gegebenen Fraktion und den gekennzeichneten Peptiden der nächsten Fraktion, zuzüglich δmax, bestimmt werden. Wenn daher δmax 7 min und w3 = 5 min ist, können die Fraktionen des primären Durchlaufs dann vorzugsweise für den sekundären Durchlauf durch 12 min getrennt (z.B. Fraktionen 10, 22, 34 usw., falls w1 gleich 1 min ist) getrennt, kombiniert werden. Diese Werte treffen zu, wenn δmax und δmin im wesentlichen über den gesamten Gradienten konstant bleiben. Abhängig von den chromatographischen Bedingungen können die δp-Werte leicht über die Fraktionen veränderlich sein. Es ist beispielsweise beobachtet worden, dass für die veränderten Methioninpeptide die hydrophilen Verschiebungen unter einigen Umständen etwas kleiner für die hydrophoberen Peptide als für die hydrophileren sind, welche zu früheren Zeit eluieren. In dem TFA/Acetonitril-System ist diese Regression beschränkt und kann daher einfach korrigiert werden. Unter anderen chromatographischen Bedingungen jedoch ist diese Regression betonter und wird daher berücksichtigt. Daher ist ein Korrekturfaktor λn (wie in Beispiel 18 gezeigt) vorgesehen. λn ist der Korrekturfaktor für die δp's bei einer gegebenen Fraktion (η), in welcher die Konzentration des Lösungsmittels B als ConcBn angegeben ist. Für den Fall, dass eine lineare Korrelation zwischen λn und ConcBn vorliegt, wird dies als λn = a·ConcBn + b (Gleichung 3) ausgedrückt. Unter Verwendung des TFA/Acetonitril-Systems, das in Beispiel 18 beschrieben ist, einer C18 RP-HPLC-Säule und hydrophilen Verschiebungen aufgrund einer Oxidation der Methioninpeptide wurde bestimmt, dass a = –0,002 und b = 1,002 ist. Daher beträgt in diesem Beispiel für eine Fraktion, die 10% des Lösungsmittels B enthält, λ10 = –0,002·10 + 1,002 = 1 und eine Fraktion, die 50% des Lösungsmittels B enthält, hat λ50 = –0,002·50 + 1,002 = 0,902. Dies bedeutet, dass dann, wenn in der Fraktion mit 10% Lösungsmittel B δmin = 2 min und δmax = 7 min beträgt, und w2 7 min – 2 min – 1 min = 4 min beträgt. Dieser Wert von w2 in dem kombinierten oder zusammengegebenen Modus in der 50% des Lösungsmittels B enthaltenen Fraktion wird w2c = 7 min betragen. 0,902 – 2min·0,902 – 1 = 3,51 min.
  • Um das Sortiersystem zu justieren bzw. anzupassen, werden δmax und δmin für die früheren Eluierungsfraktionen bzw. die späten Eluierungsfraktionen bestimmt, und die Sammelzeiten werden dann als das δmax aus den früheren Fraktionen angenommen, und δmin aus den späteren Fraktionen genommen. Daher w2c: δmax, λ (frühe Fraktionen) – δmin. λ (späte Fraktionen) – w1 (Gleichung 4).
  • In einem Beispiel gilt: w2c = 7 min – 1,8 min – 1 min = 4,2 min
  • Neben der Verwendung eines konstanten w2c-Werts durch den gesamten Sortierungsprozess hindurch, kann die Regression von δmax und δmin auch dazu verwendet werden, die Fraktionen des primären Durchlaufs zu selektieren, um eine bessere Sortiereffizienz zu erreichen. Dies könnte der Fall sein, wenn Verschiebungen im Laufe des Gradienten von Lösungsmittel B stark betroffen sind. Unter der Annahme, dass Werte a und b aus Gleichung 3 a = –0,02 und b = 1,2 und δmin = 2 min und δmax = 7 min betragen, werden dann die Verschiebungen bei Fraktion 10 (10% von Lösungsmittel B) δmax = 7 min und w2 = 4 min sein. Wenn δmax und δmin während des Durchlaufs nicht beeinträchtigt würden, sollte die nächste Fraktion dann bei 22 min sein. Wenn man jedoch annimmt, dass die Werte für a und b aus Gleichung 3 a = 0,02 und b = 1,2 betragen, ist dann λ22 = –0,2 × 22 + 1,2 = 0,776 und δmax22 = 7 × 0,76 = 5,32 min mit t'3 = 10 min + 5 min + 5,32 min = 20,32 min. Daher könnte die nächste Fraktion nun Fraktion 21 anstatt 22 sein, und das neue λ21 würde dann sein: λ21 = 0,78 und δmax21 = 7 × 0,78 = 5,46 = 5,46 min. Daher könnte t'3 mindestens zur Zeit 10 min + 5 min + 5,46 min = 20,46 min genommen werden. Gegeben, dass die nächste ausgewählte Fraktion Fraktion 21 ist, ist es möglich, zu berechnen, welches die nächste Fraktion sein wird, die der vorhergehenden am nächsten folgt. Dies ist Fraktion 31, weil λ31 sein wird: 0,58 und δmax = 4,06 min. Daher wird t''3 sein: t"3 = 21 min + 5 min + 4,06 min = 30,1 min. Unter Verfolgung der gleichen Berechnungen kann man nun Fraktion 39 einschließen, für welche λ39 = 0,42 und δmax = 2,94 min ist. Daher gilt: t'''3 = 31 min + 5 min + 2,94 min = 38,94 min usw. Um das Prinzip des Peptidsortierers zu illustrieren, wird ein illustratives Beispiel für gekennzeichnete Peptide ausgearbeitet, sowie für Fraktionen, die mit einem Elutionsfenster w1 isoliert werden, das x/2 entspricht und ohne Regression (eine Konstantenverschiebung über den gesamten Gradienten wird angenommen). Falls das Elutionsfenster des gesamten Durchlaufs 1 aller Peptide, die aus dem Protein-Peptid-Gemisch stammen, 20x entspricht, werden dann 40 Fraktionen mit einem x/2-Fenster (erste Fraktion: 0 bis x/2; zweite Fraktion x/2 bis x; dritte Fraktion: x bis 3x/2, ...) gesammelt. Im einfachsten Ansatz wird jede Fraktion individuell dem chemischen und/oder enzymatischen Aminosäurenveränderungsschritt unterworfen, und die Peptide werden einem sekundären Durchlauf unter chromatographischen Bedingungen unterworfen, die im wesentlichen ähnlich zu Durchlauf 1 sind. Durchlauf 2 trennt die gekennzeichneten Peptide von den unveränderten Peptiden.
  • Um die Chromatographie- und Analysezeit zu begrenzen, ist der Ablauf durch Zusammenlegen bzw. Zusammengeben von Fraktionen optimiert worden, die man aus Durchlauf 1 erhält. Zusammengeben bzw. Poolen kann mit den primären Fraktionen vor der Veränderungsreaktion durchgeführt werden oder kann mit den veränderten Fraktionen durchgeführt werden. Eine veränderte Fraktion ist eine Fraktion, bei der die Peptide einer erfindungsgemäßen chemischen und/oder enzymatischen Veränderung unterworfen worden sind.
  • In dem Beispiel wird ein Zusammengeben mit Fraktionen vor der Veränderungsreaktion durchgeführt. Nach dem primären chromatographischen Durchlauf werden die folgenden Fraktionen zusammengegeben: Fraktion 1 (0 bis x/2) mit Fraktion 8 (7x/2 bis 4x), 15 (7x bis 15x/2), 22 (21x/2 bis 11x), 29 (14x bis 29x/2) und 36 (35x/2 bis 18x). Auf ähnliche Weise wird Fraktion 2 mit den Fraktionen 9, 16, 23, 30 und 37 zusammengegeben; Fraktion 3 wird mit den Fraktionen 10, 17, 24, 31 und 38 zusammengegeben; Fraktion 4 wird mit den Fraktionen 11, 18, 25, 32 und 39 zusammengegeben; Fraktion 5 wird mit den Fraktionen 12, 19, 26, 33 und 40 zusammengegeben; Fraktion 6 wird mit den Fraktionen 13, 20, 27 und 34 zusammengegeben; und Fraktion 7 wird mit den Fraktionen 14, 21, 28 und 35 zusammengegeben. Die sieben Zusammengebungen bzw. Pools werden chemisch und/oder enzymatisch an mindestens einer spezifischen Aminosäure verändert, und jede der sieben Pools wird separat Durchlauf 2 unter chromatographischen Bedingungen unterworfen, welche im wesentlichen ähnlich zu der primären chromatographischen Trennung sind. Dank der Auswahl der richtigen Kombination von Fraktionen in jedem Pool, eluieren die gekennzeichneten Peptide in den Fenstern eindeutig unterschiedlich von der Zeit, in welcher die unveränderten Peptide bekanntermaßen eluieren, und es existiert kein Überlapp zwischen gekennzeichne ten Peptiden, die aus unterschiedlichen Fraktionen in dem gleichen Pool stammen. In einem nicht-beschränkenden Beispiel, in dem die Veränderung der spezifischen Aminosäuren in den gekennzeichneten Peptiden eine Vorwärtsverschiebung an einer hydrophoben Trennsäule einführt, wobei die Verschiebung im Wert zwischen x und 2x variiert (dies impliziert, dass die Werte für δmin = x/2, δmax = 5x/2, w1 = x/2 und w3 = 7x/2 betragen), werden die gekennzeichneten Peptide in dem ersten Pool beispielsweise in den Fraktionen [–2x bis –x/2], [3x/2 bis 3x], [5x bis 13x/2], [17x/2 bis 10x], [12x bis 27x/2] und [31x/2 bis 17x] gesammelt. Ein ähnlicher Ansatz wird für die Pools 2 bis 7 verfolgt. Daher brauchen in diesem Beispiel statt 40 wiederholten Durchläufen nur sieben sekundäre Durchläufe mit den Pools durchlaufen zu werden. Die gekennzeichneten Peptide, die während dieses sekundären Durchlaufs eluieren, können beispielsweise direkt in die Ionenquelle eines Online-verbundenen Massenspektrometers für sofortige Identifizierung weiter gereicht werden. Die oben beschriebene Zusammengebungsstrategie ist ein nicht-beschränkendes Beispiel. Es wird den Fachleuten klar sein, dass ähnliche Strategien entwickelt werden können, um mehr oder weniger Pools bzw. Zusammengebungen zu erzeugen, und dass ähnliche Strategien auf Identifizierungspeptide angewendet werden können. Die Wahl der Zahl der Pools wird u.a. abhängen von: (i) der Intervallverschiebung δp, die durch die chemische oder enzymatische Veränderung eingebracht wird, (ii) das Elutionsfenster der aus der primären chromatographischen Trennung aufgesammelten Fraktionen und (iii) der Notwendigkeit, die chromatographische Zeit und die Analysezeit zu optimieren. Die vorliegende Erfindung sieht auch die Verwendung eines parallelen Säulensortierers vor. Mit einem parallelen Säulensortierer wird das Verfahren, das auf einer Einzelsäule basiert, mit einer Mehrzahl von Säulen durchgeführt, die parallel (d.h. synchron) arbeiten. Der parallele Sortierer enthält eine Vielzahl identischer Säulen, welche unter exakt den gleichen Bedingungen (Durchsatz, Gradient usw.) durchlaufen.
  • Das allgemeine Prinzip eines Parallelsortierers kann durch das folgende, nicht beschränkende Beispiel erklärt werden, bei dem 12 Pools von Peptidfraktionen erzeugt werden, und δp zwischen x/2 und 5x/2 liegt und die hydrophile Verschiebung zwischen den gekennzeichneten Peptiden und den nicht veränderten Peptiden ist. Falls das gesamte Elutionsfenster aller Peptide, die aus dem primären chromatographischen Durchlauf stammen, 20x entspricht, werden dann 40 Fraktionen mit einem x/2-Fenster gesammelt. Daher können nach dem primären chromatographischen Durchlauf die folgenden Fraktionen zusammengegeben werden: Fraktion 1 (0 bis x/2) mit den Fraktionen 13 (6x bis 13x/2), 25 (12x bis 25x/2) und 37 (18x bis 37x/2). Auf gleiche Weise wird Fraktion 2 mit den Fraktionen 14, 26 und 38 zusammengegeben; Fraktion 3 wird mit den Fraktionen 15, 27 und 39 zusammengegeben; Fraktion 4 wird mit den Fraktionen 16, 28 und 40 zusammengegeben; Fraktion 5 wird mit den Fraktionen 17 und 29 zusammengegeben; Fraktion 6 wird mit den Fraktionen 18 und 30 zusammengegeben; Fraktion 7 wird mit den Fraktionen 19 und 31 zusammengegeben; Fraktion 8 wird mit den Fraktionen 20 und 32 zusammengegeben; Fraktion 9 wird mit den Fraktionen 21 und 33 zusammengegeben; Fraktion 10 wird mit den Fraktionen 22 und 34 zusammengegeben; Fraktion 11 wird mit den Fraktionen 23 und 35 zusammengegeben und Fraktion 12 wird mit den Fraktionen 24 und 36 zusammengegeben. Die 12 Pools werden dann chemisch und/oder enzymatisch an mindestens einer ausgewählten Aminosäure verändert. Bei einem alternativen Ansatz wird jede Fraktion zuerst der Veränderung unterworfen, und ein Zusammengeben wird mit den veränderten Fraktionen durchgeführt. Tabelle II enthält Berechnungen der theoretischen Verschiebungen der 12 gekennzeichneten Peptid-Pools. Falls jeder der 12 veränderten Pools (das ist ein Pool, der veränderte Fraktionen enthält) Durchlauf 2 unterworfen wird, existiert dann unter chromatographischen Bedingungen, die gleich oder zumindest sehr ähnlich der primären chromatographischen Trennung an einem Einzelsäulensortierer sind, zu jeder Zeit ein "leeres" Elutionsfenster von 9x/2 zwischen den Fraktionen (die in einem Pool vorhanden sind) vorhanden sein, welche gekennzeichnete Peptide umfassen. Dieses leere Elutionsfenster von 9x/2 ist ein "totes Intervall" für die chromatographische Trennung als auch für das Analysegerät, weil keine gekennzeichneten Peptide in diesem Elutionsfenster eluieren, und folgerichtig keine gekennzeichneten Peptide zu einem geeigneten Analysegerät gesendet werden können. Ein paralleler Säulensortierer ist vorzugsweise ein Gerät, bei dem 2, 3, 4 oder mehr Säulen einen sekundären chromatographischen Durchlauf zur gleichen Zeit unter im wesentlichen ähnlichen Bedingungen (Durchsatz, Gradient usw.) durchführen, und worin der Ausgang des Parallelsortierers direkt mit einem Analysegerät verbunden ist. Ein Parallelsäulensortierer teilt die chromatographische Trennungszeit, welche normalerweise für eine Serie von hintereinander geschalteten Einzelsäulen notwendig ist, um ungefähr die Zahl der Säulen, welche in dem Parallelsäulensortierer verwendet werden. In einem nicht beschränkenden Beispiel, in dem ein Parallelsäulensortierer drei Säulen umfasst, werden die veränderten Pools parallel mit einer bevorzugten Kombination veränderter Pools wieder laufen gelassen. Daher besteht der Vorteil der Verwendung eines Parallelsäulensortierers nicht nur darin, dass die gesamte Peptidsortierzeit erheblich verringert werden kann, sondern auch darin, dass sich eine begrenzte Zahl toter Intervalle zwischen der Auswahl gekennzeichneter Peptide aus den ver änderten Fraktionen ergibt, so dass die Detektion der gekennzeichneten Peptide kontinuierlich erfolgen kann. Wie in Tabelle II für das oben beschriebene, nicht beschränkende Beispiel gezeigt, liegt eine bevorzugte Kombination veränderter Pools vor, wenn die veränderten Pools 1, 5 und 9 in einem primären Durchlauf in drei parallele Säulen geladen werden, veränderte Pools 2, 6 und 10 in einem sekundären Durchlauf an drei parallelen Säulen geladen werden, veränderte Pools 3, 7 und 11 in einem dritten Durchlauf in drei parallele Säulen geladen werden und veränderte Pools 4, 8 und 12 in einem vierten Durchlauf in drei parallele Säulen geladen werden. Mit der oben beschriebenen Kombination veränderter Pools existiert eine fast perfekte Angleichung zwischen den Intervallen, in welchen die gekennzeichneten Peptide aus den parallelen Säulen in jedem der vier Durchläufe eluieren. Wenn Säulen 1, 2 und 3 zur gleichen Zeit gestartet werden, werden die gekennzeichneten Peptide aus Säule I, Pool 1, Fraktion 1 zuerst bei einem Fenster –2x bis –x/2 eluieren. Der nächste Fluss gekennzeichneter Peptide kommt von Säule II, Pool 5, Fraktion 5; diese gekennzeichneten Peptide werden an einem Fenster 0 bis 3x/2 eluieren. Diese werden dann von gekennzeichneten Peptiden von Säule III, Pool 9, Fraktion 9 gefolgt, welche an einem Fenster 2x bis 7x/2 eluieren. Die folgenden gekennzeichneten Peptide eluieren von Säule I, Pool 1, Fraktion 13 bei einem Fenster 4x bis 11x/2 usw. ... (um einen möglichen Überlapp zwischen den gekennzeichneten Peptiden aus den unterschiedlichen Pools zu vermeiden, wird ein Fenster von x/2 zwischen jedem der zwei gekennzeichneten Peptidelutionsfenster eingeführt). In dem Peptidsortierer, werden die von Säule I, II und III eluierenden gekennzeichneten Peptide kontinuierlich an ein Analysegerät wie beispielsweise ein Massenspektrometer, weitergereicht. Die Tatsache, dass die gekennzeichneten Peptide in jedem Durchlauf ohne Unterlass eluieren, führt zu einem kontinuierlichen Fluss von Peptiden in das Analysegerät. Sobald der erste Durchlauf abgeschlossen ist, kann der zweite Durchlauf gestartet werden, gefolgt vom dritten und vom vierten Durchlauf. Die oben angesprochene Zusammengebungsstrategie ist ein nicht beschränkendes Beispiel. Es wird den Fachleuten klar sein, dass andere Kombinationen an Zahlen von Pools und parallelen Säulen zu gleichen bzw. ähnlichen Ergebnissen führen kann, d.h., eine kontinuierliche chromatographische Elution gekennzeichneter Peptide, unmittelbar gekoppelt mit einer kontinuierlichen Analyse der Peptide in beispielsweise einem Massenspektrometer. Die Wahl der Anzahl von Pools und Säulen wird unter anderem abhängen von i) dem Intervall δp, welches durch die chemische oder enzymatische Veränderung eingeführt bzw. ausgelöst wird, ii) dem Elutionsfenster der aus der primären chromatographischen Trennung gesammelten Fraktionen und iii) der Notwendigkeit, die Chromatographiezeit und die Analysezeit zu optimieren. Es wird den Fachleuten auch klar sein, dass dieser Parallelsäulen-Ansatz angewendet werden kann, um Identifizierungspeptide zu isolieren.
  • Die Erfindung kann auch einen Mehrsäulen-Peptidsortierer verwenden. Solch ein Mehrfachsäulen-Peptidsortierer ist im wesentlichen aus einer Zahl paralleler Säulensortierer aufgebaut, welche in einem kombinierten parallelen und seriellen Modus arbeiten. Solch ein Parallelsortierer umfasst im wesentlichen y-mal einen Satz von z Säulen, wobei die z Säulen parallel verbunden sind. In einem nicht beschränkenden Beispiel ist ein Mehrsäulen-Sortierer mit y = 3 und z = 3 ein Neun-Säulen-Sortierer. Solch ein Neun-Säulen-Sortierer arbeitet mit drei Sätzen von jedes Mal drei parallel verbundenen Säulen. Die drei parallelen Säulensätze werden als A, B und C bezeichnet. Die individuellen Säulen von A werden als I, II und III bezeichnet; die individuellen Säulen von B werden als I', II' und III' bezeichnet; und die individuellen Säulen von C werden als I'', II'' und III'' bezeichnet. Ein Satz paralleler Säulen arbeitet mit einem Verzug (θ genannt) im Vergleich zum vorherigen Satz. Daher startet der parallele Sortierer B mit einem Verzug von θ in Bezug auf den parallelen Sortierer A, und der parallele Sortierer C startet mit einem Verzug von θ nach dem Start des parallelen Sortierers B mit einem Bezug von 2θ nach dem Start des parallelen Sortierers A. Es ist wichtig, sich zu merken, dass in dem Mehrsäulen-Sortierer nur eine Durchlauf-I-Fraktion veränderter Peptide zu einer gegebenen Zeit pro Säule verarbeitet wird. Daher werden für das Beispiel eines Neun-Säulen-Sortierers neun Fraktionen gekennzeichneter Peptide (oder von Identifizierungspeptiden) gleichzeitig verarbeitet. Dies unterscheidet sich von den zwei vorher beschriebenen Sortierern (d.h., einem Einsäulen-Peptid-Sortierer und einem parallelen Sortierer), wo verschiedene veränderte Fraktionen strategisch zusammengegeben und gleichzeitig geladen werden. Da nur eine Fraktion von gekennzeichneten Peptiden (oder von Identifizierungspeptiden) zu der Zeit an dem Mehrsäulen-Sortierer verarbeitet wird, ist die Steuerung der Genauigkeit der Durchsatz (d.h., in dem sekundären chromatographischen Schritt) nicht so wichtig wie in den vorher beschriebenen Sortierern. Ein weiterer Vorteil des Mehrsäulen-Sortierers ist, dass er gut daran angepasst ist, gekennzeichnete Peptide von nicht veränderten Peptiden in den Fällen zu trennen, bei denen die chromatographische Verschiebung gekennzeichneter Peptide sich über die unterschiedlichen Fraktionen hindurch signifikant ändert. Auf gleiche Weise ist der Mehrsäulen-Sortierer gut daran angepasst, Identifizierungspeptide von veränderten Peptiden zu trennen.
  • Der Mechanismus eines Mehrsäulen-Peptidsortierers wird als ein nicht begrenzendes Beispiel für einen Neun-Säulen-Peptidsortierer erklärt, wobei die Elutionsfenster der veränderten Fraktionen so wie in Tabelle II dargestellt verwendet werden. An Säule I wird eine veränderte Fraktion 1 geladen, an Säule II wird eine veränderte Fraktion 13 geladen und an Säule III wird eine geänderte Fraktion 25 geladen. System B (Säulen I', II' und III') wird mit veränderten Fraktionen 2, 14 bzw. 26 geladen und System C (Säulen I'', II'' und III'') wird mit veränderten Fraktionen 3, 15 bzw. 27 geladen. Wie man an Tabelle II sehen kann, starten, wenn die drei Säulen von System A simultan gestartet werden, die drei Säulen von System B alle mit einer Verzögerung θ = 3x/2, und die drei Säulen von System C starten alle mit einer Verzögerung 2θ = 3x (in Bezug auf System A), wobei eine minimale Totzeit während der Elution der gekennzeichneten Peptide existiert. Wenn der Mehrsäulen-Peptidsortierer beispielsweise gemäß der oben beschriebenen Einstellungen gefahren wird, werden gekennzeichnete Peptide aus System A, Säule I, Fraktion 1 zuerst an einem vorbestimmten Fenster –2x bis –x/2 eluieren, gefolgt durch gekennzeichnete Peptide aus System B, Säule I', Fraktion 2, eluierend an einem Fenster 0 bis 3x/2, gefolgt von gekennzeichneten Peptiden von System C, Säule I'', Fraktion 3, die bei einem Fenster 2x bis 7x/2 eluieren, gefolgt durch gekennzeichnete Peptide von System A, Säule II, Fraktion 13, eluierend an einem Fenster 4x bis 11x/2 usw. Darüber hinaus kann das gesamte Sortieren der in Tabelle II dargestellten Fraktionen in fünf Durchläufen durchgeführt werden: Durchlauf 1: System A (1, 13, 25), System B (2, 14, 26), System CF (3, 15, 27); Durchlauf 2: System A (4, 16, 28), System B (5, 17, 29), System C (6, 18, 30); Durchlauf 3: System A (7, 19, 31), System B (8, 20, 32), System C (9, 21, 33); Durchlauf 4: System A (10, 22, 34), System B (11, 23, 35), System C: (12, 24, 36); und Durchlauf 5: System A (37), System B (38), System C (39, 40). Es wird den Fachleuten klar sein, dass andere Kombinationen paralleler und serieller Säulen zu ähnlichen Resultaten führen können, und dass der Mehrsäulen-Peptidsortierer gleichfalls gut angewendet werden kann, um Identifizierungspeptide zu isolieren. Die Wahl der Anzahl der Säulen, ihrer Anordnung und der an den Säulen geladenen Fraktionen wird unter anderem abhängen von: (i) dem Intervall δp, der durch die chemische oder enzymatische Veränderung eingeführt wird, ii) dem Elutionsfenster der aus der primären chromatographischen Trennung gesammelten Fraktionen und iii) dem Bedarf, die Chromatographiezeit und die Analysezeit zu optimieren.
  • Es wird dem Fachmann weiterhin klar sein, dass Peptidsortierer, welche das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung durchführen, auch auf vollautomatische Art und Weise unter Verwendung kommerziell erhältlicher Auto-Injektoren, HPLC-Ausrüstung und automatisierter Fraktions-Kollektoren durchgeführt werden könnten. Daher sollten die vorliegenden Beispiele für Peptidsortierer nicht als abschließend angesehen werden. Verschiedene Varianten, einschließlich elektrophoretischer und Ionenaustausch-chromatographischer Systeme sind gleichfalls verwendbar. Vollständigkeitshalber können Peptidsortierer zum Sortieren von Identifizierungspeptiden auf der Grundlage der gleichen Prinzipien aufgebaut werden.
  • Die darstellende Ausführungsform stellt weiterhin ein System zum Durchführen des oben beschriebenen Verfahrens der Proteom-Analyse in einer selektiven und effizienten Art bereit. Wie diskutiert, führt eine primäre chromatographische Säule eine anfängliche Trennung des komplexen Peptid-Gemischs durch. Die primäre chromatographische Säule trennt das komplexe Peptid-Gemisch in mindestens zwei Fraktionen unter einem definierten Satz von Bedingungen. Beispielsweise trennt die primäre chromatographische Säule das Protein-Peptid-Gemisch durch Eluieren der Säule mit einem vorbestimmten Lösungsmittelgradienten und eine vorbestimmten Durchsatz. Die sich aus der primären chromatographischen Trennung ergebenden Fraktionen können strategisch zusammengegeben werden, um eine Vielzahl von Fraktionen mit unterschiedlichen Elutionszeiten in einer Vielzahl zusammengelegter bzw. zusammengegebener Fraktionen zu kombinieren, wie oben beschrieben. Die zusammengelegten bzw. zusammengegebenen Fraktionen können im folgenden verändert werden, um einen Satz veränderter Peptide und einen Satz nicht veränderter Peptide für jede Fraktion zu ergeben. Gemäß einer alternativen Ausführungsform werden die Fraktionen zuerst unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren verändert und dann strategisch in einen Satz zusammengelegter Fraktionen zusammengegeben, wobei jede Fraktion in einer zusammengegebenen Fraktion einen Satz veränderter und einen Satz nicht veränderter Peptide umfasst. In einer sekundären chromatographischen Trennung werden die veränderten Peptide von den unveränderten Peptiden getrennt. Die isolierten Peptide können dann analysiert werden, um ein Protein zu identifizieren.
  • Die zweite chromatographische Trennung kann unter Verwendung eines Einzelsäulen-Peptidsortierers 10 durchgeführt werden, wie in 9 gezeigt. Gemäß der dargestellten Ausführungsform arbeitet der Einzelsäulen-Peptidsortierer 10 in Reihe mit einer primären chromatographischen Säule und umfasst eine sekundäre chromatographische Säule 11.
  • Gemäß der darstellenden Ausführungsform ist die sekundäre chromatographische Säule 11 im wesentlichen identisch in Art, Größe, Form und anderen Parametern zur primären chromatographischen Säule. Die gezeigte sekundäre chromatographische Säule 11 arbeitet weiterhin unter im wesentlichen ähnlichen chromatographischen Bedingungen. Beispielsweise wird gemäß der gezeigten Ausführungsform die sekundäre chromatographische Säule mit einem identischen oder im wesentlichen ähnlichen Lösungsmittelgradienten zu dem Lösungsmittelgradienten eluiert, welcher verwendet wird, um die Trennung in der primären chromatographischen Säule zu bewirken, und mit einem identischen oder im wesentlichen ähnlichen Durchsatz. Der gezeigte Peptidsortierer 10 umfasst weiterhin ein Lösungsmittelsystem, das eine Lösungsmittelpumpe 12 umfasst, welche mit mindestens einem Lösungsmittel-Reservoir verbunden ist. Die Lösungsmittelpumpe 12 liefert den vorbestimmten Lösungsmittelgradienten an die sekundäre Säule 11. Ein Probeninjektor 13 ist vorgesehen, um der Säule eine Fraktion oder eine zusammengegebene Fraktion zur Trennung bereitzustellen. Das Peptidsortiersystem umfasst weiterhin einen Satz von Einlassventilen bzw. -hähnen 14 zum Steuern und Lenken eines Lösungsmittel- und Probenflusses zum Einlass 15 der sekundären Säule. Das Peptidsortiersystem 10 aus 9 umfasst weiterhin einen Satz von Auslasshähnen 51 zum Steuern eines Flusses von dem Auslass 16 der sekundären Säule 10 und zum Lenken des Eluats von der sekundären Säule 10 zwischen einem Abfallbehälter 17, einem Fraktionskollektor 15 und/oder einer Ionenquelle eines Online-verbundenen Analysegeräts 19. Ein Ventilsteuersystem 50 ist vorgesehen, um den Betrieb der Hähne 14, 51 zu steuern und zu regeln. Gemäß der gezeigten Ausführungsform umfasst das Analysegerät ein Massenspektrometer, obwohl der Fachmann erkennen wird, dass jedes geeignete Analysegerät zum Identifizieren eines Proteins, wie die oben beschriebenen, verwendet werden kann. Wie diskutiert, eluieren veränderte Peptide unterscheidbar bzw. eindeutig von den nicht veränderten Peptiden in der sekundären Säule 11, was eine Isolierung und Identifizierung der veränderten auftretenden Peptide erlaubt. Es ist für einen Fachmann klar, dass die gleichen Prinzipien (Säule) verwendet werden können, um Identifizierungspeptide von veränderten Peptiden zu trennen.
  • Während die zum Erbringen des sekundären chromatographischen Schritts verwendete Säule als separat und unterschiedlich von der primären Säule dargestellt ist, wird der Fachmann erkennen, dass eine einzelne Säule verwendet werden kann, um die primären und die sekundären chromatographischen Schritte der gezeigten Ausführungsform durchzuführen. Beispielsweise kann das komplexe Gemisch in Fraktionen unter Verwendung einer gegebe nen chromatographischen Säule getrennt werden. Die gegebene Säule kann gereinigt und im folgenden für den sekundären chromatographischen Schritt wiederverwendet werden.
  • Gemäß einer alternativen Ausführungsform kann die Trennung der veränderten Fraktionen unter Verwendung eines Parallelsäulen-Peptidsortiersystems durchgeführt werden, wie in den 12a und 12b gezeigt. Wie diskutiert, wird das komplexe Gemisch zuerst unter Verwendung einer primären chromatographischen Säule getrennt mittels der oben beschriebenen Verfahren verändert und strategisch zusammengegeben, und zwar vor oder nach dem Schritt des Veränderns. Die veränderten und zusammengegebenen Fraktionen werden dann einem sekundären chromatographischen Schritt unterzogen, um eine Trennung geänderter und nicht veränderter Peptide zu bewirken. Das in 12a gezeigte Parallelsäulen-Peptidsortiersystem 20 verbessert die Effizienz und Geschwindigkeit des sekundären chromatographischen Schritts erheblich. Wie gezeigt, umfasst das Parallelsäulensystem 20 eine Mehrzahl von im wesentlichen identischen sekundären chromatographischen Säulen 21a, 21b bzw. 21c, die parallel verbunden sind. Die sekundären chromatographischen Säulen 21a, 21b, 21c des Parallelsäulensystems sind bezüglich der primären chromatografischen Säule, die zur Durchführung einer primären Trennung des komplexen Gemischs verwendet wird, identisch oder im wesentlichen ähnlich in Größe, Form und anderen chromatographischen Parametern. Gemäß der Ausführungsform umfasst das Peptidsortiersystem drei sekundäre Säulen. Jedoch wird der Fachmann erkennen, dass jede geeignete Zahl von parallel verbundenen chromatographischen Säulen verwendet werden kann, und dass die vorliegende Erfindung nicht auf die gezeigt Ausführungsform mit den drei Säulen beschränkt ist. Die gleichen mechanischen Prinzipien können auch dazu verwendet werden, Identifizierungspeptide zu isolieren.
  • Wie gezeigt, umfasst das Parallelsäulensystem 20 einen Satz von Lösungsmittelsystemen 22a, 22b, 22c, die jeder der Säulen 21a, 21b bzw. 21c entsprechenden. Jede Lösungsmittelpumpe ist mit einem Satz von Lösungsmittel-Reservoirs verbunden und stellen der korrespondierenden sekundären Säule einen vorbestimmten Lösungsmittelgradienten zur Verfügung. Das Parallelsäulen-Peptidsortiersystem 20 umfasst weiterhin einen Probeninjektor 23, der mit den Einlässen 25a, 25b und 25c der sekundären Säulen 21a, 21b, 21c zum Einführen einer Probe in die eine oder mehrere der sekundären Säulen gekoppelt ist. Ein Satz von Einlasshähnen 24 wird zum Steuern und Lenken eines Lösungsmittel- und Probenflusses zu einer ausgewählten sekundären Säule bereitgestellt. Ein Satz von Auslasshähnen 53 ist vorgesehen, um ein Eluat von den Auslässen 26a, 26b, 26c zu den sekundären Säulen 21a, 21b, 21c zwischen einem Abfallbehälter 27 einem Fraktionskollektor 28 und/oder einer Ionenquelle eines Online-verbundenen Analysegeräts 29 wie beispielsweise einem Massenspektrometer zu steuern und zu lenken. Ein Hahnsteuersystem 55 ist vorgesehen, um den Betrieb der Hähne 24, 53 zu steuern und zu regeln.
  • Gemäß einer alternativen Ausführungsform des Parallelsäulen-Peptidsortiersystems, das in 12b gezeigt ist, wird eine einzelne Lösungsmittelpumpe 58 verwendet, um einen Lösungsmittelgradienten an den sekundären parallelen Säulen 20a', 20b', 20c' im Peptidsortiersystem 20' bereitzustellen. Das Peptidsortiersystem von ...
  • 12b ist im wesentlichen ähnlich zu dem Peptidsortiersystem aus 12a mit der Ausnahme des Lösungsmittel-Systems. Wie gezeigt, wird eine einzelne Lösungsmittelpumpe 58 verwendet, um ein Lösungsmittelgemisch von den Lösungsmittelreservoirs zu den parallelen sekundären Säulen zu pumpen. In der in 12 gezeigten Ausführungsform wird ein gesteuertes Aufteilersystem, das einen Satz von Flussratenregulierern 59 umfasst, verwendet, um den Fluss des Lösungsmittels von der Lösungsmittelpumpe 58 zu den parallelen sekundären Säulen 20a', 20b', 20c' zu steuern und zu lenken.
  • Gemäß noch einer Ausführungsform, in 13 gezeigt, umfasst ein alternatives Peptidsortiersystem 30 zum Durchführen des sekundären chromatographischen Schritts der Erfindung eine Mehrzahl paralleler Säulensätze, die in einem kombinierten seriellen/parallelen Modus arbeiten. Gemäß der gezeigten Ausführungsform umfasst das Peptidsortiersystem 30 aus 13 eine Mehrzahl seriell verbundener sekundärer Säulensätze 41, 42, 43. Jeder sekundäre Säulensatz 41, 42, 43 umfasst eine Mehrzahl sekundärer Säulen 41a, 41b, 41c, 42a, 42b, 42c, 43a, 43b, 43c, die parallel verbunden sind. Ein Fachmann wird erkennen, dass das dargestellte Peptidsortiersystem nicht auf die gezeigte Zahl von Säulen und Säulensätzen beschränkt ist, und dass jede geeignete Zahl paralleler Säulen und serieller Säulensätze verwendet werden kann, um den sekundären chromatographischen Schritt der gezeigten Ausführungsform durchzuführen.
  • [In dem Peptidsortiersystem 30 aus 13 wird eine einzelne veränderte Fraktion von Peptiden, die aus dem primären chromatographischen Durchlauf hergestellt worden ist, zu einer gegebenen Zeit pro Säule verarbeitet. Die Fraktionen werden 1 zu einer Zeit an einer ausgewählten Säule geladen, und ein Lösungsmittelgradient wird jeder entsprechenden Säule bereitgestellt, um eine Trennung der veränderten Peptide in jeder Fraktion von den nicht veränderten Peptiden zu bewirken. Ein Probeninjektor 13a, 13b, 13c ist vorgesehen und mit jedem sekundären Säulensatz 41, 42 bzw. 43 verbunden, um eine Peptidfraktion in eine ausgewählte sekundäre Säule in dem sekundären Säulensatz einzuführen. Ein Lösungsmittelsystem, das eine Lösungsmittelpumpe 12a, 12b, 12c umfasst, ist vorgesehen und mit jedem sekundären Säulensatz 41, 42 bzw. 43 verbunden, um einen vorbestimmten Lösungsmittelgradienten zu einer vorbestimmten Zeit dem entsprechenden Säulensatz zur Verfügung zu stellen. Ventilsysteme der sekundären Säulensätze 41, 42 bzw. 43 werden entsprechend als a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, in 41; a', b', c', d', e', f, h', i', j', k', l', m', n', o' in 42; a'', b'', c'', d'', e'', f', g'', h'', i'', j'', k'', l'', m'', n'', o'', in 43 durchnummeriert. Ein Satz von Einlasshähnen 44 steuert und lenkt den Lösungsmittelfluss von den Lösungsmittelpumpen und den Probenfluss von den Probeninjektoren zu den Einlässen der sekundären Säulen in den sekundären Säulensätzen 41, 42, 43. Die Auslässe der sekundären Säulen 41a, 41b, 41c, 42a, 42b, 42c, 43a, 43b, 43c sind verbunden mit und lenken Eluat von den sekundären Säulen zu einem Abfallbehälter 27, einem Fraktionskollektor 48 und/oder einer Ionenquelle eines Online-verbundenen Analysegeräts 29. Ein Hahnsteuersystem 50 ist vorgesehen, um den Betrieb der Hähne 14, 51 zu steuern und zu lenken.
  • Die Lösungsmittelpumpen 12a, 12b, 12c sind konfiguriert, um einen vorbestimmten Lösungsmittelgradienten für den entsprechenden Säulensatz 41, 42, 43 bei einer ausgewählten Zeitdauer in Gang zu setzen. Beispielsweise initiert die erste Lösungsmittelpumpe 12a einen ersten geeigneten Lösungsmittelgradienten in dem Säulensatz 41 zu einer vorgegebenen Zeit, um eine Trennung jeder Fraktion in den Sekundärsäulen 41a, 41b, 41c des ersten Satzes 41 zu bewirken. Der Lösungsmittelgradient wird über jede sekundäre Säule 41a, 41b, 41c in dem ersten Satz entwickelt. Nach einer ausgewählten Verzögerung initiert die zweite Lösungsmittelpumpe 12b einen identischen oder im wesentlichen identischen Lösungsmittelgradienten in dem zweiten Satz der sekundären Säulen 42 zu einer zweiten vorgegebenen Zeit. Das zweite Lösungsmittelsystem entwickelt den Lösungsmittelgradienten über jede sekundäre Säule 42a, 42b, 42c, um eine Trennung jeder Fraktion in den sekundären Säulen 42a, 42b, 42c in dem zweiten Satz 42 zu bewirken. Schlussendlich, nach einer ausgewählten Verzögerung, initialisiert die dritte Lösungsmittelpumpe 12c einen identischen oder im wesentlichen identischen Lösungsmittelgradienten in dem dritten Satz der sekundären Säulen 43, um eine Trennung eines dritten Satzes von Fraktionen zu bewirken. Die beschriebene Konfiguration stellt dem Fraktionskollektor 48 und/oder der Ionenquelle des Online-verbundenen Analysegeräts 49 einen kontinuierlichen Strom getrennter und isolierter Peptide bereit, um ein in der Fraktion verändertes Peptid und ein zu dem veränderten Peptid zugehöriges Protein zu identifizieren.
  • Das Peptidsortiersystem 30 aus 13 kann unter Verwendung eines Satzes sekundärer Säulen 41a, 41b, 41c, 42a, 42b, 42c, 43a, 43b, 43c implementiert werden, welche wesentlich kleiner als die primäre Säule sind. Die sekundären Säulen 41a, 41b, 41c, 42a, 42b, 42c, 43a, 43b, 43c können auch aus weniger teurem, wegwerfbarem Material gebildet werden. Auf diese Art verbessert das Peptidsortiersystem 30 der gezeigten Ausführungsform nicht nur die Geschwindigkeit der Proteomanalyse der vorliegenden Erfindung erheblich, das gezeigte Peptidsortiersystem 30 verringert weiterhin die Kosten einer Durchführung der Analyse. Das oben beschriebene mechanische Prinzip kann dazu verwendet werden, gekennzeichnete Peptide von nicht veränderten Peptiden zu trennen oder Identifizierungspeptide von veränderten Peptiden zu trennen.
  • Daher stellt in einer weiteren Ausführungsform die Erfindung ein System zum Sortieren von Peptiden bereit, welches umfasst: a) eine primäre chromatographische Säule zum Trennen eines Protein-Peptid-Gemischs in eine Mehrzahl von Fraktionen unter einem definierten Satz von Randbedingungen, wobei jede Fraktion im folgenden einer Veränderung mindestens einer Aminosäure unterzogen wird, um gekennzeichnete Peptide zu generieren, und worin die geänderten Fraktionen in einen Satz zusammengegebener Fraktionen zusammengegeben werden, wobei jede zusammengegebene Fraktion mindestens zwei veränderte Fraktionen aufweist, und b) einen Satz sekundärer chromatographischer Säulen, welche eine erste sekundäre chromatographische Säule zum Trennen einer ersten zusammengegebenen Fraktion und mindestens einer zweiten sekundären chromatographischen Säule umfasst, welche parallel mit der ersten sekundären chromatographischen Säule zum Trennen einer zweiten zusammengegebenen Fraktion angeordnet sind, wobei der Satz sekundärer chromatographischer Säulen eine Isolierung der gekennzeichneten Peptide unter im wesentlichen identischen Bedingungen durchführt wie der definierte Satz von Bedingungen, wobei sich kein Elutionsüberlapp zwischen i) den gekennzeichneten Peptiden aus unterschiedlichen Fraktionen innerhalb eines Pools oder zwischen Pools ergibt und ü) den gekennzeichneten Peptiden und den unveränderten Peptiden.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein System zum Sortieren von Peptiden bereit, welches umfasst: eine primäre chromatographische Säule zum Trennen einer Protein-Peptid-Mischung in eine Mehrzahl von Fraktionen unter einem definierten Satz von Bedingungen, und wobei jede Fraktion im folgenden einer Veränderung mindestens einer Aminosäure unterzogen wird, um veränderte Peptide und unveränderte Peptide herzustellen, und worin die veränderten Fraktionen in einen Satz zusammengegebener Fraktionen zusammengegeben werden, wobei jede zusammengegebene Fraktion mindestens zwei veränderte Fraktionen enthält, und einen Satz sekundärer chromatographischer Säulen, der eine erste sekundäre chromatographische Säule zum Trennen einer ersten zusammengegebenen Fraktion und mindestens eine zweite sekundäre chromatographische Säule, welche parallel zu der ersten sekundären chromatographischen Säule angeordnet ist, zum Trennen einer zweiten zusammengegebenen Fraktion enthält, wobei der Satz sekundärer chromatographischer Säulen eine Isolierung der Identifizierungspeptide unter im wesentlichen identischen Bedingungen wie der definierte Satz von Bedingungen durchführt, wobei sich kein Elutionsüberlapp zwischen i) den Identifizierungspeptiden aus den unterschiedlichen Fraktionen innerhalb eines Pools oder zwischen Pools und ü) den Identifizierungspeptiden und den veränderten Peptiden ergibt.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst das System weiterhin einen Auslass zu einem Satz zweiter chromatographischer Säulen zum Sammeln von Eluat aus der ersten sekundären chromatographischen Säule und der zweiten sekundären chromatographischen Säule.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst das System weiterhin ein mit dem Auslass verbundenes Analysegerät.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst das System weiterhin einen mit dem Auslass verbundenen Abfallbehälter zum Aufsammeln eines Abfallprodukts aus dem Satz sekundärer Chromatographiesäulen.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst das System weiterhin einen mit dem Satz sekundärer chromatographischer Säulen gekoppelten Probeninjektor zum Injizieren einer zusammengegebenen Fraktion in eine der ersten sekundären Säulen und der zweiten sekundären Säulen.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst das System weiterhin einen Satz von Probeninjektor-Hähnen zum Leiten der zusammengegebenen Fraktion von dem Probeninjektor zu der ersten sekundären Säule und der zweiten sekundären Säule.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst das System weiterhin ein Lösungsmittelsystem zum Bereitstellen eines Lösungsmittelgradienten an dem Satz sekundärer chromatographischer Säulen.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst das Lösungsmittelsystem eine erste Lösungsmittelpumpe zum Bereitstellen eines Lösungsmittelgradienten an der ersten sekundären chromatographischen Säule und eine zweite Lösungsmittelpumpe zum Bereitstellen eines Lösungsmittelgradienten an der zweiten sekundären chromatographischen Säule.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst das Lösungsmittelsystem: eine Lösungsmittelpumpe, die mit der ersten sekundären chromatographischen Säule und der sekundären chromatographischen Säule verbunden ist; ein gesteuertes Aufspaltungs- bzw. Splittersystem, das einen ersten Durchsatzregler zum Regeln eines Lösungsmittelflusses zu der ersten sekundären chromatographischen Säule und einen zweiten Durchsatzregler zum Regeln eines Lösungsmittelflusses zu der zweiten sekundären chromatographischen Säule umfasst.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst das System weiterhin einen Fraktionskollektor zum Aufsammeln eines Eluats von dem Satz sekundärer chromatographischer Säulen.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst das System weiterhin ein Hahnsteuersystem zum Steuern des Satzes von Probeninjektionshähnen.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform in dem System sind die ersten und zweiten sekundären chromatographischen Säulen im wesentlichen identisch zu der ersten Säule.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform wird in dem System ein erster Lösungsmittelgradient an die erste Säule angelegt, um eine Trennung des Protein-Peptid-Gemischs zu erreichen, und ein zweiter Lösungsmittelgradient, welcher im wesentlichen identisch zu dem ersten Lösungsmittelgradienten ist, wird an die sekundären Säulen angelegt, um eine Trennung der zusammengegebenen Fraktionen zu bewirken.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Isolieren gekennzeichneter Peptide aus einem Protein-Peptid-Gemisch bereit, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer primären chromatographischen Säule zum Trennen des Protein-Peptid-Gemischs; (b) Injizieren des Protein-Peptid-Gemischs in die primäre chromatographische Säule, um das Protein-Peptid-Gemisch in einen Satz von Fraktionen unter einem bestimmten Satz von Bedingungen zu trennen; (c) Verändern mindestens einer der Fraktionen in dem Satz von Fraktionen, um einen Satz veränderter Fraktionen zu bilden, wobei eine veränderte Fraktion eine Teilmenge gekennzeichneter Peptide und eine Teilmenge unveränderter Peptide umfasst; (d) Zusammengeben einer ersten veränderten Fraktion und einer zweiten veränderten Fraktion, um eine erste zusammengegebene Fraktion zu bilden, wobei kein Elutionsüberlapp auftritt zwischen i) den gekennzeichneten Peptiden aus den ersten und zweiten veränderten Fraktionen und ii) den gekennzeichneten Peptiden und den unveränderten Peptiden der Fraktionen; (e) Zusammengeben einer dritten veränderten Fraktion und einer vierten veränderten Fraktion, um eine zweite zusammengegebene Fraktion zu bilden, wobei kein Elutionsüberlapp auftritt zwischen i) den gekennzeichneten Peptiden aus der dritten und vierten veränderten Fraktion und ii) den gekennzeichneten Peptiden und den unveränderten Peptiden der Fraktionen; (f) Bereitstellen einer sekundären chromatographischen Säule zum Trennen einer Teilmenge gekennzeichneter Peptide aus einer Teilmenge unveränderter Peptide; und (g) Trennen der ersten zusammengegebenen Fraktion unter Verwendung der sekundären chromatographischen Säule unter dem definierten Satz von Bedingungen, um die Teilmengen gekennzeichneter Peptide in der ersten veränderten Fraktion und der zweiten veränderten Fraktion zu isolieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Isolieren eines Identifizierungspeptids in einem Protein-Peptid-Gemisch bereit, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer primären chromatographischen Säule zum Trennen des Protein-Peptid-Gemischs; (b) Injizieren des Protein-Peptid-Gemischs in die primäre chromatographische Säule zum Trennen des Protein-Peptid-Gemischs in einen Satz von Fraktionen unter einem definierten Satz von Bedingungen; (c) Verändern mindestens einer der Fraktionen in dem Satz von Fraktionen zum Bilden eines Satzes veränderter Fraktionen, wobei eine veränderte Fraktion eine Teilmenge veränderter Peptide und eine Teilmenge von Identifizierungspeptiden umfasst; (d) Zusammengeben einer ersten veränderten Fraktion und einer zweiten veränderten Fraktion zum Bilden einer ersten zusammengegebenen Fraktion, wobei kein Elutionsüberlapp auftritt zwischen i) den veränderten Peptiden aus der ersten und der zweiten veränderten Fraktion und ii) den veränderten Peptiden und den Identifizierungspeptiden der Fraktionen; (e) Zusammengeben einer dritten veränderten Fraktion und einer vierten veränderten Fraktion zum Bilden einer zweiten zusammengegebenen Fraktion, wobei kein Elutionsüberlapp auftritt zwischen i) den Identifizierungspeptiden aus der dritten und vierten veränderten Fraktion und ii) den veränderten Peptiden und den Identifizierungspeptiden der Fraktionen; (f) Bereitstellen einer ersten sekundären chromatographischen Säule zum Trennen einer Teilmenge veränderter Peptide aus einer Teilmenge von Identifizierungspeptiden und (g) Trennen der ersten zusammengegebenen Fraktion unter Verwendung der sekundären chromatographischen Säule unter dem definierten Satz von Bedingungen, um die Teilmengen von Identifizierungspeptiden in der ersten veränderten Fraktion und der zweiten veränderten Fraktion zu isolieren.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform umfassen die vorhergehenden Verfahren weiterhin den Schritt des Trennens der zweiten zusammengegebenen Fraktion unter Verwendung der ersten sekundären chromatographischen Säule unter dem definierten Satz von Bedingungen, um die Teilmengen der gekennzeichneten oder Identifizierungs-Peptide in der dritten veränderten Fraktion und der vierten veränderten Fraktion zu isolieren.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform umfassen die vorherigen Verfahren weiterhin die Schritte: (h) Bereitstellen einer zweiten sekundären chromatographischen Säule, welche im wesentlichen parallel zu der ersten sekundären chromatographischen Säule angeordnet ist, zum Trennen einer Teilmenge veränderter Peptide aus einer Teilmenge unveränderter Peptide in einer Fraktion; und (i) Trennen der zweiten zusammengegebenen Fraktion unter Verwendung der zweiten sekundären chromatographischen Säule unter dem definierten Satz von Bedingungen, um die Teilmengen veränderter Peptide in der dritten veränderten Fraktion und der zweiten veränderten Fraktion zu isolieren.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform umfassen die vorherigen Verfahren weiterhin den Schritt des Lenkens der gekennzeichneten oder Identifizierungs-Peptide zu einem Analysegerät.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform umfassen die vorherigen Methoden den Schritt des Identifizierens eines Identifizierungs- oder gekennzeichneten Peptids und seines korrespon dierenden Proteins unter Verwendung des Analysegeräts in Kombination mit einer Datenbanksuche.
  • In dem was folgt, wird eine informativere Beschreibung verschiedener der unterschiedlichen Schritte der Erfindung dargestellt.
  • I. Präparation eines Protein-Peptid-Gemischs
  • Protein-Peptid-Gemische, die von einer Proteine enthaltenden Probe stammen (die Protein-Peptid-Gemische), werden durch im Stand der Technik beschriebene Verfahren erlangt, wie beispielsweise durch chemische oder enzymatische Spaltung oder Verdauung. In einem bevorzugten Aspekt werden die Proteine mittels eines proteolytischen Enzyms verdaut. Trypsin ist ein besonders bevorzugtes Enzym, weil an den Seiten von Lysin und Arginin spaltet, was geladene Peptide ergibt, welche typischerweise eine Länge von ungefähr 5 bis 50 Aminosäuren und ein Molekulargewicht von zwischen ungefähr 500 bis 5.000 Dalton aufweisen. Solche Peptide sind insbesondere geeignet zur Analyse mittels Massenspektroskopie. Eine nicht-beschränkende Liste von Proteasen, welche auch in dieser Erfindung verwendet werden können, umfasst Lysobacter enzymogenes-Endoproteinase Lys-C, Staphylocolococus aureus-Endoproteinase Glu-C (V8-Protease), Pseudomonos fragi-Endoproteinase Asp-N und Clostripain. Proteasen mit niedrigerer Spezifizität, wie beispielsweise Bacillus subtilis-Subtilisin, Procainpepsin und Tritirachium album-Proteinase K, können in dieser Erfindung ebenfalls verwendet werden.
  • Alternativ können auch chemische Reagenzien verwendet werden, um die Proteine in Peptide zu spalten. Beispielsweise kann Zyanbromid verwendet werden, um Proteine an Methionin-Resten in Peptide zu spalten. Chemische Fragmentierung kann auch durch beschränkte Hydrolyse unter sauren Bedingungen angewendet werden. Alternativ kann BNPS-Skatol verwendet werden, um an der Seite von Tryptophan zu spalten. Teilweise NH2-terminale Degradation unter Verwendung entweder chemisch induzierter Leiter mit Isothiocyanat oder unter Verwendung von Aminopeptidase-Behandlung kann ebenfalls verwendet werden.
  • II. Chromatographie
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "chromatographischer Schritt" oder "Chromatographie" auf Verfahren zum Trennen chemischer Substanzen, welche im Stand der Technik weit erhältlich sind. In einem bevorzugten Ansatz macht er Verwendung von relativen Raten, mit denen chemische Substanzen aus einem sich bewegenden Strom von Gas oder Flüssigkeit an einer stationären Substanz adsorbiert werden, welche üblicherweise ein fein verteilter Feststoff, ein Blatt von Filtermaterial oder ein dünner Film einer Flüssigkeit auf der Oberfläche eines Festkörpers ist. Chromatographie ist eine vielseitige Methode, welche Mischungen von Verbünden sogar in Abwesenheit detaillierten Vorwissens über die Zahl, Natur oder relativen Mengen der individuellen vorliegenden Substanzen trennen kann. Das Verfahren wird weit genutzt zur Trennung chemischer Verbindungen bzw. Verbünde biologischen Ursprungs (beispielsweise von Aminosäuren, Proteinfragmenten, Peptiden, Proteinen, Phospholipiden, Steroiden usw.) und von komplexen Gemischen aus Petroleum und flüchtigen aromatischen Gemischen, wie beispielsweise Parfüms und Geschmackstoffen. Die am meisten verwendete Säulen-nutzende flüssige Technik ist die Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie, in welcher eine Pumpe die flüssige mobile Phase durch eine hocheffiziente, dicht gepackte Säule bei hohem Druck zwingt. Neuere Überblicke über chromatographische Techniken sind von M. Meyer, 1998, ISBN: 047198373X und A. Cappiello et al. (2001) Mass. Spectrom. Rev. 20(2): 88–104, beschrieben, welche hiermit vollinhaltlich durch Bezug eingeführt sind. Andere in letzter Zeit entwickelte Verfahren, die im Stand der Technik beschrieben sind, und neue chromatographische Verfahren, welche im Stand der Technik verfügbar werden, können ebenfalls verwendet werden. Einige Beispiele für Chromatographie sind die Umkehrphasen-Chromatographie (RP), die Ionenaustausch-Chromatographie, die hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie, Größenausschluss-Chromatographie, Gelfiltrations-Chromatographie oder Affinitäts-Chromatographie, wie beispielsweise Immunoaffinitäts- und immobilisierte Affinitäts-Chromatographie.
  • Chromatographie ist eine von mehreren Trennungstechniken. Elektrophorese und alle Varianten, wie beispielsweise Kapillarelektrophorese, Freifluss-Elektrophorese usw., sind weitere Elemente dieser Gruppen. Im letzteren Fall ist die treibende Kraft ein elektrisches Feld, welches unterschiedliche Kräfte an gelösten Stoffen unterschiedlicher Ionenladung ausübt. Die Widerstandskraft ist die Viskosität des nicht-fließenden Lösungsmittels. Die Kombination dieser Kräfte ergibt Ionen-Mobilitäten, welche für jeden gelösten Stoff besonders geeignet sind. Einige Beispiele sind Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und native Gelelektrophorese. Kapillar-Elektrophorese-Verfahren umfassen Kapillar-Gelelektrophorese, Kapillarzonen-Elektrophorese, Kapillarelektro-Chromatographie, Kapillar-isoelektrische Fokussierungs- und Affinitäts-Elektrophorese. Diese Techniken werden beschrieben in: P. McKay, An Introduction to Chemistry, Science Seminar, Department of Recovery Sciences, Genentech Inc., welches hiermit durch Referenz vollinhaltlich eingeführt wird.
  • III. Puffer
  • Die Verfahren der Erfindung benötigen eine Kompatibilität zwischen den Trennungsbedingungen im primären Durchlauf, den Reaktionsbedingungen in dem Veränderungsschritt, den Trennungsbedingungen in dem sekundären Durchlauf und den Bedingungen, um die eluierenden gekennzeichneten oder Identifizierungspeptide in Analysegeräten, wie beispielsweise Massenspektrometern, zu analysieren. Wie oben angemerkt, bestimmen die Kombination der chromatographischen Bedingungen in dem primären und sekundären Durchlauf und die chromatographischen Verschiebungen, die durch den Veränderungsschritt induziert werden, die Möglichkeit, die gekennzeichneten oder Identifizierungspeptide aus jeder Fraktion zu isolieren, welche man aus einem Protein-Peptid-Gemisch in dem primären Durchlauf erhält. Wie ebenfalls schon vorher angemerkt, sind in einer bevorzugten Ausführungsform die chromatographischen Bedingungen des primären Durchlaufs und des sekundären Durchlaufs die gleichen, oder sie sind im wesentlichen gleich.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die in beiden chromatographischen Schritten verwendeten Puffer(lösungen) und/oder Lösungsmittel kompatibel mit den Bedingungen, welche benötigt werden, um eine effiziente Durchführung der chemischen und/oder enzymatischen Reaktionen in dem Veränderungsschritt zwischen den beiden chromatographischen Schritten durchzuführen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Natur der Lösungsmittel und Puffer in dem primären Durchlauf, dem sekundären Durchlauf und dem Veränderungsschritt identisch oder im wesentlichen gleich. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Puffer und Lösungsmittel kompatibel mit den Bedingungen, die benötigt werden, um eine massenspektrometrische Analyse durchzuführen. Definieren solcher Puffer und Lösungsmittel benötigt ein Abstimmen und Feinabstimmen [und solche Randbedingungen sind aus dem Stand der Technik nicht erhältlich]. Beispiele, um dieses Abstimmen zu zeigen, werden beispielsweise in Beispiel 9 beschrieben.
  • Für einige Ausführungsformen der Erfindung mit bestimmten Typen gekennzeichneter Peptide oder Identifizierungspeptide, ist es sehr schwierig, falls nicht sogar unmöglich, einen Satz identischer oder im wesentlichen gleicher Puffer und/oder Lösungsmittel zu entwerfen, welcher durch den ganzen Vorgang des primären Durchlaufs, Veränderungsschritts, sekundären Durchlaufs und der Analyse hindurch verwendet werden kann.
  • Beispielsweise mag die chemische und/oder enzymatische Reaktion, um die Peptide in dem Veränderungsschritt zu verändern, bestimmte Reaktionsbedingungen benötigen, welche nicht kompatibel mit den in dem primären und/oder sekundären Durchlauf verwendeten Puffern ist. In diesen Fällen werden die Puffer/Lösungsmittel-Bedingungen in den Fraktionen vor dem Veränderungsschritt geändert und/oder nach dem Veränderungsschritt, dessen Veränderung mit den Verfahren nach dem Stand der Technik durchgeführt wird, wie beispielsweise eine Extraktion einer Gefriertrocknung und ein Rückauflösungsschritt, ein Ausfällungs- und Rückauflösungs-Schritt, einer Dialyse gegen einen geeigneten Puffer/Lösungsmittel oder sogar eine schnelle Umkehrphasentrennung mit einem steilen Gradienten.
  • Eine weitere Komplikation mag die Zusammensetzung des in dem Protein-Peptid-Gemisch vorhandenen Puffers/Lösungsmittels vor dem Beginn des primären Durchlaufs sein. Anwendung eines Vorbehandlungsschritt, wie oben angemerkt, mag bestimmte Puffer/Lösungsmittel-Bedingungen benötigen, welche nicht mit dem Puffer/Lösungsmittel zur Durchführung des primären Durchlaufs kompatibel sind. Alternativ können die Bedingungen für die Präparation/Isolierung von Proteinen aus ihrer biologischen Quelle zu der Kontaminierung des Proteingemischs oder des Protein-Peptid-Gemischs mit Verbindungen führen, welche mit dem primären Durchlauf negativ wechselwirken. In diesen Situationen wird die Puffer/Lösungsmittel-Zusammensetzung des Proteingemischs oder des Protein-Peptid-Gemischs verändert, um sie mit dem primären Durchlauf kompatibel zu machen. Ein solches Ändern wird mit Verfahren durchgeführt, welche im Stand der Technik beschrieben sind, wie beispielsweise einer Extraktion, einer Gefriertrocknung und einem Wiederauflösungsschritt, einer Ausfällung und einem Rückauflösungsschritt, einer Dialyse gegen einen geeigneten Puffer/ein geeignetes Lösungsmittel oder sogar durch eine schnelle Umkehrphasentrennung mit einem steilen Gradienten.
  • In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist der Puffer/das Lösungsmittel des sekundären Durchlaufs nicht kompatibel mit dem Durchführen der Analyse der eluierenden gekennzeichneten Peptide oder Identifizierungspeptide. In solchen Fällen wird der Puffer/das Lösungsmittel in den aus dem sekundären Durchlauf gesammelten Fraktionen verändert, um die Bedingungen kompatibel mit der Analyse mit beispielsweise einem Massenspektrometer zu gestalten. Ein solches Ändern wird mit im Stand der Technik beschriebenen Methoden durchgeführt, wie beispielsweise mittels einer Extraktion, einer Gefriertrocknung und einem Wiederauflösungsschritt, einer Ausfällung und einem Wiederauflösungsschritt, einer Dialyse gegen einen geeigneten Puffer/ein geeignetes Lösungsmittel oder sogar durch eine schnelle Umkehrphasenseparation mit einem steilen Gradienten. Alternativ können die Fraktionen mit den gekennzeichneten Peptiden oder Identifizierungspeptiden gesammelt und für eine dritte Reihe von Trennungen rekombiniert werden, was im folgenden als tertiärer Durchlauf bezeichnet wird. Dieser tertiäre Durchlauf wird dergestalt durchgeführt, dass die eluierenden gekennzeichneten oder Identifizierungspeptide mit einem Massenspektrometer analysiert werden können. Ein Beispiel der Strategie und der Zusammengebungsstrategie wird beispielsweise in Beispiel 18 beschrieben.
  • Äquivalente
  • Die Fachleute werden viele Äquivalente der bestimmten Ausführungsformen der hierin beschriebenen Erfindung erkennen oder in der Lage sein, sie ohne mehr als Routineuntersuchungen festzustellen. Beispielsweise kann eine Chromatographie in vielen Fällen durch Elektrophorese ersetzt werden. Elektrophoretische Techniken umfassen (kapillare) Gelelektrophorese, (kapillare) Elektrochromatographie, (kapillare) isoelektrische Fokussierungs- und Affinitätselektrophorese. In noch einem weiteren äquivalenten Beispiel könnte eine Veränderung auch eine physikalische Veränderung sein. Beispielsweise kann ein Aussetzen von Peptiden einer erhöhten Temperatur zum (partiellen) Entfalten von temperaturempfindlichen Peptiden führen, und als eine Folge werden diese Peptide ein anderes chromatographisches Verhalten erlangen.
  • Beispielsweise stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, um eine Teilmenge von Peptiden aus einem Protein-Peptid-Gemisch zu isolieren, welches die folgenden Schritte aufweist: (a) anfängliches Trennen des Protein-Peptid-Gemischs in Fraktionen von Peptiden mittels Chromatographie, (b) Aussetzen jeder Fraktion einer erhöhten Temperatur und (c) Isolieren der physikalisch veränderten Peptide mittels einer zweiten Chromatographie, wobei die Chromatographie des anfänglichen und des zweiten Trennungsschrittes mit der gleichen Art von Chromatographie durchgeführt wird, und wobei die chromatographischen Bedingungen in beiden Trennungen vorzugsweise gleich oder im wesentlichen ähnlich sind. In einem Umkehrmodus werden die Peptide, welche nach dem Aussetzen einer erhöhten Temperatur unverändert bleiben, in Schritt (c) isoliert. In einer bestimmten Ausführungsform kann das Aussetzen einer erhöhten Temperatur sogar während des sekundären Durchlaufs angewandt werden, anstatt vor dem sekundären Durchlauf.
  • Eine weitere Möglichkeit ist es, dass Durchlauf 1 oder Durchlauf 2 in der Anwesenheit eines Magnetfelds durchgeführt werden. Dieses Magnetfeld beeinflusst dann spezifisch die Elution oder Migration von Peptiden, die magnetempfindlich sind. Beispielsweise könnten magnetische Teilchen, die mit bestimmten Antikörpern beschichtet sind, die gegen Phosphotyrosin gelenkt werden, einem Protein-Peptid-Gemisch hinzugefügt werden. Die Phosphotyrosin-enthaltenen Peptide werden unter dem Einfluss des Magnetfelds spezifisch beeinflusst.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Spezifische chemische Veränderung von Methiononresten
  • Ein Protein-Peptid-Gemisch wurde gemäß dem in der Erfindung beschriebenen Verfahren erzeugt, und die relativ seltene Aminosäure Methionin wurde zur Veränderung ausgewählt. Wie in der Literatur dokumentiert, ist es ein Ansatz, Methionin durch chemische Oxidation zu verändern, welches zu einer Sulfoxidbildung und zu einer Sulfonbildung führen kann. Methionin umfassende Peptide können in ihre Sulfon-Derivate unter Verwendung stark oxidierender Bedingungen umgewandelt werden, wie beispielsweise mit Perameisensäure oder anderen Per-Säuren (Toennies und Homiller, 1942 und Hirs, 1956). Es ist bekannt, dass die stärkeren Oxidationsbedingungen ziemlich hart und nicht selektiv genug sind. Die Bildung von Methioninsulfoxid läuft bei Kontakt von Methionin mit Luft. Jedoch ist bei Vorhandensein von 0,5% H2O2 bei Raumtemperatur und niedrigem pH (1% TFA) diese Reaktion in weniger als 30 min abgeschlossen. Interessanterweise wurde es unter diesen milden Bedingungen beobachtet, dass sowohl Cystein als auch Tryptophan, zwei andere Reste, die sehr empfindlich auf Oxidation reagieren, schlecht oxidierten oder überhaupt nicht oxidierten. Dieser Schluss wurde gezogen aus einem Oxidieren einer großen Variation von Trp- Peptiden, Cys-Peptiden und Met-Peptiden, gefolgt durch HPLC-Analysen und Massenspektrometrie der Reaktionsprodukte. Ein illustratives Beispiel der Spezifizität der Reaktion ist in 3 gezeigt. Beide Methioninveränderungen (die Sulfoxid- und die Sulfon-Derivate) sind hydrophiler (das Sulfon-Derivat zu einem geringeren Grad als das Sulfoxid-Derivat) als das nicht veränderte Methionin. Die bestimmte milde chemische Oxidation von Methionin-Resten enthaltenen Peptiden zu Methionin-Sulfoxid wurde in dieser Erfindung vorzugsweise ausgenutzt aufgrund der Spezifizität der Veränderung von Methionin und aufgrund der optimalen Bedingungen, um gekennzeichnete Peptide von nicht veränderten Peptiden zu trennen. Die Experimente zeigen, dass unter den Bedingungen der Erfindung diese Methioninveränderung effizient verwendet werden kann, um die Methionin-Sulfoxid-veränderten Peptide größtenteils von den nicht veränderten Peptiden in einem komplexen Gemisch von Peptiden oder einem Protein-Peptid-Gemisch zu trennen. Ein wichtiges Element der Erfindung ist die starke Abnahme der Hydrophobizität, wenn Peptide von der Methionin- in ihre Methionin-Sulfoxid-Form umgewandelt werden. Dies wird durch eine Verschiebung in der Elution der oxidierten Peptide zu geringeren Konzentrationen des organischen Lösungsmittels während der Umkehrphasen-Chromatographie gezeigt (hier als die frontale oder hydrophile Verschiebung bezeichnet). Unter Verwendung unterschiedlicher Methionin-enthaltender Peptide und auch unter Verwendung von Bedingungen für eine Umkehrphasen-Chromatographie, wird gezeigt, dass ein großes Spektrum von Peptiden, die oxidierte Methionine enthalten, effizient aus dem Pool der unveränderten Peptide getrennt werden kann. Abhängig von den chromatographischen Bedingungen wird gezeigt, dass sich die hydrophiler Verschiebungen in der Elution der oxidierten Peptide signifikant unterscheiden können. Diese Ergebnisse zeigen, dass durch Verwenden der richtigen Bedingungen Verschiebungen von 3 min bis zu mehr als 7 min unter Standardgradienten hin zu geringeren Modifizierungskonzentrationen erreicht werden können. Dies wird für einen Peptid-Durchlauf in unterschiedlichen Systemen (Tabelle III) dargestellt. Große Verschiebungen werden systematisch mit dem NH4Ac/Methanol-System beobachtet. Kleinere, aber immer noch signifikante Verschiebungen werden mit der TFA/Acetonitril- oder HCOOH/Acetonitril-Kombination bemerkt. Im Prinzip können alle in Tabelle III angegebenen Systeme in dem Sortierprozess verwendet werden. In allen folgenden Beispielen haben wir das 0,1% TFA/Acetonitril- oder das 0,1% HCOOH/Acetonitril-Gemisch verwendet. Es sollte klar sein, dass das Peptidsortiersystem die Verwendung anderer Lösungsmittelsysteme nicht ausschließt. Die HCOOH/Acetonitril-Kombination ist ein Ansatz, welcher verwendet werden kann, wenn gekennzeichnete Peptide mit Elektrosprüh-MS analysiert werden. Inte ressanterweise sind die hydrophilen Verschiebungen der gekennzeichneten Peptide (sogar dann, wenn sie aus der gleichen Fraktion in dem primären chromatographischen Durchlauf stammen) nicht identisch und können sogar erheblich variieren. Daher scheint die Oxidation einen veränderlichen Effekt zu haben, welcher Sequenz-abhängig sein kann. Im besonderen werden die Methionin-Peptide, welche in einem Ein-Minuten-Intervall in dem primären Durchlauf gesammelt worden sind, nun als ihre Sulfoxid-Form in größeren Zeitintervallen (beispielsweise in 4 min) in den sekundären Durchläufen eluieren. Dies ist ein wichtiger Vorteil, weil die ausgewählten Methionin-enthaltenen Peptide während des sekundären Durchlaufs in größeren Zeitintervallen eluieren, und dies die Auflösungskapazität des Trennungssystems signifikant erhöht. Als Folge nimmt eine Co-Elution gekennzeichneter Peptide ab, die Peptide eluieren gradueller, in einer weniger zusammengedrückten Art, was eine bessere Präsentation zur Identifikation für das Massenspektrometer erlaubt.
  • Ein alternativer Ansatz, um die Methionin-Seitenketten in Peptiden zu verändern, ist die Reaktion mit Alkylhalogeniden, wie beispielsweise Methyliodid, was zu einer Bildung des Sulfonium-Ions führt (Rothgeb et al., 1977). Diese Reaktion läuft langsam und erreicht ihren Abschluss nach mehr als 8 Stunden. Ein Protein-Peptid-Gemisch wird gemäß dem in der Erfindung beschriebenen Verfahren erzeugt. Ein primärer Durchlauf wird beispielsweise mit einer Anionenaustausch-Säule durchgeführt, und Fraktionen werden gesammelt. Diese Fraktionen werden beispielsweise mit Methyliodid verändert, welches mit Methionenrest-enthaltenen Peptiden spezifisch reagiert. Als ein Ergebnis werden Methionin-enthaltende Peptide verändert (Methionin-Reste werden in ihre Sulfoniumionen umgewandelt) und haben eine unterschiedliche Ladung, und die sich ergebenden, gekennzeichneten Peptide migrieren unterschiedlich von den unveränderten Peptiden an Ionenaustausch-Säulen. Die chromatographischen Bedingungen des ersten und sekundären Durchlaufs werden unter identischen oder ähnlichen chromatographischen Bedingungen durchgeführt. Insbesondere bewirkt diese Veränderung eine schnellere Elutionsrate der gekennzeichneten Peptide, wenn solche Peptide an einen Anionenaustauscher übergeben werden (z.B. MONO Q- oder DEAE-Säulen) oder eine niedrigere Elutionsrate an einem Kationen-Austauscher (z.B. Mono S, Phosphocellulose).
  • Beispiel 2: Spezifische chemische Veränderung von Cystein-Resten
  • Ein Protein-Peptid-Gemisch wird mit einer oben beschriebenen Verfahren erzeugt, und eine spezifische chemische Veränderung von Cystein-Resten wird durchgeführt. Diese Veränderung basiert beispielsweise auf der spezifischen Umwandlung von Cysteinpeptiden in ein hydrophileres Derivat, das eine hydrophile Verschiebung während einer Umkehrphasen-HPLC durchläuft. Verschiedene Reagenzien können diese Voraussetzungen erfüllen. Beispielsweise wandeln Reaktionen mit Iodacetamid, Iodacetat, Ethylenimin, Bromethylamin, Acrylamid und 4-Vinylpyridin alle Cystein in Verbindungen um, welche sich unter Umkehrphasen-Bedingungen hydrophiler verhalten. Zusätzlich werden alle diese Verbindungen einer Oxidation durch H2O2 unterzogen, was zur Bildung ihrer korrespondierenden Sulfoxid-Derivate führt, welche sogar noch hydrophiler sind. Es ist wichtig anzumerken, dass die Verschiebung aufgrund der Oxidation hier weniger ausgeprägt ist als für den Fall der Methionin-Oxidation. Wenn jedoch die Verschiebungen zwischen dem freien Thiol-Cystein-Derivat und seinem veränderten und oxidierten Gegenstück kombiniert werden, erhält man Gesamtverschiebungen der gekennzeichneten Peptide, welche zu denen für eine Methionin-Sulfoxid-Bildung gemessenen ähnlich sind (4). Das folgende Reaktionsschema (i) zeigt ein Beispiel, wie Cysteinreste spezifisch chemisch dergestalt verändert werden können, dass die Veränderung zur Trennung gekennzeichneter Cys-Peptide von nicht veränderten Peptiden gemäß dieser Erfindung verwendet werden kann. Daher ist das Protokoll das folgende: Das Proteingemisch wird in 8 M Harnstoff in 1% TFA aufgelöst und wird als erstes mit H2O2 (1% Endkonzentration) für 30 min bei 25°C behandelt, was zu einer Sulfoxid-bildung aller in dem Proteingemisch vorhandenen Methionin-Reste führt. Die Proteine werden dann über Nacht bei –20°C nach Hinzufügen von 4 Volumina Ethanol ausgefällt. Ausgefällte Proteine werden durch Zentrifugieren wiedergewonnen, einmal mit 1 ml Ethanol-Wasser (3:1 Volumenanteile) ausgewaschen. Das gewaschene Proteinpellet wird dann in 8 M Harnstoff 0,1 M Tris-HCl bei pH 8,6 rückaufgelöst und ein zweifacher molarer Überschuss von Tributylphosphin wird hinzugefügt, wodurch alle S-S-Brücken in Thiolgruppen umgewandelt werden. Peptide werden durch spezielle Spaltung erzeugt (bequemerweise wird Trypsin verwendet), und das Protein-Peptid-Gemisch wird durch RP-HPLC (primärer Durchlauf) getrennt und in einer solche Anzahl von Fraktionen zusammengesammelt, das sie während des Durchlaufs 2 die Trennung der gekennzeichneten Peptide von den nicht veränderten Peptiden in jeder der gesammelten Fraktionen erlauben. In jeder Fraktion werden die Cysteinreste in ihre S-Propionamid-Derivate durch Reaktion mit Acrylamid in einer Pufferlösung mit pH 6,8 umgewandelt (Sechi und Chait, 1998).
  • Dieser Reaktion folgt unmittelbar eine Oxidation mit H2O2 in 1% TFA, was die S-Propionamid-Derivate in die hydrophilere Sulfoxid-Form umwandelt. Letzteres ist unten beschrieben (i).
  • Figure 00790001
  • Beide Reaktionen erreichen ihren Abschluss innerhalb einer kurzen Zeit, und kein Zwischenprodukt kann entdeckt werden (4). Darüber hinaus können diese Reaktionen in Folge durchgeführt werden, ohne die Reagenzien in den Zwischenschritten zu entfernen. Daher kann das gesamte Gemisch nach dem letzten Oxidationsschritt erreicht werden, kann an die RP-HPLC-Säule geladen werden, und die gekennzeichneten Peptide können unter Verwendung identischer oder sehr ähnlicher chromatographischer Bedingungen wie während des primären Durchlaufs von den nicht veränderten Peptiden getrennt werden. Im Folgenden werden die gekennzeichneten Peptide an ein Analysegerät wie beispielsweise ein Massenspektrometer weitergereicht, um die Identität des gekennzeichneten Peptids und seines entsprechenden Proteins zu identifizieren. Dieses Vorgehen wird für jede während des Durchlaufs 1 gesammelte Fraktion wiederholt. Peptidsortierer, die aus mehreren Säulen in paralleler und/oder serieller Anordnung bestehen, können verwendet werden, um die für die chromatographischen Trennungen und die Analyse benötigte Zeit zu optimieren.
  • In einer alternativen Version der Reaktionssequenz kann man den Protein-Voroxidierungs- und -ausfällungs-Schritt auslassen, dann startend mit der Spaltung der Proteine, um ein Protein-Peptid-Gemisch zu erzeugen. Dann wird der erste Oxidationsschritt an dem Protein-Peptid-Gemisch bei saurem pH durchgeführt, gefolgt durch eine Reduktion bei pH 8,6 mit einem Überschuss an NaBH4, und den anderen Veränderungsschritten (Reaktion mit Acrylamid und Oxidation) wie oben beschrieben. Alle diese Reaktionen können auch kontinuierlich ohne zwischengeschaltete Reinigungsschritte durchgeführt werden.
  • Noch ein weiteres alternatives Verfahren zum Auswählen für Cystein-enthaltende Peptide, das ein Ein-Schritt-Vorgehen umfasst, basiert auf der Reaktion mit (5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoat) oder DTNB), welche SH-enthaltende Peptide in ihre gemischte Disulfid-Form umwandelt. Diese Reaktion ist verwendet worden, um den freien SH-Anteil von Proteinen und Peptiden quantitativ zu messen (G. L. Ellman (1959)). Die Reaktion eines Cystein-enthaltenen Peptids mit DTNB ist in (ii) gezeigt.
  • Figure 00800001
  • Die gemischte Disulfid-Form des Peptids ist hydrophober als ihre SH-Entsprechung und eluiert später in dem Peptid-Sortierprozess. Dieses Verfahren erlaubt es auch, zwischen freien SH- und Disulfid-Peptiden zu unterscheiden. In der Tat, werden durch Auslassen des Reduktionsschritts mit der vorliegenden Erfindung nur Peptide isoliert, welche ein freies SH tragen, während S-S-Peptide nicht isoliert werden. Falls jedoch das Protein- oder Peptid- Gemisch vor dem primären Durchlauf des Sortierprozesses reduziert wird, wird dann die Summe der SH- und S-S-Peptide sortiert.
  • Beispiel 3: Spezifische chemische Veränderung der Summe von Methionin- und Cystein-Resten
  • Das Vorgehen ist identisch zu dem Vorgehen zum spezifischen Verändern von Cystein-Resten (siehe Beispiel 2) mit der Ausnahme, dass der Vor-Oxidations-Schritt der Methionin-Reste ausgelassen wird. Die Reaktionssequenz beginnt mit der Reduktion eines Proteingemischs mit Tributylphosphin, gefolgt durch enzymatische oder chemische Spaltung. Das Protein-Peptid-Gemisch wird durch RP-HPLC getrennt, und jede Fraktion wird durch Reaktion mit Acrylamid verändert, unmittelbar gefolgt durch Oxidation mit H2O2. Die Methionin-Peptide werden nun zusammen mit den veränderten Cystein-Peptiden oxidiert, und beide Arten gekennzeichneter Peptide zeigen eine hydrophile Verschiebung, wenn sie chromatographisch unter Verwendung ähnlicher Bedingungen wie in dem primären Durchlauf getrennt werden. 5 fasst die verschiedenen Reaktionssequenzen in den Met-, Cys- und Met + Cys-Sortiermoden zusammen.
  • Beispiel 4: Spezifische Veränderung von Phosphoserin- und Phosphothreonin-Peptiden
  • Ein Protein-Peptid-Gemisch wird wie hier schon vorher beschrieben erzeugt, und eine Klasse co- oder post-translational modifizierter Peptide wird spezifisch isoliert. Hier wird ein Beispiel für eine Strategie zum Isolieren von Phosphoserin- und Phosphothreonin-enthaltenden Peptiden bereitgestellt. Phosphoserin- und Phosphothreonin-enthaltende Peptide werden in ihre Dehydroalanin- und Dehydroamino-2-buttersäure-Derivate durch alkalische β-Eliminierung der Phosphatanteile umgewandelt. Michael-Hinzufügung von Ethanthiol wandelt ersteres in das S-Ethylcystein-Derivat um und letzteres in das β-Methyl-S-ethylcystein-Derivat (Weckwerth et al., 2000). Diese Thioether-enthaltenden Aminosäure-Derivate werden in ihre entsprechenden Sulfoxidformen umgewandelt, folgend der Reaktion mit H2O2, welche ähnlich zur Oxidation der Methioninreste ist. Um ein Mischen mit Methionin-Peptiden zu vermeiden, und um auch eine β-Eliminierung an den Cysteinen während der alkalischen Behandlung zu vermeiden, wird das Proteingemisch zunächst mit Perameisensäure oxidiert, gemäß Hirs (1956). Dieser Schritt wandelt Methionin in die Disulfon- Form um, und Cystein-Reste in Cysteinsäure. Nach Dialyse gegen destilliertes Wasser wird das Proteingemisch mit Trypsin in 50 mM Ammoniumbicarbonat bei 37°C über Nacht bei einem Verhältnis von Trypsin/Gesamtprotein von 1:100 verdaut. Dem Trypsin enthaltenden Verdauungsmittel bzw. Aufschlussprodukt (10 μl) wird 50 μl eines 2:2:1:0,65-Gemisches von H2=/DMSO/EtOH/5 M NaOH hinzugefügt, und 60 μl Ethanthiol werden hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wird für 3 Stunden auf 50°C erwärmt und durch Hinzufügen von 60 μl einer 20%igen Essigsäure und 10 μl Acetonitril abgeschreckt. Das Protein-Peptid-Gemisch wird durch Umkehrphasen-Chromatographie (Durchlauf 1) in eine solchen Zahl von Fraktionen getrennt, dass es die Trennung gekennzeichneter Peptide von nicht veränderten Peptiden in jeder der aufgesammelten Fraktionen in Durchlauf 2 erlauben wird. In jeder Fraktion sind die Peptide mit H2O2 oxidiert. Da Methionin und Cystein in dem früheren Oxidationsschritt oxidiert worden sind, werden nun S-Ethylcystein und β-Methyl-S-ethylcystein in ihre Sulfoxid-Derivate oxidiert (siehe Reaktionsgleichungen iii und iv). Diese Sulfoxid-Derivate sind bedeutend hydrophiler. Jede Fraktion wird an eine RP-HPLC-Säule geladen, und durch Verwendung identischer oder ähnlicher chromatographischer Bedingungen wie in Durchlauf 2 werden die gekennzeichneten Peptide (S-Ethylcystein-Sulfoxid und β-Methyl-S-ethylcystein-Sulfoxide, welche entsprechend die Phosphoserin- und Phosphothreonin-enthaltenen Peptide repräsentieren) von den nicht veränderten Peptiden getrennt. Die gekennzeichneten Peptide werden im Folgenden an ein Analysegerät, wie beispielsweise ein Massenspektrometer, weitergereicht, um die korrespondierenden gekennzeichneten Peptide und ihr phosphorylisiertes Protein zu identifizieren. Zusätzlich erlaubt es ein Neutralverlust-Scan von RSOH (hier ist R = Ethyl) (78 amu) während der massenspektrometrischen Analyse eine weitere Verifizierung der Authentizität beider Arten gekennzeichneter Peptide (Stehen und Mann, 2000). Letzteres bedeutet, dass eine interne Steuerung für die Authentizität von S-Ethylcystein-Sulfoxid bzw. β-Methyl-S-ethylcystein-Sulfoxid besteht, welche entsprechend die Phosphoserin- und Phosphothreonin-enthaltenden Peptide repräsentiert, und zwar aufgrund der beobachteten Neutralverluste, die der Messung der gekennzeichneten Peptide durch Massenspektrometrie folgen.
  • Es ist interessant zu bemerken, dass die alkalische β-Eliminierungs-Reaktion auch unter milderen alkalischen Bedingungen durchgeführt werden kann, und zwar unter Verwendung von 0,5 M LiOH bei 4°C, dadurch das H2O/DMSO/EtOH/5 M NaOH-Gemisch, das oben angegeben ist, ersetzend (Sakaguchi et al., 2001).
  • Figure 00830001
  • Ein alternatives Phosphopeptid-Sortiersystem nutzt den hydrophoben Unterschied zwischen phosphorylierten und dephosphorylierten Peptiden durch Umkehrphasen-Chromatographie bei pH 5,0. Das weiter unten ausgeführte Vorgehen ist bei Beispiel für solch einen Ansatz. Ein Protein-Peptid-Gemisch wird wie vorher beschrieben erzeugt. In dieser Mischung vorhandene Peptide werden nun durch RP-HPLC unter Verwendung von 10 mM NH4Ac, pH 5,0/Acetonitril (oder NH4Ac/Methanol oder anderen) als eluierendem Lösungsmittel getrennt und in 1 min-Fraktionen gesammelt. In diesen Fraktionen vorhandene Peptide werden mit einer allgemeinen Phosphatase behandelt (wie beispielsweise einer alkalischen Phosphatase). Die dephosphorylierten Peptide sind weniger hydrophob als ihre phosphorylierten Zwischenprodukte und werden daher einer hydrophoben Verschiebung während einer sekundären chromatographischen Trennung unter identischen oder im wesentlichen ähnlichen chromatographischen Bedingungen wie in Durchlauf 1 unterzogen, und dies erlaubt ihr Sortieren. Es ist wichtig zu bemerken, dass die hydrophobe Verschiebung wichtiger bei pH 5,0 ist als bei niedrigeren pH-Werten, was die Verwendung der 0,1%igen TFA- oder 0,1%igen HCOOH-Systeme in dem Sortierprozess weniger attraktiv macht.
  • Eine interessante Option ist die Verwendung von Trennungssystemen, welche besonders zur Trennung von Phosphoryl-enthaltenen Verbindungen bzw. Verbünden angepasst sind. Solch ein System könnte beispielsweise aus dem absobosphärischen Nukleotid-Nucleosid-Material (Alltech) bestehen, kombiniert mit 60 nM NH4H2PO4 und 5 mM Tetrabutylammoniumphosphat, pH 5,0, als Lösungsmittel A und Methanol (5 mM Tetrabutylammoniumphosphat) als Lösungsmittel B.
  • Ein anderer Weg zum Sortieren von Phospopeptiden unter Verwendung einer Dephosphorylierungsmethode basiert auf dem Verlust der negativ geladenen Phosphoryl-Gruppe. In diesem Fall werden die Durchläufe 1 und 2 entweder an Ionenaustausch-Säulen oder durch elektrophoretische Mittel durchgeführt. Wenn beispielsweise die Durchläufe 1 und 2 an einer Mono-Q-Säule oder einer DEAE-Säule bei pH 6,0 durchgeführt werden, werden alle dephosphorylierten Peptidarten eine Vorwärtsverschiebung zeigen, weil sie weniger stark an den Anionenaustauscher gebunden sind. Ein ähnlicher Effekt mag durch die Verwendung von Kapillar-Elektrophorese erreicht werden, wenn die dephosphorylierten Peptidarten eine Anodenverschiebung zeigen, was wiederum zu dem Sortiervorgang führt.
  • Es ist wichtig zu betonen, dass jegliches Sortiervorgehen, das auf einem Dephosphorylierungsschritt beruht, welcher entweder durch enzymatische (beispielsweise allgemeine oder spezifische Phosphatasen) oder chemische (beispielsweise β-Eliminierung in alkalischen Bedingungen) Mittel durchgeführt werden kann, die Möglichkeit bereitstellt, eine Mehrzahl phosphorylierter Arten auszuwählen.
  • Noch ein weiteres Verfahren zum Sortieren von Phosphopeptides beruht auf der Bildung eines nicht-kovalenten Komplexes zwischen Phosphopeptiden und Fe3+-Chelaten. Eine Protein-Peptid-Mischung wird wie vorher beschrieben erzeugt. In diesem Gemisch vorhandene Peptide werden in Durchlauf 1 durch RP-HPLC unter Verwendung von 10 mM NH4Ac, pH 5,0/Acetonitril (oder NH4Ac/Methanol oder anderem) als Eluiermittel getrennt, und in 1-minütigen Zeitabständen gesammelt. In jeder dieser Fraktionen vorhandene Peptide werden im Durchlauf 2 über die gleiche chromatographische Säule getrennt, aber nun in Lösungsmitteln, die Iminodiacetat und Fe3+ enthalten, wodurch ein Dichelat-Komplex mit Phosphopeptiden gebildet wird. Dieser Komplex eluiert an einer unterschiedlichen Position im Vergleich zu derjenigen der freien Phosphopeptide und erlaubt eine Isolierung der Phosphopeptide. Diese unterschiedliche Chromatographie bildet wiederum eine Plattform für ein effizientes Sortiervorgehen.
  • Beispiel 5: Auswahl von ε-N-acetylierten Peptiden
  • Acetylierung einer bestimmten Zahl von Lysin-ε-Aminogruppen der nukleosomen Histone H2A, H2B, H3 und H4 und möglicherweise anderer Faktoren modifiziert die Chromatinstruktur und führt zu einem Anstieg der Transkriptionsaktivität. Veränderungen in dem Grad der Acetylierung werden wahrscheinlich mit zellularer Wucherung in Verbindung gebracht und könnte Apoptose, Nekrose oder mehrere andere pathologische Situationen anzeigen. Zusätzlich zum Acetylierungsstatus kann jetzt schon in einem sehr früheren Stadium zwischen normalen und neoplastischen Zellen (z.B. in Brustkrebs) unterschieden werden. Auch hier wiederum kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um die acetylierten Peptide selektiv zu sortieren, beispielsweise unter Verwendung einer Deacetylierung als dem Verschiebungsprinzip für das Peptidsortieren. Ein Beispiel einer solchen Strategie wird weiter unten als ein Illustrationsbeispiel bereitgestellt. Ein Protein-Peptid-Gemisch aus einem nuklearen Extrakt wird durch Trypsinteilung der isolierten Proteine erzeugt. Trypsin spaltet bei Arg und Lys, aber nicht an der acetylierten Lysin-Seitenkette. Das erhaltene Peptidgemisch wird in Durchlauf 1 durch RP-HPLC unter Verwendung von 0,1% TFA als Lösungsmittel A und 0,09% TFA in 70% Acetonitril als Lösungsmittel B getrennt, und zwar mit einem ansteigenden Gradienten von 1% Lösungsmittel B/min und einem Durchsatz von 80 μl/min (Säule 2,1 mm innerer Durchmesser und 250 mm Länge). Eluierende Peptide werden in 1-minütigen Intervallen aufgesammelt. Jede Fraktion wird getrocknet, in einer geeigneten Pufferlösung rückaufgelöst und mit einer Histon-Deacetylase (HDA) behandelt, beispielsweise ganze oder teilweise gereinigte Präparationen der Hefe-Rpd3 (Klasse I), der Hefe HDA1 (Klasse II) oder der NAD+-abhängigen Sir2-Klassenproteine (für einen Überblick siehe Furumai et al., 2001). Aufgrund der Acetylierung werden die Peptide hydrophiler und eluieren bei niedrigeren Acetonitril-Konzentrationen. Aufgrund dieses Unterschieds in der Hydrophilizität und durch Anwenden der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die deacetylierten Peptide (gekennzeichnete Peptide) von den unveränderten Peptiden während des sekundären Durchlaufs zu trennen. Die Verschiebung in der Elution ist vergleichbar mit den für die Veränderung von Methionin zu Methioninsulfoxid-Peptiden gemessenen Verschiebungen. Die Natur jedes der gekennzeichneten Peptide und ihrer korrespondierenden Proteine wird beispielsweise durch Verwendung von MS/MS oder sehr genauer Bestim mung der Masse jeder der gekennzeichneten Peptide bestimmt. Dies erlaubt die Identifizierung der Proteine in dem ursprünglichen Proteingemisch.
  • Um den Unterschied in ε-N-acetylierten Peptiden zwischen zwei Proben (z.B. unterschiedlichen Zelltypen) quantitativ zu bestimmen, werden Protein-Peptid-Gemische durch Trypsin-Verdauung entweder in H2 16O (Probe 1) oder H2 18O (Probe 2) erzeugt. Beide Protein-Peptid-Gemische werden vor dem primären Durchlauf gemischt und weiter wie oben beschrieben zusammenverarbeitet. Ein gekennzeichnetes Peptid aus jedem beliebigen bzw. zufälligen Protein X in Probe 1 ko-eluiert in dem sekundären Durchlauf mit dem gleichen gekennzeichneten Peptid von dem gleichen Protein X in Probe 2. Weil die gekennzeichneten Peptide aus Probe 1 bzw. Probe 2 16O und 18O tragen, treten sie als Doppelspitzen in einer massenspektrometrischen Analyse auf. Die Peakintensität oder -oberfläche wird berechnet, und das Verhältnis der gekennzeichneten Peptide, die zweimal 16O tragen, gegen die zweimal 18O tragenden gekennzeichneten Peptide, ist proportional zum Grad der Acetylierung dieses Peptids in beiden verglichenen Proben.
  • Beispiel 6a: Auswahl von NH2-terminalen Peptiden, welche aus in vivo NH2-terminal blockierten Proteinen abgeleitet sind
  • Eine weitere Anwendung der vorliegenden Erfindung ist die Isolierung einer Teilmenge von Peptiden, welche aus NH2-terminal blockieren Proteinen abgeleitet werden. Die meisten von diesen mögen acetylierte Peptide (Eukaryonten) oder formylierte Peptide (Prokaryonten) sein. Um in der Lage zu sein, nur NH2-terminal blockierte Peptide auszuwählen und um einen Verlust von Amino-terminal blockieren Peptiden, die einen Lysinrest umfassen, zu vermeiden, werden die Proteine enthaltenen Proben vorbehandelt. Bei einem Ansatz wird die Probe zuerst mit O-Methylisoharnstoff bei pH 10 guanidinisiert, wodurch Lysin-Seitenketten in ihre Guanidin-Derivate umgewandelt werden. α-Aminogruppen reagieren viel langsamer mit diesem Reagens als es ε-Aminogruppen tun (Plapp et al., 1971) und werden daher nicht oder nur in geringem Umfang in ihre Guanidin(ium)-Derivate umgewandelt.
  • Erfindungsgemäß werden die Proteine im folgenden einem Trypsin-Verdauungsmittel ausgesetzt. Trypsin spaltet sowohl Arginin als auch Homoarginin, wenn auch mit einer langsa meren Rate (letzteres wird aus den guanidinisierten Lysinen abgeleitet), und das Verdauungsmittel erzeugt daher eine freie α-Aminogruppe in jedem erzeugten Peptid, außer in solchen, die eine blockierte Protein-Aminoendgruppe enthalten. Das Protein-Peptid-Gemisch wird nun an eine Umkehrphasen-Säule übergeben und in eine solche Zahl von Fraktionen getrennt, dass die Trennung veränderter Peptide von nicht veränderten Peptiden während des sekundären Durchlaufs in jeder der gesammelten Fraktionen möglich ist. Jeder Fraktion wird beispielsweise Phenylisocyanat (PIC) hinzugefügt, welches mit den freien NH2-Gruppen der Peptide reagiert. Als ein Ergebnis erlangen alle Peptide mit einer freien NH2-Gruppe eine Phenylcarbamoyl-(PC-)Gruppe, was das Peptid hydrophober macht (6). Die aus den NH2-terminal blockierten Proteinen abgeleiteten Peptide werden nicht verändert. Das Peptidgemisch wird an eine RP-HPLC-Säule geladen und unter Verwendung ähnlicher oder identischer chromatographischer Bedingungen wie in Durchlauf 1 werden die veränderten Peptide von den nicht veränderten Identifizierungspeptiden (d.h., den Amino-terminal blockierten Peptiden) getrennt. Daher wird in diesem Beispiel die Mehrheit der Peptide verändert und verzögert (hydrophobe Verschiebung), während die Teilmenge der nicht veränderten Peptide an einer unveränderten Position während der sekundären Durchläufe eluiert. Dies wird das "Umkehrsortiervorgehen" genannt.
  • Das Ausmaß der hydrophoben Verschiebungen kann verändert werden durch Ändern der chemischen Natur der NH2-endständig bzw. -terminal reagierenden Derivate. Bekannte Verfahren beschreiben eine Vielzahl von Isocyanat-(IC)-Veränderungsreaktionen, welche als eine Alternative zu PIC in dem in diesem Kapitel beschriebenen Sortierprozess verwendet werden können. Beispielsweise können auch Reaktionen mit Trifluoracetyl-IC, Allyl-IC, Naphthalin-IC, Fluorescein-IC, usw. verwendet werden. Die hydrophobe Verschiebung von Peptiden mit einer freien α-NH2-Gruppe kann auch durch jede andere quantitative Veränderungsreaktion erreicht werden, welche für α-NH2-Gruppen spezifisch ist. Die Liste der Reagenzien umfasst beispielsweise Acetyl-N-hydroxysuccinimid und alle acylierenden Reagenzien, F-moc-N-Hydroxysuccinimid, Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) oder Nicotinol(oxy)succinimid. Bei der letzten Wahl von Reagenzien und Bedingungen sollte es klar sein, dass die Veränderungsreaktion nur auf die α-NH2-Gruppen beschränkt ist und mindestens 90% verändern sollte, vorzugsweise 95%, noch bevorzugter 99% und am meisten bevorzugt einen sogar noch höheren Prozentsatz der Peptide mit einer freien NH2-Gruppe.
  • Beispiel 6b: Auswahl von NH2-terminalen Peptiden, abgeleitet von Proteinen mit einer freien NH2-Endgruppe
  • Dieses Beispiel zeigt, wie NH2-endständige bzw. -terminale Peptide, die von Proteinen mit einer freien NH2-Endgruppe, die in einem Protein-Peptid-Gemisch vorhanden sind, abgeleitet sind, sortiert werden können. Ein besonderer Vorteil dieses Verfahrens verlässt sich auf die Tatsache, dass die gekennzeichneten Peptide mit einer Sulfonsäuregruppe erlangt werden können, welche an ihrer NH2-Endgruppe befestigt ist, welche ideal für einen hohen Durchsatz bei MALDI-PSD-Analyse geeignet ist (T. Keough et al. (1999)). Die Proteine enthaltene Probe wird zuerst mit Tributylphosphin behandelt, gefolgt von Iodacetamid in Protein-denaturierenden Puffern. Dieser Schritt führt zu einer Derivatisierung von Cystein-Seitenketten und wird unmittelbar durch die Guanidierungsreaktion gefolgt, welche Lysine in Homoarginine umwandelt. Die α-NH2-Gruppen werden dann mit einem Isothiocyanat-Derivat blockiert, wie beispielsweise Phenylisothiocyanat (PITC) oder den gut bekannten löslichen Braunitzer-Reagens (1,5-Disulfonylnaphthalin-3-isothiocyanat). Daher sind die nun in dem Gemisch vorhandenen Proteine an ihren SH-Gruppen (als den Acetamid-Derivaten), ihren ε-NH2-Gruppen (als Homoarginine) und ihren α-NH2-Gruppen (als ihre Thiocarbamoyl-Derivate) derivatisiert worden. Folgende Spaltung mit Trypsin erzeugt nun einen neuen Satz freier α-NH2-Gruppen an jeder neuen Teilungsstelle. Diese kann effizient durch Reaktion mit Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) blockiert werden. Die finale vorbehandelte Protein-Peptid-Mischung umfasst nun vier Arten von NH2-endständig blockierten Peptiden. Zuerst Peptide, die aus in vivo-blockierten Proteinen abgeleitet wurden: entweder α-NH2-acetylisierte (Eukaryonten-) oder formylierte (Prokaryonten-)Peptide, zweitens Peptide, die mit TNBS blockiert wurden, drittens Peptide, die durch Pyroglutaminsäure blockiert wurden und welche spontan nach der Trypsin-Spaltung vor einem Glutaminrest usw. erzeugt sein könnten und viertens Peptide, die durch ein Thiocarbamoyl-(TC-)Derivat blockiert wurden. Letzteres repräsentiert die Teilmenge von Peptiden, welche den Protein-Amino-endständigen Peptiden entspricht. Von den vier Arten von NH2-endständig blockierten Peptiden sind nur die TC-Peptide dafür bekannt, empfindlich auf eine Säurebehandlung zu sein und werden den NH2-endständigen Rest gemäß der gut bekannten Edman-Chemie verlieren. Daher entfernt eine Behandlung des Peptidgemischs mit konzentrierter TFA die erste Aminosäure der TC-Peptide, wodurch eine neue freie NH2-Endgruppe erzeugt wird. Zu diesem Moment wird das Peptidgemisch in Durchlauf 1 getrennt und in einer solchen Zahl von Fraktionen gesammelt, dass es in jedem der gesammelten Fraktionen die Trennung der veränderten Peptide von den nicht veränderten Peptiden während des sekundären Durchlaufs erlaubt. Jeder Fraktion wird ein NH2-spezifisches Reagens hinzugefügt, welches selektiv die Teilmenge der Peptide mit freien NH2-Gruppen verändert. So ein Reagens kann entweder TNBS oder eine acetylierende Verbindung sein, was zu hydrophoberen Peptiden fuhrt. In einer besonderen Ausführungsform kann dieses Reagens jedoch aus der durch T. Keough et al., 1999 entwickelten Chemie bestehen oder aus analogen Verbindungen, welche die Peptide mit einer Sulfonsäure-Einheit oder einem Sulfonsäure-Rest an der α-NH2-Gruppe verändern. Diese gekennzeichneten Peptide können wiederum selektiv unter Verwendung von RP-Chromatographie- oder Ionenaustausch-Chromatographie-Abläufen sortiert werden, die erfindungsgemäß durchgeführt werden. Ein wichtiger Aspekt von Peptiden, die eine NH2-endständige Sulfonsäuregruppe tragen, ist ihre besondere Fragmentierung unter Bedingungen, welche gegenwärtig in dem MALDI-TOF-MS-Modus verwendet werden, was eine sehr schnelle und einfache Ableitung der Aminosäuresequenz erlaubt, wodurch der Weg für eine effiziente MALDI-basierte Analyse mit hohem Durchsatz und eine Identifikation der sortierten Peptide eröffnet wird.
  • Ein Beispiel der aufeinanderfolgenden chemischen oder enzymatischen Schritte, die zu der Sortierung der einfach sequenzierbaren Peptide führen, die aus Proteinen mit einer freien NH2-Endgruppe abgeleitet sind, ist weiter unten zusammengefasst:
    Schritt 1: Reduktion, gefolgt durch Reaktion mit Iodacetamid
    Schritt 2: Umwandlung von Lysin-Seitenketten in Homoarginin
    Schritt 3: Umwandlung freier α-NH2-Gruppen in Thiocarbamoyl-Derivate
    Schritt 4: Fälle modifizierte Proteine aus oder reinige durch Gelfiltration
    Schritt 5: Spalte mit Trypsin
    Schritt 6: Modifiziere Peptide mit Trinitrobenzolsulfonat
    Schritt 7: Behandle mit konzentriertem TFA
    Schritt 8: Verdünne mit Wasser und trenne das Protein-Peptid-Gemisch im primären Durchlauf
    Schritt 9: Verändere die Peptide jeder Fraktion mit einem NH2-terminal blockierenden Reagens, vorzugsweise mittels Sulfoacetylierung
    Schritt 10: Sortiere die gekennzeichneten Peptide in dem sekundären Durchlauf
    Schritt 11: Analysiere gekennzeichnete Peptide durch MALDI-PSD oder ESI-CID oder MALDI-CID
    Schritt 12: Identifiziere Peptide auf der Grundlage der durch eine Serie von y-Ionen erzeugten Sequenz
  • Dieses Vorgehen mag insbesondere angepasst werden, um eine interne Spaltung von Proteinen (Beispiel 8) zu untersuchen, da diese unweigerlich zu neuen NH2-Endgruppen führt, welche im allgemeinen keine bekannte Blockierungsgruppe tragen. Es ist auch betonenswert, dass dieser Sortierprozess wiederum ein direkter Ansatz ist, welcher eine positive Auswahl sulfoacetylierter Peptide durchführt, wodurch eine Kontamination mit nicht veränderten Peptiden vermieden oder minimiert wird, sogar wenn die Sulfoacetylierungsreaktion (hier die Veränderungsreaktion) nicht bis zu ihrem Abschluss durchgeführt worden ist.
  • Beispiel 7: Auswahl der NH2-endständigen Peptide, die aus Proteinen abgeleitet wurden, die in einem komplexen Proteingemisch vorhanden sind
  • Die Technologie, in welcher ein Protein eines komplexen Gemisches, wie beispielsweise eines Zelllysats, durch ein Identifizierungspeptid (das NH2-endständige Peptid) repräsentiert wird, wird weiter unten als individuelle Peptidmassen-basierte Proteomik (IPMBP, siehe Beispiel 10) bezeichnet. Der Ablauf beginnt mit der Umwandlung der Protein-Cysteine mit Iodacetamid oder ähnlichen SH-spezifischen Reagenzmitteln, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Dann ist es den Proteinen erlaubt, mit O-Methylisoharnstoff zu reagieren, wodurch die ε-Lysine in ihre Guanidinium-Derivate (Homoarginin) umgewandelt werden. Es ist wichtig, festzustellen, dass die ε-NH2-Gruppen verändert werden, während die α-NH2-Gruppen der Proteine nicht unter den verwendeten Reaktionsbedingungen verändert werden. In einem nächsten Schritt werden die Proteine acetyliert, beispielsweise mit Acetyl-N-hydroxysuccinimid. In einem nächsten Schritt wird ein Protein-Peptid-Gemisch beispielsweise durch Trypsin-Spaltung erzeugt, und dieses Protein-Peptid-Gemisch wird in einem primären chromatographischen Schritt getrennt. Jeder Fraktion wird Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) hinzugefügt, welche quantitativ mit den freien NH2-Gruppen an den Peptiden reagiert. Es ist wichtig, anzumerken, dass die aus der Amino-Endgruppe eines Proteins abgeleiteten Peptide nicht mit diesem Reagens reagieren können, weil die NH2-Gruppe dieser Peptide vorher durch eine Acetyl-Gruppe blockiert worden ist. Die Peptide mit einer freien NH2-Gruppe erhalten eine Trinitrobenzol-Gruppe (TNB), wodurch diese Peptide hydrophober werden. Wenn so die Peptide aus jeder Fraktion an einem RP-HPLC-Säulen-Durchlauf unter gleichen chromatographischen Bedingungen wie während Durchlauf 1 getrennt werden, werden die veränderten TNB-enthaltenen Peptide von den nicht veränderten Identifizierungspeptiden (d.h., allen Amino-endständig blockierten Peptiden) getrennt. In dieser Aufstellung werden die isolierten nicht veränderten Identifizierungspeptide von den Amino-Endgruppen der Proteine abgeleitet und werden eine NH2-endständige Acetylgruppe enthalten (z.B., wenn eukaryontische Zellextrakte verwendet werden).
  • Bei einem anderen Verfahren wird das Proteingemisch durch Umwandeln der Protein-Cysteine in ihre Carboxamid-Derivate umgewandelt. In dem nächsten Schritt werden die Proteine mit dem Acetyl-N-hydroxysuccinimid acetyliert, und zwar sowohl an ihren ε-NH2- als auch an ihren α-NH2-Gruppen. Dann wird ein Protein-Peptid-Gemisch durch Spaltung mit Trypsin erzeugt. Da alle Lysin-Seitenketten vorher acetyliert worden sind, geschieht die Spaltung durch Trypsin vornehmlich an der COOH-Endgruppe von Arginin. Alle zusätzlichen Schritte, einschließlich des Peptidsortiervorgangs, werden wie oben beschrieben durchgeführt. Dies führt zu der Isolierung der Amino-endständigen Peptide aller in dem Gemisch vorhandenen Proteine. Sie werden als nicht veränderte Identifizierungspeptide sortiert.
  • Bei einem alternativen Ansatz werden die Proteine mit einer äquimolaren Mischung von Acetyl- und Trideuteroacetyl-N-hydroxysuccinimid acetyliert, was zu einer unterschiedlichen Isotopenmarkierung der Protein-freien α-NH2-Endgruppen führt. In einem nächsten Schritt wird das Proteingemisch mit Trypsin verdaut, und das Protein-Peptid-Gemisch wird an eine Umkehrphasen-Säule weitergereicht und in eine solche Zahl von Fraktionen getrennt, dass eine Trennung der veränderten Peptide von den nicht veränderten Peptiden während Durchlauf 2 in jeder der gesammelten Fraktionen möglich ist. Jeder Fraktion wird Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) hinzugefügt, welche quantitativ mit den freien NH2-Gruppen an den Peptiden reagiert. Wenn so wiederum die Peptide aus jeder Fraktion durch einen RP-HPLC-Säulenlauf unter gleichen chromatographischen Bedingungen wie in Durchlauf 1 getrennt werden, werden die veränderten TNB-enthaltenen Peptide von den nicht veränderten Identifizierungspeptiden getrennt. Bei diesem Aufbau tragen Peptide, welche von Proteinen abgeleitet wurden, welche bereits in vivo blockiert worden sind, die CH3-CO-Gruppe, während Peptide, die von Proteinen mit einer freien α-NH2-Gruppe (wel che im Laufe der Durchführung verändert wurde) abgeleitet wurden, nun mit dem doppeltmarkierten CH3-CO/CD3-CO-Teil gekennzeichnet sind. Die nicht veränderten Identifizierungspeptide aus jeder Fraktion werden an ein Massenspektrometer weitergeleitet, um die Masse und Sequenz jedes individuellen Peptids zu bestimmen. Wichtigerweise erlaubt diese Analyse simultan die Unterscheidung zwischen Peptiden, welche bereits von in vivo blockierten Proteinen abgeleitet wurden, und Peptiden, die von Proteinen mit einer freien α-NH2-Gruppe abgeleitet wurden, weil letztere Gruppe von Peptiden als Dubletts auftreten (getrennt durch 3 amu).
  • Alternativ wird TNBS bei dem Vorgang durch Phenylisocyanat (PIC) oder ähnliche Verbindungen ersetzt, welche freie NH2-Gruppen blockieren können. Für den Fall von NH2-endständig formylierten Peptiden wird das gleiche Sortiervorgehen durchgeführt. Daher werden formylierte Peptide zusammen mit den Peptiden sortiert, welche mit den doppelten CH3-CO/CD3-Markierungen (siehe oben) gekennzeichnet worden sind. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass unser Sortierverfahren auch Peptide sortiert, welche Pyroglutaminsäure an ihren NH2-Endgruppen führen. Solche Peptide können im Laufe der enzymatischen Spaltung gebildet werden, wenn NH2-endständiges Glutamin erzeugt wird. Massenspektrometrie, in welcher eine Peptidfragmentierung verwendet wird, kann zwischen einem NH2-endständigen Acetyl und Pyroglutamat unterscheiden, was es erlaubt, zwischen dem NH2-endständigen Peptid und jedem intern erzeugten Peptid zu unterscheiden.
  • Beispiel 8: Identifizierung von intern proteolytisch verarbeiteten Proteinen in Gesamtzelllysaten und Lokalisierung der Verarbeitungsstellen unter Verwendung der Erfindung
  • Oft werden Proteine intern aufgrund der Aktion spezifischer Proteasen gespalten. Dieses Phänomen wird beispielsweise zu Beginn einer Apoptose aufgrund der Aktivierung von Caspasen beobachtet. Interne Proteinverarbeitung mag auch ein wichtiger Schritt während einer normalen Zellentwicklung sein, und solche Prozesse können eine wichtige physiologische Rolle spielen. Zusätzlich ist eine Proteinspaltung in dem Vorläufer-Molekül ein Vorgang, der zur Reifung eines Proteins führt. Ein Erkennen dieser Prozesse bildet ein fundamentales Element in der modernen Proteomik. Unsere Erfindung erlaubt die Identifikation sowohl der Natur des verarbeiteten Proteins als auch der Stelle des Verarbeitungsortes. Ein typisches, aber nicht beschränkendes, experimentelles Protokoll wird weiter unten beschrie ben. Als Erstes werden aus einem Gesamtzelllysat abgeleitete Proteine mit Tributylphosphin reduziert, und die SH-Gruppen werden mit Iodacetat blockiert. Diese Reaktion wird unter denaturierenden Konzentrationen von Guanidinium-HCl (6 M) bei pH 8,6 durchgeführt. Es wird empfohlen, Harnstoff-enthaltende Puffer nicht für die Umkehrsortiermethoden zu verwenden (also Methoden, in welchen die unveränderten Peptide als Identifizierungspeptide ausgewählt werden). In der Tat kann ein längerer Kontakt mit Harnstoff zu einer Peptid-Carbamylierung führen, und solche Peptide würden auch als ungewünschte Produkte aussortiert. In diesem Stadium werden Überschüsse an Reagenzmittel und Pufferstoffen durch Ausfällung in vier Volumen Ethanol bei –20°C über Nacht entfernt. Die Proteinausfällung wird durch Zentrifugieren wiedergewonnen und erneut in einem kleinen Volumen von 6 M Guanidinium in Phosphatpuffer mit pH 8,5 aufgelöst. Alternativ können Reagenzien und Puffer durch einen Gelfiltrationsschritt in 6 M Guanidinium-HCl in Phosphatpuffer bei pH 8,5 entfernt werden. Die Acetyl- oder Nicotinol-N-hydroxysuccinimid-Ester werden hinzugefügt, um die freien NH2-Gruppen in ihre korrespondierenden Acetyl- oder Nicotinol-Derivate umzuwandeln. Alternativ, wie in Beispiel 7, wird eine 1:1-Mischung der Acetyl- und Trideuteroacetyl-Derivate verwendet. In diesem zweiten Beispiel wird eine 1/1-Mischung von H4- und D4-Formen der Nicotinol-Derivate verwendet (M. Munchbach et al. (2000)). Die Acetylierungsreaktion wird durch Hinzufügen von 1 M Überschuss von Tris-HCl pH 8,5 über das Acetylierungsreagens gestoppt, auf 1 M Guanidinium-HCl verdünnt oder gegen 0,5% NH4HCO3 dialysiert, und dann mit Trypsin verdaut. Die sich ergebenden Peptide werden der primären chromatographischen Trennung unterworfen. Jede Fraktion wird dann mit einem Reagenzmittel behandelt, welches quantitativ mit den neu erzeugten freien Peptid-α-NH2-Gruppen reagiert (z.B. Trinitrobenzolsulfonat, Acetyl-N-succinimid-Ester, Phenylisocyanat usw.). Ein Wiederdurchlaufen dieser behandelten Fraktionen in einem sekundären Durchlauf transferiert nun alle Peptide, welche in dem letzten Reaktionsschritt regiert haben, in Richtung hydrophoberer Positionen, während alle Peptide, welche bereits in vivo blockiert waren oder welche NH2-endständig mittels der Vorbehandlung vor dem primären Durchlauf blockiert waren oder Peptide mit NH2-endständiger Pyrrolidoncarbonsäure als nicht veränderte Identifizierungspeptide in der gleichen Position wiedergewonnen werden, bei der sie während des primären Durchlaufs eluierten. Durch Vergleichen der Peptidmuster des Proteinlysats aus zwei unterschiedlichen Proben ist es möglich, Peptide zu identifizieren, welche sich aus den neu erzeugten NH2-Endgruppen ableiten, welche für sowohl die Natur des verarbeiteten Proteins als auch den genauen Spaltungsort informativ sind. Das oben dargestellte Experiment kann auf mehreren Wegen variiert werden, wobei es immer noch das allgemeine Prinzip des Sortierens von Identifizierungspeptiden beibehält. Beispielsweise werden nach Umwandeln der Proteine mit SH-reagierenden und NH2-reagierenden Verbindungen die Proteine mit Trypsin in H2 16O (Probe 1) und H2 18O (Probe 2) verdaut. Mit diesem Experiment kann eine differenzielle Quantifizierung des Ausmaßes der Proteinverarbeitung zwischen zwei Proben untersucht werden. Daher werden nach der Trypsinspaltung Probe 1 und Probe 2 in gleichen Verhältnissen kombiniert, und das Gemisch wird in einem primären chromatographischen Durchlauf getrennt. Jede Fraktion wird dann mit einem Reagenzmittel behandelt, das mit den freien α-NH2-Gruppen reagiert (z.B. Trinitrobenzolsulfonat, Acetyl-N-succinimid-Ester, Phenylisocyanat usw.). Ein erneuter Durchlauf dieser behandelten Fraktionen in einem sekundären Durchlauf transferiert nun alle Peptide, welche in dem letzten Reaktionsschritt reagiert haben hin zu hydrophoberen Positionen, während alle Peptide, welche bereits in vivo blockiert waren oder welche NH2-endständig mittels der Vorbehandlung vor dem primären Durchlauf blockiert waren oder Peptide mit NH2-endständigen Pyrrolidoncarbonsäure als nicht veränderte Identifizierungspeptide in der gleichen Position wiedergewonnen werden, bei der sie während des primären Durchlaufs eluierten. Die leichten (16O) und schweren (18O) Peptide sind chemisch sehr ähnlich und jedes Peptidpaar trennt auf gleiche Art und ionisiert auch auf die gleiche Art. Während einer Massenspektrometrie trennen sich das leichte und schwere Peptid, weil das schwere Peptid einen Massenanstieg von 4 amu hat. Diese Trennung ist ausreichend, um die differenzielle Quantifizierung des Ausmaßes der Proteinverarbeitung in den zwei Proben genau zu messen.
  • Beispiel 9: Puffersysteme
  • Ein wichtiges Element der Erfindung ist die Wahl der Peptidtrennungsbedingungen in Bezug zu und integriert mit 1) den zur Veränderung der Peptide verwendeten Reaktionsbedingungen und 2) der Art des massenspektrometrischen Ansatzes, welcher verwendet wird, um die gekennzeichneten oder die Identifizierungs-Peptide zu analysieren und zu identifizieren. Um diesen Punkt zu illustrieren, werden im weiteren verschiedene Beispiele dafür beschrieben, wie Methionin-Peptide aus Protein-Peptid-Gemischen unter Berücksichtigung dieses Integritätsaspekts des Vorgehens ausgewählt werden. In einem Beispiel wird der primäre Durchlauf in dem TFA-Acetonitril-System durchgeführt, und der Oxidationsschritt wird in 1% TFA/H2O2 gemacht. Der sekundäre Durchlauf wird ebenfalls in dem TFA/Acetonitril-System durchgeführt, während die Peptidmassenmessungen mittels MALDI-TOF-MS oder mittels PSD-MALDI-RETOF-MS gemacht werden, welche nicht empfindlich auf Spuren von TFA sind (siehe unten). So wird in diesem Protokoll das Gegenion TFA vom Anfang des primären Systems bis zum vollständigen sekundären Durchlauf durch die Prozedur hindurch nicht verändert. Für den Fall, dass die Identifikation der gekennzeichneten Peptide oder Identifizierungspeptide mittels Elektrosprühionisation (ESI-MS) durchgeführt wird, wird dann das TFA-System nicht empfohlen, da TFA dafür bekannt ist, Ionencluster zu bilden, welche mit MS-Messungen interferieren (Mirza und Chait, 1994). Daher werden als ein zweites Beispiel nun sowohl der primäre als auch der sekundäre Durchlauf in einem HCOOH/Acetonitril-System durchgeführt, weil dieses System eine effiziente Ionisation mittels ESI erlaubt. Jedoch kann der zwischengeschaltete Oxidationsschritt, um die Sulfoxid-Methionin-Peptide zu erzeugen, nicht in der Anwesenheit von HCOOH durchgeführt werden, weil dies zur Bildung von Perameisensäure führt, und dadurch zur Umwandlung der Methionin-Seitenketten in die Sulfoxid- und Sulfonderivate. Daher wird der Oxidationsschritt hier in einer 1%igen TFA und 0,5% H2O2-Mischung durchgeführt. In diesem Fall ist die Natur der Gegenionen zwischen den zwei aufeinander folgenden chromatographischen Schritten und der Veränderung nicht die gleiche, was den Ionen-bindenden Effekt während des sekundären Durchlaufs möglicherweise beeinflusst. Hier ist der Störeffekt aufgrund der relativ niedrigen Konzentration von TFA nicht wichtig. Dies könnte ein Problem werden, wenn die TFA-Konzentration erhöht wird, oder wenn Gegenionen mit stärkeren Ionen-bindenden Effekten während des Veränderungsschritts verwendet werden. In Zusammenfassung wird es bevorzugt, die Natur der Pufferlösung durch die primären und zweiten Durchläufe hindurch, während des Veränderungsschritts und während der massenspektrometrischen Analyse unverändert zu lassen. Falls dies nicht gemacht werden kann, oder falls die Pufferlösungen in dem chromatographischen Prozess unterschiedlich von den in der Massenspektrometrie verwendeten Lösungsmitteln sind, könnte dann ein dritter chromatographischer Durchlauf durchgeführt werden.
  • Entlang dieser Linie mag es wichtig sein, die in dem Protein-Peptid-Gemisch vor Beginn des primären Durchlaufs vorhandenen Pufferionen zu berücksichtigen. Idealerweise sollten die in dem Protein-Peptid-Gemisch vorhandenen Pufferionen dieselben sein wie die während des primären Durchlaufs und des sekundären Durchlaufs verwendeten. Für den Fall, dass die Pufferionen in dem Protein-Peptid-Gemisch zu divergent sind, kann die notwendige Anpassung mittels verschiedener im Stand der Technik verfügbarer Verfahren erreicht werden. Sie kann beispielsweise durch Dialysieren des Proteingemischs gegen geeignete Puffer vor der Trypsin-Verdauung erreicht werden. Alternativ könnte eine kurze Umkehrphasen-(RP-)Trennung mit steilem Gradienten vor Beginn des primären Durchlaufs hinzugefügt werden. Während dieser schnellen RP-Trennung werden Salze entfernt, und Peptide erhalten die richtigen Gegenionen, welche in den primären und sekundären Durchläufen verwendet werden. Peptide, die aus diesem schnellen RP-Schritt eluieren, werden kombiniert und gefriergetrocknet, bevor sie in der für den primären Durchlauf geeigneten Pufferlösung aufgelöst werden. Das Vorgehen, in welchem das Peptidgemisch in die idealste Ionen-Bedingung gebracht wird, wird hier der Konditionierungsschritt genannt. Ein Beispiel, wo eine Peptid-Gemisch-Konditionierung wichtig ist, wird weiter unten beschrieben.
  • Menschliches Plasma wird durch Hinzufügen eines Citratpuffers vorbereitet, um ein Verklumpen zu verhindern. Wenn ein Trypsin enthaltendes Verdauungsmittel aus einer solchen Gesamtplasma-Proteinvorbereitung direkt dem primären chromatographischen Schritt unterworfen wird, wird die Peptidtrennung durch das ursprünglich in dem Peptid-Gemisch vorhandenen Citrat beeinflusst. Wenn die unveränderten Peptide nun für den sekundären Durchlauf weitergeführt werden, wobei das Citrat fast nicht vorhanden ist, kann sich eine ungewollte Verschiebung aufgrund der Änderung beim Ionenbinden ergeben. Diese Art von Verschiebungen ist wichtiger für hydrophilere Peptide, welche beim Beginn des Gradienten eluieren, als für die später eluierenden hydrophoben Peptide. Der Citrat-Effekt in dem primären Durchlauf wird durch erstes Durchlaufen des Protein-Peptid-Gemisches über eine schnelle RP-Säule unter Verwendung eines steilen Gradienten eines organischen Lösungsmittels vermieden. Peptide, die über den gesamten Gradienten eluieren, werden gesammelt, durch Gefriertrocknung oder Vakuumtrocknung getrocknet und in dem geeigneten Puffer vor dem primären Durchlauf wieder aufgelöst. Durch Konditionieren des Protein-Peptid-Gemischs stellt man die gleichen oder identische chromatographische Bedingungen über den gesamten Sortierprozesse sicher. Der Konditionierungsschritt ist auch wichtig als Reinigungsschritt, welcher Verbindungen entfernt, welche die Sortiersäulen allmählich verschmutzen.
  • Beispiel 10: Individuelle Peptidmassen-basierte Proteomik (IPMBP)
  • Erfindungsgemäß ist es möglich, eine Teilmenge gekennzeichneter Peptide oder Identifizierungspeptide aus einem komplexen Peptidgemisch oder einem Protein-Peptid-Gemisch auszuwählen. Weiterhin werden gemäß der Erfindung die Peptide und zugehörige Proteine mit geeigneten Analysemitteln identifiziert, wie beispielsweise einem Massenspektrometer. Mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer wird die Masse dieser Peptide gemessen, jedoch ist dies nicht immer ausreichend, um Peptide und ihre korrespondierenden Proteine eindeutig zu identifizieren. In diesem Beispiel werden verschiedene Ansätze beschrieben, um den Informationsgehalt der isolierten gekennzeichneten oder Identifizierungspeptide zu erhöhen. Dies erlaubt es einem, die Identifikation einer höheren Zahl dieser Peptide durch eine einfache Bestimmung ihrer Masse mit einem Massenspektrometer eindeutig zu bestimmen. Dieser Ansatz wird als individuelle Peptidmassen-basierte Proteomik (IPMBP) bezeichnet.
  • 10.1 IPMBP an Endoproteinase-LysC-erzeugten Peptiden
  • Die Verwendung der Erfindung erlaubt es einem, Peptide auszuwählen, welche ein oder mehrere Exemplare einer bestimmten Aminosäure enthalten. Die Kenntnis, dass diese Aminosäure in dem ausgewählten Peptid vorhanden sein muss, wird verwendet, um die Zahl der Peptide zu erhöhen, welche eindeutig identifiziert werden können. Ein Ansatz ist es, Unterdatenbanken aufzubauen, welche nur die Massen von Peptiden enthalten, von denen bekannt ist, dass sie mindestens einen Rest der bestimmten Aminosäure enthalten. Falls beispielsweise Methionin als die bestimmte Aminosäure ausgewählt worden ist, wird eine Unterdatenbank mit den Massen der Peptide erzeugt, die mindestens ein Methionin enthalten, und die Massen jedes der Methionin-enthaltenden gekennzeichneten Peptide wird mit dieser Datenbank abgeglichen.
  • Eine weitere Erhöhung des Prozentsatzes gekennzeichneter Peptide oder Identifizierungspeptide, welche eindeutig bestimmt werden können, wird durch die Verwendung spezifischer Proteasen erreicht. In einem Beispiel wird Endoproteinase-LysC verwendet. In diesem Beispiel wurde eine Datenbank aufgebaut, welche alle möglichen Peptide enthielt, welche durch in silico-Endoproteinase-LysC-Verdauung menschlicher und E. coli-Proteine abgeleitet worden sind (entnommen der SwissProt-Datenbank, Version 39.0). Aus dieser Datenbank wurde eine Unterdatenbank von Peptiden erzeugt, welche bestimmte Kriterien erfüllten: ihre monoisotopische Masse sollte zwischen 700 Da und 4000 Daliegen, und sie sollten mindestens einen Methioninrest enthalten. Die Unterdatenbank wurde gemäß der ansteigenden Peptidmasse indiziert, und dann wurde die Zahl der Peptide berechnet, welche als eindeutige Identifikatoren für ihre Stammproteine verwendet werden könnten, d.h. Peptide, bei denen die Masse bis auf drei Stellen genau gemessen mit einer eindeutigen Peptidsequenz korrespondiert. Aus diesen Berechnungen wurde beobachtet, dass 91% der berechneten menschlichen Peptidmassen und 95% der berechneten E. coli-Peptidmassen als eindeutige Identifizierungspeptide dienen (7). Auf ähnliche Weise wurde die Zahl der Proteine in den Datenbanken, welche mindestens eine dieser eindeutigen Kennungen enthielten, berechnet, und es wurde gefunden, dass für beide Spezies mehr als 80% der Proteine auf diesem Weg identifiziert werden können. Um diese Strategie für eine Peptid-basierte Proteomik mit hohem Durchsatz zu verwenden, müssen die Peptidmassen mit sehr hohen Genauigkeiten gemessen werden. Wie in letzter Zeit veröffentlicht, könnten solche hohen Massengenauigkeiten gut innerhalb der Möglichkeiten eines Fourier-Transformations-Massenspektrometers (FTMS) unter Verwendung einer internen Kalibrierungsprozedur liegt (O'Connor und Costello, 2000).
  • So lange dieses Genauigkeitsniveau nicht erreicht ist, kann ein sehr schneller Abfall in der Identifizierungsleistung erwartet werden. Ebenfalls ergeben aus einer statistischen Sicht größere Datenbanken weniger eindeutige Zuweisungen als kleinere. Es wird daher bevorzugt, die IPMBP-Suchalgorithmen auf eine einzelne Spezies von Organismen zu lenken. Für diese simulierten Experimente wurde Endoproteinase-LysC verwendet, welches im Mittel größere Proteine erzeugt als beispielsweise Trypsin- oder Chymotrypsin-Verdauungen. Verwendung der letzteren Enzyme oder Kombinationen verschiedener Proteasen werden zu Peptid-Datenbanken führen, welche eine größere Zahl von Einträgen haben, wodurch sowohl die Zahl der eindeutigen Peptidmassen als auch die Zahl der Proteine sinkt, welche eindeutig durch IPMBP identifiziert werden können.
  • 10.2 Anreicherung des Informationsgehalts der Peptide
  • Um folgerichtigere Kriterien ohne die Verwendung der zeitaufwendigen MS/MS-Analyse zu erhalten, wurde der Informationsgehalt der gekennzeichneten Peptide weiterhin durch spezifisches Ändern freier NH2-Gruppen in dem Peptid erhöht unter Verwendung einer äquimolaren Mischung von Essigsäure-N-hydroxysuccinimid-Ester und Trideuteroessigsäure-N-hydroxysuccinimid-Ester. Als das Ergebnis dieser Umwandlungsreaktion erlangen die gekennzeichneten Peptide oder Identifizierungspeptide eine vorbestimmte Zahl von CH3-CO(CD3-CO)-Gruppen, und zwar abhängig von der Zahl der freien NH2-Gruppen in diesen Peptiden. Die Zahl der aufgenommenen Gruppen kann einfach aus dem Ausmaß der beo bachteten Massenverschiebung in den Peptiddubletts abgeleitet werden. Beispielsweise entspricht eine Verschiebung von 3 amu der Anwesenheit einer NH2-Gruppe, eine 3 und 6 amu-Verschiebung zwei NH2-Gruppen und eine Verschiebung von 3, 6 und 9 amu deckt die Anwesenheit dreier NH2-Gruppen in dem Peptid auf. Verändern der freien NH2-Gruppen wird bequemerweise nach einer Proteinverdauung durchgeführt, aber vor dem Beginn des primären Durchlaufs. Die Acetylierung der freien NH2-Gruppen in den Peptiden erhöht die Hydrophobizität der Peptide. Diesen Effekt außer Acht lassend, ist das Ausmaß der hydrophilen Verschiebungen (δmin und δmax), die beispielsweise nach einer Methioninoxidation (siehe Beispiel 1) erreicht wird, ähnlich dazu, wie wenn die Peptide nicht acetyliert werden. Die vorliegende Erfindung kann daher gleichfalls bei diesem Ansatz durchgeführt werden. Unter Verwendung dieses Ansatzes, kombiniert mit dem hier oben beschriebenen Ansatz, kann die folgende Information für jedes der gekennzeichneten Peptide erlangt werden: (1) Masse, bestimmt durch MS, (2) Zahl der Reste einer spezifisch ausgesuchten Aminosäure (z.B. Methioni) und (3) Zahl der freien Aminogruppen. Diese kombinierte Information erhöht die Zahl der gekennzeichneten oder Identifizierungspeptide erheblich, welche eindeutig durch Durchsuchen von Datenbanken und Teildatenbanken identifiziert werden können, wie hier oben beschrieben.
  • Zusätzlich kann dieser Ansatz dazu verwendet werden, das Peptidverhältnis in den zwei Mischungen zu bestimmen. In diesem Beispiel werden Peptide von einer Probe mit Essigsäure-N-hydroxysuccinimid-Ester acetyliert und Peptide von der zweiten Probe werden mit Trideuteroessigsäure-N-hydroxysuccinimid-Ester acetyliert. Das Verhältnis der zwei Isotopenformen jedes in Massenspektren gemessenen gekennzeichneten Peptids wird im Folgenden verwendet, um einen quantitativen Vergleich durchzuführen. In einem differenziellen quantitativen Verfahren wurde letztens ein ähnlicher Ansatz durch Brancia et al. (2001) veröffentlicht, der O-Methylisoharnstoff verwendete, um die Zahl der Lysinreste in trypsinbehandelten Peptiden zu bestimmen, und er zeigte, dass diese zusätzliche Information den Gesamterfolg der Proteinidentifikation unter Verwendung herkömmlicher Suchmethoden verbessert. Die Kombination dieses Ansatz mit der vorliegenden Erfindung verbessert weiterhin den Prozentsatz der Peptide, welche eindeutig identifiziert werden können, erheblich.
  • Ein zusätzliches wichtiges Stück Information ist die Elutions- oder Migrationszeit eines gegebenen Peptids in dem Trennungssystem (z.B. während des primären Durchlaufs), weil es uns erlaubt, zwischen Peptiden mit identischen oder sehr ähnlichen Massen, aber unterschiedlichen Hydrophobizitäten oder Netto-Elektroladungen zu unterscheiden.
  • 10.3 IPMBP durch Auswählen von NH2-endständigen trypsinbehandelten Peptiden
  • In der vorliegenden Erfindung ist es möglich, beispielsweise nach den NH2-endständigen Peptiden von NH2-endständig blockierten Proteinen (Beispiel 6a) zu sortieren, aber diese Idee wird ausgeweitet auf die NH2-endständigen Peptide aller Proteine in einer Probe (Beispiel 7). In 6 wird ein Verfahren zum spezifischen Sortieren von Peptiden gezeigt, welche aus in vivo NH2-blockierten Proteinen abgeleitet werden (höchst wahrscheinlich NH2-acetylierte NH2-formylierte oder pyroglutamylierte Proteine). Unter Verwendung einer Variation dieses Vorgehens (Beispiel 7) sind wir auch in der Lage, nach NH2-endständigen Peptiden für die meisten, falls nicht alle, der in einem Protein-Peptid-Gemisch vorhandenen Proteine spezifisch zu sortieren. Dieses Vorgehen erlaubt es auch, zwischen Peptiden zu unterscheiden, die von in vivo NH2-endständig blockierten Proteinen und von Proteinen mit einer freien NH2-Endgruppe abgeleitet sind. Als letztes kann die Masse dieser sortierten NH2-endständigen Peptide einfach unter Verwendung beispielsweise eines Massenspektrometers bestimmt werden.
  • Ein wichtiger Vorteil dieses Ansatzes ist es, dass er nach den Amino-terminalen Peptiden der Proteine auswählt. Als eine Folge wird die Identifizierung der mit den Peptiden korrespondierenden Proteine erheblich vereinfacht, weil die Suche, um die Peptidmassen mit den Massen der in Datenbanken gespeicherten Peptide zu korrelieren, nun auf die Massen der Amino-endständigen Peptide in den Datenbanken beschränkt werden kann. Als ein Ergebnis ist es für die große Mehrzahl der Peptide möglich, das Peptid seinem korrespondierenden Protein eindeutig zuzuordnen. In einer idealen Situation kann jedes NH2-endständige Peptid als das einzige repräsentative Identifizierungspeptid seines korrespondierenden Stammproteins angesehen werden, was das Proteinidentifizierungsproblem hauptsächlich auf einen 1-Protein/1-Peptid-Zusammenhang reduziert. Dies bedeutet, dass wir für ein Gemisch von 1000 unterschiedlichen Proteinen 1000 unterschiedliche Identifizierungspeptide zu suchen haben. Es existiert einige Schwierigkeit im Verifizieren dieser Annahme durch eine einfache Computersimulation unter Verwendung genomischer DNA-Sequenzen, weil man nicht immer das Ausmaß des Verarbeitens an der NH2-Endgruppe während einer in vivo-Proteinreife kennt. Beispielsweise wird β-zytoplasmisches Actin zuerst synthetisiert als: Met-Cys-Asp-Asp-Asp-Ile-, aber letztendlich in Acetyl-Asp-Asp-Asp-Ile ... verarbeitet mit dem aufeinander folgenden Entfernen von Met und Cys vor der Hinzufügung einer Acetylgruppe (Redman und Rubenstein, 1984). Das Problem des "unvorhersagbaren" NH2-endständigen Proteinverarbeitens wird gelöst durch zuerst Auswählen und dann Identifizieren jedes Identifizierungspeptids durch einen MS/MS- oder PSD-Ansatz. Diese Untersuchungen sind nicht zu kompliziert, weil die sortierten NH2-endständigen Peptide entweder Arginin oder Homoarginin (hArg) enthalten, und diese sind dafür bekannt, dass sie sehr effizient ionisieren und hauptsächlich y-artige Fragmentionen während einer MS/MS-Analyse erzeugen (Biermann, 1990), was zu einfach interpretierbaren Spektren führt. Wie bereits in Abschnitt 10.2 angemerkt, kann die Elutions- oder Migrationszeit eines Identifizierungspeptids ein wertvoller und ausreichender zusätzlicher Parameter sein, der mit seiner Gesamtmasse kombiniert wird, um ein Identifizierungspeptid vollständig zu identifizieren. Daher wird die Masse jedes Identifizierungspeptids, kombiniert mit seinen chromatographischen Eigenschaften zusammen mit der Information, von welchem Protein dieses spezifische Peptid abgeleitet worden ist, in einer relationalen Datenbank abgespeichert. Dies bedeutet, dass es in den meisten Fällen möglich ist, die Masse der Identifizierungspeptide mit ihrem Stammprotein eindeutig zu korrelieren.
  • 10.4 Die Verwendung von IPMBP in einem quantitativen differenzialen Proteomansatz
  • Das Vorgehen, IPMBP in einem quantitativen Proteomansatz unter Verwendung von Identifizierungspeptiden zu nutzen, umfasst die folgenden Schritte: Gemäß dem in Beispiel 7 beschriebenen Vorgehen werden die Proteine aus einem Protein-Peptid-Gemisch 1 zuerst Cystein-modifiziert und guandinisiert und dann N-endständig acetyliert. Die Proteine werden dann mit Trypsin in Anwesenheit von H2 16O verdaut. Das gleiche Vorgehen wird für das Protein-Peptid-Gemisch 2 durchgeführt, aber nun wird die Trypsin-Verdauung in Anwesenheit von H2 18O ausgeführt. Trypsin katalysiert nicht nur die Spaltung seiner Zielpeptidverbindungen, sondern baut auch zwei Sauerstoffatome ein, die von Wasser an den Spaltungsseiten aufgenommen werden, (siehe beispielsweise Schnolzer et al., 1996) (Rose et al., 1983). Daher werden die aus dem Protein-Peptid-Gemisch 1 abgeleiteten Peptide COOH-endständig mit zwei 16O-Isotopen markiert, während aus dem Protein-Peptid-Gemisch 2 stammende Peptide nun zwei 18O-Isotope tragen, was das gleiche Peptid, das aus den unterschiedlichen Gemischen stammt, durch 4 amu unterscheidet. Nun werden die Peptidgemische kombiniert und über die erste Säule laufen gelassen (Durchlauf 1). Peptide werden wieder in Fraktionen gesammelt und an ihrer α-Aminogruppe durch ein spezifisches Reagens markiert, welches eine hydrophobe (oder hydrophile) Gruppe trägt. Nun werden aus sich NH2-endständig blockierten Proteinen (in vivo oder in vitro) abgeleitete Peptide in dem sekundären Durchlauf nicht bewegen und können zu gleichen Elutionszeitintervallen wie in Durchlauf 1 gesammelt werden. Im Gegensatz dazu durchlaufen alle veränderten Peptide, welche an der NH2-Gruppe nach dem primären Durchlauf reagiert haben, eine hydrophobe/hydrophile Verschiebung und bewegen sich von der Position fort, welche eingenommen wurde, bevor sie markiert wurde. Wenn hydrophile Reagenzien verwendet werden, um die freien α-Aminogruppen zu verändern, erkennen wir eine hydrophile Verschiebung der veränderten Peptide im Vergleich zu den NH2-endständig blockierten Peptiden. Da jedoch die Peptide mit einer freien α-Aminogruppe bereits hydrophil sind, führen die meisten Blockier-Reagenzien zu einer hydrophoberen Verbindung, welche später eluiert als die Peptide mit der freien Aminogruppe. Bei einer massenspektrometrischen Analyse der isolierten Identifizierungspeptide entdecken wir nun zwei Arten von Identifizierungspeptid-Dubletts: solche, die sich bei 4 amu auftrennen (dem Unterschied zwischen dem Aufweisen von zwei 16O- in Bezug auf zwei 18O-Isotope), und solchen, welche von in vivo blockierten Proteinen abgeleitet sind. Die Verhältnisse der Peakintensitäten oder Peakoberflächen beleuchten das relative Verhältnis der korrespondierenden Proteine in den zwei Gemischen. Die zweite Art von Dubletts wird durch 7 amu getrennt (der Differenz zwischen zwei 16O- und zwei 18O-Isotopen, erhöht durch den Unterschied zwischen drei H-Atomen und drei D-Atomen) und wird von Proteinen aus den Proben abgeleitet, welche eine freie NH2-Endgruppe hatte. Die Verhältnisse der Peakintensitäten oder Peakoberflächen reflektiert wiederum die relativen Verhältnisse der korrespondierenden Proteine in den zwei Gemischen. Das Reaktionsschema für den quantitativen differenziellen NH2-endständigen Peptid-Ansatz ist in 8 zusammengefasst.
  • Eine Alternative zu dem 16O/18O-Differenzial-Markierungsverfahren ist die Verwendung von gekennzeichneten oder Identifizierungspeptiden, welche chemisch synthetisiert sind und mindestens eine deuterierte (oder jegliche Art von schwerem Isotop 13C, 15N) Aminosäure aufweisen, was eine ausreichende Auftrennung der natürlichen Identifizierungspeptide im Gegensatz zu den "schweren" synthetischen Identifizierungspeptiden durch Massenspektrometrie erlaubt. Die "schweren" Peptide dienen nun als interne Standards. Daher wird das synthetische Peptid in bekannten Mengen dem Protein-Peptid-Gemisch hinzugefügt und wird zusammen mit seiner natürlichen Entsprechung sortiert. Vergleich der Peakverhältnisse des Peptids in dem Massenspektrometer erlaubt eine relative quantitative Abschätzung des natürlichen Identifizierungspeptids im Vergleich zu dem hinzugefügten synthetischen Peptid.
  • Solche isotopenmarkierten gekennzeichneten oder Identifizierungs-Peptide könnten beispielsweise deuteriertes Leucin (z.B. L-Leucin-d10, einen Massenunterschied von 10 amu erzeugend) oder deuteriertes Methionin enthalten. Letzteres mag bequem sein, wenn Met-enthaltene Peptide sortiert werden (siehe beispielsweise Beispiele 1, 18, 19 und 20).
  • Da die große Mehrheit der trypsinbehandelten Peptide entweder mit Arginin oder Lysin abschließen, und da die chemische Peptidsynthese an der COOH-Endgruppe beginnt und sich in Richtung der NH2-Endgruppe weiterarbeitet, könnten alle Peptide synthetisiert werden, startend mit entweder deuteriertem Lysin oder deuteriertem Arginin, während die anderen Aminosäuren mit ihren natürlichen Derivaten angefügt werden könnten. In diesem Fall könnte ein Festphasenträger verwendet werden, auf welchem bereits deuteriertes Lysin oder deuteriertes Arginin über einen spaltbaren Verbindungsarm mit dem Festphasenträger verbunden ist. Solche Festphasenharze könnten als allgemeines Startmaterial verwendet werden, von dem aus jede Art von schwerem gekennzeichneten oder Identifizierungspeptid durch herkömmliche Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert werden könnte.
  • Beispiel 11: Eine Peptidsortiervorrichtung unter Verwendung eines Einzelsäulensystems
  • Das grundsätzliche Protokoll der Erfindung, um beispielsweise Methionin-enthaltene Peptide aus einem Protein-Peptid-Gemisch zu isolieren, besteht aus zwei aufeinander folgenden chromatographischen Schritten: einem RP-HPLC-Schritt des Protein-Peptid-Gemischs, durchgeführt in dem Lösungsmittelsystem, welches gefunden wurde, die geeignetsten Verschiebungen zwischen den oxidierten Methionin-Peptiden und den nicht veränderten Peptiden zu erzeugen, und welches auch am meisten kompatibel mit entweder Elektrosprüh- oder MALDI-Ionisiationsabläufen ist. Der zweite RP-HPLC-Durchlauf, welcher nach dem Oxidationsschritt durchgeführt wird, wird unter den gleichen oder sehr ähnlichen chromatographischen Bedingungen durchgeführt, so dass nur die oxidierten Peptide nach vorne verschoben werden, während die nicht veränderten Peptide bei ihren ursprünglichen Eluti onszeiten verbleiben. Dieses Prinzip wird in verschiedenen Wegen dazu verwendet, Methionin-Peptide von Nicht-Methionin-Peptiden zu trennen. Daher wird in einem Einzelsäulensystem, das schematisch in 9 dargestellt ist, der erste Durchlauf (Durchlauf 1) des gesamten zellularen Peptidgemischs an einer Standard-Umkehrphasensäule durchgeführt (beispielsweise einer 2,1 mm I.D. × 25 cm C-18 RP-Säule, Vydac Separations Group). Dies wird als der erste Durchlauf bezeichnet, und das UV-Absorptionsprofil der Peptide von einem E. coli-Lysat wird in 10 gezeigt. Folgend einem anfänglichen isokratischen Waschschritt mit 5% Lösungsmittel B für 10 min wird die Säule mit einem Acetonitril-Gradienten eluiert, welcher linear bei 1% von Lösungsmittel B/min für 95 min ansteigt. Pufferlösung A besteht aus 0,1% Trifluoressigsäure (TFA), während Pufferlösung B aus 0,09% TFA in 70% Acetonitril besteht. Die Strömung wird bei einer Rate von 80 μl/min konstant gehalten, und Fraktionen von 80 μl werden in 0,5 ml-Eppendorf-Röhrchen gesammelt. Insgesamt werden 40 Fraktionen gesammelt. Die erste gesammelte Fraktion wird Fraktion Nr. 10 genannt (eluierend zwischen 18 und 19 min vom Start des Gradienten und 23% von Lösungsmittel B entsprechend). Die letzte gesammelte Fraktion (eluierend zwischen 57 und 58 min vom Start des Gradienten und 63% von Lösungsmittel B entsprechend) wird die Nr. 49 gegeben. In diesem experimentellen Aufbau werden nur die Methioninreste, die in den Peptiden in den Fraktionen vorhanden sind, spezifisch chemisch verändert, Peptide, welche oxidierte Methioninreste enthalten, werden hier als Met-SO-Peptide bezeichnet. Die spezifische Veränderung wird folgendermaßen durchgeführt. Jede Fraktion wird vakuumgetrocknet und in dem Oxidationsgemisch wieder aufgelöst, welches aus 1% TFA in Wasser besteht, welchem 30% Stammlösung von H2O2 hinzugefügt wurde, um ihm eine Endkonzentration von 0,5% H2O2 zu geben. Die Oxidation konnte für 30 min bei 30°C voranschreiten, und die Lösung wird dann unmittelbar an die RP-Säule für die sekundären Durchläufe geladen. Erfindungsgemäß wird es höchst bevorzugt, jede Fraktion nach der Oxidation unter den gleichen oder sehr ähnlichen chromatographischen Bedingungen und an der gleichen Säule wieder durchlaufen zu lassen. Unter Verwendung der gleichen Bedingungen in Durchlauf 2 eluieren die Met-SO-Peptide zwischen 6 und 2 min vor der Hauptmenge der unveränderten Peptide. Ein Ansatz ist es, jede Fraktion getrennt laufen zu lassen, und dies für jede der 40 Fraktionen zu tun. Ein solcher Ansatz benötigt nicht nur eine erhebliche Menge an HPLC-Zeit, sondern belegt auch wichtige Maschinenzeit am Massenspektrometer. Um eine ökonomischere Verwendung sowohl der HPLC-Ausrüstung als auch des Massenspektrometers zu erreichen, und um den ganzen Prozess zu beschleunigen, haben wir die Zahl der Trennungen durch Zusammengeben mehrerer Fraktionen des primä ren Durchlaufs verringert unter Vermeidung eines Überlappens der vorwärts-verschobenen gekennzeichneten Peptide mit den unveränderten Peptiden aus den vorhergehenden Fraktionen und unter Vermeiden eines Überlappens der gekennzeichneten Peptide aus einer Fraktion mit den gekennzeichneten Peptiden einer anderen Fraktion. Vor Festsetzen dieses Protokolls haben wir die hydrophilen Verschiebungen einer bedeutenden Zahl synthetischer Methionin-enthaltener Peptide nach Oxidation gemessen und bemerkt, dass die große Mehrzahl der Verschiebungen weniger als 6%, aber mehr als 2% des Lösungsmittels B betrug; und daher in einem Fenster zwischen 6 und 2 min in dem in unseren Experimenten verwendeten Gradienten lag (siehe auch Tabelle III). In der 2-min-Zone, die zwischen den verschobenen Peptiden und dem Hauptanteil des Peptidmaterials liegt, haben wir nur sehr wenige Methionin-Peptide beobachtet, aber stattdessen haben wir schon einige nicht veränderte Peptide gemessen, welche sich von dem großen Peak der Hauptmenge der Peptide ausgespreizt haben. Um ein Überlappen bzw. Überlagern in der Elution der gekennzeichneten Peptide zu vermeiden, welche von den zwei Fraktionen in dieser bestimmten experimentellen Festsetzung stammen, braucht es mindestens 6 min Elutionsunterschied zwischen diesen zwei Fraktionen (z.B. wurde dies für Fraktion 10 die Fraktion 17 gewesen sein). Jedoch haben wir aus Sicherheitsgründen eine zusätzliche Elutionszeit von 5 min hinzugefügt, die der Elution der Fraktion mit starker Spitze folgt, bevor die Elution der nächsten Gruppe oxidierter Methioninpeptide erlaubt wurde. Dies bedeutet, dass wir für die sekundären Durchläufe Fraktionen kombinieren konnten, welche in dem primären Durchlauf durch Intervalle von 12 min getrennt wurden. Wir kombinierten Fraktion 10 mit den Fraktionen 22, 34 und 46. Auf ähnliche Weise kombinierten wir Fraktion 11 mit den Fraktionen 23, 35 und 47 usw. Eine vollständige Liste des Fraktionen-Zusammenlebens für die sekundären Durchläufe ist in Tabelle IVA gezeigt. Das UV-Absorptionsprofil eines typischen sekundären Durchlaufs (Durchlauf 2A, welcher Fraktionen 10, 22, 34 und 46 kombiniert) ist in 11 gezeigt. Die Methionin-SO-Peptide wurden jedesmal in den Intervallen zwischen 6 und 2 min aufgesammelt, wodurch sie der Zeit vorausgingen, in welcher die unveränderten Peptide zu eluieren erwartet wurden. Daher wurden in dem Beispiel von Durchlauf 2A oben oxidierte Peptide in Fraktionen 4–7, 16–19, 28–31 und 40–43 gesammelt (Tabelle IVA). Die oxidierten Peptide in den verbleibenden sekundären Durchläufen wurden gesammelt, wie es weiterhin in Tabelle IVA aufgelistet ist. Daher haben wir insgesamt 12 solcher sekundärer Trennungen aufeinander folgend durchzuführen, um alle Fraktionen aus dem primären Durchlauf abzudecken. Hier sollte hinzugefügt werden, dass die in dem hier beschriebenen Sortierprozess verwendeten Zeitintervalle und -fenster Änderungen abhängig von dem ausgewählten chromatographischen System oder der Art der Komponenten, welche zu sortieren sind, unterworfen sein können. Beispielsweise beschreiben wir in Beispiel 18 einen Sortierprozess unter Verwendung unterschiedlicher Zeitintervalle und -fenster, um auch Methioninpeptide zu sortieren, aber unter Verwendung des HCOOH/Acetonitril-Systems. Es ist selbstverständlich, dass die Zeitintervalle und -fenster an jede bestimmte Fragestellung angepasst werden müssen (z.B. Sortieren auf Phoshopeptide, Sortieren auf N-ε-acetylierte Peptide, Sortieren auf die NH2-endständigen Peptide usw.).
  • Die Met-SO-Peptide, die während der sekundären Durchläufe eluieren, können entweder direkt in eine Ionenquelle eines Online-verbundenen Massenspektrometers weitergereicht werden (beispielsweise ein ESI-basiertes Massenspektrometer) oder sie können in kleinen Aliquots für eine weitere MALDI-TOF/RETOF-MS-Analyse gesammelt werden, oder direkt in schmalen Tropfen auf die MALDI-Zielplatte für eine MALDI-MS-Analyse mit hohem Durchsatz aufgepunktet werden. Alternativ können die sortierten Met-SO-Peptide in Eppendorf-Röhrchen gesammelt und für eine mögliche dritte Serie von Trennungen (die hier als tertiäre Durchläufe bezeichnet werden) zu rekombinieren. Letzteres mag notwendig sein, wenn ein Peptidsortieren in TFA-enthaltenden Systemen durchgeführt worden ist, während die Analyse von ESI-MS durchgeführt wird. In der Tat ist TFA dafür bekannt, Ionenclusterung während eines Elektrosprühens zu bewirken, was eine Peptiddetektion und MS/MS-Analyse ernsthaft beeinträchtigt (Mirza und Chait, 1994). Dies ist nicht der Fall, wenn entweder 0,05% HCOOH oder eine 10 mM NH4Ac-Püfferlösung bei pH 5,7 als Gegenionen verwendet werden. Es sollte realisiert werden, dass die Verwendung letzteren Systems Verschiebungen in den Peptidelutionszeiten erzeugen kann, wenn sie mit den in den vorhergehenden Durchläufen verwendeten TFA-Systemen verglichen werden, was möglicherweise zu einer ungewünschten Spitzenakkumulation führt und daher zum Risiko einer ineffizienten Peptididentifikation. In den Tabelle IVB und IVC zeigen wir zwei unterschiedliche Schemata, die zeigen, wie die aus den sekundären Durchläufen abgeleiteten Fraktionen zusammengegeben werden können, um einen dritten Durchlauf durchzuführen. Für den Fall, dass identische Gegenionen in dem Lösungsmittel durch die unterschiedlichen Durchläufe hindurch verwendet werden, können wir Fraktionen kombinieren, welche nacheinander eluieren. Beispielsweise kann die Fraktion 4–7 aus Durchlauf 2A mit Fraktion 8–11 aus Durchlauf 2E, Fraktion 12–15 aus Durchlauf 21, Fraktion 16–19 aus Durchlauf 2A, Fraktion 20–23 aus Durchlauf 2E, Fraktion 24–27 aus Durchlauf 21, Fraktion 28–31 aus Durchlauf 2A, Fraktion 32–35 aus Durchlauf 2E, Fraktion 36–39 aus Durchlauf 21 und Fraktion 40–43 aus Durchlauf 2A kombiniert werden (in Tabelle IVB blau markiert). Die übrigen Fraktionen werden auf ähnliche Weise wie in Tabelle IVB gezeigt kombiniert, was zu vier Pools fuhrt, bei denen die Komponenten in vier dritten Durchläufen 3A, 3B, 3C und 3D getrennt werden können. Im Fall, dass wir 0,05% HCOOH in den tertiären Durchläufen verwenden, ist es empfehlenswert, nur die Hälfte der Fraktionen zu jeder Zeit zu verwenden. Daher legen wir nun für Durchlauf 3'A die Fraktionen 4–7 aus Durchlauf 2A mit Fraktionen 12–15 aus Durchlauf 21, Fraktion 20–23 aus Durchlauf 2E, Fraktion 28–31 aus Durchlauf 2A und Fraktion 36–39 aus Durchlauf 21 zusammen. Die anderen Kombinationen sind wiederum in Tabelle IVC aufgelistet und werden in acht unterschiedlichen tertiären Durchläufen (3'A bis 3'H) getrennt. Noch weitere Kombinationen, um Fraktionen aus den sekundären Durchläufen zusammenzulegen, um einen tertiären Durchlauf durchzuführen, sind möglich. Obwohl tertiäre Durchläufe, wie oben beschrieben, wichtig sind, um eine bessere Dispersion der Peptide über verschiedene Durchläufe zu erhalten, ist es effizienter und schneller, die Peptide unmittelbar zu identifizieren, wenn sie während des sekundären Durchlaufs der Säule eluieren. Aus einer Zeitperspektive ist letzteres mit einer Einzelsäulen-Peptidsortiervorrichtung nicht optimal, weil die Met-SO-Peptide bei Intervallen eluieren, welche durch 8-Minuten-Blocks getrennt sind, in denen keine Aufsammlungen möglich sind. Diese 8-Minuten-Blocks können mit zwei 4-Minuten-Elutionen aufgefüllt werden, wenn drei Säulen gleichzeitig gefahren werden. Der Aufbau eines solchen 3-Säulen-Peptidsortierers wird in Beispiel 12 beschrieben.
  • Für den Fall, dass der Umkehrsortierprozess verwendet wird, in welchem unveränderte Peptide sortiert und als Identifizierungspeptide aufgesammelt werden, während veränderte Peptide, welche die Mehrheit der Peptide des ursprünglichen Protein-Peptid-Gemischs bilden, fallengelassen oder für andere Analysen verwendet werden, ist das folgende Vorgehen evident.
  • Verwenden ähnlicher Werte von Peptidverschiebungen wie solche, welche im Beispiel der oben beschriebenen Methioninoxidation verwendet wurden, unter der Annahme, dass primäre Fraktionen von 1 min genommen worden sind (W = 1 min), annehmend, dass alle veränderten Peptide zwischen 6 und 2 min vor der Elutionsposition der Identifizierungspeptide eluieren, sammeln wird dann die Identifizierungspeptide in dem gleichen Zeitintervall, wie sie in dem primären Durchlauf genommen werden, während die veränderten Peptide, welche zwischen –6 und –2 min eluieren, nicht analysiert werden. Es sollte klar sein, dass nun die veränderten Peptide die Hauptmenge der Peptide bilden, während die nicht veränderten Peptide eine kleinere Fraktion des ursprünglichen Gemischs darstellen. Es ist auch wichtig, darauf hinzuweisen, dass ein wenig Verbreiterung des Fensters auftreten kann, in welchem unveränderte Peptide während des sekundären Durchlaufs aufgrund der Abwesenheit großer Mengen von Peptiden in dem sekundären Durchlauf eluieren. Daher werden die unveränderten Identifizierungspeptide besser in einem Fenster aufgesammelt, welches ein wenig weiter ist als w1: beispielsweise 0,5 min vor und hinter den Zeitintervallen von w1.
  • Wie im Beispiel für die Methioninoxidation können wir wieder die Fraktionen 10, 22, 34 und 46 des primären Durchlaufs kombinieren. Nun werden die veränderten Peptide fallengelassen, welche in den Fraktionen 4–7, 16–19, 28–31 und 40–43 eluieren, während die Identifizierungspeptide nun in Fraktionen 9,5–11,5 min, 21,5–23,5 min, 33,5–35,5 min und 45,5–47,5 min aufgesammelt werden.
  • Der Umkehrsortierprozess kann daher mit der gleichen Vorrichtung wie der normale Sortierprozess durchgeführt werden, und zwar mit minimalen Veränderungen an dem Peptidsammelprogramm.
  • Es sollte den Fachleuten hier wiederum klar sein, dass die Verschiebungszeiten veränderlich sind, und zwar abhängig von dem chromatographischen System, den Bedingungen und der verwendeten Veränderungschemie oder -abläufen.
  • Beispiel 12: Eine Drei-Säulen-Peptid-Sortiervorrichtung
  • Um die Gesamtpeptidsortierzeit zu verringern, wird nun das in Beispiel 11 befolgte, auf einer einzelnen RP-HPLC-Säule für alle Schritte beruhende Vorgehen mit drei Säulen ausgeführt, welche parallel und gleichzeitig arbeiten. Eine schematische Ansicht eines solchen Sortiersystems ist in 12 gezeigt. Diese Peptidsortiervorrichtung umfasst drei identische RP-Säulen, welche unter exakt den gleichen Bedingungen (Strömungsrate, Gradient, usw.) laufen. Um identische Bedingungen zu erreichen, werden diese Säulen jeweils mit Hochdruckpumpe und Lösungsmittelmischvorrichtungen verbunden, welche die Durchsätze und Gradienten in den drei Säulen (12A) genau steuern. Alternativ werden die drei Säulen durch eine einfache Hochdruckpumpe befüllt, während die Durchsätze zu jeder der Säulen mittels eines Aufteilventils bzw. -hahns überwacht werden, welches in der Lage ist, die Durchsätze zu steuern (12B). An Säule 1 luden wir die Fraktionen 10, 22, 34 und 46 von Durchlauf 1. Genau der gleiche Durchsatz und Gradient wie in Durchlauf 1 wird erzeugt. Die Säule wird zunächst mit 0,1% TFA in 5% Lösungsmittel B (z.B. 70% Acetonitril in 0,09% TFA) für 10 min gewaschen. Dann fahren wir mit den Gradienten aus Durchlauf 1 mit einem Gradienten von 1% Lösungsmittel B/min fort. Von min 4 bis zum Ende von min 7 (wir sammeln die Fraktionen 4–7 der Met-SO-Peptide oder wir lenken sie in die Ionenquelle der MS-Vorrichtung zur Analyse; alternativ wird das 4–7-Eluat in kleinen Aliquots gesammelt, beispielsweise durch Verwendung eines MikroBlotter (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) für weitere Analyse durch MALDI-TOF-MS. Von min 8–15 wird das Eluat wiederum zum Abfall gelenkt. Bei 16 min sammeln wir den zweiten Stoß von Met-SO-Peptiden, die aus Fraktion 22 im Durchlauf 1 stammen. Diese Sammlung oder Analyse wird während des Intervalls von 16–19 min (Fraktion 16–19) durchgeführt. Dann wird das Eluat wieder verworfen bis zum 28–31-Minuten-Intervall, währenddessen wir den dritten Stoß der Met-SO-Peptide sammeln, welche ursprünglich aus Fraktion 34 abgeleitet werden. Bei 32 min wird die Sammlung gestoppt, und das Eluat wird im folgenden in den Abfall gelenkt. Der Gradient wird wie in Durchlauf 1 mit einer zusätzlichen Sammlung von Fraktionen 40–43 weitergeführt und 58 min nach Beginn des Gradienten fertiggestellt, gefolgt durch einen Re-Äquilibrierungsschritt mit 0,1% TFA für 30 min. Säule II, welche nun mit Fraktionen 14, 26 und 38 beladen worden ist, wird genau unter den gleichen Bedingungen wie oben für Säule I durchlaufen. Nun werden die Met-SO-Peptide in den Zeitintervallen 8–11, 20–23 und 32–35 gesammelt. Säule III wird mit den Fraktionen 18, 30 und 42 geladen, unter den gleichen Bedingungen durchlaufen und unter der gleichen Synchronität wie die Säulen I und II. Die Met-SO-Peptide eluieren nun in den Zeitintervallen 12–15, 24–27 und 36–39. Wenn die Durchläufe mit den drei Peptidsäulen simultan arbeiten, sehen wir keine toten Intervalle zwischen der Met-SO-Peptidanalyse mehr. In der Tat, wie in Tabelle V gezeigt, analysieren wie die Produkte von Säule I während der min 4–7, 16–19, 28–31 und 40–43, diejenigen von Säule II während der min 8–11, 20–23 und 32–35, während solche aus Säule III während der Zeitminuten 12–15, 24–27 und 36–39 gespeichert werden. Diese zehn Zeitintervalle können perfekt ausgerichtet werden, was in einem kontinuierlichen Fluss von Met-SO-Peptiden zu den MS-Instrumenten führt. Hier wiederum ist es wichtig anzumerken, dass die Methioninpeptide, welche ursprünglich in einer Gesamtzeit von 10 min während des primären Durchlaufs eingefangen wurden, nun nach Sortieren an die MS-Apparatur geliefert werden, und zwar gespreizt über einen Gesamtzeitrahmen von 40 min, was viel bessere analytische Bedingungen erzeugt. Zusätzlich ist es auch möglich, den Durchsatz während des Zeitintervalls zu reduzieren, in welchem die Met-SO-Peptide eluieren, so dass das Massenspektrometer die eluierenden Peptide effizienter selektieren und analysieren kann. Daher können wir eine Art von Peak-Parking-Verfahren (Davis et al., 1995) zu der Zeit verwenden, bei der die Met-SO-Peptide das Sortiersystem eluieren. Dies braucht die Anpassung der Elutionszeiten in den anderen verbundenen Säulen. Der zweite dreifache Durchlauf wird nun mit den kombinierten Fraktionen 11, 23, 35 und 47 durchgeführt, die an Säule I getrennt werden, mit Fraktionen 15, 27 und 39 an Säule II und mit Fraktionen 19, 31 und 43 an Säule III. Wiederum werden die Met-SO-Peptide in Zeitintervallen 5–8, 17–20, 29–32 und 41–44 für Säule I aufgesammelt, in Intervallen 9–12, 21–24 und 33–36 für Säule II und in Intervallen von 13–16, 25–28 und 37–40 für Säule III. Alle Kombinationen der Fraktionen aus Durchlauf 1 und das Abspeichern der Met-SO-Peptide sind schematisch in Tabelle V dargestellt. Der Betrieb der Hähne durch den gesamten Ablauf hindurch ist in Tabelle VI dargestellt. Daher können wir durch Verwendung eines Dreisäulen-Peptidsortierers nun alle Met-SO-Peptide aus einem komplexen Gemisch in insgesamt vier sekundären Durchläufen trennen. Da jeder Durchlauf ungefähr 120 min dauern wird, einschließlieh Beladen, Waschen, Elution und Re-Äquilibrierung, kann der gesamte Met-SO-Sortierschritt aus einem Gesamtzelllysat in ungefähr 500 min durchgeführt werden. Dieser Sortierprozess kann direkt unter Verwendung eines Online-verbundenen Massenspektrometers überwacht werden. Alternativ können Eluate von Met-SO-Peptiden für weitere Kombination und Analyse in tertiären Durchläufen gesammelt werden, oder Eluate können in kleinen Aliquots an MALDI-Targets aufgepunktet werden, was eine Analyse mit durchlaufend hohem Durchsatz erlaubt. Es sollte bemerkt werden, dass zusätzlich zu den Bedingungen der RP-HPLC-Chromatographie, wie hier verwendet, der gleiche Sortiervorgang mit Säulensystemen durchgeführt werden kann, was viel schnellere Elutionszeiten erlaubt, wodurch der Gesamtsortierprozess herabgesetzt wird.
  • Beispiel 13: Eine Neunsäulen-Peptidsortiervorrichtung
  • Ein Aufbau einer Neunsäulen-Peptidsortiervorrichtung ist in 13 dargestellt. Die ersten drei Säulen sind mit einer Gradientenpumpe und einem Probeninjektor verbunden. Es existiert eine zweite und eine dritte Serie von Säulen, welche jeweils mit einer Gradientenpumpe und einem Probeninjektor verbunden sind. Die neun Säulen, welche kleine wegwerfbare Säulen sein können, sind in drei Einheiten unterteilt. Einheit A umfasst die Säulen I, II und III, während die Einheiten B und C die Säulen I', II', III' bzw. I'', II'', III'' enthalten. An Säule I laden wir Fraktion 12 aus Durchlauf 1, an Säule II Fraktion 24 und an Säule III Fraktion 36. Jedem Beladungsvorgang folgt ein Waschschritt mit Lösungsmittel A für mindestens 10 min. Dann wird der Gradient gestartet (ein Anstieg von 1% Lösungsmittel B pro min). Der Gradient wird zunächst nur über Säule I laufen gelassen. Diese Säule ist zwischen 0 und 5 min voreingestellt. Die Met-SO-Peptide eluieren zwischen 6 und 9 min, und die Säule wird zwischen 10 und 16 min gewaschen. Bei 17 min, werden die Hähne so angeordnet, dass der Gradient nun durch Säule II hindurchgeht, welche zunächst für 1 min äquilibriert wird. Die Met-SO-Peptide werden zwischen 18 und 21 min aufgesammelt, und die Säule wird von min 22 bis 28 gewaschen. Bei min 29 wird der Gradient in Säule III geleitet, welche 1 min voreingestellt wird. Die Met-SO-Peptide werden zwischen 30 und 33 min eluiert, gefolgt durch einen Waschgang von min 34 bis zum Ende des Gradienten. Das System B (Säulen I', II' und III') wird mit Fraktionen 13, 25 bzw. 37 geladen und mit einem identischen Programm entwickelt, aber mit einer Verzögerung von 3 min gegenüber System A. Daher sortieren die Met-SO-Peptide zu Zeiten 10–13 (I'), 22–23 (II') und 34–37 (III'). Das gleiche Programm wird für System C verwendet (Säulen I'', II'' und III'') mit Fraktionen 14, 26 und 38 und einer Verzögerung von 6 min gegenüber System A. Die korrespondierenden Met-SO-Peptide werden in den Intervallen 14–17 (I''), 26–29 (II'') und 38–41 (III'') aufgesammelt. Daher sortieren wir in einem Schrittvorgehen die Met-SO-Peptide aus 9 Fraktionen gleichzeitig. Vier zusätzliche solcher Durchläufe, in denen die Fraktionen geladen und wie in Tabelle VII aufgezeigt, aufgesammelt werden, führt zu einem vollständigen Sortieren all der in dem ursprünglichen Gemisch vorhandenen Met-SO-Peptide. Eine volle Beschreibung der Ventileinstellungen während des gesamten Durchlaufs wird in Tabelle VIII bereitgestellt. Ein wichtiger Aspekt der Neunsäulen-Peptidsortiervorrichtung ist, dass die Säulenausmaße und die Gesamtausgestaltung des Systems unterschiedlich von dem in dem primären Durchlauf verwendeten sind. Damit ist gemeint, dass es sogar dann, wenn die RP-Lösungsmittel und Lösungsmittelsysteme identisch gehalten werden, möglich ist, dass unterschiedliche Elutionszeiten auftreten. Eine Lösung dieses Problems ist die Verwendung eines gefärbten synthetischen (Ala)n-Arg-Gemischs (siehe Beispiel 14), das dem Peptidgemisch hinzugefügt wird. Dies erlaubt die Verwendung der aufeinanderfolgenden gefärbten Peaks als Referenzpunkte, was die Fraktionsaufsammlung während des primären Durchlaufs führt. Daher können Fraktionen zwischen zwei aufeinander folgenden gefärbten Spitzen oder um die gefärbten Spitzen herum aufgesammelt werden. Die gleichen gefärbten Referenzkomponenten können dann dazu verwendet werden, die Fraktionsaufsammlung zu den Peptidsortierern zu führen. Die Verwendung des Neunsäulen-Peptidsortierers zusammen mit Referenzver bindungen ist insbesondere vorteilhaft in dem Sortierprozess für NH2-endständige Peptide (siehe Beispiele 6 und 7). Im letzteren Fall werden die sortierten Peptide nicht verändert und bleiben mit den farbigen Referenzpeptiden zusammen, während die Hauptmenge der nicht sortierten Peptide zurückbleibt und sich von den gefärbten Referenzen weg bewegt.
  • Ein Durchlauf mittels dieses Neunsäulen-Sortierers wird in ungefähr 60 min durchgeführt, was bedeutet, dass der gesamte Sortierprozess in ±300 min oder 5 h beendet ist. Es ist wichtig anzumerken, dass in diesen Sortierer kleine und preiswerte Säulen verwendet werden können. Wenn nur eine Fraktion pro Säule verarbeitet wird, sind die Durchsatz-Genauigkeiten nicht so wichtig wie in Systemen, wo mehrere Fraktionen an eine Einzelsäule geladen werden. Alle Durchläufe können auch bei niedrigerem Druck durchgeführt werden, was weniger Anforderungen und Pumpen und Hähne stellt. Der Neunsäulen-Sortierer ist auch besser an Situationen angepasst, wo hydrophile Verschiebungen entweder größer oder kleiner als solche sind, die häufig während einer Methioninsulfoxid-Formation gemessen werden. Dies mag der Fall sein, wenn die Methanol-chromatographischen Systeme verwendet werden oder wenn Cystein-Derivate oxidiert werden (siehe Tabelle III). Die hierin beschriebenen unterschiedlichen Peptidsortierer sind einige Beispiele, welche den Aufbau ähnlicher Sortierer mit einer unterschiedlichen Zahl von Säulen nicht ausschließen.
  • Beispiel 14: Kalibrierung von Peptidsortierern
  • Die Effizienz und Genauigkeit der Peptidsortierer hängt hauptsächlich von der Reproduzierbarkeit der Säulentrennungen ab. Daher ist es von praktischem Nutzen für die Installation aber auch für das regelmäßige Überwachen der Sortierer, ein Peptid-Kalibrationsgemisch oder ein Gemisch von Komponenten zu verwenden, welches den gesamten Bereich eines Lösungsmittelgradienten abdeckt und welches überwacht werden kann, entweder durch Massenspektrometrie, Lichtabsorption oder durch andere Mittel. Als ein nicht-beschränkendes Beispiel verwenden wir hier ein chemisch erzeugtes Peptidgemisch, welches aus einer veränderlichen Zahl von Alanin besteht, an welchem ein COOH-endständiger Argininrest angebracht wurde (Alan-Arg mit n im Bereich von 7 bis 42). Dieses Gemisch wird unter Verwendung herkömmlicher Festphasen-Syntheseprozeduren hergestellt bzw. synthetisiert (Merrifield, 1963). Unter Verwendung eines Gemischs von 97% Fmoc-Ala und 3% von tBoc-Ala zur Peptidverlängerung werden frühzeitige Stopps nach jedem Zyklus in 3% der wachsenden Peptidketten erzeugt. Diese Art von Synthesestrategie erbringt ein Gemisch, in welchem sich jede Komponente von der anderen durch das Hinzufügen eines Alanins unterscheidet, was einen Satz von Peptiden erbringt, welches eine ineinander übergehende Veränderung sowohl in der Masse (71 amu) als auch in der Hydrophobizität zeigt. Daher kann im Fall der obigen Beispiele ein gegebenes Elutionsfenster (w1) auch durch ein oder mehrere Peptide aus diesem Gemisch mit gut bestimmten Massenwerten gekennzeichnet werden. Als eine nicht-beschränkende Darstellung ist das Elutionsprofil des NH2-Alan-Arg-COOH-Gemischs an einer C18-RP-Säule unter Verwendung von 0,1% TFA als Ionen und Acetonitril als Modifizierer gezeigt (14A). Eine farbige Version eines solchen Kalibrationsverbunds kann durch Synthetisieren des Poly-Ala-Peptids mit einem zusätzlichen Lysin-Rest erreicht werden, was eine kovalente Hinzufügung eines farbigen Anteils mittels der ε-Aminogruppe erlaubt; Alan-Lys-Gly-Arg.
  • Dieses Peptidkalibrierungsgemisch wird verwendet, um die Eigenschaften und Charakteristiken jeder Säule in der Peptidsortiervorrichtung zu überwachen und um das gesamte System zu kalibrieren. Dies kann durchgeführt werden durch Mischen der Kalibrierungspeptide mit dem aus der Probe abgeleiteten Peptidgemisch während des primären Durchlaufs. Jede Justierung des Elutionsprofils des Kalibrierungsverbundes wird mittels herkömmlicher Mittel durchgeführt, die in dem Gebiet gut bekannt sind, wie beispielsweise durch Auswechseln der Modifizierer-Konzentration, Verändern des Elutionsgradienten, Ändern der Säulentemperatur, Hinzufügen von Ionenpaarungsmitteln, wie beispielsweise Octylamin oder Dodecylsulfat, oder durch Hinzufügen von Tetrahydrofuran oder Propanol zu Lösungsmittel B usw. Das gleiche Peptid-Kalbrierungsgemisch wird auch dazu verwendet, das Massenspektrometer insbesondere in den MALDI-TOF-MS-Maschinen zu kalibrieren, um einen hohen Grad an Genauigkeit zu erreichen (14B).
  • Beispiel 15: Identifizierung der Peptide und Zuordnung der Stammproteine
  • Die gekennzeichneten Peptide oder Identifizierungspeptide, die in einem sekundären Durchlauf eluieren oder von einem tertiären Säulensystem stammen, werden direkt in die Ionenquelle eines Elektrosprüh-Massenspektrometers weitergereicht und dann weiter im MS/MS-Modus aufgeteilt. Partielle Sequenzinformation wird von den MS/MS-Fragmentierungsspektren gesammelt und für eine Peptididentifikation in den Sequenzdatenbanken verwendet. Weil gekennzeichnete Peptide in Durchlauf 2 über ein breites Zeitintervall allmählich eluieren, tritt eine nur minimale Co-Elution dieser Peptide auf, und die Auf lösungsleistung des MS/MS erhöht sich signifikant (siehe beispielsweise Beispiel 18). Die vorliegende Erfindung wird auch dazu verwendet, Peptide mittels MALDI-TOF-MS-Techniken zu identifizieren. In der Tat werden MALDI-TOF-MS-Techniken mit hohem Durchsatz verwendet, um die gekennzeichneten Peptide oder Identifizierungspeptide schnell zu durchsuchen bzw. zu scannen. Dafür nutzen wir beispielsweise das Peptid-basierte Konzentrationsverfahren, bei dem Peptide schubweise ("in batch") an POROS 50 R2-Perlen adsorbiert werden, zur Zielscheibe transferiert werden und am Ziel ("on-target") mit den MALDI-Matrix-Verbindungen desorbiert werden (Gevaert et al., 1997 und Gevaert et al., 1998). Die erhaltene Information ist auf die Gesamtpeptidmassen beschränkt, welche nicht immer ausreichend für eine eindeutige Identifizierung ist, wenn sie nicht genau gemessen werden kann. Es existieren verschiedene Wege, zusätzliche Information zu beschaffen, welche zu einer zwingenderen Information führt.
  • Beispielsweise verifiziert man für Met-SO-Peptide, ob die Peptide Met-SO enthalten. Diese Peptide sind durch einen effizienten neutralen Verlust von Methansulfonsäure (64 amu) charakterisiert, welcher während einer massenspektrometrischen Analyse beobachtet wird (15). Auf den Verlust der Methansulfonsäure folgend, scheinen die Peptide ihre Vibrationsenergie verloren zu haben, was ihnen eine offensichtliche Stabilität in der MALDI-PSD-Analyse verschafft. Es ist daher fast unmöglich, interpretierbare Nachquellenzerfalls-(post source decay; PSD)-Spektren von Met-SO-Peptiden zu erzeugen, wodurch ein Werkzeug zur Peptidinformation unter Verwendung von MALDI-Spektrometrie verloren geht. Es gibt verschiedene Wege, um das PSD-Problem zu umgehen. Als erstes können die Met-SO-Peptide auf ihre ursprüngliche Struktur durch Behandeln mit Reduktionsmitteln, wie beispielsweise N-(Methyl)mercaptoacetamid rückreduziert werden (Houghten und Li, 1981). Zweitens und bequemer werden die Met-SO-Peptide zusätzlich in ihre korrespondierenden Sulfonderivate unter Verwendung von Perameisensäure oxidiert (Hirs, 1956) oder mittels einer längeren Inkubation mit H2O2 (beispielsweise für 24 h bei Raumtemperatur). Sowohl die Methionin-Sulfone als auch die Methionin-Peptide erreichen viel bessere MALDI-PSD-Spektren als die korrespondierenden Sulfoxide. An dieser Stelle ist es Wert festzustellen, dass wenig neutraler Verlust für die Sulfon-Peptide beobachtet wird, was bessere PSD-Spektren ergibt.
  • Bei einem alternativen Ansatz können die Peptide durch Kollisions-aktivierte Dissoziation (CAD) fragmentiert werden. Diese Art von Fragmentierung ist weniger empfindlich auf den durch das Sulfoxid induzierten Dipol und ist daher ein wichtiges Werkzeug beim Erzeugen von Sequenzinformation von Met-SO-Peptiden (Beispiel 18).
  • Ein weiteres Verfahren, um weitere Information zu erlangen, basiert auf einer teilweisen NH2-Endgruppen-Degradation entweder unter Verwendung von chemisch induzierten Leitern mit Isothiocyanat (Chait et al., 1993) oder durch Aminopeptidasen (Caprioli und Fan, 1986). Dieses Verfahren stellt ausreichend Information an den NH2-Endstellen jedes Peptids zur Verfügung, was zu einer vollständigen Identifikation führt. Solche Aminopeptidase-Verdauung oder Leitersequenzierung ist insbesondere vorteilhaft in Systemen mit hohem Durchsatz, aber es ist auch bei weniger komplexen Peptidgemischen praktikabel.
  • Daher ist eine Kombination der genau gemessenen Peptidmassen, der Zuordnung einer oder mehrerer Methioninreste, kombiniert mit einer teilweisen Sequenzinformation von den NH2-Endgruppen der Peptide, ausreichend restriktiv, um die meisten, wenn nicht sogar alle, Peptide aus Gesamtlysaten eindeutig zu identifizieren.
  • An dieser Stelle wird auch auf zusätzliche Methoden hingewiesen, welche zur Identifikation von Peptiden und Stammproteinen beschrieben werden, die auf genau gemessenen Massen basieren und welche in Beispiel 10 beschrieben sind.
  • Beispiel 16: Eine Bestimmung der quantitativen relativen Mengen von Proteinen in zwei Proben
  • Um auf eine relative quantitative Art die Proteinexpressionsniveaus in zwei Sätzen von Zellen oder mehr aus allgemein zwei unterschiedlichen Proben zu vergleichen, werden Proteinlysate jeder Präparation mit Trypsin verdaut. In einer Probe wird die Trypsinverdauung in H2 16O ausgeführt, während die Verdauung der zweiten Probe in H2 18O fortschreitet. Trypsin hat die Möglichkeit des Einbauens zweier Sauerstoffatome von Wassermolekülen an den COOH-Endgruppen von neu erzeugten Seiten (Rose et al., 1983 und Schnölzer et al., 1996).
  • Daher hat Probe 1, welche in H2 16O trypsinbehandelt worden ist, alle Peptide mit normalen Massen, während Probe 2 Peptide enthält (außer für die meisten der COOH-endständigen Peptide), die Massenerhöhungen von 2 und 4 amu entsprechend dem Einbau von ein und zwei 18O-Isotopen aufweisen. Das relative Verhältnis der zwei 18O-Formen eines Peptids hängt von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich der Natur des Peptids, der Aktivität des Enzyms und der Reinheit des 18O-Wassers, und dann muss das Ausmaß des Einbaus von zwei 18O-Isotopen in Peptiden, wenn der 18O-Einbau für relative quantitative Messungen verwendet wird, in den Gesamtberechnungen berücksichtigt werden (Stewart et al., 2001).
  • Während die Verdauungen separat ausgeführt werden, können alle weiteren Prozesse einschließlich des Sortierens der Methionin-Peptide an dem Gemisch der zwei Verdauungsgemische durchgeführt werden, und zwar ohne erkennbaren Rückaustausch von Sauerstoffatomen. Die 16O- und 18O-Verdauungsgemische werden gemischt und der Isolierung der gekennzeichneten, an Methionin veränderten Peptide (Met-SO-Peptid) unterworfen. Die Methionin-gekennzeichneten Peptide können beispielsweise wie in Beispiel 15 beschrieben identifiziert werden. Die leichten (16O-) und schweren (18O-)Peptide sind chemisch sehr ähnlich und werden jeweils auf die gleiche Art koppeln. Sie werden auf die gleiche Art ionisieren. Nur während einer Massenspektrometrie werden sie sich in das leichte Peptid und das schwere Peptid auftrennen (letzteres hat höhere Massen von 2 und 4 amu wegen des Einbaus eines oder zweier 18O-Atome). Die durch den 18O-Einbau eingeführte Ionentrennung ist ausreichend, um die Verhältnisse der leichten gegenüber denen der schweren Peptide genau zu messen und daher das Verhältnis eines Proteins in den zwei Proben zu bestimmen (z.B. Mirgorodskaya et al., 2000). Eine schematische Darstellung des gesamten Vorgangs wird in 16A gegeben.
  • Um den 18O-Einbau für die relative quantitative Analyse zu testen, haben wir eine Blutplättchen-zytosolischen und Membranskelett-Fraktion (hergestellt wie in den Beispielen 20 und 21) einmal in normalem 16O-Wasser und einmal in 18O-Wasser (95% rein, ARC Laboratories, Amsterdam, Niederlande) unter Verwendung von Trypsin für 16 h bei 37°C verdaut. Vor dem primären Durchlauf wurde ein Teil des 16O-Verdauungsgemischs mit zwei Teilen des 18O-Digests gemischt, die Probe wurde auf 1% TFA angesäuert und die Methionin gekennzeichneten Peptide wurden aus dem Peptidgemisch, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung eines Einsäulen-Peptidsortiersystems (Beispiel 11 aussortiert.
  • Bei der LC-MS-Analyse wurden die 18O/16O-Verhältnisse der beobachteten Peptidionen wie oben beschrieben berechnet. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in 16B gezeigt und bestätigen, dass Peptidverhältnisse allgemein um 2 herum variieren, was anzeigt, dass diese Art von Isotopen-Markierungstechnologie für eine quantitative Proteomanalyse geeignet ist.
  • Wir haben weiterhin die Verwendung des 18O-Markierens durch Verdauen zweier gleicher Mengen von Rinderserumalbumin mit Trypsin bestätigt, eines in normalem H2O und das zweite in H2 18O (95% 18O). Nach 18 h Verdauung wurden beide Peptidgemische gemischt, durch HPLC getrennt und mittels MALDI-TOF-MS analysiert. Für 19 Peptide verglichen wir die Peakhöhen der Isotope, welche durch die Markierungsprozedur nicht beeinträchtigt waren (z.B. die 13C-Isotope). Die Werte wurden weiterhin aufgrund der Anwesenheit von 95% H2 18O korrigiert und in 17 kombiniert. Wir maßen ein durchschnittliches Verhältnis von 1,03 für die 19 Peptide, was sehr gut mit dem molaren Verhältnis korrespondiert, bei welchem die Protein- Verdauungsgemischs am Beginn des Experiments gemischt wurden. Die meisten Werte stimmen sehr gut mit dem erwarteten Wert überein, wobei die Extremwerte 0,84 und 1,20 betragen (Tabelle IX). Dieses Experiment zeigt, dass eine Markierung mit stabilen Isotopen während einer Verdauung mit Trypsin die Grundlage für eine quantitative differenzielle Proteomuntersuchung bildet und mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
  • Die differenzielle isotopische Markierung kann auch auf alternativen Wegen durchgeführt werden, von denen einige nun kurz angemerkt werden. Markierungsprozeduren beruhen auf bekannten chemischen Reaktionen und können entweder auf der Proteinebene oder auf der Peptidebene durchgeführt werden. Weiter unten beschreiben wir eine Zahl von Reaktionen, welche für differenzielles Markieren verwendet werden. Peptide können beispielsweise durch die folgenden Reagenspaare geändert werden: Methylisocyanat/Trideuteromethylisocyanat (v); Ethylisocyanat/Pentadeuteroethylisocyanat (vi); Phenylisocyanat/Pentadeuterophenylisocyanat (vii); Acetyl-N-hydroxysuccinimid/Trideuteroacetyl-N-hydroxysuccinimid (viii). Alle diese Verbindungen sind dafür bekannt, dass sie spezifisch und quantitativ mit α-NH2- und ε-NH2-Gruppen reagieren. Die endgültige Wahl des Veränderungsreagens wird auf der Verfügbarkeit der deuterierten Form, dem Preis, der chemischen Stabilität und dem laboratorischen Komfort des Reagens beruhen. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Stabilität des Adduktes während des Ionisationsschritts in dem Massenspektrometer. Die Reaktionsgleichungen für jede dieser Reagenzien in deuterierter Form ist unten angegeben.
  • Figure 01180001
  • Für den Fall, dass größere Massendifferenzen zwischen den "leichten" und "schweren" Peptiden benötigt wird, könnten dann größere deuterierte Gruppen oder Gruppen, in denen 13C-, 15N und Deuterium kombiniert sind, verwendet werden. Beispielsweise würde es einem die Verwendung einer Hydroxybutyrylgruppe (HO-CD2-CD2-CD2-CO-) erlauben, einen Unterschied von 6 amu zu erzeugen, um die NH2-Endgruppe spezifisch zu markieren. Alternativ würde es die Verwendung einer 13CD3-13CD2-CO-Propionylgruppe einem erlauben, einen Unterschied von 7 amu'2 zu erzeugen um die NH2-Endgruppe zu markieren. Sogar noch expliziter würde es uns die Verwendung von 13C-markiertem und deuteriertem Nicotinolderivaten (N13C5D4CO-) erlauben, eine Massendifferenz von 9 amu zu verwenden. Es sollte den Fachleuten bekannt sein, dass von allen diesen Gruppen N-Hydroxysuccinimid oder Sulfo-N-hydroxysuccinimid-Ester synthetisiert werden können.
  • Es ist auch klar, dass D Deuterium in der in dieser Erfindung beschriebenen Formel 2H darstellt.
  • Peptide können auch mittels einer Schiff'schen Basenbildung mit deuteriertem Acetol gebildet werden, gefolgt durch Reduktion mit Natriumborhydrid (Geoghegan et al., 1979). Bei dieser Reaktion ist beschrieben worden, dass sie unter milden Bedingungen durchgeführt wird und zur Hinzufügung nur eines Moleküls Acetol pro Aminogruppe führt, wodurch ein sekundäres Amin gebildet wird (ix). Die deuterierten Amine werden nun fünf nicht-austauschbare Deuteriumatome enthalten und sich durch 5 amu von ihrer nicht-deuterierten Entsprechung absetzen. Peptide werden sowohl in der α-NH2-Gruppe als auch in den ε-NH2-Gruppen von Lysin verändert, was zu einem Massenanstieg von fünf (für Arginin-Peptide) oder 10 amu (für Lysin-Peptide) führt. Die dahinter stehenden Reaktionen sind unten gezeigt.
  • Figure 01190001
  • Die hier aufgeführten Beispiele stellen nur einige Darstellungen eines breiteren Spektrums von Veränderungs- bzw. Umwandlungsreaktionen dar, welche zum differenziellen isotopischen Markieren verwendet werden können.
  • Beispiel 17: Eine quantitative differenzielle Proteomanzeige, um molare Verhältnisse von Proteinen in einer Probe anzuzeigen
  • Das Vorgehen zur Proteinidentifizierung über ihre repräsentativen Peptide unter Verwendung von Massenspektrometrie ist qualitativ, aber nicht quantitativ. Tatsächlich zeigen Peptide differenzielle Verluste auf ihre Reinigung folgend, und Peptide können auf eine sehr variable und unvorherbestimmbare Art ionisiert werden, und zwar abhängig von ihrer chemischen Natur und aufgrund der anderen in dem Gemisch vorhandenen Peptide. Dieses Phänomen ist in dem MS-Gebiet als Ionisationsunterdrückung gut bekannt (Krause et al., 1999). Jedoch wird, wie in Beispiel 16 gezeigt, die Massenspektrometrie quantitativ, wenn eine der zwei Proben mit einer Isotopen-Markierung markiert werden kann, welche die Peptide chemisch nicht differenziert, welche aber in dem Massenspektrometer unterschieden und gemessen werden kann. Wir verwenden nun das gleiche Prinzip der differenziellen Isotopen-Markierung, um die relativen Verhältnisse der Proteine in einer einzigen Probe zu messen. Dies kann durchgeführt werden durch Hinzufügen von bekannten Mengen von Referenzpeptiden zu der Probe. Dies sind Peptide, die von den in der Probe vorhandenen Peptiden abgeleitet worden sind, und deren Sequenz ausreichend ist, um ihr Stammprotein eindeutig zu identifizieren. Referenzpeptide werden vorzugsweise auch als einfach isolierte Peptide ausgewählt, welche zusätzlich bei der Massenspektrometrie gut ionisieren. In dem Protokoll zum Auswählen von Methionin-gekennzeichneten Peptiden (Met-SO-Peptide) sind die Referenzpeptide Methionin-enthaltene Peptide, sie enthalten vorzugsweise auch einen Argininrest oder werden für eine effiziente Ionisation behandelt. Jedes zu quantifizierende Protein sollte durch mindestens ein und vorzugsweise zwei oder mehr Referenzpeptide repräsentiert werden. Referenzpeptide sollten sich von ihren synthetischen Entsprechungen durch eine unterschiedliche Isotopenmarkierung unterscheiden, welche ausreichend groß ist, um beide Formen in herkömmlichen Massenspektrometern zu unterscheiden. Wie hier bereits ausgeführt ist, ist ein Unterschied von 4 amu ausreichend. Eine solche isotopische Differenzierung kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden, und wir stellen hier einige Beispiele vor. Am bequemsten werden isotopisch markierte Referenzpeptide durch Trypsinverdauung des Proteingemischs in H2 18O erzeugt. Die korrespondierenden synthetischen Entsprechungen der Referenzpeptide werden mit ihren natürlichen Isotopen erzeugt bzw. synthetisiert. Eine solche chemische Synthese kann in großem Maßstab unter Verwendung eines Mehrfachpeptidsynthetisierers (Zuckermann et al., 1992) durchgeführt werden.
  • Ein Beispiel eines Protokolls, um die Quantität eines Zielproteins in einer bestimmten Protein enthaltenden Probe zu bestimmen, lässt sich folgendermaßen zusammenfassen: (i) ein Referenzpeptid wird aus dem Zielprotein ausgewählt, (ii) das korrespondierende synthetische Gegenstück wird synthetisiert, (iii) die Proteinprobe wird mit Trypsin unter Anwesenheit von H2 18O verdaut, (iv) eine bekannte Menge des synthetischen Referenzpeptids wird dem Protein-Peptid-Gemisch hinzugefügt (vorzugsweise ist die Menge des synthetischen Referenzpeptids vergleichbar mit der erwarteten Menge des Referenzpeptids), (v) das Gemisch wird der Erfindung unterworfen, um die gekennzeichneten Peptide zu separieren, (vi) die gekennzeichneten Peptide werden beispielsweise mittels MALDI-TOF-MS analysiert, (vii) die Referenzpeptide und das synthetische Referenzpeptid werden in dem Prozess coeluieren und werden als Zwillingsspitzen in dem Massenspektrum auftauchen, (viii) die Peakoberfläche jeder der Doppelspitzen wird berechnet, (ix) das Verhältnis zwischen beiden Spitzen erlaubt es, die Menge des Referenzpeptids und, zugehörig, die Menge des Zielproteins in der bestimmten Probe zu berechnen. Dieses Protokoll kann offensichtlich auch für Identifizierungspeptide verwendet werden und kann daran auf verschiedene Wege angepasst werden. Es kann beispielsweise einfach ausgeweitet werden, um die Quantität mehrfacher (sogar mehr als 100) Zielproteine in einer Probe zu bestimmen und daher die Produktionsniveaus vieler Zielproteine in einer gegebenen Probe messen. Offensichtlich kann dieser Ansatz auch dazu verwendet werden, die Menge von Zielproteinen in einer großen Zahl von Proben zu messen und zu vergleichen. Solche Ergebnisse können beispielsweise verwendet werden, um Krankheiten oder den Effekt und Nebeneffekte von Proben vorauszusagen, zu überwachen oder zu diagnostizieren.
  • Bei einem alternativen Ansatz tragen die synthetischen Peptide die ungewöhnlichen Isotope, während die Referenzpeptide, die aus den Proteinen erzeugt wurden, natürliche Isotope sind. Falls wir beispielsweise Methionin-enthaltende Peptide auswählen, ist es möglich, die kommerziell verfügbaren deuterierten Methionine (CH3-SCD2CD2-CH(NH2)COOH) in die synthetischen Referenzpeptide einzubauen, wodurch der Gesamtpeptidmasse 4 amu hinzugefügt werden. Alternativ können die synthetischen Referenzpeptide auch deuteriertes Arginin enthalten, welches nun 7 amu zur Gesamtpeptidmasse hinzufügt. Es sollte klar sein, dass jede Aminosäure, von der deuterierte, 15N- oder 13C-Formen existieren, in diesem Protokoll bedacht werden kann. Noch ein weiterer alternativer Ansatz ist es, die synthetischen Referenzpeptide mit einer farbigen fluoreszenten oder auf andere Weise messbaren Gruppe angebracht zu gestalten. Durch Einführen einer allgemeinen farbigen Marke, welche den gleichen molekularen Extinktionskoeffizienten für alle Referenzpeptide zeigt, wird es einfach sein, die Menge jedes Referenzpeptids zu quantifizieren. Die quantifizierbare Gruppe sollte mit einem Anker oder einer Verbindung mit dem Peptid verbunden sein, welche ausreichend stabil während normaler Konservierung ist, aber welche von dem Referenzpeptid durch gesteuerte chemische oder enzymatische Prozesse freisetzbar ist. Beispielsweise kann ein Farbstoff wie beispielsweise eine 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonatgruppe (maximaler molekularer Absorptionskoeffizient von 557 mm) mittels einer Ala-Lys-Verbindungssequenz mit dem Referenzpeptid verbunden werden (Reedman und Radda, 1968). Die Trypsinverdauung, welche normalerweise durchgeführt wird, um das Peptidgemisch aus dem gesamten Lysin zu erzeugen, würde nun auch das Referenzpeptid an der COOH-Endgruppenverbindung des Lysinrests spalten und daher den Farbstoff und die Verbindung von dem Rest der Peptide freigeben (x).
  • Figure 01220001
  • Wenn die Proteinverdauung in H2 18O in Anwesenheit der farbigen Referenzpeptide durchgeführt wird, werden die freigesetzten Referenzpeptide auch an ihrer freien COOH-Endgruppe isotopisch markiert. Daher wird die Trypsinverdauung der farbigen Peptide separat in H2 16O durchgeführt und dem Gesamtpeptidgemisch erst am Ende der Verdauung hinzugefügt. Das Verbindungsstück zwischen dem Farbstoff und dem Referenzpeptid kann ebenfalls chemisch unter Bedingungen gespalten werden, bei denen der Rest des Peptids nicht beeinflusst wird.
  • Beispiel 18: Analyse des Proteoms von Escherichia coli (Stamm K12)
  • 109 E. coli-K12-Zellen wurden aus einer kultivierten Gleichgewichtswachstumsphase entfernt, durch sanfte Zentrifugierung pelletiert, 4 Mal mit 1 ml von 100 mM NaCl in 20 mM Phosphatpuffer bei pH 7,2 gewaschen und durch Ultraschall in 1 ml von 4 M Harnstoff in 100 mM Phosphatpuffer bei pH 8,0 lysiert. Das Lysat wurde durch Zentrifugierung bei 100.000 × g in einer "Airfuge" gereinigt, worauf die Harnstoffkonzentration auf 1 M unter Verwendung von 100 mM Phosphatpuffer bei pH 8,0 herabgesetzt wurde. 10 μg Trypsin wurden 1 ml des Proteingemischs hinzugefügt (was 250·106 E. coli-Zellen entspricht), und die Verdauung konnte über Nacht bei 37°C durchgeführt werden, und wurde durch Ansäuerung mit TFA gestoppt. Ein Viertel des sich ergebenden Protein-Peptid-Gemischs (entsprechend 50·106 E. coli-Zellen) wurde auf eine 2,1 mm i.d. × 25 cm C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule, die in 0,1 TFA (Lösungsmittel A) äquilibriert bzw. ins Gleichgewicht gebracht wurde. Die Säule wurde zuerst für 10 min mit 5% Lösungsmittel B (70% Acetonitril in 0,09% TFA) gewaschen, wonach mit einem linearen Gradienten ansteigender Konzentrationen von Lösungsmittel B verwendet wurde, um die Peptide aus der stationären Säulenphase zu eluieren: der Durchsatz wurde bei 80 μl pro min gehalten, und ein Gradient von 1% Lösungsmit tel B pro min wurde festgesetzt. Fraktionen von 1 min (d.h. 80 μl) wurden gesammelt. Die erste Fraktion wurde 18 min nach dem Start des Gradienten gesammelt und mit 10 nummeriert. Dieser Fraktion folgten 39 zusätzliche 80 μl-Fraktionen und bei der letzten Fraktion (Fraktion 49) hatte die Konzentration von Lösungsmittel B 63% erreicht, was ungefähr 44% Acetonitril entspricht. Der Gradient wurde für 37 min ohne Fraktionsaufsammlung weitergeführt und 105 min nach dem Start des HPLC-Laufs beendet. Das UV-Absorptionsprofil (bei 214 nm) dieses Durchlaufs (hier als primärer Durchlauf bezeichnet) ist in 10 gezeigt. Alle gesammelten Fraktionen wurden vakuumgetrocknet und bei –20°C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Fraktionen, die für die sekundären Durchläufe zusammengegeben wurden, wurden in 59 μl von 1% TFA wieder aufgelöst und in 0,5% H2O2 durch Hinzufügen von 1 μl einer 30%igen Stammlösung von H2O2 gemacht. Die Oxidationsreaktion konnte für 30 min bei 30°C weitergeführt werden, worauf die Probe nicht getrocknet, sondern unmittelbar für eine Chromatographie verwendet wurde. Unter Verwendung eines Einzelsäulen-Peptidsortierer (siehe Beispiel 11) kombinierten wir Fraktionen 10, 22, 34 und 46 für den ersten sekundären Durchlauf (Lauf 2A) und sammelten die oxidierten Methionin-Peptide in den Zeitintervallen 4–7, 16–19, 28–31 und 40–43. Für das Zusammengeben der anderen Fraktionen des primären Durchlaufs verwendeten wir die Kombinationen und Sammelzeiten, wie sie in Tabelle IVA zusammengefasst sind. Das UV-Absorptionsprofil eines typischen sekundären Durchlaufs (Lauf 2A, in welchem Fraktionen 10, 22, 34 und 46 kombiniert wurden), ist in 11 gezeigt. Die Zeitintervalle, während derer diese Peptide gesammelt wurden, sind zwischen den Säulen in 11 gezeigt. Während dieser 4 min-Periode wurden die Peptide in acht aufeinanderfolgenden Fraktionen von jeweils 30 s (d.h., in 40 μl-Fraktionen) gesammelt. Insgesamt erlangten wir 32 Fraktionen von Durchlauf 2A. 11 zusätzliche sekundäre Durchläufe wurden aufeinanderfolgend ausgeführt, um den vollen Peptidsatz (Tabelle IVA) abzudecken. Eine Suspension hydrophober Poros® 50 R2-Perlen wurde den gesammelten Fraktionen hinzugefügt (Gevaert et al., 1997), und die Fraktionen wurden vakuumgetrocknet. Peptide, die auf den hinzugefügten Perlen konzentriert waren, wurden in 0,7 μl einer MALDI-Matrix-Lösung (enthaltend 4% α-Cyanozimtsäure und 1%-2,5-Dihydroxybenzoesäure) in 0,1% TFA-Acetonitril (1/1) desorbiert und zum MALDI-Target für eine Peptidmassenanalyse in dem Reflectron-Modus transferiert (welcher eine einfache Überwachung und Überprüfung der Methionin-Sulfoxid-enthaltenden Peptide erlaubt). 15 zeigt die MALDI-RETOF-MS-Spektren von zwei Fraktionen aus dem sekundären Durchlauf 2A, in welchem, wie erwartet, nur Methionin-Sulfoxid-Peptide beobachtet wurden. Im Anschluss an die Analyse aller in den gesammelten 320 sekundären Fraktionen vorhandener Peptide waren wir in der Lage, 1720 unterschiedliche Peptide zu messen, von denen 1618 mindestens einen Methionin-Rest enthielten. Die gemessenen Massen dieser 1618 Peptide sind in Tabelle IX aufgelistet. 18 zeigt für jede Fraktion des primären Durchlaufs die Zahl der Met-SO-Peptide (blau) gegen Peptide, von denen wir nicht nachweisen konnten, dass sie ein oxidiertes Met enthalten (rot).
  • Dies entspringt entweder der Tatsache, dass der typische neutrale Verlust von Methansulfensäure nicht klar beobachtet wurde oder dass einige nicht Methionin enthaltende Peptide während des Sortierprozesses hindurchschlüpften. In diesem Experiment bestätigten wir, dass die sortierten Peptide für 94% aus Peptiden bestehen, für welche das Vorhandensein von Met verifiziert werden konnte. Dies illustriert die Spezifizität unseres Sortiersystems sogar dann, wenn Gesamtzelllysate verwendet wurden.
  • In einem zweiten Schritt haben wir nun die sortierten Peptide und ihre korrespondierenden Stammproteine identifiziert. Daher verdauten wir wieder 1 ml des aus den 250·106 E. coli-K12-Zellen hergestellten Proteingemischs in 1 M Harnsäure und 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 8,0. 10 μg Trypsin wurden hinzugefügt, und die Verdauung konnte über Nacht bei 37°C ablaufen. Am Ende der Verdauung wurde das sich ergebende Protein-Peptid-Gemisch mit Tributylphosphin für 5 min reduziert und mit Ameisensäure (Endkonzentration 1%) angesäuert. Ein Fünftel des sich ergebenden Protein-Peptid-Gemischs (entsprechend 50·106 E. coli-Zellen) wurde auf eine C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule geladen (ID 2,1 mm × 250 mm; Vydac 218MS52). Diese Säule war mit 0,05% COOH als Lösungsmittel A äquilibriert. Die Säule wurde zuerst für 10 min mit 100% Lösungsmittel A ausgewaschen. Ein linearer Gradient von 1% Lösungsmittel B pro min (Lösungsmittel B = 0,05% HCOOH in 70% Acetonitril) wurde verwendet, um die Peptide bei einer Strömungsrate von 80 μl pro min zu eluieren. Die Peptid-UV-Absorptions-Profile wurden bei 214 nm unter Verwendung eines UV-Detektors (Applied Biosystems Inc. 759A Absorptionsdetektor) aufgezeichnet. Fraktionen von 1 min wurden gesammelt. Die erste Fraktion wurde 30 min nach Start des Gradienten gesammelt und mit 30 nummeriert. 50 Fraktionen wurden weiterhin bis Nr. 80 gesammelt. Alle gesammelten Fraktionen wurden vakuumgetrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert. Fraktionen, die für die sekundären Durchläufe zusammengegeben wurden, wurden in 50 μl von 1% TFA rückaufgelöst und machten 0,5% in H2O2 durch Hinzufügen von 1 μl einer Stammanmeldung von 30% H2O2. Die Oxidationsreaktion (der Veränderungsschritt für Methionine als einer bestimmten Aminosäure gemäß der vor liegenden Erfindung) konnte für 30 min bei 30°C ablaufen, wonach die Probe nicht getrocknet sondern unmittelbar auf die RP-Säule für den sekundären Durchlauf geladen wurde. Unter Verwendung eines Einzelsäulen-Peptidsortierers, der in Beispiel 11 beschrieben ist, kombinierten wir die folgenden Fraktionen für den primären Durchlauf: 41, 54, 67, 80 und sammelten die oxidierten Peptide (die gekennzeichneten Peptide) in den entsprechenden Zeitintervallen 31–39, 44–52, 57–65 und 70–78. Zusammengegebene Fraktionen des primären Durchlaufs und gesammelte Fraktionen aus dem sekundären Durchlauf sind in Tabelle X angegeben. Im Gegensatz zu unserem vorhergehenden Beispiel, bei dem die gekennzeichneten Peptide in 4-min-Zeitintervallen gesammelt wurden, sammelten wir nun die gekennzeichneten Peptide in einem Zeitintervall von 8 min (8 Fraktionen von jeweils 8 μl) und 1 min vor der Elution der unveränderten Peptide. Daher δmax = 10 min, δmin = 1 min und w2 = 8 min mit w1 = 1 min. Da jeder sekundäre Durchlauf 4 kombinierte Fenster (w2) enthielt, wurden die Met-SO-Peptide (daher Methionin-veränderte gekennzeichnete Peptide) über 32 Fraktionen von jeweils 80 μl gesammelt. Dann wurden alle ungerade nummerierten sekundären Fraktionen kombiniert, getrocknet und wieder in 45 μl Lösungsmittel A (= 0,05% HCOOH) aufgelöst; die Hälfte dieses Gemischs wurde auf eine 0,075 mm interner Durchmesser (15 cm lang) Nano-Säule (C18 Pepmap, LC Packings) geladen, welche mit einer Auffangsäule und einem Applied Biosystems Inc. 120A-Analysegerät-HPLC verbunden war. Ein Gradient von 0% B bis 100% B in 220 min wurde mit 0,05% HCOOH als Lösungsmittel A und 0,05% HCOOH in 70% Acetonitril als Lösungsmittel B gebildet. Die Voraufteilungs-Lösungsmittelströmungsrate von 60 μl pro min wurde auf ungefähr 200 nl pro min unter Verwendung eines Strömungsaufteilers (Acurate, LC Packings) reduziert. Die eluierenden Peptide wurden über eine metallbeschichtete Quarzglasnadel (FS360-20-10-D-5-C7, New Objective) in die Z-Sprüh-Ionenquelle eines Q-TOF-Massenspektrometers (Micromass UK Limited, Altincham, UK) eingeführt. Daten wurden in dem datenabhängigen Aufnahmemodus unter Verwendung von Masslynx NT (Version 3.4) analysiert. Nur doppelt geladene Ionen wurden automatisch für eine MS/MS-Analyse ausgewählt. Der Schwellwert wurde auf 40 Zähler/s festgesetzt, und ausgewählte Ionen wurden für 4 s durch Kollision mit Argonatomen fragmentiert. Alle MS/MS-Spektren wurden mittels MASCOT (Matrix Science Ltd., London) akkumuliert und unter Verwendung einer Proteindatenbank, die nur E. coli-Proteine umfasst, analysiert. Eine eindeutige Identifikation beruht auf MASCOT's "Wahrscheinlichkeits-basiertem Mowse-Kern" (Perkins et al., 1999). Die verbleibende Hälfte jeder der Fraktionen wurde wiederum einem Nano-LC-MS/MS unter Verwendung einer Ausschließungsliste unterworfen, welche alle die doppelt geladenen Ionen enthält, welche in dem vorhergehenden Durchlauf entdeckt wurden. Der Schwellwert wurde nun auf 25 Zähler/s festgesetzt, und die ausgewählten Ionen wurden für 5 s fragmentiert. Die gleiche Abfolge wurde für die gerade-nummerierten Fraktionen wiederholt. Alle Protein-Identifizierungsdaten wurden schließlich kombiniert. Aus allen Nano-LC-MS/MS-Durchläufen wurde eine Gesamtmenge von 6.437 CID-Spektren erzeugt (Tabelle XI). Diese CID-Spektren führten zu 2543 kommentierten Spektren nach Eingeben in den MASCOT-Server.
  • Eine Identifizierung der sortierten Met-SO-Peptide aller Fraktionen führte zur Identifizierung von ungefähr 767 unterschiedlichen E. coli-Peptiden (Tabelle XII). Jedes Protein wurde durch im Mittel 2,2 Methionin-enthaltene Peptide pro Protein abgedeckt.
  • Wir identifizierten alle messbaren ribosomalen Proteine, welche ungefähr 10% der Gesamtproteinmasse von E. coli darstellen, neben Familien von Nebenproteinen, wie beispielsweise der Aminoacyl-t-RNA-Synthetasen und neben sehr geringfügigen Proteinen wie beispielsweise dem lac-Repressor (bestätigt durch drei unabhängig isolierte Met-Peptide) noch mindestens 19 andere Repressoren. Diese Ergebnisse zeigen das Ausmaß des durch diese Erfindung erreichten dynamischen Bereichs, was die Detektion von seltenen Proteinen in Anwesenheit von hauptsächlichen vorhandenen Proteinen erlaubt. Zusätzlich identifizierten wir auch eine wichtige Zahl bekannter Membranproteine und Proteine mit einem hohen hydrophoben Profil, was einen besseren Zugang zu dem großen Feld biologisch wichtiger Membranproteine nahe legt.
  • Wenn die doppelte Menge von E. coli-Zellen (100·106 Zellen) mittels herkömmlicher 2D-Gelanalyse analysiert wurde, gefolgt durch MALDI-basierte Proteinidentifizierung, wurden 86 Proteine identifiziert.
  • Verglichen mit den 767 Proteinen in der frei verfügbaren Untersuchung liegt hier eine Empfindlichkeit vor, welche mindestens 10 Mal und höchstwahrscheinlich sogar viel höher ist als letztere. Es ist auch wichtig, zu betonen, dass eine Verunreinigung durch Keratine von menschlicher Haut, welche häufig als "die klassische Verunreinigung" beobachtet wird, wenn 2D-Gele benutzt werden, drastisch reduziert und sogar vollkommen abwesend war, wenn die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden. Diese Analysen wurden mit 1 Äquivalent von 50·106 E. coli-Bakterien durchgeführt. Dies entspricht Proteinmengen, wel che in ±50.000 bis 100.000 Tierzellen vorhanden sind, was die hohe Empfindlichkeit der Technik zeigt. Die Erfindung erlaubt es, die Proteome beginnend von einer kleinen Zahl von Zellen zu bestimmen. Dies erlaubt es, differenzielle Proteinausdrücke in Situationen zu analysieren, welche außerhalb der Reichweite herkömmlicher Anwendungen liegt. Durch die vorliegende Erfindung lässt sich eine Proteinproduktion in kleinen Tumorbiopsien analysieren, in kleinen Teilregionen des Hirns, in Zellen, welche durch Zellsortierung ausgewählt worden sind, in kleinen Teilregionen des Herzens, in Plaque-bildenden Stellen in Blutgefäßen usw. Die erfindungsgemäßen Verfahren sortieren die Methionin-Peptide effizient aus hochkomplexen Gemischen heraus. Darüber hinaus erhält man die gekennzeichneten Peptide nicht auf einmal, sondern allmählich über viele Fraktionen sortiert und daher in das Massenspektrometer in einer zusammenhängenden Weise eingeführt, welche eine viel effizientere Detektion sicherstellen. Dies wird am besten durch die Detektion von 1618 unterschiedlichen Met-Peptiden von einem E. coli-Proteom unter Verwendung der MALDI-TOF-MS-Detektion der Eluate des sekundären Durchlaufs illustriert.
  • Es sollte bemerkt werden, dass, falls gewünscht, die erfindungsgemäßen Verfahren auch ohne die Verwendung von toxischen oder korrosiven Materialien erreicht werden können. Beispielsweise kann Acetonitril durch Ethanol und TFA durch einen NH4Ac-Puffer ersetzt werden, ohne die Gesamtsortierqualität zu beeinträchtigen.
  • Beispiel 19: Partielle Proteomanalyse menschlichen Plasmas
  • Als Ausgangsmaterial wurde 1 ml gefriergetrockneten menschlichen Plasmas (das ungefähr 60 mg Proteinmaterial enthält und im wesentlichen frei von verunreinigenden Zellen ist) verwendet. Die getrocknete Probe wurde in 1 ml frisch präpariertem 8 M Harnstoff erneut aufgelöst, welcher 2% Tributylphosphin und 50 mM Tris-HCl bei pH 8,7 enthielt. Vor der Verdauung wurde die Konzentration des Harnstoffs 4 Mal durch Hinzufügen von 3 ml von 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,7) herabsetzt. Eine Fraktion dieser Probe von 200 μl (entsprechend ungefähr 3 mg des Proteinmaterials) wurde zur Proteinverdauung mit 20 μg Trypsin (Sequenzierungsgrad-modifizierte Trypsin-Form Promega, Madison, WI, USA) verwendet. Die Verdauung lief über Nacht bei einer konstanten Temperatur von 37°C ab und wurde durch Säuerung gestoppt. Die Hälfte dieses Verdauungsgemischs wurde präkonditioniert durch Durchlaufenlassen der Peptide über eine Probenreinigungs-RP-Säule (Agilent Technologies) (2,1 interner Durchmesser × 20 mm, gepackt mit Vydac C18-RP-Perlen), unter Verwendung eines steilen Gradienten von Acetonitril in 0,1% TFA. Ein linearer Gradient von 0% Lösungsmittel B (70% Acetonitril in 0,1% TFA in Wasser) zu 100% Lösungsmittel B wurde innerhalb von 14 min bei einer Strömungsrate von 0,2 ml pro min erzeugt. Das gesamte Eluat wurde gesammelt, vakuumgetrocknet und wieder in 100 μl Lösungsmittel A (0,1% TFA in Wasser) aufgelöst.
  • Das Protein-Peptid-Gemisch wurde dann dem Sortierprozess unterworfen. Nach Laden des Peptidgemischs wurde die Säule mit 0,1% TFA in Wasser (Baker HPLC-analysiert, Mallinckrodt Baker B. V., Deventer, Niederlande) (Lösungsmittel A) für 20 min bei einem konstanten Fluss von 1 ml/min unter Verwendung eines Waters ACTION Analysegeräts (Waters Corporate, Milford, MA, USA) gereinigt. Daraufhin folgend wurde ein linearer Gradient von 70% Acetonitril (Baker-HPLC-analysiert) in 0,1% TFA in Wasser (100% Lösungsmittel B über 70 min) verwendet, daher ein Anstieg von 1% Lösungsmittel B pro min, um die Peptide von der RP-Säule zu eluieren. In einer letzten Phase wurde die Säule mit Lösungsmittel B ausgespült und mit Lösungsmittel A vor der nächsten Probeneinspritzung wieder ins Gleichgewicht gesetzt. In Durchlauf I wurden in einem Zeitrahmen zwischen 28 min (entsprechend 11,4% Lösungsmittel B oder 8% Acetonitril) und 70 min (71,4% Lösungsmittel B oder 50% Acetonitril) eluierte Peptide in Fraktionen von 1 min (oder 1 ml) unter Verwendung eines Gilson 22 l XL-Flüssigkeitsbehandlers (Gilson SAS, Villers Le Bel, Frankreich) gesammelt. Insgesamt 42 primäre Fraktionen wurden so gesammelt.
  • Jede primäre Fraktion wurde vor Oxidation der Methionin-Reste vollständig getrocknet. Primäre Fraktionen, welche für die sekundären Durchläufe zusammengegeben werden konnten (in einer analogen Aufstellung wie der in Tabelle IVA beschriebenen), wurden in 100 μl von 1% TFA rückaufgelöst, welchen 2 μl 30% H2O2 hinzugegeben wurden. Die Oxidationsreaktion der Methionin-Reste lief für 30 min bei 30°C, wonach die primären Fraktionen zusammengegeben und an die gleiche RP-HPLC-Säule geladen wurden, welche für die primäre Trennung verwendet wurde, und Peptide wurden in diesem sekundären Durchlauf unter exakt den gleichen chromatographischen Bedingungen, wie sie während des primären Durchlaufs vorlagen, fraktioniert. Hier wurden gekennzeichnete Peptide in einem Zeitintervall von 8 min (8 Unterfraktionen von jeweils 1 ml) zwischen 9 und 1 min vor der Elution der unveränderten Peptide gesammelt. LC-MS/MS-Analysen wurden an den aus den zwei primären Fraktionen aussortierten Peptiden durchgeführt. Daher wurden die gesammelten sortierten Peptide aus der primären Fraktion 25 alle kombiniert, getrocknet und erneut in 200 μl Lösungsmittel A (0,05% Ameisensäure in Wasser) aufgelöst, und ein Zwanzigstel dieses Gemischs wurde in eine Nanosäule (C18 Pepmap, LC Packings) von 0,075 mm Innendurchmesser (15 cm lang) geladen, welche mit einer Einfangsäule verbunden war und einem Applied Biosystems Inc.-120A-Analysegerät-HPLC. Das gleiche wurde für alle sortierten Peptide aus der primären Fraktion 26 durchgeführt.
  • Ein Gradient von 0% B zu 100% B in 220 min wurde mit 0,05% HCOOH als Lösungsmittel A und 0,05% HCOOH in 70% Acetonitril als Lösungsmittel B gebildet. Die Lösungsmittelflussrate von 60 μl/min vor einer Aufteilung wurde auf ungefähr 200 nl/min unter Verwendung eines Strömungsaufteilers (Acurate, LC Packings) herabgesetzt. Eluierende Peptide wurden mittels einer metallbeschichteten Quarzglasnadel (FS360-20-10-D-5-C7, New Objective) in die Z-Sprühionenquelle eines Q-TOF-Massenspektrometers (Micromass UK Limited, Altincham, UK) eingefügt. Daten wurden in dem datenabhängigen Aufnahmemodus unter Verwendung von Masslynx NT (Version 3,4) analysiert, und doppelt geladene Ionen wurden automatisch für die MS/MS-Analyse ausgewählt. Der Schwellwert wurde auf 40 Zähler/s festgesetzt und ausgewählte Ionen wurden für 4 s durch Kollision mit Argonatomen fragmentiert.
  • Alle MS/MS-Spektren wurden akkumuliert und durch MASCOT (Matrix Science Ltd., London) unter Verwendung der SWISS-PROT-Proteindatenbank (Release 40.10) analysiert, unter Beschränkung der Suche auf menschliche Proteine. Die Proteinidentifizierung verließ sich auf MASCOTs "Wahrscheinlichkeits-basiertem Mowse-Kern" (Perkins et al., 1999). Den ersten LC-MS/MS-Läufen folgend wurden Ionenausschlusslisten angefertigt und für folgende LC-MS/MS-Läufe verwendet, um die Zahl der Peptide zu erhöhen, die analysiert wurden. Nun wurde der Schwellwert auf 25 Zähler/s gesetzt, und die ausgewählten Ionen wurden für 5 s fragmentiert.
  • Die sich ergebenden Proteinidentifizierungsdaten von diesen vier LC-MS/MS-Durchläufen wird kombiniert und ist in Tabelle XIII gezeigt. Wie man bemerken kann, sind sehr bis mäßig häufige Plasmaproteine, wie beispielsweise Serumalbumin (Konzentration von ungefähr 3 bis 4 g/100 ml), α-Mikroglobulin, Apolipoprotein B-100 und Fibrinogen-β-Kette vorhanden neben unerwarteten (Kern-)Proteinen, wie beispielsweise dem Spliceing-Faktor U2AF 35 kDA-Untereinheit und ein Zink-Fingerprotein. Diese begrenzte Analyse des menschlichen Plasmaproteoms zeigt schon klar den hohen dynamischen Bereich der Tech nik: sehr häufige Proteine werden neben sehr seltenen Proteinen identifiziert. Zusätzlich ist es wichtig, aufzuzeigen, dass seltenere Proteine identifiziert werden können, ohne vorher Hauptkomponenten, wie Serumalbumin, und die Antikörper zu entfernen. Darüber hinaus liegt das zugehörige Plasmavolumen, das für diese LC-MS/MS-Untersuchungen verwendet wurde, im Bereich von einem 1 Mikroliter, was die endgültige Empfindlichkeit dieser Technik zeigt.
  • Beispiel 20: Partielle Proteomanalyse menschlicher Thrombozyten
  • Das Leukozytenfilm-Zellmaterial eines Äquivalents zu einer menschlichen Blutentnahme, das ungefähr 500 × 109 Blutplättchen enthält, wurde in zwei gleiche Fraktionen aufgeteilt und für 10 min bei 1000 × g zentrifugiert. Die pelletierten Blutplättchen wurden dreimal mit 10 ml Tyrode-I-Puffer gewaschen, von welchem BSA ausgelassen wurde, jedes Mal gefolgt durch einen Zentrifugierungsschritt für 10 min bei 1000 × g, und wurden letztendlich in einer Gesamtmenge von 10 ml BSA-freiem Tyrode-I-Puffer suspendiert (Ardlie et al., 1970). Die Blutplättchen-Suspension wurde durch Hinzufügen von 10 ml 0,5% Triton X-100 in 25 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,5 lysiert, welcher einen Protease-Inhibitor-Cocktail (CompleteTM, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) enthält. Die lysierte Blutplättchen-Suspension wurde für 10 min bei 10.000 × g zentrifugiert, um die Zytoskelett-Fraktion zu entfernen (Fox et al., 1993), worauf 2,5 ml des Proteingemischs (d.h. 1 Äquivalent von 62,5 × 109 Blutplättchen), in 3,5 ml 10 mM Natriumphosphatpufferlösung bei pH 9,0 an einer Sephadex® G-25 M-Säule (PD-10-Säule, Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) entsalzt wurde. Das entsalzte Proteingemisch wurde in einem Zentrifugen-Vakuumkonzentrator auf 1 ml konzentriert, für 5 min in einem Wasserbad gekocht und für 15 min auf Eis gelegt. Ein Protein-Peptid-Gemisch wurde durch Verdauung der Proteine über Nacht mit 20 μg Trypsin (Sequenzier-Grad-modifizierte Trypsinform, Promega, Madison, WI, USA) bei 37°C erzeugt.
  • Eine Fraktion des Protein-Verdauungsgemischs von 50 μl, korrespondierend zu dem von ungefähr 3 × 109 Blutplättchen extrahierten Proteinmaterial, wurde in eine Umkehrphasen-ZORBAX® 300SB-C18-Säule mit enger Bohrung (2,1 innerer Durchmesser × 150 mm, Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) eingespritzt, welche mit einem Agilent 1100-Serie-Kapillar-LC-System unter der Steuerung der Agilent ChemStation-Softwaremodule gekoppelt war. Folgend auf die Einspritzung der Probe wurde ein Lö sungsmittelgradient bei einem konstanten Fluss von 80 μl pro min entwickelt. Zuerst wurde die Säule mit 0,1% TFA in Wasser (Baker HPLC-analysiert, Mallinckrodt Baker B. V., Deventer, Niederlande) (Lösungsmittel A) für 10 min ausgewaschen, gefolgt von einem linearen Gradienten von 70% Acetonitril (Baker HPLC-analysiert) in 0,1% TFA (Lösungsmittel B) über 100 min (daraus ein Anstieg von 1% Lösungsmittel B pro min) (primärer Durchlauf). Peptide wurden aus einer Gesamtmenge von 48 Fraktionen von jeweils 1 min (oder 80 μl) gesammelt, und zwar in einer Mikrotiterplatte unter Verwendung des Agilent Serie 1100-Fraktionssammlers, beginnend bei 40 min (entsprechend einer Konzentration von 30% Lösungsmittel B). Fraktionen, die durch 12 min getrennt waren (siehe Tabelle XIV) wurden zusammengegeben und vollständig in einem Zentrifugal-Vakuumkonzentrator getrocknet.
  • Die getrockneten Fraktionen wurden in 70 μl 1%igem TFA in Wasser rückaufgelöst und in den Agilent Serie 1100 Wellplate Sampler platziert. Die Methionin-Oxidationsreaktion lief in dieser Abteilung automatisch durch Überbringen von 14 μl einer frischen wässrigen 3%igen H2O2-Lösung zu der Ampulle, die das Peptidgemisch enthält. Diese Reaktion lief für 30 min bei einer konstanten Temperatur von 30°C, worauf dann die Probe unmittelbar in die RP-HPLC-Säule eingespritzt wurde. Unter den gegebenen experimentellen Bedingungen eluieren Methionin-Sulfoxid-enthaltende Peptide allgemein in einem Zeitrahmen von 7 min bis 1 min vor der äquivalenten Zeit der korrespondierenden primären Fraktion (siehe Tabelle XIV), und wurden in 8 Teilfraktionen gesammelt. Der Sammlung der Met-SO-Peptide folgend wurden alle identisch nummerierten Abzüge zusammengegeben, beispielsweise für Durchlauf 2A (Tabelle XIV), die Fraktionen 12.1, 24.1, 36.1 und 48.1 und vor der LC-MS/MS-Analyse vollständig getrocknet.
  • Die in den zusammengegebenen und getrockneten Abzügen eines sekundären Durchlaufs vorhandenen Peptide wurden in 20 μl von 0,1% Ameisensäure in einem Gemisch von Acetonitril/Wasser (2/98 im Volumen) (Lösungsmittel A) aufgelöst, von denen 10 μl automatisch an eine Einfangsäule von 0,3 mm innerem Durchmesser × 5 mm (PepMap, LC Packings, Amsterdam, Niederlande) bei einer Flussrate von 20 μl/min Lösungsmittel A (gesamte Ladezeit: 5 min) mit einem CapLC-System (Micromass UK Limited, Cheshire, UK) eingespritzt wurden. Durch Umschalten des Strömungshahns wird die Auffangsäule mit einem binären Lösungsmittelgradienten zurückgespült, welcher simultan mit dem Injektionszyklus gestartet wird, und die Probe wird dadurch auf eine nanogroße Umkehrphasen- C18-Säule geladen (0,75 innerer Durchmesser × 150 mm PepMapTM-Säule, LC Packings). Das Lösungsmittelzuführsystem lief bei einem konstanten Fluss von 5 μl pro min und durch die Verwendung eines 1:25-Fluss(auf)teilers wurden 200 nl pro min des Lösungsmittels durch die Nanosäule gelenkt. Peptide wurden von der stationären Phase unter Verwendung eines Gradienten von 0% bis 100% Lösungsmittel B eluiert, der in 25 min angelegt wurde. Der Auslass der Nanosäule war Online-verbunden mit einer distalen metallbeschichteten Quarzglas-PicoTipTM-Nadel 8PicoTipTM FS360-20-10-D-C7, New Objective Inc., Wobum, MA, USA), die vor dem Einlass eines Q-TOF-Massenspektrometers (Micromass UK Limited, Cheshire, UK) platziert wurde. Automatische datenabhängige Erfassung mit dem Q-TOF-Massenspektrometer wurde 15 min, nachdem das Strömungsventil geschaltet wurde, begonnen. Die Erfassungsparameter wurden so gewählt, dass nur doppelt oder dreifach geladene Ionen für eine Fragmentierung ausgewählt wurden. Das Strömungsventil wurde 51 min nach dem Beginn des Injektionszyklus zurückgeschaltet.
  • Die erhaltenen CID-Spektren in jedem LC-MS/MS-Durchlauf wurden automatisch in ein Mascot-akzeptabelles Format (pkl-Format) unter Verwendung von Proteinlynx umgewandelt, welches von der Micromass' Masslynx-Software (Version 3.4) erhältlich ist. Die CID-Peaklisten wurden zur Proteinidentifizierung in einer lokal gespeicherten Datenbank verwendet, die nur die SWISSPROT (Release 40.10)-Humansequenzen verwendet, und zwar unter Verwendung des Mascot-Algorithmus. Die folgenden Suchparameter wurden verwendet: Enzyme: Trypsin, maximale Zahl fehlender Spaltungen: 2, feste Modifikationen: keine, variable Modifikationen: Oxidation (M), pyro-Glu (N-endständig E und Q), Peptidtoleranz: 0,3 Da, MS/MS-Toleranz: 0,25 Da und Peptidladung: 2+ oder 3+. Eine Batch-Verarbeitung des Ergebnissatzes von Mascot wurde durchgeführt, um eine endgültige Liste der identifizierten Peptide zu erhalten. Nur die Peptide, die durch Mascot an erster Stelle aufgeführt waren, wurden gehalten, und die Peptide, für welche der Ergebniswert niedriger als die Identität oder die homologen Schwellwerte waren, wurden fallengelassen.
  • In Tabelle XV sind die Ergebnisse dargestellt, die durch Analysieren der Methionin-Sulfoxid-enthaltenen Peptide erlangt wurden, die aus acht primären Fraktionen in zwei sekundären Durchläufen (2A und 2E, Tabelle XIV) aussortiert wurden. Insgesamt 16 LC-MS/MS-Analysen wurden durchgeführt, um die gekennzeichneten Peptide zu sequenzieren. 201 Peptide wurden unter Verwendung des MASCOT-Datenbanksuchalgorithmus identifiziert, welche mindestens einen Met-SO-Rest enthielten. Einige gekennzeichnete Peptide – besonders solche von sehr häufigen Blutplättchen-Proteinen, wie beispielsweise Actin und Myosin – waren in folgenden Teilfraktionen vorhanden, was die Tatsache erklärt, dass bei einem Daten-"Reinigen" 98 eindeutige MetSO-Peptide zurückgehalten werden konnten. Diese MetSO-Peptide entsprechen 74 unterschiedlichen Proteinen (Tabelle XV). Einige der bekannten häufigen Blutplättchenproteine, wie beispielsweise Myosin, α-Actinin, Talin, Vinculin und Actin wurden durch mehrfache Peptide identifiziert, jedoch konnte eine Mehrzahl der Proteine nur unter Verwendung einer Peptidsequenz identifiziert werden. Es ist wichtig zu betonen, dass einige dieser Proteine aufgrund ihrer großen Größe (beispielsweise Talin (Molekulargewicht von 270 kDa) und die schwere Kette von Myosin (Molekulargewicht von 226 kDa)) auf 2-D-Gelen kaum entdeckt werden.
  • Der dynamische Bereich unserer Peptidsortiertechnologie für Proteomanalyse wird schon aus diesem begrenzten Satz von Daten offensichtlich. Beispielsweise werden seltene Proteine, wie beispielsweise die ras-bezogenen Proteine, die auf 2-D-Gelen schwer zu entdecken sind, neben sehr häufigen Proteinen, wie beispielsweise Actin, Tubulin, den Tropomyosinen, Talin und Myosin, identifiziert, welche wahrscheinlich mindestens 1000-fach häufiger in diesen Zellen auftreten. Wichtigerweise wurden fünf unterschiedliche Isoformen dieser Proteine (RAC1_HUMAN, RALA_HUMAN, RAPB_HUMAN, RB5A-HUMAN und RB5B-HUMAN) identifiziert (Tabelle XV), von denen eines, RB5A_HUMAN, mit zwei unterschiedlichen gekennzeichneten Peptiden identifiziert wurde.
  • Eine der Proteinklassen, die an 2-D-Gelen schwer zu entdecken sind, sind hydrophobe Proteine. In unserem begrenzten Blutplättchen-Proteom haben wir sehr hydrophobe Proteine identifiziert, wie beispielsweise das LIM- und SH3-Domänprotein 1 (GRAVY-Wert von –1,02), den Calumenin-Vorläufer (GRAVY-Wert von –1,01) und Moesin (GRAVY-Wert von –0,98), welche aufgrund ihrer hydrophoben Natur normalerweise an 2-D-Gelen kaum entdeckt werden.
  • Beispiel 21: Acetylierte Amino-endständige Arginin-endende Peptide des Proteoms menschlicher Thrombozyten
  • Als Ausgangsmaterial wurde eine zytosolische und Membranskelett-Präparation, wie in Beispiel 20 hergestellt, verwendet. 1,5 ml der entsalzten Proteinmischung (abgeschätzte Menge von ca. 9 mg oder 300 nmol Gesamtproteinmaterials) wurde in einem Zentrifugal- Vakuumkonzentrator auf ungefähr 1 ml getrocknet. Diesem Proteingemisch wurde festes Guanidinium-Hydrochlorid zu einer Endkonzentration von 4 M hinzugefügt. Die Proteine wurden durch Hinzufügen von 40 μl 0,5% Tributylphosphin in n-Propanol zu diesem Gemisch und Inkubation von 30 min bei Umgebungstemperatur reduziert. 188 μl frisch zubereiteter 40 nmol/μl Lösung von Iodacetamid wurde dem reduzierten Proteingemisch hinzugefügt, und die Proteine wurden für 90 min bei 37°C im Dunklen alkyliert. Diese Proteinlösung wurde mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1,5 ml verdünnt, wonach dann 500 μl dieses Gemischs an einer NAPTM-5-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) entsalzt und in 1 ml von 250 mM Tris·HCl bei pH 7,9, welches 250 μM Guanidin-Hydrochlorid enthält, gesammelt wurde. Dieses entsalzte Proteingemisch wurde auf die Hälfte seines Volumens mittels Vakuumtrocknens konzentriert, für 5 min in einem Wasserbad gekocht, für 10 min auf Eis gelegt, worauf dann 10 μg Trypsin (Sequenzierungs-Grad-modifiziertes Trypsin von Promega) hinzugefügt wurden. Die proteolytische Verdauung lief über Nacht bei einer konstanten Temperatur von 37°C und wurde durch Ansäuerung mit TFA angehalten.
  • Folgend auf eine Zentrifugierung, um jegliches unlösliche Material zu entfernen, wurde das erhaltene Peptidgemisch an einer Umkehrphasen-HPLC-Säule separiert (4,6 innerer Durchmesser × 250 mm RP-HPLC-C18-Säule, Vydac Separations Group). Folgend auf die Einbringung der Probe an der Säule, wurde ein Gradient einer ansteigenden Konzentration von Acetonitril verwendet, um das Peptidgemisch zu fraktionieren. Zunächst wurde die Säule mit 0,1% TFA in Wasser (Baker HPLC-analysiert) (Lösungsmittel A) für 5 min bei einem konstanten Fluss von 1 ml pro min unter Verwendung einer Waters-Gradientensteuerung und zweier Waters-Modell 510-Lösungsmittelpumpen ausgewaschen. Dem folgend wurde ein linearer Gradient von 70% Acetonitril (Baker HPLC-analysiert) in 0,1 TFA in Wasser (100% Lösungsmittel B) über 70 min (daher ein Anstieg von 1% Acetonitril pro min) verwendet, um die Peptide von der RP-Säule zu eluieren. In einer letzten Phase wurde die Säule mit Lösungsmittel B gründlich ausgewaschen und mit Lösungsmittel A vor der nächsten Probeneinbringung reäquilibriert. Zwischen 2 min (entsprechend 0% Lösungsmittel B) und 66 min (87,1% Lösungsmittel B oder 61% Acetonitril) eluierende Peptide wurden in 16 primären Fraktionen von jeweils 4 ml gesammelt.
  • Alle primären Fraktionen wurden vollständig in einem Zentrifugal-Vakuumkonzentrator getrocknet und in 1 ml von 50 mM Natriumborat bei pH 9,0 wieder aufgelöst. Für jede primäre Fraktion wurde die Hälfte des Peptidgemischs verwendet, um Peptide an ihren freien Aminogruppen durch Hinzufügen von 3 μl von 0,1 M wässriger 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure-Lösung (TNBS) (Sigma) zu blockieren, während die andere Hälfte als Kontrolle verwendet wurde. Die Reaktion lief für 60 min bei 37°C, wonach zusätzliche 3 μl von 0,1 M TNBS hinzugefügt wurden und wieder für 60 min bei 37°C inkubiert wurde. Die Mehrheit der TNB-Peptide als auch der Reaktionsnebenprodukte von TNBS (z.B. Picrat) werden mit 500 μl Ethylacetat (äquilibriert mit Wasser) extrahiert. Dieser Extraktionsvorgang wurde zweimal wiederholt. Die Wasserphase, die die N-endständig blockierten (acetylierten), Lysin-freien und Arginin-endenden Peptide enthält, wurde im Vakuum getrocknet. Die TNBS-Modifikationsreaktion, wie oben beschrieben, wird ein zweites Mal wiederholt, um es den verbleibenden Spuren der Peptide mit freien Aminogruppen zu erlauben, zu reagieren. Das getrocknete Produkt wird in Lösungsmittel A aufgelöst und dem sekundären Durchlauf unterworfen, in welchem Peptide in einem Gesamtfenster von 7,5 min (beginnend 2 min vor dem Beginn des Aufsammelns des ursprünglichen primären Fraktion) in insgesamt 15 Teilfraktionen von jeweils 500 μl gesammelt wurden. Jeder Abzug wurde getrocknet, in 20 μl einer 0,1%igen Ameisensäure in einer Mischung von Acetonitril in Wasser (2/98 im Volumen) erneut aufgelöst, von welchen 10 μl für LC-MS/MS-Analyse verwendet wurden, und für die in den Beispielen 19 und 20 beschriebene Proteinidentifikation verwendet wurden.
  • Bei der MASCOT-basierten Datenbanksuche wurden die folgenden Suchparameter verwendet: Enzym: Trypsin, maximale Zahl fehlender Spaltungen: 2, feste Modifikationen: keine, variable Modifikationen: Acetylierung (N-Endgruppe), Oxidation (M), pyro-Glu (N-Endgruppe E und Q), Peptidmassentoleranz: 0,3 Da, MS/MS-Toleranz: 0,25 Da und Peptidladung: 2+ oder 3+. Eine Batch-Verarbeitung des Ergebnissatzes von MASCOT wurde durchgeführt, um eine endgültige Liste der identifizierten Peptide zu erhalten. Nur die Peptide, die durch MASCOT vorne positioniert wurden und ihre Identität und/oder homologen Schwellwerte erreichten, wurden zurückgehalten und sind in Tabelle XVI zusammen mit ihren korrespondierenden Vorläufer-Proteinen kombiniert. Wie erwartet, wurden neben natürlich blockierten (acetylierten) N-Endgruppen-Peptiden, welche mit einem Arginin-Rest enden und Peptide, die mit einer Pyroglutaminsäure beginnen und solche, die mit einem Prolinrest beginnen, ebenfalls sortiert. Ersteres liegt an der Bildung eines zyklisch blockierenden Rests, während das n-Endgruppenprolin ein sekundäres Amin bildet, welches nicht mit TNBS reagiert.
  • Zusätzlich zu den identifizierten Peptiden zeigen wir eine Liste von 183 de novo abgeleiteten Peptidsequenzmarkern von MS/MS-Spektren, welche nicht zu einer eindeutigen Identifikation in der SWISSPROT-Datenbank unter Verwendung des MASCOT-Datenbanksuchalgorithmus führten (Tabelle XVII). Die meisten der abgeleiteten Markierungen sind homologisch basierte Suchwerkzeuge, wie beispielsweise BLAST und PASTA. Sie repräsentieren höchstwahrscheinlich acetylierte N-Endgruppen-Peptide von Proteinen, deren zugehörige Sequenzen jetzt noch nicht in den verfügbaren Sequenzdatenbanken aufgelistet sind.
  • Beispiel 22: Eine begrenzte Proteom-Analyse, basierend auf der Isolierung von NH2-endständigen Peptiden der in menschlichen Thrombozytenextrakten vorhandenen Proteine
  • Im Gegensatz zu den vorhergehenden Beispielen haben wir hier die Veränderungschemie dergestalt modifiziert, dass nun die NH2-endständigen Identifizierungspeptide der in der Probe vorhandenen Proteine, einschließlich solcher mit blockierten und solcher mit einer freien Amino-Endgruppe isoliert und zur Proteinidentifizierung verwendet werden können.
  • Als Ausgangsmaterial verwendeten wir eine zytosolische und Membranskelett-Präparation menschlicher Thrombozyten, wie für die Beispiele 20 und 21 präpariert. 500 μl des entsalzten Proteingemischs (geschätzte Menge von ungefähr 3 mg) wurde in einem Zentrifugal-Vakuumkonzentrator auf ungefähr 400 μl konzentriert. Diesem Proteingemisch wurde festes Guanidin-Hydrochlorid bis zu einer endgültigen Konzentration von 4 M hinzugefügt. Proteine wurden durch Hinzufügen von Tributylphosphin (14 μl einer frischen 0,5%-Lösung in n-Propanol) für 30 min bei Umgebungstemperatur reduziert. 62,5 μl einer frisch präparierten 40 nmol/μl-Lösung von Iodacetamid in H2O wurde dem reduzierten Proteingemisch hinzugefügt, und die Proteine wurden für 90 min bei 37°C im Dunklen alkyliert. Im folgenden wurde dieses Gemisch an einer NAPTM-5-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) entsalzt und in 1 ml von 250 mM Natriumphosphat, gepuffert bei pH 8,0, und 1 M Guanidin-Hydrochlorid enthaltend, aufgesammelt. Dieses Volumen wurde in einem Zentrifugal-Vakuumkonzentrator auf seine Hälfte konzentriert. Sowohl die α- als auch ε-Amine wurden durch Hinzufügen eines 50-fachen molaren Überschusses von Sulfo-N-hydroxysuccinimid-Acetat und Inkubieren dieses Gemischs für 90 min bei Raumtemperatur acetyliert. Mögliche Acetylierung von Hydroxyl- und COOH-Gruppen wurde durch Hinzufügen von 1 μl Hydroxylamin zum Protein-Reaktionsgemisch umgekehrt. Vor einer Proteolyse wurde das Proteingemisch an einer NAPTM-5-Säule entsalzt und in einem Gesamtvolumen von 1 ml 50 mM Tris-HCl bei pH 7,9, enthaltend 250 mM Guanidin-Hydrochlorid, entsalzt. Dieses entsalzte Proteingemisch wurde durch Vakuumtrocknen auf die Hälfte seines Volumens konzentriert, für 5 min in einem Wasserbad gekocht, für 10 min auf Eis gelegt, worauf 10 μg Trypsin (Sequenzierungsgrad-modifiziertes Trypsin von Promega) hinzugefügt wurde. Proteolytische Verdauung lief über Nacht bei einer konstanten Temperatur von 37°C und wurde durch Säuerung mit TFA gestoppt.
  • Der Sortierprozess für die acetylierten Amino-endständigen Peptide wurde unter gleichen Bedingungen und an der gleichen RP-HPLC-Säule durchgeführt, wie in Beispiel 21 beschrieben. In Tabelle XVIII sind die Ergebnisse gezeigt, die einer LC-MS/MS-Analyse der Amino-endständigen Peptide folgen, welche aus zwei primären Fraktionen (9 und 10) aussortiert wurden. Dies stellt 1/8 der Gesamtzahl der Fraktionen dar. Der MASCOT-Algorithmus wurde wiederum verwendet, um die fragmentierten Peptide zu identifizieren, und die Parameter wurden hier wie in Beispiel 21 beschrieben festgesetzt, außer, dass die Acetylierung der Lysinreste eine zusätzliche variable Modifikation war.
  • Diese teilweise Proteomanalyse (nur 12,5% des insgesamt analysierbaren Materials wurde verwendet) ergab 26 unterschiedliche Proteine, welche identifiziert werden konnten (siehe Tabelle XVIII). Interessanterweise wurden häufige Proteine, wie beispielsweise Actin, neben seltenen identifiziert, wie beispielsweise Kinasen und Phosphatasen und hydrophoben Proteinen, wie beispielsweise dem DAD-1-Protein, welches als ein integrales Membranprotein vorausgesagt wird. Darüber hinaus haben wir wie in Beispiel 21 eine Zahl von Peptidionen analysiert, welche nicht zu einer Identifikation unter Verwendung des MASCOT-Algorithmus führten, aber interpretationsfähige Fragmentationsspektren ergaben. Diese Spektren wurden de novo interpretiert, jedoch führten die sich ergebenden 48 Peptidsequenz-Marker (in Tabelle XIX gezeigt) nicht zu irgendeiner eindeutigen Identifikation unter Verwendung von Suchwerkzeugen von Sequenz-Homologie-basierten Datenbanken, wie beispielsweise FASTA und BLAST. Wir nehmen an, dass diese Sequenzen neue Proteine darstellen, deren Sequenzen noch nicht in den Datenbanken verfügbar sind.
  • Beispiel 23: Spezifische Isolierung der COOH-endständigen Peptide von Proteinen in komplexen Gemischen
  • Der Ablauf beginnt mit der Umwandlung der Proteincysteine mit Iodacetamid oder ähnlichen SH-spezifischen Reagenzien, die auf dem Gebiet bekannt sind. Dann wird das Proteingemisch mit Trypsin verdaut, wodurch man ein Protein-Peptid-Gemisch erzeugt. Diese Gesamtmischung der Peptide wird dann mit einem Diazo-Derivat behandelt, das Ether mit Tyrosin bildet und Ester mit allen COOH-Gruppen, einschließlich den COOH-Gruppen von Arg und Lys an dem Ende der Peptide und den COOH-Endgruppen der von den COOH-Endgruppenteilen der Proteine abgeleiteten Peptide.
  • Diese vorbehandelten Peptide wurden dann durch Normal- oder Umkehrphasen-Chromatographie separiert und eluierende Peptide wurden in einer solchen Zahl von Fraktionen gesammelt, dass die Trennung veränderter Peptide von nicht veränderten Peptiden während des sekundären Durchlaufs in jeder der gesammelten Fraktionen möglich war.
  • In jeder Fraktion wurde Trypsin hinzugefügt, wodurch die Ester in den Arg- und Lys-Resten zurückhydrolysiert wurden, während die anderen COOH-Ester, einschließlich der Ester an den COOH-Endgruppen der Proteine – welche im allgemeinen keinen Arg- oder Lys-Rest enthalten – durch Trypsin nicht zurück-hydrolysiert wurden. Daher wurden alle Trypsinpeptide außer den COOH-endständigen Peptiden verändert und während des sekundären Durchlaufs verschoben. Die COOH-endständigen Peptide wurden daher in dem sekundären Durchlauf als nicht-veränderte Peptide in dem gleichen Zeitintervall wiederaufgefunden, in dem sie während des primären Durchlaufs eluieren.
  • Der Kandidat Diazo-Derivate könnte das sehr reaktive und giftige Diazomethan oder Phenyldiazomethan oder noch besser ein nicht-flüchtiges, stabileres und wasserlösliches Diazo-Derivat sein. Alle diese Verbindungen reagieren mit COOH-Gruppen in ihre korrespondierenden Ester oder mit phenolischen Gruppen in ihre korrespondierenden Ether.
  • Die Ester der Arg- und Lys-COOH-Gruppen sind Substrate von Trypsin und werden gleich der korrespondierenden Peptidverbindungen hydrolysiert.
  • Die Hydrolysereaktion des Benzoylester des COOH-endständigen Lys ist in Schema (xi) dargestellt.
  • Figure 01390001
  • Abkürzungen
    • 2D:
      zweidimensional
      CAD:
      Kollisons-aktivierte Dissoziation
      DTT:
      Dithiothreitol
      ESI:
      Elektrosprühionisation
      EST:
      ausgedrückter Sequenzmarker
      FTMS:
      Fourier-Transformations-Massenspektrometrie
      ICAT:
      Isotopen-codierte Affinitätsmarke
      ID-Peptid:
      Identifizierungspeptid
      IPG:
      immobilisierter pH-Gradient
      ITC:
      Isothiocyanat
      LC:
      Flüssigchromatographie
      LC-MS/MS:
      Flüssigchromatographie und Tandem-MS
      MALDI-RETOF-MS:
      MALDI-Reflectron TOF-MS
      MALDI-TOF-MS:
      Matrix-unterstützte Laser-Desorptionsionisation – Flugzeit – Massenspektrometrie
      Met-SO:
      Methioninsulfoxid
      MS/MS:
      Tandem-MS
      MS:
      Massenspektrometrie
      MW:
      Molekulargewicht
      pl:
      isoelektrischer Punkt
      PITC:
      Phenylisothiocyanat
      PMF:
      Peptidmassenfingerabdruck
      PSD:
      Post-Source-Decay (Nachquellenzerfall)
      PTC:
      Phenylthiocarbamyl
      RP-HPLC:
      Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie
      SDS:
      Natriumdodecylsulfat
      TFA:
      Trifluoressigsäure
  • Tabelle I:
    Figure 01410001
  • Tabelle II:
    Figure 01410002
  • Tabelle III:
    Figure 01420001
  • Tabelle III: (weitergeführt)
    Figure 01420002
  • Tabelle IVA:
    Figure 01420003
  • Figure 01430001
  • Tabelle IVB:
    Figure 01430002
  • Tabelle IVC:
    Figure 01430003
  • Tabelle IVC: (weitergeführt)
    Figure 01430004
  • Tabelle V:
    Figure 01440001
  • Tabelle VII:
    Figure 01440002
  • Figure 01450001
  • Tabelle VIII
    Figure 01460001
  • Beispiele für Hahneinstellungen in dem Neun-Säulen-Sortierer
  • Eine Beschreibung des Betriebs des Hahneinstellsystems eines Systems A wird gegeben. +: offener Hahn; -: geschlossener Hahn. Fraktion 12 des primären Laufs wird auf Säule I geladen, Fraktion 24 auf Säule II und Fraktion 36 auf Säule III. Ein linearer Gradient wird gebildet, ansteigend um 1% pro min von Lösungsmittel B. Dieser Gradient erhöht sich auf 55% Lösungsmittel B. Veränderte Peptide werden zwischen 6 min und 9 min (6–9), 18–21 und 30–33 gesammelt, wie durch die durchgehenden Säilen gezeigt. Hähne sind angegeben; a–g sind Hochdruckhähne; h–o und p–r sind Niederdruck-Totvolumen-Hähne. Linien zeigen das Verbindungsröhrensystem.
  • Tabelle IX
    Figure 01470001
  • Figure 01480001
  • Figure 01490001
  • Figure 01500001
  • Figure 01510001
  • Tabelle IX (weiterf.)
    Figure 01520001
  • Tabelle X:
    Figure 01520002
  • Tabelle X: (weitergeführt)
    Figure 01530001
  • Tabelle XI: Die Tabelle zeigt die Zahl der erlangten MS/S-Spektren an, die zur Identifizierung von E. coli Proteinen führten.
    Figure 01530002
  • Tabelle XII:
    Figure 01530003
  • Tabelle XII: (weiterf.)
    Figure 01540001
  • Tabelle XII: (weiterf.)
    Figure 01550001
  • Tabelle XII: (weiterf.)
    Figure 01560001
  • Tabelle XII: (weiterf.)
    Figure 01570001
  • Tabelle XII: (weiterf.)
    Figure 01580001
  • Tabelle XII: (weiterf.)
    Figure 01590001
  • Tabelle XII: (weiterf.)
    Figure 01600001
  • Tabelle XII: (weiterf.)
    Figure 01610001
  • Tabelle XII: (weiterf.)
    Figure 01620001
  • Tabelle XII: (weiterf.)
    Figure 01630001
  • Figure 01640001
  • Tabelle XII: (weiterf.)
    Figure 01650001
  • Tabelle XII: (weiterf.)
    Figure 01660001
  • Tabelle XII: (weiterf.)
    Figure 01670001
  • Tabelle XIII:
    Figure 01680001
  • Figure 01690001
  • Tabelle XV: Liste von Proteinen und Peptiden, die durch Analysieren der Met-SO-Peptide identifiziert wurden, welche in zwei sekundären Durchläufen aus insgesamt 8 primären Fraktionen aussortiert wurden. Die in dieser Tabelle dargestellten Ergebnisse erlangte man 16 LC-MS/MS-Durchläufen an den sortierten Met-SO-Peptiden folgend. Proteine wurden aus einer Triton-löslichen Fraktion menschlicher Trombozyten erlangt.
    Figure 01700001
  • Tabelle XV: (weiterf.)
    Figure 01710001
  • Tabelle XV: (weiterf.)
    Figure 01720001
  • Tabelle XV: (weiterf.)
    Figure 01730001
  • Tabelle XVI:
    Figure 01740001
  • Tabelle XVI: (weiterf.)
    Figure 01750001
  • Tabelle XVI: (weiterf.)
    Figure 01760001
  • Tabelle XVII: De novo abgeleitete Peptidsequenzmarker aus MS/MS-Spektren aus sortierten acetylierten Arginin-enthaltenden Lysin-freien amino-terminalen Peptiden (Bsp. 21) die nicht zu einer eindeutigen Identifizierung von Proteinen unter Verwendung von MS/MS-basierten Databanksuchwerkzeugen wie beispielsweise MASCOT führten. Die primäre Fraktion, von der die Peptide sortiert wurden, ist angezeigt, als auch die Masse der Peptide und der abgeleitete Sequenzmarker aus N → C (m = Methionin-Sulfoxide, x = nicht zugeordnete Aminosäure).
    Figure 01770001
  • Tabelle XVII (weitergeführt)
    Figure 01780001
  • Tabelle XVIIIA:
    Figure 01790001
  • Tabelle XVIIIA: (weitergeführt)
    Figure 01800001
  • Tabelle VIIIB: k repräsentiert acetylierte Lysine
    Figure 01810001
  • Tabelle XIX:
    Figure 01810002
  • Tabelle XIX: (weiterf.)
    Figure 01820001
  • Tabelle XIX: (weiterf.)
    Figure 01830001
  • Literaturliste
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Claims (71)

  1. Verfahren zur Isolierung einer Teilmenge von Peptiden aus einem Protein-Peptid-Gemisch, bei dem: (a) das Protein-Peptid-Gemisch mittels Chromatographie in Fraktionen von Peptiden getrennt wird; (b) chemisch, oder enzymatisch, oder chemisch und enzymatisch mindestens eine Aminosäure von mindestens einem der Peptide in jeder Fraktion verändert wird, wodurch eine Teilmenge von veränderten Peptiden erzeugt wird; und (c) diese veränderten oder so genannten gekennzeichneten Proteine mittels Chromatographie aus jeder Fraktion isoliert werden, wobei die Chromatographie der Schritte (a) und (c) mit derselben Art von Chromatographie durchgeführt wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die chromatographischen Bedingungen der Schritte (a) und (c) dieselben oder im Wesentlichen ähnlich sind.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem Schritt (a) ein oder mehrere Vorbehandlungsschritte vorausgehen.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, bei dem die Aminosäure, die einer Veränderung unterzogen wird, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Arginin, Prolin, Cystein, Methionin, Tryptophan, Lysin, Tyrosin, Histidin, Phenylalanin, und jeglicher Kombination aus zwei oder drei davon.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die einer Veränderung unterzogene Aminosäure Methionin ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die einer Veränderung unterzogene Aminosäure Cystein ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die einer Veränderung unterzogene Aminosäure Methionin und Cystein ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, bei dem die einer Veränderung unterzogene Aminosäure eine co- oder posttranslational modifizierte Aminosäure ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die co- oder posttranslationale Modifikation ausgewählt ist aus Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Sulphatierung, Ubiquitinierung, Alkylierung, Nitrosylierung, Oxidation, Hydroxylierung, Methylierung und jeglicher Kombination davon.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die co- oder posttranslational modifizierte Aminosäure eine phosphorylierte Aminosäure ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die co- oder posttranslational modifizierte Aminosäure eine glykosylierte Aminosäure ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die co- oder posttranslational modifizierte Aminosäure eine ε-N-acetylierte Aminosäure ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, das außerdem den Schritt der Identifizierung der gekennzeichneten Peptide und ihrer korrespondierenden Proteine umfasst.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem der Identifizierungsschritt durch ein Tandem-Massenspektrometer in Kombination mit Datenbankdurchsicht durchgeführt wird.
  15. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem der Identifizierungsschritt durch Post-Source-Decay-Analyse in Kombination mit Datenbankdurchsicht durchgeführt wird.
  16. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem der Identifizierungsschritt durch Messung der Masse der Peptide in Kombination mit Datenbankdurchsicht durchgeführt wird.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem der Identifizierungsschritt außerdem auf einem oder mehreren des Folgenden basiert: (a) dem Vorliegen der veränderten Aminosäure; (b) der Bestimmung der Anzahl an freien Aminogruppen in den gekennzeichneten Peptitden; (c) dem Wissen um die Spaltungsspezifität der zur Herstellung des Protein-Peptid-Gemisches verwendeten Protease; und (d) dem Gesamtmittel der Hydropathizität der Peptide.
  18. Verfahren zur Bestimmung der relativen Menge von mindestens einem Protein in mehr als einer Proteine enthaltenden Probe, bei dem: (a) die in einer ersten Probe vorliegenden Peptide mit einem ersten Isotop markiert werden; (b) die in einer zweiten Probe vorliegenden Peptide mit einem zweiten Isotop markiert werden; (c) das Protein-Peptid-Gemisch der ersten Probe mit dem Protein-Peptid-Gemisch der zweiten Probe kombiniert wird; (d) die kombinierten Protein-Peptid-Gemische mittels Chromatographie in Fraktionen von Peptiden getrennt werden; (e) mindestens eine Aminosäure von mindestens einem der Peptide in jeder Fraktion chemisch, oder enzymatisch, oder chemisch und enzymatisch verändert wird; (f) die gekennzeichneten Peptide mittels Chromatographie aus jeder Fraktion isoliert werden, wobei die Chromatographie mit derselben Art von Chromatographie wie in Schritt (d) durchgeführt wird; (g) eine massenspektroskopische Analyse der isolierten gekennzeichneten Peptide durchgeführt wird; (h) die relative Mengen der gekennzeichneten Peptide in jeder Probe durch Vergleichen der Peak-Höhen der identischen aber unterschiedlichen, isotopenmarkierten gekennzeichneten Peptide berechnet werden, und (i) die Identität dieser gekennzeichneten Peptide und ihrer korrespondierenden Proteine bestimmt wird.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem Schritt (d) ein oder mehrere Vorbehandlungsschritte vorausgehen.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 oder 19, bei dem die chromatographischen Bedingungen der Schritte (d) und (f) dieselben oder im Wesentlichen ähnlich sind.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18, 19 oder 20, bei dem die Bestimmung der Identität der gekennzeichneten Peptide durch ein Verfahren durchgeführt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Tandem-Massenspektroskopie-Verfahren, Post-Source-Decay-Analyse, Messung der Masse der Peptide, und Messung der Masse der amino-terminalen Peptide, in Kombination mit Datenbankdurchsicht.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem die Bestimmung der Identität, des gekennzeichneten Peptids außerdem auf einem oder mehreren des Folgenden beruht: (a) der Anwesenheit der veränderten Aminosäure; (b) der Bestimmung der Anzahl an freien Aminogruppen in den gekennzeichneten Peptiden; (c) dem Wissen um die Spaltungsspezifität der zur Herstellung des Protein-Peptid-Gemisches verwendeten Protease; und (d) dem Gesamtmittel der Hydropathizität der Peptide.
  23. Verfahren zur Bestimmung der Menge von mindestens einem in einer Probe vorliegenden Protein, bei dem: (a) ein Protein-Peptid-Gemisch hergestellt wird; (b) eine bekannte Menge von mindestens einem synthetischen Referenz-Peptid, das unterschiedlich isotopenmarkiert im Vergleich zu seinem Referenz-Peptid-Gegenstück ist, zu dem Gemisch gegeben wird, wobei das synthetische Referenz-Peptid und das Referenz-Peptid-Gegenstück in Schritt (d) verändert werden; (c) das Gemisch mittels Chromatographie in Fraktionen von Peptiden getrennt wird; (d) mindestens eine Aminosäure von mindestens einem der Peptide in jeder Fraktion chemisch, oder enzymatisch, oder chemisch und enzymatisch verändert wird; (e) die gekennzeichneten Peptide aus jeder Fraktion mittels Chromatographie isoliert werden, wobei die Chromatographie mit derselben Art von Chromatographie durchgeführt wird, wie in Schritt (c); (f) eine massenspektroskopische Analyse der gekennzeichneten Peptide durchgeführt wird; (g) die Menge an in der Probe vorliegendem Protein berechnet wird, indem ein Vergleich der Peak-Höhen von synthetischem Referenz-Peptid und seinem Referenz-Peptid durchgeführt wird und (h) die Identität dieser Referenz-Peptide und ihrer korrespondierenden Proteine bestimmt wird.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem Schritt (c) ein oder mehrere Vorbehandlungsschritte vorausgehen.
  25. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 oder 24, bei dem die chromatographischen Bedingungen der Schritte (c) und (e) dieselben oder im Wesentlichen ähnlich sind.
  26. Verfahren nach einem der Ansprüche 23, 24 oder 25, bei dem die Bestimmung der Identität der Referenz-Peptide nach einem Verfahren durchgeführt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Tandem-Massenspektroskopie-Verfahren, Post-Source-Decay-Analyse, Messung der Masse der Peptide, und Messung der Masse der amino-terminalen Peptide, in Kombination mit Datenbankdurchsicht.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, bei dem die Bestimmung der Identität der Referenz-Peptide außerdem auf einem oder mehreren des Folgenden beruht: (a) der Anwesenheit der veränderten Aminosäure; (b) der Bestimmung der Anzahl an freien Aminogruppen in den Referenz-Peptiden; (c) dem Wissen um die Spaltungsspezifität der zur Herstellung des Protein-Peptid-Gemisches verwendeten Protease; und (d) dem Gesamtmittel der Hydropathizität der Peptide.
  28. Verfahren zur Isolierung einer Teilmenge von Peptiden aus einem Protein-Peptid-Gemisch, bei dem: (a) das Protein-Peptid-Gemisch mittels Chromatographie in Fraktionen von Peptiden getrennt wird; (b) mindestens eine Aminosäure in der Mehrzahl der Peptide in jeder Fraktion chemisch, oder enzymatisch, oder chemisch und enzymatisch verändert wird, wodurch eine Teilmenge von unveränderten Peptiden erhalten wird; und (c) diese unveränderten oder so genannten Identifizierungspeptide mittels Chromatographie aus jeder Fraktion isoliert werden, wobei die Chromatographie der Schritte (a) und (c) mit derselben Art von Chromatographie durchgeführt wird.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, bei dem die Chromatographiebedingungen der Schritte (a) und (c) dieselben oder im Wesentlichen ähnlich sind.
  30. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 oder 29, bei dem Schritt (a) ein oder mehrere Vorbehandlungsschritte vorausgehen.
  31. Verfahren nach einem der Ansprüche 28, 29 oder 30, bei dem die Identifizierungs-Peptide amino-terminale blockierte Peptide sind.
  32. Verfahren nach einem der Ansprüche 28, 29 oder 30, bei dem die Identifizierungs-Peptide amino-terminale Peptide sind.
  33. Verfahren nach einem der Ansprüche 28, 29 oder 30, bei dem die Identifizierungs-Peptide carboxy-terminale Peptide sind.
  34. Verfahren nach Anspruch 28, 29 oder 30, bei dem die Identifizierungs-Peptide intern, proteolytisch prozessierte Peptide sind.
  35. Verfahren nach Anspruch 32, bei dem in vivo blockierte amino-terminale Peptide von in vivo unblockierten freien amino-terminalen Peptiden unterschieden werden.
  36. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 35, bei dem außerdem die Identifizierungspeptide und ihren korrespondierenden Proteine identifiziert werden.
  37. Verfahren nach Anspruch 36, bei dem der Identifizierungsschritt durch ein Tandem-Massenspektrometer in Kombination mit Datenbankdurchsicht unterstützt wird.
  38. Verfahren nach Anspruch 36, bei dem der Identifizierungsschritt durch eine Post-Source-Decay-Analyse in Kombination mit Datenbankdurchsicht unterstützt wird.
  39. Verfahren nach Anspruch 36, bei dem der Identifizierungsschritt durch Messung der Masse der Peptide in Kombination mit Datenbankdurchsicht durchgeführt wird.
  40. Verfahren nach Anspruch 39, bei dem der Identifizierungsschritt außerdem auf einem oder mehreren des Folgenden basiert: (a) der Bestimmung der Anzahl an freien Aminogruppen in den Identifizierungspeptiden; (b) dem Wissen um die Spaltungsspezifität der zur Herstellung des Protein-Peptid-Gemisches verwendeten Protease; und (c) dem Gesamtmittel der Hydropathizität der Peptide.
  41. Verfahren zur Bestimmung der relativen Menge von mindestens einem Protein in mehr als einer Proteine enthaltenden Probe, bei dem: (a) die in einer ersten Probe vorliegenden Peptide mit einem ersten Isotop markiert werden; (b) die in einer zweiten Probe vorliegenden Peptide mit einem zweiten Isotop markiert werden; (c) das Protein-Peptid-Gemisch der ersten Probe mit dem Protein-Peptid-Gemisch der zweiten Probe kombiniert wird; (d) die kombinierten Protein-Peptid-Gemische mittels Chromatographie getrennt werden; (e) mindestens eine Aminosäure in der Mehrzahl der Peptide in jeder Fraktion chemisch, oder enzymatisch, oder chemisch und enzymatisch verändert wird; (f) die Identifizierungspeptide aus jeder Fraktion mittels Chromatographie isoliert werden, wobei die Chromatographie mit derselben Art von Chromatographie durchgeführt wird, wie die in Schritt (d); (g) eine massenspektrometrische Analyse der isolierten Identifizierungspeptide durchgeführt wird; (h) die relativen Mengen der Identifizierungspeptide in jeder Probe durch Vergleich der Peak-Höhen der identischen aber unterschiedlich isotopenmarkierten Identifizierungspeptide berechnet werden; und (i) die Identität dieser Identifizierungspeptide und ihrer korrespondierenden Proteine bestimmt wird.
  42. Verfahren nach Anspruch 41, bei dem Schritt (d) ein oder mehrere Vorbehandlungsschritte vorausgehen.
  43. Verfahren nach einem der Ansprüche 41 oder 42, bei dem die chromatographischen Bedingungen der Schritte (d) und (f) dieselben oder im Wesentlichen ähnlich sind.
  44. Verfahren nach einem der Ansprüche 41, 42 oder 43, bei dem die Bestimmung der Identität der Identifizierungspeptide durchgeführt wird durch ein Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Tandem-Massenspektroskopie-Verfahren, Post-Source-Decay-Analyse, Messung der Masse der Peptide, und Messung der Masse der amino-terminalen Peptide, in Kombination mit Datenbankdurchsicht.
  45. Verfahren nach Anspruch 44, bei dem zur Bestimmung der Identität der Identifizierungspeptide diese außerdem basierend auf einem oder mehreren des Folgenden identifiziert werden: (a) der Bestimmung der Anzahl an freien Aminogruppen in den Identifizierungspeptiden; (b) dem Wissen um die Spaltungsspezifität der zur Herstellung des Protein-Peptid-Gemisches verwendeten Protease; und (c) dem Gesamtmittel der Hydropathizität der Peptide.
  46. Verfahren zur Bestimmung der Menge von mindestens einem in einer Probe vorliegenden Protein, bei dem: (a) ein Protein-Peptid-Gemisch hergestellt wird; (b) zu dem Gemisch eine bekannte Menge von mindestens einem synthetischen Referenz-Peptid, das im Vergleich zu seinem Referenz-Peptid-Gegenstück unterschiedlich isotopenmarkiert ist, gegeben wird, wobei das synthetische Referenz-Peptid und das Referenz-Peptid-Gegenstück in Schritt (d) nicht verändert werden; (c) das Gemisch mittels Chromatographie in Fraktionen von Peptiden getrennt wird; (d) mindestens eine Aminosäure in der Mehrzahl der Peptide in jeder Fraktion chemisch, oder enzymatisch, oder chemisch und enzymatisch verändert wird; (e) die Identifizierungspeptide mittels Chromatographie aus jeder Fraktion isoliert werden, wobei die Chromatographie mit derselben Art von Chromatographie wie in Schritt (c) durchgeführt wird; (f) eine massenspektrometrische Analyse der Identifizierungspeptide durchgeführt wird; (g) die Menge des in der Probe vorliegenden Proteins durch Vergleichen der Peak-Höhen des synthetischen Referenz-Peptids mit seinem Referenz-Peptid-Gegenstück berechnet wird; und (h) die Identität der Referenzpeptide und ihrer korrespondierenden Proteine bestimmt wird.
  47. Verfahren nach Anspruch 46, bei dem Schritt (c) ein oder mehrere Vorbehandlungsschritte vorausgehen.
  48. Verfahren nach einem der Ansprüche 46 oder 47, bei dem die chromatographischen Bedingungen der Schritte (c) und (e) dieselben oder im Wesentlichen ähnlich sind.
  49. Verfahren nach einem der Ansprüche 46, 47 oder 48, bei dem die Bestimmung der Identität der Referenzpeptide durchgeführt wird durch ein Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Tandem-Massenspektroskopie-Verfahren, Post-Source-Decay-Analyse, Messung der Masse der Peptide, und Messung der Masse der aminoterminalen Peptide, in Kombination mit Datenbankdurchsicht.
  50. Verfahren nach Anspruch 49, bei dem die Bestimmung der Identität der Referenzpeptide außerdem auf einem oder mehreren des Folgenden basiert: (a) der Bestimmung der Anzahl an freien Aminogruppen in den Referenzpeptiden; (b) dem Wissen um die Spaltungsspezifität des zur Herstellung der Protein-Peptid-Gemisches verwendeten Protease; und (c) dem Gesamtmittel der Hydropathizität der Peptide.
  51. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 50, bei dem das Verfahren zur Diagnose einer Krankheit oder einer Prädisposition für eine Krankheit verwendet wird.
  52. Vorrichtung zum Sortieren von Peptiden, die umfasst: eine primäre chromatographische Säule zur Trennung eines Protein-Peptid-Gemisches unter einem definierten Satz von Bedingungen in eine Vielzahl von Fraktionen, wobei jede Fraktion anschließend einer Veränderung von mindestens einer Aminosäure unterzogen wird und dadurch gekennzeichnete Peptide erzeugt werden, und wobei die veränderten Fraktionen zu einem Satz zusammengegebener Fraktionen zusammengegeben werden, wobei jede zusammengegebene Fraktion mindestens zwei veränderte Fraktionen umfasst; und einen Satz von sekundären chromatographischen Säulen, die eine erste sekundäre chromatographische Säule zur Trennung einer ersten zusammengegebenen Fraktion und mindestens eine zweite parallel zur ersten chromatographischen Säule angeordnete sekundäre chromatographische Säule zur Trennung einer zweiten zusammengegebenen Fraktion umfasst, wobei der Satz an sekundären chromatographischen Säulen die Isolierung der gekennzeichneten Peptide unter im Wesentlichen identischen Bedingungen wie dem definierten Satz von Bedingungen durchführt, wobei es keinen Elutionsüberlapp zwischen i) den gekennzeichneten Peptiden aus verschiedenen Fraktionen innerhalb einer Zusammengebung oder zwischen Zusammengebungen und ii) den gekennzeichneten Peptiden und den unveränderten Peptiden gibt.
  53. Vorrichtung zum Sortieren von Peptiden, die umfasst: eine primäre chromatographische Säule zur Trennung eines Protein-Peptid-Gemisches unter einem definierten Satz von Bedingungen in eine Vielzahl von Fraktionen, wobei jede Fraktion anschließend einer Veränderung von mindestens einer Aminosäure unterzogen wird und dadurch veränderte Peptide und unveränderte Peptide erzeugt werden, und wobei die veränderten Fraktionen zu einem Satz zusammengegebener Fraktionen zusammengegeben werden, wobei jede zusammengegebene Fraktion mindestens zwei veränderte Fraktionen umfasst; und einen Satz von sekundären chromatographischen Säulen, die eine erste sekundäre chromatographische Säule zur Trennung einer ersten zusammengegebenen Fraktion und mindestens eine zweite parallel zur ersten chromatographischen Säule angeordnete sekundäre chromatographische Säule zur Trennung einer zweiten zusammengegebenen Fraktion umfasst, wobei der Satz an sekundären chromatographischen Säulen die Isolierung der Identifizierungspeptide unter im Wesentlichen identischen Bedingungen wie dem definierten Satz von Bedingungen durchführt, wobei es keinen Elutionsüberlapp zwischen i) den Identifizierungspeptiden aus verschiedenen Fraktionen innerhalb einer Zusammengebung oder zwischen Zusammengebungen und ii) den Identifizierungspeptiden und den veränderten Peptiden gibt.
  54. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 52 oder 53, die außerdem einen Auslass zu dem Satz der sekundären chromatographischen Säulen zum Sammeln des Eluats aus der ersten sekundären chromatographischen Säule und der zweiten sekundären chromatographischen Säule umfasst.
  55. Vorrichtung nach Anspruch 54, die außerdem einen an den Auslass angeschlossenen Analysator umfasst.
  56. Vorrichtung nach Anspruch 54, die außerdem einen an den Auslass angeschlossenen Abfall-Behälter zum Sammeln eines Abfall-Produkts aus dem Satz der sekundären chromatographischen Säulen umfasst.
  57. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 52 oder 53, die außerdem einen Proben-Injektor umfasst, der zur Injektion einer zusammengegebenen Fraktion in entweder die erste sekundäre Säule oder in die zweite sekundäre Säule mit dem Satz von sekundären Säulen verbunden ist.
  58. Vorrichtung nach Anspruch 57, die außerdem einen Satz von Proben-Injektionshähnen zur Leitung der zusammengegebenen Fraktion aus dem Proben-Injektor auf entweder die erste sekundäre Säule oder auf die zweite sekundäre Säule umfasst.
  59. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 52 oder 53, die außerdem ein Lösungsmittelsystem zur Bereitstellung eines Lösungsmittelgradienten auf den Satz von sekundären chromatographischen Säulen umfasst.
  60. Vorrichtung nach Anspruch 59, bei dem das Lösungsmittelsystem eine erste Lösungsmittelpumpe zur Bereitstellung eines Lösungsmittelgradienten zur ersten sekundären chromatographischen Säule und eine zweite Lösungsmittelpumpe zur Bereitstellung eines Lösungsmittelgradienten zur zweiten sekundären chromatographischen Säule umfasst.
  61. Vorrichtung nach Anspruch 59, bei dem das Lösungsmittelsystem umfasst: eine an die erste sekundäre chromatographische Säule und an die zweite sekundäre chromatographische Säule angeschlossene Lösungsmittel-Pumpe; eine kontrollierte Aufteilungsvorrichtung, die eine erste Flusseinstellvorrichtung zur Einstellung eines Lösungsmittelflusses zur ersten sekundären chromatographischen Säule und eine zweite Flusseinstellvorrichtung zur Einstellung eines Lösungsmittelflusses zur zweiten sekundären chromatographischen Säule umfasst.
  62. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 52 oder 53, die außerdem einen Fraktionssammler zur Sammlung eines Eluats aus dem Satz der sekundären chromatographischen Säulen umfasst.
  63. Vorrichtung nach Anspruch 58, die außerdem eine Hahneinstellvorrichtung zur Einstellung des Satzes der Proben-Injektions-Hähne umfasst.
  64. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 52 oder 53, bei der die erste und die zweite sekundäre chromatographische Säule im Wesentlichen identisch mit der primären Säule sind.
  65. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 52 oder 53, bei der ein erster Lösungsmittelgradient auf die primäre Säule angewendet wird, um eine Trennung des Peptid-Protein-Gemisches zu bewirken, und ein zweiter Lösungsmittelgradient, der im Wesentlichen identisch mit dem ersten Lösungsmittelgradienten ist, auf die sekundären Säulen angewendet wird, um die Trennung der zusammengegebenen Fraktionen zu bewirken.
  66. Verfahren zur Isolierung eines gekennzeichneten Peptids aus einem Protein-Peptid-Gemisch, bei der: (a) eine primäre chromatographische Säule zur Trennung des Protein-Peptid-Gemisches bereitgestellt wird; (b) das Protein-Peptid-Gemisch in die primäre chromatographische Säule injiziert wird, um das Protein-Peptid-Gemisch unter einem definierten Satz an Bedingungen in einen Satz von Fraktionen aufzutrennen; (c) mindestens eine der Fraktionen aus dem Satz an Fraktionen unter Bildung eines Satzes an veränderten Fraktionen verändert wird, wobei eine veränderte Fraktion eine Teilmenge an gekennzeichneten Peptiden und eine Teilmenge an unveränderten Peptiden enthält; (d) eine erste veränderte Fraktion und eine zweite veränderte Fraktion unter Bildung einer ersten zusammengegebenen Fraktion zusammengegeben werden, wobei es keinen Elutionsüberlapp zwischen i) den gekennzeichneten Peptiden aus den ersten und zweiten veränderten Fraktionen und ii) den gekennzeichneten Peptiden und den unveränderten Peptiden dieser Fraktionen gibt; (e) eine dritte veränderte Fraktion und eine vierte veränderte Fraktion unter Bildung einer zweiten zusammengegebenen Fraktion zusammengegeben werden, wobei es keinen Elutionsüberlapp zwischen i) den gekennzeichneten Peptiden der dritten und der vierten veränderten Fraktionen und ii) den gekennzeichneten Peptiden und den unveränderten Peptiden dieser Fraktionen gibt; (f) eine erste sekundäre chromatographische Säule zur Trennung einer Teilmenge an gekennzeichneten Peptiden von einer Teilmenge an unveränderten Peptiden bereitgestellt wird; (g) die erste zusammengegebene Fraktion unter Verwendung der sekundären chromatographischen Säule unter dem definierten Satz an Bedingungen getrennt wird, um so die Teilmengen an gekennzeichneten Peptiden in der ersten veränderten Fraktion und in der zweiten veränderten Fraktion zu isolieren.
  67. Verfahren zur Isolierung eines Identifizierungspeptids aus einem Protein-Peptid-Gemisch, bei der: (a) eine primäre chromatographische Säule zur Trennung des Protein-Peptid-Gemisches bereitgestellt wird; (b) das Protein-Peptid-Gemisch in die primäre chromatographische Säule injiziert wird, um das Protein-Peptid-Gemisch unter einem definierten Satz an Bedingungen in einen Satz von Fraktionen aufzutrennen; (c) mindestens eine der Fraktionen aus dem Satz an Fraktionen unter Boldung eines Satzes an veränderten Fraktionen verändert wird, wobei die veränderte Fraktion eine Teilmenge an veränderten Peptiden und eine Teilmenge an Identifizierungspeptiden enthält; (d) eine erste veränderte Fraktion und eine zweite veränderte Fraktion unter Bildung einer ersten zusammengegebenen Fraktion zusammengegeben werden, wobei es keinen Elutionsüberlapp zwischen i) den veränderten Peptiden aus den ersten und zweiten veränderten Fraktionen und ii) den veränderten Peptiden und den Identifizierungspeptiden dieser Fraktionen gibt; (e) eine dritte veränderte Fraktion und eine vierte veränderte Fraktion unter Bildung einer zweiten zusammengegebenen Fraktion zusammengegeben werden, wobei es keinen Elutionsüberlapp zwischen i) den Identifizierungspeptiden der dritten und der vierten veränderten Fraktionen und ii) den veränderten Peptiden und den Identifizierungspeptiden dieser Fraktionen gibt; (f) eine erste sekundäre chromatographische Säule zur Trennung einer Teilmenge an veränderten Peptiden von einer Teilmenge an Identifizierungspeptiden bereitgestellt wird; (g) die erste zusammengegebene Fraktion unter Verwendung der sekundären chromatographischen Säule unter dem definierten Satz an Bedingungen getrennt wird, um so die Teilmengen an Identifizierungspeptiden in der ersten veränderten Fraktion und in der zweiten veränderten Fraktion zu isolieren.
  68. Verfahren nach den Ansprüchen 65 oder 67, bei dem außerdem die zweite zusammengegebene Fraktion unter Verwendung der ersten sekundären chromatographischen Säule unter dem definierten Satz an Bedingungen getrennt wird, um so die Teilmengen an gekennzeichneten oder Identifizierungspeptiden in der dritten veränderten Fraktion und der vierten veränderten Fraktion zu isolieren.
  69. Verfahren nach Anspruch 66 oder 67, bei dem außerdem: (h) eine im Wesentlichen parallel zur ersten sekundären chromatographischen Säule angeordnete zweite sekundäre chromatographische Säule bereitgestellt wird, um eine Teilmenge an veränderten Peptiden von einer Teilmenge an unveränderten Peptiden in einer Fraktion zu trennen; und (i) die zweite zusammengegebene Fraktion unter Verwendung der zweiten sekundären chromatographischen Säule unter dem definierten Satz an Bedingungen getrennt wird, um so die Teilmenge an veränderten Peptiden in der dritten veränderten Fraktion und der zweiten veränderten Fraktion zu isolieren.
  70. Verfahren nach einem der Ansprüche 66 oder 67, bei dem außerdem die gekennzeichneten oder Identifizierungspeptide zu einem Analysator geleitet werden.
  71. Verfahren nach Anspruch 70, bei dem die Identifizierung eines gekennzeichneten oder Identifizierungspeptids und seines korrespondierenden Proteins unter Verwendung des Analysators in Kombination mit einer Datenbankdurchsicht durchgeführt wird.
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