DE102017011423B4

DE102017011423B4 - Verfahren und Vorrichtung für lsotopenverhältnis-Massenspektrometrie

Info

Publication number: DE102017011423B4
Application number: DE102017011423.4A
Authority: DE
Inventors: Jens Griep-Raming
Original assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Current assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Priority date: 2017-02-07
Filing date: 2017-12-11
Publication date: 2024-05-16
Anticipated expiration: 2037-12-12
Also published as: US20180226238A1; US10607822B2; CN108398479A; GB201718521D0; GB201701986D0; DE102017011423A1; GB2559452A; GB2559452B; CN108398479B

Abstract

Verfahren der Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie umfassend:Fließenlassen einer flüssigen mobilen Phase, die eine Probe enthält, durch eine Trennvorrichtung mit einer ersten Flussrate, wobei die Probe mindestens eine Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis umfasst, wobei die erste Flussrate mindestens 50% einer optimalen Flussrate beträgt, die einer minimalen Trennstufenhöhe der Trennvorrichtung entspricht;Reduzieren der Flussrate der durch die Trennvorrichtung fließenden flüssigen mobilen Phase von der ersten Flussrate auf eine zweite Flussrate, die niedriger als die erste Flussrate ist, aber einer höheren Trennstufenhöhe der Trennvorrichtung entspricht, für mindestens einen Abschnitt der Zeit, während der die mindestens eine Molekülspezies aus der Trennvorrichtung austritt, wobei die Flussrate derart reduziert wird, dass eine gewünschte Präzision des Isotopenverhältnisses erreicht wird;Analysieren der Masse der mindestens einen Molekülspezies, die aus der Trennvorrichtung ausgetreten ist, mindestens während die Flussrate auf die zweite Flussrate reduziert ist; undBestimmen aus der Massenanalyse von mindestens einem Isotopenverhältnis der mindestens einen Molekülspezies aus den Intensitäten der Massenpeaks von mindestens zwei Isotopologen der mindestens einen Molekülspezies, wobei die Massenanalyse mit einem Massenauflösungsvermögen durchgeführt wird, das hoch genug ist, um die zwei häufigsten Massenpeaks bei der nominellen Masse von mindestens einem der Isotopologe aufzulösen.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Massenspektrometrie. Die Erfindung betrifft speziell die Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (IRMS) und insbesondere mit Flüssigkeitschromatografie gekoppelte IRMS. Die Erfindung bietet sowohl Verfahren als auch eine Vorrichtung.
Hintergrund
Herkömmlicherweise werden akkurate und präzise Messungen auf Magnetsektor-Massenspektrometern vorgenommen, insbesondere Magnetsektor-Massenspektrometer, die einen Multikollektor zur gleichzeitigen Detektion von Isotopen verwenden. Vor der Analyse wird eine Probe typischerweise einer Oxidation, Pyrolyse und/oder Reduktion bei einer erhöhten Temperatur unterzogen, um gasförmige Moleküle zu erzeugen, zum Beispiel eines oder mehrere von CO_x, NO_x, N₂, H₂O und SO₂ (x = 1 oder 2). Die Gase werden anschließend in das Isotopenverhältnis-Massenspektrometer zur Isotopenanalyse eingebracht. In einem Isotopenverhältnis-Spektrometer werden die Gase ionisiert und die Verhältnisse der entsprechenden Isotope werden gemessen, zum Beispiel durch Vergleichen der Outputs von verschiedenen Kollektoren. Die Verhältnisse der interessierenden Isotopen werden typischerweise im Vergleich zu einem Isotopenstandard gemessen, um jegliche Verzerrung oder systematische Messabweichung auszuschalten.
Kürzlich wurde gezeigt, dass elektrostatische Orbitalfallen-Massenspektrometer, wie z. B. ein Orbitrap™-Massenspektrometer (Thermo Scientific), ebenfalls dazu in der Lage sind, präzise Isotopenverhältnisse zu messen, die im Prinzip auch akkurat sein sollten (John Eiler, Präsentation beim Clumped Isotope Workshop, Januar 2016; John Eiler et al. Poster auf der Konferenz ASMS 2016). Derartige Ergebnisse wurden unter Verwendung eines Orbitrap-Massenspektrometers erzielt, das mit einer Gaschromatografie-(GC)-Säule gekoppelte Elektronenstoß-Ionisation einsetzt und einen Peak-Broadener prozessabwärts der GC-Säule verwendet. Das Konzept eines Peak-Broadeners in Form eines Inline-Spülvolumens ist aufgrund von langsamerer Diffusion in einer Flüssigkeit bei einem LC-Aufbau schwierig zu implementieren. Das würde Inhomogenitäten im Effluent verursachen und somit dazu führen, dass die Messung weniger reproduzierbar wird.
Die Messung von präzisen und akkuraten Isotopenverhältnissen mittels mit einem Massenspektrometer gekoppelter Flüssigkeitschromatografie (LC) hat bestimmte Probleme aufgeworfen. LC stellt eine etablierte Technik im Bereich von Biochemie, Life Science und Pharmakologie zur Trennung von molekularen Komponenten in einer Mischung dar. Eine typische Probe enthält organische Moleküle, die in einem organischen Lösemittel oder einer wässrigen Lösung oder einem Medium, das Wasser und ein organisches Lösemittel umfasst, gelöst wurden. Für derartige Proben wird die Trennung der Moleküle vom Lösemittel im Allgemeinen mit einer organischen mobilen Phase mittels Techniken wie z. B. Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie (high performance liquid chromatography - HPLC), Kapillarzonenelektrophorese (capillaryzone electrophoresis - CZE) und Größenausschlusschromatografie (sizeexclusion chromatography - SEC) durchgeführt. Allerdings ist das Koppeln eines Isotopenverhältnis-Massenspektrometers an ein Flüssigkeitschromatografiesystem mit technischen Herausforderungen verbunden, da die mobile Phase der LC häufig auf einem organischen Lösemittel basiert und/oder kohlenstoffhaltige Puffer enthält, und daher dieselben Spezies von Oxidations- oder Reduktionsprodukten wie die interessierenden organischen Probenmoleküle erzeugt und somit die Isotopenanalyse stört. Es wurden bereits verschiedene Versuche für das Koppeln von Flüssigkeitschromatografie und IRMS unternommen, wie nachstehend bezeichnet.
In „Moving-wire device for Carbon Isotopic Analyses of Nanogram Quantities of Nonvolatile Organic Carbon" (A. L. Sessions, S. P. Sylva und J. M. Hayes, Anal. Chem., 2005, 77, 6519-6527) ist ein Verfahren zur Analyse von ¹³C -Verhältnissen von in Lösung gelösten nichtflüchtigen organischen Proben beschrieben. Die Output-Lösung des Trennsystems wird auf einem Nickeldraht getrocknet, um die mobile Phase aus der Probe zu entfernen. Der Probenrest wird dann verbrannt und das entstandene CO₂ mittels IRMS gemessen. Allerdings werden Präzision und Empfindlichkeit dieses Verfahrens durch einen hohen Hintergrundwert des aus dem im Draht enthaltenen Kohlenstoff stammenden CO₂ eingeschränkt. Das Koppeln mittels beweglichem Draht war aufgrund der damit zwangsläufig verbundenen Unzuverlässigkeit kommerziell nicht erfolgreich.
US20020072126A1 offenbart ein rekonfigurierbares Multimodus-Analysesystem, das einen Park- oder MS/MS-Detektionsmodus bereitstellt, bei dem der Fluss des Säuleneluents reduziert ist, um eine längere Analysezeit innerhalb eines einzelnen eluierenden Detektionspeaks zu ermöglichen. Eine Mikro-Schaltventileinheit kann zwischen dem normalen (MS-)Modus, bei dem das Säuleneluent direkt zu einer MS-Einheit geleitet wird, und einem Peak-Parking- (oder MS/MS-)Modus rekonfiguriert werden, bei dem der Säulenfluss im normalen Modus unterbrochen und der Gradient angehalten wird, während der interessierende Detektionspeak langsamer durch die MS-Einheit fließt. Eine Mikrospritzenpumpe trägt zu der niedrigeren MS/MS-Flussrate bei. Eine MS-Steuereinheit steuert Mikroschaltventile, um zwischen MS- und MS/MS-Modus umzuschalten. Nach einem Detektionspeak wird der MS-Modus wiederhergestellt, und die Primärpumpe des Systems kehrt zu den normalen Flussraten und Gradientenbedingungen zurück. Der Moduswechsel kann für jeden Chromatogramm-Detektionspeak durchgeführt werden.
„Review: Current applications and challenges for liquid chromatography coupled to isotope ratio mass spectrometry (LC/IRMS)" (J.-P. Godin, and J. S. 0. Mc Cullagh, Rapid Commun. Mass Spectrom., Vol. 25, 2011, S. 3019-3028) gibt ein Überblick über die technischen Fortschritte und Einschränkungen, die methodischen Entwicklungen und die neuen Anwendungen der an die Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie gekoppelten Flüssigkeitschromatographie.
US20080092639A1 beschreibt ein Gerät und ein Verfahren zur Steuerung des Flüssigkeitschromatographieflusses unter Beibehaltung einer Trennung der analytischen Komponenten und unter Gewährleistung einer längeren Zeit für die Detektoranalyse, um gleichzeitig die Nachweisempfindlichkeit und Auflösung zu erhöhen.
DE60204669T2 offenbart ein Verfahren zur Isolierung einer Teilmenge von Peptiden aus einem Protein-Peptid-Gemisch, bei dem: (a) das Protein-Peptid-Gemisch mittels Chromatographie in Fraktionen von Peptiden getrennt wird; (b) chemisch, oder enzymatisch, oder chemisch und enzymatisch mindestens eine Aminosäure von mindestens einem der Peptide in jeder Fraktion verändert wird, wodurch eine Teilmenge von veränderten Peptiden erzeugt wird; und (c) diese veränderten oder so genannten gekennzeichneten Proteine mittels Chromatographie aus jeder Fraktion isoliert werden, wobei die Chromatographie der Schritte (a) und (c) mit derselben Art von Chromatographie durchgeführt wird.
US20080265152A1 offenbart ein Massenspektrometer, das ein Hochdruck-Flüssigkeitschromatographiesystem umfasst, das mit einer Brennkammer und einem Isotopenverhältnis-Massenanalysator mittels einer Elektrospray-Ionenquelle und einer Vorrichtung für die asymmetrische lonenmobilitätsspektrometrie verbunden ist. Analyt- und Lösungsmittelmoleküle werden durch die lonenquelle ionisiert. Gewünschte Analyt-Ionen werden von der feldasymmetrischen lonenmobilitätsspektrometrie-Vorrichtung im Wesentlichen zur Verbrennungskammer weitergeleitet, während unerwünschte Lösungsmittel-Ionen von der feldasymmetrischen lonenmobilitätsspektrometrie-Vorrichtung erheblich abgeschwächt werden.
US20150041635A1 offenbart ein Verfahren zur Massenspektrometrie, bei dem die Intensität eines Analyten durch Bestimmung der Intensität erster charakteristischer Fragmentionen bestimmt wird, wenn die Intensität der ersten charakteristischen Fragmentionen innerhalb eines ersten Intensitätsbereichs liegt, der dem Nachweis- oder Sättigungsbereich eines lonendetektors entspricht. Liegt die Intensität der ersten charakteristischen Fragment-Ionen jedoch außerhalb des ersten Intensitätsbereichs, so dass der Ionendetektor gesättigt wäre, wird die Intensität des Analyten durch Bestimmung der Intensität von zweiten unterschiedlichen charakteristischen Fragment-Ionen bestimmt.
Ein weiteres Verfahren zum Koppeln eines Flüssigkeitschromatografiesystems an ein IRMS wird in ""Continuous-Flow Isotope Ratio Mass Spectrometry Using the Chemical Reaction Interface with Either Gas or Liquid Chromatography Introduction" (Y. Teffera, J. Kusmierz, F. Abramson, Anal.Chem., 1996, 68, 1888-1894)" vorgestellt. Bei diesem Verfahren wird die das Flüssigkeitschromatografiesystem verlassende Lösung vor der chemischen Oxidation des trockenen Aerosols an semipermeablen Membranen desolvatisiert. Die oxidierten Produkte werden dann mittels IRMS analysiert. Allerdings wird beim beschriebenen Verfahren die mobile Phase nicht auf die erforderlichen extrem niedrigen Lösemittelwerte entfernt, z. B. auf ein Lösemittel-/Probenverhältnis besser als 1:100.
Die nasschemische Oxidation (wie beim LC-Isolink™ von Thermo Fisher Scientific verwendet) ermöglicht das Koppeln an Flüssigkeitschromatografie. Der Lösungs-Output aus dem Chromatografiesystem wird mit einem Oxidationsmittel gemischt und einem Oxidationsreaktor zugeführt. Im Oxidationsreaktor werden die organischen Verbindungen in CO₂ umgewandelt, das dann im IRMS analysiert wird. Allerdings erfolgt keine Trennung der mobilen Phase von der Probe, und daher ist dieses Verfahren nicht für LC-Trennverfahren geeignet, die eine organische mobile Phase oder Flüssigphasenmodifikatoren oder kohlenstoffhaltige Puffer verwenden.
Zusätzlich haben die den herkömmlichen LC-MS-lonenquellen eigenen mit lonenquellenfluktuationen zusammenhängenden Probleme, wie z. B. Elektrosprayionisierung (electrospray ionization - ESI) oder chemische Ionisierung bei Atmosphärendruck (atmospheric pressure chemical ionization - APCI), eine weitere abschreckende Wirkung auf die Verwendung von LC-MS für akkurate und präzise Isotopenverhältnis-Messungen.
In einer kürzlich vorgestellten Präsentation (A. Breidbach, Improved precision of measured isotope ratio through peak parking and scan-based statistics in IDMS of small organic molecules, Poster ThOS36-02, 20. Internationale Massenspektrometrie-Konferenz 2014, Genf, CH) wurde ein Verfahren zum Peak-Parking verwendet, das das Ausschneiden eines LC-Peaks aus einem Chromatogramm und Einfangen der eluierenden Spezies in einer Probenschleife beinhaltet. Die Schleife wird anschließend durch einen geringeren, von einer zweiten Pumpe erzeugten Strom zum Massenspektrometer gespült und überführt. Die Schritte des Entnehmens der Probe aus dem Hauptstrom in eine Schleife und anschließenden Spülens in das Massenspektrometer haben nicht den Grad an Präzision und Genauigkeit erreicht, der für Isotopenverhältnismessungen häufig gewünscht wird. Darüber hinaus ist das System komplex und erfordert die zusätzliche Probenschleife und ein zweites Pumpensystem.
Dementsprechend besteht nach wie vor ein Bedarf an präziser und akkurater Bestimmung von Isotopenverhältnissen mittels mit LC gekoppelter, massenspektrometrischer Detektion.
Zusammenfassung
Nach einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren der Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie bereitgestellt, umfassend:

Fließenlassen einer flüssigen mobilen Phase, die eine Probe enthält, durch eine Trennvorrichtung mit einer ersten Flussrate, wobei die Probe mindestens eine Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis umfasst;
Reduzieren der Flussrate der durch die Trennvorrichtung fließenden flüssigen mobilen Phase von der ersten Flussrate auf eine zweite Flussrate, die niedriger als die erste Flussrate ist, aber einer höheren Trennstufenhöhe der Trennvorrichtung entspricht, für mindestens einen Abschnitt der Zeit, während der die mindestens eine Molekülspezies aus der Trennvorrichtung austritt, , wobei die Flussrate derart reduziert wird, dass eine gewünschte Präzision des Isotopenverhältnisses zu erreicht wird;
Analysieren der Masse der mindestens einen Molekülspezies, die aus der Trennvorrichtung ausgetreten ist, mindestens während die Flussrate eingestellt oder reduziert wird; und
Bestimmen aus der Massenanalyse von mindestens einem Isotopenverhältnis der mindestens einen Molekülspezies aus der Massenanalyse.

Nach einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren der Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie nach Anspruch 1 bereitgestellt.
Das mindestens eine Isotopenverhältnis ist aus den Intensitäten von Massenpeaks von mindestens zwei Isotopologen der mindestens einen Molekülspezies mit einer unterschiedlichen oder derselben nominellen Masse bestimmt, wobei die Massenanalyse mit einem Massenauflösungsvermögen durchgeführt wird, das hoch genug ist, um die zwei häufigsten Massenpeaks bei der nominellen Masse von mindestens einem der zur Bestimmung des Isotopenverhältnisses verwendeten Isotopologe, vorzugsweise bei den nominellen Massen von jedem der zur Bestimmung des Isotopenverhältnisses verwendeten Isotopologe, aufzulösen. In diesem Zusammenhang soll aufgelöst bedeuten, dass zwei nebeneinanderliegende Peaks Peakspitzen aufweisen, die voneinander unterscheidbar sind, d. h. dass es zwischen ihnen ein Tal gibt.
Das mindestens eine Isotopenverhältnis kann aus den Intensitäten der Massenpeaks von mindestens zwei Isotopologen der mindestens einen Molekülspezies mit einer unterschiedlichen oder derselben nominellen Masse bestimmt werden, wobei vorzugsweise jeder für die Bestimmung des Isotopenverhältnisses verwendete Isotopolog-Massenpeak von mindestens evtl. anderen Massenpeaks bei derselben nominellen Masse abgesetzt ist, die mehr als 20% (vorzugsweise mehr als 10% oder mehr als 5%) der Intensität des Isotopolog-Massenpeaks betragen.
Der Schritt des Analysierens der Masse der mindestens einen Molekülspezies, die aus der Trennvorrichtung ausgetreten ist, wird durchgeführt mindestens während die Durchflussrate reduziert ist oder auf die Durchflussrate eingestellt ist, um eine gewünschte Präzision des Isotopenverhältnisses zu erreichen.
Nach noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine Vorrichtung für Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie bereitgestellt, umfassend:

eine Trennvorrichtung zum Trennen von Komponenten einer Probe in einer flüssigen mobilen Phase, wobei die Komponenten der Probe mindestens eine Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis umfassen;
mit der Trennvorrichtung prozessabwärts gekoppeltes Massenspektrometer zur Analyse der Masse der mindestens einen Molekülspezies, während die mindestens eine Molekülspezies aus der Trennvorrichtung eluiert, und Bestimmen von mindestens einem Isotopenverhältnis der mindestens einen Molekülspezies aus der Massenanalyse; und
einen Regulierer, der dazu konfiguriert ist, den Fluss der flüssigen mobilen Phase durch die Trennvorrichtung zu regulieren, um die flüssige mobile Phase durch die Trennvorrichtung für einen ersten Zeitabschnitt bei einer ersten Flussrate fließen zu lassen und die Flussrate der flüssigen mobilen Phase durch die Trennvorrichtung von der ersten Flussrate auf eine zweite Flussrate, die niedriger als die erste Flussrate ist, für mindestens einen Abschnitt der Zeit, während der die mindestens eine Molekülspezies aus der Trennvorrichtung eluiert, einzustellen oder zu reduzieren, um eine gewünschte Präzision des Isotopenverhältnisses zu erreichen, wobei die Flussrate derart reduziert wird, dass eine gewünschte Präzision des Isotopenverhältnisses erreicht wird.

Nach noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine Vorrichtung für Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie nach Anspruch 25 bereitgestellt.
Das Massenspektrometer kann vorzugsweise eine Massenanalyse mit einem Massenauflösungsvermögen durchführen, das hoch genug ist, um die zwei häufigsten Massenpeaks bei der nominellen Masse von mindestens einem der Isotopologen aufzulösen. Vorzugsweise kann das Massenspektrometer Massenanalyse mit einem Massenauflösungsvermögen durchführen, das hoch genug ist, dass jeder für die Bestimmung des Isotopenverhältnisses verwendete Isotopolog-Massenpeak von mindestens jedem anderen Massenpeak bei derselben nominellen Masse abgesetzt ist, was mehr als 20% (vorzugsweise mehr als 10% oder mehr als 5%) der Intensität des Isotopolog-Massenpeaks beträgt.
Die Durchflussrate der durch die Trennvorrichtung fließenden flüssigen mobilen Phase für mindestens einen Abschnitt der Zeit, während der die mindestens eine Molekülspezies aus der Trennvorrichtung austritt, wird eingestellt oder reduziert, um eine gewünschte Präzision des Isotopenverhältnisses zu erreichen, wie in diesem Schriftstück nachstehend beschrieben.
Nach noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren der Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie bereitgestellt, umfassend:

Fließenlassen einer flüssigen mobilen Phase, die eine Probe enthält, durch eine Trennvorrichtung, wobei die Probe mindestens eine Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis umfasst;
Einstellen der Durchflussrate der durch die Trennvorrichtung fließenden flüssigen mobilen Phase für mindestens einen Abschnitt der Zeit, während der die mindestens eine Molekülspezies aus der Trennvorrichtung austritt, auf eine Durchflussrate, die es ermöglicht, eine gewünschte Präzision des Isotopenverhältnisses zu erreichen;
Analysieren der Masse der mindestens einen Molekülspezies, die aus der Trennvorrichtung ausgetreten ist, mindestens während die Durchflussrate reduziert ist;
Bestimmen von mindestens einem Isotopenverhältnis der mindestens einen Molekülspezies aus der Massenanalyse.

Eine Trennvorrichtung und ein Massenspektrometer werden vorzugsweise wie vorstehend beschrieben bereitgestellt. Zusätzlich ist ein Regler vorzugsweise dazu konfiguriert, die Durchflussrate der flüssigen mobilen Phase durch die Trennvorrichtung für mindestens einen Abschnitt der Zeit, während der die mindestens eine Molekülspezies aus der Trennvorrichtung eluiert, auf eine Durchflussrate einzustellen, die es ermöglicht, eine gewünschte Präzision des Isotopenverhältnisses zu erreichen. Vorzugsweise ist die gewünschte Präzision des Isotopenverhältnisses <20 δ‰ und noch bevorzugter ist die gewünschte Präzision des Isotopenverhältnisses <10 δ‰. In bestimmten Ausführungsformen wird ein Schritt des Reduzierens der Durchflussrate nicht verwendet, sondern statt dessen kann die gesamte Trennung der Probe einschließlich bis hin zur Elution der mindestens einen Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis mit einer Durchflussrate durchgeführt werden, die niedrig genug ist, um zu ermöglichen, die gewünschte Präzision des Isotopenverhältnisses zu erreichen. Derartige Ausführungsformen haben jedoch den Nachteil, dass sich die Gesamtanalysezeit erhöht. Daher ist es vorzuziehen, einen Schritt des Reduzierens der Durchflussrate für eine begrenzte Zeit zu verwenden, insbesondere für mindestens einen Abschnitt der Zeit, während der die mindestens eine Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis aus der Trennvorrichtung eluiert.
Die Erfindung ermöglicht eine präzise und akkurate Bestimmung des Isotopenverhältnisses mittels einer mit einer flüssigkeitsbasierten Probentrenntechnik, wie z. B. LC, gekoppelten massenspektrometrischen Detektion, insbesondere wenn organische Lösemittel verwendet werden. Die Erfindung kann auch die Verwendung von lonisierungstechniken ermöglichen, die typischerweise gerne mit LC-MS verwendet werden, wie z. B. Ionisierung bei Atmosphärendruck (atmospheric pressure ionization - API), zum Beispiel Elektrosprayionisierung (ESI) oder chemische Ionisierung bei Atmosphärendruck (APCI).
Die Trennvorrichtung ist eine Probentrennvorrichtung zum Trennen von Molekülspezies einer Probe in einer flüssigen Phase. Die Trennvorrichtung umfasst vorzugsweise eine Flüssigkeitschromatografie-(LC)-Säule, zum Beispiel eine Säule für Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie (HPLC) oder Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatografie (UHPLC), oder Größenausschlusschromatografie (SEC) oder lonenchromatografie (IC). Der Innendurchmesser der LC-Säule liegt vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 10 Millimeter (mm), es können jedoch kleinere oder größere Säulendurchmesser eingesetzt werden. Der Chromatografietyp kann zum Beispiel Umkehrphasenchromatografie (reversed-phase chromatography - RPC) oder Normalphasenchromatografie (normal-phase chromatography - NPC) sein. Die Trennvorrichtung kann einen Boden für Dünnschichtchromatografie (thin-layer chromatography - TLC) umfassen. Vorzugsweise ist die Chromatografie eine, bei der die mobile Phase wenigstens teilweise, oder vollständig, organisches Lösemittel umfasst. Die Trennvorrichtung kann ein Kapillarelektrophorese-(capillary electrophoresis - CE) -System umfassen, zum Beispiel Kapillarzonenelektrophorese (CZE) oder andere elektrophoretische Techniken, einschließlich Kapillar-Gel-Elektrophorese (capillary gel electrophoresis - CGE).
Die flüssige mobile Phase kann eine wässrige Phase oder organisches Lösemittel oder Mischung aus Wasser und organischem Lösemittel sein. Vorzugsweise umfasst die flüssige mobile Phase eine Menge an organischem Lösemittel (wie z. B. mindestens 10 Vol.-%, 20 Vol.-%, 30 Vol.-%, 40 Vol.-% oder 50 Vol.-% organisches Lösemittel). Die flüssige mobile Phase kann mindestens 60 Vol.-%, 70 Vol.-%, 80 Vol.-%, 90 Vol.-% oder 100 Vol.-% organisches Lösemittel umfassen. Das organische Lösemittel kann ein einziges organisches Lösemittel oder eine Mischung aus zwei oder mehr organischen Lösemitteln sein. Die Zusammensetzung der flüssigen mobilen Phase kann sich gemäß eines vorgegebenen Gradienten über die Zeit hinweg ändern. Wo eine flüssige mobile Gradienten-Phase verwendet wird, umfasst zumindest ein Teil des Gradienten organisches Lösemittel. Die flüssige mobile Phase wird im Allgemeinen mittels mindestens einer Pumpe durch die Trennvorrichtung geströmt.
Die Probe kann zum Beispiel einer von Extrakten aus Blut, Urin, Speichel, Rückenmarksflüssigkeit oder anderem biologischen Material, Extrakten von Lebensmitteln, Futtermitteln, Erde, Staub, Industrieprodukten, Verbrennungsprodukten oder ähnlichen, lysierten Zellen sein.
Die zu analysierende Probe kann eine einzige Molekülspezies umfassen, oder umfasst eher typisch eine Vielzahl von Molekülspezies, wobei es mindestens eine Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis gibt. Die Molekülspezies können nach ihren unterschiedlichen Retentionszeiten in der Trennvorrichtung getrennt werden.
Die Probe kann der mobilen Phase von einem Autosampler über einen Injektionsport oder eine Injektionsschleife zugeführt werden.
Die mindestens eine Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis ist oder sind typischerweise ein organisches Molekül. Das Molekulargewicht der mindestens einen Molekülspezies beträgt vorzugsweise weniger als 1000 Da (1 Da = 1,66·10^-27 kg), bevorzugter weniger als 800 Da, noch bevorzugter weniger als 600 Da und sogar noch bevorzugter weniger als 300 Da. Das Molekulargewicht der mindestens einen Molekülspezies beträgt vorzugsweise mehr als 45 Da, bevorzugter mehr als 60 Da.
Die flüssige mobile Phase, die die Probe enthält, wird durch die Trennvorrichtung geströmt, sodass die mindestens eine Molekülspezies umfassende Probe aus der Trennvorrichtung austritt, vorzugsweise nachdem sie von der mindestens einen anderen Molekülspezies getrennt wurde, bevorzugter nachdem mindestens eine Vielzahl von Molekülspezies durch die Trennvorrichtung abgetrennt wurden (d. h. eine Vielzahl von Molekülspezies der Probe treten zu unterschiedlichen Retentionszeiten aus der Trennvorrichtung aus), und anschließend detektiert werden kann, d. h. von einem prozessabwärts angeordneten Massenspektrometer auf ihre Masse analysiert werden kann. Die mindestens eine Molekülspezies, die ein zu bestimmendes Isotopenverhältnis aufweist, wird durch die Trennvorrichtung vorzugsweise von anderen Molekülspezies getrennt. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Probe in der mobilen Phase daher durch eine Trennvorrichtung, wie z. B. eine Flüssigkeitschromatografiesäule, geströmt, um zwei oder mehrere Molekülspezies der Probe zu trennen. Bevorzugter wird die mindestens eine Molekülspezies, die ein zu bestimmendes Isotopenverhältnis aufweist, auf diese Weise von anderen Molekülspezies getrennt, d. h. nach Retentionszeit getrennt. Es ist jedoch nicht ausschlaggebend, dass die mindestens eine Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis auf diese Weise von allen anderen Molekülspezies in der Probe getrennt wird. Es ist jedoch vorzuziehen, dass die Trennung derart ist, dass im Massenspektrum das Vorhandensein von Störpeaks von anderen Molekülspezies in der Nähe der Massenpeaks der mindestens einen Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis (d. h. in einer Nähe von mehr als 2 m/z-Einheiten zu den Isotopenpeaks) minimiert wird. Am bevorzugtesten sind keine Störpeaks von anderen Molekülspezies in der Nähe von mehr als 2 m/z-Einheiten zu den Isotopenpeaks der mindestens einen Molekülspezies, die ein zu bestimmendes Isotopenverhältnis aufweist, vorhanden. Bevorzugter werden die von der mindestens einen Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis stammenden Massenpeaks (d. h. die interessierende Verbindung) von allen anderen Peaks von im Wesentlichen koeluierenden Molekülspezies basisliniengetrennt. Koeluierende Spezies im vorliegenden Zusammenhang bedeutet, dass Peaks von jeder Spezies in demselben Massenspektrum detektiert werden.
Die prozessabwärts im Massenspektrometer durchgeführte Massenanalyse kann vorzugsweise das Masse-/Ladungsverhältnis (m/z) von zwei oder mehr aus der Trennvorrichtung koeludierenden (d. h. mit denselben oder ähnlichen, d. h. überlappenden, Retentionszeiten) Molekülspezies messen und dadurch zwischen ihnen unterscheiden, wobei insbesondere die koeluierenden Molekülspezies unterschiedliche m/z aufweisen.
Die flüssige mobile Phase wird vorzugsweise durch die Trennvorrichtung zunächst mit einer ersten Durchflussrate geströmt, bevor die Durchflussrate auf unter die erste Durchflussrate reduziert wird. Wenn die Durchflussrate reduziert wird, wird sie vorzugsweise auf eine zweite Durchflussrate, unterhalb der ersten Durchflussrate, reduziert, für mindestens einen Abschnitt der Zeit, während der die mindestens eine Molekülspezies aus der Trennvorrichtung austritt, d. h. eluiert, d. h. für mindestens einen Abschnitt der Zeit, während der sich die mindestens eine Molekülspezies im aus der Trennvorrichtung austretenden Eluat befindet. Die Durchflussrate wird vorzugsweise für die gesamte, oder mindestens im Wesentlichen die gesamte, Zeit, während der die mindestens eine Molekülspezies aus der Trennvorrichtung austritt, reduziert. Die Durchflussrate kann reduziert werden von einem Zeitpunkt, bevor, z. B. kurz bevor, die mindestens eine Molekülspezies aus der Trennvorrichtung auszutreten beginnt, bis zu mindestens einem Zeitpunkt, zu dem das meiste der mindestens einen Molekülspezies aus der Trennvorrichtung ausgetreten ist, wie z. B. bis zu einem Zeitpunkt, zu dem die mindestens eine Molekülspezies im Wesentlichen aufgehört hat, aus der Trennvorrichtung auszutreten. Die Durchflussrate kann reduziert bleiben bis zu einem Zeitpunkt, nach dem alles von der mindestens einen Molekülspezies aus der Trennvorrichtung ausgetreten ist. Nachdem der Durchfluss auf diese Weise reduziert worden ist, kann die Durchflussrate erhöht werden, typischerweise auf die erste Durchflussrate, bevor die Durchflussrate reduziert wurde. Diese anschließende Erhöhung der Durchflussrate geschieht vorzugsweise zu einem Zeitpunkt, nach dem die mindestens eine Molekülspezies im Wesentlichen aufgehört hat, aus der Trennvorrichtung zu eluieren. Somit kann die Durchflussrate wieder auf ihre ursprüngliche, höhere (erste) Durchflussrate erhöht werden, d. h. sobald die mindestens eine Molekülspezies im Wesentlichen aufgehört hat, aus der Trennvorrichtung zu eluieren. Der Durchfluss wird typischerweise wieder erhöht, sobald der Elutionspeak der mindestens einen Molekülspezies im Wesentlichen vorbei ist. Die Durchflussrate wird typischerweise um einen Faktor von mindestens 3, oder noch besser mindestens 5 oder noch besser mindestens 10, oder in einigen Fällen mindestens 100, reduziert. Der Reduktionsfaktor hängt typischerweise mit der Säulengröße (Durchmesser) zusammen. Spezifische Durchflussraten können daher von den Abmessungen der Trennvorrichtung (z. B. dem Innendurchmesser (I.D.) der Säule) abhängig sein. Für den Fall einer Flüssigkeitschromatografiesäule und einer ESIlonenquelle sind Beispiele von typischen Bereichen von Durchflussraten vor der Reduzierung der Durchflussrate: 4 mm (I.D.)-Säule = 800-2000µl/min.; 2,1 mm-Säule = 150-400µl/min.; 1 mm-Säule = 30-80µl/min.; und 0,5 mm-Säule = 10-30µl/min. Es ist wünschenswert, die Durchflussrate so zu reduzieren, dass die niedrigste stabile Durchflussrate einer typischen ESI-Ionenquelle verwendet wird, die typischerweise im Bereich von 2-5µl/min. liegt. Die Durchflussrate wird somit typischerweise um einen Faktor von: 160-1000 für eine 4 mm-Säule; 30-200 für eine 2,1 mm-Säule; 5-40 für eine 1 mm-Säule; und 2-15 für eine 0,5 mm-Säule reduziert. In diesem Schriftstück wird davon ausgegangen, dass der Querschnitt der Chromatografiesäule kreisförmig ist.
Vorzugsweise ist die Trennvorrichtung eine Flüssigkeitschromatografie-(LC)-Säule (zum Beispiel entweder eine HPLC- oder UHPLC-Säule). Die LC-Säule hat einen Innendurchmesser und vorzugsweise umfasst der Schritt des Reduzierens der Durchflussrate das Reduzieren der Durchflussrate auf einen Wert in ml/min., der weniger als die Hälfte des durch 0,06x(Innendurchmesser in mm)² vorgegebenen Werts beträgt. Von dieser Formel wurde empirisch festgestellt, dass sie eine geeignete reduzierte Durchflussrate definiert. In einigen Ausführungsformen, die eine LC-Säule als Trennvorrichtung einsetzen, wird die Durchflussrate der flüssigen mobilen Phase durch die Trennvorrichtung für mindestens einen Abschnitt der Zeit, während der die mindestens eine Molekülspezies aus der Trennvorrichtung eluiert, optional die gesamte Trennzeit, auf eine Durchflussrate eingestellt, die es ermöglicht, eine gewünschte Präzision des Isotopenverhältnisses zu erreichen. Diese eingestellte Durchflussrate wird vorzugsweise durch einen Wert in ml/min. angegeben, der weniger als die Hälfte des durch 0.06x(Innendurchmesser in mm)² angegebenen Werts beträgt. Es wurde ebenfalls festgestellt, dass eine eingestellte oder reduzierte Durchflussrate, die geeignet ist, im Allgemeinen unterhalb des etwa 0,5-fachen der Untergrenze des vom Säulenhersteller für eine optimale chromatografische Auflösung empfohlenen Durchflussratenbereichs liegt. Es ist bekannt, dass eine optimale Durchflussrate in der Chromatografie mit der Van Deemter-Gleichung bestimmt werden kann, die eine Abhängigkeit der optimalen Durchflussrate von der linearen Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase definiert. Die optimale Durchflussrate skaliert auch mit dem Quadrat des Säulendurchmessers (für Säulen mit einem kreisförmigen Querschnitt). Die eingestellte oder reduzierte Durchflussrate kann unterhalb des 0,5-fachen der optimalen Durchflussrate (d. h. der Durchflussrate für das minimale Höhenäquivalent eines theoretischen Bodens (HETP)), d. h. wie durch die Van Deemter-Gleichung gegeben, liegen. $HETP = A + B / u + C . u$
Wobei

HETP = Höhenäquivalent eines theoretischen Bodens, ein Maß für das Auflösungsvermögen der Säule [m]
A = Eddy-Diffusions-Parameter [m]
B = Diffusionskoeffizient der eluierenden Partikel in Längsrichtung [m² s^-1]
C = Widerstand gegenüber Massenübergangskoeffizienten des Analyten zwischen mobiler und stationärer Phase [s]
u = lineare Geschwindigkeit [m s^-1]

Ein schematisches Van Deemter-Diagramm der allgemeinen Beziehung zwischen dem HETP und der Durchflussrate für eine HPLC-Säule ist in 15 dargestellt. Die optimale Durchflussrate für die Säule tritt bei einer minimalen Trennstufenhöhe auf, wie dargestellt. Vorzugsweise liegt die erste Durchflussrate bei der Erfindung am oder nahe beim Optimum (d. h. der optimalen Durchflussrate, die der minimalen Trennstufenhöhe der Trennvorrichtung oder Säule entspricht). Die erste Durchflussrate sollte wünschenswerterweise mindestens 50% der optimalen Durchflussrate, oder mit zunehmender Präferenz, mindestens 70%, oder mindestens 80%, oder mindestens 90% der optimalen Durchflussrate betragen. In einigen Ausführungsformen kann die erste Durchflussrate im Bereich von +/- 50% der optimalen Durchflussrate wie in 15 angegeben, bevorzugter +/- 30% oder +/- 20%, oder am bevorzugtesten +/- 10% der optimalen Durchflussrate liegen. Die zweite Durchflussrate ist niedriger als die erste Durchflussrate, entspricht aber einer höheren Trennstufenhöhe. Die höhere Trennstufenhöhe entspricht einer niedrigeren chromatografischen Trenneffizienz. Es wurde jedoch festgestellt, dass eine derartige reduzierte Durchflussrate zu einer Verbesserung der Präzision der Isotopenverhältnismessungen durch hochauflösende akkurate Massenspektrometrie führt, wenn die Molekülspezies aus der Trennvorrichtung austreten. Wünschenswerterweise beträgt die zweite Durchflussrate weniger als 50% der optimalen Durchflussrate und kann mit zunehmender Präferenz weniger als 40%, oder weniger als 30%, oder weniger als 20%, oder weniger als 10% der optimalen Durchflussrate betragen. Einige Beispiele von bevorzugten Ausführungsformen können die folgenden ersten und zweiten Durchflussraten verwenden:

(i) eine erste Durchflussrate beträgt mindestens 50% der optimalen Durchflussrate und eine zweite Durchflussrate beträgt weniger als 50% der optimalen Durchflussrate, wobei die zweite Durchflussrate vorzugsweise im Vergleich zur ersten Rate um einen Faktor von mindestens 2 reduziert ist;
(ii) eine erste Durchflussrate beträgt mindestens 70% der optimalen Durchflussrate und eine zweite Durchflussrate beträgt weniger als 30% der optimalen Durchflussrate, wobei die zweite Durchflussrate vorzugsweise im Vergleich zur ersten Rate um einen Faktor von mindestens 3 reduziert ist;
(iii) eine erste Durchflussrate beträgt mindestens 80% der optimalen Durchflussrate und eine zweite Durchflussrate beträgt weniger als 20% der optimalen Durchflussrate, wobei die zweite Durchflussrate vorzugsweise im Vergleich zur ersten Rate um einen Faktor von mindestens 5 reduziert ist;
(iv) eine erste Durchflussrate beträgt mindestens 90% der optimalen Durchflussrate und eine zweite Durchflussrate beträgt weniger als 10% der optimalen Durchflussrate, wobei die zweite Durchflussrate vorzugsweise im Vergleich zur ersten Rate um einen Faktor von mindestens 10 reduziert ist;
(v) eine erste Durchflussrate, die +/- 50% der optimalen Durchflussrate beträgt, und eine zweite Durchflussrate, die weniger als 50% der optimalen Durchflussrate beträgt, wobei die zweite Durchflussrate vorzugsweise im Vergleich zur ersten Rate um einen Faktor von mindestens 2 reduziert ist;
(vi) eine erste Durchflussrate, die +/- 30% der optimalen Durchflussrate beträgt, und eine zweite Durchflussrate, die weniger als 30% der optimalen Durchflussrate beträgt, wobei die zweite Durchflussrate vorzugsweise im Vergleich zur ersten Rate um einen Faktor von mindestens 3 reduziert ist;
(vii) eine erste Durchflussrate, die +/- 20% der optimalen Durchflussrate beträgt, und eine zweite Durchflussrate, die weniger als 20% der optimalen Durchflussrate beträgt, wobei die zweite Durchflussrate vorzugsweise im Vergleich zur ersten Rate um einen Faktor von mindestens 5 reduziert ist;
(viii) eine erste Durchflussrate, die +/- 10% der optimalen Durchflussrate beträgt, und eine zweite Durchflussrate, die weniger als 10% der optimalen Durchflussrate beträgt, wobei die zweite Durchflussrate vorzugsweise im Vergleich zur ersten Rate um einen Faktor von mindestens 10 reduziert ist.

Vorzugsweise unterliegen die vorstehenden Beispiele von ersten und zweiten Durchflussraten auch dem Kriterium, dass die zweite Durchflussrate im Vergleich zur ersten Durchflussrate um einen Faktor von mindestens 2, oder mindestens 3, oder noch besser mindestens 5, oder sogar noch besser mindestens 10, oder mindestens 20, oder mindestens 50, oder mindestens 100 reduziert ist.
Die Reduzierung der Durchflussrate kann auf unterschiedliche Weise erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Drehzahl der Pumpe (d. h. der Pumpdruck), die den Strom der mobilen Phase durch die Trennvorrichtung antreibt, reduziert werden. Die Pumpe ist prozessaufwärts der Trennvorrichtung angeordnet. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann der Strom prozessaufwärts der Trennvorrichtung aufgespalten werden, sodass eine reduzierte Durchflussrate der mobilen Phase die Trennvorrichtung passiert, z. B. sodass ein Anteil des Stroms der mobilen Phase in eine Verzweigungsströmungsbahn prozessaufwärts der Trennvorrichtung umgeleitet wird und ein Anteil durch die Trennvorrichtung läuft. Ein angesteuertes Ventil kann angesteuert werden, um den Strom durch die Verzweigungsleitung zu leiten, wenn die reduzierte Durchflussrate durch die Trennvorrichtung erforderlich ist. Die Drehzahl der Pumpe kann in dieser Ausführungsform beibehalten werden, oder sie kann zusammen mit der Umleitung des Stroms verändert werden. Die Umleitung des Stroms kann bereitgestellt werden mittels eines T-Abzweigstücks oder eines anderen Mehrweg-Abzweigstücks (3-Wege- oder mehr), das in der Strömungsbahn der mobilen Phase prozessaufwärts der Trennvorrichtung angeordnet ist, und mindestens eines Ventils, das sich an einer vom Abzweigstück wegführenden Verzweigungsströmungsbahn zum Regeln des Stroms in die Verzweigungsströmungsbahn befindet. Der umgeleitete Strom kann dem Abfall zugeführt oder wieder in den Kreislauf eingebracht oder recycelt werden. Die Durchflussrate muss nicht nur zwischen zwei diskreten Durchflussraten abgestuft sein, sondern kann gemäß eines programmierten Gradienten von Durchflussraten verändert werden. Zum Beispiel kann die Durchflussrate allmählich reduziert werden und dann allmählich erhöht werden, oder kann zwei oder mehrere unterschiedliche Gradienten von Durchflussreduzierung und/oder anschließend wieder zwei oder mehr Gradienten von Durchflusserhöhung durchlaufen. Der Regler, der dazu konfiguriert ist, die Durchflussrate der flüssigen mobilen Phase durch die Trennvorrichtung zu reduzieren, kann ein Regler sein, der das Trennsystem steuert, das die Trennvorrichtung (wie z. B. ein LC-System) und das Massenspektrometer umfasst. Der Regler umfasst vorzugsweise ein Computersystem, das Eingabedaten empfängt, z. B. von gemessenen Massenspektren, von der Retentionszeit für den interessierenden Peak (d. h. für die Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis), und das Trennsystem auf Basis der Eingabedaten steuert, um die Durchflussrate nach der Erfindung zu reduzieren. Der Regler kann zum Beispiel die Pumpendrehzahl einer Pumpe des Trennsystems (z. B. LC-System) steuern und/oder die Betätigung des einen oder der mehreren Ventile steuern, um den Strom durch das Trennsystem zu regeln. Der Regler kann dazu konfiguriert werden, den Strom der flüssigen mobilen Phase durch die Trennvorrichtung zu steuern, d. h. die flüssige mobile Phase durch die Trennvorrichtung für einen ersten Zeitabschnitt bei einer ersten Durchflussrate fließen zu lassen und die Durchflussrate der flüssigen mobilen Phase durch die Trennvorrichtung von der ersten Durchflussrate auf eine zweite Durchflussrate, die niedriger als die erste Durchflussrate ist, für mindestens einen Zeitabschnitt, in dem die mindestens eine Molekülspezies aus der Trennvorrichtung eluiert, zu reduzieren.
Die Analyse der Masse der mindestens einen Molekülspezies, die aus der Trennvorrichtung ausgetreten ist, findet vorzugsweise statt, wenn die Molekülspezies aus der Trennvorrichtung austritt, indem man das Eluat von der Trennvorrichtung in das Massenspektrometer fließen lässt. Alternativ kann die mindestens eine Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis, das aus der Trennvorrichtung austritt, gesammelt und für eine Offline-Massenanalyse aufbewahrt werden. Zum Beispiel könnte das Eluat in Mikrotiterplatten gesammelt und später durch Infusion oder Nanospray in ein Massenspektrometer zur Massenanalyse eingebracht werden.
Die Analyse der Masse der mindestens einen Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis, die aus der Trennvorrichtung ausgetreten ist, wird vorzugsweise über mindestens die Zeit hinweg durchgeführt, in der die Durchflussrate der flüssigen mobilen Phase reduziert ist. Die Reduzierung der Durchflussrate hat den Effekt, dass die Peakbreite (oder Elutionszeit, d. h. die Zeit, die sie im Eluat verbringt) für die mindestens eine Molekülspezies, die ein zu bestimmendes Isotopenverhältnis aufweist, erhöht wird. Somit kann die Gesamtmassenanalysenzeit für die mindestens eine Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis durch die Reduzierung der Durchflussrate effektiv ausgeweitet werden, z. B. indem die Anzahl der Messpunkte um einen Faktor des Verhältnisses der Peakbreiten (z. B. Peakbreite mit Durchflussreduzierung/Peakbreite ohne Durchflussreduzierung) erhöht wird. Die Signalintensität wird vorzugsweise durch die Reduzierung der Durchflussrate nicht erheblich beeinträchtigt. Das ist der Fall bei vielen der im Massenspektrometer bei der Kopplung mit einer Flüssigkeitstrennung wie LC eingesetzten bevorzugten lonisierungsverfahren, wie z. B. einem Elektrospray-Ionisierungsverfahren. Somit bietet die Durchflussreduzierung insgesamt eine bessere Präzision der Massenanalysenmessung und dadurch verbesserte Präzision der Bestimmung des Isotopenverhältnisses. Die Präzision des Isotopenverhältnisses skaliert im Allgemeinen mit dem Kehrwert der Quadratwurzel der Anzahl von aufgezeichneten Massenspektren (ungefähr die Messzeit), sodass längere Messzeiten präzisere Ergebnisse bereitstellen. Die Reduzierung der Durchflussrate wird mindestens solange aufrechterhalten, wie es dauert, die gewünschte Präzision zu erreichen. Im Allgemeinen bietet es keinen weiteren Vorteil, die Durchflussrate für einen längeren Zeitraum als den, der erforderlich ist, um diese Präzision zu erreichen, reduziert zu halten, da es zu unnötig langen Analysezeiten führen könnte. Die gewünschte Präzision des Isotopenverhältnisses liegt vorzugsweise bei <20 δ‰, vorzugsweise (in der Reihenfolge zunehmender Präferenz) <15δ‰, oder <10δ‰, oder <7δ‰, oder <55‰, oder <3δ‰, oder <1δ‰, oder <0,5δ‰, oder <0,1‰. Auf diese Weise kann eine Bestimmung der Analysedauer auf der erwarteten Präzision basiert werden. Falls beispielsweise gewünscht wird, eine Präzision von 1‰ zu erreichen, könnte zum Beispiel experimentell bestimmt werden, dass die mit 10 Scans erreichte Präzision 17%o beträgt (ein Scan kann ein Spektrum ergeben). Daher kann errechnet werden, dass für eine Präzision von 1‰ mindestens 10×(17‰/1‰)² = 10x289 Scans erfasst werden müssen, und die mit der Durchflussrate zusammenhängenden Versuchsparameter können dementsprechend eingestellt werden. In einem Ansatz wird das Isotopenverhältnis daher mit einer ersten Präzision des Isotopenverhältnisses basierend auf einer ersten Anzahl von im Allgemeinen in einem ersten Versuch gemessenen Spektren bestimmt. Basierend auf der ersten Präzision des Isotopenverhältnisses und der ersten Anzahl von gemessenen Spektren kann für eine gewünschte zweite (im Allgemeinen bessere als die erste Präzision des Isotopenverhältnisses) Präzision des Isotopenverhältnisses eine zweite Anzahl von gemessenen Spektren bestimmt werden, um die zweite Präzision des Isotopenverhältnisses zu erreichen. Anschließend kann im Allgemeinen in einem zweiten Versuch das Isotopenverhältnis mit der zweiten Genauigkeit des Isotopenverhältnisses mittels der zweiten Anzahl von gemessenen Spektren bestimmt werden.
Das Verfahren kann weiterhin das Kalibrieren des mindestens einen aus den Intensitäten der Massenpeaks von mindestens zwei Isotopologen bestimmten Isotopenverhältnisses umfassen. Die Genauigkeit der Messung des Isotopenverhältnisses kann verbessert werden, indem das mindestens eine rohe Isotopenverhältnis (d. h. das direkt aus den Massenspektren bestimmte Verhältnis) gegen ein oder mehrere Isotopenverhältnisse für einen oder mehrere bekannte Standards nach dem Stand der Technik kalibriert wird. Zum Beispiel können durch Messen eines oder mehrerer Isotopenverhältnisse von einem oder mehreren bekannten Standards am Massenspektrometer ein oder mehrere Kalibrierfaktoren erhalten und anschließend auf das mindestens eine rohe Isotopenverhältnis angewandt werden, um ein kalibriertes Isotopenverhältnis bereitzustellen.
Die Massenanalyse kann das Aufzeichnen des Massenspektrums der Molekülspezies statt nur spezifischer Massenpeaks umfassen. Zum Beispiel kann das Massenspektrum der Molekülspezies mittels eines elektrostatischen Orbitalfallen-Massenanalysators oder FT-ICR-Massenanalysators oder TOF-Massenanalysators aufgezeichnet werden. Mit langsameren oder scannenden Massenanalysatoren, wie z. B. Quadrupol-Massenanalysatoren oder Magnetsektor-Massenanalysatoren oder mit Multikollektor-Magnetsektor-Massenanalysatoren können nur bestimmte Massenpeaks mit ausreichender Auflösung in dem mit der Flüssigphasen-Trenntechnik, wie z. B. LC, verfügbaren Zeitrahmen überwacht werden.
Das mindestens eine Isotopenverhältnis der Molekülspezies, das bestimmt wird, kann mindestens eines von ¹³C/¹²C, ¹⁴C/¹²C, ¹⁵N/¹⁴N, ²H/¹H, ¹⁸O/¹⁶O, ¹⁷O/¹⁶O, oder ³⁴S/³²S, ³⁷Cl/³⁵Cl, ⁸¹Br/⁷⁹Br, ²⁹Si/²⁸Si, ³⁰Si/²⁸Si usw. (oder der Kehrwert derartiger Verhältnisse) sein. Die Bestimmung des Verhältnisses ist im Allgemeinen die des Verhältnisses des schweren zum leichten Isotop (R), wie z. B. $R = \frac{Schweres Isotop}{Leichtes Isotop} = \frac{{}^{13}C}{{}^{12}C} = \frac{{}^{15}X}{{}^{14}X} = \frac{{}^{15}O}{{}^{16}O} e t c .$
Das Isotopenverhältnis kann als Delta-Schreibweise (δ-Schreibweise) bestimmt werden. Das allgemeine Verfahren zum Aufzeichnen von stabilen Isotopenverhältnissen aus der IRMS-Analyse bedient sich der Delta-Schreibweise. Der δ-Wert ist das stabile Isotopenverhältnis einer unbekannten Probe bezogen auf einen Standard (d. h. Referenzmaterial) mit bekanntem Isotopenwert, berechnet als: $δ [‰] = \frac{R_{(P r o b e)} - R_{(S t a n d a r d)}}{R_{(S t a n d a r d)}} * 1000 = (\frac{R_{(P r o b e)}}{R_{(S t a n d a r d)}} - 1) * 1000$
Vorzugsweise ist das aus der Massenanalyse bestimmte Isotopenverhältnis ein korrigiertes Isotopenverhältnis, wobei ein aus der Massenanalyse gemessenes Isotopenverhältnis mittels eines Diagramms von gemessenen Isotopenverhältnissen gegenüber korrekten (zertifizierten) Isotopenverhältnissen (was in diesem Schriftstück auch korrekte δ-Werte bedeutet), die aus einer Vielzahl von Standard- oder Referenzmaterialien (z. B. eines bekannten korrekten Isotopenverhältnisses oder δ-Werts) erhalten wurden, korrigiert wird.
Das Bestimmen des Isotopenverhältnisses in der vorliegenden Erfindung basiert auf den Intensitäten, zum Beispiel auf dem Vergleichen (d. h. dem Finden des Verhältnisses) der Intensitäten, von Massenpeaks von Isotopologen der Molekülspezies, in der die Isotopologen unterschiedliche nominelle Massen (sie sich typischerweise um eine oder zwei nominelle Masseneinheiten unterscheiden) aufweisen. Das bedeutet, dass keine Verbrennung der Probenmolekülspezies zu CO₂ usw. durchgeführt wird. Die mindestens eine Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis weist vorzugsweise ein unterschiedliches Masse-/Ladungsverhältnis zu den Molekülen der mobilen Phase, z. B. zum Lösemittel der mobilen Phase, auf und somit ist das von der mindestens einen Molekülspezies aufgezeichnete Spektrum nicht vom Lösemittel gestört (keine isobaren Interferenzen von den Molekülen der mobilen Phase). Das umgeht das Problem, dass eine mobile Phase, die auf einem organischen Lösemittel basiert und/oder kohlenstoffhaltige Puffer enthält, bei einer Verbrennungstechnik für die Isotopenverhältnisanalyse dieselben Spezies von Oxidations- oder Reduktionsprodukten wie die interessierenden organischen Probenmoleküle erzeugen würde. Typischerweise kann der monoisotopische Peak (für das monoisotopische Isotopolog) im Massenspektrum der mindestens einen Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis, z. B. der [M+H]⁺-Peak in einem aus einer Elektrospray-Quelle erhaltenen Massenspektrum, eine Isotopenhäufigkeit für das bestimmte interessierende leichte Isotop (z. B. ¹²C, ¹⁴N, ¹⁶O, ¹H, ³²S) bereitstellen, und ein A+1-Peak oder A+2-Peak (wobei A der monoisotopische Massenpeak ist) für ein A+1-Isotopolog oder A+2-Isotopolog (im Allgemeinen mit derselben Ladung wie das monoisotopische Isotopolog) kann eine Isotopenhäufigkeit für das bestimmte interessierende schwere Isotop (z. B. ¹³C, ¹⁵N, ¹⁸O, ²H, ³⁴S) bereitstellen. Das Bestimmen des Isotopenverhältnisses kann somit das Vergleichen der Intensität eines monoisotopischen Massenpeaks A mit einem A+1-Massenpeak oder A+2-Massenpeak umfassen, um ein Isotopenverhältnis eines leichten Isotops und eines schweren Isotops von Interesse bereitzustellen. Es wurde festgestellt, dass das hohe Auflösungsvermögen des Massenspektrometers, insbesondere eines solchen Spektrometers, das einen Orbitrap- oder einen FT-ICR-Massenanalysator umfasst, einen bestimmten A+1-Peak (oder A+2-Peak) eines Isotopologs mit dem bestimmten interessierenden schweren Isotop (¹³C oder ¹⁵N oder ¹⁸O oder ²H oder ³⁴S usw.) auflösen kann, d. h. den Peak von anderen nominellen A+1-Massenpeaks (oder nominellen A+2-Massenpeaks) von Isotopologen mit einem anderen schweren Isotop absetzen kann. Jeder für das Bestimmen des Isotopenverhältnisses verwendete Isotopolog-Massenpeak sollte vorzugsweise von mindestens jedem anderen Massenpeak bei derselben nominellen Masse abgesetzt werden, was mehr als 20% oder bevorzugter mehr als 10% oder am bevorzugtesten mehr als 5% der Intensität des Isotopolog-Massenpeaks sind. Zum Beispiel zeigt in einer Ausführungsform der Erfindung das aufgelöste Isotopenpeakmuster von A+1-Peaks, dass ein ¹³C-Isotopolog-Peak ausreichend von einem ¹⁵N-Isotopolog-Peak oder ²H-Peak abgesetzt werden kann. Weiterhin zeigt das aufgelöste Isotopenpeakmuster von A+2-Peaks, dass ein ¹⁸O-Isotopolog-Peak ausreichend von einem ¹³C₂-Isotopolog-Peak oder einem ¹³C¹⁵N-Isotopolog-Peak abgesetzt werden kann. Somit ermöglicht die Erfindung eine Analyse von mehrfach substituierten Isotopologen sowie einfach substituierten Isotopologen. Die Massenanalyse setzt daher vorzugsweise den monoisotopischen Peak von A+1- und A+2-Peaks ab. Die Massenanalyse setzt weiterhin vorzugsweise zwei oder mehrere A+1-Isotopologe und/oder zwei oder mehrere A+2-Isotopologe voneinander ab. Das leichte Isotop wird vorzugsweise ausgewählt aus ¹²C, ¹⁴N, ¹⁶O, ¹H, ³²S ³⁵Cl, ⁷⁹Br, ²⁸Si und das schwere Isotop wird vorzugsweise ausgewählt aus ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O, ²H, ³⁴S, ³⁷Cl, ⁸¹Br, ²⁹Si, ³⁰Si. In diesem Schriftstück sind bei der Bezugnahme auf Peaks bei derselben nominellen Masse nicht Peaks bei demselben nominellen Masse-/Ladungsverhältnis (m/z) gemeint. Zum Beispiel werden in einem Fall von isotopischen Massenpeaks aufgrund von mehrfach geladenen Ionen (z. B. +5 oder höher, +10 oder höher, ...) mehrere isotopische Peaks (wie z. B. A+1, A+2, A+3-Peaks) mit demselben nominellen m/z erscheinen (obwohl sie nicht dieselbe nominelle Masse aufweisen). Die Erfindung befasst sich nicht damit, derartige mehrfach geladene isotopische Peaks (mit unterschiedlicher nomineller Masse) voneinander abzusetzen. Vielmehr befasst sich die Erfindung damit, verschiedene Isotopologe einer spezifischen A+n-Gruppe von Peaks (n=1, 2, 3, ...) auszulösen, d. h. Peaks bei derselben nominellen Masse aufzulösen. Dementsprechend bezieht sich eine Bezugnahme auf Peaks bei derselben nominellen Masse' effektiv auf ein Massenspektrum, wobei alle mehrfach geladenen Peaks in einfach geladene Peaks transformiert worden sind. Mit anderen Worten ist für mehrfach geladene Ionen nicht beabsichtigt, die A+1, A+2, A+3, ... -Peaks voneinander, sondern vielmehr die vielfachen Isotopolog-Peaks bei derselben A+n (A+1, A+2, A+3, ...)-Gruppe voneinander abzusetzen.
Vorzugsweise sind die Isotopologe nicht isotopenmarkiert, d. h. sie sind nicht künstlich in mindestens einem Isotop angereichert. Somit befasst sich die Erfindung nicht in erster Linie mit sogenannten Isotopenmarkier-Versuchen, bei denen eine Probe isotopenmarkiert ist, während es eine andere Probe nicht ist, und das Verhältnis einer isotopenmarkierten Molekülspezies zu einer unmarkierten Molekülspezies bestimmt wird. In der Erfindung ist die mindestens eine Molekülspezies aus einer Probe, nicht zwei oder mehreren Proben wie in Markier-Versuchen, abgeleitet. Dementsprechend ist das Isotopenverhältnis der Molekülspezies, das bestimmt wird, vorzugsweise ein natürliches oder inhärentes Isotopenverhältnis der Molekülspezies, d. h. nicht ein Verhältnis der Häufigkeit einer markierten Molekülspezies gegenüber einer nicht markierten Molekülspezies. Die Messung von natürlichen oder inhärenten Häufigkeiten von Isotopen kommt häufig in Umweltchemie, Geochemie und forensischer Analyse, sowie in der biologischen, biochemischen und biomedizinischen Forschung und Anwendungen zum Einsatz.
Die Massenanalyse wird vorzugsweise mit einem hohen Auflösungsvermögen (R) durchgeführt. Die Massenanalyse wird vorzugsweise mit einem ausreichenden Auflösungsvermögen (R) zum Auflösen von Massenpeaks von Isotopologen der mindestens einen Molekülspezies durchgeführt. Die Massenanalyse wird vorzugsweise mit einem Massenauflösungsvermögen durchgeführt, das hoch genug ist, um die zwei häufigsten Massenpeaks (Isotopologe der Molekülspezies oder Nicht-Isotopolog-Interferenzen von anderen Molekülspezies) bei der nominellen Masse des mindestens einen der zur Bestimmung des Isotopenverhältnisses verwendeten Isotopologe (vorzugsweise bei den nominellen Massen von jedem der zur Bestimmung des Isotopenverhältnisses verwendeten Isotopologe) aufzulösen. Die zwei häufigsten Massenpeaks, die bei derselben nominellen Masse aufgelöst werden, sind wünschenswerterweise zwei Isotopologe (da vorzugsweise der Schritt der Flüssigkeitstrennung sicherstellen wird, dass keine anderen Molekülspezies vorhanden sind, die Massenpeaks innerhalb von 2 m/z-Einheiten der zur Bestimmung des Isotopenverhältnisses verwendeten Isotopologe aufweisen). Die zwei häufigsten Massenpeaks bei der nominellen Masse sind vorzugsweise Peaks, die, falls sie nicht aufgelöst werden, jeweils erheblich zu dem zu bestimmenden Isotopenverhältnis beitragen würden (z. B. indem sie >20% oder >10% oder > 5% der Peakintensität des Isotopologs bei der nominellen Masse beitragen). Die Massenanalyse wird vorzugsweise mit einem Massenauflösungsvermögen durchgeführt, das hoch genug ist, um die zwei häufigsten A+1-Isotopologe und/oder die zwei häufigsten A+2-Isotopologe aufzulösen (wobei A der monoisotopische Massenpeak ist). Die Massenanalyse wird vorzugsweise mit einem ausreichenden Auflösungsvermögen (R) durchgeführt, um mindestens eines der folgenden Isotopolog-Paare der mindestens einen Molekülspezies aufzulösen: ¹³C- und ¹²C-Isotopologe, ¹⁵N- und ¹⁴N-Isotopologe, ¹⁸O- und ¹⁶O-Isotopologe, ³⁴S- und ³²S-Isotopologe. Das Auflösungsvermögen ist vorzugsweise hoch genug, um Isotopologe aufzulösen, die ansonsten erheblich (z. B. mit einem Beitrag von mehr als 20% oder 10% oder 5% zur beobachteten Peakhäufigkeit) zum interessierenden Isotopenverhältnis beitragen würden. Die Massenanalyse wird vorzugsweise mit einem ausreichenden Auflösungsvermögen (R) durchgeführt, um A+1-Peaks (wobei A der monoisotopische Massenpeak ist) infolge von ¹³C-Isotopologen und ¹⁵N-Isotopologen aufzulösen. Die Massenanalyse wird vorzugsweise mit einem ausreichenden Auflösungsvermögen (R) durchgeführt, um A+2-Peaks infolge von ¹⁸O-Isotopologen, ¹³C₂-Isotopologen und ¹³C¹⁵N-Isotopologen aufzulösen. Das Auflösungsvermögen R (bei m/z 200) beträgt vorzugsweise mindestens 50.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 400.000 oder mindestens 500.000. Um die Erfassungszeit aufzuwiegen, liegt das Auflösungsvermögen R (bei m/z 200) vorzugsweise im Bereich von 50.000 bis 400.000, oder von 100.000 bis 400.000, bevorzugter von 50.000 bis 300.000, oder von 100.000 bis 300.000, oder sogar noch bevorzugter von 200.000 bis 300.000. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Auflösungsvermögen hoch genug, um alle Isotopologe aufzulösen, die andernfalls erheblich zum interessierenden Isotopenverhältnis beitragen würden (d. h. Isotopologe, die einen Beitrag von mehr als 20% oder 10% oder 5% zur beobachteten Peakhäufigkeit leisten würden). Das Auflösungsvermögen ist jedoch wünschenswerterweise nicht erheblich höher als es für die Auflösung derartiger Isotopologe erforderlich ist (da ein Betrieb mit einem höheren Auflösungsvermögen im Allgemeinen den Schritt der Massenanalyse verlangsamt).
Das Verfahren und die Vorrichtung der Erfindung können typischerweise eine Präzision des Isotopenverhältnisses (Wiederholbarkeit) von <20 δ‰ (d. h. <2 δ%), vorzugsweise <10 δ‰ (<1 δ%) bereitstellen. Vorzugsweise wird die Durchflussrate auf eine derartige Durchflussrate und/oder für mindestens so lange Zeit reduziert, dass eine gewünschte Präzision des Isotopenverhältnisses erreicht wird. Vorzugsweise ist die gewünschte Präzision des Isotopenverhältnisses <20 δ‰, oder <15 δ‰, oder <10 δ‰, oder <7 δ‰, oder <5 δ‰, oder <3 δ‰, oder <1 δ‰, oder <0,5 oder <0,1 %o.
Das Massenspektrometer umfasst vorzugsweise eine geeignete lonisierungsquelle. Bevorzugte lonisierungsquellen sind lonisierungsquellen, die mit dem Koppeln mit einer Flüssigkeitstrennvorrichtung, wie z. B. einer LC-Säule, kompatibel sind. Diese bevorzugten lonisierungsquellen können eine Elektrospray-Ionisierungs-Quelle (ESI), Nanospray-Ionisierungsquelle, andere Quelle für Ionisierung bei Atmosphärendruck (API), wie z. B. Quelle für Chemikalien-Ionisierung bei atmosphärischem Druck (APCI), sein. Es können jedoch andere lonisierungsquellen verwendet werden, wie z. B. Elektronenstoß-(EI)-Ionisierung, chemische Ionisierung (Cl) usw.
Das Massenspektrometer umfasst vorzugsweise einen Massenanalysator mit einem Massenauflösungsvermögen, das hoch genug ist, um die zwei häufigsten Massenpeaks bei der nominellen Masse eines Isotopologs aufzulösen, das zur Bestimmung eines Isotopenverhältnisses der Molekülspezies, die ein zu bestimmendes Isotopenverhältnis aufweisen, verwendet wird. Das Massenauflösungsvermögen ist wünschenswerterweise hoch genug, um mindestens die zwei häufigsten Massenpeaks bei der nominellen Masse jedes zur Bestimmung des Isotopenverhältnisses verwendeten Isotopologs aufzulösen. Die zwei häufigsten Massenpeaks können die Massenpeaks der zwei häufigsten Isotopologe der Molekülspezies bei derselben nominellen Masse sein. Die zur Bestimmung des Isotopenverhältnisses verwendeten Isotopologe der Molekülspezies bei jeweils unterschiedlicher nomineller Masse sind vorzugsweise eines der zwei häufigsten Isotopologe bei jener nominellen Masse. Das Massenspektrometer kann einen der folgenden Typen von Massenanalysatoren umfassen: eine lonenfalle, HF-Ionenfalle, elektrostatische lonenfalle, elektrostatische Orbitalfalle (wie z. B. Orbitrap), Fourier-Transformations-(FTMS)-Analysator, Fourier-Transformations-lonenzyklotronresonanz-(FT-ICR-)-Analysator, Timeof-flight-(TOF)-Analysator, linearen TOF, Orthogonal-Beschleunigungs-TOF-(OA-TOF), Reflektron-TOF, Multi-Reflexions-TOF (MR-TOF), Quadrupol-massenfilter, Magnetsektor-Massenanalysator. Vorzugsweise umfasst das Massenspektrometer einen Massenanalysator, der zu einer hohen Auflösung und akkuraten Masse (HR-AM) in der Lage ist. Vorzugsweise umfasst das Massenspektrometer einen Massenanalysator, der in der Lage ist, alle interessierenden m/z in einer Erfassung oder einem Scan zu messen. Bevorzugte Massenspektrometer umfassen eine elektrostatische lonenfalle, elektrostatische Orbitalfalle (wie z. B. Orbitrap), oder ein FT-ICR oder ein TOF, wie z. B. ein Einzelreflexions- oder Multi-Reflexions-(MR)-TOF (vorzugsweise MR-TOF).
Die Massenanalyse umfasst das Ionisieren der mindestens einen Molekülspezies in einer lonisierungsquelle, um Ionen der mindestens einen Molekülspezies zu erzeugen, gefolgt vom Analysieren der Masse der Ionen mittels eines Massenanalysators. Es wird daher ein Massenspektrometer bereitgestellt, das die lonisierungsquelle und den Massenanalysator umfasst. Das Verfahren umfasst vorzugsweise das Filtern der Ionen nach ihrer Masse prozessabwärts der lonisierungsquelle und prozessaufwärts des Massenanalysators. Das Massenspektrometer umfasst somit vorzugsweise einen Massenfilter zwischen der lonisierungsquelle und dem Massenanalysator. Auf diese Weise können die Ionen aus der lonenquelle den Massenfilter auf dem Weg zum Massenanalysator passieren. Der Massenfilter kann ein enges m/z-Fenster von Ionen zum Injizieren in den Massenanalysator zur Massenanalyse auswählen, d. h das m/z-Fenster, um das m/z der Molekülspezies, die ein zu bestimmendes Isotopenverhältnis aufweist, zu beinhalten. Dadurch wird es möglich, dass der Massenanalysator mit einer größeren Anzahl von Ionen der Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis gefüllt wird. Die Lösemittelmatrixmoleküle können ebenfalls vorzugsweise durch den Massenfilter, der mit dem engen, das m/z der zu analysierenden Molekülspezies enthaltenden m/z-Fenster betrieben wird, aus dem lonenstrom entfernt werden. Ein bevorzugter Massenfilter ist ein Quadrupol-Massenfilter. Das enge vom Massenfilter gewählte m/z-Fenster kann 20 amu (1 amu = 1 Da = 1,66·10^-27kg), breit oder weniger, oder 15 amu breit oder weniger, oder 10 amu breit oder weniger sein. Die Ionen der Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis, insbesondere die nach der Masse gefilterten Ionen, werden vorzugsweise in einem Ionenspeicher, wie z. B einer linearen lonenfalle, prozessabwärts der lonenquelle und, soweit vorhanden, des Massenfilters gesammelt. Die gesammelten Ionen können anschließend aus dem Ionenspeicher in den Massenanalysator zur Massenanalyse ausgestoßen werden. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet eine gekrümmte lineare Falle (oder C-Falle) als Ionenspeicher und das Ausstoßen der Ionen aus der C-Falle in eine elektrostatische Orbitalfalle (wie z. B. ein Orbitrap) als Massenanalysator.
Das Bestimmen von mindestens einem Isotopenverhältnis der mindestens einen Molekülspezies kann das Bestimmen von mindestens einem positionsspezifischen Isotopenverhältnis umfassen. Die Ionen können optional vor der Massenanalyse fragmentiert werden, sodass die Masse der Fragmente analysiert werden kann, um dadurch positionsspezifische Informationen über die Isotopenverhältnisse zu erhalten. Somit kann in derartigen Ausführungsformen der Schritt des Bestimmens von mindestens einem Isotopenverhältnis der mindestens einen Molekülspezies das Bestimmen von positionsspezifischen Informationen über das ermittelte Isotopenverhältnis umfassen. Das Massenspektrometer kann somit eine Fragmentierungszelle prozessabwärts der lonisierungsquelle umfassen, die z. B. in Bezug auf den Massenanalysator so angeordnet ist, dass interessierende Molekülspezies fragmentiert und anschließend die Fragmente auf ihre Masse analysiert werden können. Zum Beispiel können Ionen durch den Massenfilter gefiltert, dann fragmentiert und dann die Fragmente auf ihre Masse analysiert werden, optional nach dem Speichern der Fragmente in dem lonenspeicher. Auf diese Weise können aus den isotopischen Massenmustern der Fragmente, die vom Massenanalysator gemessen werden, positionsspezifische Informationen über die Isotopenverhältnisse erhalten werden. Die Fragmentierungszelle kann eine Kollisionszelle zur kollisionsinduzierten Dissoziation (CID) oder eine Zelle für Elektronentransfer-Dissoziation (ETD) oder Elektroneneinfang-Dissoziation (ECD) oder photoinduzierte Dissoziation (PID) usw. sein.
Es versteht sich, dass es durch die Verwendung von kombinierten Mitteln zum Bestimmen eines positionsspezifischen Isotopenverhältnisses und der mehrfach substituierten Isotopologe möglich ist, die Molekülspezies zu analysieren, um positionsspezifische Isotopenverhältnisse von mehrfach substituierten Isotopologen zu bestimmen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 zeigt ein Ablaufdiagramm, das schematisch eine Ausführungsform der Erfindung darstellt.
2 zeigt schematisch eine Ausführungsform einer Vorrichtung für LC/MS zum Einsatz bei der Erfindung.
3 zeigt schematisch eine andere Ausführungsform einer Vorrichtung für LC/MS zum Einsatz bei der Erfindung.
4 zeigt schematisch eine Ausführungsform eines Massenspektrometerinstruments zum Einsatz bei der Erfindung.
5 zeigt ein repräsentatives Massenspektrum, das aus einer Probe von Koffein bei einem Infusions-MS-Versuch erhalten wurde.
6 zeigt ein gemessenes und simuliertes Isotopenmuster von Koffein.
7 zeigt ein Diagramm von gemessenen Isotopenverhältnissen (196/195) vs. bekannten zertifizierten δ ¹³C-Werten von Koffein aus einem Infusions-MS-Versuch.
8 zeigt einen Lösemittelstufengradienten, der bei einem LC/MS-Vergleichsversuch verwendet wurde.
9 zeigt ein Chromatogramm und Massenspektrum, das bei einem LC/MS-Vergleichsversuch erhalten wurde.
10 zeigt ein Diagramm von gemessenen Isotopenverhältnissen von Koffein vs. bekannten zertifizierten δ ¹³C-Werten aus einem LC/MS-Vergleichsversuch.
11 zeigt einen Lösemittelstufengradienten, der bei einem LC/MS-Versuch mit einer reduzierten Durchflussstufe verwendet wurde.
12 zeigt ein Chromatogramm, Massenspektrum und LC-Pumpendruck vs. Zeit-Profil, die bei einem LC/MS-Versuch unter Verwendung von reduziertem Durchfluss erhalten wurden.
13 zeigt ein Diagramm von gemessenen Isotopenverhältnissen von Koffein vs. bekannten zertifizierten δ ¹³C-Werten aus einem LC/MS-Vergleichsversuch unter Verwendung von reduziertem Durchfluss.
14 zeigt ein schematisches Massenspektrum, das ein isotopisches Massenpeakmuster von Isotopologen einer eluierenden Molekülspezies abbildet. Die durchgezogenen Linien stellen Massenpeaks von Isotopologen derselben Molekülspezies dar, deren Isotopenverhältnis bestimmt werden soll. Die gepunkteten Linien stellen Massenpeaks von externen Interferenzen dar.
15 zeigt eine schematische Beziehung zwischen HETP und der Durchflussrate für eine HPLC-Säule.

Detaillierte Beschreibung von Ausführungsformen
Um ein detaillierteres Verständnis der Erfindung zu ermöglichen, werden nun Ausführungseispiele unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben.
Unter Bezugnahme auf 1 wird ein Verfahren im Zusammenhang mit einer LC-Säule beschrieben, es versteht sich jedoch, dass die Erfindung auf andere flüssigkeitsbasierte Trennvorrichtungen wie vorstehend beschrieben anwendbar ist. In einem ersten Schritt 102 wird eine Probe, die eine Anzahl von zu trennenden Komponenten enthält, in eine flüssige mobile Phase auf eine herkömmliche Weise in ein LC-System injiziert. Typischerweise sind eine Vielzahl von Komponenten zu trennen. In anderen Ausführungsformen kann in der Probe eine einzige Komponente vorliegen.
Es kann eine Vorrichtung wie schematisch in 2 dargestellt verwendet werden. Bei dieser Ausführungsform ist ein Massenspektrometer 10 über eine Schnittstelle mit einem LC-System 20 verbunden. Das LC-System weist einen Autosampler 24 zum Aufnehmen von zu analysierenden Proben und ein Pumpensystem 28 auf, das mindestens eine Pumpe enthält, wie z. B. eine Spritzenpumpe, um die flüssige mobile Phase anzutreiben und einen Probeninjektor, um eine Probe in die mobile Phase einzuspritzen. Ein bevorzugtes Massenspektrometer 10 ist ein Q Exactive® von Thermo Scientific, wie z. B. das Q Exactive® HF, das einen Orbitrap-Massenanalysator aufweist. Ein bevorzugtes LC-System ist ein Vanquish® UHPLC-System von Thermo Scientific. Die mit der Probe beschickte mobile Phase wird durch die LC-Säule 30 gepumpt. Eine bevorzugte LC-Säule ist eine Accucore aQ HPLC-Säule, 2,1×100 mm von Thermo Scientific. Das Massenspektrometer 10 und LC-System 20 unterliegen typischerweise der Kontrolle eines Reglers 15, der ein Computersystem aufweist. Der Regler übernimmt typischerweise die Datenerfassung vom Massenspektrometer und Datenverarbeitung der erfassten Daten. Die Datenverarbeitung enthält die Bestimmung von Isotopenverhältnissen aus den Massenanalysedaten. Der Regler steuert auch das Pumpensystem des LC-Systems 20, um die Durchflussrate der mobilen Phase nach der Erfindung zu reduzieren. Es versteht sich, dass der Regler für das LC-System oder die Trennvorrichtung in anderen Ausführungsformen ein von einem Regler für das Massenspektrometer separater Regler sein kann.
Eine andere Vorrichtung zum Einsatz bei der Erfindung ist schematisch in 3 dargestellt, die nachstehend detaillierter beschrieben wird.
Die Probe umfasst mindestens eine Komponente, die eine Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis ist. Die mobile Phase umfasst typischerweise ein organisches Lösemittel. Falls ein Gradienten-Lösemittel verwendet wird, umfasst zumindest ein Teil des Gradienten typischerweise ein organisches Lösemittel. In anderen Ausführungsformen könnte jedoch eine auf Wasser basierende, sogar vollständig wässrige mobile Phase verwendet werden.
In Schritt 104 wird die mobile Phase unter Verwendung des Pumpensystems durch die LC-Säule mittels der Pumpe zum Massenspektrometer geströmt, und ein oder mehrere der Komponenten der Probe werden durch die LC-Säule getrennt, wenn sie aus der Säule mit unterschiedlichen Retentionszeiten eluieren. Das Eluat und die mobile Phase, die die Säule verlassen, fließen zum prozessabwärts angeordneten Massenspektrometer zur Detektion. In einer anderen Ausführungsform können die aus der LC-Säule eluierenden Komponenten in einem oder mehreren getrennten Kammern gesammelt und/oder gespeichert werden und anschließend offline (z. B. in einem getrennten Massenspektrometer offline) analysiert werden. Beispiel: Die LC-Probensammlung könnte in Mikrotiterplatten erfolgen und später von einem MS durch Infusion oder Elektrospray oder Nanospray analysiert werden.
In bevorzugten Ausführungsformen kann das Massenspektrometer in einem Erfassungszyklus das volle Massenspektrum jedes der aus der Säule eluierenden Komponenten analysieren, d. h. alle Massen (m/z)-Peaks einer Verbindung können in einem einzigen Erfassungszyklus aufgezeichnet werden. Spektrometer, die Analysatoren für eine hohe Auflösung und akkurate Masse (HR-AM) umfassen, werden bevorzugt. Bevorzugte Spektrometer beinhalten Massenanalysatoren der folgenden Typen: Fourier-Transformations-(FT)-Massenanalysator, elektrostatische Orbitalfallen (wie z. B. ein Orbitrap-Massenanalysator), die typischerweise FT, FT-ICR-Massenanalysatoren sind, und Einzel- oder Multi-Reflexions-TOF-Massenanalysatoren. In derartigen Analysatoren werden alle Massen- (m/z)-Peaks einer Verbindung während eines Erfassungszyklus (in diesem Schriftstück als eine ,parallele' Messung bezeichnet) gemessen, d. h. aus einer einzigen Einspritzung von Ionen in den Analysator.
Das Massenspektrometer analysiert typischerweise das Eluat über die Zeit, z. B. in festgelegten Probenahmeintervallen, um ein Massenchromatogramm bereitzustellen, d. h. eine Reihe von Massenspektren, die an einer Reihe von Datenpunkten über die Retentionszeit hinweg gemessen wurden. In Schritt 106 wird die Durchflussrate der flüssigen mobilen Phase, die durch die LC-Säule fließt, für zumindest einen Abschnitt der Zeit reduziert, während dem die Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis aus der Säule austritt. Die Durchflussrate in der bevorzugten Ausführungsform wird reduziert, unmittelbar bevor die interessierende Molekülspezies aus der Säule auszutreten beginnt (z. B. zu einem Zeitpunkt beginnend von zwischen 1 und 100 Sek. vorher, bevorzugter zwischen 1 und 50 Sek. vorher und noch bevorzugter zwischen 1 und 10 Sek. vorher). Die Rate bleibt reduziert bis zu mindestens einem Zeitpunkt, zu dem das meiste der Molekülspezies aus der Säule ausgetreten ist, wie z. B. bis zu einem Zeitpunkt, zu dem die Molekülspezies im Wesentlichen aufgehört hat, aus der Säule auszutreten, oder vorzugsweise bis die gewünschte Präzision bei der Bestimmung des Isotopenverhältnisses erreicht worden ist. Die Durchflussrate kann reduziert bleiben bis zu einem Zeitpunkt, nach dem die gesamte Molekülspezies aus der Säule ausgetreten ist. Die Durchflussrate wird typischerweise um einen Faktor von mindestens 3, oder noch besser mindestens 5 oder noch besser mindestens 10, oder in einigen Fällen mindestens 100, reduziert. Der Reduktionsfaktor hängt typischerweise mit der Säulengröße (Durchmesser) wie vorstehend beschrieben zusammen. Typischerweise wird eine um einen Faktor zwischen 5 und 1000, oder zwischen 5 und 200, reduzierte Durchflussrate eingesetzt. Nachdem der Durchfluss auf diese Weise reduziert worden ist, kann die Durchflussrate erhöht werden, typischerweise auf die ursprüngliche Durchflussrate, bevor die Durchflussrate reduziert wurde. Der Zeitpunkt, an dem die Durchflussrate reduziert werden sollte, kann aus einer vorausgehenden Messung (d. h. einem vorausgehendem LC-Versuch) bestimmt werden, oder er kann aus einer Datenbank bekannt sein, oder er kann von vornherein bekannt sein. Alternativ kann der Zeitpunkt, an dem die Durchflussrate reduziert werden sollte, durch die Detektion von einem oder mehreren Massenspektrumpeaks der interessierenden Molekülspezies in Echtzeit ausgelöst werden, wenn das Massenspektrometer die eluierenden Spezies analysiert.
Die Reduzierung der Durchflussrate kann auf unterschiedliche Weise erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Drehzahl der Pumpe (d. h. der Pumpdruck), die den Strom der mobilen Phase durch die Säule antreibt, reduziert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann der Strom prozessaufwärts der Säule durch Ansteuern eines Ventils aufgespalten werden, sodass ein Anteil des Stroms der mobilen Phase in eine Verzweigungsströmungsbahn prozessaufwärts der Trennvorrichtung umgeleitet wird und nur ein Anteil durch die Säule geführt wird, wodurch eine reduzierte Durchflussrate durch die Säule bereitgestellt wird. Ein derartiges System ist schematisch in 3 dargestellt. In 3 sind die Systemkomponenten im Allgemeinen ähnlich wie in 2, sodass dieselben Bezugsnummern dieselben Komponenten bezeichnen. In der Konfiguration nach 3 wurde jedoch ein T-Abzweigstück 40 in die Strömungsbahn prozessaufwärts der LC-Säule eingefügt und mit einem HPLC-Schaltventil 50 verbunden. Das Ventil kann zwischen zwei Positionen umgeschaltet werden: i) einem blockierten Port, und ii) einem Port, der mit einer Durchflussbegrenzungskapillare verbunden ist, die zu einer Abfallaufnahmevorrichtung 60 führt. Falls das Ventil auf Position i) geschaltet ist, fließt der gesamte Strom durch die Säule. Wenn das Ventil jedoch auf Position ii) geschaltet ist, fließt nur ein Bruchteil des Stroms durch die Säule (z. B. 10%), wodurch die Zeit ausgeweitet wird, die es dauert, um einen Peak aus der Säule zu eluieren, und es zu einer erheblichen Peakverbreiterung kommt. Das Schaltventil 50 unterliegt der Kontrolle des Reglers 15.
In Schritt 108 zeichnet das Massenspektrometer zu einem Zeitpunkt während der Probenelution das Massenspektrum des interessierenden Peaks aus der LC-Säule auf, das der mindestens einen Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis entspricht. Wie erwähnt, zeichnet das Massenspektrometer das Massenspektrum des Eluats in einer über die Zeit aufgenommenen Sequenz von Datenerfassungszyklen auf, während es aus der LC-Säule austritt. Das Massenspektrum wird typischerweise aufgezeichnet über den Bereich von Retentionszeiten von 0 Minuten (oder Probeninjektion), bis mindestens das Massenspektrum der Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis über seinen Elutionspeak aufgezeichnet wurde. Wie beschrieben, wird die Durchflussrate während des Zeitraums des interessierenden Elutionspeaks reduziert, was die Peakbreite (oder Elutionszeit, d. h. die Zeit, die sie im Eluat verbringt) für die Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis vergrößert. Somit kann die Gesamtmassenanalysenzeit für die Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis durch die Reduzierung der Durchflussrate ausgeweitet werden, d. h. indem die Anzahl der Messpunkte um einen Faktor des Verhältnisses der Peakbreiten (Peakbreite mit Durchflussreduzierung / Peakbreite ohne Durchflussreduzierung) erhöht wird. Bei vielen der im Massenspektrometer bei der Kopplung mit einer Flüssigkeitstrennung wie LC eingesetzten bevorzugten lonisierungsverfahren, wie z. B. einem Elektrospray-Ionisierungsverfahren, wird die Signalintensität nicht wesentlich von der Reduzierung der Durchflussrate beeinträchtigt. Somit ist das Gesamtergebnis ein Zuwachs an Präzision des Massenspektrums. Die Präzision des Isotopenverhältnisses liegt vorzugsweise bei <20 δ‰, vorzugsweise (in der Reihenfolge zunehmender Präferenz) <15δ‰, oder <10δ‰, oder <7δ‰, oder <5δ‰, oder <3δ‰, oder <1δ‰, oder <0,5δ‰, oder <0,1‰.
Das aufgezeichnete Massenspektrum enthält ein isotopisches Muster, aus dem eine Vielzahl von isotopischen Peaks, d.h. Peaks infolge von unterschiedlichen Isotopologen der Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis, aufgelöst werden kann. Aus der Analyse des isotopisch aufgelösten Massenspektrums kann ein Isotopenverhältnis bestimmt werden (Schritt 110). Zum Beispiel ist es möglich, aus den Intensitäten von zwei oder mehreren aufgelösten isotopischen Peaks im Massenspektrum, wobei einer oft der monoisotopische Peak ist, ein Isotopenverhältnis (optional als ein Delta-(δ)-Wert ausgedrückt) für ein Element zu bestimmen. Bevorzugte interessierende Elemente zum Bestimmen eines Isotopenverhältnisses sind C, N, O, H, S, P, CI, Br und Si. Einige übliche zu bestimmende Isotopenverhältnisse beinhalten ¹³C/¹²C, ¹⁴C/¹²C, ¹⁵N/¹⁴N, ²H/¹H, ¹⁸O/ ¹⁸O, ¹⁷O/¹⁶O oder ³⁴SP²S, ³⁷Cl/³⁵Cl, ⁸¹Br/⁷⁹Br, ²⁹Si/²⁸Si, ³⁰Si/²⁸Si usw.
Die Bestimmung des Isotopenverhältnisses in der vorliegenden Erfindung kann auf den Intensitäten basieren, zum Beispiel auf dem Vergleichen (d. h. dem Finden des Verhältnisses) der Intensitäten, von Massenpeaks von Isotopologen der Molekülspezies, in der die Isotopologe unterschiedliche nominelle Massen (typischerweise sich durch eine oder zwei nominelle Masseneinheiten unterscheidend) aufweisen. Typischerweise kann der monoisotopische Peak (für monoisotopische Isotopologe) im Massenspektrum der mindestens einen Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis, z. B. der [M+H]⁺-Peak in einem aus einer Elektrospray-Quelle erhaltenen Massenspektrum, eine Isotopenhäufigkeit für das bestimmte interessierende leichte Isotop (z. B. ¹²C, ¹⁴N, ¹⁶O, ¹H, ³²S) bereitstellen, und ein A+1-Peak oder A+2-Peak (wobei A der monoisotopische Massenpeak ist) für ein A+1-Isotopolog oder A+2-Isotopolog kann eine Isotopenhäufigkeit für das bestimmte schwere interessierende Isotop (z. B. ¹³C, ¹⁵N, ¹⁸O, ²H, ³⁴S) bereitstellen. Das Bestimmen des Isotopenverhältnisses kann somit das Vergleichen der Intensität eines monoisotopischen Massenpeaks A mit einem A+1-Massenpeak oder A+2-Massenpeak umfassen, um ein Isotopenverhältnis eines leichten Isotops und eines schweren Isotops von Interesse bereitzustellen. Es wurde festgestellt, dass das hohe Auflösungsvermögen des Massenspektrometers, insbesondere eines Spektrometers, das einen Orbitrap-Massenanalysator umfasst, einen bestimmten A+1-Peak (oder A+2-Peak) eines Isotopologs mit dem bestimmten interessierenden schweren Isotop (¹³C oder ¹⁵N oder ¹⁸O oder ²H oder ³⁴S usw.) auflösen kann, d. h. jenen bestimmten Isotopolog-Peak von anderen nominellen A+1-Massenpeaks (oder nominellen A+2-Massenpeaks) von Isotopologen mit einem anderen schweren Isotop absetzen kann. Jeder für das Bestimmen des Isotopenverhältnisses verwendete Isotopolog-Massenpeak sollte vorzugsweise von mindestens jedem anderen Massenpeak bei derselben nominellen Masse abgesetzt werden, was mehr als 20% oder bevorzugter mehr als 10% oder am bevorzugtesten mehr als 5% der Intensität des Isotopolog-Massenpeaks sind. Zum Beispiel zeigt in einer Ausführungsform der Erfindung das aufgelöste Isotopenpeakmuster von A+1-Peaks, dass ein ¹³C-Isotopolog-Peak ausreichend von einem ¹⁵N-Isotopolog-Peak oder ²H-Peak abgesetzt werden kann. Weiterhin zeigt das aufgelöste Isotopenpeakmuster von A+2-Peaks, dass ein ¹⁸O-Isotopolog-Peak ausreichend von einem ¹³C₂-Isotopolog-Peak oder einem ¹³C¹⁵N-Isotopolog-Peak abgesetzt werden kann. Somit ermöglicht die Erfindung eine Analyse von mehrfach substituierten Isotopologen sowie einfach substituierten Isotopologen. Die Massenanalyse setzt daher vorzugsweise den monoisotopischen Peak von A+1- und A+2-Peaks ab. Die Massenanalyse setzt weiterhin vorzugsweise zwei oder mehrere A+1-Isotopologe und/oder zwei oder mehrere A+2-Isotopologe voneinander ab.
In einigen Ausführungsformen kann die Bestimmung des Isotopenverhältnisses in der vorliegenden Erfindung auf den Intensitäten basieren, zum Beispiel auf dem Vergleichen (d. h. dem Finden des Verhältnisses) der Intensitäten, von Massenpeaks von Isotopologen der Molekülspezies, in der die Isotopologen dieselbe nominelle Masse haben. Zum Beispiel kann die Bestimmung des Isotopenverhältnisses auf einem Verhältnis des ¹⁵N-Isotopolog-Peak zum ¹³C-Isotopolog-Peak basieren.
Die Massenanalyse wird vorzugsweise mit einem ausreichenden Massenauflösungsvermögen (R) durchgeführt, um Massenpeaks von Isotopologen der mindestens einen Molekülspezies aufzulösen, zum Beispiel, um die zwei häufigsten Massenpeaks bei der nominellen Masse des mindestens einen der zur Bestimmung des Isotopenverhältnisses verwendeten Isotopologe (vorzugsweise bei den nominellen Massen von jedem der zur Bestimmung des Isotopenverhältnisses verwendeten Isotopologe) aufzulösen. Die zwei häufigsten Massenpeaks, die bei derselben nominellen Masse aufgelöst werden, sind typischerweise zwei Isotopologe (da der Schritt der Flüssigkeitstrennung typischerweise bedeutet, dass keine anderen Molekülspezies vorhanden sind, die Massenpeaks innerhalb von 2 m/z-Einheiten der zur Bestimmung des Isotopenverhältnisses verwendeten Isotopologe aufweisen). Die zwei häufigsten Massenpeaks bei der nominellen Masse sind vorzugsweise Peaks, die, falls sie nicht aufgelöst werden, jeweils erheblich zu dem zu bestimmenden Isotopenverhältnis beitragen würden (z. B. indem sie >20% oder >10% oder > 5% der Peakintensität des Isotopologs bei der nominellen Masse beitragen). Die Massenanalyse wird vorzugsweise mit einem Massenauflösungsvermögen durchgeführt, das hoch genug ist, um die zwei häufigsten A+1-Isotopologe und/oder die zwei häufigsten A+2-Isotopologe aufzulösen (wobei A der monoisotopische Massenpeak ist).
Unter Bezugnahme auf 14 ist ein schematisches Massenspektrum dargestellt, das ein isotopisches Massenpeakmuster von Isotopologen einer eluierenden Molekülspezies abbildet. Die durchgezogenen Linien stellen Massenpeaks von Isotopologen derselben Molekülspezies dar, deren Isotopenverhältnis bestimmt werden soll. Die gepunkteten Linien stellen Massenpeaks von externen Interferenzen von anderen Molekülspezies dar. Es ist ein monoisotopischer Peak P1 einer nominellen Masse A dargestellt, der von einem kleinen externen Interferenz-Massenpeak i1 bei derselben nominellen Masse A abgesetzt wird. Ein Isotopolog-Peak P2 wird ebenfalls bei nomineller Masse A+1 angezeigt, der zusammen mit dem monoisotopischen Peak P1 dazu verwendet werden soll, ein Isotopenverhältnis der Molekülspezies zu finden, d. h. das Verhältnis der Intensität des P2 (A+1)-Peaks zum P1 (A)-Peak, was als ein Delta-Wert ausgedrückt werden kann. Der P2 A+1-Isotopolog-Peak ist von zwei anderen A+1-Isotopolog-Peaks P3 und P4 sowie einem externen Interferenz-Peak i2 abgesetzt. Es ist zu sehen, dass mindestens die zwei häufigsten A+1-Massenpeaks, P2 und P4, voneinander nach ihrer Masse abgesetzt sind. Es ist besonders wichtig, dass P2 von P4 abgesetzt ist, da P4 mehr als 20% der Intensität des P2-Peaks beträgt und somit das Bestimmen des Isotopenverhältnisses erheblich beeinträchtigen würde. Es ist auch vorzuziehen, dass P2 von P3 abgesetzt ist, da P3 mehr als 10% der Intensität des P2-Peaks beträgt. Beispielsweise könnte der A+1-Peak, P2, das ¹³C-Isotopolog sein und zusammen mit dem monoisotopischen Peak P1 dazu verwendet werden, das ¹³C/¹²C-Verhältnis zu bestimmen. Darüber hinaus könnte der A+1-Peak, P3, das ¹⁵N-Isotopolog sein, und zusammen mit dem monoisotopischen Peak P1 dazu verwendet werden, das ¹⁵N/¹⁴N-Verhältnis zu bestimmen. Ähnlich sind mit den nominellen A+2-Massenpeaks Isotopolog-Peaks P5, P6, P7 und P8 und ein externer Interferenz-Peak i3 dargestellt, die alle voneinander nach ihrer Masse abgesetzt sind und mit dem monoisotopischen Peak P1 zur Bestimmung der Isotopenverhältnisse verwendet werden können, z. B. von Isotopen, die sich um zwei nominelle Masseneinheiten unterscheiden, wie z. B. ³⁴S/³²S oder ¹⁸O/¹⁶O, oder von mehrfach substituierten Isotopologen, wie z. B. ¹³C₂ oder ¹³C¹⁵N. Wichtig ist, dass mindestens die zwei häufigsten A+2-Massenpeaks, P6 und i3, voneinander nach ihrer Masse abgesetzt sind.
Zum Bestimmen des Isotopenverhältnisses aus dem Massenspektrum können unterschiedliche Arbeitsabläufe verwendet werden. Ein Beispiel für einen Arbeitsablauf zum Bestimmen des Isotopenverhältnisses aus dem Massenspektrum wird in den folgenden Schritten gegeben.

1. Bestimmen der Peakintensitäten der zwei interessierenden Isotopenpeaks für jedes erfasste Spektrum (darin sind jene Spektren zu Retentionszeiten enthalten, wenn kein Peak aus der Säule eluiert). Das erfolgt typischerweise, indem der Punkt mit der höchsten Intensität innerhalb eines engen Massenfensters um die akkurate Masse des interessierenden Peaks herangezogen wird. Für Massenanalysatoren, die nicht FT-basiert sind, kann Peakintegration das Verfahren der Wahl anstelle der Höhe des Peaks sein.
2. Optionaler Schritt: Bestimmen der durchschnittlichen Hintergrundintensität der zwei Massenpeaks in einem Bereich des Chromatogramms, in dem kein interessierender Peak und keine mit den interessierenden Massen interferierenden Peaks eluieren. Das kann ein Mittelwert, geometrisches Mittel oder jedes andere ähnliche Verfahren zum Bestimmen eines solchen Werts sein. Dieser Schritt kann das Analysieren und Entfernen von Ausreißern enthalten. Dieser Schritt kann andere Schritte (wie Drift-Überprüfung) enthalten, um sicherzustellen, dass der ausgewählte Teil des Chromatogramms für die Hintergrundbestimmung geeignet ist.

3. Optionaler Schritt: Subtrahieren der durchschnittlichen Hintergrundintensitäten von den interessierenden Peaks für jedes Spektrum über den eluierten Peak hinweg.
4. Bestimmen des Isotopenverhältnisses für jedes Spektrum durch Dividieren der Intensität des ersten interessierenden Isotopenpeaks (optional mit abgezogenem Hintergrund) durch die Intensität des anderen interessierenden Peaks.
5. Optionaler Schritt: Verwenden von statistischen Werkzeugen, um die ermittelten Verhältnisse zu validieren und zu verbessern. Zum Beispiel: i) Analysieren und Entfernen von Ausreißern, ii) Bestimmen, ob es irgendeinen Zeittrend (instrumenteller Drift) in den Daten gibt, iii) Auftragen der Verhältnisse vs. Peakintensitäten in einem Diagramm, um jegliche Abhängigkeit von Peakintensität auszuschalten, usw.
6. Bestimmen des durchschnittlichen Isotopenverhältnisses und des mit dem Datensatz zusammenhängenden Standardfehlers basierend auf dem aus Schritt 4 (oder optional aus Schritt 5) erhaltenen Datensatz.

In einem alternativen Datenauswertungsmodus könnten die Spektren erst gemittelt werden, dann der Hintergrund subtrahiert und das letztendliche Isotopenverhältnis als das Verhältnis der zwei interessierenden Peaks in dem gemittelten Spektrum bestimmt werden.
Versuchsbeispiele
Nun werden einige den Umfang der Erfindung nicht einschränkende Versuchsbeispiele beschrieben, um das Verständnis für die Erfindung zu erleichtern.
Proben- und Referenzmaterialien
Zum Nachweis der Wirksamkeit der Erfindung wurde Koffein als eine Modellverbindung verwendet. Drei zertifizierte isotopische Referenzmaterialen von Koffein wurden von USGS bezogen: USGS61, USGS62, USGS63 (Schimmelmann, A., Qi, H., Coplen, T.B., Brand, W.A., Fong, J., Meier-Augenstein, W., Kemp, H.F., Toman, B., Ackermann, A., Assonov, S. und Aerts-Bijma, A.T., 2016. Organic Reference Materials for Hydrogen, Carbon, and Nitrogen Stable Isotope-Ratio Measurements: Caffeines, n-Alkanes, Fatty Acid Methyl Esters, Glycines, I-Valines, Polyethylenes, and Oils. Analytical chemistry, 88(8), S. 4294-4302). Eine zusätzliche Koffeinprobe wurde von Sigma Aldrich® (Sigma Aldrich® C-8960, Los # 30K0169) bezogen und unter Verwendung eines mit einem EA-Isolink-Element-Analysator gekoppelten Delta-V-Massenspektrometers charakterisiert. Die zertifizierten δ ¹³C-Referenzwerte (für USGS61-63) und Messwerte (für die Probe von Sigma Aldrich®, in diesem Dokument als BRE001 bezeichnet) sind in Tabelle 1 aufgezeichnet. Tabelle 1 - Zertifizierte Referenzwerte und gemessene Werte für δ ¹³C

Probenname δ ¹³ C [‰]

USGS61 -35,05

USGS62 -14,97

USGS63 -1,17

BRE001 -39,21
Beispiel 1 - Infusionsmessungen (Vergleichsbeispiel)
Probenlösungen von ca. 10µg/ml der in Tabelle 1 aufgelisteten Proben in Methanol/Wasser 50:50 (v:v) wurden zubereitet und direkt in ein Standard-Thermo Scientific Q Exactive® HF Orbitrap-Massenspektrometer von Thermo Fisher Scientific infundiert. Eine schematische Darstellung des Instruments, das ein bevorzugtes Massenspektrometer zum Einsatz bei der Erfindung ist, ist in 4 dargestellt. Das Massenspektrometer 200 umfasst eine Elektrospraylonenquelle 202, die Ionen erzeugt, die in eine HF-Linse 204 eintreten, bevor sie durch die aktive Strahlführungs-Ionenoptik 206 zu einem Quadrupol-Massenfilter 208 geführt werden. Ein Massenisolationsfenster kann durch den Massenfilter eingestellt werden, um Ionen der gewünschten Masse zu einer prozessabwärts angeordneten lonenfalle (C-Falle) 210 durchzuleiten, wo die Ionen vor dem Ausstoßen der Ionen in den Orbitrap-Massenanalysator 212 zur Massenanalyse gesammelt werden können. Falls erforderlich, können die Ionen durch die C-Falle 210 zu einer prozessabwärts angeordneten Higher-Energy-Collision-Dissociation- (HCD)-Zelle 214 geleitet werden, wo die Ionen vor der Rückkehr in die C-Falle 210 fragmentiert und anschließend im Orbitrap-Massenanalysator 212 auf ihre Masse analysiert werden.
Das Spektrometer wurde mit den folgenden Parametern betrieben:

- Infusion mittels einer Spritzenpumpe
- Massenisolationsbereich des Spektrometers: 190-200 m/z
- Auflösungsvermögen =240k @ m/z 200
- Es wurden 10 Mikroscans verwendet, d. h. es wurden für jede einer Fourier-Transformation unterzogene Transienten 10 Scans im Orbitrap durchgeführt.
- AGC-Sollwert: 1E6
- 15 min. Gesamtdatenerfassung, was ca. 160 Scans pro Datendatei (mit 10 pro Scan verwendeten Mikroscans) ergibt.

5 zeigt ein repräsentatives Massenspektrum, das aus der BRE001-Koffeinprobe, die in das Q Exactive® HF-Massenspektrometer infundiert wurde, erhalten wurde. Der monoisotopische Koffeinpeak, der dem [M+H]⁺-Ion entspricht, ist an 195,09 und ein A+1-Peak an 196,09 markiert. Aufgrund der hohen Auflösung des Instruments zeigt ein genauerer Blick auf das Massenspektrum der Isotopenpeaks, dass der ¹³C-Isotopenpeak bei 196,09 gut vom ¹⁵N-Isotopenpeak bei 196,08, aber nicht vom ¹⁷O-Isotopenpeak abgesetzt ist, wie in 6 dargestellt. Die natürliche Häufigkeit von ¹⁷O ist jedoch im Vergleich zu den Variationen bei ¹³C-Häufigkeit vernachlässigbar, sodass dies für die Untersuchung ziemlich akzeptabel ist.
Die oberste Reihe von Spektren in 6 zeigt das gemessene Isotopenmuster von Koffein und belegt das Auflösungsvermögen. Die untere Reihe von Spektren stellt eine Simulation der Spektren von Koffein dar, um die gute Übereinstimmung mit den gemessenen Daten zu zeigen. Die Peak-Beschriftungen in 6 zeigen den Typ von Koffein-Isotopolog (z. B. ¹⁵N, ¹³C, ¹³C₂ usw.) an.

Alle Proben wurden sequenziell unter Verwendung einer Standard-/ Proben-Bracketing-Sequenz mit USGS61 als Bracketing-Standard gemessen. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Messungen, wobei der Standard als Typ STD bezeichnet wird und jede der Proben als Typ UNK bezeichnet wird. 7 zeigt das Diagramm der gemessenen Isotopenverhältnisse (196/195) vs. der bekannten zertifizierten δ ¹³C-Werte und zeigt auch die lineare Kalibrierkurve. Der Standardfehler für jede einzelne Messung beim Infusionsversuch lag bei ungefähr 0,5-0,6‰ und die Genauigkeit des Verfahrens lag bei ca. 2-2,5‰. Tabelle 2

Sequenz	Probe	Typ	Verhältnis (gemessen)	δ ¹³ C (‰) Zertifizierter Wert	δ ¹³ C (‰) (berechnet)
1	BRE001	UNK	0,0853857	-39,21	-36,47
2	USGS61	STD	0,0855069	-35,05
3	BRE001	UNK	0,0855094	-39,21	-35,34
4	USGS61	STD	0,0855632	-35,05
5	USGS62	UNK	0,0874976	-14,97	-12,08
6	USGS61	STD	0,0855020	-35,05
7	USGS63	UNK	0,0885502	-1,17	-0,29
8	USGS61	STD	0,0856490	-35,05
9	BRE001	UNK	00855340	-39,21	-36,39

Beispiel 2 - LC/MS-Messunqen ohne reduzierten Durchfluss (Vergleichsbeispiel)
Bei dem Versuch wurden Probenlösungen von 10 µg/ml (+/-0,02 µg/ml) der in Tabelle 1 aufgelisteten Proben in Methanol/Wasser 20:80 verwendet. Ein LC/MS-System wie schematisch in 2 dargestellt wurde mit dem folgenden LC-Aufbau verwendet:

- Thermo Fisher Scientific Vanquish® LC-System mit Autosampler und quaternärer Pumpe
- 10µl Injektion (entspricht 100ng injiziert)
- Thermo Fisher Scientific Accucore aQ-Säule; 2,1x100 mm, 2,6 mm Partikelgröße
- Lösemittel A: Wasser, 0,1% Ameisensäure (formic acid - FA), 2 mM Ammoniumacetat
- Lösemittel B: Methanol, 0,1% FA, 2mM Ammoniumacetat
- Lösemittelgradient 100%A (0-0,5 min.); 50%A/50%B (0,5-3,0 min.); 20%A/80%B (3,0-3,3 min.); 100%A (3,3-5 min.). 8 zeigt den beim Versuch verwendeten Lösemittelstufengradienten.

Das Massenspektrometer wurde mit den folgenden Parametern betrieben:

- Massenscan/-isolationsbereich: 190-200 m/z
- Auflösungsvermögen =240k @ m/z 200
- 1 Mikroscan pro verarbeiteter Transiente
- AGC-Sollwert: 1E6
- 4 min. Gesamtdatenerfassung

Die Erfassungs- und Datenauswertungsstrategie verwendete Folgendes:

- Proben/Standard-Bracketing
- USGS1 als Referenz/Standard
- 8 Wiederholungen des Bracketing-Sets (49 Injektionen insgesamt)
- Datenauswertung verwendete USGS1-Messungen zur Korrektur von Drift
- Direkte Berechnung von δ-Werten ohne zusätzliche Korrekturen

9 zeigt ein typisches Chromatogramm und Massenspektrum. Mit der LC-Peakbreite von Koffein von ca. 0,5 min. ergab dies ca. 40 Scans über den LC-Peak hinweg. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der Messungen und 10 zeigt das Diagramm der gemessenen Isotopenverhältnisse vs. der bekannten zertifizierten δ ¹³C-Werte zusammen mit der linearen Kalibrierkurve. Der Standardfehler jeder einzelnen Messung lag bei ungefähr 4-6‰. Die Genauigkeit des Verfahrens lag bei ca. 5‰. Tabelle 3

Probe	δ ¹³ C (‰) (gemessen)	StdFeh (‰)	StdAbw (‰)	δ ¹³ C (‰) Zertifizierter Wert
USGS61	-35,05	Nicht zutreffend	Nicht zutreffend	-35,05
USGS62	-17,44	1,72	4,85	-14,97
USGS63	-1,56	1,59	4,51	-1,17
BRE001	-37,14	0,58	1,65	-39,21

Beispiel 3 - LC/MS-Messunqen mit reduziertem Durchfluss
Bei dem Versuch wurden Probenlösungen von 10µg/ml (+/-0,02 µg/ml) der in Tabelle 1 aufgelisteten Proben in Methanol/Wasser 20:80 verwendet. Ein LC/MS-System wie schematisch in 3 dargestellt wurde mit dem folgenden LC-Aufbau verwendet:

- Thermo Fisher Scientific Vanquish® LC mit Autosampler und quaternärer Pumpe
- 10µl Injektion (entspricht 100ng injiziert)
- Thermo Fisher Scientific Accucore aQ-Säule; 2,1×100 mm, 2,6 mm Partikelgröße
- Lösemittel A: Wasser, 0,1% FA, 2mM Ammoniumacetat
- Lösemittel B: Methanol, 0,1% FA, 2mM Ammoniumacetat
- Gradient 100%A (0-0,5 min.); 50%A/50%B (0,5-8,5 min.); 20%A/80%B (8,5-9,0 min.); 100%A (9,0-11,0 min.) (Stufengradient).
- Umleitventilschaltung bei t=2,75 min. und t=8,00 min.

11 zeigt den beim Versuch verwendeten Lösemittelstufengradienten. Bei diesem Versuch wurde ein Aufbau mit reduziertem Durchfluss verwendet. Wie in 3 dargestellt, wurde ein T-Stück in die Strömungsbahn vor der LC-Säule eingefügt und mit einem HPLC-Schaltventil verbunden. Das Ventil konnte auf eine von zwei Positionen geschaltet werden: i) einen blockierten Port, oder ii) einen Port, der mit einer Durchflussbegrenzungskapillare verbunden war, die zum Abfall führte. Falls das Ventil auf Position i) geschaltet war, floss der gesamte Strom durch die Säule. Wenn das Ventil jedoch auf Position ii) geschaltet war, floss nur ein Bruchteil des Stroms durch die Säule, wodurch die Zeit ausgeweitet wurde, die es dauerte, um einen Peak aus der Säule zu eluieren. Dies führte zu einer erheblichen Peakverbreiterung. In diesem Fall wurde die Peakbreite von 0,5 min. auf ca. 6 min. ausgeweitet. Aufgrund der Charakteristiken des Elektrospray-Ionisierungsverfahrens wurde die Signalintensität vom Abfallen der Durchflussrate nicht erheblich beeinträchtigt, was effektiv die Analysezeit ausweitete und die Anzahl der Messpunkte mit dem Verhältnis der Peakbreiten multiplizierte. Es versteht sich, dass die reduzierte Durchflussrate auch implementiert werden könnte, indem eine Konfiguration wie in 2 dargestellt verwendet würde, indem die Pumpendrehzahl (Druck) für die erforderliche Dauer reduziert würde. Der Ansatz mit der reduzierten Durchflussrate ergab eine viel bessere Präzision der Messung des Isotopenverhältnisses.
Das Massenspektrometer wurde mit den folgenden Parametern betrieben:

Die Erfassungs- und Datenauswertungsstrategie verwendete Folgendes:

- Proben/Standard-Bracketing
- USGS1 als Referenz/Standard
- 8 Wiederholungen des Bracketing-Sets (49 Injektionen insgesamt)
- Datenauswertung unter Verwendung von USGS1-Messungen zur Korrektur von Drift
- Direkte Berechnung von δ-Werten; keine zusätzlichen Korrekturen

12 zeigt ein typisches Chromatogramm, Massenspektrum und LC-Pumpendruck vs. Zeit-Profil. Mit der auf ca. 6 min. erhöhten LC-Peakbreite von Koffein führte dies zu ca. 400 Scans über den LC-Peak hinweg. Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse der Messungen und 13 zeigt das Diagramm der gemessenen Isotopenverhältnisse vs. der bekannten zertifizierten δ ¹³C-Werte zusammen mit der linearen Kalibrierkurve. Der Standardfehler für jede einzelne Messung lag bei ungefähr 0,7-0,9‰ und die Genauigkeit des Verfahrens lag bei ca. 2‰. Es zeigt sich, dass der Ansatz der Erfindung mit der reduzierten Durchflussrate eine zuverlässige Bestimmung von präzisen und akkuraten Isotopenverhältnissen von Molekülspezies mittels hochauflösender Massenspektrometrie (z. B. Orbitrap-Massenspektrometer) gekoppelt mit Flüssigkeitschromatografie oder einer anderen Flüssigkeitstrennung ermöglicht. Tabelle 4

Probe	δ ¹³ C (‰) (gemessen)	StdFeh (%0)	StdAbw (‰)	δ ¹³ C (‰) Zertifizierter Wert
USGS61	-35,05	Nicht zutreffend	Nicht zutreffend	-35,05
USGS62	-14,45	0,79	2,25	-14,97
USGS63	-1,36	0,77	2,18	-1,17
BRE001	-37,86	0,64	1,81	-39,21

In diesem Schriftstück bedeutet der Begriff Masse-/Ladungsverhältnis (m/z) in Bezug auf die Massenanalyse jede auf m/z bezogene Größe der Massenanalyse, zum Beispiel Masse, Zeit (z. B. Flugzeit bei einer TOF-Massenanalyse), Frequenz (z. B. lonenoszillationsfrequenz bei einer Fourier-Transformations-Massenanalyse) usw.
Die Verwendung von einem und allen hier bereitgestellten Beispielen, oder von beispielhafter Sprache („beispielsweise“, „wie z. B.“, „zum Beispiel“ und dergleichen) soll lediglich der besseren Veranschaulichung der Erfindung dienen und stellt keine Einschränkung in Bezug auf den Geltungsbereich der Erfindung dar, sofern nichts anderes beansprucht wird. Keine sprachliche Formulierung in der Spezifikation soll so ausgelegt werden, dass sie irgendein nicht beanspruchtes Element als wesentlich für die Praxis der Erfindung anzeigt.
Im Sinne ihrer Verwendung in diesem Dokument, einschließlich der Ansprüche, sind Singularformen von Begriffen in diesem Schriftstück so auszulegen, dass sie auch die Pluralform umfassen und umgekehrt, sofern der Kontext nicht etwas anderes nahelegt. Sofern zum Beispiel der Kontext nicht etwas anderes nahelegt, bedeutet ein Singularbezug in diesem Schriftstück, einschließlich in den Ansprüchen, wie z.B. „ein“ oder „eine“, „ein/eine/eines oder mehrere“.
In der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen dieser Spezifikation bedeuten die Worte „umfassen“, „einschließlich“, „aufweisend“ und „enthalten“ und die Varianten der Worte, zum Beispiel „umfassend“ und „umfasst“ usw., „einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein“, und sollen andere Komponenten nicht ausschließen (und schließen sie nicht aus).
Die vorliegende Erfindung deckt ebenfalls die genauen Begriffe, Merkmale, Werte und Bandbreiten usw. ab, falls diese Begriffe, Merkmale, Werte und Bandbreiten usw. in Verbindung mit Begriffen wie etwa, ca., im Allgemeinen, im Wesentlichen, hauptsächlich, mindestens, usw. verwendet werden (d. h. „etwa 3“ deckt auch „genau 3“ ab, oder „im Wesentlichen konstant“ deckt auch „genau konstant“ ab).
Der Begriff „mindestens ein“ ist so zu verstehen, dass er „ein oder mehrere“ bedeutet, und daher beide Ausführungsformen, die eine oder mehrere Komponenten umfassen, einschließt. Weiterhin haben abhängige Ansprüche, die sich auf unabhängige Ansprüche beziehen, die Merkmale mit „mindestens ein/e“ beschreiben, dieselbe Bedeutung, wenn das Merkmal mit „der/die/das“ ebenso wie mit „der/die/das mindestens ein/e“ bezeichnet wird.
Alle in dieser Spezifikation beschriebenen Schritte können in jeder beliebigen Reihenfolge oder gleichzeitig ausgeführt werden, sofern nicht anders angegeben oder der Kontext nicht etwas anderes erfordert.
Alle in dieser Spezifikation offengelegten Merkmale können in jeder beliebigen Kombination kombiniert werden, mit Ausnahme von Kombinationen, bei denen mindestens einige dieser Merkmale und/oder Schritte sich gegenseitig ausschließen. Insbesondere gelten die bevorzugten Merkmale der Erfindung für alle Aspekte der Erfindung und können in jeder beliebigen Kombination verwendet werden. Ebenso können in nicht wesentlichen Kombinationen beschriebene Merkmale getrennt (nicht miteinander kombiniert) verwendet werden.

Claims

Verfahren der Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie umfassend: Fließenlassen einer flüssigen mobilen Phase, die eine Probe enthält, durch eine Trennvorrichtung mit einer ersten Flussrate, wobei die Probe mindestens eine Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis umfasst, wobei die erste Flussrate mindestens 50% einer optimalen Flussrate beträgt, die einer minimalen Trennstufenhöhe der Trennvorrichtung entspricht; Reduzieren der Flussrate der durch die Trennvorrichtung fließenden flüssigen mobilen Phase von der ersten Flussrate auf eine zweite Flussrate, die niedriger als die erste Flussrate ist, aber einer höheren Trennstufenhöhe der Trennvorrichtung entspricht, für mindestens einen Abschnitt der Zeit, während der die mindestens eine Molekülspezies aus der Trennvorrichtung austritt, wobei die Flussrate derart reduziert wird, dass eine gewünschte Präzision des Isotopenverhältnisses erreicht wird; Analysieren der Masse der mindestens einen Molekülspezies, die aus der Trennvorrichtung ausgetreten ist, mindestens während die Flussrate auf die zweite Flussrate reduziert ist; und Bestimmen aus der Massenanalyse von mindestens einem Isotopenverhältnis der mindestens einen Molekülspezies aus den Intensitäten der Massenpeaks von mindestens zwei Isotopologen der mindestens einen Molekülspezies, wobei die Massenanalyse mit einem Massenauflösungsvermögen durchgeführt wird, das hoch genug ist, um die zwei häufigsten Massenpeaks bei der nominellen Masse von mindestens einem der Isotopologe aufzulösen.
Verfahren der Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie umfassend: Fließenlassen einer flüssigen mobilen Phase, die eine Probe enthält, durch eine Trennvorrichtung mit einer ersten Flussrate, wobei die Probe mindestens eine Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis umfasst, wobei die erste Flussrate mindestens 50% einer optimalen Flussrate beträgt, die einer minimalen Trennstufenhöhe der Trennvorrichtung entspricht; Reduzieren der Flussrate der durch die Trennvorrichtung fließenden flüssigen mobilen Phase von der ersten Flussrate auf eine zweite Flussrate, die niedriger als die erste Flussrate ist, aber einer höheren Trennstufenhöhe der Trennvorrichtung entspricht, für mindestens einen Abschnitt der Zeit, während der die mindestens eine Molekülspezies aus der Trennvorrichtung austritt, wobei die Flussrate derart reduziert wird, dass eine gewünschte Präzision des Isotopenverhältnisses erreicht wird; Analysieren der Masse der mindestens einen Molekülspezies, die aus der Trennvorrichtung ausgetreten ist, mindestens während die Flussrate auf die zweite Flussrate reduziert ist; und Bestimmen aus der Massenanalyse von mindestens einem Isotopenverhältnis der mindestens einen Molekülspezies aus den Intensitäten der Massenpeaks von mindestens zwei Isotopologen der mindestens einen Molekülspezies, wobei jeder für die Bestimmung des Isotopenverhältnisses verwendete Isotopolog-Massenpeak von mindestens jedem anderen Massenpeak bei derselben nominellen Masse abgesetzt ist, die mehr als 20% der Intensität des Isotopolog-Massenpeaks betragen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Trennvorrichtung eine Chromatografie-Säule, Größenausschlusschromatografie-(SEC)-Säule, lonenchromatografie-(IC)-Säule, ein Dünnschichtchromatografie-(TLC)-Boden oder Kapillarelektrophorese-(CE)-System ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Trennvorrichtung eine Flüssigkeitschromatografie-Säule ist, wobei die Säule einen Innendurchmesser hat und wobei das Reduzieren der Flussrate das Reduzieren der Flussrate von der ersten Rate auf die zweite Rate umfasst, die einen Wert in ml/min. aufweist, der weniger als die Hälfte des durch 0,06x(Innendurchmesser in mm)² vorgegebenen Werts beträgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die flüssige mobile Phase ein organisches Lösemittel umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Flussrate für mindestens die gesamte Zeit, während der die mindestens eine Molekülspezies aus der Trennvorrichtung austritt, auf die zweite Flussrate reduziert ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Isotopenverhältnis mit einer Präzision des Isotopenverhältnisses von <20 δ‰ bestimmt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Flussrate von der zweiten Flussrate erhöht wird, sobald die mindestens eine Molekülspezies aufgehört hat, aus der Trennvorrichtung zu eluieren.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die zweite Flussrate um einen Faktor von mindestens 5 im Vergleich zur ersten Flussrate reduziert ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die erste Flussrate mindestens 80% der optimalen Flussrate und die zweite Flussrate weniger als 20% der optimalen Flussrate beträgt, wobei die zweite Flussrate relativ zur ersten Rate um einen Faktor von mindestens 5 oder mindestens 10 reduziert ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Flussrate von der ersten Flussrate auf die zweite Flussrate durch Reduzieren einer Pumpendrehzahl einer Pumpe reduziert wird, die die flüssige mobile Phase durch die Trennvorrichtung fließen lässt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Flussrate von der ersten Flussrate auf die zweite Flussrate reduziert wird, indem der Fluss der mobilen Phase prozessaufwärts der Trennvorrichtung so aufgespalten wird, dass durch die Trennvorrichtung eine reduzierte Flussrate der mobilen Phase fließt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Massenanalyse von einem Massenspektrometer für eine hohe Auflösung und akkurate Masse (HR-AM) durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Massenanalyse mit einem Massenauflösungsvermögen durchgeführt wird, das hoch genug ist, um die zwei häufigsten A+1-Isotopologe und/oder die zwei häufigsten A+2-Isotopologe der mindestens einen Molekülspezies aufzulösen, wobei A der monoisotopische Massenpeak ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Massenanalyse mit einem Auflösungsvermögen von mindestens 50.000 durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Massenanalyse mittels eines Massenspektrometer durchgeführt wird, das einen Massenanalysator umfasst, ausgewählt aus: einem elektrostatischen Orbitalfallen-Massenanalysator, einem FT-ICR-Massenanalysator oder einem Time-of-Flight-TOF-Massenanalysator.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Massenanalyse das Ionisieren der mindestens einen Molekülspezies vor dem Ausstoßen der Ionen in einen Massenanalysator zur Massenanalyse umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Massenanalyse das Fragmentieren der ionisierten mindestens einen Molekülspezies vor der Massenanalyse umfasst.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Bestimmen von mindestens einem Isotopenverhältnis der mindestens einen Molekülspezies das Bestimmen von positionsspezifischen Informationen über das ermittelte Isotopenverhältnis umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Bestimmen von mindestens einem Isotopenverhältnis das Vergleichen der Intensität eines monoisotopischen Massenpeaks A mit einem A+1-Massenpeak oder A+2-Massenpeak umfasst, um ein Isotopenverhältnis eines leichten Isotops und eines interessierenden schweren Isotops bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Massenanalyse zwei oder mehrere A+1-lsotopologe und/oder zwei oder mehrere A+2-Isotopologe auflöst.
Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, wobei das leichte Isotop ausgewählt wird aus ¹²C, ¹⁴N, ¹⁶O, ¹H, ³²S, ³⁵Cl,⁷⁹Br, ²⁸Si und das schwere Isotop ausgewählt wird aus ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O, ²H, ³⁴S, ³⁷Cl, ⁸¹Br, ²⁹Si, ³⁰Si.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Bestimmen von mindestens einem Isotopenverhältnis der mindestens einen Molekülspezies das Vergleichen der Intensität von zwei Peaks mit derselben nominellen Masse umfasst, die entweder zwei A+1-Massenpeaks oder zwei A+2-Massenpeaks sind.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, das weiterhin das Kalibrieren des mindestens einen aus den Intensitäten der Massenpeaks von mindestens zwei Isotopologen bestimmten Isotopenverhältnisses gegenüber einem oder mehreren Isotopenverhältnissen für einen oder mehrere bekannte Standards umfasst.
Vorrichtung für Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie umfassend: eine Trennvorrichtung zum Trennen von Komponenten einer Probe in einer flüssigen mobilen Phase, wobei die Komponenten der Probe mindestens eine Molekülspezies mit einem zu bestimmenden Isotopenverhältnis umfassen; ein mit der Trennvorrichtung prozessabwärts gekoppeltes Massenspektrometer zur Analyse der Masse der mindestens einen Molekülspezies, wenn die mindestens eine Molekülspezies aus der Trennvorrichtung eluiert, und Bestimmen von mindestens einem Isotopenverhältnis der mindestens einen Molekülspezies aus der Massenanalyse, wobei die Massenanalyse mit einem Massenauflösungsvermögen durchgeführt wird, das hoch genug ist, um die zwei häufigsten Massenpeaks bei der nominellen Masse von mindestens einem der Isotopologe aufzulösen; und einen Regulierer, der dazu konfiguriert ist, den Fluss der flüssigen mobilen Phase durch die Trennvorrichtung zu regulieren, um die flüssige mobile Phase durch die Trennvorrichtung für einen ersten Zeitabschnitt bei einer ersten Flussrate fließen zu lassen und die Flussrate der flüssigen mobilen Phase durch die Trennvorrichtung von der ersten Flussrate auf eine zweite Flussrate, die niedriger als die erste Flussrate ist, für mindestens einen Abschnitt der Zeit, während der die mindestens eine Molekülspezies aus der Trennvorrichtung eluiert, zu reduzieren, wobei die Flussrate derart reduziert wird, dass eine gewünschte Präzision des Isotopenverhältnisses erreicht wird.