DE102020129645A1 - Massenspektrometrieverfahren - Google Patents

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Abstract

Es wird ein Massenspektrometrieverfahren bereitgestellt. Das Verfahren umfasst das Hinzufügen eines Isotopologs eines Zielanalyten zu einer Probe und das Ionisieren der Probe und des Isotopologs, wenn diese aus einem Chromatographiesystem eluieren, um Vorläuferionen zu bilden. Die Vorläuferionen werden unter Verwendung einer datenunabhängigen Erfassungsmethodik (DIA) einer Massenanalyse unterzogen, die das Durchführen von Massenanalyse-Scans in der MS1-Domäne und das Durchführen von Massenanalyse-Scans in der MS2-Domäne umfasst. Nach dem Erkennen, dass das Isotopolog aus dem Chromatographiesystem eluiert, umfasst das Verfahren ferner das Durchführen von mehreren Zielscans, die jeweils ein Zielisolationsfenster mit einem Masse-zu-Ladung-Verhältnis aufweisen, das für den Zielanalyten über die Dauer eines chromatographischen Peaks des Isotopologs repräsentativ ist, um den Zielanalyten mindestens entweder zu erkennen oder zu quantifizieren, wobei die Zielscans konfiguriert sind, um zusätzliche Quantifizierungsdaten für den Zielanalyten bereitzustellen.

Description

  • Gebiet der Offenbarung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Massenspektrometrieverfahren und ein Massenspektrometer zur Durchführung eines Massenspektrometrieverfahrens. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur datenunabhängigen Erfassungs (engl. data independent acquisition, DIA) -Massenspektrometrie und ein Massenspektrometer zur Durchführung derselben.
  • Stand der Technik
  • Die Massenspektrometrie ist eine seit langem etablierte Technik zur Erkennung und Quantifizierung häufig komplexer Gemische großer organischer Moleküle. In den letzten Jahren wurden Techniken entwickelt, die die Analyse von mehreren biologischen und nicht-biologischen Materialien mit Anwendungen in den Bereichen Strafverfolgung, Umwelt, wissenschaftliche Forschung und Biologie ermöglichen. Beispielsweise können in der Proteomik einfache und komplexe Proteinmischungen analysiert werden, mit Anwendungen in der Wirkstoffentdeckung, der Erkennung von Krankheiten usw.
  • Proteine, die eine große Anzahl von Aminosäuren umfassen, haben typischerweise ein signifikantes Molekulargewicht. Dementsprechend ist eine genaue Erkennung und Quantifizierung des Proteins durch direkte massenspektrometrische Messung eine Herausforderung. Es ist daher bekannt, eine Fragmentierung des Vorläuferprobenmaterials durchzuführen. Es sind verschiedene Fragmentierungstechniken bekannt, die zur Erzeugung unterschiedlicher Fragmentionen aus den Vorläuferionen führen können. Darüber hinaus kann der Fragmentierungsmechanismus durch unterschiedliche angelegte Fragmentierungsenergien beeinflusst werden.
  • Die Analyse von Proben kann grob in DDA-Methodiken (engl. data dependent acquisition, DDA) und DIA-Methodiken (engl. data independent acquisition, DIA) unterteilt werden. Die DDA versucht zu bestätigen, dass eine oder mehrere Spezies in einer bestimmten Probe vorhanden ist/sind. DDA-Verfahren erkennen eine feste Anzahl von VorläuferionenSpezies und wählen und analysieren diese mittels Tandem-Massenspektrometrie. Die Bestimmung, welche Vorläuferionenspezies für DDA von Interesse sind, kann auf der Intensitätsrangfolge basieren (zum Beispiel den zehn am häufigsten vorkommenden Spezies, wie sie durch Peaks in einem Vorläufermassenspektrum beobachtet werden, im Folgenden als MS1 bezeichnet) oder durch Definieren einer Einschlussliste von Vorläufermassenspektralpeaks, beispielsweise durch Benutzerauswahl, erfolgen, aus denen Fragmentspektren, die im Folgenden als MS2 bezeichnet werden, unabhängig von der Intensitätsrangfolge des Peaks im Vorläufermassenspektrum MS1 stets erfasst werden.
  • Im Gegensatz dazu versucht die DIA festzustellen, was in einer Stichprobe potenziell unbekannter Identität vorhanden ist. Um die Molekülstruktur unbekannter Probenmoleküle zu bestimmen, kann eine Kombination von MS1-Scans mit breitem Massenbereich und einer Reihe von MS2-Scans bereitgestellt werden. Die DIA vermeidet die in der DDA erforderlichen Entscheidungen, indem einfach der interessierende Massenbereich (normalerweise benutzerdefiniert) in Segmente unterteilt und MS2-Spektren für jedes Segment erhalten werden. Mit der DIA wird das Erfassen eines MS1-Vorläuferspektrums mehr oder weniger optional, da die Parameter des Vorläuferauswahlfensters selbst Informationen über den Bereich möglicher Vorläuferionen enthalten.
  • Die DIA-Methodiken sind von besonderer Relevanz für die Aufzeichnung eines wesentlichen Teils der Informationen aus der Probe und können für gezielte therapeutische Anwendungen verwendet werden. Insbesondere können DIA-Methodiken Hochdurchsatz-, reproduzierbare und empfindliche Arbeitsabläufe für die Analyse von klinischen Markern, Krebsmutationen und/oder Sequenzvarianten auf Genebene und Protein-/Peptidebene bereitstellen. Dies wiederum hilft, den Krankheitsmechanismus in der Proteogenomik-Forschung zu verstehen und zusätzliche Informationen für klinische Entscheidungen bereitzustellen.
  • Beispielsweise offenbart GB 1701857.3 (veröffentlicht als GB 2559395 A ) ein datenunabhängiges Erfassungsverfahren der Massenspektrometrie zum Analysieren einer Probe. Die DIA-Methodik ermöglicht die hochauflösende Erkennung und Quantifizierung einer Probe in der MS1-Domäne (d. h. mit Nicht-Fragment-Vorläuferionen). Aufgrund der relativ hohen Auflösung, die in den MS1-Domänen-Scans verwendet wird, ist es möglich, zwischen zwei verschiedenen Probenmolekülen mit geringen Massenunterschieden zu unterscheiden, beispielsweise kann eine MS1-Scan-Auflösung von 120.000 zwischen Peptiden mit ungefähr 30 ppm (parts per million) Massendifferenz unterscheiden. Die Methodik verwendet auch einen Zyklus von MS2-Spektren mit einer relativ niedrigeren Auflösung, um eine sekundäre Bestätigung der vorläufigen Erkennung basierend auf der Analyse von MS1-Daten bereitzustellen. Die MS1-Scans sind über die MS2-Scans verteilt, und die MS1-Wiederholungsrate wird (unabhängig von der MS2-Zykluszeit) so eingestellt, dass eine ausreichende Anzahl von Datenpunkten über einen chromatographischen Peak für eine genaue Quantifizierung aus dem chromatographischen Peakbereich erfasst wird.
  • Zusammenfassung
  • Gemäß einem ersten Aspekt der Offenbarung wird ein Massenspektrometrieverfahren bereitgestellt. Das Verfahren umfasst:
    1. a) Hinzufügen eines Isotopologs eines Zielvorläufers zu einer Probe;
    2. b) Ionisieren der Probe und des Isotopologs beim Eluieren aus einem Chromatographiesystem;
    3. c) Massenanalyse der Probe unter Verwendung einer datenunabhängigen Erfassungsmethodik (DIA), die das Durchführen von Massenanalyse-Scans in der MS1-Domäne und das Durchführen von Massenanalyse-Scans in der MS2-Domäne umfasst.
  • Nach dem Erkennen, dass das Isotopolog aus dem Chromatographiesystem eluiert, umfasst das Verfahren ferner das Durchführen von Zielscans, die ein Zielisolationsfenster aufweisen, das ein Masse-zu-Ladung-Verhältnis enthält, das für den Zielvorläufer über die Dauer eines chromatographischen Peaks des Isotopologs für die Erkennung und/oder Quantifizierung des Zielvorläufers repräsentativ ist, wobei die Zielscans konfiguriert sind, um zusätzliche Quantifizierungsdaten für den Zielanalyten bereitzustellen. Die Zielscans haben ein Zielisolationsfenster, das in der Größenordnung der Breite des Isolationsfensters der Massenanalyse-Scans in der MS2-Domäne der DIA-Methodik liegt, vorzugsweise schmaler und vorzugsweise kleiner als 10 Da.
  • Das Verfahren des ersten Aspekts führt Zielscans durch, die ein Isolationsfenster aufweisen, das zur Erkennung und/oder Quantifizierung eines Zielanalyten ausgewählt ist. Es versteht sich, dass ein Zielanalyt manchmal in einer geringen Menge in einer Probe vorhanden sein kann, wodurch es schwierig wird, ihn nachzuweisen. Insbesondere ist für eine gegebene Probe die Retentionszeit eines Zielanalyten möglicherweise nicht bekannt, bevor die DIA-Methodik durchgeführt wird. Da der Zielanalyt möglicherweise nur in geringen Mengen in der Probe vorhanden ist, ist es schwierig, die Retentionszeit mit herkömmlichen Verfahren zu bestimmen. Dementsprechend wird der Probe ein Isotopolog hinzugefügt. Ein Isotopolog ist ein Molekül, das sich von seinem Ausgangsmolekül dadurch unterscheidet, dass mindestens ein Atom eine unterschiedliche Anzahl von Neutronen aufweist. Da das Isotopolog die gleiche chemische Struktur wie der interessierende Zielanalyt aufweist, ist die Retentionszeit des Isotopologs dem Zielanalyten ähnlich. Das Isotopolog kann jedoch aufgrund der unterschiedlichen Anzahl von Neutronen in einem Massenanalyse-Scan vom Zielanalyten unterschieden werden.
  • Dementsprechend kann das Verfahren des ersten Aspekts zusätzlich zu den MS1- und MS2-Scans der DIA-Methodik eine Reihe von Zielscans bereitstellen. Beispielsweise können die Zielscans in der MS1-Domäne und/oder der MS2-Domäne durchgeführt werden. In einigen Ausführungsformen können die Zielscans Ziel-Selected-Ion-Monitoring (SIM) -Scans und/oder Ziel-MS2-Scans umfassen. Die Zielscans werden durchgeführt, wenn erkannt wird, dass das Isotopolog aus dem Chromatographiesystem eluiert. Dementsprechend kann das Verfahren des ersten Aspekts Zielscans bereitstellen, die zur Erkennung von Zielvorläufern mit relativ geringer Häufigkeit als Teil einer DIA-Methodik geeignet sein können. Nach der Detektion des Isotopologs werden die Zielscans über eine Dauer des chromatographischen Peaks des Isotopologs durchgeführt, der im Allgemeinen dem chromatographischen Peak des Zielanalyten entspricht. Da die Zielscans nach Erkennung des Isotopologs durchgeführt werden, können die Zielscans so durchgeführt werden, dass die Gesamtzykluszeit des Massenspektrometrieverfahrens nicht signifikant erhöht wird.
  • In einigen Ausführungsformen können die Zielscans mehrere Ziel-MS2-Scans und/oder mehrere Ziel-SIM-Scans umfassen. Ziel-MS2-Scans sind Massenanalyse-Scans, die mit einem Zielisolationsfenster durchgeführt werden, das ein für den Zielanalyten repräsentatives Masse-zu-Ladung-Verhältnis enthält, wobei der Massenanalyse-Scan in der MS2-Domäne durchgeführt wird. Ziel-SIM-Scans sind Massenanalyse-Scans, die mit einem Zielisolationsfenster durchgeführt werden, das ein für den Zielanalyten repräsentatives Masse-zu-Ladung-Verhältnis enthält, wobei der Massenanalyse-Scan in der MS1-Domäne durchgeführt wird. Die Zielscans, ob Ziel-MS2-Scans oder Ziel-SIM-Scans, haben ein Zielisolationsfenster, das in der Größenordnung der Breite des Isolationsfensters der Massenanalyse-Scans in der MS2-Domäne der DIA-Methodik liegt, vorzugsweise schmaler und vorzugsweise weniger als 10 Da, weniger als 8 Da, weniger als 6 Da, weniger als 4 Da oder weniger als 2 Da.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Erkennen, dass das Isotopolog aus dem Chromatographiesystem eluiert, das Erkennen, dass das Isotopolog unter Verwendung der Daten aus dem MS1-Scan eluiert. Unter Verwendung des MS1-Scans zur Erkennung des Isotopologs kann gefolgert werden, dass der Zielanalyt aus dem Chromatographiesystem eluiert, wodurch die Zielscans gemäß dem Verfahren des ersten Aspekts ausgelöst werden. In einigen Ausführungsformen umfasst das Erkennen, dass das Isotopolog aus dem Chromatographiesystem eluiert, das Erkennen, dass das Isotopolog unter Verwendung von Daten aus den Massenanalyse-Scans in der MS2-Domäne zusätzlich zum MS1-Scan eluiert.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Durchführen von jedem Ziel-MS2-Scan das Massenselektieren der Analytionen basierend auf dem Zielisolationsfenster und die Fragmentierung der Vorläuferionen innerhalb des Zielisolationsfensters, um Zielfragmentionen zu bilden, und das Massenanalysieren der Zielfragmentionen.
  • In einigen Ausführungsformen weist jeder Ziel-MS2-Scan ein Zielisolationsfenster auf, das ein für den Zielanalyten repräsentatives Masse-zu-Ladung-Verhältnis und ein für das Isotopolog repräsentatives Masse-zu-Ladung-Verhältnis enthält. Als solches kann die MS2-Massenanalyse der Isotopologionen mit der MS2-Massenanalyse des Zielanalyten kombiniert werden. Das Zielisolationsfenster kann tatsächlich ein kontinuierliches Isolationsfenster sein, das Masse-zu-Ladung-Verhältnisse, die für den Zielanalyten repräsentativ sind, und Masse-zu-Ladung-Verhältnisse, die für das Isotopolog repräsentativ sind, enthält. Als solches kann ein einzelnes Massenisolationsfenster bereitgestellt werden, um beide Ionen, die für den Zielanalyten und das Isotopolog repräsentativ sind, einer Massenselektion zu unterziehen. Die einer Massenselektion unterzogenen Zielanalyten- und Isotopologen-Ionen können zusammen fragmentiert werden, um Zielfragmentionen und Isotopologenfragmentionen bereitzustellen, die anschließend zusammen einer Massenanalyse unterzogen werden.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren nach dem Erkennen, dass das Isotopolog aus dem Chromatographiesystem eluiert, ferner das Durchführen von Isotopologen-Scans, die ein Isotopologen-Isolationsfenster aufweisen, das ein für das Isotopolog repräsentatives Masse-zu-Ladung-Verhältnis über die Dauer eines chromatographischen Peaks des Isotopologs zur Quantifizierung des Isotopologs enthält. Die Isotopologen-Scans können mehrere Isotopologen-SIM-Scans und/oder mehrere Isotopologen-MS2-Scans umfassen. Dementsprechend kann das Verfahren gemäß dem ersten Aspekt mehrere Zielscans bereitstellen, die den chromatographischen Peak des Zielanalyten charakterisieren können, und mehrere Isotopologen-Scans, die den chromatographischen Peak des Isotopologs charakterisieren können. Als solches kann das Verfahren gemäß dem ersten Aspekt Kalibrierungskurven über die Dauer des chromatographischen Peaks für jeden der Zielvorläufer und des Isotopologs erstellen. Das Erstellen von Kalibrierungskurven für den Zielanalyten und das Isotopolog kann verwendet werden, um eine weitere Erkennung und Quantifizierung des Zielanalyten und/oder Isotopologs bereitzustellen.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Hinzufügen eines Isotopologs eines Zielanalyten zu der Probe das Hinzufügen einer ersten Menge eines ersten Isotopologs des Zielanalyten mit einer ersten Masse zu der Probe und das Hinzufügen einer zweiten Menge eines zweiten Isotopologs des Zielanalyten mit einer zweiten Masse zu der Probe, wobei sich die zweite Menge und die zweite Masse von der ersten Menge bzw. der ersten Masse unterscheiden. Die erste und die zweite Menge sind bekannt und können daher bekannte Konzentrationen der ersten und zweiten Isotopologen in der Probe liefern. Nach dem Erkennen, dass das erste und/oder das zweite Isotopolog aus dem Chromatographiesystem eluiert, umfasst das Verfahren das Durchführen von mehreren ersten Isotopologen-Scans mit einem ersten Isotopologen-Isolationsfenster, einschließlich eines Masse-zu-Ladung-Verhältnisses, das für das erste Isotopolog repräsentativ ist, und das Durchführen von mehreren zweiten Isotopologen-Scans mit einem zweiten Isotopologen-Isolationsfenster, das ein für das zweite Isotopolog repräsentatives Masse-zu-Ladung-Verhältnis enthält, und Erzeugen einer Quantifizierungskalibrierung aus den ersten Isotopologen-Scans, den zweiten Isotopologen-Scans und den Zielscans. Mehrere erste Isotopologen-Scans und mehrere zweite Isotopologen-Scans können jeweils Isotopologen-MS2-Scans und/oder Isotopologen-SIM-Scans umfassen. Es versteht sich, dass die Peakintensitäten der Fragmente in den ersten und zweiten Isotopologen-Scans die unterschiedlichen Mengen der ersten und zweiten Isotopologen widerspiegeln, die der Probe zugesetzt wurden. Dementsprechend können das erste und das zweite Isotopolog verwendet werden, um eine Kalibrierungskurve für das Massenspektrometrieverfahren zu erstellen. Die Daten aus dem ersten und zweiten Isotopologen-Scan können mit den Zielscan-Daten kombiniert werden, um eine Quantifizierungskalibrierung für den Zielanalyten zu bestimmen und somit den Zielanalyten mit verbesserter Genauigkeit zu quantifizieren.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Durchführen von jedem Isotopologen-MS2-Scan das Massenselektieren der Vorläuferionen basierend auf dem Isotopologen-Isolationsfenster und die Fragmentierung der Vorläuferionen innerhalb des Isotopologen-Isolationsfensters, um Isotopologen-Fragmentionen zu bilden, und das Unterziehen der Isotopologen-Fragmentionen einer Massenanalyse.
  • In einigen Ausführungsformen kann sich das Isolationsfenster für jeden Zielscan von dem Isolationsfenster für jeden Isotopologen-Scan unterscheiden. Es versteht sich, dass sich das Masse-zu-Ladung-Verhältnis der Zielanalytionen von dem Masse-zu-Ladung-Verhältnis der Isotopologen-Ionen unterscheidet. Dementsprechend können unterschiedliche Isolationsfenster für die Isotopologen-Ionen und die Zielionen bereitgestellt werden, um sicherzustellen, dass die jeweiligen Zielscans und Isotopologscans selektiv sind. Zum Beispiel kann durch die Bereitstellung selektiver Ziel-MS2-Scans und Isotopologen-MS2-Scans die Empfindlichkeit und Genauigkeit des Massenspektrometrieverfahrens verbessert werden.
  • In einigen Ausführungsformen kann jeder durchgeführte Ziel-MS2-Scan mit einem jeweiligen Isotopologen-MS2-Scan gemultiplext werden. Als solches können die durch das Zielisolationsfenster für einen Ziel-MS2-Scan ausgewählten Ionen mit den Ionen kombiniert werden, die unter Verwendung des Isotopologen-Isolationsfensters für einen jeweiligen Isotopologen-MS2-Scan ausgewählt wurden. Die kombinierten Ionen können dann fragmentiert und zusammen in einem einzigen Massenanalyse-Scan einer Massenanalyse unterzogen werden. Ein solches Multiplexen der Ziel-MS2-Scans und der Isotopologen-MS2-Scans kann die Zykluszeit des Massenspektrometrieverfahrens weiter reduzieren.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Multiplexen eines Ziel-MS2-Scans mit einem Isotopologen-MS2-Scan Folgendes: Kombinieren der Vorläuferionen innerhalb des Zielisolationsfensters für jeden Ziel-MS2-Scan mit den Vorläuferionen innerhalb des Isotopologen-Isolationsfensters, um gemultiplexte Vorläuferionen zu bilden, wobei die gemultiplexten Vorläuferionen fragmentiert werden, um gemultiplexte Fragmentionen zu bilden, und Massenanalyse der gemultiplexten Fragmentionen. Die Vorläuferionen innerhalb des Zielisolationsfensters können mit den Vorläuferionen innerhalb des Isotopologen-Isolationsfensters in einer lonenspeichervorrichtung kombiniert und dort als gemultiplexte Vorläuferionen gespeichert werden. Die gemultiplexten Vorläuferionen können fragmentiert werden, um gemultiplexte Fragmentionen zu bilden, beispielsweise durch Ausstoßen der gemultiplexten Vorläuferionen zu einer Fragmentierungsvorrichtung, wie einer Kollisionszelle. In einigen Ausführungsformen umfasst das Multiplexen eines Ziel-MS2-Scans mit einem Isotopologen-MS2-Scan: Fragmentierung von Vorläuferionen innerhalb des Zielisolationsfensters für jeden Ziel-MS2-Scan, um Zielfragmentionen zu bilden, Fragmentierung von Vorläuferionen innerhalb des Isotopologen-Isolationsfensters, um Isotopologen-Fragmentionen zu bilden, Kombinieren der Zielionen und der Isotopologen-Fragmentionen, um gemultiplexte Fragmentionen zu bilden, und Massenanalyse der gemultiplexten Fragmentionen. Die gemultiplexten Fragmentionen können kombiniert und in einer lonenspeichervorrichtung gespeichert werden, bevor die gemultiplexten Fragmentionen einer Massenanalyse unterzogen werden.
  • In einigen Ausführungsformen kann jeder Ziel-SIM-Scan mit einem Isotopologen-SIM-Scan gemultiplext werden. In einigen Ausführungsformen umfasst das Multiplexen eines Ziel-SIM-Scans mit einem Isotopologen-SIM-Scan das Kombinieren der Vorläuferionen innerhalb des Zielisolationsfensters für jeden Ziel-SIM-Scan mit den Vorläuferionen innerhalb des Isotopologen-Isolationsfensters, um gemultiplexte Vorläuferionen zu bilden, und eine Massenanalyse der gemultiplexten Vorläuferionen.
  • In einigen Ausführungsformen sind die Zielscans während der gesamten DIA-Methodik über die Dauer des chromatographischen Peaks des Isotopologs verschachtelt. In einigen Ausführungsformen können die Isotopologen-Scans während der gesamten DIA-Methodik über die Dauer des chromatographischen Peaks des Isotopologs verschachtelt sein. Als solches können die Zielscans über die Dauer des chromatographischen Peaks des Isotopologs verteilt sein, der im Allgemeinen dem chromatographischen Peak des Zielanalyten entspricht. In einigen Ausführungsformen können die chromatographischen Peaks des Zielanalyten und des Isotopologs die gleiche Form und Zeit haben. In einigen Ausführungsformen kann das schwerere Molekül einen chromatographischen Peak aufweisen, der hinter dem chromatographischen Peak des leichteren Moleküls zurückbleibt. Das Ausmaß der Verzögerung kann vor Durchführung des Massenspektrometrieverfahrens bestimmt und berücksichtigt werden. In vielen Fällen ist das Ausmaß der Verzögerung relativ unbedeutend, so dass ein wesentlicher Anteil (z. B. mindestens 50 %) der Dauer des chromatographischen Peaks des Isotopologs mit der Dauer des chromatographischen Peaks des Zielanalyten überlappt. Beispielsweise kann es hilfreich sein, die Verzögerung für die Quantifizierung des Zielanalyten zu kennen, um die Planung der Zielscans so zu verbessern, dass sie dem chromatographischen Peak des Zielanalyten besser entsprechen.
  • In einigen Ausführungsformen sind die Zielscans und/oder die Isotopologen-Scans in Intervallen von nicht mehr als zwei Sekunden in der gesamten DIA-Methodik verschachtelt. In einigen Ausführungsformen werden die Zielscans mindestens sechsmal pro chromatographischem Peak durchgeführt, um genauere Quantifizierungsdaten für den Zielanalyten zu erhalten.
  • In einigen Ausführungsformen ist das Zielisolationsfenster für jeden Ziel-MS2-Scan nicht größer als 5 Da. In einigen Ausführungsformen ist das Isotopologen-Isolationsfenster für jeden Isotopologen-MS2-Scan nicht größer als 5 Da. In einigen Ausführungsformen dürfen das Zielisolationsfenster und/oder das Isotopologen-Isolationsfenster nicht größer als 4 Da, 3 Da oder 2 Da sein. In einigen Ausführungsformen kann das Zielisolationsfenster für Zielanalytionen von dem Masse-zu-Ladung-Verhältnis des Zielanalytions abhängen, wobei Zielanalytionen mit höherer Ladung ein schmaleres Isolationsfenster aufweisen können. Durch die Bereitstellung von Isolationsfenstern, die relativ schmal sind, können andere Vorläuferionen von den zusätzlichen MS2-Scans ausgeschlossen werden. Dies kann wiederum das Signal-Rausch-Verhältnis der Zielanalyten/Isotopologen-Ionen in den MS2-Spektren verbessern. Darüber hinaus kann das Ausschließen anderer Vorläuferionen von den zusätzlichen MS2-Scans die nachfolgende Analyse der Ziel-MS2-Scan-Daten vereinfachen.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst die Massenanalyse der Probe unter Verwendung einer datenunabhängigen Erfassungsmethodik (DIA) das Durchführen von mehreren MS1-Scans der Vorläuferionen; und das Durchführen von mehreren MS2-Scans der Vorläuferionen. Dem Fachmann sind verschiedene DIA-Methodiken bekannt. Es versteht sich, dass die zusätzlichen MS2-Scans (Ziel-MS2-Scan und/oder Isotopologen-MS2-Scan) zusätzlich zu den Scans der DIA-Methodik durchgeführt werden müssen. Die MS2-Scans der DIA-Methodik können im Allgemeinen jeweils für ein anderes Massenbereichssegment oder Isolationsfenster des interessierenden Vorläufermassenbereichs durchgeführt werden, so dass eine Reihe von MS2-Scans der DIA-Methodik den interessierenden Vorläufermassenbereich abdeckt. Die DIA-Methodik und das Verfahren des ersten Aspekts können an jedem bekannten Massenspektrometer durchgeführt werden, das konfiguriert ist, um eine DIA-Erfassung durchzuführen. Insbesondere kann das Verfahren des ersten Aspekts an einem Massenspektrometer durchgeführt werden, das einen Orbitalfallen-Massenanalysator, ein Tandem-Massenspektrometer, umfassend zwei Massenanalysatoren, usw. umfasst.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst die Massenanalyse der Probe unter Verwendung einer DIA-Methodik:
    • Auswählen eines interessierenden Vorläufermassenbereichs für die zu analysierende Probe;
    • Durchführen von mehreren MS1-Scans, wobei jeder der MS1-Scans umfasst:
      • Massenanalyse der Vorläuferionen über den interessierenden Vorläufermassenbereich unter Verwendung eines Massenanalysators, der mit einer ersten, relativ höheren Auflösung von mindestens 50.000 bei m/z = 200 amu betrieben wird, zur Erkennung und/oder Quantifizierung der Probe in der MS1-Domäne über den interessierenden Vorläufermassenbereich;
      und
    • Durchführen von einer Reihe von MS2-Scans durch:
      • Segmentieren des interessierenden Vorläufermassenbereichs in mehrere Vorläufermassenbereichssegmente, wobei
      • für jedes Vorläufermassenbereichssegment:
        • die Vorläuferionen innerhalb dieses Massenbereichssegments fragmentiert werden und
        • Durchführen eines MS2-Scans des Fragment-Massenbereichssegments mit dem Massenanalysator, der mit einer zweiten, relativ niedrigeren Auflösung betrieben wird, so dass jedes der Fragment-Probensegmente über den interessierenden Vorläufermassenbereich in der MS2-Domäne fragmentiert und gescannt wird,
      wobei das Durchführen der MS1-Scans während des Durchführens jeder der Reihen von MS2-Scans verschachtelt ist, so dass die MS1-Scans ein Massenchromatogramm der Probe liefern.
  • Eine solche DIA-Methodik ist in GB 2559395 A offenbart, und weitere Verfeinerungen der Methodik sind darin beschrieben. Der gesamte Inhalt von GB 2559395 A wird hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Gemäß der oben diskutierten DIA-Methodik werden mehrere MS1-Scans der Vorläuferionen über einen interessierenden Vorläufermassenbereich durchgeführt, so dass jeder MS1-Scan zur Quantifizierung und/oder Erkennung der Probe in der MS1-Domäne über den gesamten interessierenden Vorläufermassenbereich geeignet ist. Als solches versteht es sich, dass sich jeder der MS1-Scans im Wesentlichen über den gesamten interessierenden Vorläufermassenbereich erstreckt. Die MS1-Scans werden unter Verwendung eines Massenanalysators durchgeführt, der mit einer ersten, relativ höheren Auflösung betrieben wird, um die Probe in der MS1-Domäne über den interessierenden Massenbereich zu quantifizieren. Als solches ist die relativ hohe Auflösung des Massenanalysators eine Auflösung, die ausgewählt wird, um Interferenzen von Matrix- oder anderen Probenionen im MS1-Scan zu reduzieren oder zu minimieren und am stärksten bevorzugt zu eliminieren, wodurch die Erkennung und Quantifizierung der Vorläuferprobenionen in der MS1-Domäne ermöglicht wird. Die relativ hohe Auflösung der MS1-Scans wird mit einer Auflösung von mindestens 50.000 durchgeführt, um ausreichend zwischen Vorläuferionen mit ähnlichen Massen zu unterscheiden, so dass eine genaue Quantifizierung und/oder Erkennung in der MS1-Domäne durchgeführt werden kann.
  • Gemäß der oben beschriebenen DIA-Methodik können die MS1-Scans mehrere Male durchgeführt werden, verschachtelt mit der Leistung der Reihe von MS2-Scans. Daher werden die MS1-Scans während der gesamten Durchführung einer Reihe von MS2-Scans mehrmals wiederholt, um die Vorläuferionen in der MS1-Domäne über die Dauer eines chromatographischen Peaks wiederholt abzutasten. Die mehreren MS1-Scans und mindestens eine Reihe von MS2-Scans (vorzugsweise jedoch nicht mehr als zwei Reihen) werden innerhalb des Zeitraums basierend auf der Breite des chromatographischen Peaks (z. B. FWHM) durchgeführt. In einigen Ausführungsformen ist die Anzahl der durchgeführten MS1-Scans mindestens doppelt so hoch oder mindestens dreimal so hoch wie die Anzahl der Reihen der durchgeführten MS2-Scans. Somit liefern die MS1-Scans ein Massenchromatogramm der Probe, wenn sie aus dem Chromatographiesystem eluiert. Vorzugsweise werden die MS1-Scans mindestens dreimal, stärker bevorzugt mindestens fünfmal und am stärksten bevorzugt mindestens siebenmal über die Dauer einer Reihe von MS2-Scans durchgeführt. Durch mehrmaliges Wiederholen des MS1-Scans kann eine genauere Quantifizierung der Vorläuferionen erzielt werden. Als solches können die MS1-Scans wiederholt werden, um die Vorläuferionen mehrmals abzutasten.
  • In einigen Ausführungsformen ist der Massenanalysator, der zum Durchführen von dem MS1- und/oder MS2-Scan verwendet wird, ein Orbitalfallen-Massenanalysator. Vorteilhafterweise können unter Verwendung eines Orbitalfallen-Massenanalysators MS1-Scans mit einer relativ hohen Auflösung durchgeführt werden, und eine Reihe von MS2-Scans kann mit einer relativ niedrigen Auflösung durchgeführt werden, während ein relativ kompakter Massenanalysator verwendet wird.
  • In einigen Ausführungsformen wird der Orbitalfallen-Analysator verwendet, um MS1-Scans durchzuführen, die Teil der DIA-Methodik mit einer Auflösung von mindestens 50.000 sind, um eine verbesserte Quantifizierung von Vorläuferionen in der MS1-Domäne bereitzustellen. Beispielsweise kann eine relativ hohe Auflösung für den erfindungsgemäßen Orbitalmassen-Einfanganalysator mindestens 100.000 betragen, und eine relativ niedrige Auflösung (für die MS2-Scans) kann weniger als 60.000 oder weniger als 50.000 oder weniger als 40.000 betragen, stärker bevorzugt weniger als 30.000. In einigen Ausführungsformen können Auflösungen für die MS2-Scans von weniger als 20.000 oder weniger als 15.000 oder weniger als 10.000 (z. B. 7.500) ausreichend sein, wodurch die Verwendung schmalerer Massenbereichssegmente ermöglicht wird, was bei der Validierung der Erkennung/Quantifizierung der Vorläuferionen hilft. Dementsprechend kann in dem vorliegenden Verfahren ein Orbitalfallen-Massenanalysator verwendet werden, um die Auflösung der MS1-Scans zur Quantifizierung der Vorläuferionen zu optimieren, während die Auflösung der MS2-Scans optimiert wird, um die Quantifizierung der Vorläuferionen zu validieren.
  • Obwohl ein Orbitalfallen-Massenanalysator verwendet werden kann, um MS1-Scans mit einer relativ hohen Auflösung von mindestens 100.000 durchzuführen, wird der Fachmann erkennen, dass andere Massenanalysatoren mit einer Auflösung von mindestens 100.000 ebenfalls zur Verwendung in dem Verfahren des ersten Aspekts geeignet sein können. Beispielsweise kann ein MR-ToF-Massenanalysator (engl. multi-reflection time-of-flight, MR-ToF) oder ein FT-ICR-Massenanalysator (engl. Fourier transform ion cyclotron resonance, FT-ICR) verwendet werden. Die hohe Massengenauigkeit des Orbitalfallen-Massenanalysators oder des FT-ICR-Massenanalysators ermöglicht eine hohe Zuverlässigkeit der Erkennung von Proben aus den MS1-Scans, wobei die MS2-Scans eine Bestätigung der Erkennung liefern. In einigen Ausführungsformen kann ein Massenanalysator (z. B. ein Orbitalfallen-Massenanalysator) verwendet werden, um MS1-Scans mit einer relativ hohen Auflösung von mindestens 120.000 oder mindestens 130.000 oder mindestens 140.000 oder mindestens 150.000 durchzuführen. Durch Erhöhen der Auflösung der MS1-Scans wird die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen verschiedenen Probenionen und Matrixionen verbessert, wodurch die Genauigkeit der Probenquantifizierung verbessert wird.
  • Gemäß einem zweiten Aspekt der Offenbarung wird ein Massenspektrometer bereitgestellt. Das Massenspektrometer dient zur Durchführung einer datenunabhängigen Erfassungsmassenspektrometrie an einer Probe, zu der ein Isotopolog eines Zielanalyten hinzugefügt wird. Das Massenspektrometer umfasst eine Ionisationsquelle zur Erzeugung von mehreren Vorläuferionen, einen Massenanalysator, eine Fragmentierungsvorrichtung, einen Massenselektor, ein Chromatographiesystem, das konfiguriert ist, um Moleküle der Probe zu trennen, die dem Massenselektor nachgelagert sind; und eine Steuerung. Die Steuerung ist konfiguriert, um zu:
    • bewirken, dass die Ionisationsquelle die Probe und das Isotopolog ionisiert, wenn sie aus einem Chromatographiesystem eluieren, um Vorläuferionen zu bilden;
    • bewirken, dass das Massenspektrometer die Vorläuferionen unter Verwendung einer datenunabhängigen Erfassungsmethodik (DIA) einer Massenanalyse unterzieht, umfassend das Durchführen von Massenanalyse-Scans in der MS1-Domäne und das Durchführen von Massenanalyse-Scans in der MS2-Domäne;
    • erkennen, ob das Isotopolog aus dem Chromatographiesystem eluiert, auf dem die Steuerung weiter konfiguriert ist;
    • bewirken, dass das Massenspektrometer mehrere Zielscans durchführt, die jeweils ein Zielisolationsfenster aufweisen, einschließlich eines Masse-zu-Ladung-Verhältnisses, das über eine Dauer eines chromatographischen Peaks des Isotopologs für den Zielanalyten repräsentativ ist, um den Zielanalyten mindestens entweder zu erkennen oder zu quantifizieren, wobei die Zielscans konfiguriert sind, um zusätzliche Quantifizierungsdaten für den Zielanalyten bereitzustellen.
  • Dementsprechend versteht es sich, dass das Massenspektrometer des zweiten Aspekts konfiguriert sein kann, um das Verfahren des ersten Aspekts der Offenbarung durchzuführen.
  • In einigen Ausführungsformen kann die Steuerung des Massenspektrometers weiter konfiguriert sein, um das Massenspektrometer zu einem der weiteren optionalen Merkmale des Verfahrens des oben beschriebenen ersten Aspekts zu veranlassen.
  • Gemäß einem dritten Aspekt der Offenbarung wird ein Computerprogramm bereitgestellt. Das Computerprogramm umfasst Anweisungen, um das Massenspektrometer des zweiten Aspekts zu veranlassen, das Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der Offenbarung auszuführen.
  • Gemäß einem vierten Aspekt der Offenbarung wird ein computerlesbares Medium bereitgestellt. Das computerlesbare Medium hat darauf das Computerprogramm des dritten Aspekts gespeichert.
  • Figurenliste
  • Die Erfindung kann auf vielerlei Arten praktisch umgesetzt werden, und eine spezifische Ausführungsform wird nun lediglich beispielhaft anhand der Figuren beschrieben, wobei gilt:
    • - 1 zeigt eine schematische Anordnung eines Massenspektrometers, das zum Durchführen von Verfahren gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung geeignet ist;
    • - 2 zeigt ein Diagramm eines Beispiels einer DIA-Methodik, die gemäß Ausführungsformen der Offenbarung durchgeführt werden kann;
    • - 3 zeigt ein weiteres Diagramm eines Massenspektrometrieverfahrens, bei dem zusätzlich zu einer DIA-Methodik Ziel-MS2-Scans durchgeführt werden;
    • - 4 zeigt Diagramme von zwei weiteren DIA-Methodiken, die in Ausführungsformen der Offenbarung durchgeführt werden können;
    • - 5 zeigt ein Diagramm einer anderen DIA-Methodik, die in einer Ausführungsform der Offenbarung durchgeführt werden kann.
  • Detaillierte Beschreibung
  • In der vorliegenden Offenbarung wird auf Auflösungen eines Massenanalysators Bezug genommen. Alle Auflösungen, auf die in dieser Offenbarung Bezug genommen wird, werden vom Fachmann so verstanden, dass sie sich auf eine Auflösung eines Massenanalysators bei einem Masse-zu-Ladung-Verhältnis (m/z) von 200 amu (m/z = 200 amu) beziehen. Der Fachmann wird verstehen, dass das m/z-Verhältnis, bei dem die Auflösung des Massenanalysators spezifiziert ist, lediglich die Auflösung des Massenanalysators bei diesem m/z-Wert anzeigt und nicht an den m/z-Bereich gebunden ist, über den der Massenanalysator gemäß der Methodik der vorliegenden Erfindung gescannt wird.
  • 1 zeigt eine schematische Anordnung eines Massenspektrometers 10, das zur Durchführung von Verfahren gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Die Anordnung von 1 stellt schematisch die Konfiguration des Q-Exactive®-Massenspektrometers von Thermo Fisher Scientific, Inc. dar.
  • In 1 wird eine zu analysierende Probe (zum Beispiel von einem Autosampler) einer Chromatografievorrichtung, wie z. B. einer Flüssigkeitschromatografie-(LC)-Säule (nicht in 1 abgebildet), zugeführt. Ein derartiges Beispiel für eine LC-Säule ist die monolithische Säule ProSwift von Thermo Fisher Scientific, Inc., die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie (HPLC) bietet, indem sie die in einer mobilen Phase geführte Probe unter hohem Druck durch eine stationäre Phase von unregelmäßig geformten oder kugelförmigen Partikeln führt, die die stationäre Phase darstellen. In der HPLC-Säule eluieren Probenmoleküle mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten je nach deren Ausmaß an Interaktion mit der stationären Phase.
  • Ein Chromatograf kann durch Messen der Menge der aus der HPLC-Säule eluierenden Probenmoleküle im Zeitverlauf mittels eines Detektors (zum Beispiel eines Massenspektrometers) hergestellt werden. Probenmoleküle, die aus der HPLC-Säule eluieren, werden als Peak über einer Basismessung am Chromatografen detektiert. Wo unterschiedliche Probenmoleküle unterschiedliche Elutionsraten aufweisen, können mehrere Peaks am Chromatografen detektiert werden. Vorzugsweise werden einzelne Proben-Peaks von anderen Peaks im Chromatogramm zeitlich getrennt, sodass unterschiedliche Probenmoleküle nicht miteinander interferieren.
  • An einem Chromatografen entspricht ein Vorliegen eines chromatografischen Peaks einem Zeitraum, über den die Probenmoleküle am Detektor vorliegen. Als solche ist eine Breite eines chromatografischen Peaks gleichwertig einem Zeitraum, über den die Probenmoleküle an einem Detektor vorliegen. Vorzugsweise weist ein chromatografischer Peak ein gaussförmiges Profil auf oder es kann angenommen werden, dass er ein gaussförmiges Profil aufweist. Entsprechend kann basierend auf einer Anzahl von ausgehend vom Peak berechneten Standardabweichungen eine Breite des chromatografischen Peaks berechnet werden. Beispielsweise kann eine Peak-Breite basierend auf vier Standardabweichungen eines chromatografischen Peaks berechnet werden. Alternativ kann basierend auf der Breite bei der Hälfte der maximalen Peak-Höhe eine Peak-Breite berechnet werden. Es können auch andere zum Bestimmen der Peak- Breite in der Technik bekannte Verfahren geeignet sein. Als solche stellen die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erfassten MS1-Daten somit ein Massenchromatogramm der aus der Säule eluierten Probe bereit.
  • Die somit via Flüssigkeitschromatografie abgetrennten Probenmoleküle werden dann mittels einer Elektrospray-Ionisierungsquelle (ESI-Quelle) 20 ionisiert, die unter atmosphärischem Druck steht. Fachleute werden erkennen, dass andere geeignete Arten von Ionisationsquellen verwendet werden können, wie chemische Ionisation bei Atmosphärendruck (APCI), Thermospray-Ionisation usw. Probenionen treten anschließend in eine Vakuumkammer des Massenspektrometers 10 ein und werden durch eine Kapillare 25 in eine Nur-HF-S-Linse 30 gerichtet. Die Ionen werden durch die S-Linse 30 in einen Injektions-Flachpol 40 fokussiert, der die Ionen in einen gebogenen Flachpol 50 mit einem axialen Feld injiziert. Der gebogene Flachpol 50 führt (geladene) Ionen entlang einer gekrümmten Bahn hindurch, während unerwünschte neutrale Moleküle, wie z. B. verschleppte Lösemittelmoleküle, nicht entlang der gekrümmten Bahn geführt werden und verloren gehen.
  • Ein lonengatter (TK-Linse) 60 ist am distalen Ende des gebogenen Flachpols 50 angeordnet und steuert den Durchgang der Ionen vom gebogenen Flachpol 50 in einen nachgelagert angeordneten Quadrupol-Massenfilter 70. Der Quadrupol-Massenfilter 70 ist typischerweise, aber nicht notwendigerweise segmentiert und dient, wenn er in einem selektiven Modus betrieben wird, als Bandpassfilter, der den Durchgang eines ausgewählten Masse-zu-Ladung-Verhältnisses oder eines begrenzten Masse-zu-Ladung-Verhältnisses ermöglicht, während Ionen anderer Masse-zu-Ladung-Verhältnisse (m/z) ausgeschlossen werden. Der Quadrupol-Massenfilter 70 kann betrieben werden, um den Durchgang von Ionen eines relativ breiten Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnis (z. B. 400-1210 amu) zu ermöglichen, insbesondere für MS1-Scans, was zum Erfassen von einem breiten Massenspektrum nützlich ist.
  • Ionen passieren dann eine Quadrupol-Austrittslinsen-/Halblinsen-Anordnung 80, die den Durchtritt von Ionen in einen Transfer-Multipol 90 steuert. Der Transfer-Multipol 90 leitet die nach ihrer Masse gefilterten Ionen vom Quadrupol-Massenfilter 70 in eine Ionenfalle, die eine gekrümmte Falle (C-Falle) 100 ist. Die C-Falle 100 weist längs verlaufende, gekrümmte Elektroden auf, die mit HF-Spannungen versorgt werden, und Abschlusskappenelektroden, die mit Gleichspannungen versorgt werden, um mögliche Barrieren an den Enden der C-Falle 100 bereitzustellen. Das Ergebnis ist ein Potenzialtopf, der sich entlang der gekrümmten Längsachse der C-Falle 100 erstreckt. In einem ersten Betriebsmodus werden die Abschlusskappen-Gleichspannungen auf die C-Falle aufgesetzt, sodass Ionen, die vom Transfer-Multipol 90 ankommen, im Potenzialtopf der C-Falle 100 akkumuliert werden, wo sie gekühlt werden. Die Injektionszeit (IT) der Ionen in die C-Falle bestimmt die Anzahl der Ionen (lonenpopulation), die anschließend aus der C-Falle in den Massenanalysator ausgestoßen werden. Während eine C-Falle 100 in dem Massenspektrometer von 1 verwendet wird, könnten in anderen Ausführungsformen, beispielsweise wenn ein anderer Typ eines Massenanalysators verwendet wird, stattdessen verschiedene lonenspeichervorrichtungen verwendet werden, z. B. eine lineare Falle mit geraden, nicht gebogenen Elektroden.
  • Gekühlte Ionen befinden sich in einer Wolke am Boden des Potentialtopfs und werden dann orthogonal von der C-Falle 100 zu einer Orbitalfallen-Vorrichtung 110 wie dem Orbitrap®-Massenanalysator ausgestoßen, der von Thermo Fisher Scientific, Inc. vertrieben wird. Die Orbitalfallen-Vorrichtung 110 hat eine außermittige Injektionsöffnung und die Ionen werden als kohärente Pakete durch die außermittige Injektionsöffnung in die Orbitalfallen-Vorrichtung 110 injiziert. Ionen werden dann innerhalb der Orbitalfallen-Vorrichtung 110 durch ein hyperlogarithmisches elektrisches Feld eingefangen und einer Vor- und Rückwärtsbewegung in einer Längsrichtung unterzogen, während sie um die innere Elektrode kreisen.
  • Die axiale Komponente (z-Komponente) der Bewegung der Ionenpakete in der Orbitalfallen-Vorrichtung 110 ist (mehr oder weniger) als einfache harmonische Bewegung definiert, wobei die Winkelfrequenz in der z-Richtung auf die Quadratwurzel des Masse-zu-Ladung-Verhältnisses einer gegebenen lonenspezies bezogen ist. Somit werden Ionen im Zeitverlauf gemäß ihrem Masse-zu-Ladung-Verhältnis aufgetrennt.
  • Ionen in der Orbitalfallen-Vorrichtung 110 werden durch Verwendung eines Bilddetektors (nicht in 1 abgebildet) detektiert, der eine „Transiente“ in der Zeit-Domäne erzeugt, die Informationen über alle lonenspezies enthält, wenn sie den Bilddetektor passieren. Die Transiente wird dann einer schnellen Fourier-Transformation (engl. fast Fourier transformation, FFT) unterzogen, die eine Reihe von Peaks in der Frequenzdomäne bewirkt. Aus diesen Peaks kann ein Massenspektrum erzeugt werden, das die Menge/Ionenintensität gegenüber dem m/z darstellt.
  • In der vorhergehend beschriebenen Konfiguration werden die Probenionen (spezifischer, eine Teilmenge der Probenionen innerhalb eines relevanten Massenbereichs, ausgewählt durch den Quadrupol-Massenfilter) ohne Fragmentierung durch die Orbitalfallen-Vorrichtung 110 analysiert. Das resultierende Massenspektrum wird mit MS1 bezeichnet.
  • Die MS2 Analyse (oder allgemeiner MSn) kann ebenfalls durch das Massenspektrometer 10 von 1 ausgeführt werden. Um dies zu erreichen, werden Vorläufer-Probenionen generiert und dem Quadrupol-Massenfilter 70 zugeführt, wo ein subsidiärer Massenbereich ausgewählt wird. Die Ionen, die den Quadrupolmassenfilter 70 verlassen, werden durch die C-Falle 100 zur Fragmentierungskammer 120 geleitet. Die Fragmentierungskammer 120 ist im Massenspektrometer 10 von 1 eine Vorrichtung für höherenergetische kollisionsinduzierte Dissoziation (engl. „higher energy collisional dissociation“, HCD), der ein Kollisionsgas zugeführt wird. Das an die Fragmentierungskammer 120 angelegte Potential ist derart, dass Vorläuferionen, die in die Fragmentierungskammer 120 gelangen, eine ausreichende Energie haben, so dass ihre Kollisionen mit Kollisionsgasmolekülen zu der Fragmentierung der Vorläuferionen in Fragmentionen führen. Die Fragmentionen werden dann aus der Fragmentierungskammer 120 zurück zur C-Falle 100 ausgestoßen, wo sie erneut eingefangen und im Potenzialtopf gekühlt werden. Schließlich werden die in der C-Falle eingefangenen Fragmentionen im rechten Winkel zur Orbitalfallen-Vorrichtung 110 zur Analyse und Detektion ausgestoßen. Das resultierende Massenspektrum der Fragmentionen wird mit MS2 bezeichnet.
  • Obwohl in 1 eine HCD-Fragmentierungskammer 120 dargestellt ist, können stattdessen andere Fragmentierungsvorrichtungen eingesetzt werden, wobei Verfahren wie kollisionsinduzierte Dissoziation (engl. collision induced dissociation, CID), Elektroneneinfang-Dissoziation (engl. electron capture dissociation, ECD), Elektronentransfer-Dissoziation (engl. electron transfer dissociation, ETD), Photodissoziation und so weiter zur Anwendung kommen.
  • Die „Sackgassen“-Konfiguration der Fragmentierungskammer 120 in 1, wobei Vorläuferionen axial aus der C-Falle 100 in einer ersten Richtung in Richtung zur Fragmentierungskammer 120 ausgestoßen werden und die resultierenden Fragmentionen in die C-Falle 100 in der entgegengesetzten Richtung zurückgeführt werden, ist in WO-A-2006/103412 ausführlicher beschrieben.
  • Das Massenspektrometer 10 wird gesteuert durch eine Steuerung 130, die beispielsweise dazu konfiguriert ist, die Zeitwahl für das Ausstoßen der Einfangkomponenten zu steuern, die geeigneten Potenziale an den Elektroden des Quadrupols einzustellen usw., um die Ionen zu fokussieren und zu filtern, die Massenspektraldaten von der Orbitalfallen-Vorrichtung 110 einzufangen, die Abfolge der MS1- und MS2-Scans zu steuern, und so weiter. Es versteht sich, dass die Steuerung einen Computer umfassen kann, der nach einem Computerprogramm betrieben werden kann, das Anweisungen umfasst, um das Massenspektrometer zum Ausführen der Schritte des Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung zu veranlassen. Natürlich kann in anderen Ausführungsformen ein Massenspektrometer eine Fragmentierungskammer umfassen, die in einer „Durchflug“-Konfiguration angeordnet ist, wobei Fragmentionen durch die Fragmentierungskammer zu einem weiteren Massenanalysator, wie einer linearen Ionenfalle, zur MS2-Analyse wandern. Beispielsweise umfasst das Fusion Lumos Tribrid-Massenspektrometer von Thermo Fisher Scientific, Inc. eine solche „Durchflug“-Fragmentierungskammer.
  • Es versteht sich, dass die spezifische Anordnung der in 1 dargestellten Komponenten für die nachfolgend beschriebenen Verfahren nicht wesentlich ist. Tatsächlich sind andere Anordnungen zum Ausführen der loneneinfangverfahren von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung geeignet. Beispielsweise kann ein Mehrfachreflexions-Flugzeit-Massenanalysator (engl. multi-reflection time-of-flight, MR-ToF) oder ein Fourier-Transformations-Ionenzyklotronresonanz-Massenanalysator (engl. Fourier transform ion cyclotron resonance, FT-ICR) anstelle eines Orbitalfallen-Massenanalysators verwendet werden.
  • Eine beispielhafte erste Ausführungsform des Verfahrens wird nun unter Bezugnahme auf die 2 und 3 beschrieben.
  • Die zu analysierende Probe enthält Probenmoleküle, einschließlich mindestens eines interessierenden Zielanalyten. Zu Beginn wird der zu analysierenden Probe ein Isotopolog eines interessierenden Zielanalyten hinzugefügt. Ein Isotopolog ist ein isotopenmarkiertes Molekül, das sich von seinem Ausgangsmolekül (dem Zielanalyten) dadurch unterscheidet, dass mindestens ein Atom eine unterschiedliche Anzahl von Neutronen aufweist. In einigen Ausführungsformen kann das Ausgangsmolekül ein zielgerichtetes endogenes interessierendes Peptid sein (Zielanalyt). Solche zielgerichteten endogenen Peptide können in zu analysierenden Proben, wenn überhaupt, nur in relativ geringer Häufigkeit vorhanden sein, was es schwierig macht, sie unter Verwendung herkömmlicher DIA-Methodiken nachzuweisen.
  • Insbesondere ist für eine gegebene Probe die Retentionszeit eines Zielanalyten möglicherweise nicht bekannt, bevor die DIA-Methodik durchgeführt wird. Da der Zielanalyt möglicherweise nur in geringen Mengen in der Probe vorhanden ist, ist es schwierig, die Retentionszeit mit herkömmlichen Verfahren zu bestimmen. Dementsprechend wird der Probe ein Isotopolog in einer Menge zugesetzt, die ausreicht, um das Isotopolog durch Massenanalyse leicht detektieren zu können. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Isotopolog der Probe in einer bekannten Menge zugesetzt, die ausreicht, um das Detektieren des Isotopologs zu ermöglichen. Das Isotopolog liefert dementsprechend einen isotopenmarkierten internen Standard. Da das Isotopolog die gleiche chemische Struktur wie der interessierende Zielanalyt aufweist, ist die Retentionszeit des Isotopologs dem Zielanalyten ähnlich oder gleich.
  • In einigen Ausführungsformen können einer Probe mehrere verschiedene Isotopologe des interessierenden Zielanalyten hinzugefügt werden. Jedes Isotopolog kann relativ zum interessierenden Zielanalyten eine andere Isotopenmarkierung aufweisen. Die verschiedenen Isotopologen können der Probe in verschiedenen bekannten Mengen zugesetzt werden.
  • Die Probe und das Isotopolog können von einer Flüssigchromatographie (LC)-Säule als Teil der oben beschriebenen beispielhaften Vorrichtung (wie in 1 gezeigt) geliefert werden.
  • In der Ausführungsform der 2 und 3 können die Probenmoleküle und Isotopologenmoleküle von der LC-Säule geliefert werden, so dass die datenunabhängige Erfassungsmethodik gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Daten über die Probenmoleküle und Isotopologenmoleküle erfasst, wenn sie aus der Chromatographievorrichtung eluieren. Es versteht sich, dass die LC-Säule im Verlauf eines Experiments dem Massenspektrometer zeitweise nur Probenmoleküle, nur Isotopologenmoleküle oder Probenmoleküle und Isotopologenmoleküle in Abhängigkeit von den Retentionszeiten der Probenmoleküle und Isotopologenmoleküle zuführen kann. Die Bezugnahme auf die Zufuhr von Probenmolekülen und Isotopologenmolekülen aus der LC-Säule in dieser Offenbarung schließt einen der oben beschriebenen Fälle ein.
  • Gemäß den Verfahren dieser Offenbarung analysiert das Massenspektrometer die Probenmoleküle und die Isotopologenmoleküle gemäß einer DIA-Methodik, die MS1-Scans und MS2-Scans umfasst. Dem Fachmann sind verschiedene DIA-Methodiken bekannt, die gemäß Ausführungsformen dieser Offenbarung durchgeführt werden können. Als solches versteht es sich, dass Verfahren und Massenspektrometer der Offenbarung nicht auf irgendeine spezifische DIA-Methodik beschränkt sind.
  • Beispielsweise zeigt 2 ein Beispiel einer DIA-Methodik, die gemäß Ausführungsformen dieser Offenbarung durchgeführt werden kann. 2 zeigt einen einzelnen Zyklus einer DIA-Methodik. Wie in 2 gezeigt, werden mit der Zeit auf der horizontalen Achse und dem m/z auf der vertikalen Achse mehrere MS1-Scans (dargestellt durch die vertikalen Balken) und eine Reihe von MS2-Scans (dargestellt durch die Punkte, die zusammen die Reihe von MS2-Scans bilden) in einem einzigen Zyklus der DIA-Methodik (Workflow) durchgeführt. Der in 2 gezeigte Zyklus umfasst das Durchführen von einer Reihe von MS2-Scans und von mehreren (drei) MS1-Scans über eine Dauer von ungefähr 5,23 s. MS1-Scans können unter Verwendung der in 1 gezeigten Vorrichtung (oder einer anderen geeigneten Vorrichtung) durchgeführt werden.
  • Um einen einzelnen MS1-Scan durchzuführen, eluieren Probenmoleküle und/oder Isotopologenmoleküle von einer LC-Säule, die dann unter Verwendung der ESI-Quelle 20 unter Bildung von Vorläuferionen ionisiert werden. Anschließend treten Vorläuferionen (Probenionen und/oder Isotopologen-Ionen) in die Vakuumkammer des Massenspektrometers 10 ein. Die Vorläuferionen werden durch die Kapillare 25, die Nur-HF-Linse 30, den Injektionsflachpol 40, den gebogenen Flachpol 50 und in das Quadrupolmassenfilter 70 auf die oben beschriebene Weise geleitet. Der Quadrupolmassenfilter 70 wird von der Steuerung 130 gesteuert, um die Vorläuferionen gemäß dem ausgewählten interessierenden Vorläufermassenbereich zu filtern. Ein großer m/z-Bereich oder ein großes Fenster, z. B. > 500 m/z Einheiten breit, wie beispielsweise ein Fenster 400-1200 m/z, wird vom Massenfilter 70 ausgewählt. In der Ausführungsform von 2 beträgt der interessierende Vorläufermassenbereich für die MS1-Scans 400-1210 m/z.
  • Vorläuferionen passieren dann die Quadrupol-Austrittslinsen/Split-Linsen-Anordnung 80, den Transfer-Multipol 90 und gelangen in die C-Falle 100. Von der C-Falle 100 können die Vorläuferionen in den Orbitalfallen-Massenanalysator 110 injiziert werden. Sobald die Vorläuferionen innerhalb des Orbitalfallen-Massenanalysators stabilisiert sind, wird der MS1-Scan unter Verwendung des Bildstromdetektors durchgeführt, um die Vorläuferionen zu erfassen, die in dem Orbitalfallen-Massenanalysator 110 vorhanden sind. Die Detektion der Vorläuferionen in dem Orbitalfallen-Massenanalysator 110 kann so konfiguriert sein, dass sie mit einer relativ hohen Auflösung für den MS1-Scan (relativ zur Auflösung der MS2-Scans) durchgeführt wird.
  • Gemäß der DIA-Methodik von 2 wird während eines DIA-Zyklus eine Reihe von MS2-Scans über den interessierenden Vorläufermassenbereich durchgeführt. Um einen einzelnen MS2-Scan eines Massenbereichssegments durchzuführen, werden eluierende Moleküle von einer LC-Säule, die je nach Retentionszeit Proben- und/oder Isotopologenmoleküle sein können, ionisiert, um Vorläuferionen zu bilden. Die Vorläuferionen werden auf ähnliche Weise wie beim MS1-Scan in das Massenspektrometer injiziert. Die Vorläuferionen für den MS2-Scan laufen durch die Kapillare 25, die Nur-HF-Linse 30, den Injektionsflachpol 40, den gebogenen Flachpol 50 und in den Quadrupolmassenfilter 70 auf ähnliche Weise wie die Probenionen für den MS1-Scan.
  • Sobald die Vorläuferionen für den MS2-Scan den Quadrupol-Massenfilter 70 erreichen, wird der Quadrupol-Massenfilter 70 von der Steuerung 130 gesteuert, um die Vorläuferionen gemäß dem relativ schmalen Massenbereich des abgetasteten Massenbereichssegments (relativ zum interessierenden Vorläufermassenbereich) einer Massenfiltration zu unterziehen. Beispielsweise beträgt in der Ausführungsform von 2 der Massenbereich jedes Massenbereichssegments 15 Th.
  • Die (gefilterten Massensegment-) Vorläuferionen gelangen vom Quadrupolmassenfilter 70 durch die C-Falle 100 in Richtung der Fragmentierungskammer 120.
  • In der HCD-Fragmentierungskammer 120 kollidieren die hochenergetischen Vorläuferionen mit Kollisionsgasmolekülen, was zu der Fragmentierung der Vorläuferionen in Fragmentionen führt. Als solche können die Fragmentionen Fragment-Probenionen und/oder Fragment-Isotopologen-Ionen umfassen. Die Fragmentionen werden dann aus der Fragmentierungskammer 120 zurück zur C-Falle 100 ausgestoßen, wo sie eingefangen und gekühlt werden. Die Fragmentionen werden dann in den Orbitalfallen-Massenanalysator 110 ausgestoßen, der mit einer relativ niedrigeren Auflösung für die Analyse (MS2-Scan) betrieben wird, was eine schnellere Scan-Geschwindigkeit (kürzere transiente Erfassungszeit) ermöglicht. Die resultierende Erfassung eines Massenspektrums wird als MS2-Scan bezeichnet.
  • Gemäß der DIA-Methodik von 2 steuert die Steuerung 130 das Massenspektrometer 10, um eine Reihe von MS2-Scans über den interessierenden Massenbereich durchzuführen. Für die Reihe von MS2-Scans wird der interessierende Massenbereich in mehrere Massenbereichssegmente unterteilt, wobei jedes Massenbereichssegment einen Teil des interessierenden Massenbereichs abdeckt. Für jedes Massenbereichssegment fragmentiert das Massenspektrometer 10 die Vorläuferionen innerhalb dieses Massenbereichssegments und führt einen MS2-Scan der Fragment-Vorläuferionen innerhalb des Massenbereichssegments durch. Das Massenspektrometer führt einen MS2-Scan für jedes Massenbereichssegment des interessierenden Massenbereichs durch, um eine Reihe von MS2-Scans zu erstellen.
  • Wie in 2 gezeigt, werden die MS2-Scans der Massenbereichssegmente nacheinander durchgeführt, beginnend an der unteren Grenze des interessierenden Massenbereichs. Natürlich können in anderen Ausführungsformen die MS2-Scans, die die Reihe von MS2-Scans bilden, in einer anderen Reihenfolge durchgeführt werden. Beispielsweise können in einigen Ausführungsformen die MS2-Scans der Massenbereichssegmente nacheinander beginnend an der Obergrenze des interessierenden Massenbereichs durchgeführt werden, oder in anderen Ausführungsformen können die MS2-Scans in einer allgemein zufälligen oder pseudozufälligen Reihenfolge angeordnet sein.
  • Gemäß der Ausführungsform steuert die Steuerung 130 das Massenspektrometer 10, um DIA-Zyklen durchzuführen, die die mehreren MS1-Scans über den interessierenden Massenbereich und auch die Reihe von MS2-Scans umfassen.
  • Die zeitliche Abfolge der verschiedenen Stufen der Ionisierung, Filterung, Abscheidung, dem Auswurf, der Fragmentierung (für MS2) und Analyse für jeden MS1- und MS2-Scan kann von der Steuerung 130 gesteuert werden, um den Durchsatz zu optimieren. So ist es beispielsweise möglich, Vorläuferionen in dem Orbitalfallen-Massenanalysator 110 zu analysieren, um einen MS1-Scan zu erhalten, während sich ein Teilbereich der Vorläuferionen (Massenbereichssegment) bereits in der Fragmentierungskammer 120 befindet, um dort zu fragmentieren. Alternativ können die Fragmentionen gekühlt und in der C-Falle 100 eingefangen werden, während die Analyse der Vorläuferionen in dem Orbitalfallen-Massenanalysator 110 durchgeführt wird, so dass die Fragmentionen in den Orbitalfallen-Massenanalysator 110 zum Erhalten eines MS2-Scans injiziert werden können, sobald die Vorläuferionenanalyse abgeschlossen ist. Während der Zeit, in der ein MS1-Scan in dem Massenanalysator 110 durchgeführt wird, kann es möglich sein, sowohl die Fragmentierung eines Massensegments von Vorläuferionen als auch das Abkühlen und Einfangen der Fragmente in der C-Falle 100 durchzuführen, die zur Injektion in den Massenanalysator 110 bereit sind.
  • Die MS1-Scans können über die Dauer der Reihe von MS2-Scans mehrmals wiederholt werden. Das Wiederholen der MS1-Scans über die Dauer der Reihe von MS2-Scans kann dazu führen, dass die MS1-Scans über die Dauer eines chromatographischen Peaks der Probenionen einige Male wiederholt werden, so dass der chromatographische Peak über seine Dauer mehrmals abgetastet wird. Beispielsweise wird in der Ausführungsform von 2 der MS1-Scan dreimal über die Dauer einer einzelnen Reihe von MS2-Scans durchgeführt. In einigen Ausführungsformen werden die MS1-Scans so durchgeführt, dass ein chromatographischer Peak der Probenionen mindestens dreimal, fünfmal oder siebenmal abgetastet wird. Mindestens ein DIA-Zyklus wird über einen chromatographischen Peak durchgeführt. In einigen Ausführungsformen werden mindestens zwei DIA-Zyklen über einen chromatographischen Peak durchgeführt. In einigen Ausführungsformen werden nicht mehr als zwei DIA-Zyklen über einen chromatographischen Peak durchgeführt. Vorteilhafterweise wird durch mehrmaliges Abtasten eines chromatographischen Peaks in der MS1-Domäne die Anzahl der Datenpunkte über dem Peak erhöht, wodurch die Detektion von Vorläuferionen in dem chromatographischen Peak verbessert wird. Durch mehrmaliges Abtasten des Peaks kann jedes der Vorläuferionen im Probenpeak in mehreren MS1-Scans nachgewiesen werden, was zu einer besseren Quantifizierungsgenauigkeit führt.
  • Wie in 2 gezeigt, werden drei MS1-Scans über die Dauer einer Reihe von MS2-Scans durchgeführt. Daher sind die MS1-Scans in Intervallen von ungefähr 1,74 Sekunden zu wiederholen (eine MS1-Abtastrate von ~ 0,57 Hz). Die Auflösung für die MS1-Scans ist in einem interessierenden Massenbereich von 400 bis 1.210 m/z auf 120.000 eingestellt. Für das Massenspektrometer von 1 beträgt eine Erfassungszeit eines einzelnen MS1-Scans, der mit einer Auflösung von 120.000 durchgeführt wird, ungefähr 256 ms. In einigen Ausführungsformen kann der Overhead zwischen Scans in dem Massenanalysator 120 ungefähr 20 ms betragen. Dementsprechend kann die Gesamtdauer zum Durchführen von den drei MS1-Scans in der Methodik von 2 ungefähr 828 ms betragen.
  • In der DIA-Methodik von 2 werden die MS2-Daten zur Validierung der MS1-Daten erfasst, d. h. um die Erkennung von Probenmolekülen zu bestätigen. Daher ist es für Quantifizierungszwecke nicht erforderlich, mehrere Reihen von MS2-Daten über die Dauer eines chromatographischen Peaks zu erhalten. Dementsprechend kann eine Reihe von MS2-Scans über eine längere Dauer erhalten werden (relativ zur Dauer eines chromatographischen Peaks und zum Scanintervall der MS1-Scans). Wie in 2 gezeigt, ist die Leistung der MS1-Scans während der Durchführung einer Reihe von MS2-Scans verschachtelt. In dem in 2 gezeigten Beispiel werden für den interessierenden Massenbereich 400 bis 1210 m/z gewählt, und für den Massenbereich für jedes der Segmente werden 15 Da gewählt. Daher können 54 MS2-Scans (in 2 nicht genau gezeigt) in einer einzelnen Reihe von MS2-Scans in der Ausführungsform von 2 durchgeführt werden. In 2 verwendet die Methodik beispielsweise eine Q Exactive® HF-Vorrichtung, wie oben beschrieben, sodass jeder MS2-Scan mit einer Auflösung von 30.000 in einer Erkennungszeit von ca. 64 ms mit einem Overhead von ca. 16 ms (Gesamtscanzeit ungefähr 80 ms) erfasst werden kann. Dementsprechend kann eine einzelne Reihe von MS2-Scans, die mit mehreren MS1-Scans mit der erforderlichen MS1-Abtastrate verschachtelt sind, mit einer Zykluszeit von ungefähr 5,2 Sekunden durchgeführt werden, wie in 2 gezeigt.
  • Wie bereits erwähnt, sind die MS1-Scans ungefähr alle 1,74 Sekunden zwischen den MS2-Scans verschachtelt, und die Gesamtzeit für die Durchführung einer Reihe von MS2-Scans, die mit den MS1-Scans verschachtelt sind, beträgt ungefähr 5,23 Sekunden. Zwischen jedem MS1-Scan werden 18 MS2-Scans abgetastet. Das heißt, die gesamte Sequenz, um eine Reihe von MS2-Scans zu erhalten, ist: MS1 (400-1210 m/z), MS2 (400-415 m/z), MS2 (415-430 m/z) ... MS2 (655-670 m/z), MS1 (400-1210 m/z), MS2 (670-685) ... MS2 (925-940), MS1 (400-1210 m/z), MS2 (940-955) ... MS2 (1195-1210).
  • Dementsprechend stellt eine DIA-Methodik einer Ausführungsform der Offenbarung eine Reihe von MS1-Scans mit einem hohen Auflösungsvermögen (z. B. 120.000) bereit, so dass die MS1-Scans zur Quantifizierung der Vorläuferionen verwendet werden können. Die hohe Massengenauigkeit trug zur Eindeutigkeit der Vorläufererkennungen bei. Die MS2-Scans der Fragment-Vorläuferionen werden zur Validierung der Vorläufererkennung verwendet. Aufgrund der in der MS1-Domäne durchgeführten hochauflösenden Quantifizierung ist in der MS2-Domäne keine relativ große Zeitauflösung erforderlich, und daher kann der MS2-Scan nur für die Validierung der Identität des Vorläuferions optimiert werden. Dieser Ansatz ermöglicht ein datenunabhängiges Erfassungsverfahren der Massenspektrometrie, das eine verbesserte Empfindlichkeit und Selektivität aufweist. Darüber hinaus kann die Quantifizierung von Vorläuferionen in der MS1-Domäne unter Verwendung eines „bibliotheksfreien“ Ansatzes durchgeführt werden, wodurch die Anforderungen an die Nachbearbeitung der erfassten Daten verringert werden.
  • Verfahren zur Analyse von DIA MS1-Scandaten und zur Quantifizierung von Vorläuferionen unter Verwendung eines bibliotheksfreien Ansatzes ist in „DIA-Umpire: comprehensive computational framework for data independent acquisition proteomics“, Tsou et al., Nat Methods, März 2015, S. 258-264, beschrieben.
  • Es versteht sich natürlich, dass die obige Beschreibung einer DIA-Methodik nur ein mögliches Beispiel für eine DIA-Methodik ist. Als solches wird der Fachmann erkennen, dass die vorliegende Offenbarung nicht auf die obige DIA-Methodik beschränkt ist und dass andere DIA-Methodiken in Verbindung mit den nachstehend beschriebenen Ziel-MS2-Scans verwendet werden können.
  • Zum Beispiel können die DIA-Methodiken unter Verwendung eines Tribrid-Massenspektrometers (Quadrupol-Orbitrap-Ionen-Falle), die in „valuation of Dataindependent Acquisition (DIA) Approaches for Spiked Peptides in HeLa Digest on Q-OTqlT Mass Spectrometer“, Wei Zhang, et al. (verfügbar unter http://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/PN-64122-Q-OT-qIT-ASMS2014-PN64122-EN.pdf) offenbart sind, verwendet werden. Bei diesen Methodiken kann ein Orbitrap-Massenanalysator verwendet werden, um MS1-Scans von Vorläuferionen durchzuführen, während eine lineare Ionenfalle verwendet werden kann, um eine MS2-Analyse der Fragmentionen durchzuführen. Beispiele für einen einzelnen Zyklus von DIA-Methodiken, wie in Zhang et al. beschrieben, sind in 4 wiedergegeben. Es versteht sich, dass gemäß Ausführungsformen dieser Offenbarung ein Isotopolog zu einer zu analysierenden Probe gemäß diesen Methodiken hinzugefügt werden kann, wobei nach der Detektion des Isotopologs weitere Ziel-MS2-Scans und gegebenenfalls Isotopologen-MS2-Scans durchgeführt werden können, wie hier beschrieben.
  • In ähnlicher Weise können die in US 2018-0350576 A1 offenbarten DIA-Methodiken unter Verwendung eines Orbitrap-Massenanalysators zur Durchführung der MS1-Scans und eines ToF-Massenanalysators zur Durchführung der MS2-Scans verwendet werden. Zum Beispiel zeigt 5 eine Reproduktion einer DIA-Methodik, die in US 2018-0350576 A1 weiter beschrieben wird. Es versteht sich, dass gemäß den Ausführungsformen dieser Offenbarung ein Isotopolog zu einer zu analysierenden Probe gemäß diesen Methodiken hinzugefügt werden kann, wobei nach der Detektion des Isotopologs weitere Ziel-MS2-Scans und gegebenenfalls Isotopologen-MS2-Scans durchgeführt werden können, wie hier beschrieben.
  • Zusätzlich zu der oben beschriebenen DIA-Methodik versucht ein Verfahren gemäß einer Ausführungsform der Offenbarung zu erkennen, wann die Isotopologenmoleküle aus dem Chromatographiesystem eluieren, um zusätzliche Ziel-MS2-Scans durchzuführen.
  • In einigen Ausführungsformen kann die Steuerung 130 erkennen, dass Isotopologen-Ionen aus dem Chromatographiesystem eluieren, indem sie die MS1-Scandaten auf Massenspektralpeaks analysiert, die den bekannten Masse-zu-Ladung-Verhältnissen der hinzugefügten Isotopologen-Ionen entsprechen. In einigen Ausführungsformen kann die Steuerung 130 erkennen, dass Isotopologen-Ionen eluieren, indem sie die MS1-Scandaten auf Massenspektralpeaks analysiert, die einem Isotopenmuster der Isotopologen-Ionen entsprechen. Beispielsweise kann in einigen Ausführungsformen die Steuerung 130 vorab mit einer Peptidsequenz versehen sein, die für das Isotopolog repräsentativ ist, da die Identität des Zielanalyten bekannt ist. Mit der gegebenen Peptidsequenz können theoretische Peptidisotopenmuster für verschiedene Ladungszustände simuliert werden, z. B. 2+, 3+ und 4+. Die theoretischen m/z-Werte für jeden Ladungszustand können berechnet werden.
  • Die Steuerung kann die MS1-Scandaten in Echtzeit analysieren (engl. on-the-fly-matching), indem sie die theoretischen Peptidisotopenmuster mit den Massenspektralpeaks der MS1-Daten vergleicht. Wenn Massenspektralpeaks der MS1-Daten mit dem theoretischen Peptidisotopenmuster innerhalb einer vorbestimmten Fehlerschwelle übereinstimmen, bestimmt die Steuerung 130, dass das Isotopolog (und damit der Zielanalyt) aus der Chromatographievorrichtung eluiert. In einigen Ausführungsformen kann eine vorbestimmte Fehlerschwelle (Massenfehler) von weniger als 5 ppm verwendet werden.
  • Gemäß der Ausführungsform von 2 werden MS1-Scans während der gesamten DIA-Methodik wiederholt. Dementsprechend können die MS1-Scans verwendet werden, um zu erkennen, wann das Isotopolog von der Chromatographievorrichtung eluiert. In einigen Ausführungsformen können die MS1-Scans bei einer Frequenz von mindestens 0,5 Hz durchgeführt werden, um genauer zu bestimmen, wann das Isotopolog beginnt, aus dem Chromatographiesystem zu eluieren. Natürlich können für andere DIA-Methodiken die MS2-Scans verwendet werden, um zu erkennen, ob das Isotopolog aus der Chromatographievorrichtung eluiert. Als solches versteht es sich, dass die Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung nicht auf die Verwendung von MS1-Scandaten zum Erkennen des Isotopologs beschränkt sind.
  • Als zusätzlichen Bestätigungstest kann die Steuerung das Vorhandensein des Isotopologs auch unter Verwendung der Reihe von MS2-Scans validieren. Es versteht sich, dass die Steuerung mit der Struktur, wie beispielsweise einer Peptidsequenz, die für das Isotopolog repräsentativ ist, in silico ein MS2-Massenspektrum für das Isotopolog erzeugen kann. Dieses MS2-Massenspektrum kann für das On-the-Fly-Matching oder die Echtzeitsuche verwendet werden. Somit kann nach der Erkennung des Isotopologs in den MS1-Scandaten der nächste MS2-Scan mit einem Massenbereichssegment, das das Isotopolog abdeckt, MS2-Scandaten erzeugen, die verwendet werden können, um das Vorhandensein des Isotopologs zu bestätigen.
  • Nach dem Bestimmen, dass Isotopologenmoleküle aus dem Chromatographiesystem eluieren, kann die Steuerung 130 die Sequenz von MS1- und MS2-Scans unterbrechen, die die DIA-Methodik bilden, um eine Reihe von Zielscans durchzuführen. Die Reihe von Zielscans wird durchgeführt, um zusätzliche Quantifizierungsdaten für den Zielanalyten bereitzustellen. In der Ausführungsform der 2 und 3 sind die Zielscans Ziel-MS2-Scans. Es versteht sich, dass in anderen Ausführungsformen die Zielscans Zielscans umfassen können, die in der MS1-Domäne durchgeführt werden, beispielsweise Ziel-SIM-Scans. Beispielsweise können die durchgeführten Zielscans eine Reihe von Ziel-MS2-Scans, eine Reihe von Ziel-SIM-Scans oder eine Reihe von Ziel-MS2-Scans und Ziel-SIM-Scans umfassen.
  • In der in 3 gezeigten Ausführungsform weist jeder Ziel-MS2-Scan ein Isolationsfenster auf, das ein Masse-zu-Ladung-Verhältnis aufweist, das für den Zielanalyten repräsentativ ist. Die Steuerung 130 kann die Sequenz von MS1- und MS2-Scans, die die DIA-Methodik bilden, wiederholt über die Dauer eines chromatographischen Peaks des Isotopologs unterbrechen, um weitere Ziel-MS2-Scans durchzuführen. Dementsprechend können die Ziel-MS2-Scans zusätzliche MS2-Scandaten des Ziels für die Erkennung und/oder Quantifizierung des Zielanalyten bereitstellen. Wenn also festgestellt wird, dass Isotopologenmoleküle aus dem Chromatographiesystem eluieren, kann über die Dauer des chromatographischen Peaks eine größere Anzahl von MS2-Scans mit einem Isolationsfenster einschließlich eines Masse-zu-Ladung-Verhältnisses des Zielanalyten (Ziel-MS2-Scan) als die Anzahl von MS2-Scans durchgeführt werden, die ein Isolationsfenster einschließlich eines Masse-zu-Ladung-Verhältnisses des Zielanalyten aufweisen, die gemäß der Sequenz von MS2-Scans durchgeführt werden, die die DIA-Methodik bilden. Die Ziel-MS2-Scans können somit außerhalb der Sequenz von der Sequenz von MS2-Scans durchgeführt werden, die die DIA-Methodik bilden.
  • Die Ziel-MS2-Scans werden zusätzlich zu den MS1- und MS2-Scans der oben beschriebenen DIA-Methodik durchgeführt. Wie oben diskutiert, werden die Ziel-MS2-Scans durchgeführt, um die Erkennung von Zielanalyten zu unterstützen, die möglicherweise nur in einer relativ geringen Menge in der Probe vorhanden sind. Dementsprechend kann es schwierig sein, solche Zielanalyten unter Verwendung einer herkömmlichen DIA-Methodik nachzuweisen, da die Massenspektren durch häufigere Spezies maskiert werden können. Somit werden in den Verfahren dieser Offenbarung Ziel-MS2-Scans mit einem Isolationsfenster durchgeführt, das den Zielanalyten enthält. Die durchgeführten Ziel-MS2-Scans können sehr zielgerichtete Scans zur Erkennung und/oder Quantifizierung des spezifischen Zielanalyten sein (d. h. versuchen, andere mögliche Bestandteile auszuschließen, um das Signal-Rausch-Verhältnis des Massenspektralpeaks der Zielanalytionen zu verbessern).
  • In einigen Ausführungsformen können die durchgeführten Zielscans das Durchführen von Zielscans in der MS1-Domäne umfassen. Beispielsweise können in einigen Ausführungsformen Ziel-Selective-Ion-Monitoring (SIM) -Scans durchgeführt werden, um zusätzliche Quantifizierungsdaten für den Zielanalyten bereitzustellen. Beispielsweise kann das Massenspektrometer von 1 konfiguriert sein, um zusätzliche Ziel-SIM-Scans durchzuführen, nachdem erkannt wurde, dass das Isotopolog von der Chromatographievorrichtung eluiert. Ähnlich wie bei den Ziel-MS2-Scans können Vorläuferionen unter Verwendung des Quadrupol-Massenfilters 70 massenselektiert werden. Der Quadrupol-Massenfilter 70 verwendet ein Zielisolationsfenster, das ein Masse-zu-Ladung-Verhältnis enthält, das für den Zielanalyten zur Masse repräsentativ ist, um die Vorläuferionen einer Massenselektion zu unterziehen. Die massenselektierten Vorläuferionen können dann zur Massenanalyse in der MS1-Domäne zum Massenanalysator 110 transportiert werden.
  • Bei SIM-Scans kann das Zielisolationsfenster im Vergleich zu den für die MS2-Scans der DIA-Methodik verwendeten Isolationsfenstern relativ schmal sein. In einigen Ausführungsformen können die Ziel-SIM-Scans ein Isolationsfenster aufweisen, das ein Masse-zu-Ladung-Verhältnis enthält, das für das Zielanalytion repräsentativ ist und nicht größer als 5 Th breit ist. In einigen Ausführungsformen darf die Breite des Zielisolationsfensters nicht größer sein als: 4 Th, 3 Th oder 2 Th. Das Zielisolationsfenster kann um ein erwartetes Masse-zu-Ladung-Verhältnis eines Ions des Zielanalyten zentriert sein. Unter Verwendung eines relativ schmalen Zielisolationsfensters können die Ziel-SIM-Scans unter Verwendung einer längeren loneninjektionszeit der Vorläuferionen im Vergleich zu den MS1-Scans der DIA-Methodik durchgeführt werden. Beispielsweise kann unter Verwendung des in 1 gezeigten Spektrometers eine längere loneninjektionszeit verwendet werden, um Vorläuferionen in dem Zielisolationsfenster in die C-Falle 100 zu injizieren, als die loneninjektionszeiten, die für die Isolationsfenster für die MS1-Scans der DIA-Methodik verwendet wurden.
  • Darüber hinaus können die Zielscans dieser Offenbarung auf verschiedene Arten durchgeführt werden, beispielsweise wie in den nachstehenden Optionen dargelegt.
  • Eine erste Option besteht darin, Zielscans durchzuführen, beispielsweise Ziel-MS2-Scans des Zielanalyten unter Verwendung eines Zielisolationsfensters. Das Zielisolationsfenster kann im Vergleich zu den Isolationsfenstern, die für die MS2-Scans der DIA-Methodik verwendet werden, relativ schmal sein. Als solches können in einigen Ausführungsformen die Ziel-MS2-Scans ein Isolationsfenster aufweisen, das ein Masse-zu-Ladung-Verhältnis enthält, das für das Zielanalytion repräsentativ ist das nicht größer als 5 Th breit ist. In einigen Ausführungsformen darf die Breite des Zielisolationsfensters nicht größer sein als: 4 Th, 3 Th oder 2 Th. Das Zielisolationsfenster kann um ein erwartetes Masse-zu-Ladung-Verhältnis eines Ions des Zielanalyten zentriert sein. Unter Verwendung eines relativ schmalen Zielisolationsfensters können die Ziel-MS2-Scans unter Verwendung einer längeren loneninjektionszeit der Vorläuferionen im Vergleich zu den MS2-Scans der DIA-Methodik durchgeführt werden. Beispielsweise kann unter Verwendung des in 1 gezeigten Spektrometers eine längere loneninjektionszeit verwendet werden, um Vorläuferionen in dem Zielisolationsfenster in die C-Falle 100 und/oder Fragmentierungsvorrichtung 120 zu injizieren als die loneninjektionszeiten, die für die Isolationsfenster für die MS2-Scans der DIA-Methodik verwendet werden.
  • Die Ziel-MS2-Scans können nach Erkennung der aus dem Chromatographiesystem eluierenden Isotopologen-Ionen wiederholt werden. Die Ziel-MS2-Scans können mit einer Frequenz von mindestens 0,3 Hz oder mindestens 0,5 Hz oder ungefähr der gleichen Frequenz wie die MS1-Scans durchgeführt werden. Beispielsweise können in der Ausführungsform von 3 die Ziel-MS2-130-Scans ungefähr alle zwei Sekunden nach der Erkennung der Isotopologen-Ionen in dem MS1-Scan 100 wiederholt werden. Die Frequenz der Ziel-MS2-Scans 130, 131, 132 ermöglicht eine genauere Quantifizierung des Zielanalyten und die Bestimmung der Form des chromatographischen Peaks.
  • Zusätzlich zum Durchführen von Zielscans der Zielanalytionen kann das Verfahren auch das Durchführen von Isotopologen-Scans der Isotopologen-Ionen umfassen. Die Isotopologen-Scans können durchgeführt werden, um zusätzliche Quantifizierungsdaten für das Isotopolog zu erhalten. Die Isotopologen-Scans können in der MS1-Domäne oder der MS2-Domäne durchgeführt werden. Beispielsweise können die Isotopologen-Scans eine Reihe von Isotopologen-MS2-Scans und/oder eine Reihe von Isotopologen-SIM-Scans umfassen.
  • In der Ausführungsform von 3 können Isotopologen-MS2-Scans durchgeführt werden. In solchen Ausführungsformen werden die Isotopologen-MS2-Scans zusätzlich zu den MS1- und MS2-Scans der oben beschriebenen DIA-Methodik durchgeführt. Solche Isotopologen-MS2-Scans können ein Isotopologen-Isolationsfenster aufweisen, das ein Masse-zu-Ladung-Verhältnis enthält, das für die Isotopologen-Ionen repräsentativ ist. Ähnlich wie bei den Ziel-MS2-Scans können auch die Isotopologen-MS2-Scans ein relativ schmales Isolationsfenster aufweisen, das nicht größer als 5 Th breit ist. In einigen Ausführungsformen darf die Breite des Isotopologen-Isolationsfensters jedes Isotopologen-MS2-Scans nicht größer sein als: 4 Th, 3 Th oder 2 Th. Die Isotopologen-MS2-Scans können ein Isolationsfenster aufweisen, das im Wesentlichen dem der Ziel-MS2-Scans entspricht. Die Isolationsfenster der Ziel-MS2-Scans und/oder Isotopologen-MS2-Scans können schmaler sein als die MS2-Scans der oben beschriebenen DIA-Methodik.
  • Die Isotopologen-MS2-Scans können auf ähnliche Weise wie die Ziel-MS2-Scans durchgeführt werden. Beispielsweise kann für das Massenspektrometer von 1 das Durchführen von einem Isotopologen-MS2-Scan umfassen: Massenselektion der Vorläuferionen mit einem Masse-zu-Ladung-Verhältnis innerhalb des Isotopologen-Isolationsfensters unter Verwendung des Quadrupol-Massenfilters 70. Die massenselektierten Vorläuferionen können dann in die Fragmentierungskammer 120 übertragen werden, wo die Vorläuferionen innerhalb des Isotopologen-Isolationsfensters fragmentiert werden, um Isotopologen-Fragmentionen zu bilden. Die Isotopologen- Fragmentionen können dann unter Verwendung des Massenanalysators 110 massenselektiert werden.
  • Wie in 3 gezeigt, können Isotopologen-MS2-Scans auch nach Erkennung der Isotopologen-Ionen in den MS1-Scan-Daten durchgeführt werden. Die Isotopologen-MS2-Scans können mit einer Frequenz von mindestens 0,3 Hz oder mindestens 0,5 Hz durchgeführt werden. In einigen Ausführungsformen können die Isotopologen-MS2-Scans ungefähr alle zwei Sekunden nach der Erkennung der Isotopologen-Ionen wiederholt werden.
  • In einigen Ausführungsformen können die Isotopologen-MS2-Scans mit der gleichen Frequenz wie die Ziel-MS2-Scans durchgeführt werden, oder in anderen Ausführungsformen können die Isotopologen-Scans mit einer anderen Frequenz durchgeführt werden. Die Isotopologen-Scans können entweder vor oder nach den Ziel-MS2-Scans durchgeführt werden. Die Ziel-MS2-Scans (und gegebenenfalls die Isotopologen-MS2-Scans) können wiederholt werden, um Informationen zu erhalten, die zur Charakterisierung des chromatographischen Peaks der Isotopologenmoleküle geeignet sind, die aus der Chromatographievorrichtung eluieren. Durch Wiederholen der Ziel-MS2-Scans und/oder der Isotopologen-MS2-Scans mit einer solchen Frequenz können möglicherweise Daten erhalten werden, die zur Charakterisierung der Form des chromatographischen Peaks geeignet sind. Die Ziel-MS2-Scans (und optional die Isotopologen-MS2-Scans) können wiederholt werden, bis die Isotopologen-Ionen in den MS1-Scan-Daten nicht mehr erfasst werden. In anderen Ausführungsformen können die Ziel-MS2-Scans (und gegebenenfalls die Isotopologen-MS2-Scans) nach der Erkennung der Isotopologen-Ionen in den MS1-Scandaten eine vorbestimmte Anzahl von Malen wiederholt werden, z. B. mindestens zwei-, drei-, vier-, fünf-, sechs-, sieben- oder achtmal oder mehr.
  • In einigen Ausführungsformen können mehrere unterschiedliche Isotopologe in unterschiedlichen Mengen zu einer Probe hinzugefügt werden. Zum Beispiel eine erste Menge eines ersten Isotopologen mit einer ersten Masse, eine zweite Menge eines zweiten Isotopologen mit einer zweiten Masse, wobei sich die Mengen und Massen der jeweiligen Isotopologen unterscheiden. Nachdem erkannt wurde, dass mindestens eines der Isotopologen aus dem Chromatographiesystem eluiert, umfasst das Verfahren:
    • das Durchführen von mehreren MS2-Scans, die ein erstes Isotopologen-Isolationsfenster aufweisen, einschließlich eines Masse-zu-Ladung-Verhältnisses, das für das erste Isotopolog repräsentativ ist;
    • das Durchführen von mehreren MS2-Scans, die ein zweites Isotopologen-Isolationsfenster aufweisen, einschließlich eines Masse-zu-Ladung-Verhältnisses, das für das zweite Isotopolog repräsentativ ist; und
    • das Erzeugen einer Quantifizierungskalibrierung aus den ersten Isotopologen-MS2-Scans, den zweiten Isotopologen-MS2-Scans und den Ziel-MS2-Scans.
  • Es versteht sich natürlich, dass in einigen Ausführungsformen mehr als zwei verschiedene Isotopologe zu der Probe hinzugefügt werden können, die anschließend in der MS2-Domäne während des Massenspektrometrieverfahrens analysiert werden können. Dementsprechend kann ein Zielanalyt mit mehreren verschiedenen Isotopologen, die ein unterschiedliches m/z aufweisen, isotopisch markiert werden, aber immer noch zu einem ähnlichen Zeitpunkt wie der Zielanalyt eluieren. Durch zwei oder mehr Isotopologe mit unterschiedlichen bekannten Konzentrationen in der Probe kann eine Quantifizierungskalibrierung, wie beispielsweise eine Kalibrierungskurve, als Teil des Massenspektrometrieverfahrens durch Isotopenverdünnungsanalyse bestimmt werden. Es versteht sich, dass in einigen Ausführungsformen der Offenbarung die Quantifizierungskalibrierung als Teil eines Nachverarbeitungsschritts erzeugt werden kann (d. h. nachdem die Probe von der Chromatographievorrichtung vollständig eluiert wurde). In anderen Ausführungsformen der Offenbarung kann die Quantifizierungskalibrierung in Echtzeit erzeugt werden, wenn die Daten vom Massenanalysator erzeugt werden.
  • Durch Durchführen von Isotopologen-Scans unabhängig von den Zielscans können die Isotopologen-Ionen unabhängig von den Zielanalytionen analysiert werden. Dies kann wünschenswert sein, um die Genauigkeit und das Signal-Rausch-Verhältnis des Zielanalytionen-Signals im Zielscan zu erhöhen. Es versteht sich natürlich, dass die Unabhängigkeit der Zielscans und der Isotopologen-Scans auf Kosten der Durchführung zusätzlicher Isotopologen-Scans geht, was die Gesamtzykluszeit verlängert. Insbesondere für Ausführungsformen, in denen mehrere Zielanalyten teilweise zusammen eluieren können, kann die Anzahl der zusätzlichen Isotopologen-Scans, die durchgeführt werden, in Kombination zu einer signifikanten Verlängerung der Zykluszeit führen.
  • Eine zweite Möglichkeit besteht darin, einen Zielscan durchzuführen, bei dem Isotopologen-Ionen und Zielanalytionen (falls vorhanden) zusammen in einem einzigen Scan einer Massenanalyse unterzogen werden. Beispielsweise kann der einzelne Scan in der MS1-Domäne (z. B. einem SIM-Scan) oder in der MS2-Domäne (d. h. einem MS2-Scan) durchgeführt werden. Bei einem solchen Ziel-MS2-Scan kann das Isolationsfenster (ein kombiniertes Isolationsfenster), das zur Massenselektion der Ionen verwendet wird, ausgewählt werden, um einen kontinuierlichen Masse-zu-Ladung-Bereich zu definieren, der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse umfasst, die für das Zielanalytion und das Isotopologen-Ion repräsentativ sind. Bei einem Ziel-SIM-Scan kann das Isolationsfenster (ein kombiniertes Isolationsfenster), das zur Massenselektion der Ionen verwendet wird, ausgewählt werden, um einen kontinuierlichen Masse-zu-Ladung-Bereich zu definieren, der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse enthält, die für das Zielanalytion und das Isotopologen-Ion repräsentativ sind.
  • In einigen Ausführungsformen darf die Breite eines kombinierten Isolationsfensters nicht größer als 8 Th sein. In anderen Ausführungsformen darf die Breite eines kombinierten Isolationsfensters nicht größer als 6 Th oder 4 Th sein.
  • Es versteht sich, dass die Breite eines kombinierten Isolationsfensters breiter sein kann als das Zielisolationsfenster oder die Isotopologen-Isolationsfenster, die für die z. B. unabhängigen Ziel-MS2-Scans und Isotopologen-MS2-Scans der oben beschriebenen ersten Option verwendet werden, was sich auf das Signal-Rausch-Verhältnis der Zielanalytionen und Isotopologen-Ionen auswirken könnte. Während das kombinierte Isolationsfenster für diese in einigen Fällen breiter sein kann, versteht es sich, dass die Anzahl der zusätzlichen durchgeführten Scans im Vergleich zur ersten Option verringert sein kann.
  • Eine dritte Option besteht darin, einen Zielscan durchzuführen, der mit einem Isotopologen-Scan oder mehreren Isotopologen-Scans gemultiplext wird (wobei der Probe mehrere verschiedene Isotopologe eines Zielanalyten hinzugefügt werden). Beispielsweise kann ein Ziel-MS2-Scan mit einem Isotopologen-MS2-Scan oder mehreren Isotopologen-MS2-Scans gemultiplext werden (wobei der Probe mehrere verschiedene Isotopologe eines Zielanalyten hinzugefügt werden). Ein Ziel-SIM-Scan kann mit einem Isotopologen-SIM-Scan oder mehreren Isotopologen-SIM-Scans gemultiplext werden (wobei der Probe mehrere verschiedene Isotopologe eines Zielanalyten hinzugefügt werden).
  • Für einen gemultiplexten Ziel-MS2-Scan wird eine erste Gruppe von Vorläuferionen unter Verwendung eines ersten Isolationsfensters massenselektiert, das einem Masse-zu-Ladung-Verhältnis eines Zielanalytions entspricht. Die erste Gruppe von Vorläuferionen kann in einer Ionenfalle gespeichert und/oder fragmentiert sein, beispielsweise in der C-Falle 100 oder der Fragmentierungskammer 120 des Massenspektrometers von 1. Eine zweite Gruppe von Vorläuferionen kann dann unter Verwendung eines zweiten Isolationsfensters massenselektiert werden, das ein Masse-zu-Ladung-Verhältnis enthält, das für ein Isotopologen-Ion repräsentativ ist. Die zweite Gruppe von Vorläuferionen kann ähnlich wie die erste Gruppe gespeichert und/oder fragmentiert werden. Die erste und die zweite Gruppe von Vorläuferionen können dann zusammen fragmentiert und die Masse der Fragmentionen zusammen in einem einzelnen gemultiplexten MS2-Scan analysiert werden. Somit werden durch Durchführen von einem gemultiplexten MS2-Scan ein Zielanalytion und mindestens ein Isotopologen-Ion unter Verwendung verschiedener Isolationsfenster getrennt einer Massenselektion unterzogen, und dann wird ein einzelner gemultiplexter MS2-Scan zur Analyse des massenselektierten Zielanalytions und mindestens eines Isotopologen-Ions durchgeführt.
  • Durch Multiplexen des Ziel-MS2-Scans mit dem Isotopologen-MS2-Scan kann jedes der ersten und zweiten Isolationsfenster relativ schmal sein (im Vergleich zum kombinierten Isolationsfenster der zweiten Option). In einigen Ausführungsformen kann jedes der ersten und zweiten Isolationsfenster eine Breite von nicht mehr als 5 Th haben. In einigen Ausführungsformen dürfen das erste und/oder das zweite Isolationsfenster eine Breite von nicht mehr als 4 Th, 3 Th oder 2 Th aufweisen. Es versteht sich, dass in einigen Ausführungsformen die Breiten des ersten und des zweiten Isolationsfensters unterschiedlich sein können. Durch Bereitstellen relativ schmaler Isolationsfenster für jedes der zu analysierenden Isotopologen-Ionen und Zielanalytionen können die gemultiplexten Ziel-MS2-Scans und Isotopologen-MS2-Scans eine relativ hohe Empfindlichkeit und eine relativ hohe Selektivität für den gemultiplexten MS2-Scan aufweisen, ähnlich wie bei der ersten Option.
  • Durch Multiplexen des Ziel-MS2-Scans mit dem Isotopologen-MS2-Scan kann die Anzahl der zusätzlich durchgeführten MS2-Scans auf ähnliche Weise wie bei der oben diskutierten zweiten Option reduziert werden. Als solches können das Multiplexen der Ziel-MS2-Scans und der Isotopologen-MS2-Scans die Gesamtzykluszeit des Massenspektrometrieverfahrens gemäß Ausführungsformen dieser Offenbarung verringern. Es versteht sich, dass das Multiplexen der MS2-Scans ermöglichen kann, dass zwei oder mehr Gruppen von Ionen mit unterschiedlichen Isolationsfenstern massenselektiert und in einem einzigen MS2-Scan kombiniert werden. Als solche können gemultiplexte MS2-Scans gemäß dieser Offenbarung mehrere Isotopologen-Ionen mit unterschiedlichen Masse-zu-Ladung-Verhältnissen in einem einzigen MS2-Scan kombinieren. Wie oben diskutiert, werden in einigen Ausführungsformen mehrere Isotopologe, die eine unterschiedliche Masse (z. B. eine unterschiedliche Anzahl von Neutronen) aufweisen, der Probe in unterschiedlichen Mengen zugesetzt. Nach dem Erkennen, dass mindestens eines der Isotopologen aus dem Chromatographiesystem eluiert, können mehrere Isotopologen-MS2-Scans durchgeführt werden. In einigen Ausführungsformen können mehrere Isotopologen-MS2-Scans für jedes der Isotopologen durchgeführt werden. Als solches kann jeder der mehreren Isotopologen-MS2-Scans ein Isolationsfenster aufweisen, das einem jeweiligen Masse-zu-Ladung-Verhältnis eines der Isotopologen-Ionen entspricht. Es versteht sich, dass die Intensitäten der entsprechenden Fragmentpeaks für jeden Isotopologen-MS2-Scan die unterschiedlichen Mengen des der Probe zugesetzten Isotopologen widerspiegeln. Eine Quantifizierungskalibrierung kann aus den verschiedenen Peakintensitäten des Isotopologen-MS2-Scans erzeugt werden und basierend auf der Kalibrierung wird eine Quantifizierung des Zielanalyten aus der Intensität eines oder mehrerer Peaks in den Ziel-MS2-Scans bestimmt. In einigen Ausführungsformen können mehrere Isotopologen unterschiedlicher Masse eines Zielanalyten der Probe in unterschiedlichen Mengen zugesetzt werden, so dass sie unterschiedliche Konzentrationen in der Probe aufweisen. Die mehreren Isotopologen unterschiedlicher Masse können sich in ihrer Nennmasse oder exakten Masse unterscheiden.
  • Ein gemultiplexter MS2-Scan kann verwendet werden, um Proben zu analysieren, die mehrere Isotopologe eines Zielanalyten enthalten. In einigen Ausführungsformen kann ein gemultiplexter MS2-Scan durchgeführt werden, indem der Ziel-MS2-Scan mit mehreren Isotopologen-MS2-Scans der Isotopologen unterschiedlicher Masse gemultiplext wird. Der gemultiplexte MS2-Scan kann im Wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt werden, wobei dritte, vierte, fünfte usw. Gruppen von Vorläuferionen ebenfalls in dem gemultiplexten MS2-Scan enthalten sind. Da die Isotopologen unterschiedlicher Masse in unterschiedlichen Mengen oder Konzentrationen vorhanden sind, kann eine Quantifizierungskalibrierungskurve aus den Intensitäten der Isotopologen- und/oder Isotopologen-Fragmentpeaks aus dem gemultiplextem MS2-Scan generiert werden, die verwendet werden können, um den Zielanalyten in der Probe aus einem einzelnen gemultiplextem MS2-Scan genau zu quantifizieren.
  • Ein gemultiplexter Ziel-SIM-Scan kann nach einem ähnlichen Konzept wie der gemultiplexte Ziel-MS2-Scan durchgeführt werden. Als solche wird eine erste Gruppe von Vorläuferionen unter Verwendung eines ersten Isolationsfensters massenselektiert, das einem Masse-zu-Ladung-Verhältnis eines Zielanalytions entspricht. Die erste Gruppe von Vorläuferionen kann in einer Ionenfalle beispielsweise in der C-Falle 100 oder der Fragmentierungskammer 120 des Massenspektrometers von 1 gespeichert sein. Eine zweite Gruppe von Vorläuferionen kann dann unter Verwendung eines zweiten Isolationsfensters massenselektiert werden, das ein Masse-zu-Ladung-Verhältnis enthält, das für ein Isotopologen-Ion repräsentativ ist. Die zweite Gruppe von Vorläuferionen kann ähnlich wie die erste Gruppe gespeichert werden. Die erste und die zweite Gruppe von Vorläuferionen können dann zusammen in einem einzelnen gemultiplexten SIM-Scan einer Massenanalyse unterzogen werden. Somit kann durch Durchführen von einem gemultiplexten SIM-Scan ein Zielanalytion und mindestens ein Isotopologen-Ion unter Verwendung verschiedener Isolationsfenster getrennt massenselektiert werden, und anschließend wird ein einzelner gemultiplexter SIM-Scan zur Analyse des massenselektierten Zielanalytions und mindestens eines Isotopologen-Ions durchgeführt.
  • Bei einer vierten Option kann eine Echtzeitsuche verwendet werden, um Isotopologe, beispielsweise Peptide, im laufenden Betrieb zu erkennen. Dies kann durch Analysieren der MS1-Scandaten auf Massenspektralpeaks erfolgen, die den bekannten Masse-zu-Ladung-Verhältnissen der hinzugefügten Isotopologen-Ionen oder einem Isotopenmuster der Isotopologen-Ionen entsprechen. Nach der Erkennung der Isotopologen (Peptide) kann ein gemultiplexter DIA-Scan zur Quantifizierung ausgelöst werden.
  • 3 zeigt eine Ausführungsform eines Massenspektrometrieverfahrens, das an dem in 1 gezeigten Massenspektrometer durchgeführt werden kann und das viele der obigen Merkmale veranschaulicht.
  • In einem ersten Schritt des in 3 gezeigten Verfahrens, das auf einer LC-MS-Analyse einer Probe basiert, die Zielanalyten enthält, werden die Zielanalytenidentitäten in das Massenspektrometer eingegeben und Isotopologe der Zielanalyten werden zu der Probe hinzugefügt. In diesem Beispiel sind die Zielanalyten Peptidsequenzen, von denen erwartet wird, dass sie in der Probe vorhanden sind. Mit den gegebenen Peptidsequenzen werden theoretische Isotopenmuster mit und ohne Isotopenmarkierung für verschiedene Ladungszustände der Peptide, z. B. 2+, 3+ und 4+, unter Verwendung bekannter Verfahren simuliert. Die theoretischen m/z-Werte für jeden Ladezustand können berechnet werden.
  • In einem zweiten Schritt wird, wenn die Probe aus dem Chromatographiesystem eluiert, ein MS1-Scan 100 des Vorläufermassenbereichs 400-1210 Th durchgeführt. Die theoretischen Vorläuferinformationen über m/z-Werte von Massenspektralpeaks und Isotopenmustern aus dem ersten Schritt werden verwendet, um die theoretischen Massenspektralpeaks für das Isotopolog im laufenden Betrieb mit den im MS1-Spektrum erfassten Massenspektralpeaks abzugleichen. Die Peakmerkmale eines Isotopologen-Isotopenmusters und die genauen Massen der detektierten Merkmale in der MS1 können als übereinstimmend angesehen werden, wenn beispielsweise der Massenfehler zwischen ihnen weniger als 5 ppm beträgt und die Isotopenmusterübereinstimmung basierend auf dem theoretischen Isotopenmuster besser als 80 % ist. Optional wird eine Übereinstimmungsfunktion in eine interne dynamische Überwachungsliste zur kontinuierlichen Überwachung in den kommenden MS2-DIA-Scans aufgenommen, in denen die m/z-Werte der Vorläufer enthalten sind. In dem Beispiel von 3 wird ein Vorläufer 110 m/z 500,5 (2+) eines Isotopologenpeptids aus dem MS1-Scan durch Abgleichen detektiert.
  • In einem dritten Schritt kann aus der Peptidsequenzinformation ein theoretisches MS2-Spektrum in silico erzeugt werden, das für das On-the-Fly-Matching oder die Echtzeitsuche verwendet wird, indem das theoretische MS2-Spektrum mit dem im DIA-Verfahren für den detektierten Vorläufer erfassten MS2-Spektrum verglichen wird. Wenn der DIA-MS2-Scan 120 für die detektierte Vorläufermasse (500,5 m/z) in der dynamischen Liste des zweiten Schritts durchgeführt wird, werden die Fragmente des detektierten Isotopologenpeptids aus seinem theoretischen MS2-Spektrum mit den Peaks des erfassten DIA-MS2-Scans verglichen.
  • In der Ausführungsform von 3 werden DIA-MS2-Scans, die Teil der DIA-Methodik sind, in der Reihenfolge von dem niedrigen Masse-zu-Ladung-Verhältnis zu einem hohen Masse-zu-Ladung-Verhältnis nach der Analyse des Zielanalyten in der MS1-Domäne als Teil der DIA-Methodik durchgeführt. Natürlich kann in anderen Ausführungsformen der DIA-MS2-Scan, der die Isotopologenpeptide enthält, priorisiert und kurz nach (z. B. unmittelbar) nach dem MS1-Scan durchgeführt werden, wobei die Peakmerkmale eines Isotopologen-Isotopenmusters und die genauen Massen der detektierten Merkmale in der MS1 als übereinstimmend angesehen werden können.
  • In einem vierten Schritt wird die Erkennung des Isotopologenpeptids aus dem MS1-Scan bestätigt, wenn das DIA-MS2-Spektrum mit dem theoretischen MS2-Spektrum des interessierenden Isotopologenpeptids übereinstimmt. Das MS2-Übereinstimmungskriterium umfasst eine oder die gesamte Anzahl übereinstimmender Fragmente, den Massenfehler der Fragmente und den Ladungszustand der Fragmente usw. Ein gemultiplexter Ziel-MS2-Scan 130 mit schmalem Fenster wird dann sofort unter Verwendung separater Isolationsfenster 141, 142 (jeweils 2 m/z breit) sowohl für das Isotopologenpeptid 141 als auch für das entsprechende endogene Zielpeptid 142 ausgelöst. Für die Massenselektion der Isotopologenpeptidionen 141 wird die loneninjektionszeit auf relativ niedrig eingestellt (z. B. 10 ms), da ein ausreichendes Signal der zugesetzten Isotopologenpeptide vorliegt. Für die Massenselektion des endogenen Zielpeptids 142 wird zur Sicherstellung der Quantifizierungsempfindlichkeit die loneninjektionszeit auf relativ hoch eingestellt (z. B. 100 ms). Dementsprechend wird die Gesamtinjektionszeit des Isotopologs und der endogenen Peptide vor der Fragmentierung so eingestellt, dass sie ungefähr parallel zur Detektionszeit des Orbitrap-Massenanalysators (z. B. 128 ms) verläuft, um die Arbeitszyklusgeschwindigkeit zu verbessern.
  • In der Ausführungsform von 3 wird der gemultiplexte MS2-Scan nach der Analyse des Zielanalyten in der MS2-Domäne als Teil der DIA-Methodik durchgeführt. Natürlich kann in anderen Ausführungsformen der Ziel-MS2-Scan (z. B. der gemultiplexte MS2-Scan) priorisiert und kurz nach (z. B. unmittelbar) nach dem MS1-Scan durchgeführt werden, wobei die Peakmerkmale eines Isotopologen-Isotopenmusters und die genauen Massen der erfassten Merkmale in der MS1 als übereinstimmend angesehen werden können.
  • In einem fünften Schritt werden nach dem ersten gemultiplexten Ziel-MS2-Scan 130 die DIA-Scans gemäß der DIA-Methodik fortgesetzt. Wie in 3 gezeigt, umfasst die DIA-Methodik mehrere MS2-Scans 100, 101, 102, 103 und mindestens eine Reihe von MS2-Scans 150. Um eine gute Quantifizierungsgenauigkeit sicherzustellen, werden mindestens 7-8 Datenpunkte für das endogene Peptid aus gemultiplexten Ziel-MS2-Scans 130, 131, 132 erfasst und werden über den chromatographischen Peak für das Isotopolog und die endogenen Peptide 141, 142 ausgelöst. Basierend auf einer typischen chromatographischen Peakbreite für Peptide von ungefähr 16 s wird daher der gemultiplexte Ziel-MS2-Scan desselben Paares von Isotopologen und endogenen Peptiden alle 2 s wiederholt, bis das Isotopologen-Peptid im MS1-Scan nicht mehr detektierbar ist oder der letzte gemultiplexte MS2-Scan einer festen Anzahl von gemultiplexten Scans erfasst wird.
  • Wie oben erwähnt, kann in einigen Ausführungsformen der Offenbarung ein DIA-MS2-Scan einer DIA-Methodik, die die Isotopologenpeptide enthält, priorisiert und kurz danach (z. B. unmittelbar) nach dem MS1-Scan durchgeführt werden, wobei die Peakmerkmale eines Isotopologen-Isotopenmusters und die genauen Massen der erfassten Merkmale in dem MS1 als übereinstimmend angesehen werden können. Darüber hinaus kann in einigen Ausführungsformen der Ziel-MS2-Scan (z. B. der gemultiplexte MS2-Scan) priorisiert und kurz danach (z. B. unmittelbar) nach dem MS1-Scan durchgeführt werden, wobei die Peakmerkmale eines Isotopologen-Isotopenmusters und die genauen Massen der erfassten Merkmale in dem MS1 als übereinstimmend angesehen werden können. Als solches versteht es sich, dass in einigen Ausführungsformen der Ziel-MS2-Scan durchgeführt werden kann, indem ein MS2-Scan der DIA-Methodik modifiziert wird. Damit der Ziel-MS2-Scan zusätzliche Quantifizierungsdaten für den Zielanalyten liefert, kann der Ziel-MS2-Scan eine erhöhte Injektionszeit und/oder ein schmaleres Zielisolationsfenster im Vergleich zum nicht modifizierten DIA-MS2-Scan der DIA-Methodik aufweisen. Als solches können in dieser Ausführungsform Ziel-MS2-Scans durch eine Modifikation eines geplanten MS2-Scans der DIA-Methodik durchgeführt werden. In anderen Ausführungsformen können Zielscans zusätzlich zu den geplanten Scans der DIA-Methodik durchgeführt werden (d. h. zusätzliche Ziel-MS2-Scans und/oder zusätzliche Ziel-SIM-Scans).
  • Dementsprechend können Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung verwendet werden, um ein Massenspektrometrieverfahren bereitzustellen, das einer DIA-Methodik folgt, während gleichzeitig eine gezielte Erkennung und/oder Quantifizierung eines oder mehrerer vorab identifizierter Zielanalyten ermöglicht wird. Das Massenspektrometrieverfahren eignet sich besonders zur Erkennung und/oder Quantifizierung eines oder mehrerer Zielanalyten mit geringer Menge. Insbesondere können die Verfahren und Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung mit einem hochauflösenden MS1-basierten Quantifizierungs-DIA-Workflow kombiniert werden, der ein hohes Vertrauen in die Erkennung und eine bessere Genauigkeit der Quantifizierung liefern kann, als bisher im Stand der Technik vorgenommene Ansätze. Die Erfindung ist in Bereichen wie z. B. Genmutationsdetektion, Genom- und/oder Proteomsequenzierung, prognostische und/oder diagnostische Tests von Krebs, Detektion und Quantifizierung bekannter klinischer Marker und beispielsweise Arzneimittelwirkungstests vorteilhaft.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Patentliteratur
    • GB 2559395 A [0007, 0028]
    • US 20180350576 A1 [0083]

Claims (25)

  1. Massenspektrometrieverfahren, umfassend: Hinzufügen eines Isotopologs eines Zielanalyten zu einer Probe; Ionisieren der Probe und des Isotopologs beim Eluieren aus einem Chromatographiesystem unter Bildung von Vorläuferionen; Massenanalyse der Vorläuferionen unter Verwendung einer datenunabhängigen Erfassungsmethodik (DIA), umfassend das Durchführen von Massenanalyse-Scans in der MS1-Domäne und das Durchführen von Massenanalyse-Scans in der MS2-Domäne; wobei nach dem Erkennen, dass das Isotopolog aus dem Chromatographiesystem eluiert, das Verfahren ferner das Durchführen von mehreren Zielscans umfasst, die jeweils ein Zielisolationsfenster mit einem für den Zielanalyten repräsentativen Masse-zu-Ladung-Verhältnis über die Dauer eines chromatographischen Peaks des Isotopologs aufweisen, um den Zielanalyten mindestens entweder zu erkennen oder zu quantifizieren, wobei die Zielscans konfiguriert sind, um zusätzliche Quantifizierungsdaten für den Zielanalyten bereitzustellen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielscans in der MS1-Domäne und/oder der MS2-Domäne durchgeführt werden.
  3. Massenspektrometrieverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Erkennen, dass das Isotopolog aus dem Chromatographiesystem eluiert, das Erkennen des Isotopologs zumindest auf der Grundlage der Massenanalyse-Scans, die in der MS1-Domäne durchgeführt wurden, umfasst.
  4. Massenspektrometrieverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jeder Zielscan ein Zielisolationsfenster aufweist, das ein für den Zielanalyten repräsentatives Masse-zu-Ladung-Verhältnis und ein für das Isotopolog repräsentatives Masse-zu-Ladung-Verhältnis enthält.
  5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mehreren Zielscans mehrere Ziel-MS2-Scans und/oder mehrere Selected Ion Monitoring (SIM) - Scans umfassen.
  6. Massenspektrometrieverfahren nach Anspruch 5, wobei das Durchführen von jedem Ziel-MS2-Scan umfasst: Massenselektieren der Vorläuferionen mit einem Masse-zu-Ladung-Verhältnis innerhalb des Zielisolationsfensters und Fragmentierung der Vorläuferionen innerhalb des Zielisolationsfensters, um Zielfragmentionen zu bilden; und Massenanalysieren der Fragment-Zielionen.
  7. Massenspektrometrieverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei nach dem Erkennen, dass das Isotopolog aus dem Chromatographiesystem eluiert, das Verfahren ferner das Durchführen von Isotopologen-Scans mit einem Isotopologen-Isolationsfenster, einschließlich eines für das Isotopolog repräsentativen Masse-zu-Ladung-Verhältnisses über die Dauer eines chromatographischen Peaks des Isotopologs zur Quantifizierung des Isotopologs umfasst, wobei die Isotopologen-Scans mehrere Isotopologen-MS2-Scans und/oder mehrere Isotopologen-SIM-Scans umfassen.
  8. Massenspektrometrieverfahren nach Anspruch 7, wobei das Durchführen von jedem Isotopologen-MS2-Scan umfasst: Massenselektieren der Vorläuferionen mit einem Masse-zu-Ladung-Verhältnis innerhalb des Isotopologen-Isolationsfensters und Fragmentieren der Vorläuferionen innerhalb des Isotopologen-Isolationsfensters zur Bildung von Isotopologen- Fragmentionen; und Massenanalysieren der Isotopologen-Fragmentionen.
  9. Massenspektrometrieverfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei jeder Ziel-MS2-Scan mit einem Isotopologen-MS2-Scan gemultiplext und/oder jeder Ziel-SIM-Scan mit einem Isotopologen-SIM-Scan gemultiplext wird.
  10. Massenspektrometrieverfahren nach Anspruch 9, wobei das Multiplexen eines Ziel-MS2-Scans mit einem Isotopologen-MS2-Scan umfasst: Kombinieren der Vorläuferionen innerhalb des Zielisolationsfensters für jeden Ziel-MS2-Scan mit den Vorläuferionen innerhalb des Isotopologen-Isolationsfensters, um gemultiplexte Vorläuferionen zu bilden; Fragmentieren der gemultiplexten Vorläuferionen, um gemultiplexte Fragmentionen zu bilden; und Massenanalysieren der gemultiplexten Fragmentionen.
  11. Massenspektrometrieverfahren nach Anspruch 7, wobei das Multiplexen eines Ziel-MS2-Scans mit einem Isotopologen-MS2-Scan umfasst: Fragmentieren der Vorläuferionen innerhalb des Zielisolationsfensters für jeden Ziel-MS2-Scan und Fragmentieren der Vorläuferionen innerhalb des Isotopologen-Isolationsfensters; Speichern der Fragmentionen aus beiden Fenstern zusammen, um gemultiplexte Fragmentionen zu bilden; und Massenanalysieren der gemultiplexten Fragmentionen.
  12. Massenspektrometrieverfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das Multiplexen eines Ziel-SIM-Scans mit einem Isotopologen-SIM-Scan umfasst: Kombinieren der Vorläuferionen innerhalb des Zielisolationsfensters für jeden Ziel-SIM-Scan mit den Vorläuferionen innerhalb des Isotopologen-Isolationsfensters, um gemultiplexte Vorläuferionen zu bilden; und Massenanalysieren der gemultiplexten Vorläuferionen.
  13. Massenspektrometrieverfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, wobei das Hinzufügen eines Isotopologs eines Zielanalyten zu der Probe umfasst: Hinzufügen einer ersten Menge eines ersten Isotopologen des Zielanalyten, der eine erste Masse aufweist, zu der Probe; und Hinzufügen einer zweiten Menge eines zweiten Isotopologs des Zielanalyten zu der Probe, wobei sich die zweite Menge und die zweite Masse von der ersten Menge bzw. der ersten Masse unterscheiden, wobei nachdem Erkennen, dass das erste und/oder das zweite Isotopolog aus dem Chromatographiesystem eluiert, das Verfahren umfasst: Durchführen von mehreren ersten Isotopologen-Scans mit einem ersten Isotopologen-Isolationsfenster, einschließlich eines Masse-zu-Ladung-Verhältnisses, das für das erste Isotopolog repräsentativ ist; Durchführen von mehreren zweiten Isotopologen-Scans mit einem zweiten Isotopologen-Isolationsfenster, einschließlich eines Masse-zu-Ladung-Verhältnisses, das für das zweite Isotopolog repräsentativ ist; wobei die ersten und zweiten Isotopologen-Scans Isotopologen-MS2-Scans und/oder Isotopologen-SIM-Scans sind und Erzeugen einer Quantifizierungskalibrierung aus den ersten Isotopologen-Scans, den zweiten Isotopologen-Scans und den Zielscans;
  14. Massenspektrometrieverfahren nach Anspruch 13, wobei jeder Zielscan mit einem jeweiligen ersten und zweiten Isotopologen-Scan gemultiplext wird.
  15. Massenspektrometrieverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei bei Durchführung die Ziel- und/oder Isotopologen-Scans über die Dauer des chromatographischen Peaks des Isotopologs in der gesamten DIA-Methodik verschachtelt werden.
  16. Massenspektrometrieverfahren nach Anspruch 15, wobei die Zielscans und/oder die Isotopologen-Scans in Intervallen von nicht mehr als 2 Sekunden während der gesamten DIA-Methodik verschachtelt sind.
  17. Massenspektrometrieverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zielisolationsfenster für jeden Zielscan nicht größer als 3 Th; und/oder das Isotopologen-Isolationsfenster für jeden Isotopologen-Scan nicht größer als 3 Th ist.
  18. Massenspektrometrieverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Massenanalysieren der Probe unter Verwendung einer DIA-Methodik (Data Independent Acquisition) umfasst: Durchführen von mehreren MS1-Scans der Vorläuferionen; und Durchführen von mehreren MS2-Scans der Vorläuferionen.
  19. Massenspektrometrieverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Massenanalyse der Probe unter Verwendung einer DIA-Methodik umfasst; Auswählen eines interessierenden Vorläufermassenbereichs für die zu analysierende Probe; Durchführen von mehreren MS1-Scans, wobei jeder der MS1-Scans umfasst: Massenanalyse der Vorläuferionen über den interessierenden Vorläufermassenbereich unter Verwendung eines Massenanalysators, der mit einer ersten, relativ höheren Auflösung von mindestens 50.000 bei m/z = 200 amu betrieben wird, zur Erkennung und/oder Quantifizierung der Probe in der MS1-Domäne über den interessierenden Vorläufermassenbereich; und Durchführen von einer Reihe von MS2-Scans durch: Segmentieren des interessierenden Vorläufermassenbereichs in mehrere Vorläufermassenbereichssegmente, wobei für jedes Vorläufermassenbereichssegment: die Vorläuferionen innerhalb dieses Massenbereichssegments fragmentiert werden und Durchführen eines MS2-Scans des Fragment-Massenbereichssegments mit dem Massenanalysator, der mit einer zweiten, relativ niedrigeren Auflösung betrieben wird, so dass jedes der Fragment-Probensegmente über den interessierenden Vorläufermassenbereich in der MS2-Domäne fragmentiert und gescannt wird, wobei das Durchführen der MS1-Scans während des Durchführens jeder der Reihen von MS2-Scans verschachtelt ist, so dass die MS1-Scans ein Massenchromatogramm der Probe liefern.
  20. Massenspektrometrieverfahren nach Anspruch 19, wobei mindestens drei, mindestens fünf oder mindestens sieben MS1-Scans in der Zeit durchgeführt werden, die zum Durchführen von einer Reihe von MS2-Scans benötigt wird.
  21. Massenspektrometrieverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der MS1-Scan und/oder der MS2-Scan unter Verwendung eines Orbitalfallen-Massenanalysators durchgeführt werden.
  22. Massenspektrometer zur Durchführung einer datenunabhängigen Erfassungsmassenspektrometrie an einer Probe, zu der ein Isotopolog eines Zielanalyten hinzugefügt wird, wobei das Massenspektrometer umfasst: eine Ionisationsquelle zur Erzeugung von mehreren Vorläuferionen; einen Massenanalysator; eine Fragmentierungsvorrichtung; einen Massenselektor; ein Chromatographiesystem, das konfiguriert ist, um Moleküle der Probe zu trennen, die dem Massenselektor nachgelagert sind; und eine Steuerung, die konfiguriert ist, um zu: bewirken, dass die Ionisationsquelle die Probe und das Isotopolog ionisiert, wenn sie aus einem Chromatographiesystem eluieren, um Vorläuferionen zu bilden; bewirken, dass das Massenspektrometer die Vorläuferionen unter Verwendung einer datenunabhängigen Erfassungsmethodik (DIA) einer Massenanalyse unterzieht, umfassend das Durchführen von Massenanalyse-Scans in der MS1-Domäne und das Durchführen von Massenanalyse-Scans in der MS2-Domäne; erkennen, ob das Isotopolog aus dem Chromatographiesystem eluiert, auf dem die Steuerung weiter konfiguriert ist; bewirken, dass das Massenspektrometer mehrere Zielscans durchführt, die jeweils ein Zielisolationsfenster aufweisen, einschließlich eines Masse-zu-Ladung-Verhältnisses, das für den Zielanalyten repräsentativ ist, über eine Dauer eines chromatographischen Peaks des Isotopologs für die Erkennung und/oder Quantifizierung des Zielanalyten, wobei die Zielscans konfiguriert sind, um zusätzliche Quantifizierungsdaten für den Zielanalyten bereitzustellen.
  23. Massenspektrometer nach Anspruch 22, wobei die Steuerung ferner konfiguriert ist, um das Massenspektrometer zu veranlassen, die Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 21 durchzuführen.
  24. Computerprogramm, umfassend Anweisungen, um das Massenspektrometer nach Anspruch 22 oder Anspruch 23 zu veranlassen, das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 auszuführen.
  25. Computerlesbares Medium, auf dem das Computerprogramm nach Anspruch 24 gespeichert ist.
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