DE112020003212T5

DE112020003212T5 - Verfahren und Vorrichtung für die Massenspektrometrie

Info

Publication number: DE112020003212T5
Application number: DE112020003212.4T
Authority: DE
Inventors: Denis CHERNYSHEV; Nicolaie Eugen DAMOC; Christian Thöing; Jan-Peter Hauschild; Alexander Makarov
Original assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Current assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Priority date: 2019-07-04
Filing date: 2020-06-24
Publication date: 2022-04-07
Also published as: WO2021001246A1; GB2585372B; GB2585372A; GB201909609D0

Abstract

Ein Verfahren zur Massenspektrometrie und ein Massenspektrometer werden bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Ionisierung einer Probe zur Erzeugung einer Vielzahl von Vorläuferionen, die Durchführung eines ersten MS1-Scans und die Durchführung eines zweiten MS1-Scans. Die Durchführung des ersten MS1-Scans umfasst: Transportieren eines ersten Satzes der Vorläuferionen zu einem Massenanalysator unter Verwendung einer lonentransportvorrichtung, die mit einer ersten Einstellung betrieben wird, und Massenanalyse des ersten Satzes der Vorläuferionen. Die Durchführung des zweiten MS1-Scans umfasst den Transport eines zweiten Satzes von Vorläuferionen zu einem Massenanalysator unter Verwendung der lonentransportvorrichtung, die mit einer zweiten Einstellung betrieben wird, und die Massenanalyse des zweiten Satzes von Vorläuferionen. Die erste Einstellung und die zweite Einstellung der lonentransportvorrichtung sind so beschaffen, dass eine Energie, die dem zweiten Satz von Vorläuferionen durch die lonentransportvorrichtung zugeführt wird, geringer ist als die Energie, die dem ersten Satz von Vorläuferionen durch die lonentransportvorrichtung zugeführt wird. Das Verfahren umfasst ferner die Bestimmung, ob ein Massenspektralpeak in mindestens einem der ersten MS1-Abtastung oder der zweiten MS1-Abtastung auf der Grundlage der Intensitäten der Massenspektralpeaks der ersten und zweiten MS1-Abtastung auf einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak hinweist.

Description

Gebiet der Offenlegung
Diese Offenlegung bezieht sich auf Methoden der Massenspektrometrie und ein Massenspektrometer. Insbesondere bezieht sich diese Offenlegung auf Verfahren der datenabhängigen Massenspektrometrie und der datenunabhängigen Massenspektrometrie.
Hintergrund
Die Massenspektrometrie ist eine seit langem etablierte Technik zur Identifizierung und Quantifizierung von oft komplexen Gemischen großer organischer Moleküle. In den letzten Jahren wurden Techniken entwickelt, die die Analyse eines breiten Spektrums biologischer und nicht-biologischer Materialien ermöglichen und in Bereichen wie der Strafverfolgung (z. B. Identifizierung von Drogen und Sprengstoffen), der Umweltüberwachung, der Lebensmittelsicherheit, der pharmazeutischen und anderen wissenschaftlichen Forschung sowie der Biologie (z. B. in der Proteomik, der Untersuchung einfacher und komplexer Zusammensetzungen von Proteinen, mit Anwendungen in der Arzneimittelforschung, der Identifizierung von Krankheiten usw.) Anwendung finden.
Proteine, die aus einer großen Anzahl von Aminosäuren bestehen, haben in der Regel ein hohes Molekulargewicht. Daher ist die genaue Identifizierung und Quantifizierung des intakten Proteins durch direkte massenspektrometrische Messung eine Herausforderung. Es ist daher bekannt, die Vorläuferprotein-Ionen zu fragmentieren (Top-down-Proteomik). Es ist eine Vielzahl von Fragmentierungstechniken bekannt, die dazu führen können, dass aus den Vorläufer-Ionen unterschiedliche Fragment-Ionen entstehen. Außerdem kann der Fragmentierungsmechanismus durch unterschiedliche angewandte Fragmentierungsenergien beeinflusst werden. Proben, die Proteine beinhalten, können auch durch Verdauung aufgespalten werden, um kleinere Peptide zu erzeugen, die dann mittels Massenspektrometrie analysiert werden (Bottom-up-Proteomik), wobei häufig auch eine Fragmentierung der Peptide zur Unterstützung der Identifizierung erfolgt.
Die Tandem-Massenspektrometrie ist eine Methode der Massenspektrometrie, bei der aus einer Probe Vorläuferionen erzeugt werden, die von einem ersten Massenfilter oder Massenanalysator ausgewählt und dann in eine Fragmentierungskammer geleitet werden. Die Vorläuferionen in der Fragmentierungskammer werden anschließend fragmentiert, um Produkt-Ionen zu bilden. Die Fragmentierung der Vorläuferionen kann durch Zusammenstöße mit einem Kollisionsgas in der Kammer oder durch andere Techniken wie Elektronentransferdissoziation oder Photodissoziation erfolgen. Die Produkt-Ionen werden dann mit einem Massenanalysator analysiert. Die sich daraus ergebenden Produkt-Ionen-Spektren können zur Bestimmung der chemischen Identität und/oder Struktur des Vorläufer-Ions und damit zur Identifizierung des Vorläufers verwendet werden.
Die Analyse von Proben kann grob in eine datenunabhängige Analyse/Akquisition (DIA) und eine datenabhängige Analyse/Akquisition (DDA) unterteilt werden.
Bei der DIA wird versucht, die molekulare Struktur von Probenmolekülen mit Hilfe eines Ansatzes zu bestimmen, bei dem der erste Massenfilter in einem Tandem-Massenspektrometer so eingestellt wird, dass alle Ionen innerhalb eines ausgewählten m/z-Bereichs durchgeleitet werden. Dieser Bereich von Vorläuferionen wird dann in der zweiten Stufe des Tandem-Massenspektrometers fragmentiert und die resultierenden Fragmente werden anschließend in der dritten Stufe des Tandem-Massenspektrometers analysiert.
Im Gegensatz dazu identifiziert die DDA eine feste Anzahl von Vorläuferionen-Spezies, wählt Vorläuferionen mit einem bestimmten Masse-Ladungs-Verhältnis aus und analysiert diese mittels Tandem-Massenspektrometrie. Die Bestimmung, welche Vorläuferionen-Spezies bei der DDA von Interesse sind, kann auf einer Intensitätsrangliste („TopN“-Methode) beruhen (z. B. die zehn häufigsten Spezies, wie sie von den Peaks in einem Vorläufer-Massenspektrum beobachtet werden, im Folgenden als „MS1“ bezeichnet), oder durch Festlegung einer „Einschlussliste“ von Vorläufer-Massenspektralpeaks (z. B. durch Benutzerauswahl), von denen unabhängig von der Intensitätsrangliste des Peaks im Vorläufer-Massenspektrum (MS1) immer Fragmentspektren - im Folgenden als „MS2“ bezeichnet - erfasst werden. Andernfalls kann eine „Ausschlussliste“ von Peaks in MS1 definiert werden, z. B. durch einen Benutzer, z. B. auf der Grundlage von Vorkenntnissen über die erwarteten Probeninhalte.
Dementsprechend ist es insbesondere für DDA-Methoden wünschenswert, Vorläuferionen im MS1-Massenspektrum für die weitere Analyse genau zu identifizieren.
In einem Tandem-Massenspektrometer können verschiedene lonentransportvorrichtungen vorhanden sein, um Ionen zu manipulieren und durch das Tandem-Massenspektrometer zu leiten. Typischerweise verwenden Ionentransportvorrichtungen HF- und/oder DC-Felder, um die Ionen zu manipulieren und zu leiten. In einigen Fällen kann die Verwendung dieser elektrischen Felder zu einer gewissen Fragmentierung von (Vorläufer-)Ionen führen. Solche Fragmentierungsereignisse können an jeder Stelle des Massenspektrometers zwischen der lonenquelle und dem Massenanalysator auftreten, z. B. in den lonentransportvorrichtungen, die Vorläuferionen in eine Fragmentierungskammer und/oder einen Massenanalysator leiten. Dadurch können allgemein unerwünschte Fragment-Ionen in die Probe der zu analysierenden Vorläufer-Ionen eingebracht werden, die nicht repräsentativ für die zu analysierende Probe sind. Dies verringert den dynamischen Bereich für die Vorläuferionenspektren (MS1), da unerwünschte Fragment-Ionen die Kapazität des Analysators in Anspruch nehmen, die für Vorläuferionen verwendet werden könnte. Darüber hinaus verbrauchen Fragment-Ionen wertvolle Gerätezeit für ihre Identifizierung oder Bestätigung durch SIM-, MS/MS- und MSⁿ-Experimente im Falle der datenabhängigen Analyse (DDA). Im Allgemeinen erhöht das Vorhandensein von unbeabsichtigten Fragment-Ionen in MS1-Spektren die Komplexität der Datenverarbeitung nach der Erfassung und der Interpretation der oben genannten Experimente.
Eine bekannte Methode zur Entdeckung von Vorläuferionen ist in US-B-6,586,727 offenbart, die ein Verfahren offenbart, bei dem zwei MS2-Massenspektren erhalten werden, eines mit einer Kollisionszelle, die in einem Hoch-Fragmentierungsmodus betrieben wird, und das andere, bei dem die Kollisionszelle in einem Niedrig-Fragmentierungsmodus betrieben wird. Mindestens ein in Frage kommendes Vorläuferion kann identifiziert werden, indem Ionen mit einem bestimmten Masse-Ladungs-Verhältnis im Massenspektrum mit hoher Fragmentierung mit der Intensität von Ionen mit demselben Masse-Ladungs-Verhältnis im Massenspektrum mit niedriger Fragmentierung verglichen werden. Wenn ein Peak mit hoher Intensität im Spektrum mit geringer Fragmentierung, aber nicht im Spektrum mit hoher Fragmentierung gefunden wird, ist es wahrscheinlich, dass der Peak ein Vorläuferion darstellt.
US-B-6,717,130 offenbart ein Verfahren, bei dem eine Kollisionszelle wiederholt zwischen einem im Wesentlichen Fragmentierungsbetrieb und einem im Wesentlichen Nicht-Fragmentierungsbetrieb umgeschaltet wird. Vorläufer- und Fragment-Ionen können auf der Grundlage ihrer nahe beieinander liegenden Elutionszeiten identifiziert und zugeordnet werden.
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, Methoden der Massenspektrometrie zu verbessern, die Vorläuferionen identifizieren. Insbesondere zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, Probleme im Zusammenhang mit der Fragmentierung durch die Ionenoptik eines Massenspektrometers zu lösen.
Zusammenfassung der Offenbarung
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Massenspektrometrie bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Ionisierung einer Probe zur Erzeugung einer Vielzahl von Vorläuferionen, die Durchführung eines ersten MS1-Scans und die Durchführung eines zweiten MS1-Scans. Die Durchführung des ersten MS1-Scans umfasst: Transportieren eines ersten Satzes der Vorläuferionen zu einem Massenanalysator unter Verwendung einer lonentransportvorrichtung, die mit einer ersten Einstellung betrieben wird, und Massenanalyse des ersten Satzes der Vorläuferionen. Die Durchführung des zweiten MS1-Scans umfasst den Transport eines zweiten Satzes von Vorläuferionen zu einem Massenanalysator unter Verwendung der lonentransportvorrichtung, die mit einer zweiten Einstellung betrieben wird, und die Massenanalyse des zweiten Satzes von Vorläuferionen. Die erste Einstellung und die zweite Einstellung der lonentransportvorrichtung sind so vorgesehen, dass eine Energie, die dem zweiten Satz von Vorläuferionen durch die lonentransportvorrichtung zugeführt wird, geringer ist als die Energie, die dem ersten Satz von Vorläuferionen durch die lonentransportvorrichtung zugeführt wird. Das Verfahren umfasst ferner die Bestimmung, ob ein Massenspektralpeak in mindestens einem der ersten MS1-Abtastung oder der zweiten MS1-Abtastung auf der Grundlage der Intensitäten der Massenspektralpeaks der ersten und zweiten MS1-Abtastung auf einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak hinweist.
Die beteiligten Erfinder haben erkannt, dass die „Standard“-Einstellungen einer oder mehrerer lonentransportvorrichtungen, die für den Transport von Ionen zu einem Massenanalysator verwendet werden, in der Regel optimiert sind, um die Übertragung der von diesen Vorrichtungen transportierten Ionen zu verbessern oder zu maximieren. Ein Merkmal solcher „Standard“-Einstellungen ist, dass die interne Energie des Ions, die in den lonentransportvorrichtungen akkumuliert wird, dazu führen kann, dass einige besonders instabile Ionen (d. h. Ionen, die für eine Fragmentierung bei relativ niedriger Energie anfällig sind) fragmentieren. In einigen Ausführungsformen kann zum Beispiel die Stärke der elektrischen Felder in einer lonentransportvorrichtung (d. h. die Einstellungen des elektrischen Feldes) optimiert werden, um die Übertragung der von der Vorrichtung transportierten Ionen zu verbessern oder zu maximieren.
Es wird deutlich, dass die lonentransportvorrichtungen bei „Standard“-Einstellungen nicht so konfiguriert sind, dass sie absichtlich eine Fragmentierung der Ionen herbeiführen (da ein MS1-Scan durchgeführt wird), sondern dass die Fragmentierung der Ionen ein unerwünschter Nebeneffekt der zum Transport der Ionen verwendeten Energie ist. In einigen Ausführungsformen enthalten die lonentransportvorrichtungen daher keine Fragmentierungskammer, oder die lonentransportvorrichtungen enthalten eine Fragmentierungskammer, die nicht für die Fragmentierung von Ionen während der MS1-Scans konfiguriert ist. In einigen Ausführungsformen befinden sich die lonentransportvorrichtungen stromaufwärts von einer Fragmentierungskammer, d. h. zwischen einer lonenquelle und einer Fragmentierungskammer.
Die Erfinder haben auch erkannt, dass die lonentransportvorrichtungen so konfiguriert werden können, dass die Ionen im zweiten MS1-Scan mit einer geringeren Energiemenge beaufschlagt werden als im ersten Scan. Beispielsweise kann der erste MS1-Scan mit „Standard“-Einstellungen durchgeführt werden, während der zweite MS1-Scan mit „weichen“ Einstellungen durchgeführt wird, so dass den Ionen eine geringere Energiemenge zugeführt wird als bei „Standard“-Einstellungen.
Sogenannte „Soft“-Einstellungen für lonentransportvorrichtungen können die (unerwünschte) Fragmentierung von Ionen, die aus dem Ionentransport durch lonentransportvorrichtungen resultiert, reduzieren (oder eliminieren), indem die eingesetzte Energiemenge verringert wird. Eine Folge der Optimierung der „weichen“ Einstellungen der lonentransportvorrichtungen im Hinblick auf eine geringere Fragmentierung ist, dass der lonenstrom (Anzahl der Ionen pro Zeiteinheit) der von diesen Vorrichtungen transportierten Ionen verringert werden kann. Eine solche Verringerung kann durch eine Verlängerung der Injektionszeit zur Akkumulation von Ionen für die Massenanalyse kompensiert werden. Wenn jedoch die Experimentierzeit begrenzt ist, ist es möglich, dass die maximal zulässige Injektionszeit erreicht wird, bevor die gleiche Anzahl von Ionen wie bei den Standardeinstellungen gesammelt wird. Daher können bei „weichen“ Einstellungen weniger Ionen der anschließenden Massenanalyse unterzogen werden als bei den Standardeinstellungen. Daher ist das Signal-Rausch-Verhältnis von Massenspektren, die von einem mit „weichen“ Einstellungen betriebenen lonentransportgerät erzeugt werden, möglicherweise nicht so hoch wie das Signal-Rausch-Verhältnis von Massenspektren, die mit einem lonentransportgerät erzeugt werden, das bei einer ähnlichen lonenakkumulationszeit mit Standardeinstellungen betrieben wird. Es ist wichtig zu beachten, dass weder beim ersten noch beim zweiten MS1-Scan das Massenspektrometer (z. B. die lonentransportvorrichtungen) so konfiguriert ist, dass die Erzeugung von Fragmenten maximiert wird, anders als bei einem MS2-Scan.
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, die Analyse von Massenspektralpeaks eines MS1-Scans zu verbessern, indem zwei MS1-Scans mit unterschiedlichen lonentransportenergien durchgeführt werden und bestimmt wird, ob Massenspektralpeaks im ersten und/oder zweiten MS1-Scan auf (unfragmentierte) Vorläuferionen-Massenspektralpeaks hinweisen. Beispielsweise können die ersten und zweiten MS1-Scans MS1-Scans über den gesamten Massenbereich sein.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung dient der Analyse einer Probe. Es versteht sich, dass die Probe eine Vielzahl von Molekülen umfassen kann. Bei den Probenmolekülen kann es sich um eine Mischung von Molekülen mit unterschiedlichen Molekulargewichten handeln. Die Probenmoleküle können ionisiert werden, um eine Vielzahl von Vorläufer-Ionen zu erzeugen. Die Vorläufer-Ionen können unterschiedliche lonisierungszustände haben. Dementsprechend können die Vorläufer-Ionen unterschiedliche Masse-Ladungs-Verhältnisse (m/z) aufweisen.
In einigen Ausführungsformen der Erfindung können die erste und die zweite Einstellung der lonentransportvorrichtung durch Veränderung der elektrischen Felder der lonentransportvorrichtung vorgenommen werden. So können die erste Einstellung und die zweite Einstellung der lonentransportvorrichtung eine erste Einstellung des elektrischen Feldes und eine zweite Einstellung des elektrischen Feldes sein. In einigen Ausführungsformen kann die lonentransportvorrichtung beispielsweise Elektroden umfassen, die so konfiguriert sind, dass sie ein elektrisches Hochfrequenz- und/oder Gleichstromfeld für den Ionentransport bereitstellen. Die Größe des elektrischen Hochfrequenz- und/oder Gleichstromfeldes kann zwischen der ersten und der zweiten Einstellung variiert werden, so dass die auf die Ionen übertragene Energiemenge gemäß dem ersten Aspekt gesteuert wird. Insbesondere ist in einigen Ausführungsformen die Stärke des elektrischen HF- und/oder Gleichstromfeldes für die erste Einstellung größer als die Stärke des elektrischen HF- und/oder Gleichstromfeldes für die zweite Einstellung. In einigen Ausführungsformen der Erfindung können die ersten und zweiten Einstellungen der lonentransportvorrichtung durch Variieren anderer Einstellungen als Alternative oder zusätzlich zu dem elektrischen Feld der Ionentransportvorrichtung bereitgestellt werden. Beispielsweise kann in einigen Ausführungsformen eine lonentransportvorrichtung so konfiguriert sein, dass sie die von ihr transportierten Ionen aktiviert. Die Aktivierung von Ionen, die von der lonentransportvorrichtung transportiert werden, kann die innere Energie der Ionen erhöhen. Dementsprechend kann das Ausmaß, in dem Ionen durch den Ionentransport aktiviert werden, zwischen der ersten und der zweiten Einstellung (d. h. der ersten und der zweiten Aktivierungseinstellung) variiert werden.
In einigen Ausführungsformen kann eine lonentransportvorrichtung so konfiguriert sein, dass Ionen durch die Anwendung von Laserstrahlung, einem Elektronenstrahl, einem lonenstrahl oder einem Molekularstrahl aktiviert werden.
Bei der Laserstrahlung, die auf die durch die lonentransportvorrichtung transportierten Ionen einwirkt, kann es sich zum Beispiel um Infrarotstrahlung, Strahlung des sichtbaren Lichts oder Ultraviolettstrahlung handeln. Die Anwendung der Laserstrahlung auf Ionen in der lonentransportvorrichtung kann die innere Energie der Ionen erhöhen. Dementsprechend kann bei ersten Einstellungen der lonentransportvorrichtung Laserstrahlung mit einer ersten Intensität auf die Ionen in der lonentransportvorrichtung ausgeübt werden. Bei zweiten Einstellungen der lonentransportvorrichtung kann die Intensität der Laserstrahlung reduziert oder ganz entfernt werden, so dass die innere Energie der von der Ionentransportvorrichtung transportierten Ionen bei den zweiten Einstellungen geringer ist als die innere Energie der von der lonentransportvorrichtung transportierten Ionen bei den ersten Einstellungen.
In ähnlicher Weise kann die Intensität eines Elektronenstrahls, eines lonenstrahls oder eines Molekularstrahls zwischen ersten und zweiten Einstellungen (Aktivierungseinstellungen) variiert werden, so dass die Menge an Energie, die auf die von der lonentransportvorrichtung transportierten Ionen einwirkt, gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung gesteuert wird.
Gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung werden MS1-Scans von Sätzen von Vorläufer-Ionen durchgeführt. Gemäß dieser Offenbarung soll sich ein MS1-Scan auf einen Scan eines Satzes von Ionen (Vorläufer-Ionen) beziehen, die durch Ionisierung einer Probe erzeugt und zu einem Massenanalysator transportiert wurden. Ein MS1-Scan zielt darauf ab, massenspektrale Peaks zu messen, die unfragmentierten Vorläufer-Ionen entsprechen. Dementsprechend geht der MS1-Scan davon aus, dass die Vorläuferionen zum Massenanalysator transportiert werden, ohne dass sie einem absichtlichen Fragmentierungsprozess unterzogen werden. Wie bereits erwähnt, kann jedoch eine gewisse (ungewollte) Fragmentierung der Ionen infolge einer übermäßigen internen Energie auftreten, die von den Vorläuferionen auf ihrem Weg durch eine lonentransportvorrichtung zwischen der lonenquelle und dem Massenanalysator angesammelt wird. Diese durch den Ionentransport hervorgerufene Fragmentierung ist im Allgemeinen unerwünscht, und daher versucht die vorliegende Erfindung, die Auswirkungen dieser Fragmentierung bei der Analyse und/oder Identifizierung von Vorläuferionen in einem MS1-Massenspektrum zu verringern und/oder zu beseitigen.
Gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung wird der zweite MS1-Scan mit der lonentransportvorrichtung durchgeführt, die mit einer zweiten Einstellung betrieben wird, so dass die Energie, die dem zweiten Satz von Vorläuferionen durch die lonentransportvorrichtung zugeführt wird, geringer ist als die Energie, die dem ersten Satz von Vorläuferionen durch die lonentransportvorrichtung zugeführt wird. Durch die Verwendung einer niedrigeren Energie für den zweiten MS1-Scan (z. B. einen Soft-Scan) kann das Vorhandensein von durch den Ionentransport verursachten fragmentierten Ionen in der zweiten Gruppe von Vorläuferionen im Vergleich zur ersten Gruppe von Vorläuferionen reduziert und/oder eliminiert werden. Im Allgemeinen sind die zweiten Einstellungen der lonentransportvorrichtung im zweiten MS1-Scan so konfiguriert, dass die durch den Ionentransport induzierten fragmentierten Ionen reduziert und/oder eliminiert werden, was jedoch auf Kosten der Intensität der massenspektralen Peaks geht (d. h. der zweite MS1-Scan kann mit einer zweiten Einstellung der lonentransportvorrichtung durchgeführt werden, die so optimiert ist, dass die Intensität der massenspektralen Peaks aufgrund der durch den Ionentransport induzierten fragmentierten Ionen reduziert und/oder eliminiert wird, aber nicht so optimiert ist, dass die Intensität der massenspektralen Peaks verbessert wird).
Es gibt mehrere Möglichkeiten für die massenspektralen Peaks in den ersten und zweiten MS1-Scans, die sich aus dem Massenspektrometrieverfahren gemäß dem ersten Aspekt ergeben. So kann ein bestimmter Massenspektralpeak nur im ersten MS1-Scan, nur im zweiten MS1-Scan oder sowohl im ersten als auch im zweiten MS1-Scan auftreten. Beispielsweise kann ein Massenspektralpeak, der im ersten MS1-Scan, aber nicht im zweiten MS1-Scan oder mit deutlich geringerer Intensität im zweiten MS1-Scan auftritt, einem Ion zugeschrieben werden, das durch eine durch Ionentransport induzierte Fragmentierung erzeugt wurde. Umgekehrt kann ein massenspektraler Peak, der im zweiten MS1-Scan, nicht aber im ersten MS1-Scan oder mit ähnlicher oder deutlich höherer Intensität im zweiten MS1-Scan auftritt, einem Vorläuferion zugeordnet werden. Dementsprechend kann durch den Vergleich der Peaks im ersten MS1-Massenspektrum mit den Peaks im zweiten MS1-Massenspektrum festgestellt werden, ob die Massenspektralpeaks im ersten MS1-Scan-Massenspektrum auf einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak hinweisen. Mit dem Hinweis auf einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak kann das Verfahren gemäß dieser Offenbarung feststellen, dass der Massenspektralpeak wahrscheinlich dem eines unfragmentierten Vorläuferions der Probe entspricht. Somit kann der Massenspektralpeak nicht das Ergebnis eines durch den Ionentransport induzierten Fragmentionsions oder das Ergebnis eines Ionenclusters mit einem ähnlichen Masse-Ladungs-Verhältnis sein.
In einigen Ausführungsformen bestimmt das Verfahren gemäß dem ersten Aspekt, ob die massenspektralen Peaks im ersten MS1-Scan auf Vorläuferionen hinweisen. Der erste MS1-Scan wird unter ersten Feldeinstellungen durchgeführt, so dass den Ionen eine relativ höhere Energie zugeführt wird, so dass es wahrscheinlicher ist, dass transportinduzierte Fragmente vorhanden sind. Beispielsweise kann der erste MS1-Scan mit einer ersten Einstellung einer lonentransportvorrichtung durchgeführt werden, die optimiert ist, um die Intensität der Massenspektralpeaks zu verbessern (d. h. unter Verwendung von Standardeinstellungen der lonentransportvorrichtungen), d. h. als Ergebnis einer höheren lonentransmission, die aber dazu führt, dass die Vorläuferionen beim Erreichen des Massenanalysators eine relativ höhere innere Energie haben. Dementsprechend können in einigen Ausführungsformen die im ersten MS1-Scan-Massenspektrum angezeigten Vorläuferionen-Massenspektralpeaks ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen und somit für die weitere Analyse und/oder Identifizierung des Vorläuferions besser geeignet sein.
Es wird darauf hingewiesen, dass die nach dem Verfahren des ersten Aspekts bestimmten Vorläuferionen-Massenspektralpeaks nicht auf der Erzeugung von fragmentierten Ionen (d. h. einem MS2-Scan) beruhen. Beispielsweise ist die Bestimmung von Vorläuferionen-Massenspektralpeaks nicht von der Erzeugung fragmentierter Ionen in einer Vorrichtung abhängig, die so konfiguriert ist, dass sie die Fragmentierung von Ionen induziert, wie z. B. eine Fragmentierungskammer. Das heißt, die Methode kann ohne weitere MS2-Analyse feststellen, ob ein Massenspektralpeak einem (nicht fragmentierten) Vorläuferion entspricht. Stattdessen werden nur MS1-Scans verwendet, um festzustellen, ob ein massenspektraler Peak einem Vorläuferion entspricht.
In einigen Ausführungsformen wird ein Massenspektralpeak mit einem ersten Masse-Ladungs-Verhältnis im ersten und/oder zweiten MS1-Scan auf der Grundlage eines ersten Verhältnisses der Intensität des Massenspektralpeaks im zweiten MS1-Scan zur Intensität des Massenspektralpeaks im ersten MS1-Scan als Vorläuferionen-Massenspektralpeak bestimmt. So kann der erste (oder zweite) MS1-Scan einen Massenspektralpeak mit einem ersten Masse-Ladungs-Verhältnis erfassen. Die Intensität des massenspektralen Peaks wird mit der Intensität des entsprechenden massenspektralen Peaks (d. h. mit demselben Masse-Ladungs-Verhältnis) in dem anderen MS1-Scan verglichen. Natürlich kann es vorkommen, dass bei einigen Proben der entsprechende Massenspektralpeak in einem der Scans nicht vorhanden (oder von Hintergrundrauschen nicht zu unterscheiden) ist. In diesem Fall kann die Intensität des Peaks als die Intensität des Hintergrundrauschens bei dem Masse-Ladungs-Verhältnis des analysierten Massenspektralpeaks aufgezeichnet werden.
Ein erstes Verhältnis kann beispielsweise das Verhältnis des vom Massenanalysator gemessenen extrahierten lonenstroms eines Massenspektralpeaks des zweiten MS1-Scans (XIC₂) bei einem ersten Masse-Ladungs-Verhältnis zu dem vom Massenanalysator gemessenen extrahierten lonenstrom des Massenspektralpeaks bei der ersten Masse-Ladung im ersten MS1-Scan (XIC₁) sein. Alternativ kann ein erstes Verhältnis ein Verhältnis des Signal-Rausch-Verhältnisses eines Massenspektralpeaks bei dem ersten Masse-Ladungs-Verhältnis in dem zweiten MS1-Scan (SN₂) zu einem Signal-Rausch-Verhältnis des Massenspektralpeaks bei dem ersten Masse-Ladungs-Verhältnis in dem ersten MS1-Scan (SN₁) sein. Das erste Verhältnis kann mit einem vorgegebenen Referenzpegel verglichen werden, um festzustellen, ob es sich bei dem massenspektralen Peak um einen massenspektralen Peak eines Vorläuferions handelt.
In einigen Ausführungsformen wird ein Massenspektralpeak mit einem ersten Masse-Ladungs-Verhältnis im ersten und/oder zweiten MS1-Scan auf der Grundlage des ersten Verhältnisses im Verhältnis zu einem zweiten Verhältnis einer durchschnittlichen Intensität der Massenspektralpeaks des zweiten MS1-Scans zu einer durchschnittlichen Intensität der Massenspektralpeaks des ersten MS1-Scans als Vorläuferionen-Massenspektralpeak bestimmt. Somit kann das zweite Verhältnis als Referenzpegel verwendet werden, mit dem das erste Verhältnis verglichen werden kann.
Die durchschnittliche Intensität der Massenspektralpeaks des ersten MS1-Scans und/oder die durchschnittliche Intensität der Massenspektralpeaks des zweiten MS1-Scans kann auf einem Durchschnitt des extrahierten lonenstroms der Massenspektralpeaks, der vom Massenanalysator für die jeweiligen Scans gemessen wurde, oder auf einem Durchschnitt des Signal-Rausch-Verhältnisses der Massenspektralpeaks für den jeweiligen Scan basieren. In einigen Ausführungsformen kann jede durchschnittliche Intensität des ersten und zweiten MS1-Scans aus der durchschnittlichen Intensität über im Wesentlichen denselben Bereich von Masse-Ladungs-Verhältnissen für jeden Scan bestimmt werden. In einer Ausführungsform kann ein zweites Verhältnis der durchschnittlichen extrahierten Ionenströme auf der Grundlage eines Verhältnisses eines Gesamtionenstroms für den ersten MS1-Scan zum Gesamtionenstrom für den zweiten MS1-Scan berechnet werden, wobei die Gesamtionenströme über einen entsprechenden Masse-Ladungs-Bereich summiert werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein zweites Verhältnis des durchschnittlichen Einzel-zu-Rausch-Verhältnisses auf der Grundlage eines Verhältnisses einer Summe des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses für jeden Peak im zweiten MS1-Scan zu einer Summe des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses für jeden Peak im ersten MS1-Scan über einen entsprechenden Masse-zu-Ladungsbereich berechnet werden.
In einigen Ausführungsformen kann ein Referenzpegel ein Kriterium für die Bestimmung sein, ob Massenspektralpeaks auf Vorläuferionen-Massenspektralpeaks hinweisen. Der Referenzpegel kann auch ein Kriterium für die Bestimmung von Massenspektralpeaks sein, die auf eine durch den Ionentransport verursachte Fragmentierung und/oder lonencluster hinweisen.
In einigen Ausführungsformen wird ein Massenspektralpeak im ersten MS1-Scan als Vorläuferionen-Massenspektralpeak auf der Grundlage eines dritten Verhältnisses des ersten Verhältnisses zum zweiten Verhältnis relativ zum Referenzpegel auf der Grundlage des ersten und zweiten MS1-Scans bestimmt. Es wird deutlich, dass einige besonders empfindliche Vorläuferionen sogar bei einer relativ niedrigen „weichen“ zweiten Einstellung fragmentiert werden können (d. h. bei einer zweiten Einstellung, die bewirkt, dass den Vorläuferionen durch die Ionentransportvorrichtung eine relativ geringe Energiemenge zugeführt wird). So können in einigen Proben fragmentierte Ionen sowohl in der ersten als auch in der zweiten Gruppe von Vorläuferionen vorhanden sein. Durch Vergleich der Änderung der Peakintensität für den Massenspektralpeak mit der durchschnittlichen Änderung der Peakintensität für die beiden MS1-Scans kann das Verfahren des ersten Aspekts bestimmen, ob ein Massenspektralpeak, der sowohl im ersten als auch im zweiten MS1-Scan auftritt, ein Vorläuferionen-Massenspektralpeak oder ein Ergebnis der durch den Ionentransport induzierten Fragmentierung ist.
So kann beispielsweise ein Massenspektralpeak des ersten MS1-Scans das Ergebnis einer durch den Ionentransport induzierten Fragmentierung sein. Im zweiten MS1-Scan, der so durchgeführt wird, dass die auf den zweiten Satz von Vorläuferionen übertragene Energie geringer ist als die des ersten Satzes von Vorläuferionen, kann die Intensität des Massenspektralpeaks im zweiten MS1-Scan relativ zum durchschnittlichen Intensitätsabfall im gesamten Spektrum verringert sein. Dementsprechend kann das Verfahren feststellen, dass der Massenspektralpeak das Ergebnis einer durch Ionentransport induzierten Fragmentierung ist. Zur Festlegung eines Kriteriums für die Bestimmung, ob Massenspektralpeaks im ersten MS1-Scan das Ergebnis einer durch Ionentransport induzierten Fragmentierung sind, kann ein Referenzpegel vorgesehen werden.
In einigen Ausführungsformen kann der Referenzpegel auf einem vierten Verhältnis zwischen einer Injektionszeit für den ersten MS1-Scan und einer Injektionszeit für den zweiten MS1-Scan basieren. Insbesondere kann der Referenzpegel gleich dem vierten Verhältnis sein. Auf diese Weise kann der erwartete durchschnittliche Abfall der Peakintensität mit der Änderung der Injektionszeit zwischen dem ersten und dem zweiten MS1-Scan korreliert werden. Dementsprechend kann der Referenzpegel, der das Kriterium für den Nachweis einer durch den Ionentransport induzierten Fragmentierung darstellt, auf einem vierten Verhältnis der Injektionszeiten für die ersten und zweiten MS1-Scans basieren.
In einigen Ausführungsformen kann der Referenzpegel entsprechend dem Masse-Ladungs-Verhältnis des zu identifizierenden Massenspektralpeaks eingestellt werden. In einigen Ausführungsformen kann das Auftreten und/oder der Nachweis von durch Ionentransport induzierten Fragmenten vom Masse-Ladungs-Verhältnis abhängig sein. So kann ein drittes Verhältnis für einen Massenspektralpeak, der aus einer durch Ionentransport induzierten Fragmentierung resultiert, durch das Masse-Ladungs-Verhältnis des Peaks beeinflusst werden. Dementsprechend kann ein Referenzpegel, der ein Kriterium für die Identifizierung einer durch Ionentransport induzierten Fragmentierung darstellt, auch von der Masse zur Ladung abhängig sein.
Beispielsweise kann ein Massenspektrum für einige Proben hauptsächlich aus durch Ionentransport induzierten Fragmenten bestehen. Dementsprechend kann ein Verhältnis der Intensitäten (XIC, SN) zu einem Referenzpegel der gesamten (oder durchschnittlichen) ioneninduzierten Ströme (TIC) oder ein gesamtes (oder durchschnittliches) Signal-Rausch-Verhältnis (SNA) weniger empfindlich für die Erkennung von fragmentierten Ionen sein, da die Menge der fragmentierten Ionen im zweiten MS1-Scan mit niedrigerer Energie immer noch signifikant sein kann. Daher kann der Referenzpegel auf der Grundlage von Referenzmessungen der massenspektralen Peak-Intensität bei ersten und zweiten Einstellungen für die Ionentransportvorrichtung kalibriert werden. Dementsprechend kann in einigen Ausführungsformen der Referenzpegel auch ein Kriterium für die Bestimmung sein, ob ein Massenspektralpeak auf der Grundlage des ersten Verhältnisses auf einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak hinweist.
Dementsprechend können die Verfahren und Systeme dieser Offenbarung kalibriert werden, um massenabhängige Schwankungen bei der Übertragung von Ionen durch die lonentransportvorrichtungen des Massenspektrometers zu berücksichtigen. Es ist bekannt, dass bei einigen Massenspektrometern die Intensität, mit der Fragmentionen identifiziert werden, durch die massenabhängige Übertragungseffizienz beeinflusst werden kann. Durch Kalibrierung der Steuerung zur Berücksichtigung der Übertragungseffizienz kann das Verfahren verbessert werden, um durch den Ionentransport induzierte Fragmente und/oder lonencluster genauer zu erkennen.
In einigen Ausführungsformen kann ein Massenspektralpeak als Vorläuferionen-Massenspektralpeak bestimmt werden, wenn das dritte Verhältnis mindestens X % des Referenzpegels beträgt, wobei X mindestens: 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % oder 60 % beträgt. So kann beispielsweise in einer Ausführungsform ein Massenspektralpeak als Vorläuferionen-Massenspektralpeak bestimmt werden, wenn das dritte Verhältnis mindestens 50 % des Referenzpegels beträgt. Dementsprechend können Massenspektralpeaks, die auf Fragment-Ionen hinweisen, ausgeschlossen werden, während Massenspektralpeaks, die auf (fragile) Vorläufer-Ionen hinweisen, identifiziert werden können.
In einigen Experimenten kann eine Probe auch Cluster-Ionen enthalten. Bei Cluster-Ionen kann es sich um Kombinationen von Vorläufer-Ionen handeln, die durch nicht-kovalente Kräfte miteinander verbunden sind und häufig bei MS1-Scans unter niedrigen Energiebedingungen (Soft-Scans) auftreten. Cluster-Ionen können zum Beispiel protonierte Lösungsmittel oder Addukte sein. Dementsprechend kann ein massenspektraler Peak, der zwischen dem ersten und dem zweiten MS1-Scan einen signifikanten Anstieg der Intensität aufweist (relativ zu einer durchschnittlichen Intensitätsänderung), als Hinweis auf einen Ionencluster mit einem ähnlichen Masse-Ladungs-Verhältnis gewertet werden. Um zwischen Cluster-Ionen und einem massenspektralen Peak, der auf ein Vorläufer-Ion hinweist, zu unterscheiden, kann daher in einigen Ausführungsformen eine Obergrenze für das dritte Verhältnis festgelegt werden. Beispielsweise kann ein Massenspektralpeak auch dann als Vorläuferionen-Massenspektralpeak bestimmt werden, wenn das dritte Verhältnis nicht mehr als 500 %, 400 %, 300 % oder 200 % der Größe des Referenzpegels beträgt. Bei Experimenten, bei denen keine Cluster-Ionen erwartet werden, oder wenn der Benutzer nicht zwischen Massenspektralpeaks, die auf Vorläufer-Ionen hinweisen, und Massenspektralpeaks, die auf Cluster-Ionen hinweisen, unterscheiden möchte, kann die Obergrenze für das dritte Verhältnis natürlich nicht verwendet werden.
In einigen Ausführungsformen wird der erste Massenanalysator zur Durchführung des ersten und zweiten MS1-Scans verwendet. Dementsprechend kann ein einziger Massenanalysator verwendet werden, um Vorläuferionen-Massenspektralpeaks für die weitere Verarbeitung zu bestimmen. Der erste Massenanalysator kann ein Fourier-Transformations-Massenanalysator sein, z. B. ein Orbitrap®-Massenanalysator oder ein lonenzyklotronresonanz-Massenanalysator (ICR). Alternativ kann der erste Massenanalysator auch ein Flugzeit-Massenanalysator (ToF) sein. Es können auch andere Arten von Massenanalysatoren verwendet werden, z. B. eine RF-Ionenfalle (vom 3D- oder linearen Typ), ein Quadrupol-Massenanalysator oder ein Magnetsektor-Massenanalysator. In einigen anderen Ausführungsformen kann ein erster Massenanalysator zur Durchführung des ersten MS1-Scans und ein zweiter Massenanalysator zur Durchführung des zweiten MS1-Scans verwendet werden. So kann beispielsweise ein Tandem-Massenanalysator, der zwei Massenanalysatoren umfasst, zur Durchführung des Verfahrens des ersten Aspekts verwendet werden. Der erste und der zweite Massenanalysator können von gleichem oder unterschiedlichem Typ sein.
Das Verfahren des ersten Aspekts kann bei einer Vielzahl von Massenspektrometrietypen angewendet werden.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Offenbarung wird ein Verfahren zur datenabhängigen Massenspektrometrie bereitgestellt. Das Verfahren umfasst das Verfahren der Massenspektrometrie gemäß dem ersten Aspekt der Offenbarung, die Massenauswahl eines dritten Satzes von Vorläuferionen auf der Grundlage eines Masse-Ladungs-Verhältnisses, das einem bestimmten Vorläuferionen-Massenspektralpeak entspricht, und die Fragmentierung der Ionen, um einen Satz von fragmentierten Ionen zu erzeugen, und die Durchführung eines MS2-Scans der fragmentierten Ionen unter Verwendung eines Massenanalysators.
Gemäß dem zweiten Aspekt der Offenbarung kann ein Verfahren der datenabhängigen Analyse (DDA) Massenspektrometrie bereitgestellt werden. Vorteilhafterweise wird die Qualität der MS1-Daten verbessert, da das Auftreten von fragmentierten Ionen, die aus einer durch den Ionentransport induzierten Fragmentierung in den für die DDA ausgewählten Vorläuferionen resultieren, reduziert werden kann. Da durch die Auswahl der Vorläuferionen, die mit dem Verfahren der DDA-Massenspektrometrie gemäß dem zweiten Aspekt analysiert werden sollen, unerwünschte Peaks aufgrund von unbeabsichtigt fragmentierten Ionen besser ausgeschlossen werden können, kann die Komplexität der Nachbearbeitung und Interpretation der resultierenden Daten verringert werden.
Gemäß einem dritten Aspekt der Offenbarung kann ein Verfahren zur datenunabhängigen Massenspektrometrie bereitgestellt werden. Das Verfahren umfasst ein Verfahren der Massenspektrometrie gemäß dem ersten Aspekt der Offenbarung und die Durchführung einer Vielzahl von datenunabhängigen MS2-Scans.
Das Verfahren der datenunabhängigen Massenspektrometrie kann einen Datensatz für die datenunabhängige Analyse (DIA) bereitstellen, der leichter zu analysieren ist, da die Massenspektralpeaks in den MS1-Scans leichter charakterisiert werden können. So können beispielsweise vor der Analyse der MS2-Daten Massenspektralpeaks, die auf Vorläuferionen hinweisen, allein aus den MS1-Daten identifiziert werden.
Gemäß einem vierten Aspekt der Offenbarung wird ein Massenspektrometer zur Analyse einer Probe bereitgestellt. Das Massenspektrometer umfasst eine lonisierungsquelle, einen Massenanalysator, eine lonentransportvorrichtung und eine Steuerung. Die Ionisationsquelle ist so konfiguriert, dass sie eine Probe ionisiert, um eine Vielzahl von Vorläuferionen zu erzeugen. Die lonentransportvorrichtung ist so konfiguriert, dass sie Vorläuferionen von der Ionisationsquelle zum Massenanalysator transportiert. Die Steuerung ist so konfiguriert, dass sie einen ersten MS1-Scan durchführt, indem sie die lonentransportvorrichtung veranlasst, einen ersten Satz von Vorläuferionen zu einem Massenanalysator zu transportieren, wobei eine erste Einstellung verwendet wird, und den ersten MS1-Scan an dem ersten Satz von Vorläuferionen mit dem Massenanalysator durchführt. Die Steuerung ist auch so konfiguriert, dass sie einen zweiten MS1-Scan durchführt, indem sie die lonentransportvorrichtung veranlasst, einen zweiten Satz von Vorläuferionen zu einem Massenanalysator zu transportieren, wobei eine zweite Einstellung verwendet wird, und den zweiten MS1-Scan an dem zweiten Satz von Vorläuferionen unter Verwendung des Massenanalysators durchführt. Die zweite Einstellung der lonentransportvorrichtung ist so konfiguriert, dass sie dem zweiten Satz von Vorläuferionen eine geringere Energiemenge verleiht als eine Energiemenge, die durch die erste Einstellung der lonentransportvorrichtung dem ersten Satz von Vorläuferionen verliehen wird. Die Steuereinheit ist so konfiguriert, dass sie auf der Grundlage der Massenspektralpeaks des ersten und des zweiten MS1-Scans feststellt, ob ein Massenspektralpeak in mindestens einem der beiden Scans, dem ersten MS1-Scan oder dem zweiten MS1-Scan, auf einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak hinweist.
Dementsprechend kann das Massenspektrometer des vierten Aspekts für die Durchführung der Verfahren eines der ersten bis dritten Aspekte der Offenbarung bereitgestellt werden.
Figurenliste
Die Erfindung wird nun in Bezug auf die folgenden nicht einschränkenden Figuren beschrieben. Weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der detaillierten Beschreibung, wenn man sie in Verbindung mit den Figuren betrachtet, wobei:

- 1 zeigt eine schematische Darstellung eines Massenspektrometers gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;
- 2 zeigt eine graphische Darstellung eines ersten und zweiten MS1-Scans, die durch Verfahren gemäß dieser Offenbarung erhalten werden können;
- 3 zeigt ein Diagramm von dritten Verhältnissen, die aus ersten und zweiten MS1-Scans für eine ALELFR-Probe bestimmt wurden;
- 4 zeigt ein Diagramm von dritten Verhältnissen, die aus ersten und zweiten MS1-Scans für eine Calmix-Infusionsprobe bestimmt wurden;
- 5 zeigt eine grafische Darstellung einer Zeitreihe von chromatografischen Peaks, die durch Flüssigchromatografie einer Probe erzeugt wurden, die einen Sechs-Protein-Mix-Verdau in reinen Lösungsmitteln umfasst;
- 6 zeigt eine graphische Darstellung der in 5 gezeigten Daten nach der Analyse durch das Verfahren dieser Offenbarung;
- 7 zeigt ein Histogramm von Vorläuferionen nach einem Massenspektrometrieversuch gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung; und
- 8 zeigt eine graphische Darstellung einer Methode der datenunabhängigen Massenspektrometrie.

Detaillierte Beschreibung
Der Begriff „Masse“ kann sich hier auf das Verhältnis von Masse zu Ladung (m/z) beziehen.
Der Begriff „innere Energie“ eines Moleküls oder Ions kann sich auf die Gesamtenergie beziehen, die in diesem Molekül oder Molekülion enthalten ist, aber weder die kinetische Energie seiner Bewegung noch seine potenzielle Energie aufgrund äußerer Kraftfelder umfasst. Die innere Energie des Moleküls oder Molekülions soll also die Energiegewinne und -verluste des Moleküls oder Molekülions berücksichtigen, die auf Änderungen seines inneren Zustands zurückzuführen sind.
1 zeigt eine schematische Anordnung eines Massenspektrometers 10, das für die Durchführung von Verfahren gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Die Anordnung in stellt schematisch die Konfiguration des Q-Exactive™ Massenspektrometers von Thermo Fisher Scientific, Inc. dar.
In 1 kann eine zu analysierende Probe (z. B. von einem Autosampler) einem chromatographischen Gerät wie einer Flüssigchromatographiesäule (nicht in 1 dargestellt) zugeführt werden. Ein Beispiel für eine LC-Säule ist die monolithische ProSwift-Säule von Thermo Fisher Scientific, Inc., die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) bietet, indem die in einer mobilen Phase befindliche Probe unter hohem Druck durch eine stationäre Phase aus unregelmäßig oder kugelförmig geformten Partikeln gepresst wird, die die stationäre Phase bilden. In der HPLC-Säule eluieren die Probenmoleküle je nach dem Grad ihrer Wechselwirkung mit der stationären Phase mit unterschiedlicher Geschwindigkeit.
Die so durch Flüssigchromatographie getrennten Probenmoleküle werden anschließend mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI-Quelle) 20 bei Atmosphärendruck ionisiert. Die ESI-Quelle 20 erzeugt aus den Probenmolekülen Vorläufer-Ionen. Die Vorläuferionen gelangen dann in eine Vakuumkammer des Massenspektrometers 10 und werden über eine Kapillare 25 in einen Stacked Ring Ion Guide (SRIG) 30 geleitet. Die Vorläuferionen werden durch den SRIG 30 in einen Injektionsflachpol 40 fokussiert, der die Ionen in einen gebogenen Flachpol 50 mit einem axialen Feld injiziert.
Der gebogene Flachpol 50 umfasst einen Eingangsabschnitt 51, einen gebogenen Führungsabschnitt 53 und einen Ausgangsabschnitt 52. Der gebogene Führungsabschnitt 53 bietet einen gekrümmten Weg vom Eingangsabschnitt 51 bis zum Ausgangsabschnitt 53. Der gebogene Flachpol 50 führt (geladene) Ionen auf einem gekrümmten Weg durch ihn hindurch, während unerwünschte neutrale Moleküle wie mitgerissene Lösungsmittelmoleküle nicht auf dem gekrümmten Weg geführt werden und verloren gehen.
Eine lonenschleuse (TK-Linse) 60 befindet sich am distalen Ende des gebogenen Flachpols 50 und steuert den Durchgang der Ionen vom gebogenen Flachpol 50 in einen nachgeschalteten Quadrupol-Massenfilter 70. Der Quadrupol-Massenfilter 70 ist in der Regel, aber nicht notwendigerweise, segmentiert und dient als Bandpassfilter, der den Durchgang einer ausgewählten Massenzahl oder eines begrenzten Massenbereichs ermöglicht, während Ionen mit anderen Masse-Ladungs-Verhältnissen (m/z) ausgeschlossen werden. Der Quadrupol-Massenfilter 70 kann auch einen breiten Massenbereich durchlassen, z. B. für MS1-Scans. In einer alternativen Ausführungsform könnten anstelle des Quadrupol-Massenfilters auch andere Arten von Massenselektoren verwendet werden, die in der Technik bekannt sind.
Die Ionen gelangen dann durch eine Quadrupol-Ausgangslinsen/Splitlinsen-Anordnung 80 in einen Transfer-Multipol 90. Der Transfer-Multipol 90 leitet die massengefilterten Ionen aus dem Quadrupol-Massenfilter 70 in eine gekrümmte lineare Ionenfalle (C-Falle) 100. Die C-Falle 100 hat in Längsrichtung verlaufende, gekrümmte Elektroden, die mit HF-Spannungen versorgt werden, und Endkappen, an die Gleichspannungen angelegt werden. Das Ergebnis ist ein Potentialtopf, der sich entlang der gekrümmten Längsachse der C-Falle 100 erstreckt. In einer ersten Betriebsart werden die Gleichspannungen der Endkappen an der C-Falle so eingestellt, dass die vom Transfermultipol 90 ankommenden Ionen im Potenzialtopf der C-Falle 100 eingefangen und dort abgekühlt werden. Die Injektionszeit (IT) der Ionen in die C-Falle bestimmt die Anzahl der Ionen (Ionenpopulation), die anschließend aus der C-Falle in den Massenanalysator ausgestoßen werden.
Die gekühlten Ionen befinden sich in einer Wolke am Boden des Potenzialtopfs und werden dann orthogonal aus der C-Falle 100 in eine Orbitalfalle 110 wie den Orbitrap®-Massenanalysator von Thermo Fisher Scientific, Inc. geschleudert, wo die Ionen einer Massenanalyse unterzogen werden. Die Orbitrap-Vorrichtung 110 hat eine dezentrale Injektionsöffnung, und die Ionen werden als kohärente Pakete durch die dezentrale Injektionsöffnung in die Orbitrap-Vorrichtung 110 injiziert. Die Ionen werden dann innerhalb der orbitalen Einfangvorrichtung 110 durch ein hyperlogarithmisches elektrisches Feld eingefangen und durchlaufen eine Hin- und Herbewegung in Längsrichtung, während sie um die innere Elektrode kreisen.
Die axiale (z) Komponente der Bewegung der Ionenpakete in der orbitalen Einfangvorrichtung 110 ist (mehr oder weniger) als einfache harmonische Bewegung definiert, wobei die Winkelfrequenz in der Längsrichtung mit der Quadratwurzel des Masse-Ladungs-Verhältnisses einer bestimmten Ionenart in Beziehung steht. Somit trennen sich die Ionen im Laufe der Zeit entsprechend ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis.
Die schwingenden Ionen in der Orbitalfangvorrichtung 110 werden mit Hilfe eines Bilddetektors (in nicht dargestellt) erfasst, der im Zeitbereich einen „Transienten“ erzeugt, der Informationen über alle Ionenarten enthält, während sie den Bilddetektor passieren. Der Transient wird dann einer Fast Fourier Transformation (FFT) unterzogen, was zu einer Reihe von Spitzen im Frequenzbereich führt. Aus diesen Peaks kann ein Massenspektrum erstellt werden, das die Häufigkeit/Ionenintensität im Verhältnis zu m/z darstellt.
In der oben beschriebenen Konfiguration werden die Vorläuferionen (genauer gesagt, ein Satz von Vorläuferionen innerhalb eines interessierenden Massenbereichs, der vom Quadrupol-Massenfilter ausgewählt wird) von der Orbitalfangvorrichtung 110 ohne Fragmentierung analysiert. Das resultierende Massenspektrum wird als MS1 bezeichnet.
MS/MS (oder allgemeiner: MSⁿ) kann auch mit dem Massenspektrometer 10 von durchgeführt werden. Dazu werden Vorläuferionen erzeugt und zum Quadrupol-Massenfilter 70 transportiert, wo eine Nebenmasse oder ein Massenbereich ausgewählt wird. Die Vorläuferionen, die den Quadrupol-Massenfilter 70 verlassen, werden in der C-Falle 100 erneut gekühlt, dann aber in axialer Richtung zu einer Fragmentierungskammer oder -zelle 120 ausgestoßen. Alternativ dazu können in einigen Ausführungsformen die Vorläuferionen vom Quadrupol-Massenfilter 70 durch die C-Falle 100 in die Fragmentierungskammer 120 wandern, ohne gekühlt zu werden. Bei der Fragmentierungskammer 120 handelt es sich im Massenspektrometer 10 von um eine Vorrichtung für die kollisionelle Dissoziation mit höherer Energie (HCD), der ein Kollisionsgas zugeführt wird. Vorläuferionen, die in die Fragmentierungskammer 120 gelangen, stoßen mit hoher Energie auf die Gasmoleküle, was zu einer Fragmentierung der Vorläuferionen in Fragment-Ionen führt. Die Fragment-Ionen werden dann aus der Fragmentierungskammer 120 zurück in die C-Falle 100 geschleudert, wo sie erneut im Potentialtopf gefangen und abgekühlt werden. Schließlich werden die in der C-Falle gefangenen Fragment-Ionen orthogonal zur Orbitalfangvorrichtung 110 zur Analyse und Detektion ausgestoßen. Das resultierende Massenspektrum der Fragment-Ionen wird als MS2 bezeichnet.
Obwohl in 1 eine HCD-Fragmentierungskammer 120 dargestellt ist, können stattdessen auch andere Fragmentierungsvorrichtungen verwendet werden, wie z. B. kollisionsinduzierte Dissoziation (CID), Elektroneneinfangdissoziation (ECD), Elektronentransferdissoziation (ETD), Photodissoziation usw.
Die „Sackgassen“-Konfiguration der Fragmentierungskammer 120 in 1, bei der Vorläuferionen axial aus der C-Falle 100 in einer ersten Richtung zur Fragmentierungskammer 120 ausgestoßen werden und die resultierenden Fragment-Ionen in der entgegengesetzten Richtung zur C-Falle 100 zurückgeführt werden, wird in der WO-A-2006/103412 näher beschrieben.
Das Massenspektrometer 10 wird von einer Steuereinheit 130 gesteuert, die beispielsweise so eingerichtet ist, dass es den Zeitpunkt des Ausstoßes der Einfangkomponenten steuert, die entsprechenden Potentiale an den Elektroden der lonentransportvorrichtungen einstellt, um die Ionen zu fokussieren und zu filtern, die Massenspektraldaten von der orbitalen Einfangvorrichtung 110 erfasst, die Abfolge der MS1- und MS2-Scans steuert und so weiter. Es versteht sich, dass die Steuerung einen Computer umfassen kann, der gemäß einem Computerprogramm betrieben werden kann, das Anweisungen enthält, um das Massenspektrometer zu veranlassen, die Schritte des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung auszuführen.
Es versteht sich von selbst, dass die in 1 gezeigte spezifische Anordnung der Komponenten für die nachfolgend beschriebenen Verfahren nicht wesentlich ist. In der Tat sind andere Anordnungen für die Durchführung der Methoden zur Identifizierung von Vorläuferionen in Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung geeignet. Zum Beispiel können die Methoden dieser Offenbarung auch in einem Tandem-Massenspektrometer durchgeführt werden. In einer Ausführungsform kann ein Tandem-Massenspektrometer für die Durchführung der ersten und/oder zweiten MS1-Scans bereitgestellt werden.
Gemäß einer Ausführungsform dieser Offenbarung wird ein Verfahren zur Massenspektrometrie bereitgestellt. Das Verfahren kann mit einem Massenspektrometer, wie dem oben beschriebenen und in 1 gezeigten Massenspektrometer 10, durchgeführt werden.
Zunächst ist die Steuereinheit so konfiguriert, dass sie die ESI-Quelle 20 veranlasst, die Moleküle einer ihr zugeführten Probe zu ionisieren, um eine Vielzahl von Vorläufer-Ionen zu erzeugen. Die Probe kann wie oben beschrieben von einem Flüssigkeitschromatographiesystem geliefert werden.
Die Steuerung ist so konfiguriert, dass sie das Massenspektrometer veranlasst, einen ersten MS1-Scan und einen zweiten MS1-Scan durchzuführen. Es wird deutlich, dass die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist, den ersten und zweiten MS1-Scan in einer bestimmten Reihenfolge durchzuführen. Die erste und die zweite MS1-Abtastung können in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden. In einigen Ausführungsformen werden die erste und die zweite MS1-Abtastung mit im Wesentlichen demselben Masse-Ladungs-Verhältnis durchgeführt. Zum Beispiel kann in einer Ausführungsform jeder MS1-Scan über ein Masse-Ladungs-Verhältnis von m/z = 300 bis m/z = 1500 durchgeführt werden.
Der erste MS1-Scan kann unter Verwendung eines ersten Satzes der Vielzahl von Vorläuferionen (erster Satz von Vorläuferionen) durchgeführt werden. Die Durchführung des ersten MS1-Scans umfasst den Transport des ersten Satzes von Vorläuferionen von der ESI-Quelle 20 des Massenspektrometers 10 zu der orbitalen Einfangvorrichtung 110 unter Verwendung des oben beschriebenen Massenspektrometers 10. Die Steuereinheit ist so konfiguriert, dass sie die lonentransportvorrichtungen steuert, indem sie geeignete Potenziale einstellt, um den ersten Satz von Vorläuferionen zur orbitalen Einfangvorrichtung 110 zu transportieren.
So kann der erste Satz von Ionen durch die Kapillare 25, die SRIG 30, den Injektionsflachpol 40, den gebogenen Flachpol 50, das lonentor (TK-Linse) 60, den Quadrupol-Massenfilter 70, die Quadrupol-Austrittslinsen/Splitlinsen-Anordnung 80, den Transfermultipol 90 und die C-Falle 100 in die orbitale Einfangvorrichtung 110 transportiert werden. So kann der erste Satz von Vorläuferionen von der lonisierungsquelle (ESI-Quelle 20) über eine Vielzahl von lonentransportvorrichtungen zu einem Massenanalysator transportiert werden. Im Allgemeinen kann die vorliegende Offenbarung auf Massenspektrometer mit einer oder mehreren lonentransportvorrichtungen angewendet werden.
Die Orbitalfangvorrichtung 110 kann zur Massenanalyse des ersten lonensatzes verwendet werden, um einen ersten MS1-Scan zu erhalten. Die Orbitalfangvorrichtung 110 kann so konfiguriert sein, dass sie den ersten MS1-Scan mit einer Auflösung von mindestens 15.000 durchführt. Vorzugsweise kann die orbitale Einfangvorrichtung den ersten MS1-Scan mit einer Auflösung von mindestens 50.000, 75.000 oder 100.000 durchführen.
Die Steuerung ist auch so konfiguriert, dass sie das Massenspektrometer veranlasst, den zweiten MS1-Scan durchzuführen. Der zweite MS1-Scan kann unter Verwendung eines zweiten Satzes der Vielzahl von Vorläuferionen (ein zweiter Satz von Vorläuferionen) durchgeführt werden. Die Durchführung des zweiten MS1-Scans umfasst den Transport des zweiten Satzes von Vorläuferionen von der ESI-Quelle 20 des Massenspektrometers 10 zur orbitalen Einfangvorrichtung 110. Der zweite Satz von Ionen kann mit denselben lonentransportvorrichtungen, die für den ersten MS1-Scan verwendet wurden, zur orbitalen Fallenvorrichtung transportiert werden.
Die Orbitalfangvorrichtung 110 kann zur Massenanalyse des zweiten lonensatzes verwendet werden, um einen zweiten MS1-Scan zu erhalten. Die Orbitalfangvorrichtung 110 kann so konfiguriert sein, dass sie den zweiten MS1-Scan mit einer Auflösung von mindestens 15.000 durchführt. Vorzugsweise kann die orbitale Einfangvorrichtung den zweiten MS1-Scan mit einer Auflösung von mindestens 50.000, 75.000 oder 100.000 durchführen.
Beim Transport der Ionen zum Massenanalysator 110 zur Durchführung der MS1-Scans, wie oben beschrieben, ist zu beachten, dass die Vorläuferionen nicht in die Fragmentierungszelle 120 gelangen. Alternativ könnten die Ionen beim Transport der Ionen zum Massenanalysator 110 zur Durchführung der MS1-Scans in die Fragmentierungszelle 120 eintreten und dann zur C-Falle zurückkehren, jedoch unter Einstellungen (z. B. Druck und/oder Kollisionsenergie), bei denen die Fragmentierungszelle 120 keine Fragmentierung verursacht.
Um die ersten und zweiten Sätze von Vorläuferionen durch die mehreren lonentransportvorrichtungen zum Massenanalysator zu transportieren, wird den lonentransportvorrichtungen Energie zugeführt, um die Vorläuferionen einzuschließen und zu leiten. In der Regel werden die lonentransportvorrichtungen mit Hilfe elektrischer Felder, die an die lonentransportvorrichtungen angelegt werden, eingegrenzt und geleitet. Bei den elektrischen Feldern kann es sich um Gleichstrom, Hochfrequenz oder eine Kombination aus Gleichstrom- und Hochfrequenzfeldern handeln, je nach Beschaffenheit der Vorrichtung. Die Steuereinheit kann so konfiguriert sein, dass sie ein Potenzial, einen Strom oder eine Leistung steuert, die den lonentransportvorrichtungen zugeführt werden, um die elektrischen Felder zu steuern. Durch die Steuerung der elektrischen Felder der lonentransportvorrichtungen kann die Steuereinheit die Energiemenge steuern, die von den lonentransportvorrichtungen auf die Vorläuferionen übertragen wird, wenn ein Satz von Vorläuferionen von der ESI-Quelle 20 zur Orbitalfangvorrichtung 110 transportiert wird. Die elektrischen Felder, die für den ersten MS1-Scan an die lonentransportvorrichtungen des Massenspektrometers 10 angelegt werden, können eine erste elektrische Feldeinstellung (erste Einstellung) sein, und die elektrischen Felder, die für den zweiten MS1-Scan an die Ionentransportvorrichtungen angelegt werden, können eine zweite elektrische Feldeinstellung (zweite Einstellung) sein.
Ein wichtiger Unterschied zwischen der ersten und der zweiten Einstellung des elektrischen Feldes besteht in der Energiemenge, die auf die Vorläuferionen einwirkt, wenn sie durch die lonentransportvorrichtung(en) zum Massenspektrometer transportiert werden. In vielen lonentransportvorrichtungen werden elektrische HF- und/oder Gleichstromfelder für den Ionentransport verwendet. Werden für den Ionentransport elektrische Gleichstromfelder verwendet, kann die Energie, die die lonentransportvorrichtungen auf die Vorläuferionen übertragen, von der Gleichstrompotenzialdifferenz zwischen einer oder mehreren lonentransportvorrichtungen abhängen. Die auf die Vorläuferionen übertragene Energiemenge kann auch von der Amplitude der für den Ionentransport (z. B. in Ionenleitern) angelegten HF-Spannung abhängen. So kann eine zweite Einstellung des elektrischen Feldes eine oder mehrere Einstellungen des elektrischen HF- und/oder Gleichstromfeldes für die lonentransportvorrichtungen vorsehen, so dass beispielsweise die Potenzialdifferenz, die die zweite Gruppe von Vorläuferionen erfährt, geringer ist als die Potenzialdifferenz für die erste Einstellung des elektrischen Feldes.
In einer Ausführungsform können die von der Steuereinheit 130 an das Massenspektrometer angelegten HF- und DC-Spannungen unter den ersten elektrischen Feldeinstellungen beispielsweise wie folgt sein. An die ESI-Quelle 20 kann eine Gleichspannung von 3,5 kV angelegt werden. An der Kapillare 25 kann eine Gleichspannung von 25 V anliegen. Die SRIG 30 kann eine Gleichspannung von 25 V und eine HF-Spannung von 100 Vpp (HF-Spannungsamplitude gemessen von Spitze zu Spitze) haben, der Injektions-Flachpol 40 kann einen Gleichstrom-Offset von 8 V und eine HF-Spannung von 200 Vpp haben, der gebogene Flachpol 50 kann eine HF-Spannung von 300 Vpp und eine Offset-Gleichspannung von 6 V haben. Über den gebogenen Flachpol 50 kann vom Eingangsabschnitt 51 bis zum Ausgangsabschnitt 52 ein elektrischer Gleichfeldgradient angelegt werden, wobei über den Führungsabschnitt 53 eine Potenzialdifferenz von 30 V angelegt wird. An das lonentor (TK-Linse) 60 am Eingang zum Quadrupol-Massenfilter 70 kann eine Gleichstromspannung von -10 V angelegt werden. Der Quadrupol-Massenfilter 70 kann mit einem Gleichstrom-Offset von 5 V und einer HF-Spannung von 300 Vpp beaufschlagt werden. An die Quadrupol-Austrittslinse 80 kann eine Gleichspannung von -35 V angelegt werden. An den Transfermultipol 90 kann ein Offset von -3 V Gleichspannung und eine HF-Spannung von etwa 1000 Vss angelegt werden. Die C-Falle 100 kann eine Offset-Gleichspannung von 5 V an der Eingangslinse, eine Offset-Gleichspannung von 0 V in der Mitte der C-Falle 100 und eine Offset-Gleichspannung von 10 V an der Ausgangslinse aufweisen. An die C-Falle 100 kann eine HF-Spannung von 2000 Vss angelegt werden.
In einer Ausführungsform der Offenbarung können die an die ESI-Quelle 20, die Kapillare 25 und das SRIG 30 angelegten Gleichfelder zwischen dem ersten und zweiten MS1-Scan variiert werden. Bei der ersten Einstellung des elektrischen Feldes (erster MS1-Scan) kann ein Gleichstromfeld von 25 V an die Kapillare 25 und das SRIG 30 angelegt werden. Für die zweite Einstellung des elektrischen Feldes kann ein Gleichfeld von 15 V an die Kapillare 25 und das SRIG 30 angelegt werden. Das an den SRIG 30 angelegte HF-Feld kann ebenfalls variiert werden. Bei der ersten Einstellung des elektrischen Feldes kann die Spannung von Spitze zu Spitze (V_pp) 100 Vpp betragen. Für die zweite Einstellung des elektrischen Feldes kann das angelegte HF-Feld 0 Vpp betragen. Es wird deutlich, dass die zweite Einstellung des elektrischen Feldes den Ionen beim Transport zum Massenanalysator eine geringere Energie verleiht als die erste Einstellung des elektrischen Feldes (d. h. die zweite Einstellung des elektrischen Feldes wird als weichere Einstellung bezeichnet).
Das an den gebogenen Flachpol 50 angelegte Gleichstromfeld kann ebenfalls variiert werden. In einer Ausführungsform kann die Gleichspannung zur Erzeugung des Gradienten beispielsweise 30 V für die erste elektrische Feldeinstellung und 15 V für die zweite elektrische Feldeinstellung betragen. Das an die C-Falle 100 angelegte elektrische Feld kann ebenfalls variiert werden. Beispielsweise kann in einer Ausführungsform der an die C-Falle angelegte Gleichstrom-Offset für die erste Einstellung des elektrischen Feldes 0 V betragen, während für die zweite Einstellung des elektrischen Feldes der an die C-Falle 100 angelegte Gleichstrom-Offset 3 V betragen kann. Dementsprechend kann die Offset-Differenz des elektrischen Gleichfelds (d. h. eine Potenzialdifferenz) zwischen dem gebogenen Flachpol 50 und der C-Falle 100 bei der zweiten elektrischen Feldeinstellung im Vergleich zur ersten elektrischen Feldeinstellung verringert werden. Das an die C-Falle 100 angelegte HF-Feld kann bei der ersten Einstellung des elektrischen Feldes 2000 Vpp betragen, während das HF-Feld bei der zweiten Einstellung des elektrischen Feldes 1500 Vpp betragen kann.
Andere Gleich- und Hochfrequenzfelder, die von Ionentransportvorrichtungen im Massenspektrometer 10 bereitgestellt werden, können für den ersten und zweiten MS1-Scan konstant gehalten werden. Alternativ können die Einstellungen für weitere lonentransportvorrichtungen des Massenspektrometers 10 in ähnlicher Weise wie oben beschrieben variiert werden, um erste und zweite elektrische Feldeinstellungen zu schaffen, wobei das Ausmaß der durch den Ionentransport induzierten Fragmentierung in der zweiten elektrischen Feldeinstellung im Vergleich zur ersten elektrischen Feldeinstellung verringert wird. Somit ist die Energie, die dem zweiten Satz von Ionen während des Transports zum Massenanalysator unter den zweiten elektrischen Feldeinstellungen zugeführt wird, geringer als die Energie, die dem ersten Satz von Ionen während des Transports zum Massenanalysator unter den ersten elektrischen Feldeinstellungen zugeführt wird. Folglich kann ein Anstieg der inneren Energie des zweiten lonensatzes im Verhältnis zum Anstieg der inneren Energie des ersten lonensatzes verringert werden, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer durch den Ionentransport verursachten Fragmentierung des zweiten lonensatzes verringert wird.
Die Steuereinheit (z. B. ein Computerprozessor) kann dann die Massenspektren des ersten und zweiten MS1-Scans analysieren. Die Steuereinheit kann die Isotopenhüllkurvendetektion verwenden, um massenspektrale Peaks zu identifizieren. Die Steuereinheit kann im ersten MS1-Scan nach Massenspektralpeaks suchen und im zweiten MS1-Scan nach einem entsprechenden Massenspektralpeak mit demselben Masse-Ladungs-Verhältnis mit einer vorgegebenen Genauigkeit suchen. In der Regel beträgt die Genauigkeit eines OrbiTrap-Massenanalysators etwa ±5 ppm. Die Genauigkeit kann je nach Versuchseinstellung von etwa ±1 ppm oder bis zu etwa ±50 ppm angegeben werden. Stellt das Kontrollgerät fest, dass im zweiten MS1-Scan kein entsprechender Peak vorhanden ist, kann das Kontrollgerät feststellen, dass der Massenspektralpeak im ersten MS1-Scan auf ein Fragment-Ion hinweist. Entspricht ein Massenspektralpeak im ersten MS1-Scan einem Peak im zweiten MS1-Scan, kann die Steuerenheit feststellen, dass der Massenspektralpeak im ersten MS1-Scan auf einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak hindeutet.
Bei einigen zu analysierenden Proben können durch Ionentransport induzierte Fragmente sowohl im ersten MS1-Scan als auch im zweiten MS1-Scan vorhanden sein. Ein Verfahren gemäß einer Ausführungsform dieser Offenbarung kann in einem solchen Szenario weiter zwischen Vorläuferionen-Massenspektralpeaks und ionen-transportinduzierten Fragmentpeaks unterscheiden, indem es eine durchschnittliche Variation der Signalintensität zwischen dem ersten und zweiten MS1-Scan berücksichtigt.
Dementsprechend kann die Steuereinheit in einigen Ausführungsformen der Offenlegung bestimmen, dass ein Massenspektralpeak des ersten MS1-Scans einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak anzeigt, und zwar auf der Grundlage eines ersten Verhältnisses der Intensität des Massenspektralpeaks im zweiten MS1-Scan (P₂) zur Intensität des Massenspektralpeaks im ersten MS1-Scan (P₁), relativ zu einem zweiten Verhältnis einer durchschnittlichen Intensität des zweiten MS1-Scans (A2) zu einer durchschnittlichen Intensität des ersten MS1-Scans (A1). So kann die relative Größe der Fraktion P₂/P₁ mit der relativen Größe der Fraktion A₂/A₁ verglichen werden.
In einigen Ausführungsformen kann die Steuereinheit beispielsweise feststellen, dass der massenspektrale Peak des ersten MS1-Scans ein durch Ionentransport induziertes Fragment-Ion anzeigt, wenn das erste Verhältnis (P₂/P₁) wesentlich niedriger ist als das zweite Verhältnis (d. h. P₂/P₁ << A₂/A₁). Die Steuereinheit kann bestimmen, dass, wenn das erste Verhältnis (P₂/P₁) im Allgemeinen ähnlich dem zweiten Verhältnis ist (d. h. P₂/P₁ ~ A₂/A₁), der Massenspektralpeak des ersten MS1-Scans ein Vorläuferion anzeigt. In einigen Ausführungsformen kann das erste Verhältnis wesentlich niedriger als das zweite Verhältnis sein, wenn das erste Verhältnis nicht mehr als 50 %, 40 %, 30 %, 20 % oder 10 % des zweiten Verhältnisses beträgt. In anderen Ausführungsformen kann das erste Verhältnis auf der Grundlage eines Referenzpegels, wie weiter unten beschrieben, als wesentlich niedriger als das zweite Verhältnis bestimmt werden.
2 zeigt eine grafische Darstellung eines ersten und eines zweiten MS1-Scans, die durch Verfahren gemäß dieser Offenbarung erhalten werden können. Wie oben beschrieben, wird der zweite MS1-Scan mit einer niedrigeren Energie für die lonentransportvorrichtungen durchgeführt als der erste MS1-Scan. Jedes Diagramm zeigt die Intensität (P₁, P₂) einer Vielzahl von Massenspektralpeaks, aufgetragen gegen das Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) des entsprechenden Peaks. Entsprechende Peaks mit einem ähnlichen m/z-Wert sind in jedem Diagramm mit gleichen Buchstaben (a, b, c, d, e) gekennzeichnet.
Wie aus 2 hervorgeht, sind die Intensitäten der Peaks a, c und e im Allgemeinen zwischen dem ersten und zweiten MS1-Scan unverändert. Daher ist ein erstes Verhältnis (P₂/P₁) für jeden der Peaks a, c und e im Allgemeinen ähnlich wie das zweite Verhältnis (d. h.. P₂/P₁ ~ A₂/A₁) für die beiden MS1-Scans. Somit kann festgestellt werden, dass die Peaks a, c und e auf massenspektrale Vorläufer-Ionen-Peaks hinweisen.
Die Intensität von Peak d in 2 ist im ersten MS1-Scan wesentlich höher als im zweiten MS1 -Scan. Daher ist ein erstes Verhältnis (P₂/P₁) für Peak d wesentlich kleiner als das zweite Verhältnis (d. h. P₂/P₁ << A₂/A₁). Somit kann festgestellt werden, dass dieser Peak für einen massenspektralen Vorläufer-Ionen-Peak nicht repräsentativ ist. Tatsächlich ist der Peak d ein Hinweis auf eine durch den Ionentransport verursachte Fragmentierung. Durch die Verringerung der Energie, die den Ionen während des lonentransports im zweiten MS1-Scan zugeführt wird, wird die durch den Ionentransport induzierte Fragmentierung im zweiten MS1-Scan und damit die relative Intensität dieses Peaks im zweiten MS1-Scan verringert.
Die Intensität von Peak b in 2 ist im zweiten MS1-Scan wesentlich höher als im ersten MS1 -Scan. Daher ist ein erstes Verhältnis (P₂/P₁) für Peak b wesentlich höher als das zweite Verhältnis (d. h. P₂/P₁ >> A₂/A₁). Bei Massenspektralpeaks mit einem ersten Verhältnis, das wesentlich höher ist als das zweite Verhältnis, kann der Massenspektralpeak für ein Vorläuferion repräsentativ sein, das besonders empfindlich ist (d. h. das Vorläuferion ist unter der für den ersten Scan verwendeten lonentransportenergie anfällig für Fragmentierung).
Verschiedene vom Massenspektrometer 10 gemessene Parameter können für die Intensität eines Massenspektralpeaks repräsentativ sein. In einigen Ausführungsformen kann die Peakintensität eines Massenspektrumspeaks durch einen extrahierten lonenstrom (XIC) dargestellt werden, der vom Massenanalysator (orbitales Einfanggerät 110) gemessen wird. Als solches kann das erste Verhältnis ein Verhältnis des extrahierten lonenstroms (XIC₂) des zweiten MS1-Scans zum extrahierten lonenstrom sein, der vom Massenanalysator des ersten MS1-Scans (XIC₁) gemessen wurde. In anderen Ausführungsformen kann die Peakintensität eines Massenspektralpeaks durch das Signal-Rausch-Verhältnis eines Peaks dargestellt werden. Dementsprechend kann ein erstes Verhältnis ein Verhältnis des Signal-Rausch-Verhältnisses eines Peaks des zweiten MS1-Scans (SN₂) zu einem Signal-Rausch-Verhältnis eines Peaks des ersten MS1-Scans (SN₁) sein.
Verschiedene vom Massenspektrometer 10 gemessene Parameter können auch als Durchschnittsintensitäten verwendet werden. In einigen Ausführungsformen kann jede durchschnittliche Intensität des ersten und zweiten MS1-Scans aus der durchschnittlichen Intensität über im Wesentlichen denselben Bereich von Masse-Ladungs-Verhältnissen für jeden Scan bestimmt werden. In einigen Ausführungsformen kann eine durchschnittliche Peakintensität der durchschnittliche extrahierte lonenstrom (XIC_A) für das Massenspektrum sein. Der durchschnittliche extrahierte lonenstrom kann berechnet werden als der gesamte extrahierte lonenstrom während des Scans geteilt durch den Massenbereich des Scans (oder als Summe der lonenstrommessungen geteilt durch die Anzahl der lonenstrommessungen über den Massenbereich des Scans). Als solches kann das zweite Verhältnis ein Verhältnis des durchschnittlichen extrahierten lonenstroms (XIC_A2) des zweiten MS1-Scans zum durchschnittlichen extrahierten lonenstrom sein, der vom Massenanalysator des ersten MS1-Scans (XIC_A1) gemessen wurde. Alternativ kann ein zweites Verhältnis ein Verhältnis des durchschnittlichen Signal-Rausch-Verhältnisses des zweiten MS1-Scans (SN_A2) zu einem durchschnittlichen Signal-Rausch-Verhältnis des ersten MS1-Scans (SN_A1) sein.
Dementsprechend kann das Massenspektrometer 10 die folgenden Kriterien verwenden, um zu bestimmen, ob ein Massenspektralpeak im ersten MS1-Scan auf ein Fragment-Ion hinweist: XIC₂ / XIC₁ << XIC_A2 / XIC_A1; oder SN₂ / SN₁ << SN_A2 / SN_A1.
Die durchschnittliche Intensität des ersten und zweiten MS1-Scans kann in einigen Ausführungsformen durch die Gesamtintensität über im Wesentlichen denselben Bereich von Masse-Ladungs-Verhältnissen für jeden Scan dargestellt werden. Die Gesamtintensität kann der Gesamtionenstrom (TIC) für das Massenspektrum sein. Als solches kann das zweite Verhältnis ein Verhältnis des vom Massenanalysator gemessenen Gesamtionenstroms (TIC₂) des zweiten MS1-Scans zum Gesamtionenstrom des ersten MS1-Scans (TIC₁) sein. Alternativ kann ein zweites Verhältnis ein Verhältnis des Gesamtsignal-Rausch-Verhältnisses des zweiten MS1-Scans (TIC₁) zu einem Gesamtsignal-Rausch-Verhältnis des ersten MS1-Scans (allSN₁) sein.
Dementsprechend kann das Massenspektrometer 10 die folgenden Kriterien verwenden, um zu bestimmen, ob ein Massenspektralpeak im ersten MS1-Scan auf ein Fragment-Ion hinweist: XIC₂ / XIC₁ << TIC₂ / TIC₁; oder SN₂ / SN₁ << allSN₂ / allSN₁.
Das Kriterium zur Bestimmung, ob ein massenspektraler Peak im ersten MS1-Scan ein Fragment-Ion darstellt, kann ein festes Verhältnis zwischen dem ersten und dem zweiten Verhältnis sein. Dieses Verhältnis kann als ein drittes Verhältnis zwischen dem ersten und dem zweiten Verhältnis realisiert werden. Dementsprechend kann das Massenspektrometer die folgenden Kriterien verwenden, um zu bestimmen, ob ein Massenspektralpeak im ersten MS1-Scan ein Fragment-Ion darstellt: (XIC₂ / XIC₁) / (XIC_A2 / XIC_A1) << 1; oder (SN₂/ SN₁) / (SN_A2 / SN_A1) << 1 oder (XIC₂ / XIC₁) / (TIC₂ / TlC₁) << 1; oder (SN₂/ SN₁) / (allSN₂ / allSN₁) << 1.
Die Identifizierung von Fragment-Ionen-Peaks bedeutet, dass sie aus dem ersten und/oder zweiten MS1-Spektrum ausgeschlossen werden können, insbesondere für die nachfolgende Verarbeitung, z. B. durch DDA- und DIA-Verarbeitung. Dadurch wird die Qualität der MS1-Daten verbessert.
In einer Ausführungsform kann ein Referenzpegel als Kriterium verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Massenspektralpeak im ersten MS1-Scan auf ein Fragment-Ion hinweist. Wenn das dritte Verhältnis innerhalb eines bestimmten, durch den Referenzpegel definierten Bereichs liegt, wird der Massenspektralpeak im MS1-Scan als Vorläuferionen-Massenspektralpeak bestimmt. Wird beispielsweise festgestellt, dass das dritte Verhältnis eines Massenspektralpeaks mindestens 50 % des Referenzpegels beträgt, kann der Massenspektralpeak als Vorläuferionen-Massenspektralpeak eingestuft werden. Dementsprechend kann ein Massenspektralpeak, der einen signifikanten Intensitätsabfall zwischen dem ersten und dem zweiten MS1-Scan (im Verhältnis zu einer durchschnittlichen Intensitätsänderung) aufweist, als ein Peak bestimmt werden, der auf ein durch den Ionentransport induziertes Fragment hinweist. Wird beispielsweise festgestellt, dass das dritte Verhältnis weniger als 50 % des Referenzpegels beträgt, kann der massenspektrale Peak als Hinweis auf ein Fragment-Ion gewertet werden. Natürlich kann der Referenzpegel auf jeden geeigneten Wert eingestellt werden, je nachdem, wie sicher man sein möchte, dass ein Peak auf ein Fragment-Ion zurückzuführen ist. In einigen Ausführungsformen kann der Referenzpegel zum Beispiel mindestens 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 oder 0,5 betragen. In einigen Ausführungsformen kann der Referenzpegel nicht höher sein als: 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,5, 1,8 oder 2.
Darüber hinaus können Ausführungsformen dieser Offenbarung auch eine Obergrenze für die Kriterien vorsehen. Wird beispielsweise festgestellt, dass das Drittelverhältnis eines Massenspektralpeaks nicht größer als das Zweifache des Referenzpegels ist, kann der Massenspektralpeak als Vorläuferionen-Massenspektralpeak eingestuft werden. Dementsprechend kann ein Massenspektralpeak, der eine signifikante Zunahme der Intensität zwischen dem ersten und dem zweiten MS1-Scan (relativ zu einer durchschnittlichen Änderung der Intensität) aufweist, als Hinweis auf einen lonencluster mit einem ähnlichen Masse-Ladungs-Verhältnis bestimmt werden. Die Information, dass der Peak möglicherweise für Cluster-Ionen repräsentativ ist, kann zur Vereinfachung der weiteren Analyse durch das Massenspektrometer nützlich sein. Bei Cluster-Ionen kann es sich um Kombinationen von Vorläufer-Ionen handeln, die durch nicht-kovalente Kräfte miteinander verbunden sind, wie sie häufig bei MS1-Scans unter niedrigen Energiebedingungen (Soft-Scans) vorkommen. Cluster-Ionen können zum Beispiel protonierte Lösungsmittel oder Addukte sein.
In einer Ausführungsform kann der Referenzpegel auf einem vierten Verhältnis einer Injektionszeit für den ersten MS1-Scan zu einer Injektionszeit für den zweiten MS1-Scan basieren. Bei dem im Massenspektrometer 10 dieser Offenbarung implementierten Verfahren kann eine Injektionszeit für einen MS1-Scan die Zeit sein, die für die Injektion von Vorläuferionen in die C-Falle 100 benötigt wird. Es wird deutlich, dass die Injektionszeit die Anzahl der Ionen (lonenpopulation) bestimmt, die anschließend aus der C-Falle 100 in den Massenanalysator ausgestoßen werden. Darüber hinaus kann die Variation der elektrischen Feldeinstellungen der lonentransportvorrichtungen dazu führen, dass sich die C-Falle 100 bei den zweiten elektrischen Feldeinstellungen langsamer füllt als bei den ersten elektrischen Feldeinstellungen. Daher kann im Massenspektrometer 10 dieser Offenbarung die Injektionszeit für den ersten und zweiten MS1-Scan so variiert werden, dass etwa die gleiche Anzahl von Ionen in die C-Falle 100 injiziert wird. Die Injektionszeit für die ersten und zweiten MS1-Abtastungen kann mit einem automatischen Verstärkungsregelungsmechanismus gesteuert werden, wie beispielsweise in US 6,987,216 beschrieben.
In anderen Ausführungsformen, die auf verschiedenen Massenspektrometersystemen implementiert sind, kann die Injektionszeit die Anzahl der Ionen und/oder die für die Injektion der Ionen in den Massenanalysator benötigte Zeit angeben. Wie der Fachmann versteht, kann die Zeit, die für die Injektion der Ionen in den Massenanalysator benötigt wird, die Intensität des massenspektralen Peaks (d. h. das Signal-Rausch-Verhältnis) beeinflussen, da mit zunehmender Injektionszeit eine größere Anzahl von Ionen in den Massenanalysator injiziert werden kann. So kann das vierte Verhältnis der Injektionszeiten für den ersten und zweiten MS1-Scan einen Hinweis auf die relativen Signalpegel geben, die bei jedem der ersten und zweiten MS1-Scans zu erwarten sind.
Der Referenzpegel kann so bestimmt werden, dass er gleich dem vierten Verhältnis ist. Wenn das dritte Verhältnis innerhalb eines bestimmten Bereichs liegt, der durch das vierte Verhältnis definiert ist, wird der Massenspektralpeak im MS1-Scan als Vorläuferionen-Massenspektralpeak bestimmt. Wird beispielsweise festgestellt, dass das dritte Verhältnis eines Massenspektralpeaks mindestens 50 % des vierten Verhältnisses beträgt, kann der Massenspektralpeak als Vorläuferionen-Massenspektralpeak eingestuft werden. In anderen Ausführungsformen kann das Kriterium für die Feststellung, dass der Massenspektralpeak ein Vorläuferionen-Massenspektralpeak ist, darin bestehen, dass das dritte Verhältnis mindestens X % des vierten Verhältnisses beträgt, wobei X für 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % oder 60 % steht.
Zum Beispiel kann für das Massenspektrometer 10 dieser Offenbarung eine Injektionszeit für den ersten MS1-Scan 1 ms und eine Injektionszeit für den zweiten MS1-Scan 10 ms betragen. Somit kann ein viertes Verhältnis etwa 0,1 betragen. Das vierte Verhältnis kann in Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden, bei denen die Injektionszeit zur Injektion einer vorgegebenen Anzahl von Ionen in die C-Falle 100 für den ersten und zweiten MS1-Scan in den zulässigen Bereich der Injektionszeiten für das Massenspektrometer 10 fällt.
So kann in einer Ausführungsform, bei der der Referenzpegel, der durch das vierte Verhältnis der Injektionszeiten gegeben ist, 0,1 beträgt, ein Massenspektralpeak als Indikator für einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak bestimmt werden, wenn das dritte Verhältnis innerhalb des Bereichs liegt: $0.05 \leq drittes Verh \ddot{a} ltnis \leq 0 .2$
In einem Beispiel wird eine bekannte Probe eines tryptischen Peptids (ALELFR) mit dem Massenspektrometer 10 der vorliegenden Offenbarung analysiert. Diese spezielle Probe ist besonders empfindlich für eine durch Ionentransport induzierte Fragmentierung. Die Probe wird von der ESI-Quelle 20 ionisiert, und es werden zwei MS1-Scans der Vorläufer-Ionen erstellt. Die Injektionszeit für den ersten MS1-Scan betrug 3,2 ms, und die Injektionszeit für den zweiten MS1-Scan betrug 24 ms. Somit werden der erste und der zweite MS1-Scan mit einem Injektionszeitverhältnis (viertes Verhältnis) von 0,133 durchgeführt. Die aus den beiden MS1-Scans erhaltenen Massenspektren werden analysiert, und eine grafische Darstellung der Analyse ist in zu sehen. zeigt eine Darstellung der dritten Verhältnisse (z. B. (XIC₂ / XIC₁) / (XIC_A2 / XIC_A1)), die für die mit den beiden MS1-Scans gemessenen massenspektralen Peaks berechnet wurden. Die dritten Verhältnisse werden gegen das entsprechende Masse-Ladungs-Verhältnis des massenspektralen Peaks aufgetragen. Zu Referenzzwecken wird auch eine Linie eingezeichnet, die das Verhältnis der Injektionszeit (viertes Verhältnis) darstellt. Wie oben beschrieben, ist in diesem Beispiel das Kriterium zur Bestimmung, ob ein Massenspektralpeak auf einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak hinweist, wenn das dritte Verhältnis eines Massenspektralpeaks mindestens 50 % des vierten Verhältnisses beträgt. Dementsprechend können Massenspektralpeaks bei etwa m/z 435,272 und m/z 564,315 als Ergebnis einer durch den Ionentransport induzierten Fragmentierung bestimmt werden. Diese Peaks entsprechen bekanntermaßen den Fragmenten des ALELFR-Vorläuferions. Der Massenspektralpeak m/z = 748,436 kann als Massenspektralpeak eines Vorläuferions identifiziert werden, da das dritte Verhältnis dem vierten Verhältnis sehr ähnlich ist. Es ist bekannt, dass Peaks bei diesen Masse-Ladungs-Verhältnissen den Masse-Ladungs-Verhältnissen der verschiedenen lonisierungszustände des bekannten ALELFR-Vorläufers entsprechen.
Der massenspektrale Peak bei m/z = 374,722 in 3 kann nominell als Hinweis auf eine durch Ionentransport induzierte Fragmentierung eingestuft werden, da die Peakintensität weniger als 50 % des vierten Verhältnisses beträgt. Der massenspektrale Peak entspricht jedoch einem mehrfach geladenen Peak (in diesem Fall doppelt geladen) des Vorläuferions ALELFR. Bei einigen besonders empfindlichen Vorläuferionen wie ALELFR wird beobachtet, dass mehrfach geladene Vorläuferionen bei der Analyse unter relativ niedrigen elektrischen Feldern (d. h. zweiten elektrischen Feldern) nicht so stabil sind wie der einfach geladene Zustand. Dies kann dazu führen, dass Massenspektralpeaks, die mit mehrfach geladenen Vorläuferionen assoziiert sind, fälschlicherweise als Hinweis auf eine durch den Ionentransport verursachte Fragmentierung identifiziert werden. Um zu versuchen, solche Identifizierungen zu korrigieren, kann die Steuereinheit auch prüfen, ob Massenspektralpeaks, die als Hinweis auf ein durch Ionentransport induziertes Fragment identifiziert wurden, mit einem Massenspektralpeak assoziiert werden können, der als Hinweis auf ein einfach geladenes Vorläuferion identifiziert wurde. In der Darstellung von kann der Massenspektralpeak bei m/z = 374,722 mit dem Massenspektralpeak m/z = 748,436 assoziiert werden, der als Indikator für ein Vorläuferion (ALELFR¹⁺) bestimmt wurde. So kann der Kontrolleur durch eine weitere Überprüfung feststellen, dass der massenspektrale Peak bei m/z = 374,722 auf ein Vorläuferion (ALELFR²⁺) hinweist.
In einem zweiten Beispiel wird eine Probe einer Calmix-Infusionslösung mit dem Massenspektrometer 10 der vorliegenden Offenbarung analysiert. Die Calmix-Probe enthält: 0,0005% n-Butylamin, 2 µg/mL Koffeinlösung, 1 µg/mL MRFA (Peptid), 0,001% UltraMark 1621, 50% Acetonitril, 25% Methanol und 1% Essigsäure. Die Probe wird mit der ESI-Quelle 20 ionisiert, und es werden zwei MS1-Scans der Vorläufer-Ionen erstellt. Die Injektionszeit für den ersten MS1-Scan betrug 0,94 ms, und die Injektionszeit für den zweiten MS1-Scan betrug 6,4 ms. Somit wurden der erste und der zweite MS1-Scan mit einem Injektionszeitverhältnis (viertes Verhältnis) von etwa 0,147 durchgeführt. Die aus den beiden MS1-Scans erhaltenen Massenspektren werden analysiert, und eine grafische Darstellung der Analyse ist in zu sehen. zeigt eine Darstellung der dritten Verhältnisse ((XIC₂ / XIC₁) / (XIC_A2 / XIC_A1)), die für die mit den beiden MS1-Scans gemessenen massenspektralen Peaks berechnet wurden. Die dritten Verhältnisse sind gegen das entsprechende Masse-Ladungs-Verhältnis des Massenspektralpeaks aufgetragen. Zu Referenzzwecken wird auch eine Linie eingezeichnet, die das Verhältnis der Injektionszeit (viertes Verhältnis) darstellt. Wie oben beschrieben, ist in diesem Beispiel das Kriterium zur Bestimmung, ob ein Massenspektralpeak auf einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak hinweist, wenn das dritte Verhältnis eines Massenspektralpeaks mindestens 50 % des vierten Verhältnisses beträgt. Dementsprechend wird ein MRFA-Fragment mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von m/z 393,224 identifiziert, und ein Massenspektralpeak bei m/z 524,265 wird als Vorläuferionen-Massenspektralpeak bestimmt.
5 zeigt eine Zeitreihe chromatographischer Peaks, die bei der Flüssigchromatographie eines Verdauungsgemisches aus sechs Proteinen in reinen Lösungsmitteln (ohne komplexe Matrix) entstanden sind. Die chromatografischen Peaks wurden mit einem Massenanalysator analysiert, der zwei unabhängige MS1-Scans mit „Standard“- (ein erster MS1-Scan) und „Soft“-Einstellungen (ein zweiter MS1-Scan) für das elektrische Feld beim Ionentransport durchführte. Das Masse-Ladungs-Verhältnis für jeden chromatographischen Peak ist in der Zeitreihe angegeben. 5 ist somit repräsentativ für Rohdaten, die durch MS1-Scans erzeugt werden können. Es ist zu erkennen, dass sich die relativen Intensitäten zumindest einiger Peaks zwischen dem ersten und dem zweiten MS1-Scan ändern, während andere Peaks weitgehend unverändert bleiben, was die Identifizierung von Peaks aufgrund von Vorläufern und Peaks aufgrund von Fragmenten gemäß der erfindungsgemäßen Methode ermöglicht.
6 ist eine grafische Darstellung der in 5 gezeigten Daten nach der Analyse durch ein Verfahren zur Analyse massenspektraler Peaks gemäß einer Ausführungsform dieser Offenbarung. Dementsprechend wurden die Peaks im ersten MS1-Scan mit den entsprechenden Peaks im zweiten MS1-Scan verglichen. In Übereinstimmung mit den Methoden dieser Offenbarung wird der Peak bei m/z = 585,3 als massenspektraler Vorläufer-Ionen-Peak bestimmt. Andere durch den Ionentransport induzierte Fragmente werden ebenfalls im ersten MS1-Scan angezeigt. Der ermittelte Vorläuferionen-Massenspektralpeak bei m/z 585,3 entspricht bekanntermaßen dem in der Probe enthaltenen tryptischen Peptid VGPLLAC(carboxymethyl)LLGR.
7 zeigt ein Histogramm der Vorläufer-Ionen nach einem MassenspektrometrieExperiment gemäß einer Ausführungsform dieser Offenbarung. In dem Massenspektrometrieexperiment von 7 wurde ein Massenspektrometer 10 zur Massenanalyse eines HeLa-Digests mit ersten und zweiten MS1-Scans gemäß dieser Offenbarung verwendet. Für jeden massenspektralen Peak, der in den ersten und zweiten MS1-Scans detektiert wurde, wurden erste, zweite und dritte Verhältnisse gemäß dieser Offenbarung berechnet. Die dritten Verhältnisse, die nach der Analyse der in den beiden MS1-Scans identifizierten massenspektralen Peaks berechnet wurden, wurden gegen das vierte Verhältnis (Referenzniveau) normiert und in 7 als Histogramm aufgetragen (d. h. 1 bedeutet, dass das dritte Verhältnis gleich dem vierten Verhältnis ist). Wie in 7 gezeigt, werden bei der Analyse eine Reihe von Massenspektralpeaks mit einem normalisierten dritten Verhältnis von mehr als 2 identifiziert, wobei einige Massenspektralpeaks ein normalisiertes drittes Verhältnis von mehr als 4 aufweisen (wie durch den Pfeil in 7 angezeigt). Solche massenspektralen Peaks können auf Vorläuferionen hindeuten, die für eine durch den Ionentransport induzierte Fragmentierung anfällig sind und daher mit „Standard“-Ionentransporteinstellungen typischerweise schwer zu analysieren wären.
In einigen Ausführungsformen dieser Offenlegung kann der Referenzpegel kalibriert werden, um von der Masse zum Ladungsverhältnis abhängige Schwankungen bei den Kriterien zur Bestimmung, ob ein Massenspektralpeak auf einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak hindeutet, zu berücksichtigen. So kann ein (vorbestimmter) Referenzpegel, der zur Bestimmung verwendet wird, ob ein erstes oder drittes Verhältnis eines Massenspektralpeaks auf einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak hindeutet, so kalibriert werden, dass er eine Abhängigkeit vom Masse-Ladungs-Verhältnis berücksichtigt.
Beispielsweise kann ein Massenspektrum für einige Proben hauptsächlich aus Fragmenten bestehen, die durch den Ionentransport verursacht wurden. Dementsprechend kann ein Verhältnis der Intensitäten (z. B. XIC, SN) zu einem Referenzpegel auf der Grundlage der gesamten ioneninduzierten Ströme (TIC) oder eines durchschnittlichen Signal-Rausch-Verhältnisses (SN_A) weniger empfindlich auf den Nachweis fragmentierter Ionen reagieren, da die Menge der fragmentierten Ionen im zweiten MS1-Scan mit niedrigerer Energie immer noch erheblich sein kann. Daher kann der Referenzpegel für das Massenspektrometer auf der Grundlage von Referenzmessungen der Massenspektralpeakintensität bei ersten und zweiten elektrischen Feldeinstellungen kalibriert werden. Die Referenzmessungen können im Voraus unter Verwendung einer bekannten Referenzprobe durchgeführt und von der Steuereinheit für künftige Messungen gespeichert werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Offenbarung kann das Massenspektrometer 1 aus 1 so modifiziert werden, dass es eine lonenaktivierungsvorrichtung enthält. Die lonenaktivierungsvorrichtung kann so konfiguriert sein, dass sie Ionen aktiviert, die von einer der lonentransportvorrichtungen (Kapillare 25, SRIG 30, Injektions-Flachpol 40, gebogener Flachpol 50, lonentor (TK-Linse) 60, Quadrupol-Massenfilter 70, Quadrupol-Austrittslinsen/Splitlinsenanordnung 80, Transfer-Multipol 90 und C-Falle 100) in die Orbitalfangvorrichtung 110 transportiert werden. Die Ionen müssen nicht unbedingt gespeichert werden, um von der lonenaktivierungsvorrichtung aktiviert zu werden. Beispielsweise kann die lonenaktivierungsvorrichtung so konfiguriert sein, dass sie Ionen im Injektions-Flachpol 40 aktiviert.
In einigen Ausführungsformen kann es beispielsweise wünschenswert sein, Ionen zu aktivieren, um Vorläuferionen zu desolvieren, wenn ein Cluster von Vorläufer-Lösungsmittel-Ionen in der Probe vorhanden ist. Die lonenaktivierungsvorrichtung kann den Ionen für den ersten MS1-Scan Energie zuführen, so dass die Intensität der Vorläufer-Lösungsmittel-Cluster-Ionen im ersten MS1-Scan reduziert wird. Beim zweiten MS1-Scan kann die lonenaktivierungsvorrichtung inaktiv sein (d. h. keine Energie abgeben) oder mit verringerter Intensität betrieben werden, so dass es zu einer geringeren Desolvation der Vorläufer-Lösungsmittelbündel-Ionen kommt. Dadurch kann ein Unterschied in der Intensität der Vorläufer-Lösungsmittel-Cluster-Ionen zwischen dem ersten und dem zweiten MS1-Scan entstehen, was die Identifizierung von Vorläufer-Ionen-Massenspektralpeaks durch den Vergleich der Massenspektralpeaks des ersten und zweiten MS1-Scans ermöglicht. Bestimmte durch den Ionentransport induzierte Fragmente können auch im ersten MS1-Scan durch den Vergleich der Massenspektralpeaks des ersten und zweiten MS1-Scans angezeigt werden.
Bei der ionenaktivierenden Vorrichtung kann es sich um eine Laserstrahlquelle, eine Elektronenstrahlquelle, eine lonenstrahlquelle oder eine Molekularstrahlquelle handeln. Die Laserstrahlquelle kann eine Laserstrahlung mit einer Wellenlänge liefern, die geeignet ist, die zu analysierenden Vorläuferionen zu aktivieren. Bei dem Laser kann es sich zum Beispiel um einen Infrarotlaser, einen Laser für sichtbares Licht oder einen UV-Laser handeln. Die lonenaktivierungsvorrichtung ist so konfiguriert, dass sie den Ionen Energie zuführt, aber nicht absichtlich die Ionen fragmentiert.
Dementsprechend können die Verfahren und Systeme dieser Offenbarung kalibriert werden, um massenabhängige Schwankungen bei der Übertragung von Ionen durch die lonentransportvorrichtungen des Massenspektrometers zu berücksichtigen. Bei einigen Massenspektrometern kann sich die massenabhängige Übertragungseffizienz auf die Intensität auswirken, mit der Fragment-Ionen identifiziert werden. Durch Kalibrierung der Steuerung zur Berücksichtigung der Übertragungseffizienz kann das Verfahren verbessert werden, um durch den Ionentransport verursachte Fragmente genauer zu erkennen.
Die Systeme und Methoden dieser Offenlegung analysieren massenspektrale Peaks auf der Grundlage verschiedener Beziehungen zwischen Parametern, die mit dem ersten und zweiten MS1-Scan verbunden sind. Die Beziehungen zwischen den Parametern werden hier als verschiedene Verhältnisse beschrieben. Die hier definierten Verhältnisse werden im Allgemeinen als Verhältnis eines Parameters, der mit dem zweiten MS1-Scan verbunden ist, zu einem Parameter, der mit dem ersten MS1-Scan verbunden ist, dargestellt. Es versteht sich von selbst, dass die Beziehungen zwischen den Parametern, die dem ersten und zweiten MS1-Scan zugeordnet sind, und die zugehörigen Kriterien für die Analyse massenspektraler Peaks auch durch Umkehrungen der in dieser Offenbarung beschriebenen Verhältnisse dargestellt werden können. Daher ist in dieser Offenbarung beabsichtigt, dass die Bezugnahme auf eine Bestimmung/Berechnung „auf der Grundlage“ eines Verhältnisses jede Bestimmung/Berechnung umfasst, die beliebige Umkehrungen der genannten Verhältnisse oder Kriterien verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform dieser Offenbarung wird ein Verfahren der datenabhängigen Massenspektrometrie bereitgestellt. Das datenabhängige Verfahren der Massenspektrometrie führt erste und zweite MS1-Scans durch und analysiert die massenspektralen Peaks im Wesentlichen in Übereinstimmung mit den oben beschriebenen Verfahren. Durch die Bestimmung, welche massenspektralen Peaks in den ersten und/oder zweiten MS1-Scans auf Vorläuferionen hinweisen, kann die nachfolgende datenabhängige Analyse auf die interessierenden Vorläuferionen konzentriert werden. Mit anderen Worten: Alle Massenspektralpeaks, die als Fragment-Ionen identifiziert werden, können von der nachfolgenden datenabhängigen Analyse ausgeschlossen werden. So können die nachfolgenden Verfahrensschritte und die Analyse durch die Eliminierung der durch den Ionentransport verursachten Fragmente von der weiteren Analyse vereinfacht werden.
So kann das Verfahren der datenabhängigen Massenspektrometrie die Informationen aus dem ersten und zweiten MS1-Scan verwenden, um Ionen mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis auszuwählen, das auf ein Vorläuferion für die MS2-Analyse hinweist. Beim Massenspektrometer 10 dieser Offenbarung kann der Schritt der Massenauswahl eines dritten lonensatzes durch den Quadrupol-Massenfilter 70 durchgeführt werden. Der dritte Satz von Ionen kann dann in der Fragmentierungskammer 120 (absichtlich) fragmentiert werden, um einen Satz fragmentierter Ionen zu erzeugen. Diese fragmentierten Ionen können dann zur Massenanalyse in die Orbitalfangvorrichtung 110 transportiert werden. Der resultierende Scan der fragmentierten Ionen wird als MS2-Scan bezeichnet.
In einer Ausführungsform der datenabhängigen Massenspektrometrie können die obersten N häufigsten Vorläuferionen für die MS2-Analyse ausgewählt werden. Bei der Auswahl der N häufigsten Vorläuferionenspezies können die Massenspektralpeaks berücksichtigt werden, die bei den MS1-Scans als Hinweis auf einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak ermittelt wurden. So können Ionen mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis, das Massenspektralpeaks entspricht, die nicht als Vorläuferionen bestimmt wurden (d. h. durch Ionentransport induzierte Fragment-Ionen), vom Massenspektrometer außer Acht gelassen und nicht weiter analysiert werden.
Methoden der datenabhängigen Analyse (DDA) für die Massenspektrometrie sind dem Fachmann gut bekannt. Dementsprechend kann das hier beschriebene Verfahren der datenabhängigen Massenspektrometrie alle anderen Schritte oder Merkmale der DDA enthalten, die dem Fachmann bekannt sind.
In einer anderen Ausführungsform dieser Offenbarung wird ein Verfahren der datenunabhängigen Massenspektrometrie bereitgestellt.
Im Allgemeinen umfassen die Verfahren der datenunabhängigen Massenspektrometrie die Durchführung eines MS1-Scans über einen breiten m/z-Bereich (ein MS1-Scan über den gesamten Bereich) und einer Vielzahl von MS2-Scans. Für jeden MS2-Scan wird ein Massenfilter (z. B. Quadrupol-Massenfilter 70) so eingestellt, dass eine Gruppe von Vorläuferionen mit einem relativen Bereich von m/z ausgewählt wird. Die nach Masse ausgewählten Vorläuferionen werden dann in einer Fragmentierungskammer (z. B. Fragmentierungskammer 120) fragmentiert, und die resultierenden Fragmente werden anschließend analysiert. Ein datenunabhängiges Verfahren der Massenspektrometrie umfasst also die Durchführung eines MS1-Scans, der den interessierenden Massenbereich abdeckt, und einer Vielzahl datenunabhängiger MS2-Scans.
Gemäß dem Verfahren der datenunabhängigen Massenspektrometrie dieser Offenbarung wird das Verfahren der Massenspektrometrie durchgeführt, um einen MS1-Scan über den interessierenden Massenbereich zu erhalten. So werden ein erster und ein zweiter MS1-Scan erhalten, wobei die für den Transport des zweiten Satzes der Vorläuferionen zum Massenanalysator verwendete Energie geringer ist als die für den Transport des ersten Satzes der Vorläuferionen zum Massenanalysator verwendete Energie. Es können auch mehrere datenunabhängige MS2-Scans durchgeführt werden, um Daten zu erhalten, die für eine datenunabhängige Analyse geeignet sind.
Das Verfahren der datenunabhängigen Massenspektrometrie kann einen Datensatz für die DIA liefern, der leichter zu analysieren ist, da die Massenspektralpeaks in den MS1-Abtastungen leichter charakterisiert werden können. So können beispielsweise vor der Analyse der MS2-Daten Massenspektralpeaks, die auf Vorläuferionen hinweisen, allein aus den MS1-Daten identifiziert werden, was die Verarbeitung der Daten vereinfacht.
In einer Ausführungsform der datenunabhängigen Massenspektrometrie, die in 8 grafisch dargestellt ist, kann beispielsweise ein erster MS1-Scan unter „Standard“-lonentransporteinstellungen und ein zweiter MS1-Scan unter „weichen“ lonentransporteinstellungen durchgeführt werden. So kann der zweite MS1-Scan mit den lonentransportvorrichtungen durchgeführt werden, die den Vorläuferionen für den zweiten MS1-Scan weniger Energie zuführen als die Energie, die den Vorläuferionen für den ersten „Standard“-MS1-Scan zugeführt wird. Die beiden MS1-Scans können nacheinander durchgeführt werden, gefolgt von einer Vielzahl datenunabhängiger MS2-Scans. In anderen Ausführungsformen kann der erste und/oder zweite MS1-Scan nach der Vielzahl der MS2-Scans oder zwischen einigen der MS2-Scans durchgeführt werden.
Die Methoden der DIA-Massenspektrometrie sind dem Fachmann gut bekannt. Dementsprechend kann die hier beschriebene Methode der DIA-Spektrometrie alle anderen Schritte oder Merkmale der DIA enthalten, die dem Fachmann bekannt sind. Insbesondere ist zu beachten, dass die beiden MS1-Scans und die mehreren MS2-Scans in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden können.
Während das in 1 gezeigte Massenspektrometer 1 einen Massenanalysator (Orbitalfangvorrichtung 110) umfasst, kann ein Massenspektrometer in anderen Ausführungsformen eine Vielzahl von Massenanalysatoren umfassen, z. B. einen ersten Massenanalysator und einen zweiten Massenanalysator. Ein Beispiel ist das Orbitrap Fusion™ Tribrid-Massenspektrometer, das einen linearen lonenfallen-Massenanalysator und einen Orbitalfallen-Massenanalysator umfasst, die unterschiedliche maximale Massenauflösungen erreichen können. Solche Konfigurationen können die Einschaltdauer aufgrund der Parallelisierung verschiedener Geräteoperationen erhöhen. Bei den oben beschriebenen DDA- und DIA-Verfahren kann das Massenspektrometer (über seine Steuerung) beispielsweise so konfiguriert werden, dass die MS1-Abtastungen mit dem ersten Massenanalysator und die mindestens eine MS2-Abtastung mit dem zweiten Massenanalysator durchgeführt werden. In einigen Ausführungsformen ist der erste Massenanalysator so konfiguriert, dass er die MS1-Abtastungen mit einer höheren Massenauflösung durchführt als der zweite Massenanalysator für die Durchführung der MS2-Abtastungen konfiguriert ist.
Es wird deutlich, dass die vorliegende Offenbarung nicht auf die oben beschriebenen Ausführungsformen beschränkt ist und dass Modifikationen und Variationen der oben beschriebenen Ausführungsformen für den Fachmann ohne weiteres erkennbar sind. Merkmale der oben beschriebenen Ausführungsformen können in jeder geeigneten Kombination mit Merkmalen anderer oben beschriebener Ausführungsformen kombiniert werden, wie es für den Fachmann leicht erkennbar ist, und die spezifischen Kombinationen von Merkmalen, die in den oben beschriebenen Ausführungsformen beschrieben sind, sollten nicht als einschränkend verstanden werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 6586727 B [0010]
US 6717130 B [0011]
WO 2006/103412 A [0065]
US 6987216 [0100]

Claims

Verfahren zur Massenspektrometrie, umfassend: Ionisierung einer Probe zur Erzeugung einer Vielzahl von Vorläuferionen; Durchführen eines ersten MS1-Scans, umfassend: Transportieren eines ersten Satzes der Vorläuferionen zu einem Massenanalysator unter Verwendung einer lonentransportvorrichtung, die mit einer ersten Einstellung betrieben wird, und Massenanalyse des ersten Satzes der Vorläuferionen; Durchführen eines zweiten MS1-Scans, umfassend: Transportieren eines zweiten Satzes der Vorläuferionen zu einem Massenanalysator unter Verwendung der Ionentransportvorrichtung, die mit einer zweiten Einstellung betrieben wird; und Massenanalyse des zweiten Satzes der Vorläufer-Ionen; wobei die erste Einstellung und die zweite Einstellung der lonentransportvorrichtung so vorgesehen sind, dass eine Energie, die auf den zweiten Satz von Vorläuferionen durch die Ionentransportvorrichtung übertragen wird, geringer ist als die Energie, die auf den ersten Satz von Vorläuferionen durch die lonentransportvorrichtung übertragen wird; und Bestimmen, ob ein Massenspektralpeak in mindestens einem der ersten MS1-Abtastung oder der zweiten MS1-Abtastung einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak anzeigt, basierend auf relativen Intensitäten von Massenspektralpeaks der ersten und zweiten MS1-Abtastung.
Verfahren zur Massenspektrometrie nach Anspruch 1, wobei die lonentransportvorrichtung Elektroden umfasst, die konfiguriert sind, um ein elektrisches HF- und/oder Gleichstromfeld für den Ionentransport bereitzustellen, wobei eine Größe des elektrischen HF- und/oder Gleichstromfeldes für die erste Einstellung größer ist als die Größe des elektrischen HF- und/oder Gleichstromfeldes für die zweite Einstellung.
Verfahren zur Massenspektrometrie nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Intensität des massenspektralen Peaks in den ersten und/oder zweiten MS1-Scans auf folgender Grundlage beruht: einem extrahierten lonenstrom des Massenspektralpeaks, der vom Massenanalysator gemessen wird; oder einem Signal-Rausch-Verhältnis des Peaks.
Verfahren zur Massenspektrometrie nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei ein Massenspektralpeak mit einem ersten Masse-Ladungs-Verhältnis in den ersten und zweiten MS1-Abtastungen auf der Grundlage eines ersten Verhältnisses einer Intensität des Massenspektralpeaks in der zweiten MS1-Abtastung zu einer Intensität des Massenspektralpeaks in der ersten MS1-Abtastung als Hinweis auf einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak bestimmt wird.
Verfahren zur Massenspektrometrie nach Anspruch 4, wobei ein Massenspektralpeak mit einem ersten Masse-Ladungs-Verhältnis im ersten und zweiten MS1-Scan auf der Grundlage des ersten Verhältnisses relativ zu einem zweiten Verhältnis einer durchschnittlichen Intensität der Massenspektralpeaks des zweiten MS1-Scans zu einer durchschnittlichen Intensität der Massenspektralpeaks des ersten MS1-Scans als Hinweis auf einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak bestimmt wird.
Massenspektrometrisches Verfahren nach Anspruch 5, wobei die durchschnittliche Intensität der massenspektralen Peaks des ersten MS1-Scans und/oder die durchschnittliche Intensität der massenspektralen Peaks der zweiten MS1-Scans auf folgenden Werten basieren kann einem Mittelwert des extrahierten lonenstroms der Massenspektralpeaks, der von dem Massenanalysator für den jeweiligen Scan gemessen wurde; oder einem Mittelwert des Signal-Rausch-Verhältnisses für die massenspektralen Peaks des jeweiligen Scans.
Massenspektrometrisches Verfahren nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, wobei ein Massenspektralpeak im ersten und zweiten MS1-Scan als Hinweis auf einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak bestimmt wird, basierend auf: einem dritten Verhältnis des ersten Verhältnisses zu dem zweiten Verhältnis, relativ zu einem Referenzpegel.
Verfahren zur Massenspektrometrie nach Anspruch 7, wobei der Referenzwert gleich einem vierten Verhältnis einer Injektionszeit für den ersten MS1-Scan zu einer Injektionszeit für den zweiten MS1-Scan ist.
Verfahren zur Massenspektrometrie nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Referenzpegel entsprechend dem Masse-Ladungs-Verhältnis des zu analysierenden Massenspektralpeaks kalibriert wird.
Verfahren zur Massenspektrometrie nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei der Referenzpegel auf der Grundlage von Referenzmessungen der Massenspektralpeakintensität bei ersten und zweiten Einstellungen für eine Vielzahl von Masse-Ladungs-Verhältnissen kalibriert wird.
Verfahren zur Massenspektrometrie nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei ein Massenspektralpeak als Vorläuferionen-Massenspektralpeak bestimmt wird, wenn: das dritte Verhältnis mindestens X % des Referenzpegels beträgt, wobei X mindestens: 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % oder 60 % ist; und/oder das dritte Verhältnis nicht größer als 500 %, 400 %, 300 %, 200 % oder 150 % des Referenzpegels ist.
Verfahren zur Massenspektrometrie nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Massenanalysator zur Durchführung der ersten und zweiten MS1-Abtastung verwendet wird; oder ein erster Massenanalysator verwendet wird, um den ersten MS1-Scan durchzuführen, und ein zweiter Massenanalysator verwendet wird, um den zweiten MS1-Scan durchzuführen.
Verfahren zur Massenspektrometrie nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Massenanalysator ein Fourier-Transformations-Massenanalysator, vorzugsweise ein Orbital-Trapping-Massenanalysator, ist.
Verfahren zur datenabhängigen Massenspektrometrie, umfassend: ein Verfahren der Massenspektrometrie nach einem der Ansprüche 1 bis 13; Durchführen eines MS2-Scans, umfassend: Massenauswahl eines dritten Satzes der Vorläuferionen auf der Grundlage eines Masse-Ladungs-Verhältnisses, das einem bestimmten Vorläuferionen-Massenspektralpeak entspricht; Fragmentieren des dritten Satzes von Vorläuferionen, um einen Satz von fragmentierten Ionen zu erzeugen; und Massenanalyse der fragmentierten Ionen.
Verfahren zur datenunabhängigen Massenspektrometrie, umfassend: ein Verfahren der Massenspektrometrie nach einem der Ansprüche 1 bis 13; und Durchführen einer Vielzahl von datenunabhängigen MS2-Scans.
Massenspektrometer zum Analysieren einer Probe, umfassend: eine lonisierungsquelle, die zur Ionisierung einer Probe konfiguriert ist, um eine Vielzahl von Vorläuferionen zu erzeugen; einen Massenanalysator; eine lonentransportvorrichtung, die zum Transport von Vorläuferionen von der Ionisationsquelle zum Massenanalysator konfiguriert ist; eine Steuerung, die eingerichtet ist: (i) zur Durchführung eines ersten MS1-Scans durch: Veranlassen der lonentransportvorrichtung, einen ersten Satz der Vorläuferionen zu einem Massenanalysator zu transportieren, wobei eine erste Einstellung der lonentransportvorrichtung verwendet wird; Massenanalyse des ersten Satzes der Vorläuferionen unter Verwendung des Massenanalysators; (ii) Durchführen eines zweiten MS1-Scans durch: Veranlassen der lonentransportvorrichtung, einen zweiten Satz der Vorläuferionen zu einem Massenanalysator zu transportieren, wobei eine zweite Einstellung der lonentransportvorrichtung verwendet wird; Massenanalyse des zweiten Satzes der Vorläuferionen unter Verwendung des Massenanalysators; wobei die zweite Einstellung der lonentransportvorrichtung so konfiguriert ist, dass sie dem zweiten Satz von Vorläuferionen eine geringere Energiemenge verleiht als eine Energiemenge, die durch die erste Einstellung der lonentransportvorrichtung dem ersten Satz von Vorläuferionen verliehen wird (iii) Analysieren eines Massenspektralpeaks in der ersten und/oder zweiten MS1-Abtastung durch Bestimmen, ob ein Massenspektralpeak in mindestens einer der ersten oder zweiten MS1-Abtastung einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak anzeigt, basierend auf den relativen Intensitäten der Massenspektralpeaks der ersten und zweiten MS1-Abtastung.
Massenspektrometer nach Anspruch 16, wobei die lonentransportvorrichtung Elektroden umfasst, die dazu eingerichtet sind, ein elektrisches Gleichstromfeld für den Ionentransport bereitzustellen, wobei eine Größe des elektrischen Gleichstromfelds für die erste Einstellung größer ist als die Größe des elektrischen Gleichstromfelds für die zweite Einstellung.
Massenspektrometer nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, wobei die lonentransportvorrichtung ferner eine Ionenaktivierungsvorrichtung umfasst, die so konfiguriert ist, dass sie den ersten und zweiten Sätzen von Vorläuferionen Energie zuführt, wobei eine Größe der zugeführten Energie für die erste Einstellung größer ist als die Größe der zugeführten Energie für die zweite Einstellung.
Massenspektrometer nach Anspruch 16, 17 oder 18, wobei die Steuerung dazu eingerichtet ist, zu bestimmen, ob ein Massenspektralpeak mit einem ersten Masse-Ladungs-Verhältnis in dem ersten und/oder zweiten MS1-Scan auf der Grundlage eines ersten Verhältnisses einer Intensität des Massenspektralpeaks in dem zweiten MS1-Scan zu einer Intensität des Massenspektralpeaks in dem ersten MS1-Scan auf einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak hinweist.
Massenspektrometer nach Anspruch 19, wobei die Intensität des massenspektralen Peaks in den ersten und/oder zweiten MS1-Abtastungen auf: einem extrahierten lonenstrom des Massenspektralpeaks, gemessen durch den Massenanalysator; oder einem Signal-Rausch-Verhältnis des vom Massenanalysator gemessenen Massenspektralpeaks.
Massenspektrometer nach Anspruch 19 oder Anspruch 20, wobei die Steuerung dazu eingerichtet ist, zu bestimmen, ob ein Massenspektralpeak mit einem ersten Masse-Ladungs-Verhältnis in dem ersten und/oder zweiten MS1-Scan auf der Grundlage des ersten Verhältnisses relativ zu einem zweiten Verhältnis einer durchschnittlichen Intensität der Massenspektralpeaks des zweiten MS1-Scans zu einer durchschnittlichen Intensität der Massenspektralpeaks des ersten MS1-Scans auf einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak hinweist.
Massenspektrometer nach Anspruch 21, wobei die durchschnittliche Intensität der Massenspektralpeaks des ersten MS1-Scans und/oder die durchschnittliche Intensität der Massenspektralpeaks des zweiten MS1-Scans auf folgenden Werten basiert einem Mittelwert des extrahierten lonenstroms der Massenspektralpeaks, der von dem Massenanalysator für den jeweiligen Scan gemessen wird; oder einem Mittelwert des Signal-Rausch-Verhältnisses der vom Massenanalysator für den jeweiligen Scan gemessenen Massenspektralpeaks.
Massenspektrometer nach Anspruch 21 oder Anspruch 22, wobei die Steuerung so konfiguriert ist, dass sie auf der Grundlage eines dritten Verhältnisses des ersten Verhältnisses zum zweiten Verhältnis relativ zu einem Referenzpegel bestimmt, ob ein Massenspektralpeak in dem ersten und/oder zweiten MS1-Scan einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak anzeigt.
Massenspektrometer nach Anspruch 23, wobei die Steuerung dazu eingerichtet ist, den Referenzpegel entsprechend dem Masse-Ladungs-Verhältnis des zu analysierenden Massenspektralpeaks zu kalibrieren.
Massenspektrometer nach Anspruch 23 oder Anspruch 24, wobei die Steuerung dazu eingerichtet ist, den Referenzpegel auf der Grundlage von Referenzmessungen der Massenspektralpeakintensität bei den ersten und zweiten Einstellungen für eine Vielzahl von Masse-Ladungs-Verhältnissen zu kalibrieren.
Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 23-25, wobei ein Massenspektralpeak als Hinweis auf einen Vorläuferionen-Massenspektralpeak bestimmt wird, wenn: das dritte Verhältnis mindestens X % des Referenzpegels beträgt, wobei X mindestens: 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % oder 60 % ist; und/oder das dritte Verhältnis nicht größer als 500 %, 400 %, 300 %, 200 % oder 150 % des Referenzpegels ist.
Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 16 bis 26, ferner umfassend: eine Fragmentierungskammer, wobei die Fragmentierungskammer mit der lonenquelle und dem Massenanalysator durch die lonentransportvorrichtung verbunden ist, wobei die Steuerung ferner so konfiguriert ist, dass sie mindestens einen MS2-Scan durchführt, durch:: Veranlassen der lonentransportvorrichtung, einen dritten Satz der Vorläuferionen zur Fragmentierungskammer zu transportieren; Veranlassen der Fragmentierungskammer, die Vorläuferionen zu fragmentieren, um einen Satz von Fragmentionen zu erzeugen; Bewirken, dass die Ionentransportvorrichtung die Fragmentionen zu einem Massenanalysator transportiert; Durchführen des MS2-Scans an den Fragment-Ionen mit dem Massenanalysator
Massenspektrometer nach Anspruch 27, wobei die lonentransporteinrichtung einen Massenselektor umfasst, wobei die Steuerung ferner so konfiguriert ist, dass sie den mindestens einen MS2-Scan durchführt, durch: Veranlassen des Massenselektors zur Massenauswahl des dritten Satzes von Vorläuferionen, die zur Fragmentierungskammer transportiert werden sollen, basierend auf einem bestimmten Vorläuferionen-Massenspektralpeak.
Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 27 oder 28, wobei das Massenspektrometer einen ersten Massenanalysator und einen zweiten Massenanalysator umfasst; wobei die Steuerung so konfiguriert ist, dass sie die MS1-Abtastungen unter Verwendung des ersten Massenanalysators und die mindestens eine MS2-Abtastung unter Verwendung des zweiten Massenanalysators durchführt.
Massenspektrometer nach Anspruch 29, wobei der erste Massenanalysator so konfiguriert ist, dass er die MS1-Abtastungen mit einer höheren Massenauflösung durchführt als der zweite Massenanalysator für die Durchführung der MS2-Abtastungen konfiguriert ist.
Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 29 oder 30, wobei der erste Massenanalysator ein Fouriertransformations-Massenanalysator ist, vorzugsweise ein Orbitalfallen-Massenanalysator, und/oder der zweite Massenanalysator ein Flugzeit-Massenanalysator oder eine Ionenfalle ist.