DE20122885U1

DE20122885U1 - Massenspektrometer

Info

Publication number: DE20122885U1
Application number: DE20122885U
Authority: DE
Original assignee: Micromass UK Ltd
Current assignee: Micromass UK Ltd
Priority date: 2000-06-09
Filing date: 2001-06-11
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2011-06-12
Also published as: DE60140150D1; US20010052569A1; EP2299469A1; GB2364168B; EP2056334B1; JP2009258116A; ATE445227T1; GB0105227D0; GB2364168A; US6586727B2; EP2299469B1; EP2056334A2; EP2056334A3; JP5154511B2

Abstract

Massenspektrometer mit:
einer Ionenquelle (1);
einer Kollisionszelle (4) zum Fragmentieren von Ionen, wobei in einem ersten Modus Ionen in der Kollisionszelle (4) fragmentiert werden und in einem zweiten Modus Ionen im wesentlichen nicht fragmentiert werden;
einem Massenanalysator; und
einem Steuerungs- bzw. Kontrollsystem zum automatischen Umschalten zwischen den zwei Modi wenigstens einmal alle 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Sekunden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Massenspektrometer.
Dem Verfahren der Massenspektrometrie, bei dem die von einer Probe erzeugten Ausgangs- bzw. Stammionen durch ein erstes Massenfilter/einen ersten Massenanalysator ausgewählt und dann zu einer Kollisionszelle geleitet werden, in der sie durch Kollisionen mit neutralen Gasmolekülen fragmentiert werden, um Tochterionen (oder "Produktionen") zu liefern, ist der Name Tandemmassenspektrometrie (MS/MS) gegeben worden. Dann wird die Massenanalyse der Tochterionen durch ein zweites Massenfilter/einen zweiten Massenanalysator ausgeführt, wobei die resultierenden Tochterionenspektren verwendet werden können, um die Struktur des Stammions (oder "Vorgängerions") zu bestimmen und es folglich zu identifizieren. Die Tandemmassenspektrometrie ist besonders für die Analyse komplexer Mischungen, wie z. B. von Biomolekülen, nützlich, weil sie die Notwendigkeit für eine chemische Reinigung vor der Massenspektralanalyse vermeidet.
Es ist eine besondere Form der Tandemmassenspektrometrie bekannt, die als Stammionenabtastung bezeichnet wird, bei der in einem ersten Schritt das zweite Massenfilter/der zweite Massenanalysator so beschaffen ist, dass es/er als ein Massenfilter wirkt, so dass es/er nur Tochterionen durchlässt und erfasst, die ein spezifisches Masse-Ladungs-Verhältnis besitzen. Das spezifische Masse-Ladungs-Verhältnis ist so festgelegt, dass es dem Masse-Ladungs-Verhältnis von Tochterionen entspricht, von denen bekannt ist, dass sie charakteristische Produkte sind, die sich aus der Fragmentierung eines speziellen Stammions oder eines speziellen Typs von Stammionen ergeben. Dann wird das erste Massenfilter/der erste Massenanalysator stromaufwärts der Kollisionszelle abgetastet, während das zweite Massenfilter/der zweite Massenanalysator fest verbleibt, um das Vorhandensein von Tochterionen zu überwachen, die das spezifische Masse-Ladungs-Verhältnis besitzen. Dann können die Masse-Ladungs-Verhältnisse der Stammionen, die die charakteristischen Tochterionen liefern, bestimmt werden. Als einen zweiten Schritt kann dann ein vollständiges Tochterionenspektrum für jedes der Masse-Ladungs-Verhältnisse der Stammionen, die die charakteristischen Tochterionen erzeugen, erhalten werden, indem das erste Massenfilter/der erste Massenanalysator so betrieben wird, dass es/er die Stammionen auswählt, die ein spezielles Masse-Ladungs-Verhältnis besitzen, während das zweite Massenfilter/der zweite Massenanalysator abgetastet wird, um das resultierende volle Tochterionenspektrum aufzuzeichnen. Dies kann dann für die anderen Stammionen von Interesse wiederholt werden. Das Abtasten der Stammionen ist nützlich, wenn es nicht möglich ist, auf Grund des Vorhandenseins von chemischem Rauschen, dem häufig begegnet wird, z. B. in den Elektrospray-Massenspektren von Biomolekülen, die Stammionen in einem direkten Massenspektrum zu identifizieren.
Die Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer, die ein erstes Quadrupol-Massenfilter/einen ersten Quadrupol-Massenanalysator, eine Quadrupol-Kollisionszelle, in die ein Kollisionsgas eingeleitet wird, und ein zweites Quadrupol-Massenfilter/einen zweiten Quadrupol-Massenanalysator besitzen, sind wohlbekannt. Ein weiterer Typ des Massenspektrometers (ein Hybrid-Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer) ist bekannt, bei dem das zweite Quadrupol-Massenfilter/der zweite Quadrupol-Massenanalysator durch einen orthogonalen Flugzeit-Massenanalysator ersetzt ist.
Wie im Folgenden gezeigt wird, leiden beide Typen von Massenspektrometer, wenn sie verwendet werden, um herkömmliche Verfahren der Stammionenabtastung und des anschließenden Erhaltens eines Tochterionenspektrums eines Stammionenkandidaten auszuführen, an niedrigen Arbeitszyklen, die sie für die Verwendung in Anwendungen ungeeignet machen, die einen höheren Arbeitszyklus erfordern, wie z. B. Online-Chromatographie-Anwendungen.
Die Quadrupole besitzen einen Arbeitszyklus von etwa 100%, wenn sie als ein Massenfilter verwendet werden, aber ihr Arbeitszyklus fällt auf etwa 0,1%, wenn sie in einem Abtastmodus als ein Massenanalysator verwendet werden, um z. B. für einen Massenbereich von 500 Masseneinheiten mit Peaks, die an ihrer Basis eine Masseneinheit breit sind, eine Massenanalyse auszuführen.
Die orthogonalen Beschleunigungs-Flugzeit-Analysatoren besitzen in Abhängigkeit von den relativen Masse-Ladungs-Werten ("m/z-Werten") der verschiedenen Ionen im Spektrum typischerweise einen Arbeitszyklus im Bereich von 1–20%. Der Arbeitszyklus verbleibt jedoch derselbe, ungeachtet dessen, ob der Flugzeitanalysator als ein Massenfilter verwendet wird, um Ionen mit einem speziellen Masse-Ladungs-Verhältnis durchzulassen, oder ob der Flugzeitanalysator verwendet wird, um ein volles Massenspektrum aufzuzeichnen. Dies ist auf die Art des Betriebs der Flugzeitanalysatoren zurückzuführen. Wenn sie verwendet werden, um ein Tochterionenspektrum zu erfassen und aufzuzeichnen, beträgt der Arbeitszyklus eines Flugzeitanalysators typischerweise etwa 5%.
In erster Approximation beträgt der herkömmliche Arbeitszyklus, wenn versucht wird, Stammionenkandidaten unter Verwendung eines Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometers zu entdecken, etwa 0,1% (das erste Quadrupol- Massenfilter/der erste Quadrupol-Massenanalysator wird mit einem Arbeitszyklus von 0,1% abgetastet, während das zweite Quadrupol-Massenfilter/der zweite Quadrupol-Massenanalysator als ein Massenfilter mit einem Arbeitszyklus von 100% wirkt). Wenn dann ein Tochterionenspektrum für einen speziellen Stammionenkandidaten erhalten wird, ist der Arbeitszyklus außerdem etwa 0,1% (das erste Quadrupol-Massenfilter/der erste Quadrupol-Massenanalysator wirkt als ein Massenfilter mit einem Arbeitszyklus von 100%, während das zweite Quadrupol-Massenfilter/der zweite Quadrupol-Massenanalysator mit einem Arbeitszyklus von etwa 0,1% abgetastet wird). Der resultierende Arbeitszyklus des Entdeckens einer Anzahl von Stammionenkandidaten und des Erzeugens eines Tochterspektrums von einem der Stammionenkandidaten beträgt deshalb etwa 0,1%/2 (zurückzuführen auf einen zweistufigen Prozess, wobei jede Stufe einen Arbeitszyklus 0,1% besitzt) = 0,05%.
Der Arbeitszyklus eines Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometers zum Entdecken von Stammionenkandidaten beträgt etwa 0,005% (der Quadrupol wird mit einem Arbeitszyklus von etwa 0,1% abgetastet, während der Flugzeitanalysator als ein Massenfilter mit einem Arbeitszyklus von etwa 5% wirkt). Sobald Stammionenkandidaten entdeckt worden sind, kann ein Tochterionenspektrum eines Stammionenkandidaten mit einem Arbeitszyklus von 5% erhalten werden (der Quadrupol wirkt als ein Massenfilter mit einem Arbeitszyklus von etwa 100%, während der Flugzeitanalysator mit einem Arbeitszyklus von 5% abgetastet wird). Der resultierende Arbeitszyklus des Entdeckens einer Anzahl von Stammionenkandidaten und des Erzeugens eines Tochterspektrums von einem der Stammionenkandidaten beträgt deshalb etwa 0,005% (weil 0,005% « 5% gilt).
Wie gesehen werden kann, besitzt ein Dreifachquadrupol einen etwa eine Größenordnung höheren Arbeitszyklus als ein Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer zum Ausführen herkömmlicher Verfahren der Stammionenabtastung und des Erhaltens bestätigender Tochterionenspektren der entdeckten Stammionenkandidaten. Derartige Arbeitszyklen sind jedoch nicht hoch genug, um praktisch und effizient für das Analysieren von Echtzeitdaten verwendet zu werden, was erforderlich ist, wenn die Quelle der Ionen das Eluent der Ionen von einer Chromatographievorrichtung ist.
Elektrospray- und Laserdesorptions-Techniken haben es möglich gemacht, molekulare Ionen mit sehr hohen Molekulargewichten zu erzeugen, wobei die Flugzeit-Massenanalysatoren auf Grund ihres hohen Wirkungsgrades beim Aufzeichnen eines vollen Massenspektrums für die Analyse derartiger Biomoleküle mit großen Massen vorteilhaft sind. Sie besitzen außerdem eine hohe Auflösung und eine hohe Massengenauigkeit.
Andere Formen der Massenanalysatoren, wie z. B. Quadruprol-Ionenfallen, sind in einigen Arten zu den Flugzeitanalysetoren ähnlich, weil sie wie die Flugzeitanalysetoren keine kontinuierliche Ausgabe bereitstellen können und folglich einen niedrigen Wirkungsgrad besitzen, falls sie als ein Massenfilter verwendet werden, um kontinuierlich Ionen durchzulassen, was ein wichtiges Merkmal der herkömmlichen Verfahren der Stammionenabtastung ist. Sowohl die Flugzeit-Massenanalysatoren als auch die Quadrupol-Ionenfallen können als "Massenanalysatoren mit diskontinuierlicher Ausgabe" bezeichnet werden.
Es ist erwünscht, verbesserte Verfahren und verbesserte Vorrichtungen für die Massenspektrometrie zu schaffen. Insbesondere ist es erwünscht, die Stammionen in Chromatographieanwendungen zu identifizieren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Massenspektrometer gemäß Anspruch 1 geschaffen.
Die Stammionen, die zu einer speziellen Klasse der Stammionen gehören und die durch ein charakteristisches Tochterion oder einen charakteristischen "neutralen Verlust" erkennbar sind, werden traditionell durch die Verfahren des Abtastens der "Stammionen" oder des Abtastens mit "konstantem neutralen Verlust" entdeckt.
Frühere Verfahren zum Aufzeichnen der Abtastungen der "Stammionen" oder der Abtastungen des "konstanten neutralen Verlustes" umfassen das Abtasten eines oder beider Quadrupole in einem Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer oder das Abtasten des Quadrupols in einem orthogonalen Tandem-Quadrupol-TOF-Massenspektrometer oder das Abtasten wenigstens eines Elements in anderen Typen der Tandem-Massenspektrometer. Als eine Folge leiden diese Verfahren am niedrigen Arbeitszyklus, der den Abtastinstrumenten zugeordnet ist. Als eine weitere Folge können Informationen verworfen oder verloren werden, während das Massenspektrometer in Anspruch genommen ist, wenn es eine Abtastung der "Stammionen" oder eine Abtastung des "konstanten neutralen Verlustes" aufzeichnet. Als eine weitere Folge sind diese Verfahren nicht für die Verwendung geeignet, wo es erforderlich ist, dass das Massenspektrometer Substanzen analysiert, die direkt aus der Gas- oder Flüssigkeits-Chromatographie eluiert werden.
Gemäß der bevorzugten Ausführungsform wird ein orthogonales Tandem-Quadrupol-TOF-Massenspektrometer verwendet. Gemäß der Erfindung werden die Stammionenkandidaten unter Verwendung eines Verfahrens entdeckt, bei dem sequentielle Massenspektren mit niedriger und hoher Kollisionsenergie aufgezeichnet werden. Das Hin- und Herschalten wird nicht unterbrochen. Statt dessen wird ein vollständiger Satz der Daten erfasst, wobei dieser dann später verarbeitet wird. Die Fragmentionen werden den Stammionen durch die Nähe der Anpassung ihrer entsprechenden Elutionszeiten zugeordnet. In dieser Weise können die Stammionenkandidaten bestätigt werden oder nicht, ohne die Erfassung der Daten zu unterbrechen, wobei keine Informationen verloren werden müssen.
Sobald ein experimenteller Durchlauf abgeschlossen worden ist, werden die Hochfragmentierungs- und Niederfragmentierungs-Massenspektren nachverarbeitet. Die Stammionen werden erkannt, indem ein Hochfragmentierungs-Massenspektrum mit einem Niederfragmentierungs-Massenspektrum, die im Wesentlichen zur gleichen Zeit erhalten sind, verglichen werden und die Ionen mit einer größeren Intensität in dem Niederfragmentierungs-Massenspektrum als in dem Hochfragmentierungs-Massenspektrum beobachtet werden.
Ähnlich können Tochterionen erkannt werden, indem Ionen mit einer größeren Intensität in dem Hochfragmentierungs-Massenspektrum relativ zu dem Niederfragmentierungs-Massenspektrum beobachtet bzw. festgestellt werden.
Sobald eine Anzahl von Stammionen erkannt worden ist, kann eine Untergruppe von möglichen Stammionkandidaten aus all den Stammionen ausgewählt werden.
Gemäß einer Ausführungsform können mögliche Stammionkandidaten auf Grundlage ihrer Beziehung zu einem vorbestimmten Tochterion ausgewählt werden. Das vorbestimmte Tochterion kann z. B. Ionen umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die umfasst: (i) Immoniumionen von Peptiden; (ii) funktionale Gruppen, die die Ionen der Phosphatgruppe PO₃ ^– aus phosphorylierten Peptiden enthalten; und (iii) Massen-Anhängsel, die vorgesehen sind, um von einem spezifischen Molekül oder einer spezifischen Klasse von Molekülen abgespalten zu werden und um anschließend identifiziert werden und folglich das Vorhandensein des spezifischen Moleküls oder der spezifischen Klasse von Molekülen zu melden. Ein Stammion kann als ein möglicher Stammionenkandidat in die engere Wahl gezogen werden, indem ein Massenchromatogramm für das vorgegebene Tochterion unter Verwendung der Hochfragmentierungs-Massenspektren erzeugt wird. Dann wird das Zentrum eines jeden Peaks in dem Massenchromatogramm zusammen mit der (den) korrespondierenden Vorbestimmtes-Tochterion-Elutionszeit(en) bestimmt. Dann werden für jeden Peak in dem Vorbestimmtes-Tochterion-Massenchromatogramm sowohl das Niederfragmentierungs-Massenspektrum, das unmittelbar vor der Vorbestimmtes-Tochterion-Elutionszeit erhalten ist, und das Niederfragmentierungs-Massenspektrum, das unmittelbar nach der Vorbestimmtes-Tochterion-Elutionszeit erhalten ist, nach dem Vorhandensein von zuvor erkannten Stammionen abgefragt. Dann wird für ein zuvor erkanntes Stammion, das sowohl in dem Niederfragmentierungs-Massenspektrum, das unmittelbar vor der Vorbestimmtes-Tochterion-Elutionszeit erhalten ist, als auch in dem Niederfragmentierungs-Massenspektrum, das unmittelbar nach der Vorbestimmtes-Tochterion-Elutionszeit erhalten ist, als vorhanden erkannt ist, ein Massenchromatogramm erzeugt, wobei das Zentrum eines jeden Peaks in jedem Massenchromatogramm zusammen mit der (den) korrespondierenden Möglicher-Stammionkandidat-Elutionszeit(en) bestimmt wird. Die möglichen Stammionkandidaten können dann gemäß der Nähe der Anpassung ihrer Elutionszeit mit der Vorbestimmtes-Tochterion-Elutionszeit eingeordnet werden, wobei eine Liste von endgültigen Stammionkandidaten durch das Zurückweisen möglicher Stammionkandidaten gebildet werden kann, wenn ihre Elutionszeit der Vorbestimmtes-Tochterion-Elutionszeit mehr als eine vorbestimmte Menge vorausgeht oder sie um mehr als eine vorbestimmte Menge übertrifft.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform kann ein Stammion als ein möglicher Stammionenkandidat auf Grundlage seiner Verursachung eines vorbestimmten Massenverlustes in die engere Wahl gezogen werden. Für jedes Niederfragmentierungs-Massenspektrum wird eine Liste von Zieltochterion-Masse-Ladungs-Werten, die aus dem Verlust eines vorbestimmten Ions oder neutralen Teilchen von jedem zuvor erkannten Stammion, das in dem Niederfragmentierungs-Massenspektrum vorhanden ist, resultieren würde, erzeugt. Dann werden sowohl das Hochfragmentierungs-Massenspektrum, das unmittelbar vor dem Niederfragmentierungs-Massenspektrum erhalten ist, und das Hochfragmentierungs-Massenspektrum, das unmittelbar nach dem Niederfragmentierungs-Massenspektrum erhalten ist, nach dem Vorhandensein von Tochterionen mit einem Masse-Ladungs-Wert, der mit einem Zieltochterion-Masse-Ladungs-Wert korrespondiert, abgefragt. Eine Liste von möglichen Stammionkandidaten (die optional ihre korrespondierenden Tochterionen enthält) wird dann gebildet, indem in die Liste ein Stammion eingeschlossen bzw. eingefügt wird, wenn ein Tochterion mit einem Masse-Ladungs-Wert, der mit einem Zieltochterion-Masse-Ladungs-Wert korrespondiert, sowohl in dem Hochfragmentierungs-Massenspektrum, das unmittelbar vor dem Niederfragmentierungs-Massenspektrum erhalten ist, als auch in dem Hochfragmentierungs-Massenspektrum, das unmittelbar nach dem Niederfragmentierungs-Massenspektrum erhalten ist, als vorhanden erkannt wird. Dann kann ein Massenverlustchromatogramm basierend auf möglichen Stammionkandidaten und ihren korrespondierenden Tochterionen erzeugt werden. Das Zentrum eines jeden Peaks in dem Massenverlustchromatogramm wird zusammen mit der (den) korrespondierenden Massenverlust-Elutionszeit(en) bestimmt. Dann wird für jeden möglichen Stammionkandidaten ein Massenchromatogramm unter Verwendung der Niederfragmentierungs-Massenspektren erzeugt. Für das korrespondierende Tochterion wird außerdem ein Korrespondierendes-Tochterion-Massenchromatogramm erzeugt. Dann wird das Zentrum eines jeden Peaks in dem Möglicher-Stammionkandidat-Massenchromatogramm und dem Korrespondierendes-Tochterion-Massenchromatogramm zusammen mit der (den) korrespondierenden Möglicher-Stammionkandidat-Elutionszeit(en) und der (den) Korrespondierendes-Tochterion-Elutionszeit(en) bestimmt. Dann kann eine Liste von endgültigen Stammionkandidaten gebildet werden, indem mögliche Stammionkandidaten zurückgewiesen werden, wenn die Elutionszeit eines möglichen Stammionkandidaten der Korrespondierendes-Tochterion-Elutionszeit mehr als eine vorbestimmte Menge vorausgeht oder sie um mehr als eine vorbestimmte Menge übertrifft.
Sobald eine Liste von endgültigen Stammionkandidaten gebildet worden ist (die vorzugsweise nur einige der ursprünglich erkannten Stammionen und möglichen Stammionenkandidaten enthält), kann dann jeder endgültige Stammionenkandidat identifiziert werden.
Die Identifikation der Stammionen kann ausgeführt werden, indem von einer Kombination von Informationen Gebrauch gemacht wird. Diese kann die genau bestimmte Masse des Stammions enthalten. Sie kann außerdem die Massen der Fragmentionen enthalten. In einigen Fällen können die genau bestimmten Massen der Tochterionen bevorzugt sein. Es ist bekannt, dass ein Protein aus den Massen, vorzugsweise den genauen Massen, der Peptidprodukte aus den Proteinen, die enzymatisch digeriert worden sind, identifiziert werden kann. Diese können mit jenen verglichen werden, die aus einer Bibliothek bekannter Proteine erwartet werden. Es ist außerdem bekannt, dass, wenn die Ergebnisse dieses Vergleichs mehr als ein mögliches Protein vorschlagen, dann die Mehrdeutigkeit durch die Analyse der Fragmente von einem oder mehreren der Peptide aufgelöst werden kann. Die bevorzugte Ausführungsform erlaubt, dass eine Mischung von Proteinen, die enzymatisch digeriert worden sind, in einer einzigen Analyse identifiziert wird. Die Massen oder die genauen Massen aller Peptide und ihrer zugeordneten Fragmentionen können in einer Bibliothek bekannter Proteine gesucht werden. Alternativ können die Peptidmassen oder die genauen Massen in der Bibliothek der bekannten Proteine gesucht werden, wobei, wenn mehr als ein Protein vorschlagen wird, das richtige Protein bestätigt werden kann, indem nach Fragmentionen gesucht wird, die jenen entsprechen, die von den relevanten Peptiden von jedem Proteinkandidaten erwartet werden.
Der Schritt des Identifizierens eines jeden endgültigen Stammionkandidaten umfasst vorzugsweise: Abfragen der Elutionszeit des endgültigen Stammionkandidaten, Erzeugen einer Liste von möglichen Tochterionkandidaten, welche die zuvor erkannten Tochterionen umfasst, welche sowohl in dem Niederfragmentierungs-Massenspektrum, das unmittelbar vor der Elutionszeit des endgültigen Stammionkandidaten erhalten ist, als auch in dem Niederfragmentierungs-Massenspektrum, das unmittelbar nach der Elutionszeit des endgültigen Stammionkandidaten erhalten ist, vorhanden sind, Erzeugen eines Massenchromatogramms von jedem möglichen Tochterionkandidaten, Bestimmen des Zentrums eines jeden Peaks in jedem Möglicher-Tochterionkandidat-Massenchromatogramm, und Bestimmen der korrespondierenden Möglicher-Tochterionkandidat-Elutionszeit(en). Die möglichen Tochterionkandidaten können dann gemäß der Nähe der Anpassung ihrer Elutionszeit mit der Elutionszeit des endgültigen Stammionkandidaten eingeordnet werden. Dann kann eine Liste von endgültigen Tochterionkandidaten gebildet werden, indem mögliche Tochterionkandidaten zurückgewiesen werden, wenn die Elutionszeit des möglichen Tochterionkandidaten der Elutionszeit des endgültigen Stammionkandidaten mehr als eine vorbestimmte Menge vorausgeht oder sie um mehr als eine vorbestimmte Menge übertrifft.
Die Liste von endgültigen Tochterionkandidaten kann noch weiter verfeinert oder verringert werden, indem eine Liste von benachbarten Stammionen, die in dem Niederfragmentierungs-Massenspektrum, das in der Zeit am nächsten zu der Elutionszeit des endgültigen Stammionkandidaten erhalten ist, vorhanden sind, erzeugt wird. Dann wird ein Massenchromatogramm für jedes Stammion, das in der Liste enthalten ist, erzeugt, wobei das Zentrum eines jeden Massenchromatogramms zusammen mit der (den) korrespondierenden Benachbartes-Stammion-Elutionszeit(en) erzeugt wird. Dann kann ein endgültiger Tochterionkandidat mit einer Elutionszeit, welche eher einer Benachbartes-Stammion-Elutionszeit als der Elutionszeit des endgültigen Stammionkandidaten entspricht, von der Liste der endgültigen Tochterionkandidaten zurückgewiesen werden.
Die endgültigen Tochterionkandidaten können einem endgültigen Stammionkandidaten gemäß der Nähe der Anpassung ihrer Elutionszeiten zugeordnet werden, wobei alle endgültigen Tochterionkandidaten, welche mit den endgültigen Stammionkandidaten verknüpft sind, aufgelistet werden können.
Eine alternative Ausführungsform, die eine größere Menge der Datenverarbeitung umfasst, die aber trotzdem an sich einfacher ist, wird außerdem betrachtet. Sobald die Stamm- und Tochterionen identifiziert worden sind, wird dann ein Stammionen-Massenchromatogramm für jedes erkannte Stammion erzeugt. Dann werden das Zentrum eines jeden Peaks in dem Stammion-Massenchromatogramm und die korrespondierenden Stammion-Elutionszeit(en) bestimmt.
Ähnlich wird ein Tochterion-Massenchromatogramm für jedes erkannte Tochterion erzeugt, wobei dann das Zentrum eines jeden Peaks in dem Tochterion-Massenchromatogramm und die korrespondierenden Tochterion-Elutionszeit(en) bestimmt werden. Anstatt dann nur eine Teilmenge der erkannten Stammionen zu identifizieren, werden dann alle (oder fast alle) der erkannten Stammionen identifiziert. Die Tochterionen werden gemäß der Nähe der Anpassung bzw. des Fits ihrer jeweiligen Elutionszeiten zu Stammionen zugeordnet, wobei dann alle Tochterionen, welche mit einem Stammion verknüpft worden sind, aufgelistet werden können.
Obwohl es für die vorliegende Erfindung nicht wesentlich ist, können die durch die Ionenquelle erzeugten Ionen durch ein Massenfilter, vorzugsweise ein Quadrupol-Massenfilter, geführt werden, bevor sie zu den Fragmentierungsmitteln geführt werden. Dies stellt ein alternatives oder ein zusätzliches Verfahren zum Erkennen eines Tochterions dar. Ein Tochterion kann erkannt werden, indem die Ionen in einem Hochfragmentierungs-Massenspektrum, die ein Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen, das durch die Fragmentierungsmittel nicht durchgelassen wird, erkannt werden, d. h., die Tochterionen werden auf Grund dessen erkannt, dass sie ein Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen, das außerhalb des Transmissionsfensters des Massenfilters liegt. Wenn die Ionen nicht durch das Massenfilter durchgelassen werden würden, dann müssen sie in den Fragmentierungsmitteln erzeugt worden sein.
Die Ionenquelle kann entweder eine Elektrospray-Ionenquelle, eine Atmosphärendruck-Ionenquelle mit chemischer Ionisation oder eine matrixunterstützte Laserdesorptions-Ionenquelle ("MALDI-Ionenquelle") sein. Derartige Ionenquellen können über eine Zeitspanne mit einem Eluent ausgestattet sein bzw. werden, wobei das Eluent aus einer Mischung mittels eines Flüssigkeitschromatographen oder Kapillarelektrophorese abgetrennt worden ist.
Alternativ kann die Ionenquelle eine Elektronenstoß-Ionenquelle, eine chemische Ionisations-Ionenquelle oder eine Feldionisations-Ionenquelle sein. Derartige Ionenquellen können über eine Zeitspanne mit einem Eluent ausgestattet sein bzw. werden, wobei das Eluent aus einer Mischung mittels eines Gaschromatographen abgetrennt worden ist.
Ein Massenfilter, vorzugsweise ein Quadrupol-Massenfilter, kann stromaufwärts der Kollisionszelle vorgesehen sein. Ein Massenfilter ist jedoch für die vorliegende Erfindung nicht wesentlich. Das Massenfilter kann eine Hochpass-Filtercharakteristik aufweisen und z. B. eingerichtet sein, um Ionen mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis durchzulassen bzw. zu transmittieren, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die umfasst: (i) ≥ 100; (ii) ≥ 150; (iii) ≥ 200; (iv) ≥ 250; (v) ≥ 300; (vi) ≥ 350; (vii) ≥ 400; (viii) ≥ 450; und (ix) ≥ 500. Alternativ kann das Massenfilter eine Tiefpass- oder Bandpass-Filtercharakteristik aufweisen.
Obwohl es nicht wesentlich ist, kann stromaufwärts der Kollisionszelle eine Ionenführung vorgesehen sein. Diese Ionenführung kann entweder ein Hexapol, ein Quadrupol oder ein Oktopol sein.
Alternativ kann die Ionenführung eine Anzahl von Ringelektroden mit im Wesentlichen konstanten inneren Durchmessern ("Ionentunnel") oder eine Anzahl von Ringelektroden mit im Wesentlichen sich verjüngenden inneren Durchmessern ("Ionentrichter") umfassen.
Der Massenanalysator ist vorzugsweise entweder ein Quadrupol-Massenfilter, ein Flugzeit-Massenanalysator (vorzugsweise ein orthogonaler Beschleunigungs-Flugzeit-Massenanalysator), eine Ionenfalle, ein Magnetsektoranalysator oder ein Fouriertransformations-Ionenzyklotonresonanz-Massenanalysator ("FTICR-Massenanalysator").
Die Kollisionszelle kann entweder ein Quadrupolstabset, ein Hexapolstabset oder ein Oktopolstabset sein, wobei benachbarte Stäbe auf im Wesentlichen der gleichen Gleichspannung aufrechterhalten werden, wobei eine HF-Spannung an die Stäbe angelegt ist. Die Kollisionszelle bildet abgesehen von einer Ioneneintritts- und Ionenaustrittsöffnung vorzugsweise ein im Wesentlichen gasdichtes Gehäuse. Ein Kollisionsgas, wie z. B. Helium, Argon, Stickstoff oder Methan, kann in die Kollisionszelle eingeführt werden.
In einem ersten Modus des Betriebs (d. h. Hochfragmentierungs-Modus) kann eine Spannung an die Kollisionszelle angelegt sein, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die umfasst: (i) ≥ 15 V; (ii) ≥ 20 V; (iii) ≥ 25 V; (iv) ≥ 30 V; (v) ≥ 50 V; (vi) ≥ 100 V; (vii) ≥ 150 V; und (viii) ≥ 200 V. In einem zweiten Modus des Betriebs (d. h. Niederfragmentierungs-Modus) kann eine Spannung an die Kollisionszelle angelegt sein, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die umfasst: (i) ≤ 5 V; (ii) ≤ 4,5 V; (iii) ≤ 4 V; (iv) ≤ 3,5 V; (v) ≤ 3 V; (vi) ≤ 2,5 V; (vii) ≤ 2 V; (viii) ≤ 1,5 V; (ix) ≤ 1 V; (x) ≤ 0,5 V; und (xi) im Wesentlichen 0 V. Gemäß weniger bevorzugten Ausführungsformen können im ersten Modus Spannungen unter 15 V angelegt sein und/oder können im zweiten Modus Spannungen über 5 V angelegt sein. Sowohl im ersten als auch im zweiten Modus kann z. B. eine Spannung von etwa 10 V angelegt sein. Vorzugsweise beträgt die Spannungsdifferenz zwischen den zwei Modi wenigstens 5 V, 10 V, 15 V, 20 V, 25 V, 30 V, 35 V, 40 V, 50 V oder mehr als 50 V.
Nun werden verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung lediglich beispielhaft und unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung beschrieben, worin:
1 eine schematische Zeichnung eines Massenspektrometers gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist;
2 ein Schema einer Ventilumschaltanordnung während des Ladens und Entsalzen einer Probe ist. Das Nebenbild zeigt die Desorption einer Probe aus einer analytischen Säule;
3(a) zeigt ein Tochterionen-Massenspektrum, während 3(b) das entsprechende Stammionen-Massenspektrum mit einem Massenfilter, das erlaubt, das Ionen mit einem m/z > 350 durchgelassen werden, zeigt;
4(a)–(e) zeigen Massenchromatogramme, die das Zeitprofil der verschiedenen Massenbereiche zeigen; und
5 zeigt die Massenchromatogramme nach den 4(a)–(e), die aufeinander überlagert sind;
6 zeigt ein Massenchromatogramm von 87,04 (Asparagin-Immoniumion);
7 zeigt ein Fragment T5 von der ADH-Sequenz ANEL-LINVK MW 1012,59;
8 zeigt ein Massenspektrum für die Niederenergiespektren eines tryptischen Digerierens bzw. Digestes bzw. Verdaus des β-Kaseins;
9 zeigt ein Massenspektrum für die Hochenergiespektren eines tryptischen Digestes des β-Kaseins; und
10 zeigt eine verarbeitete und erweiterte Ansicht des gleichen Massenspektrums wie in 9.
Nun wird unter Bezugnahme auf 1 eine bevorzugte Ausführungsform beschrieben. Ein Massenspektrometer 6 umfasst eine Ionenquelle 1, vorzugsweise eine Elektrospray-Ionisationsquelle, eine Ionenführung 2, ein Quadrupol-Massenfilter 3, eine Kollisionszelle 4 und einen orthogonalen Beschleunigungs-Flugzeit-Massenanalysator 5, der ein Reflektron enthält. Die Ionenquelle 2 und das Massenfilter 3 können nötigenfalls weggelassen werden. Das Massenspektrometer 6 ist vorzugsweise an einen Chromatographen, wie z. B. einen (nicht gezeigten) Flüssigkeitschromatographen, angeschlossen, so dass die in die Ionenquelle 1 eintretende Probe vom Eluent des Flüssigkeitschromatographen genommen werden kann.
Das Quadrupol-Massenfilter 3 ist in einer evakuierten Kammer angeordnet, die auf einem relativ niedrigen Druck gehalten wird, z. B. kleiner als 10^–5 mbar. Die Stabelektroden, die das Massenfilter 3 umfassen, sind mit einer Leistungsquelle verbunden, die sowohl HF- als auch DC-Potentiale erzeugt, die den Bereich der Masse-Ladungs-Werte bestimmen, die durch das Massenfilter 3 durchgelassen werden.
Die Kollisionszelle 4 kann entweder ein Quadrupolstabset bzw. -satz oder ein Hexapolstabset umfassen, das in einem im Wesentlichen gasdichten Gehäuse (bis auf eine kleine Ioneneintritts- und -austrittsöffnung) eingeschlossen ist, in das ein Kollisionsgas, wie z. B. Helium, Argon, Stickstoff oder Methan, bei einem Druck zwischen 10^–4 und 10^–1 mbar, bevorzugter 10^–3 mbar und 10^–2 mbar, eingeleitet werden kann. Geeignete HF-Potentiale für die Elektroden, die die Kollisionszelle 4 umfassen, werden durch eine (nicht gezeigte) Leistungsquelle bereitgestellt.
Die durch die Ionenquelle 1 erzeugten Ionen werden durch die Ionenführung 2 durchgelassen und gehen über eine Zwischenkammeröffnung 7 in eine Vakuumkammer 8. Die Ionenführung 2 wird auf einem Druck aufrechterhalten, der zwischen dem der Ionenquelle und dem der Vakuumkammer 8 liegt. In der gezeigten Ausführungsform wird die Massenfilterung der Ionen 3 durch das Massenfilter 3 ausgeführt, bevor sie in die Kollisionszelle 4 eintreten. Die Massenfilterung ist jedoch für die vorliegende Erfindung nicht wesentlich. Die aus der Kollisionszelle 4 austretenden Ionen gehen in einen Flugzeit-Massenanalysator 5. Andere ionenoptische Komponenten, wie z. B. weitere Ionenführungen und/oder elektrostatische Linsen, können vorhanden sein (wobei sie weder in den Figuren gezeigt sind noch hierin beschrieben sind), um die Ionentransmission zwischen den verschiedenen Teilen oder Stufen der Vorrichtung zu maximieren. Um optimale Vakuumbedingungen in der Vorrichtung aufrechtzuerhalten, können verschiedene (nicht gezeigte) Vakuumpumpen vorgesehen sein. Der Flugzeit-Massenanalysator 5, der ein Reflektron enthält, arbeitet in einer bekannten Weise, indem er die Durchgangszeit der Ionen misst, die in einem Paket der Ionen enthalten sind, so dass ihre Masse-Ladungs-Verhältnisse bestimmt werden können.
Steuermittel (die nicht gezeigt sind) stellen Steuersignale für die verschiedenen (nicht gezeigten) Leistungsversorgungen bereit, die jeweils die notwendigen Betriebspotentiale für die Ionenquelle 1, die Ionenführung 2, das Quadrupol-Massenfilter 3, die Kollisionszelle 4 und den Flugzeit-Massenanalysator 5 bereitstellen. Diese Steuersignale bestimmen die Betriebsparameter des Instruments, z. B. die Masse-Ladungs-Verhältnisse, die durch das Massenfilter 3 durchgelassen werden, und den Betrieb des Analysators 5. Die Steuermittel werden typischerweise durch die Signale von einem (nicht gezeigten) Computer gesteuert, der außerdem verwendet werden kann, um die erfassten Massenspektraldaten zu verarbeiten. Der Computer kann außerdem die vom Analysator 5 erzeugten Massenspektren anzeigen und speichern und Befehle von einer Bedienungsperson empfangen und verarbeiten. Die Steuermittel können automatisch eingestellt werden, so dass sie ohne das Eingreifen einer Bedienungsperson verschieden Verfahren ausführen und verschiedene Bestimmungen ausführen, oder sie können optional eine Eingabe einer Bedienungsperson in verschiedenen Stufen erfordern.
Die Steuermittel sind außerdem so beschaffen, dass sie die Kollisionszelle 4 zwischen wenigstens zwei verschiedenen Modi hin- und herschalten. In einem Modus ist eine relativ hohe Spannung, wie z. B. ≥ 15 V, an die Kollisionszelle angelegt, die in Kombination mit der Wirkung der verschiedenen anderen ionenoptischen Vorrichtungen stromaufwärts der Kollisionszelle 4 ausreichend ist, um einen beträchtlichen Grad der Fragmentierung der hindurchgehenden Ionen zu verursachen. In einem zweiten Modus ist eine relativ niedrige Spannung, wie z. B. ≤ 5 V, angelegt, die eine relativ kleine (wenn überhaupt eine) signifikante Fragmentierung der hindurchgehenden Ionen verursacht.
Die Steuermittel schalten zwischen den Modi gemäß der bevorzugten Ausführungsform etwa jede Sekunde um. Wenn das Massenspektrometer im Zusammenhang mit einer Ionenquelle verwendet wird, die mit einem Eluent versehen wird, das von einer Mischung mittels Flüssigkeits- oder Gas-Chromatographie getrennt wird, kann das Massenspektrometer 6 während mehrerer Zehn Minuten betrieben werden, wobei über diese Zeitspanne mehrere hundert Hochfragmentierungs-Massenspektren und mehrere hundert Niederfragmentierungs-Massenspektren erhalten werden können.
Am Ende des experimentellen Durchlaufs werden die Daten, die erhalten worden sind, analysiert, wobei die Stammionen und die Tochterionen auf der Grundlage der relativen Intensität eines Peaks in einem Massenspektrum, das erhalten wird, wenn sich die Kollisionszelle 4 in einem Modus befunden hat, im Vergleich zur Intensität desselben Peaks in einem Massenspektrum, das zeitlich etwa eine Sekunde später erhalten worden ist, als sich die Kollisionszelle 4 im zweiten Modus befunden hat, erkannt werden.
Gemäß einer Ausführungsform werden die Massenchromatogramme für jedes Stamm- und Tochterion erzeugt, wobei die Tochterionen den Stammionen auf der Grundlage ihrer relativen Elutionszeiten zugeordnet werden.
Es ist ein Vorteil dieses Verfahrens, dass, weil alle Daten erfasst und anschließend verarbeitet werden, dann alle Fragmentionen einem Stammion durch die Nähe der Anpassung ihrer entsprechenden Elutionszeiten zugeordnet werden können. Dies erlaubt, dass alle Stammionen aus ihren Fragmentionen identifiziert werden, ungeachtet dessen, ob sie durch das Vorhandensein eines charakteristischen Tochterions oder eines charakteristischen "neutralen Verlustes" entdeckt worden sind.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Versuch unternommen, die Anzahl der Stammionen von Interesse zu verringern. Eine Liste möglicher (d. h. noch nicht endgültiger) Stammionenkandidaten wird gebildet, indem nach Stammionen gesucht wird, die ein vorbestimmtes Tochterion von Interesse verursacht haben, z. B. ein Immoniumion von einem Peptid. Alternativ kann eine Suche nach Stamm- und Tochterionen ausgeführt werden, bei der das Stammion in eine erste Komponente, die ein vorgegebenes Ion oder ein vorgegebenes neutrales Teilchen umfasst, und eine zweite Komponente, die ein Tochterion umfasst, fragmentiert worden sein könnte. Dann können verschiedene Schritte unternommen werden, um die Liste der möglichen Stammionenkandidaten zu verringern/zu verfeinern, um eine Anzahl endgültiger Stammionenkandidaten übrigzulassen, die anschließend identifiziert werden, indem die Elutionszeiten der Stamm- und Tochterionen verglichen werden. Wie klar ist, könnten zwei Ionen ähnliche Masse-Ladungs-Verhältnisse, aber unterschiedliche chemische Strukturen besitzen, wobei sie folglich am wahrscheinlichsten unterschiedlich fragmentiert würden, was es ermöglicht, dass ein Stammion auf der Grundlage eines Tochterions identifiziert wird.
Beispiel 1
Gemäß einer Ausführungsform wurden mittels eines modularen Micromass-CapLC-System Proben in das Massenspektrometer eingebracht. Die Proben wurden auf eine C18-Kassette (0,3 mm × 5 mm) geladen und während 3 Minuten bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 μl pro Minute mit 0,1% HCOOH entsalzt (siehe 2). Dann wurde das Zehnwegeventil so umgeschaltet, dass die Peptide für die Trennung auf die analytische Säule eluiert wurden, siehe das Nebenbild in 2. Die Strömung von den Pumpen A und B wurde aufgespalten, um eine Strömungsgeschwindigkeit bzw. -rate durch die Säule von etwa 200 nl/min zu erzeugen.
Die verwendete analytische Säule war eine PicoFrit^TM-Säule (www.newobjective.com), die mit Waters Symmetry^TM C18 (www.waters.com) gefüllt war. Dies wurde aufgebaut, um direkt in das Massenspektrometer zu sprühen. Das Elektrospray-Potential (ca. 3 kV) wurde über einen Stutzen aus rostfreiem Stahl mit niedrigem Totvolumen an die Flüssigkeit angelegt. Eine kleine Menge (etwa 5 psi (3,4 × 10⁴ Nm^–2)) von Sprühgas wurde um die Sprayspitze eingeleitet, um den Elektrospray-Prozess zu unterstützen.
Die Daten wurden unter Verwendung eines orthogonalen Quadrupol-Beschleunigungs-Flugzeit-Hybridmassenspektrometers Q-TOF2 (www.micromass.co.uk) erfasst, an das eine Z-Spray-Nanoströmungs-Elektrospray-Ionenquelle angepasst war. Das Massenspektrometer wurde im Modus für positive Ionen mit einer Quellentemperatur von 80°C und einer Kegelgas-Strömungsgeschwindigkeit bzw. einer konischen Gasströmungsrate von 40l/h betrieben.
Das Instrument wurde mit einer Vielpunkteichung unter Verwendung ausgewählte Fragmentionen geeicht, die sich aus der kollisionsinduzierten Zerlegung (CID) von Glufibrinopeptid b ergaben. Alle Daten wurden unter Verwendung der Software-Suite MassLynx verarbeitet.
3(a) und 3(b) zeigen Tochter- bzw. Stammionenspektren eines tryptischen Digestes bzw. Verdaus des ADH, das als Alkoholdehydrogenase bekannt ist. Das in 3(a) gezeigte Tochterionenspektrum wurde erhalten, während die Spannung der Kollisionszelle hoch war, z. B. etwa 30 V, was zu einer signifikanten Fragmentierung der hindurchgehenden Ionen führte. Das in 3(b) gezeigte Stammionenspektrum wurde bei einer niedrigen Kollisionsenergie erhalten, z. B. ≤ 5 V. Die in 3(b) dargestellten Daten wurden unter Verwendung eines Massenfilters 3 erhalten, das eingestellt war, um Ionen mit einem Masse-Ladungs-Wert > 350 durchzulassen. Die Massenspektren in diesem speziellen Beispiel wurden aus einer Probe erhalten, die aus einem Flüssigkeitschromatographen eluiert wurde, wobei die Spektren ausreichend schnell und zeitlich eng zusammen erhalten wurden, so dass sie im Wesentlichen derselben Komponente oder denselben Komponenten entsprachen, die aus dem Flüssigkeitschromatographen eluiert wurden.
In 3(b) gibt es mehrere Peaks mit hoher Intensität im Stammionenspektrum, z. B. die Peaks bei 418,7724 und 568,7813, die im entsprechenden Tochterionenspektrum eine beträchtlich geringere Intensität besitzen. Diese Peaks können deshalb als die Stammionen erkannt werden. Ebenso können die Ionen, die im Tochterionenspektrum intensiver als im Stammionenspektren sind (oder die in der Tat im Stammionenspektrum auf Grund des Betriebs eines Massenfilters stromaufwärts der Kollisionszelle nicht vorhanden sind), als die Tochterionen erkannt werden. Alle Ionen mit einem Masse-Ladungs-Wert < 350 in 3(a) können deshalb entweder auf der Grundlage, dass sie einen Masse-Ladungs-Wert besitzen, der kleiner als 350 ist, oder bevorzugter auf der Grundlage ihrer relativen Intensität in Bezug auf das entsprechende Stammionenspektrum leicht als Tochterionen erkannt werden.
4(a)–(e) zeigen jeweils Massenchromatogramme (d. h. graphische Darstellungen der erfassten Ionenintensität gegen die Erfassungszeit) für drei Stammionen und zwei Tochterionen. Es wurde bestimmt, dass die Stammionen Masse-Ladungs-Verhältnisse von 406,2 (der Peak "MC1"), 418,7 (der Peak "MC2") und 568,8 (der Peak "MC3") besaßen, während bestimmt wurde, dass die zwei Tochterionen Masse-Ladungs-Verhältnisse von 136,1 (die Peaks "MC4" und "MC5") und 120,1 (der Peak "MC6") besaßen.
Es ist ersichtlich, dass der Stammionen-Peak MC1 gut mit dem Tochterionen-Peak MC5 korreliert ist, d. h., es erscheint, dass ein Stammion mit m/z = 406,2 fragmentiert wurde, um ein Tochterion mit m/z = 136,1 zu erzeugen. Ähnlich sind die Stammionen-Peaks MC2 und MC3 gut mit den Tochterionen-Peaks MC4 und MC6 korreliert, es ist aber schwierig, zu bestimmen, welches Stammion welchem Tochterion entspricht.
5 zeigt die Peaks nach den 4(a)–(e), die einander überlagert sind (wobei sie in einem unterschiedlichen Maßstab gezeichnet sind). Durch den sorgfältigen Vergleich der Peaks MC2, MC3, MC4 und MC6 ist ersichtlich, dass in der Tat das Stammionen MC2 und das Tochterion MC4 gut korreliert sind, wohingegen das Stammion MC3 gut mit dem Tochterion MC6 korreliert ist. Dies deutet daraufhin, dass die Stammionen mit m/z = 418,7 fragmentiert wurden, um Tochterionen mit m/z = 136,1 zu erzeugen, und dass die Stammionen mit m/z = 568,8 fragmentiert wurden, um Tochterionen mit m/z = 120,1 zu erzeugen.
Diese Kreuzkorrelation der Massenchromatogramme kann durch eine Bedienungsperson oder bevorzugter durch ein automatisches Peak-Vergleichsmittel, wie z. B. ein geeignetes Peak-Vergleichs-Software-Programm, das auf einem geeigneten Computer ausgeführt wird, ausgeführt werden.
Beispiel 2 – Die automatische Entdeckung eines Peptids, das das Aminosäure-Asparagin enthält
6 zeigt das Massenchromatogramm für m/z 87,04, das aus einer HPLC-Trennung und der unter Verwendung des Micromass Q-TOF-Massenspektrometers erhaltenen Massenanalyse extrahiert wurde. Das Immoniumion für das Aminosäure-Asparagin besaß einen m/z-Wert von 87,04. Dieses Chromatogramm wurde aus allen hochenergetischen Spektren extrahiert, die im Q-TOF aufgezeichnet wurden.
7 zeigt das volle Massenspektrum, das der Abtastnummer 604 entspricht. Dies war ein im Q-TOF aufgezeichnetes niederenergetisches Massenspektrum, wobei es das nieder energetische Spektrum neben dem hochenergetischen Spektrum bei der Abtastung 605 war, die dem größten Peak im Massenchromatogramm von m/z 87,04 entspricht. Dies zeigt, dass das Stammion für das Asparagin-Immoniumion bei m/z 87,04 eine Masse von 1012,54 besitzt, weil es das einfach geladene (M + H)⁺-Ion bei m/z 1013,54 und das doppelt geladene (M + 2H)⁺⁺-Ion bei m/z 507,27 zeigt.
Beispiel 3 – Die automatische Entdeckung der Phosphorylierung eines Proteins durch neutralen Verlust
8 zeigt ein Massenspektrum von den niederenergetischen Spektren, die in einem Q-TOF-Massenspektrometer von einem tryptischen Digerieren des Proteins β-Kasein aufgezeichnet wurden. Die Produkte des Digestes bzw. Verdaus des Proteins wurden durch HPLC getrennt, wobei eine Massenanalyse ausgeführt wurde. Die Massenspektren wurden im Q-TOF aufgezeichnet, das im MS-Modus arbeitete und für aufeinanderfolgende Spektren zwischen niedriger und hoher Kollisionsenergie in der Gaskollisionszelle wechselte.
9 zeigt das Massenspektrum aus den hochenergetischen Spektren, die während der gleichen Periode der HPLC-Trennung wie der in der obigen 8 aufgezeichnet wurden.
10 zeigt eine verarbeitete und erweiterte Ansicht des gleichen Massenspektrums wie in der obigen 9. Für dieses Spektrum sind die Kontinuumdaten so verarbeitet worden, um die Peaks zu identifizieren und als Linien anzuzeigen, deren Höhen proportional zur Peak-Fläche sind, wobei an ihnen Massen vermerkt sind, die ihren Schwerpunktsmassen entsprechen. Der Peak bei m/z 1031,4395 ist das doppelt geladene (M + 2H)⁺⁺-Ion eines Peptids, während der Peak bei m/z 982,4515 ein doppelt geladenes Fragmention ist. Es muss ein Fragmention sein, weil es im niederenergetischen Spektrum nicht vorhanden ist. Der Massenunterschied zwischen diesen Ionen beträgt 48,9880. Die theoretische Masse für H₃PO₄ beträgt 97,9769, wobei der m/z-Wert für das doppelt geladene H₃PO₄ ⁺⁺-Ion 48,9884 beträgt, ein Unterschied von nur 8 ppm vom beobachteten Wert.

Claims

Massenspektrometer mit: einer Ionenquelle (1); einer Kollisionszelle (4) zum Fragmentieren von Ionen, wobei in einem ersten Modus Ionen in der Kollisionszelle (4) fragmentiert werden und in einem zweiten Modus Ionen im wesentlichen nicht fragmentiert werden; einem Massenanalysator; und einem Steuerungs- bzw. Kontrollsystem zum automatischen Umschalten zwischen den zwei Modi wenigstens einmal alle 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Sekunden.
Massenspektrometer gemäß Anspruch 1, bei dem die Ionenquelle (1) ausgewählt ist aus der Gruppe, die umfasst: (i) eine Elektrospray-Ionenquelle; (ii) eine Atmosphärendruck-Ionenquelle mit chemischer Ionisation; und (iii) eine matrixunterstützte Laserdesorptions-Ionenquelle.
Massenspektrometer gemäß Anspruch 2, bei dem die Ionenquelle (1) über eine Zeitspanne mit einem Eluenten ausgestattet ist, wobei der Eluent aus einer Mischung mittels Flüssigkeitschromatographie oder Kapillarelektrophorese abgetrennt worden ist.
Massenspektrometer gemäß Anspruch 1, bei dem die Ionenquelle (1) ausgewählt ist aus der Gruppe, die umfasst: (i) eine Elektronenstoß-Ionenquelle; (ii) eine chemische Ionisations-Ionenquelle; und (iii) eine Feldionisations-Ionenquelle.
Massenspektrometer gemäß Anspruch 4, bei dem die Ionenquelle (1) über eine Zeitspanne mit einem Eluenten ausgestattet ist, wobei der Eluent aus einer Mischung mittels Gaschromatographie abgetrennt worden ist.
Massenspektrometer gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Ionenquelle (1) eine Atmosphärendruck-Ionenquelle umfasst.
Massenspektrometer gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der Massenanalysator ein Flugzeit-Massenanalysator (5) ist.
Massenspektrometer gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der Massenanalysator ausgewählt ist aus der Gruppe, die umfasst: (i) ein Quadrupol-Massenfilter; (ii) eine Ionenfalle; (iii) ein Magnetsektoranalysator; und (iv) ein Fouriertransformations-Ionenzyklotonresonanz-Massenanalysator ("FTICR-Massenanalysator").
Massenspektrometer gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, ferner mit einem Massenfilter stromaufwärts der Kollisionszelle (4).
Massenspektrometer gemäß Anspruch 9, bei dem der Massenfilter einen Quadrupol-Massenfilter (3) umfasst.
Massenspektrometer gemäß Anspruch 9 oder 10, bei dem der Massenfilter eine Hochpass-Filtercharakteristik aufweist.
Massenspektrometer gemäß Anspruch 11, bei dem der Massenfilter eingerichtet ist, um Ionen mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis durchzulassen bzw. zu transmittieren, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die umfasst: (i) ≥ 100; (ii) ≥ 150; (iii) ≥ 200; (iv) ≥ 250; (v) ≥ 300; (vi) ≥ 350; (vii) ≥ 400; (viii) ≥ 450; und (ix) ≥ 500.
Massenspektrometer gemäß Anspruch 9 oder 10, bei dem der Massenfilter eine Tiefpass- oder Bandpass-Filtercharakteristik aufweist.
Massenspektrometer gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, ferner mit einer Ionenführung (2) stromaufwärts der Kollisionszelle (4), wobei die Ionenführung (2) ausgewählt ist aus der Gruppe, die umfasst: (i) ein Hexapol; (ii) ein Quadrupol; (iii) ein Oktapol; (iv) eine Anzahl von Ringelektroden mit im wesentlichen konstanten inneren Durchmessern; und (v) eine Anzahl von Ringelektroden mit im wesentlichen sich verjüngenden inneren Durchmessern.
Massenspektrometer gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Kollisionszelle (4) ausgewählt ist aus der Gruppe, die umfasst: (i) ein Quadrupol-Stabset; (ii) eine Hexapol-Stabset; und (iii) ein Oktopol-Stabset.
Massenspektrometer gemäß Anspruch 15, bei dem die Kollisionszelle (4) ein im wesentlichen gasdichtes Gehäuse bildet.
Massenspektrometer gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Steuerungssystem in wenigstens einem ersten der wenigstens zwei Modi eingerichtet ist, um eine Spannung an die Kollisionszelle (4) anzulegen, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die umfasst: (i) ≥ 15 V; (ii) ≥ 20 V; (iii) ≥ 25 V; (iv) ≥ 30 V; (v) ≥ 50 V; (vi) ≥ 100 V; (vii) ≥ 150 V; und (viii) ≥ 200 V.
Massenspektrometer gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Steuerungssystem in wenigstens einem zweiten der wenigstens zwei Modi eingerichtet ist, um eine Spannung an die Kollisionszelle (4) anzulegen, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die umfasst: (i) ≤ 5 V; (ii) ≤ 4,5 V; (iii) ≤ 4 V; (iv) ≤ 3,5 V; (v) ≤ 3 V; (vi) ≤ 2,5 V; (vii) ≤ 2 V; (viii) ≤ 1,5 V; (ix) ≤ 1 V; (x) ≤ 0,5 V; und (xi) im wesentlichen 0 V.
Massenspektrometer gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem ein Kollisionsgas, welches Helium, Argon, Stickstoff oder Methan umfasst, bei der Verwendung in die Kollisionszelle (4) eingeführt wird.
Massenspektrometer mit: einer Ionenquelle (1), wobei die Ionenquelle (1) eine Atmosphärendruck-Ionenquelle umfasst; einer Kollisionszelle (4) zum Fragmentieren von Ionen, wobei in einem ersten Modus Ionen in der Kollisionszelle (4) fragmentiert werden und in einem zweiten Modus Ionen im wesentlichen nicht fragmentiert werden; einem Massenanalysator, wobei der Massenanalysator einen Fouriertransformations-Ionenzyklotonresonanz-Massenanalysator ("FTICR-Massenanalysator") umfasst; und einem Steuerungs- bzw. Kontrollsystem zum automatischen Umschalten zwischen den zwei Modi wenigstens einmal alle 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Sekunden.