DE102017111067B4

DE102017111067B4 - Isomeren-Analyse in TIMS-Q-q-TOF Massenspektrometern

Info

Publication number: DE102017111067B4
Application number: DE102017111067.4A
Authority: DE
Inventors: Alexander Harder; Markus Lubeck; Sven Meyer; Detlev Suckau
Original assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2016-06-02
Filing date: 2017-05-22
Publication date: 2021-09-23
Anticipated expiration: 2037-05-23
Also published as: CN107462623A; DE102017111067A1; US10473620B2; US20170350861A1; US20190154632A1; US10317362B2

Abstract

Verfahren zur Analyse eines Substanzgemisches in einem Massenspektrometer, das ein Speicherionen-Mobilitätsseparator, einen Massenseparator, eine Fragmentierungszelle und einen Flugzeitanalysator umfasst, wobei eine erste Massen-Mobilitäts-Übersicht aufgenommen wird, Ionensignale aus der ersten Massen-Mobilitäts-Übersicht ausgewählt werden und nachfolgend Fragment-Ionenspektren von nach Mobilität und Masse selektierten Ionen der ausgewählten Ionensignale aufgenommen werden, dadurch gekennzeichnet, dass(a) eines der ausgewählten Ionensignale, dessen Fragment-Ionenspektrum und/oder die Substanzidentifizierung daraufhin untersucht wird, ob dieses Ionensignal von Interesse eine Überlagerung von Signalen verschiedener Ionensorten ist, die nicht ausreichend nach Massen oder Mobilität aufgelöst sind, und(b) ein zusätzliches Fragment-Ionenspektrum von nach Mobilität und Masse selektierten Ionen des Ionensignals von Interesse aufgenommen wird, wobei die Scangeschwindigkeit des Speicherionen-Mobilitätsseparators im Bereich des Ionensignals von Interesse so verringert wird, dass die nach Mobilität und Masse selektierten Ionen des zusätzlich aufgenommenen Fragment-Ionenspektrums zu denen des vorher aufgenommenen Fragment-Ionenspektrums eine kleinere Mobilitätsbandbreite ΔK aufweisen.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse von komplexen Substanzgemischen und insbesondere zur Identifizierung von Isomeren und Isobaren unter Verwendung von Flugzeit-Massenspektrometern, die mit einem Speicherionen-Mobilitätsspektrometer, einem Massenfilter und einer Fragmentierungszelle ausgerüstet sind.
Stand der Technik
Die Patentschrift US 7,838,826 B1 (M. A. Park, 2008) offenbart ein Speicherionen-Mobilitätsspektrometer (TIMS = trapped ion mobility spectrometer), das im Folgenden auch als Speicherionen-Mobilitätsseparator bezeichnet wird. In einem Speicherionen-Mobilitätsspektrometer werden Ionen typischerweise in einem multipolaren Ionenleitsystem durch einen Gasstrom gegen eine elektrische Feldbarriere getrieben, die bevorzugt eine Rampe mit ansteigender elektrischer Feldstärke aufweist. Die Ionen sammeln sich entlang der Rampe an den Stellen, an denen jeweils die Gasreibung für eine Ionensorte im Gleichgewicht mit der rücktreibenden elektrischen Kraft steht. Die Ionen sammeln sich also räumlich getrennt nach ihrer Ionenmobilität. Sind beispielsweise nach einer voreingestellter Sammelzeit genügend Ionen gespeichert, so wird das elektrische Gegenfeld der elektrischen Feldbarriere in einem „Scan“ heruntergefahren, wodurch die Ionen sequentiell von kleinen zu höheren Mobilitäten über das Ende der Rampe hinweg entlassen und einem Massenspektrometer, vorzugsweise einem Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss, zugeführt werden.
Die zeigt einen typischen Speicherionen-Mobilitätsseparator in schematischer Darstellung sowie eine Betriebsweise des Speicherionen-Mobilitätsseparators. Durch eine Kapillare (8) tritt Gas (7) mit mitgeführten Ionen (6) in die erste Vakuumstufe eines Massenspektrometers ein. Durch eine Elektrode (9) werden die Ionen (6) in einen Hochfrequenz-Ionentrichter (10) (RF ion funnel) gedrückt und zur Röhre (11) des Speicherionen-Mobilitätsseparators geführt, die aus segmentierten Ringelektroden aufgebaut ist. In der Röhre (11) wird ein quadrupolares Hochfrequenzfeld erzeugt, das die Ionen nahe an der Achse der Röhre (11) hält, indem Hochfrequenzpotentiale mit alternierender Phase an die Quadranten (1, 2, 3, 4) der Ringelektroden angelegt werden. Außerdem wird in der Röhre (11) durch Gleichspannungspotentiale an den Ringelektroden ein elektrisches Feld E(z) erzeugt, das eine Rampe, längs derer die elektrische Feldstärke ansteigt (zwischen Position 20 und 23), und ein Plateau (zwischen Position 23 und 24) aufweist. Ein Gasfluss (14, 16) mit laminarem Geschwindigkeitsprofil drückt die Ionen auf die Rampe zu. Ionen gleicher Mobilität sammeln sich an einer Stelle auf der Rampe, an der die Gasreibung mit der rücktreibenden Kraft des elektrischen Feldes im Gleichgewicht steht. Nach einer bestimmten Sammelzeit (Diagramm A), werden die Gleichspannungen abgesenkt (Diagramm B), und die Ionen können mobilitätssequentiell über das Plateau hinweg die Röhre (11) durch die Blende (13) verlassen.
Das Herunterfahren des elektrischen Gegenfeldes (Scan) dauert typischerweise zwischen von 20 bis 250 Millisekunden. Der Speicherionen-Mobilitätsseparator kann sehr kompakt sein. Die Röhre (11) als Hauptteil kann beispielsweise eine Länge von nur fünf Zentimeter aufweisen.
Diese Art von Mobilitätsspektrometer ist insofern einzigartig, als dass das Mobilitätsauflösungsvermögen von der Scangeschwindigkeit abhängt. Die zeigt die Mobilitätsauflösung als Funktion der Scandauer. Mit einer Scandauer von nur 20 Millisekunden wird für Ionen einer Mobilität von etwa Ko=0,5 eine Mobilitätsauflösung von R_mob = K₀/ΔK₀ = 60 erreicht; mit 300 Millisekunden Scandauer steigt die Mobilitätsauflösung auf R_mob = 120 an.
In der US-amerikanischen Patentanmeldung 14/931,163 (M. A. Park et al.; „Acquisition of Fragment Ion Mass Spectra of Ions Separated by their Mobility"; veröffentlicht als US 2017/0122906 A1 ), das hier durch Zitat vollinhaltlich eingeschlossen sein soll, wird ein Verfahren zur Identifizierung von organischen Substanzen in einem komplexem Substanzgemisch, wie z.B. dem enzymatischem Verdau eines Proteoms, geschildert. Das dort offenbarte Verfahren wird bevorzugt mit einem massenspektrometrischen System durchgeführt, das schematisch in dargestellt ist und folgende Komponenten umfasst: einen Flüssigkeitschromatographen (optional), eine Ionenquelle, einen (akkumulativen) Speicherionen-Mobilitätsseparator, ein Massenfilter, eine Fragmentierungszelle und ein Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss und Reflektor.
Die in Flüssigkeit gelösten Substanzen werden einer Ionenquelle, vorzugsweise einer Elektrosprüh-Ionenquelle, zugeführt und ionisiert, wobei je nach Komplexität des Substanzgemisches die Substanzen bereits chromatographisch aufgetrennt sein mögen oder auch ungetrennt aus einer Spritzenpumpe stammen können.
Zunächst wird ohne Einsatz des Massenfilters und der Fragmentierungszelle eine Massen-Mobilitäts-Übersicht aufgenommen, wie sie in schematisch dargestellt ist. Typischerweise werden die im Speicherionen-Mobilitätsseparator gespeicherten Ionen in einem etwa 50 Millisekunden dauernden Mobilitätsscan nach ihrer Mobilität getrennt und zum Flugzeitspektrometer überführt, wo die nach Mobilität getrennten Ionensorten massenspektrometrisch analysiert werden. Ein modernes Flugzeitmassenspektrometer kann 10 000 Massenspektren pro Sekunde aufnehmen, wobei es zweckmäßig sein kann, einige der aufgenommenen Massenspektren zu addieren, um eine hinreichend gute Qualität und eine große Signaldynamik zu erreichen.
Die Massen-Mobilitäts-Übersicht weist bei komplexen Substanzgemischen eine Vielzahl von Ionensignalen auf, die längs der Mobilitätsachse typischerweise etwa ein bis drei Millisekunden ausgedehnt sind. Die Mobilitätsauflösung ist dabei sehr viel kleiner als die Massenauflösung. Die Massen der Ionensignale fallen längs der Mobilitätsachse ab, wobei einfach und mehrfach geladene Ionen stark streuende, einander zum Teil überlappende Streifen bilden (siehe ). Die ist stark vereinfacht; zum einen sind die Isotopenverteilungen eines jeden Ionensignals nicht gezeigt, zum anderen enthält die Abbildung nur relativ wenige Ionensignale, bei komplexen Substanzgemischen können es Tausende von Ionensignalen sein.
Aus der Massen-Mobilitäts-Übersicht wird danach eine erste Gruppe von Ionensignalen ausgewählt, wobei die Gruppe eine Reihe von Ionensignalen enthält, die zeitlich nacheinander angeordnet sind, also in Richtung der Mobilitätsachse nicht überlappen. Die zeigt eine mögliche Auswahl einer Gruppe von Ionensignalen, die in der Massen-Mobilitäts-Übersicht durch Ellipsen eingekreist sind.
Nach der Aufnahme der Massen-Mobilitäts-Übersicht und der Auswahl einer ersten Gruppe von Ionensignalen wird nachfolgend ein Mobilitätsscan zur Identifizierung der Substanzen der Ionensignale der Gruppe durchgeführt. Dazu werden das Massenfilter, die Fragmentierungszelle und das Flugzeitmassenspektrometer benötigt. Nach der Befüllung des Speicherionen-Mobilitätsseparators und dem Start des Mobilitätsscans wird das Massenfilter, in der Regel ein Quadrupol-Massenfilter, auf Durchlass für Ionen des ersten Ionensignals aus der Gruppe geschaltet. Dabei sollen bevorzugt alle Ionen der Isotopenverteilung erfasst werden, um zu Fragment-Ionenspektren zu gelangen, deren Isotopenverteilungen mit denen von Referenzspektren aus Spektrenbibliotheken übereinstimmen. Deshalb wird das Massenfilter auf eine Durchlassbreite von einigen atomaren Masseneinheiten (Dalton) eingestellt. Die hiermit nach Mobilität (Scanzeitpunkt) und Masse selektierten Ionen des ersten Ionensignals werden in der Fragmentierungszelle fragmentiert; die Fragment-Ionen werden als Fragment-Ionenspektrum im Flugzeitmassenspektrometer gemessen. In der Regel ist aus diesem Fragment-Ionenspektrum eine Identifizierung der Substanz möglich, meist über Vergleiche mit Referenzspektren einer Spektrenbibliothek. Im weiteren Verlauf desselben Mobilitätsscans werden in gleicher Weise die Ionen weiterer Ionensignale nach Mobilität und Masse selektiert und fragmentiert. Die zeitlichen Abstände zwischen den Ionen der Gruppe sind so gewählt, dass das Massenfilter auf die Masse der Ionen des nachfolgenden Ionensignals umgeschaltet werden kann. Die Identifizierungen der weiteren Substanzen der ausgesuchten Ionensignale dieser Gruppe erfolgen durch die Aufnahmen der entsprechenden Fragment-Ionenspektren. Anschließend wird der Speicherionen-Mobilitätsseparator mit einer weiteren Ladung von Ionen befüllt, und es kann die Identifizierung einer zweiten Gruppe von Ionensignalen aus der Massen-Mobilitäts-Übersicht beginnen.
Ist der Mobilitätsscan beispielsweise 20 Millisekunden lang und hat ein Ionensignal beim Verlassen des Speicherionen-Mobilitätsseparators typischerweise eine Dauer von 2,5 Millisekunden, so können in einem Mobilitätsscan für jede Gruppe bis zu acht Signale ausgewählt werden; für einen Mobilitätsscan von 50 Millisekunden Dauer kann jede Gruppe etwa 20 Signale enthalten. Sind in einer Massen-Mobilitäts-Übersicht etwa 200 einigermaßen gleichmäßig verteilte Ionensignale vorhanden, so können sie bei 50 Millisekunden Scandauer auf etwa 10 Gruppen verteilt werden. Sind sie nicht gleichmäßig verteilt, so kann es erforderlich sein, mehr als 10 Gruppen zu bilden, um alle Signale der Massen-Mobilitäts-Übersicht zu erfassen.
Zur Verbesserung der Qualität können auch mehrere Massen-Mobilitäts-Übersichten aufgenommen und aufaddiert werden. Es kann zudem für größere Molekülen zweckmäßig sein, nur Ionensignale von Ionen auszusuchen, die mindestens doppelt geladen sind, da sich diese leichter als einfach geladenen Ionen und mit hoher Ausbeute fragmentieren lassen.
Bei einer angenommenen Scandauer von jeweils 50 Millisekunden können etwa 20 solcher Messzyklen durchfahren werden, ehe nach etwa einer Sekunde eine neue Massen-Mobilitäts-Übersicht gemessen wird, um beispielsweise einer Veränderung während einer chromatographischen Trennung Rechnung zu tragen. Es können somit theoretisch etwa 400 Ionensorten pro Sekunde identifiziert werden. In der Praxis wird diese Anzahl von Messungen nicht ganz erreicht, selbst wenn so viele Ionenarten vorhanden sind. Es stehen aber in der Regel selbst in sehr komplexen Substanzgemischen gar nicht so viele Ionensorten zur Verfügung. Die überschüssige Messkapazität kann dann dazu verwendet werden, schwache Ionensignale in aufeinanderfolgenden Messzyklen mehrfach zu vermessen und die Fragment-Ionenspektren zu addieren, um eine bessere Spektrenqualität und damit eine sicherere Identifizierung zu erreichen.
Dieses Verfahren kann je nach den analytischen Erfordernissen in vielfältiger Weise abgewandelt werden. So kann durch längere Scandauern eine höhere Mobilitätsauflösung erreicht werden, wobei gleichzeitig für jede Gruppe größere Anzahlen an Ionensignalen ausgewählt werden können. Durch einen Speicherionen-Mobilitätsseparator mit paralleler Akkumulation von Ionen (US--amerikanische Patentanmeldung US 14/614,456 ; „Trapping Ion Mobility Spectrometer with Parallel Accumulation“, M. A. Park and M. Schubert; veröffentlicht als US 2016/0231275 A1 ) können alle Ionen einer Ionenquelle ausgenutzt werden, ohne dass während der Mobilitätsscans Verluste von Ionen auftreten. Die zeigt eine bevorzugte Betriebsweise eines Speicherionen-Mobilitätsseparators mit paralleler Akkumulation. Die verlängerte Röhre (11) ist hier in zwei Bereiche (IIa) und (IIb) unterteilt. In beiden Bereichen können Rampen mit ansteigender Feldstärke eingestellt werden, wie in den Diagrammen D und E ersichtlich. Der erste Bereich dient zu Sammeln der Ionen, während die Ionen des zweiten Bereichs einem Mobilitätsscan unterliegen. Ist der Mobilitätsscan beendet, so können die Ionen des ersten Bereichs in etwa einer Millisekunde in den zweiten Bereich überführt werden.
Die Offenlegungsschrift US 2013/0299690 A1 offenbart Verfahren zur Erhöhung des Auflösungsvermögens, der Spezifität und der Kapazität in Ionenmobilitätsspektrometern, in denen Ionen mit Hilfe von elektrischen Wanderfelder (travelling wave) nach Mobilität getrennt werden. Aus der Offenlegungsschrift ist weiterhin ein sogenannter „Zoom“-Modus bekannt, in dem ein Bereich eines Mobilitätsspektrum in einer datenabhängigen Weise ausgewählt wird und dort die Mobilitätsauflösung in einer nachfolgenden Mobilitätsspektrum erhöht wird.
Unter „Isomeren“ versteht man Moleküle, die die gleiche Zusammensetzung aus Elementen, also die gleiche Bruttoformel, besitzen, aber verschiedene Primärstrukturen („strukturelle Isomere“) oder verschiedene sekundäre oder tertiäre Strukturen haben („konformationale Isomere“). Isomere haben exakt die gleiche Masse. Unter „Isobaren“ versteht man verschiedene Moleküle, die aus verschiedenen Elementen so zusammengesetzt sind, dass ihre Masse die gleiche Anzahl von atomaren Masseneinheiten (Dalton) aufweist, aber nicht die exakt gleiche Masse. Man spricht dann von „gleicher Nominalmasse“. Molekül-Ionen zeigen stets Isotopenverteilungen, die sich über mehrere Dalton erstrecken. Überlagern sich die Molekül-Ionen zweier Moleküle, die sich in ihrer Masse nur um ein, zwei, drei Dalton unterscheiden, so kann man mit einem Massenfilter die Isotopenverteilungen dieser Moleküle nicht voneinander trennen. Diese Moleküle werden hier „Fast-Isobare“ genannt. Wenn hier von „Isomeren“ die Rede ist, so soll der Ausdruck häufig auch die „Isobaren“ oder „Fast-Isobaren“ mit umfassen.
Aufgabe der Erfindung
Es besteht ein Bedarf für Verfahren zur Analyse von komplexen Substanzgemischen, mit denen isomere und isobare organische Substanzen in komplexen Substanzgemischen identifiziert werden können, insbesondere pharmakologische Substanzen von besonderem analytischem Interesse, und die Mobilität Ko oder der Stoßquerschnitt σ der Substanzen möglichst genau bestimmt werden kann.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfahrung hat gezeigt, dass nicht alle Ionensignale einer Massen-Mobilitäts-Übersicht zu einzelnen, homogenen Ionensorten gehören. Jedes Ionensignal kann einer Ionensorte, aber gelegentlich auch mehrere, nicht nach ihrer Mobilität aufgelöste Isomere oder Isobare enthalten, deren Isotopenverteilungen sich überlappen. Ionengemische mit genügend verschiedener Mobilität sind durch die bekannten Verfahren bereits nach Mobilität aufgelöst. Andere Ionengemische enthalten Ionensorten, die nicht nach Mobilität aufgelöst sind.
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, in dem mit einem Massenspektrometer, das ein Speicherionen-Mobilitätsseparator, einen Massenseparator, eine Fragmentierungszelle und einen Flugzeitanalysator umfasst, eine erste Massen-Mobilitäts-Übersicht aufgenommen wird und Ionensignale aus der ersten Massen-Mobilitäts-Übersicht ausgewählt werden und nachfolgend Fragment-Ionenspektren von nach Mobilität und Masse selektierten Ionen der ausgewählten Ionensignale aufgenommen werden. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass in einem ersten Schritt eines der ausgewählten Ionensignale, dessen Fragment-Ionenspektrum und/oder die Substanzidentifizierung daraufhin untersucht wird, ob dieses Ionensignal von Interesse eine Überlagerung von Signalen verschiedener Ionensorten ist, die nicht ausreichend nach Massen oder Mobilität aufgelöst sind. In einem zweiten Schritt wird ein zusätzliches Fragment-Ionenspektrum von Ionen des Ionensignals von Interesse aufgenommen, wobei die Scangeschwindigkeit des Speicherionen-Mobilitätsspektrometer im Bereich des Ionensignals von Interesse so verringert wird, dass die nach Mobilität und Masse selektierten Ionen des zusätzlich aufgenommenen Fragment-Ionenspektrums zu denen des vorher aufgenommenen Fragment-Ionenspektrums eine kleinere Mobilitätsbandbreite ΔK aufweisen.
Unter einem „Ionensignal“ wird hier das Signal derjenigen Ionen verstanden, die beim Mobilitätsscan aus dem Speicherionen-Mobilitätsseparator quasi gleichzeitig entlassen und dem nachfolgenden Massenanalysator zugeführt wird.
Die Massen-Mobilitäts-Übersicht, aus der die Mobilität bzw. der Stoßquerschnitt und die Masse des Ionensignals ermittelt werden, und/oder das Fragment-Ionenspektrum können für die Substanzidentifizierung der Ionensignale verwendet werden. Das zusätzliche Fragment-Ionenspektrum wird bevorzugt zur Substanzidentifizierung des Ionensignals von Interesse verwendet. Zusätzlich kann eine zweite Massen-Mobilitäts-Übersicht aufgenommen werden, wobei die Scangeschwindigkeit im Bereich des Ionensignals von Interesse so verringert wird, dass in der zweiten Übersicht der Bereich um das Ionensignal von Interesse mit einer gegenüber der ersten Übersicht erhöhten Mobilitätsauflösung gemessen wird und die Mobilität oder der Stoßquerschnitt aus der zweiten Massen-Mobilitäts-Übersicht zur Substanzidentifizierung des Ionensignals von Interesse verwendet wird.
Die zweite, detailliertere Massen-Mobilitäts-Übersicht wird im Folgenden auch „Zoom-Übersicht“ genannt; sie enthält nicht mehr alle Ionensignale, sondern nur noch die Ionensignale der in engen Massen- und Mobilitätsbereichen ausgewählten Ionensorten.
Das Ionensignal von Interesse kann bezüglich der Signalbreite oder Signalform oder beidem darauf hin untersucht werden, ob es eine Überlagerung von Signalen verschiedenen Ionensorten ist. Die Signalbreite und/oder die Signalform des Ionensignals von Interesse werden bevorzugt mit der Signalbreite bzw. Signalform einer einzelnen Ionensorte verglichen und insbesondere auf eine Abweichung entlang der Mobilitätsrichtung hin untersucht.
Die Scangeschwindigkeit des Speicherionen-Mobilitätsseparators wird im Bereich des Ionensignals von Interesse auch verringert, um Ionen für das zusätzliche Fragment-Ionenspektrum mit einer kleineren Mobilitätsbandbreite ΔK selektieren zu können.
Das Ionensignal von Interesse wird aus den Ionensignalen der ersten Übersicht ausgewählt, wobei für die Auswahl eine Auswahlliste verwendet wird, die bekannte Isomere oder Isomere von besonderem analytischem Interesse enthält. Die Auswahlliste ist dabei bevorzugt von der Art des Substanzgemisches abhängig. Die Auswahl kann aber auch durch einen Anwender erfolgen, der das Ionensignal von Interesse in einer visuellen Darstellung der ersten Übersicht markiert. Die Ausdehnung der Markierung in Richtung der Mobilität kann dabei die Mobilitätsauflösung des zweiten Überblicks im Bereich des Ionensignals von Interesse vorgeben und den oder die Parameter des Speicherionen-Mobilitätsseparators festlegen. Es werden dabei bevorzugt nur solche Ionensignale ausgewählt, die nicht bereits in einer vorhergehenden Übersicht ausgewählt und identifiziert worden sind.
Die Aufnahme der ersten und/oder zweiten Übersicht kann eine Kalibrierung der Mobilitätsachse umfassen, so dass die Mobilität oder der Stoßquerschnitt des Ionensignals von Interesse bestimmt werden können. Für die Kalibrierung werden bevorzugt die bekannten Mobilitäten oder Stoßquerschnitte von identifizierten Substanzen des Substanzgemisches oder von Referenzsubstanzen verwendet, wobei die Referenzsubstanzen dem Substanzgemisch zugefügt werden. Insbesondere können dem Substanzgemisch mindestens zwei Referenzsubstanzen zugefügt werden, die die Mobilität des Ionensignals von Interesse einschließen.
Das Substanzgemisch kann der Ionenquelle in gelöster Form mit einer Spritzenpumpe zugeführt werden, wobei die Massen-Mobilitäts-Übersichten von Messung zu Messung im Wesentlichen gleichbleiben.
Das Substanzgemisch kann aber auch zuerst in einem Chromatographen aufgetrennt und als aufgetrenntes Substanzgemisch der Ionenquelle zugeführt werden. Der Chromatograph ist bevorzugt ein Flüssigkeitschromatograph (LC), wobei das aufgetrennte Substanzgemisch der Ionenquelle in flüssiger Form zugeführt wird. Der Chromatograph (Substanzseparator) kann aber auch ein Gaschromatograph sein oder eine elektrophoretische Auftrennung durchführen, z.B. in Form einer Kapillarelektrophorese. Für komplexe Gemische kann auch nach einer Auftrennung noch immer eine Vielzahl von Substanzen überlagert sein.
Werden die Substanzen des Substanzgemisches mittels eines Substanzseparators aufgetrennt und der Ionenquelle zugeführt, so erscheinen die zu einer Substanz gehörigen Ionensignale in zeitlich aufeinanderfolgend aufgenommenen Massen-Mobilitäts-Übersichten nur dann, wenn die Konzentration der Substanz eine Empfindlichkeitsschwelle überschritten hat. Die Konzentration nimmt dann in weiteren Massen-Mobilitäts-Übersichten zunächst zu, überschreitet ein Maximum, und nimmt wieder ab. Es ist besonders günstig, dass ein Ionensignal in einer visuellen Darstellung einer Massen-Mobilitäts-Übersicht nur dann angezeigt wird oder ein Ionensignal von Interesse nur dann ausgewählt wird, wenn das Ionensignal das Maximum während der Substanzseparation erreicht hat. In der Nähe des Maximums liegt zudem für eine kurze Zeit eine etwa konstante Konzentration der Substanz vor.
Sollen mehrere Proben mit gleichartiger Zusammensetzung aufgetrennt und analysiert werden, beispielsweise immer in gleicher Weise auf das Auftreten bestimmter Isomere hin, so können die optimalen Geräteparameter des Substanzseparators und/oder des Massenspektrometers für Substanzen von Interesse in einem oder mehreren Durchläufen einer ersten Probe bestimmt und für die nachfolgend untersuchten Proben verwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren wird also für eine Serie von gleichartigen Proben anhand einer ersten Probe detailliert ausgearbeitet und dann für die weiteren Proben in gleicher Weise verwendet. Es ist dabei zweckmäßig, die Geräteparameter, die sich während des Separationsvorgangs der ersten Probe verändern, zu speichern und später für weitere gleichartige Proben wieder zu verwenden, wobei insbesondere zu den bekannten Retentionszeiten bestimmter Substanzen von Interesse die entsprechenden Geräteparameter des Massenspektrometers, insbesondere des Speicherionen-Mobilitätsseparators, des Massenfilters, der Fragmentierungszelle und/oder des Flugzeitanalysators, verwendet werden.
Figurenliste

Die zeigt einen typischen Speicherionen-Mobilitätsseparator in schematischer Darstellung sowie eine Betriebsweise des Speicherionen-Mobilitätsseparators.
Die zeigt die Mobilitätsauflösung eines Speicherionen-Mobilitätsseparators als Funktion der Scandauer.
Die zeigt ein massenspektrometrisches System, mit dem die erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt ausgeführt werden können. Die Verwendung des Speicherionen-Mobilitätsseparators (TIMS) mit seiner einstellbaren Mobilitätsauflösung erlaubt es, Untersuchungen an einzelnen Ionensorten mit höchster Mobilitätsauflösung durchzuführen.
Die zeigt eine schematische Darstellung einer Massen-Mobilitäts-Übersicht, die mit dem massenspektrometrischen System aus aufgenommen worden ist, wobei der Massenfilter und die Fragmentierungszelle außer Betrieb sind. In der Übersicht ist eine Gruppe von acht Ionensignalen ausgewählt, deren Ionen in einem nachfolgenden Messzyklus identifiziert werden können. Die gibt nur grob das Schema einer Massen-Mobilitäts-Übersicht wieder; viele Details sind hier nicht sichtbar. So ist beispielsweise nicht gezeigt, dass für jedes Ionensignal wegen der hohen Massenauflösung des Flugzeit-Massenspektrometers eine Isotopenverteilung zu erkennen ist.
Die zeigt eine bevorzugte Betriebsweise eines Speicherionen-Mobilitätsseparators mit paralleler Akkumulation.
Die zeigt eine schematische Darstellung einer Massen-Mobilitäts-Übersicht, in der eine Serie von Ionensignalen (53) nach Mobilität aufgelöst wurde. Weitere Ionensignale (50, 51, 52) bestehen aus mehreren Ionensorten, sind aber nicht mobilitätsaufgelöst. Sind diese Ionensignale von besonderem analytischem Interesse, so können sie in einem nachfolgenden Verfahrensschritt nach ihrer Mobilität aufgelöst gemessen werden, insbesondere durch Anwendung von Zoomverfahren.
Die stellt schematisch eine zweite Massen-Mobilitäts-Übersicht (Zoom-Übersicht) der Signalgruppe (50) aus der dar, in der der Massenbereich auf 15 Dalton eingeschränkte ist, und der Mobilitätsbereich der Signalgruppe (50) durch einen langsamen Scan mit 400 Millisekunden überstrichen wird. Die Signalgruppe ist jetzt nach Mobilität aufgelöst und zeigt in dieser Darstellung auch ihre Isotopenstruktur. Die Signalgruppe (50d) scheint ein Isobar mit anderer Isotopenzusammensetzung zu sein.
Die zeigt eine schematische Darstellung einer Massen-Mobilitäts-Übersicht, in der ein Analytsignal von besonderem Interesse (55) von zwei Kalibriersignalen (54) und (56) genau bekannter Mobilität umgeben sind, um in einem Zoomscan die Mobilität des Analytsignals (55) genau bestimmen zu können.
Die zeigt eine bevorzugte Betriebsweise eines Speicherionen-Mobilitätsseparators mit paralleler Akkumulation, in der ein „räumlicher Zoom“ verwendet wird, um einen eingeschränkten Mobilitätsbereich zu analysieren und den Einfluss der Raumladung zu minimieren.
Die gibt einen konstruierten Ausschnitt aus einem LC-Chromatogramm von Sekunde 900 bis Sekunde 952 wieder, mit einigen Substanzpeaks, die jeweils Halbwertsbreiten von 10 Sekunden haben. Die Linie (60) stellt die Empfindlichkeitsschwelle dar. Wird alle Sekunde eine Massen-Mobilitäts-Übersicht gemessen, dargestellt durch die gestrichelten Vertikallinien, so erscheint die gestrichelt eingezeichnete Substanz erstmalig zum Zeitpunkt t = 929 s, und zwar mit der Intensität (61). In den darauffolgenden Massen-Mobilitäts-Übersichten steigt die Intensität von (62) bis (68) an, wobei die Intensität (68) zu Beginn des Intensitätsmaximums liegt. Eine programmgesteuerte Analyse kann für jede Substanz feststellen, wann das Maximum erreicht wird, und für die Auswahl der zu messenden Substanzen, wie sie in gezeigt wird, nur solche Substanzen anbieten, die nahe am Maximum erscheinen und außerdem in vergangenen Messzyklen noch nicht identifiziert wurden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die zeigt eine schematische Darstellung einer Massen-Mobilitäts-Übersicht, die mit dem massenspektrometrischen System aus aufgenommen worden ist, wobei Massenfilter und die Fragmentierungszelle außer Betrieb waren. In der Übersicht ist eine Gruppe von acht Ionensignalen ausgewählt, deren Ionen in einem nachfolgenden Messzyklus identifiziert werden können. Die gibt nur grob das Schema einer Massen-Mobilitäts-Übersicht wieder; viele Details sind hier nicht sichtbar. So ist beispielsweise nicht gezeigt, dass jedes Ionensignal wegen der hohen Massenauflösung des Flugzeit-Massenspektrometers eine Isotopenverteilung aufweist. Ein Ionensignal erscheint in einer visuellen Detaildarstellung der Übersicht als ein Bündel kurzer waagrechter Striche, die aber nur bei hohem Bildschirm-Zoom als Bündel zu erkennen sind.
Für die Identifizierung der ausgewählten Ionensignale wird nach der Befüllung des Speicherionen-Mobilitätsseparators (TIMS-Zelle) mit genügend Ionen ein Mobilitätsscan gestartet. Das Massenfilter wird beim Erscheinen des ersten Ionensignals am Ausgang des Speicherionen-Mobilitätsseparators auf die Masse dieses Ionensignals gesetzt, und die Ionen werden durch das Massenfilter durchgelassen. Die gefilterten Ionen werden dann in der Fragmentierungszelle fragmentiert, und die Fragment-Ionen werden im Flugzeitmassenanalysator gemessen. In der Regel ist es möglich, die Substanz des Ionensignals aus dem Fragment-Ionenspektrum zu bestimmen. Es folgen die Aufnahmen der Fragment-Ionenspektren der zweiten, dritten Substanz und so weiter. Sind alle acht Ionensignale dieser Signalgruppe vermessen, so kann die TIMS-Zelle neu befüllt werden, und eine zweite Gruppe von Ionensignalen kann in einem zweiten Messzyklus vermessen werden.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Feinanalyse organischer Substanzen in komplexen Gemischen, das mit einem Massenspektrometer durchgeführt wird, das eine Ionenquelle, ein Speicherionen-Mobilitätsseparator (TIMS), einen Massenseparator, eine Fragmentierungszelle und einen Flugzeitanalysator umfasst. Sowohl Isomere wie auch Isobare lassen sich prinzipiell durch Mobilitätsspektrometer trennen. Auch Fast-Isobare lassen sich in der Regel durch Mobilitätsspektrometer trennen.
In einem ersten Durchlauf wird mindestens eine Massen-Mobilitäts-Übersicht aufgenommen und es werden ausgewählte Ionensignale aus diesen Übersichten durch Aufnahme und Auswertung von Fragment-Ionenspektren der Ionen dieser Ionensignale identifiziert (erster Durchlauf).
Die Ionensignale, ihre Fragment-Ionenspektren, ihre Substanzidentifizierungen und/oder die identifizierten Substanzstrukturen werden daraufhin untersucht, ob Ionensignale aus diesen Übersichten möglicherweise Überlagerungen verschiedener Ionensorten sind, die nicht ausreichend nach Massen oder Mobilität aufgelöst sind, und ob also möglicherweise ein Gemisch aus Isomeren, Isobaren oder Fast-Isobaren vorliegt.
In einem zweiten Durchlauf werden weitere Übersichten und/oder Fragment-Ionenspektren aufgenommen, wobei Detailverfahren mit veränderten Verfahrensparametern verwendet werden, um Ionensignale von analytischem Interesse mit erhöhter Mobilitätsauflösung oder Mobilitätsgenauigkeit zu messen, insbesondere um Ionen von analytischem Interesse von anderen Ionensorten getrennt zu messen oder zu selektieren. Detailverfahren des Speicherionen-Mobilitätsseparators sind insbesondere der zeitliche oder räumliche Zoom. Die Mobilitätsauflösung bzw. Mobilitätstrennschärfe im Bereich eines Ionensignals von analytischem Interesse kann dabei größer als 100, bevorzugt größer als 300, insbesondere größer als 500 sein.
Es kommt bei vielen Analysenverfahren aber nicht nur darauf an, Gruppen mit mehreren Isomeren aufzuspüren. Ist bekannt, dass für eine Substanz aus einer Substanzgruppe mehrere Isomeren vorkommen können, und wird für diese Substanz nur ein Isomer gefunden, so kann es von besonderem analytischen Interesse sein, um welches der Isomere es sich hier handelt. Insbesondere bei Konformationsisomeren unterscheiden sich die Fragment-Ionenspektren oft nur so geringfügig, dass eine sichere Identifizierung des Isomers anhand dieses Spektrums nicht möglich ist. Wird eine ganze Gruppe von Isomeren gefunden, so ist es meist möglich, die Isomeren der Gruppe anhand der Struktur der Isomerengruppe zu bestimmen; für ein einzeln vorkommendes Isomer ist das aber in der Regel nicht möglich. Ergibt eine Fragment-Ionenanalyse keinen Hinweis auf die Identität des Isomers, so kann das Isomer häufig über eine präzise Bestimmung der Mobilität oder des Stoßquerschnitts identifiziert werden.
Die zeigt eine schematische Darstellung einer Massen-Mobilitäts-Übersicht, in der eine Serie von Ionensignalen (53) nach Mobilität aufgelöst ist. Weitere Ionensignale (50, 51, 52) bestehen aus einem Ionengemisch mehrerer Ionensorten, die aber nicht mobilitätsaufgelöst sind. Die Existenz von Ionengemischen kann häufig an einem zeitlich verlängerten Ionensignal in Mobilitätsrichtung abgelesen werden, insbesondere dann, wenn die Übersicht bereits mit einer entsprechend hohen Mobilitätsauflösung aufgenommen wurde. Oft kann das Vorliegen von Ionengemischen aber dem Signal überhaupt nicht angesehen werden. Sind diese Ionensignale von besonderem analytischem Interesse, so können sie in einem nachfolgenden Verfahrensschritt nach ihrer Mobilität aufgelöst gemessen werden, insbesondere durch Anwendung von Zoomverfahren.
Die Suche nach Ionensignalen, die möglicherweise nicht aufgelöste Signalüberlagerungen von verschiedenen Ionensorten sind, kann auf verschiedene Weisen geschehen:

(a) Computerprogramme können die Ionensignale in den Massen-Mobilitäts-Übersichten automatisch analysieren, insbesondere deren zeitliche Breite (Signalbreite) und Intensitätsverteilung (Signalform), aber auch Überlappungen von Isotopenverteilungen.
(b) Ein Anwender kann visuell die Ionensignale untersuchen. Dabei kann er durch Datenbanken unterstützt werden, die insbesondere solche Substanzgruppen umfassen, die häufig Isomere enthalten. Die Datenbanken können dabei insbesondere Substanzgruppen von besonderem analytischem Interesse enthalten und spezifisch für die Art des zu untersuchenden Substanzgemisches sein.
(c) Die Fragment-Ionenspektren sollten insbesondere im Falle der Isobaren und der Fast-Isobaren verschieden voneinander sein und eine Mischung verschiedener Ionensorten erkennen lassen. Auch Ionengemische mit verschiedenen Anzahlen an Doppelbindungen können so erkannt werden.
(d) Substanzen, die in der Übersicht des ersten Durchlaufs identifiziert wurden, können auch ohne Analyse der Ionensignale anhand von Datenbanken auf die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Isomeren hin untersucht werden. Die Datenbanken können auch hier insbesondere solche Substanzgruppen enthalten, bei denen die Messung von Isomeren analytisch von besonderem Interesse ist, oder spezifisch für die Art des zu untersuchenden Substanzgemisches sein. Damit können auch Ionensignale, deren Signalform und -breite keinerlei Auffälligkeiten zeigen, in die Messung eines zweiten Durchlaufs eingeschlossen werden. Manche Substanzgruppen neigen zu Isomeren, deren Mobilitäten sich nur sehr wenig unterscheiden, beispielsweise, weil sich bei zwei Isomeren eine Doppelbindung an zwei benachbarten Kohlenstoffatomen befinden kann. Solche Unterscheidungen können insbesondere pharmakologisch wichtig sein. Tritt nur ein Isomer auf, so ist es häufig von besonderem Interesse, genau zu bestimmen, um welches Isomer es sich handelt.
(e) Ein Vergleich der zumindest angenähert gemessenen Stoßquerschnitte σ mit bibliotheksartigen Sammlungen von Substanzdaten mit ihren Stoßquerschnitten kann beispielsweise automatisiert durch Computerprogramme vorgenommen werden und bei Diskrepanzen zu genaueren Messungen führen.

Es sei hier angemerkt, dass es nicht immer sinnvoll ist, alle Ionensignale, die Isomere oder Isobare umfassen könnten, auch im zweiten Durchlauf mit erhöhter Mobilitätsauflösung zu messen. Es kommt hier vordringlich auf die analytische Bedeutsamkeit an.
Es müssen nicht immer nur Isomere oder Isobare sein, die zu Ionensignalen führen, die eine Überlagerung von Ionensignalen verschiedener Ionensorten sind und nicht sauber nach Masse und Mobilität aufgelöst erscheinen. Das Massenfilter wird üblicherweise so eingestellt, dass für eine Ionensorte die gesamte Isotopengruppe durchgelassen wird; für schwerere Ionen kann die Durchlassbreite optimal etwa fünf Dalton oder mehr betragen. Dadurch werden aber Gemische aus Ionensorten, deren Molekülmassen sich nur um wenige Dalton unterscheiden, nicht mehr sauber getrennt. Sind die Moleküle sehr verschieden, so ist die Mischung an den Fragment-Ionenspektren zu erkennen. Sie können aber auch fast strukturgleich sein, beispielsweise wenn sie leicht verschiedene Anzahlen von Doppelbindungen besitzen. Ihre Molekülmassen unterscheiden sich dann nur um jeweils zwei, vier oder sechs Dalton (für einfach geladene Ionen). Auch solche Mischungen von Ionensorten mit Molekülmassen, die nur wenige Dalton Unterschied aufweisen, können durch das erfindungsgemäße Verfahren in einem zweiten Durchlauf mit einer entsprechend erhöhten Mobilitätsauflösung getrennt werden.
Werden Ionensignale gefunden, für die ein besonderes Interesse für eine Feinanalyse besteht, kann das Identifizierungsverfahren mit dem gleichen Substanzgemisch ein zweites Mal durchlaufen werden, wobei aber für jedes Ionensignal von Interesse eigens eingerichtete Detailverfahren mit eigens berechneten Verfahrensparametern eingestellt werden.
In der Regel wird dabei ein zeitlicher Zoom eingestellt, der den Mobilitätsscan für die Ionensignale von analytischem Interesse so spreizt, dass ein erhöhtes Mobilitätsauflösungsvermögen im Bereich dieser Ionensignale erreicht wird (siehe Patentschrift US 8,766,176 B2 ; „Acquisition Modes for Ion Mobility Spectrometers using Trapped Ions“, D. A. Kaplan et al.). Wie hoch das Auflösungsvermögen sein muss, kann oft nur durch Erfahrung oder durch Angaben in geeigneten Bibliotheken angegeben werden. Es werden bevorzugt Auflösungen der Mobilität von R_mob = 150 bis 250 eingestellt werden.
Können die Ionensignale Überlagerungen sein, und sind diese Ionensignale analytisch von genügend hohem Interesse, so werden nach erneuter Befüllung der TIMS-Zelle weitere Übersichten und/oder Fragment-Ionenspektren aufgenommen, wobei Detailverfahren mit veränderten Verfahrensparametern verwendet werden, um die Ionensignale von analytischem Interesse mit erhöhter Mobilitätsauflösung oder Mobilitätsgenauigkeit zu messen, insbesondere um Ionen von analytischem Interesse von anderen Ionensorten getrennt zu messen oder zu selektieren. je nach Erfordernis größer als 100, größer als 300, oder sogar größer als 500 sein. Diese zweite Massen-Mobilitäts-Übersicht mit erhöhter Mobilitätsauflösung werde hier „Zoom-Übersicht“ genannt.
In ist eine solche Zoom-Übersicht zu sehen, allerdings in stark vereinfachter Form. So sind die Intensitäten der Ionen jeder einzelnen Isotopenverteilung hier alle gleich gezeichnet, um den Unterschied der Isotopenverteilungen (50c) und (50d) sichtbar zu machen. Es ist in der Zoom-Übersicht die Signalgruppe (50) der dargestellt. Die Zoom-Übersicht zeigt, dass die Signalgruppe (50) aus vier einzelnen Ionensorten besteht, wobei die vierte Ionensorte (50d) wahrscheinlich ein Isobar ist, da eine andersartige Isotopenverteilung vorliegt. Die Zoom-Übersicht zeigt nur noch einen Massenbereich von 15 Dalton, und die Mobilitätsachse ist durch einen zeitlichen Mobilitäts-Zoom auf 400 Millisekunden gedehnt, um die hohe Mobilitätsauflösung zu erreichen.
Aus der Zoom-Übersicht können dann wieder einige Ionensignale ausgewählt werden, die jetzt in der Regel einzelne Ionensorten, also Isomere, Isobare oder Fast-Isobare, darstellen. In einem weiteren Schritt des Verfahrens können Fragment-Ionenspektren dieser Ionensignale aufgenommen werden. Die Fragment-Ionenspektren können zur Identifizierung der nunmehr getrennten Isomere, Isobare oder Fast-Isobare verwendet werden, wobei jedoch nicht immer eine eindeutige Identifizierung erreicht wird, weil sich die Fragment-Ionenspektren von Isomeren sehr ähneln können. Ist bekannt, dass für eine Substanz aus einer Substanzgruppe mehrere Isomere vorkommen können, und wird für diese Substanz nur ein Isomer gefunden, so kann es von besonderem analytischem Interesse sein, um welches der Isomere es sich hier handelt.
Ein zeitlicher Zoom kann auch durch einen räumlichen Zoom unterstützt werden. Die zeigt eine bevorzugte Betriebsweise eines Speicherionen-Mobilitätsseparators mit paralleler Akkumulation, in der ein „räumlicher Zoom“ verwendet wird, um einen eingeschränkten Mobilitätsbereich zu analysieren und den Einfluss der Raumladung und dadurch auftretende Verluste zu minimieren. Beim räumlichen Zoom wird im speichernden Teil (IIa) wie auch im scannenden Teil (11b) durch zusätzliche Spannungen an den Elektroden der Röhre eine Rampe eingestellt, bei der jeweils ein Teil der Rampe zwischen Positionen (41) und (42) bzw. (45) und (46) sehr flach gehalten wird, um hier Ionen eines sehr kleinen Mobilitäts-Bereichs weit gespreizt voneinander zu speichern. Es können damit in diesem Mobilitätsbereich weit mehr Ionen gespeichert werden, da der Einfluss der Raumladung auf die Ionen unterdrückt wird. Dieses Verfahren wird in der US-amerikanischen Patentanmeldung 14/931,125 (M. A Park und O. Raether; „Spatial Zoom Mode for Accumulative Trapped Ion Mobility Spectrometry“, veröffentlicht als US 9,546,980 B1 ) genau beschrieben.
Die Berechnung der optimalen Verfahrensparameter für die Ionensignale von analytischem Interesse kann automatisch erfolgen, beispielsweise dann, wenn das Ionensignal in einer Massen-Mobilitäts-Übersicht des ersten Durchlaufs eine Überlagerungsstruktur erkennen lässt. Die erforderlichen Mobilitätsauflösungen für die Ionensignale von analytischem Interesse können auch, wenn vorhanden, aus Bibliotheken von Isomeren entnommen werden. Die Ionensignale von analytischem Interesse können in einer Liste der Ionensignale, die aus dem ersten Durchlauf gewonnen wurde, vermerkt werden. Es können aber die Ionensignale von Interesse einfach in einer Darstellung der Massen-Mobilitäts-Übersicht auf einem Bildschirm ausgewählt werden, indem die Ionensignale dort markiert werden, z.B. mit einem Kästchen eingerahmt werden. Dabei kann die Größe des Kästchens auch in die gewünschte Auflösung angeben.
Besteht ein Interesse an einer genauen Bestimmung der Mobilität Ko oder des Stoßquerschnitts σ einer Substanz, so kann man dem Substanzgemisch insbesondere für den zweiten (oder einem weiteren) Durchlauf des Verfahrens Referenzsubstanzen (Kalibriersubstanzen) genau bekannter Mobilität (oder genau bekannter Stoßquerschnitte) mit ähnlicher oder gleicher Masse und nur geringfügig anderer Mobilität hinzufügen. Die zeigt eine schematische Darstellung einer Massen-Mobilitäts-Übersicht, in der ein Analytsignal von besonderem Interesse (55) von zwei Kalibriersignalen (54) und (56) genau bekannter Mobilität umgeben sind, um in nachfolgenden Durchlauf mit einem zeitlichen Zoom die Mobilität des Analytsignals (55) genau bestimmen zu können. Es ist bevorzugt, mindestens zwei Referenzsubstanzen möglichst zu beiden Seiten des Ionensignals von analytischem Interesse hinzuzufügen, so dass man die Mobilität des Ionensignals und die der beiden Referenzsubstanzen in einem zeitlichen Zoom eines Mobilitätsscans messen kann. Aus dieser Messung lässt sich dann die Mobilität der Substanz mit hoher Genauigkeit und Präzision interpolieren. Für eine kalibrierte Messung können aber auch die bekannten Mobilitäten oder Stoßquerschnitte bereits identifizierter Substanzen des komplexen Substanzgemisches herangezogen werden.
Die in dargestellte Ionenquelle ist bevorzugt eine Elektrosprüh-Ionenquelle (ESI), der die Substanzen in flüssiger Form zugeführt werden; es können jedoch auch andere Ionisationsarten verwendet werden, wie z.B. Thermospray-Ionisation, Chemische Ionisation oder Photoionisation jeweils bei Atmosphärendruck nach Verdampfung der zugeführten Flüssigkeit oder Liquid Injection Field Desorption Ionization (LIFDI). Die Substanzen können der Ionenquelle aber auch in gasförmiger Form, z.B. durch Kopplung an einen Gaschromatographen, zugeführt werden, wobei die Ionisierung beispielsweise mittels Elektronenstoßionisation oder chemischer Ionisation erfolgen kann.
Die Substanzen können der Ionenquelle als gelöste Substanzen direkt durch eine Spritzenpumpe oder nach einer Auftrennung mittels Flüssigkeitschromatographie oder Elektrophorese zugeführt werden. Eine chromatographische Vortrennung kann dabei eine Stunde oder länger dauern und eine Vielzahl von Massen-Mobilitäts-Übersichten mit einigen Hunderttausend Ionensignalen liefern.
Werden die Substanzen des komplexen Gemischs chromatographisch oder elektrophoretisch aufgetrennt zugeführt, so erscheinen die zu einer Substanz gehörigen Ionensignale in den etwa sekündlich aufgenommenen Massen-Mobilitäts-Übersichten nur dann, wenn die Konzentration der Substanz eine Empfindlichkeitsschwelle überschritten hat. Die gibt einen konstruierten Ausschnitt aus einem LC-Chromatogramm von Sekunde 900 bis Sekunde 952 wieder, mit Substanzpeaks, die jeweils Halbwertsbreiten von 10 Sekunden haben. Die Linie (60) stellt die Empfindlichkeitsschwelle dar. Wird alle Sekunde eine Massen-Mobilitäts-Übersicht gemessen, dargestellt durch die gestrichelten Vertikallinien, so erscheint das Ionensignal für die gestrichelt eingezeichnete Substanz erstmalig zur Zeit t=929 s, und zwar mit der Intensität (61). In den darauffolgenden Massen-Mobilitäts-Übersichten steigt die Intensität dieses Ionensignals von (62) bis (68) an, wobei die Intensität (68) zu Beginn des Intensitätsmaximums liegt. Eine programmgesteuerte Analyse kann für jedes Ionensignal der Massen-Mobilitäts-Übersichten feststellen, wann das Maximum erreicht wird. Es ist dann möglich, für die Auswahl der Ionensignale, deren Fragment-Ionenspektren gemessen werden sollen (siehe ), nur Substanzen nahe am Maximum anzubieten. Das gleiche gilt auch für die Ionensignale, die einer Feinanalyse auf Isomere, Isobare oder Fast-Isobare unterzogen werden sollen.
Die kann bei Anwendung dieses Verfahrens zur Beschränkung auf die Maxima völlig neu gelesen werden: Die Ionensignale der Massen-Mobilitäts-Übersicht mögen nur diejenigen Ionensignale sein, die sich nahe an den Maxima der LC-Peaks befinden, und die nicht bereits in vorangegangenen Messzyklen identifiziert wurden. Dieses Verfahren hilft, die Massen-Mobilitäts-Übersichten für extrem komplexe Substanzgemische übersichtlicher zu machen.
Im Falle einer Vortrennung mittels Flüssigkeitschromatographie oder Elektrophorese ist eine Kalibration schwierig, da Kalibriersubstanzen gewöhnlich zu anderen Zeiten eluieren als die Analytsubstanzen. Es kann aber eine Kalibrationslösung zugemischt werden, idealerweise automatisiert.
Es sei hier noch angemerkt, dass häufig Serien von Analysen an Substanzgemischen durchgeführt werden, von denen bekannt ist, dass sie fast gleich zusammengesetzt sind und alle der gleichen analytischen Zielsetzung unterliegen. Ist für eine solche Art von Substanzgemisch ein Detailverfahren (zweiter Durchlauf) mit zufriedenstellenden Feinanalysen von Isomeren, Isobaren oder Fast-Isobaren aufgestellt, so ist es nicht unbedingt notwendig, den ersten Durchlauf durchzuführen. Ein einmalig durchgeführter erster Durchlauf kann dann als Grundlage für Analysen einer bestimmten Art von Substanzgemisch verwendet werden. Sollen mittels einer chromatographischen oder elektrophoretischen Trennung viele Proben mit etwa gleichartiger Zusammensetzung analysiert werden, beispielsweise immer in gleicher Weise auf das Auftreten bestimmter Isomere hin, so können die in ersten Trennungsdurchläufen einer ersten Probe gewonnenen und entwickelten Detailverfahren in den Trennungsdurchläufen weiterer Proben automatisch ablaufen, wobei die zu den gegebenen Retentionszeiten gehörigen Parameter verwendet werden. Es wird also vorgeschlagen, die Parameterveränderungen während der Durchläufe zu speichern und später für ähnliche Proben wieder zu verwenden.
Ist das Massenspektrometer mit Computern genügender Kapazität und genügender Schnelligkeit ausgestattet, und können entsprechende Programme bereitgestellt werden, so ist es möglich, die Messung von Massen-Mobilitäts-Übersichten, die Auswahl von Gruppen von Ionensignalen, die Messung der Fragment-Ionenspektren, die Auswahl von Ionensignalen von besonderem analytischem Interesse, die Messung von Zoom-Übersichten, und die Messung der Fragment-Ionenspektren der jetzt getrennten Ionensorten in einem einzigen LC-Durchlauf vollautomatisch vorzunehmen. Erfolgt die Auswahl der Ionensignale von Interesse mit Hilfe des Benutzers, so sind dazu mindestens zwei LC-Durchläufe erforderlich, wobei im zweiten LC-Durchlauf die Zoom-Übersichten gemessen werden.

Claims

Verfahren zur Analyse eines Substanzgemisches in einem Massenspektrometer, das ein Speicherionen-Mobilitätsseparator, einen Massenseparator, eine Fragmentierungszelle und einen Flugzeitanalysator umfasst, wobei eine erste Massen-Mobilitäts-Übersicht aufgenommen wird, Ionensignale aus der ersten Massen-Mobilitäts-Übersicht ausgewählt werden und nachfolgend Fragment-Ionenspektren von nach Mobilität und Masse selektierten Ionen der ausgewählten Ionensignale aufgenommen werden, dadurch gekennzeichnet, dass (a) eines der ausgewählten Ionensignale, dessen Fragment-Ionenspektrum und/oder die Substanzidentifizierung daraufhin untersucht wird, ob dieses Ionensignal von Interesse eine Überlagerung von Signalen verschiedener Ionensorten ist, die nicht ausreichend nach Massen oder Mobilität aufgelöst sind, und (b) ein zusätzliches Fragment-Ionenspektrum von nach Mobilität und Masse selektierten Ionen des Ionensignals von Interesse aufgenommen wird, wobei die Scangeschwindigkeit des Speicherionen-Mobilitätsseparators im Bereich des Ionensignals von Interesse so verringert wird, dass die nach Mobilität und Masse selektierten Ionen des zusätzlich aufgenommenen Fragment-Ionenspektrums zu denen des vorher aufgenommenen Fragment-Ionenspektrums eine kleinere Mobilitätsbandbreite ΔK aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zusätzliche Fragment-Ionenspektrum zur Substanzidentifizierung des Ionensignals von Interesse verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine zweite Massen-Mobilitäts-Übersicht aufgenommen wird, wobei die Scangeschwindigkeit im Bereich des Ionensignals von Interesse so verringert wird, dass in der zweiten Übersicht der Bereich um das Ionensignal von Interesse mit einer gegenüber der ersten Übersicht erhöhten Mobilitätsauflösung gemessen wird und die Mobilität oder der Stoßquerschnitt aus der zweiten Massen-Mobilitäts-Übersicht zur Substanzidentifizierung des Ionensignals von Interesse verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Signalbreite oder die Signalform des Ionensignals von Interesse oder beides darauf hin untersucht wird, ob es eine Überlagerung von Signalen verschiedenen Ionensorten ist.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Signalbreite oder die Signalform oder beides bezüglich einer Abweichung von der Signalbreite oder Signalform einer einzelnen Ionensorte untersucht wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Abweichung zwischen dem Ionensignal von Interesse und dem Ionensignal einer einzelnen Ionensorte entlang der Mobilitätsrichtung untersucht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass für die Auswahl des Ionensignals von Interesse aus den Ionensignalen der ersten Übersicht eine Auswahlliste verwendet wird, die bekannte Isomere oder Isomere von besonderem analytischem Interesse enthält.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswahlliste von der Art des Substanzgemisches abhängt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein Anwender das Ionensignal von Interesse in einer visuellen Darstellung der ersten Übersicht markiert.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Anwender das Ionensignal von Interesse in einer visuellen Darstellung der ersten Übersicht markiert und die Ausdehnung der Markierung in Richtung der Mobilität die Mobilitätsauflösung der zweiten Übersicht im Bereich des Ionensignals von Interesse vorgibt und die Scangeschwindigkeit im Bereich des Ionensignals von Interesse festlegt.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass Mobilitätsachse der ersten und/oder zweiten Übersicht kalibriert ist und die Mobilität oder der Stoßquerschnitt des Ionensignals von Interesse bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass für die Kalibrierung die bekannten Mobilitäten oder Stoßquerschnitte identifizierter Substanzen des Substanzgemisches verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass für die Kalibrierung die bekannten Mobilitäten oder Stoßquerschnitte von Referenzsubstanzen verwendet wird, die dem Substanzgemisch zugefügt werden.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass dem Substanzgemisch mindestens zwei Referenzsubstanzen zugefügt werden, die die Mobilität des Ionensignals von Interesse einschließen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Mobilitätswert oder der Stoßquerschnitt zur Identifizierung der Substanzkomponenten des Ionensignals von Interesse verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben durch einen Substanzseparator, insbesondere einen Flüssigkeitschromatographen, separiert und dem Massenspektrometer zugeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass ein Ionensignal in einer visuellen Darstellung einer Massen-Mobilitäts-Übersicht nur dann angezeigt wird oder ein Ionensignal von Interesse nur dann ausgewählt wird, wenn das Ionensignal das Maximum während der Substanzseparation erreicht hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren für eine Serie von gleichartigen Proben anhand einer ersten Probe detailliert ausgearbeitet und dann für die weiteren Proben in gleicher Weise verwendet wird.