DE102014008264A1

DE102014008264A1 - Isotopenmustererkennung

Info

Publication number: DE102014008264A1
Application number: DE102014008264.4A
Authority: DE
Inventors: c/o Thermo Fisher Scientific Hans (Brem Pfaff; Timothy James Stratton
Original assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Current assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Priority date: 2013-06-07
Filing date: 2014-06-06
Publication date: 2014-12-11
Anticipated expiration: 2034-06-07
Also published as: US20140361159A1; GB2514836A; CN104237364A; CN104237364B; GB201310174D0; DE102014008264B4; GB2514836B; US10658165B2

Abstract

Ein Maß der Häufigkeit wird für ein Element oder eine Elementkombination innerhalb einer Probe festgelegt, wobei das Element oder die Elementkombination wenigstens eine Isotopenvariante aufweist. Ein Isotopen-Massenspektralmuster wird für das Element oder die Elementkombination definiert, das eine erwartete Häufigkeit und erwartete Masse-zu-Ladung-Verhältnisdifferenz für jede Isotopenvariante anzeigt. Diese werden relativ zur jeweiligen Häufigkeit und zum Masse-zu-Ladung-Verhältnis eines Hauptisotops identifiziert. Das Isotopen-Massenspektralmuster wird mit Massenspektraldaten aus einer Molekülmassenanalyse der Probe verglichen, um Peakgruppen zu identifizieren, die jeweils mit dem Isotopen-Massenspektralmuster übereinstimmen. Ein Maß der Häufigkeit wird für das Element oder die Elementkombination als Funktion der Intensitätsmessung eines oder mehrerer Peaks von jeder der identifizierten Peakgruppen bestimmt.

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und System zur Bestimmung eines Maßes der Häufigkeit für ein Element oder eine Elementkombination innerhalb einer Probe, wobei das Element oder die Elementkombination wenigstens eine Isotopenvariante aufweist.
Hintergrund der Erfindung
Die Massenspektrometrie kann zur qualitativen und quantitativen Identifikation von Verbindungen in verschiedensten Proben verwendet werden, einschließlich Metabolomik, Proteomik, Pestizidanalyse, Identifikation natürlicher Substanzen, Pharmazeutika und vergleichbarer Gebiete. In derartigen Analysen wird insbesondere die Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC/MS) verwendet.
Auf diesem Gebiet wird häufig die Erkennung von Isotopenmustern für nützlich gehalten. Die Steuerung eines Massenspektrometers auf der Basis detektierter Isotopen-Fingerabdrücke (Muster im Massenspektrum) ist auch bekannt. Beispiele davon sind gezeigt in: Drexler, D. M. et al., "Automated Identifikation of Isotopically Labeled Pesticides and Metabolites by Intelligent 'Real Time' Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry using a Bench-top Ion Trap Mass Spectrometer", Rapid Commun. Mass Spectrom., 1998, 12, 1501–1507; Chernushevich, I. V. et al., "An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry", J. Mass Spectrom., 2001, 36, 849–865; Lock C. et al., "ICAT Labeled Protein Analysis via Automated Liquid Chromatography/Orthogonal MALDI QqTof", Proceedings of the 49th ASMS Conference an Mass Spectrometry and Allied Topics, May 27–31, 2001; und im US-7,189,964 .
Diese Techniken greifen oft auf starke Isotopensignale von Komponenten wie Chlor oder Brom zurück, wo der Beitrag zum gesamten Isotopenmuster von schweren Isotopen signifikant ist (> 30% für Chlor und > 80% für Brom). Ohne hohe Auflösung wird es schwierig, eine Feinstruktur im Spektrum zu trennen. Die Feinstruktur kann hier als Fähigkeit definiert werden, die Mitglieder der Nominalteile des Isotopenmusters (A1, A2, A3, etc.) in ihre Bestandteile zu trennen, die von den spezifischen Atomen beigetragen werden, welche die beobachtete Spezies ausmachen. Die geringen Massendifferenzen in den Isotopen von Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Chlor, Brom und anderen Atomen und deren Häufigkeiten (entweder natürlich oder artifiziell) sind die Quelle dieser Isotopen-Feinstruktur.
Die hochauflösende Massenspektrometrie wird üblicherweise zur Quantifizierung von Schadstoffen verwendet. Dies kann beispielsweise durch die Verwendung der Doppelfokussierungssektor-Massenspektrometrie vorgenommen werden. Die hohe Auflösung kann zwischen Peaks aus verschiedenen Quellen mit derselben Nominalmasse differenzieren. Ein Beispiel davon ist in der WO2010/025834 gezeigt, die sich in gemeinsamer Inhaberschaft mit der vorliegenden Erfindung befindet.
Neuere Entwicklungen haben begonnen, die hochauflösende Massenspektrometrie zu verwenden, um die Schwierigkeiten bei der Erkennung von Isotopenmustern zu überwinden. Das EP 2 128 791 diskutiert den Vergleich von Isotopenmustern mit simulierten Isotopenmustern, um eine Analyse der Elementzusammensetzung zu führen. Stoll, N. et al., "Isotope Pattern Evaluation for the Reduction of Elemental Compositions Assigned to High-Resolution Mass Spectral Data from Electrospray Ionization Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry", J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2006, 17, S. 1692–1699, diskutiert die Verwendung einer Isotopen-Feinstruktur zur Kürzung von Elementzusammensetzungs-Kandidatenlisten (siehe insbesondere 4 und S. 1696, Spalte 2). Auch ist die quantitative Isotopen-Feinstrukturanalyse ebenfalls in der Isotopenverhältnisanalyse bekannt, wenn auch vorherrschend mit dem Ziel der Vermeidung von Interferenzen. Dies ist im EP 1 770 779 gezeigt, insbesondere für geologische Anwendungen.
Zur Detektion von Metaboliten wird häufig eine sogenannte „Massendefektanalyse” oder „Kendrick-Massenanalyse” verwendet. Verschiedene Aspekte dieses Verfahrens werden im US-8,237,106 , US-8,063,357 , US-7,634,364 und US-7,381,568 diskutiert. Im Wesentlichen wird durch die Identifikation von Ionen mit einer bestimmten Klasse von exakten Massendefekten erwartet, metabolische Derivate bestimmter bekannter Substanzen einzufangen. Diese Verfahren verwenden direkt eine einzelne exakte Masse zur Identifikation von Mitgliedern einer Substanzklasse.
Alle dieser Ansätze (jedoch insbesondere der Ansatz des Isotopen-Fingerabdrucks und der Ansatz zum Filtern nach einem „Massendefekt”) sind auf die Identifikation der vollständigen Elementzusammensetzung einer Verbindung, eines Moleküls oder eines Fragments fokussiert. Obwohl der Ansatz des Massendefekts das Vorliegen einer einzelnen funktionellen Gruppe identifizieren kann, ist dies weiterhin auf die Analyse einzelner Moleküle begrenzt. Eine Analyse, die das gesamte Massenspektrum berücksichtigt, ist signifikant schwieriger.
Zusammenfassung der Erfindung
Vor diesem Hintergrund sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Maßes der Häufigkeit für ein Element oder eine Elementkombination innerhalb einer Probe vor, wobei das Element oder die Elementkombination wenigstens eine Isotopenvariante aufweist. Das Verfahren umfasst: Identifizieren eines Isotopen-Massenspektralmusters für das Element oder die Elementkombination, welches Isotopen-Massenspektralmuster eine erwartete Häufigkeit und erwartete Masse-Ladung-Verhältnisdifferenz für jede der einen oder mehreren Isotopenvarianten anzeigt, wobei die erwartete Häufigkeit und erwartete Masse-zu-Ladung-Verhältnisdifferenz relativ zur jeweiligen Häufigkeit und zum Masse-zu-Ladung-Verhältnis eines Hauptisotops des Elements oder der Elementkombination identifiziert wird; Vergleichen des Isotopen-Massenspektralmusters mit Massenspektraldaten aus einer Molekülmassenanalyse der Probe, welche Massenspektraldaten eine Vielzahl von Peaks umfassen, wobei jeder Peak eine Intensitätsmessung für ein jeweiliges Masse-zu-Ladung-Verhältnis anzeigt, welches Vergleichen eine Vielzahl von Peakgruppen identifiziert, die jeweils mit dem Isotopen-Massenspektralmuster übereinstimmen; und Bestimmen eines Maßes der Häufigkeit für das Element oder die Elementkombination als Funktion der Intensitätsmessung eines oder mehrerer Peaks von jeder der identifizierten Vielzahl von Peakgruppen.
So kann die Erfindung ein allgemeines, effizientes und zuverlässiges Verfahren zur Identifikation von Mitgliedern einer bestimmten Substanzklasse in großen Datensätzen vorsehen. Die Detektion von Komponenten in einem komplexen Strom von Massenspektrometriedaten kann (zumindest teilweise) durch die Anwendung einer Isotopensuche erzielt werden, die das Isotopen-Feinmuster verwendet, das aus Messungen mit sehr hoher Auflösung verfügbar ist. Messungen mit hoher (beispielsweise Auflösungsvermögen, RP, > 50.000, 70.000 oder 100.000 bei Masse 400) oder ultrahoher Auflösung (beispielsweise RP > 150.000, 200.000, 240.000 bei Masse 400) und genauer Masse (beispielsweise < 3 ppm mit externer Kalibrierung) können erzielt werden. Die Isotopen-Feinmustererkennung kann dann ein leistungsstarkes Werkzeug sein, um die Identifikation kleiner Moleküle zu bestätigen und zu unterstützen. Das Hauptisotop ist typischerweise das häufigste, das muss jedoch nicht unbedingt so sein. In einigen Fällen kann es das Isotop mit der geringsten Masse sein. Anstelle des Erzielens eines echten „molekularen” Fingerabdrucks analysiert die Erfindung die Feinstruktur, um Peakgruppen zu identifizieren, die für ein bestimmtes Element charakteristisch sind. Dies kann die Feinheiten und Schwierigkeiten eliminieren, die mit dem Versuch assoziiert sind, Peaks mit herkömmlichen Techniken miteinander zu gruppieren.
Die gewünschte Auflösung kann abhängig sein von dem Element oder der Elementkombination (wie einer funktionellen Gruppe, beispielsweise einigen Elementen in einer festgelegten Menge oder einem charakteristischen Paar, beispielsweise ¹³C + ¹⁵N, oder Ähnlichem), das bzw. die zu untersuchen ist, und anderen (möglicherweise interferierenden) Elementen, die in der Probe vorliegen. Das spezifische Muster kann das Ergebnis eines oder mehrerer Elemente sein, die zum gesamten beobachteten Muster beitragen. Zusätzlich oder alternativ dazu kann das spezifische Muster das Ergebnis natürlicher Häufigkeiten oder artifiziell induzierter Häufigkeiten sein (beispielsweise durch stabile oder Radiomarkierung von Verbindungen). In einer Variation der Erfindung kann der Schritt des Vergleichens eine einzelne Peakgruppe identifizieren, die mit dem Isotop-Massenspektralmuster übereinstimmt; und der Schritt der Bestimmung eines Maßes der Häufigkeit für das Element oder die Elementkombination kann als Funktion der Intensitätsmessung eines oder mehrerer Peaks von der identifizierten Peakgruppe durchgeführt werden.
Die Erfindung kann zur gezielten und ungezielten qualitativen Identifikation von Verbindungen in verschiedensten Proben anwendbar sein, einschließlich Metabolomik, Proteomik, Pestizidanalyse, Identifikation natürlicher Substanzen, Pharmazeutika und vergleichbarer Gebiete.
Hinsichtlich der Feinstruktur haben bestehende Ansätze dazu tendiert, die Analyse von allem anderen als dem Hauptisotop zu vermeiden. Eine hochauflösende Massenanalyse kann das Ausmaß der Feinstruktur verbessern, das identifiziert werden kann. Die hohe Auflösung kann mit Bezugnahme auf die Anzahl signifikanter Stellen nach dem Dezimalzeichen in m/z verstanden werden (beispielsweise wenigstens 4). Typischerweise ist ein Auflösungsvermögen von 70.000 zweckmäßig, 200.000 wird bevorzugt (beispielsweise zur Trennung von ¹⁵N und ¹³C an der Position A1), und 250.000 RP (alle bei m/z 400) wird mehr bevorzugt (was genug sein kann, um die Isotopen-Feinstruktur in den meisten „kleinen” Molekülen der Masse 50 bis 600 Da vollständig aufzulösen). Gegebenenfalls wird jedoch ein Auflösungsvermögen (bei m/z 400) berücksichtigt von wenigstens einem von: 30.000; 50.000; 70.000; 100.000; 150.000; 200.000; 250.000; und 300.000. Geeignete Massenanalysatoren können umfassen: einen Doppelfokussierungssektor-Analysator; einen FT-ICR-Analysator; einen Orbital-Trapping-Analysator; und einen Flugzeit(TOF)-Analysator, einschließlich eines Mehrfachreflexions-TOF.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren ferner das Vornehmen einer Molekülmassenanalyse der Probe, um so die Massenspektraldaten vorzusehen. Gegebenenfalls kann das Verfahren das Bestimmen einer Mindestauflösung für die Massenspektraldaten auf der Basis des identifizierten Isotopen-Massenspektralmusters umfassen. Vorzugsweise umfasst das Verfahren ferner das Steuern eines Massenanalysators, um die Molekülmassenanalyse vorzunehmen und dadurch die Massenspektraldaten vorzusehen, um wenigstens die bestimmte Mindestauflösung zu erzielen. In besonderen Ausführungsformen kann dies den Schritt des Vornehmens der Molekülmassenanalyse umfassen, die durchgeführt wird, um wenigstens die bestimmte Mindestauflösung zu erzielen. Auf diese Weise kann die gewünsche Auflösung, die abhängig sein kann von dem Element oder der Elementkombination, das bzw. die zu untersuchen ist, und anderen (möglicherweise interferierenden) Elementen, die in der Probe vorliegen, festgelegt werden, bevor die Molekülmassenanalyse der Probe durchgeführt wird. Dann kann die Molekülmassenanalyse der Probe gemäß der bestimmten Mindestauflösung durchgeführt werden.
Vorteilhaft umfasst das Verfahren ferner das Wiederholen der Schritte des Vergleichens und Bestimmens für jede einer Vielzahl von Proben, um so eine Vielzahl von Maßen der Häufigkeit für das Element oder die Elementkombination vorzusehen, wobei jedes Maß der Häufigkeit für eine jeweilige Probe der Vielzahl von Proben dient. In den bevorzugten Ausführungsformen wird die Vielzahl von Proben generiert durch eine von: Chromatographie (beispielsweise Gaschromatographie, Flüssigchromatographie, Ionenchromatographie oder superkritischer Fluidchromatographie); und bildgebender Ionisierung (beispielsweise unter Verwendung von MALDI oder SIMS). Vorteilhaft wird die Vielzahl von Proben generiert in einem oder in beiden von: einem Bereich unterschiedlicher Zeiten und einem Bereich unterschiedlicher Raumpositionen (die zweidimensionale und dreidimensionale Positionen umfassen können, beispielsweise mit einem Tiefenprofil). In den meisten derartigen Fällen wird die Vielzahl von Proben in einem Bereich unterschiedlicher Zeiten generiert, auch wenn sie sich auf einen Bereich unterschiedlicher Raumpositionen beziehen.
Die Erfindung kann besonders nützlich sein zur Identifikation aller Substanzen in einem Massenchromatogramm (oder einer ähnlichen Technik, bei der eine Vielzahl von Proben analysiert wird), die ein bestimmtes Element oder eine Elementkombination enthalten. Bestehende Techniken sind auf das gesamte Molekül fokussiert und auf die Analyse der vollständigen Elementzusammensetzung des Moleküls (oder MS/MS Fragments) begrenzt. Diese neue Technik vermeidet die Notwendigkeit, die vollständige Elementzusammensetzung zu kennen, um das Element oder die Elementkombination quer über mehrfache Moleküle zu identifizieren, die in derselben Probe vorliegen.
Insbesondere kann die Bestimmung eines Maßes der Häufigkeit helfen, zwei Fragen zu beantworten: das Finden aller Komponenten im Chromatographiedurchlauf, die irgendein spezifiziertes Isotopen-Feinmuster enthalten, das beispielsweise das Vorliegen einer Anzahl von Atomen von S, N, Cl, O, etc., oder das Vorliegen eines spezifischen Feinmusters von irgendeiner Kombination der genannten Beispielatome (wie 1Cl und 2S) umfassen kann; und aus dem gemessenen Isotopenmuster und der Feinstruktur kann das Umgekehrte angewendet werden, so dass die angeführten gleichen Toleranzen und Berechnungen verwendet werden können, um zu bestimmen, wie viele solcher Atome (S, Cl, N, O, etc.) in einer beliebigen Komponente enthalten sind.
Die Erfindung verwendet vorzugsweise eine Isotopen-Fingerabdrucktechnik (wobei das Isotopen-Massenspektralmuster mit den Massenspektraldaten verglichen wird). Diese Technik kann auf verschiedensten Wegen implementiert werden. In einigen Ausführungsformen umfasst der Schritt des Vergleichens das Identifizieren eines der Peaks der Massenspektraldaten als Hauptpeak. Der Hauptpeak ist typischerweise der häufigste, muss es jedoch nicht unbedingt sein. In einigen Fällen kann es der Peak mit der geringsten Masse sein. Vorzugweise umfasst dieser Schritt ferner: für jede Isotopenvariante vom Isotopen-Massenspektralmuster, Identifizieren eines jeweiligen Variantenpeaks der Massenspektraldaten mit einer Intensität relativ zu jener des Hauptpeaks und der Masse-zu-Ladung-Verhältnisdifferenz zu jener des Hauptpeaks, die der erwarteten Häufigkeit und dem erwarteten Masse-zu-Ladung-Verhältnis der jeweiligen Isotopenvariante vom Isotopen-Massenspektralmuster entsprechen. Dann können der Hauptpeak und jeder der jeweiligen Variantenpeaks eine Peakgruppe aus der Vielzahl von Peakgruppen definieren. Die Peakgruppe kann daher als mit dem Isotopen-Massenspektralmuster übereinstimmend angesehen werden (Fingerabdruck).
Es ist zu beachten, dass bestehende Isotopenmustersuchen allgemein auf „grobe” Muster beschränkt waren, welche aus äußerst häufigen Spezies wie ³⁵Cl/³⁷Cl und ⁷⁹Br/⁸¹Br entstehen, die stark genug sind, um gegen die Beiträge zur Intensität von schweren Isotopen von Schwefel, Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, etc., mit niedrigerer Häufigkeit für Anwendungen kleiner Moleküle resistent zu sein. Die Erfindung nützt die Fähigkeit genauer Massedaten mit sehr hoher Auflösung, um die Kontributoren des Isotopenmusters zu trennen und sie einzeln zu beobachten. Die Erfindung sieht ein Mittel vor, um nach sehr spezifischen Elementzusammensetzungen zu suchen, das früher nicht verfügbar war. Nun werden spezifische Details des Verfahrens zur Bestimmung einer Übereinstimmung (Entsprechung) in Ausführungsformen diskutiert.
In Ausführungsformen wird die Intensität des Variantenpeaks relativ zu jener des Hauptpeaks als der erwarteten Häufigkeit der Isotopenvariante entsprechend definiert, wenn die relative Intensität des Variantenpeaks und die erwartete Häufigkeit der Isotopenvariante gleich sind oder sich um nicht mehr als eine vorherbestimmte Variation unterscheiden. Vorzugsweise wird die vorherbestimmte Variation durch die Messung der Variation von Signalen innerhalb des Massenanalysators festgelegt, der die Massenspektraldaten vorgesehen hat. Die Messung eines Ionensignals kann von Scan zu Scan variieren, als Ergebnis der Messvariation von Signalen innerhalb des Massenspektrometers, die aus Quellen wie einem Einströmen von Ionen von der Quelle und der Detektorreaktion entstehen. Diese Variation gemessener Intensitäten einzelner Signale kann die Fingerabdruckübereinstimmung beeinträchtigen, indem die gemessene Intensität von jener wegbewegt wird, die von diesem Spektralmuster erwartet wird. Die vorherbestimmte Variation ist ein Toleranzwert, der ein kleines Variationsfenster rund um jede beobachtete Intensität gestattet.
Zusätzlich oder alternativ dazu wird die Masse-zu-Ladung-Verhältnisdifferenz von jener des Hauptpeaks als entsprechend der erwarteten Masse-zu-Ladung-Verhältnisdifferenz der Isotopenvariante identifiziert, wenn die Masse-zu-Ladung-Verhältnisdifferenz des Variantenpeaks und die erwartete Masse-zu-Ladung-Verhältnisdifferenz der Isotopenvariante gleich sind oder sich um nicht mehr als eine vorherbestimmte Toleranz unterscheiden. Die vorherbestimmte Toleranz (die in Teilen pro Million, ppm, gemessen werden kann) kann eine kleine Variation in der gemessenen Masse gestatten. Vorzugsweise ist die vorherbestimmte Toleranz eine Funktion des Masse-zu-Ladung-Verhältnises des Hauptpeaks und eines konstanten Toleranzwerts, bevorzugter ein Produkt der vorherbestimmten Masse und des konstanten Toleranzwerts. Andere Faktoren tragen gegebenenfalls auch zur vorherbestimmten Toleranz bei.
In einigen Ausführungsformen umfasst der Schritt des Vergleichens ferner die Bestimmung eines Signal-Rausch-Verhältnisses für die Peakgruppe. Dann kann der Schritt des Vergleichens ferner das Festlegen eines erwarteten Signal-Rausch-Verhältnisses für jede Isotopenvariantee vom Isotopen-Massenspektralmuster umfassen, durch das Kombinieren des für die Peakgruppe bestimmten Signal-Rausch-Verhältnisses mit der erwarteten Häufigkeit der jeweiligen Isotopenvariante. In diesem Fall kann der Schritt des Identifizierens eines jeweiligen Variantenpeaks der Massenspektraldaten vom erwarteten Signal-Rausch-Verhältnis für die Isotopenvariante abhängig sein, die dem Variantenpeak entspricht, der wenigstens ein Schwellenwert ist. Gegebenenfalls ist der Schwellenwert 1. Das Ignorieren von Peakgruppen mit einem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis vermeidet Fehler, so dass das vorherbestimmte Maß der Häufigkeit als Mindestniveau angesehen werden kann.
Vorteilhaft umfasst der Schritt der Bestimmung des Maßes der Häufigkeit das Kombinieren einer Intensitätsmessung für einen oder mehrere der Variantenpeaks jeder Peakgruppe aus der Vielzahl von identifizierten Peakgruppen. Dies kann gestatten, dass das bestimmte Maß alle Peakgruppen reflektiert, die quer über das Massenspektrum identifiziert wurden. In der bevorzugten Ausführungsform umfasst der Schritt des Kombinierens das Summieren der Intensitätsmessung für einen oder mehrere der Variantenpeaks jeder Peakgruppe aus der Vielzahl von identifizierten Peakgruppen.
Gegebenenfalls umfasst der Schritt des Kombinierens: Bestimmen eines Gewichts für jede identifizierte Peakgruppe, wobei das Gewicht anzeigt, wie viele von dem Element oder der Elementkombination in einem Molekül einer Verbindung vorliegen, die der identifizierten Peakgruppe entspricht. Die Anzahl von Elementen oder Elementkombinationen, die in der Verbindung vorliegen, kann bestimmt werden, und dies kann demgemäß als Gewicht für den einen oder mehrere Peaks der identifizierten Peakgruppe verwendet werden. Eine Peakgruppe kann gegebenenfalls mehr als ein Gewicht aufweisen, wobei jedes Gewicht für einen jeweiligen Peak der Peakgruppe spezifisch ist.
In solchen Fällen kann der Schritt des Kombinierens ferner umfassen: Multiplizieren der Intensitätsmessung für einen oder mehrere der Variantenpeaks jeder Peakgruppe aus der Vielzahl von identifizierten Peakgruppen mit dem für die jeweilige Peakgruppe bestimmten Gewicht. Vorzugsweise umfasst der Schritt des Kombinierens ferner: Summieren der mit den Gewichten multiplizierten Intensitätsmessungen.
Zusätzlich oder alternativ dazu umfasst das Verfahren ferner: Multiplizieren des für jede der Vielzahl von Peakgruppen bestimmten Gewichts mit einer Nominalmasse für das Element oder die Elementkombination. Dann kann das Verfahren ferner umfassen: Festlegen einer Wahrscheinlichkeitshöhe für die Peakgruppe auf der Basis der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse für Peaks der Peakgruppe und des mit der Nominalmasse für die Peakgruppe multiplizierten Gewichts. Vorteilhaft umfasst das Verfahren ferner das Bestimmen beliebiger Peakgruppen, für welche die festgelegte Wahrscheinlichkeitshöhe unter einer Schwelle liegt. Dann kann der Schritt des Kombinierens keine Intensitätsmessungen für jene Peakgruppen kombinieren, für welche die festgelegte Wahrscheinlichkeitshöhe als unter der Schwelle bestimmt wird. Dies kann gestatten, dass identifizierte Peakgruppen, die klar fehlerhaft sind, verworfen werden (jene, für die das Masse-zu-Ladung-Verhältnis des Peaks geringer ist als die Nominalmasse, die für das Element oder die Elementkombination bestimmt wurde, welches bzw. welche angenommenerweise in dem Molekül vorliegt, das dem Peak entspricht).
In einigen Ausführungsformen können die Massenspektraldaten unter Verwendung einer Tandemmassenspektrometrie oder unter Verwendung einer MSⁿ generiert werden, die von einer Gesamtionenfragmentierung kommen kann oder ansprechend auf eine vorhergehende Detektion eines spezifischen Elements während der Erfassung der Massenspektraldaten ausgelöst werden kann. Gegebenenfalls kann das Verfahren ferner umfassen: Identifizieren von einer Elementzusammensetzung, -struktur oder beidem.
In Ausführungsformen kann das Verfahren ferner umfassen: Vergleichen des bestimmten Maßes der Häufigkeit mit einem oder mehreren von: einem bestimmten Maß der Häufigkeit für eine Kontrollprobe; und einem vorherbestimmten Maß der Häufigkeit für andere Elemente einer Zeitserie von Proben. Eine Zeitserie von Proben können Proben sein, die derselben Einzelperson oder demselben Pool zu unterschiedlichen Zeiten nach der Verabreichung eines Pharmazeutikums abgenommen wurden.
In einem weiteren Aspekt wird ein Computerprogramm vorgesehen, das konfiguriert ist, wenn es von einem Prozessor betrieben wird, das Verfahren wie hier beschrieben durchzuführen. Dies kann unter Verwendung einer beliebigen Form einer Steuerlogik, Digitallogik, programmierbaren Logik oder anderen Verarbeitungstechnologie implementiert werden. Das Computerprogramm kann beispielsweise verwendet werden, um bestehende Massenspektraldaten zu analysieren. Zusätzlich oder alternativ dazu kann die Steuerung eines Massenspektrometers (oder nur eines Teils davon) unter Verwendung des Computerprogramms möglich sein.
In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung ein Massenspektrometriesystem vor, umfassend: einen Massenanalysator, der konfiguriert ist, Massenspektraldaten für eine Probe vorzusehen; und einen Prozessor, der konfiguriert ist, das Verfahren wie hier beschrieben unter Verwendung der vom Massenanalysator vorgesehenen Massenspektraldaten durchzuführen. Es ist ferner klar, dass die Vorrichtung oder Strukturmerkmale, die konfiguriert sind, einen beliebigen der hier beschriebenen Verfahrensschritte durchzuführen, auch vorgesehen werden können.
Außerdem wird auch eine Kombination beliebiger bestimmter Merkmale von innherhalb eines Aspekts oder zwischen Aspekten vorgesehen, auch wenn nicht ausdrücklich geoffenbart.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung kann auf verschiedensten Wegen praktiziert werden, von denen nun einer als bloßes Beispiel und mit Bezugnahme auf die beigeschlossenen Zeichnungen beschrieben wird, in denen:
1 eine schematische Darstellung eines beispielhaften bekannten Systems zeigt, unter Verwendung dessen eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung implementiert werden kann;
2 ein Beispiel einer Benutzerschnittstelle zur Steuerung einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;
3 ein weiteres Beispiel der Benutzerschnittstelle von 2 veranschaulicht;
4 ein zweites Beispiel einer Benutzerschnittstelle zur Steuerung einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;
5 einen ersten Satz von Beispielergebnissen von einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt;
6 einen zweiten Satz von Beispielergebnissen von einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt; und
7 einen dritten Satz von Beispielergebnissen von einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
Detaillierte Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform
Vor dem Vorsehen eines spezifischen praktischen Beispiels für den Betrieb einer Ausführungsform der Erfindung wird zuerst eine Ausführungsform der Erfindung in allgemeiner Hinsicht beschrieben. Die Erfindung verwendet ein Massenspektrometer, das typischerweise umfasst: eine Ionenquelle; einen Massenanalysator; einen Detektor; und ein Verarbeitungssystem. Das Verarbeitungs(Computer)-system empfängt einen Detektorausgang und verwendet diesen, um ein Massenspektrum zu generieren. Das Verarbeitungssystem steuert normalerweise auch das Massenspektrometer. Die Erfindung bezieht sich auf die Verarbeitung (und Generierung) der Massenspektraldaten, die verwendet werden, um ein Massenspektrum vorzusehen.
Übersicht über die Ausführungsform
Bevor der Prozess beginnt, wird vom Benutzer (oder von einem abrufenden Software-Paket, das am Computersystem läuft) ein Analyseziel definiert. Dies ist die Sammlung von Informationen über das Vorliegen und die Menge eines bestimmten Elements oder einer Kombination von Elementen. Das Element kann beispielsweise Schwefel oder Chlor sein.
In einem ersten Schritt wird die Isotopensignatur für dieses einzelne Element oder die Kombination bestimmt. Der Einfachheit halber wird der Rest dieser Offenbarung auf den Fall fokussiert, wo ein einzelnes Element ausgewählt wird, es ist jedoch leicht verständlich, dass dies ausgedehnt werden kann, um eine Kombination von Elementen abzudecken. Der exakte Massenabstand für die Isotope des Zielelements wird bestimmt. Zusätzlich werden die Isotopenverhältnisse zur späteren Verwendung bestimmt. Diese können auf der Basis gespeicherter Nachschlagtabellen bestimmt, berechnet oder auf andere Weise festgelegt werden.
In einem zweiten Schritt werden die Massenspektraldaten für Peaks gesucht, die im Abstand mit der bestimmten exakten Massendifferenz vorliegen. Beispielsweise sind diese: ein sogenannter „Monoisotopen” peak (ein Hauptpeak, manchmal auch „M” oder „A0” genannt); und ein bestimmter exakter Masseteil eines „M + x” (oder Ax) Peaks (wobei x eine Zahl ist), bei einer Nominalmasse, die um x mehr ist als M, die jedoch exakt mit dem im ersten Schritt bestimmten Massenabstand übereinstimmen sollte. Die exakte Massendifferenz (die etwa eine ganze Zahl ist für einzeln geladene Ionen, und für doppelt geladene Ionen entweder eine ganze Zahl oder die Hälfte einer ganzen Zahl ist) ist vom Element abhängig. Für Schwefel kann dies beispielsweise der „M + 2” (oder A2) Peak sein.
Der Monoisotopenpeak ist normalerweise der Peak, der die geringste Masse innerhalb des Isotopenclusters der Verbindung aufweist. Dieser Peak kann das leichteste Isotop aller Elemente in der Verbindung enthalten, und daher wird kein weiterer Peak, der zu derselben Verbindung gehört, bei dieser (Nominal-)Masse erwartet.
Die Identifikation von Peaks an der M + 1 und M + 2 Position ist normalerweise nicht so einfach wie für den Monoisotopenpeak. Eine typische organische Verbindung (die vom Vorliegen von Wasserstoff, Kohlenstoff, Sauerstoff und Stickstoff dominiert wird, in Abhängigkeit von der Verbindungsklasse ungefähr in dieser Reihenfolge des Auftretens der Zahlen) kann einige unterschiedliche Isotopenzusammensetzungen beim M + 1 und üblicherweise sogar mehr beim M + 2 und bei Peaks höherer Ordnung aufweisen. Sogar eine extrem einfache Substanz wie Methan (CH₄) kann bereits zwei Signale bei M + 1 aufweisen, wobei eines ¹³C₁H₄ (m/z = 17,0341) repräsentiert und eines ¹²C²H₁1H₃ (m/z = 17,0370) repräsentiert.
So wird vorzugsweise auch die Massenspektralauflösung bestimmt, die erforderlich ist, um den zweiten Peak ohne Interferenz von anderen Massen für eine durchschnittliche Verbindung bei derselben Masse zu beobachten. Diese Auflösung kann von der Masse und dem berücksichtigten Pool von Elementen sowie vom Zielelement abhängig sein. Gegebenenfalls wird die Auflösung vor der Datenerfassung oder während der Datenerfassung bestimmt, so dass die gewünschte Analyse aus den aufgezeichneten Daten möglich sein kann. Typischerweise wird ein Mindestauflösungsvermögen bestimmt, und das Spektrometer wird betrieben, um wenigstens ein solches Mindestauflösungsvermögen quer über einen Massenbereich von Interesse vorzusehen. Dies kann die Anforderungen vermeiden, ein Auflösungsvermögen im Voraus präzise zu kennen und das Spektrometer präzise zu steuern, um bei diesem Auflösungsvermögen zu arbeiten.
In einem dritten Schritt wird eine generalisierte Häufigkeitsquantität aus den gefundenen Peakpaaren bestimmt. Die berechnete Quantität ist nicht unbedingt relativ zu einer bestimmten einzelnen Substanz, sondern stattdessen zu einem bestimmten Element oder einer Kombination (Gruppe) von Elementen. Im einfachsten Fall wird eine derartige Massenquantität einfach durch das Addieren aller Peaks erzeugt, die mit dem Distanzkriterium aus einem Spektrum übereinstimmen. Dies kann für mehrfache Spektren erweitert werden, wobei jedes Spektrum zu einer Massenquantität führt. Die mehrfachen Spektren können unter Verwendung des Ausgangs einer Chromatographie oder Ergebnisdatensatzes einer bildgebenden Massenspektrometrie generiert werden. Dann können die einzelnen Massenquantitäten jeweils einen Punkt einer Spur bilden. Die Massenquantitäten, welche die Spur bilden, können aus allen Spektren oder aus einer Auswahl von Spektren ausgewählt werden (beispielsweise nur Spektren, die mit einer bestimmten Einstellung erfasst wurden, wie einem bestimmten Massenbereich, einem bestimmten Fragmentierungsverfahren oder einer Energie, einer bestimmten Polarität, etc.). Diese Spur kann in der Zeit aufgetragen werden (für das Chromatographiebeispiel), um eine Element- oder Elementkombinationsspur vorzusehen, wie eine Schwefelspur.
Einige optionale, zusätzliche Teile für die Ausführungsform können das Folgende umfassen.

1. Das Isotopenverhältnis der (wenigstens) zwei Peaks, die zur Extraktion von Daten verwendet werden, wird evaluiert, um: (a) die Anzahl von in der Verbindungen vorliegenden Elementen zu bestimmen und die Daten entsprechend zu gewichten (beispielsweise mit einem Gewicht, w, gleich der Anzahl von Elementen); und/oder (b) eine Konsistenzprüfung an den Daten vorzunehmen. Unter Verwendung des Beispiels von Schwefel könnte, nach dem Finden eines A2 Peaks mit 9% der Intensität des A0 Peaks, eine Datenevaluierungs-Software ein Gewicht von w = 2 bestimmen und die Intensität des Peakpaars mit 2 multiplizieren, bevor sie mit der Intensität von den anderen Peaks in demselben Spektrum addiert wird. Zusätzlich oder alternativ dazu wird, beim Finden eines A2 Peaks mit 120% der Intensität des A0 Peaks, die Wahrscheinlichkeit, p, dass viele Schwefelatome (angenommen 20) in einem Molekül mit einer Masse A0 vorliegen, bestimmt. In diesem Fall gilt beispielsweise p = 0 für alle Massen unter 640, und ein Peak einer niedrigeren Masse als dieser Wert könnte als fehlerhaft angesehen und zur Konstruktion der Schwefelspur außer Acht gelassen werden.
2. Wenn mehr als zwei Peaks zur Evaluierung verwendet werden könnten (beispielsweise M + 0,99939 und M + 1,99580 für Schwefel), könnten der zweite Peak oder zweite und weitere Peaks für die Konsistenzprüfung und Korrektur verwendet werden.
3. Zusätzlich oder alternativ zum Anzeigen einer Summe aller gefundenen Element-(oder Elementkombinations-)intensitäten könnte die Anzeige mit zugrundeliegenden Informationen versehen werden. Beispielsweise kann ein Chromatogramm oder Bild Peaks (das heißt lokale Maxima) aufweisen, die beispielsweise versehen sind mit der Anzahl von Massen im Spektrum, die zur Intensität des Peaks beitragen, der Anzahl von Elementen (wie Schwefelatomen) in diesem Peak, mit der wahrscheinlichsten Elementzusammensetzung des Isotopenmusters, welches das Massenspektralsignal enthält, das zum Peak beiträgt (siehe beispielsweise EP-2 128 791 ), mit einer Verknüpfung zum zugrundeliegenden Massenspektrum oder zu den Massenspektren, der interpolierten Zeit des Maximums in der Spur, co-eluierenden Substanzen, etc. Die Anzeige kann interaktiv sein, wobei der Benutzer beispielsweise einen Mauszeiger über die Daten bewegen oder einen Bereich markieren muss.
4. Massenspektralpeaks, die zusammen gehören und zu dem Paar, das unter Verwendung des Elementkriteriums gefunden wurde, könnten beispielsweise unter Verwendung des im EP-2 322 922 beschriebenen Verfahrens extrahiert werden.
5. Andere optionale Aktivitäten können umfassen: Glätten der extrahierten Element-(oder Elementkombinations-)spur; Entfernung von Ausreißern; und automatische Erzeugung von „Standardspuren” (wie S, Br, Cl).

Der folgende Punkt ist zu beachten. Durch das Zurückgreifen auf die exakten Massenpaare ist die vollständige Sammlung aller Isotope, die zu einer Substanz gehören, implizit. Jede Elutionszeit oder -heuristik, die auf einem „wahrscheinlichen Muster” basiert, ist rein optional. Beispielsweise gilt für ein ¹³C³²S + ¹³C³⁴S Paar dieselbe Logik wie für das „originale” ¹²C³²S + ¹²C³⁴S Paar. Beide werden extrahiert, vorausgesetzt sie haben ausreichende Signal-Rausch-Verhältnisniveaus.
Es gibt zwei Ansätze zur Handhabung von Elementhäufigkeiten. In einem ersten Ansatz werden zwei Auftreten eines Elements in einer Verbindung getrennt von einem einzelnen Auftreten behandelt. Beispielsweise wird das Muster für Verbindungen, die ein einzelnes Schwefelatom (XS1) umfassen, getrennt vom Muster für Verbindungen gesucht, die zwei Schwefelatome (XS2) umfassen. Ähnlich wird eine getrennte Suche nach Verbindungen durchgeführt, die drei Schwefelatome (XS3) umfassen, usw. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um alle Fälle eines bestimmten Elements mit besonderen Charakteristiken herauszufinden. Beispielsweise kann er verwendet werden, um Verbindungen zu finden, die exakt ein ¹⁴C oder exakt drei ¹³C enthalten. Die Daten werden effektiv direkt auf die m/z Differenz gefiltert, um mit dem vorgeschriebenen Isotopenverhältnis für das Element von Interesse anfänglich übereinzustimmen. In einem zweiten Ansatz erfolgt ein anfänglicher Filterschritt nach Masse, nur in einem weiteren Sinn. Dann wird folglich die Zahl des Elements oder der Elementkombination von Interesse in jedem Molekül bestimmt. Dies kann flexibler sein, steigert jedoch möglicherweise die Komplexität.
So gestattet die Ausführungsform: die Verwendung des Isotopen-Feinmusters, das mit hoher Auflösung verfügbar ist, und von Daten mit hoher Massengenauigkeit, um mehr erweiterte Isotopensuchen vorzunehmen; die Verwendung mehrfacher Signale, die für eine gleichzeitige Isotopenmustersuche kombiniert werden; und die Fähigkeit, sowohl nach natürlichen Häufigkeiten oder artifiziell induzierten (stabilen oder radiomarkierten) Mustern zu suchen. Der klassische „Isotopenmuster”-Ansatz wird auch durch den Feinstruktur-Ansatz ersetzt, der spezifische bestimmte exakte Massendifferenzen zwischen einem ersten und zweiten Peak unter Verwendung einer hohen Auflösung berücksichtigt, um direkt nach Element durch ihren Isotopenabstand zu suchen. Die durch die hohe Auflösung generierte Spezifität entfernt eine Interferenz von anderen Isobaren.
Bestehende Isotopen-Fingerabdrucktechniken verwenden typischerweise Massen und Intensitäten, erfordern jedoch, dass ein vollständiges molekulares Isotopenmuster simuliert und verglichen wird, um eine Übereinstimmung zu erzielen. Tatsächlich wurden typischerweise absolute Massen im Gegensatz zu relativen Massen verwendet. Die Verwendung relativer Massendifferenzen kann jedoch vorteilhaft sein. Beispielsweise kann ein Peak eines Hauptisotops (A0) mit einem weiteren Peak in einer Distanz der Differenz zwischen ¹⁴N und ¹⁵N klar das Vorliegen von Stickstoff in der Verbindung bedeuten. Dann kann daher die Intensität des Signals an der A1 Position (ein Peak mit einer Nominalmasse, die um Eins größer ist als der A0 Peak) quantitative Informationen über die Stickstoffhäufigkeit vorsehen. Wenn das Intensitätsverhältnis zwischen A0 und A1 (¹⁵N) von einem tabulierten Verhältnis verschieden ist, kann dies beispielsweise eine Anreicherung oder Verarmung anzeigen, oder dass mehr als ein Stickstoffatom vorliegt.
Übersicht über ein spezifisches Beispiel
Mit Bezugnahme auf 1 ist eine schematische Darstellung eines beispielhaften bekannten Systems gezeigt, unter Verwendung dessen eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung implementiert werden kann. Das beispielhafte bekannte System 1 umfasst ein Massenspektrometer 20 mit einem stromaufwärtigen Chromatographen 10 und einem angeschlossenen Computersystem 70 zur Evaluierung der auflaufenden Daten.
Das Massenspektrometer 20 hat eine übliche Ausbildung, die umfasst: ein Einlasssystem 30; eine Ionenquelle 40 (wie eine Elektrospray-Ionisierungsquelle); einen Massenanalysator 50 (wie einen Doppelfokussierungssektor-Analysator, FT-ICR, Orbital Trapping-Analysator oder Flugzeit(TOF)-Analysator, einschließlich eines Mehrfachreflexions-TOF); und einen Detektor 60 (der einen Einlassschlitz aufweisen kann). Stromaufwärts vom Einlasssystem 30 liegt eine Vorrichtung zur chromatgraphischen Trennung 10, beispielsweise ein Gaschromatograph (GC) oder ein Flüssigchromatograph (LC). Die am Detektor 60 entstehenden Signale werden vom Computersystem 70 verarbeitet und konditioniert. Das Computersystem 70 steuert auch den Betrieb des Massenspektrometers 20.
Arbeitsbeispiel
Das mit Bezugnahme auf 1 beschriebene System kann verwendet werden, um das Vorliegen von Schwefelatomen in Proben auf folgende Weise zu detektieren.
Der erste Schritt (wie oben definiert) läuft wie folgt ab.
Schritt 1.1: Zwei Algorithmusparameter werden definiert: eine Intensitätstoleranz als Prozentsatz (Toll), welche die maximale Differenz zwischen der erwarteten und gemessenen Intensität eines Pakets ist; und eine Massentoleranz in ppm (TolM), welche die maximale Massenabweichung zwischen der erwarteten und gemessenen Masse ist.
Schritt 1.2: Das theoretische Isotopenmuster (bei unendlicher Auflösung) des Elements oder der Elementkombination, die berücksichtigt wird (hier S1), wird berechnet. Das Muster bei unendlicher Auflösung wird auch „Musterspektrum” genannt. Für S1 erscheint dieses Musterspektrum wie folgt (die relative Häufigkeit bezieht sich auf den Monoisotopenpeak). Tabelle 1

m/z Relative Häufigkeit (%)

31,97152 100,0

32,97091 0,80

33,96732 4,52

35,96653 0,02
Schritt 1.3: Berechnen der Massendifferenzen zwischen der häufigsten Masse und den Musterpaketen von Interesse. Die Pakete von Interesse sind jene, die stark genug sind (über 0,5%), und die von interferierenden Isobarionen im Massenspektrum gut getrennt sind (wie oben diskutiert). Die Massendifferenzen und die relativen Intensitäten werden in einer Tabelle „erwarteter Pakete” zur späteren Verwendung gespeichert. Die Tabelle sieht nun wie folgt aus. Tabelle 2

Δm/z Relative Häufigkeit (%)

0 100,0

0,99939 0,80

1,99580 4,52
Schritt 1.4: Gegebenenfalls wird die Tabelle nun auf folgende Weise modifiziert. Alle der Pakete (Peaks) werden in absteigender Intensitätsreihenfolge sortiert und werden dann mit Indices von 0 bis n versehen. Dieser Schritt kann eine konsistente Verarbeitung von Isotopenmustern gestatten, wobei das Paket mit der geringsten Masse nicht der Basispeak ist (wie in Br₂). Dann sieht die Tabelle nun wie folgt aus. Tabelle 3

Index Δm/z Relative Häufigkeit (%)

0 0 100,0

1 1,99580 4,52

2 0,99939 0,80
Der zweite und dritte Schritt der Berechnung des Isotopen-Feinstruktur-Massenchromatogramms (wie oben definiert) laufen dann auf folgende Weise ab.
Für jeden Scan von Interesse (der MS¹ für Präkursorspektren oder MSⁿ für Produktspektren sein kann) bei einer Retentionszeit (RT) von x wird ein Chromatogrammpunkt mit RT x und der Häufigkeit y bestimmt. Die Häufigkeit y wird unter Verwendung des folgenden Algorithmus berechnet.

1. y = 0 setzen.
2. Durch alle Pakete (Masse = m, Intensität = i, Rauschen = n) im Scan in aufsteigender m/z iterieren und für jedes Paket das Folgende durchführen: 2.1 Massentoleranz tol = m/(1eE·TolM) berechnen. 2.2 Gemessenen S/N(Signal-Rausch-Verhältnis)-Wert für das Paket berechnen, S/N_meas 2.3 Erwarteten S/N-Wert für alle Pakete in der Tabelle wie folgt berechnen: S/N_[index] = S/N_meas·RelInt_[index]/100, wobei RelInt die relative Häufigkeit ist. Beispielsweise führt ein Paket mit einer Intensität i = 12345 und einem Rauschen n = 200 zu S/N_meas als 61,725. Die Tabelle sieht nun wie folgt aus.

Index	Δm/z	Relative Häufigkeit (%)	S/N_[index]
0	0	100,0	61,73
1	1,99580	4,52	2,79
2	0,99939	0,80	0,49

2.4. Wenn S/N₍₁₎ kleiner ist als 1,0, mit diesem Paket nicht weitergehen. Mit dem nächsten Paket in Schritt 2.1 fortsetzen. 2.5 Für alle Zeilen in der Tabelle mit einem S/N_[index] > 1,0 Folgendes durchführen. Die Häufigkeit y wird inkrementiert, falls ein gemessenes Paket innerhalb sowohl des Massentoleranzfensters als auch des Intensitätstoleranzfensters vorliegt, das heißt mit m/z zwischen (m + Δm/z_[index] – tol) und (m + Δm/z_[index] + tol), und mit einer Intensität j zwischen (i – i·(relInt_[index] + isv) und (i + i·(relInt_[index] + isv), wobei isv eine Intensitätsvariation ist, die von Ionenstatistiken abgeleitet wird. Falls diese Bedingungen beide erfüllt werden, dann die Häufigkeit y durch das Addieren der Intensität j mit y inkrementieren, so dass: y = y + j. 2.6 Mit dem nächsten Paket in Schritt 2.1 fortsetzen, wobei die Schritte 2.1 bis 2.5 wiederholt werden, bis alle m/z Pakete im Scan von Interesse analysiert wurden. Auf diese Weise wird, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis über der Schwelle 1,0 ist, die Häufigkeit y mit mehrfachen Intensitäten j inkrementiert, wenn Pakete im Scan von Interesse mit den Musterpaketen von Interesse innerhalb der Massen- und Intensitätstoleranz übereinstimmen. Dann ist die Häufigkeit y ein bestimmtes Maß der Häufigkeit für das Element oder die Elementkombination von Interesse innerhalb der Probe. (Es ist zu beachten, dass S/N_[index] in Tabelle 4 durch die Berechnung für das nächste Paket überschrieben wird, jedesmal wenn die Schritte wiederholt werden).

Die Messung eines Ionensignals wird von Scan zu Scan quer über einen chromatographischen Peak variieren. Diese Variation ist das Ergebnis einer Messvariation von Signalen innerhalb des Massenspektrometers, die von Quellen wie einem Einströmen von Ionen von der Quelle, einer Detektorreaktion und Ionenzählstatistiken entstehen. Diese Variation in gemessenen Intensitäten einzelner Signale beeinträchtigt diesen Algorithmus, indem das gemessene Signal vom erwarteten durch relInt (relative Häufigkeit) weg bewegt wird. Der Toleranzwert (isv) gestattet ein kleines Toleranzfenster rund um jede beobachtete Intensität auf nahezu gleiche Weise, wie eine Massentoleranz (gemessen in Teilen pro Million, ppm) eine kleine Variation in der gemessenen Masse gestattet.
In der Praxis können die Werte von Δm/z und der relativen Häufigkeit (relInt) für Indices größer als 0 als Benutzerparameter vorgesehen werden. Dies kann ein komplexeres Mustersuchen oder Mustersuchen nur an ausgewählten Abschnitten des gesamten gemessenen Isotopen-Feinmusters gestatten. Als Beispiel könnten die eingegebenen Parameter für ein kleines Molekül, wo das gewünschte zu detektierende Muster das kombinierte A0 ist, und Feinstruktursignale von ³⁴S A2 und zweimal ¹³C A2 von einem Benutzer wie folgt definiert werden. Tabelle 5

Index Δm/z Relative Häufigkeit (%)

0 0 100

1 1,99580 4,52

2 2,00671 1,00
Dennoch ist eine Benutzereingabe normalerweise nicht notwendig. Falls ausreichende Informationen verfügbar sind (Massengenauigkeit des Instruments zur Messung relativer m/z Distanzen, im Gegensatz zur absoluten Messgenauigkeit, die eine viel stärkere Abhängigkeit von guter Massenkalibrierung aufweist), werden diese stattdessen verwendet. So erfordert der Algorithmus nur Daten mit ausreichender Auflösung und Genauigkeit für die Messung von (relativ kleinen) Massendifferenzen. Er ist daher stabil gegenüber einem Drift der Massenkalibrierung.
Benutzerschnittstelle
Der Algorithmus kann von einem Computerprogramm mit einer Benutzerschnittstelle implementiert werden, um es dem Benutzer zu gestatten, Kriterien vorzusehen und Ergebnisse aus den Massenspektraldaten zu präsentieren. Die Benutzerschnittstelle kann eine Anzahl unterschiedlicher Teile aufweisen: Eingabe des in den Daten zu suchenden Elements; entsprechendes Setup der Massenspektrometrie und Chromatographie; Extraktion von Daten, um alle Ereignisse zu finden, die das in den Suchkriterien ausgewählte Element oder die Elementkombination enthalten.
Mit nunmehriger Bezugnahme auf die 2 und 3 werden Beispiele einer Benutzerschnittstelle zur Steuerung einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. Dies zeigt, wie die Auflösung aus einer Liste erwarteter anderer Elemente bestimmt werden kann (vorzugsweise vorherbestimmt), die in der Probe vorliegen. Das Auflösungsvermögen („Res” in den 2 und 3) ist bei m/z 400 vorgesehen und kann dann aus einer Formel für andere Massen in Abhängigkeit vom Instrumententyp bestimmt werden.
Als Nächstes wird mit Bezugnahme auf 4 ein zweites Beispiel einer Benutzerschnittstelle zur Steuerung einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. Dies zeigt, dass der Benutzer spezifizieren kann: die Elementzusammensetzung; Auflösung (Auflösungsvermögen); eine Schwelle; und welcher der Spurenkandidaten auszuwählen ist. Erweiterungen für eine Elementzählung (das Beispiel von 4 würde Komponenten mit zwei Schwefelatomen detektieren) können auch vorgesehen werden.
Eine benutzerdefinierte Formel (wie das Pharmazeutikum, das die Basis zu findender Metaboliten bildet) oder eine ausgewählte Spektralregion durch die Analyse einer Elementzusammensetzung wird verwendet. Unter Verwendung von einer von diesen, und angesichts einer verfügbaren oder ausgewählten Analysatorauflösung, sagt das System vorher, welche Elemente aufgelöst werden könnten und bietet sie zur Erzeugung einer „Spur”. Beispielsweise kann die Spur von of ¹³C von Vorteil sein.
Praktisches Beispiel
Omeprazol („Omep”) ist ein Protonenpumpeninhibitor, der bei der Behandlung von Dyspepsie, Reflux, etc., häufig verwendet wird. Zentral für seine Struktur und seinen pharmazeutischen Mechanismus ist ein Schwefelatom. Die Molekülformel ist C₁₇H₁₉N₃O₃S.
In diesem Beispiel wurden schwefelhaltige Omeprazol-Metabolismusproben untersucht und auf einem High Resolution (HR)/Accurate Mass (AM) LC/MS/MS Instrument erfasst (spezifisch dem Q Exactive^TM Instrument, hergestellt von Thermo Fisher Scientific, Inc.), das einen Orbital Trapping-Massenanalysator umfasst. Das Auflösungsvermögen und die genaue Massendetektion vom Orbital Trapping-Massenanalysator erleichtern den Identifikationsprozess unter Verwendung eines Isotopen-Feinmusters, wie oben beschrieben.
Aufgrund des Schwefelgehalts des Originalpharmazeutikums wird erwartet, dass viele Metaboliten auch Schwefel enthalten. So ist eine Suche nach allen Verbindungen, die Schwefel enthalten, ein nützliches Werkzeug zur Identifikation wahrscheinlicher Metaboliten von Omep. Diese Kandidaten können dann beispielsweise durch die Beobachtung der Intensitätsprogression in der Zeit in den Proben (wie Blut) bestätigt werden, die zu unterschiedlichen Zeiten nach der Verabreichung einer Dosis abgenommen werden. Dies wird unter der Annahme durchgeführt, dass die Metaboliten zuerst ansteigen und dann mit der Zeit nach der Verabreichung sinken, während angenommen wird, dass die meisten gefundenen anderen Verbindungen konstant sind (außer sie werden direkt oder indirekt durch das Pharmazeutikum und seine Metaboliten beeinträchtigt, es ist jedoch wahrscheinlich, dass diese eine unterschiedliche Zeitentwicklung zeigen).
Omeprazol in Humandosis-Urinmetabolismusproben wurde in 0–3 h, 3–5 h und 5–7 h Zeitbereichen abgenommen. Die Proben wurden durch das Instrument, gekoppelt mit einem Ultrahochdruck-Flüssigchromatographie(UHPLC)-System, analysiert. LC-MS und MS-MS Daten wurden unter Verwendung eines Full MS Scans erfasst, gefolgt von einer Gesamtionenfragmentierung (AIF) und dann einer (Neutralverlust) NL-getriggerten datenabhängigen MS² bei einem Auflösungsvermögen von 70,000, 35,000 bzw. 17,500. Der UHPLC-Gradient war 2%/98% ACN/H₂O mit 0,1% Ameisensäure zu 90%/10% ACN/H₂O mit 0,1% Ameisensäure in 10 min unter Verwendung einer C-18-Säule (2 × 100 mm, 1,9 um). Die Daten wurden unter Verwendung des Algorithmus der obigen Ausführungsform analysiert, um S-enthaltende Peaks zu identifizieren.
Als Nächstes wird mit Bezugnahme auf 5 ein erster Satz von Beispielergebnissen aus dieser Ausführungsform dargestellt. Dies zeigt die Intensität in der Retentionszeit sowohl für den Gesamtionenstrom (TIC) als auch die Schwefelspur, die unter Verwendung des Algorithmus der Erfindung generiert wurde. Einige Kandidaten für Metaboliten sind im TIC ersichtlich, einige jedoch nicht. Diese sind alle hingegen in der Schwefelspur ersichtlich.
Als Nächstes wird mit Bezugnahme auf 6 ein zweiter Satz von Beispielergebnissen aus einer Ausführungsform dargestellt. Wiederum ist die absolute Intensität in der Retentionszeit aufgetragen. Die Schwefelspur (fettgedruckt) ist mit erwarteten Metaboliten in Omeprazol aufgetragen. Das Omep-System wurde herkömmlich ziemlich gut untersucht (in dem Sinn, dass viele Metaboliten bekannt sind). 6 vergleicht die Schwefelspur mit den extrahierten Massenchromatogrammen (die gemäß einem im EP-2,322,922 geoffenbarten Verfahren generiert werden können) mit den in den Daten gefundenen bekannten Metaboliten. Die Entsprechung ist klar ersichtlich.
In diesem Beispiel waren das A2 Isotop mit einem ³⁴S und das A2 Isotop mit zwei ¹³C im Full MS Scan in den Daten gut getrennt. Durch die Verwendung des Isotopen-Feinmusters eines S-Elements und eines Modelling von Gaußschen Peakformen gemäß dem ausgewählten Auflösungsvermögen des Massenspektrometerinstruments wurden Full Scan-Massen auf Übereinstimmungen mit dem Isotopen-Feinmuster gefiltert. Omeprazol-Metaboliten, Sulfatkonjugate und endogene Verbindungen wie Urothion wurden unter Verwendung dieses Ansatzes identifiziert.
Mit nunmehriger Bezugnahme auf 7 wird ein dritter Satz von Beispielergebnissen aus einer Ausführungsform dargestellt. Wie in den 5 und 6 wird die absolute Intensität in der Retentionszeit aufgetragen, jedoch für den Gesamtionenstrom (TIC) und für eine Chlorspur (generiert mit einem Verfahren gemäß der obigen Offenbarung) des Pharmazeutikums Haloperidol (HP). HP enthält ein Chloratom. So wird erwartet, dass viele Metaboliten auch Cl enthalten. Wie für 7 ersichtlich ist, ist die Matrix in diesem Versuch sehr komplex, wobei nur ein großer Bereich auf der TIC-Kurve gezeigt wird. Andererseits identifiziert die Chlorspur leicht eine Vielzahl von klaren Kandidaten für Metaboliten. Von diesen ist nur der besondes intensive bei 15,3 min im TIC sichtbar.
Für die in den 5 bis 7 (sowie anderen Ausführungsformen) berücksichtigten Beispiele kann ein typischer Ansatz die identifizierten Verbindungen durch verschiedene Verfahren „qualifizieren”. Diese können beispielsweise umfassen:

a) Identifizieren der Elementzusammensetzung und -struktur (gegebenenfalls unter Verwendung von MS/MS Daten, die von einer Gesamtionenfragmentierung stammen können oder ansprechend auf die Detektion von Cl bzw. S während der Erfassung getriggert werden können); und
b) Vergleichen des Ergebnisses (in dem Sinn der erzeugten Element- oder Elementkombinations ”spur”) mit: einer Kontrollprobe; oder anderen Elementen einer Zeitserie (das heißt, derselben Person oder demselben Pool abgenommenen Proben in einem Bereich unterschiedlicher Zeiten nach der Verabreichung des Pharmazeutikums). Beispielsweise kann zu einer ersten Zeit (T = 0) eine erste (Referenz-)Blutprobe abgenommen und dann ein Pharmazeutikum verabreicht werden. Zu einer zweiten Zeit (beispielsweise T = 30 min) kann eine zweite Blutprobe abgenommen werden, und zu einer dritten Zeit (beispielsweise T = 60 min) kann eine dritte Blutprobe abgenommen werden. Dann wird ein Maß der Häufigkeit getrennt für jede Probe gemäß dem an jeder Probe vorgenommenen Verfahren bestimmt, und die Ergebnisse werden verglichen. In Fällen kann ein potenzieller Metabolit, der durch eine Schwefelspur identifiziert wird, aus der Betrachtung ausgeschlossen werden, wenn gefunden wird, dass er von der ersten Probe vorliegt und sich mit der Zeit nicht ändert, nachdem die Person das Pharmazeutikum erhalten hat.

Obwohl nun eine spezifische Ausführungsform beschrieben wurde, ist Fachleuten klar, dass Variationen und Modifikationen möglich sind. Beispielsweise ist klar, dass die Erfindung nicht als Teil an einem LC/MS System verwendet werden muss. Beispielsweise kann die Erfindung auch bei einer bildgebenden Massenspektrometrie oder tatsächlich einer Standard-Massenspektrometrie anwendbar sein (in welchem Fall normalerweise nur ein einzelner Wert aus der Verarbeitung des Massenspektrums resultieren wird).
Fachleute werden auch verstehen, dass einige Merkmale optional sind und weggelassen oder in einigen Fällen ersetzt werden können. Beispielsweise muss die Auflösung nicht spezifisch im Voraus eingestellt werden, vorausgesetzt sie wird hoch genug eingestellt, um zu gestatten, dass Isotopenvarianten unterschieden werden. Auch können in Fällen einige Teile des Vorgangs zur Identifikation von Elementen oder Kombinationen auf der Basis ihrer Isotope geändert werden. Die Kombination von Intensitätsmessungen kann auf vielen verschiedenen Wegen erfolgen. Die Intensität aller der identifizierten Peaks, die das Element oder die Kombination enthalten, oder nur einiger (beispielsweise ohne den Monoisotopenpeak) kann summiert werden. Vorausgesetzt, dass ein konsistenter Ansatz vorgenommen wird, wird das Ergebnis mit anderen Ergebnissen vergleichbar sein, die unter Verwendung desselben Ansatzes generiert wurden.
Die obige Ausführungsform diskutiert nicht allgemein mehrfache Ladungszustände. Diese sind in der Metabolomik unüblich. Es sind jedoch zwei Ansätze üblich zur Handhabung mehrfach geladener Ionen. In einem ersten Ansatz wird der gesamte Prozess unter Berücksichtigung von Fraktionen der m/z Massendifferenz (beispielsweise 1/2, 1/3, etc.) wiederholt. In einem zweiten Ansatz wird zuerst eine Dekonvolution vorgenommen. Mit anderen Worten werden Berechnungen verwendet, um alle m/z Peaks mit der Ladung (z) zu multiplizieren, um ein neues Spektrum zu erhalten, wo die Ladung dann effektiv immer 1 ist.
Es gibt einen breiten Bereich möglicher Anwendungen für die geoffenbarte Technik. Einige von diesen wurden oben diskutiert. Nun werden auch andere präsentiert.
Die Erfindung kann einen neuen Ansatz für die Elementzusammensetzungsanalyse vorsehen. Beispielsweise können herkämmliche Ansätze auf der Basis der „Spektraldistanz” durch eine direkte auf der Feinstruktur basierende Elementzählung unter Verwendung der geoffenbarten Technik ersetzt werden. Wie oben angegeben, haben viele Elemente ein charakteristisches Linienpaar. Die Intensität der A1 (oder A2, etc.) Linien kann dann in die Anzahl von Atomen dieses Elements in einem Molekül der Verbindung umgewandelt werden. Beispielsweise kann dies eine Erweiterung der ¹³C-basierten Kohlenstoffzählung sein. Obwohl diese Technik wohlbekannt und etabliert ist, kann sie in der Praxis aufgrund von Interferenzen von anderen Isotopen, sogar bei Daten mit mäßig hoher Auflösung, ungenau sein.
Eine weitere Anwendung der geoffenbarten Technik kann eine Steuerung umfassen, die von der Detektion eines Elements oder einer Elementkombination abhängig ist, beispielsweise eines Triggers beim Auftreten eines bestimmten Elements oder einer Elementkombination (wie Schwefel) oder einer bestimmten Quantität eines Elements oder einer Elementkombination in einem Molekül einer Verbindung (beispielsweise mehr als drei Sauerstoffatome). Wenn ein bestimmtes Element (oder eine Kombination) als über der Schwelle während der Datenerfassung detektiert wird, könnte die Instrumentensteuerungs-Software zu einem spezifizierten Analyseverfahren wechseln. Das Analyseverfahren (das unterschiedlich sein kann) könnte umfassen: Vornehmen einer Tandemmassenspektrometrie (beispielsweise wenn Schwefel detektiert wird oder 3 Sauerstoff- oder 2 Stickstoffatome detektiert werden); und Wiederholen der Massenanalyse mit einer höheren Auflösung, wenn Isobare (Peaks bei derselben Nominalmasse, jedoch unterschiedlicher exakter m/z) nicht korrekt aufgelöst werden.
Die geoffenbarte Technik kann auch im Zusammenhang mit einer Gesamtionenfragmentierung (AIF) nützlich sein. Daten können in einer MS/MS Spur gesucht werden, ein Element kann für eine Präkursor- oder Fragmentausrichtung oder beides detektiert werden. Es ist üblich, Fragmente nach der Elutionszeit zu assoziieren. Ein weiterer Weg zur Festlegung einer Präkursor/Fragment-Beziehung kann beispielsweise sein, ein Element in einem Elternion zu identifizieren, indem nach allen verwandten Fragmenten nach der Signatur dieses Elements (beispielsweise Schwefel) gesucht wird. Dies kann auch mit Elementkombinationen möglich sein.
In der Proteomik kann die Technik beispielsweise bei der Analyse von Cystein verwendet werden. Dies ist eine Aminosäure, die Schwefel enthält. Die Schwefelatome unterschiedlicher Cystein-Einheiten verknüpfen sich über eine S=S Bindung. In der Praxis erzeugen diese S=S (Schwefel) Brücken analytische Herausforderungen, da sich in vielen Fällen nur das Gerüst der Schwefelbindung während eines Fragmentierungsereignisses spaltet. So sind weniger Informationen verfügbar, da das Molekül als Ganzes nicht auseinanderzufallen scheint, wenn nur ein „Ring” geöffnet wird, aber keine zweite Spaltung auftritt. Während der Erfassung kann eine höhere Kollisionsenergie, ein unterschiedliches Fragmentierungsverfahren oder ein spezielles Fragmentierungsschema (wie eine ETD plus Kollisionsaktivierung) gewählt werden. Diese Ereignisse können dann später unter Verwendung der geoffenbarten Technik rasch aus den Daten gezogen werden, um Schwefel zu detektieren.
Bei Nahrungsmittel- oder Pestizidanalysen können Suchen nach Elementen wie Schwefel, Chlor und Brom nützlich sein. Diese können übliche Pestizide und Schadstoffe sein, wie in Dioxiden und Flammhemmern.
In der Petroleomik kann die Identifikation des Schwefelgehalts hilfreich sein. Diese kann MS/MS verwenden, um Möglichkeiten für eine gezielte Schwefelverarmung des Gemischs auf der Basis funktioneller Gruppen zu identifizieren. Der Schwefelgehalt eines Erdölgemischs kann unter Verwendung der geoffenbarten Technik direkt evaluiert und quantitativ geschätzt werden.
Eine weitere Anwendung kann das Triggern an mit Isotopen angereicherten Peaks involvieren. Dies kann MS/MS verwenden, wie oben angegeben.
Neben anderen Elementen kann es auch möglich sein, ¹⁴C-markierte Metaboliten aus sogenannten pharmazeutischen „Mikrodosis”-Studien zu identifizieren. In solchen Studien wird eine Substanz vor der Verabreichung mit ¹⁴C angereichert. Herkömmlich werden dann die Metaboliten unter Verwendung von Radioaktivitätsdetektoren identifiziert, aber das ¹²C-¹⁴C Paar kann auch direkt beobachtet werden. Während die natürliche Häufigkeit von ¹⁴C (1%) normalerweise zu gering ist für eine effiziente Detektion durch Massenspektrometrie, können angereicherte Peaks mittels der geoffenbarten Technik detektierbar sein.
Die Quantifizierung kann direkt unter Verwendung des Häufigkeitsmaßes oder der Spur vorgenommen werden, die gemäß der Technik generiert werden. Dies kann jedoch ein Kalibriermittel erfordern, wie oben diskutiert.
Ein duales Erfassungsschema kann für die Erfassung der Massenspektraldaten verwendet werden. Darin kann eine „langsame” Erfassung verwendet werden, um eine ultrahohe Auflösung vorzusehen und dorthin zu führen, wo nach bestimmten Metaboliten zu suchen ist. Eine „schnelle” Erfassung kann für die tatsächliche Analyse verwendet werden. Beispielsweise kann dies das Vorsehen eines 250.000 RP Versuchs unterstützen. In diesem Fall können nur wenige Spektren über einem chromatographischen Peak erfasst werden. Dies kann ein geringeres Problem werden, wenn eine zusätzliche Analyse mit niedriger Auflösung durchgeführt wird. In diesem Fall hilft die geoffenbarte Technik, Regionen von Interesse zu identifizieren, die dann in den Hochgeschwindigkeitsdaten detaillierter evaluiert werden.
Die Technik kann auch verwendet werden, um die Verwendung von Ionenstatistikinformationen zu korrigieren, um Häufigkeitsgrenzen einzustellen, wodurch falsche negative Ergebnisse vermieden werden. Die Dekonvolution überlappender Isotopenmuster kann auch durch die Identifikation möglicher (oder unmöglicher) Peakpaare erzielt werden. Wenn beispielsweise zwei Peaks in einer Distanz beabstandet sind, die nicht erklärt werden kann, kann daraus geschlossen werden, dass sie zu unterschiedlichen Substanzen gehören.
Die Technik kann mit verschiedenen Markern und Tags verwendet werden, wie Tandem Mass Tags (TMT) und dgl. Jedes einzigartige Element-Tag könnte gezogen werden, was eine rasche Übersicht bieten kann, wenn ein TMT oder Neutronencodierender(„Neucode”-)Marker im Chromatogramm vorliegt. Diese Technik könnte auch für Metallionenmarker verwendet werden, wie sie beispielsweise in „dünn besetzten” Spektren wegen ihrer charakteristischen Muster gefunden werden können. In dicht besetzten („dichten”) Spektren können die Isotopensignaturen schwer von den anderen Informationen zu trennen sein. Die Feinstruktur sollte hier behilflich sein. Typischerweise werden Lanthanoide verwendet. Dies kann eine einzigartige Feinverschiebung ergeben, die dann sogar bei niedrigeren Auflösungen beobachtet werden kann. Die Massendefekte sind typischerweise substanziell.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Verfahren zur Bestimmung eines Maßes der Häufigkeit für ein Element oder eine Elementkombination innerhalb einer Probe, wobei das Element oder die Elementkombination wenigstens eine Isotopenvariante aufweist, wobei das Verfahren umfasst: Identifizieren eines Isotopen-Massenspektralmusters für das Element oder die Elementkombination, wobei das Isotopen-Massenspektralmuster eine erwartete Häufigkeit und erwartete Masse-Ladung-Verhältnisdifferenz für jede der einen oder mehreren Isotopenvarianten anzeigt, wobei die erwartete Häufigkeit und erwartete Masse-zu-Ladung-Verhältnisdifferenz relativ zur jeweiligen Häufigkeit und zum Masse-zu-Ladung-Verhältnis eines Hauptisotops des Elements oder der Elementkombination identifiziert wird; Vergleichen des Isotopen-Massenspektralmusters mit Massenspektraldaten aus einer Molekülmassenanalyse der Probe, wobei die Massenspektraldaten eine Vielzahl von Peaks umfassen, wobei jeder Peak eine Intensitätsmessung für ein jeweiliges Masse-zu-Ladung-Verhältnis anzeigt, wobei das Vergleichen eine Vielzahl von Peakgruppen identifiziert, die jeweils mit dem Isotopen-Massenspektralmuster übereinstimmen; und Bestimmen eines Maßes der Häufigkeit für das Element oder die Elementkombination als Funktion der Intensitätsmessung eines oder mehrerer Peaks von jeder der identifizierten Vielzahl von Peakgruppen.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend: Vornehmen einer Molekülmassenanalyse der Probe, um so die Massenspektraldaten vorzusehen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, ferner umfassend: Bestimmen einer Mindestauflösung für die Massenspektraldaten auf der Basis des identifizierten Isotopen-Massenspektralmusters; und Steuern eines Massenanalysators, um die Molekülmassenanalyse vorzunehmen und dadurch die Massenspektraldaten vorzusehen, um wenigstens die bestimmte Mindestauflösung zu erzielen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend: Wiederholen der Schritte des Vergleichens und Bestimmens für jede einer Vielzahl von Proben, um so eine Vielzahl von Maßen der Häufigkeit für das Element oder die Elementkombination vorzusehen, wobei jedes Maß der Häufigkeit für eine jeweilige Probe der Vielzahl von Proben dient.
Verfahren nach Anspruch 4, bei welchem die Vielzahl von Proben generiert wird durch Chromatographie oder bildgebende Ionisierung.
Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, bei welchem die Vielzahl von Proben generiert wird in einem oder in beiden von: einem Bereich unterschiedlicher Zeiten und einem Bereich unterschiedlicher Raumpositionen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem der Schritt des Vergleichens umfasst: Identifizieren eines der Peaks der Massenspektraldaten als Hauptpeak; und für jede Isotopenvariante vom Isotopen-Massenspektralmuster, Identifizieren eines jeweiligen Variantenpeaks der Massenspektraldaten mit einer Intensität relativ zu jener des Hauptpeaks und der Masse-zu-Ladung-Verhältnisdifferenz zu jener des Hauptpeaks, die der erwarteten Häufigkeit und dem erwarteten Masse-zu-Ladung-Verhältnis der jeweiligen Isotopenvariante vom Isotopen-Massenspektralmuster entsprechen; und wobei der Hauptpeak und jeder der jeweiligen Variantenpeaks eine Peakgruppe aus der Vielzahl von Peakgruppen definieren.
Verfahren nach Anspruch 7, bei welchem die Intensität des Variantenpeaks relativ zu jener des Hauptpeaks als entsprechend der erwarteten Häufigkeit der Isotopenvariante identifiziert wird, wenn die relative Intensität des Variantenpeaks und die erwartete Häufigkeit der Isotopenvariante gleich sind oder sich um nicht mehr als eine vorherbestimmte Variation voneinander unterscheiden.
Verfahren nach Anspruch 8, bei welchem die vorherbestimmte Variation durch eine Messung der Variation von Signalen innerhalb des Massenanalysators festgelegt wird, der die Massenspektraldaten vorgesehen hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, bei welchem die Masse-zu-Ladung-Verhältnisdifferenz zu jener des Hauptpeaks als entsprechend der erwarteten Masse-zu-Ladung-Verhältnisdifferenz der Isotopenvariante identifiziert wird, wenn die Masse-zu-Ladung-Verhältnisdifferenz des Variantenpeaks und die erwartete Masse-zu-Ladung-Verhältnisdifferenz der Isotopenvariante gleich sind oder sich um nicht mehr als eine vorherbestimmte Toleranz voneinander unterscheiden.
Verfahren nach Anspruch 10, bei welchem die vorherbestimmte Toleranz eine Funktion des Masse-zu-Ladung-Verhältnisses des Hauptpeaks und eines konstanten Toleranzwerts ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, bei welchem der Schritt des Vergleichens ferner umfasst: Bestimmen eines Signal-Rausch-Verhältnisses für die Peakgruppe; und Festlegen eines erwarteten Signal-Rausch-Verhältnisses für jede Isotopenvariante vom Isotopen-Massenspektralmuster, durch das Kombinieren des für die Peakgruppe definierten Signal-Rausch-Verhältnisses mit der erwarteten Häufigkeit der jeweiligen Isotopenvariante; und bei welchem der Schritt des Identifizierens eines jeweiligen Variantenpeaks der Massenspektraldaten vom erwarteten Signal-Rausch-Verhältnis für die Isotopenvariante abhängig ist, die dem Variantenpeak entspricht, der mindestens ein Schwellenwert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, bei welchem der Schritt der Bestimmung des Maßes der Häufigkeit umfasst: Kombinieren einer Intensitätsmessung für einen oder mehrere der Variantenpeaks jeder Peakgruppe aus der Vielzahl von identifizierten Peakgruppen.
Verfahren nach Anspruch 13, bei welchem der Schritt des Kombinierens das Summieren der Intensitätsmessung für einen oder mehrere der Variantenpeaks jeder Peakgruppe aus der Vielzahl von identifizierten Peakgruppen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, bei welchem der Schritt des Kombinierens umfasst: Bestimmen eines Gewichts für jede identifizierte Peakgruppe, wobei das Gewicht anzeigt, wie viele von dem Element oder der Elementkombination in einem Molekül einer Verbindung vorliegen, die der identifizierten Peakgruppe entspricht; und Multiplizieren der Intensitätsmessung für einen oder mehrere der Variantenpeaks jeder Peakgruppe aus der Vielzahl von identifizierten Peakgruppen mit dem für die jeweilige Peakgruppe bestimmten Gewicht; und Summieren der mit den Gewichten multiplizierten Intensitätsmessungen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, ferner umfassend: Bestimmen eines Gewichts für jede identifizierte Peakgruppe, wobei das Gewicht anzeigt, wie viele von dem Element oder der Elementkombination in einem Molekül einer Verbindung vorliegen, die der identifizierten Peakgruppe entspricht; Multiplizieren des für jede der Vielzahl von Peakgruppen bestimmten Gewichts mit einer Nominalmasse für das Element oder die Elementkombination; und Festlegen einer Wahrscheinlichkeitshöhe für die Peakgruppe auf der Basis der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse für Peaks der Peakgruppe und des mit der Nominalmasse für die Peakgruppe multiplizierten Gewichts; und Bestimmen beliebiger Peakgruppen, für welche die festgelegte Wahrscheinlichkeitshöhe unter einer Schwelle liegt; bei welchem der Schritt des Kombinierens keine Intensitätsmessungen für jene Peakgruppen kombiniert, für welche die festgelegte Wahrscheinlichkeitshöhe als unter der Schwelle bestimmt wird.
Computerprogramm, welches konfiguriert ist, wenn es von einem Prozessor betrieben wird, das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche durchzuführen.
Massenspektrometriesystem, umfassend: einen Massenanalysator, der konfiguriert ist, Massenspektraldaten für eine Probe vorzusehen; und einen Prozessor, der konfiguriert ist, das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 unter Verwendung der vom Massenanalysator vorgesehenen Massenspektraldaten durchzuführen.