DE102014118481B4

DE102014118481B4 - Verfahren und Vorrichtung zum Analysieren einer komplexen Probe

Info

Publication number: DE102014118481B4
Application number: DE102014118481.5A
Authority: DE
Inventors: Scott J. Geromanos; Marc V. Gorenstein; Daniel Golick; Steven J. Ciavarini
Original assignee: Waters Technologies Corp
Current assignee: Waters Technologies Corp
Priority date: 2013-12-12
Filing date: 2014-12-12
Publication date: 2023-03-16
Anticipated expiration: 2034-12-13
Also published as: US11137380B2; US10692709B2; GB201421942D0; US20200279726A1; GB2529493A; US10115576B2; US20150170892A1; GB2529493B; US20190131117A1; DE102014118481A1

Abstract

Verfahren (300) zum Analysieren einer komplexen Probe, umfassend:
Durchführen (310) einer sequenziellen Chromatographie-IMS-MS-Analyse einer Probe, um eine Mehrzahl experimenteller Massenspektren, die isotopische Cluster aufweisen, zu erhalten, wobei jedes Spektrum der Mehrzahl von Spektren einer chromatographischen Retentionszeit und einer Ion-Mobilität-Driftzeit zugeordnet ist;
Berechnen (320) eines modellhaften isotopischen Clusters eines Präkursor- oder Produkt-Ions, das einer Kandidaten-Verbindung in der Probe zugeordnet ist, entsprechend den natürlichen Isotopenhäufigkeits-Verhältnissen von Elementen, aus denen sich die Verbindung zusammensetzt;
Vergleichen (330) von Peaks des modellhaften isotopischen Clusters mit entsprechenden Peaks eines isotopischen Clusters eines der experimentellen Massenspektren, um einen oder mehrere gesättigte oder überlagerte Peaks des experimentellen isotopischen Clusters zu extrahieren; und
Identifizieren (316) eines oder mehrerer der extrahierten gesättigten oder überlagerten Peaks und jeglicher ungesättigter und nicht-überlagerter Peaks in jedem der experimentellen isotopischen Cluster in Abhängigkeit eines Peak-Form-Parameters für jeden der Peaks in jedem der experimentellen isotopischen Cluster;
wobei das Vergleichen (330) ein Ableiten der korrekten Intensitäten der gesättigten oder überlagerten Peaks umfasst, basierend auf dem modellhaften isotopischen Cluster und einem ungesättigten und nicht-überlagerten Peak in dem experimentellen isotopischen Cluster.

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf die Analyse einer komplexen Probe und genauer auf die Quantifizierung von Verbindungen in einer komplexen Probe durch Flüssigchromatographie (liquid chromatography; LC), Ionenmobilitäts-Spektrometrie (ion mobility spectrometry; IMS) und Massenspektrometrie (mass spectrometry; MS).
HINTERGRUND
MS in Verbindung mit LC ist ein allgemein bekanntes Vorgehen, um Verbindungen in einer Probe zu quantifizieren. Die Quantifizierung wird typischerweise durchgeführt, indem Verbindungen zunächst durch LC voneinander getrennt werden, um eine Sequenz von Chromatogrammen zu erzeugen, von denen jedes einem Retentionszeit-(retention time; RT)- Fenster entspricht; als nächstes werden die voneinander getrennten Verbindungen mittels MS ionisiert und detektiert, um eine Mehrzahl von Massenspektren zu erzeugen, die Ionen-Peaks aufweisen; dann wird eine Peak-Fläche oder eine Flächensumme aller Peaks innerhalb eines Masse-Fensters, das einer Ziel-Verbindung zugeordnet ist, verwendet, um quantitative Informationen über die Verbindung abzuleiten, wobei angenommen wird, dass eine Korrelation zwischen der Peak-Fläche und der Verbindungskonzentration besteht. US 2009/0294654 A1 , US 2013/0218478 A1 und US 2013/0080073 A1 beschreiben jeweils verschiedene Chromatographie-IMS-MS Verfahren.
Dieses Vorgehen sieht sich allerdings beim Quantifizieren einer Ziel-Verbindung in einer komplexen Probe großen Herausforderungen gegenüber, da es konzeptionell auf zwei Annahmen basiert: erstens, alle bei der Quantifizierung verwendeten Ionen-Peaks sind einer Ziel-Verbindung zugeordnet; zweitens, alle bei der Quantifizierung verwendeten Ionen-Peaks sind so geformt und positioniert, wie theoretisch vorhergesagt. Allerdings sind diese Annahmen nicht gültig beim Quantifizieren von Verbindungen, die in einer komplexen Probe ineinandergreifen, da, weil die Komplexität (oder/und der Dynamikbereich) einer Probe zunimmt, die Wahrscheinlichkeit, dass mehrere Verbindungen bei LC im gleichen RT-Fenster koeluieren, ebenfalls zunimmt, was zu Massenspektren führt, in denen Ionen verschiedener Verbindungen einen gleichen Masse-Ladungs-Verhältnis-(m/z)-Bereich einnehmen und miteinander interferieren. Darüber hinaus nimmt, weil die Komplexität einer Probe zunimmt, die Anzahl von häufigen Verbindungen (highabundance compounds) in der Probe ebenfalls proportional zu, was einen Detektor sättigen und die Linearität der Detektor-Antwort stören kann, da es immer eine instrumentelle Detektionsgrenze geben wird. Entsprechend ist ein Signalprofil nicht mehr mit der Menge der Verbindungen korreliert, weil deren Konzentration über ein Maß steigt, das einen Detektor sättigt.
Der Begriff „komplexe Probe“, so wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Probe, die eine Vielzahl von natürlich vorkommenden oder von Menschen gemachten biologischen Komponenten enthält, wie Proteine, Peptide, Metabolite, Lipide, Antikörper in Serum oder Mischungen derselben.
ZUSAMMENFASSUNG
Einige Ausführungsformen entspringen teilweise der Erkenntnis, dass die quantitative Genauigkeit und der effektive Dynamikbereich einer Massenanalyse einer komplexen Probe verbessert werden kann durch Gewinnen von Daten mit einem Chromatographie-IMS-MS-System, Erzeugen einer Sequenz von experimentellen Massenspektren, die isotopische Cluster aufweisen, die einer Ziel-Verbindung zugeordnet sind; Berechnen eines modellhaften isotopischen Clusters entsprechend einem experimentellen isotopischen Cluster; und Vergleichen des berechneten modellhaften Clusters mit dem experimentellen Cluster, wobei wenigstens ein ungesättigter und nicht-überlagerter Peak des experimentellen isotopischen Clusters verwendet wird, um gesättigte oder überlagerte Peaks aus dem experimentellen isotopischen Cluster der Ziel-Verbindung zu extrahieren.
Der Begriff „modellhafter isotopischer Cluster“, so wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Gruppe isotopischer Moleküle oder isotopischer Zusammensetzungen, die sich auf eine Verbindung beziehen, die Massen und relative Intensitäten aufweist, die, basierend auf den natürlichen Isotopenhäufigkeits-Verhältnissen von Elementen, die die Verbindung bilden, berechnet werden. Der Begriff „experimenteller isotopischer Cluster“, so wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Gruppe detektierter Ionen, welche die gleiche elementare Zusammensetzung, aber verschiedene isotopische Zusammensetzungen hat, und welche in einem experimentellen Massenspektrum beobachtet wird.
Die Begriffe „Molekül“, „Verbindung“ und „Ion“, sowie hier verwendet, sind austauschbar in dem Kontext einer Elementarzusammensetzung, die sie teilen.
Die Begriffe „isotopischer Peak", „isotopisches Ion“, „Isotop“, „Masse-Peak“, „Ionen-Peak“ und „Ion“ werden von dem einschlägigen Fachmann so verstanden werden, dass sie sich auf einen Masse-Peak eines Massenspektrums beziehen.
Einige Ausführungsformen nutzen Wissen über Verbindungen, die aus Elementen zusammengesetzt sind, die aufgrund der natürlichen Häufigkeitsverhältnisse der Isotope natürlich vorkommende Isotope mit mehreren Molekülmassen haben. Folglich bildet eine solche Verbindung, wenn Sie mittels MS analysiert wird, eine Reihe von isotopischen Ionen, die in einen oder mehrere isotopische Cluster eingehüllt sind. Die Erfindung nutzt den Vorteil eines Chromatographie-IMS-MS-Systems, das die Fähigkeit einer mehrdimensionalen Trennung mit einem hohen Massenauflösungsvermögen vereint und daher vereinfachte experimentelle Massenspektren erzeugen kann, die weniger sowie besser aufgelöste isotopische Peaks aufweisen, die in einem oder mehreren isotopischen Clustern verteilt sind. Solche vereinfachten experimentellen Massenspektren bilden eine Grundlage, auf der eine quantitative Analyse einer komplexen Probe durchgeführt wird.
Einige Ausführungsformen bringen die Bestimmung eines modellhaften isotopischen Clusters mit sich, der einer Verbindung zugeordnet ist, und zwar mittels einer Berechnung, die auf den natürlichen Isotopenhäufigkeits-Verhältnissen der Elemente basiert, aus denen die Verbindung zusammengesetzt ist. Ein solcher modellhafter isotopischer Cluster liefert modellhafte Intensitätsverhältnisse zwischen jedem Paar von isotopischen Peaks der Verbindung. Einige Ausführungsformen verwenden weiterhin einen modellhaften isotopischen Cluster und einen einzelnen ungesättigten und nicht-überlagerten isotopischen Peak in einem entsprechenden experimentellen isotopischen Cluster, um die korrekten Intensitäten von gesättigten oder überlagerten isotopischen Peaks in dem gleichen experimentellen isotopischen Cluster abzuleiten. Diese Ausführungsformen können die quantitative Genauigkeit über einen ausgedehnten Dynamikbereich verbessern.
Eine Ausführungsform stellt einen Verfahren zum Analysieren einer komplexen Probe zur Verfügung, welches die Durchführung einer sequenziellen Chromatographie-IMS-MS-Analyse einer Probe umfasst, um eine Mehrzahl experimenteller Massenspektren, die isotopische Cluster aufweisen, zu erhalten. Jedem Spektrum der Mehrzahl von Spektren ist eine chromatographische Retentionszeit und eine Ionenmobilität-Driftzeit zugeordnet. Das Verfahren umfasst auch ein Berechnen eines modellhaften isotopischen Clusters eines Präkursor- oder Produkt-Ions, das einer Kandidaten-Verbindung in der Probe zugeordnet ist, und zwar entsprechend den natürlichen Isotopenhäufigkeits-Verhältnissen der Elemente, aus denen die Verbindung zusammengesetzt ist. Das Verfahren umfasst des Weiteren ein Vergleichen von Peaks des modellhaften isotopischen Clusters mit entsprechenden Peaks eines isotopischen Clusters eines der experimentellen Massenspektren, um einen oder mehrere gesättigte oder überlagerte Peaks des experimentellen isotopischen Clusters zu extrahieren. Wenigstens einer der Peaks des experimentellen isotopischen Clusters ist ungesättigt und nicht-überlagert.
Bei einigen Anwendungen ist die Probe eine biologische Probe, die beispielsweise Proteine, Peptide, Metabolite, Lipide oder die Gemische derselben umfasst.
Bei einigen Anwendungen umfassen die experimentellen Massenspektren wenigstens ein der Kandidaten-Verbindung zugeordnetes Präkursor- oder Produkt-Ion-Spektrum oder beide Spektren davon.
Bei einigen Anwendungen umfasst das Verfahren ein Bestimmen von Werten, die der Form des Peaks zugeordnet sind. Mit der Form des Peaks zugeordnete Werte können beispielsweise die Halbwertsbreite (full-width-at-half-maximum height; FWHM) umfassen.
Bei einigen Anwendungen umfasst das Verfahren weiterhin ein Erstellen eines Filters für jeden der Peaks in jedem der experimentellen isotopischen Cluster. Der Filter ist ein Kriterium, um die Qualität eines Masse-Peaks zu beurteilen, und er wird erstellt auf der Basis von Werten, die der Form des Peaks zugeordnet sind, einer vorab bestimmten instrumentellen Auflösung und einem Toleranzwert, wobei die instrumentelle Auflösung eine Massenauflösung umfasst.
Bei einigen Anwendungen umfasst das Verfahren weiterhin ein Identifizieren eines oder mehrerer gesättigter oder überlagerter Peaks und jedes ungesättigten und nicht-überlagerten Peaks in jedem der experimentellen isotopischen Cluster, basierend auf dem Filter für jeden der Peaks in jedem der experimentellen isotopischen Cluster.
Bei einigen Anwendungen wiederholt sich das Identifizieren für jeden der Peaks in jedem der experimentellen isotopischen Cluster, zuerst für die experimentellen isotopischen Cluster eines Präkursor-Ions, dann für die experimentellen isotopischen Cluster eines Produkt-Ions, bis ein ungesättigter und nicht-überlagerter Peak identifiziert wird.
Bei einigen Anwendungen umfasst das Berechnen des modellhaften isotopischen Clusters ein Berechnen der Anzahl, Massen und relativen Intensitäten der isotopischen Zusammensetzungen der Kandidaten-Verbindung, basierend auf den natürlichen Isotopenhäufigkeits-Verhältnissen der Elemente, aus denen sich die Verbindung zusammensetzt.
Bei einigen Anwendungen umfasst das Berechnen des modellhaften isotopischen Clusters ein Bezugnehmen auf ein oder mehrere Bibliotheks-Spektren, um eine Übereinstimmung zwischen einem experimentellen isotopischen Cluster und einem isotopischen Cluster in einem Spektrum der Bibliotheks-Spektren zu finden, und die Bibliotheks-Spektren werden durch statistische Analyse wiederholter Identifizierungen von Verbindungen, die mit der Kandidaten-Verbindung identisch sind, erzeugt.
Bei einigen Anwendungen umfasst das Vergleichen ein Korrigieren von Intensitäten der gesättigten oder überlagerten Peaks, basierend auf dem modellhaften isotopischen Cluster und (einem) ungesättigten und nicht-überlagerten Peak(s) in dem experimentellen isotopischen Cluster.
Bei einigen Anwendungen umfasst das Vergleichen weiterhin ein Rekonstruieren des experimentellen isotopischen Clusters, basierend auf den Peaks korrekter und/oder korrigierter Intensitäten, wodurch eine quantitative Genauigkeit über einen weiten Dynamikbereich bei sowohl gesättigten als auch überlagerten Isotop-Clustern erreicht wird.
Eine andere Ausführungsform beinhaltet ein System, welches umfasst: ein Chromatographie-Modul zum Trennen einer Probe, die interessierende Verbindungen umfasst; ein IMS-Modul, das dazu eingerichtet ist, die durch das Chromatographie-Modul getrennte Probe zu empfangen und die empfangene Probe weiter zu trennen; ein MS-Modul, das dazu eingerichtet ist, eine Massenanalyse an der weiter getrennten Probe durchzuführen; und eine Datenverarbeitungseinheit, die in Verbindung mit dem MS-Modul steht und einen oder mehrere Prozessoren und eine Mehrzahl von ausführbaren Programmen umfasst, die, wenn sie von einem der Prozessoren ausgeführt wird, das oben beschriebene Verfahren umsetzt.
Bei einigen Anwendungen ist das Chromatographie-Modul ein Flüssigchromatographie-(LC)-Modul.
Bei einigen Anwendungen ist das IMS-Modul in das MS-Modul eingebettet und ein Massenanalysator des MS-Moduls hat ein Massenauflösungsvermögen im Bereich von ungefähr 20.000 bis ungefähr 100.000 FWHM.
In einigen Fällen umfasst das Massenspektrometrie-Modul einen Flugzeit-Massenanalysator mit orthogonaler Beschleunigung (orthogonal acceleration time-of-flight mass analyzer).
Weitere Anwendungen, Merkmale und Vorteile werden im Lichte der Beschreibung, Zeichnungen und Patentansprüche offensichtlich sein.
Figurenliste
In den Zeichnungen beziehen sich gleiche oder gleichartige Bezugszeichen und Zahlen allgemein auf gleiche oder gleichartige Elemente der verschiedenen Ansichten. Des Weiteren sind die Zeichnungen nicht notwendigerweise maßstabsgetreu.

1 zeigt zwei simulierte Massenspektren A, B einer gleichen Verbindung, wobei A von einem ungesättigten Detektor stammt, während B durch Detektor-Sättigung beeinflusst ist.
2 ist ein schematischer Überblick eines Chromatographie-IMS-MS-Systems, entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung.
3 ist ein Flussdiagramm eines Verfahrens zum Analysieren, oder genauer, Quantifizieren einer komplexen Probe entsprechend einer weiteren Ausführungsform der Erfindung.
4A und 4B sind Diagramme von zwei Massenspektren, 4A ist ein experimentelles Spektrum mit zwei sich überlappenden isotopischen Clustern und 4B zeigt die zwei Cluster aufgelöst durch Anwendung des Verfahrens, wie es in 3 dargestellt ist.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und System entsprechend den angehängten Ansprüchen.
Einige veranschaulichende Anwendungen werden nun mit Bezug auf die 1-4 beschrieben. Im Lichte dieser Beschreibung, der Ansprüche und Figuren werden Modifikationen und Abwandlungen dieser Anwendungen sowie alternative Ausführungsformen für den einschlägigen Durchschnittsfachmann offensichtlich sein.
1 zeigt zwei simulierte Massenspektren A, B, die beide einer Verbindung m Molekulargewicht von 1000 Dalton _{(Da) (1000 u) zugeordnet sind}. Spektrum A enthält isotopische Peaks eines ungesättigten Detektors, während Spektrum B isotopische Peaks enthält, die durch Detektor-Sättigung beeinflusst sind. Wie aus Spektrum B ersichtlich ist, werden die intensivsten Peaks und Intensitätsverhältnisse zwischen den Peaks am stärksten durch Detektor-Sättigung beeinflusst.
2 ist ein schematischer Überblick eines Systems 200 zur Analyse, wie beispielsweise zur Identifizierung und Quantifizierung einer komplexen Probe, welches ein Chromatographie-Modul 210, ein IMS-Modul 220, ein MS-Modul 230 und eine Datenverarbeitungseinheit 240 umfasst.
Bei einigen Anwendungen ist das Chromatographie-Modul 210 ein LC-Modul, wo eine Mischung von Verbindungen in einer flüssigen mobilen Phase getragen wird und durch eine Chromatographie-Säule, die mit einer stationären Phase gepackt ist, fließt, um getrennt zu werden. Die Verbindungen werden aufgrund ihrer unterschiedlichen Affinitäten zu der mobilen und stationären Phase voneinander getrennt. Die LC ist leistungsstark beim Trennen von Verbindungen mit ausgeprägten physikochemischen Eigenschaften, z.B. Verbindungen mit unterschiedlichen Polaritäten oder unterschiedlichen Transportfähigkeiten durch die mobile Phase. Die Trennung erzeugt eine Sequenz von Chromatogrammen, von denen jedes durch ein RT-Fenster gekennzeichnet ist, das einer oder mehreren Verbindungen zugeordnet ist. Das Chromatographie-Modul 210 kann jede geeignete Konfiguration haben, z.B. eine ein- oder zweidimensionale Konfiguration haben, oder jede geeignete Größenordnung aufweisen, z.B. Mikro- oder Nano-Skala, wie dem Durchschnittsfachmann im Bereich der Chromatographie klar sein wird. Ein Beispiel eines Chromatographie-Moduls, mit dem einige Ausführungsformen der Erfindung angemessen umgesetzt werden, ist ein nanoACQUITY-UPLC^®-System, erhältlich von der Waters Corporation, Milford, Massachusetts.
Das IMS-Modul 220 trennt Verbindungen basierend auf deren Mobilitäten oder Driftzeiten (drift times; DT). Bei bevorzugten Anwendungen ist das IMS-Modul 220 in das MS-Modul 230 eingebettet. Die Verbindungen werden zunächst ionisiert und bewegen sich dann durch die Driftröhre 222, die in dem IMS-Modul 220 enthalten ist. Die Driftröhre 222 weist ein angelegtes elektrisches Feld auf und ist mit einem Driftgas gefüllt, das optional in einer Richtung entgegengesetzt zur Ionenbewegung fließen kann. Die Mobilität eines Ions wird bestimmt durch sein m/z und seinen „Kollisionsquerschnitt“, der eine Funktion der Form und Größe des Ions ist. Im Allgemeinen ist die Driftzeit (DT), die das Ion benötigt, umso länger, je größer der Kollisionsquerschnitt ist. Die IMS liefert eine zusätzliche Dimension der Trennung einer Probe und kann einige Verbindungen unterscheiden, die schwer mittels LC unterscheidbar sind, z.B. Verbindungen, die ähnliche physikochemische Eigenschaften haben und bei der LC in einem gleichen RT-Fenster koeluieren. Diese zusätzliche Dimension der Trennung minimiert die Effekte von Ionen-Interferenzen in komplexen Proben.
Es können eine Anzahl unterschiedlicher Formen von IMS verwendet werden. In einigen Ausführungsformen umfasst das IMS-Modul 220 eine Driftröhre, die eine Anzahl von Schutzringen aufweist, die untereinander über gleichwertige Widerstände und mit einer Gleichspannungsquelle (DC voltage source) verbunden sind, die einen linearen Gleichspannungs-Gradienten entlang der Driftröhre erzeugt. Bei anderen Ausführungsformen kann das IMS-Modul 220 ein feldasymmetrisches IMS umfassen. Bei weiteren Ausführungsformen umfasst das IMS-Modul 220 eine Reihe von Platten-Elektroden, von denen jede eine Öffnung aufweist, durch die Ionen übertragen werden. Ein Beispiel eines IMS-Moduls, mit dem einige Ausführungsformen der Erfindung angemessen umgesetzt werden können, wird in der veröffentlichten Anmeldung US 2003/0001084 A1 von Bateman et al., veröffentlicht am 2. Januar 2003, beschrieben.
Das MS-Modul 230 führt eine Massenanalyse der Verbindungen durch, die durch das Chromatographie-Modul 210 und weiter durch das IMS-Modul 220 getrennt wurden, und erzeugt eine Mehrzahl experimenteller Massenspektren, die isotopische Cluster aufweisen, die einer Kandidaten-Verbindungen zugeordnet sind, wobei jedes der experimentellen Massenspektren einer chromatographischen RT und einer lonenmobilität-DT zugeordnet ist. Bei einigen Anwendungen umfasst das MS-Modul 230 einen Flugzeit-Massenanalysator mit orthogonaler Beschleunigung (oa-TOF), der ein Massenauflösungsvermögen im Bereich von ungefähr 20.000 bis ungefähr 100.000 FWHM aufweist. Das MS-Modul 230 kann jedwede geeigneten Konfigurationen haben, wie dem Durchschnittsfachmann im Bereich der Chromatographie klar sein dürfte. Ein Beispiel eines solchen MS-Moduls ist ein SYNAPT™-High-Definition-MS-System, erhältlich von der Waters Corporation, Milford, MA.
Die Datenverarbeitungseinheit 240, die mit dem MS-Modul 230 in Verbindung steht, empfängt Massesignale vom MS-Modul 230 und führt eine massenspektrometrische Analyse der Probe durch, basierend auf den empfangenen Signalen. Die Datenverarbeitungseinheit 240 kann marktübliche Rechnersysteme umfassen. Beispiele bekannter Rechnersysteme umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Personal Computer, Server Computer, Handgeräte oder Laptops, Multiprozessor-Systeme, Mikroprozessor-basierte Systeme, Mini-Computer, Mainframe-Computer und dergleichen, wie sie im Stand der Technik bekannt sind. Die Datenverarbeitungseinheit 240 weist eine Mehrzahl von ausführbaren Programmen auf, die, wenn sie von einem der Prozessoren ausgeführt werden, in ein Verfahren umgesetzt werden, dessen Beschreibung unmittelbar folgt.
3 ist ein Flussdiagramm eines Verfahrens 300 zur Analyse einer komplexen Probe. Das Verfahren umfasst ein Durchführen (310) einer sequenziellen Chromatographie-IMS-MS-Analyse einer Probe, um eine Mehrzahl experimenteller Massenspektren, die isotopische Cluster aufweisen, zu erhalten. Jedes Spektrum der Mehrzahl von Spektren ist einer chromatographischen RT und einer Ionenmobilität-DT zugeordnet. Das Verfahren umfasst auch ein Berechnen (320) eines modellhaften isotopischen Clusters eines Präkursor- oder Produkt-Ions, das einer Kandidaten-Verbindung in der Probe zugeordnet ist, entsprechend den natürlichen Isotopenhäufigkeits-Verhältnissen der Elemente, aus denen die Verbindung zusammengesetzt ist. Das Verfahren umfasst weiterhin ein Vergleichen (330) von Peaks des modellhaften isotopischen Clusters mit Peaks eines experimentellen isotopischen Clusters, um einen oder mehrere gesättigte oder überlagerte Peaks des experimentellen isotopischen Clusters zu extrahieren. Wenigstens ein Peak innerhalb des experimentellen isotopischen Clusters ist ungesättigt und nicht-überlagert, was genutzt werden kann, um die korrekten Intensitäten von gesättigten oder überlagerten Peaks desselben experimentellen Clusters abzuleiten, basierend auf dem modellhaften isotopischen Cluster.
Bei den meisten Anwendungen wird das Verfahren zur quantitativen Analyse einer Verbindung in einer komplexen Probe verwendet, z.B. Analyse der Häufigkeit oder der Veränderung der relativen Häufigkeit der Verbindung gegenüber z.B. einer Kontrollprobe.
Sämtliche natürlich vorkommenden Elemente, z.B. Kohlenstoff, Wasserstoff usw., existieren als Mischungen von Isotopen, und als Folge hiervon weist jede Verbindung, die aus natürlich vorkommenden Elementen zusammengesetzt ist, eine Mehrzahl molekularer Massen auf, die den unterschiedlichen Isotopen und den natürlichen Isotopenhäufigkeits-Verhältnissen jedes Elements entsprechen. Entsprechend existiert eine solche Verbindung, wenn sie ionisiert wird, als eine Mehrzahl von isotopischen Ionen, die in einem oder mehreren isotopischen Clustern verteilt sind, und das Intensitätsverhältnis zwischen jedem Paar von isotopischen Ionen in einem isotopischen Cluster ist, theoretisch, proportional zum natürlichen Isotopenhäufigkeits-Verhältnis der Elemente, aus denen die Verbindung zusammengesetzt ist. Das Verfahren 300 nutzt dieses natürliche Phänomen bei der massenspektrometrischen Quantifizierung einer komplexen Probe.
Bei den meisten Anwendungen umfasst die Durchführung von (310) ein Sammeln von Daten von der Probe in einem System, welches ein Chromatographie-Modul, ein IMS-Modul und ein MS-Modul umfasst, um eine Sequenz von Roh-Massenspektren zu erzeugen, die der Kandidaten-Verbindungen zugeordnet sind und die eine Reihe von isotopischen Ionen aufweisen, die in einem oder mehreren isotopischen Clustern verteilt sind, und zwar in Abhängigkeit von der Anzahl der Ladungszustände des isotopischen Ions. Jedes Spektrum der Roh-Massenspektren ist einer chromatographischen RT und einer Ionenmobilität-DT zugeordnet. Ein Beispiel eines solchen Systems ist das in 2 gezeigte System 200, welches eine mehrdimensionale Trennungsfähigkeit mit einem hohen Massenauflösungsvermögen kombiniert und vereinfachte Massenspektren produziert, die weniger sowie besser aufgelöste Peaks aufweisen. Zusätzlich umfasst die Durchführung von (310) ein Verarbeiten der Roh-Massenspektren, beispielsweise einschließlich einer Basislinien-Erkennung, Glättung und Rauschunterdrückung. Das Verarbeiten erzeugt eine Mehrzahl von aufgelösten experimentellen Massenspektren, von denen jedes eine Reihe von isotopischen Peaks umfasst, die auf einen oder mehrere isotopischen Cluster verteilt sind, von denen jeder mit einem Ladungszustand bezeichnet ist.
Bei einigen Anwendungen umfasst das Verfahren 300 ein Erhalten (312) eines Datensatzes aus den experimentellen Massenspektren, und zwar für jeden Peak in jedem der experimentellen isotopischen Cluster. Der Datensatz enthält ein m/z, Werte, die der Peak-Form zugeordnet sind, wie Peak-Höhe, Peak-Fläche und FWHM, und RT und DT, welche einem der Massespektren zugeordnet sind, in denen der Peak vorhanden ist. Eine detaillierte Beschreibung, wie man die Daten beispielsweise erhält, wird in dem Artikel gegeben, der in Proteomics, 2011, 11, 1-23, von Scott Geromanos et al., veröffentlicht wurde.
Bei einigen Anwendungen umfasst das Verfahren 300 weiterhin ein Einrichten (314) eines Filters für jeden der Masse-Peaks in jedem der experimentellen isotopischen Cluster, basierend auf dem Datensatz, der in Schritt (312) erhalten wurde. Der Filter ist ein Kriterium, um die Qualität eines Masse-Peaks zu beurteilen, beispielsweise wie gut ein Peak gemessen wurde und ob ein Peak gesättigt oder überlagert ist. Der Filter kann eingerichtet werden durch erwartete Werte, die der Peak-Form zugeordnet sind, beispielsweise eine erwartete FWHM, die auf Basis einer bekannten oder vorab bestimmten instrumentellen Massenauflösung und einem Toleranzwert berechnet werden kann. Wenn ein MS-Modul beispielsweise eine vorab bestimmte Massenauflösung von 20.000 für einen Peak mit einer mittleren Masse von 2000 Da hat, dann kann die erwartete FWHM des Peaks berechnet werden, und zwar durch Division der mittleren Masse durch die Massenauflösung, was 0,1 Da ergibt. Diese erwartete FWHM kann dann als Filter zur Beurteilung eines Masse-Peaks dienen, zusammen mit einem Toleranzwert. Wenn beispielsweise die gemessene FWHM eines Masse-Peaks größer ist als der erwartete Wert, plus oder minus einem Toleranzwert, dann wird der Peak als gesättigt oder überlagert angesehen. In ähnlicher Weise kann ein Filter für einen chromatographischen Peak oder einen Drift-Peak berechnet werden, und zwar basierend auf der erwarteten jeweiligen Instrument-Leistung. Bei einigen Anwendungen wird ein Filter für einen beobachteten Masse-Peak eingerichtet durch Einbeziehung des Filters eines entsprechenden chromatographischen Peaks und eines Drift-Peaks, und ein gewichteter Durchschnitt des Filters wird zur Qualifizierung eines beobachteten Masse-Peaks verwendet. Eine detaillierte Beschreibung, wie ein solcher Filter für den jeweiligen Masse-Peak eingerichtet wird, wird beispielsweise in Anal. Bioanal. Chem., 2012, DOI 10.1007/s00216-012-6197-y, von Scott Geromanos et al gegeben.
Weiterhin umfasst das Verfahren 300 ein Identifizieren (316) eines oder mehrerer gesättigter oder überlagerter Ionen-Peaks in einem der experimentellen isotopischen Cluster. Wenigstens einer der Peaks ist ungesättigt und nicht-überlagert, und zwar basierend auf dem eingerichteten Filter für jeden der Peaks des experimentellen isotopischen Clusters. Wenn die FWHM eines Peaks nicht mit ihrer erwarteten FWHM innerhalb einer festgelegten Toleranz übereinstimmt, wird der Peak als gesättigter oder überlagerter Peak identifiziert, und ansonsten gilt der Peak als ungesättigt und nicht-überlagert. Der Schritt des Identifizierens (316) wiederholt sich optional für jeden Ionen-Peak in jedem der experimentellen isotopischen Cluster, zunächst für die Peaks eines Präkursor-Ions, dann für die Peaks eines Produkt-Ions, bis ein ungesättigter und nicht-überlagerter Peak identifiziert wird, falls wenigstens ein Ionen-Peak in einem der experimentellen isotopischen Cluster ungesättigt und nicht-überlagert ist. Mit den vereinfachten und gut aufgelösten experimentellen Massenspektren, die beispielsweise mit dem System 200 erzeugt werden, können verfälschte und unverfälschte Peaks effektiv identifiziert werden, da Peaks und Überlagerungsereignisse bei jedem der experimentellen isotopischen Cluster deutlich reduziert werden, so dass jede auf einen Peak einwirkende Verzerrung relativ leicht erkannt werden kann.
Bei einigen Anwendungen beinhaltet das Berechnen (320) eines modellhaften isotopischen Clusters der ionisierten Kandidaten-Verbindung ein Berechnen der Anzahl, Massen und relativen Intensitäten von isotopischen Molekülen oder isotopischen Zusammensetzungen, die sich auf die Verbindung beziehen, und zwar basierend auf den Element-Isotopen und deren Häufigkeits-Verhältnissen. Beispielsweise rührt für Bio-Moleküle der Großteil der isotopischen Zusammensetzungs-Variation von Kohlenstoff her, wobei die natürliche Häufigkeit von ¹³C ungefähr 1,1% von ¹²C beträgt. Solche Informationen können verwendet werden, um die relativen Häufigkeiten der verschiedenen isotopischen Zusammensetzungen eines Bio-Moleküls zu berechnen. Die relativen Intensitäten der Ionen eines isotopischen Clusters eines solchen Bio-Moleküls können durch die Formel 1 abgeschätzt werden $l_{n} = (\begin{matrix} N \\ n \end{matrix}) p^{n} {(1 - p)}^{N - n}$
wobei N die Gesamtzahl von Kohlenstoffatomen in einem Molekül ist, n die Anzahl von ¹³C-Isotopen angibt, p die natürliche Häufigkeit von ¹³C und I_n die relative Intensität von jedem ¹³C-Isotop in dem Molekül ist.
Das Berechnen (320) liefert eine theoretische isotopische Verteilung einer Verbindung, und solch ein modellhafter isotopischer Cluster oder theoretisches isotopisches Verteilungsmodell kann verwendet werden, um die Intensitätsverhältnisse der isotopischen Peaks eines beobachteten isotopischen Clusters der ionisierten Verbindung vorherzusagen.
Bei einigen Anwendungen umfasst das Berechnen (320) ein Bezugnehmen auf Bibliothek-Spektren oder Datenbank-Spektren, die isotopische Muster oder Cluster von Verbindungen zeigen, welche physikochemische Eigenschaften ähnlich denen der Kandidaten-Verbindung haben. Solche Bibliothek-Spektren oder Datenbank-Spektren werden normalerweise durch statistische Analyse von nachgebildeten Spektren oder wiederholte Identifikationen von Verbindungen erhalten, die identisch oder ähnlich der Kandidaten-Verbindung sind. Sobald eine Übereinstimmung zwischen einem experimentellen isotopischen Cluster und einem isotopischen Cluster in einem Spektrum der Bibliothek-Spektren gefunden wird, kann der isotopische Cluster aus dem Bibliothek-Spektrum als modellhafter isotopischer Cluster genutzt werden, der dem experimentellen isotopischen Cluster entspricht. Eine detaillierte Beschreibung, wie man einen modellhaften isotopischen Cluster durch Bezugnahme auf Bibliothek-Spektren berechnet, wird beispielsweise in J. Am. Soc. Mass Spectrum, 2012, DOI: 10.1007/s 13361-012-0416-9, von Konstantinos Thalassinos et al. gegeben.
Das Verfahren 300 umfasst weiterhin ein Vergleichen (330) von Peaks in dem modellhaften isotopischen Cluster mit entsprechenden Peaks in einem experimentellen isotopischen Cluster. Wenigstens einer der Peaks ist ungesättigt und nicht-überlagert, um einen oder mehrere gesättigte oder überlagerte Peaks in dem experimentellen isotopischen Cluster zu extrahieren.
Das Vergleichen (330) umfasst optional ein Überlagern der korrekten Intensitäten der gesättigten oder überlagerten Peaks, und zwar basierend auf dem modellhaften isotopischen Cluster und dem wenigstens einen ungesättigten und nicht-überlagerten Peak in dem experimentellen isotopischen Cluster. Wenn beispielsweise Ion A1 als ungesättigter und nicht-überlagerter Peak identifiziert wird und A2 als ein gesättigter oder überlagerter Peak, und wenn, basierend auf dem berichteten modellhaften isotopischen Cluster, das Häufigkeitsverhältnis von Ion A1 zu Ion A2 1:10 beträgt, dann kann die korrekte Intensität von Ion A2 direkt abgeleitet werden, indem man die Intensität von A1 mit 10 multipliziert. In gleicher Weise können die korrekten Intensitäten anderer gesättigter oder überlagerter Peaks in dem gleichen experimentellen isotopischen Cluster abgeleitet werden. Das Vergleichen (330) umfasst optional ein Rekonstruieren des gesamten experimentellen isotopischen Clusters, wodurch eine quantitative Genauigkeit über einen weiten Dynamikbereich unterstützt wird.
4A und 4B sind Diagramme von zwei Massenspektren. 4A ist ein experimentelles Spektrum, das zwei isotopische Cluster A, B enthält, die einander überlappen oder sich überlagern. A weist einen ersten isotopischen Peak mit einem m/z-Wert von 483,768 auf und B weist einen ersten isotopischen Peak mit einem m/z-Wert von 484,268 auf. 4B zeigt, dass die zwei Cluster A, B aufgelöst werden, indem man das in 3 dargestellte Verfahren anwendet, und mit dem experimentellen Spektrum aus 4A überlagert.
Obwohl eine Reihe von Anwendungen oben beschrieben wurden, sind im Lichte der vorangehenden Lehre andere Modifikationen, Variationen und Anwendungen möglich.
Obwohl beispielsweise, wie oben beschrieben, ein beeinträchtigter Peak, entweder gesättigt oder überlagert, durch einen Filter identifiziert werden kann, der, basierend auf den erwarteten Werten, die der Peak-Form zugeordnet sind, eingerichtet wird, kann ein beeinträchtigter Peak alternativ durch Musterabgleich erkannt werden, d.h. durch direktes Abgleichen eines experimentellen isotopischen Clusters, in dem sich der Peak befindet, mit einem theoretischen oder erwarteten Peak, der der gleichen Verbindung zugeordnet ist.
Entsprechend soll die Erfindung nicht durch die vorangehende beispielhafte Beschreibung definiert werden, sondern durch den Schutzbereich der nachfolgenden Ansprüche.

Claims

Verfahren (300) zum Analysieren einer komplexen Probe, umfassend: Durchführen (310) einer sequenziellen Chromatographie-IMS-MS-Analyse einer Probe, um eine Mehrzahl experimenteller Massenspektren, die isotopische Cluster aufweisen, zu erhalten, wobei jedes Spektrum der Mehrzahl von Spektren einer chromatographischen Retentionszeit und einer Ion-Mobilität-Driftzeit zugeordnet ist; Berechnen (320) eines modellhaften isotopischen Clusters eines Präkursor- oder Produkt-Ions, das einer Kandidaten-Verbindung in der Probe zugeordnet ist, entsprechend den natürlichen Isotopenhäufigkeits-Verhältnissen von Elementen, aus denen sich die Verbindung zusammensetzt; Vergleichen (330) von Peaks des modellhaften isotopischen Clusters mit entsprechenden Peaks eines isotopischen Clusters eines der experimentellen Massenspektren, um einen oder mehrere gesättigte oder überlagerte Peaks des experimentellen isotopischen Clusters zu extrahieren; und Identifizieren (316) eines oder mehrerer der extrahierten gesättigten oder überlagerten Peaks und jeglicher ungesättigter und nicht-überlagerter Peaks in jedem der experimentellen isotopischen Cluster in Abhängigkeit eines Peak-Form-Parameters für jeden der Peaks in jedem der experimentellen isotopischen Cluster; wobei das Vergleichen (330) ein Ableiten der korrekten Intensitäten der gesättigten oder überlagerten Peaks umfasst, basierend auf dem modellhaften isotopischen Cluster und einem ungesättigten und nicht-überlagerten Peak in dem experimentellen isotopischen Cluster.
Verfahren (300) nach Anspruch 1, wobei die Probe eine biologische Probe ist, die Proteine, Peptide, Metabolite, Lipide oder Mischungen derselben umfasst.
Verfahren (300) nach Anspruch 1, wobei das Durchführen (310) weiterhin ein Verarbeiten der Roh-Spektraldaten zur Ladungszustand-Dekonvolution umfasst.
Verfahren (300) nach Anspruch 1, wobei das Berechnen des modellhaften isotopischen Clusters ein Bezugnehmen auf ein oder mehrere Bibliothek-Spektren umfasst, um eine Übereinstimmung zwischen einem isotopischen Cluster der experimentellen Massenspektren und einem isotopischen Cluster in einem Spektrum der Bibliothek-Spektren zu finden.
Verfahren (300) nach Anspruch 4, wobei die Bibliothek-Spektren wiederholten Identifikationen von Verbindungen zugeordnet sind, die identisch mit der Kandidaten-Verbindung sind.
Verfahren (300) nach Anspruch 1, wobei das Vergleichen weiterhin ein Rekonstruieren des experimentellen isotopischen Clusters mit den Peaks von abgeleiteten korrekten Intensitäten umfasst.
System (200) zum Analysieren einer komplexen Probe, umfassend: ein Chromatographie-Modul (210) zur Trennung einer Probe, die interessierende Verbindungen umfasst; ein lonenmobilitäts-Spektrometrie-Modul (220), das dazu eingerichtet ist, die von dem Chromatographie-Modul (210) getrennte Probe zu empfangen und die empfangene Probe weiter zu trennen; ein Massenspektrometrie-Modul (230), das dazu eingerichtet ist, eine Massenanalyse an der weiter getrennten Probe durchzuführen; und eine Datenverarbeitungseinheit (240), die mit dem Massenspektrometrie-Modul (230) verbunden ist und einen oder mehrere Prozessoren und eine Mehrzahl von ausführbaren Programmen umfasst, welche, wenn sie von einem der Prozessoren ausgeführt wird, das Verfahren (300) nach Anspruch 1 umsetzt.
System (200) nach Anspruch 7, wobei das Chromatographie-Modul (210) ein Flüssigchromatographie-Modul ist.
System (200) nach Anspruch 7, wobei das lonenmobilitäts-Spektrometrie-Modul (220) in das Massenspektroskopie-Modul eingebettet ist.
System (200) nach Anspruch 7, wobei das Massenspektrometrie-Modul (230) einen Flugzeit-Massenanalysator mit orthogonaler Beschleunigung umfasst.
System (200) nach Anspruch 10, wobei der Massenanalysator ein Massenauflösungsvermögen in einem Bereich von ungefähr 20.000 bis ungefähr 100.000 FWHM aufweist.